UA83734U - Спосіб кріоконсервування ядровмісних клітин кордової крові, у тому числі гемопоетичних стовбурових клітин - Google Patents
Спосіб кріоконсервування ядровмісних клітин кордової крові, у тому числі гемопоетичних стовбурових клітин Download PDFInfo
- Publication number
- UA83734U UA83734U UAU201304364U UAU201304364U UA83734U UA 83734 U UA83734 U UA 83734U UA U201304364 U UAU201304364 U UA U201304364U UA U201304364 U UAU201304364 U UA U201304364U UA 83734 U UA83734 U UA 83734U
- Authority
- UA
- Ukraine
- Prior art keywords
- cells
- cell suspension
- temperature
- cord blood
- cryoprotectant
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 30
- 210000004700 fetal blood Anatomy 0.000 title claims abstract description 16
- 230000002607 hemopoietic effect Effects 0.000 title abstract 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 18
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 claims abstract description 18
- 238000007710 freezing Methods 0.000 claims abstract description 13
- 230000008014 freezing Effects 0.000 claims abstract description 13
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims abstract description 9
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 claims abstract description 9
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims abstract description 6
- 229920003171 Poly (ethylene oxide) Polymers 0.000 claims abstract description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 claims abstract description 3
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 24
- 239000002577 cryoprotective agent Substances 0.000 claims description 23
- 210000003958 hematopoietic stem cell Anatomy 0.000 claims description 14
- 238000005138 cryopreservation Methods 0.000 claims description 11
- 239000000725 suspension Substances 0.000 claims description 6
- 230000000149 penetrating effect Effects 0.000 claims description 4
- 238000007654 immersion Methods 0.000 claims description 3
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 abstract 5
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 16
- 210000003995 blood forming stem cell Anatomy 0.000 description 13
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 13
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 10
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 7
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 5
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 3
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 3
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 2
- GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J Trypan blue Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[Na+].C1=C(S([O-])(=O)=O)C=C2C=C(S([O-])(=O)=O)C(/N=N/C3=CC=C(C=C3C)C=3C=C(C(=CC=3)\N=N\C=3C(=CC4=CC(=CC(N)=C4C=3O)S([O-])(=O)=O)S([O-])(=O)=O)C)=C(O)C2=C1N GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J 0.000 description 2
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 2
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 2
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 2
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- 208000034423 Delivery Diseases 0.000 description 1
- 230000006978 adaptation Effects 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 210000000601 blood cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 1
- 239000008150 cryoprotective solution Substances 0.000 description 1
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 1
- 230000002335 preservative effect Effects 0.000 description 1
- 230000009993 protective function Effects 0.000 description 1
- 238000004062 sedimentation Methods 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 230000007704 transition Effects 0.000 description 1
- 238000010792 warming Methods 0.000 description 1
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
Спосіб кріоконсервування ядровмісних клітин кордової крові, в тому числі гемопоетичних стовбурових клітин включає додавання до суспензії клітин при 0- розчину кріопротектору і програмне заморожування до -60…- з наступним зануренням у рідкий азот. Як кріопротектор використовують непроникаючий кріопротектор поліетиленоксид м.м. 1500, виготовлений на фізіологічному розчині хлористого натрію. Додавання розчину кріопротектору до суспензії клітин проводять по краплях протягом 20 хв. до кінцевої концентрації кріопротектору в суспензії клітин 10 %. Заморожування до температури -60…- здійснюють зі швидкістю 5…5,5 °C/х з наступною 10-хвилинною витримкою при цій температурі.
Description
Корисна модель належить до галузі кріобіології та кріомедицини і може бути використана для низькотемпературного консервування ядровмісних клітин кордової крові (ЯВК) з метою подальшого використання їх як джерела гемопоетичних стовбурових клітин у клінічній медицині.
Існує спосіб кріоконсервування кровотворних клітин кордової крові (1, згідно з яким клітини змішують з непроникаючим кріопротектором декстраном молекулярної маси 60 000 у концентрації 1,2 о, охолоджують до -27...-28 С зі швидкістю 1-4 "С/хв, витримують при цій температурі впродовж 15-20 хв і далі занурюють у рідкий азот. Розморожування здійснюють на водяній бані при температурі 41 "С. Кількість збережених ядерних клітин, що визначено за методом суправітального забарвлення трипановим синім, після розморожування становить 97,1 95, кількість життєздатних кровотворних клітин - попередників (КУОк) в суспензіях кріоконсервованих клітин, що визначено за методом культивування в агарі, - 79,4 95.
Суттєвим недоліком даного способу є відносно низький показник життєздатності КУОК в суспензіях кріоконсервованих клітин через використання у кріозахисному розчині лише одного типу кріопротектора-декстрану молекулярної маси 60 000. Відомо, що традиційний метод кріоконсервування ГСК передбачає додавання до кріозахисного розчину кріопротектора диметилсульфоксиду (ДМСО) у концентрації 10 95. Однак окрім захисної функції ДМСО у високих концентраціях може чинити токсичну дію на клітини крові, яка, у кінцевому рахунку, призводить до зниження життєздатності клітин після процесу заморожування-нагріву та певного обмеження у практичному використанні.
Відомий спосіб кріоконсервування кровотворних клітин кордової крові людини |2І, згідно з яким заздалегідь готують розчин ДМСО в поліглюкіні, до сконцентрованої суспензії клітин, що містить в собі ГСК, при постійному перемішуванні додають рівний об'єм приготовленого кріозахисного розчину до кінцевої концентрації ДМСО у суспензії клітин 5-6 9о. Контейнер з клітинною суспензією приміщують в кріобокс з щільною кришкою і переносять в пари рідкого азоту при температурі -167ж2 "С. Через 1-2 години від початку заморожування контейнер з біоматеріалом переносять у сховище з рідким азотом (-1967С) для подальшого довгострокового зберігання. Розморожують біоматеріал на водяній бані при температурі 38 "С до моменту переходу замороженого матеріалу у рідку фазу.
Кількість життєздатних клітин після процедури заморожування-нагріву, визначена шляхом
Зо суправітального забарвлення трипановим синім, становить 92,8153,20 95. Абсолютна кількість клітин з імунофенотипом СОЗ4: (ГСК), яку визначали в проточному цитометрі ЕАС 5сап (Весіоп
Біскіпзоп ОЗА), складає 2,74ж2,67 " 107 (від 0,13 х 107 до 16,37 х 107).
Недоліком цього способу є те, що абсолютна кількість ГСК у відігрітих зразках коливається у дуже великих межах - від 0,13 х 10 до 16,37 х 10, що вказує на значну нестабільність якості кінцевого біологічного матеріалу. Окрім того, спосіб передбачає використання кріобоксу, який пристосований для заморожування зразків лише в упаковці конкретного типу і розміру, з певним об'ємом зразка, що значно звужує можливості використання даного способу.
Найбільш близьким до заявленого за своєю суттю є спосіб кріоконсервування кровотворних клітин кордової крові людини, в тому числі гемопоетичних стовбурових клітин ІЗ). В даному способі при температурі 0...4 "С до суспензії ЯВК одноразово додають 2,5мл 25 95-го розчину
ДМСО, який заздалегідь готують на поліглюкіні. Кінцева концентрація ДМСО у суспензії клітин становить 595. Отриману завись клітин розливають у кріосампули і поміщають у камеру програмного заморожувача, попередньо охолоджену до 0 "С. Протягом наступних 20 хв суспензію клітин витримують при цій температурі, після чого зразки заморожують до температури -60...-65 "С зі швидкістю 3....3,5 "С/хв і далі занурюють у рідкий азот. Відігрівають на водяній бані при температурі 40....42 "С до зникнення кристалів льоду.
При оцінки після розморожування показників життєздатності методом проточної цитофлуориметрії з використанням ДНК-барвника 7ААбБ, життєздатність ЯВК та ГСК становить 85,1-8,6 95 і 95,4--4,6 95, відповідно.
Суттєвим недоліком цього способу є те, що в ньому використовують розчин кріопротектору
ДМСО, який навіть у такій незначній кінцевій концентрації (5 95) потребує процедури видалення його із клітинної суспензії після розморожування. Відмивання клітин від кріопротектору ускладнює спосіб кріоконсервування, а також призводить до втрати від 15 до 3095 гемопоетичних стовбурових клітин.
В основу корисної моделі поставлено задачу створити такий спосіб кріоконсервування ядровмісних клітин кордової крові, у тому числі гемопоетичних стовбурових клітин, в якому би, за рахунок заміни кріопротектору та удосконалення режиму заморожування, забезпечувалась можливість виключити процедуру відмивання клітин від кріопротектору за умови збереження високих показників життєздатності ГСК у розмороженому зразку.
Ця задача вирішується тим, що у способі кріоконсервування ядровмісних клітин кордової крові, в тому числі гемопоетичних стовбурових клітин, який включає додавання до суспензії клітин при 0-4"С розчину кріопротектору і програмне заморожування до -60...-6570 з наступним зануренням у рідкий азот, згідно з корисною моделлю, як кріопротектор використовують непроникаючий кріопротектор поліетиленоксид м.м. 1500, виготовлений на фізіологічному розчині хлористого натрію, додавання розчину кріопротектору до суспензії клітин проводять по краплям протягом 20 хв до кінцевої концентрації кріопротектору в суспензії клітин 1095, а заморожування до температури -60...-65 С здійснюють зі швидкістю 5...5,5 "С/хв з наступною 10-хвилинною витримкою при цій температурі.
Додавання ПЕО-1500 до суспензії клітин по краплям забезпечує поступову адаптацію клітин до зростаючих концентрацій кріопротектору. Заморожування зразків з постійною швидкістю охолодження 5...5,5 "С/хв є найбільш сприятливим для ЯВК, особливо ГСК. Витримка протягом 10 хв. перед зануренням у рідкий азот дозволяє вирівняти температуру по всьому об'єму зразка і таким чином гарантувати однаковість режиму заморожування для всіх клітин. Таким чином, використання непроникаючого кріопротектору ПЕО-1500 у поєднанні з удосконаленим режимом заморожування надає можливість виключити процедуру відмивання клітин від кріопротектору після розморожування при збереженні високих показників життєздатності ГСК та ЯВК.
Виключення процедури відмивання клітин від кріопротектору після їх розморожування дозволяє запобігти втрати клітин, яка відбувається під час видалення кріопротектору, спрощує використання клітинної суспензії та сприяє більш широкому її застосуванню в практичній медицині.
Спосіб пояснюється наступними прикладами.
Приклад 1. Для виділення ядровмісних клітин, до складу яких входять гемопоетичні стовбурові клітини, брали дозу кордової крові об'ємом від 60 до 90 мл, яка була заготовлена на консерванті "Глюгіцир" після нормальних пологів. Середня абсолютна кількість ЯВК в 1 мл складала (1,7-50,52)хХ107. Середня абсолютна кількість ЯВК та ГСК в дозі складала (1,0-02,2)хХ109 та (4,24-1,4)х106 відповідно. Седиментацію еритроцитів проводили центрифугуванням цільної кордової крові протягом 20-30 хвилин при 1000 д до утворення надосаду, який містить у собі ЯВК та ГСК. Надосад відділяли у окремий флакон та повторювали
Зо центрифугування при тих же умовах. По закінченню центрифугування ще раз видаляли шар ядровмісних клітин та об'єднували з отриманими після першого центрифугування. Загалом після центрифугування залишали концентрат клітин об'ємом 10 мл. Середня абсолютна кількість ЯВК в 1 мл складала (9,4:1,3) х 107.
Життєздатність ЯВК та ГСК визначали методом проточної цитофлуориметрії на проточному цитометрі ГАС Саїїрбиг з використанням реагентів Весіоп ОісКіпзоп згідно міжнародному
ІЗНАСЕ протоколу. Середній вміст ЯВК та ГСК становив, відповідно, 95,024,9 95 та 97,053,1 95.
Життєздатність клітин була на рівні 99,0 Об.
При температурі 0...4 "С до отриманої суспензії ЯВК дозовано, по краплям протягом 20 хв, додавали 10 мл 20 95-го розчину ПЕО-1500, який заздалегідь готували на фізіологічному розчині. Кінцева концентрація ПЕО-1500 у суспензії клітин становила 10 95. Отриману завись клітин розливали у кріоампули і приміщали у камеру програмного заморожувача, яка попередньо була охолоджена до 0 "С, після чого зразки охолоджували до температури -60...- 65 "С зі швидкістю 5...5,5 "С/хв, витримували при цій температурі 10 хв і далі занурювали у рідкий азот. Відігрівали на водяній бані при температурі 40....42 "С до зникнення кристалів льоду.
Життєздатність визначали методом проточної цитофлуориметрії, який є найбільш адекватним для даного типу клітин, з використанням ДНК-барвника 7ААО. Життєздатність ЯВК та ГСК були на рівні 85,1:27,3 95 і 95,4ж4,1 95, відповідно.
Приклад 2. Спосіб здійснювали аналогічно Прикладу 1, за винятком того, що заморожування до температури -60...-65 "С проводили з різними швидкостями. Результати по життєздатності
ЯВК кордової крові та ГСК наведені у Таблиці, з якої видно, що при використанні кріопротектору
ПЕО-1500 оптимальною є швидкість охолодження 5...5,5 "С/хв., яка забезпечує збереження показників життєздатності після розморожування на рівні прототипу.
Таблиця
Життєздатність ЯВК та ГСК кордової крові в залежності від швидкості охолодження
Швидкість
Життєздатність ЯВК, 90| 70,3ж7,2 | 74,3ж53,9 | 75,0-4,3 87,157,6 85,157,3 | 58,455,7
Життєздатність ГСК, бо | 78,3ж25,9 | 85,2-4,1 | 85,8:53,7 95,0-4,6 95,4-4,1 | 63,2-6,2
Джерела інформації: 1. Патент України Мо 31847 А, А0О1М1/02, 2000. Спосіб кріоконсервування кровотворних клітин кордової крові. 2. Гришина В.В. Разработка оптимальньїх методов криоконсервирования кроветворньмх клеток пуповинной крови человека для трансплантации // Клеточная трансплантация и тканевая инженерия.-2006.- Мо 1(3).- С. 52-59. 3. Патент України Мо 92227, АО1М1/02, 2010. Спосіб кріоконсервування ядровмісних клітин кордової крові, у тому числі гемопоетичних стовбурових клітин (прототип).
Claims (1)
- ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІСпосіб кріоконсервування ядровмісних клітин кордової крові, в тому числі гемопоетичних стовбурових клітин, який включає додавання до суспензії клітин при 0-47 розчину кріопротектору і програмне заморожування до -60...-657С з наступним зануренням у рідкий азот, який відрізняється тим, що як кріопротектор використовують непроникаючий кріопротектор поліетиленоксид м.м. 1500, виготовлений на фізіологічному розчині хлористого натрію, додавання розчину кріопротектору до суспензії клітин проводять по краплям протягом 20 хв до кінцевої концентрації кріопротектору в суспензії клітин 10 956, а заморожування до температури -60...-65С здійснюють зі швидкістю 5...5,5"С/х з наступною 10-хвилинною витримкою при цій температурі.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| UAU201304364U UA83734U (uk) | 2013-04-08 | 2013-04-08 | Спосіб кріоконсервування ядровмісних клітин кордової крові, у тому числі гемопоетичних стовбурових клітин |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| UAU201304364U UA83734U (uk) | 2013-04-08 | 2013-04-08 | Спосіб кріоконсервування ядровмісних клітин кордової крові, у тому числі гемопоетичних стовбурових клітин |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| UA83734U true UA83734U (uk) | 2013-09-25 |
Family
ID=52279073
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| UAU201304364U UA83734U (uk) | 2013-04-08 | 2013-04-08 | Спосіб кріоконсервування ядровмісних клітин кордової крові, у тому числі гемопоетичних стовбурових клітин |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| UA (1) | UA83734U (uk) |
-
2013
- 2013-04-08 UA UAU201304364U patent/UA83734U/uk unknown
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| ES2588438T3 (es) | Materiales y métodos para la recogida hipotérmica de sangre entera | |
| Arav | Cryopreservation of oocytes and embryos | |
| RU2416197C1 (ru) | Способ криоконсервирования гемопоэтических стволовых клеток пуповинной крови | |
| CN104145943A (zh) | 一种人脐带华通氏胶组织的冻存保护液及其制备与应用 | |
| EA028147B1 (ru) | Криозащитный агент, содержащая его композиция и способ криоконсервирования | |
| Jahan et al. | Current and future perspectives for the cryopreservation of cord blood stem cells | |
| Stoll et al. | Membrane stability during biopreservation of blood cells | |
| Yang et al. | A hemocompatible cryoprotectant inspired by freezing-tolerant plants | |
| CA3127139A1 (en) | Preservation of stem cells | |
| RU2624214C1 (ru) | Способ криоконсервирования гемопоэтических стволовых клеток | |
| Chen et al. | Cryopreservation of tissues and organs: present, bottlenecks, and future | |
| CN107711823B (zh) | 一种常温保存的细胞冻存液及其应用 | |
| Anastasiadi et al. | When I need you most: frozen red blood cells for transfusion | |
| UA83734U (uk) | Спосіб кріоконсервування ядровмісних клітин кордової крові, у тому числі гемопоетичних стовбурових клітин | |
| JP2002233356A (ja) | 細胞の保存液および該保存液を用いた細胞の保存方法 | |
| Setia et al. | Outcome of 51 autologous peripheral blood stem cell transplants after uncontrolled-rate freezing (“dump freezing”) using− 80° C mechanical freezer | |
| Kim et al. | Application of phosphoenolpyruvate into canine red blood cell cryopreservation with hydroxyethyl starch | |
| Shamkhi et al. | Trehalose and ascorbic acid improves the cryopreser-vation of umbilical cord blood hematopoietic stem cells (CD34+) with low concentrations of dimethyl-sulfoxide | |
| Kim et al. | Influence of pre-freeze treatment and cryo-storagetemperature on the post-thaw stability of canine red blood cells cryopreserved in the presence of hydroxyethyl starch | |
| BIOBANKING | Evaluation of a sterling cycle controlled rate freezing device for simultaneous cryopreservation of multiple units | |
| Țogoe et al. | Cryopreservation of red blood cells: a review. | |
| JP7486286B2 (ja) | 生物学的物質の凍結保存および安定化のための氷核形成調合物 | |
| Mirabet et al. | Cryopreservation of hematopoietic stem cells from umbilical cord blood for transplantation | |
| CA2482045C (en) | Method of cryopreserving cells | |
| UA92248U (uk) | Спосіб кріоконсервування еритроцитів людини |