CN113186221A - 水牛源lif的制备及其在水牛精原干细胞体外培养的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种水牛源LIF的制备方法，以CHO‑K1作为宿主细胞来生产水牛源LIF细胞因子，先构建PB‑LIF‑Pola载体，然后将PB‑LIF‑Pola载体与Hypbase共转到CHO‑K1细胞，并在0‑6μg/ml Puro浓度下进行加压约20d左右，之后进行扩大培养，冻存。研究表明，建系后的CHO‑K1细胞能够成功表达水牛源LIF基因并分泌水牛源LIF生长因子。据此，发明人研制了水牛精原干细胞条件培养液，发现培养液中仅需加入较低水平的水牛源LIF即可达到较高浓度鼠源LIF在维持体外水牛精原干细胞特性的效果。因此，本发明可解决水牛精原干细胞体外培养中加入其它物种LIF生长因子成本较高的问题，而且初步建立了以水牛源LIF为关键的条件培养液优化水牛SSCs体外系统。
Description
技术领域
本发明属于水牛基因技术领域，尤其涉及水牛源LIF的制备及其在水牛精原干细胞体外培养的应用。
背景技术
水牛是我国华南水稻种植地区的重要役畜，我国水牛属于沼泽型水牛，产肉量、产奶量及繁殖率等生产性能低，通过引进优秀水牛种质资源对其进行杂交改良或采用基因修饰技术创制水牛新品种依然是当前的重要任务。精原干细胞(spermatogonial stem cell，SSCs)是创制水牛新品种或其进行水牛种质资源保存的理想种子细胞。精原干细胞是A型精原细胞中一类具有自我更新的细胞，是雄性体内唯一能够进行遗传信息传递的成体细胞。在雄性哺乳动物中，SSCs通过自我更新与分化保持其数量相对恒定是精子持续发生的前提和基础。因此，通过体外培养获得优良品种的SSCs，将会改善水牛的劣质性状，从而推动畜牧业的发展。
SSCs的命运是由其生存环境以及本身细胞内部环境决定的；SSCs生存的微环境包括不同的体细胞(Sertoli cell/支持细胞；peritubular myoid cells/PMC/管周类肌样细胞；peritubular macrophage/Peritubular MΦ/小巨噬细胞；Ledig cell/睾丸间质细胞；Lymphatic endothelial cells/LEC/淋巴管内皮细胞；Testicular endothelial cells/TEC/睾丸内皮细胞)。研究表明体细胞所分泌的生长因子对SSCs的生存至关重要，比如：胶质细胞源性神经营养因子(Glialcellline-Derived Neurotrophic Factor；GDNF)、成纤维细胞生长因子(fibroblast growth factors，FGFs)、集落刺激因子(colony-stimulatingfactor 1，CSF1)以及白血病抑制因子(Lekemia inhibitory factor，LIF)。在体外培养SSCs的过程中，需要维持SSCs的干性，即需要抑制其分化；LIF生长因子有着抑制其分化的作用，因此目前在体外培养过程中需要加入大量的其它物种的LIF生长因子量，但是如此成本较高，也对实验进行造成困扰。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供水牛源LIF的制备及其在水牛精原干细胞体外培养的应用。
为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：
一种水牛源LIF的制备方法，以CHO-K1作为宿主细胞来生产水牛源LIF细胞因子，先构建PB-LIF-Pola载体，然后将PB-LIF-Pola载体与Hypbase共转到CHO-K1细胞，并在0-6μg/ml Puro浓度下进行加压，之后进行扩大培养，冻存。
Puro浓度为3.5μg/ml。
PB-LIF-Pola载体按以下进行构建：
采用第一对扩增引物，从合成的质粒中P下LIF片段，并添加相应的酶切位点，上游引物5`端添加XbaI限制性核酸内切酶位点，下游引物5`端添加EcoRI限制性核酸内切酶位点，并且相应的加入保护碱基；
采用第二对扩增引物，从XP61上P下POLA片段，并添加相应的酶切位点，上游引物5`端添加EcoRI限制性核酸内切酶位点，下游引物5`端添加EcoRI限制性核酸内切酶位点，并且相应的加入保护碱基；
同样用XbaI、BamHI和EcoRI酶切PB513载体、LIF片段和pola片端，并将三个片段用solutionI连接。
PCR扩增的引物、体系及程序为：
故第一对扩增引物如下：
Sense primer GCtctagaatgaaggtcttggcggcagga
Anti-sense primer CGgaattcctagaaggcctgggccagca
第二对扩增引物如下：
Sense primer CGgaattcctgtgccttctagttgccagc
Anti-sense primer Cgggatccccatagagcccaccgcatcc
PCR体系：
PCR程序：
酶切PB513载体、LIF片段和pola片端的酶切体系为：
连接体系为：
水牛源LIF在水牛精原干细胞体外培养中的应用。
水牛精原干细胞条件培养液，该培养液中加入权利要求1水牛源LIF。
水牛源LIF的浓度为1ng/ml。
针对目前其它物种LIF生长因子成本较高、干扰实验等问题，发明人建立了一种水牛源LIF的制备方法，以CHO-K1作为宿主细胞来生产水牛源LIF细胞因子，先构建PB-LIF-Pola载体，然后将PB-LIF-Pola载体与Hypbase共转到CHO-K1细胞，并在0-6μg/ml Puro浓度下进行加压约20d左右，之后进行扩大培养，冻存。研究表明，建系后的CHO-K1细胞能够成功表达水牛源LIF基因并分泌水牛源LIF生长因子。据此，发明人研制了水牛精原干细胞条件培养液，发现培养液中仅需加入较低水平的水牛源LIF即可达到较高浓度鼠源LIF在维持体外水牛精原干细胞特性的效果。因此，本发明可解决水牛精原干细胞体外培养中加入其它物种LIF生长因子成本较高的问题，而且初步建立了以水牛源LIF为关键的条件培养液优化水牛SSCs体外系统。
附图说明
图1水牛LIF基因及其POLA载体构建电泳图，图中：M是DL2000marker，1-4是POLA片段，5-8是LIF片段。
图2是酶切鉴定电泳图，图中M是DL2000marker，4、7、9是单克隆菌落。
图3是质粒测序与NCBI比对结果，图中：Sbjct代表测序得到的LIF基因，Query代表NCBI上官网公布的水牛的LIF基因CDS序列。
图4是CHO细胞最佳抗Puro浓度的筛选结果图。
图5是CHO-k1细胞转染试剂的筛选结果图。
图6是加压得到细胞系的细胞状态图，图中：a是明场，b是绿光。
图7建系后的CHO-K1细胞检测结果图，图中：a是检测转染后的细胞系是否有目的基因的表达，a中M是DL2000marker，1是未转染PB-LIF载体的CHO细胞，2-4是转染PB-LIF载体的CHO细胞；b是ELSA检测测试浓度的标准曲线；c是扩大培养后分在不用细胞培养皿里，所测试出分泌的LIF因子的浓度。
图8是细胞培养图。
图9是克隆状细胞消化前后图，图中：a消化前，b消化后。
图10对照组细胞免疫染色图。
图11实验组细胞免疫染色图。
具体实施方式
一、载体构建
从NCBI上下载水牛LIF基因CDs区序列(XM_025267047.1)，送到华大基因合成该序列(见序列表SEQ.ID.NO.1)。在该序列5`端加入XbaI限制性核酸内切酶位点，并在LIF序列加入EcoRI限制性核酸内切酶位点从而连接POLA片段(从XP61上切下)；在LIF序列3`端添加BamHI限制性核酸内切酶位点。
从合成的质粒中P下LIF片段，并添加相应的酶切位点，上游引物5`端添加XbaI限制性核酸内切酶位点，下游引物5`端添加EcoRI限制性核酸内切酶位点，并且相应的加入保护碱基。故第一对扩增引物如下：
Sense primerG ctctagaatgaaggtcttggcggcagga(见序列表SEQ.ID.NO.2)
Anti-sense primer CGgaattcctagaaggcctgggccagca(见序列表SEQ.ID.NO.3)
从XP61上P下POLA片段，并添加相应的酶切位点，上游引物5`端添加EcoRI限制性核酸内切酶位点，下游引物5`端添加EcoRI限制性核酸内切酶位点，并且相应的加入保护碱基。故第二对扩增引物如下：
Sense primer CGgaattcctgtgccttctagttgccagc(见序列表SEQ.ID.NO.4)
Anti-sense primer Cgggatccccatagagcccaccgcatcc(见序列表SEQ.ID.NO.5)
PCR扩增体系如下：
PCR体系：
PCR程序：
同样用XbaI、BamHI和EcoRI酶切PB513载体、LIF片段和pola片端，并将三个片段用solutionI连接。酶切体系如下：
37℃酶切1h，之后进行跑胶回收，测浓度进行连接。连接体系如下：
之后22℃连接2h。
结果：如图1所示为酶切得到的片段。
二、连接产物转化及鉴定
连接后的质粒命名为PB-LIF载体，然后转化到大肠杆菌DH5a感受态细胞中，37℃摇床孵化1h后涂板，全湿培养箱37℃倒置培养16h，在琼脂糖氨苄青霉素(Amp)的LB固体培养基上挑选阳性克隆菌，并对阳性克隆菌进行酶切鉴定以及摇菌提取质粒，进行测序分析。鉴定引物如下：
F:GCtctagaatgaaggtcttggcggcagga
R:Cgggatccccatagagcccaccgcatcc
结果：如图2所示为连接的片段，其菌斑鉴定结果表明LIF片段+pola片段＝840bp，
之后进行摇菌提取质粒送去华大基因测序，测序引物如下：
F:agctcgtttagtgaaccgtcaga
R:cgatgtgcgctctgcccactgac
结果：如图3所示为测序结果后与NCBI上官网比对的结果。
三、对CHO细胞最佳抗Puro浓度的筛选
分别采用0、2、2.5、3、3.5、4、5、6μg/ml，对CHO细胞最佳抗Puro浓度进行筛选。
结果：如图4所示，细胞在5μg/ml和6μg/ml分别在day7和day6细胞全部死光；而2μg/ml、2.5μg/ml和3μg/ml的细胞密度和对照组并没有明显的差别，而3.5μg/ml在day10细胞全部死光，故3.5μg/ml的puro浓度为最佳浓度。
四、CHO-k1细胞转染试剂的筛选
分别采用PEI和LIP3000转染试剂，对CHO-k1细胞转染试剂进行筛选。
结果：如图5所示，在同等时间、同等转染DNA的量以及相同的转染剂的量的情况下，发现PEI转染试剂的效果明显优于LIP3000。
五、建立PB-LIF-CHO-K1细胞系
将PB-LIF-Pola载体与Hypbase共转到CHO-K1细胞，并用上述最佳Puro浓度进行加压约20d左右，之后进行扩大培养，冻存。
结果：如图6所示为加压20d后，阳性细胞筛选的结果。
六、检测建系后的CHO-K1细胞是否表达水牛源LIF基因及是否分泌水牛源LIF生长因子
中国仓鼠卵巢细胞是目前生产重组蛋白的理想哺乳动物细胞宿主，在真核细胞中，CHO细胞是目前重组蛋白生产的首选体系。其具有准确的转录后修饰功能，表达的蛋白在分子结构、理化特性和生物学功能方面最接近于天然蛋白质分子，具有产物胞外分泌功能。并且具有很少分泌自身的内源蛋白的特性。此前，中国仓鼠卵巢细胞作为生产水牛源LIF的宿主细胞并无相关报道，发明人首次进行了尝试，但对于建系后的CHO-K1细胞是否表达水牛源LIF基因及是否分泌水牛源LIF生长因子需要进一步验证。
1.基因检测
(1)分别提取未转染的CHO-K1细胞(对照组)和建系的CHO-K1细胞(实验组)的总RNA a:分别将对照组与实验组的细胞进行离心，各自加入1ml TRIZOL，并反复吹打，静止5min左右，以便使其充分裂解。
b:各自加入0.2ml的氯仿，剧烈震荡15s，室温放置5min。
c:4℃10000g离心15min，样品分为三层，底层为黄色有机相，上层为无色水相和中间层。
d:把水相转移到新管中，并加入0.5ml的异丙醇，室温放置10min。
e:75％乙醇(现用现配)洗涤RNA沉底；4℃7500g离心5min，并弃上清。
f:室温放置干燥RNA沉淀，大约5min左右，并用RNA-free水溶解。
反转录(试剂盒购买于TAKARA)：
去除基因组DNA反应
反转录
2.ELSA检测PB-LIF-CHO-K1细胞系上清液是否分泌LIF因子
a:收集PB-LIF-K1细胞的上清夜。
b:稀释标准样品；浓度分别为200ng/ml，400ng/ml，800ng/ml，1600ng/ml，3200ng/ml。
c:加样：设置空白孔(不加样品及酶标试剂，其余步骤相同)，标准孔，待测样品孔；在酶标包被板上标准品加样50μl，待测样品孔中先加样品稀释液40μl，然后再加待测样品10μl(样品的最终浓度稀释5倍)。
d:温育：用封板膜封板后置37℃30min。
e:配液：30倍稀释浓缩洗涤液。
f:洗涤：揭开封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30s后弃去，重复5次，拍干。
g:加酶：每孔加入酶标试剂50μl。
h:温育：同步骤d。
i：洗涤：同步骤f。
j:显色：每孔先加显色剂A 50μl，再加显色剂B 50μl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色10min。
k:终止：每孔加终止液50μl，终止反应。
l:测定：以空白孔调零，450nm波长测量各孔的吸光度(OD值)。
结果：如图7所示为建系后的CHO-K1细胞检测结果。
七、从3-6月的幼龄水牛睾丸中分离细胞
a：将睾丸去除白膜，用75％酒精洗3次，5min/次。
b:将去除白膜后的睾丸，放置超净台中用剪刀剪碎，并转移至大皿中，根据睾丸的重量加入DNase，collagense，并放到37℃培养箱中消化。
c：在显微镜下观察，直至精细小管完全散开，转移至50ml离心管中，2000r，5min；然后弃去液体，并用PBS重悬，同样离心。
d:用细胞培养液重悬，用显微镜观察，是否分散为单个细胞；若没有则用0.05％胰酶至37℃消化，离心1500，3min。
e:用细胞冻存液重悬，并分装到冻存管里，隔天存放置液氮中，备用。
八、细胞培养液的制备
九、将分别加入水牛源LIF与鼠源LIF的细胞培养体系进行对SSCs的体外培养(1)将差异贴壁得到的生殖细胞等量的分配到对照组与实验组，进行相同条件下培养
结果：细胞生长如图8所示，实验组在第二天左右，开始形成形成串状，而对照组在第三天左右形成；并且两组都基本在第八天形成克隆状，在第九天对照组与实验组的部分克隆状都自行散至单个细胞，并且从细胞培养得出，在第九天对照组较实验组的克隆体积小，但是散成单个细胞较实验组多。
之后将克隆状细胞进行消化，并进行细胞免疫荧光染色。
结果：如图9-11所示，在相同天数内，1ng/ml水牛源LIF与10ng/ml LIF在维持体外水牛精原干细胞特性能够达到相同的效果。
序列表
<110> 广西大学
<120> 水牛源LIF的制备及其在水牛精原干细胞体外培养的应用
<160> 5
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 609
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atgaaggtct tggcggcagg agtcgtgccc ctgctgctgg ttctccactg gaaacacggg 60
gccgggagcc cccttcccat caccccggtc aacgccacct gtgccacccg ccatccctgt 120
cccagcaacc tcatgaacca gatcagaaac cagctgggac aactcaacag cagtgccaac 180
agcctcttta tcctctatta cacggcccag ggggagccct tccccaacaa cctggacaag 240
ctgtgcagcc ccaacgtgac tgacttcccg cccttccacg ccaacggcac ggagaaggcc 300
cggctggtgg agctgtaccg catcatagcg tacctgggcg cctccctggg caacatcacg 360
cgggaccaga aggtcctcaa cccctacgcc cacggcctgc acagcaagct gaacaccacg 420
gctgacgtcc tgcggggtct tctcagcaac gtgctctgcc gcttgtgcag caagtaccac 480
gtgagccacg tggacgtgac ctacggcccc gacacctcgg gcaaggacgt cttccagaag 540
aagaagctgg gctgtcagct cctggggaag tacaagcagg tcatcgccgt gctggcccag 600
gccttctag 609
<210> 2
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gctctagaat gaaggtcttg gcggcagga 29
<210> 3
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
cggaattcct agaaggcctg ggccagca 28
<210> 4
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
cggaattcct gtgccttcta gttgccagc 29
<210> 5
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
cgggatcccc atagagccca ccgcatcc 28
Claims (9)
1.一种水牛源LIF的制备方法，其特征在于以CHO-K1作为宿主细胞来生产水牛源LIF细胞因子，先构建PB-LIF-Pola载体，然后将PB-LIF-Pola载体与Hypbase共转到CHO-K1细胞，并在0-6μg/ml Puro浓度下进行加压，之后进行扩大培养，冻存。
2.根据权利要求1所述的水牛源LIF的制备方法，其特征在于：所述Puro浓度为3.5μg/ml。
3.根据权利要求1所述的水牛源LIF的制备方法，其特征在于所述PB-LIF-Pola载体按以下进行构建：
采用第一对扩增引物，从合成的质粒中P下LIF片段，并添加相应的酶切位点，上游引物5`端添加XbaI限制性核酸内切酶位点，下游引物5`端添加EcoRI限制性核酸内切酶位点，并且相应的加入保护碱基；
采用第二对扩增引物，从XP61上P下POLA片段，并添加相应的酶切位点，上游引物5`端添加EcoRI限制性核酸内切酶位点，下游引物5`端添加EcoRI限制性核酸内切酶位点，并且相应的加入保护碱基；
同样用XbaI、BamHI和EcoRI酶切PB513载体、LIF片段和pola片端，并将三个片段用solutionI连接。
4.根据权利要求3所述的水牛源LIF的制备方法，其特征在于所述PCR扩增的引物、体系及程序为：
故第一对扩增引物如下：
Sense primer GCtctagaatgaaggtcttggcggcagga
Anti-sense primer CGgaattcctagaaggcctgggccagca
第二对扩增引物如下：
Sense primer CGgaattcctgtgccttctagttgccagc
Anti-sense primer Cgggatccccatagagcccaccgcatcc
PCR体系：
PCR程序：
5.根据权利要求3所述的水牛源LIF的制备方法，其特征在于所述酶切PB513载体、LIF片段和pola片端的酶切体系为：
6.根据权利要求4所述的水牛源LIF的制备方法，其特征在于所述连接体系为：
7.水牛源LIF在水牛精原干细胞体外培养中的应用。
8.一种水牛精原干细胞条件培养液，其特征在于该培养液中加入权利要求1所述水牛源LIF。
9.根据权利要求8所述的水牛精原干细胞条件培养液，其特征在于：所述水牛源LIF的浓度为1ng/ml。
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