WO2022244502A1

WO2022244502A1 - 皮膚付属器誘導能を有する細胞、及びその製造方法

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Publication number: WO2022244502A1
Application number: PCT/JP2022/015867
Authority: WO
Inventors: 昌和栗田
Original assignee: 昌和栗田
Priority date: 2021-05-21
Filing date: 2022-03-30
Publication date: 2022-11-24
Also published as: JPWO2022244502A1

Abstract

【課題】身体外皮として働きうる重層上皮組織形成能を有し、さらに皮膚付属器誘導能を有する細胞を体細胞から直接転換させること。【解決手段】皮膚付属器誘導能を有する細胞に相対的に強発現する少なくとも１種の遺伝子を体細胞に導入する工程を含む、皮膚付属器誘導能を有する細胞の製造方法。

Description

皮膚付属器誘導能を有する細胞、及びその製造方法

　本発明は、皮膚付属器誘導能を持たない体細胞から誘導される皮膚付属器誘導能を有する細胞、及びその製造方法に関する。また、本発明は、該皮膚付属器誘導能を有する細胞を利用した、皮膚及び皮膚付属器再生用の細胞製剤、皮膚潰瘍の治療方法、禿髪症・乾皮症・皮脂欠乏症の治療方法、皮膚及び皮膚付属器再生法開発プラットフォームに関する。更に、本発明は、皮膚付属器誘導能を持たない体細胞から皮膚付属器誘導能を有する細胞に誘導するための細胞調製用組成物に関する。

　皮膚付属器は毛包・脂腺・汗腺などよりなり、機械的障害からの保護、保温、保湿、体温調整などの役割を担っている。皮膚付属器は胎児期、器官発生の過程で、上皮組織と間葉組織の相互作用によって形成される（非特許文献１参照）。

　皮膚付属器の欠損、障害、機能不全によってもたらされる代表的な病態として、禿髪症、皮脂欠乏症などがある。体温調節障害や、皮膚乾燥によって掻痒感をもたらすほか、整容的な障害の原因となる。

　臨床的には失われた皮膚付属器を再生することは困難で、通常身体他部位から植皮術、皮弁形成術などによって既存の付属器を移植することが必要になる。

　そこで、成体内に皮膚付属器の再生、新生をもたらす方法として、胎児や新生児動物皮膚由来の細胞を移植し、皮膚付属器の再構成を得る方法（非特許文献２、３参照）や、多能性幹細胞から器官様培養（オルガノイド）形成を介して付属器様構造を得る方法などが開発されてきた（非特許文献４，５参照）が、短期間に十分量の皮膚付属器の再生、新生を得ることは困難であった。

　皮膚付属器の新生、再生には身体表層に存在する上皮細胞と真皮ないし皮下に存在する間葉系細胞、両者の相互作用と環境因子が重要な役割を果たす（非特許文献６，７参照）。特に近年では、遺伝子組み換え動物を用いた研究によって、LEF1遺伝子、SHH遺伝子など皮膚発生にかかわる遺伝子の発現が皮膚付属器、特に毛包の再生の環境因子として重要であることが示唆されている（非特許文献８～１０）。

　発生の過程で、ひとたび細胞系譜の定まった体細胞は、同一細胞系譜内で増殖、分化を継続する。対して、生理的には認められない細胞系譜の転換を直接転換とよび、皮膚線維芽細胞から筋細胞（非特許文献１１）、神経細胞（非特許文献１２参照）、心筋細胞（非特許文献１３参照）、肝細胞（非特許文献１４参照）、重層扁平上皮形成能を有する細胞（特許文献１、非特許文献１５参照）などへの直接転換技術が報告されている。

　このような従来技術を背景として、皮膚線維芽細胞、脂肪由来間葉系細胞をはじめとする皮膚付属器誘導能を持たない体細胞から直接誘導でき、皮膚付属器の再生、新生を与えうる皮膚付属器誘導能を有する細胞を開発し、皮膚付属器の欠損、障害、機能不全に対する治療を目的とした細胞供給源の提供を実現させることが切望されているが、未だ皮膚付属器誘導能を有する細胞が、皮膚付属器誘導能を持たない体細胞から直接転換された報告はない。

国際公開第２０１６／０７２１０５号

Lee J, Boscke R, Tang PC, Hartman BH, HellerS, Koehler KR. "Cell Research",2018, 22(1), p242-254 Yuspa SH, Morgan DL, Walker RJ, Bates RR. "J Invest Dermatol", 1970, 55(6), p379-89. Worst PK, Mackenzie IC, Fusenig NE. "Cell Tissue Res", 1982, 225(1), p65-77. Lee J, Boscke R, Tang PC, Hartman BH, HellerS, Koehler KR. "Cell Rep",2018, 22(1), p242-254. Lee J, Rabbani CC, Gao H, Steinhart MR,Woodruff BM, Pflum ZE, Kim A, Heller S, Liu Y, Shipchandler TZ, Koehler KR.　"Nature", 2020, 582(7812), p399-404. Sennett R, Wang Z, Rezza A, Grisanti L,Roitershtein N, Sicchio C, Mok KW, Heitman NJ, Clavel C, Ma'ayan A, Rendl M.　"Dev Cell", 2015, 34(5), p577-591. Yang H, Adam RC, Ge Y, Hua ZL, Fuchs E. "Cell", 2017, 169(3), p483-496. Lim CH, Sun Q, Ratti K, Lee SH, Zheng Y,Takeo M, Lee W, Rabbani P, Plikus MV, Cain JE, Wang DH, Watkins DN, Millar S,Taketo MM, Myung P, Cotsarelis G, Ito M.　"Nat Commun", 2018, 9(1), 4903. Phan QM, Fine GM, Salz L, Herrera GG, WildmanB, Driskell IM, Driskell RR.　"Elife", 2020, 9, e60066. Sun X, Are A, Annusver K, Sivan U, Jacob T,Dalessandri T, Joost S, Fullgrabe A, Gerling M, Kasper M. "Elife", 2020, 9, e46756. Davis RL, Weintraub H, Lassar AB,　"Cell", 1987 Dec 24, 51(6), p987-1000 Vierbuchen T1, Ostermeier A, Pang ZP, KokubuY, Sudhof TC, Wernig M, "Nature", 2010,463(7284), p1035-1041 Ieda M, Fu JD, Delgado-Olguin P, VedanthamV, Hayashi Y, Bruneau BG, Srivastava D, "Cell", 2010, 142(3), p375-386 Sekiya S, Suzuki A, "Nature", 2011, 475(7356), p390-393 Kurita M, Araoka T, Hishida T, O'Keefe DD,Takahashi Y, Sakamoto A, Sakurai M, Suzuki K, Wu J,Yamamoto M, Hernandez-Benitez R, Ocampo A, Reddy P, Shokhirev MN, MagistrettiP, Nunez Delicado E, Eto H, Harii K, Izpisua Belmonte JC, "Nature", 2018, 561(7722), p243-247

　そこで、本発明は、上記従来技術の課題を解決するため、毛髪・毛包・脂腺など皮膚付属器を誘導しうる、皮膚付属器誘導能を有する細胞を、皮膚付属器誘導能を持たない体細胞から直接転換させることを目的の一つとする。より具体的には、本発明は、毛髪・毛包・脂腺など皮膚付属器を形成する能力をもった細胞供給源を提供するための技術を確立することを目的とする。また、本発明は、かかる体細胞から誘導した皮膚付属器誘導能を有する細胞の様々な用途を提供することを目的とする。

　本発明者は、前記課題を解決するために皮膚付属器誘導能を持たない代表的な体細胞として脂肪組織由来間葉系細胞を採用し、旺盛な皮膚付属器再構成能を有する胎児期の皮膚上皮細胞、胎児期の皮膚間葉系細胞、及び毛包を構成する間葉系細胞を特徴づける可能性の高い遺伝子の導入によって、免疫不全動物背部に装着したスキンチャンバー内への混合移植によって毛髪、毛包、脂腺の再生、新生を与えうる皮膚付属器誘導能を有する細胞群を製造できることを見出した。

　即ち、本発明は、下記に掲げる態様の発明を提供する。
１　皮膚付属器誘導能を有する細胞に相対的に強発現する少なくとも１種の遺伝子を含む導入遺伝子を、皮膚付属器誘導能を持たない体細胞に導入する工程を含む、皮膚付属器誘導能を有する細胞の製造方法。

２　（１）LEF1遺伝子と、
　（２）DNP63A遺伝子、GRHL2遺伝子、及びTFAP2A遺伝子から選択された１種、２種、又は３種の遺伝子と、
を含む導入遺伝子を、皮膚付属器誘導能を持たない体細胞に遺伝子導入する工程を含む、皮膚付属器誘導能を有する細胞の製造方法。

３　LEF1遺伝子、DNP63A遺伝子、GRHL2遺伝子、及びTFAP2A遺伝子の４遺伝子を含む導入遺伝子を、皮膚付属器誘導能を持たない体細胞に遺伝子導入する工程を含む、皮膚付属器誘導能を有する細胞の製造方法。

４　（１）LEF1遺伝子と、
　（２）DNP63A遺伝子、GRHL2遺伝子、TFAP2A遺伝子、及びMYCファミリー遺伝子の少なくとも一つ、から選択された少なくとも１種、２種、３種、又は４種の遺伝子と、
を含む導入遺伝子を、皮膚付属器誘導能を持たない体細胞に遺伝子導入する工程を含む、皮膚付属器誘導能を有する細胞の製造方法。

５　LEF1遺伝子、DNP63A遺伝子、GRHL2遺伝子、TFAP2A遺伝子、及びMYCファミリー遺伝子の少なくとも一つの少なくとも５遺伝子を含む導入遺伝子を、皮膚付属器誘導能を持たない体細胞に遺伝子導入する工程を含む、皮膚付属器誘導能を有する細胞の製造方法。

６　前記導入遺伝子は、前記MYCファミリー遺伝子としてcMYC遺伝子を含む上記４又は５に記載の皮膚付属器誘導能を有する細胞の製造方法。

７　SHH遺伝子、ETV1遺伝子、FOXD1遺伝子、PRDM1遺伝子、及びLEF1遺伝子から選択された一つ以上の遺伝子を含む導入遺伝子を、皮膚付属器誘導能を持たない体細胞に遺伝子導入する工程を含む、皮膚付属器誘導能を有する細胞の製造方法。

８　SHH遺伝子を含む導入遺伝子を、皮膚付属器誘導能を持たない体細胞に遺伝子導入する工程を含む、皮膚付属器誘導能を有する細胞の製造方法。

９　SHH遺伝子及びLEF1遺伝子を含む導入遺伝子を、皮膚付属器誘導能を持たない体細胞に遺伝子導入する工程を含む、皮膚付属器誘導能を有する細胞の製造方法。

１０　ETV1遺伝子、PRDM1遺伝子、及びFOXD1遺伝子から選択された１種、２種、又は３種の遺伝子を含む導入遺伝子を、皮膚付属器誘導能を持たない体細胞に遺伝子導入する工程を含む、皮膚付属器誘導能を有する細胞の製造方法。

１１　（１）SHH遺伝子と、
　（２）ETV1遺伝子、PRDM1遺伝子、FOXD1遺伝子及びLEF1遺伝子から選択された一つ以上の遺伝子と、
を含む導入遺伝子を、皮膚付属器誘導能を持たない体細胞に遺伝子導入する工程を含む、皮膚付属器誘導能を有する細胞の製造方法。

１２　（１）ETV1遺伝子及びPRDM1遺伝子；
　（２）FOXD1遺伝子及びPRDM1遺伝子；又は
　（３）ETV1遺伝子、PRDM1遺伝子、及びFOXD1遺伝子；
を含む導入遺伝子を、皮膚付属器誘導能を持たない体細胞に遺伝子導入する工程を含む、皮膚付属器誘導能を有する細胞の製造方法。

１３　複数種類の遺伝子を遺伝子導入する際に、導入遺伝子が異なる複数の細胞を用意する、上記７乃至１２の何れか１項に記載の皮膚付属器誘導能を有する細胞の製造方法。

１４　前記体細胞がヒト由来である、上記１乃至１３の何れか１項に記載の皮膚付属器誘導能を有する細胞の製造方法。

１５　前記体細胞が、皮膚線維芽細胞、皮下脂肪組織由来間質細胞（皮下脂肪細胞）、胚性線維芽細胞、脂肪細胞、筋肉細胞、骨芽細胞、軟骨細胞、循環血中の単核球、ＥＳ細胞、又は間葉系幹細胞等から分化させた体細胞である、上記１乃至１４の何れか１項に記載の皮膚付属器誘導能を有する細胞の製造方法。

１６　上記１乃至１５の何れか１項に記載の製造方法により製造される皮膚付属器誘導能を有する細胞。

１７　上記１６に記載の皮膚付属器誘導能を有する細胞を含む、細胞製剤。

１８　（１）SHH遺伝子、又はSHH遺伝子及びLEF1遺伝子を含む導入遺伝子を、皮膚付属器誘導能を持たない体細胞に遺伝子導入する工程を経て製造された皮膚付属器誘導能を有する第１の細胞と、
　（２）ETV1遺伝子、PRDM1遺伝子、及びFOXD1遺伝子から選択された一つ以上の遺伝子を含む導入遺伝子を、皮膚付属器誘導能を持たない体細胞に遺伝子導入する工程を経て製造された皮膚付属器誘導能を有する第２の細胞と、
を含む細胞製剤。

１９　前記第２の細胞の導入遺伝子は、
　（１）ETV1遺伝子及びPRDM1遺伝子；
　（２）FOXD1遺伝子及びPRDM1遺伝子；又は
　（３）ETV1遺伝子、PRDM1遺伝子、及びFOXD1遺伝子；
を含む、上記１８に記載の細胞製剤。

２０　足場材料を含む上記１７乃至１９の何れか１項に記載の細胞製剤。

２１　前記足場材料がコラーゲンである、上記２０に記載の細胞製剤。

２２　前記細胞製剤は、皮膚組織再生用、毛髪再生用である上記１７乃至２１の何れか１項に記載の細胞製剤。

２３　前記細胞製剤がシート状構造物又は３次元構造の細胞集合体である上記１７乃至２２の何れか１項に記載の細胞製剤。

２４　上記１６に記載の皮膚付属器誘導能を有する細胞又は上記１７乃至２３の何れか１項に記載の細胞製剤を非ヒト哺乳動物に投与して、前記哺乳動物の体内で前記皮膚付属器誘導能を有する細胞から皮膚付属器を形成させることにより製造される、皮膚付属器を形成させた非ヒト哺乳動物。

２５　上記２４に記載の非ヒト哺乳動物に被験物質を投与し、皮膚及び／又は皮膚付属器組織に対する被験物質の薬効を判定する工程を含む、被験物質の薬効を判定する方法。

２６　上記２４に記載の非ヒト哺乳動物に抗がん剤や放射線などのストレスを負荷し、皮膚及び／又は皮膚付属器組織に対するストレスを判定する工程を含む、外的要因の影響を判定する方法。

２７　上記１乃至１２の何れか１項に記載の製造方法において使用される導入遺伝子を含む、皮膚付属器誘導能を有する細胞調整用組成物。

２８　前記導入遺伝子が、体細胞に導入可能な形態で含まれる、上記２７に記載の細胞調整用組成物。

２９　上記１６に記載の皮膚付属器誘導能を有する細胞を培養して作製された皮膚及び皮膚付属器様組織。

３０　上記２９に記載の皮膚及び皮膚付属器様組織に対し、被験物質を投与し、皮膚及び／又は皮膚付属器様組織に対する被験物質の薬効を分析する工程を含む、被験物質の薬効の分析方法。

３１　上記２９に記載の皮膚及び皮膚付属器様組織に対し、抗がん剤や放射線などのストレスを負荷し、皮膚及び／又は皮膚付属器様組織に対するストレスを分析する工程を含む、外的要因の影響の分析方法。

３２　上記１乃至１２の何れか１項に記載の遺伝子を体細胞に遺伝子導入するために特化したベクターのキット。

３３　上記１６に記載の皮膚付属器誘導能を有する細胞を用いた、細胞の皮膚付属器誘導能を評価する方法。

３４　皮膚付属器誘導能を有する細胞を製造することを目的とするベクターであって、LEF1遺伝子、DNP63A遺伝子、GRHL2遺伝子、TFAP2A遺伝子、及びcMYC遺伝子を発現するベクター。

３５　皮膚付属器誘導能を有する細胞を製造することを目的とするベクターであって、SHH遺伝子、ETV1遺伝子、PRDM1遺伝子、FOXD1遺伝子、及びLEF1遺伝子を発現するベクター。

３６　皮膚付属器誘導能を有する細胞を製造することを目的とする第１のベクターであって、SHH遺伝子、又はSHH遺伝子及びLEF1遺伝子を発現する第１のベクターと、
　皮膚付属器誘導能を有する細胞を製造することを目的とする第２のベクターであって、ETV1遺伝子、PRDM1遺伝子、及びFOXD1遺伝子から選択された一つ以上の遺伝子を発現する第２のベクターと、を含むベクターのキット。

３７　前記第２のベクターは、
　（１）ETV1遺伝子及びPRDM1遺伝子；
　（２）FOXD1遺伝子及びPRDM1遺伝子；又は
　（３）ETV1遺伝子、PRDM1遺伝子、及びFOXD1遺伝子；
を発現する、上記３６に記載のベクターのキット。

３８　前記ベクターはウイルスベクターである、上記３４若しくは３５に記載のベクター又は上記３２、３６若しくは３７に記載のベクターのキット。

３９　上記２乃至６の何れか１項に記載の製造方法で製造された皮膚付属器誘導能を有する細胞と、皮膚付属器誘導能を有する間葉系細胞とを含む、細胞製剤。

４０　前記皮膚付属器誘導能を有する間葉系細胞は、上記７乃至１２の何れか１項に記載の製造方法で製造された皮膚付属器誘導能を有する細胞である、上記３９に記載の細胞製剤。

４１　上記７乃至１２の何れか１項に記載の製造方法で製造された皮膚付属器誘導能を有する細胞と、皮膚付属器誘導能を有する上皮系細胞とを含む、細胞製剤。

４２　前記皮膚付属器誘導能を有する上皮系細胞は、上記２乃至６の何れか１項に記載の製造方法で製造された皮膚付属器誘導能を有する細胞である、上記４１に記載の細胞製剤。

　本発明によれば、皮膚付属器を含んだ皮膚と同等の特性を有する組織を形成する能力をもった細胞を提供できる。かかる皮膚付属器を再構成する細胞は、禿髪症・乾皮症・皮脂欠乏症など皮膚付属器の欠損、機能不全に起因する病態のほか、熱傷、外傷、褥瘡、糖尿病性潰瘍、末梢循環不全による皮膚潰瘍などの皮膚潰瘍の治療に有効な医療手段又は細胞製剤を提供することができる。また、本発明によれば、患者の体細胞（皮膚由来の細胞に限らない。例えば血液、脂肪組織間質細胞等）から皮膚付属器誘導能を有する細胞を作成し、作成された細胞に対し様々な解析を行うことで疾患の病態解明又は治療に寄与できる。特にヒトの体細胞から作成した皮膚付属器誘導能を有する細胞は、創薬や薬品開発の材料として、薬効確認の点においても適している。また、自己複製能と分化の相反する特性を有する皮膚付属器誘導能を有する細胞を用いることによって、癌や肉腫など幹細胞を起源とする病態解明に寄与できる。また、本発明で作成した細胞の移植、ないし本発明の生体内の体細胞への応用によって、皮膚潰瘍面のような皮膚及び皮膚付属器の欠損する病態、加齢性の変化によって皮膚付属器及びその機能の低下した状態や皮膚潰瘍治癒後など、皮膚付属器の不足する病態を有する患者において、皮膚付属器の再生、新生を誘導し皮膚付属器機能の充足を図るための治療手段及び治療方法として用いることができる。

成体マウス皮膚由来細胞の移植試験のシェーマであり、成体マウスより上皮系細胞、間葉系細胞を単離培養して免疫不全動物に移植することを表している。成体マウス皮膚由来細胞の移植試験（参考例１）の結果を示す写真であり、成体マウス皮膚由来の上皮系細胞、間葉系細胞を移植しても皮膚付属器が再生されなかったことが示されている。新生児マウス皮膚由来細胞の移植試験のシェーマであり、新生児マウス皮膚より上皮系細胞、間葉系細胞を単離培養して免疫不全動物に移植することを表している。新生児マウス皮膚由来細胞の移植試験（参考例２）の結果を示す写真であり、新生児マウス皮膚由来の上皮系細胞、間葉系細胞を移植すると皮膚付属器が再生されたことが示されている。成体マウス脂肪組織細胞由来の間葉系細胞に遺伝子導入して作成した誘導上皮細胞と、新生児マウス皮膚由来の間葉系細胞の移植試験のシェーマである。成体マウス脂肪組織細胞由来の間葉系細胞にDNP63A, GRHL2, TFAP2A, cMYCを遺伝子導入して作成した誘導上皮細胞と、新生児マウス皮膚由来の間葉系細胞の移植試験（比較例１）の結果を示す写真であり、成体マウス脂肪組織細胞由来の間葉系細胞にDNP63A, GRHL2, TFAP2A, cMYCを遺伝子導入して作成した誘導上皮細胞と、新生児マウス皮膚由来の間葉系細胞を移植しても皮膚付属器が再生されなかったことが示されている。マウス成体脂肪由来間葉系細胞に対するDNP63A、GRHL2、TFAP2A、c-MYC、SHHの遺伝子導入試験（比較例２）の結果を示す写真であり、マウス成体脂肪由来間葉系細胞に対してDNP63A、GRHL2、TFAP2A、c-MYC、SHHを遺伝子導入しても上皮系細胞を誘導することができなかったことが示されている。マウス成体脂肪由来間葉系細胞に対するDNP63A、GRHL2、TFAP2A、c-MYC、FOXD1の遺伝子導入試験（比較例３）の結果を示す写真であり、マウス成体脂肪由来間葉系細胞に対してDNP63A、GRHL2、TFAP2A、c-MYC、FOXD1を遺伝子導入すると上皮系細胞を誘導することができることが示されている。成体マウス脂肪組織細胞由来の間葉系細胞にDNP63A, GRHL2, TFAP2A, cMYC、FOXD1を遺伝子導入して作成した誘導上皮細胞と、新生児マウス皮膚由来の間葉系細胞の移植試験（比較例３）の結果を示す写真であり、成体マウス脂肪組織細胞由来の間葉系細胞にDNP63A,GRHL2, TFAP2A, cMYC、FOXD1を遺伝子導入して作成した誘導上皮細胞と、新生児マウス皮膚由来の間葉系細胞を移植しても皮膚付属器が再生されなかったことが示されている。マウス成体脂肪由来間葉系細胞に対するDNP63A、GRHL2、TFAP2A、c-MYC、LEF1の遺伝子導入試験（実施例１）の結果を示す写真であり、マウス成体脂肪由来間葉系細胞に対してDNP63A、GRHL2、TFAP2A、c-MYC、LEF1を遺伝子導入すると上皮系細胞を誘導することができることが示されている。成体マウス脂肪組織細胞由来の間葉系細胞にDNP63A, GRHL2, TFAP2A, cMYC、LEF1を遺伝子導入して作成した誘導上皮細胞と、新生児マウス皮膚由来の間葉系細胞の移植試験（実施例１）の結果を示す写真であり、成体マウス脂肪組織細胞由来の間葉系細胞にDNP63A,GRHL2, TFAP2A, cMYC、LEF1を遺伝子導入して作成した誘導上皮細胞と、新生児マウス皮膚由来の間葉系細胞を移植すると皮膚付属器の再生を得ることができることが示されている。培養ヒト繊維芽細胞に対して皮膚付属器誘導能をもつ間葉系細胞を誘導するための候補因子を遺伝子導入した際の、マーカー遺伝子（PROM1遺伝子、CRABP1遺伝子、VCAN遺伝子）発現の変化を示している。ALLはすべての候補因子を同時に遺伝子導入した際のマーカー遺伝子の発現の変化である。各棒グラフは平均値を、エラーバーは標準偏差を示している。NC（遺伝子導入なしのコントロール）に比較して統計学的に優位な変化を認めるものについては*で示した（* p<0.05, ** p<0.01, ***p<0.001）。培養ヒト繊維芽細胞に対して皮膚付属器誘導能をもつ間葉系細胞を誘導するための候補因子を遺伝子導入した後、アルカリフォスファターゼ染色を行った際の、陽性細胞数を示している。ALLはすべての候補因子を同時に遺伝子導入した際の陽性細胞数である。各棒グラフは平均値を、エラーバーは標準偏差を示している。NC（遺伝子導入なしのコントロール）に比較して統計学的に優位な変化を認めるものについては*で示した（* p<0.05, ** p<0.01, *** p<0.001）。培養ヒト繊維芽細胞に対して皮膚付属器誘導能をもつ間葉系細胞を誘導するための候補因子のうち単独の遺伝子導入によって、マーカー遺伝子発現およびアルカリフォスファターゼ発現の結果から有効性が高いと判断された候補因子を複数組み合わせて遺伝子導入した際の、アルカリフォスファターゼ陽性細胞数を示している。＋は当該因子が加わっていることを、－は加わっていないことを示している。各棒グラフは平均値を、エラーバーは標準偏差を示している。NC（遺伝子導入なしのコントロール：一番右の結果）に比較して統計学的に優位な変化を認めるものについては*で示した（* p<0.05, ** p<0.01, ***p<0.001）。成体マウス脂肪由来間葉系細胞に対してDNP63A、GRHL2、TFAP2A、c-MYC、LEF1を遺伝子導入して作成した誘導上皮細胞と、成体マウス脂肪由来間葉系細胞に対して皮膚付属器誘導能をもつ間葉系細胞を誘導するための候補因子を遺伝子導入した誘導間葉系細胞の移植試験のシェーマである。成体マウス脂肪由来間葉系細胞に対してDNP63A、GRHL2、TFAP2A、c-MYC、LEF1を遺伝子導入して作成した誘導上皮細胞と、成体マウス脂肪由来間葉系細胞に対してETV1、FOXD1、PRDM1を遺伝子導入して作成した誘導間葉系細胞、成体マウス脂肪由来間葉系細胞に対してSHH、LEF1を遺伝子導入して作成した誘導間葉系細胞の移植試験（実施例２－１）の結果を示す写真であり、これら誘導細胞の移植によって皮膚付属器の再生を得ることができることが示されている。成体マウス脂肪由来間葉系細胞に対してDNP63A、GRHL2、TFAP2A、c-MYC、LEF1を遺伝子導入して作成した誘導上皮細胞と、成体マウス脂肪由来間葉系細胞に対してETV1、FOXD1、PRDM1を遺伝子導入して作成した誘導間葉系細胞、成体マウス脂肪由来間葉系細胞に対してSHH、LEF1を遺伝子導入して作成した誘導間葉系細胞の移植試験（実施例２－１）の結果を示す断面写真であり、組織学的に成熟した毛髪シャフト（矢印１）、毛母様組織（矢印２）、脂腺様組織（矢印３）を確認できる。成体マウス脂肪由来間葉系細胞に対してDNP63A、GRHL2、TFAP2A、c-MYC、LEF1を遺伝子導入して作成した誘導上皮細胞と、成体マウス脂肪由来間葉系細胞に対してETV1、FOXD1、PRDM1を遺伝子導入して作成した誘導間葉系細胞、成体マウス脂肪由来間葉系細胞に対してSHH、を遺伝子導入して作成した誘導間葉系細胞の移植試験（実施例２－２）の結果を示す写真であり、これら誘導細胞の移植によって皮膚付属器の再生を得ることができることが示されている。成体マウス脂肪由来間葉系細胞に対してDNP63A、GRHL2、TFAP2A、c-MYC、LEF1を遺伝子導入して作成した誘導上皮細胞と、成体マウス脂肪由来間葉系細胞に対してETV1、FOXD1を遺伝子導入して作成した誘導間葉系細胞、成体マウス脂肪由来間葉系細胞に対してSHH、LEF1を遺伝子導入して作成した誘導間葉系細胞の移植試験（実施例２－３）の結果を示す写真であり、これら誘導細胞の移植によって皮膚付属器の再生を得ることができることが示されている。成体マウス脂肪由来間葉系細胞に対してDNP63A、GRHL2、TFAP2A、c-MYC、LEF1を遺伝子導入して作成した誘導上皮細胞と、成体マウス脂肪由来間葉系細胞に対してFOXD1、PRDM1を遺伝子導入して作成した誘導間葉系細胞、成体マウス脂肪由来間葉系細胞に対してSHH、LEF1を遺伝子導入して作成した誘導間葉系細胞の移植試験（実施例２－４）の結果を示す写真でありこれら誘導細胞の移植によって皮膚付属器の再生を得ることができることが示されている。成体マウス脂肪由来間葉系細胞に対してDNP63A、GRHL2、TFAP2A、c-MYC、LEF1を遺伝子導入して作成した誘導上皮細胞と、成体マウス脂肪由来間葉系細胞に対してETV1、PRDM1を遺伝子導入して作成した誘導間葉系細胞、成体マウス脂肪由来間葉系細胞に対してSHH、LEF1を遺伝子導入して作成した誘導間葉系細胞の移植試験（実施例２－５）の結果を示す写真であり、これら誘導細胞の移植によって皮膚付属器の再生を得ることができることが示されている。成体マウス脂肪由来間葉系細胞に対してDNP63A、GRHL2、TFAP2A、c-MYC、LEF1を遺伝子導入して作成した誘導上皮細胞と、成体マウス脂肪由来間葉系細胞に対してETV1、FOXD1, PRDM1、LEF1を遺伝子導入して作成した誘導間葉系細胞の移植試験（実施例２－６）の結果を示す写真であり、これら誘導細胞の移植によって皮膚付属器の再生を得ることができることが示されている。成体マウス脂肪由来間葉系細胞に対してDNP63A、GRHL2、TFAP2A、c-MYC、LEF1を遺伝子導入して作成した誘導上皮細胞と、成体マウス脂肪由来間葉系細胞に対してETV1、FOXD1, PRDM1、SHH、LEF1を遺伝子導入して作成した誘導間葉系細胞の移植試験（実施例２－７）の結果を示す写真であり、これら誘導細胞の移植によって皮膚付属器の再生を得ることができることが示されている。成体マウス脂肪由来間葉系細胞に対してDNP63A、GRHL2、TFAP2A、c-MYC、LEF1を遺伝子導入して作成した誘導上皮細胞と、成体マウス脂肪由来間葉系細胞に対してSHH、LEF1を遺伝子導入して作成した誘導間葉系細胞の移植試験（実施例２－８）の結果を示す写真である。これら誘導細胞の移植によって皮膚付属器の再生を得ることができることが示されている。成体マウス脂肪由来間葉系細胞に対してDNP63A、GRHL2、TFAP2A、c-MYC、LEF1を遺伝子導入して作成した誘導上皮細胞と、成体マウス脂肪由来間葉系細胞に対してPRDM1を遺伝子導入して作成した誘導間葉系細胞、成体マウス脂肪由来間葉系細胞に対してSHH、LEF1を遺伝子導入して作成した誘導間葉系細胞の移植試験（実施例２－９）の結果を示す写真であり、これら誘導細胞の移植によって皮膚付属器の再生を得ることができることが示されている。成体マウス脂肪由来間葉系細胞に対してDNP63A、GRHL2、TFAP2A、c-MYC、LEF1を遺伝子導入して作成した誘導上皮細胞と、成体マウス脂肪由来間葉系細胞に対してFOXD1,PRDM1を遺伝子導入して作成した誘導間葉系細胞、成体マウス脂肪由来間葉系細胞に対してSHHを遺伝子導入して作成した誘導間葉系細胞の移植試験（実施例２－１０）の結果を示す写真であり、これら誘導細胞の移植によって皮膚付属器の再生を得ることができることが示されている。(Ａ)は移植部の全体像であり、(Ｂ)は発毛部の拡大像である。成体マウス脂肪由来間葉系細胞に対してDNP63A、GRHL2、TFAP2A、c-MYC、LEF1を遺伝子導入して作成した誘導上皮細胞と、成体マウス脂肪由来間葉系細胞に対してPRDM1を遺伝子導入して作成した誘導間葉系細胞、成体マウス脂肪由来間葉系細胞に対してSHHを遺伝子導入して作成した誘導間葉系細胞の移植試験（実施例２－１１）の結果を示す写真であり、これら誘導細胞の移植によって皮膚付属器の再生を得ることができることが示されている。(Ａ)は移植部の全体像であり、(Ｂ)は発毛部の拡大像である。成体マウス脂肪由来間葉系細胞に対してDNP63A、GRHL2、TFAP2A、c-MYC、LEF1を遺伝子導入して作成した誘導上皮細胞と、成体マウス脂肪由来間葉系細胞に対してFOXD1を遺伝子導入して作成した誘導間葉系細胞、成体マウス脂肪由来間葉系細胞に対してSHHを遺伝子導入して作成した誘導間葉系細胞の移植試験（実施例２－１２）の結果を示す写真であり、これら誘導細胞の移植によって皮膚付属器の再生を得ることができることが示されている。(Ａ)は移植部の全体像であり、(Ｂ)は発毛部の拡大像である。成体マウス脂肪由来間葉系細胞に対してDNP63A、GRHL2、TFAP2A、c-MYC、LEF1を遺伝子導入して作成した誘導上皮細胞と、成体マウス脂肪由来間葉系細胞に対してSHHを遺伝子導入して作成した誘導間葉系細胞の移植試験（実施例２－１３）の結果を示す写真であり、これら誘導細胞の移植によって皮膚付属器の再生を得ることができることが示されている。(Ａ)は移植部の全体像であり、(Ｂ)は発毛部の拡大像である。成体マウス脂肪由来間葉系細胞に対してDNP63A、GRHL2、TFAP2A、c-MYC、LEF1を遺伝子導入して作成した誘導上皮細胞と、成体マウス脂肪由来間葉系細胞に対してETV1,FOXD1, PRDM1を遺伝子導入して作成した誘導間葉系細胞の移植試験（実施例２－１４）の結果を示す写真であり、これら誘導細胞の移植によって皮下に毛包様構造、成熟した毛髪シャフトを得ることができることが示されている。（Ａ）は２８日目（Ｄ２８）の外観の写真で、点線は組織像を採取した部位であり、（Ｂ）はヘマトキシリンエオジン染色（ＨＥ）した組織像の断面写真であり、点線の四角は（Ｃ）の位置を示しており、（Ｃ）は拡大像であり、（Ｄ）、（Ｅ）は、（Ｃ）と連続する切片の組織像である。矢印は成熟した毛髪シャフトを示しており、切片の中で連続する一連のシャフトが認められたことを示している。成体マウス脂肪由来間葉系細胞に対してDNP63A、GRHL2、TFAP2A、LEF1を遺伝子導入して作成した誘導上皮細胞と、成体マウス脂肪由来間葉系細胞に対してETV1, FOXD1, PRDM1を遺伝子導入して作成した誘導間葉系細胞、成体マウス脂肪由来間葉系細胞に対してSHH, LEF1を遺伝子導入して作成した誘導間葉系細胞の移植試験（実施例３）の結果を示す写真であり、これら誘導細胞の移植によって皮膚付属器の再生を得ることができることが示されている。(Ａ)は移植部の全体像であり、(Ｂ)は発毛部の拡大像である。成体マウス脂肪由来間葉系細胞に対してDNP63A、GRHL2、TFAP2A、c-MYC、LEF1を遺伝子導入して作成した誘導上皮細胞と、皮膚付属器誘導能を有する間葉系細胞に相対的に強発現する複数の遺伝子を組み合わせて遺伝子導入した間葉系細胞１種類もしくは２種類を免疫不全動物背部に装着したチャンバー内に共移植することによって、移植部位に認めた毛髪発毛の本数である。各条件についてそれぞれ２回実験を行った結果を示している。（Ａ）シリコンチャンバーの鋳型、（Ｂ）作成されたシリコンチャンバー、（Ｃ）背部にシリコンチャンバーを逢着したマウス。

１．皮膚付属器誘導能を有する細胞の製造方法、及び皮膚付属器誘導能を有する細胞の用途
　本発明において、「皮膚付属器誘導能を有する細胞」とは、表皮など、外界に触れる部位において身体内部を機械的障害、感染などの外的要因から保護する重層上皮の前駆細胞もしくは幹細胞として働く能力を備えている細胞（換言すれば、上皮幹細胞）であって、適切な間葉系細胞とともに移植することによって毛包、脂腺などの皮膚付属器の再構成を与える細胞、及び／又は適切な上皮系細胞と移植することによって、毛包、脂腺などの皮膚付属器の再構成を与える間葉系細胞のことを意味し、胎児期や新生児期の皮膚由来細胞や成体の毛包・付属器から採取された細胞も含む。さらに、皮膚付属器誘導能を有する細胞は、重層扁平上皮形成能も有している。

　本発明の皮膚付属器誘導能を有する細胞の製造方法は、皮膚付属器誘導能を持たない体細胞に、皮膚付属器誘導能を有する細胞（例えば、胎児、新生児由来の皮膚細胞や毛包、脂腺など皮膚付属器を構成する細胞）に相対的に強く発現している少なくとも１種の遺伝子を導入する工程を含むことを特徴とする。以下、導入する遺伝子を「導入遺伝子」と呼ぶ。導入遺伝子は、皮膚付属器誘導能を有する細胞に相対的に強発現する遺伝子を複数種類導入してもよいし、皮膚付属器誘導能を有する細胞に相対的に強発現する遺伝子に加えて、相対的に強発現しない遺伝子を組み合わせてもよい。

　ここで、「導入遺伝子」は、タンパク質をコードする遺伝子のみならず、マイクロRNA等のnoncoding RNAも含む。また、「皮膚付属器誘導能を有する細胞に相対的に強発現する遺伝子」とは、成体由来のケラチノサイト、皮膚線維芽細胞や脂肪由来間葉系細胞等の皮膚付属器誘導能を持たない細胞に比較して、皮膚付属器誘導能を有する細胞において発現量が多いことがリアルタイムＰＣＲ法、マイクロアレイ、RNAシーケンス等の遺伝子発現量の定量的評価法によって確認される遺伝子を指す。なお、「相対的に強発現しない遺伝子」とは、皮膚付属器誘導能を持たない細胞に比較して、皮膚付属器誘導能を有する細胞において発現量が少ない遺伝子を指す。

　皮膚付属器誘導能を有する上皮系細胞に相対的に強発現する遺伝子は、少なくとも次のタンパク質をコードする遺伝子を含む。DNP63A遺伝子、GRHL2遺伝子、TFAP2A遺伝子、cMYC遺伝子、LEF1遺伝子。

　皮膚付属器誘導能を有する間葉系細胞に相対的に強発現する遺伝子は、少なくとも次のタンパク質をコードする遺伝子を含む。SOX2遺伝子、LEF1遺伝子、HOXC4遺伝子、HOXC9遺伝子、HOXC13遺伝子、JARID2遺伝子、HEY1遺伝子、HEY2遺伝子、FOXO1遺伝子、FOXD1遺伝子、EGR3遺伝子、MEF2C遺伝子、LHX2遺伝子、PRRX1遺伝子、PRRX2遺伝子、CREB3遺伝子、ETV1遺伝子、TFAP2A遺伝子、cMYC遺伝子、TBX6遺伝子、MSX2遺伝子、SHH遺伝子、PRDM1遺伝子。

　本発明で使用するいずれの遺伝子も、その塩基配列は公知である（表１）。なお、本明細書において、NCBIとは、米国立生物工学情報センター（NationalCenter for Biotechnology Information）の略であり、表１のAccessionNo.もNCBIが提供するデータベースに登録されているものである。

　これらの遺伝子の多くの由来は、ヒトを含む哺乳動物において共通して存在しており、任意の哺乳動物由来のものを使用できるが、導入する体細胞の由来に応じて適宜選択することが望ましい。例えば、体細胞としてヒト由来のものを使用する場合であれば、上記導入遺伝子はヒト由来であることが望ましい。また、上記導入遺伝子は、野生型遺伝子以外に、その遺伝子産物のアミノ酸配列における数個（例えば１～１０個、好ましくは１～６個、更に好ましくは１～４個、より好ましくは１～３個、特に好ましくは１又は２個）のアミノ酸が置換、欠失、及び／又は挿入されており、且つ、野生型の遺伝子産物と同等の機能を有する変異遺伝子産物をコードしている変異遺伝子であってもよい。またそれぞれの遺伝子がコードするアミノ酸と同様のアミノ酸をコードするようにコドンを変更・最適化した配列を用いてもよい。

　本発明において、上記導入遺伝子は、公知の配列情報に基づいて、常法に従って調製することができる。例えば、哺乳動物由来の細胞からRNAを抽出し、常法に従ってクローニングすることにより、目的とする遺伝子のcDNAを調製することができる。また、人工遺伝子として合成することもできる。人工遺伝子合成に際して、導入する体細胞の由来動物に合わせてコドンの最適化を行うこともできる。

　本発明において、皮膚付属器誘導能を有する細胞に誘導される「体細胞」としては、その種類については特に制限されず、あらゆる組織又は部位由来のものが使用できる。本発明で使用される体細胞としては、例えば、皮膚、皮下脂肪、筋肉、胎盤、骨、軟骨、血液、角膜実質等の組織由来のものが挙げられ、より具体的には、皮膚線維芽細胞、皮下脂肪組織由来間質細胞（皮下脂肪細胞）、胚性線維芽細胞、脂肪細胞、筋肉細胞、骨芽細胞、軟骨細胞、循環血中の単核球、が例示される。これらの中でも、生体に対して侵襲が軽微であり、且つより効率的に皮膚付属器誘導能を有する細胞を作製するという観点から、皮膚由来細胞、皮下脂肪由来細胞、もしくは血液由来細胞が好ましく、特に皮膚線維芽細胞及び皮下脂肪組織由来間質細胞、循環血液中の単核球が好ましい。このように、様々な細胞から材料を選択でき、とりわけ皮膚由来細胞や皮下脂肪由来細胞、循環血液中の単核球等の入手容易な細胞をも使用できることは、患者の負担を軽減し、細胞の安定な入手の点でも、臨床上の利点がある。また、上記体細胞として、市販品を使用してもよく、またＥＳ細胞や間葉系幹細胞等から分化させた体細胞を使用することもできる。

　また、上記体細胞は、皮膚付属器誘導能を有する細胞の使用目的に応じて、ヒト、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、ネコ、イヌ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ヤギ、サル等の哺乳動物由来のものから適宜選択されるが、ヒトの治療、病態解明又は薬効確認等のヒトを対象とする目的で使用する場合にはヒト由来のものが好適である。また、ヒト由来の体細胞を使用する場合、胎児、幼児、小児、及び成人のいずれに由来するものであってもよい。皮膚付属器誘導能を有する細胞をヒトの治療、病態解明又は薬効確認等の目的で使用する場合には、患者から採取した体細胞を使用することが望ましい。

　上記導入遺伝子の体細胞への導入は、動物細胞のトランスフェクションにおいて通常使用される方法で行うことができる。具体的には、上記導入遺伝子を体細胞へ導入する方法として、ベクターを使用する方法；リン酸カルシウム法；リポフェクション法；エレクトロポレーション法；マイクロインジェクション法等が例示される。これらの中でも、導入効率の点から、ベクターを使用する方法が好ましい。ベクターを使用して上記導入遺伝子を体細胞に導入する場合には、ベクターとして、ウイルスベクター、非ウイルスベクター（プラスミド（ＤＮＡ）ベクター、ｍＲＮＡベクターを含む）、人工ウイルス等を用いることができるが、アデノ随伴ウイルス及びレトロウイルス、レンチウイルス等のウイルスベクターが、安全性の観点から好適に使用される。なお、ベクターを使用する場合であって、上記導入遺伝子が複数の場合は、各々別のベクターに組み込まれていてもよいし、１つのベクターに２種以上の導入遺伝子が組み込まれていてもよい。

　斯くして上記導入遺伝子が導入された体細胞は、皮膚付属器誘導能を有する細胞に誘導することができる。

　また、生体内に存在する体細胞に対して上記遺伝子導入手段やベクターを用いて導入遺伝子の遺伝子導入を行うことによって、生体内の体細胞から皮膚付属器誘導能を有する細胞を誘導することも可能である。導入遺伝子としては、皮膚付属器誘導能を有する上皮系細胞に相対的に強発現する遺伝子であってもよいし、皮膚付属器誘導能を有する間葉系細胞に相対的に強発現する遺伝子であってもよいが、両方の遺伝子を導入することが好ましい。

［誘導上皮細胞］
　本発明の皮膚付属器誘導能を有する細胞の製造方法、特に上皮系の細胞は、（１）LEF1遺伝子と、（２）DNP63A遺伝子、GRHL2遺伝子、及びTFAP2A遺伝子から選択された１種、２種、又は３種の遺伝子と、を含む導入遺伝子を、皮膚付属器誘導能を持たない体細胞に遺伝子導入する工程を含むことが好ましい。特に、本発明の皮膚付属器誘導能を有する上皮系細胞の製造方法としては、LEF1遺伝子、DNP63A遺伝子、GRHL2遺伝子、及びTFAP2A遺伝子の４遺伝子を含む導入遺伝子を、皮膚付属器誘導能を持たない体細胞に遺伝子導入する工程を含むことが好ましい。

　さらに本発明の皮膚付属器誘導能を有する細胞の製造方法、特に上皮系の細胞は、（１）LEF1遺伝子と、（２）DNP63A遺伝子、GRHL2遺伝子、TFAP2A遺伝子、及びMYCファミリー遺伝子の少なくとも一つ、から選択された少なくとも１種、２種、３種、又は４種の遺伝子と、を含む導入遺伝子を、皮膚付属器誘導能を持たない体細胞に遺伝子導入する工程を含むことが好ましい。特に、本発明の皮膚付属器誘導能を有する上皮系細胞の製造方法としては、LEF1遺伝子、DNP63A遺伝子、GRHL2遺伝子、TFAP2A遺伝子、及びMYCファミリー遺伝子の少なくとも一つの少なくとも５遺伝子を含む導入遺伝子を、皮膚付属器誘導能を持たない体細胞に遺伝子導入する工程を含むことが好ましい。

　Mycファミリー遺伝子としては、c-Myc、N-Myc、及びL-Myc等が挙げられる。これらのMycファミリー遺伝子は、単独で使用してもよく、また複数の遺伝子を組み合わせて使用してもよい。Mycファミリー遺伝子としてはc-Myc遺伝子を使用することが好ましい。

　また、非特許文献１５において、重層扁平上皮形成能を誘導する方法において認められるように、皮膚付属器誘導能を有する上皮系の細胞は、上記４遺伝子又は５遺伝子にさらに他の遺伝子を追加することによっても製造することが可能である。つまり、導入遺伝子は、上記４遺伝子又は５遺伝子の少なくとも１種を含んでおり、さらに他の遺伝子（重層扁平上皮形成能及び皮膚付属器誘導能の発現を阻害しないものが好ましい）を追加してもよい。

　皮膚付属器誘導能を有する上皮細胞に誘導された細胞の選択は、ケラチノサイトの単離、増幅に適した培養条件下での増殖能の有無、及び上皮細胞としての特性を有するか否かを指標として行うことができる。このような皮膚付属器誘導能を有する上皮細胞は、具体的には、ケラチノサイトを単離、増幅するのに適したフィーダー細胞（3T3-J2フィーダー細胞、3T3細胞、マウス胚線維芽細胞、ヒト皮膚線維芽細胞などに対して、マイトマイシンCや放射線処理を行い増殖能を失活させたもの）上や、ケラチノサイト無血清培地で培養することによって相対的に高い増殖能を呈することから、継代処理を継続することによって選択が可能である。フィーダー上でのケラチノサイトの分裂可能回数を比較的に向上させることができるRhoキナーゼ阻害剤（Y27632等）を加えることも有効である。また、上皮細胞に特異的な表面抗原(CDH1, Epi-CAM等)を用いてフローサイトメトリーや磁気細胞分離装置を用いた細胞分離を行うことにより、皮膚付属器誘導能を有する上皮細胞の純度を高めることが可能である。また、体細胞に、予め上皮細胞マーカー遺伝（CDH1, Epi-CAM等）のプロモーターに薬剤耐性遺伝子を結合して作ったレポーター遺伝子コンストラクトを導入しておいた場合には、上皮細胞の特性を獲得した細胞は薬剤存在下で生育可能になるので、薬剤存在下での生育を指標として、選択することもできる。

　斯くして得られた皮膚付属器誘導能を有する誘導上皮細胞は、フィーダー上でRhoキナーゼ阻害剤を加えた液体培地内で培養すると増殖可能であり、通常行われる10継代程度までは皮膚付属器誘導能を維持したまま安定に増殖することができる。皮膚付属器誘導能を有する誘導上皮細胞の培養には、動物細胞の培養に通常使用される培地を用いることができる。皮膚付属器誘導能を有する上皮細胞の培養に使用される好適な培地の一例として、無血清ケラチノサイト培地（Keratinocyte-SFM、Life technologies社）などが例示される。bFGFなど、培養条件下でのケラチノサイトの増殖を早めるサイトカインや各種の薬理活性物質を添加することも有用である。

　斯くして得られた皮膚付属器誘導能を有する誘導上皮系細胞は、免疫不全動物背部に装着したチャンバー内に皮膚付属器誘導能を有する新生児動物皮膚由来間葉系細胞と混合移植することによって、皮膚付属器の再構成、再生を与える。対して、成体由来の皮膚細胞、皮膚付属器誘導能を有しない誘導上皮系細胞（例えば体細胞に対して非特許文献１５に記載の方法で誘導したDNP63A遺伝子、GRHL2遺伝子、TFAP2A遺伝子、cMYC遺伝子を遺伝子導入することによって誘導される重層扁平上皮形成能を有する細胞を、免疫不全動物背部に装着したチャンバー内に皮膚付属器誘導能を有する新生児動物皮膚由来間葉系細胞と混合移植しても、皮膚付属器の再構成、再生は得られない。

　新生児動物由来の上皮系細胞や、成体由来の皮膚付属器から単離された細胞も同様に、皮膚付属器誘導能を有する新生児動物皮膚由来間葉系細胞と混合移植することによって、皮膚付属器の再構成、再生を与えるが、動物から単離されたこれらの細胞には、皮膚付属器誘導能をもつ間葉系細胞が混入していることが多い。つまり、従来は皮膚付属器誘導能をもつ上皮系細胞のみを皮膚付属器誘導能をもつ間葉系細胞から分離して単離することが困難であった。対して、斯くして得られた皮膚付属器誘導能を有する誘導上皮系細胞は、皮膚付属器誘導能をもつ一方で、皮膚付属器誘導能をもつ間葉系細胞が混入していない。本性質を利用し、皮膚付属器誘導能を有する誘導上皮系細胞と皮膚付属器誘導能の有無が不明の間葉系細胞とを混合移植することによって、その間葉系細胞が皮膚付属器誘導能を有するか否かの判定を行うための評価系として用いることができる。

　斯くして得られた皮膚付属器誘導能を有する誘導上皮系細胞は、皮膚潰瘍面のような皮膚及び皮膚付属器の欠損する病態、加齢性の変化によって皮膚付属器及びその機能の低下した状態や皮膚潰瘍治癒後など、量的、質的に皮膚付属器の不足する病態を有する患者に対して移植することによって、皮膚及び皮膚付属器の再生、新生を与える治療方法となる。

　非特許文献１５において、重層扁平上皮形成能を有する細胞を誘導する遺伝子を生体内に存在する体細胞に対して遺伝子導入することによって、重層扁平上皮形成能を有することのない生体内の体細胞から重層扁平上皮形成能を有する細胞を誘導しているように、生体内に存在する体細胞に対して上記遺伝子導入手段やベクターを用いて導入遺伝子の遺伝子導入を行うことによって、生体内の体細胞から皮膚付属器誘導能を有する上皮系細胞を誘導することも可能である。

　すなわち、生体内に存在する体細胞に対して、皮膚付属器誘導能を有する上皮系細胞を誘導する遺伝子の遺伝子導入を行う遺伝子導入手段やベクターは、皮膚潰瘍面のような皮膚及び皮膚付属器の欠損する病態、加齢性の変化によって皮膚付属器及びその機能の低下した状態や皮膚潰瘍治癒後など、皮膚付属器の不足する病態を有する患者に対して遺伝子導入を行い、皮膚付属器誘導能を有する上皮系細胞を誘導することによって、皮膚及び皮膚付属器の再生、新生を与える治療方法となる。

［誘導間葉系細胞］
　本発明の皮膚付属器誘導能を有する細胞の製造方法、特に間葉系の細胞は、（１）PRDM1遺伝子、（２）FOXD1遺伝子、（３）ETV1遺伝子、（４）LEF1遺伝子、（５）SHH遺伝子から選択された少なくとも一種の遺伝子を皮膚付属器誘導能を持たない体細胞に遺伝子導入する工程を含むことが好ましい。

　本発明の皮膚付属器誘導能を有する細胞の製造方法、特に間葉系の細胞は、少なくともSHH遺伝子を皮膚付属器誘導能を持たない体細胞に遺伝子導入する工程を含むことが好ましい。

　本発明の皮膚付属器誘導能を有する細胞の製造方法、特に間葉系の細胞は、少なくともSHH遺伝子及びLEF1遺伝子を皮膚付属器誘導能を持たない体細胞に遺伝子導入する工程を含むことが好ましい。

　本発明の皮膚付属器誘導能を有する細胞の製造方法、特に間葉系の細胞は、（１）PRDM1遺伝子、（２）FOXD1遺伝子、（３）ETV1遺伝子から選択された少なくとも一種の遺伝子を皮膚付属器誘導能を持たない体細胞に遺伝子導入する工程を含むことも好ましい。

　本発明の皮膚付属器誘導能を有する細胞の製造方法、特に間葉系の細胞は、（１）SHH遺伝子と、（２）ETV1遺伝子、PRDM1遺伝子、FOXD1遺伝子及びLEF1遺伝子から選択された一つ以上の遺伝子と、を皮膚付属器誘導能を持たない体細胞に遺伝子導入する工程を含むことも好ましい。

　本発明の皮膚付属器誘導能を有する細胞の製造方法、特に間葉系の細胞は、（１）SHH遺伝子、又はSHH遺伝子及びLEF1遺伝子と、（２）ETV1遺伝子、PRDM1遺伝子、FOXD1遺伝子から選択された一つ以上の遺伝子と、を皮膚付属器誘導能を持たない体細胞に遺伝子導入する工程を含むことも好ましい。

　本発明の皮膚付属器誘導能を有する細胞の製造方法、特に間葉系の細胞は、（１）ETV1遺伝子及びPRDM1遺伝子；（２）FOXD1遺伝子及びPRDM1遺伝子；又は（３）ETV1遺伝子、PRDM1遺伝子、及びFOXD1遺伝子を、皮膚付属器誘導能を持たない体細胞に遺伝子導入する工程を含むことも好ましい。

　また、　非特許文献１５において、重層扁平上皮形成能を誘導する方法において認められるように、皮膚付属器誘導能を有する間葉系細胞は、上記に記載された遺伝子にさらに他の遺伝子を追加することによっても製造することが可能である。

　斯くして得られた皮膚付属器誘導能を有する誘導間葉系細胞は、例えば10%のFBS（ウシ胎児血清）を添加したDMEM培地や、N2-supplementを添加したAdvanced-DMEM培地などで培養可能である。bFGFなど、培養条件下で間葉系細胞の増殖を早めるサイトカインや各種の薬理活性物質を添加することも有用である。

　斯くして得られた皮膚付属器誘導能を有する誘導間葉系細胞（例えば皮膚付属器誘導能を持たない間葉系細胞に対して、PRDM1遺伝子、FOXD1遺伝子を遺伝子導入した誘導間葉系細胞及びLEF1遺伝子、SHH遺伝子を遺伝子導入した誘導間葉系細胞）は、免疫不全動物背部に装着したチャンバー内に、上記皮膚付属器誘導能を有する上皮細胞と混合移植することによって、皮膚付属器の再構成、再生を与える。対して、成体由来の皮膚間葉系細胞を、免疫不全動物背部に装着したチャンバー内に、皮膚付属器誘導能を有する上皮系細胞と混合移植しても、皮膚付属器の再構成、再生は得られない。

　斯くして得られた皮膚付属器誘導能を有する誘導間葉系細胞は、免疫不全動物背部に装着したチャンバー内に皮膚付属器誘導能を有する新生児動物皮膚由来上皮系細胞と混合移植することによって、皮膚付属器の再構成、再生を与える。新生児動物から初代培養して早期の間葉系細胞や、成体由来の皮膚付属器から単離された細胞も同様に、皮膚付属器誘導能を有する上皮系細胞と混合移植することによって、皮膚付属器の再構成、再生を与えるが、動物から単離されたこれらの細胞には、皮膚付属器誘導能をもつ上皮系細胞が混入している可能性がある。対して、斯くして得られた皮膚付属器誘導能を有する誘導間葉系細胞は、皮膚付属器誘導能をもつ一方で、皮膚付属器誘導能をもつ上皮系細胞が混入していない。本性質を利用し、皮膚付属器誘導能を有する誘導間葉細胞と皮膚付属器誘導能の有無が不明の上皮系細胞とを混合移植することによって、その上皮系細胞が皮膚付属器誘導能を有するか否かの判定を行うための評価系として用いることができる。

　斯くして得られた皮膚付属器誘導能を有する誘導間葉系細胞は、皮膚潰瘍面のような皮膚及び皮膚付属器の欠損する病態、加齢性の変化によって皮膚付属器及びその機能の低下した状態や皮膚潰瘍治癒後など、量的、質的に皮膚付属器の不足する病態を有する患者に対して移植することによって、皮膚及び皮膚付属器の再生、新生を与える治療方法となる。

　非特許文献１５において、重層扁平上皮形成能を有する細胞を誘導する遺伝子を生体内に存在する体細胞に対して遺伝子導入することによって、重層扁平上皮形成能を有することのない生体内の体細胞から重層扁平上皮形成能を有する細胞を誘導しているように、生体内に存在する体細胞に対して上記遺伝子導入手段やベクターを用いて導入遺伝子の遺伝子導入を行うことによって、生体内の体細胞から皮膚付属器誘導能を有する間葉系細胞を誘導することも可能である。

　すなわち、生体内に存在する体細胞に対して、皮膚付属器誘導能を有する間葉系細胞を誘導する遺伝子の遺伝子導入を行う遺伝子導入手段やベクターは、皮膚潰瘍面のような皮膚及び皮膚付属器の欠損する病態、加齢性の変化によって皮膚付属器及びその機能の低下した状態や皮膚潰瘍治癒後など、皮膚付属器の不足する病態を有する患者に対して遺伝子導入を行い、皮膚付属器誘導能を有する間葉系細胞を誘導することによって、皮膚及び皮膚付属器の再生、新生を与える治療方法となる。このため、皮膚付属器誘導能を有する間葉系細胞を誘導する遺伝子の遺伝子導入を行う遺伝子導入手段やベクターは該治療用製剤を作成するための組成物となる。

　このように、本発明で得られる皮膚付属器誘導能を有する上皮細胞及び間葉系細胞は増殖能を有しており、且つ生体内で皮膚付属器の再生が可能であるので、熱傷、外傷、医原性損傷（腫瘍切除後等）、褥瘡、糖尿病性潰瘍、末梢循環不全による皮膚潰瘍でもたらされる皮膚潰瘍などの治療に有効であり、皮膚及び皮膚付属器組織再生用の細胞製剤（医薬組成物）として使用できる。

　上記皮膚付属器誘導能を有する上皮細胞、間葉系細胞を皮膚及び皮膚付属器組織再生用の細胞製剤として調製する場合、上記皮膚付属器誘導能を有する上皮細胞、間葉系細胞と共に、必要に応じて、薬学的に許容される希釈用担体を含んでいてもよい。ここで、薬学的に許容される希釈用担体としては、例えば、生理食塩水、緩衝液等が例示される。更に、当該細胞製剤は、必要に応じて、薬理活性成分や皮膚付属器誘導能を有する上皮細胞、間葉系細胞の栄養源となる成分が含まれていてもよい。

　上記皮膚付属器誘導能を有する上皮細胞、間葉系細胞は培養条件下で皮膚及び皮膚付属器様組織を形成した組織工学的製剤として皮膚疾患部位に適用してもよい。組織工学的製剤は、シート状構造物（例えば、上皮細胞シート）や、３次元構造をもった器官原基などの細胞集合体を含んできる。

　上記皮膚付属器誘導能を有する上皮細胞、間葉系細胞を皮膚及び皮膚付属器組織再生用の組織工学的製剤として作製する場合、皮膚付属器誘導能を有する上皮細胞、間葉系細胞と共に、必要に応じて、薬理活性成分や皮膚付属器誘導能を有する上皮細胞、間葉系細胞の栄養源となる成分と併用してもよい。

　上記皮膚付属器誘導能を有する上皮細胞、間葉系細胞は、皮膚線維芽細胞や脂肪組織由来間質細胞などの間葉系細胞を含むコラーゲンなどの細胞外基質を足場として、シート状構造物や、三次元構造を有する皮膚及び皮膚付属器様組織や器官原基などの細胞集合体を作製したのちに皮膚疾患部位に適用してもよい。

　上記皮膚付属器誘導能を有する上皮細胞、間葉系細胞を皮膚及び皮膚付属器再生用の三次元構造を有する皮膚及び皮膚付属器様組織として作製する場合、上記皮膚付属器誘導能を有する上皮細胞、間葉系細胞と共に、必要に応じて、薬理活性成分や皮膚付属器誘導能を有する上皮細胞、間葉系細胞の栄養源となる成分と併用してもよい。このように足場材料を使用することによって、より速やかに移植部位での皮膚及び皮膚付属器の再生が可能になる。

　使用可能な足場材料としては、薬学的に許容される限り、特に制限されず、適用する軟骨組織の部位に応じて適宜選択されるが、例えば、ゲル状体の、生体親和性の高い（biocompatible）材料が挙げられる。使用可能な足場材料として、好ましくはコラーゲン、ファイブロネクチン、ヒアルロン酸、マトリゲル及びこれらの複合体等が例示される。これらの足場材料は、１種単独で使用してもよく、２種以上を組み合わせて使用してもよい。

　また、上記足場材料の形状についても特に制限されず、当該細胞製剤の適用対象となる皮膚及び皮膚付属器組織の損傷部位の形状に応じて適宜設計すればよい。

　当該細胞製剤を上皮組織の疾患部位に適用する方法については、当該細胞製剤のタイプ、適用される皮膚組織の部位等に応じて適宜設定されるが、例えば治療目的の皮膚潰瘍の部位に当該細胞製剤を直接散布する方法、培養条件下で構成された組織様の三次元構造体を直接散布する方法、植皮術に準じてシート、三次元構造体を縫合固定する方法などがあげられる。

　また、皮膚組織の疾患部位に適用される当該細胞製剤の投与量については、細胞製剤のタイプ、上皮組織の部位、症状の程度、患者の年齢や性別等に基づいて、皮膚及び皮膚付属器組織の再生に有効な量を適宜設定すればよい。

　また、上記皮膚付属器誘導能を有する上皮細胞、間葉系細胞が投与されて、誘導皮膚及び皮膚付属器を有する細胞から形成された皮膚及び皮膚付属器組織を有する非ヒト哺乳動物は、皮膚及び／又は皮膚付属器組織に対する被験物質の薬効を評価、分析するためのツールとして使用できる。即ち、上記皮膚付属器誘導能を有する上皮細胞、間葉系細胞から形成された皮膚及び皮膚付属器組織を有する非ヒト哺乳動物に被験物質を投与し、当該皮膚及び／又は皮膚付属器組織に対する被験物質の薬効を判定、分析することによって、皮膚及び／又は皮膚付属器組織に対する被験物質の薬効を評価、分析することができる。ここで、被験物質とは、皮膚及び／又は皮膚付属器組織に対する薬効の評価、分析対象となる物質であり、具体的には、皮膚及び／又は皮膚付属器疾患の治療薬の候補物質が挙げられる。非ヒト哺乳動物としては、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、ネコ、イヌ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ヤギ、サル等が適宜選択される。

　また、上記皮膚付属器誘導能を有する上皮細胞、間葉系細胞から形成された皮膚及び皮膚付属器組織を有する非ヒト哺乳動物は、抗がん剤や放射線など、皮膚及び／又は皮膚付属器組織に障害を及ぼす外的要因の皮膚及び／又は皮膚付属器組織に対する影響を調べるモデルとして用いることができる。

　また、上記皮膚付属器誘導能を有する上皮細胞、間葉系細胞を含むコラーゲンゲルなどの足場によって作成された三次元構造体は、皮膚及び／又は皮膚付属器組織に対する被験物質の薬効を評価、分析するためのツールとして使用できる。即ち、上記皮膚付属器誘導能を有する上皮細胞、間葉系細胞及び皮膚線維芽細胞を含むコラーゲンゲルなどの足場によって作成された三次元構造体に被験物質を投与し、当該皮膚及び／又は皮膚付属器組織に対する被験物質の薬効を判定、分析することによって、皮膚及び／又は皮膚付属器組織に対する被験物質の薬効を評価、分析することができる。ここで、被験物質とは、皮膚及び皮膚付属器組織に対する薬効の評価、分析対象となる物質であり、具体的には、皮膚及び／又は皮膚付属器疾患の治療薬の候補物質が挙げられる。特に、末梢血循環単核球など、比較的侵襲が少なく採取可能な体細胞から誘導した皮膚付属器誘導能を有する上皮細胞、間葉系細胞を用いることにより、多彩な遺伝的背景を有する多くのドナーに対する薬効を広く評価、分析することができる。

　また、上記皮膚付属器誘導能を有する上皮細胞、間葉系細胞は、様々な皮膚及び皮膚付属器組織の病態を解明、分析するためのツールとして使用でき、更にはヒト体細胞から誘導した皮膚付属器誘導能を有する上皮細胞、間葉系細胞は、皮膚及び皮膚付属器疾患に対する創薬や薬品開発のためのツールとしても有用である。例えば、人体から取り出された体細胞に、導入遺伝子を導入して皮膚付属器誘導能を有する上皮細胞、間葉系細胞を製造し、さらにかかる細胞を培養して作製された皮膚及び皮膚付属器様組織に対し、被験物質を投与し、前記皮膚及び皮膚付属器様組織に対する被験物質の薬効を評価、分析したり、抗がん剤や放射線などのストレスを負荷し、前記皮膚及び皮膚付属器組織に対するストレスを評価、分析したりすることができる。薬効又はストレスの評価、分析は、例えば、被験物質を投与した組織又はストレスを付加した組織と、投与又は付与していない組織とを比較して確認してもよい。

２．実験結果
　以下に、実施例等に基づいて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらによって限定されるものではない。

［参考例１］　マウス成体皮膚由来上皮系細胞とマウス成体皮膚由来間葉系細胞の移植実験
　成体マウス背部より得られた皮膚検体を0.25%トリプシン4℃でオーバーナイト処理し、真皮から剥離した表皮組織及び真皮表層面より採取した細胞を3T3-J2フィーダー細胞上にRho-kinase inhibitor であるY27632（SELLECK社）を含むケラチノサイトＦ培地で播種することによってマウス成体皮膚由来上皮系初代培養細胞を採取した。一方、成体マウス腰背部より得られた皮膚検体を0.25%トリプシン4℃でオーバーナイト処理し、表皮組織を剥離した真皮組織、もしくは皮下脂肪組織を0.1%コラゲナーゼで37℃1時間処理し、採取した細胞を10% ウシ新生仔血清を加えたDMEM培地で播種することによってマウス成体皮膚由来間葉系初代培養細胞を採取した。１－３日培養したマウス成体皮膚由来上皮系初代培養細胞及びマウス成体皮膚由来間葉系初代培養細胞を免疫不全動物背部に装着したシリコン製チャンバー内に移植した。シリコン製チャンバーを用いた皮膚付属器再構成アッセイの定法にのっとり、移植後１週間でシリコン製チャンバーの上部に穴をあけ、移植後２週間でシリコン製チャンバーを除去したのち、移植後４～５週まで観察を続けた（図１）。チャンバー部位は移植細胞によって上皮化を得たが、皮膚付属器の再構成・再生は得られなかった（図２）。

　フィーダーとして用いた3T3-J2フィーダー細胞は、J-TEC社より分譲された細胞株である。10% ウシ新生仔血清をDMEM培地に加えた3T3細胞培地を用いて、常法に従い維持の上、フィーダー細胞として用いる前日にマイトマイシンC 10 μg/mlの培地で１時間処理ののち、2.0×105 細胞／ウェルの濃度で継代してフィーダーとして用いた。

［参考例２］　マウス新生児皮膚由来上皮系細胞とマウス新生児皮膚由来間葉系細胞の移植実験
　新生児マウス背部より得られた皮膚検体を0.25%トリプシン4℃でオーバーナイト処理し、真皮から剥離した表皮組織及び真皮表層面より採取した細胞を3T3-J2フィーダー細胞上にRho-kinase inhibitor であるY27632（SELLECK社）を含むケラチノサイトＦ培地で播種することによってマウス新生児皮膚由来上皮系初代培養細胞を採取した。一方、新生児マウス背部より得られた皮膚検体を0.25%トリプシン4℃でオーバーナイト処理し、表皮組織を剥離した真皮組織、皮下脂肪組織を0.1%コラゲナーゼで37℃1時間処理し、採取した細胞を10% ウシ新生仔血清を加えたDMEM培地で播種することによってマウス新生児皮膚由来間葉系初代培養細胞を採取した。１－３日培養したマウス新生児皮膚由来上皮系初代培養細胞及びマウス新生児皮膚組織由来間葉系初代培養細胞を免疫不全動物背部に装着したシリコン製チャンバー内に移植した。移植後１週間でシリコン製チャンバーの上部に穴をあけ、移植後２週間でシリコン製チャンバーを除去したのち、移植後４～５週まで観察を続けた（図３）。チャンバー部位に毛髪発毛、皮膚付属器の再構成、再生を得た（図４）。

［比較例１］　重層扁平上皮形成能をもった誘導上皮細胞とマウス新生児皮膚由来間葉系細胞の移植実験
　成体マウス皮下脂肪組織を0.1%コラゲナーゼで37℃1時間処理し、採取した細胞を10% ウシ新生仔血清を加えたDMEM培地で播種することによってマウス成体脂肪由来間葉系初代培養細胞を採取した。２継代ののち、アデノ随伴ウイルスベクター（adeno associated virus vector、AAV）を用いて、DNP63A遺伝子, GRHL2遺伝子,TFAP2A遺伝子, c-MYC遺伝子を遺伝子導入することによって、重層扁平上皮形成能をもった誘導上皮細胞を作成した。当該誘導上皮細胞とマウス新生児皮膚組織由来間葉系初代培養細胞を免疫不全動物背部に装着したシリコン製チャンバー内に移植した。移植後１週間でシリコン製チャンバーの上部に穴をあけ、移植後２週間でシリコン製チャンバーを除去したのち、移植後４～５週まで観察を続けた（図５）。チャンバー部位は移植細胞によって上皮化を得たが、皮膚付属器の再構成・再生は得られなかった（図６）。

［比較例２］
　遺伝子導入によってマウス成体脂肪由来間葉系初代培養細胞から皮膚付属器誘導能を有する上皮細胞を誘導する方法を開発するために、マウス成体脂肪由来間葉系初代培養細胞を２継代ののち、AAVを用いてDNP63A遺伝子、GRHL2遺伝子、TFAP2A遺伝子、c-MYC遺伝子、SHH遺伝子を遺伝子導入したところ、誘導上皮細胞を得ることができなかった（図７）。

［比較例３］
　遺伝子導入によってマウス成体脂肪由来間葉系初代培養細胞から皮膚付属器誘導能を有する上皮細胞を誘導する方法を開発するために、マウス成体脂肪由来間葉系初代培養細胞を２継代ののち、AAVを用いてDNP63A遺伝子、GRHL2遺伝子、TFAP2A遺伝子、c-MYC遺伝子、FOXD1遺伝子を遺伝子導入したところ、誘導上皮細胞を得た（図８）。

　斯くして得られた誘導上皮細胞を及びマウス新生児皮膚組織由来間葉系初代培養細胞を免疫不全動物背部に装着したシリコン製チャンバー内に移植した。移植後１週間でシリコン製チャンバーの上部に穴をあけ、移植後２週間でシリコン製チャンバーを除去したのち、移植後４～５週まで観察を続けた。チャンバー部位は移植細胞によって上皮化を得たが、皮膚付属器の再構成・再生は得られなかった（図９）。

［実施例１］　皮膚付属器誘導能をもつ誘導上皮細胞とマウス新生児皮膚由来間葉系細胞の移植実験
　遺伝子導入によってマウス成体脂肪由来間葉系初代培養細胞から皮膚付属器誘導能を有する上皮細胞を誘導する方法を開発するために、マウス成体脂肪由来間葉系初代培養細胞を２継代ののち、AAVを用いてDNP63A遺伝子、GRHL2遺伝子、TFAP2A遺伝子、c-MYC遺伝子、LEF1遺伝子を遺伝子導入したところ、誘導上皮細胞を得た（図１０）。

　斯くして得られた誘導上皮細胞及びマウス新生児皮膚組織由来間葉系初代培養細胞を免疫不全動物背部に装着したシリコン製チャンバー内に移植した。移植後１週間でシリコン製チャンバーの上部に穴をあけ、移植後２週間でシリコン製チャンバーを除去したのち、移植後４～５週まで観察を続けた。チャンバー部位に毛髪発毛、皮膚付属器の再構成、再生を得た（図１１）。斯くして得られた誘導上皮細胞は皮膚付属器誘導能をもつ誘導上皮細胞としての性質を満たしていた。詳細については後記実施例１に記載する。

［比較例４］　マウス新生児皮膚由来上皮系細胞と誘導間葉系細胞の移植実験
　マウス成体脂肪由来間葉系初代培養細胞に遺伝子導入することによって得られる誘導細胞であって、皮膚付属器誘導能をもつ上皮細胞と共移植することによって、皮膚付属器の再構成、再生を与える皮膚付属器誘導能をもつ間葉系細胞を誘導するための候補遺伝子として、皮膚付属器誘導能を有する間葉系細胞に相対的に強発現する遺伝子（SOX2遺伝子、LEF1遺伝子、HOXA9遺伝子、HOXC4遺伝子、HOXC9遺伝子、HOXC13遺伝子、JARID2遺伝子、HEY1遺伝子、HEY2遺伝子、FOXO1遺伝子、FOXD1遺伝子、EGR3遺伝子、MEF2C遺伝子、LHX2遺伝子、PRRX1遺伝子、CREB3遺伝子、ETV1遺伝子、TFAP2A遺伝子、cMYC遺伝子、TBX6遺伝子、MSX2遺伝子、SHH遺伝子、PRDM1遺伝子）を選択した。

　マウス新生児皮膚由来上皮系初代培養細胞を、皮膚付属器誘導能をもつ上皮細胞と考え、初代培養時に混入するマウス新生児皮膚由来間葉系を除去するために２－３継代培養した上皮系細胞と、マウス成体脂肪由来間葉系初代培養細胞を２継代ののち、レトロウイルスベクターを用いて、皮膚付属器誘導能を有する間葉系細胞に相対的に強発現する複数の遺伝子を組み合わせて遺伝子導入した細胞とともに、免疫不全動物背部に装着したシリコン製チャンバー内に移植した。中にはチャンバー部位に少量の毛髪発毛、皮膚付属器の再構成、再生を得たマウスも認められたが、導入遺伝子によって一定の傾向を認めず、マウス新生児皮膚由来上皮系初代培養細胞を、マウス新生児皮膚由来間葉系を除去するために２－３継代培養した上皮系細胞には実際にはマウス新生児皮膚由来間葉系が混入している可能性が高かった。マウス新生児皮膚由来上皮系初代培養細胞の皮膚付属器誘導能を維持した状態で、マウス新生児皮膚由来間葉系の混入のない上皮細胞を得ることは困難であった。

　この点、マウス成体脂肪由来間葉系初代培養細胞に対してDNP63A遺伝子、GRHL2遺伝子、TFAP2A遺伝子、c-MYC遺伝子、及びLEF1遺伝子（実施例１及び２）又はDNP63A遺伝子、GRHL2遺伝子、TFAP2A遺伝子、及びLEF1遺伝子（実施例３）を遺伝子導入することによって得られた誘導上皮細胞は、皮膚付属器誘導能をもつ一方で、皮膚付属器誘導能をもつ間葉系細胞が混入していない。本性質を利用し、実施例２及び３に記載のとおり、皮膚付属器誘導能を有する誘導上皮系細胞と混合移植することによって、ある特定の間葉系細胞が皮膚付属器誘導能を有するか否かの判定を行うための評価に用いることができた。

［実施例２］　皮膚付属器誘導能をもつ誘導上皮細胞と皮膚付属器誘導能をもつ誘導間葉系細胞の移植実験
　まず、遺伝子組み換え動物を用いた研究によって、毛包の再生の環境因子として重要であることが示唆されているSHH遺伝子、LEF1遺伝子を候補とした。マウス成体脂肪由来間葉系初代培養細胞を２継代ののち、AAVを用いてDNP63A遺伝子、GRHL2遺伝子、TFAP2A遺伝子、c-MYC遺伝子、LEF1遺伝子を遺伝子導入して作成した皮膚付属器誘導能をもつ誘導上皮細胞（実施例１）と、マウス成体脂肪由来間葉系初代培養細胞を２継代ののち、レトロウイルスベクターを用いてSHH遺伝子単独で遺伝子導入した間葉系細胞（実施例２－１３）と、もしくはSHH遺伝子及びLEF1遺伝子を組み合わせて遺伝子導入した間葉系細胞（実施例２－８）とを免疫不全動物背部に装着したチャンバー内に共移植した。移植後１週間でシリコン製チャンバーの上部に穴をあけ、移植後２週間でシリコン製チャンバーを除去したのち、移植後４～５週まで観察を続けた。チャンバー部位に少数の毛髪の発毛を認めた（図２４、図２９）。

　次に、皮膚付属器誘導能をもつ誘導上皮細胞と共移植することによって、皮膚付属器の再構成、再生を与える皮膚付属器誘導能をもつ間葉系細胞を誘導する因子をさらに選択するために各候補遺伝子を遺伝子導入した際の皮膚付属器誘導能をもつ間葉系細胞のマーカー遺伝子（PROM1遺伝子、CRABP1遺伝子、VCAN遺伝子）発現の変化（図１２）及び、アルカリフォスファターゼ発現の変化（図１３）を調べた。単独の遺伝子導入でマーカー遺伝子、アルカリフォスファターゼ発現を強くすることからFOXD1遺伝子、HEY1遺伝子、HEY2遺伝子、ETV1遺伝子、TFAP2A遺伝子をより可能性の高い候補因子として選択し、これらの中から更に複数の候補遺伝子を組み合わせで遺伝子導入した際のアルカリフォスファターゼ発現の変化（図１４）を調べ、候補遺伝子選択の参考とした。一連の解析を通して、最終的に皮膚付属器誘導能をもつ誘導間葉系細胞を誘導するための因子として特にETV1およびFOXD1が有効である可能性が高いと考え、後の生体による移植実験でその有効性が確認された。

　SHH遺伝子、LEF1遺伝子、環境因子とは異なった機序で皮膚付属器誘導能をもつ間葉系細胞を誘導する因子を選択するために、ETV1遺伝子、FOXD1遺伝子、PRDM1遺伝子を候補とした。マウス成体脂肪由来間葉系初代培養細胞を２継代ののち、AAVを用いてDNP63A遺伝子、GRHL2遺伝子、TFAP2A遺伝子、c-MYC遺伝子、LEF1遺伝子を遺伝子導入して作成した皮膚付属器誘導能をもつ誘導上皮細胞（実施例１）と、マウス成体脂肪由来間葉系初代培養細胞を２継代ののち、レトロウイルスベクターを用いて、ETV1遺伝子、FOXD1遺伝子、PRDM1遺伝子を組み合わせて遺伝子導入した間葉系細胞（実施例２－１４）とを免疫不全動物背部に装着したチャンバー内に共移植し、移植後１週間でシリコン製チャンバーの上部に穴をあけ、移植後２週間でシリコン製チャンバーを除去したのち、移植後４～５週まで観察を続けた。組織学的検索によって細胞移植部の中央部皮下、本来毛髪の認められない部位に、毛包様構造と成熟した毛髪シャフトを認めた（図３０）。

　ETV1遺伝子、FOXD1遺伝子、PRDM1遺伝子を組み合わせて遺伝子導入することによって、SHH遺伝子、LEF1遺伝子、環境因子とは異なった機序で皮膚付属器誘導能をもつ間葉系細胞を誘導することが考えられたことから、これらの遺伝子を遺伝子導入した複数種類の細胞を移植することによって、より効率よく毛髪発毛、皮膚付属器の再構成、再生を与えうることが示唆された。

　皮膚付属器誘導能をもつ誘導上皮細胞と共移植することによって、皮膚付属器の再構成、再生を与える皮膚付属器誘導能をもつ間葉系細胞を誘導する因子を選択するために、マウス成体脂肪由来間葉系初代培養細胞を２継代ののち、AAVを用いてDNP63A遺伝子、GRHL2遺伝子、TFAP2A遺伝子、c-MYC遺伝子、LEF1遺伝子を遺伝子導入して作成した皮膚付属器誘導能をもつ誘導上皮細胞（実施例１）と、マウス成体脂肪由来間葉系初代培養細胞を２継代ののち、レトロウイルスベクターを用いて、皮膚付属器誘導能を有する間葉系細胞に相対的に強発現する複数の遺伝子を組み合わせて遺伝子導入した間葉系細胞１種類もしくは２種類を免疫不全動物背部に装着したチャンバー内に共移植した（図１５）。移植後１週間でシリコン製チャンバーの上部に穴をあけ、移植後２週間でシリコン製チャンバーを除去したのち、移植後４～５週まで観察を続けた。第１及び第２の誘導間葉系細胞に導入した遺伝子は表２に記載のとおりである。実施例２－１～２－１３に記載の１３種類の組み合わせで遺伝子導入した誘導間葉系細胞１種類もしくは２種類を共移植した動物において、チャンバー部位に毛髪発毛、皮膚付属器の再構成、再生を得た。

　それぞれの導入遺伝子の組み合わせについて２回の実験を行い、実体顕微鏡検索上、発毛の認められた本数を数えた結果、導入遺伝子、細胞を組み合わせることによってより多くの毛髪発毛、皮膚付属器の再構成、再生を得ることができることがわかった。図３２は、実施例２－１～２－１３の各２回の実験における毛髪発毛の本数の結果一覧である。また、同じ組み合わせの複数種類の導入遺伝子を用いるに際しても複数の誘導間葉系細胞を用意して移植することによって、より優れた結果を得ることができることがわかった。例えば、実施例２－６の第１の誘導間葉細胞のように、ETV1遺伝子、FOXD1遺伝子、PRDM1遺伝子、SHH遺伝子を１細胞に遺伝子導入して移植するよりも、実施例２－２のように、SHH遺伝子を遺伝子導入した第１の誘導間葉細胞と、ETV1遺伝子、FOXD1遺伝子、及びPRDM1遺伝子を遺伝子導入した第２の誘導間葉細胞を用意して移植する方が優れていた。

　斯くして得られた誘導間葉系細胞は、皮膚付属器誘導能をもつ誘導上皮細胞と共移植することによって、皮膚付属器の再構成、再生を与える、皮膚付属器誘導能をもつ間葉系細胞としての性質を満たすことを確認した。

［実施例３］　
　さらにマウス成体脂肪由来間葉系初代培養細胞を２継代ののち、AAVを用いてDNP63A遺伝子、GRHL2遺伝子、TFAP2A遺伝子、LEF1遺伝子を遺伝子導入して作成した誘導上皮細胞と、マウス成体脂肪由来間葉系初代培養細胞を２継代ののち、レトロウイルスベクターを用いて、ETV1遺伝子、FOXD1遺伝子、PRDM1遺伝子を遺伝子導入した間葉系細胞及びLEF1遺伝子、SHH遺伝子を遺伝子導入した間葉系細胞を免疫不全動物背部に装着したチャンバー内に共移植した（図１５）。移植後１週間でシリコン製チャンバーの上部に穴をあけ、移植後２週間でシリコン製チャンバーを除去したのち、移植後４～５週まで観察を続けた。チャンバー部位に毛髪発毛、皮膚付属器の再構成、再生を得たことから、AAVを用いてDNP63A遺伝子、GRHL2遺伝子、TFAP2A遺伝子、LEF1遺伝子を遺伝子導入して作成した誘導上皮細胞は皮膚付属器誘導能をもつ上皮細胞としての性質を満たすことを確認した。なお、実施例においては遺伝子の導入にウイルスベクターを用いたが、これに限らず、プラスミドベクターやｍＲＮＡベクターなど、導入遺伝子の発現を即するようなあらゆるベクターで投与することが可能である。

１－１　マウス成体脂肪由来間葉系初代培養細胞から皮膚付属器誘導能をもつ誘導上皮細胞への誘導
　培養条件下にあるマウス成体脂肪由来間葉系細胞に対して遺伝子導入するためのDNP63A遺伝子、GRHL2遺伝子、TFAP2A遺伝子、c-MYC遺伝子、LEF1遺伝子を発現するAAVを作成した。

　AAVの作成には、NBRC（独立行政法人製品評価技術基盤機構　バイオテクノロジー分野）より購入したヒトGatewayエントリークローン及びメーカー（System Biosciences社、Gene Copoeia社、Origene社）より購入したプラスミド及びBJ fibroblast (ATCC社)から採取されたｍRNAをもとに作成したcDNAを鋳型として、In-Fusion（登録商標） HD Cloning Kit (Clonetech社)を用いてPCR増幅したコーディングシーケンスをpAAV-CAG-GFP (AddgenePlasmid #37825)バックボーンにクローニングしたpAAVプラスミド、AAV-DJ Rep-Cap Plasmid（Cell Biolabs社）を用いて、参考文献２（Grieger, J. C., Choi, V. W. & Samulski, R. J.Production and characterization of adeno-associated viral vectors. “Nat Protocol”, 2006, 1(3), p1412-1428）の方法にしたがって作成した。AAVのタイタリングには常法に従ってqPCRを用いた。

　成体マウス（C57BL/6）腰背部より得られた皮下脂肪検体を細切後、0.1%コラゲナーゼで37℃1時間処理し、採取した細胞を10% ウシ新生仔血清を加えたDMEM培地で播種することによってマウス成体脂肪由来間葉系初代培養細胞を採取した。２継代培養ののち、10%DMSOを含む15% ウシ新生仔血清を加えたDMEM培地で凍結保存した。凍結細胞を解凍し、１継代培養ののち、10% ウシ新生仔血清を加えたDMEM培地で1wellあたり50000-100000細胞播種し、翌日に、1wellあたり10¹⁰Gene Copy(GC)のDNP63A遺伝子発現AAVDJ、10⁹GCのGRHL2遺伝子発現AAVDJ、5×10⁹GCのTFAP2A遺伝子発現AAVDJ、5×10⁹GCのcMYC遺伝子発現AAVDJ、2×10⁹GCのLEF1遺伝子発現AAVDJを感染させた。２日目、３日目、５日目に新鮮な培地に培地交換を行い、６日目からは培地をRho-kinase inhibitor であるY27632（Wako社）を含むケラチノサイトＦ培地に交換し、以降連日培地交換を行った

　ケラチノサイトＦ培地は常法に従い調整した。本試験では、225mlのF12培地（WAKO社）、225mlのDME/F12培地(WAKO社)を混合したものに25mlウシ新生仔血清を加え、アデニン（Sigma社）24 μg/ml、コレラ毒素（Wako社）8.4 ng/ml、インスリン（WAKO社） 5 μg/ml、ハイドロコルチゾン（Sigma社） 0.4 μg/ml、ペニシリン（WAKO社）100 U/ml、ストレプトマイシン（WAKO社）100 μg/ml、EGF（WAKO社） 10 ng/mlに調整した。さらに、本試験においては、上記ケラチノサイトＦ培地をY-27632（Selleck社）10μMに調整して用いた。

　１０日目から１５日目にかけて、図１０に記載のような上皮様のコロニーの出現を認めるため、１５日目に、マイトマイシン処理した６ウェルプレートに用意した3T3-J2フィーダー細胞上に継代した。継代後は２日ごとに培地交換を行い、サブコンフルエントの時点（１週間前後）で１：３～１：８の比率で継代培養することによって、細胞数を増加させ、10%DMSOを含むY27632加ケラチノサイトF培地で凍結保存し、必要に応じて解凍・増幅の上、移植実験に使用した。

１－２　マウス成体脂肪由来間葉系初代培養細胞から誘導された皮膚付属器誘導能をもつ誘導上皮細胞と、マウス新生児皮膚由来間葉系細胞とによる皮膚付属器の再生
　実施例１－１で得られた誘導上皮細胞及びマウス新生児皮膚組織由来間葉系初代培養細胞を以下の手順により免疫不全動物背部に装着したシリコン製チャンバー内に移植した。２枚の１０ｃｍ細胞培養ディッシュ（ビオラモ社）に用意した3T3-J2フィーダー細胞上でケラチノサイトＦ培地を用いてサブコンフルエントまで培養した誘導上皮細胞を0.25%トリプシン 37℃で2分間処理後トリプシン溶液を吸引することによってフィーダー細胞を除去したのち、さらに0.25%トリプシン 37℃で５－１０分処理を行いケラチノサイトＦ培地10mlで回収し、誘導上皮細胞を含む懸濁液とした。一方、新生児マウス背部より得られた皮膚検体を0.25%トリプシン4℃でオーバーナイト処理後、表皮組織を剥離した真皮組織、皮下脂肪組織を0.1%コラゲナーゼで37℃1時間処理し、採取した細胞を６ウェルプレート（ビオラモ社）の１ウェルに10% ウシ新生仔血清を加えたDMEM培地で播種したマウス新生児皮膚由来間葉系初代培養細胞を３日間培養後、0.25%トリプシン 37℃で５－１０分処理を行い10% ウシ新生仔血清を加えたDMEM培地で回収し新生児皮膚組織由来間葉系初代細胞懸濁液とした。両懸濁液をそれぞれ100μmのセルストレーナーを用いてろ過した後に混合し、300G ５分間遠心後の細胞ペレットを、ケラチノサイトF培地と10% ウシ新生仔血清を加えたDMEM培地を１：１に混合した培地100μlに懸濁した溶液を、免疫不全動物背部に装着したドーム型シリコン製チャンバー内に移植した。移植後１週間でシリコン製チャンバーの上部に穴をあけ、移植後２週間でシリコン製チャンバーを除去したのち、移植後４～５週まで観察を続けた。チャンバー部位に毛髪発毛、皮膚付属器の再構成、再生を得た（図１１）。斯くして得られた誘導上皮細胞は皮膚付属器誘導能をもつ誘導上皮細胞としての性質を満たしていた。

　免疫不全動物としては、BALB/cAJcl-nu/nu（実験動物中央研究所由来）マウスを用いた。シリコンチャンバーは、参考文献３(Lichti U, Anders J, Yuspa SH.　Isolation and short-term culture of primary keratinocytes, hair follicle populations anddermal cells from newborn mice and keratinocytes from adult mice for in vitroanalysis and for grafting to immunodeficient mice. “NatProtocol”, 2008, 3(5), p799-810)に記載の方法に準じた方法で装着できるものを、３Ｄプリンターで内径10mm、鍔の幅3mm、厚さ0.5mm大に作成した鋳型に型取り用シリコン（HVT-4000、エングレービングジャパン）を流し込んで作成した。図３３（Ａ）はシリコンチャンバーの鋳型であり、図３３（Ｂ）は作成されたシリコンチャンバーである。マウス背部の皮膚を円形に切除してシリコンチャンバーを挿入し、ナイロン糸で逢着した。図３３（Ｃ）は背部にシリコンチャンバーを縫着したマウスである。

２－１　マウス成体脂肪由来間葉系初代培養細胞から皮膚付属器誘導能をもつ誘導間葉系細胞への誘導
　培養条件下にあるマウス成体脂肪由来間葉系細胞に対して遺伝子導入するためのETV1遺伝子、FOXD1遺伝子、PRDM1遺伝子、SHH遺伝子、LEF1遺伝子を発現するレトロウイルスを作成した。

　レトロウイルスプラスミドの作成は、NBRC（独立行政法人製品評価技術基盤機構　バイオテクノロジー分野）より購入したヒトGatewayエントリークローン、BJ fibroblast (ATCC社)、ヒト繊維芽細胞（タカラバイオ社）から採取されたｍRNAをもとに作成したcDNAを鋳型として、In-Fusion（登録商標） HD Cloning Kit (Clonetech社)を用いてPCR増幅したコーディングシーケンスをPMXsレトロウイルスにサブクローニングした。パッケージングプラスミド（pCMV-gagpol-PA, pCMV-VSVg）とともにLipofectamine2000（Thermo Fisher Scientific）を用いて、293FT細胞（Thermo Fisher Scientific）にトランスフェクションし、培地交換後の細胞上清をレトロウイルス液として用いた。　　　

　成体マウス（C57BL/6）腰背部より得られた皮下脂肪検体を細切後、0.1%コラゲナーゼで37℃1時間処理し、採取した細胞を10% ウシ新生仔血清を加えたDMEM培地で播種することによってマウス成体脂肪由来間葉系初代培養細胞を採取した。２継代培養ののち、それぞれ10%のSHH遺伝子発現レトロウイルス溶液、LEF1遺伝子発現レトロウイルス溶液を含む10%ウシ新生仔血清加DMEM培地（ポリブレン4ug/ml）で培養することによって、SHH遺伝子、LEF1遺伝子を発現する第１の誘導間葉系細胞を作成し、同様に、それぞれ10%のETV1遺伝子発現レトロウイルス溶液、FOXD1遺伝子発現レトロウイルス溶液、PRDM1遺伝子発現レトロウイルス溶液を含む10% ウシ新生仔血清加DMEM培地（ポリブレン4ug/ml）で培養することによって、ETV1遺伝子、FOXD1遺伝子、PRDM1遺伝子を発現する第２の誘導間葉系細胞を作成した。

　実施例１－１で得られた誘導上皮系細胞（DNP63A遺伝子、GRHL2遺伝子、TFAP2A遺伝子、c-MYC遺伝子、LEF1遺伝子発現AAVによる）と実施例２－１で得られた２種類の誘導間葉系細胞（SHH遺伝子、LEF1遺伝子発現レトロウイルスによる第１の誘導間葉系細胞と、ETV1遺伝子、FOXD1遺伝子、PRDM1遺伝子発現レトロウイルスによる第２の誘導間葉系細胞）を免疫不全動物背部に装着したチャンバー内に共移植した。移植後１週間でシリコン製チャンバーの上部に穴をあけ、移植後２週間でシリコン製チャンバーを除去したのち、移植後４週まで観察を続けた。チャンバー部位に毛髪発毛、皮膚付属器の再構成、再生を得た（図１６）。組織学的検索によって同部位に成熟した毛髪シャフト、毛母組織、脂腺組織の再生を認めた（図１７）。

　２－２　　実施例１－１に準じた実験手法で、DNP63A遺伝子、GRHL2遺伝子、TFAP2A遺伝子、c-MYC遺伝子、LEF1遺伝子によって誘導された誘導上皮細胞と、実施例２－１に準じた実験手法で、SHH遺伝子によって誘導された第１の誘導間葉系細胞１、及びETV1遺伝子、FOXD1遺伝子、PRDM1遺伝子によって誘導された第２の誘導間葉系細胞を免疫不全動物背部に装着したチャンバー内に共移植した。移植後１週間でシリコン製チャンバーの上部に穴をあけ、移植後２週間でシリコン製チャンバーを除去したのち、移植後４週まで観察を続けた。チャンバー部位に皮膚付属器の再生を得た（図１８）。

　２－３　実施例１－１に準じた実験手法で、DNP63A遺伝子、GRHL2遺伝子、TFAP2A遺伝子、c-MYC遺伝子、LEF1遺伝子によって誘導された誘導上皮細胞と、実施例２－１に準じた実験手法で、SHH遺伝子、LEF1遺伝子によって第１の誘導された誘導間葉系細胞１、及びETV1遺伝子、FOXD1遺伝子によって誘導された第２の誘導間葉系細胞２を免疫不全動物背部に装着したチャンバー内に共移植した。移植後１週間でシリコン製チャンバーの上部に穴をあけ、移植後２週間でシリコン製チャンバーを除去したのち、移植後４週まで観察を続けた。チャンバー部位に皮膚付属器の再生を得た（図１９）。

　２－４　実施例１－１に準じた実験手法で、DNP63A遺伝子、GRHL2遺伝子、TFAP2A遺伝子、c-MYC遺伝子、LEF1遺伝子によって誘導された誘導上皮細胞と、実施例２－１に準じた実験手法で、SHH遺伝子、LEF1遺伝子によって誘導された第１の誘導間葉系細胞、及びFOXD1遺伝子、PRDM1遺伝子によって誘導された第２の誘導間葉系細胞を免疫不全動物背部に装着したチャンバー内に共移植した。移植後1週間でシリコン製チャンバーの上部に穴をあけ、移植後２週間でシリコン製チャンバーを除去したのち、移植後４週まで観察を続けた。チャンバー部位に皮膚付属器の再生を得た（図２０）。

　２－５　実施例１－１に準じた実験手法で、DNP63A遺伝子、GRHL2遺伝子、TFAP2A遺伝子、c-MYC遺伝子、LEF1遺伝子によって誘導された誘導上皮細胞と、実施例２－１に準じた実験手法で、SHH遺伝子、LEF1遺伝子によって誘導された第１の誘導間葉系細胞、及びETV1遺伝子、PRDM1遺伝子によって誘導された第２の誘導間葉系細胞２を免疫不全動物背部に装着したチャンバー内に共移植した。移植後1週間でシリコン製チャンバーの上部に穴をあけ、移植後２週間でシリコン製チャンバーを除去したのち、移植後４週まで観察を続けた。チャンバー部位に皮膚付属器の再生を得た（図２１）。

　２－６　実施例１－１に準じた実験手法で、DNP63A遺伝子、GRHL2遺伝子、TFAP2A遺伝子、c-MYC遺伝子、LEF1遺伝子によって誘導された誘導上皮細胞と、実施例２－１に準じた実験手法で、ETV1遺伝子、FOXD1遺伝子、PRDM1遺伝子、SHH遺伝子によって誘導された誘導間葉系細胞を免疫不全動物背部に装着したチャンバー内に共移植した。移植後1週間でシリコン製チャンバーの上部に穴をあけ、移植後２週間でシリコン製チャンバーを除去したのち、移植後４週まで観察を続けた。チャンバー部位に皮膚付属器の再生を得た（図２２）。

　２－７　実施例１－１に準じた実験手法で、DNP63A遺伝子、GRHL2遺伝子、TFAP2A遺伝子、c-MYC遺伝子、LEF1遺伝子によって誘導された誘導上皮細胞と、実施例２－１に準じた実験手法で、ETV1遺伝子、FOXD1遺伝子、PRDM1遺伝子、SHH遺伝子、LEF1遺伝子によって誘導された誘導間葉系細胞を免疫不全動物背部に装着したチャンバー内に共移植した。移植後1週間でシリコン製チャンバーの上部に穴をあけ、移植後２週間でシリコン製チャンバーを除去したのち、移植後４週まで観察を続けた。チャンバー部位に皮膚付属器の再生を得た（図２３）。

　２－８　実施例１－１に準じた実験手法で、DNP63A遺伝子、GRHL2遺伝子、TFAP2A遺伝子、c-MYC遺伝子、LEF1遺伝子によって誘導された誘導上皮細胞と、実施例２－１に準じた実験手法で、SHH遺伝子、LEF1遺伝子によって誘導された誘導間葉系細胞を免疫不全動物背部に装着したチャンバー内に共移植した。移植後1週間でシリコン製チャンバーの上部に穴をあけ、移植後２週間でシリコン製チャンバーを除去したのち、移植後４週まで観察を続けた。チャンバー部位に皮膚付属器の再生を得た（図２４）。

　２－９　実施例１－１に準じた実験手法で、DNP63A遺伝子、GRHL2遺伝子、TFAP2A遺伝子、c-MYC遺伝子、LEF1遺伝子によって誘導された誘導上皮細胞と、実施例２－１に準じた実験手法で、SHH遺伝子、LEF1遺伝子によって誘導された第１の誘導間葉系細胞、PRDM1遺伝子によって誘導された第２の誘導間葉系細胞を免疫不全動物背部に装着したチャンバー内に共移植した。移植後1週間でシリコン製チャンバーの上部に穴をあけ、移植後２週間でシリコン製チャンバーを除去したのち、移植後４週まで観察を続けた。チャンバー部位に皮膚付属器の再生を得た（図２５）。

　２－１０　実施例１－１に準じた実験手法で、DNP63A遺伝子、GRHL2遺伝子、TFAP2A遺伝子、c-MYC遺伝子、LEF1遺伝子によって誘導された誘導上皮細胞と、実施例２－１に準じた実験手法で、SHH遺伝子によって誘導された第１の誘導間葉系細胞、FOXD1遺伝子、PRDM1遺伝子によって誘導された第２の誘導間葉系細胞を免疫不全動物背部に装着したチャンバー内に共移植した。移植後1週間でシリコン製チャンバーの上部に穴をあけ、移植後２週間でシリコン製チャンバーを除去したのち、移植後４週まで観察を続けた。チャンバー部位に皮膚付属器の再生を得た（図２６）。

　２－１１　実施例１－１に準じた実験手法で、DNP63A遺伝子、GRHL2遺伝子、TFAP2A遺伝子、c-MYC遺伝子、LEF1遺伝子によって誘導された誘導上皮細胞と、実施例２－１に準じた実験手法で、SHH遺伝子によって誘導された第１の誘導間葉系細胞、PRDM1遺伝子によって誘導された第２の誘導間葉系細胞を免疫不全動物背部に装着したチャンバー内に共移植した。移植後1週間でシリコン製チャンバーの上部に穴をあけ、移植後２週間でシリコン製チャンバーを除去したのち、移植後４週まで観察を続けた。チャンバー部位に皮膚付属器の再生を得た（図２７）。

　２－１２　実施例１－１に準じた実験手法で、DNP63A遺伝子、GRHL2遺伝子、TFAP2A遺伝子、c-MYC遺伝子、LEF1遺伝子によって誘導された誘導上皮細胞と、実施例２－１に準じた実験手法で、SHH遺伝子によって誘導された第１の誘導間葉系細胞、FOXD1遺伝子によって誘導された第２の誘導間葉系細胞を免疫不全動物背部に装着したチャンバー内に共移植した。移植後1週間でシリコン製チャンバーの上部に穴をあけ、移植後２週間でシリコン製チャンバーを除去したのち、移植後４週まで観察を続けた。チャンバー部位に皮膚付属器の再生を得た（図２８）。

　２－１３　実施例１－１に準じた実験手法で、DNP63A遺伝子、GRHL2遺伝子、TFAP2A遺伝子、c-MYC遺伝子、LEF1遺伝子によって誘導された誘導上皮細胞と、実施例２－１に準じた実験手法で、SHH遺伝子によって誘導された誘導間葉系細胞を免疫不全動物背部に装着したチャンバー内に共移植した。移植後1週間でシリコン製チャンバーの上部に穴をあけ、移植後２週間でシリコン製チャンバーを除去したのち、移植後４週まで観察を続けた。チャンバー部位に皮膚付属器の再生を得た（図２９）。

　２－１４　実施例１－１に準じた実験手法で、DNP63A遺伝子、GRHL2遺伝子、TFAP2A遺伝子、c-MYC遺伝子、LEF1遺伝子によって誘導された誘導上皮細胞と、実施例２－１に準じた実験手法で、ETV1遺伝子、FOXD1遺伝子、PRDM1遺伝子によって誘導された誘導間葉系細胞を免疫不全動物背部に装着したチャンバー内に共移植した。移植後１週間でシリコン製チャンバーの上部に穴をあけ、移植後２週間でシリコン製チャンバーを除去したのち、移植後４～５週まで観察を続けた。図３０（Ａ）は２８日目（Ｄ２８）の外観の写真であり、（Ｂ）はヘマトキシリンエオジン染色（ＨＥ）した組織像の断面写真（上は全体写真、下３枚はその一部拡大写真）であるが、外観写真から発毛は観察されていないが、組織学的検索によって細胞移植部の中央部皮下、本来毛髪の認められない部位に、毛包様構造と成熟した毛髪シャフトを認めた。本実施例において製造されたETV1遺伝子、FOXD1遺伝子、PRDM1遺伝子によって誘導された誘導間葉系細胞は、実施例２－１及び２－２においては、第２の誘導間葉系細胞として、第１の誘導間葉系細胞と併せて移植されているが、単独でも毛包様構造及び成熟した毛髪シャフト誘導能を有することが確認された。かかる誘導能を有する誘導間葉系細胞は、これを用いて例えば生理的にSHHやLEF1を高発現する部位に移植することによって皮膚付属器の再生を得ることができる。さらに、本実施例の結果から、ETV1遺伝子、FOXD1遺伝子、PRDM1遺伝子を含む導入遺伝子によって、in vitroで皮膚および皮膚付属器様組織を作成することができ、移植をはじめとする用途に用いることができる。また、生理的にSHHを高発現する細胞と共移植することによって皮膚付属器誘導能をもつ細胞群の一部として用いることもできる。

　マウス成体脂肪由来間葉系初代培養細胞から誘導された皮膚付属器誘導能をもつ他の誘導上皮細胞、誘導間葉系細胞による皮膚付属器の再生
　本実施例では、誘導上皮細胞の導入遺伝子として、DNP63A遺伝子、GRHL2遺伝子、TFAP2A遺伝子、LEF1遺伝子の４遺伝子を採用した。実施例１－１に準じた実験手法で、DNP63A遺伝子、GRHL2遺伝子、TFAP2A遺伝子、LEF1遺伝子によって誘導された誘導上皮細胞と、SHH遺伝子、LEF1遺伝子によって誘導された第１の誘導間葉系細胞、ETV1遺伝子、FOXD1遺伝子、PRDM1遺伝子によって誘導された第２の誘導間葉系細胞を免疫不全動物背部に装着したチャンバー内に共移植した。移植後1週間でシリコン製チャンバーの上部に穴をあけ、移植後２週間でシリコン製チャンバーを除去したのち、移植後４週まで観察を続けた。チャンバー部位に皮膚付属器の再生を得た（図３１）。

　実施例１及び３から理解されるように、DNP63A遺伝子、GRHL2遺伝子、TFAP2A遺伝子、c-MYC遺伝子、LEF1遺伝子の５遺伝子、又は、DNP63A遺伝子、GRHL2遺伝子、TFAP2A遺伝子、LEF1遺伝子の４遺伝子を、皮膚付属器誘導能を持たない体細胞に遺伝子導入することにより、皮膚付属器誘導能を有する誘導上皮細胞を製造することができた。比較例１～３では、誘導上皮細胞を得ることができなかったとから、皮膚付属器誘導能を有する上皮細胞を製造するには、LEF1遺伝子を導入する必要があることが判明した。LEF1遺伝子と併せて導入する遺伝子としては、DNP63A遺伝子、GRHL2遺伝子、TFAP2A遺伝子、及びc-MYC遺伝子から選択された一つ又は複数の遺伝子を導入することが好ましい。

　また、実施例２－１３から、SHH遺伝子を、皮膚付属器誘導能を持たない体細胞に遺伝子導入することにより、皮膚付属器誘導能を有する誘導間葉細胞を製造することができた。また実施例２－８から、SHH遺伝子、LEF1遺伝子を、皮膚付属器誘導能を持たない体細胞に遺伝子導入することにより、皮膚付属器誘導能を有する誘導間葉細胞を製造することができた。さらに、実施例２－１４から、ETV1遺伝子、PRDM1遺伝子、及びFOXD1遺伝子を、皮膚付属器誘導能を持たない体細胞に遺伝子導入することにより、皮膚付属器誘導能を有する誘導間葉細胞を製造することができた。図３２によれば、これらの細胞は同時に移植することによってより高い皮膚付属器誘導能を得ることができることが示唆される。特にETV1遺伝子, PRDM1遺伝子,FOXD1遺伝子の一部を遺伝子導入した細胞と、SHH遺伝子単独、もしくはSHH遺伝子およびLEF1遺伝子を遺伝子導入した細胞を同時に移植することによって、より高い皮膚付属器誘導能を有する誘導間葉細胞となることが示唆される。

Claims

　皮膚付属器誘導能を有する細胞に相対的に強発現する少なくとも１種の遺伝子を含む導入遺伝子を、皮膚付属器誘導能を持たない体細胞に導入する工程を含む、皮膚付属器誘導能を有する細胞の製造方法。
　（１）LEF1遺伝子と、
　（２）DNP63A遺伝子、GRHL2遺伝子、及びTFAP2A遺伝子から選択された１種、２種、又は３種の遺伝子と、
を含む導入遺伝子を、皮膚付属器誘導能を持たない体細胞に遺伝子導入する工程を含む、皮膚付属器誘導能を有する細胞の製造方法。
　LEF1遺伝子、DNP63A遺伝子、GRHL2遺伝子、及びTFAP2A遺伝子の４遺伝子を含む導入遺伝子を、皮膚付属器誘導能を持たない体細胞に遺伝子導入する工程を含む、皮膚付属器誘導能を有する細胞の製造方法。
　（１）LEF1遺伝子と、
　（２）DNP63A遺伝子、GRHL2遺伝子、TFAP2A遺伝子、及びMYCファミリー遺伝子の少なくとも一つ、から選択された少なくとも１種、２種、３種、又は４種の遺伝子と、
を含む導入遺伝子を、皮膚付属器誘導能を持たない体細胞に遺伝子導入する工程を含む、皮膚付属器誘導能を有する細胞の製造方法。
　LEF1遺伝子、DNP63A遺伝子、GRHL2遺伝子、TFAP2A遺伝子、及びMYCファミリー遺伝子の少なくとも一つの少なくとも５遺伝子を含む導入遺伝子を、皮膚付属器誘導能を持たない体細胞に遺伝子導入する工程を含む、皮膚付属器誘導能を有する細胞の製造方法。
　前記導入遺伝子は、前記MYCファミリー遺伝子としてcMYC遺伝子を含む請求項４又は５に記載の皮膚付属器誘導能を有する細胞の製造方法。
　SHH遺伝子、ETV1遺伝子、FOXD1遺伝子、PRDM1遺伝子、及びLEF1遺伝子から選択された一つ以上の遺伝子を含む導入遺伝子を、皮膚付属器誘導能を持たない体細胞に遺伝子導入する工程を含む、皮膚付属器誘導能を有する細胞の製造方法。
　SHH遺伝子を含む導入遺伝子を、皮膚付属器誘導能を持たない体細胞に遺伝子導入する工程を含む、皮膚付属器誘導能を有する細胞の製造方法。
　SHH遺伝子及びLEF1遺伝子を含む導入遺伝子を、皮膚付属器誘導能を持たない体細胞に遺伝子導入する工程を含む、皮膚付属器誘導能を有する細胞の製造方法。
　ETV1遺伝子、PRDM1遺伝子、及びFOXD1遺伝子から選択された１種、２種、又は３種の遺伝子を含む導入遺伝子を、皮膚付属器誘導能を持たない体細胞に遺伝子導入する工程を含む、皮膚付属器誘導能を有する細胞の製造方法。
　（１）SHH遺伝子と、
　（２）ETV1遺伝子、PRDM1遺伝子、FOXD1遺伝子及びLEF1遺伝子から選択された一つ以上の遺伝子と、
を含む導入遺伝子を、皮膚付属器誘導能を持たない体細胞に遺伝子導入する工程を含む、皮膚付属器誘導能を有する細胞の製造方法。
　（１）ETV1遺伝子及びPRDM1遺伝子；
　（２）FOXD1遺伝子及びPRDM1遺伝子；又は
　（３）ETV1遺伝子、PRDM1遺伝子、及びFOXD1遺伝子；
を含む導入遺伝子を、皮膚付属器誘導能を持たない体細胞に遺伝子導入する工程を含む、皮膚付属器誘導能を有する細胞の製造方法。
　複数種類の遺伝子を遺伝子導入する際に、導入遺伝子が異なる複数の細胞を用意する、請求項７乃至１２の何れか１項に記載の皮膚付属器誘導能を有する細胞の製造方法。
　前記体細胞がヒト由来である、請求項１乃至１３の何れか１項に記載の皮膚付属器誘導能を有する細胞の製造方法。
　前記体細胞が、皮膚線維芽細胞、皮下脂肪組織由来間質細胞（皮下脂肪細胞）、胚性線維芽細胞、脂肪細胞、筋肉細胞、骨芽細胞、軟骨細胞、循環血中の単核球、ＥＳ細胞、又は間葉系幹細胞等から分化させた体細胞である、請求項１乃至１４の何れか１項に記載の皮膚付属器誘導能を有する細胞の製造方法。
　請求項１乃至１５の何れか１項に記載の製造方法により製造される皮膚付属器誘導能を有する細胞。
　請求項１６に記載の皮膚付属器誘導能を有する細胞を含む、細胞製剤。
　（１）SHH遺伝子、又はSHH遺伝子及びLEF1遺伝子を含む導入遺伝子を、皮膚付属器誘導能を持たない体細胞に遺伝子導入する工程を経て製造された皮膚付属器誘導能を有する第１の細胞と、
　（２）ETV1遺伝子、PRDM1遺伝子、及びFOXD1遺伝子から選択された一つ以上の遺伝子を含む導入遺伝子を、皮膚付属器誘導能を持たない体細胞に遺伝子導入する工程を経て製造された皮膚付属器誘導能を有する第２の細胞と、
を含む細胞製剤。
　前記第２の細胞の導入遺伝子は、
　（１）ETV1遺伝子及びPRDM1遺伝子；
　（２）FOXD1遺伝子及びPRDM1遺伝子；又は
　（３）ETV1遺伝子、PRDM1遺伝子、及びFOXD1遺伝子；
を含む、請求項１８に記載の細胞製剤。
　足場材料を含む請求項１７乃至１９の何れか１項に記載の細胞製剤。
　前記足場材料がコラーゲンである、請求項２０に記載の細胞製剤。
　前記細胞製剤は、皮膚組織再生用、毛髪再生用である請求項１７乃至２１の何れか１項に記載の細胞製剤。
　前記細胞製剤がシート状構造体又は３次元構造の細胞集合体である請求項１７乃至２２の何れか１項に記載の細胞製剤。
　請求項１６に記載の皮膚付属器誘導能を有する細胞又は請求項１７乃至２３の何れか１項に記載の細胞製剤を非ヒト哺乳動物に投与して、前記哺乳動物の体内で前記皮膚付属器誘導能を有する細胞から皮膚付属器を形成させることにより製造される、皮膚付属器を形成させた非ヒト哺乳動物。
　請求項２４に記載の非ヒト哺乳動物に被験物質を投与し、皮膚及び／又は皮膚付属器組織に対する被験物質の薬効を判定する工程を含む、被験物質の薬効を判定する方法。
　請求項２４に記載の非ヒト哺乳動物に抗がん剤や放射線などのストレスを負荷し、皮膚及び／又は皮膚付属器組織に対するストレスを判定する工程を含む、外的要因の影響を判定する方法。
　請求項１乃至１２の何れか１項に記載の製造方法において使用される導入遺伝子を含む、皮膚付属器誘導能を有する細胞調整用組成物。
　前記導入遺伝子が、体細胞に導入可能な形態で含まれる、請求項２７に記載の細胞調整用組成物。
　請求項１６に記載の皮膚付属器誘導能を有する細胞を培養して作製された皮膚及び皮膚付属器様組織。
　請求項２９に記載の皮膚及び皮膚付属器様組織に対し、被験物質を投与し、皮膚及び／又は皮膚付属器様組織に対する被験物質の薬効を分析する工程を含む、被験物質の薬効の分析方法。
　請求項２９に記載の皮膚及び皮膚付属器様組織に対し、抗がん剤や放射線などのストレスを負荷し、皮膚及び／又は皮膚付属器様組織に対するストレスを分析する工程を含む、外的要因の影響の分析方法。
　請求項１乃至１２の何れか１項に記載の遺伝子を体細胞に遺伝子導入するために特化したベクターのキット。
　請求項１６に記載の皮膚付属器誘導能を有する細胞を用いた、細胞の皮膚付属器誘導能を評価する方法。
　皮膚付属器誘導能を有する細胞を製造することを目的とするベクターであって、LEF1遺伝子、DNP63A遺伝子、GRHL2遺伝子、TFAP2A遺伝子、及びcMYC遺伝子から選択された一つ以上の遺伝子を発現するベクター。
　皮膚付属器誘導能を有する細胞を製造することを目的とするベクターであって、SHH遺伝子、ETV1遺伝子、PRDM1遺伝子、FOXD1遺伝子、及びLEF1遺伝子から選択された一つ以上の遺伝子を発現するベクター。
　皮膚付属器誘導能を有する細胞を製造することを目的とする第１のベクターであって、SHH遺伝子、又はSHH遺伝子及びLEF1遺伝子を発現する第１のベクターと、
　皮膚付属器誘導能を有する細胞を製造することを目的とする第２のベクターであって、ETV1遺伝子、PRDM1遺伝子、及びFOXD1遺伝子から選択された一つ以上の遺伝子を発現する第２のベクターと、を含むベクターのキット。
　前記第２のベクターは、
　（１）ETV1遺伝子及びPRDM1遺伝子；
　（２）FOXD1遺伝子及びPRDM1遺伝子；又は
　（３）ETV1遺伝子、PRDM1遺伝子、及びFOXD1遺伝子；
を発現する、請求項３６に記載のベクターのキット。
　前記ベクターはウイルスベクターである、請求項３４若しくは３５に記載のベクター又は請求項３２、３６若しくは３７に記載のベクターのキット。
　請求項２乃至６の何れか１項に記載の製造方法で製造された皮膚付属器誘導能を有する細胞と、皮膚付属器誘導能を有する間葉系細胞とを含む、細胞製剤。
　前記皮膚付属器誘導能を有する間葉系細胞は、請求項７乃至１２の何れか１項に記載の製造方法で製造された皮膚付属器誘導能を有する細胞である、請求項３９に記載の細胞製剤。
　請求項７乃至１２の何れか１項に記載の製造方法で製造された皮膚付属器誘導能を有する細胞と、皮膚付属器誘導能を有する上皮系細胞とを含む、細胞製剤。
　前記皮膚付属器誘導能を有する上皮系細胞は、請求項２乃至６の何れか１項に記載の製造方法で製造された皮膚付属器誘導能を有する細胞である、請求項４１に記載の細胞製剤。