KR20080086433A

KR20080086433A - 시험관 내와 생체 내에서의 세포를 재생시키는 방법들

Info

Publication number: KR20080086433A
Application number: KR1020087011489A
Authority: KR
Inventors: 지판 후
Original assignee: 지판 후
Priority date: 2005-10-14
Filing date: 2006-10-16
Publication date: 2008-09-25
Also published as: WO2007047766A3; CN102329788A; EP1934361A4; WO2007047766A2; EP1934361A2; AU2006304575A1; JP2009526517A; CN102329778A; CN102329779B; US20070087437A1; CN102329779A; BRPI0618411A2; CN102329788B

Abstract

본 발명은 세포들, 조직 및 신체 전체를 재생시키는 방법을 제공한다. 세포들을 재생시키는 키트들 뿐만 아니라 재생 완충액들과 작용제들도 제공된다. 체세포들을 탈분화시키고 세포들을 다른 세포 유형들로 분화시키는 방법들도 제공된다.

배아 줄기 세포(ESC), 다능성(pluripotent) 세포, 중복성(multipotent) 세포, 자가(autologous) 이식, 신생세포(novacell)

Description

시험관 내와 생체 내에서의 세포를 재생시키는 방법들{METHODS FOR REJUVENATING CELLS IN VITRO AND IN VIVO}

본 발명은 세포를 재생시키는 방법들 및 이러한 재생된 세포들의 인간 임상적 사용과 수의학적 사용에 관한 것으로서, 더 구체적으로는 다능성(pluripotent) 또는 중복성(multipotent) 배아 줄기 또는 줄기 유사 세포들이 되는 체세포들을 재생시키는 방법에 관한 것이다. 본 재생 방법은 포유류의 기관과 신체들에도 적용될 수 있다.

노화는 돌이킬 수 없는 생명 과정이다. 노화는 해롭고, 점진적이며 보편적으로 일어나는 비가역적인 변화들의 증세이다. 세포 노화는 세포 기능성의 감소, 스트레스에 대응하는 능력의 감퇴, 항상성 불균형의 증가 및 질병 위험의 증가에 의하여 특징된다. 따라서, 노화 그 자체는 "질병 과정"으로 여겨질 수 있으며, 거대분자들, 세포들, 조직들 및 기관들에 손상이 축적되는 것이다.

세포 노화는 유지, 수복 및 방어 반응을 담당하는 시스템들에 영향을 미치는 유전자 발현에서의 변화에 의존하는, 피검자의 일생에 거쳐 작동하는 생물학적 시계로 조절된다. 노화는 세포가 분화하는 동안에 DNA 복제 과정에서의 텔로미어들의 단축과 관련되어 있다. 노화는 자유 라디칼들, 글리케이션(glycation), 방사선, 교 차(cross-linking) 등에 의하여 거대분자들(DNA, RNA, 단백질들, 탄수화물류 및 인지질류)로부터 조직들에 이르는 누적적인 돌연변이와 손상에 의하여 촉진된다.

노화 과정에서 수많은 유전자 경로들이 확인되었다. 이러한 경로들 중 하나는 NAD+ 의존성 히스톤 디아세틸라아제인 Sir2 유전자를 포함한다. 여분의(extra copies) Sir2는 벌레류와 파리류의 수명을 연장할 수 있다. 인간 아날로그(analogue) SIRT1 단백질은 p53, Ku70, 특이적 히스톤 잔기들 및 전사 인자들의 포크헤드 군(forkhead family)를 탈아세틸화하는 것으로 증명되었다. 미토콘드리아 자유 라디칼들의 영향에 대항하여 보호하는 단백질인 초과산화물 불균등화효소는 과다발현되는 경우에 휴지기에서의 효모 수명을 연장할 수 있다. 그러나, 이러한 메커니즘이 인간과 모델 생물체의 생물학 및 병태생리학간의 명백한 차이점으로 인하여 인간에게도 존재하는 지의 여부는 알려져 있지 않다.

삶의 질은 노화로 감소된다. 노화 때문에, 힘줄과 인대의 콜라겐과 엘라스틴은 특히, 글리케이션(설탕에 의한 단백질들의 교차)으로 인하여 그 신축성이 감소하고 분절화가 더 증가한다. 관절 연골은 닳아지고 관절 사이의 활액(synovial fluid)은 "묽어진다". 순환 기능의 감소는 이러한 과정에 기여한다. 콜라겐과 엘라스틴도 피부 내에서 교차하여 그 탄력성에 손상이 생긴다. 손톱의 케라틴 단백질도 "방수" 역할을 하는 피부 외층(표피)의 구성요소이다. 외피는 나이가 들어감에 따라 얇아져서 주름이 지게 된다. 땀샘에 의한 분비 감소로 인하여 열사병에 대한 취약성이 증가하게 된다. 모낭과 관련된 멜라닌세포들(피부와 모발 착색 물질 멜라닌을 생성하는 세포들)이 기능을 중단하는 경우 모발은 백발이 된다. 멜라닌세포 기 능이 부분적으로 감소하면 모발은 회색을 띄게 된다. 그러나 코카서스 계 사람들의 90 %는 손등에 갈색을 띈 반점("간반") 형태로 멜라닌의 양이 증가하는 것을 보인다. 허파에 콜라겐과 엘라스틴 단백질의 유연성이 상실되면 탄성 반도(elastic recoil)가 감소하게 된다. 이로 인한 공기 유통이 더 어려워져, 공기 교환과 호흡을 감소시켜 작업 수행 능력을 감소시킨다.

동물 세포는 생식 세포(정자 또는 난자), 줄기 세포 및 체세포(분화된 기능성 체세포들)로 분류될 수 있다. 조직 배양에서 배아 섬유아세포들은 50 회 분할의 헤이플릭 한계(Hayflick Limit)에 이르기 전에 분할을 중단한다(Hayflick L, Moorhead PS Exp Cell Res 1961, 25: 585-621). 생식 세포, 줄기 세포 및 "불멸화(immortalized) 암 세포는 소실된 텔로미어들을 대체하는 텔로머라아제라 불리는 효소를 포함하여 이들이 헤이플릭 한계에 이르는 것을 방지한다. 인간 생식 세포에서, 암 세포의 약 85 %, 인간 텔로머라아제 역전사 효소(hTERT)와 RNA 주형은 새로운 텔로머라아제들을 발생시키기에 충분하다. 텔로미어 기능을 유지하는 데 필요한 단백질에서의 결손은 염색체 불안정 및 암으로도 이어질 수 있다. 텔로머라아제 발현은 세포들을 산화적 스트레스에 의하여 유도되는 세포자살에 더 높은 내성을 지니게 한다.

텔로머라아제의 역 전사효소 소단위체(subunit)로 형질감염된 인간 체세포들은 텔로머라아제를 발현한다. 그러한 세포들은 그것들의 헤이플릭 한계를 넘어서 20 개체수 배가(population doubling)을 보였으며, 연속하여 정상적이고, 건강하면서도 젊은 세포 외관과 활성을 보였다. 그러한 결과들은 체세포 내에서 천연 텔로 머라아제의 발현을 유도하거나 자연적 형태보다 더 우수한 인공(engineered) 텔로머라아제로 구성된 세포들에 유전자 물질을 첨가하는 유전자 요법의 형태에 의한 몇몇 조직들에서의 젊음의 유지가 가능할 수 있다는 현실적 희망을 창출한다.

생활양식의 변화와 질병 예방를 통하여 노화 과정을 늦춰 평균 수명을 연장하는 방법들(예컨대, 열량 섭취를 줄이면서도 적절한 영양분을 유지, 저-지방/고-섬유질 식사 섭취, 담배와 알코올 회피, 운동 및 항산화 보조제 섭취)에 관한 광범위한 연구가 실시되어왔다. 그러나, 극단적인 생활양식의 변화 없이, 노화를 늦추는 즉각적인 이익을 얻는 것은 어렵다.

용어 정의에 의하면, 줄기 세포는 자가-재생하며, 신경 세포에서 근육 세포에 이르는 다양한 기능성의 성숙 세포로 분화할 수 있는 미분화된 세포이다. 미분화된 세포들이 분할하여 특이적인 체세포와 줄기 세포로 분화하는 딸 세포를 형성하게 된다. 배아 줄기 세포들(이하 "ESC들")은 배아로부터 유래하며 본래 다능성이다. 다능성 세포들은 태아 발달에 필요한 모두는 아니지만 대부분의 조직들을 발생시킬 수 있다. 다능성 세포들은 특정한 기능(예컨대, 다능성 혈액 줄기 세포들은 적혈구, 백혈구 및 혈소판을 생성한다)을 지닌 세포들을 주로 발생시키는 중복성 세포들로 분화한다. ESC들은 이용된 분화 상태들에 따라 특정한 세포, 조직 또는 심지어 기관으로 분화될 수 있다. 인간 ESC들은 파킨슨씨 병과 같은 질병 치료를 위한 세포 대체 요법들과 이식(implantation), 조직 이식(tissue grafting) 및 약물과 독소에 대한 스크리닝에서 유용하다. ESC들은 이식 및 인슐린, 항체들 및 인자 VIII와 같은 생물약학적 제품류의 제조를 위한 세포 배양 발달에서 유용할 수도 있다.

ESC들은 수많은 인간 질병들의 치료에 전도가 유망하다. 그러나, ESC들에 대한 우려가 몇 가지 존재한다. 첫째, 태아로부터 ESC들을 얻는 것에 대한 윤리적이고 정치적인 문제가 있다. 둘째, 미국 국립 보건원(NIH)이 자금을 제공하는 연구 프로젝트들은 22 개 ESC 계통들(lines)의 제한된 세트에 국한되어 기초 연구에 충분하다고 할 수 없다. 셋째, 우리 신체 내에서의 면역 시스템은 이식된 ESC들에 대항하여 보호한다. 따라서, 이식된 ESC들이나 제대 혈액 줄기 세포의 거부 반응을 유발하며, 이식편대숙주 질병(graft-versus-host disease)에 이를 수 있다.

핵 이입을 이용하는 데 더하여, 세포 재프로그래밍에 의한 체세포들의 다능성 세포들로의 형질 변환을 시도해왔다. Hansis 등(Curr Biol 2004, 14:1475-1480)은 인간 림프구들과 인간 293T 신장 세포들을 포함한, 체세포들을 제노푸스(Xenopus) 난자 추출물과 재프로그래밍하는 방법을 기술하였다. 이들은 시험관 내 재프로그래밍에 대하여 BRG1이 필요하다는 것을 발견하였다. 그러나, 상기 세포들이 다능성 특성을 획득하였는지의 여부는 분명하지 않다. Tada 등(Curr Biol 2001, 11:1553-1558)은 시험관 내 세포 잡종형성반응(hybridization)에 의하여 체세포들을 다능성 세포들로의 형질 변환하는 프로토콜을 기술하였다. 이들은 말단 분화된 흉선 세포들을 배아 줄기 세포들(ESC들)로서 융합하였다. 이러한 ESC-흉선 세포 잡종 세포들은 원 ESC들의 다능성을 가졌다. 그러나, 이러한 잡종 세포들은 불안정한 게놈들을 지닌 사배체세포들이며 임상 치료에 직접 이용될 수는 없다. Do와 그 공동 연구자들(Stem Cells 2004, 22:941-949)은 시험관 내 세포 잡종형성반 응에 의하여 체세포들을 다능성 세포들로 형질 변환하는 유사한 프로토콜을 기재하였다. 이들은 ESC들을 신경구 세포들과 융합하였다. 이렇게 융합된 세포들은 ESC들 내에서의 다능성에 필수적인 유전자인 활성화된 Oct4를 가졌다. 이들은 ESC들의 재프로그래밍 능력이 ESC 핵으로부터 유래하였다는 것을 보였다. 유사하게도, 이러한 잡종 세포들은 사배체세포들이었으며 세포 대체 요법에는 이용할 수 없다. Collas와 그 공동 연구자들(Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 2003, 358:1389-1395)은 세포 요법을 위해 세포들을 분화전환시키는(transdifferentiate) 일련의 논문들을 발표하였다. 그러나, 기술적인 난관들로 인하여 이들은 아직까지 체세포들을 다능성 세포들로 분화전환에 성공했다고 보고하지 못했다.

성장기에 노화가 중단될 수 있을 것 같지 않는 반면에, 손상된 기관, 조직, 세포 및 심지어 분자들까지도 대체하거나 복구하는 것은 좀 더 확고한 전략일 듯하다. 이러한 전략들로 세포들을 재생시키고 노화된 생물체들에 기능을 회복시킬 수 있다. 따라서 종래 기술의 몇 가지 문제점들을 극복하거나 적어도 완화시키며, 시험관 내와 생체 내에서 세포를 효율적으로 재생시키는 좀 더 효과적이며 실질적인 방법을 제공하는 것이 본 발명의 목적이며, 하기의 개시물은 상술한 업계의 요구를 충족시키고 다른 장점들도 제공하는 실질적인 시스템을 제공한다.

세포들, 조직들 및 신체 전체를 재생시키는 기술적으로 명확한 방법들을 제공하는 것이 본 발명의 목적이다.

일 실시예에서, a. 노화된 체세포들을 포함하는 표본을 제공하는 단계; b. 재생 추출물, 알부민, ATP, 인산크레아틴, 크레아틴 키나아제, RNase 억제제 및 뉴클레오티드 인산염류를 포함하는 재생 용액을 제공하는 단계; c. 상기 노화된 세포들을 상기 재생 용액과 결합시켜 상기 재생 용액의 성분들이 상기 세포들을 침투하는 데 충분한 시간 동안 배양하는 단계; 및 d. 염화 칼슘 및 선택적으로는 항체들이 있는 KO-DMEM과 같은 적절한 세포 배지의 용액을 첨가하는 단계를 포함하는 노화된 세포를 재생시키는 방법이 제공된다. 이 방법에서, 상기 재생 추출물은 난자, 수정란, 배반포, 배아, 제대혈 줄기 세포, 줄기 세포, 원시 생식 세포(primordial germ cell), 배아 줄기 세포 또는 태아로부터 선택된 초기 발달기의 세포들로부터 추출될 수 있다. 상기 태아 세포들은 태아 간세포들일 수 있다. 선택적으로, 상기 재생 추출물은 세포들 또는 핵들을 포함하는 세포들의 부분들로부터 추출된다. 선택적으로, 상기 재생 추출물은 세포 주기의 임의의 기에 있는 세포들이나 핵들로부터 또는 세포 주기의 다양한 기들에 있는 복수의 세포들이나 핵들로부터 구해질 수 있다.

다른 실시예에서, 노화된 체세포들을 포함하는 표본을 제공하는 단계; 재생 추출물, 알부민, ATP, 인산크레아틴, 크레아틴, RNase 억제제 및 뉴클레오티드 인산염류를 포함하는 재생 용액을 제공하는 단계; 상기 노화된 세포들을 상기 재생 용액과 결합시켜 상기 재생 용액의 성분들이 상기 세포들을 침투하여 재생된 세포들을 생성하는 데 충분한 시간 동안 배양하는 단계; 상기 재생된 세포들에 세포 배지, 염화 칼슘 및 선택적으로는 항체들의 용액을 첨가하여 세포 개체수를 늘리는 단계; 플레이트의 덮개 상이나 코팅되지 않은 페트리 접시 상에 역으로(inverted) 달라붙은 소적 내에서 상기 개체수가 늘어난 세포들을 세포 덩어리 형성을 촉진하도록 충분한 시간 동안 성장시키는 단계; 성장 인자들로 보충된 적절한 배지의 희석 아가로스 젤 상이나 코팅된 플레이트 및 디스크들 상이나 마트리젤(Matrigel) 상에서 배상체들(EB들)을 형성하도록 현탁액 내에서 상기 덩어리들을 성장시키는 단계; 피더 세포들의 상부에 배상체-유사 세포들을 배양시키는 단계; 및 줄기 세포들과 동일한 형태를 가진 세포 군체들을 선택하여, 상기 체세포들이 세포 요법 및 미용 용도의 응용을 위하여 다능성 세포들로 탈분화되는 단계를 포함하는 세포들을 다능성 배아 줄기-유사(ESL) 세포들로 재생시키는 방법이 제공된다. 상기 희석 아가로스 젤은 약 0.2 % 내지 2 % 아가로스일 수 있다.

다른 실시예에서, 다능성 세포로부터 mRNA를 추출하는 단계; 적어도 하나의 리포솜 전달 시약 내에서 mRNA를 캡슐화하는 단계; 체세포들을 mRNA의 리포솜들로 노출시키는 단계; 플레이트의 덮개 상이나 코팅되지 않은 페트리 상에 역으로(inverted) 달라붙은 소적 내에서 상기 노출된 체세포들을 세포 덩어리 형성을 촉진하도록 충분한 시간 동안 성장시키는 단계; 희석 아가로스 젤 상이나 코팅되지 않은 페트리 접시 내에서 배상체들(EB들)을 형성하도록 현탁액 내에서 상기 덩어리진 세포들을 성장시키는 단계; 성장 인자들로 보충된 적절한 배지의 피더 세포들 상이나 코팅된 플레이트 및 디스크들 상 또는 마트리젤 상에 EB 세포들을 배양시키는 단계; 및 줄기 세포들의 형태를 지닌 세포 군체들을 선택하여, 상기 체세포들이 세포 요법 및 미용 용도의 응용을 위하여 다능성 세포들로 탈분화되는 단계를 포함하는 배아 줄기 세포(ESC) mRNA을 이용한 형질전환에 의하여 체세포들을 다능성 ESL 세포들로 재생시키는 방법이 제공된다. 상기 다능성 세포들은 ESC들, 원시 생식 세포들(PGC들), 태아 세포들, 난자들, 수정란들, 제대혈 줄기 세포들, 조직 줄기 세포들, 배반포 세포들 또는 그 조합일 수 있다. 상기 충분한 시간은 약 2 시간 내지 하룻밤 동안이다. 리포솜들에 의한 형질전환 대신에, 상기 세포들을 전기천공법 또는 바이러스-매개를 거칠 수 있다.

다른 실시예에서, a. ESC들을 제공하는 단계; b. 상기 ESC들 내에서 DNA 복제를 무력화시키는 단계; c. 상기 비-복제 ESC들을 다수의 상기 체세포들과 혼합시키는 단계; d. 상기 비-복제 ESC들과 상기 체세포들에 폴리에틸렌 글리콜을 첨가하여 이를 융합시키는 단계; e. 상기 융합된 세포들을 역 소적들 내에서 성장시켜 덩어리진 세포들을 생성하는 단계; f. 상기 덩어리진 세포들을 희석 아가로스 젤 상의 현탁액 내에서 1 내지 10 계대(passage)들을 거쳐 성장시켜 배상체들(EB들)을 생성하는 단계; g. 성장 인자들로 보충된 적절한 배지의 피더 세포들 상이나 코팅된 플레이트들 상 또는 마트리젤 상에서 EB들을 성장시키는 단계; 및 h. 줄기 세포들의 정형적인 형상을 지니고 포유류-특이적 이배체 ESL 세포들을 포함하는 환자-특이적 ESL 세포들의 세포 군체들을 선택하는 단계를 포함하는 ESC들을 포유류 체세포들과 세포 융합에 의한 자가 이식을 위한 다능성 이배체 ESL 세포들을 형성하는 방법이 제공된다. 상기 ESC는 줄기 세포들로 대체될 수 있으며 상기 체세포들은 섬유아세포들일 수 있다. 상기 DNA 복제 무력화 단계는 물리적 또는 화학적 처리에 의하여 수행될 수 있다. 상기 물리적 처리는 γ 방사선 또는 자외선에의 노출일 수 있다. 상기 화학적 처리는 염색체 DNA와 결합하는 액티노마이신 D, 에토포시드(etoposide), DNA 킬레이트 및 상호작용제류(chelating and interacting agents) 및 다른 화학치료제들을 포함하는 화학물질들일 수 있다.

또 다른 실시예에서, a. 표적 세포들을 제공하는 단계; b. 상기 표적 세포들 내에서 DNA 복제를 무력화하는 단계; c. 자가 체세포들을 제공하는 단계; d. 상기 비-복제 표적 세포들과 상기 자가 체세포들을 결합하는 단계; e. 상기 세포들을 융합시키기 위하여 상기 결합물에 폴리에틸렌 글리콜을 첨가하여 상기 비-복제 표적 세포들이 상기 체세포들의 게놈을 재프로그래밍하는 단계; f. 적절한 세포 배지 내에서 상기 융합된 세포들을 성장시켜 표적 세포들의 형태와 기능을 가진 이배체 세포들을 생성하는 단계; 및 g. 표적 세포들의 형태와 기능을 가지는 재프로그래밍된 자가 이배체 세포들을 선택하여, 세포 대체 요법 및 미용 용도의 목적으로 공여자에게 재프로그래밍된 자가 이배체 세포들을 이용가능하게 하는 단계를 포함하는 비-복제 표적 세포들을 노화된 체세포들과 융합하여 그 내부로 재프로그래밍을 유도하는 이배체 치료 세포들을 형성시키는 방법이 제공된다. DNA 복제의 무력화 단계는 물리적 또는 화학적 처리에 의하여 수행될 수 있다. 상기 물리적 처리는 γ 방사선 또는 자외선에의 노출일 수 있다. 상기 화학적 처리는 염색체 DNA와 결합하는 액티노마이신 D, 에토포시드, DNA 킬레이트 및 상호작용제류 및 다른 화학치료제들을 포함하는 화학물질들일 수 있다. 상기 표적 세포들은 외생성 ESC들이나 성체 줄기 세포들 또는 인슐린-분비 세포들일 수 있다. 상기 체세포들은 성숙한 피부 세포들, 혈액 세포들 및 골수 세포들일 수 있다.

다른 실시예에서, ESC들이나 조직 줄기 세포들을 사용하는 세포 요법과 미용 용도 응용을 실시하는 방법이 제공된다. 우선, ESL 세포들이 제공된다; 이후 상기 세포 요법이나 미용 용도 응용을 실시하지만, 상기 ESC들이나 조직 줄기 세포들을 환자-특이적 이배체 ESL 세포들로 대체한다.

다른 실시예에서, a. 피부 세포를 침투하는 작용제로 피부를 사전처리하는 단계; b. 신생세포 추출물들, ESC 추출물들, 줄기 세포 추출물들, 난자 추출물들, 재조합 단백질들 또는 그 조합물로부터 선택된 재생제들(rejuvenating agents)을 바르는 단계; c. 상기 재생제로 피부 접촉을 유지하는 단계; 및 d. 필요하다면 단계 a 내지 c를 반복하는 단계를 포함하는 인간 피부를 국소적으로 재생시키는 방법이 제공된다. 이 방법은 상기 피부의 살균이 선행할 수 있다. 상기 재생제는 알부민, ATP, 인산크레아틴, 크레아틴 키나아제, RNase 억제제 및 뉴클레오티드 인산염류가 첨가되는 세포 또는 핵 추출물을 포함할 수 있다.

또 다른 실시예에서, a. 신생세포들, ESC들, 조직 줄기 세포들, 난자들 또는 배아, 태아, 태아 조직들, 재조합 단백질들 또는 그 조합으로부터 구해진 세포들을 제공하는 단계; b. 상기 세포들이 추출되도록 분리시키는 단계; c. 상기 세포들을 적어도 2 회의 동결-해동 사이클들을 거치게 하는 단계; d. 상기 세포들을 고속으로 원심분리시키는 단계; 및 e. 상기 재생 인자들을 포함하는 상층액을 빼내는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 전체 세포들로부터 재생 인자들을 제제하는 방법이 제공된다.

또 다른 실시예에서, a. 신생세포들, ESC들, 조직 줄기 세포들, 난자들 또는 배아, 태아, 태아 조직들, 재조합 단백질들 또는 그 조합으로부터 구해진 세포들을 제공하는 단계; b. 태아 세포들 및/또는 ESC들을 포함하는 상기 세포들이 추출되도록 분리시키는 단계; c. 저장성 완충액 내에서 상기 세포들을 용해시키는 단계; d. 원심분리시켜 상층액을 분리하는 단계; e. 남아있는 핵들을 적어도 2 회의 동결-해동 사이클들을 거치게 하는 단계; f. 원심분리시켜 상기 핵들의 추출물을 구하는 단계; 및 g. 투석에 의하여 상기 상층액을 선택적으로 농축시키는 단계를 포함하는 핵들로부터 재생 인자들을 제제하는 방법이 제공된다.

또 다른 실시예에서, a. 세포들이나 핵들로부터 제제된 재생제들을 제공하는 단계; 및 b. 신호, 증세 또는 시험 결과들에 있어서 개선이 있을 때까지 기관에 주기적으로 상기 재생제들을 투여하여 상기 기관의 노화를 늦추고/늦추거나 그 기능을 개선시키는 단계를 포함하는 기관을 국소적으로 재생시키는 방법이 제공된다. 상기 투여 방법은 정맥내, 피하, 복강내, 근육내, 심실내, 기관내, 관절내, 심막내, 폐내, 비강내 또는 동맥내 경로에 의한 것일 수 있다. 상기 비강내 경로를 이용하여, 상기 재생제들을 비강으로 넣어 상기 재생제들이 중추 신경계에 이르러 신경 퇴행성 질병들을 치료할 수 있다.

다른 실시예에서, a. 다공-개방(pore-opening) 처리로 체세포들을 처리하고 생리학적 완충액으로 세척하는 단계; b. 단계 a의 상기 세포들을 재생 완충액, ESC 핵 추출물 및 원하는 세포 추출물들에 약 한 시간 동안 노출시키는 단계; c. 20 % FBS, 페니실린, 스트렙토마이신, 글루타민, 비필수 아미노산들, 베타-메르캅토에탄올, bFGF, TGF-β1 및 LIF로 선택적으로 보충된 KO-DMEM 용액 내에 단계 b의 세포들을 성장시키는 단계; d. 플레이트의 덮개 상에 역으로(inverted) 달라붙은 소적 내에서 상기 배양된 세포들을 약 2 시간 내지 하룻밤 동안 배양시키는 단계; e. 상기 역 소적들을 채집하여 결합하는 단계; 및 f. 상기 세포들이 원하는 세포들을 형성할 때까지 원하는 세포-생성 작용제들로 보충된 DMEM의 젤라틴-코팅된 플레이트들 상에 상기 채집된 세포들을 성장시키는 단계를 포함하는 약어로된 과정에 의하여 포유류 체세포들을 재생시키고 이들을 원하는 세포들로 분화시키는 방법이 제공된다. 일 변형에서, 상기 체세포는 섬유아세포들을 포함하며, 상기 원하는 세포 유형은 근육 세포들이며 상기 원하는 세포-생성 작용제들은 2 % 비활성화된 말 혈청과 근원세포 세포 배양 배지로부터 여과된 상층액을 포함하며, 상기 채집된 세포들은 근관세포들을 형성할 때까지 그렇게 노출된다. 이 방법에서, 단계 a.는 상기 섬유아세포들을 트립신-EDTA, 스트렙토라이신 O, 전기천공법 또는 바이러스-매개를 포함할 수 있다.

다른 실시예에서, a. 세포들 또는 핵들 또는 그것들의 조합으로부터 유래한 재생 인자들; 1 ㎎/㎖ 알부민; 1 mM ATP; 5 mM 인산크레아틴; 25 ㎍/㎖ 크레아틴 키나아제; 0.4 U/㎖ RNase 억제제; 및 4 가지 dNTP들의 각각 1 mM을 포함하는 재생 완충액 조성물이 제공된다. 바람직하게는 상기 조합 추출물은 태아 세포 추출물의 약 절반 및 ESC들의 핵 추출물의 절반이다. 바람직하게는 상기 세포 또는 핵 추출물은 세포가 없다.

일 실시예에서, 포유류 신체를 전신으로 재생시키고 총체적인 건강과 면역 기능을 개선시키는 방법은 신생세포 추출물들, 줄기 세포 추출물들, 난자 추출물들, 신생세포들, ESC들, 줄기 세포들, 재조합 단백질들 또는 그 조합으로부터 유래한 재생제들을 제공하는 단계; 및 상기 재생제들을 개선에 의해 나타나는 바와 같이 주기적으로 투여하는 단계를 가진다. 상기 투여 경로는 정맥내, 복강내, 근육내, 척수강내, 비강내 경로 또는 그 조합일 수 있다.

일 실시예에서, 조직 배양에서 수많은 계대들을 거친 세포들을 재생시키는 방법은 이전에 배양된 세포들을 제공하는 단계; 재생 추출물, 알부민, ATP, 인산크레아틴, 크레아틴 키나아제 RNase 억제제 및 뉴클레오티드 인산염류를 제공하는 단계; 상기 세포들을 상기 재생 용액과 결합시켜 상기 재생 용액의 성분들이 상기 세포들을 침투하는 데 충분한 시간 동안 배양시키는 단계; 및 세포 배지, 염화 칼슘 및 선택적으로는 항생제들을 첨가하는 단계; 및 상기 세포들을 배양시켜 상기 세포 개체수를 늘려서 조직 배양액 내에 수많은 계대들을 거치는 세포들을 재생시키는 단계를 가진다. 또한 상기 방법에 대한 일 변형은 마지막 두 단계들을 하기의 단계들로 대체한다: 플레이트의 덮개 상이나 코팅되지 않은 페트리 접시 상에 역으로 달라붙은 소적 내에서 상기 재생된 세포들을 세포 덩어리 형성을 촉진하도록 충분한 시간 동안 성장시키는 단계, 0.2 % 내지 2 % 아가로스 상 또는 코팅되지 않은 페트리 접시 내에 EB들을 형성하도록 현탁액으로 상기 세포 덩어리들을 성장시키는 단계, 성장 인자들로 보충된 적절한 배지의 피더 세포들 상이나 코팅된 플레이트들 또는 디스크들 상 또는 마트리젤 상에서 EB-유사 세포들을 배양시키는 단계, 및 줄기 세포들과 동일한 형태를 지닌 세포 군체들을 선택하여, 상기 이전에 배양된 세포들을 다른 조직 배양을 위하여 다능성 세포들로 탈분화시키는 단계.

화학 요법들에 의하여 유발 여부에 상관없이 액체 암, 백혈병, 림프종 및 조혈 이상을 치료하는 방법은 우선 노화된 체세포들을 제공; 재생 추출물, 알부민, ATP, 인산크레아틴, 크레아틴 키나아제, RNase 억제제 및 뉴클레오티드 인산염류를 포함하는 재생 용액을 제공; 상기 노화된 체세포들을 상기 재생 용액과 결합시키고 상기 재생 용액의 성불들이 상기 세포들을 침투하도록 충분한 시간 동안 배양시킴; 세포 배지, 염화 칼슘 및 선택적으로는 항생제들의 용액을 첨가하여 상기 세포 개체수를 늘림; 상기 재생된 세포들을 분리시킴; 상기 재생된 세포들을 생리학적 용액과 결합시켜 제제된 재생된 세포들을 우선 제공하는 단계를 가진다. 그 다음 상기 재생된 세포들을 화학 요법들에 의하여 유발 여부에 상관없이 액체 암, 백혈병, 림프종 및 조혈 이상을 앓는 포유류에게 투여한다.

다른 실시예에서, 중추신경계 외상, 뇌졸중, 알츠하이머병, 파킨슨병 또는 근위축성 측색 경화증을 앓는 포유류를 치료하는 방법이 개시된다. 제 1 단계는 i. 노화된 체세포들의 표본을 제공하는 단계; ii. 재생 추출물, 알부민, ATP, 인산크레아틴, 크레아틴 키나아제, RNase 억제제 및 뉴클레오티드 인산염류를 포함하는 재생 용액을 제공하는 단계; iii. 상기 노화된 체세포들을 상기 재생 용액과 결합시키고 상기 재생 용액의 성분들이 상기 세포들을 침투하도록 충분한 시간 동안 배양시키는 단계; iv. 세포 배지, 염화 칼슘 및 선택적으로는 항생제들의 용액을 첨가하여 상기 세포 개체수를 늘리는 단계; v. 상기 재생된 세포들을 분리시키는 단계; 및 vi. 상기 재생된 세포들을 생리학적 용액과 결합시켜 투여가능한 제제를 제제하는 단계에 의하여 제제된 재생된 세포들을 제공하는 것이다. 그 다음 단계는 중추신경계 외상, 뇌졸중, 알츠하이머병, 파킨슨병 또는 근위축성 측색 경화증을 앓고 있는 포유류에 상기 재생된 세포들을 투여하는 것이다.

다른 실시예에서, a. 노화하는 세포들의 다공들을 개방하는 작용제로서, 상기 작용제는 트립신과 스트렙토라이신 O로부터 선택되는 작용제; b. 재생 완충액 조성물; 및 c. 배아 세포들 및 ESC 핵들의 무세포(cell-free) 추출물을 포함하는 노화하는 세포들을 재생시키는 키트가 개시된다. 상기 추출물은 다능성 세포들로부터 유래한 mRNA 추출물로 대체될 수 있다. 상기 다능성 세포들은 ESC들, PGC들, 태아 세포들, 난자들, 수정란들, 제대혈 줄기 세포들, 조직 줄기 세포들, 배반포 세포들 또는 그 조합일 수 있다.

도 1은 개인으로부터 성숙 세포를 얻어서 그 세포를 배양하고, 그 세포를 "신생세포(novacell)"로 재생하여 이후에 세포 대체 요법에서 이용하는 진보적인 방법을 요약한 것이다.

도 2A 내지 2F는 섬유아세포 대조군(A, B 및 C) 및 태아 추출물(fetal extract)로 재생된 신생세포들(D), ESC 핵 추출물로 재생된 신생세포들(E) 및 역 소적(inverted droplet) 내에서 재생된 섬유아세포(F)를 도시한다. 도 2G 내지 2I는 노화된 골수 기질 세포 대조군(G)과 태아 추출물로 재생된 신생세포들(H) 및 ESC 핵 추출물로 재생된 신생세포들(I)을 도시한다.

도 3A 및 3B는 미처리 피부 생검(A) 및 더 많은 세포 증식을 보인 재생된 피부 생검(B)의 현미경사진이다.

도 4A는 미재생 FNSK2 세포를 도시한다; 도 4B 내지 4F는 상이한 기 들(stages)에서 FNSK2로부터 형성된 신생세포를 도시한다. 4B는 초기 FN-ESL 신생세포를 도시한다; 4C는 배상체 내에서의 FN-ESL 신생세포를 도시한다; 도 4D는 마트리젤 코팅된 플레이트 상에서의 더 많이 성장했음을 도시한다; 그리고 4F는 피더(feeder) 세포들의 층 상에서의 FN-ESL 신생세포를 도시한다.

도 5는 젤의 사진으로 FNSK2 섬유아세포들이 3 가지 배아 줄기 세포-특이적 생물지표들(Oct-4, Ndp2L1 및 DPPA3)을 생성하지 않으며, 재생된 세포들의 3 가지 다른 기들(stages) 모두가 그러한 생물지표들을 생성하는 것을 나타낸다.

도 6A 내지 6I는 다양한 프로토콜들로부터 유래한 시초 성숙 섬유아세포와 신생세포를 도시한다. 도 6B 내지 6E는 상기 성숙 세포들을 처리하는 다양한 방법들로부터 유래한 신생세포들이 재생 인자들에 침투되었음을 도시한다. 도 6F 내지 6K는 다양한 재생 추출물들로부터 유래한 신생세포를 도시한다.

도 7A 내지 7D는 어른 남성의 섬유아세포로부터 생성된 융합(fusion) 신생세포와 방사선과 악티노마이신 D에 의한 복제 손상(replication impairment) 이후의 복제-결손(replication-defect) 줄기 세포를 도시한다.

도 8은 세포 요법을 위한 신생세포 생성의 재생 및 분화 과정을 요약한 것이다.

도 9A 내지 9G는 신생세포들의 신경 전구체, 신경 세포, 인슐린-분비 섬(insulin-secreting island), C-펩티드 양성 섬, 휘젓는 심근세포(beating cardiomyocyte), 골격 근세포(skeletal myocytes) 및 지방세포로의 분화를 각각 도시한다.

도 10A 내지 10D는 미재생 종양 세포, 피더 세포 상의 신생세포, ESL 신생세포 군체들(colonies) 및 피더 세포 상의 ESL 신생세포 군체를 각각 도시한다. 재생 후에, 종양 세포는 더 적은 수의 아가-겔 형성 군체들에 의해 보여진 바와 같이 종양-생성 능력이 낮아지거나 없어졌고 누드(nude) 쥐들에서는 종양이 전혀 없었음을 도시한다. 이러한 재생-유도 탈분화는 종양 요법들을 개선시키는 혁신적인 전략을 제공할 수 있다.

도 11A 내지 11C는 성숙한 섬유아세포를 재생 근세포로 변환하는 1-단계 재생/분화 프로토콜의 결과들을 도시한다.

도 12는 재생 과정을 겪은 쥐들에서 텔로머라아제의 재활성화를 보여주는 겔 블럿이다; 2, 3 및 7 번 레인(lane)은 미처리 대조군을 도시한다; 그리고 4와 5 레인은 재생의 결과를 도시하며 6 레인의 ESC들의 양성 대조에 필적한다.

도 13은 신생세포들을 사용하여 생체 내 재생을 생성하는 과정을 요약한 것이다.

도 14A와 14B는 미처리 피부 상처와 생체 내 재생 이후에 사라진 상처를 도시한다.

도 15A 내지 15D는 나이 든 쥐 대조군(A와 C)을 포함하는 쥐들을 도시한다. 도 15B와 15D는 더 활성화된 재생 쥐들을 도시한다.

도 16은 사전 프로그래밍한 pES 벡터의 개략도이다. 제한 효소들을 사용하여 전사 인자들을 pEGFP-N3 벡터로 클로닝하였다.

도 17A, 17B 및 17C는 섬유아세포, 2-단계 시험관 내 후생적 재프로그래밍에 의하여 피더 세포 상에 성장하는 다능성 배아 줄기-유사(ESL) 세포 및 마트리젤-코팅된 플레이트 상에 성장하는 ESL 세포를 각각 도시한다.

본 발명은 노화된 세포들을 더 활발하고 더 효력이 있는(potent) "신생세포들(novacells)"로 재생시키는 방법을 기술한다. 신생세포들은 전능성(totipotent), 다능성(pluripotent) 및 중복성(multipotent)이 된다. 재생된 세포들은 노화하는 동안에 상실했던 기능을 회복하여 인간 질병의 세포 대체 요법들에서 유용하다. 이러한 방법을 생체 내로 적용할 경우에, 세포 재생은 조직들, 기관들 및 신체 전체의 노화 과정을 늦추거나 정지시킬 것이다.

본 발명의 주된 장점은 재생 세포를 받는 환자의 세포들이나 조직들을 재생시킨다는 점에 있다. 그러한 자가(autologous) 세포들과 조직들을 이용하면 이식편대숙주 거부반응을 전개할 위험이 없다는 것이다. 재생되는 세포들을 피부, 혈액 또는 골수를 포함하는 다양한 원천으로부터 회수할 수 있다.

도 1은 노화된 세포들을 생체 내에서 효력이 있는 신생세포들로 재생시키는 과정을 개략적으로 그린 개략도이다. 노인으로부터(예컨대, 피부, 혈액, 골수 또는 생검 조직들로부터) 세포들을 우선 회수하여 적절한 배지 내에서 배양하여 세포 개체수를 확장시킨다. 세포들을 세포막 투과화제(permeabilizing reagent)(예컨대, 트립신/EDTA)에 선택적으로 노출시켜 세포들의 간극 연결을 개방한다. 원심분리하여 상기 투과화제를 분리한 이후에, 세포들은 재생 완충액 내에서 완충 인자들로 재생된다. 37 ℃에서 짧은 시간 동안(약 30 분 내지 3 시간) 배양한 후에, 우태 혈 청(FBS)과 항체가 존재하는 배지 내에서 세포들을 성장시킨다. 재생된 세포들은 생리학적 기능을 증진하며 노화된 시작 세포들보다 더 빠른 속도로 성장한다. 이러한 재생된 신생세포들은 피부에의 화장 응용을 포함한 세포 요법에서 유용하다.

조혈 작용을 돕는 간엽 기원의 비-조혈 세포들인 골수 기질 세포들은 다능성이며 배양 중에 자가-복제를 한다. 이러한 선조들(progenitors)은 ESC들 처럼 조골세포, 연골모세포, 지방세포, 심근세포, 뉴런-유사 세포 및 성상세포와 같은 다른 많은 세포 유형들로 분화될 수 있다. 기질 세포들의 가소성은 세포 대체 요법에서 잠재적 이용을 위한 기초이다.

그러나, 노화는 세포 배양 중인 골수 기질 세포들의 성장에 중요한 결정인자이기도 하다. 나이 든 쥐들로부터 분리한 기질 세포들은 어린 쥐들로부터 분리한 것들보다 더 천천히 성장한다. 따라서 그러한 골수 기질 세포들을 세포 대체 요법에서 사용하기 전에 시험관 내에서 이들을 재생시키는 것이 바람직하다. 백혈병과 다른 조혈성 질환들의 치료에 이식을 하기 전 골수의 성장과 회복을 증진시킬 골수 세포의 재생도 바람직하다고 할 수 있다.

줄기 세포는 자가-재생력과 특정 조직의 성장 세포로의 분화능력을 가진다능성 세포로 정의된다(Morrison et al, Ann Rev Cell Dev Biol 1995, 11:35-71). ESC들의 특징들 중 하나는 분화 배지(differentiating media) 내에서 다른 세포들로 분화하는 능력에 있다. ESC들은 미분화된 배상체들(EBs)로도 성장한다.

일반적으로, 노화된 세포들을 효력이 있는 신생세포들로 재생시키는 방법은 발달기의 초기에서의 세포들 예컨대, 배아, 태아, 배반포, ESC들, 줄기 세포, 제대 혈 줄기 세포 및 난자로부터 유래한 조직과 세포 구성요소들을 포함하는 재생 시약으로 시험관 내에서 세포들을 효력이 있는 신생세포들로 재생시키는 단계를 포함한다. 재생 추출물의 소스는 재생되는 세포보다 일반적으로 더 활발하다.

이렇게 생성된 신생세포들은 원 세포들보다 형태, 생리 및 기능성 면에서 작용이 더 활발하며(younger-acting) 증식을 더 많이 한다. 이러한 신생세포들은 시험관 내와 생체 내에서의 시작 세포들보다 기능을 더 증진시킨다. 이와 같은 더 어린 세포 작용은 더 많은 콜라겐과 엘라스틴의 생성과 적혈구 증식이 더 많이 되는 적혈구 전구체와 골수 세포들을 포함하지만 여기에 제한되지 않는다. 신생세포들이 형태, 생리, 기능성 및 다능성 면에서 ESC들의 특징들을 가지는 것이 바람직하다. 예컨대, 특이적 질병 치료, 거부반응이 없는(compatible) 새로운 기관과 조직들의 창조 및 새로운 치료제의 스크리닝과 같은 연구 및 상용 응용에서 ESC들을 대체하는 데 이러한 신생세포들이 사용될 수 있다.

섬유아세포, 림프구, 상피 세포, 내피 세포, 골격, 심근 및 평활근 세포, 간세포, 췌장 소도 세포(pancreatic islet cell), 골수 세포, 성상세포 및 비-배아 줄기 세포(즉, 조직 줄기 세포)를 포함하지만, 여기에 제한되지 않는 광범위한 체세포들이 여기에 개시된 방법들에 사용될 수 있다. 이러한 절차는 조직 배양 중에 수많은 계대(passage)를 겪는 세포들을 재생하는 데에도 유용하다.

세포 요법에서 원하는 조직이나 조직-특이적 전구 세포들로 분화하는 ESC들을 대체하는 데 신생세포들이 이용될 수 있다. 재생된 신생세포들은 질병을 치료하기 위하여 인간이나 동물의 특이적 기관이나 조직으로 이식하는 데에도 유용하다.

재생제(rejuvenating agent)라는 용어는 세포들을 재프로그래밍하고 예컨대, 신생아, 태아, 배아 및 ESC들과 같은 초기 발달기의 세포들로 재생시킬 수 있는 인자들을 의미한다. 본 발명에 사용된 재생제들은 체세포들을 다능성 신생세포들로 재생시킬 수 있는 재생 인자들을 포함하는 조직 추출물, 핵 추출물 또는 세포 추출물을 포함하지만 여기에 제한되지 않는다. 재생제는 배아, 신생아, 신생아 조직(newborn tissue), 태아, 태반 및 태아 간과 기타 조직들의 조직 추출물들을 포함한다. 핵 추출물은 ESC들, 줄기 세포, 제대혈 줄기 세포, 생식 세포와 원시 생식 세포들(PGC들), 난자, 수정란, 배아, 신생아 조직, 태아 간, 다른 태아 조직 및 다른 미성숙 조직들로부터 구해질 수 있다. 재생 인자들은 재조합 단백질 및 재조합 cDNA와 DNA 단독 또는 벡터 내의 그러한 것일 수도 있다(예컨대, 플라스미드 또는 바이러스). 본 발명의 다른 태양에서, 재생제는 ESC들, 줄기 세포, 제대혈 줄기 세포, PGC들, 난자, 수정란, 배아, 신생아 조직, 태아 간 및 다른 조직들로부터 유래한 mRNA 또는 RNA 전체를 포함한다. 이러한 mRNA 또는 RNA 전체를 체세포들로 도입하면 mRNA가 후생적으로 게놈을 재프로그래밍하고 세포들을 전능성이나 다능성 세포들로 재생시키는 세포 내부에서의 인자들을 합성할 수 있게 한다. 또한, 재생제는 ECS들, PGC들, 난자, 수정란, 배아, 신생아 조직, 신생아 혈청, 태반, 태아 간 및 다른 태아 조직들에서 클로닝 된 신생아 혈청과 재조합 단백질들을 포함한다.

신생세포들은 아직 재생되지 않은 세포들보다 더 활발하게 작용하며 더 증식성이 있는 재생된 세포들로 정의된다. 또한, 신생세포들은 기능성이 개선됨을 보여주며 수명이 연장된다. 신생세포들은 텔로머라아제 활성을 증진시켜 텔로미어들을 더 길게 한다. 이러한 세포들은 조기 노화됨이 없이 무한적인 계대를 거쳐 생존할 수 있다.

신생세포들은 단백질, 효소, 호르몬 및 성장 인자들을 포함하지만 여기에 제한되지 않는 더 많은 생물학적 화합물들을 합성한다. 따라서, 신생세포들은 특이적 세포, 조직 및 기관들의 기능을 회복시키는 데 유용하다. 예를 들어, 노화된 피부 섬유아세포들은 콜라겐과 엘라스틴을 생성하지 못하거나 실제 더 적은 양을 만들어서 피부 주름을 유발한다. 재생된 섬유아세포들은 태아 및 신생아 피부 세포들의 섬유아세포들처럼 작용하며, 노인들의 주름살을 치료하기 위하여 피부에 이식되거나 주입되는 경우 더 많은 콜라겐과 엘라스틴을 생성한다. 골수 세포와 조혈 세포와 같은 재생된 혈액 세포들은 더 많이 증식되며 수명이 연장되어 재생불량성 빈혈, 선천성 빈혈, 화학요법 유발 빈혈(chemotherapy-caused anemia) 및 다른 혈액 질환에 유익하다.

치료 목적에 따라 다양한 투여 방법들이 이용될 수 있다. 전달 방법은 다양하여 정맥내, 피하, 복강내, 근육내, 척수내, 뇌실내(intra-cerebroventricular), 기관내 및 관절내(관절 속으로)를 포함하지만 여기에 제한되지 않는다. 재생 인자들도 피부에 바르거나, 특히 피부 침투성을 증대시키는 피부 부착제에 붙일 수도 있다.

"유효량"이라는 용어는 여기서는 분화제(differentiation agent), 전구체나 선조 세포(progenitor cell), 신경 세포와 같은 특화된 세포와 같은 구성요소의 농도 또는 용량 및/또는 줄기 세포 및/또는 선조 세포를 줄기 및/또는 선조 세포를 신경 세포와 같은 특화된 세포나 다른 세포 유형들로의 분화를 포함하는 의도된 결과를 생성하는 데 유효한 다른 작용제의 농도 또는 용량을 서술하는 데 쓰인다. 본 발명에 따른 조성물들은 뇌 또는 척수에서나 치료되는 질병이나 병태에서의 안정화나 개선과 같은 유익한 변화(예컨대, 신경성 결손을 포함한 다양한 퇴행성 질병이나 병태를 멈추거나 되돌리기와 같은)을 일으키도록 조성물 내에서 신생세포들의 이식을 달성하는 데 사용될 수 있다.

"투여" 또는 "투여하는"이라는 용어는 명세서 전반에 걸쳐서 신생세포들과 같은 본 발명의 세포들이나 거기서 구해진 분화된 세포들에 의하여 치료의 목적으로 환자에게 전달되는 과정을 서술하는 데 쓰인다. 본 발명의 세포들은 장관외성(parenteral), 척수강내, 심실내, 실질내(척수, 뇌간 또는 운동 피질), 조내(intracisternal), 두개골내, 선조체내, 구강, 국소 및 흑질내를 포함하지만 여기에 제한되지 않는 다양한 경로를 통하여 투여된다. 기본적으로 본 발명의 세포들이 최종 표적 사이트에 도달할 수 있도록 임의의 방법이 이용될 수 있다. 본 발명의 세포들은 신생세포들이나 분화된 세포들의 형태로 투여될 수 있다. 본 발명에 따른 조성물들은 분화제로 처리하지 않거나("미처리" 즉, 신생세포 표본 내에서 세포들의 분화를 촉진하기 위하여 다른 처리 없이) 신생세포 표본 내에서 몇몇 줄기 세포 및/또는 선조 세포들을 신경원 표현형과 같은 분화된 표현형을 드러내는 세포들로 분화시키게 하는 분화제나 다른 작용제로 처리("처리된")한 후에 본 발명에 따른 조성물들을 사용할 수 있다. 세포들은 환자에게 투여되기 전에 생체 외 분화를 겪을 수 있다.

투여는 종종 처리되는 질병이나 병태에 의존하며 예컨대, 정맥내, 뇌척수액으로의 투여에 의한, 비강 흡입에 의한, 병 걸린 조직으로의 직접 이식, 또는 다른 전신성 또는 국소성 수단에 의한 장관외성 경로를 통하는 것이 바람직할 수 있다. 예를 들어, 알츠하이머병, 헌팅턴병 및 파킨슨병의 경우, 바람직한 투여 경로는 중추신경계로 직접 이식(예컨대, 파킨슨 병의 경우 선조체, 흑질 또는 그 양쪽 모두)일 것이다. 근위축성 측색 경화증(루게릭병)과 다발성 경화증의 경우에, 예상되는 바람직한 투여 경로는 뇌척수액으로의 주입이다.

"이식(grafting)"과 "이식(transplanting)" 및 "이식편(graft)"과 "이식술(transplantation)"이라는 용어들은 명세서 전반에 걸쳐서 세포들이 환자의 중추신경계에 미치는 손상을 회복(이러한 손상으로 유발된 인지 결함(cognitive deficit)이나 행동 결함(behavioral deficit)을 줄일 수 있음), 대뇌혈관 사고(뇌일혈) 또는 물리적 손상(외상)에 의한 신경 손상인 급성 또는 아급성 신경변성 질환(acute or subacute neurodegenerative disease)의 치료와 같은 호의적인 결과를 보여주는 의도의 사이트에 전달되는 본 발명의 세포들에 의한 과정을 기술하는 데 동의적으로 쓰인다. 본 발명의 세포들은 이식이 될 수 있도록 적절한 부위(들)에 세포 이동에 의존하는, 당업자에게 알려진 임의의 투여 방식에 의하여 신체의 말단 부위에 전달될 수도 있다.

분자 생물학 기법

업계에 알려져 있고 특정하게 기술되어 있지 않은 표준 분자 생물학 기법들 은 일반적으로 Sambrook et a., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, Cold Springs Harbor Laboratory, NY (1989, 1992)와 Ausubel et a., CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley and Sons, Baltimore, MD (1989)에 기술된 바와 같이 따르고 있다. Jam et al, PCR PROTOCOLS: A GUIDE TO METHODS AND APPLICA?ONS, Academic Press, San Diego, CA (1999)에 명기되어 있는 바와 같이 폴리머라아제 연쇄 반응(PCR) 방법이 채용된다. 달리 언급이 없으면, Sambrook et al, MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, Cold Springs Harbor Laboratory Press 및 미합중국 특허 번호 4,666,828; 4,683,202; 4,801,531; 5,192,659; and 5,272,057에 기술되고 여기에 그대로 참조로 포함된 방법에 일반적으로 기술된 바와 같이 다른 핵산 기법들을 포함하는 반응들과 조작들을 수행한다. 유동 세포계측법과 결합한 제자리(in situ) PCR을 이용하여 특이적인 DNA와 mRA 서열들을 포함하는 세포들을 검출할 수 있다(예컨대, Testoni et al, 1996, Blood, 87:3822).

업계에 알려져 있고 특정하게 기술되어 있지 않은 면역학의 표준 방법들은 일반적으로 Stites et al (Eds.), BASIC AND CLINICAL IMMUNOLOGY, 8 Ed., Appleton & Lange, Norwalk, CT (1994); 및 Mishell and Shigi (Eds.), SELECTED METHODS IN CELLULAR IMMUNOLOGY, W.H. Freeman and Co., New York (1980)에 기술된 바와 같이 따르고 있다.

면역학적 분석법(immunoassays)

일반적으로, 면역학적 분석법들을 채용하여 세포 표면 표지 등에 대한 시료 를 분석한다. 면역세포화학적 분석법들은 당업자에게 잘 알려져 있다. 다중클론성과 단일클론성 항체 양쪽 모두를 분석법에 이용할 수 있다. 적절하다면 효소-결합 면역 측정법들(ELISAs)과 방사선면역측정법(RIA)들과 같은 면역측정법들이 당업자에게 잘 알려져 있으며 이용될 수 있다. 이용가능한 면역측정법들은 특허와 과학 논문에 광범위하게 기술되어 있다. 예를 들어, Sambrook et al, MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, Cold Springs Harbor, New York, 1989 뿐만 아니라 미합중국 특허 3,791,932; 3,839,153; 3,850,752; 3,850,578; 3,853,987; 3,867,517; 3,879,262; 3,901,654; 3,935,074; 3,984,533; 3,996,345; 4,034,074; 4,098,876; 4,879,219; 5,011,771; 및 5,281,521를 참조. 수많은 다른 과학 참고문헌들이 발간되어 당업자가 이를 용이하게 이용할 수 있다.

유전자 요법

여기에 쓰인 유전자 요법은 수많은 질병이나 병태를 치료, 방지 또는 완화하기 위하여 관심 대상인 유전 물질(예컨대, DNA나 RNA)의 숙주 내 이입(transfer)을 의미한다. 관심 대상인 유전 물질은 그 생체 내 생성을 원하는 생성물(예컨대, 단백질, 폴리펩티드, 펩티드, 기능성 RNA 및/또는 안티센스 분자)를 엔코딩한다. 예를 들어, 관심 대상인 유전 물질은 치료 가치가 있는 호르몬, 수용체, 폴리펩티드나 펩티드 효소를 엔코딩한다. 또한, 관심 대상인 유전 물질은 자살 유전자를 엔코딩한다. 상세한 리뷰를 위해서 ADVANCES IN PHARMACOLOGY, Academic Press, San Diego, CA, 1997의 "유전자 요법"을 참조하시오.

이식(transplantation)을 위한 세포 투여

환자 개인의 임상 상태, 투여 사이트 및 방법, 투여 일정, 환자의 연령, 성, 체중 및 의료 종사자들에게 중요한 다른 인자들을 고려하여, 양질의 의료에 따라 본 발명의 신생세포들이 투여되고 복용될 수 있다. 이러한 목적을 위한 약학적 "유효량"이나 복용 스케줄은 실험 임상 연구, 약학 및 임상 의료계의 당업자에게 알려진 그러한 고려사항들에 의하여 결정될 것이다. 상기 유효량은 안정화, 개선(활발한 외관과 기능을 포함하지만 여기에 제한되지 않음) 또는 증세의 제거 및 당업자에 의하여 질병 경과, 퇴행 또는 개선의 적절한 대책으로 선택된 다른 지표들을 달성하는 데 효과가 있어야 한다.

본 발명의 방법에서, 신생세포들은 중추 신경계 또는 다른 조직이나 기관들에 신경세포들을 이식하는 데 적절한 다양한 경로들에 의하여 신생세포들이 투여될 수 있다. 그러한 경로들은 구강 및 국소적 투여뿐만 아니라 정맥내와 동맥내 투여, 척수강내 투여, 심실내 투여, 실질내, 두개골내, 조내, 선조체내 및 흑질내 투여를 포함하는 장관외성 투여를 포함하지만 여기에 제한되지 않는다.

신생세포들의 유효량을 포함하는 약학적 조성물들도 본 발명의 고려대상이다. 이러한 조성물들은 선택적으로 약학적으로 수용가능한 담체, 첨가제나 부형제와 조합된 세포들의 유효한 수량을 포함하며, 하나 이상의 적절한 매질 내에 현탁된다. 본 발명의 몇몇 태양들에서, 이식을 필요로 하는 환자에게 세포들이 살균 식염수에 담겨 투여된다. 본 발명의 다른 태양들에서, 항크스액(Hanks Balanced Salt Solution: HBSS), 이솔라이트(Isolyte) S, pH 7.4 또는 5 % 포도당 용액, 0.9 % 염화 나트륨 또는 5 % 포도당과 0.9 % 염화 나트륨의 혼합물로부터 선택된 그러한 다른 유체들에 담겨 투여된다. 희석제의 다른 예들은 젖산 링거액, 젖산 링거 첨가 5 % 포도당 용액, 노르모졸(Normosol)-M과 5 % 포도당 및 아실화(acylated) 링거액으로부터 선택된다. 무혈청 세포 매지의 사용을 포함한 또 다른 접근법들도 이용될 수 있다. 환자에게 세포들의 전신성 투여는 몇몇 징후(indication)들에서 바람직할 수 있다; 반면에, 질환을 앓고 있고/있거나 손상된 조직의 사이트나 근접한 직접적인 투여는 약학 강연 및 당업자에 의해 결정되는 다른 징후들에서 바람직할 수 있다. 주사용이나 이식용 펠렛(pellet)들을 포함하는 다양한 다른 매체에 의한 피검 세포들의 투여도 고려 대상이다.

본 발명에 따른 약학적 조성물들은 바람직하게는 약 1.0 X 10⁴ 개 내지 1.0 X 10¹⁴ 개의 세포들, 더 바람직하게는 약 1 X 10⁵ 내지 1 X 10¹³ 개의 세포들, 더욱 더 바람직하게는 약 1.0 X 10⁵ 내지 1 X 10¹² 개의 세포들의 범위 내에서 유효한 수량의 신생세포들을 포함한다. 상기 세포들은 선택적으로는 약학적으로 수용가능한 결과를 달성하는 데 필요한 약학적으로 수용가능한 담체, 첨가제류, 보조제류 또는 부형제류와 조합된 현탁액으로 일반적으로 투여된다.

본 명세서 전반에 걸쳐서, 다양한 특허와 특허 발간물들을 참고하였다. 그러한 발간물들 내에서 인용된 모든 특허와 특허 발간물들의 개시물들은 본 발명이 속하는 업계를 좀 더 상세히 서술하기 위하여 여기에 그대로 참조로 포함되었다. 하 기의 예들은 본 발명의 청구항의 범위를 제한하려는 의도가 아니라, 오히려 몇몇 실시예들을 대표하려는 의도이다. 당업자에게는 예시된 예들에서 발생하는 임의의 변형예들이 본 발명의 범위 내에 속한다는 의도이다.

예

노화된 세포들을 시험관 내에서 효력이 있는 신생세포들로 재생시키는 절차를 개략한 개요가 도 1에 도시되어 있다. 우선, 세포들을 예컨대, 피부, 혈액, 골수 또는 생검 조직과 같이 어른으로부터 구하여 적절한 배지에 배양하여 세포 개체수를 늘린다. 다음으로, 세포들을 예컨대, 트립신/EDTA와 같은 세포막-투과화제에 노출시켜 세포들의 간극 연결을 개방한다. 원심분리한 이후에, 재생 완충액 내의 재생 인자들로 세포들을 재생시킨다. 임의의 이론에 구속되는 것은 아니지만, 재생 인자들이 핵으로 들어가서 염색질을 리모델링하는 것으로 여겨진다. 후생적 재프로그래밍(예컨대, DNA 메틸화와 히스톤 변형)은 세포 성장과 노화에 관련된 유전자들을 활성화시킨다. 이러한 인자들로 배양한 후에, 우태혈청(FBS)과 항체들이 존재하는 배지 내에서 세포들을 성장시킨다. 재생된 세포들은 생리학적 기능성(텔로머라아제나 텔로미어 길이, 성장 인자 발현, 콜라겐 합성 및 세포 복제능과 같은)을 증진시키고 노화된 원 세포들과 비교하여 더 빠른 속도로 성장한다. 이렇게 재생된 신생세포들은 화장품 응용을 포함한 세포 요법에 유용하다. 세포 요법들은 시험관 내에서 분화된 신생세포들에 따라서 다양하게 변한다. 사용례는 간기능 부전, 위궤양, 화상, 백혈병과 화학요법-관련 빈혈을 포함하지만, 여기에 제한되지 않는다.

예 1 - 피부 섬유아세포들의 배양

살균처리한 후에, 49 세 남성 지원자의 피부 생검 조직(2 ㎟)을 전박의 내측면(inner forearm)으로부터 채취하였다. 상기 피부 생검 조직을 살균된 면도칼로 작게 몇 조각으로 잘라내어 6-웰 플레이트에 직접 넣어 거기서, DMEM 배지(Invitrogen, Carlsbad, CA)의 얇은 층으로 덮고, 10 % 우태혈청(FBS), 페니실린 100 U/㎖과 스트렙토마이신 100 ㎍/㎖로 보충하여 5 % CO₂로 보충된 실내 공기에서 37 ℃의 온도로 성장시킨다. 상기 배지를 신선한 DMEM으로 매일 교체하였다.

약 2 주간 배양한 후에, 섬유아세포들은 절개한 피부의 닿는 면(skin edge) 주변에서 성장하기 시작하였다. 트립신/섬유아세포 용액을 1200 rpm으로 3 분 동안 원심분리시켰다. 섬유아세포 펠렛을 재현탁하여 세포들의 개수를 세었다. 갯수에 따라, 세포들을 DMEM 배지의 새로운 6-웰 또는 24-웰 플레이트에 뿌린다(seed). 섬유아세포들을 모아서 75 ㎜ 플레이트나 플라스크에 옮겨넣어 개체수를 더 늘렸다. 이러한 노화된 섬유아세포들은 재생된 세포들보다 더 느리게 성장하고 콜라겐과 엘라스틴을 더 적게 생성한다(이하 참조). 세포들을 다시 트립신 처리하고, 원심분리 시켜 10 % FBS와 8 % DMSO 내에서 재현탁 하였다. 이러한 세포 용액을 액체 질소에 저장하였다.

예 2 - 혈액이나 골수 세포들의 배양

골수 이식의 성공률은 연령이 높을수록 떨어지므로, 조혈기능 복원에는 어린(신생아) 세포들이 바람직하다고 추론할 수 있다. 유사하게도 노화는 세포 배양에서 골수 기질 세포들의 중요한 결정 인자이기도 하다. 나이 든 쥐들로부터 분리한 기질 세포들은 어린 쥐들로부터 분리한 것들보다 더 천천히 성장한다. 따라서 노화된 골수 세포들이 세포 대체 요법에 사용되기 이전에 시험관 내에서 재생시키는 것이 바람직하다.

적혈구는 시험관 내 재생에 사용될 수 있는 말단 분화된 세포들의 신속 간편한 원천을 제공한다. 나트륨 헤파린을 항응고제로 사용하여 10 ㎖ 혈액 표본을 채집하고 이를 15 ㎖ 튜브에 첨가하여, EDTA(3 mM)를 포함하는 인산염-완충 식염수(PBS)에 4 분하여 희석하였다. 희석된 혈액을 50 ㎖ 코니컬 튜브(conical tube) 내의 Ficoll-Hypaque 배지(Sigma, St. Louis MO)로 옮겨넣어 20 ℃에서 30 분 동안 스윙 버킷 로터(swinging-bucket rotor)에서 400 rpm으로 계속해서 원심분리하였다. 상층(혈장)을 제거하고 간기 세포층(림프구 및 단핵구를 포함)을 제 2의 50 ㎖ 튜브로 조심스럽게 옮겨 넣었다. 2 mM EDTA를 포함하는 PBS를 전체 30 ㎖ 부피에 첨가하고 300 rpm으로 10 내지 20 분 더 원심분리 하였다. 이러한 세척 단계를 반복하고, 세포 펠렛을 가스를 제거한(degassed) 완충액(PBS, pH 7.2, 0.5 % 우혈청 알부민(BSA)과 2 mM EDTA로 보충함) 300 ㎕ 내에서 재현탁하였다. 상기 세포들을 75 내지 100 ㎜ 플레이트 상의 DMEM 배지(Invitrogen) 내에 재현탁하였다. 줄기 세포들을 포함한 생 단핵구들이 약 30 분 내에 플레이트에 붙게 된다. 남아있는 적혈구들과 다른 백혈구들은 여전히 배지에 현탁되어 있고, 단순히 배지만 교체하여 세 척하였다. 플레이트에 붙어있는 세포들을 트립신 처리하고 재생 목적으로 사용하였다. 선택적으로, MiniMacs 분리 키트(Miltenyi Biotec, Auburn, CA)를 사용하여 CD34-양성 선조 세포들을 더 분리할 수 있다. 백혈구 펠렛을 채집하여 10 % FBS와 줄기 세포 인자(SCF, 10 ng/㎖), Flt3 리간드(FL, 10 ng/㎖), 인터루킨-3(IL-3, 20 ng/㎖), IL-6(10 ng/㎖), IL-11(10 ng/㎖), 트롬보포이에틴(TPO, 50 ng/㎖) 및 에리트로포이에틴(EPO, 4 단위/㎖)으로 보충한 Myelocult 배지(H1500, Stem Cell Technologies, Vancouver, BC, Canada)에 배양하였다. EMD Biosciences, San Diego, CA, and BD BioSciences, San Jose, CA로부터 사이토카인(cytokine)을 구입하였다. 상기 배양물을 5 % CO₂로 보충한 공기에서 37 ℃로 배양하였다.

예 3 - 재생 인자로서 배아 추출물의 제제

초기 발달 단계(예컨대, 태아 및 배아)에서 채집한 조직들은 세포 재생을 위한 재생 인자들의 뛰어난 원천이다. 하기 쥐 태아 간 예는 그 절차를 도시한다.

임신한 쥐로부터 태아를 채집하여 태아 간을 절개하여 얼음 냉각한 PBS를 포함하는 페트리 접시로 옮겨 넣는다. 살균한 가위나 면도칼을 이용하여 간 조직을 작은 조각들로 잘게 썰고, PBS에 담긴 채 유리 균질화기(glass homogenizer)로 옮겨 넣는다. 절구 공이가 약 20 분 동안 상하로 움직임에 따라, 간 조직이 균질화 시켰다. 상기 세포들을 나일론 층을 통과시켜 섬유성 연결 조직 제거하고, 4 ℃ 600 rpm으로 10 분 동안 원심분리하였다. 세포들을 얼음 냉각 추출 완충액(50 mM HEPES, pH 7.4, 50 mM KCl, 5 mM MgCl2, 2 mM 베타-메르캅토에탄올 및 5 mM EGTA)으로 2 회 세척하였다. 하기 프로테아제 억제제들을 더 포함하는 동일한 완충액으로 세포들을 세척하였다: 사이토칼라신(cytochalasin) B, 류펩틴(leupeptin), 아프로티닌(aprotinin) 및 펩스타틴 A(각각 10 ㎍/㎖). 얼음 상에서 5 분 동안 배양한 후에, 세포들을 1000 rpm으로 1 분 동안 원심분리하였다. 상층액을 조심스럽게 제거하여 용액 부피의 대략 절반 정도를 남겨 두었다.

세포들을 3회 동결/해동 사이클(-80 ℃에서 상온으로)을 거치게 하고, 4 ℃에서 12,000 rpm으로 30 분 동안 원심분리하였다. 상층액 추출물을 채집하여 2 % 글리세롤을 첨가하였다. 0.6 ㎖ 튜브 내에서 분취량(0.1 ㎖)을 액체 질소에서 동결시키고 -80 ℃에서 저장하였다.

이와 같은 태아 및 배아 추출물들은 노화된 세포, 조직, 기관 및 전체 포유류 신체를 재생하는 인자들이 풍부하다. 다른 태아 조직, 태아 전신, 배아 및 태반을 추출함으로써 본 방법도 이용할 수 있다.

예 4 - 재생 인자들 목적의 배아 줄기 세포들(ESC들)의 제제

ESC들을 트립신 처리하여(예 1 참조) 1.5 ㎖ 튜브 내에 약 2 x 10⁷ 개의 세포들을 채집하였다. 예 3에서 기술한 바와 같이, 우선 세포들을 얼음 냉각 추출 완충액으로 2 회 세척하고, 이후 동결/해동 사이클(-80 ℃에서 상온으로)을 3 회 실시하고, 4 ℃에서 12,000 rpm으로 30 분 동안 원심분리하였다. 상층액 추출물을 채 집하여 2 % 글리세롤을 첨가하였다. 0.6 ㎖ 튜브 내에서 상층액 분취량(0.1 ㎖)을 액체 질소에서 동결시키고 -80 ℃에서 저장하였다.

본 방법은 세포 재생에 사용 목적을 위한 다른 조직 줄기 세포, 제대혈 줄기 세포 및 재생된 새로운 세포들로부터 세포 추출물을 분리하는 데 사용될 수도 있다. 본 방법은 또한 태아, 배아 및 태아 조직들과 같은 조직들로부터 조직 추출물들을 추출하는 데 사용될 것이다.

예 5 - ESC 핵 추출물들로부터 재생 인자들의 제제

상술한 방법(Tian et al, DNA Repair (Amst), 2002, 1:1039-49)을 이용하여 ESC들의 핵 추출물들을 정제하였다. 간단하게는 상온에서 2200 rpm으로 5 분 동안 원심분리하여 ESC들을 수확하고 냉각된 PBS의 5 배 세포 부피로 이를 1 회 세척하였다. ESC들은 완충액 A, 10 mM HEPES 완충액의 저장성 완충액, 1.5 mM MgCl₂, 10 mM KCl, 0.5 mM DTT의 5 x 세포 부피 내에 현탁시켰다. 4 ℃를 유지한 채, 유리 균질화기(Wheaton A Dounce 균질화기, 약 10 행정)를 사용하여 ESC들을 용해시켰으며, 2200 rpm으로 15 분 동안 원심분리하여 핵들을 채집하였다. 상기 핵들을 완충액 C(10 mM HEPES 완충액, 25 % 글리세롤, 1.5 mM MgCl₂, 420 mM NaCl, 0.5 PMSF, 0.5 mM 디티오트레이톨[DTT])의 ½ 핵 부피에 담구어 추출하고, 4 ℃에서 30 분 동안 흔들고(필요하다면 상기 Dounce 내에서 다시 균질화시킴) 동결/해동 사이클(-80 ℃에서 상온으로)을 3 회 거쳤다. 상기 현탁액을 4 ℃에서 30 분 동안 고속(12,000 rpm, SS-34)으로 원심분리하였다. 그 다음 냉장실에서 완충액 D(20 mM HEPES, pH 7.9, 20 % 글리세롤, 0.2 mM EDTA, 100 mM KCl, 0.5 mM 페닐메틸설포닐플루오라이드[PMSF] 및 0.5 DTT)의 50 부피 초과에 대하여 상층액을 투석하였다. 완충액을 교체하고 용액 D의 50 부피 초과에 대하여 2.5 시간 동안 투석하였다. 상층액을 30 ㎖ 코르텍스 튜브들로 옮겨 넣고 4 ℃ HB-4 로터에서 10,000 rpm으로 20 내지 30 분 동안 회전시켰다. 단백질 농도를 측정하여 25 내지 30 mg/㎖ 단백질로 조절하여 액체 질소에서 0.1 ㎖ 분취량으로 동결시키고 이후 세포 재생의 목적으로 -80 ℃에서 저장하였다.

본 방법은 다른 조직 줄기 세포들, 제대혈 줄기 세포들 및 재생된 세포들로부터 핵 추출물들을 분리하는 데에도 사용될 수 있다.

예 6 - 노화된 세포들을 재생시키는 방법

다양한 어린 포유류 피검체의 조직이나 세포들로부터 채집한 세포 또는 핵 추출물들을 이용하여 시험관 내에서 노화된 세포들을 재생할 수 있다. 재생한 이후에, 상기 세포들은 더 강한 효력을 가진다. 재생한 이후, 노화 과정에서 상실한 세포들의 기능성이 회복되었다. 피부 섬유아세포들을 사용하여 그 절차를 예시하였다.

섬유아세포들은 예 1에 언급한 바와 같이 제조되었다. 간단히 말해서, 섬유아세포들을 트립신처리하고 1.5 ㎖ 튜브들 내에서 약 3 x 10⁵ 세포의 분취량으로 채 집하였다. 세포들을 얼음 냉각한 항크스액(HBSS)으로 세척하고 300 내지 1000 ng/㎖ 스트렙토라이신 O(SLO, Sigma)로 37 ℃에서 1 시간 동안 사전처리하여 세포 간극 연결을 개방하였다. 200 ㎕ 얼음 냉각 HBSS로 세척한 이후에, 세포들을 4 ℃에서 1200 rpm으로 3 분 동안 원심분리하였고, 세포들을 완충액 T(20 mM HEPES, pH 7.3, 110 mM KAc, 5 mM NaAc, 2 mM MgAc, 1 mM EGTA, 2 mM DTT 및 아프로티닌, 펩스타틴 A와 류펩틴 각각 1 ㎍/㎖)으로 세척하였다. 원심분리한 이후에, 1 ㎎/㎖ BSA, 1 mM ATP, 5 mM 인산크레아틴, 25 ㎍/㎖ 크레아틴 키나아제(Sigma), 0.4 U/㎖ RNase 억제제(Invitrogen) 및 4 종류의 dNTP들(뉴클레오티드 트리포스페이트) 각각 1 mM 및 완충액 T 내에서 제제된 ESC 핵 추출물들을 포함하는 재생 완충액 20 ㎕ 내에서 세포 펠렛을 현탁시켰다(Martys JL et al, 1995 J. Biol. Chem 270:25976-84; Hansis C et al, 2004 Curr Biol 14:1475-80). 간헐적으로 두드려주며 수조 내의 37 ℃에서 약 1 시간 동안 세포들을 배양하였다. 이러한 재생 단계 이후에, SLO에 의하여 개방된 막공들을 재봉인하기 위하여 6-웰 플레이트 내에서 2 mM CaCl₂와 항생제들을 포함하는 KO-DMEM을 첨가하여 세포들을 재봉인하였다. 재생된 섬유아세포들이 융합(confluent)될 때까지 KO-DMEM 배지를 매일 교체하였다. 세포들을 트립신 처리하였으며, 100 ㎜ 플레이트들로 분리시켰다. 도 2는 태아 추출물로 처리된 신생세포들(도 2D)과 ES 세포 핵 추출물들로 처리된 신생세포들과 비교한 섬유아세포 대조군(도 2A와 2B)을 도시한다. 섬유아세포 대조군은 아주 느린 속도로 성장하여 융합성에 이르지 않았다; 세포들이 광범위하게 분리되어 플레이트 내에서 드물 게 분포하였다. 이에 반하여, 신생세포들은 급속히 성장하여 융합성에 이르렀다; 신생세포들은 군집이 잘 되어 있어 함께 모여 있다. 이러한 재생 세포들을 미래에 사용을 목적으로 액체 질소에 저장하였다.

몇 가지 변형예들이 고찰대상이다. 단백질 효소들(예컨대, 트립신과 콜라게나아제), 세제류(디지토닌) 및 전기천공법도 세포 재생전 세포막 사전처리에 이용될 수 있다. 독자적인 연구에서(데이타 미도시), 태아 조직 추출물 부피의 반과 ESC들의 핵 추출물 부피의 반을 사용하면 최적인 것을 보였다. 태아 조직 추출물들은 노화된 세포들의 재생을 위한 개시인자(initiator)로 작용하며, ESC의 핵 추출물들은 재생 과정을 촉진시키는 부스터(booster)의 역할을 하였다.

이 절차에 의하여 재생하는 세포들은 미처리 원 세포들과 동일한 형태를 유지하였다. 그러나, 재생된 세포들은 세포 대조군보다 더 높은 세포 증식률과 더 나은 세포 기능을 가졌다. 예를 들어, 재생된 섬유아세포들은 미처리 섬유아세포들보다 더 많은 콜라겐과 엘라스틴들을 합성하였는데, 이는 미용 치료요법들에서 가치가 있음을 보여주는 것이다(하기 데이터 참조). 재생된 골수 세포들이나 조혈 줄기 세포들은 액체 암, 백혈병 및 화학요법 치료로 유발된 조혈 이상(hematopoietic dysfunction)의 치료에 유용할 것이다. 재생된 세포들이 길이가 더 긴 텔로미어들과 텔로머라아제 활성이 더 높을 것이라고도 기대한다.

예 7 - 피부 조직의 재생

이것은 노화된 피부 조직의 더 간단한 재생 방법이다. 예 1에서와 같이 피부 생검 조직을 구하였고 이를 10 % FBS와 100 U/㎖ 페니실린 및 100 ㎍/㎖ 스트렙토마이신으로 보충한 DMEM 배지 내에서 성장시켰다. 하룻밤 동안의 배양 이후에, 상기 피부 조직은 플레이트에 들러붙었다. 상기 배지를 제거하고 제생 완충액 50 ㎕와 재생 인자들(ESC 핵 추출물들) 50 ㎕를 상기 피부 조직에 첨가하였다. 피부 조직들을 37 ℃에서 4 시간 동안 재생시켰으며, 이후에 FBS와 2 x DMEM의 1 부피를 첨가하였다. 매 2일 마다 배지 교체를 하명 2 주 동안 피부 조직들을 배양하였다. 도 3은 왼편이 미처리 피부를 도시하는데, 섬유아세포들이 약간 생성하였다. 오른편의 재생된 피부는 피부로부터 나와서 피부와 닿는 면에 들러붙은 새롭게 성장하는 많은 세포들을 가진다. 이러한 데이터는 개별 세포들뿐만 아니라 피부 조직도 재생이 가능하다는 것을 예증한다. 재생한 이후에, 피부는 어린 피부의 기능을 얻으며 새로운 세포들을 더 많이 성장시킨다. 따라서, 이러한 재생 절차를 이용하여 조직이나 기관들을 복구하고 노화된 조직이나 기관들의 기능을 회복하는 데 이용될 수 있다.

상기 절차를 이용하여 노화된 쥐로부터 분리한 골수 기질 세포들을 재생하였다. 노화된 쥐로부터 분리된 골수 기질 세포 대조군은 아주 느리게 성장하였다(도 2A). 태아 간 추출물들로 재생한 이후에, 기질 세포들은 매우 건강해 보였고 좀 더 빠른 속도로 배가하였다(도 2H). 흥미로운 것은 ESC 핵 추출물들로 재생된 기질 세포들이 배양 중에 더 잘 성장하였다는 것이다(도 2I).

예 8 - 쥐 피부 섬유아세포들의 배아 줄기-유사(ESL) 신생세포들로의 재생

쥐 섬유아세포의 세포계(FNSK1; Hu et al, MoI Endocrinol 1995, 9:628-36; Hu et al, J Biol Chem 1996, 271:18253-62))를 쥐 ESC의 핵 추출물들에 의하여 시험관 내에서 재생시켰다. 3 번의 선택 단계들을 취하여 섬유아세포들을 ESL 신생세포들로 탈분화시켰다. 이러한 특수한 선택 절차 이후에, 충분히 재프로그램된 그러한 세포들만이 선택 배지 내에서 성장하였다. 1) 상기 재생된 세포들을 우선 역 소적 내에서 성장시킨 이후에 20 % FBS, 1x 항생제들(100 U/㎖ 페니실린과 100 ㎍/㎖), 1 mM 글루타민, 1 % 비필수 아미노산들, 0.1 mM 베타-메르캅토에탄올, 4 ng/㎖ bFGG, 0.12 ng/㎖ TGF-β 및 10 ng/㎖ LIF로 보충된 녹아웃 DMEM(KO-DMEM) 내의 0.35 % 아가로스 젤 상의 현탁액 내에서 성장시켰다. 2) 상기 ESL 군집을 선택하여 이후 배아 섬유아세포 피더 세포들 상에서 성장시켰다. 배양한 이후에, 몇몇 세포들은 덩어리져서 ESC와 동일한 형상을 가지는 작은 신생세포 군집을 형성하였다. 2 일 더 성장한 이후에, 상기 신생세포 군집들은 더 자라났다(도 4D). 3) 세포 군집들을 조심스럽게 집어내어 신선한 피더 세포들 상에서 씨를 내렸다(도 4F). 이렇게 유도된 세포들을 FN-ESL이라고 부르며, 개체수가 늘어나면서 액체 질소에 저장하였지만, ESC 표지들을 위해 남겨지며 분석되는 1 분취량은 제외하였다. 이런 실험은 시험관 내의 재생 방법 이후에 탈분화 프로토콜이 이어지면 섬유아세포들이 ESL 세포들로의 탈분화 유도가 가능하다는 것을 보여준다. 그들의 형상과 텔로머라아제의 존재를 (ESC들과 공통으로) 기반으로(예 9와 20 참조), 이러한 FN-ESL 세포들이 세포 요법 내의 ESC들처럼 기능 할 것이라고 기대된다.

이러한 가설을 시험하기 위하여, EB들을 배양된 FN-ESL 세포들로부터 성장시 켰다. FN-ESL 세포들을 37 ℃ 1000 U/㎖ LIF가 존재하는 20 % FBS와의 KO-DMEM 배지 내에서 배양시켰다. 기하급수적으로 성장하는 FN-ESL을 트립신 분리에 의하여 채집하였고 뒤집은 페트리 접시의 덮개 위로 소적들(20 ㎕)을 달라 붙이는 세포 현탁액을 만들었다. 상기 접시의 바닥을 PBS나 물로 채웠다. 3 일 후에, EB들이 형성되어 0.1 % 젤라틴으로 사전-코팅된 신선한 배양 접시 위에 이들을 채집하였다. FN-ESL에 의한 EB들의 형성은 FN-ESL이 ESC들처럼 작용한다는 것을 보여준다.

예 9 - FN-ESL 세포들 내에서의 ESL 표지들의 발현

트립신-EDTA를 사용하여 플레이트들로부터 FN-ESL 세포들을 채집하였다. 삼-시약(Tri-Reagent) 방법(Sigma, St. Louis, MO)에 의하여 세포들로부터 전체 RNA를 추출하였다. cDNA 합성에서 DNA 오염을 제거하기 위하여, RNA 표본들을 우선 DNase로 처리하였고; 이후 cDNA를 RNA 역전사 효소로 합성하였다(Vu and Hoffman, J Biol Chem 1996, 271:9014-9023; Hu et al, MoI Endocrinol 1995, 9:628-36; Hu et al, J Biol Chem 1996, 271:18253-62).

이전에 서술된 Vu 1996, ibid ; Yao et al, J Clin Invest 2003, 111 :265-73에서와 같이 cDNA 표본들 내에서의 PCR에 의하여 유전자 발현이 시험되었다. 50 μM dNTP, 1 nM 프라이머, 0.125 U KTl DNA 폴리머라아제가 존재하는 3.0 ㎕ 반응 혼합물 내에서 cDNA 표본들을 증폭시켰다(Hu et al, J Biol Chem, 1997, 272-20715-20; Yao, 2003, ibid). 상기 cDNA들과 프라이머들을 95 ℃에서 1.5 분 동안 가열한 이후에, 95 ℃에서 15 초 동안, 65 ℃에서 40 초 동안 그리고 72 ℃에서 30 초 동안 35 사이클로 증폭시켰다. PCR 생성물들은 5 % 폴리아크릴아미드-우레아 젤 상에서 전기영동을 거치며 포스포이미지(phoshoImage) 스캐너(Molecular Dynamics, Sunnyvale, CA)로 스캔하였다. mRNA 수량화(quantitation)를 위하여 하기의 PCR 프라이머들을 사용하였다.

Oct4: 5'-프라이머(#3284)-AGCACGAGTGGAAAGCAACTCAGA (서열 ID 번호: 1)

3'-프라이머(#3285)-CTTCTGCAGGGCTTTCATGTCCTG (서열 ID 번호: 2)

Ndp52Ll: 5'-프라이머(#3288)-TAGAAGAGATGGAACAGCTCAGTGA (서열 ID 번호: 3)

3'-프라이머(#3289)-ATTGACCCTCTGTGTTGCTTCCAGT (서열 ID 번호: 4)

Dppa3: 5'-프라이머(#3290)-CTATAGCAAAGATGAGAAGACTTGT (서열 ID 번호: 5)

3'-프라이머(#3291)-TGCAGAGACATCTGAATGGCTCACT (서열 ID 번호: 6)

β- actin: 5'-프라이머(#1483)-TGAGCTGCGTGTGGCTCCCGA (서열 ID 번호: 7)

3'-프라이머(#1484)-GATAGCACAGCCTGGATAGCA (서열 ID 번호: 8)

도 5는 100 bp DNA 표지들에 대한 1 및 14 레인을 도시한다. 2, 6, 10 및 15 레인은 재생되지 않은 섬유아세포 대조 세포들의 결과들을 포함한다. 3, 7, 11 및 15는 초기 ESL 신생세포들의 결과들을 포함한다. 4, 8, 12 및 17 레인은 신생세포 군체들의 결과들을 포함한다. 5, 9, 13 및 18 레인은 피더 세포들 상에 성장한 신생세포들의 결과들을 보여준다. 섬유아세포 대조군은 말단 분화되었으며 3 가지 ESC 지표들(Oct-4, Ndp2L1 및 Dppa3)을 발현하지 않았다. 그러나, 상기 재생된 신생세포들의 3 개 기(stage) 모두가 상기 3 가지 ESC 지표들을 높은 수준으로 발현하였다. 내부 대조(internal control) β-액틴은 대조군들을 포함하여, 모든 세포 유형들에서 동등하게 발현되었다. 이러한 데이터는 시험관 내 재생 방법이 체세포들을 다능성이며 세포 요법에서 ESC들의 대체에 유용한 다른 세포들과 조직들로 분화할 수 있는 ESL 신생세포들로 탈분화할 수 있다는 것을 예증한다.

예 10 - 시험관 내 후생적 재프로그래밍에 의한 다능성 세포들의 형성

선행 예에서, 섬유아세포들은 트립신화되었으며, 약 10⁶ 개의 세포들이 1.5 ㎖ 튜브들 내로 분취된다. 상기 튜브들을 원심분리하여 상층액을 따라 내었다. 이후 50 ㎕ 트립신-EDTA(Invitrogen)를 첨가하여 그 혼합물을 37 ℃에서 5 분 동안 배양하여 세포막들을 침투하였다. 상기 세포들을 1200 rpm으로 3 분 동안 원심분리하여 세포들을 펠렛화 하였다. 세포들을 완충액 T(20 mM HEPES, pH 7.3, 110 mM KAc, 5 mM NaAc, 2 mM MgAc, 1 mM EGTA, 2 mM DTT 및 아프로티닌, 펩스타틴 A와 류펩틴 각각 1 ㎍/㎖). 이후 20 ㎕ 재생 완충액(2 ㎎/㎖ BSA, 2 mM ATP, 10 mM 인산크레아틴, 40 U/㎖ 크레아틴 키나아제, 0.5 ㎕ RNase 억제제, 5 ㎕ 완충액 T, 10 ㎕ ES 또는 배아 추출물) 에서 세포들을 재현탁 하였으며 37 ℃에서 1 시간 동안 재생시켰다. 재생 과정의 말기에, 10 % FBS, 1 x 항생제들(페니실린 100 U/㎖과 스트렙토마이신 100 ㎍/㎖), 1 mM 글루타민, 1 % 비필수 아미노산들, 0.1 mM 베타-메르캅토에탄올, 4 ng/㎖ 염기성 섬유아세포 성장 인자(bFGF), 0.12 ng/㎖ TGF-β1 및 10 ng/㎖ 백혈병 억제 인자(LIF)로 보충된 KO-DMEM 280 ㎕를 재생 용액에 첨가하였다.

예 6에서와 같이, 세제류(예컨대, 디지토닌), 스트렙토라이신 O(STO) 또는 전기천공법도 이용되어 세포 재생 전에 세포막을 사전처리할 수 있다.

재생한 이후에, 세포들은 직접 플레이트 되는 경우에 다능성 ESL로 자동적으로 탈분화 하지 않는다. 그러나, 재생된 세포들은 배가 시간이 짧으며 다른 개선된 생리학적 기능들을 가지고 있다. 하기 3-단계 선택 과정을 이용하여 완전히 재프로그램된 세포들을 분리하였다.

재생된 세포들을 20 ㎕ 소적 내에서 성장시켰다. 세포 소적들을 100 ㎜ 플레이트의 덮개 상에 놓고, 이후 플레이트를 조심스럽게 뒤집었다. PBS를 플레이트의 바닥에 두었다. 세포들을 하룻밤 동안 배양시켰다. 재생된 세포들은 본 기에서 고도로 이동성이 강하다; 대부분이 상향 이동하여 플레이트의 코팅되지 않은 덮개에 들러붙었다. 덮개에서 세포들을 떼어내기 위하여, 세포들을 트립신화 하였다. 모든 세포 소적들을 이어지도록 모아서, 여기에 1 ㎖ KO-DMEM을 첨가하였다. 이후 상기 세포들을 피더 세포들 상에서 성장시켰다(미재생된 세포들이나 재프로그램되지 않은 세포들). 매일 배지를 교체하여 재생된 세포들이 유지되었다. 덩어리진 ESL 세포 군체들을 선택하여 0.5 % 아가로스 젤의 상부 상에 4 ng/㎖ bFGF, 0.12 ng/㎖ TGF-β1과 10 ng/㎖ LIF로 보충된 KO-DMEM 내에 현탁된 세포들로 성장시킨다. 재프로그램되지 않은 세포들과 부분적으로 재프로그램된 세포들은 현탁 배지 내에서 생존하지 않았다. 몇몇 계대들(2 내지 4 일)을 지난 이후에, 덩어리진 ESL 신생세포들을 피더 세포층 상에서 성장하도록 옮겨 넣었다. ESC들의 유사한 형태를 지니고 건강한 세포 유형의 세포들을 선택하여 ES 표지들을 더 분석하기 위하여 개체수를 늘렸다. 몇몇 계대들을 지난 후에, 이러한 세포들을 액체 질소 내에 보관하거나 혈구형 검사(cell typing)과 분화 분석용으로 사용하였다.

이러한 3 단계의 특별한 처리(역 소적, 아가로스 상에 세포 현탁 및 ESC 선택)를 거친 후에, 이러한 배양된 신생세포들은 노화된 원 세포들과는 상이한 세포 형태를 가졌다. 이러한 신생세포들은 다능성이며 세포 요법에서 정상적인 불균일 ESC들을 대체할 수 있다. 이러한 세포들은 수용주(recipient)로부터 유래하였기 때문에, 자가 신생세포들은 제대혈 줄기 세포들 및 다른 세포 이식체들을 사용하여 발생할 수 있는 이식편대숙주 반응들을 유발하지 않는다.

예 11 - 인간 피부 섬유아세포들을 시험관 내 후생적 재프로그래밍에 의하여 다능성 신생세포들로 전환

49 세 남성으로부터 얻은 섬유아세포들을 배양하여 다른 사전처리들과 다른 세포 추출물들로 시험관 내에서 재생시켰다. 재생한 이후에, 신생세포들을 선택하여 아가로스 젤 상에 성장시켰으며 현미경으로 신생세포 군체들의 사진들을 촬영하였다. 트립신-EDTA(도 6B), 스트렙토라이신 O(도 6C), 디지토닌(도 6D) 및 전기천공법(도 6E)으로 섬유아세포들을 사전처리하면 미처리 대조 섬유아세포들(도 6A)과 비교하여 재생된 세포들을 유사하게 생성하였다는 것을 데이터는 명백히 보여주었다. 또한, ESC 핵들(도 6F), GC 세포들(도 6G), 배반포들(도 6H) 및 제포푸스 난자들(도 6I)의 추출물들에 의하여 섬유아세포들이 유사하게 재생되었다.

예 12 - 복제-결손(replication-defect) ESC 융합에 의한 다능성 신생세포들의 형 성

몇몇 연구 그룹들은 ESC들과의 시험관 내 잡종형성반응이나 융합에 의하여 체세포들(예컨대, 섬유아세포들)로부터 ESC들을 형성하였다고 보고하였다(예컨대, Tada et al, Current Biology 2001, 11:1553-58; and Cowan et ctl, Science 2005, 309:1369-73). 그러나, 그렇게 형성된 ESC들은 표적 세포와 ESC들 양쪽의 게놈을 포함하는 사배체세포들이다. 사배체세포들은 유전적으로 불안정하다고 여겨지기 때문에 임상용으로 바람직하지 않다.

이러한 문제를 해결하기 위하여, "ESC 복제-결손"(ESR) 방법을 이용한 체세포들로부터 사배체가 아닌 이배체 다능성 ESC들을 만들어 내는 신규한 접근법을 개발하였다. 이 방법에서, ESC들의 게놈이 상기 융합의 새롭게 들어온 세포들을 복제하지 않거나 기여하지 않도록 ESC들을 재프로그래밍하는 DNA 복제의 복잡한 일련의 절차(machinery)를 우선 무력화시켰다. ESC 복제를 당분간 비활성화시키지만, 기존의 게놈은 여전히 mRNA와 이후 표적 세포를 ESC로 분화전환시키는 데 필수적인 재프로그래밍 인자들의 단백질들을 생성한다. 가장 중요한 것은 이러한 것들은 개별화된 ESC이며 그래서 질병 치료에 ESC들을 대체하는 데 유용하다는 것이다.

DNA 복제를 무력화시키는 데 이용되는 방법들은 방사선, 화학 합성물, 화합요법, 바이러스 및 물리적 처리에 ESC들의 노출을 포함하지만, 여기에 제한되지 않는다. 이러한 방법들을 이용하여 피더 세포들의 DNA 복제를 블로킹한다. DNA 복제를 무력화시키는 두 가지 방법들을 ESC들에서 시험하였다.

일 방법에서, ESC들을 방사선(세슘, 3000 rds)에 노출시켰다. 노출한 이후 에, ESC DNA를 손상시켜 딸 세포들의 생성을 위한 복제가 일어나지 않게 된다. 그러나, 이렇게 처리된 ESC들은 최대 1 주일까지 배양액에서 생존하며, 세포 재프로그래밍에 필요한 유전자들을 포함한 많은 유전자들이 여전히 활성화되어 있으며 단백질을 발현하고 있다. 따라서, 방사선에 조사된 ESC들은 체세포들을 다능성 ESC들로 전환시키는 재프로그래밍 인자들을 제공하는 신뢰할 만한 소스로 이용될 수 있다. 복제-결손 특성으로 인하여, ESC의 게놈은 복제하지 않았으므로 세포 융합 이후에 딸 세포들의 게놈에 기여하지 않았다.

다른 방법에서, ESC들을 0.5 ㎍/㎖ 액티노마이신 D에 하룻밤 동안 노출시켜 DNA 복제를 비활성시켰다. 처리 이후에, 액티노마이신 D는 ESC들의 DNA 복제를 차단하였지만, 단백질 합성의 복잡한 일련의 절차는 손상되지 않은 상태를 유지한다. 세포 융합 이후에, 처리된 ESC들은 융합 세포들의 재프로그래밍 인자들에 기여하였지만 딸 세포들의 게놈에는 기여하지 않았다. 몇몇 선택 계대를 거친 이후에, 그러한 이배체 ECS들만이 성장하였고 치료용으로 이용가능하였다.

세포 융합을 위해, 동일한 양의 복제-결손 ECS들과 표적 체세포들(예컨대, 섬유아세포들)을 혼합하여 CMF 완충액(칼슘과 마그네슘이 없는 HBSS)으로 2 회 세척하였다. 세포 펠렛을 원심분리하여 잔존하는 완충액을 완전히 제거하였다. 그 이후 튜브를 가볍게 두드려 세포 펠렛을 느슨하게 하며 혼합시키고, 이후 1.5 내지 2 ㎖ PEG(폴리에틸렌 글리콜 1500, Cat. No. 783641, Roche, Germany)를 1 분에 걸쳐 첨가하였다. 세포와 PEG를 혼합시키기 위하여, 튜브를 다시 가볍게 두드리고 회전시켰다. 그 다음으로 사전-보온한(37 ℃) PMF 완충액(0.2 M PIPES, pH 6.95, 2 mM MgSO4 및 4 mM EGTA) 20 ㎖를 3 내지 5 분에 걸쳐 한 방울씩 세포 송이들을 부수지 않고 첨가하였다. PMF 완충액 20 ㎖를 더 서서히 첨가하고 튜브를 조심스럽게 거꾸로 돌려 세포들을 혼합하였다. 이후 세포들을 1200 rpm으로 5 분 동안 원심분리하였고 4 ng/㎖ bFGF와 0.12 ng/㎖ TGF-β1으로 보충된 KO-DMEM 배지로 재현탁 시켰다. 상술한 바와 같이, 융합된 세포들을 아가로스 젤의 상이나 젤라틴-코팅된 플레이트 상에서 현탁한 상태로 배양시켰다.

또한, 전기천공법과 바이러스-매개성 세포 융합을 이용하여 융합 세포들을 복제-결손 ESC들과 표적 세포들로부터 융합 세포들을 만들어낼 수 있다. 전기천공법에 대하여, 동일한 양의 복제-결손 ESC들과 표적 체세포들을 혼합하여 PBS 내에서 3 회 세척하였다. 세포들을 10⁶ 세포/㎖의 농도로 0.3 M 마니톨 완충액 내에서 현탁 시켰다. 1-㎜ 전극 간격을 지닌 슬라이드 글래스들이 있는 BTX Electro Cell Manipulator 2000(BTX, Holliston, MA)을 이용한 전기 융합(E = 2.5 내지 3.0 KF/㎝)에 의하여 잡종 세포들이 생성되었다. 융합 이후에, 4 ng/㎖ bFGF와 0.12 ng/㎖ TGF-β1으로 보충된 KO-DMEM 배지 내에서 세포들을 배양하고 선택하였다.

융합 이후에, 복제-결손 ESC들에 의해 제공된 인자들에 의하여 융합된 세포들 내에서 체세포들의 핵들이 후생적으로 재프로그래밍 된다. 몇 번의 계대를 거친 이후에, 원 복제-결손 ESC들의 게놈은 완전히 사라지고 융합 세포들 내에 재프로그램된 체세포 게놈을 남겨 두었다. 선택 이후에, 배양된 새로운 세포들은 다능성을 가지게 되었으며 이배체세포들이므로, 세포 대체 요법에서 유용하였다.

데이터는 방사선(도 7A와 7B)과 액티노마이신 D(도 7C와 7D)가 결함이 있는 DNA 복제를 유발하였다는 것을 보여주었다. 세포 융합 이후에, 이배체 ESL-신생세포들을 선택하여 개체수를 늘렸다. 이러한 이배체 ESL-신생세포들은 환자로부터 얻은 ESC들이며 재프로그래밍 공여자 세포들(E12 ESC들)의 게놈을 오염시킬 위험은 없었다. 이러한 융합된 세포들은 ESC들과 동일한 형상과 성장 속도를 가졌다. 유사하게도 융합된 세포들은 Oct4, Nanog 및 Stellar의 ESC 생물지표들을 발현시켰다. 따라서, 융합된 세포들은 세포 대체 요법에 유용하다.

예 13 - 다능성 신생세포들의 분화

도 8은 노화된 세포들을 다능성 신생세포들을 재생시키고 이후 분화된 세포들를 재생시키는 진보적인 절차를 요약한 것이다. 도 1과 같이, 노화된 세포들을 우선 채집하여 적절한 배지에 배양시켜 세포 개체수를 늘렸다. 세포들을 세포막 투과화제(예컨대, 트립신/EDTA)에 노출시켜 세포의 간극 연결을 개방한 이후에, 재생 완충액 내의 재생 인자들로 세포들을 재생시켰다. 재생시킨 이후에, 특이적인 성장 인자들로 보충된 적절한 배지 내에서 세포들을 성장시켰다. 이후 피터 세포들이나 코팅된 매트릭스(예컨대, 매트리젤 또는 아가로스) 상에서 다능성 신생세포들의 군체들을 선택하였다. 선택된 신생세포들은 배아 줄기 세포들(ESC들)이나 다른 조직-특이적 줄기 세포들의 기본적 특징들을 가지며 세포 요법에서 ESC들과 줄기 세포들을 대체하는 데 유용하다. 이러한 신생세포들의 장점들 중 하나는 이들이 동일한 환자로부터 유래하여 환자에게 되돌려질 때 면역 거부반응에 걸릴 확률 상당히 줄 이거 제거한다는 것이다. 다른 장점은 인간 배아의 사용을 기피하기 때문에 신생세포들이 세포 요법에 사용될 경우 윤리적으로나 정치적으로 우려되는 바가 없다는 것이다.

이러한 방법들은 세포들의 유형에 따라 변하게 된다. 일반적으로, 배아 줄기 세포들을 분화시키는 데 이용되는 방법들은 ESL-신생세포들의 분화에 적절하다는 것이다. 하기는 신생세포들이 지방세포와 골세포들로 어떻게 미분화되는지를 보여주는 예이다.

1000 U/㎖의 LIF가 존재하는 37 ℃의 20 % FBS로 보충된 KO-DMEM 배지 내에서 ESL 신생세포들을 배양시켰다. 세포 페트리 접시의 덮개 상으로 소적들(30 ㎕)이 들러붙도록 세포 현탁액을 만들었다. 접시 바닥을 PBS로 채웠다. 2 일 후에, 배상체들(EB들)이 형성되며 0.1 % 젤라틴으로 사전 코팅된 신선한 배양 접시 상에 이들을 채집하였다. 지방세포 분화에 대하여, 들러붙은 EB들을 올-트랜스-래티노산(ATRA) 10^-6 M로 3 일 동안 처리한 이후에 인슐린 10^-7 M과 트리요오드티로닌(T3) 10^-9로 처리한다. 조골세포 분화에 대하여, 아스코르브산 인산염 3 x 10^-4 M과 γ-글리세로인산염을 포함하는 배지에서 5 일째 되는 날에 시작한 1,25(OH)₂ 비타민 D₃ 10^-8 M으로 EB들을 처리하였다. 배양액들을 10, 20 및 30 일에 종결시켰고 면역조직화학적 염색에 사용하였다. 분화 이후에, 지방세포와 골세포들의 형성을 면역조직 화학적 염색에 의해 확인하였다.

분화된 지방세포들의 지질을 염색하기 위하여, 세포들을 PBS로 세척하였으며 상온에서 2 분 동안 10 % 중성 포르말린 내에 고정시켰다. 세포들을 수돗물로 헹군 이후에, 기름 방울들이 현미경으로 그 염색이 육안으로 확인될 때까지인 10 내지 12 분 동안 Oil-Red-O로 세포들을 염색하였다. 이후 슬라이드들을 50 % 이소프로판올과 수돗물로 헹궜다. 세포들을 헤마톡실린으로 10 분 동안 대비염색하였다. 분화된 지방세포들을 광학 현미경으로 관찰하였다(도 9G). 미처리 섬유아세포 대조군에서는 지질 염색이 없었다(미도시). 이에 비하여, 분화 이후에, FN-ESL 신생세포들은 세포질 내에 축적되는 지질들을 합성하였다. 이러한 데이터는 FN-ESL 신생세포들이 지방세포들로 분화되는 잠재력을 지녔으며 지방세포들로 분화하였다는 것을 나타낸다.

예 14 - FN-ESL 신생세포들의 골격 근세포들로의 분화

EB들이 상술한 바와 같이 형성되었다. 그로부터 FN-ESL 세포들(약 5 x 10⁵)을 20 % FBS, 2 mM L-글루타민, 1 x 비필수 아미노산들, 450 μM 모노티오글리세롤(Sigma) 및 항생제들로 보충된 Iscove's Modified Eagle 배지(Invitrogen) 내의 뒤집힌 10 ㎜ 세균학적 페트리 접시들로 옮겨 넣었다. 5 내지 7 일 후에, EB들을 0.1 % 젤라틴 코팅된 6-웰 조직 배양 접시 상에 웰 당 7 내지 10 EB들의 밀도로 플레이트 시키고 4 일 동안 배양하였다. 세포들을 Dulbeccos-PBS(D-PBS)로 세척하였으며, 2 % 비활성화된 말 혈청과 C1C12 배양 배지(0.2 ㎛ 필터로 여과시킴)의 상층 액 1 ㎖로 보충된 DMEM 2 ㎖/웰로 배양시켰다. 배지를 2 내지 4 일 동안 매일 교체하였다. 미분화하는 동안 근관세포(myotube) 형성은 현미경 관찰에 의하였다.

면역조직화학적 염색에 의하여 골격근의 분화를 확인하였다. 분화된 세포들을 D-PBS로 3 회 세척하였으며 5 분 동안 100 % 에탄올로 고정시켰다. 백그라운드를 0.05 내지 0.1 % 사포닌을 포함하는 D-PBS 내에서 1 내지 2 %의 정상적인 염소 혈청으로 상온에서 1 시간 동안 블록킹 하였다. 제 1 항체를 BSA 4 ㎎/㎖과 0.05 내지 0.1 % 사포닌을 포함하는 D-PBS 내에서 희석시켰다. 쥐의 항-MHC 제 1 항체(Sigma, 1:500)를 첨가하였고 상온에서 1 내지 3 시간 동안 또는 4 ℃에서 하룻밤 동안 배양시켰다. 이후 세포들을 D-PBS로 5 회 세척하였다(고속 헹굼 2 회, 15 분 동안 1 회 및 5 분 동안 2 회). 제 2 항체 용액(염소 항-쥐 1:1000)을 첨가하여 상온에서 0.5 내지 1 시간 동안 배양시켰다. 0.05 % 사포닌을 포함하는 D-PBS로 5 회 세척한 이후에, 세포들을 Zeiss Axiovert 200 역 형광 현미경으로 관찰하였다.

대조 세포들 내에서 골격근 단백질의 면역염색은 없었다(미도시). 분화 이후에, FN-ESL 신생세포들은 덩어리지고 근관세포들로 융합되며 골격근-특이적 단백질들을 합성하였다(도 9F). 이러한 데이터는 FN-ESL 신생세포들이 골격근들로 분화되는 잠재력을 지녔으며 골격근들로 분화하였다는 것을 나타낸다.

예 15 - FN-ESL 신생세포들의 심근세포들로의 분화

20 % FBS, 1000 U/㎖ LIF, L-글루타미, 비필수 아미노산들 및 베타-메르캅토에탄올로 보충된 녹아웃 Dulbecco's modified Eagle 배지(KO-DMEM) 내의 BMM2/NG 피더 세포들 상에서 FN-ESL 신생세포들을 배양시켰다. BMM2/NG 피더 세포들을 30 그레이(Gray)의 γ선-조사로 사전처리하여 그 복제를 중단시켰다. FN-ESL 신생세포들을 LIF가 존재하는 KO-DMEM 내에서 약 2.0 x 10⁶ 세포들의 밀도로 페트리 박테리아 배양 접시들 내에 씨를 내렸다. 3 일 후에, EB들을 채집하여 10 % FBS/KO-DMEM의 ! % 마트리젤 코팅된 조직 배양 접시들로 플레이트 시켰다. 2 시간 후에, 100 ng/㎖ 액티빈 A를 배지에 첨가하여 세포들을 24 시간 동안 배양시켰다. 배지를 10 % FBS/KO-DMEM으로 다시 대체하고 6 시간 동안 배양하였다. 이후 배지에 10^-6 M ATRA를 첨가하여 24 시간 더 세포들을 배양시켰다. 10 ng/㎖ bFGF로 보충된 10 % FBS/KO-DMEM으로 세포들을 처리하고 3 일 동안 배양시켰으며, B27, 라미닌 1 ㎍/㎖, 10 mM 니코틴아미드 및 10 ng/㎖ bFGF로 보충된 DMEM/F12(1:1)을 포함하는 N2 배지로 교체하였다. 이러한 N2 배지는 투석할 때까지 매일 교체하였다.

N2 배지 내에서 4 일째 되는 날에, 배양액 내에서는 휘젓는(beating) 세포 클러스터들이 있었다. 휘젓는 심근세포들 일부를 슬라이드에 옮겨 넣고, 4 ℃에서 하룻밤 동안 PBS 내의 4 % 파라포름알데히드에 의하여 고정시킨 이후에 인산염 완충액으로 2 회 세척하였다. 비-특이적 결합 사이트들을 상온에서 1 시간 동안 말 혈청으로 블로킹하였다. 제 1 및 제 2 항체로의 배양은 상온에서 1 시간이었다. 하기 제 1 항체들 및 희석액들을 사용하였다: 인슐린 AB-6쥐 모노클로날 항체(Lab Vision, Fremont, CA) 1:200, 트로포닌 T 쥐 모노클로날 항체(Lab Vision, Fremont, CA) 1:100 및 항-C-펩티드 항체(LINCO Research, Inc., St. Louis, MO) 1:100. 제 2 간편-사용(ready-to-use) 만능 항체(universal antibody)를 제작자 지침에 따라 사용하였다. DAB(3,3'-디아미노벤지딘)을 반응 기질로 사용하였다. Zeiss Axiovert 200 역 현미경으로 이미지들을 캡쳐 하였다(도 9C 내지 E).

이러한 데이터는 FN-ESL 신생세포들이 기능성의 휘젓는 세포들로 분화할 수 있다는 것을 보여준다.

예 16 - FN-ESL 신생세포들의 인슐린-분비 판크레아 베타 세포들로의 분화

EB들이 상술한 바와 같이 형성되었다. 쥐 ESC에 대하여 서술된 3-단계 방법(Shi et al, Stem Cells, 2005, 23:656-62)을 약간 변형 이용하여 인슐린-분비 세포들을 분화시켰다. 간편-사용 Vectastain 만능 급속 키트(Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA)를 사용하여 표준 면역조직화학적 프로토콜을 수행하였다. 간단히 말해서, 세포들을 4 ℃에서 하룻밤 동안 PBS 내의 4 % 파라포름알데히드에 의하여 고정시킨 이후에 PBS로 2 회 세척하였다. 비-특이적 결합 사이트들을 말 혈청으로 블로킹시킨 이후에 세포들을 인슐린 Ab-6 쥐 모노클로날 항체(1:200; Lab Vision)와 항-D-펩티드 항체(1:100; Linco Research, Inc.)로 배양시켰다. 제 2 간편-사용 만능 항체를 제작자 지침에 따라 사용하였다. DAB를 반응 기질로 사용하였다. Zeiss 역 현미경으로 이미지들을 캡쳐 하였다. 대조 세포들에서는 인슐린의 면역염색이 없었다. 분화 이후에, 몇몇 FN-ESL 신생세포들은 세포섬들로 덩어리지는 것으로 관찰되었다. 섬의 세포들은 세포질 내에서 육안으로 볼 수 있는 인슐린을 합성하였다(도 9C 및 9D에서는 갈색). 더 오랫동안 유도하면 큰 덩어리 세포들 내 에서 인슐린 신호들의 축적으로 이어진다. 이러한 데이터는 FN-ESL 신생세포들이 인슐린-유도 세포들로 분화되는 잠재력을 지녔으며 인슐린-유도 세포들로 분화하였다는 것을 보여준다.

예 17 - FN-ESL 신생세포들의 신경 세포들로의 분화

Zhang et al에 의해 이전에 기술된 방법(2001, Nat Biotechnol 19:1129-33)에 의하여 FN- ESL 신생세포들로부터 신경 외배엽 세포들의 세대를 달성하였다. 간단히 말해서, EB들로 덩어리가 지면, 분화하는 ESC들은 FGF-2 존재시에 수많은 신경관-유사 구조들을 형성하였다. 신경 전구체들을 그 미분 부착(differential adhesion)을 기초로 하여 분리하여 정제하였다. FGF-2를 뇌-유도 신경영양성 인자(BDNF)로 대체한 후에, 세포들은 뉴런들, 성상세포들 및 희소돌기아교세포들(oligodendrocytes)로 분화하였다. 신경 세포들의 면역조직화학적 염색을 이전에 서술한 대로(Zhang ibid.) 실행하였다. 본 연구에 사용된 제 1 항체들은 네스틴(Chemicon, Temecula, CA, 1:750)과 βIII-튜불린(Covance Research Products, Berkeley, CA, 1:2000)에 대항하는 다클론성 항체들을 포함하였다. 적절한 형광 제 2 항체들(도 9A 및 9B)을 사용하여 항원들을 시각화하였다. 이러한 데이터는 ESL 신생세포들이 신경 세포들로 분화할 수 있으며 분화하였다는 것을 보여준다.

예 18 - 인간 윌름스 종양 세포계(Human Wilms' Tumor Cell)의 ESL 신생세포들로의 전환하는 방법

인간 세포들을 신생세포들로의 전환을 예시하기 위하여, 상술한 방법을 이용한 쥐 ESC 핵 추출물들에 의하여 인간 윌름스 종양 세포계(WTCL)를 시험관 내에서 재생시켰다. 재생된 세포들을 배양시키고 배아 섬유아세포 피더 세포들 상에서 선택하였다. 배양한 이후에, 몇몇 세포들은 덩어리가 지며 ESC 형태를 지닌 작은 신생세포 군체들을 형성하였다. 세포 군체들을 조심스럽게 집어 올려 피더 세포들 상에 씨를 내렸다. 도 10 A는 미변환 WTCL 종양 세포들을 보여준다. 도 10 B는 WT-ESL 신생세포 군체들을 보여준다. 도 10C는 피더 세포들 상의 WT-ESL 싹들(sprouts)을 보여준다; 그리고 도 10D는 피더 세포들 상에 WT-ESL 신생세포 군체를 보여준다. 이러한 결과들은 시험관 내 재생 방법은 인간 세포들을 배아 줄기-유사 세포들로의 세포 탈분화를 유도할 수 있었다는 것을 보여준다. 이후 이러한 WT-ESL 신생세포들을 상술한 방법들을 이용하여 다양한 세포 유형들로 미분화시킬 수 있다. 재생한 이후에, 종양 세포들은 더 적은 수의 아가-겔-형성 군체들에 의해 보여지는 바와 같이 종양-생성 능력이 전혀 없거나 더 낮은 수준을 보여주고 있으며 누드 쥐들에서는 종양이 전혀 없었다. 이러한 재생-유도 탈분화는 종양 요법들의 개발에 혁신적인 전략을 제공할 수 있다.

예 19 - 일-단계 재생 및 분화(OSRD) 프로토콜

상술한 바와 같이, 노화된 체세포들을 우선 다능성 신생세포들로 재생시킨 이후에 이후 지방세포들, 골세포들, 심장세포들, 골격근 및 인슐린-분비 세포들과 같은 다른 세포들로 분화시켰다. 이러한 절차들은 몇 개월이 걸릴 수 있다. 그 과 정들을 촉진시키기 위하여, ESC 핵 추출물들을 재생 인자들로 특이적 세포 추출물들을 분화 유도체로 사용하여 이러한 두 가지 절차들을 단순한 일-단계 프로토콜(이하 OSRD 절차)로 결합시켰다. 하기는 섬유아세포들로 시작하여 골격근으로 종결한 예이다. 섬유아세포들을 ESC들의 핵 추출물들과 근육 추출물들로 동시에 처리하였다.

섬유아세포들(약 10⁶ 개 세포들)을 1.5 튜브들 내에 분취시켰다. 50 ㎕ 트립신-EDTA(Invitrogen)으로 처리하고, 완충액 T로 세척한 이후에, 세포들을 ESC 핵 추출물들과 골격근 추출물들을 포함하는 재생 완충액(1 ng/㎖ BSA, 1 mM ATP, 5 mM 인산크레아틴, 25 ㎍/㎖ 크레아틴 키나아제(Sigma), 2 U RNasin[Promega, Madison, WI], 100 μM GTP 및 1 mM dNTP들(뉴클레오티드 삼인산염)) 50 ㎕ 내에 재현탁 시켰다. 세포들을 37 ℃에서 1 시간 동안 재생시켰다. 이후 처리된 세포들을 20 % FBS, 1 x 항체들(100 U/㎖ 페니실린과 100 ㎍/㎖ 스트렙토마이신), 1 mM 글루타민, 1 % 비필수 아미노산들, 0.1 mM 베타-메르캅토에탄올, 4 ng/㎖ bFGF, 0.12 ng/㎖ TGF-β1 및 10 ng/㎖ LIF로 보충된 KO-DMEM 내의 역 소적들 내에서 성장시켰다. 2 일 째 날 오전 동안에, 역 소적들을 채집하여 결합하였고, 채집된 세포들을 2 % 비활성화된 말 혈청과 쥐 근원세포(C1C12) 배양 배지(0.2 ㎛ 필터에 의하여 여과됨)의 상층액 1 ㎖로 보충된 DMEM 내에서 젤라틴-코팅된 플레이트 상에서 성장시켰다. 배지를 2 내지 4 일 동안 매일 교체하였다. 분화하는 동안에 형성된 근관세포들을 면역형광 염색법으로 검사하였다.

현미경 사진들과 면역조직화학적 염색에 의하여 골격근의 형성을 검사하였다. 재생한 이후에, 섬유아세포들은 아가로스 겔 상에서 작은 EB들로서 성장하였다(도 11A). 분화시에, 세포들은 덩어리져서 근관세포들로 융합되며 골격근-특이적 단백질들을 합성하였다(도 11C). 이러한 데이터는 일-단계 재생 분화를 이용하면 섬유아세포들은 직접 재생되며 골격근으로 분화될 수 있음을 보여준다.

예 20 - 텔로머라아제의 재활성화

진성(true) 생식 세포들과 줄기 세포들은 텔로미어들을 대체하여, 이들이 헤이플릭 한계를 겪는 것을 방지시키는 텔로머라아제라 불리는 효소를 포함한다. 인간 생식 세포들과 암 세포들의 약 85 % 내에서, 인간 텔로머라아제 역전사 효소(human TElomerase Reverse Transcriptase, hTERT)와 RNA 주형은 새로운 텔로미어들을 발생시키기에 충분하다.

상술한 재생된 세포들이 생식 세포들과 줄기 세포들과 텔로머라아제의 존재를 공유하는지의 여부를 결정하기 위하여 TRAP 분석법(Kim NW et al, Science 1994 266:2011-15)에 의한 텔로머라아제 활성을 측정하였다. 도 12는 미재생 및 재생된 섬유아세포들을 위한 텔로머라아제 생성물들을 보여준다. 인간 피부 JH1 섬유아세포들과 쥐 피부 FNSK6 섬유아세포들을 각각 포함하는 2 레인과 3 레인에서 보이는 바와 같이 미재생 세포들은 검출할 수 있을 만큼의 텔로머라아제 생성물을 가지지 않는다. 6 레인에서 보여진 ESC 결과들과 같이, 두 가지 유형의 재생된 세포들은 세포들 내에서의 텔로머라아제 활성의 증거인 텔로머라아제 생성물들을 생성하였 다(4 레인과 5 레인).

예 21 - 조직 또는 기관들을 재생시키는 생체 내 방법들

핵 추출물들, 배아 줄기 세포들의 세포 추출물들, 줄기 세포들, 제대혈 줄기 세포들 및 신생세포들을 포함하는 상술한 재생 인자들도 생체 내 재생 방법들에 직접 사용하여 조직, 기관 및 신체를 재생시킬 수 있다. 재생 인자들을 국소적으로 주입하여 이를 전신적으로 달성할 수 있거나 원하는 활성 사이트에 재생 인자들을 주입하여 이를 달성할 수 있다. 이를 도 13에 요약해 두었다.

생체 내 재생의 예로서, 오른손에 몇 가지 상처-유발 염색 부위(injury-caused pigmented area)들을 지닌 한 남성 지원자의 피부 색소형성(skin pigmentation)의 제거를 시험하였다. 상기 피부에 국소적으로 바른 핵 추출물들이나 ES 세포들의 세포 추출물들로 피부를 재생시킬 수 있다(예컨대, 색소형성과 주름살들을 제거). 재생되는 부위를 우선 70 % 이소프로필 알코올로 살균하였다. 이후 트립신-EDTA(Invitrogen) 층을 상기 부위에 바르고 말리지 않은 채 10 분 동안 유지하였다. 이후 상기 피부를 0.9 % 식염수 용액으로 세척하였다. 1 x 재생 완충액 내에 제조한 인간 ESC 핵 추출물들에 올-거즈-스펀지(ALL-Gauze-sponge)의 2 개 층들을 적셔 상기 침투되는 부위에 가볍게 발랐다. 기화를 방지하기 위하여, ES-추출액을 적신 스펀지를 얇은 플라스틱으로 덮고 그 플라스틱의 끝 부분들을 적절한 테이프로 피부에 봉하였다. 하룻밤 동안 재생시킨 이후에, 피부를 0.9 % 식염수로 세척하고 피부 로션의 얇은 층을 재생 부위에 발랐다. 이 절차를 2 주 동안 주당 1 또는 2 회 반복하였고 필요한 만큼 반복할 수 있다. 도 14A는 처리 전 염색된 피부 부위(화살표)를 보여준다. 도 14B는 처리 2 주 후의 덜 염색된 부위를 보여준다. 재생한 이후에, 피부는 부드럽고, 윤이 나며 생생해졌다. 색소형성도 재생 처리 이후에 사라졌다. 환자는 불쾌감을 전혀 경험하지 않았다. 이러한 데이터는 조직을 생체 내에서 재생시키는 것이 고도로 개연성이 있다는 것을 보여준다.

피부를 재생시키는 다른 방법은 주당 2 회씩 ESC들과 줄기 세포들의 핵 추출물들이나 세포 추출물들을 피하로 주사하는 것이다. 핵 추출물들의 인자들은 피부 세포들을 재생시키고 색소형성과 주름살들을 제거한다. 피부를 재생시키는 또 다른 방법은 ESC들, 줄기 세포들 또는 제대혈 줄기 세포들을 피하로 주사하는 것이다. 주사된 세포들은 피하에서 증식하고 피부 세포들을 재생시키는 성장 인자들을 분비하며 색소형성 및 주름살들을 제거한다.

예 22 - 전신을 재생하는 방법

상기 개시된 재생 인자들을 전신으로 전달하여 전신을 재생시킬 수 있다. 재생 인자들은 ESC들, 줄기 세포들, 제대혈 줄기 세포들 및 신생세포들로부터 유래한 핵 추출물들 및 세포 추출물들을 포함하지만 여기에 제한되지 않는다. 줄기 세포들, 제대혈 줄기 세포들 및 신생세포들을 포함하는 배양된 세포들도 이러한 목적에 사용될 수 있다. 신체를 재생시키기 위하여, ESC들, 줄기 세포들, 제대혈 줄기 세포들 및 신생세포들의 핵 추출물들이나 세포 추출물들을 정맥내 주사, 피하 주사, 근육내 주사, 척수강내 주사, 비강 스프레이, 서방성(slow-release) 펠렛들, 국소 처리법 등을 포함하는 알려진 실용적인 임상 방법들을 이용하여 인체에 직접 투여할 수 있다. 핵 추출물들이나 세포 추출물들 내의 재생 인자들을 신체의 모든 조직과 기관에 노출시켰다. ESC, 줄기 세포들, 제대혈 줄기 세포들 및 신생세포들도 보통의 방법들을 이용하여 투여될 수 있다. 이러한 세포들은 조직들과 기관들에 이르게 될 때 생존하여 증식할 수 있다. 국소적으로, 세포들은 분화되어 노화된 세포들을 대체할 것이다.

일 연구에서, 재생 인자들은 전신성으로 사용되어 동물들을 재생시켰다. 노화한 흉선을 제거한 쥐들(nu+/nu+, 2 년 생)을 3 군으로 나누었다. 1 군(쥐 2 마리)은 ESC 추출액들을 쥐 한 마리당 추출물 1 ㎖로 총 3 주 동안 주당 2 회씩 꼬리의 정맥으로 받았다. 2 군(쥐 2 마리)은 PBS 대조 용액을 정맥으로 받았다. 3 군(쥐 2 마리)은 GN-ESL 신생세포들을 주당 2 회씩 꼬리 정맥으로(1 ㎖에 약 10⁷ 개) 받았다. 음식 소비와 체중을 매 2 일씩 기록하였다. 동물의 움직임을 카메라로 기록하였다.

도 15A와 15C는 PBS-대조군의 노화된 쥐들을 도시한다. 도 15B는 ESC 추출물들로 재생된 쥐들을 도시한다. 도 15D는 신생세포들로 재생된 쥐들을 도시한다. 3 주 동안의 처리 이후에, 대조군은 체중, 음식 소비, 외관 및 활동을 포함한 모든 측정된 변수들에서의 상당한 변화를 전혀 겪지 않았다. 그러나, ESC 추출물이나 FN-ESL 신생세포들로 처리된 쥐들은 체중에 상당한 변화가 없었다고는 하지만, 더 많은 음식을 소비하였다. 동시에, 재생된 쥐들은 대조군 쥐들보다 육체적으로 더 활발하고 더 정력적이었다. 가장 흥미로운 것은 대조군 동물들보다 재생된 쥐들의 엷게 주름진 피부가 더 부드러워지고, 두터워 졌으며 더 건강해졌다. 예비적이기는 하지만, 이러한 데이터는 ESC 추출물이나 FN-ESL 신생세포들에 의한 재생으로 노화된 동물들의 생명을 개선 시킨다는 것을 제시한다.

이러한 생체 내 재생 방법들은 면역 기능 증진, 일반적인 신체 건강 개선, 스포츠 능력의 향상, 질병과 마비 증세 회복 보조, 사람의 수명 연장, 중추신경계의 선천성 결함들 교정, 상처입거나 노화된 기관들(예컨대, 심장, 신장, 간 및 뇌) 복구, 노화된 백발을 젊고 검은 머릿결로 변환, 피부 주름들 및 색소형성 감소 및 알츠하이머병, 파킨슨병, 근위축성 측색 경화증(루게릭병)과 뇌졸중과 같은 신경변성 질병들의 치료에 이용될 수 있다.

예 23 - 2-단계 시험관 내 세포 재프로그래밍에 의한 체세포들의 다능성 배아 줄기-유사(ESL) 세포들로의 재생

1. 사전프로그래밍 벡터 구성. 쥐의 체세포 재프로그래밍에 대한 우리의 연구에서 처럼, 3 가지 인간 ES 세포 전사 인자들(Oct4, Sox2 및 Nanog)을 포유류 발현 벡터(pEGFP-N3, Clontech, Palo Alto, CA)로 클로닝 시켰다. 인간 ES 세포계 H7(NIH 코드 WA07)으로부터 제제된 cDNA를 이용한 PCR을 사용하여 전사 인자들을 증폭시켰다. 전장 cDNA 생성물들을 제한 효소들(Nhe1, Bg12와 EcoR1)로 소화시키며 pEGFP N3 벡터로 클로닝시켰다(도 16). 이러한 전사 인자들은 2 개의 프로모터들(각각 pCMV와 pTK)의 조절 하에 발현되며 내부 리보솜 진입 사이트(IRES)와 전사 종말 폴리 A 신호들(BGH-pA 및 SV40-pA)에 의해 분리되었다. 최종 프로그래밍 벡터(pES)는 pCMV -Oct4-IRES-Sox2-BGHpA- pTK -Nanog-IRES-EGFP-SV40pA의 직렬 순서로 3 가지 전사 인자들과 EFGP 단백질을 가진다(도 16). Oct4와 Sox2는 CMV 프로모터(pCMV)에 의하여 전사되는 반면에, Nagog과 EFGP는 TK 프로모터(pTK)에 의하여 조종된다. EGFP를 사용하여 벡터 단백질들을 발현시키는 세포들을 추적한다.

2. ES 세포 전사 인자들을 이용한 인간 섬유아세포들의 사전프로그래밍. 10 % 우태혈청, 100 U/㎖ 페니실린과 100 ㎍/㎖ 스트렙토마이신으로 보충된 DMEM 배지(Invitrogen, Carlsbad, CA) 배지 내에 4 가지 세포계들(HFB1, JHF1, HSF1 및 HBS1)을 유지시키며 5 % CO₂로 37 ℃에서 성장시켰다. 기하급수적으로 성장하는 세포들(2x105 개)을 제조자 지침을 따라서 Lipofectamine 2000(Invitrogen)으로 캡슐된 사전프로그래밍 pES 벡터 DNA(4 ㎍)를 이용하여 잠정적으로 형질변환시켰다. 형질변환된 지 72 시간 후에, 벡터 단백질들을 발현하는 세포들을 FACS(FACSVantage SE, Becton Dickinson)에 의하여 정렬시키고 새로운 6-웰 플레이트들 내에 씨를 뿌렸다. 콘플루언스 이후에, 세포들을 채집하여 하기에 서술된 제 2-단계 재프로그래밍에 사용하였다.

3. ES 핵 추출물들을 이용한 사전프로그래밍된 세포들의 후생적 재프로그래밍. 상기 3 가지 ES 전사 인자들을 이용한 재프로그래밍 이후에, 세포들을 ES 세포 추출물들로 처리하여 섬유아세포 게놈의 발생형을 충분히 리셋하였다. 이전에 서술된 방법(Tian et al, DNA Repair(Amst), 2002, 1:1039-49)을 이용하여 인간 H7 ES 세포계로부터 배아 줄기 세포들의 핵 추출물들을 추출하였다. 500 ng/㎖ 스트렙토라이신(Sigma, St. Louis, MO)으로 세포들을 막-침투시켰으며(Taranger CK, Noer A, Sorensen AL, Hakelien AM, Boquest AC, Collas P. Induction of dedifferentiation, genomewide transcriptional programming, and epigenetic reprogramming by extracts of carcinoma and embryonic stem cells. MoI Biol Cell 2005;16:5719-5735; Hansis et al, Curr Biol 2004, 14:1475-1480) 10 ㎕ 수송 완충액(20 mM HEPES, pH 7.3, 110 mM KAc, 5 mM NaAc, 2 mM MgAc2, 1 mM EGTA, 2 mM DTT5 및 아프로티닌, 펩스타틴 A 및 류펩틴 각각 1 ㎍/㎖) 내에서 현탁시켰다. 이후 막-침투된 세포들을 37 ℃에서 재프로그래밍 완충액(2 mg/ml BSA, 2 mM ATP, 10 mM 인산크레아틴, 40 U/ml 크레아틴 키나아제 및 20 U/ml RNASE OUT (Invitrogen)) 내에서 제제된 H7 ES 세포 추출물들 10 ㎕를 첨가하여 1 시간 동안 재프로그래밍시켰다. 세포 재프로그래밍 이후에, 세포막을 2 mM CaCl₂로 봉인하였으며 10 % FBS, 1x 항생제들(100 U/㎖ 페니실린 및 100 ㎍/㎖ 스트렙토마이신), 1 mM 글루타민, 1 % 비필수 아미노산들, 0.1 mM 베타-메르캅토에탄올, 4 ng/㎖ 염기성 섬유아세포 성장 인자(bFGF) 및 0.12 ng/㎖ TGF-β1으로 보충된 500 ㎕ KO-DMEM 배지(Invitrogen) 500 ㎕을 첨가하여 반응을 중단시켰다.

4. 충분히 재프로그래밍된 세포들의 선택. 페트리 접시들의 덮개 상의 소적들(20 ㎕)에 상기 처리된 세포들을 달라붙여 충분히 재프로그래밍된 세포들을 선택하였다. 달라붙은 소적들 내에서, 충분히 재프로그래밍된 세포들은 무더기로 덩어 리지고 페트리 접시들의 덮개에 부착되는 반면에, 재프로그래밍되지 않은 세포들은 개별 세포들로서 배지 내에 머무른다. 무더기를 이룬 재프로그래밍된 세포들을 페트리 접시들의 덮개로부터 채집하여 성장 인자들로 보충된 KO-DMEM 배지 내의 피더 세포들 상에서 성장시켰다. 그렇게 충분히 재프로그래밍된 세포들은 그 세포 형태를 ES 세포들 쪽으로 더 변화시켜 피더 세포들 상의 전형적인 ESL 세포 클론들을 형성하였다. ESL 세포 클론들을 채집하여 Ludwig et al.(Ludwig TE, Bergendahl V, Levenstein ME, Yu J, Probasco MD, Thomson JA. Feeder-independent culture of human embryonic stem cells. Nat Methods 2006;3:637-646.)이 서술한 피더-독립성(feeder-independent) mTeSR1 배양 배지 내에서 개체수를 늘렸다.

5. 충분히 재프로그래밍된 ESL 세포들은 다능성이었다. 이전에 일 연구에서 M. Spretus 수컷들과 C57B/c 암컷들로부터 유래한 쥐 섬유아세포 세포계 FSK6 내에서 이러한 재프로그래밍 방법을 시험한 것을 보였다(Hu, et al, 1996, J Biol Chem 271:18253- 62). 조건 배지 내에서 선택한 이후에, FSK6 섬유아세포들을 ES 세포들과 동일한 세포 형태를 보였던 ESL 세포들로 전환시켰다. 재프그래밍된 세포들은 ES-특이적 생물표지들(Oct4, Ndp52L1 및 Dppa3)을 발현시켰으며 활성화된 텔로머라아제 활성을 가졌다(도 5). 이 경우에, 이러한 ESL 세포들(도 17B 및 17C에 도시됨)도 수많은 다른 세포 유형들로의 분화에 의하여 보여진 바와 같이 다능성이었다.

이러한 데이터는 체세포들이 우리의 시험관 내 재프로그래밍 프로토콜에 의하여 효율적으로 재프로그래밍될 수 있다는 개념을 증명하였다.

본 발명은 예시적인 방식으로 서술되었으며, 사용된 용어는 제한적이라기보다는 서술적인 성격으로 의도되었음을 이해하여야 한다. 본 발명의 수많은 변형과 변경사항들은 상기 가르침의 견지에서 가능하며, 당업자는 이러한 가르침의 견지에서 본 발명의 청구항들의 사상에서 벗어나거나 그 범위를 초과하지 않으면서 다른 실시예들과 변형들을 창출할 수 있다. 그러므로, 첨부된 청구항들의 범위 내에서, 본 발명은 구체적으로 서술된 것과는 다른 방식으로 실시될 수 있음을 이해하여야 한다. 따라서, 여기에 쓰인 도면들과 서술들은 예시적으로 제공되어 본 발명의 이해를 용이하게 하였으며 그 범위를 제한하는 것으로 해석되지 않아야 함을 이해하여야 한다.

Claims

a. 노화된 체세포들을 포함하는 표본(sample)을 제공하는 단계;

b. 재생 추출물(rejuvenating extract), 알부민, ATP, 인산크레아틴, 크레아틴 키나아제, RNase 억제제 및 뉴클레오티드 인산염류(nucleotide phosphates)를 포함하는 재생 용액을 제공하는 단계;

c. 상기 노화된 세포들을 상기 재생 용액과 결합시켜 상기 재생 용액의 성분들이 상기 세포들을 침투하는 데 충분한 시간 동안 배양하는 단계; 및

d. 세포 배지, 염화 칼슘 및 선택적으로는 항체들의 용액을 첨가하여 재생된 세포들을 생성시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 노화된 세포들을 재생시키는 방법.
청구항 1에 있어서,

상기 재생된 세포들은 자가(autologous) 세포들인 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 1에 있어서,

상기 배양 배지는 bFGF와 TGF-β1을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 1에 있어서,

상기 재생 추출물은 난자, 수정란, 배반포, 배아, 제대혈 줄기 세포, 조직- 특이적 줄기 세포, 줄기 세포 원시 생식 세포(primordial germ cell), 태아, 배아 줄기 세포, 태아, 특이적 태아 조직 또는 그것의 조합물로부터 선택된 초기 발달기의 세포들로부터 추출되는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 4에 있어서,

상기 재생 추출물은 세포들 또는 핵들을 포함하는 세포들의 부분들로부터 추출되는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 4에 있어서,

상기 재생 추출물은 세포 주기의 임의의 기에 있는 세포들이나 핵들로부터 또는 세포 주기의 다양한 기들에 있는 복수의 세포들이나 핵들로부터 구해지는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 4에 있어서,

상기 특이적 태아 조직은 간인 것을 특징으로 하는 방법.
a. 노화된 체세포들을 포함하는 표본을 제공하는 단계;

b. 재생 추출물, 알부민, ATP, 인산크레아틴, 크레아틴 키나아제, RNase 억제제 및 뉴클레오티드 인산염류를 포함하는 재생 용액을 제공하는 단계;

c. 상기 노화된 세포들을 상기 재생 용액과 결합시켜 상기 재생 용액의 성분 들이 상기 세포들을 침투하는 데 충분한 시간 동안 배양하는 단계;

d. 세포 배지, 염화 칼슘 및 선택적으로는 항체들의 용액을 첨가하는 단계;

e. 플레이트의 덮개 상이나 코팅되지 않은 페트리 접시 상에 역으로(inverted) 달라붙은 소적 내에서 단계 d의 상기 재생된 세포들을 세포 덩어리 형성을 촉진하도록 충분한 시간 동안 성장시키는 단계;

f. 희석 아가로스 젤 상이나 코팅되지 않은 페트리 접시 내에서 배상체들(EB들)을 형성하도록 현탁액 내에서 상기 세포 덩어리들(cell aggregations)을 성장시키는 단계;

g. 성장 인자들로 보충된 적절한 배지의 피더 세포들의 상부 또는 코팅된 플레이트 상 또는 디스크들 또는 마트리젤 상에 EB 세포들을 배양시키는 단계; 및

h. 그 군체의 세포들이 줄기 세포들과 동일한 형태를 가진 군체들을 선택하여, 상기 체세포들이 세포 요법 및 미용 용도의 응용을 위하여 다능성 세포들로 탈분화되는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 세포를 다능성 배아 줄기-유사(ESL) 세포들로 재생시키는 방법.
청구항 8에 있어서,

상기 세포 덩어리 형성을 촉진하는 데 충분한 시간은 약 두 시간 내지 하룻밤 동안인 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 8에 있어서,

상기 희석 아가로스 젤은 약 0.2 % 내지 약 2 % 아가로스인 것을 특징으로 하는 방법.
a. ESC들로부터 mRNA를 추출하는 단계;

b. 적어도 하나의 리포솜 전달 시약 내에서 mRNA를 캡슐화하는 단계;

c. 체세포들을 mRNA의 리포솜들로 노출시키는 단계;

d. 플레이트의 덮개 상이나 코팅되지 않은 페트리 상에 역으로(inverted) 달라붙은 소적 내에서 상기 노출된 체세포들을 세포 덩어리 형성을 촉진하도록 충분한 시간 동안 성장시키는 단계;

e. 희석 아가로스 젤 상이나 코팅되지 않은 페트리 접시 내에서 배상체들(EB들)을 형성하도록 현탁액 내에서 상기 덩어리진 세포들을 성장시키는 단계;

f. 성장 인자들로 보충된 적절한 배지의 피더 세포들의 상부 또는 코팅된 플레이트 상 또는 디스크들 또는 마트리젤 상에 EB 세포들을 배양시키는 단계; 및

g. 줄기 세포들의 형태를 지닌 세포 군체들을 선택하여, 상기 체세포들이 세포 요법 및 미용 용도의 응용을 위하여 다능성 세포들로 탈분화되는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 ESC mRNA 형질전환에 의하여 체세포들을 다능성 ESL 세포들로 재생시키는 방법.
청구항 11에 있어서,

상기 단계 a의 다능성 세포들은 배아 줄기 세포들(ESC들), 원시 생식 세포 들(PGC들), 태아 세포들, 난자들, 수정란들, 제대혈 줄기 세포들, 조직 줄기 세포들, 배반포 세포들 또는 그 조합인 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 11에 있어서,

상기 단계 d의 충분한 시간은 약 2 시간 내지 하룻밤(overnight) 동안인 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 11에 있어서,

단계 b와 c는 체세포들을 전기천공하여 다능성 세포들로부터 mRNA를 형질전환하는 단계로 대체하는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 14에 있어서,

상기 체세포들을 전기천공하는 단계는 바이러스들에 의하여 상기 mRNA를 상기 체세포들로의 이입을 바이러스-매개하는 단계로 대체하는 것을 특징으로 하는 방법.
a. ESC들을 제공하는 단계;

b. 상기 ESC들 내에서 DNA 복제를 무력화시키는 단계;

c. 상기 비-복제 ESC들을 다수의 상기 체세포들과 혼합시키는 단계;

d. 상기 비-복제 ESC들과 상기 체세포들에 폴리에틸렌 글리콜을 첨가하여 이 를 융합시키는 단계;

e. 상기 융합된 세포들을 역 소적들 내에서 성장시켜 덩어리진 세포들을 생성하는 단계;

f. 상기 덩어리진 세포들을 희석 아가로스 젤 상의 현탁액 내에서 1 내지 10 계대(passage)들을 거쳐 성장시켜 배상체들(EB들)을 생성하는 단계; 및

g. 성장 인자들로 보충된 적절한 배지의 피더 세포들 상이나 코팅된 플레이트들 상 또는 마트리젤 상에서 EB들을 성장시키는 단계; 및

h. 줄기 세포들의 정형적인 형상을 지니고 포유류 개체-특이적 이배체 ESL 세포들을 포함하는 세포 군체들을 선택하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 ESC들을 포유류 개별 체세포들과 세포 융합에 의한 자가 이식을 위한 다능성 이배체 ESL 세포들을 형성하는 방법.
청구항 16에 있어서,

DNA 복제 무력화는 물리적 처리 또는 화학적 처리에 의하여 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 17에 있어서,

상기 물리적 처리는 γ 선을 이용한 조사 또는 자외선에의 노출을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 17에 있어서,

상기 화학적 처리는 염색체 DNA와 결합하는 화학물질들을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 19에 있어서,

DNA-결합 화학물질들은 액티노마이신 D, DNA 킬레이트 및 상호작용제류(chelating and interacting agents), 에토포시드(etoposide) 및 다른 화학치료제들을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
a. 표적 세포들을 제공하는 단계;

b. 상기 표적 세포들 내에서 DNA 복제를 무력화하는 단계;

c. 자가 체세포들을 제공하는 단계;

d. 상기 비-복제 표적 세포들과 상기 자가 세포들을 결합하는 단계;

e. 상기 세포들을 융합시키기 위하여 상기 결합물에 폴리에틸렌 글리콜을 첨가하여 상기 비-복제 표적 세포들이 상기 체세포들의 게놈을 재프로그래밍하는 단계;

f. 적절한 세포 배지 내에서 상기 융합된 세포들을 성장시켜 표적 세포들의 형태와 기능을 가진 이배체 세포들을 생성하는 단계; 및

g. 표적 세포들의 형태와 기능을 가지는 재프로그래밍된 자가 이배체 세포들을 선택하여, 세포 대체 요법 및 미용 용도의 목적으로 공여자에게 재프로그래밍된 자가 이배체 세포들을 이용가능하게 하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 비-복제 표적 세포들을 체세포들과 융합하여 그 내부로 재프로그래밍을 유도하는 이배체 치료 세포들을 형성시키는 방법.
청구항 21에 있어서,

DNA 복제의 무력화는 물리적 처리 또는 화학적 처리에 의하여 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 22에 있어서,

상기 물리적 처리는 γ 선을 이용한 조사 또는 자외선에의 노출을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 22에 있어서,

상기 화학적 처리는 염색체 DNA와 결합하는 화학물질들을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 24에 있어서,

DNA-결합 화학물질들은 액티노마이신 D, 에토포시드, DNA 킬레이트 및 상호작용제류 및 다른 화학치료제들을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 21에 있어서,

상기 표적 세포들은 외생성 ESC들이나 성체 줄기 세포들을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 21에 있어서,

상기 체세포들은 성숙한 피부 세포들, 혈액 세포들 및 골수 세포들로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
a. ESL 세포들을 제공하는 단계; 및

b. ESC들 또는 조직 줄기 세포들을 대체하는 ESL 세포들로 세포 요법 또는 미용 용도를 수행하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 ESC들 또는 조직 줄기 세포들을 사용하는 세포 요법 및 미용 용도를 수행하는 방법.
a. 피부 세포를 침투하는 작용제로 피부를 사전처리하는 단계;

b. 상기 피부에 신생세포 추출물들, ESC 추출물들, 줄기 세포 추출물들, 난자 추출물들, 재조합 단백질들 또는 그 조합물로부터 선택된 재생제들(rejuvenating agents)을 바르는 단계;

c. 상기 재생제로 피부 접촉을 유지하는 단계; 및

d. 필요하다면 단계 a 내지 c를 반복하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 색소형성(pigmentation) 또는 주름살들을 줄이기 위하여 피부를 국소적으로 재 생시키는 방법.
청구항 29에 있어서,

단계 a 전에, 상기 피부를 살균하고 선택적으로는 상기 재생제들이 상기 피부에 주사되는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 29에 있어서,

상기 재생제는 알부민, ATP, 인산크레아틴, 크레아틴 키나아제, RNase 억제제 및 뉴클레오티드 인산염류가 첨가되는 세포 또는 핵 추출물을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
a. 신생세포들, ESC들, 조직 줄기 세포들, 난자들 또는 배아, 태아, 태아 조직, 재조합 단백질들 또는 그 조합으로부터 구해진 세포들을 제공하는 단계;

b. 상기 세포들이 추출되도록 분리시키는 단계;

c. 상기 세포들을 적어도 2 회의 동결-해동 사이클들을 거치게 하는 단계;

d. 상기 세포들을 고속으로 원심분리시키는 단계; 및

e. 상기 재생 인자들을 포함하는 상층액을 빼내는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 전체 세포들로부터 재생 인자들을 제제하는 방법.
a. 신생세포들, ESC들, 조직 줄기 세포들, 난자들, 또는 배아, 태아, 태아 조직, 재조합 단백질들 또는 그 조합으로부터 구해진 세포들을 제공하는 단계;

b. 상기 세포들이 추출되도록 분리시키는 단계;

c. 저장성 완충액 내에서 상기 세포들을 용해시키는 단계;

d. 상기 용해된 세포들을 원심분리시켜 상층액을 분리하는 단계;

e. 남아있는 핵들을 적어도 2 회의 동결-해동 사이클들을 거치게 하는 단계;

f. 원심분리시켜 상기 핵들의 추출물을 구하는 단계; 및

g. 선택적으로, 투석에 의하여 상기 추출물을 농축시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 핵들로부터 재생 인자들을 제제하는 방법.
a. 청구항 26 또는 27에 의하여 제제된 재생제들을 제공하는 단계; 및

b. 신호, 증세 또는 시험 결과들에 있어서 개선이 있을 때까지 기관에 주기적으로 상기 재생제들을 투여하여 상기 기관의 노화를 늦추고/늦추거나 그 기능을 개선시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 기관을 국소적으로 재생시키는 방법.
청구항 34에 있어서,

투여는 정맥내, 피하, 복강내, 근육내, 심실내, 기관내, 관절내, 심막내, 폐내, 비강내 또는 동맥내 경로에 의한 투여를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 35에 있어서,

상기 비강내 경로는 상기 재생제들을 비강으로 넣어 상기 재생제들이 중추 신경계에 이르러 신경 퇴행성 질병들을 치료하는 것을 특징으로 하는 방법.
a. 다공-개방(pore-opening) 처리로 포유류 체세포들을 처리하고 생리학적 완충액으로 세척하는 단계;

b. 단계 a의 상기 세포들을 재생 완충액, ESC 핵 추출물 및 원하는 세포 추출물들에 약 한 시간 동안 노출시키는 단계;

c. 적절한 상태 하에서 20 % FBS 페니실린, 스트렙토마이신, 글루타민, 비필수 아미노산들, 베타-메르캅토에탄올, bFGF, TGF-β1 및 LIF로 선택적으로 보충된 KO-DMEM 용액 내에 단계 b의 세포들을 성장시키는 단계;

d. 플레이트의 덮개 상에 역으로(inverted) 달라붙은 소적(droplets) 내에서 상기 배양된 세포들을 약 2 시간 내지 하룻밤 동안 배양시켜 역 소적들을 형성하는 단계;

e. 상기 역 소적들을 채집하여 결합하는 단계; 및

f. 상기 세포들이 원하는 세포들을 형성할 때까지 원하는 세포-생성 작용제들로 보충된 DMEM의 젤라틴-코팅된 플레이트들 상에 상기 채집된 세포들을 성장시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 전체 세포들로부터 재생 인자들을 제제하는 방법.
청구항 37에 있어서,

상기 체세포는 섬유아세포들을 포함하며, 상기 원하는 세포 유형은 근육 세포들이며 상기 원하는 세포-생성 작용제들은 2 % 비활성화된 말 혈청과 근원세포 세포 배양 배지로부터 여과된 상층액을 포함하며, 상기 채집된 세포들은 근관세포들을 형성할 때까지 그렇게 노출되는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 38에 있어서,

단계 a.는 상기 섬유아세포들을 트립신-EDTA, 스트렙토라이신 O, 전기천공법 또는 바이러스-매개를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
a. 세포들 또는 핵들 또는 그것들의 조합으로부터 유래한 재생 인자들;

b. 1 ㎎/㎖ 알부민;

c. 1 mM ATP;

d. 5 mM 인산크레아틴;

e. 25 ㎍/㎖ 크레아틴 키나아제;

f. 0.4 U/㎖ RNase 억제제; 및

g. 4 가지 dNTP들의 각각 1 mM을 포함하는 것을 특징으로 하는 포유류에 투여하기 적절한 재생 완충액 조성물.
청구항 40에 있어서,

상기 조합 추출물은 태아 추출물의 약 절반 및 ESC들의 핵 추출물의 절반인 것을 특징으로 하는 재생 조성물.
청구항 40에 있어서,

상기 세포 또는 핵 추출물은 세포가 없는 것을 특징으로 하는 재생 조성물.
a. 신생세포 추출물들, 줄기 세포 추출물들, 난자 추출물들, 신생세포들, ESC들, 줄기 세포들, 재조합 단백질 또는 그 조합으로부터 유래한 재생제들을 제공하는 단계; 및

b. 상기 재생제들을 개선에 의해 나타나는 바와 같이 주기적으로 투여하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 포유류 신체를 전신으로 재생시키고 총체적인 건강과 면역 기능을 개선시키는 방법.
청구항 43에 있어서,

상기 투여 경로는 정맥내, 복강내, 근육내, 척수강내, 비강내 경로 또는 그 조합을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
a. 이전에 배양된 세포들을 제공하는 단계;

b. 재생 추출물, 알부민, ATP, 인산크레아틴, 크레아틴 키나아제 RNase 억제제 및 뉴클레오티드 인산염류를 제공하는 단계;

c. 상기 세포들을 상기 재생 용액과 결합시켜 상기 재생 용액의 성분들이 상 기 세포들을 침투하는 데 충분한 시간 동안 배양시키는 단계; 및

d. 세포 배지, 염화 칼슘 및 선택적으로는 항생제들을 첨가하는 단계; 및

e. 상기 세포들을 배양시켜 상기 세포 개체수를 늘려서 조직 배양액 내에 수많은 계대들을 거치는 세포들을 재생시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 조직 배양액 내에서 수많은 계대들을 거치는 세포들을 재생시키는 방법.
청구항 45에 있어서,

f. 플레이트의 덮개 상이나 코팅되지 않은 페트리 접시 상에 역으로 달라붙은 소적 내에서 단계 c의 상기 재생된 세포들을 세포 덩어리 형성을 촉진하도록 충분한 시간 동안 성장시키는 단계;

g. 0.2 % 내지 2 % 아가로스 상 또는 코팅되지 않은 페트리 접시 내에 EB들을 형성하도록 현탁액으로 상기 세포 덩어리들을 성장시키는 단계;

h. 성장 인자들로 보충된 적절한 배지의 피더 세포들 상이나 코팅된 플레이트들 또는 디스크들 상 또는 마트리젤 상에서 EB들을 배양시키는 단계;

i. 줄기 세포들과 동일한 형태를 지닌 세포 군체들을 선택하여, 상기 이전에 배양된 세포들을 다른 조직 배양을 위하여 다능성 세포들로 탈분화시키는 단계로서 단계 d와 e를 더 대체하는 것을 특징으로 하는 방법.
a. 재생된 세포들을 제공하는 단계로서, 상기 세포들은 하기의 단계들에 의하여 제제되며

i. 노화된 체세포들을 제공하는 단계;

ii. 재생 추출물, 알부민, ATP, 인산크레아틴, 크레아틴 키나아제, RNase 억제제 및 뉴클레오티드 인산염류를 포함하는 재생 용액을 제공하는 단계;

iii. 상기 노화된 체세포들을 상기 재생 용액과 결합시키고 상기 재생 용액의 성불들이 상기 세포들을 침투하도록 충분한 시간 동안 배양시키는 단계;

iv. 세포 배지, 염화 칼슘 및 선택적으로는 항생제들의 용액을 첨가하여 상기 세포 개체수를 늘리는 단계; 및

v. 상기 재생된 세포들을 분리시키는 단계; 및

vi. 상기 재생된 세포들을 생리학적 용액과 결합시켜 투여가능한 제제를 제제하는 단계; 및

b. 화학 요법들에 의하여 유발 여부에 상관없이 액체 암, 백혈병, 림프종 및 조혈 이상을 앓는 포유류에 재생된 세포들을 투여하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 화학 요법들에 의하여 유발 여부에 상관없이 액체 암, 백혈병, 림프종 및 조혈 이상을 앓는 포유류를 치료하는 방법.
a. 재생된 세포들을 제공하는 단계로서, 상기 세포들은 하기의 단계들에 의하여 제제되며

i. 체세포들을 제공하는 단계;

ii. 재생 추출물, 알부민, ATP, 인산크레아틴, 크레아틴 키나아제, RNase 억제제 및 뉴클레오티드 인산염류를 포함하는 재생 용액을 제공하는 단계;

iii. 상기 노화된 체세포들을 상기 재생 용액과 결합시키고 상기 재생 용액의 성분들이 상기 세포들을 침투하도록 충분한 시간 동안 배양시키는 단계;

iv. 세포 배지, 염화 칼슘 및 선택적으로는 항생제들의 용액을 첨가하여 상기 세포 개체수를 늘리는 단계; 및

v. 상기 재생된 세포들을 분리시키는 단계; 및

vi. 상기 재생된 세포들을 생리학적 용액과 결합시켜 투여가능한 제제를 제제하는 단계; 및

b. 중추신경계 외상, 뇌졸중, 알츠하이머병, 파킨슨병 또는 근위축성 측색 경화증을 앓고 있는 포유류에 상기 재생된 세포들을 투여하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 중추신경계 외상, 뇌졸중, 알츠하이머병, 파킨슨병 또는 근위축성 측색 경화증을 앓는 포유류를 치료하는 방법.
a. 노화하는 세포들의 다공들을 개방하는 작용제로서, 상기 작용제는 트립신과 스트렙토라이신 O로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 작용제;

b. 청구항 34의 재생 완충액; 및

c. 배아 세포들 및 ESC 핵들의 무세포(cell-free) 추출물을 포함하는 노화하는 세포들을 재생시키는 키트.
청구항 49에 있어서,

단계 c의 상기 추출물은 다능성 세포들로부터 유래한 mRNA 추출물로 대체되 는 것을 특징으로 하는 키트.
청구항 50에 있어서,

상기 다능성 세포들은 배아 줄기 세포들, 원시 생식 세포들, 태아 세포들, 난자들, 수정란들, 제대혈 줄기 세포들, 조직 줄기 세포들, 배반포 세포들 또는 그 조합인 것을 특징으로 하는 키트.
a. 포유류 발현 벡터 내에서 적어도 하나의 인간 ES 세포 전사 인자를 제공하는 단계;

b. 단계 a의 상기 벡터를 기하급수적으로(exponentially) 성장하는 인간 세포들로 형질전환(transfection)시키는 단계;

c. 형질전환 이후에, 상기 벡터를 발현하는 세포들을 분리시키는 단계;

d. 컨플루언스될 때까지 플레이트들 상에서 분리된 벡터-발현 세포들을 성장시키는 단계;

e. 상기 벡터-발현 세포들을 채집하는 단계;

f. 상기 벡터-발현 세포들을 막-침투 용액 및 ES 세포 추출물들로 처리하는 단계;

g. 상기 추출물-처리된 세포들의 막들을 봉인하는 단계; 및

h. 상기 추출물-처리된 세포들을 달라붙은 소적들 내에 두어 성장시키고 덩어리진 충분히 재프로그래밍된 세포들을 분리시키는 단계를 포함하는 것을 특징으 로 하는 체세포들을 재생시키는 방법.
청구항 52에 있어서,

인간 ES 세포 전사 인자들은 Oct4, Sox2 및 Nanog인 것을 특징으로 하는 방법.