KR101135648B1 - 소 유래 신규 Hyal 5 유전자 및 이를 이용한 소 정자의 수정능 판별방법 - Google Patents

소 유래 신규 Hyal 5 유전자 및 이를 이용한 소 정자의 수정능 판별방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 정소세포에서 특이적으로 발현하는 소 유래 신규 Hyal 5를 코딩하는 유전자 및 이를 이용한 소 정자의 수정능 판별방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로는, 소 정소세포에서 특이적으로 발현되는 Hyal 5를 코딩하는 신규 유전자 및 상기 Hyal 5에 대한 항체를 이용하여 Hyal 5의 유전자 발현 여부를 확인함으로써 소 정자의 수정능을 판별하는 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따르면, 소 유래 신규 Hyal 5의 유전자는 정소세포에서 특이적으로 발현되는 마커로서 소 정자의 수정 여부를 간단하게 검사하는데 유용하다.
Hyal 5, 정자, 수정능, 재조합 단백질

Description

소 유래 신규 Hyal 5 유전자 및 이를 이용한 소 정자의 수정능 판별방법{Gene Enconding Hyal 5 Isolated from Bovine and Method for Discriminating Fertility of Bovine Sperm Using Thereof}
본 발명은 정소세포에서 특이적으로 발현하는 소 유래 신규 Hyal 5 (Hyaluronidase 5) 유전자 및 이를 이용한 소 정자의 수정능 판별방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 소 정소에서 발현되는 Hyal 5를 코딩하는 신규 유전자 및 상기 Hyal 5에 대한 항체를 이용하여 Hyal 5 유전자(hyal 5)의 발현 여부를 확인함으로써 소 정자의 수정능 판별하는 방법에 관한 것이다.
수란관으로 배란된 난자는 큐물러스 세포군(cumulus cells)에 의하여 둘러 싸여져 있다. 마우스에서는 약 3000개의 큐물러스 세포들이 하나의 난자를 싸고 있는데 이러한 세포들은 배란 직전에 hyaluronic acide(HA)를 분비한다. HA는 glucoronurate와 N-acetyl glucosamine으로 구성된 이당(disaccharide)이 250-25000개로 연결된 구조이다. 이러한 HA의 분비와 함께 큐물러스 세포들 사이는 공간이 형성되어 확장된다. 수정이 일어나기 위해서 정자는 HA와 함께 난자를 둘러싸 고 있는 큐물러스 세포사이를 통과하여야 하는데, 정자는 세포간 물질인 hyaluronic acide와 결합조직간의 glucosaminic bond를 가수분해하여 용해시킴으로써 조직간 장벽을 없애주는 작용을 하는 것으로 알려진 Hyaluronidase를 방출하여 HA와 함께 싸여져있는 큐물러스 세포사이를 통과하게 된다. 상기 내용과 같이 Hyaluronidase는 정자의 수정능에 있어서 중요한 인자로 작용하게 된다.
Hyaluronidase는 PH-20가 대표적으로 알려져 있으며 생쥐, 원숭이, 사람을 포함하는 다양한 종의 정자에서 발현된다고 알려져 있다. PH-20는 큐물러스 세포가 세포군 구조를 이루지 못하고 분산되게 하는 작용을 하며 HA 분해 효소활성도를 나타냄으로써 수정능에 직접적으로 영향을 미치는 것으로 알려졌다(Lin Y, et.al., J Cell Biol., 125; 1157-1163, 1994).
그러나 PH-20이 큐물러스 세포군을 분해하는 것에 필수가 아닌 것임이 밝혀졌으며 PH-20 이외의 다른 Hyaluronidase가 존재하여 수정능에 관여한다는 것이 본 연구자들에 의하여 밝혀졌다(Kim E, et. al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 102(50); 18028-18033, 2005). 밝혀진 새로운 Hyaluronidase는 Hyal 5로써 생식세포에서만 발현되는 막 단백질로서, Hyaluronidase domain과 투명대 결합도메인 및 GPI anker domain 으로 구성되어 있으며, 분자량은 약 60 kDa으로 알려졌다.
이러한 수정능에 관여하는 정자 특이적 마커들은 동물의 인공 수정시 사용되며, 돼지나 소의 번식 성적 향상, 경영비용 절감, 노동력 감소, 질병전파 방지의 목적을 가지며 개량의 촉진을 위한 수단으로써 활용되고 있다. 하지만 이러한 정자 특이적 마커들은 현재까지 Izumo, ADAM2, PH-20이 알려져 있으나 대부분 마우스 정 자의 특성을 연구하는데 사용되고 있다. 반면에 소과 동물에서는 수정능을 확인할 수 있는 소 정자에 있어서는 그 특성을 판별하기 위한 특별한 마커 단백질 및 그에 대한 항체가 확인되지 않고 있으며, 때문에 소 정자의 특성을 파악하는데 어려움이 있다.
이에, 본 발명자들은 상기 문제점을 해결하기 위하여 예의 노력한 결과, 소의 정소에서 발현되는 Hyal 5의 신규 유전자 및 이에 대한 항체를 이용하여 Hyal 5의 발현 여부를 확인함으로써, 정자 수정 능력을 판별할 수 있다는 것을 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명의 주된 목적은 소 유래 Hyal 5 및 이를 코딩하는 유전자(hyal 5)를 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 유전자를 함유하는 재조합 벡터 및 상기 유전자 또는 재조합 벡터로 재조합 미생물을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 유전자의 발현 여부를 확인하는 것을 특징으로 하는 소 정자의 수정능 판별방법을 제공하는 데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 소 유래 Hyal 5, 이를 코딩하는 유전자(hyal 5), 상기 유전자를 함유하는 재조합 벡터 및 상기 유전자 또는 재조합 벡터로 형질전환된 재조합 미생물을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 Hyal 5에 특이적으로 결합하는 항체 및 그 제조방법을 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 항체의 제조방법은 (a) 상기 재조합 미생물을 배양하여 Hyal 5 를 발현시킨 다음, 정제하는 단계; 및 (b) 상기 정제된 Hyal 5를 동물(단, 인간은 제외)에 주사하여 면역반응을 유도하는 단계 ; 및 (c) 상기 면역반응이 유도된 동물의 혈청으로부터 Hyal 5에 대한 항체를 분리하는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명은 또한, 소 정소에서 상기 유전자의 발현 여부를 확인하는 것을 특징으로 하는 소 정자의 수정능 판별 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 정소세포에서 특이적으로 발현하는 소 유래 신규 Hyal 5 유전자 및 여기에 특이적으로 결합하는 항체를 이용하여 소 정자의 수정능을 효과적으로 판별할 수 있다.
일 관점에서, 본 발명은 서열번호 1의 유전자의 아미노산 서열로 표시되는 Hyal 5 및 이를 코딩하는 유전자(Hyal 5)에 관한 것이다.
Hyaluronidase는 정자에서 발현된다고 알려져 있으며 세포간 물질을 용해 시킴으로써 수정을 용이하게 한다고 알려져 있다. 상기 Hyal 5는 hyaluronic acide와 결합조직간의 glucosaminic bond를 가수분해하여 용해시키는 Hyaluronidase의 하나로서, 마우스의 정자에서 수정능에 영향을 미치는 요인으로 알려져 있으나 소과 동물에서의 연구는 아직 이루어지지 않고 있었다.
본 발명에서는 소의 정소 조직으로부터 전체 RNA를 추출하여 cDNA를 합성한 후, Hyal 5 cDNA를 분리하였고, 상기 cDNA를 벡터에 클로닝하여 Hyal 5 유전자의 서열을 확인하였다. 상기 클로닝된 소 Hyal 5 유전자를 바탕으로 Hyal 5 유전자에 특이적인 프라이머를 제작한 후, PCR을 수행하여 Hyal 5 유전자를 클로닝한 결과, 소에서 유래된 신규 Hyal 5 유전자를 얻었다.
본 발명에 있어서, 상기 hyal 5는 서열번호 1의 아미노산으로 표시된다. 하지만 Hyal 5의 활성을 갖는 범위에서, 일부 아미노산이 변이된 유사 아미노산 서열, 다시 말해, 상기 아미노산 서열과 70%, 바람직하게는 80%, 90%, 또는 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 실질적으로 동일한 아미노산 서열 또는 그 단편으로 본 발명에 포함될 수 있다.
코돈의 축퇴성으로 인해서 또는 상기 Hyal 5를 코딩하는 유전자를 발현시키고자하는 생물에서 선호되는 코돈을 고려하여, 본 발명의 유전자는 코딩영역으로부터 발현되는 Hyal 5의 기능이 변화되지 않는 범위 내에서 코딩영역의 다양한 변형이 이루어질 수 있고 코딩영역을 제외한 부분에서 유전자의 발현에 미치지 않는 범위 내에서 다양한 변형 또는 수식이 이루어질 수 있으며, 그러한 변형 유전자 역시 본 발명의 범위에 포함된다.
따라서, 상기 유전자는 서열번호 2의 유전자와 실질적으로 동일한 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드 및 유전자의 단편을 포함한다. 여기서 실질적으로 동일한 폴리뉴클레오테드란, 80%, 90%, 또는 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 실질적으로 동일한 아미노산 서열 또는 그 단편으로 본 발명에 포함될 수 있다.
다른 관점에서, 본 발명은 상기 Hyal 5를 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터에 관한 것이다.
본 발명에서, "벡터(vector)"는 적합한 숙주 내에서 DNA를 발현시킬 수 있는 적합한 조절 서열에 작동가능하게 연결된 DNA 서열을 함유하는 DNA 제조물을 의미한다. 벡터는 플라스미드, 파지 입자 또는 간단하게 잠재적 게놈 삽입물일 수 있다. 적당한 숙주로 형질 전환되면, 벡터는 숙주 게놈과 무관하게 복제하고 기능할 수 있거나, 또는 일부 경우에 게놈 그 자체에 통합될 수 있다. 플라스미드가 현재 벡터의 가장 통상적으로 사용되는 형태이므로, 본 발명의 명세서에서 "플라스미드(plasmid)" 및 "벡터(vector)"는 때로 상호 교환적으로 사용된다. 본 발명의 목적상, 플라스미드 벡터를 이용하는 게 바람직하다. 이러한 목적에 사용될 수 있는 전형적인 플라스미드 벡터는 (a) 숙주 세포당 수백 개의 플라스미드 벡터를 포함하도록 복제가 효율적으로 이루어지도록 하는 복제 개시점, (b) 플라스미드 벡터로 형질전환된 숙주세포가 선발될 수 있도록 하는 항생제 내성 유전자 및 (c) 외래 DNA 절편이 삽입될 수 있는 제한효소 절단부위를 포함하는 구조를 지니고 있다. 적절한 제한효소 절단부위가 존재하지 않을지라도, 통상의 방법에 따른 합성 올리고뉴클레오타이드 어댑터(oligonucleotide adaptor) 또는 링커(linker)를 사용하면 벡터와 외래 DNA를 용이하게 라이게이션(ligation)할 수 있다.
라이게이션 후에, 벡터는 적절한 숙주세포로 형질전환되어야 한다. 형질전환은 Sambrook, et. al., supra의 1.82 섹션에 기술된 칼슘 클로라이드 방법을 사용해서 용이하게 달성될 수 있다. 선택적으로, 전기천공법(electroporation)(Neumann, et. al., EMB., 1; 841, 1982) 또한 이러한 세포들의 형질전환에 사용될 수 있다.
아울러, 상기 유전자는 다른 핵산 서열과 기능적 관계로 배치될 때 "작동가 능하게 연결(operably linked)" 된다. 이것은 적절한 분자(예를 들면, 전사 활성화 단백질)가 조절 서열(들)에 결합될 때 유전자 발현을 가능하게 하는 방식으로 연결된 유전자 및 조절 서열(들) 일 수 있다. 예를 들면, 전서열(pre-sequence) 또는 분비리더(leader)에 대한 DNA는 폴리펩타이드의 분비에 참여하는 전단백질로서 발현되는 경우 폴리펩타이드에 대한 DNA에 작동가능하게 연결되고; 프로모터 또는 인핸서는 서열의 전사에 영향을 끼치는 경우 코딩서열에 작동가능하게 연결되거나; 또는 리보좀 결합 부위는 서열의 전사에 영향을 끼치는 경우 코딩 서열에 작동가능하게 연결되거나; 또는 리보좀 결합 부위는 번역을 용이하게 하도록 배치되는 경우 코딩 서열에 작동가능하게 연결된다. 일반적으로 "작동가능하게 연결된"은 연결된 DNA 서열이 접촉하고, 또한 분비 리더의 경우 접촉하고 리딩 프레임 내에 존재하는 것을 의미한다. 그러나, 인핸서(enhancer)는 접촉할 필요가 없다. 이들 서열의 연결은 편리한 제한 효소 부위에서 라이게이션 (연결)에 의해 수행된다. 그러한 부위가 존재하지 않는 경우, 통상의 방법에 따른 합성 올리고뉴클레오티드 어댑터(oligonucleotide adaptor) 또는 링커(linker)를 사용한다.
또 다른 관점에서, 본 발명은 상기 유전자 또는 재조합 벡터가 삽입된, 다시말해, 상기 Hyal 5를 코딩하는 유전자가 염색체 상에 삽입되거나, 상기 재조합 벡터로 형질전환된 재조합 미생물에 관한 것이다.
상기 형질전환된 재조합 미생물은, DNA의 도입효율이 높고, 도입된 DNA의 발현 효율이 높은 숙주세포가 통상 사용되며, 원핵 및 진핵 세포를 포함하는 모든 미생물로서, 박테리아, 효모, 곰팡이 등이 이용가능하고, 본 발명의 실시예에서는 E. coli를 사용하였으나, 이에 한정되지 않고, 상기 Hyal 5가 충분히 발현될 수 있는 것이라면 어떠한 종류의 미생물이라도 무방하다. 예컨대 박테리아, 곰팡이 및 효모로 구성된 군에서 선택되는 미생물을 사용할 수 있다.
상기 형질전환된 재조합 미생물은 임의의 형질전환 방법에 따라 제조할 수 있다. 본 발명의 "형질전환(transformation)"은 DNA를 숙주로 도입하여 DNA가 염색체의 인자로서 또는 염색체 통합완성에 의해 복제 가능하게 되는 것으로 외부의 DNA를 세포 내로 도입하여 인위적으로 유전적인 변화를 일으키는 현상을 의미한다. 일반적으로 형질전환방법에는 전기천공법(electroporaton), 인산칼슘(CaPO4) 침전, 염화칼슘(CaCl2)침전, 미세주입법(microinjection), 초산 리튬-DMSO법 등이 있다.
또 다른 관점에서, 본 발명은 소 유래 Hyal 5에 대한 항체 및 이의 제조 방법에 관한 것이다.
본 발명에서, “항체”란 항원성 부위에 대해서 지시되는 특이적인 단백질 분자를 의미한다. 본 발명의 목적상, 항체는 소 유래 Hyal 5 대해 특이적으로 결합하는 항체를 의미하며, 다클론 항체, 단클론 항체 및 재조합 항체를 모두 포함한다.
상기한 바와 같이 소 유래 Hyal 5이 규명되었으므로, 이를 이용하여 항체를 생성하는 것은 당업계에 널리 공지된 기술을 이용하여 용이하게 제조할 수 있다.
다클론 항체는 상기한 소 유래 Hyal 5을 동물에 주사하고 동물로부터 채혈하여 항체를 포함하는 혈청을 수득하는 당업계에 널리 공지된 방법에 의해 생산할 수 있 다. 이러한 다클론 항체는 염소, 토끼, 양, 원숭이, 말, 돼지, 소 개 등의 임의의 동물 종 숙주로부터 제조 가능하다. 본 발명의 실시예에서는 토끼를 사용하였으나, 이에 한정되지 않고, 상기 Hyal 5의 항체가 형성되는 어떠한 종류의 동물이라도 무방하다. 예컨대 염소, 양, 원숭이, 말, 돼지, 개, 마우스로 구성된 군에서 선택되는 동물을 사용 할 수 있다.
또 다른 관점에서, 본 발명은 상기 Hyal 5에 결합하는 항체를 이용한 소 정자의 수정능 판별방법에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 소 정소세포에서 Hyal 5 유전자의 발현 여부를 확인하여 기 위하여 소 정자를 채취하고 단백질을 추출하여 전기영동한 후, 상기에서 제조된 소 유래 Hyal 5에 대한 항체를 이용하여 Hyal 5의 발현 여부를 확인함으로써 소의 수정능을 확인할 수 있다. 본 발명의 실시예에서는 유전자 발현을 확인하기 위해서 상기와 같이 면역 블롯법(Immunoblot)을 사용하였으나, 이것에 한정되지 않고, 면역조직화학법(Immunohistology), 효소면역측정법(ELISA) 등의 일반적으로 사용되고 있는 유전자 확인 방법을 사용할 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1: 소 Hyal 5 유전자의 클로닝
소 Hyal 5 cDNA를 제조하기 위하여, 소의 정소 조직을 적출하여 각 조직의 10배 부피로 이소젠(isogen, Nippongene)을 넣고, 초음파 파쇄기를 이용하여 조직을 분쇄한 후, 이소프로파놀(isopropanol)을 이용하여 분리된 상층액으로부터 전체 RNA를 추출하였다.
상기에서 수득된 전체 RNA 5㎍/㎕ 농도를 취해서 Superscript III RT kit(Invitrogen, USA) 시약을 이용하여 cDNA를 제작하였다. 즉, 50 ℃에서 1시간 동안 역전사효소에 의해 제1 가닥 cDNA를 합성한 후, 80 ℃에서 5분 동안 반응시킨 다음, RNaseH 효소를 처리하여 37 ℃에서 20분 동안 배양하여 최종적으로 cDNA를 수득하였다.
상기 획득한 cDNA를 0.8% 아가로오스겔 전기영동으로 확인한 후, 2.0 kb 부근의 밴드들을 잘라서 DNA만을 순수분리하여, pGEM T-벡터(Promega)에 클로닝한 다음, 염기서열을 결정하였다.
그 결과, 상기 방법에서 확인한 소 유래의 신규 Hyal 5 유전자는 서열번호 1의 아미노산 서열을 가지는 것으로 확인되었다.
상기에서 클로닝한 소 hyal 5의 서열을 바탕으로 소 Hyal 5 유전자에 특이적인 프라이머를 제작(서열번호 3, 4)하여 AdvatageTM cDNA PCR Kit & Polymerase Mix(Clontech)를 이용하여 PCR를 수행하고, 상기 PCR 산물을 0.8% 아가로오스 겔에 전기영동한 후, 밴드를 잘라내어 pBS 벡터(Stratagene)에 클로닝하였다.
그 결과, 본 발명에 따른 소 hyal 5는 마우스 hyal 5와 59.6%의 상동성을 가지고 있는 것으로 확인되었다.
hyal 5 센스 프라이머 (서열번호 3) :
5'- atgcctcgctggggccgcgactgccccctt -3'
hyal 5 안티센스 프라이머 (서열번호 4):
5'- taatcactgaatttatattttaatag -3'
실시예 2: 정소에서의 hyal 5의 발현
상기에서 합성된 cDNA를 주형으로 사용하여 서열번호 5-10에 명시한 프라이머를 사용하여 94 ℃ 60 초, 60 ℃ 60 초, 72 ℃ 90 초를 35번 반복하는 조건으로 RT-PCR을 수행하고, 반응이 종료된 혼합액을 1.0% TAE 아가로스 겔에 전기영동한 후, 에티디엄 브로마이드(ethidium bromide)로 염색하여 유전자의 발현 패턴을 조사하였다.
PH-20 센스 프라이머(서열번호 5):
5'- TATTTTATGYTRAMGACTTGG -3'
PH-20 안티센스 프라이머(서열번호 6):
5'- CTCCAKTYTTCCCAGTCAAT -3'
Hyal 5 센스 프라이머 (서열번호 7) :
5'- TAYATGCCAATAGACAATGTG -3'
Hyal 5 안티센스 프라이머 (서열번호 8):
5'- CAATTGTATTCACAAGGTCATC -3'
Vps35 센스 프라이머(서열번호 9):
5'- AGTGAAGAGAATCATGAACCCT -3'
Vps35 안티센스 프라이머(서열번호 10):
5'- TTAAAGGATGAGACCTTCATAG -3'
그 결과, 도 1에서 나타난 바와 같이, PH-20는 마우스, 렛, 소, 돼지, 원숭이에서 발현하였으나 hyal 5의 경우, 설치류와 소의 정소에서만 발현하고 돼지와 원숭이에서는 발현하지 않는 것을 확인할 수 있었다. 이것으로 신규 hyal 5가 소의 정소에서 발현하는 것을 확인하였다.
실시예 3: 소 유래 Hyal 5의 항체 제작
소 유래 Hyal 5의 항체를 생산하기 위하여, Hyal 5의 288~383 아미노산 영역을 프라이머(서열번호 11, 12)를 이용하여 PCR 법에 의해 증폭하였다.
Hyal 5 센스 프라이머 (서열번호 11) :
5'- AAGAATTCAAGAAGGGTCTATTCAGTTG -3'
Hyal 5 안티센스 프라이머 (서열번호 12):
5'- TTCTCGAGTCTAGCTTGTGGAGAAG -3'
상기 증폭된 PCR 산물을 His tag이 내재되어 있는 pET32a 벡터(Novagen, Co., USA)에 클로닝한 후, E. coli BL21(DE3)에 도입하여 형질전환 시켰다. 상기 형질전환 미생물을 배양한 후, 소 유래 Hyal 5의 발현 여부를 SDS-PAGE법으로 확인하였다. 그 결과, 도 2에서 나타나는 바와 같이 5, 6번의 재조합 단백질을 생산할 수 없는 negative control은 소 유래 Hyal 5가 발현하지 않았고 1, 2, 3, 4번의 형질전환 미생물에서만 소 유래 Hyal 5가 발현되는 것을 확인할 수 있었다.
상기 1 내지 4번의 형질전환 미생물에서 중에서 3번의 형진전환 미생물에서 발현된 소 유래 Hyal 5를 니켈 레진으로 충진된 His-친화성 크로마토그래피를 이용하여 정제한 후, 도 3에서 나타나는 것과 같이 Hyal 5가 가장 많이 검출된 2번과 3번 튜브를 PBS로 투석하였다. 상기 정제된 Hyal 5를 500 ㎍씩 10일 간격으로 토끼에게 5회 주사하고 혈액을 채취하였다. Hyal 5 항체를 정제하기 위하여 채취된 혈액을 37 ℃에서 1시간 반응 시킨 후, 혈청을 분리하기 위하여 4 ℃에서 12시간 정치한 다음, 10000 × g로 10분간 원심분리하여 상층액을 회수하였다. 상층액에서 Hyal 5 IgG를 분리하기 위하여 5 mg의 Protein G plus (Pierce)와 결합시킨후, Elution buffer (pH 2.2 20 mM Glycine)으로 정제를 한후, PBS 용액으로 투석을 하였다.
실시예 4: 소 정자에서 Hyal 5의 발현 확인
소의 정소조직에서에서 속출한 정자를 단백질 억제제(Sigma, Protein inhibitor Coactail)가 첨가된 추출용액(1% TX-100)에서 가용화시킨 후, 원심분리 하여 상층액을 수득하였다. 상기 상층액을 단백질 어세이에 의하여 정량하였다. 상기 정량된 4 ㎍의 정량된 소 부고환의 Caput에서 채취한 정자(Ca. Sperm)와 소 부고환의 Couda(cauda)에서 채취한 정자(Co. Sperm)에 SDS 샘플 버퍼를 넣고 3분간 열 변성시킨 후 10%의 SDS-PAGE 겔에 로딩하여 전기영동으로 분리하였다. 분리된 단백질을 폴리비닐리덴 플로라이드(polyvinylidene fluoride, PVDF)막으로 옮기고, 2% 탈지 분유(skim milk)로 블로킹하였다. 그리고 실시예 3에서 제조된 소 유래 Hyal 5의 항체를 넣어 반응시킨 후, HRP(Horse-Radish peroxidase)가 연결된 2차 항체(Jackson ImmunoResearch Laboratories)를 처리하여 발생하는 신호를 X-ray 필름에 현상하였다.
그 결과, 도 4에 나타난 바와 같이, 소 부고환의 caput과 couda에서 채취한 정자에서 Hyal 5가 발현되는 것을 확인하였고 이를 통해 Hyal 5가 정소 세포 및 정자의 특이 마커로 사용할 수 있다는 것을 확인하였다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구 항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
도 1은 마우스, 렛, 햄스터, 소, 돼지, 원숭이의 정소에서 hyal 5, PH-20, 및 Vps35의 발현 양상을 RT-PCR로 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 소 유래 Hyal 5 유전자(hyal 5)의 일 부분이 클로닝된 벡터가 도입된 재조합 미생물에서 Hyal 5의 발현 여부를 확인한 것이다. (1-4: 재조합 미생물, 5-6: negative control)
도 3은 Hyal 5가 발현된 재조합 미생물을 정제하여 Hyal 5의 검출 여부를 확인한 것이다.
도 4는 소 정자에서 소 유래 Hyal 5의 발현 여부를 확인한 것이다.
<110> Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology <120> Gene Enconding Hyal5 Isolated from Bivine and Method for Discriminating Fertility of Bovine Sperm Using Thereof <130> P09-B211 <160> 12 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 657 <212> PRT <213> Bos taurus <400> 1 Met Pro Arg Trp Gly Arg Asp Cys Pro Leu Leu Ala Leu Ala Ala Leu 1 5 10 15 Ala Cys Leu Ser Ala Val Val Asp Gly Pro Val Gly Ser Arg Leu Ala 20 25 30 Leu Val Ser Pro Leu Phe Phe Thr Asp Glu Ala Thr Cys Lys Thr Leu 35 40 45 Leu Lys Gln Glu Ala Arg Arg Ile Ile Phe Lys Tyr Ile Ser Ser Leu 50 55 60 Tyr Ile Phe Ile His Gln Ser Gly Phe Ile Pro Tyr Phe Leu Phe Cys 65 70 75 80 Val Tyr Ile Leu His Gln Ile Leu Asp Lys Pro Lys Cys Val Gly Glu 85 90 95 Lys Lys Cys Lys Ser Leu Leu Phe Ala Val Gly Met Leu Arg His Gln 100 105 110 His Ile Ser Phe Arg Asn Phe Val Gly Ser Asn Gly Ala Pro Gln Ala 115 120 125 Val Phe Thr Phe Leu Leu Val Pro Cys Cys Leu Ala Leu Asn Phe Thr 130 135 140 Ala Pro Pro Leu Ile Pro Asn Ile Pro Phe Leu Trp Ala Trp Asn Ala 145 150 155 160 Pro Thr Asn His Cys Ala Glu Ile Phe Ser Met Pro Pro Asp Leu Gly 165 170 175 Leu Phe Ser Leu Val Gly Ser Pro Gln Lys Asp Val Thr Gly Gln Pro 180 185 190 Ile Thr Leu Phe Tyr Ala Asp Arg Leu Gly Tyr Tyr Pro Lys Ile Asn 195 200 205 Glu Arg Thr Gly Val His Lys Asn Gly Gly Ile Pro Gln Val Ala Ser 210 215 220 Leu Lys Lys His Leu Asp Lys Ala Glu Lys Asp Ile Ala Tyr Tyr Met 225 230 235 240 Pro Ile Asp Asn Val Gly Leu Ala Val Ile Asp Trp Glu Asn Trp Arg 245 250 255 Pro Thr Trp Val Arg Asn Trp Lys Pro Lys Asp Val Tyr Lys Lys Ala 260 265 270 Ser Ile Glu Leu Val Leu Gln Gln Asn Arg His Phe Thr Leu Lys Glu 275 280 285 Ala Thr Lys Arg Ala Lys Ala Asp Phe Glu Lys Ala Ala Lys Ser Phe 290 295 300 Met Gln Glu Thr Leu Lys Leu Gly Lys Phe Leu Arg Pro Asn His Leu 305 310 315 320 Trp Gly Tyr Tyr Leu Phe Pro Asp Cys Tyr Asn His His Tyr Asn Gln 325 330 335 Ala Asn Tyr Asn Gly Ser Cys Phe Asp Glu Glu Lys Arg Arg Asn Asp 340 345 350 Ala Leu Asn Trp Leu Trp Lys Glu Ser Thr Ala Leu Tyr Pro Ser Val 355 360 365 Tyr Leu Asn Thr Lys Leu Lys Ser Ser Pro Gln Ala Arg Leu Phe Val 370 375 380 Arg Asn Arg Val Gln Glu Ala Ile Arg Leu Ser Lys Val Ala Asn Val 385 390 395 400 Lys Ser Pro Leu Pro Val Phe Val Tyr Thr Arg Pro Val Phe Ser Asp 405 410 415 Met Ser Ser Lys Phe Leu Ser Gln Asp Asp Leu Val Ser Thr Ile Gly 420 425 430 Glu Ser Ile Ala Leu Gly Ala Ser Gly Ile Ile Met Trp Gly Ser Phe 435 440 445 Asn Leu Ser Leu Thr Lys Gln Ser Cys Met Asn Leu Ser Asn Tyr Leu 450 455 460 Asn Thr Ile Leu Asn Pro Tyr Ile Ile Asn Val Thr Leu Ala Ala Lys 465 470 475 480 Met Cys Ser Gln Val Leu Cys His Glu Glu Gly Val Cys Thr Arg Lys 485 490 495 His Trp Asn Ser Thr Asp Tyr Leu His Leu Asn Pro Met Asn Phe Ala 500 505 510 Ile Gln Arg Arg Lys Tyr Gly Lys Tyr Thr Ile His Gly Lys Pro Thr 515 520 525 Leu Glu Asp Leu Leu Gln Phe Ser Glu Asn Phe Tyr Cys Ser Cys Tyr 530 535 540 Ala Asn Ile His Cys Lys Lys Arg Asp Ile Lys Asn Ile His Thr Ile 545 550 555 560 Asn Val Cys Phe Ala Glu Asp Val Cys Ile Asn Ala Ser Leu Asn Ser 565 570 575 Asp Arg Ser Lys His Ser Ser Ser Gln Lys Asp Ile Ser Ser Thr Thr 580 585 590 Phe Ser Thr Val Ser Ser Ser Thr Pro Thr Ala Lys Val Ser Ala Arg 595 600 605 Val Pro Gly Lys Asp His Val Ser Leu Lys Ile Arg Leu Pro Gly Glu 610 615 620 Ala Leu Ser Asn Thr Ile Gln Arg Gly His Lys Ser Val Asp Trp Lys 625 630 635 640 Asn Ile Phe Arg Gln Leu Tyr Phe Gln Asn Ile Lys Asn Glu Thr Asn 645 650 655 Tyr <210> 2 <211> 1993 <212> DNA <213> Bos taurus <400> 2 atgcctcgct ggggccgcga ctgccccctt ctggctctgg ctgccctcgc ctgcctgtct 60 gctgtggtgg atggacctgt cggcagccgg ctagctctag tcagtccttt gttctttaca 120 gatgaagcaa cttgcaaaac attgctaaaa caagaagcaa gaagaataat atttaaatac 180 atatcatcat tatacatttt tatccatcaa agtggcttca ttccatactt tctcttctgt 240 gtttatatct tacatcaaat attagataaa ccaaagtgtg taggagaaaa aaagtgcaaa 300 tcattacttt ttgcagtggg aatgctaagg caccagcata tctcttttag gaactttgtt 360 gggtccaatg gagcacccca ggcagtgttc accttccttc tggttccatg ttgtttggct 420 ttgaacttta cagcaccccc tctcattcca aatattcctt tcctgtgggc ctggaatgcc 480 ccaactaacc attgtgctga aatatttagc atgcctccag atctgggcct cttctcctta 540 gtaggaagcc cccaaaaaga tgttacagga caacctatta cattatttta tgctgatagg 600 cttggctact atcctaagat aaatgaaaga acaggtgtcc ataagaatgg tggaattcct 660 caggtggctt ccttaaaaaa acatttggac aaagctgaaa aagacattgc ctattacatg 720 ccaatcgaca acgtgggctt ggcggtcatt gactgggaaa actggaggcc tacctgggta 780 agaaactgga aacctaaaga tgtttacaag aaggcgtcta ttgagttggt tctgcaacaa 840 aatagacact ttactttgaa agaggctacc aagagagcga aagcggattt tgaaaaggca 900 gcaaagagct tcatgcaaga gactttaaaa ttgggaaagt ttcttcggcc aaaccactta 960 tggggttatt atctttttcc tgattgttac aatcatcatt ataaccaagc taattacaat 1020 ggaagttgct ttgatgaaga gaaaagaaga aatgatgcac tcaattggtt gtggaaggaa 1080 agcactgccc tttacccctc tgtttatttg aataccaagc taaaatcttc tccacaagct 1140 agactctttg ttcgtaatcg tgttcaggaa gccattcgat tgtctaaagt tgccaatgtt 1200 aaaagtccac ttccggtttt tgtatatacc cgtccagttt ttagtgatat gtcttcaaaa 1260 ttcctttctc aggatgacct tgtgagtaca attggtgaga gcattgctct aggtgcttct 1320 ggaattataa tgtggggaag cttcaactta agcctaacta agcaatcttg catgaaccta 1380 agcaattact tgaatactat actgaatcct tatataatca acgtcactct agcagccaaa 1440 atgtgtagcc aagtgttgtg ccacgaggaa ggagtgtgta caaggaaaca ctggaattca 1500 accgactatc ttcacctgaa cccaatgaat tttgctattc aaaggcggaa atatggaaaa 1560 tacaccatac atgggaaacc cacacttgaa gacctgctac aattttctga aaatttttat 1620 tgcagttgtt atgccaacat ccactgtaaa aaaagagata taaaaaacat tcatactatt 1680 aatgtatgtt ttgctgaaga tgtttgtata aacgcttctc taaactcaga ccgcagtaag 1740 cactcttcta gccagaaaga tatatcttct accactttta gcactgtctc atcctccaca 1800 ccgactgcca aagtgtctgc acgtgttcct gggaaagatc atgtgtccct caaaatcagg 1860 cttccagggg aagccctctc caacaccatc caaaggggcc ataagagtgt tgactggaaa 1920 aatatattcc gtcagttata ctttcaaaac attaaaaatg aaacaaacta ttaaaatata 1980 aattcagtga tta 1993 <210> 3 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hyal 5 sense primer <400> 3 atgcctcgct ggggccgcga ctgccccctt 30 <210> 4 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial 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<220> <223> hyal 5 antisense primer <400> 12 ttctcgagtc tagcttgtgg agaag 25

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  7. 소 정자에서 Hyal 5를 코딩하는 유전자(hyal 5)의 발현 여부를 확인하는 것을 특징으로 하는 소 정자의 수정능 판별방법.
  8. 제7항에 있어서, 상기 유전자의 발현 여부 확인은 Hyal 5에 특이적으로 결합하는 항체를 이용하는 것을 특징으로 하는 방법.
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