ES2262143T3

ES2262143T3 - Cerdos transgenicos que expresan factor viii de coagulacion humano.

Info

Publication number: ES2262143T3
Application number: ES95933128T
Authority: ES
Inventors: Henryk Lubron; William N. Drohan; William H. Velander
Original assignee: American National Red Cross; Virginia Tech Intellectual Properties Inc
Current assignee: American National Red Cross; Virginia Tech Intellectual Properties Inc
Priority date: 1994-09-21
Filing date: 1995-09-21
Publication date: 2006-11-16
Anticipated expiration: 2015-09-21
Also published as: EP0807170A1; EP0807170B1; US5880327A; CA2200610C; JP2010017184A; DE69534907T2; EP1739170A2; ATE321785T1; DE69534907D1; JPH10506013A; CA2200610A1; US6255554B1; EP1739170A3; WO1996009377A1

Abstract

UN ANIMAL MAMIFERO TRANSGENICO NO HUMANO LLEVA UNA SECUENCIA EXOGENA DE ADN DE DOBLE CORDON INTEGRADA ESTABLEMENTE EN EL GENOMA DEL ANIMAL, QUE INCLUYE UNIDADES REGULADORAS DE LA ACCION CIS HUMANO QUE CODIFICA UNA SECUENCIA DE ADN Y UN PEPTIDO DE SEÑAL, DONDE LAS UNIDADES REGULADORAS DE ACCION CIS 5 EN LAS CELULAS DE LAS GLANDULAS MAMARIAS Y EL PEPTIDO DE SEÑAL ESTA ACTIVO DIRIGIENDO EL FACTOR VIII RECIENTEMENTE EXPRESADO EN LA LECHE DEL ANIMAL. EL PROMOTOR PUEDE SER UN PROMOTOR DE PROTEINA LACTEA TAL COMO PROMOTOR DE PROTEINA ACIDO DE SUERO, CASEINA, LACTALBUMINA, O BETA-LACTOGLOBULINA. LOS MAMIFEROS TRANSGENICOS SON PREFERENTEMENTE ANIMALES DE GRANJA, POR EJEMPLO VACAS, CABRAS, OVEJAS, CONEJOS Y CERDOS. LA EXPRESION CONCURRENTE DE UN GEN PARA UN FACTOR HUMANO DE VON WILLEBRAND EN LA LECHE PUEDE USARSE PARA ESTABILIZAR EL FACTOR VIII RECIENTEMENTE SEGREGADO.

Description

Cerdos transgénicos que expresan factor VIII de coagulación humano.

Antecedentes de la invención

Esta invención se refiere en general a animales transgénicos y a su uso como biorreactores para la producción de cantidades clínicamente útiles de proteínas. Más concretamente, esta invención se refiere a un cerdo transgénico manipulado mediante ingeniería genética para que exprese la proteína Factor VIII humano recombinante y para que secrete la proteína recién expresada en la leche, a partir de la cual la proteína se puede aislar con facilidad.

El Factor VIII ("F8") es una glicoproteína de plasma sanguíneo, con una masa molecular de aproximadamente 260 kDa, producida en el hígado de mamíferos. Es un componente crítico de la cascada de reacciones de coagulación que conducen a la coagulación de la sangre. En esta cascada existe una etapa en la que el Factor IXa, juntamente con F8, convierte el Factor X en una forma activada, el Factor Xa. El F8 actúa como cofactor en esta etapa, requiriéndose su presencia junto con la de iones calcio y fosfolípidos para la actividad del Factor IXa. Los dos trastornos hemofílicos más comunes están causados por una deficiencia de F8 funcional (Hemofilia A, aproximadamente el 80% de los casos)o de Factor IXa funcional (Hemofilia B o enfermedad del Factor de Christmas).

Hasta fecha reciente, el tratamiento estándar de la hemofilia A implicaba infusiones frecuentes de preparaciones de concentrados de Factor 8 derivados de los plasmas de donantes humanos. Aunque esta terapia sustitutiva generalmente es eficaz, este tratamiento pone a los pacientes en riesgo de contraer enfermedades de transmisión vírica tales como la hepatitis y el SIDA. Aunque este riesgo se ha reducido con una purificación adicional del F8 procedente de plasma mediante inmunopurificación usando anticuerpos monoclonales, e inactivando los virus mediante tratamiento con un disolvente orgánico o con calor, esas preparaciones han incrementado enormemente el coste del tratamiento, y no están exentas de riesgo. Por estas razones, los pacientes se han tratado de manera episódica, en lugar de manera preventiva. Una complicación adicional es que aproximadamente el 15% de los pacientes desarrollan anticuerpos inhibidores contra el F8 de esta manera preparado.

Un avance importante en el tratamiento de la Hemofilia A ha sido el aislamiento de clones de cDNA que codifican la secuencia completa de 2.351 aminoácidos del F8 humano (véase, Wood y col., Nature, 312: 330 (1984) y la Patente de EE. UU. Núm. 4.757.006, de 12 de Julio de 1.988) y la provisión de la secuencia de DNA del gen de F8 humano y de métodos recombinantes para su producción).

El análisis de la secuencia de aminoácidos primaria deducida de F8 humano, determinada a partir del cDNA clonado, indica que es un heterodímero procesado que proviene de un polipéptido precursor de mayor tamaño. El heterodímero consiste en una cadena ligera C-terminal de aproximadamente 80 kDa, en asociación, dependiente de la presencia de iones metálicos, con un fragmento de cadena pesada N-terminal de aproximadamente 210 kDa. Véase la revisión de Kaufman, Transfusion Med. Revs., 6: 235 (1992). La activación fisiológica del heterodímero tiene lugar a través de la escisión proteolítica de las cadenas de proteína por acción de trombina (Factor IIa). La trombina escinde la cadena pesada en una proteína de 90 kDa, y a partir de ella en fragmentos de 54 kDa y 44 kDa. La trombina escinde también la cadena ligera de 80 kDa en una proteína de 72 kDa. Son esta última proteína, y los dos fragmentos de cadena pesada (de 54 kDa y 44 kDa anteriormente mencionados) mantenidos unidos por medio de iones calcio, los que constituyen el F8 activo. La inactivación tiene lugar cuando las proteínas de 72 kDa y 44 kDa son escindidas nuevamente por acción de trombina, proteína C activada Factor Xa. En el plasma, este complejo del F8 está estabilizado por medio de su asociación con un exceso de 50 veces de la proteína Factor von Willebrand ("vWF"), que parece inhibir la destrucción proteolítica de F8.

La secuencia de aminoácidos de F8 está organizada en tres dominios estructurales: Un dominio A triplicado de 330 aminoácidos, un dominio B único de 980 aminoácidos y un dominio C duplicado de 150 aminoácidos. El dominio B no presenta homología con respecto a otras proteínas y proporciona 18 de los 25 sitios potenciales de glicosilación ligada a asparagina (N) de esta proteína. Aunque el F8 porcino y el F8 humano muestran una notable divergencia en sus dominios B, la proteína porcina se puede usar para tratar la Hemofilia A en seres humanos. Esto sugiere que, o bien la cadena B no es crítica para la actividad biológica de la holomolécula, o bien que las múltiples versiones de este dominio son similarmente eficaces. El F8 porcino y el F8 humano muestran una homología del 80%-85% en dos de los tres dominios A.

Aunque es probable que el hepatocito sea el tipo celular que produce F8 in vivo, hasta la fecha no existen líneas celulares naturales conocidas que expresen esta proteína. Kaufman, 1992, anteriormente citado, y Wood y col. 1984, anteriormente citado, transfectaron células transformadas de riñón de hámster con un vector que contenía un gen que codifica F8 y expresaron esta proteína. Kaufman, Nature 342: 207 (1989), expresaron F8 recombinante en células CHO, pero la producción y secreción de la proteína recién sintetizada en el medio acondicionado fue muy lenta. Se dijo que esto se había debido a tres factores: al requerimiento de la presencia del vWF en el medio acondicionado usado en estos sistemas de cultivo con el fin de proteger al F8 recién secretado de una destrucción proteolítica (en ausencia del vWF, el Factor VIII se secretaba en forma de cadenas incompletas que eran seguidamente degradadas); a la secreción incompleta del F8 recién sintetizado por parte de las células (la mayor parte permaneció en el retículo endoplásmico); y a un nivel bajo del mRNA de F8 como resultado de un evento post-traduccional. Las células CHO secretaron F8 recombinante estable únicamente cuando del gen del vWF se expresó al mismo tiempo. Inconvenientes adicionales para el uso de sistemas de cultivos de tejidos de mamíferos para la producción de F8 en cantidades clínicamente útiles son el coste del medio de crecimiento y la capacidad de producción limitada de los sistemas de cultivo de tejidos de mamíferos.

Sigue existiendo una importante necesidad de un medio eficiente y relativamente barato para producir cantidades grandes de la proteína F8 humana, libre de partículas infecciosas, y adecuada para uso clínico. El sistema en cerdos transgénicos descrito más adelante, que produce F8 humana mediante métodos recombinantes, satisface esta necesidad.

Se ha estimado, por ejemplo, por Paleyanda y col., en RECOMBINANT TECHNOLOGY IN HEMOSTASIS AND THROMBOSIS, Hoyer y col., redactores, (Plenum Press, NY, 1991), que el mercado de EE.UU. para F8 es de aproximadamente 600.000.000 unidades por año. Sobre una actividad específica de 5.000 U/mg, se requieren aproximadamente 120 g al año. Suponiendo un nivel de expresión alcanzable de 50 mg/litro en la leche de un animal transgénico de la invención y una pérdida del 50% de la proteína durante la purificación, se ha estimado que aproximadamente 1 vaca (que produce 6.000 litros de leche al año), 10 cabras, ovejas o cerdos (que producen 500 litros de leche al año) o 5.333 conejos (que producen 0,9 litros de leche al año) serían más que suficientes para abastecer toda la demanda de este país con respecto a F8 (Paleyanda y col., anteriormente citado).

Sumario de la invención

Es por lo tanto un objetivo de esta invención proporcionar un cerdo hembra transgénico que produce F8.

Es otro objetivo de esta invención proporcionar un procedimiento para producir cerdos transgénicos con las características anteriormente mencionadas.

Es otro objetivo más de la invención proporcionar un método para producir F8 biológicamente activo en cantidades comercialmente valorables, induciendo a un cerdo hembra transgénico a que secrete en su leche el F8 expresado, y aislando esta proteína a partir de la leche.

Es todavía otro objetivo proporcionar un cerdo transgénico que ha llevado integrado de manera estable en su genoma el DNA que codifica F8, de manera que la proteína se expresa y se secreta en la leche del animal.

Estos objetivos se han llevado a cabo mediante la producción de un cerdo transgénico que expresa una proteína Factor VIII humano recombinante con actividad biológica completa, o uno de sus fragmentos polipeptídicos o una de sus modificaciones, teniendo también dichos fragmentos y modificaciones actividad biológica completa, y que secreta dicha proteína expresada en la leche de dicho cerdo, comprendiendo dicho cerdo transgénico un cerdo hembra en cuyo genoma se ha incorporado una construcción de DNA integrada de manera estable, comprendiendo dicha construcción de DNA un promotor de proteínas de la leche, operativamente ligado a una secuencia de DNA exógeno bicatenario que codifica dicha proteína Factor VIII o dicho fragmento o modificación de la misma, que está operativamente ligada a un DNA que codifica un péptido señal, en la que dicho promotor es específicamente activo en células de glándula mamaria, dicho péptido señal es eficaz en dirigir el Factor VIII recién expresado hacia la leche de dicho cerdo hembra, y en la que dicha secuencia de DNA exógeno bicatenario es el cDNA del Factor VIII, el cual no comprende ninguno de los intrones del Factor VIII.

Estos objetivos se pueden llevar a cabo con construcciones de DNA bicatenario que comprenden un promotor de proteínas de la leche operativamente ligado a una secuencia de DNA que codifica F8, o a una secuencia de DNA que codifica un péptido señal que dirige el F8 recién expresado hacia la leche del animal hospedador, construcciones que se usan para producir el animal transgénico.

Otros objetivos, características y ventajas de la presente invención resultarán evidentes a partir de la descripción detallada que viene a continuación y de las reivindicaciones adjuntas. Se debe sobrentender, sin embargo, que la descripción detallada y los ejemplos que se proporcionan más adelante, aunque indican las realizaciones preferidas no se deben considerar limitativos en modo alguno.

Descripción de las figuras

La Figura 1 es una representación esquemática de una construcción de cDNA de F8 humano que muestra la contribución de las secuencias genómicas de la proteína ácida de suero lácteo ("WAP") (del inglés, "Whey Acid Protein"). El inserto de 14,6 kb, compuesto por un gen WAP de 2,6 kb en 5', un cDNA de F8 humano de 7,5 kb, y un gen WAP de 4,6 kb en 3', se puede cortar mediante digestión del plásmido con NotI, liberando el vector pPolyIIID de 2,1 kb.

La Figura 2 es una representación esquemática de un gen de cDNA híbrido de WAP de ratón-F8 humano, que muestra la inserción de un cDNA de F8 humano de 7,5 kb en el sitio KpnI del gen WAP de ratón, en el plásmido p225.11.

La Figura 3 muestra una transferencia Western de proteínas de suero lácteo separadas, obtenidas de ratones transgénicos inducidos para que expresen F8 humano en su leche. La primera pista de la izquierda muestra los marcadores de peso molecular. La pista siguiente muestra el F8 humano auténtico, con las bandas principales situadas a aproximadamente 80 kDa y a aproximadamente 210 kDa. La pista siguiente muestra las proteínas de un suero lácteo de control. Las pistas marcadas como F2 y F3 muestran las proteínas en el suero lácteo de ratones transgénicos inducidos para que expresen F8 humano recombinante.

Descripción detallada de la invención

Se ha inventado un cerdo transgénico que expresa una proteína Factor VIII humano recombinante con actividad biológica completa, o uno de sus fragmentos polipeptídicos o una de sus modificaciones, teniendo también dichos fragmentos y modificaciones actividad biológica completa, y que secreta dicha proteína expresada en la leche de dicho cerdo, comprendiendo dicho cerdo transgénico un cerdo hembra en cuyo genoma se ha incorporado una construcción de DNA integrada de manera estable, comprendiendo dicha construcción de DNA un promotor de proteínas de la leche, operativamente ligado a una secuencia de DNA exógeno bicatenario que codifica dicha proteína Factor VIII o dicho fragmento o modificación de la misma, que está operativamente ligada a un DNA que codifica un péptido señal, en la que dicho promotor es específicamente activo en células de glándula mamaria, dicho péptido señal es eficaz en dirigir el Factor VIII recién expresado hacia la leche de dicho cerdo hembra, y en la que dicha secuencia de DNA exógeno bicatenario es el cDNA del Factor VIII, el cual no comprende ninguno de los intrones del Factor
VIII.

El término "animal" aquí significa todos los animales mamíferos excepto los seres humanos. También incluye un animal individual en todas las fases del desarrollo, que incluyen las fases embrionaria y fetal. Un animal "transgénico" es todo animal que contiene células que portan información genética recibida, directa o indirectamente, mediante manipulación genética deliberada a nivel subcelular, tal como mediante microinyección o infección con virus recombinantes.

"Transgénico" en el presente contexto no abarca los clásicos cruces de razas ni la fertilización in vitro, sino que significa animales en los que una o más de sus células reciben una molécula de DNA recombinante. Aunque es sumamente preferido que esta molécula esté integrada en los cromosomas del animal, la invención también abarca el uso de secuencias de DNA de replicación extracromosómica, tales como las que puedan ser manipuladas por ingeniería genética dentro de cromosomas artificiales de levaduras.

La expresión "animal transgénico de la línea de células germinales" se refiere a un animal transgénico en el que la información genética ha sido recogida e incorporada en una célula de la línea germinal, confiriendo con ello la capacidad de transferir esa información a los descendientes. Si esos descendientes, poseen en efecto parte o toda esa información, son también animales transgénicos.

La información que ha de ser introducida en el animal es preferiblemente de origen extraño con respecto a la especie animal a la que el receptor pertenece (es decir, es "heteróloga"), pero la información también puede ser de origen extraño solamente con respecto al receptor individual concreto, o con respecto a la información genética que el receptor ya posee. En este último caso, el gen introducido se puede expresar de manera diferente a como se expresa el gen natural.

Los animales transgénicos de esta invención son cerdos.

Es sumamente preferido que un animal transgénico de la presente invención se produzca introduciendo en embriones de células individuales los polinucleótidos apropiados que codifican F8 humano o sus fragmentos o sus productos modificados, de manera tal que esos polinucleótidos se integran de forma estable en el DNA de las células de la línea germinal del animal maduro, y se heredan del modo mendeliano normal.

Los avances en las tecnologías de micromanipulación de embriones permiten en la actualidad de introducción de un DNA heterólogo en óvulos de mamífero fertilizados. Por ejemplo, células troncales totipotenciales o pluripotenciales se pueden transformar mediante microinyección, precipitación mediada con fosfato cálcico, fusión con liposomas, infección retrovírica u otros medios, las células transformadas se introducen luego en el embrión, y el embrión se convierte luego en un animal transgénico. En un método sumamente preferido, embriones en desarrollo se infectan con un retrovirus que contiene el DNA deseado y se producen animales transgénicos a partir de ese embrión infectado. En uno de los métodos más preferidos, sin embargo, los DNA apropiados se coinyectan en el pronúcleo o en el citoplasma de embriones, preferiblemente en la fase de células aisladas, y se deja que los embriones se desarrollen en animales transgénicos maduros. Esas técnicas son muy conocidas. Véanse las revisiones de procedimientos estándar de laboratorio para la microinyección de DNA heterólogos en óvulos fertilizados de mamíferos, que incluyen Hogan y col., MANIPULATING THE MOUSE EMBRYO, (Cold Spring Harbor Press, 1986); Krimpenfort y col., Biotechnology 9: 844 (1991); Palminter y col., Cell, 41: 343 (1985); Kraemer y col., GENETIC MANIPULATION OF THE EARLY MAMMALIAN EMBRYO, Cold Spring Harbor Laboratory Press 1985); Hammer y col., Nature, 315: 680 (1985); Wagner y col., Patente de EE.UU. Núm. 5.175.385; Krimpenfort y col., Patente de EE.UU. Núm. 5.175.384.

El cDNA de F8 humano se puede obtener aislándolo de fuentes genómicas apropiadas (es decir, de hígado humano, que es el órgano natural de producción de esta proteína) mediante métodos alternativos que incluyen la preparación de los cDNA a partir de mRNA moldes aislados, síntesis directa, o alguna de sus combinaciones, según se describe en Wood y col., 1984, anteriormente citado, y en Toole y col., Patente de EE.UU. Núm. 4.757.006.

Los cDNA que codifican F8 o sus fragmentos individuales o sus proteínas modificadas se pueden fusionar, en el marco de lectura correcto, con señales reguladoras apropiadas, según se describe con detalle más adelante, para producir una construcción genética que es luego amplificada, por ejemplo, mediante preparación de un vector plasmídico bacteriano (p. ej., de E. coli) conforme a métodos convencionales. Véase Sambrook y col., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Press 1989).

La construcción amplificada se separa después escindiéndola del vector y se purifica para usar en la producción de animales transgénicos. La purificación puede llevarse a cabo por medio de uno o más ciclos de HPLC aniónica; técnicas alternativas incluyen ultracentrifugación a través de un gradiente de sacarosa o NaCl, electroelución en gel seguida de tratamiento en agarosa y precipitación con alcohol, o cromatografía de baja presión. La purificación por medio de varios ciclos de HPLC permite obtener frecuencias de transformación notablemente altas, del orden del 20% o más, tanto en ratones como en cerdos.

Aunque la presente invención conlleva preferiblemente el uso de construcciones de DNA que producen la proteína F8 humana deseada o natural per se, la proteína deseada también se puede producir en forma de una proteína de fusión que contiene otra proteína. Por ejemplo, la proteína recombinante deseada de esta invención se puede producir como parte de una proteína recombinante de mayor tamaño con el fin de estabilizar la proteína deseada o de hacer que su purificación a partir de la leche sea más fácil y rápida. Las parejas de fusión se separan luego mediante métodos químicos o enzimáticos, y la proteína deseada se aísla.

El F8 humano recombinante ("rhF8") se puede producir también con una secuencia idéntica a la de la proteína natural, o se puede producir en forma de uno de sus fragmentos o modificaciones. Diversos rhF8 modificados o sus subunidades se pueden producir alterando un DNA clonado usando técnicas muy conocidas de mutagénesis in vitro tales como las expuestas en las referencias anteriormente citadas.

La producción de animales transgénicos que contienen el gen de rhF8 implica el uso de un cDNA que codifica la proteína precursora o un rhF8 heterodimérico. La secuencia de bases de longitud completa de cada una de las cadenas de proteína se describe en la publicación anteriormente mencionada de Wood y col. y en Tool y col., anteriormente citados.

Las construcciones de DNA útiles en la presente invención proporcionan una secuencia de DNA bicatenario que codifica rhF8 operativamente ligado a todas las señales que actúan en cis necesarias para la expresión específica de glándula mamaria de esta proteína, para la glicosilación post-traduccional y la secreción de la proteína en la leche o en otros fluidos corporales, y para la expresión de su actividad biológica completa.

En esta invención también se pueden utilizar secuencias de F8 modificadas. Las modificaciones útiles dentro de este contexto incluyen, pero no se limitan a ellas, aquellas que alteran las modificaciones post-traduccionales, el tamaño o el sitio activo, o que fusionan esta proteína o sus porciones a otra proteína. Esas modificaciones se pueden introducir en la proteína mediante métodos muy conocidos en esta técnica, tales como sintetizando genes modificados mediante ligación de oligonucleótidos solapantes o introduciendo mutaciones en los genes clonados, mediante, por ejemplo, mutagénesis mediada por oligonuclótidos.

Las regiones reguladoras que actúan en cis, útiles en la invención, incluyen promotores que son específicamente activos en células de glándula mamaria y que involucran a proteínas de la leche. Entre estos promotores, sumamente preferidos son los promotores corto y largo de WAP, los promotores corto y largo de \alpha-, \beta- y kappa-caseína, el promotor de \alpha-lactalbúmina y el promotor de \beta-lactoglobulina ("BLG").

Los promotores se pueden seleccionar tomando como base las composiciones de proteína de diferentes leches. Por ejemplo, los promotores de WAP y de BLG son particularmente útiles con cerdos transgénicos. Los promotores corto y largo de WAP de roedores se han usado para expresar el gen WAP de ratas, el gen de tPA humana y el gen de CD4, mientras que el promotor de BLG de ovejas se ha usado para expresar el gen BLG de ovejas, el gen de la alfa-1-antitripsina humana y el gen del Factor IX humano. Como revisiones, véanse Paleyanda y col., 1991, anteriormente citado, y Clark y col., TIBTECH 5: 20 (1987).

Preferidos entre los promotores encargados de llevar a cabo la presente invención son los promotores de caseína y WAP de roedores, y los promotores de caseína, \alpha-lactalbúmina y BLG procedentes de ganado porcino, bovino, equino y ovino (cerdos, ovejas, cabras, vacas, caballos), conejos, roedores y mascotas domésticas (perros y gatos). Los genes correspondientes a estos promotores se han aislado y sus características se han publicado. Como revisiones, véase Clark y col., 1987), anteriormente citado, y Henninghausen, Protein Expression and Purification 41: 3 (1990).

El promotor se puede aislar llevando a cabo etapas convencionales de digestión con endonucleasas de restricción y subclonación. Se prefiere un promotor de WAP de ratón, aislado en forma de un fragmento EcoRI-Kpn1 de 2,6 kb, inmediatamente en 5' con respecto a la secuencia señal de WAP, aunque el promotor "largo" de WAP (el promotor en 5' Sau3A-Kpn1 de 4,2 kb del gen WAP de ratón, o uno de sus fragmentos) es también adecuado para llevar a cabo esta invención.

Son importantes en la presente invención las secuencias reguladoras que dirigen la secreción de proteínas en la leche y/o en otros fluidos corporales del animal transgénico. En relación con esto, las secuencias reguladoras tanto homólogas como heterólogas son útiles en la invención. En general, se pueden usar secuencias reguladoras que se sabe que dirigen la secreción de proteínas de la leche, tales como péptidos señal procedentes de proteínas de la leche o el polipéptido diana naciente.

Entre las secuencias útiles que regulan la transcripción además de los promotores anteriormente comentados, están las secuencias estimuladoras de la transcripción, las señales de corte y empalme, señales de terminación de la transcripción y sitios de poliadenilación. Particularmente útiles en relación con esto son las secuencias que aumentan la eficiencia de la transcripción de los genes de F8 en células de glándula mamaria o en otras células de los animales transgénicos anteriormente listados. Son preferidas las secuencias reguladoras de la transcripción correspondientes a proteínas con un alto nivel de expresión en células de glándula mamaria (véase lo que antecede).

Preferiblemente, el sistema o construcción de expresión de esta invención incluye también una región que no se traduce en 3' en dirección aguas abajo de la secuencia de DNA que codifica la proteína recombinante deseada, o del gen de la proteína de la leche utilizado para la regulación. Esta región al parecer estabiliza el transcrito de RNA del sistema de expresión y de este modo aumenta el rendimiento de la proteína deseada. Entre las regiones que no se traducen en 3', útiles a este respecto, están las secuencias que proporcionan una señal poliA. Esas secuencias pueden derivar, p. ej., del antígeno pequeño de SV40, de la región que no se traduce en 3' de la caseína, o de otras secuencias que no se traducen en 3' muy conocidas en esta técnica. Preferiblemente, la región que no se traduce en 3' deriva de una proteína específica de leche. El efecto estabilizador de este transcrito con la región poliA es importante para estabilizar el mRNA de la secuencia de expresión. También importantes para el aumento de la eficiencia de la expresión son los sitios de unión al ribosoma. Asimismo, las secuencias que regulan la modificación post-traduccional de F8 son útiles en la invención.

Por lo tanto, de acuerdo con esta invención, un DNA quimérico bicatenario, que incluye genes que codifican la proteína F8, operativamente ligado a secuencias reguladoras que actúan en cis y que promueven una expresión eficiente de la proteína anterior en la leche, se introducen en un embrión en el que se integran en el genoma embrionario y se hacen parte de la dotación genética heredable de la totalidad de las células del animal, incluyendo las células de la línea germinal, del adulto que madura a partir del embrión. Las proteínas recombinantes así expresadas y secretadas en la leche son inmunológicamente reactivas, y se pueden medir con un ensayo IRMA que se describirá más adelante.

En los casos en los que la síntesis de una cadena de las subunidades de F8 puede ser limitante en la producción de la holoproteína, la expresión de esta cadena se puede incrementar colocando el gen en un locus genómico diferente. Este otro locus puede contener una secuencia de DNA bajo el control de la misma secuencia reguladora o de una secuencia reguladora diferente a la de las otras secuencias.

En una realización particularmente preferida, los transgenes de la invención consisten generalmente en secuencias de la proteína WAP de la leche que flanquean aguas arriba y aguas abajo las secuencias de péptido señal/cDNA de F8 (Figuras 1 y 2). Una secuencia reguladora natural de WAP 5', que termina en un sitio de restricción accesible, inmediatamente delante del codón ATG o en el codón ATG, se puede ligar a los sitios de restricción, lo que tiene lugar en el ATG de secuencias que se traducen sin que se utilicen secuencias enlazadoras derivadas de las cadenas de F8 humano. Cada una de las combinaciones de secuencia reguladora en 5' y secuencia de F8 traducible que terminan en un sitio de restricción particular, se puede luego ligar a el sitio de restricción correspondiente que está presente al comienzo de la región que no se traduce en 3' de WAP y que añade una región flanqueante 3' de WAP. Este motivo de la construcción permite a la secuencia reguladora natural en 5' y a la 3'-UTR de los genes de la proteínas de la leche estar directamente yuxtapuestos sin secuencias interpuestas. Se pueden seleccionar sitios de restricción particulares de los extremos de todas las construcciones con el fin de facilitar la concatenación de las construcciones en un único dominio dentro del genoma del animal.

Aunque las anteriores descripciones generales de las construcciones de DNA de la invención se han dado con referencia al promotor de WAP, hay que destacar que otros promotores adecuados (véase su comentario en lo que antecede) se pueden ligar de manera similar a los polinucleótidos que codifican F8. A modo de ilustración, el comentario siguiente describe el uso del promotor de BLG para aumentar la eficiencia de la expresión de F8 y de proteínas de fusión F8-BLG en glándulas mamarias.

Por medio de las técnicas anteriormente descritas, el cDNA que codifica F8 se puede insertar en un gen BLG ovino. Por ejemplo, con el fin de producir una construcción de ese tipo, el gen BLG ovino de 11,2 kpb se puede modificar para que posea un sitio único EcoRV en dirección aguas arriba del codón iniciador ATG en el vector pUCXSRV. La secuencia de alrededor de esta región se cambia de la siguiente manera:

1

Esto permite la clonación de fragmentos de extremos romos en dirección aguas arriba del gen BLG. El fragmento de 7,5 kb procedente de un plásmido (p. ej., p122, Figura 2), que contiene un cDNA que codifica hF8, se aísla, se generan extremos romos con la DNA-polimerasa de T4 y el producto se liga en pUCXSRV escindido con EcoRV. Después de la transformación de E. coli con este plásmido, los clones que se producen se pueden caracterizar mediante un análisis de restricción del DNA plasmídico preparado con un método miniprep y mediante determinación de la secuencia de nucleótidos de alrededor de los sitios de unión para la clonación en 5' y 3' en el DNA. Los clones que tienen la estructura deseada se pueden usar para producir roedores, cerdos, ovejas, vacas, caballos y otros animales de granja y mascotas domésticos (gatos y perros) transgénicos que secretan un producto de fusión F8-BLG en sus fluidos biológicos según se describe más adelante.

Una secuencia genómica de F8 humano también se puede fusionar al promotor de la BLG ovina ilustrado en el comentario que viene a continuación. Las secuencias de DNA que codifican la BLG ovina en el plásmido pUCXSRV se delecionan para generar un vector que contiene solamente secuencias del promotor de la BGL ovina (pUCSV). Al igual que con pUCSRV, los fragmentos con extremos romos se pueden fusionar a esta región de promotor mediante ligación a un sitio EcoRV único. Las secuencias en 5' con respecto a este sitio son idénticas en ambos plásmidos.

Las secuencias genómicas de F8 de tamaño mayor que aproximadamente 15 kpb se pueden introducir en animales transgénicos, a pesar de su longitud, a través del uso de cósmidos con secuencias de F8 solapantes, después de lo cual el ensamblaje necesario de un polinucleótido genómico completo que codifica hF8 se consigue mediante recombinación homóloga in vivo después de una microinyección en una célula embrionaria. En construcciones útiles en el ejemplo anterior, se usa un plásmido en el que las secuencias genómicas de F8 están fusionadas a secuencias que flanquean en 3' a la BLG ovina, justo detrás del codón de terminación de la traducción, para asegurar una transcripción, terminación y poliadenilación correctas. El gen de hF8 fusionado a secuencias que flanquean en 3' a la BLG ovina, se escinde del plásmido, los extremos protuberantes en 3' se reparan usando la enzima de Klenow, y el producto se liga en pUCSR escindido con EcoRV. Después de la transformación de E. coli, los clones resultantes se caracterizan mediante un análisis del DNA por restricción y determinando las secuencias de nucleótidos de alrededor de los sitios de unión para la clonación en 5' y 3'. Los clones que contienen la estructura deseada se pueden introducir en óvulos de animales fertilizados para la producción de animales transgénicos.

Se pueden construir diversos vectores basados en el gen BLG. En construcciones basadas en esta estrategia, las secuencias que codifican la proteína BLG ovina están delecionadas, pero las secuencias del promotor en 5' se conservan. Cada uno de los vectores puede poseer un complemento diferente de intrones procedentes del gen ovino y un sitio EcoRV único que permite la clonación de fragmentos de extremos romos entre el promotor y la región flanqueante 3'del gen. Sin embargo, cada uno de los vectores contiene el promotor de BLG, el sitio EcoRV y la secuencia flanqueante en 3' de BLG. En cada uno de los recombinantes, se aísla el fragmento KpnI, de 7,5 kpb, procedente de p122, se generan extremos romos como en lo que antecede, y el producto se liga a secuencias del vector escindido con EcoRV. Las construcciones que tienen las estructuras correctas (determinadas según se ha descrito en lo que antecede) se pueden usar para expresar F8 en la leche de animales transgénicos.

Ratones doblemente transgénicos que tienen secuencias genómicas de la BLG natural que se les han inyectado en forma de construcciones independientes para ser concatenadas in vivo como secuencias flanqueantes adicionales para la construcción del cDNA diana que porta BLG (tal como, promotor de BLG-Intrón I-EcoRV-Intrón VI-flanco BLG 3' más BLG) proporcionan más frecuentemente un nivel de expresión más alto que el observado con el uso de construcciones de promotor de BLG -cDNA de F8- gen BLG o de promotor de BLG -secuencia genómica de F8 (\pm extremo 3' de BLG). Las secuencias genómicas intactas o naturales de la BLG que se encuentran preligadas a cDNA diana-BLG pueden proporcionar las mismas ventajas. Este mismo principio se puede extender a las secuencias genómicas de WAP.

La obtención de leche procedente de un animal transgénico según la presente invención se lleva a cabo mediante medios convencionales. Véanse, p. ej., McBurney y col., J. Lab. Clin. Med. 64: 485 (1964); Velander y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 12003 (1992).

F8 o sus fragmentos o sus productos proteicos se pueden aislar y purificar a partir de la leche mediante medios convencionales sin que su actividad se afecte de modo deletéreo. Un método preferido consiste en una combinación de cromatografía de intercambio aniónico e inmunocromatografías, crioprecipitaciones, precipitación inducida con ion zinc, de proteínas de leche entera o de suero lácteo (leche desgrasada). En relación con esta técnicas, véase Bringe y col., J. Dairy Res. 56: 543 (1989).

Se sabe que la leche contiene varias proteasas que poseen el potencial de degradar proteínas extrañas. Estas proteasas incluyen por regla general una proteasa alcalina con las actividades de tripsina y de quimotripsina, una serina-proteasa, una enzima similar a quimotripsina, una aminopeptidasa y una proteasa ácida. Clark y col. (1987), anteriormente citado. Puede ser por lo tanto conveniente proteger el F8 recién secretado o sus fragmentos contra una degradación proteolítica. Estas precauciones incluyen el procesamiento rápido de la leche después de su recogida y la adición a la leche de inhibidores de la proteolisis muy conocidos, tales como los que aparecen listados en SIGMA CHEMICAL CO. CATÁLOGO (edición de 1.993), página 850.

Según se ha comentado anteriormente, en condiciones fisiológicas el vWF forma un complejo con el F8 circulante y mantiene estable a éste último contra la degradación. El cDNA del vWF, que se encuentra disponible en la American Type Culture Collection, Rockville, MD, puede integrarse en una construcción similar a la descrita en las Figuras 1 y 2, y se puede microinyectar en un embrión al mismo tiempo que la construcción que porta F8. En esas condiciones, ambas proteínas se expresarán y secretarán en la leche.

Para la determinación de F8 y/o vWF recién secretados en suero lácteo, los autores de la invención han usado el ensayo inmunoradiométrico, esencialmente según Hoyer y col., Methods Enzymol. 84: 51, 56-57 (1982). Los antígenos F8 se miden con un anticuerpo inhibidor Fab' anti-F8 humano marcado radiactivamente con yodo, que procede de pacientes con autoanticuerpos o de pacientes hemofílicos transfundidos que han producido inhibidores. Los antígenos vWF se miden con anticuerpos procedentes de conejo, obtenidos mediante inmunización con F8 purificado. Ambos ensayos usan un anticuerpo marcado radiactivamente que ha sido purificado a partir de inmunocomplejos. La medida de los antígenos en estos ensayos se basa en la solubilidad diferencial de los complejos antígeno-anticuerpo y del anticuerpo libre en disoluciones de sulfato amónico.

Los siguientes Ejemplos se proporcionan simplemente para ilustrar la invención, y no deben ser interpretados como limitativos del alcance de la invención que se describe en la memoria descriptiva y en las reivindicaciones adjuntas.

Ejemplo 1 Construcción de un gen híbrido de cDNA de mWAP-hF8

Un vector pPolyIII-D (p120 en la Figura 2) se sometió a restricción con Kpn1, se hizo de extremos romos y se religó para producir el vector A sin un sitio Kpn1.

Un gen mWAP de 7,2 kb se escindió del plásmido p121 con EcoRI, se hizo de extremos romos y se ligó en el vector A que se había linearizado con EcoR1. El producto fue un plásmido de 9,3 kb (p184 marcado) en el que el gen WAP estaba flanqueado por EcoR1 y por sitios de restricción Not1 adyacentes.

Una digestión parcial del plásmido p122 con Kpn1 produjo un cDNA de F8 de 7,5 kb, flanqueado por sitios de restricción Kpn1. Este cDNA se insertó luego en el plásmido p184 en un sitio Kpn1 de dentro del gen mWAP para producir el plásmido p225.11, un plásmido de 16,8 kb. Flanqueando el gen del F8 humano se encuentra un segmento 5' de mWAP de 2,6 kb, con un sitio Not1 agua arriba, y un gen mWAP en 3', de 4,6 kb, con un sitio Not1 aguas abajo.

Como se muestra en la Figura 1, el inserto de 14,7 kb que comprende el gen híbrido 5' mWAP/hF8/mWAP 3' puede ser escindido mediante digestión del plásmido p225.11 con Not1, liberando con ello el vector pPolyIII-D de 2,1 kb.

El plásmido p225.11 se ha depositado en la American Type Culture Collection, Rockville, MD (ATCC, Núm. de Registro \hskip0,5cm ).

Los solicitantes por la presente invención garantizan de que: (1) durante la pendencia de esta solicitud de patente, el acceso a los plásmidos depositados estará disponible para las personas convenientemente designadas por el Comisionado de Patentes y Marcas Registradas; (2) con posterioridad a la expedición de esta patente, los plásmidos estarán disponibles al público sin restricción alguna durante el período en vigor de la patente, o durante cinco años después de la última petición de una muestra, o durante treinta años, cualquiera que sea el período más largo; y (3) los plásmidos no viables serán sustituidos.

Ejemplo 2 Ensayo de la proteína Factor VIII en suero lácteo mediante un ensayo IRMA

El ensayo IRMA descrito en Hoyer (1982, ibídem) se usó para estimar la concentración del Factor VIII humano recombinante (hrF8) en el suero lácteo de ratones transgénicos producidos con el sistema del promotor de mWAP descrito en lo que antecede.

Materiales

: Suero lácteo, ratón f 2.1.9.10

: Suero lácteo, ratón f 2.13.9

: Suero lácteo, ratón f 2.1.13.13

: Suero lácteo, ratón f 2.1.22.8

: Suero lácteo, ratón de control D15

Los resultados de los ensayos IRMA se muestran en la tabla que viene a continuación.

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Designación de PDL	Vol. de la muestra *	Antígeno	Factor VIII
Núm. ID del ratón	\mul	unidades/ml	ng/ml
Control D15	100	0,041	8,2
F2.1.13.9	100	0,045	9,0
F2.1.9.10	50	0,100	20,0
F2.1.22.8	40	0,144	28,8
F2.1.13.13	50	0,093	18,6
* \begin{minipage}[t]{155mm} Muestras almacenadas a -20^{o}C. En 2 animales, el almacenamiento de la leche a 4^{o}C produjo una disminución de los valores del ensayo IRMA \end{minipage}

En relación con el valor de referencia de este método, (ratón de control D15), la producción de antígeno (F8) se elevó con un valor medio de aproximadamente el 250% en tres de cuatro ratones.

Ejemplo 3 Transferencias Western de muestras de suero lácteo de ratón

Sueros lácteos procedentes de dos ratones transgénicos (F2 y F3) se sometieron a inmunotransferencia con el fin de identificar el Factor VIII humano recombinante (rhF8) en las muestras. Las transferencias Western se muestran en la Figura 3.

Tampón para trombina: NaCl 0,15 M, HEPES 15 mM, CaCl_{2} 5 mM, Tween 80 al 0,01%, pH 7,4.

Trombina: 2 U/ml.

TBS: Tris 20 mM, NaCl 500 mM, pH 8,0.

TBS/T: TBS con Tween 20 al 0,05%.

TBS/T/NFDM: con leche desgrasada y desecada al 5%.

Anticuerpo primario en TBS/T/NFDM 1X:

: mAb 413 (concentración final 2 \mug/ml; anti-cadena pesada)

: mAb 37 (concentración final 5 \mug/ml; anti-cadena ligera)

Anticuerpo secundario diluido en proporción 1:6.000 en TBS/T 1X.

Conjugado de estreptavidina y fosfatasa alcalina (GIBO).

Sistema de revelado luminiscente conjugado con biotina, LumiPhos (Boehringer-Mannheim).

Procedimiento

1) Muestras de suero lácteo (proteína total 200 \mug) se digirieron con trombina (130 \muU/\mul) durante 5 min. Después de añadir un volumen igual de Tampón para las muestras 2X, las muestras se hirvieron durante 5 min, y se enfriaron rápidamente en hielo.

2) Después de hacer correr las muestras sobre un gel de Laemmli de acrilamida al 7,5%, de 1,2 mm de grosor, las proteínas se sometieron a electrotransferencia sobre una membrana de nitrocelulosa, a 12 v durante 1,5 h. Las membranas se almacenaron en TBS a 4ºC.

3) Después de bloquear las membranas en TBS/T/NFDM durante 1 h y de lavarlas 3 veces en TBS/T, la membrana se expuso a un anticuerpo primario durante 2 h a temperatura ambiente, se retiró el anticuerpo en exceso y la membrana se lavó 3 veces en TBS/T.

4) Las membranas se expusieron al anticuerpo secundario durante 15 min a temperatura ambiente y luego se lavaron 4 veces con TBS/T.

5) Después de incubar las membranas en LumiPhos conforme a las instrucciones del fabricante, durante 20 min en oscuridad, una película Kodak XAR-5 se expuso a las membranas durante 25 min, y la película se lee en un densitómetro.

La primera pista de la izquierda consiste en marcadores de peso molecular de 45 kDa a 200 kDa. La segunda pista por la izquierda es un hF8 estándar que muestra una banda principal en la posición de aproximadamente 80 kDa y otra banda en la posición de aproximadamente 210 kDa. La tercera pista por la izquierda muestra las proteínas de suero lácteo de control. Las pistas F2 y F3 muestran sueros lácteos transgénicos; aparecieron nuevas bandas fuertemente teñidas en la posición de aproximadamente 80 kDa, en comparación con el control, en paralelo con el hF8 estándar. Las pistas F2 y F3 muestran también bandas intensamente teñidas en la posición de aproximadamente 120 kDa, una banda que es relativamente débil en el control y que está aparentemente ausente en el hF8 estándar. Su identidad se desconoce.

Considerados en conjunto, los datos de los Ejemplos 2 y 3 demuestran que los ratones transgénicos de la invención expresaron un F8 humano recombinante auténtico y secretaron esta proteína en la leche del animal.

Claims

1. Un cerdo transgénico que expresa una proteína Factor VIII humano recombinante con actividad biológica completa, o uno de sus fragmentos polipeptídicos o una de sus modificaciones, teniendo también dichos fragmentos y modificaciones actividad biológica completa, y que secreta dicha proteína expresada en la leche de dicho cerdo, comprendiendo dicho cerdo transgénico un cerdo hembra en cuyo genoma se ha incorporado una construcción de DNA integrada de manera estable, comprendiendo dicha construcción de DNA un promotor de proteínas de la leche, operativamente ligado a una secuencia de DNA exógeno bicatenario que codifica dicha proteína Factor VIII o dicho fragmento o modificación de la misma, que está operativamente ligada a un DNA que codifica un péptido señal, en la que dicho promotor es específicamente activo en células de glándula mamaria, dicho péptido señal es eficaz en dirigir el Factor VIII recién expresado hacia la leche de dicho cerdo hembra, y en la que dicha secuencia de DNA exógeno bicatenario es el cDNA del Factor VIII, el cual no comprende ninguno de los intrones del Factor VIII.

2. Un cerdo transgénico según la reivindicación 1, en el que dicha proteína Factor VIII es una proteína precursora o un heterodímero.

3. Un cerdo transgénico según la reivindicación 2, en el que dicha proteína precursora o proteína heterodimérica comprende una glicoproteína de aproximadamente 2.332 residuos de aminoácidos que incluye una secuencia de aminoácidos C-terminal de aproximadamente 80 kDa y una secuencia de aminoácidos N-terminal de aproximadamente 210 kDa.

4. Un cerdo transgénico según una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en el que dicho promotor de proteínas de la leche, activo en tejido de glándula mamaria de dicho cerdo transgénico, se selecciona entre el grupo que consiste en los promotores de la proteína ácida de suero lácteo, caseína, alfa-lactalbúmina y beta-lactoglobulina.

5. Un cerdo transgénico según una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en el que dicha construcción de DNA comprende además una región 3' que no se traduce en dirección aguas abajo de la secuencia de DNA que codifica la proteína recombinante deseada.

6. Un cerdo transgénico según la reivindicación 5, en el que dicha región 3' que no se traduce proporciona una señal de poliA.

7. Un procedimiento para producir una proteína Factor VIII humano recombinante con la actividad biológica completa, que comprende las etapas de:

(a) proporcionar un cerdo hembra transgénico dentro de cuyo genoma se ha integrado de manera estable una construcción de DNA, comprendiendo dicha construcción de DNA un promotor de proteínas de la leche, operativamente ligado a una secuencia de DNA exógeno bicatenario que codifica la proteína Factor VIII y una secuencia de DNA operativamente ligada que codifica un péptido señal, siendo dicho promotor específicamente activo en células de glándula mamaria de dicho cerdo transgénico, siendo dicho péptido señal eficaz en dirigir el Factor VIII recién expresado hacia la leche de dicho cerdo, y en la que dicha secuencia de DNA exógeno bicatenario es el cDNA del Factor VIII, el cual no comprende ninguno de los intrones del Factor VIII;

(b) hacer que dicho cerdo hembra lacte;

(c) recoger la leche procedente de dicho cerdo hembra; y,

(d) aislar dicha proteína a partir de dicha leche.

8. Un procedimiento para producir un cerdo hembra transgénico que produce una proteína Factor VIII humano recombinante con actividad biológica completa, o uno de sus fragmentos polipeptídicos o una de sus modificaciones, teniendo también dichos fragmentos y modificaciones actividad biológica completa, en el tejido mamario de dicho cerdo, y que secreta dicha proteína en la leche de dicho cerdo, que comprende las etapas de:

(a) proporcionar una construcción de DNA que comprende un promotor de proteínas de la leche operativamente ligado a una secuencia de DNA exógeno bicatenario que codifica dicha proteína Factor VIII operativamente ligada a un DNA que codifica un péptido señal, siendo dicho promotor específicamente activo en células de glándula mamaria de dicho cerdo transgénico, siendo dicho péptido señal eficaz en dirigir el Factor VIII recién expresado hacia la leche de dicho cerdo, y en la que dicha secuencia de DNA exógeno bicatenario es el cDNA del Factor VIII, el cual no comprende ninguno de los intrones del Factor VIII;

(b) purificar dicha construcción de DNA;

(c) colocar dentro de un embrión de un cerdo hembra dicha construcción de DNA purificado en condiciones en las que dicha construcción de DNA está integrada de manera estable en el genoma de dicho cerdo; y,

(d) hacer que dicho embrión llegue a término de manera que se genera un cerdo transgénico.

9. Un procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 7-8, en el que dicha construcción de DNA está contenida en un plásmido.

10. Células transformadas de un cerdo transgénico de una cualquiera de las reivindicaciones 1-6.

11. La proteína Factor VIII humano secretada por las células transformadas de la reivindicación 10.