JP2003238600A - 組換え可溶性組織因子の発現および精製 - Google Patents
組換え可溶性組織因子の発現および精製Info
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 １回のクロマトグラフィー工程により、精製
されたタンパク質、特に血液凝固タンパク質の単離を可
能にする方法および手段を提供すること。 【解決手段】 ＨＰＣ−４と呼ばれ、アメリカンタイプ
カルチャーコレクション、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ，
に、１９８８年１１月２日に寄託され、そしてＡＴＣＣ
番号ＨＢ ９８９２として受託されたモノクローナル抗
体によってカルシウムの存在下で結合したエピトープ、
および融合タンパク質とＨＰＣ−４抗体との結合により
単離されるべきタンパク質、を含む融合タンパク質であ
って、ここで、該エピトープおよび該単離されるべきタ
ンパク質が、特異的なプロテアーゼ切断部位によって分
離される、融合タンパク質。
されたタンパク質、特に血液凝固タンパク質の単離を可
能にする方法および手段を提供すること。 【解決手段】 ＨＰＣ−４と呼ばれ、アメリカンタイプ
カルチャーコレクション、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ，
に、１９８８年１１月２日に寄託され、そしてＡＴＣＣ
番号ＨＢ ９８９２として受託されたモノクローナル抗
体によってカルシウムの存在下で結合したエピトープ、
および融合タンパク質とＨＰＣ−４抗体との結合により
単離されるべきタンパク質、を含む融合タンパク質であ
って、ここで、該エピトープおよび該単離されるべきタ
ンパク質が、特異的なプロテアーゼ切断部位によって分
離される、融合タンパク質。
Description
【発明の詳細な説明】
【０００１】米国政府は、国立衛生研究所（Ｎａｔｉｏ
ｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ）
からの認可により、認可番号Ｒ０１ ＨＬ４４２２５お
よびＲ０１ ＨＬ２９８０７により、本発明における権
利を有する。 【０００２】 【発明の属する技術分野】本発明は、一般に、組換え技
術およびプロテインＣチモーゲンに特異的なモノクロー
ナル抗体の特有のエピトープを用いて、タンパク質、特
に血液凝固タンパク質を精製する方法の領域にある。 【０００３】 【従来の技術】タンパク質を精製する方法は長年使用さ
れてきており、そしてそれらの方法は、一般に、クロマ
トグラフィー法（例えば、イオン交換クロマトグラフィ
ー、分子量ふるい法、高圧液体クロマトグラフィー、ア
フィニティクロマトグラフィー）、および電気泳動法
（例えば、アガロースまたはアクリルアミドゲルの電気
泳動法、および等電点電気泳動法）に分けられ得る。こ
れらの方法のすべてに共通な不利な点は、出発物質がい
くつかの工程を通過して、所望の材料が実質的に純度の
高いところまで不純物を除去することをこれらの方法が
要求するということである。 【０００４】免疫アフィニティクロマトグラフィーにお
いて、所望のタンパク質または他の分子に対する抗体
が、クロマトグラフィーの基質上に固定化され、タンパ
ク質混合物が、その抗体をタンパク質に結合させる条件
下で基質に加えられ、非結合物質が洗浄により除去さ
れ、そして結合したタンパク質が、例えば、高ｐＨまた
は低ｐＨの、タンパク変性剤またはカオトロープを用い
て溶離される。最後に溶離された物質は、実質的に純度
の高いタンパク質であり、それは完全な生物活性をしば
しば欠いている。 【０００５】この方法の変法は、１９９１年７月１２日
付けで出願された米国特許出願第０７／７３０，０４０
号に記載され、これはＣｈａｒｌｅｓ Ｔ． Ｅｓｍｏ
ｎおよびＮａｏｍｉ Ｌ． Ｅｓｍｏｎによる１９８８
年１２月３０日付けで出願された「プロテインＣに対す
るモノクローナル抗体」というタイトルの米国特許出願
第０７／２９２，４４７号の継続出願であり、モノクロ
ーナル抗体のＨＰＣ−４の特性を開示している。ＨＰＣ
−４と呼ばれるモノクローナル抗体を分泌するハイブリ
ドーマ細胞系は、アメリカンタイプカルチャーコレクシ
ョン（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ
Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）， Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ， Ｍ
Ｄに１９８８年１１月２日に寄託され、そしてＡＴＣＣ
番号 ＨＢ９８９２で受託された。この寄託は、特許の
認可により公に入手可能である。 【０００６】ＨＰＣ−４は、活性化プロテインＣ（ＡＰ
Ｃ）ではなく、プロテインＣに結合し、そしてカルシウ
ムの存在下でのみ結合する。従って、抗体がアフィニテ
ィ支持体上に固定化されるとき、プロテインＣは、血漿
由来源または極めて穏やかな条件下での組織培養発現系
のいずれかから単離され得る。これは、生成物の生物活
性および固体支持体樹脂の安定性を維持する上で重要で
ある。活性化プロテインＣはどんな条件下でも結合しな
いので、得られた精製物はＡＰＣを全く含まない。 【０００７】抗体は、プロテインＣ分子の限定された領
域に結合し、その領域は、重鎖の残基６位と１７位の
間、特異的には、Ｅ Ｄ Ｑ Ｖ Ｄ Ｐ Ｒ Ｌ Ｉ
ＤＧ Ｋ、の中に含まれる。このペプチドは、固体支
持体樹脂上に直接に固定化され得、そしてマウス腹水ま
たは組織培養上清液から高濃度で抗体を単離するために
用いられ得る。この方法は、たとえ非常に希釈された溶
液からでさえも、抗体を非常に純度の高い形態で高収率
で単離することを可能にする。抗体は、カルシウムイオ
ンの除去あるいは所望ならば、１．５ Ｍグアニジンの
いずれかにより、固体支持体ペプチドから除去され得、
そしてグアニジンは精製されたモノクローナル抗体の機
能に影響を及ぼさない。 【０００８】ＨＰＣ−４と組み合わせてプロテインＣエ
ピトープを用いる精製方法は、他のタンパク質、特に血
液凝固タンパク質の精製に適用され得る場合有利であ
る。完全に異なる抗体を用いるそのようなある種のシス
テムは、Ｐｒｉｃｋｅｔｔら，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕ
ｅｓ ７（６）， ５８０−５８９ （１９８９）に記
載され、Ｃａ２＋配位に用いられるエンテロキナーゼ部
位のいくつかを認識するカルシウム依存性抗体を用いて
おり、そしてそのエンテロキナーゼ部位のいくつかは、
５８３頁の図４および５８６頁の表Ｉから示される残基
１、２、３、４、および７位を含んでいる。この配列
は、単離されるべきタンパク質のＮ末端に結合し、次い
でウロキナーゼでの処理により除去される。 【０００９】 【発明が解決しようとする課題】従って、本発明の目的
は、１回のクロマトグラフィー工程により、精製された
タンパク質、特に血液凝固タンパク質の単離を可能にす
る方法および手段を提供することである。 【００１０】さらなる目的は、モノクローナル抗体によ
り特異的に結合するアミノ酸配列を有する組換えタンパ
ク質を提供することである。 【００１１】 【課題を解決するための手段】本発明は、ＨＰＣ−４と
呼ばれ、アメリカンタイプカルチャーコレクション、Ｒ
ｏｃｋｖｉｌｌｅ， ＭＤ，に、１９８８年１１月２日
に寄託され、そしてＡＴＣＣ番号ＨＢ ９８９２として
受託されたモノクローナル抗体によってカルシウムの存
在下で結合したエピトープ、および融合タンパク質とＨ
ＰＣ−４抗体との結合により単離されるべきタンパク
質、を含む、融合タンパク質に関する。 【００１２】１つの実施形態において、前記エピトープ
が、１２個のアミノ酸配列Ｅ ＤＱ Ｖ Ｄ Ｐ Ｒ
Ｌ Ｉ Ｄ Ｇ Ｋからなる。 【００１３】１つの実施形態において、前記エピトープ
と前記単離されるべきタンパク質との間に、特異的なプ
ロテアーゼ切断部位をさらに含む。 【００１４】１つの実施形態において、前記プロテアー
ゼ切断部位が、Ｘａ因子によって特異的に切断されるア
ミノ酸配列：Ｉｌｅ Ｇｌｕ Ｇｌｙ Ａｒｇ （ＩＥ
ＧＲ）、エンテロキナーゼによって特異的に切断される
アミノ酸配列：Ａｓｐ Ａｓｐ Ａｓｐ Ａｓｐ Ｌｙ
ｓ （ＤＤＤＤＫ）、およびトロンビンによって特異的
に切断されるアミノ酸配列：Ｐｈｅ／Ｇｌｙ Ｐｒｏ
Ａｒｇ （Ｆ／ＧＰＲ）からなる群より選択される。 【００１５】１つの実施形態において、前記単離される
べきタンパク質が、組織因子およびトロンボモジュリン
４−６からなる群より選択される。 【００１６】１つの実施形態において、Ｎ末端が１２個
のアミノ酸配列Ｅ Ｄ Ｑ Ｖ ＤＰ Ｒ Ｌ Ｉ Ｄ
Ｇ Ｋ、Ｘａ因子によって特異的に切断されるアミノ
酸配列、および組織因子から本質的になる。 【００１７】１つの実施形態において、前記組織因子
が、可溶性組織因子である。 【００１８】別の局面において、本発明は、エピトープ
およびタンパク質を含む融合タンパク質をコードする単
離された核酸配列を提供し、この核酸配列は、ＨＰＣ−
４と呼ばれ、アメリカンタイプカルチャーコレクショ
ン、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ， ＭＤ，に、１９８８年１１
月２日に寄託され、そしてＡＴＣＣ番号ＨＢ ９８９２
として受託されたモノクローナル抗体によってカルシウ
ムの存在下で結合したエピトープ、および融合タンパク
質とＨＰＣ−４抗体との結合により単離されるべきタン
パク質、を含む融合タンパク質をコードする。 【００１９】１つの実施形態において、前記エピトープ
が、１２個のアミノ酸配列Ｅ ＤＱ Ｖ Ｄ Ｐ Ｒ
Ｌ Ｉ Ｄ Ｇ Ｋからなる。 【００２０】１つの実施形態において、前記エピトープ
と前記単離されるべきタンパク質との間に、特異的なプ
ロテアーゼ切断部位をさらに含む。 【００２１】１つの実施形態において、前記プロテアー
ゼ切断部位が、Ｘａ因子によって特異的に切断されるア
ミノ酸配列：Ｉｌｅ Ｇｌｕ Ｇｌｙ Ａｒｇ （ＩＥ
ＧＲ）、エンテロキナーゼによって特異的に切断される
アミノ酸配列：Ａｓｐ Ａｓｐ Ａｓｐ Ａｓｐ Ｌｙ
ｓ （ＤＤＤＤＫ）、およびトロンビンによって特異的
に切断されるアミノ酸配列：Ｐｈｅ／Ｇｌｙ Ｐｒｏ
Ａｒｇ （Ｆ／ＧＰＲ）からなる群より選択される。 【００２２】１つの実施形態において、前記単離される
べきタンパク質が、組織因子およびトロンボモジュリン
ＥＧＦドメイン４−６からなる群より選択される。 【００２３】１つの実施形態において、Ｎ末端が１２個
のアミノ酸配列Ｅ Ｄ Ｑ Ｖ ＤＰ Ｒ Ｌ Ｉ Ｄ
Ｇ Ｋ、Ｘａ因子によって特異的に切断されるアミノ
酸配列、および組織因子から本質的になる。 【００２４】１つの実施形態において、前記組織因子
が、可溶性組織因子である。 【００２５】１つの実施形態において、原核細胞、酵母
細胞、および哺乳動物細胞からなる群より選択される細
胞中で発現するためのベクター内に挿入される。 【００２６】別の局面において、本発明は、ＨＰＣ−４
と呼ばれ、アメリカンタイプカルチャーコレクション、
Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ， ＭＤ，に、１９８８年１１月２
日に寄託され、そしてＡＴＣＣ番号ＨＢ ９８９２とし
て受託されたモノクローナル抗体にカルシウムの存在下
で結合するアフィニティによって精製され得るタンパク
質を製造する方法を提供し、この方法は、ＨＰＣ−４に
よってカルシウムの存在下で結合するエピトープ、およ
び単離されるべきタンパク質を含む融合タンパク質を発
現する工程を包含し、該融合タンパク質が、該タンパク
質をコードする配列由来であり、該配列が発現系におけ
るベクター内に挿入される。 【００２７】１つの実施形態において、前記発現系が、
培養中の、真核細胞、酵母細胞および哺乳動物細胞から
なる群より選択される。 【００２８】１つの実施形態において、前記エピトープ
と前記単離されるべきタンパク質との間に、前記融合タ
ンパク質における選択的なプロテアーゼ切断部位を発現
する工程をさらに包含する。 【００２９】１つの実施形態において、カルシウムの存
在下で、前記タンパク質と固定化されたＨＰＣ−４抗体
とを結合することによって前記融合タンパク質を単離す
る工程、該固定化されたＨＰＣ−４抗体をカルシウム含
有溶液で洗浄することによって非結合タンパク質を除去
する工程、および結合した融合タンパク質からカルシウ
ムを除去する溶液で該固定化されたＨＰＣ−４抗体を洗
浄することによって該固定化ＨＰＣ−４抗体から該融合
タンパク質を溶離する工程をさらに包含する。 【００３０】１つの実施形態において、前記融合タンパ
ク質から前記ＨＰＣ−４エピトープを除去する工程をさ
らに包含する。 【００３１】１つの実施形態において、前記融合タンパ
ク質が、前記エピトープと前記単離されるべきタンパク
質との間に特異的なプロテアーゼ切断部位を含み、遊離
であるかまたは固定化されたプロテアーゼを用いて、該
単離されるべきタンパク質から該エピトープを切断する
工程をさらに包含する。 【００３２】１つの実施形態において、前記単離される
べきタンパク質が、組織因子およびトロンボモジュリン
からなる群より選択される。 【００３３】１つの実施形態において、前記プロテアー
ゼが、Ｘａ因子、エンテロキナーゼおよびトロンビンか
らなる群より選択される。 【００３４】「ＨＰＣ−４」と呼ばれる特異的モノクロ
ーナル抗体を用いて、溶液から迅速に単離され得る形態
のいかなるタンパク質をも製造する方法が開示されてい
る。ＨＰＣ−４は、カルシウムを組み合わせて認識され
るプロテインＣチモーゲンの１２個のアミノ酸のエピト
ープに結合する。エピトープと単離されるべきタンパク
質との融合タンパク質を形成し得ること、およびＨＰＣ
−４ベースのアフィニティクロマトグラフィーを用いて
そのタンパク質を単離し得ることが、現在確定されてい
る。好ましい実施態様においては、特異的なプロテアー
ゼ切断部位は、エピトープとタンパク質との間に挿入さ
れ、その結果、そのエピトープは単離されたタンパク質
から容易に除去され得る。最も好ましい実施態様におい
ては、融合タンパク質は、適切なベクター内に挿入され
た組換え遺伝子の発現により形成される。 【００３５】１つの例においては、プロテインＣチモー
ゲン（「ＨＰＣ−４」）に特異的な抗体によりカルシウ
ムと組み合わせて認識される、プロテインＣチモーゲン
の１２個のアミノ酸のエピトープと、Ｘａ因子切断部位
とを含む機能的に活性な可溶性組織因子は、適切な原核
生物または真核生物の発現系内に挿入されるベクターか
ら発現された。組換え可溶性組織因子は、適切な基質上
に固定化されたＨＰＣ−４モノクローナル抗体を用い
て、１回のクロマトグラフィー工程で迅速に単離され得
る。一旦単離されると、プロテインＣエピトープは、Ｘ
ａ因子で切断することにより除去され、機能的に活性な
可溶性組織因子を残す。 【００３６】 【発明の実施の形態】ＨＰＣ−４抗体を用いてアフィニ
ティクロマトグラフィーにより簡単に単離された融合タ
ンパク質は、１２個のアミノ酸のＨＰＣ−４エピトープ
をコードするＤＮＡ配列をベクター内に挿入し、続いて
単離されるべきタンパク質をコードする遺伝子を挿入す
ることにより調製される。好ましい実施態様において、
特異的なプロテアーゼ切断部位は、ベクター内のエピト
ープとタンパク質コード配列との間に挿入され、その結
果、得られた融合タンパク質は容易に切断されて、エピ
トープペプチドおよび所望のタンパク質を生じる。 【００３７】以下の限定されない実施例において、ＨＰ
Ｃ−４の１２個のアミノ酸残基のエピトープをコードす
る核酸配列は、発現タンパク質が、ＨＰＣ−４エピトー
プ、続いてＸａ因子切断部位、そして次いでシグナルペ
プチド、細胞質ゾルの尾部分、および膜の両側にわたる
削除されるドメインを有していた組織因子のアミノ末端
を含むような方向に、発現ベクター内に挿入される。 【００３８】（ＨＰＣ−４モノクローナル抗体）ＨＰＣ
−４抗体およびその使用は、１９９１年７月１２日付け
で出願された米国特許出願第０７／７３０，０４０号に
記載され、これはＣｈａｒｌｅｓ Ｔ．Ｅｓｍｏｎおよ
びＮａｏｍｉ Ｌ． Ｅｓｍｏｎによる１９８８年１２
月３０日付けで出願された「プロテインＣに対するモノ
クローナル抗体」というタイトルの米国特許出願第０７
／２９２，４４７号の継続出願であり、その教示は、本
明細書中に援用されている。ＨＰＣ−４モノクローナル
の特性の詳細な分析は、Ｓｔｅａｒｎｓら， 「Ｃａ２
＋依存性モノクローナル抗体とプロテインＣ活性化ペプ
チド領域との相互作用」， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅ
ｍ． ２６３，８２６−８３２ （１９８８）に述べら
れている。 【００３９】ＨＰＣ−４モノクローナル抗体は、プロテ
インＣの重鎖および Ｃａ２＋の活性化領域内に存在す
るペプチド配列に対して特異的である。このペプチド配
列は、１２個のアミノ酸、すなわちグルタミン酸−アス
パラギン酸−グルタミン−バリン−アスパラギン酸−プ
ロリン−アルギニン−ロイシン−イソロイシン−アスパ
ラギン酸−グリシン−リジン（Ｅ Ｄ Ｑ Ｖ Ｄ Ｐ
Ｒ Ｌ Ｉ Ｄ ＧＫ）（配列番号１）からなる。こ
の配列の利点は、この配列が合成により作られるには十
分短いが、特異性を与えるには十分長い、ということで
あり、これにより抗体と融合タンパク質以外のタンパク
質との可能性のある交差反応が回避される。 【００４０】抗体は、ペプチド結合部位に加えて少なく
とも１つの金属イオン結合部位を有すると思われる。ペ
プチド結合活性は、金属イオン結合部位での結合に、応
じているか、または「依存して」いる。金属イオン結合
部位は、カルシウムのような二価の金属陽イオン、ある
いはＴｂ３＋のような、同様のイオン半径および配位特
性を有する金属に結合し得る。ペプチドは、Ｃａ２＋を
結合せず、それゆえＣａ２＋結合部位は、融合タンパク
質に付加されない。これは、３頁に記載されるＰｒｉｃ
ｋｅｔｔの方法において潜在的に固有な単離マトリック
スとのＣａ２＋介在性相互作用を最小限にする。組織因
子の場合には、それはまた、ＶＩＩ因子（組織因子に対
するリガンド）に結合するカルシウムが、組織因子融合
タンパク質内の付加した金属結合部位による干渉（ｉｎ
ｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ）なしで研究され得ることを意味
する。 【００４１】カルシウムが抗体内で金属イオン結合部位
に結合する場合は、モノクローナル抗体はペプチドへの
結合に対して著しくさらに受容的になる。金属イオンが
モノクローナル抗体の金属イオン結合部位に結合しない
場合は、抗原結合部位は抗原の結合に対して比較的非受
容的である。従って、抗体−抗原結合は、抗体の周囲の
培地内の金属イオン濃度を変化させることにより制御さ
れ得る。 【００４２】（発現および精製されるべきタンパク質）
本明細書中に記載の方法は、融合タンパク質として発現
され、ＨＰＣ−４を用いて単離され、次いで純度の高い
タンパク質としてエピトープから分離され得るタンパク
質に関して限定はされない。 【００４３】（ベクターおよび発現系）ｐｅｌＢリーダ
ーペプチドＨＰＣ−４エピトープ、および、単離される
べきタンパク質、好ましくは特異的なプロテアーゼ切断
部位によって分離されるべきタンパク質をコードする配
列を発現するためのベクターが選択される。市販されて
いる好適な細菌発現ベクターの例としては、ｐｃＤＮＡ
ＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＃Ｖ４００−２０）、
ｐＮＨ８ａ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、＃２１５２０１）
およびｐＢＴａｃ１（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎ
ｈｅｉｍ、＃１０８１３６５）が挙げられる。Ｅ． ｃ
ｏｌｉのような細菌中で全長あるいは部分的なｃＤＮＡ
配列を発現するために、これらのベクターを用い、ここ
で発現されたタンパク質は、通常、細菌の細胞質中に封
入体と呼ばれる不溶性の沈殿として蓄積する。目的とす
るタンパク質を抽出するためには、高濃度（通常８Ｍ）
の尿素のようなカオトロピック剤が、封入体を溶解する
ために必要とされる。この過程は、タンパク質を変性さ
せるので、その結果、目的のタンパク質は不活性とな
る。活性のあるタンパク質を得るためには、通常制御す
ることが非常に非効率的で困難である折り畳み過程を必
要とする。市販されている哺乳動物発現ベクターの例と
して、ｐＲｃ／ＲＳＶ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ， ＃Ｖ
７８０−２０）、ｐＲｃ／ＣＭＶ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅ
ｎ ＃Ｖ７５０−２０）、およびｐＭＣ１Ｎｅｏ（Ｓｔ
ｒａｔａｇｅｎｅ ＃２１３２０１）が挙げられる。こ
れら発現ベクターは通常、哺乳動物細胞において組換え
タンパク質を高レベルで発現させ得る好適なプロモータ
ーを含有し、そして、これらはまた、自己のゲノムにこ
れらのベクターを統合した哺乳動物細胞を選択するため
に使用し得る薬剤耐性遺伝子も含有する。これらのベク
ターは、全長ｃＤＮＡおよび配列の５’末端にリーダー
ペプチドを有するあらゆる他のＤＮＡフラグメントの発
現に適している。これらの構築物は、好適な発現系、す
なわちＥ．ｃｏｌｉのような原核細胞あるいは酵母また
は哺乳動物細胞培養系のような真核細胞のいずれかに移
される。 【００４４】公知の方法論を用いて、タンパク質を産生
するためのトランスジェニック動物を生み出すために、
融合タンパク質をコードするｃＤＮＡを胚に挿入するこ
ともできる。組織特異的プロモーターをタンパク質をコ
ードする配列と組み合わせて使用することにより、特定
の組織でタンパク質の発現をし得る。例えば、Ｍａｎｉ
ａｔｉｓら、（１９８２）が記載するように、透析バッ
グ中の電気溶出に続いて、１％アガロースゲルで融合遺
伝子を単離する。溶離ＤＮＡを、沈殿させ、水に再溶解
させ、そして製造業者（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ ａｎｄ
Ｓｃｈｕｅｌｌ，Ｉｎｃ．，Ｋｅｅｎｅ，ＮＨ）の指
示に従ってｅｌｕｔｉｐ−Ｄカラムに通すことで精製す
る。精製ＤＮＡを、マイクロインジェクションするため
に、５ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ ７．４）および０．１ｍ
Ｍ ＥＤＴＡに３μｇ／ｍｌの濃度で溶解する。 【００４５】マウスあるいは他のウサギまたはヒツジの
ような好適な動物の胚を、販売業者から入手する。ウシ
血清アルブミン、ゼラチン、およびプロナーゼのような
試薬を、Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．， Ｓ
ｔ． Ｌｏｕｉｓ， ＭＯから入手する。過剰排卵用ホ
ルモン、ＰＭＳおよびｈＣＧを、Ｏｒｇａｎｏｎ，Ｉｎ
ｃ．， ＮＪから入手する。ヒアルロニダーゼを、Ｓｉ
ｇｍａから購入する。制限酵素を、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａ
ｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ， Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡから入
手する。前核にＤＮＡをマイクロインジェクションする
ために、Ｎａｒａ Ｓｈｉｇｅ， ＵＳＡ， Ｉｎ
ｃ．， Ｒａｉｎｉｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｃ
ｏ．， Ｗｏｂｕｒｎ， ＭＡ製のマイクロマニピュレ
ーターを使用し得る。ＤＭＥＭ、ウシ胎児血清、および
ＤＰＢＳは、ＧＩＢＣＯ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，
Ｇａｉｔｈｅｒｓｖｉｌｌｅ， ＭＤから入手し得
る。 【００４６】トランスジェニックマウスを構築するため
の、胚マニピュレーションおよびマイクロインジェクシ
ョンの手法は、Ｂ．Ｈｏｇａｎ、Ｆ．Ｃｏｓｔａｎｔｉ
ｎｉおよびＥ．Ｌａｃｙ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈ
ａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， １９８６）の
「マウス胚のマニピュレーション」に記載されている。
類似の方法が、他のトランスジェニック動物を生み出す
ために使用される。マウス接合体を、妊娠雌ウマ血清
（ＰＭＳ）に続いて、４８時間後にヒト絨毛性性腺刺激
ホルモンで過剰排卵させた６週才の雌から集める。準備
された雌を雄と一緒にし、翌朝、膣栓をチェックする。
発情している偽妊娠の雌を選択し、精管切除で不妊とな
った雄と一緒にし、そして受容体として用いた。接合体
を集め、そして丘細胞を、ヒアルロニダーゼ（１ｍｇ／
ｍｌ）で処理することによって除いた。雄と交配した雌
から前核胚を回収する。濾胞の成長を誘発するために妊
娠雌ウマ血清ＰＭＳ（５ＩＵ）で、そして排卵を誘発す
るためにヒト絨毛性性腺刺激ホルモンｈＣＧ（５１Ｕ）
で雌を処理する。胚をＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ修飾リン酸
緩衝生理食塩水（ＤＰＢＳ）中で回収し、そして１０％
ウシ胎児血清を添加したＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ修飾必須
培地（ＤＭＥＭ）に保持する。 【００４７】Ｎｉｋｏｎ ｄｉａｐｈｏｔ顕微鏡に取り
付けたＮａｒｉｓｈｉｇｅマイクロマニピュレーターを
用いて、マイクロインジェクションを行い得る。マイク
ロインジェクションするとき、油浸下で胚を、ＤＰＢＳ
の１００マイクロリットル滴量中に保つ。ＤＮＡ溶液
を、見える範囲で最も大きい雄性前核にマイクロインジ
ェクションする。インジェクションの成功を、前核の膨
張によってモニターする。インジェクション後直ちに、
胚を受容体である雌、すなわち精管切除を受けた雄のマ
ウスと交配した成熟マウスに移す。受容体である雌を、
２，２，２−トリブロモエタノールを用いて麻酔する。
腰付近を切開して輸卵管を露出させ、胚を輸卵管の膨大
領域に移す。体壁を縫合し、そして皮膚を傷クリップで
閉じる。受容体を識別するために耳にノッチを入れ、分
娩まで維持する。 【００４８】３週齢の時に約２から３ｃｍの長さの尾試
料を、ＤＮＡ分析にかける。尾試料を、０．７ｍｌの５
０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ ８．０、１００ｍＭ ＥＤＴ
Ａ、０．５％ＳＤＳおよび３５０μｇのプロテイナーゼ
Ｋの存在下に、５５℃で一晩インキュベートすることに
より消化する。消化物を、等量のフェノールで一回、そ
して等量のフェノール：クロロホルム（１：１混合物）
で一回抽出する。上清を、７０μｌの３Ｍの酢酸ナトリ
ウム（ｐＨ ６．０）と混合し、そして等量の１００％
エタノールを加えてＤＮＡを沈澱させる。ＤＮＡを、微
量遠心で遠沈し、７０％エタノールで１回洗浄し、乾燥
しそして１００μＬのＴＥ緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉ
ｓ、ｐＨ ８．０および１ｍＭ ＥＤＴＡ）に溶解す
る。１０から２０μｌのＤＮＡを、ＢａｍＨＩおよびＢ
ｇｌ１１またはＥｃｏＲＩで切断し、１％アガロースゲ
ル上で電気泳動し、ニトロセルロース紙上にブロッティ
ングし、そして３２Ｐ標識ＤＮＡ配列とハイブリダイズ
した。トランスジェニック動物を、オートラジオグラフ
ィーによって同定する。 【００４９】トランスジェニック雌を交配する。分娩後
５日めに、乳汁試料を採取し、そして融合タンパク質に
ついて検定した。トランスジェニック雄を、６から７週
才のときに交配する。同腹Ｆｌをトランスジェニック遺
伝子について分析する。陽性の雌を飼育し、５週才のと
きに交配する。分娩後５日めに、乳汁試料を融合タンパ
ク質について検定する。乳汁分泌の誘発因子であるオキ
シトシンを０．０５単位注射した麻酔されたマウスか
ら、乳汁試料（５０−２００μｌ）を採取する。乳房触
診で補助し、乳汁をガラスキャピラリーに集める。続い
て、融合タンパク質を、ＨＰＣ−４抗体に結合させるこ
とによって単離する。 【００５０】（ＨＰＣ−４抗体エピトープを用いる精
製）抗体は、融合タンパク質の精製および単離のために
種々の基質に結合され得、この基質としてアガロース、
アクリルアミドおよび他のタイプの通常のクロマトグラ
フィー用樹脂、フィルター等が挙げられる。これらの材
料は、それらにタンパク質を結合させる方法と同様に、
当業者に公知である。材料の選択は、かなりの部分、精
製規模あるいは分析すべき試料、および、生体適合性、
ならびに、最終産物が薬学用途に関する場合は政府機関
の認可に依存する。 【００５１】（プロテアーゼ切断部位）最も好ましい実
施態様において、融合タンパク質は、エピトープと単離
されるべきタンパク質との間にプロテアーゼ切断部位を
有する。好適な部位は、Ｘａ因子によって切断される配
列：ＩｌｅＧｌｕＧｌｙＡｒｇ （ＩＥＧＲ）、エンテ
ロキナーゼによって切断される配列：ＡｓｐＡｓｐＡｓ
ｐＡｓｐＬｙｓ （ＤＤＤＤＫ）、およびトロンビンに
よって切断される配列：Ｐｈｅ／ＧｌｙＰｒｏＡｒｇ
（Ｆ／ＧＰＲ）を有する。 【００５２】ＨＰＣ−４を用いた精製に続いて、融合タ
ンパク質を、適当な酵素で処理をして所望のタンパク質
から結合ペプチドを切断する。 【００５３】本発明は、下記の実施例を参考にすること
によりさらに理解されるが、これらには限定されない。 【００５４】 【実施例】（実施例１：融合切断組織因子の発現のため
のベクターの構築。）血液凝固は、血小板凝集の誘起お
よびフィブリノーゲンから、血小板プラグを安定化する
フィブリンへの開裂をするタンパク質分解酵素であるト
ロンビンの産生の結果起こる。血液中で循環している数
多くの前駆酵素および前駆因子は、この過程において、
それらが連続的あるいは一斉に活性型に転換されるいく
つかの段階を通して相互作用し、最終的に、Ｖａ因子、
カルシウムイオン、および血小板の存在下で、活性化し
たＸ因子（ｆＸａ）によってプロトロンビンをトロンビ
ンに活性化する。 【００５５】Ｘ因子は、それぞれ外因系および内因系経
路と呼ばれる２つの経路のどちらかによって活性化され
得る。内因系経路、すなわち表面介在活性化経路は、タ
ンパク質前駆体が切断されて活性なプロテアーゼを形成
する一連の反応からなり、これはＸＩＩ因子からＸＩＩ
ａ因子への活性化に始まり、この活性化はＸＩ因子をＸ
Ｉａ因子に転換し、この転換はＩＸ因子をカルシウムの
存在下でＩＸａ因子に転換する。ＩＸ因子はまた、外因
系経路を通して、組織因子（ＴＦ）が活性化ＶＩＩ因子
（ＶＩＩａ因子；ｆＶＩＩａ）と協同することによって
活性化され得る。活性化ＩＸ因子は、カルシウム、リン
脂質（血小板）、およびＶＩＩＩａ因子の存在下で、Ｘ
因子をＸａ因子に活性化する。 【００５６】生理学的には、凝固における主経路は、外
因系で、その中心となる段階はＶＩＩ因子のＶＩＩａ因
子への活性化だと考えられている。凝固アッセイ、およ
び、他のＶＩＩ因子からＶＩＩａ因子への転換を測定す
るために設計された活性アッセイは、通常、ＶＩＩａ因
子の凝固活性に必要とされるコファクターであるＴＦを
使用する必要がある。最も一般的には、ＴＦは、トロン
ボプラスチンとして知られる比較的粗製の調製物として
供給される。組織因子は、タンパク質およびリン脂質成
分を有する必須の膜糖タンパク質である。それは様々な
組織および種から単離され、４２，０００および５３，
０００の分子質量を有することが報告されている。組織
因子をコードするＤＮＡおよびこのタンパク質を発現す
る方法は、例えば、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ， Ｉｎｃ．に
よる欧州特許出願第０ ２７８７７６号およびＪ．Ｈ．
ＭｏｒｒｉｓｓｅｙらによるＣｅｌｌ ５０，１２９−
１３５（１９８７）に現在報告されている。 【００５７】切形型組織因子（ｔＴＦ）のヌクレオチド
（配列番号２）およびアミノ酸（配列番号３）配列を下
記に示し、これは、下記のように１９９１年４月１０日
に出願された米国出願第０７／６８３，６８２号に記載
の配列から改変され、この技術は本明細書中で援用され
ている。切形型組織因子タンパク質は、組織因子の予想
された膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインを欠いてい
る。切形型組織因子と野生型組織因子との間の本質的な
違いは、切形型組織因子はリン脂質膜表面にもはやつな
がらないことである。可溶性組織因子は、活性化ＶＩＩ
因子（ＦＶＩＩ）のためのコファクターであって、前駆
体であるＶＩＩ因子（ＦＶＩＩ）のコファクターではな
い。天然の組織因子はＦＶＩＩおよびＦＶＩＩａのコフ
ァクターである。 【００５８】下記のアミノ酸およびヌクレオチド配列
は、切形型組織因子の可溶形をコードする。ヌクレオチ
ド配列に、続き番号を左に付ける。アミノ酸配列は、ヌ
クレオチド配列の上に、標準の一文字コードを用いて示
され、Ｍｏｒｒｉｓｓｅｙら、Ｃｅｌｌ ５０，１２９
−１３５（１９８７）によって報告された成熟組織因子
タンパク質の番号付けに従って右に番号付けされてい
る。５’末端のＳｍａＩ部位および３’末端のＸｂａＩ
部位には下線を付す。ＳｍａＩ部位の最初の３個のヌク
レオチドは、制限酵素であるＳｍａＩで消化により除去
される。これは、ｔＴＦ ｃＤＮＡクローンのリーディ
ングフレームを保存するような様式で、ｔＴＦ ｃＤＮ
Ａ配列を、ｐＩＮ−ＩＩＩ−ｐｅｌＢ−ＨＰＣ−４発現
ベクターのＳｔｕＩ部位に平滑末端で連結させる。 【００５９】 【化１】 （ｐＩＮ−ＩＩＩ−ｐｅｌＢ発現ベクターの構築：）こ
のベクターは、ｐＩＮ−ＩＩＩ−ｏｍｐＡ 由来である
（Ｊｏｈｎ Ｇｈｒａｙｅｂら、ＥＭＢＯ Ｊ． ３
（１０）：２４３７−２４４２ （１９８４））。Ｘｂ
ａＩおよびＢａｍＨＩを有するｐＩＮ−ＩＩＩ−ｏｍｐ
Ａの切断により、Ｓｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ配列Ｇ
ＡＧＧを含むＤＮＡフラグメント、およびｏｍｐＡシグ
ナルペプチドをコードするヌクレオチド配列の全体が除
去される。図１に示すように、８つの重複オリゴヌクレ
オチド（４つのセンスおよび他の４つの相補的なアンチ
センス）を連結して、ｐｅｌＢシグナルペプチドを表す
２２残基長のペプチドをコードするオリゴヌクレオチド
配列が後続し、欠失しているＳｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒ
ｎｏ配列を含むＤＮＡフラグメントを合成した（Ｓａｈ
ｕ−Ｐｉｎｇ Ｌｅｉら、Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．
１６９（９）：４３７９−４３８３、１９８７）（ア
ミノ酸 −２２から−１）（配列番号４）。 【００６０】ＥｃｏＲＩ制限部位は、２つの余分な残基
Ｇｌｕ、Ｐｈｅ（＋１および２）をコードするｐｅｌＢ
リーダー配列の直後で、このＤＮＡフラグメント中に含
有される。ＤＮＡフラグメント（配列番号５）はまた、
１２アミノ酸残基長のペプチド（残基３〜１４）をコー
ドし、このペプチドはＣａ＋＋依存モノクローナル抗体
ＨＰＣ−４のエピトープである。ＥｃｏＲＩ制限部位
は、ＨＰＣ−４エピトープをｐｅｌＢシグナルペプチド
から分離する。エピトープをコードするヌクレオチドの
後に、４つのアミノ酸残基Ｉｌｅ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、お
よびＡｒｇをコードするヌクレオチドが存在し、Ｘａ因
子切断部位（配列番号６）を形成する。 【００６１】このベクター中へ標的遺伝子をクローニン
グして発現させるために用いるいくつかの制限酵素部位
を含む配列が、Ｘａ因子切断部位の後に続く。図１に示
したように、このＤＮＡフラグメントは、ｐＩＮ−ＩＩ
Ｉ−ｏｍｐＡのＸｂａＩおよびＢａｍＨＩ部位に連結す
るためにＸｂａＩの粘着末端を５’末端に、そしてＢａ
ｍＨＩ粘着末端を３’末端に含有する。ｐＩＮ−ＩＩＩ
−ｐｅｌＢの複合クローニング部位は、ＳｔｕＩ、Ｎｏ
ｔ Ｉ、ＨｉｎｄＩＩＩ、およびＢａｍＨＩを含有す
る。ＳｔｕＩは、６ｂｐ平滑末端カッターであり、その
認識部位はＡＧＧＣＣＴである；それがこの部位を切断
する際に、３つのヌクレオチド、ＡＧＧをＤＮＡフラグ
メントの３’末端に残し、これはＦＸａ切断部位の最後
の残基であるＡｒｇをコードする。従って、ＳｔｕＩを
有するこのベクターおよび他の３’末端クローニング部
位（ＮｏｔＩまたはＨｉｎｄＩＩＩあるいはＢａｍＨ
Ｉ）のうちのいずれかの二重消化は、発現に適する標的
遺伝子の指向性クローニング（ｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌ
ｃｌｏｎｉｎｇ）を提供する。 【００６２】ｐｅｌＢリーダーペプチド（アミノ酸 −
２２から−１）（配列番号４）；ＨＰＣ−４エピトープ
（アミノ酸 ＋３から１４）（配列番号１）；およびＦ
Ｘａ切断部位（アミノ酸 １５から１８）（配列番号
６）をコードする合成ＤＮＡフラグメントのオリゴヌク
レオチド配列を、以下に示す。Ｓｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａ
ｒｎｏ配列ＧＡＧＧ（Ｓ−Ｄ）を、上線で示す。クロー
ニングに有効な制限酵素部位を、下線で示し、それはＥ
ｃｏＲＩ（２つの余分なアミノ酸＋１および＋２を作り
出すｐｅｌＢリーダー配列とＨＰＣ−４エピトープとの
間）、ＳｔｕＩ、ＮｏｔＩ、およびＨｉｎｄＩＩＩであ
る。細菌シグナルペプチドによって切断したｐｅｌＢリ
ーダーペプチド切断部位を、矢印で示す。このＤＮＡフ
ラグメントは、８つの重複オリゴヌクレオチドの連結に
より形成された結果、ｐＩＮ−ＩＩＩ−ｏｍｐＡベクタ
ーのＸｂａＩおよびＢａｍＨＩ部位へ連結するために
５’末端に粘着ＸｂａＩ部位を、そして３’末端に粘着
ＢａｍＨＩ部位を有する。センス鎖と下の相補的なアン
チセンス鎖のオリゴヌクレオチドとの境界を、太字で示
す。 【００６３】 【化２】 （ｐＩＮ−ＩＩＩ−ｐｅｌＢ−ｔＴＦの構築：）ｐＩＮ
−ＩＩＩ−ｐｅｌＢ−ｔＴＦの構築を、図２に図式化し
て示す。ｐＪＨ２７は、ベクターｐＧＥＭ−７Ｚｆ
（＋）（Ｐｒｏｍｅｇａ）のＢａｍＨＩとＸｂａＩ制限
部位との間でクローン化した完全な切形型組織因子（ｔ
ＴＦ）ｃＤＮＡ配列を含むプラスミドである。ｐＩＮ−
ＩＩＩ−ｐｅｌＢ発現ベクター中のクローニング部位と
適合する５’および３’末端を有するｔＴＦ ｃＤＮＡ
フラグメントの調製は、２段階の工程で行った。最初の
段階でプラスミドｐＪＨ２７を、ＢｂｖＩ制限酵素で消
化し、ＤＮＡ配列をｔＴＦシグナルペプチドおよび飽和
ｔＴＦタンパク質の最初の１１残基をコードするｃＤＮ
Ａの５’末端から切断して除いた。ｔＴＦ遺伝子を修復
するために、１１の欠失した残基をコードし、平滑な半
−ＳｍａＩ部位を５’末端を形成している２つの相補的
なオリゴヌクレオチドを合成した。このオリゴヌクレオ
チドは、ＢｂｖＩによって作られたｔＴＦｃＤＮＡ配列
の粘着末端にハイブリダイズすることで連結し得る粘着
末端を含有する。 【００６４】第２段階で、改変したｃＤＮＡ挿入物を、
ｐＪＨ２７から、ＸｂａＩを用いる消化により除去し、
その挿入物をアガロースゲル電気泳動法により分離し、
そして溶離してアガロースゲルから精製した。生成した
完全なｔＴＦをコードするｃＤＮＡフラグメントを、ｐ
ＵＣ１９プラスミドのＳｍａＩおよびＸｂａＩ部位にサ
ブクローニングした。図２に示すように、次いでｔＴＦ
ｃＤＮＡフラグメントを、ｐＵＣ１９からＳｍａＩお
よびＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素を用いて除去し、そしてｐ
ＩＮ−ＩＩＩ−ｐｅｌＢ発現ベクターのＳｔｕＩおよび
ＨｉｎｄＩＩＩ部位にサブクローニングした。 【００６５】（実施例２：融合タンパク質の発現および
単離。）細胞周辺抽出物のための細菌の増殖： Ｅ．
ｃｏｌｉのＸＬ１−Ｂ株を３７℃でＬＢ培地中で増殖し
た。一晩培養物のうちの５００μｌを、２５ｍｌのＬＢ
および１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有する１２
５ｍｌのフラスコに移した。そのフラスコを３７℃で２
〜３時間、ＯＤ６００が０．６〜０．７に等しくなるま
で振盪した。アンピシリン（Ａｍｐ）を含有する１リッ
トルのＬＢ培地に、全２５ｍｌの細菌培養物を接種し、
そして３７℃でＯＤ６００＝０．６〜０．７になるまで
振盪を続けた。次いで培養を、１ｍＭ イソプロピル−
β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）で誘導
し、そして振盪をさらに８時間、室温で続けた。細菌培
養物を、約３０００ｒｐｍで２０分間、遠心分離にか
け、培地を細胞から分離した。細胞のペレットを、５０
ｍｌの冷水で再懸濁させ、１／２時間氷上で振盪しなが
らインキュベートした。次いで細胞周辺抽出物を、１
０，０００ｇで１／２時間回転させて集めた。 【００６６】タンパク質の約３／４が、Ｅ． ｃｏｌｉ
の培地中で発現し、そして１／４が、低張ショックによ
り細胞周辺腔から回収された。細胞周辺抽出物を、（上
記のように遠心分離により浄化した）培地と混合し、そ
してその混合物を、３０００ＭＷカットオフメンブラン
（Ａｍｉｃｏｎ）を有する限外濾過螺旋カートリッジ濃
縮装置（ｕｌｔｒａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ ｓｐｉｒａ
ｌ ｃａｒｔｒｉｄｇｅ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ）
を用いて最初の量の約１／１０に濃縮した。濃縮の次
に、この物質を０．１ＭのＮａＣｌ、０．０２ＭのＴｒ
ｉｓおよび１ｍＭの塩化カルシウムに入れ、そして同様
の緩衝液（Ａｆｆｉ−ＧｅｌＴＭ １０で固定した５ｍ
ｇ／ｍｌのＨＰＣ−４ ＩｇＧ；全部で４ｍｌを、１リ
ットルの出発細菌培養物に用いた）で平衡化したＨＰＣ
−４カラムにかけ、約２００ｍｌの１Ｍ ＮａＣｌ、１
ｍＭのＣａＣｌ２を含有するｐＨ ７．５の０．０２Ｍ
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌで洗浄し、続いて約１０〜２０ｍｌ
の同様の、ただし０．１ＭのＮａＣｌを含まない緩衝液
で洗浄し、そしてタンパク質を０．１Ｍ ＮａＣｌ、
０．０２Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、５ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐ
Ｈ ７．５で溶離した。カラムからのｔＴＦの溶離を２
８０ｎｍの光の吸収でモニターし；タンパク質の１本の
ピークを観察した。 【００６７】（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ：）アフィニティクロ
マトグラフィーからのピーク画分のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分
析（１０％アクリルアミドを用いるＬａｅｍｍｌｉ系、
Ｌａｅｍｍｌｉ、Ｎａｔｕｒｅ ２２７：６８０−６８
５（１９７０））は、図３に示すように、還元および非
還元の両方の状態で３０ｋｄあたりで１本のモノマー性
のバンドを示す。これはグリコシル化されない際のｔＴ
Ｆの予想分子量と一致する。 【００６８】約１ｍｇの可溶性組織因子を、１リットル
の出発細菌培養物から回収し、そしてそれは、ＳＤＳゲ
ル電気泳動により分かるように均一である。組織因子
は、ジスルフィド結合が還元されなくても、ゲル中でモ
ノマーとして働く。この様式で単離した可溶性の切形型
組織因子タンパク質は、ＨＰＣ−４エピトープが除去さ
れないときでさえ、ＶＩＩａ因子に対して完全な補因子
活性を有する；この活性は、図４で示したように、哺乳
動物細胞で発現されるＨＰＣ−４エピトープを有さない
切形型組織因子のものに等しい。 【００６９】そのタンパク質は、哺乳動物の細胞培養物
内で発現されたタンパク質に機能的に等価であるが、そ
のコストは１０％未満である。この機能的等価性は、Ｘ
因子活性化に依存するＶＩＩａ因子濃度、および両方の
供給源由来の組織因子の、ＶＩＩａ因子アミド溶解活性
（ａｍｉｄｏｌｙｔｉｃ ａｃｔｉｖｉｔｙ）を同等に
増加する能力によって証明される。 【００７０】（実施例３：ＨＰＣ−４エピトープと組み
合わせた融合タンパク質技術を用いた他のタンパク質の
単離。）これらのタンパク質のアミノ末端領域に連結す
るエピトープを有するトロンボモジュリンフラグメン
ト、Ｘ因子のＥＧＦドメインおよびタンパク質ＣのＥＧ
Ｆドメインを、他のＥ． ｃｏｌｉ細胞周辺腔発現系で
発現させ、そこから回収した。第４〜第６のＥＧＦドメ
インのトロンボモジュリンのフラグメントをまた、上述
のように抗体カラムの一段階精製で、培養哺乳動物細胞
から単離した。この場合、トロンボモジュリン第４〜第
６ＥＧＦドメインをコードするＤＮＡを、ＰＣＲにより
ｃＤＮＡから増幅し、そしてＨＰＣ−４エピトープおよ
びＸａ切断部位が後に続くトランスフェリンシグナルペ
プチドをコードする合成オリゴヌクレオチドに連結し
た。生じるＤＮＡフラグメントを、ヒト２９３細胞中で
発現させるために、ｐＲＣ／ＲＳＶ哺乳動物細胞発現ベ
クター中にサブクローニングした。 【００７１】本明細書中に記載した方法および組成物の
改変および変更は、前述の詳細な説明より当業者に明白
である。そのような改変および変更が、請求の範囲内に
なることを意図する。 【００７２】 【発明の効果】本発明によれば、１回のクロマトグラフ
ィー工程により、精製されたタンパク質、特に血液凝固
タンパク質の単離を可能にする方法および手段が提供さ
れる。 【００７３】 【配列表】 【００７４】 【表１】
ｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ）
からの認可により、認可番号Ｒ０１ ＨＬ４４２２５お
よびＲ０１ ＨＬ２９８０７により、本発明における権
利を有する。 【０００２】 【発明の属する技術分野】本発明は、一般に、組換え技
術およびプロテインＣチモーゲンに特異的なモノクロー
ナル抗体の特有のエピトープを用いて、タンパク質、特
に血液凝固タンパク質を精製する方法の領域にある。 【０００３】 【従来の技術】タンパク質を精製する方法は長年使用さ
れてきており、そしてそれらの方法は、一般に、クロマ
トグラフィー法（例えば、イオン交換クロマトグラフィ
ー、分子量ふるい法、高圧液体クロマトグラフィー、ア
フィニティクロマトグラフィー）、および電気泳動法
（例えば、アガロースまたはアクリルアミドゲルの電気
泳動法、および等電点電気泳動法）に分けられ得る。こ
れらの方法のすべてに共通な不利な点は、出発物質がい
くつかの工程を通過して、所望の材料が実質的に純度の
高いところまで不純物を除去することをこれらの方法が
要求するということである。 【０００４】免疫アフィニティクロマトグラフィーにお
いて、所望のタンパク質または他の分子に対する抗体
が、クロマトグラフィーの基質上に固定化され、タンパ
ク質混合物が、その抗体をタンパク質に結合させる条件
下で基質に加えられ、非結合物質が洗浄により除去さ
れ、そして結合したタンパク質が、例えば、高ｐＨまた
は低ｐＨの、タンパク変性剤またはカオトロープを用い
て溶離される。最後に溶離された物質は、実質的に純度
の高いタンパク質であり、それは完全な生物活性をしば
しば欠いている。 【０００５】この方法の変法は、１９９１年７月１２日
付けで出願された米国特許出願第０７／７３０，０４０
号に記載され、これはＣｈａｒｌｅｓ Ｔ． Ｅｓｍｏ
ｎおよびＮａｏｍｉ Ｌ． Ｅｓｍｏｎによる１９８８
年１２月３０日付けで出願された「プロテインＣに対す
るモノクローナル抗体」というタイトルの米国特許出願
第０７／２９２，４４７号の継続出願であり、モノクロ
ーナル抗体のＨＰＣ−４の特性を開示している。ＨＰＣ
−４と呼ばれるモノクローナル抗体を分泌するハイブリ
ドーマ細胞系は、アメリカンタイプカルチャーコレクシ
ョン（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ
Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）， Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ， Ｍ
Ｄに１９８８年１１月２日に寄託され、そしてＡＴＣＣ
番号 ＨＢ９８９２で受託された。この寄託は、特許の
認可により公に入手可能である。 【０００６】ＨＰＣ−４は、活性化プロテインＣ（ＡＰ
Ｃ）ではなく、プロテインＣに結合し、そしてカルシウ
ムの存在下でのみ結合する。従って、抗体がアフィニテ
ィ支持体上に固定化されるとき、プロテインＣは、血漿
由来源または極めて穏やかな条件下での組織培養発現系
のいずれかから単離され得る。これは、生成物の生物活
性および固体支持体樹脂の安定性を維持する上で重要で
ある。活性化プロテインＣはどんな条件下でも結合しな
いので、得られた精製物はＡＰＣを全く含まない。 【０００７】抗体は、プロテインＣ分子の限定された領
域に結合し、その領域は、重鎖の残基６位と１７位の
間、特異的には、Ｅ Ｄ Ｑ Ｖ Ｄ Ｐ Ｒ Ｌ Ｉ
ＤＧ Ｋ、の中に含まれる。このペプチドは、固体支
持体樹脂上に直接に固定化され得、そしてマウス腹水ま
たは組織培養上清液から高濃度で抗体を単離するために
用いられ得る。この方法は、たとえ非常に希釈された溶
液からでさえも、抗体を非常に純度の高い形態で高収率
で単離することを可能にする。抗体は、カルシウムイオ
ンの除去あるいは所望ならば、１．５ Ｍグアニジンの
いずれかにより、固体支持体ペプチドから除去され得、
そしてグアニジンは精製されたモノクローナル抗体の機
能に影響を及ぼさない。 【０００８】ＨＰＣ−４と組み合わせてプロテインＣエ
ピトープを用いる精製方法は、他のタンパク質、特に血
液凝固タンパク質の精製に適用され得る場合有利であ
る。完全に異なる抗体を用いるそのようなある種のシス
テムは、Ｐｒｉｃｋｅｔｔら，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕ
ｅｓ ７（６）， ５８０−５８９ （１９８９）に記
載され、Ｃａ２＋配位に用いられるエンテロキナーゼ部
位のいくつかを認識するカルシウム依存性抗体を用いて
おり、そしてそのエンテロキナーゼ部位のいくつかは、
５８３頁の図４および５８６頁の表Ｉから示される残基
１、２、３、４、および７位を含んでいる。この配列
は、単離されるべきタンパク質のＮ末端に結合し、次い
でウロキナーゼでの処理により除去される。 【０００９】 【発明が解決しようとする課題】従って、本発明の目的
は、１回のクロマトグラフィー工程により、精製された
タンパク質、特に血液凝固タンパク質の単離を可能にす
る方法および手段を提供することである。 【００１０】さらなる目的は、モノクローナル抗体によ
り特異的に結合するアミノ酸配列を有する組換えタンパ
ク質を提供することである。 【００１１】 【課題を解決するための手段】本発明は、ＨＰＣ−４と
呼ばれ、アメリカンタイプカルチャーコレクション、Ｒ
ｏｃｋｖｉｌｌｅ， ＭＤ，に、１９８８年１１月２日
に寄託され、そしてＡＴＣＣ番号ＨＢ ９８９２として
受託されたモノクローナル抗体によってカルシウムの存
在下で結合したエピトープ、および融合タンパク質とＨ
ＰＣ−４抗体との結合により単離されるべきタンパク
質、を含む、融合タンパク質に関する。 【００１２】１つの実施形態において、前記エピトープ
が、１２個のアミノ酸配列Ｅ ＤＱ Ｖ Ｄ Ｐ Ｒ
Ｌ Ｉ Ｄ Ｇ Ｋからなる。 【００１３】１つの実施形態において、前記エピトープ
と前記単離されるべきタンパク質との間に、特異的なプ
ロテアーゼ切断部位をさらに含む。 【００１４】１つの実施形態において、前記プロテアー
ゼ切断部位が、Ｘａ因子によって特異的に切断されるア
ミノ酸配列：Ｉｌｅ Ｇｌｕ Ｇｌｙ Ａｒｇ （ＩＥ
ＧＲ）、エンテロキナーゼによって特異的に切断される
アミノ酸配列：Ａｓｐ Ａｓｐ Ａｓｐ Ａｓｐ Ｌｙ
ｓ （ＤＤＤＤＫ）、およびトロンビンによって特異的
に切断されるアミノ酸配列：Ｐｈｅ／Ｇｌｙ Ｐｒｏ
Ａｒｇ （Ｆ／ＧＰＲ）からなる群より選択される。 【００１５】１つの実施形態において、前記単離される
べきタンパク質が、組織因子およびトロンボモジュリン
４−６からなる群より選択される。 【００１６】１つの実施形態において、Ｎ末端が１２個
のアミノ酸配列Ｅ Ｄ Ｑ Ｖ ＤＰ Ｒ Ｌ Ｉ Ｄ
Ｇ Ｋ、Ｘａ因子によって特異的に切断されるアミノ
酸配列、および組織因子から本質的になる。 【００１７】１つの実施形態において、前記組織因子
が、可溶性組織因子である。 【００１８】別の局面において、本発明は、エピトープ
およびタンパク質を含む融合タンパク質をコードする単
離された核酸配列を提供し、この核酸配列は、ＨＰＣ−
４と呼ばれ、アメリカンタイプカルチャーコレクショ
ン、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ， ＭＤ，に、１９８８年１１
月２日に寄託され、そしてＡＴＣＣ番号ＨＢ ９８９２
として受託されたモノクローナル抗体によってカルシウ
ムの存在下で結合したエピトープ、および融合タンパク
質とＨＰＣ−４抗体との結合により単離されるべきタン
パク質、を含む融合タンパク質をコードする。 【００１９】１つの実施形態において、前記エピトープ
が、１２個のアミノ酸配列Ｅ ＤＱ Ｖ Ｄ Ｐ Ｒ
Ｌ Ｉ Ｄ Ｇ Ｋからなる。 【００２０】１つの実施形態において、前記エピトープ
と前記単離されるべきタンパク質との間に、特異的なプ
ロテアーゼ切断部位をさらに含む。 【００２１】１つの実施形態において、前記プロテアー
ゼ切断部位が、Ｘａ因子によって特異的に切断されるア
ミノ酸配列：Ｉｌｅ Ｇｌｕ Ｇｌｙ Ａｒｇ （ＩＥ
ＧＲ）、エンテロキナーゼによって特異的に切断される
アミノ酸配列：Ａｓｐ Ａｓｐ Ａｓｐ Ａｓｐ Ｌｙ
ｓ （ＤＤＤＤＫ）、およびトロンビンによって特異的
に切断されるアミノ酸配列：Ｐｈｅ／Ｇｌｙ Ｐｒｏ
Ａｒｇ （Ｆ／ＧＰＲ）からなる群より選択される。 【００２２】１つの実施形態において、前記単離される
べきタンパク質が、組織因子およびトロンボモジュリン
ＥＧＦドメイン４−６からなる群より選択される。 【００２３】１つの実施形態において、Ｎ末端が１２個
のアミノ酸配列Ｅ Ｄ Ｑ Ｖ ＤＰ Ｒ Ｌ Ｉ Ｄ
Ｇ Ｋ、Ｘａ因子によって特異的に切断されるアミノ
酸配列、および組織因子から本質的になる。 【００２４】１つの実施形態において、前記組織因子
が、可溶性組織因子である。 【００２５】１つの実施形態において、原核細胞、酵母
細胞、および哺乳動物細胞からなる群より選択される細
胞中で発現するためのベクター内に挿入される。 【００２６】別の局面において、本発明は、ＨＰＣ−４
と呼ばれ、アメリカンタイプカルチャーコレクション、
Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ， ＭＤ，に、１９８８年１１月２
日に寄託され、そしてＡＴＣＣ番号ＨＢ ９８９２とし
て受託されたモノクローナル抗体にカルシウムの存在下
で結合するアフィニティによって精製され得るタンパク
質を製造する方法を提供し、この方法は、ＨＰＣ−４に
よってカルシウムの存在下で結合するエピトープ、およ
び単離されるべきタンパク質を含む融合タンパク質を発
現する工程を包含し、該融合タンパク質が、該タンパク
質をコードする配列由来であり、該配列が発現系におけ
るベクター内に挿入される。 【００２７】１つの実施形態において、前記発現系が、
培養中の、真核細胞、酵母細胞および哺乳動物細胞から
なる群より選択される。 【００２８】１つの実施形態において、前記エピトープ
と前記単離されるべきタンパク質との間に、前記融合タ
ンパク質における選択的なプロテアーゼ切断部位を発現
する工程をさらに包含する。 【００２９】１つの実施形態において、カルシウムの存
在下で、前記タンパク質と固定化されたＨＰＣ−４抗体
とを結合することによって前記融合タンパク質を単離す
る工程、該固定化されたＨＰＣ−４抗体をカルシウム含
有溶液で洗浄することによって非結合タンパク質を除去
する工程、および結合した融合タンパク質からカルシウ
ムを除去する溶液で該固定化されたＨＰＣ−４抗体を洗
浄することによって該固定化ＨＰＣ−４抗体から該融合
タンパク質を溶離する工程をさらに包含する。 【００３０】１つの実施形態において、前記融合タンパ
ク質から前記ＨＰＣ−４エピトープを除去する工程をさ
らに包含する。 【００３１】１つの実施形態において、前記融合タンパ
ク質が、前記エピトープと前記単離されるべきタンパク
質との間に特異的なプロテアーゼ切断部位を含み、遊離
であるかまたは固定化されたプロテアーゼを用いて、該
単離されるべきタンパク質から該エピトープを切断する
工程をさらに包含する。 【００３２】１つの実施形態において、前記単離される
べきタンパク質が、組織因子およびトロンボモジュリン
からなる群より選択される。 【００３３】１つの実施形態において、前記プロテアー
ゼが、Ｘａ因子、エンテロキナーゼおよびトロンビンか
らなる群より選択される。 【００３４】「ＨＰＣ−４」と呼ばれる特異的モノクロ
ーナル抗体を用いて、溶液から迅速に単離され得る形態
のいかなるタンパク質をも製造する方法が開示されてい
る。ＨＰＣ−４は、カルシウムを組み合わせて認識され
るプロテインＣチモーゲンの１２個のアミノ酸のエピト
ープに結合する。エピトープと単離されるべきタンパク
質との融合タンパク質を形成し得ること、およびＨＰＣ
−４ベースのアフィニティクロマトグラフィーを用いて
そのタンパク質を単離し得ることが、現在確定されてい
る。好ましい実施態様においては、特異的なプロテアー
ゼ切断部位は、エピトープとタンパク質との間に挿入さ
れ、その結果、そのエピトープは単離されたタンパク質
から容易に除去され得る。最も好ましい実施態様におい
ては、融合タンパク質は、適切なベクター内に挿入され
た組換え遺伝子の発現により形成される。 【００３５】１つの例においては、プロテインＣチモー
ゲン（「ＨＰＣ−４」）に特異的な抗体によりカルシウ
ムと組み合わせて認識される、プロテインＣチモーゲン
の１２個のアミノ酸のエピトープと、Ｘａ因子切断部位
とを含む機能的に活性な可溶性組織因子は、適切な原核
生物または真核生物の発現系内に挿入されるベクターか
ら発現された。組換え可溶性組織因子は、適切な基質上
に固定化されたＨＰＣ−４モノクローナル抗体を用い
て、１回のクロマトグラフィー工程で迅速に単離され得
る。一旦単離されると、プロテインＣエピトープは、Ｘ
ａ因子で切断することにより除去され、機能的に活性な
可溶性組織因子を残す。 【００３６】 【発明の実施の形態】ＨＰＣ−４抗体を用いてアフィニ
ティクロマトグラフィーにより簡単に単離された融合タ
ンパク質は、１２個のアミノ酸のＨＰＣ−４エピトープ
をコードするＤＮＡ配列をベクター内に挿入し、続いて
単離されるべきタンパク質をコードする遺伝子を挿入す
ることにより調製される。好ましい実施態様において、
特異的なプロテアーゼ切断部位は、ベクター内のエピト
ープとタンパク質コード配列との間に挿入され、その結
果、得られた融合タンパク質は容易に切断されて、エピ
トープペプチドおよび所望のタンパク質を生じる。 【００３７】以下の限定されない実施例において、ＨＰ
Ｃ−４の１２個のアミノ酸残基のエピトープをコードす
る核酸配列は、発現タンパク質が、ＨＰＣ−４エピトー
プ、続いてＸａ因子切断部位、そして次いでシグナルペ
プチド、細胞質ゾルの尾部分、および膜の両側にわたる
削除されるドメインを有していた組織因子のアミノ末端
を含むような方向に、発現ベクター内に挿入される。 【００３８】（ＨＰＣ−４モノクローナル抗体）ＨＰＣ
−４抗体およびその使用は、１９９１年７月１２日付け
で出願された米国特許出願第０７／７３０，０４０号に
記載され、これはＣｈａｒｌｅｓ Ｔ．Ｅｓｍｏｎおよ
びＮａｏｍｉ Ｌ． Ｅｓｍｏｎによる１９８８年１２
月３０日付けで出願された「プロテインＣに対するモノ
クローナル抗体」というタイトルの米国特許出願第０７
／２９２，４４７号の継続出願であり、その教示は、本
明細書中に援用されている。ＨＰＣ−４モノクローナル
の特性の詳細な分析は、Ｓｔｅａｒｎｓら， 「Ｃａ２
＋依存性モノクローナル抗体とプロテインＣ活性化ペプ
チド領域との相互作用」， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅ
ｍ． ２６３，８２６−８３２ （１９８８）に述べら
れている。 【００３９】ＨＰＣ−４モノクローナル抗体は、プロテ
インＣの重鎖および Ｃａ２＋の活性化領域内に存在す
るペプチド配列に対して特異的である。このペプチド配
列は、１２個のアミノ酸、すなわちグルタミン酸−アス
パラギン酸−グルタミン−バリン−アスパラギン酸−プ
ロリン−アルギニン−ロイシン−イソロイシン−アスパ
ラギン酸−グリシン−リジン（Ｅ Ｄ Ｑ Ｖ Ｄ Ｐ
Ｒ Ｌ Ｉ Ｄ ＧＫ）（配列番号１）からなる。こ
の配列の利点は、この配列が合成により作られるには十
分短いが、特異性を与えるには十分長い、ということで
あり、これにより抗体と融合タンパク質以外のタンパク
質との可能性のある交差反応が回避される。 【００４０】抗体は、ペプチド結合部位に加えて少なく
とも１つの金属イオン結合部位を有すると思われる。ペ
プチド結合活性は、金属イオン結合部位での結合に、応
じているか、または「依存して」いる。金属イオン結合
部位は、カルシウムのような二価の金属陽イオン、ある
いはＴｂ３＋のような、同様のイオン半径および配位特
性を有する金属に結合し得る。ペプチドは、Ｃａ２＋を
結合せず、それゆえＣａ２＋結合部位は、融合タンパク
質に付加されない。これは、３頁に記載されるＰｒｉｃ
ｋｅｔｔの方法において潜在的に固有な単離マトリック
スとのＣａ２＋介在性相互作用を最小限にする。組織因
子の場合には、それはまた、ＶＩＩ因子（組織因子に対
するリガンド）に結合するカルシウムが、組織因子融合
タンパク質内の付加した金属結合部位による干渉（ｉｎ
ｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ）なしで研究され得ることを意味
する。 【００４１】カルシウムが抗体内で金属イオン結合部位
に結合する場合は、モノクローナル抗体はペプチドへの
結合に対して著しくさらに受容的になる。金属イオンが
モノクローナル抗体の金属イオン結合部位に結合しない
場合は、抗原結合部位は抗原の結合に対して比較的非受
容的である。従って、抗体−抗原結合は、抗体の周囲の
培地内の金属イオン濃度を変化させることにより制御さ
れ得る。 【００４２】（発現および精製されるべきタンパク質）
本明細書中に記載の方法は、融合タンパク質として発現
され、ＨＰＣ−４を用いて単離され、次いで純度の高い
タンパク質としてエピトープから分離され得るタンパク
質に関して限定はされない。 【００４３】（ベクターおよび発現系）ｐｅｌＢリーダ
ーペプチドＨＰＣ−４エピトープ、および、単離される
べきタンパク質、好ましくは特異的なプロテアーゼ切断
部位によって分離されるべきタンパク質をコードする配
列を発現するためのベクターが選択される。市販されて
いる好適な細菌発現ベクターの例としては、ｐｃＤＮＡ
ＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＃Ｖ４００−２０）、
ｐＮＨ８ａ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、＃２１５２０１）
およびｐＢＴａｃ１（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎ
ｈｅｉｍ、＃１０８１３６５）が挙げられる。Ｅ． ｃ
ｏｌｉのような細菌中で全長あるいは部分的なｃＤＮＡ
配列を発現するために、これらのベクターを用い、ここ
で発現されたタンパク質は、通常、細菌の細胞質中に封
入体と呼ばれる不溶性の沈殿として蓄積する。目的とす
るタンパク質を抽出するためには、高濃度（通常８Ｍ）
の尿素のようなカオトロピック剤が、封入体を溶解する
ために必要とされる。この過程は、タンパク質を変性さ
せるので、その結果、目的のタンパク質は不活性とな
る。活性のあるタンパク質を得るためには、通常制御す
ることが非常に非効率的で困難である折り畳み過程を必
要とする。市販されている哺乳動物発現ベクターの例と
して、ｐＲｃ／ＲＳＶ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ， ＃Ｖ
７８０−２０）、ｐＲｃ／ＣＭＶ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅ
ｎ ＃Ｖ７５０−２０）、およびｐＭＣ１Ｎｅｏ（Ｓｔ
ｒａｔａｇｅｎｅ ＃２１３２０１）が挙げられる。こ
れら発現ベクターは通常、哺乳動物細胞において組換え
タンパク質を高レベルで発現させ得る好適なプロモータ
ーを含有し、そして、これらはまた、自己のゲノムにこ
れらのベクターを統合した哺乳動物細胞を選択するため
に使用し得る薬剤耐性遺伝子も含有する。これらのベク
ターは、全長ｃＤＮＡおよび配列の５’末端にリーダー
ペプチドを有するあらゆる他のＤＮＡフラグメントの発
現に適している。これらの構築物は、好適な発現系、す
なわちＥ．ｃｏｌｉのような原核細胞あるいは酵母また
は哺乳動物細胞培養系のような真核細胞のいずれかに移
される。 【００４４】公知の方法論を用いて、タンパク質を産生
するためのトランスジェニック動物を生み出すために、
融合タンパク質をコードするｃＤＮＡを胚に挿入するこ
ともできる。組織特異的プロモーターをタンパク質をコ
ードする配列と組み合わせて使用することにより、特定
の組織でタンパク質の発現をし得る。例えば、Ｍａｎｉ
ａｔｉｓら、（１９８２）が記載するように、透析バッ
グ中の電気溶出に続いて、１％アガロースゲルで融合遺
伝子を単離する。溶離ＤＮＡを、沈殿させ、水に再溶解
させ、そして製造業者（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ ａｎｄ
Ｓｃｈｕｅｌｌ，Ｉｎｃ．，Ｋｅｅｎｅ，ＮＨ）の指
示に従ってｅｌｕｔｉｐ−Ｄカラムに通すことで精製す
る。精製ＤＮＡを、マイクロインジェクションするため
に、５ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ ７．４）および０．１ｍ
Ｍ ＥＤＴＡに３μｇ／ｍｌの濃度で溶解する。 【００４５】マウスあるいは他のウサギまたはヒツジの
ような好適な動物の胚を、販売業者から入手する。ウシ
血清アルブミン、ゼラチン、およびプロナーゼのような
試薬を、Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．， Ｓ
ｔ． Ｌｏｕｉｓ， ＭＯから入手する。過剰排卵用ホ
ルモン、ＰＭＳおよびｈＣＧを、Ｏｒｇａｎｏｎ，Ｉｎ
ｃ．， ＮＪから入手する。ヒアルロニダーゼを、Ｓｉ
ｇｍａから購入する。制限酵素を、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａ
ｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ， Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡから入
手する。前核にＤＮＡをマイクロインジェクションする
ために、Ｎａｒａ Ｓｈｉｇｅ， ＵＳＡ， Ｉｎ
ｃ．， Ｒａｉｎｉｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｃ
ｏ．， Ｗｏｂｕｒｎ， ＭＡ製のマイクロマニピュレ
ーターを使用し得る。ＤＭＥＭ、ウシ胎児血清、および
ＤＰＢＳは、ＧＩＢＣＯ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，
Ｇａｉｔｈｅｒｓｖｉｌｌｅ， ＭＤから入手し得
る。 【００４６】トランスジェニックマウスを構築するため
の、胚マニピュレーションおよびマイクロインジェクシ
ョンの手法は、Ｂ．Ｈｏｇａｎ、Ｆ．Ｃｏｓｔａｎｔｉ
ｎｉおよびＥ．Ｌａｃｙ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈ
ａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， １９８６）の
「マウス胚のマニピュレーション」に記載されている。
類似の方法が、他のトランスジェニック動物を生み出す
ために使用される。マウス接合体を、妊娠雌ウマ血清
（ＰＭＳ）に続いて、４８時間後にヒト絨毛性性腺刺激
ホルモンで過剰排卵させた６週才の雌から集める。準備
された雌を雄と一緒にし、翌朝、膣栓をチェックする。
発情している偽妊娠の雌を選択し、精管切除で不妊とな
った雄と一緒にし、そして受容体として用いた。接合体
を集め、そして丘細胞を、ヒアルロニダーゼ（１ｍｇ／
ｍｌ）で処理することによって除いた。雄と交配した雌
から前核胚を回収する。濾胞の成長を誘発するために妊
娠雌ウマ血清ＰＭＳ（５ＩＵ）で、そして排卵を誘発す
るためにヒト絨毛性性腺刺激ホルモンｈＣＧ（５１Ｕ）
で雌を処理する。胚をＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ修飾リン酸
緩衝生理食塩水（ＤＰＢＳ）中で回収し、そして１０％
ウシ胎児血清を添加したＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ修飾必須
培地（ＤＭＥＭ）に保持する。 【００４７】Ｎｉｋｏｎ ｄｉａｐｈｏｔ顕微鏡に取り
付けたＮａｒｉｓｈｉｇｅマイクロマニピュレーターを
用いて、マイクロインジェクションを行い得る。マイク
ロインジェクションするとき、油浸下で胚を、ＤＰＢＳ
の１００マイクロリットル滴量中に保つ。ＤＮＡ溶液
を、見える範囲で最も大きい雄性前核にマイクロインジ
ェクションする。インジェクションの成功を、前核の膨
張によってモニターする。インジェクション後直ちに、
胚を受容体である雌、すなわち精管切除を受けた雄のマ
ウスと交配した成熟マウスに移す。受容体である雌を、
２，２，２−トリブロモエタノールを用いて麻酔する。
腰付近を切開して輸卵管を露出させ、胚を輸卵管の膨大
領域に移す。体壁を縫合し、そして皮膚を傷クリップで
閉じる。受容体を識別するために耳にノッチを入れ、分
娩まで維持する。 【００４８】３週齢の時に約２から３ｃｍの長さの尾試
料を、ＤＮＡ分析にかける。尾試料を、０．７ｍｌの５
０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ ８．０、１００ｍＭ ＥＤＴ
Ａ、０．５％ＳＤＳおよび３５０μｇのプロテイナーゼ
Ｋの存在下に、５５℃で一晩インキュベートすることに
より消化する。消化物を、等量のフェノールで一回、そ
して等量のフェノール：クロロホルム（１：１混合物）
で一回抽出する。上清を、７０μｌの３Ｍの酢酸ナトリ
ウム（ｐＨ ６．０）と混合し、そして等量の１００％
エタノールを加えてＤＮＡを沈澱させる。ＤＮＡを、微
量遠心で遠沈し、７０％エタノールで１回洗浄し、乾燥
しそして１００μＬのＴＥ緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉ
ｓ、ｐＨ ８．０および１ｍＭ ＥＤＴＡ）に溶解す
る。１０から２０μｌのＤＮＡを、ＢａｍＨＩおよびＢ
ｇｌ１１またはＥｃｏＲＩで切断し、１％アガロースゲ
ル上で電気泳動し、ニトロセルロース紙上にブロッティ
ングし、そして３２Ｐ標識ＤＮＡ配列とハイブリダイズ
した。トランスジェニック動物を、オートラジオグラフ
ィーによって同定する。 【００４９】トランスジェニック雌を交配する。分娩後
５日めに、乳汁試料を採取し、そして融合タンパク質に
ついて検定した。トランスジェニック雄を、６から７週
才のときに交配する。同腹Ｆｌをトランスジェニック遺
伝子について分析する。陽性の雌を飼育し、５週才のと
きに交配する。分娩後５日めに、乳汁試料を融合タンパ
ク質について検定する。乳汁分泌の誘発因子であるオキ
シトシンを０．０５単位注射した麻酔されたマウスか
ら、乳汁試料（５０−２００μｌ）を採取する。乳房触
診で補助し、乳汁をガラスキャピラリーに集める。続い
て、融合タンパク質を、ＨＰＣ−４抗体に結合させるこ
とによって単離する。 【００５０】（ＨＰＣ−４抗体エピトープを用いる精
製）抗体は、融合タンパク質の精製および単離のために
種々の基質に結合され得、この基質としてアガロース、
アクリルアミドおよび他のタイプの通常のクロマトグラ
フィー用樹脂、フィルター等が挙げられる。これらの材
料は、それらにタンパク質を結合させる方法と同様に、
当業者に公知である。材料の選択は、かなりの部分、精
製規模あるいは分析すべき試料、および、生体適合性、
ならびに、最終産物が薬学用途に関する場合は政府機関
の認可に依存する。 【００５１】（プロテアーゼ切断部位）最も好ましい実
施態様において、融合タンパク質は、エピトープと単離
されるべきタンパク質との間にプロテアーゼ切断部位を
有する。好適な部位は、Ｘａ因子によって切断される配
列：ＩｌｅＧｌｕＧｌｙＡｒｇ （ＩＥＧＲ）、エンテ
ロキナーゼによって切断される配列：ＡｓｐＡｓｐＡｓ
ｐＡｓｐＬｙｓ （ＤＤＤＤＫ）、およびトロンビンに
よって切断される配列：Ｐｈｅ／ＧｌｙＰｒｏＡｒｇ
（Ｆ／ＧＰＲ）を有する。 【００５２】ＨＰＣ−４を用いた精製に続いて、融合タ
ンパク質を、適当な酵素で処理をして所望のタンパク質
から結合ペプチドを切断する。 【００５３】本発明は、下記の実施例を参考にすること
によりさらに理解されるが、これらには限定されない。 【００５４】 【実施例】（実施例１：融合切断組織因子の発現のため
のベクターの構築。）血液凝固は、血小板凝集の誘起お
よびフィブリノーゲンから、血小板プラグを安定化する
フィブリンへの開裂をするタンパク質分解酵素であるト
ロンビンの産生の結果起こる。血液中で循環している数
多くの前駆酵素および前駆因子は、この過程において、
それらが連続的あるいは一斉に活性型に転換されるいく
つかの段階を通して相互作用し、最終的に、Ｖａ因子、
カルシウムイオン、および血小板の存在下で、活性化し
たＸ因子（ｆＸａ）によってプロトロンビンをトロンビ
ンに活性化する。 【００５５】Ｘ因子は、それぞれ外因系および内因系経
路と呼ばれる２つの経路のどちらかによって活性化され
得る。内因系経路、すなわち表面介在活性化経路は、タ
ンパク質前駆体が切断されて活性なプロテアーゼを形成
する一連の反応からなり、これはＸＩＩ因子からＸＩＩ
ａ因子への活性化に始まり、この活性化はＸＩ因子をＸ
Ｉａ因子に転換し、この転換はＩＸ因子をカルシウムの
存在下でＩＸａ因子に転換する。ＩＸ因子はまた、外因
系経路を通して、組織因子（ＴＦ）が活性化ＶＩＩ因子
（ＶＩＩａ因子；ｆＶＩＩａ）と協同することによって
活性化され得る。活性化ＩＸ因子は、カルシウム、リン
脂質（血小板）、およびＶＩＩＩａ因子の存在下で、Ｘ
因子をＸａ因子に活性化する。 【００５６】生理学的には、凝固における主経路は、外
因系で、その中心となる段階はＶＩＩ因子のＶＩＩａ因
子への活性化だと考えられている。凝固アッセイ、およ
び、他のＶＩＩ因子からＶＩＩａ因子への転換を測定す
るために設計された活性アッセイは、通常、ＶＩＩａ因
子の凝固活性に必要とされるコファクターであるＴＦを
使用する必要がある。最も一般的には、ＴＦは、トロン
ボプラスチンとして知られる比較的粗製の調製物として
供給される。組織因子は、タンパク質およびリン脂質成
分を有する必須の膜糖タンパク質である。それは様々な
組織および種から単離され、４２，０００および５３，
０００の分子質量を有することが報告されている。組織
因子をコードするＤＮＡおよびこのタンパク質を発現す
る方法は、例えば、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ， Ｉｎｃ．に
よる欧州特許出願第０ ２７８７７６号およびＪ．Ｈ．
ＭｏｒｒｉｓｓｅｙらによるＣｅｌｌ ５０，１２９−
１３５（１９８７）に現在報告されている。 【００５７】切形型組織因子（ｔＴＦ）のヌクレオチド
（配列番号２）およびアミノ酸（配列番号３）配列を下
記に示し、これは、下記のように１９９１年４月１０日
に出願された米国出願第０７／６８３，６８２号に記載
の配列から改変され、この技術は本明細書中で援用され
ている。切形型組織因子タンパク質は、組織因子の予想
された膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインを欠いてい
る。切形型組織因子と野生型組織因子との間の本質的な
違いは、切形型組織因子はリン脂質膜表面にもはやつな
がらないことである。可溶性組織因子は、活性化ＶＩＩ
因子（ＦＶＩＩ）のためのコファクターであって、前駆
体であるＶＩＩ因子（ＦＶＩＩ）のコファクターではな
い。天然の組織因子はＦＶＩＩおよびＦＶＩＩａのコフ
ァクターである。 【００５８】下記のアミノ酸およびヌクレオチド配列
は、切形型組織因子の可溶形をコードする。ヌクレオチ
ド配列に、続き番号を左に付ける。アミノ酸配列は、ヌ
クレオチド配列の上に、標準の一文字コードを用いて示
され、Ｍｏｒｒｉｓｓｅｙら、Ｃｅｌｌ ５０，１２９
−１３５（１９８７）によって報告された成熟組織因子
タンパク質の番号付けに従って右に番号付けされてい
る。５’末端のＳｍａＩ部位および３’末端のＸｂａＩ
部位には下線を付す。ＳｍａＩ部位の最初の３個のヌク
レオチドは、制限酵素であるＳｍａＩで消化により除去
される。これは、ｔＴＦ ｃＤＮＡクローンのリーディ
ングフレームを保存するような様式で、ｔＴＦ ｃＤＮ
Ａ配列を、ｐＩＮ−ＩＩＩ−ｐｅｌＢ−ＨＰＣ−４発現
ベクターのＳｔｕＩ部位に平滑末端で連結させる。 【００５９】 【化１】 （ｐＩＮ−ＩＩＩ−ｐｅｌＢ発現ベクターの構築：）こ
のベクターは、ｐＩＮ−ＩＩＩ−ｏｍｐＡ 由来である
（Ｊｏｈｎ Ｇｈｒａｙｅｂら、ＥＭＢＯ Ｊ． ３
（１０）：２４３７−２４４２ （１９８４））。Ｘｂ
ａＩおよびＢａｍＨＩを有するｐＩＮ−ＩＩＩ−ｏｍｐ
Ａの切断により、Ｓｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ配列Ｇ
ＡＧＧを含むＤＮＡフラグメント、およびｏｍｐＡシグ
ナルペプチドをコードするヌクレオチド配列の全体が除
去される。図１に示すように、８つの重複オリゴヌクレ
オチド（４つのセンスおよび他の４つの相補的なアンチ
センス）を連結して、ｐｅｌＢシグナルペプチドを表す
２２残基長のペプチドをコードするオリゴヌクレオチド
配列が後続し、欠失しているＳｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒ
ｎｏ配列を含むＤＮＡフラグメントを合成した（Ｓａｈ
ｕ−Ｐｉｎｇ Ｌｅｉら、Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．
１６９（９）：４３７９−４３８３、１９８７）（ア
ミノ酸 −２２から−１）（配列番号４）。 【００６０】ＥｃｏＲＩ制限部位は、２つの余分な残基
Ｇｌｕ、Ｐｈｅ（＋１および２）をコードするｐｅｌＢ
リーダー配列の直後で、このＤＮＡフラグメント中に含
有される。ＤＮＡフラグメント（配列番号５）はまた、
１２アミノ酸残基長のペプチド（残基３〜１４）をコー
ドし、このペプチドはＣａ＋＋依存モノクローナル抗体
ＨＰＣ−４のエピトープである。ＥｃｏＲＩ制限部位
は、ＨＰＣ−４エピトープをｐｅｌＢシグナルペプチド
から分離する。エピトープをコードするヌクレオチドの
後に、４つのアミノ酸残基Ｉｌｅ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、お
よびＡｒｇをコードするヌクレオチドが存在し、Ｘａ因
子切断部位（配列番号６）を形成する。 【００６１】このベクター中へ標的遺伝子をクローニン
グして発現させるために用いるいくつかの制限酵素部位
を含む配列が、Ｘａ因子切断部位の後に続く。図１に示
したように、このＤＮＡフラグメントは、ｐＩＮ−ＩＩ
Ｉ−ｏｍｐＡのＸｂａＩおよびＢａｍＨＩ部位に連結す
るためにＸｂａＩの粘着末端を５’末端に、そしてＢａ
ｍＨＩ粘着末端を３’末端に含有する。ｐＩＮ−ＩＩＩ
−ｐｅｌＢの複合クローニング部位は、ＳｔｕＩ、Ｎｏ
ｔ Ｉ、ＨｉｎｄＩＩＩ、およびＢａｍＨＩを含有す
る。ＳｔｕＩは、６ｂｐ平滑末端カッターであり、その
認識部位はＡＧＧＣＣＴである；それがこの部位を切断
する際に、３つのヌクレオチド、ＡＧＧをＤＮＡフラグ
メントの３’末端に残し、これはＦＸａ切断部位の最後
の残基であるＡｒｇをコードする。従って、ＳｔｕＩを
有するこのベクターおよび他の３’末端クローニング部
位（ＮｏｔＩまたはＨｉｎｄＩＩＩあるいはＢａｍＨ
Ｉ）のうちのいずれかの二重消化は、発現に適する標的
遺伝子の指向性クローニング（ｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌ
ｃｌｏｎｉｎｇ）を提供する。 【００６２】ｐｅｌＢリーダーペプチド（アミノ酸 −
２２から−１）（配列番号４）；ＨＰＣ−４エピトープ
（アミノ酸 ＋３から１４）（配列番号１）；およびＦ
Ｘａ切断部位（アミノ酸 １５から１８）（配列番号
６）をコードする合成ＤＮＡフラグメントのオリゴヌク
レオチド配列を、以下に示す。Ｓｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａ
ｒｎｏ配列ＧＡＧＧ（Ｓ−Ｄ）を、上線で示す。クロー
ニングに有効な制限酵素部位を、下線で示し、それはＥ
ｃｏＲＩ（２つの余分なアミノ酸＋１および＋２を作り
出すｐｅｌＢリーダー配列とＨＰＣ−４エピトープとの
間）、ＳｔｕＩ、ＮｏｔＩ、およびＨｉｎｄＩＩＩであ
る。細菌シグナルペプチドによって切断したｐｅｌＢリ
ーダーペプチド切断部位を、矢印で示す。このＤＮＡフ
ラグメントは、８つの重複オリゴヌクレオチドの連結に
より形成された結果、ｐＩＮ−ＩＩＩ−ｏｍｐＡベクタ
ーのＸｂａＩおよびＢａｍＨＩ部位へ連結するために
５’末端に粘着ＸｂａＩ部位を、そして３’末端に粘着
ＢａｍＨＩ部位を有する。センス鎖と下の相補的なアン
チセンス鎖のオリゴヌクレオチドとの境界を、太字で示
す。 【００６３】 【化２】 （ｐＩＮ−ＩＩＩ−ｐｅｌＢ−ｔＴＦの構築：）ｐＩＮ
−ＩＩＩ−ｐｅｌＢ−ｔＴＦの構築を、図２に図式化し
て示す。ｐＪＨ２７は、ベクターｐＧＥＭ−７Ｚｆ
（＋）（Ｐｒｏｍｅｇａ）のＢａｍＨＩとＸｂａＩ制限
部位との間でクローン化した完全な切形型組織因子（ｔ
ＴＦ）ｃＤＮＡ配列を含むプラスミドである。ｐＩＮ−
ＩＩＩ−ｐｅｌＢ発現ベクター中のクローニング部位と
適合する５’および３’末端を有するｔＴＦ ｃＤＮＡ
フラグメントの調製は、２段階の工程で行った。最初の
段階でプラスミドｐＪＨ２７を、ＢｂｖＩ制限酵素で消
化し、ＤＮＡ配列をｔＴＦシグナルペプチドおよび飽和
ｔＴＦタンパク質の最初の１１残基をコードするｃＤＮ
Ａの５’末端から切断して除いた。ｔＴＦ遺伝子を修復
するために、１１の欠失した残基をコードし、平滑な半
−ＳｍａＩ部位を５’末端を形成している２つの相補的
なオリゴヌクレオチドを合成した。このオリゴヌクレオ
チドは、ＢｂｖＩによって作られたｔＴＦｃＤＮＡ配列
の粘着末端にハイブリダイズすることで連結し得る粘着
末端を含有する。 【００６４】第２段階で、改変したｃＤＮＡ挿入物を、
ｐＪＨ２７から、ＸｂａＩを用いる消化により除去し、
その挿入物をアガロースゲル電気泳動法により分離し、
そして溶離してアガロースゲルから精製した。生成した
完全なｔＴＦをコードするｃＤＮＡフラグメントを、ｐ
ＵＣ１９プラスミドのＳｍａＩおよびＸｂａＩ部位にサ
ブクローニングした。図２に示すように、次いでｔＴＦ
ｃＤＮＡフラグメントを、ｐＵＣ１９からＳｍａＩお
よびＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素を用いて除去し、そしてｐ
ＩＮ−ＩＩＩ−ｐｅｌＢ発現ベクターのＳｔｕＩおよび
ＨｉｎｄＩＩＩ部位にサブクローニングした。 【００６５】（実施例２：融合タンパク質の発現および
単離。）細胞周辺抽出物のための細菌の増殖： Ｅ．
ｃｏｌｉのＸＬ１−Ｂ株を３７℃でＬＢ培地中で増殖し
た。一晩培養物のうちの５００μｌを、２５ｍｌのＬＢ
および１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有する１２
５ｍｌのフラスコに移した。そのフラスコを３７℃で２
〜３時間、ＯＤ６００が０．６〜０．７に等しくなるま
で振盪した。アンピシリン（Ａｍｐ）を含有する１リッ
トルのＬＢ培地に、全２５ｍｌの細菌培養物を接種し、
そして３７℃でＯＤ６００＝０．６〜０．７になるまで
振盪を続けた。次いで培養を、１ｍＭ イソプロピル−
β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）で誘導
し、そして振盪をさらに８時間、室温で続けた。細菌培
養物を、約３０００ｒｐｍで２０分間、遠心分離にか
け、培地を細胞から分離した。細胞のペレットを、５０
ｍｌの冷水で再懸濁させ、１／２時間氷上で振盪しなが
らインキュベートした。次いで細胞周辺抽出物を、１
０，０００ｇで１／２時間回転させて集めた。 【００６６】タンパク質の約３／４が、Ｅ． ｃｏｌｉ
の培地中で発現し、そして１／４が、低張ショックによ
り細胞周辺腔から回収された。細胞周辺抽出物を、（上
記のように遠心分離により浄化した）培地と混合し、そ
してその混合物を、３０００ＭＷカットオフメンブラン
（Ａｍｉｃｏｎ）を有する限外濾過螺旋カートリッジ濃
縮装置（ｕｌｔｒａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ ｓｐｉｒａ
ｌ ｃａｒｔｒｉｄｇｅ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ）
を用いて最初の量の約１／１０に濃縮した。濃縮の次
に、この物質を０．１ＭのＮａＣｌ、０．０２ＭのＴｒ
ｉｓおよび１ｍＭの塩化カルシウムに入れ、そして同様
の緩衝液（Ａｆｆｉ−ＧｅｌＴＭ １０で固定した５ｍ
ｇ／ｍｌのＨＰＣ−４ ＩｇＧ；全部で４ｍｌを、１リ
ットルの出発細菌培養物に用いた）で平衡化したＨＰＣ
−４カラムにかけ、約２００ｍｌの１Ｍ ＮａＣｌ、１
ｍＭのＣａＣｌ２を含有するｐＨ ７．５の０．０２Ｍ
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌで洗浄し、続いて約１０〜２０ｍｌ
の同様の、ただし０．１ＭのＮａＣｌを含まない緩衝液
で洗浄し、そしてタンパク質を０．１Ｍ ＮａＣｌ、
０．０２Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、５ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐ
Ｈ ７．５で溶離した。カラムからのｔＴＦの溶離を２
８０ｎｍの光の吸収でモニターし；タンパク質の１本の
ピークを観察した。 【００６７】（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ：）アフィニティクロ
マトグラフィーからのピーク画分のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分
析（１０％アクリルアミドを用いるＬａｅｍｍｌｉ系、
Ｌａｅｍｍｌｉ、Ｎａｔｕｒｅ ２２７：６８０−６８
５（１９７０））は、図３に示すように、還元および非
還元の両方の状態で３０ｋｄあたりで１本のモノマー性
のバンドを示す。これはグリコシル化されない際のｔＴ
Ｆの予想分子量と一致する。 【００６８】約１ｍｇの可溶性組織因子を、１リットル
の出発細菌培養物から回収し、そしてそれは、ＳＤＳゲ
ル電気泳動により分かるように均一である。組織因子
は、ジスルフィド結合が還元されなくても、ゲル中でモ
ノマーとして働く。この様式で単離した可溶性の切形型
組織因子タンパク質は、ＨＰＣ−４エピトープが除去さ
れないときでさえ、ＶＩＩａ因子に対して完全な補因子
活性を有する；この活性は、図４で示したように、哺乳
動物細胞で発現されるＨＰＣ−４エピトープを有さない
切形型組織因子のものに等しい。 【００６９】そのタンパク質は、哺乳動物の細胞培養物
内で発現されたタンパク質に機能的に等価であるが、そ
のコストは１０％未満である。この機能的等価性は、Ｘ
因子活性化に依存するＶＩＩａ因子濃度、および両方の
供給源由来の組織因子の、ＶＩＩａ因子アミド溶解活性
（ａｍｉｄｏｌｙｔｉｃ ａｃｔｉｖｉｔｙ）を同等に
増加する能力によって証明される。 【００７０】（実施例３：ＨＰＣ−４エピトープと組み
合わせた融合タンパク質技術を用いた他のタンパク質の
単離。）これらのタンパク質のアミノ末端領域に連結す
るエピトープを有するトロンボモジュリンフラグメン
ト、Ｘ因子のＥＧＦドメインおよびタンパク質ＣのＥＧ
Ｆドメインを、他のＥ． ｃｏｌｉ細胞周辺腔発現系で
発現させ、そこから回収した。第４〜第６のＥＧＦドメ
インのトロンボモジュリンのフラグメントをまた、上述
のように抗体カラムの一段階精製で、培養哺乳動物細胞
から単離した。この場合、トロンボモジュリン第４〜第
６ＥＧＦドメインをコードするＤＮＡを、ＰＣＲにより
ｃＤＮＡから増幅し、そしてＨＰＣ−４エピトープおよ
びＸａ切断部位が後に続くトランスフェリンシグナルペ
プチドをコードする合成オリゴヌクレオチドに連結し
た。生じるＤＮＡフラグメントを、ヒト２９３細胞中で
発現させるために、ｐＲＣ／ＲＳＶ哺乳動物細胞発現ベ
クター中にサブクローニングした。 【００７１】本明細書中に記載した方法および組成物の
改変および変更は、前述の詳細な説明より当業者に明白
である。そのような改変および変更が、請求の範囲内に
なることを意図する。 【００７２】 【発明の効果】本発明によれば、１回のクロマトグラフ
ィー工程により、精製されたタンパク質、特に血液凝固
タンパク質の単離を可能にする方法および手段が提供さ
れる。 【００７３】 【配列表】 【００７４】 【表１】
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、ＨＰＣ−４エピトープおよびＸａ因子
切断部位をコードする発現ベクターｐＩＮ−ＩＩＩ−ｐ
ｅｌＢ、続いて単離されるべきタンパク質をコードする
遺伝子を挿入するためのいくつかの制限酵素部位であ
る。 【図２】図２は、ｐＩＮ−ＩＩＩ−ｐｅｌＢ−ｔＴＦ発
現ベクターの構築を含む工程のスキーム表示である。ｔ
ＴＦのサブクローニングは２段階で行われた。最初の段
階で、ｔＴＦ遺伝子を含む中間プラスミド（ｐＵＣ−ｔ
ＴＦ）が調製された。２番目の段階で、ｔＴＦ遺伝子
は、ｐＵＣ−ｔＴＦから取り除かれ、そしてｔＴＦ遺伝
子は、ｐＩＮ−ＩＩＩ−ｐｅｌＢ（より詳細には文中を
参照のこと）内にサブクローニングされた。得られたｐ
ＩＮ−ＩＩＩ−ｐｅｌＢ−ｔＴＦは、発現のために、
Ｅ． ｃｏｌｉ（ＸＬ１−Ｂ）の形質転換に対して用い
られた。 【図３】図３は、組織因子のＳＤＳゲル電気泳動の写真
であり、この組織因子は、ジスルフィド結合の還元がな
くてもゲル内でモノマーとして動く。 【図４】図４は、ｔＴＦ（ｎＭ）に対する、ＴＴＦ−Ｈ
ＰＣ−４のＸａ生成速度（ｍ吸光度／分／分）（白抜き
丸）；ＴＴＦ−２９３のＸａ生成速度（ｍ 吸光度／分
／分）（黒塗り丸）；およびＴＴＦ−Ｘａ−ＤＩＧのＸ
ａ生成速度（ｍ 吸光度／分／分）（白抜き四角）のグ
ラフである。
切断部位をコードする発現ベクターｐＩＮ−ＩＩＩ−ｐ
ｅｌＢ、続いて単離されるべきタンパク質をコードする
遺伝子を挿入するためのいくつかの制限酵素部位であ
る。 【図２】図２は、ｐＩＮ−ＩＩＩ−ｐｅｌＢ−ｔＴＦ発
現ベクターの構築を含む工程のスキーム表示である。ｔ
ＴＦのサブクローニングは２段階で行われた。最初の段
階で、ｔＴＦ遺伝子を含む中間プラスミド（ｐＵＣ−ｔ
ＴＦ）が調製された。２番目の段階で、ｔＴＦ遺伝子
は、ｐＵＣ−ｔＴＦから取り除かれ、そしてｔＴＦ遺伝
子は、ｐＩＮ−ＩＩＩ−ｐｅｌＢ（より詳細には文中を
参照のこと）内にサブクローニングされた。得られたｐ
ＩＮ−ＩＩＩ−ｐｅｌＢ−ｔＴＦは、発現のために、
Ｅ． ｃｏｌｉ（ＸＬ１−Ｂ）の形質転換に対して用い
られた。 【図３】図３は、組織因子のＳＤＳゲル電気泳動の写真
であり、この組織因子は、ジスルフィド結合の還元がな
くてもゲル内でモノマーとして動く。 【図４】図４は、ｔＴＦ（ｎＭ）に対する、ＴＴＦ−Ｈ
ＰＣ−４のＸａ生成速度（ｍ吸光度／分／分）（白抜き
丸）；ＴＴＦ−２９３のＸａ生成速度（ｍ 吸光度／分
／分）（黒塗り丸）；およびＴＴＦ−Ｘａ−ＤＩＧのＸ
ａ生成速度（ｍ 吸光度／分／分）（白抜き四角）のグ
ラフである。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(71)出願人 594003676
825 Ｎ．Ｅ． 13ｔｈ Ｓｔｒｅｅｔ,
Ｏｋｌａｈｏｍａ Ｃｉｔｙ，Ｏｋｌａｈ
ｏｍａ 73104，Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔ
ｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ
(72)発明者 アリレザ リザイエ
アメリカ合衆国 オクラホマ 73160，ム
ーア，エス．イー． トゥエルフス スト
リート 1216
(72)発明者 チャールズ ティー． エスモン
アメリカ合衆国 オクラホマ 73111，オ
クラホマ シティー， ノース ストーン
ウォール 5800
(72)発明者 ジェームズ エイチ． モリッセイ
アメリカ合衆国 オクラホマ 73118，オ
クラホマ シティー， ダブリュー．ユー
バンクス 228
Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA80 CA04 DA06 EA04
HA01
4H045 AA10 BA10 BA41 CA40 DA65
EA20 FA74 GA26
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 【請求項１】 ＨＰＣ−４と呼ばれ、アメリカンタイプ
カルチャーコレクション、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ， Ｍ
Ｄ，に、１９８８年１１月２日に寄託され、そしてＡＴ
ＣＣ番号ＨＢ ９８９２として受託されたモノクローナ
ル抗体によってカルシウムの存在下で結合したエピトー
プ、および融合タンパク質とＨＰＣ−４抗体との結合に
より単離されるべきタンパク質、を含む融合タンパク質
であって、 ここで、該エピトープおよび該単離されるべきタンパク
質が、特異的なプロテアーゼ切断部位によって分離され
る、 融合タンパク質。
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