BRPI0903975A2

BRPI0903975A2 - processo de modificação de células-tronco embrionárias bovinas e processo de purificação de proteìnas geradas por células-tronco embrionárias bovinas modificadas

Info

Publication number: BRPI0903975A2
Application number: BRPI0903975-9A
Authority: BR
Inventors: Sharon Lisauskas Ferraz De Campos
Original assignee: Sharon Lisauskas Ferraz De Campos
Priority date: 2009-03-06
Filing date: 2009-03-06
Publication date: 2011-01-11
Also published as: US20120231545A1; WO2010099589A1

Abstract

PROCESSO DE MODIFICAçãO DE CéLULAS-TRONCO EMBRIONáRIAS BOVINAS E PROCESSO DE PURIFICAçãO DE PROTEìNAS GERADAS POR CéLULAS-TRONCO EMBRIONáRIAS BOVINAS MODIFICADAS. A presente invenção está relacionada ao processo de modificação de células-tronco embrionárias bovinas e processo de purificação de proteinas geradas por células-tronco modificadas. Em especial, a presente invenção se situa no campo da terapêutica médica e veterinária.

Description

Relatório Descritivo

Processo de Modificação de Células-Tronco EmbrionáriasBovinas ε Processo de Purificação de Proteínas geradas porCélulás-Tronco Embrionárias Bovinas modificadas.

Campo da Invenção

A presente invenção está relacionada ao processo de modificação decélulas-tronco embrionárias bovinas e processo de purificação de proteínasgeradas por células-tronco modificadas. Em especial, a presente invenção sesitua no campo da terapêutica médica e veterinária.

Antecedentes da Invenção

A crescente demanda por biomoléculas de interesse farmacológico temlevado ao desenvolvimento de sistemas adicionais para a produção deproteínas recombinantes em larga escala e sob custos mais reduzidos.Sistemas de expressão utilizando células de procariotos e de eucariotossuperiores vêm sendo apontados como possíveis alternativas para a produçãode proteínas de interesse farmacológico (Leite, 2000). A secreção dessespolipeptídeos no leite de animais transgênicos também possibilita não apenasaltos rendimentos de produção de fármacos heterólogos como também aocorrência de seu processamento e modificações pós-traducionais de maneiracorreta (Kerr et al., 1996). De maneira complementar, a produção desse tipo debiomolécula em sistemas eucariotos tem apresentado característicasinteressantes tanto com relação à manutenção de seu processo de síntese,enovelamento e processamento, quanto à significativa redução de custos,aumento de estabilidade, manutenção de atividade biológica e ausência decontaminantes e patógenos comuns aos humanos (Kusnadi et al., 1997). Ofator IX (FIX) de coagulação sangüínea é um exemplo prático dessa produçãoheteróloga, em que foi comprovada a detecção do fator IX recombinante ebiologicamente ativo quando produzido no leite de camundongas transgênicas(Lisauskas et al., 2008). Camundongas transgênicas Mus muscullus foramdesenvolvidas como modelo experimental no Brasil transformadas com o genehumano do fator IX de coagulação sangüínea. As camundongas secretaram noleite o FIX recombinante. Testes de atividade da proteína recombinante emamostras de sangue de pacientes hemofílicos do tipo B foram realizados comauxílio de coagulômetro, comprovando a bioatividade da proteína. A expressãodo fator IX humano de coagulação sangüínea biologicamente ativa emcamundongas transgênicas (Eyestone, 1994; Lisauskas et al., 2008) justifica aaplicabilidade do uso de sistemas heterólogos eucarióticos, utilizados comobiofábricas para a produção constante, em larga escala e sob custos maisreduzidos de proteínas humanas, limitadas pela escassez de suprimentosbiológicos, ou seja, de matéria-prima inicial para a posterior purificação dessasproteínas.

Os primeiros sucessos da utilização da tecnologia do DNA recombinantena produção de proteínas em sistemas heterólogos têm sido demonstrados pormeio da produção comercial de hormônios e vacinas em microrganismos e/oucélulas em cultura. Proteínas humanas, dentre elas, insulina, anticorpos,eritropoietina, fator VIII, fator IX etc, podem ser produzidas em sistemas"artificiais" e substitutivos às técnicas de purificação a partir de compostoshumanos. Esses sistemas podem funcionar como uma constante cadeia deprodução de novos fármacos associados a proteínas humanas recombinantes.Apesar de eficientes, esta estratégia possui algumas limitações intrínsecas.Entre estas, a principal está na impossibilidade de produção em larga escala.Isto se deve principalmente porque os fermentadores contêm um limitado número de células, as quais são mantidas em condições metabólicas sub-ótimas. Fermentadores com alta capacidade podem produzir proteínasrecombinantes em larga escala, mas não a baixo custo.

Na tentativa de avanços tecnológicos na área de produção derecombinantes, surgiram tecnologias adicionais para a produção de proteínasde valor farmacêutico em que os sistemas heterólogos se restringiam à culturade células de mamíferos in vitro ou produção em microorganismos. A partir dadécada de 90, a utilização de animais transgênicos tem demonstrado seraltamente eficiente para a produção de proteínas recombinantes no leite, emlarga escala e custo reduzido (Houdebine, 1994; Wall, 1996)

A utilização de um camundongo transgênico expressando uma proteínarecombinante validou a hipótese da utilização de animais como biorreatores(Palmiter et al., 1982; Choo et al., 1987; Lisauskas et al„ 2008). Para aprodução em larga escala, a demonstração foi dada em 1987, através de umovino produzindo beta-lactoglobulina (Simons et al., 1987). Estes resultadosforam confirmados por meio da produção experimental de dezenas deproteínas recombinantes no leite de diferentes espécies animais (Clark, 1998;Wall, 1999; Rudolph, 1999).

A possibilidade em se utilizar células animais somáticas transfectadas(Felgner et al., 1989; Egilmez et al., 1996; Friend et al., 1996; Oliveira et al.,2005; Iguma et al., 2005) como doadoras de núcleos para a transferêncianuclear abriu uma nova perspectiva prática e viável para a geração de bovinostransgênicos (Carver et al., 1993). McCreath et al. (2000) produziram um ovinotransgênico a partir da transferência nuclear de fibroblastos fetais,transformados com o vetor Iinearizado COLT-2, o qual induziu a expressão daproteína alfa-antitripsina no leite de ovelhas. Entretanto, muitos desafiostécnicos ainda necessitam ser superados e os processos precisam serdesenvolvidos e otimizados na área da transferência nuclear, introdução nogenoma e expressão dos transgenes a nível desejado (Palmiter et al., 1982;Simons et al., 1987; Clark, 1998; Wall, 1999; Rudolph, 1999; Lisauskas et al.,2007).

A fim de aperfeiçoar o processo de geração de bovinos transgênicos,Saito et al. (2003) e Li Wang et al. (2005) modificaram geneticamente células-tronco embrionárias bovinas e conseguiram resultados superiores na produçãoe desenvolvimento de embriões após a transferência nuclear, quandocomparado com a utilização de células somáticas (fibroblastos) geneticamentemodificadas como doadoras de núcleos transgênicos.A saúde pública é um dos principais focos da biotecnologia por meio douso da engenharia genética na produção de bioprodutos, alimentos comcaracterísticas nutracêuticas, bioinseticidas, vacinas de DNA1 e proteínasrecombinantes humanas obtidas a partir de sistemas alternativos de produção.

Atualmente, a expectativa de vida dos brasileiros tende a aumentar devido aosavanços da biotecnologia na medicina, por meio de diagnósticos precoces dedoenças letais; na agropecuária, por meio do aumento da produtividade nasáreas de plantio e por meio do melhoramento genético de rebanhos comerciais;e na indústria, por meio do desenvolvimento de novos fármacos com aplicaçãona área médica, fazendo com que fatores limitantes, como suprimentos deplasma e de compostos biológicos humanos, sejam supridos pelos sistemasalternativos de produção de fármacos.

Um animal transgênico, segundo a definição da Federação Européia dasAssociações de Ciência em Animais de Laboratório, é "um animal que possuiseu genoma modificado artificialmente pelo homem, quer por meio daintrodução, quer da alteração ou da inativação de um gene (uma seqüênciadefinida de DNA). Esse processo deve culminar na alteração da informaçãogenética contida em todas as células desse animal, até mesmo nas célulasgerminativas (óvulos e espermatozóides), fazendo com que essa modificaçãoseja transmitida aos descendentes".

O método mais utilizado para introdução de genes é a transgenia poradição, por meio do qual é inserida no genoma uma ou várias cópias de umgene de interesse - daí suas outras denominações: adição gênica e modelo desuperexpressão de genes. O gene adicionado pode ser endógeno ou exógeno.O primeiro tipo já existe no genoma do animal. Este é usado quando se querproduzir uma quantidade maior da proteína codificada já existente, aumentandoa quantidade de sua cópia no genoma. Genes exógenos pertencem à outraespécie e são usados para fazer um animal produzir uma nova proteína,ausente na forma desejada na espécie receptora.

Os primeiros sucessos da utilização da tecnologia do DNA recombinantena produção de proteínas em sistemas heterólogos, foram demonstrados pormeio da produção comercial de hormônios e vacinas em microrganismos e/oucélulas em cultura. Entretanto, existem limitações para a produção de algumasproteínas recombinantes em sistemas bacterianos devido ao nãoprocessamento pós-traducional de maneira a produzir moléculasbiologicamente ativas. Em outros casos, as proteínas de interesse estão emforma de agregados, e não podem ser facilmente recuperadas. Como opção,diferentes proteínas recombinantes têm sido produzidas em células animais.Fermentadores contendo hibridomas, células CHO entre outros, têm sidoextensivamente utilizados para a produção de anticorpos contra Hepatite B,eritropoietina, fator Vlll etc. Apesar de eficientes, esta estratégia possuialgumas limitações intrínsecas. Dentre estas, a principal está naimpossibilidade de produção em larga escala. Isto se deve principalmenteporque os fermentadores contêm um limitado número de células, as quais sãomantidas em condições metabólicas sub-ótimas. Fermentadores com altacapacidade podem produzir proteínas recombinantes em larga escala, mas nãoa baixo custo.

Na tentativa de avanços tecnológicos na área de produção de proteínasrecombinantes, surgem tecnologias adicionais para a produção de proteínas deinteresse econômico em larga escala de produção. Animais transgênicos (Wall,1996; Houdebine, 1994) e plantas transgênicas (Kusnadi et al., 1997; Leite etal., 2000.) têm demonstrado ser altamente eficientes para a produção deproteínas recombinantes biologicamente ativas, em larga escala e sob custosmais reduzidos.

A utilização de um camundongo transgênico expressando uma proteínarecombinante validou a hipótese da utilização de animais como biorreatores(Lisauskas et al., 2008; Choo et al., 1987; Simons et al., 1987; Palmiter et al.,1982). Para a produção em larga escala, a demonstração foi dada em 1993,por meio da produção de proteínas recombinantes na espécie ovina (Carver etal., 1993; Wright and Colman, 1997). Estes resultados foram confirmados pormeio da produção experimental de dezenas de proteínas recombinantes noleite de diferentes espécies animais (Rudolph, 1999; Clark, 1998; Wall, 1999;Eyestone1 1994).

O leite contém proteínas que são naturalmente expressadas pelaglândula mamária durante a lactação. As duas principais categorias deproteínas produzidas no leite envolvem as caseínas e proteínas solúveis. Osgenes codificantes para algumas destas proteínas foram clonados e oselementos reguladores que controlam os locais de expressão tecido-específicoe temporal foram caracterizados. Em nosso vetor de expressão construído, aseqüência codificante do gene de interesse, o gene do fator IX humano decoagulação sangüínea, foi construída ligada a um promotor que direcionou aexpressão do produto gênico para as glândulas mamárias de camundongas.Neste projeto, o Laboratório da Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia(CENARGEN) - Brasília - DF, em parceria com a Universidade de Brasília -UnB e a Universidade Federal Paulista - UNIFESP, desenvolveramcamundongas transgênicas expressando o fator IX de coagulação humana noleite. Os camundongos geneticamente modificados foram produzidos com basena técnica de microinjeção do vetor de expressão diretamente nos pró-núcleosmasculinos, gerando linhagens germinativas geneticamente modificadas(Lisauskas et al., 2008). Estudos foram conduzidos para avaliar a presença dotransgene introduzido tanto na matriz quanto na progênie, utilizando PCR esouthern blot, além de análises da expressão do fator no leite dascamundongas (western blot). A validação desse sistema heterólogo por meioda produção dessa proteína recombinante foi confirmada por ensaios debioatividade da proteína recombinante purificada do leite, demonstrando suaatividade e a capacidade de coagulação da proteína (fator IX humano) emsangue de pacientes hemofílicos. O Hospital de Apoio de Brasília foi oresponsável pelos bioensaios da proteína recombinante.

Após a validação do sistema heterólogo de produção de proteínasrecombinantes no leite dos animais gerados como modelos experimentais, opróximo passo foi atingir a produção em larga escala. Células animaistransfectadas e devidamente caracterizadas têm sido utilizadas como fontesdoadoras de seus núcleos para a síntese de proteínas em animais de grandeporte. Neste contexto, as espécies de caprinos e bovinos são candidatasimportantes para a produção de proteínas recombinantes devido à altacapacidade de produção de leite e conseqüentemente de proteína recuperada(McCreath et al., 2000; Yull et al., 1997).

A possibilidade de se utilizar células animais somáticas transfectadas -fibroblastos bovinos - (Iguma et al., 2005; Egilmez et al., 1996; Friend et al.,1996; Felgner et al., 1989) como doadoras dos núcleos para a transferêncianuclear abriu uma nova perspectiva para a geração de bovinos e ovinostransgênicos (Cibelli et al., 1998; Carver et al., 1993). McCreath et al. (2000)produziram um ovino transgênico a partir da transferência nuclear defibroblastos fetais, transformados com o vetor Iinearizado COLT-2, o qualinduziu a expressão da proteína alfa-antitripsina no leite de ovelhas.

Entretanto, muitos desafios técnicos ainda necessitam ser superados eos processos precisam ser desenvolvidos e otimizados nas áreas de: célulasde eleição como doadoras dos núcleos transgênicos para a transferêncianuclear; introdução no genoma e expressão dos transgenes a nível desejado;aumento das taxas de embriões reconstruídos e as taxas de gestação deembriões transgênicos (Lisauskas et al., 2007; Iguma et al., 2005; Rudolph,1999; Wall, 1999; Clark, 1998.) O conhecimento dos fenômenos envolvidos naintegração e na segregação de genes exógenos em animais transgênicos,principalmente nos de grande porte, é fundamental para o futuro controledestes processos (Stinnakre et al., 1999).

A fim de aperfeiçoar o processo de geração de bovinos transgênicos,Saito et al. (2003) modificaram geneticamente células-tronco embrionáriasbovinas e conseguiram resultados superiores na produção e desenvolvimentode embriões após a transferência nuclear, quando comparado com a utilizaçãode células somáticas (fibroblastos) geneticamente modificadas como doadorasde núcleos transgênicos.

O presente trabalho propôs a modificação genética de células bovinaspara serem modelos de estudos para a futura geração de linhagens de célulasdoadoras aptas à produção de bovinos transgênicos. Com base na estratégiada transfecção de fibroblastos isolados de tecido adulto (Oliveira et al., 2005;Oleskovicz et al., 2004), foram geradas linhagens celulares bovinas MDBK(Madin Darby Bovine Kidney) com inserções não-deletérias do transgene evariáveis níveis de expressão (Fujiwara et al., 1999; Fujiwara et al., 2003;Forsbach et al., 2003; Lisauskas et al., 2007). Os sítios de integração dostransgenes nos cromossomos que propiciam sua expressão não estão bemcaracterizados, mas acredita-se ser regiões transcricionalmente ativas daeucromatina (Day et al., 2000). No estado de heterocromatina os fatorestranscricionais são inacessíveis, e freqüentemente está relacionado àhipermetilação por citosinas e à hipoacetilação pelas histonas (Ng and Bird,1999). A conseqüência direta desta configuração da cromatina é quetransgenes que se integram randomicamente às proximidades daheterocromatina freqüentemente apresentam níveis mais baixos de expressão(Dobie et al., 1996). Com os estudos feitos neste trabalho, foi possívelestabelecer linhagens clones transfectadas de células MDBK bovinas, gerandoeventos elites quanto ao local de integração do transgene no genoma, e quantoà detecção da expressão estável destes transgenes nessas linhagens. Aaplicação futura dessa caracterização pode funcionar como modelo deintegração de outros vetores de expressão no genoma bovino, utilizando-segenes-alvo ("gene targeting"), para a transformação genética das célulasdoadoras de núcleos transgênicos para a reconstrução embrionária após atransferência nuclear. Segundo Iguma et al. (2005) a transferência de núcleobaseia-se na geração de animais transgênicos com genótipo preestabelecido.

Os animais clones bovinos são produzidos a partir de células geneticamentemodificadas, utilizadas como fontes doadoras de núcleos transformados emicroinjetadas em ovócitos previamente enucleados. O embrião transgênicogerado segue para a transferência em vacas receptoras (Cibelli et al., 1998;Schnieke et al., 1997; Campbell et al., 1996).

Entretanto, a fim de aumentar a eficiência de produção de embriõestransgênicos reconstruídos após a transferência nuclear (TN) e aumentar astaxas de prenhez desses embriões, deve ser utilizada a estratégia datransfecção de células-tronco isoladas de embriões bovinos (Li Wang et al.,2005). Segundo Saito et al. (2003) sete embriões provenientes de células-tronco geneticamente modificadas foram transferidos para sete animaisreceptores e cinco fetos (71%) foram confirmados. A taxa de freqüência degestação (71%) e de animais nascidos provenientes de blastocistos derivadosde células-tronco geneticamente modificadas foram maiores que as taxas degestações geradas a partir de células somáticas (aproximadamente 55%),reportadas após a TN. O desenvolvimento dos sistemas para a geração debovinos transgênicos (Saito et al., 2003; Li Wang et al., 2005) visam aoaprimoramento da produção de embriões transgênicos utilizando células-troncoembrionárias bovinas como doadoras de núcleos geneticamente modificados.No nossò estudo, foram estabelecidas cinco colônias de células-troncoembrionárias bovinas para serem futuramente transfectadas in vitro, efuncionarem como fontes doadoras de núcleos transgênicos, a fim de aumentartanto as taxas de reconstrução embrionária pós-TN, quanto às taxasgestacionais pós-transferência de embriões (TE).

A utilização de animais transgênicos deverá permitir a expressão deproteínas com estruturas complexas, estabilidade e atividade biológica in vitro ein vivo, consistência da produção entre os diferentes animais e entre gerações,além de possibilitar a produção de algumas proteínas que ainda não foramproduzidas utilizando outros sistemas. Pode-se conseguir uma eficienteprodução de dezenas de gramas da proteína recombinante por litro de leite,chegando a quilogramas por ano. Um aumento de produtividade entre 10-1000vezes, produção em larga escala de maneira mais econômica, e reduzidoinvestimento quando comparado aos sistemas de células em cultura. Sistemasde produção que utilizam células em cultura podem produzir no máximo 1-2gramas, ou mais tipicamente 100-200 mg por litro por dia (Wright and Colmann,1997; Van Cott et al., 1996; Denman et al., 1991; Gordon et al., 1987).Comparando-se com uma cabra: sua produção diária de leite é tipicamente 2-4litros, contendo 10 ou mais gramas de proteína recombinante por litro, podendoesta prover mais matéria prima de proteína recombinante do que um biorreatorde 1000 litros (Denman et ai, 1991).

Atualmente, a utilização de animais transgênicos tem demonstrado seraltamente eficiente para a produção de proteínas recombinantes no leite, emlarga escala e custos mais reduzidos, os quais têm recebido aceitação pelasagências de regulamentação responsáveis pela produção de fármacos. Asprincipais plataformas tecnológicas existentes em relação à utilização deanimais como biofábricas estão restritas a alguns Institutos de Pesquisa eEmpresas Privadas situados nos Estados Unidos e Europa. Na Argentina,cinco animais bovinos geneticamente modificados com o gene do hormônio decrescimento humano produzidos no leite foram gerados pela empresa privadaBio Sidus no período de 2002 a 2004. Segundo esta empresa, um único animalpode chegar a produzir 15 gramas de proteína por dia, e meio quilo por mês.Cada dose recebida por um paciente contém pouco mais de 1 mg de hormôniode crescimento de máxima pureza. É fundamental o estabelecimento dossistemas requeridos para a efetiva produção de proteínas recombinantes noleite de animais transgênicos na América Latina, como uma das estratégiastecnológicas.

A utilização de transgênicos para a produção de proteínasrecombinantes deverá prover uma fonte segura, renovável e efetiva para aprodução de proteínas biologicamente ativas, as quais somente estariamdisponíveis por meio da utilização de células do sangue, tecidos oubiorreatores. A utilização da tecnologia de transgênicos é especialmenteatrativa para a produção de proteínas recombinantes necessárias em largaescala. Isso se dá devido às unidades de dosagens requeridas, administraçõesmúltiplas, aplicação em larga escala na população, ou necessidade deprodução industrial. Além disso, a utilização de animais transgênicos permiteexpressar proteínas bioquimicamente complexas que não podem serproduzidas de forma economicamente viável em cultura de células. Osignificativo baixo custo em capital e custos operacionais para a produção decompostos não processados, fazem com que os transgênicos tenham um customais efetivo do que outros sistemas de produção de proteínas recombinantes.

Algumas das vantagens da produção de proteínas recombinantesutilizando transgênicos são: leite como fonte de matéria prima não processadasegura, abundante, renovável, de fácil obtenção e de boa aceitação pública;possibilidade da produção de proteínas heterólogas com estruturas complexas;estabilidade da proteína e atividade biológica in vitro e in vivo; produçãoconsistente entre as diferentes gerações dos animais; eficiência de produção:dezenas de gramas da matéria prima por litro de leite, muitos quilogramas deproteínas por animal (cabra, ovelha, bovino) por ano, níveis de produtividadede 10 a 1000 vezes maiores do que sistemas de células em cultura;recuperação e purificação da proteína em grandes quantidades e altaconcentração da proteína na matéria prima inicial / kg de leite.

Neste contexto, a espécie bovina é a eleita para a produção de proteínasrecombinantes devido ao alto nível de produção de leite e proteína, ambosaceitos como fontes de dieta. O leite dos bovinos tem sido extensivamentecaracterizado a nível bioquímico, fato que facilita o desenvolvimento das etapassubseqüentes para a purificação das proteínas recombinantes. Além disso,existe a possibilidade do desenvolvimento de espécies transgênicas paraaplicações específicas, como vacas para a produção em grande quantidade(toneladas) ou coelhos e camundongos para produção de pequenasquantidades de proteínas requeridas em menor escala, ou simplesmente comomodelo de estudo para a expressão de proteínas recombinantes em sistemasheterólogos (Lisauskas et al., 2007).

A glândula mamária pode ser considerada atualmente o melhorbiorreator disponível (Colman, 1996; Rudolph, 1999). Estudos extensivos têmdemonstrado a possibilidade da produção de uma grande variedade deproteínas recombinantes no leite, muitas delas, sendo proteínas complexas,como: IGFI humano (Zinoveiva et al., 1998), hGH (Devinoy et al., 1994),lisozima humana (Lee et al., 1998), Iactoferrina humana (Platenburg et al.,1994), eritropoietina humana (Sohn et al., 1999), hormônio da paratireóidehumano (Rokkones et al., 1996). Estes exemplos demonstram a capacidade daglândula mamária para sintetizar, maturar e secretar proteínas recombinantes.

Em termos econômicos, existe um mercado global em expansão paradiferentes classes de proteínas recombinantes expressas no leite. Algumasvezes a demanda excede 100 kg. O mercado anual para antitrombina III,utilizada no tratamento da deficiência (hereditária), é de aproximadamente 70Kg, a um custo de US$ 2000-6000 o grama, segundo a IMS America Ltd.(Plymouth Meeting, MA). No caso da alfa-antripsina, indicada para o tratamentoda fibrose cística, o mercado se aproxima de US$ 30-50 milhões, sendo que350 Kg são utilizados somente nos Estados Unidos, de acordo com a IMS.

Para as proteínas provenientes do plasma humano, fator Vlll e IX, o mercadoanual é de aproximadamente 5-10 kg. De acordo com World Federation ofHemophilia (Montreal, Canada), a venda atual de fator IX é deaproximadamente US$190 milhões nos Estados Unidos. O Fator Vlll é deaproximadamente US$ 2 bilhões. O mercado potencial para os produtosmencionados tem sido limitado pelo suprimento de plasma. No Brasil, segundoo Hospital de Apoio de Brasília - DF, todo o fator que é comprado no país éimportado. Um frasco do remédio custa cerca de US$ 100, sendo que cadapaciente chega a utilizar 20 frascos por semana.

A etapa final do processo, que consiste na purificação das proteínasrecombinantes do leite geralmente não apresenta dificuldades particulares.

Entre os possíveis contaminantes biológicos, os prions são os que podemapresentar problemas. Entretanto, existem evidências homologadas, inclusivepela World Health Organization, enfatizando que prions não têm sidodetectados em associação com leite e sêmen (Rudolph, 1995; Ziomek, 1996).

Além disso, recentemente, rebanhos produtores de proteínas recombinantesdirecionados à comercialização requerem sistemas fechados de controlesanitário no intuito de erradicar as possíveis contaminações por prionsprovenientes desses animais controlados (Gavin, 2001).

Esta plataforma tecnológica deverá formar a base fundamental para afutura utilização de diferentes seqüências regulatórias e codificantes,prospectadas e devidamente caracterizadas, por meio de projetos de análisegenômica funcional e de proteomas. Como conseqüência direta, irá possibilitarum cenário de efetiva aplicação da manipulação da tecnologia do DNArecombinante para a geração de produtos em benefício da nossa sociedade.Hemofilia no Brasil e no mundo

A Hemofilia é uma doença hemorrágica decorrente da incapacidade de osangue coagular. Atinge o público masculino de qualquer grupo étnico naproporção de 1 a cada 10 mil nascidos. No Brasil, há cerca de 8 mil hemofílicoscadastrados, no entanto, pela falta de diagnóstico, existem pacientes ainda nãoidentificados.

O sangue do hemofílico produz em quantidades insuficientes os fatoresde coagulação como o Fator VII, o Vlll e o IX, entre outros. Daí a necessidadede tomar aplicações venosas a fim de conter os sangramentos. Possuem açãoeficaz no organismo por cerca de 12-24 h, de acordo com cada caso. A formatradicional de reposição são os fatores de origem plasmática, ou seja, osprodutos derivados das doações de sangue. No entanto, recentes pesquisaspermitiram a descoberta de produtos não-derivados do sangue, tambémconhecidos com recombinantes, e com os mesmos efeitos terapêuticos.

A disponibilidade de concentrados de fatores de coagulaçãorecombinantes tem permitido a realização de tratamentos eficazes paraprevenção de seqüelas da hemofilia sem incrementar o risco de contaminaçãoviral outrora existente com a utilização de produtos derivados de sanguehumano. A inclusão do medicamento livre de plasma humano é a única forma,atualmente disponível, para eliminar o risco de exposição a novos patógenosainda não estudados ou desconhecidos.

Cabe ressaltar a contaminação em proporções catastróficas, no mundointeiro, da infecção por HIV, que assolou grupos suscetíveis como acomunidade dos hemofílicos na década de 80. Vale, ainda, lembrar aexistência de agentes infecciosos mais recentes como o "Creutzfeldt-Jakob",relacionado à encefalopatia bovina espongiforme, conhecido por todos como adoença da vaca louca. Destaque, também, para o vírus "influenza aviárioH5N1", causador da gripe do frango.

O risco de contaminação por patógenos transmitidos pelo plasmahumano tem sido reduzido pelo investimento em tecnologias de inativação virala fim de tornar as aplicações do medicamento menos arrriscadas. No entanto,este processo onera o custo de produção e induz o parque fabril de fármacos ainvestir nos produtos recombinantes.

A incessante aplicação de recursos em pesquisa promove vantagemcompetitiva em poder do detentor do conhecimento. Inúmeros são os exemplosde quem investe elevada soma de recursos sobre determinada linha depesquisa, para, em seguida, auferir lucros na venda de seus produtos, emlicenças de uso ou outras formas de retorno do investimento. No casoespecífico, a pesquisa para o domínio da produção dos fatores recombinantes,tende a se tornar investimento plausível e compensador, uma vez que sejamlevados em conta o seguinte:

1) as leis brasileiras não permite um acompanhamento eficaz do doador,limitando em quantidade e qualidade a matéria-prima(sangue humano), um fatoque reduz o atendimento da demanda; cabe destacar que a oferta é limitada,também, em outros países;

2) o medicamento não derivado de sangue humano reduz,significativamente, a possibilidade de reações alérgicas, freqüentes em muitospaciente hemofílicos e que dificultam o tratamento, além de aumentar asegurança na infusão;

3) a melhora do tratamento de portadores de hemofilia é diretamenteproporcional à quantidade de fator de coagulação ofertada, que pode serincrementada com a inserção de recombinantes;

Isso posto, urge a necessidade de se buscar fontes alternativas deprodução de recombinantes para contribuir no tratamento daquelacoagulopatia, de ingressar em seleto grupo de domínio do conhecimento daquímica fina, de se valorizar o pesquisador brasileiro e alcançar a auto-suficiência.Há uma pesquisa inédita no Brasil, por enquanto suspensa, que é aprodução de Fator IX de coagulação recombinante de origem do leite de vaca.Demonstrou ser um Projeto viável, salvo contraprovas ainda não apresentadas,diante de outras pesquisas similares. É inédito no mundo. Sua produção emescala industrial garante a autosuficiência do mercado nacional compossibilidade de exportação. Por ser considerado medicamento de altatecnologia, o produto recombinante pode ser negociado livremente nomercado. Além do Fator IX, podem ser produzidos pela mesma tecnologiaoutros como o Vll e o VIII. O clima, as condições ambientais e a tecnologiaalcançada pela agropecuária brasileira garantem oferta ilimitada da matéria-prima a ser industrializada.

Hemofilia é um distúrbio genético da coagulação que faz com que osangue não forme um efetivo coágulo. Na ausência desse coágulo, injúriasinternas e lacerações externas são incapazes de serem resolvidas de maneiracorreta. Hemofilia AeB são herdadas geneticamente como distúrbiosrecessivos ligados ao sexo (Cromossomo X) e ocorre quase queexclusivamente em homens na ordem de 1 em cada 5000 nascidos nosEstados Unidos e Canadá. Aproximadamente 13,5 mil americanos têmhemofilia A (também denominada de hemofilia clássica), em que o fator Vlll decoagulação está ausente ou não é produzido em quantidades suficientes. Já3,5 mil pessoas nos Estados Unidos têm hemofilia B (também denominadaChristmas disease), em que o fator IX de coagulação está ausente ou não estápresente em quantidades suficientes. No Canadá, cerca de 2000 pessoas têmhemofilia A e 450 têm hemofilia B. No Brasil, existe uma incidência estimada de1 em cada 10000 habitantes, sendo que 85% dos pacientes têm hemofilia A e15% têm hemofilia B.

Enquanto a hemofilia pode resultar de uma mutação genéticaespontânea, é mais freqüentemente apresentada como um distúrbiohereditário. Essa doença é causada por uma deleção ou uma mutação do geneque modifica a habilidade do organismo de produzir quantidades suficientes defatores para promoverem a coagulação. Esta cascata age por duas vias, e visaà formação de um coágulo sempre que um vaso é lesado, impedindo que osangue extravase pela lesão indefinidamente. As pessoas afetadas por estadoença não produzem um dos dois fatores importantes para que esta cascataseja eficaz, o fator Vlll ou o fator IX. Assim, são incapazes de coagular osangue.

Até hoje, o tratamento para esta doença é a injeção destes fatores quefaltam (o Vlll ou o IX), por meio de derivados do sangue de doadores sadios oufabricados por engenharia genética. Estes fatores, porém, são muito instáveis,exigindo injeções freqüentes.

A hemofilia é caracterizada como grave quando a atividade do fator decoagulação implicado é menor do que 1% do normal. Isso freqüentementeresulta em sangramento espontâneo. A doença é leve quando a atividade émaior do que 5% do normal e moderada quando a atividade do fator decoagulação encontra-se entre esses dois valores. Cerca de 50% dos pacienteshemofílicos têm doença grave ou moderada e necessitam de tratamento paraas hemorragias graves, desde várias vezes ao mês até poucas vezes por ano.

Normalmente, os pacientes que sofrem de hemofilia B são tratados comfator IX obtido a partir do plasma humano de pacientes sadios. Mas aadministração de derivados do sangue em pacientes apresenta alto risco decontaminação por agentes infecciosos, como hepatite, AIDS, infecções porbactérias e parasitas. Por esse motivo, em vários países do mundo vemcrescendo significativamente o emprego dos produtos obtidos por engenhariagenética. No Canadá, por exemplo, uma lei exige, desde 1995, que apenasfatores de coagulação sangüínea deste tipo sejam comercializados, emdetrimento dos hemoderivados.

Até a década de 90, as tecnologias para a produção de proteínasrecombinantes de interesse farmacêutico se restringiam à cultura de células demamíferos in vitro ou produção em microorganismos. A partir daí, a utilizaçãode animais transgênicos demonstrou ser altamente eficiente para a produçãode proteínas recombinantes no leite, em larga escala e custos mais reduzidos(Houdebine, 1994; Wall, 1996).Várias são as aplicações da tecnologia da transgênese animal. SegundoAxelrod et al. (1990) foi demonstrado que células primárias de fibroblastos depele de cães hemofílicos, transfectadas por retrovírus contendo cDNA do fatorIX de coagulação, secretaram altos níveis do fator IX biologicamente ativo nomeio de cultura em que as células estavam sendo cultivadas. Já Choo et al.(1987) produziram camundongos transgênicos pela microinjeção de cDNA defator IX humano nos pronúcleos de ovócitos pré-fertilizados. Os camundongostransgênicos expressaram altas taxas do mRNA e atividade de coagulaçãoativa, que foram indistinguíveis da atividade do fator IX provenientes do plasmanormal humano.

Esses dados demonstram a capacidade de expressão de proteínasrecombinantes altamente complexas em camundongos transgênicos. Além deservir como background para a produção de fator IX humano em animais degrande porte (Schnieke et al., 1997; Cibelli et al., 1998) e em larga escala deprodução, para aplicação terapêutica e de terapias gênicas para a hemofilia B.Inserção de DNA exógeno

DNAs exógenos podem ser inseridos em genomas por meio deintegração retroviral, transposons, e por técnicas não-virais de transferência degenes, como por exemplo, ensaios de transfecção. Os locais de tais inserçõessão usualmente identificados por preparação de bibliotecas genômicas eisolamento de linhagens clones contendo o DNA exógeno e as seqüênciasflanqueadoras. Neste projeto, linhagens celulares bovinas transgênicas foramutilizadas como modelo de estudos da integração dos transgenes. Váriaslinhagens celulares clones de MDBK (Madin Darby Bovine Kidney)transfectadas foram expandidas a partir de uma única célula isolada e colocadaem cultivo celular até a expansão em torno de 36 μg de DNA. As linhagenscelulares preestabelecidas foram plaqueadas numa concentração de 3 χ 105células/ml em uma placa de 24 poços e transfectadas com o vetor plasmidialpClneo-β, previamente construído no laboratório, compreendendo os genesneo (antibiótico neomicina) e β-gal (β-galactosidase) sob controle do promotorconstitutivo CMV (citomegalovírus). A transfecção realizou-se utilizando oreagente Lipofectamina™ (Invitrogen, USA), segundo Oliveira et al., 2005.Vinte dias após a transfecção e seleção em meio suplementado com antibióticogeneticina (G418: 400 μg/ml), as células transgênicas foram isoladas eexpandidas em cultura. O DNA genômico das linhagens clones foramresgatados e as seqüências flanqueadoras foram identificadas pela técnica deresgate de plasmídio em Escherichia coli.

Uma vez que a integração de DNAs exógenos pela técnica detransfecção dá-se aleatoriamente, o método baseado na técnica de IPCR (PCRinvertido) para amplificar a região flanqueadora do DNA cromossomal no localde inserção do transgene é um método simples e útil para este propósito. Autilização desta técnica por meio de importantes estudos deve contribuir paranovos conhecimentos na construção de vetores bovinos com genes-alvo.

Genes-alvo é um método mais poderoso e eficiente de manipulaçãogenética e requer basicamente os mesmos procedimentos de transfecção,seleção e cultivo celular. O objeto de alcance para inúmeros benefíciosbiomédicos, como por exemplo, a ablação de antígenos de transplantesxenorreativos, inativação de genes responsáveis por doençasneuropatogênicas e a inserção precisa de transgenes determinados paraproduzir proteínas de terapia humana, têm incentivado setores tanto comerciaisquanto medicinais para o investimento nesta nova tecnologia, cuja propostabaseia-se no local de integração apropriado de uma maneira mais exata econseqüentemente mais eficiente a fim de produzir determinadas variantes emquantidades desejáveis.

Vetores de expressão

O ponto chave da tecnologia de transgênese se resume na introduçãode determinada informação genética com nova funcionalidade no genomahospedeiro. A estratégia para a construção de um "transgene" envolve aseleção de um elemento regulatório gênico (geralmente denominado promotor,mas usualmente contendo um elemento "enhancer" (acentuador) além de umpromotor) que tem como função determinar o tecido no qual o gene seráexpresso, bem como o tempo e a magnitude de expressão. Em alguns casos, oelemento regulatório pode agir como um "interruptor", permitindo ao transgeneser "ligado" (ativado) ou "desligado" (inativado). A segunda parte da construçãogênica consiste na seqüência de DNA que codifica a proteína desejada(geralmente referida como o componente estrutural de um transgene). Afinalização do transgene se restringe ao elemento regulatório denominado"terminador" que tem a função de "avisar" o término da transcrição dotransgene em questão. A maioria dos terminadores consistem numa seqüênciarica de A (nucleotídeo Adenina), denominada de cauda poly(A), responsávelpela "sinalização" ao mecanismo de transcrição de que aquela seqüência é otérmino do transgene.

Cultivo de células animais

A cultura de tecidos surgiu no começo do século vinte (Harrison, 1907;Carrel, 1912) como um método para se estudar o comportamento das célulasanimais desprovidas de variações sistêmicas ocorridas no organismo animal.Essas células oscilam em número e em tamanho tanto durante a homeostase,quanto sob condições de stress. A técnica foi elaborada primeiramente peladesagregação de fragmentos de tecidos, sendo que o crescimento das célulaslimitava-se à sua migração, a partir do fragmento do tecido dissociado. Acultura de um tecido pode ter como origem a dissociação do material biológico,tratado de diferentes formas (enzimático, mecânico ou químico), sendo que ascélulas dispersas desse tecido tratado podem então ser cultivadas in vitro parasubseqüentes estudos.

A tecnologia de cultura de tecidos tem sido adotada aplicavelmentedentro de muitas rotinas na medicina e na indústria. Análises cromossomais decélulas, retiradas do útero pela técnica de amniocentese, não só podem revelardistúrbios genéticos do feto que ainda nem nasceu e infecções virais podemser analisadas qualitativamente e quantitativamente por meio de monocamadasde cultura de células hospedeiras, efeitos tóxicos de certos componentesfarmacêuticos, além de análises de potenciais poluentes do meio ambiente quepodem ser detectados e mensurados por meio de ensaios de formação decolônias (Freshney, 1992).Ao se começar uma cultura de tecidos, alguns parâmetros devem serajustados, como o controle físico-químico do meio ambiente das células: pH,temperatura, pressão osmótica, O2, CO2, etc., mantendo uma condiçãofisiológica relativamente constante e controlada. A maioria dos meios de culturautilizados ainda requer suplementação com soro, cuja concentração é variáveldependendo do tecido em questão (Honn et al., 1975). E podem conter aindaelementos indefinidos, tais como certos hormônios e outras substânciasregulatórias. Gradualmente, as funções do soro são estudadas e comoresultado estão substituindo-o cada vez mais por constituintes definidos(Olmsted, 1967).

O tipo celular eleito para ser cultivado deve estar baseado nos fins deutilização da cultura, ou seja, as células estarão destinadas para:transformação genética, linhagem celulares permanentes, doadoras de núcleopara transferência nuclear, monocamada para co-cultivo etc. Além disso, olaboratório deve dispor, no mínimo, de equipamentos necessários e condiçõesde assepsia, antes de se iniciar uma cultura de tecidos.

No presente trabalho foram cultivadas linhagens celulares somáticas debovinos in vitro. As células MDBK são consideradas imortalizadas, ou seja, ascélulas são senescentes, mesmo quando cultivadas in vitro, podendo sersubmetidas a mais de 300 repiques (Lisauskas et al., 2007). Essas células sãoaderentes, de fácil manutenção e crescimento rápido, compatíveis com longosperíodos de cultura e intervenções ao longo das análises de monitoramentorequeridas.

Modificação genética de células de mamíferos

Várias tecnologias para a introdução e expressão das construçõesgênicas em diferentes animais vêm sendo desenvolvidas e aperfeiçoadas.Sistemas acurados de transporte de poucas quantidades de DNA se restringem(1) à microinjeção de DNA dentro do pronúcleo masculino de ovócitosfertilizados, sendo utilizada para produção de camundongos transgênicos(Lisauskas et al., 2008), coelhos (Rosochacki et al., 2002), ovinos (Simons etal., 1988; Hammer et al., 1985), suínos (Hammer et al., 1985) e bovinos (Wallet al., 1985; Wall et al., 1988; Krimpenfort et ai, 1991; Wall et al., 1996),mesmo com apenas uma pequena proporção (-5%) dos animais contendo otransgene integrado em seu genoma (Eyestone, 1994; Damak et al., 1996); (2)à utilização de células espermáticas como fontes carreadoras de DNA exógeno(Gandolfi et al., 2000; Perry et al., 1999; Lauria & Gandolfi, 1993; Lavitrano etal., 1989; Brackett et al., 1971); e (3) a vetores baseados em transposons(Belur et al., 2003). Por outro lado, sistemas que transportam grandesquantidades de DNA envolvem o uso de vetores retrovirais (Chan et al., 1998;Haskell & Bowen, 1995; Huszar et al., 1985; Jahner et al., 1985; van der Puttenet al., 1985), por sua eficiência de penetração celular e integração estável dotransgene no genoma hospedeiro. Uma vez que retrovírus conseguem apenasinfectar células em divisão celular, podendo causar efeitos deletérios nascélulas, como resultado de mutagêneses insercionais quando da integração doprovírus no genoma (Onions et al., 1993), sistemas mais eficientes detransporte de DNA, chamados de vetores adenovirais, que conseguem infectarcélulas que não estão em divisão celular, podem também ser utilizados, apesarde não conseguirem se integrar no genoma hospedeiro (Channon et al., 1996;Tsukui et al., 1996; Feldman & Isner, 1995). Outros sistemas de vetores virais,chamados vetores epissomais, utilizam o genoma viral de um papilomavírustipol de bovino e se mantém como elemento genético extracromossomalestável de auto-repiicação (DiMaio et al., 1982; Ohe et al., 1995; Sarver et al.,1981; Mannik etal., 2003).

Atualmente o método mais seguro e mais simples requerido paratransfectar células de mamíferos é a lipotransfecção, utilizando Iipossomoscatiônicos (Cibelli, 1998; Keefer, 2001; Oliveira et al., 2005). O mecanismo detransfecção mediado por Iipossomo aparece como resultado da associaçãoentre os lipídios catiônicos e o DNA que fornecem uma rede de cargaspositivas ao redor do vetor, permitindo a ligação com a rede de cargasnegativas da superfície celular (Felgner et al., 1989). Lipossomos sãotranslocados para dentro da célula por fusão com a membrana plasmática oupor fagocitose (Wrobel & Collins, 1995; Friend et al., 1996), e algumaspartículas podem entrar no núcleo por fusão com o envelope nuclear (Wrobel &Collins, 1995; Friend et ai, 1996; Thierry et ai, 1997). Com isso, animaisclones bovinos podem ser produzidos a partir de linhagens caracterizadas decélulas geneticamente modificadas, como fontes doadoras de núcleostransformados e microinjetadas em ovócitos previamente enucleados(Campbell etal., 1996; Schnieke et ai, 1997; Iguma et al., 2005).Lócus de integração

Devido à aleatoriedade da integração do transgene no genoma bovinopela técnica de lipotransfecção, apenas um pequeno número de eventos irágerar animais transgênicos, expressando a proteína de interesse em níveisdesejados (Schnieke et ai, 1997). A fim de aprimorar o método delipotransfecção, alguns autores têm estudado o lócus de integração do vetorplasmidial no genoma hospedeiro (Shi-Wu Li et ai, 1996, Lisauskas et al.,2007), bem como a caracterização desses locais. A abordagem baseia-se natécnica de resgate do plasmídio em Escherichia coli e permite a retirada dovetor de expressão do genoma em estudo, e a caracterização das regiõesflanqueadoras do DNA hospedeiro, a fim de isolar as regiões de integração dostransgenes (Mannik et ai, 2003).

A vantagem, em se estudar o lócus de integração do transgene possibilitaa seleção e geração de eventos elites que expressem o transgene em níveismais altos e desejáveis, além da utilização de linhagens aptas à transferêncianuclear para a geração de bovinos transgênicos. O sucesso reportado porMcCreath et al. (2000) baseia-se em estratégias desenvolvidas para aaplicação da técnica na geração de vetores bovinos com genes-alvo ("genetargeting").

Neste trabalho, parâmetros preestabelecidos de lipotransfecção paracélulas somáticas bovinas (Oliveira et al., 2005; Oleskovicz et al., 2004) foramutilizados como protocolo base e aplicados em linhagens celulares bovinasMDBK (Lisauskas et ai, 2007), a fim de se estudar os locais de integração dostransgenes para servirem como modelo de transformação genética de célulasaptas a serem doadoras de núcleos transgênicos para a transferência nuclear.Células-tronco

O nome células-tronco foi originado da tradução do inglês de "stem-cell"."Stem" significa caule, haste. O verbo "to stem" por sua vez, significa originar.

As células-tronco têm essa denominação por terem a capacidade de regenerarcélulas do sangue e de diversos tipos de tecidos que compõem o corpohumano. Por exemplo: células da pele só podem constituir a pele mas, ascélulas-tronco podem constituir diferentes tecidos do organismo.

Todo organismo pluricelular é composto por diferentes tipos de células.Entre as cerca de 75 trilhões de células existentes em um homem adulto, porexemplo, são encontrados em torno de 200 tipos celulares distintos. Todos elesderivam de células precursoras, denominadas células-tronco ("stem cells"). Oprocesso de diferenciação, que gera as células especializadas — da pele, dosossos e cartilagens, do sangue, dos músculos, do sistema nervoso e dosoutros órgãos e tecidos humanos — é regulado, em cada caso, pela expressãode genes específicos nas células-tronco, mas ainda não se sabe em detalhescomo isso ocorre e que outros fatores estão envolvidos.

As células-tronco são células indiferenciadas, que podem se multiplicar eregenerar tecidos Iesionados porque têm a capacidade de se transformar emcélulas idênticas às dos tecidos em que foram implantadas. Por exemplo: seuma pessoa com infarto do miocárdio tem uma parte do coração afetada e ascélulas dessa região morrem, as células-tronco podem se transformar emcélulas cardíacas e substituir as células mortas, regenerando o tecidolesionado. Outra hipótese, no caso do diabetes, é de que as células-tronco, seinseridas no pâncreas, poderiam se diferenciar e começar a produzir insulina, oque traria a cura para pessoas portadoras dessa doença.

As células-tronco estão presentes desde a vida embrionária até a vidaadulta, e provavelmente até nossa morte. São elas as responsáveis pelaformação do embrião e também pela manutenção dos tecidos na vida adulta.Elas estão presentes em: vários tecidos humanos (sangue, medula e outrostecidos), mas em quantidade muito pequena; no cordão umbilical e na placenta(em quantidades bem maiores); em embriões nas fases iniciais da divisãocelular, isto é, na fase de blastocisto.Classificação morfológica

- Totipotentes: As células-tronco embrionárias que podem formar todos ostecidos incluindo a placenta são denominadas embrionárias - totipotentes. Elasconstituem o primeiro grupo de até 32 células, e se formam nas primeiras 72horas após a fecundação do óvulo. Neste momento, não é possível identificarneste grupo celular qualquer diferenciação de tecido específico. A formação daplacenta e de seus anexos somente ocorre quando estas células totipotentessão implantadas no útero.

- Multipotentes: As células embrionárias, a partir do quinto ou sexto dia após afecundação, quando constituem um grupo de 64 células, são capazes deformar qualquer espécie de tecido exceto placenta, e são denominadas célulasmultipotentes.

- Oligopotentes: As células-tronco adultas que podem originar mais de um tipode tecido são chamadas oligopotentes, e encontram-se, por exemplo, no tecidointestinal.

- Unipotentes: Em órgãos já formados, por exemplo, o sistema nervoso, sãoencontradas células-tronco tipo adulto que dão origem a um único tipo detecido, a função provável destas células é a reparação de tecidosdeterminados. Já na medula óssea a função das células-tronco tipo adulto émanter o nível de elementos figurados do sangue que necessitam constantesubstituição.

Clonagem Terapêutica (Yanagimachi R, 2002)

Esse processo consiste em obter um embrião da pessoa doente por meioda técnica de clonagem e retirar as suas células-tronco. Essas células têmpotencial para se transformar em qualquer tipo de célula adulta do corpo,como, por exemplo, células cardíacas ou nervosas. Assim, elas poderiam serestimuladas a se transformar no mesmo tipo de célula que estão lesadas noorganismo do doente. Por exemplo: uma pessoa com leucemia quenecessitasse de um transplante de medula seria clonada, dando origem a umembrião, do qual seriam retiradas as células-tronco. Dessa forma, a pessoaseria doadora para si mesma, sem correr o risco de que seu organismo viessea rejeitar o transplante, pois as células utilizadas seriam retiradas de seu clone,que apresentaria a mesma constituição genética que ela.

A utilização das células-tronco para fins terapêuticos pode representartalvez a única esperança para o tratamento de inúmeras doenças ou parapacientes que sofreram lesões incapacitantes da medula espinhal queimpedem seus movimentos. Em 1997 foi anunciado o primeiro mamíferogerado a partir de células somáticas de um indivíduo adulto por meio datransferência nuclear, a ovelha Dolly (Wilmut et al., 1997). Dolly só nasceudepois de 276 tentativas que fracassaram. Além disso, dentre as 277 células"da mãe de Dolly" que foram inseridas em um óvulo sem núcleo, 90% nãoalcançaram nem o estágio de blastocisto. A tentativa posterior de clonar outrosmamíferos tais como camundongos, porcos, bezerros, um cavalo e um veado,também tem mostrado uma eficiência muito baixa e uma proporção muitogrande de abortos e embriões malformados. É interessante que dentre todosos mamíferos que já foram clonados, a eficiência é um pouco maior embezerros (cerca de 10% a 15%). Penta, a primeira bezerra brasileira clonada apartir de uma célula somática adulta, em 2002, morreu com pouco mais de ummês. Ainda em 2002, foi anunciada a clonagem do copy cat, o primeiro gato deestimação clonado a partir de uma célula somática adulta. Para isto foramutilizados 188 óvulos que geraram 87 embriões e apenas um animal vivo. Narealidade, experiências recentes com diferentes modelos animais têm mostradoque essa reprogramação dos genes, para o estágio embrionário, o processoque originou Dolly, é extremamente difícil.

O grupo liderado por Ian Wilmut, o cientista escocês que se tornou famosopor essa experiência, afirma que praticamente todos os animais que foramclonados nos últimos anos a partir de células não embrionárias estão comproblemas. Entre os diferentes defeitos observados nos pouquíssimos animaisque nasceram vivos após inúmeras tentativas, observa-se: telômerosencurtados; placentas anormais; gigantismo em ovelhas e gado; defeitoscardíacos em porcos; problemas pulmonares em vacas, ovelhas e porcos;problemas imunológicos; falha na produção de leucócitos; defeitos muscularesem carneiros.

De acordo com Hochedlinger e Jaenisch (2003), os avanços recentes emclonagem reprodutiva permitem quatro conclusões importantes: 1) A maioriados clones morre no início da gestação; 2) os animais clonados têm defeitos eanormalidades semelhantes, independentemente da célula doadora ou daespécie; 3) essas anormalidades provavelmente ocorrem por falhas nareprogramação do genoma; 4) a eficiência da clonagem depende do estágio dediferenciação da célula doadora. De fato, a clonagem reprodutiva a partir decélulas embrionárias tem mostrado uma eficiência de 10 a 20 vezes maiorprovavelmente porque os genes, que são fundamentais no início daembriogênese, estão ainda ativos no genoma da célula doadora.

Um dos objetivos da biotecnologia animal é a aplicação de técnicas atuaisda engenharia genética para a produção de animais de grande porte comcaracterísticas desejáveis. Os carneiros (Dattena et al., 2006), o porco(Piedrahita et al., 1990), o coelho (Chiang et al., 2008), os bovídeos (Keefer etal., 1994; Verma et al., 2007), o rato (Ouhibi et al., 1995), e o macaco (Mitalipovet al., 2003) tem sido relatados como potenciais fontes doadoras de células-tronco embrionárias.

O método usado para o isolamento de células-tronco embrionáriashumanas foi adaptado às outras espécies com algumas modificações.Entretanto, tentativas preliminares de cultura da massa interna celular (ICM) devárias espécies sobre camada de células embrionárias de camundongos ousobre cultura primária de fibroblastos de camundongos na presença do fatorinibitório da leucemia (LIF) foram raramente bem sucedidas. Uma combinaçãode fatores de crescimento pode ser requerida para a proliferação destas célulaspluripotentes, como foi demonstrado no cultivo de células de linhagensprimordiais de camundongos (Tielens et al., 2006). No nosso estudo, células-tronco embrionárias bovinas, isoladas da massa celular interna de blastocistosbovinos produzidos in vitro, só foi possível quando cultivada sobre camada decélulas-tronco embrionárias de camundongos, fornecendo, dessa maneira,meio de cultivo condicionado por tais células em crescimento concomitante.

No Brasil, com a perspectiva de baixas taxas de reconstrução embrionáriae baixas taxas gestacionais após a clonagem por transferência nuclear pormeio da utilização de células somáticas, geraram a necessidade de se isolarcélulas-tronco a partir de embriões bovinos produzidos in vitro, comoexpectativa no uso dos núcleos transfectados para a geração futura de bovinostransgênicos utilizados como biorreatores.

A técnica de isolamento de células-tronco embrionárias bovinas abreuma perspectiva futura viável para a geração de linhagens clones de células-tronco para estudos de função gênica, de expressão gênica e na geração denúcleos transformados com genes exógenos, principalmente de interessefarmacológico, como fontes doadoras desses núcleos para a transferêncianuclear e à geração de animais biorreatores.

É extremamente importante que as pessoas entendam a diferença entreclonagem humana, clonagem terapêutica e terapia celular com células-troncoembrionárias ou não. A maioria dos países da comunidade européia, oCanadá, a Austrália, o Japão, a China, a Coréia e Israel aprovaram pesquisascom células embrionárias de embriões até 14 dias. Essa é também a posiçãodas academias de ciência de 63 países, inclusive o Brasil. É fundamental que anossa legislação também aprove estas pesquisas porque elas poderão salvarinúmeras vidas.

Essas 63 academias de ciência do mundo que se posicionaram contra aclonagem reprodutiva defendem as pesquisas com células embrionárias parafins terapêuticos. Em relação aos que acham que a clonagem terapêutica podeabrir caminho para clonagem reprodutiva devemos lembrar que existe umadiferença intransponível entre os dois procedimentos: a implantação ou não emum útero humano. Basta proibir a implantação no útero. Se pensarmos quequalquer célula humana pode ser teoricamente clonada e gerar um novo ser,poderemos chegar ao exagero de achar que toda vez que tiramos a cutícula ouarrancamos um fio de cabelo, estamos destruindo uma vida humana empotencial. Afinal, o núcleo de uma célula da cutícula poderia ser colocado emum óvulo enucleado, inserido em um útero e gerar uma nova vida!

A prática da clonagem-terapêutica suscita grandes dúvidas que exigem,por parte dos órgãos responsáveis estudo, bom senso e ética, para que não selegalize um comportamento que contrarie os interesses humanos e, por outrolado, abra um campo enorme à exploração indiscriminada.

Existem células-tronco em vários tecidos (como medula óssea, sangue,fígado) de crianças e adultos. Entretanto, a quantidade é pequena e nãosabemos ainda em quais tecidos são capazes de se diferenciar.As células-tronco embrionárias são importantes fontes na medida em quefornecem resultados promissores no desenvolvimento embrionário in vitro declones de animais domésticos após a técnica de transferência nuclear. Isso sedá pela potencial aplicação das células-tronco na possibilidade intrínseca dediferenciação celular em qualquer tecido adulto, e neste caso, em secomportarem como célula embrionária.

No Brasil, as pesquisas, ainda em andamento, indicam que as célulasembrionárias seriam capazes de diferenciar-se em quase todos os tecidoshumanos. Mas, a Lei de Biosegurança - que gera muitas polêmicas - sópermite que sejam usadas para fins científicos e, no caso das humanas, apósestarem armazenadas por mais de 3 anos, com o consentimento dos pais.

Os avanços na biotecnologia fizeram com que o DNA pudesse sermanipulado de maneira controlada, gerando espécies modificadas de ratos,camundongos, ovelhas, bovinos, cabras, suínos e até primatas. A geração demodelos transgênicos, como por exemplo, o camundongo, tornou possível autilização de animais em experimentação produzidos em laboratório comofontes para estudo de características funcionais do homem que se desejamestudar.

A vantagem da aplicação de ferramentas de engenharia genética para odesenvolvimento de técnicas de produção de biofármacos e vacinas é apossibilidade de aumento do rendimento e da capacidade de produção,propiciando uma redução dos custos, assim como a possibilidade de melhorcontrole dos processos e qualidade dos produtos. O Brasil, hoje, depende daimportação de biofármacos. As pesquisas no país pretendem contribuir paramudar esta realidade, por meio do desenvolvimento de tecnologias de pontapara a obtenção de produtos recombinantes.

A utilização de animais transgênicos tem demonstrado ser altamenteeficiente para a produção de proteínas recombinantes no leite, em larga escalae custos mais reduzidos, os quais têm recebido aceitação pelas agências deregulamentação responsáveis pela produção de fármacos. Apesar de inúmerasquestões éticas envolvendo o tema esperarem soluções apropriadas, osanimais transgênicos são muito promissores para a bioindústria, paradiagnósticos clínicos e para estudos em pesquisa básica.

Sendo assim, a expressão do fator IX de coagulação biologicamente ativoem sistemas de expressão utilizando animais transgênicos, possibilitou aavaliação do funcionamento da expressão do recombinante em camundongostransgênicos (Lisauskas et al., 2008), justificando a aplicabilidade futura dossistemas em bovinos transgênicos utilizados como biofábricas ou biorreatores.

O gene do fator IX de coagulação humana foi integrado por meio datransgenia por adição, o método mais utilizado na introdução de genes, e nestecaso, do gene exógeno. Genes exógenos pertencem à outra espécie, nestecaso espécie humana e são usados para fazer um animal produzir uma novaproteína, ausente na espécie receptora, neste caso camundongos.

Uma vez que a inserção do transgene no genoma hospedeiro, por essemétodo, até onde se sabe é aleatória, ela pode ser ineficaz ou até mesmo letal,devido ao local onde o gene está integrado ser incerto. Na primeirapossibilidade, o transgene pode se inserir em uma região do cromossomo quedificulta ou inviabiliza a sua expressão, fazendo com que o animal nãoapresente o fenótipo em nível desejado. Na segunda, a inserção aleatória podeprovocar, por exemplo, a inativação de um gene essencial ao desenvolvimentona fase embrionária, com conseqüente inviabilidade ou morte prematura doanimal. Nesse caso, o fenótipo do animal transgênico é independente dotransgene, ou seja, não foi causado por uma característica do gene inserido,mas pelo local onde esse gene se integrou. Uma questão importante emexperimentos com animais transgênicos diz respeito ao "efeito de posição" dosgenes e os efeitos da região na qual eles se inserem. Ou seja, devemosdiscutir os diferentes padrões da expressão do transgene no genomahospedeiro, dependente de seu sítio de integração. Por causa dessaspossibilidades, a comparação de várias linhagens transgênicas com a mesmamodificação genética é imprescindível para que se possa inferir a inserção não-deletéria de um gene ou tentar correlacioná-lo ao nível da expressão dotransgene no local da inserção (Lisauskas et al., 2007). No intuito de aplicaresse modelo de estudo na geração de eventos elites de expressão dostransgenes, a chamada modificação genética dirigida ou controlada (genes-alvo) é o método empregado para a modificação e inativação de genes queexige o conhecimento de sua localização no genoma. Essa técnica possibilitasubstituir um gene funcional por uma seqüência mutada que, uma vezintroduzida, inativa o gene endógeno original, gerando um animal conhecidocomo modelo knock-out. Da mesma forma, é possível alterar uma pequenaseqüência do gene, gerando um modelo knock-in que produzirá uma proteínamodificada em vez da proteína endógena presente no animal. O termo knock-inse deve ao fato de o gene endógeno ser retirado do genoma e substituído poroutro com uma pequena modificação.

Várias técnicas são utilizadas para produzir animais transgênicos poradição de segmentos de DNA ao genoma - entre elas, a microinjeçãopronuclear de embriões, a transferência de DNA mediada porespermatozóides, a infecção de embriões por vetores retrovirais, atransferência de DNA mediada por transposons, a injeção de células-troncoembrionárias geneticamente modificadas, a transferência nuclear de célulasgeneticamente modificadas. Dentre todos esses procedimentos, a microinjeçãopronuclear é o mais utilizado na produção de camundongos transgênicos. Ataxa de integração do DNA no genoma embrionário é baixa - cerca de 1 % a 6%(Lisauskas et al., 2008). Ou seja, apenas alguns animais nascidos carregarão otransgene integrado em seus cromossomos. A integração do transgene pormicroinjeção, como dito anteriormente, ocorre de forma aleatória no genoma, etodas as células do animal são geneticamente modificadas, inclusive asgerminativas, de modo que essa alteração será transmitida aos seusdescendentes. Todo animal transgênico positivo originado de um embriãomicroinjetado é classificado como fundador de uma linhagem transgênicaúnica, que difere de outro fundador quanto ao local de inserção e ao número decópias do transgene no genoma. Outro método a ser aplicado na geração decamundongos geneticamente modificados consiste no isolamento e mantençade células-tronco indiferenciadas in vitro e, posteriormente, com a modificaçãogenética destas e injeção em embriões receptores, pode-se produzircamundongos quiméricos. Isso provou definitivamente que essas células sãocapazes de iniciar o processo de diferenciação e produzir um indivíduocompleto. As células-tronco embrionárias são totipotentes, ou seja, capazes degerar qualquer tipo de tecido. Elas são oriundas de embriões na fase inicial dedesenvolvimento, após cerca de quatro dias da fertilização do óvulo. O embriãonessa fase é denominado blastocisto e possui centenas de células-tronco nasua massa celular interna, que darão origem a todos os tecidos do organismoadulto. Atualmente, essa técnica é rotineiramente aplicada em camundongos,uma das únicas espécies - além da humana - em que se domina totalmente ocultivo de células-tronco embrionárias. Para outras espécies, há dificuldade emse manter indiferenciadas as células-tronco derivadas de embriões em cultura.No nosso trabalho, células-tronco embrionárias bovinas foram isoladas ecultivadas por longos períodos mantendo sua indiferenciação. O próximo passoao isolamento de células-tronco embrionárias é a seleção daquelasgeneticamente modificadas, e a técnica de eleição que se mostrou eficaz foipor meio da técnica a laser. As células transfectadas podem formar linhagensclones e bancos de células para a futura produção de bovinos transgênicos.

Inúmeras são as aplicações potenciais da utilização de animaisgeneticamente modificados como modelos para o estudo das causas, daprogressão, dos estágios e sintomas de doenças cardiovasculares, auto-imunes, neurológicas, entre outras. Ao se utilizar linhagens de células-troncogeneticamente modificadas pode-se permitir uma análise detalhada dafisiopatologia de doenças, propiciar também o desenvolvimento de novasformas de tratamento, novos testes diagnósticos, agentes terapêuticos maiseficazes e baratos, e o tão esperado estabelecimento de protocolos de terapiagênica.

Além disso, o transplante de órgãos e tecidos de animais em sereshumanos, ou xenotransplante, é também foco de interesse no uso dostransgênicos. Existe carência mundial de órgãos para transplantes clínicos, einfelizmente muitos pacientes morrem na fila de espera. As vantagens doxenotransplante sobre os transplantes tradicionais incluem o suprimentoilimitado de órgãos e a conseqüente diminuição das filas de espera. Atualmenteos pesquisadores desenvolvem porcos transgênicos cujos órgãos podem serseguramente utilizados para transplante em humanos. Para isso, é precisosuperar o sistema imunológico que reconhece e destrói todas as células quenão possuem marcadores específicos humanos na sua superfície, ocasionandoo fenômeno da rejeição. Para contornar esse problema, foram criados porcostransgênicos portadores de um gene que codifica uma proteína da superfíciede células humanas. Como resultado, esses porcos possuem órgãos contendomarcadores de células humanas, o que impede que componentes do sistemaimune do receptor ataquem e destruam o órgão transplantado. Paralelamente,outros grupos de pesquisa estudam uma estratégia diferente para minimizar arejeição de órgãos na xenotransplantação. Ela consiste em eliminar do genomado porco, pelo método de knockout, o gene que codifica a α -1,3-galactosiltransferase, uma enzima presente na superfície das células daqueleanimal que é reconhecida pelo sistema imunológico humano. Sem esta enzima,a primeira etapa na rejeição ao órgão transplantado não acontece. Apesar dasboas perspectivas do xenotransplante, a utilização do método ainda é foco deinúmeros aspectos éticos que devem ser bastante discutidos.

Outra aplicação promissora dos transgênicos é na pecuária e indústria. Osmétodos de seleção de características desejadas, como por exemplo,aumentar a produção de leite, estão baseados no cruzamento seletivo econvencional dos animais. Porém, o cruzamento seletivo é extremamente lentoe dispendioso, além de ser um processo que não garante os resultadosdesejados. As novas técnicas de biologia molecular tornaram possível aintrodução ou manipulação de características desejáveis nos animais, emmenos tempo e com mais precisão. Como exemplo, citamos a geração devacas transgênicas, manipulando-se genes endógenos, as quais produzemmaior quantidade de leite/dia.

Na indústria farmacêutica um processo denominado "humanização decamundongos" utiliza-se desses modelos animais no desenvolvimento denovas drogas. Por meio desse processo, um gene é retirado do genoma doanimal pela técnica de knock-out e, em substituição, um gene humano éinserido pelo método de adição gênica. Essa técnica deve facilitarenormemente o desenvolvimento de novos medicamentos, barateando oscustos e diminuindo o tempo para uma nova droga chegar às farmácias. Outraimportante aplicação da transgenia animal é a produção de animais conhecidoscomo biorreatores. Estes são geralmente animais domésticos de médio egrande porte, utilizados para a produção de proteínas recombinantes humanasde grande interesse biológico e comercial, como enzimas, hormônios, fatoresde crescimento, fatores da coagulação. Em geral a proteína de interesse éexpressa no leite do animal, tornando sua produção mais barata e eficiente. Em1997, o primeiro bovino transgênico, a vaca Rosie, produzia leite enriquecidocom a proteína humana lactoalbumina. Esse leite transgênico é mais nutritivopara humanos que o leite natural, e poderia ser introduzido na alimentação decrianças com carência de nutrientes específicos. Há também pesquisas emcurso voltadas para a produção de leite transgênico contendo as proteínasnecessárias para o tratamento de doenças como fenilcetonúria, enfisemahereditário e fibrose cística. No nosso estudo, camundongas transgênicasproduziram no leite o fator IX humano de coagulação. A proteína recombinantegerada foi testada e provou ser biologicamente eficaz na coagulação dosangue de pacientes hemofílicos.O futuro da transgênese animal é indiscutivelmente o uso desses animaiscomo biofábricas para a produção de proteínas recombinantes em benefício denossa sociedade. Essa produção proporcionará ilimitada quantidade demedicamentos sendo produzidos de maneira abundante, além de fornecê-los aum baixo custo e podendo suprir bancos de hospitais, principalmente os darede pública de saúde. Atualmente o Brasil dispende grandes quantidades dedinheiro pagas à importação de fármacos não produzidos pelas indústriasbrasileiras. Com essa tecnologia, o país economizará fundos de investimentosem outras áreas precárias do país, como educação e segurança pública.Entretanto, apesar de as vantagens da utilização dos animais transgênicos, oBrasil ainda sofre com os muitos obstáculos políticos e legais que rondam àfrenagem de tal tecnologia. Em um país que atualmente sofre com a falta dedinheiro para a importação de produtos essenciais para a mantença daqualidade de vida de pessoas portadoras de doenças raras, a precariedade dadistribuição de medicamentos na rede pública de saúde, as constantes mortesde pessoas à espera de órgãos a serem transplantados, o alto custo napurificação de hemoderivados e o risco destes na transmissão de possíveisdoenças, além da falta de estudos dos efeitos na aplicação de novas drogasmanipuladas e distribuídas comercialmente, constitui um crime a tentativa debarrar a ascensão da nova tecnologia e permitir que os brasileiros, no futuro,aumentem as suas chances de cura ou de simples expectativa de vidaproporcionada pelas novas abrangências de tal tecnologia. Baseado nessesaspectos, a tecnologia do DNA recombinante, bem como a engenhariagenética que já estão disponíveis em nosso país vem ao encontro daconcretização das possibilidades apontadas acima, se pessoas influentes emnosso país tentassem se interar dos benefícios, das possibilidades de longoalcance da tecnologia e dos reais riscos das técnicas em aplicação. Ao invésde trabalhar em leis e formas legais que vão de encontro aos reais benefíciospara a população trazidos por esta tecnologia.

Essa positiva revolução da medicina, que envolverá a produção derecombinantes eficazes a baixo custo de produção, a produção ilimitada deórgãos para xenotransplantes, a manipulação de células-tronco humanas paraa cura de doenças cuja única solução é o uso dessas células totipotentes, deveser absorvida como única solução viável para o Brasil cuja precariedade é oadjetivo principal em todas as áreas de excelência do país.

Em especial, a presente invenção está relacionada ao processo demodificação de células-tronco embrionárias bovinas e processo de purificaçãode proteínas geradas por tais células modificadas.

Do que se depreende da literatura pesquisada, não foram encontradosdocumentos antecipando ou sugerindo os ensinamentos da presente invenção,de forma que a solução aqui proposta possui novidade e atividade inventivafrente ao estado da técnica.

Obieto da Invenção

A presente invenção está relacionada ao processo de modificação decélulas-tronco embrionárias bovinas e processo de purificação de proteínasgeradas por tais células modificadas.

Em especial, a presente invenção se situa no campo da terapêuticamédica e veterinária.

É, portanto, outro objeto da presente invenção o processo demodificação de células-tronco embrionárias bovinas compreendendo as etapasde:

a) construir vetores de expressão compreendendo:

a1) pelo menos uma seqüência nucleotídica capaz deexpressar o gene do fator IX de coagulação sangüínea humano e/ouseus fragmentos contendo peptídeo sinal bovino na extremidade 5';

a2) pelo menos um promotor adequado.

b) contactar células-tronco embrionárias bovinas com os vetoresde expressão de a).

Em especial, linhagens de células-tronco embrionárias bovinas foramisoladas a partir da massa celular interna de embriões bovinos produzidos invitro a fim de se tornarem, no futuro, fontes de células-tronco embrionáriasbovinas, serem modificadas geneticamente e utilizadas para a transferêncianuclear na obtenção de bovinos transgênicos.

É, portanto, outro objeto da presente invenção o processo de purificaçãode proteínas geradas por células-tronco embrionárias bovinas modificadasconmpreendendo as etapas de:

a) acoplar cauda de histidina à extremidade 3' de pelo menosuma seqüência nucleotídica capaz de expressar o gene do fator IX decoagulação sangüínea humano e/ou seus fragmentos contendo peptídeosinal bovino na extremidade 5';

b) purificar a), promovendo a separação do composto bioquímico.

Estes e outros objetos da invenção serão imediatamente valorizadospelos versados na arte e pelas empresas com interesses no segmento, e serãodescritos em detalhes suficientes para sua reprodução na descrição a seguir.

Descrição das Figuras

A Figura 1 descreve o Vetor de expressão pBCIFIX (1A) usado para ageração dos camundongos transgênicos. A seqüência codante do gene FIXhumano foi fusionada ao sinal de secreção de beta-caseína bovina(MAKVLILACLVALALA) e clonado no sítio de restrição de Xho\ do vetor deexpressão comercial pBC1 (Invitrogen, EUA).

A Figura 1B representa a β-caseína 3' DNA genômico que permite acorreta tradução e poliadenilação do mRNA.

A Figura 1C representa a Ampicilina.

A Figura 1D representa a pMB1 ori.

A Figura 1E representa 2X isolado de β-globina.

A Figura 1F (P β-caseína) representa a indução da expressão dotransgene em células epiteliais da glândula mamária.

A Figura 1G representa fragmentos de DNA Genômico provenientes daregião codificadora da proteína β-caseína.A Figura 2 (A) descreve a Avaliação por meio de PCR nos camundongostransgênicos. 1, 2, 3, 4 correspondem aos camundongos transgênicos; 5camundongos não-transgênicos; 6 controle negativo interno das reações; 7sequencia do gene do FIX correspondente a 495 pb. A Figura 2 (B) descreveas Análises de southem blot das linhagens transgênicas 1 e 2 (1, 2, 3, 4, 5 e 6)e da linhagem não-transgênica (7).

A Figura 3 descreve IVesfern blot do leite de fêmeas transgênicasexpressando o gene fo FIX humano. 1 corresponde a 350 ng da proteína doFIX purificada (Sigma, EUA); 2 corresponde a 100 pg de proteína total de leitede fêmea não-transgênica; 3 e 4 a 100 pg de fêmeas fundadoras transgênicasdas linhagens 1 e 2; 5 e 6 a 100 pg da progênie Fi da linhagem 1; 7 e 8 a 100pg da progênie Fi da linhagem 2.

A Figura 4 descreve o Isolamento manual do botão embrionário deembriões bovinos produzidos in vitro.

A Figura 5 descreve Embriões bovinos produzidos in vitro em diferentesfases do desenvolvimento, utilizados para o isolamento via laser de seu botãoembrionário.

A Figura 6 descreve Cinco (5) Colônias de Células-tronco EmbrionáriasBovinas isoladas pelo Sistema de Isolamento manual.

A Figura 7 descreve fotos em diferentes zoom da cultura de fibroblastosde camundongos utilizados como monocamada base para o cultivo delinhagens embrionárias de células-tronco de outras espécies.

A Figura 8 descreve Colônias ES cells de camundongos recém-repicadas - 5x.

A Figura 9 descreve Colônias ES cells recém-repicadas, indiferenciadase em início de diferenciação

A Figura 10 descreve Colônias human ES cells transformadas com GFPem diferentes zoom sob contraste de fase.

A Figura 11 descreve Colônias human ES cells transformadas com GFPem diferentes zoom sob incidência de Ultra-Violeta.As Figuras 12 e 13 descrevem RT-PCR e Western Blot de BMP-2 eBMP-4, respectivamente.

A Figura 14 descreve Fibroblastos bovinos transfectados com pCMVR,usando Lipofectamina (200X).

A Figura 15 descreve a detecção por PCR do gene neo em DNAgenômico de fibroblastos bovinos a partir de 2 colônias celulares transfectadas,I-Marcador de peso molecular;II-PCR sem molde, para confirmar a ausência decontaminação na reação; Ill- 10pg do vetor pCI-neo purificado; IV-200 ng defibroblastos de DNA não-transfectados; V- 200 ng de DNA de fibroblasto bovinotransfectado e Vl - 200 ng de células de DNA transfectadas da segundalinhagem.

Descrição Detalhada da Invenção

Os exemplos a seguir não têm o intuito de limitar o escopo da invenção,mas sim de somente ilustrar uma das inúmeras maneiras de se realizar ainvenção.

Processo de modificação de células-tronco embrionárias bovinas

O processo de modificação de células-tronco embrionárias bovinas dapresente invenção compreende as etapas de:

a) construir vetores de expressão compreendendo:

a2) pelo menos um promotor adequado.

Vetores de expressão

Entende-se por "vetores de expressão" os vetores capazes de expressara informação genética de um fragmento de DNA inserido em um DNA exógenoe podem ser selecionados do grupo que compreende plasmídeos, vírus,cosmídeos e/ou YACs. Os vetores de expressão são acoplados a promotores,que são seqüências capazes de promover a expressão da seqüência de DNAna célula desejada.

Expressão do fator IX recombinante humano no leite de camundongosConstrução do vetor de expressão

A região codificadora do gene do fator IX humano [(Número de acessoao GeneBank XM_010270.4) (Yoshitake et ai., 1985) (Texto 1)] foi amplificadapor PCR (Reação em Cadeia da Polimerase) a partir de uma biblioteca decDNA (k TripIEx, Clontech1 USA) de fígado humano. Esses fragmentos foramclonados no vetor pGEM-T Easy (Promega, USA) específico para clonagem deprodutos de PCR. Os pares de primers: BCproFIX [5'-GCTCGAGATGGCAAAGGTCCTCATCCTTGCCTGCCTGGTGGCTCTGGCCCTTGCAACAGTTTTTCTTGATCATGAAA-3'], incluindo o sítio para a enzimaXhol (sublinhado) e a seqüência do sinal de secreção da beta-caseína bovina(em negrito); e FIXstop3C [5'-CCTTCTCGAGCCATCTTTCATTAAGTGAGC-3'], incluindo o sítio para a enzima Xhol (sublinhado), resultaram naamplificação do fragmento de 1.378 pares de bases, o cassete de expressão aser clonado. As reações de PCR foram conduzidas no termociclador em tubosde reação de 50 μΙ_, contendo 10 ng DNA, 60 mM Tris/H2S04 (pH 8.9), 18 mM(NH4)2SO4, 2 mM MgSO4, 250 nM de cada dNTP, 200 nM de cada primer, e 5U da enzima Taq platinum DNA polymerase high fidelity (Invitrogen, USA). Osciclos de reações foram preliminarmente tratados a 95°C por 5 minutos esubmetidos a 35 ciclos de amplificação consistindo de 95°C por 1 minuto, 55°Cpor 1 minuto, e 68°C por 1 min, com um ciclo final de alongamento de 68°C por5 minutos.

Os produtos de PCR foram seqüenciados utilizando-se os primersuniversais M13 e T7 em seqüenciador automático ABI Prisml 3700. Ofragmento de 1.378 pares de bases, proveniente do gene do fator IXrearranjado, foi clonado no sítio de clonagem de Xho\ do vetor de expressãocomercial pBC1 (Invitrogen, USA) para a geração do vetor final denominadopBCIFIX (Figura 1), que fora utilizado nas mofificações genéticas dosmamíferos.

Produção in vitro de embriões bovinos

Os ovários provenientes da raça Holandesa foram coletados em umfrigorífico, imediatamente após a morte dos animais e transportados em DPBS(Invitrogen, USA) em caixas térmicas em torno de 37 0C para o laboratório deprodução in vitro de embriões bovinos. Agulhas descartáveis calibre 40x12cmforam utilizadas para a aspiração dos folículos sob vácuo de aproximadamente10 mmhg (milímetros de mercúrio).

Os ovócitos foram coletados em tubos Falcon de 50 mL (Falcon, USA), equando repletos, eram imediatamente transferidos para placas de Petri grandes(Falcon, USA) para serem rastreados e avaliados. Na medida em que osovócitos eram selecionados, eram colocados em placas de Petri pequenas(Falcon, USA) contendo o meio de seleção de ovócitos: 200 mL de TL HepesSolution (CAMBREX), 3 mg/mL de BSA V (SIGMA), 2 mL de PTR [5 mL TLHepes Solution (CAMBREX), 11 mg de Piruvic Acid (SIGMA)], e 100 μί de

Gentamicin Sulfate [CAMBREX; [ ] 0,5 μΙ/mL].

Os ovócitos classificados em graus 1, 2 e 3 (Peixer et al., 1997), eramcolocados em meio de maturação contendo 4,5 mL de Médium 199(CAMBREX, USA), 50 μΐ de PTR, 500 μΐ de Soro Fetal Bovino (Invitrogen,USA), 5 μί. de Gonadotrophin (Sigma, USA), 5 μΐ de Gentamicin Sulfate(CAMBREX, USA) e 5 [iL Estradiol (SIGMA, USA), em incubadora de cultivocelular à 39°C e 5% CO2, em atmosfera com 100% de unidade.

Após a maturação dos ovócitos por 24 horas, estes eram pré-lavados etransferidos para placas com meio apropriado para a fertilização contendo 5 mLde IVF-TL Solution (EmbryoMax, USA), 30 mg de BSA-FAF (SIGMA, USA), 50μί de PTR e 2,5 μί de Gentamicin Sulfate (CAMBREX, USA).

A inseminação era realizada com sêmen de touro Holandês comercial(0,25 mL/palheta congelada). As palhetas eram descongeladas por 10segundos em ar e 20 segundos em banho-maria a 37°C. O sêmen eracentrifugado (1000 rpm/6minutos) em meio de gradiente Percoll contendo [500μL de Percoll 90% (Invitrogem, USA) e 500 μL de Percoll 45% (250 μL dePereoll 90% com 250 μL de PTR)]. O sobrenadante era descartado e o pelletcontendo os espermatozóides viáveis era ressuspendido com 1 mL de meio TLHepes (CAMBREX, USA). O sêmen era novamente centrifugado por 6 minutose era descartado do sobrenadante em torno de 600 μL, sendo que os 400 μLrestantes, ressuspendia o pellet formado.

Imediatamente antes à inseminação, era adicionada às gotas dafertilização 4 μL da mistura das alíquotas de Heparina (10 μg/MI; Sigma, USA)e de PHE (Penicilamina, Heparina e Epinefrina; SIGMA, USA). A doseinseminante em torno de 0,75 μL/25 ovócitos era adicionada em cada gota eeram incubadas à 39°C e 5% CO2, em atmosfera com 100% de unidade.

Os ovócitos fertilizados por 24 horas eram pré-lavados e transferidos paraplacas com meio de cultivo contendo 5 mL de SOF Solution (EmbryoMax,USA), 2,5 mL de Gentamicin Sulfate (CAMBREX, USA), 100 pL de PTR, 50 pLde Non-Essential AA Solution (100X) (SIGMA, USA), 100 pLde Essential AASolution (BME-50X) (SIGMA, USA) e 40 mg de BSA-FAF (SIGMA, USA). Estesembriões eram cultivados durante sete dias em incubadora à 39°C e 5% CO2,em atmosfera com 100% de unidade, antes de serem utilizados no isolamentode sua massa celular interna.

Isolamento das células-tronco embrionárias bovinas e manutenção daslinhagens

Um total de 260 embriões após sete dias de produção in vitro foiutilizado para o isolamento de células-tronco embrionárias bovinas. O botãoembrionário ou a massa celular interna foi isolado por dissociação mecânica ecolocados em placas de cultura sobre o tapete celular formado de células PMF-P3 tratadas com mitomicina C (Chemicon, USA), e cultivadas em incubadora à39°C e 5% CO2, em atmosfera com 100% de unidade.

O meio de cultivo das colônias de células-tronco embrionárias bovinasdenominado ES cells media (Embrionic Stem cells media) consistia de 300 mLde meio Knock out D-MEM (Invitrogen, USA), 54 mL de Soro Fetal Bovino(Hyclone, USA), 2,4 mL de Non-Essential AA Solution (100X) (SIGMA, USA),2,4 mL de L-Glutamine 200mM (Invitrogen, USA), 0,4 mL Gentamycin(CAMBREX, USA), 250 pL de β-Mercaptoetanol (Sigma, USA) e 30 μί deleukemia-inhibitory factor (LIF; Sigma, USA).

A renovação do meio de cultivo se realizava a cada três dias, sendo queo repique era feito apenas a cada quinzena de cultivo das colônias de células-tronco embrionárias bovinas.

Descrição do método de isolamento manual das células-troncoembrionárias bovinas

Foram utilizados embriões D-7 para a remoção manual de células-tronco.Utilizou-se um sistema manual de micromanipulação em que as células dobotão embrionário foram removidas precisamente por meio de navalhas ultra-finas (Bio-technology, USA) a fim de causar menor dano possível às célulasisoladas. Foram obtidas 05 colônias-tronco por este sistema de isolamento queforam submetidas a análises moleculares para a certificação da pluripotênciacelular;

A técnica consistiu em escolher embriões Grau I de classificação segundoPeixer et al. (1997), separá-los em gotas individuais para que a remoção dobotão embrionário fosse de maneira isolada, evitando a contaminação celularentre embriões.

Imediatamente após a secção, o botão embrionário foi transferido paraplacas de 04 poços (Nunc, USA), contendo meio ES cells, à 39°C e 5% CO2,em atmosfera com 100% de unidade.

Modificação genética de células de mamíferos

O vetor PBC1-FIX foi utilizado na transformação estável das linhagensclones de células somáticas e de células-tronco embrionárias bovinas. Ascélulas bovinas foram plaqueadas em placas de 24 poços (FALCON, USA) auma concentração de 2x105 células.

Para cada poço, 0,5 μg DNA (pBC1-FIX) foi diluído em 25 μΙ D-MEM(Invitrogen, USA) sem soro fetal bovino (SFB), 4 μΙ de Reagente Plus(Invitrogen, USA) e 1 μΙ IipofectAMINA® (Invitrogen, USA). A solução foihomogeinizada e incubada à temperatura ambiente por 30 minutos. O meio decultivo da placa que continha as células (ES cells media) foi retirado e a misturacontendo o vetor de expressão adicionada às células. Após 5 horas deincubação, à 39°C, 5% CO2, em 100% de umidade, a solução foi substituídapor meio de cultivo ES cells media com SFB (Invitrogen, USA).

Quarenta e oito horas após a transfecção, as células foram diluídas 1:10e isoladas para a manutenção de linhagens clones de células somáticas e decélulas-tronco embrionárias bovinas. As linhagens clones de células bovinascultivadas foram criopreservadas em meio contendo 5 ml_ de ES cells media, 4ml_ de Soro Fetal Bovino e 1 mL de DMSO (Dimethyl sulfoxide; Sigma, USA) eacondicionadas em botijões de Nitrogênio Líquido a 196°C negativos.Recuperação e Purificação inicial da proteína

A purificação do produto gênico produzido no leite é realizada por meio dacentrifugação em que há a separação da fase lipídica e da fase protéica doleite. Esta recuperação visa à obtenção de uma alta concentração da proteínapurificada da matéria prima inicial para as análises preliminares de bioatividadeda proteína recombinante (Lisauskas et al., 2008).

A fim de purificar a proteína recombinante em escala industrial ecomercial, o composto protéico deve ser isolado via HPLC (CromatografiaLíquida de Alta Eficiência) (Van Cott et al., 1996; Wright & Colman, 1997).

Análises da integração e expressão gênica

Análises moleculares [PCR e southern blot (Figura 2); western blot(Figura 3)] e bioensaios (Tabela 1) são conduzidos a fim de detectar aslinhagens transgênicas, a expressão da proteína recombinante no leite dosanimais e sua atividade coagulante.

Análises de western blot confirmam a presença da correta massamolecular da proteína recombinante (50 KDa) no leite dos animaistransgênicos, certificando a correta estratégia de transformação quandoutilizado o vetor de expressão construído, baseado na utilização do sinal desecreção da beta-caseína bovina.

Análises da bioatividade da proteína recombinanteA fim de comprovar a atividade da proteína recombinante em sua açãocoagulante, o leite dos animais fundadores da linhagem 01, da linhagem 02,plasma humano normal, plasma humano hemofílico, e leite de fêmeas não-transgênicas foram comparados. A atividade de coagulação detectada emmU/mL (mili-unidades/mililitros) foi 17, 31, 44, 7 e 0, respectivamente. O tempode coagulação foi estimado em 76, 69, 37.6, 87 e 141 segundos,respectivamente. A atividade da proteína foi estimada em porcentagem de suaação coagulante (Tabela 1).

Bioatividade da proteína recombinante

<table>table see original document page 45</column></row><table>

Tabela 1: Atividade de coagulação do FIX recombinante no leite decamundongas transgênicas e não-transgênicas.

Texto 1. Código Genético e Seqüência polipeptídica do gene do fator IXhumano de coagulação sangüínea.

Translation of Unknown (1-1320)Universal code

Total amino acid number: 439, MW=49445Max ORF: 1-1317, 439 AA, MW=49445

ACAGTTTTTCTTGATCATGAAAACGCCAACAAAATTCTGAATCGGCCAAAGAGGTATAAT1 TVFLDHENANKILNRPKRYN61

TCAGGTAAATTGGAAGAGTTTGTTCAAGGGAACCTTGAGAGAGAATGTATGGAAGAAAAG21 SGKLEEFVQGNLERECMEEK

121

TGTAGTTTTGAAGAAGCACGAGAAGTTTTTGAAAACACTGAAAGAACAACTGAATTTTGG41 CSFEEAREVFENTERTTEFW

181

AAGCAGTATGTTGATGGAGATCAGTGTGAGTCCAATCCATGTTTAAATGGCGGCAGTTGC61 KQYVDGDQCESNPCLNGGSC

241

AAGGATGACATTAATTCCTATGAATGTTGGTGTCCCTTTGGATTTGAAGGAAAGAACTGT81 KDDINSYECWCPFGFEGKNC

301

GAATTAGATGTAACATGTAACATTAAGAATGGCAGATGCGAGCAGTTTTGTAAAAATAGT101 ELDVTCNIKNGRCEQFCKNS

361

GCTGATAACAAGGTGGTTTGCTCCTGTACTGAGGGATATCGACTTGCAGAAAACCAGAAG121 ADNKVVCSCTEGYRLAENQK

421

TCCTGTGAACCAGCAGTGCCATTTCCATGTGGAAGAGTTTCTGTTTCACAAACTTCTAAG141 SCEPAVPFPCGRVSVSQTSK

481

CTCACCCGTGCTGAGGCTGTTTTTCCTGATGTGGACTATGTAAATTCTACTGAAGCTGAA161 LTRAEAVFPDVDYVNSTEAE

541

ACCATTTTGGATAACATCACTCAAAGCACCCAATCATTTAATGACTTCACTCGGGTTGTT181 TILDNITQSTQSFNDFTRVV

601

GGTGGAGAAGATGCCAAACCAGGTCAATTCCCTTGGCAGGTTGTTTTGAATGGTAAAGTT201 GGEDAKPGQFPWQVVLNGKV

661

GATGCATTCTGTGGAGGCTCT ATCGTT AATGAAAAATGGATTGTAACTGCTGCCCACTGT221 DAFCGGSIVNEKWIVTAAHC

721

GTTGAAACTGGTGTT AAAATT ACAGTTGTCGCAGGTGAACATAATATTGAGGAGACAGAA241 VETGVKITVVAGEHNIEETE

781

CATACAGAGCAAAAGCGAAATGTGATTCGAATTATTCCTCACCACAACTACAATGCAGCT261 HTEQKRNVIRIIPHHNYNAA841

ATTAATAAGTACAACCATGACATTGCCCTTCTGGAACTGGACGAACCCTTAGTGCTAAAC281 INKYNHDIALLELDEPLVLN

901

AGCTACGTTACACCTATTTGCATTGCTGACAAGGAATACACGAACATCTTCCTCAAATTT301 SYVTPICIADKEYTNIFLKF

961

GG ATCTGGCTATGTAAGTGGCTGGGG AAG AGTCTTCC ACA AAGGG AG ATC AGCTTTAGTT321 GSGYVSGWGRVFHKGRSALV

1021

CTTCAGTACCTTAGAGTTCCACTTGTTGACCGAGCCACATGTCTTCGATCTACAAAGTTC341 LQYLRVPLVDRATCLRSTKF

1081

ACCATCTATAACAACATGTTCTGTGCTGGCTTCCATGAAGGAGGTAGAGATTCATGTCAA361 TIYNNMFCAGFHEGGRDSCQ

1141

GGAGATAGTGGGGGACCCCATGTTACTGAAGTGGAAGGGACCAGTTTCTTAACTGGAATT381 GDSGGPHVTEVEGTSFLTGI

1201

ATTAGTTGGGGTGAAGAGTGTGCAATGAAAGGCAAATATGGAATATATACCAAGGTATCC401 ISWGEECAMKGKYGIYTKVS

1261

CGGTATGTCAACTGGATTAAGGAAAAAACAAAGCTCACTCACCACCACCACCACCACTAA421 RYVNWIKEKTKLTHHHHHH*

Transfeccão de células MDBK (Madin Darbv Bovine Kidnev Cells)

Preparação do DNA

A construção do vetor de expressão foi efetuada de acordo comprocedimentos padrões da tecnologia do DNA recombinante (Sambrook et al.,1989). O sistema de transformação das células somáticas MDBK utilizado foipadronizado segundo Oliveira et al. (2005).

As células MDBK foram transfectadas com o vetor de expressãodenominado pCIneoBeta, construído no nosso laboratório, que contém o geneda beta-galactosidase sob controle do promotor constitutivo CMV e o gene neo(seqüência codante da neomicina fosfotransferase) sob controle do promotorconstitutivo SV40. Este vetor foi construído introduzindo o gene da beta-galactosidase, após a excisão de sua seqüência codante de seu vetorcomercial de origem pCMV-β (7.2 kb) (Clontech, Palo Alto, CA, USA), com aenzima de restrição Not\ e introduzida no sítio de clonagem do vetor comercialpCI-neo (5,472 pb).

O plasmídio foi amplificado em linhagens de Escherichia coli DH5a epurificado segundo Kit de Purificação de Plasmídios Giga da Quiagen (Qiagen,Valencia, CA, USA). A concentração do DNA plasmidial após a purificação emcoluna Quiagen foi mensurada por absorbância sob Ultra Violeta aocomprimento de onda de 260 nm. A pureza do plasmídio foi asseguradasegundo corrida em gel de agarose a 1 % e mensuração da relação A260/A280em espectrofotômetro. O vetor foi seqüenciado e apto para a transformaçãodas células.

Cultivo celular e lipofecção da linhagem MDBK

Linhagens celulares bovinas MDBK foram cultivadas em garrafas decultura celular (35 cm2), em meio de cultivo RPMI 1640 (Gibco) suplementadocom 10% de soro fetal bovino (Gibco), 2 mM L-glutamina, 100 μο/ιηΙ penicilinae 100 μ9/ητιΙ estreptomicina à 39°C em 5 % CO2, 5% O2 e 93% N2 ematmosfera úmida; sendo a substituição de meio realizada todas as segundas,quartas e sextas-feiras. As células utilizadas nos experimentos partiram daquinta passagem de cultivo, sendo que as passagens foram realizadas quandoa confluência celular atingia em torno de 80%. As células eram removidas daplaca de cultura com tratamento de 0,05 % de tripsina-EDTA (1 ml/garrafa) por10 minutos à 39°C. O total das células era centrifugado, ressuspendido ecolocado novamente em garrafas de cultivo.

As MDBKs foram plaqueadas numa concentração de 3x105 céls/ml (80-90% de confluência) em placa de 24 poços e transfectadas no dia seguinte,utilizando o Iipossomo IipofectAMINA® Plus (Gibco, BRL Life Technologies), deacordo com Oliveira et al., 2005.

Para cada poço, 0,5 μg DNA (pCIneo-beta) foi diluído em 25 μΙ D-MEMsem soro fetal bovino (SFB), 4 μΙ de Reagente Plus e 1 μΙ IipofectAMINA®. Asolução foi homogeinizada e incubada à temperatura ambiente por 30 minutos.

O meio de cultivo (RPMI 1640 com SFB) da placa que continha as células foiretirado e a solução (sem SFB) adicionada às células. Após as 5 horas deincubação, a solução foi substituída por meio de cultivo RPMI 1640 com SFB.

Seleção das linhagens MDBKs transgênicas e isolamento de colôniasclones

48 horas após a transfecção, o meio de cultivo RPMI 1640 com SFB foisubstituído por meio de cultivo RPMI 1640 suplementado com SFB e comantibiótico geneticina (G418: 400 μο/ιηΙ). Após 20 dias em cultivo seletivo, umaúnica célula MDBK foi isolada em placa de ELISA (96 poços) para cultivo delinhagem clone transfectada, sob 100 μΙ de meio RPMI 1640 com geneticina.Neste caso, a substituição por meio novo era realizada semanalmente. Quandoa cultura atingia a confluência do poço da placa de ELISA, por volta de 15 diasde cultivo, as células eram tripsinizadas e passadas para um poço de umaplaca de 24 poços. Permaneciam em cultivo até sua confluência, cerca de 10dias, e então eram passadas para uma garrafa de cultura. Todo processo deseleção foi realizado em meio com antibiótico. As colônias foram expandidasaté a totalidade de 6 garrafas de cultura confluentes, sendo que cinco garrafaseram utilizadas para o isolamento do DNA genômico (-36 μg) e uma garrafaera reservada para a congelação das células para a formação de um banco degermoplasma.

Detecção da atividade de β-galactosidase

45 dias pós-transfecção, ou seja, antes de começar a expandir as culturasnas garrafas, foram feitos ensaios para a detecção da expressão de β-galactosidase nas células transfectadas, como segurança em expandir apenasas colônias transgênicas. As células que expressaram β-galactosidase foramvisualizadas por ensaio com B-bromo-4-chloro-3-ingylo^-galactopyranoside (X-gal). As células foram fixadas com glutaraldeído 50% (Sigma, USA) e comformaldeído 37% por 15 minutos e então incubadas com solução X-gal (0,2%X-gal, 2mmol/l MgCI2, 5mmol/l K4Fe(CN)6, 5mmol/l K3Fe(CN)6). O sucesso datransfecção das células foi demonstrado pela coloração azul das colôniasclones na sua totalidade, após 48 horas de incubação.Isolamento do DNA genômico

As cinco garrafas de culturas confluentes destinadas ao isolamento deDNA foram tratadas com 0,05% de tripsina-EDTA (1 ml/garrafa) por 10 minutosà 39°C. O total de todas as garrafas foi centrifugado, ressuspendido em PBS(Tampão salina fosfatada) e lavado por mais três vezes com o intuito de retiraro máximo de resíduo do meio de cultivo. O DNA genômico foi isolado segundoMcCreath et al. (2000), utilizando Kit de isolamento e purificação de DNAgenômico (Wizard®).

Técnica de Resgate de Plasmídio em E. coli

Dez microgramas de DNA genômico provenientes das linhagenstransgênicas clones foram digeridos com enzima de restrição adequada (quecontenha apenas um sítio de restrição dentro do plasmídio, de preferênciadentro do gene em questão), neste caso enzima EcoRI (Invitrogen, USA),durante 3 horas a 37°C. Após a reação, o DNA foi precipitado pela a adição de3 volumes de Acetato/Etanol, incubado por pelo menos 30 minutos a -20°C ecentrifugado por 15 minutos a 4°C em microcentrífuga refrigerada (14000 rpm).

O DNA foi lavado com etanol 70% (v/v) e ressuspendido em 110 μΙ de águamilliQ autoclavada. O DNA foi ligado com T4 DNA Iigase (Invitrogen, USA) em400 μΙ overnight. No dia seguinte, a ligação foi precipitada (mesmo protocolodescrito) em ressuspensão final de 10 μΙ de água. A ligação foi transformadaem células competentes XLI-BIue por eletroporação no sistema BIO RAD deacordo com as especificações do fabricante. O DNA plasmidial das colôniastransformantes foi extraído com Kit Quiagen ("miniprep") e posteriormenteanalisado por perfil de restrição.

Identificação dos transgenes e regiões flanqueadoras

O DNA genômico das células MDBK foi extraído e purificado utilizandoWizard® Genomic DNA Purification Kit (Promega, Madison, Wl). Análises dePCR foram conduzidas a fim de confirmar a inserção dos transgenes.

A seqüência dos nucleotídeos dos dois pares de primers utilizados foi: a)para o gene Ampr: AMP 7 (5'-CTTAATCAGTGAGGCACC-3') e AMP 850c (5'-TCAACATTTCCGTGTCGC-3') para amplificar 860 pb do gene neo; e b) para ogene β-galactosidase: ERip-gal (5'-TACGGCCTGTATGTGGTGGATG-3') eER2p-gal (5-CCAGTGCAGGAGCTCGTTATCG-3') para amplificar 820 pb dogene gal. As condições dos ciclos foram: 96°C / 2minutos; 94°C / 30segundos;

56°C / 30segundos; 72°C / 45segundos; X 40 ciclos; + 72°C / IOminutos; 4°C /24horas. Os produtos de PCR foram analisados por corrida em gel de agarosecomprovando a integração dos genes Ampr e β-gaí.

As regiões do genoma animal em que os transgenes foram integradosforam detectadas a partir do mesmo material proveniente da técnica de resgatede plasmídios, e seqüenciados no seqüenciador automático ABI Prism. Asseqüências foram submetidas a análises computacionais utilizando o pacote deprogramas de biologia molecular GCG. Neste caso, os primers foramdesenhados baseados no local da enzima de restrição cujo DNA foi tratadoinicialmente e em que provavelmente as regiões flanqueadoras do genomaanimal aparecem. As seqüências dos primers são: pCINEOB 1013: (5'^·3')CTCTCCACAGGTGTCCACTC e pCINEOB 1252c (5'->3')GTGTCCAGACCAATGCCTCC.

Análises da integração

Análises moleculares e bioquímicas foram conduzidas durante asdiferentes etapas do desenvolvimento do projeto, envolvendo ensaioshistoquímicos (X-gal), PCR e IPCR. Os protocolos foram efetuados de acordocom as orientações dos fabricantes (Stratagene), tecnologia do DNArecombinante (Sambrook et al., 1989) e segundo Aragão et al. (1988).

Neste estudo, nós seqüenciamos a região flanqueadora da integração dostransgenes em 26 linhagens celulares independentes de células MDBK,produzidas por transfecção via lipossomos. Para os 26 clones resgatados, asseqüências foram em tamanho e qualidade suficientes para distinguirambigüidade no local da inserção no genoma bovino entre as linhagens.

Nenhuma correlação foi estabelecida entre o local da integração dostransgenes e o nível de expressão de beta-galactosidase proporcionado poreste local.

Análises de PCR confirmaram a presença de ambos os transgenes, β-gale neo, em todas as linhagens clones geradas. Resgates de plasmídiosconfirmaram a presença de parte do transgene integrado e parte do sítio deintegração do genoma bovino (tamanhos variando de 250 a 930 pb) no lócusde integração. As seqüências foram comparadas por meio de pesquisasBLAST de DNA genômico feitas manualmente contra o banco de dados doGeneBank utilizando o servidor de web NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov)·

Os resultados revelaram que os transgenes foram integrados em 12diferentes cromossomos, sugerindo que não há preferência cromossomal paraa inserção do DNA exógeno. Resultados similares foram observados paraArabidopsis, em que as inserções foram encontradas em cinco cromossomos(Rios et al., 2002). A presença da integração do vetor em regiões contíguas foiobservada em dois clones B2 e D8. Duas seqüências (B2.4 e A1.5) nãoapresentaram similaridade com seqüência de bovinos disponibilizadas noGeneBank.

A maioria dos eventos de integração ocorreu dentro de regiões dogenoma que são permissivas à transcrição, como observadas pela expressãodos genes da beta-galactosidase e o gene da neomicina. Entretanto, nesteestudo todos os clones foram selecionados sob pressão de seleção positiva(400 /L/g/ml geneticina), a qual facilitou o isolamento de linhagens transfectadascuja integração ocorreu em seqüências transcritas. Apesar de a maioria dostransgenes integrar em regiões da cromatina permissivas à transcrição, nósnão estabelecemos uma conexão entre a integração e o nível de expressão dotransgene proporcionado por estes locais.

Nós determinamos ambas as regiões flanqueadoras da linhagem E4. Istonos permitiu a comparação entre o lócus da linhagem transfectada com o lócushomólogo na linhagem selvagem. Foi observado que 11 nucleotídeos foramdeletados na borda esquerda do sítio de integração do transgene. Este dadorevela uma mutação insercional do gene ed1, o qual codifica para a proteínaectodisplasina Α. A deleção parcial ou total desse gene causa a doençadenominada displasia ectodérmica anidrótica em bovinos (Drogemuller et al.,2002). Além disso, outras mutações insercionais foram observadas: no cloneCL2 (no gene RPGR, associado à degeneração progressiva da retina devido auma retinite pigmentosa), no clone CL1 (no gene myo10, que codifica para amiosina X), e no clone C10.13 (no gene bmp2, que codifica para a proteínamorfogenética 2 formadora de osso).

A identificação desses tipos de linhagens clones é importante para aprevenção de fenótipos indesejáveis para o nascimento de animaistransgênicos ou para a geração de modelos apropriados para estudos defunção gênica.

Obtenção das células-tronco embrionárias bovinas

<table>table see original document page 53</column></row><table>

Tabela 2 - Obtenção de células tronco embrionárias bovinas1) Isolamento e desenvolvimento de colônias clones provenientes de células-tronco embrionárias humanas expressando o gene da GFP (Green FluorescentProtein);

2) Seleção via isolamento a laser e expansão in vitro de eventos elites decélulas-tronco embrionárias humanas, segundo a expressão;

3) Criopreservação das linhagens de células-tronco humanas transfectadas;

4) O cultivo pós-descongelamento das linhagens de células-tronco humanastransfectadas para a detecção de sua viabilidade e manutenção de suatotipotencialidade.

5) Produção in vitro de embriões bovinos como fontes doadoras do botãoembrionário;

6) Isolamento de células-tronco bovinas a partir do botão embrionário deembriões;

7) Comparação das duas técnicas de isolamento de células-troncoembrionárias bovinas: isolamento via laser e isolamento manual;

8) Estabelecimento de linhagens de células-tronco embrionárias bovinas aptaspara a transfecção in vitro\

9) Geração das primeiras linhagens celulares bovinas provenientes doisolamento de células-tronco embrionárias bovinas como fontes de núcleostransgênicos, na geração de animais geneticamente modificados para aprodução de recombinantes de interesse bioindustrial.

Isolamento de células-tronco embrionárias bovinas

A fonte utilizada para a remoção das células-tronco bovinas foiproveniente de embriões D-7 ou D-12 produzidos in vitro.

Foram estabelecidas duas técnicas para a remoção das células-tronco:técnica manual e técnica a laser.

Isolamento Manual (BEM et al„ 1987; RUMPF et al„ 1992)

Foram utilizados embriões D-7 para a remoção manual de células-tronco.

Utilizou-se um sistema manual de micromanipulação em que as células dobotão embrionário foram removidas precisamente por meio de navalhas ultra-finas (Bio-technology - USA) a fim de causar menor dano às células isoladaspor este método.

Foram obtidas 05 colônias-tronco por este sistema de isolamento queforam submetidas a análises moleculares para a certificação da pluripotênciacelular (compatível com células-tronco).

A técnica consistiu em escolher embriões Grau I de classificação (IETS,2000), separá-los um a um em gotas individuais para que a remoção do botãoembrionário se dê individualmente, evitando a contaminação celular entreembriões.

Uma vez individualizado o botão embrionário, este foi seccionado o maisprecisamente possível, evitando a contaminação com as células do trofoblastodo próprio embrião. O trofoblasto inibe o desenvolvimento das células do botãoembrionário e não mantém a pluripotência destas.

Imediatamente após a secção, o botão embrionário foi transferido paraplacas de 04 poços (Nunc, USA), contendo meio ES cells (sem a adição dereagente LIF), em incubadora apropriada. Houve crescimento celular duranteos 05 meses de treinamento, em que pudemos observar as primeiras colônias.

Testes subseqüentes foram feitos a fim de detectar marcadoresmoleculares compatíveis com o desenvolvimento de células-troncoembrionárias bovinas.

Isolamento a laser (P.A.L.M. Microlaser Technologies AG, 2003)

Foram utilizados embriões D-12 para a remoção manual de células-tronco.

Após o D-7 os embriões foram transferidos para a placa de petriapropriada para a manipulação a laser contendo meio ES cells.

Foram cultivados durante 3 dias e incubados na estufa até que osembriões atingissem a fase de eclosão celular.

Uma vez eclodidos, os embriões fixaram-se à membrana da placautilizada no equipamento a laser e não se moveram no momento da incidênciado laser.

Utilizou-se o sistema Laser Pressure Catapulting LPC - P.A.L.M.

Microlaser Technologies (Quick Software Guide MB 2.2-0103 (EN) em que ascélulas do embrião são demarcadas pelo laser, há a incidência de laser àscélulas, o isolamento do grupo celular selecionado e a sucção deste grupoindividualizado.

O equipamento foi ajustado para tais padrões: inicialmente: Objetiva 40x,Robot LPC; UV Energy slides 37; UV Focus slides 50; ocorrendo ajustes delaser e focus ao longo do processo e a cada novo embrião.

As células removidas por este sistema foram isoladas a cada embriãomanipulado e colocadas em placas de 96 poços. A cada semana foramrepicadas e removidas para novos poços.

Não foram obtidas colônias-tronco por este sistema de isolamento devidoa idéia da fixação dos embriões após o cultivo prolongado de 12 dias tersurgido 1 mês antes do término do estágio no exterior.

Este método está em procedimento no laboratório a fim de testar aeficácia deste processo.

Um dos objetivos da biotecnologia animal é a aplicação de técnicas atuaisda engenharia genética para a produção de animais de grande porte comcaracterísticas desejáveis. Atualmente, genes exógenos podem serintroduzidos no genoma de camundongos via "embryonic stem cells" (ES cells)(Nagy et al., 1990) e por meio de técnicas de recombinação homóloga. Nestesistema, as culturas de ES cells de camundongos podem ser usadas comouma ferramenta para a adição, a deleção ou silenciamento de genes em locaisespecíficos do genoma. Além disso, ES cells têm a capacidade dedesenvolvimento estável para formar células derivadas das três camadas decélulas germinativas embrionárias, e diferenciação bem sucedida in vitro emneurônios, em células hematopoiéticas e em músculo cardíaco.

O isolamento de linhagens pluripotentes de ES cells humanas deblastocistos tem sido também relatado (Rhind et al., 2003; kim et al., 2005). Emvista da provável contribuição significante de ES cells aos esforços emmanipular o genoma, e para substituir vários tecidos e órgãos lesionados,parece apropriado tentar adaptar esta tecnologia à melhoria genética deanimais de grande porte e para gerar produtos transgênicos. À exceção doscamundongos e do homem, os carneiros (Dattena et al., 2006), o porco(Piedrahita et al., 1990), o coelho (Chiang et al., 2007), os bovídeos (Keefer etal., 1994; Verma et al., 2007), o rato (Ouhibi et al., 1995), e o macaco (Mitalipovet al., 2003) tem sido relatados como potenciais fontes doadores de ES cells.

O método usado para o isolamento de ES cells humanas foi adaptado àsoutras espécies com algumas modificações. Entretanto, tentativas preliminaresde cultura da massa interna celular (ICM) de várias espécies sobre camada defedders cells embrionárias de camundongos ou sobre cultura primária defibroblastos de camundongos na presença do fator inibitório da leucemia (LIF)foram raramente bem sucedidas. Uma combinação de fatores de crescimentopode ser requerida para a proliferação destas células pluripotentes, como foidemonstrado no cultivo de células de linhagens primordiais de camundongos(Tielens et al., 2006). No nosso estudo, ES cells bovinas, isoladas da massainterna de blastocistos bovinos produzidos in vitro, só foi possível quandocultivada sobre camada de ES cells de camundongos, fornecendo, dessamaneira, meio de cultivo condicionado por tais células em crescimentoconcomitante.

Mas o desenvolvimento de linhagens clones de ES cells possui ahabilidade em ser estudadas seqüências, regulação, ou expressão gênica,geradas a partir de uma única célula, isoladas de tecidos especializados eutilizadas como fontes doadoras das células em estudo.

Com base nisso, a necessidade em se desenvolver técnicas deisolamento de células a partir dos tecidos em estudo, gerou a necessidade dese isolar células-tronco a partir de embriões bovinos produzidos in vitro, comoexpectativa no uso dos núcleos transfectados para a geração futura de bovinostransgênicos utilizados como biorreatores.

Uma das maiores preocupações no estabelecimento dessa técnica é atentativa de descartar qualquer possibilidade de contaminação por célulascircunvizinhas, no momento de seu isolamento. A contaminação é eliminada eas células isoladas podem ser processadas e desenvolvidas como linhagenspuras e como fontes potenciais para a transfecção in vitro.Uma vez transfectadas, dentre os trilhões de células geradas como poolno tapete celular, pode-se utilizar a incidência a laser a fim de detectar apenasas células transfectadas desse tapete. Os procedimentos baseados na PCRsão usados posteriormente para a amplificação das seqüências de DNA/RNAinseridas (Shutze e Lahr1 1998), enquanto que métodos tais comoespectrometria de massa podem ser usados para determinar seqüências deaminoácidos dos polipeptídeos que são gerados pela expressão gênica dalinhagem clone gerada (Jimenez et al., 1994).

Além da aplicação potencial da transgenia animal, os biólogos celulares emoleculares têm um objetivo experimental adicional para isolar preparaçõesnão contaminadas de células únicas isoladas da cultura de tecidos. Tais célulaspodem ser examinadas, manipuladas, e potencialmente clonadas na tentativaem fornecer mais material biológico para análises e sistemas menos complexospara estudos dos processos biológicos sadios e dos mutantes.

O sistema baseado a laser foi desenvolvido para circunscrever e isolarcélulas vivas a partir de tecido vivo ou células não-viáveis de regiões de tecidosfixos. O método envolve a fixação das regiões do tecido de interesse a umapelícula termoplástica na qual elas se ligam e crescem. A película usada para amicrodissecção e para o isolamento das células é aderida a uma placa decultura e tratada especialmente para absorver a luz do laser. Desse modo, ascélulas/grupos individuais de células das regiões do tecido que são escolhidaspara serem catapultadas são isoladas (Fend et al., 2000), e conseqüentementecolocadas em meio de cultura específico para o desenvolvimento de linhagensclones (Stich et al. 2003).

A técnica a laser fornece a oportunidade de usar células únicas isoladasde tecidos vivos sadios e tumorais para análises funcionais ou na preparaçãode bibliotecas clonais para investigações diversas na biologia celular,farmacologia, desenvolvimento de drogas, testes ambientais, e para odesenvolvimento de vacinas personalizadas de encontro aos tumoresespecíficos.A seleção, o isolamento e a análise das células vivas dos tecidos queexpressam quimeras das proteínas fluorescentes verdes (GFP) e análisessubseqüentes de função ou da expressão das células transformadas com GFPsão também aplicações possíveis. Nesse estudo, células-tronco embrionáriashumanas transfectadas com GFP, foram utilizadas para o teste do isolamentode células individuais via aplicação de laser e a viabilidade celular decrescimento pós-isolamento. O crescimento de colônias clones de células-tronco embrionárias humanas foi possível ao se utilizar as células isoladas vialaser e cultivá-las sobre monocamada celular de fedders cells decamundongos.

Baseado nisso, a técnica de isolamento via laser e via manual abre umaperspectiva futura viável para a geração de linhagens clones de células-troncopara estudos de função gênica, de expressão gênica e na geração de núcleostransformados com genes exógenos, principalmente de interessefarmacológico, como fontes doadoras desses núcleos para a transferêncianuclear e à geração de animais biorreatores.

Cultivo de Fedders cells (Monocamada celular)

A monocamada celular de Fedders cells (fibroblastos de camundongos) écrucial para o preparo do condicionamento do meio de cultivo celularpreviamente à adição de células-tronco, tanto humanas quanto embrionáriasbovinas. Essa monocamada permite a aderência das colônias de células-tronco, além do condicionamento do meio de cultivo em que receberá ascélulas-tronco.

O meio de cultura para as Fedders cells é denominado MEF.

Tabela 3- Meio de Cultura: MEF

<table>table see original document page 59</column></row><table><table>table see original document page 60</column></row><table>

Para o cultivo das células fedders (monocamada) foram utilizadas 5placas de Petri previamente tratadas com "Ultrapure water with 0,1% gelatin"(filtrada e acondicionada a T0C ambiente). Foi adicionada 10 mL da soluçãoacima e deixou-se por 30 minutos para o tratamento eficaz das placas quereceberam as células fedders.

Descongelou-se uma alíquota de células PMEF-P3 (Neomicina resistente)para o cultivo de 5 placas de Petri. Centrifugou-se e ressuspendeu-se com 5mL de meio de cultura MEF para fedders cells e adicionou-se 1 mL de meio +células em cada placa de Petri tratada, completando com 4 mL de meioadicionais/placa.

Incubou-se as placas por cerca de 24 horas antes da adição das MouseEmbryonic Stem Cells.

Para a manutenção das células feeders deve-se repicá-las a cada 2 ou 3dias de cultivo quando atingem a confluência.

Repique de Embryonic Stem Cells - ES cells (Células-troncoembrionárias)

Atingida a confluência das placas contendo células-tronco + Fedders cells,mais ou menos a cada 3 dias de cultivo celular, é necessário a renovação dascélulas e a redução da densidade celular em cada placa de cultura a fim de seevitar a morte por apoptose devido a alta concentração de células.

Para se realizar o repique das células-tronco humanas, de camundongose embrionárias bovinas utilizou-se o protocolo a seguir:

- Pré-lavagem das placas com 5 mL de PBS;

- Adicionou-se 5 mL de Trypisin-EDTA na placa contendo ES cells;

- Esperou-se por 10 minutos a 37°C (dentro da incubadora);

- Recolheram-se as ES cells + as células fedders + Trypsin, num tubo Falconde 15 mL;- Adicionou-se 5 mL de ES media no tubo, a fim de paralizar a ação daTripsina;

- Centrifugou-se por 4 minutos a 1000 rpm;

- Desprezou-se o sobrenadante e ressuspendeu-se o pellet com 10 mL de ESmedia, homogeinizando bastante para a obtenção de single cells;

- Diluiu-se 1:4 as células;

- Substitui-se o meio de cultura das placas de feeders adicionando-se 5 mL deES media + ES cells;

- Adicionou-se mais 5 mL de ES media em cada placa;

- Cultivou-se a 37°C, 5% CO2, com alta umidade.

1X Freezing Media (Meio de Congelação de células)

A cada repique celular se faz necessária a criopreservação das células emcultura a fim de se evitar algum risco de contaminação posterior da cultura e aperda da passagem celular em que as células se encontravam.A identificação de cada passagem é importante para estudos de viabilidadecelular em cultura, uma vez que essas células podem ser usadas comodoadoras dos núcleos transgênicos utilizando a transferência nuclear.O meio de congelação das células e o protocolo estão descritos a seguir:

<table>table see original document page 61</column></row><table>

- Pré-lavagem das placas com 5 mL de PBS;

- Adicionou-se 5 mL de Trypisin-EDTA na placa contendo ES cells;

- Esperou-se por 10 minutos a 37°C (dentro da incubadora);

- Recolheram-se as ES cells + as células fedders + Trypsin, num tubo Falconde 15 mL;- Dissociou-se as colônias a fim de congelá-las como single cells;

- Adicionou-se 5 mL de ES media no tubo, a fim de paralizar a ação daTripsina;

- Centrifugou-se por 4 minutos a 1000 rpm;

- Desprezou-se o sobrenadante e ressuspendeu-se o pellet com 2 mL de 1XFreezing media pré-resfriado;

- Imediatamente, transferiu-se 1 mL da suspensão para cada vial decongelação;

- Transferiu-se os vials para uma caixa pré-resfriada com Isopropanol no seuinterior a-80°C;

- Após 24 ou 48 horas, transferiu-se os vials para o botijão de NitrogênioLiquido.

Meio de Células-Tronco embriônicas de camundongo: Knock Out mESMedia

A fim de se cultivar células-tronco embrionárias de camundongos eembrionárias bovinas, o meio de cultivo foi elaborado de acordo com protocoloabaixo:

<table>table see original document page 62</column></row><table>

* Homogeinizar e filtrar 0.22 μ

O Meio de Cultura base é preparado e acondicionado a 4°C.Deve-se filtrar o meio após fazê-lo e acondicioná-lo por no máximo 2semanas.O Reagente LIF é utilizado em adição à monolayer (fedders) para amantença da totipotência das células.

Células-tronco embriônicas humanas: hESC - Culture Media

A fim de se cultivar células-tronco embrionárias humanas, o meio decultivo foi elaborado de acordo com protocolo abaixo:

<table>table see original document page 63</column></row><table>

* Homogeinizar e filtrar 0.22 μ

Solução estoque B-FGF (Basic Fibroblast Growth Factor - bFGF, humanrecombinant, Invitrogen, USA)

- Preparou-se 0.1% BSA em DPBS:

- 0.3 g BSA em um tubo Falcon de 50 mL.

- adicionou-se 30 mL de DPBS e homogeinizou-se bem.

- Separou-se 5 mL da solução 0.1 % BSA em DPBS:

- Tubo B-FGF (10 pg) e homogeinizou-se.

- Aliquotou-se 500 pL em cada eppendorf e identificou-se;

- Acondicionou-se a - 20°C.

Cultivo de Células-Tronco embriônicas humanas modificadas comproteína fluorescente verde (GFP) with Green Fluorescent Protein hESC(ATCC - PubMed: 12529550)

O meio hESC foi condicionado em MEF media durante 24 horas para serutilizado em placas contendo as colônias GFPhESC.A cada 24 horas o meio MEF era coletado (18 mL), adicionado B-FGF(140 μΙ_), filtrado e adicionado às placas contendo a cultura das célulasGFPhESC.

Isolamento das células GFPhESC via laser

1. Detecção do tapete de células-tronco embrionárias humanastransformadas com GFP1 baseada na fluorescência das células após excitaçãocom Ultra-violeta e filtro de visualização verde;

2. Imediatamente após a detecção das células potencialmentemodificadas, foi ajustado o equipamento a laser nas seguintes especificações:

Objetiva 10X; Robot LPC; UV Energy slides 46; UV Focus slides 73;

3. Foi aplicado o laser às células e recolhidas no "cap" (pequenaquantidade de meio de cultura para o acondicionamento de apenas 1 célula) doequipamento;

4. Imediatamente após a colheita, as células foram colocadas em placasde Elisa para o crescimento isolado das colônias humanas com GFP.

Cultivo de embriões bovinos in vitro

(Greve et al., 1991; Krimpenfortetal., 1991; Carolan et al., 1992; Bols et al.,1995; Peixeret al., 1997; Rumpfetal., 2000)

O Cultivo in vitro de embriões bovinos foi realizado no Laboratório sobresponsabilidade do Dr. Rick Monson e supervisão do Dr. Dave.

O protocolo utilizado foi desenvolvido no próprio laboratório dospesquisadores, baseado nas diversas bibliografias sobre o assunto. Devido aisso, o protocolo não foi autorizado para a descrição de seus componentes.

Foi produzido um total de 260 embriões conforme tabela abaixo:

Tabela 3. Produção de embriões in vitro como fonte do botão embrionário paraa remoção das células-tronco embrionárias bovinas.<table>table see original document page 65</column></row><table>

PROCEDIMENTOS FIV

DIA -2: Aspiração folicular

1. Os ovários eram coletados em um frigorífico, e transportados em caixastérmicas em torno de 30 0C1 por meio de transporte aéreo;

2. No laboratório, eram lavados em água corrente e aquecida em torno de35°C e prontos para serem aspirados;

3. Eram utilizadas agulhas descartáveis calibre 40x12 para a aspiração dosfolículos sob vácuo de aproximadamente 10 mmhg;

4. Os ovócitos eram coletados em tubos Falcon de 50 mL, e quandorepletos, eram imediatamente transferidos para placas de Petri grandepara serem rastreados e avaliados;

5. A medida que os ovócitos eram selecionados, eram colocados emplacas de Petri pequenas, contendo o meio de seleção de ovócitosapropriado (Protocolo não autorizado a ser divulgado).DIA -1: Maturação dos ovócitos

1. Após serem selecionados, os ovócitos de graus 1, 2 e 3 eram colocadosem placas contendo gotas de meio de cultura apropriado para amaturação ovocitária (Protocolo não autorizado);

2. Ficavam durante 18 a 24 horas dentro de incubadoras apropriadas paraa maturação.

DIA 0: Fertilização dos ovócitos maturados

1. Os ovócitos maturados por 24 horas eram pré-lavados (para a remoçãode qualquer resíduo de meio de cultura de maturação) e eramtransferidos para outras placas contendo gotas de meio de culturaapropriado para a fertilização ovocitária (Protocolo não autorizado);

2. O sêmen era preparado por meio de gradiente específico para aseparação de espermatozóides viáveis para a fertilização dos ovócitos;

3. As gotas inseminadas eram colocadas durante 24 horas em incubadoraapropriada para a fertilização;

DIA 1 ao DIA 7: Cultivo dos embriões

1. Os ovócitos fertilizados por 24 horas eram pré-lavados (para a remoçãode qualquer resíduo de meio de cultura de fertilização) e eramtransferidos para outras placas contendo gotas de meio de culturaapropriado para o cultivo embrionário (Protocolo não autorizado);

2. Os embriões eram cultivados durante 7 dias em incubadora apropriadapara o desenvolvimento embrionário;

3. No Dia 7, uma parte dos embriões era disponibilizada para o laboratóriode Stem Cells1 sob a supervisão da Dra Gabriela Cezar, para a tentativade isolamento manual de células-tronco embrionárias bovinas;

4. A outra parte era cultivada até o Dia 10, em meio de cultivo apropriadopara ES cells, em que os embriões, então, eram utilizados para oisolamento a laser de células-tronco embrionárias bovinas.

A construção do vetor de expressão foi efetuada de acordo comprocedimentos padrões da tecnologia do DNA recombinante (Sambrook et al.,1989). O sistema de transformação de células somáticas foi padronizadosegundo Oliveira et al. (2005) e aplicado para os Fibroblastos bovinos (paper 5).

O vetor de expressão comercial pCI-neo (Promega, Madison, Wl1 USA) foiusado para a transfecção estável dos fibroblastos bovinos. Este vetor carrega ogene da neomicina fosfotransferase sob controle do promotor constitutivo CMVe seqüência poli-A.

O plasmídio foi amplificado em linhagens de Escherichia coli DH5a epurificado segundo Kit de Purificação de Plasmídios Giga da Quiagen (Qiagen,Valencia, CA, USA). A concentração do DNA plasmidial após a purificação emcoluna Quiagen foi mensurada por absorbância sob Ultra Violeta aocomprimento de onda de 260 nm. A pureza do plasmídio foi asseguradasegundo corrida em gel de agarose a 1% e mensuração da relação A260/A280em espectrofotômetro.

Geração dos bovinos transgênicos

As etapas de: a) Obtenção de linhagens de fibroblastos bovinosprovenientes de animais de aptidão leiteira, aptas à transfecção in vitro\ b)Transfecção e isolamento de linhagens clones doadoras; c) Seleção doseventos elites; foram conduzidas segundo Oliveira et al., 2005.

As etapas de: d) Preparação das células doadoras; e) Citoplasma receptor(ovócitos coletados in vivo e in vitro) de animais de raças leiteiras; f)Enucleação (Micromanipulador); Transferência da célula doadora transgênica efusão ao citoplasma receptor (por estímulos elétricos); g) Ativação artificial ecultivo embrionário in vitro; h) Avaliações do desenvolvimento (taxa declivagem e taxa de blastocistos); i) Transferência dos embriões para vacasreceptoras; estão descritas no paper 5 para a geração de bovinos transgênicosutilizando fibroblastos geneticamente modificados como fontes doadoras denúcleos transgênicos por meio da técnica de transferência nuclear.

Preparação de células doadoras

Células de fibroblastos transfectadas foram plaqueadas a umaconcentração de 0.5 X 105 células em placas de 24 poços e cultivadas em meiode cultura FAEX + 10% Soro fetal bovino, até atingir 100% de confluência.Após, o meio de cultura foi substituído pelo meio com teor reduzido de soro(5%) e as células incubadas a 38°C, 5% CO2, durante 4-8 dias até atransferência nuclear. Imediatamente antes da transferência nuclear, as célulasdoadoras foram coletadas por meio de tripsinização utilizando 0.05% tripsina-EDTA, lavadas duas vezes, e ressuspendidas em meio contendo 1% soro dealbumina bovina (BSA).Citoplasma receptor

Os ovócitos que foram utilizados eram provenientes de vacas vivas e deovários de abatedouro. No primeiro caso, foram coletados por meio de punçãofolicular guiada por ultra-som de vacas separadas para esta finalidade.Enquanto que folículos de 2 a 8 mm foram puncionados de ováriosprovenientes de abatedouro por um sistema a vácuo. Os complexos cumulus-ovócitos (CCO's) com citoplasma homogêneo e mais de 5 camadas de célulasda granulosa foram selecionados. Destes, foram separados grupos de vinte atrinta que foram colocados em poços contendo 400 μΙ de meio de maturação invitro (MIV) coberto com óleo mineral e incubados a 39°C, 5% CO2 ematmosfera com umidade saturada. O meio de maturação (MIV) consistiu deTCM 199 suplementado com 10% v:v de soro fetal bovino (SFB), 0,1 U/ml deFSH, 0,1 U/ml de LH, 0,1 mg/ml de L-glutamina e 1% depenicilina/estreptomicina. Após 22 a 24 horas do início da maturação, os CCO'sforam desnudos por meio de pipetagens em solução de hialuronidase a 0,2%.Enucleação

Antes de seguirem para a enucleação, os ovócitos foram colocados emmeio de bancada acrescido de corante vital Hoechst 33342 e citocalasina D por10 a 15 minutos. O meio de bancada consistiu de TCM 199 com Hepesadicionado de 10% v:v de SFB e 1% de penicilina/estreptomicina.

Os ovócitos foram manipulados em meio de bancada suplementado comcitocalasina D.

Para verificar a retirada da placa metafásica e do primeiro corpúsculopolar, a biópsia succionada por meio de uma pipeta de 25 a 30 μηι de diâmetrofoi exposta à luz ultravioleta (UV). A cromatina corada com Hoechst 33342quando exposta à UV fluoresce sob a luz, comprovando o procedimentocorreto.

Transferência da célula doadora e fusão

Os fibroblastos transfectados foram introduzidos no espaço perivitelíneodo ovócito enucleado. Em seguida, os complexos citoplasma-fibroblasto foramalinhados entre dois eletrodos e submetidos a dois pulsos DC (corrente direta)de 1,5 kV/cm por 50 μ5β9. Estes estímulos elétricos foram aplicados emsolução a 0,28M de manitol, 0,1 mM de MgSO4 e 0,05 mM de CaCI2 com ointuito de promover formação temporária de poros nas membranasplasmáticas, induzindo assim a fusão das duas estruturas. Após a eletrofusãoos embriões reconstruídos passaram por banhos em meio de bancada eposteriormente foram colocados em meio de cultivo.

Ativação artificial e cultivo embrionário

Três a cinco horas após a aplicação dos pulsos elétricos foi conduzida aativação do complexo citoplasma-fibroblasto. Estes foram incubados emsolução 5 μΜ de ionomicina por 4 a 5 minutos ou então em solução de etanol a7% por 5 minutos. Em seguida, as estruturas passaram por banhos de meioSOFaa (Synthetic Oviduct Fluid) e foi avaliada a taxa de fusão antes de seremtransferidas para a placa de cultivo. O cultivo in vitro (CIV) dos embriõesreconstruídos foi realizado em poços contendo 400 μΙ de meio SOFaasuplementado com 5 % v:v de SFB, 0,5 mg/ml de mio-inositol, 0,1 mg/ml decitrato tri-sódio, 0,1 mg/ml de L-glutamina, 20 aminoácidos essenciais e 7 nãoessenciais. O meio SOFaa conteve uma camada de 400 μΙ de óleo mineralcobrindo-o. O CIV foi realizado a 39°C, 5% de Cos, 5% de O2 e umidadesaturada.

Avaliações do desenvolvimento e transferência dos embriões

Após 48 horas da eletrofusão, a taxa de clivagem dos embriões foiavaliada. O cultivo in vitro seguiu até 7 a 8 dias após a fusão, quando então foiverificada a taxa de blastocisto. Os embriões foram transferidos pelo métodonão-cirúrgico para vacas receptoras que tiveram idade uterina sincronizadacom a do embrião. Estas vacas ficaram sob observação quanto ao retorno docio e tiveram a prenhez confirmada por ultra-sonografia com 30 a 35 dias degestação.

PCR e Southern blot foram conduzidos a fim de detectar a integraçãoestável do transgene tanto nas células doadoras quanto nas células dos fetostransgênicos.

Os nossos resultados mostraram que a transfecção de células somáticasdoadoras dos núcleos transgênicos não influencia negativamente as taxas deeficiência da produção in vitro de embriões após o processo de TN(porcentagem de fusão, clivagem e blastocistos), do mesmo modo queconcluíram Roh et al. (2000) e Han et al. (2001) para bovinos. Da mesmamaneira, dados publicados de fibroblastos fetais de porcos transfectados com ogene EGFP (enhanced green fluorescent protein) (Koo et al., 2001; MartinezDiaz et al., 2003) corroboraram nossos achados. Entretanto, resultadossimilares têm sido contraditórios em bovinos, mesmo com dados do mesmogrupo de pesquisa. Arat et al. em 2001 relataram eficiências similares entrecélulas da granulosa de animais adultos transfectadas e não-transfectadas emsuas taxas de clivagem e taxas de blastocistos. Já Arat et al. em 2002demonstraram que linhagens de células adultas e fetais expressando EGFPapresentaram capacidade de desenvolvimento in vitro de embriões após a TNmais baixas quando comparadas com as mesmas linhagens de célulastransfectadas, porém não expressando EGFP. Mais exemplos e resultadoscontraditórios têm sido observados em bovinos; alguns artigos (Zakhartchenkoet al., 2001; Bhuiyan et al., 2004) indicam uma significante diminuição nastaxas de blastocistos quando usadas células transfectadas comparadas comcélulas não-transfectadas, enquanto que outros autores não reportaram taisdiferenças (Brink et al., 2000; Brophy et al., 2003). Zakhartchenko et al. (2001)atribuíram as baixas taxas de desenvolvimento embrionário pós-reconstrução,com fibroblastos fetais transfectados, aos longos períodos de culturarequeridos para a transfecção e seleção dos eventos elites, mas não aotransgene per se.Provavelmente, as diferenças entre resultados reportados até agora sãodevidos mais precisamente ao tipo de vetor de expressão, protocolos detransfecção celular (Bhuiyan et al., 2004), métodos de TN e condições dacultura das células doadoras de seus núcleos transgênicos (Wells et al., 2003;

Miyoshi et al., 2003). Além disso, o local de integração do transgene usado esua possível interferência na expressão de genes endógenos podem influenciarnos resultados (Hodges and Stice, 2003).

No nosso estudo, não foram observadas diferenças significativas nastaxas iniciais de prenhez (< que 40 dias de gestação) entre células doadorasde núcleos transfectados e não-transfectados, relatado também porZakhartchenko et al. (2001). Por outro lado, Forsberg et al. (2002) reportaramtaxas mais baixas de prenhez inicial pós TN por células doadoras transfectadasdo que por células não-transgênicas. No nosso trabalho, o pequeno número deanimais receptores gestando embriões clonados transgênicos e não-transgênicos impossibilita resultados conclusivos acerca da sobrevivência dosembriões transgênicos ou não-transgênicos a termo. O decréscimo nas taxasde gestação encontradas com embriões transfectados podem ser em parteexplicadas pelo aumento da incidência de apoptose celular nos blastocistosproduzidos a partir de longos períodos do cultivo das células doadoras dosnúcleos para a TN como também relatado por Jang et al. (2004). Estes autorestambém relataram que o desenvolvimento de parâmetros in vitro (taxas deblastocisto e contagem celular de blastocisto) não são afetados por períodosprolongados das culturas celulares.

As linhagens de fibroblastos utilizadas em nosso estudo foram isoladas depele de orelha de uma bezerra de clone embrionário (Sousa et al, 2000; Igumaet al., 2001). Esta linhagem celular foi eleita devido a resultados superiores empre-experimentos para esse propósito. Dentre esses, cariotipagem (dados nãomostrados) e alta eficiência de transfecção (60-70%; Oliveira et al., 2005).

Para a finalidade da clonagem de animais transgênicos, o uso de célulassomáticas adultas é mais aconselhável do que o uso de células fetais,especialmente quando a escolha permite selecionar animais comcaracterísticas de alta produção (alta produção leiteira e alta taxa decrescimento), mérito genético valorado e sanidade animal assegurada.

Uma vez que o vetor de expressão utilizado pCI-neo possui um único sítiode restrição para SamHI1 análises de Southern blot dos fetos transgênicosforam realizadas no intuito de confirmar a integração do transgene, além deevidenciar a presença de apenas uma cópia integrada no genoma bovino.Ambos os fetos apresentaram o mesmo padrão de integração, uma vez queforam gerados a partir da mesma linhagem celular transfectada.

Em suma, o trabalho não encontrou diferenças significativas entre astaxas de desenvolvimento embrionário após TN1 quando comparadas linhagensdoadoras de núcleos transfectados e não-transfectados. Em outras palavras,os resultados não mostraram efeitos deletérios quando do uso da técnica detransfecção celular, até a idade gestacional de 40 dias, em que os fetostransgênicos foram extirpados para análises moleculares do transgene.

BMP-2 e BMP-4

cDNA dos genes bone morphogenetic protein-2 (BMP-2) e bonemorphogenetic protein-4 (BMP-4) foram sintetizados a partir de RNA totalextraído de tecidos ósseos de pacientes que apresentavam trauma facial(fraturas no maxilar entre o T e o 10° dia pós-trauma) e clonados num vetorpara expressão em células de mamíferos, sob controle do promotor decitomegalovírus (CMV). Os vetores contendo os genes BMP-2 e BMP-4 foramutilizados para a transfecção de fibroblastos bovinos. mRNAs foramindiretamente detectados por RT-PCR nas células transfectadas. As proteínasBMP-2 e BMP-4 foram detectadas mediante análises de Western Blot. Osresultados demonstram a possibilidade de produção desses fatores decrescimento celular em fibroblastos bovinos. Essas células poderão serutilizadas como fontes doadoras de material genético para a técnica detransferência nuclear na geração de animais transgênicos.

RNA total foi isolado do tecido ósseo dos referidos pacientes. RNA foiisolado usando Trizol e a síntese de cDNA foi realizada com o kit Superscript II,de acordo com as instruções do fabricante.Os genes BMP foram amplificados por PCR usando primers para BMP-2(F=GTGCTTCTTAGACGGACTGC e R= GTACTAGCGACACCCACAAC) a fimde amplificar 1,233 pb do gene BMP-2 e BMP-4(F=AGCCATTCCGTAGTGCCATC e R=AAGGACTGCCTGATCTCAGC) paraamplificar 1,373 pb do gene BMP-4.

Cada reação de PCR foi realizada em misturas de 25 μΙ contendo 60mMde Tris-S04 (pH 8,9), 18 mM de sulfato de amônia, 2mM de MgS04, 200 μΜde cada dNTP, 200 μΜ de cada primer, 1U de polimerase de alta fidelidadeTaq platinum. A mistura foi depositada sobre óleo mineral, desnaturada por 2min em 94°C em um ciclador termal MJ Research e amplificada por 30 ciclos(94°C por 15 s, 55°C por 30s, 68°C por 2 min). Os produtos foram corridos emgel de agarose 1%, marcados com brometo de etídio e visualizados em luz UV.As seqüências de DNA amplificadas foram clonadas com vetor pGEM-T eseqüenciadas. Os genes foram então clonados no sítio de restrição Notl novetor pCMV-B, substituindo o gene da B-galactosidase, sob controle dopromotor citomegalovírus (CMV) para expressão em células mamíferas paragerar vetores pCMV-BMP2 e pCMV-BMP4.

Fibroblastos bovinos são transfectados com os vetores pCMV-BMP2 epCMV-BMP4 usando LipofectAmine Plus, de acordo com as instruções dofabricante. A fim de detectar os genes de expressão BMP-2 e BMP-4 (mRNA)nas células de fibroblastos transgênicas, RT-PCR foi realizado. O isolamentodo RNA total e PCR foram conduzidos como previamente descrito.Amplificação RT-PCR de BMP-2 e BMP-4 foram realizadas em 3 linhagens defibroblastos independentes. RT-PCR com RNA total sem a síntese de DNA nãorevelou amplificação, atestando a ausência de contaminantes na amostra.Western-blot foi realizado como descrito previamente, usando anticorposmonoclonais, que revelaram a produção das proteínas BMP-2 e BMP-4.

Análise de RT-PCR de fibroblastos bovinos transfectados com osvetores pCMV-BMP2 (A) e pCMV-BMP4 (B). Fileira 1: 1kb Ladder; Fileiras 2-4:linhagens celulares de fibroblastos transfectadas; Fileira 5: Linhagenscelulares de fibroblastos não-transfectados; Fileira 6: RNA total sem síntese deDNA.

Análise de Western-Blot mostrando a presença das proteínas BMP-2 eBMP-4 em fibroblastos bovinos transfectados.

Lipossomos para transfeccão de fibroblastos

Desenvolvimento de sistema de transfecção eficiente em célulasutilizando lipossomos, especialmente em fibroblastos, caprinos, ovinos ebovinos, estabelecendo uma fundação para utilização de células de fibroblastotransfectadas para gerar animais transgênicos através de tecnologia detransferência nuclear e estudos de função de genes.

Cultura de células de fibroblasto

- Biópsia da pele da orelha de bovinos, caprinos e ovinos.

- Amostras lavadas 3 χ com 1 ml de PBS gelado suplementado compenincilina (100IU/ml) e estreptomicina (100 pg/ml). Os fragmentos da peleforam lavados 4 χ com 1 ml de solução de Tripsina (tripsina 0,05% p/v e EDTA0,02% p/v) e transferidos para garrafas de cultura de células contendo 4 ml deD-MEM, 10% de soro fetal, penincilina e estreptomicina. Células foramcultivadas a 37°C e 5% de C02 até atingirem 70% de confluência. Célulascrescidas foram tripnizadas e transferidas para novas garrafas de cultura decélulas sem os fragmentos de pele originais.

Vetores

- Foi utilizado pCMVB, vetor que carrega o gene da b-galactosidase sobo controle da seqüência promotora CMV e uma seqüência poli-A.

- Foi também utilizado o vetor pCI-neo para permitir transfecçõesestáveis, que carrega o gene de fosfotransferase de neomicina sob controle daseqüência promotora CMV e uma seqüência poli-A.

- Plasmídeos foram amplificados com linhagem DH5a de E. coli epurificados usando Qiagen Plasmid Giga Kit. Concentrações de DNAplasmídico foram medidas por absorção UV 260 nm e pureza do DNAplasmídico foi acessada usando eletroforese com gel de agarose e proporçõesA260/A280.

Parâmetros afetando as transfecções transientes de células de fibroblastobovinas, ovinas e caprinas

Diversos parâmetros foram medidos, como: 1) Eficiência da transfecçãocelular DNA/lipossoma; 2) Efeito da densidade celular na taxa de transfecçãoutilizando culturas bovinas de fibroblastos; 3) Efeito do vetor plasmídico naeficiência de transfecção em células de fibroblastos bovinas.

Ensaio bioquímico de β-galactosidade

- Expressão de β-galactosidade foi detectada 24 horas após atransfecção, sendo calculada sob microscópio óptico (100X).

Transfecção estável de fibroblastos

Células de fibroblastos bovinos foram crescidas em placas de cultura etransfectadas com 0,5 pg pCI-neo e Lipofectamina (8,3 μΙ/ml) com reagentePlus (13.3 pg/ml). 48 horas após a transfecção, células foram diluídas 1:10 eG418 foi adicionado para chegar a concentração final de 0,5 mg/ml. Célulastransfectadas atingiram subconfluência após 7 dias de seleção. Na terceirapassagem, uma porção das células foi diluída 1:10, cultivadas sob pressãoseletiva de antibióticos e criopreservados. A outra porção foi diluída 1:1000 ecultivadas sob pressão seletiva de antibióticos poe 7 dias. Colônias individuaisforam isoladas e expandidas para criopreservação, contagem de cromossomose análise por PCR.

Análise por PCR

Dna genômico de duas linhagens de fibroblastos bovinos transfectados enão-transfectados foram extraídos e purificados. DNA genômico foi usadocomo molde nas reações de PCR contendo primers específicos do gene neo(420 pb): NPT151 (5'-ATGATTGAAGAAGATGGATTG-3') e NPT941 (5-GAAGAACTCGTCAAAGAAGGCC-3'). A reação de PCR foi feita em umvolume final de 25 μΙ contendo 10 mM Tris-HCI, pH 8,4, 50 mM KCI, 2 mMMgCI2, 160 μΜ de cada dNTP, 0,4 μΜ de cada primer e 2U Taq polimerase. Areação de PCR compreendeu 35 ciclos (94C/1min; 60C/1min, 72C/1min) emciclador termal PT-100. Produtos de PCR amplificados foram analisados em1,5% de gel de agarose com brometo de etídio (50 mg/ml) e as respectivasimagens foram digitalizadas.

Os versados na arte valorizarão os conhecimentos aqui apresentados epoderão reproduzir a invenção nas modalidades apresentadas e em outrosvariantes, abrangidos no escopo das reivindicações anexas.

Claims

Processo de Modificação de Células-Tronco EmbrionáriasBovinas ε Processo de Purificação de Proteínas geradas porCélulas-Tronco Embrionárias Bovinas modificadas.

1. Processo de modificação de células-tronco embrionárias bovinascaracterizado por compreender as etapas de:a) construir vetores de expressão compreendendo:a1) pelo menos uma seqüência nucleotídica capaz deexpressar o gene do fator IX de coagulação sangüínea humano e/ouseus fragmentos contendo peptídeo sinal bovino na extremidade 5';a2) pelo menos um promotor adequado;b) contactar células-tronco embrionárias bovinas com os vetoresde expressão de a).

2.

Processo de purificação de proteínas geradas por células-troncoembrionárias bovinas modificadas caracterizado por compreender as etapasde:a) acoplar cauda de histidina a extremidade 3' de pelo menosuma seqüência nucleotídica capaz de expressar o gene do fator IX decoagulação sangüínea humano e/ou seus fragmentos compreendendopeptídeo sinal bovino na extremidade 5' presente em células-troncoembrionárias bovinas;b) purificar a), permitindo a separação da proteína gerada pelascélulas-tronco embrionárias bovinas.