KR20020010188A - 뱀의 독소로부터 유래된 혈소판 응집억제 단백질 및 그의제조방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 한국산 살모사(Agkistrodon halys brevicaudus)의 독소로부터 유래되었으며, 혈소판 응집 억제제로서의 활성을 나타내는 Sal-C, 그를 코딩하는 cDNA 및 전기 단백질의 제조방법에 관한 것이다. 본 발명의 Sal-C는 한국산 살모사의 독소를 채취한 다음, 음이온 교환수지, 겔 여과 및 HPLC 역상 크로마토그래피하여, Sal-C를 정제하는 공정을 포함하는 방법에 의하여 제조되며, 디스인테그린 유사영역(disintegrin-like domain) 및 C-말단 영역(C-terminal domain)을 포함하는 분자량 약 28kDa의 디스인테그린 계열의 단백질이다. 본 발명의 Sal-C는 콜라겐 뿐만 아니라 혈소판 표면 당단백질 GP IIb-IIIa가 매개하는 ADP에 의해 유도되는 혈소판 응집을 효율적으로 억제하므로, 혈소판 응집에 의하여 유발되는 혈전증을 치료할 수 있는 약제의 유효성분으로 유용하게 사용될 수 있을 것이다.

Description

뱀의 독소로부터 유래된 혈소판 응집억제 단백질 및 그의 제조방법{A Platelet Aggregation Inhibitor Derived from Snake Venom and Process for Preparing the Same}

본 발명은 뱀의 독소로부터 유래된 신규한 혈소판 응집억제 단백질의 cDNA및 전기 단백질에 관한 것이다. 좀 더 구체적으로, 본 발명은 한국산살모사(Agkistrodon halys brevicaudus)의 독소로부터 유래되었으며, 혈소판 응집억제제로서의 활성을 나타내는 Sal-C, 그를 코딩하는 cDNA 및 전기 단백질의 제조방법에 관한 것이다.

뱀독소는 세린계 단백분해효소(serine protease)와 금속성 단백분해효소(metalloprotease)를 다량 포함하며, 이들은 출혈, 혈소판 응집, 혈액 응고 등의 활성을 나타낸다. 이러한 활성 중에서 출혈은 대부분 뱀독에 포함된 Zn²⁺의존형 금속성 단백분해효소가 세포외 기질(extracellular matrix)을 분해함으로써 야기되며(참조: Howard, L. et al., Biochem. J., 317:45-50, 1996), 이때 혈소판 응집저해 인자가 출혈을 더욱 악화시킨다(참조: Kang, I. C. et al., Thromb. Res., 91:65-73, 1998; Huang, T. F. et al., Biochemistry, 28:661-666, 1989; Dennis, M. S. et al., Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A., 87:2471-2475, 1990).

상술한 출혈성 독소를 포함하는 금속성 단백분해효소들은 금속성 단백분해분해 영역(metalloprotease domain)이외에도 디스인테그린 유사영역(disintegrin-like domain), 시스테인이 풍부한 C-말단영역(cysteine rich C-terminal domain) 등의 일부 또는 전부를 포함하는 구조를 가지므로, 금속성 효소영역만을 가진 효소 보다는 활성이 훨씬 활성이 높으며(참조: Hite, L. A. et al., Biochemistry, 31:6203-6211, 1992), 전기 금속성 단백분해효소는 분자량이 큰 독소로부터 자가용해 또는 단백질 분해효소에 의하여 분해된 산물임이 밝혀졌다(참조: Hite, L. A. et al., Arch. Biochem. Biophys., 308:182-191, 1994; Takeya, H. et al., J.Biol. Chem., 265:16068-16073, 1990).

최근에는, 전술한 금속성 단백분해효소의 단편이 분리되어, 프로세싱된 단백질은 강력한 혈소판 응집억제 인자이며, 원섬유성 콜라겐(fibrillar collagen)에 결합함이 알려졌다(참조: Usami, Y. et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 201:331-339, 1994; Shimokawa, K. et al., Arch. Biochem. Biophys., 343:35-43, 1997). 내벽성 혈전(intramural thrombus) 형성의 초기단계에 있어서, 새로이 노출된 콜라겐에 혈소판이 부착되는데, 이러한 과정을 고려해 볼 때, 혈소판과 콜라겐과의 결합을 억제하는 것이 혈전증을 예방 또는 치료할 수 있는 가능성이 있음을 알 수 있다. 따라서, 혈소판과 콜라겐과의 결합을 억제할 수 있는 단백질을 이용한 혈소판응집 저해제의 개발에 대한 가능성이 끊임없이 대두되었다.

이에, 본 발명자들은 뱀의 독소로부터 혈전을 예방 및 치료할 수 있는 단백질을 분리하여 이를 항혈전제의 유효성분으로 사용될 수 있는지를 탐색하고자 예의 연구 노력한 결과, 한국산 살모사(Agkistrodon halys brevicaudus)의 독소를 채취한 다음, 음이온 교환수지, 겔 여과 및 HPLC 역상 크로마토그래피하여, 단백질을 정제하는 공정을 포함하는 방법에 의하여 제조된 단백질이 강력하게 혈소판을 응집함을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.

결국, 본 발명의 주된 목적은 한국산 살모사의 독소로부터 분리된 혈소판 응집억제 단백질의 cDNA를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 전기 한국산 살모사의 독소로부터 분리된 cDNA로부터 유추되는 혈소판 응집억제 단백질을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 전기 단백질을 한국산 살모사의 독소로부터 제조하는 방법을 제공하는 것이다.

도 1은 본 발명의 혈소판 응집억제 단백질의 고체상 억제분석한 결과를 나타내는 그래프이다.

도 2는 본 발명의 혈소판 응집억제 단백질의 혈소판 응집억제 분석한 결과를 나타내는 그래프이다.

도 3은 본 발명의 혈소판 응집억제 단백질을 암호화하는 cDNA 염기서열이다.

도 4는 본 발명의 혈소판 응집억제 단백질과 공지의 혈소판 응집억제 단백질의 아미노산 서열을 비교한 그림이다.

이하에서는, 본 발명의 신규한 혈소판 응집억제 단백질의 cDNA 및 혈소판 응집억제 단백질을 보다 더 구체적으로 설명하고자 한다.

우선, 본 발명자들은 한국산 살모사의 독소를 채취한 다음, 음이온 교환수지, 겔 여과 및 HPLC 역상 크로마토그래피하는 공정을 포함하는 방법에 의하여 뱀의 독소로부터 혈소판 응집억제 활성을 지니는 단백질을 정제하였다. 이때, 음이온 교환 수지는 QAE-세파로즈 음이온 교환 수지 컬럼(QAE-Sepharose anion-exchange column)을 사용하여 200 내지 250mM NaCl의 농도구배를 갖는 Tris-HCl 완충용액(pH 8.0)으로 용출시켜 수행하며, 겔 여과는 슈퍼덱스 75(Superdex 75) 겔 여과 컬럼을 사용하여 용출시켜 수행하고, HPLC 역상 크로마토그래피는 0.05 내지 10%(v/v) 트리플루오로아세트산(trifluoroacetic acid, TFA)으로 평형이 유지된 정제용 역상 HPLC(semi-preparative Capcell Pak C18 reverse-phase HPLC)를 사용하여 수행할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

전기 제조방법에 의하여 정제된 단백질의 분자량은 SDS-PAGE 분석시, 약28kDa임이 확인되었고, 아미노말단 서열을 분석한 결과, Ile-Val-Ser-Pro-Pro-Val-X-Gly-Asn-Glu-Leu-Leu-Glu-Val-Gly-Glu-Glu-X-Asp-(서열번호 1)임이 밝혀졌다. 이어, 아미노산 서열을 기초로 한 프라이머와 폴리 A 꼬리(poly A tail)를 기초로 한 프라이머를 이용하여 프로브(probe)를 제조하여, 전기 살모사 독소샘(venom gland)의 cDNA 라이브러리를 작제하여 전기 정제된 단백질의 cDNA를 클로닝하여 전기 정제된 단백질의 염기서열을 결정하였다. 전기 염기서열로부터 유추된 아미노산 서열을 분석한 결과, 전기 정제된 단백질은 프로세싱된(processed) 단백질로서, 24개의 시스테인을 포함하는 212개의 아미노산으로 이루어져 있으며, 신호서열(signal sequence), N-말단 프로펩타이드 영역, 디스인테그린-유사(disintegrin-like) 영역, 중앙의 금속성 단백분해효소 영역 및 시스테인이 풍부한 C-말단 영역로 구성되어 있는 디스인테그린 계열(disintegrin family)의 신규한 단백질임이 확인되었는 바, 이를 'Sal-C'라 명명하였다. 전기 Sal-C 단백질의 일차 아미노산 서열을 공지의 디스인테그린 계열의 혈소판 응집억제 인자인 카트로콜라스타틴(Catrocollastatin)이나 자라하긴(Jararhagin)과 비교하여 볼 때, 약 95%의 상동성(homology)를 가짐을 알 수 있었다.

아울러, 혈소판 응집의 한가지 기작은 혈소판에 존재하는 당단백질인 GP IIb-IIIa에 피브리노겐이 결합함으로써 일어나는 것인 바, Sal-C의 활성은 이들의 결합을 억제하는 정도를 측정함으로써 결정하였다. 그 결과, 본 발명의 Sal-C는 GP IIb-IIIa에 결합하는 것을 억제하는 모티프로 알려진 Arg-Gly-Asp 모티프(RGD motif)를 갖지 않음에도 불구하고, 피브리노겐에 GP Ⅱb-Ⅲa가 결합하는 것을 강하게 억제하는 특성을 가짐을 확인하였는 바, 본 발명의 Sal-C는 혈전증 치료에 유용하게 사용될 수 있음을 알 수 있었다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의하여 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예 1: 단백질의 정제

한국산 살모사(Agkistrodon halys brevicaudus)로부터 채취한 조(crude)독소 1g을 20mM Tris-HCl(pH 8.0)에 희석한 후, 200mM NaCl을 포함하는 20mM Tris-HCl 완충용액(pH 8.0)으로 미리 평형을 유지시킨 QAE-세파로즈 음이온 교환수지 컬럼(QAE-Sepharose anion-exchange column, Pharmacia-LKB Biotechnology Inc., Sweden)에 주입하고 250mM NaCl을 포함하는 전기 완충용액으로 용출시켰다. 그런 다음, 용출된 분획을 GP Ⅱb-Ⅲa 결합분석을 통하여 혈소판 응집억제 활성을 보이는 분획들을 수득하여, 한외여과장치(ultrafiltration system, Amicon, U.S.A.)로 농축시켰다.

이어, 전기 농축액을 슈퍼덱스 75(Superdex 75, Pharmacia, Sweden) 겔 여과 컬럼(7.5x300mm)에 유속 0.5ml/min으로 주입한 후 PBS로 용출시키고, 용출된 분획을 ADP에 의해 유도되는 혈소판 응집억제 활성을 측정함으로써 활성분획을 모아 농축시켰다.

그런 다음, 0.1%(v/v) 트리플루오로아세트산(trifluoroacetic acid, TFA)으로 이미 평형이 유지된 역상 HPLC(semi-preparative Capcell Pak C18 reverse-phase HPLC column, 5㎛, Japan)에 전기 농축액을 주입한 후, 0.1%(v/v) TFA로 세척하고 20%(v/v) 아세토니트릴로 재세척하였다. 이어, 흡착된 단백질은 214nm에서 흡광도를 측정하고, 0.1%(v/v) TFA에서 20% 내지 50%(v/v) 아세토니트릴의 직선 농도구배로 용출시켰다. 이때, 단백질 농도의 측정은 로리(Lowry)법(참조: Lowry, O. H. et al., J. Biol. Chem., 193:265-275, 1951)으로 수행하였다. 혈소판 응집을 억제하는 활성은 39% 아세토니트릴 농도에서 고순도로 용출되었다. 그 결과, 단백질의 최종수율은 약 2mg이었으며, 이는 전체 독소 단백질의 1%에 해당되었다.

실시예 2: 정제된 단백질의 순도확인 및 아미노산 말단 서열분석

전기 정제된 단백질을 환원조건하에서 12% SDS-PAGE하였다. 그 결과, 분자량 28kDa의 단백질이 단일밴드로 나타나 순수하게 정제되었음을 확인할 수 있었다.이어, 자동 아미노산 서열 분석기(Applied Biosystems Inc., U.S.A.)를 이용하여 에드만 분해법(Edman degradation)으로 자연(intact) Sal-C의 아미노말단 서열을 분석한 결과, Ile-Val-Ser-Pro-Pro-Val-X-Gly-Asn-Glu-Leu-Leu-Glu-Val-Gly-Glu-Glu-X-Asp-(서열번호 1)로 나타났다.

실시예 3: 정제된 단백질의 혈소판 응집억제 역가

실시예 3-1: 피브리노겐/GP IIb-IIIa ELISA

나흐만(Nachman)과 륭(Leung)의 방법(참조: Nachman, R. L. et al., J. Clin. Invest., 69:263-269, 1982)을 수정한 피브리노겐/GP IIb-IIIa ELISA 방법으로 하기와 같은 고체상 억제분석(solid-phase inhibition assay)을 수행하였다: 즉, 마이크로타이터 플레이트(microtiter plate)를 순수한 사람의 피브리노겐(10㎍/ml)으로 코팅한 후, 20mM Tris-HCl, pH 7.5, 0.02% NaN₃, 2mM CaCl₂, 0.05% Tween-20 및 150mM NaCl를 포함하는 TACTS에 용해시킨 1% BSA(bovine serum albumin)로 1시간 동안 블라킹(blocking)하였다. 그 후, 플레이트를 세척하고 정제된 단백질을 첨가하고, 곧이어 0.5% BSA가 포함된 TACTS에 용해시킨 순수한 GP IIb-IIIa(40㎍/ml)를 첨가하여 2시간 동안 반응시켰다. 여기에 사용된 혈소판 GP IIb-IIIa는 피텔라(Pytela) 등의 방법에 의해서 제조하였다(참조: Pytela, R. et al., Science, 231:1559-1562, 1986). 이어, 반응이 완결되면 플레이트를 세척하고 사람 GP IIIa에 대한 마우스 항체(mouse anti-human GP IIIa antibody)를 첨가하고 1시간 동안 반응시켜 전기 마우스 항체를 1차 결합시킨 다음, 세척과정을 거쳐 2차 항체(goat anti-mouse IgG)를 첨가하고 반응시켰다. 그런 다음, 세척과정을 거쳐 발색기질 용액을 첨가하고, 약 10분 후 3M HCl로 반응을 정지시키고 495nm에서 흡광도를 측정하였다.

도 1은 정제된 단백질의 고체상 억제분석한 결과를 나타내는 그래프이다. 도 1에서 보듯이, 정제된 단백질의 50% 억제농도(IC₅₀) 값은 13nM으로 결합억제 능력이 높은 것으로 나타났다.

실시예 3-2: 정제된 단백질의 혈소판 응집억제 역가 측정

혈소판 응집과정에서 정제된 단백질의 기능을 규명하기 위하여, 콜라겐에 의해 유도되는 혈소판 응집 및 ADP에 의해 유도되는 혈소판 응집을 전기 정제된 단백질이 억제할 수 있는지를 하기의 방법으로 측정하였다: 즉, 혈소판 농축액을 실온에서 원심분리하여 혈소판이 풍부한 혈장(platelet-rich plasma, PRP)과 혈소판이 제거된 혈장(platelet-poor plasma, PPP)으로 나누어, PRP를 혈소판 300,000개/㎕가 되도록 PPP로 희석하였다. 이어, PBS에 용해된 PRP 450㎕와 정제된 단백질 50㎕의 혼합물 또는 PBS를 37℃ 조건으로 Chrono-log Aggregometer(Chronlog Co., U.S.A.)에서 3분간 반응시킨 후 투광도를 측정하고, ADP(20μM) 또는 콜라겐(2μM)을 첨가하여 혈소판 응집반응을 개시시키고, 혈소판 응집억제 역가는 응집반응이 최고치에 달하는 조건에서 측정하였다.

도 2는 본 발명의 정제된 단백질의 혈소판 응집억제 분석한 결과를 나타내는그래프이다. 도 2에서 보듯이, 콜라겐과 ADP에 의해 유도되는 혈소판 응집에 대한 정제된 단백질의 IC₅₀값은 각각 71nM과 230nM이었으며, 1μM 하에서는 혈소판 응집이 완전히 억제됨을 알 수 있었는 바, 전기 정제된 단백질은 혈소판 응집억제 활성을 가짐을 확인할 수 있었다.

실시예 4: 염기서열 결정

λZAP^TMXR cDNA 클로닝 키트(Stratagene, U.S.A.)와 실험실내 패키징 키트(in vitropackaging kit, Amersham, Sweden)를 이용하여 살모사 독소샘(venom gland)의 cDNA 라이브러리를 작제하기 위하여 필요한 프로브(probe)를 다음과 같이 작제하였다: 즉, 전기에서 분리한 Sal-C 단백질의 N-말단 아미노산 서열에 기초하여 합성한 축퇴 올리고뉴클레오타이드(degenerate oligonucleotide) 프라이머와 폴리 A 꼬리(poly A tail)에 기초하여 합성한 프라이머를 이용하여 약 900bp의 PCR 산물을 수득하고, 클레나우 절편(Klenow fragment, Promega, U.S.A.)과 [α-³²P]dATP를 이용하여³²P로 동위원소표지하였다. 이어, 플레이팅(plating), 트랜스퍼(transfer), 혼성화(hybridization)를 표준화된 방법에 의거하여 수행하였으며, 전혼성화 및 혼성화는 55℃에서 수행하고, 세척은 65℃에서 수행하였다. 그런 다음, 양성 플라크를 SM완충액(SM buffer)에서 추출하고, λZAP^TMXR cDNA 클로닝키트(Stratagene, U.S.A.)에 있는 방법에 의거하여, R408보조 파지(R408 helper phage)를 이용하여 pBluescript 파지미드(phagemid)에 플라스미드를 회수하였다.

이어, DNA 염기서열 결정은 시퀘나제 키트(Sequenase kit, USB)를 이용해서 디데옥시(dideoxy)방법에 의하여 수행하고(참조: Sanger, F. et al., Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A., 74:5463-5467, 1977), cDNA 클론 염기서열의 분석과 이로부터 유추된 혈소판 응집억제 단백질의 아미노산 서열 분석은 DNASIS, PROSIS 및 BLAST 탐색 프로그램(참조: Altschul, S. F. et al., J. Mol. Biol., 215:403-410, 1990)을 이용하여 수행하였다.

도 3은 본 발명의 혈소판 응집억제 단백질을 암호화하는 cDNA 염기서열이다: 이때, 굵은 활자체로 개시된 염기서열은 코딩영역을 나타내며; 밑줄친 부분은 금속성 단백분해효소 영역을; 및, 박스부분은 개시코돈(initiation codon)과 코딩영역의 처음 코돈을 각각 나타낸다. 도 3에서 보듯이, 혈소판 응집억제 단백질의 전체 cDNA는 2440bp이며, Sal-C를 코딩하는 cDNA(서열번호 2)는 1827bp임을 확인할 수 있었다. 아울러, 혈소판 응집억제 단백질은 호모사피엔스 ADAM 12(Homo sapiensA disintegrin and metalloprotease 12), 엠 무스쿨러스 MDC 단백질-9 전구체 cDNA(M musculusMDC protein 9-precursor cDNA) 및 엠 파시쿨라스 부고환의 첨단 단백질 1(M. fascicularsepididymal apical protein 1, EAP)와 60%의 상동성을 가지는 것으로 확인되었다.

이어, 전기의 염기서열로부터 유추된 폴리펩타이드의 아미노산 서열을 종래의 공지된 아미노산 서열과 비교분석한 결과, 여러종의 뱀 독소에서 확인된 금속성단백분해효소/디스인테그린 유전자 계열(metalloprotease/disintegrin gene family)와 비슷한 모듈 구조(modular structure)를 가지는 것으로 나타났다. 특히, 혈소판 응집억제 단백질의 폴리펩타이드 서열은 카트로콜라스타틴(Catrocollastatin, 참조: Zhou, Q. et al., Biochem. J., 307:411-417, 1995)이나 자라하긴(Jararhagin, 참조: Paine, M. J. et al., J. Biol. Chem., 267:22869-22876, 1992)과 같은 모듈 구조를 포함하는데, 이들은 신호 서열(signal sequence), N-말단 프로펩타이드 영역(propeptide domain), 중앙 금속성 단백분해효소(metalloprotease) 영역, 디스인테그린-유사(disintegrin-like) 영역 및 시스테인이 풍부한 C-말단영역을 포함함을 확인할 수 있었다.

전기 에드만 분해법에 의해 결정된 N-말단 아미노산 서열과 클로닝된 cDNA로부터 유추된 폴리펩타이드의 아미노산 서열을 종합해 볼 때, 혈소판 응집억제 단백질은 프로세싱된 단백질로서, 24개의 시스테인을 포함하는 212개의 아미노산으로 이루어진 단쇄 폴리펩타이드이며, 스페이서-디스인테그린-유사(spacer-disintegrin-like) 영역과 시스테인이 풍부한 C-말단영역의 조각을 포함하며, SECD(Ser-Glu-Cys-Asp sequence) 아미노산 서열을 포함하는 디스인테그린 계열의 신규한 단백질임이 밝혀졌는 바, 본 발명의 정제된 단백질을 'Sal-C'라 명명하였다. 아울러, Sal-C의 아미노산 서열에서, GP Ⅱb-Ⅲa에 피브린이 결합하는 것을 억제하는 모티프로 알려진 Arg-Gly-Asp 모티프(RGD motif)를 갖지 않음에도 불구하고, 피브리노겐에 GP Ⅱb-Ⅲa가 결합하는 것을 강하게 억제하는 특성을 가짐을 확인하였다.

실시예 5: Sal-C와 뱀독 혈소판 응집억제인자의 아미노산 서열비교

전기 Sal-C의 일차 아미노산 서열을 공지의 다른 뱀 독소 단백질의 일차 서열과 비교분석하였다. 도 4는 본 발명의 Sal-C와 공지의 혈소판 응집억제 단백질과의 아미노산 서열을 비교한 것이다: 이때, 어두운 부분은 Sal-C와 공지의 아미노산 간의 상동성이 없는 서열을 나타낸다. 도 4에서 보듯이, 본 발명의 Sal-C의 디스인테그린-유사영역(서열번호 3) 및 C-말단 영역(서열번호 4)은 카트로콜라스타틴-C(참조: Shimokawa, K. et al., Arch. Biochem. Biophys., 343:35-43, 1997)와 95%의 상동성이 있고, 자라하긴-C(참조: Usami, Y. et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 201:331-339, 1994)와는 96%의 상동성을 보임을 확인할 수 있었다.

아울러, 상술한 공지의 두가지 단백질은 콜라겐에 의해 유도되는 혈소판 응집억제 역가는 높으나, GP IIb-IIIa가 매개하는 것으로 알려진 ADP에 의해 유도되는 응집억제 역가는 낮거나 없는 것으로 알려져 있으나, 본 발명의 Sal-C는 전자의 역가는 이들과 비슷하지만 후자의 역가 즉, ADP에 의하여 유도되는 응집억제 역가가 이들보다 강하게 나타남을 확인할 수 있었다.

이상에서 상세히 설명하고 입증하였듯이, 본 발명은 한국산살모사(Agkistrodon halys brevicaudus)의 독소로부터 유래되며, 혈소판 응집억제제로서의 활성을 나타내는 Sal-C, 그를 암호화하는 cDNA 및 전기 단백질의 제조방법을 제공한다. 본 발명의 Sal-C는 한국산 살모사의 독소를 채취한 다음, 음이온 교환수지, 겔 여과 및 HPLC 역상 크로마토그래피하여, Sal-C를 정제하는 공정을 포함하는 방법에 의하여 제조되며, 디스인테그린 유사영역(disintegrin-like domain) 및 C-말단 영역(C-terminal domain)을 포함하는 분자량 약 28kDa의 디스인테그린 계열의 단백질이다. 아울러, 본 발명의 Sal-C는 콜라겐 뿐만 아니라 혈소판 표면 당단백질 GP IIb-IIIa가 매개하는 ADP에 의해 유도되는 혈소판 응집을 효율적으로 억제하므로, 혈소판 응집으로 인하여 유발되는 혈전증을 치료할 수 있는 약제의 유효성분으로 유용하게 사용될 수 있을 것이다.

Claims (5)

1. 한국산 살모사(Agkistrodon halys brevicaudus)의 독소로부터 분리된 서열번호 2로 나타내는 Sal-C cDNA.
2. 서열번호 2의 염기서열로부터 유추되며, 서열번호 3의 디스인테그린-유사영역(disintegrin-like domain) 및 서열번호 4의 C-말단 영역(C-terminal domain)을 포함하는 Sal-C.
3. 제 2항에 있어서,

   혈소판 응집억제 활성을 갖는 것을 특징으로 하는

   Sal-C.
4. 한국산 살모사(Agkistrodon halys brevicaudus)의 독소를 채취한 다음, 음이온 교환수지, 겔 여과 및 HPLC 역상 크로마토그래피하여, Sal-C를 정제하는 공정을 포함하는 Sal-C의 제조방법.
5. 제 4항에 있어서,

   음이온 교환 수지는 QAE-세파로즈 음이온 교환 수지(QAE-Sepharose

   anion exchange) 컬럼을 사용하며;

   겔 여과는 슈퍼덱스 75(Superdex 75) 겔 여과 컬럼을 사용하고;

   및, HPLC 역상 크로마토그래피는 정제용 역상 HPLC(semi-preparative

   Capcell Pak C18 reverse-phase HPLC)를 사용하여 수행하는 것을

   특징으로 하는

   Sal-C의 제조방법.