CN105524897A - 转录激活因子样效应因子核酸酶及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了转录激活因子样效应因子核酸酶及其应用,其中,该转录激活因子样效应因子核酸酶特异性识别生长激素受体基因。该转录激活因子样效应因子核酸酶能够有效用于对非人动物生长激素受体(GHR)基因进行定点敲除,从而能够有效地干扰动物生长轴通路。
Description
技术领域
本发明涉及生物工程领域,具体地,涉及转录激活因子样效应因子核酸酶及其应用,更具体地,涉及转录激活因子样效应因子核酸酶、多核苷酸、构建体、细胞、制备转基因动物的方法以及筛选治疗侏儒症药物的方法。
背景技术
通常,动物例如人、猪和小鼠等的生长是由生长轴来调控的。生长轴是动物体内从下丘脑——垂体——靶器官的一系列激素及其受体所组成的神经内分泌系统,由生长激素释放因子(GRF)、生长激素(GH)和胰岛素样生长因子(IGF)构成。下丘脑根据机体需要分泌生长激素释放激素(growthhormonereleasinghormone,GHRH)和生长抑素(somatostatin,SS),以双重作用于垂体,控制生长激素的分泌;生长激素作用有两种方式,一是经血液循环至肝脏,与细胞膜表面的生长激素受体(growthhormonereceptor,GHR)结合,启动细胞内的信号转导机制,促进胰岛素样生长因子(insulin-likegrowthfactors,IGFs)的表达;IGFs再通过血液循环到达机体的局部组织,促进组织细胞的生长和分化。二是GH直接作用于靶器官GHR,通过旁分泌或自分泌IGFs或直接影响细胞的代谢而调节器官的生长发育。
与其他激素或者生长因子一样,GH必需与靶细胞上相应受体结合后才能产生生物学效应,因此动物生长快慢很大程度上取决于靶器官上GHR表达的时空特异性。这方面的研究对揭示动物生长发育机理及GH作用机理具有重要的意义。
然而,目前关于GHR表达的研究仍有待改善。
发明内容
本发明旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。为此,本发明的一个目的在于提出一种能够对非人动物生长激素受体(GHR)基因进行定点敲除的手段。
在本发明的第一方面,本发明提供了一种转录激活因子样效应因子核酸酶。根据本发明的实施例,该转录激活因子样效应因子核酸酶特异性识别生长激素受体基因。发明人发现,该转录激活因子样效应因子核酸酶能够有效用于对非人动物生长激素受体(GHR)基因进行定点敲除,从而能够有效地干扰动物生长轴通路。
根据本发明的实施例,本发明的转录激活因子样效应因子核酸酶包含FokI核酸酶,其中,所述FokI核酸酶具有SEQIDNO:4或SEQIDNO:5所示的氨基酸序列。
根据本发明的实施例,本发明的转录激活因子样效应因子核酸酶特异性识别SEQIDNO:1所示序列或SEQIDNO:1所示序列的互补序列。
根据本发明的实施例,本发明的转录激活因子样效应因子核酸酶特异性识别下列之一:SEQIDNO:2所示序列或SEQIDNO:2所示序列的互补序列;SEQIDNO:3所示序列或SEQIDNO:3所示序列的互补序列。
根据本发明的实施例,本发明的转录激活因子样效应因子核酸酶包括SEQIDNO:7或8所示的氨基酸序列。
在本发明的第二方面,本发明提供了一种多核苷酸。根据本发明的实施例,该多核苷酸包含下列之一:(1)至少一种编码SEQIDNO:1~5任一项所述转录激活因子样效应因子核酸酶的核酸序列;或者(2)(1)的互补序列。由此,该多核苷酸能够有效用于对非人动物生长激素受体(GHR)基因进行定点敲除,从而能够有效地干扰动物生长轴通路。
在本发明的第三方面,本发明提供了一种构建体。根据本发明的实施例,该构建体包括前面所述的多核苷酸。利用该构建体,能够将前面所述的多核苷酸引入到动物细胞中,进而,能够实现对动物细胞中的GHR基因敲除,从而能够有效地干扰动物生长轴通路,进一步,可以抑制动物的生长,使得动物的体型比野生型动物小。
在本发明的第四方面,本发明提供了一种细胞。根据本发明的实施例,该细胞包含前面所述的多核苷酸,或者前面所述的构建体。由此,该细胞的GHR基因被敲除,可以作为细胞模型用于筛选能够治疗侏儒症的药物,另外,利用该细胞,可以有效地获得体型比野生型动物小的动物。
在本发明的第五方面,本发明提供了一种制备转基因动物的方法。根据本发明的实施例,该方法包括:提供转基因动物细胞;提供所述动物的去核卵母细胞;将所述转基因动物细胞引入所述动物的无核卵母细胞中,以便获得融合卵母细胞;以及利用所述融合卵母细胞,通过人工克隆技术制备所述转基因动物,其中,所述转基因动物细胞为前面所述的细胞。根据本发明的实施例,所述动物为非人哺乳动物,优选猪,更优选巴马猪。利用该方法,能够有效地获得非人小型化动物,从而该动物可以适合作为宠物,或者作为筛选治疗侏儒症药物等科学研究的动物模型。
在本发明的第六方面,本发明提供了一种筛选治疗侏儒症药物的方法。根据本发明的实施例,该方法包括:测量转基因动物的体重、体长、体高、胸围中的至少之一;将所述转基因动物与药物接触;测量接触药物后的所述转基因动物的体重、体长、体高、胸围中的至少之一,其中,所述转基因动物是通过前面所述的方法制备的,接触药物前的转基因动物的体重、体长、体高、胸围中的至少之一小于非转基因动物,所述接触药物后的转基因动物的体重、体长、体高、胸围中的至少之一大于所述接触药物前的转基因动物,且所述接触药物后的转基因动物的体重、体长、体高、胸围中的至少之一与非转基因动物相当,是所述药物能够用于治疗侏儒症的指示。利用该方法,能够快速有效地筛选治疗侏儒症的药物。
附图说明
图1是根据本发明一个实施例的构建体的实验结果图,其中,图1A是TALEN载体菌液PCR结果,图1B是第一构建体TALEN1和第二构建体TALEN2的质粒和酶切鉴定电泳图;
图2是根据本发明一个实施例的第一构建体和第二构建体共转染细胞后的活性鉴定结果;
图3是根据本发明一个实施例的GHR打靶细胞克隆鉴定结果,PCR扩增后通过PstI酶切处理后的电泳结果;
图4是根据本发明一个实施例的部分GHR打靶细胞克隆第二次PCR鉴定结果;
图5是根据本发明一个实施例的GHR-16、GHR-148克隆测序比对图;
图6是根据本发明一个实施例的出生一个月时GHR敲除转基因侏儒症猪的照片;
图7是根据本发明一个实施例的出生小猪的电泳鉴定图;
图8是根据本发明一个实施例的出生小猪的测序鉴定图;
图9是根据本发明一个实施例的6头出生小猪的蛋白印记图;以及
图10是根据本发明一个实施例的部分出生小猪表型观察结果,
图10a为GHR敲除转基因巴马猪生长曲线图,
图10b为具体测量数据表,
图10c为5月龄时4头阳性猪(616-1、616-3、616-4、616-6)和2头阴性猪(616-2、616-5)对照结果。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例。下面描述的实施例是示例性的,仅用于解释本发明,而不能理解为对本发明的限制。实施例中未注明具体技术或条件的,按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者,均为可以通过市购获得的常规产品。
“基因打靶”技术是上世纪80年代发展起来的技术,指利用细胞脱氧核糖核酸(DNA)可与外源性DNA同源序列发生同源重组的性质,定向改造生物某一基因的技术,具有定位性强、打靶后的基因随染色体稳定遗传的特点。这种技术可以按照预先设计的方式对生物遗传信息进行精细改造。30年来打靶技术在基因功能研究,动物品种改良、人类疾病动物模型研制等领域得到了广泛的应用,但是传统打靶技术打靶效率低,基因定点整合效率大约为10-6~10-7,而且表达常受到位置效应的影响,从而致使打靶技术的应用大大受限。TALE(Transcriptionactivator-likeeffectors)是一种源于植物致病菌Xanthomonas的崭新的靶向基因操作技术。研究证明TALE蛋白的氨基酸序列与靶位点的核酸序列具有恒定的对应关系,一个模块单元识别一个碱基,简单且特异性极好。每个模块单元由33-35个氨基酸组成,其中第12、13位氨基酸,即RVD区域决定其识别的碱基。TALENs是TALE连接上非特异性内切酶FokI酶后所形成一种非常有用的位点特异性基因修饰工具,非特异性核酸酶FokI以二聚体形式进行DNA剪切。因此有效识别剪切的TALEN载体是成对作用的。在TALEs所识别的两条DNA序列之间有12-16bp的spacer序列作为FokI剪切位点。TALENs技术可以识别和切割特定DNA区域,是基因敲除领域崭新的工具,具有实验简单,周期短,识别序列特异性高,脱靶效率低等特点,为基因功能研究,培育新品系,为药物筛选、细胞治疗等提供有力的帮助。
猪与人类相比,在遗传水平、生理机理、代谢功能及器官大小等方面都极为相近,是良好的实验动物模型。本发明利用TALEN技术对猪GHR基因进行打靶,获得双敲除的GHR细胞系,通过手工克隆技术获得GHR-/-的转基因侏儒猪。可为人侏儒症及与老龄化有关生物医学研究提供动物模型,也可以作为研究GH/IGF1生长轴相关基因调控生长发育的疾病模型。
在本发明的第一方面,本发明提供了一种转录激活因子样效应因子核酸酶。根据本发明的实施例,该转录激活因子样效应因子核酸酶特异性识别生长激素受体基因。发明人发现,该转录激活因子样效应因子核酸酶能够有效用于对非人动物生长激素受体(GHR)基因进行定点敲除,从而能够有效地干扰动物生长轴通路。
根据本发明的实施例,本发明的转录激活因子样效应因子核酸酶包含FokI核酸酶,其中,所述FokI核酸酶具有SEQIDNO:4或SEQIDNO:5所示的氨基酸序列。其中,SEQIDNO:4和SEQIDNO:5分别具有如下所示的序列:
TCCCAGCTAGTGAAATCTGAATTGGAAGAGAAGAAATCTGAACTTAGACATAAATTGAAATATGTGCCACATGAATATATTGAATTGATTGAAATCGCAAGAAATTCAACTCAGGATAGAATCCTTGAAATGAAGGTGATGGAGTTCTTTATGAAGGTTTATGGTTATCGTGGTAAACATTTGGGTGGATCAAGGAAACCAGACGGAGCAATTTATACTGTCGGATCTCCTATTGATTACGGTGTGATCGTTGATACTAAGGCATATTCAGGAGGTTATAATCTTCCAATTGGTCAAGCAGATGAAATGAGATATGTCGAAGAGAATCAAACAAGAAAGCAT AACCCTAATGAATGGTGGAAAGTCTATCCATCTTCAGTAACAGAATTTAAGTTCTTGTTTGTGAGTGGTCATTTCAAAGGAAACTACAAAGCTCAGCTTACAAGATTGAATCATATCACTAATTGTAATGGAGCTGTTCTTAGTGTAGAAGAGCTTTTGATTGGTGGAGAAATGATTAAAGCTGGTACATTGACACTTGAGGAAGTGAGAAGGAAATTTAATAACGGTGAGATAAACTTT(SEQIDNO:4);
TCCCAGCTAGTGAAATCTGAATTGGAAGAGAAGAAATCTGAACTTAGACATAAATTGAAATATGTGCCACATGAATATATTGAATTGATTGAAATCGCAAGAAATTCAACTCAGGATAGAATCCTTGAAATGAAGGTGATGGAGTTCTTTATGAAGGTTTATGGTTATCGTGGTAAACATTTGGGTGGATCAAGGAAACCAGACGGAGCAATTTATACTGTCGGATCTCCTATTGATTACGGTGTGATCGTTGATACTAAGGCATATTCAGGAGGTTATAATCTTCCAATTGGTCAAGCAGATGAAATGCAAAGATATGTCGAGAATCAAACAAGAAACAAGCATATCAACCCTAATGAATGGTGGAAAGTCTATCCATCTTCAGTAACAGAATTTAAGTTCTTGTTTGTGAGTGGTCATTTCAAAGGAAACTACAAAGCTCAGCTTACAAGATTGAAT ACTAATTGTAATGGAGCTGTTCTTAGTGTAGAAGAGCTTTTGATTGGTGGAGAAATGATTAAAGCTGGTACATTGACACTTGAGGAAGTGAGAAGGAAATTTAATAACGGTGAGATAAACTTT(SEQIDNO:5)。
根据本发明的实施例,本发明的转录激活因子样效应因子核酸酶特异性识别SEQIDNO:1所示序列或SEQIDNO:1所示序列的互补序列。其中,SEQIDNO:1所示序列如下:TCCTTGTCAGAGCATCTCAGAGTCTGCAGAGAGTTCATCCAGGCCTAGAGA(SEQIDNO:1)。
根据本发明的实施例,本发明的转录激活因子样效应因子核酸酶特异性识别下列之一:SEQIDNO:2所示序列或SEQIDNO:2所示序列的互补序列;SEQIDNO:3所示序列或SEQIDNO:3所示序列的互补序列。其中,SEQIDNO:2和SEQIDNO:3所示序列分别如下所示:TCCTTGTCAGAGCATCTC(SEQIDNO:2);TCATCCAGGCCTAGAGA(SEQIDNO:3)。
根据本发明的实施例,本发明的转录激活因子样效应因子核酸酶包括SEQIDNO:7或8所示的氨基酸序列。SEQIDNO:7和SEQIDNO:8所示氨基酸序列如下:HD-HD-NG-NG-NN-NG-HD-NI-NN-NI-NN-HD-NI-NG-HD-NG-HD(SEQIDNO:7);HD-NG-HD-NG-NI-NN-NN-HD-HD-NG-NN-NN-NI-NG-NN-NI(SEQIDNO:8)。
在本发明的第二方面,本发明提供了一种多核苷酸。根据本发明的实施例,该多核苷酸包含下列之一:(1)至少一种编码SEQIDNO:1~6任一项所述转录激活因子样效应因子核酸酶的核酸序列;或者(2)(1)的互补序列。
在本发明的第三方面,本发明提供了一种构建体。根据本发明的实施例,该构建体包括前面所述的多核苷酸。利用该构建体,能够将前面所述的多核苷酸引入到动物细胞中,进而,能够实现对动物细胞中的GHR基因敲除,从而能够有效地干扰动物生长轴通路,进一步,可以抑制动物的生长,使得动物的体型比野生型动物小。
需要说明的是,在本发明中所使用的术语“构建体”是指这样的一种遗传载体,其包含特定核酸序列,并且能够将目的核酸序列转入宿主细胞中,使目的核酸序列整合到宿主细胞的基因组上,以获得重组细胞。根据本发明的实施例,构建体的形式不受特别限制。根据本发明的实施例,其可以为质粒、噬菌体、人工染色体、粘粒(Cosmid)、病毒的至少一种。根据本发明的具体示例,构建体呈质粒的形式。质粒作为遗传载体,具有操作简单,可以携带较大片段的性质,便于操作和处理。质粒的形式也不受特别限制,既可以是环形质粒,也可以是线性质粒,即可以是单链的,也可以是双链的。本领域技术人员可以根据需要进行选择。在本发明中所使用的术语“核酸”可以是任何包含脱氧核糖核苷酸或者核糖核苷酸的聚合物,包括但不限于经过修饰的或者未经修饰的DNA、RNA,其长度不受任何特别限制。对于用于构建重组细胞的构建体,优选所述核酸为DNA,因为DNA相对于RNA而言,其更稳定,并且易于操作。
上面对根据本发明实施例的构建体进行了描述。当然,本领域技术人员能够理解的,构建体还可以包含其他常规的元件以促进构建体被转入宿主细胞中并且整合到宿主细胞的基因组上,正常发挥功能,例如复制起点、多克隆位点等。在此对这些元件不再赘述。
在本发明的第四方面,本发明提供了一种细胞。根据本发明的实施例,该细胞包含前面所述的多核苷酸,或者前面所述的构建体。由此,该细胞的GHR基因被敲除,可以作为细胞模型用于筛选能够治疗侏儒症的药物,另外,利用该细胞,可以有效地获得体型比野生型动物小的动物。
根据本发明的实施例,可以利用前面所述的构建体转化宿主细胞获得上述细胞。根据本发明的实施例,使用本发明的构建体转化宿主细胞的方法不受特别限制。根据本发明的一些具体示例,可以通过脂质体法进行所述转化。根据本发明的一些示例,可以通过核转仪进行所述转化。由此,可以提高将构建体引入宿主细胞中的效率,并且可以方便地筛选目的核酸序列与宿主细胞的染色体成功地发生整合的细胞,进一步能够提高制备上述细胞的效率。需要说明的是,在本文中所使用的术语“转化”与“转染”是可以互换使用的,均是指将外源核酸序列引入宿主细胞中的操作。
在本发明的第五方面,本发明提供了一种制备转基因动物的方法。根据本发明的实施例,该方法包括:提供转基因动物细胞;提供所述动物的去核卵母细胞;将所述转基因动物细胞引入所述动物的无核卵母细胞中,以便获得融合卵母细胞;以及利用所述融合卵母细胞,通过人工克隆技术制备所述转基因动物,其中,所述转基因动物细胞为前面所述的细胞。根据本发明的实施例,所述动物为非人哺乳动物,优选猪,更优选巴马猪。利用该方法,能够有效地获得非人小型化动物,从而该动物可以适合作为宠物,或者作为筛选治疗侏儒症药物等科学研究的动物模型。
在本发明的第六方面,本发明提供了一种筛选治疗侏儒症药物的方法。根据本发明的实施例,该方法包括:测量转基因动物的体重、体长、体高、胸围中的至少之一;将所述转基因动物与药物接触;测量接触药物后的所述转基因动物的体重、体长、体高、胸围中的至少之一,其中,所述转基因动物是通过前面所述的方法制备的,所述转基因动物是通过前面所述的方法制备的,接触药物前的转基因动物的体重、体长、体高、胸围中的至少之一小于非转基因动物,所述接触药物后的转基因动物的体重、体长、体高、胸围中的至少之一大于所述接触药物前的转基因动物,且所述接触药物后的转基因动物的体重、体长、体高、胸围中的至少之一与非转基因动物相当,是所述药物能够用于治疗侏儒症的指示。利用该方法,能够快速有效地筛选治疗侏儒症的药物。
实施例1:识别GHR基因位点TALEN载体(剪切构建体)构建及活性检测
载体构建:
分析GHR位点序列,选择TCCTTGTCAGAGCATCTCAGAGTCTGCAGAGAGTTCATCCAGGCCTAGAGA(SEQIDNO:1)作为TALEN载体识别剪切序列,SEQIDNO:1识别GHR基因2号外显子的一段序列,该识别序列中间有一个天然的PstI酶切位点,可以用于酶切鉴定。具体地,TALEN1识别TCCTTGTCAGAGCATCTC(SEQIDNO:2),即组装的TALEN1模块顺序为:HD-HD-NG-NG-NN-NG-HD-NI-NN-NI-NN-HD-NI-NG-HD-NG-HD(SEQIDNO:7);TALEN2识别TCATCCAGGCCTAGAGA(SEQIDNO:3)的反向互补序列,组装TALEN2的模块顺序为:HD-NG-HD-NG-NI-NN-NN-HD-HD-NG-NN-NN-NI-NG-NN-NI(SEQIDNO:8)。
然后,按照如下步骤构建TALEN表达骨架载体:将商业载体pcDNA3.1(-)上的CMV-MCS-BGPA序列扩增下来连接到T载体上,构建CMV-T。合成TALE-fokI序列,其中TALE蛋白合成N段456个核苷酸(翻译152个氨基酸残基),C端189个核苷酸(翻译63个氨基酸残基),N端和C端之间为2个方向相反的IIS内切酶BsmBI,用于TALENs模块的连接,fokI根据文献突变3个氨基酸残基成ELD和KKR,其中,ELD突变3个氨基酸残基为:Q486E:CAA→GAG、N496D:AAC→GAT以及I499L:ATC→CTC,ELD具有SEQIDNO:4所示的序列,KKR突变3个氨基酸残基为:E490K:GAA→AAG、H537R:CAT→CGC以及I538K:ATC→AAA,KKR具有SEQIDNO:5所示的序列,故TALEN1和TALEN2的核酸酶是异源二聚体活性。将合成的TALE-fokI序列用XhoI和AflII酶切连接到CMV-T上,构建获得TAL-ELD和TAL-KKR骨架终载体。
将组装的模块分别连接到TAL-ELD和TAL-KKR终载体上(即TALEN1-ELD和TALEN2-KKR。,完成TALEN1载体和TALEN2载体的构建。图1为TALEN1和TALEN2的载体构建电泳图,其中,图1A是TALEN载体菌液PCR结果,图1B为第一构建体TALEN1和第二构建体TALEN2的质粒和酶切鉴定电泳图。从图1可以看出,PCR检测目的条带大小为3k,第一构建体和第二构建体质粒大小为7k,XhoI和AflII双酶切条带大小为3k和4k。
活性检测:
TALEN1和TALEN2识别序列之间的spacer为5′-AGAGTCTGCAGAGAGT-3′,是核酸酶FokI的剪切位点,其中CTGCAG是PstI限制性内切酶的识别位点。活性检测的原理是,有活性的TALENs会剪切spacer序列,使PstI的识别序列发生改变,跟阴性对照(转染EGFP质粒)相比,经过PstI酶切的该区域PCR产物将有未切开的片段。
活性检测的具体操作如下:
载体构建完成后,将TALEN1和TALEN2载体共转染PK15细胞系(猪肾脏细胞),72小时后提取细胞DNA,PCR之后,PstI酶切检测,设置转染EGFP的PK15细胞系作为阴性对照,活性检测结果见图2。从图2可知,转染TALENs的细胞(GHRTALEN)DNA有未酶切片段(452bp),而阴性对照(control)则完全切割(279bp和173bp),表明构建的TALENs有剪切活性。
其中,TALEN载体构建PCR鉴定引物序列如下:
pTAL-F:TTGGCGTCGGCAAACAGTGG,
pTAL-R:CGGCGATTGACTCTTCTGAT;
活性鉴定引物序列如下:
GHR2-F:TTCATGTTTCTGGGCTGTG,
GHR2-R:ACTTGTTTGCTTGCTGTGC。
实施例2:GHR打靶细胞的转染筛选和鉴定
提取无内毒素TALENs质粒和pcDNA3.1(+)。并AhdI酶切pcDNA3.1(+)载体使其线性化。采用核转方法将TALENs质粒和pcDNA3.1(+)线性化片段共转染巴马猪胎儿成纤维细胞,转染比例为2μgTALENs:0.8μgpcDNA3.1(+)线性化片段。
将转染后的细胞分盘到10cm,利用500μg/ml的G418进行细胞筛选,筛选1周后,出现阳性克隆,将阳性克隆挑取到48孔板继续扩大培养,并换200μg/ml浓度G418维持。需要说明的是,不同的细胞系G418的致死浓度不一样,所以要先对细胞系做G418致死浓度的测定,本实施例中的巴马成纤维细胞系的G418致死浓度为500μg/ml。
将细胞扩繁到24孔板,提取DNA后用GHR2-F/R引物进行PCR,
PCR扩增体系为:
PCR扩增采用TAKARA的EXTaq酶,反应体系(单位:μl)如下:
PCR扩增参数为:
取3μlPCR产物进行电泳鉴定条带大小,然后取10μlPCR产物,用PstI进行酶切鉴定,酶切体系如下:
PCR产物用PstI酶切后电泳鉴定,PCR产物经PstI酶切后,如果该TALEN剪切位点被剪切,则PstI酶切后只有一条带(452bp),如果该位点没被剪切,则PstI酶切后出现2条带(279bp和173bp)。GHR打靶细胞克隆鉴定结果见图3,部分克隆第二次PCR鉴定结果见图4。图3中,“-”标记为细胞阴性对照,PCR扩增目的条带为452bp,PstI酶切处理后条带大小为279bp和173bp,共鉴定173个克隆,78个有剪切活性(红色标示)。图4中,GHR-16、GHR-148经PstI酶切处理后只有未切开的一条带,PCR鉴定为双敲除细胞系。
将酶切后只有一条带的克隆(GHR-16、148)送测序鉴定,GHR-16、GHR-148克隆测序比对图结果如图5,其中,GHR-WT为野生型序列。由图5可知,GHR-16经测序缺失11个碱基,属于移码突变,只编码41个氨基酸,GHR148经测序缺失9个碱基,属于缺失3个氨基酸的突变。最后,选取GHR-16细胞系送手工克隆。
实施例3手工克隆获得转基因小猪
具体流程如下:
获得巴马猪卵巢,收集卵子,并将其在改良的TL-Hepes-PVA缓冲液中清洗后,放入培养板中,在培养箱内进行未成熟卵细胞体外成熟(invitromaturation,IVM)培养,得到成熟卵子。其中,改良的TL-Hepes-PVA缓冲液的配方为:114MNaCl、3.2MKCl、0.34MNaH2PO4、10M乳酸钠、0.50MMgCl2·6H2O、10MHepes、0.2M丙酮酸钠、12M山梨醇、2MNa2HCO3、2MCaCl2·2H2O、0.01体积%PVA。
然后,将所得到的成熟卵子在显微镜下用小刀片去核,以便获得成熟去核卵母细胞。接着,挑取单个GHR-16克隆细胞系细胞,利用融合仪电激将其融入到成熟去核卵母细胞中,制成重构胚。随后将重构胚放入培养箱内,培养5~6天,形成成熟囊胚。对囊胚进行体外移植,共移植4头代孕母猪。代孕母猪均为二元杂受体。妊娠114天之后,共产下10头小猪,出生一个月时GHR敲除转基因侏儒症猪的照片如图7所示。
实施例4出生小猪的检测
取实施例3中获得的1月龄小猪耳组织,提取DNA总DNA后,PCR产物用PstI酶切进行鉴定,PCR条件如实施例2所示,鉴定结果如图7和图8,其中,图7为出生小猪电泳鉴定图,其中,3头(519-2、616-2、616-5)为阴性,酶切条带为279bp和173bp,7头(356-1、519-1、615-1、616-1、616-3、616-4、616-6)酶切后没有279bp和173bp条带,为双敲除阳性转基因猪;图8为出生小猪测序鉴定图,其中,3头为阴性(519-2、616-2、616-5),7头为双敲除阳性转基因猪(356-1、519-1、615-1、616-1、616-3、616-4、616-6),与酶切电泳结果一致。
接下来,对出生小猪进行蛋白印记检测,检测步骤如下:
1、小猪耳组织总蛋白的提取:
1)取小猪耳组织30mg左右,置于1.5mL的EP管中,
2)加400微升RIPA裂解液(碧云天生物技术公司,用前加4微升100mmol的PMSF),以剪刀剪碎组织块,
3)超声波处理5s×3次,
4)冰上孵育15分钟,
5)12000转离心5分钟取上清转移至另一EP管中备用。
2、BCA法测定蛋白的浓度:
1)根据样品数量,按50体积BCA试剂A加1体积BCA试剂B(50:1)配制适量BCA工作液,充分混匀,
2)取10μL完全溶解蛋白标准品,用PBS稀释至100μL,使终浓度为0.5mg/mL,
3)将标准品按0,1,2,4,8,12,16,20μL加到96孔板的标准品孔中,加PBS补足到20μL,
4)加1μL样品到96孔板的样品孔中,用PBS稀释至20μL,
5)各孔加入200μLBCA工作液,37℃放置30分钟,
6)测定A562,根据标准曲线计算出蛋白浓度。
3、SDS-凝胶电泳:
按如下表格配制SDS分离胶和浓缩胶
4、灌胶与上样:
1)玻璃板对齐后放入制胶器中卡紧,然后垂直卡在架子上准备灌胶,
2)按前面方法配8%分离胶,灌胶时,用枪吸取5ml胶沿玻璃放出,待胶面升到适当高度时即可,然后胶上加一层水进行液封,
3)按前面方法配5%的浓缩胶,灌胶时将剩余空间灌满浓缩胶然后将梳子插入浓缩胶中,待凝固后,轻轻拔出梳子即可点样,
4)用水冲洗一下浓缩胶,将其放入电泳槽中,入缓冲液后拔掉梳子,
5)样品准备:测完蛋白含量后,计算含50μg蛋白的溶液体积即为上样量,取出上样样品至1.5ml的EP管中,加入5×SDS上样缓冲液至终浓度为1×,沸水中煮5-10min使蛋白变性,
6)上样:加200mL的电泳液后开始准备上样,用枪吸取10μL样品(约50μg)到孔中。
7)电泳:电泳时间1.5h,电压为90V,电泳至溴酚兰刚跑出即可终止电泳,进行转膜。
5、转膜:
1)将切好的PVDF膜先置于甲醇中泡3-10s,然后置于转膜缓冲液中备用,
2)在加有转移液的搪瓷盘里放入转膜用的夹子、两块海绵垫、滤纸和浸过的膜,
3)将夹子打开使黑的一面保持水平,在上面垫一张海绵垫,除去气泡,在垫子上垫一层滤纸,轻轻除去气泡,
4)剥胶:轻轻撬开玻璃板,将多余的胶刮去,小心剥下分离胶盖于滤纸上,用手调整使其与滤纸对齐,轻轻除去气泡,将膜盖满于胶上并除去气泡,在膜上盖一张略小于膜的滤纸并除去气泡,最后盖上另一个海绵垫,合起夹子,
5)将夹子放入转移槽中,使夹的黑面对槽的黑面,夹的白面对槽的红面,在槽的一边放冰块降温,110V转移2h。
6、免疫反应:
1)将膜用TBS从下向上浸湿后,移至含有封闭液的平皿中,室温下脱色摇床上摇动封闭1h,
2)将一抗用TBST稀释至适当浓度于小皿中,从封闭液中取出膜,用TBS清洗一遍,将膜蛋白面朝下放于抗体液面上,赶出残留气泡,4℃孵育过夜,
3)用TBS在室温下脱色摇床上洗两次,每次10min,再用TBST洗一次,10min,
4)同上方法准备二抗稀释液并与膜接触,37℃孵育2h,用TBS在室温下脱色摇床上洗两次,每次10min;再用TBST洗一次,10min,进行化学发光反应。
7、化学发光及曝光反应
1)将A和B两种试剂在保鲜膜上等体积混合;1min后,将膜蛋白面朝下与此混合液充分接触;1min后,将膜移至另一保鲜膜上,去尽残液,包好,
2)在暗室中,在红灯下取出X-光片,剪裁成适当大小;打开X-光片夹,把X-光片放在膜上,关上X-光片夹,开始计时;根据信号的强弱适当调整曝光时间,一般为1min或5min,
3)曝光完成后,打开X-光片夹,取出X-光片,迅速浸入显影液中显影1~2min,待出现明显条带后,即刻终止显影,显影结束后,把X-光片在清水中清洗一遍,浸入定影液中,定影时间一般为5~10min,以胶片透明为止;用自来水冲去残留的定影液后,室温下晾干,
4)将胶片进行扫描或拍照,分析目标带的分子量,分析结果如图9所示。从图9可以看出,519-2、616-2、616-5阴性小猪在约130KD有条带,而356-1、519-1、615-1、616-1、616-3、616-4、616-6双敲除的小猪无条带,说明阳性小猪GHR已经移码突变,无GHR蛋白的表达。
再接下来,对所得到的小猪的成长进行追踪调查。结果如图10。其中,图10a为GHR敲除转基因巴马猪生长曲线图,图10b为具体测量数据表,图10c为5月龄时4头阳性猪(616-1、616-3、616-4、616-6)和2头阴性猪(616-2、616-5)对照结果,从图10可以看出,4头阳性猪与2头阴性猪相比体尺较小,长势迟缓,说明了GHR敲除确实影响了猪的生长发育,使猪生长发育受阻。
在本说明书的描述中,参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中,对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且,描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外,在不相互矛盾的情况下,本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例,可以理解的是,上述实施例是示例性的,不能理解为对本发明的限制,本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。
Claims (10)
1.一种转录激活因子样效应因子核酸酶,其特异性识别生长激素受体基因。
2.根据权利要求1所述的转录激活因子样效应因子核酸酶,其特征在于,包含FokI核酸酶,其中,所述FokI核酸酶具有SEQIDNO:4或SEQIDNO:5所示的氨基酸序列。
3.根据权利要求1所述的转录激活因子样效应因子核酸酶,其特征在于,特异性识别SEQIDNO:1所示序列或SEQIDNO:1所示序列的互补序列。
4.根据权利要求3所述的转录激活因子样效应因子核酸酶,其特征在于,特异性识别下列之一:
SEQIDNO:2所示序列或SEQIDNO:2所示序列的互补序列;
SEQIDNO:3所示序列或SEQIDNO:3所示序列的互补序列。
5.根据权利要求1所述的转录激活因子样效应因子核酸酶,其特征在于,包括SEQIDNO:7或8所示的氨基酸序列。
6.一种多核苷酸,其特征在于,包含下列之一:
(1)至少一种编码SEQIDNO:1~5任一项所述转录激活因子样效应因子核酸酶的核酸序列;或者
(2)(1)的互补序列。
7.一种构建体,其特征在于,包括权利要求6所述的多核苷酸。
8.一种细胞,其特征在于,包含权利要求6所述的多核苷酸,或者权利要求7所述的构建体。
9.一种制备转基因动物的方法,其特征在于,包括:
提供转基因动物细胞;
提供所述动物的去核卵母细胞;
将所述转基因动物细胞引入所述动物的无核卵母细胞中,以便获得融合卵母细胞;以及
利用所述融合卵母细胞,通过人工克隆方法制备所述转基因动物,
其中,
所述转基因动物细胞为权利要求8所述的细胞,
任选地,所述动物为非人哺乳动物,优选猪,更优选巴马猪。
10.一种筛选治疗侏儒症药物的方法,其特征在于,包括:
测量转基因动物的体重、体长、体高、胸围中的至少之一;
将所述转基因动物与药物接触;
测量接触药物后的所述转基因动物的体重、体长、体高、胸围中的至少之一,
其中,
所述转基因动物是通过权利要求9所述的方法制备的,
接触药物前的转基因动物的体重、体长、体高、胸围中的至少之一小于非转基因动物,所述接触药物后的转基因动物的体重、体长、体高、胸围中的至少之一大于所述接触药物前的转基因动物,且所述接触药物后的转基因动物的体重、体长、体高、胸围与非转基因动物相当,是所述药物能够用于治疗侏儒症的指示。
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CN105949293A (zh) * | 2016-06-28 | 2016-09-21 | 福建农林大学 | 植物源高效转录激活功能域sac3及应用 |
CN106172237A (zh) * | 2016-08-08 | 2016-12-07 | 贵州大学 | Ghr基因敲除纯合香猪的选育方法 |
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CN108949832A (zh) * | 2018-07-13 | 2018-12-07 | 中国农业大学 | 一种用于敲除猪ghr基因的打靶载体及其应用 |
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Non-Patent Citations (7)
Title |
---|
TOMAS CERMAK等: "Efficient design and assembly of custom TALEN and other TAL effector-based constructs for DNA targeting", 《NUCLEIC ACIDS RESEARCH》 * |
TOSHIYUKI YAMAJI等: "Establishment of HeLa Cell Mutants Deficient in Sphingolipid-Related Genes Using TALENs", 《PLOS ONE》 * |
VICTORIA M. BEDELL等: "In vivo genome editing using a high-efficiency TALEN system", 《NATURE》 * |
YANNICK DOYON等: "Enhancing zinc-finger-nuclease activity with improved obligate heterodimeric architectures", 《NATURE METHODS》 * |
李飞达等: "利用TALENs 和手工克隆技术高效获得GHR基因敲除巴马猪", 《遗传》 * |
沈延等: "TALEN 构建与斑马鱼基因组定点突变的试验方法与流程", 《遗传》 * |
沈延等: "类转录激活因子效应物核酸酶(TALEN)介导的基因组定点修饰技术", 《遗传》 * |
Cited By (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN105949293A (zh) * | 2016-06-28 | 2016-09-21 | 福建农林大学 | 植物源高效转录激活功能域sac3及应用 |
CN105949293B (zh) * | 2016-06-28 | 2019-08-13 | 福建农林大学 | 植物源高效转录激活功能域sac3及应用 |
CN106172237A (zh) * | 2016-08-08 | 2016-12-07 | 贵州大学 | Ghr基因敲除纯合香猪的选育方法 |
CN106172237B (zh) * | 2016-08-08 | 2019-05-10 | 贵州大学 | Ghr基因敲除纯合香猪的选育方法 |
CN106978438A (zh) * | 2017-02-27 | 2017-07-25 | 北京大北农生物技术有限公司 | 提高同源重组效率的方法 |
CN109063415A (zh) * | 2018-06-08 | 2018-12-21 | 温州大学 | 一种定义功能子通路扰动程度的方法 |
CN108949832A (zh) * | 2018-07-13 | 2018-12-07 | 中国农业大学 | 一种用于敲除猪ghr基因的打靶载体及其应用 |
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