CN104906052B

CN104906052B - 一种自体来源富血小板血浆冻干粉的制备方法

Info

Publication number: CN104906052B
Application number: CN201410093843.0A
Authority: CN
Inventors: 徐剑炜; 潘龙
Original assignee: Zhongshan Hospital Fudan University
Current assignee: Zhongshan Hospital Fudan University
Priority date: 2014-03-14
Filing date: 2014-03-14
Publication date: 2017-09-05
Anticipated expiration: 2034-03-14
Also published as: CN104906052A

Abstract

本发明涉及一种自体来源富血小板血浆冻干粉的制备方法：首先制备高浓度PRP；然后离心PRP获得血小板和血浆，血小板负载海藻糖后以‑0.9~‑1.1℃/min速率降温到‑75~‑85℃，维持12 h以上，液氮浴1 h以上冷冻，同时将血浆直接降温至‑75~‑85°C，保持12 h以上，液氮浴1 h以上；另外取部分PRP激活后冷冻；最后所有样品均升温至‑35~‑38°C，0.01~0.03Torr下维持140~160 min，再以0.9~1.1°C/min速率升温到‑8~‑12°C，0~0.2Torr下维持140~160 min，最后升温到21~23°C，0~0.2Torr下至少维持24 h，获得冻干粉。本发明制备的冻干粉储存条件方便并可长期保存，且使用方法简便。

Description

一种自体来源富血小板血浆冻干粉的制备方法

【技术领域】

本发明涉及富血小板血浆的制备和长期保存技术，具体地说，是一种自体来源富血小板血浆冻干粉的制备方法。

【背景技术】

富血小板血浆（Platelet rich plasma，PRP）含有大量的具有生物活性的血小板，在一定条件下，这些血小板通过激活、聚集、脱颗粒等过程将贮存在其中的多种细胞因子释放到周围环境中，促进细胞增殖、分化及组织重建修复。PRP在口腔颌面外科、骨科及整形外科等临床学科有着广泛的应用。

目前PRP的制备方法并没有统一的标准，不同方法所得血小板含量差别较大。另外，临床上PRP的长期保存仍然存在问题。通常人血小板制品保存在血库22°C环境中的时间只有3-7天，冷藏（4°C）或者是低温冻存（-80°C或-196°C）虽然在一定程度上减少了血小板制品的污染机会，但是会导致血小板冷损伤，缩短血小板的寿命。也有用醛类对血小板固定后再冻干的保存技术，但是这样会损害到血小板功能。

离心分离常用于各种血液制品的制备。血液中各种血细胞的比重不同，在一定离心力作用下，具有不同的沉降系数。通过第一步低速离心，以沉降血液中比重大的的红细胞和白细胞，从而将比重小的血小板进行分离。第二步高速离心可沉降血小板，达到富集浓缩的目的。其中离心重力及时间均会影响所得血液制品中的物质含量。

冻干技术在医药工业、食品工业、科研和其他部门均得到广泛的应用。冷冻干燥就是把含有大量水分的物质预先进行降温冻结成固体，然后在真空的条件下使水蒸汽直接升华出来，而物质本身剩留在冻结时的冰架中，因此它干燥后体积不变。但是冷冻和干燥的过程操作不当则可能会损伤生物制品的活性。

综上所述，亟需一种能减少血小板损伤和尽量保存其生物活性，适用于临床应用的血小板制品的制备方法及长期保存方法。

【发明内容】

本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种富血小板血浆冻干粉的制备方法。

本发明的再一的目的是，提供一种富血小板血浆的保存方法。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案是：

一种富血小板血浆冻干粉的制备方法，它包括以下步骤：

a）高浓度PRP的制备；

b）PRP血小板部分冻干粉的制备：将步骤a）制备的PRP离心分离获得血小板，洗涤后用含有33~37 mM海藻糖的溶液36~37°C温育3.5~4.5 h，然后用冻干缓冲液重悬后放入超低温冰箱，以-0.9~-1.1℃/min速率降温到-75~-85℃，维持12 h以上，液氮浴1 h以上；再放入冻干机，升温至-35~-38°C，真空度0.01~0.03 Torr并维持140~160 min后，以0.9~1.1°C/min速率上升到-8~-12°C，真空度0~0.2 Torr维持140~160 min，最后升温到21~23°C，真空度0~0.2 Torr至少维持24 h；

c）PRP血浆部分冻干粉及氯化钙激活PRP冻干粉的制备：将步骤a）制备的PRP离心分离获得血浆；用氯化钙溶液处理步骤a）制备的PRP，离心后保留上清；将所述血浆或所述上清放入超低温冰箱，直接降温至-75~-85°C，保持12 h以上，然后液氮浴1 h以上；再将所述血浆或所述上清放入冻干机，升温至-35~-38°C，真空度0.01~0.03 Torr并维持140~160min，然后温度以0.9~1.1°C/ min速率上升到-8~-12°C，真空度0~0.2 Torr维持140~160min，最后升温到21~23 °C，真空度0~0.2 Torr至少维持24 h。

优选地，所述的海藻糖浓度为35 mM。

优选地，所述的制备方法包括以下步骤：

a）高浓度PRP的制备；

b）PRP血小板部分冻干粉的制备：将步骤a）制备的PRP离心分离获得血小板，洗涤后用含有35 mM海藻糖的buffer A溶液37°C温育4 h，再用冻干缓冲液重悬后放入超低温冰箱，以-1℃/min速率降温到-80℃，维持12 h，液氮浴1 h以上；再放入冻干机，升温至-35°C，真空度0.02 Torr并维持150 min，然后温度以1°C/ min速率上升到-10°C，真空度0.1 Torr维持150 min，最后升温到22°C，真空度0.1 Torr至少维持24 h；

c）PRP血浆部分冻干粉及氯化钙激活PRP冻干粉的制备：将步骤a）制备的PRP离心分离获得血浆；用氯化钙溶液处理步骤a）制备的PRP，离心后保留上清；将所述血浆或所述上清放入超低温冰箱，直接降温至-80°C，保持12 h，液氮浴1 h以上；再将所述血浆或所述上清放入冻干机，升温至-35°C，真空度0.02 Torr并维持150 min，然后温度以1°C/ min速率上升到-10°C，真空度0.1 Torr，维持150 min，最后升温到22°C，真空度0.1 Torr，至少维持24 h。

作为本发明的一种实施方式，所述的步骤a）具体是：将外周血在200×g下离心10min，保留上层血浆，再1390×g离心15 min，保留沉淀和上层部分血浆。

作为本发明的一种实施方式，所述的“用氯化钙溶液处理步骤a）制备的PRP”具体是将质量分数10%的氯化钙溶液与步骤a）制备的PRP混合后在21~23 °C静置1 h以上。

为实现上述第二个目的，本发明采取的技术方案是：

一种富血小板血浆的保存方法，它是按照如上任一所述的方法制备得到富血小板血浆冻干粉，然后真空密封保存。

本发明优点在于：

本发明可制备获得高浓度富血小板血浆，再采用海藻糖作为血小板的负载保护剂，对细胞膜在降温和干燥过程中进行保护，防止血小板聚集和激活，并通过冷冻、真空干燥等步骤进一步制备获得PRP血小板部分冻干粉、PRP血浆部分冻干粉及氯化钙激活PRP冻干粉，该制备方法经济有效、容易开展，冻干粉制品储存条件方便（室温下即可，无需冷藏）并可长期保存，6个月仍然具备高浓度的血小板及细胞因子，同时该冻干粉制品的使用方法简单，直接复水即可，无需再次激活。本发明的技术使得病人抽一次血就可以多次使用自体来源的PRP及细胞因子冻干粉，有利于提高治疗效果，安全性更高，在临床上具有广阔的应用前景。

【具体实施方式】

下面对本发明提供的具体实施方式作详细说明。

本发明的基本技术路线是：

1、高浓度PRP的制备及激活

将抗凝全血通过两步离心法分离制备高浓度PRP。将部分PRP用氯化钙溶液进行激活，激活后1 h至24 h内分离上清和沉淀，离心后弃去沉淀，保留上清并进行冻干；未激活的PRP直接离心法分离血小板及血浆，分别冻干。

2、冷冻干燥

冻干过程主要分为冷冻过程和低温真空干燥过程，以下分别介绍：

①PRP血小板部分的冷冻干燥

将血小板沉淀用缓冲液A（buffer A）和冻干缓冲液（lyophilization buffer）进行预处理。然后进行程序冷冻。冷冻结束后，样品放入冻干机按照一定预设程序进行低温真空干燥。

②PRP血浆部分及PRP激活后上清的冷冻干燥

将PRP血浆部分或PRP激活后上清进行程序冷冻。冷冻结束后，样品放入冻干机按照一定预设程序进行低温真空干燥。

③所有冻干后的样品于室温下真空保存。

实施例1 PRP冻干粉的制备（一）

1、高浓度PRP的制备及激活

①抽取一定量的外周抗凝静脉血至无菌离心管，记录初始体积（V₀ mL）。采用两步离心法制备PRP。第一次采用离心力200×g，离心10 min。小心吸取上层血浆至另一离心管，弃去下层红细胞。第二次离心采用离心力1390×g，离心15 min。按照保留初始体积1/10计算需要保存PRP体积（PRP体积为1/10 V₀ mL）。弃去上层多余血浆，将下层血小板沉淀吹匀，获得高浓度PRP。

②取全血和步骤①制备的少量PRP用全自动血液体液分析仪（HST-N system,Sysmex, TOA Medical Electronics Co., Kobe, Japan）进行血小板计数。当PRP血小板数目是全血4倍或以上，并且计数高于1,000,000/μL时可用于后续激活及冻干。

③取部分PRP用于激活，具体方法是每1.2 mL PRP加入50 μL质量分数10%的氯化钙（CaCl₂）溶液，室温（22°C）静置1 h以上。激活后的PRP会形成纤维蛋白凝胶（fibringlue/ gel），可先用无菌针头破坏胶体，然后进行高速离心，离心力21,000×g，离心5 min。弃去沉淀，保留上清，记录上层清液体积（V₂ mL）。

需要说明的是，以上所有技术操作均在室温（22°C）和无菌环境中进行。

2、冷冻干燥

2.1 PRP血小板部分的冷冻干燥

①将新鲜分离制备的PRP通过离心力12,000×g，离心1秒，分离血小板及上层血浆。记录血浆部分体积（V₁ mL）。然后将下层血小板沉淀用buffer A （100 mM NaCl, 10 mMKCl, 10 mM EGTA, 10 mM imidazole, 10 mM prostaglandin-E1, pH 6.8）溶液重悬和洗涤2次。每次离心方法同前。第二次重悬后进行血小板计数，用含有35 mM海藻糖（trehalose）的buffer A溶液调整血小板浓度在(1-2)×10⁹ /mL，37°C温育4 h。温育结束后，12,000×g离心1 sec，吸去上层血浆，保存该部分血浆于无菌冻存管中用于后续冻干。用冻干缓冲液（lyophilization buffer，包含9.5 mM HEPES, 142.5 mM NaCl, 4.8 mMKCl, 1 mM MgCl₂, 30 mM trehalose, 1%人血清白蛋白）重悬血小板沉淀，获得含有血小板的冻存液。

②用与相应实验室冻干机（VirTis® AdVantage^TM, SP Industries, NY）配套的无菌冻存管分装含有血小板的冻存液，每支冻存管样品体积不超过1/2。然后将冻存管放入程序降温盒（Nalgene®）进行程序降温，程序降温盒放入-80°C冰箱内，降温程序为：从室温开始，降温速率-1℃/min，温度降低到-80℃，维持时间12 h。然后迅速取出冻存管，放入液氮（-196°C）1 h以上。

③在完成冷冻过程后，将冻干机冷凝器和隔板的温度调整到-45°C，同时设定温控程序。从液氮中取出样本，迅速放入冻干机隔板上，进行真空冻干过程。当样本液氮浴去除后，温度上升到-35°C，真空度0.02Torr，在这一条件下维持150 min。然后温度以1°C/ min速率上升到-10°C，真空度0.1Torr，维持150 min。最后温度上升到室温（22°C），速率不要求，真空度0.1Torr，维持24 h。然后用氮气压瓶塞，真空密封样本。

2.2 PRP血浆部分的冷冻干燥

①将PRP离心后的血浆部分直接程序降温至-80°C，保持12 h。然后放入液氮（-196°C）1 h。

②待冻干机冷凝器及隔板温度降到-45°C后，从液氮中取出样本放入冻干机。当样本液氮浴去除后，温度上升到-35°C，真空度0.02Torr在这一条件下维持150 min。然后温度以1°C/ min速率上升到-10°C，真空度0.1Torr，维持150 min。最后温度上升到室温（22°C），速率不要求，真空度0.1Torr，至少维持24 h。然后用氮气压瓶塞，真空密封样本。

2.3 激活后PRP上清部分的冷冻干燥

①将激活后PRP上清部分直接程序降温至-80°C，保持12 h。然后放入液氮（-196°C）1 h以上。

②待冻干机冷凝器及隔板温度降到-45°C后，从液氮中取出样本放入冻干机。当样本液氮浴去除后，温度上升到-35°C，真空度0.02 Torr, 在这一条件下维持150 min。然后温度以1°C/ min速率上升到-10°C，真空度0.1 Torr，维持150 min。最后温度上升到室温（22°C），速率不要求，真空度0.1 Torr，至少维持24 h。然后用氮气压瓶塞，真空密封样本。

实施例2 PRP冻干粉的制备（二）

1、高浓度PRP的制备及激活

具体操作同实施例1。

2、冷冻干燥

2.1 PRP血小板部分的冷冻干燥

①将新鲜分离制备的PRP通过离心力12,000×g，离心1秒，分离血小板及上层血浆。记录血浆部分体积（V₁ mL）。然后将下层血小板沉淀用buffer A （100 mM NaCl, 10 mMKCl, 10 mM EGTA, 10 mM imidazole, 10 mM prostaglandin-E1, pH 6.8）溶液重悬和洗涤2次。每次离心方法同前。第二次重悬后进行血小板计数，用含有33 mM海藻糖（trehalose）的buffer A溶液调整血小板浓度在1×10⁹ /mL，36°C温育4.5h。温育结束后，12,000×g离心1 sec，用冻干缓冲液（lyophilization buffer，包含9.5 mM HEPES, 142.5mM NaCl, 4.8 mM KCl, 1 mM MgCl₂, 30 mM trehalose, 1%人血清白蛋白）重悬，获得含有血小板的冻存液。

②用与相应实验室冻干机（VirTis® AdVantage^TM, SP Industries, NY）配套的无菌冻存管分装含有血小板的冻存液，每支冻存管样品体积不超过1/2。然后将冻存管放入程序降温盒（Nalgene®）进行程序降温，程序降温盒放入-80°C冰箱内，降温程序为：降温速率-0.9℃/min，温度降低到-75℃，维持时间15 h 。然后迅速取出冻存管，放入液氮（-196°C）8 h。

③在完成冷冻过程后，将冻干机冷凝器和隔板的温度调整到-45°C，同时设定温控程序。从液氮中取出样本，迅速放入冻干机隔板上，进行真空冻干过程。当样本液氮浴去除后，温度上升到-35℃，真空度0.03 Torr在这一条件维持160 min。然后温度以0.9°C/ min速率上升到-12°C，真空度0 Torr维持140 min。最后温度上升到23°C，真空度0 Torr速率不要求，维持48 h。然后用氮气压瓶塞，真空密封样本。

2.2 PRP血浆部分的冷冻干燥

①将PRP离心后的血浆部分直接程序降温至-75°C，保持15 h。然后放入液氮（-196°C）8 h。

②待冻干机冷凝器及隔板温度降到-45°C后，从液氮中取出样本放入冻干机。当样本液氮浴去除后，温度上升到-35°C，真空度0.03 Torr，在这一条件维持160 min。然后温度以0.9°C/ min速率上升到-12°C，真空度0 Torr，维持140 min。最后温度上升到23°C，真空度0 Torr，速率不要求，维持48 h。然后用氮气压瓶塞，真空密封样本。

2.3 激活后PRP上清部分的冷冻干燥

①将激活后PRP上清部分直接程序降温至-75°C，保持15h。然后放入液氮（-196°C）8 h。

实施例3 PRP冻干粉的制备（三）

1、高浓度PRP的制备及激活

具体操作同实施例1。

2、冷冻干燥

2.1 PRP血小板部分的冷冻干燥

①将新鲜分离制备的PRP通过离心力12,000×g，离心1秒，分离血小板及上层血浆。记录血浆部分体积（V₁ mL）。然后将下层血小板沉淀用buffer A （100 mM NaCl, 10 mMKCl, 10 mM EGTA, 10 mM imidazole, 10 mM prostaglandin-E1, pH 6.8）溶液重悬和洗涤2次。每次离心方法同前。第二次重悬后进行血小板计数，用含有37 mM海藻糖（trehalose）的buffer A溶液调整血小板浓度在2×10⁹ /mL，38°C温育3.5h。温育结束后，12,000×g离心1 sec，用冻干缓冲液（lyophilization buffer，包含9.5 mM HEPES, 142.5mM NaCl, 4.8 mM KCl, 1 mM MgCl₂, 30 mM trehalose, 1%人血清白蛋白）重悬，获得含有血小板的冻存液。

②用与相应实验室冻干机（VirTis® AdVantage^TM, SP Industries, NY）配套的无菌冻存管分装含有血小板的冻存液，每支冻存管样品体积不超过1/2。然后将冻存管放入程序降温盒（Nalgene®）进行程序降温，程序降温盒放入-80°C冰箱内，降温程序为：降温速率-1.1℃/min，温度降低到-85℃，时间14 h。然后迅速取出冻存管，放入液氮（-196°C）10h。

③在完成冷冻过程后，将冻干机冷凝器和隔板的温度调整到-45°C，同时设定温控程序。从液氮中取出样本，迅速放入冻干机隔板上，进行真空冻干过程。当样本液氮浴去除后，温度上升到-38°C，真空度0.01 Torr，在这一温度维持140 min。然后温度以1.1°C/ min速率上升到-8°C，真空度0.2 Torr，维持160 min。最后温度上升到21°C，速率不要求，真空度0.2 Torr，维持80 h。然后用氮气压瓶塞，真空密封样本。

2.2 PRP血浆部分的冷冻干燥

①将PRP离心后的血浆部分直接程序降温至-85°C，保持14 h。然后放入液氮（-196°C）10 h。

②待冻干机冷凝器及隔板温度降到-45°C后，从液氮中取出样本放入冻干机。当样本液氮浴去除后，温度上升到-38°C，真空度0.01 Torr，在这一温度维持140 min。然后温度以1.1°C/ min速率上升到-8°C，真空度0.2 Torr，维持160 min。最后温度上升到21°C，速率不要求，真空度0.2 Torr，维持80 h。然后用氮气压瓶塞，真空密封样本。

2.3 激活后PRP上清部分的冷冻干燥

①将激活后PRP上清部分直接程序降温-85°C，保持14 h。然后放入液氮（-196°C）10 h。

对比例1

1、高浓度PRP的制备及激活

具体操作同实施例2。

2、冷冻干燥

2.1 PRP血小板部分的冷冻干燥

具体操作同实施例2，不同之处仅在于所用的buffer A溶液中海藻糖浓度为32mM。

2.2 PRP血浆部分的冷冻干燥

具体操作同实施例2。

对比例2

1、高浓度PRP的制备及激活

具体操作同实施例3。

2、冷冻干燥

2.1 PRP血小板部分的冷冻干燥

具体操作同实施例3，不同之处仅在于步骤②的降温速率为-1.15℃/min。

2.2 PRP血浆部分的冷冻干燥

具体操作同实施例3，不同之处仅在于步骤②中温度上升到21°C后，控制真空度为0.3 Torr，维持80 h。

2.3激活后PRP上清部分的冷冻干燥

具体操作同实施例3，不同之处仅在于步骤②中是以1.15°C/ min速率上升到-8°C。

实施例4 稳定性实验

1 方法与材料

①将实施例1-3及对比例1-2的所有冻干样本室温真空避光保存，分别设保存1个月和6个月两个处理。

②保存到期后将样本进行复水。Ca-FD PRP（激活后PRP上清部分）直接加入同体积（V₂ mL）无菌生理盐水，并取少量样本检测其中的细胞因子含量。对于FD PRP（冻干富血小板血浆），先用同体积生理盐水复水血浆冻干粉，然后将复水后血浆和血小板冻干粉混合均匀，取少量复水后FD PRP样本，检测血小板含量，离心去除血小板后检测其中细胞因子含量。

③通过酶联免疫吸附试验（ELISA）检测全血及PRP（未激活）、Ca-FD PRP、复水后FDPRP中的转化生长因子（Transforming growth factor-β1，TGF-β1）、血小板来源生长因子-AB（Platelet-derived growth factor-AB，PDGF-AB）和血管内皮细胞生长因子（Vascularendothelial growth factor，VEGF) 的含量。

④数据统计：统计结果采用均数±标准差，在统计方法上，同种细胞因子在不同处理组的比较采用非配对样本Students’t-test。数据处理及分析采用SPSS 19.0软件包进行相关分析。p<0.05认为有统计学显著性差异。

2 结果

2.1 血小板计数

各处理血小板计数结果见表1。表中数据表明，在室温保存1个月后，实施例1-3的FD PRP复水后仍然保持较高血小板含量，尤其实施例1在保存6个月后血小板含量仍然高达（1059±167）×10⁶/mL。新鲜分离PRP血小板计数比较全血血小板计数具有显著性差异：p<0.05；各实施例及对比例复水后FD PRP血小板计数比较全血血小板计数均具有显著性差异：p<0.05；实施例1-3复水后FD PRP血小板计数比较对比例1复水后FD PRP血小板计数具有显著性差异：p<0.05；实施例1-3复水后FD PRP血小板计数比较对比例2复水后FD PRP血小板计数具有显著性差异：p<0.05。

表1 血小板计数

注：PRP表示富血小板血浆；FD PRP表示冻干富血小板血浆；Ca-FD PRP表示氯化钙激活1小时后进行冻干的富血小板血浆。血小板计数结果用均数±标准差。

2.2 细胞因子含量测定

细胞因子含量测定结果见表2和表3。表中数据表明，在TGF-β1、PDGF-AB和VEGF含量方面，Ca-FD PRP分别比较FD PRP和新鲜分离PRP均具有显著性差异，p<0.05；而FD PRP和新鲜分离PRP比较p＞0.05，无明显统计学差异。保存1个月后，在TGF-β1、PDGF-AB和VEGF含量方面，实施例1-3复水后FD PRP比较对比例2均具有显著性差异：p<0.05；实施例1-3复水后Ca-FD PRP比较对比例2均具有显著性差异：p<0.05。保存6个月后，在TGF-β1、PDGF-AB和VEGF含量方面，实施例1-3复水后FD PRP比较对比例2均具有显著性差异：p<0.05；实施例1-3复水后Ca-FD PRP比较对比例2均具有显著性差异：p<0.05。实施例1-3的TGF-β1、PDGF-AB和VEGF含量在保存1个月及6个月后比较均无显著性差异：p＞0.05。

表2 细胞因子含量测定结果（1个月）

注：PRP表示富血小板血浆；FD PRP表示冻干富血小板血浆；Ca-FD PRP表示氯化钙激活1小时后进行冻干的富血小板血浆。细胞因子含量以均数±标准差表示。

表3 细胞因子含量测定结果（6个月）

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。

Claims

1.一种富血小板血浆冻干粉的制备方法，其特征在于，它包括以下步骤：

a)高浓度PRP的制备：将外周血在200×g下离心10min，保留上层血浆，再1390×g离心15min，保留沉淀和上层部分血浆；

b)PRP血小板部分冻干粉的制备：将步骤a)制备的PRP离心分离获得血小板，洗涤后用含有33～37mM海藻糖的溶液36～37℃温育3.5～4.5h，然后用冻干缓冲液重悬后放入超低温冰箱，以-0.9～-1.1℃/min速率降温到-75～-85℃，维持12h以上，液氮浴1h以上；再放入冻干机，升温至-35～-38℃，真空度0.01～0.03Torr并维持140～160min后，以0.9～1.1℃/min速率上升到-8～-12℃，真空度0～0.2Torr维持140～160min，最后升温到21～23℃，真空度0～0.2Torr至少维持24h；

c)PRP血浆部分冻干粉及氯化钙激活PRP冻干粉的制备：将步骤a)制备的PRP离心分离获得血浆；用氯化钙溶液处理步骤a)制备的PRP，离心后保留上清；将所述血浆或所述上清放入超低温冰箱，直接降温至-75～-85℃，保持12h以上，然后液氮浴1h以上；再将所述血浆或所述上清放入冻干机，升温至-35～-38℃，真空度0.01～0.03Torr并维持140～160min，然后温度以0.9～1.1℃/min速率上升到-8～-12℃，真空度0～0.2Torr维持140～160min，最后升温到21～23℃，真空度0～0.2Torr至少维持24h。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的海藻糖浓度为35mM。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，它包括以下步骤：

b)PRP血小板部分冻干粉的制备：将步骤a)制备的PRP离心分离获得血小板，洗涤后用含有35mM海藻糖的bufferA溶液37℃温育4h，再用冻干缓冲液重悬后放入超低温冰箱，以-1℃/min速率降温到-80℃，维持12h，液氮浴1h以上；再放入冻干机，升温至-35℃，真空度0.02Torr并维持150min，然后温度以1℃/min速率上升到-10℃，真空度0.1Torr维持150min，最后升温到22℃，真空度0.1Torr至少维持24h；

c)PRP血浆部分冻干粉及氯化钙激活PRP冻干粉的制备：将步骤a)制备的PRP离心分离获得血浆；用氯化钙溶液处理步骤a)制备的PRP，离心后保留上清；将所述血浆或所述上清放入超低温冰箱，直接降温至-80℃，保持12h，液氮浴1h以上；再将所述血浆或所述上清放入冻干机，升温至-35℃，真空度0.02Torr并维持150min，然后温度以1℃/min速率上升到-10℃，真空度0.1Torr，维持150min，最后升温到22℃，真空度0.1Torr，至少维持24h。

4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的“用氯化钙溶液处理步骤a)制备的PRP”具体是将质量分数10％的氯化钙溶液与步骤a)制备的PRP混合后在21～23℃静置1h以上。

5.一种富血小板血浆的保存方法，其特征在于，它是按照权利要求1-4任一所述的方法制备得到富血小板血浆冻干粉，然后真空密封保存。