JP2023516767A

JP2023516767A - 動物の製造方法

Info

Publication number: JP2023516767A
Application number: JP2022553625A
Authority: JP
Inventors: 呉光明; 陳捷凱; 呉凱▲しぃん▼
Original assignee: Mingceler Biotechnology Co Ltd
Current assignee: Mingceler Biotechnology Co Ltd
Priority date: 2020-03-06
Filing date: 2020-07-13
Publication date: 2023-04-20
Also published as: EP4144857A1; WO2021174742A1; EP4144857A4

Abstract

動物の製造方法及び応用を提供する。当該方法は、四倍体胚と胚性幹細胞を重合させ新たな再構成胚又はキメラ胚を形成することを含み、当該四倍体胚は２－細胞期に発育した四倍体胚である。２－細胞期の四倍体胚と胚性幹細胞との重合を利用し、四倍体補償技術でマウスを製造する効率安定性が低く、純粋系マウスからの胚性幹細胞の効率が低いという問題を改善し、マウスの出生率を向上させ、正常な胚移植に近づけ、幹細胞から胚及び成体ネズミを直接製造して表現型研究を行うことができる。

Description

本開示は生物医薬の分野に属し、動物の製造方法に関する。

実験動物疾患モデルはヒト疾患の発生原因、発症メカニズム、予防治療技術及び治療薬物の開発に対して不可欠な研究ツールである。一般的な実験動物は、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウサギ、イヌ、サル、ブタ及び魚などを含む。しかしながら、ヒトと動物では遺伝子及びタンパク質配列に依然として多くの差異が存在し、多くのヒトタンパク質は動物の相同タンパク質と結合して生物活性を生成することができず、多くの臨床試験の結果も動物実験の結果と一致しない。

遺伝子工学技術の継続的な発展及び成熟に伴い、ヒト細胞又は遺伝子で動物の内因性同類細胞又は遺伝子を代替するか又は置換することにより、ヒトにより近い生物系又は疾患モデルを確立し、ヒト化実験動物モデル（ｈｕｍａｎｉｚｅｄａｎｉｍａｌｍｏｄｅｌ）を確立することは、既に臨床的に新しい治療方法又は手段に重要なツールが提供されている。ここで、遺伝子ヒト化動物モデルは、すなわち遺伝子操作技術を利用して、ヒトの正常又は突然変異遺伝子で動物の同類遺伝子を代替し、動物体内でヒトにより近い正常又は突然変異を確立することができる。ヒト遺伝子断片の存在により、動物体内にヒト機能を含有するタンパク質を発現するか又は部分的に発現することができ、それによりヒトと動物の臨床実験の差異を大幅に減少させ、動物レベルで薬物スクリーニングを行うことに可能性を提供する。

２０１９－ｎＣｏＶは、ＳＡＲＳコロナウイルスと同様に、アンジオテンシン変換酵素２（Ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎ－ｃｏｎｖｅｒｔｉｎｇｅｎｚｙｍｅ２、ＡＣＥ２）をヒトに感染する重要なターゲットとし、ここで、２０１９－ｎＣｏＶはヒトに感染する以外に様々な哺乳動物、例えばサル、ブタ、ウサギ、フェレット、オランウータン等に感染することができるが、マウス及びラットを除く。サル、ブタ及びウサギ等は動物モデルとして２０１９－ｎＣｏＶを感染させて薬物スクリーニングとして用いられ、その成長周期が長くかつ体型が大きく大量に操作しにくく、大量に操作しやすいマウスモデルは２０１９－ｎＣｏＶに感染させにくい。

四倍体とは、細胞に含まれる染色体が最小染色体セット数の四倍であり、すなわち細胞に四つの完全な染色体セットを有する生物個体又は細胞である。自然条件下で、哺乳動物の四倍体胚の発生率が非常に低くかつ一般的に単独の個体に正常に発育することができない。

一定数量の胚性幹細胞（ＥＳ）細胞と四倍体胚をキメラ化し、そのキメラの発育過程において、ＥＳ細胞と四倍体胚はランダムに分布せず、すなわちその四倍体胚部分は卵黄嚢内胚葉と胎盤栄養膜細胞（例えば絨毛膜外胚葉、栄養膜細胞など）などの胚体外組織の形成のみに関与し、ＥＳ細胞は胚様体、尿膜、羊膜、卵黄嚢中胚葉と絨毛膜中胚葉部分の生成に広く関与し、卵黄嚢内胚葉と胎盤栄養膜細胞系譜の生成に関与せず、すなわち両者の発育能は相補性を有し、このような現象は四倍体相補技術と呼ばれる。

この技術によってクローニングされた動物個体は、完全にＥＳ細胞から発育されたものであり、ＥＳ動物と呼ばれる。細胞核移植方法により製造されたクローン胚を代理母に移植した後に胎児の出生率は１～２％と非常に低く、四倍体補償技術により、すなわちＥＳＣ細胞系を嚢胚期の四倍体胚ベクターに注射すると、胎児の出生率を２０～３０％に向上させることができ、動物クローンの効率を顕著に向上させる。近年、国内外の多くの科学者はいずれもこの技術を鋭意研究し、多くの創造的な研究成果を取得した。四倍体補償技術により生成された動物モデルは非常に一般的に応用され、例えば系譜特異的な遺伝子機能の特定、胚体外組織及び胚組織の遺伝子機能の分析、細胞の自発及び非自発的遺伝子機能の識別、メジャーとマイナー欠陥の区別、表現型分析の促進などである。胚キメラの応用は初期胚発育の研究に限定されず、出生後の胎児発育、身体機能の研究にも応用することができる。キメラと分子ツールを組み合わせて使用する場合、このような分子ツールは細胞において時間及び系譜特異的な方式で遺伝活性を修飾することができ、遺伝子機能の正確、詳細かつ大規模な分析に利便性を提供する。条件付きで遺伝子発現を変化させる方式で遺伝活動（Ｎａｇｙ２０００）を変化させたり、遺伝子機能を調節したりすることができる。現在、ＥＳ細胞の発育能に対する評価は、主にｉｎｖｉｔｒｏでの細胞分化の研究、及び細胞多能性を反映する分子マーカーの転写活性の分析に焦点を当てている。胚キメラの一つの独特な特徴は、外来細胞が胚にキメラ化することができ、細胞が胚の発育過程において分化能を十分に励起することができることである。細胞は全面的な細胞系譜の試験を受け、これは多能性の真の程度をより明らかにすることができる。キメラは、哺乳類動物の多能性を予測するための細胞ｉｎｖｉｖｏ評価において最も全面的で最も厳密な重要なツールである。

いくつかの実施形態において、本開示は、動物の出生率を向上させることができる製造方法を提供する。

いくつかの実施形態において、本開示は、動物四倍体補償又は相補方法（ｔｅｔｒａｐｌｏｉｄｅｍｂｒｙｏｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ）を提供する。

いくつかの実施形態において、本開示は、四倍体胚と胚性幹細胞を重合させ新たな再構成胚又はキメラ胚を形成することを含み、前記四倍体胚は２－細胞期にある四倍体胚である、動物の製造方法を提供する。

いくつかの実施形態において、前記胚性幹細胞は、継代数がｐ１５世代以内の胚性幹細胞である。

いくつかの実施形態において、前記胚性幹細胞は、継代数がｐ１２－ｐ１５世代の胚性幹細胞である。

いくつかの実施形態において、前記方法は、四倍体補償法又は四倍体胚相補法（ｔｅｔｒａｐｌｏｉｄｅｍｂｒｙｏｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ）を使用する。

いくつかの実施形態において、前記方法は、（１）動物の２－細胞胚を取得するステップと、（２）ステップ（１）に記載の２－細胞胚を融合液に入れ、融合させ、四倍体胚を取得するステップと、（３）ステップ（２）における四倍体胚を培地に入れて培養するステップと、（４）ステップ（３）における２－細胞期に発育した四倍体胚を胚性幹細胞と重合させ、キメラ胚を形成するステップと、（５）ステップ（４）におけるキメラ胚を偽妊娠した動物子宮に移植し、胚を満期妊娠に発育させることにより、動物を取得するステップと、を含む。

いくつかの実施形態において、ステップ（３）における培養時間は８－２４時間である。

いくつかの実施形態において、ステップ（３）における培地はＫＳＯＭ培地である。

いくつかの実施形態において、該レシピエント胚に由来する非ヒト動物はヒト以外の任意の動物であってもよく、例えば、ブタ、ラット、マウス、ハムスター、ウサギ、ブタ、ウシ、シカ、ヒツジ、ヤギ、ニワトリ、ネコ、ウマ、イヌ、オランウータン、サルである。同時に、レシピエントに移植された細胞の元の供給源として用いられる哺乳動物は、ヒト又はヒト以外の哺乳動物であってもよく、例えば、ブタ、ラット、マウス、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、イヌ、ヒヒ、チンパンジー、ゴリラ、オランウータン、サル、マーモセット、ボノボ等である。

いくつかの実施形態において、前記動物は哺乳動物である。

いくつかの実施形態において、前記動物は非ヒト哺乳動物である。

いくつかの実施形態において、前記動物はブタ、ラット、マウス、ハムスター、ウサギ、ブタ、ウシ、シカ、ヒツジ、ヤギ、ニワトリ、ネコ、ウマ、イヌ、オランウータン、サルから選択される。

いくつかの実施形態において、前記動物はネズミから選択される。いくつかの実施形態において、前記動物は成体ネズミから選択される。いくつかの実施形態において、前記動物は胎児ネズミから選択される。

従来の技術によると、動物を製造するための現在の技術は実際の応用の要件を満たすことが困難である。例えば、マウスの製造において、早期研究によると、マウスの四倍体胚は正常に発育できず、胎盤の栄養膜及び胚外内胚葉しか形成することができず（Ｔａｒｋｏｗｓｋｉｅｔａｌ．，１９７７）、胚性幹細胞は胎児自体全体、及び卵黄嚢の中胚葉、羊膜、尿膜、臍帯等を形成することができるが、栄養膜及び卵黄嚢内胚葉を形成する能力は非常に限られている（Ｂｅｄｄｉｎｇｔｏｎｅｔａｌ．，１９８９）。四倍体補償技術はこのような完璧な相補関係に基づいて生み出されたものであり、最も極端な場合に、最高品質の純粋系遺伝的背景の胚性幹細胞を使用すると、胎児の出生率が最高で１５％に達することができるが、これらのマウスは出生した直後に全て死亡した（Ｎａｇｙｅｔａｌ．，１９９０）。

その後に、人々は早期継代のＦ１遺伝的背景の胚性幹細胞を使用して得られたキメラ胚は満期まで発育し成年まで生きることができるが、効率がわずか３．８％であることを判明した（Ｎａｇｙｅｔａｌ．，１９９３）。その後に、遺伝子ターゲッティング後のＦ１胚性幹細胞は再クローニングされた後に生存率が５－１５％に達することができるが、純粋系の胚性幹細胞で製造されたマウスの生存率は依然として０－１．４％に過ぎなかったことが報告された（Ｅｇｇａｎｅｔａｌ．，２００１）。２００６年、ＧｕｙＳＥａｋｉｎｅｔａｌ．は胚性幹細胞と二倍体又は四倍体との凝集を利用してマウスを生成する方法を発表した（ＥａｋｉｎａｎｄＨａｄｊａｎｔｏｎａｋｉｓ，２００６）。また、その他の方法文献（Ｇｅｒｔｓｅｎｓｔｅｉｎ，２０１５；ＫａｎｇａｎｄＧａｏ，２０１５；Ｌｉｅｔａｌ．，２０１５；Ｓｈｉｎｏｚａｗａｅｔａｌ．，２００６；Ｔａｎａｋａｅｔａｌ．，２００９；Ｗｅｎｅｔａｌ．，２０１４；Ｙａｍａｇｕｃｈｉｅｔａｌ．，２０１８；Ｚｈａｏｅｔａｌ．，２００９；Ｚｈａｏｅｔａｌ．，２０１０）が挙げられる。２００９年に、ＭｉｃｈａｌＪ．Ｂｏｌａｎｄｅｔａｌ．は四倍体補償技術を利用してマウス誘導多能性幹細胞から生成されたマウスの出生率は０－７％であり、多くは０％であった（Ｂｏｌａｎｄｅｔａｌ．，２００９）。中でも、ＺｈｏｕＱｉが国際ジャーナルＮＡＴＵＲＥで発表した出生率もわずか０－３％であった（Ｚｈａｏｅｔａｌ．，２００９）。Ｆ１背景の胚性幹細胞は大量の細胞株のスクリーニング、技術改善、及び再クローニングにより、四倍体補償技術によりマウスの生成効率が向上したが、Ｆ１は理想的な遺伝的背景ではなく、該技術も依然として実際の応用の要件を満たしにくく、特に純粋系の胚性幹細胞を用いて四倍体補償技術により遺伝子組換えマウスを直接的に製造することは依然として大きな困難に直面する。

いくつかの実施形態において、本開示は、前記動物の製造方法を使用した、遺伝子編集動物の製造方法を提供する。いくつかの実施形態において、前記動物は遺伝子的にヒト化された動物である。いくつかの実施形態において、前記動物は哺乳動物である。いくつかの実施形態において、前記動物は非ヒト哺乳動物である。いくつかの実施形態において、前記動物はブタ、ラット、マウス、ハムスター、ウサギ、ブタ、ウシ、シカ、ヒツジ、ヤギ、ニワトリ、ネコ、ウマ、イヌ、オランウータン、サルから選択される。いくつかの実施形態において、前記げっ歯類動物はネズミである。いくつかの実施形態において、前記動物は成体ネズミである。いくつかの実施形態において、前記動物は胎児ネズミである。

遺伝子編集マウスの取得は、通常、多能性幹細胞の嚢胚注射、受精卵注射直接編集、体細胞核移植、四倍体補償技術等の複数種がある。中でも、多能性幹細胞の嚢胚注射は、生殖細胞系列を介して伝達されたキメラマウスを取得してさらに継代増殖を行ってホモ接合マウスを取得する必要があり、５ヶ月以上の時間を必要とする。受精卵注射は、一般的に遺伝子ノックアウト編集に用いられ、遺伝子編集ポリシーが制限されかつ技術的に操作の難易度が大きく、その後に生まれたマウスを同定する必要があり、必ずしも目的とするマウスを直接的に取得できるわけではない。体細胞核移植と四倍体補償技術は、いずれもホモ接合体である遺伝子編集マウスを直接的に取得することができるが、二種類の方法の生存率がいずれも低く、１０％以下であり、一般的に１％程度である。そして、体細胞核の移動操作の難易度が大きく、マイクロインジェクションは胚に与えるダメージが大きく、四倍体補償法は胚に直接的なダメージを与えない。遺伝子編集マウスを直接的に取得することに関して、四倍体補償技術は体細胞核移植操作に対して簡単であり、効率が高く、遺伝子編集動物を取得する時間が短く、かつ多能性幹細胞に遺伝子編集を行うことが比較的に容易である。

いくつかの実施形態において、遺伝子マウスの製造方法を提供し、前記方法は、（１）マウスの２－細胞胚を取得するステップと、（２）ステップ（１）に記載の２－細胞胚を融合液に入れ、融合させ、四倍体胚を取得するステップと、（３）ステップ（２）における四倍体胚を培地に入れて培養するステップと、（４）ステップ（３）における２－細胞期に発育した四倍体胚を胚性幹細胞と重合させ、キメラ胚を形成するステップと、（５）ステップ（４）におけるキメラ胚を偽妊娠したマウスの子宮に移植し、胚を満期妊娠に発育させることにより、遺伝子編集マウスを取得するステップと、を含む。

いくつかの実施形態において、前記方法は、胚性幹細胞及び四倍体胚を重合させ新たな再構成胚を形成することを含む。ここで、前記胚性幹細胞は一般的な胚性幹細胞であってもよく、遺伝子編集された胚性幹細胞であってもよく、例えばヒト化遺伝子の動物胚性幹細胞等であり、具体的には限定されない。

いくつかの実施形態において、四倍体胚と胚性幹細胞を重合させ新たな再構成胚又はキメラ胚を形成することを含み、前記四倍体胚は２－細胞期にある四倍体胚である、動物キメラ胚の製造方法を提供する。

いくつかの実施形態において、前記方法は四倍体補償法又は四倍体胚相補法を使用する。

いくつかの実施形態において、前記方法は、（１）動物の２－細胞胚を取得するステップと、（２）ステップ（１）に記載の２－細胞胚を融合液に入れ、融合させ、四倍体胚を取得するステップと、（３）ステップ（２）における四倍体胚を培地に入れて培養するステップと、（４）ステップ（３）における２－細胞期に発育した四倍体胚を胚性幹細胞と重合させ、キメラ胚を形成するステップと、を含む。いくつかの実施形態において、ステップ（３）における培養時間は８－２４時間である。いくつかの実施形態において、ステップ（３）における培地はＫＳＯＭ培地である。いくつかの実施形態において、前記動物は哺乳動物である。いくつかの実施形態において、前記動物は非ヒト哺乳動物である。いくつかの実施形態において、前記動物はブタ、ラット、マウス、ハムスター、ウサギ、ブタ、ウシ、シカ、ヒツジ、ヤギ、ニワトリ、ネコ、ウマ、イヌ、オランウータン、サルから選択される。いくつかの実施形態において、前記動物はネズミから選択される。いくつかの実施形態において、前記動物は成体ネズミから選択される。いくつかの実施形態において、前記動物は胎児ネズミから選択される。

いくつかの実施形態において、前記方法は、２－細胞期に発育した四倍体胚を胚性幹細胞と重合させキメラ胚を得ることを含む。本発明者らはさらに意外に、２－細胞期の四倍体胚と胚性幹細胞との重合を利用し、四倍体補償技術を利用してマウスを製造する効率安定性が低く、純粋系マウスからの胚性幹細胞の効率が低いという問題を大幅に改善し、マウスの出生率を質的に向上させ、正常な胚移植に近づけ、同時に現在の最先端の遺伝子編集方法Ｃａｓ９の限界性を克服し、幹細胞から胚及び成体ネズミを直接製造して表現型研究を行うことができ、ネズミの繁殖に必要な大量の時間、人力及び物資を節約し、四倍体補償技術で遺伝子組換えマウスを製造するための実用性の問題を徹底的に解決し、商業化のレベルに達することを発見した。

いくつかの実施形態において、動物の製造方法において、成分がマンニトール、ＭｇＳＯ₄、ＣａＣｌ₂及びウシ血清アルブミンを含む組成物が使用され、前記マンニトール、ＭｇＳＯ₄、ＣａＣｌ₂及びウシ血清アルブミンの質量比は９～５３：０．０１５～０．２４１：０．０１３～０．２３：０．０１～５である。

いくつかの実施形態において、前記方法は、成分がマンニトール、ＭｇＳＯ₄、ＣａＣｌ₂及びウシ血清アルブミンを含む組成物が使用され、前記マンニトール、ＭｇＳＯ₄、ＣａＣｌ₂及びウシ血清アルブミンの質量比は９～５３：０．０１５～０．２４１：０．０１３～０．２３：０．０１～５である。

いくつかの実施形態において、前記組成物におけるマンニトール、ＭｇＳＯ₄、ＣａＣｌ₂及びウシ血清アルブミンの質量比は１８～５２：０．０１８～０．２４１：０．０１６～０．２３：０．０１－４である。

いくつかの実施形態において、前記組成物におけるマンニトール、ＭｇＳＯ₄、ＣａＣｌ₂及びウシ血清アルブミンの質量比は２７～５２：０．０１８～０．１２：０．０１６～０．１：１～３．５である。

いくつかの実施形態において、前記組成物は、マンニトール０．０５－０．２９Ｍ、ＭｇＳＯ₄０．１２－２ｍＭ、ＣａＣｌ₂０．１２－２ｍＭ、ウシ血清アルブミン０．０１－５ｍｇ／ｍＬという成分を含む。

いくつかの実施形態において、前記組成物は、マンニトール０．１－０．２８Ｍ、ＭｇＳＯ₄０．１５－２ｍＭ、ＣａＣｌ₂０．１５－２ｍＭ、ウシ血清アルブミン０．０１－４ｍｇ／ｍＬという成分を含む。

いくつかの実施形態において、前記組成物は、マンニトール０．１５－０．２８Ｍ、ＭｇＳＯ₄０．１５－１ｍＭ、ＣａＣｌ₂０．１５－１ｍＭ、ウシ血清アルブミン１－３．５ｍｇ／ｍＬという成分を含む。

いくつかの実施形態において、前記組成物は、マンニトール０．１８－０．２８Ｍ、ＭｇＳＯ₄０．１５－０．５ｍＭ、ＣａＣｌ₂０．１５－０．５ｍＭ、ウシ血清アルブミン２－３．５ｍｇ／ｍＬという成分を含む。

いくつかの実施形態において、前記組成物は、マンニトール０．２－０．２８Ｍ、ＭｇＳＯ₄０．１５－０．３ｍＭ、ＣａＣｌ₂０．１５－０．３ｍＭ、ウシ血清アルブミン２－３ｍｇ／ｍＬという成分を含む。

いくつかの実施形態において、前記組成物は、マンニトール０．２７Ｍ、ＭｇＳＯ₄０．２ｍＭ、ＣａＣｌ₂０．２ｍＭ、ウシ血清アルブミン３ｍｇ／ｍＬという成分を含む。

いくつかの実施形態において、前記組成物を母液として、次に所望の濃度の作業液に調製してもよい。

いくつかの実施形態において、前記組成物は作業液であってもよく、調製する必要がなく、そのまま使用することができる。

いくつかの実施形態において、本開示は、遺伝子編集動物胚細胞又は遺伝子編集動物の製造における前記組成物の応用を提供する。

いくつかの実施形態において、前記組成物は動物の四倍体胚を製造するために用いられる。

いくつかの実施形態において、前記方法は、マンニトール、ウシ血清アルブミン、Ｍｇ²⁺及びＣａ²⁺を含む融合液が使用され、前記融合液は濃度を向上させたＭｇ²⁺及びＣａ²⁺を有し、又は、前記融合液のＭｇ²⁺及びＣａ²⁺の濃度はそれぞれ０．１２－２ｍＭ、０．１２－２ｍＭである。

いくつかの実施形態において、前記融合液におけるマンニトール、ウシ血清アルブミンの濃度はそれぞれ０．０５－０．２９Ｍ、０．０１－５ｍｇ／ｍＬである。

いくつかの実施形態において、前記Ｍｇ²⁺及びＣａ²⁺はそれぞれＭｇＳＯ₄及びＣａＣｌ₂に由来する。

いくつかの実施形態において、前記融合液は四倍体胚を製造するために用いられる。

現在、四倍体の取得方法は生物法、化学法及び物理法による製造が挙げられる。マイクロマニピュレーションにより、２つの二倍体胚細胞核を１つの１－細胞期胚細胞の細胞質に注射することは操作技術に対する要求が高く、同時にマイクロマニピュレーションは胚に対する損害が大きい。サイトカラシンＢ又はコルヒチンを使用して卵割球細胞の分裂を抑制して四倍体を製造することは胚の発育に悪影響を与え、胚の発育を遅らせたり妨げたりすることさえある。また、センダイウイルス、ポリエチレングリコール、直流電撃等の方法を採用して細胞を融合させることができ、センダイウイルスは病原性があり、ポリエチレングリコールは毒性が残存するのに対して、電気融合法は短時間で可逆的なエレクトロポレーションが生じるだけで、化学試薬の毒性及びウイルスの病原性を排除し、四倍体胚を製造するための最も一般的で最も効率的な方法である。しかし、従来の四倍体補償技術には、胚の電気融合効率が１００％に達せず、マウスを製造する効率安定性が低く、純粋系マウスからの胚性幹細胞に対する効率が低いという問題が存在する。本発明者らは研究過程において、本開示の改善された電気融合液を使用する場合の融合効率が８０－９０％から１００％に向上することができ、大きな実用的意義を有することを意外に発見した。

いくつかの実施形態において、本開示は、前記方法で製造された動物を提供する。

いくつかの実施形態において、前記動物は哺乳動物である。いくつかの実施形態において、前記動物は非ヒト哺乳動物である。いくつかの実施形態において、前記動物はブタ、ラット、マウス、ハムスター、ウサギ、ブタ、ウシ、シカ、ヒツジ、ヤギ、ニワトリ、ネコ、ウマ、イヌ、オランウータン、サルから選択される。いくつかの実施形態において、前記動物はネズミから選択される。いくつかの実施形態において、前記動物は成体ネズミから選択される。いくつかの実施形態において、前記動物は胎児ネズミから選択される。いくつかの実施形態において、前記動物は遺伝子編集動物から選択される。いくつかの実施形態において、前記動物は遺伝子ヒト化動物から選択される。いくつかの実施形態において、前記遺伝子はＡＣＥ２である。

いくつかの実施形態において、本開示は、マンニトール、ウシ血清アルブミン、Ｍｇ²⁺及びＣａ²⁺を含有する融合液を提供し、前記融合液は濃度を向上させたＭｇ²⁺及びＣａ²⁺を有し、又は、前記融合液のＭｇ²⁺及びＣａ²⁺の濃度はそれぞれ０．１２－２ｍＭ、０．１２－２ｍＭである。

いくつかの実施形態において、前記融合液体におけるマンニトール、ウシ血清アルブミンの濃度はそれぞれ０．０５－０．２９Ｍ、０．０１－５ｍｇ／ｍＬである。

いくつかの実施形態において、前記動物の製造方法は前記融合液を使用する。

いくつかの実施形態において、本開示は、遺伝子編集動物又はその子孫の組織、体液、細胞、細胞核及びそれらの破砕物又は抽出物を提供し、前記動物は上記方法で構築されるものである。いくつかの実施形態において、前記動物は哺乳動物である。いくつかの実施形態において、前記動物は非ヒト哺乳動物である。いくつかの実施形態において、前記動物はブタ、ラット、マウス、ハムスター、ウサギ、ブタ、ウシ、シカ、ヒツジ、ヤギ、ニワトリ、ネコ、ウマ、イヌ、オランウータン、サルから選択される。いくつかの実施形態において、前記動物はネズミから選択される。いくつかの実施形態において、前記動物は成体ネズミから選択される。いくつかの実施形態において、前記動物は胎児ネズミから選択される。

ヒト由来ＡＣＥ２及びネズミ由来ＡＣＥ２は、遺伝子配列に一定の差異が存在するため、ウイルス感染後、ヒト由来ＡＣＥ２はネズミ由来ＡＣＥ２よりもＳＡＲＳ－ＣｏＶに対する感受性がより強く、病理学的症状がより明らかであることが文献で報告されている。現在の臨床研究では、より優れた動物モデルが緊急に必要とされている。

ｈＡＣＥ２遺伝子組換えマウスは２０１９－ｎＣｏＶに感染可能で肺組織の典型的な病原性特徴が現れることが確認された（https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2020.02.07.939389v3#disqus_thread）。ｈＡＣＥ２遺伝子組換えマウスはｈＡＣＥ２の全身性過剰発現のマウスモデルであり、ＡＣＥ２時空間的組織発現特徴をシミュレーションすることができない。

いくつかの実施形態において、本開示は、マウスＡＣＥ２部位でヒト化ＡＣＥ２を発現させる方法で２０１９－ｎＣｏＶ感受性マウスヒト化ＡＣＥ２動物モデルを大量に製造することにより、２０１９－ｎＣｏＶに対して薬物スクリーニング及び疾患研究等の応用を行う。

いくつかの実施形態において、本開示は、特異的なＲＮＡ断片配列を提供する。

いくつかの実施形態において、前記ＲＮＡ断片配列は、単離されたＲＮＡ断片配列である。

いくつかの実施形態において、本開示は、ＡＣＥ２遺伝子を標的とする特異的ｓｇＲＮＡ配列を提供する。

いくつかの実施形態において、前記ｓｇＲＮＡ配列は、単離されたｓｇＲＮＡ配列である。いくつかの実施形態において、本開示は、ＡＣＥ２遺伝子を標的とする特異的ターゲティングベクターを提供する。

いくつかの実施形態において、前記ターゲティングベクターは、単離されたターゲティングベクターである。

いくつかの実施形態において、本開示は、ＡＣＥ２遺伝子ヒト化細胞株を提供する。

いくつかの実施形態において、本開示は、ＡＣＥ２遺伝子ヒト化細胞株の製造方法を提供する。

いくつかの実施形態において、本開示は、ＡＣＥ２遺伝子ヒト化動物を提供する。

いくつかの実施形態において、本開示は、遺伝子ヒト化動物の製造方法を提供する。

いくつかの実施形態において、本開示は、ＡＣＥ２遺伝子ヒト化マウス胚性幹細胞モデルを提供する。

いくつかの実施形態において、本開示は、ＳＥＱＩＤＮＯ：１９に示される配列と少なくとも８５％又は少なくとも９０％又は少なくとも９１％又は少なくとも９２％又は少なくとも９３％又は少なくとも９４％又は少なくとも９５％又は少なくとも９６％又は少なくとも９７％又は少なくとも９８％又は少なくとも９９％、又は１００％の同一性を有する上流プライマーと、ＳＥＱＩＤＮＯ：２０に示される配列と少なくとも８５％又は少なくとも９０％又は少なくとも９１％又は少なくとも９２％又は少なくとも９３％又は少なくとも９４％又は少なくとも９５％又は少なくとも９６％又は少なくとも９７％又は少なくとも９８％又は少なくとも９９％、又は１００％の同一性を有する下流プライマーとを含むプライマー組み合わせを提供する。

いくつかの実施形態において、上記プライマーは、単離されたプライマーである。

いくつかの実施形態において、前記プライマー組み合わせは、ＳＥＱＩＤＮＯ：２１に示される配列と少なくとも８５％又は少なくとも９０％又は少なくとも９１％又は少なくとも９２％又は少なくとも９３％又は少なくとも９４％又は少なくとも９５％又は少なくとも９６％又は少なくとも９７％又は少なくとも９８％又は少なくとも９９％、又は１００％の同一性を有する上流プライマーと、ＳＥＱＩＤＮＯ：２２に示される配列と少なくとも８５％又は少なくとも９０％又は少なくとも９１％又は少なくとも９２％又は少なくとも９３％又は少なくとも９４％又は少なくとも９５％又は少なくとも９６％又は少なくとも９７％又は少なくとも９８％又は少なくとも９９％、又は１００％の同一性を有する下流プライマーとをさらに含む。

いくつかの実施形態において、前記プライマー組み合わせは、ＳＥＱＩＤＮＯ：２３に示される配列と少なくとも８５％又は少なくとも９０％又は少なくとも９１％又は少なくとも９２％又は少なくとも９３％又は少なくとも９４％又は少なくとも９５％又は少なくとも９６％又は少なくとも９７％又は少なくとも９８％又は少なくとも９９％、又は１００％の同一性を有する上流プライマーと、ＳＥＱＩＤＮＯ：２４に示される配列と少なくとも８５％又は少なくとも９０％又は少なくとも９１％又は少なくとも９２％又は少なくとも９３％又は少なくとも９４％又は少なくとも９５％又は少なくとも９６％又は少なくとも９７％又は少なくとも９８％又は少なくとも９９％、又は１００％の同一性を有する下流プライマーとをさらに含む。

いくつかの実施形態において、前記プライマー組み合わせは、ＳＥＱＩＤＮＯ：２５に示される配列と少なくとも８５％又は少なくとも９０％又は少なくとも９１％又は少なくとも９２％又は少なくとも９３％又は少なくとも９４％又は少なくとも９５％又は少なくとも９６％又は少なくとも９７％又は少なくとも９８％又は少なくとも９９％、又は１００％の同一性を有する上流プライマーと、ＳＥＱＩＤＮＯ：２６に示される配列と少なくとも８５％又は少なくとも９０％又は少なくとも９１％又は少なくとも９２％又は少なくとも９３％又は少なくとも９４％又は少なくとも９５％又は少なくとも９６％又は少なくとも９７％又は少なくとも９８％又は少なくとも９９％、又は１００％の同一性を有する下流プライマーとをさらに含む。

いくつかの実施形態において、本開示は、前記プライマー組み合わせの、細胞株又は細胞系又は非ヒト動物の製造における応用を提供する。

いくつかの実施形態において、上記細胞は、単離された細胞である。

いくつかの実施形態において、前記動物は哺乳動物である。いくつかの実施形態において、前記動物はブタ、ラット、マウス、ハムスター、ウサギ、ブタ、ウシ、シカ、ヒツジ、ヤギ、ニワトリ、ネコ、ウマ、イヌ、オランウータン又はサルから選択される。いくつかの実施形態において、前記哺乳動物はげっ歯類動物である。いくつかの実施形態において、前記動物はネズミである。いくつかの実施形態において、前記動物は成体ネズミから選択される。いくつかの実施形態において、前記動物は胎児ネズミから選択される。

いくつかの実施形態において、前記動物は遺伝子ヒト化動物である。

いくつかの実施形態において、前記遺伝子はＡＣＥ２である。

いくつかの実施形態において、本開示は、前記プライマー組み合わせの、ターゲッティングベクターの製造における応用を提供する。

いくつかの実施形態において、本開示は、互いに連結された５’相同性アーム配列、ヒト由来ＡＣＥ２遺伝子断片及びＳＶ４０ｐｏｌｙＡ配列を含むターゲッティングベクターを提供し、前記５’相同性アームは前記対象ゲノム遺伝子座での５’標的配列と相同性を有する５’相同性アームである。

いくつかの実施形態において、上記ターゲッティングベクターは、単離されたターゲッティングベクターである。

いくつかの実施形態において、前記ターゲッティングベクターは、前記プライマー組み合わせを使用することにより、５’相同性アーム配列、ヒト由来ＡＣＥ２遺伝子断片及びＳＶ４０ｐｏｌｙＡ配列を連結する。

いくつかの実施形態において、前記ターゲッティングベクターは、ヒト由来ＡＣＥ２遺伝子のＣＤＳ配列を動物遺伝子のプロモーター及び５’ＵＴＲ領域配列に挿入した後、動物目的遺伝子プロモーターを利用してヒト目的遺伝子の発現を起動するために用いられる。

いくつかの実施形態において、前記５’相同性アーム配列は、ＳＥＱＩＤＮＯ：１５に示される配列と少なくとも８５％又は少なくとも９０％又は少なくとも９１％又は少なくとも９２％又は少なくとも９３％又は少なくとも９４％又は少なくとも９５％又は少なくとも９６％又は少なくとも９７％又は少なくとも９８％又は少なくとも９９％、又は１００％の同一性を有する。

いくつかの実施形態において、前記ＡＣＥ２遺伝子のＣＤＳ配列は、ＳＥＱＩＤＮＯ：１２に示される配列と少なくとも８５％又は少なくとも９０％又は少なくとも９１％又は少なくとも９２％又は少なくとも９３％又は少なくとも９４％又は少なくとも９５％又は少なくとも９６％又は少なくとも９７％又は少なくとも９８％又は少なくとも９９％、又は１００％の同一性を有する。

いくつかの実施形態において、前記ＳＶ４０ｐｏｌｙＡ配列は、ＳＥＱＩＤＮＯ：１４に示される配列と少なくとも８５％又は少なくとも９０％又は少なくとも９１％又は少なくとも９２％又は少なくとも９３％又は少なくとも９４％又は少なくとも９５％又は少なくとも９６％又は少なくとも９７％又は少なくとも９８％又は少なくとも９９％、又は１００％の同一性を有する。

いくつかの実施形態において、前記ＳＶ４０ｐｏｌｙＡ配列は、前記ＣＤＳ配列の後に位置する。

いくつかの実施形態において、前記ターゲッティングベクターは、３’相同性アームをさらに含み、前記３’相同性アームは前記対象ゲノム遺伝子座での３’標的配列と相同性を有する３’相同性アームである。

いくつかの実施形態において、前記ターゲッティングベクターは、ＳＥＱＩＤＮＯ：１７に示される配列と少なくとも８５％又は少なくとも９０％又は少なくとも９１％又は少なくとも９２％又は少なくとも９３％又は少なくとも９４％又は少なくとも９５％又は少なくとも９６％又は少なくとも９７％又は少なくとも９８％又は少なくとも９９％、又は１００％の同一性を有するスクリーニングマーカーＰＧＫ－Ｐｕｒｏをさらに含む。

いくつかの実施形態において、前記ターゲッティングベクターは、ＳＥＱＩＤＮＯ：１８に示される配列と少なくとも８５％又は少なくとも９０％又は少なくとも９１％又は少なくとも９２％又は少なくとも９３％又は少なくとも９４％又は少なくとも９５％又は少なくとも９６％又は少なくとも９７％又は少なくとも９８％又は少なくとも９９％、又は１００％の同一性を有するＦｒｔ配列をさらに含む。

いくつかの実施形態において、前記ターゲッティングベクターの各配列断片の連結順序は順に５’相同性アーム配列、ヒト由来ＡＣＥ２遺伝子断片、ＳＶ４０ｐｏｌｙＡ配列、ｆｒｔ配列、ＰＧＫ－Ｐｕｒｏ配列、ｆｒｔ配列及び３’相同性アーム配列となっている。

いくつかの実施形態において、前記動物は哺乳動物である。いくつかの実施形態において、前記動物はブタ、ラット、マウス、ハムスター、ウサギ、ブタ、ウシ、シカ、ヒツジ、ヤギ、ニワトリ、ネコ、ウマ、イヌ、オランウータン、サルから選択される。いくつかの実施形態において、前記哺乳動物はげっ歯類動物である。いくつかの実施形態において、前記動物はネズミである。いくつかの実施形態において、前記動物は成体ネズミから選択される。いくつかの実施形態において、前記動物は胎児ネズミから選択される。

いくつかの実施形態において、本開示は、前記ターゲッティングベクターの遺伝子ヒト化動物モデルの製造における応用を提供する。前記ヒト化ＡＣＥ２マウスモデルは元のマウスＡＣＥ２部位が特異的に発現されたｈＡＣＥ２マウスモデルであり、元のｍＡＣＥ２の発現特徴をシミュレーションすることができ、組織特異性を有し、ヒトが２０１９－ｎＣｏＶに感染する発症過程をより厳密にシミュレーションすることができる。

いくつかの実施形態において、本開示は、ＰＣＲ増幅により得られた産物断片である５’相同性アーム、ヒトＡＣＥ２ＣＤＳ及びＳＶ４０ｐｏｌｙＡをブリッジＰＣＲ法で連続断片５ａｒｍ－ｈＡＣＥ－ＳＶ４０にＰＣＲするステップを含む、前記ターゲッティングベクターの製造方法を提供する。

いくつかの実施形態において、前記ＰＣＲの反応系は、２×ＰｈａｎｔａＭａｘＢｕｆｆｅｒが約２５μＬ、ｄＮＴＰＭｉｘが約１μＬ、１０μＭ上流プライマーが約２μＬ、１０μＭ下流プライマーが約２μＬ、ＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅが約１μＬ、テンプレートチェーン５’相同性アーム、ヒトＡＣＥ２ＣＤＳ、ＳＶ４０ｐｏｌｙＡ断片がそれぞれ約２０－２００ｎｇ、５０μＬまでＨ₂Ｏを補足し、ＰＣＲ増幅反応条件が約６２－６８℃で開始し、各サイクルが約０．２－０．５℃下げるとされている。

いくつかの実施形態において、前記５’相同性アーム断片を増幅するために用いられるプライマーは、ＳＥＱＩＤＮＯ：１９に示される配列と少なくとも８５％又は少なくとも９０％又は少なくとも９１％又は少なくとも９２％又は少なくとも９３％又は少なくとも９４％又は少なくとも９５％又は少なくとも９６％又は少なくとも９７％又は少なくとも９８％又は少なくとも９９％、又は１００％の同一性を有する上流プライマーと、ＳＥＱＩＤＮＯ：２０に示される配列と少なくとも８５％又は少なくとも９０％又は少なくとも９１％又は少なくとも９２％又は少なくとも９３％又は少なくとも９４％又は少なくとも９５％又は少なくとも９６％又は少なくとも９７％又は少なくとも９８％又は少なくとも９９％、又は１００％の同一性を有する下流プライマーとを含む。

いくつかの実施形態において、前記プライマーは、単離されたプライマーである。

いくつかの実施形態において、前記ヒト由来ＡＣＥ２遺伝子断片を増幅するために用いられるプライマーは、ＳＥＱＩＤＮＯ：２１に示される配列と少なくとも８５％又は少なくとも９０％又は少なくとも９１％又は少なくとも９２％又は少なくとも９３％又は少なくとも９４％又は少なくとも９５％又は少なくとも９６％又は少なくとも９７％又は少なくとも９８％又は少なくとも９９％、又は１００％の同一性を有する上流プライマーと、ＳＥＱＩＤＮＯ：２２に示される配列と少なくとも８５％又は少なくとも９０％又は少なくとも９１％又は少なくとも９２％又は少なくとも９３％又は少なくとも９４％又は少なくとも９５％又は少なくとも９６％又は少なくとも９７％又は少なくとも９８％又は少なくとも９９％、又は１００％の同一性を有する下流プライマーとを含む。

いくつかの実施形態において、前記ＳＶ４０ｐｏｌｙＡ配列に使用されるプライマーは、ＳＥＱＩＤＮＯ：２３に示される配列と少なくとも８５％又は少なくとも９０％又は少なくとも９１％又は少なくとも９２％又は少なくとも９３％又は少なくとも９４％又は少なくとも９５％又は少なくとも９６％又は少なくとも９７％又は少なくとも９８％又は少なくとも９９％、又は１００％の同一性を有する上流プライマーと、ＳＥＱＩＤＮＯ：２４に示される配列と少なくとも８５％又は少なくとも９０％又は少なくとも９１％又は少なくとも９２％又は少なくとも９３％又は少なくとも９４％又は少なくとも９５％又は少なくとも９６％又は少なくとも９７％又は少なくとも９８％又は少なくとも９９％、又は１００％の同一性を有する下流プライマーとを含む。

いくつかの実施形態において、前記方法は、５ａｒｍ－ｈＡＣＥ－ＳＶ４０断片に対してＡｇｅＩ＋ＭｌｕＩダブルダイジェスションを行い、３’相同性アーム断片に対してＡｓｃＩ＋ＨｉｎｄＩＩＩダブルダイジェスションを行った後に、それぞれダイジェスション・ライゲーションの方法により連結することにより、ターゲッティングベクターを得るステップをさらに含む。

いくつかの実施形態において、前記３’相同性アーム断片に使用されるプライマーは、ＳＥＱＩＤＮＯ：２５に示される配列と少なくとも８５％又は少なくとも９０％又は少なくとも９１％又は少なくとも９２％又は少なくとも９３％又は少なくとも９４％又は少なくとも９５％又は少なくとも９６％又は少なくとも９７％又は少なくとも９８％又は少なくとも９９％、又は１００％の同一性を有する上流プライマーと、ＳＥＱＩＤＮＯ：２６に示される配列と少なくとも８５％又は少なくとも９０％又は少なくとも９１％又は少なくとも９２％又は少なくとも９３％又は少なくとも９４％又は少なくとも９５％又は少なくとも９６％又は少なくとも９７％又は少なくとも９８％又は少なくとも９９％、又は１００％の同一性を有する下流プライマーとを含む。

いくつかの実施形態において、本開示は、前記プライマー組み合わせを使用するヒト化動物細胞株の製造方法を提供する。

いくつかの実施形態において、前記方法は前記ターゲッティングベクターを使用することを含む。

いくつかの実施形態において、前記方法はヒト目的遺伝子を動物細胞に導入することにより、目的遺伝子が動物細胞内でヒト目的遺伝子のＣＤＳを発現することを含む。

いくつかの実施形態において、前記目的遺伝子はＡＣＥ２である。

いくつかの実施形態において、前記動物は哺乳動物である。いくつかの実施形態において、前記動物はげっ歯類動物である。いくつかの実施形態において、前記動物はネズミである。

いくつかの実施形態において、前記細胞は胚性幹細胞である。

いくつかの実施形態において、前記製造方法は、（１）前記ターゲッティングベクターを製造するステップと、（２）製造されたターゲッティングベクター、及びｓｇＲＮＡが連結されたベクターを動物由来の胚性幹細胞に導入するステップと、（３）ステップ（２）における胚性幹細胞をクローンに培養すれば得られるステップと、を含む。

いくつかの実施形態において、前記ｓｇＲＮＡは、ＳＥＱＩＤＮＯ：１又はＳＥＱＩＤＮＯ：２に示される配列と少なくとも８５％又は少なくとも９０％又は少なくとも９１％又は少なくとも９２％又は少なくとも９３％又は少なくとも９４％又は少なくとも９５％又は少なくとも９６％又は少なくとも９７％又は少なくとも９８％又は少なくとも９９％、又は１００％の同一性を有するｓｇＲＮＡを含む。

いくつかの実施形態において、前記動物は哺乳動物である。いくつかの実施形態において、前記動物はブタ、ラット、マウス、ハムスター、ウサギ、ブタ、ウシ、シカ、ヒツジ、ヤギ、ニワトリ、ネコ、ウマ、イヌ、オランウータン、サルから選択される。いくつかの実施形態において、前記哺乳動物はげっ歯類動物である。いくつかの実施形態において、前記げっ歯類動物はネズミである。いくつかの実施形態において、前記動物は成体ネズミから選択される。いくつかの実施形態において、前記動物は胎児ネズミから選択される。いくつかの実施形態において、前記動物は遺伝子ヒト化動物である。

いくつかの実施形態において、本開示は、前記方法で製造されたＡＣＥ２遺伝子ヒト化動物細胞株又は細胞系を提供する。

いくつかの実施形態において、前記細胞はヒト化マウス胚性幹細胞である。

いくつかの実施形態において、本開示は、上記プライマー組み合わせを引用することを含む、非ヒト動物の製造方法を提供する。

いくつかの実施形態において、前記製造方法は前記ターゲッティングベクターを使用する。

いくつかの実施形態において、前記細胞を動物体内に注入することを含む。

いくつかの実施形態において、本開示は、上記方法で製造された非ヒト動物を提供する。

いくつかの実施形態において、前記ヒト化マウス胚性幹細胞はヒトＡＣＥ２遺伝子を含み、該ヒト化マウス胚性幹細胞はマウスモデルに特異的分化又は調製された後にヒトの全長ＡＣＥ２タンパク質を発現することができ、同時に内因性ＡＣＥ２タンパク質の発現が減少又は消失する。

いくつかの実施形態において、本開示は、ヒト化マウス又はその子孫の組織、体液、細胞、及びそれらの破砕物又は抽出物を提供し、前記ヒト化マウスは上記方法で製造される。

いくつかの実施形態において、本開示は、前記製造方法で得られたヒト化動物モデル又はその子孫の、ヒト抗体の製造、又は薬理学、免疫学、微生物学及び医学研究のモデル系における応用、又は動物実験疾患モデルの生産及び利用、病原学研究及び／又は新たな診断戦略及び／又は治療戦略の開発における応用、又はＡＣＥ２遺伝子機能、ＡＣＥ２抗体、ＡＣＥ２標的に対する薬物のスクリーニング、検証、評価または研究、薬効研究の方面における用途を提供する。

ｐＸ３３０プラスミドマップである。ｐＸ３３０－ｓｇＲＮＡ１の構築配列決定結果図である。ｐＸ３３０－ｓｇＲＮＡ２の構築配列決定結果図である。ｐＸ３３０－ｓｇＲＮＡ１－３の切断効率の検証結果である。ｐＸ３３０－ｓｇＲＮＡ３の構築配列決定結果図である。ヒト化ＡＣＥ２のターゲッティングスキームの概略図である。ヒト化ＡＣＥ２のターゲッティングベクターの配列決定結果情報である。比較例１における連結された３つの断片のＰＣＲ同定図である。ヒト化ＡＣＥ２マウス胚性幹細胞遺伝子型のＰＣＲ同定結果図である。ＰＧＫ－Ｐｕｒｏを削除した後のヒト化ＡＣＥ２マウス胚性幹細胞遺伝子型のＰＣＲ同定結果図である。ヒト化ＡＣＥ２遺伝子の概略図である。例８で形成されたヒト化ＡＣＥ２遺伝子改造マウスの画像である。ｑＰＣＲでヒト化ＡＣＥ２マウスのｈＡＣＥ２の発現を測定した結果、ヒト化ＡＣＥ２マウス組織がｈＡＣＥ２を特異的に発現し、野生型マウスがｈＡＣＥ２を発現しないことを示す。ｑＰＣＲでヒト化ＡＣＥ２マウスのｍＡＣＥ２の発現を測定した結果、ｈＡＣＥ２マウスのｍＡＣＥ２の発現が欠失したことを示す。ウェスタンブロッティング実験でｈＡＣＥ２マウス及び野生型ＡＣＥ２マウスの腸組織におけるｈＡＣＥ２タンパク質の発現を測定した結果、ｈＡＣＥ２マウスがタンパク質レベルでｈＡＣＥ２タンパク質を発現したことを示す。例１０、試験例１、例１１、試験例２でマウスを製造するフローチャートである。例１２、試験例３、例１３、試験例４でマウスを製造するフローチャートである。例１０－１３のマウスの出生率を示す結果図である。試験例１－４のマウスの出生率を示す結果図である。

以下、具体的な実施例により本開示の技術的解決手段をさらに説明し、具体的な実施例は本開示の保護範囲を限定するものではない。他の人が本開示の概念に基づいて行ったいくつかの本質的でない修正及び調整は依然として本発明の保護範囲に属する。

別途に定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術と科学用語の定義は当業者によく知られている定義と同じである。なお、記載された内容と類似するか又は均等である任意の方法及び材料はいずれも本開示の方法に適用することができ、具体的な実施形態において好ましい方法及び材料が説明されている。

本明細書で使用された「一」及び「一種」は文法上の不定冠詞の解釈を意味し、「一つ」、「一種」又は「複数」、「複数種」（即ち「少なくとも一つ」、「少なくとも一種」）を意味する。例えば「一要素」は、一種又は複数種の要素を意味する。

「ＣＤＳ」はコード配列（Ｃｏｄｉｎｇｓｅｑｕｅｎｃｅ）の略語であり、「コード配列」は遺伝子のポリペプチド産物をコードするための任意のヌクレオチド配列を意味する。逆に、「非コード配列」という用語とは、遺伝子のポリペプチド産物をコードしない任意のヌクレオチド配列を意味する。

「断片」という用語とは、参照核酸よりも長さが短く、共通部分に参照核酸と同じヌクレオチド配列を含むヌクレオチド配列を意味すると理解されるべきである。適切であれば、本開示に係るこのような核酸断片は、より大きなポリヌクレオチドに含まれてもよく、該断片はより大きなポリヌクレオチドの構成成分である。このような断片は、本開示の核酸の少なくとも６、８、９、１０、１２、１５、１８、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３９、４０、４２、４５、４８、５０、５１、５４、５７、６０、６３、６６、７０、７５、７８、８０、９０、１００、１０５、１２０、１３５、１５０、２００、３００、５００、７２０、９００、１０００又は１５００個の連続したヌクレオチド範囲内の長さのオリゴヌクレオチドを含み、又は選択的にこのようなオリゴヌクレオチドで構成される。

本明細書において、文脈上別段の要求がない限り、単語「含む」、「含有する」は前記ステップ又は要素又はステップ及び要素の集合を含むと理解されるべきであるが、任意の他のステップ又は要素又はステップ及び要素の集合を排除するものではない。すなわち、開放式限定とされている。

「対応する」とは、（ａ）あるポリヌクレオチドは、参照ヌクレオチド配列の全部又は一部と実質的に同一又は相補的なヌクレオチド配列を有し、又は、あるポリヌクレオチドはペプチド又はタンパク質中のアミノ酸配列と完全に同一のアミノ酸配列をコードすること、又は、（ｂ）あるペプチド又はポリペプチドは、参照ペプチド又はタンパク質中のアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有することを意味する。

「下流」という用語とは、参照ヌクレオチド配列３’端に位置するヌクレオチド配列を意味する。特に、下流ヌクレオチド配列は、通常、転写開始点の後の配列に関する。例えば、遺伝子の翻訳開始コドンは転写開始部位の下流に位置する。

「上流」という用語とは、参照ヌクレオチド配列５’端に位置するヌクレオチド配列を意味する。特に、上流ヌクレオチドは、通常、コード配列又は転写開始点の５’側に位置する配列に関する。例えば、ほとんどのプロモーターは転写開始部位の上流に位置する。

「プロモーター」とは、コード配列又は機能性ＲＮＡの発現を制御することができるＤＮＡ配列を意味する。一般的に、コード配列はプロモータ配列の３’端に位置する。プロモーターは全体的に天然遺伝子に由来するか、又は天然に見られる異なるプロモーターに由来する異なる要素から構成され、又は合成されたＤＮＡセグメントを含むことさえあり得る。当業者に理解されるように、異なるプロモーターは遺伝子が異なる組織又は細胞タイプにおいて、又は発育の異なる段階において、又は異なる環境又は生理的条件に応答して発現するように指導することができる。ほとんどの細胞タイプにおいてほとんどの場合に遺伝子を発現させるプロモーターは、通常「構成型プロモーター」と呼ばれる。特定の細胞タイプにおいて遺伝子を発現させるプロモーターは、通常「細胞特異的プロモーター」又は「組織特異的プロモーター」と呼ばれる。遺伝子を特定の発育又は細胞分化段階で発現させるプロモーターは、通常「発育特異的プロモーター」又は「細胞分化特異的プロモーター」と呼ばれる。プロモーターを誘導する薬剤、生体分子、化学品、リガンド、光又は類似物に細胞を暴露又はこれらの物質で細胞を処理した後に誘導され遺伝子を発現させるプロモーターは、通常「誘導型プロモーター」又は「調節型プロモーター」と呼ばれる。さらに理解されたいことは、ほとんどの場合、調節配列の正確な限界が完全に限定されていないため、異なる長さのＤＮＡセグメントは同じプロモーター活性を有する可能性がある。

「５’ＵＴＲ」又は「５’非コード配列」又は「５’非翻訳領域（ＵＴＲ）」という用語とは、コード配列の上流側（５’）に位置するＤＮＡ配列を意味する。

「制限エンドヌクレアーゼ」及び「制限酵素」という用語とは、二本鎖ＤＮＡ内の特定のヌクレオチド配列に結合して切断する酵素を意味する。

「ベクター」という用語とは、それが連結された核酸分子を転移することができる核酸分子を意味する。ベクターの一種のタイプとしては「プラスミド」であり、それは他のＤＮＡセグメントを連結可能な環状の二本鎖ＤＮＡループを意味する。別の種類のベクターとしてはウイルスベクターであり、中でも他のＤＮＡセグメントはウイルスゲノム内に連結することができる。いくつかのベクターは、これらのベクターが導入された宿主細胞において自己複製することができる（例えば、細菌の複製開始点を有する細菌ベクター及びエピソーム哺乳動物ベクターである）。他のベクター（例えば、非エピソーム哺乳動物ベクター）を宿主細胞に導入した後に宿主細胞のゲノムに組み込むことができ、したがって宿主ゲノムと共に複製する。なお、いくつかのベクターはそれらが操作的に連結された遺伝子を発現するように指導することができる。

いくつかのベクターは、本開示において「組換え発現ベクター」（又は単に「発現ベクター」という）と呼ばれることは、挿入された核酸配列が宿主に形質転換された後に発現できるように設計されたベクター、プラスミド又はビヒクルを意味する。要するに、組換えＤＮＡ技術に使用される発現ベクターは常にプラスミド形式である。本明細書の「プラスミド」と「ベクター」は交換して使用され、プラスミドはベクターが最も一般的に使用される形式であるためである。しかし、本開示は、同等の役割を果たすウイルスベクター（例えば、複製欠陥型レトロウイルス、アデノウイルス及びアデノ随伴ウイルス）などの、そのような発現ベクターの他の形式を含むことを意図する。

「プラスミド」という用語は染色体外要素を意味し、それらは常に細胞の中心代謝の一部としない遺伝子を持ち、常に環状二本鎖ＤＮＡ分子の形態をしている。このような要素は任意の由来の自律複製配列、ゲノム組み込み配列、ファージ又はヌクレオチド配列、線形、環状又はスーパーコイルの、一本鎖又は二本鎖のＤＮＡ又はＲＮＡであってもよく、中でも多くのヌクレオチド配列は既に独特な構造に連結又は組換えされており、該構造は選択された遺伝子産物に対するプロモーター断片及びＤＮＡ配列並びに適切な３’端非翻訳配列を細胞に導入することができる。

「ターゲティングベクター」又は「ターゲッティングベクター」は、所望の遺伝的修飾に隣接する、内因性染色体核酸配列に「相同な」配列を含むＤＮＡ構築物である。前記フランキング相同配列（「相同性アーム」と呼ばれる）は、前記相同性アームと対応する内因性配列との間に存在する相同性により、前記ターゲッティングベクターが前記ゲノムにおける特定の染色体位置に位置決めされるように指導し、「相同組換え」と呼ばれる過程により前記所望の遺伝的修飾を導入する。「ターゲティングベクター」と「ターゲッティング」は同じ意味で使用される場合がある。ターゲティングベクターを採用して挿入核酸をラット、真核、非ラット真核、哺乳動物、非ヒト哺乳動物、ヒト、げっ歯類動物、非ラットげっ歯類動物、マウス又はハムスターの核酸の標的遺伝子座に導入する。前記ターゲティングベクターは前記挿入核酸を含み、さらに５’相同性アーム及び３’相同性アームを含み、前記挿入核酸が側方連結される。前記挿入核酸に側方連結された相同性アームは、ラット、真核、非ラット真核、哺乳動物、非ヒト哺乳動物、ヒト、げっ歯類動物、非ラットげっ歯類動物、マウス又はハムスターの核酸の標的遺伝子座内の領域に対応する。説明を容易にするために、標的ゲノム遺伝子座内の対応する相同ゲノム領域は本明細書では「標的部位」と呼ばれる。例えば、ターゲティングベクターは第１の標的部位及び第２の標的部位に相補的な第１の相同性アーム及び第２の相同性アームにより側方連結された第１の挿入核酸を含むことができる。したがって、前記ターゲティングベクターはこれにより細胞のゲノム内の相同性アームと相補標的な部位との間で発生した相同組換えイベントを介して挿入核酸をラット、真核、非ラット真核、哺乳動物、非ヒト哺乳動物、ヒト、げっ歯類動物、非ラットげっ歯類動物、マウス又はハムスターの核酸の標的遺伝子座に組み込むことに役立つ。

一実施形態において、前記ラット、真核、非ラット真核、哺乳動物、非ヒト哺乳動物、ヒト、げっ歯類動物、非ラットげっ歯類動物、マウス又はハムスターの核酸の標的遺伝子座は、５’相同性アームに相補的な第１の核酸配列及び３’相同性アームに相補的な第２の核酸配列を含む。

ベクターは、例えばトランスフェクション、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、形質導入、細胞融合、ＤＥＡＥデキストラン、リン酸カルシウム沈殿、リポフェクション（リソソーム融合）、遺伝子銃又はＤＮＡベクタートランスポーターの使用など、本分野の既知の方法により所望の宿主細胞に導入することができる（例えば、Ｗｕｅｔａｌ．，１９９２，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：９６３－９６７；Ｗｕ及びＷｕ，１９８８，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３：１４６２１－１４６２４；及びＨａｒｔｍｕｔｅｔａｌ．，１９９０年３月１５日に提出されたカナダ特許出願２，０１２，３１１を参照）。

「トランスフェクション」という用語とは、細胞が外因性又は異種のＲＮＡ又はＤＮＡを取り込むことを意味する。外因性又は異種のＲＮＡ又はＤＮＡが既に細胞内に導入され
た場合、該細胞はこのようなＲＮＡ又はＤＮＡにより「トランスフェクト」される。トランスフェクトするＲＮＡ又はＤＮＡが表現型の変化に影響を与える場合、該細胞は外因性又は異種のＲＮＡ又はＤＮＡにより「形質転換」される。形質転換するＲＮＡ又はＤＮＡは、細胞のゲノムを構成する染色体ＤＮＡに組み込まれてもよい（共有結合されてもよい）。

「相同性」又は「相同な」という用語は、配列、例えばヌクレオチド又はアミノ酸配列の二本の配列が最適な対照及び比較により、少なくとも約７５％のヌクレオチド又はアミノ酸、少なくとも約８０％のヌクレオチド又はアミノ酸、少なくとも約９０－９５％のヌクレオチド又はアミノ酸、例えば９７％超のヌクレオチド又はアミノ酸が同一であることを意味する。当業者に理解されるように、最適な遺伝子ターゲティングのために、ターゲティング構築物は内因性ＤＮＡ配列と相同なアーム（すなわち「相同性アーム」）を含むべきである。したがって、ターゲティング構築物とターゲティングされた内因性配列との間で相同組換えを発生させることができる。

本明細書で使用されるように、２つの領域が互いに十分なレベルの配列同一性を有する場合に相同性アームと標的部位（すなわち相同ゲノム領域）は互いに相補的であり、それにより相同組換え反応のための基質として機能する。「相同性」とは、ＤＮＡ配列が対応する又は「相補的な」配列と同一であるか又は配列同一性を共有することを意味する。所定の標的部位とターゲティングベクター上に見られる対応する相同性アームとの間の配列同一性は、相同組換えの発生を可能にする任意の程度の配列同一性であってもよい。例えば、ターゲティングベクターの相同性アーム（又はその断片）と標的部位（又はその断片）が共有する配列同一性の量は少なくとも５１％、５３％、５７％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８３％、８５％、８７％、８９％、９１％、９３％、９５％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性であってもよく、したがって前記配列は相同組換えを経験する。なお、相同性アームと相補的標的部位との間の相補的相同領域は、切断された認識部位での相同組換えを促進するのに十分な任意の長さを有することができる。したがって、相同性アームは細胞のゲノム内の対応する標的部位と相同組換えを行うのに十分な相同性を有する。説明を容易にするために、相同性アームは本明細書において５’相同性アーム及び３’相同性アームとして言及される。該用語はターゲティングベクターにおける相同性アームと挿入核酸との相対位置に関する。

いくつかの実施形態において、前記ターゲティングベクターの相同性アームは、対応する標的部位との相同組換えイベントを促進するのに十分な任意の長さを有することができ、例えば少なくとも５－１０ｋｂ、５－１５ｋｂ、１０－２０ｋｂ、２０－３０ｋｂ、３０－４０ｋｂ、４０－５０ｋｂ、５０－６０ｋｂ、６０－７０ｋｂ、７０－８０ｋｂ、８０－９０ｋｂ、９０－１００ｋｂ、１００－１１０ｋｂ、１１０－１２０ｋｂ、１２０－１３０ｋｂ、１３０－１４０ｋｂ、１４０－１５０ｋｂ、１５０－１６０ｋｂ、１６０－１７０ｋｂ、１７０－１８０ｋｂ、１８０－１９０ｋｂ、１９０－２００ｋｂの長さ又はそれ以上の長さを含む。以下にさらに詳細に説明するように、ターゲティングベクターはより大きい長さのターゲティングアームを採用することができる。特定の実施形態において、５’相同性アーム及び３’相同性アームの合計は少なくとも１０ｋｂであり、又は５’相同性アーム及び３’相同性アームの合計は少なくとも約１６ｋｂ－約１００ｋｂであり、又は約３０ｋｂ－約１００ｋｂであり、他の実施形態において、前記ＡＣＥ２の５’相同性アーム及び３’相同性アームの合計のサイズは約１０ｋｂ－約１５０ｋｂ、約１０ｋｂ－約１００ｋｂ、約１０ｋｂ－約７５ｋｂ、約２０ｋｂ－約１５０ｋｂ、約２０ｋｂ－約１００ｋｂ、約２０ｋｂ－約７５ｋｂ、約３０ｋｂ－約１５０ｋｂ、約３０ｋｂ－約１００ｋｂ、約３０ｋｂ－約７５ｋｂ、約４０ｋｂ－約１５０ｋｂ、約４０ｋｂ－約１００ｋｂ、約４０ｋｂ－約７５ｋｂ、約５０ｋｂ－約１５０ｋｂ、約５０ｋｂ－約１００ｋｂ、又は約５０ｋｂ－約７５ｋｂ、約１０ｋｂ－約３０ｋｂ、約２０ｋｂ－約４０ｋｂ、約４０ｋｂ－約６０ｋｂ、約６０ｋｂ－約８０ｋｂ、約８０ｋｂ－約１００ｋｂ、約１００ｋｂ－約１２０ｋｂ又は約１２０ｋｂ－約１５０ｋｂである。

本明細書におけるいくつかの実施例はヒト化遺伝子編集哺乳動物に関し、前記ヒト化遺伝子編集哺乳動物のゲノムはヒトの全長ＡＣＥ２タンパク質をコードするポリリボ核酸を含む。例えば、前記ポリリボ核酸は、プロモーターポリリボ核酸に操作可能に連結される。いくつかの実施形態において、ヒト化遺伝子編集哺乳動物は、ヒト化遺伝子編集哺乳動物の内因性ＡＣＥ２タンパク質をコードするポリリボ核酸の全部または一部を発現せず、ヒトＡＣＥ２タンパク質をコードする前記ポリリボ核酸は、ヒトＡＣＥ２タンパク質の修飾を含む。

いくつかの実施形態において、前記細胞は多能性細胞、非多能性細胞、哺乳動物細胞、ヒト細胞、非ヒト哺乳動物細胞、げっ歯類動物細胞、マウス細胞、ハムスター細胞、非ヒト多能性細胞、ヒト多能性細胞、げっ歯類動物多能性細胞又は線維芽細胞又は肺細胞である。

いくつかの上記方法において、前記細胞は初代細胞又は不死化細胞である。いくつかの上記方法において、前記げっ歯類動物の多能性細胞はマウス又はラット胚性幹（ＥＳ）細胞である。

いくつかの上記方法において、前記動物細胞又は前記ヒト細胞は、初代細胞又は不死化細胞である。いくつかの上記方法において、前記動物細胞又は前記ヒト細胞は多能性細胞である。いくつかの上記方法において、前記動物の多能性細胞はマウス胚性幹（ＥＳ）細胞である。いくつかの上記方法において、前記ヒトの多能性細胞はヒト胚性幹（ＥＳ）細胞、ヒト成体幹細胞、発育が制限されたヒト前駆細胞又はヒト人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞である。

いくつかの実施形態において、本明細書におけるいくつかの実施例は、ヒト化遺伝子編集細胞を提供し、特に単離されたヒト及び非ヒト全能性又は多能性幹細胞、特にマウス胚性幹細胞をさらに提供し、それは一種又は複数種のｉｎｖｉｔｒｏでの連続的な遺伝子修飾の後に多能性を維持するとともに生殖細胞系列を介して前記標的遺伝子修飾を子孫に伝えることができる。

本明細書で使用される「胚性幹細胞」または「ＥＳ細胞」という用語は、胚への導入後に胚の任意の組織の発育を促進することができる胚由来の全能性または多能性細胞を含む。本明細書で使用される「多能性細胞」という用語は、分化細胞の２つ以上のタイプに発育する能力を有する未分化細胞を含む。「非多能性細胞」という用語は、多能性細胞ではない細胞を含む。

いくつかの上記方法において、前記標的遺伝子編集は、前記対象ゲノム遺伝子座における内因性核酸配列の欠失又は前記対象ゲノム遺伝子座における前記核酸の挿入を同時に含む。

いくつかの実施形態において、前記遺伝子修飾又は遺伝子編集は、細胞（例えば、真核細胞、非ラット真核細胞、哺乳動物細胞、ヒト細胞、非ヒト哺乳動物細胞、多能性細胞、非多能性細胞、非ヒト多能性細胞、ヒト多能性細胞、ヒトＥＳ細胞、ヒト成体幹細胞、発育が制限されたヒト前駆細胞、ヒトｉＰＳ細胞、ヒト細胞、げっ歯類動物細胞、非ラットげっ歯類動物細胞、ラット細胞、マウス細胞、ハムスター細胞、線維芽細胞又はチャイニーズハムスターの卵巣（ＣＨＯ）細胞）に対して独立して実施された２種又は複数種の修飾を含む。第１の修飾は、エレクトロポレーション又は本分野の既知の任意の他の方法により実現することができる。続いて、適切な第２の核酸構築物を使用して、同一の細胞ゲノムに対して第２の修飾を行う。前記第３の修飾は第２のエレクトロポレーション又は本分野の既知の任意の他の方法により実現することができる。様々な実施形態において、同一細胞の第１の遺伝子修飾及び第２の遺伝子修飾の後に、例えば連続エレクトロポレーション又は本分野の既知の任意の他の適切な方法を使用して（連続的に）第３の遺伝子修飾、第４の遺伝子修飾、第５の遺伝子修飾、第６の遺伝子修飾等の連続的な修飾を実現することができる（一つの遺伝子修飾は他の遺伝子修飾に追従する）。

いくつかの実施形態において、本開示は、ターゲッティングベクターの相同組換え方法で遺伝子の編集を行い、外因性核酸を内因性ゲノムに挿入する。

いくつかの実施形態において、前記挿入核酸は、真核、非ラット真核、哺乳動物、ヒト又は非ヒト哺乳動物の核酸配列について、相同又はオーソロガスのヒト核酸配列を挿入するか、又はそれらで置換することを含む。

いくつかの実施形態において、前記所定の挿入されたポリヌクレオチドは、例えば、げっ歯類動物、非ラットげっ歯類動物、ラット、マウス、ハムスター、哺乳動物、非ヒト哺乳動物、真核生物、非ラット真核生物、ヒト、農業動物又は家畜動物を含む任意の生物に由来することができる。

特定の実施形態において、前記挿入核酸はラット由来の核酸を含むことができ、それはゲノムＤＮＡの断片、ＣＤＮＡ、調節領域又はその任意の部分又は組み合わせを含むことができる。他の実施形態において、前記核酸は真核生物、非ラット真核生物、哺乳動物、ヒト、非ヒト哺乳動物、げっ歯類動物、非ラットげっ歯類動物、ヒト、ラット、マウス、ハムスター、ウサギ、ブタ、ウシ、シカ、ヒツジ、ヤギ、ニワトリ、ネコ、イヌ、フェレット、霊長類動物（例えば、マーモセット、アカゲザル）、家畜哺乳動物又は農業哺乳動物又は任意の他の目標生体からの核酸を含むことができる。本明細書でより詳細に概説するように、様々な方法及び組成物に採用された核酸の挿入は対象標的遺伝子座の「ヒト化」を引き起こすことができる。

いくつかの実施形態において、前記遺伝子修飾は核酸配列の付加である。いくつかの実施形態において、前記挿入核酸はコード配列における遺伝子修飾を含む。いくつかの実施形態において、前記遺伝子修飾はコード配列の欠失突然変異を含む。いくつかの実施形態において、前記遺伝子修飾は２種類の内因性コード配列の融合を含む。いくつかの実施形態において、前記挿入核酸は、真核、非ラット真核、哺乳動物、ヒト又は非ヒト哺乳動物の核酸配列について、相同又はオーソロガスのヒト核酸配列を挿入するか、又はそれらで置換することを含む。いくつかの実施形態において、前記挿入核酸は、対応するマウスＤＮＡ配列を含む内因性マウス遺伝子コード領域に相同又はオーソロガスのヒト核酸配列を挿入するか又はマウスＤＮＡ配列を置換することを含む。いくつかの実施形態において、前記挿入核酸は、対応するマウスＤＮＡ配列を含む内因性マウス遺伝子コード領域に相同又はオーソロガスのヒト核酸配列を挿入するか又はマウスＤＮＡ配列を置換することを含む。いくつかの実施形態において、ターゲッティングベクターを利用し、マウスＡＣＥ２部位に対して、ｍＡＣＥ２に隣接するＥＸＯＮ１ＣＤＳ開始ＡＴＧ部位にｈＡＣＥ２配列を挿入する。

いくつかの実施形態において、前記ターゲティングベクターの核酸配列は、ゲノムに組み込む時に哺乳動物、ヒト又は非ヒト哺乳動物のＡＣＥ２遺伝子座の領域の遺伝子修飾を生成するポリヌクレオチドを含むことができ、ここで、ＡＣＥ２遺伝子座での遺伝子修飾はＡＣＥ２活性の減少、ＡＣＥ２活性の増加又はＡＣＥ２活性の調整を引き起こす。いくつかの実施形態において、ＡＣＥ２遺伝子が完全に置換されるように生成する。

いくつかの実施形態において、前記挿入核酸は、調節エレメントを含むことができ、例えばプロモータ、エンハンサー又は転写を含む。

いくつかの実施形態において、所定の挿入されたポリヌクレオチド及び／又は哺乳動物、ヒト細胞又は非ヒト哺乳動物の遺伝子座の対応する置換領域は、コード領域、イントロン、エクソン、非翻訳領域、調節領域、プロモーター又はエンハンサー又はそれらの任意の組み合わせであってもよい。

本明細書は、１種又は複数種の対象ポリヌクレオチドの標的遺伝子座への標的化組込みを可能にする方法であって、上記で概説したように配列を導入することにより遺伝子編集細胞を生成する方法を提供する。「導入」は、配列が細胞の内部に入るように、配列（ポリペプチドまたはポリヌクレオチド）を細胞に提示する。

任意の生体由来の任意の細胞は本明細書の提供する方法に用いることができる。特定の実施形態において、前記細胞は、真核生物、非ラット真核生物、哺乳動物、非ヒト哺乳動物、ヒト、げっ歯類動物、非ラットげっ歯類動物、ラット、マウス又はハムスターに由来する。特定の実施形態において、前記細胞は、真核細胞、非ラット真核細胞、多能性細胞、非多能性細胞、非ヒト多能性細胞、非ヒト哺乳動物細胞、ヒト多能性細胞、ヒトＥＳ細胞、ヒト成体幹細胞、発育が制限されたヒト前駆細胞、ヒト人工多能性細胞（ｉＰＳ）細胞、哺乳動物細胞、ヒト細胞、線維芽細胞、げっ歯類動物細胞、非ラットげっ歯類動物細胞、ラット細胞、マウス細胞、マウスＥＳ細胞、ハムスター細胞又はＣＨＯ細胞である。

いくつかの実施形態において、前記方法で採用された細胞はその遺伝子座に安定的に組み込まれたＤＮＡ構築物を有する。「安定的に組み込まれる」又は「安定的に導入される」とはポリヌクレオチドを細胞に導入することを意味し、したがってヌクレオチド配列が細胞のゲノムに組み込まれその子孫によって継承され得る。

いくつかの実施形態において、細胞に１種又は複数種のポリヌクレオチドは、エレクトロポレーション、細胞質内注射、ウイルス感染、アデノウイルス、レンチウイルス、レトロウイルス、トランスフェクション、脂質媒介性トランスフェクション、又はＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｉｏｎＴＭ媒介を経由して細胞に導入される。

いくつかの実施形態において、前記発現構築物は前記導入された核酸と共に導入される。

いくつかの実施形態において、前記細胞に前記１種又は複数種のポリヌクレオチドを導入することは一定の時間で複数回実行することができる。いくつかの実施形態において、前記細胞に前記１種又は複数種のポリヌクレオチドを導入することは一定の時間で少なくとも２回実行し、一定の時間で少なくとも３回実行し、一定の時間で少なくとも４回実行し、一定の時間で少なくとも５回実行し、一定の時間で少なくとも６回実行し、一定の時間で少なくとも７回実行し、一定の時間で少なくとも８回実行し、一定の時間で少なくとも９回実行し、一定の時間で少なくとも１０回実行し、一定の時間で少なくとも１１回実行し、一定の時間で少なくとも１２回実行し、一定の時間で少なくとも１３回実行し、一定の時間で少なくとも１４回実行し、一定の時間で少なくとも１５回実行し、一定の時間で少なくとも１６回実行し、一定の時間で少なくとも１７回実行し、一定の時間で少なくとも１８回実行し、一定の時間で少なくとも１９回実行し、又は一定の時間で少なくとも２０回実行することができる。

いくつかの実施形態において、前記ターゲティングベクター（導入核酸を含有する）と発現ベクター（ｓｇＲＮＡを含有する）は同時に細胞に導入される。

いくつかの実施形態において、（ａ）挿入核酸を含むターゲティングベクターで多能性細胞のゲノムを修飾することによりドナー細胞を形成し、前記挿入核酸はヒト核酸配列を含むこと、（ｂ）前記ドナー細胞を宿主胚に導入すること、及び（ｃ）代理母に前記宿主胚を妊娠させ、ここで前記代理母は前記ヒト核酸配列を含む子孫を生成すること、を含むヒト化非ヒト動物を製造するための方法をさらに提供する。いくつかの実施形態において、前記ドナー細胞は胚盤胞段階又は前桑実胚段階（すなわち、４－細胞段階又は８－細胞段階）にある宿主胚に導入される。さらなる実施形態において、前記遺伝子修飾は生殖細胞系列を介して伝達することができる。

いくつかの特定の実施形態では、（ａ）ＡＣＥ２遺伝子断片を含むターゲティングベクターとｓｇＲＮＡが連結された発現ベクターをマウス胚細胞に導入し、遺伝子編集のドナー細胞を形成すること、（ｂ）前記ドナー細胞をマウス胚に導入すること、及び（ｃ）代理母に前記マウス胚を妊娠させ、ここで前記代理母は前記ヒトＡＣＥ２配列を含む子孫を生成すること、を含むヒト化マウスを製造するための方法を提供する。

本明細書において、「四倍体相補技術」は「四倍体胚補償技術」又は「四倍体相補方法」又は「四倍体胚相補方法」と同等であってもよく、それらは一定数量の胚性幹細胞（ＥＳ）細胞と四倍体胚をキメラ化することを意味し、そのキメラの発育過程において、ＥＳ細胞と四倍体胚はランダムに分布せず、すなわちその四倍体胚部分は卵黄嚢内胚葉及び胎盤栄養膜細胞（例えば絨毛膜外胚葉、栄養膜細胞など）などの胚体外組織の形成のみに関与し、ＥＳ細胞は胚様体、尿膜、羊膜、卵黄嚢中胚葉及び絨毛膜中胚葉部分の生成に広く関与し、卵黄嚢内胚葉及び胎盤栄養膜細胞系譜の生成に関与せず、すなわち両者の発育能は相補性を有し、このような現象は四倍体相補技術と呼ばれる。

いくつかの場合において、「胚」という用語は、出生前の任意の時点の動物被験者に由来するか、又は出生前の任意の時点の動物被験者の体内の組織及び細胞に由来するものを意味する。

いくつかの場合において、「胚」は受精後８週間で胎児になる前に子宮に移植された受精卵母細胞を表すために用いられる。この定義によれば、受精卵母細胞は移植前に通常、前胚（ｐｒｅ－ｅｍｂｒｙｏ）と呼ばれる。しかしながら、この特許出願を通じて、本発明者らはより広い用語を使用して胚を定義し、それは前胚段階を含む。したがって、それは卵母細胞の受精から桑実胚、胚盤胞の孵化及び移植までの全ての発育段階を含む。

胚は略球形であり、ゼラチン様の外殻で囲まれた１つ又は複数の細胞（卵割球）で構成され、細胞のない基質は透明帯と呼ばれる。透明帯は胚が孵化するまで、様々な機能を実行し、透明帯は胚評価の優れたマーカーである。該帯は球状で半透明であり、細胞破片と明確に区別される。

哺乳動物の着床前の胚は、直径が約９０～１２０ミクロンで、外表面に明らかに見える糖タンパク質で構成された透明帯がある。受精卵の片側に、１－２個の減数分裂時に形成された極体が見られる。

受精後の２３－４３．５時間の間に卵子が第１回の有糸分裂を経た後に２つの卵割球を有する胚が形成される。２－細胞期の胚の細胞は楕円形に近く、大きさがほぼ等しく、電気ショックの後に２つの卵割球が４倍体細胞に融合することができ、さらに４倍体胚に発育する。受精卵は２つに分けて２つの卵割球すなわち２－細胞期が形成され、さらに、２つの卵割球はさらに２つに分けて４つ、すなわち４－細胞期が形成される。さらに２つに分けて８つ、すなわち８－細胞期が形成され、５回分裂して３２個の細胞に分裂した時、すなわち「桑実胚」が形成される。４－細胞期に、４つの卵割球が交差して配列することが見られる。８－細胞期の卵割球は上下二層に配列し、緊密な連結の形成に伴って緻密化が現れ始める。１６－細胞期から桑実胚と呼ばれ、内部細胞塊と栄養膜の分化が現れる。受精後７２時間に胚が３２－細胞期に発育し、卵割球の間に隙間が現れ、増大した後に完全な胞胚腔が形成され、腔の片側に一塊の細胞が集中し、これはすなわち内部細胞塊である。胞胚腔の周りを取り囲む一層の扁平細胞は、栄養膜と呼ばれる。この時、胞胚はこの時点で胚盤胞とも呼ばれる。後期胚盤胞は膨張され透明帯から押し出し、すなわち孵化胚盤胞となる。

胚という用語は、受精卵母細胞、受精卵（ｚｙｇｏｔｅ）、２－細胞、４－細胞、８－細胞、１６－細胞、桑実胚、胚盤胞、拡張胚盤胞及び孵化胚盤胞、及びその間の全ての段階（例えば３－細胞又は５－細胞）の各段階を示すために用いられる。

本明細書で使用される「キメラ胞胚」又は「キメラ胚」とは、胚性幹細胞を含むキメラ状態の胞胚又は胚を意味する。そのキメラ胞胚又は胚は、インジェクション法により製造される以外に、例えばいわゆる「凝集法」を用いて製造することができ、その「凝集法」において、胚＋胚、又は胚＋細胞を蓋付きのペトリ皿において互いに密着させることにより、キメラ胞胚を製造する。さらに、本開示におけるレシピエントの胞胚又は胚と移植対象の細胞との間の関係は同種異体関係又は異種異体関係であってもよい。

本明細書で使用される用語「投与」又は「移植」は、細胞を所望の部位に少なくとも部分的に位置決めすることにより所望の効果を生成する方法又は経路を意味し、細胞を被験者に配置するとされている。

例１ＡＣＥ２遺伝子ｓｇＲＮＡ１及びｐＸ３３０－ｓｇＲＮＡプラスミドの構築
標的部位を識別するｓｇＲＮＡ１配列を合成する。
ｓｇＲＮＡ１配列（ＳＥＱＩＤＮＯ：１）：５’－ｔａｃｔｇｃｔｃａｇｔｃｃｃｔｃａｃｃｇａｇｇ－３’
ｓｇＲＮＡ部位にＢｂｓＩ制限部位を導入することによりｓｇＲＮＡの上流及び下流のアニーリングプライマーを合成して後続のアニーリング実験を行う。ｓｇＲＮＡ１を合成する上流及び下流の一本鎖プライマーの配列は以下のとおりである。
上流：５’－ｃａｃｃｇｃｔｔｇｇｃａｔｔｔｔｃｃｔｃｇｇｔｇａ－３’（ＳＥＱＩＤＮＯ：４）
下流：５’－ａａａｃｔｃａｃｃｇａｇｇａａａａｔｇｃｃａａｇｃ－３’（ＳＥＱＩＤＮＯ：５）
ｐＸ３３０プラスミドの由来：ｐＸ３３０ベクターマップは、図１に示すとおりである。当該プラスミド骨格はＭｉａｏｌｉｎｇプラスミドプラットフォームに由来し、品番はＰ０１２３である。
上記ｓｇＲＮＡアニーリングプライマーをアニーリングした後にそれぞれｐＸ３３０プラスミド（プラスミドをまずＢｂｓＩで線形化する）に連結し、発現ベクターｐＸ３３０－ｓｇＲＮＡ１を取得する。
具体的な連結反応系は表１に示すとおりである。

反応条件は以下のとおりである。１６℃で３０ｍｉｎ以上連結させ、３０μＬのＴＯＰ１０コンピテント細胞に形質転換し、次に２００μＬを取ってＡｍｐ耐性プレートに塗布し、３７℃で少なくとも１２時間培養した後に２つのクローンを選択してＡｍｐ耐性を含有するＬＢ培地（５ｍＬ）に接種し、３７℃、２５０ｒｐｍで少なくとも１２時間揺れ培養する。
無作為に選択されたクローンは配列決定会社に送られ配列決定検証され、配列決定の結果は図２に示すとおりであり、連結が正確な発現ベクターｐＸ３３０－ｓｇＲＮＡ１を選択して後続の実験を行う。

例２ＡＣＥ２遺伝子ｓｇＲＮＡ２及びｐＸ３３０－ｓｇＲＮＡ２プラスミドの構築
標的部位を識別するｓｇＲＮＡ２配列を合成する。
ｓｇＲＮＡ２－配列（ＳＥＱＩＤＮＯ：２）：５’－ｃｔｔｇｇｃａｔｔｔｔｃｃｔｃｇｇｔｇａｇｇｇ－３’
ｓｇＲＮＡ部位にＢｂｓＩ制限部位を導入することによりｓｇＲＮＡの上流及び下流のアニーリングプライマーを合成して後続のアニーリング実験を行う。ｓｇＲＮＡ２を合成する上流及び下流の一本鎖プライマーの配列は以下のとおりである。
上流：５’－ｃａｃｃｇｔａｃｔｇｃｔｃａｇｔｃｃｃｔｃａｃｃｇ－３’（ＳＥＱＩＤＮＯ：６）
下流：５’－ａａａｃｃｇｇｔｇａｇｇｇａｃｔｇａｇｃａｇｔａｃ－３’（ＳＥＱＩＤＮＯ：７）
ｐＸ３３０プラスミドの由来：ｐＸ３３０ベクターマップは、図１に示すとおりである。当該プラスミド骨格はＭｉａｏｌｉｎｇプラスミドプラットフォームに由来し、品番はＰ０１２３である。
上記ｓｇＲＮＡアニーリングプライマーをアニーリングした後にそれぞれｐＸ３３０プラスミド（プラスミドをまずＢｂｓＩで線形化する）に連結し、発現ベクターｐＸ３３０－ｓｇＲＮＡ２を取得する。
具体的な連結反応系は表２に示すとおりである。

反応条件は以下のとおりである。１６℃で３０ｍｉｎ以上連結させ、３０μＬのＴＯＰ１０コンピテント細胞に形質転換し、次に２００μＬを取ってＡｍｐ耐性プレートに塗布し、３７℃で少なくとも１２時間培養した後に２つのクローンを選択してＡｍｐ耐性を含有するＬＢ培地（５ｍＬ）に接種し、３７℃、２５０ｒｐｍで少なくとも１２時間揺れ培養する。
無作為に選択されたクローンは配列決定会社に送られ配列決定検証され、配列決定の結果は図３に示すとおりであり、連結が正確な発現ベクターｐＸ３３０－ｓｇＲＮＡ２を選択して後続の実験を行う。

例３ｐＸ３３０－ｓｇＲＮＡの切断効率の同定
それぞれ２μｇの例１、例２で製造されたｐＸ３３０－ｓｇＲＮＡプラスミドをリポフェクタミン３０００（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ３０００、ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、品番Ｌ３０００００１）方法でマウス胚性幹細胞にトランスフェクトし、具体的なトランスフェクション操作についてはＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ３０００試薬の操作説明を参照する。トランスフェクションから２日後のマウス胚性幹細胞を採取し、細胞ゲノム抽出キット（Ｔｉａｎｇｅｎ、ＤＰ３０４－０２）でゲノムを抽出する。次にゲノム切断部位の両側にＰＣＲの上流及び下流プライマーを設計して、上流プライマー（５ａｒｍ－ｓｇＦ：ｇｇｔｔｔｔｇａｔｔｔｇｇｃｃａｔａａａａｔｇｔｔａｇｃ（ＳＥＱＩＤＮＯ：１０））及び下流プライマー（３ａｒｍ－ｓｇＲ：ａｔｔｃｃｃａｇｇｔｃｃａｇｔｔｔｃａｃｃｔａａｇ（ＳＥＱＩＤＮＯ：１１））は抽出して得られたゲノムに対してＰＣＲ反応を行う（Ｎｏｖｏｚａｎ社のＰｈａｎｔａＭａｘＳｕｐｅｒ－ＦｉｄｅｌｉｔｙＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅを使用する）。次にＴ７エンドヌクレアーゼＩ（Ｔ７ＥＩ）（Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｍ０３０２Ｌ）を利用してｐＸ３３０－ｓｇＲＮＡの切断効率を検証し、原理としては、Ｔ７エンドヌクレアーゼＩは不完全なペアＤＮＡを識別して切断することができる。
Ｔ７ＥＩ実験の具体的な操作ステップは以下のとおりである。
ｐＸ３３０－ｓｇＲＮＡ１及びｐＸ３３０－ｓｇＲＮＡ２をそれぞれトランスフェクトした上記細胞からゲノムを抽出し、５ａｒｍ－ｓｇＦ＋３ａｒｍ－ｓｇＲ増幅により得られたＰＣＲ産物を回収し（Ｔｉａｎｇｅｎ、ＤＰ２１４－０２）、１μｇを取ってアニーリング反応を行い、反応系は以下のとおりである。

次にアニーリング生成物に１μＬのＴ７エンドヌクレアーゼＩを添加して３７℃で３０ｍｉｎ反応させ、その後にそのままゲル電気泳動による検証を実施する。ゲル電気泳動の結果は図４に示すとおりである。例１、例２のｓｇＲＮＡ１及びｓｇＲＮＡ２はその切断バンドの輝度が高く（ｓｇＲＮＡ１は約３７６ｂｐ及び５８１ｂｐの二本のバンドに切断することができ、ｓｇＲＮＡ２は約３７１ｂｐ及び５８６ｂｐの二本のバンドに切断することができる）、高い切断効率を有する。
切断効率は主に図により示されるため、例１、２の解決手段の効果を示すために、図４には同時に別のｓｇＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ３で表記する）の切断効率が挙げられる。
列挙されたｓｇＲＮＲＡ３配列（ＳＥＱＩＤＮＯ：３）：５’－ｃａａｇｔｇａａｃｔｔｔｇａｔａａｇａｃａｇｇ－３’
ｓｇＲＮＡ３を合成する上流及び下流の一本鎖プライマーの配列は以下のとおりである。
上流：５’－ｃａｃｃｇｃａａｇｔｇａａｃｔｔｔｇａｔａａｇａｃ－３’（ＳＥＱＩＤＮＯ：８）
下流：５’－ａａａｃｇｔｃｔｔａｔｃａａａｇｔｔｃａｃｔｔｇｃ－３’（ＳＥＱＩＤＮＯ：９）
他のステップは例１と同じである。無作為に選択されたクローンは配列決定会社に送られ配列決定検証され、配列決定の結果は図５に示すとおりであり、連結が正確な発現ベクターｐＸ３３０－ｓｇＲＮＡ３を選択して後続の実験を行う。
他のｓｇＲＮＡ及びｐＸ３３０－ｓｇＲＮＡプラスミドの構築は本開示例の重点ではないため、説明及び列挙を省略する。

例４ターゲッティングベクターの設計
ヒトＡＣＥ２遺伝子（ＧｅｎｅＩＤ：ＩＤ：５９２７２）ＣＤＳタンパク質コード配列（ＮＣＢＩ登録番号ＮＭ＿００１３７１４１５．１ → ＮＰ＿００１３５８３４４．１に基づくトランスクリプトであり、そのＣＤＳ配列（ｈＡＣＥ２－ＣＤＳ）はＳＥＱＩＤＮＯ：１２に示すとおりであり、タンパク質配列（ｈＡＣＥ２－ｐｒｏｔｅｉｎ）はＳＥＱＩＤＮＯ：１３に示すとおりである）をマウスＡｃｅ２のプロモーター及び５’ＵＴＲ領域配列に挿入した後、マウスＡｃｅ２プロモーターを利用してヒトＡＣＥ２の遺伝子発現を起動する。同時に、挿入されたヒトＡＣＥ２のＣＤＳ配列の後にＳＶ４０ｐｏｌｙＡ配列信号（ＳＶ４０－ｐｏｌｙＡ配列はＳＥＱＩＤＮＯ：１４に示すとおりである）の終止信号を加えてヒトＡＣＥ２ｍＲＮＡの転写停止を強化する。
配列設計に基づいて、本発明者らは図６に示すようなターゲッティングスキーム及び５’相同性アーム（５ａｒｍ）、ヒトＡＣＥ２遺伝子断片、３’相同性アーム（３ａｒｍ）を含むベクターをさらに設計した。ここで、５’相同性アームはＮＣＢＩ登録番号がＡＣ０９１６０６．８である第１２５６８３－１２６６５２位のヌクレオチド（５’相同性アーム配列はＳＥＱＩＤＮＯ：１５に示すとおりである）であり、３’相同性アームはＮＣＢＩ登録番号がＡＣ０９１６０６．８の第１２６７９６－１２７７６６位のヌクレオチド（３’相同性アーム配列はＳＥＱＩＤＮＯ：１６に示すとおりである）である。同時に、ＰＧＫ－ピューロマイシン異種遺伝子パッケージもスクリーニングの目的でベクターに挿入され、ピューロマイシン耐性遺伝子（ＰＧＫ－ｐｕｒｏ、ＳＥＱＩＤＮＯ：１７）発現カセットの両端に一対の同方向のｆｒｔ部位（ＳＥＱＩＤＮＯ：１８）が設計され、したがってＦＬＰ組換え酵素を利用して除去することにより、遺伝子組換えによる安全性問題を解決することができる。構築されたベクターは完全な配列検証が行われる。ターゲティングの前に、ＡｇｅＩにより、前記ベクターは線形化される（ターゲッティングベクターの概略図及びターゲッティングスキームの概略図は図６に示すとおりである）。
ベクターの構築過程は以下のとおりである。
５’相同性アームのブリッジ断片を増幅するための上流プライマー（５ａｒｍ－ｐｃｒＦ：ｔｃｇｃａｃａｃａｔｔｃｃａｃａｔｃｃａｃｃｇｇｔｃｃｃｔａｔｇｇａｇｔｇｇａｇａａｇａｇｔｃｔｔａ（ＳＥＱＩＤＮＯ：１９））及びそれとマッチングする下流プライマー（５ａｒｍ－ｐｃｒＲ：ｇａａｇｇａｇｃｃａｇｇａａｇａｇｃｔｔｇａｃａｔｃｔｔｔｃｃｃｃｇｔｇｃｇｃｃａａｇａｔｃｃ（ＳＥＱＩＤＮＯ：２０））を設計する。
ヒトＡＣＥ２ＣＤＳのブリッジ断片を増幅するための上流プライマー（ｈＡＣＥ２－Ｆ：ｇｇａｔｃｔｔｇｇｃｇｃａｃｇｇｇｇａａａｇａｔｇｔｃａａｇｃｔｃｔｔｃｃｔｇｇｃｔｃｃｔｔｃ（ＳＥＱＩＤＮＯ：２１））及びそれとマッチングする下流プライマー（ｈＡＣＥ２－Ｒ：ｃａｔｔａｔａａｇｃｔｇｃａａｔａａａｃａａｇｔｔｃｔａａａａｇｇａｇｇｔｃｔｇａａｃａｔｃａｔｃ（ＳＥＱＩＤＮＯ：２２））を設計する。
ＳＶ４０ｐｏｌｙＡのブリッジ断片を増幅するための上流プライマー（ＳＶ４０－Ｆ：ｇａｔｇａｔｇｔｔｃａｇａｃｃｔｃｃｔｔｔｔａｇａａｃｔｔｇｔｔｔａｔｔｇｃａｇｃｔｔａｔａａｔｇ（ＳＥＱＩＤＮＯ：２３））及びそれとマッチングする下流プライマー（ＳＶ４０－Ｒ：ＡＧＡＧＡＡＴＡＧＧＡＡＣＴＴＣＧＣＡＣＧＣＧＴｔａａｇａｔａｃａｔｔｇａｔｇａｇｔｔｔｇｇａｃ（ＳＥＱＩＤＮＯ：２４））を設計する。
３’相同性アーム断片を増幅するための上流プライマー（３ａｒｍ－ｐｃｒＦ：ｔａｃｇａａｇｔｔａｔＧｔｃｇａｃｇｃＧＧＣＧＣＧＣＣｇａａｔｔａｔａａｔａｃｔａａｃａｔｔａｃｔｇ（ＳＥＱＩＤＮＯ：２５））及びそれとマッチングする下流プライマー（３ａｒｍ－ｐｃｒＲ：ｔａｔｇａｃｃａｔｇａｔｔａｃｇｃｃａａｇｃｔｔａａｇａｃｃａａａｃｔａｔｔａｇａｇｃａｇｔｔａａａａｇｃ（ＳＥＱＩＤＮＯ：２６））を設計する。５’相同性アームと３’相同性アームの増幅テンプレートはＣ５７ＢＬ６／Ｊマウスゲノムであり、ヒトＡＣＥ２の増幅テンプレートはヒト肺細胞ｃＤＮＡである。ＰＣＲ反応系（Ｎｏｖｏｚａｎ社のＰｈａｎｔａＭａｘＳｕｐｅｒ－ＦｉｄｅｌｉｔｙＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅを使用する）及び条件は表４に示すとおりである。

例えば、ＰＣＲ増幅により得られた産物断片である５’相同性アーム、ヒトＡＣＥ２ＣＤＳ、ＳＶ４０ｐｏｌｙＡをブリッジＰＣＲ（ｏｖｅｒｌａｐＰＣＲ）を使用してＴｏｕｃｈｄｏｗｎＰＣＲ法を組み合わせて連続断片５ａｒｍ－ｈＡＣＥ－ＳＶ４０にＰＣＲする。またＰＣＲ増幅により得られた３’相同性アームを回収した後に相同組換えターゲッティングベクターを構築するために直接的に用いられ、構築過程は以下のとおりである。
１．５ａｒｍ－ｈＡＣＥ－ＳＶ４０断片についてＡｇｅＩ＋ＭｌｕＩダブルダイジェスションを行う。３’相同性アーム断片についてＡｓｃＩ＋ＨｉｎｄＩＩＩダブルダイジェスションを行った後にそれぞれダイジェスション・ライゲーションの方法に連結することにより、ターゲッティングベクターを得る。
２．ダイジェスション同定後に得られたポジティブターゲッティングベクターは配列決定同定に送られ、配列決定会社により配列が正確であると検証され（図７に示す）、それによりヒト化ＡＣＥ２ターゲッティングベクターの取得に成功した。ターゲッティングベクター配列全体はＳＥＱＩＤＮＯ：２７に示すとおりである。

例５
ＰＣＲ増幅により得られた産物断片である５’相同性アーム、ヒトＡＣＥ２ＣＤＳ、ＳＶ４０ｐｏｌｙＡをブリッジＰＣＲ（ｏｖｅｒｌａｐＰＣＲ）法を使用して連続断片５ａｒｍ－ｈＡＣＥ－ＳＶ４０にＰＣＲする。ＰＣＲ反応条件は表５に示すとおりであり、他の条件は例４と同じである。

結果は図８に示すように、３つの断片が連結された断片を増幅することができなかった。

例６ヒト化ＡＣＥ２マウス胚性幹細胞の取得
そのうちの一つの実施形態において、ヒト化ＡＣＥ２マウス胚性幹細胞の取得は以下の方法で行うことができる。
（１）Ｃ５７ＢＬ６／Ｊマウス胚性幹細胞（前記胚性幹細胞は確立された胚性幹細胞系に由来する）を液体窒素凍結保存セルバンクから蘇生させ、特に継代数がｐ１０以内のマウス胚性幹細胞を使用し、６ｃｍのペトリ皿で３日間培養成長させる。
（２）Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ^TM ＩＩｓ／２ｂエレクトロポレーター及びＭｏｕｓｅＥＳＣｅｌｌＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（登録商標）Ｋｉｔ（Ｌｏｎｚａ、ＶＰＨ－１００１）マウス胚性幹細胞エレクトロポレーションキットを組み合わせて使用して、Ａ０２３プログラムを使用して、約２×１０⁶個の胚性幹細胞がエレクトロポレーションされ、前記エレクトロポレーション過程は３μｇの線形化ターゲッティングベクター（例４のターゲッティングベクター）及び１μｇのｐＸ３３０－ｓｇＲＮＡ１を含有する１００μＬのエレクトロポレーションバッファーで行われる。前記トランスフェクトされた細胞は３つの６ウェルプレートのウェルに播種されて培養され、３６時間回復させる。回復した後、１μｇ／ｍＬのピューロマイシン（Ｍｅｒｃｋ社）が細胞培地に添加される。
３－４日のスクリーニングを経た後、ガラスニードルを使用してモノクローンを吸引する方式でピューロマイシン耐性マウス胚性幹細胞クローンを選び出して９６ウェルプレートで培養する。翌日、モノクローンをトリプシン処理して２つの部分に分け、そのうちの一方の細胞を１０μＬのＮＰ４０溶解バッファーで５６℃で６０分間単独に溶解し、次に９５℃で１０分間溶解する。
ここで、他方のマウス胚性幹細胞の培養の具体的なステップは以下のとおりである。一日前に飼育層フィーダー細胞を準備し、必要に応じて異なるウェルプレートに敷き、一晩培養して単層を形成する。ここで、飼育層フィーダー細胞はマイトマイシンＣ（ＭＭＣ）法で処理して調製されたマウス胚線維芽細胞である。ＬＩＦ及び２ｉ（ｃｈｉｒ９９０２１及びｐＤ０３２５９０１ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）を含有するｍＥＳ培地を使用して培養し、毎日新鮮な培地に交換し、細胞の成長状況に応じて培地を適宜増やすことができ、一般的に３日に一世代を継代し、継代時に０．２５％トリプシンで消化し、６ｃｍディッシュに３０万、６ウェルプレートに各ウェル１０万程度の密度で播種する。
ｍＥＳ＋ＬＩＦ＋２ｉ培地の構成は以下のとおりである。ＫｎｏｃｋｏｕｔＤＭＥＭ（１×，ｇｉｂｃｏ）＋１５％ＦＢＳ（ＦＲＯＮＴＢＩＯＭＥＤＩＣＡＬ、０．２２μｍＭｉｌｌｉｐｏｒｅフィルター濾過）＋ＧｌｕｔａＭＡＸ（１００×，ｇｉｂｃｏ）＋ＮＥＡＡ（１００×，ｇｉｂｃｏ）＋Ｐ／Ｓ（Ｐ：５０ｕｎｉｔｓ，Ｓ：５０ｍｇ／ｍｌ、Ｈｙｃｌｏｎｅ）＋β－ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ（ｇｉｂｃｏ、使用濃度０．１ｍＭ）＋ＬＩＦ（１０００ｕｎｉｔｓ／ｍｌ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）＋ＣＨＩＲ９９０２１（ＧＳＫ３β阻害剤、使用濃度３μＭ）＋ＰＤ０３２５９０１（ＭＥＫ阻害剤、使用濃度１μＭ）。
ＮＰ４０溶解液の組成は以下のとおりである。１０ｍＬＴＥ（２０ｍＭＴｒｉｓｐＨ８．０、１５０ｍＭＮａＣｌ、２ｍＭＥＤＴＡ）＋０．５％ＮＰ４０＋１０μＬプロテアーゼＫ（１０ｍｇ／ｍＬ）。
上記方法におけるｐＸ３３０－ｓｇＲＮＡ１をｐＸ３３０－ｓｇＲＮＡ２又はｐＸ３３０－ｓｇＲＮＡ３に置き換え、他のステップはｐＸ３３０－ｓｇＲＮＡ１と同じである。
ｐＸ３３０－ｓｇＲＮＡ１、ｐＸ３３０－ｓｇＲＮＡ２及びｐＸ３３０－ｓｇＲＮＡ３とターゲッティングベクターとの組み合わせによるターゲッティング効果は表６に示すとおりである。

例７ヒト化ＡＣＥ２マウス胚性幹細胞の遺伝子型の同定
例６で最後に得られた細胞溶解物を遺伝子型同定のＰＣＲスクリーニングテンプレートとする。ＰｈａｎｔａＭａｘＳｕｐｅｒ－ＦｉｄｅｌｉｔｙＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅ試薬（Ｎｏｖｏｚａｎ社）を使用することにより、メーカーの説明書に基づいてＰＣＲスクリーニングを実施する。ＰＣＲ分析はマウスＡｃｅ２部位に挿入された５’相同性アーム及び３’相同性アームを有するＨＤＲを方向性させる。ＡＣＥ２遺伝子がＸ染色体に位置し、使用されたマウス胚性幹細胞がＸＹ雄性であるため、バイアレリックジーンターゲティングの発生が存在しない。
方向性挿入プライマーの上流がピューロマイシン耐性内部に位置すると同定され（Ｐｕｒｏ－Ｆ：ａａｃｃｔｃｃｃｃｔｔｃｔａｃｇａｇｃ（ＳＥＱＩＤＮＯ：２８））、それとペアリングするプライマーの下流が３’相同性アームの外側に位置する（３ａｒｍ－ｏｕｔＲ：ｔａｃａｇｃｃａｇｇａｔｃｔｇｇａｔｇｔｃａｇｃ（ＳＥＱＩＤＮＯ：２９））。組換えベクターの挿入位置が正確であれば、長さが１５０４ｂｐであるべきのバンドが現れるはずである。この時に、マウス胚性幹細胞Ａｃｅ２部位のゲノム配列をＳＥＱＩＤＮＯ：３０に置換する。
ＰＣＲ同定の結果は図９に示すとおりであり、合計１４株のクローンを同定した。ここで、＊でマークされたものは陽性クローンであり、同時にＰＣＲ産物は配列決定の結果に応じて一致する。このＰＣＲ結果が陽性であるマウス胚性幹細胞クローンは、成功的に編集されたヒト化マウス胚性幹細胞モデルであるが、ＰＧＫ－Ｐｕｒｏスクリーニングマーカーは依然として保持され、ＰＧＫ－Ｐｕｒｏの両端が一対の同方向のｆｒｔ部位を有するため、ＦＬＰ組換え酵素を利用して除去することにより遺伝子組換えによる安全性問題を解決することができる。
ＰＧＫ－Ｐｕｒｏスクリーニングマーカーの削除方法は以下のとおりである。
上記ＰＣＲ結果が陽性であるマウス胚性幹細胞を６ｃｍディッシュに培養し続け、Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ^TM ＩＩｓ／２ｂエレクトロポレーター及びＭｏｕｓｅＥＳＣｅｌｌＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（登録商標）Ｋｉｔ（Ｌｏｎｚａ、ＶＰＨ－１００１）マウス胚性幹細胞エレクトロポレーションキットを組み合わせて使用して、Ａ０２３プログラムを使用して、約２×１０⁶個の胚性幹細胞がエレクトロポレーションされ、前記エレクトロポレーション過程はｐＰＧＫ－ＦＬＰｏプラスミド（Ａｄｄｇｅｎｅ、１３７９３）を含有する１００μＬのエレクトロポレーションバッファーで行われる。前記トランスフェクトされた細胞は６つの６ウェルプレートのウェルに播種され、３日後、ガラスニードルを使用してモノクローンを吸引する方式でマウス胚性幹細胞クローンを選び出して９６ウェルプレートで培養する。翌日、モノクローナルを消化継代して二分割し、一部をピューロマイシンによるスクリーニングを行い、一部を正常に培養する。ＰＧＫ－Ｐｕｒｏ耐性スクリーニングマーカーを成功的に削除すると、ピューロマイシンによるスクリーニングした後に細胞が不耐性になり死亡する。ピューロマイシン不耐性の対応するクローンは、上流プライマー（ｈＡＣＥ２－Ｆ：ｔｇａｔａｇｔｇｇｔｔｇｇｃａｔｔｇｔ（ＳＥＱＩＤＮＯ：３１））及び下流プライマー（３ａｒｍ－ｏｕｔＲ：ｔａｃａｇｃｃａｇｇａｔｃｔｇｇａｔｇｔｃａｇｃ（ＳＥＱＩＤＮＯ：２９））を使用してゲノム遺伝子型のＰＣＲ同定を行うことができる。ＰＧＫ－Ｐｕｒｏスクリーニングマーカーを成功的に削除すると、ＰＣＲ産物の長さは１５３２ｂｐであり、ＰＧＫ－Ｐｕｒｏを削除する前のＰＣＲ産物の長さは２８６３ｂｐである。遺伝子型の同定結果は図９に示すとおりであり、ゲル電気泳動バンドが１５００ｂｐにあるものはＰＧＫ－ｐｕｒｏを成功的に削除した後のクローンであり、バンドが３０００ｂｐにあるものは削除前のクローンである。ピューロマイシン不耐性の対応するクローンは、最終的にヒト化ＡＣＥ２ターゲッティングされたマウス胚性幹細胞に成功的に編集され、すなわちマウス胚性幹細胞は最終的に図１０に示すようなヒト化ＡＣＥ２遺伝子を取得した。最終的にＰＧＫ－ｐｕｒｏを削除した後のマウス胚性幹細胞のＡｃｅ２部位のゲノム配列はＳＥＱＩＤＮＯ：３２に示される配列に置換された。

例８ヒト化ＡＣＥ２遺伝子改造マウスの形成
１、７．５単位のＰＭＳＧを４－１０週齢のＢ６Ｃ３Ｆ１のメスマウスに腹腔内注射し、４８時間後にｈＣＧを注射して、ＣＤ１のオスマウスと一緒にケージに入れ、翌朝、メスマウスの膣栓をチェックして、膣栓のあるメスマウスを選び出し、メスマウスの対応する受精時間を記録する。
２、翌日、妊娠マウスを頸椎脱臼法により安楽死させ、７０％のアルコールでマウスの腹部を消毒し、ドレッシング・ピンセット及び眼科用ハサミで腹部の皮膚及び筋肉層を切り、腹腔を開く。ピンセットで一つの子宮角の上部を掴み、ハサミで卵管近くの膜に小さな開口を開け、卵管と卵巣の接続部を切断し、卵管及び付属する子宮を３５ｍｍのペトリ皿に移し、ピンセットで卵管采側を固定し、Ｍ２培養液（Ｈｏｇａｎ，Ｂ．（１９９４）．Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇｔｈｅｍｏｕｓｅｅｍｂｒｙｏ：ａｌａｂｏｒａｔｏｒｙｍａｎｕａｌ，２ｎｄｅｄｎ（ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ，ＮＹ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ）．）を充填したフラッシングニードルで卵管采に軽く挿入し、０．１ｍＬのＭ２培養液で卵管をフラッシュし、卵移動管でフラッシュされた胚を収集し、Ｍ２で３回洗浄し、Ｅ１．５のマウス２－細胞胚を収集する。
３、収集されたマウス胚を０．１ｍＭのＭｇＳＯ₄、０．１ｍＭのＣａＣｌ₂及び０．３％ウシ血清アルブミンを含有する０．３Ｍのマンニトール（Ｓｉｇｍａ－ＡｌｄｒｉｃｈＩｎｃ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）に入れ、ＣｅｌｌｆｕｓｉｏｎＣＦ－１５０／Ｂ電気融合装置及び２５０－ｕｍ融合タンク（ＢＬＳＬｔｄ．，Ｂｕｄａｐｅｓｔ、Ｈｕｎｇａｒｙ）で６０Ｖ、５０マイクロ秒の直流電融合を行い、４倍体胚を得る。ＫＳＯＭ培地（Ｓｕｍｍｅｒｓ，Ｍ．Ｃ．，ＭｃＧｉｎｎｉｓ，Ｌ．Ｋ．，Ｌａｗｉｔｔｓ，Ｊ．Ａ．，Ｒａｆｆｉｎ，Ｍ．，ａｎｄＢｉｇｇｅｒｓ，Ｊ．Ｄ．（２０００）．ＩＶＦｏｆｍｏｕｓｅｏｖａｉｎａｓｉｍｐｌｅｘｏｐｔｉｍｉｚｅｄｍｅｄｉｕｍｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｅｄｗｉｔｈａｍｉｎｏａｃｉｄｓ．ＨｕｍＲｅｐｒｏｄ１５，１７９１－１８０１．）に入れ、ＣＯ₂インキュベーターで２４時間培養した後に、酸性タイロード溶液（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｔ１７８８）で透明帯を除去し、胚性幹細胞（例６で得られたヒト化ＡＣＥ２マウス胚性幹細胞）と凝集させ、マウス胚を形成する（Ｎａｇｙ，Ａ．，Ｒｏｓｓａｎｔ，Ｊ．，Ｎａｇｙ，Ｒ．，Ａｂｒａｍｏｗ－Ｎｅｗｅｒｌｙ，Ｗ．，ａｎｄＲｏｄｅｒ，Ｊ．Ｃ．（１９９３）．Ｄｅｒｉｖａｔｉｏｎｏｆｃｏｍｐｌｅｔｅｌｙｃｅｌｌｃｕｌｔｕｒｅ－ｄｅｒｉｖｅｄｍｉｃｅｆｒｏｍｅａｒｌｙ－ｐａｓｓａｇｅｅｍｂｒｙｏｎｉｃｓｔｅｍｃｅｌｌｓ．ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ９０，８４２４－８４２８．）
４、ＣＯ₂インキュベータ内で一晩インキュベートし、Ｅ２．５日の偽妊娠マウスの子宮に移植し、１７日後に代理マウスを頸椎脱臼法により安楽死させた後に開腹手術を行い、生存及び呼吸している新生マウスを授乳マウスのケージ内に入れ、２１日後に離乳し、完全に胚性幹細胞に由来する遺伝子組換えマウス、すなわち、ヒト化ＡＣＥ２遺伝子改造マウスが得られる（図１２）。
対応する培地組成は、表７に示すとおりである。

例９ヒト化ＡＣＥ２マウス発現の同定
新生ヒト化ＡＣＥ２マウス及び野生型マウスを解剖し、それぞれ肺、腎臓、腸を取り出し、Ｔｒｉｚｏｌで溶解し、次に細胞／組織トータルＲＮＡ抽出キット（Ｎｏｖｏｚａｎ、ＲＣ１０１－０１）でＲＮＡを抽出し、及びＨｉＳｃｒｉｐｔＩＩＱＲＴＳｕｐｅｒＭｉｘｆｏｒｑＰＣＲ試薬（Ｎｏｖｏｚａｎ、Ｒ２２２－０１）で反転させる。抽出された組織のｃＤＮＡについて、ｈＡＣＥ２特異的プライマー（ｈＡＣＥ２－ｑＦ：ＴＧＡＴＡＧＴＧＧＴＴＧＧＣＡＴＴＧＴ、ｈＡＣＥ２－ｑＲ：ＣＧＡＴＧＧＡＧＧＣＡＴＡＡＧＧＡＴＴ）及びｍＡＣＥ２特異的プライマー（ｍＡＣＥ２－ｑＦ：ＧＧＴＴＧＧＣＡＴＣＡＴＣＡＴＣＣＴ；ｍＡＣＥ２－ｑＲ：ＧＴＣＴＧＡＧＣＡＴＣＡＴＣＡＣＴＧＴ）を使用してｑＰＣＲ測定（Ｎｏｖｏｚａｎ、Ｑ３２１－０２）を行ったところ、ヒト化ＡＣＥ２マウス組織がｈＡＣＥ２を特異的に発現し、野生型マウスがｈＡＣＥ２を発現せず（図１３）、かつｈＡＣＥ２マウスのｍＡＣＥ２発現が欠失した（図１４）。さらに、本発明者らはそれぞれｈＡＣＥ２マウス及び野生型ＡＣＥ２マウスの腸組織を採取しウエスタン・ブロッティング実験を行い、ヒト特異的ＡＣＥ２抗体（Ａｂｃａｍ、ａｂ１０８２０９）でドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動法（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）を行ってｈＡＣＥ２マウスがタンパク質レベルでｈＡＣＥ２タンパク質を発現していることが確認された（図１５）。

例１０マウスの製造方法（２－細胞期／Ｍｇ ²⁺ 及びＣａ ²⁺ 濃度を高めた電気融合液群）
本例で使用されたマウス胚性幹細胞は、上記例６、例７で得られたピューロマイシン不耐性のヒト化ＡＣＥ２ターゲティングされたマウス胚性幹細胞である。具体的な実験では、液体窒素凍結保存セルバンクから蘇生させ、特に継代数がｐ１５以内の胚性幹細胞を使用し、６ｃｍのペトリ皿で３日間培養成長させる。本例では、第１２世代の胚性幹細胞を使用した。
１、例１０で使用された溶液組成はそれぞれ表８－表１０に示すとおりである。

２、マウスの製造
（１）７．５単位のＰＭＳＧを４－１０週齢のＢ６Ｃ３Ｆ１のメスマウスに腹腔内注射し、４８時間後にｈＣＧを注射して、ＣＤ１のオスマウスと一緒にケージに入れ、翌朝、メスマウスの膣栓をチェックして、膣栓のあるメスマウスを選び出し、メスマウスの対応する受精時間を記録する。
（２）翌日、妊娠マウスを頸椎脱臼法により安楽死させ、７０％のアルコールでマウスの腹部を消毒し、ドレッシング・ピンセット及び眼科用ハサミで腹部の皮膚及び筋肉層を切り、腹腔を開く。ピンセットで一つの子宮角の上部を掴み、ハサミで卵管近くの膜に小さな開口を開け、卵管と卵巣の接続部を切断し、卵管及び付属する子宮を３５ｍｍのペトリ皿に移し、ピンセットで卵管采側を固定し、Ｍ２培養液（Ｈｏｇａｎ、１９９４）を充填したフラッシングニードルで卵管采に軽く挿入し、０．１ｍＬのＭ２培養液で卵管をフラッシュし、卵移動管でフラッシュされた胚を収集し、Ｍ２で３回洗浄し、Ｅ１．５（受精後１．５日）のマウス２－細胞胚を収集する。
（３）収集されたマウス２－細胞胚を改良された電気融合液（表８に記載された組成）に入れ、ＣｅｌｌｆｕｓｉｏｎＣＦ－１５０／Ｂ電気融合装置及び２５０－ミクロン電極間隔の融合タンク（ＢＬＳＬｔｄ．，Ｂｕｄａｐｅｓｔ、Ｈｕｎｇａｒｙ）で６０ボルト、５０マイクロ秒の直流電気融合を行い、それにより四倍体胚が得られ、その後に融合された胚をＫＳＯＭ培地（Ｓｕｍｍｅｒｓｅｔａｌ．，２０００）に入れ、ＣＯ₂インキュベーターで１５時間培養する。その結果、改善された電気融合液の融合効率が１００％に達することが示されている。
（４）四倍体胚を２－細胞期に発育させ、酸性タイロード溶液で透明帯を除去し、０．２５％トリプシンで消化された後のマウス胚性幹細胞と凝集させ、さらに２４時間培養した後にキメラ胚を形成する。
（５）最後に、キメラ胚を妊娠２．５日の偽妊娠マウスの子宮に移し、１７日後に満期まで発育した新生マウスが得られる。
四倍体胚は、胎盤等の胚体外組織のみを効果的に形成できるため、四倍体胚と胚性幹細胞とのキメラ胚から得られた新生マウスは完全に胚性幹細胞に由来する。
本例のマウスを製造するフローチャートは図１６に示すとおりである。マウスの出生率の結果は図１８に示すとおりであり、図１８から分かるように、例１０の方法で製造されたマウスの生存率は２５％（１０／４０）に達した。

試験例１
胚性幹細胞の取得が例１０と異なる以外に、他は例１０の操作ステップと同様である。
本例において、マウス胚性幹細胞は遺伝子修飾されていない一般的な胚性幹細胞であり、その取得は以下の方法に従って行われる。Ｃ５７ＢＬ６／Ｊマウス胚性幹細胞を液体窒素凍結保存セルバンクから蘇生させ、継代数がｐ１２のマウス胚性幹細胞を使用し、６ｃｍのペトリ皿で３日間培養成長させる。
マウスを製造するフローチャートは図１６に示すとおりである。マウスの出生率の結果は図１９に示すとおりであり、図１９から分かるように、試験例１の方法で製造されたマウスの生存率は３３．３％（４８／１４４）に達した。

例１１マウスの製造方法（２－細胞期／従来の融合液群）
本例で使用されたマウス胚性幹細胞は、上記例６、例７で得られたピューロマイシン不耐性のヒト化ＡＣＥ２ターゲティングされたマウス胚性幹細胞である。具体的な実験では、液体窒素凍結保存セルバンクから蘇生させ、特に継代数がｐ１５以内の胚性幹細胞を使用し、６ｃｍのペトリ皿で３日間培養成長させる。本例では、第１２世代の胚性幹細胞を使用した。
ここで、ＫＳＯＭ培地及びＭ２培養液は例１０と同じである。
１．７．５単位のＰＭＳＧを４－１０週齢のＢ６Ｃ３Ｆ１のメスマウスに腹腔内注射し、４８時間後にｈＣＧを注射して、ＣＤ１のオスマウスと一緒にケージに入れ、翌朝、メスマウスの膣栓をチェックして、膣栓のあるメスマウスを選び出し、メスマウスの対応する受精時間を記録する。
２．翌日、妊娠マウスを頸椎脱臼法により安楽死させ、７０％のアルコールでマウスの腹部を消毒し、ドレッシング・ピンセット及び眼科用ハサミで腹部の皮膚及び筋肉層を切り、腹腔を開く。ピンセットで一つの子宮角の上部を掴み、ハサミで卵管近くの膜に小さな開口を開け、卵管と卵巣の接続部を切断し、卵管及び付属する子宮を３５ｍｍのペトリ皿に移し、ピンセットで卵管采側を固定し、Ｍ２培養液（Ｈｏｇａｎ、１９９４）を充填したフラッシングニードルで卵管采に軽く挿入し、０．１ｍＬのＭ２培養液で卵管をフラッシュし、卵移動管でフラッシュされた胚を収集し、Ｍ２で３回洗浄し、Ｅ１．５のマウス２－細胞胚を収集する。
３．収集されたマウス２－細胞胚を電気融合液（表１１に示される組成）に入れ、ＣｅｌｌｆｕｓｉｏｎＣＦ－１５０／Ｂ電気融合装置及び２５０－ミクロン電極間隔の融合タンク（ＢＬＳＬｔｄ．，Ｂｕｄａｐｅｓｔ、Ｈｕｎｇａｒｙ）で６０ボルト、５０マイクロ秒の直流電気融合を行い、それにより四倍体胚が得られ、その後に融合された胚をＫＳＯＭ培地（Ｓｕｍｍｅｒｓｅｔａｌ．，２０００）に入れ、ＣＯ₂インキュベータで２４時間培養する。その結果、融合効率が８０－９０％であり、電気融合効率が１００％に達することができない。
４．四倍体胚を２－細胞期に発育させ、酸性タイロード溶液で透明帯を除去し、０．２５％トリプシンで消化された後のマウス胚性幹細胞と凝集させ、さらに２４時間培養した後にキメラ胚を形成し、又は胚盤胞期まで４８時間培養し、胚性幹細胞をマイクロマニピュレーションにより胚盤胞腔に注入する（Ｎａｇｙｅｔａｌ．，１９９３）。
５．最後に、キメラ胚を妊娠２．５日の偽妊娠マウスの子宮に移し、１７日後に満期まで発育した新生マウスが得られる。四倍体胚は、胎盤等の胚体外組織のみを効果的に形成できるため、四倍体胚と胚性幹細胞とのキメラ胚から得られた新生マウスは完全に胚性幹細胞に由来する。

マウスを製造するフローチャートは図１６に示すとおりである。本実施のマウスの出生率の結果を図１８に示すとおりである。図１８から分かるように、マウスの生存率は１４．２％（１５／１０６）であった。

試験例２
胚性幹細胞の取得が例１１と異なる以外に、他は例１１の操作と同様である。
本例において、マウス胚性幹細胞は遺伝子修飾されていない一般的な胚性幹細胞であり、その取得は以下の方法に従って行われる。Ｃ５７ＢＬ６／Ｊマウス胚性幹細胞を液体窒素凍結保存セルバンクから蘇生させ、継代数がｐ１２のマウス胚性幹細胞を使用し、６ｃｍのペトリ皿で３日間培養成長させる。
マウスを製造するフローチャートは図１６に示すとおりである。マウスの出生率の結果は図１９に示すとおりであり、図１９から分かるように、マウスの生存率は２１．１％（３２／１５２）であった。

例１２マウスの製造方法（４－細胞期／Ｍｇ ²⁺ 及びＣａ ²⁺ 濃度を高めた電気融合液群）
本例で使用されたマウス胚性幹細胞は、上記例６、例７で得られたピューロマイシン不耐性のヒト化ＡＣＥ２ターゲティングされたマウス胚性幹細胞である。具体的な実験では、液体窒素凍結保存セルバンクから蘇生させ、特に継代数がｐ１５以内の胚性幹細胞を使用し、６ｃｍのペトリ皿で３日間培養成長させる。本例では、第１２世代の胚性幹細胞を使用した。
ここで、ＫＳＯＭ培地及びＭ２培養液は例１０と同じである。
１．７．５単位のＰＭＳＧを４－１０週齢のＢ６Ｃ３Ｆ１のメスマウスに腹腔内注射し、４８時間後にｈＣＧを注射して、ＣＤ１のオスマウスと一緒にケージに入れ、翌朝、メスマウスの膣栓をチェックして、膣栓のあるメスマウスを選び出し、メスマウスの対応する受精時間を記録する。
２．翌日、妊娠マウスを頸椎脱臼法により安楽死させ、７０％のアルコールでマウスの腹部を消毒し、ドレッシング・ピンセット及び眼科用ハサミで腹部の皮膚及び筋肉層を切り、腹腔を開く。ピンセットで一つの子宮角の上部を掴み、ハサミで卵管近くの膜に小さな開口を開け、卵管と卵巣の接続部を切断し、卵管及び付属する子宮を３５ｍｍのペトリ皿に移し、ピンセットで卵管采側を固定し、Ｍ２培養液（Ｈｏｇａｎ、１９９４）を充填したフラッシングニードルで卵管采に軽く挿入し、０．１ｍＬのＭ２培養液で卵管をフラッシュし、卵移動管でフラッシュされた胚を収集し、Ｍ２で３回洗浄し、Ｅ１．５のマウス２－細胞胚を収集する。
３．収集されたマウス２－細胞胚を電気融合液（表１２に示される組成）に入れ、ＣｅｌｌｆｕｓｉｏｎＣＦ－１５０／Ｂ電気融合装置及び２５０－ミクロン電極間隔の融合タンク（ＢＬＳＬｔｄ．，Ｂｕｄａｐｅｓｔ、Ｈｕｎｇａｒｙ）で６０ボルト、５０マイクロ秒の直流電気融合を行い、それにより四倍体胚が得られ、その後に融合された胚をＫＳＯＭ培地（Ｓｕｍｍｅｒｓｅｔａｌ．，２０００）に入れ、ＣＯ₂インキュベータで２４時間培養する。その結果、改善された電気融合液の融合効率が１００％に達することが示されている。
４．四倍体胚を４－細胞期に発育させ、酸性タイロード溶液で透明帯を除去し、０．２５％トリプシンで消化された後のマウス胚性幹細胞と凝集させ、さらに２４時間培養した後にキメラ胚を形成し、又は胚盤胞期まで４８時間培養し、胚性幹細胞をマイクロマニピュレーションにより胚盤胞腔に注入する（Ｎａｇｙｅｔａｌ．，１９９３）。
５．最後に、キメラ胚を妊娠２．５日の偽妊娠マウスの子宮に移し、１７日後に満期まで発育した新生マウスが得られる。四倍体胚は、胎盤等の胚体外組織のみを効果的に形成できるため、四倍体胚と胚性幹細胞とのキメラ胚から得られた新生マウスは完全に胚性幹細胞に由来する。

マウスを製造するフローチャートは図１７に示すとおりである。
本実施のマウスの出生率の結果を図１８に示すとおりである。図１８から分かるように、マウスの生存率は２．５％（３／１２１）であった。

試験例３
胚性幹細胞の取得が例１２と異なる以外に、他は例１２の操作と同様である。
本例において、マウス胚性幹細胞は遺伝子修飾されていない一般的な胚性幹細胞であり、その取得は以下の方法に従って行われる。Ｃ５７ＢＬ６／Ｊマウス胚性幹細胞を液体窒素凍結保存セルバンクから蘇生させ、継代数がｐ１２のマウス胚性幹細胞を使用し、６ｃｍのペトリ皿で３日間培養成長させる。
マウスを製造するフローチャートは図１７に示すとおりである。マウスの出生率の結果は図１９に示すとおりであり、図１９から分かるように、マウスの生存率は７．５％（９／１２０）であった。

例１３マウスの製造方法（４－細胞期／従来の融合液群）
本例で使用されたマウス胚性幹細胞は、上記例６、例７で得られたピューロマイシン不耐性のヒト化ＡＣＥ２ターゲティングされたマウス胚性幹細胞である。具体的な実験では、液体窒素凍結保存セルバンクから蘇生させ、特に継代数がｐ１５以内の胚性幹細胞を使用し、６ｃｍのペトリ皿で３日間培養成長させる。本例では、第１２世代の胚性幹細胞を使用した。ここで、ＫＳＯＭ培地及びＭ２培養液は例１０と同じである。
１．７．５単位のＰＭＳＧを４－１０週齢のＢ６Ｃ３Ｆ１のメスマウスに腹腔内注射し、４８時間後にｈＣＧを注射して、ＣＤ１のオスマウスと一緒にケージに入れ、翌朝、メスマウスの膣栓をチェックして、膣栓のあるメスマウスを選び出し、メスマウスの対応する受精時間を記録する。
２．翌日、妊娠マウスを頸椎脱臼法により安楽死させ、７０％のアルコールでマウスの腹部を消毒し、ドレッシング・ピンセット及び眼科用ハサミで腹部の皮膚及び筋肉層を切り、腹腔を開く。ピンセットで一つの子宮角の上部を掴み、ハサミで卵管近くの膜に小さな開口を開け、卵管と卵巣の接続部を切断し、卵管及び付属する子宮を３５ｍｍのペトリ皿に移し、ピンセットで卵管采側を固定し、Ｍ２培養液（Ｈｏｇａｎ、１９９４）を充填したフラッシングニードルで卵管采に軽く挿入し、０．１ｍＬのＭ２培養液で卵管をフラッシュし、卵移動管でフラッシュされた胚を収集し、Ｍ２で３回洗浄し、Ｅ１．５のマウス２－細胞胚を収集する。
３．収集されたマウス２－細胞胚を電気融合液（表１３に示される組成）に入れ、ＣｅｌｌｆｕｓｉｏｎＣＦ－１５０／Ｂ電気融合装置及び２５０－ミクロン電極間隔の融合タンク（ＢＬＳＬｔｄ．，Ｂｕｄａｐｅｓｔ、Ｈｕｎｇａｒｙ）で６０ボルト、５０マイクロ秒の直流電気融合を行い、それにより四倍体胚が得られ、その後に融合された胚をＫＳＯＭ培地（Ｓｕｍｍｅｒｓｅｔａｌ．，２０００）に入れ、ＣＯ₂インキュベータで２４時間培養する。電気融合効率は８０－９０％であった。
４．四倍体胚を４－細胞期に発育させ、酸性タイロード溶液で透明帯を除去し、０．２５％トリプシンで消化された後のマウス胚性幹細胞と凝集させ、さらに２４時間培養した後にキメラ胚を形成し、又は胚盤胞期まで４８時間培養し、胚性幹細胞をマイクロマニピュレーションにより胚盤胞腔に注入する（Ｎａｇｙｅｔａｌ．，１９９３）。
５．最後に、キメラ胚を妊娠２．５日の偽妊娠マウスの子宮に移し、１７日後に満期まで発育した新生マウスが得られる。四倍体胚は、胎盤等の胚体外組織のみを効果的に形成できるため、四倍体胚と胚性幹細胞とのキメラ胚から得られた新生マウスは完全に胚性幹細胞に由来する。

本例５でマウスを製造する過程及び結果は図１７に示すとおりである。図１７から分かるように、マウスの製造効率が非常に低い。さらに、マウスの出生率の結果は図１８に示すとおりである。図１８から分かるように、マウスの生存率はわずか０．３％（１／３５０）であった。

試験例４
胚性幹細胞の取得が例１３と異なる以外に、他は例１３の操作と同様である。
本例において、マウス胚性幹細胞は遺伝子修飾されていない一般的な胚性幹細胞であり、その取得は以下の方法に従って行われる。Ｃ５７ＢＬ６／Ｊマウス胚性幹細胞を液体窒素凍結保存セルバンクから蘇生させ、継代数がｐ１２のマウス胚性幹細胞を使用し、６ｃｍのペトリ皿で３日間培養成長させる。
マウスを製造するフローチャートは図１７に示すとおりである。マウスの出生率の結果は図１９に示すとおりであり、図１９から分かるように、マウスの生存率はわずか２．５％（４／１６３）であった。

Claims

キメラ胚の製造方法であって、前記方法は四倍体胚と胚性幹細胞を重合させ新たな再構成胚又はキメラ胚を形成することを含み、前記四倍体胚は２－細胞期にある四倍体胚であり、
好ましくは、前記方法は四倍体補償法又は四倍体胚相補法を使用し、
好ましくは、前記方法は
（１）動物の２－細胞胚を取得するステップと、
（２）ステップ（１）に記載の２－細胞胚を融合液に入れ、融合させ、四倍体胚を取得するステップと、
（３）ステップ（２）における四倍体胚を培地に入れて培養するステップと、
（４）ステップ（３）における２－細胞期に発育した四倍体胚を胚性幹細胞と重合させ、キメラ胚を形成するステップと、を含み、
好ましくは、ステップ（３）における培養時間は約８－２４時間であり、
又は好ましくは、ステップ（３）における培地はＫＳＯＭ培地である、キメラ胚の製造方法。
非ヒト動物の製造方法であって、前記方法は四倍体胚と胚性幹細胞を重合させ新たな再構成胚又はキメラ胚を形成することを含み、前記四倍体胚は２－細胞期にある四倍体胚であり、
好ましくは、前記方法は四倍体補償法又は四倍体胚相補法を使用し、
好ましくは、前記方法は
（１）動物の２－細胞胚を取得するステップと、
（２）ステップ（１）に記載の２－細胞胚を融合液に入れ、融合させ、四倍体胚を取得するステップと、
（３）ステップ（２）における四倍体胚を培地に入れて培養するステップと、
（４）ステップ（３）における２－細胞期に発育した四倍体胚を胚性幹細胞と重合させ、キメラ胚を形成するステップと、を含み、
好ましくは、ステップ（３）における培養時間は約８－２４時間であり、
又は好ましくは、ステップ（３）における培地はＫＳＯＭ培地であることを特徴とする、非ヒト動物の製造方法。
前記動物は哺乳動物であり、
好ましくは、前記動物は非ヒト哺乳動物であり、
好ましくは、前記動物はブタ、ラット、マウス、ハムスター、ウサギ、ブタ、ウシ、シカ、ヒツジ、ヤギ、ニワトリ、ネコ、ウマ、イヌ、オランウータン、サルから選択され、
好ましくは、前記動物はネズミから選択され、
好ましくは、前記動物は成体ネズミから選択され、
好ましくは、前記動物は胎児ネズミから選択され、
好ましくは、前記動物は遺伝子編集動物であり、
好ましくは、前記動物は遺伝子ヒト化動物であり、
好ましくは、前記遺伝子はＡＣＥ２である、請求項１又は２に記載の方法。
前記融合は、成分がマンニトール、ＭｇＳＯ₄、ＣａＣｌ₂及びウシ血清アルブミンを含む組成物が使用され、前記マンニトール、ＭｇＳＯ₄、ＣａＣｌ₂及びウシ血清アルブミンの質量比は９～５３：０．０１５～０．２４１：０．０１３～０．２３：０．０１～５であり、
好ましくは、前記組成物におけるマンニトール、ＭｇＳＯ₄、ＣａＣｌ₂及びウシ血清アルブミンの質量比は１８～５２：０．０１８～０．２４１：０．０１６～０．２３：０．０１－４であり、
好ましくは、前記組成物におけるマンニトール、ＭｇＳＯ₄、ＣａＣｌ₂及びウシ血清アルブミンの質量比は２７～５２：０．０１８～０．１２：０．０１６～０．１：１～３．５であり、
好ましくは、前記組成物は、マンニトール０．０５－０．２９Ｍ、ＭｇＳＯ₄０．１２－２ｍＭ、ＣａＣｌ₂０．１２－２ｍＭ、ウシ血清アルブミン０．０１－５ｍｇ／ｍＬという成分を含み、
好ましくは、前記組成物は、マンニトール０．１－０．２８Ｍ、ＭｇＳＯ₄０．１５－２ｍＭ、ＣａＣｌ₂０．１５－２ｍＭ、ウシ血清アルブミン０．０１－４ｍｇ／ｍＬという成分を含み、
好ましくは、前記組成物は、マンニトール０．１５－０．２８Ｍ、ＭｇＳＯ₄０．１５－１ｍＭ、ＣａＣｌ₂０．１５－１ｍＭ、ウシ血清アルブミン１－３．５ｍｇ／ｍＬという成分を含み、
より好ましくは、前記組成物は、マンニトール０．１８－０．２８Ｍ、ＭｇＳＯ₄０．１５－０．５ｍＭ、ＣａＣｌ₂０．１５－０．５ｍＭ、ウシ血清アルブミン２－３．５ｍｇ／ｍＬという成分を含み、
さらに好ましくは、前記組成物は、マンニトール０．２－０．２８Ｍ、ＭｇＳＯ₄０．１５－０．３ｍＭ、ＣａＣｌ₂０．１５－０．３ｍＭ、ウシ血清アルブミン２－３ｍｇ／ｍＬという成分を含み、
好ましくは、前記組成物は電気融合液であり、
又は好ましくは、前記電気融合液はマンニトール、ウシ血清アルブミン、Ｍｇ²⁺及びＣａ²⁺を含み、前記電気融合液は濃度を高めたＭｇ²⁺及びＣａ²⁺を有し、又は、前記電気融合液のＭｇ²⁺及びＣａ²⁺の濃度はそれぞれ０．１２－２ｍＭ、０．１２－２ｍＭであり、
好ましくは、前記電気融合液におけるマンニトール、ウシ血清アルブミンの濃度はそれぞれ０．０５－０．２９Ｍ、０．０１－５ｍｇ／ｍＬであり、
より好ましくは、前記Ｍｇ²⁺及びＣａ²⁺はそれぞれＭｇＳＯ₄及びＣａＣｌ₂に由来し、
より好ましくは、前記電気融合液は四倍体胚を製造するために用いられる、請求項１又は２に記載の方法。
請求項２～４のいずれか一項に記載の方法で製造される非ヒト動物又はその子孫の組織、体液、細胞、及びそれらの破砕物又は抽出物。
請求項１～４のいずれか一項に記載の方法で製造される非ヒト動物。
ＳＥＱＩＤＮＯ：１９に示される配列と少なくとも８５％又は少なくとも９０％又は少なくとも９１％又は少なくとも９２％又は少なくとも９３％又は少なくとも９４％又は少なくとも９５％又は少なくとも９６％又は少なくとも９７％又は少なくとも９８％又は少なくとも９９％、又は１００％の同一性を有する上流プライマーと、ＳＥＱＩＤＮＯ：２０に示される配列と少なくとも８５％又は少なくとも９０％又は少なくとも９１％又は少なくとも９２％又は少なくとも９３％又は少なくとも９４％又は少なくとも９５％又は少なくとも９６％又は少なくとも９７％又は少なくとも９８％又は少なくとも９９％、又は１００％の同一性を有する下流プライマーとを含むプライマー組み合わせ。
前記プライマー組み合わせは、ＳＥＱＩＤＮＯ：２１に示される配列と少なくとも８５％又は少なくとも９０％又は少なくとも９１％又は少なくとも９２％又は少なくとも９３％又は少なくとも９４％又は少なくとも９５％又は少なくとも９６％又は少なくとも９７％又は少なくとも９８％又は少なくとも９９％、又は１００％の同一性を有する上流プライマーと、ＳＥＱＩＤＮＯ：２２に示される配列と少なくとも８５％又は少なくとも９０％又は少なくとも９１％又は少なくとも９２％又は少なくとも９３％又は少なくとも９４％又は少なくとも９５％又は少なくとも９６％又は少なくとも９７％又は少なくとも９８％又は少なくとも９９％、又は１００％の同一性を有する下流プライマーとをさらに含み、
より好ましくは、前記プライマー組み合わせは、ＳＥＱＩＤＮＯ：２３に示される配列と少なくとも８５％又は少なくとも９０％又は少なくとも９１％又は少なくとも９２％又は少なくとも９３％又は少なくとも９４％又は少なくとも９５％又は少なくとも９６％又は少なくとも９７％又は少なくとも９８％又は少なくとも９９％、又は１００％の同一性を有する上流プライマーと、ＳＥＱＩＤＮＯ：２４に示される配列と少なくとも８５％又は少なくとも９０％又は少なくとも９１％又は少なくとも９２％又は少なくとも９３％又は少なくとも９４％又は少なくとも９５％又は少なくとも９６％又は少なくとも９７％又は少なくとも９８％又は少なくとも９９％、又は１００％の同一性を有する下流プライマーとをさらに含み、
より好ましくは、前記プライマー組み合わせは、ＳＥＱＩＤＮＯ：２５に示される配列と少なくとも８５％又は少なくとも９０％又は少なくとも９１％又は少なくとも９２％又は少なくとも９３％又は少なくとも９４％又は少なくとも９５％又は少なくとも９６％又は少なくとも９７％又は少なくとも９８％又は少なくとも９９％、又は１００％の同一性を有する上流プライマーと、ＳＥＱＩＤＮＯ：２６に示される配列と少なくとも８５％又は少なくとも９０％又は少なくとも９１％又は少なくとも９２％又は少なくとも９３％又は少なくとも９４％又は少なくとも９５％又は少なくとも９６％又は少なくとも９７％又は少なくとも９８％又は少なくとも９９％、又は１００％の同一性を有する下流プライマーとをさらに含む、請求項７に記載のプライマー組み合わせ。
請求項７又は８に記載のプライマー組み合わせの、細胞株又は細胞系又は非ヒト動物の製造における応用であって、
好ましくは、前記動物は哺乳動物であり、
好ましくは、前記動物はブタ、ラット、マウス、ハムスター、ウサギ、ブタ、ウシ、シカ、ヒツジ、ヤギ、ニワトリ、ネコ、ウマ、イヌ、オランウータン又はサルから選択され、
好ましくは、前記哺乳動物はげっ歯類動物であり、
好ましくは、前記動物はネズミであり、
好ましくは、前記動物は成体ネズミから選択され、
好ましくは、前記動物は胎児ネズミから選択され、
好ましくは、前記動物は遺伝子ヒト化動物であり、
好ましくは、前記遺伝子はＡＣＥ２である。
互いに連結された５’相同性アーム配列、ヒト由来ＡＣＥ２遺伝子断片及びＳＶ４０ｐｏｌｙＡ配列を含むターゲッティングベクターであって、
好ましくは、前記５’相同性アームは前記対象ゲノム遺伝子座での５’標的配列と相同性を有する５’相同性アームであり、
好ましくは、前記ターゲッティングベクターは、請求項７又は８に記載のプライマー組み合わせにより、５’相同性アーム配列、ヒト由来ＡＣＥ２遺伝子断片及びＳＶ４０ｐｏｌｙＡ配列を連結し、
好ましくは、前記ターゲッティングベクターは、ヒト由来ＡＣＥ２遺伝子のＣＤＳ配列を動物遺伝子のプロモーター及び５’ＵＴＲ領域配列に挿入した後、動物目的遺伝子プロモーターを利用してヒト目的遺伝子の発現を起動するために用いられ、
好ましくは、前記５’相同性アーム配列は、ＳＥＱＩＤＮＯ：１５に示される配列と少なくとも８５％又は少なくとも９０％又は少なくとも９１％又は少なくとも９２％又は少なくとも９３％又は少なくとも９４％又は少なくとも９５％又は少なくとも９６％又は少なくとも９７％又は少なくとも９８％又は少なくとも９９％、又は１００％の同一性を有し、
好ましくは、前記ＡＣＥ２遺伝子のＣＤＳ配列は、ＳＥＱＩＤＮＯ：１２に示される配列と少なくとも８５％又は少なくとも９０％又は少なくとも９１％又は少なくとも９２％又は少なくとも９３％又は少なくとも９４％又は少なくとも９５％又は少なくとも９６％又は少なくとも９７％又は少なくとも９８％又は少なくとも９９％、又は１００％の同一性を有し、
好ましくは、前記ＳＶ４０ｐｏｌｙＡ配列は、ＳＥＱＩＤＮＯ：１４に示される配列と少なくとも８５％又は少なくとも９０％又は少なくとも９１％又は少なくとも９２％又は少なくとも９３％又は少なくとも９４％又は少なくとも９５％又は少なくとも９６％又は少なくとも９７％又は少なくとも９８％又は少なくとも９９％、又は１００％の同一性を有し、
好ましくは、前記ＳＶ４０ｐｏｌｙＡ配列は、前記ＣＤＳ配列の後に位置し、
好ましくは、前記ターゲッティングベクターは、３’相同性アームをさらに含み、前記３’相同性アームは前記対象ゲノム遺伝子座での３’標的配列と相同性を有する３’相同性アームであり、
好ましくは、前記３’相同性アームの配列は、ＳＥＱＩＤＮＯ：１６に示される配列と少なくとも８５％又は少なくとも９０％又は少なくとも９１％又は少なくとも９２％又は少なくとも９３％又は少なくとも９４％又は少なくとも９５％又は少なくとも９６％又は少なくとも９７％又は少なくとも９８％又は少なくとも９９％、又は１００％の同一性を有し、
好ましくは、前記ターゲッティングベクターは、ＳＥＱＩＤＮＯ：１７に示される配列と少なくとも８５％又は少なくとも９０％又は少なくとも９１％又は少なくとも９２％又は少なくとも９３％又は少なくとも９４％又は少なくとも９５％又は少なくとも９６％又は少なくとも９７％又は少なくとも９８％又は少なくとも９９％、又は１００％の同一性を有するスクリーニングマーカーＰＧＫ－Ｐｕｒｏをさらに含み、
好ましくは、前記ターゲッティングベクターは、ＳＥＱＩＤＮＯ：１８に示される配列と少なくとも８５％又は少なくとも９０％又は少なくとも９１％又は少なくとも９２％又は少なくとも９３％又は少なくとも９４％又は少なくとも９５％又は少なくとも９６％又は少なくとも９７％又は少なくとも９８％又は少なくとも９９％、又は１００％の同一性を有するＦｒｔ配列をさらに含み、
好ましくは、前記ターゲッティングベクターの各配列断片の連結順序は順に５’相同性アーム配列、ヒト由来ＡＣＥ２遺伝子断片、ＳＶ４０ｐｏｌｙＡ配列、ｆｒｔ配列、ＰＧＫ－Ｐｕｒｏ配列、ｆｒｔ配列及び３’相同性アーム配列となっており、
好ましくは、前記動物は哺乳動物であり、
好ましくは、前記動物はブタ、ラット、マウス、ハムスター、ウサギ、ブタ、ウシ、シカ、ヒツジ、ヤギ、ニワトリ、ネコ、ウマ、イヌ、オランウータン、サルから選択され、
好ましくは、前記哺乳動物はげっ歯類動物であり、
好ましくは、前記動物はネズミであり、
好ましくは、前記動物は成体ネズミから選択され、
好ましくは、前記動物は胎児ネズミから選択され、
好ましくは、前記動物は遺伝子ヒト化動物であり、
好ましくは、前記遺伝子はＡＣＥ２である。
請求項１０に記載のターゲッティングベクターの、非ヒト動物の製造における応用であって、
好ましくは、前記動物は哺乳動物であり、
好ましくは、前記動物はブタ、ラット、マウス、ハムスター、ウサギ、ブタ、ウシ、シカ、ヒツジ、ヤギ、ニワトリ、ネコ、ウマ、イヌ、オランウータン、サルから選択され、
好ましくは、前記哺乳動物はげっ歯類動物であり、
好ましくは、前記動物はネズミであり、
好ましくは、前記動物は成体ネズミから選択され、
好ましくは、前記動物は胎児ネズミから選択され、
好ましくは、前記動物は遺伝子ヒト化動物であり、
好ましくは、前記遺伝子はＡＣＥ２である。
ＰＣＲ増幅により得られた産物断片である５’相同性アーム、ヒトＡＣＥ２ＣＤＳ及びＳＶ４０ｐｏｌｙＡをブリッジＰＣＲ法で連続断片５ａｒｍ－ｈＡＣＥ－ＳＶ４０にＰＣＲするステップを含む、請求項１０に記載のターゲッティングベクターの製造方法であって、
前記ＰＣＲの反応系は、
２×ＰｈａｎｔａＭａｘＢｕｆｆｅｒが約２５μＬ、
ｄＮＴＰＭｉｘが約１μＬ、
１０μＭ上流プライマーが約２μＬ、
１０μＭ下流プライマーが約２μＬ、
ＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅが約１μＬ、
約５０μＬまでＨ₂Ｏを補足し、
テンプレートチェーン５’相同性アーム、ヒトＡＣＥ２ＣＤＳ、ＳＶ４０ｐｏｌｙＡ断片がそれぞれ約２０ｎｇ－２００ｎｇであるとされており、
好ましくは、前記ＰＣＲの反応手順は、
ＰＣＲ増幅反応条件が約６２－６８℃で開始し、各サイクルが約０．２－０．８℃下げるとされており、
好ましくは、前記５’相同性アーム断片を増幅するために用いられるプライマーは、ＳＥＱＩＤＮＯ：１９に示される配列と少なくとも８５％又は少なくとも９０％又は少なくとも９１％又は少なくとも９２％又は少なくとも９３％又は少なくとも９４％又は少なくとも９５％又は少なくとも９６％又は少なくとも９７％又は少なくとも９８％又は少なくとも９９％、又は１００％の同一性を有する上流プライマーと、ＳＥＱＩＤＮＯ：２０に示される配列と少なくとも８５％又は少なくとも９０％又は少なくとも９１％又は少なくとも９２％又は少なくとも９３％又は少なくとも９４％又は少なくとも９５％又は少なくとも９６％又は少なくとも９７％又は少なくとも９８％又は少なくとも９９％、又は１００％の同一性を有する下流プライマーとを含み、
好ましくは、前記ヒト由来ＡＣＥ２遺伝子断片を増幅するために用いられるプライマーは、ＳＥＱＩＤＮＯ：２１に示される配列と少なくとも８５％又は少なくとも９０％又は少なくとも９１％又は少なくとも９２％又は少なくとも９３％又は少なくとも９４％又は少なくとも９５％又は少なくとも９６％又は少なくとも９７％又は少なくとも９８％又は少なくとも９９％、又は１００％の同一性を有する上流プライマーと、ＳＥＱＩＤＮＯ：２２に示される配列と少なくとも８５％又は少なくとも９０％又は少なくとも９１％又は少なくとも９２％又は少なくとも９３％又は少なくとも９４％又は少なくとも９５％又は少なくとも９６％又は少なくとも９７％又は少なくとも９８％又は少なくとも９９％、又は１００％の同一性を有する下流プライマーとを含み、
好ましくは、前記ＳＶ４０ｐｏｌｙＡ配列を増幅するために用いられるプライマーは、ＳＥＱＩＤＮＯ：２３に示される配列と少なくとも８５％又は少なくとも９０％又は少なくとも９１％又は少なくとも９２％又は少なくとも９３％又は少なくとも９４％又は少なくとも９５％又は少なくとも９６％又は少なくとも９７％又は少なくとも９８％又は少なくとも９９％、又は１００％の同一性を有する上流プライマーと、ＳＥＱＩＤＮＯ：２４に示される配列と少なくとも８５％又は少なくとも９０％又は少なくとも９１％又は少なくとも９２％又は少なくとも９３％又は少なくとも９４％又は少なくとも９５％又は少なくとも９６％又は少なくとも９７％又は少なくとも９８％又は少なくとも９９％、又は１００％の同一性を有する下流プライマーとを含み、
好ましくは、前記方法は、５ａｒｍ－ｈＡＣＥ－ＳＶ４０断片に対してＡｇｅＩ＋ＭｌｕＩダブルダイジェスションを行い、３’相同性アーム断片に対してＡｓｃＩ＋ＨｉｎｄＩＩＩダブルダイジェスションを行った後に、それぞれダイジェスション・ライゲーションの方法により連結することにより、ターゲッティングベクターを得るステップをさらに含み、
好ましくは、前記３’相同性アーム断片に使用されるプライマーは、ＳＥＱＩＤＮＯ：２５に示される配列と少なくとも８５％又は少なくとも９０％又は少なくとも９１％又は少なくとも９２％又は少なくとも９３％又は少なくとも９４％又は少なくとも９５％又は少なくとも９６％又は少なくとも９７％又は少なくとも９８％又は少なくとも９９％、又は１００％の同一性を有する上流プライマーと、ＳＥＱＩＤＮＯ：２６に示される配列と少なくとも８５％又は少なくとも９０％又は少なくとも９１％又は少なくとも９２％又は少なくとも９３％又は少なくとも９４％又は少なくとも９５％又は少なくとも９６％又は少なくとも９７％又は少なくとも９８％又は少なくとも９９％、又は１００％の同一性を有する下流プライマーとを含む。
請求項７又は８に記載のプライマー組み合わせを使用する、細胞株又は細胞系の製造方法であって、
好ましくは、前記方法は請求項１０に記載のターゲッティングベクターを使用することを含み、
好ましくは、前記方法はヒト目的遺伝子を動物細胞に導入することにより、目的遺伝子が動物細胞内でヒト目的遺伝子のＣＤＳを発現することを含み、
好ましくは、前記目的遺伝子はＡＣＥ２であり、
好ましくは、前記動物は哺乳動物であり、
好ましくは、前記動物はブタ、ラット、マウス、ハムスター、ウサギ、ブタ、ウシ、シカ、ヒツジ、ヤギ、ニワトリ、ネコ、ウマ、イヌ、オランウータン、サルから選択され、
好ましくは、前記動物はげっ歯類動物であり、
好ましくは、前記動物はネズミであり、
好ましくは、前記動物は成体ネズミから選択され、好ましくは、前記動物はネズミであり、
好ましくは、前記動物は胎児ネズミから選択され、
好ましくは、前記動物は遺伝子ヒト化動物であり、
好ましくは、前記細胞は胚性幹細胞であり、
好ましくは、前記製造方法は、
（１）請求項１０に記載のターゲッティングベクターを製造するステップと、
（２）前記ターゲッティングベクター、及びｓｇＲＮＡが連結されたベクターを動物由来の胚性幹細胞に導入するステップと、
（３）ステップ（２）における胚性幹細胞をクローンに培養すれば得られるステップと、を含み、
好ましくは、前記ｓｇＲＮＡは、ＳＥＱＩＤＮＯ：１又はＳＥＱＩＤＮＯ：２に示される配列と少なくとも８５％又は少なくとも９０％又は少なくとも９１％又は少なくとも９２％又は少なくとも９３％又は少なくとも９４％又は少なくとも９５％又は少なくとも９６％又は少なくとも９７％又は少なくとも９８％又は少なくとも９９％、又は１００％の同一性を有するｓｇＲＮＡから選択され、
又は好ましくは、前記動物は哺乳動物であり、
好ましくは、前記動物はブタ、ラット、マウス、ハムスター、ウサギ、ブタ、ウシ、シカ、ヒツジ、ヤギ、ニワトリ、ネコ、ウマ、イヌ、オランウータン、サルから選択され、
さらに好ましくは、前記哺乳動物はげっ歯類動物であり、
さらに好ましくは、前記げっ歯類動物はネズミであり、
好ましくは、前記動物は成体ネズミから選択され、
好ましくは、前記動物は胎児ネズミから選択され、
好ましくは、前記動物は遺伝子ヒト化動物であり、
好ましくは、前記遺伝子はＡＣＥ２である。
請求項１３に記載の方法で製造された細胞株又は細胞系。
請求項７又は８のいずれか一項に記載のプライマー組み合わせを使用することを含む、非ヒト動物の製造方法であって、
好ましくは、前記方法は請求項１０に記載のターゲッティングベクターを使用することを含み、
好ましくは、前記方法は請求項１４に記載の細胞を動物体内に注入することを含み、
好ましくは、前記動物は哺乳動物であり、
好ましくは、前記動物はブタ、ラット、マウス、ハムスター、ウサギ、ブタ、ウシ、シカ、ヒツジ、ヤギ、ニワトリ、ネコ、ウマ、イヌ、オランウータン、サルから選択され、
さらに好ましくは、前記哺乳動物はげっ歯類動物であり、
さらに好ましくは、前記げっ歯類動物はネズミであり、
好ましくは、前記動物は成体ネズミから選択され、
好ましくは、前記動物は胎児ネズミから選択され、
好ましくは、前記動物は遺伝子ヒト化動物であり、
好ましくは、前記遺伝子はＡＣＥ２である。
請求項１５に記載の方法で製造される非ヒト動物又は非ヒト動物又はその子孫の組織、体液、細胞、及びそれらの破砕物又は抽出物。
請求項１５に記載の方法で得られたヒト化動物モデル又はその子孫の、ヒト抗体の製造、又は薬理学、免疫学、微生物学及び医学研究のモデル系における応用、又は動物実験疾患モデルの生産及び利用、病原学研究及び／又は新たな診断戦略及び／又は治療戦略の開発における応用、又はＡＣＥ２遺伝子機能、ＡＣＥ２抗体、ＡＣＥ２標的に対する薬物のスクリーニング、検証、評価または研究、薬効研究の方面における用途。