CN102334472B - 一种脐带保存液及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种脐带保存液，用来短期保存采集后到分离前的脐带。该脐带保存液的主要成分为氯化钠、葡萄糖、人血清白蛋白、氯化钾、无水氯化钙，辅助成分为头孢哌酮钠和酚红。其主要成分的作用是维持脐带组织内细胞的渗透平衡、保持脐带的湿润状态和短时间提供营养成分；辅助成分的作用是对可能发生的污染进行预防和提示已经发生的污染。使用此保存液可以保存脐带内间充质干细胞的活性，脐带在2℃-10℃的情况下有效保存至少72小时，分离出的间充质干细胞活性受时间的影响很小，大大减少了脐带从采集到制备的时间限制，所用的所有成分均符合临床使用标准，并能有效降低污染概率。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其是涉及一种短期保存采集后到分离前的脐带的保存液。
背景技术
脐带是连接胎儿和胎盘的管状结构，除了有两条动脉和一条静脉三根血管外，血管和羊膜之间疏松的胶状物质（我们称之为华通氏胶）里还含有丰富的脐带间充质干细胞。间充质干细胞是干细胞家族的重要成员，具有多向分化潜能、造血支持和促进干细胞植入、免疫调控和自我复制等特点，是用于衰老和病变引起的组织器官损伤修复理想的种子细胞。脐带间充质干细胞因其来源广泛，易获得，并具有间充质干细胞的所有特性，日益受到人们的关注，越来越多的人开始储存脐带间充质干细胞以备将来不时之需。储存脐带间充质干细胞包括脐带的采集、运输、交接、检测、分离、冻存、复苏、原代培养和传代培养等诸多步骤，在脐带采集后到分离前需要运输、交接和检测三个步骤，实际操作中需要存放较长的时间。脐带一旦采集，脱离了原有的体内环境，其中间充质干细胞的活性会受很多的因素的影响，诸如时间、温度、渗透压等。目前的脐带间充质干细胞的保存很多情况需要异地采集，运输、交接和检测三个步骤所用的时间就更长，脐带需存放的时间较长，影响因素就更加的复杂。所以，对采集的脐带进行必要的保存是脐带间充质干细胞储存中不可缺少的重要步骤。
目前，国内的脐带保存多采用直接装瓶或者补加基础培养基的方法来保存脐带。直接装瓶脐带的保存时间一般少于24小时，给脐带的运输、交接和检测带来了不小的时间压力，也限制了脐带间充质干细胞保存业务发展的范围；另外，通过加入基础培养基来保存脐带，因为基础培养基不能达到临床级别的要求，为脐带间充质干细胞的保存带来了风险，而且基础培养基富含营养物质，脐带的新陈代谢不能有效减少，新陈代谢的废物随时间累积也会影响脐带间充质干细胞的活性。
发明内容
本发明的目的是为了克服现有技术中保存时间短、干细胞活性受影响、基础培养基达不到临床使用级别的问题，而提供一种既能达到临床标准又能有效保存脐带的保存液，该保存液配比简单，操作容易实现，使采集后的脐带在运输、交接、分离前检测等过程中，能够在较长时间内有效保存生物活性，提高取材使用效率。
为了达到上述目的，本发明采用的技术方案是：一种脐带保存液，在1L脐带保存液中含有：氯化钠6000-6800mg、葡萄糖1000-2000mg、人血清白蛋白10000-20000mg、氯化钾250-400mg、无水氯化钙50-300mg、头孢哌酮钠100-150mg、酚红1-10mg，余量为注射用水。
进一步地，在1L脐带保存液中含有：氯化钠6200-6600mg、葡萄糖1000-1200mg、人血清白蛋白10000-12000 mg、氯化钾300-400mg、无水氯化钙150-200mg、头孢哌酮钠120-130mg、酚红4-6mg，余量为注射用水。
如上所述的全部成分均为注射级别。
一种脐带保存液的制备方法，包括以下步骤：
(a)取0.5L的注射用水, 加入氯化钠6000-6800mg、氯化钾250-400mg、无水氯化钙50-300mg后充分混匀；
(b)取0.2L的注射用水，加入葡萄糖1000-2000mg、人血清白蛋白10000-20000mg后充分混匀；
(c)取0.1L的注射用水，加入头孢哌酮钠100-150mg后充分混匀；
(d)取0.1L的注射用水，加入酚红1-10mg后充分混匀；
(e)将步骤(a)(b)(c)(d)分别得到的溶液加入到同一容器中，混匀后观察溶液是否澄清，若有沉淀，将溶液置磁力搅拌器上搅拌直至溶液澄清；
(f)将步骤(e)所得混合溶液中补加注射用水至1L，此时溶液颜色应为紫红色，若溶液颜色呈桔黄，则说明配置过程有问题应及时废弃，以0.22um滤器过滤后2-10℃保存，即为脐带保存液。
本发明脐带保存液中的主要成分氯化钠、氯化钾、无水氯化钙的主要作用是维持脐带内细胞的渗透平衡；主要成分葡萄糖、人血清白蛋白的主要作用是短时间提供营养成分又尽可能的减少代谢；主要成分注射用水的主要作用是保持脐带的湿润状态和溶解保存液的有效成分；辅助成分头孢哌酮钠和酚红的作用是对可能发生的污染进行预防和提示已经发生的污染。
本发明的脐带保存液用于保存从脐带采集后到脐带分离前的人来源的脐带。本发明的脐带保存液可以在保存脐带的过程中降低脐带的新陈代谢，减少代谢物的累积，又能提供一些基本的营养物质和能量物质，以维持最低的代谢水平，能有效地保存脐带中的间充质干细胞的活性，大大减少运输、交接、检测的时间限制。经此种保存液保存的脐带，分离出的间充质干细胞活性受时间的影响很小，大大减少了脐带从采集到制备的时间限制，且所用的所有成分均符合临床标准，污染率小。经此保存液2-10℃恒温保存的脐带，在保存72小时后脐带中细胞活性是采集的新鲜脐带的95%，采集保存后的脐带同不加任何溶液保存的脐带的污染率相比，由1.2%降到了0.15%。
附图说明
图1为经保存液保存的72小时的脐带分离后培养出的P1代脐带间充质干细胞。
具体实施方式
实施例1
一种脐带保存液，是在1L保存液中包含氯化钠6000mg、葡萄糖1000mg、人血清白蛋白10000mg、氯化钾250mg、无水氯化钙50mg、头孢哌酮钠100mg、酚红1mg，余量为注射用水，上述的全部成分均为注射级别。
该保存液制备方法为：
(a)取0.5L的注射用水，加入氯化钠6000mg、氯化钾250mg、无水氯化钙50mg后充分混匀；
(b)取0.2L的注射用水，加入葡萄糖1000mg、人血清白蛋白10000mg后充分混匀；
(c)取0.1L的注射用水，加入头孢哌酮钠100mg后充分混匀；
(d)取0.1L的注射用水，加入酚红1mg后充分混匀；
(e)将步骤(a)(b)(c)(d)分别得到的溶液加入到同一容器中，混匀后观察溶液是否澄清，若有沉淀，将溶液置磁力搅拌器上搅拌直至溶液澄清；
(f)将步骤(e)所得混合溶液中补加注射用水至1L，此时溶液颜色应为紫红色，以0.22um滤器过滤后2-10℃保存，即为脐带保存液。
实施例2
一种脐带保存液，是在1L保存液中包含氯化钠6800mg、葡萄糖2000mg、人血清白蛋白20000mg、氯化钾400mg、无水氯化钙300mg、头孢哌酮钠150mg、酚红10mg，余量为注射用水，上述的全部成分均为注射级别。
该保存液制备方法为：
(a)取0.5L的注射用水,，加入氯化钠6800mg、氯化钾400mg、无水氯化钙300mg后充分混匀；
(b)取0.2L的注射用水，加入葡萄糖2000mg、人血清白蛋白20000mg后充分混匀；
(c)取0.1L的注射用水，加入头孢哌酮钠150mg后充分混匀；
(d)取0.1L的注射用水，加入酚红10mg后充分混匀；
(e)将步骤(a)(b)(c)(d)分别得到的溶液加入到同一容器中，混匀后观察溶液是否澄清，若有沉淀，将溶液置磁力搅拌器上搅拌直至溶液澄清；
(f)将步骤(e)所得混合溶液中补加注射用水至1L，此时溶液颜色应为紫红色，以0.22um滤器过滤后2-10℃保存，即为脐带保存液。
实施例3
一种脐带保存液，是在1L保存液中包含氯化钠6500mg、葡萄糖1500mg、人血清白蛋白15000mg、氯化钾300mg、无水氯化钙150mg、头孢哌酮钠120mg、酚红5mg，余量为注射用水，上述的全部成分均为注射级别。
该保存液制备方法为：
(a)取0.5L的注射用水，加入氯化钠6500mg、氯化钾300mg、无水氯化钙150mg后充分混匀；
(b)取0.2L的注射用水，加入葡萄糖1500mg、人血清白蛋白15000mg后充分混匀；
(c)取0.1L的注射用水，加入头孢哌酮钠120mg后充分混匀；
(d)取0.1L的注射用水，加入酚红5mg后充分混匀；
(e)将步骤(a)(b)(c)(d)分别得到的溶液加入到同一容器中的溶液加入到同一容器，混匀后观察溶液是否澄清，若有沉淀，将溶液置磁力搅拌器上搅拌直至溶液澄清；
(f) 将步骤(e)所得混合溶液中补加注射用水至1L，此时溶液颜色应为紫红色，以0.22um滤器过滤后2-10℃保存，即为脐带保存液。
脐带的采集及保存：实施例1-3所述的脐带保存液均用于保存从脐带采集后到脐带分离前的人来源的脐带，即：胎儿娩出后10秒钟内，按手术常规结扎脐带后剪断采集，将采集的脐带放入装有医用酒精的消毒瓶中，浸泡1分钟，再放入装有无菌生理盐水的清洗瓶中浸泡1分钟后，放入装有本发明所述的脐带保存液的脐带采集瓶中，拧紧瓶盖并密封，放入恒温箱中2-10℃恒温保存至分离。
保存液的保存效果对比：胎儿娩出后10秒钟内，按手术常规结扎脐带后剪断采集，将采集的脐带放入装有医用酒精的消毒瓶中，浸泡1分钟，再放入装有无菌生理盐水的清洗瓶中浸泡1分钟后，均分为5段，分别保存在本发明的脐带保存液、磷酸盐缓冲液PBS、生理盐水和培养基DMEM/F12中，最后一段直接将脐带单独放置，在2-10℃恒温保存24小时、48小时、72小时后分离，取相同克数组织块常规培养15天后，消化计数，留一段新鲜的脐带小段不保存作为对照，直接分离后取相同克数组织块常规培养15天，消化后计数为1.02*106。
保存结果显示如下：
对现有的脐带采集进行污染率统计，不加任何溶液保存的脐带1389份中有17份污染，污染率为1.2%；经保存液保存的1932份脐带中只有3份污染，污染率为0.15%。
本发明的脐带保存液可以在保存脐带的过程中降低脐带的新陈代谢，减少代谢物的累积，又能提供一些基本的营养物质和能量物质，以维持最低的代谢水平，能有效地保存脐带中的间充质干细胞的活性，大大减少运输、交接、检测的时间限制，可满足异地采集的需要，也可以有效地防止大面积污染的发生，大大增加了脐带间充质干细胞储存业务拓展的范围。
Claims (3)
1.一种脐带保存液，其特征在于，在1L脐带保存液中含有：氯化钠6000-6800mg、葡萄糖1000-2000mg、人血清白蛋白10000-20000mg、氯化钾250-400mg、无水氯化钙50-300mg、头孢哌酮钠100-150mg、酚红1-10mg，余量为注射用水。
2.根据权利要求1所述的一种脐带保存液，其特征在于，在1L脐带保存液中含有：氯化钠6200-6600 mg、葡萄糖1000-1200mg、人血清白蛋白10000-12000 mg、氯化钾300-400mg、无水氯化钙150-200mg、头孢哌酮钠120-130mg、酚红4-6mg，余量为注射用水。
3.如权利要求1所述的一种脐带保存液的制备方法，包括以下步骤：
(a)取0.5L的注射用水, 加入氯化钠6000-6800mg、氯化钾250-400mg、无水氯化钙50-300mg后充分混匀；
(b)取0.2L的注射用水,加入葡萄糖1000-2000mg、人血清白蛋白10000-20000mg后充分混匀；
(c)取0.1L的注射用水,加入头孢哌酮钠100-150mg后充分混匀；
(d)取0.1L的注射用水,加入酚红1-10mg后充分混匀；
(e)将步骤(a)(b)(c)(d)分别得到的溶液加入到同一容器中，混匀后观察溶液是否澄清，若有沉淀，将溶液置磁力搅拌器上搅拌直至溶液澄清；
(f)将步骤(e)所得混合溶液中补加注射用水至1L，以0.22um滤器过滤后2-10℃保存，即为脐带保存液。
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