JPH07506090A - 組換え可溶性組織因子の発現および精製 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 組換え可溶性組織因子の発現および精製米国政府は、国立衛生研究所（Ｎａｔｉ ｏｎａｌ　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅｓ　ｏｆ　Ｈｅａｌｔｈ）からの認可により、認 可番号ＲＯＩ　ＩＩＬ４４２２５およびＲＯＩ　ＨＬ２９８０７により、本発明 における権利を有する。

本発明は、一般に、組換え技術およびプロティンＣチモーゲンに特異的なモノク ローナル抗体の特有のエピトープを用いて、タンパク質、特に血液凝固タンパク 質を精製する方法の領域にある。

タンパク質を精製する方法は長年使用されてきており、そしてそれらの方法は、 一般に、クロマトグラフィー法（例えば、イオン交換クロマトグラフィー、分子 量ふるい法、高圧液体クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー） 、および電気泳動法（例えば、アガロースまたはアクリルアミドゲルの電気泳動 法、および等電点電気泳動法）に分けられ得る。これらの方法のすべてに共通な 不利な点は、出発物質がいくつかの工程を通過して、所望の材料が実質的に純度 の高いところまで不純物を除去することをこれらの方法が要求するということで ある。

免疫アフィニティクロマトグラフィーにおいて、所望のタンパク質または他の分 子に対する抗体が、クロマトグラフィーの基質上に固定化され、タンパク質混合 物が、その抗体をタンパク質に結合させる条件下で基質に加えられ、非結合物質 が洗浄により除去され、そして結合したタンパク質が、例えば、高ｐＨまたは低 ｐＨの、タンパク変性剤またはカオトロープを用いて溶離される。最後に溶離さ れた物質は、実質的に純度の高いタンパク質であり、それは完全な生物活性をし ばしば欠いている。

この方法の変法は、１９９１年７月１２日付けで出願された米国特許出願第０７ ７７３０．０４０号に記載され、これはＣｈａｒｌｅｓ　Ｔ、　Ｅｓｍｏｎおよ びＮａｏｍｉ　Ｌ、　Ｅｓｍｏｎによる１９８８年１２月３０日付けで出願され た「プロティンＣに対するモノクローナル抗体」というタイトルの米国特許出願 第０７／２９２．４４７号の継続出願であり、モノクローナル抗体のＲＰＣ−４ の特性を開示している。ＲＰＣ−４と呼ばれるモノクローナル抗体を分泌するハ イブリドーマ細胞系は、アメリカンタイプカルチャーコレクション（Ａｎ＋ｅｒ ｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ）、　Ｒｏｃｋｖ ｉｌｌｅ、　ＭＤに１９８８年１１月２日に寄託され、そしてＡＴＣＣ番号ＨＢ ９８９２で受託された。この寄託は、特許の認可により公に入手可能である。

ＨＰＣ−４は、活性化プロティンＣ（ＡＰＣ）ではなく、プロティンＣに結合し 、そしてカルシウムの存在下でのみ結合する。従って、抗体がアフイニテイ支持 体上に固定化されるとき、プロティンＣは、血漿由来源または極めて穏やかな条 件下での組織培養発現系のいずれかから単離され得る。これは、生成物の生物活 性および固体支持体樹脂の安定性を維持する上で重要である。活性化プロティン Ｃはどんな条件下でも結合しないので、得られた精製物はＡＰＣを全く含まない 。

抗体は、プロティンＣ分子の限定された領域に結合し、その領域は、重鎮の残基 ６位と１７位の間、特異的には、ＥＤＱＶ　Ｄ　Ｐ　ＲＬ　Ｉ　Ｄ　Ｇ　Ｋ、の 中に含まれる。このペプチドは、固体支持体樹脂上に直接に固定化され得、そし てマウス腹水または組織培養上清液から高濃度で抗体を単離するために用いられ 得る。この方法は、たとえ非常に希釈された溶液からでさえも、抗体を非常に純 度の高い形態で高収率で単離することを可能にする。抗体は、カルシウムイオン の除去あるいは所望ナラば、１．５Ｍグアニジンのいずれかにより、固体支持体 ペプチドから除去され得、そしてグアニジンは精製されたモノクローナル抗体の 機能に影響を及ぼさない。

ＲＰＣ−４と組み合わせてプロティンＣエピトープを用いる精製方法は、他のタ ンパク質、特に血液凝固タンパク質の精製に適用され得る場合有利である。完全 に異なる抗体を用いるそのようなある種のシステムは、Ｐｒ１ｃｋｅｔｔら、　 Ｂ　ｏＴｅｃｈ　ｕｅｓ７（６）、　５８０−５８９　（１９８９）に記載され 、Ｃａ”配位に用いられるエンテロキナーゼ部位のいくつかを認識するカルシウ ム依存性抗体を用いており、そしてそのエンテロキナーゼ部位のいくつかは、５ ８３頁の図４および５８６頁の表１から示される残基１．２．３．４、および７ 位を含んでいる。この配列は、単離されるべきタンパク質のＮ末端に結合し、次 いでウロキナーゼでの処理により除去される。

従って、本発明の目的は、１回のクロマトグラフイ一工程により、精製されたタ ンパク質、特に血液凝固タンパク質の単離を可能にする方法および手段を提供す ることである。

さらなる目的は、モノクローナル抗体により特異的に結合するアミノ酸配列を有 する組換えタンパク質を提供することである。

発明の要旨 ｒＨＰｃ−４Ｊと呼ばれる特異的モノクローナル抗体を用いて、溶液から迅速に 単離され得る形態のいかなるタンパク質をも製造する方法が開示されている。Ｒ ＰＣ−４は、カルシウムを組み合わせて認識されるプロティンＣチモーゲンの１ ２個のアミノ酸のエピトープに結合する。エピトープと単離されるべきタンパク 質との融合タンパク質を形成し得ること、およびＲＰＣ−４ベースのアフィニテ ィクロマトグラフィーを用いてそのタンパク質を単離し得ることが、現在確定さ れている。好ましい実施態様においては、特異的なプロテアーゼ切断部位は、エ ピトープとタンパク質との間に挿入され、その結果、そのエピトープは単離され たタンパク質から容易に除去され得る。

最も好ましい実施態様においては、融合タンパク質は、適切なベクター内に挿入 された組換え遺伝子の発現により形成される。

１つの例においては、プロティンＣチモーゲン（ｒ　ＨＰＣ−４Ｊ）に特異的な 抗体によりカルシウムと組み合わせて認識される、プロティンＣチモーゲンの１ ２個のアミノ酸のエピトープと、Ｘａ因子切断部位とを含む機能的に活性な可溶 性組織因子は、適切な原核生物または真核生物の発現系内に挿入されるベクター から発現された。組換え可溶性組織因子は、適切な基質上に固定化されたＲＰＣ −４モノクローナル抗体を用いて、１回のクロマトグラフィ一工程で迅速に単離 され得る。一旦単離されると、プロティンＣエピトープは、Ｘａ因子で切断する ことにより除去され、機能的に活性な可溶性組織因子を残す。

図面の簡単な説明 図１は、■ＰＣ−４エピトープおよびＸａ因子切断部位をコードすｌｔ［ベクタ ーｐｌＮ−１１ｌ−ｐｅｌＢ、続いて単離されるべきタンパク質をフードする遺 伝子を挿入するためのいくつかの制限酵素部位である。

図２は、ｐｌＮ−１！Ｉ−ｐｅｌＢ−ｔＴＦ発現ベクターの構築を含む工程のス キーム表示である。ｔＴＦのサブクローニングは２段階で行われた。最初の段階 で、ｔＴＦ遺伝子を含む中間プラスミド（ｐＵＣ−ｔＴＦ）が調製された。２番 目の段階で、ｔＴＦ遺伝子は、ｐＵＣ−ｔＴＦから取り除かれ、モしてｔＴＦ遺 伝子は、ｐｌＮ−１１１−ｐｅｌＢ　（より詳細には文中を参照のこと）内にサ ブクローニングされた。

得られたｐｌＮ−１１１−ｐｅｌＢ−ｔＴＦは、発現のために、Ｅ、　ｃｏｌｉ （ＸＬＩ−Ｂ）の形質転換に対して用いられた。

図３は、組織因子のＳＤＳゲル電気泳動の写真であり、この組織因子は、ジスル フィド結合の還元がなくてもゲル内でモノマーとして動く。

図４は、ｔＴＦ　（ｎＭ）に対する、ＴＴＦ−ＨＰＣ−４のＸａ生成速度（Ｉ１ １吸光度／分／分）（白抜き丸）　；　ＴＴＦ−２９’３のＸａ生成速度（ｍ吸 光度／分／分）（黒塗り丸）；およびＴＴＦ−Ｘａ−ＤＩＧのＸａ生成速度（ｍ 吸光度／分／分）（白抜き四角）のグラフである。

発明の詳細な説明 ＨＰＣ−４抗体を用いてアフイニテイクロマトグラフイーにより簡単に単離され た融合タンパク質は、１２個のアミノ酸のＲＰＣ−４エピトープをコードするＤ ＮＡ配列をベクター内に挿入し、続いて単離されるべきタンパク質をコードする 遺伝子を挿入することにより調製される。好ましい実施態様において、特異的な プロテアーゼ切断部位は、ベクター内のエピトープとタンパク質コード配列との 間に挿入され、その結果、得られた融合タンパク質は容易に切断されて、エビト ープペプチドおよび所望のタンパク質を生じる。

以下の限定されない実施例において、ＨＰＣ−４の１２個のアミノ酸残基のエピ トープをコードする核酸配列は、発現タン／くり質が、ＲＰＣ−４エピトープ、 続いてＸａ因子切断部位、モして次１．Ｘでシグナルペプチド、細胞質ゾルの尾 部分、および膜の両側にわたる削除されるドメインを有していた組織因子のアミ ノ末端を含むような方向に、発現ベクター内に挿入される。

ＨＰＣ−４モノクローナル ＨＰＣ−４抗体およびその使用は、１９９１年７月１２日付けで出願された米国 特許出願第０７７７３０．０４０号に記載され、これはＣｈａｒｌｅｓ　Ｔ、　 Ｅｓｎ＋ｏｎおよびＮａｏｍｉ　Ｌ、　Ｅｓ＋ｏｏｎによる１９８８年１２月３ ０日付けで出願された「プロティンＣに対するモノクローナル抗体」というタイ トルの米国特許出願第０７／２９２．４４７号の継続出願であり、その教示は、 本明細書中に援用されている。ＲＰＣ−４モノクローナルの特性の詳細な分析は 、５ｔｅａｒｎｓら、ｒＣａ”依存性モノクローナル抗体とプロティンＣ活性化 ペプチド領域との相互作用Ｊ　、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　２６３．８ ２６−８３２　（１９８８）に述べられている。

）ＩＰＣ−４モノクローナル抗体は、プロティンＣの重鎮およびＣａ”の活性化 領域内に存在するペプチド配列に対して特異的である。このペプチド配列は、１ ２個のアミノ酸、すなわちグルタミン酸−アスパラギン酸−グルタミン−バリン −アスパラギン酸−ブロリンーアルギニンーロイシンーイソロイシンーアスノ（ ラギン酸−グリシンーリジ７　（Ｅ　Ｄ　Ｑ　Ｖ　Ｄ　Ｐ　ＲＬ　Ｉ　Ｄ　ＣＩ Ｃ）　（配列番号１）からなる。この配列の利点は、この配列が合成により作ら れるには十分短いが、特異性を与えるには十分長い、ということであり、これに より抗体と融合タンパク質以外のタンパク質との可能性のある交差反応が回避さ れる。

抗体は、ペプチド結合部位に加えて少なくとも１つの金属イオン結合部位を宵す ると思われる。ペプチド結合活性は、金属イオン結合部位での結合に、応じてい るか、または「依存して」いる。金属イオン結合部位は、カルシウムのような二 価の金属陽イオン、あるいはＴｂ”のような、同様のイオン半径および配位特性 を有する金属に結合し得る。ペプチドは、Ｃａ”を結合せず、それゆえＣａ”結 合部位は、融合タンパク質に付加されない。これは、３頁に記載されるＰｒ１ｃ ｋｅｔｔの方法において潜在的に固有な単離マトリックスとのＣａ”介在性相互 作用を最小限にする。組織因子の場合には、それはまた、Ｖｌ＋因子（組織因子 に対するリガンド）に結合するカルシウムが、組織因子融合タンパク質内の付加 した金属結合部位による干渉（ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ）なしで研究され得る ことを意味する。

カルシウムが抗体内で金属イオン結合部位に結合する場合は、モノクローナル抗 体はペプチドへの結合に対して著しくさらに受容的になる。金属イオンがモノク ローナル抗体の金属イオン結合部位に結合しない場合は、抗原結合部位は抗原の 結合に対して比較的非受容的である。従って、抗体−抗原結合は、抗体の周囲の 培地内の金属イオン濃度を変化させることにより制御され得る。

および　１されるベ　タンパク 本明細書中に記載の方法は、融合タンパク質として発現され、ＲＰＣ−４を用い て単離され、次いで純度の高いタンパク質としてエピトープから分離され得るタ ンパク質に関して限定はされない。

ベクターおよび　工 ｐｅｌＢ’Ｊ−ｆ−ペプチドＲＰＣ−４エピトープ、および、単離されるべきタ ンパク質、好ましくは特異的なプロテアーゼ切断部位によって分離されるべきタ ンパク質をコードする配列を発現するためのベクターが選択される。市販されて いる好適な細菌発現ベクターの例としては、ｐｃＤＮＡ　ＩＩＨｎｖｉｔｒｏｇ ｅｎ　＃Ｖ４００−２０）、　ｐＮＨ８ａ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、　＄２１５ ２０１）およびｐＢＴａｃｌ　（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ、　 ＄１０８１３６５）が挙げられる。Ｅ、　ｃｏｌｔのような細菌中で全長あるい は部分的なｃＤＮＡ配列を発現するために、これらのベクターを用い、ここで発 現されたタンパク質は、通常、細菌の細胞質中に封入体と呼ばれる不溶性の沈殿 として蓄積する。目的とするタンパク質を抽出するためには、高濃度（通常１１ Ｍ）の尿素のようなカオトロピ・ツク剤が、封入体を溶解するために必要とされ る。この過程は、タンパク質を変性させるので、その結果、目的のタンパク質は 不活性となる。活性のあるタンパク質を得るためには、通常制御することが非常 に非効率的で困難である折り畳み過程を必要とする。市販されている哺乳動物発 現ベクターの例として、ｐＲｃ／ＲＳＶ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、　＃Ｖ７８Ｇ −２０）、ｐＲｃ／ＣＭＶ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ　＃Ｖ７５０−２０）、およ びｐＭｃＩＮｅｏ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ　＃２１３２０１）力５挙げられる。

これら発現ベクターは通常、哺乳動物細胞において組換えタンパク質を高レベル で発現させ得る好適なプロモーターを含有し、そして、これらはまた、自己のゲ ノムにこれらのベクターを統合した哺乳動物細胞を選択するために使用し得る薬 剤耐性遺伝子も含有する。これらのベクターは、全長ｃＤＮＡおよび配列の５° 末端にリーダーペプチドを有するあらゆる他のＤＮＡフラグメントの発現に適し ている。これらの構築物は、好適な発現系、すなわちＥ、ｃｏｌｉのような原核 細胞あるいは酵母または哺乳動物細胞培養系のような真核細胞のいずれかに移さ れる。

公知の方法論を用いて、タンパク質を産生ずるためのトランスジェニック動物を 生み出すために、融合タンパク質をコードするｃＤＮＡを胚に挿入することもで きる。組織特異的プロモーターをタンパク質をコードする配列と組み合わせて使 用することにより、特定の組織でタンパク質の発現をし得る。

例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓら、（１９８２）が記載するように、透析バッグ中の 電気溶出に続いて、１％アガロースゲルで融合遺伝子を単離する。溶離ＤＮＡを 、沈殿させ、水に再溶解させ、そして製造業者（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ　ａｎｄ 　５ｃｈｕｅｌｌ、Ｉｎｃ、、Ｋｅｅｎｅ、ＮＨ）の指示に従ってｅｌｕｔｉｐ −Ｄカラムに通すことで精製する。精製ＤＮＡを、マイクロインジェクションす るために、５ｍＭ　Ｔｒｉｓ（ｐＨ７，４）および０゜１μＭ　ＥＤＴＡに３μ ｇ／ｍｌの濃度で溶解する。

マウスあるいは他のウサギまたはヒツジのような好適な動物の胚を、販売業者か ら入手する。ウシ血清アルブミン、ゼラチン、およびプロナーゼのような試薬を 、Ｓｉｇｍａ　ＣｈｅｍｉｃａｌＣｏ、、　Ｓｔ、　Ｌｏｕｔｓ、　ＭＯから入 手する。過剰排卵用ホルモン、ＰＭＳおよびｈＣＧを、Ｏｒｇａｎｏｎ、Ｉｎｃ 、、　ＮＪから入手する。ヒアルロニダーゼを、Ｓｉｇ＋ａａから購入する。制 限酵素を、Ｎｅｗ　ＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ、　Ｂｅｖｅｒｌｙ、　ＭＡ から入手する。前核にＤＮＡをマイクロインジェクションするために、Ｎａｒａ 　Ｓｈｉｇｅ、　ＵＳＡ、　Ｉｎｃ、、　Ｒａｔｎｉｎ　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ ｓ　Ｃｏ、、　Ｗｏｂｕｒｎ、　ＭＡ製のマイクロマ０ピュレ−ターを使用し得 る。ＤＭＥＭ、ウシ胎児血清、およびＤＰ　ＢＳは、ＧＩＢＣＯＬａｂｏｒａｔ ｏｒｉｅｓ、　Ｇａ１ｔｈｅｒｓｖｉｌｌｅ、　ＭＤから入手し得る。

トランスジェニックマウスを構築するための、胚マニピユレーションおよびマイ クロインジェクションの手法は、Ｂ、Ｈ。

ｇａｎ％　Ｆ、Ｃｏ５ｔａｎｔｉｎｉおよびＥ、Ｌａｃｙ（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉ ｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、　１９８６）の「マウス胚のマニ ピユレーション」に記載されている。類似の方法が、他のトランスジェニック動 物を生み出すために使用される。マウス接合体を、妊娠雌ウマ血清（ＰＭＳ）に 続いて、４８時間後にヒト絨毛性性腺刺激ホルモンで過剰排卵させた６週才の雌 から集める。準備された雌を雄と一緒にし、翌朝、膣栓をチェックする。発情し ている偽妊娠の雌を選択し、精管切除で不妊となった雄と一緒にし、そして受容 体として用いた。接合体を集め、そして丘細胞を、ヒアルロニダーゼ（ｆｉｇ／ ｍｌ）で処理することによって除いた。雄と交配した雌から前核胚を回収する。

濾胞の成長を誘発するために妊娠雌ウマ血清ＰＭＳ（５１Ｕ）で、そして排卵を 誘発するためにヒト絨毛性性腺刺激ホルモンｈＣＧ（５１Ｕ）で雌を処理する。

胚をＤｕｌｂｅｃｃｏ°Ｓ修飾リン酸緩衝生理食塩水（ＤＰＢＳ）中で回収し、 そして１０％ウシ胎児血清を添加したＤｕｌｂｅｃｃｏ’　ｓ修飾必須培地（Ｄ ＭＥＭ）に保持する。

Ｎ１ｋｏｎ　ｄｉａｐｈｏｔ顕微鏡に取り付たＮａｒｉｓｈｉｇｅマイクロマニ ピュレーターを用いて、マイクロインジェクションを行い得る。

マイクロインジェクションするとき、油浸下で胚を、ＤＰＢＳの１００マイクロ リットル滴量中に保つ。ＤＮＡ溶液を、見える範囲で最も大きい雄性前核にマイ クロインジェクシコンする。インジェクンヨンの成功を、前核の膨張によってモ ニターする。

インジェクション後直ちに、胚を受容体である雌、すなわち精管切除を受けた雄 のマウスと交配した成熟マウスに移す。

受容体である雌を、２．２．２−トリブロモエタノールを用いて麻酔する。腰付 近を切開して輸卵管を露出させ、胚を輸卵管の膨大領域に移す。体壁を縫合し、 そして皮膚を傷クリップで閉じる。受容体を識別するために耳にノツチを入れ、 分娩まで維持する。

３週齢の時に約２から３ｃｍの長さの尾試料を、ＤＮＡ分析にかける。尾試料を 、０．７ｍｌの５０＋ａＭ　ＴｒｉｓＳｐＨ８，０，１００ｍＭ　ＥＤＴＡ、　 ０゜５％ＳＤＳおよび３５０μｇのプロテイナーゼにの存在下に、５５℃で一晩 インキユベートすることにより消化する。消化物を、等量のフェノールで一回、 そして等量のフェノール：クロロホルム（１：１混合物）で−回抽出する。上清 を、７０μｌの３Ｍの酢酸ナトリウム（ｐＨ６，０）と混合し、そして等量の１ ００％エタノールを加えてＤＮＡを沈澱させる。ＤＮＡを、微量遠心で遠沈し、 ７０％エタノールで１回洗浄し、乾燥しそして１００μＬのＴＥ緩衝液（１０ｍ Ｍ　Ｔｒｉｓ、　ｐＨ８，０および１ｍＭ　ＥＤＴＡ）に溶解する。１０から２ ０μｌのＤＮＡを、ＢａｍＨＩおよびＢｇｌｌｌまたはＥｃｏＲＩで切断し、１ ％アガロースゲル上で電気泳動し、ニトロセルロース紙上にプロ・ツティングし 、そして３２ｐ標識ＤＮＡ配列とハイブリダイズした。トランスジェニック動物 を、オートラジオグラフィーによって同定する。

トランスジェニック雌を交配する。分娩後５日めに、乳汁試料を採取し、そして 融合タンパク質について検定した。トランスジェニック雄を、６から７週才のと きに交配する。同腹Ｆｌをトランスジェニック遺伝子について分析する。陽性の 雌を飼育し、５週才のときに交配する。分娩後５日めに、乳汁試料を融合タンパ ク質について検定する。乳汁分泌の誘発因子であるオキシトシンを０．０５単位 注射した麻酔されたマウスから、乳汁試料（５０−２００μｌ）を採取する。乳 房触診で補助し、乳汁をガラスキャピラリーに集める。続いて、融合タンパク質 を、ＨＰｃ−４抗体に結合させることによって単離する。

ＲＰＣ−４エピトープを　いる　１ 抗体は、融合タンパク質の精製および単離のために種々の基質に結合され得、こ の基質としてアガロース、アクリルアミドおよび他のタイプの通常のクロマトグ ラフィー用樹脂、フィルター等が挙げられる。これらの材料は、それらにタンパ ク質を結合させる方法と同様に、当業者に公知である。材料の選択は、かなりの 部分、精製規模あるいは分析すべき試料、および、生体適合性、ならびに、最終 産物が薬学用途に関する場合は政府機関の認可に依存する。

プロテアーゼ　。Ｉ 最も好ましい実施態様において、融合タンパク質は、エピトープと単離されるべ きタンパク質との間にプロテアーゼ切断部位を有する。好適な部位は、Ｘａ因子 によって切断される配列：　ＩｌｅＧｌｕＧｌｙＡｒｇ　（ＩＥＧＲ）、エンテ ロキナーゼによって切断される配列：　ＡｓｐＡｓｐＡｓｐＡｓｐＬｙｓ　（Ｄ ＤＤＤＫ）、およびトロンビン先こよって切断される配列：　Ｐｈｅ／ＧｌｙＰ ｒｏＡｒｇ　（Ｆ／ＧＰＲ）を有する。

ＨＰＣ−４を用いた精製に続いて、融合タンパク質を、適当な酵素で処理をして 所望のタンパク質から結合ペプチドを切断する。

本発明は、下記の実施例を参考にすることによりさらに理解されるが、これらに は限定されない。

実施例１：融合切断組織因子の発現のためのベクターの構築。

血液凝固は、血小板凝集の誘起およびフィブリノーゲンから、血小板プラグを安 定化するフィブリンへの開裂をするタンパク質分解酵素であるトロンビンの産生 の結果起こる。血液中で循環している数多くの前駆酵素および前駆因子は、この 過程において、それらが連続的あるいは一斉に活性型に転換されるいくつかの段 階を通して相互作用し、最終的に、Ｖａ因子、カルシウムイオン、および血小板 の存在下で、活性化したＸ因子（ｒｘａ）によってプロトロンビンをトロンビン に活性化する。

Ｘ因子は、それぞれ外因系および内因系経路と呼ばれる２つの経路のどちらかに よって活性化され得る。内因系経路、すなわち表面介在活性化経路は、タンｔ＜ ９質前駆体が切断されて活性なプロテアーゼを形成する一連の反応からなり、こ れはＸ１１因子からＸ１ｌａ因子への活性化に始まり、この活性化はＸ１因子を Ｘｌａ因子に転換し、この転換はＩＸ因子をカルシウムの存在下でＩＸａ因子に 転換する。１ｘ因子はまた、外因系経路を通して、組織因子（ＴＦ”）が活性化 Ｖ１１因子（Ｖｌｌａｌｌへ　ｆＶＩＩａ）と協同することによって活性化され 得る。活性化ＩＸ因子は、カルシウム、リン脂質（血小板）、およびＶｌｌｌａ 因子の存在下で、Ｘ因子をＸａ因子に活性化する。

生理学的には、凝固における主経路は、外因系で、その中心となる段階はＶｌ＋ 因子のＩ／Ｉｌａ因子への活性化だと考えられている。凝固アッセイ、および、 他のＶｌ＋因子からＶｌｌａｌｌへの転換を測定するために設計された活性アッ セイは、通常、■！Ｉａ因子の凝固活性に必要とされるコファクターであるＴＦ を使用する必要がある。最も一般的には、ＴＦは、トロンボプラスチンとして知 られる比較的粗製の調製物として供給される。

組織因子は、タンパク質およびリン脂質成分を有する必須の膜糖タンパク質であ る。それは様々な組織および種から単離され、４２．０００および５３，０００ の分子質量を有することが報告されている。組織因子をコードするＤＮＡおよび このタンパク質を発現する方法は、例えば、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ、　Ｉｎｃ、に よる欧州特許出願第０２７８７７６号およびＪ、Ｈ，Ｍｏｒｒｉｓｓｅｙらによ る江且５０．１２９−１３５（１９８７）に現在報告されている。

切形型組織因子（ｔＴＦ）のヌクレオチド（配列番号２）およびアミノ酸（配列 番号３）配列を下記に示し、これは、下記のように１９９１年４月１０日に出願 された米国出願第０７／６８３．６８２号に記載の配列から改変され、この技術 は本明細書中で援用されている。切形型組織因子タンパク質は、組織因子の予想 された膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインを欠いている。切形型組織因子と野 生型組織因子との間の本質的な違いは、切形型組織因子はリン脂質膜表面にもは やつながらないことである。

可溶性組織因子は、活性化Ｖｌｌ因子（ＦＶｌｌ）のためのコファクターであっ て、前駆体であるＶｌ＋因子（ＦＶＩＩ）のコファクターではない。天然の組織 因子はＦＶＩＩおよびＦＶＩＩａのコファクターである。

下記のアミノ酸およびヌクレオチド配列は、切形型組織因子の可溶形をフードす る。ヌクレオチド配列に、続き番号を左に付ける。アミノ酸配列は、ヌクレオチ ド配列の上に、標準の一文字コードを用いて示され、Ｍｏｒｒｉｓｓｅｙら、Ｃ ｅ１１５０，１ｌ２９−１３５（１９？）によって報告された成熟組織因子タン パク質の番号付けに従って右に番号付けされている。５°末端の５ｏｄａ　１部 位および３°末端のＸｂａ　１部位には下線を付す。Ｓｍａ　１部位の最初の３ 個のヌクレオチドは、制限酵素であるＳ＋＋＋ａｌで消化により除去される。こ れは、ｔＴＦ　ｃＤＮＡクローンのリーディングフレームを保存するような様式 で、ｔＴＦ　ｃＤＮＡ配列を、ｐｌＮ−１１１−ｐｅＩＢ−ＲＰＣ−４発現ベク ターの５ｔｕ１部位に平滑末端で連結させる。

（以下余白） ＩＮ−１１１−ｅｌＢ　ベクターの　Ｌこのベクターは、ｐｌＮ−１１１−姐已 由来である（Ｊｏｈｎ　Ｇｈｒａｙｅｂら、ＥＭＢＯＪ、　３（１０）　：　２ ４３７−２４４２　（１９８４））　、　ＸｂａｌおよびＢａｍＨＩを有するｐ ｌＮ−Ｉｌｌ−坦匠の切断により、Ｓｈｉｎｅ−Ｄａ１ｇａｒｎｏ配列ＧＡＧＧ を含むＤＮＡフラグメント、およびｏｍｐＡシグナルペプチドをコードするヌク レオチド配列の全体が除去される。図１に示すように、８つの重複オリゴヌクレ オチド（４つのセンスおよび他の４つの相捕的なアンチセンス）を連結して、ｐ ｅｌＢシグナルペプチドを表す２２残基長のペプチドをコードするオリゴヌクレ オチド配列が後続し、欠失しているＳｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎ。

配列を含むＩ）ＮＡフラグメントを合成した（Ｓａｈｕ−Ｐｉｎｇ　Ｌｅｔら、 Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、　１６９（９）：　４３７９−４３８３．１９８７ ）　（アミノ酸−２２から−１）（配列番号４）。

ＥｃｏＲＩ制限部位は、２つの余分な残基ＧｌｕＳＰｈｅ　（＋１および２）を コードするｐｅｌＢリーダー配列の直後で、このＤＮＡフラグメント中に含有さ れる。ＤＮＡフラグメント（配列番号５）はまた、１２アミノ酸残基長のペプチ ド（残基３〜１４）をコードし、このペプチドはＣａ”　”依存モノクローナル 抗体ＲＰＣ−４のエピトープである。ＥｃｏＲＩ制限部位は、ＨＰＣ−４エピト ープをｐｅｌＢシグナルペプチドから分離する。エピトープをコードするヌクレ オチドの後に、４つのアミノ酸残基１１ｅ、　Ｇｌｕ、　Ｇｌｙ、およびＡｒｇ をコードするヌクレオチドが存在し、Ｘａ因子切断部位（配列番号６）を形成す る。

このベクター中へ標的遺伝子をクローニングして発現させるだめに用いるいくつ かの制限酵素部位を含む配列が、Ｘａ因子切断部位の後に続く。図１に示したよ うに、このＤＮＡフラグメントは、ｐｌＮ−１１１−」皿のＸｂａｌおよびＢａ ｎ旧部位に連結するためにＸｂａｌの粘着末端を５°末端に、そしてＢａｍ旧粘 着末端を３°末端に含有する。ｐｌＮ−Ｉ　１ｔ−ｐｅｌＢの複合クローニング 部位は、５ｔｕ１、Ｎｏｔ　ｌ、Ｈｔｎｄｌｌｌ、およびＢａａ旧を含有する。

Ｓｔｕ＋は、６ｂｐ平滑末端カツターであり、その認識部位はＡＧＧ　ＣＣＴで ある；それがこの部位を切断する際に、３つのヌクレオチド、ＡＧＧをＤＮＡフ ラグメントの３゛末端に残し、これはＦＸａ切断部位の最後の残基であるＡｒｇ をコードする。従って、５ｔｕｌを有するこのベクターおよび池の３゛末端クロ 一ニング部位（ＮｏｔｌまたはＨｔｎｄｌｌｌあるいはＢａｍＨＩ）のうちのい ずれかの二重消化は、発現に適する標的遺伝子の指向性クローニング（ｄｉｒｅ ｃｔｉｏｎａｌ　ｃｌｏｎｉｎｇ）を提供する。

ｐｅｌＢリーダーペプチド（アミノ酸−２２から−１）（配列番号４　）　；　 ）ＩＰｃ−４エピトープ（アミノ酸＋３から１４）（配列番号１）；およびＦＸ ａ切断部位（アミノ酸１５から１８）（配列番号６）をコードする合成りＮＡフ ラグメントのオリゴヌクレオチド配列を、以下に示す。Ｓｈｉｎｅ−Ｄａ１ｇａ ｒｎｏ配列ＧＡＧＧ　（Ｓ−Ｄ）を、上線で示す。クローニングに有効な制限酵 素部位を、下線で示し、それはＥｃｏＲｌ　（２つの余分なアミノ酸＋１および ＋２を作り出すｐｅｌＢリーダー配列とＲＰＣ−４エピトープとの間）、５ｔｕ ｌ、Ｎｏｔｌ、および１ｉｎｄｌｌｌである。細菌シグナルペプチドによって切 断したｐｅｌＢリーダーペプチド切断部位を、矢印で示す。このＤＮＡフラグメ ントは、８つの重複オリゴヌクレオチドの連結により形成された結果、ｐｌＮ− １１１−姐已ベクターのＸｂａｌおよびＢａｏ＋旧部位へ連結するために５°末 端に粘着Ｘｂａ１部位を、そして３゛末端に粘着Ｂａ＋ｍ旧部位を有する。セン ス鎖と下の相補的なアンチセンス鎖のオリゴヌクレオチドとの境界を、太字で示 す。

ｌＮ−１１１−ｅｌＢ−ｔＴＦの　： ｐｌＮ−１１１−ｐｅｌＢ−ｔＴＦの構築を、図２に図式化して示すａ　ｐＪＨ ２７は、ベクターｐＧＥＭ−７２ｆ　（＋）　（Ｐｒｏｍｅｇａ）のＢａｌ１１ 旧とＸｂａｌ制限部位との間でクローン化した完全な切形型組織因子（ｔＴＦ） ｃＤＮＡ配列を含むプラスミドである。ｐ　ｌＮ−１１１−ｐｅｌＢ発現ベクタ ー中のクローニング部位と適合する５′および３′末端を有するｔＴＦ　ｃＤＮ Ａフラグメントの調製は、２段階の工程で行った。最初の段階でプラスミドｐＪ ｌ＋２７を、Ｂｂｖｌ制限酵素で消化し、ＤＮＡ配列をｔＴＦシグナルペプチド および飽和ｔＴＦタンパク質の最初の１１残基をコードするｃＤＮＡの５゛末端 から切断して除いた。ｔＴＦ遺伝子を修復するために、１１の欠失した残基をコ ードし、平滑な半一５ｒｓａ１部位を５°末端を形成している２つの相補的なオ リゴヌクレオチドを合成した。このオリゴヌクレオチドは、Ｂｂｖｌによって作 られたｔＴＦ　ｃＤＮＡ配列の粘着末端にハイブリダイズすることで連結し得る 粘着末端を含有する。

第２段階で、改変したｃＤＮＡ挿入物を、ｐＪＨ２７がら、Ｘｂａｌを用いる消 化により除去し、その挿入物をアガロースゲル電気泳動法により分離し、そして 溶離してアガロースゲルから精製した。生成した完全なｔＴＦをコードするｃＤ ＮＡフラグメントを、ｐＬｌｃ１９プラスミドのＳｍａｌおよびＸｂａ　Ｉ部位 にサブクローニングした。図２に示すように、次いでｔＴＦ　ｃＤＮＡフラグメ ントを、ｐＵＣ１９からＳｍａｌおよびＨｉｎｄｌｌｌ制限酵素を用いて除去し 、そしてｐ　ｌＮ−１１１−ｐｅｌＢ発現ベクターのＳｔｕ！および旧ｎｄ１１ １部位にサブクローニングした。

実施例２：融合タンパク質の発現および単離。

。刀　のための　の　：Ｅ、ｃｏｌｉのＸＬＩ−Ｂ株を３７℃でＬＢ培地中で増 殖した。−晩培養物のうちの５００μｌを、２５＋ｓｌのＬＢおよび１００μｇ ／＋ｎｌのアンピシリンを含有する１２５ａ＋１のフラスコに移した。そのフラ スコを３７℃で２〜３時間、ｏＤ６８ｉｌが０．６〜０．７に等しくなるまで振 盪した。アンピシリン（Ａｍｐ）を含有する１リツトルのＬＢ培地に、全２５ｍ １の細菌培養物を接種し、そして３７℃で０Ｄｅｏ＋＋＝０．６〜０．７になる まで振盪を続けた。次いで培養を、１ｍＭイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクト ピラノシド（ＩＰＴＧ）で誘導し、そして振盪をさらに８時間、室温で続けた。

細菌培養物を、約３００Ｏｒｐｍで２０分間、遠心分離にかけ、培地を細胞から 分離した。細胞のペレットを、５０ｍ１の冷水で再懸濁させ、１／２時間水上で 振盪しながらインキユベートした。次いで細胞周辺抽出物を、１０．　ＯＤＯｇ で１／２時間回転させて集めた。

タンパク質の約３／４が、Ｅ、　ｃａｌｆの培地中で発現し、そして１／４が、 低張ショックにより細胞周辺腔から回収された。細胞周辺抽出物を、（上記のよ うに遠心分離により浄化した）培地と混合し、そしてその混合物を、３００ＯＭ Ｗカットオフメンプラン（Ａ＋ａｉｃｏｎ）を有する限外濾過螺旋カートリッジ 濃縮装置（Ｕｌｔｒａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ　５ｐｉｒａｌ　ｃａｒｔｒｉｄｇ ｅ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ）を用いて最初の量の約１７１０に濃縮した。濃 縮の次に、この物質を０．１ＭのＮａＣ１，０，０２ＭのＴｒｉｓおよび１ｍＭ の塩化カルシウムに入れ、そして同様の緩衝液（Ａｆｆｉ−Ｇｅｌ”　１０で固 定した５ｍｇ／ｍｌのＲＰＣ−４１ｇＧ；全部で４ｍｌを、１リツトルの出発細 菌培養物のに用いた）で平衡化したＨＰＣ−４カラムにかけ、約２００ｍ１のＩ Ｍ　ＮａＣ１，１ｍＭのＣａＣｌ２を含有するｐＨ１，５の０．０２Ｍ丁ｒｊｓ −ＨＣＩで洗浄し、続いて約１０〜２０ｍ＋の同様の、ただし０．１ＭのＮａＣ １を含まない緩衝液で洗浄し、そしてタンパク質を０．１Ｍ　ＮａＣｌ、０．（ １２Ｍ　Ｔｒｆｓ−ＨＣＩ、　５ｍＭＥＤＴＡ、　ｐＨ７，５で溶離した。カラ ムからのｔＴＦの溶離を２８０ｎｏ＋の光の吸収でモニターし；タンパク質の１ 本のピークを観察した。

５ＤＳ−ＰＡＧＥ　： アフィニティクロマトグラフィーからのピーク画分の５ＤＳ−ＰＡＧＥ分析（１ ０％アクリルアミドを用いるＬａｅｍ＋ｍｌｉ系、Ｌａｅ＋１ｍ１ｉｂＮａｔｕ ｒｅ　２２７：　６８０−６８５（１９７０））は、図３に示すように、還元お よび非還元の両方の状態で３０ｋｄあたりで１本のモノマー性のバンドを示す。

これはグリコジル化されない際のｔＴＦの予想分子量と一致する。

約１ｍｇの可溶性組織因子を、１リツトルの出発細菌培養物から回収し、そして それは、ＳＤＳゲル電気泳動により分かるように均一である。組織因子は、ジス ルフィド結合が還元されなくても、ゲル中でモノマーとして働く。この様式で単 離した可溶性の切形型組織因子タンパク質は、ＲＰＣ−４エピトープが除去され ないときでさえ、Ｖ目ａ囚子に対して完全な補因子活性を有する；この活性は、 図４で示したように、哺乳動物細胞テ発現されるＲＰＣ−４エピトープを有さな い切形型組織因子のものに等しい。

そのタンパク質は、哺乳動物の細胞培養物内で発現されたタンパク質に機能的に 等価であるが、そのコストは１０％未満である。この機能的等偏性は、Ｘ因子活 性化に依存するＶｌｌａ因子濃度、および両方の供給源由来の組織因子の、Ｖｌ ｌａ因子アミド溶解活性（ａｍｉｄｏｌｙｔｉｃ　ａｃｔｉｖｉｔｙ）を同等に 増加する能力によって証明される。

（以下余白） 実施例ａ　：　ＨＰＣ−４エピトープと組み合わせた融合タンパク質技術を用い た他のタンパク質の単離。

これらのタンパク質のアミン末端領域に連結するエピトープヲ有スるトロンボモ ジュリンフラグメント、Ｘ因子のＥＧＦドメインおよびタンパク質ＣのＥＧＦド メインを、池のＥ、　ｃｏｌｉ細胞周細胞周辺系発現系させ、そこから回収した 。第４〜第６のＥＧＦドメインのトロンボモジュリンのフラグメントをまた、上 述のように抗体カラムの一段階精製で、培養哺乳動物細胞から単離した。この場 合、トロンボモジニリン第４〜第６２ＧＦドメインをコードするＤＮＡを、ＰＣ ＲによりｃＤＮＡから増幅し、そしてＲＰＣ−４エピトープおよびＸａ切断部位 が後に続くトランスフェリンシグナルペプチドをコードする合成オリゴヌクレオ チドに連結した。生じるＤＮＡフラグメントを、ヒト２９３細胞中で発現させる ために、ｐＲＣ／ＲＳＶ哺乳動物細胞発現ベクター中にサブクローニングした。

本明細書中に記載した方法および組成物の改変および変更は、前述の詳細な説明 より当業者に明白である。そのような改変および変更が、次の請求の範囲内にな ることを意図する。

（以下余白） 配列表 （１）一般的情報： （１）出願人：オクラホマ　メディカル　リサーチ　ファウンディシ１ン（１、 発明の名称：組換え可溶性組織因子の発現および精製（ｉｉｉ）配列数：９ （１ｖ）関連住所： （Ａ）住所人ニキルパトリック　アンド　コープイー（Ｂ）＃地ニスイード　２ ８００．　ビーチツリー　ストリート　１１００（Ｃ）市：　Ｔトランク （Ｄ）州：　シ′貫−ゾ゛Ｔ （Ｅ）国：１ノリ方合衆国 （Ｆ）郵便番号：　３０３０９−４５３０（Ｖ）コンビ１−ター読み出し形態： （Ａ）媒体型：フロッピーディスク （Ｂ）コンピューター：　ＩＢＭ　ＰＣ互換用（Ｃ）操作システム：　ＰＣ−Ｄ ＯＳ／ＭＳ−ＤＯＳ（０）ソフトウェア：パテントインリリースｔｔ、ａ、バー ジｌン＃１．２５（ｖｉ）現在の出願データ： （＾）出願番号： （Ｂ）出願口： （Ｃ，）分類： （ｖｉｉ＋）代理人／事務所情報： （Ａ）氏名：パブスト、パトレア　エル。

（Ｂ）登録番号：　３１．２８４ （Ｃ）％１会／記録番号：　ＯＭＲＦ１３Ｑヰ ｏｏｏｏ。

１　へ　ａ５　管　ロ ー　−〜　閂 （菫Ｉ）配列：配列番号：３： Ｇｌｕ　ｋｌ：ｑ　Ｔｈｒ　Ｌａｕ　Ｖａｔ　ｈｒｑ　Ａｒｇ　Ａｓｎ　Ａｓｎ 　Ｔｈｒ　Ｐｈａ　Ｉａｕ　Ｓａｒ　Ｌｅｕ　Ａｒｇ　Ａｓ■ １３０　１コ５　１４０ （２）配列番号、４の情報： （１）配列の特色： （＾）長さ：１６０塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数ニ一本鎖 （Ｄ）トボロノー：直鎖状 （１１）配列の種類：　ｅＤＮＡ （ｉｉｉ）ハイポセティカル：Ｎ。

（１ｖ）アンチセンス、Ｎ。

（ｖｉ）起源： （Ａ）生物名：　Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ（ｉｘ）配列の特徴 （Ａ）特徴を表す記号：　ｗｉｓｅ−ｆｅａｔｕｒｅ（Ｂ）存在位置：　ｌｏ、 、１３ （Ｄ）他の情報：／注＝　ｒｓｈｉｎｅ−Ｄａ１ｇａｒｎｏ配列」（ｉｘ）配列 の特徴 （Ａ）特徴を表す記号：　ｍ１ｓｃｊｅａｔｕｒｅ（Ｂ）存在位置：　２２．． ８５ （Ｄ）他の情報：／注＝「ｐｅｌＢリーダーペプチド」（ｉｘ）配列の特徴 （Ａ）特徴を表す記号：　５ｉｓｅ−ｆｅａｔｕｒｅ（Ｂ）存在位置：　３．． １４ （Ｄ）他の情報：／注＝　ｒｌｌＰｃ−４エピトープ」Ｑ　ｏ　。

１　へ　１ ９　Ｎ　リ （ｌｖ）アンチセンス二Ｎ０ （１ｘ）配列の特徴 （Ａ）特徴を表す記号：　Ｃｌｅａｖａｇｅ−ｓｉｔｅ（Ｂ）存在位置：１．４ （Ｄ）他の情報：／注＝ｒＸａ因子切断部位」（ｘｉ）配列：配列番号６： （２）配列番号７の情報： （ｉ）配列の特色： （＾）長さ＝５アミノ酸 （Ｂ）型二アミノ酸 （Ｃ）鎖の数ニ一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）配列の種類：ペプチド （ｉｉｉ）ハイポセテイカル＝ＮＯ （１ｖ）アンチセンス＝ＮＯ （ｌｘ）配列の特徴 （Ａ）特徴を表す記号：　Ｃｌｅａｖａｇｅ−ｓｉｔｅ（Ｂ）存在位置＝１．５ （ＤＪ他の情報・／注＝「エンテロキナーゼ切断部位」（ｘｌ）配列：配列番号 、７： （２）配列番号、８の情報： （ｉ）配列の特色： （Ａ）長さ、３アミノ酸 （Ｂ）型二アミノ酸 （Ｃ）鎖の数ニ一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （１１）配列の種類・ペプチド （■１）ハイボセティカル：Ｎ。

（ｉｖ）アンチセンス二Ｎ。

（１ｘ）配列の特徴 （Ａ）特徴を表す記号：　Ｃｌｅａｖａｇｅ−ｓｉｔｅ（Ｂ）存在位置：１３ （Ｄ）他の情報：／注＝「トロンビン切断部位」（ｘｌ）配列：配列番号、８： （２）配列番号・９の情報： （ｉ）配列の特色： （Ａ）長さ＝３アミノ酸 （Ｂ）型二アミノ酸 （Ｃ）鎖の数ニ一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉ　ｉ）配列の種′Ｈ：ペプチド （ｉｉｉ）ハイボセティカル：Ｎ。

（１ｖ）アンチセンス：Ｎｏ （１ｘ）配列の特徴 （Ａ）特徴を表す記号：　Ｃｌｅａｖａｇｅ−ｓｉｔｅ（Ｂ）存在位置：１．３ （Ｄ）他の情報：／注ｗ「トロンビン切断部位」（ｘｉ）配列：配列番号９： ｒ／（：　マ 補正書の写しく翻訳文）提出書（特許法第１８４条の７第１項）ｒｌｔ）、　Ｊ

Claims (23)

【特許請求の範囲】
1. １．ＨＰＣ−４と呼ばれ、アメリカンタイプカルチャーコレクション、Ｒｏｃｋ ｖｉｌｌｅ，ＭＤ，に、１９８８年１１月２日に寄託され、そしてＡＴＣＣ番号 ＨＢ９８９２として受託されたモノクローナル抗体によってカルシウムの存在下 で結合したエピトープ、および融合タンパク質とＨＰＣ−４抗体との結合により 単離されるべきタンパク質、 を含む、融合タンパク質。
2. ２．前記エピトープが、１２個のアミノ酸配列ＥＤＱＶＤＰＲＬＩＤＧＫからな る、請求項１に記載の融合タンパク質。
3. ３．前記エピトープと前記単離されるべきタンパク質との間に、特異的なプロテ アーゼ切断部位をさらに含む、請求項１に記載の融合タンパク質。
4. ４．前記プロテアーゼ切断部位が、Ｘａ因子によって特異的に切断されるアミノ 酸配列：ｎｌｌｅＧｌｕＧｌｙＡｒｇ（ＩＥＧＲ）、エンテロキナーゼによって 特異的に切断されるアミノ酸配列：ＡｓｐＡｓｐＡｓｐＡｓｐＬｙｓ（ＤＤＤＤ Ｋ）、およびトロンビンによって特異的に切断されるアミノ酸配列：Ｐｈｅ／Ｇ ｌｙＰｒｏＡｒｇ（Ｆ／ＧＰＲ）からなる群より選択される、請求項３に記載の 融合クンバク質。
5. ５．前記単離されるべきタンパク質が、組織因子およびトロンボモジュリン４− ６からなる群より選択される、請求項１に記載の融合タンパク質。
6. ６．Ｎ末端が１２個のアミノ酸配列ＥＤＱＶＤＰＲＬＩＤＧＫ、Ｘａ因子によっ て特異的に切断されるアミノ酸配列、および組織因子から本質的になる、請求項 １に記載の融合タンパク質。
7. ７．前記組織因子が、可溶性組織因子である、請求項６に記載の融合タンパク質 。
8. ８．エピトープおよびタンパク質を含む融合タンパク質をコードする単離された 核酸配列であって、ＨＰＣ−４と呼ばれ、アメリカンタイプカルチャーコレクシ ョン、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ．ＭＤ，に、１９８８年１１月２日に寄託され、そし てＡＴＣＣ番号ＨＢ９８９２として受託されたモノクローナル抗体によってカル シウムの存在下で結合したエピトープ、および融合タンパク質とＨＰＣ−４抗体 との結合により単離されるべきクンパク質、 を含む触合タンパク質をコードする単離された核酸配列。
9. ９．前記エピトープが、１２個のアミノ酸配列ＥＤＱＶＤＰＲＬＩＤＧＫからな る、請求項８に記載の核酸配列。
10. １０．前記エピトープと前記単離されるべきタンパク質との間に、特異的なプロ テアーゼ切断部位をさらに含む、請求項８に記載の核酸配列。
11. １１．前記プロテアーゼ切断部位が、Ｘａ因子によって特異的に切断されるアミ ノ酸配列：ｌｌｅＧｌｕＧｌｙＡｒｇ（ＩＥＧＲ）、エンテロキナーゼによって 特異的に切断されるアミノ酸配列：ＡｓｐＡｓｐＡｓｐＡｓｐＬｙｓ（ＤＤＤＤ Ｋ）、およびトロンビンによって特異的に切断されるアミノ酸配列：Ｐｈｅ／Ｇ １ｙＰｒｏＡｒｇ（Ｆ／ＧＰＲ）からなる群より選択される、請求項８に記載の 核酸配列。
12. １２．前記単離されるべきタンパク質が、組織因子およびトロンボモジュリンＥ ＧＦドメイン４−６からなる群より選択される、請求項８に記載の核酸配列。
13. １３．Ｎ末端が１２個のアミノ酸配列ＥＤＱＶＤＰＲＬＩＤＧＸ、Ｘａ因子によ って特異的に切断されるアミノ酸配列、および組織因子から本質的になる、請求 項８に記載の核酸配列。
14. １４．前記組織因子が、可溶性組織因子である、請求項１３に記載の核酸配列。
15. １５．原核細胞、酵母細胞、および哺乳動物細胞からなる群より選択される細胞 中で発現するためのベクター内に挿入される、請求項１３に記載の核酸配列。
16. １６．ＨＰＣ−４と呼ばれ、アメリカンクイプカルチャーコレクション、Ｒｏｏ ｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ，に、１９８８年１１月２日に寄託され、そしてＡＴＣＣ番 号ＨＢ９８９２として受託されたモノクローナル抗体にカルシウムの存在下で結 合するアフィニティによって精製され得るタンパク質を製造する方法であって、 ＨＰＣ−４によってカルシウムの存在下で結合するエピトープ、および単離され るべきタンパク質を含む融合タンパク質を発現する工程を包含し、 該融合タンパク質が、該クンバク質をコードする配列由来であり、該配列が発現 系におけるベクター内に挿入される、方法。
17. １７．前記発現系が、培養中の、真核細胞、酵母細胞および哺乳動物細胞からな る群より選択される、請求項１６に記載の方法。
18. １８．前記エピトープと前記単離されるべきクンバク質との間に、前記融合クン バク質における選択的なプロテアーゼ切断部位を発現する工程をさらに包含する 、請求項１６に記載の方法。
19. １９．カルシウムの存在下で、前記クンパク質と固定化されたＨＰＣ−４抗体と を結合することによって前記融合タンパク質を単離する工程、該固定化されたＨ ＰＣ−４抗体をカルシウム含有溶液で洗浄することによって非結合クンバク質を 除去する工程、および結合した融合タンパク質からカルシウムを除去する溶液で 該固定化されたＨＰＣ−４抗体を洗浄することによって該固定化ＨＰＣ−４抗体 から該融合クンパク質を溶離する工程をさらに包含する、請求項１６に記載の方 法。
20. ２０．前記融合タンパク質から前記ＨＰＣ−４エピトープを除去する工程をさら に包含する、請求項１９に記載の方法。
21. ２１．前記融合タンパク質が、前記エピトープと前記単離されるべきクンパク質 との間に特異的なプロテアーゼ切断部位を含み、遊離であるかまたは固定化され たプロテアーゼを用いて、該単離されるべきタン′寸ク質から該エピトープを切 断する工程をさらに包含する、請求項２０に記載の方法。
22. ２２．前記単離されるべきクンバク質が、組織因子およびトロンボモジュリンか らなる群より選択される、請求項１６に記載の方法。
23. ２３．前記プロテアーゼが、Ｘａ因子、エンテロキナーゼおよびトロンビンから なる群より選択される、請求項２１に記載の方法。