CN113712023B - 一种血小板的保存方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种血小板的保存方法。本发明从保存所致血小板的凋亡、活化角度，血小板生理功能丧失，回输至体内止血血栓形成能力及清除效率角度探讨不同温度对保存血小板的影响，最终选择血小板保存的最佳温度，高于4℃不高于8℃，优选为6℃，该温度下保存的血小板生理功能最佳，血栓形成能力最佳，体内清除效率最慢。相比现有认可的保存温度4℃及22℃，延长了血小板的保存期限，最大限度保持了血小板的生理功能，同时也满足了血小板储存方法简便、长期大量保存、运输方便等方面的要求，适于临床上普遍推广与应用。同时，本发明还研究了血小板在不同保存温度发生凋亡的机制，得出了低温（4℃及6℃）以及22℃保存血小板所致凋亡的原因。
Description
技术领域
本发明涉及一种保存方法，具体涉及一种血小板保存方法。
背景技术
血小板是从成熟的巨核细胞胞浆解脱落下来的无核细胞成分，其在止血和血栓形成中起着至关重要的作用，广泛用于治疗血小板减少和血小板功能障碍所致的出血性疾病，以及接受骨髓抑制性化疗的患者。随着医学技术的发展，其临床应用日益广泛，然而血小板制品在临床上仍长期处于严重供不应求的状况，未来的供需矛盾还会更加突出，因此，血小板输血保障仍然是世界的前沿性难题。由于血小板寿命短，结构和功能易受多种因素的影响，血小板的保存迫切需要达到以下目标：储存方法简便、长期大量保存、运输方便、即刻止血效果显著。血小板的长期、有效保存问题，一直是国际输血工作者研究的热点和难点，是一个世界难题。
近年来，国内外充分肯定的保藏条件是于22℃持续振荡保存，此时血小板活力和稳定性得到较好的维持，在许多国家将22℃作为常规温度得到应用。然而，22℃常温保存血小板易受细菌污染，在每1000至2000个血小板产品中，就有1个被细菌污染，这可能在输血后引起败血症；另外，血小板的逐步激活导致血小板的积累代谢副产物，导致血小板功能和生存力逐渐下降。美国食品与药品监督管理局（FDA）规定，血小板的储存时间为3-5天，过期将予以废弃，这将造成大量的血小板浪费。由于窒温保存血小板时间短，长期以来，优化改善现有的血小板保存条件仍然在不断研究。
由于低温可抑制细菌生长，现已有一些研究者提出低温储存血小板，然而，由于血小板是一个活的细胞，深低温（-80℃）保存血小板虽可延长保存期，临床应用证明其即刻止血效果明显，但不足之处在于：1）需特大贵重的深低温保存冰箱（-80℃）或消耗大量的液氮；2）携带不方便；3）远距离运输困难；尤其是4）经过冷冻的血小板会使其生物活性受到致命损伤。还有也人尝试使用4℃保持血小板，该温度相比22℃保存，虽可以降低血小板的细菌污染率，适当延长血小板的保存期限，然而在4℃条件下冷藏的血小板易被激活、凝集，而不再具有功能活性，且输入人体后很快被体内巨噬细胞吞噬清除，使体内存活期明显缩短。因此，由于缺乏必要的理论指导、技术手段和设备条件，目前为止，世界上尚没有系统研究温度对血小板影响的结论性、指导性研究成果。
发明内容
为了解决以上现有技术存在的问题，本发明的目的在于提供一种血小板的保存方法，从保存所致血小板的凋亡、活化角度，生理功能丧失，回输至体内的血栓形成能力及清除效率角度探讨不同温度对保存血小板的影响，从而筛选出血小板保藏最佳的条件。选择0℃，2℃，4℃，6℃，8℃，10℃，12℃，14℃，15℃及22℃等10种温度保存血小板；离心法分离人富含血小板血浆（hPRP）；流式细胞仪连续检测保存第1至第7天血小板的凋亡、活化程度；聚集仪检测不同温度保存的血小板聚集功能，连续检测7天；体内FeCl3损伤肠系膜血栓模型检测不同温度保存的血小板的血栓形成能力；免疫缺陷（SCID）小鼠体内回输模型检测保持血小板体内的存活时间和清除效率。
为了实现上述目的，本发明提供以下技术方案：
一种血小板的保存方法，该方法将制得的富含血小板血浆置于高于4℃不高于8℃温度下进行保存。
优选的，本发明所述的血小板保存方法，该方法将制得的富含血小板血浆置于6℃温度下进行保存。
人的富含血小板血浆（hPRP）的制备：
无菌抽取25-50mL健康人静脉血，将全血与无菌1/9体积比的人3.8%柠檬酸钠抗凝剂混合，缓慢颠倒混匀。抗凝后的全血室温1100rpm离心11分钟，离心后下层为红细胞，中层为白细胞，上层即为富含血小板的血浆（PRP）。小心地将上层PRP吸出移至无菌的15mL 的离心管中。中下层继续室温3500rpm离心10分钟，上清即为不含血小板血浆（PPP）,取出上清至无菌离心管，备用（留以稀释PRP）。全自动人血细胞计数仪计数，计数后调整浓度至为（1-3）´108/mL。
hPRP的不同条件保存：
准备好的hPRP/hPLT以200μL/管分装至无菌的1.5mL的EP管中。随后将分装好的血小板分别置于不同的温度环境下，包括0℃，2℃，4℃，6℃，8℃，10℃，12℃，14℃，15℃以及22℃，然后在分别保存1，2，3，4，5，6，7天后检测hPRP/hPLT的凋亡活化指标。另外，准备好的hPRP/hPLT以1.2mL/管分装至无菌的1.5mL的EP管中。随后将分装好的血小板分别置于不同的温度环境下，包括4℃，6℃及22℃，然后在分别保存1，2，3，4，5，6，7天后检测hPRP/hPLT在不同诱导剂诱导情况下的聚集情况，筛选出最佳的保存温度为6℃。
有益效果：本发明公开了一种血小板的保存方法，本发明从保存所致血小板的凋亡活化角度，聚集功能丧失，血栓形成能力及回输至体内清除效率角度探讨不同温度对保存血小板的影响，最终选择出6℃作为血小板保存的最佳温度，同时，在高于4℃不高于8℃温度下仍然可达到较好的保存效果，在此温度区间范围内，保存7天后的血小板，血小板的性能明显优于其他保存温度。同时，对血小板保存的机制进行了研究，低温（4℃及6℃）保存血小板所致凋亡是由于PKC通路活化激活PDE3A水解cAMP增多所致PKA活性下降，但6℃保存的血小板PKC通路活化程度较低故而保存的血小板状态更好。22℃保存血小板所致凋亡一方面是由于酶活性的改变，另一方面是由于保存时间延长蛋白发生降解所致。
本发明选出血小板保存的最适温度高于4℃不高于8℃，优选为6℃，与现阶段我国保存血小板的标准温度22℃及科学家们最为广泛研究的4℃相比，血小板在保存1至7天后，血小板聚集功能最佳，血栓形成能力最佳，体内清除效率最慢。因此，在该温度区间下特别是6℃保存血小板，相比现有认可的保存温度，延长了血小板的保存期限，同时也满足了血小板储存方法简便、长期大量保存、运输方便等方面的要求，适于临床上普遍推广与应用。
附图说明
图1 为hPRP在0℃，2℃，4℃，6℃，8℃，10℃，12℃，14℃，15℃及22℃保存一到七天后JC1指标发生的改变图。不同的显著性水平分别为*p＜0.05，** p＜0.01，***p＜0.001，****p＜0.0001。
图2 为hPRP在0℃，2℃，4℃，6℃，8℃，10℃，12℃，14℃，15℃及22℃保存一到七天后PS指标发生的改变图。不同的显著性水平分别为*p＜0.05，** p＜0.01，***p＜0.001，****p＜0.0001。
图3 为hPRP在0℃，2℃，4℃，6℃，8℃，10℃，12℃，14℃，15℃及22℃保存一到七天后CD62P发生的改变图。不同的显著性水平分别为*p＜0.05，** p＜0.01，***p＜0.001，****p＜0.0001。
图4 为hPRP在0℃，2℃，4℃，6℃，8℃，10℃，12℃，14℃，15℃及22℃保存一到七天后PAC1指标发生的改变图。不同的显著性水平分别为*p＜0.05，** p＜0.01，***p＜0.001，****p＜0.0001。
图5 为hPRP连续保存7天聚集功能的改变图。（A）Ristocetin诱导的血小板聚集；（B）Ristocetin诱导血小板聚集的统计结果；（C）Collagen诱导的血小板聚集；（D）Collagen诱导血小板聚集的统计结果；（E）ADP诱导的血小板聚集；（F）ADP诱导血小板聚集的统计结果；当p＜0.05作为差异显著。不同的显著性水平分别为*p＜0.05，** p＜0.01，***p＜0.001，****p＜0.0001。
图6 为4℃，6℃及22℃保存4天的hPRP回输至SCID小鼠体内血栓形成能力的检测图。
图7 为4℃，6℃及22℃保存4天的hPRP回输至SCID小鼠体内清除效率的检测图；当p＜0.05作为差异显著。不同的显著性水平分别为*p＜0.05，** p＜0.01，***p＜0.001，****p＜0.0001。
图8 为4℃，6℃及22℃温度下hPLT连续保存7天casepase3蛋白动态表达变化图。（A）4℃，6℃及22℃分别保存的血小板从第一天到第七天casepase3蛋白发生的改变；（B）分别从第一天到第七天，4℃，6℃及22℃保存的血小板casepase3蛋白发生的变化。
图9 为4℃，6℃及22℃温度下hPLT连续保存7天BCL-XL，BAK，BAX蛋白动态表达变化图。（A）4℃，6℃及22℃分别保存的血小板从第一天到第七天BCL-XL，BAK，BAX蛋白发生的改变；（B）分别从第一天到第七天，4℃，6℃及22℃保存的血小板BCL-XL，BAK，BAX蛋白发生的变化。
图10 为4℃，6℃及22℃温度下hPLT连续保存7天PKA活性的改变图。（A）4℃，6℃及22℃分别保存的血小板从第一天到第七天pVASP（Ser157），VASP，p-GPIbβ（Ser166），GPIbβ蛋白发生的改变；（B）分别从第一天到第七天，4℃，6℃及22℃保存的血小板pVASP（Ser157），VASP蛋白发生的变化。
图11 为4℃，6℃及22℃温度下hPLT连续保存七天后PKA活性的ELISA检测结果图；当p＜0.05作为差异显著。不同的显著性水平分别为*p＜0.05，** p＜0.01，***p＜0.001，****p＜0.0001。
图12 为4℃，6℃及22℃温度下PKACα重组蛋白连续保存七天后PKA活性的ELISA检测结果图；当p＜0.05作为差异显著。不同的显著性水平分别为*p＜0.05，** p＜0.01，***p＜0.001，****p＜0.0001。
图13 为4℃，6℃及22℃温度下血小板连续保存七天后cAMP含量的ELISA检测结果图；当p＜0.05作为差异显著。不同的显著性水平分别为*p＜0.05，** p＜0.01，***p＜0.001，****p＜0.0001。
图14 为4℃，6℃及22℃温度下血小板连续保存七天后PDE3A的ELISA检测结果图；当p＜0.05作为差异显著。不同的显著性水平分别为*p＜0.05，** p＜0.01，***p＜0.001，****p＜0.0001。
图15 为4℃，6℃及22℃温度下hPLT连续保存7天PDE3A蛋白动态表达变化图。（A）4℃，6℃及22℃分别保存的血小板从第一天到第七天PDE3A蛋白发生的改变；（B）分别从第一天到第七天，4℃，6℃及22℃保存的血小板PDE3A蛋白发生的变化。
图16 为8-Br-cAMP预处理血小板对保存血小板状态的影响图。（A）WesternBlot检测 PKA活性的改变；（B）JC1的改变；（C）PS的改变；（D）CD62P的改变；（E）PAC1的改变；当p＜0.05作为差异显著。不同的显著性水平分别为*p＜0.05，** p＜0.01，***p＜0.001，****p＜0.0001。
图17 为Forskolin预处理血小板对保存血小板状态的影响图。（A）WesternBlot检测 PKA活性的改变；（B）JC1的改变；（C）PS的改变；（D）CD62P的改变；（E）PAC1的改变；当p＜0.05作为差异显著。不同的显著性水平分别为*p＜0.05，** p＜0.01，***p＜0.001，****p＜0.0001。
图18 为Milirone预处理血小板对保存血小板状态的影响图。（A）WesternBlot检测 PKA活性的改变；（B）JC1的改变；（C）PS的改变；（D）CD62P的改变；（E）PAC1的改变；当p＜0.05作为差异显著。不同的显著性水平分别为*p＜0.05，** p＜0.01，***p＜0.001，****p＜0.0001。
图19 为Enoximone预处理血小板对保存血小板状态的影响图。（A）WesternBlot检测 PKA活性的改变；（B）JC1的改变；（C）PS的改变；（D）CD62P的改变；（E）PAC1的改变；当p＜0.05作为差异显著。不同的显著性水平分别为*p＜0.05，** p＜0.01，***p＜0.001，****p＜0.0001。
图20 为4℃，6℃及22℃温度下hPLT连续保存7天PKC活性的检测结果图。（A）4℃，6℃及22℃分别保存的血小板从第一天到第七天p-PKC substrate蛋白发生的改变；（B）分别从第一天到第七天，4℃，6℃及22℃保存的血小板p-PKC substrate蛋白发生的变化。
图21 为PKC抑制剂预处理血小板后下游通路的检测结果图。
图22 为GO6983预处理血小板对保存血小板状态的影响图。（A）JC1的改变；（B）PS的改变；（C）CD62P的改变；（D）PAC1的改变；当p＜0.05作为差异显著。不同的显著性水平分别为*p＜0.05，** p＜0.01，***p＜0.001，****p＜0.0001。
图23 为4℃，6℃及22℃保存WT及Bad敲除小鼠血小板凋亡活化指标检测结果图。（A）4℃，6℃及22℃连续保存WT及Bad敲除小鼠血小板七天的膜电位去极化检测（JC1）；（B）4℃，6℃及22℃连续保存WT及Bad敲除小鼠血小板七天的PS外翻；（C）4℃，6℃及22℃连续保存WT及Bad敲除小鼠血小板七天的CD62P检测；（D）4℃，6℃及22℃连续保存WT及Bad敲除小鼠血小板七天的PAC1检测。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，但实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
一、血小板最佳保存温度的选择
本发明提供了一种延长血小板保存的方法，从血小板凋亡活化、聚集功能、血栓形成能力及体内血小板清除速率方面着手，选择保存血小板的最适温度。选择JC1，PS，CD62P，PAC1四个指标来检测血小板的凋亡活化状态。JC1可检测膜电位去极化，是血小板发生凋亡的特异性指标。PS外翻，即磷脂酰丝氨酸外翻，其可发生在血小板发生活化及凋亡后，是检测血小板凋亡的非特异性指标。CD62P，即p-选择素，是血小板α颗粒蛋白，其可反应血小板的释放水平。PAC1，可检测活化的IIBIIA，可反应血小板的活化程度。通过这些指标的变化选择血小板最佳的保存温度。
为了进一步证实初步结果，继续应用不同的诱导剂如Ristocetin，Collagen及ADP诱导不同温度下保存不同时间的血小板的聚集能力，还进行了不同条件处理的hPRP回输至SCID小鼠体内血栓形成能力的检测以及不同温度保存的hPRP回输至SCID小鼠体内清除效率的检测。
1.1 实验方法
1.1.1 人的富含血小板血浆（hPRP）的制备
无菌抽取25-50mL健康人静脉血，将全血与无菌1/9体积比的人3.8%柠檬酸钠抗凝剂混合，缓慢颠倒混匀。抗凝后的全血室温1100rpm离心11分钟，离心后下层为红细胞，中层为白细胞，上层即为富含血小板的血浆（PRP）。小心地将上层PRP吸出移至无菌的15mL 的离心管中。中下层继续室温3500rpm离心10分钟，上清即为不含血小板血浆（PPP）,取出上清至无菌离心管，备用（留以稀释PRP）。全自动人血细胞计数仪计数，计数后调整浓度至为（1-3）´108/mL。
1.1.2 hPRP的不同条件保存
准备好的hPRP/hPLT以200μL/管分装至无菌的1.5mL的EP管中。随后将分装好的血小板分别置于不同的温度环境下，包括0℃，2℃，4℃，6℃，8℃，10℃，12℃，14℃，15℃以及22℃，然后在分别保存1，2，3，4，5，6，7天后检测hPRP/hPLT的凋亡活化指标。另外，准备好的hPRP/hPLT以1.2mL/管分装至无菌的1.5mL的EP管中。随后将分装好的血小板分别置于不同的温度环境下，包括4℃，6℃及22℃，然后在分别保存1，2，3，4，5，6，7天后检测hPRP/hPLT在不同诱导剂诱导情况下的聚集情况。
1.1.3 流式检测血小板膜电位去极化
使用亲脂性阳离子染料JC-1测定血小板线粒体膜电位去极化，处理后的血小板中加入JC-1使其终浓度为2 μg/mL，总体积每管350 mL，室温避光孵育5 min后，流式细胞仪检测。血小板发生凋亡后表现为JC-1聚集体的含量减少，这反映在FL2通道荧光数量的减少，而FL1通道荧光数量增多。
1.1.4 流式检测血小板磷脂酰丝氨酸（PS）外翻
使用FITC标记的lactadherin检测血小板表面的PS外翻，10μg/mL FITC-lactadherin加入待测血小板中，充分混匀后，室温孵育30分钟，流式检测前加入MTB 补足总体积350 μL，血小板发生凋亡后，磷脂酰丝氨酸外翻，流式细胞仪上表现为FL1通道荧光数量增多。
1.1.5 流式检测血小板CD62P释放
用FITC标记的CD62P抗体检测P 选择素释放，20μg/mL FITC-CD62P加入待测血小板中，充分混匀后，室温孵育15分钟后，流式检测前加入MTB 补足总体积350μL。血小板发生活化后可表现为释放增多，其中P选择素为释放物之一。流式细胞仪上表现为FL1通道荧光数量增多。
1.1.6 流式检测血小板活化
用FITC标记PAC-1标记活化的αⅡbβ3，20μg/mL FITC- PAC-1加入待测血小板中，充分混匀后，室温孵育15分钟后，流式检测前加入MTB补足总体积350 μL，血小板活化的特征是FL1通道荧光数量增多。
1.1.7 血小板聚集实验
血小板在不同的温度即4℃，6℃及22℃分别保存1，2，3，4，5，6，7后，血小板聚集仪检测hPRP在不同诱导剂（Ristocetin1.25mg/mL；ADP 20μM; Collagen 5μg/mL）诱导后的聚集能力。在双通道Chrono-Log聚集仪中监测激动剂诱导的血小板聚集。从全血中离心获得的贫血小板血浆（PPP）用于对照孔。将不同温度保存的hPRP样本吸取250μL样品至比色杯中。将两个比色皿分别放置在PRP孔和参考孔中，样品孔中加入搅拌棒和250μL样品，另一个用250μL PPP作参照，然后在37℃下孵育3分钟。 在1200 rpm的搅拌下，按下SET BASELINES按钮，可对通道进行0至100％的光透射率校准。通过添加上述激动剂来引发聚集，并通过光密度进行监测，在加入激动剂后的5分钟内，光密度转换为活性百分比。
1.1.8 血小板回输模型
将在不同温度即4℃，6℃及22℃环境下保存4天的hPRP经过离心浓缩至浓度为4×109/mL的悬液，室温静置1h。向麻醉的受体SCID小鼠通过球后静脉丛回输100μL 4×109/mL的hPRP；分别于注射后30s（基础值）、20分钟、40分钟、2h、4h及24h后小鼠眼窝静脉采血全血，流式细胞仪分析标记血小板，经小鼠ACD抗凝后，全血用PE-抗小鼠CD41，APC-抗人CD41抗体在室温下标记15分钟，350μL MTB稀释后流式检测。保存hPRP占比=anti-人CD41阳性血小板/（anti-小鼠CD41阳性血小板+ anti-人CD41阳性血小板）。以30s为基础值，每个时间点的保存hPRP占比除以30s的保存hPRP占比，以算出最终比率及做统计。
1.1.9 钙黄绿素标记人血小板
（1）将在不同温度即4℃，6℃及22℃环境下保存4天的hPRP，经3500rpm，2分钟离心后，去上清，CGS buffer重悬；
（2）室温2500 rpm，2分钟，去上清，CGS buffer 重悬；
（3）室温2500 rpm，2分钟，去上清，MTB buffer 重悬；
（4）上述洗涤血小板调至1×109/mL，与钙黄绿色-AM（calcein-AM）5μg/mL室温下孵育15分钟；
（5）加入等体积含20μg/mL PGI2CGS buffer 稀释；
（6）室温2500 rpm，2分钟离心，去上清，CGS（含10μg/mL PGI2）buffer重悬；
（7）室温2500 rpm，2分钟离心，去上清，PPP重悬；
（8）hPRP调整至1×109/mL，静息1小时备用。
1.1.10 体内血栓形成
将在不同温度即4℃，6℃及22℃环境下保存4天的hPRP经过离心浓缩至浓度为1×109/mL的悬液，室温静置1h后。向麻醉的受体SCID小鼠通过球后静脉丛回输100μL×109/mL的hPRP，使用氯化铁诱导（FeCl3诱导）的肠系膜小动脉血栓形成模型。简而言之，用钙黄绿素-AM（5μg/ mL）标记洗涤过的4℃，6℃及22℃保存4天后的hPRP，麻醉受体雄性小鼠，并使肠系膜血管床外化。随后用预处理的hPRP（100 μL×109/mL）眼眶静脉注射SCID小鼠。通过局部应用浸有5％的FeCl3的3 mm2滤纸诱导血栓形成。选择一个小动脉并用倒置荧光显微镜（Leica Microsystems）可视化并记录在录像带上。
1.1.11 统计学分析
所有数据均表示为均值±标准差，数据采用单因素方差分析或多因素方差分析进行统计。采用双尾t检验对两组进行比较。使用GraphPad Prism 5软件评估数据的显著性。当p＜0.05作为差异显著。不同的显著性水平分别为*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001，****p＜0.0001。所有需要使用动物的实验均按窝数随机分组，样本量是根据先前实验中观察到的变异性和初步数据预先确定的。
1.2 实验结果
1.2.1 hPRP保存一至七天后凋亡活化指标的改变
血小板凋亡是线粒体介导的细胞程序性死亡的内在形式，BCL-2 家族蛋白与线粒体外膜相互作用，导致跨膜电位去极化，跨膜电位差消失，线粒体肿胀破裂，将线粒体内的细胞色素 C 释放入胞浆内。PS 外翻是内途径依赖细胞凋亡的另一个明显标记分子。血小板是由脂质双层外膜包裹，静息状态时，90%以上的磷脂酰丝氨酸分布于内膜，当血小板发生凋亡，细胞膜表面张力降低，PS 会通过不同的途径翻转到外膜表面，细胞暴露 PS 可被吞噬细胞当作“吃我”信号而吞噬。于是选择线粒体膜电位去极化及 PS 外翻指标来检测保存所致血小板凋亡水平的检测。CD62P 释放及由静息型转向活化型的 IIBIIIA (PAC-1)用来检测保存所致的血
小板活化水平。
如图1-4所示，分别为hPRP置于不同温度（0℃，2℃，4℃，6℃，8℃，10℃，12℃，14℃，15℃，22℃）保存1-7后，血小板凋亡活化指标的变化图。
如图 1-4所示，血小板在不同温度保存 1 天后，不同温度保存的血小板均发生膜电位去极化程度均较低（图1）；0℃较其它温度保存下，PS外翻程度较高；0℃保存的血小板的CD62P、PAC1阳性率均在10%以上，明显高于其它温度保存下的数值，因此血小板在不同温度保存 1 天后， 0℃保存的血小板活化水平高于其他温度，而其他温度保存 1 天后的血小板状态尚未发生明显的血小板损伤。
血小板在不同温度保存 2 天后，0℃保存的血小板发生膜电位去极化程度最高，0℃保存下，PS外翻程度最高，初步表明0℃环境保存下的血小板状态不如其他的温度；0℃、2℃保存的血小板的CD62P、PAC1阳性率明显高于其它温度，从而说明0℃、2℃保存的血小板活化水平较高，初步表明 0℃、2℃温度保存的血小板所致的血小板保存损伤较高，而血小板保存损伤主要体现在血小板活化方面。
血小板在不同温度保存 3 天后，0℃保存的血小板发生膜电位去极化程度最高，另外 2℃及 22℃保存的血小板发生的线粒体膜电位去极化水平虽低于 0℃，但相较于其他温度仍然较高，初步表明0℃、2℃及 22℃保存的血小板所致的血小板保存损伤程度高于其他温度。PS 外翻趋势与线粒体膜电位去极化趋势基本一致，进一步表明在 0℃、2℃及22℃保存血小板 3 天时，凋亡程度高于其他温度。从CD62P 及PAC1阳性率水平来看，0℃、2℃及 22℃保存的血小板活化水平较高。结合凋亡活化检测的四个指标结果来看，在 0℃、2℃及 22℃温度保存血小板 3 天时，血小板保存损伤程度较高，这也许可以解释日本目前在血小板保存时要求在 22℃不超过3 天的原因。
血小板在不同温度保存 4 天后，0℃、22℃保存的血小板发生膜电位去极化程度最高，与22℃相比，2℃、4℃、6℃、8℃、10℃、12℃、14℃及15℃膜电位去极化程度较低；与其他温度相比，8℃保存的血小板PS外翻程度较低，0℃及 2℃在保存 4 天时，PS外翻已出现双峰，表明血小板状态已经很差，想要保存更长时间的难度较大。通过 CD62P 及 PAC1 的检测结果来看，6℃及 8℃环境保存优于其他温度，可以保存更长时间。
血小板在不同温度保存5天后，与其它温度相比，6℃，8℃，10℃，12℃，14℃及15℃保存5天的血小板，膜电位去极化程度较低，PS 外翻趋势与线粒体膜电位去极化趋势基本一致。通过 CD62P 及 PAC1 的检测结果来看，相比于其他温度，6℃及8℃保存的血小板活化程度仍然较低。
血小板在不同温度保存6天和7后的结果，随着保存时间延长，血小板发生保存损伤的程度逐渐加剧，与其它温度相比，6℃血小板膜电位去极化程度最低，PS外翻程度最低。通过 CD62P 及 PAC1 的检测结果来看，相比于其他温度，6℃保存的血小板活化程度最低。因此，在保存 6 天及7天后，6℃保存的血小板凋亡活化水平仍然低于其他温度，是血小板保存的最佳温度。同时，从图1-4的实验结果可以得出，在高于4℃不高于8℃的温度范围内保存血小板，血小板凋亡活化水平虽然低于6℃下保存的血小板，然而其凋亡活化水平仍然低于其它温度，也适合作为血小板的保存温度。
1.2.2 hPRP保存不同时间聚集功能的改变
上述流式细胞仪检测的保存血小板的凋亡活化结果已初步表明6℃是保存血小板的最佳温度。为了进一步证明6℃是血小板保存的最佳温度，接下来检测血小板保存后的聚集功能。由于4℃是目前探讨的低温保存血小板的最常用温度，22℃是目前国内血小板保存的标准温度，最终选择4℃，6℃及22℃三个来探讨血小板的功能状况。
从图5所示，Ristocetin诱导（图5A-B）的4℃及22℃保存血小板的聚集功能从第一天到第七天依次减弱，6℃保存的血小板聚集功能从第一天到第七天变化较小。保存4，5，6，7天后，6℃保存的血小板聚集功能最佳，具有统计学意义。Collagen诱导（图5C-D）的4℃，6℃及22℃保存血小板的聚集功能从第一天到第七天依次减弱，但6℃保存的血小板聚集功能下降最少。在保存1，2，3，4，5，6，7后，6℃保存的血小板聚集功能均最佳，具有统计学意义。ADP诱导（图5E-F）的4℃，6℃及22℃保存血小板的聚集功能从第一天到第七天依次减弱，6℃保存的血小板聚集功能从第一天到第七天变化较小。保存4，5，6，7天后，6℃保存的血小板聚集功能最佳，具有统计学意义。这些结果均进一步表明6℃是血小板保存的最佳温度。
1.2.3 不同条件处理的hPRP回输至SCID小鼠体内血栓形成能力的检测
上述流式细胞仪检测得到的凋亡活化指标及聚集结果表明6℃是血小板保存的最佳温度。为了进一步证明6℃是hPRP保存的最佳温度，接下来检测不同温度保存的hPRP回输至体内的血栓形成能力。将不同温度即4℃，6℃及22℃环境下保存4天的hPRP经过离心浓缩至浓度为1×109/mL的悬液，并用钙黄绿素-AM（5μg/mL）标记洗涤血小板，并用PPP重悬浓缩至1×109/mL，室温静置1h后。麻醉受体SCID小鼠通并使小鼠肠系膜血管床外化，随后用预处理的hPRP（100 μL×109/mL）眼眶静脉注射SCID小鼠。通过局部应用浸有5％的FeCl3的3mm2滤纸诱导血栓形成。选择一个小动脉并用倒置荧光显微镜观察并记录。如图6所示，6℃保存的hPRP血栓形成能力强于4℃及22℃，22℃保存的hPRP血栓形成能力强于4℃。
1.2.4 不同温度保存的hPRP回输至SCID小鼠体内清除效率的检测
上述流式细胞仪检测得到的凋亡活化指标，聚集结果及体内的血栓形成结果均表明6℃是血小板保存的最佳温度。最后，检测不同温度保存的hPRP回输到体内，观察血小板清除效率。在4℃，6℃及22℃保存hPRP4天后，将hPRP浓缩至4×109/mL的悬液，室温静置1h。向麻醉的受体SCID小鼠通过球后静脉丛回输100μL 4×109/mL的hPRP，分别于注射后30s（基础值）、20分钟、40分钟、2h、4h及24h后小鼠眼窝静脉采血全血，流式细胞仪分析保存血小板回输到体内的清除效率。如图7所示，随着时间的延长，保存后的hPRP回输到SCID小鼠体内被逐渐清除，24h内就会被清除完全。然而，不同温度保存的血小板回输到SCID小鼠体内的清除率不同，在回输到体内20min，40min，2h，4h及24h时，6℃保存的hPRP清除效率均低于4℃及22℃，在回输到体内20min，40min，2h及4h，22℃保存的hPRP清除效率低于4℃。且在20min时，具有统计学意义。
综上所述，上述结果表明，在不同温度保存相同时间时，血小板凋亡活化程度有所不同。从膜电位去极化水平指标来看：0℃保存的hPRP，从保存第三天起，发生膜电位去极化程度明显高于其他温度；22℃保存的hPRP，从保存第四天起，发生膜电位去极化程度明显高于其他温度；2℃及4℃保存的血小板，从保存第五天起，发生膜电位去极化水平明显升高；8℃保存的血小板，从保存第六天起，发生膜电位去极化水平明显升高；而其他温度下保存的血小板从第一天到第七天，JC1发生的改变不大，其中改变最小的是6℃保存的血小板。从PS外翻指标来看：0℃保存的hPRP，从保存第一天起，已有明显的PS外翻；22℃保存的hPRP，从保存第四天起，呈现出明显的PS外翻；2℃及4℃保存的血小板，从保存第五天起，发生明显的PS外翻；而其他温度PS外翻水平从第一天到第七天相对较低，其中PS外翻程度改变最小的是6℃保存的血小板。从CD62P指标来看：0℃及2℃保存的血小板，从保存第二天起，已发生明显的CD62P释放；4℃保存的血小板，从保存第四天起，已发生明显的CD62P释放；10℃，12℃，14℃，15℃及22℃保存的血小板，从保存第三天起，已发生明显的CD62P释放；8℃保存的血小板，从保存第五天起，已发生明显的CD62P释放。从PAC1指标来看：0℃保存的hPRP，从保存第一天起，已有明显的IIBIIIA活化；2℃，4℃，8℃及10℃保存的血小板，从第二天起，已有明显的IIBIIIA活化；22℃保存的血小板，从第四天起，才有明显的IIBIIIA活化，这些提示22℃及研究最多的低温（4℃）保存血小板并不是最佳选择，6℃才是血小板的最适温度。这也可以解释为什么以往研究的低温保存血小板效果并不佳，且有很多缺点，如冷血小板被肝巨噬细胞迅速从循环中清除，导致半衰期约为1.3天，而RT-PLT半衰期为4天。
应用不同的诱导剂如Ristocetin，Collagen及ADP诱导不同温度下保存不同时间的血小板的聚集能力，正如预期那样，6℃保存的血小板从第一天到第七天，聚集能力均是最强的。用FeCl3损伤肠系膜静脉的血栓模型中，也同样证实6℃是血小板功能保存最完整的温度。通过构建回输人hPRP至SCID小鼠体内后检测清除效率的模型，发现6℃保存的血小板清除效率最低，在体内循环最久，22℃次之，4℃最差。
二、温度对血小板保存影响的机制的研究
血小板凋亡是近年来研究的热点，对于揭示血小板寿命和存活的调控机制具有重要意义。越来越多的证据表明，在病理和生理条件下，固有的凋亡程序会导致血小板的破坏。血小板线粒体膜电位去极化、caspase活性增强和磷脂酰丝氨酸暴露，导致血小板经历凋亡细胞死亡。已证实血小板含有多种凋亡相关蛋白，如Bcl-2家族蛋白和多种caspase家族蛋白。Takahiro Kodama等人的研究表明室温（22℃）保存后的人血小板发生了自发的凋亡，Bcl-xl的表达逐渐下降。Bak/Bax缺陷或Bcl-xl过表达的血小板在保存时凋亡减少，而Bid/Bim缺陷的血小板则未见凋亡，表明血小板寿命受抗凋亡和促凋亡多结构域Bcl-2家族蛋白的精细平衡调节。PKA活性抑制可导致促凋亡蛋白BAD在Ser155位点发生去磷酸化，导致凋亡蛋白bcl-xl在线粒体中的滞留，进而导致细胞凋亡。在本研究中，血小板在不同温度下保存的凋亡机制是如何的，以下进行详细说明。
2.1 实验方法
2.1.1 人的洗涤血小板（hPLT）制备
无菌抽取25-50mL健康人静脉血，将全血与无菌1/7体积比的人ACD抗凝剂混合，缓慢颠倒混匀。抗凝后的全血室温1100rpm离心11分钟，离心后下层为红细胞，中层为白细胞，上层即为富含血小板的血浆（PRP）。小心地将上层PRP吸出移至高压灭菌的1.5 mL的Ep管中。随后经3500rpm离心2分钟后，弃去上清，管底部为血小板沉淀，将血小板重悬于37℃预温的CGS缓冲液中，轻轻吹打直至混匀。2500rpm离心2分钟，洗去血浆蛋白，沉淀的血小板最终重悬于一定体积37℃预温的MTB缓冲液中，计数后调整浓度至为3´108/mL，加入CaCl2、MgCl2使其终浓度为1mM。重悬后的洗涤血小板在22-26℃静置1小时以使其恢复至生理状态后用于后续实验。
2.1.2 小鼠洗涤血小板的制备
室温下0.2g/mL的10%水合氯醛经腹腔注射入小鼠体内，大约3分钟小鼠进入麻醉状态，将小鼠四肢以腹部朝上的方式固定于试验台上，酒精消毒后，眼科剪打开下腹腔，暴露出下腔静脉，含有小鼠ACD抗凝剂（全血与ACD体积比为7:1）的1mL注射器针头斜面向下插入小鼠下腔静脉，在空针内充分混匀后，针头取下将全血注入1.5mL EP管中，将3只小鼠的全血混合至15mL离心管中，加入两倍体积生理盐水稀释全血，充分混匀后， 1100 rpm离心11分钟，上清中为富含血小板的血浆，小心地将上层PRP吸出移至高压灭菌的1.5 mL的Ep管中。随后经3500 rpm离心2分钟后，弃去上清，将底部血小板重悬于37℃预温的CGS缓冲液中，轻轻吹打直至混匀。2500 rpm离心2分钟，洗去血浆蛋白，同样方法重复洗涤一次，最终重悬于一定体积37℃预温的MTB缓冲液中，计数后调整浓度至为3´108/mL，加入CaCl2、MgCl2使其终浓度为1mM。重悬后的洗涤血小板在室温即22-24℃静置2小时以使其恢复至生理状态后用于后续实验研究。
2.1.3 hPLT的不同条件保存
准备好的hPLT以200μL/管分装至无菌的1.5mL的EP管中。随后将分装好的血小板分别置于不同的温度环境下，包括4℃，6℃以及22℃，然后分别保存1，2，3，4，5，6，7天后将其用于后续实验研究。
2.1.4 小鼠PLT的不同条件保存
准备好的小鼠PLT，包括野生型（WT）及Bad敲除（KO）小鼠血小板以200μL/管分装至无菌的1.5mL的EP管中。随后将分装好的血小板分别置于不同的温度环境下，包括4℃，6℃以及22℃，然后在分别保存1，2，3，4，5，6，7天后检测WT及KO小鼠的凋亡活化指标。
2.1.5 流式检测血小板膜电位去极化
使用亲脂性阳离子染料JC-1测定血小板线粒体膜电位去极化，处理后的血小板中加入JC-1使其终浓度为2 μg/mL，总体积每管350 mL，室温避光孵育5 min后，流式细胞仪检测。血小板发生凋亡后表现为JC-1聚集体的含量减少，这反映在FL2通道荧光数量的减少，而FL1通道荧光数量增多。
2.1.6 流式检测血小板磷脂酰丝氨酸（PS）外翻
使用FITC标记的lactadherin检测血小板表面的PS外翻，10μg/mL FITC-lactadherin加入待测血小板中，充分混匀后，室温孵育30分钟，流式检测前加入MTB 补足总体积350 μL，血小板发生凋亡后，磷脂酰丝氨酸外翻，流式细胞仪上表现为FL1通道荧光数量增多。
2.1.7 流式检测人血小板CD62P释放
用FITC标记的抗人CD62P抗体检测P 选择素释放，20μg/mL FITC-CD62P加入待测血小板中，充分混匀后，室温孵育15分钟后，流式检测前加入MTB 补足总体积350μL。血小板发生活化后可表现为释放增多，其中P选择素为释放物之一。流式细胞仪上表现为FL1通道荧光数量增多。
2.1.8 流式检测小鼠血小板CD62P释放
用FITC标记的抗小鼠CD62P抗体检测P 选择素释放，2 μL FITC-CD62P加入待测血小板中，充分混匀后，室温孵育15分钟后，流式检测前加入MTB 补足总体积350μL。血小板发生活化后可表现为释放增多，其中P选择素为释放物之一。流式细胞仪上表现为FL1通道荧光数量增多。
2.1.9 流式检测人血小板活化
用FITC标记PAC-1标记活化的αⅡbβ3，20μg/mL FITC- PAC-1加入待测血小板中，充分混匀后，室温孵育15分钟后，流式检测前加入MTB补足总体积350 μL，血小板活化的特征是FL1通道荧光数量增多。
2.1.10 流式检测小鼠血小板活化
用PE标记JON/A标记活化的αⅡbβ3，2 μL PE- JON/A加入待测血小板中，充分混匀后，室温孵育15分钟后，流式检测前加入MTB补足总体积350 μL，血小板活化的特征是FL2通道荧光数量增多。
2.1.11 血小板Caspase-3的活化检测
不同温度即4℃，6℃及22℃分别保存1，2，3，4，5，6，7天的200μL 3´108/mL血小板，加入1/9体积的10×细胞裂解液（含2mM PMSF、2 mM NaF、2mM Na3VO4以及蛋白酶抑制剂）冰上裂解30分钟后，加入总体积1/3的4´蛋白上样缓冲液，99℃金属浴5分钟后，冷却至室温，-80℃保存；蛋白经SDS-PAGE胶分离后，将条带转至PVDF膜，5%脱脂奶粉封闭1小时后，PVDF膜与1:500稀释的抗caspase-3一抗共孵育，4℃孵育过夜后，TBST洗涤5分钟，重复三次后，与HRP耦连的二抗共孵育，ECL发光后，检测蛋白水平，同时检测各组血小板的GAPDH蛋白表达情况，以此作为内参分析各组样本上样量是否一致。
2.1.12 Western Blot蛋白检测
不同温度即4℃，6℃及22℃分别保存1，2，3，4，5，6，7天的200μL 3´108/mL血小板，加入10×裂解液（含2mM PMSF、2 mMNaF、2mM Na3VO4以及蛋白酶抑制剂）冰上裂解30分钟后，加入蛋白上样缓冲液混匀，99℃金属浴5分钟后，蛋白经SDS-PAGE胶分离，转移至PVDF膜后，5%脱脂奶粉封闭1小时，PVDF膜先后与相应稀释浓度的一抗（GAPDH，β-actin，BAK，BAX，BCL-XL，p-VASP(Ser157)，VASP，p-PKC substrate，p-GPIbβ（Ser166），GPIbβ，PDE3A）、二抗共孵育，条带经ECL发光显示。
2.1.13 PKA重组蛋白的活性检测
用PKA活性试剂盒（目录ADI-EKS-390A； Enzo Life Science Inc），通过ELISA检查PKA活性检测PKA活性。
（1）盒子中所含试剂：PKA底物微量滴定板，磷酸化底物抗体，Anti-Rabbit IgG:HRP Conjμgate，抗体稀释缓冲液，激酶测定稀释缓冲液，ATP，Active PKA，20X WashBuffer，TMB Substrate，终止液2
（2）样本处理：将有活性的PKA重组蛋白分别置于0℃，2℃，4℃，6℃，8℃，10℃，12℃，14℃，15℃以及22℃，在第一天，第二天，第三天，第四天，第五天，第六天，第七天检测重组蛋白的活性
（3）步骤：
a.回复室温：PKA底物微量滴定板，抗体稀释缓冲液，激酶测定稀释缓冲液，TMB底物和终止液2。
b.在室温下，将PKA底物微量滴定板的孔用50μL激酶测定稀释液浸泡10分钟。小心地从每个孔中吸出液体。
c.将处理的样本即30μL的PKA重组蛋白添加到PKA底物微量滴定板的适当孔中。
d.通过向每个孔中加入10 µL稀释的ATP（空白样品除外）来引发反应。
e.在30°C下孵育90分钟。
f.通过排空每个孔的内容物来停止反应。
g.除空白外，向每个孔中添加40 µL磷酸化底物抗体。
h.在室温下孵育60分钟。
i.用100 µL 1X洗涤缓冲液将孔洗涤4次。
j.向空白孔中加入40 µL稀释的抗兔IgG：HRP偶联物，空白孔除外。
k.在室温下孵育30分钟。
l.用100 µL 1X洗涤缓冲液将孔洗涤4次。
m.在每个孔中加入60 µL TMB底物。
n.在室温下孵育30分钟。
o.在每个孔中加入20 µL终止液2。
p.测量450 nm处的吸光度。
（4）计算：
通过以下公式计算相对PKA激酶活性：（样品平均吸光度-空白平均吸光度）/每次测定所用粗蛋白的量。
2.1.14 保存血小板的PKA活性检测
样本处理：将200μL 3´108/mL hPLT分别置于0℃，2℃，4℃，6℃，8℃，10℃，12℃，14℃，15℃以及22℃，分别保存1，2，3，4，5，6，7天。配置2´lysis buffer，按照体积1：1加入hPLT样本中，同时加入NaF，Na3VO3，PMSF，Cocktail。冰上裂解30min，1000g，10min离心取上清，样本冻存于-80℃冰箱。余步骤同上述。
2.1.15 cAMP检测
用cAMP检测试剂盒（目录RPN225； GE Healthcare Life Sciences），通过ELISA检查cAMP含量。
（1）盒子中所含试剂：包被驴抗兔抗体的微孔板；Assay buffer（0.05 M醋酸钠缓冲液）；cAMP 标准品；Antiserum；兔抗cAMP抗体；cAMP-辣根过氧化物酶耦联；Wash buffer；TMB substrate；Lysis reagent 1；Lysis reagent 2。
（2）样本处理：取180μL不同温度下保存不同时间的血小板，加20μL Lysisreagent 1A，室温下摇晃10min以促进血小板裂解。裂解完全的样本冻存于-80℃冰箱备用。
（3）稀释标准品：
a. 以25、50、100、200、400、800、1600和3200 fmol标记8根1.5mL EP管。
b.将500μL裂解试剂Lysis reagent 1B移入这些试管中。
c.将500μLcAMP标准品（64 pmol / mL）加入3200 fmol的移液管中，并充分混合。
d.将500μL从3200 fmol管转移到1600 fmol管，并充分涡旋混合。
e.依次用剩余的试管重复此加倍稀释，并在每次稀释后涡旋。
f.每个系列稀释液中的100μL等分试样将从25–3200 fmol产生8个标准水平的cAMP。
（4）步骤：
a. 准备Assay buffer，Lysis reagent和浓度范围为25-6400 fmol的标准液。
b.使用前将所有试剂回复至室温并充分混合。尤其是酶底物TMB。
c.设置具有足够孔的微孔板，以根据需要运行所有空白，标准液和样品。推荐的底物空白（B），非特异性结合（NSB），标准（0-6400 fmol）和样品（S）孔。
d.移取100μL裂解试剂1B和100μL裂解试剂2B到NSB孔中。
e.将100μL裂解试剂1B移入零标准（0）孔中。
f.用干净的移液器吸取每种标准品100μL到适当的孔中。
g.移取100μL未知样品至适当的孔中。
h.移取100μL Antiserum到除空白和NSB孔之外的所有孔中。
i.用提供的盖子盖住培养皿，轻轻混合，置于3-5℃孵育2小时。
j.小心地将50μL cAMP-过氧化物酶结合物移入除空白以外的所有孔中。
k.盖好板，轻轻混合， 3-5℃，孵育60分钟。
l.弃上清，用400μL Wash Buffer抽吸并洗涤所有孔四次。将板在薄纸上吸干，以确保在吸干过程中清除所有残留体积。彻
m.立即将150μL酶底物分配到所有孔中，盖好板并在微孔板振荡器上在室温（15-30°C）下混合60分钟。混合液将形成蓝色，在630 nm处读取。
（5）计算：
通过以下公式计算并绘画标准曲线：%B/B0 = (标准品or样本OD-NSB OD)/(0标准品OD-NSB OD) x 100。
2.1.16 PDE3A活性检测
用PDE活性检测试剂盒（目录ab139460；Abcam），通过ELISA检查PDE活性。
（1）盒子中所含试剂：PDE Enzyme；5’-Nucleotidase (5 kU/μL)；3’,5’-cAMPSubstrate (1mM)；PDE Assay Buffer；Green Assay Reagent；5’-AMP Standard (100 μM)；96-well Clear Microplate。
（2）样本处理：取100mL 3´108/mL不同温度下保存不同时间的血小板，加入15 μL10×裂解液（含2mM PMSF、2 mMNaF、2mM Na3VO4以及蛋白酶抑制剂，IBMX）冰上裂解30分钟后。1000g，10min离心后取上清，冻存于-80℃以备用。
（3）样本脱盐（Zeba™ Spin脱盐）：
a.卸下色谱柱的底部封口或板的底部密封材料。松开瓶盖（并不卸下瓶盖）。
b.将色谱柱放入1.5mL离心管，并进行1500g，1min离心分离，以除去存储溶液。
c.丢弃流通液，然后将色谱柱放回收集管中。
d.在树脂顶部添加洗涤/平衡缓冲液。离心管并丢弃流通物。再重复两次此步骤。
注意：每次旋转后，树脂应显示为白色且无液体。如果存在液体，请确保使用正确的离心速度和时间。离心不完全可能导致样品回收率差或样品稀释。
e.吸干色谱柱或板的底部以除去多余的液体。将色谱柱转移到新的1.5mL离心管。
f.将样品放在树脂上。1500g，2min离心，收集下层液体。
g. 丢弃旋转柱。
（4）制备标准曲线：制备75、50、37.5、25、18.75、12.5、6.25μM的5'-AMP标准品；75、50、37.5、25、18.75、12.5、6.25μM的5'-AMP标准品浓度分别对应于3、2、1.5、1.0、0.75、0.50和0.25 nmol 5'-AMP。
a）将80μL的75μM 5'-AMP标准溶液添加至测定板的孔A，并将80μL的50μM标准溶液添加至B孔。
b）向C到H孔中添加40μL 1X PDE assay buffer。
c）从A孔中取出40μL，然后将其添加到C孔中。通过上下移液几次将其充分混合。
d）从C孔中取出40μL并将其添加到E孔中。将E孔充分混合，然后除去40μL并丢弃。
e）从B孔中取出40μL，然后将其添加到D孔中。通过上下吹打几次将其充分混合。重复此过程，将40μL从D孔移至F，然后从F移至G。
从G孔中取出40μL并丢弃。请勿进入空白H孔。
f）向每个孔中加入10μL 5'-核苷酸酶（5 kU /μL），并充分混合。
g）在30°C孵育30分钟。
（5）步骤：
a.准备溶解在PDE分析缓冲液中的，含有PDE酶，底物和测试化合物的样品。即cAMPSubstrate 20 μL+ 5’-Nucleotidase (5 kU/μL)10 μL+ sample 20 μL。
b. 30℃，30min孵育样品。
c.加入100μL Green Assay Reagent终止反应。
搅动板或将孔轻轻搅碎以混合。
注意：避免在孔中产生气泡。
d.显影30分钟。
e.酶标仪 OD620nm读数。
（6）计算：5'-AMP释放=（OD620nm – y轴截距）/斜率
2.1.17 PKA通路活化实验
洗涤hPLT分别用8-Br-cAMP（12.5μM，25μM，50μM）及Forskolin（1.25μM，1.875μM，2.5μM）及DMSO（对照）预处理后，置于6℃环境保存4天后用流式细胞仪检测血小板的凋亡及活化指标，同时制备蛋白样本以便用Wsetern blot检测对PKA的影响。
2.1.18 PDE3A活性抑制实验
洗涤hPLT分别用Milrinone（6.25μM，12.5μM，25μM）及Enoximone（0.5μM，1μM，2μM）及DMSO（对照）预处理后，置于6℃环境保存4天后用流式细胞仪检测血小板的凋亡及活化指标，同时制备蛋白样本以便用Wsetern blot检测对PKA的影响。
2.1.19 PKC活性抑制实验
洗涤hPLT分别用GO6983（50nM，100nM，200nM）及DMSO（对照）预处理后，置于6℃环境保存4天后用流式细胞仪检测血小板的凋亡及活化指标，同时制备蛋白样本以便用Wsetern blot检测对PKC的影响。
2.1.20 统计学分析
所有数据均表示为均值±标准差，数据采用单因素方差分析或多因素方差分析进行统计。采用双尾t检验对两组进行比较。使用GraphPad Prism 5软件评估数据的显著性。当p＜0.05作为差异显著。不同的显著性水平分别为*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001，****p＜0.0001。所有需要使用动物的实验均按窝数随机分组，样本量是根据先前实验中观察到的变异性和初步数据预先确定的。
2.2 实验结果
2.2.1 不同温度下hPLT保存不同时间后caspase3酶切片段增加，凋亡增加
为了进一步证明血小板在保存过程中发生凋亡，除了膜电位去极化及PS外翻，还检测凋亡执行蛋白caspase3的表达。在凋亡过程中，线粒体功能障碍引发生物能量学破坏，最终引起质膜完整性破坏并导致形态学改变。线粒体ΔΨm去极化位于caspase-3信号通路上游，而caspase-3是半胱天冬酶家族刽子手之一，可导致细胞的解体和崩溃，是凋亡发生的执行蛋白。如图8A所示，研究发现，4℃保存的血小板在保存1，2，3，4，5，6天后，未发现caspase3的酶切片段，在保存第七天时，检测到了caspase3的酶切片段；6℃保存的血小板在保存1，2，3，4，5，6天后，未发现caspase3的酶切片段；22℃保存的血小板在保存1，2，3天后，未发现caspase3的酶切片段，但在保存4，5，6，7天后，检测到了明显caspase3的酶切片段，随着保存时间延长，酶切片段增加。
同时，还检测了保存同样时间时，在不同温度即4℃，6℃及22℃保存时，凋亡执行蛋白caspase3的变化。如图8B所示，在保存第1、2及3天时，三个温度下保存的血小板caspase3均未检测出酶切条带。在保存第4、5、6及第7天时，22℃保存保存的血小板可检测出caspase3酶切条带。这些结果进一步表明血小板在长期保存时会发生凋亡，但不同的温度下保存的血小板发生凋亡的程度不同，22℃保存的血小板发生的凋亡最早并且随时间延长越来越多。4℃保存的血小板在第七天开始发生凋亡。6℃保存的血小板在保存七天内并未检测出caspase3酶切条带。这些结果也间接表明6℃是保存血小板的最佳温度。
2.2.2 hPLT连续保存七天后凋亡相关蛋白的检测
接着，探讨了血小板保存过程中发生凋亡的分子机制。已有文章表明室温保存血小板发生凋亡时，BCL-2蛋白家族包括BCL-XL和BAX蛋白的表达随时间逐渐降低，但BAK表达的降低发生在较晚的时间点，意味着BCL-XL、BAX、BAK发生降解。于是先检测不同温度保存的血小板中BCL-XL、BAX、BAK蛋白表达情况。
与之前的研究一致，22℃保存的血小板BCL-XL、BAK、BAX蛋白表达随着保存时间延长而降低。BCL-XL的蛋白表达从第6天开始降低，第7天降低更多。BAX的蛋白表达从第4天开始降低，随着保存时间延长，降低越来越明显。BAK的蛋白表达从第6天开始降低。但是，4℃及6℃保存的血小板，BCL-XL、BAK、BAX的蛋白表达从保存第一天至第七天并未发生改变（图9A）。同时，还检测了在保存同样时间后，不同温度下保存的血小板BCL-XL、BAK、BAX的蛋白表达情况。如图9B所示，在保存6，7天时，4℃及6℃保存的血小板中BAX，BAK，BCL-XL表达水平一致，而22℃保存的血小板中BAX，BAK，BCL-XL表达水平比4℃及6℃的血小板低。初步表明不同温度保存的血小板发生凋亡的机制有所不同。
2.2.3 hPLT连续保存七天后PKA活性随时间延长逐渐下降
通过前期研究发现PKA活性是调节血小板凋亡的主要调控环节，于是猜想低温保存血小板导致凋亡可能是随着保存时间延长PKA活性下降所致。PKA活性可以用PKA底物GPIbβ在Ser166处的磷酸化（p-GPIbβ（Ser166））以及VASP在Ser157处的磷酸化（pVASP（Ser157））来表示。PKA活性降低时，GPIbβ（Ser166）及pVASP（Ser157）发生去磷酸化。
如图10A所示，4℃，6℃及22℃保存的血小板随着保存时间延长，PKA活性有不同程度的下降，4℃保存的血小板pVASP（Ser157）从第4天起发生明显的去磷酸化，4℃保存的血小板pVASP（Ser157）从第六天开始发生去磷酸化，且VASP总蛋白表达不变，表明PKA活性下降。虽然22℃保存的血小板pVASP（Ser157）磷酸化水平下降，但总的VASP蛋白表达也同时下降，表明PKA活性的降低可能是由于蛋白发生了降解。同样地，虽然发生去磷酸化的时间不同，但GPIbβ（Ser166）随着保存时间的延长，也同样发生了去磷酸化，表明PKA活性的下降。
同时，还检测了在保存同样时间后，不同温度下保存的血小板BCL-XL、BAK、BAX的蛋白表达情况。如图10B所示，在保存4，5，6，7天时，4℃，6℃及22℃保存的血小板中pVASP（Ser157）水平明显下降，但6℃的下降最为平缓，另外，4℃及6℃保存的血小板VASP表达一致，22℃保存的血小板中VASP表达水平比4℃及6℃的血小板低。进一步表明4℃及6℃保存的血小板发生凋亡是由于PKA活性的下降，而22℃是由于蛋白的降解。
2.2.4 hPLT连续保存七天后PKA活性随时间延长逐渐下降
为了进一步夯实上述Western Blot检测的蛋白结果，接下来应用ELISA酶联检测试剂盒检测PKA活性的变化。如图11所示，以保存一天后的血小板PKA活性为基础值，4℃及6℃保存的血小板PKA活性随着保存保存时间的延长，活性在逐渐下降，但6℃保存的血小板PKA活性下降速率相对缓慢，22℃保存的血小板在保存1，2，3，4，5天时，PKA活性逐渐下降，且下降速率高于4℃，但在保存6，7天时，血小板PKA活性不降反比第5天升高了，这可能与血小板的保存状态有关。在22℃保存6及7天后，血小板有些许活化，甚至聚集块的产生，此与PKA活性反常性升高有关。
2.2.5 PKACα重组蛋白连续保存七天后PKA活性随时间延长逐渐下降
上述结果已揭示PKA活性下降是血小板凋亡的调控环节。为了探讨PKA是否是不同温度保存血小板发生凋亡不同程度的直接影响因素。构建了有活性的PKACα重组蛋白，将PKACα置于不同的温度下，包括4℃，6℃及22℃，连续保存7天，用ELISA酶联检测试剂盒检测PKA活性七天的变化。
如图12所示，不同温度保存的PKACα重组蛋白活性皆随保存时间延长而下降，但4℃，6℃及22℃三个温度之间保存的PKACα重组蛋白活性下降速率相差甚微，表明PKA活性下降并不是温度影响保存血小板凋亡的直接影响因素。
2.2.6 hPLT连续保存七天后cAMP含量随保存时间延长逐渐下降
上述PKACα重组蛋白不同温度保存七天的PKA活性变化结果表明PKA活性下降是温度影响血小板凋亡的下游环节。接下来进一步探讨PKA通路的上游环节。增加或减少的cAMP以协同方式与PKA（cAMP依赖性激酶）结合，导致其激活或失活。于是连续收集4℃，6℃及22℃保存7天的血小板样本，检测不同温度下保存血小板不同时间cAMP的含量。如图13所示，4℃，6℃及22℃保存的血小板均随着保存时间延长，cAMP含量逐渐减少。另外，22℃保存的血小板cAMP含量下降速率最快，4℃次之，6℃保存的血小板cAMP含量下降速率最慢，与不同温度下保存的血小板随着时间延长PKA活性下降的速率一致。
2.2.7 hPLT连续保存七天后PDE活性随保存时间延长而增加
上述结果表明cAMP含量下降是不同温度保存血小板发生不同程度凋亡的原因，接下来检测cAMP的上游机制。细胞内cAMP的水平取决于磷酸二酯酶（PDE）的水解以及腺苷酸环化酶（AC）的合成。由于PDE3A是血小板中最丰富的PDE，继而检测4℃，6℃及22℃保存7天的血小板中PDE3A活性的改变。
如图14所示不同温度下，血小板中PDE活性均随着保存时间延长而成倍增加。并且4℃保存的血小板随着天数增加，PDE活性增加速率高于6℃，这跟检测的cAMP含量下降趋势一致。然而22℃保存的血小板虽然随着时间延长PDE活性增加，但增加的趋势与cAMP下降的趋势却并不吻合。
2.2.8 hPLT连续保存七天后PDE3A的总蛋白水平检测
上述PDE活性检测结果，我们发现22℃保存的血小板随着保存时间延长PDE活性虽然有所增加但并不如预期。于是猜测，这种现象可能跟22℃保存的血小板随着时间延长蛋白发生降解有关。
如图15A所示，22℃保存的血小板从第2天开始，PDE3A的蛋白表达开始逐渐下降，而4℃及6℃保存的血小板PDE3A从第1天到第7天表达量没有变化。同时，还检测了在保存同样时间后，不同温度下保存的血小板PDE3A的蛋白表达情况。如图15B所示，在保存7天时，4℃及6℃保存的血小板PDE3A表达一致，而22℃保存的血小板中PDE3A表达水平比4℃及6℃的血小板低，这些结果表明22℃保存的血小板PDE3A蛋白发生降解。
2.2.9 PKA活化剂8-Br-cAMP预处理hPLT后可部分回复保存血小板所致的凋亡活化
以上结果已揭示不同温度保存血小板可以通过活化PKC通路，进一步增强PDE3A的活性，从而使cAMP的水解加快，导致PKA活性减低，从而导致血小板发生不同程度凋亡。为了进一步夯实这一结果，接下来分别采用PKA活化剂，PDE3A抑制剂及PKC抑制剂来预处理保存的血小板，Western blot检测对下游PKA或者PKC活性的影响；同时流式细胞仪检测活化剂或者抑制剂预处理的血小板凋亡活化指标的改变。该部分主要讨论应用不同浓度cAMP刺激剂即PKA活化剂8-Br-cAMP预处理血小板，6℃保存血小板4天后，凋亡活化指标的改变。如图16所示，8-Br-cAMP可以剂量依赖地活化PKA通路并抑制6℃保存的血小板凋亡活化程度。
2.2.10 PKA活化剂forkolin预处理hPLT后可部分回复保存血小板所致的凋亡活化
Forskolin是腺苷环化酶（AC）的活化剂，可刺激cAMP产生进一步活化PKA通路。选择三种浓度的forskolin预处理血小板，在6℃保存血小板4天后，血小板的凋亡活化程度可以剂量依赖地被逆转。同时用p-GPIbβ（Ser166）及pVASP（Ser157）来反映PKA的活性，发现PKA被剂量依赖地被激活，表明血小板凋亡活化地逆转是PKA活性增强所致（图17）。
2.2.11 PDE3A抑制剂Milirone预处理hPLT后可部分回复保存血小板所致的凋亡活化
Milirone是PPDE3A的抑制剂，其可抑制PDE3A的活性是cAMP水解减少，从而间接提高PKA的活性。本部分选择6.25μM，12.5μM及25μM的Milirone预处理血小板，以DMSO组作为对照，在6℃保存血小板4天后，流式细胞仪检测血小板的凋亡活化结果，并从蛋白层面验证选择的Milirone浓度可以活化PKA通路。如图18所示，Milirone可以剂量依赖地活化PKA通路并抑制6℃保存的血小板凋亡活化程度。
2.2.12 PDE3A抑制剂Enoximone预处理hPLT后可部分回复保存血小板所致的凋亡活化
Enoximone亦为PDE3A的抑制剂，本研究中选择Enoximon三个浓度即0.5μM，1μM及2μM预处理血小板，Western blot检测对下游PKA活性的影响；同时流式细胞仪检测血小板凋亡活化指标。如图19所示，Enoximone可以剂量依赖地活化PKA通路并抑制6℃保存的血小板凋亡程度，但对血小板的活化水平没有影响。
2.2.13 hPLT连续保存七天后PKC通路随着时间延长逐渐活化
上述结果已证实PDE3A活性增加是不同温度保存后血小板发生不同程度凋亡的主要环节。接下来进一步探讨PDE3A活性为何会在不同温度处理后增加。已有文献报道。PDE3A激活需要PKC的激活，且在血小板中PDE3A是PKC的靶标。于是检测不同温度保存血小板不同时间时的PKC活性变化。如图20A所示4℃及6℃保存的血小板在随着保存时间延长，PKC活性逐渐增强。且从保存第一天至第七天4℃保存的血小板PKC活性均高于6℃(图20B)。
2.2.14 PKC抑制剂GO6983预处理hPLT后可激活PKA通路
上述结果已经证实血小板随着保存时间延长，PKA活性下降，PKC活性增强，PDE3A的激活需要PKC活性增强。为了进一步验证PKC是PKA的上游。用不同浓度PKC的抑制剂GO6983预处理血小板后，然后保存4天后，同时检测PKA及PKC的活性，结果显示，PKC活性被抑制后，PKA活性增加，表明PKC是保存所致血小板凋亡的上游信号通路（图21）。
最后，应用PKC抑制剂GO6983预处理血小板，Western blot检测GO6983对下游PKC活性的影响，确定PKC活性被抑制。流式细胞仪检测血小板的凋亡活化指标，并从蛋白层面进一步验证凋亡执行蛋白caspase3的酶切片段。如图22 所示，GO6983可以剂量依赖抑制PKC的活性，并抑制血小板的凋亡活化水平。
2.2.16 Bad敲除小鼠的血小板保存后凋亡活化低于WT小鼠
先前的研究已发现PKA活性导致下游Bad ser155去磷酸化，促凋亡蛋白Bad在蛋白激酶A（PKA）和Akt的作用下，其112、136和155位点丝氨酸可被磷酸化，从而导致Bcl-xL/Bad异二聚体复合物解聚，磷酸化的Bad可与14-3-3结合停留在胞浆中，被释放出的抑凋亡蛋白Bcl-xL在线粒体外膜与Bak相结合，从而抑制了线粒体途径凋亡的发生。因此，促凋亡蛋白Bad的磷酸化水平在血小板凋亡的发生中起关键的调控作用。另外，抗GPIbα抗体诱导的凋亡事件在缺乏PKA底物的Bad敲除小鼠的血小板中明显减少。
于是探讨WT小鼠及Bad敲除小鼠血小板在不同的温度下保存后凋亡活化指标的检测。如图23所示，从图中可以看出，22℃保存的WT小鼠血小板，随着保存时间延长，膜电位去极化、PS外翻、CD62P释放及活化的IIBIIIA水平越来越高。相同温度下保存的Bad小鼠血小板，随着保存时间延长，凋亡活化指标上升比较缓慢，比WT小鼠血小板发生的凋亡活化的程度低，且有统计学意义。而4℃及6℃保存的WT小鼠血小板，随着保存时间延长，膜电位去极化及CD62P释放水平变化不大，PS外翻水平直至第7天开始明显增加，活化的IIBIIIA水平随着时间延长逐渐上升。同样温度下保存的Bad小鼠血小板，膜电位去极化、PS外翻、CD62P释放及活化的IIBIIIA水平与WT基本一致。
综上所述，本部分通过研究血小板保存发生凋亡的机制得出以下结论：低温（4℃及6℃）保存血小板所致凋亡是由于PKC通路活化，进一步激活PDE3A，水解cAMP增多所致PKA活性下降，但6℃保存的血小板PKC通路活化程度较低故而保存的血小板状态更好。22℃保存血小板所致凋亡一方面是由于酶活性的改变，另一方面是由于保存时间延长蛋白发生降解所致。
Claims (1)
1.一种血小板的保存方法，其特征在于，所述保存方法将制得的富含血小板血浆置于6℃温度下进行保存1至7天，其中，所述富含血小板血浆的制备方法如下：无菌抽取25-50mL健康人静脉血，将全血与无菌1/9体积比的人3.8％柠檬酸钠抗凝剂混合，缓慢颠倒混匀；抗凝后的全血室温1100rpm下离心11分钟，离心后下层为红细胞，中层为白细胞，上层即为富含血小板的血浆，将上层富含血小板的血浆吸出移至无菌的15ml的离心管中，备用。
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Citations (7)
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|---|---|---|---|---|
| CN1220696A (zh) * | 1995-01-05 | 1999-06-23 | 加利福尼亚大学董事会 | 血小板抗低温激活的稳定作用 |
| CN104114688A (zh) * | 2011-09-26 | 2014-10-22 | 先进保存技术股份有限公司 | 活组织保存的方法 |
| CN105050390A (zh) * | 2012-12-19 | 2015-11-11 | 先进保存技术股份有限公司 | 血小板浓缩物保存方法 |
| CN104673747A (zh) * | 2015-02-27 | 2015-06-03 | 中国人民解放军第三军医大学第一附属医院 | 一种血小板裂解液的制备方法及其应用 |
| CN107592789A (zh) * | 2015-04-23 | 2018-01-16 | 骨治疗公司 | 治疗性细胞的体外保存 |
| CN108366551A (zh) * | 2015-06-09 | 2018-08-03 | 哈佛学院董事会 | 血小板的长期储存和保存 |
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