KR100350906B1

KR100350906B1 - 뱀의 독소로부터 분리된 신규한 트롬빈 유사효소 및 그의제조방법

Info

Publication number: KR100350906B1
Application number: KR1020000032654A
Authority: KR
Inventors: 정광회; 김두식; 고유석
Original assignee: (주)바이오버드
Priority date: 2000-06-14
Filing date: 2000-06-14
Publication date: 2002-09-05
Also published as: KR20010111891A

Abstract

본 발명은 뱀 독소로부터 분리된 신규한 트롬빈 유사효소(thrombin-like enzyme) 및 그의 제조방법에 관한 것이다. 본 발명의 트롬빈 유사효소는 한국산 칠점사(Agkistrodon saxatilis emelianov)의 독소를 음이온 교환 크로마토그래피를 수행하고 겔 여과한 후, 음이온 교환 크로마토그래피를 재수행하는 단계를 포함하는 정제방법에 의하여 분리 정제되며, 다음과 같은 특성을 가지는 세린계 단백분해효소인 신규한 트롬빈 유사효소로 밝혀졌다: (ⅰ) 한국산 칠점사의 독소로부터 유래되며; (ⅱ) IIGGDEXNINEHRFL인 N-말단 아미노산 서열을 포함하고; (ⅲ) 분자량이 약 39kD의 당단백질이며; (ⅳ) 펩타이드-N-글리코시다제-F에 의하여 아스파라긴 잔기에 연결된 당이 제거된 후의 분자량은 약 28kD이고; (ⅴ) PMSF 또는 류펩틴에 의하여 효소 활성이 억제되며; (ⅵ) 트롬빈 특이성 기질인 D-Phe-Pip-Arg-p-nitroanilide 또는 칼리크레인 특이성 기질인 N-benzoyl-Phe-Val-Arg-p-nitroanilide을 분해하고, 이들 기질에 대한 K_m값은 34 내지 64μM이고; (ⅶ) 효소 활성의 초기 단계에서 피브리노겐 A 사슬을 분해하고, 반응이 연장될 경우 피브리노겐 B 사슬을 분해하며; 및, (ⅷ) 피브린 용해효소에 의하여 용이하게 분해되는 불안정한 피브리노겐 응괴(fibrinogen clotting)를 유도한다.

Description

뱀의 독소로부터 분리된 신규한 트롬빈 유사효소 및 그의 제조방법{Novel Thrombin-like Enzyme Derived from Snake Venom and a Process for Preparing the Same}

본 발명은 뱀의 독소로부터 분리된 신규한 트롬빈 유사효소(thrombin-likeenzyme) 및 그의 제조방법에 관한 것이다. 좀 더 구체적으로, 본 발명은 한국산 칠점사(Agkistrodon saxatilis emelianov)의 독소로부터 분리되며, 불안정한 피브리노겐 응괴(fibrinogen clotting)를 형성하는 트롬빈 유사효소 및 그의 제조방법에 관한 것이다.

뱀의 독소에는 혈액 응고의 여러 단계에 작용하는 다양한 종류의 세린계 단백분해효소가 존재하는데(참조: Stocker, K.F., Snake venom proteins affecting hemostasis and fibrinolysis in medical use of snake venom proteins, (Stocker,K.F.,ed.) CRC Press, Inc., Boca Raton, pp. 97-160, 1990), 이들은 비정상적인 혈전의 생성으로 인한 질병 치료에 이용될 수 있으므로, 현재까지 각종 뱀의 독소로부터 전기 단백분해효소들이 분리되어 그들의 특성이 규명되었다. 이 중에서 트롬빈 유사효소(thrombin-like enzyme)(참조: Esnouf, M.P. and Tunnah, G.W., Brit. J. Haematol., 13:581-590, 1967; Markland, F.S. and Damus, P.S., J. Biol. Chem., 246:6460-6473, 1971; Pan, H. et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 255:412-415, 1989)와 피브린 용해효소(참조: Matsui, T. et al., Eur. J. Biochem., 252:569-575, 1998; Siigur, E. and Siigur, J. Biochim. Biophys. Acta, 1074:223-229, 1991)는 피브리노겐에 작용하여 혈액을 탈피브리노겐화(defibrinogenation)함으로써 혈액의 점도를 저하하는 것으로 알려져 있다. 특히, 트롬빈 유사효소에 의하여 생성된 피브린 단량체(monomer)는 불안정한 특성을 가지므로, 인체내의 트롬빈에 의해 생성된 피브린보다 섬유소용해효소(plasmin)에의한 단백분해에 더욱 민감하여 즉시 분해되므로, 탈피브리노겐화의 초기단계에서는 피브린 분해산물이 증가하지만, 결과적으로는 피브리노겐이 고갈된 후에는 피브린 단량체가 점점 감소하게 되어, 체내의 피브린이 정상 수준이 되는 것으로 알려져 있다(참조: Chang, M. C. and Huang, T. F., J. Lab. Clin. Med., 125:508-516, 1995). 아울러, 전기 효소들은 혈장에 존재하는 응집인자에 영향을 주지 않을 뿐만 아니라 혈소판 응집이나 유리(release) 반응을 유도하지 않는 장점이 있어(참조: Stocker, K.F., Snake venom proteins affecting hemostasis and fibrinolysis in medical use of snake venom proteins, (Stocker, K.F., ed.) CRC Press, Inc., Boca Raton, pp. 97-160, 1990), 이를 혈전성 질환에 이용하려는 연구가 시도되었다.

이에, 본 발명의 발명자들은 뱀독으로부터 혈전성 질환에 효율적으로 사용될 수 있는 효소를 분리하고자 예의 노력한 결과, 한국산 칠점사(Agkistrodon saxatilis emelianov)의 독소로부터 신규한 트롬빈 유사효소를 분리 정제하고, 전기 트롬빈 유사효소가 트롬빈과 경쟁적으로 피브리노겐에 작용하여 불안정한 피브린 응괴를 형성하므로 혈중 플라스민이나 피브린 용해효소에 의하여 용이하게 분해되므로, 피브리노겐의 농도를 감소시켜 혈액의 점도를 떨어뜨려 혈전 형성을 억제할 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.

결국, 본 발명의 주된 목적은 한국산 칠점사의 독소로부터 분리한 신규한 트롬빈 유사효소를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 한국산 칠점사의 독소로부터 전기 트롬빈 유사효소의 제조방법을 제공하는 것이다.

도 1은 본 발명의 트롬빈 유사효소의 SDS-PAGE 결과를 나타낸 사진이다.

도 2는 본 발명의 트롬빈 유사효소와 뱀의 독소에 존재하는 세린계 단백분해효소의 N-말단 아미노산 서열을 비교한 그림이다.

도 3은 단백분해효소의 억제인자에 의한 본 발명의 트롬빈 유사효소 활성의 억제를 나타낸 그래프이다.

도 4는 본 발명의 트롬빈 유사효소의 기질 선택성을 나타낸 그래프이다.

도 5는 본 발명의 트롬빈 유사효소에 의하여 형성된 응괴에 대한 피브린 용해효소의 활성을 나타낸 그래프이다.

이하, 본 발명의 뱀의 독소로부터 분리된 신규한 트롬빈 유사효소 및 그를 제조하는 방법을 보다 구체적으로 설명하고자 한다.

본 발명자들은 한국산 칠점사(Agkistrodon saxatilis emelianov)의 독소를 음이온 교환 크로마토그래피를 수행하고 겔 여과한 후, 음이온 교환 크로마토그래피를 재수행하는 단계를 포함하는 방법에 의하여, 뱀의 독소로부터 트롬빈 유사효소를 제조하였다. 이때, 음이온 교환 크로마토그래피는 Q-세파로즈 FPLC 컬럼 및 Mono Q FPLC 컬럼을 사용하고, 겔 여과는 슈퍼덱스 75 FPLC 컬럼을 사용하여 수행하였으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

전기 제조방법에 의하여 정제된 트롬빈 유사효소의 분자량은 SDS-PAGE 분석시 약 39kD이었으며, 펩타이드-N-글리코시다제-F로 아스파라긴 잔기에 연결된 당을 제거하여 SDS-PAGE를 수행할 경우 펩타이드의 분자량은 약 28kD로 확인되었다. 이어, N-말단 아미노산 서열을 분석한 결과, IIGGDEXNINEHRFL로서 기타 뱀독의 세린계 단백분해효소와 높은 유사성을 보임을 확인하였다. 아울러, 본 발명의 트롬빈 유사효소는 트롬빈 특이성 기질인 D-Phe-Pip-Arg-p-nitroanilide 또는 칼리크레인 특이성 기질인 N-benzoyl-Phe-Val-Arg-p-nitroanilide을 분해하고, 이들 기질에 대한 K_m값이 34 내지 64μM로 나타났으며, PMSF 또는 류펩틴에 의하여 효소 활성이 억제되는 특성을 가지므로, 트롬빈과는 기질 특이성 및 여러 가지 억제인자에 대한 감수성이 다름을 확인하였다. 트롬빈 유사효소의 활성에 있어서, 초기 단계에서 피브리노겐 A 사슬을 분해하고, 반응이 연장될 경우 피브리노겐 B 사슬을 분해할 뿐만 아니라, 피브린 용해효소에 의하여 용이하게 분해되는 불안정한 피브리노겐 응괴(fibrinogen clotting)를 유도함을 확인하였다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예 1: 트롬빈 유사효소의 정제

한국산 칠점사로부터 트롬빈 유사효소를 정제하기 위하여, 한국산 칠점사(Agkistrodon saxatilis)로부터 채취한 조독소 1㎖을 20mM Tris-HCl(pH 8.0)에 10배 희석한 다음, 20mM Tris-HCl(pH 8.0)으로 미리 평형을 유지시킨 Q-세파로즈 FPLC 컬럼(Pharmacia, Sweden)에 주입하여 50mM NaCl을 포함하는 상기 완충용액으로 용출시켜 0.05M의 용출분획에서 트롬빈 유사효소 활성이 나타남을 확인한 후,트롬빈 유사효소의 활성을 가진 분획들을 모아 농축시킨 후, 전기 농축액을 150mM NaCl을 포함하는 20mM Tris-HCl(pH 8.0)으로 미리 평형을 유지시킨 슈퍼덱스 75 FPLC 컬럼(Superdex 75, Pharmacia, Sweden)에서 겔 여과하였다. 이어, 트롬빈 유사효소 활성을 가진 분획들을 모아서 20mM Tris-HCl(pH 8.0)로 미리 평형을 유지시킨 Mono Q FPLC 컬럼(Pharmacia, Sweden)에 주입하고, 0 내지 0.2M NaCl의 직선 농도 구배로 용출시켜, 최종적으로 190mg의 조독소 단백질로부터 0.62mg의 트롬빈 유사효소를 수득하였다.

전기 수득된 효소의 활성은 하기의 트롬빈응괴 역가검정(thrombin clotting assay, fibrinogen plate assay)법으로 측정하였다(참조: Hofmann et al., Biochimie., 65:201-210, 1983). 즉, 50mM Tris-HCl(pH 7.5)에 용해시킨 사람 피브리노겐(0.5mg/㎖, (주)녹십자, 한국) 0.5㎖에 37℃에서 5분간 항온 처리한 정제된 효소 0.1㎖을 첨가하고 응괴되는데 걸리는 시간을 측정한 결과, 효소의 역가는 350 NIHunit/mg로 나타났다.

트롬빈 유사효소의 정제

	트롬빈-유사효소
	총 단백질(㎎)	총 활성(NIHunit)*	특이활성(NIHunit/㎎)
뱀의 조독소(crude venom)	190	2660	14
Q-세파로즈(Q-Sepharose)	18.2	1750	96.2
슈퍼덱스 75(Superdex 75)	3.7	772	257.3
모노-Q FPLC (Mono-Q FPLC)	.062	217	350

*: 피브리노겐 응고활성을 사람의 트롬빈의 NIH 효소의 단위로 나타내었다.

실시예 2: 정제된 트롬빈 유사효소의 분자량 확인

실시예 1에서 정제된 트롬빈 유사효소의 분자량을 결정하기 위하여 환원조건하에서 12% SDS-PAGE를 수행하였으며, 동시에 당단백질인 트롬빈 유사효소를 펩타이드-N-글리코시다제-F(peptide-N-glycosidase F(2효소단위/mg 단백질, Sigma, U.S.A.)와 37℃에서 24시간 동안 반응시켜 아스파라긴 잔기에 연결된 당을 제거한 후, 환원 조건하에 12% SDS-PAGE를 수행하였다.

도 1은 본 발명의 트롬빈 유사효소의 SDS-PAGE 결과를 나타낸 사진이다: 이때, 레인 1은 본 발명의 트롬빈 유사효소를 나타내며, 레인 2는 펩타이드-N-글리코시다제-F로 탈글리코실화된 트롬빈 유사효소를 각각 나타낸다. 도 1에서 보듯이, 본 발명의 트롬빈 유사효소는 분자량이 약 39kD인 단일 밴드로 나타났으며, 본 발명의 트롬빈 유사효소를 펩타이드-N-글리코시다제-F와 반응시킨 후, 분자량이 약 28kD의 단일밴드로 나타남을 확인할 수 있었다.

실시예 3: 트롬빈 유사효소의 N-말단 아미노산 서열 분석

정제된 효소를 12% SDS-PAGE하여 PVDF 막에 전기이입(electrotransfer)시킨 후 단백질 서열분석기(Applied Biosystems Precise Protein Sequencing System,Applied Biosystesm Inc., U.S.A.)을 이용하여 N-말단 아미노산 서열을 결정하였다.

도 2는 본 발명의 트롬빈 유사효소와 뱀의 독소에 존재하는 세린계 단백분해효소의 N-말단의 아미노산 서열을 비교한 것이다: 즉, 공지된 안크로드(Ancrod, 참조: Au, L.C. et al., Biochem. J., 294:387-390, 1993), 바트록소빈(Batroxobin, 참조: Itoh, N. et al., J. Biol. Chem., 263:7628-7631, 1988), 플라복소빈(Flavoxobin, 참조: Shieh, T.C. et al., J. Biochem., 103:596-605, 1988)과 본 발명의 트롬빈 유사효소를 비교하였다. 도 2에서 보듯이, 본 발명의 트롬빈 유사효소의 아미노산 서열은 공지된 단백분해효소들과는 상이하며, 신규한 트롬빈 유사효소로 확인되었다.

실시예 4: 효소활성의 억제

상기 트롬빈 유사효소에 대한 억제인자들의 영향을 보기 위하여, 1mM의 PMSF(phenylmethyl-sulfonyl fluoride), 5mM의 PMSF, 10mM의 EDTA, 펩스타틴(pepstatin), 류펩틴(leupeptin), 히루딘(hirudin) 또는 트립신 억제인자(trypsin inhibitor) 등의 단백분해효소의 억제인자와 트롬빈 유사효소(10㎕ in 20mM Tris-HCl, pH 7.5, 10 pmole)를 37℃에서 5분간 전처리한 후, 합성 기질(N-benzoyl-Phe-Pip-Arg-p-nitroanilide, S-2238, Sigma, U.S.A., 이하 'S-2238'이라 함)과 반응시켜 남은 역가를 측정하였다.

도 3은 단백분해효소의 억제인자에 의한 본 발명의 트롬빈 유사효소 활성의 억제를 나타낸 그래프이다. 도 3에서 보듯이, 트롬빈에서 피브리노겐 인식부위인 엑소사이트(exosite)에 결합하여 효소활성을 억제하는 것으로 알려져 있는 히루딘(참조: Jandrot-Perrus, M. et al., Thromb. Haemost., 66:300-305, 1991)에 의하여 트롬빈 유사효소의 단백분해 역가가 감소되지 않음을 확인하였는 바, 본 발명의 트롬빈 유사효소의 피브리노겐 인식 부위가 트롬빈과는 상이함을 확인할 수 있었다. 한편, PMSF는 트롬빈 유사효소의 단백분해역가를 용량 의존적으로 매우 강력하게 억제하는 것으로 나타났으며, 류펩틴도 억제효과를 보였다. 이들 결과로 미루어 보아, 트롬빈 유사효소는 세린계 단백분해효소이고, 트롬빈이나 피브린 용해효소와는 억제인자에 대한 감수성이 상이함을 확인할 수 있었다.

실시예 5: 트롬빈 유사효소의 기질 특이성

합성된 발색기질을 사용하여, 전기 트롬빈 유사효소의 기질 특이성을 조사하였다: 50㎕의 발색기질(3mM)인 기질 1(D-Phe-Pip-Arg-p-nitroanilide, 이하 'S-2238'라 함), 기질 2(N-benzoyl-Pro-Phe-Arg-p-nitroanilide, 이하 'B-2133'라 함), 기질 3(D-Val-Leu-Lys-p-nitroanilide, 이하 'V-7127'이라 함), 기질 4(N-p-tosyl-Gly-Pro-Lys-p-nitroanilide, 이하 'T-6140'이라 함) 또는 기질 5(N-Benzoyl-Ile-Glu-Gly-Arg-p-nitroanilide, 이하 'B-2291'이라 함)와 50㎕의 트롬빈 유사효소(1μM), 0.9㎖의 Tris-HCl(pH 7.5)을 37℃에서 20분간 반응시킨 후, 405nm에서 흡광도의 증가로 기질의 분해정도를 측정하였다.

도 4는 본 발명의 트롬빈 유사효소의 기질 선택성을 나타낸 그래프이다: 이때, ■는 트롬빈 유사효소의 기질 분해활성을 나타내며, ▧는 사람의 트롬빈의 기질 분해활성을 나타내고, ▤는 사람의 유로키나제의 기질 분해활성을 나타낸다. 도 4에서 보듯이, 트롬빈 특이성 기질인 S-2238과 혈장 칼리크레인(kallikrein)의 기질인 B-2291은 쉽게 분해되었으며, 플라스미노겐 활성인자(plasminogen activator)의 기질인 V-7127은 약간 분해되었다. 이러한 합성 기질에 대하여 트롬빈 유사효소는 낮은 K_m값(34-64μM)을 나타났는 바, 본 발명의 트롬빈 유사효소는 높은 기질 특이성과 강한 결합 친화력을 가짐을 확인할 수 있었다.

실시예 6: 트롬빈 유사효소의 활성

실시예 6-1: 트롬빈 유사효소의 피브리노겐 용해 활성

전기 트롬빈 유사효소의 피브노겐용해(fibrinogenolytic) 역가를 측정하기 위하여, 50mM Tris-HCl(pH 7.5)에 용해시킨 피브리노겐(0.2%) 0.1ml에 검사하고자 하는 시료 0.1㎖을 첨가하여 37℃에서 반응시킨 후, 10분, 30분, 60분에 일정량을 취하여 피브리노겐의 절단 유형을 SDS-PAGE로 조사하였으며, 트롬빈 유사효소에 의한 피브리노겐 A 및 B의 분해 양상은 효소반응이 일어나는 4시간 동안 HPLC C18 컬럼으로 확인하였다. 그 결과, 트롬빈 유사효소는 초기 단계에 피브리노겐 A 사슬을 분해하여 피브리노겐의 응괴를 초래하며, 효소 반응을 길게 연장하면 피브리노겐 B 사슬이 분해되고, 이때의 분해산물은 피브린 용해효소와는 상이함을 확인할 수 있었다.

실시예 6-2: 피브린 용해효소에 대한 피브린 응괴의 감수성

트롬빈에 의해 유도된 피브린 응괴와 트롬빈 유사효소에 의해 유도된 피브린 응괴가 한국산 칠점사로부터 분리된 피브린 용해효소(참조: 본 출원과 동일자에 출원하는 「뱀의 독소로부터 분리된 신규한 피브린 용해효소 및 그의 제조방법」)에 의해 분해되는 정도를 피브린 플레이트 역가 검정법(fibrin plate assay)으로 측정하였다(참조: Astrup, T. and Mullertz, S., Arch. Biochem. Biophys., 40:346-351, 1952): 즉, 5㎖의 피브리노겐(0.5%)에 3 효소단위(unit)의 트롬빈 또는 트롬빈 유사효소를 첨가하여 피브린 응괴를 형성시킨 후, 피브린 용해효소 10㎕를 피브린 응괴 표면에 첨가하고 37℃에서 6시간 동안 반응시켰으며, 피브린 용해활성은 용해된 부분의 흡광도를 600nm에서 측정하여 흡광도 감소로 결정하였다.

도 5는 본 발명의 트롬빈 유사효소에 의한 피브린 용해활성을 나타낸 그래프이다: 이때, ●는 사람의 트롬빈에 의한 피브린 용해활성을 나타내고, ■는 트롬빈 유사효소에 의한 피브린 용해 활성을 나타낸다. 도 5에서 보듯이, 트롬빈에 의해 유도된 피브린 응괴와 트롬빈 유사효소에 의해 유도된 피브린 응괴 모두에서 용해된 부분이 나타났으나, 트롬빈 유사효소의 플레이트가 트롬빈 플레이트 보다 2배 더 투명하게 나타남을 알 수 있었는 바, 본 발명의 트롬빈 유사효소에 의해 응괴된 피브린 응괴를 한국산 칠점사로부터 분리된 피브린 용해효소가 더욱 용이하게 분해하므로 전기 트롬빈 유사효소는 피브린 용해효소와 함께 사용되어 혈중 피브리노겐을 효과적으로 제거할 수 있음을 확인할 수 있었다.

이상에서 상세히 설명하고 입증하였듯이, 본 발명은 뱀의 독소로부터 분리된 신규한 트롬빈 유사효소 및 그의 제조방법을 제공한다. 본 발명의 트롬빈 유사효소는 한국산 칠점사(Agkistrodon saxatilis emelianov)의 독소를 음이온 교환 크로마토그래피, 겔 여과, 다시 음이온 교환 크로마토그래피하는 단계를 포함하는 정제방법으로 분리 정제된다. 본 발명의 트롬빈 유사효소는 트롬빈과 경쟁적으로 피브리노겐에 작용하여 불안정한 피브린 응괴를 형성하므로 혈중 플라스민 또는 피브린 용해효소에 의해 용이하게 분해되는 바, 피브리노겐의 농도를 감소시켜 혈액의 점도를 저하시킨다. 따라서, 본 발명의 트롬빈 유사효소는 전기 피브린 용해효소와 상호 보완적으로 작용하여 혈전과 관련된 질병 치료에 유용하게 사용될 수 있을 것이다.

Claims

다음과 같은 특성을 가지는 세린계 단백분해효소인 트롬빈 유사효소:

(ⅰ) 한국산 칠점사(Agkistrodon saxatilis emelianov)의 독소로부터 유래되는 당단백질이며;

(ⅱ) IIGGDEXNINEHRFL인 N-말단 아미노산 서열을 포함하고;

(ⅲ) SDS-PAGE로 분석시, 분자량이 약 39kD이며;

(ⅳ) 펩타이드-N-글리코시다제-F에 의하여 아스파라긴 잔기에 연결된 당이 제거된 후의 분자량은 약 28kD이고;

(ⅴ) PMSF 또는 류펩틴에 의하여 효소활성이 억제되며;

(ⅵ) 트롬빈 특이성 기질인 D-Phe-Pip-Arg-p-nitroanilide 또는 칼리크레인 특이성 기질인 N-benzoyl-Phe-Val-Arg-p-nitrdanilide을 분해하고, 이들 기질에 대한 K_m값은 34 내지 64μM이고;

(ⅶ) 효소 활성의 초기 단계에서 피브리노겐 A 사슬을 분해하고, 반응이 연장될 경우 피브리노겐 B 사슬을 분해하며; 및,

(ⅷ) 피브린 용해효소에 의하여 용이하게 분해되는 불안정한 피브리노겐 응괴(fibrinogen clotting)를 유도한다.
한국산 칠점사(Agkistrodon saxatilis emelianov)의 독소를 음이온 교환 크로마토그래피를 수행하고 겔 여과한 후, 음이온 교환 크로마토그래피를 재수행하는 단계를 포함하는 제 1항의 트롬빈 유사효소를 제조하는 방법.