KR20020010189A - 뱀의 독소로부터 유래된 피브리노겐 응고억제 단백질 및그의 제조방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 한국산 살모사(Agkistrodon halys brevicaudus)의 독소로부터 유래되었으며, 피브리노겐 응고억제 활성을 나타내는 살모린(Salmorin), 그를 코딩하는 cDNA 및 전기 단백질의 제조방법에 관한 것이다. 본 발명의 살모린은 한국산 살모사의 독소를 채취하고, 이를 음이온 교환 크로마토그래피를 수행하고 겔 여과한 후, 음이온 교환 크로마토그래피를 재수행하는 공정을 포함하는 방법에 의하여 제조된다. 본 발명의 살모린은 비환원 조건하에서 SDS-PAGE 분석시 약 27kDa의 단일 밴드로 나타나며, 환원조건하에서는 SDS-PAGE 분석시 약 15kDa의 A 사슬과 14kDa의 B 사슬로 분리되고, 살모린 A 사슬과 B 사슬의 시스테인 잔기 7개를 가지는 단백질이며, 프로트롬빈과 2분자 복합체를 이루어 프로트롬빈이 트롬빈으로 활성화되는 것을 강력하게 억제함으로써 용량의존적으로 피브리노겐 응고를 억제하며, 히루딘과 경쟁적으로 작용함으로써 혈액응고를 지연시키는 특성을 가지는 바, 살모린은 항혈전제의 유효성분으로 널리 활용될 수 있을 것이다.

Description

뱀의 독소로부터 유래된 피브리노겐 응고억제 단백질 및 그의 제조방법{A Fibrinogen Clotting Inhibitor Derived from Snake Venom and Process for Preparing the Same}

본 발명은 뱀의 독소로부터 유래된 신규한 피브리노겐 응고억제 단백질의 cDNA 및 전기 단백질에 관한 것이다. 좀 더 구체적으로, 본 발명은 한국산 살모사(Agkistrodon halys brevicaudus)의 독소로부터 유래되었으며, 피브린 응고를 억제의 활성을 나타내는 살모린(Salmorin), 그를 코딩하는 cDNA 및 전기 단백질의 제조방법에 관한 것이다.

현재까지 뱀독소로부터 혈액응고 및 혈소판 응집에 관여하는 많은 효소와 억제인자들의 복합물이 분리되었으며(참조: Stoker, K. F., Medical Use of Snake Venom Protein, Boston, CRC Press, 97-160, 1990), 전기 효소의 예로서는 피브리노겐을 응괴시키는 트롬빈 유사효소(thrombin-like enzyme)(참조: Holleman, W. H. and Weiss, L. J., J. Biol. Chem., 251:1663-1669, 1976; Itoh, N. et al., J.Biol. Chem., 262:3132-3135, 1987), 피브린(피브리노겐)을 분해하는 피브린(피브리노겐) 용해 효소(fibrino(geno)lytic enzyme, 참조: Markland, F. S. Jr., Thromb. Haemost., 65:438-443, 1991), 혈소판 응집 활성인자, 혈소판 응집 억제인자 등을 들 수 있다. 이들 효소들은 C-형 렉틴 모티프(motif)를 포함하는 두 개의 소단위체(subunit)가 이황화결합으로 연결되어(disulfide-linked) 있는 것이 알려져 있으나, 이들이 혈소판 응집에 관여하는 정확한 기작은 알려져 있지 않다(참조: Drickamer, K., J. Biol. Chem., 263:9557-9560, 1998).

한편, 피브리노겐의 응괴를 촉매하는 트롬빈은 다기능의 세린계 단백분해효소로서, 응고(clotting), 항응집 인자의 활성화 및 기타 생리적 조절작용에 관여한다(참조: Esmon, C. T., Annu. Rev. Cell. Biol., 9:1-26, 1993). 혈액응고인자들이 트롬빈에 결합하는 과정에서 트롬빈의 활성부위 뿐만 아니라 분자 외부의 결합부위도 중요한 역할을 하는데(참조: Guillin, M. C. et al., Thromb. Haemost., 74:129-133, 1995), 예를 들어 피브리노겐은 트롬빈의 외부 결합부위인 엑소사이트 1(exosite 1)에 결합하는 것으로 알려져 있다(참조: Bouton, M. C. et al., Thromb. Haemost., 80:310-315, 1998). 전기 트롬빈의 활성화 과정에서는 프로트롬빈(prothrombin)이 트롬빈으로 변환되는 과정을 거치며, 이러한 과정은 지혈작용에 있어서 중추적인 역할을 한다. 프로트롬비나제(prothrombinase)는 전기 변환 과정을 촉매하는 복합체이며, 세린계 단백분해효소인 factor Xa, cofactor Va, 인지질(phospholipid) 및 칼슘으로 이루어져 있다.

상술한 혈액응고의 과정은 혈전 및 혈전으로 인하여 유발되는 관상동맥질환,뇌혈관 질환, 맥혈전증 등의 심혈관질환과 관련되어 있으므로, 피브리노겐 및 트롬빈의 활성화를 억제하는 것은 혈전성 질환의 예방 및 치료에 필수적이다.

이에, 본 발명자들은 혈전성 질환의 예방 및 치료를 위하여, 혈액응고에 관련된 단백질을 분리하여 이를 항혈전제의 유효성분으로 사용될 수 있는지를 탐색하고자 예의 연구 노력한 결과, 한국산 살모사(Agkistrodon halys brevicaudus)의 독소를 채취한 다음, 음이온 교환 크로마토그래피, 겔 여과 및 음이온 교환 크로마토그래피를 재수행하는 단계를 포함하는 방법에 의하여 제조된 단백질이 강력하게 피브리노겐 응고를 억제하는 신규한 단백질임을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.

결국, 본 발명의 주된 목적은 한국산 살모사의 독소로부터 분리한 신규한 피브리노겐 응고억제 단백질의 cDNA를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 전기 한국산 살모사의 독소로부터 분리된 cDNA로부터 유추되는 피브리노겐 응고 억제 단백질을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 전기 단백질을 한국산 살모사의 독소로부터 제조하는 방법을 제공하는 것이다.

도 1a는 살모린 A 사슬의 cDNA 염기 서열 및 이로부터 유추된 아미노산 서열을 나타낸다.

도 1b는 살모린 B 사슬의 cDNA 염기서열 및 이로부터 유추된 아미노산 서열을 나타낸다.

도 2a는 살모린 A 사슬과 공지의 뱀독 C-형 렉틴의 아미노산 서열을 비교한 그림이다.

도 2b는 살모린 B 사슬과 공지의 뱀독 C-형 렉틴의 아미노산 서열을 비교한 그림이다.

도 3은 본 발명의 살모린에 의한 피브리노겐 응고억제 효과를 나타내는 그래프이다.

도 4는 본 발명의 살모린이 히루딘에 의한 트롬빈 억제작용을 저해함을 나타내는 그래프이다.

도 5a는 본 발명의 살모린과 프로트롬빈의 PAGE 결과를 나타낸 사진이다.

도 5b는 본 발명의 살모린의 factor Xa가 매개하는 프로트롬빈 활성화에 대한 영향을 나타내는 사진이다.

도 6a는 본 발명의 살모린의 존재하에 factor Xa-매개성 프로트롬빈 활성을 나타내는 그래프이다.

도 6b는 본 발명의 살모린에 의한 피브리노겐 응고시간의 지연을 나타내는 그래프이다.

이하에서는, 본 발명의 신규한 피브리노겐 응고 억제 단백질의 cDNA 및 피브리노겐 응고억제 단백질을 보다 구체적으로 설명하고자 한다.

우선, 본 발명자들은 한국산 살모사의 독소를 채취한 다음, 음이온 크로마토그래피, 겔 여과 및 음이온 교환 크로마토그래피하는 공정을 포함하는 방법에 의하여, 뱀의 독소로부터 단백질을 정제하였다. 이때, 음이온 교환 크로마토그래피는 Q-세파로즈 FPLC 컬럼 및 Mono Q FPLC 컬럼을 사용하고, 겔 여과는 슈퍼덱스 75 FPLC 컬럼을 사용하여 수행하였으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

전기 제조방법에 의하여 정제된 단백질의 분자량은 비환원 조건에서 27kDa이었고, 정제된 단백질은 환원조건에서 두 개의 각각 다른 15kDa과 14kDa의 사슬로 된 2개의 소단위체로 이루어진 이형이합체(heterodimeric) 단백질임을 확인할 수 있었는 바, 전기 사슬을 각각 'A사슬' 및 'B사슬'로 명명하였다. 아울러, 전기 단백질은 A 사슬과 B 사슬의 시스테인 잔기 7개를 가짐이 밝혀졌다.

전기 혈액의 응고를 억제하는 단백질의 염기서열을 분석하기 위하여, 살모사 독소샘(venom gland)의 cDNA 라이브러리를 작제하여 전기 단백질의 cDNA를 클로닝하였다: 즉, 전기 단백질의 A 및 B 펩타이드 각각의 N-말단 아미노산 서열을 결정한 다음, 그를 기초로 한 프라이머를 합성하여 cDNA 클론 선별에 사용하였고, 이렇게 수득된 cDNA를 기초로 한 역방향 프라이머를 합성하여 전기 단백질의 cDNA 클론을 수득하였다. 그런 다음, cDNA 클론의 염기 서열을 결정하여 아미노산 서열을 유추한 결과, A사슬과 B사슬 모두 23 잔기의 소수성 신호 펩타이드(signal peptide)를 포함하며 각각 131 잔기와 122 잔기의 아미노산으로 이루어져 있고,두 펩타이드 사슬은 45%의 서열 동질성을 보였다. 아울러, 정제된 단백질은 일차 아미노산 서열상에서 공지의 뱀독 C-형 렉틴 단백질과 비교한 결과 높은 유사성을 보이며, 암호화영역(coding region)은 45-65%의 유사성이 있는 신규한 단백질로 확인되어, 이를 '살모린(Salmorin)'이라 명명하였다.

이어, 전기 살모린이 혈액의 응고작용을 촉매하는 트롬빈에 대하여 어떠한 영항을 미치는지를 살펴본 결과, 살모린이 트롬빈의 활성 부위가 아닌 다른 엑소사이트(exosite)에 결합하여 트롬빈-피브리노겐 결합을 방해하는 것으로 추측되었다. 또한, 살모린은 프로트롬빈과 2분자 복합체를 이루어 프로트롬빈이 트롬빈으로 활성화되는 것을 강력하게 억제함으로써, 혈액의 응고를 지연하는 것으로 확인이 되었다. 따라서, 본 발명의 살모린은 트롬빈과 프로트롬빈에 결합하여 피브리노겐 응고를 강력하게 억제하여 혈액응고를 지연함을 알 수 있었는 바, 전기 살모린은 혈전증 치료에 유용하게 사용될 수 있을 것이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 좀 더 구체적으로 설명하기로 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의하여 제한되지 않는다는 것은 당 업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예 1: 단백질의 정제

한국산 살모사(Agkistrodon halys brevicaudus)로부터 채취한 조독소(crude extract) 256mg을 20mM Tris-HCl(pH 8.0)으로 10배 희석한 후, 200mM NaCl을 포함하는 20mM Tris-HCl(pH 8.0)로 미리 평형을 유지시킨 Q-세파로즈 HP 컬럼(2.6x10cm, Pharmacia, Sweden)에 전기 조독소를 주입하고, 200mM NaCl을 포함하는 20mM Tris-HCl로 피브리노겐 응고억제 활성을 가지는 분획을 용출시켰으며, 피브리노겐 응고억제 활성은 다음과 같은 피브리노겐 응고역가 측정법(fibrinogen clotting assay, 참조: Hofmann, H. et al., Biochimie, 65:201-210, 1983)에 의하여 수행되었다: 즉, 전기 용출분획을 0.1㎖의 트롬빈(Sigma Chemical Co., U.S.A.)과 37℃에서 2분간 전처리하여 트롬빈의 최종농도가 0.5 unit/㎖가 되게 한 후, 20mM Tris-HCl(pH 7.5)에 용해시킨 0.5㎖의 사람 피브리노겐(0.5mg/㎖, (주)녹십자)에 전기 용출분획/트롬빈을 첨가하여 피브리노겐이 응고되는데 걸리는 시간을 측정하였다.

전기 피브리노겐 억제활성을 보이는 분획을 농축시키고, 농축액은 150mM NaCl을 포함하는 20mM Tris-HCl(pH 8.0)으로 평형을 유지시킨 슈퍼덱스 75 FPLC 컬럼(Superdex 75 FPLC 1x30cm, Pharmacia, Sweden)에 주입하여 겔 여과 크로마토그래피를 하였다. 이어, 활성분획들을 수득하여 모노 Q FPLC 컬럼(Mono Q FPLC column, 0.5x5cm)에 주입한 후, 평형 완충용액에 200mM-300mM NaCl을 포함시켜 직선 농도구배로 용출시킨 결과, 단백질이 약 265mM NaCl 농도에서 고순도로 용출되었다. 전기 용출된 단백질의 최종수율은 0.5mg로서, 전체 독소 단백질의 0.2%에 해당됨을 확인하였다.

실시예 2: 정제된 단백질의 순도확인

전기 정제된 단백질을 비환원 조건 및 2-머캅토에탄올(2-mercaptoethanol)이 존재하는 환원조건하에서 15% SDS-PAGE를 수행하여, 비환원적 조건에서 정제된 단백질은 27kD의 단일밴드로 나타났고, 환원조건하에서는 15kDa의 사슬과 14kDa 사슬의 두가지 폴리펩타이드로 분리되었다. 따라서, 본 발명의 정제된 단백질은 두 개의 다른 소단위체로 이루어진 이형이합체(heterodimeric)의 단백질임을 확인할 수 있었는 바, 전기 15kDa의 사슬을 'A 사슬'이라고 하고, 14kDa의 사슬을 'B 사슬'이라고 명명하였다.

실시예 3: cDNA 클로닝 및 염기서열

살모사 독소샘(venom gland)의 cDNA 라이브러리를 λZAP^TMXR cDNA 클로닝 키트(Stratagene, U.S.A.)와 실험실내 패킹(in vitropackaging) 키트(Amersham, U.S.A.)를 이용하여 다음과 같이 작제하였다: 우선, 피브리노겐 응고억제 단백질의 cDNA 선별에 필요한 프라이머는 전기 분리한 피브리노겐 응고억제 단백질 펩타이드의 N-말단 아미노산 서열을 결정하여(Applied Biosystems Precise Protein Sequencing System, U.S.A.), 이에 기초한 축퇴 올리고뉴클레오타이드(degenerateoligonucleotide) 프라이머를 합성하였다.

A 사슬(서열번호 1): 5'-GCTGATTT(T/C)TT(T/C)TG(T/C)CC-3'

B 사슬(서열번호 2): 5'-GATTGTCC(C/T)TC(A/C/G/T)GG(A/C/G/T)TGG-3'

cDNA 라이브러리는 T7 프라이머와 전기 합성한 프라이머를 이용하여 PCR로 선별하였고, 각 사슬에 대하여 약 550bp의 PCR 산물을 수득하고, 이를 pGEM-T 벡터(Promega, U.S.A.)에 클로닝하였다. 이어, pGEM-T 벡터에 클로닝한 PCR 산물의 염기서열 결정은 시퀘나제 키트(Sequenase kit, USB)를 이용하여 하기와 같이 수행하였다: 즉, cDNA의 5' 말단까지 완전한 염기서열 결정을 위하여 정제된 단백질의 A 사슬과 B 사슬의 부분 cDNA 염기서열에 기초한 역방향(antisense) 프라이머를 합성하였으며, 이때 사용된 역방향 프라이머의 서열은 하기와 같다.

A 사슬(서열번호 3): 5'-GACTAAGCCTCGCAGACGAA-3'

B 사슬(서열번호 4): 5'-CTAGGCCTGGAACTCGC-3'

전기 클론된 cDNA의 염기 서열과 유추된 아미노산 서열의 분석은 DNASIS, PROSIS 및 BLAST 탐색 프로그램을 사용하여 수행하였다.

도 1a는 정제된 단백질 A 사슬의 cDNA 염기서열(서열번호 5) 및 이로부터 유추된 아미노산 서열(서열번호 6)을 나타낸다. 도 1a에서 보듯이, 정제된 단백질의A 사슬을 암호화하는 cDNA는 462bp의 개방해독틀(open reading frame), 정지코돈(stop codon), 124bp의 3'-비번역영역(3'-untranslated region) 및 폴리 A 꼬리(poly A tail)를 포함함을 확인할 수 있었다.

도 1b는 정제된 단백질 B 사슬(서열번호 7)의 cDNA 염기서열 및 이로부터 유추된 아미노산 서열(서열번호 8)을 나타낸다. 도 1b에서 보듯이, 정제된 단백질의 B 사슬을 암호화하는 cDNA는 435bp의 개방해독틀, 정지코돈, 126b의 3'-비번역영역 및 폴리 A 꼬리를 포함함을 알 수 있었다. 아울러, A와 B 사슬의 성숙화된(mature) N-말단 앞에는 23 잔기의 소수성 신호 펩타이드(signal peptide)가 있음을 확인하였다.

전기 염기서열로부터 아미노산 서열을 유추하여, 정제된 단백질을 구성하는 A 소단위체와 B 소단위체는 각각 131 잔기와 122 잔기의 아미노산을 포함하며, 두 폴리펩타이드 사슬은 45%의 서열 상동성을 나타냄을 확인할 수 있었다. 아울러, 유추된 아미노산 서열로부터 계산한 두 펩타이드의 분자량은 A 사슬 14890Da과 B 사슬 14341Da으로서, SDS-PAGE에서 결정한 겉보기 분자량과 일치함을 확인하였다.

실시예 4: 정제된 단백질과 뱀독 C-형 렉틴(lectin)의 아미노산 서열비교

정제된 단백질의 A사슬과 B사슬의 유추된 일차 아미노산 서열을 여러가지 뱀독 C-형 렉틴의 A사슬과 B사슬 아미노산 서열과 비교하였다.

도 2a는 정제된 단백질 A 사슬과 공지의 뱀독 C-형 렉틴의 아미노산 서열을비교한 그림이며, 도 2b은 정제된 단백질 B 사슬과 공지의 뱀독 C-형 렉틴의 아미노산 서열을 비교한 그림이다: 이때, (*) 표시된 부분은 시스테인 잔기를 나타낸다. 도 2a에서 보듯이, A 사슬에 대하여, 하부(Habu) IX/X-BP(참조: Atoda, H. et al., J. Biol. Chem., 266:14903-14911, 1991)과는 65%의 상동성을, 보트로세틴(Botrocetin, 참조: Usami, Y. et al., Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A., 90:928-932, 1993)과는 56%의 상동성을, 마무시긴(Mamushigin, 참조: Sakurai, Y. et al., Thromb. Haemost., 79:1199-1207, 1998)과는 51%의 상동성을, 에키세틴(Echicetin, 참조: Peng, M. et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 205:68-72, 1994: Polgar, J. et al., Biochem. J., 323:533-537, 1997)과는 45%의 상동성을, 콘벌크신(Convulxin, 참조: Leduc, M. and Bon, C., Biochem. J., 333:389-393, 1998)과는 50%의 상동성을, 보트로자라신(Bothrojaracin, 참조: Arocas, V. et al., Eur. J. Biochem., 248:550-557, 1997)과는 56%의 상동성을 보였다.

아울러, 도 2b에서 보듯이, B 사슬은 하부 IX/X-BP와는 80%의 상동성을, 보트로세틴과는 48%의 상동성을, 마무시긴과는 48%의 상동성을, 에키세틴과는 48%의 상동성을, 콘벌크신과는 50%의 상동성을, 보트로자라신과는 52%의 상동성을 보였다.

특히, 정제된 A 사슬과 B 사슬의 시스테인 잔기 7개는 고도로 보존되어 있으며, 이들 중 6개는 사슬 내부의 이황화결합(disulfide bond) 형성에 관여하며, 예를 들면 Cys⁴-Cys¹⁵, Cys³²-Cys¹²⁹및 Cys¹⁰⁴-Cy¹²¹는 A 사슬의 이황화결합에 관여하며, Cys²-Cys¹³, Cys³⁰-Cys¹¹⁸및 Cys⁹⁵-Cys¹¹⁰은 B 사슬의 이황화결합에 관여한다. 아울러, 나머지 A 사슬의 Cys⁸¹및 B 사슬의 Cys⁷⁵는 두 소단위체를 연결하는데 관여한다.

본 발명의 정제된 단백질을 C-형 렉틴 계열 단백질들의 염기서열을 비교해 보면 비번역영역에서는 거의 동일하지만, 암호화영역은 45-65%의 상동성이 있는 것으로 나타났다. 이러한 결과를 종합한 결과, 본 발명의 정제된 단백질은 신규한 단백질임이 확인되어, 이를 '살모린(Salmorin)'이라 명명하였다.

실시예 5: 정제된 단백질의 피브리노겐 응고억제 기작

실시예 5-1: 트롬빈 활성에 대한 정제된 단백질의 영향

피브리노겐 응고를 직접 촉매하는 트롬빈에 대하여 본 발명의 살모린이 어떠한 영향을 미치는지를 알아보기 위하여, 전기 실시예 1에 상술한 방법으로 살모린의 피브리노겐 응고시간을 측정하였다: 이때, 37℃에서 2분 동안 살모린과 트롬빈을 반응시킨 다음, 0.5㎖의 피브리노겐(0.5㎎/㎖)이 용해된 20mM Tris-HCl(pH 7.5)에 전기 살모린/트롬빈을 첨가하여 응고시간을 측정하였다. 도 3은 본 발명의 살모린에 의한 피브리노겐 응고억제 효과를 나타내는 그래프이다. 도 3에서 보듯이,살모린의 피브리노겐 응고억제 효과는 살모린의 용량에 의존하여 증가됨을 확인할 수 있었다.

트롬빈 활성에 대한 살모린의 억제효과는 아미도분해(amidolytic) 활성을 측정할 수 있는 발색기질인 D-페닐-피페콜릴-아르기닌-p-니트로아닐라이드 (D-Phe-Pipecolyl-Arg-p-nitroanilide, 이하 'S-2238'이라 함, Sigma Chemical Co., U.S.A.)를 사용하여 측정한 결과, 살모린이 S-2238의 분해를 저해하지 않음을 확인할 수 있었는 바, 트롬빈의 활성부위에 살모린이 직접 결합하지 않는 것을 알 수 있었다.

한편, 트롬빈의 활성부위와 엑소사이트 1에 결합하여 트롬빈의 아미도분해 활성을 억제하는 것으로 알려진 히루딘(참조: Rydel, T. J. et al., Science, 249:277-280, 1990)의 작용에 대하여 살모린이 어떠한 영향을 미치는지 알아 보았다. 도 4은 본 발명의 살모린이 히루딘에 의한 트롬빈 억제작용을 저해함을 나타내는 그래프이다: 이때, (▲)는 S-2238을 처리한 경우를 나타내며, (△)는 히루딘과 S-2238을 함께 처리한 경우를 나타낸다. 도 4에서 보듯이, 히루딘의 작용을 본 발명의 살모린이 방해하는 것을 확인할 수 있었는 바, 살모린이 트롬빈의 엑소사이트 1에 결합하여 피브리노겐이나 히루딘과 경쟁할 것으로 예상되었다.

결론적으로, 본 발명의 살모린은 트롬빈의 활성에 직접 영향을 주지 않으며, 트롬빈이 유도하는 피브리노겐 응고를 억제하는 것을 확인할 수 있었다.

실시예 5-2: 프로트롬빈과 살모린 복합체의 확인

전기 실시예 5-1의 결과에 의하여, 본 발명의 살모린은 프로트롬빈이 factor Xa에 의해 트롬빈으로 활성화되는 과정을 억제함을 확인하였는 바, 살모린이 프로트롬빈과 직접 결합함으로써 전기 과정을 억제하는지를 하기의 방법으로 조사하였다: 우선, 프로트롬빈(Calbiochem, U.S.A.)을 살모린과 50mM Tris-HCl(pH 7.5)에서 5분간 전처리한 후 12% 미변성(native)-PAGE를 수행하였으며, 살모린과 프로트롬빈의 결합양상은 비환원 조건의 미변성-PAGE로 분석하였다.

도 5a는 살모린과 프로트롬빈의 PAGE 결과를 나타낸 사진이다: 이때, 레인 1은 30pmole의 프로트롬빈을; 레인 2는 5pmole의 살모린을; 레인 3은 15pmole의 살모린으로 전처리된 30pmole의 프로트롬빈을; 및, 레인 4는 30pmole의 살모린으로 전처리된 프로트롬빈을 나타낸다. 도 5a에서 보듯이, 살모린과 프로트롬빈을 같은 몰비율(molar ratio)로 처리했을 때, 두 개의 단백질 밴드는 사라지고 서서히 단일 밴드가 나타남을 알 수 있었는 바, 본 발명의 살모린은 프로트롬빈과 2분자 복합체를 형성함을 확인할 수 있었다.

한편, 도 5b는 factor Xa가 매개하는 프로트롬빈 활성화에 대한 본 발명의 살모린의 영향을 나타내는 사진이다: 이때, 레인 1은 10pmole의 factor X를; 레인 2는 5pmole의 살모린을; 및, 레인 3은 5pmole의 살모린으로 전처리된 10pmole의 factor X를 나타낸다. 도 5b에서 보듯이, factor Xa는 본 발명의 살모린과 복합체를 이루지 않는 것으로 나타났다.

이어, 살모린/프로트롬빈 복합체에 대하여 factor Xa가 어떠한 작용을 하는지를 하기의 방법으로 측정하였다: 즉, 프로트롬빈 10pmole과 factor Xa 0.05unit(50mM Tris-HCl, pH 7.5) 및 살모린을 37℃에서 20분간 반응시킨 후, 반응 혼합액을 12% SDS-PAGE하였다.

도 6a는 본 발명의 살모린의 존재하에 factor Xa-매개성 프로트롬빈 활성을 나타내는 그래프이다: 이때, 레인 1은 프로트롬빈을; 레인 2는 factor Xa로 전처리된 프로트롬빈을; 레인 3은 1pmole의 살모린의 존재하에 factor Xa로 전처리된 프로트롬빈을; 및, 레인 4는 10pmole의 살모린의 존재하에 factor Xa로 전처리된 프로트롬빈을 나타낸다. 도 6a의 레인 2에서 보듯이, factor Xa에 의해 프로트롬빈이 가수분해되어 메이조트롬빈(meizothrombin)의 절편(fragment) 1과 2 및 프리트롬빈 2(prethrombin 2)로 절단되며, 제 4레인에서 보듯이, 프로트롬빈이 살모린과 같은 몰비율로 존재할 때 분해과정이 완전히 억제됨을 알 수 있었다.

아울러, 본 발명의 살모린의 존재하에서 프로트롬빈의 활성화 억제는 전기 실시예 1의 방법에 의하여 피브리노겐 응고에 걸리는 시간을 측정하였다. 도 6b는 본 발명의 살모린에 의한 피브리노겐 응고시간의 지연을 나타내는 그래프이다: 이때, (▲)는 10nM의 프로트롬빈, 살모린 및 factor Xa의 혼합물일 경우를; (△)는 30nM의 프로트롬빈, 살모린 및 factor Xa의 혼합물일 경우를; 및, (□)는 50nM의 프로트롬빈, 살모린 및 factor Xa의 혼합물일 경우를 나타낸다. 도 6b에서 보듯이, 살모린/프로트롬빈의 몰농도 비율에 비례해서 피브리노겐 응고가 지연됨을 확인할 수 있었다.

이상에서 상세히 설명하고 입증하였듯이, 본 발명은 한국산 살모사(Agkistrodon halys brevicaudus)의 독소로부터 분리된 신규한 피브리노겐 응고 억제 단백질과 그의 제조방법을 제공한다. 본 발명의 살모린은 한국산 살모사의 독소를 채취한 다음, 이를 음이온 교환 크로마토그래피를 수행하고 겔 여과한 후, 음이온 교환 크로마토그래피를 재수행하는 공정을 포함하는 방법에 의하여 제조되며, 전기 제조된 살모린은 비환원 조건하에서 SDS-PAGE 분석시 약 27kDa의 단일 밴드로 나타나며, 환원조건하에서는 SDS-PAGE 분석시 약 15kDa의 A 사슬과 14kDa의 B 사슬로 분리되고, 살모린 A 사슬과 B 사슬의 시스테인 잔기 7개를 가지는 단백질이며, 프로트롬빈과 2분자 복합체를 이룬다. 아울러, 전기 살모린은 트롬빈이 트롬빈으로 활성화되는 것을 강력하게 억제함으로써 용량의존적으로 피브리노겐 응고를 억제하며, 히루딘과 경쟁적으로 작용함으로써 혈액응고를 지연시키는 특성을 갖는 바, 본 발명의 살모린은 항혈전제의 유효성분으로 널리 활용될 수 있을 것이다.

Claims (5)

1. 한국산 살모사(Agkistrodon halys brevicaudus)의 독소로부터 분리되며, 살모린 A 사슬을 코딩하는 서열번호 5로 나타내어지는 염기서열 및 살모린 B 사슬을 암호화하는 서열번호 7로 나타내어지는 염기서열로 구성되는 살모린(Salmorin)의 cDNA.
2. 서열번호 5의 염기서열로부터 유추되는 살모린의 A 사슬 및 서열번호 7의 염기서열로부터 유추되는 살모린의 B 사슬로 구성되는 살모린.
3. 제 2항에 있어서.

   피브리노겐 응고 억제 활성을 갖는 것을 특징으로 하는

   살모린.
4. 한국산 살모사(Agkistrodon halys brevicaudus)의 독소를 채취한 다음, 음이온 교환 크로마토그래피를 수행하고 겔 여과한 후, 음이온 교환 크로마토그래피를 재수행하는 공정을 포함하는 살모린의 제조방법.
5. 제 4항에 있어서,

   음이온 교환 크로마토그래피는 Q-세파로즈 HP(Q-Sepharose HP) 컬럼을

   사용하며;

   겔 여과는 슈퍼덱스 75(Superdex 75)를 사용하고; 및,

   재수행되는 음이온 교환 크로마토그래피는 모노 Q FPLC(Mono Q FPLC)

   컬럼을 사용하는 것을 특징으로 하는

   살모린의 제조방법.