KR100835736B1

KR100835736B1 - 디스인테그린을 포함하는 항혈전제

Info

Publication number: KR100835736B1
Application number: KR1020030051430A
Authority: KR
Inventors: 정광회; 유원규; 홍성유; 손영덕; 고유석; 강승우; 최원석; 장양수; 김두식
Original assignee: (주)바이오버드
Priority date: 2003-07-25
Filing date: 2003-07-25
Publication date: 2008-06-09
Also published as: KR20050012457A

Abstract

본 발명은 신규한 재조합 단백질인 hD15K를 포함하는 혈전증 치료제에 관한 것이다. 좀 더 구체적으로, 본 발명은 Adam15 단백질로부터 유래된 유전자 재조합 방법을 이용해 얻어낸 신규한 단백질인 hD15K의 혈전증 치료제로서의 용도에 관한 것이다. 본 발명에 의하면, hD15K은 효과적으로 혈전형성을 저해할 수 있고, 혈전형성을 효과적으로 저해할 수 있는 농도범위에서도 세포독성을 나타내지 않는다. 또한 hD15K는 αvβ3 인테그린과 비트로넥틴간의 상호작용에는 전혀 영향을 미치지 않아 αvβ3 인테그린과 결합하는 기존의 디스인테그린들에 의해 유발될 수 있는 부작용은 현저히 감소시키며 혈전형성을 효과적으로 저해하기 때문에 이 단백질은 혈전증 치료제로 유용하게 사용될 수 있을 것이다.

Description

디스인테그린을 포함하는 항혈전제{Antithrombotics comprising Disintegrin}

도 1은 인간유래 ADAM15의 디스인테그린 도메인 cDNA염기서열과 그로부터 코딩되는 아미노산 서열을 나타낸다.

도 2는 인간유래 ADAM15의 디스인테그린 도메인의 RGD 서열 부위를 KGD로 치환 시킨 아미노산 서열

도 3는 인간유래 ADAM15의 디스인테그린 도메인의 RGD 서열 부위를 KGD로 코딩하는 재조합 cDNA서열을 나타낸다.

도4은 인간 유래 디스인테그린 유전자 발현벡터 pPhD-15와 pPHD-15K의 제작 과정을 나타낸다.

본 발명은 신규한 재조합 단백질인 hD15K를 포함하는 항혈전제에 관한 것이다. 좀 더 구체적으로, 본 발명은 Adam15 단백질로부터 유래된 유전자 재조합 방법을 이용해 얻어낸 신규한 단백질인 hD15K의 혈전증 치료제로서의 용도에 관한 것이다.

디스인테그린(Disintegrin)은 뱀독에서 처음 정제된 단백질로서 아미노산 70여개로 구성되어 있으며 시스틴 잔기를 다량 함유하고 있고 인테그린(integrin)에 결합할 수 있는 부위를 가지고 있다. 일반적으로, 뱀독의 disintegirn의 인테그린 결합 부위는 Arg-Gly-Glu(RGD), 혹은 Lys-Gly-Glu(KGD) 로 이루어져 있으며 최근 보고에 따르면 전형적인 인테그린 결합 부위이외에 X-X-Cys-Glu(XXCD)로 구성된 디스인테그린들이 발표되고 있다. 또한 디스인테그린의 유전자 구조를 살펴보면 5 방향(단백질의 N-말단 방향)에 메탈로프로테이즈(metalloprotease) 도메인(domain)이 존재하고 있는데 이러한 메탈로프로테이즈/디스인테그린 단백질이 인테그린의 전구체로서 인식되고 있다. 디스인테그린이 인테그린의 antagonist로 작용하는 생화학적 활성은 디스인테그린을 이용한 다양한 질환들의 치료제로서의 개발 가능성을 매우 높여 주고 있는데, 뱀독 디스인테그린의 혈소판 응집 억제 활성은 혈소판의 세포 표면에 존재하는 인테그린 GP IIb-IIIa (α2bβ3)와 fibrinogen의 결합을 억제하는 항 인테그린 작용에서 기인하며 이를 이용한 질병 치료제 개발이 광범위하게 진행되고 있다. 그리고, 포유류에서도 뱀독 유래 디스인테그린과 유사한 구조와 기능을 가진 단백질들이 존재함이 보고되었으며 ADAM(a disintegrin and metalloprotease)이라 일컫는 이러한 단백질들은 뱀독의 그것과 달리 세포막 통과 부위를 가진 막단백질의 형태를 가지고 있어 세포와 세포, 혹은 세포와 세포간 기질(extracellular matrix) 사이의 상호 작용을 매개하는 것으로 알려져 있다. 지금까지 ADAM 단백질은 약 34 가지가 유전자 클로닝을 통해 보고되었으며 생리적 기능이 비교적 명확히 밝혀진 것으로는 정자와 난자 사이의 수정을 매개하는 feritin α/β, TNF-α의 분비를 도와주는 TACE(TNF alpha converting enzyme)등이 있다. ADAM 단백질 역시 천식, 관절염, 치매, 동맥 경화, 암 등의 여러 가지 질환들과 관련이 있다는 연구 결과들이 발표되고 있다(Duffy, M. J., et al. 2003, Thromb. Haemost. 89, 622-631).

본 발명의 목적은 αvβ3 인테그린과 결합하는 기존의 디스인테그린들에 의해 유발될 수 있는 부작용은 현저히 감소시키며 혈전형성을 효과적으로 저해하는 혈전증 치료제를 제공하는 것이다.

상기의 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 유효량의 재조합 단백질을 활성성분으로 포함하는 혈전증 치료제를 제공한다.

본 발명의 재조합 단백질은 서열목록2에 기재된 단백질인 것이 바람직하다.

또 본 발명은 상기의 재조합 단백질을 코딩하는 서열목록3에 기재된 DNA를 제공한다.

또한 본 발명은 상기 서열목록 3의 DNA를 포함하는 발현벡터 pPhD-15K를 제공한다.

본 발명에서 혈전증 치료에 유용한 본 발명의 단백질의 유효량은 0.1-0.5 mg/kg 체중인 것이 바람직하다.

이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.

재조합 hD15K 단백질을 제조하는 방법은 전기 형질전환체를 배양하고, 이로부터 재조합 hD15K 단백질을 수득하는 공정을 포함한다: 이때, 형질전환체를 배양하는 방법은 형질전환체를 최소 글리세롤 배지에 접종하여 O.D600 1.0이 될 때까지 배양하고, 원심분리하여 배양액을 제거한 세포를 수득한 다음, 메탄올이 함유된 최소 메탄올 배지에 전기 세포를 현탁한 후, 유가식으로 배양하는 것이다. 사용되는 최소 글리세롤 배지는 질소원으로서 효모추출물 또는 펩톤 등을 0.5 내지 1.5%정도 포함하고, 탄소원으로서 글리세롤, 덱스트로스 또는 글루코스 등을 0.5 내지 2.5%정도 포함하며, 그 외 극미량의 바이오틴 등을 포함하는 pH 5.0 내지 7.0, 바람직하게는 pH 5.5 내지 6.5, 가장 바람직하게는 pH 6.0의 배지이고, 최소 메탄올 배지는 최소 글리세롤 배지에 탄소원으로서 배지에 대하여 0.1 내지 1.0%(v/v), 바람직하게는 0.3 내지 0.8%(v/v), 가장 바람직하게는 0.5%(v/v)의 메탄올을 함유한 배지이다. 또한, 배양 조건은 20 내지 40℃, 바람직하게는 25 내지 35℃, 가장 바람직하게는 30℃에서 12 내지 24시간, 바람직하게는 16 내지 20시간, 가장 바람직하게는 18시간동안 배양한다.

한편, 재조합 hD15K를 수득하는 공정은 전기 형질전환체를 배양한 배양액을 소수성컬럼과 고성능액체 크로마토그래피(HPLC)에 적용하여 재조합 hD15K를 순수분리하는 것이다. 사용되는 소수성컬럼에 충진되는 레진으로는 페닐-세파로스를 사용함이 바람직한데, 사용되는 이동상으로는 0.5 내지 2M 암모늄 설페이트 용액을 사용함이 바람직하다. 또한, HPLC컬럼으로는 소스 30 컬럼(source 30 RPC column)을 사용함이 바람직하고, 이동상으로는 TFA가 포함된 아세토니트릴을 사용함이 바 람직하다.

이하, 비한정적인 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다.

실시예 1: ADAM15를 암호화하는 유전자 서열분석

ADAM15를 코딩하는 cDNA를 얻기 위하여, 인간의 제대정맥 내피세포(HUVEC: human umbilical vein endothelial cell)로부터 total RNA를 뽑은 후 Oligo-dT 프라이머와 역전사효소를 이용하여 cDNA를 작제하였다. 다음으로, ADAM15의 디스인테그린 도메인 N-말단 및 C-말단 아미노산 서열을 코딩하는 cDNA 서열을 바탕으로 제조한 5'-프라이머로서, 센스 프라이머 1: 5'-gagccgggcgagcagtgtgactgtg-3'(서열목록 4; Glu⁴³⁰-Cys⁴³⁷) 및 안티센스 프라이머 2: 5'-ccctaggctgacatcagggggacac-3'(서열목록 5; Cys⁵⁰⁰-Gly⁵⁰⁷)를 이용하여, HUVEC cDNA를 주형으로 하는 중합효소연쇄반응(PCR)을 수행한 결과, 234bp에 해당하는 ADAM15의 디스인테그린 도메인 유전자 산물을 수득하였다. PCR을 수행하여 얻은 절편을 아가로오스 젤로 분리정제하고, pGEM-T(Promega, U.S.A.) 벡터로 서브클로닝하여 디스인테그린 도메인의 cDNA를 포함하는 플라스미드를 수득하였으며, 이를 이용하여 cDNA의 유전자 서열을 분석하고, 분석된 DNA서열로부터 ADAM15의 디스인테그린 도메인 아미노산 서열을 유추하였다(도1 및 서열목록 1참조 ).

실시예 2: 디스인테그린 도메인 유전자 발현벡터의 제조

ADAM15 디스인테그린 발현벡터를 클로닝하기 위하여 실시예 1에서 획득한 디스인테그린 유전자 234bp절편에 제한효소(XhoI) 염기서열과 단백질 분해효소인 KEX2로 절단 될 수 있는 아미노산 서열을 암호화하는 염기서열을 포함하는 N-말단 프라이머인 5-CCGCTCGAGAAAAGAgagccgggcgagcagtgt-3(서열목록 6; Glu⁴³⁰-Cys⁴³⁵), 두 개의 번역 종결 코돈(stop codon)과 BamHI 제한 효소 부위를 포함하는 C-말단 프라이머인 5-CGGAATTCTCATTAccctaggctgacatcag3(서열목록 7; Asp⁵⁰³-Gly⁵⁰⁷) 및 주형으로서 실시예 4에서 수득한 디스인테그린 도메인 cDNA를 갖는 플라스미드를 사용하고, 로보싸이클러(RobocyclerTM, Stratagen USA)를 사용하여 중합 효소 연쇄반응(PCR: polymerase chain reaction)을 실시하였다. PCR반응은 열변성(denaturation) 94 ℃ 1분, 주형과 프라이머 결합(annealing) 61℃ 1분 및 프라이머 연장반응(polymerization) 72℃ 1분을 1주기(cycle)로하여 30주기를 실시하였다. 이 반응으로부터 증폭된 약 263bp의 DNA절편을 PCR 산물 전용 클로닝 플라스미드인 pGEM-Teasy(3.015kbp, Promega. USA)에 T4 DNA 연결효소(Ligase)와 반응시켜 재조합 플라스미드를 작제하고, 이를 대장균 XL1Blue에 도입하여 형질전환체를 작제하였다. 작제된 형질전환체를 앰피실린100㎍/㎖가 첨가된 루리아 보타니(LB: Luria Botani)평판 배지에서 배양하여, 흰색 콜로니를 형성하는 형질전환 대장균 균주를 선별한 다음, 이로부터 플라스미드(pGEMhD-15)를 추출하여 이를 제한효소 지도분석과 DNA 염기서열 분석(Genotech. 대전, 한국)을 실시한 결과, PCR반응으로 증폭된 263bp의 절편이 디스인테그린 도메인의 cDNA 임을 확인하였다. 전기 추출 된 pGEMhD-15 플라스미드를 XhoI과 BamHI으로 절단하여 수득한 DNA절편을 발현벡터 pPIC9(8.0kbp)의 α-factor 분비신호단백질 C-말단부위에 삽입하여 디스인테그린 도메인의 발현벡터 pPhD-15(가명:pPIC human Disintegrin 15: 8.3kbp)를 작제하였다(참조: 도 2).

실시예 3: 디스인테그린 hD-15 단백질 생산균주의 조성 및 발현

실시예2에서 작제된 pPhD-15를 SalI으로 절단하여 선형의 DNA를 수득한 다음, 전기 선형의 DNA를 0.5㎍/㎕농도로 함유하는 TE 완충용액에 Pichia pastoris(GS115 균주, Invitrogen) 컴피턴트 세포(competent cell) 80㎕를 혼합하고, 엘렉트로포레이터(Electroporator, Bio-Rad Gene Pulser, U.S.A.)를 사용하여 1.5 KV의 전압조건 하에 형질전환을 수행하였다. 이어, 형질전환된 균주를 히스티딘 결손 아가로스 평판 배지에 도말하고, 30℃에서 3일간 배양하였다. 배양 후, 배지에서 성장한 콜로니를 선별하여 최소 글리세롤 배지(100mM Sodium Phosphate pH 6.0, Yeast Nitrogen Base 1.34%, biotin 4 x 10-5%, glycerol 1%) 1L에 접종한 다음, 30℃에서 세포농도가 O.D600 1.0이 될 때 까지 배양하고, 배양물을 3,000 xg 에서 원심 분리하여 배지가 제거된 세포만을 수득하며, 수득한 세포를 최소 메탄올 배지(100mM Sodium Phosphate pH 6.0, Yeast Nitrogen Base 1.34%, biotin 4 x 10-5%, methanol 0.5%)에 현탁시키고, 30℃에서 배양하여, 재조합 인간 유래 디스인테그린 hD-15의 발현을 유도하였다. 이어, 24시간 간격으로 메탄올을 0.5%의 농도로 첨가하며 96시간 동안 배양한 결과, 배지내에 hD-15 단백질이 축적됨을 확인하였다.

전기 배양물을 5000 xg 에서 원심 분리하여 배양액을 수득하고, 이를 1.5M 암노늄 설페이트 용액으로 평형화시킨 페닐-세파로스(Phenyl-sepharose, Bio-Rad, U.S.A.)가 충진된 컬럼(1.3 x 20cm)에 주입한 다음, 1M 암노늄 설페이트 용액을 20ml/hour의 유속으로 용출시켜 hD-15 활성분획을 수득하였다. 이때, hD-15 단백질의 활성은 혈소판이 풍부한 인간 혈장(혈장 1L당 3 x 105개의 혈소판 존재) 225㎕와 PBS에 용해된 혈소판 응집억제 펩타이드 용액(0.1g/ml) 25㎕를 혼합하여 5분간 25℃의 조건으로 어그리고미터(Aggregometer, Chromo-Log, U.S.A.)에서 반응시킨 다음, 응집제인 ADP를 첨가하고 혼탁도를 측정하는 인간 혈소판의 응집분석법을 실시하였다. 이어, 수득한 활성분획을 0.1%(v/v) TFA를 포함하는 증류수로 평형화시킨 HPLC 컬럼(source 30 RPC column, 7.8 x 300mm)에 주입시키고, 0.1%(v/v) TFA를 포함하는 아세토니트릴로 0 내지 50%까지 선형구배(linear gradient)를 걸어 단백질을 용출시켜서, 순수분리된 hD-15를 수득하였다. 이때, 제조수율은 배양액 1L당 107mg임을 알 수 있었다.

실시예 4: 디스인테그린 도메인 KGD 치환 유전자 발현벡터의 작제 및 재조합 단백질 생산

실시예(2)에서 클로닝한 hD-15 인간 디스린테그린 도메인의 RGD(알기닌, 글 리신, 세린)아미노산 motif의 알기닌을 라이신 아미노산으로 바꾼 치환체를 만들고자, KGD를 암호화하는 염기서열을 포함하는 센스 프라이머인 5-g tcg tcc tac caa agg gga ttg tga-3 (서열목록 8; Arg⁴⁸¹-Asp⁴⁸⁸)와 그의 상보적인 안티센스 프라이머인 5-tca caa tcc cct ttg gta gga cga c-3(서열목록 9)를 이용하여 실시예 (1)에서 수득한 디스인테그린 도메인 cDNA를 갖는 pGEMhD-15 플라스미드를 주형으로 pfu DNA 중합 효소를 사용하여 중합 효소 연쇄반응(PCR: polymerase chain reaction)을 실시하였다. PCR반응은 열변성(denaturation) 94℃ 1분, 주형과 프라이머 결합(annealing) 58℃ 1분 및 프라이머 연장반응(polymerization) 72℃ 3분을 1주기(cycle)로하여 30주기를 실시하였다. 이반응으로부터 증폭된 약 3.278kbp의 플라스미드 DNA를 0.8% 아가로스 전기영동을 통해 PCR 증폭 성공 여부를 확인한 후 이를 대장균 XL1Blue에 도입하여 형질전환체를 작제하였다. 작제된 형질전환체를 앰피실린100㎍/㎖가 첨가된 루리아 보타니(LB: Luria Botani)평판 배지에서 배양하여, 흰색 콜로니를 형성하는 형질전환 대장균 균주를 선별한 다음, 이로부터 플라스미드를 추출하여 이를 제한효소 지도분석과 DNA 염기서열 분석(Genotech. 대전, 한국)을 실시한 결과, PCR반응으로 증폭된 3.278kbp 의 플라스미드 DNA의 디스인테그린 도메인 내의 RGD 암호화 서열이 KGD암호화 서열로 치환 된 것을 확인하였다. 이 치환체 역시 전기 작제된 발현용 벡터인 pPhD-15와같이 XhoI과 BamHI으로 절단하여 수득한 DNA절편을 발현벡터 pPIC9(8.0kbp)의 α-factor 분비신호단백질 C-말단부위에 삽입하여 KGD 치환 디스인테그린 발현벡터 pPhD-15K(가명:pPIC human Disintegrin 15 K : 8.3kbp)를 작제하였다(참조: 도 2). 이렇게 작제된 pPhD-15K 발현벡터를 실시예2와 동일한 방법으로 Pichia 발현 균주를 조성하고 세포배양을 통해 천연형 hD-15 디스인테그린 단백질의 생산 및 정제하였다. 또한 정제 수율은 hD-15와 hD-15K 단백질간에 차이가 없음을 확인하였다.

실시예 5: 재조합 디스인테그린 단백질과 공지의 혈소판 응집억제 펩타이드와의 활성 비교

재조합 디스인테그린 단백질 hD-15(RGD)와 hD-15K(KGD) 및 공지의 혈소판 응집억제 펩타이드인 살모신(salmosin) 또는 GRGDSP 펩타이드와의 활성을 비교하기 위하여, 혈소판이 풍부한 인간 혈장(혈장 1L당 3 x 105개의 혈소판 존재) 225㎕와 PBS에 용해된 혈소판 응집억제 펩타이드 용액(0.1g/ml) 25㎕를 혼합하여 5분간 25℃의 조건으로 어그리고미터(Aggregometer, Chromo-Log, U.S.A.)에서 반응시킨 다음, 응집제인 ADP를 첨가하고 혼탁도를 측정하는 인간 혈소판의 응집분석법을 실시하였다(참조: 표1). 표1 에서 보듯이 재조합인간 유래 천연형 hD-15(RGD)는 IC50 값이 약270nM 인데 비하여 hD-15K(KGD) 단백질의 IC50 값이 약 179nM로 확인되었는 바, 이는 KGD 치환체인 hD-15K가 삭사틸린의 IC50 값인 173nM와 거의 비슷한 활성을 가지는 것으로 평가되었으며, GRGDSP 펩타이드보다는 약 1,000배 이상 우수한 활성이었다.

[표 1]

혈소판 응집저해 평가법의 IC₅₀

검색시료	IC₅₀(nM)
삭사틸린	173
hD-15 (RGD)	270
hD-15K (KGD)	179
GRGDSP	270 x 10³

실시예 6: 재조합 KGD 단백질이 GPIIb-IIIa 인테그린과 파이브리노젠의 결합에 미치는 영향

96-웰 플레이트를 인산염완충용액(PBS)에 용해시킨 파이브리노젠(0.5㎍/웰)으로 4℃에서 16시간 동안 코팅하였다. 전기 플레이트를 세척한 다음, 플레이트 상의 남겨진 단백질 결합부위를 봉쇄시키기 위하여, 10mg/ml의 열변성된 우혈청알부민(BSA)을 처리하여 1시간 동안 배양하고, 플레이트를 사용하기 전에 PBS로 세척하였다. GPIIb-IIIa 인테그린과 재조합 KGD 단백질 또는 GPIIb-IIIa 인테그린 결합 단백질을 섞은 후 파이브리노젠이 코팅된 플레이트에 넣어주고 37℃에서 2시간 동안 반응시켰다. 플레이트의 각 웰을 세척한 후 GPIIb-IIIa 인테그린에 대한 항체 (1차 항체)를 넣어주고 37℃에서 2시간동안 반응시켰다. 다시 플레이트의 각 웰을 세척한 후 1차 항체에 결합하는 퍼옥시데이즈가 결합되어 있는 2차 항체를 넣어주고 37℃에서 1시간동안 반응시키고 퍼옥시데이즈에 반응하여 색이 변하는 기질을 각 웰에 첨가하여 색의 변화에 따른 흡광도를 측정해 단백질이 GPIIb-IIIa 인테그 린과 파이브리노젠의 결합에 미치는 영향을 측정하였다.

[표 2]

GPIIb-IIIa 인테그린과 파이브리노젠간의 결합에 대한 IC₅₀

검색시료	IC₅₀(nM)
삭사틸린	2.0
hD-15K (KGD)	2.2
GRGDSP	4.2 x 10³

표 2 에서 보듯이 재조합 KGD 단백질의 IC50 값이 약 2.2nM로 확인되었는 바, 이는 삭사틸린의 IC50 값인 2.0nM과 비교할 때, 거의 비슷한 활성을 가지는 것으로 평가되었으며, GRGDSP 펩타이드보다는 약 1,000배 이상 우수한 활성이었다.

실시예 7: 재조합 KGD 단백질이 αvβ3 인테그린과 비트로넥틴 의 결합에 미치는 영향

96-웰 플레이트를 인산염완충용액(PBS)에 용해시킨 비트로넥틴(0.5㎍/웰)으로 4℃에서 16시간 동안 코팅하였다. 전기 플레이트를 세척한 다음, 플레이트 상의 남겨진 단백질 결합부위를 봉쇄시키기 위하여, 10mg/ml의 열변성된 우혈청알부민(BSA)을 처리하여 1시간 동안 배양하고, 플레이트를 사용하기 전에 PBS로 세척하였다. αvβ3 인테그린과 재조합 KGD 단백질 또는 αvβ3 인테그린 결합 단백질을 섞은 후 비트로넥틴이 코팅된 플레이트에 넣어주고 37℃에서 2시간 동안 반응시켰 다. 플레이트의 각 웰을 세척한 후 αvβ3 인테그린에 대한 항체 (1차 항체)를 넣어주고 37℃에서 2시간동안 반응시켰다. 다시 플레이트의 각 웰을 세척한 후 1차 항체에 결합하는 퍼옥시데이즈가 결합되어 있는 2차 항체를 넣어주고 37℃에서 1시간동안 반응시키고 퍼옥시데이즈에 반응하여 색이 변하는 기질을 각 웰에 첨가하여 색의 변화에 따른 흡광도를 측정해 단백질이 αvβ3 인테그린과 비트로넥틴 의 결합에 미치는 영향을 측정하였다.

[표 3]

αvβ3 인테그린과 비트로넥틴간의 결합에 대한 IC₅₀

검색시료	IC₅₀(nM)
삭사틸린	180
hD-15 (RGD)	182
hD-15K (KGD)	> 2.0 x 10⁴
GRGDSP	3.1 x 10⁵

표 3에서 알 수 있듯이 삭사틸린 같이 RGD 서열을 가지고 있는 단백질은 αvβ3 인테그린과 비트로넥틴의 결합을 방해하지만 RDG를 KGD로 변형시킨 hD-15K (KGD)의 경우에는 αvβ3 인테그린과 비트로넥틴의 결합에 거의 영향을 미치지 못하였다.

실시예 8: 재조합 hD-15K에 의한 항혈전작용

마우스에 콜라겐과 에피네프린(epinephrine)의 혼합용액을 정맥주사할 때, 폐동맥내에 혈전이 형성되고, 이에 의하여 폐동맥이 폐쇄되어 1분 이내에 대부분의 마우스가 마비, 동공확장, 호흡곤란 및 경련의 증상을 보이며, 5분 이내에 70%의 마우스가 사망한다. 따라서, 실시예 6에서 수득한 재조합 hD-15K를 정맥주사하여, 전기 혈전증상을 감소시킬 수 있는지 확인하였다. ICR마우스 꼬리 정맥에 0.1ml PBS만을 주사한 대조군과 hD-15K를 각각 0.1mg/kg, 0.25mg/kg, 0.5mg/kg으로 주사한 후에 10분이 경과한 다음 각각의 마우스 당 120㎍ 콜라겐 + 12㎍ 에피네프린/ 0.1ml PBS를 주사한 다음 마우스의 생존율을 측정하였다. 마우스의 꼬리정맥에kg당 10㎖ PBS만을 주사한 A그룹; 마우스에 KGD 단백질(600㎍/10㎖ PBS/kg)을 꼬리정맥에 주사하고, 콜라겐과 에피네프린 혼합용액(900㎍ 콜라겐 + 90㎍ 에피네프린/10㎖ PBS/kg)을 꼬리정맥에 주사한 B그룹; 마우스에 콜라겐과 에피네프린 혼합용액(900㎍ 콜라겐 + 90㎍ 에피네프린/10㎖ PBS/kg)을 꼬리정맥에 주사하고 30초 경과 후, kg당 10㎖ PBS만을 꼬리정맥에 주사한 C그룹; 및, 마우스에 콜라겐과 에피네프린 혼합용액(900㎍ 콜라겐 + 90㎍ 에피네프린/10㎖ PBS/kg)을 꼬리정맥에 주사하고 30초 경과 후, KGD 단백질(600㎍/10㎖ PBS/kg)을 꼬리정맥에 주사한 D그룹으로 나누어 각각의 생존률을 측정하였다 (참조: 표 3).

[표 4]

재조합 hD-15K에 의한 항 혈전작용

재조합 hD-15K (mg/kg)	0	0.1	0.25	0.5
사망군/시험군	18/20	16/20	11/20	3/20
생존율 (%)	10	20	55	85

상기 표 3에서 보듯이, hD-15K를 처리한 경우, 생존률이 급격히 증가된 결과로 미루어 볼 때, 콜라겐과 에피네프린 혼합용액으로 인한 혈전의 발생을hD-15K이 억제하였다고 추측되며, KGD 단백질을 미리 처리한 경우는 이를 나중에 처리할 때보다 향상된 효과를 나타냄을 알 수 있었다.

실시예 9: 급성독성 시험

본 발명에서 혈전증 치료제로서 사용되는 재조합 hD-15K의 급성독성을 알아보기 위하여, 재조합 hD-15K를 웅성 C57BL/6 마우스에 피하주사하고, 투여후 7일간에 걸쳐 마우스의 사망수를 관찰하여 LD50 값을 결정하였는 바, LD50 값은 약 1100mg/kg이었다. 따라서, 하기에 표시하는 유효량의 범위에서, 본 발명의 재조합 KGD 단백질을 유효성분으로 함유하는 혈전증 치료제는 충분히 안전한 약물임을 알 수 있었다.

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시태양일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

이상에서 상세히 설명하고 입증하였듯이, 본 발명은 인간 유전자인 ADAM15로부터 얻은 디스인테그린 유전자를 돌연변이시킨 후 Pichia pastoris에서 발현시켜 혈소판 표면에 존재하는 GPIIb-IIIa 인테그린에만 특이적으로 결합 혈소판 응집을 저해할 수 있는 재조합 단백질을 생산하는 것을 포함한다. 본 발명에 의하면, hD-15K는 효과적으로 혈전형성을 저해할 수 있고, 혈전형성을 효과적으로 저해할 수 있는 농도범위에서도 세포독성을 나타내지 않는다. 또한 hD-15K는 αvβ3 인테그린과 비트로넥틴간의 상호작용에는 전혀 영향을 미치지 않아 αvβ3 인테그린과 결합하는 기존의 디스인테그린들에 의해 유발될 수 있는 부작용은 현저히 감소시키며 혈전형성을 효과적으로 저해하기 때문에 이 단백질은 혈전증 치료제로 유용하게 사용될 수 있을 것이다.

<110> BioBud Co., Ltd.; CHUNG KWANG HOE <120> Antithrombotics comprising Disintegrin <160> 9 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 78 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Glu Pro Gly Glu Gln Cys Asp Cys Gly Phe Leu Asp Asp Cys Val Asp 1 5 10 15 Pro Cys Cys Asp Ser Leu Thr Cys Gln Leu Arg Pro Gly Ala Gln Cys 20 25 30 Ala Ser Asp Gly Pro Cys Cys Gln Asn Cys Gln Leu Arg Pro Ser Gly 35 40 45 Trp Gln Cys Arg Pro Thr Arg Gly Asp Cys Asp Leu Pro Glu Phe Cys 50 55 60 Pro Gly Asp Ser Ser Gln Cys Pro Pro Asp Val Ser Leu Gly 65 70 75 <210> 2 <211> 78 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mutant disintegrin(KGD-form) amino acid sequence <400> 2 Glu Pro Gly Glu Gln Cys Asp Cys Gly Phe Leu Asp Asp Cys Val Asp 1 5 10 15 Pro Cys Cys Asp Ser Leu Thr Cys Gln Leu Arg Pro Gly Ala Gln Cys 20 25 30 Ala Ser Asp Gly Pro Cys Cys Gln Asn Cys Gln Leu Arg Pro Ser Gly 35 40 45 Trp Gln Cys Arg Pro Thr Lys Gly Asp Cys Asp Leu Pro Glu Phe Cys 50 55 60 Pro Gly Asp Ser Ser Gln Cys Pro Pro Asp Val Ser Leu Gly 65 70 75 <210> 3 <211> 234 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Mutant disintegrin(KGD-form) cDNA sequence <400> 3 gagccgggcg agcagtgtga ctgtggcttc ctggatgact gcgtcgatcc ctgctgtgat 60 tctttgacct gccagctgag gccaggtgca cagtgtgcat ctgacggacc ctgttgtcaa 120 aattgccagc tgcgcccgtc tggctggcag tgtcgtccta ccaaagggga ttgtgacttg 180 cctgaattct gcccaggaga cagctcccag tgtccccctg atgtcagcct aggg 234 <210> 4 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sense primer for ADAM15 disintegrin domain <400> 4 gagccgggcg agcagtgtga ctgtg 25 <210> 5 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense primer for ADAM15 disintegrin domain <400> 5 ccctaggctg acatcagggg gacac 25 <210> 6 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> N-terminal primer for ADAM15 Disintegrin expression vector cloning <400> 6 ccgctcgaga aaagagagcc gggcgagcag tgt 33 <210> 7 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> C-terminal primer for ADAM15 disintegrin expression vector cloning <400> 7 cggaattctc attaccctag gctgacatca g 31 <210> 8 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sense primer containing KGD encoding region <400> 8 gtcgtcctac caaaggggat tgtga 25 <210> 9 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense primer complementary for sense primer(sequence ID No.8) <400> 9 tcacaatccc ctttggtagg acgac 25

Claims

유효량의 서열목록 2에 기재된 단백질을 활성성분으로 포함하는 항혈전제.
삭제
제 1 항의 단백질을 코딩하는 서열목록 3에 기재된 DNA.
제 3 항의 DNA를 포함하는 발현벡터 pPhD-15K.
제 1 항에 있어서,

상기의 유효량은 0.1-0.5 mg/kg 체중인 것을 특징으로 하는 항혈전제.