CN103710297A - 大鼠毛囊干细胞的分离培养方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及大鼠毛囊干细胞的分离培养方法，该方法包括以下步骤：1）选用一周龄SD大鼠触须部皮肤；用镊子和一次性注射器针头从皮下组织端拉出毛囊，收集形态完好且处于生长期的毛囊，显微镜下将毛囊切成三等份，取中间部分，PBS漂洗后放入50mL培养瓶中，加入DMEM/F12补充培养基，1周后毛囊隆突部有细胞爬出，形成克隆；2）培养条件为37℃、5%CO₂培养箱中，每2-3d换液一次；3）毛囊干细胞的传代消化条件为：TrypLE^TMExpress(1X)，no Phenol Red，37℃消化8-10min；4)毛囊干细胞的纯化。本发明由于采用了上述的技术方案，得到了理想的毛囊干细胞。

Description

大鼠毛囊干细胞的分离培养方法

技术领域

本发明涉及干细胞、皮肤组织工程学领域，尤其涉及一种大鼠毛囊干细胞的分离、培养、纯化、鉴定方法。 

技术领域 

皮肤作为人体最大的器官，具有感觉、调节体温、分泌与排泄、防止水分蒸发等多种作用，其中最主要的功能是作为人体与外界环境的屏障以维持内环境的稳定，同时其也是免疫系统的重要组成部分。随着社会经济的发展，特别是作为“世界工厂”的我国制造业和手工业的繁荣发展，各种涉及皮肤缺损的外伤特别是烧伤、压轧伤、切割伤等也越来越多。其中，外伤导致的皮肤大面积缺损常常导致非常严重的肢体残疾，甚至死亡。目前临床上治疗皮肤缺损的标准治疗方法是自体皮肤移植，由于具有无免疫排斥反应，成活率高等特点，其在临床上应用极为广泛，并取得了很好的疗效。但自体皮肤移植的缺点也非常明显，由于是自体取材，其本身就是对患者的再次损伤，极大增加了患者痛苦，而且有发生供皮区感染，不愈合等并发症的风险。更为严重的是，对于上述的大面积皮肤缺损，常由于缺乏足够可供移植的自体皮肤而导致创面修复困难，严重影响了治疗进程，甚至导致死亡。 

正因如此，科学家们一直试图寻找一种外源性的皮肤替代物。早在公元前1500年，异种皮肤移植就被用于临时覆盖皮肤缺损创面。而随着组织工程学的创立和发展，皮肤组织工程学迅速兴起，并成为近十年来研究的热点。组织工程学是应用工程学及生命科学的原理与方法，研究生物替代物，以用于重建、保持或提高组织功能的一门学科。目前，国外应用皮肤组织工程学构建人工皮肤的研究已取得了实质性进展，Apligraf、OrCel、Suprathel、Biobrane、OASIS、Integra、Lyphoder等产品已先后被美国药品与食品管理局(FDA)批准上市并已应用于临床皮肤缺损的治疗中。 

然而，虽然目前已有以上数种人工皮肤产品可供临床选择，也确实促进了对大面积皮肤缺损患者的临床治疗。但是，根据我们多年临床应用过程中遇到的问题，结合文献报道，我们认为目前人工皮肤移植还存在着许多问题，其中甚至包括可能导致治疗最终失败的“硬伤”：①由于以上人工皮肤产品都没有血管生成能力，导致移植的人工皮肤没有血管系统供给营养，从而使人工皮肤容易发生坏死，使移植失败。②人工皮肤产品中所含的各种异体细胞容易引起免疫排斥反应，临床上常出现移植的皮肤坏死、脱落，严重的甚至出现全身免疫反应等严重并发症，并且有可能传播疾病。③目前所有的人工皮肤产品都只能恢复正常皮肤的部分解剖结构和生理功能，而无法再生具有重要功能的皮肤附属器结构，例如：血管、毛发、汗腺等。 

毛囊干细胞是一类存在于毛囊外根鞘隆突部的干细胞，具有未分化性、自我更新和体外增殖能力强等特点。体外培养研究中的毛囊干细胞表现出了高克隆形成能力，具有很高的再生潜能。由于毛囊干细胞来源于毛发，可以直接从患者自身取得，数量极其丰富，且没有任何并发症，对患者完全无创，现已成为皮肤组织工程学研究的焦点。Taylor等（Taylor G,Lehrer MS,Jensen PJ,et al.Involvement of follicular stem cells in forming not only the follicle but also the epidermis.Cell,2000,102(4):451-461.）研究发现毛囊干细胞不仅能够分化形成毛囊，而且还参与了表皮组织的形成过程。Stelios等发表的最新研究结果证明，头发毛囊中含有大量的干细胞，是最容易获得的干细胞来源之一，并已成功将毛囊干细胞分化发育生成新的脉管系统。血管内皮细胞生长因子165(VEGF165)是血管内皮细胞生长因子5种亚型之一，其活性最强，分布范围最广，是VEGF体内发挥作用的主要亚型。近年来围绕VEGF165为中心的血管再生性基因治疗研究成为国内外研究热点。 

为此申请人申请了一种VEGF165基因修饰毛囊干细胞的方法，该方法以毛囊干细胞为种子细胞，具有体外培养时能快速大量扩增，来源非常丰富，减小免疫排斥反应；同时利用VEGF165基因转染修饰毛囊干细胞，能够形成具有扩张和收缩功能的新的工程血管系统，将很好的解决移植人工皮肤容易坏死，成活率低的问题。 

发明内容

为了解决目前毛囊干细胞的来源问题，本发明的目的是提供大鼠毛囊干细胞的分离培养方法。本发明的毛囊干细胞具有体外培养时能快速大量扩增，来源非常丰富，减小免疫排斥反应的特点，能够很好的解决移植人工皮肤容易坏死，成活率低的问题。 

为了实现上述的第一个目的，本发明采用了以下的技术方案： 

1）选用一周龄SD大鼠触须部皮肤，置入0.25%Dispase酶37℃消化2h；用镊子和一次性注射器针头从皮下组织端拉出毛囊，收集形态完好且处于生长期的毛囊，显微镜下将毛囊切成三等份，取中间部分，PBS漂洗后放入50mL培养瓶中，加入DMEM/F12补充培养基，1周后毛囊隆突部有细胞爬出，形成克隆；所述的DMEM/F12补充培养基成分为：44mlDMEM/F12培养液、5mlKSR血清替代物、500μl青链霉素混合液、500μl L-谷氨酰胺、500μl非必需氨基酸、20ng/ml重组人表皮细胞生长因子、10ng/ml重组人碱性成纤维细胞生长因子、50μl羟基乙醇、10ng/ml氢化可的松； 

2）培养条件为37℃、5%CO₂培养箱中，每2-3d换液一次； 

3）毛囊干细胞的传代消化条件为：TrypLE^TMExpress(1X)，no Phenol Red，37℃消化8-10min； 

4)毛囊干细胞的纯化：将100μg/ml的IV型胶原按照3ml/100mm dish的量包被在培养 皿中，室温静置1h；将100mm培养皿的原代细胞用胰蛋白酶消化，离心收集细胞后，吹打成单细胞悬液接种于培养皿中，20min后，将未贴壁的细胞连同培养液一起吸出；贴壁的细胞用完全培养基培养，每3天换液；P2代再纯化一次。 

本发明由于采用了上述的技术方案，得到了理想的毛囊干细胞，可以对该毛囊干细胞进行基因修饰，然后以此为种子细胞，种植于三维明胶海绵组织支架，构成成具有新的血管系统的新型复合人工皮肤模型。该模型具有以下独特的优点： 

①作为干细胞，毛囊干细胞具有体外培养时能快速大量扩增，长期体外传代培养，细胞功能旺盛等特点，并且具有很高的再生和分化能力，这将极大缩短体外培养扩增时间，提高临床治疗效率； 

②由于能够形成具有扩张和收缩功能的新的工程血管系统，将很好的解决移植人工皮肤容易坏死，成活率低的问题； 

③本研究中所用的种子细胞—毛囊干细胞取自自体毛发，来源非常丰富，也非常容易获得，且不会对患者造成任何损伤和痛苦； 

④由于种子细胞取自自体组织，免疫排斥反应和传播疾病等问题将迎刃而解； 

⑤相对于目前的人工皮肤产品，此新型人工皮肤将更大程度的恢复和再生正常皮肤组织的解剖结构和生理功能。 

附图说明

图1-图3为原代毛囊干细胞从毛囊隆突部爬出，呈鸟巢状、上皮样细胞，排列紧密40×。 

图4为纯化前的P1代毛囊干细胞，以铺路石状为主，夹杂多种细胞形态100×。 

图5为IV型胶原筛选纯化后的P3代毛囊干细胞，呈典型的铺路石状100×。 

图6为大鼠毛囊干细胞组样品RNA抽提电泳图，泳道1：SD大鼠毛囊干细胞组样品RNA。 

图7为6个相关引物和rActb引物在SD大鼠毛囊干细胞cDNA中的扩增条带； 

泳道1：Marker DL2000（从上至下分别为2000,1000,750,500,250,100bp）； 

泳道2：rActb引物在SD大鼠毛囊干细胞cDNA中的扩增（目的条带173bp） 

泳道3：rKrt10引物在SD大鼠毛囊干细胞cDNA中的扩增（目的条带175bp），此处为引物二聚体； 

泳道4：rKrt15引物在SD大鼠毛囊干细胞cDNA中的扩增（目的条带94bp）； 

泳道5：rKrt19引物在SD大鼠毛囊干细胞cDNA中的扩增（目的条带156bp）； 

泳道6：rCD34引物在SD大鼠毛囊干细胞cDNA中的扩增（目的条带146bp）； 

泳道7：rItgb1引物在SD大鼠毛囊干细胞cDNA中的扩增（目的条带72bp）； 

泳道8：rItgb6引物在SD大鼠毛囊干细胞cDNA中的扩增（目的条带188bp）。 

图8为6个目的基因的基因表达情况评价柱状图。 

图9-图11为P3代毛囊干细胞的免疫荧光染色，分别为整合素β1、整合素a6、角蛋白15,100×。 

图12为纯化后的P3毛囊干细胞的生长曲线图，n=7。 

具体实施方式

实施例1毛囊干细胞的分离、培养 

1）选用一周龄SD大鼠触须部皮肤，置入0.25%Dispase酶37℃消化2h；用镊子和一次性注射器针头从皮下组织端拉出毛囊，收集形态完好且处于生长期的毛囊，显微镜下将毛囊切成三等份，取中间部分，PBS漂洗后放入50mL培养瓶中，加入DMEM/F12补充培养基，1周后毛囊隆突部有细胞爬出，形成克隆。如图1-图3。 

2）所述的DMEM/F12补充培养基成分为全新的配方：44mlDMEM/F12培养液、5mlKSR血清替代物、500μl青链霉素混合液、500μl L-谷氨酰胺、500μl非必需氨基酸、20ng/ml重组人表皮细胞生长因子、10ng/ml重组人碱性成纤维细胞生长因子、50μl羟基乙醇、10ng/ml氢化可的松； 

3）培养条件为37℃、5%CO2培养箱中，每2-3d换液一次； 

4）毛囊干细胞的传代消化条件为：TrypLE^TMExpress(1X)，no Phenol Red(Gibco公司CAT:12604013)，37℃消化8-10min； 

实施例2毛囊干细胞的纯化 

1）将100μg/ml的IV型胶原按照3ml/100mm dish的量包被在培养皿中，室温静置1h；将100mm培养皿的原代细胞用胰蛋白酶消化，离心收集细胞后，吹打成单细胞悬液接种于培养皿中，20min后，将未贴壁的细胞连同培养液一起吸出；贴壁的细胞用完全培养基培养，每3天换液；P2代再纯化一次，如图4-5。 

实施例3毛囊干细胞的鉴定 

1)Q-PCR检测：分选纯化后的P3代毛囊干细胞进行Q-PCR检测。具体方法如下： 

具体方法如下： 

1.1）从干扰质粒转染的293T细胞中抽提总RNA。如图6 

1.1．1）将培养液去除后，用PBS润洗细胞。 

1.1．2）向12孔板中培养的细胞中每孔加入500ul Trizol，在室温下水平放置5min，使裂解液均匀分布于细胞表面，然后用移液枪吹打细胞使细胞脱落。 

1.1．3）将细胞裂解液转移至离心管中，并用1mL枪头反复吹打直至裂解液中无明显沉淀，在室温下放置5min，使得核酸蛋白复合物完全分离。 

1.1．4）每管加入100μl氯仿，用手上下颠倒ep管15s，室温静置15min，4℃，12000rpm，离心15min。 

1.1．5）吸取上清移至新的1.5ml ep管，加入等体积-20℃预冷的异丙醇，混匀后-20℃沉淀10min。 

1.1．6）4℃，12000rpm离心10min后，去上清，加入1ml4℃预冷的75%乙醇，洗涤沉淀，4℃，10000rpm离心5min，弃上清。吸水纸吸去残液，室温干燥。 

1.1．7）加入10μl RNase-free水，至完全溶解，NanoDrop测定RNA的浓度。 

1.2）RNA反转录成cDNA 

根据Fermentas公司的M-MLV操作说明书进行反转录，体系如下： 

在RNase-Free的PCR管中加入（总体系20ul） 

42℃孵育60min，70℃10min;cDNA冻存于-20℃或即刻PCR。 

1.3）RT-PCR预实验 

以反转录的cDNA为模板，用目的基因特异性引物和内参引物扩增待检测的目的基因片段和看家基因，摸索适合qPCR上机的最佳引物退火温度和模板量，若有杂带应重新调整PCR过程中的退火温度，直至杂带消失。 

1.4）Q-PCR正式实验 

1.4．1）在RT-PCR预实验摸索出最佳的引物退火温度和模板量的前提下，使用2×SYBR Green Mix配制PCR Mix，根据需要上机的样品数和重复数，计算并配制PCR Mix，体系如下： 

成分	体积
		2*SYBR Green Mix	10ul

[0066] 

引物Mix	1ul
		模板	1ul
超纯水	8ul
		总体积	20ul

1.4．2） 分装至AXYGEN PCR8连管，微型离心机瞬时离心混匀PCR体系。 

1.4．3） 将上述样品放入Eppendorf Realplex荧光定量PCR仪，SYBR Green法荧光定量PCR以分析各基因的表达，PCR程序设置如下： 

 

PCR反应可设成4步法：（退火温度结合引物的Tm值及RT-PCR预实验的结果自行设定，融解曲线设从80℃开始） 

 

◆ 　 预变性Cycle 1:(1X) 

◆ 　 Step 1:   95.0°C               for02:00. 

◆ 　 PCR循环 Cycle 2:(40X) 

◆ 　 Step 1:   95.0°C               for00:15. 

◆ 　 Step 2:   60.0°C                      for00:15. 

◆ 　 Step 3:        72.0°C                       for00:20. 

◆ 　 Step4:         83.0°C                      for00:08. 

◆   数据采集和实时定量分析(Data collection and real-time analysis enabled). 

◆ 　 Cycle 3:(1X) 

◆ 　 Step 1:   80°C  for01:00. 

◆ 　 溶解曲线 Cycle 4:(31X) 

◆ 　 Step 1:   60.0°C-95.0°C  for00:10. 

◆   循环数2后，增加设定值温度0.5℃(IncreaSe Set point temperature after cycle2by0.5℃) 

◆   熔点曲线的数据收集和功能分析(Melt curve data collection and analysis enabled). 

◆ 1.5）数据分析：用△△Ct法进行各基因表达的相对定量。如图8，表1 

表1为分选纯化后的P3代毛囊干细胞进行Q-PCR检测，用△△Ct法进行各基因表达的相对定量。 

2)细胞免疫荧光染色法:将P3代细胞培养到对数生长期，消化后接种在玻片上，贴壁培养2d后，吸掉培养液，用PBST漂洗，加入4%PFA固定后，再用5%BSA室温封闭。分别加入一抗整合素β1（integrin-β1）抗鼠多克隆抗体（1：100）、整合素a6（integrin-a6）多克隆抗体（1：50）以及角蛋白15（keratin-15）多克隆抗体（1:100），室温孵育，PBST洗涤后，再加标记二抗避光30min，加DAPI（1:2000）染核5min，避光晾干，用mounting solution封片，如图9-11。 

实施例4毛囊干细胞的增殖能力 

1）生长曲线测定：将P3代毛囊干细胞，消化后以1×10⁵/ml的细胞浓度接种在24孔板上，分别于1、2、3、4、5、6、7d进行细胞计数板计数，每天设置6个复孔，取平均数。然后绘制细胞生长曲线，如图12。 

Claims (2)

1.大鼠毛囊干细胞的分离培养方法，其特征在于该方法包括以下的步骤：

1）选用一周龄SD大鼠触须部皮肤，置入0.25%Dispase酶37℃消化2h；用镊子和一次性注射器针头从皮下组织端拉出毛囊，收集形态完好且处于生长期的毛囊，显微镜下将毛囊切成三等份，取中间部分，PBS漂洗后放入50mL培养瓶中，加入DMEM/F12补充培养基，1周后毛囊隆突部有细胞爬出，形成克隆；所述的DMEM/F12补充培养基成分为：44mlDMEM/F12培养液、5mlKSR血清替代物、500μl青链霉素混合液、500μl L-谷氨酰胺、500μl非必需氨基酸、20ng/ml重组人表皮细胞生长因子、10ng/ml重组人碱性成纤维细胞生长因子、50μl羟基乙醇、10ng/ml氢化可的松；

2）培养条件为37℃、5%CO₂培养箱中，每2-3d换液一次；

3）毛囊干细胞的传代消化条件为：TrypLE^TMExpress(1X)，no Phenol Red，37℃消化8-10min；

4)毛囊干细胞的纯化：将100μg/ml的IV型胶原按照3ml/100mm dish的量包被在培养皿中，室温静置1h；将100mm培养皿的原代细胞用胰蛋白酶消化，离心收集细胞后，吹打成单细胞悬液接种于培养皿中，20min后，将未贴壁的细胞连同培养液一起吸出；贴壁的细胞用完全培养基培养，每3天换液；P2代再纯化一次。

2.根据权利要求1获得的毛囊干细胞。

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