CN105695511A - 一种永生化毛囊干细胞系及其制备方法 - Google Patents

一种永生化毛囊干细胞系及其制备方法 Download PDF

Info

Publication number
CN105695511A
CN105695511A CN201610134289.5A CN201610134289A CN105695511A CN 105695511 A CN105695511 A CN 105695511A CN 201610134289 A CN201610134289 A CN 201610134289A CN 105695511 A CN105695511 A CN 105695511A
Authority
CN
China
Prior art keywords
hair follicle
stem cells
follicle stem
immortalization
culture medium
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201610134289.5A
Other languages
English (en)
Inventor
李玉红
星懿展
杨珂
郭海英
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Third Military Medical University TMMU
Original Assignee
Third Military Medical University TMMU
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Third Military Medical University TMMU filed Critical Third Military Medical University TMMU
Priority to CN201610134289.5A priority Critical patent/CN105695511A/zh
Publication of CN105695511A publication Critical patent/CN105695511A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0625—Epidermal cells, skin cells; Cells of the oral mucosa
    • C12N5/0627—Hair cells
    • C12N5/0628—Hair stem cells; Hair progenitors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2510/00—Genetically modified cells
    • C12N2510/04—Immortalised cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/10041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2740/10043—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/10—Plasmid DNA
    • C12N2800/106—Plasmid DNA for vertebrates
    • C12N2800/107—Plasmid DNA for vertebrates for mammalian

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明涉及一种永生化毛囊干细胞系及其制备方法，包括如下步骤：分离培养原代小鼠毛囊干细胞；生产逆转录病毒上清液；建立永生化毛囊干细胞系：接种原代毛囊干细胞；在步骤(2)收集的病毒上清液中加入聚凝胺；细胞贴壁后，吸掉培养基，加入含聚凝胺的病毒上清液；间隔一定时间更换新的含聚凝胺的病毒上清液；在第2轮换液时，加入潮霉素筛选；筛选3-5轮后，终止筛选，常规培养；筛选好的细胞即为永生化的毛囊干细胞。本发明所获得的永生化的小鼠毛囊干细胞在经历40次传代后，仍然能够在裸鼠上重建完整的毛囊结构。解决了毛囊干细胞无法长期培养和培养后失去干性的难题，可以大大降低毛囊干细胞研究及应用的劳动力成本及经济成本。

Description

一种永生化毛囊干细胞系及其制备方法
技术领域
本发明涉及一种永生化毛囊干细胞系及其制备方法。
背景技术
干细胞的研究为再生医学带来了前所未有的前景。胚胎干细胞研究较成熟，但它的应用受到伦理的限制；诱导多能干细胞解决了伦理问题，却面临肿瘤威胁、诱导效率低等问题；因此，对成体干细胞的研究仍然是干细胞研究领域的热点。毛囊干细胞(hairfolliclestemcell,HFSC)与其他成体干细胞相比，最大的特点是它本身就不断经历着周期性的活化与静息，同时，毛囊干细胞位于皮肤，获取方便。毛囊干细胞的这些特性使毛囊干细胞成为干细胞与再生医学研究的理想模型。
研究发现，毛囊干细胞除了参与毛囊的周期性再生外，还参与皮肤的创伤修复。而且，有研究者甚至发现毛囊干细胞能够帮助损伤神经或脊髓的修复，并且能诱导分化为具有功能的心肌细胞。因此，毛囊干细胞具有广泛的应用前景。
无论利用毛囊干细胞进行基础研究，还是进行应用研究，毛囊干细胞的大量获取都是关键因素。
现有技术中存在如下技术问题：目前毛囊干细胞的获取方式一般通过解剖显微镜分离培养或者进行流式细胞仪、磁珠分选仪的分离培养原代细胞。这些方法获得的毛囊干细胞的缺点是，随着培养代数的增加，毛囊干细胞逐渐失去其干性(即分化形成完整毛囊的能力)，而且，这种毛囊干细胞无法长期传代培养。现有方法如果需要获得足够实验研究甚至临床使用的毛囊干细胞，需要耗费巨量的劳动力成本及经济成本。因此，迫切需要一种可以长期培养，而仍然保持其干性的毛囊干细胞。
发明内容
针对以上上述现有技术问题和发明目的，本发明提出一种永生化毛囊干细胞系的制备方法，包括如下步骤：
(1)分离培养原代小鼠毛囊干细胞；
(2)生产逆转录病毒上清液；
(3)建立永生化毛囊干细胞系：
(3-1)接种原代毛囊干细胞；
(3-2)在步骤(2)收集的病毒上清液中加入聚凝胺；
(3-3)细胞贴壁后，吸掉培养基，加入含聚凝胺的病毒上清液；
(3-4)间隔一定时间更换新的含聚凝胺的病毒上清液；
(3-5)在第2轮换液时，加入潮霉素筛选；
(3-6)筛选3-5轮后，终止筛选，常规培养；
(3-7)筛选好的细胞即为永生化的毛囊干细胞。
进一步地，步骤(3)中具体步骤如下：
(3-1)在直径6cm的细胞培养皿中接种原代毛囊干细胞，起始密度为30-60％融合；
(3-2)在前面收集的病毒上清液中加入聚凝胺，使终浓度为5-20ug/ml；
(3-3)细胞贴壁后，吸掉培养基，加入3ml含聚凝胺的病毒上清液；
(3-4)每8-12小时换新的含聚凝胺的病毒上清液；
(3-5)在第2轮换液时，加入终浓度为100-400ug/ml的潮霉素筛选；
(3-6)筛选4-5轮后，终止筛选，改用正常的毛囊干细胞培养基常规培养；
(3-7)筛选好的细胞即为永生化的毛囊干细胞。
进一步地，步骤(2)包括如下步骤：
(2-1)接种HEK293细胞；
(2-2)准备转染试剂；
(2-3)充分混合转染试剂后室温放置；
(2-4)洗HEK293细胞，加入无血清的DMEM培养基；
(2-5)加入上述混合后的转染试剂；
(2-6)吸掉培养基，加含血清的培养基；
(2-7)在转染后间隔一定时间分别收集病毒上清液，暂存。
进一步地，步骤(2)具体采用如下步骤：
(2-1)在直径6cm的细胞培养皿中接种HEK293细胞，起始密度为30-60％融合；
(2-2)接种6-8小时后，准备转染试剂：500ulDMEM培养基，10ulpAmpho质粒，10ul含SV40T抗原的逆转录病毒载体质粒，10-20ul脂质体；
(2-3)充分混合转染试剂后，室温放置20分钟；
(2-4)用无血清的DMEM培养基洗HEK293细胞3遍，加入2ml无血清的DMEM培养基；
(2-5)加入上述混合后的转染试剂；
(2-6)3-5小时后，吸掉培养基，加3ml含血清的培养基；
(2-7)在转染后的24小时，48小时，72小时，96小时分别收集病毒上清液，暂存于4度冰箱。
进一步地，进一步包括步骤(4)：鉴定永生化毛囊干细胞系。
进一步地，步骤(4)中包括如下步骤：
(4-1)细胞传代能力鉴定；
(4-2)形态学鉴定；
(4-3)标记物鉴定；
(4-4)生物学鉴定。
进一步地，步骤(4-1)中，按常规培养方法对永生化的毛囊干细胞进行反复传代，在细胞传代至第40代时，仍具有良好的生长能力，取传至第40代的永生化的毛囊干细胞进行进一步鉴定。
进一步地，步骤(4-2)中，永生化的毛囊干细胞在传代40代后，仍具有克隆样生长的特性。
进一步地，步骤(4-3)中，通过流式细胞术按常规方法鉴定永生化的毛囊干细胞，在传代40代后，仍有57.1％的细胞表达毛囊干细胞的特征性标记物CD34，说明该细胞系仍保留原代毛囊干细胞的特性；步骤(4-4)中，进行裸鼠毛囊重建实验。传代40代后永生化毛囊干细胞仍能重建完整毛囊，说明该细胞仍具有原代毛囊干细胞的功能。
一种永生化毛囊干细胞系，采用上述的方法制备得到。
与目前现有技术相比，本发明所获得的永生化的小鼠毛囊干细胞在经历40次传代后，仍然能够在裸鼠上重建完整的毛囊结构。解决了毛囊干细胞无法长期培养和培养后失去干性的难题，可以大大降低毛囊干细胞研究及应用的劳动力成本及经济成本。
附图说明
图1为本发明克隆样生长的毛囊干细胞
图2为流式细胞术鉴定毛囊干细中CD34的表达
图3为永生化的毛囊干细胞裸鼠重建毛囊
具体实施方式
下面根据附图对本发明进行详细描述，其为本发明多种实施方式中的一种优选实施例。
在一个优选实施例中：
分离培养原代小鼠毛囊干细胞，采用文献报道的方法(Nowak,J.A.andE.Fuchs,Isolationandcultureofepithelialstemcells.MethodsMolBiol,2009.482:p.215-32)。
生产逆转录病毒上清液：
1.在直径6cm的细胞培养皿中接种HEK293细胞，起始密度为30-60％融合
2.接种6-8小时后，准备转染试剂：500ulDMEM培养基，10ulpAmpho质粒，10ul含SV40T抗原的逆转录病毒载体质粒，10-20ul脂质体
3.充分混合转染试剂后，室温放置20分钟
4.用无血清的DMEM培养基洗HEK293细胞3遍，加入2ml无血清的DMEM培养基
5.小心加入上述混合后的转染试剂
6.3-5小时后，吸掉培养基，加3ml含血清的培养基
7.在转染后的24小时，48小时，72小时，96小时分别收集病毒上清液，暂存于4度冰箱。
建立永生化毛囊干细胞系：在直径6cm的细胞培养皿中接种原代毛囊干细胞，起始密度为30-60％融合；在前面收集的病毒上清液中加入聚凝胺，使终浓度为5-20ug/ml；细胞贴壁后，吸掉培养基，加入3ml含聚凝胺的病毒上清液；每8-12小时换新的含聚凝胺的病毒上清液；在第2轮换液时，加入终浓度为100-400ug/ml的潮霉素筛选；筛选4-5轮后，终止筛选，改用正常的毛囊干细胞培养基常规培养；筛选好的细胞即为永生化的毛囊干细胞
鉴定永生化毛囊干细胞系：细胞传代能力鉴定，按常规培养方法对永生化的毛囊干细胞进行反复传代，在细胞传代至第40代时，仍具有良好的生长能力，取传至第40代的永生化的毛囊干细胞进行进一步鉴定。形态学鉴定：永生化的毛囊干细胞在传代40代后，仍具有克隆样生长的特性。见附图1。标记物鉴定：通过流式细胞术按常规方法鉴定永生化的毛囊干细胞，在传代40代后，仍有57.1％的细胞表达毛囊干细胞的特征性标记物CD34，说明该细胞系仍保留原代毛囊干细胞的特性。见附图2。生物学鉴定：按文献报道的方法(Weinberg,W.C.,etal.,Reconstitutionofhairfollicledevelopmentinvivo:determinationoffollicleformation,hairgrowth,andhairqualitybydermalcells.JInvestDermatol,1993.100(3):p.229-36.)进行裸鼠毛囊重建实验。传代40代后永生化毛囊干细胞仍能重建完整毛囊，说明该细胞仍具有原代毛囊干细胞的功能。见附图3。
在另一个优选实施例中：
一、分离培养原代小鼠毛囊干细胞，采用文献报道的方法(Nowak,J.A.andE.Fuchs,Isolationandcultureofepithelialstemcells.MethodsMolBiol,2009.482:p.215-32)。
二、生产逆转录病毒上清液
1.在直径6cm的细胞培养皿中接种HEK293细胞，起始密度为30-60％融合
2.接种3-5小时后，准备转染试剂：250ulDMEM培养基，5-10ulpAmpho质粒，5-10ul含SV40T抗原的逆转录病毒载体质粒，10-20ul脂质体
3.充分混合转染试剂后，室温放置20分钟。
4.用无血清的DMEM培养基洗HEK293细胞3遍，加入3ml无血清的DMEM培养基
5.小心加入上述混合后的转染试剂
6.3-5小时后，吸掉培养基，加4ml含血清的培养基
7.在转染后的24小时，48小时，72小时，96小时分别收集病毒上清液，暂存于4度冰箱。
三、建立永生化毛囊干细胞系
1.在直径6cm的细胞培养皿中接种原代毛囊干细胞，起始密度为30-60％融合
2.在前面收集的病毒上清液中加入聚凝胺，使终浓度为5-20ug/ml
3.细胞贴壁后，吸掉培养基，加入4ml含聚凝胺的病毒上清液
4.每8-12小时换新的含聚凝胺的病毒上清液
5.在第2轮换液时，加入终浓度为100-400ug/ml的潮霉素筛选
6.筛选3-5轮后，终止筛选，改用正常的毛囊干细胞培养基常规培养
7.筛选好的细胞即为永生化的毛囊干细胞
四、鉴定永生化毛囊干细胞系
1.细胞传代能力鉴定
按常规培养方法对永生化的毛囊干细胞进行反复传代，在细胞传代至第40代时，仍具有良好的生长能力，取传至第40代的永生化的毛囊干细胞进行进一步鉴定。
2.形态学鉴定
永生化的毛囊干细胞在传代40代后，仍具有克隆样生长的特性。见附图1。
3.标记物鉴定
通过流式细胞术按常规方法鉴定永生化的毛囊干细胞，在传代40代后，仍有57.1％的细胞表达毛囊干细胞的特征性标记物CD34，说明该细胞系仍保留原代毛囊干细胞的特性。见附图2。
4.生物学鉴定
按文献报道的方法(Weinberg,W.C.,etal.,Reconstitutionofhairfollicledevelopmentinvivo:determinationoffollicleformation,hairgrowth,andhairqualitybydermalcells.JInvestDermatol,1993.100(3):p.229-36.)进行裸鼠毛囊重建实验。传代40代后永生化毛囊干细胞仍能重建完整毛囊，说明该细胞仍具有原代毛囊干细胞的功能。见附图3。
上面结合附图对本发明进行了示例性描述，显然本发明具体实现并不受上述方式的限制，只要采用了本发明的方法构思和技术方案进行的各种改进，或未经改进直接应用于其它场合的，均在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种永生化毛囊干细胞系的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)分离培养原代小鼠毛囊干细胞；
(2)生产逆转录病毒上清液；
(3)建立永生化毛囊干细胞系：
(3-1)接种原代毛囊干细胞；
(3-2)在步骤(2)收集的病毒上清液中加入聚凝胺；
(3-3)细胞贴壁后，吸掉培养基，加入含聚凝胺的病毒上清液；
(3-4)间隔一定时间更换新的含聚凝胺的病毒上清液；
(3-5)在第2轮换液时，加入潮霉素筛选；
(3-6)筛选3-5轮后，终止筛选，常规培养；
(3-7)筛选好的细胞即为永生化的毛囊干细胞。
2.如权利要求1所述的永生化毛囊干细胞系的制备方法，其特征在于，步骤(3)中具体步骤如下：
(3-1)在直径6cm的细胞培养皿中接种原代毛囊干细胞，起始密度为30-60％融合；
(3-2)在前面收集的病毒上清液中加入聚凝胺，使终浓度为5-20ug/ml；
(3-3)细胞贴壁后，吸掉培养基，加入3ml含聚凝胺的病毒上清液；
(3-4)每8-12小时换新的含聚凝胺的病毒上清液；
(3-5)在第2轮换液时，加入终浓度为100-400ug/ml的潮霉素筛选；
(3-6)筛选4-5轮后，终止筛选，改用正常的毛囊干细胞培养基常规培养；
(3-7)筛选好的细胞即为永生化的毛囊干细胞。
3.如权利要求1或2所述的永生化毛囊干细胞系的制备方法，其特征在于，步骤(2)包括如下步骤：
(2-1)接种HEK293细胞；
(2-2)准备转染试剂；
(2-3)充分混合转染试剂后室温放置；
(2-4)洗HEK293细胞，加入无血清的DMEM培养基；
(2-5)加入上述混合后的转染试剂；
(2-6)吸掉培养基，加含血清的培养基；
(2-7)在转染后间隔一定时间分别收集病毒上清液，暂存。
4.如权利要求3所述的永生化毛囊干细胞系的制备方法，其特征在于，步骤(2)具体采用如下步骤：
(2-1)在直径6cm的细胞培养皿中接种HEK293细胞，起始密度为30-60％融合；
(2-2)接种6-8小时后，准备转染试剂：500ulDMEM培养基，10ulpAmpho质粒，5-10ul含SV40T抗原的逆转录病毒载体质粒，10-20ul脂质体；
(2-3)充分混合转染试剂后，室温放置20分钟；
(2-4)用无血清的DMEM培养基洗HEK293细胞3遍，加入2ml无血清的DMEM培养基；
(2-5)加入上述混合后的转染试剂；
(2-6)3-5小时后，吸掉培养基，加3ml含血清的培养基；
(2-7)在转染后的24小时，48小时，72小时，96小时分别收集病毒上清液，暂存于4度冰箱。
5.如权利要求1-4中任一项所述的永生化毛囊干细胞系的制备方法，其特征在于，进一步包括步骤(4)：鉴定永生化毛囊干细胞系。
6.如权利要求5所述的永生化毛囊干细胞系的制备方法，其特征在于，步骤(4)中包括如下步骤：
(4-1)细胞传代能力鉴定；
(4-2)形态学鉴定；
(4-3)标记物鉴定；
(4-4)生物学鉴定。
7.如权利要求6所述的永生化毛囊干细胞系的制备方法，其特征在于，步骤(4-1)中，按常规培养方法对永生化的毛囊干细胞进行反复传代，在细胞传代至第40代时，仍具有良好的生长能力，取传至第40代的永生化的毛囊干细胞进行进一步鉴定。
8.如权利要求6或7所述的永生化毛囊干细胞系的制备方法，其特征在于，步骤(4-2)中，永生化的毛囊干细胞在传代40代后，仍具有克隆样生长的特性。
9.如权利要求6-8中任一项所述的永生化毛囊干细胞系的制备方法，其特征在于，步骤(4-3)中，通过流式细胞术按常规方法鉴定永生化的毛囊干细胞，在传代40代后，仍有57.1％的细胞表达毛囊干细胞的特征性标记物CD34，说明该细胞系仍保留原代毛囊干细胞的特性；步骤(4-4)中，进行裸鼠毛囊重建实验。传代40代后永生化毛囊干细胞仍能重建完整毛囊，说明该细胞仍具有原代毛囊干细胞的功能。
10.一种永生化毛囊干细胞系，其特征在于，采用如权利要求1-9所述的方法制备得到。
CN201610134289.5A 2016-04-13 2016-04-13 一种永生化毛囊干细胞系及其制备方法 Pending CN105695511A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610134289.5A CN105695511A (zh) 2016-04-13 2016-04-13 一种永生化毛囊干细胞系及其制备方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610134289.5A CN105695511A (zh) 2016-04-13 2016-04-13 一种永生化毛囊干细胞系及其制备方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN105695511A true CN105695511A (zh) 2016-06-22

Family

ID=56220272

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201610134289.5A Pending CN105695511A (zh) 2016-04-13 2016-04-13 一种永生化毛囊干细胞系及其制备方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN105695511A (zh)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106754724A (zh) * 2016-12-09 2017-05-31 西北农林科技大学 一种永生化的牛精原干细胞系及其构建方法
CN106987562A (zh) * 2017-05-09 2017-07-28 西北民族大学 一种永生化小鼠造血干细胞系的制备方法

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20080286243A1 (en) * 2006-07-05 2008-11-20 Seoul National University Industry Foundation Method For Isolation of a Hair Follicle Stem Cell and a Composition For Hair Reproduction
CN101330830A (zh) * 2005-10-18 2008-12-24 国家犹太医学研究中心 条件无限增殖化长期干细胞和制备和使用所述细胞的方法
CN101974488A (zh) * 2010-06-21 2011-02-16 西北农林科技大学 一种永生化的猪胰腺干细胞系及其构建与分化方法
CN103710297A (zh) * 2013-07-10 2014-04-09 杭州市萧山区中医院 大鼠毛囊干细胞的分离培养方法
CN103865877A (zh) * 2014-03-11 2014-06-18 中国人民解放军第三军医大学第二附属医院 永生化人软骨终板干细胞系的制备方法及其用途

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101330830A (zh) * 2005-10-18 2008-12-24 国家犹太医学研究中心 条件无限增殖化长期干细胞和制备和使用所述细胞的方法
US20080286243A1 (en) * 2006-07-05 2008-11-20 Seoul National University Industry Foundation Method For Isolation of a Hair Follicle Stem Cell and a Composition For Hair Reproduction
CN101974488A (zh) * 2010-06-21 2011-02-16 西北农林科技大学 一种永生化的猪胰腺干细胞系及其构建与分化方法
CN103710297A (zh) * 2013-07-10 2014-04-09 杭州市萧山区中医院 大鼠毛囊干细胞的分离培养方法
CN103865877A (zh) * 2014-03-11 2014-06-18 中国人民解放军第三军医大学第二附属医院 永生化人软骨终板干细胞系的制备方法及其用途

Non-Patent Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
JONATHAN A. NOWAK ET AL.: "Isolation and Culture of Epithelial Stem Cells", 《METHODS MOL BIOL.》 *
JONATHAN A. NOWAK ET AL.: "Isolation and Culture of Epithelial Stem Cells", 《METHODS MOL BIOL.》, vol. 482, 12 October 2009 (2009-10-12), pages 215 - 232, XP055190452, DOI: 10.1007/978-1-59745-060-7_14 *
李玉红: "Wnt10b在毛囊周期调控中的作用及机制研究", 《中国博士学位论文全文数据库 医药卫生科技辑》 *
李玉红: "Wnt10b在毛囊周期调控中的作用及机制研究", 《中国博士学位论文全文数据库 医药卫生科技辑》, no. 12, 15 December 2011 (2011-12-15), pages 075 - 2 *
解慧琪等: "SV40与细胞永生化", 《中国修复重建外科杂志》 *
解慧琪等: "SV40与细胞永生化", 《中国修复重建外科杂志》, vol. 14, no. 3, 31 December 2000 (2000-12-31), pages 170 - 174 *
陈万涛: "《口腔颌面头颈部肿瘤生物学》", vol. 1, 31 May 2015, 上海交通大学出版社, pages: 68 *
陶谦: "SV40与细胞永生性转化", 《癌症》 *
陶谦: "SV40与细胞永生性转化", 《癌症》, vol. 20, no. 3, 31 December 2001 (2001-12-31), pages 332 - 334 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106754724A (zh) * 2016-12-09 2017-05-31 西北农林科技大学 一种永生化的牛精原干细胞系及其构建方法
CN106987562A (zh) * 2017-05-09 2017-07-28 西北民族大学 一种永生化小鼠造血干细胞系的制备方法

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP6749961B2 (ja) 高い増殖能を有する多能性間葉系幹細胞の識別および培養のための方法
CN102154197B (zh) 一种在低血清和无血清培养基中高密度悬浮培养的bhk-21细胞及其制备方法
CN105420189A (zh) 一种无血清培养基及其制备方法和用途
CN103361308B (zh) 一种规模化扩增骨髓间充质干细胞的方法
US20180362932A1 (en) Reagent kit for step-by-step huc-msc culture and huc-msc acquired using said reagent kit
CN103555587A (zh) 一种从自然水体中筛选高油脂藻类的方法
CN105695511A (zh) 一种永生化毛囊干细胞系及其制备方法
CN107418930A (zh) 一种纯化与扩增人骨髓间充质干细胞的制备方法
CN110564675A (zh) 一种毛囊干细胞的分离提取方法
CN101445792A (zh) 诱导骨髓间充质干细胞分化为成骨细胞的细胞共培养方法
CN106987559A (zh) 一种重组chok1细胞株的构建方法及其应用
CN103333854B (zh) 一种绒山羊毛囊干细胞体外高效培养的技术方法
CN105420186A (zh) 一种用于培养细胞的试剂盒
CN102140440A (zh) 用骨髓组织块分离及培养禽类骨髓间充质干细胞的方法
CN101892191A (zh) 诱导小鼠胚胎干细胞向神经细胞分化的方法
CN105420187A (zh) 一种用于分步培养hUC-MSC的试剂盒及采用所述试剂盒获得的hUC-MSC
CN102628029A (zh) 地贫诱导多能干细胞及其制备方法和用途
CN103048298B (zh) 一种甘氨酸修饰的量子点探针标记活细胞的方法
CN103525761A (zh) 分离培养动物骨髓间充质干细胞的方法
CN113322234A (zh) 永生化人cd34+cd38-造血干细胞系的制备方法及应用
CN103266082A (zh) 一种体外诱导胚胎干细胞分化为神经元的方法
CN103266084B (zh) 富集干细胞的三步分离法
CN105316283A (zh) 一种临床级胎盘间充质干细胞制备方法
CN103333918B (zh) 一种提高猪克隆胚胎体外发育效率的方法
CN110129271A (zh) 一种胶质瘤干细胞的分选方法

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination