JP4937570B2

JP4937570B2 - 魚類による蛋白質の製造方法

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Publication number: JP4937570B2
Application number: JP2005343862A
Authority: JP
Inventors: 浩田丸; 純司黒川
Original assignee: 浩田丸
Priority date: 2005-11-29
Filing date: 2005-11-29
Publication date: 2012-05-23
Anticipated expiration: 2025-11-29
Also published as: JP2007143497A

Description

本発明は、魚類に蛋白質を発現させるためのベクター及びこれを用いることによる蛋白質の製造方法に関する。特に膜蛋白質であって、生物学的に活性な（ネイティヴな）蛋白質の製造方法に関する。

組換え蛋白質の発現方法として、酵母や大腸菌等の微生物による発現方法や、哺乳動物の培養細胞等による発現方法が知られている。
しかし、微生物による発現方法では、異種の蛋白質の正確なグリコシル化や折り畳みができず、生物学的に不活性な蛋白質が得られることが多い。このような不活性な蛋白質は、目的とする活性が得られないために利用価値が低い。また、その機能や構造を解析することができないという問題があった。また一方、哺乳動物の培養細胞等による発現方法では、このような問題は解決できるが、細胞の培養に時間がかかるため、大量の蛋白質を発現させ、回収及び／又は精製するには、非常に高価であるという問題があった。

さらに、トランスジェニックウシやヒツジのミルク中に異種の組換え蛋白質を製造する方法（例えば、特許文献１参照）や、トランスジェニックニワトリの卵中に異種の組換え蛋白質を製造する方法（例えば、非特許文献１参照）が知られている。
しかし、これらは動物の飼育に手間がかかり、発現方法ならびに組換え体を確立するまでに時間がかかるという問題があった。また、ミルク中の溶解酵素によって、得られた蛋白質が加水分解されてしまい、蛋白質の回収が効率的でないという恐れがあった。

最近、トランスジェニック魚による異種の組換え蛋白質を製造する方法も開発されている。例えば、ラットミオシン重鎖遺伝子由来筋肉特異的エレメントが隣接するヒトＦＶＩＩ配列を含むプラスミドを用い、アフリカナマズ又はゼブラフィッシュにヒトＦＶＩＩ配蛋白質を発現している（例えば、特許文献２参照）。
魚類を用いて組換え蛋白質を製造することは、１）大量に生産でき、安価であること、２）多数の技術が利用できること、３）人と魚の両方に感染するウイルスあるいはプリオンは知られていないので疾患の伝染の可能性は非常に低いこと等の利点があり、有用であるといえる。
しかし、現在知られている方法では、導入された魚の全身で蛋白質を発現させており、局在的に発現させる方法は知られていない。また発現を確認した後、蛋白質を回収及び／又は精製して利用できるとする旨の示唆はあるものの、実際に十分に利用できる量の蛋白質を回収及び／又は精製した例はみられていない。従って、魚類を用いる方法において、短い時間で十分量の蛋白質を製造できる蛋白質の製造方法の提供が望まれている。
特開平９−２９４５８６号公報特表２００１−５０１４８２号公報日経バイオビジネス，ｐ５６〜５９，０５，２００５．

本発明は、魚類に膜蛋白質を発現させるためベクター及び魚類による蛋白質の製造方法の提供を課題とする。特に膜蛋白質であって、生物学的に活性な（ネイティヴな）蛋白質の製造方法の提供を課題とする。

本発明者らは、前記課題を解決するために鋭意研究を行った結果、配列表配列番号１に記載の塩基配列の一部又は全部をプロモーター配列として含むベクターを作成し、このベクターを魚類に挿入することで、蛋白質の製造方法を構築できることを見出し、本発明を完成するに至った。これらのベクターによる蛋白質の発現では、蛋白質が局在化されて発現するため、回収及び／又は精製が容易である。

すなわち、本発明は、次の（１）〜（１５）に関する。
（１）魚類に膜蛋白質を発現させるためのプロモーター配列を有するベクター。
（２）プロモーター配列が配列表配列番号１〜３のいずれかに記載の配列である上記（１）に記載のベクター。
（３）プロモーター配列が、魚類の一部に局在化して膜蛋白質を発現させるものである上記（１）に記載のベクター。
（４）さらに、プロモーター配列により発現される膜蛋白質を回収及び／又は精製するためのタグ配列を有する上記（１）〜（３）のいずれかに記載のベクター。
（５）膜蛋白質を回収及び／又は精製するためのタグ配列がＨｉｓ−ｔａｇ又はＧＳＴをコードする塩基配列である上記（４）に記載のベクター。
（６）さらに、プロモーター配列により発現される膜蛋白質が発現されたことを確認するための配列を有する上記（１）〜（５）のいずれかに記載のベクター。
（７）膜蛋白質が発現されたことを確認するための配列が、ＧＦＰをコードする塩基配列である上記（６）に記載のベクター。
（８）魚類がゼブラフィッシュである上記（１）〜（７）のいずれかに記載のベクター。
（９）膜蛋白質がＣＤ８１である上記（１）〜（８）のいずれかに記載のベクター。
（１０）魚類に膜蛋白質を発現させる蛋白質の製造方法。
（１１）上記（１）〜（９）のいずれかに記載のベクターを魚類の受精卵又は胚に導入する蛋白質の製造方法。
（１２）蛋白質を魚類の一部に局在して発現させる上記（１０）又は（１１）に記載の蛋白質の製造方法。
（１３）魚類がゼブラフィッシュである上記（１０）〜（１２）のいずれかに記載の蛋白質の製造方法。製造方法
（１４）配列表配列番号１〜３のいずれかに記載のプロモーター配列。
（１５）上記（１）〜（９）のいずれかに記載のベクターが導入されたトランスジェニック魚類。

本発明の方法を用いることにより、蛋白質を大量に製造することができる。また、本発明の方法では、生物学的に活性な（ネイティヴな）蛋白質が得られることから、ゲノムライブラリーなどにおいて塩基配列は既知であるが、構造や機能が未知な蛋白質を製造し、解析することで、有用な蛋白質をスクリーニングすることが可能となる。

本発明のベクターは、魚類において蛋白質を発現できるベクターであればいずれのものも用いることができ、蛋白質を発現するための調節配列と、蛋白質をコードする塩基配列を含むことが好ましい。
調節配列には、少なくともプロモーター配列を含み、さらにプロモーターのレギュレーター、プロモーターのエンハンサー、及び／又は翻訳開始部位の一部あるいは全部のようなその他のエレメントを含むことが好ましい。また、３´から核酸コード配列に機能可能なように結合したポリアデニル化（ポリＡ）シグナル、例えばＳＶ４０ポリＡシグナルあるいはチヌークサーモンポリＡシグナルを含んでいてもよい。
そして、蛋白質の発現にあたり、その塩基配列をプロモーター配列の下流にそのまま組み込むか、導入するためのＭＣＳ（マルチクローニングサイト：ｍｕｌｔｉｃｌｏｎｉｎｇｓｉｔｅ）を含むことが好ましい。さらに、蛋白質の発現を検出し、回収及び／又は精製するための塩基配列を含むことが好ましい。
このような塩基配列がコードする蛋白質としては、従来知られているいずれのものも用いることができるが、例えばＧＳＴ（グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ：ＧｌｕｔａｔｈｉｏｎｅＳ−ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）、ＧＦＰ（緑色蛍光蛋白質：ＧｒｅｅｎＦｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔＰｒｏｔｅｉｎ）、Ｈｉｓ−ｔａｇ、糖結合ドメイン、多糖結合ドメイン、レクチン、蛋白質相互作用ドメイン、核酸結合ドメイン等を挙げる事ができる。このＧＦＰにはＥＧＦＰ（ＥｎｈａｎｃｅｄＧｒｅｅｎＦｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔＰｒｏｔｅｉｎ）も含まれる。このうちＧＳＴ又はＨｉｓ−ｔａｇは主に発現させた蛋白質の回収及び／又は精製に用いられ、ＧＦＰは主に導入された遺伝子をコードする蛋白質の細胞内発現の確認に用いられる。

本発明のベクターは、蛋白質を発現できるベクターであれば、任意の種類のものを用いることができる。ベクターは直線形態のものであってもよく、環状形態のものであってもよい。例えば、本発明で設計したｐＺｅｘ−ＧＳＴ又はｐＺｅｘ−ＧＦＰを用いることが好ましい。

本発明のプロモーター配列は、魚類において蛋白質を発現できるプロモーター配列であればいずれのものも用いることができる。プロモーター配列の選択によって、蛋白質の発現箇所を、魚類の全体又は一部とすることができる。
魚類の一部とは、魚体の特定の組織や、細胞のことをいい、例えば、魚類の特定の組織に局在して発現させたい場合には、その組織に特異的なプロモーター配列を用いることが好ましい。胚外組織の細胞である、卵黄シンシチウム層（Ｙｏｌｋｓｙｎｃｙｔｉａｌｌａｙｅｒ：ＹＳＬ）又は被覆層（Ｅｎｖｅｌｏｐｉｎｇｌａｙｅｒ：ＥＶＬ）等の細胞に局在して発現させるような場合には、魚類本体に及ぼす影響が少ないと考えられ、好ましい。

このように、本発明のプロモーター配列は、発現させる部位によって、いずれのものも用いることができるが、例えば、孵化腺（ｈａｔｃｈｉｎｇｇｌａｎｄ）に局在して発現する孵化プロテアーゼ（ｈａｔｃｈｉｎｇｇｌａｎｄｅｎｚｙｍｅ）をコードする遺伝子のプロモーター配列である配列表配列番号１に記載の塩基配列を用いることができる。
この塩基配列の全部をプロモーター配列として用いることもできるが、発現させる目的や発現量、ベクターの作成上における制限等に応じて、その一部とすることもでき、蛋白質を発現できれば長さは特に問わない。例えば、発現量を少量としたい場合には、配列表配列番号２又は配列表配列番号３の塩基配列をプロモーター配列として用いることもできる。

なお、配列表配列番号１〜３のいずれかの塩基配列をプロモーターとして用いる場合、孵化腺に局在して蛋白質が発現できる。そのため、蛋白質の発現が、魚類の発生に合わせて受精卵又は胚等にベクターを導入した後、概ね１２〜７２時間（以下、ｈｐｆとする）でみられる。特に４８ｈｐｆで著しい発現がみられる傾向がある。これらの蛋白質の発現時間は発現する蛋白質の種類によって異なるが、本発明のベクターによって孵化腺に局在して蛋白質を発現できることは、短い時間で必要な蛋白質を得ることを可能とするため好ましい。

さらに、本発明のベクターは、複製可能なベクター、例えば複製可能な発現ベクターであることが好ましい。本発明で設計したベクターを、細菌宿主細胞又は酵母宿主細胞のような宿主細胞中で複製することで、魚類への安定した導入が行える。
またベクターは、ベクターが導入された形質転換体を同定するために、マーカー遺伝子として、例えばアンピシリン耐性遺伝子やネオマイシン耐性遺伝子、又は酵母形質転換体の選択を可能とするためのマーカー遺伝子を含むことが好ましい。

本発明では、真核生物の蛋白質において、正確なグリコシル化や折り畳みがなされた生物学的に活性な（ネイティヴな）蛋白質を発現し、製造することができる。従って、これらを発現、製造の対象とする蛋白質とすることが好ましい。例えばＣＤ８１のような４回膜貫通型蛋白質等を挙げることができる。このような、発現、製造の対象とする蛋白質は、いずれの蛋白質でもよく、同種（魚類）の蛋白質でも、哺乳類等の異種の蛋白質であってもよい。
また、ゲノムライブラリーで塩基配列が解明されたが、遺伝子工学的な手法において生物学的に活性な（ネイティヴな）蛋白質の発現ができなかった蛋白質等も発現、製造の対象とする蛋白質とすることができる。ゲノムのライブラリーにおいて、構造や機能が未知の蛋白質を発現させ、それらを解明することで、医薬等の開発に有用な蛋白質のスクリーニングも可能となる。
逆に、医薬等への有用性が既知の蛋白質であれば、本発明の方法によって生物学的に活性な（ネイティヴな）蛋白質を発現させることにより製造でき、ヒト又は動物の患者の疾患あるいはその他の病理的状態の治療、予防、又は緩和等に用いることができる。

発現、製造の対象とする蛋白質をコードする塩基配列をベクターに組み込むにあたり、その塩基配列はＤＮＡあるいはＲＮＡのいずれでもよいが、ＤＮＡであることが好ましく、特にゲノムＤＮＡあるいはｃＤＮＡであることが好ましい。
ベクターに組み込む塩基配列としては、発現、製造の対象とする蛋白質が生物学的に活性な（ネイティヴな）完全な形態で発現され得る全てをコードする塩基配列であってもよいし、例えば抗原認識部のように機能的に活性な部分等の一部の塩基配列をコードするものであってもよい。また、誘導体等の変異体をコードするものであってもよく、ネイティヴなものとは１以上のアミノ酸において異なるポリペプチドをコードするものであってもよい。又は、核酸配列はネイティヴな配列とは異なるが、同じアミノ酸配列をコードするものであってもよい。

本発明の蛋白質の製造方法とは、発現、製造の対象とする蛋白質をコードする塩基配列を組み込んだベクターを、魚類の受精卵や胚等に導入することで発現させ、回収及び／又は精製することをいう。
ベクターの導入には、一般的に行われているいずれの導入方法も利用することができる。例えばベクターをレトロウイルス粒子、ラムダウイルス粒子にパッケージして、これを細胞中に移入することができる。また、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈降、バイオリスティック法（例えばタングステンボンバードメント）により、あるいは裸の核酸ベクターもしくは構築物を溶液中の細胞と接触させることにより導入することができる。このうち、マイクロインジェクションによる導入が特に好ましい。マイクロインジェクションは受精の前、受精後、卵割後の二細胞、四細胞、もしくは八細胞期に行うことができる。

本発明の蛋白質を発現するための受精卵又は胚は、魚類であればいずれのものでも用いることができる。このうち、硬骨魚類が好ましく、分類としては、Ｃｙｐｒｉｎｉｄａｅ、Ｃｉｃｈｌｉｄａｅ、Ｓａｌｍｏｎｉｄａｅ、Ｃｌａｒｉｄａｅ、Ｓｉｌｕｒｉｄａｅ及びＩｃｔａｌｕｒｉｄａｅ等の硬骨魚類が挙げられる。
特に好ましい魚の種類としては、コイ（例えばＣｙｐｒｉｎｕｓｃａｒｐｉｏ）、ゼブラフィッシュ（Ｄａｎｉｎｏｒｅｒｉｏ）、アフリカナマズ（Ｃｌａｒｉａｓｇａｒｉｅｐｉｎｕｓ）、テラピア（Ｏｒｅｏｃｈｒｏｎｉｓｎｉｌｏｔｉｃｕｓ）、タイセイヨウサケ（ＳａｌｍｏＳａｌａｒ）、ニジマス（Ｏｎｃｏｒｈｙｎｃｕｓｍｙｋｉｓｓ）、メダカ（Ｏｒｙｚｉａｓｌａｔｉｐｅｓ）が挙げられる。

発現させた蛋白質の回収には、一般的に行われているいずれの回収方法も利用することができる。例えば、蛋白質の発現が確認された組織等を切り出し、そこから回収する方法や、ウェスタンブロッティングにおいて蛋白質の発現が確認された領域を切り出し、そこから抽出する方法などが挙げられる。
さらに回収した蛋白質の精製では、従来知られているいずれの精製方法でも行うことができる。従来知られている精製方法としては、カラムクロマトグラフィーやアフィニティークロマトグラフィーが挙げられ、これらを用いることにより蛋白質の精製ができる。
市販のアフィニティークロマトグラフィーとしては、ＧＳＴｔｒａｐＨＰやＨｉｓＴｒａｐＨＰ（いずれもアマシャムバイオサイエンス製）等が挙げられる。
本発明によって、発現され、回収及び／又は精製された蛋白質は、その後の使用目的にもよるが、少なくともμｇオーダー以上であることが好ましい。
以下、本発明の実施例を示すが、本発明はこれらによって制限されない。

試料の調製
＜ベクターの作成＞
１．ベクターの設計
１）プロモーター配列の調製
ゼブラフィッシュゲノムＤＮＡライブラリー（ＬａｍｂｄａＰＳＧｅｎｏｍｉｃＬｉｂｒａｒｙｆｒｏｍｚｅｂｒａｆｉｓｈ；ＭｏＢｉＴｅｃ製）より、ＰＣＲによって配列表配列番号１に記載の塩基配列をプロモーター配列として単離した。
配列表配列番号１に記載の塩基配列を鋳型として、ＴＡＫＡＲＡＥＸＴａｑを用い、配列表配列番号６及び配列番号７のプライマーを用いて表１に記載の条件でＰＣＲを行った。増幅されたＤＮＡ断片の塩基配列は、ＤＮＡシークエンサー（ベックマン製）を用いて決定した。これによって単離された配列表配列番号１に記載の塩基配列は、ＨａｔｃｈｉｎｇｇｌａｎｄｅｎｚｙｍｅであるＨＥ１遺伝子の約１ｋｂ上流のプロモーター領域であった。
配列表配列番号６のプライマーは５´側にＸｈｏＩサイトを有し、配列表配列番号７に記載のプライマーは５´側にＢａｎＨＩサイトを有する。これらのプライマーを用いたことで、増幅されたプロモーター配列もこのＸｈｏＩ−ＢａｍＨＩサイトを有することになり、ベクターに組み込むことができる。

２）ベクターの調製
ベクターは研究用ベクターｐＸＩ−ＧＦＰ（参考文献；ＪｏｈｎｓｏｎＡＤ，ＫｒｉｅｇＰＡ．ｐＸｅＸ，ａｖｅｃｔｏｒｆｏｒｅｆｆｉｃｉｅｎｔｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｃｌｏｎｅｄｓｅｑｕｅｎｃｅｓｉｎＸｅｎｏｐｕｓｅｍｂｒｙｏｓ．Ｇｅｎｅ．１９９４Ｓｅｐ．）をベースとした。このベクターのＸｈｏＩ−ＢａｍＨＩサイトに連結されていたプロモーター配列（ツメガエルＥＦ１−αプロモーター）を除き、上記１）で増幅したＸｈｏＩ−ＢａｍＨＩサイトを有するプロモーター配列を組み込んだ。

３）蛋白質の検出、回収及び／又は精製のための塩基配列の調製
ａ．ＧＳＴマダイのＧＳＴをコードする塩基配列（ＮａｔｉｏｎａｌＣｅｎｔｅｒｆｏｒＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＩｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）データベース；アクセッションナンバーＡＢ１５８４１０）を用いた。ベクターへ導入するために末端をＢａｍＨＩ−ＣｌａＩサイトとした。
ｂ．ＧＦＰ
研究用ベクターｐＸＩ−ＧＦＰに含まれるクロンテック社のＧＦＰをコードする塩基配列をそのまま用いた。
ｃ．Ｈｉｓ−ｔａｇ
Ｈｉｓをコードする塩基配列を６つつなげてＨｉｓ−ｔａｇとした。ベクターへ導入するために末端をＢａｍＨＩ−ＣｌａＩサイトとした。

４）蛋白質の調製
また発現、製造の対象とする蛋白質の一つとして、配列表配列番号５に記載の４回膜貫通型蛋白質ＣＤ８１をコードする塩基配列（ＮＣＢＩデータベース；アクセッションナンバーＮＭ１３１５１８）を用いた。ベクターへ導入するために末端をＮｏｔＩ−ＣｌａＩサイトとした。

２．ライゲーション及び大腸菌の形質転換
上記１．で調製した各塩基配列を導入遺伝子として、ＤＮＡＬｉｇａｔｉｏｎＫｉｔＶｅｒ．２（ＴＡＫＡＲＡ）Ｉ液を用いてベクターとライゲーションした。本発明における各ベクターは、図１の組成になるように作成した。
図１では、ａ．ｐＸＩ−ＧＦＰの組成、ｂ．ｐＺｅｘ−ＧＦＰの組成及びｃ．ｐＺｅｘ−ＧＳＴの組成を示している。また、ｄ．ｐＺｅｘ−ＧＦＰの組成及びｅ．ＣＤ８１の塩基配列を組込んだｐＺｅｘ−ＧＦＰの組成を示している。
まず、ｂ．ｐＺｅｘ−ＧＦＰの作成にあたり、ａ．ｐＸＩ−ＧＦＰをベースとして、ＸｈｏＩ−ＢａｍＨＩサイトに連結されているプロモーター配列（ツメガエルＥＦ１−αプロモーター）をこれらの制限酵素より切り出した。次にＸｈｏＩ−ＢａｍＨＩサイトを有するように調製したプロモーター配列をベクターに組込み、ｐＺｅｘ−ＧＦＰを作成した。
次にｃ．ｐＺｅｘ−ＧＳＴの作成にあたり、ｂ．ｐＺｅｘ−ＧＦＰのＢａｍＨＩ−ＣｌａＩサイトに連結されているＧＦＰをこれらの制限酵素より切り出した。次にＢａｍＨＩ−ＣｌａＩサイトを有するＧＳＴをベクターに組込んだ。ＧＳＴの下流にＨｉｓ−ｔａｇを付加し、ｐＺｅｘ−ＧＳＴを作成した。
また、発現、製造の対象とする蛋白質としてＣＤ８１の塩基配列を組込んだｐＺｅｘ−ＧＦＰの作成にあたり、ｄ．ｐＺｅｘ−ＧＦＰのＮｏｔＩ−ＣｌａＩサイトにＣＤ８１の塩基配列を組込んだ。ＣＤ８１の下流にＨｉｓ−ｔａｇを付加し、ｅ．ｐＺｅｘ−ＧＦＰを作成した。

３．ベクターの複製上記２で調製したベクターを用いて、Ｅ．ｃｏｌｉＤＨ５αを宿主として形質転換を行った。
Ｅ．ｃｏｌｉＤＨ５αの菌体培養にはＬＢ培地（１％Ｔｒｙｐｔｏｎｅ，０．５％Ｙｅａｓｔｅｘｔｒａｃｔ，１．０％ＮａＣｌ；ｐＨ７．２）に終濃度５０ｍｇ／ｍｌのアンピシリンを添加し、寒天を１．５％添加しＬＢ平板培地とした。
形質転換体の選択及びインサートのチェックは次のように行った。すなわち、上記のＬＢ平板培地に形質転換体を接種し、３７℃で一晩培養し、コロニーからのダイレクトＰＣＲ法によりインサートが組込まれたことを確認した。
ダイレクトＰＣＲ法は、配列表配列番号６及び７に記載のプライマーを用いた。一晩培養したコロニーをようじで取り上げ、表２の組成のＰＣＲ溶液に懸濁して反応を行った。反応条件は表３に示した。アニーリング温度はプライマーのＴｍ値に依存し、ＥｘｔｅｎｓｉｏｎＴｅｍｐ．７２℃は挿入ＤＮＡ断片の鎖長により反応時間を調整した。

得られた形質転換体を、終濃度５０μｇ／ｍｌとなるようにアンピシリンを加えたＬＢ液体培地に接種し３７℃で一晩培養した。この液体培地から形質転換体を集菌し、ＱＩＡｐｒｅｐＭｉｎｉｐｒｅｐＫｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ製）を用いて菌体からベクターＤＮＡを抽出し、ジデオキシ法により塩基配列を解析し、遺伝子が正確にサブクローニングされていることを確認した。

４．塩基配列決定及び解析
シーケンシング反応は、ＤＴＣＳＱｕｉｃｋＳｔａｒｔｋｉｔ（ＢＥＣＫＭＡＮ製）を用いてジデオキシ法で行った。
塩基配列の決定は、ＣＥＱ２０００ＸＬ（ＢＥＣＫＭＡＮ製）を用いて行い、塩基配列の解析にはＧＥＮＥＴＹＸ（ソフトウェア開発製）及びＣＥＱ２０００ＤＮＡＡｎａｌｙｓｉｓＳｙｓｔｅｍ（ＢＥＣＫＭＡＮ製）を用いた。

ＰＣＲ増幅断片の分画はアガロースゲル電気泳動により行った。また、泳動はサブマリン型電気泳動装置（Ａｄｖａｎｃｅ製）を用いて適当時間行った。ＤＮＡ断片の塩基対数に対応したアガロース濃度のゲルを用い、アガロースの溶解及び泳動にはＴＡＥ緩衝液を用いた。泳動緩衝液及びゲルには終濃度０．５μｇ／ｍｌとなるようにエチジウムブロマイドを加えた。サイズマーカーとしてＭａｒｋｅｒ６（ニッポンジーン製）及び１００ｂｐＤＮＡｌａｄｄｅｒ（ＴＯＹＯＢＯ製）を用いた。泳動後、ゲルに３００ｎｍのＵＶ光を照射し、目的のサイズに位置するバンドを切り出した。
ゲルから切り出した増幅ＤＮＡ断片の回収は、ＷｉｚａｒｄＳＶＧｅｌａｎｄＰＣＲＣｌｅａｎ−ＵｐＳｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ製）を使用して行った。

５．ベクターＤＮＡの調製
ベクターＤＮＡの抽出は、ＱＩＡｐｒｅｐＭｉｎｉｐｒｅｐＫｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ製）を用いて行った。すなわち、５ｍｌのＬＢ液体培地にてそれぞれのベクターによって形質転換された大腸菌を３７℃で１６時間培養した。その後１５０００×ｇにて３分間遠心分離を行い、大腸菌を集菌した。この大腸菌ペレットに２５０μｌのＰ１Ｂｕｆｆｅｒを加えて再攪拌した。次に、２５０μｌのＰ２Ｂｕｆｆｅｒを加えて上下に５回ほどよく攪拌した。さらに３５０μｌのＮ３Ｂｕｆｆｅｒにて菌体を破壊した後に１４０００×ｇで１０分間遠心分離を行った。この上清をキット付随のＳｐｉｎｃｏｌｕｍｎに入れて１分間室温で静置した。１４０００×ｇにて４５秒間遠心分離を行い、次に５００μｌのＰＢＢｕｆｆｅｒを加えた。１４０００×ｇにて４５秒間遠心分離を行い、その廃液を除去した後に７５０μｌのＰＥＢｕｆｆｅｒを加えて再び１４０００×ｇにて４５秒間遠心分離を行った。廃液を除去し、乾燥させるために１４０００×ｇにて１分間遠心分離を行い、新しいチューブにカラムを移した。３０μｌのｄＨ_２Ｏを加えて室温で１分間静置させ、１４０００×ｇにて４５秒間遠心分離してベクター溶液の溶出を行った。

＜ゼブラフィッシュの成育＞
ゼブラフィッシュは水温２８℃、明期１４時間、暗期１０時間で飼育されたものを使用した。受精卵は、任意に選んだ健康な雌雄数組が産んだ直後のものを採取し、飼育水をＨｏｌｔｆｒｅｔｅｒ’ｓＳｏｌｕｔｉｏｎ（ＨＳ）に置換して２８℃で飼育した。ＨＳは表４に示す組成で調製した。
未受精卵は産卵前の胚と定義し、産卵期に入った雌の卵巣をＨＳで洗浄して採集した。また、１２、２４及び４８ｈｐｆの胚は、採取時間の前後１５分間を含む３０分間以内に採取した受精卵を０ｈｐｆとして、ＨＳにおいて２８℃で飼育した場合の各時間後の胚と定義した。

＜ｐＺｅｘ−ＧＳＴを用いた蛋白質の発現及び回収＞
ベクターの導入
上記実施例１で作製したｐＺｅｘ−ＧＳＴ（図１ｃ）を用い、上記実施例１で得たゼブラフィッシュの０ｈｐｆの受精卵にマイクロインジェクションにより導入した。導入の際のベクターの濃度は０．０２μｇ／μｌに調製して行い、受精卵一個当たりに概ね５０−２００ｅｇｇｓ／μｌで行った。導入したゼブラフィッシュの受精卵をＨＳ中、２８℃で飼育し、ウェスタンブロッティングによってマダイのＧＳＴの発現を確認した。

＜ウェスタンブロッッティング＞
１．試料の調製
１）胚
ベクターを導入した受精卵を、飼育水をＨＳに置換し、２８℃で４８ｈｐｆまで飼育した。
飼育後発生した初期胚を回収してＨＳで洗浄後、ＰＢＳｂｕｆｆｅｒを添加して４℃で１０分間ホモジナイズした。１２０００×ｇ、４℃、１０分間遠心分離後、残さ（不溶物）を取り除いて粗蛋白質溶液を得た。この蛋白質溶液に、予めＰＢＳｂｕｆｆｅｒで平衡化しておいたニッケル（Ｎｉ）レジンを添加して穏やかに攪拌後、４℃で一定時間（本実験ではｏｖｅｒｎｉｇｈｔ：１６時間）静置した。６０００×ｇ、４℃、１０分間遠心分離後、ニッケル（Ｎｉ）レジンを回収してＰＢＳｂｕｆｆｅｒを添加して穏やかに攪拌後、再度６０００×ｇ、４℃、１０分間遠心分離した。この操作を２、３回行い、最終的に溶出用緩衝液（ＰＢＳｂｕｆｆｅｒ＋５００ｍＭイミダゾール）を添加して、穏やかに攪拌後、４℃で３０分間静置した。６０００×ｇ、４℃、１０分間遠心分離後、上清をベクターにより発現した蛋白質画分とした。

２）市販抗体
ＧＳＴの検出はアルカリフォスファターゼ法により、ＧＳＴに融合してあるＨｉｓ−ｔａｇを検出することにより行った。１次抗体として、Ａｎｔｉ−Ｈｉｓ抗体（アマシャム製）を用い、２次抗体としてＨＲＰ標識ラビット抗ヤギＩｇ’ｓ（ＢＩＯＳＯＵＲＣＥ製）を用いた。これらの抗体は、１次及び２次抗体ともに５００倍希釈で使用したものを用いた。また、発色基質には、ＤＡＢ（同仁化学研究所製）を用いた。

２．ウェスタンブロッティング
Ｌａｅｍｍｌｉらの方法にしたがい、胚より抽出した蛋白質を１２．５％ゲルで分離した。電気泳動条件は、ゲル１枚あたり２０ｍＡ定電流で泳動した。また、蛋白質の染色はＣｏｏｍａｓｉｅｂｒｉｌｌｉａｎｔｂｌｕｅＲ−２５０を用い、分子量マーカーはＬｏｗ−ｍｏｌｅｃｕｌａｒ−ｗｅｉｇｈｔＳＤＳｃａｌｉｂｒａｔｉｏｎｋｉｔ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ製）を用いた。ブロッティング装置はホライズブロット（ＡＴＴＯ製）を用い、メンブランはクリアブロット・Ｐ膜（ＡＴＴＯ製）を用いた。図２Ａに導入したベクターの概要及び図２ＢにＧＳＴの発現の結果を示した。図２Ｂに示したように、本発明のベクターの導入により、ＧＳＴが局在して発現することが確認された。

＜ｐＺｅｘ−ＧＦＰを用いた蛋白質の発現及び回収＞
１．ベクターの導入
上記実施例１で作製したｐＺｅｘ−ＧＦＰ（図１ｂ）を用い、上記実施例１と同様に、ゼブラフィッシュの０ｈｐｆの受精卵一個当たりに概ね５０−２００ｅｇｇｓ／μｌとなるようにマイクロインジェクションにより導入した。

２．蛋白質の発現の確認
ベクターを導入した受精卵をＨＳ中、２８℃で飼育し、ＧＦＰの発現を調べた。図３Ａに導入したベクターの概要及び図３ＢにＧＦＰの発現の結果を示した。図３Ｂに示したように、比較として用いたｐＸＩ−ＧＦＰでも発現は見られるが、本発明のベクターを用いた場合では、ＧＦＰが局在して発現することが確認された。

＜ｐＺｅｘ−ＧＦＰにおけるプロモーターのレポーターアッセイ＞
１．ベクターの作成
ｐＺｅｘ−ＧＦＰを用い、図４Ａに示したようにプロモーター配列として配列表配列番号１に記載の塩基配列を全部又は一部を含むｐＺｅｘ−ＧＦＰＩ〜ＩＶを作成した。ｐＺｅｘ−ＧＦＰＩには配列表配列番号１に記載の塩基配列、ｐＺｅｘ−ＧＦＰＩＩには配列番号２に記載の塩基配列、ｐＺｅｘ−ＧＦＰＩＩＩには配列番号３に記載の塩基配列及びｐＺｅｘ−ＧＦＰＩＶには配列番号４に記載の塩基配列をそれぞれプロモーター配列として用いた。
それぞれのプロモーター配列をベクターに導入するために、配列番号３及び４に記載の塩基配列は末端をＢａｍＨＩ−ＸｈｏＩサイトとして実施例１と同様の方法により増幅した。配列番号３に記載の塩基配列の増幅には、配列表配列番号７及び配列番号８に記載のプライマーを用い、配列番号４に記載の塩基配列の増幅には、配列番号７及び９に記載のプライマーを用いた。
また、配列番号２に記載の塩基配列は配列表配列番号１のプロモーター配列をＥｃｏＲＩで切断することでＥｃｏＲＩ−ＸｈｏＩサイトを有するプロモーター配列とした。これらの各塩基配列を導入遺伝子として、実施例１と同様にライゲーションし、ベクターの複製を行った。

２．ＧＦＰの発現
上記でのｐＺｅｘ−ＧＦＰＩ〜ＩＶを用い、上記実施例１と同様に得たゼブラフィッシュの０ｈｐｆの受精卵にマイクロインジェクションにより導入した。この受精卵をＨＳ中、２８℃で飼育し、ＧＦＰの発現を確認した。
図４Ｂに示すように、ｐＺｅｘ−ＧＦＰＩ〜ＩＩＩを導入した受精卵において、ＧＦＰが局在して発現することが確認された。ベクターに含まれるプロモーター配列によって、ｐＺｅｘ−ＧＦＰＩを導入した胚が、最も強いＧＦＰの発現を示した。

＜ｐＺｅｘ−ＧＦＰを用いた膜蛋白質の発現及び回収＞
１．ベクターの導入
上記実施例１で作製したｐＺｅｘ−ＧＦＰ（図１ｅ）を用い、上記実施例２と同様に、ゼブラフィッシュの０ｈｐｆの受精卵一個当たりに概ね５０−２００ｅｇｇｓ／μｌとなるようにマイクロインジェクションにより導入した。導入したゼブラフィッシュの受精卵をＨＳ中、２８℃で飼育し、抗Ｈｉｓ−ｔａｇ抗体による免疫染色によって膜蛋白質の発現を確認した。

＜免疫組織染色＞
１．試料の調製
１）胚
ａ，胚の処理
ベクターを導入した受精卵をＨＳ中で、２８℃で４８ｈｐｆまで飼育した。シャーレに胚を移し、卵膜はピンセットを用いて取り除いた。以降の操作は１．５ｍｌ容チューブにて行った。この卵膜除去を施した胚を４％パラホルムアルデヒドｉｎＰＢＳに浸漬し、４℃で２４時間静置した。ＰＢＳＴｗ（０．１％Ｔｗｅｅｎ２０ｉｎＰＢＳ）に置換し、５分間洗浄した。これを計４回行い、１００％メタノールに置換後、−２０℃で保存した。この状態で数ヶ月保存が可能となった。なお、ＰＢＳの組成は表４に示した。
ｂ，再水和反応
−２０℃にて保存した胚を室温に戻し、６６％メタノールｉｎＰＢＳＴｗに置換して、室温に５分間静置後、３３％メタノールｉｎＰＢＳＴｗでも同様の操作を行った。続いて、ＰＢＳＴｗで同様の操作を２回行った。
ｃ，Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ処理
胚の内部まで試薬を浸透させるため、終濃度１０μｇ／ｍｌのＰｒｏｔｅｉｎａｓｅ（ＳＩＧＭＡ製）により胚の適度な消化を行った。再水和反応後の胚を１０μｇ／ｍｌＰｒｏｔｅｉｎａｓｅｉｎＰＢＳＴｗに置換し、処理する胚が２４ｈｐｆの胚であった場合においては６分間２８℃に静置後、２ｍｇ／ｍｌグリシンｉｎＰＢＳＴｗで２回洗浄した。
ｄ，再固定
Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ処理した胚をグリシンｉｎＰＢＳＴｗから４％パラホルムアルデヒドｉｎＰＢＳに置換し、４℃で２０分間静置して固定した。その後、ＰＢＳＴｗで５分間静置し、計５回洗浄した。

２）市販抗体
膜蛋白質の発現は、アルカリフォスファターゼ法により、Ａｎｔｉ−Ｈｉｓ抗体（アマシャム製）を用いてＨｉｓ−ｔａｇを検出することにより行った。２次抗体はＨＲＰ標識ラビット抗ヤギＩｇ’ｓ（ＢＩＯＳＯＵＲＣＥ製）を用いて検出した。また、発色基質には、ＤＡＢ（同仁化学研究所製）を用いた。

２．ホールマウント抗体ハイブリダイゼーション
５００倍希釈になるようにＡｎｔｉ−Ｈｉｓ−ｔａｇ抗体を１ｍｌハイブリダイゼーション緩衝液（５０％ホルムアミド，５×ＳＳＣ，５０μｇ／ｍｌヘパリン（Ｓａｐｏｎｉｎ製），０．１％Ｔｗｅｅｎ２０，５ｍｇ／ｍｌｔｏｒｕｌａＲＮＡ）に調整し、室温で一晩反応を行った。

１）プロトコル
Ｗｈｏｌｅｍｏｕｎｔａｎｔｉｂｏｄｙｓｔａｉｎｉｎｇ
1133162343531_4.html
，）を参照して行った。
具体的には、
ａ．２６時間の胚を、２つのピンセットで注意深くＤｅｃｈｏｒｉｏｎａｔｅし、ＰＢＳＴｗに入れた。１時間、４℃で固定を行った。
ｂ．５ｍｌ０．１％ＢＳＡｉｎＰＢＳで１０分間洗浄し、さらに５ｍｌＰＢＳで１０分間ずつ３回洗浄した。
ｃ．０．２％サポニンと０．５ｍＬの一次抗体を含むＰＢＳ中で、４℃で一晩インキュベートした。
ｄ．０．２％サポニンを含むＰＢＳを数回置換しながら、少なくとも２時間洗浄した。
ｅ．ペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）（Ｇｏａｔａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅＩｇＧ＋ＩｇＭ−ＨＲＰ）１／５００を結合した０．５ｍｌの二次抗体とともに４℃で一晩インキュベートした。
ｆ．０．２％サポニンを含むＰＢＳを数回置換しながら、少なくとも２時間洗浄した。
ｇ．１ｍｌＨＲＰ基質バッファーで洗浄した。
ｈ．ＨＲＰ基質をＤｅｖｅｌｏｐし、５分後に解剖顕微鏡（ｄｉｓｓｅｃｔｉｎｇｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ）でモニターした。茶色が明確に確認されたところで、ＰＢＳでの洗浄によって反応を止めた。
ｉ．１：１グリセロール：ＣＭＦＥＴに浸し、続いて１：４グリセロール：ＣＭＦＥＴに浸すことによって、胚をクリアーにした。解剖顕微鏡（ｄｉｓｓｅｃｔｉｎｇｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ）で観察した。ｍｏｕｎｔｗｉｔｈｄｅｐｒｅｓｓｉｏｎｓｌｉｄｅｓは、複合顕微鏡で観察した。

２）洗浄
洗浄溶液１（５０％ホルムアミド，２×ＳＳＣ，０．１％Ｔｗｅｅｎ２０）に置換し、室温１０分間、洗浄溶液２（２×ＳＳＣ，０．１％Ｔｗｅｅｎ２０）に置換し、室温１０分間、洗浄溶液３（０．２×ＳＳＣ，０．１％Ｔｗｅｅｎ２０）に置換して室温３０分間の洗浄を各２回ずつ行った。

３）ブロッキングと染色
５％ＳｈｅｅｐｓｅｒｕｍｉｎＰＢＳＴｗに置換し、室温で１時間静置してブロッキングを行った。２０００倍希釈したＡｎｔｉ−ＤｉｇｏｘｉｇｅｎｉｎＡＰＦａｂｆｒａｇｍｅｎｔ（ロシュ・ダイアグノスティックス製）１００μｌに置換し、４℃で一晩静置した後、ＰＢＳＴｗを用いて室温で２０分間の洗浄を６回行った。さらに、ＰＢＳで室温５分間洗浄し、ＢＭｐｕｒｐｌｅに置換して室温で反応させ、随時染色の具合を顕微鏡で確認し、適度な濃さに染まったところで、ＰＢＳＴｗに置換して２回洗浄した。

４）透明化と観察
３３％メタノールｉｎＰＢＳＴｗに置換して室温５分間、６６％メタノールｉｎＰＢＳＴｗに置換して室温５分間静置した後、さらに１００％メタノールに置換した。再度１００％メタノールに置換した後、ＢＡＢＢ（１０ｍｌビンジルアルコール，２０ｍｌベンジルベンゾエイト）に置換することにより胚を透明化した。これを顕微鏡で観察した。図５Ａに導入したベクターの概要及び図５Ｂに蛋白質の発現の結果を示した。図５Ｂに示したように、矢印の部分に局在して蛋白質の発現が確認された。

本発明の方法は生物学的に活性な（ネイティヴな）蛋白質を大量に製造することができることから、有用な蛋白質のスクリーニングなどに利用できる。

各ベクターの組成を示した図である（実施例１）。Ａ：導入したベクターの概要を示した図である（実施例２）。Ｂ：ＳＤＳ−ＰＡＧＥによるＧＳＴの発現を示した図である（実施例２）。Ａ：導入したベクターの概要を示した図である（実施例３）。Ｂ：ＧＦＰの発現を示した図である（実施例３）。Ａ：プロモーターのレポーターアッセイにおけるプロモーター配列の概要を示した図である（実施例４）。Ｂ：プロモーターのレポーターアッセイにおけるＧＦＰの発現を示した図である（実施例４）。Ａ：導入したベクターの概要を示した図である（実施例５）。Ｂ：ホールマウント抗体ハイブリダイゼーションによるＨｉｓ−ｔａｇの発現を示した図である（実施例５）。

Claims

魚類に膜蛋白質を発現させるための、配列表配列番号１〜３のいずれかに記載のプロモーター配列を有するベクター。
プロモーター配列が、魚類の一部に局在化して膜蛋白質を発現させるものである請求項１に記載のベクター。
さらに、プロモーター配列により発現される膜蛋白質を回収及び／又は精製するためのタグ配列を有する請求項１または２に記載のベクター。
膜蛋白質を回収及び／又は精製するためのタグ配列がＨｉｓ−ｔａｇ又はＧＳＴをコードする塩基配列である請求項３に記載のベクター。
さらに、プロモーター配列により発現される膜蛋白質が発現されたことを確認するための配列としてＧＦＰをコードする塩基配列を有する請求項１〜４のいずれかに記載のベクター。
魚類がゼブラフィッシュである請求項１〜５のいずれかに記載のベクター。
膜蛋白質がＣＤ８１である請求項１〜６のいずれかに記載のベクター。
請求項１〜７のいずれかに記載のベクターを魚類の受精卵又は胚に導入する蛋白質の製造方法。
蛋白質を魚類の一部に局在して発現させる請求項８に記載の蛋白質の製造方法。
魚類がゼブラフィッシュである請求項８または９に記載の蛋白質の製造方法。
配列表配列番号１〜３のいずれかに記載の塩基配列を有するプロモーター。
請求項１〜７のいずれかに記載のベクターが導入されたトランスジェニック魚類。