JP2024510298A - 放射線療法と連携して抗腫瘍に使用される製剤の調製におけるマラリア原虫の使用 - Google Patents
放射線療法と連携して抗腫瘍に使用される製剤の調製におけるマラリア原虫の使用 Download PDFInfo
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Abstract
放射線療法と連携して抗腫瘍に使用される製剤の調製におけるマラリア原虫の使用、および放射線療法と連携して使用されるマラリア原虫抗腫瘍製剤を提供する。【選択図】図１
Description
本発明は、バイオ医薬分野に関し、具体的には、放射線療法と連携して抗腫瘍に使用される製剤の調製におけるマラリア原虫の使用に関する。
腫瘍治療方法には、手術、放射線、化学療法（分子標的治療を含む）という３つの伝統的なモードがあり、新たな生物治療（免疫治療を含む）もある。臨床的には、総合治療を主とし、手術と化学放射線療法とを併用する方式は、早期に発見された腫瘍に対して治療効果が良いが、後期に進展した腫瘍に対して治療効果が良くない。現在、後期悪性固形腫瘍の治療において、様々な生物治療は、より多くの選択を提供し、分子標的薬、抗体、免疫治療薬（例えば、ＰＤ－１）および細胞治療（例えば、ＣＡＲ－Ｔ、ＴＩＬ、ＣＩＫ）は、いくつかの進展があったが、癌の急速な発展を阻止することがまだできなかった。
マラリアは、主に、蚊刺によって伝播する、マラリア原虫感染による虫媒介性感染症であり、世界保健機関によって世界三大感染症（エイズ、結核およびマラリア）の１つとして挙げられる。ヒトに感染するマラリア原虫は、主に、熱帯熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）、三日熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｖｉｖａｘ）、四日熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｍａｌａｒｉａｅ）、卵形マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｏｖａｌｅ）およびサルマラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｋｎｏｗｌｅｓｉ）という５つのタイプがあり、最もよく見られるのは、熱帯熱マラリア原虫および三日熱マラリア原虫である。ネズミマラリア原虫も、主に、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｃｈａｂａｕｄｉ、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｙｏｅｌｉｉ、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｂｅｒｇｈｅｉおよびＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｖｉｎｃｋｅｉという４つのタイプがある。
マラリア原虫はマラリアの病原体であり、１９８１年、Ｇｒｅｅｎｔｒｅｅ ＬＧは、マラリア療法を腫瘍の治療に使用する構想を初めて提出し、１９８８年、タイの学者Ａｎｇｓｕｂｈａｋｏｒｎらは、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｂｅｒｇｈｅｉに感染したラットがアフラトキシンによって誘発される肝癌の発生を予防できることを発見し、２００６年、劉英傑らは、マウスモデルでＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｙｏｅｌｉｉが滑膜肉腫癌細胞（Ｓ１８０）に対して一定の腫瘍抑制効果を有することを観察した。陳小平らは、マウスモデルにおいて、マラリア原虫感染が肺癌、肝癌、結腸癌、乳癌等の様々な腫瘍に対して腫瘍の成長、転移を著しく抑制し、担癌マウスの生存期間を延長することを研究発見した。マラリア原虫感染は、腫瘍の局所および全身性抗腫瘍特異的免疫反応を強化し、全身性の長時間効果的な腫瘍の特異的免疫記憶の発生を誘導することができる。マラリア原虫感染は、腫瘍微小環境を改善することもでき、骨髄系由来の抑制性細胞（ＭＤＳＣｓ）、調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇｓ）および腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭｓ）のような腫瘍組織内の様々な抑制性免疫細胞の割合または数を著しく低減することにより、腫瘍組織内の免疫抑制微小環境を解除し、Ｔ細胞の腫瘍組織への浸潤を促進し、腫瘍細胞を効果的に殺傷する。
しかし、全ての腫瘍患者が新たな免疫療法に対して抗腫瘍反応を生じることではなく、高い個人差を有し、依然として腫瘍治療分野の１つの巨大な障害であるため、ポリシーの改良を切望している。マラリア原虫免疫療法は、抗マラリア薬により感染率を制御することで、臨床的毒副作用を低減することができ、安全な免疫療法であるため、マラリア原虫に基づく著しい抗腫瘍効果が得られる新たな連携治療ポリシーの開発は、非常に有意義であり、新しい腫瘍治療構想を提供することもできる。
従来技術の不足に対し、本発明の目的は、放射線療法と連携して抗腫瘍に使用される製剤の調製におけるマラリア原虫の使用を提供することである。本発明は、マラリア原虫免疫療法（生物療法）と放射線療法との連携に成功し、高いバイオセキュリティを有し、単一のマラリア原虫免疫療法または単一の放射線療法と比べて腫瘍の成長をより顕著に抑制し、かつ接種された担癌マウスの生存期間を延長し、腫瘍の治療に新しいポリシーおよび考えを提供する。マラリア原虫免疫療法は、感染によって生体の末梢血を増加し、脾臓でより多くの割合または絶対数のＣＤ４＋Ｔ、ＣＤ８＋Ｔ細胞を生成し、末梢血および脾臓内のＴｒｅｇｓおよびＭＤＳＣｓ細胞の割合を低減し、腫瘍成長を抑制し、放射線療法は、腫瘍細胞を直接殺傷することにより腫瘍組織量を低減するが、放射線療法は、脾臓内のＣＤ４＋Ｔ、ＣＤ８＋Ｔ細胞の絶対数を低減し、一定の抗腫瘍免疫能力を損傷し、マラリア原虫免疫療法および放射線療法は、いずれも免疫細胞の腫瘍への浸潤を促進し、相補的かつ相乗的な抗腫瘍効果を発揮することができる。
この発明目的を達成するために、本発明は、以下の技術案を採用する。
態様１において、本発明は、放射線療法と連携して抗腫瘍に使用される製剤の調製におけるマラリア原虫の使用を提供する。
腫瘍の病因が複雑であるため、単一の免疫療法または単一の放射線療法は腫瘍の治療で限界性が大きく、所望の治療効果を達成することができず、本発明は、初めてマラリア原虫免疫療法と放射線療法とを連携して抗腫瘍用の製剤として使用し、ここで、マラリア原虫免疫療法は、天然免疫系を全面的に活性化してかつ一定の特異的免疫を誘導することにより、多標的効果を有し、しかし、マラリア原虫免疫療法は腫瘍を直接殺傷できず、腫瘍の体積が大きければ、マラリア原虫免疫療法の治療効果に影響を及ぼす。ここで、放射線療法は、腫瘍細胞を直接殺傷し、腫瘍組織量を低減し、腫瘍抗原を放出することができ、マラリア原虫免疫療法によって活性化された免疫系の治療に対する介入に有利であり、抗腫瘍免疫能力を強化する。
マラリア原虫感染は、天然免疫系を全面的に活性化し、ＣＤ４＋Ｔ、ＣＤ８＋Ｔ細胞の割合および絶対数を含み、放射線療法は腫瘍を直接殺傷できるが、リンパ球細胞の絶対数を損傷することもあり、一定の免疫抑制作用を有する。マラリア原虫感染は、マクロファージおよび樹状細胞（ＤＣ）を刺激し、ＭＨＣ ＩＩ、ＣＤ８０、ＣＤ８６およびＣＤ２８分子を高発現し、それらのＩＬ－１２、ＩＦＮ－α／β／γ、ＴＮＦ－α、ＩＬ－８およびＮＯ等の様々なサイトカインの分泌を促進し、抗原提示細胞の分化および成熟を促進する。赤内期マラリア原虫は、感染早期で宿主の免疫細胞を広く活性化し、大量のＩＦＮ－γおよびＴＮＦ－α等のサイトカインの発生を誘導し、ＮＫ、γδＴ、ＮＫＴ細胞を活性化し、その殺傷能力を強化し、腫瘍の局所および全身性抗腫瘍特異的免疫反応を強化することができる。マラリア原虫感染は、ＴＡＭｓを低減してかつ大量のエクソソームを産生する方式により、血管が生成した複数の経路および標的に作用し、腫瘍組織内の血管生成を顕著に抑制する。それとともに、マラリア原虫感染は、全身の長時間効果的な腫瘍特異的免疫記憶の発生を誘導することもできる。
放射線療法は、細胞の染色体を破壊することにより腫瘍細胞を直接殺傷し、生体が電離してラジカルを生成することを引き起こすこともでき、ラジカルは更に生物高分子と作用し、細胞の不可逆的損傷を引き起こし、腫瘍組織を直接および間接的に破壊する。放射線療法後に、腫瘍細胞は、細胞アポトーシスおよび壊死からオートファジーおよび細胞分裂異常まで、高い多様性を示し、これにより、大量の腫瘍抗原を元に放出し、タンパク質の翻訳を増加して腫瘍関連抗原の量および種類の顕著な増加を促進し、カルレティキュリンが腫瘍細胞表面に露出することにより、ＨＭＧＢ１およびＡＴＰ等の分子を放出してＤＣ細胞の腫瘍抗原に対する摂取、提示およびＴ細胞の活性化を促進する。マラリア原虫感染は、骨髄系由来の抑制性細胞（ＭＤＳＣｓ）、調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇｓ）および腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭｓ）のような腫瘍組織内の様々な抑制性免疫細胞の割合または数を著しく低減することにより、腫瘍微小環境を改善し、Ｔ細胞の腫瘍組織への浸潤を促進し、腫瘍細胞を効果的に殺傷する。
以上をまとめ、マラリア原虫感染と放射線療法との連携は、生体のＣＤ４＋Ｔ、ＣＤ８＋Ｔ細胞の割合および絶対数を増加し、抗原提示細胞によるより多くの特異的抗原への認識を強化し、生体の抗腫瘍免疫反応に有利であり、残留した腫瘍細胞を効果的に除去し、生体のＩＦＮ－γおよびＴＮＦ－α等の抗腫瘍のサイトカインを増加し、ＮＫ、γδＴ、ＮＫＴ細胞を活性化してその殺傷腫瘍能力を強化し、腫瘍微小環境におけるＴｒｅｇｓ、ＭＤＳＣｓおよびＴＡＭｓの割合または数を低下し、相補的かつ相乗的な抗腫瘍効果を形成することができる。
好ましくは、前記マラリア原虫は、熱帯熱マラリア原虫、三日熱マラリア原虫、四日熱マラリア原虫、卵形マラリア原虫、またはサルマラリア原虫のいずれか１種または少なくとも２種の組み合わせを含み、例えば、熱帯熱マラリア原虫と三日熱マラリア原虫との組み合わせ、三日熱マラリア原虫と四日熱マラリア原虫との組み合わせ、卵形マラリア原虫とサルマラリア原虫との組み合わせ等であり、他の任意の組み合わせ方式はいずれも選択でき、ここで説明を省略する。
三日熱マラリア原虫であることが好ましい。
好ましくは、前記マラリア原虫の接種量は、１００個以上のマラリア原虫または５つ以上のマラリア原虫スポロゾイトであり、例えば、１００個のマラリア原虫、１２０個のマラリア原虫、１４０個のマラリア原虫、１５０個のマラリア原虫、１６０個のマラリア原虫、５個のマラリア原虫スポロゾイト、８個のマラリア原虫スポロゾイト、１０個のマラリア原虫スポロゾイト、１５個のマラリア原虫スポロゾイト等であり、他の任意の具体的な点値はいずれも選択でき、ここで説明を省略する。
前記マラリア原虫の接種量は、当業者は実際の状況に応じて調節することができ、患者の個人差によって感染できるマラリア原虫の数が異なるため、一般的に、前記マラリア原虫の接種量は、１００個以上のマラリア原虫または５つ以上のマラリア原虫スポロゾイトである。
本発明に係るマラリア原虫感染は、長期間マラリア原虫感染であり、感染周期が長いほど、腫瘍に対する抑制効果が明らかになり、前記長期間マラリア原虫感染とは、マラリア原虫を感染してマラリア原虫感染の慢性期まで持続し、かつしばらく維持してから、抗マラリア薬を投与して感染を終了するか、または感染を終了せず、患者が虫付きの状態にあり、マラリア原虫感染後に、約６～８週の感染急性期を経た後、慢性期に入り、この時、末梢血のみで少量のマラリア原虫を検出できるが、急性期の臨床的症状が現れない。
好ましくは、前記放射線療法は、α線、β線、γ線、Ｘ線、電子線、または陽子線を含む。
好ましくは、前記放射線療法は、単一回放射線療法、複数回放射線療法、または分割放射線療法を含む。
好ましくは、前記放射線療法は、全身性放射線療法または局所放射線療法を含む。
好ましくは、前記腫瘍は、肺癌、胃癌、結腸癌、肝癌、乳癌、前立腺癌、卵巣癌、膵癌および脳腫瘍を含む。
好ましくは、前記製剤の剤形は、薬剤学的に許容可能ないずれかの剤形を含む。
好ましくは、前記製剤は、薬剤学的に許容可能な薬用補助剤のいずれか１種または少なくとも２種の組み合わせを更に含む。前記補助剤は、賦形剤、希釈剤、担体、調味剤、粘着剤、または充填剤のいずれか１種または少なくとも２種の組み合わせである。
好ましくは、前記マラリア原虫は、薬用担体に担持されたマラリア原虫である。
好ましくは、前記薬用担体は、リポソーム、ミセル、デンドリマー、微小球、またはマイクロカプセルを含む。
態様２において、本発明は、放射線療法と連携して使用されるマラリア原虫製剤である抗腫瘍の製剤を提供する。
前記抗腫瘍の製剤は、高いバイオセキュリティを有し、単一のマラリア原虫免疫療法および単一の放射線療法と比べてより強い腫瘍成長の抑制効果を有し、担癌マウスの生存期間をより効果的に延長することができ、腫瘍の治療に新しいポリシーおよび考えを提供し、放射線療法の用量または放射線療法の回数を減少することで放射線療法の患者免疫系に対する傷害を低減し、放射線療法の副作用を低減し、腫瘍患者の治療コストを低減することができ、マラリア原虫免疫療法と放射線療法との連携療法は、相補的かつ相乗的な効果により、より強い抗腫瘍特異的反応を起こす。
前記抗腫瘍の製剤内のマラリア原虫は、マラリア原虫、またはマラリア原虫と他の補助剤との組み合わせを腫瘍患者の体内に投与してマラリア原虫に感染させれば良く、当業者は、実際の状況に応じて本分野の公知の方法を選択して行うことができ、注射の方式であることが好ましい。
本発明において、ヒトがマラリア原虫に感染した後に形成された慢性マラリア原虫感染は、数年間にわたって持続存在することができ、更に同種または異種のマラリア原虫によって繰り返し感染できるため、長期間の繰り返すマラリア原虫感染状態を形成することができ、マラリア原虫は、腫瘍細胞の成長を抑制し、患者の寿命を延長することができ、腫瘍患者のためにより長い治療タイミングおよび生体の免疫環境を獲得し、患者の脳腫瘍の治療および回復に寄与する。
本発明において、マラリア原虫感染は、腫瘍に対する免疫監視機構を強化することができる。マラリア原虫感染過程において、危険シグナル分子病原体に関連するパターン認識分子（ＰＡＭＰｓ）を放出し、グリコシルホスファチジルイノシトールアンカー（ＧＰＩアンカー）、ヘム、免疫刺激核酸モチーフ、および他の未知の分子を含むものは、宿主の免疫細胞のパターン認識受容体（ＰＲＲｓ）によって認識でき、異なる転写プログラムをトリガし、複数の下流シグナル経路を刺激して全身性免疫反応の発生を誘導し、ＴＮＦ－α、ＩＬ－１β、ＩＬ－２、ＩＬ－６、ＩＬ－１２、ＩＦＮｓ等のサイトカインを放出し、ＮＫ、ＮＫＴ、γ／δＴおよびＤＣ細胞を活性化した後にＣＤ４＋ＴおよびＣＤ８＋Ｔ細胞の割合または絶対数を活性化し、ＴＧＦ－β、ＩＬ－１０等のサイトカインを低減してＴｒｅｇｓ、ＭＤＳＣｓおよびＴＡＭｓ細胞の割合を低減し、腫瘍の免疫抑制微小環境を改善することを含み、マラリア原虫感染は、腫瘍の特異的Ｔ細胞の増殖およびＣＤ８＋Ｔ細胞の細胞傷害（ＣＴＬ）活性を増加することにより、適応性抗腫瘍免疫を誘導し、且つ、これらの細胞の腫瘍組織への浸潤を増加して腫瘍細胞を殺傷する。
本発明において、マラリア原虫感染による発熱は、腫瘍細胞死を促進する可能性がある。医学文献で、発熱性感染は腫瘍の自然退縮に関連し、マラリアは、典型的な発熱性感染である。マウスで、マラリア原虫は短期的な感染しか引き起こすことができず、発熱せず、マウスモデルで、重ねてのマラリア原虫感染を観察しにくく、一方、ヒトで、マラリア原虫感染は長期的な寄生虫血症を引き起こすことができ、急性期高熱に伴い、このような症候群は、ライフサイクル全体にわたって複数回繰り返すことができる。従って、蚊刺によって自然に得られたマラリア原虫により、肝期および血期マラリア原虫感染が発生し、免疫系を連続的に刺激して腫瘍を有効な腫瘍ワクチンに変換し、急性期の発熱、およびその腫瘍血管新生抑制効果と併せて、腫瘍に対して多経路多標的の治療作用を果たす。
本発明において、放射線療法は、α線、β線、γ線、Ｘ線、電子線、または陽子線等の線により、腫瘍患者の腫瘍組織を照射し、細胞の染色体を直接破壊することで、腫瘍成長を制御する。放射線療法は、分割放射線の回数、単一回の放射線量および放射線の総量等を調整することにより、異なるタイプの腫瘍および異なる段階の腫瘍を治療する。放射線療法は、腫瘍の一部を殺傷し、腫瘍抗原を放出し、局所的な腫瘍ワクチンに誘導し、アブスコパルの放射線治療されていない腫瘍の縮小または消失に繋がり、「アブスコパル効果」を形成する。放射線療法は、生体の免疫系を活性化することにより、抗腫瘍免疫効果を誘導して改善する。
好ましくは、前記製剤と放射線療法とは同時に投与する。
好ましくは、前記製剤と放射線療法とは順次投与する。
前記製剤と放射線療法とは、同時に投与してもよいし、順次投与してもよく、例えば、まずマラリア原虫感染を投与し、時間をおいてから放射線療法を投与してもよいし、まず放射線療法を投与し、時間をおいてからマラリア原虫感染を投与してもよいし、またはマラリア原虫感染と放射線療法とを交互に行ってもよい。
好ましくは、前記マラリア原虫は、熱帯熱マラリア原虫、三日熱マラリア原虫、四日熱マラリア原虫、卵形マラリア原虫、またはサルマラリア原虫のいずれか１種または少なくとも２種の組み合わせを含み、三日熱マラリア原虫であることが好ましい。
好ましくは、前記マラリア原虫の接種量は、１００個以上のマラリア原虫または５つ以上のマラリア原虫スポロゾイトであり、例えば、１００個のマラリア原虫、１２０個のマラリア原虫、１４０個のマラリア原虫、１５０個のマラリア原虫、１６０個のマラリア原虫、５個のマラリア原虫スポロゾイト、８個のマラリア原虫スポロゾイト、１０個のマラリア原虫スポロゾイト、１５個のマラリア原虫スポロゾイト等であり、他の任意の具体的な点値はいずれも選択でき、ここで説明を省略する。
好ましくは、前記腫瘍は、肺癌、胃癌、結腸癌、肝癌、乳癌、前立腺癌、卵巣癌、膵癌、または脳腫瘍を含む。
好ましくは、前記製剤の投与方式は、静脈注射、腹腔注射、筋肉注射、皮下注射、経口投与、舌下投与、鼻腔投与、または経皮投与を含む。
態様３において、本発明は、放射線療法とマラリア原虫療法とを連携して使用する療法である抗腫瘍の連携療法を提供する。
好ましくは、前記放射線療法とマラリア原虫とは同時に投与する。
好ましくは、前記放射線療法とマラリア原虫とは順次投与する。
好ましくは、前記マラリア原虫は、熱帯熱マラリア原虫、三日熱マラリア原虫、四日熱マラリア原虫、卵形マラリア原虫、またはサルマラリア原虫のいずれか１種または少なくとも２種の組み合わせを含み、三日熱マラリア原虫であることが好ましい。
好ましくは、前記マラリア原虫の接種量は、１００個以上のマラリア原虫または５つ以上のマラリア原虫スポロゾイトである。
好ましくは、前記腫瘍は、肺癌、胃癌、結腸癌、肝癌、乳癌、前立腺癌、卵巣癌、膵癌および脳腫瘍を含む。
好ましくは、前記マラリア原虫の投与方式は、静脈注射、腹腔注射、筋肉注射、皮下注射、経口投与、舌下投与、鼻腔投与、または経皮投与を含み、静脈注射であることが好ましい。
従来技術に対し、本発明は、以下の有益な効果を有する。
本発明は、マラリア原虫と放射線療法との連携に成功し、高いバイオセキュリティを有し、マラリア原虫は、主に間欠的な寒熱の発作を引き起こし、抗マラリア薬を使用することにより感染率を制御し、急激な寒熱の発作を回避し、安全性が確保され、脳の正常機能および他の器官組織の機能に危害を与えない。且つ、単一のマラリア原虫治療または単一の放射線療法と比べて腫瘍の成長をより顕著に抑制し、主に腫瘍を直接殺傷すること、および相補的かつ相乗的な免疫効果により、特異的抗腫瘍反応を強化して腫瘍成長を抑制し、患者の生存期間を延長する。本発明に係る抗腫瘍の連携製剤は比較的経済的であり、臨床でよく使用される標準化学療法の使用コストが高く、相対的に、マラリア原虫免疫療法のコストはかなり低く、患者にマラリア原虫スポロゾイトまたは赤内期のマラリア原虫を注射し、安価な抗マラリア薬でマラリア原虫感染率を制御することにより、マラリア原虫感染の副作用が比較的少なく、腫瘍患者に対して簡単な対症治療を行い、血液の一般検査および肝腎機能を定期的に監視すれば良く、患者にとって余計な他の費用が必要とせず、更に、病態の変化に従い、いつでも治療を再開したり治療を終了したりすることができ、治療コースは人為的に制御できる。マラリア原虫と放射線療法との連携用の製剤は、比較的安全で、経済的で、実行可能性がある新たな腫瘍治療手段であり、これは、腫瘍の治療に新しいポリシーおよび考えを提供する。
以下、本願の技術案について具体的な実施形態により更に説明する。当業者であれば、前記実施例は、本発明を理解するためのものに過ぎず、本発明の具体的な制限と見なされるべきではないことを理解すべきである。
マラリア原虫感染と放射線療法との連携で皮下接種のＬＬＣ肺癌を治療する実験例
本実施例に必要な実験材料および製剤は、以下を含む。
動物：Ｃ５７ＢＬ／６マウス、メス、６～８週齢、上海ＳＬＡＣ実験動物有限責任公司に由来し、マラリア原虫：マウスＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｙｏｅｌｉｉ（Ｐ．ｙｏｅｌｉｉ １７ＸＮＬ、ＭＲＡ－５９３、Ｐｙ）、Ｍａｌａｒｉａ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｒｅｓｏｕｒｃｅ Ｃｅｎｔｅｒ（ＭＲ４）の無料贈答に由来し、マウス肺癌細胞系ＬＬＣ：アメリカタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）に由来し、Ｇｉｅｍｓａ染剤粉末：Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社から購入され、アベルチン（２，２，２－トリブロモエタノール、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社から購入され、Ｔ４８４０２、調製濃度１．２％）、病理スライドガラス：商品番号１０１２７１０１Ｐ－Ｇ、江蘇世泰実験器材有限公司から購入され、セダーウッド油：中国上海標本モデル工場に由来し、ＰＢＳ緩衝液：ＳＨ３０２５６．０１、Ｈｙｃｌｏｎｅ社から購入され、生理食塩水：辰欣薬業股分有限公司から購入された。
赤血球溶解液（ＡＣＫ Ｌｙｓｉｓ Ｂｕｆｆｅｒ）の調製：ＮＨ４Ｃｌ，１５０ｍＭ、ＫＨＣＯ３，１０ｍＭ、Ｎａ２ＥＤＴＡ，０．１ｍＭ。
ＦＯＸＰ３固定透過剤：Ｍｏｕｓｅ Ｆｏｘｐ３ Ｆｉｘａｔｉｏｎ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅ（２０ｘ）（ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ ５１－９００６１２４）、Ｍｏｕｓｅ Ｆｏｘｐ３ Ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅ（５ｘ）（ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ ５１－９００６１２５）。
抗体：ＦＩＴＣ ａｎｔｉ－ｍｏｕｓｅ ＣＤ３ Ａｎｔｉｂｏｄｙ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、ｃａｔ：１００２０４）、ＰｅｒＣＰ ａｎｔｉ－ｍｏｕｓｅ ＣＤ４ Ａｎｔｉｂｏｄｙ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、ｃａｔ：１００５３８）、Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ Ｖｉｏｌｅｔ ５１０ＴＭａｎｔｉ－ｍｏｕｓｅ ＣＤ８ａ Ａｎｔｉｂｏｄｙ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、ｃａｔ：１００７５２）、Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ Ｖｉｏｌｅｔ ７１１ＴＭａｎｔｉ－ｍｏｕｓｅ ＣＤ４５ Ａｎｔｉｂｏｄｙ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、ｃａｔ：１０３１４７）、ＡＰＣ／ＦｉｒｅＴＭ７５０ ａｎｔｉ－ｍｏｕｓｅ／ｈｕｍａｎ ＣＤ１１ｂ Ａｎｔｉｂｏｄｙ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、ｃａｔ：１０１２６２）、Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ Ｖｉｏｌｅｔ ４２１ＴＭａｎｔｉ－ｍｏｕｓｅ Ｌｙ－６Ｃ Ａｎｔｉｂｏｄｙ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、ｃａｔ：１２８０３２）、ＰＥ／Ｃｙ７ ａｎｔｉ－ｍｏｕｓｅ Ｌｙ－６Ｇ Ａｎｔｉｂｏｄｙ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、ｃａｔ：１２７６１８）、ＡＰＣ ａｎｔｉ－ｍｏｕｓｅ ＣＤ２５ Ａｎｔｉｂｏｄｙ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、ｃａｔ：１０１９１０）、ＰＥ ａｎｔｉ－ｍｏｕｓｅ ＦＯＸＰ３ Ａｎｔｉｂｏｄｙ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、ｃａｔ：１２６４０４）、ＡＰＣ Ｒａｔ ＩｇＧ２ｂ、κＩｓｏｔｙｐｅ Ｃｔｒｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、ｃａｔ：４００６１１）、ＰＥ Ｒａｔ ＩｇＧ２ｂ、κＩｓｏｔｙｐｅ Ｃｔｒｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、ｃａｔ：４００６０８）、Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ Ｖｉｏｌｅｔ ４２１ＴＭＲａｔ ＩｇＧ２ｃ、κＩｓｏｔｙｐｅ Ｃｔｒｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、ｃａｔ：４００７２５）、ＰＥ／Ｃｙ７ Ｒａｔ ＩｇＧ２ａ、κＩｓｏｔｙｐｅ Ｃｔｒｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、ｃａｔ：４００５２１）、ＴｒｕＳｔａｉｎ ＦｃＸＴＭ（ａｎｔｉ－ｍｏｕｓｅ ＣＤ１６／３２）Ａｎｔｉｂｏｄｙ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、ｃａｔ：１０１３２０）、Ｚｏｍｂｉｅ ＹｅｌｌｏｗＴＭＦｉｘａｂｌｅ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ｋｉｔ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、ｃａｔ：４２３１０３）。
機器：Ｘ線照射装置：型番ＲＳ２０００、Ｒａｄ Ｓｏｕｒｃｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、鉛ブロック、顕微鏡：オリンパス顕微鏡ＣＸ３１、ノギス：電子デジタル表示ノギス、商品番号６７８０４０、ＥＸＰＬＯＩＴから購入され、フローサイトメーター（Ｃｙｔｅｋ(R)Ａｕｒｏｒａ）。
具体的な操作ステップは、以下のとおりである。
（一）動物モデルを確立し、具体的な方法は以下のとおりである。
（１）細胞の蘇生：マウス肺癌細胞系ＬＬＣを蘇生し、５％のＣＯ２、３７℃の恒温インキュベーターで静置して培養した。
（２）細胞の増幅培養：２日毎に１回継代し、細胞がシャーレ底部の８０％を満たすと、０．２５％のパンクレアチン－ＥＤＴＡ消化液で消化し、１：３で希釈して継代した。
（３）マウスの剃毛：Ｃ５７ＢＬ／６マウスの右側肩甲から右後背部までの毛をキレイに剃った。
（４）単細胞懸濁液の調製：対数増殖期の細胞を０．２５％のパンクレアチン－ＥＤＴＡ消化液で消化した後、ＰＢＳで３回洗浄し、無血清１６４０培地で細胞を再懸濁し、細胞濃度が５×１０６となった。
（５）マウス皮下への腫瘍細胞接種：Ｃ５７ＢＬ／６マウスの右側肩甲領域に皮下接種し、１匹あたり細胞懸濁液体積０．１ｍＬ注射し、ＬＬＣ細胞の接種量が５×１０５個／匹であり、接種当日を腫瘍接種の０日目とした。
（６）実験群の分け：腫瘍を接種した後の７日目に、腫瘍サイズに従って分層し、ランダムにサンプリングして群を分け、腫瘍群（ＬＬＣ）、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｙｏｅｌｉｉ治療群（ＬＬＣ＋Ｐｙ）、放射線療法群（ＬＬＣ＋ＲＴ）、連携治療群（ＬＬＣ＋Ｐｙ＋ＲＴ）という４群に分け、群毎に１０匹とした。
（二）マラリア原虫を担癌マウスに接種し、具体的な方法は以下のとおりである。
（１）マラリア原虫の蘇生：ＬＬＣ肺癌を接種した後の１日目に、液体窒素タンク内に凍結保存されたネズミマラリア原虫の血（１．０ｍＬ／本）を、３７℃のウォーターバスで急速に振とうし、素早く均一に混合させて融解させ、マラリア原虫活性を保持した。
（２）マラリア原虫の接種：均一に混合した後、０．２ｍＬ／匹でＣ５７ＢＬ／６マウスに腹腔注射して接種し、毎回２匹のマウスに接種して繁殖用マウス（ｂｒｅｅｄｉｎｇ ｍｉｃｅ）とした。
（３）薄い血膜の作成および顕微鏡検査：マウスの尾を切って約１～１．５μＬ採血し、スライドガラスに塗り、２．５ｃｍの長舌状の薄い血膜に作成し、ドライヤーで乾燥した。メタノールで血膜を１ｍｉｎ浸潤し、１×Ｇｉｅｍｓａ染液で３０ｍｉｎ染色し、水道水でキレイに洗い流し、ドライヤーで乾燥した。油レンズ１００×でマラリア原虫感染率を観察した。マラリア原虫感染率の変化を観察した。
（４）マラリア原虫溶液の調製：感染率が３％～１０％に達すると、赤血球を計数し（一匹のマラリア原虫に感染した繁殖用マウス、一匹のマラリア原虫を接種していないＮａiｖｅマウス）、尾を切って５μＬ採血して９９５μＬのＰＢＳに再懸濁し、赤血球を計数し、１ｍＬ体積あたりのマラリア原虫に感染した赤血球数を計算した。０．２ｍＬ体積の３．８％クエン酸ナトリウム抗凝固剤でＥＰチューブを湿潤し、眼球を摘出して採血し、必要な接種マラリア原虫の濃度および総量を計算し、ＰＢＳで濃度を２．５×１０６／ｍＬに調製した。
（５）担癌マウスの接種：腫瘍を皮下接種した後の７日目に、各マウスに０．２ｍＬ接種し、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｙｏｅｌｉｉ治療群（ＬＬＣ＋Ｐｙ）および連携治療群（ＬＬＣ＋Ｐｙ＋ＲＴ）の各マウスに５×１０５個のマラリア原虫を含む赤血球液を接種し、対照群に同じ数のマラリア原虫を含まない赤血球を接種した。
（三）放射線療法でマウスを治療し、具体的な方法は以下のとおりである。
（１）腫瘍を接種した後の１０日目に、放射線療法治療群および連携治療群のマウスを秤量し、１．２％のアベルチンを０．４ｍｌ／２０ｇ体重で腹腔注射した。
（２）マウスを麻酔した後、マウスカゴに入れ、カスタマイズした鉛ブロックを被せ、腫瘍組織部分を露出させた。
（３）マウスカゴを照射装置内部に置き、プローブをマウスカゴの真ん中に置き、照射室体のドアを閉め、設定画面で「Ｍａｎｕａｌ」をクリックし、電圧、電流のデフォルト値を１６０ｋＶ、２５ｍＡに設定し、照射量を１２Ｇｙとし、放射量率１．２Ｇｙ／ｍｉｎに基づき、必要な照射時間を計算した。
（４）線量計をゼロに校正し、線量を再計測し、「ＳＴＡＲＴ」をクリックし、機器は照射プログラムを開始した。
（５）マウスを照射した後、マウスを取り出し、線量を計算し、毎回にマウスの照射量が一致することを確保した。
（四）フローサイトメトリー検出を行い、具体的な方法は以下のとおりである。
（１）腫瘍を接種した後の１９日目に、マウスを秤量し、腫瘍サイズを測定して記録した。
（２）抗凝固管を用意し、眼球を摘出して採血し、マウスを解剖してから、脾臓と腫瘍とを分離し、脾臓および腫瘍を秤量した。
（３）脾細胞を分離し、脾臓→剥離し、脾臓を破砕→脾臓細胞を収集、濾過→遠心後→赤血球を溶解し（時間を２分以内に制御した）→中和溶解→遠心→１５ｍＬの培地で再懸濁→２～３分静置し、上澄みを１２ｍＬ吸引して１５ｍＬの遠心管内に転移→遠心→５ｍＬ再懸濁→細胞計数（トリパンブルー法で計数）→２×１０６の脾細胞を取り→細胞外染色検査→ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８およびＭＤＳＣｓ、３×１０６の脾細胞を取り→細胞外染色→固定透過→ＦｏｘＰ３染色→Ｔｒｅｇｓ細胞の割合を検出した。
（４）末梢血細胞の分離：全血→遠心（３５０ｇ、５ｍｉｎ）→上澄みを収集し→細胞洗浄→遠心（３５０ｇ、５ｍｉｎ）→上澄みを捨て→赤血球を溶解し→２回洗浄→１ｍＬのＰＢＳ（２％のＦＢＳを含む）で再懸濁→０．２ｍＬの細胞懸濁液を取って検出し→細胞外染色検査→ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８およびＭＤＳＣｓ、０．３ｍＬの細胞懸濁液を取り→細胞外染色→固定透過→ＦｏｘＰ３染色→Ｔｒｅｇ細胞の割合を検出した。
（五）検出指標は、以下を含む。
（１）腫瘍体積サイズの測定：３日毎に腫瘍測定を行い、楕円体積計算式（Ｄ×ｄ×ｄ）／２で腫瘍体積（立方ミリメートルを単位として）を計算し、ただし、「Ｄ」は腫瘍の長径を表し、「ｄ」は短径を表した。腫瘍サイズは、平均腫瘍体積±標準平均誤差（ＳＥＭ）で表され、腫瘍の成長曲線を作成した。ＴＷＯ－ＷＡＹ ＡＮＯＶＡ分散分析により群間の統計分析を行い、Ｐ≦０．０５である場合、「＊」で表し、Ｐ≦０．０１である場合、「＊＊」で表し、いずれも群間の差が顕著な統計学的意義を持つことを示した。
（２）腫瘍重量の比較：腫瘍を接種した後の１９日目に、腫瘍を分離し、電子秤で腫瘍重量を秤量し、非ペアリングＳｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔテストを行い、データは平均腫瘍重量±ＳＤ値であり、Ｐ≦０．０５である場合、「＊」で表し、Ｐ≦０．０１である場合、「＊＊」で表し、いずれも群間の差が顕著な統計学的意義を持つことを示した。
（３）マウスの生存統計：生存は、生存期間中央値および延長された生存期間の百分率で評価され、Ｋａｐｌａｎ－Ｍｅｉｅｒ法で生存率を推定し、生存曲線図を作成し、生存期間中央値を計算した。Ｐ≦０．０５である場合、「＊」で表し、Ｐ≦０．０１である場合、「＊＊」で表し、いずれも群間の差が顕著な統計学的意義を持つことを示した。
（４）マラリア原虫感染率の統計：マラリア原虫感染率は、マウス赤血球のマラリア原虫に感染した百分率で評価され、計算式は、（マラリア原虫に感染した赤血球数／総赤血球）×１００％であり、具体的な操作は、尾の静脈から採血して塗抹し、メタノールで固定し、ギムザ染液で染色し、顕微鏡で赤血球に感染したマラリア原虫数および赤血球総数を観察し、赤血球総数が約１０００個であり、マラリア原虫感染率を計算し、感染率を平均感染率±標準平均誤差（ＳＥＭ）で表し、マラリア原虫感染周期の曲線を描画し、放射線療法がマラリア原虫感染に影響を及ぼすか否かを観察した。
（５）マウス体重の秤量：３日毎に秤量し、体重成長を平均体重±標準平均誤差（ＳＥＭ）で表し、マラリア原虫感染による担癌マウスの体重への影響を観察した。
（６）フローサイトメトリー検出：脾臓および末梢血内のＣＤ３＋Ｔ、ＣＤ４＋Ｔ、ＣＤ８＋Ｔ、ＭＤＳＣｓおよびＴｒｅｇｓ等の細胞の割合を検出し、脾臓内のＣＤ３＋Ｔ、ＣＤ４＋Ｔ、ＣＤ８＋Ｔ細胞の絶対数を計数し、非ペアリングＳｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔテストを行い、データは平均値±ＳＤ値であり、Ｐ≦０．０５である場合、「＊」で表し、Ｐ≦０．０１である場合、「＊＊」で表し、いずれも群間の差が顕著な統計学的意義を持つことを示した。
（六）検出結果は、以下を含む。
（１）図１の腫瘍の成長曲線、図２の腫瘍重量の比較および図３の腫瘍解剖に示すように、単一のマラリア原虫感染治療群および単一の放射線療法治療群と比べ、マラリア原虫感染と放射線療法との連携治療群は、いずれもＬＬＣ肺癌の成長を顕著に抑制し、いずれも顕著な統計学的意義を持っている。
（２）図４の担癌マウスの生存期間の統計に示すように、単一のマラリア原虫感染治療群（生存期間中央値が３５日）および単一の放射線療法治療群（生存期間中央値が３４．５日）と比べ、マラリア原虫感染と放射線療法との連携治療群（生存期間中央値が４９日）は、いずれも担癌マウスの生存期間中央値を顕著に延長し、いずれも顕著な統計学的意義を持っている。
（３）図５の担癌マウスの体重に示すように、放射線療法は、担癌マウスの体重への影響が小さく、単一のマラリア原虫感染治療群および連携治療群の担癌マウスは、マラリア原虫感染の上昇に伴って体重を低減し、マラリア原虫感染率が徐々に低下すると、体重が徐々に回復して上昇した。
（４）図６のマラリア原虫感染率の曲線に示すように、単一のマラリア原虫感染治療群と連携治療群の感染率周期は一致であり、連携治療群のマラリア原虫感染のピークは、単一のマラリア原虫感染治療群よりも３日遅れた。
（５）図７～１１の末梢血の免疫指標に示すように、マラリア原虫感染は、末梢血のＣＤ３＋／ＣＤ４５＋、ＣＤ４＋／ＣＤ４５＋Ｔ細胞の割合を増加し、放射線療法治療は、末梢血のＣＤ３＋／ＣＤ４５＋、ＣＤ８＋／ＣＤ４５＋、ＣＤ４＋／ＣＤ４５＋Ｔ細胞の割合を増加せず、マラリア原虫感染は、末梢血内のＴｒｅｇｓ／ＣＤ４＋Ｔ、ＭＤＳＣｓ／ＣＤ４５＋Ｔ細胞の割合を低減する。マラリア原虫は、担癌マウスの末梢血のＣＤ３＋／ＣＤ４５＋、ＣＤ８＋／ＣＤ４５＋、ＣＤ４＋／ＣＤ４５＋Ｔ細胞の割合を増加してかつＴｒｅｇｓ／ＣＤ４＋Ｔ、ＭＤＳＣｓ／ＣＤ４５＋Ｔ細胞の割合を低減することにより、抗腫瘍免疫能力を強化することができる。
（６）図１２～１８の脾臓の免疫指標に示すように、マラリア原虫感染は、脾臓のＣＤ３＋／ＣＤ４５＋、ＣＤ４＋／ＣＤ４５＋Ｔ細胞の割合を増加し、ＣＤ８＋／ＣＤ４５＋Ｔ細胞の割合を低減するが、脾臓のＣＤ３＋Ｔ、ＣＤ４＋Ｔ、ＣＤ８＋Ｔ絶対数を増加し、マラリア原虫感染は、Ｔｒｅｇｓ／ＣＤ４＋Ｔ、ＭＤＳＣｓ／ＣＤ４５＋Ｔ細胞の割合を低減する。放射線療法治療は、脾臓のＣＤ３＋／ＣＤ４５＋、ＣＤ８＋／ＣＤ４５＋、ＣＤ４＋／ＣＤ４５＋Ｔ細胞の割合を変化せず、脾臓内のＴｒｅｇｓ／ＣＤ４＋の割合を増加し、ＭＤＳＣｓ／ＣＤ４５＋Ｔ細胞の割合を低減し、脾臓のＣＤ３＋Ｔ、ＣＤ８＋Ｔ、ＣＤ４＋Ｔ細胞の絶対数を低減した。マラリア原虫は、担癌マウスの脾臓のＣＤ３＋／ＣＤ４５＋、ＣＤ４＋／ＣＤ４５＋Ｔ細胞の割合を増加してかつＴｒｅｇｓ／ＣＤ４＋Ｔ、ＭＤＳＣｓ／ＣＤ４５＋Ｔの割合を低減し、脾臓のＣＤ３＋、ＣＤ４＋、ＣＤ８＋Ｔ細胞の絶対数を増加することにより、抗腫瘍免疫能力を強化することができ、一方、放射線療法は、脾臓内のＴｒｅｇｓ／ＣＤ４＋Ｔの割合を増加し、脾臓ＣＤ３＋、ＣＤ８＋、ＣＤ４＋Ｔ細胞の絶対数を低減し、抗腫瘍の免疫能力を損傷した。マラリア原虫感染は放射線療法と相補的な抗腫瘍効果を形成することができる。
マラリア原虫感染と放射線療法との連携で頭蓋内インサイチュ接種のＧＬ２６１膠腫を治療する実験例
本実施例に必要な実験材料および製剤は、以下を含む。
動物：Ｃ５７ＢＬ／６マウス、メス、６～８週齢、上海ＳＬＡＣ実験動物有限責任公司に由来し、腫瘍細胞：ＧＬ２６１、廣州ＣＥＬＬＣＯＯＫ ＢＩＯＴＥＣＨ有限公司に由来し、ＧＬ２６１／ｍｃｈｅｒｒｙ－Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅは、ＣＡＳ Ｌａｍｖａｃ （Ｇｕａｎｇｚｈｏｕ） Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏ., Ｌｔｄ.で構築され、マラリア原虫：マウスＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｙｏｅｌｉｉ（Ｐ．ｙｏｅｌｉｉ １７ＸＮＬ、ＭＲＡ－５９３、Ｐｙ）、Ｍａｌａｒｉａ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｒｅｓｏｕｒｃｅ Ｃｅｎｔｅｒ（ＭＲ４）の無料贈答に由来し、ルシフェラーゼ基質：Ｄ－Ｌｕｃｉｆｅｒｉｎ、Ｐｏｔａｓｓｉｕｍ Ｓａｌｔ Ｄ－ルシフェリンカリウム塩、Ｙｅａｓｅｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（上海）社から購入され、Ｇｉｅｍｓａ染剤粉末：Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社から購入され、ＤＭＥＭ ｂａｓｉｃ培地：１１９９５０６５、Ｇｉｂｃｏから購入され、ＦＢＳ牛胎児血清：０４－００１－１ＡＣＳ、Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓから購入され、アベルチン（２，２，２－トリブロモエタノール、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社から購入され、Ｔ４８４０２、調製濃度１．２％）、アルコール、ヨードチンキ、過酸化水素水、生理食塩水、シリコンオイル、硫酸ゲンタマイシン注射液、エリスロマイシン軟膏。
ＣＤ３抗体：ａｂ１６６６９、Ａｂｃａｍ社から購入され、ＨＲＰ二次抗体：ａｂ９７０５１、Ａｂｃａｍ社から購入され、ヘマトキシリン：５１２７５－１００ｍｌ、Ｓｉｇｍａ社から購入された。
機器：Ｘ線照射装置：型番ＲＳ２０００、Ｒａｄ Ｓｏｕｒｃｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、鉛ブロック、生体撮像装置：ＩＶＩＳ Ｓｐｅｃｔｒｕｍ、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社から購入され、脳定位固定装置：深セン市ＲＷＤ生命科技有限公司から購入され、小型ハンドヘルド頭蓋ドリル：深セン市ＲＷＤ生命科技有限公司から購入され、マイクロシリンジ：５μｌ規格、Ｈａｍｉｌｔｏｎから購入された。電子デジタル表示ノギス：商品番号６７８０４０、ＥＸＰＬＯＩＴから購入され、手術器具（手術パッド、タイマー、メスの刃体、メスの持ち手、眼科手術用ハサミ、眼科手術用無鈎鑷子、眼科手術用有鈎鑷子、持針器、縫い針、めん棒、縫合糸等）。
具体的な操作ステップは、以下のとおりである
（一）動物モデルを確立し、具体的な方法は以下のとおりである。
（１）細胞の蘇生：マウス膠腫細胞系ＧＬ２６１／ｍｃｈｅｒｒｙ－ｌｕｃを蘇生し、５％のＣＯ２、３７℃の恒温インキュベーターに静置して培養した。
（２）細胞の増幅培養：２日毎に１回継代し、細胞がシャーレ底部の８０％を満たすと、０．２５％のパンクレアチン－ＥＤＴＡ消化液で消化し、１：３で希釈して継代した。
（３）ＧＬ２６１／ｍｃｈｅｒｒｙ－ｌｕｃ細胞の用意：指数成長期のＧＬ２６１／ｍｃｈｅｒｒｙ－ｌｕｃ細胞をＰＢＳで洗浄し、パンクレアチンで消化し、ＰＢＳで３回洗浄し、細胞を計数し、ＲＰＩＭ １６４０培地で再懸濁し、細胞濃度が２×１０８／μＬとなり、氷上で保存した。
（４）７５％のアルコールで手術器具を消毒した。
（５）注射針およびマイクロシリンジの用意：１ｍＬの注射器で注入針および接続ホースにシリコンオイルを満たし、ホースの詰まりの有無を検査し、空気泡を防止し、注射器をマイクロシリンジに交換し、注入針を取り付け、適量の細胞量を吸引してガス漏れの有無をテストした。
（６）マウスの麻酔：１．２％のアベルチン麻酔薬を０．４ｍＬ／２０ｇ体重の用量で腹腔投与し、マウスを麻酔した。
（７）マウスの剃毛：剃毛ナイフで頭頂部の毛をキレイに剃り、目から両耳までの間の毛をできるだけキレイに剃った。
（８）マウスを脳定位固定装置に固定し、まず、マウスの歯を固定し（前歯を鼻クリップの孔に置いた）、鑷子で口を少し開き、舌を引き出し、その後、後頭部を固定し（イヤーロッドを２つの耳内に入れ、主に頬骨を固定することに用いられた）、最後に、鼻クリップをしっかりと固定した。
（９）ヨードチンキで皮膚を消毒し、中心線に沿ってメスで皮膚を切開し、切り口は目の後ろから耳へ約１０ｍｍであり、メスで補助し、頭骨上の結合組織を削り、めん棒に過酸化水素水をつけて頭骨を拭き、頭蓋骨のブレグマをより明らかにした。
（１０）注入針の先をブレグマに合わせ、ブレグマを基準点とし、マウス頭部の横方向をＸ軸とし、縦方向の中心線をＹ軸とし、定位固定装置のＸおよびＹ軸を０ｍｍに設定し、注入針を移動し、Ｘ軸の前の１ｍｍが穴開け箇所であり、Ｙ軸の中心線の右側の１．８ｍｍで、注入針を再び下降し、マウスの頭蓋骨表面に合わせ、更にＺ軸を０ｍｍに設定し、注入針を上昇し、鉛筆で頭蓋骨の穴開け箇所をマークし、穴径が約２ｍｍであった。
（１１）細胞注射：また、注入針をブレグマに位置決め、Ｘ、Ｙ、Ｚデジタルディスプレイを用いて注射位置（右１．８ｍｍ、前１ｍｍ、深さ３．４ｍｍ）を決め、細胞を注射し、１μｌの注射量の注射速度が約１ｍｉｎであり、針を５ｍｉｎ留置し、針を抜く時にゆっくりと抜く必要がある。
（１２）縫合：縫合後に、エリスロマイシン軟膏で傷口に塗布し、また、０．１ｍＬの硫酸ゲンタマイシン注射液を筋肉注射した。
（１３）生体撮像：腫瘍を接種した後の７日目に、マウス生体を撮像し、マウス頭部の腫瘍部位の全光束量を計算した。
（１４）実験群の分け：分層ランダムサンプリングにより群を分け、対照膠腫群（ＧＬ２６１）、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｙｏｅｌｉｉ治療群（ＧＬ２６１＋Ｐｙ）、放射線療法治療群（ＧＬ２６１＋ＲＴ）、連携治療群（ＧＬ２６１＋Ｐｙ＋ＲＴ）という４群に分けた。
（二）マラリア原虫をマウスに接種し、具体的な方法は以下のとおりである。
（１）マラリア原虫の蘇生：腫瘍を接種した後の１日目に、液体窒素タンク内に凍結保存されたネズミマラリア原虫の血（１．０ｍＬ／本）を、３７℃のウォーターバスで急速に振とうし、素早く均一に混合させて融解させ、マラリア原虫活性を保持した。
（２）マラリア原虫の接種：蘇生後に、均一に混合した後、０．２ｍＬ／匹でＣ５７ＢＬ／６マウスに腹腔注射して接種し、毎回２匹のマウスに接種した。
（３）薄い血膜の作成および顕微鏡検査：マラリア原虫を繁殖用マウスに接種した後の４、６日目に、マウスの尾を切って約１～１．５μＬ採血し、スライドガラスに塗り、２．５ｃｍの長舌状の薄い血膜に作成し、ドライヤーで乾燥した。メタノールで血膜を１ｍｉｎ浸潤し、１×Ｇｉｅｍｓａ染液で３０ｍｉｎ染色し、水道水でキレイに洗い流し、ドライヤーで乾燥した。油レンズ１００×でマラリア原虫感染率を観察した。マラリア原虫感染率の変化を観察した。
（４）マラリア原虫溶液の調製：感染率が３％～１０％に達すると、赤血球を計数してから、尾を切って５μｌ採血して９９５μＬのＰＢＳに再懸濁し、赤血球を計数した。１ｍＬ体積あたりのマラリア原虫に感染した赤血球数を計算した。０．２ｍＬ体積の３．８％クエン酸ナトリウム抗凝固剤でＥＰチューブを湿潤し、眼球を摘出して採血し、必要な接種マラリア原虫の濃度および総量を計算し、ＰＢＳで濃度を２．５×１０６／ｍＬに調製した。
（５）担癌マウスの接種：腫瘍を接種した後の７日目に、各マウスに０．２ｍＬ接種し、即ち、各マウスに５×１０５個のマラリア原虫を接種し、対照群に同じ数のマラリア原虫を含まない赤血球を接種した。
（三）放射線療法でマウスを治療し、具体的な方法は以下のとおりである。
（１）腫瘍を接種した後の１０日目に、放射線療法治療群および連携治療群のマウスを秤量し、アベルチンを０．４ｍｌ／２０ｇ体重で腹腔注射した。
（２）マウスを麻酔した後、マウスカゴに入れ、カスタマイズした鉛ブロックを被せ、頭部の腫瘍接種部位を露出させ、マウスの目等の他の部位を良く保護した。
（３）マウスカゴを照射装置内部に置き、プローブをマウスカゴの真ん中に置き、照射室体のドアを閉め、設定画面で「Ｍａｎｕａｌ」をクリックし、電圧、電流のデフォルト値を１６０ｋＶ、２５ｍＡに設定し、照射量を１２Ｇｙとし、放射量率１．２Ｇｙ／ｍｉｎに基づき、必要な照射時間を計算した。
（４）線量計をゼロに校正し、線量を再計測し、「ＳＴＡＲＴ」をクリックし、機器は照射プログラムを開始した。
（５）マウスを照射した後、マウスを取り出し、線量を計数した。
（四）免疫組織化学で膠腫へのＣＤ３＋Ｔ細胞の浸潤を検出し、具体的な方法は以下のとおりである。
（１）腫瘍を接種した後の２１日目に、マウスを秤量して記録した。
（２）材料取り：抗凝固管を用意し、眼球を摘出して採血し、マウスを解剖してから、脾臓と脳とを分離した。
（３）１０％の中性ホルムアルデヒドで脳組織を固定した。
（４）ブロックのトリミング：実験に必要な一部の組織を０．５×０．５×０．２ｃｍにカットし、包埋箱に入れ、組織が大きすぎると、ブロックのトリミングの後に３０分固定した。
（５）洗浄：流水で２ｈ洗い流し、余分な固定液を洗浄した。
（６）脱水：７０％のアルコールで１ｈ、８５％のアルコールで１ｈ、９５％のアルコールで１ｈ、無水エタノールで４５ｍｉｎ、無水エタノールで４５ｍｉｎ行った。
（７）透明：１００％のアルコール、キシレンの等量混合液で１５ｍｉｎ、キシレンで０．５ｈ（または、透明になるまで）行い、キシレンを１回交換する必要があった。エタノールとパラフィンとが相溶せず、キシレンがエタノールにもパラフィンにも溶解できるため、脱水後に、更にキシレンを経て過渡する必要があり、組織内が全てキシレンによって占められていると、光は透過でき、組織は異なる程度の透明状態を呈した。
（８）パラフィンへの浸漬：６０℃で溶かしたパラフィンに組織を浸漬し、６０℃のオーブンでパラフィンに浸漬し、パラフィンが３瓮あり、１瓮に１ｈ浸漬した。
（９）包埋：溶解したパラフィンフィルムを包埋枠に１層注ぎ、組織ブロックを迅速に置き、切断面を下にして位置を補正し、包埋箱に入れ、パラフィン液を滴下し、凝固を待った。
（１０）切片：４～６μｍの組織切片を切り、脱離防止のシリコン化スライドに載せ、スライドを６０℃のオーブンで３ｈ焼き付けた後、４℃の冷蔵庫に保存した。
（１１）パラフィンの脱離：実験前に、まず、スライドを６０℃のオーブンで３０ｍｉｎ焼成した。パラフィン切片を新鮮なキシレンに入れ、１０分間×３回浸漬した。
（１２）ハイドレーション（ｈｙｄｒａｔｉｏｎ）：余分な液体を除去した後、無水エタノール内に入れ、３分間×３回浸漬し、余分な液体を除去した後、９５％のエタノール内に入れ、３分間×２回浸漬し、余分な液体を除去した後、７５％のエタノール内に入れ、３分間×２回浸漬し、蒸留水で１分間洗い流し、ＰＢＳ緩衝液内に入れた。
（１３）内因性ペルオキシターゼの遮断：３％のＨ２Ｏ２をスライドに滴下し、室温で１０分間静置し、ＰＢＳ緩衝液で３分間×３回洗い流した。
（１４）抗原修復：０．０１ＭのｐＨ６．０のクエン酸塩緩衝液を用いて高圧加熱法で修復し、ＰＢＳ緩衝液で３分間×３回洗い流した。
（１５）ブロッキング：正常な非免疫血清ブロッキング液で、室温で２０分間かかって余分な液体を除去した。
（１６）一次抗体インキュベート：組織のサイズに応じ、１００μＬまたは適量の一次抗体を滴下し、３７℃で６０分間インキュベートし、ＰＢＳ緩衝液で３分間×３回洗い流した。
（１７）二次抗体インキュベート：１００μＬまたは適量の酵素標識羊抗兎ＩｇＧポリマーを滴下し、室温で２０分間インキュベートし、ＰＢＳ緩衝液で３分間×３回洗い流した。
（１８）発色：適量の新鮮に調製されたＤＡＢ発色液を加え、２５℃で８分間インキュベートした。
（１９）再染色：水道水で１０ｍｉｎ洗い流し、ヘマトキシリン染色液でインキュベートし、溶液の着色効果によって時間を増加または短縮し、水道水で１５ｍｉｎ洗い流した。
（２０）分化およびブルーイング：１％の塩酸アルコールで５ｓ分化し、流水で１０ｍｉｎ洗い流し、染色が薄い場合、ヘマトキシリンの染色を続けることができた。
（２１）脱水、透明、封止、顕微鏡検査、撮像。
（五）腫瘍を二次接種し、具体的な方法は以下のとおりである。
（１）細胞の蘇生：ＬＬＣ肺癌およびＧＬ２６１膠腫細胞を蘇生した。
（２）マウスの剃毛：連携治療群の治癒されたマウスと、ブランク群のマウスの左、右側の毛をキレイに剃った。
（３）細胞の接種：連携治療群の治癒されたマウスおよびブランク群のマウスは、各マウスの左側に５×１０５ＬＬＣ肺癌細胞を接種し、右側に２×１０６ＧＬ２６１細胞を接種した。
（４）腫瘍の測定：３日毎に腫瘍の長径と短径を１回測定し、腫瘍のサイズを計算し、腫瘍の成長曲線を描画した。
（六）検出指標は、以下を含む。
（１）マウスの生体撮像：７日毎にマウスの生体撮像を行い、脳の全光束量を計算し、脳腫瘍のサイズを特性評価し、腫瘍のサイズは平均腫瘍体積±標準平均誤差（ＳＥＭ）で表し、腫瘍の成長曲線を作成した。Ｔｗｏ－Ｗａｙ ＡＮＯＶＡ分散分析により群間の統計分析を行い、Ｐ≦０．０５である場合、「＊」で表し、Ｐ≦０．０１である場合、「＊＊」で表し、いずれも群間の差が顕著な統計学的意義を持つことを示した。
（２）マウスの生存統計：生存は、生存期間中央値および延長された生存期の百分率で評価され、Ｋａｐｌａｎ－Ｍｅｉｅｒ法で生存率を推定し、生存曲線図を作成し、生存期間中央値を計算した。Ｐ≦０．０５である場合、「＊」で表し、Ｐ≦０．０１である場合、「＊＊」で表し、いずれも群間の差が顕著な統計学的意義を持つことを示した。
（３）マラリア原虫感染率の統計：マラリア原虫感染率は、マウス赤血球のマラリア原虫に感染した百分率で評価され、計算式は、（マラリア原虫に感染した赤血球数／総赤血球）×１００％であり、具体的な操作は、尾の静脈から採血して塗抹し、メタノールで固定し、ギムザ染液で染色し、顕微鏡で赤血球に感染したマラリア原虫数および赤血球総数を観察し、赤血球総数が約１０００個であり、マラリア原虫感染率を計算し、感染率を平均感染率±標準平均誤差（ＳＥＭ）で表し、マラリア原虫感染周期の曲線を描画し、放射線療法がマラリア原虫感染に影響を及ぼすか否かを観察した。
（４）マウス体重の秤量：３日毎に秤量し、体重成長を平均体重±標準平均誤差（ＳＥＭ）で表し、放射線療法およびマラリア原虫感染による担癌マウスの体重への影響を観察した。
（５）脳組織の免疫組織化学：ＧＬ２６１細胞を接種した後の２１日目に、ＣＤ３＋Ｔ細胞の脳腫瘍および腫瘍の近傍領域への浸潤状況を観察した。
（七）検出結果は、以下を含む。
（１）図１９の膠腫生体撮像の光束量統計および図２０の生体撮像の結果に示すように、単一のマラリア原虫感染治療および放射線療法治療と比べ、マラリア原虫感染と放射線療法との連携治療は、マウスの頭蓋内インサイチュ接種の膠腫ＧＬ２６１の成長を顕著に抑制した。
（２）図２１の担癌マウスの生存曲線に示すように、単一のマラリア原虫感染治療および放射線療法治療と比べ、マラリア原虫感染と放射線療法との連携治療は、頭蓋内インサイチュ接種の担癌マウスの生存期間を顕著に延長した。
（３）図２２の担癌マウスの体重曲線に示すように、マラリア原虫感染および放射線療法は、担癌マウスの体重への影響が小さく、モデル群の担癌マウスは、脳の膠腫の急速な成長により、担癌マウスの体重も徐々に低下した。
（４）図２３の感染率曲線に示すように、単一のマラリア原虫感染治療群と連携治療群の感染率周期は一致し、連携治療群のマラリア原虫感染ピークは、単一のマラリア原虫感染治療群よりも３日遅れた。
（５）図２４の脳腫瘍部位のＣＤ３免疫組織化学に示すように（図中の矢印は、ＣＤ３＋Ｔ発現細胞を意味した）、マラリア原虫感染治療、放射線療法および連携治療は、脳腫瘍の成長を顕著に抑制することができ、いずれもＣＤ３＋Ｔ細胞の脳腫瘍および癌の近傍への浸潤を促進することができる。単一のマラリア原虫感染治療および放射線療法治療と比べ、マラリア原虫感染と放射線療法との連携治療は、より多くのＣＤ３＋Ｔ細胞の浸潤を促すことができる。
（６）図２５のＧＬ２６１再接種および図２６のＬＬＣ再接種の腫瘍の成長曲線に示すように、マラリア原虫感染と放射線療法との連携で治癒されたマウスは、再度接種されたＧＬ２６１膠腫の成長を抑制することができ、非相同のＬＬＣ肺癌に対して有効な抗腫瘍効果を形成しなかった。マラリア原虫感染と放射線療法との連携は、有効な免疫記憶を形成することができる。
本発明は、上記実施例により本発明の放射線療法と連携して抗腫瘍に使用される製剤の調製におけるマラリア原虫の使用について説明したが、本発明は上記実施例に限定するものではなく、すなわち、本発明は上記実施例に依存して実施しなければならないことを意味するものではないことを、出願人より声明する。当業者であれば、本発明に対するいかなる改良、本発明の製品の各原料に対する等価的な置換および補助成分の追加、具体的な形態の選択等は、全て本発明の保護範囲および開示範囲内に含まれることを理解すべきである。
以上、本発明の好ましい実施形態を詳細に説明したが、本発明は上記実施形態における具体的な内容に限定されるものではなく、本発明の技術的思想の範囲内で、本発明の技術案に対して様々な簡単な変形を行うことができ、これらの簡単な変形は全て本発明の保護範囲に属している。
なお、上記具体的な実施形態に説明した各具体的な技術的特徴は、矛盾ない限り、いかなる適切な形態で組み合わせることができ、必要がない重複を回避するために、本発明では様々な可能な組み合わせの形態については特に説明しない。
本発明は、バイオ医薬分野に関し、具体的には、放射線療法と連携して抗腫瘍に使用される製剤の調製におけるマラリア原虫の使用に関する。
腫瘍治療方法には、手術、放射線、化学療法（分子標的治療を含む）という３つの伝統的なモードがあり、新たな生物治療（免疫治療を含む）もある。臨床的には、総合治療を主とし、手術と化学放射線療法とを併用する方式は、早期に発見された腫瘍に対して治療効果が良いが、後期に進展した腫瘍に対して治療効果が良くない。現在、後期悪性固形腫瘍の治療において、様々な生物治療は、より多くの選択を提供し、分子標的薬、抗体、免疫治療薬（例えば、ＰＤ－１）および細胞治療（例えば、ＣＡＲ－Ｔ、ＴＩＬ、ＣＩＫ）は、いくつかの進展があったが、癌の急速な発展を阻止することがまだできなかった。
マラリアは、主に、蚊刺によって伝播する、マラリア原虫感染による虫媒介性感染症であり、世界保健機関によって世界三大感染症（エイズ、結核およびマラリア）の１つとして挙げられる。ヒトに感染するマラリア原虫は、主に、熱帯熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）、三日熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｖｉｖａｘ）、四日熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｍａｌａｒｉａｅ）、卵形マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｏｖａｌｅ）およびサルマラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｋｎｏｗｌｅｓｉ）という５つのタイプがあり、最もよく見られるのは、熱帯熱マラリア原虫および三日熱マラリア原虫である。ネズミマラリア原虫も、主に、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｃｈａｂａｕｄｉ、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｙｏｅｌｉｉ、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｂｅｒｇｈｅｉおよびＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｖｉｎｃｋｅｉという４つのタイプがある。
マラリア原虫はマラリアの病原体であり、１９８１年、Ｇｒｅｅｎｔｒｅｅ ＬＧは、マラリア療法を腫瘍の治療に使用する構想を初めて提出し、１９８８年、タイの学者Ａｎｇｓｕｂｈａｋｏｒｎらは、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｂｅｒｇｈｅｉに感染したラットがアフラトキシンによって誘発される肝癌の発生を予防できることを発見し、２００６年、劉英傑らは、マウスモデルでＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｙｏｅｌｉｉが滑膜肉腫癌細胞（Ｓ１８０）に対して一定の腫瘍抑制効果を有することを観察した。陳小平らは、マウスモデルにおいて、マラリア原虫感染が肺癌、肝癌、結腸癌、乳癌等の様々な腫瘍に対して腫瘍の成長、転移を著しく抑制し、担癌マウスの生存期間を延長することを研究発見した。マラリア原虫感染は、腫瘍の局所および全身性抗腫瘍特異的免疫反応を強化し、全身性の長時間効果的な腫瘍の特異的免疫記憶の発生を誘導することができる。マラリア原虫感染は、腫瘍微小環境を改善することもでき、骨髄系由来の抑制性細胞（ＭＤＳＣｓ）、調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇｓ）および腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭｓ）のような腫瘍組織内の様々な抑制性免疫細胞の割合または数を著しく低減することにより、腫瘍組織内の免疫抑制微小環境を解除し、Ｔ細胞の腫瘍組織への浸潤を促進し、腫瘍細胞を効果的に殺傷する。
しかし、全ての腫瘍患者が新たな免疫療法に対して抗腫瘍反応を生じることではなく、高い個人差を有し、依然として腫瘍治療分野の１つの巨大な障害であるため、ポリシーの改良を切望している。マラリア原虫免疫療法は、抗マラリア薬により感染率を制御することで、臨床的毒副作用を低減することができ、安全な免疫療法であるため、マラリア原虫に基づく著しい抗腫瘍効果が得られる新たな連携治療ポリシーの開発は、非常に有意義であり、新しい腫瘍治療構想を提供することもできる。
従来技術の不足に対し、本発明の目的は、放射線療法と連携して抗腫瘍に使用される製剤の調製におけるマラリア原虫の使用を提供することである。本発明は、マラリア原虫免疫療法（生物療法）と放射線療法との連携に成功し、高いバイオセキュリティを有し、単一のマラリア原虫免疫療法または単一の放射線療法と比べて腫瘍の成長をより顕著に抑制し、かつ接種された担癌マウスの生存期間を延長し、腫瘍の治療に新しいポリシーおよび考えを提供する。マラリア原虫免疫療法は、感染によって生体の末梢血を増加し、脾臓でより多くの割合または絶対数のＣＤ４＋Ｔ、ＣＤ８＋Ｔ細胞を生成し、末梢血および脾臓内のＴｒｅｇｓおよびＭＤＳＣｓ細胞の割合を低減し、腫瘍成長を抑制し、放射線療法は、腫瘍細胞を直接殺傷することにより腫瘍組織量を低減するが、放射線療法は、脾臓内のＣＤ４＋Ｔ、ＣＤ８＋Ｔ細胞の絶対数を低減し、一定の抗腫瘍免疫能力を損傷し、マラリア原虫免疫療法および放射線療法は、いずれも免疫細胞の腫瘍への浸潤を促進し、相補的かつ相乗的な抗腫瘍効果を発揮することができる。
この発明目的を達成するために、本発明は、以下の技術案を採用する。
態様１において、本発明は、放射線療法と連携して抗腫瘍に使用される製剤の調製におけるマラリア原虫の使用を提供する。
腫瘍の病因が複雑であるため、単一の免疫療法または単一の放射線療法は腫瘍の治療で限界性が大きく、所望の治療効果を達成することができず、本発明は、初めてマラリア原虫免疫療法と放射線療法とを連携して抗腫瘍用の製剤として使用し、ここで、マラリア原虫免疫療法は、天然免疫系を全面的に活性化してかつ一定の特異的免疫を誘導することにより、多標的効果を有し、しかし、マラリア原虫免疫療法は腫瘍を直接殺傷できず、腫瘍の体積が大きければ、マラリア原虫免疫療法の治療効果に影響を及ぼす。ここで、放射線療法は、腫瘍細胞を直接殺傷し、腫瘍組織量を低減し、腫瘍抗原を放出することができ、マラリア原虫免疫療法によって活性化された免疫系の治療に対する介入に有利であり、抗腫瘍免疫能力を強化する。
マラリア原虫感染は、天然免疫系を全面的に活性化し、ＣＤ４＋Ｔ、ＣＤ８＋Ｔ細胞の割合および絶対数を含み、放射線療法は腫瘍を直接殺傷できるが、リンパ球細胞の絶対数を損傷することもあり、一定の免疫抑制作用を有する。マラリア原虫感染は、マクロファージおよび樹状細胞（ＤＣ）を刺激し、ＭＨＣ ＩＩ、ＣＤ８０、ＣＤ８６およびＣＤ２８分子を高発現し、それらのＩＬ－１２、ＩＦＮ－α／β／γ、ＴＮＦ－α、ＩＬ－８およびＮＯ等の様々なサイトカインの分泌を促進し、抗原提示細胞の分化および成熟を促進する。赤内期マラリア原虫は、感染早期で宿主の免疫細胞を広く活性化し、大量のＩＦＮ－γおよびＴＮＦ－α等のサイトカインの発生を誘導し、ＮＫ、γδＴ、ＮＫＴ細胞を活性化し、その殺傷能力を強化し、腫瘍の局所および全身性抗腫瘍特異的免疫反応を強化することができる。マラリア原虫感染は、ＴＡＭｓを低減してかつ大量のエクソソームを産生する方式により、血管が生成した複数の経路および標的に作用し、腫瘍組織内の血管生成を顕著に抑制する。それとともに、マラリア原虫感染は、全身の長時間効果的な腫瘍特異的免疫記憶の発生を誘導することもできる。
放射線療法は、細胞の染色体を破壊することにより腫瘍細胞を直接殺傷し、生体が電離してラジカルを生成することを引き起こすこともでき、ラジカルは更に生物高分子と作用し、細胞の不可逆的損傷を引き起こし、腫瘍組織を直接および間接的に破壊する。放射線療法後に、腫瘍細胞は、細胞アポトーシスおよび壊死からオートファジーおよび細胞分裂異常まで、高い多様性を示し、これにより、大量の腫瘍抗原を元に放出し、タンパク質の翻訳を増加して腫瘍関連抗原の量および種類の顕著な増加を促進し、カルレティキュリンが腫瘍細胞表面に露出することにより、ＨＭＧＢ１およびＡＴＰ等の分子を放出してＤＣ細胞の腫瘍抗原に対する摂取、提示およびＴ細胞の活性化を促進する。マラリア原虫感染は、骨髄系由来の抑制性細胞（ＭＤＳＣｓ）、調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇｓ）および腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭｓ）のような腫瘍組織内の様々な抑制性免疫細胞の割合または数を著しく低減することにより、腫瘍微小環境を改善し、Ｔ細胞の腫瘍組織への浸潤を促進し、腫瘍細胞を効果的に殺傷する。
以上をまとめ、マラリア原虫感染と放射線療法との連携は、生体のＣＤ４＋Ｔ、ＣＤ８＋Ｔ細胞の割合および絶対数を増加し、抗原提示細胞によるより多くの特異的抗原への認識を強化し、生体の抗腫瘍免疫反応に有利であり、残留した腫瘍細胞を効果的に除去し、生体のＩＦＮ－γおよびＴＮＦ－α等の抗腫瘍のサイトカインを増加し、ＮＫ、γδＴ、ＮＫＴ細胞を活性化してその殺傷腫瘍能力を強化し、腫瘍微小環境におけるＴｒｅｇｓ、ＭＤＳＣｓおよびＴＡＭｓの割合または数を低下し、相補的かつ相乗的な抗腫瘍効果を形成することができる。
好ましくは、前記マラリア原虫は、熱帯熱マラリア原虫、三日熱マラリア原虫、四日熱マラリア原虫、卵形マラリア原虫、またはサルマラリア原虫のいずれか１種または少なくとも２種の組み合わせを含み、例えば、熱帯熱マラリア原虫と三日熱マラリア原虫との組み合わせ、三日熱マラリア原虫と四日熱マラリア原虫との組み合わせ、卵形マラリア原虫とサルマラリア原虫との組み合わせ等であり、他の任意の組み合わせ方式はいずれも選択でき、ここで説明を省略する。
三日熱マラリア原虫であることが好ましい。
好ましくは、前記マラリア原虫の接種量は、１００個以上のマラリア原虫または５つ以上のマラリア原虫スポロゾイトであり、例えば、１００個のマラリア原虫、１２０個のマラリア原虫、１４０個のマラリア原虫、１５０個のマラリア原虫、１６０個のマラリア原虫、５個のマラリア原虫スポロゾイト、８個のマラリア原虫スポロゾイト、１０個のマラリア原虫スポロゾイト、１５個のマラリア原虫スポロゾイト等であり、他の任意の具体的な点値はいずれも選択でき、ここで説明を省略する。
前記マラリア原虫の接種量は、当業者は実際の状況に応じて調節することができ、患者の個人差によって感染できるマラリア原虫の数が異なるため、一般的に、前記マラリア原虫の接種量は、１００個以上のマラリア原虫または５つ以上のマラリア原虫スポロゾイトである。
本発明に係るマラリア原虫感染は、長期間マラリア原虫感染であり、感染周期が長いほど、腫瘍に対する抑制効果が明らかになり、前記長期間マラリア原虫感染とは、マラリア原虫を感染してマラリア原虫感染の慢性期まで持続し、かつしばらく維持してから、抗マラリア薬を投与して感染を終了するか、または感染を終了せず、患者が虫付きの状態にあり、マラリア原虫感染後に、約６～８週の感染急性期を経た後、慢性期に入り、この時、末梢血のみで少量のマラリア原虫を検出できるが、急性期の臨床的症状が現れない。
好ましくは、前記放射線療法は、α線、β線、γ線、Ｘ線、重イオン線、電子線、または陽子線を含む。
好ましくは、前記放射線療法は、単一回放射線療法、複数回放射線療法、または分割放射線療法を含む。
好ましくは、前記放射線療法は、全身性放射線療法または局所放射線療法を含む。
好ましくは、前記腫瘍は、肺癌、胃癌、結腸癌、肝癌、乳癌、前立腺癌、卵巣癌、膵癌および脳腫瘍を含む。
好ましくは、前記製剤の剤形は、薬剤学的に許容可能ないずれかの剤形を含む。
好ましくは、前記製剤は、薬剤学的に許容可能な薬用補助剤のいずれか１種または少なくとも２種の組み合わせを更に含む。前記補助剤は、賦形剤、希釈剤、担体、調味剤、粘着剤、または充填剤のいずれか１種または少なくとも２種の組み合わせである。
好ましくは、前記マラリア原虫は、薬用担体に担持されたマラリア原虫である。
好ましくは、前記薬用担体は、リポソーム、ミセル、デンドリマー、微小球、またはマイクロカプセルを含む。
態様２において、本発明は、放射線療法と連携して使用されるマラリア原虫製剤である抗腫瘍の製剤を提供する。
前記抗腫瘍の製剤は、高いバイオセキュリティを有し、単一のマラリア原虫免疫療法および単一の放射線療法と比べてより強い腫瘍成長の抑制効果を有し、担癌マウスの生存期間をより効果的に延長することができ、腫瘍の治療に新しいポリシーおよび考えを提供し、放射線療法の用量または放射線療法の回数を減少することで放射線療法の患者免疫系に対する傷害を低減し、放射線療法の副作用を低減し、腫瘍患者の治療コストを低減することができ、マラリア原虫免疫療法と放射線療法との連携療法は、相補的かつ相乗的な効果により、より強い抗腫瘍特異的反応を起こす。
前記抗腫瘍の製剤内のマラリア原虫は、マラリア原虫、またはマラリア原虫と他の補助剤との組み合わせを腫瘍患者の体内に投与してマラリア原虫に感染させれば良く、当業者は、実際の状況に応じて本分野の公知の方法を選択して行うことができ、注射の方式であることが好ましい。
本発明において、ヒトがマラリア原虫に感染した後に形成された慢性マラリア原虫感染は、数年間にわたって持続存在することができ、更に同種または異種のマラリア原虫によって繰り返し感染できるため、長期間の繰り返すマラリア原虫感染状態を形成することができ、マラリア原虫は、腫瘍細胞の成長を抑制し、患者の寿命を延長することができ、腫瘍患者のためにより長い治療タイミングおよび生体の免疫環境を獲得し、患者の脳腫瘍の治療および回復に寄与する。
本発明において、マラリア原虫感染は、腫瘍に対する免疫監視機構を強化することができる。マラリア原虫感染過程において、危険シグナル分子病原体に関連するパターン認識分子（ＰＡＭＰｓ）を放出し、グリコシルホスファチジルイノシトールアンカー（ＧＰＩアンカー）、ヘム、免疫刺激核酸モチーフ、および他の未知の分子を含むものは、宿主の免疫細胞のパターン認識受容体（ＰＲＲｓ）によって認識でき、異なる転写プログラムをトリガし、複数の下流シグナル経路を刺激して全身性免疫反応の発生を誘導し、ＴＮＦ－α、ＩＬ－１β、ＩＬ－２、ＩＬ－６、ＩＬ－１２、ＩＦＮｓ等のサイトカインを放出し、ＮＫ、ＮＫＴ、γ／δＴおよびＤＣ細胞を活性化した後にＣＤ４＋ＴおよびＣＤ８＋Ｔ細胞の割合または絶対数を活性化し、ＴＧＦ－β、ＩＬ－１０等のサイトカインを低減してＴｒｅｇｓ、ＭＤＳＣｓおよびＴＡＭｓ細胞の割合を低減し、腫瘍の免疫抑制微小環境を改善することを含み、マラリア原虫感染は、腫瘍の特異的Ｔ細胞の増殖およびＣＤ８＋Ｔ細胞の細胞傷害（ＣＴＬ）活性を増加することにより、適応性抗腫瘍免疫を誘導し、且つ、これらの細胞の腫瘍組織への浸潤を増加して腫瘍細胞を殺傷する。
本発明において、マラリア原虫感染による発熱は、腫瘍細胞死を促進する可能性がある。医学文献で、発熱性感染は腫瘍の自然退縮に関連し、マラリアは、典型的な発熱性感染である。マウスで、マラリア原虫は短期的な感染しか引き起こすことができず、発熱せず、マウスモデルで、重ねてのマラリア原虫感染を観察しにくく、一方、ヒトで、マラリア原虫感染は長期的な寄生虫血症を引き起こすことができ、急性期高熱に伴い、このような症候群は、ライフサイクル全体にわたって複数回繰り返すことができる。従って、蚊刺によって自然に得られたマラリア原虫により、肝期および血期マラリア原虫感染が発生し、免疫系を連続的に刺激して腫瘍を有効な腫瘍ワクチンに変換し、急性期の発熱、およびその腫瘍血管新生抑制効果と併せて、腫瘍に対して多経路多標的の治療作用を果たす。
本発明において、放射線療法は、α線、β線、γ線、Ｘ線、重イオン線、電子線、または陽子線等の線により、腫瘍患者の腫瘍組織を照射し、細胞の染色体を直接破壊することで、腫瘍成長を制御する。放射線療法は、分割放射線の回数、単一回の放射線量および放射線の総量等を調整することにより、異なるタイプの腫瘍および異なる段階の腫瘍を治療する。放射線療法は、腫瘍の一部を殺傷し、腫瘍抗原を放出し、局所的な腫瘍ワクチンに誘導し、アブスコパルの放射線治療されていない腫瘍の縮小または消失に繋がり、「アブスコパル効果」を形成する。放射線療法は、生体の免疫系を活性化することにより、抗腫瘍免疫効果を誘導して改善する。
好ましくは、前記製剤と放射線療法とは同時に投与する。
好ましくは、前記製剤と放射線療法とは順次投与する。
前記製剤と放射線療法とは、同時に投与してもよいし、順次投与してもよく、例えば、まずマラリア原虫感染を投与し、時間をおいてから放射線療法を投与してもよいし、まず放射線療法を投与し、時間をおいてからマラリア原虫感染を投与してもよいし、またはマラリア原虫感染と放射線療法とを交互に行ってもよい。
好ましくは、前記マラリア原虫は、熱帯熱マラリア原虫、三日熱マラリア原虫、四日熱マラリア原虫、卵形マラリア原虫、またはサルマラリア原虫のいずれか１種または少なくとも２種の組み合わせを含み、三日熱マラリア原虫であることが好ましい。
好ましくは、前記マラリア原虫の接種量は、１００個以上のマラリア原虫または５つ以上のマラリア原虫スポロゾイトであり、例えば、１００個のマラリア原虫、１２０個のマラリア原虫、１４０個のマラリア原虫、１５０個のマラリア原虫、１６０個のマラリア原虫、５個のマラリア原虫スポロゾイト、８個のマラリア原虫スポロゾイト、１０個のマラリア原虫スポロゾイト、１５個のマラリア原虫スポロゾイト等であり、他の任意の具体的な点値はいずれも選択でき、ここで説明を省略する。
好ましくは、前記腫瘍は、肺癌、胃癌、結腸癌、肝癌、乳癌、前立腺癌、卵巣癌、膵癌、または脳腫瘍を含む。
好ましくは、前記製剤の投与方式は、静脈注射、腹腔注射、筋肉注射、皮下注射、経口投与、舌下投与、鼻腔投与、または経皮投与を含む。
態様３において、本発明は、放射線療法とマラリア原虫療法とを連携して使用する療法である抗腫瘍の連携療法を提供する。
好ましくは、前記放射線療法とマラリア原虫とは同時に投与する。
好ましくは、前記放射線療法とマラリア原虫とは順次投与する。
好ましくは、前記マラリア原虫は、熱帯熱マラリア原虫、三日熱マラリア原虫、四日熱マラリア原虫、卵形マラリア原虫、またはサルマラリア原虫のいずれか１種または少なくとも２種の組み合わせを含み、三日熱マラリア原虫であることが好ましい。
好ましくは、前記マラリア原虫の接種量は、１００個以上のマラリア原虫または５つ以上のマラリア原虫スポロゾイトである。
好ましくは、前記腫瘍は、肺癌、胃癌、結腸癌、肝癌、乳癌、前立腺癌、卵巣癌、膵癌および脳腫瘍を含む。
好ましくは、前記マラリア原虫の投与方式は、静脈注射、腹腔注射、筋肉注射、皮下注射、経口投与、舌下投与、鼻腔投与、または経皮投与を含み、静脈注射であることが好ましい。
従来技術に対し、本発明は、以下の有益な効果を有する。
本発明は、マラリア原虫と放射線療法との連携に成功し、高いバイオセキュリティを有し、マラリア原虫は、主に間欠的な寒熱の発作を引き起こし、抗マラリア薬を使用することにより感染率を制御し、急激な寒熱の発作を回避し、安全性が確保され、脳の正常機能および他の器官組織の機能に危害を与えない。且つ、単一のマラリア原虫治療または単一の放射線療法と比べて腫瘍の成長をより顕著に抑制し、主に腫瘍を直接殺傷すること、および相補的かつ相乗的な免疫効果により、特異的抗腫瘍反応を強化して腫瘍成長を抑制し、患者の生存期間を延長する。本発明に係る抗腫瘍の連携製剤は比較的経済的であり、臨床でよく使用される標準化学療法の使用コストが高く、相対的に、マラリア原虫免疫療法のコストはかなり低く、患者にマラリア原虫スポロゾイトまたは赤内期のマラリア原虫を注射し、安価な抗マラリア薬でマラリア原虫感染率を制御することにより、マラリア原虫感染の副作用が比較的少なく、腫瘍患者に対して簡単な対症治療を行い、血液の一般検査および肝腎機能を定期的に監視すれば良く、患者にとって余計な他の費用が必要とせず、更に、病態の変化に従い、いつでも治療を再開したり治療を終了したりすることができ、治療コースは人為的に制御できる。マラリア原虫と放射線療法との連携用の製剤は、比較的安全で、経済的で、実行可能性がある新たな腫瘍治療手段であり、これは、腫瘍の治療に新しいポリシーおよび考えを提供する。
以下、本願の技術案について具体的な実施形態により更に説明する。当業者であれば、前記実施例は、本発明を理解するためのものに過ぎず、本発明の具体的な制限と見なされるべきではないことを理解すべきである。
マラリア原虫感染と放射線療法との連携で皮下接種のＬＬＣ肺癌を治療する実験例
本実施例に必要な実験材料および製剤は、以下を含む。
動物：Ｃ５７ＢＬ／６マウス、メス、６～８週齢、上海ＳＬＡＣ実験動物有限責任公司に由来し、マラリア原虫：マウスＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｙｏｅｌｉｉ（Ｐ．ｙｏｅｌｉｉ １７ＸＮＬ、ＭＲＡ－５９３、Ｐｙ）、Ｍａｌａｒｉａ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｒｅｓｏｕｒｃｅ Ｃｅｎｔｅｒ（ＭＲ４）の無料贈答に由来し、マウス肺癌細胞系ＬＬＣ：アメリカタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）に由来し、Ｇｉｅｍｓａ染剤粉末：Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社から購入され、アベルチン（２，２，２－トリブロモエタノール、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社から購入され、Ｔ４８４０２、調製濃度１．２％）、病理スライドガラス：商品番号１０１２７１０１Ｐ－Ｇ、江蘇世泰実験器材有限公司から購入され、セダーウッド油：中国上海標本モデル工場に由来し、ＰＢＳ緩衝液：ＳＨ３０２５６．０１、Ｈｙｃｌｏｎｅ社から購入され、生理食塩水：辰欣薬業股分有限公司から購入された。
赤血球溶解液（ＡＣＫ Ｌｙｓｉｓ Ｂｕｆｆｅｒ）の調製：ＮＨ４Ｃｌ，１５０ｍＭ、ＫＨＣＯ３，１０ｍＭ、Ｎａ２ＥＤＴＡ，０．１ｍＭ。
ＦＯＸＰ３固定透過剤：Ｍｏｕｓｅ Ｆｏｘｐ３ Ｆｉｘａｔｉｏｎ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅ（２０ｘ）（ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ ５１－９００６１２４）、Ｍｏｕｓｅ Ｆｏｘｐ３ Ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅ（５ｘ）（ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ ５１－９００６１２５）。
抗体：ＦＩＴＣ ａｎｔｉ－ｍｏｕｓｅ ＣＤ３ Ａｎｔｉｂｏｄｙ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、ｃａｔ：１００２０４）、ＰｅｒＣＰ ａｎｔｉ－ｍｏｕｓｅ ＣＤ４ Ａｎｔｉｂｏｄｙ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、ｃａｔ：１００５３８）、Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ Ｖｉｏｌｅｔ ５１０ＴＭａｎｔｉ－ｍｏｕｓｅ ＣＤ８ａ Ａｎｔｉｂｏｄｙ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、ｃａｔ：１００７５２）、Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ Ｖｉｏｌｅｔ ７１１ＴＭａｎｔｉ－ｍｏｕｓｅ ＣＤ４５ Ａｎｔｉｂｏｄｙ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、ｃａｔ：１０３１４７）、ＡＰＣ／ＦｉｒｅＴＭ７５０ ａｎｔｉ－ｍｏｕｓｅ／ｈｕｍａｎ ＣＤ１１ｂ Ａｎｔｉｂｏｄｙ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、ｃａｔ：１０１２６２）、Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ Ｖｉｏｌｅｔ ４２１ＴＭａｎｔｉ－ｍｏｕｓｅ Ｌｙ－６Ｃ Ａｎｔｉｂｏｄｙ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、ｃａｔ：１２８０３２）、ＰＥ／Ｃｙ７ ａｎｔｉ－ｍｏｕｓｅ Ｌｙ－６Ｇ Ａｎｔｉｂｏｄｙ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、ｃａｔ：１２７６１８）、ＡＰＣ ａｎｔｉ－ｍｏｕｓｅ ＣＤ２５ Ａｎｔｉｂｏｄｙ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、ｃａｔ：１０１９１０）、ＰＥ ａｎｔｉ－ｍｏｕｓｅ ＦＯＸＰ３ Ａｎｔｉｂｏｄｙ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、ｃａｔ：１２６４０４）、ＡＰＣ Ｒａｔ ＩｇＧ２ｂ、κＩｓｏｔｙｐｅ Ｃｔｒｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、ｃａｔ：４００６１１）、ＰＥ Ｒａｔ ＩｇＧ２ｂ、κＩｓｏｔｙｐｅ Ｃｔｒｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、ｃａｔ：４００６０８）、Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ Ｖｉｏｌｅｔ ４２１ＴＭＲａｔ ＩｇＧ２ｃ、κＩｓｏｔｙｐｅ Ｃｔｒｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、ｃａｔ：４００７２５）、ＰＥ／Ｃｙ７ Ｒａｔ ＩｇＧ２ａ、κＩｓｏｔｙｐｅ Ｃｔｒｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、ｃａｔ：４００５２１）、ＴｒｕＳｔａｉｎ ＦｃＸＴＭ（ａｎｔｉ－ｍｏｕｓｅ ＣＤ１６／３２）Ａｎｔｉｂｏｄｙ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、ｃａｔ：１０１３２０）、Ｚｏｍｂｉｅ ＹｅｌｌｏｗＴＭＦｉｘａｂｌｅ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ｋｉｔ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、ｃａｔ：４２３１０３）。
機器：Ｘ線照射装置：型番ＲＳ２０００、Ｒａｄ Ｓｏｕｒｃｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、鉛ブロック、顕微鏡：オリンパス顕微鏡ＣＸ３１、ノギス：電子デジタル表示ノギス、商品番号６７８０４０、ＥＸＰＬＯＩＴから購入され、フローサイトメーター（Ｃｙｔｅｋ(R)Ａｕｒｏｒａ）。
具体的な操作ステップは、以下のとおりである。
（一）動物モデルを確立し、具体的な方法は以下のとおりである。
（１）細胞の蘇生：マウス肺癌細胞系ＬＬＣを蘇生し、５％のＣＯ２、３７℃の恒温インキュベーターで静置して培養した。
（２）細胞の増幅培養：２日毎に１回継代し、細胞がシャーレ底部の８０％を満たすと、０．２５％のパンクレアチン－ＥＤＴＡ消化液で消化し、１：３で希釈して継代した。
（３）マウスの剃毛：Ｃ５７ＢＬ／６マウスの右側肩甲から右後背部までの毛をキレイに剃った。
（４）単細胞懸濁液の調製：対数増殖期の細胞を０．２５％のパンクレアチン－ＥＤＴＡ消化液で消化した後、ＰＢＳで３回洗浄し、無血清１６４０培地で細胞を再懸濁し、細胞濃度が５×１０６となった。
（５）マウス皮下への腫瘍細胞接種：Ｃ５７ＢＬ／６マウスの右側肩甲領域に皮下接種し、１匹あたり細胞懸濁液体積０．１ｍＬ注射し、ＬＬＣ細胞の接種量が５×１０５個／匹であり、接種当日を腫瘍接種の０日目とした。
（６）実験群の分け：腫瘍を接種した後の７日目に、腫瘍サイズに従って分層し、ランダムにサンプリングして群を分け、腫瘍群（ＬＬＣ）、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｙｏｅｌｉｉ治療群（ＬＬＣ＋Ｐｙ）、放射線療法群（ＬＬＣ＋ＲＴ）、連携治療群（ＬＬＣ＋Ｐｙ＋ＲＴ）という４群に分け、群毎に１０匹とした。
（二）マラリア原虫を担癌マウスに接種し、具体的な方法は以下のとおりである。
（１）マラリア原虫の蘇生：ＬＬＣ肺癌を接種した後の１日目に、液体窒素タンク内に凍結保存されたネズミマラリア原虫の血（１．０ｍＬ／本）を、３７℃のウォーターバスで急速に振とうし、素早く均一に混合させて融解させ、マラリア原虫活性を保持した。
（２）マラリア原虫の接種：均一に混合した後、０．２ｍＬ／匹でＣ５７ＢＬ／６マウスに腹腔注射して接種し、毎回２匹のマウスに接種して繁殖用マウス（ｂｒｅｅｄｉｎｇ ｍｉｃｅ）とした。
（３）薄い血膜の作成および顕微鏡検査：マウスの尾を切って約１～１．５μＬ採血し、スライドガラスに塗り、２．５ｃｍの長舌状の薄い血膜に作成し、ドライヤーで乾燥した。メタノールで血膜を１ｍｉｎ浸潤し、１×Ｇｉｅｍｓａ染液で３０ｍｉｎ染色し、水道水でキレイに洗い流し、ドライヤーで乾燥した。油レンズ１００×でマラリア原虫感染率を観察した。マラリア原虫感染率の変化を観察した。
（４）マラリア原虫溶液の調製：感染率が３％～１０％に達すると、赤血球を計数し（一匹のマラリア原虫に感染した繁殖用マウス、一匹のマラリア原虫を接種していないＮａiｖｅマウス）、尾を切って５μＬ採血して９９５μＬのＰＢＳに再懸濁し、赤血球を計数し、１ｍＬ体積あたりのマラリア原虫に感染した赤血球数を計算した。０．２ｍＬ体積の３．８％クエン酸ナトリウム抗凝固剤でＥＰチューブを湿潤し、眼球を摘出して採血し、必要な接種マラリア原虫の濃度および総量を計算し、ＰＢＳで濃度を２．５×１０６／ｍＬに調製した。
（５）担癌マウスの接種：腫瘍を皮下接種した後の７日目に、各マウスに０．２ｍＬ接種し、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｙｏｅｌｉｉ治療群（ＬＬＣ＋Ｐｙ）および連携治療群（ＬＬＣ＋Ｐｙ＋ＲＴ）の各マウスに５×１０５個のマラリア原虫を含む赤血球液を接種し、対照群に同じ数のマラリア原虫を含まない赤血球を接種した。
（三）放射線療法でマウスを治療し、具体的な方法は以下のとおりである。
（１）腫瘍を接種した後の１０日目に、放射線療法治療群および連携治療群のマウスを秤量し、１．２％のアベルチンを０．４ｍｌ／２０ｇ体重で腹腔注射した。
（２）マウスを麻酔した後、マウスカゴに入れ、カスタマイズした鉛ブロックを被せ、腫瘍組織部分を露出させた。
（３）マウスカゴを照射装置内部に置き、プローブをマウスカゴの真ん中に置き、照射室体のドアを閉め、設定画面で「Ｍａｎｕａｌ」をクリックし、電圧、電流のデフォルト値を１６０ｋＶ、２５ｍＡに設定し、照射量を１２Ｇｙとし、放射量率１．２Ｇｙ／ｍｉｎに基づき、必要な照射時間を計算した。
（４）線量計をゼロに校正し、線量を再計測し、「ＳＴＡＲＴ」をクリックし、機器は照射プログラムを開始した。
（５）マウスを照射した後、マウスを取り出し、線量を計算し、毎回にマウスの照射量が一致することを確保した。
（四）フローサイトメトリー検出を行い、具体的な方法は以下のとおりである。
（１）腫瘍を接種した後の１９日目に、マウスを秤量し、腫瘍サイズを測定して記録した。
（２）抗凝固管を用意し、眼球を摘出して採血し、マウスを解剖してから、脾臓と腫瘍とを分離し、脾臓および腫瘍を秤量した。
（３）脾細胞を分離し、脾臓→剥離し、脾臓を破砕→脾臓細胞を収集、濾過→遠心後→赤血球を溶解し（時間を２分以内に制御した）→中和溶解→遠心→１５ｍＬの培地で再懸濁→２～３分静置し、上澄みを１２ｍＬ吸引して１５ｍＬの遠心管内に転移→遠心→５ｍＬ再懸濁→細胞計数（トリパンブルー法で計数）→２×１０６の脾細胞を取り→細胞外染色検査→ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８およびＭＤＳＣｓ、３×１０６の脾細胞を取り→細胞外染色→固定透過→ＦｏｘＰ３染色→Ｔｒｅｇｓ細胞の割合を検出した。
（４）末梢血細胞の分離：全血→遠心（３５０ｇ、５ｍｉｎ）→上澄みを収集し→細胞洗浄→遠心（３５０ｇ、５ｍｉｎ）→上澄みを捨て→赤血球を溶解し→２回洗浄→１ｍＬのＰＢＳ（２％のＦＢＳを含む）で再懸濁→０．２ｍＬの細胞懸濁液を取って検出し→細胞外染色検査→ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８およびＭＤＳＣｓ、０．３ｍＬの細胞懸濁液を取り→細胞外染色→固定透過→ＦｏｘＰ３染色→Ｔｒｅｇ細胞の割合を検出した。
（五）検出指標は、以下を含む。
（１）腫瘍体積サイズの測定：３日毎に腫瘍測定を行い、楕円体積計算式（Ｄ×ｄ×ｄ）／２で腫瘍体積（立方ミリメートルを単位として）を計算し、ただし、「Ｄ」は腫瘍の長径を表し、「ｄ」は短径を表した。腫瘍サイズは、平均腫瘍体積±標準平均誤差（ＳＥＭ）で表され、腫瘍の成長曲線を作成した。ＴＷＯ－ＷＡＹ ＡＮＯＶＡ分散分析により群間の統計分析を行い、Ｐ≦０．０５である場合、「＊」で表し、Ｐ≦０．０１である場合、「＊＊」で表し、いずれも群間の差が顕著な統計学的意義を持つことを示した。
（２）腫瘍重量の比較：腫瘍を接種した後の１９日目に、腫瘍を分離し、電子秤で腫瘍重量を秤量し、非ペアリングＳｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔテストを行い、データは平均腫瘍重量±ＳＤ値であり、Ｐ≦０．０５である場合、「＊」で表し、Ｐ≦０．０１である場合、「＊＊」で表し、いずれも群間の差が顕著な統計学的意義を持つことを示した。
（３）マウスの生存統計：生存は、生存期間中央値および延長された生存期間の百分率で評価され、Ｋａｐｌａｎ－Ｍｅｉｅｒ法で生存率を推定し、生存曲線図を作成し、生存期間中央値を計算した。Ｐ≦０．０５である場合、「＊」で表し、Ｐ≦０．０１である場合、「＊＊」で表し、いずれも群間の差が顕著な統計学的意義を持つことを示した。
（４）マラリア原虫感染率の統計：マラリア原虫感染率は、マウス赤血球のマラリア原虫に感染した百分率で評価され、計算式は、（マラリア原虫に感染した赤血球数／総赤血球）×１００％であり、具体的な操作は、尾の静脈から採血して塗抹し、メタノールで固定し、ギムザ染液で染色し、顕微鏡で赤血球に感染したマラリア原虫数および赤血球総数を観察し、赤血球総数が約１０００個であり、マラリア原虫感染率を計算し、感染率を平均感染率±標準平均誤差（ＳＥＭ）で表し、マラリア原虫感染周期の曲線を描画し、放射線療法がマラリア原虫感染に影響を及ぼすか否かを観察した。
（５）マウス体重の秤量：３日毎に秤量し、体重成長を平均体重±標準平均誤差（ＳＥＭ）で表し、マラリア原虫感染による担癌マウスの体重への影響を観察した。
（６）フローサイトメトリー検出：脾臓および末梢血内のＣＤ３＋Ｔ、ＣＤ４＋Ｔ、ＣＤ８＋Ｔ、ＭＤＳＣｓおよびＴｒｅｇｓ等の細胞の割合を検出し、脾臓内のＣＤ３＋Ｔ、ＣＤ４＋Ｔ、ＣＤ８＋Ｔ細胞の絶対数を計数し、非ペアリングＳｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔテストを行い、データは平均値±ＳＤ値であり、Ｐ≦０．０５である場合、「＊」で表し、Ｐ≦０．０１である場合、「＊＊」で表し、いずれも群間の差が顕著な統計学的意義を持つことを示した。
（六）検出結果は、以下を含む。
（１）図１の腫瘍の成長曲線、図２の腫瘍重量の比較および図３の腫瘍解剖に示すように、単一のマラリア原虫感染治療群および単一の放射線療法治療群と比べ、マラリア原虫感染と放射線療法との連携治療群は、いずれもＬＬＣ肺癌の成長を顕著に抑制し、いずれも顕著な統計学的意義を持っている。
（２）図４の担癌マウスの生存期間の統計に示すように、単一のマラリア原虫感染治療群（生存期間中央値が３５日）および単一の放射線療法治療群（生存期間中央値が３４．５日）と比べ、マラリア原虫感染と放射線療法との連携治療群（生存期間中央値が４９日）は、いずれも担癌マウスの生存期間中央値を顕著に延長し、いずれも顕著な統計学的意義を持っている。
（３）図５の担癌マウスの体重に示すように、放射線療法は、担癌マウスの体重への影響が小さく、単一のマラリア原虫感染治療群および連携治療群の担癌マウスは、マラリア原虫感染の上昇に伴って体重を低減し、マラリア原虫感染率が徐々に低下すると、体重が徐々に回復して上昇した。
（４）図６のマラリア原虫感染率の曲線に示すように、単一のマラリア原虫感染治療群と連携治療群の感染率周期は一致であり、連携治療群のマラリア原虫感染のピークは、単一のマラリア原虫感染治療群よりも３日遅れた。
（５）図７～１１の末梢血の免疫指標に示すように、マラリア原虫感染は、末梢血のＣＤ３＋／ＣＤ４５＋、ＣＤ４＋／ＣＤ４５＋Ｔ細胞の割合を増加し、放射線療法治療は、末梢血のＣＤ３＋／ＣＤ４５＋、ＣＤ８＋／ＣＤ４５＋、ＣＤ４＋／ＣＤ４５＋Ｔ細胞の割合を増加せず、マラリア原虫感染は、末梢血内のＴｒｅｇｓ／ＣＤ４＋Ｔ、ＭＤＳＣｓ／ＣＤ４５＋Ｔ細胞の割合を低減する。マラリア原虫は、担癌マウスの末梢血のＣＤ３＋／ＣＤ４５＋、ＣＤ８＋／ＣＤ４５＋、ＣＤ４＋／ＣＤ４５＋Ｔ細胞の割合を増加してかつＴｒｅｇｓ／ＣＤ４＋Ｔ、ＭＤＳＣｓ／ＣＤ４５＋Ｔ細胞の割合を低減することにより、抗腫瘍免疫能力を強化することができる。
（６）図１２～１８の脾臓の免疫指標に示すように、マラリア原虫感染は、脾臓のＣＤ３＋／ＣＤ４５＋、ＣＤ４＋／ＣＤ４５＋Ｔ細胞の割合を増加し、ＣＤ８＋／ＣＤ４５＋Ｔ細胞の割合を低減するが、脾臓のＣＤ３＋Ｔ、ＣＤ４＋Ｔ、ＣＤ８＋Ｔ絶対数を増加し、マラリア原虫感染は、Ｔｒｅｇｓ／ＣＤ４＋Ｔ、ＭＤＳＣｓ／ＣＤ４５＋Ｔ細胞の割合を低減する。放射線療法治療は、脾臓のＣＤ３＋／ＣＤ４５＋、ＣＤ８＋／ＣＤ４５＋、ＣＤ４＋／ＣＤ４５＋Ｔ細胞の割合を変化せず、脾臓内のＴｒｅｇｓ／ＣＤ４＋の割合を増加し、ＭＤＳＣｓ／ＣＤ４５＋Ｔ細胞の割合を低減し、脾臓のＣＤ３＋Ｔ、ＣＤ８＋Ｔ、ＣＤ４＋Ｔ細胞の絶対数を低減した。マラリア原虫は、担癌マウスの脾臓のＣＤ３＋／ＣＤ４５＋、ＣＤ４＋／ＣＤ４５＋Ｔ細胞の割合を増加してかつＴｒｅｇｓ／ＣＤ４＋Ｔ、ＭＤＳＣｓ／ＣＤ４５＋Ｔの割合を低減し、脾臓のＣＤ３＋、ＣＤ４＋、ＣＤ８＋Ｔ細胞の絶対数を増加することにより、抗腫瘍免疫能力を強化することができ、一方、放射線療法は、脾臓内のＴｒｅｇｓ／ＣＤ４＋Ｔの割合を増加し、脾臓ＣＤ３＋、ＣＤ８＋、ＣＤ４＋Ｔ細胞の絶対数を低減し、抗腫瘍の免疫能力を損傷した。マラリア原虫感染は放射線療法と相補的な抗腫瘍効果を形成することができる。
マラリア原虫感染と放射線療法との連携で頭蓋内インサイチュ接種のＧＬ２６１膠腫を治療する実験例
本実施例に必要な実験材料および製剤は、以下を含む。
動物：Ｃ５７ＢＬ／６マウス、メス、６～８週齢、上海ＳＬＡＣ実験動物有限責任公司に由来し、腫瘍細胞：ＧＬ２６１、廣州ＣＥＬＬＣＯＯＫ ＢＩＯＴＥＣＨ有限公司に由来し、ＧＬ２６１／ｍｃｈｅｒｒｙ－Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅは、ＣＡＳ Ｌａｍｖａｃ （Ｇｕａｎｇｚｈｏｕ） Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏ., Ｌｔｄ.で構築され、マラリア原虫：マウスＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｙｏｅｌｉｉ（Ｐ．ｙｏｅｌｉｉ １７ＸＮＬ、ＭＲＡ－５９３、Ｐｙ）、Ｍａｌａｒｉａ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｒｅｓｏｕｒｃｅ Ｃｅｎｔｅｒ（ＭＲ４）の無料贈答に由来し、ルシフェラーゼ基質：Ｄ－Ｌｕｃｉｆｅｒｉｎ、Ｐｏｔａｓｓｉｕｍ Ｓａｌｔ Ｄ－ルシフェリンカリウム塩、Ｙｅａｓｅｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（上海）社から購入され、Ｇｉｅｍｓａ染剤粉末：Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社から購入され、ＤＭＥＭ ｂａｓｉｃ培地：１１９９５０６５、Ｇｉｂｃｏから購入され、ＦＢＳ牛胎児血清：０４－００１－１ＡＣＳ、Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓから購入され、アベルチン（２，２，２－トリブロモエタノール、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社から購入され、Ｔ４８４０２、調製濃度１．２％）、アルコール、ヨードチンキ、過酸化水素水、生理食塩水、シリコンオイル、硫酸ゲンタマイシン注射液、エリスロマイシン軟膏。
ＣＤ３抗体：ａｂ１６６６９、Ａｂｃａｍ社から購入され、ＨＲＰ二次抗体：ａｂ９７０５１、Ａｂｃａｍ社から購入され、ヘマトキシリン：５１２７５－１００ｍｌ、Ｓｉｇｍａ社から購入された。
機器：Ｘ線照射装置：型番ＲＳ２０００、Ｒａｄ Ｓｏｕｒｃｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、鉛ブロック、生体撮像装置：ＩＶＩＳ Ｓｐｅｃｔｒｕｍ、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社から購入され、脳定位固定装置：深セン市ＲＷＤ生命科技有限公司から購入され、小型ハンドヘルド頭蓋ドリル：深セン市ＲＷＤ生命科技有限公司から購入され、マイクロシリンジ：５μｌ規格、Ｈａｍｉｌｔｏｎから購入された。電子デジタル表示ノギス：商品番号６７８０４０、ＥＸＰＬＯＩＴから購入され、手術器具（手術パッド、タイマー、メスの刃体、メスの持ち手、眼科手術用ハサミ、眼科手術用無鈎鑷子、眼科手術用有鈎鑷子、持針器、縫い針、めん棒、縫合糸等）。
具体的な操作ステップは、以下のとおりである
（一）動物モデルを確立し、具体的な方法は以下のとおりである。
（１）細胞の蘇生：マウス膠腫細胞系ＧＬ２６１／ｍｃｈｅｒｒｙ－ｌｕｃを蘇生し、５％のＣＯ２、３７℃の恒温インキュベーターに静置して培養した。
（２）細胞の増幅培養：２日毎に１回継代し、細胞がシャーレ底部の８０％を満たすと、０．２５％のパンクレアチン－ＥＤＴＡ消化液で消化し、１：３で希釈して継代した。
（３）ＧＬ２６１／ｍｃｈｅｒｒｙ－ｌｕｃ細胞の用意：指数成長期のＧＬ２６１／ｍｃｈｅｒｒｙ－ｌｕｃ細胞をＰＢＳで洗浄し、パンクレアチンで消化し、ＰＢＳで３回洗浄し、細胞を計数し、ＲＰＩＭ １６４０培地で再懸濁し、細胞濃度が２×１０８／μＬとなり、氷上で保存した。
（４）７５％のアルコールで手術器具を消毒した。
（５）注射針およびマイクロシリンジの用意：１ｍＬの注射器で注入針および接続ホースにシリコンオイルを満たし、ホースの詰まりの有無を検査し、空気泡を防止し、注射器をマイクロシリンジに交換し、注入針を取り付け、適量の細胞量を吸引してガス漏れの有無をテストした。
（６）マウスの麻酔：１．２％のアベルチン麻酔薬を０．４ｍＬ／２０ｇ体重の用量で腹腔投与し、マウスを麻酔した。
（７）マウスの剃毛：剃毛ナイフで頭頂部の毛をキレイに剃り、目から両耳までの間の毛をできるだけキレイに剃った。
（８）マウスを脳定位固定装置に固定し、まず、マウスの歯を固定し（前歯を鼻クリップの孔に置いた）、鑷子で口を少し開き、舌を引き出し、その後、後頭部を固定し（イヤーロッドを２つの耳内に入れ、主に頬骨を固定することに用いられた）、最後に、鼻クリップをしっかりと固定した。
（９）ヨードチンキで皮膚を消毒し、中心線に沿ってメスで皮膚を切開し、切り口は目の後ろから耳へ約１０ｍｍであり、メスで補助し、頭骨上の結合組織を削り、めん棒に過酸化水素水をつけて頭骨を拭き、頭蓋骨のブレグマをより明らかにした。
（１０）注入針の先をブレグマに合わせ、ブレグマを基準点とし、マウス頭部の横方向をＸ軸とし、縦方向の中心線をＹ軸とし、定位固定装置のＸおよびＹ軸を０ｍｍに設定し、注入針を移動し、Ｘ軸の前の１ｍｍが穴開け箇所であり、Ｙ軸の中心線の右側の１．８ｍｍで、注入針を再び下降し、マウスの頭蓋骨表面に合わせ、更にＺ軸を０ｍｍに設定し、注入針を上昇し、鉛筆で頭蓋骨の穴開け箇所をマークし、穴径が約２ｍｍであった。
（１１）細胞注射：また、注入針をブレグマに位置決め、Ｘ、Ｙ、Ｚデジタルディスプレイを用いて注射位置（右１．８ｍｍ、前１ｍｍ、深さ３．４ｍｍ）を決め、細胞を注射し、１μｌの注射量の注射速度が約１ｍｉｎであり、針を５ｍｉｎ留置し、針を抜く時にゆっくりと抜く必要がある。
（１２）縫合：縫合後に、エリスロマイシン軟膏で傷口に塗布し、また、０．１ｍＬの硫酸ゲンタマイシン注射液を筋肉注射した。
（１３）生体撮像：腫瘍を接種した後の７日目に、マウス生体を撮像し、マウス頭部の腫瘍部位の全光束量を計算した。
（１４）実験群の分け：分層ランダムサンプリングにより群を分け、対照膠腫群（ＧＬ２６１）、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｙｏｅｌｉｉ治療群（ＧＬ２６１＋Ｐｙ）、放射線療法治療群（ＧＬ２６１＋ＲＴ）、連携治療群（ＧＬ２６１＋Ｐｙ＋ＲＴ）という４群に分けた。
（二）マラリア原虫をマウスに接種し、具体的な方法は以下のとおりである。
（１）マラリア原虫の蘇生：腫瘍を接種した後の１日目に、液体窒素タンク内に凍結保存されたネズミマラリア原虫の血（１．０ｍＬ／本）を、３７℃のウォーターバスで急速に振とうし、素早く均一に混合させて融解させ、マラリア原虫活性を保持した。
（２）マラリア原虫の接種：蘇生後に、均一に混合した後、０．２ｍＬ／匹でＣ５７ＢＬ／６マウスに腹腔注射して接種し、毎回２匹のマウスに接種した。
（３）薄い血膜の作成および顕微鏡検査：マラリア原虫を繁殖用マウスに接種した後の４、６日目に、マウスの尾を切って約１～１．５μＬ採血し、スライドガラスに塗り、２．５ｃｍの長舌状の薄い血膜に作成し、ドライヤーで乾燥した。メタノールで血膜を１ｍｉｎ浸潤し、１×Ｇｉｅｍｓａ染液で３０ｍｉｎ染色し、水道水でキレイに洗い流し、ドライヤーで乾燥した。油レンズ１００×でマラリア原虫感染率を観察した。マラリア原虫感染率の変化を観察した。
（４）マラリア原虫溶液の調製：感染率が３％～１０％に達すると、赤血球を計数してから、尾を切って５μｌ採血して９９５μＬのＰＢＳに再懸濁し、赤血球を計数した。１ｍＬ体積あたりのマラリア原虫に感染した赤血球数を計算した。０．２ｍＬ体積の３．８％クエン酸ナトリウム抗凝固剤でＥＰチューブを湿潤し、眼球を摘出して採血し、必要な接種マラリア原虫の濃度および総量を計算し、ＰＢＳで濃度を２．５×１０６／ｍＬに調製した。
（５）担癌マウスの接種：腫瘍を接種した後の７日目に、各マウスに０．２ｍＬ接種し、即ち、各マウスに５×１０５個のマラリア原虫を接種し、対照群に同じ数のマラリア原虫を含まない赤血球を接種した。
（三）放射線療法でマウスを治療し、具体的な方法は以下のとおりである。
（１）腫瘍を接種した後の１０日目に、放射線療法治療群および連携治療群のマウスを秤量し、アベルチンを０．４ｍｌ／２０ｇ体重で腹腔注射した。
（２）マウスを麻酔した後、マウスカゴに入れ、カスタマイズした鉛ブロックを被せ、頭部の腫瘍接種部位を露出させ、マウスの目等の他の部位を良く保護した。
（３）マウスカゴを照射装置内部に置き、プローブをマウスカゴの真ん中に置き、照射室体のドアを閉め、設定画面で「Ｍａｎｕａｌ」をクリックし、電圧、電流のデフォルト値を１６０ｋＶ、２５ｍＡに設定し、照射量を１２Ｇｙとし、放射量率１．２Ｇｙ／ｍｉｎに基づき、必要な照射時間を計算した。
（４）線量計をゼロに校正し、線量を再計測し、「ＳＴＡＲＴ」をクリックし、機器は照射プログラムを開始した。
（５）マウスを照射した後、マウスを取り出し、線量を計数した。
（四）免疫組織化学で膠腫へのＣＤ３＋Ｔ細胞の浸潤を検出し、具体的な方法は以下のとおりである。
（１）腫瘍を接種した後の２１日目に、マウスを秤量して記録した。
（２）材料取り：抗凝固管を用意し、眼球を摘出して採血し、マウスを解剖してから、脾臓と脳とを分離した。
（３）１０％の中性ホルムアルデヒドで脳組織を固定した。
（４）ブロックのトリミング：実験に必要な一部の組織を０．５×０．５×０．２ｃｍにカットし、包埋箱に入れ、組織が大きすぎると、ブロックのトリミングの後に３０分固定した。
（５）洗浄：流水で２ｈ洗い流し、余分な固定液を洗浄した。
（６）脱水：７０％のアルコールで１ｈ、８５％のアルコールで１ｈ、９５％のアルコールで１ｈ、無水エタノールで４５ｍｉｎ、無水エタノールで４５ｍｉｎ行った。
（７）透明：１００％のアルコール、キシレンの等量混合液で１５ｍｉｎ、キシレンで０．５ｈ（または、透明になるまで）行い、キシレンを１回交換する必要があった。エタノールとパラフィンとが相溶せず、キシレンがエタノールにもパラフィンにも溶解できるため、脱水後に、更にキシレンを経て過渡する必要があり、組織内が全てキシレンによって占められていると、光は透過でき、組織は異なる程度の透明状態を呈した。
（８）パラフィンへの浸漬：６０℃で溶かしたパラフィンに組織を浸漬し、６０℃のオーブンでパラフィンに浸漬し、パラフィンが３瓮あり、１瓮に１ｈ浸漬した。
（９）包埋：溶解したパラフィンフィルムを包埋枠に１層注ぎ、組織ブロックを迅速に置き、切断面を下にして位置を補正し、包埋箱に入れ、パラフィン液を滴下し、凝固を待った。
（１０）切片：４～６μｍの組織切片を切り、脱離防止のシリコン化スライドに載せ、スライドを６０℃のオーブンで３ｈ焼き付けた後、４℃の冷蔵庫に保存した。
（１１）パラフィンの脱離：実験前に、まず、スライドを６０℃のオーブンで３０ｍｉｎ焼成した。パラフィン切片を新鮮なキシレンに入れ、１０分間×３回浸漬した。
（１２）ハイドレーション（ｈｙｄｒａｔｉｏｎ）：余分な液体を除去した後、無水エタノール内に入れ、３分間×３回浸漬し、余分な液体を除去した後、９５％のエタノール内に入れ、３分間×２回浸漬し、余分な液体を除去した後、７５％のエタノール内に入れ、３分間×２回浸漬し、蒸留水で１分間洗い流し、ＰＢＳ緩衝液内に入れた。
（１３）内因性ペルオキシターゼの遮断：３％のＨ２Ｏ２をスライドに滴下し、室温で１０分間静置し、ＰＢＳ緩衝液で３分間×３回洗い流した。
（１４）抗原修復：０．０１ＭのｐＨ６．０のクエン酸塩緩衝液を用いて高圧加熱法で修復し、ＰＢＳ緩衝液で３分間×３回洗い流した。
（１５）ブロッキング：正常な非免疫血清ブロッキング液で、室温で２０分間かかって余分な液体を除去した。
（１６）一次抗体インキュベート：組織のサイズに応じ、１００μＬまたは適量の一次抗体を滴下し、３７℃で６０分間インキュベートし、ＰＢＳ緩衝液で３分間×３回洗い流した。
（１７）二次抗体インキュベート：１００μＬまたは適量の酵素標識羊抗兎ＩｇＧポリマーを滴下し、室温で２０分間インキュベートし、ＰＢＳ緩衝液で３分間×３回洗い流した。
（１８）発色：適量の新鮮に調製されたＤＡＢ発色液を加え、２５℃で８分間インキュベートした。
（１９）再染色：水道水で１０ｍｉｎ洗い流し、ヘマトキシリン染色液でインキュベートし、溶液の着色効果によって時間を増加または短縮し、水道水で１５ｍｉｎ洗い流した。
（２０）分化およびブルーイング：１％の塩酸アルコールで５ｓ分化し、流水で１０ｍｉｎ洗い流し、染色が薄い場合、ヘマトキシリンの染色を続けることができた。
（２１）脱水、透明、封止、顕微鏡検査、撮像。
（五）腫瘍を二次接種し、具体的な方法は以下のとおりである。
（１）細胞の蘇生：ＬＬＣ肺癌およびＧＬ２６１膠腫細胞を蘇生した。
（２）マウスの剃毛：連携治療群の治癒されたマウスと、ブランク群のマウスの左、右側の毛をキレイに剃った。
（３）細胞の接種：連携治療群の治癒されたマウスおよびブランク群のマウスは、各マウスの左側に５×１０５ＬＬＣ肺癌細胞を接種し、右側に２×１０６ＧＬ２６１細胞を接種した。
（４）腫瘍の測定：３日毎に腫瘍の長径と短径を１回測定し、腫瘍のサイズを計算し、腫瘍の成長曲線を描画した。
（六）検出指標は、以下を含む。
（１）マウスの生体撮像：７日毎にマウスの生体撮像を行い、脳の全光束量を計算し、脳腫瘍のサイズを特性評価し、腫瘍のサイズは平均腫瘍体積±標準平均誤差（ＳＥＭ）で表し、腫瘍の成長曲線を作成した。Ｔｗｏ－Ｗａｙ ＡＮＯＶＡ分散分析により群間の統計分析を行い、Ｐ≦０．０５である場合、「＊」で表し、Ｐ≦０．０１である場合、「＊＊」で表し、いずれも群間の差が顕著な統計学的意義を持つことを示した。
（２）マウスの生存統計：生存は、生存期間中央値および延長された生存期の百分率で評価され、Ｋａｐｌａｎ－Ｍｅｉｅｒ法で生存率を推定し、生存曲線図を作成し、生存期間中央値を計算した。Ｐ≦０．０５である場合、「＊」で表し、Ｐ≦０．０１である場合、「＊＊」で表し、いずれも群間の差が顕著な統計学的意義を持つことを示した。
（３）マラリア原虫感染率の統計：マラリア原虫感染率は、マウス赤血球のマラリア原虫に感染した百分率で評価され、計算式は、（マラリア原虫に感染した赤血球数／総赤血球）×１００％であり、具体的な操作は、尾の静脈から採血して塗抹し、メタノールで固定し、ギムザ染液で染色し、顕微鏡で赤血球に感染したマラリア原虫数および赤血球総数を観察し、赤血球総数が約１０００個であり、マラリア原虫感染率を計算し、感染率を平均感染率±標準平均誤差（ＳＥＭ）で表し、マラリア原虫感染周期の曲線を描画し、放射線療法がマラリア原虫感染に影響を及ぼすか否かを観察した。
（４）マウス体重の秤量：３日毎に秤量し、体重成長を平均体重±標準平均誤差（ＳＥＭ）で表し、放射線療法およびマラリア原虫感染による担癌マウスの体重への影響を観察した。
（５）脳組織の免疫組織化学：ＧＬ２６１細胞を接種した後の２１日目に、ＣＤ３＋Ｔ細胞の脳腫瘍および腫瘍の近傍領域への浸潤状況を観察した。
（七）検出結果は、以下を含む。
（１）図１９の膠腫生体撮像の光束量統計および図２０の生体撮像の結果に示すように、単一のマラリア原虫感染治療および放射線療法治療と比べ、マラリア原虫感染と放射線療法との連携治療は、マウスの頭蓋内インサイチュ接種の膠腫ＧＬ２６１の成長を顕著に抑制した。
（２）図２１の担癌マウスの生存曲線に示すように、単一のマラリア原虫感染治療および放射線療法治療と比べ、マラリア原虫感染と放射線療法との連携治療は、頭蓋内インサイチュ接種の担癌マウスの生存期間を顕著に延長した。
（３）図２２の担癌マウスの体重曲線に示すように、マラリア原虫感染および放射線療法は、担癌マウスの体重への影響が小さく、モデル群の担癌マウスは、脳の膠腫の急速な成長により、担癌マウスの体重も徐々に低下した。
（４）図２３の感染率曲線に示すように、単一のマラリア原虫感染治療群と連携治療群の感染率周期は一致し、連携治療群のマラリア原虫感染ピークは、単一のマラリア原虫感染治療群よりも３日遅れた。
（５）図２４の脳腫瘍部位のＣＤ３免疫組織化学に示すように（図中の矢印は、ＣＤ３＋Ｔ発現細胞を意味した）、マラリア原虫感染治療、放射線療法および連携治療は、脳腫瘍の成長を顕著に抑制することができ、いずれもＣＤ３＋Ｔ細胞の脳腫瘍および癌の近傍への浸潤を促進することができる。単一のマラリア原虫感染治療および放射線療法治療と比べ、マラリア原虫感染と放射線療法との連携治療は、より多くのＣＤ３＋Ｔ細胞の浸潤を促すことができる。
（６）図２５のＧＬ２６１再接種および図２６のＬＬＣ再接種の腫瘍の成長曲線に示すように、マラリア原虫感染と放射線療法との連携で治癒されたマウスは、再度接種されたＧＬ２６１膠腫の成長を抑制することができ、非相同のＬＬＣ肺癌に対して有効な抗腫瘍効果を形成しなかった。マラリア原虫感染と放射線療法との連携は、有効な免疫記憶を形成することができる。
本発明は、上記実施例により本発明の放射線療法と連携して抗腫瘍に使用される製剤の調製におけるマラリア原虫の使用について説明したが、本発明は上記実施例に限定するものではなく、すなわち、本発明は上記実施例に依存して実施しなければならないことを意味するものではないことを、出願人より声明する。当業者であれば、本発明に対するいかなる改良、本発明の製品の各原料に対する等価的な置換および補助成分の追加、具体的な形態の選択等は、全て本発明の保護範囲および開示範囲内に含まれることを理解すべきである。
以上、本発明の好ましい実施形態を詳細に説明したが、本発明は上記実施形態における具体的な内容に限定されるものではなく、本発明の技術的思想の範囲内で、本発明の技術案に対して様々な簡単な変形を行うことができ、これらの簡単な変形は全て本発明の保護範囲に属している。
なお、上記具体的な実施形態に説明した各具体的な技術的特徴は、矛盾ない限り、いかなる適切な形態で組み合わせることができ、必要がない重複を回避するために、本発明では様々な可能な組み合わせの形態については特に説明しない。
Claims (10)
- 放射線療法と連携して抗腫瘍に使用される製剤の調製におけるマラリア原虫の使用。
- 前記マラリア原虫は、熱帯熱マラリア原虫、三日熱マラリア原虫、四日熱マラリア原虫、卵形マラリア原虫、またはサルマラリア原虫のいずれか１種または少なくとも２種の組み合わせを含み、三日熱マラリア原虫であることが好ましい、
ことを特徴とする請求項１に記載の使用。 - 前記マラリア原虫の接種量は、１００個以上のマラリア原虫または５つ以上のマラリア原虫スポロゾイトである、
ことを特徴とする請求項１または２に記載の使用。 - 前記放射線療法は、α線、β線、γ線、Ｘ線、電子線、または陽子線を含み、
好ましくは、前記放射線療法は、単一回放射線療法、複数回放射線療法、または分割放射線療法を含み、
好ましくは、前記放射線療法は、全身性放射線療法または局所放射線療法を含む、
ことを特徴とする請求項１から３のいずれか１項に記載の使用。 - 前記腫瘍は、肺癌、胃癌、結腸癌、肝癌、乳癌、前立腺癌、卵巣癌、膵癌および脳腫瘍を含む、
ことを特徴とする請求項１から４のいずれか１項に記載の使用。 - 前記製剤の剤形は、薬剤学的に許容可能ないずれかの剤形を含み、
好ましくは、前記製剤は、薬剤学的に許容可能な薬用補助剤のいずれか１種または少なくとも２種の組み合わせを更に含み、
好ましくは、前記マラリア原虫は、薬用担体に担持されたマラリア原虫であり、
好ましくは、前記薬用担体は、リポソーム、ミセル、デンドリマー、微小球、またはマイクロカプセルを含む、
ことを特徴とする請求項１から５のいずれか１項に記載の使用。 - 放射線療法と連携して使用されるマラリア原虫製剤である、
ことを特徴とする抗腫瘍の製剤。 - 前記製剤と放射線療法とは同時に投与し、
好ましくは、前記製剤と放射線療法とは順次投与し、
好ましくは、前記マラリア原虫は、熱帯熱マラリア原虫、三日熱マラリア原虫、四日熱マラリア原虫、卵形マラリア原虫、またはサルマラリア原虫のいずれか１種または少なくとも２種の組み合わせを含み、三日熱マラリア原虫であることが好ましく、
好ましくは、前記マラリア原虫の接種量は、１００個以上のマラリア原虫または５つ以上のマラリア原虫スポロゾイトであり、
好ましくは、前記腫瘍は、肺癌、胃癌、結腸癌、肝癌、乳癌、前立腺癌、卵巣癌、膵癌および脳腫瘍を含み、
好ましくは、前記製剤の投与方式は、静脈注射、腹腔注射、筋肉注射、皮下注射、経口投与、舌下投与、鼻腔投与、または経皮投与を含み、静脈注射であることが好ましい、
ことを特徴とする請求項７に記載の抗腫瘍の製剤。 - 放射線療法とマラリア原虫療法とを連携して使用する療法である、
ことを特徴とする抗腫瘍の連携療法。 - 前記放射線療法とマラリア原虫とは同時に投与し、
好ましくは、前記放射線療法とマラリア原虫とは順次投与し、
好ましくは、前記マラリア原虫は、熱帯熱マラリア原虫、三日熱マラリア原虫、四日熱マラリア原虫、卵形マラリア原虫、またはサルマラリア原虫のいずれか１種または少なくとも２種の組み合わせを含み、三日熱マラリア原虫であることが好ましく、
好ましくは、前記マラリア原虫の接種量は、１００個以上のマラリア原虫または５つ以上のマラリア原虫スポロゾイトであり、
好ましくは、前記腫瘍は、肺癌、胃癌、結腸癌、肝癌、乳癌、前立腺癌、卵巣癌、膵癌および脳腫瘍を含み、
好ましくは、前記マラリア原虫の投与方式は、静脈注射、腹腔注射、筋肉注射、皮下注射、経口投与、舌下投与、鼻腔投与、または経皮投与を含み、静脈注射であることが好ましい、
ことを特徴とする請求項９に記載の連携療法。
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