KR100237582B1 - Tpo 활성을 갖는 단백질의 제조방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 서열 6의 아미노산 서열 1-332를 포함하는, 혈소판 생성을 특이적으로 자극하거나 증가시키는 생물학적 활성을 갖는 트롬보포이에틴(TPO) 또는 그의 단편, TPO 폴리펩타이드를 코딩하는 DNA 분자, 폴리펩타이드의 제조방법, 폴리펩타이드와 특이적으로 면역 반응하는 항체, 폴리펩타이드를 포함하는 약제 조성물 및 혈소판 감소증과 같은 혈소판 장해를 치료하는데 폴리펩타이드를 사용하는 방법에 관한 것이다.

Description

[발명의 명칭]

TPO 활성을 갖는 단백질의 제조방법

[발명의 상세한 설명]

본 발명은 1994. 3. 14.자 출원되어 현재 포기된 미합중국 특허출원 제 08/212,164호의 일부 계속출원인, 1994. 4. 1.자 출원되어 현재 포기된 미합중국 특허 제08/221,020호의 일부 계속출원인, 1994, 7. 20.자 출원되어 현재 계류중인 미합중국 특허출원 제08/278,083호의 일부 계속출원인, 1994. 10. 11.자 출원되어 현재 계류중인 미합중국 특허출원 제08/320,300호의 일부 계속출원인, 1994. 12. 22.자 출원되어 현재 계류중인 미합중국 특허출원 제08/361,811호의 일부 계속출원인, 1995. 1. 31.자 출원된 미합중국 특허출원(출원번호 미부여)의 일부 계속출원이다.

[기술분야]

본 발명은 특이적 방법으로 생체내에서 혈소판 생성을 자극하거나 증가시키며 또는 거핵구 전구세포의 증식 및 분화를 강화시키는 활성을 갖는 신규 단백질, 이 단백질을 코딩하는 DNA 서열 및 이를 제조하는 방법에 관한 것이다.

[배경기술]

거핵구는 혈소판을 생성하는 골수에서 주로 발견되는 거대 세포질-풍부 다핵세포이다. 거핵구는 골수에 있는 다능성 조혈 간세포로부터 생성한다. 원시 다능성 간세포는 거핵구계에 관련된 거핵구 전구세포로 어느 정도 분화한다. 거핵구 전구세포는 거핵구로 중식 및 분화한다. 거핵구는 이후에 배수체화되고 세포질성 성숙되며 최종적으로는 그들의 무핵 세포질성 단편, 즉 혈소판을 순환계로 방출한다. 평균적으로 2000∼4000의 혈소판이 하나의 성숙된 거핵구로부터 형성된다. 혈소판 형성 메카니즘은 현재까지 많은 점에서 불명확하지만 거핵구는 일반적으로 골수에 있는 동(Sinus) 내피의 알부민성 표면에 국소화되며 혈소판이 단편화되는 동 유사 혈관(sinusoid)까지 미치는 세포질성 공정을 생성하는 것으로 간주된다.

거핵구가 골수의 정맥동 표피의 피부층에 국소적으로 존재하고 세포질은 피부표피를 거쳐 정맥동의 내벽에 삭상 돌출부를 형성함으로써 혈소판이 방출되는 것으로 예상되지만 혈소판을 생성시키는 메카니즘과 관련하여 많은 불명확한 점들이 있다.

거핵구 조혈 혈소판 생성과 그의 조절을 위한 특정한 작용이 존재하는 것으로 제시되었다. 건강한 인간 및 동물에서는, 예를 들면 건강한 동물에 항혈소판 항체의 투여시에 혈소판 수가 즉시 감소하고 이후 평상시보다 많게 일시적으로 증가하며 최종적으로 정상 수준으로 돌아오는 것으로 알려져 있음에도 불구하고 효과적인 혈소판 갯수가 유지된다. 또한, 임상분야에서는 혈소판 수가 감소하면 적혈구 및 백혈구의 수가 정상수준일때 조차도 혈소판감소증 및 혈소판 증가증을 야기하는 것으로 알려져 있다.

또한, 혈소판의 가장 중요한 작용은 응혈 메카니즘에서의 혈전의 생성이다. 응혈 메카니즘이 혈소판 수의 감소로 인하여 적절히 작용하지 않으면 지혈의 추세가 일어난다.

거핵구형성 및 혈소판형성과 관련한 특정의 조절 메카니즘이 존재하는 것으로 제시되었다. 혈소판은 건강한 사람 및 정상적인 동물에서는 효과적인 수가 유지된다. 그러나, 항-혈소판 항체가 정상적인 동물에 투여될 때는 혈소판의 수만 짧은 시간내에 갑자기 감소하고 그 후 증가하기 시작하여 일시적으로 정상 수준을 초과하지만 최종적으로 정상수준으로 돌아오는 것으로 알려져 있다. 또한, 임상 분야에서는 혈소판 수의 감소(혈소판감소증) 또는 혈소판 수의 증가(혈소판 증가증)가 적혈구 및 백혈구의 수가 정상적일 때에도 발생한다. 그러나, 오늘날까지 혈소판 생성에 관련된 특정의 조절인자의 분리 및 확인 성공(예를 들면, 적혈구 형성에서의 에리트로포이에틴의 경우와 같이)이 보고되지 않았다.

혈소판의 가장 중요한 작용은 응혈 메카니즘에서의 혈병의 형성이다. 출혈경향은 지혈메카티즘의 정상적인 작용이 혈소판감소증에 의해 손상되었을 때 발생한다. 암의 방사선 치료 및 화학 요법 분야에서는 공수억제에 의해 야기된 혈소판감소증이 치명적인 합병증이고 그러한 환자에게는 출혈경향을 방지하기 위하여 혈소판 수혈법(Transfusion)이 적용된다. 혈소판 수혈법은 또한 골수이식후 환자 또는 재생불량성 빈혈 환자에게 적용된다.

그러한 혈소판 수혈법에 사용하기 위한 혈소판은 건강한 혈액 공여자의 혈액으로부터 혈소판페레시스(Plateletpheresis)에 의해 제조되지만 그러한 수혈용의 혈소판은 짧은 저장수명 및 박테리아 감염에 의한 오염을 야기할 가능성을 갖는다. 혈소판 수혈은 인간 면역결핍 바이러스(HIV) 또는 많은 감염 바이러스와 같은 위험한 바이러스에 환자가 노출되거나 수혈된 혈소판의 주 조직적합성 항원(HLA)에 대하여 특이적인 항체를 유도하거나 또는 수혈용 혈소판에 있는 오염된 임파구로 인하여 이식편 대 숙주질병(GVHD)을 야기할 위험성을 갖는다.

따라서, 본질적인 혈소판 형성이 혈소판감소증 환자내에서 자극될 수 있고, 동시에 그들의 혈소판 수형 의존성이 감소될 수 있다면 매우 큰 잇점이 될 것이다. 또한, 방사선 치료 또는 화학요법 치료를 받는 암환자의 혈소판감소증이 치료되거나 방지될 수 있다면 그러한 치료는 보다 안전하게 될 것이고 치료강도가 증가될 수 있으면 항암효과의 개선이 예상될 수 있다.

이러한 이유 때문에 거핵구 및 혈소판 생성의 조절시에 포함된 특정 조절인자의 분리 및 확인에 대하여 다수의 집중적인 연구들이 이루어져 왔다. 시험관내 연구들에서, 거핵구 형성을 조종하는 조정인자는 대략 하기의 두 인자로 나뉘어 진다. (윌리엄 등, J. Cell. Physiol., vo1.110, pp.101-104, 1982 참조). 거핵구 콜로니 자극인자(Meg-CSF)는 CFU-MK의 증식 및 분화를 자극하여 반고형 배양배지에 거핵구 콜로니들을 형성하도록 하는 조절인자이다. 소위 거핵구 강화인자(Meg-Pot), 거핵구 자극인자, 혈소판 형성 자극인자 등으로 불리는 다른 조절인자는 주로 비성숙 또는 성숙 거핵구 상에 작용함으로써 그들의 분화 및 성숙을 향상시킨다. Meg-Pot는 특정 경우에 Meg-CSF와 조합하여 검출가능하다. 또한, 실험적으로 유도된 혈소판감소증의 동물로부터 수집된 혈청 또는 혈장을 다른 정상적인 동물에 투여하였을 때 혈소판 수가 증가했기 때문에 생체내에서 혈소판 형성을 촉진할 수 있는 소위 트롬보포이에틴(Thrombopoietin, TPO)이라 불리는 체액성 인자가 있는 것으로 제시되어 왔다.

최근에는 유전자가 클론된 어떤 시토킨에 대하여 거핵구 형성 및 혈소판을 자극하는 능력을 시험하였다. 인간 IL-3은 인간 거핵구 콜로니의 형성을 자극하였으며(브루노 등, Exp. Hematol, vo1. 16, pp. 371-377, 1988 참조), 최소한 원숭이에게서는 혈소판 수가 증가했다(도나휴 등, Science, vo1, 241, p.1820, 1988 참조). 그러나, IL-3은 모든 조혈세포의 증식 및 분화시에 작용하는 인자이기 때문에 거핵구형성 및 혈소판 생성을 조절하는 특정 조절인자와 구별된다. 인간 IL-6은 Meg-CSF 활성을 나타내지 않지만 미성숙 거핵구에 대하여 작용하여 성숙 거핵구로의 분화를 증가시켰다(윌리엄 등, Exp. Hematol., vo1.18, p.69, 1990 참조). IL-6의 생체내 투여는 혈소판 생성을 유도했으며 영장류에서 높은 배수성의 골수 거핵구로의 성숙을 촉진 및 변화시켰지만 체중감소, 급성 상단백질의 유도와 같은 부작용을 야기했다(아사노 등, Blood, vo1.75, pp.1602-1605, 1990; 스타홀 등, Blood, vo1.78, pp.1467-1475, 1991 참조). 인간 IL-11은 Meg-CSF 활성이 없는 것으로 나타났지만 Meg-Pot 활성을 나타냈고 마우스들에서 혈소판 생성을 촉진했다(네벤 등, Blood, vo1.81, pp.901-908, 1993 참조). 또한, 인간 LIF는 영장류에서 혈소판 수를 매우 증가시켰지만(메이어 등, Blood, vo1.81, pp.3226-3233, 1993 참조), 거핵구에 대한 시험관내 작용은 약했다(버스타인 등, J. Cell. Physiol., vo1.153, pp.305-312, 1992 참조).

혈소판 증가 인자로서 이들 시토킨의 임상학적 적용이 기대되지만 그들의 작용은 거핵구 계통에 대하여 특이적이지 않으며 그들은 부작용을 야기한다. 따라서, 거핵구-혈소판 시스템에 대하여 특이적이고 부작용이 적은 혈소판 증가인자의 개발이 임상분야에서 요구되어 왔다.

Meg-CSF, Meg-pot 또는 TPO 활성은 혈소판감소증 환자 또는 동물의 혈청, 혈장 또는 뇨에서 또는 특정한 인간의 배양된 세포주의 배양 상청액에서 발견되었다. 그러나, 이들 활성이 단일 인자의 존재 때문인지 몇 개 인자의 조합 때문인지, 또는 그들이 기존의 시토킨과 다른 것인지는 현재 알려져 있지 않다.

호프만 등은 재생불량성 빈혈 및 무거핵구 혈소판 감소성 자반병에 걸린 환자의 혈청이 인간 거핵구 콜로니 형성을 매우 증가시키는 Meg-CSF 활성을 포함한다는 것을 발견했다(호프만 등, N.Eng J.Med., vo1.305, pp.533-538, 1981 참조). 그 후 마주르 등이 재생불량성 빈혈환자의 혈청에 존재하는 Meg-CSF 활성이 IL-3 및 GM-CSF와는 구별된다는 것을 보고했다(마주르 등, Blood, vo1.76, pp.290-297, 1990 참조). 유사한 Meg-CSF 활성이 강한 세포독소성 화학요법을 받는 암환자 및 골수이식환자의 혈청에서 발견되었다(마주르 등, Exp. Hematol., vo1.12, pp.624-628, 1984; 드 알라콘 및 슈미더, Prog. Clin. Bio. Res. vo1.215, pp.335-340, 1986 참조). 호프만 등은 겉보기 분자량 46,000의 Meg-CSF가 거핵구 감소성 혈소판감소증 환자의 혈장으로부터 정제되었지만(호프만 등, J. Clin., vo1.75, pp.1174-1182, 1985 참조) 그 물질은 정확한 아미노산 서열결정이 가능한 정도로 정제되지 않았음이 다른 연구에 의해 발견되었다고 보고 했다(호프만, Blood, vol.74, pp.1196-1212, 1989 참조). 마우스에서 새롭게 형성하는 혈소판에⁷⁵Se-셀레노메티오닌의 도입을 향상시키는 TPO형 활성을 갖는 물질은 혈소판감소증 환자의 혈장으로부터 또는 특발성 혈소판 감소성 자반증(ITP) 환자의 뇨로부터 부분적으로 정제되었으며 이 혈장-유도 인자의 겉보기 분자량은 40,000인 것으로 측정되었다. (그로시 등, Hematologica, vol.72, pp.291-295, 1987; 배누치 등, Leukemia, vol.2, pp.236-240, 1988 참조).

Meg-CSF 및 TPO형 활성은 재생불량성 빈혈 및 심함 ITP 환자의 뇨 샘플에서 검출되었다(가와키타 등, Br. J. Haematol. vol.48, pp.609-615, 1981; 가와키타 등, Blood, vol.556-560, 1983 참조). 가와키타 등은 재생불량성 빈혈환자의 뇨 추출물로부터 발견된 Meg-CSF 활성이 해리 조건하에서 겔 여과에 의해 45,000의 겉보기 분자량을 나타낸 것으로 보고했다(가와키타 등, Br. J. Haematol., vol. 62, pp.715-722, 1986 참조). 또한, 에릭슨-밀러 등은 유사한 뇨 샘플들로부터 Meg-CSF의 정제에 관하여 보고했지만 그것의 구조에 관한 정보는 없었다. (에릭슨-밀러 등, “Blood Cell Growth Factors : their present and future use in hematology and oncology” 머피 편집, 알파메드 출판사, 오하이오, 데이톤, pp.204-220, 1992). 터너 등은 골수이식 환자의 뇨로부터 Meg-CSF 활성을 갖는 거핵구 자극인자(MSF)를 정제하여 그 유전자를 클론했다(터너 등, Blood, vol.78, p.1106 279a, 1991, (abstr., supple. 1) 참조). 이 MSF는 28,000-35,000의 분자량을 갖는다. 지금까지 혈소판감소증 환자의 혈청 및 혈장에서 검출된 Meg-CSF와 상기 인자의 동일성 및 그것의 혈소판 증가 활성은 아직 밝혀져 있지 않다.

TPO형 활성을 갖는 32,000의 분자량의 물질은 인간 배자 신장-유도 세포주(HEK세포)의 배양 상청액으로부터 정제되어 그것의 생물학적 및 생화학적 특성이 광범위하게 시험되었지만 그것의 구조는 현재까지 알려지지 않았다. (맥도날드 등, J. Lab. Clin. Med., vol.106, pp.162-174, 1985; 맥도날드, Int. J. Cell Cloning, vol.7, pp. 139-155, 1989 참조). 한편, 다른 연구자들은 시험관내에서 거핵구 성숙을 향상시키는, HEK 세포의 조건화된 배지에서의 주활성이 기존의 시토킨 즉, IL-6과 EPO 때문인 것으로 보고했다(위티 등, J. Cell. Physiol., vol.15, pp.362-372, 1992 참조).

동물-유도 인자와 관련하여 에바트(Evatt)등은 토끼와 마우스에서 새롭게 형성하는 혈소판으로⁷⁵Se-셀레노메티오닌의 도입을 향상시키는 TPO형 활성이 항 혈소판 형청 주사에 의해 유도된 혈소판감소증 토끼의 혈장에서 발견되었다고 보고했다(에바트 등, J. Lab. Clin. Med., vol.83, pp.364-371, 1974 참조). 또한, 다수의 유사한 연구들이 1960년에서 1970년대 까지 보고되었다(예를 들면, 오델 등, Proc, Soc. Biol. Med., vol.108, pp.428-431, 1961; 에바트와 레빈, J. Clin. Invest., vol.48, pp.1615-1626, 1969; 하커, Am. J, Physiol., vol.218, pp.1376-1380, 1970; 슈라이너와 레빈, J. Clin. Invest. vol.49, pp.1709-1713, 1970; 및 페닝톤, Br. Med. J., vol.1, pp.606-608, 1970). 에바트 등과 힐 및 레빈은 혈소판감소증 토끼의 혈장으로부터 TPO형 활성의 부분적인 정제를 수행했다(에바트 등, Blood, vol.54, pp.377-388, 1979; 힐 및 레빈, Exp.Hematol., vol.14, pp.752-759, 1986 참조). 그 후 이러한 인자의 정제를 시험관에서의 거핵구의 증식 및 성숙을 강화시키는 활성 즉, Meg-pot 활성을 모니터하면서 계속하여 이 활성이 겔 여과에 의해 측정되었을 때, 40,000-46,000의 겉보기 분자량을 갖는다는 것을 알았다(켈러 등, Exp. Hematol., vol.16, pp.262-267, 1988; 힐 등, Exp. Hematol., vol.20, pp.354-360, 1992 참조). IL-6 활성은 항 혈소판 혈청 투여에 의해 유도된 심한 급성 혈소판감소증에 걸린 토끼의 혈장에서는 검출되지 않기 때문에 이러한 TPO성 활성은 IL-6 이외의 인자에 의한 것으로 제시되었다(힐 등, Blood, vol.80, pp.346-351, 1992).

테이리엔 및 로젠버그는 랫트 거핵구성 세포주에서 혈소판 인자 4의 생성을 자극하는 HEK 세포의 배양 상청액 및 혈소판감소증 토끼의 혈장으로부터 15,000의 겉보기 분자량은 갖는 인자를 정제했으나 그 구조에 관한 정보는 없었다(테이리엔 및 로젠버그, J. Biol. Chem., vol.262, pp.3262-3268, 1987 참조).

또한, 나케프는 항-혈소판 투여에 의해 유도된 혈소판 감소증 마우스의 혈청에서 Meg-CSF 활성을 발견했다(나케프, “Experimental Hematology Today” 바움과 레드네이 편집, Springer-Verlag, 뉴욕, pp.111-123, 1977 참조). 한편, 혈소판감소증 토끼의 혈청은 거핵구의 성숙을 강화시켰고(켈러 등, Exp. Hematol., vol.16, pp.267, 1988; 힐 등, Exp. hematol., vol.17, pp.903-907, 1989) 또 거핵구가 혈소판으로 되도록 형태학적 변화를 자극했지만(레벤 및 이, Blood, vol.69, pp.1046-1052, 1989), Meg-CSF 활성은 검출되지 않았다.

미우라 등은 치사량에 가까운 전신방사선 조사에 의해 혈소판감소증이 생긴 랫트의 혈장에서 Meg-CSF 활성을 검출하고(미우라 등, Blood, vol.63, pp.1060-1066, 1984 참조), 생체내에서 Meg-CSF 활성의 유도가 거핵구 감소와 관련되어 있지만 이 활성이 혈소판 수혈에 의해 변하지 않기 때문에 혈소판 감소에는 관련이 없다고 제시하였다(미우라 등, Exp. Hematol., vol.16, pp.139-144, 1988 참조). 마주르 및 사우스는 치사량 만큼 조사된 개의 혈청에서 Meg-CSF 활성을 검출하여 이 인자가 겔여과에 의한 측정시 175,000의 겉보기 분자량을 갖는 것으로 보고했다(마주르 및 사우스, Exp. Hematol., vol.13, pp.1164-1172, 1985 참조). 또한, 혈청-, 혈장-, 및 뇨- 유도 인자들은 다른 연구자들, 예를 들면 스트라네바 등에 의해 보고되었다(스트라네바 등, Exp. Hematol., vol.15, pp.657-663, 1987 참조).

따라서, 상기에서 설명한 바와 같이 거핵구형성 및 혈소판형성을 자극하는 많은 활성들이 혈소판감소증 환자 및 동물로부터 유도된 생리학적 샘플에서 발견되었지만, 이들 인자의 분리, 그들의 생화학적 및 생물학적 확인 및 그들의 특성 측정은 그들이 혈액 및 뇨와 같은 천연원에서 함량이 극히 적어서 이루어지지 않고 있는 실정이다.

[발명의 요약]

본 발명의 목적은 생체내에서 혈소판 생성을 자극하거나 증가시키고/또는 거핵구 전구세포의 증식 및 분화를 강화시키는 활성(이하 “TPO 활성”이라함)을 갖는 TPO 단백질을 천연원으로부터 분리하여 그것을 확인하고, TPO 단백질을 코딩하는 유전자를 분리하며, 재조합 DNA 기술로 동질의 그리고 대량의 상기 단백질을 제조하기 위한 방법을 제공하는 것이다. 상기 목적의 달성은 현재 사용되고 있는 혈소판 수혈법을 대체하거나 또는 수혈빈도를 감소시킬 것이고 또 이러한 신규 단백질은 혈소판 장해의 진단 및 치료에 이용될 것이다.

따라서, 본 발명은 (i)(a) 서열 194,195 및 196에 도시된 DNA 서열 또는 이들의 상보적 가닥; 및 (b) 상기(a)에서 정의된 바와 같은 DNA 서열 또는 이들의 단편에 스트린젠트(Stringent) 조건하에서 조잡하는 DNA서열; 및 (c) 유전암호의 축퇴(Degeneracy) 없이 상기 (a) 및 (b)에 정의된 바와 같은 DNA 서열에 교잡하는 DNA 서열로 구성된 군으로부터 선택된 TPO 활성을 갖는 단백질을 코딩하는 정제되어 분리된 DNA 서열;

(ii) 상기 DNA 서열로 형질전환 또는 형질감염된 원핵생물 또는 진핵생물 숙주 세포는 적절한 영양조건 하에서 단백질의 발현이 가능한 방식으로 배양하고; 또, 상기 DNA 서열의 발현에 의해 얻어진 소정의 단백질 생성물을 분리하는 단계를 포함하는 TPO 활성을 갖는 단백질의 제조방법:

(ⅲ) 원핵생물 또는 진핵생물 숙주세포에서 상기 DNA 서열의 발현에 의해 수득한 단백질 생성물에 관한 것이다.

본 발명은 또한 TPO 활성을 갖는 유효량의 상기 단백질을 포함하는 약제학적 조성물 및 혈소판 장애, 특히 혈소판감소증 환자에게 상기 단백질을 투여하는 것을 포함하는, 혈소판 장애의 치료 방법에 관한 것이다.

[도면의 간단한 설명]

제1도는 XRP로부터 유도된 페닐 세파로오스 6 FF/LS F2의 세파크릴 S-200HR 겔여과 크로마토그래피를 도시한 것이다.

제2도는 XRP의 저분자 TPO 셈플(세파크릴 S-200HR F3)로부터 유도된 YMC-팩 추-메 TPO-활성 분획의 캡셀(Capcell) 팩 C1 역상 크로마토그래피를 도시한 것이다.

제3도는 XRP의 저분자 TPO 샘플로부터의 캡셀 팩 C1 TPO-활성 분획의 SDS-PAGE 분석을 도시한 것이다.

제4도는 SDS-PAGE에 의해 분리된 랫트 TPO의 C18 역상 HPLC 상의 펩타이드 지도를 도시한 것이다. 펩타이드 단편은 3개의 프로테아제와의 계통적 가수분해에 의해 얻어졌다.

제5도는 랫트 CFU-MK 평가 시스템에서 XRP로부터 유도된 TPO 활성을 도시한 것이다.

제6도는 발현벡터 pEF18S의 작성을 도시한 것이다.

제7도는 랫트 CFU-MK 분석계에서 pEF18S-A2α가 도입된 COS1 세포의 배양 상청액에서의 TPO 활성을 도시한 것이다.

제8도는 랫트 CFU-MK 분석계에서 pEF18S-HL34가 도입된 COS1 세포의 배양 상청액에서의 TPO 활성을 도시한 것이다.

제9도는 랫트 CFU-MK 분석계에서 pHT1-231이 도입된 COS1 세포의 배양 상청액에서의 TPO 활성을 도시한 것이다.

제10(a)도는 랫트 CFU-MK 분석계에서 pHT1이 도입된 COS1 세포의 배양 상청액에서의 TPO 활성을 도시한 것이다.

제10(b)도는 랫트 CFU-MK 분석계에서 pHTF1이 도입된 COS1 세포의 배양 상청액에서의 TPO 활성을 도시한 것이다.

제11도는 λHGT1 클론의 제한지도 및 pHGT1 및 pEFHGTE의 자성을 도시한 것이다.(E : EcoRI, H : HindIII, S : SalI)

제12(a)도는 랫트 CFU-MK 분석계에서 pEFHGTE가 도입된 COS1 세포의 배양 상청액에서의 TPO 활성을 도시한 것이다.

제12(b)도는 M-07e 분석계에서 pEFHGTE가 도입된 COS1 세포의 배양 상청액에서의 TPO 활성을 도시한 것이다.

제13(a)도는 랫트 CFU-MK 분석계에서 pHT1-211#1, pHT1-191# 또는 pHT1-171#2가 도입된 COS1 세포의 배양 상청액에서의 TPO 활성을 도시한 것이다.

제13(b)도는 랫트 CFU-MK 분석계에서 pHT1-163#2가 도입된 COS1 세포의 배양 상청액에서의 TPO 활성을 도시한 것이다.

제14도는 M-07e 분석계에서 pHT1-211#1, pHT-171#2 또는 pHT1-163#2가 도입된 COS1 세포의 배양 상청액에서의 TPO 활성을 도시한 것이다.

제15도는 pDEF202-hTPO-P1이 도입되어 TPO가 발현되도록된 CHO 세포의 배양 상청액으로부터 인간 TPO를 정제하기 위한 역상 크로마토그래피(Vydac C4 컬럼)의 크로마토그램이다.

제16도는 pDEF202-hTPO-P1이 도입되어 TPO가 발현되도록된 CHO 세포의 배양 상청액으로부터 정제된 인간 TPO의 SDS-PAGE 분리를 도시한 사진이다.

제17도는 pCFM536/h6T(1-163)이 도입되어 TPO가 발현되도록된 대장균으로부터 인간 TPO를 정제하기 위한 역상 크로마토그래피의 크로마토그램이다.

제18도는 pCFM536/h6T(1-163)이 도입되어 TPO가 발현되도록된 대장균으로부터 분리되어 정제된 인간 TPO 변종, h65(1-163)의 SDS-PAGE 분리를 도시한 사진이다.

제19도는 인간 TPO 발현 플라스미드 pDEF202-hTPO163을 CHO 세포의 형질감염시켜 제조된, 출발물질로서 배양 상청액으로부터 hTPO163의 정제와 관련한 수퍼덱스(Superdex) 75 pg 컬럼상에서의 hTPO163의 용리 패턴을 도시한 것이다. 단백질양은 220nm에서 측정되었다.

제20도는 인간 TPO 발현 플라스미드 pDEF202-hTPO163을 CHO 세포에 형질감염시켜 제조된, 출발물질로서 배양 상청액으로부터 hTPO163의 정제시에 수퍼덱스 75pg 컬럼으로부터 용리된 표준 hTPO163의 SDS-PAGE 분석을 도시한 것이다. hTPO163은 겔상에서 은 염색되었다.

제21도는 발현벡터 pSMT201의 작성을 도시한 것이다.

제22도는 βGL-TPO, N3/TPO 또는 09/TPO가 도입되어 발현된 COS7의 배양 상청액에서 M-7e분석에 의해 측정된 바와 같은 TPO 활성을 도시한 그래프이다.

제23도는 인간 TPO의 삽입 또는 결실 유도체가 도입되어 발현된 COS7 세포배양물의 상청액에서 M-7e 분석에 의해 측정된 바와 같은 TPO 활성을 도시한 그래프이다.

제24도는 TPO를 정맥주사 및 피하주사로 투여한 마우스에서 증가된 혈소판 수를 도시한 것이다.

제25도는 TPO를 피하주사 한 후에 마우스에서 용량에 따른 혈소판 수의 증가를 도시한 것이다.

제26도는 혈소판감소증을 유발하는 5-FU로 마우스를 처리한 후 TPO 유발된 혈소판 수의 증가를 도시한 것이다.

제27도는 혈소판감소증을 유발하는 니머스틴(Nimustine) 하이드로클로라이드로 마우스를 처리한 후의 TPO 유발된 혈소판 수의 증가를 도시한 것이다.

제28도는 골수 이식 후의 혈소판감소증 마우스에서의 TPO 유발된 혈소판 수의 증가를 도시한 것이다.

제29도는 마우스에 혈소판감소증을 유발하는 X선을 조사한 후의 TPO 유발된 혈소판의 수를 도시한 것이다.

제30도는 절단된(Truncated) TPO(서열 6에 있는 아미노산 1-163)를 투여한 후의 투여량에 따른 혈소판 수의 증가를 도시한 것이다.

제31도는 혈소판감소증을 유발하는 니머스틴 하이드로클로라이드를 투여한 다음 절단된 TPO(서열 6에 있는 아미노산 1-163)를 투여한 후의 혈소판 수의 증가를 도시한 것이다.

제32도는 인간 거핵구 배양계에 첨가된 Mp1-X의 농도 증가가 거핵구 성장을 상승적으로 차단한다는 것을 도시한 것이다.

제33도는 대장균에서 발현된 TPO 유도체 [Met^-2, Lys^-1, Ala¹, Val³, Alg¹³³] TPO(1-163), [Met^-2, Lys^-1, Ala^-1, Val³, Pro¹⁴⁸] TPO(1-163) 및 [Met^-2, Lys^-1, Ala¹, Val³, Arg¹¹⁵] TPO(1-163)의 M-07e의 분석으로 측정된 TPO 활성을 설명한 것이다.

제34도는 대장균에서 발현된 TPO 유도체 [Met^-2, Lys^-1, Ala¹, Val³, Alg¹²⁹] TPO(1-163), [Met^-2, Lys^-1, Ala¹, Val³, Arg¹⁴³] TPO(1-163), [Met^-2, Lys^-1, Ala¹, Val³, Leu⁸³] TPO(1-163), [Met^-2, Lys^-1, Ala¹, Val³, Leu¹⁴⁶] TPO(1-163) 및 [Met^-2, Lys^-1, Ala^-1, Val³, Arg⁵⁹] TPO(1-163)의 M-07e 분석으로 측정된 TPO 활성을 설명한 것이다.

[발명의 상세한 설명]

본 발명에 따라서, 혈소판 생성을 특이적으로 자극하거나 증가시키는 생물학적 활성을 가지며, 서열 6의 아미노산 서열 1-332를 포함하는 트롬보포이에틴(TPO) 폴리펩타이드 및 그 유도체가 제공된다. 폴리펩타이드의 예로는 아미노산 서열 6의 1-163; 서열 6의 1-232; 서열 6의 1-151; 서열 2, 4 및 6의 아미노산의 성숙서열; 1-6 NH₂말단 아미노산이 결실된 서열로 이루어진 것들을 포함한다. 본 발명의 추가적인 폴리펩타이드의 예로는

[Thr³³, Thr³³³, Ser³³⁴, lle³³⁵, Gly³³⁶, Tyr³³⁷, Pro³³⁸, Tyr³³⁹, Asp³⁴⁰, Val³⁴¹, Pro³⁴², Asp³⁴³, Tyr³⁴⁴, Ala³⁴⁵, Gly³⁴⁶, Val³⁴⁷, His³⁴⁸, His³⁴⁹, His³⁵⁰, His³⁵¹, His³⁵², His³⁵³] TPO, [Asn²⁵, Lys²³¹, Thr³³³, Ser³³⁴, lle³³⁵, Gly³³⁶, Tyr³³⁷, Pro³³⁸, Tyr³³⁹, Asp³⁴⁰, Val³⁴¹, Pro³⁴², Asp³⁴³, Tyr³⁴⁴, Ala³⁴⁵, Gly³⁴⁶, Val³⁴⁷, His³⁴⁸, His³⁴⁹, His³⁵⁰, His³⁵¹, His³⁵², His³⁵³] TPO, [Asn²⁵] TPO 및 [Thr³³] TPO를 포함한다. 본 발명의 다른 폴리펩타이드들은 TPO 폴리펩타이드

TPO(1-163), [△Arg¹¹⁷] TPO(1-163), [△Gly¹¹⁶], TPO(1-163), [His³³, Thr^33′, Pro³⁴] TPO(1-163), [His³³, Ala^33′, Pro³⁴] TPO(1-163), [His³³, Gly^33′, Pro³⁴, Ser³⁸] TPO(1-163), [Gly¹¹⁶, Asn¹¹⁶, Arg¹¹⁷] TPO(1-163), [Gly¹¹⁶, Ala^116′, Arg¹¹⁷] TPO(1-163), [Gly¹¹⁶, Ala^116′, Arg¹¹⁷] TPO(1-163), [Gly¹¹⁶, Gly^116′, Arg¹¹⁷] TPO(1-163), [Gly¹¹⁶, Gly^116′, Arg¹¹⁷] TPO(1-163), [Ala¹, Val³, Arg¹²⁹] TPO(1-163), [Ala¹, Val³, Arg¹³³] TPO(1-163), [Ala¹, Val³, Arg¹²⁹] TPO(1-163), [Ala¹, Val³, Leu⁸²] TPO(1-163), [Ala¹, Val³, Leu¹⁴⁶] TPO(1-163), [Ala¹, Val³, Pro¹⁴⁸] TPO(1-163), [Ala¹, Val³, Arg⁵⁹] TPO(1-163), 및 [Ala¹, Val³, Arg¹¹⁵] TPO(1-163)의 유도체들을 포함한다.

본 발명의 TPO 폴리펩타이드는 또한 폴리머, 바람직하게는 폴리에틸렌글리콜에 공유결합된 것들을 포함한다. 본 발명의 TPO 폴리펩타이드는 또한 아미노산 [Met^-2- Lys^-1], [Met^-1] 또는 [Gly-1]를 포함한다. 본 발명에 의해 제공된 DNA들은 TPO 폴리펩타이드 및 상기한 유도체를 코딩하는 DNA를 포함하는데 DNA, 게놈 DNA 및 합성된 DNA로서 적절히 제공된다.

본 발명은 또한 본 발명의 DNA에 의해 코딩된 폴리펩타이드를 적당한 숙주에서 발현시키고, 상기 TPO 폴리펩타이드를 분리하는 단계를 포함하는 상기한 TPO 폴리펩타이드의 제조방법을 제공한다. 발현된 TPO 폴리펩타이드가 Met^-2- Lys^-1폴리펩타이드일 경우 그러한 방법은 상기 분리된 TPO 폴리펩타이드로부터 Met^-2- Lys^-1을 분절하는 단계를 더 포함할 수 있다.

본 발명은 또한 글루타치온-S-트랜스퍼라제(GST) 융합 폴리펩타이드와 같은 TPO 폴리펩타이드를 제조하는 방법을 제공한다. 아미노 말단 GST 폴리펩타이드, 트롬빈 인식 펩타이드 및 TPO 폴리펩타이드를 코딩하는 DNA를 적절한 숙주에 도입하고 융합 단백질을 분리하며 트롬빈과의 처리에 의해 GST 성분을 제거한다. 최종 TPO 폴리펩타이드는 [Gly^-1] 구조로 이루어진다.

본 발명은 혈소판 생성을 특이적으로 자극하거나 증가시키는 생물학적 활성을 갖는 폴리펩타이드를 발현하도록 본 발명에 따른 DNA 서열로 형질전환되거나 또는 형질감염된 원핵생물 또는 진핵생물 숙주세포를 제공한다.

본 발명의 약제학적 조성물은 약제학적으로 수용가능한 담체와 조합된 유효량의 TPO 폴리펩타이드 또는 그 유도체를 포함하며 화학요법, 방사선요법 또는 공수이식에 의해 유발된 혈소판 장해, 특히 혈소판감소증의 치료에 사용될 수 있다. 이것에 상당하는 치료방법 역시 본 발명에 의해 제공된다.

마지막으로 본 발명은 상기한 바와 같은 TPO 폴리펩타이드 그 유도체와 특이적으로 면역반응하는 항체를 제공한다. 그러한 항체들은 본 발명의 TPO 폴리펩타이드의 분리 및 정량하는 방법에 유용하다.

본 발명에 따르면, TPO 활성을 갖는 단백질을 코딩하는 신규한 DNA 서열(이하 “본 발명의 DNA 서열” 이라함)이 제공된다. 본 발명의 DNA 서열은 본 명세서에 첨부된 서열목록의 서열 2, 4 또는 6에 도시된 아미노산 서열을 코딩하는 DNA 서열을 포함한다.

TPO 활성을 해하지 않을 경우, 서열 2, 4 또는 6에 도시된 상기 아미노산 서열이 부분적으로 변경된(치환, 결실, 삽입 또는 추가) 형태를 코딩하는 DNA 서열도 본 발명의 DNA 서열에 포함된다.

다시 말하면, 본 발명의 DNA 서열은 아미노산 서열이 거의 서열 2, 4 또는 6에 도시된 아미노산 서열인 단백질 분자를 코딩하는 DNA 서열을 포함한다. 본 명세서에 사용된 “아미노산 서열이 거의 서열 2, 4 또는 6에 도시된 아미노산 서열이다” 라는 어휘는 상기 아미노산 서열이 서열 2, 4 또는 6으로 도시된 것 뿐만 아니라 TPO 활성을 해하지 않을 경우 치환, 결실, 삽입, 부가 등과 같은 부분적 변형을 갖는 서열 2, 4 또는 6으로 도시된 것들도 포함한다는 것을 의미한다.

또한, 본 발명의 DNA 서열은 기본적으로 TPO 활성을 갖는 단백질을 코딩하는 DNA 서열로 이루어진다.

“아미노산 서열을 코딩하는 DNA 서열” 이라는 어휘는 뉴클레오타이드 서열에서 축퇴를 가질 수 있는 모든 DNA 서열을 포함한다.

본 발명의 DNA 서열은 또한 하기의 서열들을 포함한다.

(a) 서열 7, 194, 195 및 196으로 대표되는 DNA 서열 또는 이들의 상보적 가닥, (b) 상기(a)에서 정의된 바와 같은 DNA 서열 또는 이들의 단편에 스트린젠트 조건하에서 교잡하는 DNA 서열 또는 (c) 유전압호의 축퇴 없이 상기(a) 및 (b)에 정의된 바와 같은 DNA 서열에 교잡하는 DNA 서열.

다시말하면 본 발명의 DNA 서열은 하기의 서열들을 포함한다.

(a) 대장균 균주 DH5에 의해 보유된 벡터 pEF18S-A2α (기탁번호 : FERM BP-4565), 대장균 균주 DH5에 의해 보유된 벡터 pHT1-231 (기탁번호 : FERM BP-4564), 대장균 DH5에 의해 보유된 벡터 pHGT1 (기탁번호 : FERM BP-4617), 대장균 균주 DH5에 의헤 보유된 벡터 pHGT1 (기탁번호 : FERM BP-4616)에 통합되며 TPO 활성을 갖는 단백질의 아미노산 서열을 코딩하는 DNA 서열 ; 또는 (b) 상기(a)에서 정의된 바와 같은 DNA 서열 또는 이들의 단편에 스트린젠트 조건하에서 교잡하고 TPO 활성을 갖는 단백질의 아미노산 서열을 코딩하는 DNA 서열.

본 발명서에 사용된 “스트린젠트” 교잡 조건 이라는 어휘는 변성 및/또는 독특한 올리고뉴클레오타이드 프라이머(탐침) 서열을 사용하여 본 발명 DNA 들의 PCR 증폭을 실시하는 실시예들에서 사용된 것이다. 예를 들면, Molecular Cloning(샘브룩 등, 콜드 스프링 하버 라보라토리 프레스, 1989)의 Chap. 11과 14, 및 Molecular Biology, 아우수벨 등 편집, Current Protocols, 미합중국(1993)의 Current Protocols에 있는 Unit 2.10 참조.

또한, TPO 활성을 갖는 단백질을 코딩하고 서열 6에 나타낸 아미노산 서열의 1-163의 위치를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 DNA 서열도 본 발명의 DNA 서열에 포함된다.

그러한 DNA 서열은 쉽게 발현되는 벡터의 작제를 용이하게 하는 초기, 종료 또는 중간 부위에 있는 제한 효소 절단부위 및/또는 추가의 DNA 서열로 보충될 수 있다. 비-포유동물의 숙주가 사용될 때는 숙주에서 유전자 발현에 바람직한 코돈이 도입될 수 있다.

본 발명의 DNA 서열의 예로는 인간을 포함하는 포유동물 세포로부터 mRNA를 제조하고 공지의 방법으로 제조된 cDNA 라이브러리로부터 일반적인 방법으로 cDNA를 스크리닝함으로써 수득한 cDNA 분자를 포함한다. 이 경우의 mRNA 공급원으로 랫트 간실질세포 유래 세포주 McA-고 8994, HTC 세포, H4-II-E 세포, 랫트 간, 신장, 뇌 및 소장, 인간의 간 등으로 구성된 세포들을 포함한다.

본 발명 DNA 서열의 또 다른 예로는 인간을 포함하는 포유동물의 세포로부터 공지의 방법으로 제조된 게놈 라이브러리로부터 일반적인 방법으로 그것을 스크리닝 하여 수득한 게놈 DNA 분자이다. 이 경우에 게놈 DNA 공급원은 인간, 랫트, 마우스 등으로부터 얻어진 염색체 DNA 제제를 포함한다.

TPO 유도체를 코딩하는 DNA 서열은 TPO 활성을 갖는 단백질은 코딩하 cDNA 서열을 기존의 부위-특이적 돌연변이 처리시켜 cDNA 서열을 변성시키고 이에 의해 대응 아미노산 서열의 부분적인 변성을 유발함으로써 수득할 수 있다.

본 발명에서 TPO 활성을 갖는 단백질의 DNA 서열 또는 아미노산 서열을 밝혔으므로 부분적으로 변성된 아미노산 서열을 코딩하는 DNA 서열은 화학적 합성법으로 쉽게 얻을 수 있다.

본 발명의 DNA 서열은 많은 재조합 DNA 기술을 사용하여 TPO 활성을 갖는 단백질을 대량 생산하는데 유용한 물질이다.

또한, 본 발명의 DNA 서열은 TPO 관련 단백질을 코딩하는 유전자 뿐만 아니라 다른 포유류 종의 TPO를 코딩하는 cDNA 및 게놈 DNA를 분리하기 위한 라벨링된 탐침으로로서 유용하다. 또한, 인간 및 다른 포유동물 종의 유전자 치료에 유용하다. 추가로, 본 발명의 DNA 서열은 TPO의 대량생산을 위한 진핵생물 숙주로서 사용될 수 있는 트랜스제닉 포유동물 종의 개발에 유용하다(팔미터 등, Science, vol.222, pp.809-814, 1983 참조).

본 발명은 또한 TPO 활성을 갖는 단백질을 코딩하는 상기 DNA 서열이 통합된 벡터, 이 벡터로 형질전환된 숙주세포 및 상기 숙주세포를 배양하고 TPO 활성을 갖는 발현된 단백질을 분리, 정제하는 것을 포함하는 TPO 활성을 갖는 단백질의 제조방법도 제공한다.

이 경우에 유용한 숙주세포의 예로는 대장균과 같은 원핵생물의 세포, 효모, 곤충, 포유동물 등과 같은 진핵생물의 세포들을 포함한다. 포유동물 세포의 예로는 COS 세포, 중국 햄스터 난소(CHO)세포, C-127세포, 어린 햄스터 신장(BHK) 세포 등을 포함한다. 효모의 예로는 베이커 효모 (Saccharomyces Cerevisiae), 메탄올 소화효소 (Pichia Pastoris) 등을 포함한다. 곤충세포의 예로는 누에 배양세포 등을 포함한다.

이들 숙주세포의 형질전환에 사용하기 위한 벡터와 관련하여 pKC30(시마타케에이치 및 엠. 로젠버그, Nature, 292, 128-132, 1981 참조), pTrc 99A(아만 이. 등, Gene, 69, 301-315, 1988 참조) 등이 대장균 세포의 형질전환에 사용될 수 있다. 포유동물 세포를 형질전환시키기 위하여, pSV2-neo (서던과 베르그, J. Mol. Appl. Genet., 1, 327-341, 1982 참조), pCAGGS (니와 등, Gene, 108, 193-200, 1991), pcDL-SRα296 (타케베 등, Mol. Cell. Biol., 8, 466-472, 1988 참조) 등이 사용될 수 있다. 효모 세포에 대해서는 pG-1 (쉐나 엠 및 야마모토 케이. 알., Science, 241, 965-967, 1988) 등이 사용될 수 있다. 재조합 바이러스 작제를 위한 전달 벡터, 예를 들면 pAc373 (럭코우 등, Bio/Technology, 6, 47-55, 1988 참조)이 누에고치 세포의 형질전환에 사용될 수 있다.

필요한 경우 각각의 이들 벡터는 진핵생물의 세포에 사용하기 위한 벡터일 경우에 복제기점, 선택마커, 프로모터 등 뿐만 아니라 RNA 접합부위, 폴리아데닐화시그널 등을 함유할 수 있다.

복제기점과 관련하여 예를 들면, SV40, 아데노바이러스, 소 유두종 바이러스로부터 유도된 서열이 포유동물 세포에 대한 벡터로 사용될 수 있다. COIE 1, R 인자, F 인자 등으로부터 유도된 서열은 대장균 세포 벡터에 사용될 수 있다. 2㎛ DNA, ARS1 등으로부터 유도된 서열이 효모 세포용 벡터에 사용될 수 있다.

유전자 발현을 위한 프로모터로서는 예를 들면, 레트로바이러스, 폴리오마바이러스, 아데노바이러스, SV40 등으로부터 유도된 것들이 포유동물 세포용 벡터에 사용될 수 있다. 박테리오파이지λ로부터 유도된 프로모터 예를 들면, trp, lpp, lac 또는 tac 프로모터가 대장균 세포용 벡터에 사용될 수 있다. ADH, PH05, GPD, PGK 또는 MAF α 프로모터가 베이커 효모 세포용 벡터에 사용될 수 있고 또 AOX1 프로모터는 메탄올 분해 효모 세포용 벡터에 사용될 수 있다. 핵 다각체 바이러스로부터 유도된 프로모터는 누에고치 세포용 벡터에 사용될 수 있다.

포유동물 세포용 벡터에 유용한 선택마커의 예는 네오마이신(neo) 내성 유전자, 티미딘 키나아제(TK) 유전자, 디하이드로폴레이트 환원효소(DHFR) 유전자, 대장균 크산틴-구아닌 포스포리보실트랜스퍼라제(Ecogpt) 유전자 등을 포함한다.

대장균 세포용 벡터에 유용한 선택마커의 예로는 키나마이신 내성 유전자, 암피실린 내성 유전자, 테트라사이클린 내성 유전자 등을 포함하고 효모세포를 위한 것들로는 Leu2, Trp1, Ura3 등의 유전자들을 포함한다.

이들 숙주-벡터 시스템의 적절한 조합을 사용하여 TPO 활성을 갖는 단백질을 제조하는 것은 상기 벡터의 적절한 부위에 본 발명의 유전자를 삽입하여 수득한 재조합 DNA로 적절한 숙주세포를 형질전환시키고 그 형질전환체를 배양한 후 최종 세포 또는 배양 배지 또는 여과물로부터 해당 폴리펩타이드를 분리 정제함으로써 수행될 수 있다. 일반적으로 사용되는 수단 및 과정이 이러한 공정에 함께 적용될 수 있다.

당해 유전자를 발현시킬 때 원래의 시그널 서열은 발현된 생성물의 상동성 N-말단을 얻기 위하여 변형되거나 또는 다른 단백질로부터 유도된 시그널 서열로 대체될 수 있다. N-말단의 상동화를 N-말단 또는 그 근처에 있는 아미노산 잔기의 수식(치환 또는 부가)에 의해 수행될 수 있다. 숙주세포로서 대장균을 사용하여 발현시키는 경우에는 메티오닌 잔기에 더하여 리신 잔기가 보충될 수 있다.

TPO 활성을 갖는 본 발명의 단백질(이하 “본 발명의 단백질” 이라함)은 각각 서열 2, 4 또는 6에 도시된 아미노산 서열을 포함하는 단백질을 포함한다. 아미노산 서열이 부분적으로 수식(치환, 결실, 삽입 또는 부가)된 TPO 유도체들 역시 그러한 수식에 의해 TPO 활성이 손상되지 않는 한 본 발명에 포함된다.

다시말하면, 본 발명의 단백질은 아미노산 서열이 거의 서열 2, 4 또는 6에 도시된 아미노산 서열인 단백질 분자를 포함한다.

본 명세서에 사용된 “아미노산 서열이 거의 서열 2, 4 또는 6에 도시된 아미노산 서열이다” 라는 어휘는 서열 2, 4 또는 6에 도시된 아미노산 서열들 뿐만아니라 치환, 결실, 삽입, 부가 등과 같은 부분적인 수식을 갖는, 서열 2, 4 또는 6에 도시된 아미노산 서열도 그러한 수식에 의해 TPO 활성이 손상되지 않는 한 포함된다.

본 발명의 단백질은 서열 6에 도시된 아미노산 서열의 7-151 위치를 포함하고 TPO 활성을 갖는 단백질을 포함한다. 서열 6에 도시된 아미노산 서열의 1-163 위치를 포함하고 TPO 활성을 갖는 단백질도 본 발명의 단백질에 포함된다.

본 발명의 다른 TPO 유도체의 예로는 생체내에서의 안정성 및 내구성이 아미노산 수식(치환, 결실, 삽입 또는 부가)에 의해 개선된 유도체, 최소한 하나의 글리코실화가 결실 또는 부가에 의해 변화된 유도체, 최소한 하나의 시스테인 잔기가 결실되거나 다른 아미노산 잔기(예를 들면, 알라닌 또는 세린 잔기)에 의해 치환된 유도체를 포함한다.

바람직하게는, 본 발명의 단백질은 화학적 합성에 의해 얻어진 cDNA 분자, 게놈 DNA 분자 또는 DNA 단편을 함유하는 재조합 벡터로 형질전환된 숙주세포로부터 분리 정제되는 것을 특징으로 한다.

세포내 발현이 숙주로서 박테리아를 사용하여 이루어질 때는 개시 메티오닌 잔기가 TPO 활성을 갖는 단백질 분자의 N-말단 측에 첨가된 단백질이 얻어지는데 이 역시 본 발명에 포함된다. 사용된 숙주에 따라 TPO 활성을 갖는 제조된 단백질이 글리코실화 되거나 되지 않을 수 있는데, 그러한 각각의 경우는 본 발명의 단백질에 포함된다.

또한, 본 발명의 단백질은 TPO 활성을 갖는 세포 배양배지 또는 인간의 뇨, 혈청 및 혈장과 같은 천연원으로부터 분리정제된, 자연적으로 발생하는 TPO-활성 단백질을 포함한다.

그러한 천연원으로 부터의 TPO 정제 방법 역시 본 발명에 포함된다. 그러한 정제방법은 이온교환 크로마토그래피, 렉틴 친화성 크로마토그래피, 트리아진색소 친화성 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 겔 여과 크로마토 그래피, 역상 크로마토그래피, 헤파린 친화성 크로마토그래피, 황산화 겔 크로마토그래피, 하이드록실아퍼타이트 크로마토그래피, 등전점 분획 크로마토그래피, 금속 킬레이트화 크로마토그래피, 예비전기영동법, 등전점 분획 겔 전기영동법 등과 같은 일반적으로 사용되는 정제 단계들중의 하나 또는 조합하여 사용함으로써 수행될 수 있다. 특정의 기술들이 본 명세서의 실시예들로부터 추론될 수 있는 TPO의 물리화학적 특성을 사용하여 조합되어 사용되는 정제공정 역시 본 발명에 포함된다. 또한, TPO를 인식할 수 있는 항체가 부착된 항체 친화성 크로마토그래피 역시 사용될 수 있다. TPO는 Mpl을 위한 리간드인 것으로 발견되었는데(드소베이지 등, Nature 369 : 533-538(1994) : 바틀리 등, Cell 77 : 117-1124 (1994); 카우샨스키 등, Nature 369 : 565-568(1994) 참조), 이것에 의헤 Mpl이 수지에 결합된 친화성 겔 친화성 겔 컬럼을 사용하여 TPO가 정제될 수 있다. 보다 상세하게는 컬럼의 예로서는 숙주세포로서 CHO 세포를 사용하는 제조합 DNA 기술에 의해 생성된 Mpl)Mpl-X)의 세포외 부위를 수지와 결합시킴으로써 제조된 Mpl-X 컬럼을 포함한다(바틀리 등, (1994), Supra 참조)

본 명세서에 기술된 바와 같이, 본 발명의 TPO 폴리펩타이드는 Mpl 수용기에 결합하고 그것의 세포외(용해성) 도메인에 특이적으로 결합하는 능력을 갖는 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명에 포함된 것은 TPO 유전자의 인간 cDNA 또는 게놈 DNA 서열의 단백질-코딩 가닥에 상보적인 DNA 성분에 의해 코딩된 단백질, 즉, 트라몬타노 등에 의해 기술된 “상보적으로 전환된 단백질”이다(Nucl. Acids Res., vol 12, pp.5049-5059, 1984 참조).

또한, 본 발명에 포함된 것은 검출가능한 마커, 예를 들면¹²⁵I 라벨링 또는 비오티닐레이션으로 라벨링되어 조직과 같은 고체 샘플 및 혈액, 뇨 등과 같은 액체샘플에서 TPO 또는 TPO 수용기-발현세포를 검출 및 정량화 하는데 유용한 시제의 제공을 가능하게 하는, 본 발명의 단백질이다.

본 발명의 비오티닐화된 단백질은 자생적 골수 이식시에 골수로부터 거핵아구를 제거하기 위해서 고정화된 스트렙트아비딘에 결합될 경우에 유용하다. 또한, 자생적 또는 이형적 골수 이식시에 자생적 또는 이형적 거핵구 세포를 농축시키기 위해서 고정화된 스트렙트아비딘에 결합할 경우에도 유용하다. 리신과 같은 독소, 디프테리아 독소 등, 또는 방사활성 동위원소와 TPO의 접합체(Conjugate)는 항종양요법 및 골수이식을 위한 조건화에 유용하다.

본 발명은 또한 방사활성 마커 또는 비오틴과 같은 비-방사활성 마커를 포함하는 검출가능한 마커로 라벨링 될 때 또는 염색체 지도상에서 인간 TPO 유전자 및/또는 관련 유전자 족의 위치 검출을 위한 교잡 과정에 사용될 때 유용한 핵산 물질을 제공한다. 그러한 물질은 또한 DNA 수준으로 인간 TPO 유전자 장해의 확인에도 유용하고 인접한 유전자들 및 그들의 장해의 확인을 위한 유전적 마커로서 사용될 수 있다.

또한, 치료적으로 효과적인 양의 본 발명 단백질과 유용하고 효과적인 희석제, 방부제, 용해제, 유화제, 보조제 및/또는 담체를 함유하는 약제학적 조성물도 본 발명에 포함된다. 본 명세서에 사용된 “치료적으로 효과적인 양” 이라는 용어는 특정 상태에 대한 치료 효과 및 투여 조건화의 경로를 제공하는 양을 의미한다. 그러한 조성물은 액체, 동결건조 및 제제의 형태로 사용되는데, 다양한 pH 값 및 이온강도를 갖는 많은 완충제(Tris-HCl, 초산염 및 인산염)로부터 선택된 희석제, 알부민 또는 젤라틴과 같은 표면 흡착 방지 첨가제, Tween 20, Tween 80, Pluronic F68 또는 담즙산염과 같은 계면활성제, 글리세롤 또는 폴리에틸렌 글리콜과 같은 용해제, 아스코르브산 또는 소듐 메타비설파이트와 같은 항산화제, 티메로살, 벤질알콜 또는 파라벤 및 락토오스 또는 만니톨과 같은 부형제 또는 강장제를 포함한다. 또한, 폴리에틸렌 글리콜과 같은 폴리머에 본 발명 단백질의 공유결합, 단백질과 금속 이온의 킬레이트화, 과립 제제 또는 폴리라틱산, 폴리글리콜산 또는 하이드로겔과 같은 폴리머 화합물로 이루어진 표면상에 단백질의 도입, 또는 리포좀, 마이크로에멀젼, 미셀, 단일층 또는 다층 부형제, 적색 환영세포 또는 스페로플라스트에 단백질의 도입을 포함하는 조성물이 사용된다. 그러한 조성물은 물리적 조건 즉, TPO 용해성, 안전성, 생체내 방출율 및 정화치에 영향을 미친다. 조성물의 선택은 사용된 TPO-활성 단백질의 물리, 화학적 특성에 따라 결정될 수 있다. 또한, 과립이 폴록사머 또는 폴록사민과 같은 폴리머와 조직특이적 수용기, 리간드 또는 항원에 대한 항체에 또는 조직 특이적 수용기 리간드에 결합하는 TPO로 피복된 과립 조성물이 본 발명에 포함된다. 본 발명 조성물의 다른 예로는 비경구, 폐를 통한, 코를 통한, 그리고 경구투여와 같은 많은 경로로 투여하기 위한 과립 형태로서 보호 코팅을 가지며 프로테아제 억제제 또는 침투 강화제를 함유하는 것을 포함한다.

본 발명의 단백질을 포함하는 약제학적 조성물은 환자의 상태 및 성, 투여경로 등에 따라 일반적으로 0.05㎍∼1mg/KG체중(TPO 단백질로서)의 양으로 하루에 몇번 투여될 수 있다.

본 발명의 단백질을 함유하는 약제학적 조성물은 증상, 성 및 투여경로에 따라 하루에 1∼7번 그리고 일주일에 1∼7일 동안 체중 kg당 25,000∼500,000의 활성성분 용량(하기에 설명되는 M-07e 분석에 의한 상대적인 활성도 하에서)으로 투여될 수 있다.

본 발명자들은 서열 6에 도시된 152번째 아미노산 서열까지 아미노산 잔기가 결실되어도 인간 TPO의 C-말단 부위와 관련하여 활성이 유지되고 또 6번째 아미노산 서열까지의 아미노산 잔기가 결실되어도 N-말단 부위와 관련한 활성이 유지된다는 것을 확인하였다.

따라서, 서열 6의 7∼15번째 아미노산 서열을 함유하고 다른 부분에서 수식(치환, 결실, 삽입 또는 추가)된, TPO 활성을 갖는 단백질 역시 본 발명의 유효성분으로서 바람직하게 사용될 수 있다. 보다 바람직할 TPO 유도체는 서열 6의 1∼163번째 아미노산 서열을 갖는 것이다.

본 발명의 단백질 이외에 EPO, G-CSF, GM-CSF, M-CSF, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, LIF 및 SCF와 같은 추가의 조혈인자중의 하나 이상을 함유하는 조성물 역시 본 발명에 포함된다.

본 발명의 단백질은 단독 또는 다른 추가적인 조혈인자와 조합하여 많은 혈소판 감소 질병을 치료하는데 유용하다. 다른 추가적인 조혈인자의 예로는 EPO, G-CSF, GM-CSF, M-CSF, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, LIF 및 SCF를 포함한다.

혈소판의 생성 장애 또는 혈소판의 수명감소(혈소판의 파괴 또는 소비에 의해 야기된)에 기인한 혈소판 감소증과 같은 혈소판 장해로 특징되는 많은 질병들이 있는데 이들은 본 발명의 단백질로 치료될 수 있다. 예를들면, 선천성 판코니(Fanconi) 빈혈 또는 화학요법 또는 방사선 조사에 의해 야기된 재생불량성 빈혈, 골수 세포곤란(Myelodysplastic) 증후군, 급성 골수구 백혈병, 골수 이식후의 재생불량성 위기에 기인한 혈소판 감소증 환자에서 혈소판의 회복의 강화를 위해 사용될 수 있다. TPO의 감소된 생성에 기인한 혈소판감소증의 치료에도 유용하다. 혈소판 또는 거핵구 수명 감소에 기인한 혈소판감소증 특발성 혈소판 감소성 자반, 재생불량성 빈혈, 후천성면역 결핍증(AIDS), 전염된 맥관내 응고 증후군 및 혈전성 혈소판감소증을 포함한다. 또한, 환자 자체의 혈소판 수를 증가시키기 위해서 수술전에 TPO를 환자에게 투여하여 증가된 혈소판이 수술시에 수혈 혈소판으로 사용되는, 혈소판의 자기수혈법에 유용하다.

본 발명 단백질의 다른 용도는 다른 화학적 또는 약제학적 약물 또는 의약치료에 의해 야기된 혈소판의 일시적 제거 또는 손상에 의해 질병의 치료이다. TPO는 그러한 환자에게서 새로운 “무손상(Intact)” 혈소판의 방출을 강화시킬 목적으로 사용될 수 있다.

본 발명은 또한 TPO에 특이적인 항체에 관한 것이다. 본 발명의 단백질은 항원으로서 사용될 수 있는데 대응 항체로는 모노클로날 및 폴리클로날 항체 및 키메라 항체 즉, 통상의 방법에 의해 제조된 “재조합” 항체를 포함한다. 그러한 항-TPO 항체를 제조하기 위해서는 인간 TPO 그 자체가 항원으로 사용될 수 있거나, 선택적으로 인간 TPO의 부분적 펩타이드가 항원으로 사용될 수 있다. 그러한 펩타이드 항원에 대한 항체가 사용될 경우에 에피토프는 항원 부위를 구체화함으로써 정의될 수 있다. 한편, 항원 단백질(TPO) 그 자체에 대한 항체가 사용될 경우에 항원부위는 항체의 에피토프를 분석함으로써 명확해질 수 있다. 그러한 경우에 명확해진 에피토프를 각각 갖는 이 항체들은 추가된 당쇄의 종류, 펩타이드 쇄의 길이 등과 같은 특성이 상이한 많은 TPO들을 분별, 검출, 정량화 및 정제하는데 이용될 수 있다.

선택된 아미노산 서열을 함유하는 TPO 펩타이드를 합성하고 적당한 항체 단백질, 예를 들면, 알부민, KLH(키이홀 림페테모시아닌(Key holl Limpethemocyanine))등에 공유결합시켜 면역반응성 항원을 제조한다. 선택적으로, 복합항원 펩타이드(MAP)형의 펩타이드는 탐(Tam)의 방법 (Proc. Natl. Acad. Sci.(USA) 85:5409-5413, 1988)에 따라서 항원으로 제조된다. 이때 보조제 등과 함께 이렇게 제조된 항원으로 면역화된 것은 항체를 생성하도록 하는데 일반적으로 이용되는 포유동물 새 등, 예를 들면 토끼, 마우스, 랫트, 염소, 양, 닭, 햄스터, 말, 기니아 돼지 등이다. 이렇게 면역화된 동물로부터 항혈청과 세포를 회수하고 또 그로부터 폴리클로날 항체를 수득하다. 펩타이드가 항원으로 사용될 경우에는 에피토프는 항원영역을 한정함으로써 정의될 수 있다. 이런 경우, 상이한 분자량을 갖는 많은 TPO 분자들 부위는 스크리닝되어 면역생리학적 가공에 의해 확인된다. 하나의 예로서 펩타이드-결실 부위는 스크리닝 되어 확인될 수 있다. 또한, 항체유전자 또는 이 유전자의 일부는 목적하는 항체를 발현하는 세포로부터 클로닝되어 유전자 조작에 의해 발현된 항체 분자를 얻는다.

일반적으로 많은 항원 결정인자(에피토프)에 대하여 특이적인 많은 항체를 함유하는 플리클로날 항체와 비교할 때, 모노클로날 항체는 항원상의 단일항원 결정인자에 대하여 특이적이다. TPO-특히 항체는 항원-항체 반응을 이용한 진단 및 분석평가의 선택성 및 특이성을 개선하는데 유용하며 TPO의 분리 및 정제를 수행하는데 유용하다. 또한, 그러한 항체들은 혈청에서 TPO를 중화 또는 제거시키는데 적용될 수 있다. 모노클로날 항체들은 또한 예를 들면, 전체 혈핵의 혈청에서 TPO를 검출 및 정량하는데 유용하다.

본 발명의 항-인간 TPO 항체는 인간 TPO의 정제 및 분리를 위한 친화성 크로마토그래피에서 리간드로서 사용될 수 있다. 그러한 친화성 크로마토그래피에서 그것이 유용하게 되도록 항체를 고정시키기 위해서는 다양한 효소들을 고정시키기 위한 어떤 통상의 방법도 사용될 수 있다. 즉, CNBr-활성화 세파로오스 4B(파마시아 화인 케미칼스 컴패니 제조)의 캐리어를 사용하는 방법 등이 사용가능하다.

고정된 항-인간 TPO 항체의 사용에 의해 인간 TPO를 실제적으로 정제하기 위해서 고정된 항-인간 TPO 항체를 컬럼에 채우고 인간 TPO-함유 액체를 컬럼을 통하여 통과시킨다. 이러한 작업에 의해 대량의 인간 TPO가 컬럼에 있는 캐리어에 흡착된다. 용출을 위한 용매로서는 예를들면 글리신-HCl 완충액(pH 2.5), 염화나트륨용액, 프로피온산, 디옥산, 에틸렌 글리콜, 카오트로픽염, 구아니딘 하이드로클로라이드, 우레아 등이 사용가능하다. 그러한 용매를 사용하여 용출함으로써 고순도의 인간 TPO가 용출된다.

본 발명의 항체는 면역화학적 정량평가 특히, 고상 샌드위치 방법에 의해 수행되는 효소-면역분석에 의해 인간 TPO를 측정하는데 사용될 수 있다.

모노클로날 항체의 잇점은 그들이 어떤 다른 면역글로불린 분자를 함유하지 않는 배지에서 하이브리도마 세포에 의해 생성될 수 있다는 것이다. 모노클로날 항체는 하이브리도마 세포의 배양 상청액이나 하이브리도마 세포의 복강내 주사에 의해 유도된 마우스 복수증으로부터 제조될 수 있다. 콜러 및 밀슈타인에 의해 기술된 하이브리도마 기술 (Eur. J. Immunol. 6: 511-519, 1976)은 다수의 특이 항원에 대한 구수준의 모노클로날 항체를 갖는 하이브리드 세포주의 형성에 널리 사용될 수 있다.

상기 수득한 항-혈청 등과 같은 항체-함유 물질을 정제함으로써 목적하는 항체를 분리하기 위해서는 단백질의 정제를 위해서 일반적으로 사용되는 하나 이상의 단계들(단백질 A 친화성 크로마토그래피, 단백질 G 친화성 크로마토그래피, 애비드겔 크로마토그래피, 항-면역글로불린 고정 겔 크로마노그래피와 같은 친화성 크로마토그래피; 양이온-교환 크로마토그래피, 음이온-교환 크로마토그래피, 렉틴 친화성 크로마토그래피, 색소흡착 크로마토그래피, 소수성 상소작용 크로마토그래피, 겔 침투 크로마토그래피, 역상 크로마토그래피, 하이드록실아퍼타이트 크로마토그래피, 플루오로-아퍼타이트 크로마토그래피, 금속 킬레이트화 크로마토그래피, 등 전점 크로마토그래피, 분배 전기영동법, 등전점 전기영동법 등)이 조합될 수 있다.

이들과 별개로 인간 TPO 단백질 그 자체 또는 항원부위 또는 그 부위의 일부를 함유하는 펩타이드 또는 즉 목적하는 항체를 인식할 수 있는 분자가 화학적으로 결합된 겔 캐리어 또는 막을 제조하고 여기에 항체-함유 물질을 첨가하여 목적하는 항체를 캐리어 또는 막 상에 흡착시키고 또 이렇게 흡착된 항체를 적당한 조건하에서 용출시켜 회수하는 항원 친화성 정제 방법이 사용될 수 있다.

본 발명은 또한 대량의 폴리펩타이드 생성물 제조를 위해 TPO 폴리펩타이드를 코딩하는 내성 DNA 서열의 사용을 가능하게 한다. 예를 들면, 생체내 및 생체외 상동성 재조합 과정을 이용하여 숙주세포를 형질전환시켜 폴리펩타이드의 발현 또는 강화된 발현을 제공한다. 바람직한 숙주세포로는 세포성 게놈의 표적부위와 상동성인 측면(Flanking) 서열을 사용하여 프로모터 또는 인헨서 서열이 삽입되어 TPO 폴리펩타이드 발현이 달성되거나 향상되는 인간 세포(예를 들면, 간, 골수 등)을 포함한다. 예를 들면, PCT WO 90/14092, WO 91/06666 및 WO 91/09955로 공개된 미합중국 특허 제5,272,071호 참조.

본 발명의 DNA에 의해 코딩된 폴리펩타이드를 적당한 숙주에서 발현시키고 그 TPO 폴리펩타이드를 분리하는 단계를 포함하는 상기 TPO 폴리펩타이드의 제조방법도 본 발명에 의해 제공된다. 발현된 TPO 폴리펩타이드가 Met^-2- Lys^-1폴리펩타이드일 경우에 상기 방법은 분리된 TPO 폴리펩타이드로부터 Met^-2- Lys^-1을 절단시키는 단계를 더 포함할 수 있다.

또한, 트롬빈 인식 폴리펩타이드를 코딩하는 DNA에 의해 분리된 글루타치온-S-트랜스퍼라제(GST) 및 TPO 폴리펩타이드 코딩 서열인 GST 폴리펩타이드 5′-에서부터 TPO 폴리펩타이드 코딩서열을 코딩하는 DNA를 적당한 숙주세포에 도입하고 GST-TPO 발현 생성물을 분리한 후 GST 아미노산을 제거하기 위하여 발현된 폴리펩타이드를 트롬빈으로 처리하는 단계를 포함하는 [Gly^-1] 구조를 갖는 TPO 폴리펩타이드의 제조방법이 제공된다. 최종 TPO 폴리펩타이드는 [Gly^-1] 구조를 갖는다.

본 발명은 하기에서 보다 상세히 설명된다.

(A) 랫트 TPO의 정제, 정제된 랫트 TPO의 부분적 아미노산 서열의 분석

및 정제 된 랫트 TPO의 생물학적 특성의 분석

본 발명자들은 먼저 CFU-MK의 증식과 분화를 강화시키는 활성을 갖는 단백질(랫트 TPO)의 정제를 시도했다. 이러한 정제연구에서 많은 천연 공급원의 선택, 크로마토그래피를 위한 겔 및 분리형태의 선택과 같은 정제 과정시에 많은 시행착오를 경험했다. 그 결과, 본 발명자들은 하기의 〈참고 실시예〉에서 설명되는 랫트 CFU-MK 분석에 기초한 마커로서 TPO 활성을 이용하여 X-선 또는 γ-선 조사에 의해 유도된 혈소판감소증 랫트의 혈장으로부터 TPO 활성을 갖는 단백질을 정제하고 정제된 단백질의 부분적 아미노산 서열을 결정하는데 성공했다〈실시예 1 및 2〉.

혈장-유도 랫트 TPO의 생물학적 특정 역시 시험되었다〈실시예 3〉.

랫트 TPO의 정제에서부터 정제된 단백질의 부분적인 아미노산 서열의 결정까지의 과정의 개요를 하기에 나타내었다.

(i) X-선 γ-선 조사에 의해 유도된 약 1,100마리의 혈소판감소증 랫트로부터 혈장 샘플을 제조하여 세파덱스 G-25 프로마토그래피, 음이온 교환 크로마토그래피(Q-세파로오스 FF) 및 렉틴 크로마토그래피(WGA-아가로오스)를 순서대로 하여 WGA-아가로오스-흡착 TPO-활성 분획을 얻었다.

(ii) 다음에, 얻어진 WGA-아가로오스-흡착 TPO-활성 분획에 대하여 트리아진 색소 친화성 크로마토그래피(TSK AF-BLUE 650 MH), 소수성 상호작용 크로마토그래피(페닐 세파로오스 6FF/LS) 및 겔 여과 크로마토그래피(세파크릴 S-200 HR)를 순서대로 행하였다. TPO 활성도는 세파크릴 S-2000 HR 겔 여과에 의해 4개의 피크(최고 분자량 분획인 F1, 이어서 F2, F3 및 F4임)로 나뉘어지기 때문에 TPO-활성분획 F2 및 F3 각각을 농축시켜 고분자량 TPO 샘플 F2 및 저분자량 TPO 샘플 F3를 얻고 이를 다음 정제 단계에서 별도로 사용하였다.

(ⅲ) 저분자량 TPO 샘플 F3을 예비 역상 크로마토그래피 (YMC-Pack PROT EIN-RP), 역상 크로마토그래피 (YMC-Pack CN-AP) 및 다른 역상 크로마토그래피(Cap cell Pack C1) 순으로 처리하였다. 얻어진 TPO-활성 분획을 소듐도데실설페이트(SDS) 폴리아크릴아미드 겔 전기영동법 (SDS-PAGE)에 적용하고 TPO-활성 물질을 겔로부터 추출하연 TPO 활성의 존재는 비-환원상태하에서 약 17,000-19,000의 겉보기 분자량에 일치하는 밴드에서 확인되었다.

(iv) 이어서, TPO-활성 분획 전부를 비-환원 조건하에서 SDS-PAGE에 적용하고 PVDF 막으로 전달시켰다. PVDF 막상에서 단백질을 계통 제한되는 효소 가수분해에 의해 펩타이드 단편으로 분해시킴으로써 랫트 TPO 단백질의 부분적인 아미노산 서열을 측정했다. 두 펩타이드 단편의 아미노산 서열 정보를 기초하여 랫트 TPO 유전자의 클로닝을 수행하였다.

(v) 이와는 별도로 세파크릴 S-200 HR에 의해 수득한 고분자량 TPO 샘플 F2를 저분자량 TPO 샘플 F3의 경우에서와 같은 방법으로 정제 처리하였다. 최종단계의 역상 크로마토그래피 (Capcell Pack C1)에 의해 수득한 TPO-활성 분획을 SDS-PAGE에 적용하고 TPO-활성 물질을 겔로부터 추출했을 때 TPO 활성의 존재는 비-환원 조건하에서 약 17,000∼22,000의 겉보기 분자량과 일치하는 밴드에서 확인되었다.

(B) TPO 생산 세포의 구체화, mRNA의 제조 및 랫트 cDNA 라이브러리의 작제

정제된 랫트 TPO는 혈장으로부터 유도되기 때문에 cDNA 클로닝에 사용하기 위한 mRNA 원으로서 기관 또는 세포를 스크린 하는 것이 필요했다. 따라서, 많은 기관 및 세포 배양 상청액에서의 TPO 활성을 랫트 혈장-유도 TPO와 생화학적 및 생물학적 특성에 기초하여 스크린했다. 그 결과, 랫트 혈장-유도 TPO와 거의 동일한 TPO 활성들이 랫트 간세포(Hepatorcyte)-유도 세포주 McA-RH8994, HTC 및 H4-II-E의 배양 상청액에서 뿐만 아니라 랫트의 본래 간세포의 배양 상청액에서도 발견되었다〈실시예 4〉.

한편, 발현벡터 pEF18S는 2개의 발현 벡터 pME18S 및 pEFVOS로부터 작제했다〈실시예 5〉. 이 벡터를 작제함으로써 삽입의 통합을 위해 사용될 수 있는 다중 클로닝 부위를 갖는 고효율 발현 벡터를 사용하여 쉽게 cDNA를 클로닝 하는 것이 가능해졌다.

상기 발혈벡터 이외에 pUC 및 pBR을 기제로한 플라스미드 벡터와 λ기제 파아지 벡터가 cDNA 라이브러리의 작제에 주로 사용된다.

McA-RH8994 세포를 배양하고 구아니딘 티오시아네이트 용액을 첨가하여 균질화시킨 다음 CsCl 밀도 구배 원심분리처리시켜 전체 RNA를 얻었다〈실시예 6〉.

RNA의 제조는 고온 페놀법, 산 구아니듐 페놀 클로로포름법 등에 의해서도 이루어 질 수 있다.

올리고 dT-고정 라텍스 입자를 사용하여 전체 RNA로부터 폴리(A)+RNA를 정제한 후에 제한효소 NotI 인식 서열이 추가된 올리고 dT를 프라이머로서 사용하여 역전사 효소의 작용에 의해 제 1 cDNA 가닥을 합성하고 이어서 RNaseH 및 대장균 DNA 폴리머라제 I을 사용하여 제 2 cDNA 가닥을 합성했다. 상기 수득한 이중가닥 cDNA 에 어댑터를 추가하고 그 결과 생긴 cDNA를 NotI 및 EcoRI으로 분해된 실시예 5에서 작제된 포유동물 세포 발현벡터 pEF18S와 결찰시킨 다음 결찰된 cDNA를 대장균 균주 DH5의 수용세포로 형질전환시켜 cDNA 라이브러리를 작제했다〈실시예 7〉.

(C) PCR에 의한 랫트 TPO cDNA 단편의 제조(클로닝)

폴리머라제 연쇄 반응(PCR)에 사용하기 위한 축퇴 프라이머를 합성하기 위해 랫트 혈장으로부터 정제된 랫트 TPO의 부분적 아미노산 서열로부터 DNA 서열을 추론하였다. 사용될 프라이머는 여기에 사용되는 프라이머의 위치 이외의 아미노산 서열에 기초하여 얻어질 수 있다. 고 축퇴 프라이머 역시 이노신의 사용 없이도 사용될 수 있다. 또한, 축뇌가 감소된 프라이머는 랫트에서 많은 용도를 갖는 코돈을 사용하여 설계될 수 있다(와다 등, Nucleic Acids Res., vol.18, p.2367-2411, 1990 참조).

플라스미드 DNA를 상기에서 제조된 cDNA 라이브러리 전부로부터 추출하고 추출된 DNA를 주형으로 사용하여 PCR을 행하였을 때 약 330bp의 밴드가 검출되었으며 이것은 뉴클레오타이드 서열분석에 의해 랫트 TPO의 일부를 코딩하는 DNA 단편(A1)단편)으로 확인되었다〈실시예 8〉.

(D) PCR에 의한 랫트 TPO cDNA의 스크리닝, 랫트 TPO cDNA의 서열

및 TPO 활성의 확인

상기에서 제조된 cDNA 라이브러리를 약 10,000 클론을 각각 함유하는 푸울(Pools)들로 나누고 각 100 푸울로부터 플라스미드 DNA를 추출했다. 각 푸율의 플라스미드 DNA를 주형으로 사용하고 A1 단편의 뉴클레오타이드 서열에 기초하여 새롭게 합성된 프라이머를 사용하여 PCR을 행하였을 대 특이적인 것으로 간주되는 밴드가 3개의 푸울에서 검출되었다. 이 3개의 푸울중 하나를 약 900 클론을 각각 함유하는 서브 푸울(sub-pools)로 나누고 100개 서브 푸울로부터 플라스미드 DNA를 정제한 후 동일한 방법으로 PCR을 행하였다. 그 결과 특이적인 밴드가 3개의 서브 푸울에서 검출되었다. 이들 푸울들중 하나를 각각이 40개 클론을 함유하는 서브 푸울로 나누고 최종적으로 각 클론을 동일한 방법으로 PCR 하여 스크린했다. 그 결과 랫트 TPO cDNA를 코딩하는 것으로 보이는 클론 pEF18S-A2α가 분리되었다.

[실시예 9 및 실시예 10]

상기 클론의 뉴클레오타이드 서열을 분석하였을 때 이것이 랫트 혈장으로부터 정제된 단백질의 부분적인 아미노산 서열을 코딩하는 것으로 나타나서 상기 클론이 랫트 TPO cDNA를 함유한다는 강한 가능성을 확인했다〈실시예 10〉.

상기 수득한 클론 pEF18S-A2 α로부터 플라스미드 DNA를 정제하고 COS1 세포에 형질감염시켰을 때 형질감염된 세포의 배양 상청액에서 TPO 활성이 발견되었다. 그 결과, 클론 pEF18S-A2 α가 랫트 TPO를 코딩하는 cDNA를 함유함이 확인되었다.

[실시예 11]

(E) 다양한 랫트 조직에서 TPO mRNA의 검출

랫트 조직에서 TPO mRNA 발현을 PCR로 분석하여 특이적 발현을 뇌, 간, 소장 및 신장에서 검출하였다〈실시예 12〉.

(F) 인간 cDNA 라이브러리의 작제

실시예 4 및 12의 결과에 기초하여 인간 TPO cDNA의 클로닝을 위한 출발 조직으로서 간을 선택했다. 이어서, 정상 인간의 간으로부터 유도된 시판중인 mDNA를 사용하여 cDNA 라이브러리를 작제했다. 랫트 라이브러리 경우와 같이 pPEF18S를 백터로서 사용하여 랫트의 경우에서와 같은 과정으로 cDNA를 합성하고 제한효소 NotI 및 EcoRI를 사용하여 직접적으로 클론된 cDNA 라이브러리를 얻었다. 대장균 DH5에 벡터-결찰된 cDNA를 도입함으로써 제조된 라이브러리는 약 1,200,000 클론을 함유했다〈실시예 13〉.

(G) RCR에 의한 인간 TPO cDNA 단편의 제조(클로닝)

랫트 TPO cDNA를 코딩하는 클론 pEF18S-A2 α의 뉴클레오타이드 서열을 기초하여 PCR을 위한 수개의 프라이머를 합성했다. 정상인의 간으로부터 유도된 시판중인 mRNA를 사용하여 cDNA를 합성하고 상기 프라이머 및 주형으로서 cDNA를 사용하여 PCR을 행하였을 때 약 620 bp의 밴드가 관찰되었다. 이 뉴클레오타이드 서열을 분석하였을 때 랫트 TPO cDNA와 약 86% 상동인 DNA 단편을 함유하는 것으로 나타나서 이것이 인간 TPO를 코딩하는 유전자의 일부라는 강한 가능성을 확인했다〈실시예 14〉.

(H) PCR에 의한 인간 TPO cDNA의 스크리닝, 인산 TPO cDNA의 서열

및 TPO 활성의 확인

상기에서 제조된 인간 cDNA 라이브러리를 증폭시켜 약 100,000 클론을 각각 함유하는 푸울들로 나누고 각 90개 푸울로부터 플라스미드 DNA를 추출했다. 각 푸울의 플라스미드 DNA 분자를 주형으로 사용하고 실시예 14에서 수득한 인간 TPO 단편의 뉴클레오타이드 서열을 기초하여 새롭게 합성된 프라이머를 이용하여 PCR을 행하였을 때 3개의 푸울에서 밴드의 검출이 가능했다. 이 푸울들중 하나를 5,000 클론을 함유하는 각 서브 푸울로 나누고 각 90개 서브 푸울로부터 플라스미드 DNA를 정제했다. 각 푸울의 플라스미드 DNA를 동일한 방법으로 RCR을 행하였을 때 5개의 서브 푸울에서 밴드의 검출이 가능했다. 이 푸울들중 하나를 250개 클론을 함유하는 각 서브 푸울로 나누고 각 90개 서브 푸울로부터 플라스미드 DNA를 정제하여 PCR을 수행하였을 때 3개의 서브 푸울에서 밴드의 검출이 가능했다. 이 푸울들중 하나를 30개 클론을 함유하는 각 서브-푸울로 나누고 각 90개 서브-푸울로부터 플라스미드 DNA를 정제하고 PCR을 수행하여 3개의 서브 푸울에서 밴드의 검출이 가능했다. 그후, 이들 서브-푸울중 하나로부터 90개 콜로니를 분리하고 그 콜로니 각각으로부터 정제된 플라스미드 DNA를 PCR하여 최종적으로 HL34라 명명된 클론을 얻었다〈실시예 15〉.

이 클론에 있는 플라스미드 DNA의 뉴클레오타이드 서열을 분석하였을 때 이 클론이 랫트 TPO cDNA 뉴클레오타이드 서열과 약 84% 상동인 cDNA를 함유하는 것이 확인되었다〈실시예 16〉.

클론된 플라스미드 DNA를 정제하고 COS 1 세로로 형질감염시켰을 때 형질감염된 세포의 배양 상청액에서 TPO 활성이 발견되었다. 그 결과, 이 플라스미드 클론이 인간 TPO를 코딩하는 cDNA를 함유하는 것으로 확인되었다〈실시예 17〉.

그러나, 이 cDNA는 종지 코돈이 이 클론에서 발견되지 않았고 폴리A 꼬리(Tail)형 서열이 3′-말단에서 발견되었기 때문에 클로닝의 인공적인 생성물인 것처럼 보였다. 따라서, 폴리 A 꼬리형 서열에 대응하는 부분을 제외한 아미노산 서열을 코딩하는 발현 벡터를 작제했다. 작제된 벡터가 COS1 세포에 발현되었을 때 최종배양 상청액에서 TPO 활성이 발견되었다〈실시예 18〉.

전장(full-length) cDNA의 구조를 분석하기 위하여 인간 TPO의 3′-말단 부위에 있는 DNA 단편을 PCR로 얻었다.

이 단편의 뉴클레오타이드 서열의 측정에서는 이 서열이 실시예 15에서 얻어진 클론 HL34에 포함된 cDNA와 부분적으로 중첩하는 것으로 나타났다. 또한, 전장 인간 TPO cDNA가 그것의 오픈 판독구조(Open Reading Frame)를 함유하고 또 353개 아미노산들로 이루어진 단백질을 코딩할 수 있는 것으로 예상되었다. 따라서, 인간 TPO가 21개 아미노산의 시그널 서열을 포함하는 353개 아미노산으로 이루어졌다는 것이 제시되었다〈실시예 19〉.

상술한 클로닝법 이외에, pUC 또는 pBR계 플라스미드 벡터, λ 파아지계 벡터등을 사용하여 작제된 라이브러리를 사용하여 랫트 TPO cDNA 단편을 탐침으로 사용한 콜로니 교잡 또는 플라크(Plaque) 교잡에 의해 인간 TPO cDNA의 클로닝을 실시할 수 있다. 축퇴 탐침의 설계시에 이노신이 축뇌의 정도를 감소시키는데 사용될 수 있다. 특정 방법으로 TPO 활성을 검출할 수 있거나 고 감수성을 갖는 분석법을 이용할 수 있을 때는 본 발명에 사용되는 바와 같은 발현 라이브러리를 사용하여 발현 클로닝을 수행할 수 있다.

그러나, 하기 실시예 15에서 설명되는 바와 같이 인간 TPO-코딩 RNA의 양이 정상인의 간에서는 매우 낮은 것처럼 보이기 때문에(이 실시예의 결과로부터 계산된 양은 3백만당 1의 비율이었다) 합성된 올리고뉴클레이타이드 또는 랫트 또는 인간 TPO cDNA 단편을 탐침으로 사용하는 교잡 스크리닝이 효과를 갖기가 매우 어려운데 이는 처리되는 클론 또는 플라크의 수가 많고 교잡법의 감수성 및 특이성이 PCR법에 비하면 열등하기 때문이다. 실제로, 본 발명의 발명자들은 랫트 TPO cDNA 단편을 탐침으로 사용하여 실시예 13에서 제조된 정상인의 간 cDNA 라이브러리에 있는 이백만 클론의 콜로니 교잡을 행하였지만 인간 TPO cDNA 클론을 얻을 수 없었다.

(I) 정상인의 간-유도 cDNA의 재작제

실시예 15에서 수득한 클론 HL34가 불완전 cDNA를 함유하는 것 처럼 보였기 때문에 시판중인 정상인 간=유도 폴리(A)⁺RNA 제제를 사용하여 cDNA를 재작제하여 완전한 인간 TPO cDNA를 얻었다. 벡터-결찰된 cDNA를 대장균 DH5에 도입함으로써 제조된 라이브러리(hTPO-F1)는 1.O ×10⁶의 형질전환제를 함유했다〈실시예 20〉.

(J) TPO cDNA클론의 스크리닝, 인간 TPO cDNA의 서열 측정 및

발현, 및 TPO 활성의 확인

실시예 14에서 수득한 부분적 cDNA의 뉴클레오타이드 서열 (서열 3) 및 실시예 19에서 추정한 인간 TPO의 완전한 cDNA의 뉴클레오타이드 서열(서열 196)을 기초하여 PCR용 프라이머를 합성했다.

실시예 20에서 작제된 인간 간 cDNA 라이브러리(hTPO-F1)를 3개의 푸울(푸울#1-3)로 나누었다. 각 푸울로부터 제조된 플라스미드 DNA를 주형으로 또 합성된 프라이머를 사용하여 PCR을 행하였다. 그 결과, 푸울 #3으로부터 제조된 플라스미드 DNA를 사용하였을 때 예상되는 크기를 갖는 DNA 단편이 증폭되었다. #3 푸울을 15,000 형질전환체를 함유하는 각 서브푸울들로 나누고 PCR을 이용한 스크리닝을 상기와 같이 수행했다. 그 결과, 예상되는 크기를 갖는 DNA의 증폭은 90개 푸울중 6개에서 발견되었다. 이들 양성 푸울을 각각 1,000개 클론을 함유하는 서브푸울로 나누고 플라스미드 DNA를 추출하여 동일한 방법으로 PCR을 행하였으나 DNA 증폭을 관찰되지 않았다. 이것은 다른 클론보다는 해당 클론의 성장이 빈약하여 플라스미드 DNA의 회수율이 낮은 것에 의해 야기되는 것으로 간주되었다. 따라서, 원 #3 푸울을 4,100 콜로니가 각 LB 플레이트 상에서 성장하는 접종물 크기로 100-LB 플레이트 상에 뿌리고 레플리카 플레이트(Replica Plate)를 각각의 접종 플레이트로부터 제조하였다. 플레이트상에서 배양된 콜로니로부터 추출된 이 DNA들을 이용하여 상기 설명한 것과 같은 방법으로 PCR을 행하였을 때 예상되는 밴드의 증폭이 100개 서브푸울중 하나에서 관찰되었다.

두 개의 레플리카 필터를 이 서브푸울의 플레이트로부터 제조하고 라벨링된 탐침 (플라스미드 pEF18S-HL34)의 EcoRI/BamHI 단편)을 사용하여 콜로니 교잡을 행하였다. 그 결과 양성으로 간주되는 단일 신호가 관찰되었다. 이 콜로니들을 원래의 플레이트로부터 수집하고 LB 플레이트상에 다시 접종하였다. 플레이트 상에서 배양된 전체 50 콜로니로부터 DNA 샘플을 제조하고 PCR을 행하여 pHTF1으로 명명된 클론을 최종적으로 얻었다〈실시예 21〉. cDNA 클론의 스크리닝시에는 교잡, PCR 및 발현 클로닝과 같은 방법들이 주로 사용되었는데 이들 방법의 조합이 스크리닝 효율성 및 감수성을 증가시켰으며 그것을 위한 노동력을 감소 시켰다. 얻어진 클론 pHTF1의 뉴클레오타이드 서열을 결정하였을 때 클론 pHTF1이 인간 TPO의 오픈 판독 구조 및 추론된 아미노산 서열 (서열 6)과 완전히 일치하는 오픈 판독 구조에 의해 코딩되는 것으로 간주되는 단백질의 오픈판독구조 및 아미노산 서열을 갖는 것으로 나타났다. 그 뉴클레오타이드 서열은 3 위치에서 추론된 것 (서열 196)과 달랐지만 이러한 차이가 아미노산 교환을 야기하지 않았다. 이 인간 TPO 단백질은 21개의 아미노산 시그널 서열을 갖는 353개 아미노산 잔기를 포함하는 것으로 확인되었다. 수득한 클론 pHTF1으로부터 플리스미드 DNA를 제조하고 COS1 세포에 형질감염 시켰을 때 배양 상청액에서 TPO 활성이 발견되었다〈실시예〉

(K) 플라크 교잡에 의한 인간 TPO 염색체 DNA의 스크리닝, 인간 TPO

염색체 DNA의 서열측정 및 발현, 및 TPO 활성의 확인

도호꾸 유니버시티, 진 리서치 센터(the Gene Research Center, Tohoku University)에 있는 티. 챠마모토 교수가 제시한 게놈 라이브러리를 하나의 플레이트가 30,000개 파아지 입자를 함유하도록 하는 접종물 크기로 18 NEYM 플레이트상에 접종시키고 이렇게 제조된 18개 플레이트 각각으로부터 2개의 레플리카 필터를 제조하였다. 인간 TPO cDNA 단편 (서열 7에 있는 염기 위치번호 178-1,025)을 PCR로 증폭시켜 정제했다.³²P로 라벨링된 정제된 단편을 탐침으로 사용하여 플라크 교잡을 수행했다. 그 결과, 13개의 양성신호를 얻었다. 원래의 플레이트로부터 플라크를 수집하여 1,000 플라크가 각 플레이트상에 형성되는 접종물 크기로 NZYM 플레이트상에 다시 접종했다. 그 플레이트의 각각으로부터 두 개의 레플리카 필터를 제조하여 상기에서 설명된 것과 동일한 조건하에서 플라크 교잡을 행하였다. 그 결과, 13개 그룹의 모든 필터상에서 양성신호가 검출되었다. 생성한 플레이트의 각각으로부터 단일 플라크를 회수하여 파아지 DNA를 제조하였다. 13개 클론으로부터 제조된 파아지 DNA 샘플에 대하여 PCR로 cDNA 코딩부위의 존재여부를 체크했다. 13개 클론중 5개 클론이 cDNA로부터 예상되는 전체 아미노산 코딩 부위를 함유하는 것처럼 보였다. 결과적으로, 이들 클론중 하나(클론 λHGT1)을 선택하여 서던블롯팅(Southern Blotting)으로 (상기 탐침을 사용하여)분석했다. HindIII 분해시킨 경우에 약 10kb의 단일 밴드가 관찰되었기 때문에 클론 λHGT1를 HindIII으로 분해시켜 아가로오스 겔 전기영동시켰다. 겔로부터 10kb 벤드를 절제하고 정제한 다음 클로닝 벡터 pUC13에 서브클로닝 시켜 pHGT1이라 명명한 클론을 얻었다〈실시예 24〉.

수득한 클론 pHGT1의 뉴클레오타이드 서열을 측정하였을 때 클론에 의해 운반된 염색체 DNA가 실시예 19에서 예상되는 단백질의 전체 코딩부위를 함유하는 것으로 발견되었으며 이 코딩부위의 뉴클레오타이드 서열은 예상되는 뉴클레오타이드 서열 (서열 196)과 완전히 일치했다.

또한, 아미노산-코딩 엑손에 해당되는 부위는 4개의 인트론을 함유하였으며 뉴클레오타이드 서열은 실시예 21에 수득한 클론 pHTF1에 의해 운반된 완전 cDNA의 서열 (서열 7)과 달랐다.

스크리닝에 의해 독립적으로 선택된 5개 염색체 DNA 클론중 4개의 잔여 클론의 뉴클레오타이드 서열을 결정하였을 때 4개 클론중 2개 클론이 클론 pHGT1과 동일하였고 다른 2개 클론은 그들이 클론 pHTF1과 함께 관찰된 3′ 비코딩 부위내에 다른 뉴클레오타이드를 가졌다는 것을 제외하고는 클론 pHGT1과 같았다〈실시예 25〉.

수득한 플라스미드 클론 pHGT1의 EcoRI 단편을 발현벡터 pPEF18S에 결찰시켜 인간 TPO 발현 플라스미드 pEFHGTE를 얻었다. 이 플라스미드 DNA(pEFHGTE)를 제조하여 COS1 세포에 형질감염 시켰을 때 배양 상청액에서 TPO 활성이 발견되었다〈실시예 26〉.

(L) 인간 TPO 결실유도체의 제조, 그들의 COS1 세포에서의

발현 및 TPO 활성의 확인

실시예 18 및 22의 결과는 인간 TPO 단백질이 카르복실-말단의 제거후에도 그것의 생물학적 활성을 나타낼 수 있는 것으로 나타났다. 따라서, 생물학적으로 활성인 부분을 더 분석하기 위해서 결실 유도체 실험을 행하였다. 실시예 18에서 얻은 플라스미드 클론 pHT1-231의 DNA를 주형으로 하고 또 합성된 올리고뉴클레오타이드를 프라이머로 사용하여 PCR에 의해 일련의 발현 플라스미드를 제조하였다.

TPO 단백질의 카르복실-말단 부위가 없는 인간 TPO 결실 유도체 즉, 위치 1-211, 1-191, 1-171 및 1-163 아미노산 서열을 코딩하는 결실 유도체를 코딩하는 DNA를 함유하는 발현 플라스미드를 얻었다. 각각의 클론으로부터 플라스미드 DNA를 제조하여 COS1 세포에 형질감염 시켰을 때 그 배양 상청액 각각에서 TPO 활성이 검출되었다〈실시예 27〉.

151 위치까지의 C-말단 아미노산 잔기가 결실된 유도체 및 6, 7 및 12 위치까지의 N-말단측 아미노산 잔기가 결실된 유도체를 설계하고 보다 상세히 TPO 활성-보유 부위를 분석하기 위하여 COS1 세포에서 발현된 후에 그 활성을 측정하였을 때, N-말단측 아미노산 잔기가 7 위치까지 삭제되었거나 C-말단측 아미노산 잔기가 151 위치까지 삭제되었을때 활성은 검출되지 않았다〈실시예 28 및 29〉.

TPO 생물학적 활성을 갖는 단백질의 유도체는 그 단백질을 코딩하는 cDNA를 수식(결실, 치환, 삽입 또는 부가) 시킴으로써 얻을 수 있다. PCR, 부위 특이적 돌연변이 유발(Mutagenesis) 및 화학적 합성과 같은 방법들이 수식에 이용될 수 있다.

(M) CHO 세포에서 인간 TPO cDNA의 발현 및 TPO의 정제

동물세포에서 서열 6에 도시된 바와 같은 인간 TPO의 추론된 아미노산 서열을 코딩하는 cDNA를 발현시킬 수 있는 발현 벡터 pHTP1을 작제했다〈실시예 30〉.

pHTP1의 TPO cDNA 부위를 사용하여 CHO 세포에서 발현을 위한 벡터 pDEF202-hTPO-P1을 작제하였다〈실시예 31〉.

CHO 세포로 벡터의 형질감염 및 이어지는 형질감염 세포의 선택결과로서 인간 TPO cDNA를 갖는 발현벡터가 CHO 세포의 염색체에 통합된 형질감염 세포를 얻었다〈실시예 32〉.

실시예 32에서, 인간 TPO 발현 플라스미드 pDEF202-hTPO-P1을 CHO 세포로 형질감염시켜 제조된 인간 TPO 생성 CHO 세포주(25mM MTX에 내성인 CHO 28-30 세포)를 대량 배양하였다〈실시예 55〉.

배양 상청액 100L로부터 인간 TPO를 정제했다〈실시예 56〉.

선택적으로 인간 TPO를 실시예 55에서의 배양 상청액으로부터 다른 방법으로 정제했다〈실시예 57〉.

(N) X63.6.5.3.세포에서 인간 TPO cDNA의 발현 및 활성의 확인

실시예 30에서 제조된 플라스미드 pBLTEN에 코딩된 TPO cDNA 부위를 사용하여 X63.6.5.3. 세포에 사용하기 위한 발현벡터 BMCGSneo-hTPO-P1을 작제했다〈실시예 33〉.

X63.6.5.3. 세포를 이 벡터로 형질감염시켰을 때 인간 cDNA -코딩 발현벡터가 그 염색체에 통합된 형질전환체 세포를 얻었다. 이 세포를 배양시켰을 때 배양 상청액에서 TPO 활성이 검출되었다〈실시예 34〉.

(O) COS1 세포에서 인간 TPO의 대량 발현 및 그것의 정제,

분자량 측정 및 생물학적 특성

실시예 30에서 제조된 발현벡터 pHTP1을 COS1 세포에 형질감염시켜 발현된 생성물을 함유하는 다량(총 약 40 리터)의 배양 상청액을 얻었다〈실시예 35〉.

발현벡터 pHTP1-유도 TPO를 함유하는, 실시예 35에서 제조된 약 7리터의 COS1 세포의 무 형청 배양 상청액으로부터 TPO의 정제를 행하였다. 소수성 상호작용 크로마토그래피, 양이온 교환컬럼 크로마토그래피, WGA 컬럼 크로마토그래피 및 역상 컬럼 크로마토그래피의 단계들을 통하여 고 활성 TPO를 얻을 수 있었다〈실시예 36〉.

COS1 세포 배양 상청액으로부터 부분적으로 정제된 TPO에 대하여 분자량 측정 및 생물학적 특성 분석을 행하였다〈실시예 37 및 38〉.

(P) 대장균에서 인간 TPO의 발현

대장균에서 글루타치온-S-트랜스퍼라제와 인간 TPO(위치 1-174의 아미노산 잔기)의 융합 단백질의 발현에 사용하기 위하여 벡터 pGEX-25/hT(1-174)를 작제하였다(이하 “GST-TPO(1-174)”로 칭함). 이 경우에, 인간 TPO cDNA 뉴클레오타이드 서열의 일부(5′-측 지역의 약 반)를 대장균 선호 코돈으로 교환하였다〈실시예 39〉.

대장균에서 GST-TPO(1-174)를 발현시키고 그 세포를 붕괴시킨 다음 침전 분획에 포함된 GST-TPO(1-174)를 용해시켰다. TPO 재생 조건의 검사, 정제조건의 검사(글루타치온 친화성 컬럼, 양이온 교환 컬럼 등) 및 트롬빈으로 GST 단백질 부위의 분해를 포함하는 다양한 단계들을 조합한 결과, 설계된 바와 같은 TPO 아미노산 서열을 함유하는 단백질의 부분적 정제가 가능했다. 이 단백질은 랫트 CFU-MK 분석계에서 TPO 활성을 나타냄이 확인되었다〈실시예 40 및 41〉.

또한, 인간 TPO(위치 1-163의 아미노산 잔기)의 1-위치 Ser 잔기 및 3-위치 Ala 잔기가 각각 Ala 잔기 및 Val 잔기로 대체되고 동시에 Lys 잔기 및 Met 잔기가 -1 및 -2위치에 각 부가된 돌연변이형 인간 TPO 단백질 (이후 “h6T(1-163)”으로 칭함)을 대장균에서 발현시키기 위한 벡터 pCFM563/h6T(1-163)를 작제했다. 이 벡터에 의해 운반된 전체부분의 인간 TPO cDNA 뉴클레오타이드 서열(1-163 아미노산 잔기에 일치하는)을 대장균 선호 코돈과 교환했다〈실시예 42〉.

대장균에서 h6T(1-163)을 발현시키고 그 세포를 용균시킨 다음 침전분획에 함유된 h6T(1-163)의 용해화 및 단백질의 재생을 위한 조건을 검사하여, 설계된 바와 같은 TPO 아미노산을 함유하는 단백질을 부분적으로 정제하는데 성공했다. 이 단백질은 랫트 CFU-MK 분석계에서 TPO 활성을 보인다는 것이 확인되었다〈실시예 43 및 44〉.

또한, Lys 잔기 및 Met 잔기가 각각 -1 및 -2 위치에 부가된 돌연변이형 인간 TPO 단백질(이하 “hMKT(1-163)”이라함)을 대장균에서 발현시키기 위한 벡터 pCFM536/hMKT(1-163)을 작제했다. hMKT(1-163)을 실시예 43에서와 같은 방법으로 대장균에서 발현시키고 그 발현 단백질을 SDS-PAGE 처리하고 PVDF 막상으로 전달한 다음 N-말단 아미노산 서열분석을 행하여 이 단백질이 설계된 아미노산 서열을 함유한다는 것을 확인했다〈실시예 52〉.

또한, Lys 잔기가 인간 TPO(아미노산 위치 1-332)의 위치 -1에 부가되고 Met 잔기가 위치 -2에 부가된 돌연변이형 인간 TPO 단백질(이하 “hMKT(1-322)” 이라함)을 대장균에서 발현시키기 위한 벡터 pCFM536/hMKT(1-332)를 작제했다. 이 hMKT를 실시예 42에서와 같은 방법으로 대장균에서 발현시키고 그 발현을 하기에 설명되는 실시예 45에서 제조된 항-인간 TPO 펩타이드 항체를 사용하여 웨스턴 블롯팅함으로써 확인했다〈실시예 66〉.

(Q) 항-TPO 펩타이드 항체의 제조 및 항-TPO 펩타이드 항체 컬럼

실시예 10에서 측정된 랫트 TPO 아미노산 서열의 세 개의 부분 영역과 일치하는 합성된 펩타이드에 의해 토끼 폴리클로날 항-TPO 펩타이드 항체를 제조했다. 이 항체들이 랫트 및 인간 TPO 분자를 인식할 수 있다는 것이 확인되었다. 또한, 서열 6(또는 서열 7)에 도시된 인간 TPO의 아미노산 서열에 있는 6개의 부분적 영역과 일치하는 펩타이드를 합성하여 토끼 폴리클로날 항 TPO 펩타이드 항체를 제조하는데 사용했다. 그 항체들은 인간 TPO를 인식하는 것으로 확인되었다〈실시예 45〉.

항-TPO 항체, TPO 수용체 등이 결합되는 것과 같이 TPO에 대하여 결합 친화성을 갖는 특성 분자로 팩킹된 컬럼을 이용하는 친화성 컬럼 크로마토그래피에 의해 TPO를 정제하는 것이 가능하다. 따라서, 먼저 실시예 45에서 수득한 항-TPO 펩타이드 항체를 결합시켜 항-TPO 항체 컬럼을 제조했다〈실시예 46〉.

(R) 항-TPO 펩타이드 항체 컬럼을 이용하여 COS1 세포에서 발현된

인간 TPO의 정제 및 그것의 분자량 및 생물학적 특성

출발물질로서 발현벡터 pHTP1으로 형질변환된 COS1 세포로부터의 배양 상청액을 사용하여 부분적으로 정제된 TPO를 얻고 항-TPO 항체 컬럼에 적용시켰다. 흡착된 분획에서 TPO 활성이 발견되었기 때문에 이 분획을 추가로 역상 컬럼 크로마토그래피를 행하여 단백질을 정제하고 그 분자량 및 생물학적 특성을 검사했다.

[실시예 47]

(S) COS1 세포에서 발현된 인간 TPO의 부분적으로 정제된 샘플의 활성 확인

실시예 36에서 정제된 TPO-활성 분획, 즉 발현 벡터 pHTP1으로 COS1 세포를 형질감염시킴으로써 수득한 배양 상청액에서부터 Capcell Pak CI 300A 컬럼의 단계까지 정제된 TPO 샘플에 대하여 생물학적 활성을 체크하여 그것이 생체에서 혈소판수를 증가시키는 작용을 하는지에 대해 측정했다〈실시예 48〉.

또한, 발현 벡터 pHTP1로 COS1 세포를 형질감염시킴으로써 제조된 33리터의 배양 상청액으로부터 양이온 교환 컬럼에 의해 수득한 조(crude) TPO 분획에 대하여 생물학적 활성을 체크하여 생체에서 혈소판 수를 증가시키는 작용을 하는지를 측정했다〈실시예 49〉.

(T) CHO 세포에서 인간 TPO 염색체 DNA의 발현 및 활성의 확인

CHO 세포에서 인간 TPO 염색체의 발현에 사용하기 위한 벡터 pDEF202-ghTPO를 작제했다〈실시예 50〉.

이 벡터를 CHO 세포에 도입시켰을 때 인간 TPO 염색체 DNA-코딩 발현 벡터가 그 염색체에 통합된 형질전환체 세포를 얻었다. 이 세포 클론을 배양했을 때 TPO 활성이 배양 상청액에서 검출되었다〈실시예 51〉.

(U) 대장균에서 발현된 돌연변이형 인간 TPO의 부분적 정제 및 활성확인

인간 TPO 뉴클레오타이드 서열-코딩 클론으로부터 유도되어 대장균에서 발현된 돌연변이형 인간 TPO에 대하여 구아니딘 하이드로클로라이드 및 글루타치온을 사용하여 재생시켜, 수득한 h6T(1-163)이 생체에서 혈소판 수를 증가시키는 작용을 한다는 것을 발견하였다〈실시예 53〉.

인간 TPO 뉴클레오타이드 서열-코딩 클론 pCFM536/h6T(1-163)으로부터 유도되어 대장균에서 발현된 돌연변이형 인간 TPO에 대하여 소듐 N-라우로일 사르코시네이트 및 황산구리를 사용하여 재생시키고 양이온 교환 크로마토그래피를 행하여 정제된 h6T(1-163)이 생체에서 혈소판 수를 증가시킨다는 것을 발견하였다〈실시예 54〉.

또한, 다른 과정을 사용하여 돌연변이형 인간 TPO, h6T(1-163)의 재생 및 정제를 수행하였다〈실시예 60 및 61〉.

(V) 곤충세포에서 인간 TPO cDNA의 발현 및 TPO 활성의 확인

곤충세포에서 인간 TPO의 발현을 위한 재조합 바이러스를 제조하고〈실시예 58〉 곤충세포 Sf21에서 발현시킨 다음 그 배양 상청액에서 TPO 활성을 확인했다〈실시예 59〉.

(W) CHO 세포에서 인간 TPO 아미노산 위치 1-163)의 발현 및 그것의 정제

서열 7에 도시된 인간 TPO 아미노산 서열에 있는 아미노산 1-163을 갖는 인간 TPO 단백질(이하 “hTPO 163”이라 함)의 CHO 세포에서의 발현을 위한 발현벡터 pHEF202-hTPO163을 작제했다. 발현벡터 pDEF202-hTPO163을 CHO 세포로 형질감염시키고 수득한 hTPO163-생산 CHO 세포주를 대량으로 배양했다. 배양 상청액으로부터 hTPO163을 정제했다〈실시예 62-65〉.

(X) 인간 TPO 치환 유도체의 제조

인간 TPO의 Arg-25 및 Glu-231이 각각 Asn과 Lys로 치환된 유도체(이하 “N3/TPO”라 함) 뿐만 아니라 His-3이 Thr로 치환된 유도체(“09/TPO”로 칭함)를 제조하였다.

각 유도체를 코딩하는 플라스미드를 배양된 COS7세포로 형질감염시켰다. 배양 상청액에서 TPO 활성을 검출하였다〈실시예 67〉.

하나의 아미노산 h6T(1-163)이 다른 아미노산으로 치환된 유도체를 대장균 발현계를 이용하여 제조했다. 각 유도체에서 TPO 활성이 발견되었다〈실시예 94〉.

(Y) 인간 TPO 삽입 또는 결실 유도체의 제조

아미노산을 hTPO163에 삽입하거나 그것으로부터 결실시켜 삽입 또는 결실 유도체를 제조한 후 생성한 유도체를 코딩하는 플라스미드로 COS7 세포를 형질감염시켰다. COS7 세포 배양물의 상청액에서 TPO 활성이 검출되었다〈실시예 68〉.

본 발명에 사용된 TPO 활성의 측정방법(시험관내 분석계)을 “참고 실시예”로서 하기에 설명한다.

(Z) 항-인간 TPO 항체의 제조 및 정제

인간 TPO의 펩타이드 단편을 이용하여 폴리클로날 항체를 제조하고〈실시예 69〉 이를 웨스턴 블롯분석〈실시예 70〉 및 항-TPO 항체 친화성 컬럼의 작제〈실시예 71〉에 사용했다.

(AA) 인간 TPO의 생체내 활성

정제된 인간 TPO를 유도된 혈소판감소증을 갖는 마우스들에 투여하고 혈소판수의 변화를 대조군에 대하여 모니터했다〈실시예 72〉-〈실시예 79〉. 약제학적 조성물은 혈소판감소증의 치료에 유용한 것으로 기재되어 있다〈실시예 80〉-〈실시예 89〉.

(BB) MPL 수용체 결합 작용으로서의 TPO 활성

TPO 활성이 MPL 수용체와의 특이적 결합작용으로 정의되는 분석법이 제공된다〈실시예 90〉-〈실시예 93〉.

[참고 실시예]

A. 랫트 거핵구 전구세포 분석(랫트 CFU-MK 분석) 계(액체 배양계)

거핵구는 활성, 에너지-의존 과정을 통하여 세로토닌(Serotonin)을 혼입하여 세포질 조밀 과립으로 저장한다(페도르코(Fedorko), Lab, Invest., vol.36, pp.310-320, 1977 참조). 이러한 현상은 CFU-MK와 인식가능한 거핵구 사이에 위치 되는 것으로 간주되는 작고 단핵의 아세틸콜린에스테라제에서 먼저 발견될 수 있다(브릭커와 주커맨, Exp. Hematol., vol. 12, P672, 1984 참조). 도입된 세로 토닌의 양은 거핵구의 크기 증가에 따라서 증가한다(쉬크와 와인슈타인, J. Lab. Clin. Med., vol.98, pp.607-615, 1981 참조). 또한 이러한 현상은 골수세포증 오직 거핵구세포에 특이적이라고 공지되어 있다(쉬크 및 와인스타인, J. Lab. Clin. Med., vol.98, pp.607-615, 1981 참조). 본 분석계에서는 고도로 강화된 랫트 CFU-MK세포(하기에 설명되는 GpIIb/IIIA⁺CFU-MK 분획)가 평가될 샘플 존재하에서 배양되어 CFU-MK로부터 성장된 거핵구로¹⁴C-세로토닌(¹⁴C-하이드록시 트립타민 크레아틴 설페이트;¹⁴C-5TH)이 혼합되는지 측정한다.

이 분석계의 잇점은 오염된 세포의 간접적인 영향(예를 들면, 관련인자 이외의 어떤 기질에 의해 자극된 오염세포에 의한 Meg-CSF 활성의 형성 또는 관련인자와 조합하여 작용하는 오염 세포에 의한 특정인자의 형성)이 감소될 수 있다는 것인데 이는 오염세포의 수가 적은 반면에 GpIIb/IIIa⁺CFU-MK 분획의 세포에서 CFU-MK의 비율이 현저하게 높기 때문이다(하기[분석법] 참조). 또한, 한 웰(well) 당 뿌려진 세포의 총수가 적기 때문에 적절한 배양조건이 상대적으로 긴 기간동안 유지될 수 있다. 배양기간동안 활성 샘플의 존재시에 CFU-MK 로부터 성장된 많은 대형 성숙 거핵구가 상 대비 현미경하에서 시각적으로 검출되어 활성의 존재 및 활성 정도를 정성적으로 판단할 수 있는 것도 또 다른 잇점이다. 정성적으로 판단의 결과는¹⁴C-세로토닌의 혼입에 기초한 정량적 측정 결과와 잘 일치한다. 따라서 정량적 측정의 신뢰성은 정성적 판단의 이용에 의해 보다 개선될 수 있다.

분석방법 :

분석에 사용되는, 고도로 강화된 랫트 CFU-MK 세포(GpIIb/IIIa⁺CFU-MK 분획)를 미야자끼 등의 방법(Exp. Hematol., vol. 20, pp.855-861, 1992)을 약간 변형하여 제조했다.

간단하게는 위스터 랫트 (수컷, 생후 8-12주)로부터 대퇴골 및 경골을 제거하여 상기와 같이 골수 세포 현탁액을 제조하였다. 레빈과 페도로코에 의해서 보고된 거핵구 분리 배지(레빈과 페도로코, Blood, vol. 50, pp.713-725, 1977 참조)의 약간 변형된 상태인 현탁 배지(13.6mM 트리소듐 시트레이트, 11.1mM 글루코오스, 1mM 아데노신, 1mM 데오필린, 10mM HEPES(pH 7.25), 0.5% 소 혈청 알부민(이하 “BSA”라 함)(Path-0-Cyte 4; 세이가가꾸 고교 컴패니 리미티드) 및 Ca²⁺와 Mg²⁺유리 행크(Hank) 평형염 용액으로 이루어진 용액 : 이하 “HATCH 용액”이라함)를 골수세포 현탁액의 제조를 위해 사용했다. 퍼콜(percoll) 용액(파마시아 제조)을 HATCH 용액으로 희석시켜 제조한 퍼콜 불연속 밀도 구배 용액 (밀도 : 1.050g/ml /1.063g/ml /1.082g/ml) 위에 제조된 골수세포 현탁액을 층지게하고 20분동안 20℃에서 400 ×g으로 원심분리했다. 원심분리 후에 1.063g/ml 와 1.082g/ml 밀도층 사이의 세포들을 회수했다. 세척후 회수된 세포를 10% 우태아 혈청(이하 “FCS”라 함)을 함유한 이스코브(Iscove′s) 변형 둘베코(Dulbecco) 배양배지(이하 “IMDM 배양배지”라 함)에 현탁시키고 100mm 조직배양 플라스틱 접시에 위치시킨 다음 5% CO₂배양기에서 1시간 동안 37℃에서 배양했다. 배양한 후, 비유착 세포를 회수하여 플라스틱 접시에서 1시간 동안 37℃에서 다시 배양시켰다. 비유착 세포들을 HATCH 용액에 현탁시키고 마우스 모노클로날 항-랫트 혈소판 GpIIb/IIIa 항체, P55 항체(미야자끼 등, Thromb. Res., vol. 59, pp.941-953, 1990)이 미리 흡착된 100mm 세균 페트리 접시상에서 1시간 동안 배양했다. 배양한 후 비유착 세포를 HATCH 용액으로 세척하여 제거했으며 고정된 P55 항체에 흡착된 잔여세포를 피펫팅하여 분리시켜 수집했다. 일반적으로 하나의 랫트로부터 3-4 ×10⁵세포를 수득하였다. 수득한 세포 분획은 고도로 강화된 랫트 CFU-MK를 함유하는데(이하 “GpIIb/IIIa⁺CFU-MK 분획”이라 함)이 세포 분획이 포화농도의 랫트 IL-3의 존재하에서 콜로니 분석계에 의한 측정에 기초하여 약 5-10%의 CFU-MK를 함유하는 것으로 알려졌다. 상기 P55 항체를 생성할 수 있는 하이브리도마는 1994. 2. 14.일에 기탁번호 FERM BP-4563으로 내셔날 인스티튜트 오브 바이오사이언스 앤드 휴먼 테크놀로지, 에이전시 오브 인더스트리얼 사이언스 앤드 테크놀로지, 미니스트리 오브 인터내셔날 트레이드 앤드 인더스트리(National Institute of Bioscience and Human Technology, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry)에 기탁되었다.

다음, 10% FCS를 함유하는 IMDM 배양배지에 얻어진 GpIIb/IIIa⁺CFU-MK 분획을 현탁시키고 96웰 조직 배양 플레이트의 웰당 10⁴세포양으로 투여했다. 각 웰에 표준샘플(하기에 상세히 설명됨) 또는 평가될 샘플을 더 공급하여 최종 배지량을 200㎕/웰로 조정했다. 제조된 플레이트를 CO₂배양기에 위치시키고 37℃에서 4일동안 배양했다. 배양 4일째에 각 웰에 0.1μCi(3.7KBq)의¹⁴C-세로토닌을 배양완료 3시간 전에 첨가하고 최종 배양을 37℃에서 계속했다. 3시간 배양후 플레이트를 1,000rpm에서 3분동안 원심분리하고 그 상청액을 흡입하여 제거했다. 각 웰에 0.05% EDTA를 함유하는 200㎕의 PBS를 첨가하고 플레이트를 원심분리하여 그 상청액을 제거하므로서 플레이트를 세척했다. 이 세척 단계를 한번 다시 반복했다. 각 웰에 있는 세포의 펠릿에 200㎕의 2% Triton X-100을 첨가하고 그 플레이트를 약 5-10분 동안 플레이트 믹서상에서 진탕시켜 세포를 전체적으로 용균시켰다. 얻어진 세포 용균액 150㎕ 부분을 시판중인 캡형 고체 신틸레이터(Ready Cap: 베크만(Beckman)사에 의해 제조된)로 이송시켜 50℃ 오븐에서 철야 방치하여 용균액을 건조시켰다. 다음날 Ready Cap을 유리 바이얼에 위치시켜 액체 신틸레이션 계수기로¹⁴C의 방사활성도를 측정하였다.

이 경우, 상기 세포 용균액에서의 아세틸콜린에스테라제 활성을 이시바시와 버스타인의 과정(Blood, vol.67, pp.1512-1514, 1986)에 따라 측정할 때¹⁴C-세로토닌 혼입분석과 거의 같은 결과를 얻을 수 있다.

표준샘플 :

첫째로, 표준샘플의 제조에 사용하기 위하여 혈소판감소증 랫트의 혈장을 하기 방법으로 제조했다.

동물당 0.5mg의 용량으로 약 24시간의 간격을 두고 두 번 상기 P55 항체를 정맥내 투여하여 정상의 수컷 위스터 랫트들(생후 7-8주)에게 혈소판감소증을 유발시켰다. 두 번째 투여한지 약 24시간 후 1ml의 3.8%(V/V)트리소듐 시트레이트 용액이 항-응고제로서 포함된 10ml 용량 주사기를 사용하여 에테르 마취하에서 복대동맥으로부터 혈액을 수집했다. 수집된 혈액 샘플을 플라스틱 원심분리 튜브에 넣고 10분동안 1200 ×g으로 원심분리하여 혈장 분획을 회수했다. 회수된 혈장 분획을 10분동안 1200 ×g으로 다시 원심분리하고 그 혈장 분획을 세포, 혈소판 등으로 이루어진 펠릿을 피하도록 주의하면서 회수하여 저장했다(그러한 방법으로 얻어진 혈장은 이하 “TRP”라 함). 실시예 1의 과정에서 따라 얻어진 Ca-처리 TRP(표준샘플 C), WGA-아가로오스 컬럼 활성 분획(표준샘플 W) 또는 페닐 세파로오스 6 FF/LS 컬럼 활성 분획(표준샘플 P)을 충분한 양의 IMDM 배양배지에 대하여 광범위하게 투석하여 분석표준으로 사용했다.

실시예 1에서 설명된 랫트 TPO 정제공정에서 표준 샘플 C를 초기단계에서 사용했지만 절반 이후에 표준샘플 W로 변경시킨 다음 표준 샘플 P로 변경했다. 표준 샘플 C의 특이적 활성을 1로 가정하여 정의하고 표준샘플 W와 P의 상대적인 활성을 정의에 근거하여 계산했다. 평가될 각 샘플의 상대적인 활성을 평가될 샘플과 표준 샘플의 투여량-반응 곡선을 비교하여 측정하였으며 평가될 샘플의 상대적인 활성을 n으로 정의했는데 이는 그 활성이 표준샘플 C의 활성보다 n배 더 높은 경우를 의미한다.

B. 콜로니 분석계

이 분석계에서는 평가될 샘플의 존재하에서 골수 세포를 반-고체 배양 배지에서 배양하여 CFU-MK의 증식과 분화에 의해 형성된 거핵구 콜로니의 수를 계산함으로써 Meg-CSF 활성을 측정한다.

분석방법 :

(a) 분리되지 않은 랫트 골수 세포 등을 사용할 경우

비-분리 랫트 골수세포, 상기 분석계 A의 GpIIb/IIIa⁺CFU-MK 각 분리단계에서 얻어진 세포들 또는 GpIIb/IIIa⁺CFU-MK 분획의 세포들 및 10% FCS, 2mM 글루타민, 1mM 피루브산 나트륨, 50μM 2-메르캅토에탄올 및 0.3% 한천(DIFCO 상에 의해 제조된 AGAR NOBLE)를 함유하는 최종부피 1ml의 IMDM 배양배지를 35-mm 조직배양 플라스틱 접시에 놓고 실온에서 고형화시킨 후 CO₂배양기중 37℃에서 배양시켰다. 일반적으로 하나의 접시당 세포수는 비분리된 골수 세포의 경우에 2-4 ×10⁵, 퍼콜 밀도구배의 단계에 있거나 유착성이 부족한 세포의 경우에 2-5 ×10⁴또는 GpIIb/IIIa⁺CFU-MK 분획의 경우에 0.5 ×10³으로 조정된다. 배양 6-7일 후 한천 디스크를 접시에서 떼어내어 유리 슬라이드(76mm ×52mm) 상에 위치시킨다. 각 한천 디스크를 건조시키기 위하여 한 조각의 50㎛ 나일론 매쉬 및 여과지를 겔상에 그 순서대로 위치시킨다. 건조된 한천 슬라이드를 고온 플레이트상에서 5분동안 50℃에서 열고정시키고 잭슨(Jackson)의 과정(Blood, vol.42, pp.413-421, 1973)에 따라 제조된 아세틸콜린에스테라제 염색액에 2-4시간동안 침지시킨다. 거핵구의 충분한 염색이 확인되면 한천 슬라이드를 물로 세척하고 공기 건조시킨다. 거핵구의 콜로니는 3개 이상의 보다 견고하게 그룹진 아세틸콜린에스테라제-양성 세포로 정의된다.

(b) 비분리된 마우스 골수 세포를 사용할 경우

콜로니 평가는 하나의 접시당 2-4 ×10⁵세포들을 사용하여 상기 과정(a)와 같은 방법으로 수행될 수 있다.

(c) 인간 골수 세포 또는 인간 제대 혈액(cord blood) 세포를 사용할 경우

인간 골수 세포 또는 인간 제대 혈액 세포는 그대로 또는 하기 방법에 의해 강화된 CFU-MK 분획으로서 사용될 수 있다.

처음에, 골수액 또는 제대혈액은 림포프렙(Lymphoprep)(다이이찌 가가꾸 컴패니, 리미티드 제조) 위에 층지게하고 원심분리하여 그 계면 백혈구 분획을 회수한다. 회수된 세포 분획으로부터 인간 표면 항원(CD2, CD11c 및 CD19)에 대하여 특이적인, 비오티닐화된 모노클로날 항체가 결합된 세포들을 아비딘-결합 자기 비드를 이용하여 제거한다. 자기 비드법에 의해 제거된 세포는 주로 B 세포, T 세포, 대식세포 및 일부의 과립구이다. 잔여세포를 FIFC-라벨링 항 CD-34항체 및 PE-라벨링 항-HLA-DR 항체를 염색시키고 세포 소터(sorter)(예를 들면, COULTER 사에 의해 제조된 ELITE)를 사용하여 CD34- 및 HLA-DR-양성 분획을 회수한다. CFU-MK 들은 이 분획에 농축된다(이하 “CD34⁺DR⁺CFU-MK 분획”이라 함). 인간 세포의 콜로니 평가는 3-5 ×10³세포의 CD34⁺DR⁺CFU-MK 분획이 하나의 접시에 사용되고 10% FCS 대신에 12.5% 인간 AB 혈장 및 12.5% FCS의 혼합물이 사용된 것을 제외하고는 랫트 골수세포를 사용하는 경우와 동일한 방법으로 수행될 수 있다. 거핵구 콜로니 형성을 위한 배양기간은 12-14일이다. 인간 거핵구의 검출을 위해서는 거핵구 표면 항원 GpIIb/IIIa(예를 들면, 데라무라 등, Exp. Hematol., vol.16, pp.834-848, 1988)에 대하여 특이적인 마우스 모노클로날 항체를 사용한 알칼린 포스파타제-항-알칼린 포스파타제 항체법에 의해 거핵구의 면역생리학적 염색을 행하여 각각 3 이상의 거핵구로 이루어진 콜로니들을 계산한다.

C. 인간 거핵아구 세포주를 사용한 분석계(M-07e 분석)

M-07e 세포인 인간 거핵아구 세포주는 GM-CSF, IL-3, SCF, IL-2 등에 반응하여 증식한다(아반찌 등, J. Cell. Physiol., vol. 145, pp.458-464, 1990 참조). 이 세포들은 TPO에도 응답하기 때문에 랫트 CFU- MK 분석계를 대체할 수 있는 분석계로 이용할 수 있다.

분석방법 :

GM-CSF의 존재하에서 유지된 M-07e 세포를 회수하여 철저히 세척한 후 10% FCS를 함유하는 IMDM 배양배지에 현탁시킨다. 그 M-07e 세포 현탁액을 96개 웰 조직배양 플레이트로 이루어진 웰에 10⁴세포 부분으로 분배하고 각 웰에 표준샘플 또는 평가될 샘플을 공급하여 최종부피를 200㎕/웰로 조정한다. 제조된 플레이트를 5% CO₂배양기에 위치시키고 3일 동안 37℃에서 배양한다. 배양 3일 후 배양 완료 4시간 전에 1μCi(37KBq)의³H-티미딘을 각 웰에 첨가한다. 배양 완료후 세포 수집기를 사용하여 유리 섬유 필터상에서 세포를 수집하여 액체 신틸레이션 계수기(예를 들면, 파마시아사에 의해 제조된 Beta Plate)로³H 방사활성을 측정한다.

D. 마우스 프로-B 세포주가 사용되는 분석계(Ba/F3 평가)

마우스 프로-B 세포주 Ba/F3는 IL3, IL4 등에 반응하여 증식하는 세포주로서 알려져 있다(팔라시오스 등, Cell, vol. 41, pp.727-734 참조). 아균주 BF-TE22는 IL3 및 IL4 뿐만 아니라 TPO에도 반응하여 세포 증식을 할 수 있기 때문에 이것은 랫트 CFU-MK 분석법 또는 인간 거핵아구 세포주-보조분석법(M-07e 분석법)을 대체할 분석계로 이용될 수 있다. 간단하게는 1ng/ml의 마우스 IL-3의 존재하에서 이 스코브즈 변형 DME 배지 (IMDM : GIBCO)에서 성장하는 BF-TE22 세포를 회수하여 IMDM으로 세 번 세척한 후 10% FCS를 함유하는 IMDM 배지에 현탁시킨다. 다음에 웰당 1 ×10⁴세포의 밀도를 갖는 96개웰 조직배양 플레이트의 웰에 세포현탁액을 분배하고 각 웰에 표준 TPO 용액 또는 시험될 샘플을 보충하여 최종 부피를 200㎕/웰로 조정한다. 그 플레이트를 5% CO₂배양기에서 2-3일 동안 배양한다. 2일 또는 3일째에 각 웰에 1μCi(3.7KBq)의³H-티미딘을 첨가하고 4시간동안 배양을 계속한다. 최종적으로 세포수집기를 사용하여 유리섬유 필터상의 세포를 수집하여 액체 신틸레이션 계수기로³H 방사활성을 측정한다. 이 분석계에서는 TPO 활성이 없는 배지에서 배양된 세포가 거의 모두 죽었으며 따라서,³H-티미딘을 혼입하지 않는다. 그러나, TPO 활성을 함유하는 배지에서 배양된 세포들은 TPO 농도-의존 방식으로 활성 증식을 나타내고³H-티미딘을 혼입한다. 또한, 이 분석의 결과는 M-07e 및 CFU-MK 분석에서와 일치한다.

본 발명의 추가적인 설명을 위하여 하기 실시예가 제공되었다.

[실시예 1-1]

항-혈소판 항체 투여에 의해 유도된 혈소판감소증 랫트의 혈장으로부터 랫트 TPO의 정제

항-혈소판 항체 투여에 의해 유도된 혈소판감소증 랫트의 혈장 제조

상기 〈참고 실시예〉 A의 랫트 거핵구 전구세포(CFU-MK) 분석계에 기술된 과정에 따라 약 1,000 마리의 랫트로부터 TRP를 정제원으로서 제조했다.

TRP로부터 랫트 TPO의 정제

TRP에서의 TPO 함량이 많아야 3백만분의 일이라는 가정하에서 약 1,000 마리 랫트의 TRP를 사용하여 정제를 행하여 1pmole 보다 약간 적은, 부분적으로 정제된 랫트 TPO를 얻었다. 일반적으로는 어렵지만 그것의 부분적인 아미노산 서열의 분석을 시도하여 3개의 부분적인 아미노산 서열을 얻었지만 낮은 정밀성을 가졌다. 이 서열들은 간에서 생성된 세린 프로테아제 억제인자(SPI)의 아미노산 서열과 일치하거나 유사했다. 이러한 결과로부터는 TPO가 세린 프로테아제 억제인자의 서열과 유사한 구조를 가졌는지 또는 이 서열이 TPO 이외의 오염된 단백질의 서열로부터 유도되었는지가 불명확했다. 이 불확실 서열들을 사용하여 랫트 cDNA 라 이브로리로부터 TPO 유전자의 클로닝을 행하였지만 가능성 있는 TPO-코딩 유전자를 얻을 수 없었다. 그 후 그러한 실패가 분석될 샘플의 저순도 및 불충분한 양에 기인한다는 가정에 기초하여 철저한 연구를 행하였다. 아미노산 분석에 필요한 정제된 최종 샘플을 얻기위하여 하기 〈실시예 1-2〉에 기술된 방법에 따라 정제했다. 놀랍게도 〈실시예 1-2〉의 결과로부터 TRP 또는 XRP(하기에 설명됨)에 있는 TPO 함량이 총혈장 단백질의 백반분의 일에서 일억분의 1로 극히 적은 양이어서 완전한 정제가 극히 어려웠었다는 것이 평가되었다.

[실시예 1-2]

전신 X-선 또는 γ-선 조사에 의해 유도된 혈소판감소증 랫트의 혈장으로 부터의 랫트 TPO의 정제

[전선 X-선 또는 γ-선 조사에 의해 유도된 혈소판감소증 랫트의 혈장의 제조]

정상의 수컷 위스터 랫트(생후 7-8주) 에게 치사량 이하(6-7Gy)의 X-선 또는 γ-선을 전신조사하여 혈소판감소증을 유발시켰다. 조사 14일후 랫트로부터 혈액을 채취하여 상기 TRP의 제조 과정과 동일한 방법으로 혈장 분획(이하 “XRP”라 함)을 제조했다.

이 경우에 약 1100 랫트 전부로부터 제조된 XRP(약 8L)를 정제원으로 사용했다.

XRP로부터 랫트 TPO의 정제

약 1100 랫트의 혈장 샘플은 총 단백질 함량이 493,000mg에 달하기 때문에 한번에 처리하기에는 너무 많았다. 따라서, 혈장 샘플을 하기 정제단계 (1)-(4)에서 약 100마리 랫트에 상응하는 11 롯트(lots)로 나누었다. 이어지는 정제단계(5)-(7)에서 샘플을 6개 뱃치로 나누었다. 정제단계(8)에서 그리고 그후에는 약 1100마리 랫트의 전 혈장으로부터 거칠게 정제된 샘플을 사용했다. 하기에서는 각 정제 단계의 정형적인 실시예가 롯트(XW9) 및 뱃치(XB6)의 경우에서 설명된다.

모든 정제 단계에서는 〈참고실시예〉에서 기술된 랫트 CFU-MK 분석계를 사용하여 TPO 활성을 측정했다. 달리 기술되지 않는한 모든 정제단계는 실온에서 수행되는 역상 크로마토그래피와 계면활성제의 존재하에서의 수퍼덱스(Superdex) 75pg 겔 여과를 제외하고 4-C로 수행되었다. 쿠마시(Coomassie) 색소 결합평가 (PIERCE에 의해 제조된 시약계, 카탈로그 No. 23236X) 또는 비신코닌산(bicinchoninic acid) (PIERCE에 의해 제조된 시약계, 카탈로그 No. 23225)을 사용한 방법으로 단백질 분석을 수행했다.

정제의 개요를 표 1에 도시하였다.

[표 1]

(1) 랫트혈장의 염화칼슘 처리, 원심분리 및 프로테아제 억제제 처리 롯트 No. XW9의 경우

-80℃에서 저장된 약 100 랫트에 상당하는 XRP(742ml; 단백질 농도, 54.8mg/ml; 총 단백질, 40,686mg)을 녹여서 폴리프로필렌 원심분리관 (Nalgene에 의해 제조된)에 분배했다. 각 튜브에 염화칼슘 분말을 100 mM의 최종 농도로 첨가했다. 4℃에서 밤새 배양한 후에 그 혼합물을 60분 동안 8,000 rpm으로 원심분리했다. 그 TPO-활성상청액(742 ml; 단백질 농도, 54.09 mg/ml; 총 단백질, 40, 740 mg)에 프로테아제 억제제 p-APMSF(와코 퓨어 케미칼 인더스트리즈, 리미티드가 카탈로그 No. 010-103930로 제조한 (p-아미노디페닐)메탄설포닐 플루오라이드 하이드로클로라이드)를 최종 농도 1mM으로 첨가했다. 얻어진 샘플을 하기 세파덱스 G-25 컬럼 완충액 교환 단계에서 사용했다.

이러한 방법에서 약 1,100 랫트로부터 유도된 전체 XRP(총, 8,184ml ; 총 단백질, 493,000mg)의 염화칼슘 p-APMSF 처리는 각 롯트가 약 100 랫트에 상응하게 11 롯트로 분할하고 이 롯트들을 하나씩 처리함으로써 이루어졌다. 생성한 11 샘플릉 다음 세파덱스 G-25 컬럼 단계에서 개별적으로 처리했다.

(2) 세파덱스 G-25〈완충액 교환〉

롯트 No. XW9의 경우

단계(1)의 칼슘 처리후에 얻은 상청액(742ml; 단백질 농도, 54.9mg/ml; 총 단백질, 40,740mg)을 20mM Tris-HCl, pH 8로 미리 평형을 유지시킨 세파덱스 G-25 컬럼(파마시아 바이오테크 제조, 카탈로그 No. 17-00333-03; 직경 11.3cm; 상 높이 47cm)에 40-70ml/분의 유량으로 부가하였다. 같은 완충액을 사용하여 용출을 행하였다. 단백질의 용출전에 용출액의 1300ml 부분을 버렸다. 용출액에서 UV 흡수가 검출되었을 때 전기 도전성이 500㎲/cm에 도달했을 때까지 분획을 모아 20mM Tris-HCl, pH 8로 교환된 TPO 활성 단백질 분획(1377ml; 단백질 농도, 27.56mg/ml; 총 단백질, 37.882mg; 단백질 수율, 93%)을 회수했다. 분획에서 TPO의 상대적 활성이 2.3인 것으로 발견되었다.

전체 롯트의 샘플을 세파덱스 G-25 컬럼 처리한 결과 총 21.117ml의 세파덱스 G-25 컬럼 TPO-활성 분획을 얻었다(총 단백질, 480,300 mg; 평균 상대 활성, 2; 총 활성 864,600).

(3) Q-세파로오스 FF〈강 음이온 교환 크로마토그래피〉

롯트 No. XW9의 경우

상기 단계(2)에서 세파로오스 G-25 처리로 얻은 TPO-활성 분획(1377ml; 단백질 농도, 27.5mg/ml; 총 단백질, 37,841mg; 상대 활성, 2.3)을 Q-세파로오스 FF(파마시아 바이오테크 제조, 카탈로그 No. 17-0510-01; 직경, 5cm; 상높이, 27cm)에 40ml/ 분의 유량으로 부가하여 20mM Tris-HCl(pH 8)을 사용하여 용출시킨다음 컬럼을 통하여 통과한 분획 F1을 수집하였다(3,949ml; 단백질 농도, 0.98mg/ml; 총 단백질, 3,870mg; 상대적 활성, 0).

다음에, 완충액을 175mM NaCl을 함유하는 20mM Tris-HCl(pH 8)로 교환하여 TPO 활성 분획 F2를 용출시켰다(4,375ml; 단백질 농도, 5.36mg/ml).

마지막으로 분획 F3(1,221ml; 단백질 농도, 3,9mg/ml, 총 단백질, 4,783mg; 상대적 활성, 3,8)을 1000mM NaCl을 함유하는, 20mM Tris-HCl(pH 8)을 사용하여 용출시켰다. TPO-활성 분획 F2에서의 총 단백질은 23,440mg인 것으로 발견되었으며 이 단계에서 단백질 수율은 61.9%이었다. 또한, TPO의 상대적인 활성은 6.8로 증가했다.

Q-세파로오스 FF에 세파덱스 G-25 TPO-활성 분획 전체 롯트를 적용한 결과 총 35,842ml의 Q-세파로오스 FF TPO-활성 분획 F2를 얻었다(총 단백질, 314,384mg; 평균 상대 활성, 9; 총 활성 2,704,000).

(4) 맥아 응집소(WGA)-아가로오스〈렉틴 친화성 크로마토그래피〉

롯트 No. XW9의 경우

세파로오스 FF 처리로 상기 단계(3)에서 얻은 TPO 활성 분획 F2를 세 부분으로 나누고 WGA-아가로오스(호넨 코포레이숀 제조, 카탈로그 No. 800273; 직경, 5cm; 상높이, 22.5cm)에 5ml/분의 유량으로 부가하고 돌베코의 등장 인산 완충액(DPBS)을 사용하여 용출시켰다. 컬럼을 통하여 통과된 분획 F1을 수집하였다(9,336ml; 단백질 농도, 2.30mg/ml; 총 단백질, 21,401mg; 상대적 활성, 6.9).

다음에 완충액을 0.2M N-아세틸-D-글루코사민 (나칼라이 테스크(Nacalai Tesque) 제조, GlcNAc, 카탈로그 No. 005-20), 150mM NaCl 및 0.02% 아지드화 나트륨을 함유하는, 20mM 인산나트륨 완충액(pH 7.2)으로 변경시켜 그 용출액을 모아서 한외여과 유니트(필트론(Filtron) 제조, Omega Ultrasette, 8,000의 겉보기 분자량 컷오프)를 사용하여 농축시킴으로써 WGA-아가로오스 흡착 TPO-활성 분획 F2(2,993ml; 단백질 농도, 0.376mg/ml)를 얻었다.

TPO-활성 분획 F2에 있는 총 단백질은 1,125mg인 것으로 발견되었으며 이 단계에서 F2의 단백질 수율은 4.8% 였다. 또한, TPO의 상대적인 활성은 101로 증가했다. 얻어진 F2분획은 -80℃에서 저장했다.

WGA-아가로오스에 전체 롯트 Q-세파로오스 FF TPO-활성 F2 분획을 부가한 결과 총 33,094ml의 WGA-아가로오스 TPO-활성 분획 F2(총 단백질, 15,030mg; 평균상대 활성, 132; 총 활성 1,987,000)를 얻었다.

(5) TSK-겔 AF-BLUE 650 MH〈트리아진 색소 친화성 크로마토그래피〉

뱃치 No. XB6의 경우

롯트 No. XW8의 WGA-아가로오스 흡착 TPO-활성 분획과 215 랫트-당량 XRP로부터 출발하는 상기 단계(4)에서 얻은 롯트 No. XW9의 WGA-아가로오스 흡착 TPO-활성 분획 F2를 뱃치 No. XB6(5,947ml; 단백질 농도, 0.38888mg/ml; 총 단백질, 2,319mg; 상대 활성, 150)과 조합했다.

조합된 샘플의 5,974ml 부분을 1,O00ml(전체 296,76g)에 대하여 0.85몰의 NaCl과 혼합하여 0.822M의 최종 NaCl 농도를 갖는 6,132ml의 용액을 제조하고 그 용액을 1M NaCl을 함유하는 20mM 인산나트륨 완충액(pH 7.2)으로 미리 평형화된 TSK-겔 AF-BLUE 650 MH(TOSOH CORP., 카탈로그 No. 08705; 직경, 5cm, 상높이, 23cm)에 7ml/분의 유량으로 부가하였다.

부가 완료후에 1M NaCl을 함유하는 20mM 인산나트륨 완충액(pH 7.2)을 사용하여 10ml/분의 유량으로 단백질을 용출시켰다. 그 용출액을 저장하고 한외여과 유니트(Omega Ultrasette, 8,000의 겉보기 분자량 컷오프)를 사용하여 농축시킴으로써 통과된 분획 F1(543ml; 단백질 농도, 2.05mg/ml; 총 단백질, 1.112mg; 상대 활성, 31)을 얻었다.

다음에 용출 완충액을 2M NaSCN으로 변경시켜 용출된 TSK-겔 AF-BLUE 650 MH 흡착 TPO-활성 분획 F2(1,427ml; 단백질 농도, 0.447mg/ml)를 얻었다.

TPO-활성 분획 F2에 있는 총 단백질은 638mg인 것으로 발견되었고 이 단계에 의한 F2의 단백질 수율은 27.5% 였다. 또한, TPO의 상대 활성은 1,500으로 증가했다. TSK-겔 AF-BLUE 650 MH 에 전체 뱃치의 WGA-아가로오스 흡착 TPO-활성 F2 분획을 부가한 결과 총 10,655ml의 TSK-겔 AF-BLUE 650 MH TPO-활성 분획 F2를 얻었다(총 단백질, 4,236mg; 평균 상대 활성, 905; 총 활성 3,834,000).

(6) 페닐 세파로오스 6FF/LS〈소수성 상소 작용 크로마토그래피〉

뱃치 No. XB6의 경우

1.424ml 부분의 TSK-겔 AF-BLUE 650MH TPO-활성 분획 F2(1,424ml; 단백질 농도, 0.447mg/ml; 총 단백질, 638mg; 상대 활성, 1,500)를 1,000ml(전체 282.2g) 당 1.5몰의 황산 암모늄 분말과 혼합하여 1.35M의 최종 황산 암모늄 농도를 갖는 1,581ml의 용액을 만들었다.

생성한 용액을 1.5M의 황산 암모늄을 함유하는 50mM 인산나트륨 완충액(pH 7.2)으로 미리 평형화시킨 페닐 세파로오스 6FF(Low Sub) 컬럼 (파마시아 바이오테크, 카탈로그 No. 17-0965-05; 직경, 5cm, 상높이, 10cm)에 7ml/분의 유량으로 부가하였다. 부가 완료후에 0.8M의 황산 암모늄을 함유하는 36mM 인산나트륨 완충액을 사용하여 10ml/분의 유량으로 용출을 수행했다. 생성한 용출액(약 3,160ml)을 모으고 한외여과 유니트(Omega Ultrasette, 8,000의 겉보기 분자량 컷오프)를 사용하여 농축시킴으로써 분획 F1(485ml; 단백질 농도, 0.194mg/ml; 총 단백질, 94.2mg; 상대 활성, 0)을 얻었다.

다음에, 용출 완충액을 20mM 인산나트륨 완충액(pH 7.2)으로 변경하여 용출된 TPO-활성 분획 F2(약 3,500ml)를 얻었다. 용출된 분획을 한외여과 유니트(Omega Ultrasette, 8,000의 겉보기 분자량 컷오프)를 사용하여 농축시키고 평가를 위한 샘플을 취했다. 이 단계에서 TPO-활성 분획 F2(220ml)의 단백질 농도 및 총 단백질은 각각 1.45mg/ml와 319mg인 것으로 밝혀졌고 이 단계에 의한 F2의 단백질 수율은 50.0%이었다. TPO의 상대 활성은 1,230인 것으로 발견되었다.

페닐 세파로오스 6FF/LS에 전체 뱃치의 TSK-겔 AF-BLUE 650MH TPO-활성 F2 분획을 부가한 결과 총 1,966ml의 페닐 세파로오스 6FF/LS TPO-활성 분획 F2를 얻었다(총 단백질, 2,762mg; 평균 상대 활성, 847; 총 활성 2,339,000).

(7) 세파크릴 S-200 HR〈겔 여과 크로마토그래피〉

뱃치 No. XB6(제1도 참조)의 경우

페닐 세파로오스 6FF/LS TPO-활성 분획 F2 (217ml; 단백질 농도, 1.45mg/ml; 총 단백질, 315mg; 상대 활성, 1,230)를 144,8ml의 5M NaCl 용액과 혼합하여 2M의 최종 NaCl 농도를 갖는 362ml 용액을 제조하여 그 용액을 YM3 막을 한외여과 유니트(직경 76mm, 아미콘 코포레이숀 제조)를 사용하여 약 50ml로 농축시켰다.

이것에 동량(50ml)의 8M 우레아를 첨가하여 최종 농도로서 1M NaCl 및 4M 우레아를 함유하는 약 100ml의 용액을 얻었다. 이것을 약 80ml로 농축시켜 88,78ml의 샘플로 만든 다음 세파크릴 S-200HR 컬럼(파마시아 바이오테크 제조, 카탈로그 No. 17-0584-01; 직경 7.5cm 및 상 높이 100cm)에 부가하였다.

그 후 3ml/분의 유량으로 DPBS를 사용하여 용출시켜 1,200ml의 공극 용량후의 용출액을 60개의 폴리프로필렌 관에서 45ml 부분씩 수집했다. 두 개 관 간격으로 분석하고 남은 것은 1,100 미리 랫트로부터 유도된 전체 샘플의 세파크릴 S-200 HR 처리가 만료될 때까지 -85℃에서 저장하였다. 평가 결과에 근거하여 뱃치 No. XB6의 분획들을 하기와 같이 그룹지었다.

(F1) 관 번호 1-15 (공극용량에 가까운 분획; 분자량, 94,000 이상)

(F2) 관 번호 16-26 (분자량, 94,000-33,000)

(F3) 관 번호 27-44 (분자량, 33,000-3,000)

(F4) 관 번호 45-55 (분자량, 3,000 이하)

이와 같이 페닐 세파로오스 6FF/LS에 의해 얻은 모든 뱃치의 TPO-활성 F2 분획을 별도로 세파크릴 S-200HR 처리하고, 분석하여 -85℃에서 저장했다. 모든 뱃치의 S-200HR 처리 완료후 뒤이은 역상 크로마토그래피(YMC-Pack PROTEIN-RP)를 실시하기 전에 상기 저장된 샘플들을 녹여서 YM3 막을 갖는 한외여과 유니트(직경 76mm, 아미콘 코포레이숀 제조)를 사용하여 농축시킴으로써 하기의 두 개 샘플을 얻었다. 세파크릴 S-200HR 에 의해 얻은 TPO-활성 분획 F2의 농축 샘플을 이후 “고분자 TPO 샘플 F2”로 칭하고 F3를 “저분자 TPO 샘플 F3”으로 칭한다.

고분자 TPO 샘플 F2와 저분자 TPO 샘플 F3는 편의상 겔 여과 크로마토그래피에서 다른 용출 영역의 분획들을 모은 것이므로 용어 “고분자” 및 “저분자”는 그들의 실제 분자량을 의미하지는 않는다.

저분자 TPO 샘플 F3 및 고분자 TPO 샘플 F2는 개별적으로 추가 정제 단계를 거치게 된다.

저분자 TPO 샘플 F3의 정제는 하기 단계(8)-(11)에 설명된다.

(8) YMC-Pack PROTEIN-RP〈역상 크로마토그래피〉

상기 단계(7)에서 얻은 저분자 TPO 샘플 F3(총 단백질, 50.3mg; 단백질 농도, 0.184mg/ml; 상대 활성, 20,000; 총 활성 1,007,000; 충량, 274ml)을 용매 A(0.025% 트리플루오로아세트 산(TFA)) 및 용매 B (0.025% TFA를 함유하는 1-프로판올)와 혼합하여 508,63의 총량을 가지며 프로판올, TFA와 단백질의 최종농도가 각각 약 20%, 0.012% 및 0.0989mg/ml인 용액을 얻었다. 이 용액을 제조하는 형성된 비용해 물질을 원심분리하여 분리하고 그 상청액을 두 개의 254.3ml(25.2mg 단백질)로 나눈 다음 30% B로 미리 평형화된 YMC-Pack PROTEIN-RP (YMC 제조, 카탈로그 No. A-PRRP-33-03-15; 직경 3cm 및 상 높이 7.5cm)로 팩킹된 컬럼에 2ml/분의 유량으로 부가하였다. 원심분리하여 얻은 침전물을 5mM CHAPS (3-[3-콜아미도프로필 디메틸암모니오]-1- 프로판 설포네이트; 도진도 래보라토리즈 제조, 카탈로그 No. 75612-03-3)를 함유하는 20ml의 20mM 아세트산나트륨(pH 5.5)에 용해시켜 컬럼에 부가했다.

샘플 적재후 약 50ml의 용매 (용매 A:B=3:1)를 컬럼을 통하여 통과시켜 통과 분획을 얻었다. 다음에, 전개 프로그램 (30% B 내지 45% B 까지의 선형구배로 120분)을 시작하여 용출액을 36개 폴리프로필렌관에 10ml 부분씩 수집했다. 같은 수집관을 사용하여 잔여 샘플에 대하여 상기 과정을 다시 반복하여 각각 20ml의 용출액을 함유하는 총 36개 분획관을 얻었다. YM3 막을 갖는 한외여과 유니트를 사용하여 통과 분획을 직접적으로 20ml로 농축시켰다.

관 번호 1-36의 20ml 분획과 통과 분획 각각의 0.1ml 부분을 20㎕의 5% BSA와 혼합하고 증발건조시켜 0.25ml의 IMDM 분석 배지에 용해시킨 다음 TPO-활성 분획을 구체화하기 위하여 평가했다. 그 결과 조합되어 저분자 TPO 샘플 F3-유도 YMC-Pack PROTEIN-RP TPO-활성 분획 F2로서 사용된 관 번호 17-27의 분획 (36.0-43.0%의 프로판올 농도 범위)에서 TPO 활성이 발견되었다. 이 분획은 다음 YMC-Pack CN-AP 단계에 사용할 때까지 -85℃에서 저장했다.

(9) YMC-Pack CN-AP 〈역상 크로마토그래피〉

상기 단계(8)에서 얻은 저분자 TPO 샘플 F3-유도 YMC-Pack PROTEIN-RP TPO-활성 분획 F2(총 단백질 2.79mg; 단백질 농도, 0.0130ml; 상대 활성, 130,000; 총 활성, 36,300)의 214.9ml 부분을 0.6ml의 50% 글리세롤과 혼합하고 1.8ml로 농축시켰다. 농축물을 최종적으로 20% 이하의 프로판올 및 약 6%의 글리세롤을 함유하는 5ml의 부피로 조정했다.

상기 농축물을 하기 컬럼 조작(각 조작 당 0.555mg 단백질 및 1ml 부피)에 사용하기 위하여 5 부분으로 나누었다. 나눠진 샘플 각각을 15% B로 미리 평형화된 YMC-Pack CN-AP로 팩킹된 컬럼(YMC 제조, 카탈로그 No. AP-513; 직경 6mm 및 상높이 250mm)에 용매 A로서 0.1% TFA 및 용매 B로서 0.05% TFA-함유 1-프로판올을 사용하여 0.6ml/분의 유량으로 부가하였다. 부가후 프로판올 농도를 15%B-25%B 까지 증가시키고 25%B-59%B까지 65분의 선형구배를 수행했다. 최종(5번째)조작 완료 후 단백질을 제외하고 동일한 조성을 갖는 용액 1ml를 컬럼에 부가하여 같은 방법으로 전개시킴으로써 컬럼에 유지된 TPO 활성을 회수했다. 여섯 번째 조작의 용출액을 얻는데 동일한 폴리프로필렌 관을 사용함으로써 각각 7.2ml의 용출액을 함유하는, 총 44개의 관을 얻었다.

얻어진 분획의 30ml 부분(각 분획의 1/240 부분)을 20㎕의 5% BSA와 혼합하고 증발건조시켜 0.24ml의 IMDM 분석 배지에 용해시킨다음 TPO-활성 분획을 구체화 시키기 위하여 분석했다. 그 결과, 조합되어 저분자 TPO 샘플 F3-유도 YMC-Pack CN-AP 주 TPO-활성 분획 FA로서 사용된 관 번호 28-33 (37.0-42.0% 프로판올 농도 범위)의 분획에서 강한 TPO 활성이 발견되었다.

(10) Capcell Pak C1 300 〈최종 역상 크로마토그래피〉

상기 단계(9)에서 얻은 43.20ml 저분자 TPO 샘플 F3-유도 TPO-활성 분획 FA (총 단백질 0.372mg; 단백질 농도, 0.00863mg/ml; 상대 활성, 800,000; 총 활성, 297,500)의 43.12ml 부분을 0.2ml의 50% 글리세롤과 혼합하고 농축시켜 0.1ml의 글리세롤 용액을 얻었다.

이 용액을 용매 A (0.1% TFA); 용매 B (0.5% TFA 함유 1-프로판올) = 85:15(15% B) 용액 2ml와 혼합하여 약 14% 프로판올, 약 4.8% 글리세롤 및 0.177mg/ml의 단백질을 함유하는 2.1ml의 샘플을 제조하였다. 제조된 샘플을 15% B로 미리 평형화시킨 Capcell Pak C1 300A로 팩킹된 컬럼(시세이도 컴패니 리미티드 제조, 카탈로그 No. C1 TYPE: SG300A: 직경 4.6mm 및 상 높이 250mm)에 부가하고 27% B 내지 38% B까지의 60분의 선형구배에 의해 0.4ml/분의 유량으로 전개시켰다. 72개의 폴리프로필렌 관에 0.6ml 부분으로 용출액을 수집했다.

얻어진 분획(각 분획의 1/200 부분) 각각의 3㎕ 부분을 20㎕의 5% BSA와 혼합하고 배지를 225㎕의 IMDM 분석 배지로 교환한 다음 75배 희석된 분획을 분석했다.

전기영동법에 사용하기 위하여 각 분획중 1㎕ 부분(1/600 분획)을 동량으로 나누고 증발건조시킨 다음 SDS-PAGE를 위하여 10㎕의 비환원 샘플 완충액을 95℃에서 5분동안 처리했다. 이렇게 처리된 샘플은 15-25% SDS-폴리아크릴아미드 프로캐스트겔(다이이치 퓨어 케미칼 컴패니, 리미티드 제조)을 사용하여 SDS-PAGE 처리시킨 다음 2D-은 염색 II “DAIICHI”로 이루어진 은 염색 키트(다이이치 퓨어 케미칼 컴패니, 리미티드 제조, 카탈로그 No. 167997; 이하 “은 염색 키트”라 함)로 염색했다. 분자량 마커로서 [DAIICHI]-III 저분자량 마커(다이이치 퓨어 케미칼 컴패니, 리미티드 제조, 카탈로그 No. 181061; 이하 “DPCIII”라 함)을 사용했다.

상기 분석의 결과로서 관 번호 35-43의 분획(30.0-32.5% 프로판올 농도 범위)에서 현저한 TPO 활성이 발견되었다. 이들중 관 번호 36-42의 분획(30.5-32.0% 프로판올 농도 범위)을 조합하여 주 TPO-활성 분획 FA로 사용했다. 그 결과는 제2도에 도시하였다.

크로마토그램으로부터 추론된 단백질 함량을 분석 결과와 비교했을 때 얻어진 분획은 39.6㎍의 총 단백질, 9.5㎍/ml의 단백질 농도, 4,890,000의 상대 활성 및 193,600의 총 활성을 갖는 것으로 밝혀졌다. TPO-활성 분획 번호 36-42의 SDS-PAGE 패턴의 검사는 염색 밀도가 활성 강도와 관련있는 밴드가 존재함을 나타냈다. 또한, 이 비환원된 밴드의 겉보기 분자량이 동일 겔상의 환원된 표준 분자 량 단백질과 비교할 때 17,000-19,000인 것으로 발견되어 이 밴드가 TPO의 강력한 후보임을 나타냈다.

(11) 전기영동겔로부터 TPO-활성 단백질의 추출 〈15% SDS-PAGE〉

TOI-활성 분획 FA의 분석예

상기 단계(10)에서 얻은 저분자 TPO 샘플 F3-유도 TPO 활성 분획 F3(총 단백질 39.6㎍; 단백질 농도, 9.4㎍/㎖; 상대 활성, 4,890,000; 총 활성, 193,600) 4,200㎕중 활성 단백질 추출에 사용하기 위하여 5.5㎕(1/764 분획) 그리고 은 염색에 사용하기 위하여 2.5㎕(1/1680 분획)를 각 샘플관으로 보내고 증발건조시켜 1시간 동안 37℃에서 SDS-PAGE를 위하여 10 ㎕의 비환원 샘플 완충액과 반응시킨 다음 18시간 동안 37℃에서 방치함으로써 SDS 반응을 수행했다.

미리 염색된 저 범위 마커(바이오-래드 래보라토리즈, 인코포레이티드 제조, 161-0305) 및 상기 DPCIII를 분자량 마커로서 사용했다. 마이크로슬랩(Microslap) 겔을 사용하여 일반적으로 사용되는 과정(라에믈리(Laemmli), Nature, vol. 227, pp.680-685, 1970)에 따라 이들 샘플의 15% SDS-PAGE를 40℃에서 수행했다. 전기 영동의 완료 후 은 염색이 이루어지는 겔 부분을 즉시 칼로 절단하여 고정 용액에 넣은 다음 은 염색 키트를 사용하여 염색했다.

이와 별도로 활성의 검출을 위해 사용되는 모든 분자량 범위의 겔을 칼로 34조각으로 자르고 1.5-2.5mm의 폭을 갖는 겔 조각을 고바야시의 약간 변형된 방법 (일본 생화학 학회에 의해 공개된, 고바야시, 엠, Seikagaku(Biochemistry), vol. 59, No.9, 1987 참조)으로 분쇄했다. 미세한 단편으로 분쇄된 각 겔 조각을 0.3ml의 추출 완충액(20mM Tris-HCl, pH 8, 500mM NaCl, 0.05% BSA)과 혼합하고 4℃에서 6시간동안 진탕시켜 추출시켰다.

이것에 500mM 인산칼륨(pH 6.8)을 20mM의 최종 농도로 첨가했다. 4℃에서 1시간 진탕한 후 생성한 혼합물을 Ultra Free C3GV 0.22㎛ 여과 유니트(밀리포어 코포레이숀 제조, UFC3 OGV OS)로 전달하고 15분동안 1,000 ×g(400rpm)으로 원심분리하여 침전된 SDS를 제거하고 상청액을 회수했다. 여액을 Ultra Free C3-LGC 한외여과 유니트(겉보기 분자량 컷 오프 10,000, 밀리포어 코포레이숀 제조, UFC3 LGC 00)로 전달하고 3,000 ×g(7000 rpm)으로 원심분리했다. 농축된 용액의 부피가 약 50㎕에 도달했을 때, 300㎕의 200mM 인산나트륨 완충액(pH 7.2)을 첨가하고 다시 한외여과 하였다.

300㎕의 20mM 인산나트륨 완충액을 사용하여 한외여과를 두 번 반복하여 잔여 SDS를 제거했다. 그 후 무균화되고 TPO 활성 측정이 이루어진 샘플(300㎕)의 제조를 위하여 분석배지를 교환하는 유사한 단계를 반복했다.

DPCIII 분자량 마커에 기초하여 약 17,000-19,000, 14,000 및 11,000의 겉보기 분자량을 나타낸 세 개의 단백질 밴드가 은 염색에 의하여 명확히 검출되었다.

상기 단계(10)에서 활성 강도와 염색 밀도 사이의 관례를 갖고 약 17,000-19,000의 겉보기 분자량을 갖는 밴드가 Capcell Pak C1 컬럼 TPO-활성 분획의 전기영동에서 관찰되었다. 이 단계(11)의 실험에서는 약 17,000-19,000의 겉보기 분자량을 갖는 밴드에서도 TPO 활성이 발견되었다(제3도 참조).

상기 결과를 기초로하여, Capcell Pak C1 300A 컬럼의 활성 분획에서 TPO-활성 단백질이 전기영동 겔상에서 검출가능한 수준으로 정제된다는 것이 확인되었다.

15% SDS-PAGE에 의해 얻어진 밴드의 은 염색 밀도에 기초하여 총 TPO-활성 분획에서 후보 TPO 단백질(약 17,000-19,000의 겉보기 분자량)의 양이 약 1.7㎍인 것으로 측정되었다.

고분자 TPO 샘플 F2의 정제는 하기 단계(12)-(15)에서 설명된다.

(12) YMC-Pack PROTEIN-RP 〈역상 크로마토그래피〉

상기 단계(7)에서 얻은 저분자 TPO 샘플 F2(총 단백질, 257mg; 단백질 농도, 10.894mg/ml; 상대 활성, 7,840; 2,015,000; 총량, 287ml)를 95.8ml (샘플의 1/3 부피)의 용매 B(0.025% TFA를 함유하는 1-프로판올)와 혼합하여 전체 부피가 383ml이고 또 최종 프로판올, TFA 및 단백질 농도가 약 25%, 0.006% 및 0.671mg/ml인 용액을 수득하였다. 0.025%의 TFA 용액을 용매 A로 사용하였다. 사용된 샘플의 제조시 형성된 비용해성 물질을 원심분리로 분리하고 그 상청액을 6개의 62.3ml(42.8mg 단백질) 부분으로 나눈 다음 30% B로 미리 평형화된, YMC-Pack PROTEIN-RP로 팩킹된 컬럼(YMC 제조, 카탈로그 No. A-PRRP-33-03-15; 직경 3cm 및 상높이 7.5cm)에 2ml/분의 유량으로 부가하였다. 원심분리로부터 얻은 침전물을 5mM CHAPS를 함유하는 10ml의 20mM 아세트산나트륨(pH 5.5)에 용해시켜 컬럼에 부가했다.

샘플 적재후 약 50ml의 용매(용매 A:B:=3:1)를 컬럼으로 통하여 통과시켜 통과 분획을 얻었다. 다음에, 전개 프로그램(30% B 내지 45% B 까지의 120분의 선형구배)을 시작하여 그 용출액을 24개 폴리프로필렌 관에 10ml 부분으로 수집했다. 같은 수집관을 사용하여 상기 공정을 6개로 나눈 샘플에 대하여 반복함으로써 각각 90ml의 용출액을 함유하는 총 24개 분획관을 얻었다. 통과 분획과 관 번호 1의 분획을 조합한 후 YM3막을 갖는 한외여과 유니트(직경 76mm, 아미콘 코포레이숀 제조)를 사용하여 90ml로 직접 농축시켰다.

통과 분획 + 관 번호 1 분획 및 관번호 2-24 각각의 0.3ml 부분과 10㎕의 5% BSA와 혼합하고 증발건조시켜 0.30ml의 IMDM 분석 배지에 용해시킨 다음 TPO-활성 분획을 구체화시키기 위하여 분석하였다. 그 결과, 조합되어 저분자 TPO 샘플 F2-유도 YMC-Pack PROTEIN-RP TPO-활성 분획 F2로서 사용된 관 번호 10-15의 분획 (34.0-39.5%의 프로판올 농도 범위)에서 TPO 활성이 발견되었다. 이 분획을 다음 YMC-Pack CN-AP 단계에 사용할 때까지 -85℃에서 저장했다.

(13) 수퍼덱스 75pg 〈CHAPS의 존재하에서 겔여과 크로마토그래피〉

상기 단계(12)에서 얻은 538.2ml의 고분자 TPO 샘플 F2-유도 YMC-Pack PROTEIN-RP TPO-활성 분획 F2(총 단백질 11.3mg; 단백질 농도, 0.021mg/ml; 상대 활성, 227,000; 총 활성, 2,565,000)를 0.6ml의 50% 글리세롤과 혼합하고 증발에 의해 농축시켰다. 이것에 18ml의 20mM CHAPS를 첨가하고 교반한 다음 41시간 동안 4℃에서 배양했다. 그 후 제 1 샘플을 HiLoad 26/60 수퍼덱스 75pg로 팩킹된 컬럼(파마시아 바이오테크 제조, 카탈로그 No. 17-1070-01; 직경 2.6cm 및 상 높이 60cm)에 부가하여 5mM CHAPS를 함유하는 DPBS를 사용하여 1ml/분의 유량으로 용출시켰다. 각 샘플(단백질 농도, 0.466mg/ml; 단백질, 1.86mg)의 4ml 부분을 컬럼에 부가하였다.

이 경우에 전체 YMC-Pack PROTEIN-RP TPO-활성 분획을 6 부분으로 나누어서 수퍼덱스 75 컬럼 조작을 6번 반복했다. 각 조작의 용출액을 45개관에 5ml 부분씩 수집하고 최종적으로 6개 컬럼 조작의 완료 후에 각각 30ml의 용출액을 함유하는 45개 분획을 얻었다.

수득한 분획 각각의 0.1ml 부분을 10㎕의 5% BSA와 혼합하고 증발건조시키고 0.25ml의 IMDM 분석 배지에 용새시켜 TPO-활성 분획을 구체화하기 위하여 평가했다. 그 결과, 조합되어 저분자 TPO 샘플 F2-유도 수퍼덱스 75pg TPO-활성 분획 F2로서 사용된 관 번호 13-31의 분획(78,000-3,000의 분자량 범위)에서 TPO 활성이 발견되었다.

(14) YMC-Pack CN-AP 〈역상 크로마토그래피〉

상기 단계(13)에서 수득한 고분자 TPO 샘플 F2-유도 75pg TPO-활성 분획 F2 540ml(분자량 78,000-3,000)(총 단백질 1.11 mg; 단백질 농도, 0.00216 mg/ml; 상대 활성, 1,750,000; 총 활성, 1,943,000)의 513.2ml 부분을 1/10 부피의 용매 B(0.05% TFA를 함유하는 1-프로판올)와 혼합하고 15% B로 미리 평형화시킨, YMC-Pack CN-AP로 팩킹된 컬럼(YMC 제조, 카탈로그 No. A-P513; 직경 6mm 및 상높이 250mm)에 0.6ml/분의 유량으로 용매 A (0.1% TFA) 및 용매 B를 사용하여 부가하였다. 부가후, 프로판올 농도를 15% B 에서부터 25% B로 증가시키고 25% B에서 50% B로의 60분 선형구배를 실시하였다.

YMC-Pack CN-AP 컬럼 크로마토그래피의 개시전에 총 사용 샘플의 1/20 부분을 활성의 적당한 회수를 확인하기 위하여 시험 조작했다. 그 후, 잔여 19/20 부분을 2개의 샘플로 나누어 두 번 조작했다. 다시말하면 컬럼 조작을 세 번 반복했다.

동일한 44개 폴리프로필렌 관이 3조각의 용출물을 모으는데 사용되었기 때문에 각각 3.6ml 용출물을 함유하는 총 44개관을 얻었다.

수득한 분획의 5㎕ 부분(각 분획의 1/720 부분)을 25ml의 IMDM 분석 배지와 혼합하고 TPO-활성 분획을 구체화하기 위하여 분석하였다. 그 결과, 조합되어 고분자 TPO 샘플 F2-유도 YMC-Pack CN-AP 주 TPO-활성 분획 FA로 사용된 관 번호 24 내지 30의 분획(36.0-42.0%의 프로판올 농도 범위)에서 현저히 강한 TPO 활성이 발견되었다.

(15) Capcell Pak C1 300A 〈최종 역상 크로마토그래피〉

상기 단계(14)에서 얻은 25.20ML 고분자 TPO 샘플 F2-유도 YMC-Pack CN-AP TPO-활성 분획 FA(총 단백질, 0.606 mg; 단백질 농도, 0.0246 mg/ml; 상대 활성, 700,000; 총 활성, 424,000)의 24.66ml 부분을 0.4ml의 50% 글리세롤과 혼합하고 증발시켜 농축시켰다.

이렇게하여 수 %의 프로판올 농도, 10%의 글리세롤 농도 및 0.303 mg/ml의 단백질 농도를 갖는 2ml의 농축 샘플을 얻었다. 이것을 15% B로 미리 평형화시킨 Capcell Pak C1 300A로 팩킹한 컬럼(시세이도 컴패니 리미티드 제조, 카탈로그 No. C1 TYPE: SG300A; 직경 4.6mm 및 상 높이 250mm)에 용매 A(0.1% TFA) 및 용매 B(0.5% TFA 함유 1-프로판올)를 사용하여 부가하고 0.4ml/분의 유량으로 27% B에서 38% B까지 60분 선형구배로 전개시켰다. 이 용출액들을 72개의 폴리프로필렌 관에 0.6㎕ 부분으로 수집했다.

각기 수득한 분획의 0.75㎕ 부분(각 분획의 1/800 부분)을 20㎕의 5% BSA와 혼합하고 배지를 225㎕의 IMDM 분석 배지로 교환하여 300배 희석된 분석을 분석하였다.

각 분획의 2㎕ 부분(1/300 분획)을 전기영동에 사용하기 위하여 샘플로 하고 증발건조시킨 다음 SDS-PAGE를 위하여 10㎕의 비환원 샘플 완충제로 95℃에서 5분동안 처리했다. 처리된 샘플을 15-25% SDS-폴리아크릴아미드 프로캐스트 겔(다이이치 퓨어 캐미칼 컴패니, 리미티드 제조)을 사용하여 SDS-PAGE 하고 상기 은 염색 키트를 사용하여 염색했다. 상기에서 설명된 DPCIII를 분자량 마커로 사용했다.

상기 분석 결과, 관 번호 33-39의 분획(29.5-31.5% 프로판올 농도 범위)에서 상당한 TPO 활성이 발견되었다. 이들중 관 번호 34-39의 분획(30.0-31.5% 프로판올 농도 범위)을 조합하여 주 TPO-활성 분획 A로 사용했다. 주 TPO 활성 분획의 SDS-PAGE 패턴의 검사는 상기 단계(10)에서 설명된 저분자 TPO 샘플 F3-유도 TPO-활성 분획의 경우와 유사한 비환원 조건하에서 17,0000-19,000의 겉보기 분자량 범위내에서 염색 밀도가 활성강도와 관계있는 밴드의 존재가 나타났다.

[실시예 2]

정제된 랫트 TPO의 부분적 아미노산 서열 분석

실시예 1의 정제단계(10)에서 얻은 Capcell Pak C1 300A 컬럼 TPO-활성 분획 FA에서 랫트 TPO 후보 단백질의 아미노산 서열 분석은 이와마쓰의 과정(이와마쓰) 등, “Shin Kiso Seikugaku Jikken-ho(New Basic Biochemical Experiments)”, vol.4, pp.33-84, pub. Maruzen; 이와마쓰, 에이, Seikagaku(Biochemistry)”, vol.63, No.2, pp.139-143, 1991; 이와마쓰, 에이, Electrophoresis, vol.13, pp.142-147, 1992)에 따라 실시하였다. 즉, 샘플을 SDS-PAGE 처리하고 폴리비닐리덴 디플루오라이드(PVDF) 막상에 전기적으로 전달했다. PVDF 막상에서 단백질의 환원 및 S-알킬화 후에, 처리된 단백질을 세 개의 프로테아제로 그 위치에서 계통적 및 단계적 제한 효소 가수분해에 의해 펩타이드 단편으로 분해시키고 각 분해 단계시 그 펩타이드 단편을 역상 크로마토그래피로 분리 및 정제한 다음 고감수성 아미노산 서열 측정법으로 그들의 아미노산 서열을 분석했다. 이 과정을 하기에서 보다 상세히 설명한다.

저분자 TPO 샘플 F3-유도 Capcell Pak C1 300A TPO 분획 FA에 있는

TPO 후보 단백질의 분석화

(1) Capcell Pak C1 300A 컬럼 TPO 분획 FA(관련번호 36-42)의 농도

실시예 1의 정제단계(10)에서 얻은 4,200㎕의 저분자 TPO 샘플 F3-유도 Capcell Pak C1 300A 컬럼 TPO-활성 분획 F4(관련번호 36-42) (총 단백질, 39.6㎍; 단백질 농도, 9.4㎍/ml; 상대 활성, 4,890,000; 총 활성, 193,600)중 4,151㎕(총 분획의 98.8%)를 아미노산 서열 분석에 사용했다. 크로마토그램으로부터 추론된 총단백질은 39.1㎍이었는데 그중 약 1.6㎍이 SDS-PAGE한 후 은으로 염색되었으며 약 17,000-19,000의 겉보기 분자량을 갖는 TPO 후보 단백질이었다.

이 샘플들을 글리세롤과 혼합하고 증발에 의해 농축시켜 5㎕의 글리세롤 용액을 얻었다. 이것에 SDS-PAGE를 위하여 비환원 완충액을 첨가하고 1M Tris-HCl(pH 8)을 첨가하여 pH를 조정함으로써 20mM Tris-HCl (pH 8.0), 50mM Tris-HCl (pH 6.8), 1.1% SDS, 2mM EDTA, 0.02% 브로모페놀 블루 및 30% 글리세롤을 함유하는 25㎕의 샘플을 얻었다.

제조된 샘플을 14시간 동안 실온에서 유지시키고 5분 동안 60℃에서 처리함으로써 과도한 가열없이 적당한 SDS 반응을 실시하였다.

(2) 전기영동

마이크로-슬랩 겔(4.0% 아크릴아미드 스택킹 겔 및 15% 아크릴아미드 분리 겔)을 제조하여 실온에서 2.5mA, 다음에 17.5mA의 일정전류로 2시간 동안 SDS-PAGE 처리하였다. 미리 염색된 저 범위 마커(Bio-Rad, 161-0305) 및 DOCIII를 분자량 마커로서 사용했다. 전기영동후 즉시 그 단밸질 분자들을 PVDF 막상으로 전달하였다(하기 단계 참조).

비환원 조건하에서 또는 디티오트레이톨(DTT)로 샘플을 환원시킨 후 15-25% 폴리아크릴아미드 프로캐스트 겔(다이이치 퓨어 케미칼스 컴패니 리미티드 제조, Multigel 15/25, 카탈로그 No. 211072)을 사용하는 다른 전기영동법에서 상기 샘플의 일부를 사용했다. 상기에서 설명한 은 염색 키트를 사용하여 그 겔을 염색시켰을 때 TPO인 것으로 예상되는 단백질 밴드의 분자량이 환원 조건하에서 약 19,000이었고, Capcell Pak C1 300A의 TPO 후보 단백질의 순도가 수%에 지나지 않음이 확인되었다. 또한, 밴드의 이동성이 비환원 및 환원 조건하에서 변했기 때문에 후보 단백질이 최소한 하나의 디설파이드 결합을 함유하는 것으로 추측되었다.

(3) 전기 블롯팅에 의한 PVDF 막상으로 단백질의 전달 및 밴드의 검출

PVDF 막 (ProBlott; 어플라이드 바이오시스템 제조, 카탈로그 No. 400994)으로의 단백질 전달은 반-건조 전달장치 (메리솔(Marysol)에 의해 제조된 모델명 KS-8460)를 사용하여 16mA(11-17V)의 일정한 전류로 1시간 동안 수행했다. 0.3M Tris 및 20% 메탄올(pH 10.4)로 이루어진 용액을 양극액으로 사용하고 25mM Tris 및 20% 메탄올 (pH 10.4)로 이루어진 용액을 전달 막 용액으로 그리고 25mM Tris, 40mM 아미노카프로인산과 20% 메탄올(pH 10.4)을 함유하는 용액을 음극액으로서 사용했다.

전달된 막을 Ponceau S 염색용액(100ml의 물중의 0.1g의 Ponceau S 및 1ml의 아세트산)으로 염색했을 때 다수의 밴드가 검출되었으며 이들 밴드중 하나가 약 19,000의 분자량을 갖는 후보 단백질의 밴드인 것으로 확인되었다. 이 밴드를 이어지는 펩타이드 단편 형성 단계에 사용하기 위하여 절단했다.

(4) 펩타이드 단편 형성, 펩타이드 매핑(Mapping) 및 아미노산 서열 분석

PVDF 막으로 전달되어 환원후 S-알칼화된 TPO 후보 단백질의 계통적 단편화를 수행하기 위하여 하기 세 개의 프로테아제를 사용하여 단계적인 제한 효소 가수분해를 실시하였다.

제1분해 : 리실 엔도펩티다제(Achromobacter Lyticus m497-1, 와코 케미칼 인더스트리즈 리미티드 제조, 카탈로그 No. 129-02541)

제2분해 : 엔도프로테나제 Asp-N(베링거-만하임 코포레이숀 제조, 카탈로그 No. 1054 589)

제3분해 : 트립신-TPCK(보르팅톤 바이오케미컬 제조, 카탈로그 No. 3740)

각 효소분해에 의해 수득한 펩타이드 단편을 회수하여 Wakosil-II 5C18 C18 역상 컬럼(와코 퓨어 케미칼 인더스트리즈, 리미티드 제조, 직경 2.0mm 및 길이 150mm)에 부가하고 용매 A(0.05% TFA) 및 용매 B(이 소프로판올: 아세토니트릴 = 7:3, 0.02% TFA)를 사용하여 0.25ml/분의 유량으로 또 30℃의 컬럼온도에서 1% B에서 50% B까지 30분간의 선형구배로 용출시켰다. 이 방법으로 펩타이드 매핑이 이루어졌다(제4도 참조). 그 펩타이드 단편을 회수한 후 개스상 아미노산 서열 분석기(시마즈 코포레이숀 제조, PPSQ-2)를 사용하여 에드만 분해 처리하였다. 그 후 서열 분석기로부터 차례로 회수된, N-말단이 PTH와 결합된 각 아미노산을 이소크래틱 용출에 의해 C18 역상 컬럼 크로마토그래피를 사용하여 확인했다. 그 결과를 다음에 요약했다.

상기 서열에서 N-말단에 있는 괄호안에 도시된 것은 계통적 효소 분해로부터 추론될 수 있는 아미노산 잔기들이다.

(5) 수득한 아미노산 서열의 상동성 분석〈상동성 조사〉

수득한 아미노산 서열이 기존에 보고된 단백질에 함유되는지 또는 유사한 서열을 갖는 단백질이 있는 지를 알아보기 위하여 서열분석 소프트웨어 Mac Vector (코닥 인터내셔날 바이오테크놀로지스, 인코포레이티드 제조)를 사용하여 분석하였다. 기존 단백질 또는 기존 유전자에 관한 정보로서는 Entrez Release 6 데이타 베이스(1993. 8. 15.에 공개된, National Center for Biotechnology Information, National Library of Medicine, National Institute of Health, U. S. A. 참조)를 사용했다. 거기에 포함된 데이타 베이스는 아래와 같다.

Entrez Release 6 데이타 베이스

NCBI-GenBank, 1993. 8. 15. (Release 78.0)

EMBL, 1993. 7. 15. (Release 35.0 + 업데이트)

DDBJ, 1993. 7. 15.

SWISS-PROT, 1993. 4. (Release 25.0)

PIR, 1993. 6. 30. (Release 37.0)

PDB, 1993. 4.

PRF, 1993. 5.

dbEST, 1993. 7. 5. (Release 1.10)

미합중국 및 유럽특허

그 결과 AP12의 서열(K)DSFLADVK는 랫트 코르티코스테로이드-결합 글로블린(CBG) 전구물질의 내부 서열 KDSFLADVK와 완전히 일치했다[PIR 데이타 베이스 수납 No. A40066; 스미스와 하몬드; “랫트 코르티코스테로이드-결합 글리블린; 다른 생리학적 조건하에서 간에서의 기본적인 구조 및 메신저 리보핵산 레벨”, Mol. Endocrinol., (1989), 3, 420-426].

추가의 상세한 시험에서는 AP3의 서열(K)XYYESZ(X는 A, S, G, M 또는 Q이고 Z는 E 또는 K)와 매우 유사성을 갖는 서열 KQYYESE(서열 193)이 랫트 CBG 아미노산 서열에 포함되는 것으로 나타났다. 랫트 CBG에서는 AP12와 AP3의 서열에 상당하는 서열들이 서로 결합하여 내부 아미노산 서열 KDSFLADVKQYYESE (서열 190)을 형성한다.

AP12 및 AP3 이외의 단편의 아미노산 서열과 관련해서는 고려될만한 유사성을 갖는 단백질이나 유전자가 발견되지 않았다.

[실시예 3]

혈소판감소증 랫트의 혈장으로부터 유도된 TPO의 생물학적 활성 분석

(1) CFU-MK 분석계(액체 배양계)

전형적인 예로서 제5도는 혈소판감소증 랫트 혈장으로부터 부분적으로 정제된 TPO 샘플(실시예 1-2의 정제단계(8)에서 설명된 YMC Pack Protein 컬럼으로부터의 TPO-활성 분획 F2)을 사용할 경우의 투여량 반응곡선(Dose Response Curve)을 도시한 것이다. 배양 세포를 현미경하에서 주기적으로 관찰하였을 때 거핵구의 생성 및 성숙 즉, 세포 크기의 증가가 거핵구 수의 증가와 함께 인식되었다. 특히, 의미있는 변화로서는 거핵구 형성이 배양의 마지막 날인 4일째에 발견된 점이다(그들은 3일째에는 거의 인식될 수 없었다). 그러한 형성 과정은 세포질 형성(레븐 및 이, Blood, vol.69, pp.1046-1052, 1987) 또는 프로플레이트릿(Proplatelet) 형성과정 (톱(Topp)등, Blood, vol.76, pp.912-924, 1990) 이라 하는데 이것은 성숙 거핵구로부터 더 분화된 혈소판 전구 물질 구조인 것으로 보이며 시험관내에서 관찰될 때 까지는 거핵구 분화의 최종 단계인 것으로 간주된다. 그러한 형태학적 변화는 TPO 샘플만을 사용하여 고 빈도로 관찰되었기 때문에 이 인자 단독으로 CFU-MK의 증식과 분화를 자극하여 성숙 거핵구를 생성할 수 있으며 최종적으로 혈소판을 방출할 수 있다.

(2) 콜로니 분석계

혈소판감소증 랫트의 혈장으로부터 부분적으로 정제된 TPO 샘플을 비분리 랫트 골수세포, 분리/농축단계 각각의 세포 또는 GpIIb/IIIa⁺CFU-MK 분획을 사용한 콜로니 분석계로써 검사했을 때 랫트-혈장 유도 TPO는 거핵구 콜로니의 형성을 자극했다. 랫트 IL-3, 마우스 GM-CSF 또는 인간 EPO와 같은 다른 시토킨에 의해 유도된 거핵구 콜로니들과 비교할 때 상기 TPO-유도 거핵구 콜로니들은 각 콜로니가 보다 소수의 거핵구로 이루어지지만 각 거핵구의 크기가 크면 성숙된 것을 의미하는 것을 특징으로 한다. 또한, TPO가 다른 세포계의 콜로니들을 생성하지 않거나 거의 생성하지 않기 때문에 TPO의 Meg-CSF 활성이 거핵구-특이적인 것으로 간주될 수 있다. 이러한 사실들을 기초로 랫트 IL-3, 마우스 GM-CSF 및 인간 EPO와 같은 다른 시토킨들과 다른 생물학적 특성을 가지며 독특한 Meg-CSF 활성을 나타낸다.

혈소판감소증 랫트의 혈장으로부터 부분적으로 정제된 TPO 샘플은 또한 인간골수 세포 또는 인간 제대 혈액 세포로부터 유도된 CD34⁺, DR⁺세포 분획상에서 Meg-CSF 활성을 나타냈고 많은 수의 인간 거핵구 콜로니를 유도하였는데, 이는 이 인자가 종 특이성이 없다는 것을 지시한다.

[실시예 4]

TPO 생성 세포의 특징화

(1) 랫트 TPO 생성 기관의 스크리닝

랫트 TPO 유전자의 클로닝에 사용하기 위한 mRNA 원을 확실히 하기 위해서 랫트 TPO 생성 기관의 스트리닝 및 특징화를 수행했다. 먼저, P55 항체 투여에 의해 혈소판감소증에 걸린 랫트로부터 골수, 폐, 간 및 비장을 주기적으로 절제하여 그들의 세포(폐 및 간의 경우에 기관 부위)를 배양한 후 배양 상청액에서의 활성을 랫트 CFU-MK 분석계로 검사했다. 그러나 이 초기 시도에서는 현저한 결과를 산출하지 못했다. 따라서, 랫트에서 간과 TPO 생성 사이의 관계를 나타낸 보고서(시에 멘스마 등, J. Lab, Clin. Med., vol.86, pp.817-833, 1975)를 고려하여 P55 항체투여에 의해 유도된 혈소판감소증 랫트의 간으로부터 콜라게나제 관류(Perfusion)에 의해 제조된 배양 간세포에 대하여 추가의 시험을 실시하였다. 그 배양 상청액을 WGA-아가로오스 컬럼에 부가하고 흡착된 분획을 Vydac 페닐 역상 컬럼상에서 분별하였을 때 랫트 CFU-MK 분석계 랫트 혈장-유도 TPO 활성과 같은 위치에서 매우 유사한 활성이 발견되었다. 정상 랫트 간세포의 배양 상청액에서도 약하지만 동일한 활성이 발견되었다. 이 결과들은 간이 TPO-생성 기관중 하나라는 것을 강하게 암시했다.

(2) 랫트 TPO-생성 세포주의 스크리닝

상기 결과를 기초로하여 랫트 TPO-생성 세포주의 스크리닝을 수행했다. 먼저, 20개의 랫트 간-유도 세포주 각각을 세포가 거의 합류 단계에 도달했을 때까지 각 계대 배양 액체 배지에서 배양하고 배양배지를 5% FCS가 보충된 동일한 각각의 배지와 교환한 다음 3일동안 계속하여 배양했다. 각각의 배양 상청액을 상기 단계(1)에서 설명된 과정에 따라 부분적으로 정제하여 TPO 생산이 되는지 검사했을 때 세 개의 랫트 간 실질적(Parenchymal) 세포-유도 세포주, 즉, McA-RH 8994 세포(ATCC 기탁번호 CRL 1602; 벡커등, “Oncodevelopmental Gene Expression”, 피쉬맨과 셀 편찬, Academic Press, NY, pp.259-270, 1976; 다이니뽕 파마슈티칼 컴패니 리미티드로부터 구입), H4-II-E 세포(ATCC 기탁번호 CRL 1548; 피톳(Pitot) 등, Nat. Cancer Inst. Monogr., vol. 13, pp.229-245, 1964; 다이니뽕 파마슈티칼 컴패니 리미티드로부터 구입) 및 HCT 세포(톰슨 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol.56, pp.296-303; 1966; 다이니뽕 파마슈티칼 컴패니 리미티드로부터 구입)에서 TPO 활성이 뚜렷하게 발견되었다.

(3) McA-RH 8994 세포, H4-II-E 세포 및 HTC 세포에서 TPO 활성의 상세한 분석

상기 3개 랫트 세포주로부터 분비된 TPO-활성 단백질의 생화학적 및 생물학적 특성을 상세히 검사하여 랫트 혈장-유도 TPO와 비교하였다.

McA-RH 8994 세포를 10% FCS 함유 알파-MEM(-) 액체 배양배지에 현탁시켜 175㎠ 플라스틱 조직 배양 플라스크에 1 ×10⁶세포/플라스크로 전달했다. 5% CO₂배양기중 37℃에서 3일 배양한 후 배지를 5% FCS 함유 IMDM 배양배지로 교환하여 추가로 3일동안 배양을 계속하여 배양 상청액을 회수했다. H4-II-E 세포는 10% FCS 함유 둘베코 변형 이글 액체 배양배지(글루코오스 4.5g/l, 이하 “DMEM”이라 함)에 현탁시켜 175㎠ 플라스틱 조직 배양 플라스크에 5 ×10⁵세포/플라스크로 전달했다. 5% CO₂배양기중 37℃에서 3일간 배양한 후 배지를 5% FCS 함유 IMDM 배양배지로 교환하여 추가로 3일동안 배양을 계속하여 배양 상청액을 회수했다. 또한 HTC 세포를 5% FCS 함유 DMEM 액체 배양배지에 현탁시켜 175㎠ 플라스틱 조직 배양 플라스크에 2.5 ×10⁵세포/플라스크로 전달했다. 5% CO₂배양기중 37℃에서 3일간 배양한 후 배지를 5% FCS 함유 IMDM 배양배지로 교환하여 추가로 3일동안 배양을 계속하여 배양 상청액을 회수했다.

3개의 세포주 각각으로부터 수득한 배양 상청액중 2리터 부분을 사용하여 실시예 1-2에 기재된 XRP로부터의 TPO 정제과정에 따라 세포주-유도 TPO의 부분적 정제를 수행했다. 결과의 개요를 하기에 설명했다.

먼저 한외여과 장치를 사용하여 각 배양 상청액을 약 6회 농축시키고 배지를 세파덱스 G-25 컬럼을 사용하여 20mM Tris-HCl 완충액(pH 8.0)으로 교환했다. 그 용출액을 Q-세파로오스 FF 컬럼에 부가하고 그 컬럼을 20mM Tris-HCl(pH 8.0)로 세척한 다음 175mM NaCl을 함유하는 20mM Tris-HCl(pH 8.0)을 사용하여 흡착된 분획을 용출시켰다. 용출된 분획을 WGA-아가로오스 컬럼에 부가하고 PBS로 그 컬럼을 세척한 다음 흡착된 분획을 0.2M GlcNAc 및 0.15M NaCl을 함유하는 20mM 인산나트륨(pH 7.2)을 사용하여 용출시켰다. 그 용출액을 TSK-겔 AF-BLUE 650MH 컬럼에 부가하고 흡착된 분획을 2M NaSCN을 사용하여 용출시켰다. 그 용출액을 페닐 세파로오스 6 FF/LS 컬럼에 부착하고 그 컬럼을 1.5M 황산암모늄 함유 50mM 인산나트륨(pH 7.2)으로 이어서 36mM 인산나트륨 함유 0.8mM 황산 암모늄으로 세척한 다음 흡착된 분획을 20mM 인산 나트륨(pH 7.2)으로 용출시켰다. 수득한 흡착 분획을 농축시킨 다음 역상 Vydac 단백질 C4 컬럼(더 세퍼레이션 그룹(The Separation Group)에 의해 제조된, 카탈로그 No. 214 TP51015; 직경 1cm 및 상 높이 15cm)을 이용하여 분별했다. 즉, 샘플을 20% B로 미리 평형화시킨 C4 컬럼에 부가하고 전개용매 A중의 0.1% TFA, 및 전개 용매 B중의 0.05% TFA를 함유하는 1-프로판올을 사용하여 20% B에서 40% B까지의 90분 선형구배로 1ml/분의 유량으로 용출시켰다. 그 결과 이 세포주들로부터 유도된 각 TPO-활성 단백질은 30-40%의 1-프로판올 농도에서 용출되었다. 각 정제 단계의 샘플에서의 TPO 활성을 랫트 CFU-MK 분석계로 측정했을 때 3개의 세포주의 TPO 활성이 XRP-TPO 활성과 유사한 패턴을 나타내는 결과를 보여주었다(실시예 1-2 참조). CFU-MK 분석계에 의해 측정된 각 정제 단계에서의 상대 활성, 활성 수율 등을 표 2에 도시하였다. 또한, 최종 역상 컬럼으로부터의 용출액의 TPO 활성을 랫트 CFU-MK 분석계로 측정했을 때 3개 세포주의 TPO 활성 및 XRP-유도 TPO는 같은 피크 지역에서 발견되었다. 랫트 GpIIb/IIIa⁺CFU-MK를 분리 및 농축하기 위하여 흡착 소모 단계에서 얻어진 비흡착세포를 사용하여 역상 컬럼으로부터의 TPO-활성 분획의 콜로니 분석을 실행했을 때, Meg-CSF 활성의 용출패턴은 랫트 CFU-MK 분석계에 의해 측정된 TPO-활성과 매우 유사했다(표 3 참조). 또한, 3개의 세포주의 TPO 활성 각각은 XRP-유도 TPO의 경우와 유사하게 다른 세포계의 콜로니를 형성하지 않거나 조금 형성했다.

역상 컬럼으로부터 모아진 활성 분획 각각을 실시예 1-2에 기술된 과정에 따라 SDS-PAGE 했다. 단백질을 그 겔로부터 추출하여 랫트 CFU-MK 분석계로 TPO 활성을 측정했을 때 XRP-유도 TPO, McA-RH 8994, 세포-유도 TPO 및 H4-II-E 세포-유도 TPO의 겉보기 분자량은 각각 17,000-22,000, 33,000-39,000 및 31,000-38,000인 것으로 발견되었으며, HTC 세포-유도 TPO는 17,000-22,000 및 28,000-35,000의 겉보기 분자량을 나타냈다.

따라서, McA-RH 8994 세포, H4-II-E 세포 및 HTC 세포에 의해 제조된 TPO 단백질은 그들의 생화학적 특성이 겉보기 분자량면에서 서로 약간 다름에도 불구하고 생물학적 특성면에서는 XRP-유도 TPO와 일치한다는 결과를 나타낸다. 본 발명에서의 현저한 발견은 혈액에 포함된 TPO-활성 단백질 분자가 그 생산세포에서 또는 생산세포로부터 분비된 후 특정 또는 불규칙한 부위에서의 부분적 분해 산물일 수 있는 가능성이 있다는 것이다. 또한 다양한 길이를 갖는 TPO 유전자(mRNA 및 cDNA)가 존재할 수 있음을 암시한다.

[표 2]

[표 3]

[실시예 5]

cDNA 라이브러리를 위한 발현 벡터(pEF18S)의 작제

cDNA 단편이 쉽게 통합될 수 있으며 클론된 cDNA의 고 발현 효율성을 나타낼 수 있는 벡터를 TPO cDNA의 클로닝 및 발현에 사용하기 위하여 작제했다. 즉, SR α 프로모터를 고발현 프로모터로 알려진 인장인자 1α(EF1 α) 프로모터로 대체하여 발현벡터 pEM18S로부터 발현벡터 pEF18S를 작제했다(제6도 참조). 1㎍의 발현 벡터 pEF-BOS(미즈시마 등, Nucleic Acids Res., vol.18, p.5322, 1990)를 제한 효소 HindIII 및 EcoRI로 부분적으로 분해시키고 그 분해물을 2% 아가로오스 겔(FMC Bio Products 제조) 전기영동하여 약 1200bp의 DNA 단편을 분리한 다음 Prep-A-Gene DNA 정제 키트(바이오-래드 레버러토리즈, 인코포레이티드 제조; 다공성 실리카 매트릭스-보조 DNA 흡착에 의해 실시되는 DNA의 선택적 정제에 사용하기 위한 키트로서 윌리스 등, Bio Techniques, vol.9, pp.92-99, 1990에 의해 보고된 과정을 기초로 개발되었다)를 사용하여 DNA 단편을 정제함으로써 인장 인자 1 α의 프로모터를 얻었다. 수득한 DNA 단편의 100ng 부분을 HindIII 및 EcoRI으로 미리 분해시킨, 50ng의 발현벡터 pME18S(리우 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol.90, pp.8957-8961, 1993)와 결찰시켰다. 시판중인 숙주 균주인 고 수용 대장균 DH5(도요보 컴패니 리미티드 제조; 힌나한 등의 J. Mol. Biol., vol.166, pp.557-580, 1983의 변형된 방법에 따라 제조된 수용 대장균 균주)의 세포들을 작제된 벡터로 형질전환시켰다. 형질전환 세포의 배양후 12 콜로니를 임의로 선택하여 각 콜로니로부터 플라스미드 DNA를 정제했다. 이 DNA 분자들의 제한 효소 분해 패턴을 분석함으로써 해당 플라스미드(pEF18S)를 함유하는 총 10 클론을 얻었다. 그 후, 그들로부터 선택된 클론을 배양하여 다량의 플라스미드 DNA를 제조했다.

기본적으로 Molecular cloning(샘브룩 등, 콜드 스프링 하버 래보라토리 프레스, 1989)에 기술된 과정에 따라 플라스미드 DNA를 정재했다. 즉, 상기에서 얻은 클론 pEF18S를 50㎕/mg의 암피실린 함유 50㎖ LB 배지 (1% 박토-트립톤 (Bacto-trypton, 0.5% 박토-효모 추출물, 0.5% NaCl)에서 철야로 37℃에서 배양하여 원심분리로 수집된 세포들을 4㎖의 TEG-라이소자임 용액(25mM Tris-HCl, pH8, 10mM EDTA, 50mM 글루코오스, 0.5% 라이소자임)에 현탁시켰다. 이것에 8㎖의 0.2N NaOH/1% SDS 용액 및 6㎖의 3M 칼륨/5M 아세테이트 용액을 첨가하여 세포를 완전히 현탁시켰다. 현탁액의 원심분리후 그 상청액을 페놀/클로로포름(1:1)으로 처리하고 같은 양의 이소프로판올과 혼합한 다음 원심분리했다. 그 펠릿을 TE 용액(10mM Tris-HCl, pH 7.5, 1mM EDTA)에 용해시켜 RNase 및 페놀/클로로포름(1:1)으로 처리한 후 에탄올 침전시켰다. 생성한 펠릿을 다시 TE 용액에 용해시킨 다음 NaCl와 폴리에틸렌글리콜 3000을 각각 0.63M과 7.5%의 최종 농도로 첨가하였다. 원심분리후, 펠렛을 TE 용액에 용해시키고 에탄올로 침전시켰다. 이 방법으로 약 300㎍의 플라스미드 DNA를 얻었다. 그 DNA중 100㎍ 부분을 제한효소 EcoRI 및 NotI으로 완전히 분해시키고 0.8% 아가로오스 겔(FMC Bio Products 제조) 전기 영동시킨다음 회수된 벡터 단편을 Prep-A-Gene DNA 정제 키트(바이오-래드 래보라토리즈, 인코포레이티드 제조)를 사용하여 정제시켜 플라스미드 DNA 약 55㎍을 얻고 이를 이어지는 cDNA 라이브러리 작제에 사용하였다.

[실시예 6]

McA-RH 8994 세포로 부터의 mRNA의 정제

실시예 4의 콜로니 분석에서 상대적으로 고활성을 나타낸 McA-RH 8994를 랫트 TPO cDNA 클로닝에 사용하기 위한 물질로 선택하여 하기 실험을 하였다.

기본적으로 Molecular Cloning(샘브룩 등, 콜드 스프링 하버 래보라토리 프레스, 1989)에 기술된 과정에 따라 총 RNA의 분리를 수행했다. 즉, McA-RH 8994 세포를 직경 90mm의 15개의 배양 접시에서 집합체로 생장시켰다. 액체 배지의 제거후에 각 접시에 있는 세포들을 0.8ml의 5M 구아니딘 용액(5M 구아니딘 티오시아네이트, 5mM 시트르산 나트륨(pH 7.0), 0.1M β-메르캅토에탄올, 0.5% 사르코실황산나트륨)에 완전히 현탁시키고 모든 접시에 있는 현탁물을 단일 관에 수집한 다음 총 부피를 구아니딘 용액으로 20ml로 조정했다. 세포분열로 인하여 점성으로 되는 상기 혼합물을 혼합물이 거의 비점성으로 될 때까지 18G 바늘, 이어서 21G 바늘이 구비된 20ml 주사기로 약 20번 반복 흡입/방출하였다. 벡크만(Beckman) SW28 로터에 사용하기 위한 폴리알로먼(Polyallomer) 원심분리관의 쿠션으로서 5.7M CsCl-0.1M EDTA(pH 7.5)의 18ml 부분을 사용하여 약 20ml의 상기 혼합물을 층들이 방해받지 않으며 관이 거의 채워지는 방법으로 쿠션위에 부드럽게 층지게 하였다. 제조된 관을 20℃에서 25,000rpm으로 20시간 동안 원심분리하였다. 상기 펠릿을 소량의 80% 에탄올로 두 번 세척하고 TE 용액에 용해시켜 페놀/클로로포름(1:1)으로 추출한 다음 1/10 부피의 3M 아세트산 나트륨 및 2.5 부피의 에탄올로 에탄올 침전 시켰다. 이 방법으로 약 2.5mg의 총 RNA를 약 10⁸세포로부터 얻었다.

Oligotex^TM-dT30(수퍼)(저팬 신세틱 러버/니폰 로슈(Japan Synthetic Rubber/Nippon Roche) 제조; 올리고 dT 분자는 라텍스 입자상에 공유결합하여 고정되며 폴리(A)⁺RNA의 정제는 일반적으로 그러한 목적에 사용되는 올리고 dT 컬럼을 사용하는 것과 유사하게 달성된다)을 사용하여 총 RNA로부터 폴리(A)⁺RNA의 정제가 수행된다. 그 결과, 약 500㎍의 총 RNA로부터 20㎍의 폴리(A)⁺RNA를 얻었다.

[실시예 7]

랫트 cDNA 라이브러리의 작제

5′-말단에 EcoRI 인식부위 및 3′-말단에 NotI 인식부위를 갖는 이중 가닥 cDNA는 Time Saver^TMcDNA 합성 키트(파마시아 제조; 오카야마 및 베르그, Mol. Cell. Biol., vol.2, pp.161-170, 1982의 변형된 방법에 기초한 cDNA 합성 키트) 및 DIRECTIONAL CLONING TOOLBOX(파마시아 제조; cDNA 합성에 사용하기 위한 NotI 인식서열을 함유하는 하나의 프라이머 5′-AACTGGAAGAATTC GCGGCCGCAGGAACT(T)₁₈-3′ (서열 15) 및 EcoRI 인식서열의 추가에 사용하기 위한 어댑터 5′-AATTCGGCACGAG-3′ (서열 16) 및 5′-CTCGTGCCG-3′ (서열 17)을 함유하는 세트)를 사용하여 실시예 6에서 얻은 5㎍의 폴리(A)⁺RNA로부터 합성했다. 합성된 cDNA를 EcoRI 및 NotI으로 미리 분해시킨 1.2㎍의 발현벡터 pEF18S(실시예 5 참조)와 결찰시키고 8.4㎖의 상기 고 수용 대장균 DH5(도요보 컴패니 리미티드 제조)으로 형질전환시켰다. 그결과 5.3 ×10⁵의 형질전환체를 얻었다.

[실시예 8]

PCR에 의한 랫트 cDNA 단편의 제조(클로닝)

실시예 7에서 작제된 McA-RH 8994 cDNA 라이브러리의 530,000클론을 50㎍의 암피실린 함유 50㎖ LB 배지에서 밤새 배양시키고 QIAGEN-tip100 (DIAGEN 제조; DNA 정제용 음이온 교환 실리카 컬럼)를 사용하여 원심분리에 의해 수집된 세포로부터 McA-RH 8994 cDNA 라이브러리 플라스미드를 정제했다. 약 200㎍의 플라스미드 DNA를 얻었다.

실시예 2에 기술된 펩타이드 단편 AP8의 아미노산 서열과 상응하는 두 안티-센스(anti-sense) 뉴클레오타이드 프라이머 AP8-1R 및 AP8-2R, 및 cDNA의 제조에 사용된 플라스미드 벡터 pEF18S(제6도 참조)의 인간 신장인자 1α의 제 1 인트론과 상응하는 두 센스 뉴클레오타이드 프라이머 EF1 α-1 및 EF1 α-2를 합성했다. 394 DNA/RNA 합성기(어플라이드 바이오시스템스 제조; β-시아노에틸아미디트법에 기초한 합성기)를 사용하여 이들 프라이머를 합성하고 합성 DNA 정제용 OPC 컬럼(어플라이드 바이오시스텝스 제조; 트리틸기를 갖는 합성 DNA의 정제에 사용하기 위한 역상 실리카 겔 컬럼)을 사용하여 정제했다. 합성되어 정제된 DNA 분자들을 각각 TE 용액에 50μM의 최종 농도로 용해시켜 사용할때까지 -20℃에 저장했다. 하기 과정에 사용된 합성 올리고뉴클레오타이드는 같은 방법으로 합성 및 정제했다.

프라이머 AP8-1R 및 AP8-2R을 다까하시 등에 의해 보고된 (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol.82, pp.1931-1935, 1985)바와 같이 데옥시이노신이 도입된, 17 연속 뉴클레오타이드로 이루어진 프라이머들과 혼합했다.

각각 21 및 20 뉴클레오타이드로 이루어진 프라이머 EF1 α-1 및 EF1 α-2를 우에쓰끼 등에 의해 보고된(J. Biol. Chem., vol.264, pp.5791-5798, 1989) 게놈 서열의 위치 1491-1512 및 1513-1532의 뉴클레오타이드 서열에 기초하여 합성했다.

3㎍의 McA-RH 8994 cDNA 라이브러리 플라스미드를 주형으로 AP8-1R (500 pmol) 및 EF1 α-1 (100 pmol)를 프라이머로, 및 AmpliTaq^TMDNA 폴리머라제를 갖는 GeneAmp^TMPCR 시약 키트(다까라 스조 컴패니 리미티드; PCR에 사용하기 위한 한 셋트의 열안정 TaqI 폴리머라제, 반응 완충액 및 dNTP)를 사용하여 GeneAmp^TMPCR 시스템 9600(퍼킨-엘머 제조; PCR용 열 사이커(cycker)(100㎕ 부피; 95℃에서 2분동안 가열, 95℃에서 1분간 변성, 40℃에서 1분동안 어닐링하고 72℃에서 1분동안 합성시키며 또 72℃에서 7분간 최종 배양하는 것으로 이루어진 각 사이클을 총 35 사이클 반복)에 의해 PCR을 수행했다. 증폭된 DNA 단편의 특이성을 개선하기 위하여 상기 수득한 PCR 반응용액 1㎍을 주형으로하고 EF1 α-2(100 pmol) 및 AP8-2R(500 pmol)을 프라이머로 사용하여 추가의 PCR을 수행했다(100㎕ 부피; 95℃에서 2분동안 가열, 각 사이클이 95℃에서 1분동안 변성시키고 45℃에서 1분간 어닐링한 다음 72℃에서 1분동안 합성하는 것으로서 총 35 사이클 및 72℃에서 7분동안 최종 배양).

이렇게 수득한 반응용액을 2% 아가로오스 겔(FMC BioProducts 제조) 전기영동시켜 상기 Prep-A-Gene DNA 정제 키트(바이오-래드 래보라토리즈, 인코포레이티드 제조)를 사용하여 정제된 PCR의 주 생성물로서 약 330bp의 DNA 단편을 분리했다. 상기 정제된 DNA 단편을 T4 DNA 리가아제(라이프 테크놀로지스 제조)를 사용하여 PCR^TMII 벡터(인비트로겐 제조, PCR 생성물의 TA 클로닝용 벡터)로 서브클로닝 시켰다. PCR에 사용되는 열안정 폴리머라제가 말단 트랜스퍼라제 활성을 갖기 때문에 상기 증폭된 DNA 단편을 하나의 데옥시아데닐산을 PCR-증폭 DNA의 3′-말단에 첨가하기 위한 효소의 특성을 사용하여 5′-dT 점착 말단을 갖는 PCR^TMII 벡터로 직접적으로 서브클로닝시켰다. QIAGEN-tip 100(DIAGEZ 제조)을 사용하여 생성된 클론들로부터 임의로 선택된 28개 클론으로부터 플라스미드 DNA 분자를 정제하고 그들의 뉴클레오타이드 서열을 Taq Dye Deoxy^TM터미네이터 사이클 서열결정 키트(어플라이드 바이오시스템스 제조; 생거 등, Proc, Natl. Acad. Sci. USA, vol.74, pp.5463-5467, 1977의 디데옥시법에 기초한, 형광색소를 사용하는 PCR-보조 뉴클레오타이드 서열 측정에 사용하기 위한 키트)를 사용하여 373A DNA 서열결정기(어플라이드 바이오시스템스 제조, 형광 서열 결정기)로 측정했다.

AP8-2R 프라이머에 인접한, 상기에 도시한 AP8의 아미노산 서열의 세 아미노산 잔기(IIe/Thr/Ser)-Val-Pro-를 코딩하는 DNA 단편을 상기 수득한 DNA 단편으로부터 선택하여 그 전체 길이를 서열화했을 때 261bp의 cDNA를 함유했다. 이 cDNA 단편의 위치 173-175는 메티오닌을 코딩했으며 이 코딩 프레임은 AP8의 아미노산 프레임과 일치했다. DNA 단편의 위치 173-175를 삽입한 서열은 코작(kozak)의 서열(코작, 엠, Cell, vol. 44, pp.238-292, 1986)과 일치했기 때문에 이 cDNA 단편이 랫트 TPO 단백질의 N-말단을 코딩하는, 번역 개시 영역을 함유하는 것으로 보인다. 이 cDNA 단편을 A1이라 명명했다. 벡터서열을 제외한 A1 단편의 뉴클레오타이드 서열 및 그것으로부터 추론된 아미노산 서열을 본 명세서에 첨부된 서열 목록 (서열 1)에 도시하였다.

[실시예 9]

PCR에 의한 랫트 cDNA 클론의 스크리닝

상기 cDNA 라이브러리를 약 10,000클론의 푸울로 나누고 50㎍/㎖의 암피실린을 함유하는 1㎖의 상기 LB 배지에서 밤새 배양한 후 자동 플라스미드 분리 장치 PI-100(구라보 인더스트리즈, 리미티드에 의해 제조된 VER-3.0; Molecular Cloning, 샘브룩 등, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989에 기술된 알칼리 SDS법의 변형된 방법에 기초한 자동 플라스미드 DNA 추출장치)을 사용하여 플라스 미드 DNA 추출을 행하였다. 이것과 별도로 하기의 두 올리고뉴클레오타이드를 cDNA 단편 A1에 기초하여 합성하고 정제했다.

(서열 1의 서열 위치 1-17의 센스 서열; CGAG는 어댑터 서열을 나타낸다)

(서열 1의 서열 위치 212-232의 안티-센스 서열)

상기에서 수득한 1/30 부피의 각 플라스미드 DNA 샘플을 주형으로 사용하고 상기 합성된 올리고뉴클레오타이드를 프라이머로 또 AmpliTaq^TMDNA 폴리머라제를 갖는 GeneAmp^TMPCR 시약 키트(다까라 스조 컴패니 리미티드 제조)를 사용한 GeneAmp^TMPCR 시스템 9600(퍼킨-엘머 제조) (각 사이클이 94℃에서 30초동안 변성시키고 66℃에서 30초간 어닐링한 다음 72℃에서 1분동안 합성하는 것으로 이루어지는, 총 30사이클)을 사용하여 PCR을 수행했다. 그 결과, 검사된 100개 푸울중 3푸울에서 236bp의 특이적 밴드가 검출되었다. 이 세 푸울중 하나를 약 900개 클론의 서브푸울로 나누어 동일한 방법으로 PCR을 수행했을 때 시험된 100개 서브-푸울중 3 푸울에서 특이 밴드가 검출되었다. 이 서브푸울중 하나를 40개클론의 푸울들로 나누어 동일한 스크리닝 과정을 수행했을 때 시험된 100개 푸울중 3개 푸울에서 특이 밴드가 발견되었다. 이 후보 푸울중 하나를 50㎍/㎖의 암피실린이 보충된 LB 플레이트(15% 한천을 함유하는 LB 배지)상에서 배양하여 각각의 형성된 콜로니들은 같은 방법으로 플라스미드 DNA 추출 및 PCR을 행하였다. 그 결과, 시험된 100개 클론중 2개 클론에서 양성밴드가 검출되었다.

[실시예 10]

랫트 TPO cDNA의 서열결정

기본적으로 Molecular Cloning(샘브룩 등, 콜드 스프링 하버 래보라토리 프레스, 1989)에 기술된 과정에 따라 플라스미드 DNA 정제를 수행하였다. 실시예 9에서 얻은 두 클론 각각을 50㎍/㎖의 암피실린을 함유하는 50㎖의 LB 배지에서 밤새 배양하여 실시예 6에 기술된 것과 동일한 방법으로 정제후에 약 300㎍의 플라스미드 DNA를 얻었다.

수득한 플라스미드 DNA Taq Dye Deoxy^TM터미네이터 사이클 서열결정키트(어플라이드 바이오시스템스 제조)를 사용하여 실시예 8에서 기술된 것과 동일한 방법으로 서열결정화하여 A1 단편을 함유하는 완전 뉴클레오타이드 서열을 측정하였다. 그 결과, 두 클론의 뉴클레오타이드 서열이 서로 완전히 일치하여 그들이 동일한 클론임을 보여주었다. 이 클론들 중 하나를 선택하여 이 클론에 의해 운반된 플라스미드를 pEF18S-A2 α로 명명했다. 그것의 뉴클레오타이드 서열 및 그것으로부터 추론된 아미노산 서열을 서열 목록(서열 2)에 도시하였다.

서열목록(서열 2)에 도시된 서열은 독특한 특성을 갖는다. 172bp 5′ 비-번역 부위의 서열 하류는 메틴오닌으로 출발하는 21개 아미노산으로 이루어진 단백질 분비 시그널 서열로 추측되는 소수성 아미노산이 풍부한 아미노산 서열을 코딩한다. 이 단백질은 126 아미노산 잔기 및 종지 코돈(TAA)에 이은 폴리 A 꼬리와 1025 뉴클레오타이드의 3′ 비-번역 서열을 함유한다. 이 단백질은 실시예 2에서 분석된 아미노산 서열 AP8(서열 2중의 아미노산 번호 1-12)와 상응하는 서열을 함유하지만 N-글리코실화를 위한 콘센서스 서열을 함유하지 않는다. 3′ 비-번역 서열의 말단에 가깝게 위치된 1624-1629 뉴클레오타이드 서열은 콘센서스 서열과 다르지만 잠재적인 폴리아데닐화 서열인 것으로 보인다.

대장균 균주 DH5에 포함된 벡터 pEF18S-A2 α는 내셔날 인스티튜트 오브 바이오사이언스 앤드 휴먼 테크놀로지, 에이전시 오브 인더스트리얼 사이언스 앤드 테크놀로지, 미니스트리 오브 인터내셔날 트레이드 앤드 인더스트리, 일본(National Institute of Bioscience and Human Technology, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry, Japan)에 기탁번호 FERM BP-4565로 1994. 2. 14일에 본 발명자들에 의해 기탁되었다.

[실시예 11]

COS1 세포에서 랫트 TPO cDNA의 발현 및 TPO 활성의 확인

클로로킨(Chloroquine) 처리를 포함하는 DEAE-덱스트란법(숌페이락 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol.78, pp.7575-7578, 1981; 루드만 등, Nucl. Acids Res., Vol. 11, pp.1295-1308, 1983)을 약간 변형시킴으로써 하기 방법으로 플라스미드 pEF18S-A2 α를 COS1 세포로 형질감염시켰다. COS1 세포 (ATCC CRL1650)를 10% FCS 함유의 상기 DMEM 배지에 현탁시키고 100mm 플라스틱 조직 배양 접시에 넣은 다음 세포가 약 40% 성장 단계에 도달할때까지 5% CO₂배양기중 37℃에서 배양시켰다. 별도로, 30㎕의 HBS(21mN HEPES, 145mM NaCl, pH 7.1)에 용해된 플라스미드 pEF18S-A2 α(10㎍)를 500㎍/㎖의 DEAE-덱스트란(파마시아 제조), 80μM의 클로로킨(시그마 케미칼 컴패니 제조), 8%(v/v)의 HBS 및 9%(v/v)의 Nu-Serum(콜라보레이티브 리서치, 인코포레이티드 제조)가 보충된 4㎖의 DMEM 배양배지에 첨가했다. 제조된 혼합물을 DMEM 배양배지로 두 번 세척한, 상기에서 배양된 COS1 세포에 첨가하고 5% CO₂배양기중 37℃에서 5시간동안 배양을 계속했다. 그 후, 접시에 있는 배양 상청액을 흡입하여 제거하고 접시에 있는 잔여 세포를 10% FCS 함유의 15㎖ DMEM 배양배지가 보충된, DMEM 배양배지로 두 번 세척한 다음 5% CO₂배양기중 37℃에서 3-5일동안 배양하여 그 배양 상청액을 회수했다.

얻어진 배양 상청액은 IMDM 배양배지에 대하여 광범위하게 투석하고 랫트 CFU-MK 분석계로 평가했다. 플라스미드 pEF18S-A2 α가 발현된 COS1 세포의 배양 상청액에서는 투여량-의존 형태로 TPO 활성이 발견되었다(제7도). XRP-유도 TPO의 경우와 유사하게 많은 거핵구가 4일 배양시에 신장 세포질 돌기를 형성했다. 반대로, 플라스미드 pEF18S만 형질감염된 COS1 세포의 배양 상청액에서는 TPO 활성이 발견되지 않았다(제7도). M-07e 분석계에서는 플라스미드 pEF18S-A2 α가 발현된 COS1 세포의 배양 상청액에서 M-07e 세포 증식 강화 활성이 투여량 의존 형태로 발견되었지만 플라스미드 pEF18S만 발견된 COS1 세포의 배양 상청액에서는 발견되지 않았다. 이 결과는 A2 α가 TPO 활성을 갖는 단백질을 코딩하는 cDNA를 함유하는 것임을 입증하였다.

다음에, 생체내에서 혈소판 생산을 촉진하는 상기 TPO 활성 능력을 조사하기 위하여 부분적으로 정제된 TPO 샘플을 제조하였다. 먼저 플라스미드 pEF18S-A2 α로 형질감염된 COS1 세포를 0.2mg의 BSA가 보충된 무혈청 배양배지에서 3일동안 배양하여 약 5.8리터의 무혈청 배양 상청액을 얻었다. 프로테아제 억제제 p-APMSF를 1mM의 최종 농도로 상기 무혈청 배양 상청액에 첨가하고 그 혼합물을 0.22㎛ 필터를 사용하여 여과했다. 5793㎖의 여액(단백질 농도, 0.229mg/㎖; 총 단백질 1,326mg; 상대 활성, 1,000; 총 활성, 1,326,000)에 1000㎖용 NaCl 0.85몰(총 288g)을 첨가하여 0.822M NaCl를 함유하는 용액 5849㎖를 얻었다. 이렇게하여 제조된 용액을 1M NaCl을 함유하는 20mM 인산나트륨 (pH 7.2)으로 미리 평형화시킨 TSK-겔 AF-BLUE 650MH 컬럼(토소 코포레이숀 제조, 카탈로그 No. 08705; 직경 5cm 및 상높이 6cm)에 7㎖/분의 유량으로 부가하였다. 샘플 부가 완료후 1M NaCl을 함유하는 20mM 인산 나트륨 (pH 7.2)으로 용출시켰을 때 약 7900㎖의 용출액이 컬럼을 통과하였다. 이 용출액을 모아서 한외여과 유니트(Omega Ultrasette, 겉보기 분자량 컷 오프 8,000; 필트론 제조)를 사용하여 농축시킴으로써 통과 분획 F1(460m; 단백질 농도, 2.1 mg/ml; 총 단백질, 973mg; 상대 활성, 16.3)을 얻었다. 다음에 용출용액을 2M NaSCN으로 바꾸고 YM3 막을 갖는 한외여과 유니트(직경 76mm, 아미콘 코포레이숀 제조)를 사용하여 용출된 TSK-겔 AF-BLUE 650MH-흡착 TPO 활성 분획 F2(2840ml)를 6.81㎖로 농축시켰다. 이 TPO-활성 분획 F2중의 총 단백질은 12.5mg이었고 이 단계에서 F2의 단백질 수율은 0.62%였다. TPO의 상대 활성은 240인 것으로 평가되었다. 다음에 F2를 HiLoad 26/60 수퍼덱스 200pg(파마시아 바이오테크제조, 카탈로그 No. 17-1071-01; 직경 2.6cm; 상 높이 60cm)에 부가하고 50mM NaCl을 함유하는 20mM 아세트산 나트륨(pH 5.5)으로 1㎖/분의 유량으로 전개하였다. 전개 개시후 TPO-활성은 부가후 94-260㎖ 범위의 용출액에서 발견되었다. 이 용출액을 모아서 수퍼덱스 200pg TPO-활성 분획 F2(66㎖; 단백질 농도, 0.112mg/㎖; 총 단백질 7.41mg; 상대 활성, 142,860; 총 활성, 1,058,600)를 얻었다. 다음에 완충액 A(20mM 아세트산 나트륨(pH 5.5) 완충액 B(500 mM NaCl을 함유하는 20mM 인산나트륨(pH 7.2)을 제조하여 100% A로 미리 평형화시킨 강력한 양이온 교환 컬럼 RESOURCE S(파마시아 바이오테크 제조, 카탈로그 No. 17-1178-01; 직경 0.64cm; 상 높이 3cm)에 1㎖/분의 유량으로 용출시켰다. 그 후 100%A에서 100%B까지 40분의 선형구배로 0.3㎖/분의 유량으로 용출시켰다. 분석했을 때 넓은 범위의 용출액 (5%B-32%B)에서 TPO 활성이 검출되었다. TPO-활성 용출액을 모아서 M3막을 갖는 한외여과 유니트(직경 25mm, 아미콘 코포레이숀 제조)를 사용하여 농축시킴으로써 RESOURCE S TPO-활성 분획 F2(1.65㎖; 단백질 농도, 4.74mg/㎖; 총 단백질, 7.82 mg; 상대 활성, 71,400; 총 활성, 558,600)를 얻었다.

투여전 날 혈소판 수가 측정된 ICR 수컷 마우스(생후 9주)에 부분적으로 정제된 TPO 샘플을 연속적으로 5일동안 (474㎍(100㎕)마우스/일) 피하주사로 투여하였다. 대조군으로서 BSA(200㎍(100㎕)마우스/일) 또는 부분적으로 정제된 TPO의 용매로서 사용된 완충액(100㎍(100㎕)마우스/일)을 동일한 방법으로 투여했다. 최종 투여한 다음날 각 마우스의 심장으로부터 혈액을 수집하여 혈구계(F800, 토아리오 덴시 제조)를 사용하여 혈소판 수를 측정했다. 부분적으로 정제된 TPO-투여 마우스의 혈소판 수는 BSA-투여 마우스의 혈소판 수보다 약 1.74배 그리고 완충액-투여 마우스에서보다 약 1.90배 더 높았다. 이러한 결과들은 TPO가 생체내에서 혈소판 생산을 촉진한다는 것을 입증했다. 또한, 마우스 급성 상 단백질로서 알려진 면역 억제성 산성 단백질(IAP)의 양은 부분적으로 정제된 TPO-투여 마우스에서 상승되지 않았기 때문에 TPO가 급성상 단백질의 유도와 관련하여 IL-6 및 IL-11과 다르다는 것을 강하게 암시했다.

[실시예 12]

랫트 조직에서 TPO mRNA의 검출

랫트 생체에 랫트 TPO mRNA 발현 조직을 위치시키기 위하여 다양한 랫트 조직으로부터 RNA를 추출했다. 총 6마리의 랫트에게 실시예 1에 기술된 것과 동일한 방법으로 X-선 조사하여 다양한 조직(뇌, 흉선, 폐, 간, 심장, 비장, 소장, 신장, 고환 및 골수세포)을 X-선 조사후 11-14일째 날에 랫트로부터 절제하여 즉시 액체 질소에 냉동시켰다. RNA 분리 시약 ISOGEN(와코 퓨터 케미칼 인더스트리즈, 리미티드 제조)을 사용하여 전체 RNA를 추출했다. 사용되는 ISOGEN의 양은 각 냉동조직 샘플의 중량에 따라 결정되고, 시약 첨가된 조직샘플을 조직의 완전한 분해가 달성될때까지 (10,000rpm으로 약 45-60초) 균질기(Physcotron^RNS-60, NITI-ON Medical & Physical Instruments MFG, CO., LTD. 제조)로 처리했다. 촘친스키 등의 산 구아니딘 페놀 클로로포름법(Anal. Biochem, vol. 162, pp.156-159, 1987)에 기초한 과정을 이용하여 그 조직 균질물을 전체 RNA 추출처리시켰다. 그 결과, 각 조직으로부터 1.1 내지 5.6mg의 전체 RNA를 수득하였다.

Oligotex^TM-dT30(Super)(저팬 신세틱 러버/니폰 로슈 제조)을 사용하여 20㎍의 폴리(A)⁺RNA를 약 500㎍의 전체 RNA로부터 정제했다.

랜덤 프라이머를 사용하여, 각 조직으로부터 얻어진 1㎍의 폴리(A)⁺RNA로부터 cDNA의 제 1 가닥을 합성했다. 즉, 1㎍의 폴리(A)⁺RNA를 10㎕의 멸균수에 용해시키고 70℃에서 15분동안 배양한 다음 급냉시켰다. 이것에 75pmoles의 랜덤 프라이머 (다까라 스조 컴패니, 리미티드 제조), 10U의 RNase 억제제(베링거-만하임 코포레이숀 제조), 50mM의 Tris-HCl(pH 8.3), 75mM의 KCl, 3mM의 MgCl₂및 200U의 Supper Script^TMII(라이프 테크놀로지에 의해 제조된 역전사효소)를 첨가했다. 제조된 용액(전체 부피 20㎕)을 37℃에서 1시간 동안 배양하고 그 반응 용액을 70℃에서 10분동안 배양하여 효소를 불활성화시킨 다음 사용할때까지 -20℃에서 저장했다.

실시예 10에서 얻은 랫트 TPO cDNA 서열에 기초하여 신규 PCR용 프라이머를 합성했다. 합성된 프라이머의 서열은 하기와 같다.

(서열 2에서 위치 347-367)

(서열 2에서 위치 1005-1025에 해당하는 안티-센스 프라이머)

합성된 cDNA 용액 각각의 1/10 부피를 주형으로하고 rTPO-I와 rTPO-N의 각각 1μM를 프라이머로하여 또 AmpliTaq^TMcDNA 폴리머라제를 갖는 GeneAmp^TMPCR 시약키트(다까라 스조 컴패니 리미티드 제조)를 사용하고, GeneAmp^TMPCR 시스템 9600(퍼킨-엘머 제조)를 이용하여 95℃에서 2분간 가열하고, 각 사이클이 95℃에서 1분간 변성시키고, 57℃에서 1분동안 어닐링한 다음 72℃에서 1분동안 합성한 다음 72℃에서 7분간 최종 배양하는 것으로 이루어진 총 30 사이클로 100㎕ 부피로 PCR을 수행했다. 얻어진 반응용액 각각을 2% 아가로오스 겔(FMC BioProducts 제조)을 사용하여 전기영동시켜 증폭된 밴드를 검사했을 때 TPO mRNA에 특이적인 것으로 보이는 밴드가 뇌, 간, 소장 및 신장으로부터의 겔상에서 발견되었다. 발현량은 판단할 수 없음에도 불구하고 이 결과는 랫트에서 TPO mRNA의 발현이 이들 기관의 조직에서 발생한다는 것을 나타낸다. 인간 신체에서 유사한 발현형태의 존재 가능성 및 실시예 4에서의 결과를 함께 고려했을 때 간이 인간 TPO cDNA의 획득을 위한 적절한 출발물질인 것으로 보인다.

[실시예 13]

인간 정상 간-유도 cDNA 라이브러리 작제

실시예 12의 결과에 기초하여 인간 TPO cDNA의 클로닝에 사용하기 위한 출발 물질로서 간을 선택했다. 실시예 6에 기술된 것과 동일한 방법으로 5′-말단상에 EcoRI 인식 부위 및 3′-말단상에 NotI 인식부위를 갖는 이중가닥 cDNA를 Saver^TMcDNA 합성 키트(파마시아 제조) 및 DIRECTIONAL CLONING TOOLBOX(파마시아 제조)를 사용하여 5㎍의 시판중인 정상 인간의 간-유도 폴리(A)⁺RNA(클론테크 제조 : 촘친스키 등의 산 구아니딘 페놀 클로로포름법에 기초하여 추출된 생성물)로부터 합성했다. 합성된 cDNA을 EcoRI과 NotI으로 미리 분해시킨 1.2㎍의 상술한 발현 벡터 pEF18S에 결찰시킨 다음 8.4ml의 상기 고 수용 대장균 DH5(도요보 컴패니 리미티드 제조)로 형질전환시켰다. 그 결과 1.2 ×10⁶의 형질전환체를 얻었다.

[실시예 14]

PCR에 의한 인간 TPO cDNA 단편의 제조(클로닝)

랜덤 프라이머를 사용하여 1㎍의 시판중인 정상 인간의 간-유도 폴리(A)⁺RNA(클론테크 제조)로부터 cDNA의 제 1 가닥을 합성했다. 즉, 1㎍의 폴리(A)⁺RNA를 10㎕의 멸균수에 용해시키고 70℃에서 15분동안 배양한 다음 빠르게 냉각시켰다. 이것에 75pmoles의 랜덤 프라이머(다까라 스조 컴패니 리미티드 제조), 10U의 RNase 억제제 (베링거-만하임 코포레이숀 제조), 50mM의 Tris-HC1(pH 8.3), 75mM의 KC1, 3mM의 MgCl₂및 200U의 역전사효소 Super Script^TMII(라이프 테크놀로지즈 제조)를 첨가했다. 제조된 용액(총 부피, 20㎕)를 37℃에서 1시간 동안 배양한 다음 생성한 반응용액을 70℃에서 10분동안 배양하여 효소를 불활성화시킨 후 사용할 때까지 -20℃에서 저장했다.

PCR용 프라이머를 랫트 TPO cDNA 서열 (서열 2)에 기초하여 합성했다. 합성된 프라이머의 서열은 다음과 같다.

(서열 2에서의 위치 173-193)

(서열 2에서의 위치 1005-1025에 상응하는 안티-센스 프라이머)

합성된 cDNA 용액 각각 1/10 부피를 주형으로 하고 rTPO-AIN과 rTPO-N의 각각 1μM 및 AmpliTaq^TMDNA 폴리머라제를 갖는 GeneAmp^TMPCR 시약 키트(다까라 스조 컴패니 리미티드 제조)를 사용하고 GeneAmp^TMPCR 시스템 9600 (퍼킨-엘머 제조)을 이용하여 95℃에서 2분간 배양하고, 각 사이클이 95℃에서 1분동안 변성시키고, 57℃에서 1분동안 어닐링한 다음 72℃에서 1분동안 합성하고 72℃에서 7분간 최종 배양하는 것으로 이루어진 총 35 사이클을 반복하여 100㎕ 부피로 PCR을 수행했다.

얻어진 반응용액 각각을 2% 아가로오스 겔(FMC BioProducts 제조)을 사용하여 전기영동시켜 약 620 bp의 DNA 단편을 PCR의 주 생성물로 단리하였고, 이는 상술한 Prep-A-Gene DNA 정제 키트(바이오-래드 래보라토리즈, 인코포레이티드 제조)를 사용하여 정제하였다. 정제된 DNA 단편의 뉴클레오타이드 서열은 상기 Taq Dey Deoxy^TM터미네이터 사이클 서열결정 키트(어플라이드 바이오시스템스 제조)를 사용하여 373A DNA 서열결정기(어플라이드 바이오시스템스 제조)로 측정했다. 프라이머 잔기를 제외한 결정된 뉴클레오타이드 서열과 그들로부터 추정된 아미노산 서열은 서열목록(서열 3)에 도시되었다.

프라이머 서열을 제외한 이 DNA 단편은 580bp의 길이를 갖는다. 비교하였을 때 인간 cDNA은 랫트 cDNA 뉴클레오타이드 서열과 86%의 상동성을 나타냈는데 이것은 이 DNA 단편이 인간 TPO cDNA의 일부를 코딩함을 의미한다.

[실시예 15]

PCR에 의해 인간 TPO cDNA 클론의 스크리닝

서열 3에 기초하여 인간 TPO-상당 프라이머를 합성했다. 합성된 프라이머의 서열은 하기와 같다.

(서열 3에서의 위치 60-80)

(서열 3에서의 위치 479-499에 해당되는 안티-센스 프라이머)

실시예 13에서 작제한 인간 cDNA 라이브러리를 증폭시키고 여러 푸울들 (각 푸울은 약 100,000 클론을 함유한다)로 나누어 50㎍/ml의 암피실린을 함유하는 1ml의 상기 LB 배지에서 밤새 배양한 다음 자동 플라스미드 분리장치 PI-100(VER-3.0, 구라보 인더스트리즈, 리미티드 제조)을 사용하여 플라스미드 DNA 추출을 행하였다. 추출된 DNA를 TE용액에 용해시켰다.

추출된 DNA 샘플 5%를 주형으로 하고 합성된 올리고뉴클레오타이드(hTPO-I 및 hTPO-J) 각각 1μM를 프라이머로 하며 또 AmpliTaq^TMDNA 폴리머라제를 갖는 GeneAmp^TMPCR 시약 키트(다까라 스조 컴패니 리미티드 제조)를 사용하고 GeneAmp^TMPCR 시스템 9600(퍼킨-엘머 제조) (각 사이클이 95℃에서 1분간 변성시키고, 59℃에서 1분간 어닐링한 다음 72℃에서 1분간 합성한 다음 72℃ 7분동안 최종 배양 하는 것으로 이루어지는, 총 35 사이클)에 의해 20㎕ 부피로 PCR을 실시하였다. 그 결과, 사용된 90개 푸울중 3개 푸울에서 특이적인 밴드가 검출되었다. 이 3개 푸울중 하나를 각각이 약 5,000개 클론을 함유하는 서브-푸울로 나누어 플라스미드 DNA를 90개 서브-푸울로부터 정제한 다음 동일한 방법으로 PCR을 수행하였다. 그 결과, 5개 서브-푸울에서 특이적 밴드가 검출되었다. 이 5개 푸울 중 하나를 각각이 250개 클론을 함유하는 서브 푸울로 나누고 플라스미드 DNA를 90개 서브-푸울로부터 추출했다. 추출된 샘플을 동일한 방법으로 PCR하였을 때 특이적 밴드가 3개 서브-푸울에서 검출되었다. 이들 3개 푸울중 하나를 각각이 30개 클론을 함유하는 서브-푸울로 나누고 플라스미드 DNA를 90개 서브-푸울로부터 정제하여 동일한 방법으로 PCR을 수행하였다. 그 결과, 3개 서브-푸울에서 특이적 밴드가 검출되었다. 후보 푸울들 중 하나를 50㎍/ml 함유하는 상기 LB 플레이트상에서 배양하여 형성된 90개 콜로니 각각을 플라스미드 추출 처리하고 동일한 방법으로 PCR하였다. 그 결과, 클론 HL34를 최종적으로 수득하였다.

[실시예 16]

인간 TPO cDNA의 서열결정

기본적으로, Molecular Cloning(샘브룩 등, Cold Sprind Harbor Laboratory Press, 1989)에 기술된 과정에 따라 플라스미드 DNA를 정제했다. 50㎍/ml의 암피실린을 함유하는 50ml의 LB 배지에서 클론 HL34를 밤새 배양시키고 원심분리에 의해 수집된 세포를 4ml의 상기 TEG-리소자임 용액에 현탁시켰다. 이것에 8ml의 0.2N NaOH/1% SDS 용액 및 6ml의 3M 칼륨/5M 아세테이트 용액을 첨가하여 세포를 완전히 현탁시켰다. 현탁액의 원심 분리후, 그 상청액을 같은 양의 이소프로판올과 혼합된 페놀/클로로포름(1:1)으로 처리하고 원심분리했다. 생성한 펠릿을 TE 용액에 용해시키고 RNase 이어서 페놀/클로로포름(1:1)으로 처리한 다음 에탄올 침전시켰다. 그 펠릿을 다시 NaCl과 폴리에틸렌 글리콜 3,000이 각각 0.63M 및 7.5%의 최종 농도로 첨가된 TE 용액에 용해시켰다. 원심분리후, 펠릿을 TE 용액에 용해시키고 에탄올로 침전시켰다. 이 방법으로 약 300㎍의 pEF18S-HL34 플라스미드 DNA를 얻었다.

이렇게 정제된 플라스미드 DNA를 상기 373A DNA 서열결정기 (어플라이드 바이오시스템스 제조)에 부가하여 상기 Taq Dye Deoxy^TM터미네이터 사이클 서열결정 키트(어플라이드 바이오시스템스 제조)를 사용하여 그것의 완전한 뉴클레오타이드 서열을 측정하였다. 측정된 뉴클레오타이드 서열 및 그것으로부터 추론된 아미노산 서열을 서열목록(서열 4)에 도시하였다. 이 경우에 서열 3의 뉴클레오타이드에 기초하여 합성된 올리고뉴클레오타이드 및 서열분석에 의해 얻은 내부 서열에 기초하여 설계된 합성 올리고뉴클레오타이드를 프라이머로서 뉴클레오타이드 서열결정에 사용했다.

그 결과, 플라스미드 클론 pEF18S-HL34가 861 bp의 cDNA 단편을 포함하며 실시예 2에서 분석된 아미노산 서열 AP8(서열 4에서 아미노산 번호 1-12) 및 TP2/TP3(서열 4에서 아미노산 번호 157-162)와 매우 상동인 서열을 함유하는 것으로 확인되었다. 이 DNA 단편은 위치 25에서 출발하는 오픈 판독 구조를 코딩 하는 것으로 보이지만 말단 코돈을 함유하지 않고 그의 3′-말단상에 76 염기로된 폴리A 꼬리형 서열을 함유한다. 폴리A 꼬리형 서열 바로 전의 253개 아미노산 잔기들로 이루어진 아미노산 서열은 랫트 TPO cDNA의 상응부분(서열 2에 도시된 147 잔기들로 이루어진 아미노산 서열 분자)와 84% 상동성을 나타냈다. 따라서, 이 클론은 랫트 TPO cDNA와 일치하는 인간 cDNA의 일부를 코딩하는 DNA 단편인 것으로 발견되었다. 말단 코돈의 부재 및 3′-말단상에 폴리A 꼬리형 서열의 존재로 인하여 이 클론이 완전한 cDNA가 아니라 cDNA 라이브러리 작제 과정에 나타나는 인공생성물로 보인다.

[실시예 17]

COS 1 세포에서 인간 TPO cDNA 의 발현 및 TPO 활성의 확인

수득한 플라스미드 클론 pEF18S-HL34를 이용하여 실시예 11의 과정에 따라 COS1 세포를 형질감염시켰다. 즉, 형질감염은 클로로킨 처리를 포함하는 DEAE-덱스트란 방법에 의해 10㎍의 플라스미드 DNA로써 실시하였다. COS-1세포를 37℃에서 3-5일동안 배양시키고 상청액을 수집했다.

수득한 배양 상청액을 IMDM 배양 배지에 대하여 광범위하게 투석하여 랫트 CFU-MK 분석계로 평가했다. 플라스미드 pEF18S-HL34가 발현된 COS 1 세포의 베양 상청액에서 투여량 의존 형태로 TPO 활성이 검출되었다(제8도). 배양 4일 후, 많은 거핵구가 신장 세포질 돌기를 형성했다. 반대로 플라스미드 pEF18S만이 발현된 COS 1 세포의 배양 상청액에서는 TPO 활성이 발견되지 않았다(제8도). M-07e 분석계에서, M-07e 세포 증식 강화 활성은 플라스미드 pEF18S-HL34가 형질감을 통하여 발현된 COS 1 세포의 배양 상청액에서만 발견되었다. 이러한 결과는 pEF18S-HL34가 TPO 활성을 갖는 단백질을 코딩하는 유전자를 함유한다는 것을 입증했다. 또한, 인간 TPO가 랫트 거핵구 전구세포상에서 작용하는 것으로 나타났다(종 특이성 없음).

[실시예 18]

인간 TPO 결실형 cDNA의 발현 및 TPO 활성의 확인

실시예 15에서 얻은 클론 HL34는 3′-측에 폴리A 꼬리형 연속 서열을 포함하는 cDNA을 함유하는데, 이것은 랫트 TPO cDNA에 존재하지 않았고 따라서, 실험의 인공생성물인 것으로 보인다. 따라서, 결실 DNA에 의해서 발현된 단백질이 TPO 활성을 갖는지를 알아보기 위하여 폴리A 꼬리형 서열이 결실된 cDNA 분자를 제조했다. PCR을 사용하여 결실 cDNA를 제조했다. PCR용 프라이머의 서열은 제한효소 인식부위 (hTP05에는 EcoRI 그리고 hTP03에 대해서는 두 개의 종지 코돈 TAA 및 TGA)가 각 프라이머의 5′-말단에 추가된 아래와 같다.

(서열 4에서의 위치 1-21).

(서열 4에서의 위치 757-780에 상응하는 안티-센스 프라이머)

실시예 16에서 수득한 플라스미드 클론 pEF18S-HL34의 플라스미드 DNA 1㎍을 주형으로 하고, 합성된 hTP05 및 hTP03의 각각 10μM을 프라이머로하며 또 AmpliTaq^TMDNA 폴리머라제를 갖는 GeneAmp^TMPCR 시약 키트(다까라 스조 캠패니 리미티드 제조)를 사용하여 GeneAmp^TMPCR 시스템 9600(퍼킨엘머 제조)에 의해 각 사이클이 95℃에서 1분간 변성시키고 65℃에서 1분간 어닐링한 다음 72℃에서 1분간 합성한 다음 72℃에서 7분간 최종 배양하는 것으로 이루어진 총 15 사이클을 반복함으로써 100㎕의 부피로 PCR을 수행했다. 이렇게 수득한 약 800bp의 밴드를 제한효소 EcoRI 및 NotI으로 분해시키고 정제한 다음 동일한 제한 효소로 미리 처리한 발현벡터 pEF18S에 서브-클로닝했다. 생성한 형질전환체로부터 약 800bp의 DNA의 단편을 함유한 5개 클론을 선택하여 실시예 5에 기술된 과정에 따라 다량의 플라스미드 DNA를 제조했다. 각 플라스미드의 약 800bp 증폭 영역의 전체길이를 뉴클레오타이드 서열분석하여 실시예 16에서 분석된 뉴클레오타이드 서열과 완전한 동일성을 발견하였다(서열 4에서의 위치 1-780).

수득한 플라스미드 클론을 pHT1-231로 명명했다. 대장균 균주 DH5에 포함된 벡터 pHT1-231은 내셔날 인스티튜트 오브 바이오사이언스 앤드 휴먼 테크놀로지, 에이전시 오브 인더스트리얼 사이언스 앤드 테크놀로지, 미니스트리 오브 인터내셔날 트레이드 앤드 인더스트리, 일본에 기탁번호 FERM BP-4564로 1994. 2. 14일에 본 발명자들에 의해 기탁되었다.

수득한 플라스미드를 실시예 11의 과정에 따라 COS 1 세포로 형질감염시켰다. 즉, 클로로킨 처리를 포함하는 DEAE-덱스트란 방법에 의해 10㎍의 플라스미드 DNA로 형질감염을 수행하였다. COS 1 세포를 3-5일동안 37℃에서 배양시켜 상청액을 수집하였다.

수득한 배양 상청액을 IMDM 배양배지에 대하여 광범위하게 투석하여 랫트 CFU-MK 분석계로 평가했다. 플라스미드 pHT1-231이 발현된 COS 1 세포의 배양 상청액에서 TPO 활성이 발견되었다(제9도). 배양 4일째 많은 거핵구가 신장 세포질 돌기를 형성했다. 반대로, 플라스미드 pEF18S만 발현된 COS 1 세포의 배양 상청액에서는 TPO 활성이 발견되지 않았다. M-07e 분석계에서 플라스미드 pHT1-231이 발현된 COS 1 세포의 배양 상청액에서만 M-07e 세포 증식 강화 활성이 발견되었다.

이 결과들은 pHT1-231이 TPO 활성을 갖는 단백질을 코딩하는 cDNA을 함유한다는 것을 입증했다.

[실시예 19]

PCR에 의한 인간 TPO cDNA의 3′-말단 영역의 제조

실시예 15에서 제조된 클론 HL34는 폴리(A) 꼬리형 서열을 포함하는 cDNA을 함유하므로 3′-말단 영역이 불완전하다는 것을 암시했다. 따라서, PCR로 전체길이의 3′-말단 영역을 얻기 위해 노력했다. 실시예 16에서 결정된 서열에 기초하여 하기 4 종류의 PCR용 5′-측 프라이머를 합성했다.

(서열 4에서의 위치 574-594)

(서열 4에서의 위치 595-615)

(서열 4에서의 위치 660-680)

(서열 4에서의 위치 692-712)

폴리(A) 부분의 처음부터 cDNA을 증폭시키기 위하여 3′-말단의 4개 염기들에서 혼합된 뉴클레오타이드를 함유하는 하기 3′-측 프라이머를 합성하였다. 혼합된 뉴클레오타이드 없이 앵커 프라이머를 합성하였다.

0.5㎍의 올리고 dT 프라이머(이것은 파마시아에 의해 제조된 Time Saver^TMcDNA 합성 키트에 포함된다)를 사용하여 실시예 14에서와 같이 1㎍의 시판중인 인간의 정상 간-유도 폴리(A)⁺RNA(클론테크 제조)로부터 cDNA 의 제 1 가닥을 합성하였다. 합성된 cDNA 용액중 1/10 부피를 주형으로 하고, 20μM의 hTPO-H 프라이머 및 10μM의 hTPO3혼합 프라이머 및 AmpliTaq^TMDNA 플리미라제를 갖는 GeneAmp^TMPCR 시약 키트(다까라 스조 컴패니 리미티드 제조)를 사용하여 GeneAmp^TMPCR 시스템 9600(퍼킨엘머 제조)에 의해 96℃에서 2분간 가열하고 각 사이클이 96℃에서 1분간 열 변성시키고, 48℃에서 1분간 어닐링한 다음 72℃에서 1분간 합성하고 이어 72℃에서 7분동안 최종 배양하는 것으로 이루어진 총 10 사이클을 반복하여 50㎕ 부피로 PCR을 수행했다.

제 1 PCR로 부터의 용액의 1/10 부피를 주형으로 하고 20μM의 hTPO-K 프라이머 및 10μM의 hTPO3혼합 프라이머를 사용하고, 96℃에서 2분간 가열하고 각 사이클이 96℃에서 1분간 열 변성시키고 63℃에서 1분간 어닐링한 다음 72℃에서 1분간 합성하며 이어서 72℃에서 7분동안 최종 배양하는 것으로 이루어진 총 10 사이클을 반복하여 50㎕ 부피로 제 2 PCR을 수행했다.

제 2 PCR로 부터의 용액의 1/10 부피를 주형으로 하고 20μM의 hTPO-N 프라이머 및 10μM의 hTPO3혼합 프라이머를 사용하고, 96℃에서 2분간 가열하고 각 사이클이 96℃에서 1분간 열 변성시키고 63℃에서 1분간 어닐링한 다음 72℃에서 1분간 합성하며 이어서 72℃에서 7분동안 최종 배양하는 것으로 이루어진 총 10 사이클을 반복하여 50㎕ 부피로 제 3 PCR을 수행했다.

제 3 PCR로 부터의 용액의 1/10 부피를 주형으로 하고 20μM의 hTPO-K 프라이머 및 10μM의 hTPO3혼합 프라이머를 사용하고, 96℃에서 2분간 가열하고 각 사이클이 96℃에서 1분간 열 변성시키고 63℃에서 1분간 어닐링한 다음 72℃에서 1분간 합성하며 이어서 72℃에서 7분동안 최종 배양하는 것으로 이루어진 총 10 사이클을 반복하여 50㎕ 부피로 제 4 PCR을 수행했다.

제 4 PCR로 부터의 용액의 1/10 부피를 주형으로 하고 20μM의 hTPO-K 프라이머 및 10μM의 hTPO3앵커 프라이머를 사용하고, 96℃에서 2분간 가열하고 각 사이클이 96℃에서 1분간 열 변성시키고 58℃에서 1분간 어닐링한 다음 72℃에서 1분간 합성하며 이어서 72℃에서 7분동안 최종 배양하는 것으로 이루어진 총 10 사이클을 반복하여 50㎕ 부피로 제 5 PCR을 수행했다.

수득한 반응 용액을 2% 아가로오스 겔(FMC Bio Products 제조)전기 영동하여 약 600bp의 DNA 단편을 PCR의 주생성물로서 분리하며 이를 상기 Prep-A-Gene DNA 정제 키트(바이오-래드-래보라토리즈, 인코포레이티드 제조)을 사용하여 정제하였다. 정제된 DNA 단편의 뉴클레오타이드 서열은 상기 Taq Dye Deoxy^TM터미네이타 사이클 서열결정 키트(어플라이드 바이오시스템스 제조)를 사용하여 373A DNA 서열 결정기(어플라이드 바이오 시스템스 제조)로 직접 측정했다. 이렇게 결정된 뉴클레오타이드 서열 및 그것으로부터 추론된 아미노산 서열을 서열목록(서열 5)에 도시하였다.

이 DNA 단편은 프라이머 hTPO-O로 출발하는 130개 아미노산을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열, 이어서 3′-말단에 180개 이상의 뉴클레오타이드의 서열을 갖는다(577 위치 이후의 뉴클레오타이드는 측정할 수 없었다). 글리신으로 출발하는 30개 아미노산 서열은 서열 4에서의 위치 203-232의 아미노산 서열과 일치한다. 또한, 위치 1-94의 뉴클레오타이드 서열은 서열 4에서의 위치 629-785의 뉴클레오타이드 서열과 일치한다.

실시예 17에서의 cDNA 단편 및 본 실시예에서의 PCR-증폭단편의 서열분석 결과 인간 TPO 단백질은 서열 6에 도시된 바와 같이 21개 아미노산 시그널 서열과 함유하는 353개 아미노산으로 이루어지는 것으로 추정되었다.

[실시예 20]

인간의 정상 간-유도 cDNA 라이브러리의 재작제

실시예 15에서 얻은 클론 HL34가 종지 코돈 없이 오픈 판독구조의 3′-말단상에서 직접적으로 폴리 A 꼬리형 서열을 함유했고 따라서, cDNA 합성의 인공생성물인 것으로 보였기 때문에 5㎍의 시판중인 인간의 정상 간-유도 폴리(A)⁺RNA 제제(클론테크 제조)를 사용하여 cDNA 라이브러리를 제작제 했다. cDNA 합성 및 λ클로닝 키트용 SuperScript^TM람다 시스템 및 SuperScript^TMII RNase H^-(둘다 라이프 테크놀로지스 제조)를 사용하여 cDNA의 합성을 실시했다. 폴리(A)⁺RNA를 열 변성시킨 다음 키트에 부착된 프라이머로서 NotI 서열-포함 올리고 dT를 함유하는 20㎕의 반응용액(50mM Tris-HC1, pH 8.3, 75mM KC1, 3mM MgC1₂, 1mM DTT, 1mM dNTP 혼합, 200U의 SuperScript^TMII RNase H^-)에 첨가하고 37℃에서 60분간 배양하였다.

cDNA의 제 2 가닥 합성후(25mM Tris-HC1, pH 8.3, 100mM KC1, 5mM MgC1₂, 250μm dNTP 혼합, 5mM DTT, 40U의 대장균 DNA 폴리머라제. I, 2U의 대장균 RNase H 및 10U의 대장균 DNA 리가아제를 함유하는 150㎕의 반응 용액중 16℃에서 2시간 배양), 10U의 T4 DNA 폴리머라제를 첨가하고 생성한 혼합물을 16℃에서 5분간 배양했다. 이 반응 용액을 65℃에서 10분동안 가열하고 같은 부피의 페놀/클로로포름으로 추출한 다음 400bp 이하의 길이를 갖는 cDNA 분자들을 SizeSep^TM400 스펀(Spun) 컬럼(파마시아에 의해 제조된 Time Saver^TMcDNA 합성 키트에 부착된, 저분자량 DNA 제거용 스펀컬럼)을 사용하여 제거했다. EcoRI 어댑터(파마시아에 의해 제조된 Directional Cloning Toolbox에 부착된)를 첨가한 후, 처리된 샘플을 NotI로 분해시키고 다시 SizeSep^TM400 스펀컬럼에 부가하여 저분자량 DNA를 제거했다. 5′-말단상에 EcoRI 인식서열 및 3′-말단상에 NotI 인식서열을 함유하는 1.3㎍의 합성된 이중 가닥 cDNA를 EcoRI 및 NotI으로 미리 분해시킨 발현벡터 pEF18S에 결찰시킨 다음 9.2㎖의 고 수용 대장균 DH5(도요보 컴패니 리미티드 제조)로 형질전환 시켰다. 수득한 인간의 간 cDNA 라이브러리(hTPO-F1)는 1.0 ×10⁶개의 형질전환체를 함유했다.

[실시예 21]

인간의 간 cDNA 라이브러리 hTPO-F1으로부터 TPO cDNA 클론의 스크리닝

서열목록에 도시된 서열 3과 6을 기초로 하여 PCR용 인간 TPO cDNA 상응하는 프라이머를 합성했다. 합성된 프라이머의 서열은 다음과 같다.

(서열 3에서의 위치 60-80)

(서열 6에서의 위치 901-921의 서열과 상응하는 안티-센스 프라이머)

실시예 20에서 작제된 인간의 간 cDNA 라이브러리 hTPO-F1(1.0 ×10⁶개의 형질전환체)을 3개의 푸울 (푸울#1-3)로 나누고 그 푸울을 냉동시켰다. 각 푸울로부터 제조된 2㎍의 플라스미드 DNA를 주형으로 하고 합성된 올리고뉴클레오타이드(hTPO-I 및 hTPO-KU) 각각 1μM을 프라이머로 사용하여 PCR을 행하였다. AmpliTaq^TMDNA 폴리머라제를 갖는 GeneAmp^TMPCR 시약 키트(다카라 스조 컴패니 리미티드 제조)를 사용하여 GeneAmp^TMPCR 시스템 9600(퍼킨-엘머 제조)에 의해 100㎕ 부피로 PCR을 수행하였다(각 사이클이 95℃에서 1분간 변성처리하고 59℃에서 어닐링한 다음 72℃에서 1분간 합성하고 이어서 72℃에서 7분간 최종 배양하는 것으로 이루어진 총 35사이클). 그 결과, 예상되는 크기를 갖는 DNA 단편은 푸울 #3으로부터 제조된 플라스미드 DNA가 사용되었을 때 증폭되었다. 이 #3 푸울을 15,000 형질전환체를 함유하는 서브-푸울로 나누고 이 서브푸울들을 50㎍/ml의 암피실린 함유 LB 배지 1ml에서 밤새 배양시킨 다음 자동 플라스미드 분리장치 PI-100을 사용하여 플라스미드 DNA를 추출했다. 추출된 DNA를 TE 용액에 용해시키고 그 용액중 5%를 주형으로 사용하여 상기와 동일조건하에서 동일한 프라이머를 사용하여 PCR을 행하였다. 그 결과 90개 푸울중 6개 푸울에서 예상되는 크기를 갖는 DNA의 증폭이 발견되었다. 이들 양성 푸울중 하나를 1,000개 클론을 함유하는 서브푸울로 나누고 플라스미드 DNA를 추출한 다음 상기한 것과 동일한 방법으로 PCR을 행하였을 때, DNA 증폭이 발견되지 않았다. 일련의 PCR에 의해 증폭된 DNA 단편의 전기영동 겔상의 밴드 밀도는 서브푸울이 더 나누어졌을 때 더 낮았는데 이는 해당 클론의 성장 불량으로 인한 플라스미드 DNA의 회수가 낮은 것에 기인하는 것으로 보인다. 따라서, 원래의 #3 푸울을 사용하여 콜로니 교잡함으로써 또다른 스크리닝을 했다.

#3 푸울을 4,100 콜로니가 각 LB 한천 플레이트상에서 성장하도록 하는 접종 크기로 15cm 직경의 100LB 한천 플레이트상에 뿌렸다. 접종된 플레이트의 각각으로부터 레플리카 플레이트를 제조한 후에 이들 복제 플레이트 중 하나를 37℃에서 6시간동안 배양시켜 플레이트상에서 성장된 콜로니들을 회수하고 플라스미드 DNA 샘플을 추출하였다. 상기한 방법과 동일하게 이 DNA 샘플들을 PCR 하였을 때, 예상되는 크기와 일치하는 밴드의 증폭이 100개 서브푸울중 하나에서 관찰되었다. BIODYNE^TMA THANSFER MEMBRANE(PALL 제조)을 사용하여 이 서브푸울의 플레이트로부터 두 개의 레플리카 필터를 제조하였다. 10% SES에서 10분동안, 0.5N NaOH/1.5M NaC1에서 10분동안, 그리고 0.5M Tris-HC1 (pH 8.0)/1.5M NaC1에서 10분동안 순서대로 필터를 침지시킨 다음 30분동안 공기 건조시킨 다음 80℃의 진공 오븐에서 1시간 동안 고온건조시킴으로써 필터를 변성시켰다. 고온건조된 필터를 1% SDS가 보충된 6 ×SSC (1 리터의 물, pH 7.0에 용해된 175.3g의 NaC1 및 88.2g의 시트르산 나트륨으로 이루어진 20 ×SSC 원용액을 희석시켜 제조)로 세척하였다. 50% 포름아미드, 6 ×SSC, 6 ×덴하트(Denhardt′s)용액 (500ml의 물에 5g의 Ficoll, 5g의 폴리비닐피롤리돈 및 5g의 소 혈청알부민 분획 V를 함유하는 50 ×덴하트 용액으로부터 제조), 1% SDS 및 20㎍/ml의 연어정자 DNA로 이루어진 30ml의 반응용액에서 교반하면서 42℃에서 30분 동안 배양함으로써 상기 세척된 필터의 예비교잡을 수행하였다. 예비교잡후, 반응용액을 동일한 조성을 갖는 30ml의 교잡용액과 교환하고[α-³²P] dCTP(애머샴 제조)로 라벨링된 탐침과 혼합한 다음 42℃에서 20시간동안 교반하면서 배양하였다. 이 실험에 사용된, 라벨링된 탐침은 5′-말단에서부터 458 위치 염기까지의 범위인 서열 4의 일부를 정제하고 이 정제된 부분을 메가프라임(Megaprime) DNA 라벨링 시스템(Anal. Biochem., 132, 6-13, 1983에 기술된 방법에 기초하여 애머샴이 제조한 키트)을 이용한 랜덤 프라이머 수법으로 라벨링하여 얻은 플라스미드 pEF18S-HL34의 EcoRI/BamHI 단편이었다. 처리된 필터를 42℃에서 2 ×SSC/0.1% SDS 용액으로 30분동안, 이어서 42℃에서 2 ×SSC/0.1% SDS 용액으로 30분동안 세척하였다. 증감지 및 X-OMAT^TMAR5 필름(이스트만 코닥 제조)을 사용하여 -70℃에서 그 필터를 16시간동안 자기방사능사진 처리시켰다. 그 결과 양성인 것으로 간주되는 단일 신호가 관찰되었다. 이 신호와 거의 일치하는 콜로니를 원래의 플레이트에서 수집하여 10-cm LB 한천 플레이트상에 다시 접종하였다. 플레이트 상에서 성장된 총 50개 콜로니들을 별도로 배양시켜 상기에서 설명한 것과 동일한 조건하에서 상기 프라이머 hTPO-I와 hTPO-KU를 사용하여 그들의 샘플을 PCR 처리하였다. 그 결과, 예상되는 크기와 일치하는 밴드의 증폭은 하나의 콜론에서만 발견되었는데 이것을 pHTF1이라 명명하였다.

[실시예 22]

인간 TPO cDNA 클론 pHTF1의 뉴클레오타이드 서열의 측정

기본적으로 Molecular Cloning (샘브룩 등, 콜드 스프링 하버 래보라토리 프레스, 1989)에 기술된 과정에 따라 플라스미드 DNA의 정제를 수행했다. 50㎍/ml의 암피실린을 함유하는 50ml의 LB 배지에서 클론 pHTF1을 밤새 배양시켰다. 생성한 세포를 원심분리로 수집하고 4ml의 상기 TEG-리소자임 용액에 현탁시켰다. 이것에 8ml의 0.2N NaOH/1% SDS 용액 및 6ml의 3M 칼륨/5M 아세테이트 용액을 첨가하여 세포를 완전히 현탁시켰다. 현탁액을 원심분리한 후 그 상청액을 페놀/클로로 포름(1:1)으로 처리하고 동량의 이소프로판올과 혼합한 다음 원심분리했다. 생성한 펠릿을 TE 용액에 용해시키고 RNase 및 페놀/클로로포름(1:1)으로 처리한 다음 에탄올 침전시켰다. 생성한 펠릿을 NaCl 및 폴리에틸렌 글리콜 3,000이 각각 0.63M 및 7.5%의 최종 농도로 첨가된 TE 용액에 다시 용해시켰다. 원심분리한 후, 펠릿을 TE 용액에 용해시키고 에탄올 침전시켰다. 이 방법으로 약 300㎍의 플라스미드 DNA pHTF1을 얻었다.

정제된 플라스미드 DNA를 상기 373A DNA 서열결정기(어플라이드 바이오 시스템스 제조)에 부가하고 상기 Taq Dye Deoxy^TM터미네이터 사이클 서열결정 키트(어플라이드 바이오 시스템스 제조)를 사용하여 완전 뉴클레오타이드 서열을 측정했다. 측정된 뉴클레오타이드 서열 및 추론된 아미노산 서열을 서열목록(서열 7)에 도시하였다. 서열 6의 뉴클레오타이드 및 서열반응 분석에 의해 얻어진 내부서열에 기초하여 합성된 올리고뉴클레오타이드를 뉴클레오타이드 서열 측정에서 프라이머로서 사용했다.

그 결과, 클론 pHTF1은 1,721 bp의 cDNA 단편을 함유하며 실시예 2에서 분석된 아미노산 서열 AP8(서열 7에서의 아미노산 번호 1-12) 및 TP2TP3(서열 7에서의 아미노산 번호 157-162)과 높은 상동성을 갖는다는 것이 확인되었다. 이 DNA 단편은 101 염기들의 5′비코딩 영역, 102-104 뉴클레오타이드 위치에서 코딩되는 메티오닌 잔기에서부터 1,158 내지 1,160 뉴클레오타이드 위치에서 코딩되는 글리신 잔기로 끝나는 353개 아미노산 잔기로 이루어진 오픈 판독구조 이어지는 종지 코돈(TAA), 531 염기의 3′ 비코딩 영역 및 30 염기의 폴리 A 꼬리서열을 갖는 것으로 보인다. 오픈 판독구조에 의해 코딩 되는 것으로 간주되는 단백질의 아미노산의 서열은 서열 6에 도시된 인간 TPO의 예상되는 아미노산 서열과 완전히 일치했다. pHTF1의 cDNA 서열은 서열 6에 도시된 추정 cDNA 서열보다 큰 크기를 가지며 5′측에 77개의 추가적인 염기 및 폴리 A 꼬리 서열의 전면의 3′측에 347개의 추가 염기를 함유한다. 이 뉴클레오타이드 서열은 서열 6과는 3위치에서 상이하였다. 즉, 서열 7에서 A(위치 84), A(위치 740) 및 G(위치 1,198)는 서열 6에서 각각 C, T 및 A 였다. 위치 740에서의 돌연변이 만이 단백질 코딩 부위에 포함되었지만 이 돌연변이는 염기 A와 T 모두가 트레오닌 코돈의 세 번째 염기였기 때문에 아미노산 교환을 야기하지 않았다. 이들 염기 치환의 원인은 그 때에는 명확하지 않았지만 플라스미드 클론 pHTF1의 분석에 의해서 인간 TPO 단백질이 21개의 아미노산 시그널 서열을 갖는 353개의 아미노산 잔기를 포함하는 것으로 확인되었다. 시그널 서열을 제외한 성숙 단백질의 분자량은 35,466인 것으로 나타났다.

대장균 균주 DH5에 포함된 벡터 pHTF1은 내셔날 인스티튜브 오브 바이오사이언스 앤드 휴먼-테크놀로지, 에이전시 오브 인더스트리얼 사이언스 앤드 테크놀로지, 미니스크리 오브 인터내셔날 트레이드 앤드 인더스트리, 일본에 기탁번호 FERM BP-4617로 1994. 3. 24일에 본 발명자들에 의해 기탁되었다.

[실시예 23]

COS 1 세포에서 인간 TPO cDNA 클론 pHTF1의 발현 및 TPO 활성의 확인

이렇게 수득한 플라스미드 클론 pHTF1을 사용한 COS 1 세포의 형질감염은 실시예 11의 과정에 따라 실시하였다. 즉, 클로로킨 처리를 포함하는 DEAE-덱스트란 방법에 의해 10㎍의 플라스미드 DNA로써 형질감염을 수행하였다. 형질감염된 COS1 세포를 37℃에서 3일동안 배양시켜 배양 상청액을 수집하였다.

얻어진 배양 상청액을 IMDM 배양 배지에 대하여 광범위하게 투석하여 랫트 CFU-MK 분석계로 평가했다. 플라스미드 pHTF1이 발현된 COS1 세포의 배양 상청액에서 투여량 의존적 양식으로 TPO 활성이 발견되었다(제10(a)도). 반대로, 플라스미드 pEF18S만 발현된 COS1 세포의 배양 상청액에서는 TPO 활성이 발견되지 않았다(제10(a)도). M-07e 분석계에서 유사한 결과를 얻었다. 플라스미드 pHTF1이 발현된 COS 1 세포의 배양 상청액은 투여량 의존적 양식으로 M-07e 세포증식을 현저히 증가시켰다(제10(b)도). 이 결과들은 pHTF1이 TPO 활성을 갖는 단백질을 코딩하는 cDNA을 함유한다는 것을 입증했다.

[실시예 24]

인간 TPO 염색체 DNA의 클로닝

인간 TPO cDNA를 탐침으로 사용하여 인간 TPO 염색체 DNA의 클로닝을 수행했다. 클로닝에 사용된 게놈 라이브러리는 도호꾸 유니버시티, 유전자 연구센터에 있는 티. 아마모또 교수로부터 받은 선물이었다(인간 염색체 DNA를 제한효소 Sau3AI로 부분적으로 분해시키고 그 부분적 분해물을 스트라타진(Stratagene)에 의해 제조된 파아지벡터 람다 EMBL3의 BamHI 부위에 결찰시켜 작제한, 사카이(Sakai) 등, J. Biol. Chem. 269, 2173-2182, 1994에서 보고된 라이브러리). 인간 TOP cDNA를 탐침으로 사용하여 상기 라이브러리를 스크리닝하는 것은 기본적으로 Molecular Cloning(샘브룩 등, 콜드 스프링 하버 래보라토리 프레스, 1989)에 기재된 과정에 따라 실시하였다. 숙주로서 대장균 LE392를 사용하여 하나의 플레이트가 30,000 파아지 입자를 포함하도록하는 접종크기로 NZYM(1리터의 물, pH 7.0에 10g의 NZ 아민, 5g의 NaC1, 5g의 박토효모 추출물, 2g의 MgSO₄, 7H₂O 및 15g의 한천)을 함유하는 15cm 플레이트상에 상기 라이브러리를 접종하였다. BIODYNE^TMA TRANSFER MEMBRANE(PALL 제조)을 사용하여 제조된 18개 플레이트의 각각으로부터 두 개의 레플리카 필터를 제조하였다. 0.5N NaOH/1.5M NaC1에서 10분동안, 그리고 0.5N Tris-HC1/(pH 8.0)/1.5M NaC1에서 10분동안 필터를 침지시키고 30분동안 공기-건조시킨 다음 80℃에의 진공오븐에서 1시간 동안 베이킹함으로써 필터를 변성시켰다. 50% 포름아미드, 5 ×SSC, 5 ×덴하트 용액 1% SDS 및 20㎍/ml의 연어정자 DNA로 이루어진 500ml의 반응용액중 42℃에서 1시간 동안 배양하여 상기 필터의 예비교잡을 수행하였다. 탐침으로 사용하기 위하여, 인간 TPO cDNA 단편(서열 7)에서의 염기 위치번호 178 내지 1,025)를 PCR로 증폭시키고 정제하여 그 정제된 단편을 램덤 프라이머 DNA 라벨링 키트(Anal. Biochem., 132 6-13, 1983에 기술된 랜덤 프라이머 방법에 기초하여 다까라 스조에 의해 제조된 DNA 라벨링 키트)를 사용하여³²P로 라벨링했다. 이 PCR에 사용된 프라이머의 서열은 다음과 같다.

(서열 7에서의 위치 178-198)

(서열 7에서의 위치 1005-1025의 서열에 상응하는 안티-센스 프라이머)

동위원소-라벨링 탐침을 사용하여 예비교잡 용액과 동일한 조성을 갖는 500ml의 반응용액중 42℃에서 20시간 동안 교잡시켰다. 처리된 필터를 실온에서 2 ×SSC/0.1% SDS 용액으로 세 번, 이어서 68℃에서 0.1 ×SSC/0.1% SDS 용액으로 1시간 동안 한번 세척하였다. 증감지 및 X-OMAT^TMAR5 필름(이스트만 코닥 제조)을 사용하여 -70℃에서 16시간 동안 상기 필름을 자기 방사능사진 처리시켰다. 그 결과 13개의 양성신호가 관찰되었다. 각 양성 신호와 거의 일치하는 플라크를 원래의 플레이트에서 수집하여 1000개 플라크가 각 플레이트상에 형성된 접종크기로 15-cm NZYM 플레이트상에 다시 접종하였다. 두 개의 레플리카 필터를 각 플레이트로부터 제조하여 상기에 설명된 조건과 동일조건하에서 교잡시켰다. 그 결과, 13개 그룹의 모든 필터상에서 양성 신호들이 검출되었다. 각 플레이트로부터 단일 플라크를 회수하여 Moleculor Cloning에 기술된 플레이트 용균 방법으로 파아지 DNA를 제조했다. 13개 클론으로부터 제조된 파아지 DNA 샘플에 대하여 하기 서열을 갖는 프라이머를 사용하여 PCR법으로 cDNA 코딩 영역이 존재하는지 확인했다.

(서열 6에서의 위치 1-21)

(서열 6에서의 위치 127-147의 서열에 상응하는 안티-센스 프라이머)

(서열 6에서의 위치 503-523)

(서열 6에서의 위치 1,070-1,090의 서열에 상응하는 안티-센스 프라이머)

이 프라이머들의 조합을 사용하여 PCR을 수행했을 때 13개 클론 중 5개 클론이 cDNA로부터 예상되는 전체 아미노산 코딩 영역을 함유하는 것으로 보였다. 이 5개 클론에 포함된 염색체 DNA 분자는 약 20kb의 유사한 길이를 가졌으며 예비적인 제한 효소 분석을 행하였을 때 거의 동일한 패턴을 나타냈다. 따라서, 이 클론들중 하나(클론 λHGT1)을 선택하여 서던 볼롯팅으로 분석했다. 즉, 클론 λHGT1의 DNA 1㎍을 제한효소 EcoRI 또는 HindIII으로 완전히 분해시키고 0.8% 아가로오스 겔 전기영동처리시킨 다음 겔상의 밴드를 BIODYNE^TMA TRANSFER MEMBRANE(PALL 제조) 상으로 전달했다. 그 필터를 30분동안 공기건조 시키고 진공오븐 중 80℃에서 2시간동안 베이킹 하였다. 50% 포름아미드, 5 ×SSC, 5 ×덴하트 용액, 1% SDS 및 20㎍/ml의 연어정자 DNA로 이루어진 50ml의 반응용액 중 42℃에서 1시간 동안 배양하여 상기 필터의 예비교잡을 수행하였다. 탐침으로 사용하기 위하여 인간 TPO cDNA 단편(서열 7에서의 염기 위치번호 178-1, 025)을 PCR로 증폭시키고 정제하여 그 정제된 단편을 랜덤 프라이머 DNA 라벨링 키트(다까라 스조 제조)를 사용하여³²P 로 라벨링 했다. 동위 원소-라벨링된 탐침을 사용하여 예비교잡 용액과 동일한 조성을 갖는 50ml의 반응용액 중 42℃에서 20시간 동안 교잡을 행하였다. 처리된 필터를 실온에서 2 ×SSC/0.1% SDS 용액으로 5분동안 세 번 이어서 68℃에서 0.1 ×SSC/0.1% SDS 용액으로 1시간 동안 한번 세척하였다. 중감지 및 X-OMAT^TMAR5 필름(이스트만 코닥 제조)을 사용하여 -70℃에서 그 필터를 16시간 동안 자기방사능사진 처리시켰다. 그 결과, HindIII 분해의 경우에서 약 10kb의 단일밴드가 관찰되었다. 따라서, 클론 λHGT1의 DNA 10㎍을 HindIII으로 분해시키고 0.8% 아가로오스 전기영동시킨 다음 10kb 밴드를 겔로부터 절제하여 Prep-A-Gene DNA 정제키트(바이오-래드 제조)를 사용하여 정제한 다음 HindIII으로 미리 분해시킨 클로닝 벡터 pUC13(파마시아 제조)에 서브클로닝했다. 이 경우에, 도요보에 의해 제조된 고 수용 대장균 DH5를 숙주균주로서 사용하였다.

얻어진 클론들중 10kb HindIII를 함유하는 클론을 선택하여 pHGT1으로 명명하였다.

파아지 클론 λHGT1의 제한 지도를 제11도에 도시하였다.

[실시예 25]

인간 TPO 염색체 클론 pHGT1의 뉴클레오타이드 서열 결정

기본적으로, Molecular Cloning(샘브룩 등, 콜드 스프링 하버 래보라토리 프레스, 1989)에 기술된 과정에 따라 클론 pHGT1의 배양 및 플라스미드 DNA의 정제를 수행했다. 50㎍/ml의 암피실린을 함유하는 50ml의 LB 배지에서 클론 PGHT1을 밤새 배양시켰다. 세포를 원심분리로 수집하고 4ml의 상기 TEG-리소자임 용액에 현탁시켰다. 이것에 8ml의 0.2N NaOH/1% SDS 용액 및 6ml의 3M 칼륨/5M 아세테이트 용액을 첨가하여 세포를 완전히 현탁시켰다. 현탁물의 원심분리후 그 상청액을 페놀/클로로포름(1:1)으로 처리하고 동량의 이소프로판올과 혼합한 다음 원심분리했다. 생성한 펠릿을 TE 용액에 용해시키고 RNase 및 페놀/클로로포름(1:1)으로 처리한 다음 에탄올 침전시켰다. 그 펠릿을 NaC1 및 폴리에틸렌 글리콜 3000이 각각 0.63M 및 7.5%의 최종 농도로 첨가된 TE 용액에 다시 용해시켰다. 원심분리후 펠릿을 TE 용액에 용해시키고 에탄올로 침전시켰다. 이 방법으로 약 300㎍의 플라스미드 DNA pGHT1을 얻었다.

정제된 플라스미드 DNA를 상기 373A DNA 서열결정기(어플라이드 바이오 시스템스 제조)에 부가시키고 상기 Taq Dye Deoxy^TM터미네이터 사이클 서열결정 키트(어플라이드 바이오시스템스 제조)를 사용하여 cDNA 뉴클레오타이드 서열로부터 예상되는 단백질-코딩 영역 주위의 뉴클레오타이드 서열을 측정했다. 측정된 뉴클레오타이드 서열 및 추론된 아미노산 서열을 서열목록(서열 8)에 도시하였다. cDNA의 뉴클레오타이드 서열 분석을 위하여 실시예 22에서 사용된 올리고뉴클레오타이드 및 서열 반응분석에 의해 얻어진 내부서열에 기초하여 설계된 합성 올리고뉴클레오타이드를 뉴클레오타이드 서열 측정에 프라이머로서 사용했다.

그 결과 플라스미드 클론 pHGT1에 포함된 염색체 DNA는 서열 6으로부터 추론된 아미노산 서열의 전체 코딩 부위를 함유하는 것으로 발견되었으며 코딩 부위의 뉴클레오타이드 서열은 서열 6과 완전히 일치했다. 또한, 아미노산-코딩 엑손에 해당하는 영역을 5′측으로부터 231bp, 286bp, 1932bp 및 236bp의 길이를 갖는 4개의 인트론을 상기 순서대로 함유했다(제11도). 또한, 뉴클레오타이드 서열은 실시예 22에 기술된 위치와 동일한 3 위치에서 서열 7의 cDNA 뉴클레오타이드 서열과 달랐다(서열 6과 7사이의 다른 위치). 즉, 서열 7에서의 A(위치 84), A(위치 740) 및 G(위치 1,198)는 서열 8에서 각기 C, T 및 A 였다. 따라서, 실시예 21에서 얻은 인간 TPO cDNA 클론 pHTF1의 뉴클레오타이드는 3 위치에서 인간 염색체 DNA 클론 pHGT1의 뉴클레오타이드 서열과 다른 것으로 나타났다. 따라서, cDNA 클론 pTHE1 서열에서의 돌연변이가 염색체 DNA 서열에 반영되는지 분석하기 위하여 스크리닝에 의해 개별적으로 선택된 5개의 염색체 DNA 클론중 4개 클론의 뉴클레오타이드 서열을 측정했다. Molecular Cloning에 기술된 플레이트 용균 방법에 따라 제조된 파아지 DNA 샘플을 사용하여 직접 뉴클레오타이드 서열 측정방법으로 서열분석을 수행했다. 뉴클레오타이드 서열에서 상기 3개의 돌연변이 위치가 분석될 수 있도록 하는 서열 부분을 기초로 합성된, 실시예 22에 사용된 서열 프라이머 및 Taq Dye Deoxy^TM터미네이터 사이클 서열결정 키트(어플라이드 바이오시스템스 제조)를 사용하여 상기 373A DNA 서열 결정기(어플라이드 바이오시스템스 제조)에 부가하여 각 클론의 서열을 결정했다. 4개 클론 모두의 뉴클레오타이드 서열은 서열 6과 동일한 것으로 발견되었다. 서열 7에 상응하는 위치 84 및 740을 상기 4개 클론에서 C와 T로 치환시켰다. 그러나 위치 1,198은 2개 클론에서 G였고 나머지 2개 클론에서는 A였다. 다시말하면, 원래의 염색체 DNA에 두 형태의 고유한 뉴클레오타이드 서열이 있는 것으로 나타났다. 현재로서는 뉴클레오타이드 서열에서의 그러한 차이가 상동성 염색체로부터 유도되는지 또는 복수의 유전자로부터 유도되는지는 명확하지 않다. 또한, 뉴클레오타이드 서열의 차이는 클론테크가 시판하고 있는 폴리(A)⁺RNA가 백인 기원인 반면에 염색체 DNA는 일본인 기원이기 때문에 인종적 차이에 의해 기인될 수 있는 것으로 암시되었다.

대장균 균주 DH5에 포함된 벡터 pHGT1은 내셔날 인스티튜트 오브 바이오사이언스 앤드 휴먼-테크놀로지, 에이전시 오브 인더스트리얼 사이언스 앤드 테크놀로지, 미니스트리 오브 인터내셔날 트레이드 앤드 인더스트리, 일본에 기탁번호 FERM BP-4616으로 1994. 3. 24일에 본 발명자들에 의해 기탁되었다.

[실시예 26]

COS1 세포에서 인간 TPO 염색체 DNA의 발현 및 TPO 활성의 확인

서브 클로닝하여 얻은 플라스미드 클론 pHGT1은 총 4개의 EcoRI 인식서열을 포함했는데, 그중 3개는 삽입 분자에 또 1개는 벡터내에 있었다. 뉴클레오타이드 서열 분석에 따르면 전체 인간 TPO 단백질-코딩 영역은 삽입분자의 5′측에 가장 가까운 EcoRI 인식서열과 벡터에서의 EcoRI 인식 서열 사이에 개재된 약 4.3kbp의 DNA 단편에 포함되는 것으로 나타났다. 따라서, 이 단편을 EcoRI-처리 발현 벡터 pEF18S에 결찰시켜 4개의 인간 TPO 발현 플라스미드 pEFHGTE#1-4를 얻었다(제11도 참조). 이 플라스미드 DNA들을 제조함으로써 발현실험을 수행하였다. 기본적으로 Molecular Cloning(샘브룩 등, 콜드 스프링 하버 래보라토리 프레스, 1989)에 기술된 과정에 따라 플라스미드 DNA를 정제하여 약 250㎍의 플라즈미드 DNA를 얻었다.

실시예 11의 과정에 따라 얻어진 클론 pEFHGTE#1-4를 사용하여 COS1 세포를 형질감염시켰다. 즉, 클로로킨 처리를 포함하는 DEAE-덱스트란 방법에 의해 10㎍의 플라스미드 DNA로써 형질감염을 수행하였다. 형질감염된 COS 1 세포를 37℃에서 3일동안 배양시켜 상청액을 수집하였다.

얻어진 배양 상청액을 IMDM 배양배지에 대하여 광범위하게 투석하여 랫트 CFU-MK 분석계로 평가했다. 4개 클론 (pEFHGTE#1-4)각각이 발현된 COS1 세포의 배양 상청액에서 투여량 의존 방식으로 TPO 활성이 검출되었다. 반대로, 플라스미드 pEF18S만 발현된 COS1 세포의 배양 상청액에서는 TPO 활성이 발견되지 않았다. pEFHGTE#1에 대한 대표적인 데이타를 제12(a)도에 도시하였다. M-07e 분석계에서 유사한 결과를 얻었다. 4개 클론 (pEFHGTE#1-4) 각각이 발현된 COS1 세포의 배양 상청액은 투여량 의존 방식으로 M-07e 세포 증식을 현저히 증가시켰다. pEFHGTE#1에 대한 대표적인 데이타를 제12(b)도에 도시하였다.

이 결과들은 플라스미드 클론 pEFHGTE#1-4가 인간 TPO의 기능적인 염색체 DNA를 포함하는 것을 입증하였다.

[실시예 27]

인간 TPO 결실형 DNA의 제조 및 그것의 COS1 세포에서의 발현 및 TPO 활성의 확인

실시예 18의 결과는 인간 TPO가 세 번재 카르복실의 제거후에도 그것의 생물학적 활성을 나타낸다는 것을 가르키고 있다. 따라서, 생물학적으로 활성인 단백질을 더 평가하기 위하여 결실 유도체 실험을 수행하였다. 이 실시예에서는 pHT1-231에 의해 코딩된 TPO 단백질(아미노산 1-231)의 카르복시-말단 단부로부터 20, 40, 60 및 68 아미노산이 없는 TPO 결실 유도체가 실험관내에서 생물학적 활성을 나타내는지 시험하였다. 가장 짧은 유도체(1-163)는 여전히 실시예 2에서 기술된 랫트 혈청 TPO의 TP/2/3에 상응하는 아미노산 서열을 포함했다. 또 실시예 18에서 얻은 플라스미드 클론 pHT1-231의 DNA를 주형으로 하고 합성된 뉴클레오타이드를 프라이머로 사용하여 PCR에 의해 결실 플라스미드를 제조했다. PCR용으로 사용되는 프라이머의 서열은 다음과 같다:

(EcoRI 인식서열을 서열 4에서의 위치 1-21의 서열에 부가함으로써 제조; 이것은 제9도에 기술된 것과 동일 서열이다);

(위치 1-163 아미노산 잔기를 코딩하는 결실 유도체 제조에 사용하기 위한 NotI 인식서열과 두 개의 종지 코돈 TAA 및 TGA를 첨가함으로써 제조된, 서열 4에서의 위치 555-576 서열에 상응하는 안티센스 프라이머);

(위치 1-171 아미노산 잔기를 코딩하는 결실 유도체 제조에 사용하기 위한 NotI 인식서열 및 두 개의 종지 코돈 TAA와 TGA를 첨가함으로써 제조된, 서열 4에서의 위치 576-600 서열에 상응하는 안티센스 프라이머);

(위치 1-191 아미노산 잔기를 코딩하는 결실 유도체 제조에 사용하기 위한 NotI 인식 서열과 두 개의 종지 코돈 TAA 및 TGA를 첨가함으로써 제조된, 서열 4에서의 위치 636-660의 서열에 상응하는 안티센스 프라이머); 및

(위치 1-211 아미노산 잔기를 코딩하는 결실 유도체의 제조에 사용하기 위한 NotI 인식서열 및 두 개의 종지 코돈 TAA와 TGA를 첨가함으로써 제조된, 서열 4에서의 위치 696-720의 서열에 상응하는 안티센스 프라이머).

실시예 18에서 얻은 플라스미드 클론 pHT1-231의 플라스미드 DNA 1 ㎍을 주형으로하고, 합성된 hTPO-5(5′측용) 및 hTPO -2, -3, -4 및 -S(3′ 측용) 각각 10μM를 프라이머로 하고 또 AmpliTaq^TMDNA 폴리머라제를 갖는 GeneAmp^TMPCR 시약 키트(다까라 스조 제조)를 사용하여 GeneAmp^TMPCR 시스템 9600(퍼킨-엘머 제조)에 의해 각 사이클이 95℃에서 1분간 변성시키고, 65℃에서 1분간 어닐링한 다음 72℃에서 1분간 합성하고 이어서 72℃에서 7분간 최종 배양하는 것으로 이루어지는 총 20 사이클을 반복함으로써 100㎕의 부피로 PCR을 실시하였다. 각 PCR에 의해 얻어진 밴드를 제한효소 EcoRI 및 NotI으로 분해시키고 그 분해물을 1% 아가로오스 겔(FME BioProducts 제조) 전기영동하여 각 PCR로 증폭된 예상 크기를 갖는 주 DNA 단편을 분리하였다. Prep-A-Gene DNA 정제 키트(바이오-래드 제조)를 사용하여 분리된 DNA 단편을 정제하고 동일한 제한 효소로 미리 처리된 발현 벡터 pEF18S에 서브클론 했다. 이 경우에 숙주 균주로서 도요보에 의해 제조된 고 수용 대장균 DH5가 사용되었다. 각 PCR로부터 생성된 형질전환체로부터 기본적으로 Molecular Cloning (샘브룩 등, 콜드 스프링 하버 래보라토리 프레스, 1989)에 기술된 과정에 따라 플라스미드 DNA 샘플을 제조하기 위하여 에상 크기의 삽입물을 함유하는 4-5개 클론을 선택했다. 그러한 일련의 작업에서는 플라스미드 DNA 샘플을 위치 1-163 아미노산 잔기를 코딩하는 삽입 유도체(pHT1-163#1-5), 위치 1-171 아미노산 잔기를 코딩하는 결실 유도체(pHT1-171#1-4), 위치 1-191 아미노산 잔기를 코딩하는 결실 유도체(pHT1-191#1-4) 및 위치 1-211 아미노산 잔기(pHT1-211#1-4)를 코딩하는 결실유도체(pHT1-211#1-4)로부터 얻었다. 각 플라스미드 DNA의 증폭된 부위의 전체길이를 뉴클레오타이드 서열 분석하여 그것의 서열 4에 도시된 뉴클레오타이드 서열과의 완전 동일성을 발견하였다.

상기 수득한 플라스미드를 이용하여 COS1 세포를 실시예 11의 과정에 따라 형질감염시켰다. 즉, 클로로킨 처리를 포함하는 DEAE-덱스트란 방법에 의해 10㎍의 플라스미드 DNA로써 형질감염을 수행하였다. 형질감염된 COS1 세포를 3일동안 배양시켜 상청액을 수집하였다.

수득한 배양 상청액을 IMDM 배양배지에 대하여 광범위하게 투석하여 랫트 CFU-KM 분석계로 평가했다. pHT1-211, pHT1-191, pHT1-171 또는 pHT1-163 각각이 발현된 COS1 세포의 배양 상청액에서 투여량 의존 방식으로 TPO 활성이 발견되었다. pHT1-121#1, pHT1-191#1 및 pHT1-171#2에 관한 대표적인 데이타를 제13(a)도에 도시하고 또 pHT1-163#2에 관한 데이타는 제13(b)도에 도시하였다. M-07e 분석계에서 유사한 결과를 얻었다. pHT1-211, pHT1-191, pHT1-171 또는 pHT1-163 각각이 발현된 COS1 세포의 배양 상청액은 M-07e 세포증식을 매우 증가시켰다. pHT1-211#1, pHT1-191#1 및 pHT1-171#2 또는 pHT1-163#2에 관련한 대표적인 데이타는 제14도에 도시하였다.

이 결과들은 인간 TPO가 Ser (위치 163) 이후의 카르복시-말단 절반이 결실된 후에도 시험관내에서 생물학적 활성을 유지함을 나타내며 이는 인간 TPO의 생물학적 활성부분이 Ser(위치 163)에서 종료하는 아미노-말단 절반내에서 위치하는 것을 암시했다.

[실시예 28]

C-말단 결실형 인간 TPO의 제조 및 그것의 COS1 세포에서의 발현과 형성

활성을 나타내는 인간 TPO 단백질에 필요한 영역을 분석하기 위하여 실시예 27에서 얻은 결실 유도체로부터 C-말단 아미노산을 더 결실시키고 COS1 세포에서 발현된 TPO 활성을 검사했다. 실시예 16에서 얻은 플라스미드 클론 pEF 18S-HL34를 사용하여 163 위치 세린에서 출발하는 C-말단 아미노산 잔기를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 결실시킴으로써 발현 플라스미드를 제조했다. 이러한 결실 플라스미드의 작제는 PCR을 사용하여 달성하였다. PCR에 사용하기 위한 프라이머의 서열은 다음과 같다.

(서열 4에서의 위치 1-21의 서열에 EcoRI 인식 서열을 부가함으로써 제조; 실시예 18에 도시된 것과 동일한 서열);

(서열 4에서의 위치 514-537의 서열에 상응하는 안티센스 프라이머; 위치 1-150의 아미노산 서열을 코딩하는 결실 돌연변이체의 제조에 사용하기 위한 NotI 인식서열과 2개의 종지코돈 TAA 및 TGA를 첨가함으로써 제조);

(서열 4에서의 위치 518-540의 서열에 상응하는 안티센스 프라이머; 위치 1-151의 아미노산 잔기를 코딩하는 결실 유도체의 제조에 사용하기 위한 NotI 인식서열과 2개의 종지 코돈 TAA 및 TGA를 첨가함으로서 제조);

(서열 4에서의 위치 526-546의 서열에 상응하는 안티센스 프라이머; 위치 1-153의 아미노산 잔기를 코딩하는 결실 유도체의 제조에 사용하기 위한 NotI 인식서열과 2개의 종지코돈 TAA 및 TGA를 첨가함으로써 제조);

(서열 4에서의 위치 529-549의 서열에 상응하는 안티센스 프라이머; 위치 1-154의 아미노산 잔기를 코딩하는 결실 유도체의 제조에 사용하기 위한 NotI 인식서열과 2개의 종지코돈 TAA 및 TGA를 첨가함으로써 제조);

(서열 4에서의 위치 532-552의 서열에 상응하는 안티센스 프라이머; 위치 1-154의 아미노산 잔기를 코딩하는 결실 유도체의 제조에 사용하기 위한 NotI 인식서열과 2개의 종지코돈 TAA 및 TGA를 첨가함으로써 제조);

(서열 4에서의 위치 535-555의 서열에 상응하는 안티센스 프라이머; 위치 1-156의 아미노산 잔기를 코딩하는 결실 유도체의 제조에 사용하기 위한 NotI 인식서열과 2개의 종지코돈 TAA 및 TGA를 첨가함으로써 제조);

(서열 4에서의 위치 538-558의 서열에 상응하는 안티센스 프라이머; 위치 1-157의 아미노산 잔기를 코딩하는 결실 유도체의 제조에 사용하기 위한 NotI 인식서열과 2개의 종지코돈 TAA 및 TGA를 첨가함으로써 제조).

실시예 16에서 얻은 플라스미드 클론 pEF18S-HL34의 플라스미드 DNA 1㎍을 주형으로하고 헙성된 각 올리고뉴클레오타이드(5′측에 대한 hTPO-5 및 3′측에 대한 hTPO-150, -151, -153, -154, -155, -156 및 -157) 10μM를 프라이머로 사용하여 PCR을 수행했다. PCR 반응은 Amplitaq^TMDNA 플라이머라제를 갖는 GeneAmp^TMPCR 시약 키트(다까라 스조 제조)를 사용하여 GeneAmp^TMPCR 시스템 9600(퍼킨-엘머 제조)에 의해 각 사이클이 95℃에서 1분간 변성시키고, 66℃에서 1분간 어닐링하며 또 72℃에서 1분간 합성한 다음 72℃에서 7분간 최종 배양하는 것으로 이루어진 총 20사이클을 반복함으로써 100㎕ 의 부피로 실시하였다. 각 PCR에 의해 수득한 밴드를 제한효소 EcoRI 및 NotI로 분해시키고 그 분해물을 1% 아가로오스 겔(FMC BioProducts 제조) 전기영동하여 각 PCR에 의해 예상크기를 갖는 주 DNA 단편을 분리하였다. Prep-A-Gene DNA 정제키트(바이오-래드 제조)를 사용하여, 분리된 DNA 단편을 정제하고 동일한 제한효소로 미리 처리시킨 발현벡터 pEF18S에 서브 클로닝했다. 이 경우에 숙주균주로서 도요보에 의해 제조된 고 수용 대장균 DH5가 사용되었다. 각 PCR로부터 생성된 형질전환체로부터 기본적으로 Molecular Cloning (샘브룩 등, 콜드 스프링 하버 래보라토리 프레스, 1989)에 기술된 과정에 따라 플라스미드 DNA 샘플을 제조하기 위하여 예상크기의 삽입물을 함유하는 3-5개 클론을 선택했다. 그러한 일련의 작업에 의해 위치 1-150 아미노산 잔기를 코딩하는 삽입 유도체(pHT1-150#21, 22 및 25), 위치 1-151 아미노산 잔기를 코딩하는 결실 유도체(pHT1-151#16, 17 및 18), 위치 1-153 아미노산 잔기를 코딩하는 결실 유도체(pHT1-153#1-5), 위치 1-154 아미노산 잔기를 코딩하는 결실 유도체(pHT1-154#1-5), 위치 1-155 아미노산 잔기를 코딩하는 결실 유도체(pHT1-155#1-5), 위치 1-156 아미노산 잔기를 코딩하는 결실 유도체(pHT1-156#1-5) 및 위치 1-157 아미노산 잔기를 코딩하는 결실 유도체(pHT1-157#1-5)로부터 플라스미드 DNA 샘플을 수득하였다.

상기 정제된 플라스미드 DNA 샘플들중 pHT1-150#21, 22 및 25와 pHT1-151#16, 17 및 18의 서열을 Taq Dye Deoxy^TM터미네이터 사이클 서열결정 키트(어플라이드 바이오 시스템스 제조)를 사용하여 어플라이드 바이오 시스템스에서 제조된 373A DNA 서열결정기로 측정함으로써 예상되는 TPO cDNA 서열이 전체 뉴클레오타이드 서열에 걸쳐 치환되지 않음을 확인했다.

실시예 11의 과정에 따라 상기 수득한 클론을 사용하여 COS1 세포를 형질감염시켰다. 즉, 클로로킨 처리를 포함하는 DEAE-덱스트란법으로 각 플라스미드 DNA 샘플 10㎍으로 형질감염시키고 배양 3일 후 배양 상청액을 회수했다. 얻어진 배양 상청액을 상기에 기술된 IMDM 배양배지에 대하여 투석하고 M-07e 분석계로 평가했다. 1-151 위치 아미노산, 1-153 위치 아미노산, 1-154 위치 아미노산, 1-155 위치 아미노산, 1-156 위치 아미노산, 또는 1-157 위치 아미노산으로 이루어진, C-말단 결실 유도체를 코딩하는 각 클론들로 형질감염된 COS1 세포의 배양 상청액에서 TPO 활성이 검출되었다. 이 유도체들 모두는 위치 151에 시스테인 잔기를 함유한다. 그러나, 151 위치에 있는 시스테인 잔기가 결실된 1-150 위치 아미노산으로 이루어진 C-말단측 결실 유도체를 코딩하는 클론으로 형질감염된 COS1 세포의 배양 상청액에서는 TPO 활성이 검출되지 않았다.

[실시예 29]

N-말단 결실형 인간 TPO의 제조 및 COS1 세포에서의 그것의 발현과 활성

생물학적인 활성이 나타나는 TPO 단백질에 필요한 영역을 분석하기 위하여 실시예 28에서 수득한 결실 유도체중 N-말단 측 아미노산을 추가로 결실시켜 제조한 결실 유도체의 TPO 활성 발현을 검사했다. 실시예 16에서 수득한 플라스미드 클론 pEF18S-HL34 및 실시예 27에서 수득한 플라스미드 클론 pHT1-163을 사용하여 시그널 서열 이후의 N-말단 아미노산 잔기를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 결실시킴으로써 발현 플라스미드를 제조했다. PCR을 사용하여 결실 플라스미드를 작제했다. PCR에서 사용하기 위하여 제조된 프라이머의 서열은 다음과 같다.

(서열 4에서의 위치 1-21의 서열에 EcoRI 인식서열을 첨가함으로써 제조; 실시예 18에 도시된 것과 동일 서열)

(서열 4에서의 위치 757-780의 서열에 상응하는 안티센스 프라이머; 8개의 종결코돈 TAA와 TGA 및 NotI 인식서열을 첨가하여 제조; 위치 1-231 아미노산 잔기를 코딩하는 결실 유도체의 제조에 사용하기 위하여 합성된 것과 동일서열);

(서열 4에서의 위치 555-576의 서열에 상응하는 안티센스 프라이머; 위치 1-163 아미노산 잔기를 코딩하는 결실 유도체의 제조);

(서열 4에서의 위치 124-173; 위치 1-12의 아미노산 잔기가 결실된 유도체의 제조에 사용하기 위하여 제조);

(서열 4에서의 위치 64-87 및 124-148의 서열에 상응하는 안티센스 프라이머; 위치 1-12 아미노산 잔기가 결실된 유도체의 제조에 사용하기 위하여 제조);

(서열 4에서의 위치 106-154 ; 위치 1-6 아미노산 잔기가 결실된 유도체의 제조에 사용하기 위하여 제조);

(서열 4에서의 위치 64-87 및 106-129의 서열에 상응하는 안티센스 프라이머; 위치 1-6 아미노산 잔기가 결실된 유도체의 제조에 사용하기 위하여 제조);

(서열 4에서의 위치 109-157의 서열에 상응하는 안티센스 프라이머; 위치 1-7 아미노산 잔기가 결실된 유도체의 제조에 사용하기 위하여 제조); 및

(서열 4에서의 위치 64-87 및 109-132의 서열에 상응하는 안티센스 프라이머, 위치 1-7 아미노산 잔기가 결실된 유도체의 제조에 사용하기 위하여 제조).

(1) 위치 1-12의 아미노산 잔기가 결실된 유도체(pHT13-231)의 제조

실시예 18에서 얻은 플라스미드 클론 pEF18S-HL34의 플라스미드 DNA 1.4㎍을 주형으로 하고 합성된 올리고뉴클레오타이드(하나의 조합으로 hTPO-13 및 hTPO 3 그리고 또다른 조합으로 hTPO-5 및 hTPO-13R) 각각 5μM를 플라이머로서 사용하여 PCR을 수행했다. Amplitaq^TMDNA 폴리머라제를 갖는 GeneAmp^TMPCR 시약 키트를 사용하고 geneAmp^TMPCR 시스템 9600(퍼킨-엘머 제조)을 사용하여, 90℃에서 5분간 변성시킨 후, 각 사이클이 95℃에서 1분간 변성시키고, 65℃에서 1분간 어닐링시킨 다음 72℃에서 1분간 합성하고 이어서 72℃에서 7분간 최종 배양하는 것으로 이루어지는 총 30 사이클을 반복하여 100㎕의 부피로 PCR을 수행했다. 각 PCR 생성물을 1.2% 아가로오스 겔(FMC BioProducts 제조) 전기영동하여 예상 크기를 갖는 주 DNA 단편을 분리하였다. 이어서 Prep-A-Gene DNA 정제 키트(바이오-래드 제조)를 사용하여, 분리된 DNA 단편을 정제하고 15㎕ 의 완충액에 용해시켰다. 그후, 각 제조된 용액의 1㎕ 부분을 주형으로 사용하여 제 2 PCR을 수행했다.

제 2 PCR은 합성된 프라이머(hTPO-5 및 hTPO3) 각각 5μM를 사용하여 실행했다. Amplitaq^TMDNA 플리머라제를 갖는 GeneAmp^TMPCR 시약 키트(다까라 스조 제조)를 사용하고 GeneAmp^TMPCR 시스템 9600(퍼킨-엘머 제조)을 사용하며 95℃에서 5분간 변성시킨 후 각 사이클이 95℃에서 1분간 변성시키고, 60℃에서 1분간 어닐링하며 72℃에서 1분간 합성한 다음 72℃에서 7분간 최종 배양하는 것으로 이루어지는 총 20 사이클을 반복하여 100㎕ 의 부피로 PCR을 수행했다. 각 PCR 생성물을 1.2% 아가로오스 겔(FMC BioProducts 제조) 전기영동처리하여 예상 크기를 갖는 주 DNA 단편을 분리하였다. 이어서 Prep-A-Gene DNA 정제 키트(바이오-래드 제조)를 사용하여, 분리된 DNA 단편을 정제하고 TE 완충액 15㎕ 에 용해시켰다. 동일한 제한 효소 EcoRI 및 NotI으로 분해시킨 후 생성한 용액을 동일 부피의 페놀/클로로포름으로 추출하고 에탄올 침전시켰다. 원심분리후 생성한 침전물을 15㎕ 의 TE에 용해시키고 제한 효소로 미리 처리된 발현벡터 pEF18S에 서브클로닝했다. 이 경우에 숙주 균주로서 도요보에 의해 제조된 고 수용 대장균 DH5가 사용되었다. 각 형질전환체로부터 기본적으로 Molecular cloning(샘브룩 등, 콜드 스프링 하버 래보라보리 프레스, 1989)에 기술된 과정에 따라 플라스미드 DNA 샘플을 제조하기 위하여 예상 크기의 삽입물을 함유하는 45개 클론을 선택했다. 이렇게하여 위치 1-12의 아미노산 잔기가 위치 1-231의 원 아미노산 잔기로부터 결실된 단백질 분자를 코딩하는 결실 유도체(pHT13-231)의 플라스미드 DNA를 얻을 수 있었다. 이 45개 클론들을 프라이머 hTPO-5 및 hTPO3을 사용하여 PCR처리했을 때 거의 예상되는 크기를 갖는 삽입물이 8개 클론에서 확인되었다. 이들중 3개 클론의 서열을 Taq Dye Deoxy^TM터미네이터 사이클 서열결정 키트(어플라이드 바이오시스템스 제조)를 사용하여 어플라이드 바이오 시스템스에 의해 재조된 373A DNA 서열결정기로 체크함으로써 설계된 것과 같은 TPO cDNA 서열 및 예상된 것과 같은 전체 뉴클레오타이드 서열에서 치환 등이 없는 결실을 갖는 클론 pHT13-231#3을 얻었다.

(2) 위치 1-6의 아미노산 잔기가 결실된 유도체(pHT 7-163)의 제조

이 경우에는 231 위치 아미노산이 상기 단계(1) 결실 유도체를 제조하기 위한 TPO 단백질의 C-말단으로서 설계되었음에도 불구하고 C-말단 아미노산이 결실되었을 때 조차도 TPO 활성이 발현될 수 있었기 때문에 163 위치 아미노산은 결실 유도체를 제조하기 위한 C-말단으로서 사용되었다. 같은 이유로 인하여 163 위치 아미노산은 단계(3)에서도 C-말단으로 사용되었다. 실시예 27에서 수득한 플라스미드 클론 pHT1-163의 플라스미드 DNA 1.4㎍을 주형으로 하고 또 합성된 올리고 뉴클레오타이드(하나의 조합으로 hTPO-7 및 hTPO-S 그리고 또다른 조합으로 hTPO-5 및 hTPO-7R) 각각 5μM을 프라이머로하여 PCR을 실시하였다. Amplitaq^TMDNA 폴리머라제를 갖는 GeneAmp^TMPCR 시약 키트(다까라 스조 제조)를 사용하고 GeneAmp^TMPCR 시스템 9600(퍼킨-엘머 제조)으로 95℃에서 5분간 변성시킨 후 각 사이클이 95℃에서 1분간 변성시키고, 65℃에서 1분간 어닐링하며 72℃에서 1분간 합성한 다음 72℃에서 7분간 최종 배양하는 것으로 이루어지는 총 30 사이클을 반복하여 100㎕ 의 부피로 PCR을 수행했다. 각 PCR 생성물을 1.2% 아가로오스 겔(FMC BioProducts 제조) 전기영동하여 예상 크기를 갖는 주 DNA 단편을 분리하였다. 이어서 Prep-A-Gene DNA 정제 키트(바이오-래드 제조)를 사용하여, 분리된 DNA 단편을 정제하고 15㎕ 의 TE완충액에 용해시켰다. 그후, 각 제조된 용액의 1㎕ 부분을 주형으로 사용하여 제 2 PCR을 수행했다.

합성된 프라이머(hTPO-5 및 hTPO-S) 각각 5μM를 사용하여 제 2 PCR을 수행했다. Amplitaq^TMDNA 플라머라제를 갖는 GeneAmp^TMPCR 시약 키트(다까라 스조 제조)를 사용하여 GeneAmp^TMPCR 시스템 9600(퍼킨-엘머 제조)을 사용하며 95℃에서 5분간 변성시킨 후 각 사이클이 95℃에서 1분간 변성시키고, 60℃에서 1분간 어닐링하며 72℃에서 1분간 합성한 다음 72℃에서 7분간 최종 배양하는 것으로 이루어진는 총 30 사이클을 반복하여 100㎕ 의 부피로 PCR을 수행했다. 각 PCR 생성물을 1.2% 아가로오스 겔(FMC BioProducts 제조) 전기영동처리하여 예상 크기를 갖는 주 DNA 단편을 분리하였다. 이어서 Prep-A-Gene DNA 정제 키트(바이오-래드 제조)를 사용하여, 분리된 DNA 단편을 정제하고 TE 완충액 15㎕ 에 용해시켰다. 제한 효소 EcoRI 및 NotI으로 분해시킨 후 생성한 용액을 동 부피의 페놀/클로로포름으로 추출하고 에탄올 침전시켰다. 원심분리후, 생성한 침전물을 15㎕ 의 TE 완충액에 용해시킨 다음 동일 제한효소로 미리 처리된 발현벡터 pEF18S에 서브클로닝했다. 이 경우에 숙주 균주로서 도요보에 의해 제조된 고 수용 대장균 DH5가 사용되었다. 각 형질전환체로부터 기본적으로 Molecular cloning(샘브룩 등, 콜드 스트링 하버 래보라보리 프레스, 1989)에 기술된 과정에 따라 플라스미드 DNA 샘플을 제조하기 위하여 예상 크기의 삽입물을 함유하는 30개 클론을 선택했다. 이렇게하여 위치 1-6의 아미노산 잔기가 서열 4에서의 위치 1-163의 원 아미노산 잔기로부터 결실된 단백질 분자를 코딩하는 결실 유도체(pHT7-163)의 플라스미드 DNA를 얻을 수 있었다. 이 클론들을 프라이머 hTPO-5 및 hTPO-S를 사용하여 PCR처리했을 때 거의 예상되는 크기를 갖는 삽입물이 모든 클론에서 확인되었다. 이들중 3개 클론의 서열을 Taq Dye Deoxy^TM터미네이터 사이클 서열결정 키트(어플라이드 바이오시스템스 제조)를 사용하여 어플라이드 바이오 시스템스에 의해 재조된 373A DNA 서열결정기로 체크함으로써 설계된 것과 같은 TPO cDNA 서열 및 예상된 것과 같은 전체 뉴클레오타이드 서열에 치환 등이 없는 결실을 갖는 2개 클론 pHT7-163#4 및 #29를 얻었다.

(3) 위치 1-7의 아미노산 잔기가 결실된 유도체(pHT8-163)의 제조

상술한 위치 1-6의 아미노산의 결실을 갖는 유도체(pHT7-163) 제조와 동일한 방법으로 위치 1-7의 아미노산 잔기가 결실된 유도체(pHT8-163)를 제조했다. 실시예 27에서 얻은 플라스미드 클론 pHT1-163의 플라스미드 DNA 1㎍을 주형으로 하고 합성된 올리고뉴클레오타이드(하나의 조합으로 hTPO-8 및 hTPO-S 그리고 또다른 조합으로 hTPO-5 및 hTPO-8R) 각각 5μM을 프라이머로 하여 PCR을 실시하였다. Amplitaq^TMDNA 폴리머라제를 갖는 GeneAmp^TMPCR 시약 키트(다까라 스조에 의해 제조)를 사용하고 GeneAmp^TMPCR 시스템 9600(퍼킨-엘머 제조)에 의해 95℃에서 5분간 변성시킨 후 각 사이클이 95℃에서 1분간 변성시키고, 65℃에서 1분간 어닐링한 다음 72℃에서 1분간 합성한 다음 72℃에서 7분간 최종 배양하는 것으로 이루어진 총 30 사이클을 반복하여 100㎕ 의 부피로 PCR을 수행했다. 각 PCR 생성물을 1.2% 아가로오스 겔(FMC BioProducts 제조) 전기영동처리하여 예상 크기를 갖는 주 DNA 단편을 분리하였다. 이어서 Prep-A-Gene DNA 정제 키트(바이오-래드 제조)를 사용하여, 분리된 DNA 단편을 정제하고 TE 완충액 15㎕에 용해시켰다. 그후, 각 제조된 용액의 1㎕ 부분을 주형으로 사용하여 제 2 PCR을 수행했다.

제 2 PCR은 합성된 프라이머(hTPO-5 및 hTPOS) 각각 5μM를 사용하여 실행했다. Amplitaq^TMDNA 폴리머라제를 갖는 GeneAmp^TMPCR 시약 키트(다까라 스조 제조)를 사용하고 GeneAmp^TMPCR 시스템 9600(퍼킨-엘머 제조)에 의해 95℃에서 5분간 변성시킨 후 각 사이클이 95℃에서 1분간 변성시키고, 60℃에서 1분간 어닐링한 다음 72℃에서 1분간 합성하고 이어 72℃에서 7분간 최종 배양하는 것으로 이루어진 총 30 사이클을 반복하여 100㎕ 의 부피로 PCR을 수행했다. 각 PCR 생성물을 1.2% 아가로오스 겔(FMC BioProducts 제조) 전기영동처리하여 예상 크기를 갖는 주 DNA 단편을 분리하였다. 이어서, Prep-A-Gene DNA 정제 키트(바이오-래드 제조)를 사용하여, 분리된 DNA 단편을 정제하고 TE 완충액 15㎕ 에 용해시켰다. 그 제한 효소 EcoRI 및 NotI으로 분해시킨 후 생성한 용액을 동부피의 페놀/클로로포름으로 추출하고 또 에탄올 침전시켰다. 원심분리후 생성한 침전물을 15㎕ 의 TE에 용해시키고 제한효소로 미리 처리된 발현벡터 pEF18S에 서브클로닝했다. 이 경우 숙주균주로서 도요보에 의해 제조된 고 수용 대장균 DH5가 사용되었다. 각 형질전환체로부터 기본적으로 Molecular cloning(샘브룩 등, 콜드 스프링 하버 래보라보리 프레스, 1989)에 기술된 과정에 따라 플라스미드 DNA 샘플을 제조하기 위하여 예상 크기의 삽입물을 함유하는 30개 클론을 선택했다. 이렇게 하여 위치 1-7의 아미노산 잔기가 서열 4에서의 위치 1-163의 원 아미노산 잔기로부터 결실된 단백질 분자를 코딩하는 결실 유도체(pHT8-163)의 플라스미드 DNA를 얻을 수 있었다. 이 클론들을 프라이머 hTPO-5 및 hTPO-S를 사용하여 PCR처리했을 때 거의 예상되는 크기를 갖는 삽입물이 모든 클론에서 확인되었다. 이들중 3개 클론의 서열을 Taq Dye Deoxy^TM터미네이터 사이클 서열결정 키트(어플라이드 바이오시스템스 제조)를 사용하여 어플라이드 바이오 시스템스에 의해 제조된 373A DNA 서열결정기로 체크함으로써 설계된 것과 같은 TPO cDNA 서열 및 예상된 것과 같은 전체 뉴클레오타이드 서열에서 치환 등이 없는 결실 부위를 갖는 2개 클론 pHT8-163#33 및 #48을 얻었다.

(4) COS1 세포에서 결실 유도체의 발현 및 TPO 활성의 확인

수득한 결실 클론 각각으로 COS1 세포를 실시예 11의 과정에 따라 형질감염시켰다. 즉, 클로로킨 처리를 포함하는 DEAE-덱스트란 방법으로 10㎕ 의 각 플라스미드 DNA로써 형질감염시켜 그 배양 상청액을 배양 3일 후 회수했다. 수득한 배양 상청액을 상기한 IMDM 배지에 대하여 완전히 투석하고 M-07e 분석계로 평가했다.

그 결과, 7-163 위치 아미노산으로 이루어진 결실 유도체를 코딩하는 클론으로 형질감염된 COS1 세포의 배양 상청액에서 약하지만 의미있는 TPO 활성이 검출되었다. 그러나, 8-163 위치 아미노산 또는 13-231 위치 아미노산으로 이루어진 결실 유도체를 코딩하는 클론으로 형질감염된 COS1 세포의 배양 상청액에는 TPO 활성이 검출되지 않았다.

[실시예 30]

완전한 길이의 인간 TPO의 cDNA 플라스미드(pHTP1)의 제조

서열 6에서 추정되는 인간 TPO cDNA의 모든 아미노산 코딩 부위를 갖는 발현벡터를 포유동물 세포에서 발현시키기위해 삭제했다.

모든 인간 TPO cDNA 코딩 부위를 커버하는 DNA 단편을 제조하기 위하여 하기 방법으로 CPR을 수행했다.

사용된 프라이머의 뉴클레오타이드 서열은 하기와 같다:

(서열 6에서의 위치 105-125);

(서열 6에서의 위치 745-765의 서열에 상응하는 안티센스 프라이머);

(서열 6에서의 위치 503-523); 및

(서열 6에서의 위치 1066-1086의 서열에 상응하는 안티센스 서열에 제한효소 NotI 인식서열 및 GAGAGA 서열 (서열 82)을 첨가함으로써 제조된 서열).

실시예 16에서 수득한 플라스미드 클론 pEF18S-HL34 300ng을 주형으로 사용하여 첫 번째 PCR을 수행하였다. 프라이머 hTPO-I 및 SA 각각 1.5μM 및 Vent R^TMDNA 폴리머라제(New England Biolabs 제조) 1 유니트를 사용하여 PCR(각 사이클이 96℃에서 1분간, 62℃에서 1분간 및 72℃에서 1분간 배양한 다음 72℃에서 7분간 최종배양하는 것으로 이루어진 총 30 사이클 반복)을 수행했다. 최종농도에서 반응용액의 조성은 다음과 같다: 10mM KCl, 10mM(NH₄)₂SO₄, 20mM Tris-HCl(pH 8.8), 2mM MgSO₄, 0.1% 트리톤 X-100 및 200μm dNTP 혼합물.

인간의 정상 간으로부터 유도된, 시판되는 폴리(A)⁺RNA 제제(클론테크 제조)중 1㎍ 부분을 70℃에서 10분동안 가열하고 얼음으로 빠르게 냉각 시킨 다음 10mM의 DTT, 500μM의 dNTP혼합물, 25ng의 랜덤 프라이머(다까라 스조 제조), 10뉴니트의 RNase 억제제(베링거-만하임 제조) 및 200유니트의 SuperScript^TMII RNase 억제제(베링거-만하임 제조) 및 200 유니트의 SuperScript^TMII RNase H^-(LIFE TECHNOLOGIES 제조)와 혼합하고 37에서 1시간동안 배양하여 cDNA의 합성을 수행하였다. 그후, 합성된 cDNA 반응용액의 1/20부피를 주형으로 하고, 프라이머 hTPO-P 및 hTPO-KO 각각 2.5μM 및 Amplitaq^TMDNA 폴리머라제(다까라 스조 제조) 2.5 유니트를 사용하여 두 번째 PCR(각 사이클이 96℃에서 1분간, 58℃에서 1분간 그리고 72℃에서 1분간 배양하는 것으로 구성된 총 30 사이클 반복)을 수행했다.

첫 번째 및 두 번째 PCR의 최종 용액 각각을 1% 아가로오스 겔 전기영동처리하여 예상되는 크기의 각 주요 DNA 단편을 분리하고 Prep-A-Gene DNA 정제 키트(Bio-Rad 제조)를 사용하여 그 단편을 정제했다. 그 후, 상기 제조된 용액의 각 1/20부피를 주형으로 사용하여 세 번째 PCR을 수행했다. 이 반응(96℃에서 2분동안 가열한 다음 각 사이클이 96℃에서 2분동안 그리고 72℃에서 2분동안 배양하고 72℃에서 7분간 배양하는 것으로 이루어진 총 3사이클 반복)은 Vent R^TMDNA 폴리머라제(New England Biolabs 제조) 1 유니트를 사용하여 수행했다. 이 반응 용액을 hTPO-I 및 hTPO-KO 각각 1μM과 혼합하고 96℃에서 2분간 가열한 다음 1사이클이 96℃에서 1분간, 62℃에서 1분간 또 72℃에서 1분간 배양하고 이어 72℃에서 7분간 배양하는 것으로 이루어진 총 25 사이클을 행하였다. 생성한 반응용액을 동부피의 물 포화 페놀-클로로포름으로 추출하고 동부피의 클로로포름으로 추출한 다음 그 추출물을 에탄올 침전시켜(0.3M 아세트산나트륨 및 베링거-만하인에 의해 제조된 0.5㎕ 의 글리코겐 존재하에서 2.5부피의 에탄올)DNA를 회수했다. 회수된 DNA를 제한효소 BamHI 및 NotI로 분해시키고 1% 아가로오스 겔 전기영동처리시킨 다음 Prep-A-Gene DNA 정제 키트(Bio-Rad 제조)를 사용하여, 상기에서 분리된 예상되는 크기를 갖는 주요 밴드를 정제하고 제한효소 BamHI 및 NotI로 미리 분해시킨 pBluescript II SK⁺벡터(Stratagene 제조)에 결찰시켜 고수용 대장균 DH5(TOYOBO 제조)을 형질변환시켰다. 그 콜로니로부터 4개 클론을 선택하여 플라스미드 DNA 샘플을 제조했다. Taq Dye Deoxy^TM터미네이터 사이클 서열결정 키트(어플라이드 바이오 시스템스)를 사용하여 어플라이드 바이오 시스템스에 의해 제조된 373A DNA 서열결정기에 의해 상기 정제된 플라스미드 DNA 샘플의 서열을 체크하여 BamHI 및 NotI 사이의 부위내의 뉴클레오타이드 서열에 치환이 없게 설계된 바와 같이 TPO cDNA 서열을 갖는 클론, pBLTP를 얻었다.

클론 pBLTP를 제한효소 EcoRI 및 BamHI로 분해시키고 1% 아가로오스 겔 전기 영동처리한 다음 Prep-A-Gene DNA 정제키트(Bio-Rad 제조)를 사용하여 상기 분리된 고분자량의 밴드를 정제했다. 같은 방법으로 pEF18S-HL34를 제한효소로 처리하여 약 450bp의 DNA 단편을 정제했다. 얻어진 DNA 샘플 각각을 결찰시키고 고 수용 대장균 DH5(TOYOBO 제조)을 형질전환시켰다. 생성한 콜로니로부터 플라스미드 DNA 샘플을 제조하여 TPO cDNA 삽입물을 함유하는 클론, pBLETN을 얻었다. 수득한 pBLTEN을 제한효소 EcoRI 및 NotI으로 분해시키고 1% 아가로오스 겔 전기영동처리한 다음 분리된 약 1200bp의 DNA 단편을 Prep-A-Gene DNA 정제 키트(Bio-Red 제조)를 사용하여 정제하고 동일한 제한효소로 미리 분해시킨 발현벡터 pEF18S에 결찰시켜 고 수용 대장균 DH5(TOYOBO 제조)을 형질전환시켰다. 생성한 콜로니로부터 플라스미드 DNA 샘플을 제조하여 전체 인간 TPO 코딩부위를 함유하는 삽입물의 클론 pHTP1을 얻었다. 이 클론으로부터 플라스미드 DNA를 다량으로 제조하여 하기 실험에 사용하였다. 기본적으로 Molecular Cloing(샘브룩 등, 콜드 스프링 하버래보라토리 프레스, 1989)에 기술된 과정에 따라 플라스미드 DNA 샘플을 제조하였다.

[실시예 31]

중국 햄스터 난소(CHO)세포에서 인간 TPO를 발현시키기 위한 포유동물 발현 플라스미드 pDEF202-hTPO-P1의 작제

마우스 디하이드로폴레이트 리덕타제(DHFR) 미니진(MINIGENE)을 함유하는 플라스미드 pMG1 1㎍을 제한효소 EcoRI 및 NotI으로 분해시키고 아가로오스겔 전기영동처리하여 마우스 DHFR 미니진을 함유하는 단편(약 2.5kb)을 분리하였다. 분리된 DNA 단편을 50mM Tris-HCl(pH 7.5), 7mM MgCl₂, 1mM 2-메르캅토에탄올 및 0.2mM dNTP 혼합물로 이루어진 반응용액 25ml에 용해시키고 2 단위체의 클레노(Klenow)단편과 혼합물 다음 실온에서 30분동안 배양하여 DNA 단편의 양 말단에 둔한 단부를 형성했다. 페놀/클로로포름 처리 및 에탄올 침전후 생성한 단편을 10ml의 TE용액(10mM Tris-HCl(pH8.0)/1mM EDTA)에 용해시켰다. 포유동물 발현벡터 pEF18S를 제한효소 SmaI으로 분해시키고 알칼리성 포스파타제(다까라 스조 제조)를 사용하여 탈인산화시킨 다음 T4 DNA 리가아제(다까라 스조 제조)를 사용하여 마우스 DHFR 미니진을 함유하는 DNA 단편과 결찰시켜 발현벡터 pDEF202를 얻었다.

다음에, 작제된 발현벡터 pDEF202를 제한효소 EcoRI 및 SpeI으로 분해시키고 아가로오스 겔 전기영동처리하여 보다 큰 DNA 단편을 분리하였다. 인간 TPO cDNA를 함유하는 플라스미드 pHTP1을 제한효소 EcoRI 및 SpeI으로 분해시켜 수득한 인간 TPO cDNA을 T4 DNA 리가아제(다까라 스조 제조)를 사용하여 선형화된 pDEF202 벡터에 결찰시켜 인간 TPO cDNA를 발현하기 위한 플라스미드 pDEF202-hTPO-P1을 얻었다. 이 작제된 플라스미드는 SV40 복제기점, 인간 신장 인자 1-α프로모터, 인간 TPO cDNA의 전사를 위한 SV40 초기 폴리아데닐화 시그널, 마우스 DHER 미니진 및 pUC18-복제기점 및 β 락타마아제 유전자(Amp^r)를 함유한다.

[실시예 32]

CHO 세포에서 인간 TPO의 발현

6cm 직경 조직 배양 플레이트(Falcon 제조)를 사용하여 10% 우태아 혈청(FCS)을 함유하는 α-최소 필수 배지(α-MEM(-), 히포크산틴 및 티미딘이 보충됨)에서 CHO 세포(DHFR-균주 : Urlaub 및 Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol.77, p4216, 1980)를 유지시켰다. pDEF202-hTPO-P1 플라스미드를 사용한 CHO 세포의 형질전환은 하기에 기술되는 인산 칼슘법(CellPhect, 파마시아 제조)으로 실시하였다. 실시예 31에서 제조된 10㎍의 플라스미드 pDEF202-hTPO-P1을 120ml의 완충액 A 및 120ml의 H₂O와 혼합하고 그 혼합물을 실온에서 10분동안 배양했다. 이 용액을 120ml의 완충액 B와 더 혼합하고 실온에서 30분동안 추가로 방치하였다. 이 DNA 혼합물 용액을 배양물에 첨가하여 CO₂배양기에서 6시간 동안 배양하였다. 6시간 후 배양물을 무혈청 α-MEM(-)으로 두 번 세척하고 10% 디메틸 설폭사이드를 함유하는 α-MEM(-)으로 2분동안 처리한 다음 10%의 투석된 FCS를 함유하는 비선택 배지(α-MEM(-), 히포크산틴 및 티미딘이 보충됨)에서 2일동안 배양하였다. 배양한지 2일후 세포를 10% 투석된 FCS를 함유하는 선택배지 α-MEM(-)에서 선택했다. DHFR-양성 표현형을 갖는 형질전환된 세포를 선택하기 위하여 트립신/EDTA 용액으로 세포를 처리하고 선택배지에 재현탁시켰다. 6cm 조직 배양 플레이트에 있는 세포를 5개의 10cm 조직배양 플레이트 또는 12개의 24-웰 조직 배양 플레이트로 분리하고 선택배지에서 배양하였다. 이틀 간격으로 배양배지를 교환하였다. DHER-양성 표현형을 갖는 CHO 세포의 배양배지에서의 인간 TPO 활성을 CFU-MK 분석법, M-07e 분석법 또는 Ba/F3 분석법으로 측정하였다. 25nM의 메토트렉세이트가 보충된 선택배지에서 배양배지로 인간 TPO를 분비하는 세포를 선택하여 많은 양의 인간 TPO를 생성하는 세포 클론을 분리하였다.

이 경우에 CHO 세포의 형질감염은 pHTP1 및 pMG1 플라스미드로써 CHO 세포를 공형질감염시켜 실시할 수 있다.

플라스미드 pDEF202-hTPO-P1으로 형질전환된 CHO 균주(CHO-DUKXB 11)는 내셔널 인슈티튜브 오브 바이오 사이언스 앤드 휴먼 테크놀로지, 에이전시 오브 인더스트리언 사이언스 앤드 테크놀로지, 미니스트리 오브 인터내셔널 트레이드 앤드 인더스트리, 일본에 기탁번호 FERM BP-4988로 1995. 1. 31일에 본 출원인에 의해 기탁되었다.

[실시예 33]

X63. 6. 5. 3. 세포에 사용하기 위한 재조합 벡터 BMCGSneo-hTPO-P1의 작제

포유동물 발현 벡터 pBMCGSneo 1㎍을 제한효소 XhoI 및 NotI으로 분해시키고, 아가로오스 겔 전기영동처리시켜 벡터 DNA 부분을 분리하였다. 이 DNA 단편 및 사람의 TPO cDNA를 함유하는 플라스미드 pBLTEN을 제한효소 XhoI 및 NotI으로 본해시켜 수득한 인간 TPO cDNA (P1클론)을 T4 DNA 리가아제를 사용하여 결찰시켜 발현벡터 BMCGSneo-hTPO-P1을 수득하였다. 이 발현 플라스미드는 거대세포 바이러스 초기 프로모터, 토끼 β 글로빈 유전자-유래 인트론의 일부 및 인간 TPO cDNA의 전사를 위한 폴리아데닐화된 영역, 인간 β 글로빈 유전자, 69%의 소 유두종 바이러스 1 유전자, 티미딘 키나제 프로모터 및 폴리아데닐 영역, 포스포트랜스퍼라제 I 유전자(네오마이신 내성 유전자) 및 pBR322 복제기점 및 β-락타마아제 유전자(Amp^r)를 함유하며, 또 인간 TPO cDNA는 거대세포 프로모터의 하루 부위에 결찰되었다.

[실시예 34]

X 63. 6. 5. 3. 세포에서 발현

10% 우태아 혈청을 함유하는 둘베코의 최소필수(DME) 배지에서 X 63. 6. 5. 3. 세포를 배양하였다. BMCGSenohTPO 플라스미드를 사용항 X 63. 6. 5. 3. 세포의 형질감염은 하기에 기술된 전기천공법으로 실시하였다.

실시예 33에서 제조된 플라스미드 BMCGSneo hTPO-P1 20㎍을 10⁷세포를 함유하는 750㎕ 의 DME 배지에 첨가하고 그 혼합물을 4mm의 갭을 갖는 전기천공법 쿠베트(CUVETTE)에 넣고 4℃에서 15분동안 방치하였다. 쿠베트를 전기천공장치(BTX 600, Bix 제조)로 보내 380V, 25mF 및 24A°조건하에서 유전자를 전달하였다. 유전자 전달후 쿠베트를 4℃에서 15간 방치시킨 다음 세포를 10% 우태아 혈청 함유 DME에 현탁시키고 5개의 96웰 조직 배양 플레이트의 웰에 분배한 다은 CO₂배양기에서 2일 동안 배양하였다. 이틀 배양한 후 그 배양배지를 10% 우태아 혈청 및 1mg/ml의 G418(GIBCO 제조) 함유 DEM으로 교환하고 그 후 매3일 마다 배양배지를 교환하였다. 형질전환체의 배지에서의 인간 TPO 활성은 CFU-MK, M-07e 또는 Ba/F3 분석법으로 측정하였다. 배양배지로 인간 TPO를 분비하는 형질전환체를 제한 희석법으로 두 번 클로닝하여 인간 TPO 생성 세포주를 확립했다.

[실시예 35]

COS 1 세포에서 인간 TPO의 대규모 발현

실시예 11에서 설명한 클로로킨 처리를 포함하는 DEAE-덱스트란법에 따라 COS1 세포의 형질감염을 실시하였다. 5% 이산화탄소 배양기에서 콜라겐-피복된 175㎠ 배양 플라스크를 사용하여 10%(v/v) FCS를 함유하는 IMDM에서 COS1 세포(ATCC CRL 1650)를 이 세포가 약 100% 융합성이 될 때까지 배양시켰다. 배양 플라스크를 콜라겐으로 피복시키기 위하여 1mM HC1에 의해 농도가 0.3mg/ml로 조정된 25ml의 콜라겐 용액(Cellmatrix형 I-C, Iwaki 제조)을 각 175㎠ 배양 플라스크에 첨가하고 실온에서 1시간 방치후 콜라겐 용액을 회수한 다음 처리된 플라스크를 20-50ml의 PBS로 한번 세척했다. 250㎍/ml의 DEAE-덱스트란(파마시아 제조)을 함유하는 60μM의 클로로킨(시그마 제조) 및 10%(v/v) Nu-Serum (Collaborative 제조)을 함유하는 20ml의 IMDM 용액을 500㎕ 의 HBS에 용해된 플라스미드 pHTP1(40㎍)와 혼합하고 그 혼합물을 형질감염 바로전에 IMDM으로 한번 세척한, 하나의 175㎠ 배양 플라스크에 함유된 상술한 COS1 세포에 부가한 다음 5% CO₂배양기중 37℃에서 3시간 동안 세포를 배양함으로써 형질감염시켰다. 그후, 배양 상청액을 흡입하여 제거하고 IMDM으로 세포를 한번 세척한 후 50ml의 무혈청 배지와 혼합한 다음 5% CO₂배양기중 37℃에서 5일동안 배양하여 배양 상청액을 회수했다. 하나의 작업으로서는 175㎠의 100-260 배양 플라스크를 사용하여 5-13리터의 배양 상청액을 회수했다. IMDM에 5㎍/ml의 인슐린(시그마 제조), 5㎍/ml의 트렌스페린(시그마 제조), 10μM의 모노에탄올아민(Wako Pure Chemical Industries 제조), 25nM의 소듐 셀레나이트(시그마 제조) 및 200㎍/ml의 BSA(무 지방산 고순도 소 알부민, Nichirei 제조)이 보충되는 무 혈청 배지를 제조하였다.

[실시예 36]

COS 1 세포에서 발현된 인간의 전체길이 TPO(발현 플라스미드 pHTP1, P1 클론으로부터 유도된)의 정제 및 그것의 생물학적 활성

다음은 COS1 세포에서 발현된 인간의 전체길이 TPO(발현 플라스미드 pHTP1)의 활성 및 정제의 예를 설명한다. 혈소판 증가 활성을 시험하기 위하여 부분적으로 정제된 생성물을 먼저 제조한 다음 정제를 실시하여 고순도 생성물을 수득하였다. 하기 제조단계에서는 TPO 활성을 측정하기 위하여 M-07e 분석계를 이용했다. 랫트 CFU-MK 분석계에서도 유사한 TPO 활성이 발견되었다. 이러한 평가들을 수행할 때에 인간 혈청 알부민(HSA)을 각 샘플에 0.02-0.05%의 최종농도로 첨가했다.

먼저, 오하시(Ohashi)와 스도(Sudo)의 방법(히데야 오하시와 다다시 스도, Biosci, Biotech, Biochem.), 58(4), 758-759, 1994)에 따라 플라스미드 pHTP1으로 형질전환된 COS1 세포를 0.2g의 BSA, 5mg의 소 인슐린, 5mg의 인간 트랜스페린, 0.02mM의 모노에탄올아민 및 25nM의 소듐 셀레나이트를 함유하는 무혈청 IMDM 배양배지 100ml를 사용하여 5% CO₂중 37℃에서 5일동안 배양하여 약 7리터의 무혈청 배양 상청액을 얻었다. 이 무혈청 배양 상청액에 단백질 분해효소 억제제 p-APMSF 및 Pefabloc SC(4-(2-아미노에틸)-벤젠술포닐 플루오라이드 하이드로클로라이드, Merk 제조, 카탈로그 No. 24839)를 약 1mM의 최종농도로 첨가하고 0.2㎛ 필터를 사용하여 여과함으로써 상청액을 회수했다. 이것을 한외여과 유니트(Omega Ultrasette, 겉보기 분자량 컷오프 8,000, Filtron 제조; 또는 PLGC 펠리콘(Pellicon)카셋트, 겉보기 분자량 컷오프 10,000 Millipore 제조)를 사용하여 약 10배로 농축시키고 수둑한 농축물 723ml(단백질 농도, 3.38mg/ml ; 총 단백질 2,445mg; 상대적 활성 43,000; 및 총 활성 105,100,000)을 1,000ml의 황산알루미늄(총 288g)당 1.6몰로 혼합하여 1.5M 최종 농도의 황산 암모늄을 함유하는 804ml의 용액을 얻어 그 용액을 1.5M 황산 암모늄 함유 20mM 시트르산 나트륨 완충액(pH 5.2)으로 미리 평형화 시킨 Macro-Prep Methyl HIC 컬럼(직경 5cm 및 상높이 9cm, Bio-Red 제조, 카탈로그 No. 156-0080)에 10ml/분의 유량으로 부가하였다. 샘플적재후 1.25M 황산 암모늄을 함유하는 20mM 시트르산나트륨 완충액(pH 5.2)으로 용출시켜 통과한 분획 F1(2,384ml; 단백질 농도 0.864mg/ml; 총 단백질 2,061mg; 및 상대 활성 6,000)을 얻었다.

다음에 용출용액을 20mM 시트르산 나트륨으로 변화시켜 분획 F2(1,092ml; 단백질 농도 0.776mg/ml; 총 단백질 847mg; 및 상대 활성 150,000)를 수집하였다.

수득한 Macro-Prep Methyl HIC 컬럼 분획 F2(1,081ml)을 20mM 시트르산 나트륨 완충액(pH 5.8)으로 미리 평형화시킨 SP 세파로오스 Fast Flow 컬럼(직경 3cm 및 상높이 10cm, Pharmacia Biotech 제조, 카탈로그 No. 17-0729-01)에 10ml/분의 유량으로 부가하였다. 샘플 적재후 110mM NaCl을 함유하는 20mM 시트르산 나트륨 완충액(pH 5.6)으로 용출시켜 통과한 분획 F1(2,262ml; 단백질 농도 0.270mg/ml; 총 단백질 610mg; 및 상대 활성 30,000)을 얻었다. 다음에 용출용액을 400mM NaCl을 함유하는 20mM 시트르산 나트륨 완충액(pH 5.2)으로 변화시켜 분획 F2(856ml; 단백질 농도 0.189mg/ml; 총 단백질 162mg 및 상대 활성 300,000)을 수집하였다. 다음에, 용출용액을 1,000mM NaCl을 함유하는 20mM 시트르산 나트륨 완충액(pH 5.2)으로 변화시켜 용출된 분획 F3(370ml; 단백질 농도 0.034mg/ml; 총 단백질 12.6mg; 및 상대 활성 150,000)을 수집하였다.

SP 세파로오스 Fsat Flow 컬럼 단계의 주 TPO 활성 분회 F2(845ml)를 1-프로판올과 약 10%의 최종농도로 혼합하고 400mM NaCl을 함유하는 20mM 시트르산 나트륨 완충액(pH 5.4)으로 미리 평형화시킨 LA-WGA 컬럼(직경 2cm 및 상높이 14cm, Henen 제조, 카탈로그 No. WG-007)에 3ml/분의 유량으로 부가하였다. 샘플 적재후 400mM NaCl을 함유하는 20mM 시트르산 나트륨 완충액(pH 5.4)과 1-프로판올의 혼합물(9:1)을 사용하여 용출시켜 분획 F1(64.4ml; 단백질 농도 0.0178mg/ml; 총 단백질 1.15mg; 및 상대 활성 17,220)을 얻었다. 다음에 용출용액을 0.4M GlcNAc 및 10% 1-프로판올을 함유하는 20mM 시트르산 나트륨 완충액(pH 6.1)으로 바꾸어 용출분획 F2(45ml; 단백질 농도 0.0104mg/ml; 총 단백질 0.470mg; 및 상대 활성 675,000)을 수집하였다.

LA-WGA 컬럼 작업의 주 TPO 활성 분획 F2(340ml)를 약 0.005%의 최종농도로 TFA와 혼합하고 YMC-Pack CN-AP(직경 6mm 및 250mm 상높이, YMC 제조, 카탈로그 No. AP-513)컬럼 크로마토그래피 처리시켰다. 즉, 전개용매 A로서, 0.1% TFA를 그리고 전개용매 B로서 0.05% TFA를 함유하는 1-프로판올을 사용하여 샘플을 15% B로 미리 평형화시킨 YMC-Pack CN-AP 컬럼에 0.6ml/분의 유량으로 부가하였다. 샘플 적재후, 프로판올 농도를 15% B에서 25% B로 증가시키고 65분동안 25% B에서 50% B까지의 선형구배로 용출을 수행하면서 폴리프로필렌관에 1.5ml(2.5분) 부분씩 용출액을 수집했다.

각 관에 있는 용출액의 0.5㎕ 부분(1/3,000 분획)을 HSA와 혼합하고 한외여과에 의해 농축시켜 TPO 활성 분획의 확인에 사용하기 위한 0.25ml의 0.05% HSA 함유 IMDM 분석 배양 용액을 얻었다. 그 결과 TPO 활성 분획 FA(13.5ml)로 모아진 관번호 24-30(프로판올 농도 35.0-42.0%의 범위내)에서 강한 TPO 활성(약 630,000-4,800,000의 상대 활성)이 발견되었다.

YMC-Pack CN-AP 컬럼 단계에 의해 수득한 분획 FA를 전개용매 A로서 0.1% TFA를 그리고 전개용매 B로서 0.05% TFA를 함유하는 1-프로판올을 사용하여 CAPCELL Pak CI 300A (직경 4.6mm 및 상높이 150mm, 시세이도 제조, 카탈로그 No. CI TYPE : SG300A) 컬럼 크로마토그래피 처리시켰다. YMC-Pack CN-AP 컬럼 작업에 의해 수득한 분획 FA의 일부(8.9ml)를 0.3ml의 글리세롤과 혼합하고 원심분리 증발로 농축시켜 약 2.5ml의 10% B와 혼합한 다음 그 용액을 20% B로 미리 평형화시킨 Capcell Pak CI 300A 컬럼에 0.4ml/분의 유량으로 부가하였다. 샘플적재후 먼저 20% B로 5분동안 용출 시킨후 50분동안 20% B에서 40% B까지의 선형구배로 용출시키면서 폴리프로필렌 관에 1ml(2.5분)부분씩 용출액을 수집하였다.

각 관에 있는 용출액의 1㎕ 부분(1/1,000 분획)을 HSA와 혼합하고 한외여과로 농축시켜 TPO 활성 분획의 확인에 사용하기 위한 0.05% HSA 함유 배양 용액 0.25ml를 얻었다. 그 결과 TPO 활성 분획으로 모아진 관번호 20-23(프로판올 농도 28.5-32.5의 범위내)에서 강한 TPO 활성(약 3,000,000-22,500,000)이 발견되었다.

[실시예 37]

COS 1 세포에서 발현된 인간 TPO의 분자량 측정

COS 1 세포에서 발현된 인간의 완전한 길이의 TPO(발현 플라스미드 pHTP1, F1 클론으로부터 유도된)의 분자량은 당쇄의 추가로 인하여 펩타이드 쇄의 크기로부터 예상되는 분자량보다 더 큰 것으로 추측되었다. 따라서, 첫단계로서 COS1 세포에서 발현된 인간의 완전한 길이의 TPO(발현 플라스미드 pHTP1, F1 클론으로부터 유도된)를 함유하는 배양 상청액으로부터 하기의 방법으로 부분적으로 정제된 TPO 분획을 제조했다. 즉, 전개용매 A(0.1% 트리플루오로아세트산(TFA)) 및 전개용매 B(0.05% TFA를 함유하는 1-프로판올)를 사용하여 배양 상청액의 0.3ml 부분을 25% B로 미리 평형화시킨 YMC-Pack PROTEIN-RP (직경 0.46cm 및 15cm 상높이, YMC 제조, 카탈로그 No. A-PRRP-33-46-25)컬럼에 부가하고, 25% B를 5분동안 0.4ml/분의 유량으로 컬럼을 50분간에 걸쳐 통과시킨 다음 25% B-50% B까지의 선형밀도 구배로 분별시켰다. 프로판올 농도 34.5%-43.5%의 범위내의 용출액에서 TPO 활성이 발견되었고 이 용출액을 원심분리 증발에 의해 건조시켜 부분적으로 정제된 샘플을 얻었다.

다음에, 실시예 1에서 기술된 바와 같이 비환원 조건하에서 SDS-PAGE 전기영동의 겔로부터 단백질을 추출한 후 M-07e 분석계로 TPO 활성을 검사하거나 아래의 실시예 45에서 기술되는 웨스턴(westren)분석에 의해 환원처리 DPCIII 마커를 기초로 분자량을 측정했다. 그 결과, 약 69,000-94,000의 넓은 겉보기 분자량 범위에서 TPO 활성이 발견되었으며 따라서, 분자량의 변화를 확인했다. N-글리카나제(Genzyme 제조, 카탈로그 No. 1472-00)를 사용하여 N-글리코시딕 결합형 당쇄를 분해시킨 후 환원-처리된 DPCIII 마커에 기초한 TPO의 겉보기 분자량은 팹타이트 쇄의 크기에서 예상되는 약 35,000분자량보다 더 큰 36,000-40,000인 것으로 측정되어 0-글리코시딕 결합형 당쇄의 존재를 강하게 나타내고 있다.

동일한 방법으로 COS1 세포에서 발현된 인간의 완전한 길이의 TPO(플라스미드 pHTP1, P1 클론으로부터 유도된)의 겉보기 분자량은 63,000-83,000인 것으로 발견되었다.

[실시예 38]

인간 TPO의 생물학적 특성

주로 pHTP1으로 형질전환된 COS1 세포로 부터의 배양 상청액을 사용하여 인간 및 랫트 조혈세포상에서의 인간 TPO의 효과를 검사했다.

인간 제대 혈액으로부터 제조된 CD 34⁺DR⁺세포 분획을 사용하는 콜로니 분석법에서 인간 TPO는 많은 수의 거핵구 콜로니 형성을 자극했다. 예를 들면, 10%(v/v)의 배양 상청액 존재하에서 6,000CD 34⁺DR⁺세포에 의해 pHT1-231로 형질 전환된 COS1 세포로부터 11.5개의 거핵구 콜로니가 형성되었다. 말초혈액에 있는 인간 거핵구 전구 세포상에서의 인간 TPO의 효과를 검사하기 위하여 인간 말초 혈액으로부터 하기와 같이 CD 34⁺세포를 제조했다. 인간 말초 혈액으로부터 Ficoll-Paque 밀도 구배에 의해 얻은 백혈구 분획에는 플라스틱 접시에 유착된 세포가 부족하게 하였다. 이어서 비유착 세포에는 AIS Microselecter SAB(아사히 메디칼 제조)를 사용하는 패닝(panning)으로 SAB(콩 응집소) 양성세포가 존재하지 않게 만들었다. 상기 세포들을 AIS Microselecter CD 34상에서 배양시키고 CD 34⁺세포가 액체 배지중의 형질전환된 COS1 세포의 배양 상청액의 존재하에서 10일 동안 배양되었을 때 흡착된 세포인 CD 34⁺세포를 수집하여 큰 크기의 GpIIb/IIIa⁺세포의 선택적인 증식을 관찰하여 이 GpIIb/IIIa⁺세포에서 배수성의 증가를 발견하였다. 이러한 결과는 인간 TPO가 인간의 거핵구계의 전구 세포상에서 선택적인 활성을 나타내고 그들의 증식 및 분화를 자극한다는 것을 강하게 암시했다.

GpIIb/IIIa⁺세포의 전단계에서 얻은 랫트 골수세포 및 플라스틱 비유착 세포로 부터의 CFU-MK에 대하여 매우 풍부한 GpIIb/IIIa⁺를 사용하는 콜로니 분석법에서, 인간 TPO는 많은 수의 거핵구 콜로니의 형성을 유도했다. 예를 들면, 1,000개의 GpIIb/IIIa⁺세포에 의해 34.5개의 거핵구 콜로니가 형성되었고 또 형질전환된 COS1 세포로 부터의 20%(v/v)의 배양 상청액 존재하에서 20,000개의 플라스틱 비유착 세포에 의해 28.5개의 거핵구 콜로니가 형성되었다. 또한, 플라스틱 비유착 세포 분획이 CFU-MK 이외의 다양한 조혈 전구세포를 함유함에도 불구하고 인간 TPO 존재하에서만 거핵구의 콜로니가 형성되었는데 이는 인간 TPO가 거핵구계의 전구 세포상에서 선택적 활성을 나타낸다는 것을 암시한다. 랫트 골수로부터 얻은 GpIIb/IIIa⁺세포를 액체 배양배지중의 형질전환된 COS1 세포로 부터의 20%(v/v)의 배양 상청액 존재하에서 3-5일동안 배양했을 때, 배양 5일째에 배수성의 증가가 명확히 관찰되었다.

[실시예 39]

글루타치온-S-트랜스퍼라제(GST) 및 인간 TPO(아미노산 잔기 1-174)의 융합 단백질(이하, “GST-TPO(1-174)”라 함)을 대장균에서 발현시키기 위한 벡터의 작제

대장균에서 인간 TPO의 발현을 용이하게 하기 위하여 인간 TPO를 코딩하고 대장균 선호 코돈을 함유하는 인공 유전자를 제조했다. 이 DNA의 뉴클레오타이드 서열은 대장균에서 번역 개시에 사용하기 위하여 -1위치에 아미노-말단 메티오닌 코돈(ATG)을 함유한다.

합성 올리고뉴클레오타이드 1-12

를 제조하고 합성 올리고뉴클레오타이드 2-11 각각을 1mM ATP, 10mM Tris-아세테이트, 10mM Mg-아세테이트 및 50mM K-아세테이트로 이루어진 용액에서 T4 키나아제(파마시아 제조)로 포스포릴화시켰다. 이들 합성 올리고뉴클레오타이드를 6개의 이중 가닥 DNA단편으로 만들기 위하여, 상기 합성 올리고뉴클레오타이드를 1과 2, 3과 4, 5와 6, 7과 8, 9와 10 및 11과 12의 조합으로 만들고 각 조합을 10mM Tris/HCl(pH 7.5), 10mM MgCl₂및 50mM NaCl로 이루어진 용액에서 어닐링시켰다. 다음에 1과 2, 3과 4 및 5와 6의 3개의 이중-가닥 DNA 단편 및 7과 8, 9와 10 및 11과 12의 다른 3개의 이중-가닥 DNA 단편을 T4 리가아제(Life Technology 제조)로 처리하고, 이들 2개 반응용액을 동일한 방법으로 다시 T4 리아가제로 처리했다. 결찰 반응에 의해 얻은 DNA 단편을 BamHI(베링거-만하임 제조)로 분해시킨 후 2% 아가로오스 겔 전기영동처리하여 약 390 내지 400bp 크기의 단편을 수득하고 Prep-A-Gene DNA 정제 키트를 사용하여 정제하고 Xbal 및 BamHI(숙주로서 대장균 DH5α가 사용되었다)로 미리 분해시킨 pUC18에 서브클로닝하였다. 이렇게하여 수득한 클론으로부터 인간 TPO를 코딩하고 하기 대장균 선호 코돈을 함유하는 인공 유전자를 갖는 클론을 뉴클레오타이드 서열분석에 의해 선택하고 pUC18(XB)(1-123)으로 명명했다. 코딩쇄의 DNA 서열을 서열 목록(서열 9)에 도시하였다.

올리고 dT 프라이머를 사용하여 인간의 정상 간-유도 폴리(A)⁺RNA 1㎍으로부터 단일 가닥 cDNA를 합성하고 0.1부피의 cDNA 합성 반응용액을 주형으로 사용하여 PCR을 실시하였다. hTPO-C 및 hTPO-Z(EcoRI)를 프라이머로 사용하여 100㎕ 의 부피로 PCR 반응(96℃에서 2분간 배양하며 각 사이클이 96℃에서 1분간, 58℃에서 1분간 또 72℃에서 1분간 배양하고 72℃에서 최종 배양하는 것으로 이루어진 총 30 사이클 반복)을 실시했다. 이 방법으로 수득한 인간 TPO cDNA 단편을 BamHI 및 EcoRI으로 분해시키고 2% 아가로오스 겔 전기영동처리하여 약 600bp 크기의 단편을 회수하며, 이것을 다시 Prep-A-Gene DNA 정제 키트를 사용하여 정제하고 EcoRI 및 BamHI(대장균 DH5α가 숙주로서 사용되었다)로 미리 분해시킨 pUC18에 서브클로닝하였다. 정확한 인간 TPO 뉴클레오타이드 서열을 코딩하는 클론을 뉴클레오타이드 서열분석으로 선택하여 pUC18(BE)(124-332)로 명명했다. PCR 반응에 사용된 프라이머의 올리고뉴클레오타이드 서열은 하기와 같다:

(pHTF1 클론의 위치 329-349); 및

(pHTF1 클론의 위치 1,143-1,163에 상응하는 안티센스 프라이머에 EcoRI 인식 서열을 첨가하여 제조)

클론 pUC18(BE)(124-332)를 BamHI 및 EcoRI으로 분해시키고 2% 아가로오스 겔 전기영동처리시켜 약 600bp 크기의 인간 TPO cDNA C-말단측 단편을 회수하고, 이를 Prep-A-Gene DNA 정제 키트를 사용하여 정제하고 EcoRI 및 BamHI(대장균 DH5α가 숙주로서 사용되었다)로 미리 분해시킨 pUC18(XB)(1-123)로 서브클로닝하였다. 이렇게 하여 수득한 클론을 pUC18(XE)(1-332)로 명명했다.

1-163 위치 아미노산 잔기의 인간 TPO 펩타이드 단편에서 인간 TPO 활성의 존재가 인간 TPO cDNA의 많은 C-말단 결실 작제물이 제조되고 시험관내에서 인간 TPO 활성을 측정하도록 발현된 실시예에 의해 확인되었기 때문에 이 펩타이드 단편을 함유하는 발현 벡터를 작제했다. 이 경우에 GST-TPO(1-174)를 코딩하는 DNA 서열의 발현도 실시하였다.

pHTF1 클론의 위치 681-686에 상응하는 뉴클레오타이드 서열(위치 173과 174의 아미노산 잔기)이 제한효소 SacI에 의해 인식되기 때문에 이 제한 효소의 인식부위를 사용하는 2개의 합성 올리고뉴클레오타이드를 사용하여 2개의 종지 코돈을 도입했다. 즉, 10mM Tris/HCl(pH 7.5), 10mM MgCl₂및 50mM NaCl로 이루어진 용액에서 2개의 합성 올리고뉴클레오타이드 SSE1 및 SSE2를 어닐링하고 DNA 결찰 키트(다까라 스조 제조)를 사용하여 수득한 이중-가닥 DNA 단편을, 약 480bp의 인간 TPO cDNA C-말단 단편이 SacI 및 EcoRI과의 분해에 의해 제거된 pUC18(XE)(1-332)에 도입하여 클론 pUC18(XS)(1-174) 대장균 DH5α를 숙주로서 사용했다)를 얻었다.

여기서 사용된 합성 올리고뉴클레오타이드 서열은 다음과 같다.

상기에서 얻은 클론 pUC18(XS)(1-174)를 XbaI 및 EcoRI으로 분해시키고 2% 아가로오스 겔 전기영동 처리시켜 인간 TPO의 아미노산 잔기 1-174를 코딩하는 약 600bp 크기의 단편을 회수하고 그 단편을 Prep-A-Gene DNA 정제 키트를 사용하여 정제하고 XbaI 및 EcoRI(대장균 DH5α가 숙주로서 사용되었다)으로 미리 분해시킨 pBluescript IISK⁺(Stratagene 제조)에 서브클로닝했다. 이 방법으로 얻은 클론을 pBL(XS)(1-174)로 명명했다. 동일한 방법으로 클론 pBL(XS)(1-174)를 XbaI 및 HindIII으로 분해시켜 인간 TPO의 아미노산 잔기 1-174를 코딩하는 약 550bp 크기의 단편을 회수하고 이 단편을 Prep-A-Gene DNA 정제 키트를 사용하여 정제하고 XbaI 및 HindIII(숙주로서 대장균 DH5α가 숙주로서 사용되었다)로 미리 분해시킨 pCFM536(EP-A-136490)에 서브클로닝했다. 이 방법으로 얻은 클론을 pCFM536/hT(1-174)로 명명했다.

글루타치온-S-트랜스퍼라제(GST) 융합 단백질의 발현 벡터인 pGEX-2T(파마시아 제조)를 사용하여 GST-TPO(1-174)를 발현시키기 위하여 하기 실험을 수행했다. pCFM536/hT(1-174)를 주형으로 사용하고 2개의 PCR 프라이머 GEZ1 및 GEX3을 사용하여 PCR 반응(96℃에서 2분간 배양하고, 각 사이클이 95℃에서 1분동안, 41℃에서 1분동안 또 72℃에서 1분간 배양하고, 이어 72℃에서 최종 7분동안 배양하는 것으로 이루어진 총 22사이클 반응을 반복)을 수행했다. 이 방법으로 얻은 인간 TPO 코딩 단편을 NaeI 및 EcoRI 으로 분해시키고 2% 아가로오스 겔 전기영동시켜 약 550bp 크기의 단편을 회수한 후 그 단편을 Prep-A-Gene DNA 정제 키트를 사용하여 정제하고 EcoRI 및 Smal (숙주로서 대장균 DH5가 사용되었다)로 미리 분해시킨 pGEX-2T에 클로닝하여 정확한 인간 TPO 뉴클레오타이드 서열을 코딩하는 pGEX-2T/hT(1-174)로 명명된 클론을 뉴클레오타이드 서열 분석법으로 선택하여 GST-TPO(1-174)의 발현에 사용하기 위한 형질전환체를 제조했다. PCR에 사용된 프라이머의 올리고뉴클레오타이드 서열은 다음과 같다.

(서열 10에서의 위치 21 내지 39의 서열에 NaeI 인식서열을 첨가하여 제조);

(서열 102에서의 위치 523-549의 서열에 상응하는 안티센스 프라이머).

이 발현 플라스미드는 GST 단백질, 트롬빈 인식 펩타이드 및 인간 TPO(아미노산 잔기 1-174)를 코딩하는 DNA 서열을 함유한다. 트롬빈 인식 펩타이드 및 인간 TPO(아미노산 잔기 1-174)를 코딩하는 DNA 서열을 서열 목록(서열 10)에 도시하였다.

[실시예 40]

대장균에서 GST-TPO(1-174)의 발현

실시예 39에서 제조된 형질전환체를 50㎍/ml의 암피실린을 함유하는 60ml LB 배지를 사용하여 진탕기상 37℃에서 밤새 배양하고 배양 육즙의 25ml 부분을 50㎍/ml 암피실린 함유 LB 배지 1000㎖에 첨가한 후 A₆₀₀에서의 OD가 0.7-0.8에 도달할때까지 진탕기상, 37℃에서 배양시켰다. 그 후, 배양 육즙에 IPTG를 0.1mM의 최종 농도로 첨가하고 진탕 배양을 추가로 3시간 동안 계속하여 GST-TPO(1-174)의 발현을 유도했다.

[실시예 41]

대장균에서 발현된 GST-TPO(1-174)의 정제 및 생물학적 활성의 확인

인간 TPO 뉴클레오타이드 서열 코딩 클론 pGEX-2T/hT(1-174)로부터 유도된 GST-TPO(1-174)를 생산하는 재조합 균주의 냉동세포 5.9g 부분을 10ml의 물에 현탁시키고 고압 분쇄기를 사용하여 분쇄했다. 현탄액을 원심분리 처리시킴으로써 GST-TPO(1-174)를 침전 분획으로 회수하고 대부분의 오염된 단백질, 세포 성분 등을 제거했다. 이어, GST-TPO(1-174)를 함유하는 회수된 침전 분획을 5ml의 물에 현탁시키고 이어서 교반하면서 6ml의 1M Tris 완충액(pH 8.5), 120ml의 10M 우레아 및 16ml의 물을 첨가했다. 내용물을 용해시키기 위하여 5분간 교반한 후 생성한 용액을 균일하게 4부분으로 나누어 하기 단계(1)-(4)를 수행하였다.

(1) 나누어진 샘플중의 하나를 pH 8.5의 20mM Tris 완충액을 사용하여 10배 희석시켰다. 여기에 환원된 형태의 글루타치온 및 산화된 형태의 글루타치온을 각각 5mM 및 0.5mM의 최종 농도로 첨가하고 4℃에서 밤새 배양했다. 이 제조된 혼합물을 원심분리하여 상청액으로서의 GST-TPO(1-174)를 회수하고 이것을 pH 5.5의 20mM 시트르산 나트륨 완충액을 사용하여 2배로 희석시키고 아세트산으로 pH를 5.5로 조정했다. 용액중의 GST-TPO(1-174)를 pH 5.5의 20mM 시트르산 나트륨으로 미리 평형화시킨 SP 세파로오스 Fast Flow(Pharmacia Biotech 제조, 카탈로그 No.17-0729-01) 양이온 교환 컬럼에 가하였다. pH 5.5의 20mM 시트르산 나트륨을 세척한 후 500mm의 염화나트륨을 함유하는 pH 5.5의 20mM 시트르산 나트륨 완충액을 사용하여 GST-TPO(1-174)를 용출시켰다. 용출액중 129ml 부분을 2.6ml의 1M Tris 완충액 pH 8.5와 혼합하고 pH 8.1의 생성 혼합물을 클루타치온 세파로오스 4B(Pharmacia Biotech 제조, 카탈로그 No.17-0729-01) 컬럼에 부가하여 GST-TPO(1-174)를 흡착시켰다. 컬럼을 PBS로 세척한 후 10mM의 환원된 형태의 글루타치온을 함유하는 20mM Tris 완충액 pH 8.5를 사용하여 GST-TPO(1-174)를 용출시켰다. 그 용출액을 37 NIH 유니트의 트롬빈과 혼합하고 실온에서 4시간 동안 방치한 다음 PBS를 사용하여 10배 희석시키고 글루타치온 세파로오스 4B 컬럼에 부가하여 분해된 GST를 흡착시키고 TPO(1-174)를 비흡착된 분획으로 회수했다. 회수된 비흡착 분획을 20mM 시트르산 나트륨 완충액 pH 5.5를 사용하여 3배 희석시키고 동일 완충액으로 미리 평형화시킨 SP 세파로오스 Fast Flow 양이온 교환 컬럼에 부가한 다음 해당 화합물을 동일 완충액에 용해된 0-500mM 염화나트륨의 선형 밀도구배로 용출시켰다.

(2) 단계(1)의 모든 작업을 0.1% 폴리소르베이트 80의 존재하에서 수행하였다.

(3) 나누어진 샘플중 하나를 pH 8.5의 20mM Tris 완충액을 사용하여 10배 희석시켰다. 여기에 환원된 형태의 글루타치온 및 산화된 형태의 글루타치온을 각각 5mM 및 0.5mM의 최종 농도로 첨가하고 4℃에서 밤새 방치했다. 이 제조된 혼합물을 원심분리하여 상청액으로서의 GST-TPO(1-174)를 회수하고 이것을 pH 5.5의 20mM 시트르산 나트륨 완충액을 사용하여 2배로 희석시키고 아세트산으로 pH 5.5으로 조정했다. 용액중의 GST-TPO(1-174)를 pH 5.5의 20mM 시트르산 나트륨으로 미리 평형화시킨 SP 세파로오스 Fast Flow(Pharmacia Biotech 제조, 카탈로그 No. 17-0729-01) 양이온 교환 컬럼에 부가하였다. pH 5.5의 20mM 시트르산 나트륨 완충액으로 수지를 세척한 후 500mM의 염화 나트륨을 함유하는 pH 5.5의 20mM 시트르산 나트륨 완충액을 사용하여 GST-TPO(1-174)를 용출시켰다. 이 용출액을 1M Tris 완충액 pH 8.5로 pH 8로 조정하고 37 NIH 유니트의 트롬빈과 혼합하여 트롬빈 인식 펩타이드 링커에서 분절을 거쳐 GST 폴리펩타이드 서열을 제거하고 실온에서 4시간 동안 방치한 다음 20mM 시트르산 나트륨 완충액 pH 5.5을 사용하여 15배 희석시키고 동일 완충액으로 미리 평형화시킨 SP 세파로오스 Fast Flow 양이온 교환 컬럼에 부가하며 동일 완충액에 용해된 0-500mM 염화나트륨의 선형 밀도 구배로 해당 화합물을 용출시켰다.

(4) 단계(3)의 모든 작업은 0.1% 폴리소르베이트 80의 존재하에서 수행되었다.

SP 세파로오스 Fast Flow 양이온 교환 컬럼 크로마토그래피에 의해 약 200-400mM의 염화나트륨 밀도에서 용출된 각 분획을 IMDM 배양배지에 대하여 완전히 투석하고 랫트 CFU-MK 분석계로 평가했다. 환원제의 존재하에서 SDS-PAGE로 분획을 분석했을 때 19kd의 분자량에 상응하는 밴드가 분획의 주 단백질 밴드로서 검출되었다(순도, 1-20%). 실시예 1에 기술된 과정에 따라 SDS-PAGE 및 PVDF 막전달처리시켜 상기 밴드의 N-말단을 서열분석했을 때 상기 밴드는 pGEX-2T/hT(1-174)-유도 융합단백질로서 발현되는 TPO 서열을 함유한다는 것이 확인되었다. 이 TPO의 추론된 아미노산 서열은 트롬빈 인식 펩타이드 링커 및 링커상의 트로빈의 알려진 활성을 나타내는 [Gly-1] TPO 였다.

[실시예 42]

위치 1(Ser-〉Ala) 및 위치 3(Ala-〉Val)에서 치환을 갖는 인간 TPO(아미노 산 기 1-163)의 대장균 발현에 사용하기 위한 벡터의 작제

실시예 39에서 제조된 클론 pUC18(XE)(1-332)을 XbaI 및 EcoRI으로 분해시키고 2% 아가로오스 겔 전기영동시켜 인간 TPO의 아미노산 잔기 1-332를 코딩하는 약 1000bp 크기의 단편을 회수하고 그 단편을 Prep-A-Gene DNA 정제 키트를 사용하여 정제하고 XbaI 및 EcoRI(숙주로서 대장균 DH 5α가 사용)으로 미리 분해시킨 pBluscript II SK+ (Stratagene 제조)에 서브클로닝했다. 이 방법으로 얻은 클론을 pBL(XE)(1-332)로 명명했다. 이어, BamHI 인식 서열에서부터 위치 163 아미노산(위치 366-489)까지의 클론 pBL(XE)(1-332) 영역을 대장균 선호 코돈으로 교환하였다. 하기에 도시된 합성 올리고뉴클레오타이드 13-20를 제조하고 합성 올리고뉴클레오타이드 13과 14, 15와 16 및 17과 18의 각 쌍을 0.1mM ATP, 10mM Tris-아세테이트, 10mM-Mg 아세테이트 및 5mM K-아세테이트로 이루어진 용액을 함유하는 동일 관에서 인산화시켰다. 100mM Tris/HCl(pH 7.5), 100mM MgCl2 및 500mM NaCl로 이루어진 용액 1/10 부피를 추가로 첨가한 후 그 용액을 비등물중탕기에서 3분동안 가열하고 실온에서 냉각시켜 이중가닥 DNA 단편을 얻었다. 다음에 13과 14, 15와 16 및 17과 18로 이루어진 세쌍의 이중가닥 DNA 단편을 DNA 결합 키트(다까라 스조 제조)를 사용하여 결찰시키고 결찰된 생성물을 주형으로 사용하고 합성 올리고뉴클레오타이드 19와 20을 프라이머로 사용하여 PCR을 행하였다. 수득한 PCR 생성물을 BamHI 및 HindIII으로 분해시키고 2% 아가로오스 겔 전기영동시켜 약 130bp 크기의 단편을 Prep-A-Gene DNA 정제키트를 사용하여 회수했다. 이것을 BamHI 및 HindIII(숙주로서 대장균 DH5를 사용했다)로 미리 분해시킨 pBL(XE)(1-332)에 서브클로닝했다. 수득한 클론으로부터 서열분석법에 의해 하기 뉴클레오타이드 서열을 갖는 클론을 선택하여 pBL(XH)(1-163)으로 명명했다.

인간 TPO(위치 1-163)의 발현양을 증가시키고 프로테아제에 의한 N-말단의 가수분해를 방지할 목적으로, 인간 TPO(위치 1-163)의 위치 1(Ser-Ala) 및 위치 3(Ala-Val)에서 치환([Ala1, Val3] TPO(1-163))되고 또 동시에 -1 위치에서 Lys를 또 -2위치에서 Met를 코딩 ([Met-2, Lys-1, Ala1, Val3] TPO(1-163))하는 돌연변이형 인간 TPO(위치 1-163)(이후, “h6T(1-163)”으로 칭함)의 발현에 사용하기 위한 발현벡터를 작성했다. 하기에 도시된 4개의 합성 올리고뉴클레오타이드를 제조하고 합성 올리고뉴클레오타이드 2-9 및 3-3을 1mM ATP, 10mM Tris-아세테이트, 10mM Mg-아세테이트 및 50mM K-아세테이트로 이루어진 용액에서 T4 키나아제(파마시아 제조)로 인산화시켰다. 이들 합성 올리고뉴클레오타이드를 이중 가닥 DNA 단편으로 만들기 위하여 단일 가닥 DNA 단편 1-9와 2-9 및 3-3과 4-3의 각 쌍을 10mM Tris/HCl(pH 7.5), 10mM MgCl2 및 50mM NaCl로 이루어진 용액에서 어닐링시켰다.

수득한 1-9와 2-9 및 3-3과 4-3으로 이루어진 두쌍의 이중 가닥 DNA 결찰 키트(다까라 스조 제조)로 처리했다. 결찰 반응에 의해 수득한 DNA 단편을 XbaI 및 NruI로 미리 분해시킨 pBL(XH)(1-163)에 서브클로닝하고 하기 합성 올리고뉴클레오타이드에 의해 정확하게 치환된 클론을 서열 분석법(숙주로서 대장균 5α를 사용했다)으로 선택하고 pBL(XH)h6T(1-163)으로 명명했다.

상기 클론 pBL(XH)(1-163)을 XbaI 및 HindIII로 분해시켜 돌연변이형 인간 TPO의 아미노산 잔기 1-163을 코딩하는 약 500bp 크기의 단편을 회수하고, 이 단편을 Prep-A-Gene DNA 정제 키트를 이용하여 정제시킨 다음 XbaI 및 HindIII로 미리 분해시킨 pCFM536(EP-A-13640)에 클로닝하였다(pMW1(ATCC 번호 39933)으로 형질전환된 대장균 JM109를 숙주로 사용하였다). 이렇게 하여 수득한 클론을 pCFM536/h6T(1-163)으로 명명하며, 상기 발현 벡터를 갖는 대장균 균주를 돌연변이형 인간 TPO, 즉 h6T(1-163)의 발현에 사용할 형질전환체로 사용하였다. 이 발현 플라스미드는 서열목록(서열 11)에 도시된 DNA 서열을 함유한다.

[실시예 43]

대장균에서 h6T(1-163)의 발현

발현 플라스미드 pCFM536의 발현은 그 자체가 c1857 리프레서 유전자의 조절하에 있는 λPL 프로모터에 의해 조절했다. 실시예 42에서 얻은 형질전환체를 50㎍/ml의 암피실린 및 12.5㎍/ml의 테트라사이클린을 함유하는 60ml의 LB 배지를 사용하여 진탕기상, 30℃에서 밤새 배양하였다. 그 배양 육즙의 25㎕ 부분을 50㎍/ml의 암피실린 함유 LB 배지 1,000ml에 첨가하고 A600에서의 OD가 1.0-1.2에 도달했을 때 까지 진탕기상, 37℃에서 배양했다. 그 후, 65℃로 가열된 약 330ml의 LB 배지를 배양 육즙에 첨가하여 최종배지 온도를 42℃로 조정하고 42℃에서 3시간 동안 진탕 배양을 계속하여 h6T(1-163)의 발현을 유도했다.

[실시예 44]

대장균에서 발현된 h6T(1-163)의 정제 및 생물학적 활성의 확인

h6T(1-163)생산 재조합 균주의 냉동세포 3.6g 부분을 10ml의 물에 현탁하고 고압 분쇄기를 사용하여 분쇄시켰다. 현탁액을 원심분리 처리하여 침전 분획을 회수하고 대부분의 오염된 단백질, 세포 성분 등을 제거했다. (h6T(1-163)을 함유하는 침전 분획을 7ml의 물에 현탁시키고 그 현탁액에 3ml의 1M Tris 완충액(pH 8.5)을 교반하면서 첨가하고 추가로 우레아(최종 농도 8M), 구아니딘 하이드로클로라이드(최종 농도 6M) 및 소듐 N-라우로일 사크로시네이트(최종 농도 2%)를 첨가했다. 내용물을 용해시키기 위하여 실온에서 5-20분 동안 교반후 그 용액을 pH 8.5의 20mM Tris 완충액을 사용하여 10배 희석시키고 4℃에서 밤새 단백질을 재생새켰다. 이 경우에 공기 산화 이외의 첨가제로서 글루타치온과 황산구리를 사용했다. 원심분리하여 상청액에서 h6T(1-163)을 회수했다. 회수된 분획 각각을 환원제 존재하에서 SDS-PAGE로 분석했을 때 18kd의 분자량에 상응하는 밴드가 각 분획의 주 단백질 밴드로서 검출(순도, 30-40%)되었다. 실시예 1에 기술된 과정에 따라 SDS-PAGE 및 PVDF 막으로 전달처리하여 상기 밴드의 N-말단 서열 분석을 실시했을 때 상기 밴드는 pCMF536/h6T(1-163)유도 돌연변이형 TPO로서 발현되는 TPO 서열을 함유한다는 것이 확인되었다. 각 분획을 IMDM 배양배지에 대하여 완전히 투석하고 랫트 CFU-MK 분석계로 평가했을 때 모든 분획에서 TPO 활성이 투여량 의존 방식으로 발견되었다.

[실시예 45]

항-TPO 펩타이드 항체의 제조 및 SDS-PAGE와 웨스턴 분석에 의한 TPO의 검출

항-TPO 펩타이드 항체의 제조 성공은 면역학적 수단으로 TPO 단백질의 검출을 가능하게 했다. 따라서, 항원으로서 유용한 것 처럼 보이는 세 개의 영역(하기 참조)을 확인된 TPO 아미노산 서열로부터 선택하고 4중 가닥 복수 항원 펩타이드(MAP)형 펩타이드를 각각의 선택된 영역을 사용하여 Tam의 과정(Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85, 5409-5413, 1988)에 따라 합성한 후 각 합성된 펩타이드 100㎍을 사용하여 2마리의 토끼에 8회 면역화 처리시켜 각각의 항혈청 샘플을 얻었다.

[합성된 펩타이드 항원에 함유된 아미노산 서열]

(a) 랫트 TPO(9-28)(펩타이드 RT1 영역)

(위치 24에 있는은 유전자로부터 측정된 아미노산 잔기에서 원래 S이다)

(b) 랫트 TPO(46-66)(펩타이드 RT2 영역)

(c) 랫트 TPO(163-180)(펩타이드 RT4 영역)

(위치 178-180에 있는는 유전자로부터 측정된 아미노산 잔기에서 원래 TSG이다)

다음에, 상기 항혈청 샘플들중 항-RT1 펩타이드 및 항-RT2 펩타이드를 먼저 단백질 A(PROSEP-A : BiO Processing Ltd 제조, 카탈로그 No. 8427) 컬럼 크로마토그래피처리하여 1gG 분획(각각 2,344mg 및 1,920mg)을 제조하고 각 분획 중 54mg 및 34mg 부분을 활성형 비오틴(NHS-LC-Biotin II : PIERCE 제조, 카탈로그 No. 21336)과 결찰시켜 비오틴화 시켰다. 재조합 TPO 함유 샘플을 SDS-PAGE 처리하고 이어서 실시예 1에서와 같은 방법으로 PVDF 또는 니트로셀룰로오스 막상으로 전기 블록팅하여 상기 비오틴화 항체를 첫 번째 항체로서 사용하여 일반적인 방법으로 웨스턴 분석했다.

즉, 블롯팅한 후 막을 5분동안 20mM Tris-HCl 및 1.5M NaCl(pH 7.5)(TBS)로 이루어진 용액으로 5분동안 세척하고 0.1% Tween 함유 TBS(TTBS)로 5분간 두 번 세척한 다음 차단제(BlokaAce ; 다이니뽕 파마슈티칼 제조, 카탈로그 No. uk-B25)로 60분동안 처리했다. 다음에 상기 막을 10㎍/ML의 비오틴화 항-TPO 펩타이드 항체, 0.05% BSA 및 10% BlockAce를 함유하는 TTBS 용액으로 60분 동안 처리하고 이어 TBS로 5분동안 두 번 세척하였다. 이 막을 알칼리성 포스파타제 라벨링된 애비딘(레인코 테크놀로지스 제조, 카탈로그 번호 A108)을 10% BlockAce 함유 TTBS 용액으로 5000배 희석시켜 제조한 용액으로 30분동안 처리하고, TTBS로 5분간 2회 세척하며 TBS로 5분간 세척한 다음 알칼리성 포스파타제 기질(Bio-Rad 제조, 카탈로그 No. 170-6432)을 사용하여 컬러 현상하였다. 실온에서 상기한 웨스턴 분석을 하였다.

그 결과, COS1 세포에서 발현된 다양한 재조합 TPO 단백질 뿐만 아니라 COS1 세포 및 대장균 세포에서 발현된 다양한 재조합 TPO 단백질을 확인할 수 있었다(예컨대, 실시예에 기재된 바와 같이 COS 1 세포에서 발현된 플라스미드 pHTP1- 또는 플라스미드 pHTF1- 유도된 인간 TPO 및 그의 N-글리코시드 결합 분해 생성물, 대장균에서 발현된 GST-TPO(1-174) 및 그의 트롬빈 분해 생성물 및 대장균에서 발현된 돌연변이형 TPO인 h6T(1-163). 또한 그 결과로 말미암아 다양한 유형의 재조합 인간 TPO의 분석이 가능하였다.

상기에 더하여 항-인간 TPO 펩타이드 항체의 제조 가능성을 확인했다. 이 기술에 의해 수득한 항체는 웨스턴 분석 뿐만 아니라 항체 컬럼에 의한 TPO의 정제에도 적용될 수 있고 항체-보조 면역학적 수단에 일반적으로 사용될 수 있다.

상대적으로 적절한 항원성을 갖는 것으로 예상되는, 서열 7에 도시된 인간 TPO 아미노산 서열에서 6개 영역을 선택했다(표 4 참조). 이들 영역에 상응하는 4합체성 복수 항원 펩타이드(MAP)형 펩타이드를 합성했다. 각 펩타이드를 100mg/회의 양으로 두 마리 토끼에게 8번 면역화 시켰다.

이와 별도로 시스테인 잔기가 표 4에 도시된 각 펩타이드 부위의 C-말단에 결합된 단량체성 펩타이드도 합성했다. 이 펩타이드를 테스트 항원으로 사용하여 효소 면역분석법으로 항체역가를 측정했다. 그 결과, 상기 제조된 혈청에 대하여 항체역가의 증가가 확인되었고 따라서, 이 항원들을 항혈청으로 사용했다.

각 항원성 펩타이드를 사용하여 두 마리의 토끼를 면역화시켜 상기 펩타이드에 관한 항혈청을 생성시켰다. 생성한 2개의 항-HT1 펩타이드 항체들을 토끼 개체에 따라 항-HT1-1 펩타이드 및 항-HT1-2 펩타이드 항체라 구별지어 칭하였다. 항-HT-1 펩타이드 항체의 정제 예를 하기에 설명한다.

먼저, 시스테인 잔기가 결합된 HT1의 단량체성 펩타이드 30mg을 Sulfo-Link 결합겔(Pierce, 카탈로그 No. 44895)에 결합시켰다. 간단하게는 항원을 함유하는 펩타이드 용액을 겔 부피의 6배량의 결합 완충액(50mM Tris, 5mM EDTA-Na pH 8.5)으로 평형화시킨 겔에 15분 동안 결합시켰다. 30분 동안 배양한 후에 겔 부피의 3 배량의 결합 완충액으로 겔을 세척하였다. 0.05M L-시스테인-HCl를 함유하는 결합완충액을 1ml/ml 겔의 양으로 겔에 첨가하여 15분간에 걸처 이 반응 라디칼을 차단했다. 30분동안 배양한 후 겔부피에 대하여 8배 부피의 결합 완충액으로 겔을 세척했다. 모든 결합 반응을 실온에서 수행했다. 그 펩타이드를 겔에 28.3%의 결합효율로 공유결합시키고 0.8mg의 펩타이드/mg 겔을 갖는 항원 컬럼을 제조했다.

토끼들중 한 마리로부터 총 78.4ml의 양으로 채혈한 항-HT1-1 펩타이드를 함유하는 항혈청 76.7ml(단백질 함량 3,620mg)를 150mM NaCl 및 0.05% 아지드화나트륨을 함유하는 50mM 포스페이트 완충액으로 미리 평형화 시킨 항원 컬럼에 부가하고 동일한 완충액으로 세척하여 105.9ml의 유동-통과 분획(단백질 함량 3,680mg)을 얻었다. 흡착된 분획을 0.1M 시트레이트 완충액(pH 3.0)으로 용출시키고 즉시 21.1ml의 0.1M 카보네이트 완충액(pH 9.9)으로 중화시킨 다음 한외 여과수단(Amicon YM 30막)으로 농축시켜 150mM NaCl 및 0.05% NaN3를 함유하는 50mM 포스페이트 완충액(pH 8) 용액중의 정제된 항-HT1-1 펩타이드 항체를 수득하였다.

마찬가지로, 하기 항체들을 제조하였다: 항-HT1-2 펩타이드 항체(60.0mg) ; 항-HT2-1 펩타이드 항체(18.8mg); 항-HT2-2 펩타이드 항체(8.2mg); 등, 항-HT3 내지 항-HT6 펩타이드 항체들도 유사한 방법으로 제조할 수 있었다.

3mg의 친화성-정제 항-HT1-1 펩타이드 항체, 항-HT1-2 펩타이드 항체, 항-HT2-1 펩타이드 항체 또는 항-HT2-2 펩타이드 항체를 활성화된 비오틴(Pierce, NHS-LC-비오틴 II, 카탈로그 No. 21336)에 결합시켜 비오틴화시켰다.

상기 모든 정제된 항체들은 표 4에 표시된 아미노산 서열을 코딩하는 유전자가 도입되고 발현된 CHO 세포의 배양 상청액으로부터 부분적으로 정제된 재조합 인간 TPO 표준을 웨스턴 블롯팅(니트로셀룰로오스 필터 또는 PVDF 상에서) 및 SDS-PAGE 처리함으로써 인간 TPO를 인식하여 검출할 수 있는 것으로 밝혀졌다.

[표 4]

[실시예 46]

항-TPO 펩타이드 항체 컬럼의 제조

실시예 45에서 얻은 항-랫트 TPO 펩타이드 항체가 랫트 및 인간 TPO 분자를 인식할 수 있었기 때문에 항-RT1 펩타이드 항체 및 항-RT2 펩타이드 항체의 면역글로불린(IgG) 분획을 하기의 방법으로 화학적으로 활성화된 겔 지지체에 결합시켜 항-TPO 펩타이드 항체 컬럼을 제조했다. 재료로서 사용된 2개 항체는 두 마리 토끼의 혈청으로부터 별도로 제조했다. 즉, 두 마리 토끼로부터 제조된 항-RT1 펩타이드 항체를 각각 항-RT1-1 펩타이드 항체 및 항-RT2 펩타이드 항체로 명명하고 다른 두 마리 토끼로부터 제조된 항-RT2 펩타이드 항체를 항-RT2-1 펩타이드 항체 및 항-RT2-2 펩타이드 항체로 명명하였다. 이 항체들이 항체컬럼을 제조하기 위하여 별도로 사용되었기 때문에 총 5컬럼을 얻었다. 즉, 2개의 항-RT1 펩타이드 항체 컬럼(이하, “항-RT1 항체 컬럼” 및 “항-RT1-2 항체 컬럼” 이라 함), 2개의 항-RT2 펩타이드 항체 컬럼(이하, “항-RT2-1 항체 컬럼” 및 “항-RT2-2 항체 컬럼” 이라 함) 및 항-RT1-2 펩타이드 항체를 항-RT1-2 펩타이드 항체를 항-RT2-1 펩타이드 항체와 결합시키고 그 혼합물을 겔과 결합시켜 제조된 하나의 항체 컬럼(항-RT1-2+ 2-1 혼합 항체 컬럼).

각 항체를 20mM 인산나트륨 및 0.15M NaCl(pH 8.0) 용액에 5mg/ml의 최종 농도(항-RT1+2 혼합 항체 컬럼의 경우에 항-RT1-2 펩타이드 항체와 항-RT2-1 항체가 고르게 혼합된 것 각각 2.5mg/ml)로 용해시키고 그 용액 2.3ml 부분을 팽창된 포르밀-활성화 겔(포르밀-셀룰로핀, Chisso 제조) 1.54ml 부피와 혼합한 다음 4℃에서 2시간동안 결합반응시켰다. 이것에 1.1ml의 환원제(트리메틸아민 보란(TMAB; Seikagaku Kogyo 제조, 카탈로그 No. 680246)의 10mg/ml 용액을 첨가하고 6시간동안 추가로 결합 반응시킨 후 원심분리하여 겔부분을 회수했다. 정제된 물의 10ml 부분을 원심분리하여 다시 회수된 겔부분에 첨가하고 이 단계를 4번 반복하여 반응하지 않는 항체 분자를 제거하였다. 다음에 그 겔을 4.6ml의 차단용액(0.2M 인산나트륨 및 1M 에탄올 아민, pH 7.0) 및 1.1ml의 환원제 용액과 혼합하고 최소한 2시간동안 4℃에서 처리하고 반응하지 않는 겔중 활성기를 차단했다. 그 후, 그 겔을 원심분리를 이용하여 정제된 물과 DPBS로 세척하고, 작은 컬럼관에 팩킹하고, 3M 티오시안산 칼륨 용액 및 0.1M 글리신-HC1(pH 2.5)용액을 세척한 다음 DPBS로 평형화시켜 저장했다.

항-RT1-1 항체 컬럼, 항-RT1-2 항체 컬럼, 항-RT2-1 항체 컬럼, 항-RT2-2 항체 컬럼 및 항-RT1-2 + 2-1 혼합 항체 컬럼으로 이루어진 5개 항-TPO 펩타이드 항체 겔에서 각 IgG 분획의 결합효율은 97.4%, 95.4%, 98.4%, 98.3% 및 99.4%에 도달했다. 또한, 겔 부피당 결합된 IgG 분획의 양은 5.6mg/ml겔, 5.8mg/ml 겔, 5.7mg/ml 겔, 5.7mg/ml 겔 및 2.9mg/ml 겔이었다. 따라서, 결합효율 및 결합량은 항체출처 및 항원의 차이에 따라 변화가 심하지 않다는 것이 확인되었기 때문에 실시예 47에 도시된 실험을 이들 항체 컬럼을 사용하여 수행했다.

[실시예 47]

항-TPO 항체 컬럼을 사용하고 역상 컬럼 크로마토그래피에 의하여 COS1 세포를 발현 벡터 pHTP1로 형질전환시켜 얻은 배양상청액으로부터 유도된 TPO의 정제 및 생물학적 활성의 확인

하기에 정제 샘플을 평가하기 위한 시험관내 평가로서 M-70e 분석계를 사용했다. 발현벡터 pHTP1으로 형질전환된 COS1 세포에 의해 실시예 35에서 얻은 배양 상청액으로부터 유도된 TPO의 부분적으로 정제된 샘플(주 TPO 분획 이외의 분획 즉, Macro-Prep Methyl HIC 컬럼의 통과 분획 F1 및 20mM 시트르산 나트륨, pH 5.8로 세척함으로써 F2 이후에 용출된 분획 F3 및 SP 세파로오스 Fast Flow 컬럼의 분획 F1 및 F3)를 조합하여 TPO 서브푸울 분획(5,463.79ml ; 단백질 농도 0.490mg/ml; 총단백질 2,676mg; 상대 활성 12,100; 및 총 활성 32,380,000)을 제조하고 한외여과 유니트(Omega Ultraset, 겉보기 분자량 컷오프 8,000, Filtron 제조)을 사용하여 농축시킨 다음 농축된 분획의 용매를 DPBS로 교환하고 소량의 샘플을 YM-10 막 장착 한외여과 유니트(Amicon 제조)로 처리하여 그것을 최종적으로 0.05% 아지드화 나트륨 함유 120.2ml의 DPBS 용액으로 만들었다. 다음에, 실시예 46에서 제조된 5개의 항-TPO 펩타이드 항체 겔을 혼합하여 단일 항체 컬럼(직경 1.6cm 및 상높이 4.8cm, 이하 항-RT1+2 혼합 항체 컬럼)으로 만들고 그 TPO 서브푸울 분획을 상기 컬럼에 0.033 ml/분의 유량으로 부가하였다. 샘플적재의 완료후 DPBS 용출시켜 UV 흡수가 충분히 작을때까지 용출액을 수집하고 그 수집된 용출액을 YM-19 막 장착 한외여과 유니트(Amicon 제조)를 사용하여 농축시켜 통과 분획 F1(82.62ml ; 단백질 농도 14.3mg/ml; 총 단백질 1,184mg; 상대 활성 67,500; 및 총활성 79,900,000)을 얻었다. 다음에, 컬럼 흡착 분획 F2(92.97ml; 단백질 농도 0.12mg/ml; 총 단백질 11.1mg; 상대 활성 257,100; 및 총 활성 2,860,000)를 산성용출 용액(0.1M 글리신-HCl, pH 2.5)로 용출시켰다. 통과 분획 F1이 TPO 활성을 함유했음에도 불구하고 상대 활성이 약 20배 증가했기 때문에 항체 컬럼-흡착 TPO를 더 정제했다. 즉, 전개용매 A로서 0.1% TFA 및 전개용매 B로서 0.5% TFA를 함유하는 1-프로판올을 사용하여 항체 컬럼에서 얻은 분획 F2를 1/10부피의 전개용매 B와 혼합하고 그 혼합물을 20% B로 미리 평형화시킨 Capcell Pak CI 300A 컬럼에 0.4ml/분의 유량으로 부가하여 Capcell Pak CI 300A(Shiseido 제조, 카탈로그 No. C1 TYPE : SG 300A; 직경 4.6mm 및 상높이 150mm, 직경 4.6mm 및 상높이 35mm의 예비컬럼에 연결됨) 컬럼 크로마토그래피 처리시켰다. 샘플 적재후 20% B로 5분동안 그리고 20% B에서 40% B까지의 밀도 구배로 50분동안 용출시켜 폴리프로필렌관에 1ml(2.5분) 부분씩 용출액을 수집하였다.

2㎕ 부분(1/500 분획)의 각 관에 있는 용출액을 HSA와 혼합하고 한외여과로 농축시켜 분석에 의해 TPO 활성 분획의 검정에 사용하기 위한, 0.02% HSA를 함유하는 IMDM 분석 배양용액 0.25ml를 얻었다. 그 결과, 관번호 20-23(프로판올 농도 25.5-32.5% 범위내)의 샘플에서 강한 TPO 활성을 발견했다. 또한, 이 샘플을 실시예 45에 기술된 과정에 따라 웨스턴 분석했을 때, DPC III 분자량 마커에 기초한 환원 조건하에서 60,000-70,000의 겉보기 분자량을 갖는 TPO의 존재뿐만아니라 각각 32,000-43,000 및 20,000-30,000의 분자량을 갖는 다른 분자의 존재도 확인되었다.

[실시예 48]

COS1 세포를 발현벡터 pHTP1으로 형질전환시켜 얻은 배양 상청액으로부터 유도되어 Capcell Pak CI 300A 컬럼의 단계까지 정제된 TPO의 생물학적 활성의 확인

실시예 36에서 정제된 TPO 활성 분획, 즉 Capcell Pak CI 300A 컬럼의 관번호 20-30(프로판올 농도 28.5-32.5%의 범위내)를 모으고 0.2ml의 글리세롤과 혼합한 다음 원심분리 증발로 농축시켰다. 이것을 0.21ml의 6M 구아니딘 하이드로클로라이드 용액과 혼합하고 DPDS를 사용하여 1ml 부피로 희석시킨 다음 세파덱스 G25 컬럼(NAP-10 Pharmacia Biotech 제조, 카탈로그 No. 17-0854-01)에 의해 0.01% HSA를 함유하는 DPBS 용액으로 완충액을 교환하고, 이어 0.01% HSA를 함유하는 DPBS 용액 1.1ml와 혼합하여 최종적으로 TPO 활성 분획 FA(2.6ml)를 얻었다. 이 샘플의 생물학적 TPO 활성을 검사하기 위하여 생체내 분석을 수행했다. 즉, 각그룹이 4마리인 ICR 수컷 마우스(생후 8주)에 매일 5일동안 마리당 100㎕ 의 투여량(M-07e 분석계에 의해 측정된 110,000의 총 활성을 갖는)으로 활성 분획을 피하투여하였다. 대조군으로서 0.01%의 HSA를 함유하는 DPBS 100㎕를 같은 방법으로 피하 투여하였다. 투여 바로전 그리고 최종투여 다음날에 안저로부터 혈액을 수집하여 마이크로셀 계수기(F800, Toa Iyo Denshi 제조)로 혈소판 수를 측정했다. TPO 처리 그룹에서는 투여전 값과 비교할 때 투여 완료후 평균 약 1.42배인 반면에 대조군의 경우에 비해 1.23배 높으며 이들 사이에는 현저한 차(p〈0.05, Student T-테스트)가 있었다. 이 결과를 기초로 할 때 포유동물 세포에 의해 생성된 상기 인간 TPO는 생체내에서 혈소판 수를 증가시키는 능력을 갖는 것이 확인되었다.

[실시예 49]

COS1 세포를 발현벡터 pHTP1로 형질전환시켜 얻은 33리터의 배양 상청액으로 부터 유도되고 양이온 교환 컬럼에 의해 부분적으로 정제된 조 TPO 분획의 생물학적 활성의 확인

(1) 하기 정제 샘플을 평가하기 위한 시험관내 분석법으로서 M-07e 분석계를 이용했다. 실시예 36에 기술된 방법과 동일한 방식으로, COS1 세포를 발현벡터 pHTP1으로 형질전환시키는 것에 의해 총 33리터의 무혈청 배양 상청액을 수득하고 0.22㎛필터를 통하여 여과하여 상청액을 회수했다. 이것을 한외여과 유니트(PLGC 펠리콘 카세트, 겉보기상 분자량 컷 오프 10,000, 밀리포어 제조)로 약 10배 농축시키고 약 1mM의 최종 농도의 프로테아제 억제제 p-APMSF와 혼합하여 2,018ml 부피의 샘플(단백질 농도 3.22mg/ml; 총 단백질 6.502mg; 상대 활성 66,000 ; 및 총 활성 429,100,000)을 얻었다. 다음에, 이것을 한외여과 유니트(Omega Ultraset, 겉보기 분자량 컷오프 30,000 이상의 분자량을 갖는 분획 (부피, 1,190ml; 단백질 농도 2.54mg/ml; 총 단백질 3,020mg; 상대 활성 82,500; 및 총 활성 249,000,000) 및 30,000 이하의 분자량을 갖는 분획 (부피, 2,947ml; 단백질 농도 0.471mg/ml; 총 단백질 1,402mg; 상대 활성 4,500 ; 및 총 활성 6,310,000)을 얻었다. 30,000이하의 분자량을 갖는 분획에서의 TPO 활성의 존재는 배양상청액이 동물세포에서 발현 또는 분비되는 동안 분자량이 감소된 TPO를 함유한 가능성을 나타낸다. 한편, 30,000 이상의 분자량을 갖는 분획을 20mM 시트르산 나트륨 완충액(pH 6.1)으로 교환하고, 또 20mM 시트르산 나트륨 완충액(pH 6.1)으로 미리 평형화시킨 SP 세파로오스 Fast Flow(직경 2.6cm 및 상높이 29cm; Pharmacia Biotech 제조, 카탈로그 No.17-0729-01)컬럼에 5ml/분의 유량으로 부가하였다. 샘플 적재후 컬럼을 20mM 시트르산 나트륨 완충액(pH 6.1)으로 세척하고 용출시켰다. 다음에 전개용매 A로서 20mM 시트르산 나트륨 완충액(pH 6.1)을 그리고 전개용매 B로서 전개용매 A와 1M NaCl로 이루어진 용액을 사용하여 0% B-50% B까지의 선형구배로 215분동안 그리고 50% B-100% B까지의 선형구배로 20분동안 30ml/분의 유량으로 용출을 수행하여 그 용출액을 폴리프로필렌관에 30ml(10분) 부분씩 수집했다. 이 용출액의 일부를 M-07e 분석계로 체크하여 활성 분포를 검사했을 때 넓은 범위에서 TPO 활성의 용출이 발견되었다. 따라서, 통과 분획을 포함하는, 50mM 이하의 NaCl 농도로 용출된 분획을 분획 F1으로 모으고 50-1,000mM NaCl로 용출된 주 TPO 분획을 분획 F2로 모았다. 분획 F1의 부피는 1,951ml(단백질 농도 2,05 mg/ml; 총 단백질 3,994mg; 상대 활성 13,500 ; 및 총 활성 53,900,000)이었고 F2의 부피는 649,8ml(단백질 농도 1.11 mg/ml ; 총 단백질 721mg; 상대 활성 268,000 : 및 총 활성 193,000,000)이었다.

(2) SP 세파로오스 Fast Flow 분획 F2의 생물학적 활성 확인

상기 단계(1)에서 분리된 SP 세파로오스 Fast Flow 분획 F2 2.5ml 부분을 세파덱스 G25 컬럼(NAP-25, Pharmacia Biotech 제조, 카탈로그 No. 17-0852-01)에 의해 0.01% HSA 함유 DPBS 3.5ml와 완충액 교환시키고 이 샘플(단백질 농도 1.46mg/ml)의 생물학적 TPO 활성을 생체내에서 분석하였다. 즉 활성 분획을 각 그룹이 4마리로 된 수컷마우스(생후 8주)에 5일동안 매일 동물당 100㎕ 투여량(M-07e 분석계로 측정된 123,000의 총 활성을 갖는)으로 피하투여했다. 대조군으로 0.01%의 HSA를 함유하는 D PBS 100㎕ 를 같은 방법으로 피하투여했다. 투여 바로전 그리고 최종투여 다음날에 안저로부터 혈액을 수집하여 마이크로셀 계수기(F800, Toa Iyo Denshi 제조)로 혈소판 수를 측정했다. TPO 투여 그룹에서는 투여전 값과 비교할 때 투여완료후 평균 약 1.29배까지 혈소판 수가 증가했고 또 대조군에서 보다는 1.12배 더 증가했는데, 이들 사이에 현저한 차가 있었다(P〈0.05, Student T-테스트). 이 결과는 포유동물 세포에 의해 생성된 상기 인간 TPO가 혈소판 수 증가 능력을 갖는다는 것을 입증했다.

[실시예 50]

CHO 세포에서 인간 TPO 염색체 DNA의 발현에 사용하기 위한 재조합 벡터, pDEF202-ghTPO의 작제

벡터 pDEF202를 제한효소 KpnI 및 SpeI 으로 분해시키고 아가로오스 겔 전기영동처리하여 마우스 DHFR 미니진 및 SV40 폴리아데닐화 신호 시그널을 함유하는 단편을 단리하고 제한효소 KpnI 및 SpeI으로 처리함으로써 플라스미드 pEFHGTE로부터 SV 폴리아데닐화 시그널 함유 영역을 제거함으로써 제조한 벡터 DNA를 T4 DNA 리가아제(다까라 스조 제조)에 의해 상기 수득한 단편에 결찰시킴으로써 발현 벡터 상기 pDEF202-ghTPO를 얻었다. 이 플라스미드는 SV40 복제기점, 인간 성장인자 1-α 프로모터, 인간 TPO 유전자의 전사를 위한 SV40 초기 폴리아데닐화 영역, 마우스 DHER 미니진, pUC18 복제기점, β-락타마아제 유전자(Ampr) 및 신장인자 1-α 프로모터의 하류부위에 연결된 인간 TPO 염색체 DNA를 함유한다.

[실시예 51]

CHO 세포에서 인간 TPO 염색체 DNA의 발현

직경 6cm의 플레이트(Falcon 제조)를 사용하여 10% 우태아 혈청을 함유하는 α-최소 필수 배지(α-MEM(-), 티미딘과 하이포크산틴이 보충됨)에서 배양시킴으로써 CHO 세포(dhfr- 균주 ; Urlaub 및 Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol. 77, p4216, 1980)를 성장시키고 생성한 세포를 인산칼슘법(CellPhect, 파마시아 제조)으로 형질전환시켰다.

즉, 실시예 50에서 제조된 플라스미드 pDEF202-ghTPO 10㎍을 120㎕ 의 완충액 A 및 120㎕ 의 H2O와 혼합하고 그 혼합물을 실온에서 10분 동안 배양했다. 이 용액을 120㎕ 의 완충액 B와 혼합하고 실온에서 30분동안 추가로 배양했다. 이렇게 제조된 DNA 용액을 플레이트에 넣고 CO2 배양기에서 6시간동안 배양 하였다. 배지를 제거하고 플레이트를 α-MEM(-)로 2회 세척한 후에 10% 디메틸 설폭사이드 함유 α-MEM(-)를 플레이트에 첨가하여 실온에서 2분동안 처리했다. 다음에, 10% 투석된 우태아 혈청을 함유하는 비선택배지(하이포크산틴 및 티미딘이 보충된 α-MEM(-) op.cit)를 첨가하여 2일동안 배양한 다음 10% 투석된 우태아 혈청을 함유하는 선택배지(하이코프산틴 및 티미딘이 없는 α-MEM(-))를 사용하여 선택했다. 세포를 트립신으로 처리하고 직경 6cm의 하나의 플레이트에서 처리된 세포를 직경 10cm의 5개 플레이트 또는 24웰 플레이트의 20개 플레이트에 분배시키고 이틀마다 선택배지를 교환하면서 세포배양을 계속함으로써 선택을 행하였다. 인간 TPO 활성을 Ba/F3 분석법으로 측정했을 때, 세포의 증식이 관찰되는 플레이트 중의 배양 상청액 또는 웰에서 인간 TPO 활성의 존재가 확인되었다.

이 경우에 CHO 세포의 형질전환은 pEFHGTE 및 pMG1으로 CHO 세포를 공동 형질 전환시킴으로써 실시하였다.

[실시예 52]

Lys 잔기 및 Met 잔기가 각각 -1 및 -2 위치에 추가된 인간 TPO 단백질(위치 1-163의 아미노산잔기)(이후, “hMKT(1-163)”으로 칭함)의 대장균에서의 발현에 사용하기 위한 벡터의 작제 및 그의 발현의 확인

1- 및 3- 위치 아미노산 잔기가 인간 TPO 단백질(위치 1-163의 아미노산 잔기)과 동일한 단백질을 발현시키기 위하여 하기 합성 올리고뉴클레오타이드 1-13, 2-13, 3-3 및 4-3을 사용하여 실시예 42에 기술된 것과 동일한 방법으로, 대장균에서 hMKT(1-163)의 발현을 사용하기 위한, [Met-2 - Lys-1] TPO(1-163)이라고도 불리는 벡터 pCFM536/hMKT(1-163)를 작제했다.

이 발현 플라스미드는 서열목록(서열 12)에 도시된 DNA 서열을 함유했다. 그 후, 실시예 43에 기술된 것과 동일한 방법으로 hMKT(1-163)의 발현을 유도했다.

수득한 발현 단백질을 SDS-PAGE처리하고 PVDF 막 상으로 전달시켜 N-말단 아미노산 서열분석을 했을 때 이 단백질은 발현될 hMKT(1-163)의 아미노산 서열을 함유하는 것이 확인되었다.

[실시예 53]

구아니딘 하이드로클로라이드 및 글루타치온을 사용하는 대장균에서 발현된 인간 TPO로부터 유도된 인간 TPO, h6T(1-163)의 재생 및 정제 그리고 생물학적 활성의 확인

실시예 43에서 제조된 h6T(1-163)생산 재조합 균주의 냉동세포 1.2g 부분을 3ml의 물에 현탁하고 고압 분쇄기를 사용하여 분쇄시켰다. 상기 현탁액은 원심분리 처리하여 침전 분획을 회수하고 배부분의 오염된 단백질, 세포성분 등을 제거했다. h6T(1-163)을 함유하는 회수된 침전 분획을 4ml의 최종 부피의 물에 현탁시켰다. 1ml의 1M Tris 완충액(pH 8.5)을 상기 현탁액에 교반하면서 첨가하고 추가로 20ml의 8M 구아니딘 하이드로클로라이드를 첨가한 다음 내용물을 용해시키기 위해서 실온에서 5분동안 교반했다. 그 용액을 pH 8.5의 20mM Tris 완충액으로 10배 희석시키고 5mM의 환원형 글루타치온 및 5mM의 산화형 글루타치온을 상기 희석용액에 교반하면서 용해시키고 그 용액을 4℃에서 밤새 배양하였다. 원심분리하여 상청액에서 h6T(1-163)을 회수했다. 수득한 상청액 160ml 부분을 YM10 한외여과막(Amicon 제조)을 사용하여 농축시키고 DPBS로 완충액을 교환하여 3.4ml 최종부피 분획(단백질 농도 2.18mg/ml)을 얻었다. 이 분획을 IMDM 배양배지에 대하여 완전히 투석시키고 랫트 CFU-MK 분석계로 평가했을 때 강한 TPO 활성(상대 활성, 58,000)이 발견되었다.

상기에서 제조된 TPO 활성 분획을 생체내에서 평가했다. 즉, 각 그룹이 4마리인 ICR 수컷 마우스(생후 7주)에 매일 5일동안 마리당 170㎕ 의 투여량(CFU-MK 분석계에 의해 측정된 22,000의 총 활성을 갖는)으로 활성 분획을 피하투여하였다.

대조군으로서 DPBS 170㎕ 를 같은 방법으로 대조군의 6마리 각각에 피하투여하였다. 투여 바로전, 투여 완료 다음날 그리고 3일 후 안저로부터 혈액을 수집하여 마이크로셀 계수기(F800, Toa Iyo Denshi 제조)로 혈소판 수를 측정했다. TPO 투여 그룹에서는 투여전 값과 비교할 때 투여 완료 후 다음날에 평균 약 2.15배까지 혈소판 수가 증가했고 그러한 효과는 2.13배 더 높은 값을 나타내는 투여완료 3일 후까지도 변하지 않고 유지되었다. 투여 완료후 다음날 및 3일 후에 혈소판 수는 대조군의 경우에서 보다 1.73 및 1.80배 더 높은데 그들 사이에 큰 차이(p〈0.001, Student t-테스트)를 나타냈다. 이 결과는 대장균에 의해 상기 방법으로 제조된 인간TPO가 생체내에서 혈소판 수 증가 능력을 갖는다는 것을 입증하였다.

[실시예 54]

소듐 N-라우로일 사르코시네이트 및 황산 구리를 이용하는, 대장균에서 발현된 인간 TPO, h6T(1-163)의 재생 및 정제 그리고 생물학적 활성의 확인

실시예 43에서 제조된 h6T(1-163)생산 재조합 균주의 냉동세포 0.6g 부분 3ml의 물에 현탁하고 고압 분쇄기를 사용하여 분쇄시킨 다음 원심분리하여 침전 분획을 회수하였다. 침전 분획은 3.1ml의 물에 현탁시킨 후 1.19ml의 1M Tris 완충액(pH 9.2) 11.25ml의 1M DTT, 38㎕ 의 0.5M EDTA 및 0.38ml의 10% 소듐 데옥시콜레이트 용액을 교반하면서 첨가하고 그 혼합물을 실온에서 40분동안 교반시켰다. 이어 원심분리시켜 침전된 분획을 수거하고 대부분의 오염된 단백질, 세포 성분을 제거하였다. 생성한 침전물을 4ml의 물에 현탁시키고 원심분리시켜 h6T(1-163)을 함유하는 침전 분획을 회수하였다. 이렇게 회수한 침전 분획을 3.8ml의 물에 현탁시키고, 이 현탁액에 0.2ml의 1M 트리스 완충액(pH 8) 및 1ml의 10% 나트륨 N-라우로일 사르코시네이트를 교반하면서 부가하고, 이어 실온에서 20분간 더 교반하여 내용물을 용해시켰다. 생성한 용액을 5㎕ 의 1% 황산구리와 혼합하고 또 실온에서 철야(약 20시간)로 교반하였다. 생성한 용액을 원심분리 처리하여 h6T(1-163) 함유 상청액 분획을 회수하며, 그 상청액의 5ml 부분을 5ml의 물과 10ml의 20mM 트리스 완충액(pH 7.7)과 혼합한 다음 2.6g의 20 내지 50메쉬 Dowex 1-X4 클로라이드 형태 이온교환 수지를 부가한 다음 90분간 교반하였다. 유리 필터를 이용하여 이온 교환 수지를 제거하여 수지가 흡착되지 않은 분획을 회수하고 이를 원심분리처리하여 상청액을 회수하였다. 이렇게 수득한 상청액을 20mM 트리스 완충액(pH 7.7)로 미리 평형화된 SP 세파로오스 Fast Flow 양이온 교환 컬럼에 부가하고 0 내지 500mM NaCl의 선형 구배에 의해 동일 완충액으로 용출시켰다. SP 세파로오스 Fast Flow 양이온 교환 컬럼의 용출 분획을 IMDM 배양 배지에 대하여 완전히 투석시키고 랫트 CFU-MK 분석계로 평가했을 때, 약 100mM의 NaCl 농도로 용출된 분획에서 강한 TPO 활성(상대활성, 19,000,000)이 관찰되었다. 이 분획을 한외여과 유니트(울트라 프리 FL, 겉보기 분자량 컷오프 5000; 밀리포어 제조, 카탈로그 번호 UFC4LCC25)를 이용하여 1.6배 (2.5ml; 단백질 농도 2.5mg/ml) 농축시켰다. 이렇게 농축된 분획을 환원제 존재하에서 SDS-PAGE에 의해 분석했을 때, TPO에 상응하는 밴드가 주 밴드로 검출되었다(순도, 70 내지 80%).

상술한 과정으로 제조한 TPO 활성 분획을 생체내 시험으로 검사하였다. 즉, 각 그룹이 4마리인 ICR 수컷 마우스(생후 8주)에 매일 5일동안 마리당 100㎕ 의 투여량(CFU-MK 분석계에 의해 측정된 총 활성 47,500을 갖는)으로 활성 분획을 피하투여하였다. 대조군으로서 100mM NaCl을 함유하는 100㎕ 의 20mM 트리스 완충액 (pH 7.7)을 동일 방식으로 피하투여하였다. 투여 전날 및 투여 완료한 다음날 안저로부터 혈액을 수집하여 마이크로셀 계수기(F800, Toa Iyo Denshi 제조)로 혈소판수를 측정했다. TPO 투여 그룹에서는 투여전 값과 비교할 때 투여완료후 평균 약 1.73배까지 혈소판 수가 증가했고 대조군에서보다는 1.59배 증가되었으며, 이들 사이에는 현저한 차이(P〈0.001, Student T-테스트)를 나타냈다. 이 결과는 대장균에 의해 상기 과정으로 생산된 인간 TPO가 생체내에서 혈소판 개수를 증가시킨다는 것을 입증하였다.

[실시예 55]

CHO 세포의 대규모 배양

실시예 32에서 인간 TPO 발현 플라스미드 pDEF202-hTPO-P1을 CHO 세포로 형질전환시켜 얻은 인간 TPO 생성 CHO 세포주(CHO 28-30세포, 25nM MTX에 내성)의 대규모 배양은 하기와 같이 수행하였다. CHO 세포주를 25nM MTX 및 10% FCS를 함유하는 DMEM/F-12 배양배지(GIBCO)에서 배양 및 증식시켰다. 이 세포들을 트립신 용액으로 분리한 후 1 ×107 세포를 200ml의 동일 배지를 함유하는 회전병(Falcon 제조, Falcon 3000)에 접종하고 1rpm의 회전속도로 37℃에서 3일동안 배양했다. 3일 배양한 후 흡입하여 배양 상청액을 제거하고 점착성의 CHO세포를 100ml의 PBS로 헹구었다. 25nM MTX 또는 10% FCS를 함유하지 않는 200ml의 DMEM/F-12 배지(GIBCO)를 병에 청가하고 세포를 1rpm의 속도로 37℃에서 7일동안 배양했다. 배양 7일 후 배양 상청액을 다음 정제 과정의 출발 물질로서 회수했다. 상기한 과정을 500 회전병에서 수행하여 100L의 배양 상청액을 얻었다.

[실시예 56]

인간 TPO 생성 CHO 세포주로 부터의 인간 TPO의 정제

(1) 실시예 55에서 얻은 무혈청 배양 상청액 약 100L를 0.22㎛ 필터로 여과하여 여과액을 얻고 한외여과 유니트(PLTK Pellicon 카세트, 겉보기 분자량 30,000 컷 오프, Millpore 제조)상에서 농축시켰다. 상기 농축액의 용매를 순수한 물로 대체한 후, 단백질 분해효소 억제제들인 p-APMSF(Wako Pure Chemicals) 및 Pefabloc SC(Merck)를 상기 수용액에 각각 1mM 및 0.35mM의 최종농도로 첨가하여 분자량 30,000 이상의 분획(단백질 농도 1.60mg/ml; 총 단백질 5,805mg; 상대 활성 1,230,000 ; 총활성 7,147,000,000) 3628ml를 얻었다. 그 분획을 실시예 45에 기술된 바와 같이 웨스턴 블롯분석처리하였다. 그 결과, 66,000-100,000 사이 범위의 분자량에서 TPO 단백질의 존재가 나타났다. 보다 상세한 검사에서는 상기 TPO보다 저 분자량 TPO종이 통과 분획에 함유된 것으로 발견되었다.

30,000 이하의 분자량을 갖는 TPO를 함유한 한외여과액을 한외여과 유니트(PLGC Pellicon 카세트, 겉보기 분자량 10,000 컷오프, Millipore)를 사용하여 별도로 농축시켜 1091ml의 저분자량 TPO 분획(단백질 농도 : 0.36mg/ml; 총 단백질 684mg; 상대 활성 245,500; 및 총 활성 167,900,000)을 얻었다. 이것은 세포 배양하는 동안 저분자량 TPO종이 생성되었다는 것을 나타낸다.

다음에 30,000 이상의 분자량을 갖는 TPO를 함유하는 3,614ml의 분획에 764g의 황산암모늄 및 144.5ml의 0.5M 시트르산 나트륨 완충액(pH 5.5)을 첨가하여 1.41M(최종 농도) 황산암모늄 및 17.7mM(최종 농도) 시트르산 나트륨 완충액을 함유하는 용액 4,089ml를 제조하였다. 상기 용액으로부터 원심분리에 의해 비용해 물질을 제거한 후 투명 용액을 얻었다.

이 투명용액을 1.2M 황산 암모늄을 함유하는 20mM 시트르산 나트륨 완충액(pH 5.5)으로 미리 평형화시킨 Macro-Prep Methyl HIC 컬럼(Bio-Rad, 카탈로그 No. 156-0080; 직경 5cm, 상높이 24.5cm)에 25ml/분의 유량으로 부가하였다. 부가 완료후 1.2M 황산암모늄을 함유하는 20mM 시트르산나트륨 완충액(pH 5.5)으로 용출시켰다. 용출된 분획을 한외여과 유니트(Filtron, Omega Ultrasette, 겉보기 분자량 8,000 컷 오프)상에서 농축시켜 통과 분획 F1(4455ml; 단백질 농도: 0.400mg/ml; 총 단백질 1,780mg; 상대 활성 1,831,000)을 얻었다.

다음에 용출 완충액으로 20mM 시트르산 나트륨(pH 6.0)을 컬럼을 통하여 통과시켜 용출액을 얻고 동일한 한외여과 유니트(즉, Omega Ultrasette, 겉보기 분자량 8,000 컷오프)를 사용하여 농축시킴으로써 분획 F2(1457ml; 단백질 농도; 0.969mg/ml; 총 단백질 1411mg; 상대 활성 1,715,000)을 수집하였다. F2에서는 66,000-100,000의 분자량을 갖는 단백질의 존재가 SDS-PAGE 시에 확인되었다. 웨스턴 분석의 결과 그 단백질이 TPO인 것으로 나타났다.

다음에, Macro-Prep Methyl HIC 컬럼으로부터 용출된 F2(1443ml)를 20mM 시트르산 나트륨 완충액(pH 6.0)으로 미리 평형화시킨 SP 세파로오스 Fast Flow(Pharmacia Biotech 제조, 카탈로그 No. 17-0729-01 ; 직경 5cm, 상높이 12cm)에 15ml/분의 유량으로 부가하였다. 부가 완료후 50mM NaCl을 함유하는 20mM 시트르산나트륨 완충액(pH 6.0)으로 용출시켰다. 용출액을 수집하고 분획 F1(3,007ml; 단백질 농도 : 0.266mg/ml; 총 단백질 679mg; 상대 활성 ; 88,830)으로 명명했다. 그 후, 용출 완충액을 750mM NaCl을 함유하는 20mM 시트르산 나트륨 완충액(pH 5.4)으로 대체하여 용출된 분획 F2(931ml ; 단백질 농도 : 0.763mg/ml; 총 단백질 710mg; 상대 활성 5,558,000)을 수집하고 이것을 한외여과 유니트(Filtron, Omega Ultrasette, 겉보기 분자량 8,000 컷 오프; 및 Amicon, YM3 막)를 사용하여 202ml로 농축시켰다.

다음에, 농축된 TPO 활성 함유 분획 F2(197ml)을 세파크릴 S-200HR 겔 여과컬럼(Pharmacia Biotech 제조, 카탈로그 No. 17-0584-05 ; 직경 7.5cm, 상높이 100cm)에 3ml/분의 유량으로 부가하였다. 용출 부피 1,200-1,785ml, 1,785-2,010ml, 2,010ml-2,180ml 및 2,280-3,000ml를 별도로 수집하여 각각 분획 F1(585ml ; 단백질 농도 : 1.00mg/ml ; 총 단백질 589mg ; 상대 활성 4,118,000), F2(225ml ; 단백질 농도 : 0.263mg/ml ; 총 단백질 59.2mg; 상대 활성 2,509,000), F3(270ml ; 단백질 농도: 0.119mg/ml; 총 단백질 32.1mg; 상대 활성 2,535,000) 및 F4(720ml ; 단백질 농도: 0.0467mg/ml; 총 단백질 33.6mg; 상대 활성 1,155,000)를 얻었다. 따라서, 분별된 TPO 활성은 겔여과에 의해 측정된 것과 같은 넓은 분자량 범위를 갖는다. 분획을 SDS-PAGE 및 웨스턴 블롯 분석한 후, F1은 주로 66,000-1,000,000의 분자량을 갖는 TPO 분자 종을 가지며 ; F2는 32,000-60,000의 분자량을 갖는 셍 분자종; 및 F3는 32,000-42,000의 분자량을 갖는 TPO 분자종을 갖는 것으로 발견되었다. 모든 TPO 분자는 TPO 활성을 가졌다.

60,000-100,000의 분자량을 갖는 TPO 분자의 N-말단 아미노산 서열분석의 결과를 기초로 TPO 분자가 인간 TPO 유전자 코딩 단백질의 아미노산 서열을 갖는다는 것을 확인했다.

또한, N-글리카나아제(Genzyme, 카탈로그 No. 1472-00), 뉴라미니다제(Nakarai-Tesqu, 카탈로그 No. 242-29SP), 엔도-a-N-아세틸갈락토스아미니다제(Seikagaku Kogyo, 카탈로그 No. 100453) 및 O-글리코시다제(베링거 만하임 바이오케마가, 카탈로그 No. 1347101)로 이루어진 글루코시다제 효소 단독 또는 조합을 사용하여 66,000-100,000의 분자량을 갖는 TPO 분자를 효소 분해실험한 후 SDS-PAGE 분석처리하였다. 그 결과, TPO 펩타이드 부분은 그것이 이론적 분자량으로부터 예상되는 바와 같이 약 36,000의 분자량을 가지며 N-과 O-결합 당쇄를 모두 갖는 당 단백질인 것으로 밝혀졌다.

[실시예 57]

인간 TPO 생성 CHO 세포주로부터 인간 TPO의 정제

(1) 실시예 55에서와 동일한 방법으로 수득한 CHO 세포의 무혈청 배양 상청액 1L에 211.4g의 황산암모늄을 첨가하고 그 혼합물을 0.2㎛ 필터(Gelman Science, 카탈로그 No. 12992)를 통하여 여과했다. 수득한 여액을 1.2M 황산암모늄을 함유하는 20mM 아세트산 나트륨 완충액(pH 5.6)으로 미리 평형화시킨 Macro-Prep Methyl HIC 컬럼(Bio-Rad, 카탈로그 No. 156-0081; 직경 50cm, 상높이 90cm)에 부가하였다. 부가 완료후 1.2M 황산암모늄을 함유하는 450ml의 20mM 아세트산나트륨 완충액(pH 5.6)으로 용출시켰다. 용출 분획을 역상 Vydac C4컬럼(The Separations Group, 카탈로그 No. 214BTP54; 직경 4.6mm, 상높이 250mm)에 0.75ml/분의 유량으로 부가하였다. 5% 에탄올을 함유하는 10mM Tris 완충액(pH 6.4)(이하, “전개용매 A”라 함)으로 상기 컬럼을 15분동안 세척한 후에 전개 용매 A에서 94% 에탄올을 함유하는 10mM Tris 완충액(pH 6.4)(이하, “전개용매 B”라 함)까지의 60분 선형구배로 용출시켰다. 얻어진 크로마토그램을 제15도에 도시하였다. SDS-PAGE 분석 결과, TPO인 것으로 예상되고 또 샘플을 추가한 후 68-72분의 체류시간 분획에 상응하는 65,000-100,000의 분자량을 갖는 분자가 SDS-PAGE 겔상에서 단일 밴드로 서 나타났다(제16도). 또한 웨스턴 분석은 수득한 단백질이 TPO임을 입증하였다.

단백질 샘플의 N-말단 아미노산 분석을 단백질이 인간 TPO 유전자 코딩 단백질의 아미노산 서열을 갖는 것임을 입증하였다.

[실시예 58]

곤충세포내에서의 인간 TPO-발현을 위한 재조합 바이러스의 제조

실시예 30에서 제조된 플라스미드 pHTP1을 제한 효소 EcoRI 및 NotI로 분해시키고 1% 아가로오스 겔 전기 영동처리하여 약 1200-bp 밴드를 얻고 이것을 Prep-A-Gene DNA 정제 키트를 사용하여 정제했다. 정제된 DNA를 동일한 제한 효소로 미리 처리한 전달 벡터 pVL1393(Invitrogen 제조)에 결찰시킨 다음 고 수용대장균 DH5(Toyo Boseki)로 형질전환시켰다. 얻어진 콜로니들로부터 인간 TPO cDNA의 전체 길이 코딩 영역을 함유한 클론 pVL1393/hTPO를 선택했다. 그 클론으로부터 Molecular Cloning에 기술된 방법(샘브룩 등, 콜드 스프링 하버 래보라토리 프레스, 1989)으로 플라스미드 DNA를 제조하고, Baculo GoldTM 형질전환 키트(Farmingen)를 사용하여 곤충세포 Sf21(Invitrogen)로 형질전환시킨다음 그 형질전환된 세포를 Sf-900 배지(Life Technology)중 27℃에서 4일동안 배양시켜 바이러스를 함유하는 상청액을 회수했다. 그 상청액을 1:109 ∼ 1:105 로 희석시키고 약 7 ×105 Sf21 세포를 35mm(직경) 혈암(shale) 중 27℃에서 1시간동안 1ml의 희석 상청액과 감염시켰다. 상청액을 제거한 후, Sf-900 배지에 있는 1% 고온 아가로오스를 배양액에 위치시키고 고형화시킨 다음 습기 분위기중 27℃에서 6일간 배양했다. 형성된 단일 플라크를 집어내어 그것으로 부터의 바이러스를 200㎕의 Sf-900 배지에 방출시켰다. Sf21세포를 24-웰플레이트에 있는 상기 바이러스성 클론으로 감염시켜 바이러스를 증식시켰다. 단일 플라크로부터의 바이러스 함유 용액 일부를 페놀/클로로포름으로 처리하고 에탄올 침전시켜 바이러스성 DNA를 회수한 후 이것을 주형으로 사용하여 인간 TPO cDNA에 특이적인 프라이머를 사용한 PCR을 수행했다. 재조합 바이러스 함유 인간 TPO cDNA를 특이적 DNA 단편의 증폭에 기초하여 선택했다. 이후 Sf21 세포를 재조합 바이러스 운반 인간 TPO cDNA을 함유하는 상청액으로 감염시켜 바이러스를 증식시켰다.

[실시예 59]

Sf 곤충세포에서의 인간 TPO의 발현 및 TPO 활성의 확인

Sf21 세포를 175㎠ 배양 플라스크에서 약 80% 융합성으로 될 때까지 배양시킨 다음 실시예 58에서 제조된 인간 TPO cDNA 운반 재조합 바이러스로 27℃에서 1시간동안 감염시킨후 수득한 세포를 27℃에서 4시간동안 Sf-900 배지에서 배양하여 배양 상청액을 회수했다. 얻어진 배양상청액을 NAPTM -5컬럼(Pharmacia)상의 IMDM 배양배지로 대체했다. 그 상청액에서의 현저한 TPO 활성은 랫트 CFU-MK 분석법 및 M-07e 분석법 모두에서 투여량 의존 방식으로 검출되었다. Sf21 세포에서 발현된 재조합: 인간 TPO는 실시예 45에 기술된 웨스턴 분석법으로 확인했다.

[실시예 60]

소듐 N-라우로일 사르코시네이트 및 황산구리를 사용하는, 대장균에서의 발현을 통하여 인간 TPO 염기서열을 갖는 클론 pCFM536/h6T(1-163)으로 유도된 변종 인간 TPO, h6T(1-163)의 재생 및 h6T(1-163)의 정제

실시예 43에서 제조된 30g의 냉동 h6T(1-163) 생산 재조합 미생물을 300ml의 물에 현탁시키고 고압 분쇄장치(10,000psi, Rannie High Pressure Laboratory)에서 분쇄시킨 다음 원심분리하여 침강된 분획을 회수했다. 침강된 분획을 90ml의 물에 현탁시키고 교반하면서 150ml의 총량으로 물을 첨가했다. 이어서 그 혼합물에 9ml의 1M Tris 완충액(pH 9.2), 540㎕의 1M DTT, 1.8ml의 0.5M EDTA 및 18ml의 10% 데옥시콜린산 나트륨을 교반하면서 첨가하고, 실온에서 30분 교반했다. 침강된 분획을 원심분리하여 회수하고 대부분의 오염된 단백질 및 미생물 성분을 제거했다. 침강물에 180ml의 5mM DDT를 첨가하여 h6T(1-163)을 함유하는 침강된 분획을 얻었다. 그 침강물에 300ml의 물을 첨가하여 현탁물을 얻고 여기에 570ml의 액체양으로 물을 교반하면서 첨가했다. 이 혼합물에 30ml의 1M Tris 완충액(pH 8), 150ml의 소듐 N-라우로일 사르코신을 실온에서 20분 교반하면서 첨가하여 h6T(1-163)을 용해시켰다.

이것에 750μ1DML 1% 황산구리를 더 첨가하고 그 혼합물을 실온에서 밤새(약 20시간) 교반했다. h6T(1-163)을 함유하는 상청분획을 원심분리하여 회수한 후 그 상청액 750ml에 750ml의 물 및 1500ml의 20mM Tris 완충액(pH 7.7)을 첨가하고 교반하면서 3ml의 폴리소르베이트 80(Nikko Chemicals)를 첨가했다. 얻어진 용액에 600g의 Dowex 1-X4(10-50메쉬, 클로라이드 형태) 이온교환 수지를 첨가하고 실온에서 90분 교반했다. 유리 필터를 사용하여 비 흡착된 분획을 회수한 후 이온 교환 수지를 750ml의 20mM Tris 완충액(pH 7.7)으로 세척했다. 비흡착된 그리고 세척된 분획의 조합된 용액을 2N 수산화 나트륨으로 pH 9.2로 조정한 후 0.1% 폴리소르베이트 80을 함유하는 20mM Tris 완충액(pH 9.2)으로 평양화시킨 Q세파로오스 Fast Flow 음이온 교환컬럼(ID 5cm × 10cm)에 부가하여 비흡착된 분획을 회수했다. 수득한 비흡착 분획의 pH를 염산으로 7.2로 조정하고 0.1% 폴리소르베이트 80을 함유하는 20mM Tris 완충액(pH 7.2)으로 평형화시킨 SP 세파로오스 Fast Flow 양이온 교환 컬럼(ID 5cm × 10cm)에 부가한 다음 같은 완충액으로 OM-500mM NaCl까지의 선형구배로 용출시켰다. 용출된 분획을 SDS-PAGE 분석하여 트리플루오로아세트산이 0.1%의 농도로 첨가된 TPO 분획을 회수했다. 얻어진 용액을 Capcell Pak 5㎛ 300A C1 컬럼(ID 2.1cm × 5cm × 2, Shiseido)에 부가한 후, 0.1% 트리플루오로아세트산에서의 1-프로판을 농도를 증가시키면서 선형구배 용출 방법으로 역상 HPLC를 수행했다. 그 용출액을 환원제 부재하에서 SDS-PAGE 상에서 분석하였다. 그 결과, 역상 HPLC에서의 용출 위치에 기초하여 3개의 분획을 분별하고 각 분획을 0.1% 트리플루오로-아세트산으로 3배 희석시켰다. 희석된 각 분획을 유사한 방법으로 상기 역상 HPLC 컬럼에 부가하였다. 역상 HPLC에서 용출된 순서에 따라서 Fr. S-a, Fr. S-b 및 Fr. S-c로 명명된 3개의 TPO 분획(제17도 참조)을 환원제 부재하에서 SDS-PAGE상에서 분석했다. 그 결과, 약 18kDA(Fr. S-a), 약 19kDA(Fr. S-b) 또는 약 19kDA(Fr. S-c)의 분자량에서 단일밴드가 검출되었다(제18도 참조). 그들의 아미노산 분석 후, 측정된 각 아미노산 조성은 서열 정보로부터 추론된 대응 이론적 값과 거의 일치했다. 또한, N-말단 아미노산 분석의 결과는 그들이 예상된 서열이었다는 것을 나타냈다. 아미노산 분석에 의해 측정된 각 분획의 단백질 양은 0.64mg(Fr. S-a), 1.81mg(Fr. S-b) 또는 3.49mg(Fr. S-c)였다. IMDM 배지에 대하여 각 분획을 완전 투석시킨 M-07e 분석을 수행했다. 그 결과, 각 분획의 TPO 상대 활성은 약 1,620,000(Fr. S-a), 23,500,000(Fr. S-b) 또한 746,000,000(Fr. S-c)였다.

[실시예 61]

구아니딘 하이드로클로라이드 및 시스테인-시스틴을 사용하는, 대장균에서 발현을 통하여 인간 TPO 염기서열을 갖는 클론 pCFM536/h6T로부터 유도된 변종 인간 TPO, h6T(1-163)의 재생 및 h6T(1-163)의 정제

실시예 43에서 제조된 50g h6T(1-163) 생산 냉동 재조합 미생물을 500ml의 물에 첨가하여 현탁시키고 고압 분쇄장치(10,000psi, Rannie High Pressure Laboratory)에서 분쇄시킨 다음 원심분리하여 침강된 분획을 회수했다. 침강 분획을 물에 현탁시키고 교반하면서 물을 첨가함으로써 액체량을 250ml로 조정했다. 그 혼합물에 5ml의 1M Tris 완충액(pH 9.2), 900㎕ 의 1M DTT, 3ml의 0.5M EDTA 및 30ml의 10% 데옥시콜린산 나트륨을 첨가하고, 실온에서 30분 교반했다. 원심분리한 후 침강된 분획을 회수하고 대부분의 오염된 단백질 및 미생물 성분을 제거했다. 침강물에 300ml의 5mM DDT를 첨가하여 현탁시킨 후 h6T(1-163)을 함유하는 침강 분획을 원심분리에 의해 회수했다. h6T(1-163)을 함유하는 회수된 침강 분획을 104ml의 총 부피로 물에 현탁시켰다. 이 현탁액에 20ml의 1M Tris 완충액(pH 8.5) 및 376ml의 8M 구아니딘 하이드로크로라이드를 교반하면서 첨가한 후 실온에서 10분 교반하여 h6T(1-163)을 용해시켰다. 이것에 2500㎕ 의 0.1% 폴리소르베이트 80을 함유하는 20mM Tris 완충액(pH8.5)을 첨가하고 이어서 1M 구아니딘 하이드로클로라이드를 함유하는 2,000ml의 20mM Tris 완충액을 교반하면서 첨가한 후 5mM 시스테인 및 0.5mM 시스틴을 첨가했다. 수득한 용액을 4℃에서 밤새 배양시킨 후 원심분리하여 상청액에서 h6T(1-163)을 회수한 후 Prep Scale UF카트리지 PLDC 한외여과 막(Millipore)을 사용하여 농축시켰다. 이 농축물의 완충액을 최종 부피가 1,000ml가 될 때까지 0.1% 폴리소르베이트 80을 함유하는 20mM Tris 완충액(pH 9.2)으로 대체하였다. 수득한 용액을 0.1% 폴리소르베이트 80 함유 20mM Tris 완충액(pH 9.2)으로 대체하였다. 수득한 용액을 0.1% 폴리소르베이트 80 함유 20mM Tris 완충액(pH 9.2)으로 평형화시킨 Q 세파로오스 Fast Flow 음이온 교환 컬럼(ID 5cm × 10cm)에 부가하고 같은 완충액으로 OM-500mM 까지의 선형구배로 용출시켜 약 20mM-약 150mM NaCl에서 용출된 분획(240ml)을 회수했다. 그 분획을 20mM Tris 완충액(pH 7.2)로 4배 희석시켜 총량이 960ml가 되도록하고 아세트산으로 pH 7.2으로 조정하여 0.1% 폴리소르베이트 80을 함유하는 20mM Tris 완충액(pH 7.2)으로 평형화시킨 SP 세파로오스 Fast Flow 양이온 교환컬럼(ID 5cm × 10cm)에 부가한 다음 같은 완충액으로 OM-500mM까지의 선형구배로 용출시켰다. 용출액을 SDS-PAGE상에서 분석하여 TPO 분획을 수집했다. TPO 분획에 트리플루오로아세트산을 최종부피가 0.1%가 될 때까지 첨가했다. 그 용액을 Capcell Pak 5㎛ 300A C1 컬럼(ID 2.1cm × 5cm × 2, Shiseido)에 부가하고 0.1% 트리플루오로아세트산에서의 1-프로판올 농도를 증가시키면서 선형구배 용출방법으로 역상 HPLC를 수행했다. 그 용출액을 환원제 부재하에서 SDS-PAGE 상에서 분석하여 역상 HPLC에서의 용출 위치에 기초하여 2개 분획을 역상 HPLC에서 용출의 순서에 따라서 Fr. G-a, Fr. G-d로 명명했다(제17도 참조). 각 TPO 분획을 환원제 부재하에서 SDS-PAGE 상에서 분석했다. 그 결과, 약 18kDA(Fr. G-a) 또는 32kDA(Fr. G-d)의 분자량에서 단일 밴드가 검출되었다(제18도 참조). 또한, 환원제의 존재하에서 상기 분획을 SDS-PAGE 분석하면 양쪽 분획 모두에서 20kDa의 분자량에서 단일 밴드가 검출된다는 것을 나타냈다. 분획의 아미노산 분석결과는 각 아미노산 조성이 서열정보로부터 추정된 이론적 값과 일치하는 것으로 나타냈다. 또한, N-말단 아미노산 분석의 결과는 그들이 예상된 서열이 없다는 것을 나타냈다. 아미노산 분석의 결과로부터 측정된 각 분획의 단백질 양은 2.56mg(Fr. G-a), 1.16mg(Fr. G-d)였다. IMDM 배지에 대하여 각 분획을 완전 투석시킨 후 M-07e 분석을 수행했다. 그 결과, 각 분획은 약 3,960,000(Fr. G-a) 또한 776,000,000(Fr. G-d)의 TPO 상대 활성을 나타냈다.

[실시예 62]

CHO 세포내에서 부분적 길이 인간 TPO(아미노산 1-163) (이하 “hTPO 163” 이라함)의 발현을 위한 재조합 벡터 pDEF202-hTPO163의 작제

실시예 31에서 작제된 벡터 pDEF202를 제한효소 EcoRI 및 SpeI로 처리하고 아가로오스 겔 전기영동 처리하여 보다 큰 벡터 단편을 회수했다. 아미노산-21-163(서열 13)을 코딩하는 hTPO163 cDNA를 함유하는 플라스미드 pEF18S-hTPO163을 제한효소 EcoRI 및 SpeI로 처리하여 제조된 hTPO163 cDNA와 상기 단편을 T4 DNA 리가아제(다까라-스조)로 결찰시켜 발현 벡터 pDEF202-hTPO163을 생성하였다. 이 플라스미드는 SV40의 복제기점, 인간 신장인자 1-α-프로모터, SV40 초기 폴리아데닐화 부위, 쥐의 DHER 미니진, pUC18의 복제 기점 및 β-락타마아제 유전자(Ampr)를 포함했는데 여기에서 hTPO163 cDNA는 인간 신장인자 1-α-프로모터의 하류부위에 결합되어 있다.

[실시예 63]

CHO 세포에서의 hTPO163의 발현

CHO 세포주(dhfr-균주, Urlaub 및 Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, p4216, 1980)를 6cm 접시에 있는, 10% 우태아 혈청을 함유하는 α-최소 필수배지(티미딘 및 하이포크산틴을 갖는 α-MEM(-))에서 성장시키고 형질감염법(Seikagaku Kogyo K.K.)에 의해 pDEF202-hTPO163 플라스미드로 형질전환시켰다.

간단하게는, 실시예 62에서 제조된 플라스미드 pDEF202-hTPO163 10㎍을 240㎕ 의 0.3M MaCl 및 20㎕ 의 형질감염물 및 202㎕ 의 H2O의 혼합물과 혼합했다. 이 DNA 용액을 접시에 방울로 첨가하고 CO2 배양기에서 6시간동안 배양했다. 접시로부터 배지를 제거한 다음 α-MEM(-)로 두 번 세척한 다음 실온에서 2분동안 배양 하기 전에 α-MEM(-)을 함유하는 10% DMSO를 첨가했다. 그 후, 그 접시에 10%의 투석된 우태아혈청 함유 비선택 배지(하이포크산틴 및 티미딘을 갖는 α-MEM(-))를 첨가하고 이틀 동안 배양한 다음 10%의 투석된 우태아 혈청 함유 선택 배지(하이포크산틴 및 티미딘을 갖는 α-MEM(-))에서 선택했다. 세포를 트립신화하고, 그들을 5개의 10cm 접시 또는 6cm 이상의 접시당 12개의 24웰 접시로 나누어서 계속 배양하면서 2일 간격으로 신선한 선택 배지로 교환하여 선택을 실시하였다. 플레이트 또는 웰로부터의 상청액을 Ba/F3 분석법을 사용하여 TPO 활성을 분석함으로써 TPO 활성을 관찰했다. TPO 활성이 배양상청액에서 관찰된 세포를 25mM 메토트렉세이트 함유 선택배지로 1:15의 세포농도로 나눈 후에 새로운 플레이트 또는 웰로 전달하고 메토트렉세이트에 내성인 세포의 성장 및 클로닝을 위해 재배양 시켰다.

다르게는 CHO 세포의 형질전환은 pDEF202-hTPO163 및 pMG1을 CHO 세포로 공형질전환시킴으로써 수행할 수 있다.

플라스미드 pDEF202-hTPO163으로 형질전환된 CHO 균주(CHO-DUKXB11)는 내셔널 인스티튜트 오브 바이오사이언스 앤드 휴먼 테크놀로지, 에이전시 오브 인더스트리얼 사이언스 앤드 테크놀로지, 미니스트리 오브 트래이드 앤드 인더스트리, 일본에 기탁번호 FERM BP-4989로 1995. 1. 31.일에 기탁했다.

[실시예 64]

CHO 세포의 대규모 배양

실시예 63에서의 hTPO163 발현 플라스미드 pDEF202-hTPO163을 CHO 세포로 형질전환시켜 얻은 인간 hTPO 생산 CHO 세포주(CHO 109 세포, 10% 투석된 우태아 혈청 함유 선택비지[하이포크산틴 및 티미딘이 없는 α-MEM-]에서 상기의 선택으로 수득)의 대규모 배양은 하기와 같이 수행하였다. CHO109 세포를 10% FCS를 함유하는 DMEM/F-12 배양배지(GIBCO)에서 증식시켰다. 세포들은 트립신 용액으로 수확(또는 트립신화)한 후, 천만의 세포를 200ml의 동일배지를 함유하는 Falcon 회전 병(Falcon 3,000)에 접종하고 1rpm의 회전속도로 37℃에서 3일동안 배양했다. 흡입하여 배양배지를 제거하고 세포 배양물 표면을 100ml의 PBS로 헹구웠다. 10% FCS를 함유하지 않은 200ml의 DMEM-F-12 배양배지(GIBCO)를 세포 배양물에 첨가하고 세포를 1rpm으로 37℃에서 7일동안 배양했다. 수집된 배양 상청액을 다음 정제 과정의 출발 물질로서 사용했다. 상기와 유사한 과정을 300 회전 병에서 수행하여 60L의 무혈청 배양 상청액을 얻었다.

[실시예 65]

hTPO163 생산 CHO 세포주로 부터의 hTPO163의 정제

(1) 실시예 64에서 수득한 무혈청 배양상청액 60L를 0.22㎛ 여과필터로 여과하여 여액을 얻고 한외여과 유니트(Filtron, 분자량 10,000 컷 오프)상에서 농축시켜 농축 분획(600ml, 11.2mg 단백질/ml, 총 단백질 6.430mg)을 얻었다. 항 HT1 펩타이드 항체를 사용하여 이 분획을 웨스턴 분석한 결과 겉보기 분자량 20,000-26,000 범위에서 발현된 hTPO163 단백질의 존재가 나타났다.

농축된 배양 상청액(537ml)을 10mM 인산 나트륨 완충액(pH 6.8)으로 미리 평형화시킨 세파덱스 G-25 미세 컬럼(Pharmacia-Biotech 제조, 카탈로그 No. 17-0032-02 : 직경 10cm 및 상높이 30cm)상에서 처리하여 10mM 인산나트륨 완충액(pH 6.8)중의 용액으로 단백질 분획(938ml, 단백질 농도 4.9mg/ml, 총 단백질 4,594mg)을 얻었다.

세파덱스 G-25 미세 컬럼으로부터 수득한 단백질 분획(929ml)을 10mM 인산나트륨 완충액(pH 6.8)으로 미리 평형화시킨 SP 세파로오스 Fast Flow 컬럼(Pharmacia-Biotech 제조, 카탈로그 No. 17-0729-01 : 직경 5cm 및 상높이 12cm)으로 15m1/분의 유량으로 부가하고 10mM 인산 나크륨 완충액(ph6.8) 및 10% 에탄올을 함유하는 동일 완충액으로 용출시켰다. 이 용출액을 분획 F1(1,608m1, 단백질 농도 2.13mg/m1, 총 단백질 3,426mg)으로서 조합했다. 750mM NaCl 및 25% 에틴올을 함유하는 10mM 인산나트륨 완충액(pH 6.8)으로 두 번째 용출을 수행하여 분획 F2(651㎖, 단백질 농도 1.67mg/ml, 총 단백질 1,087mg)의 주 hTPO163 용출액을 수집했다.

SP 세파로오스 Fast Flow 컬럼으로 부터의 TPO 활성 함유 분획 F2(200ml)에 에탄올 및 정제된 물을 첨가하여 300ml의 45%(최종 농도) 에탄올 용액을 제조했다. 에탄올의 첨가로 인한 불용성 물질을 원심분리하여 제거했다. 50%의 용매 A(10mM 아세트산 나트륨 완충액(pH 6.7) 및 50%의 용매 B (90% 에탄올을 함유하는 10mM 아세트산나트륨 완충액(pH 6.7)으로 미리 평형화시킨 SOURCE 15RPC 컬럼(Pharmacia-Biotech 제조, 카탈로그 No. 17-0727-02 : 직경 2cm 및 상높이 20cm)에 상기 상청액을 2ml/분의 유량으로 주입하였다. 이 컬럼을 비흡착된 물질이 거의 완전히 용출될 때까지 55% 용매 A 및 45% 용매 B로 세척한 후 하기 용출 프로필을 따라 1.5ml/분의 유량으로 용출시켰다 : 5분동안 50% B, 50% B - 100% B의 선형구배로 140분동안 ; 및 100% B 35분동안. 분획을 5분 (7.5ml 부피에 상응) 간격으로 분획을 수집했다. 모든 분획을 SDS-PAGE하고 hTPO163의 용출 범위를 검사하기 위하여 웨스턴 분석했다. 그 결과 약 21,000-26,000의 겉보기 분자량을 갖는, 고도로 정제된 hTPO163이 66%-87%의 에탄올 범위에서 용출되는 것을 발견되었다. 이 hTPO163 단백질들중 보다 높은 분자량을 갖는 hTPO163이 보다 빨리 역상 컬럼에서 용출되었는데 이는 글리코실화된 hTPO163 분자가 증가된 친수성을 갖는다는 것을 암시한다.

SOURCE 15RPC 컬럼으로 부터의 hTPO163 용출 분획(즉, 68%-86.5%의 에탄올 범위에서 용출된 hTPO163 분획(90ml)의 88.8ml에 CHAPS를 첨가하고 그 혼합물을 농축시킨 후 세척하여 약 5% 에탄올 및 4mM CHAPS를 함유하는 2.5㎖의 농축액을 수득하였다. 이 농축액을 10% 에탄올을 함유하는 10mM 인산나트륨 완충액으로 미리 평형화시킨 수퍼덱스 75pg 컬럼(Pharmacia-Biotech 제조, 카탈로그 No. 17-1070-01 ; 직경 2.6cm 및 상높이 60cm)에 상기 상청액을 1.5ml/분의 유량으로 부가하였다. 부가한지 60분 후부터 용출 분획을 각 6ml의 양(즉, 매 4분)으로 수집했다. 그 결과, SDS-PAGE로 측정했을 때 관번호 16에서 최소한 31까지의 분획에서 hTPO163가 용출되었다. 이러한 용출 위치는 표준분자량 마커 (Bio-Rad의 혼합물, 겔 여과 표준, 카탈로그 No. 151-1901 ; 및 Calboichem, 인슐린, 카탈로그 No. 407696)을 사용하는 겔여과에서 측정된 바와 같이 약 44,000-6,000의 분자량 범위에 상응한다. 또한, 이 hTPO163 분자들은 글리코실화 감소 정도의 순서로 용출되는 것으로 나타났다. 관번호 16-31(용출부피 : 180-276ml)로부터 모든 hTPO163 종이 분획 F4로 수집되었다. 분획 FA 이외에 관번호 16-18(용출부피 : 180-198ml), 19-24(용출부피 : 198-234ml) 및 25-31(용출부피 : 234-276ml)의 분획들을 별도로 수집하여 각각 FH, EM 및 FL로 명명했다. 이들 분획 FH, FM 및 FL의 일부를 조합하여 분획 FA를 제조했다. 상기한 것을 제19도에 도시하였다.

(2) 다음에, (1)에서 설명한 수퍼덱스 75pg 컬럼으로 부터의 hTPO163 용출 분획 FH, FM, FL 및 FA를 보다 상세하게 설명한다.

상기에서 수득한 hTPO163종의 N-말단 아미노산 서열은 실시예 1에서와 동일한 방법으로 측정했지만 대부분의 N-말단 Ser 잔기는 확인할 수 없었다. 이것은 0-결합된 당이 N-말단 Ser에 추가됨을 암시한다. 또한 N-말단 Ser 이후의 서열은 hTPO의 유전자 서열로부터 예상되는 아미노산 서열인 것으로 확인되었다. FH, FM, FL 및 FA에서의 hTPO 단백질 농도는 어떤 당쇄도 함유하지 않는 펩타이드 분자였을 경우 아미노산 분석(AcccQ. Tag 법, Wasters)으로 측정된 바와 같이 각각 10.2ng/ml, 6.2ng/ml, 0.84ng/ml 및 3.2ng/ml 였다. 이 분획들(각각 100ng)을 멀티겔 15/25(다이이치 가가꾸 야쿠힌 제조, 15 내지 25% 프리캐스트 폴리아크릴아미드 겔)을 사용한 비환원 조건하 또는 DTT를 사용하는 환원 조건하에서 SDS-PAGE 처리시킨 다음 은 염색(다이이치 퓨어 케미컬 제조)시켰다. 그 결과, 각각의 분획이 고도로 순수한 hTPO163을 함유하는 것으로 발견되었다. 환원조건 하에서 표준으로서 DPCIII 분자량 마커(Daiichi Pure Chemicals)를 사용하여 계산했을 때 FH, FM, FL 및 FA에 있는 hTPO163의 겉보기 분자량은 각각 24,000-21,500, 23,000-21,000, 23,0000-20,500 및 23,500-20,500이었다(제20도 참조). 또한, 웨스턴 분석시에는 환원조건하에서 비오틴-라벨링된 SDS-PAGE 표준(Bio-Rad, 비오티닐화 SDS-PAGE 표준, 넓은 범위 : 카탈로그 No. 161-0319)을 사용하여 계산했을 때 FH, FM, FL 및 FA에 있는 hTPO의 겉보기 분자량은 각각 26,000-22,000, 25,500-22,000, 26,000-21,000 및 26,000-21,000이었다. FH, FM, FL 및 FA의 분자량 중의 이질성은 0-결합 당쇄의 이질성에 기인될 수 있다. 따라서, FH, FM, FL 및 FA를 뉴라미디다제(Neuraminidase, Nacalai tesque, 카탈로그 No. 242-29SP)로 분해시키고 DTT로 환원시킨 다음 SDS-PAGE 상에서 분석했다. 그 결과 모든 분획에서 겉보기 분자량은 약 19,000이었는데 이것은 hTPO 분자량의 이질성이 주로 hTPO163 단백질과 결합된 당쇄에 있는 시알산 양의 이질성에 기인하고 얻어진 hTPO163이 CHO 세포에 있는 당 단백질로서 발현되었음이 밝혀졌다.

(3) (2)에서 수득한 분획 FH, FM, FL 및 FA에 대하여 M-07e 분석계로 그들의 시험관내 활성을 평가했다. 그 결과, 상대적 특이 활성은 511,000,000, 775, 000,000, 1,150,000,000 및 715,000,000/mg hTPO163 단백질(어떤 당중량도 함유하지 않은 펩타이드 분자의 중량)이었다.

[실시예 66]

Lys가 위치-1에 Met가 위치 -2에 각각 추가된 인간 TPO(이하 “hMKT(1-332)”라함)의 발현을 위한 대장균 벡터의 작제 및 hMKT(1-332)의 발현

대장균에 있는 인간 TPO의 전체길이의 아미노산 서열을 발현시키기 위하여, 아미노산 164-332의 사용코돈을 하기에 설명되는 바와 같이 대장균 선호 코돈으로 교체했다.

[표 5]

합성 올리고뉴클레오타이드 21과 22 ; 23과 24 ; 25와 26 ; 27과 28 ; 29와 30 ; 31과 32 ; 33과 34 ; 35와 36 ; 37과 38 ; 또는 39와 40을 동일관내에서 T4 키나아제(Pharamcia)를 사용하여 0.1mM ATP, 10mM Tris-아세테이트, 10mM Mg-아세테이트, 50mM K-아세테이트의 용액중에서 인산화시켰다. 이후 100mM Tris/HCI(pH 7.5), 100mM MgCl2, 500mM NaCl로 이루어진 용액의 1/10 부피를 상기 반응 혼합물에 첨가하고 물중탕기에서 3분동안 끊인 다음 냉각시켜 이중 가닥 DNA를 형성시켰다. 4셋트의 이중가닥 DNA 즉, 올리고뉴클레오타이드 21과 22/23/ 및 24(조합-A) ; 올리고뉴클레오타이드 25와 26/27 및 28(조합-B) ; 올리고뉴클레오타이드 31과 32/33/ 및 34(조합-C) ; 올리고뉴클레오타이드 35와 36/37 및 38/39와 40(조합 D)를 개별적으로 DNA 결합 키트(다까라 스조)와 결찰시킨 후 조합-A를 조합-B와 결찰시키고 마찬가지로 조합-C를 조합-D와 결합시켜 결찰물-1 및 결찰물-2에 대해서는 올리고뉴클레오타이드 41과 42, 결찰물-2에 대해서는 올리고뉴클레오타이드 43과 44를 프라이머로 사용하여 PCR을 이행하였다. 결찰물-1과 -2의 PCR로부터 생성한 생성물을 각각 SacI와 EcoRV 그리고 EcoRV와 HindIII로 분해시키고 2% 아가로오스 겔상에서 전기영동 처리시킨 다음 Prep-A-Gene DNA 정제 키트를 사용하여 정제함으로써 약 240-bp 및 250-bp 단편을 회수했다. 얻어진 두 개의 단편을 SacI 및 HindIII(숙주로서 대장균 DH5가 사용된)로 미리 분해시킨 pBluescript II KS+(Stratagene)에 서브클론했다. 이 콜로니들중 표 6에 도시된 염기서열을 갖는 클론을 서열분석법을 통하여 선택한 후 pBL(SH)(174-332)로 명명했다(서열 154 참조).

[표 6]

다음에, 주형으로 실시예 42에서 제조된 pBL(XH)h6T(1-163)을 하기 합성 올리고뉴클레오타이드 45 및 46 프라이머 존재하에서 PCR을 행하여 PCR 생성물을 BamHI 및 SacI으로 분해시킨 다음 6% 폴리아크릴아미드 겔상에서 전기영동시켜 그 겔로부터 약 160-bp의 단편을 회수했다.

단편을 회수했다.

또한, pBL(SH)(174-332)을 SacI 및 HindIII로 분해시키고 그 분해물을 Prep-A-Gene DNA 정제 키트를 사용하여 정제하여 약 480-bp 단편을 얻었다. 상기에서 제조된 두 단편을 BamHI 및 HindIII로 미리 분해시킨 pBluescript II KS+(Stratagene)에 서브클론 했다. (숙주로서 대장균 DH 5가 사용되었다).

그 클론들중 표 7에 도시된 염기서열을 갖는 클론을 서열분석을 통하여 선택하고 pBL(BH)(123-332)로 명명했다(서열 157 참조).

실시예 42에서 제조된 pBL(XH)h6T(1-163)을 BamHI HindIII로 분해시키고 상기에서 제조된 pBL(BH)(123-332)도 마찬가지로 분해시켜 약 640bp의 단편을 생성시킨 후 그 두단편을 함께 결찰시켜 클론 pBL(XH)h6T(1-334)를 얻었다. 또한, 실시예 52에서 제조된 pCFM536/hMKT(1-163)을 XbaI 및 SfiI로 분해시켜 약 270-bp의 단편을 얻은 후 같은 제한효소로 소화시킨 pBL(XH)h6T(1-334)와 결찰시켜 클론 pBL(XH)hMKT(1-334)를 얻었다. pBL(XH)hMKT(1-334)를 XbaI 및 HindIII로 분해시킨 후 돌연변이형 인간 TPO 아미노산 1-332를 코딩하는 약 1040bp 단편을 회수하여 정제한 다음 XbaI 및 HindIII로 미리 분해시킨 pCFM536(EP-A-136490호)에 클론했다(pMW1(ATCC NO. 39933)으로 미리 형질전환시킨 대장균 JM109를 숙주로 사용했다). 수득한 클론을 pCFM536/hMKT(1-332)로 명명하고 이 발현벡터를 포함하는 대장균 균주를 돌연변이형 단백질 hMKT(1-332)단백질의 발현을 위한 형질전환체로서 사용했다. 발현 플라스미드 pCFM536/hMKT(1-332)는 서열 14에 도시된 DNA 서열을 함유한다.

상기 형질전환체를 50㎍/ml의 암피실린 및 12.5㎍/ml의 테트라사이클린을 함유하는 LB 배지 60ml에서 밤새 30℃에서 배양하고 그 배양물(25ml)을 50㎍/ml의 암피실린을 함유하는 1,000ml의 LB배지에 첨가하고 0D600이 1.0-1.2에 도달할때까지 36℃에서 진탕배양했다. 65℃에서 약 330ml의 LB배지를 배양물에 첨가하여 최종 온도가 42℃가 되도록 한 후에 42℃에서 3시간동안 진탕 배양을 계속하여 [Met-2 - Lys-1] TPO(1-332)라 불리는 변종 인간 TPO, hMKT(1-332) 단백질의 발현을 유도했다.

얻어진 배양물을 직접 SDS-PAGE 분석했다. SDS-PAGE 분석에서는 Multigel 15/25(Daiichi Chemical Co.)를 사용했다. 전기영동 및 쿠마시블루 염색후 hMKT(1-332) 단백질의 발현이 유도된 형질전환체와 관련된 겔상의 약 35KD의 분자량에서 발현 유도에 특이적인 단백질이 검출되었다. 또한, SDS-PAGE 및 전기블롯팅(니트로셀룰로오스 막)한 후에, 상기 발현된 단백질을 실시예 45에서 제조된 항-HT1 펩타이드 항체와 반응시켰다. 염색시킨 후, 약 35KD의 분자량에서 밴드가 검출되었는데 이것은 hMKT(1-332)가 발현되었음을 나타낸다.

[실시예 67]

인간 TPO 치환 유도체의 제조, 그들의 COS7 세포내에서의 발현 및 그들의 활성 확인

하기 과정에 따라, 인간 TPO의 아미노산이 다른 아미노산으로 부분적으로 치환된 몇 개의 유도체가 TPO 활성을 갖는지를 연구했다.

본 실시예에 사용하기위하여, 동물세포에서의 발현을 위한 벡터 pSMT201을 하기와 같이 작제하였다.

먼저, 쥐의 에리트로포이에틴 수용체(Dr. D′Andrea in Dana Farbor Cancer Institute로부터 수득 ; Cell ; 57, 277-285(1989)에 대한 cDNA를 함유하는 발현 플라스미드 pXM-mEPORn을 제한효소 KpnI 및 EcoRI으로 처리한 다음 아가로오스 겔상에서 전기영동 처리하여 쥐의 에피트로포이에틴 수용체에 대한 C움가 제거된 pXM 벡터 단편을 회수했다. 다음, 다양한 클로닝 제한 부위를 상기 발현 벡터로 도입하기 위한 2개의 올리고뉴클레오타이드를 DNA 합성기(ABI)로 합성하였다. 합성된 올리고뉴클레오타이드는 하기의 염기 서열을 갖는다 :

프라이머-1 :

프라이머 -2 :

2개의 올리고뉴클레오타이드를 혼합하고 어닐링하여 이중 가닥 올리고뉴클레오타이드를 형성한 후 T4 DNA 리가아제(다까라-스조)의 존재하에서, 상기에서 회수한 pXM 벡터와 결합시켜 발현벡터 pDMT201을 얻었다. pDMT201로부터 pDMT201에 함유된 쥐의 DHFR cDNA를 제거하기 위하여 벡터 pDMT 201 및 pEF18S를 NotI 및 HpaI로 개별적으로 분해시키고 아가로오스 겔 전기영동 처리하여 pDMT201 벡터 DNA로부터 보다 큰 단편을 그리고 pEF18S 벡터 DNA로부터 보다 작은 단편을 회수했다. 이 단편들은 T4 DNA 리가아제(다까라-스조)를 사용하여 함께 결찰시켜 발현 벡터 pSMT201을 얻었다. 제21도에 도시된 바와 같이 pSMT201은 SV40의 복제기점, 인헨서 서열, 아데노바이러스 후기 주요 프로모터 서열, 아데노바이러스 트리파타이트 리더 서열, 접합 시그널 서열, SV40 초기 폴리아델닐화부위 서열, 아데노바이러스 VS RNA 유전자 서열, pUC18의 복제기점 및 β-락타마아제 유전자(Ampr)와 함께 소정의 유전자의 결찰을 위한 하기 제한 부위를 갖는다 : BgIII, PstI, KpnI, XhoI, EcoRI, SmaI, SpeI 및 NotI 부위, 전체길이의 인간 TPO cDNA를 운반하는 실시예 30에서 설명된 pHTP를 EcoRI 및 SpeI으로 분해시켜 전체길이의 인간 TPO cDNA 단편을 얻고 이를 유사하게 미리 분해된 벡터 pSMT201에 서브클론하여 플라스미드 pSMT201-hTPO를 생성했다.

얻어진 플라스미드 pSMT201-hTPO를 주형으로 사용하여 해당 유도체의 제조를 위한 주형으로 사용된 플라스미드 β GL-TPO/pBlue를 먼저 하기와 같이 작제했다.

β GL-TPO/pBlue에서 앤웨일러(Annweiler)의 방법 (Annweiler 등, Nucleic Acids Research, 19 : 3750, 1991)으로 TPO의 5'-비번역 부위에 토끼 β-글로빈 리더 서열의 첨가를 시도했다. 이러한 목적으로 하기한 화학적으로 합성된 두 DNA 스트랜드:

를 벡터 Bluescript II SK+(Toyo-Boseki)를 EcoRI 및 SmaI으로 분해시켜 얻은 단편과 결찰시켜 리더 서열이 삽입된 벡터 β GL-TPO/pBlue를 얻었다.

하기 프라이머 서열을 사용하여 PCR을 행하였다.

(즉, SmaI 서열이 결합된, 서열 7의 102-122 서열) : 및

(즉, SpeI 및 HindIII 서열이 결합된, 서열 7의 1140-1160 서열의 안티센스)

10μM 합성 프라이머를 프라이머로 하고 1ng의 플라스미드 pSMT201-HTPO DNA를 주형으로 사용하여 PCR을 행하였다. TaKaRa PCR 증폭 키트(다까라-스조) 및 프로그램 가능한 열 제어기(MJ RESEARCH)를 사용하여 100㎕ 부피로 하기 조건하에서 PCR을 행하였다 : 94℃에서 1분, 55℃에서 2분 및 72℃에서 2분을 한 사이클로 하여 3 사이클 : 이어 94℃에서 45초, 55℃에서 1분 및 72℃에서 1분을 한 사이클로 하여 20사이클. PCR 생성물을 클로로포름으로 추출하고 두 번 에탄올 침전시킨 다음 100㎕의 TE 완충액에 현탁시켰다.

이어서, PCR 생성물을 SmaI 및 HindIII로 제한 분해시키고 페놀/클로로포름으로 추출한 다음 에탄올 침전시켰다. 그 침전물을 10㎕의 TR 완충액에 용해시킨 후 동일한 제한효소로 미리 분해시킨 벡터 β GL-TPO/pBlue에 서브클론했다(숙주세포로서 고 수용 대장균 JM109(Toyo-Boseki)를 사용했다). 얻어진 형질전환체 세포중 샘브룩 등의 Molecular Cloning(콜드 스프링 하버 래보라토리 프레스, (1998)에 기술된 바와 같이 제조된 플라스미드 DNA로부터 20개 클론을 선택했다. Taq Dye DeoxyTM 터미네이터 사이클 서열결정 키트(어플라이드 바이오시스템스, 인코포레이티드 제조) 및 373A DNA 서열결정기(어플라이드 바이오시스템스, 인코포레이티드)를 사용하여 서열결정하여 정제된 플라스미드 DNA를 확인했다. 그 결과 β GL-TPO/pBlue를 코딩하는 플라스미드는 전체길이에 걸쳐 어떤 치환도 없이 예상 TPO cDNA 서열을 갖는다는 것이 확인되었다. β GL-TPO/pBlue를 BgIII 및 SpeI으로 분해시킨 후 분해물을 페놀/클로로포름으로 추출한 다음 에탄올 침전시켰다. 얻어진 침전물을 10㎕ 의 TE 완충액에 용해시키고 동일효소로 분해시킨 벡터 pSMT201에 서브클론시켰다(숙주로서 고 수용 대장균 JM109(Toyo-Boseki)을 사용했다). Molecular Cloning(샘브룩 등, supra)에 기술된 방법에 따라 형질전환체 세포로부터 플라스미드 DNA를 제조했다. 그 발현 벡터 pSMT/β GL-TPO는 β-글로빈 리더서열 및 인간 TPO cDNA가 제21도에 도시된 바와 같이 pSMT201 벡터의 접합 시그널 서열 하류의 BgIII/SpeI 제한 부위에서 결합되는 구조를 가졌다. 이 pSMT/βGL-TPO 벡터를 COS 세포로 형질전환시키기 위하여 사용했다.

인간 TPO 치환 유도체의 제조를 위하여 이토(Ito)의 방법(Ito 등, Gene, 102 : 67-70, 1991)으로 PCR로 행하였다. 특히, 인간 TPO의 Arg-25 및 His-33이 각각 Asn 및 Thr로 치환된 인간 TPO의 두 유도체를 예시적으로 제조했다. 이 유도체들은 [Asn25] TPO 및 [Thr33] TPO로 칭할 수 있다. PCR에서는 하기 프라이머를 사용하였다.

(Bluescipt II SK+의 T7 프로모터 영역에 상당함)

(Bg1II 인식 서열의 치환용)

(서열 7의 1140-1160의 안티센스, SpeI 및 HindIII 서열에 결합됨)

(Arg25 → 서열 7의 Asn); 및

(His-33 → 서열 7의 Thr)

1ng의 플라스미드 β GL-TPO/pBlue DNA를 주형으로 사용하고 10㎍의 각 합성 프라이머를 사용하여 첫단계 PCR을 행하였었다. 이 프라이머들은 조합은 : [1] △BgIII와 “end” 프라이머 : [2] T7 및 N3 : 및 [3] T7 및 09였다. TaKaRa PCR 증폭 키트(다까라-스조) 및 프로그램 가능한 열 제어기(MJ Research)를 사용하여 100㎕ 의 부피로 하기 조건하에서 PCR을 행하였다. : 94℃에서 1분, 55℃에서 2분 및 72℃에서 2분을 한 사이클의 3사이클로한 : 94℃에서 45초, 55℃에서 1분 및 72℃에서 1분을 한 사이클로 하여 사이클의 17사이클. 각 PCR 생성물을 클로로포름으로 추출하고 에탄올로 두 번 침전시킨 다음 그 침전물을 100㎕ 의 TM 완충액에 용해시켰다. 그 PCR 생성물(각 1㎕ )을 제 2 PCR 처리시켰다. 주형의 조합은 : [1]/[2]의 PCR 생성물 및 [1]/[3]의 PCR 생성물이었다. 프라이머로는 T7과 end의 조합을 두 경우에 사용하였다. 94℃에서 10분 동안 배양 TaKaRa의 첨가 후 하기의 조건하에서 PCR을 행하였다 : 1사이클이 94℃에서 1분, 55℃에서 2분 및 72℃에서 2분인 3사이클 : 94℃에서 45초, 55℃에서 1분 및 72℃에서 2분 9사이클. 그 PCR 생성물 각각에 1㎕ 의 단백질 분해효소 K(5mg/ml), 2㎕ 의 0.5M EDTA 및 2㎕ 의 20% SDS를 첨가하고 37℃에서 30분동안 배양하여 Taq를 불활성화시킨 다음 페놀/클로로포름으로 추출하고 에탄올 침전시켰다.

그 후, 무균등액 20㎕ 에 용해된 침전물을 BgIII 및 SpeI로 분해시키고 페놀/클로로포름으로 추출한 다음 에탄올 침전시켰다. 얻어진 침전물을 10㎕ 의 TE 완충액에 용해시키고 동일한 제한 효소로 미리 분해시키고 송아지 장 알칼리성 포스파타제 (베링거 만하임 제조)으로 처리한 발현벡터 pSMT201에 서브클론했다(숙주로서 고수용 대장균 JM109를 사용했다). 얻어진 형질전환체중 각 경우에서 두 개의 클론을 선택하여 그것으로부터 Molecular Cloning(샘브룩 등, supra)에 기술된 바와 같이 플라스미드 DNA를 제조하였다.

정제된 플라스미드 DNA를 373A DNA 서열결정기 및 Taq Dye DeoxyTM 터미네이터 사이클 서열결정 키트 (둘다 어플라이드 바이오시스템스, 인코포레이티드 제조)를 사용하여 서열결정화했다.

플라이머[1]과 [3]을 사용하여 PCR을 제조된 플라스미드는 TPO 치환 유도체(09/TPO)를 코딩하는 cDNA를 함유했다. Thr(ACC)로 His33(CAC)의 아미노산 치환 및 아미노산 서열 TSIGYPYDVPDYAGVHHHHHH (서열 69)의 추가에 의한 원 C-말단(Gly332)의 연장이 확인 되었다. 이 유도체를

TPO라 칭했다.

한편, 프라이머[1]과 [2]를 사용하여 PCR에 의해 제조된 플라스미드는 TPO 치환유도체(N3/TPO)를 코딩하는 cDNA를 함유했다. Asn(ACC)로 Arg25(AGA) 그리고 Lys(AAA)로 Glu231(GAA)의 아미노산 치환 및 아미노산 서열 TSIGYPYDVPDYAGVHHHHHH의 추가에 의한 원 C-말단(Gly332)의 연장이 확인되었다. 이 유도체를

TPO라 칭했다.

얻어진 각 클론의 COS7 세포로의 형질전환을 실시예 35에 기술된 바와 같이 클로킨 처리를 포함하는 DEAE-덱스트란 법으로 수행했다. 간단하게는, 40㎕의 각 플라스미드 DNA를 형질전환에 사용하고 5일후 배양 상청액을 회수하여 Centricomp-30(아미콘 제조)을 사용하여 1/20 부피로 농축시키고 M-07e 분석에 의해 TPO 활성을 평가했다. 인간 TPO 치환유도체 N3/TPO 및 09/TPO를 코딩하는 cDNA를 함유하는 플라스미드를 각각 형질전환시킨 COS7 세포의 배양 상청액에서 투여량 의존 방식으로 TPO 활성이 검출되었다(제22도 참조).

[실시예 68]

인간 TPO의 삽입 또는 결실 유도체의 제조, 이들의 COS7 세포내에서 발현 및

TPO 활성의 확인

이 실시예에는 hTPO163 삽입 또는 결실 유도체가 TPO 활성을 가지고 있음을 증명한다.

제조된 유도체는 His 33-결실 유도체([△His33] TPO(1-163), dH33) ; Gly 116-결실유도체 ([△Gly116] TPO(1-163), dG116) ; Arg 117-결실 유도체 ([△Arg117] TPO(1-163), dR116) ; Thr-삽입 유도체 ([△His33, Thr33′, Pro34] TPO(1-163), T33′) ; Ala-삽입 유도체 ([△His33, Ala33′, Pro34] TPO(1-163), A33′) 및 Gly-삽입 유도체 ([△His33, Gly33′, Pro34, Ser38] TPO(1-163), G33′)로서 이때 Thr, Ala와 Gly은 His33과 Pro34 사이에 개별 삽입되고 : 또한, Asn-삽입 유도체 ([Gly116, Asn116′, Arg117] TPO(1-163), N16′), Ala-삽입 유도체 ([Gly116, Ala116′, Arg117] TPO(1-163), A116′), Gly-삽입 유도체 ([Gly116, Gly116, Arg117] TPO(1-163), G116′)로서 이때 Asn, Ala 및 Gly은 Gly 116과 Arg 117사이에 개별 삽입되는데 상기 모든 서열들은 서열 13에 기초한 것이다.

유도체들중 T33′와 N116′은 각각 뮤신 타입과 Asn 결합 타입의 당쇄를 도입하였다.

상기 언급한 유도체들은 이토 등(Gene, 102 : 67-70, 1991)이 기술한 바있는 방법에 의한 PCR을 사용하여 제조하였다. PCR에 사용된 프라이머 서열들은 다음과 같다.

(서열 7에 나타난 서열에 기초하는 His 33-결실유도체 제조용)

(서열 7에 나타난 서열에 기초하는 His33-결실 유도체 제조용)

(서열 7에 나타난 서열에서 Thr이 His33과 Pro34사이에 삽입된 Thr-삽입 유도체 제조용)

(서열 7에 나타난 서열에서 Ala가 His33과 Pro34사이에 삽입된 Ala-삽입 유도체 제조용)

(서열 7에서 나타난 서열에서 Gly가 His 33과 Pro34사이에 삽입된 Gly-삽입 유도체 제조용)

(서열 7에서 나타난 서열에 기초하는 Gly116-결실유도체 제조용)

(서열 7에서 나타난 서열에서 기초하는 Arg117-결실 유도체 제조용)

(서열 7에 나타난 서열에서 Asn이 Gly116과 Arg117 사이에 삽입된 Asn-삽입 유도체 제조용)

(서열 7에 나타난 서열에서 Ala이 Gly116과 Arg117 사이에 삽입된 Ala-삽입 유도체 제조용)

(서열 7에 나타난 서열에서 Gly116과 Arg117 사이에 Gly가 삽입되는 Gly 삽입 유도체 제조용)

(제한효소 EcoRI -인식 서열 치환용)

(Bluescript IISK+의 T7프로모터 영역에 상당); 및

(종지코돈 및 NotI 인식서열이 추가된 서열 7의 633-653 뉴클레오타이드 서열의 안티센스)

실시예 67에서 제조된 플라스미드 β GL-TPO/pBlue 1ng을 주형으로 하고 10㎛의 합성 프라이머를 사용하여 제 1 단계 PCR을 실시하였다. 프라이머의 조합은 [1]DRI와 endNotI 또는 [2] T7과 돌연변이된 프라이머(dH33, A33′, G33′, T33′, dG116, dR117, A116′, G116′, N16′)였다. PCR 에서는 TaKaRa PCR 증폭 키트(다까라-스조) 및 프로그램 가능한 열제어기(MJ 연구소)를 이용하고, PCR은 최종부피 100㎕으로 실행되었다.

[1]의 첫 번째 PCR 반응에서 한 사이클을 94℃에서 1분, 45℃에서 2분, 72℃에서 2분으로 하여 3사이클을 실시한 다음, 한 사이클을 94℃에서 45초, 45℃에서 1분, 72℃에서 1분으로 하여 17사이클을 실시했다. 한편, [2]의 첫 번째 PCR 반응은 94℃에서 1분, 55℃에서 2분, 72℃에서 2분의 조건으로 3사이클을 실시하고, 이어 94℃에서 45초, 55℃에서 1분, 72℃에서 1분을 한 사이클로 하여 17 사이클을 실시하였다. 각 PCR 생성물을 클로로포름으로 추출한 다음 에탄올 침전처리를 2회 실시하고, 생성한 침전물을 100㎕의 TE 완충액에 용해시켰다.

다음으로, PCR 생성물[1] 및 [2]를 각각 1㎕씩 사용하여 PCR의 제 2 단계를 실시하였다. 사용된 프라이머는 T7과 endNotI의 조합이었다. 이것을 94℃에서 10분간 배양한 다음, 각 PCR 반응 혼합물에 TaKaRa Taq를 첨가하였다. 제 2 단계 PCR은 한 사이클은 94℃에서 1분, 55℃에서 2분, 72℃에서 2분으로 하여 3사이클을 실시하고, 이어 94℃에서 45초, 55℃에서 1분, 72℃에서 1분으로 9사이클을 실시하였다. 이로써 얻어진 각 PCR 생성물에 1㎕의 5mg/㎖ 단백질 분해효소 K, 2㎕의 0.5M EDTA 및 2㎕의 20% SDS를 첨가하고 이 혼합물을 비활성 Taq에서 30분간 37℃에서 유지하였다. PCR 생성물을 페놀/클로로포름액으로 추출한 다음 에탄올 침전시키고 최종 침전물 증류수 20㎕에 용해시켰다. EcoRI 및 NotI으로 분해시킨 후, 그 용액을 페놀/클로로포름으로 추출하고 그런 다음 에탄올로 추출하였다. 상기 얻어진 침전물을 TE 완충액 10㎕에 용해시키고 상기와 동일한 제한효소로 분해시키고 알칼리성 포스파타제(송아지장, 베링거만하임 제조)로 처리된 발현 벡터(pEF18S)에 서브클론시켰다. 이때 사용되는 숙주세포는 고 수용 대장균 JM109(Toyo-Boseki)이다. 그에 따라 얻어진 형질전환체로부터 Molecular Cloning에 기재된 방법으로 사용하여 플라스미드 DNA를 제조하였다. 그런다음 Taq Dye DeoxyTM 터미네이터 사이클 서열결정 키트(Applied Biosystems) 및 Applied Biosystems 373A DNA 서열결정기를 사용하여 상기 정제된 플라스미드 DNA의 뉴클레오타이드 서열을 확인하였다. 그 결과, dH33, A33′, T33′, dG116, dR117, A116′, G116′ 및 N116′를 코딩하는 모든 플라스미드들이 의도한 부위가 아닌 다른 부위의 뉴클레오타이드가 치환됨이 없이 예상된 TPO cDNA를 갖는다는 것이 확인되었다. 또한, G33′에서 의도한 부위 이외에 염기 치환 [Pro38(CCT) → Ser(TCT)]이 관찰되었다.

얻어진 각 클론을 COS1 셀로 형질전환하는 것은 실시예 11의 방법에 따라 이행되었다. 간략히 설명하면, 상기 형질전환은 10㎍의 각 플라스미드 DNA를 사용하여 클로로킨 처리를 포함한 DEAE-덱스트린 법으로 이행한 다음 4내지 5일 후 회수된 배양 상청액을 M-07e 분석계로 평가했다. 그 결과, 아미노산 삽입이나 결실 유도체를 코딩하는 플라스미드로 형질전환된 COS1 세포 배양물들의 각 상청액내에서, TPO 활성이 투여량 의존방식으로 검출되었다(제23도 참조). 이와 반대로 TPO 유도체를 코딩하는 cDNA를 포함하지않는 발현 플라스미드 pEF18S가 형질전환되어 발현된 COS 1 세포 배양물의 상청액에서는 TPO 활성이 검출되지 않았다.

[실시예 69]

항-인간 TPO 펩타이드 항체의 제조 및 정제

(1) 항원으로서 비교적 적합하다고 간주되는 6개 영역들(표 8 참조)을 서열 191의 인간 TPO의 아미노산 서열로부터 선택하고, 그로부터 복수의 항체 펩타이드(MAP)형의 네가닥 펩타이드를 탐(Tam)의 방법으로 합성하였다(Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 85, 5409-5413, 1988). 2마리 토끼를 100㎍의 펩타이드로 8차례 걸쳐 면역시켰다.

상기 내용과는 별도로, 서열 119-124로 도시된 펩타이드 영역들 각각의 C-말단에 시스테인 잔기를 결합시킴으로써 단일-가닥 펩타이드를 생성하였다. (펩타이드 영역 HT1-6 영역으로 칭하며, 이들은 제각기 서열 191 서열의 8-28, 47-62, 108-126, 172-190, 262-284, 306,332에 해당하는 부분 펩타이드 들이다). 이들은 테스트 항원들로 사용하여서, 그에 면역된 토끼들로부터 얻은 혈청에서 항체 값은 효소-면역 분석법으로 측정하는데, 이로부터 모든 테스트용 혈청내에는 항체값이 증가됨이 확인되었다. 따라서, 이러한 혈청을 항-혈청이라 칭하였다.

또한, C-말단에 시스테인 잔기가 결합된 상기 단일 가닥 합성 펩타이드는 다음 (2)에서 항-혈청의 친화성 정제용 항원으로도 사용되었다.

(2) 2마리의 토끼 각각을 상기 언급한 항원 펩타이드중 하나를 이용하여 면역시키고 그 면역된 토끼로부터 유도된 항체를 각각 분리하였다. 구체적으로, 항-HT1 펩타이드 항체의 경우 2마리의 면역화된 토끼들로부터 항-HT1-1 펩타이드 항체 및 항-HT1-2 펩타이드 항체를 얻었다.

한가지 예로서, 항-HT1-1 펩타이드 항체의 정제에 관하여 이하에 설명한다.

먼저, 시스테인 잔기가 결합된 HT1의 단일 가닥 펩타이드 30mg을 Sulfo Link Coupling Gel(피어스사의 제조, 카탈로그 No. 44895) 12ml 상에 결합시켰다. 정확하게는, 항원을 가진 펩타이드액을 겔 부피 6배인 결합 완충액 (50mM Tris, 5mM DETA-Na, pH 8.5)으로 평형화된 겔 상에 15분간에 걸쳐 결합시키는 것이다. 다음으로 30분동안 그 상태 그대로 방치해두었다가 겔 부피의 3배인 결합 완충액으로 상기 겔을 씻어내었다. 그런다음, 0.05M L-시스테인-HCl을 함유한 결합 완충액을 1㎖/㎖-겔 비율로 겔에 첨가하는데, 이에 의하여 15분간에 걸쳐 처리되지않은 그룹이 차단되었다. 그 상태 그대로 30분간 방치한 다음, 겔 부피의 8배의 결합 완충액으로 겔을 씻어낸다. 상기 기술한 결합작업은 실온에서 이행되었다. 이런 방식으로, 펩타이드를 함유한 항원을 겔상에 공유결합에 의하여 28.3%의 결합 효율로 결합시켜서, 항원 컬럼내에 0.8mg의 펩타이드가 1㎖의 겔상에 결합된 항원 펩타이드 겔을 제조하였다. 면역된 토끼 각각으로부터의 모든 혈액을 채취한 다음, 항-HT1-1 펩타이드 항체를 함유한 항혈청 78.4㎖를 얻었다. 단백질 함량 3,620mg를 함유한 항혈청 76.7㎖를 150mM의 NaCl 및 0.05%의 아지드화나트륨을 함유한 50mM 인산 완충액(pH 8)으로 이미 평형화시킨 항원 컬럼에 첨가하고, 그런 다음 상기 컬럼을 동일한 완충액으로 세척하였다. 따라서 단백질 함량 3,680mg을 함유한 통과 분획을 수득하였다. 이어, 흡착된 분획을 0.1M 시트르산 완충액(pH 3.0)으로 희석시킨 다음 즉시 거기에 0.1M 카보네이트 완충액(pH 9.9) 21.1㎖를 첨가하여 중화시키고 아미콘사에서 생산되는 YM30 막을 이용하여 한외여과시킴으로써 농축시킨 다음 150mM 염화나트륨 및 0.05% 아지드화나트륨을 함유한 50mM 인산 완충액(pH 8)내에서 정제했다. 따라서 77.7mg의 단백질 함량을 가지는 정제된 항-HT1-1 펩타이드 항체 11.2㎖를 완충액으로 수득하였다. 상기와 동일한 방식으로, 항-HT1-2 펩타이드 항체(60.0mg), 항-HT2-1 펩타이드 항체(18.8mg), 항-HT2-2 펩타이드 항체(8.2mg) 등을 얻었다.

항-HT3 내지 항-HT6의 항체들을 상기와 동일한 방식으로 수득하였다.

[실시예 70]

TPO 웨스턴 분석의 검출

(1) 실시예 69에서 수득한 항혈청을 평가하기 위하여, 하기와 같은 방식으로 시험하였다.

서열 6의 아미노산-21 내지 332를 코딩하는 유전자가 도입되어 발현된 CHO 세포의 배양상청액으로부터 부분 정제된 재결합 인간 TPO의 표본을 일반적인 방법에 따라 SDS-폴리아크릴아미드 전기영동(SDS-PAGE) 처리한 다음 PVDF나 니트로셀룰로오스 막상에 전기적으로 블롯팅했다. 블롯팅한 후, 상기 막을 20mM Tris-HCl 및 0.5M NaCl(pH 7.5)(TBS)로 5분간 세척한 다음 0.1% 트윈 20함유 TBS(TTBS)로 5분간 각기 2회 세척하고, 차단제(BlockAce, 다이니뽕 파마슈티컬 컴패니 제조, 카탈로그 No. UK-B25)로 60분간 처리했다. 항-HT1-1 펩타이드 항체, 항-HT2-1 펩타이드 항체, 항-HT3-2 펩타이드 항체, 항-HT4-1 펩타이드 항체, 항-HT5-2 펩타이드 항체 및 항-HT6-1 펩타이드 항체를 함유하는 항혈청을 0.05% BSA 및 10% BlockAce를 함유하는 TTBS 용액으로 1/1000배 희석시켰다. 이렇게 희석된 항체들을 웨스턴 분석을 위한 주요 항체로서 사용했다. 정확하게, 상기와 같이 처리된 재결합 인간 TPO 샘플을 항-TPO 펩타이드 항체, 0.05% BSA 및 10% BlockAce를 함유하는 TTBS 용액으로 60분간 처리한 다음 TTBS로 5분간 세척했다. 그런 다음 항-토끼(ab′) 염소 비오틴화된 항체(칼테그 컴패니 제조, 카탈로그 No. L43013)를 2차 항체로 함유하는 TTBS 용액과 함께 0.05% BSA 및 10% BlockAce와 60분간 처리한 다음 각각을 TTBS로 5분간 2회 세척했다. 다음으로, 10% BlockAce 함유 TTBS로 1/5000배 희석한 알칼리성 포스파타제 라벨링된 아비딘(레인코 테크놀로지스 컴패니 제조, 카탈로그 No. A108)으로 30분간 처리한 후 TTBS로 5분간 2회 세척하고 TTBS로 5분간 세척했다. 알칼리성 포스파타제 물질(Bio-Rad 컴패니 제조, 카탈로그 No. 170-6432)을 사용하여 전개시켰다. 상기 언급한 웨스트 분석은 실온에서 실시했는데, 이는 인간 TPO가 항 혈청에 의하여 인식 및 검출됨을 입증했다.

(2) 실시예 69에서 친화성 크로마토그래피로 정제한 항-HT1-1 펩타이드 항체, 항-HT1-2 펩타이드 항체, 항-HT2-1 펩타이드 항체, 항-HT2-2 펩타이드 항체의 각 3mg을 칭량하고 활성 비오틴 (NHS-LC-비오틴 II, 피어스 컴패니 제조, 카탈로그 No. 21336)상으로 그들을 결합시킴으로써 비오틴화했다. 상기 (1)에서 사용한 재조합 인간 TPO의 동일 표본을 SDS-PAGE하고 PVDF 또는 니트로셀룰로오스 막상에 전기적으로 블롯팅하여 이러한 비오틴화된 항체들을 주요 항체로 사용하여 일반적인 웨스턴 분석을 행했다. 점을찍은 직후에 상기 막을 TBS로 5분간 세척하고 TTBS로 각기 5분간 2회 세척한 다음 차단제(BlockAce)로 60분간 처리했다. 다음으로, 이를 1㎍/㎖의 비오틴화 항-TPO 펩타이드 항체, 0.05% BSA 및 10% Block Ace를 함유하는 TTBS 용액으로 60분간 처리하고 TTBS로 각기 5분간 2회 세척했다. 다음으로 이를 10% Block Ace 함유 TTBS 액으로 알칼리성 포스파타제 라벨링된 아비딘(레인코 테크놀로지스 컴패니 제조, 카탈로그 No. A108)을 30분간 1/5000배 희석시키고 TTBS로 각기 5분간 2회 세척하고 TTBS로 5분간 세척했다. 알칼리성 포스파타제 물질(Bio-Rad 컴패니 제조, 카탈로그 No. 170-6432)을 사용하여 전개시켰다. 상기 웨스턴 분석을 실온에서 실시했는데, 이는 인간 TPO가 정제된 항체에 의하여 인식 및 검출됨을 입증한다.

[실시예 71]

항-TPO 펩타이드 항체 컬럼의 제조 및 인간 TPO의 검출

실시예 69에서 얻은 항-인간 TPO 펩타이드 항체는 인간 TPO를 인식하는 것으로 입증되었다. 이 항체들을 개별적으로 크로마토그래피 캐리어상에 결합시켜서 항-TPO 펩타이드 항체 컬럼을 제조했다. 한 예로서, 항-HT1-2 펩타이드 항체 컬럼의 제조에 관해 설명한다.

(1) 50mM Na 포스페이트 및 0.15M NaCl(pH 8.0)을 포함하고 5mg/㎖의 항체를 함유한 용액을 제조했다. 이 용액의 0.8㎖를 팽윤된 포르밀 활성화 겔(Formy-Gellulofine, 치소 컴패니 제조) 1.54㎖와 4℃에서 2시간 동안 결합시킨다. 그런 다음, 환원제 트리메틸아민보란(TMAB), (세이카가쿠 고교 가부시끼가이샤 제조, 카탈로그 No. 680246) 10mg/리터를 포함한 용액 1.1㎖을 첨가한 다음 4시간동안 결합시켰다. 이어 원심분리법으로 상기 반응 혼합액으로부터 겔 부분만을 회수하였다. 여기에 순수한 물 10㎖를 첨가하고, 원심리법으로 겔 부분만을 회수했다. 이 과정을 4회 반복하고, 이로써 반응이 안된 항체를 제거했다. 그런 다음 상기 회수된 겔을 2.1㎖의 차단완충액(0.2M 인산나트륨, 1M 에탄올아민, pH 7.0) 및 거기에 첨가된 환원제 용액 1.1㎖로 4℃에서 2시간동안 처리함으로써 반응되지 않은 겔내의 활성 군들을 차단했다. 마지막으로 최종적인 겔을 원심분리기를 사용하여 물, 20mM Tris-HCl 및 0.15M NaCl(pH 8.0)으로 세척했다. 이를 소형 컬럼관에 채우고, 3M 티오시안산 나트륨 용액 및 0.1M 글리신-HCl(pH 2.5) 용액으로 세척한 다음 다시 20mM Tris-HCl 및 0.15M NaCl(pH 8.0)용액으로 평형시켰다. 이렇게 평형화된 컬럼을 보관하였다.

항-HT1-2 항체 컬럼내의 항-TPO 펩타이드 항체 겔은 각 IgG 분획에 대하여 94.2%까지의 결합 효율을 갖는다. 겔의 단위 부피당 겔상에 결합된 IgG 분획의 양은 1.9mg/ml-겔이다. 상기와 동일한 방법으로 TPO를 항원으로 갖지 않는 IgG 겔 ㎖당 21.8mg 결합된 겔이 제조되었다. 이것은 (2)에 언급한 TPO 항체 컬럼들로부터 비특이 결합 분자들을 제거하기 위한 예비 컬럼(이후, 예비-항체 컬럼으로 칭함)으로서 사용되었다.

(2) 다음으로, 항-HT1-2 항체 컬럼을 제조하는 다른 실시예를 하기에 설명하기로 한다.

서열 119-124의 아미노산 서열을 코딩하는 유전자가 도입되어 발현된 CHO 세포배양액의 상청액으로부터 부분 정제된 재결합 인간 TPO의 표준 샘플을 (1)에서 제조된 예비 항체 컬럼(1㎖의 겔 포함)에 첨가하고, 겔의 10배 부피의 20mM Tris-HCl(pH 8.0) 및 0.15M NaCl을 컬럼을 통과시켜 컬럼을 통과한 분획을 회수하였다. 예비-항체 컬럼에 흡착된 분획을 겔의 10배 부피의 산 용출제(0.1M 글리신-HCl, pH 2.5)로 용출시켰다. 다음으로, 상기 예비-항체 컬럼을 통과한 분획을 (1)에서 제조된 항-HT1-2 항체 컬럼(겔 2㎖ 포함)에 첨가하고, 상기 컬럼을 겔의 10배 부피의 20mM Tris-HCl(pH 8.0) 및 0.15M NaCl로 세척하여 항-HT1-2 항체 컬럼을 통과하는 분획을 회수했다. 그리고나서, 항-HT1-2 항체 컬럼에 흡착된 분획을 겔의 8배 부피의 산 용출제(0.1M 글리신-HCl, pH2.5)로 용출시켰다. 이 분획들을 SDS-PAGE로 분석함으로써 TPO가 예비 항체 컬럼에 흡수되지 않고 항-HT1-2 항체 컬럼에 특징적으로 결합된다는 점과, 첨가된 샘플내의 대부분의 TPO가 항-HT1-2 항체 컬럼에 결합된다는 점을 확인했다. 이로부터, 적어도 TPO의 200 내지 300㎍/㎖-겔이 항-HT1-2 항체 컬럼내의 겔에 결합됨을 알았다.

[실시예 72]

혈소판 수를 증가시키는 TPO의 효과

8주된 정상 ICR 계통 수컷 마우스 20마리를 무작위로 4개 그룹으로 나누었다(마우스들의 안와정맥에서 미리 채혈한 후 토아 리오 덴시에 의해 제작된 마이크로셀 계수기 F-800으로 혈소판 수를 측정하였다). 네 그룹중 하나(대조-iv 그룹)에는 하루에 한번 5일간 연속하여 100 마이크로리터의 PBS를 정맥주입했다. 다른 하나의 그룹(TPO-iv 그룹)에는 100 마이크로리터의 용액(실시예 56에서 얻어진 SP 세파로오스 Fast Flow의 TPO 활성 분획 F2의 농축액을 NAP-25 컬럼[파마시아 바디오테크; 카탈로그 No. 17-0852-02]을 사용하여 PSB로 치환시킨 다음 PBS로 희석시켜 제조한 것임; M-07e 분석에 의하여 211,900 상대 활성을 가짐)을 하루에 한번 5일간 연속하여 정맥주입했다. 또 다른 그룹(대조-sc 그룹)에는 100 마이크로리터의 PBS를 하루에 한번식 5일 연속하여 피하주입하고 그 잔여 그룹(TPO-sc 그룹)에는 100 마이크로리터를 TPO-iv 그룹과 동일한 방식으로 하루에 5일 연속하여 피하주입했다. 투여를 개시한 지 6, 8, 10, 13 및 15일이 지난 뒤, 각각의 마우스들의 안와정맥에서 채혈하여 혈소판의 수를 마이크로셀 계수기(토아 리오 덴시에 의해 제조)를 이용하여 계수했다. 제24도에 혈소판의 수를 나타내었다. 따라서 대조-iv 그룹에서는 혈소판의 수가 투여 이전에 비해 6일째(O일은 투여 개시일임) 44% 증가하여 혈소판 수치가 가장 높으며, 대조-sc 그룹에서는 그 수치가 가장 높아진 8일째에도 47% 증가만을 기록하고 있다. 한편, TPO-iv 그룹에서는 투여이전에 비해 6일째에도 177% 증가를 기록하고 TPO-sc 그룹에서는 6일째에 이미 347% 증가를 나타내고 8일째는 최대 증가치인 493%를 나타내었다.

상기 결과로부터, 인간 TPO는 투여 형태나 또는 투여경로의 차이와 무관하게 혈소판 수가 증가한다는 것이 확인되었다.

[실시예 73]

혈소판 수를 증가시키는 TPO의 효과

11주된 16마리의 정상 C3H/HeJ 계통 수컷 마우스(마우스들의 안와정맥에서 미리 채혈한 후 토아 리오 덴시에 의해 제작된 마이크로셀 계수기 F-800으로 혈소판 수를 측정해둔다)들을 무작위로 4개 그룹으로 나누었다. 4개 그룹중 하나(대조군)에는 100 마이크로리터의 PBS를 하루 한번 5일 연속하여 피하주입했다. 다른 그룹(TPO-1 그룹)에는 100 마이크로리터의 용액(실시예 56에서 얻은 세파크릴 S-200HR의 TPO 활성 분획을 NAP-25를 사용하여 PBS로 희석시킴으로써 제조; M-07e 분석에 의하면 83,000 상대 활성을 가짐)으로 하루에 한번 5일 연속하여 피하주입했다. 또 다른 그룹(TPO-2 그룹)에는 100 마이크로리터의 용액(TPO-1 그룹에 사용된 TPO 활성 분획을 PBS로 2배 정도로 희석하여 제조; M-07e 분석에 의하면 41,500 상대 활성을 가짐)을 하루에 한번 5일 연속하여 피하주입했다. 최종 그룹(TPO-3 그룹)에는 100 마이크로리터의 용액(TPO-2 그룹에 사용한 TPO 활성을 2배이상 희석하여 제조; M-07e 분석에 의하여 20,750 상대 활성을 가짐)을 하루 한번 5일 연속하여 피하주입했다.

주입한 지 6, 8, 10, 12일째에 마우스의 안와정맥으로부터 채혈하고 혈소판 수를 마이크로셀 계수기(토아 리오 덴시 제조, F-800형)를 사용하여 계수했다.

혈소판의 수 변화를 제25도에 나타내었다. 따라서 대조군에서는 혈소판 수치가 거의 없는 반면에 TPO가 주입된 그룹들에서는 모든 그룹에서 주입한지 8일째에 수치가 가장 높은 정도까지 혈소판 수치가 증가하였다. 또한, 그룹들간에 투여량 대 반응(dose-response) 차이가 관찰되었다. 따라서, TPO-1 그룹에서는 6일째에 이미 200%의 증가가 관찰되고 8일째에는 약 270%까지 증가하지만 12일째에는 감소되지만 대약 65% 증가 수준을 여전히 나타내고 있는 대조그룹(p〈0.01; Dunnet 다중 비교 시험)과 현결한 차이를 나타내었다. TPO-2 그룹에서도 동일한 증가가 관찰되지만, 증대활동이 TPO-1 그룹에서 보다 작으며, 6일째와 8일째에 각각 약 140%와 160%의 증가를 나타내었다. 12일째에는 그 수치가 거의 대조 그룹에서와 동일한 정도까지 감소했다. TPO-3 그룹의 증대활동은 TPO-2 그룹의 것보다 약하며, 8일째에 그 수치가 가장 높아서 110% 증가를 기록하며 대조 그룹과는 현격한 차이(p〈0.01)를 나타냈다.

상기 결과로부터, 인간 TPO는 마우스의 계통과 무관하게 혈소판 갯수를 증가시킨다는 것과 그 작용이 투여량에 부합하는 성질을 갖는다는 것을 확인했다.

[실시예 74]

항암제 투여로 인한 혈소판 감소증에 대한 TPO의 억제 효과

8주된 30마리의 ICR 수컷 마우스들에 5-FU 200mg/kg을 정맥주입하고 두 그룹으로 무작위 분류했다(각 그룹은 15마리의 마우스를 포함함). 다음날(1일째)로부터 그룹들중 하나(대조 그룹)에게 100㎕의 PBS를 하루에 한번 5일간 연속하여 피하주입하고, 이와 동시에 다른 그룹(TPO 그룹)에는 실시예 72에서 사용된 100㎕의 TPO 활성 분획(M-07e 분석에 의하면 211,900 상대 활성 포함)을 하루에 한번 5일간 연속하여 피하주입했다. 6, 6, 8일째에 각 5마리의 마우스를 각 그룹들로부터 무작위로 선택하여 그 안와정맥으로부터 채혈하고 마이크로셀 계수기(토아 리오 덴시 제조, F-800형)에 의하여 혈소판 수를 계수했다. 혈소판의 수의 변화를 제26도에 나타내었다. 따라서 대조 그룹에서는 5-FU 투여후에 혈소판 수가 시일이 지남에 따라 감소되어 6일째 최저(5-FU를 투여하기전 값의 약 28%)로 되었고 8일째에는 반응 감소에 따라 약 1.3배 증가되었다. TPO 그룹의 경우에도 5-FU 투여 이후에도 혈소판 수가 시일이 지남에 따라 감소하고 6일째에 혈소판 갯수의 차이는 매우 적고 6일째에는 대조군 그룹에 비해 현저히(Dunnet 다중 비교 시험; p〈0.01) 높은 수치가 유지 되었다. 8일째에는 5-FU 투여 이전 값의 대략 200% 증가가 관찰되었다.

상기 결과로부터 인간 TPO가 항암제로 인한 혈소판 수 감소를 억제함을 알 수 있다.

[실시예 75]

혈소판 감소증에 대한 TPO의 치료효과

7주된 ICR 수컷 마우스 36마리에 염산 니무스틴(ACNU; 500mg/kg)을 정맥주입한 다음 마우스들을 무작위로 두 개 그룹으로 나누었다(각 그룹은 18마리의 마우스를 포함함). 다음날(1일째)로부터 그룹들 중 하나(대조 그룹)에 200㎕의 PBS를 하루에 2번 매일 연속하여 피하주입하는 동시에 다른 그룹(TPO 그룹)에는 실시예 73에서 사용된 TPO 활성 분획(PBS로 희석하지 않음)(0.04%의 트윈 80이 부가됨)(M-07e 분석에 의하면 380,000 상대 활성을 포함); 200㎕를 하루에 두 번 매일 연속하여 피하주입하였다.

상기 주입후, 각 그룹의 마우스들을 무작위로 3개 그룹으로 나누었다. 한 그룹으로부터 5일째와 12일째에 혈액을 채혈하고 다른 그룹으로부터 8일째와 14일째에 채혈하고 남은 그룹으로부터 10일째에 채혈했다. 혈액은 안와정맥으로부터 채혈하며 마이크로셀 계수기(토아 리오 덴시 제조, F-800형)에 의하여 혈소판 수를 계수했다. 혈소판 수의 변화를 제27도에 나타내었다. 따라서 대조 그룹에서는 ACNU 투여이후 혈소판 갯수는 시일이 경과함에 따라 감소하였고, 8-10일째에 그 치수가 최저가 되며(ACNU 투여 이전 값의 대략 29%) 또 12일째와 14일째에는 대략 49%와 74%만 회복되었다. 한편 TPO 그룹에서 ACNU 투여 이전 값의 대략 38%의 감소가 5일째에 관찰되고 그런 다음 상황은 증가로 바뀐다. 따라서 8일째에는 수치가 ACNU 투여 이전 값의 대략 63%까지 회복하고 10일째 이후에는 혈소판 갯수가 ACNU 투여 이전의 값보다 더 많았다. 따라서 12 및 14일째는 약 300% 및 400%까지의 증가가 각기 관찰되었다.

상기 언급한 바와 같이 대조 그룹에서 감소가 관찰되는 8-10일째에 TPO 그룹에서는 이미 증가가 관찰되며 10일째에는 혈소판 수가 ACNU 투여 이전의 값보다 더 많았다. 따라서 인간 TPO가 항암제로 인한 혈소판 감소증으로부터 회복을 촉진시킴이 확인되었다.

실시예 74의 결과를 함께 고려할 때 인간 TPO는 항암제 유형과 무관하게 혈소판 갯수의 감소를 억제하고 혈소판 감소증으로부터의 회복을 촉진시키는 것으로 예상되었다.

[실시예 76]

BMT 이후 혈소판 감소증에 대한 TPO 치료 효과

7주된 45마리의 C3H/HeN 계통의 수컷 마우스에 10Gy의 방사능을 몸 전체에 조사하고 그 다음 즉시 그들에게 동일 계통의 마우스로부터 추출한 골수세포 1 × 106을 정맥주입했다. 그런다음 마우스들을 2개 그룹으로 무작위 분류하고, 다음날(1일째)로부터 그룹들중 하나(대조 그룹)에 PBS를 주입하고 다른 그룹(TPO 그룹)에는 실시예 73에서 사용한 TPO 활성분획(M-07e 분석에 의하여 44,000 상대활성 포함)을 하루 한번 20일간 연속하여 피하주입했다.

주입 개시후, 5, 10, 14, 21째에 각 6마리의 마우스들을 무작위로 선택하고 안와정맥으로부터 혈액을 채혈하여 혈소판 갯수를 마이크로셀 계수기(토아 리오 덴시 제조, E-2500형)에 의하여 계수했다.

혈소판 갯수의 변화를 제28도에 나타내었다. 따라서 모든 그룹들에서 BMT를 가한 후 시일이 지남에 따라 혈소판 갯수가 감소하고, 10일째에 그 수가 최소가 되었다(BMT 적용 이전 값의 대략 3%), 그런 다음 점차적으로 회복이 관찰되는데 4일째에 대조 그룹과 TPO 그룹에서 제각기 약 11%와 약 13%의 수치가 관찰되었다. 21일째에는 대조 그룹에서 37%의 회복만이 관찰되는데, 반해, TPO 그룹에서는 약 65%의 회복이 관찰되어 현격한 회복 촉진 효과가 나타났다. 상기 결과로부터 실시예 56에서와 같이 제조한 인간 TPO가 BMT 적용 이후 혈소판 갯수의 회복을 촉진시킴을 확인했다.

[실시예 77]

방사선 조사 이후 혈소판감소증에 대한 TPO의 치료효과

8주된 36마리의 ICR 계통 수컷 마우스들에게 5Gy의 X선을 몸 전체에 조사하고 무작위로 2개 그룹으로 나누었다. 다음날(1일째)로부터 그룹들중 1개(대조군 그룹)에 OBS를 주입하는 동시에 다른 그룹(TPO 그룹)에는 실시예 73에서 사용한 TPO 활성분획(M-07e 분석에 의하면 1,440,000 상대 활성 포함)을 하루에 한번 3일 연속하여 피하주입하고 그 다음날로부터 M-07e 분석을 위하여 360,000 상대활성을 가진 TPO 활성 분획을 하루에 한번 7일 연속하여 피하주입했다. 주입 개시 이후, 각 그룹들을 3개의 그룹으로 나눈다. 4, 11, 21째에 한 그룹으로부터 채혈하고 7일째와 13일째에 다른 그룹으로부터 채혈하고 9일째와 15일째에 잔여 그룹으로부터 채혈했다. 채혈은 안와정맥으로부터 행하며 마이크로셀 계수기(토아 리오 덴시 제조, E-800형)을 사용하여 혈소판 갯수를 계수했다. 혈소판 갯수의 변화를 제21도에 나타내었다. 따라서 대조 그룹에서는 X선 조사 이후 시일이 지남에 따라 혈소판 갯수가 감소하고 9일째에 최저 수치가 되었다(X선 조사 이전 값의 약 25%). 11일째와 13일째에, 수치는 38%와 67%까지 각기 회복되고, 15일재에는 X 선 조사 이전 값까지 회복했다. TPO 그룹에서는 7일째에 X 선 조사 이전의 대략 24%까지 갯수가 감소했다. 그 이후 증가가 관찰되는데 9일째에는 그 수치가 대략 82%까지 회복되었다. 11일째는 혈소판 갯수가 X 선 조사 이전 값보다 더 많았고 21일째까지 이러한 경향이 계속되었다. 상기 언급한 바와 같이 대조 그룹에서 갯수가 감소하는 경향을 띠는 9일째에 TPO 그룹의 혈소판 갯수는 이미 증가로 바뀌었고 11일째에는 X 선 조사 이전보다 혈소판 갯수가 더 많았고 그 이후로도 계속 높게 유지되었다. 한편, 대조 그룹에서 혈소판 갯수가 X 선 조사 이전으로 회복되기가지는 45일이 소요되었다. 이 결과들로부터 실시예 56에서 생성된 인간 TPO가 X 선 조사 이후 혈소판 감소로부터 회복하는데 필요한 시간을 단축시키는 것과 X 선 조사 이후 혈소판 감소증에 대한 치료 효과를 보임을 확인했다.

[실시예 78]

혈소판 갯수를 증대시키는 hTPO163의 효과

안와정맥으로부터 미리 혈액을 채혈하여 마이크로셀 계수기(토아 리오 덴시 제조, F-800형)로 혈소판 갯수를 측정해 둔 15마리의 C3H/HeN의 건강한 수컷 마우스를 4개 그룹 즉, 대조 그룹, 그룹 A, 그룹 B 및 그룹 C로 무작위 분류했다. 첫 번째 그룹(대조 그룹)에서 마우스로부터 추출한 0.1% 혈청을 함유한 PBS를 하루에 한번 5일 연속하여 피하주입했다. 그룹 A, B, C에는 실시예 65에서 수득한 것으로 0.1% 마우스 혈청을 함유하는 PBS로 희석된 SP 세파로오스 Fast Flow의 TPO 활성 분획을 M-07e 분석에 의해 hTPO163의 상대 활성으로 약 40,000,000, 약 8,000,000 및 약 1,600,000/kg 체중/일의 투여량으로 5일간 연속하여 피하주입했다.

주입 후, 6, 8, 10, 12일째에 각 마우스의 안와정맥으로부터 혈액을 채혈한 후 마이크로셀 계수기(토아 리오 덴시 제조, F-800형)를 사용하여 혈소판 갯수를 계수했다. 혈소판 갯수의 변화는 제30도에 도시하였다.

따라서 대조 그룹에서 혈소판 갯수 변화가 거의 없는 반면 TPO 그룹에서는 모든 경우에 혈소판 갯수 증가가 관찰되어 주입 후 8일째 최고치를 나타내었다. TPO 각 임의 그룹들간에 투여량 대 반응관계가 관찰되었다. 따라서 그룹 A에서 6일재와 8일째에 각각 약 88%와 약 10%의 증가가 관찰되고 또 10일째에도 약 97% 증가가 유지되어 모든 데이타가 대조 그룹과 현격한 차이를 보였다(Dunnet 다중 비교 시험; P〈0.01). 그룹 b에서도 마찬가지로 유사한 증가가 관찰되는데 그 증가의 정도는 그룹 A 보다 낮아서 6일째와 8일째에 각각 약 65%와 약 84%의 증가를 보여 대조 그룹과 현격한 차이를 나타내었다. (Dunnet 다중 비교 시험; p〈0.01 또는 0.05). 그룹 C에서의 증가작용은 그룹 B 에서보다 낮았다. 최고 값을 나타내는 8일째에 여전히 약 31%의 증가를 나타냈다. 상기 결과로부터 실시예 65에서 생성된 hTPO163이 혈소판 갯수를 증가시키는 것과 그 작용이 투여량에 부응하는 반응관계를 나타내는 것을 확인했다.

[실시예 79]

혈소판 감소증에 대한 hTPO163의 치료효과

생후 8주된, C3H/HeN 계통의 100마리 수컷 마우스에 50mg/kg의 니머스틴 하이드로클로라이드(ACNU)를 정맥내 주사하고 임의로 4그룹-각각 25마리의 마우스를 포함하는 대조군 및 그룹 A, B 및 C로 나누었다. 다음날(1일)부터 대조군에는 5mg/kg의 PBS를 매일 한번씩 계속하여 피하주사하고 그룹 A, B 및 C에는 M-07e 분석에 의하면 hTPO163의 상대 활성으로 약 16,000,000 약 48,000,000 및 약 160,000,000/kg 체중/일의 투여량으로 PBS로 희석된 실시예 65에서 얻은 SP 세파로오스 Fast Flow의 TPO 활성 분획을 매일 1회로 연속해서 피하주사하였다.

주사 개시후 각 그룹의 마우스들을 5 그룹으로 임의로 분할하여 5, 8, 10, 12 및 14일째에 혈액을 채취했다. 혈액 채취를 안와정맥으로부터 행하며 마이크로셀 계수기(E-2500형; 토아 리오 덴시 제조)로 혈소판 갯수를 계수하였다. 혈소판 갯수의 변화를 제31도에 도시하였다. 그 결과, 대조군에서는 8-10일째 최저치(ACNU 투여전의 약 15-16%)를 나타냈고 회복량도 12일 및 14일째에 각각 약 28% 및 약 51% 였다. 한편, A 그룹에서는 8일재에 ACNU 투여전의 약 25%까지 감소되었다. 그러나 그후 10일 및 12일째 약 34% 및 약 89%로 증가 및 회복되었다. 14일째에는 갯수가 ACNU 투여전보다 더 높았다.

상술한 바와 같이, 최소의 혈소판은 모든 그룹에서 8일째에 나타났지만, 인간 TPO가 투여된 그룹에서 혈소판 감소는 대조 그룹에서보다 서서히 최소의 혈소판을 야기했다. 대조그룹에서는 10일째에도 혈소판 갯수의 회복이 거의 없었던 반면에 인간 TPO가 제공된 그룹에서는 정도는 다르지만 모든 그룹에서 혈소판 갯수의 회복이 나타났다. 50㎍/kg이 투여된 그룹에서는 12일째에 회복이 이미 ACNU 투여전보다 많은 수를 제공하는 것으로 나타났다. 대조 그룹에서는 회복이 14일째에도 ACNU 투여전 상태와 비교했을 때 약 51% 만큼 적었다는 사실과 비교할 때 실시예 65에서와 같이 생성된 hTPO163이 혈소판 갯수 감소의 회복을 촉진한다는 것이 명백하다. 또한, hTPO163이 항암제에 의해 야기된 혈소판 감소증에 대해 치료효과를 갖는 것으로 확인되었다.

약제의 제조예를 하기에 설명한다.

[실시예 80]

실시예 56에서 얻은 인간 TPO 분획을 농축시키고 무균 처리한 후 -20℃로 냉동시켜 주사제제로서 사용될 수 있는 냉동 생성물을 수득하였다.

[실시예 81]

실시예 56에서 얻은 인간 TPO 분획을 농축시키고 무균 작업으로 10㎖ 바이얼 병에 5㎖의 양으로 채워 -20℃로 냉동건조시킨 다음 그 병을 고무 스토퍼로 폐쇄시켜 주사제제로 사용될 수 있는 동결건조 물질을 수득하였다.

[실시예 82]

실시예 56에서 얻은 인간 TPO 분획을 농축시키고 무균 여과하여 10㎖의 바이얼병에 채워서 주사제제로 사용될 수 있는 생성물을 수득하였다.

[실시예 83]

실시예 65에서 얻은 hTPO 163 분획을 농축시키고 무균처리한 후 -20℃로 동결건조하여 주사제제로서 사용될 수 있는 냉동 생성물을 수득하였다.

[실시예 84]

실시예 65에서 얻은 hTPO163 분획을 농축시키고 무균 작업으로 10㎖ 바이얼 병에 5㎖의 양으로 채워 -20℃로 냉동 건조시킨 다음 그 병을 고무 스토퍼로 폐쇄시켜 주사제제로 사용될 수 있는 동결건조 생성물을 수득하였다.

[실시예 85]

실시예 65에서 얻은 hTPO163 분획을 농축시키고 무균 여과하여 10㎖의 바이얼병에 채워서 주사제제로 사용될 수 있는 생성물을 수득하였다.

[실시예 86]

실시예 57에서 얻은 인간 TPO 분획을 농축시키고 무균 처리한 후 -20℃로 냉동시켜 주사제제로서 사용될 수 있는 냉동 생성물을 수득하였다.

[실시예 87]

실시예 57에서 얻은 TPO 분획을 농축시키고 무균 작업으로 10㎖ 바이얼 병에 5㎖의 양으로 채워 -20℃로 냉동 건조시킨 다음 그 병을 고무 스토퍼로 폐쇄시켜 주사제제로 사용될 수 있는 동결건조 물질을 수득하였다.

[실시예 88]

실시예 57에서 얻은 TPO 분획을 농축시키고 무균 여과하여 10㎖의 바이얼 병에 채워서 주사제제로 사용될 수 있는 생성물을 수득하였다.

[실시예 89]

[재생불량성 개혈장]

헤파린화된 재생불량성 개 혈장(“APK9”) 또는 정상의 개 혈장(“NK9”)을 450라드의 총 신체 조사(irradiation)가 수용체에 전달된 것을 제외하고는 [MAZUR, E. South, K. Exp. Hematol. 13:1164-1172(1985) ; Arriaga, M., South K., Cohen J.L. and Mazur, E.M. Blood 69:486-492(1987) ; Mazur, E., Basilico, D., Newton, J. L., Cohen, J.L., Charland, C., Soh1, P.A. and Narendran, A. Blood 76:1771-1782(1990)]에 기술된 바와 같이 생성하였다.

[실시예 90]

[인간 거핵구 분석]

하기 실시예에 기술된 많은 과정 또는 적절한 다른 과정을 위한 표준 방법은 예를 들면 샘브룩 등(Eds), Molecular Cloning, Second Edition, cold Spring Harbor Laboratory Press(1987) 및 오수벨 등 (Eds), Current Protocols in Molecular Biology, Green associates/Wiley Interscience, New York(1990)와 같은, 분자생물학에서 널리 인정된 매뉴얼에 제공되어 있다.

APK9 및 분별된 APK9에 대하여 CD34+ 전구세포로부터 인간 거핵구의 발육을 자극하는 능력을 평가했다. CD34-선택세포는 기술된 (Hokom, M. H., Choi, E., Nichol, J.L., Hornkohl, A., Arakawa, T., and Hunt, P. Molecular Biology of Haematopiesis 3:15-31, 1994) 바와 같이 말초혈액 세포로부터 얻고 하기 배양배지에서 배양했다 : 1% 글루타민 Pen-strep(Irvine Scientific, Santa Ana, CA) 및 10% 헤파린화된, 혈소판 부족 인간 AB 혈장이 보충된 이스코브 변형 둘베코 배지(IMDM; GIBCO, Gran Island, NY). 또한, 2-메르캅토에탄올(10-4M), 피루브산(110㎍/㎖), 콜레스테롤(7.8㎍/㎖). 아데노신, 구아닌, 시티딘, 우리딘, 티미딘, 2-데옥시시토신, 2-데옥시아데노신, 2-데옥시구아노신(각각 10㎍/㎖, Sigma); 인간 재조합 인슐린(10㎍/㎖), 인간 트랜스페린(300㎍/㎖), 콩지질(1%, 베링거 만하임, 인디아나폴리스, IN); 인간 재조합 염기성 섬유아세포 성장인자(2ng/㎖, Genzyme, 캠브릿지, MA); 인간 재조합 내피성장 인자(15ng/㎖), 혈소판 유도 성장인자(10ng/㎖, 암겐 인 코포레이티드, 캘리포니아, 싸우전드 오크스 소재)도 포함된다. CD34-선택 세포를 테라사키형 마이크로리터 플레이트(뱅가드 인코포레이티드 제조, 뉴저지 넵튠 소재)의 웰에 있는 2 × 105㎖ 배양배지에 15㎕의 최종 부피로 플레이팅했다. 그 세포들을 공기중의 5% CO2 의 습기박스에서 8일동안 37℃에서 배양하고 1% 글루타르알데하이드로 배양 웰을 직접 고정시킨 다음 모노클로날 항체 칵테일(항-GPIb, 항-GPIIB, 바이오디자인) 및 항-GPIb(다코, 캘리포니아 카르핀테리아 소재)로 배양했다. 스트렙트아비딘-β-갈락토시다제 검출 시스템(HistoMark, Kirgegaard 및 Perry)로 면역 반응을 전개시켰다. 푸른색으로 확인된 거핵구를 100X 배율의 역상현미경으로 계수했다. 결과를 웰당 거핵구의 평균수 +/- 평균의 표준편차(SEM)로 나타냈다. 어떤 경우에는 주어진 샘플이 거핵구 발육을 유도한 정도가 실험을 위한 양성 APK9 대조군으로 정상화되는 경우 “거핵구 유니트/㎖”로 데이타를 나타냈다. 1 유니트는 1㎕의 APK9 표준물과 같은 수의 거핵구를 초래하는 물질의 양으로서의 정의된다.

5-10㎍/㎖ MPL-X(용해성 Mpl 수용체)로 차단될 수 있다면 활성은 MPL 리간드에 기인한 것으로 볼 수 있다.

APK9는 이 시스템에서 인간 거핵구 발육을 자극하는 인자를 함유하는 것으로 입증되었다. 10% NK9와 8일동안 배양된 CD34-선택세포는 무시할만한 수의 청색-염색 거핵구를 나타내는 반면에 10% APK9와 8일동안 배양된 CD34-선택세포는 매우 많은 수의 청색-염색 거핵구를 나타낸다.

제32도는 인간 거핵구 배양계에 첨가된 Mpl-X의 농도 증가가 점차 거핵구 발육을 차단한다는 것을 도시한 것이다. 5㎍/㎖ 이상의 Mpl-X의 농도에서 억제가 완료된다. 이 실험에서는 CD34-선택세포는 5% APK9에 의해 자극되었다. 이것은 Mpl-X(추정 Mpl 리간드)와 상호 작용하는 활성이 인간 거핵구 발육을 위하여 필요하다는 것을 입증하고 Mpl 리간드가 APK9 그 자체에 존재한다는 것을 암시한다.

또한, 인간 거핵구 발육에 필요한 Mpl 리간드 활성이 APK9에 존재한다는 것이 입증되었다. APK(135㎖)를 이스코브 배지에 6배 희석시키고 Mpl-X 친화성 컬럼에 부가하였다. 통과한 비결합된 물질을 수집하여 평가 전의 원래 부피로 농축시켰다. 결합된 물질을 10㎖의 1M NaCl에서 용출시키고 20%의 푸울을 투석여과시키고 평가를 위하여 4배 농축시켰다. 배지에서 배양된 CD34-선택세포 단독으로는 거핵구로 발육하지 않았다. 5% APK9에서 배양된 세포 (컬럼에 부착된 것과 동일 푸울)는 웰당 48+/-8 거핵구를 형성하였다. 10%의 비결합 물질에서 배양된 세포는 거핵구로 생성하지 않았다. 10%의 용출 푸울에서 배양된 세포는 웰당 120+/-44의 거핵구를 생성하였다. 컬럼적재 및 용출 푸울 활성은 분석에서 5㎍/㎖ Mpl-X에 의해 완전히 억제되었다.

[실시예 91]

[쥐의 세포주로 쥐 또는 인간 Mpl 수용체의 형질전환]

A. 쥐의 Mpl 수용체

전체 길이의 쥐 Mpl 수용체 cDNA를 몰로니 뮤린 사르콤(Moloney Murine Sarcome) 바이러스의 LTR로부터 유도된 전사 프로모터를 함유하는 발현벡터에 서브클론하였다. 5㎍의 상기 작제물 및 1㎍의 선택 마커 플라스미드 pWLNEO(Stratagene)을 IL-3 의존 쥐 세포주(32D, 클론 23: 그린버거 등, PNAS 80; 2931-2936(1983))로 공동 전기천공 처리하였다. 세포들을 5일동안 배양하여 과정으로부터 회수하고 800㎍/㎖의 제네티신(G418, Sigma) 및 1ng/㎖ 쥐 IL-3을 포함하는 선택 배지에서 배양했다. 생존 세포를 2 × 105 세포의 푸울로 나누고 추가로 분석될 수 있는 개체로 성장할때까지 배양시켰다. 폴리 클로날 토끼 항펩타이드 혈청을 사용하여 6 군집을 FACS 분석으로 Mpl 수용체의 표면 발현을 시험했다. 상기와 같은 항펩타이드 혈청을 사용하는 FACS 선별에 사용하기 위해 하나의 군집을 선택하였다. 모 세포주의 단일 세포 클론을 10% APK9 및 제네티신에서 성장시켜 선택하였다. 35일 동안 APK9에서 선택한 후에 그 세포를 1ng/㎖ 쥐 IL-3에서 유지시켰다. 서브클론들 중 하나인 1A6.1을 평가하는데 사용했다.

B. 인간 Mpl 수용체

전체 길이의 Mpl 수용체 서열(Vigon, I. 등, PNAS 89:5640-5644(1992)을 말로니 뮤린 사르콤(Maloney Murine Sarcome) 바이러스의 전사 프로모터를 함유하는 발현벡터(쥐 수용체와 동일한 벡터임)에 서브클론했다. 6㎍의 상기 작제물 및 6㎍의 암포트로픽 레트로 바이러스성 팩케이징 작제물(Landau, N.R., Littman, D.R., J. Virology 66: 5110-5113(1992)을 CaPO4 포유동물 형질전환 키트 Stratagene을 사용하여 3 × 106 293 세포로 형질전환시켰다. 그 세포를 2일 후 그리고 4일 후 다시 형질전환시켰다. 최종 형질전환 이후 293 세포들을 IL-의존 쥐 세포주(32D, 클론 23; 그린버거 등, PNAS 80:2931-2936(1983))과 공동배양했다. 24시간 후 32D 세포를 잡아내어 BSA 구배(Path-o-cyte; Mills Inc.)에서 밴드지게 했다. 세포를 1ng/㎖ 쥐 IL-3에서 증폭시켜 20% APK9에서 성장을 위하여 선택했다. 세포를 폴리클로날 토끼 항펩타이드 혈청을 사용하는 성장하는 FACS에 의해 수용체의 세포 표면 발현을 위하여 선별했다. 이 세포들을 평가에 사용했다.

[실시예 92]

[Mpl 리간드에 대한 1A6.1 분석]

1A6.1 세포를 배양물 IL-3이 없이 세척하고 10% 우태아 혈청(FCS), 제네티신(800㎍/㎖) 및 1% pen/strep(Gibco)가 시험 샘플의 1:1 일련의 희석으로 보충된 α MEM(Gibco)가 있는 테라사키형 마이크로티터 플레이트에 재위치시켰다(1000세포/15㎕ 총 col/웰). 48시간 후 웰당 생존가능한 세포주를 현미경으로 측정했다. 1 유니트의 활성은 웰당 200개의 생존가능한 세포가 생기는 활성의 양으로 정의했다. 분석에서 5-10㎍/㎖ Mpl-X를 포함함으로써 활성이 완전히 차단될 수 있다면 활성은 Mpl 리간드 때문인 것으로 정의되었다. APK9에서 Mpl 리간드 활성은 재생불량성 혈장의 평균 4400 +/- 539 유니트/㎖ 였다. 특별히 언급하지 않은한 Mpl 리간드 활성의 유니트는 1A1.6 분석으로 정의된다.

인간 Mpl 수용체 유전자로 형질전환된 세포의 평가는 기본적으로 1A1.6 세포에서와 동일한 방법으로 수행되었다.

[실시예 93]

[Mpl 리간드가 마우스, 개, 돼지 및 인간의 혈청 또는 재생불량성 혈장에 존재한다는 것의 입증]

Mpl 리간드는 쥐, 개, 돼지 및 인간으로부터의 재생불량성 혈장 또는 혈청에 존재한다(표 9). 예비 조사 및 12일 조사(500라드)한 후 BDF1 마우스로부터 혈장을 수집했다. 2000 유니트/㎖ 활성이 Mpl-X(10㎍/㎖)로 완전히 억제된다는 것을 입증하기 위하여 혈장을 1A6.1 분석에서 시험했다. 조사된 마우스 혈장을 1833 유니트/㎖의 활성을 나타내는 인간 거핵구 분석에서 양성이었다. 예비 조사 및 10일 조사(450라드)한 후 개로부터 혈장을 수집했다. 이 혈장을 1A6.1 분석 및 인간 거핵구 분석 모두에서 시험하였다. 양 분석에서는 활성이 검출되었고 Mpl-X(10㎍/㎖)에 의해 완전히 억제되었다. 예비조사 및 10일 조사후(650라드) 돼지로부터 혈장을 수집했다. 이 혈장을 1A6.1 분석 및 인간 거핵구 분석 모두에서 시험하였다. 양 분석에서 재생불량성 개 혈장에서 발견된 것과 필적하는 Mpl 리간드 활성(10㎍/㎖ Mpl-X로 억제가능한)이 나타났다. 재생불량성 사람으로부터 혈청을 수득하였다. 이 물질은 골수 이식 환자로부터 수집했다. 6명의 환자로부터 혈청을 1A6.1 분석으로 평가했을 때 903 유니트/㎖의 활성을 나타내는데 그의 88%는 Mpl 리간드(10㎍/㎖ Mpl-X로 억제가능한)에 기인한 것이다. 14명의 재생불량성 환자의 혈청을 인간 거핵구 분석으로 시험했다. 그룹으로서 그들은 실제적 활성, 941meg 유니트/㎖를 나타냈는데 이는 10㎍/㎖ Mpl-X로써 완전히 억제가능한 것이다. 쥐 IL-3 데이타는 1A6.1 분석의 특이성을 입증했다. 이 재조합 시토킨이 세포주의 성장을 유도하지만 10㎍/㎖ Mpl-X에 의해 차단되지 않는다.

[표 9]

[실시예 94]

[대장균 계에서 발현된 인간 TPO 유도체의 제조]

물리학적 활성, 안정성 및 용해성을 증가시키기 위한 시도로서 수개의 TPO 유도체를 설계하여 대장균에서 발현시켰다. 서열 11에 설명된 아미노산 서열을 사용하여 생성된 유도체는 아르기닌이 아미노산 위치 129에 있는 로이신으로 대체된 [Met-2, Lys-1, Ala1, Val3, Arg129] TPO(1-163)(L129R로 칭함), 아르기닌이 아미노산 위치 133에 있는 히스티딘으로 대체된 [Met-2, Lys-1, Ala1, Val3, Arg133] TPO(1-163)(H133R로 칭함), 아르기닌이 아미노산 위치 143에 있는 메티오닌으로 대체된 [Met-2, Lys-1, Ala1, Val3, Arg143] TPO(1-163)(M143R로도 칭함), 로이신이 아미노산 위치 82에 있는 글리신으로 대체된 [Met-2, Lys-1, Ala1, Val3, Arg146] TPO(1-163) (G82L로도 칭함), 프롤린이 아미노산 위치 148에 있는 세린으로 대체된 [Met-2, Lys-1, Ala1, Val3, Arg148] TPO(1-163)(S148P로도 칭함), 아르기닌이 아미노산 위치 59에 있는 리신으로 대체된 [Met-2, Lys-1, Ala1, Val3, Arg59] TPO(1-163)(K59R로도 칭함), 아르기닌이 아미노산 위치 115에 있는 글루타메이트로 대체된 [Met-2, Lys-1, Ala1, Val3, Arg115] TPO(1-163)(Q115R로도 칭함)을 포함했다.

TPO 유도체의 제조시에는 실시예 42에 기술된 h6T(1-163)을 주형으로 사용하여 하기 서열을 갖는 올리고뉴클레오타이드를 합성했다:

(서열 11에 도시된 서열에서 ArG로 치환된 Leu-129를 갖는 Arg-치환 유도체의 제조용)

(서열 11에 도시된 서열에서 Arg로 치환된 His-133을 갖는 Arg-치환 유도체의 제조용)

(서열 11에 도시된 서열에서 Arg로 치환된 Met-143을 갖는 Arg-치환 유도체의 제조용)

(서열 11에 도시된 서열에서 Leu로 치환된 Gly-82을 갖는 Leu-치환 유도체의 제조용)

(서열 11에 도시된 서열에서 Leu로 치환된 Gly-146을 갖는 Leu-치환 유도체의 제조용)

(서열 11에 도시된 서열에서 Pro로 치환된 Ser-148을 갖는 Pro-치환 유도체의 제조용)

(서열 11에 도시된 서열에서 Arg로 치환된 Lys-59을 갖는 Arg-치환 유도체의 제조용)

(서열 11에 도시된 서열에서 Arg로 치환된 Gly-115을 갖는 Arg-치환 유도체의 제조용)

시험관내 돌연변이 유발 키트(Amersham)내에서 Sculptor를 사용하여 돌연변이체 플라스미드를 작제했다. 실시예 42에 기술된 pCFM536/h6T(1-163)으로부터 유도된 Xba I-HindIII 단편을 XbaI 및 HindIII로 분해시킨 Bluescript II SK(-) 파아지미드 벡터(Stratagene, California USA)에 도입시켜 플라스미드 pSKTPO를 얻고 대장균 JM109로 형질전환시켰다. 헬퍼 파아지 M13K07(다까라 스조, 일본)을 사용하여 pSKTPO로부터 돌연변이 유발용 단일 가닥 DNA를 제조했다. 상기에 기술된 올리고뉴클레오타이드를 사용하여 공급자의 지시에 따라 돌연변이를 TPO 유전자에 도입시켰다. 공급자의 지시에 따라 DNA 서열분석 키트(Applied Biosystems, USA)로 서열분석을 행하여 TPO 돌연변이를 확인했다.

돌연변이된 pSKTPO로부터 제조된 XbaI-HindIII 단편을 XbaI와 HindIII로 분해시킨 pCFM536에 도입시켰다. 돌연변이된 유전자를 운반하는 플라스미드 pCFM536을 대장균 #216로 형질전환시켜 TPO 유도 유전자를 발현시키는 형질 전환체를 얻었다.

돌연변이된 pCFM536으로 형질전환된 대장균 #216의 배양을 상기에서 설명한 바와 같이 실시예 43에 따라 수행했다. 형질전환체의 세포 펠릿을 수집하여 최소한 1일동안 냉동기에 저장했다. 냉동된 세포 펠릿(3g)을 10mM EDTA, 10mM DTT 및 1mM PMSF를 함유하는 20mM Tris 완충액(pH 8.5) 30mL에 현탁시켰다. 그 현탁액을 얼음상에 유지시키고 1분(최소한) 간격으로 5번 초음파 처리했다. 초음파 처리된 세포를 10분동안 15000rpm으로 원심분리하여 수집했다.

그 펠릿을 8M 구아니딘 클로라이드, 5mM EDTA, 1mM PMSF를 함유하는 10mM 트리스 완충액(pH 8.7) 30mL에 현탁시키고 50mg의 DTT를 첨가하여 환원시켰다. 1-1.5시간 교반후 희석된 HCl을 사용하여 용액의 pH를 5.0으로 조정하고 희석전에 4℃로 냉각시켰다.

30% 글리세롤, 3M 우레아, 3mM 시스타민 및 1mM L-시스테인을 함유하는 10mM CAPS 완충액(pH 10.5) 1.5L에 샘플 용액을 밤새 점차적으로 희석시켰다. 최소한 2일동안 교반한 후 침전물을 45분동안 8000rpm으로 원심분리하여 제거했다. 6M 인산으로 용액의 pH를 6.8로 조정하고 2번 희석시켰다. 그 용액을 2장의 #2 여과지(ø=90mm, Toyo filter paper, 일본)로 여과한 후 CM-세파로오스 Fast Flow(Pharmacia) 컬럼(2.6 × 10cm)에 적재시켰다. 15% 글리세롤 및 1M의 우레아를 함유하는 10mM 인산 완충액(pH 6.8) 400mL로 상기 컬럼을 세척하고 15% 글리세롤을 함유하는 10mM 인산 완충액(pH 7.2)으로 평형화시켰다. 15% 글리세롤을 함유하는 10mM 인산 완충액(pH 7.2)에서 0.5mM NaCl을 함유하는 동일 완충액까지의 선형구배 시스템을 사용하여 컬럼으로부터 10mL/분의 유량으로 단백질을 용출시켰다. 280nm의 흡수도로 단백질 용출을 모니터하고 SDS-PAGE로 TPO 유도체 함유 분획을 확인하여 수집했다.

TPO 분획(약 30mL)를 Centriprep 10(Amicon)을 사용하여 2mL로 농축시킨 후 μBondasphere C4(3.9 × 150mm)의 컬럼을 갖는 역상 HPLC(Waters)로 돌연변이체 TPO를 정제했다. H2O중의 0.05% TFA에서 30% CH3CN 및 0.02% TFA를 함유하는 2-프로판올까지의 선형구배를 사용하여 40분동안 50mL/분의 유량으로 단백질 용출을 수행했다. 이러한 조건하에서 약 30분후에 TPO 유도체를 용출시켰다.

생물학적 평가를 위하여, 정제된 TPO 샘플을 1L의 10mM 인산 완충액에 대하여 2일동안 두 번 투석했다. Contriprep 10(Amicon)으로 약 0.1mg/mL로 농축시킨 후 유도체의 생물학적 활성을 상기한 바와 같이 M-07e 분석계로 평가했다. 모든 돌연변이체는 TPO의 참고 샘플인 h6T(1-163)과 거의 동일한 활성을 갖는 것으로 밝혀졌다(제33도 및 제34도 참조).

기탁리스트

Escherichia coli (pHT1-231/DH5) : FERM BP-4564 및 CCTCC-M95001

Escherichia coli (pHT18S-A2 α/DH5) : FERM BP-4564 및 CCTCC-M95002

Escherichia coli (pHGT1/DH5) : FERM BP-4616 및 CCTCC-M95003

Escherichia coli (pHF1/DH5) : FERM BP-4617 및 CCTCC-M95004

마우스-마우스 하이브리도마 P55 : FERM BP-4563 및 CCTCC-C95001

CH028/1/1/3-C6 : FERM BP-4988 및 CCTCC-C95004

CHO163T-63-79-C1 : FERM BP-4989 및 CCTCC-C95005

서열목록

(1) 일반정보 :

(i) 출원인 : 미야자끼, 히로시

가또, 다까시

오가미, 기니아

이와마쓰, 아끼히로

아끼호리, 히로미치

구로끼, 료따

시미즈, 도시유끼

무또, 다까노리

(ii) 발명의 명칭 : TPO 활성을 갖는 단백질

(ⅲ) 서열수 : 197

(iv) 서신 주소 :

(A) 주소 : 마샬, 오툴레, 게르슈타인, 무레이 앤드 보룬

(B) 가 : 싸우쓰 웨커 드라이 233 시어스 타워 6300

(C) 시 : 시카고

(D) 주 : 일리노이

(E) 국가 : 미국

(F) 우편번호 : 60606-6402

(v) 컴퓨터 판독 형태 :

(A) 매체 형태 : 플로피 디스크

(B) 컴퓨터 : IBM PC 호환형

(C) 작동시스템 : PC-DOS/MS-DOS

(D) 소프트웨어 : PatentIn Release #1.0, 버젼 #1.25

(vi) 현재 출원 데이타

(A) 출원번호 :

(B) 출원일 :

(C) 분류 :

(vii) 우선 출원 데이타 :

(A) 출원번호 : JP 39090/94

(B) 출원일 : 1994년 2월 14일

(vii) 우선 출원 데이타 :

(A) 출원번호 : JP 79842/94

(B) 출원일 : 1994년 3월 25일

(vii) 우선 출원 데이타 :

(A) 출원번호 : JP 155126/94

(B) 출원일 : 1994년 6월 1일

(vii) 우선 출원 데이타 :

(A) 출원번호 : JP 167328/94

(B) 출원일 : 1994년 6월 15일

(vii) 우선 출원 데이타 :

(A) 출원번호 : JP 227159/94

(B) 출원일 : 1994년 8월 17일

(vii) 우선 출원 데이타 :

(A) 출원번호 : JP 304167/94

(B) 출원일 : 1994년 11월 1일

(vii) 우선 출원 데이타 :

(A) 출원번호 : JP 미정

(B) 출원일 : 1994년 12월 28일

(vii) 우선 출원 데이타 :

(A) 출원번호 : JP 193169/94

(B) 출원일 : 1994년 8월 17일

(vii) 우선 출원 데이타 :

(A) 출원번호 : JP 298669/94

(B) 출원일 : 1994년 12월 1일

(vii) 우선 출원 데이타 :

(A) 출원번호 : JP 193916/94

(B) 출원일 : 1994년 8월 18일

(vii) 우선 출원 데이타 :

(A) 출원번호 : US 08/212,164

(B) 출원일 : 1994년 3월 14일

(vii) 우선 출원 데이타 :

(A) 출원번호 : US 08/221,020

(B) 출원일 : 1994년 6월 20일

(vii) 우선 출원 데이타 :

(A) 출원번호 : US 08/278,083

(B) 출원일 : 1994년 7월 20일

(vii) 우선 출원 데이타 :

(A) 출원번호 : US 08/320,300

(B) 출원일 : 1994년 10월 11일

(vii) 우선 출원 데이타 :

(A) 출원번호 : US 08/361,811

(B) 출원일 : 1994년 12월 22일

(vⅲ) 대리인 정보 :

(A) 성명 : 보룬, 마이클 에프.

(B) 등록번호 : 25,447

(C) 참조번호/서류번호 : 01017/32425

(ix) 전화통신 정보

(A) 전화 : 312/474-6300

(B) 텔레펙스 : 312/474-0448

(2) 서열 1에 대한 정보 :

(i) 서열특징 :

(A) 길이 : 261 염기쌍

(B) 유형 : 핵산

(C) 가닥수 : 이중

(D) 형태 : 선형

(ii) 분자형태 : cDNA 내지 mRNA

(vi) 기원 :

(A) 생물 : 라루스 노르베기쿠스(Rattus norvegicus)

(H) 세포주 : McA-RH8994

(xi) 서열 기술 : 서열 1 :

(2) 서열 2에 대한 정보 :

(i) 서열특징 :

(A) 길이 : 147 아미노산

(B) 유형 : 아미노산

(C) 가닥수 : 이중

(D) 형태 : 선형

(ii) 분자형태 : 단백질

(xi) 서열 기술 : 서열 2 :

(2) 서열 3에 대한 정보 :

(i) 서열특징 :

(A) 길이 : 580 염기쌍

(B) 유형 : 핵산

(C) 가닥수 : 이중

(D) 형태 : 선형

(ii) 분자형태 : cDNA 내지 mRNA

(vi) 기원 :

(A) 생물 : 호모 사피엔스(Homo Sapiens)

(F) 조직 유형 : 간

(xi) 서열 기술 : 서열 3 :

(2) 서열 4에 대한 정보 :

(i) 서열특징 :

(A) 길이 : 253 아미노산

(B) 유형 : 아미노산

(D) 형태 : 선형

(ii) 분자형태 : 단백질

(xi) 서열 기술 : 서열 4:

(2) 서열 5에 대한 정보 :

(i) 서열특징 :

(A) 길이 : 567 염기쌍

(B) 유형 : 핵산

(C) 가닥수 : 이중

(D) 형태 : 선형

(ii) 분자형태 : cDNA 내지 mRNA

(vi) 기원 :

(A) 생물 : 호모 사피엔스

(F) 조직 유형 : 간

(xi) 서열 기술 : 서열 5 :

(2) 서열 6에 대한 정보 :

(i) 서열특징 :

(A) 길이 : 353 염기쌍

(B) 유형 : 아미노산

(D) 형태 : 선형

(ii) 분자형태 : 단백질

(xi) 서열 기술 : 서열 6 :

(2) 서열 7에 대한 정보 :

(i) 서열특징 :

(A) 길이 : 1721 염기쌍

(B) 유형 : 핵산

(C) 가닥수 : 이중

(D) 형태 : 선형

(ii) 분자형태 : cDNA 내지 mRNA

(vi) 기원 :

(A) 생물 : 호모 사피엔스

(F) 조직 유형 : 간

(xi) 서열 기술 : 서열 7 :

(2) 서열 8에 대한 정보 :

(i) 서열특징 :

(A) 길이 : 4506 염기쌍

(B) 유형 : 핵산

(C) 가닥수 : 이중

(D) 형태 : 선형

(ii) 분자형태 : 게놈 DNA

(vi) 기원 :

(A) 생물 : 호모 사피엔스

(F) 세포 형태 : 말초 백혈구 세포

(xi) 서열 기술 : 서열 8 :

(2) 서열 9에 대한 정보 :

(i) 서열특징 :

(A) 길이 : 416 염기쌍

(B) 유형 : 핵산

(C) 가닥수 : 이중

(D) 형태 : 선형

(ii) 분자형태 : 합성 DNA

(xi) 서열 기술 : 서열 9 :

(2) 서열 10에 대한 정보 :

(i) 서열특징 :

(A) 길이 : 179 아미노산

(B) 유형 : 아미노산

(D) 형태 : 선형

(ii) 분자형태 : 단백질

(xi) 서열 기술 : 서열 10 :

(2) 서열 11에 대한 정보 :

(i) 서열특징 :

(A) 길이 : 535 염기쌍

(B) 유형 : 핵산

(C) 가닥수 : 이중

(D) 형태 : 선형

(ii) 분자형태 : 합성 DNA

(vi) 기원 :

(A) 생물 : 호모 사피엔스

(xi) 서열 기술 : 서열 11 :

(2) 서열 12에 대한 정보 :

(i) 서열특징 :

(A) 길이 : 535 염기쌍

(B) 유형 : 핵산

(C) 가닥수 : 이중

(D) 형태 : 선형

(ii) 분자형태 : 합성 DNA

(vi) 기원 :

(A) 생물 : 호모 사피엔스

(xi) 서열 기술 : 서열 12 :

(2) 서열 13에 대한 정보 :

(i) 서열특징 :

(A) 길이 : 555 염기쌍

(B) 유형 : 핵산

(C) 가닥수 : 이중

(D) 형태 : 선형

(ii) 분자형태 : cDNA 내지 mRNA

(vi) 기원 :

(A) 생물 : 호모 사피엔스

(F) 조직 형태 : 간

(xi) 서열 기술 : 서열 13 :

(2) 서열 14에 대한 정보 :

(i) 서열특징 :

(A) 길이 : 1043 염기쌍

(B) 유형 : 핵산

(C) 가닥수 : 이중

(D) 형태 : 선형

(ii) 분자형태 : 합성 DNA

(vi) 기원 :

(A) 생물 : 호모 사피엔스

(xi) 서열 기술 : 서열 14 :

(2) 서열 15에 대한 정보 :

(i) 서열특징 :

(A) 길이 : 45 염기쌍

(B) 유형 : 핵산

(C) 가닥수 : 이중

(D) 형태 : 선형

(ii) 분자형태 : 기타 핵산

(xi) 서열 기술 : 서열 15 :

(2) 서열 16에 대한 정보 :

(i) 서열특징 :

(A) 길이 : 13 염기쌍

(B) 유형 : 핵산

(C) 가닥수 : 단일

(D) 형태 : 선형

(ii) 분자형태 : 기타 핵산

(xi) 서열 기술 : 서열 16 :

(2) 서열 17에 대한 정보 :

(i) 서열특징 :

(A) 길이 : 9 염기쌍

(B) 유형 : 핵산

(C) 가닥수 : 단일

(D) 형태 : 선형

(ii) 분자형태 : 기타 핵산

(xi) 서열 기술 : 서열 17 :

(2) 서열 18에 대한 정보 :

(i) 서열특징 :

(A) 길이 : 12 아미노산

(B) 유형 : 아미노산

(C) 가닥수 :

(D) 형태 : 선형

(ii) 분자형태 : 펩타이드

(xi) 서열 기술 : 서열 18 :

(2) 서열 19에 대한 정보 :

(i) 서열특징 :

(A) 길이 : 12 아미노산

(B) 유형 : 아미노산

(C) 가닥수 :

(D) 형태 : 선형

(ii) 분자형태 : 펩타이드

(xi) 서열 기술 : 서열 19 :

(2) 서열 20에 대한 정보 :

(i) 서열특징 :

(A) 길이 : 12 아미노산

(B) 유형 : 아미노산

(C) 가닥수 :

(D) 형태 : 선형

(ii) 분자형태 : 펩타이드

(vi) 기원 :

(xi) 서열 기술 : 서열 20 :

(2) 서열 21에 대한 정보 :

(i) 서열특징 :

(A) 길이 : 17 염기쌍

(B) 유형 : 핵산

(C) 가닥수 : 단일

(D) 형태 : 선형

(ii) 분자형태 : 기타 핵산

(ix) 특징 :

(A) 명칭/키 : 수식 염기

(B) 위치 : 12 및 15

(D) 기타 정보 : /mod 염기 = i

(xi) 서열 기술 : 서열 21 :

(2) 서열 22에 대한 정보 :

(i) 서열특징 :

(A) 길이 : 17 염기쌍

(B) 유형 : 핵산

(C) 가닥수 : 단일

(D) 형태 : 선형

(ii) 분자형태 : 기타 핵산

(ix) 특징 :

(A) 명칭/키 : 수식 염기

(B) 위치 : 12 및 15

(D) 기타 정보 : /mod 염기 = i

(xi) 서열 기술 : 서열 22 :

(2) 서열 23에 대한 정보 :

(i) 서열특징 :

(A) 길이 : 17 염기쌍

(B) 유형 : 핵산

(C) 가닥수 : 단일

(D) 형태 : 선형

(ii) 분자형태 : 기타 핵산

(ix) 특징 :

(A) 명칭/키 : 수식 염기

(B) 위치 : 12 및 15

(D) 기타 정보 : /mod 염기 = i

(xi) 서열 기술 : 서열 23 :

(2) 서열 24에 대한 정보 :

(i) 서열특징 :

(A) 길이 : 17 염기쌍

(B) 유형 : 핵산

(C) 가닥수 : 단일

(D) 형태 : 선형

(ii) 분자형태 : 기타 핵산

(ix) 특징 :

(A) 명칭/키 : 수식 염기

(B) 위치 : 12 및 15

(D) 기타 정보 : /mod 염기 = i

(xi) 서열 기술 : 서열 24 :

(2) 서열 25에 대한 정보 :

(i) 서열특징 :

(A) 길이 : 17 염기쌍

(B) 유형 : 핵산

(C) 가닥수 : 단일

(D) 형태 : 선형

(ii) 분자형태 : 기타 핵산

(xi) 서열 기술 : 서열 25 :

(2) 서열 26에 대한 정보 :

(i) 서열특징 :

(A) 길이 : 17 염기쌍

(B) 유형 : 핵산

(C) 가닥수 : 단일

(D) 형태 : 선형

(ii) 분자형태 : 기타 핵산

(xi) 서열 기술 : 서열 26 :

(2) 서열 27에 대한 정보 :

(i) 서열특징 :

(A) 길이 : 17 염기쌍

(B) 유형 : 핵산

(C) 가닥수 : 단일

(D) 형태 : 선형

(ii) 분자형태 : 기타 핵산

(xi) 서열 기술 : 서열 27 :

(2) 서열 28에 대한 정보 :

(i) 서열특징 :

(A) 길이 : 17 염기쌍

(B) 유형 : 핵산

(C) 가닥수 : 단일

(D) 형태 : 선형

(ii) 분자형태 : 기타 핵산

(xi) 서열 기술 : 서열 28 :

(2) 서열 29에 대한 정보 :

(i) 서열특징 :

(A) 길이 : 21 염기쌍

(B) 유형 : 핵산

(C) 가닥수 : 단일

(D) 형태 : 선형

(ii) 분자형태 : 기타 핵산

(xi) 서열 기술 : 서열 29 :

(2) 서열 30에 대한 정보 :

(i) 서열특징 :

(A) 길이 : 20 염기쌍

(B) 유형 : 핵산

(C) 가닥수 : 단일

(D) 형태 : 선형

(ii) 분자형태 : 기타 핵산

(ix) 특징 :

(xi) 서열 기술 : 서열 30 :

(2) 서열 31에 대한 정보 :

(i) 서열특징 :

(A) 길이 : 21 염기쌍

(B) 유형 : 핵산

(C) 가닥수 : 단일

(D) 형태 : 선형

(ii) 분자형태 : 기타 핵산

(xi) 서열 기술 : 서열 31 :

(2) 서열 32에 대한 정보 :

(i) 서열특징 :

(A) 길이 : 21 염기쌍

(B) 유형 : 핵산

(C) 가닥수 : 단일

(D) 형태 : 선형

(ii) 분자형태 : 기타 핵산

(xi) 서열 기술 : 서열 32 :

(2) 서열 33에 대한 정보 :

(i) 서열특징 :

(A) 길이 : 21 염기쌍

(B) 유형 : 핵산

(C) 가닥수 : 단일

(D) 형태 : 선형

(ii) 분자형태 : 기타 핵산

(xi) 서열 기술 : 서열 33 :

(2) 서열 34에 대한 정보 :

(i) 서열특징 :

(A) 길이 : 21 염기쌍

(B) 유형 : 핵산

(C) 가닥수 : 단일

(D) 형태 : 선형

(ii) 분자형태 : 기타 핵산

(xi) 서열 기술 : 서열 34 :

(2) 서열 35에 대한 정보 :

(i) 서열특징 :

(A) 길이 : 21 염기쌍

(B) 유형 : 핵산

(C) 가닥수 : 단일

(D) 형태 : 선형

(ii) 분자형태 : 기타 핵산

(xi) 서열 기술 : 서열 35 :

(2) 서열 36에 대한 정보 :

(i) 서열특징 :

(A) 길이 : 21 염기쌍

(B) 유형 : 핵산

(C) 가닥수 : 단일

(D) 형태 : 선형

(ii) 분자형태 : 기타 핵산

(xi) 서열 기술 : 서열 36 :

(2) 서열 37에 대한 정보 :

(i) 서열특징 :

(A) 길이 : 21 염기쌍

(B) 유형 : 핵산

(C) 가닥수 : 단일

(D) 형태 : 선형

(ii) 분자형태 : 기타 핵산

(xi) 서열 기술 : 서열 37 :

(2) 서열 38에 대한 정보 :

(i) 서열특징 :

(A) 길이 : 21 염기쌍

(B) 유형 : 핵산

(C) 가닥수 : 단일

(D) 형태 : 선형

(ii) 분자형태 : 기타 핵산

(xi) 서열 기술 : 서열 38 :

(2) 서열 39에 대한 정보 :

(i) 서열특징 :

(A) 길이 : 21 염기쌍

(B) 유형 : 핵산

(C) 가닥수 : 단일

(D) 형태 : 선형

(ii) 분자형태 : 기타 핵산

(xi) 서열 기술 : 서열 39 :

(2) 서열 40에 대한 정보 :

(i) 서열특징 :

(A) 길이 : 21 염기쌍

(B) 유형 : 핵산

(C) 가닥수 : 단일

(D) 형태 : 선형

(ii) 분자형태 : 기타 핵산

(xi) 서열 기술 : 서열 40 :

(2) 서열 41에 대한 정보 :

(i) 서열특징 :

(A) 길이 : 21 염기쌍

(B) 유형 : 핵산

(C) 가닥수 : 단일

(D) 형태 : 선형

(ii) 분자형태 : 기타 핵산

(xi) 서열 기술 : 서열 41 :

(2) 서열 42에 대한 정보 :

(i) 서열특징 :

(A) 길이 : 21 염기쌍

(B) 유형 : 핵산

(C) 가닥수 : 단일

(D) 형태 : 선형

(ii) 분자형태 : 기타 핵산

(xi) 서열 기술 : 서열 42 :

(2) 서열 43에 대한 정보 :

(i) 서열특징 :

(A) 길이 : 31 염기쌍

(B) 유형 : 핵산

(C) 가닥수 : 단일

(D) 형태 : 선형

(ii) 분자형태 : 기타 핵산

(xi) 서열 기술 : 서열 43 :

(2) 서열 44에 대한 정보 :

(i) 서열특징 :

(A) 길이 : 31 염기쌍

(B) 유형 : 핵산

(C) 가닥수 : 단일

(D) 형태 : 선형

(ii) 분자형태 : 기타 핵산

(xi) 서열 기술 : 서열 44 :

(2) 서열 45에 대한 정보 :

(i) 서열특징 :

(A) 길이 : 31 염기쌍

(B) 유형 : 핵산

(C) 가닥수 : 단일

(D) 형태 : 선형

(ii) 분자형태 : 기타 핵산

(xi) 서열 기술 : 서열 45 :

(2) 서열 46에 대한 정보 :

(i) 서열특징 :

(A) 길이 : 31 염기쌍

(B) 유형 : 핵산

(C) 가닥수 : 단일

(D) 형태 : 선형

(ii) 분자형태 : 기타 핵산

(xi) 서열 기술 : 서열 46 :

(2) 서열 47에 대한 정보 :

(i) 서열특징 :

(A) 길이 : 21 염기쌍

(B) 유형 : 핵산

(C) 가닥수 : 단일

(D) 형태 : 선형

(ii) 분자형태 : 기타 핵산

(xi) 서열 기술 : 서열 47 :

(2) 서열 48에 대한 정보 :

(i) 서열특징 :

(A) 길이 : 21 염기쌍

(B) 유형 : 핵산

(C) 가닥수 : 단일

(D) 형태 : 선형

(ii) 분자형태 : 기타 핵산

(xi) 서열 기술 : 서열 48 :

(2) 서열 49에 대한 정보 :

(i) 서열특징 :

(A) 길이 : 21 염기쌍

(B) 유형 : 핵산

(C) 가닥수 : 단일

(D) 형태 : 선형

(ii) 분자형태 : 기타 핵산

(xi) 서열 기술 : 서열 49 :

(2) 서열 50에 대한 정보 :

(i) 서열특징 :

(A) 길이 : 21 염기쌍

(B) 유형 : 핵산

(C) 가닥수 : 단일

(D) 형태 : 선형

(ii) 분자형태 : 기타 핵산

(xi) 서열 기술 : 서열 50 :

(2) 서열 51에 대한 정보 :

(i) 서열특징 :

(A) 길이 : 21 염기쌍

(B) 유형 : 핵산

(C) 가닥수 : 단일

(D) 형태 : 선형

(ii) 분자형태 : 기타 핵산

(xi) 서열 기술 : 서열 51 :

(2) 서열 52에 대한 정보 :

(i) 서열특징 :

(A) 길이 : 21 염기쌍

(B) 유형 : 핵산

(C) 가닥수 : 단일

(D) 형태 : 선형

(ii) 분자형태 : 기타 핵산

(xi) 서열 기술 : 서열 52 :

(2) 서열 53에 대한 정보 :

(i) 서열특징 :

(A) 길이 : 21 염기쌍

(B) 유형 : 핵산

(C) 가닥수 : 단일

(D) 형태 : 선형

(ii) 분자형태 : 기타 핵산

(xi) 서열 기술 : 서열 53 :

(2) 서열 54에 대한 정보 :

(i) 서열특징 :

(A) 길이 : 21 염기쌍

(B) 유형 : 핵산

(C) 가닥수 : 단일

(D) 형태 : 선형

(ii) 분자형태 : 기타 핵산

(xi) 서열 기술 : 서열 54 :

(2) 서열 55에 대한 정보 :

(i) 서열특징 :

(A) 길이 : 21 염기쌍

(B) 유형 : 핵산

(C) 가닥수 : 단일

(D) 형태 : 선형

(ii) 분자형태 : 기타 핵산

(xi) 서열 기술 : 서열 55 :

(2) 서열 56에 대한 정보 :

(i) 서열특징 :

(A) 길이 : 30 염기쌍

(B) 유형 : 핵산

(C) 가닥수 : 단일

(D) 형태 : 선형

(ii) 분자형태 : 기타 핵산

(xi) 서열 기술 : 서열 56 :

(2) 서열 57에 대한 정보 :

(i) 서열특징 :

(A) 길이 : 39 염기쌍

(B) 유형 : 핵산

(C) 가닥수 : 단일

(D) 형태 : 선형

(ii) 분자형태 : 기타 핵산

(xi) 서열 기술 : 서열 57 :

(2) 서열 58에 대한 정보 :

(i) 서열특징 :

(A) 길이 : 42 염기쌍

(B) 유형 : 핵산

(C) 가닥수 : 단일

(D) 형태 : 선형

(ii) 분자형태 : 기타 핵산

(xi) 서열 기술 : 서열 58 :

(2) 서열 59에 대한 정보 :

(i) 서열특징 :

(A) 길이 : 42 염기쌍

(B) 유형 : 핵산

(C) 가닥수 : 단일

(D) 형태 : 선형

(ii) 분자형태 : 기타 핵산

(xi) 서열 기술 : 서열 59 :

(2) 서열 60에 대한 정보 :

(i) 서열특징 :

(A) 길이 : 42 염기쌍

(B) 유형 : 핵산

(C) 가닥수 : 단일

(D) 형태 : 선형

(ii) 분자형태 : 기타 핵산

(xi) 서열 기술 : 서열 60 :

(2) 서열 61에 대한 정보 :

(i) 서열특징 :

(A) 길이 : 30 염기쌍

(B) 유형 : 핵산

(C) 가닥수 : 단일

(D) 형태 : 선형

(ii) 분자형태 : 기타 핵산

(xi) 서열 기술 : 서열 61 :

(2) 서열 62에 대한 정보 :

(i) 서열특징 :

(A) 길이 : 41 염기쌍

(B) 유형 : 핵산

(C) 가닥수 : 단일

(D) 형태 : 선형

(ii) 분자형태 : 기타 핵산

(xi) 서열 기술 : 서열 62 :

(2) 서열 63에 대한 정보 :

(i) 서열특징 :

(A) 길이 : 40 염기쌍

(B) 유형 : 핵산

(C) 가닥수 : 단일

(D) 형태 : 선형

(ii) 분자형태 : 기타 핵산

(xi) 서열 기술 : 서열 63 :

(2) 서열 64에 대한 정보 :

(i) 서열특징 :

(A) 길이 : 38 염기쌍

(B) 유형 : 핵산

(C) 가닥수 : 단일

(D) 형태 : 선형

(ii) 분자형태 : 기타 핵산

(xi) 서열 기술 : 서열 64 :

(2) 서열 65에 대한 정보 :

(i) 서열특징 :

(A) 길이 : 38 염기쌍

(B) 유형 : 핵산

(C) 가닥수 : 단일

(D) 형태 : 선형

(ii) 분자형태 : 기타 핵산

(xi) 서열 기술 : 서열 65 :

(2) 서열 66에 대한 정보 :

(i) 서열특징 :

(A) 길이 : 38 염기쌍

(B) 유형 : 핵산

(C) 가닥수 : 단일

(D) 형태 : 선형

(ii) 분자형태 : 기타 핵산

(xi) 서열 기술 : 서열 66 :

(2) 서열 67에 대한 정보 :

(i) 서열특징 :

(A) 길이 : 38 염기쌍

(B) 유형 : 핵산

(C) 가닥수 : 단일

(D) 형태 : 선형

(ii) 분자형태 : 기타 핵산

(xi) 서열 기술 : 서열 60 : 7

(2) 서열 68에 대한 정보 :

(i) 서열특징 :

(A) 길이 : 38 염기쌍

(B) 유형 : 핵산

(C) 가닥수 : 단일

(D) 형태 : 선형

(ii) 분자형태 : 기타 핵산

(xi) 서열 기술 : 서열 68:

(2) 서열 69에 대한 정보 :

(i) 서열특징 :

(A) 길이 : 30 염기쌍

(B) 유형 : 핵산

(C) 가닥수 : 단일

(D) 형태 : 선형

(ii) 분자형태 : 기타 핵산

(xi) 서열 기술 : 서열 69 :

(2) 서열 70에 대한 정보 :

(i) 서열특징 :

(A) 길이 : 41 염기쌍

(B) 유형 : 핵산

(C) 가닥수 : 단일

(D) 형태 : 선형

(ii) 분자형태 : 기타 핵산

(xi) 서열 기술 : 서열 70 :

(2) 서열 71에 대한 정보 :

(i) 서열특징 :

(A) 길이 : 39 염기쌍

(B) 유형 : 핵산

(C) 가닥수 : 단일

(D) 형태 : 선형

(ii) 분자형태 : 기타 핵산

(xi) 서열 기술 : 서열 71 :

(2) 서열 72에 대한 정보 :

(i) 서열특징 :

(A) 길이 : 50 염기쌍

(B) 유형 : 핵산

(C) 가닥수 : 단일

(D) 형태 : 선형

(ii) 분자형태 : 기타 핵산

(xi) 서열 기술 : 서열 72 :

(2) 서열 73에 대한 정보 :

(i) 서열특징 :

(A) 길이 : 49 염기쌍

(B) 유형 : 핵산

(C) 가닥수 : 단일

(D) 형태 : 선형

(ii) 분자형태 : 기타 핵산

(xi) 서열 기술 : 서열 73 :

(2) 서열 74에 대한 정보 :

(i) 서열특징 :

(A) 길이 : 49 염기쌍

(B) 유형 : 핵산

(C) 가닥수 : 단일

(D) 형태 : 선형

(ii) 분자형태 : 기타 핵산

(xi) 서열 기술 : 서열 74 :

(2) 서열 75에 대한 정보 :

(i) 서열특징 :

(A) 길이 : 48 염기쌍

(B) 유형 : 핵산

(C) 가닥수 : 단일

(D) 형태 : 선형

(ii) 분자형태 : 기타 핵산

(xi) 서열 기술 : 서열 75 :

(2) 서열 76에 대한 정보 :

(i) 서열특징 :

(A) 길이 : 49 염기쌍

(B) 유형 : 핵산

(C) 가닥수 : 단일

(D) 형태 : 선형

(ii) 분자형태 : 기타 핵산

(xi) 서열 기술 : 서열 76 :

(2) 서열 77에 대한 정보 :

(i) 서열특징 :

(A) 길이 : 48 염기쌍

(B) 유형 : 핵산

(C) 가닥수 : 단일

(D) 형태 : 선형

(ii) 분자형태 : 기타 핵산

(xi) 서열 기술 : 서열 77 :

(2) 서열 78에 대한 정보 :

(i) 서열특징 :

(A) 길이 : 21 염기쌍

(B) 유형 : 핵산

(C) 가닥수 : 단일

(D) 형태 : 선형

(ii) 분자형태 : 기타 핵산

(xi) 서열 기술 : 서열 78 :

(2) 서열 79에 대한 정보 :

(i) 서열특징 :

(A) 길이 : 21 염기쌍

(B) 유형 : 핵산

(C) 가닥수 : 단일

(D) 형태 : 선형

(ii) 분자형태 : 기타 핵산

(xi) 서열 기술 : 서열 79 :

(2) 서열 80에 대한 정보 :

(i) 서열특징 :

(A) 길이 : 21 염기쌍

(B) 유형 : 핵산

(C) 가닥수 : 단일

(D) 형태 : 선형

(ii) 분자형태 : 기타 핵산

(xi) 서열 기술 : 서열 80 :

(2) 서열 81에 대한 정보 :

(i) 서열특징 :

(A) 길이 : 35 염기쌍

(B) 유형 : 핵산

(C) 가닥수 : 단일

(D) 형태 : 선형

(ii) 분자형태 : 기타 핵산

(xi) 서열 기술 : 서열 81 :

(2) 서열 82에 대한 정보 :

(i) 서열특징 :

(A) 길이 : 6 염기쌍

(B) 유형 : 핵산

(C) 가닥수 : 단일

(D) 형태 : 선형

(ii) 분자형태 : 기타 핵산

(xi) 서열 기술 : 서열 82 :

(2) 서열 83에 대한 정보 :

(i) 서열특징 :

(A) 길이 : 70 염기쌍

(B) 유형 : 핵산

(C) 가닥수 : 단일

(D) 형태 : 선형

(ii) 분자형태 : 기타 핵산

(xi) 서열 기술 : 서열 83 :

(2) 서열 84에 대한 정보 :

(i) 서열특징 :

(A) 길이 : 72 염기쌍

(B) 유형 : 핵산

(C) 가닥수 : 단일

(D) 형태 : 선형

(ii) 분자형태 : 기타 핵산

(xi) 서열 기술 : 서열 84 :

(2) 서열 85에 대한 정보 :

(i) 서열특징 :

(A) 길이 : 69 염기쌍

(B) 유형 : 핵산

(C) 가닥수 : 단일

(D) 형태 : 선형

(ii) 분자형태 : 기타 핵산

(xi) 서열 기술 : 서열 85 :

(2) 서열 86에 대한 정보 :

(i) 서열특징 :

(A) 길이 : 69 염기쌍

(B) 유형 : 핵산

(C) 가닥수 : 단일

(D) 형태 : 선형

(ii) 분자형태 : 기타 핵산

(xi) 서열 기술 : 서열 85 :

(2) 서열 87에 대한 정보 :

(i) 서열특징 :

(A) 길이 : 69 염기쌍

(B) 유형 : 핵산

(C) 가닥수 : 단일

(D) 형태 : 선형

(ii) 분자형태 : 기타 핵산

(xi) 서열 기술 : 서열 87 :

(2) 서열 88에 대한 정보 :

(i) 서열특징 :

(A) 길이 : 69 염기쌍

(B) 유형 : 핵산

(C) 가닥수 : 단일

(D) 형태 : 선형

(ii) 분자형태 : 기타 핵산

(xi) 서열 기술 : 서열 88 :

(2) 서열 89에 대한 정보 :

(i) 서열특징 :

(A) 길이 : 69 염기쌍

(B) 유형 : 핵산

(C) 가닥수 : 단일

(D) 형태 : 선형

(ii) 분자형태 : 기타 핵산

(xi) 서열 기술 : 서열 89 :

(2) 서열 90에 대한 정보 :

(i) 서열특징 :

(A) 길이 : 69 염기쌍

(B) 유형 : 핵산

(C) 가닥수 : 단일

(D) 형태 : 선형

(ii) 분자형태 : 기타 핵산

(xi) 서열 기술 : 서열 90 :

(2) 서열 91에 대한 정보 :

(i) 서열특징 :

(A) 길이 : 69 염기쌍

(B) 유형 : 핵산

(C) 가닥수 : 단일

(D) 형태 : 선형

(ii) 분자형태 : 기타 핵산

(xi) 서열 기술 : 서열 91 :

(2) 서열 92에 대한 정보 :

(i) 서열특징 :

(A) 길이 : 66 염기쌍

(B) 유형 : 핵산

(C) 가닥수 : 단일

(D) 형태 : 선형

(ii) 분자형태 : 기타 핵산

(xi) 서열 기술 : 서열 92 :

(2) 서열 93에 대한 정보 :

(i) 서열특징 :

(A) 길이 : 70 염기쌍

(B) 유형 : 핵산

(C) 가닥수 : 단일

(D) 형태 : 선형

(ii) 분자형태 : 기타 핵산

(xi) 서열 기술 : 서열 93 :

(2) 서열 94에 대한 정보 :

(i) 서열특징 :

(A) 길이 : 70 염기쌍

(B) 유형 : 핵산

(C) 가닥수 : 단일

(D) 형태 : 선형

(ii) 분자형태 : 기타 핵산

(xi) 서열 기술 : 서열 94 :

(2) 서열 95에 대한 정보 :

(i) 서열특징 :

(A) 길이 : 21 염기쌍

(B) 유형 : 핵산

(C) 가닥수 : 단일

(D) 형태 : 선형

(ii) 분자형태 : 기타 핵산

(xi) 서열 기술 : 서열 95 :

(2) 서열 96에 대한 정보 :

(i) 서열특징 :

(A) 길이 : 30 염기쌍

(B) 유형 : 핵산

(C) 가닥수 : 단일

(D) 형태 : 선형

(ii) 분자형태 : 기타 핵산

(xi) 서열 기술 : 서열 96 :

(2) 서열 97에 대한 정보 :

(i) 서열특징 :

(A) 길이 : 8 염기쌍

(B) 유형 : 핵산

(C) 가닥수 : 단일

(D) 형태 : 선형

(ii) 분자형태 : 기타 핵산

(xi) 서열 기술 : 서열 97 :

(2) 서열 98에 대한 정보 :

(i) 서열특징 :

(A) 길이 : 16 염기쌍

(B) 유형 : 핵산

(C) 가닥수 : 단일

(D) 형태 : 선형

(ii) 분자형태 : 기타 핵산

(xi) 서열 기술 : 서열 98 :

(2) 서열 99에 대한 정보 :

(i) 서열특징 :

(A) 길이 : 8 염기쌍

(B) 유형 : 핵산

(C) 가닥수 : 단일

(D) 형태 : 선형

(ii) 분자형태 : 기타 핵산

(xi) 서열 기술 : 서열 99 :

(2) 서열 100에 대한 정보 :

(i) 서열특징 :

(A) 길이 : 16 염기쌍

(B) 유형 : 핵산

(C) 가닥수 : 단일

(D) 형태 : 선형

(ii) 분자형태 : 기타 핵산

(xi) 서열 기술 : 서열 100 :

(2) 서열 101에 대한 정보 :

(i) 서열특징 :

(A) 길이 : 25 염기쌍

(B) 유형 : 핵산

(C) 가닥수 : 단일

(D) 형태 : 선형

(ii) 분자형태 : 기타 핵산

(xi) 서열 기술 : 서열 101 :

(2) 서열 102에 대한 정보 :

(i) 서열특징 :

(A) 길이 : 30 염기쌍

(B) 유형 : 핵산

(C) 가닥수 : 단일

(D) 형태 : 선형

(ii) 분자형태 : 기타 핵산

(xi) 서열 기술 : 서열 102 :

(2) 서열 103에 대한 정보 :

(i) 서열특징 :

(A) 길이 : 42 염기쌍

(B) 유형 : 핵산

(C) 가닥수 : 단일

(D) 형태 : 선형

(ii) 분자형태 : 기타 핵산

(xi) 서열 기술 : 서열 103 :

(2) 서열 104에 대한 정보 :

(i) 서열특징 :

(A) 길이 : 44 염기쌍

(B) 유형 : 핵산

(C) 가닥수 : 단일

(D) 형태 : 선형

(ii) 분자형태 : 기타 핵산

(xi) 서열 기술 : 서열 104 :

(2) 서열 105에 대한 정보 :

(i) 서열특징 :

(A) 길이 : 42 염기쌍

(B) 유형 : 핵산

(C) 가닥수 : 단일

(D) 형태 : 선형

(ii) 분자형태 : 기타 핵산

(xi) 서열 기술 : 서열 105 :

(2) 서열 106에 대한 정보 :

(i) 서열특징 :

(A) 길이 : 41 염기쌍

(B) 유형 : 핵산

(C) 가닥수 : 단일

(D) 형태 : 선형

(ii) 분자형태 : 기타 핵산

(xi) 서열 기술 : 서열 106 :

(2) 서열 107에 대한 정보 :

(i) 서열특징 :

(A) 길이 : 46 염기쌍

(B) 유형 : 핵산

(C) 가닥수 : 단일

(D) 형태 : 선형

(ii) 분자형태 : 기타 핵산

(xi) 서열 기술 : 서열 107 :

(2) 서열 108에 대한 정보 :

(i) 서열특징 :

(A) 길이 : 45 염기쌍

(B) 유형 : 핵산

(C) 가닥수 : 단일

(D) 형태 : 선형

(ii) 분자형태 : 기타 핵산

(xi) 서열 기술 : 서열 108 :

(2) 서열 109에 대한 정보 :

(i) 서열특징 :

(A) 길이 : 24 염기쌍

(B) 유형 : 핵산

(C) 가닥수 : 단일

(D) 형태 : 선형

(ii) 분자형태 : 기타 핵산

(xi) 서열 기술 : 서열 109 :

(2) 서열 110에 대한 정보 :

(i) 서열특징 :

(A) 길이 : 24 염기쌍

(B) 유형 : 핵산

(C) 가닥수 : 단일

(D) 형태 : 선형

(ii) 분자형태 : 기타 핵산

(xi) 서열 기술 : 서열 110 :

(2) 서열 111에 대한 정보 :

(i) 서열특징 :

(A) 길이 : 46 염기쌍

(B) 유형 : 핵산

(C) 가닥수 : 단일

(D) 형태 : 선형

(ii) 분자형태 : 기타 핵산

(xi) 서열 기술 : 서열 111 :

(2) 서열 112에 대한 정보 :

(i) 서열특징 :

(A) 길이 : 46 염기쌍

(B) 유형 : 핵산

(C) 가닥수 : 단일

(D) 형태 : 선형

(ii) 분자형태 : 기타 핵산

(xi) 서열 기술 : 서열 112 :

(2) 서열 113에 대한 정보 :

(i) 서열특징 :

(A) 길이 : 38 염기쌍

(B) 유형 : 핵산

(C) 가닥수 : 단일

(D) 형태 : 선형

(ii) 분자형태 : 기타 핵산

(xi) 서열 기술 : 서열 113 :

(2) 서열 114에 대한 정보 :

(i) 서열특징 :

(A) 길이 : 34 염기쌍

(B) 유형 : 핵산

(C) 가닥수 : 단일

(D) 형태 : 선형

(ii) 분자형태 : 기타 핵산

(xi) 서열 기술 : 서열 114 :

(2) 서열 115에 대한 정보 :

(i) 서열특징 :

(A) 길이 : 84 염기쌍

(B) 유형 : 핵산

(C) 가닥수 : 단일

(D) 형태 : 선형

(ii) 분자형태 : 기타 핵산

(xi) 서열 기술 : 서열 114:

(2) 서열 116에 대한 정보 :

(i) 서열특징 :

(A) 길이 : 20 아미노산

(B) 유형 : 아미노산

(C) 가닥수 :

(D) 형태 : 선형

(ii) 분자형태 : 펩타이드

(xi) 서열 기술 : 서열 116 :

(2) 서열 117에 대한 정보 :

(i) 서열특징 :

(A) 길이 : 21 아미노산

(B) 유형 : 아미노산

(C) 가닥수 :

(D) 형태 : 선형

(ii) 분자형태 : 펩타이드

(xi) 서열 기술 : 서열 117 :

(2) 서열 118에 대한 정보 :

(i) 서열특징 :

(A) 길이 : 18 아미노산

(B) 유형 : 아미노산

(C) 가닥수 :

(D) 형태 : 선형

(ii) 분자형태 : 펩타이드

(xi) 서열 기술 : 서열 118 :

(2) 서열 119에 대한 정보 :

(i) 서열특징 :

(A) 길이 : 21 아미노산

(B) 유형 : 아미노산

(C) 가닥수 :

(D) 형태 : 선형

(ii) 분자형태 : 펩타이드

(xi) 서열 기술 : 서열 119 :

(2) 서열 120에 대한 정보 :

(i) 서열특징 :

(A) 길이 : 16 아미노산

(B) 유형 : 아미노산

(C) 가닥수 :

(D) 형태 : 선형

(ii) 분자형태 : 펩타이드

(xi) 서열 기술 : 서열 120 :

(2) 서열 121에 대한 정보 :

(i) 서열특징 :

(A) 길이 : 19 아미노산

(B) 유형 : 아미노산

(C) 가닥수 :

(D) 형태 : 선형

(ii) 분자형태 : 펩타이드

(xi) 서열 기술 : 서열 121 :

(2) 서열 122에 대한 정보 :

(i) 서열특징 :

(A) 길이 : 19 아미노산

(B) 유형 : 아미노산

(C) 가닥수 :

(D) 형태 : 선형

(ii) 분자형태 : 펩타이드

(xi) 서열 기술 : 서열 122 :

(2) 서열 123에 대한 정보 :

(i) 서열특징 :

(A) 길이 : 23 아미노산

(B) 유형 : 아미노산

(C) 가닥수 :

(D) 형태 : 선형

(ii) 분자형태 : 펩타이드

(xi) 서열 기술 : 서열 123 :

(2) 서열 124에 대한 정보 :

(i) 서열특징 :

(A) 길이 : 27 아미노산

(B) 유형 : 아미노산

(C) 가닥수 :

(D) 형태 : 선형

(ii) 분자형태 : 펩타이드

(xi) 서열 기술 : 서열 124 :

(2) 서열 125에 대한 정보 :

(i) 서열특징 :

(A) 길이 : 46 아미노산

(B) 유형 : 아미노산

(C) 가닥수 :

(D) 형태 : 선형

(ii) 분자형태 : 펩타이드

(xi) 서열 기술 : 서열 125 :

(2) 서열 126에 대한 정보 :

(i) 서열특징 :

(A) 길이 : 46 염기쌍

(B) 유형 : 핵산

(C) 가닥수 : 단일

(D) 형태 : 선형

(ii) 분자형태 : 기타 핵산

(xi) 서열 기술 : 서열 126 :

(2) 서열 127에 대한 정보 :

(i) 서열특징 :

(A) 길이 : 38 염기쌍

(B) 유형 : 핵산

(C) 가닥수 : 단일

(D) 형태 : 선형

(ii) 분자형태 : 기타 핵산

(xi) 서열 기술 : 서열 127 :

(2) 서열 128에 대한 정보 :

(i) 서열특징 :

(A) 길이 : 34 염기쌍

(B) 유형 : 핵산

(C) 가닥수 : 단일

(D) 형태 : 선형

(ii) 분자형태 : 기타 핵산

(xi) 서열 기술 : 서열 128 :

(2) 서열 129에 대한 정보 :

(i) 서열특징 :

(A) 길이 : 84 염기쌍

(B) 유형 : 핵산

(C) 가닥수 : 단일

(D) 형태 : 선형

(ii) 분자형태 : 기타 핵산

(xi) 서열 기술 : 서열 129 :

(2) 서열 130에 대한 정보 :

(i) 서열특징 :

(A) 길이 : 47 염기쌍

(B) 유형 : 핵산

(C) 가닥수 : 단일

(D) 형태 : 선형

(ii) 분자형태 : 기타 핵산

(xi) 서열 기술 : 서열 130 :

(2) 서열 131에 대한 정보 :

(i) 서열특징 :

(A) 길이 : 47 염기쌍

(B) 유형 : 핵산

(C) 가닥수 : 단일

(D) 형태 : 선형

(ii) 분자형태 : 기타 핵산

(xi) 서열 기술 : 서열 131 :

(2) 서열 132에 대한 정보 :

(i) 서열특징 :

(A) 길이 : 49 염기쌍

(B) 유형 : 핵산

(C) 가닥수 : 단일

(D) 형태 : 선형

(ii) 분자형태 : 기타 핵산

(xi) 서열 기술 : 서열 132 :

(2) 서열 133에 대한 정보 :

(i) 서열특징 :

(A) 길이 : 49 염기쌍

(B) 유형 : 핵산

(C) 가닥수 : 단일

(D) 형태 : 선형

(ii) 분자형태 : 기타 핵산

(xi) 서열 기술 : 서열 133 :

(2) 서열 134에 대한 정보 :

(i) 서열특징 :

(A) 길이 : 50 염기쌍

(B) 유형 : 핵산

(C) 가닥수 : 단일

(D) 형태 : 선형

(ii) 분자형태 : 기타 핵산

(xi) 서열 기술 : 서열 134 :

(2) 서열 135에 대한 정보 :

(i) 서열특징 :

(A) 길이 : 50 염기쌍

(B) 유형 : 핵산

(C) 가닥수 : 단일

(D) 형태 : 선형

(ii) 분자형태 : 기타 핵산

(xi) 서열 기술 : 서열 135 :

(2) 서열 136에 대한 정보 :

(i) 서열특징 :

(A) 길이 : 47 염기쌍

(B) 유형 : 핵산

(C) 가닥수 : 단일

(D) 형태 : 선형

(ii) 분자형태 : 기타 핵산

(xi) 서열 기술 : 서열 136 :

(2) 서열 137에 대한 정보 :

(i) 서열특징 :

(A) 길이 : 47 염기쌍

(B) 유형 : 핵산

(C) 가닥수 : 단일

(D) 형태 : 선형

(ii) 분자형태 : 기타 핵산

(xi) 서열 기술 : 서열 137 :

(2) 서열 138에 대한 정보 :

(i) 서열특징 :

(A) 길이 : 49 염기쌍

(B) 유형 : 핵산

(C) 가닥수 : 단일

(D) 형태 : 선형

(ii) 분자형태 : 기타 핵산

(xi) 서열 기술 : 서열 138 :

(2) 서열 139에 대한 정보 :

(i) 서열특징 :

(A) 길이 : 50 염기쌍

(B) 유형 : 핵산

(C) 가닥수 : 단일

(D) 형태 : 선형

(ii) 분자형태 : 기타 핵산

(xi) 서열 기술 : 서열 139 :

(2) 서열 140에 대한 정보 :

(i) 서열특징 :

(A) 길이 : 50 염기쌍

(B) 유형 : 핵산

(C) 가닥수 : 단일

(D) 형태 : 선형

(ii) 분자형태 : 기타 핵산

(xi) 서열 기술 : 서열 140 :

(2) 서열 141에 대한 정보 :

(i) 서열특징 :

(A) 길이 : 50 염기쌍

(B) 유형 : 핵산

(C) 가닥수 : 단일

(D) 형태 : 선형

(ii) 분자형태 : 기타 핵산

(xi) 서열 기술 : 서열 141 :

(2) 서열 142에 대한 정보 :

(i) 서열특징 :

(A) 길이 : 51 염기쌍

(B) 유형 : 핵산

(C) 가닥수 : 단일

(D) 형태 : 선형

(ii) 분자형태 : 기타 핵산

(xi) 서열 기술 : 서열 142 :

(2) 서열 143에 대한 정보 :

(i) 서열특징 :

(A) 길이 : 51 염기쌍

(B) 유형 : 핵산

(C) 가닥수 : 단일

(D) 형태 : 선형

(ii) 분자형태 : 기타 핵산

(xi) 서열 기술 : 서열 143 :

(2) 서열 144에 대한 정보 :

(i) 서열특징 :

(A) 길이 : 50 염기쌍

(B) 유형 : 핵산

(C) 가닥수 : 단일

(D) 형태 : 선형

(ii) 분자형태 : 기타 핵산

(xi) 서열 기술 : 서열 144 :

(2) 서열 145에 대한 정보 :

(i) 서열특징 :

(A) 길이 : 50 염기쌍

(B) 유형 : 핵산

(C) 가닥수 : 단일

(D) 형태 : 선형

(ii) 분자형태 : 기타 핵산

(xi) 서열 기술 : 서열 145 :

(2) 서열 146에 대한 정보 :

(i) 서열특징 :

(A) 길이 : 51 염기쌍

(B) 유형 : 핵산

(C) 가닥수 : 단일

(D) 형태 : 선형

(ii) 분자형태 : 기타 핵산

(xi) 서열 기술 : 서열 146 :

(2) 서열 147에 대한 정보 :

(i) 서열특징 :

(A) 길이 : 51 염기쌍

(B) 유형 : 핵산

(C) 가닥수 : 단일

(D) 형태 : 선형

(ii) 분자형태 : 기타 핵산

(xi) 서열 기술 : 서열 147 :

(2) 서열 148에 대한 정보 :

(i) 서열특징 :

(A) 길이 : 51 염기쌍

(B) 유형 : 핵산

(C) 가닥수 : 단일

(D) 형태 : 선형

(ii) 분자형태 : 기타 핵산

(xi) 서열 기술 : 서열 148 :

(2) 서열 149에 대한 정보 :

(i) 서열특징 :

(A) 길이 : 51 염기쌍

(B) 유형 : 핵산

(C) 가닥수 : 단일

(D) 형태 : 선형

(ii) 분자형태 : 기타 핵산

(xi) 서열 기술 : 서열 149 :

(2) 서열 150에 대한 정보 :

(i) 서열특징 :

(A) 길이 : 21 염기쌍

(B) 유형 : 핵산

(C) 가닥수 : 단일

(D) 형태 : 선형

(ii) 분자형태 : 기타 핵산

(xi) 서열 기술 : 서열 150 :

(2) 서열 151에 대한 정보 :

(i) 서열특징 :

(A) 길이 : 21 염기쌍

(B) 유형 : 핵산

(C) 가닥수 : 단일

(D) 형태 : 선형

(ii) 분자형태 : 기타 핵산

(xi) 서열 기술 : 서열 151 :

(2) 서열 152에 대한 정보 :

(i) 서열특징 :

(A) 길이 : 21 염기쌍

(B) 유형 : 핵산

(C) 가닥수 : 단일

(D) 형태 : 선형

(ii) 분자형태 : 기타 핵산

(xi) 서열 기술 : 서열 152 :

(2) 서열 153에 대한 정보 :

(i) 서열특징 :

(A) 길이 : 21 염기쌍

(B) 유형 : 핵산

(C) 가닥수 : 단일

(D) 형태 : 선형

(ii) 분자형태 : 기타 핵산

(xi) 서열 기술 : 서열 153 :

(2) 서열 154에 대한 정보 :

(i) 서열특징 :

(A) 길이 : 490 염기쌍

(B) 유형 : 핵산

(C) 가닥수 : 이중

(D) 형태 : 선형

(ii) 분자형태 : 기타 핵산

(xi) 서열 기술 : 서열 154 :

(2) 서열 155에 대한 정보 :

(i) 서열특징 :

(A) 길이 : 24 염기쌍

(B) 유형 : 핵산

(C) 가닥수 : 단일

(D) 형태 : 선형

(ii) 분자형태 : 기타 핵산

(xi) 서열 기술 : 서열 155 :

(2) 서열 156에 대한 정보 :

(i) 서열특징 :

(A) 길이 : 56 염기쌍

(B) 유형 : 핵산

(C) 가닥수 : 단일

(D) 형태 : 선형

(ii) 분자형태 : 기타 핵산

(xi) 서열 기술 : 서열 156 :

(2) 서열 157에 대한 정보 :

(i) 서열특징 :

(A) 길이 : 157 염기쌍

(B) 유형 : 핵산

(C) 가닥수 : 이중

(D) 형태 : 선형

(ii) 분자형태 : 기타 핵산

(xi) 서열 기술 : 서열 157 :

(2) 서열 158에 대한 정보 :

(i) 서열특징 :

(A) 길이 : 100 염기쌍

(B) 유형 : 핵산

(C) 가닥수 : 단일

(D) 형태 : 선형

(ii) 분자형태 : 기타 핵산

(xi) 서열 기술 : 서열 158 :

(2) 서열 159에 대한 정보 :

(i) 서열특징 :

(A) 길이 : 108 염기쌍

(B) 유형 : 핵산

(C) 가닥수 : 단일

(D) 형태 : 선형

(ii) 분자형태 : 기타 핵산

(xi) 서열 기술 : 서열 159 :

(2) 서열 160에 대한 정보 :

(i) 서열특징 :

(A) 길이 : 70 염기쌍

(B) 유형 : 핵산

(C) 가닥수 : 단일

(D) 형태 : 선형

(ii) 분자형태 : 기타 핵산

(xi) 서열 기술 : 서열 160 :

(2) 서열 161에 대한 정보 :

(i) 서열특징 :

(A) 길이 : 66 염기쌍

(B) 유형 : 핵산

(C) 가닥수 : 단일

(D) 형태 : 선형

(ii) 분자형태 : 기타 핵산

(xi) 서열 기술 : 서열 161 :

(2) 서열 162에 대한 정보 :

(i) 서열특징 :

(A) 길이 : 29 염기쌍

(B) 유형 : 핵산

(C) 가닥수 : 단일

(D) 형태 : 선형

(ii) 분자형태 : 기타 핵산

(xi) 서열 기술 : 서열 162 :

(2) 서열 163에 대한 정보 :

(i) 서열특징 :

(A) 길이 : 35 염기쌍

(B) 유형 : 핵산

(C) 가닥수 : 단일

(D) 형태 : 선형

(ii) 분자형태 : 기타 핵산

(xi) 서열 기술 : 서열 163 :

(2) 서열 164에 대한 정보 :

(i) 서열특징 :

(A) 길이 : 22 염기쌍

(B) 유형 : 핵산

(C) 가닥수 : 단일

(D) 형태 : 선형

(ii) 분자형태 : 기타 핵산

(xi) 서열 기술 : 서열 164 :

(2) 서열 165에 대한 정보 :

(i) 서열특징 :

(A) 길이 : 22 염기쌍

(B) 유형 : 핵산

(C) 가닥수 : 단일

(D) 형태 : 선형

(ii) 분자형태 : 기타 핵산

(xi) 서열 기술 : 서열 165 :

(2) 서열 166에 대한 정보 :

(i) 서열특징 :

(A) 길이 : 35 염기쌍

(B) 유형 : 핵산

(C) 가닥수 : 단일

(D) 형태 : 선형

(ii) 분자형태 : 기타 핵산

(xi) 서열 기술 : 서열 166 :

(2) 서열 167에 대한 정보 :

(i) 서열특징 :

(A) 길이 : 35 염기쌍

(B) 유형 : 핵산

(C) 가닥수 : 단일

(D) 형태 : 선형

(ii) 분자형태 : 기타 핵산

(xi) 서열 기술 : 서열 167 :

(2) 서열 168에 대한 정보 :

(i) 서열특징 :

(A) 길이 : 27 염기쌍

(B) 유형 : 핵산

(C) 가닥수 : 단일

(D) 형태 : 선형

(ii) 분자형태 : 기타 핵산

(xi) 서열 기술 : 서열 168 :

(2) 서열 169에 대한 정보 :

(i) 서열특징 :

(A) 길이 : 21 염기쌍

(B) 유형 : 핵산

(C) 가닥수 : 단일

(D) 형태 : 선형

(ii) 분자형태 : 기타 핵산

(xi) 서열 기술 : 서열 169 :

(2) 서열 170에 대한 정보 :

(i) 서열특징 :

(A) 길이 : 30 염기쌍

(B) 유형 : 핵산

(C) 가닥수 : 단일

(D) 형태 : 선형

(ii) 분자형태 : 기타 핵산

(xi) 서열 기술 : 서열 170 :

(2) 서열 171에 대한 정보 :

(i) 서열특징 :

(A) 길이 : 41 염기쌍

(B) 유형 : 핵산

(C) 가닥수 : 단일

(D) 형태 : 선형

(ii) 분자형태 : 기타 핵산

(xi) 서열 기술 : 서열 171 :

(2) 서열 172에 대한 정보 :

(i) 서열특징 :

(A) 길이 : 24 염기쌍

(B) 유형 : 핵산

(C) 가닥수 : 단일

(D) 형태 : 선형

(ii) 분자형태 : 기타 핵산

(xi) 서열 기술 : 서열 172 :

(2) 서열 173에 대한 정보 :

(i) 서열특징 :

(A) 길이 : 27 염기쌍

(B) 유형 : 핵산

(C) 가닥수 : 단일

(D) 형태 : 선형

(ii) 분자형태 : 기타 핵산

(xi) 서열 기술 : 서열 173 :

(2) 서열 174에 대한 정보 :

(i) 서열특징 :

(A) 길이 : 27 염기쌍

(B) 유형 : 핵산

(C) 가닥수 : 단일

(D) 형태 : 선형

(ii) 분자형태 : 기타 핵산

(xi) 서열 기술 : 서열 174 :

(2) 서열 175에 대한 정보 :

(i) 서열특징 :

(A) 길이 : 27 염기쌍

(B) 유형 : 핵산

(C) 가닥수 : 단일

(D) 형태 : 선형

(ii) 분자형태 : 기타 핵산

(xi) 서열 기술 : 서열 175 :

(2) 서열 176에 대한 정보 :

(i) 서열특징 :

(A) 길이 : 24 염기쌍

(B) 유형 : 핵산

(C) 가닥수 : 단일

(D) 형태 : 선형

(ii) 분자형태 : 기타 핵산

(xi) 서열 기술 : 서열 176 :

(2) 서열 177에 대한 정보 :

(i) 서열특징 :

(A) 길이 : 24 염기쌍

(B) 유형 : 핵산

(C) 가닥수 : 단일

(D) 형태 : 선형

(ii) 분자형태 : 기타 핵산

(xi) 서열 기술 : 서열 177 :

(2) 서열 178에 대한 정보 :

(i) 서열특징 :

(A) 길이 : 27 염기쌍

(B) 유형 : 핵산

(C) 가닥수 : 단일

(D) 형태 : 선형

(ii) 분자형태 : 기타 핵산

(xi) 서열 기술 : 서열 178 :

(2) 서열 179에 대한 정보 :

(i) 서열특징 :

(A) 길이 : 27 염기쌍

(B) 유형 : 핵산

(C) 가닥수 : 단일

(D) 형태 : 선형

(ii) 분자형태 : 기타 핵산

(xi) 서열 기술 : 서열 179 :

(2) 서열 180에 대한 정보 :

(i) 서열특징 :

(A) 길이 : 27 염기쌍

(B) 유형 : 핵산

(C) 가닥수 : 단일

(D) 형태 : 선형

(ii) 분자형태 : 기타 핵산

(xi) 서열 기술 : 서열 180 :

(2) 서열 181에 대한 정보 :

(i) 서열특징 :

(A) 길이 : 26 염기쌍

(B) 유형 : 핵산

(C) 가닥수 : 단일

(D) 형태 : 선형

(ii) 분자형태 : 기타 핵산

(xi) 서열 기술 : 서열 181 :

(2) 서열 182에 대한 정보 :

(i) 서열특징 :

(A) 길이 : 22 염기쌍

(B) 유형 : 핵산

(C) 가닥수 : 단일

(D) 형태 : 선형

(ii) 분자형태 : 기타 핵산

(xi) 서열 기술 : 서열 182 :

(2) 서열 183에 대한 정보 :

(i) 서열특징 :

(A) 길이 : 34 염기쌍

(B) 유형 : 핵산

(C) 가닥수 : 단일

(D) 형태 : 선형

(ii) 분자형태 : 기타 핵산

(xi) 서열 기술 : 서열 183:

(2) 서열 184에 대한 정보 :

(i) 서열특징 :

(A) 길이 : 7 아미노산

(B) 유형 : 아미노산

(C) 가닥수 :

(D) 형태 : 선형

(ii) 분자형태 : 펩타이드

(ix) 특징 :

(A) 명칭/키 : misc 특징

(B) 기타 정보 :

/주 = “2 위치에 있는 아미노산은 Ala, Ser, Gly, Met 또는 Gln 이다”

(ix) 특징 :

(A) 명칭/키 : misc 특징

(B) 기타 정보 :

/주 = “7 위치에 있는 아미노산은 Glu 또는 Lys 이다”

(xi) 서열 기술 : 서열 184 :

(2) 서열 185에 대한 정보 :

(i) 서열특징 :

(A) 길이 : 6 아미노산

(B) 유형 : 아미노산

(C) 가닥수 :

(D) 형태 : 선형

(ii) 분자형태 : 펩타이드

(ix) 특징 :

(A) 명칭/키 : misc 특징

(B) 기타 정보 :

/주 = “6 위치에 있는 아미노산은 Glu 또는 Asp 이다”

(xi) 서열 기술 : 서열 185 :

(2) 서열 186에 대한 정보 :

(i) 서열특징 :

(A) 길이 : 7 아미노산

(B) 유형 : 아미노산

(C) 가닥수 :

(D) 형태 : 선형

(ii) 분자형태 : 펩타이드

(xi) 서열 기술 : 서열 186 :

(2) 서열 187에 대한 정보 :

(i) 서열특징 :

(A) 길이 : 13 아미노산

(B) 유형 : 아미노산

(C) 가닥수 :

(D) 형태 : 선형

(ii) 분자형태 : 펩타이드

(ix) 특징 :

(A) 명칭/키 : misc 특징

(B) 기타 정보 :

/주 = “2 위치에 있는 아미노산은 Ile, Thr 또는 Ser 이다”

(xi) 서열 기술 : 서열 187 :

(2) 서열 188에 대한 정보 :

(i) 서열특징 :

(A) 길이 : 9 아미노산

(B) 유형 : 아미노산

(C) 가닥수 :

(D) 형태 : 선형

(ii) 분자형태 : 펩타이드

(xi) 서열 기술 : 서열 188 :

(2) 서열 187에 대한 정보 :

(i) 서열특징 :

(A) 길이 : 9 아미노산

(B) 유형 : 아미노산

(C) 가닥수 :

(D) 형태 : 선형

(ii) 분자형태 : 펩타이드

(ix) 특징 :

(A) 명칭/키 : misc 특징

(B) 기타 정보 :

/주 = “1 위치에 있는 아미노산은 Lys 또는 Arg 이다”

(xi) 서열 기술 : 서열 189 :

(2) 서열 190에 대한 정보 :

(i) 서열특징 :

(A) 길이 : 15 아미노산

(B) 유형 : 아미노산

(C) 가닥수 :

(D) 형태 : 선형

(ii) 분자형태 : 펩타이드

(xi) 서열 기술 : 서열 190 :

(2) 서열 191에 대한 정보 :

(i) 서열특징 :

(A) 길이 : 332 아미노산

(B) 유형 : 아미노산

(C) 가닥수 :

(D) 형태 : 선형

(ii) 분자형태 : 단백질

(vi) 기원 :

(A) 생물 : 호모 사피엔스

(xi) 서열 기술 : 서열 191 :

(2) 서열 192에 대한 정보 :

(i) 서열특징 :

(A) 길이 : 1086 염기쌍

(B) 유형 : 핵산

(C) 가닥수 : 이중

(D) 형태 : 선형

(ii) 분자형태 : cDNA 내지 mRNA

(vi) 기원 :

(A) 생물 : 호모 사피엔스

(xi) 서열 기술 : 서열 192 :

(2) 서열 193에 대한 정보 :

(i) 서열특징 :

(A) 길이 : 7 아미노산

(B) 유형 : 아미노산

(C) 가닥수 :

(D) 형태 : 선형

(ii) 분자형태 : 펩타이드

(xi) 서열 기술 : 서열 193 :

(2) 서열 194에 대한 정보 :

(i) 서열특징 :

(A) 길이 : 1663 염기쌍

(B) 유형 : 핵산

(C) 가닥수 : 이중

(D) 형태 : 선형

(ii) 분자형태 : cDNA 내지 mRNA

(vi) 기원 :

(A) 생물 : 라투스 노르베기쿠스

(H) 세포주 : McA-RH8994

(xi) 서열 기술 : 서열 194 :

(2) 서열 195에 대한 정보 :

(i) 서열특징 :

(A) 길이 : 861 염기쌍

(B) 유형 : 핵산

(C) 가닥수 : 이중

(D) 형태 : 선형

(ii) 분자형태 : cDNA 내지 mRNA

(vi) 기원 :

(A) 생물 : 호모 사피엔스

(F) 조직 유형 : 간

(xi) 서열 기술 : 서열 195 :

(2) 서열 196에 대한 정보 :

(i) 서열특징 :

(A) 길이 : 1267 염기쌍

(B) 유형 : 핵산

(C) 가닥수 : 이중

(D) 형태 : 선형

(ii) 분자형태 : cDNA 내지 mRNA

(vi) 기원 :

(A) 생물 : 호모 사피엔스

(F) 조직 형태 : 간

(xi) 서열 기술 : 서열 196 :

(2) 서열 197에 대한 정보 :

(i) 서열특징 :

(A) 길이 : 549 염기쌍

(B) 유형 : 핵산

(C) 가닥수 : 이중

(D) 형태 : 선형

(ii) 분자형태 : 합성 DNA

(xi) 서열 기술 : 서열 197 :

Claims (5)

1. 하기 (1) 내지 (6)중 어느 하나에 개시된 단백질의 아미노산 서열을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 DNA로 원핵 생물 세포 또는 포유동물 세포를 형질전환시키고, 이 원핵생물 세포 또는 포유동물 세포를 배양하며 또 생성된 TPO 활성을 갖는 단백질을 분리 및 정제하는 것을 포함하는 하기 (1) 내지 (6)중 어느 하나에 개시된 TPO 활성을 갖는 단백질의 제조방법: (1) 서열 191에 개시된 아미노산 서열중 제 1 번 내지 제 332번의 아미노산 서열을 갖는 단백질, (2) 서열 191에 개시된 아미노산 서열중 제 1 번 내지 제332번의 아미노산 서열을 포함하는 단백질, (3) 서열 191에 개시된 아미노산 서열중 제 1 번 내지 제 231번의 아미노산 서열을 갖는 단백질, (4) 서열 191에 개시된 아미노산 서열중 제 1 번 내지 제 231번의 아미노산 서열을 포함하는 단백질, (5) 서열 191에 개시된 아미노산 서열중 제 1 번 내지 제 163번의 아미노산 서열을 갖는 단백질, (6) 서열 191에 개시된 아미노산 서열중 제 1 번 내지 제 163번의 아미노산 서열을 포함하는 단백질.
2. 제1항에 있어서, 원핵생물 세포가 세균인 방법.
3. 제2항에 있어서, 세균이 대장균인 방법.
4. 제1항에 있어서, 포유동물 세포가 CHO(Chinese Hamster Ovary) 세포인 방법.
5. 서열 191의 아미노산 서열 1-332, 1-231 및 1-163으로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 DNA로써 원핵생물 세포 또는 포유동물 세포를 형질전환시키고; 상기 원핵생물 세포 또는 포유동물 세포를 배양하며; 또 생성된 TPO 활성을 갖는 단백질을 분리 및 정제하는 것을 포함하는 TPO 활성을 갖는 단백질의 제조방법.