NO323195B1 - Protein som har TPO aktivitet, DNA kodende for nevnte protein, fremstillingsmetoder, vertceller, farmasoytiske sammensetinger, anvendelser og antistoff - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelsen vedrører nye proteiner som spesifikt stimulerer eller for-

bedrer proliferasjon og differensiering av megakarocytforløpercelle. Oppfinnelsen vedrører videre DNA sekvenser som koder for nevnte proteiner, fremgangsmåte for å fremstille nevnte proteiner, samt vertceller som er transformert eller transfektert med nevnte DNA sekvens. Farmasøytiske sammensetninger omfattende nevnte protein er og en del av foreliggende oppfinnelse. Videre omfatter oppfinnelsen også anvendelsen av nevnte polypeptid samt antistoff som spesifikt binder nevnte proteiner.

Megakarocyter er store cytoplasma-rike mange kjernede celler som fremstiller blod-

plater og som man hovedsakelig finner i benmarg. Megakarocyter har opprinnelse i en pluripotent hematopoetisk stamcelle i benmarg. En primitiv pluripotent stamcelle differensierer i en viss grad til megakarocytforløpercelle, som er bundet til mega-karocytlinjen. Megakarocytforløpercellene prolifererer og differensierer til megakarocyter. Megakarocyter gjennomgår videre polyploidisering og cytoplasmisk modning og til slutt frigjøres anukleære cytoplasmiske fragmenter, nemlig blodplater i sirkulasjons-systemet. 2 til 4000 blodplater blir gjennomsnittlig dannet fra en moden megakarocyt.

Selv om blodplatedannelsesmekanismen fremdeles er uklar på mange punkter, erkjennes det at megakarocytene er typisk lokalisert på albuminaloverflaten av sinusendotelium i benmarg og produserer cytoplasmiske prosesser som strekker seg i sinusoiden der de gjennomgår fragmentering av blodplater.

Det er mange uklare punkter når det gjelder mekanismen for å generere blodplater selv om det er sannsynlig at megakarocytene er lokalt til stede i det dermale laget av huden av den venøse sinus i benmargen og at cytoplasma kommer gjennom dermalhud og resulterer i en tråd-lignende projeksjon på den indre veggen av venøs sinus hvorved blodplatene blir tømt.

Det har vært antydet at det er en spesifikk funksjon for produksjon og kontroll av mega-karocythematopoesis blodplateproduksjon. I friske mennesker og dyr, blir antallet effektive blodplater opprettholdt selv om det er kjent at, for eksempel ved administrer-

ing av et anti-plate antistoff til friske dyr, avtar antall blodplater raskt, og de begynner å øke temporært mer enn vanlig, og ender til slutt tilbake til normalt nivå. Også innenfor det kliniske feltet har det vært kjent at en nedgang i antall blodplater trombocytopeni og trombocytose selv når antall erytrocytter og leukocytter er ved et normalt nivå.

Den mest viktige funksjonen for en blodplate er produksjon av en trombus i en hemo-statisk mekanisme. Dersom den hemostatiske mekanismen ikke fungerer riktig på grunn av nedgang i antall blodplater, resulterer dette i en tendens mot hemostase. Tilstedeværelse av en spesifikk regulatorisk mekanisme har vært foreslått med hensyn på megakaryocytopoiese og trombopoiese. Blodplater blir opprettholdt i effektive antall i friske mennesker og normale dyr. Det er imidlertid kjent at når et anti-blodplateanti-stoff ble administrert til et normalt dyr, avtar bare antall blodplater raskt i løpet av en kort tidsperiode, og starter å øke deretter og overskrider temporører det normale nivå, men vender til slutt tilbake til det normale nivå. Det er også kjent innenfor det kliniske feltet at en nedgang i antall blodplater (trombocytopeni) eller en økning i antallet (trombocytose) foregår selv under normalt antall erytrocyter og leukocyter. Til dags dato har det imidlertid ikke blitt rapportert suksess når det gjelder isolering og identifisering av en spesifikk regulatorisk faktor involvert i plateproduksjon (for eksempel med likhet i det tilfellet med erytropoietin i erytrocytdannelse).

Den viktigste funksjonen av blodplatene er dannelse av blodkoagel i den hemostatiske mekanismen. Blødningstendenser forekommer når normalfunksjon av den hemostatiske mekanismen forringes ved trombocytopeni. Innenfor feltet radioterapi og kjemoterapi av cancer, er trombocytopeni forårsaket av benmargsundertrykkelse en dødelig komplika-sjon, og blodplatetransfusjon blir anvendt på slike pasienter for å forhindre blødnings-tendens. Blodplatetransfusjon ble også anvendt til pasienter etter benmargstransplantasjon eller av aplastisk anemi.

Blodplater for anvendelse i slik blodplatetransfusjon blir fremstilt ved blodplateferese fra blod i friske blodgivere, men slike blodplater for transfusjonsbruk har en kort holdbarhet og en mulighet for å forårsake kontaminering ved bakteriell infeksjon. Blodplatetransfusjon har også en mulig fare for å eksponere pasientene til alvorlig virus slik som human immunsvikt virus (HIV) eller forskjellige hepatittvirus, inkludert antistoffer spesifikke for en hovedhistokompatibilitetsantigen (HLA) eller transfuserte blodplater eller forårsake poding versus vertssykdom (GVHD) på grunn av kontaminerte lymfo-cytter i blodplatene for transfusjonsanvendelse.

Som en konsekvens vil det være av stor fordel dersom den interne blodplatedannelsen kan bli stimulert i trombocytopene pasienter, og samtidig kan deres blodplate transfu-sjonstendens bli redusert. Dersom i tillegg trombocytopeni i cancerpasienter som gjennomgår radioterapi eller kjemoterapi kan korrigeres eller forhindres, kan slike behandlinger gjøres mer sikre, intensiteten i behandlingen kan sannsynligvis bli øket, og ytterligere forbedring av anti-cancereffekter kan forventes.

Av disse årsaker er det blitt gjort en lang rekke intensive studier på isolering og identifisering av spesifikke regulatoriske faktorer som er involvert i regulering av megakaryocyt og blodplateproduksjon. Ifølge in vitro studier, er regulatoriske faktorer som styrer megakaryocytopoese grovt inndelt i følgende to faktorer (kfr. Williams et al., J. Cell. PhysioL, vol. 110, s. 101-104 (1982). Megakaryocyt koloni stimulerende faktor (Meg-CSF) er en regulatorisk faktor som stimulerer proliferasjon og differensiering av CFU-MK for å danne megakaryocyt kolonier i et halv-fast dyrkingsmedium. Den andre regulatoriske faktoren, kaldt megakaryocytpotensierende faktor (Meg-Pot), megakaryocyt stimulerende faktor, trombopoese stimulerende faktor eller lignende virker hovedsakelig på umodne eller modne megakaryocyter og forbedrer dermed differensiering og modning. Meg-Pot er påvisbar i kombinasjon med Meg-CSF aktivitet i noen tilfeller. Siden i tillegg platetall øker når serum eller plasma samlet fra eksperimentelt induserte trombocytopeniske dyr blir administrert til andre normaldyr, har det blitt antydet at det er en humoral faktor, kalt trombopoietin (TPO) som har evne til å fremme blodplate produksjon in vivo.

I de senere år har noen cytokiner hvis gener har blitt klonet, blitt undersøkt for deres evne til å stimulere megakaryocytopoiese og trombopoiese. Humane IL-3 stumulerte dannelse av humane megakaryocytkolonier (Bruno et al., Exp. Hematol., vol. 16, s. 371-377, 1988) og i det minste i aper, øket platetall (Donahue et al., Science vol. 241, s. 1820,1988). Siden imidlertid IL-3 er en faktor som utøver sine effekter på proliferasjon . og differensiering av alle hematopoietiske celler, kan den bli adskilt fra spesifikke regulatoriske faktorer som kontrollerer megakaryocytopoiese og blodplateproduksjon. Human IL-6 viste ikke Meg-CSF aktivitet, men virket på umodne megakaryocyter og forbedret dermed deres differensiering til modne megakaryocyter (Williams et al., Exp. Hematol., vol. 18, s. 69,1990). In vivo administrering av IL-6 induserte blodplateproduksjon og fremmet både modning og skiftet til høyere ploiditet av benmarg megakaryocyter i primater, men forårsaket også sideeffekter slik som reduksjon av kroppsvekt, induksjon av akuttfaseprotein (Asano et al., Blood, vol. 75, s. 1602 -1605, 1990; Stahl et al., Blood, vol. 78, s. 1467-1475,1991). Human BL-11 viste ingen Meg-SCF aktivitet, men utviste Meg-Pot aktivitet og fremmet blodplateproduksjon i mus (Neben et al., Blood, vol. 81, s. 901-908,1993). I tillegg øket human ILF signifikant blodplatetall i primater (Mayer et al., Blood, vol. 81, s. 3226-3233,1993), men dens in vitro virkning på megakaryocyter var svak (Burstein et al., J. Cell. PhysioL, vol. 153, s. 305-312,1992).

Selv klinisk anvendelse av disse cytokinene som blodplateøkende faktorer er forventet, er deres funksjon ikke spesifikk for megakaryocytbinding og de forårsaker sideeffekter. Utvikling av en blodplate økende faktor som er spesifikk for megakaryocyt-blodplate-systemet og som sørger for få sideeffekter har vært ønsket innenfor det kliniske feltet. Meg-SCF, Meg-pot eller TPO aktivitet har vært funnet i serum, plasma eller urin fra trombocytopene pasienter eller dyr, eller i dyrkningssupernatant av visse humane dyrkede cellelinjer. Om disse aktivitetene skyldes tilstedeværelse av en enkelt faktor eller en kombinasjon av flere faktorer eller om de er forskjellige fra kjente cytokiner er for tiden ukjent.

Hoffman et al,, har funnet at sera fra pasienter med aplastisk anemi og amegakaryo-cytisk trombocytofenipurpura inneholdt en Meg-SCF aktivitet som signifikant øket human megakaryocytkolonidannelse (Hoffman et al., N. Eng. J. Med., vol. 305, s. 553-538, 1981). Deretter har Mazur et al., rapportert at Meg-CSF aktivitet som er tilstede i serum av aplastiske anemipasienter var forskjellig fra IL-3 og GM-CSF (Mazur et al., Blood, vol. 76, s. 290-297,1990). Tilsvarende Meg-CSF aktivitet har blitt funnet i sera fra cancerpasienter som mottar intensiv cytotoksisk kjemoterapi og benmarg-transplan-tatpasienter (Mazur et al., Exp. Hematol., vol. 12, s. 624-628,1984; de Alarcon and Schmeider, Prog. Clin. BIo. Res., vol. 215. s. 335-340,1986). Hoffman et al., har rapportert at Meg-CSF med en tilsynelatende molekylvekt på 46.000 ble renset fra plasma av pasienter med hypomegakaryocytisk trombocytopeni (Hoffman et al., J. Clin. Invest., vol. 75, s. 1174-1182, 1985), men det ble funnet ved ytterligere studier at materialet ikke var ved et renhetsnivå som muliggjør nøyaktig aminosyresekvensering (Hoffman, Blood, vol. 74, s. 1196-1212, 1989). En substans som har TPO- lignende aktivitet som forbedrer innkorporering av <75>se- selenometionin i nylig dannede blodplater i mus har blitt spesielt renset fra plasma av trombocytopenepasienter eller urin fra pasienter med iodopatisk trombocytopenipurpura (ITP), og tilsynelatende molekylvekt på plasmaavledet faktor ble bestemet å være 40.000 (Grossi et al., Hematologica, vol. 72, s. 291-295,1987; Vannucchi et al., Leukemia, vol. 2, s. 236-240,1988).

Meg-CSF og TPO-lignende aktiviteter har også blitt påvist i urinprøver fra pasienter med aplastisk anemi og alvorlig ITP (Kawakita et al., Br. J. Haematol., vol. 48, s. 609-615,1981; Kawakita et al., Blood, vol. 556-560,1983). Kawakita et al. har videre rapportert at Meg-CSF aktivitet som finnes i urinekstrakt fra aplastiske anemipasienter viste en tilsynelatende molekylvekt på 45.000 ved gelfiltrering under dissosiasjons-betingelser (Kawakita et al., Br. J. Haematol., vol. 62, s. 715-722,1986). Erikson-Miller et al., har også rapportert på rensing av Meg-SCF fra tilsvarende urinprøve, og ingen informasjon på struktur (Erikson-Miller et al., "Blood Cell Growth Factors: their present and future use in hematology and oncology" ed. by Murphy, AlphaMed Press, Dayton, Ohio, s. 204-220,1992). Turner et al. har renset en megakaryocytstimulerende faktor (MSF) som har Meg-SCF aktivitet fra urin av benmargstransplanterte pasienter og klonet genet (Turner et al., Blood, vol. 78, s. 1106 279a, (abstr., supple. 1)). Denne MSF har en molekylvekt fra 28.000 til 35.000. Identiteten til denne faktoren med Meg-CSF som er påvist i serum og plasmaprøver av trombocytopenepasienter og dens blodplate-økende aktivitet gjenstår å bli utledet.

En substans som har en TPO-lignende aktivitet med en molekylvekt på 32.000 har blitt renset fra dyrkningssupernatanten av en human embryonal nyre-avledet cellelinje (HEK celler) og dens biologiske og biokjemiske egenskaper har vært under omfattende under-søkelse, men dens struktur er fremdeles ukjent (McDOnald et al., J. Lab. Clin. Med., vol. 106, s. 162-174,1985; McDonald, Int. J. Cell. Cloning, vol. 7, s. 139-155,1989). Andre forskere har rapportert at hovedaktiviteten i kondisjonert medium av HEK celler, som forbedrer megakaryocyt modning in vitro, skyldes kjente cytokiner, nemlig IL-6 og EPO (Withy et al., J. Cell. PhysioL vol. 15, s. 362-372,1992).

Med hensyn på faktorer som er avledet fra dyr, har Evatt et al. rapportert at en TPO-lignende aktivitet som forbedrer innkorporering av ^Se-selenometionin inn i nylig dannede plater i kaniner og mus ble funnet i plasma av trombocytopene kaniner indusert ved antiblodplateseruminjeksjon (Evatt et al., J. Lab. Clin. Med., vol. 83, s. 364-371, 1974). I tillegg til dette har et antall tilsvarende studier blitt rapportert fra 1960 til 1970 (for eksempel Odell et al., Proe. Soc. Biol. Med., vol. 108, s. 428-431,1961; Evatt and Levin, J. Clin. Invest., vol. 48, s. 1615-1626,1969; Harker, Am. J. PhysioL vol. 218, s. 1376-1380,1970; Shreiner and Levin, J. Clin. Invest., vol. 49 s. 1709-1713,1970; og Penington, Br. Med. J., vol. 1, s. 606-608,1070). Evatt et al., and Hill and Levin har gjennomført partiell rensing av en TPO-lignende aktivitet fra plasma av trombocytopene kaniner (Evatt et al., Blood, vol, 54, s. 377-388,1979; Hill and Levin, Exp. Hematol., vol. 14, s. 752-759,1986). Deretter ble rensing av denne faktor fortsatt, og registrering av en aktivitet for å bedre differensiering av modning av megakaryocytene in vitro, nemlig Meg-Pot aktiviteten, for å vise at denne aktiviteten har en tilsynelatende molekylvekt på 40.000 til 46.000 når det ble bestemt ved gelfiltrering (Keller et al., Exp. Hematol., vol. 16, s. 262- 267,1988; Hill et al., Exp. Hematol., vol.20m s. 354-360, 1992). Siden IL-6 aktiviteten ikke var påvisbar i plasma av kaniner med alvorlig akutt trombocytopeni indusert ved antiblodplateserumadministrering, ble det hevdet at denne TPO-lignende aktiviteten skyldes en faktor som er forskjellig fra IL-6 (Hill et al., Blood, vol. 80, s. 346-351,1992).

Tayrien og Rosenberg har også renset en faktor som har en molekylvekt på 15.000 fra trombocytopen kaninplasma og dyrkningssupernatant fra HEK celler, som stimulerer produksjon av platefaktor 4 i en rotte megakaryocytisk cellelinje, men ingen informasjon når det gjelder dens struktur (Tayrien and Rosenberg, J. Biol. Chem., vol. 262, s. 3262-3268, 1987).

I tillegg har Nakeff runnet en Meg-CSF aktivitet i serum av trombocytopene mus indusert ved anti-plateadministrering (Nakeff, "Experimental Hematology Today" ed. by Baum and Ledney, Springer-Verlag, NY s, 111-123,1977). På en annen side forbedret sera fra trombocytopene kaniner modning av megakaryocyter (Keller et al., Exp. Hematol., vol. 16, s. 262-267,1988; Hill et al., Exp. Hematol., vol. 19, s. 903- 907, 1989) og stimulerte morfologisk endring av megakaryocyter til blodplater (Leven and Yee, Blood, vol. 69, s.1046-1052,1989), men hadde ingen påvisbar Meg-CSF aktivitet.

Miura et al. har påvist en Meg-CSF aktivitet i plasma fra rotter som var gjort trombocytopene ved subletal fullkroppsbestrålning (Miura et al., Blood, vol. 63, s. 1060-1066, 1984), og hevder at induksjon av Meg-CSF aktivitet in vivo er beslektet med nedgang i megakaryocyter, men ikke nedgang i blodplater, fordi denne aktiviteten ikke endres ved blodplatetransfusjon (Miura et al., Exp. Hematol., vol. 16, s. 139-144,1988). Mazur og South har påvist en Meg-CSF aktivitet i serum av subletalt betrålte hunder og rappor-terte at denne faktor har en tilsynelatende molekylvekt på 175.000 når den ble målt ved gelfiltrering (Mazur and South, Exp. Hematol., vol. 13, s. 1164-1172,1985). I tillegg til det ovennevnte har serum-, plasma- og urin-avledede faktorer blitt rapportert av andre forskere for eksempel av Straneva et al. (Straneva et al., Exp. Hematol., vol. 15, s. 657-663, 1987).

Som beskrevet over har således forskjellige aktiviteter som stimulerer megakaryocytopoiese og trombopoiese blitt funnet i biologiske prøver avledet fra trombocytopene pasienter og dyr, men isolering av disse faktorene, deres biokjemiske og biologiske identifikasjon og bestemmelse av deres karakteristiske trekk har ikke blitt oppnådd på grunn av de ekstremt små mengdene i naturlige kilder slik som blod og urin.

Målene med foreliggende oppfinnelse er å isolere et TPO protein fra naturlige kilder og identifisere det, TPO proteinet som har en aktivitet som stimulerer eller øker blodplateproduksjonen in vivo og/eller å forbedre proliferasjon og differensiering av megakaryo-cytforløperceller (heretter referert til som "TPO aktivitet"); å isolere et gen som koder for TPO proteinet og skaffe tilveie en fremgangsmåte for produksjon av nevnte protein i en homogen kvalitet og i en stor mengde med rekombinante DNA teknikker. Suksess for å nå slike mål vil føre til utbytting eller frekvens reduksjon av den for tiden anvendte blodplatetransfusjon, og et slikt nytt protein vil også bli anvendt for behandling og diagnose av blodplateforstyrrelser.

Foreliggende oppfinnelse angår derfor (i) en renset og isolert DNA sekvens som koder for et protein som har TPO aktivitet, som blir valgt fra gruppen bestående av:

(a) DNA sekvenser som er vist i SEQ JD NO: 194,195 og 196, eller komplementære tråder derav; og (b) DNA sekvenser som hybridiserer under strenge betingelser til DNA sekvensene som definert i (a) eller fragmenter derav; og (c) DNA sekvenser som vil hybridisere til DNA sekvensen som er definert i (a) og (b), men for degenerering av den genetiske koden, (ii) en fremgangsmåte for fremstilling av et protein som har TPO aktivitet, og som omfatter trinnet med: dyrking under egnede ernæringsbetingelser, prokaryotiske eller eukaryotiske vertsceller transformert eller transfektert med nevnte DNA sekvens på en måte som muliggjør ekspresjon av proteinet; og isolering av det ønskede proteinproduktet oppnådd ved ekspresjon av nevnte DNA sekvens, og (iii) et proteinprodukt oppnådd ved ekspresjon av en prokaryotisk eller eukaryotisk vertscelle av nevnte DNA sekvens.

Foreliggende oppfinnelse angår videre en farmasøytisk sammensetning som omfatter en effektiv mengde av nevnte protein som har TPO aktivitet, og en fremgangsmåte for å behandle blodplateforstyrrelser, særlig trombocytopeni, omfatter administrering av nevnte protein til pasienter som har forstyrrelsene. Figur 1 viser sephacryl S-200HR gelfiltreringskromatografi av fenylsepharose 6 FF/LS F2 avledet fra XRP. Figur 2 viser Capcell Pak Cl reversfase kromatografi av YMC- pack CN-AP TPO-aktiv fraksjon avledet fra lavmolekyl TPO prøve (Sephacryl S-200HR F3) av XRP. Figur 3 viser en SDS-PAGE analyse av Capcell Pak Cl TPO-aktiv fraksjon (FA) fra lavmolekyl TPO prøve av XRP. Figur 4 viser peptidkart på C18 reversfase HPLC av rotte TPO isolert ved SDS-PAGE. Peptidfragmentet ble oppnådd ved systematisk hydrolyse med tre proteaser.

Figur 5 viser TPO aktivitet avledet fra XRP i rotte CFU-MK analysesystemet.

Figur 6 viser en konstruksjon av ekspresjonsvektor pEF18S.

Figur 7 viser TPO aktivitet i dyrkningssupernatant av COSI celler i hvilken pEF218S-A26 ble innført i rotte CFU-MK analysesystemet. Figur 8 viser TPO aktivitet i dyrkningssupernatant av COSI celler i hvilken pEF18S-HL34 ble innført i rotte CFU-MK analysesystemet. Figur 9 viser TPO aktivitet i dyrkningssupernatant av COSI celler i hvilken pHTl-231 ble innført i rotte CFU-MK analysesystemet. Figur 10a viser TPO aktivitet i dyrkningssupernatant av COSI celler i hvilken pHTFl ble innført i rotte CFU-MK analysesystemet. Figur 10b viser TPO aktivitet i dyrkningssupernatant av COSI celler i hvilken pHTFl ble innført i rotte M-07e analysesystemet. Figur 11 viser et restriksjonskart av OHGTl klon og konstruksjon av pHGTl og FHGTE.E:EcoRL H:HindIIL S:Sall) Figur 12a viser TPO aktivitet i dyrkningssupernatant av COSI celler i hvilken pEFHGTE ble innført i rotte CFU-MK analysesystem. Figur 12b viser TPO aktivitet i dyrkningssupernatant av COSI celler i hvilken pEFHGTE ble innført i M-07e analysesystemet. Figur 13a viser TPO aktivitet i dyrkningssupernatant av COSI celler i hvilken pHTl-211#1, pHTl-191#l eller pHTl-171#2 ble innført i rotte CFU-MK analysesystemet. Figur 13b viser TPO aktivitet i dyrkningssupernatant av COSI celler i hvilken pHTl-163#2 ble innført i rotte CFU-MK analysesystemet. Figur 14 viser TPO aktivitet i dyrkningssupernatant av COS 1 celler i hvilken pHTl-211#1, pHTl-191#l, pHTl-171#2, eller pHTl-163#2 ble innført i M-07e analysesystemet. Figur 15 er et kromatogram av en reversfase kromatografi (Vydac C4 kolonne) for rensing av human TPO fra dyrkningssupernatant av CHO celler i hvilken pDEF202-hTPO-Pl har blitt innført og muliggjorde at TPO ble uttrykt. Figur 16 er et fotografi som viser SDS-PAGE separasjon av human TPO renset fra dyrkningssupernatanten av CHO celler i hvilken pDEF202-hTPO-Pl har blitt innført og tillot at TPO ble uttrykt. Figur 17 er et kromatogram av en reversfase kromatografi for rensing av human TPO fra E. coli i hvilken pCFM536/h6T(l-163) har blitt innført og tillater at TPO har blitt uttrykt. Figur 18 er et fotografi som viser SDS-PAGE separasjon av varianthuman TPO, h6T(l-163) isolert og renset fra E. coli i hvilken pCFM536/h6T(l-163) har blitt innført og muliggjorde at TPO ble uttrykt. Figur 19 viser et eluerings mønster av hTP0163 på Superdex 75 pg kolonne med hensyn på rensing av hTPO 163 fra dyrkningssupernatanten, som et utgangsmateriale, fremstilt ved transfektering av humane TPO ekspresjonsplasmid pDER202- hTPO 163 til CHO celler. Proteinmengden ble bestemt i 220 nm. Figur 20 viser en SDS-PAGE analyse av standard hTP0163 eluert på Superdex 75 pg kolonne ved rensing av hTPO 163 fra dyrkningssupernatanten, som et utgangsmateriale, fremstilt ved transfeksjon av human TPO ekspresjonsplasmid pDEF202- hTPO 163 i CHO celler. hTPO 163 ble sølvfarget på gelen.

Figur 21 viser en struktur av ekspresjonsvektoren pSMT201.

Figur 22 er en graf som viser TPO aktivitet som bestemt ved M-07e analyse, i dyrkningssupernatanten av COS7 som 6GL-TPO, N3/TPO eller 09/TPO har blitt innført i og deretter uttrykt. Figur 23 er en graf som viser TPO aktivitet, slik det ble bestemt ved M-07e analyse, i supernatanter av COS7 cellekulturer der et innskuddsderivat eller delesjonsderivat av human TPO har blitt innført og uttrykt. Figur 24 viser øket blodplatetall i mus administrert TPO via intravenøs og subkutan injeksjon. Figur 25 viser doseavhengig øket platetall i mus etter subkutan injeksjon av TPO. Figur 26 viser TPO indusert økning i blodplatetall etter behandling av mus med 5-FU for å indusere trombocytopeni. Figur 27 viser TPO indusert økning i blodplatetall etter behandling av mus med nimustinhydroklorid for å indusere trombocytopeni. Figur 28 viser TPO indusert økning i blodplatetall i trombocytopene mus etter benmargstransplantat. Figur 29 viser TPO induserte blodplatetall etter røntgenbestrålning av mus for å indusere trombocytopeni. Figur 30 viser doseavhengig økning i blodplatetall etter administrering av forkortet TPO (aminosyre 1-163 i SEQ ID NO: 6). Figur 31 viser økning i blodplatetall etter administrering av forkortet TPO (aminosyrer 1-163 i SEQ ID NO: 6) etter administrering av nimustinhydroklorid for å indusere trombocytopeni. Figur 32 viser at økende konsentrasjoner av Mpl-X tilsatt human megakaryocyt dyrkningssystem med økende blokkmegakaryocyt utvikling. Figur 33 beskriver TPO aktivitet, som er bestemt ved M-07e analyse av TPO derivater [Met"2, Lys"<1>, Ala1, Val3, Alg133]TPO(l-163), [Mer2, Lys"<1>, Ala<1>, Val3, Pro<148>]TPO(l-163) og [Mer<2>, Lys"1, Ala1, Val3, Arg115]TPO(l-163) uttrykt i E. coli. Figur 34 beskriver TPO aktivitet slik det ble bestemt ved M- 07e analyse av TPO derivater [Mer2, Lys"<1>, Ala<1>, Val<3>. Alg<129>]TPO(l-163), [Mer2 Lys"1, Ala<1>, Val3, Arg<143>]T<p>o(i-163), [Mer<2>, Lys"1, Ala1, Val3, leu82]TPO( 1-163), [Met"<2>, Lys<1>, Ala<1>, Val<3>, Leu<146>]TPO(l-163) og [Mer2 Lys"1, Ala1, Val<3>, Arg<59>]TPO(l-163) uttrykt i E. coli.

Spesielt tilveiebragt ifølge foreliggende oppfinnelse er trombopoieitin (TPO) polypeptider med biologisk aktivitet som spesifikt stimulerer eller øker blodplateproduksjonen og som omfatter aminosyresekvens 1 til 332 av SEQ ID NO: 6 eller et polypeptid som er kodet for av et polynukleotid som hybridiserer under stringente betingelser med et polynukleotid som koder for aminosyre-sekevnsen SEQ ID NO:6. Illustrative polypeptider innbefatter de som består av aminosyresekvensene 1 til 163 av SEQ ID NO: 6; 1 til 232 av SEQ ID NO: 6; 1 til 151 av SEQ ID NO: 6; den modne sekvensen av aminosyrer av SEQ ID NO: 2,4 og 6; inkludert de som har fra 1 til 6 NH2 terminale aminosyrer fjernet. Ytterligere illustrative polypeptider av oppfinnelsen innbefatter [Thr<33>, Thr<333>, Ser33* Ile335, Gly336, Tyr33?, Pro338 Tyr339, Asp34<>, Val341, Pro342, Asp343, Tyr344, Ala345, Gly346 Val34? His34», His349, His350, ffis351, His352, His353]TPO, [Asn25, Lys231, Thr333, Ser334, De335, Gly336, Tyr337, Pro338, Tyr339, Asp340, Val34*, Pro342, Asp343, Tyr344, Ala345, Gly346, Val347, His348, His349, His350, His35<1>, His352 His<353>]TPO, [Asn25]TPO og [Thr33]TPO. Andre polypeptider av oppfinnelsen innbefatter derivater av et TPO polypeptid [AHis<33>]TPO-(1-163), [AArg<ll7>]TPO(l-163), [AGly116]TPO(l-163), [His33, Thr33', Pro34]TPO(l-163), [His33, Ala33', Pro34]TPO(l-163), [His33, Gly33', Pro<34>, Ser<38>]TPO(l-163), [Gly116, Asn11<6>', Arg117]TPO(l-163), [Gly116, Ala116 Arg117]TPO(l-163).

[Gly11<6>, Gly11<6>', Arg117]TPO(l-163), [Ala<1>, Val<3>] TPO (1-163) [Ala<1>, Val<3>, Arg<129>]TPO(l-163), [Ala<1>, Val<3>, Arg133]TPO( 1-163), [Ala<1>, Val3, Arg143]TPO(l-163). [Ala<1>, Val<3>, Leu8<2>]TPO(l-163), [Ala<1>, Val<3>, Leu146]TPO( 1-163), [Ala<1>, Val3, Pro<148>]TPO(l-163), [Ala<1>, Val<3>, Arg59]TPO(l-163), og [Ala<1>, Val3, Arg115]TPO(l-163), [Arg<129>]TPO (1-163), [Arg<133>]TPO (1-163), [Arg<143>]TPO (1-163), [Leu82]TPO (1-163), [Leu1<46>]TPO (1-163), [Pro<148>]TPO (1-163), [Arg<59>]TPO (1-163) og [Argu5]TPO (1-163).

TPO polypeptidene i oppfinnelsen innbefatter også de som er konvensjonelt bundet til en polymer, fortrinnsvis polyetylenglykol. TPO polypeptidene i oppfinnelsen kan ytterligere omfatte aminosyrene [Met~<2->Lys_<1>], [Met-<1>] eller [Gly<1>]. DNA tilveiebragt i oppfinnelsen omfatter de som koder for TPO polypeptidet og derivatene som er beskrevet over og er hensiktsmessig tilveiebragt som cDNA, genomisk DNA og fremstilt DNA.

Oppfinnelsen tilveiebringer også fremgangsmåter for fremstilling av et TPO polypeptid som beskrevet over omfatter trinnene med å uttrykke et polypeptid som kodet av en DNA i oppfinnelsen i en velegnet vert, og isolering av nevnte TPO polypeptid. Der TPO polypeptidet som er uttrykt er en Met"<2-> Lys-<1> polypeptid, kan slike fremgangsmåter videre innbefatte trinnet med å kløve Met~<2->Lys_<1> fra nevnte isolerte TPO polypeptid.

Oppfinnelsen skaffer også tilveie fremgangsmåter for fremstilling av TPO polypeptider slik som glutation-S- transferase (GST) fusjonspolypeptider. DNA som koder for et aminoterminalt GST polypeptid, et trombin gjenkjenningspeptid og et TPO polypeptid blir innført i en velegnet vert, fusjonspolypeptidet blir isolert og GST delen fjernet ved behandling med trombin. Resulterende TPO polypeptider er av [Gly<1>] strukturen. Det blir videre tilveiebragt prokaryotiske eller eukaryotiske vertsceller transformert eller transfektert med en DNA sekvens ifølge oppfinnelsen på en måte som muliggjør at nevnte vertscelle uttrykker et polypeptid som har biologisk aktivitet av spesifikt stimulerende eller økende blodplateproduksjon.

Farmasøytiske sammensetninger i oppfinnelsen omfatter en effektiv mengde av et TPO polypeptid som nevnt ovenfor i kombinasjon med en farmasøytisk asksepterbar bærer og er gjenstand for anvendelse i behandling av blodplateforstyrrelser, behandling av trombocytopeni slik som den som er indusert ved kjemoterapi, radioterapi eller benmargstransplantasjon. Tilsvarende behandlingsmetoder blir også skaffet til veie i oppfinnelsen.

Foreliggende oppfinnelse omfatter også anvendelsen av nevnte polypeptider til fremstilling av et medikament til behandling av blodplateforstyrrelse hos en pasient. Nevnte blodplateforstyrrelse kan være trombocytopeni, hvor nevnte trombocytopeni kan være redusert ved kjemoterapi, radioterapi eller benmargstransplantasjon.

Oppfinnelsen skaffer avslutningsvis tilveie antistoffer som er spesifikt immunoreaktive med TPO polypeptider som beskrevet ovenfor. Slike antistoffer er nyttige i metoder for isolering og kvantifisering av TPO polypeptider i oppfinnelsen.

Ifølge foreliggende oppfinnelse blir det skaffet tilveie en ny DNA sekvens som koder for et protein som har en TPO aktivitet (blir i det etterfølgende referert til som "DNA sekvens av foreliggende oppfinnelse"). DNA sekvensen i foreliggende oppfinnelse innbefatter en DNA sekvens som koder for aminosyresekvensen som er vist i SEQ ID

. NO: 2,4 eller 6 av sekvenslistingen som følger.

Innbefattet i DNA sekvensen i foreliggende oppfinnelse er en DNA sekvens som koder for en delvis modifisert (substitusjon, delesjon, innskudd eller addisjon) versjon av den forannevnte aminosyresekvensen som er vist i SEQ ID NO: 2,4 eller 6, forutsatt at slike modifikasjoner ikke ødelegger TPO aktiviteten.

Med andre ord innbefatter DNA sekvensen i foreliggende oppfinnelse DNA sekvenser som koder for proteinmolekyler hvis aminosyresekvenser hovedsakelig er aminosyresekvenser som er vist i SEQ ID NO: 2,4 eller 6. Betegnelsen "aminosyresekvenser er hovedsakelig aminosyresekvensene som er vist i SEQ ID NO: 2,4 eller 6" slik det her blir anvendt betyr at nevnte aminosyresekvens innbefatter de som er representert ved SEQ ID NO: 2,4 eller 6 så vel som de som er representert ved SEQ ID NO: 2,4 eller 6 som har partiell modifikasjon deri slik som substitusjon, delesjon, innskudd, addisjon eller lignende, forutsatt at slike modifikasjoner ikke ødelegger TPO aktiviteten.

DNA sekvensen i foreliggende oppfinnelse består hovedsakelig av en DNA sekvens som koder for et protein som har en TPO aktivitet.

Ordene "en DNA sekvens som koder for aminosyresekvensen" innbefatter alle DNA sekvenser som kan være degenererende i nukleotidsekvenser.

DNA sekvensen i foreliggende oppfinnelse omfatter også følgende sekvenser:

(a) DNA sekvenser representert ved SEQ ID NO: 7,194,195 og 196, eller komplementære tråder derav, (b) DNA sekvenser som hybridiserer under strenge betingelser til DNA sekvensen som er definert i (a) eller fragmenter derav, eller (c) DNA sekvenser som hybridiserer til DNA sekvensene slik de er definert i (a) og (b), unntatt degenerering av den genetiske koden.

Med andre omfatter DNA sekvensene i foreliggende oppfinnelse følgende sekvenser: (a) DNA sekvensen som er integrert i vektoren pEF18S-A20 (deponering nr. FERM BP-4565) båret av en E. coli stamme DH5, en vektor pHT 1-231 (deponering nr. FERM BP-4564) båret av en E. coli stamme DH5, en vektor pHTFl (deponering nr. FERM BP-4617) båret av en E. coli stamme DH5, en vektor pHGTl (deponering nr. FERM BP-4616) båret av en E. coli stamme DH5, og som koder for aminosyresekvensen til et protein som har TPO aktivitet; eller (b) DNA sekvenser som hybridiserer (under strenge betingelser) til DNA sekvensen som er definert i (a) eller fragmenter derav, og som koder for aminosyre-sekvensen av et protein som har TPO aktivitet.

Slik det blir brukt her er representative "strenge" hybridiseringsbetingelser de som blir benyttet i eksemplene som angår PCR amplifisering av DNA i oppfinnelsen ved å anvende degenererende og/eller unike sekvensoligonukleotidprimere (prober). Se også for eksempel kapittel 11 og 14 i Molecular Cloning (Sambrook et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) og Unit 2.10 i Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel et al., Eds., Current Protocols, USA, 1993).

Også innbefattet i DNA sekvensen i foreliggende oppfinnelse er en DNA sekvens som koder for et protein som har TPO aktivitet og omfatter nukleotidsekvensen som koder for posisjonene 1-163 i aminosyresekvensen representert ved SEQ ID NO: 6.

Slike DNA sekvenser kan bli supplert med et restriksjonsenzym kløvingssete og/eller en ytterligere DNA sekvens ved initiering, terminering eller mellomliggende sete som forenkler konstruksjon og raskt uttrykte vektorer. Når en ikke-pattedyr vert blir anvendt, kan et foretrukket kodon for genekspresjon i verten bli innkorporert.

Et eksempel på DNA sekvensen i foreliggende oppfinnelse er et cDNA molekyl som ble oppnådd ved å fremstille mRNA fra celler av pattedyr, inkludert mennesker og deretter screene cDNA på vanlig måte fra et cDNA bibliotek fremstilt ved en kjent metode. Kilder for mRNA av denne type innbefatter søyler av en rotte hepatocyt-avledet cellelinje McA-RH8994, HTC celler, H4-E-E celle, rottelever, nyre, hjerne og tynntarm humanlever og lignende.

Et annet eksempel på DNA sekvensen i foreliggende oppfinnelse er et genomisk DNA molekyl som blir oppnådd ved screening på vanlig måte fra et genomisk bibliotek fremstilt ved en kjent metode fra celler av pattedyr inkludert mennesker. Kilder for genomisk DNA av denne type innbefatter kromosomale DNA preparater oppnådd fra mennekser, rotter, mus og lignende.

En DNA sekvens som koder for et TPO derivat kan bli oppnådd fra den således oppnådde cDNA sekvensen som koder for et protein som har TPO aktivitet, ved modifisering av cDNA sekvensen som gjør bruk av kjent sete-rettet mutagenese og dermed gjennomføre partiell modifikasjon av tilsvarende aminosyresekvens.

Når man har utledet aminosyresekvensen eller DNA sekvensen til et protein som har TPO aktivitet i foreliggende oppfinnelse, kan en DNA sekvens som koder for en delvis modifisert aminosyresekvens bli oppnådd på enkel måte ved kjemisk syntese.

DNA sekvensen i foreliggende oppfinnelse er et nyttig materiale for storskala produksjon av et protein som har TPO aktivitet og gjør bruk av forskjellige rekombinante DNA teknikker.

DNA sekvensen i foreliggende oppfinnelse er nyttig som en merket probe for isolering av et gen som koder for et TPO- beslektet protein, så vel som cDNA og genomisk DNA som koder for TPO eller andre pattedyrarter. Det er også nyttig i genterapien av humane og andre pattedyrarter. I tillegg er DNA sekvensen i foreliggende oppfinnelse nyttig for utvikling av transgene pattedyr som kan bli anvendt som en eukaryot vert for storskala-produksjon av TPO (Palmiter et al., Science, vol. 222, s. 809-814,1983).

Foreliggende oppfinnelse skaffer også tilveie en vektor hvori den forannevnte DNA sekvensen koder for et protein som har TPO aktivitet er integrert, vertscelletransformert med nevnte vektor og en fremgangsmåte for fremstilling av et protein som har TPO aktivitet og som omfatter dyrking av nevnte vertsceller og separering og rensing av det uttrykte proteinet som har TPO aktivitet.

Eksempler på vertsceller som er nyttige i dette tilfellet innbefatter celler av prokaryoter slik som E. coli og lignende, og eukaryoter slik som gjær, insekter, pattedyr og lignende. Illustrative eksempler på pattedyrceller innbefatter COS celler, kinesiske hamsterovarie celler (CHO) celler, C-127 celler, baby hamster nyre (BHK) celler og lignende. Illustrative eksempler på gjær innbefatter bakegjær (Saccharomyces cerevisiae), en metanol assimilerende gjær (Pichia pastoris) og lignende. Illustrative eksempler på insektsceller innbefatter silkeormdyrkede celler og lignende.

Med hensyn på vektorer for anvendelse i transformering av disse vertscellene, kan pKC30 (Shimatake H. and M. Rosenberg, Nature, 292,128-132,1981), pTrc99A (Amann E. et al., Gene, 69,301-315,1988) eller lignende blir anvendt for transformering av E. coli celler. For transformering av pattedyrceller, kan pS V2-neo (Southern and Berg, J. Mol. Appl. Genet. 1,327-341,1982), pCAGGS (Niwaet al., Gene, 108, 193-200,1991), pcDL-SR0296 (Takebe et al., Mol. Cell. Biol. 8,466-472,1988) eller lignende blir anvendt. Når det gjelder gjærceller kan pG-1 (Schena M. and Yamamoto K.R., Science, 241,965-967,1988) eller lignende bli anvendt. En overføringsvektor for rekombinant viruskonstruksjon for eksempel pAc373 (Luckow et al., Bio/Technology, 6,47-55,1988) kan bli anvendt for transformering av silkeormceller.

Ved tilfeldig behov kan hver av disse vektorene inneholde et replikasjonsorigo, selek-sjonsmarkør(er), en promoter og lignende, så vel som et RNA spleisested, et polyade-nyleringssignal og lignende i de tilfellene vektorer for anvendelse eukaryote celler.

Med hensyn på replikasjonsopprinnelsen, kan en sekvens avledet fra for eksempel S V40, adenovirus, bovin papilloma virus eller lignende bli anvendt i vektorer for pattedyrceller. En sekvens avledet fra ColEl, R faktor, F faktor eller lignende kan bli anvendt i vektorer for E. coli celler. En sekvens avledet fra 2 (im DNA, ARS1 eller lignende kan bli anvendt i vektorer for gjærceller.

Som promotere for genekspresjonen kan de som er avledet fra for eksemple retrovirus, polyoma virus, adenovirus, SV40 og lignende bli anvendt i vektorer for pattedyrceller. En promoter avledet fra bakteriofag ', for eksempel, trp, lpp, lac eller tac promoter, kan bli anvendt i vektorer for E. coli celler. ADH, PH05, GPD, PGK eller MAFO promoter kan bli anvendt i vektorene for bakegjærceller, og AOX1 promoter eller lignende i vektorer for å metanolassimilere en gjærcelle. En promoter avledet fra en kjernepoly-hedrosevirus kan bli anvendt i vektorer for silkeormceller.

Typiske eksempler på seleksjonsmarkører som er nyttige i vektorer for pattedyrceller

innbefatter neomycin (neo) resistens gen, et thymidinkinase (TK) gen, et dihydrofolat-reduktasegen (DHFR), et E. coli xanthin-guaninfosforibosyltransferase (Ecogpt) gen og lignende. Illustrative eksempler på seleksjonsmarkører som er nyttige i vektorer for E. coli celler innbefatter kanamycinresistens gen, ved ampicillinresistens gen, et terra-

cyklinresistensgen og lignende, og de for gjærceller innbefatter Leu2, Trpl, Ura3 og lignende gener.

Fremstilling av protein som har TPO aktivitet gjør bruk av passende kombinasjoner av disse vert-vektorsystemene kan bli gjennomført ved å transformere passende vertsceller med en rekombinant DNA oppnådd ved innsetting av genet av foreliggende oppfinnelse i et passende sted av forannevnte vektor, dyrke den resulterende transformanten og deretter separere og rense det interessante polypeptidet fra de resulterende cellene, eller dyrkningsmedium eller filtrat. Vanlige anvendte måter og fremgangsmåter kan bli anvendt for denne fremgangsmåten i kombinasjon.

Når man utvikler det interessante genet, kan den opprinnelige signalsekvensen bli modifisert eller erstattet med en signalsekvens avledet fra et annet protein for å oppnå homogen N-terminal av det uttrykte produktet. Homogenisering av N-terminalen kan bli gjennomført ved modifikasjon (substitusjon eller addisjon) av aminosyreresidiene i N-terminal eller dens nærhet. I det tilfellet med ekspresjonen ved å anvende E. coli som en vertscelle, for eksempel lysinresidie kan bli videre supplert i tillegg til methionin residiet.

Det nye proteinet i foreliggende oppfinnelse som har TPO aktivitet (heretter referert til som "proteinet i foreliggende oppfinnelse") omfatter proteiner som hver omfatter aminosyresekvensen som er vist i SEQ ID NO: 2,4 eller 6. TPO derivater hvis aminosyresekvenser er delvis modifisert (substitusjon, delesjon, innskudd eller addisjon) er også innbefattet i foreliggende oppfinnelse, forutsatt at TPO aktiviteten ikke er ødelagt ved modifikasjonen.

Med andre ord innbefatter proteinene i foreliggende oppfinnelse proteinmolekyler hvis aminosyresekvenser hovedsakelig er aminosyresekvensene som er vist i SEQ ID NO: 2, 4 eller 6.

Betegnelsen "aminosyresekvenser er hovedsakelig aminosyresekvenser som er vist i (eller representert ved) SEQ ID NO: 2,4 eller 6" slik det blir anvendt betyr at nevnte aminosyresekvenser innbefatter de som er vist i SEQ ID NO: 2,4 eller 6 så vel som de som er vist i SEQ ID NO: 2,4 eller 6 som har delvis modifikasjon deri slik som substitusjon, delesjon, innskudd, addisjon og lignende, forutsatt at slike modifikasjoner ikke ødelegger TPO aktiviteten.

Proteinet av oppfinnelsen innbefatter et protein som inneholder posisjonene 7-151 i aminosyresekvensen som er vist i SEQ ID NO: 6 og som har en TPO aktivitet. Også innbefattet i proteinet i foreliggende oppfinnelse er et protein som har TPO aktivitet og som omfatter posisjonene 1-163 i aminosyresekvensen som er representert ved SEQ ID NO: 6.

Eksempler på andre TPO derivater i foreliggende oppfinnelse innbefatter et derivat hvis stabilitet og holdbarhet in vivo ble forbedret ved arninosyremodifikasjonen (substitusjon, delesjon, innskudd eller addisjon), et derivat hvori minst en potensiell glykosylering ble endret ved delesjon eller addisjon, et derivat hvori minst en cysteinresidie ble utelatt eller substituert med en annen aminosyreresidie (alanin eller serinresidie for eksempel).

Proteinet i foreliggende oppfinnelse er fortrinnsvis kjennetegnet ved at det er separert og renset fra vertsceller transformert med en rekombinant vektor inneholdende et cDNA molekyl, et genomisk DNA molekyl eller et DNA fragment oppnådd ved kjemisk syntese.

Når intracellulær ekspresjon blir gjennomført ved å anvende en bakterie slik som E. coli som vert, blir et protein hvori et initieringsmethioninresidie blir tilsatt N-terminal side av et proteinmolekyl som har TPO aktivitet oppnådd, som også er inkludert i foreliggende oppfinnelse. Avhengig av verten som blir anvendt, kan det fremstilte protein som har TPO aktivitet være eller ikke være glykosylert, og alle slike tilfeller er innbefattet i proteinet i foreliggende oppfinnelse.

Proteinet i foreliggende oppfinnelse innbefatter også naturlig forekommende TPO-aktive proteiner renset og isolert fra naturlige kilder slik som celledyrkningsmedium som har TPO aktivitet eller human urin, serum eller plasma.

En fremgangsmåte for rensing av TPO fra slike naturlige kilder er også innbefattet i foreliggende oppfinnelse. En slik renseprosess kan bli gjennomført ved å benytte en av eller en kombinasjon av vanlige anvendte proteinrensetrinn slik som ionebyttekromato-grafi, lektin affinitetskromatografi, triazin farge affinitetskromatografi, hydrofob interaksjonskromatografi, gelfiltreringskromatografi, revers fase kromatografi, heparinaffini-tetskromatografi, sulfatert gelkromatografi, hydroksylapatit kromatografi, isoelektrisk fokuseringskromatografi, metallchelaterende kromatogragfi, preparativ elektroforese, isoelektrisk foksuerende gelelektroforese og lignende. En rensningsprosess hvori visse teknikker blir anvendt i kombinasjon gjør anvendelse av fysiokjemiske egenskaper av TPO som kan bli utledet fra eksemplene i beskrivelsen er også innbefattet i foreliggende oppfinnelse. I tillegg kan en antistoff affinitetskromatografi til hvilken et antistoff som har evne til å gjenkjenne TPO også bli anvendt. Det har videre blitt funnet at TPO er liganden for Mpl (de Sauvage, et al., Nature 369: 533-538 (1994); Bartley et al., Cell 77: 1117-1124 (1994); Kaushansky et al., Nature 369: 565-568 (1994)), og TPO kan bli renset ved å anvende en affinitetsgelkolonne der Mpl har blitt koblet til en harpiks. Mer spesifikt er et eksempel på kolonnen en Mpl-X kolonne som blir fremstilt ved kobling av en harpiks med en ekstracellulær region av Mpl (Mpl-X) fremstilt ved rekombinante DNA teknikker ved å anvende CHO celler som en vert (Bartley et al. (1994), supra).

Slik de her er beskrevet er TPO polypeptidene i oppfinnelsen ytterligere karakterisert ved evne til å binde til Mpl reseptoren og spesifikt til ekstracellulær domene (opp-løselig) derav.

Også innbefattet i foreliggende oppfinnelse er et protein kodet av en DNA del som er komplementær til protein-kodende tråd av en human cDNA eller en genomisk DNA sekvens av TPO genet, nemlig et "komplementært invertert protein" slik det er beskrevet av Tramontano et al. (Nucl. Acids Res., vol. 12, s. 5049-5059,1984).

Foreliggende oppfinnelse innbefatter også et protein fra foreliggende oppfinnelse som er merket med en detekterbar markør, for eksempel !25j merking eller biotinylering, og gjør således mulighet for at et reagens som er nyttig for påvisning og kvantifisering av TPO eller TPO reseptor- uttrykkende celler i faste prøver slik som vev og flytende prøver slik som blod, urin og lignende.

Biotinylert protein i foreliggende oppfinnelse er nyttig i det tilfellet med binding til immobilisert streptavidin for åfjerne megakryoblaster fra benmarg på tidspunktet med

autogen benmargstransplantasjon. Det er også nyttig i det tilfellet når det gjelder binding til immobilisert strptavidin for åkonsentrerte autogene eller allogene megakaryocytiske søyler ved tidspunktet for autogen eller allogen benmargstransplantasjon. Et konjugat av TPO med toksin slik som ricin, difteritoksin eller lignende eller med en radioaktiv isotop er nyttig i antitumorterapi og i kondisjonering for benmargstransplantasjon.

Foreliggende oppfinnelse skaffer også tilveie et nukleinsyremateriale som er nyttig når det er merket med en detekterbar markør som inkluderer en radioaktiv markør eller en ikke- radioaktiv markør slik som biotin eller når det blir anvendt i en hybridiserings-prosedyre for påvisning av posisjonen av human TPO gen og/eller dens beslektede genfamilie på et kromosomalt kart. Et slikt materiale er også nyttig ved bekreftelse av human TPO genforstyrrelser på DNA nivå og kan bli anvendt som en genetisk markør for bekreftelse av gener som ligger ved siden av og deres forstyrrelser.

Foreliggende oppfinnelse inkluderer også en farmasøytisk sammensetning som inneholder en terapeutisk effektiv mengde med protein av foreliggende oppfinnelse sammen med et nyttig og effektivt fortynningsmiddel, antiseptisk middel, oppløseliggjørings-middel, emuleringsmiddel, adjuvant og/eller bærer. Begrepet "terapeutisk effektiv mengde" slik det her blir anvendt betyr en mengde som skaffer tilveie en terapeutisk effekt for den spesifiserte tilstanden og actoiinistreringsveiene som skal benyttes. En slik sammensetning blir anvendt i form av et flytende, fryse-tørket eller tørket preparat og omfatter et fortynningsmiddel valgt fra forskjellige buffere (Tris-HCl, acetat og fosfat for eksempel) med forskjellige pH verdier og ioniske styrker, et overflate adsorberende forhindringsadditiv slik som albumin eller gelatin, et overflateaktivt middel slik som Tween 20, Tween 80, Pluronic F68 og gallesyresalt, et oppløsningsmiddel slik som glycerol eller polyetylenglykol, en antioksidant slik som askorbinsyre eller natrium-metabisulfit, et antiseptisk middel slik som timerosal, benzylalkohol eller paraben og en bærer eller tonisitetsmiddel slik som laktose eller mannitol. Det ble også anvendt en sammensetning som omfatter kovalent binding av proteinet fra foreliggende oppfinnelse til en polymer slik som polyetylenglykol, gelatering av proteinet med metallionet, in-korporering av proteinet i et granulært preparat, eller på overflaten, bestående av en polymerforbindelse slik som polymelkesyre, polyglykolsyre, eller hydrogel eller inkor-poreringer av protein i liposomer, mikroemulsjon, miceller, enkle eller flerlagsvesikler, røde celler eller spheroplaster. En slik sammensetning vil utøve påvirkning på fysikalske forhold, oppløselighet, stabilitet, in vivo frigjøringshastighet og in vivo klargjøring av TPO. Valg av sammensetning kan avgjøres avhengig av de fysikalske og kjemiske egenskapene og det anvendte TPO-aktive protein. Foreliggende oppfinnelse inkluderer også en granulær sammensetning hvori granuler blir belagt med en polymer slik som poloksamer eller poloksamin og TPO som binder til antistoffer for vevspesifikke reseptorer, ligander eller antigener eller til vevspesifikke reseptorligander. Andre eksempler på sammensetningen i foreliggende oppfinnelse er de som er i form av granuler, og har et beskyttende belegg og inneholder en proteasehemmer eller en inn-trengingsforøker, for anvendelse i forskjellige administreringsveier slik som parenteral, pulomonær, transnasal og oral administrering.

Den farmasøytiske sammensetningen som omfatter proteinet i foreliggende oppfinnelse kan bli administrert flere ganger pr dag, vanligvis i en mengde på 0.05 mg til 1 mg/kg (som TPO protein) av kroppsvekt avhengig av tilstander og pasientens kjønn, administreringsvei og lignende.

Den farmasøytiske sammensetningen som inneholder proteinet i foreliggende oppfinnelse kan bli administrert ved en dose på 25.000-500.000.000 av aktiv ingrediens (på basis av relativ aktivitet ved M-07e analyse som beskrives senere) pr kg kroppsvekt i en til flere ganger pr dag og 1 til 7 dager pr uke avhengig av symptomet, kjønn og adrrunistreringsvei.

Foreliggende oppfinnelsen har bekreftet at med hensyn på C- terminalt sete av human TPO, blir aktiviteten opprettholdt selv når aminosyreresidiene opp til 152. aminosyresekvens vist i SEQ ID NO: 6 blir utelatt og at med hensyn på N- terminalt sete, blir aktiviteten opprettholdt selv når aminosyreresidiene opp til 6. aminosyresekvens blir utelatt.

Proteinet som har TPO aktivitet inneholdende 7. til 151. aminosyresekvens av SEQ ID NO: 6 og som blir modifisert (substitusjon, delesjon, innskudd eller addisjon) eller andre deler kan fortrinnsvis bli anvendt som effektiv ingrediens i foreliggende oppfinnelse. Mer foretrukket TPO derivat er det som har 1. til 163. aminosyresekvens av

SEQ ID NO: 6.

En sammensetning som inneholder minst en av ytterligere hematopoetiske faktorer slik som EPO, G-CSF, GM-CSF, M-CSF, IL-1, EL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, EL-10, IL-11, IL-12, IL-13, LIF og SCF, i tillegg til proteinene i følgende oppfinnelse, er

. også innbefattet i foreliggende oppfinnelse.

Proteinet i følgende oppfinnelse er nyttig for behandling av forskjellige trombocytopene sykdommer, enten alene eller i kombinasjon med andre ytterligere hematopoetiske faktorer. Eksempler på andre hematopoetiske faktorer innbefatter EPO, G-CSF, GM-CSF, M-CSF, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL- 7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, EL-13,LIFog SCF.

Det er mange sykdommer som er kjennetegnet ved blodplateforstyrrelser slik som trombocytopeni på grunn av skader i produksjonen av blodplater eller reduksjon i levetiden til blodplatene (forårsaket ved destruksjon eller forbruk av blodplater), som kan bli behandlet med protein i foreliggende oppfinnelse. Den kan for eksempel bli anvendt til forbedring av gjenoppretting av blodplater i en trombocytopen pasient på grunn av kongenital Fanconi anemi eller aplastisk anemi forårsaket av kjemoterapi eller bestrålning, myelodysplastisk syndrom, akutt myelocytisk leukemi, aplastisk krise etter benmargstransplantasjon. Den er også nyttig i behandling av trombocytopeni som skyldes minsket produksjon av TPO. Trombocytopeni som skyldes reduksjon i levetiden av blodplater eller megakaryocyter innbefatter ideopatisk trombocytopeni purpura, hypoplastisk anemi, ervervet immunsviktsyndrom (AIDS), disseminert intravaskulær koaguleringssyndrom og trombotisk trombocytopeni. I tillegg er det også nyttig i dette tilfellet med autotransfusjon av blodplater, der TPO blir administrert til en pasient forut for kirurgisk operasjon for å øke antallet av pasientens egne blodplater og de således økede blodplatene blir anvendt som transfusjonsblodplater på operasjonstidspunket. Annen anvendelse av proteinet i foreliggende oppfinnelse er behandling av sykdommer som er resultat av temporal utelatelse eller skade av blodplater forårsaket av andre kjemiske eller farmasøytiske medikamenter eller helende behandling. TPO kan bli anvendt med det forbehold å forbedre frigjøring av nye "intakte" blodplater i slike pasienter.

Foreliggende oppfinnelse angår videre et isolert antistoff spesifikt for TPO. Proteinet i foreliggende oppfinnelse kan bli anvendt som antigener, og tilsvarende antistoffer innbefatter både monoklonale og polyklonale antistoffer og chimere antistoffer, nemlig "rekombinante" antistoffer, fremstilt ved konvensjonelle metoder. For å fremstille et slikt anti-TPO antistoff, kan human TPO selv bli anvendt som antigenet, eller alternativt et partielt peptid av human TPO kan bli utnyttet som antigen. Der et antistoff til antigenet av et slikt peptid blir anvendt, kan epitopen bli definert ved spesifisering av antigenregionen. På den annen side der et antistoff til antigenproteinet (TPO) selv blir utnyttet, kan antigenregionen bli klargjort ved analysering av epitopen av antistoffet. I slike tilfeller kan disse antistoffene som hver har således-klargjort epitope bli utnyttet for åfraksjonere, påvise, kvantifisere og rense forskjellige TPO som adskiller seg i sine egenskaper slik som type sukkerkjede tilsatt, lengde på peptidkjeder, etc.

Et TPO peptid som inneholder den således valgte aminosyresekvensen blir syntetisert, og bundet til et egnet bærerprotein, for eksempel albumin, KLH (nøkkelhull limpe-themocyanin) eller lignende, ved kovalent binding for å fremstille et immunoreaktivt antigen. Alternativt blir et peptid av en multippel antigenpeptidtype (MAP) fremstilt og er et antigen, i henhold til Tams metode (Proe. Nati. Acad. Sei. (USA) 85:5409-5413, 1988). Med det således fremstilte antigenet sammen med et adjuvant eller lignende, blir immuniserte pattedyr, fulger etc. som generelt blir utnyttet å gjøre at de produserer antistoffer, slik som kaniner, mus, rotter, geiter, sau, kyllinger, hamstere, hester, marsvin, etc. Fra de således-immuniserte dyr, ble det utvunnet deres anti-serum og celler, fra hvilke et polyklonalt antistoff blir oppnådd. Der det blir anvendt et peptid som antigen, kan epitopen bli definert ved spesifisering av antigenregionen. I tilfellet blir regioner av forskjellige TPO molekyler som har forskjellige molekylvekter screenet og identifisert ved immunologisk engineering. Som et eksempel kan en peptid-utelatt region bli screenet og identifisert. I tillegg blir et antistoffgen eller en del av genet klonet fra celler som uttrykker det tilsiktede antistoff for å oppnå et antistoffmolekyl som har blitt uttrykt ved genetisk engineering.

I sammenheng med polyklonalt antistoff som generelt inneholder forskjellige antistoffer som er spesifikt for forskjellige antigene determinanter (epitope), er et monoklonalt antistoff spesifikt for en enkel antigen determinant på antigene. Et TPO-spesifikt antistoff er nyttig for å bedre selektivitet og spesifisitet i en antigen- antistoff reaksjons-hjulpet diagnose og en analytisk analysemetode og ved gjennomføring av separasjon og rensing av TPO. I tillegg kan slike antistoffer bli benyttet til nøytralisering eller fjerning av TPO fra serum. Monoklonale antistoffer er også nyttige for påvisning og kvantifisering av TPO for eksempel i serum fra fullblod.

Anti-human TPO antistoff i foreliggende oppfinnelse kan bli anvendt som ligand i affinitetskromatografi for rensing og isolering av human TPO. For å fiksere antistoffet for å gjøre det nyttig i slik affinitetskromatografi, kan en hvilken som helst konvensjo-nell metode for fiksering av forskjellige enzymer bli benyttet. For eksempel kan det benyttes en metode ved å anvende en bærer av CNMr-aktivert sepharose 4B (fremstilt av Pharmacia Fine Chemicals Co.) eller lignende. For virkelig å rense human TPO ved anvendelse av fiksert anti-humant TPO antistoff, blir fikserte anti-human TPO antistoffer fylt i en kolonne og en human TPO-inneholdende væske blir ført gjennom kolonnen. Ved denne operasjonen blir et stor mengde human TPO adsorbert på bæreren i kolonnen. Som oppløsningsmiddel for eluering kan det for eksempel benyttes glycin-HC1 buffer (pH 2.5), natriumkloridoppløsning, propionsyre, dioksan, etylenglykol, chaotropisksalt, guanidinhydroklorid, urea etc. Ved eluering med et slikt oppløsnings-middel blir human TPO med en høy renhet eluert.

Antistoffet i foreliggende oppfinnelse blir anvendt for bestemmelse av human TPO ved immunokjemisk kvantitativ analyse, særlig ved enzym-immunoanalyse som blir gjennomført i en fast fase sandwich prosess.

En fordel ved monoklonale antistoffer er at de kan bli fremstilt ved hybridoma celler i et medium som ikke inneholder noen andre immunoglobulinmolekyler. Monoklonale antistoffer kan bli fremstilt ved dyrkningssupernatanter av hybridoma celler eller fra muse ascites indusert ved intraperitoneal injeksjon av hybridoma celler. Hybridoma-teknikken som opprinnelig er beskrevet av Kohler og Milstein (Eur. J. Immunol. 6:511-519,1976) kan bli anvendt for dannelse av hybridcellelinjer som innehar høye nivåer av monoklonale antistoffer for et antall spesifikke antigener.

For å isolere det aktuelle antistoffet fra det således oppnådde antistoff-inneholdende materialet, slik som anti- serum, etc. ved rensing av dette, kan et eller flere trinn (affinitetskromatografi slik som protein A affinitetskromatografi, protein G affinitetskromatografi, avidgel kromatografi, anti-immunoglobulin-fiksert gelkromatografi, etc; så vel som kationbyttekromatografi, anion-byttekromatografi, lektinaffinitetskxornato-grafi, farveadsorpsjonskromatografi, hydrofobisk interaksjonskromatografi, gel-gjermomtrengningskromatografi, revers fase kromatografi, hydroksylapatit kromatografi, fluor-apatitkromatografi, metallchelaterende kromatografi, isoelektrisk punkt-kromatografi, partisjoneringselektroforese, isoelektrisk punktelektroforese, etc.) som generelt kan benyttes for rensing av protein. Bortsett fra disse kan en metode for anti-genafflnitetsrensing også bli benyttet, der en gelbærer eller membran, til hvilken det er kjemisk bundet et human TPO protein selv eller et peptid som inneholder regionen av antigenet eller en del av regionen, eller som er et molekyl som har evne til å gjenkjenne det aktuelle antistoff, blir fremstilt, et antistoff-inneholdende materiale blir tilsatt til dette slik at det aktuelle aantistoffet blir laget og adsorbert på bæreren eller membranen, og det således adsorberte antistoffet blir deretter eluert og gjenvunnet under egnede betingelser.

Foreliggende oppfinnelsen tillater også anvendelse av endogene DNA sekvenser som koder for et TPO polypeptid for fremstilling av store mengder polypeptidprodukter. For eksempel kan in vitro og eks vivo homologe rekombineringsprosedyrer bli benyttet for å overføre vertsceller for åtilveiebringe ekspresjon eller forbedret ekspresjon av polypeptider. Foretrukne vertsceller innbefatter humane celler (for eksempel lever, benmarg og lignende) der en promoter eller forøkningssekvens blir innsatt ved å benytte flanke-sekvenser som er homologe til en målregion i et cellulært genom men det resultat at TPO polypeptidekspresjon blir gjennomført eller forbedret. Se for eksempel US-PS 5.272.071, publisert PCT WO 90/14092, WO 91/06666 og WO 91/09955.

Foreliggende oppfinnelse skaffer også tilveie fremgangsmåter for fremstilling av et TPO polypeptid som beskrevet over omfattende trinnet med å uttrykke et polypeptid som er kodet av en DNA fra oppfinnelsen i en egnet vert, og isolering av nevnte TPO polypeptid. Der TPO polypeptidet som uttrykt er et Met'<2->Lys"<1> polypeptid, kan slike fremgangsmåter vider innbefatte trinnet med kløving av Mef^-Lys"1 fra nevnte isolerte TPO polypeptid.

Det blir også skaffet tilveie metoder for å fremstille TPO polypeptider som har [Gly<1>] struktur og omfatter trinnet med å innføre i en velegnet vertscelle en DNA som koder for et glutation-S-transferase (GST) polypeptid 5' til TPO polypeptid kodende sekvenser, GST og TPO polypeptid kodende sekvenser separert ved DNA som koder for et trombin gjenkjenningspolypeptid, isolering av GST-TPO ekspresjonsprodukt og behandling av det uttrykte polypeptidet med trombin for åfjerne GST aminosyrer. Resulterende TPO polypeptider har en [Gly-<1>] struktur.

Det følgende beskriver foreliggende oppfinnelse i detalj.

Rensing av rotte TPO. analyse av partiell aminosyresekvenser av renset rotte TPO og analyse av biologiske karakteristika av renset rotte TPO

Foreligende oppfinnelse har gjort først forsøk på å rense et protein (rotte TPO) som har en aktivitet for å forbedre proliferasjon og differensiering av rotte CFU-MK. I denne rensestudien ble det gjort mange prøver og feilforsøk på renseprosedyre, slik som valg av forskjellige naturlige kilder, valg av geler for kromatografi og separasjonsmåter. Som et resultat har foreliggende oppfinnelse lykkes i å rense et protein som har en TPO aktivitet fra blodplasma av trombocytopen rotte indusert for røntgen eller gamma bestrålning, og gjør bruk av TPO aktivitet som en markør basert på en rotte CFU-MK analyse som vil beskrives i det etterfølgende i (referanse eksempel), og bestemmelse av partielle aminosyresekvenser av renset protein (eksempler 1 og 2).

Biologiske karakteristiske trekk av plasma-avledet rotte TPO ble også undersøkt (eksempel 3).

En skisse av fremgangsmåtene fra rensing av rotte TPO til bestemmelse av partielle aminosyresekvenser av renset protein er vist i det følgende. (i) Blodplasmaprøve ble fremstilt fra ca 1.100 trombocytopene rotter indusert ved røntgen eller gamma bestrålning og gjenstand for en Sephadex G-25 kromatografi, en anionbyttekromatografi (Q-Sepharose FF) og en lectin kromatografi (WGA-agarose) i den rekkefølge, og dermed oppnå en WGA- agarose-adsorbert TPO-aktiv fraksjon. (ii) Deretter ble den således oppnådde WGA-agarose- adsorberte TPO-aktiv fraksjon gjenstand for en triazin farveaffinitetskromatografi (TSK AF-BLUE 650MH), en hydrofob interaksjonskromatografi (Phenyl Sepharose 6 FF/LS) og en gelfiltreringskromatografi (Sephacryl S-200 HR) i den rekkefølge. Siden TPO aktiviteten ble delt i fire topper (Fl som høyeste molekylvektsfraksjon, etterfulgt av F2, F3 og F4) ved Sephacryl S-200 HR gelfiltrering, ble hver av TPO aktive fraksjoner F2 og F3 konsentrert for å oppnå en høymolekylvekts TPO prøver F2 og en lavmolekylvekts TPO prøve F3 som ble anvendt separat i etterfølgende rensetrinn. (iii) Lavmolekylvekts TPO prøven F3 var gjenstand for en preparativ reversfasekromatografi (YMC-Pack PROTEIN-RP), en reversfase kromatografi (YMS-Pack CN-AP) og en annen reversfase kromatografi (Capcell Pack Cl) i den rekkefølge. Når den således oppnådde TPO-aktive fraksjonen ble applisert på natriumdodecylsulfat (SDS) polyakrylamidgelelektroforese (SDS-PAGE) og TPO-aktiv substans ble ekstrahert fra gelen, ble tilstedeværelse av TPO aktivitet bekreftet i et bånd som tilsvarer molekylvekter på ca 17000 til 19000 under ikke- reduserende betingelser. (iv) Som konsekvens ble alle TPO-aktive fraksjoner applisert på SDS-PAGE under ikke-reduserende betingelser og overført til en PVDF membran. Ved gjennomføring av systematisk begrenset enzymatisk hydrolyse av proteinet på PVDF membranen i peptidfragmenter, ble delvis aminosyresekvenser av rotte TPO protein bestemt. Basert på aminosyresekvens informasjon av to peptidfragmenter, ble kloning av rotte TPO genet gjennomført. (v) Adskilt fra dette ble høymolekylvekts TPO prøve F2 oppnådd ved Sephacryl S-200 HR gjenstand for rensing på samme måte som i tilfellet med lavmolekylvekts TPO prøve F3. Når en TPO aktiv fraksjon oppnådd i det siste trinnet i revers fase kromatografi (Capcell Pack Cl) ble applisert på SDS-PAGE og TPO-aktiv substans ble ekstrahert fra gelen, ble tilstedeværelse av TPO aktivitet bekreftet i et bånd som tilsvarer en molekylvekt på ca 17000 til 22000 under ikke-reduserende betingelser.

Spesialisering av rotte TPO produserende celler,

fremstilling av mRNA og konstruksjon av rotte cDNA bibliotek Siden det således oppnådde rotte TPO har blitt avledet fra blodplasma, var det nødvendig å screene organer eller celler som kilde for mRNA for anvendelse i cDNA kloning. Som konsekvens ble TPO aktivitet i forskjellige organer og celledyrknings-supernatanter screenet basert på biokjemiske og biologiske egenskaper av rotteplasma-avledet TPO. Som resultat ble TPO aktiviteter nesten lik rotte plasma-avledet TPO funnet i dyrkningssupernatanten av rotte hepatocyt- avledede cellelinjer McA-RH8994, HTC og H4-II-E, så vel som i dyrkningssupernatanten av rotteprimære hematocyter (eksempel 4).

På en annen side ble ekspresjonsvektor pEF18S konstruert fra 2 ekspresjonsvektorer pME18S og pEFBOS (eksempel 5). Konstruksjon av denne vektor var gjort mulig ved enkel kloning av cDNA ved å anvende høyeffekt ekspresjonsvektor som har mange kloningsseter som kan bli anvendt for integrering av innskudd.

I tillegg til ekspresjonsvektoren over, blir pUC og pBR baserte plasmidvektorer og baserte fagvektorer hovedsakelig anvendt for konstruksjon av cDNA bibliotek. McA-RH8994 celler ble dyrket, homogenisert ved tilsetning av guanidintiocyanato oppløsning og de ble deretter utsatt for CsCl tetmetsgradientsentrifugering for å oppnå total RNA (eksempel 6).

Fremstilling av RNA kan også bli gjort ved en varm fenolmetode, en syreguani-diniumfenolkloroform metode og lignende.

Etter rensing av poly (A)<+> RNA fra total RNA ved å anvende oligo dT-immobilisert lateks partikler, ble første tråd cDNA syntetisert ved virkning av revers transkriptase ved anvendelse av oligo dT som en primer til hvilken et restriksjonsenzym Noti gjenkjenningssekvens hadde blitt tilsatt, etterfulgt av syntese av andre tråd cDNA ved å anvende RNase H og E. coli DNA polymerase I. En EcoRI adaptor ble tilsatt den således oppnådd dobbelt-trådede cDNA, og resulterende cDNA ble ligert med en pattedyr celle-ekspresjonsvektor pEF18S konstruert i eksempel 5, som har blitt spaltet med Noti og EcoRI og den således ligerte cDNA ble overført til kompetente celler av en E. coli stamme DH5 for å konstruere et cDNA bibliotek (eksempel 7).

(C) Fremstilling ( kloning) av rotte TPO cDNA fragment ved PCR

En DNA sekvens ble utledet fra det partielle aminosyresekvensen av rotte TPO som

hadde blitt renset fra rotteblodplasma, for å syntetisere degenererte primere som skulle bli anvendt i polymerasekjedereaksjon (PCR). Primere som skulle bli anvendt kan også bli oppnådd basert på en aminosyresekvens som er forskjellig fra posisjonen av primerene som ble anvendt her. Høyt degenererte primere kan også bli anvendt uten å benytte inosin. I tillegg kan primere med redusert degenerering bli utformet å gjøre bruk av et kodon som har en høy utnyttelse i rotte (Wada et al., Nucleic Acids Res., vol. 18, s. 2367-2411, 1990).

Når plasmid DNA ble ekstrahert fra hele delen av cDNA biblioteket fremstilt over og PCR ble gjennomført ved åanvende ekstrahert DNA som templat, ble et bånd av ca 330 bp påvist og som deretter ble bestemt ved nukleotidsekvensanalyse som et DNA fragment (Al fragment) som koder for en del av rotte TPO (eksempel 8).

(D) Screening av rotte TPO cDNA ved PCR, sekvens av rotte

TPO cDNA og bekreftelse av TPO aktivitet

cDNA bibliotek som er fremstilt over ble delt i poler, hver inneholdende ca 10.000 kloner, og plasmid DNA ble ekstrahert fra hver 100 pol. Når PCR ble utført å anvende hver pol av plasmid DNA som templat og primere nylig syntetisert basert på nukleotidsekvensen av Al fragment, ble bånd som var betraktet å være spesifikke påvist i tre poler. En av disse tre polene ble delt i under-poler, hver inneholdende ca 900 kloner, og

plasmid DNA ble renset fra 100 under-poler ved ågjennomføre PCR på samme måte. Som resultat ble det påvist et spesifikt bånd i tre under-poler. En av disse polene ble delt i under-poler hver inneholdende 40 kloner, og til slutt ble hvert klon screenet ved PCR på samme måte. Som et resultat ble et klon pEF18S-A26 som syntes å kode for rotte TPO cDNA isolert (eksempel 9 og 10).

Når nukleotidsekvensen av dette klonet ble analysert ved at kodet for den partielle aminosyresekvensen av protein renset fra rotteblodplasma, og bekreftet således en sterk mulighet at dette klonet inneholder rotte TPO cDNA (eksempel 10).

Når plasmid DNA ble renset fra klon pEF18S-A26 oppnådd over og transfektert inn i COS 1 celler, ble TPO aktivitet funnet i dyrkningssupernatanten av de transfekterte cellene. Som et resultat ble det bekreftet at klon pEF18S-A26 inneholder et cDNA som koder for rotte TPO (eksempel 11).

(E) Påvisning av TPO mRNA i forskjellige rottevev

TPO mRNA ekspresjon i rottevev ble analysert ved PCR, og spesifikk ekspresjon ble

påvist i hjerne, lever, tynntarm og nyre (eksempel 12).

(f) Konstruksjon av human cDNA bibliotek

Basert på resultatene fra eksempel 4 og 12, ble lever valgt som utgangsmateriale for kloning av human TPO cDNA. Som konsekvens ble et cDNA bibliotek konstruert ved å anvende en kommersiell mRNA avledet fra normal human lever. Ved åanvende pEF-18S som en vektor i det tilfellet med rottebibliotek, ble cDNA syntetisert ved samme fremgangsmåte som tilfellet var ved rotte for å oppnå et klonet cDNA bibliotek ved å benytte restriksjonsenzymet Noti og EcoRI. Biblioteket fremstilt ved innføring av vektor-ligert cDNA i E. coli DH5 inneholdt ca 1.200.000 kloner (eksempel 13).

(G) Fremstilling ( kloning) av human TPO cDNA fragment ved PCR

Flere primere for PCR ble syntetisert basert på nukleotidsekvensen av klon pEF18S-A20 som koder for rotte TPO cDNA. Når cDNA ble syntetisert ved å anvende en kommersiell mRNA avledet fra normal humanlever og PCR ble gjennomført ved å anvende disse primere og cDNA som et templat, ble det observert et bånd rundt 620 bp. Når nukleotidsekvensen ble analysert, fremkom det at dette klonet inneholder et DNA fragment som har en homologi på ca 86% med rotte TPO cDNA, og bekrefter således en sterk mulighet for at dette er en del av et gen som koder for human TPO (eksempel 14).

(H) Screening av human TPO cDNA ved PCR, sekvens av

human TPO cDNA og bekreftelse på TPO aktivitet

Human cDNA bibliotek fremstilt over ble amplifisert, delt i to poler hver inneholdende ca 100.000 kloner, og plasmid DNA ble ekstrahert fra hver av 90 poler. Når PCR ble gjennomført ved å anvende hver pol av plasmid DNA molekyler som et templat og primere nylig syntetisert basert på nukleotidsekvensen av human TPO fragment oppnådd i eksempel 14, ble mulige bånd påvist i tre poler. En av disse polene ble delt i under-poler hver inneholdende 5000 kloner og plasmid DNA ble renset fra hver av 90 underpoler. Når PCR ble gjennomført ved å anvende hver polplasmid DNA som et templat på samme måte, ble mulige bånd påvist i 5 under-poler. Når en av disse polene ble delt i under-poler hver inneholdende 250 kloner og plasmid DNA ble renset fra hver av 90 underpoler og gjenstand for PCR, ble mulige bånd påvist i tre under-poler. Når en av disse polene var delt i under-poler hver inneholdende 30 kloner og plasmid DNA ble renset fra hver av 90 under-poler og gjenstand for PCR, ble mulige bånd påvist i tre under- poler. Deretter ble 90 kolonier isolert fra en av disse under-polene og plasmid DNA renset fra hver av disse koloniene ble gjenstand for PCR for til slutt å oppnå et klon med navn HL34 (eksempel 15).

Når nukleotidsekvensen av plasmid DNA i dette klon ble analysert, fremkom det at dette klonet inneholder en cDNA som har ca 84% homologi med rotte TPO cDNA nukleotidsekvens (eksempel 16).

Når det klonede plasmid DNA ble renset og transfektért i COS 1 celler, ble TPO aktiviteten funnet i dyrkningssupernatanten av de transfekterte cellene. Som resultat ble det bekreftet at dette plasmidklonet inneholder cDNA som koder for human TPO (eksempel 17).

Dette cDNA synes imidlertid å være et kunstig produkt av kloning, fordi det ikke ble funnet noe termineringskodon i dette klon og en poly A hale-lignende sekvens ble funnet på3'-ende. Som konsekvens ble det konstruert en ekspresjonsvektor som koder for aminosyresekvensen som ekskluderer en tilsvarende del til poly A-hale-lignende sekvens. Når den således konstruerte vektoren ble uttrykt i COS 1 celler, ble det funnet TPO aktivitet i den resulterende dyrkningssupernatanten (eksempel 18).

DNA fragment i 3'-ende region av human TPO ble oppnådd ved PCR for å analysere strukturen av full-lengde cDNA.

Bestemmelse av nukleotidsekvensen av dette fragmentet viste at det delvis overlapper med cDNA båret ved klon HL34 oppnådd i eksempel 15. Det ble også ventet at en full-lengde human TPO cDNA kan inneholde en åpen leseramme derav og kode for et protein bestående av 353 aminosyrer. Det ble således antydet at human TPO besto av 350 aminosyrer inkludert en signalsekvens på 21 aminosyrer (eksempel 19).

I tillegg til ovenfornevnte kloningsmetode, kan kloning av human TPO cDNA bli oppnådd ved koloni hybridisering eller plakk hybridisering ved å anvende et rotte TPO cDNA fragment som en probe, ved å ta i bruk et bibliotek konstruert ved å anvende en pUC eller pBR basert plasmidvektor, en ' fag basert vektor eller lignende. Ved utform-ing av degenererende probe, kan inosin bli anvendt for å minske grad av degenerering. Når en analysemetode som kan påvise TPO aktivitet på en spesifikk måte eller med en høy sensitivitet er tilgjengelig, er det mulig å gjennomføre ekspresjonskloning ved å ta i bruk et ekspresjonsbibliotek slik det ble anvendt i foreliggende oppfinnelse.

Siden innhold av human TPO-kodende RNA imidlertid synes å være ekstremt lavt i normal human lever hvor dette beskrives senere i eksempel 15 (innhold beregnet fra resultat av dette eksempelet var i et forhold på 1 til 3 pr million), blir hybridiserings-screening der et syntetisert oligonukleotid eller et rotte eller humant TPO cDNA fragment anvendt som en probe vil bli ekstremt vanskelig å gjennomføre, fordi antall kloner eller plakk som skal bli behandlet blir klumpete og senstivitet og spesifisitet ved hybri-diseringsmetoden er skadelig på de i PCR metoden. I forbindelse med foreliggende oppfinnelse er det faktisk gjennomført kolonihybirdisering på 2 millioner kloner i normal human lever cDNA bibliotek fremstilt i eksempel 13 ved å anvende et rotte TPO cDNA fragment som en probe, men et humant TPO cDNA klon hadde ikke evne til å bli oppnådd.

(I) Rekonstruksjon av human normal lever- avledet cDNA

Siden klon HL34 oppnådd i eksempel 15 syntes å inneholde et ufullstendig cDNA, ble et cDNA bibliotek rekonstruert ved åanvende et kommersielt normalt humant lever-avledet poly (A)<+> RNA preparat for å oppnå et komplett humant TPO cDNA. Biblioteket (hTPO-Fl) fremstilt ved å innføre vektor-ligert cDNA i E. coli DH5 inneholdt 1,0 x 10<6> transformanter (eksempel 20).

(J) Screening av TPO cDNA klon, sekvensbestemmelse og ekspresjon av human TPO cDNA. og bekreftelse av TPO aktivitet

Primere for PCR ble syntetisert basert på nukleotidsekvens (SEQ DD NO: 3) av en partiell cDNA oppnådd i eksempel 14 og nukleotidsekvensen (SEQ ID NO: 196) fra en komplett cDNA fra human TPO som angitt i eksempel 19.

Human lever cDNA bibliotek (hTPO-Fl) konstruert i eksempel 20 ble delt i tre poler (pol #1-3). PCR ble gjennomført ved å anvende plasmid DNA fremstilt fra hver pol som et templat og syntetiserte primere. Som resultat ble et DNA fragment som har en forventet størrelse amplifisert når plasmid DNA fremstilt fra pol #3 ble anvendt. #3 polen ble deretter delt i under-poler hver inneholdende 15.000 transformanter og screening ved å anvende PCR ble gjennomført som over. Som resultat ble amplifisering av DNA som har den forventede størrelse funnet i 6 av 900 poler. Når en av disse positive polene delt i underpoler, hver inneholdende 1000 kloner og plasmid DNA ble ekstrahert og PCR ble gjennomført på samme måte, ble DNA amplifikasjon ikke observert. Dette betraktes åvære forårsaket av en lav utvinning av plasmid DNA som skyldes dårligere vekst av det interessante klonet i forhold til andre kloner. Opprinnelig #3 pol ble derfor spredd på 100 LB plater på en slik podningsstørrelse at 4100 kolonier vokste på hver LB plate, og i en replikaplate ble fremstilt ved hver av de således podede platene. Når PCR anvender disse DNA ektraktene fra kolonier som vokste på platen ble gjennomført på samme måte måte som beskrevet over, ble det observert amplifisering av et bånd som forventet i en av 100 underpoler.

To replikafiltere ble fremstilt fra platen fra denne underpolen, og kolonihybridisering ble gjennomført ved åanvende den merkede proben (EcoRI/BamHI fragment av plasmid pEF18S-HL34). Som resultat var et enkelt signal betraktet åvære positiv ble observert. Kolonier ble samlet fra den opprinnelige platen og kodet igjen på en LB plate. DNA prøver ble fremstilt fra totalt 50 kolonier dyrket på platen og ble utsatt for PCR for til slutt å oppnå et klon med betegnelse pHTFl (eksempel 21). Ved screening av cDNA klonen, ble metoder slik som hybridisering, PCR og ekspresjonsklonet hovedsakelig anvendt og kombinasjonen av disse metodene øket effektivitet og sensitivitet av screeningen, eller minsket arbeidet. Når nukleotidsekvensen av det således oppnådde klonet pHTFl ble bestemt, fremkom det at klonet pHTFl hadde en åpen leseramme og aminosyresekvensen av proteinet betraktes å bli kodet av en åpen leseramme som fullstendig faller sammen med den utledede aminosyresekvensen (SEQ DD NO: 6) i human TPO. Nukleotidsekvensen var forskjellig fra den utledede (SEQ ID NO: 196) i 3 posisjoner, men disse forskjeller forårsaket ingen aminosyreutbytting. Det bekreftes at human TPO protein omfatter 353 aminosyresider som har en 21 aminosyresignal-sekvens. Når plasmid DNA blir fremstilt fra det således oppnådde klon pHTFl og transfektert med COSI celler, ble TPO aktiviteten funnet i dyrkningssupernatanten (eksempel 23).

(K) Screening av human TPO kromosomal DNA ved å plakkredusere,

sekvensbestemmelse og ekspresjon av human TPO

kromosomal DNA og bekreftelse av TPO aktivitet

Et genomisk bibliotek som er gitt av prof. T. Yamamoto ved Gene Research Center, Tohoku University ble inokulert på 19 NZYM plater i en slik podningsstørrelse at en plate inneholdt 30000 fagpartikler, og to ieplikafiltere ble fremstilt ved hver av de således fremstilte 18 plater. Et humant TPO cDNA fragment (baseposisjonstall 178 til 1025 i SEQ ID NO: 7) ble amplifisert ved PCR og renset. Ved å anvende det rensede fragmentet merket med <32>p som en probe, ble plakkhybridisering gjennomført. Som et resultat ble 13 positive signaler oppnådd. Plakk ble samlet fra de opprinnelige platene og podet igjen på NZYM plater i en slik podningsstørrelse av 1000 plakk ble dannet på en plate. To replikafiltere ble fremstilt fra hver av de resulterende platene ved å gjennomføre plakkhybridisering under samme betingelser som beskrevet over. Resultatet var at positive signaler ble detektert på alle filtere av de 13 gruppene. Et enkelt plakk ble utvunnet fra hver av de resulterende platene for å fremstille fag DNA. Fag DNA prøver som var fremstilt på denne måten fra 13 kloner ble undersøkt for tilstedeværelse av cDNA kodende region ved PCR. 5 av de 13 klonene syntes å inneholde hele aminosyrekodende region som var forventet fra cDNA. Som konsekvens ble en av disse klonene (klon 6HGT1) valgt og analysert ved Southern blotting (ved å anvende den forannevnte probe). Siden et enkelt bånd på 10 kb ble observert i det tilfellet med Hindin spalting, ble DNA fra klon OHGTl spaltet med Hindm og utsatt for agarosegelelektroforese. 10 kb båndet ble snittet ut av gelen, renset og underklonet i en kloningsvektor pUC13 for til slutt å oppnå et klon ved navn pHGTl (eksempel 24).

Når nukleotidsekvensen fra det således oppnådde klon pHGTl ble bestemt, ble DNA båret av klonet funnet å inneholde en hel kodende region av proteinet som forventet i eksempel 19, og nukleotidsekvensen av den kodende regionen faller fullstendig sammen med den i den forventede nukleotidsekvensen (SEQ TD NO: 196).

I tillegg inneholdt en region som tilsvarer aminosyre-kodende exon 4 intron og nukleotidsekvensen var forskjellige fra den i komplett cDNA båret av klon pHTFl oppnådd i eksempel 21 (SEQ ID NO: 7).

Når nukleotidsekvensen av de fire gjenværende klonene blant 5 kromosomale DNA

kloner uavhengig ble valgt ved screening ble bestemt, ble det funnet at to av fire kloner var identiske med klon pHGTl og de to andre klonene var de samme som klon pHGTl med unntagelse av at de hadde et forskjellig nukleotid i 3'-ikke kodende region slik det observert med klon pHTFl (eksempel 25).

Et EcoRI fragment i det oppnådde plasmidklon pHGTl ble ligert med en ekspresjonsvektor PEF18S for å oppnå human TPO ekspresjonsplasmid pEFHGTE. Når plasmid DNA (pEFHGTE) ble fremstilt og transfektert i COSI celler, ble det funnet TPO aktivitet i dyrkningssupernatanten (eksempel 26).

(L) Fremstillin<g> av human TPO delesjonsderivater, ekspresjon i COSI celler

og bekreftelse av TPO aktivitet

Resultatene fra eksempel 18 og 22 viste at human TPO protein kunne utvise biologisk aktivitet selv etter fjerning av dens karboksy-terminale ende. For således ytterligere å analysere biologisk aktive proteiner, ble delesjonsderivateksperimenter gjennomført. En serie av ekspresjonsplasmider ble fremstilt ved PCR ved å anvende DNA av plasmidklon pHT 1-231 oppnådd i eksempel 18 som et templat og syntetiserte oligonukleotider som primere.

Ekspresjonsplasmider som inneholdt DNA som koder for human TPO delesjonsderivater som mangler karboksyl-terminal region av TPO proteinet, det vil si delesjonsderivater som koder for posisjoner 1-211,1-191,1-171 og 1-163 aminosyresekvens, ble oppnådd. Når plasmid DNA ble fremstilt fra hver av klonene og transfektert i COSI celler, ble det påvist TPO aktivitet i hver av dyrkningssupernatantene (eksempel 27).

Når derivater som har en serie av delesjoner av C-terminale aminosyresider opp til 151 posisjon og andre derivater som har respetiv utelatelse av N-terminal side aminosyreresidier opp til 6,7 og 12 posisjon ble utformet og aktivitet etter ekspresjon i COSI celler ble målt for å analysere TPO- aktivitets-bærende region ytterligere i detalj, og aktiviteten ble udetekterbar når N-terminal side aminosyreresidie blir utelatt opp til 7 posisjon eller C-terminal side aminosyresider blir utelatt opp til 151 posisjon.

(Eksempler 28 og 29).

Derivater av et protein som har TPO biologisk aktivitet kan oppnås ved modifisering (delesjon, substitusjon, innskudd eller addisjon) av cDNA kodende protein. Metoder slik som PCR, setetrettet mutagenese og kjemisk syntese kan bli anvendt for modifikasjon.

(M) Ekspresjon av human TPO cDNA i CHO celler og rensing av TPO

En ekspresjonsvektor pHTPl ble konstruert og denne kan uttrykke cDNA som koder for et utledet aminosyresekvens av human TPO som vist i SEQ ID NO: 6, i animalske celler. (Eksempel 30).

TPO cDNA region i pHTPl ble anvendt for å konstruere en vektor pDEF202-hTPO-Pl for dens ekspresjon i CHO celler. (Eksempel 31).

Som et resultat av transfeksjon av vektoren i CHO celler og etterfølgende seleksjon av transfekterte celler, ble transfekterte celler hvori ekspresjonsvektoren som bærer human TPO cDNA har blitt integrert i kromosomet av CHO oppnådd. (Eksempel 32).

I eksempel 32 ble storskaladyrking gjennomført på en human TPO produserende CHO cellelinje (CHO 28-30 celle, resistent til 25 nM MTX) som blir fremstilt ved transfektering av human TPO ekspresjonsplasmid pDEF202-hTPO-Pl i CHO celler. (Eksempel 55).

Fra dyrkningssupernatanten ble 100 L, human TPO renset. (Eksempel 56).

Alternativt ble human TPO renset fra dyrkningssupernatanten i eksempel 55 på en ulik måte. (Eksempel 57).

(N) Ekspresjon av human TPO cDNA i X63. 6. 5. 3. celler og bekreftelse på

aktivitet

Ved å anvende TPOm cDNA region kodet i plasmid pBLTEN fremstilt i eksempel 30 ble en ekspresjonsvektor BMCGSneo- hTPO-Pl konstruert for anvendelse i X63.6.5.3. celler. (Eksempler 33).

Når X63.6.5.3. celler ble transfektert med denne vektoren, ble det oppnådd en transformantcelle der human cDNA kodende ekspresjonsvektor var integrert i kromosomet. Når denne cellen ble dyrket, ble TPO aktiviteten påvist i dyrkningssupernatanten. (Eksempel 34.

(O) Stormen<g>de ekspresjon av human TPO i COS 1 celler, og rensing,

molekylvektsmåling og biologiske karaktertrekk derav Ekspresjonsvektoren pHTPl fremstilt i eksempel 30 ble transfektert i COS 1 celler for å oppnå en stor mengde (totalt ca 40 liter) dyrkningssupernatant inneholdende ekspresjonsprodukter. (Eksempel 35).

Rensing av TPO ble gjennomført fra ca 7 liter COS 1 celle serumfri dyrkningssupernatant fremstilt i eksempel 35 inneholdende ekspresjonsvektoren pHTPl-avledet TPO. Det var mulig å oppnå høy aktivitets TPO gjennom trinnet av en hydrofob interaksjonskromatografi, en kationbytte kolonnekromatografi, en WGA kolonne kromatografi og en revers fase kolonne kromatografi. (Eksempel 36).

TPO som ble delvis renset fra COS 1 dyrkningssupernatanten var gjenstand for molekylvektsmåling og biologisk karaktertrekkanalyse. (Eksempel 37 og 38).

(P) Ekspresjon av human TPO i E. coli

En vektor pGEX-2T/hT(l-174) ble konstruert for anvendelse i ekspresjon av et fusjonsprotein (blir referert til som "GST- TPO(l-174)") av glutation-S-transferase og human TPO (aminosyreresidier i posisjonene 1 til 174) i E. coli. I dette tilfellet ble en del av human TPO cDNA nukleotidsekvensen (ca halvparten av området på 5'-side) byttet ut med E. coli preferansekodon. (Eksempel 39).

GST-TPO( 1-174) blir uttrykt i E. coli, og de resulterende cellene ble disintegrert og deretter ble GST-TPO( 1-174) inneholdt i den utfelte fraksjonen gjort oppløselig.

Som et resultat av kombinasjon av forskjellige trinn inkludert undersøkelse av TPO gjenfoldingsbetingelser, undersøkelse av rensebetingelser (glutation affinitetskolonne, kationutbyttingskolonne og lignende) og spaltning av GST protein region med trombin, var det mulig å gjennomføre delvis rensning av et protein inneholdende en TPO aminosyresekvens som utformet. Det ble bekreftet at dette proteinet viser TPO aktivitet i rotte CFU/MK analysesystem. (Eksemplene 40 og 41).

En vektor pCFM536/h6T(l-163) ble også konstruert for anvendelse i ekspresjon i E. coli av et mutasjonstype human TPO protein (blir her referert til som "h6T(l-163)")" der i 1-posisjon er Ser residie og 3-posisjon Ala residie i human TPO (aminosyreresidier i posisjoner 1 til 163) henholdsvis erstattet med et Ala residie og et Val residie, og samtidig et Lys residie og et Met residie ble henholdsvis tilsatt -1 og -2 posisjoner. Hele delen av human TPO cDNA nukleotidsekvensen (tilsvarende 1 til 163 aminosyreresidier) båret av denne vektoren ble byttet ut med E. coli preferansekodon.

(Eksempel 42).

h6T( 1-163) ble uttrykt i E. coli, de resulterende cellene ble lysert og deretter ble løsningen av h6T (1-163) inneholdt i den utfelte fraksjonen og forholdene for å gjenf olde proteinene undersøkt, og dermed lykkes man i delvis rensing av et protein som inneholder en TPO aminosyresekvens som utformet. Det ble bekreftet at proteinet viser TPO aktivitet i rotte CFU-MK analysesystemet. (Eksempel 43 og 44).

I tillegg ble en vektor pCFM536/hMKT(l-163) konstruert for anvendelse i ekspresjon i E. coli av et mutasjonstype human TPO protein (som ble referert til som "hMKT(l-163)") der et Lys residie og Met residie henholdsvis ble tilsatt -1 og -2 posisjoner. hMKT(l-163) ble uttrykt i E. coli på samme måte som beskrevet i eksempel 43, og ekspresjonsproteinet var utsatt for SDS-PAGE, overført på en PVDF membran og deretter gjenstand for N-terminal aminosyresekvensanalyse, og som dermed bekrefter at dette proteinet inneholder den utformede aminosyresekvensen. (Eksempel 52).

I tillegg ble vektoren pCFM536/hMKT(l-332) for ekspresjon i E. coli av en mutasjonstype human TPO protein der et Lys residie ble tilsatt i posisjon -1 og Met residie i posisjon -2 og human TPO (aminosyreposisjoner 1 til 332) (referert til som "hMKT (1-332)") konstruert. hMKT (1-332) ble uttrykt i E. coli på samme måte som i eksempel 42, og dens ekspresjon ble bekreftet ved Western blotting ved å anvende anti-human TPO peptidantistoff fremstilt i eksempel 45 som angitt under.

(Q) Fremstilling av anti- TPO peptidantistoff og anti- TPO peptid

antistoffkolonne

Kaninpolyklonal anti-TPO peptidantistoffer ble fremstilt ved syntetiserte peptider tilsvarende de tre partielle regionene av rotte TPO aminosyresekvensen som ble bestemt i eksempel 10. Det ble bekreftet at disse antistoffene kan gjenkjenne rotte og humane TPO molekyler. Videre ble peptider som tilsvarer seks partiale regioner av aminosyre-sekvensen av human TPO viste i SEQ ID NO: 6 (eller SEQ ID NO: 7) syntetisert og deretter benyttet for å fremstille kaninpolyklonal anti-TPO peptidanitstoffer. Resulterende antistoffer ble bekreftet å gjenkjenne human TPO. (Eksempel 45).

Det er mulig å rense TPO ved en affinitetskolonne kromatografi som anvender en kolonne pakket med visse molekyler som har bindingsaffinitet for TPO, slik som anti-TPO antistoffer, TPO reseptorer og lignende blir bundet. Som en konsekvens ble en anti-TPO-antistoff kolonne først fremstilt ved å binde anti-TPO-pepitdantistoffet oppnådd i eksempel 45. (Eksempel 46).

Rensing av human TPO uttrykt i COS 1 celler ved å anvende anti-TPO peptidantistoffkolonne, og

molekylvekt og biologiske karaktertrekk derav

Ved å anvende en dyrkningssupernatant fra transfeksjon av COS 1 celler med ekspresjonsvektor pHTPl som et utgangsmateriale, ble delvis renset TPO oppnådd og applisert på anti-TPO- antistoffkolonnen. Siden TPO aktiviteten ble funnet i adsorbert fraksjon, ble denne fraksjonen videre gjenstand for en revers fase kolonnekromatografi for å rense protein og undersøke dens molekylvekt og biologiske karaktertrekk.

(Eksempel 47).

Bekreftelse av aktivitet av partiell renset

prøve av human TPO uttrykt i COS 1 celler

TPO-aktiv fraksjon renset i eksempel 36, nemlig TPO prøve renset opp av trinnet fra Capcell Pak CI 300A kolonne fra en dyrkningssupernatant oppnådd ved transfektering av COS 1 celler med ekspresjonsvektor pHTPl, ble undersøkt for dens biologiske . aktiviteter for å bestemme om den utøver en blodplateøkende virkning i det levende legemet. (Eksempel 48).

En rå TPO fraksjon oppnådd ved en kationbyttekolonne fra 33 liter av en dyrkningssupernatant fremstilt ved transfektert COS 1 celler med ekspresjonsvektor pHTPl ble undersøkt for dens biologiske aktiviteter for å finne at den øket blodplatetallet i legemet.

(Eksempel 49).

Ekspresjon av human TPO kromosomal DNA i CHO

celler og bekreftelse på aktivitet

En vektor pDEF202-ghTPO ble konstruert for anvendelse i ekspresjon av human TPO kromosom i CHO celler. (Eksempel 50).

Når denne vektoren ble innført i CHO celler, ble det oppnådd en transformerende celle hvori human TPO kromosomal DNA kodende ekspresjonsvektor var integrert i kromosom. Når dette celleklonet var dyrket, ble TPO aktiviteten påvist i dyrkningssupernatanten. (Eksempel 51).

Delvis rensing og aktivitetsbekreftelse av

mutasjonstype human TPO uttrykt i E. coli

Mutasjonstype human TPO avledet fra human TPO nukleotidsekvens-kodende klon, pCFM536/h6T( 1-163) og uttrykt i E. coli ble gjenstand for gjenfolding ved å anvende guanidinhydroklorid og glutation for å finne at det således oppnådde h6T(l-163) utøver en blodplatetall økende virkning i det levende legemet. (Eksempel 53). Mutasjonstype human TPO avledet fra human TPO nukleotidsekvens kodende klon, pCFM536/h6T( 1-163) og uttrykt i E. coli var gjenstand for gjenfolding ved å anvende natrium N-aluroyl sarcosinat og kobbersulfat og deretter til en kation-utbyttingskromatografi for å finne at det således rensede h6T( 1-163) øket blodplatetallet i det levende legemet. (Eksempel 54).

I tillegg ble gjenfolding og rensing av mutasjonstype human TPO, h6t (1-163) gjennomført for å anvende andre prosedyrer. (Eksempel 60 og 61).

(V) Ekspresjon av human TPO cDNA i innsektsceller

og identifikasjon av TPO aktivitet

En rekombinant virus for ekspresjon av human TPO i insektceller ble fremstilt (eksempel 58) og uttrykt i insektscelle Sf21, og deretter ble TPO aktiviteten identifisert i dyrkningssupernatanten. (Eksempel 59).

(W) Ekspresjon av human TPO (aminosyreposisjoner 1 til 163) i CHO celler og rensing derav.

Vektoren pDEF202-hTPO163 for ekspresjon i CHO celler av human TPO protein (referert til som "hTP0163") som har aminosyre 1 til 163 i human TPO aminosyresekvens vist i SEQ ID NO: 7 ble konstruert. Ekspresjonsvektoren av pDEF202-hTPO163 ble transfektert inn i CHO celler og den således oppnådde hTP0163-produserende CHO cellelinje ble dyrket i stor skala. Fra supernatanten av dyrkningen ble hTPO 163 renset. (Eksempel 62 til 65).

(X) Fremstilling av substitusjonsderivater av human TPO

Et derivat (referert til som "N3/TPO") der Arg-25 og Glu-231 av human TPO har blitt substituert ved henholdsvis Asn og Lys, ble fremstilt så vel som et derivat (referert til som "09/TPO") der His-33 har blitt erstattet med Thr.

Et plasmid som koder for hvert derivat ble transfektert i COS7 celler som deretter ble dyrket. TPO aktiviteten ble påvist i supernatanten av dyrkningen. (Eksempel 67).

Derivater der en aminosyre av h6T( 1-163) har vært substituert med en annen aminosyre ble fremstilt ved å anvende E. coli ekspresjonssystem. TPO aktiviteten ble funnet i hvert derivat. (Eksempel 94).

(Y) Fremstilling av innskudd eller delesionsderivater av human TPO

En aminosyre blir innskutt i eller utelatt fra hTPO 163 for åfremstille dens innskudd eller delesjonsderivater, og deretter ble COS7 celler transfektert med plasmider som koder for de resulterende derivatene. I supernatanten av COS7 cellekulturer, ble TPO aktiviteten påvist. (Eksempel 68).

En fremgangsmåte for måling av TPO aktivitet (et in vitro analysesystem) som ble anvendt i foreliggende oppfinnelse er beskrevet i følgende som "referanseeksempel".

(Z) Fremstillin<g> og rensing av anti- human TPO antistoffer Polyklonale antistoffer ble fremstilt ved å anvende peptidfragmenter og human TPO (eksempel 69) og etterfølgende utnyttelse i Western blot analyse (eksempel 70) og i konstruksjon av anti-TPO antistoff affinitetskolonner (eksempel 719.

(AA) In vivo aktivitet av human TPO

Renset human TPO ble administrert til mus med indusert trombocytopeni og endringer i platetall ble registrert versus en kontrollgruppe. (Eksempel 72), til (eksempel 79). Farmasøytisk sammensetning er beskrevet som potensiell nyttig i behandling av trombocytopeni. (Eksempel 80) til (eksempel 89).

(BB) TPO aktivitet som en funksjon av MLP reseptorbinding En analyse blir tilveiebragt der TPO aktiviteten er definert på bakgrunn av spesifikk bindingsinteraksjon med Mpl reseptoren. (Eksempel 90) til (eksempel 93).

Referanseeksempel

A. Rotte megakaryocyt progenitor celleanalyse

( rotte CFU- MK analyse) system ( flytende dyrkningssvstem) Megakaryocyter innkorporerer og lagrer serotonin i cytoplasmisk tette granuler gjennom en aktiv, energiavhengig prosess (Fedorko, Lab. Invest., vol. 36, s. 310-320,1977). Dette fenomenet kan observeres allerede i små og mononukleære acetylcholinesterase-positive celler som betraktes å være anbragt mellom CFU-MK og gjenkjennbare megakaryocyter (Bricker and Zuckerman, Ecp. Hematol., vol. 12, s. 672, 1984). Mengden av serotonin innkorporert øker i respons til økninger av størrelsen på megakaryocyter (Schick and Weinstein, J. Lab. Clin. Med., vol. 98, s. 607-615,1981). I tillegg er det kjent at slike fenomener bare er spesifikke for megakaryocytceller blant benmargceller (Schinck and Weinstein, J. Lab. Clin. Med., vol. 98, s. 607-615, (1981). I foreliggende analysesystem blir høyt anrikede rotte CFU-MK celler (GpHb/ina<+> CFU-MK fraksjon som vil beskrives senere) dyrket i nærvær av prøver som skal bli analysert, og innkorporering av <l4>C-serotonin (<l4>C-hydroksytryptarnin creatinsulfat; <*4>C-5HT) inn i megakaryocyter dyrket fra CFU- MK blir målt.

Fordeler ved dette analysesystemet er at den indirekte påvirkningen av kontaminerte celler (for eksempel dannelse av Meg-CSF aktivitet ved kontaminerte celler stimulert av en viss substans som er forskjellig fra den interessante faktoren, eller dannelse av en viss faktor ved kontaminerte celler, som gjennomgår en kombinert virkning med den aktuelle faktoren) kan bli redusert, fordi prosentdelen av CFU-MK celler i GpIIbÆQa"<1>" CFU-MK fraksjon er markert høy (se følgende (analysemetode) mens antall kontaminerende celler er lav. I tillegg kan passende dyrkningsbetingelser bli opprettholdt for en relativt lang periode, fordi total antall celler som er sådd pr brønn er lite. En annen fordel er at antall stor-størrelse modne megakaryocyter dyrket fra CFU-MK i nærvær av en aktiv prøve under en dyrkningsperiode kan visulet påvises under et fasekontrast-mikroskop, og gjør det således mulig med kvalitativ bedømmelse av tilstedeværelse og grad av aktivitet. Resultatene av denne kvalitative bedømmelsen tilsvarer godt resultatene av kvantitativ bestemmelse basert på innkorporering av <14>c-serotonin. Påliteligheten av den kvantitative bestemmelsen kan bli videre forbedret ved samlet anvendelse av kvalitativ bedømmelse.

Analysemetode:

Høyt anriket rotte CFU-MK celler (Gpnb/DIa+ CFU-MK fraksjon) anvendt i analysen ble fremstilt ved svak modifisering av fremgangsmåten til Miyazaki et al. (Exp. Hematol., vol. 20, s. 855-861,1992).

I korthet blir femur og tibia fjernet fra Wister rotter (hanner, 8 til 12 uker gamle) for å fremstille benmargcellesuspensjon som beskrevet. Et suspendeirngsmedium (en oppløsning bestående av 13.6 mM trinatriumcitrat, 11.1 mM glukose, 1 mM adenosin, 1 mM teofyllin, 10 mM HEPES (pH 7.25), 0.5% bovin serumalbumin (som blir referert til som "BSA" heretter) (Path-O-cyte 4; Seikagaku Kogyo Col., Ltd.) og Ca<2+> og Mg<2+_ >fri Hanks balanserte saltoppløsning: vil heretter bli referert til "HATCH oppløsning") som er en svakt modifisert versjon av megakaryocytseparasjonsmedier rapportert av Levin og Fedoroko, Blood, vol. 50, s. 713-725,1977) blir anvendt for fremstilling av benmargcellesuspensjon. Den således fremstilte benmargcellesuspensjonen blir anbragt lagvis over en Percoll diskontinuerlig tetthetsgradientløsning (tetthet; 1.050 g/ml( 1.063 g/ml/1.082 g/ml) som blir fremstilt ved å fortynne percoll oppløsning (fremstilt ved Pharmacia) med HATCH løsning, og sentrifugert ved 20°C i 400 x g i 20 minutter. Etter sentrifugering blir cellene mellom 1.063 g/ml og 1.082 g/ml tetthetslag gjenvunnet. Etter vasking blir gjenvundne celler suspendert i Iscoves modifiserte Dulbeccos dyrkningsmedium (blir heretter referert til sopm "IMDM dyrkningsmedium") inneholdende 10% føtalt kalveserum (blir heretter referert til som "FCS"), anbragt i 100 mm vevsdyrkningsplastskåler og dyrket ved 37°C i 1 time i en 5% CO2 inkubator. Etter inkubasjon ble ikke-festede celler gjenvunnet og dyrket igjen i plastskåler ved 37°C i 1 time. Ikke-festede celler ble suspendert i HATCH løsning og inkubert i 1 time på 100 mm bakteriologiske petriskåler til hvilken en mus monoklonalt anti-kaninplate GpIIb/ma antistoff, P55 antistoff (Miyazaki et al., Thromb. Res., vol. 59, s. 941-953, 1990) tidligere hadde blitt adsorbert. Etter inkubasjon ble ikke-festede celler fjernet ved gjennomvasking med HATCH løsning, og gjenværende celler adsorbert til immobilisert P55 antistoff blir frigjort ved pipettering og oppsamlet. Generelt oppnås 3-4 x 10<5 >celler fra en rotte. Den således oppnådde cellefraksjonen inneholder høyt anriket rotte CFU-MK (heretter referert til som "GpIIb/IIIa<+> CFU-MK fraksjon"), og det er kjent at denne cellefraksjonen inneholder ca 5 til 10% CFU-MK basert på målinger av et koloni analysesystem i nærvær av en mettet konsentrasjon av rotte IL-3. Et hybridoma som har evnen til å fremstille det forannevnte P55 antistoffet har blitt deponert under deponeringsnummer FERM BP-4563 i National Institute of Bioscience and Human Technology, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry 14. februar 1994.

Deretter ble celler av de således oppnådde GpIIb/lIIa<+> CFU- MK fraksjon suspendert i IMDM dyrkningsmedium inneholdende 10% FCS og dispendensert i porsjoner på IO<4 >celler pr brønn av en 96 brønn vevsdyrkningsplate. Hver brønn blir ytterligere supplert med en standardprøve (som vil bli beskrevet i detalj i det etterfølgende), eller en prøve som skulle bli analysert, for dermed å justere sluttmedievolumet til 200 (xl/brønn. Den således fremstilte platen blir anbragt i en CO2 inkubator og inkubert i 4 dager ved 37°C. På fjerde dag av inkubasjonen, ble 0.1 [iCi (3.7 KBq) <l>^C-serotonin tilsatt hver brønn 3 timer før fullføring av dyrkingen, og sluttinkuberingen blir fortsatt ved 37°C. Etter 3 timers inkubasjon blir platen sentrifugert ved 1000 rpm i 3 minutter og det resulterende supernatantfluidet blir fjernet ved avsuging. En 200 ul del PBS inneholdende 0.05% EDTA blir tilsatt hver brønn, og platen blir sentrifugert for å vaske platen ved fjerning av den resulterende supernatantfluiden. Dette vasketrinnet blir gjentatt en gang igjen. En 200 ul del av 2% Triton X-100 blir tilsatt den således oppnådde pelleten av celler i hver brønn, og platen ble ristet på en plateblander omtrent 5 til 10 minutter for å lysere cellene grundig. En 150 ul porsjon av det således oppnådde cellelysatet ble overført i en kommersiell dekkcelle-formet faststoff scintillator (Ready Cap; fremstilt av Bechman) som deretter blir stående over natten ved 50°C i en ovn for å tørke lysatet. Neste dag blir Ready Cap anbragt i et glass for å måle radioaktivitet av <14>C ved en væskescintillasjonsteller.

I dette tilfellet kan nesten samme resultater som de fra ^ C- serotonin inkorporerings-analysen bli oppnådd når acetylcholinesterase aktivitet i det forannevnte cellelysatet blir målt i henhold til fremgangsmåten til Ishibashi og Burstein (Blood, vol. 67, s. 1512-1514,1986).

Standardprøver:

Først ble blodplasma fra trombocytopene rotter fremstilt på følgende måte for anvendelse i fremstilling av standardprøver.

Normale hann Wistar rotter (7 til 8 uker gamle) ble gjort trombocytopene ved intravenøs administrering av det forannevnte P55 antistoff med en dose på 0,5 mg pr dyr, to ganger med et intervall på ca 24 timer. Ca 24 timer etter den andre administreringen, ble blodet samlet fra abdominal aorta under eteranestesi ved å anvende en 10 ml kapasitetssprøyte hvori 1 ml 3.8% (v/v) trinatriumcitrat løsning hadde blitt inkludert som et anti-koaguler-ingsmiddel. Den således oppsamlede blodprøven ble dispensert i plastsentrifugeringsrør og sentrifugert ved 1.200 x g i 10 minutter for å utvinne blodplasmafraksjon. Den således utvunnede blodplasmafraksjonen ble gjensentrifugert ved 1.200 x g i 10 minutter, og resulterende blodplasmafraksjon ble gjenvunnet, og er forsiktig for å unngå pellet bestående av celler, blodplater og lignende, og samles. (Blodplasma oppnådd på en slik måte blir deretter referert til som "TRP"). Ca-behandlet TRP (standardprøve C), WGA-agarosekolonne aktiv fraksjon (standardprøve W) eller fenyl sepharose 6 FF/LS kolonne aktiv fraksjon (standardprøve P) oppnådd fra TRP i overensstemmelse med fremgangsmåten i eksempel 1 ble dialysert omfattende mot et tilstrekkelig volum av IMDM dyrkningsmedium og anvendt som analysestandarder.

I rotte TPO renseprosessen som beskrevet i eksempel 1, ble standardprøve C anvendt i tidlig trinn, men ble endret til standardprøve W halvveis deretter og deretter til standard-prøve P. Spesifikk aktivitet av standardprøve C ble definert tentativt som 1, og relative aktiviteter av standardprøvene W og P ble beregnet basert på definisjonen. Relativ aktivitet av hver prøve som skulle analyseres ble bestemt ved å sammenligne dose-responskurven av standardprøven i forhold til de av prøvene som skulle bli analysert, og relativ aktivitet av prøven som skulle bli analysert ble definert som n der dens aktivitet er n ganger høyere enn den til standardprøve C.

B. Kolonianalvsesvstem

I dette analysesystem ble benmargceller dyrket i et halv-fast dyrkningsmedium i nærvær av en prøve som skulle bli analysert, og Meg-SCF aktivitet ble målt ved telling av antall megakaryocytkolonier dannet ved proliferasjon og differensiering av CFU-MK.

Analysemetode:

(a) I det tilfellet med anvendelse av useparert rotteben

margsceller og lignende

En 1 ml sluttvolum av IMDM dyrkningsmedium inneholdende u- separert rottebenmargceller, celler oppnådd i hvert separasjonstrinn fra Gpllb/Illa<+> CFU-MK av det forannevnte analysesystem A, eller celler fra GpIIb/IIIa<+> CFU-MK fraksjon, og 19\0% FSC, 2 mM glutamin, 1 mM natriumpyruvat, 50 |xm 2-merkaptoetanol og 0.3% agar (AGAR NOBLE), fremstilt av DIFCO) ble anbragt i en 35-mm vevskultur plastskål, og etter størkning ved romtemperatur, dyrket ved 37°C i en CO2 inkubator. Generelt blir antall celler pr skål justert til 2- 4 x IO<5> i tilfellet med useparerte benmargceller, 2-5 x IO<4> i det tilfellet med celler fra trinnet av Percoll densitetsgradient eller fra adherens utvasking, eller 0.5-2 x 10<3> i det tilfellet med celler av GpIIb/ma<+> CFU-MK fraksjon. Etter 6 til 7 dager av dyrkningen, ble agarskivene løsnet fra skålene og anbragt på glass-plater (76 mm x 52 mm). For åtørke hver agarskive, ble et stykke av 50-m nylonmesh og filterpapir plassert, i den rekkefølge over gelen. De således tørkede agarplatene ble varme-fiksert i 5 minutter ved 50°C på en varm plate og dyppet i 2 til 4 timer i en acetylcholinesterase fargende oppløsning fremstilt i henhold til fremgangsmåten til Jackson (Blood, vol.42, s. 413-421, 1973). Når tilstrekkelig farging av megakaryocyter blir bekreftet, blir agarplatene vasket med vann, tørket, utsatt for etter- farging med Harris hematoxylin oppløsning i 30 sekunder, vasket med vann og deretter lufttørket. Megakaryocytkolonier defineres som tre eller mer tett grupperte acetylcholinesterase-positive celler. (b) I det tilfellet med anvendelse av useparerte musbenmargceller Kolonianalysen kan bli gjennomført på samme måte som prosedyre (a) over ved å anvende 2-4 x 10<5> celler pr skål.

(c) I det tilfellet ved anvendelse av human benmargceller

eller humane margblodceller

Humane benmargceller eller humane margblodceller kan bli anvendt slik de er, eller som CFU-MK fraksjoner anriket på følgende måte.

Først ble benmargfluid eller margblod lagt over lymfoprep (fremstilt av Daiichi Kagaku Col., Ltd) og sentrifugert, og den resulterende grensesnitt leukocytfraksjonen ble gjenvunnet. Fra den således gjenvunnede cellefraksjonen, ble celler til hvilken biotinylerte monoklonale antistoffer spesifikke for humane overflateantigener binder (CD2, CD1 lc og CD 19), fjernet med avidin-bundede magnetiske perler. Celler fjernet ved den magnetiske perlemetoden er hovedsakelig B celler, T celler, makrofager og en del av granulocyter. De gjenværende cellene blir farget med FlTC-merket anti-CD34 antistoff og PE-merket anti-HLA-DR antistoff, og deretter blir en CD34- og HLA-DR-positiv fraksjon gjenvunnet ved å anvende en cellesorterer (for eksempel ELITE fremstilt av COULTER). CFU-MK celler ble konsentrert i denne fraksjonen (som blir referert til som "CD34<+>DR<+> CFU-MK fraksjon"). Kolonianalyse av humane celler kan bli gjennomført på samme måte som i det forannevnte tilfellet ved anvendelse av rottebenmargceller, med unntagelse av at 3-5 x IO<3> celler av CD34<+>DR<+> CFU-MK fraksjon ble anvendt i en skål og en blanding av 12.5% human AB plasma og 12.5% FCS ble anvendt i stedet for 10% FCS. Dyrkningsperioden for dannelse av megakaryocytkolonier er 12 til 14 dager for påvisning av humane megakaryocyter, ble immunologisk fargin av megakaryocyter gjennomført ved en alkalisk fosfåtase-anti-alkalisk fosfatase antistoffmetode med et mus monoklonalt antistoff spesifikt for en megakaryocyt-overflate antigen GpHb/IJIa (for eksempel, Teramura et al., Exp. Hematol., vol. 16, s. 843- 848,1988), og kolonier hver bestående av tre eller flere megakaryocyter ble opptelt. C. Analysesystem med en human megakrvoblastcellelinje ( M- 07e analyse) M-07e celler, en human megakaryoblast cellelinje, prolifererer som respons til GM-CSF, IL-3, SCF, IL-2 og lignende (Avanzi et al., J. Cell. PhysioL, vol. 145, s. 458-464, 1990). Siden disse cellene også responderte til TPO, kunne de anvendes til et substitutivt analysesystem for rotte CFU-MK analysesystem.

Analysemetode:

M-07e celler ble holdt i nærvær av GM-CSF blir gjenvunnet, vasket grundig og deretter suspendert i JMDM dyrkningsmedium inneholdende 10% FCS. Resulterende M-07e cellesuspensjon blir dispensert i porsjoner på IO<4> celler i brønner av en 96 brønn vevsdyrkningsplate, og hver brønn blir videre supplert med en standardprøve eller en prøve som skulle analyseres, for derved å justere sluttvolumet til 200 [il/brønn. Den således fremstilte platen blir anbragt i en 5% CO2 inkubator og inkubert i 3 dager ved 37°C. Etter 3 dyrkningsdager, ble 1 (xCi (37 KBq) <3>H-thymidin tilsatt hver brønn 4 timer før fullført dyrking. Etter fullført dyrking, blir cellene samlet på et glassfiber ved å anvende en cellehøster for å måle <3>H- radioaktivitet med en væskescintillasjonsteller (for eksempel Beta Plate fremstilt av Pharmacia).

Et analyses<y>stem ( Ba/ F3 anal<y>se) hvori en mus pro- B cellelinje blir anvendt

Mus pro-B cellelinje Ba/F3 er kjent som en cellelinje som prolifererer som respons til IL3, IL4 og lignende (Palacios et al., Cell. vol. 41, s. 727-734). Siden dens understamme BF-TE22 har evne til celleproliferasjon som respons til ikke bare 1L3 og JL4, men også TPO, kan den bli anvendt i et analysesystem som en erstatning for rotte CFU-MK analyse eller human megakaryoplastcellelinje-hjulpet analyse (M-07e analyse) som følger. I korthet blir BF-TE22 celler som vokser i Iscoves modifiserte DMEM medium (IMDM:GIBCO) i nærvær av 1 ng/ml mus IL-3 utvunnet, vasket tre ganger med IMDM og suspendert i IMDM medium inneholdende 10% FCS. Deretter blir cellesuspensjonen dispensert i brønner på en 96 brønns veddyrkningsplate med en tetthet på 1 x IO<4> celler pr brønn, hver brønn blir videre supplert med en standard TPO løsning eller en prøve som skal undersøkes og justert til et sluttvolum på 200 fil/brønn. Den resulterende platen inkubert i 2 til 3 dager i en 5% CO2 inkubator. På den andre eller tredje dagen ble 1 (iCi (37 KBq) <3>H-thymidin tilsatt hver brønn og dyrkingen blir fortsatt ytterliger 4 timer. Deretter ble cellene samlet på et glassfiberfilter ved å anvende en cellehøster for å måle <3>H radioaktivitet med en væskescintillasjonsteller. I dette analysesystemet døde nesten alle cellene dyrket i media som mangler TPO aktivitet og innkorporerer derfor ikke <3>H-thymidin. Celler dyrket i media inneholdende TPO aktivitet viser imidlertid aktivi proliferasjon på en TPO konsentrasjon-avhengig måte og innkorporerte <3>H-thymidin. I tillegg er resultater av denne analysen parallell med de fra M-07e og CFU-MK analysene.

De følgende eksemplene er skaffet tilveie for <y>tterligere åillustrere foreliggende oppfinnelse.

EKSEMPEL 1- 1

Rensing av rotte TPO fra blodplasma av trombocytopene rotter indusert ved anti-blodplateantistoff administrering. Fremstilling av blodplasma av trombocytopene rotter indusert ved anti- blodplate antistoff administrering TRP ble fremstilt som rensningskilden fra ca 1000 rotter i overensstemmelse med fremgangsmåten som er beskrevet i forannevnte (referanseeksempel) A, rottemegakaryocyt forløpercelle (CFU-MK) analysesystem.

Rensing av rotte TPO fra TRP

Til å begynne med ble rensingen gjennomført ved å anvende TRP fra ca 1000 rotter på en antagelse at TPO innhold i TRP ville være 1 pr tre millioner for det meste, og litt mindre enn 1 pmol av delvis renset rotte TPO ble oppnådd. Selv om det er vanskelig generelt ble det gjort et forsøk på å analysere dens partielle aminosyresekvenser og tre partielle aminos<y>resekvenser ble oppnådd, men med lav nøyaktighet. Disse sekvensene falt sammen med eller er nær aminosyresekvensen av en serinprotease hemmer (SP1) som er fremstilt i lever. Det var uklart fra disse resultater om TPO har en struktur som tilsvarer den i serin proteasehemmer eller om sekvensen er avledet fra de av kontaminerte proteiner forskjellige fra TPO. Ved å anvende disse usikre sekvensene, ble kloning av TPO genet fra et rotte cDNA bibliotek gjennomført, men potensielle TPO-kodende gener kunne ikke bli oppnådd. Deretter ble det gjennomført intensive studier basert på en antagelse at en slik svikt skyldes lav renhet og utilstrekkelig mengde av analysert prøve. For å oppnå en renset sluttprøve som var nødvendig for aminosyreanalyse, ble rensing gjennomført i overensstemmelse med en fremgangsmåte beskrevet i følgende (eksempel 1-2). Det ble overraskende estimert fra resultatene i (eksempel 1-2) at TPO innhold i TRP eller XRP (vil bli beskrevet under) var en ekstremt liten mengde som et hundre million til en milliard av totale plasmaproteiner, slik at fullstendig rensing av ekstremt vanskelig.

EKSEMPEL 1- 2

Rensing av rotte TPO fra blodplasma av trombocytopene rotter indusert ved total røntgen eller garnrna-stråling (fremstilling av blodplasma av trombocytopene rotter indusert ved total røntgen eller gamma-bestrålning)

Normale hannlige Wister rotter (7 til 8 uker gamle) ble gjort trombocytopene ved full-legeme bestråling med røntgen eller gammastråler ved en subletal dose (6 til 7 Gy). Blod ble samlet fra rottene den 14. dagen etter bestrålning og en blodplasmafraksjon (som heretter blir referert til som "XRP") ble fremstilt på samme måte som den forannevnte fremgangsmåten for fremstilling av TRP.

I dette tilfellet ble XRP (ca 8L) fremstilt fra totalt ca 1.100 rotter som rensekilden.

Rensing av TPO fra XRP

BLodplasma fra ca 1.100 rotter var for stor for og bearbeides samtidig fordi dens totale proteininnhold nådde 493.000 mg. Som konsekvens ble blodplasmaprøven delt i 8 lotter, hver tilsvarende ca 100 rotter, i følgende rensetrinn (1) til (4). I etterfølgende rensetrinn (5) til (7), ble prøven delt i seks satser. I og etter rensetrinn (8) ble det anvendt en rårenset prøve fra den totale blodplasmaen på ca 1.100 rotter. I det følgende blir det beskrevet typiske eksempler på hvert rensetrinn i det tilfellet med en lot (XW9) og en sats (XB6).

I alle rensetrinnene ble TPO aktiviteten målt ved å anvende rotte CFU-MK analysesystem som beskrevet i (referanseeksempel). Dersom annet ikke er angitt er alle rensetrinnene gjennomført ved 4_C, unntatt revers fase kromatografier og Superdex 75pg filtrering i nærvær av overflateaktivt middel som ble gjennomført ved romtemperatur. Proteinanalysen ble gjennomført ved en Coomassie farget bindingsanalyse (et reagenssystem fremstilt av PIERCE, katalog nr. 23236X) eller en fremgangsmåte som anvender bicinchonininsyre (et reagenssystem fremstilt av PIERCE, katalognr. 23225).

En oversikt av rensingen er vist i tabell 1.

(1) Kalsiumklorid behandling, sentrifugering og

<p>roteasehemmer behandling av rotteblodplasma

I det tilfellet med lot nr. XW9

XRP (742 ml; proteinkonsentrasjon, 54.8 mg/ml; total protein, 40.686 mg) tilsvarende ca 100 rotter, som har blitt lagret ved -80°C, ble tint og dispensert i polypropylen-sentrifugeringsrør (fremstilt av Nalgene). Kalsiumkloridpulver ble tilsatt hvert rør til en endelig konsentrasjon på 100 mM. Etter inkubering over natten ved 4°C ble resulterende blanding sentrifugert ved 8000 rpm i 60 minutter. Til den resulterende TPO-aktive supernatant fluiden (742 ml; proteinkonsentrasjon, 54.9 mg/ml; totalprotein, 40.740 mg) ble tilsatt en proteasehemmer p-APMSF ((p-aminodifenyl)metansulfonylfluoridhydro-klorid, fremstilt av Wako Pure Chemical Industries, Ltd., katalognr. 010-10393) til en sluttkonsentrasjon på 1 mM. Den således oppnådde prøven ble anvendt i følgende Sephadex G-25 kolonne etter buffemtbyttingstrinnet.

På denne måte ble kalsiumkloird/p-APMSF behandling av hel XRP avledet fra ca 1.100 rotter (total volum, 8.184 ml; totalprotein, 493.000 mg) gjennomført ved å dele den i 11 lotter, hver lot er ekvivalent til ca 100 rotter, og gjennomfører behandling av disse lottene en etter en. De resulterende 11 prøvene ble bearbeidet separat i etterfølgende Sephadex G-25 kolonnetrinn.

(2) Sephadex G- 25 ( bufferutbvtting)

i det tilfellet med lot nr. XW9

Supernatantfluid oppnådd etter kalsiumbehandling i trinn (1) (742 ml; proteinkonsentrasjon, 54.9 mg/ml; total protein, 40,740 mg) ble applisert ved en strømhastighet på 40 til 70 ml/min på en Sephadex G-25 kolonne (fremstilt av Pharmacia Biotech, katalog nr. 17-0033-03; diameter, 11.3 cm; høyde 47 cm) som hadde i forkant blitt ekvilibrert med 20 mM Tris-HCl, pH 8. Eluering ble gjennomført med samme buffer. En 1300 ml porsjon av eluatet før eluering av protein ble kastet. Når UV absorpsjon ble påvist i eluatene, ble fraksjonene samlet inntil den elektriske ledningsevnen nådde 500 iiS/cm, og dermed utvinning av TPO-aktiv proteinfraksjon som var byttet med 20 mM Tris-HCl, pH 8 (1,377 ml; proteinkonsentrasjon, 27.56 mg/ml; total protein, 37,882 mg; proteinutbytte 93%). Relativ aktivitet av TPO i fraksjonen ble funnet å være 2.3.

Som resultat av Sephadex G-25 kolonnebehandling av alle lot prøvene, ble totalt 21.117 ml av Sephadex G-25 kolonne TPO- aktiv fraksjon oppnådd (total protein 408.300 mg; gjennomsnittlig relativ aktivitet 2; total aktivitet 864.600).

(3) O- Sepharose FF ( sterk anionbvttekromatografi) i det

tilfellet med lot nr. XW9

Den TPO-aktive fraksjonen oppnådd i trinnet over (2) ved Sepharose G-25 behandling (1,377 ml; protein konsentrasjon, 27.5 mg/ml; total protein, 37,841 mg; relativ aktivitet, 2.3) ble applisert på en Q-Sepharose FF (fremstilt av Pharmacia Biotech, katalognr. 17-0510-01; diameter, 5 cm; høyde, 27 cm) ved en strmhastighet på 40 ml/min, eluert med 20 mM Tris-HCl (pH 8) og en fraksjon Fl som passerte gjennom kolonnen ble samlet (3,949 ml; proteinkonsentrasjon, 0.98 mg/ml; total protein, 3.870 mg; relativ aktivitet, 0).

Deretter ble bufferen byttet til 20 mM Tris-HCl (pH 8) inneholdende 175 mM NaCl for å eluere en TPO-aktiv fraksjon F2 (4.375 ml; proteinkonsentrasjon, 5.36 mg/ml).

Til slutt ble en fraksjon F3 (1,221 ml; proteinkonsentrasjon, 3.9 mg/ml; totalprotein, 4.783 mg; relativ aktivitet, 3.8) eluert med 20 mM Tris-HCl (pH 8) inneholdende 1000 mM NaCl. Total protein i TPO-aktiv fraksjon F2 ble funnet å være 23.440 mg, og proteinutbyttet av F2 i dette trinnet var 61.9%. I tillegg ble relativ aktivitet av TPO øket til 6.8.

Som et resultat av applisering av alle lotene på Sephadex G- 25 TPO-aktive fraksjoner til Q-Sepharose FF, ble det oppnådd totalt 35.842 ml Q-Sepharose FF TPO-aktiv fraksjon F2 (totalprotein, 314.384 mg; gjennomsnittlig relativ aktivitet 9; total aktivitet 2.704.000).

(4) Hvetespire a<g>glutinin ( WGA)- agarose

( lektin affinitetskromatografi)

I det tilfellet med lot nr. XW9

TPO-aktiv fraksjon F2 oppnådd i ovennevnte trinn (3) ved Q- Sepharode FF behandling ' ble delt i tre porsjoner og applisert på en WGA-agarose (fremstilt av Honen Corp., katalog nr. 800273; diameter 5 cm; høyde 22.5 cm) ved en strømningshastighet på 5 ml/min., og eluert med Dulbeccos isotone fosfatbuffer (DPBS). En fraksjon Fl som passerte gjennom kolonnen ble samlet (9.336 ml; proteinkonsentrasjon 2.30 mg/ml; total protein 21.407 mg; relativ aktivitet 6.9).

Deretter ble bufferen byttet til 20 mM natriumfosfatbuffer (pH 7.2) inneholdende 0.2 M N-acetyl-D-glukosamin (GlcNAc, fremstilt av Nacalai tesque, katalog nr.005-20), 150 mM NaCl og 0.02% natriumazid, og de resulterende eluatene ble samlet og konsentrert ved å anvende en ultrafiltreringsenhet (Omega Ultrasette, nominell molekylvektsavkutting på 8000; fremstilt av Filtron), for dermed å oppnå en WGA-agarose adsorberende TPO-aktiv fraksjon F3 (2.993 ml; proteinkosentrasjon 0.376 mg/ml).

Total protein i TPO-aktiv fraksjon F2 ble funnet å være 1.125 mg, og proteinutbyttet av F2 i dette trinnet var 4.8%. I tillegg ble relativ aktivitet av TPO øket til 101. Den således oppnådde F2 fraksjonen ble lagret ved -80°C.

Som resultat av applisering av alle lotene av Q-Sepharose FF TPO-aktive F2 fraksjoner til WGA-agarose, ble det oppnådd totalt 33.094 ml av WGA-agarose TPO-aktiv fraksjon F2 (total protein, 15.030 mg; gjennomsnittlig relativ aktivitet, 132; total aktivitet, 1.987.000).

TSK- eel AF- BLUE 650 MH ( triazinfarge affinitetskromatografi)

I det tilfellet med sats nr. XB6

WGA-agarose adsorberende TPO-aktiv fraksjon av lot nr. XW8 og WGA-agarose adsorberende TPO-aktiv fraksjon F2 av lot nr. XW9 oppnådd i ovennevnte trinn (4) ved å starte med 215 rotte- ekvivalenter XRP ble kombinert som en sats nr. XB6 (5.947 ml, proteinkonsentrasjon, 0.388 mg/ml; totalprotein, 2.319 mg, relativ aktivitet, 150).

En 5.974 ml porsjon av den kombinerte prøven ble blandet med 0.85 mol NaCl for 1000 ml (296.76 h totalt) for å lage en 6.132 ml løsning som har en endelig NaCl konsentrasjon på 0.822 M, og den resulterende løsningen ble applisert ved en strømhastighet på 7 ml/min. til en TSK-gel AF-BLUE 650 MH kolonne (TOSOH CORP., katalog nr. 08705; diameter, 5 cm; høyde, 23 cm) som hadde blitt ekvilibrert i forkant med 20 mM natriumfosfatbuffer ((pH 7.2) inneholdende 1 M NaCl.

Etter fullføring av appliseringen, ble protein eluert ved å anvende 20 mM natriumfosfatbuffer (pH 7.2) inneholdende 1 M NaCl ved en strømhastighet på 10 ml/min. De resulterende eluatene ble samlet og konsentrert ved å anvende en ultrafiltreringsenhet (Omega Ultrasette, nominell molekylvektsavkutting 8000), for dermed å oppnå en gjennompassert fraksjon Fl (543 ml; proteinkonsentrasjon, 2.05 mg/ml; total protein, 1.112 mg; relativ aktivitet, 31).

Deretter ble elueringsbufferen byttet til 2M NaSCN for å oppnå en eluert TSK-gel AF-BLUE 650 MH adsorberende TPO-aktiv fraksjon F2 (1,427 ml; proteinkonsentrasjon, 0.447 mg/ml).

Total protein i TPO-aktiv fraksjon F2 ble funnet å være 638 mg, og proteinutbyttet av F2 i dette trinnet var 27.5%. I tillegg ble relativ aktivitet av TPO øket til 1500.

Som resultat av applisering av alle satsene av WGA-agarose adsorberende TPO-aktiv F2 fraksjoner til TSK-gel AF-BLUE 650 MH, ble det oppnådd totalt 10.655 ml TSK-gel AF-BLUE 650 MH TPO-aktiv fraksjon F2 (total protein 4.236 mg; gjennomsnittlig relativ aktivitet, 905; total aktivitet 3.834.000).

Fenvl Sepharose 6 FF/ LS ( hydrofob interaksjonskromatografi)

I det tilfellet med sats nr. XB6

En 1.424 ml porsjon av TSK-gel AF-BLUE 650 MH TPO-aktiv fraksjon F2 (1.424 ml; protein konsentrasjon, 0.447 mg/ml; total protein, 638 mg; relativ aktivitet, 1.500) ble blandet med 1.5 mol ammoniumsulfatpulver pr 1.000 ml (282.2 g totalt) for å lage en 1.581 ml oppløsning som har en sluttammoniumsulfatkonsentrasjon på 1.35 M.

Den resulterende oppløsningen ble applisert ved en strømningshastighet på 7 ml/min til en fenyl Sepharose 6 FF (Low Sub) kolonne (Pharmacia Biotech, katalog nr. 17-0965-05; diameter, 5 cm; høyde 10 cm) som ble ekvilibrert i forkant med 50 mM natriumfosfatbuffer (pH 7.2) inneholdende 1.5 M ammoniumsulfat. Etter fullføring av appliseringen, ble eluering gjennomført ved å anvende 36 mM natriumfosfatbuffer inneholdende 0.8 M ammoniumsulfat ved en strømhastighet på 10 ml/min. De resulterende eluatene (omtrent 3.160 ml) ble samlet og konsentrert ved å anvende en ultrafiltreringsenhet (Omega Ultrasette, nominell molekylær avkuttingsvekt 8000), for dermed å oppnå en fraksjon Fl (485 ml; proteinkonsentrasjon, 0.194 mg/ml; total protein, 94.2 mg; relativ aktivitet, 0).

Deretter ble elueringsbufferen byttet til 20 mM natriumfosfatbuffer (pH 7.2) for å oppnå en eluert TPO aktiv fraksjon F2 (ca 3.500 ml). Den eluerte fraksjonen ble konsentrert ved å anvende en ultrafiltreringsenhet (Omega Ultrasette, nominell molekylær vektav-kutting 8000) og en prøve for analyse ble tatt ut. På dette trinnet ble proteinkonsentrasjon og total protein i TPO-aktiv fraksjon F2 (220 ml) funnet å være henholdsvis 1.45 mg/ml og 319 mg, og proteinutbyttet av F2 i dette trinnet var 50.0%. Relativ aktivitet av TPO ble funnet å være 1.230.

Som resultat av applisering av alle satsene med TSK-gel AF- BLUE 650 MH TPO-aktive F2 fraksjoner til fenyl Sepharose 6 FF/LS, ble det totalt oppnådd 1.966 ml fenyl Sepharose 6 FF/LS TPO-aktiv fraksjon F2 (total protein 2.762 mg; gjennomsnittlig relativ aktivitet 847; total aktivitet 2.339.000).

(7) Sephacryl S- 200 HR ( geifiltreringskromatografi)

I det tilfellet med sats nr. XB6 ( kfr, fig. 1)

Fenylsepharose 6 FF/LS TPO-aktiv fraksjon F2 (217 ml; proteinkonsentrasjon, 1.45 mg/ml; total protein, 315 mg; relativ aktivitet, 1.230) ble blandet med 144.8 ml 5 M NaCl oppløsning for å lage en 362 ml oppløsning som har en slutt NaCl konsentrasjon på 2 M, og den resulterende løsningen ble konsentrert til ca 50 ml ved å anvende en ultrafiltreringsenhet med YM 3 membran (76 mm i diameter, fremstilt av Amicon Corp.).

Til denne ble det tilsatt samme volum (50 ml) av 8 M urea, for dermed å oppnå ca 100 ml av en oppløsning inneholdende 1 M NaCl og 4 M urea som sluttkonsentrasjoner. Dette ble konsentrert til ca 80 ml, laget til en prøve av 88.78 ml og deretter applisert på en Sephacryl S-200 HR kolonne (fremstilt av Pharmacia Biotech, katalog nr. 17-0584-01; 7.5 cm i diameter og 100 cm høyde).

Deretter ble elueringen gjennomført med DPBS ved en strømhastighet på 3 ml/min, og eluatene etter et void volum på 1200 ml ble samlet i 45 ml porsjoner i 60 polypropylen-rør. Analyse ble gjennomført på annet hver rør og resten lagret ved -85°C inntil Sephacryl S-200 HR behandling av alle prøver avledet fra 1.100 rotter var fullført. Basert på analyseresultater, ble fraksjoner av sats nr. XB6 gruppert som følger.

På denne måte ble alle satsene av TPO-aktiv F2 fraksjoner oppnådd ved fenylsepharose 6 FF/LS separat gjenstand for Sephacryl S-200 HR, analysert og lagret ved -85°C. Etter fullføring av S-200 HR behandling av alle satsene og rett før etterfølgende gjennom-føring av revers fase kromatografi (YMC- Pack PROTEIN-RP), ble disse lagrede prøvene tint og konsentrert ved å anvende en ultrafiltreringsenhet med YM 3 membran (76 mm i diameter, fremstilt av Amicon Corp.) for å oppnå følgende to prøver. Den konsentrerte prøven av TPO-aktiv fraksjon F2 oppnådd ved Sephcryl S-200 HR blir heretter referert til som "høy molekylær TPO prøve F2" og den fra F3 som "lav molekylær TPO prøve F3".

Høy molekylær TPO prøve F2 og lav molekylær TPO prøve F3 er samlede fraksjoner av forskjellige elueringsområder i gelfiltreringskromatografi slik det er hensiktsmessig, og begrepet "høy molekylær" og "lav molekylær" betyr derfor ikke deres virkelige molekylvekter.

Lav molekylær TPO prøve F3 og høy molekylær TPO prøve F2 blir separat gjenstand for etterfølgende rensetrinn.

Rensing av lavmolekylær TPO prøve F3 er beskrevet i følgende trinn (8) til (11).

(8) YMC- Pack protein- RP ( revers fase kromatografi')

Lav molekylær TPO prøve F3 (total protein 50.3 mg; protein konsentrasjon 0.184 mg/ml; relativ aktivitet 20.000; total aktivitet 1.007.000; total volum, 274 ml) oppnådd i trinn (7) over ble blandet med et oppløsningsmiddel A (0.025% trifluoreddiksyre (TFA)) og et oppløsningsmiddel B (1-propanol inneholdende 0.025% TFA) for å oppnå en oppløsning som har et totalvolum på 508.63 ml og sluttkonsentrasjon for propanol, TFA og protein på henholdsvis ca 20%, 0.012% og 0.0989 mg/ml. Uoppløselige materialer dannet under fremstilling av denne løsning ble separert ved sentrifugering, og den resulterende supernatanten ble delt i to 254.3 ml (25.2 mg protein) porsjoner og applisert ved en strømhastighet på 2 ml/min til en kolonne pakket med YMC-Pack PROTEIN-RP (fremstilt av YMC, katalog nr. A-PRRP-33-03-15; 3 cm i diameter og 7,5 cm høyde) som på forhånd hadde blitt ekvilibrert med 30% B. Utfellingen som var resultat av sentrifugering ble oppløst i 20 ml 20 mM natriumacetat (pH 5.5) inneholdende 5 mM CHAPS (3-[3- cholamidopropyl)dimetylammonio]-l-propansulfonat; fremstilt av Dojindo Laboratories, katalog nr. 75612-03-3) og applisert på kolonnen.

Etter at prøven var ladet ble ca 50 ml av et oppløsningsmiddel (oppløsningsmidler A:B = 3:1) ført gjennom kolonnen for å oppnå en fraksjon som er ført gjennom. Etter ble det startet et fremkallingsprogram (120 minutter av lineær gradient fra 30% B til 45% B), og eluatene ble samlet i 36 polypropylenrør i 10 ml porsjoner. Denne prosessen ble igjen gjentatt for den gjenværende prøven ved å anvende samme oppsamlingsrør, slik at man således oppnådde totalt 36 fraksjonsrør hver inneholdende 20 ml eluat. Fraksjonen som var ført gjennom ble direkte konsentrert til 20 ml ved åanvende en ultrafiltreringsenhet med YM 3 membran (76 mm i diameter, fremstilt av Amicon Corp.).

En 0.1 ml porsjon av hver av fraksjonene som var ført gjennom og 20 ml fraksjoner av rør fra 1 til 36 ble blandet med 20 ml 5% BSA, tørket ved inndampning, oppløst i 0.25 ml IMDM analyse dyrkningsmedium og deretter analysert for å spesifisere TPO-aktiv fraksjon. Som resultat ble TPO aktiviteten funnet i fraksjonene med rør nr. 17 til 27 (36.0 til 43.0% propanolkonsentrasjonsområdet) som ble kombinert og anvendt som en lavmolekyl TPO prøve F3-avledet YMC-Pack PROTEIN-RP TPO-aktiv fraksjon F2. Denne fraksjonen ble lagret ved -85 °C inntil bruk i etterfølgende YMC-PAck CN-AP trinn.

Lav molekyl TPO prøve F3-avledet YMC-Pack PROTEIN-RP

TPO-aktiv fraksjon F2

(9) YMC- PAck CN- AP ( revers fase kromatografi')

En 214.9 ml porsjon av lav molekylær TPO prøve F3-avledet YMC-PAck PROTEIN-RP TPO-aktivi fraksjon F2 (total protein, 2.79 mg, proteinkonsentrasjon, 0.0130 mg/ml; relativ aktivitet, 130.000; total aktivitet, 36.300) oppnådd i trinn (8) over ble blandet med 0,6 ml 50% glycerol og konsentrert til 1.8 ml. Konsentratet ble til slutt justert til et volum på 5 ml inneholdende 20% eller mindre propanol og ca 6% glycerol.

Konsentratet ble delt i 5 porsjoner for anvendelse i følgende kolonne operasjon (0.555 mg protein og 1 ml volum i hver operasjon). Hver av de således oppdelte prøvene ble applisert ved en strømhastighet på 0.6 ml/min. til en kolonne pakket med YMC-Pack CN-AP (fremstilt av YMC, katalog nr. AP-513; 6 mm i diameter og 250 mm høyde) som har blitt ekvilibrert på forhånd med 15% B, ved å anvende 0,1% TFA som oppløsningsmiddel A og 0,05% TFA-inneholdende 1-propanol som oppløsningsmiddel B. Etter appliseringen ble en propanolkonsentrasjon øket fra 15% B til 25% B, og 65 minutter av lineær gradient fra 25% B til 50% B ble gjennomført. Etter fullføring av den endelige operasjonen (5.), ble 1 ml av en oppløsning som har samme sammensetning som ekskluderer protein applisert på kolonnen og fremkalt på samme måte for å gjenvinne TPO aktivitet som er en i kolonnen. Siden samme polypropylenrør ble anvendt for å samle eluatene fra 6 operajoner, ble totalt 44 rør hver inneholdende 7.2 ml eluat oppnådd.

En 30 ul porsjon av hver av de således oppnådde fraksjonene (1/240 porsjon av hver fraksjon) ble blandet med 20 [il 5% BSA, tørket og inndampet, oppløst i 0.24 ml IMDM analysedyrkningsmedium og deretter analysert for å spesifisere TPO- aktive fraksjoner. Som resultat ble sterk TPO-aktivitet funnet i fraksjonene i rør nr. 28 til 33 (37.0 til 42.0% propanol konsentrasjonsområde) som ble kombinert og anvendt som en lavmolekylær TPO prøve F3-avledet YMC-Pack CN-AP hoved TPO-aktiv fraksjon FA.

Lavmolekylær TPO prøve F3-avledet YMC-Pack CN-AP TPO-aktiv fraksjon FA

Capcell Pak Cl 300 ( slutt revers fase kromatografi)

En 32.12 ml porsjon av 43.20 ml lavmolekylær TPO prøve F3- avledet TPO-aktiv fraksjon FA (total protein 0.372 mg; protein konsentrasjon, 0.00863 mg/ml; relativ aktivitet, 800.000; total aktivitet, 297.500) oppnådd i ovennevnte trinn (9) ble blandet med 0.2 ml 50% glycerol og konsentrert for åoppnå 0.1 ml glycerol oppløsning.

Denne løsning ble blandet med 2 ml av en løsning oppløsningsmiddel A (0.1% TFA); oppløsningsmiddel B (1-propanol inneholdende 0.05% TFA) = 85:15 (15% B) for å fremstille 2,1 ml prøve inneholdende ca 14% propanol, ca 4.8% glycerol og 0.177 mg/ml protein. Den således fremstilte prøven ble applisert på en kolonne pakket med Capcell Pak Cl 300A (fremstilt av Shiseido Col., Ltd, katalog nr. Cl TYPE.SG300A; 4.6 mm i diameter og 250 mm høyde) som på forhånd hadde blitt ekvilibrert med 15% B og utviklet i 65 minutter med en lineær gradient fra 27% B til 38% B ved en strømningshastighet på 0,4 ml/min. Eluatene ble samlet i 72 polypropylenrør i 0.6 ml porsjoner.

En 3 ul porsjon av hver av de således oppnådde fraksjonene (1/200 porsjon av hver fraksjon) ble blandet med 20 ul 5% BSA, mediet ble byttet med 225 [il IMDM analysedyrkningsmedium og den således 75 ganger fortynnede fraksjon ble analysert.

En 1 ul porsjon av hver fraksjon (1/600 fraksjon) ble prøvetatt for anvendelse i elektroforese, tørket og inndampet og behandlet ved 95°C i 5 minutter med 10% av en ikke- reduserende prøvebuffer for SDS-PAGE. Den således behandlede prøven ble gjenstand for SDS-PAGE ved å anvende en 15-25% SDS-polyakrylamidforstøpt gel (fremstilt av Daiichi Pure Chemicals Col., Ltd.) og deretter farget med et sølvfargesett av 2D-Silver StainH "DAIICHI" (fremstilt av Daiichi Pure Chemicals Co., Ltd., katalog nr. 167997; og som heretter vil bli referert til som "sølvfargesett"). Når det gjelder molekylvektsmarkører ble det anvendt [DAnCHIj-III og lavmolekylvektsmarkører (fremstilt av Daiichi Pure Chemicals Co., Ltd., katalog nr. 181061; som heretter vil bli referert til som "DPCDI").

Som resultat av analysen over, ble det funnet signifikant DPO aktivitet i fraksjonene i rør nr. 35 til 43 (30.0 til 32.5% propanol konsentrasjonsområde). Av disse ble fraksjoner fra rør nr. 36 til 42 (30.5 til 32.5% propanolkonsentrasjonsområde) kombinert og anvendt som hoved TPO-aktiv fraksjon FA. Resultatene er vist i fig. 2.

Når proteininnholdet som var utledet fra kromatogrammet ble sammenlignet med analyseresultater, ble den således oppnådde fraksjonen funnet å ha total protein på 39.6 Hg, en proteinkonsentrasjon på 9.4 ug/ml, en relativt aktivitet på 4.890.000 og en totalaktivitet på 193.600. Undersøkelse av SDS-PAGE mønsteret av de TPO-aktive fraksjonsnummerene 36 til 42 viste tilstedeværelse av et bånd hvis fargingstetthet korrelerer med aktivitetsstyrke. I tillegg ble molekylvekten av dette ikke-reduserte båndet funnet å være 17.000 til 19.000 når det blir sammenlignet med de fra standardmolekyl-vektsproteiner på samme gel, som var redusert, og således viser at dette båndet er en sterk kandidat på TPO.

(11) Ekstraksion av TPO- aktivt protein fra elektroforesegel

( 15% SDS- PAGE)

Eksempel på analyse av TPO- aktiv fraksjon FA

Av 4.200 ul lavmolekylvekts TPO prøve F3-avledet TPO-aktiv fraksjon FA (total protein 39.6 ug; proteinkonsentrasjon 9.4 ug/ml; relativ aktivitet 4.890.000; total aktivitet 193.600) oppnådd i trinnet over (10), ble 5.5 ul (1/764 fraksjon) for anvendelse i aktiv proteinekstraksjon og 2.5 ul (1/1680 fraksjon) for anvendelse i sølvfarging overført til respektive prøverør, tørket og inndampet, reagert med 10 ul av en ikke-reduserende prøvebuffer for SDS-PAGE ved 37°C i 1 time og fikk deretter anledning til å stå ytterligere i 18 timer ved romtemperatur, for dermed å gjennomføre SDS- reaksjon.

For-farget lavområde markør (fremstilt av Bio-Rad Laboratories, Inc., 161-0305) og forannevnte DPCin ble anvendt som molekylvektsmarkører. Ved å bruke en mikroslab gel, ble 15% SDS-PAGE av disse prøvene gjennomført ved 4°C i overensstemmelse med den vanlige anvendte prosedyren (Laemmli, Nature, vol. 227, s. 680-685,1970). Etter fullføring av elektroforese, ble gelporsjoner som skulle være gjenstand for sølvfarging umiddelbart kuttet ut med en kniv, anbragt i en fikseringsoppløsning og deretter farget ved å anvende det forannevnte sølvfargingssettet.

Adskilt fra dette ble alle molekylvektsområder av gelen som skulle bli anvendt for påvisning av aktivitet kuttet med en kniv i 34 skiver, og hver gelskive har en bredde fra 1,5 til 2,5 mm ble knust med en svakt modifisert metode til Kobayashi (Kobayashi, M., Seikagaku (Biochemistry), vol. 59, nr. 9,1987, publisert av Japanese Biochemical Society). Hver gelskive som således ble knust i mindre fragmeter ble blandet med 0.3 ml av en ekstraksjonsbuffer (20 mM Tris-HCl, pH 8,500 mM NaCl, 0.05% BSA) og ristet i 6 timer ved 4°C for ågjennomføre ekstraksjon.

Til dette ble det tilsatt 500 mM kaliumfosfat (pH 6.8) til en sluttkonsentrasjon på 20 mM. Etter 1 times risting ved 4°C ble den resulterende blandingen overført til en ultrafri C3GV 0.22 nm filtreringsenhet (fremstilt av Millipore Corp., UFC3 OGV OS) og sentrifugert ved 1.000 x g (4000 rpm) i 15 minutter for å fjerne utfelt SDS og for gjenværende resulterende supernatantfluid. Filtratet ble overført til en ultrafri C3-LGC ultrafiltreringsenhet (nominell molekylvektsavkutting på 10.000, fremstilt av Millipore Corp., UFC3 LGC 00) og sentrifugert ved 3000 x g (7000 rpm). Når volumet av den konsentrerte løsningen nådde ca 50 ul, ble 300 ul 20 mM natriumfosfatbuffer (pH 7.2) tilsatt og igjen gjenstand for ultrafiltrering.

Ultrafiltrering som anvender 300 [il 20 mM natriumfosfatbuffer ble gjentatt to ganger for å fjerne gjenværende SDS. Deretter ble et tilsvarende trinn gjentatt for å skifte til analysedyrkingsmedium for fremstilling av en prøve (300 ul) som deretter ble sterilisert og var gjenstand for TPO aktivitetsmåling.

Tre proteinbånd ble påvist klart ved sølvfarging og viste tilsynelatende molekylvekter på ca 17.000 til 19.000,14.000 og 11.000 basert på DPCDI molekylvektsmarkør.

I foregående trinn (10) ble det observert et bånd som har en korrelasjon mellom aktivitetsstyrke og fargetetthet og som har en tilsynelatende molekylvekt på ca 17.000 til 19.000 i elektroforese av Capcell Pak Cl kolonne TPO-aktiv fraksjon. I eksperimentet i dette trinnet (11), ble TPO aktiviteten også funnet i båndet som har en tilsynelatende molekylvekt på ca 17000 til 19000 (kfr. fig. 3).

På basis av resultatene over ble det bekreftet av TPO-aktiv protein var renset i den aktive fraksjonen av Capcell Pak Cl 300A kolonnen til et påvisbart nivå på elektroforesegel. Basert på sølv-farget tetthet av båndet oppnådd ved 15% SDS- PAGE, ble mengden av det aktuelle TPO proteinet (en tilsynelatende molekylvekt på ca 17000 til 19000) i den totale TPO-aktive fraksjonen bestemt å være ca 1,7 \ ig.

Rensing av høymolekylær TPO prøve F2 ble beskrevet i følgende trinn (12) til (15).

YMC- Pack PROTEIN- RP ( revers fase kromatografi)

Høy molekylær TPO prøve F2 (totalprotein, 257 mg; proteinkonsentrasjon 0,894 mg/ml; relativ aktivitet, 7.840; total aktivitet, 2.015.000; total volum, 287 ml) oppnådd i ovennevnte trinn (7) ble blandet med 95.8 ml (1/3 volum av prøven) av et oppløsnings-middel B (1-propanol inneholdende 0.025% TFA) for å oppnå en oppløsning som har et totalvolum på 383 ml og sluttkonsentrasjoner av propanol, TFA og protein på henholdsvis ca 25%, 0.06% og 0,621 mg/ml. En oppløsning av 0.025% TFA ble anvendt for et oppløsningsmiddel A. Uoppløselige materialer dannet seg under fremstillingen av innført prøve ble separert ved sentrifugering, og resulterende supernatantfluid ble delt i seks 62.3 ml porsjoner (42.8 mg protein) og applisert ved en strømhastighet på 2 ml/min til en kolonne pakket med YMC-Pack PROTEIN-RP (fremstilt av YMC, katalog nr. A-PRRP-33-03-15; 3 cm i diameter og 7.5 cm høyde) som var blitt ekvilibrert på forhånd med 30% B. Utfellingen som er resultat av sentrifugering ble oppløst i 10 ml 20 mM natriumacetat (pH 5.5) inneholdende 5 mM CHAPS også applisert på kolonnen.

Etter at prøven var ladet ble ca 50 ml av et oppløsningsmiddel (oppløsningsmiddel A:B = 3:1) ført gjennom kolonnen for å oppnå en fraksjon som var ført gjennom. Deretter ble det startet et fremkallingsprogram (120 minutter av lineær gradient fra 30% B til 45% B), og eluatet ble samlet i 24 polypropylenrør i 15 ml porsjoner. Denne prosessen ble gjentatt for seks delte prøver ved å anvende oppsamlingsrør, slik at man således oppnådde totalt 24 fraksjonsrør hver inneholdende 90 ml eluat. Fraksjonen som var ført gjennom og rør nr. 1 fraksjon ble kombinert og direkte konsentrert til 90 ml ved å anvende en ultrafiltreringsenhet med YM3 membran (76 mm i diameter, fremstilt av Amicon Corp.).

En 0,3 ml porsjon av hver av de gjennomførte fraksjonene pluss rød nr. 1 fraksjon og

fraksjonene fra rør nr. 2 til 24 ble blandet med 10 ul 5% BSA, tørket ved inndampning, oppløst i 0,30 ml IMDM analysedyrkningsmedium og deretter analysert for å spesifisere TPO aktive fraksjoner. Som resultat ble TPO aktivitet funnet i fraksjonene i rør nr. 10 til 15 (34.0 til 39.5% propanol konsentrasjonsområde) som ble kombinert og anvendt som en høymolekylær TPO prøve F2-avledet YMC-Pack PROTEIN-RP TPO-aktiv fraksjon F2. Denne fraksjonen ble lagret ved -85°C inntil bruk i etterfølgende YMC-PAck CN-AP trinn.

Høymolekylær TPO prøve F2-avledet YMC-Pack PROTEIN-RP-TPO-aktiv fraksjon F2

(13) Superdex 75 pg ( gelfiltreringskromatografi i nærvær av CHAPS)

En 538.2 ml porsjon av høymolekylær TPO prøve F2-avledet YMC-Pack PROTEIN-RP TPO aktiv fraksjon F2 (total protein 11.3 mg; proteinkonsentrasjon 0.021 mg/ml; relativ aktivitet 227.000; total aktivitet 2.565.000) oppnådd i trinn (12) over ble blandet med 0.6 ml 50% glycerol og konsentrert ved inndampning. Til dette ble det tilsatt 18 ml 20 mM CHAPS, etterfulgt av omrøring og deretter ført i 1 times inkubering ved 4°C. Deretter ble den første prøven applisert på en kolonne pakket med HiLoad 26/60 Superdex 75 pg (fremstilt av Pharmacia Biotech, katalog nr. 17-1070-01; 2.6 cm i diameter og 60 cm høyde) og eluert med DPBS inneholdende 5 mM CHAPS ved en strømhastighet på 1 ml/min. En 4 ml porsjon av hver prøve (proteinkonsentrasjon 0.466 mg/ml; protein 1.86 mg) ble applisert på kolonnen.

I dette tilfellet ble Superdex 75 kolonneoperasjonen gjentatt 6 ganger ved opptelling av hele YMC-Pack PROTEIN-RP TPO-aktiv fraksjon i 6 porsjoner. Eluatene av hver operasjon ble samlet i 5 ml porsjoner i 45 rør, således at man til slutt oppnådde 45 fraksjoner hver inneholdende 30 ml eluat etter fullføring av 6 kolonneoperasjoner.

En 0.1 ml porsjon av hver av de således oppnådde fraksjonene ble blandet med 10 ul 5% BSA, tørket ved inndampning, oppløst i 0,25 ml IMDM analysedyrkningsmedium og deretter analysert for å spesifisere TPO-aktive fraksjoner. Som resultat ble det funnet TPO-aktivitet i fraksjonene med rør nr. 13 til 31 (molekylvektsområdet fra 78.000 til 3.000) som ble kombinert og anvendt som en høymolekylær TPO-prøve F2-avledet Superdex 75 pg TPO aktiv fraksjon F2.

Høymolekylær TPO prøve F2-avledet Superdex 75 pg TPO-aktiv fraksjon F2

YMC- Pack CN- AP ( revers fase kromatografi)

En 513.2 ml porsjon av høymolekylær TPO prøve F2-avledet Superdex 75 pg TPO-aktiv fraksjon F2 540 ml (molekylvekt, 78.000 - 3.000) (total protein, 1.11 mg; proteinkonsentrasjon 0.00216 mg/ml; relativ aktivitet, 1.750.000; total aktivitet 1.943.000) oppnådd i trinn (13) over ble blandet med 1 time volum av et oppløsnings-middel B (1-propanol inneholdende 0.05% TFA) og applisert ved en strømnings-hastighet på 0.6 ml/min til en kolonne pakket med YMC-Pack CN-AP (fremstilt av YMC, katalognr. AP-513; 6 mm i diameter og 250 mm høyde) som hadde blitt ekvilibrert på forhånd med 15% B ved å anvende et oppløsningsmiddel A (0.1% TFA) og oppløsningsmiddel B. Etter applisering ble propanolkonsentrasjonen øket fra 15% B til 25% B, og 65 minutters lineær gradient fra 25% B til 50% B ble gjennomført.

Før start av YMC-Pack CN-AP kolonnekromatografi, ble en 1/20 porsjon av den totale innsatte prøven gjenstand for en prøveoperasjoner for å bekrefte riktig gjenvinning av aktivitet. Deretter ble gjenværende 19/20 porsjon delt i to prøver for å gjennomføre operasjonen to ganger. Med andre ord ble kolonneoperasjonen gjentatt tre ganger. Siden de samme 44 polypropylenrørene ble anvendt til å samle eluatene fra tre operasjoner, ble totalt 44 rør hver inneholdende 3.6 ml eluat oppnådd.

En 5 |il porsjon av hver av de således oppnådde fraksjonene (1/720 porsjon av hver fraksjon) ble blandet med 0,25 ml IMDM analysedyrkningsmedium og deretter analysert for å spesifisere TPO-aktive fraksjoner. Som et resultat ble det funnet en markert sterk TPO aktivitet i fraksjonene i rør nr. 24 til 30 (36.0 til 42.0% propanolkonsentrasjonsområde) som ble kombinert og anvendt som en høymolekylær TPO prøve F2-avledet YMC-Pack CN-AP hoved TPO-aktiv fraksjon FA.

Høymolekylær TPO prøve F2-avledet YMC-Pack CN-AP TPO-aktiv

fraksjon FA

(15) Capcell Påk Cl 300 A ( slutt revers fase kromatografi)

En 24.66 ml porsjon av 25.20 ml høymolekylær TPO prøve F2- avledet YMC-Pack CN-AP TPO-aktiv fraksjon FA (total protein 0.606 mg; proteinkonsentrasjon, 0.0246 mg/ml; relativ aktivitet, 700.000; total aktivitet 424.000) oppnådd i trinn (14) over ble blandet med 0.4 ml 50% glycerol og konsentrert ved inndampning.

På denne måten ble 2 ml av en konsentrert prøve oppnådd med en propanolkonsentrasjon på noen få prosent, en glycerolkonsentrasjon på 10% og en proteinkonsentrasjon på 0,303 mg/ml. Dette ble applisert på en kolonne pakket med Capcell Pak Cl 300A (fremstilt av Shiseido Co., Ltd., katalognr. Cl TYPE:SG300A; 4.6 mm diameter og 250 mm høyde) som ble ekvilibrert på forhånd med 15% B ved å anvende et oppløsningsmiddel A (0,1% TFA) og oppløsningsmiddel B (1- propanol inneholdende 0.05% TFA), og utviklet i 65 minutter av lineærgradient fra 27% B til 38% B ved en strømhastighet på 0,4 ml/min. Eluatene ble samlet i 72 polypropylenrør i 0,6 ul porsjoner.

En 0.75 ni porsjon av hver av de således oppnådde fraksjonene (1/800 porsjon av hver fraksjon) ble blandet med 20 ul 5% BSA, mediet ble skiftet til 225 ul IMDM analysedyrkningsmedium og den således 300 ganger fortynnede fraksjon ble analysert.

En 2 [il porsjon av hver fraksjon (1/300 fraksjon) ble prøvetatt for anvendelse i elektroforese, tørket ved inndamping og behandlet ved 95°C i 5 minutter med 10 [il av en ikke-reduserende prøvebuffer for SDS-PAGE. Den således behandlede prøven var gjenstand for SDS-PAGE ved å anvende en 15-25% SDS-polyakrylamidforstøpt gel (fremstilt av Daiichi Pure Chemicals Co., Ltd.) og deretter farget ved å anvende det ovennevnte sølvfargingssettet. DPCDI beskrevet i foregående ble anvendt som molekylvektsmarkører.

Som resultat av analysen over, ble betydelig TPO aktivitet funnet i fraksjonene i rørene med nummer 33 til 39 (29.5 til 31.5% propanolkonsentrasjonsområde). Av disse ble fraksjoner av rør nr. 34 til 39 (30.0 til 31.5% propanol konsentrasjonsområde) kombinert og anvendt som hoved TPO-aktiv fraksjon FA. Undersøkelse av SDS-PAGE mønsteret av hoved TPO-aktiv fraksjon viste tilstedeværelse av et bånd hvis fargingstetthet korrelerer med aktivitetsstyrke, med en molekylvekt i området fra 17.000 til 19.000 under ikke-reduserende betingelser, og dette tilsvarte situasjonen med lavmolekyl TPO prøve F3-avledet TPO-aktiv fraksjon beskrevet i ovennevnte trinn (10).

Eksempel 2

Analyse av partielle aminosyresekvenser av renset rotte TPO

Aminosyresekvensanalyse av rotte TPO protein i Capcell Pak Cl 300A kolonne TPO-aktiv fraksjon FA oppnådd i rensetrinn (10) i eksempel 1 ble gjennomført i overensstemmelse med prosedyren til Iwamatsu (Iwamatsu et al., "Shin Kiso Seikagaku Jikken-ho (New Basic Biochemical Experiments)", vol. 4, s. 33-84, pub. Maruzen; Iwamatsu, A. Seikagaku (Biochemistry), vol. 63, nr. 2, s. 139-143, 1991; Iwamatsu, A., Electrophoresis, vol. 13, s. 142-147,1992). Det innebærer at prøven var gjenstand for SDS-PAGE og overført elektrisk på en polyvinyliden difluorid (PVDF) membran. Etter reduksjon og S-alkylering av proteinet på PVDF membranen, ble det således behandlede protein spaltet i peptidfragmenter ved systematisk og trinnsvis restriktiv enzymatisk hydrolyse in situ med tre proteaser, og resulterende peptidfragmenter på hvert spaltningstrinn ble separert og renset ved revers fase kromatografi og analysert for deres aminosyresekvenser ved en høysensitivtetsaminosyresekvens bestemmelsesmetode. Følgende beskriver prosessen i detalj.

Eksempel av analyse av TPO aktuelt protein i lavmolekylær TPO prøve F3- avledet Capcell Pak Cl 300A TPO fraksjon FA

(1) Konsentrasjon av Capcell Pak Cl 300A kolonne

TPO fraksjon ( rømummer 36 til 42)

Av 4200 (il lavmolekylær TPO prøve F3-avledet Capcell Pak Cl 300A kolonne TPO-aktiv fraksjon FA (rør nummer 36 til 42) oppnådd i rensetrin (10) i eksempel 1 (total protein 39.6 fig; proteinkonsentrasjon, 9.4 |ig/ml; relativ aktivitet 4.890.000; total aktivitet 193.600), ble 4.151 (il (98.8% av total fraksjon) anvendt i aminosyresekvensanalyse. Total protein utledet fra kromatogrammet var 39.1 (ig, og av dette var ca 1.6 (ig TPO proteinet farget med sølv etter SDS-PAGE og som har en molekylvekt på ca 17.000 til 19.000.

Denne prøven ble blandet med glycerol og konsentrert ved inndamping for å oppnå 5 u-l av en glyceroloppløsning. Til dette ble det tilsatt en ikke-reduserende buffer for SDS-PAGE og 1 M Tris-HCl (pH 8) for å justere pH, for dermed å oppnå ca 25 ul av prøven som inneholdt 200 mM Tris-HCl (pH 8.0), 50 mM Tris-HCl (pH 6.8), 1,1% SDS; 2 mM EDTA, 0.02% bromfenolblå og 30% glycerol.

Den således fremstilte prøven ble holdt ved romtemperatur i 14 timer og deretter behandlet ved 60°C i 5 minutter for ågjennomføre riktig SDS reaksjon uten overskudds-oppvarming.

(2) Elektroforese

Mikro-slab geler (4.0% akrylamid stacking gel og 15% akrylamid separasjonsgel) ble fremstilt og SDS-PAGE ble gjennomført ved romtemperatur i 2 timer ved en konstant strøm på 12.5 mA og deretter ved 17.5 mA. Forhåndsfarget Low Range Marker (Bio-Rad, 161-0305) og DOCDI ble anvendt som molekylvektsmarkører. Umiddelbart etter elektroforese blir de resulterende proteinmolekylene overført på en PVDF membran (se følgende trinn).

En porsjon av prøven ble også anvendt i én annen elektroforese ved å anvende 15-25% polyakrylamid forhåndsstøpt gel (Multi Gel 15/25 fremstilt av Daiichi Pure Chemicals Co., Ltd., katalognr. 211072) under ikke-reduserende betingelser eller etter redusering av prøven med ditiotreitol (DTT). Når den resulterende gelen ble farget ved å anvende sølvfargingssett som beskrevet i det foregående, ble det bekreftet at molekylvekten av proteinbåndet som man forventet å være TPO var ca 19000 under en reduserende betingelse og renhet av TPO proteinet i Capcell Pak Cl 300A kolonne var noen få prosent. I tillegg siden mobiliteten av båndet varierte under ikke- reduserende og reduserende betingelser, ble det antydet at det aktuelle proteinet inneholder minst en disulfidbinding.

Overføring av protein på PVDF membran ved elektroblotting og påvisning av bånd Proteinoverføring på en PVDF membran (ProBlott, fremstilt av Applied Biosystems, katalognr. 400994) ble gjennomført i 1 time ved en konstant strøm på 160 mA (11 til 17 V) ved åanvende en halv-tørr overføringsapparatur (Model KS-8460, fremstilt av Marysol). En oppløsning bestående av 0,3 M Tris og 20% metanol (pH 10.4) ble anvendt som anolyt, en oppløsning bestående av 25 mM Tris og 20% metanol (pH 10.4) som overføringsmembranoppløsning og en oppløsning bestående av 25 mM Tris, 40 mM aminokaproinsyre og 20% metanol (pH 10.4) som kathlyt.

Når den således overførte membranen ble farget med en Ponceau S fargingsoppløsning (0.1 g Ponceua S og 1 ml eddiksyre i 100 ml vann), ble det påvist flere bånd og et av disse båndene ble bekreftet å være den til det aktuelle protein og hadde en molekylvekt på ca 19.000. Dette båndet ble kuttet ut for anvendelse i etterfølgende peptidfragment-danningstrinn.

(4) Peptidfragmentdannelse. peptidkartlegging og

aminosyresekvensanalvse

For å gjennomføre systematisk fragmentering av TPO kandidatproteinet som er blitt overført og S-alkylert etter reduksjon på PVDF membranen, ble trinnvis restriktiv enzymatisk hydrolyse gjennomført ved å anvende følgende tre proteaser.

Første spalting: lysylendopeptidase (Achromobacter lyticus m497-l, fremstilt av Wako Pure Chemical Industries, Ltd., katalog nr. 129-02541)

andre spalting: endoproteinase Asp-N (fremstilt av Boehringer-Mannheim Corp., katalognr. 1054 589)

tredje spalting: trypsin-TPCK (fremstilt av Worthington Biochemical, katalognr. 3740).

Peptidfragmenter oppnådd i hver enzymspalting blir utvunnet, applisert på en Wakosil-II5C18 C18 reversfasekolonne (fremstilt av Wako Pure Chemical Industries, Ltd., 2.0 mm i diameter og 150 mm lengde) og eluert ved å anvende et oppløsningsmiddel A

(0.05% TFA) og et oppløsningsmiddel B (isopropanol:acetonitril = 7:3,0.02% TFA), 30 minutter av en lineær gradient fra 1% B til 50% B ved en strømhastighet på 0.25 ml/min og ved en kolonnetemperatur på 30°C. På denne måte ble peptidkartene laget (se fig. 4). Resulterende peptidfragmenter ble utvunnet og var gjenstand for Edman degradering

ved å anvende en gassfaseaminosyresekvenserer (PPSQ-2, fremstilt av Shimadzu Corp.). Deretter ble hver aminosyre gjenvunnet fra sekvenseren, hvis N-terminal var blitt koblet med PTH, ble identifisert ved å anvende C18 reversfase kolonnekromatografi ved isokratisk eluering. Resultatene er oppsummert i det følgende.

Aminosyresekvenser av peptidfragmenter oppnådd ved første spalting med lysylendopeptidase

Aminosyresekvenser av peptidfragmenter oppnådd ved andre spalting med endopepti-dase Asp-N

Aminosyresekvenser av peptidfragmenter oppnådd ved tredje spalting med trypsin-TPCK

I sekvensene over er de som er vist i parenteser i N- terminalene og aminosyreresidier som kan bli utledet fra systematisk enzymspalting.

(5) Analyse av homologi av oppnådde aminosyresekvenser

( homologisøk)

For å vite om de således oppnådde aminosyresekvensene er inneholdt i et kjent rapportert protein eller om det er et protein som har tilsvarende sekvenser, ble de analysert ved åanvende sekvensanalyseringssoftware Mac Vector (Kodak International Biotechnologies, Inc.)- Når det gjelder informasjon om kjente proteiner eller kjente gener, ble det anvendt Entrez Release 6 database (National Center for Biotechnology Information, National Library of Medicine, National Institute of Health, USA, publisert 15. august 1993). Databaser innbefattet i denne er som følger.

Entrez Release 6 database

NCBI-GenBank, 15. august 1993, (Release 78.0)

EMBL, 15. juli 1993 (Release 35.0 plus updates)

DDBJ, 15. juli 1993

SWISS-PROT, april 1993 (Release 25.0)

PIR, 30. juni 1993 (Release 37.0)

PDB, april 1993

PRF, may 1993

dbEST, 15. juli 1993 (Release 1.10)

U.S og europeiske patenter.

Som resultat falt sekvensen (K)DSFLADVK av AP12 fullstendig sammen med en intern sekvens KDSFLADVK av en rottekortikosteroid-bindende globulin (CBG) forløper (PIR database aksesjonsnr. A40066; Smith og Hammond; "Rat corticosteroid-binding globulin: primary structure and messenger ribonucleic acid levels in the liver under different physiological conditions". Mol. Endocrionol., (1989), 3,420-426).

Ytterligere detaljerte undersøkelse viste at en sekvens KQYYESE (SEQ ID NO: 193) som har en høy likhet med sekvensen (K)XYYESZ (X er A, S, G, M eller Q og Z er E eller K) av AP3 er inneholdt i rotte CBG aminosyresekvensen. I rotte CBG, er sekvenser som korresponderer med de i AP 12 og AP3 bundet til hverandre og danner dermed en intern aminosyresekvens KDSFLADVKQYYESE (SEQ ID NO: 190).

Med hensyn på aminosyresekvensene av andre fragmenter enn AP 12 og AP3 ble det ikke funnet noe protein eller gen hvis likhet kunne bli tatt i betraktning.

(Eksempel 3)

Analyse av biologiske karakteristikker av TPO avledet fra blodplasma av trombocvtooeniske rotter

(1) I rotte CFU- MK analysesystemet ( væskekultursvstem)

Som et typisk eksempel viser figur 5 en doseresponskurve for anvendelse av en TPO prøve delvis renset fra trombocytopenisk rotteplasma (TPO-aktiv fraksjon F2 fra YMC Pack-Protein-RP kolonne beskrevet i rensetrinn (8) i eksempel 1-2). Når det kulturerte cellene ble observert periodisk under et mikroskop, ble generering og modning av megakaryocyter, nemlig øking i celletall, observert, sannsynligvis sammen med økning av antall megakaryocyter. Som en spesielt signifikant forandring, ble prosessdannelse av megakaryocyter funnet på den fjerde dag som var den siste dag av dyrkingen (de var knapt observerbare på den tredje dag). En slik prosessdannelse er kalt cytoplasmisk prosessdannelse (Leven and Yee, Blood, vol. 69, s. 1046-1052,1987) eller problodplateprosessdannelse (Topp et al., Blood, vol. 76, s. 912-924,1990), som er ansett å være en blodplateforløperstruktur videre differensiert fra modne megakaryocyter og er ansett åvære det endelige trinnet av megakaryocytdifferensiering som hittil er observert in vitro. Da en slik morfologisk forandring ble observert med høyfrekvens ved bruk av TPO prøven alene, er det mulig at denne faktoren alene kan stimulere proliferasjonen og differensieringen av CFU-MK, kan produsere modne megakaryocyter og kan endelig frigi blodplater.

(2) I kolonianalysesystemet

Når en TPO prøve delvis renset fra blodplasma trombocytopeniske rotter ble undersøkt med kolonianalysesystemet ved bruk av ikke-separert rottebenmargceller, stimulerte celler fra hver av separering/konsentrajonstrinnene eller en GpIIb/IIIa<+> CFU-MK fraksjon, av det rotteplasmaavledede TPO dannelsen av en megakaryocytkoloni. Sammenlignet med megakaryocytkoloniene indusert ved andre cytokiner slik som rotte IL-3, mus GM-CSF eller human EPO, er de TPO induserte megakaryocytkoloniene kjennetegnet ved at hver koloni består av et mindre antall megakaryocyter, men hver megakaryocyt er større i størrelse, noe som betyr større modenhet. I tillegg til at TPO ikke produserte noen eller kun få kolonier i de andre cellelinjene, kan Meg-CSF aktiviteten til TPO bli ansett som megakaryocyt-spesifikk. På basis av disse f aka, er det klart at TPO har forskjellige biologiske egenskaper fra de til andre cytokiner slik som rotte IL-3, mus GM-CSF og og huamn EPO og viser unik Meg-CSF aktivitet.

TPO prøven delvis renset fra blodplasma av trombocytopeniske rotter utøvde også dets Meg-CSF aktivitet på CD34<+>, DR<+> cellefraksjoner avledet fra humane benmargceller eller humane ryggmargsblodceller og induserte signifikante antall humane megakaryocytkolonier, indikerende at denne faktoren ikke hadde noen type spesifisitet.

(Eksempel 4)

Spesialisering av rotte TPO produserende celler

(1) Screenin<g> av rotte TPO produserende organer Screening og spesialisering av rotte TPO-produserende organer ble utført for å sikre en mRNA kilde for anvendelse i kloning av et rotte TPO gen. Først, ble benmarg, lunger, lever og milt tatt periodisk fra rotter gjort trombocytopeniske med P55 antistoffadministrasjon, deres celler (organ seksjoner for lunger og lever) ble dyrket og aktiviteter i de resulterende kultursupernatantene ble undersøkt ved hjelp av CFU- MK analysesystemet. Dette initielle forsøk ga imidlertid ingen distinktive resultater. Følgelig ble det gjort ytterligere forsøk på å dyrke hematocyter fremstilt ved kollagenase perfusjon fira levere til trombocytopeniske rotter indusert med P55 antistoffadministrasjon, under hensyntaging til en rapport som indikerte en sammenheng mellom leveren og TPO produksjonen i rotter (Siemensma et al., J. Lab. Clin. Med., vol. 86, s. 817-833,1975). Når den resulterende supernatanten ble påsatt en WGA-agarosekolonne og så den adsorberte fraksjonen ble fraksjonert på eb Vydac fenyl reversfase kolonne, ble overveiende tilsvarende aktivitet funnet på den samme posisjonen av den rotteplasma avledede TPO aktiviteten i rotte CFU-MK analysesystemet. Svak, men den samme aktiviteten, ble også funnet i kultursupernatanten fra normale rotte hepatocyter. Disse resultatene antydet sterkt at leveren vil være et av de TPO produserende organene. (2) Screening av rotte TPO- produserende cellelinjer På basis av resultatene ovenfor ble screening av rotte TPO produserende cellelinjer utført. Først ble hver av 20 rotter lever-avledede cellelinjer dyrket i respektive subkulturmedier inntil cellene oppnådde nesten sammenvoksende nivå, kulturmediet ble byttet med det samme respektive medium tilsatt 5% FCS og dyrking ble fortsatt i 3 dager. Når hver av de resulterende kultursupernatantene var delvis renset ifølge prosedyren beskrevet i trinnet (1) ovenfor for å undersøke eksistensen av TPO produksjonen, ble TPO aktivitet klart funnet i tre rotte hepatiske parenchymale celleavledede cellelinjer, nemlig McA-RH8994 celler (ATCC deponeringsnummer CRL1602; Becker et al., "Oncodevelopmental Gene Expression" editert av Fisman og Seli, Academic Press, NY. s. 259-270,1976; anskaffet fra Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd.), H4- H-E celler (ATCC deponeringsnummer CRL1548; Pitot et al., Nat. Cancer Inst. Monogr., vol. 13, s. 229-245,1964; anskaffet fra Dainippon

Pharmaceutical Co., Ltd.) og HTC celler (Thompson et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA, vol. 56, s. 296-303,1966; anskaffet fra Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd.).

(3) Detaljert analyse av TPO aktivitet i McA- RH8994 celler.

H4- II- E celler og HTC celler

Biokjemiske og biologiske egenskaper til de TPO-aktive proteinene utskilt fra disse tre rottecellelinjene ble undersøkt i detalj og sammenlignet med de i rotteplasmaavledede

TPO.

McA-RH8994 celler ble suspendert i alfa-MEM(-) flytende kulturmedium inneholdende 10% FCS og overført til 175cm2 plastvevskulturflaske ved 1 x IO<6> celler/flaske. Etter 3 dagers dyrking ved 37°C i en 5% CO2 inkubator, ble mediet byttet med IMDM kulturmedium inneholdende 5% FCS og dyrking ble fortsatt i ytterligere 3 dager for å gjenvinne den resulterende kultursupernatanten. H4-H-E celler ble suspendert i Dulbeccos modifiserte Eagles flytende kulturmedium (glukose 4.5 g/l, heretter referert til som "DMEM") inneholdende 10% FCS overført til 175 cm<2> plastvevskulturflaske ved 5 x 10<5> celler/flaske. Etter 3 dagers dyrking ved 37°C i en 5% CO2 inkubator, ble mediet byttet med IMDM kulturmedium inneholdende 5% FCS og dyrkingen ble fortsatt i ytterligere 3 dager for å gjenvinne den resulterende kultursupernatanten. HTC celler ble også suspendert i DMEM flytende kulturmedium inneholdende 5% FCS og overført i en 175 cm<2> plastvevskulturflaske med 2 x 10^ celler/flaske. Etter 3 dagers dyrking ved 37°C i en 5% CO2 inkubator ble mediet byttet med IMDM kulturmedium inneholdende 5% FCS og dyrkingen ble fortsatt i ytterligere 3 dager for å gjenvinne den resulterende kultursupernatanten.

Ved bruk av en 2 liters porsjon av den således fremstilte kultursupernatanten fra hver av de tre cellelinjene ble delvis rensing av det cellelinje avledede TPO utført ifølge prosedyren beskrevet for rensing av TPO fra XRP beskrevet i eksempel 1 til 2. Nedenfor beskrives en skisse av resultatene.

Først ble hver av kultursupernatantene konsentrert omkring 6 ganger ved bruk av et ultrafiltreirngsapparat og mediet ble byttet med 20 mM Tris-HCl buffer (pH 8.0) ved bruk av en Sephadex G-25 kolonne. Det resulterende eluatet ble satt på en Q-Sepharose FF kolonne, kolonnen ble vasket med 20 mM Tris-HCl (pH 8.0) og den adsorberte fraksjonen ble eluert med 20 mM Tris-HCl (pH 8.0) inneholdende 175 mM NaCl. Disse således eluerte fraksjonene ble satt på en WGA-agarosekolonne, kolonnen ble vasket med PBS og den adsorberte fraksjonen ble eluert med 20 mM natriumfosfat (pH 7.2) inneholdende 0.2 M GlcNAc og 0.15 M NaCl. Resulterende eluater ble satt på en TSK-gel AF-BLUE 650MH kolonne, kolonnen ble vasket med 20 mM natriumfosfat (pH 7.2) inneholdende 1 M NaCl og den adsorberte fraksjonen ble eluert med 2 M NaSCN. Det resulterende eluatet ble satt på en fenyl- sepharose 6 FF/LS kolonne, kolonnen ble vasket med 50 mM natriumfosfat (pH 7.2) inneholdende 1.5 M ammoniumsulfat fulgt av 0.8 M ammoniumsulfat inneholdende 36 mM natriumfosfat og så ble den adsorberte fraksjonen eluert med 20 mM natriumfosfat (pH 7.2). Den således oppnådde adsorpsjonsfraksjonen ble konsentrert og så fraksjonert ved bruk av en revers fase Vydac protein C4 kolonne (fremstilt av The Separations Group, katalognr. 214TP51015; 1 cm i diameter og 15 cm høyde. Det vil si prøvene satt på C4 kolonnen som hadde blitt ekvilibrert på forhånd med 20% B og så ble elueringen utført i 90 minutter av lineær gradient av 20% B til 40% B med en strømningshastighet på 1 ml/min. ved bruk av 0.1% TFA i utvikling oppløsningsmiddel A og en propanol inneholdende 0.05% TFA i utviklingsoppløsningsmiddel B. Som resultat, ble hver av de TPO aktive proteinene avledet fra disse cellelinjene eluert med en 1-propanolkonsentrasjon på 30 til 43%.

Når TPO aktivitetene i prøvene i hvert rensetrinn ble målt ble rotte CFU-MK analysesystemet, viste resultatene at TPO aktiviteten på de tre cellelinjene oppførte seg med tilsvarende mønster til de til det XRP-avledede TPO (se eksempel 1-2). Relativ aktivitet, aktivitetutbytte og lignende ved hvert rensetrinn målt ved rotte CFU MK analysesystemet er vist i tabell 2.1 tillegg, når TPO aktiviteten i eluatene fra den endelige revers fase kolonnen ble målt ved rotte CFU- MK analysesystem, ble TPO aktiviteter av de tre cellelinjene og XRP-avledet TPO funnet i det samme toppområdet. Når kolonneanalyser TPO aktive fraksjoner fra revers fase kolonne ble utført ved bruk av ikke-adherente celler oppnådd i adherens uttynningstrinnet på separeringen av konsentreringene av rotte GpIIb/nia<+> CFU-MK, elueringsmønstrene til Meg-CSF aktiviteten lå nær de til TPO aktivitet målt ved rotte CFU-MK analysesystemet (se tabell 3). I tillegg, behandlet tilsvarende til filfellet ved XRP-avledet TPO, hver av TPO aktivitetene til tre cellelinjer ingen eller få kolonier av de andre cellelinjene.

Hver av de oppsamlede aktive fraksjonene fra revers fase kolonnen ble utsatt for SDS-PAGE ifølge prosedyren beskrevet i eksempel 1-2. Når protein blir ekstrahert fra den resulterende gel og TPO aktiviteten ble målt ved rotte CFU-MK analysesystemet, ble en tilsynelatende molekylvekt til XRP- avledet TPO, McA-RH8994 celleavledet TPO og H4-II-E celle- avledet TPO funnet å være henholdsvis 17.000 til 22.000, 33.000 til 39.000 og 31.000 til 38.000 og det HTC celleavledede TPO viste tilsynelatende molekylvekt på 17.000 til 22.000 og 28.000 til 35.000.

Disse resultatene avslørte således at TPO proteinene fremstilte av McA-RH8994 celler, H4-U-E celler og HTC celler er ekvivalente til de XRP-avledede TPO hva angår deres biologiske egenskaper, selv om deres biokjemiske egenskaper er svakt forskjellige fra hverandre hva angår tilsynelatende molekylvekt. Et bemerkelsesverdig funn ifølge foreliggende oppfinnelse er muligheten at et TPO-aktivt proteinmolekyl inneholdt i blod kan være et produkt av delvis fordøyelse ved dets spesifikke eller irregulere sete i dets produksjonsceller eller etter dets sekresjon fra produksjonscellene. Det er også foreslått mulig eksistens av TPO gener (mRNA og cDNA) med forskjellige lengder.

(Eksempel 5)

Kontruksjon av ekspresjonsvektor (pEF18S) for cDNA bibliotek En vektor inntil hvilket cDNA fragment kan bli integrert lett og som kan utvise en høy ekspresjonseffektivitet av det klonede cDNA, ble konstruert for anvendelse ved kloning og ekspresjon av TPO cDNA. Det vil si, en ekspresjonsvektor pEF18S ble konstruert fra ekspresjonsvektoren pME18S ved åerstatte SRoc promoteren med en forlengelsesfaktor la (EFla) promoter som er kjent som en høyekspresjonspromoter (se figur 6). Promoteren av forlengelsesfaktor la ble oppnådd ved delvis fordøying av 1 (ig av en ekspresjonsvektor pEF-BOS (Mizushima et al., Nucleic Acids Res., vol. 18, s. 5322, 1990) med restriksjonsenzymer HindHI og EcoRI, utsetter resultatet for en 2% agarosegel (fremstilt av FMC BioProducts) elektroforese for å isolere et cDNA fragment omkring 1200 bp og rensing av DNA fragmentet ved bruk av et Prep-A-gen DNA rensesett (fremstilt av Bio-Rad Laboratories, Inc.; et sett for anvendelse i selektiv rensing av DNA som utført ved porøs silika matriks-støttet DNA adsorpsjon, utviklet på basis av prosedyren rapportert av Willis et al. i Bio Techniques, vol.9, s. 92-99,1990). En 100 ng porsjon av det således oppnådde cDNA fragment ble ligert med 50 ng av en ekspresjonsvektor pME18S (Liu et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA, vol. 90, s. 8957-8961,1993) som på forhånd er blitt fordøyd med Hindm og EcoRI. Celler av en kommersiell vertstamme, Competent High E. coli DH5 (fremstilt av Toyobo Co., Ltd., en kompetent E. coli stamme fremstilt ved en modifisert fremgangsmåte ifølge Hanahan et al., J. Mol. Biol., vol. 166, s. 557-580,1983), ble transformert med den således konstruerte vektor. Etter dyrking av de transformerte celler, ble 12 kolonier valgt tilfeldig og plasmid DNA ble renset fra hver koloni. Totalt 10 kolonier inneholdende ved aktuelle plasmider (pEF18S) ble oppnådd ved analysering av restriksjonenzym etter mønster for disse DNA molekylene. Deretter ble en klon valgt derfra dyrket for å fremstille en stor mengde av plasmid DNA.

Rensing av plasmid DNA ble utført hovedsakelig ifølge prosedyren beskrevet i Molecular Cloning (Sambrook et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989). Det vil si klonen pEF18S fremstilt ovenfor ble dyrket over natt ved 37°C i 50 ml ved LB medium (1% Baco-trypton, 0.5% Bacto-gjærekstrakt, 0.5% NaCl) inneholdende 50 (i g/ml ampicillin og de resulterende cellene oppsamlet ved sentrifugering ble suspendert i 4 ml TEG-lysozym oppløsning (25 mM Tris-HCl, pH 8, 10 mM EDTA, 50 mM glukose, 0.5% lysoxym). Til dette ble det tilsatt 8 ml 0.2 N NaOH/1% SDS oppløsning og så 6 ml av 3M kalium/5 M acetatoppløsning for å suspendere cellene grundig. Etter sentrifugering av suspensjonen ble den resulterende supernatantvæsken behandlet med fenol-kloroform (1:1), blandet med det samme volum isopropanol og så sentrifugert. Den resulterende pellet ble oppløst i TE oppløsning (10 mM Tris-HCl, pH 7.5, 1 mM EDTA) og behandlet med RNase og så med fenol- kloroform (1:1), fulgt av etanolfelling. Den resulterende pellet ble igjen oppløst i TE oppløsning til hvilket det deretter ble tilsatt NaCl og polyetylenglykol 3000 til en endelig konsentrasjon på henholdsvis 0.63 M og 7.5%. Etter sentrifugering ble pelleten oppløst i TE oppløsning utfelt med etanol. På denne måten ble omkring 300 (ig plasmid DNA oppnådd. En 100 (ig porsjon av DNA som ble fullstendig kuttet med restriksjonsenzym EcoRI og Noti og utsatt for 0.8% agarosegel (fremstilt av FMC BioProducts) elektroforese og den således isolerte vektorfragment ble renset ved bruk av Prep-A-Gene DNA rensesett (fremstilt av Bio-Rad laboratories, Inc.) for å oppnå 55 (ig plasmid DNA som ble benyttet i den følgende cDNA bibliotekkonstruksjonen.

(Eksempel 6)

Rensing av mRNA fra McA-RH8994 celler

McA-RH8994 celler som viste relativt høy aktivitet i kolonianalysen i eksempel 4 ble valgt som materiale for anvendelse i rotte TPO cDNA kloning og utsatt for de følgende eksperimenter.

Isolering av totalt RNA ble utført hovedsakelig ifølge prosedyren beskrevet i Molecular Cloning (Sambrook et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989). Det vil si McA-RH8994 celler ble dyrket til sammenvoksning i 15 kulturskåler på 90 mm diameter. Etter fjerning av væskemediet, ble celler i hver skål grundig suspendert i 0.8 ml av en 5 M guanidinoppløsning (5 M guanidintiocyanat, 5 mM natriumsitrat (pH 7.0), O.lMfi-merkaptoetanol, 0.5% natriumsarcosylsulfat), og den resulterende suspensjonen i alle skålene ble oppsamlet i et rør og det totale volumet ble justert til 20 ml med den samme guanidinoppløsningen. Resulterende blanding som ble viskøs på grunn av celleødeleggelse, ble utsatt for 20 repetisjoner innsuging/utblåsing med en 20 ml sprøyte påsatt en 18G nål og så 21 g nål inntil blandingen ble nærmest ikke- viskøs. En 18 ml porsjon av 15.7 M CsCl-0.1 M EDTA (pH 7.5) ble benyttet som en pute i et polyallomer sentrifugeringsrør for anvendelse i Beckman SW28 rotor og den ovennevnte blandingen omkring 20 (il ble forsiktig lagt over puten på en slik måte at lagene ikke ble ødelagt og røret ble nesten fylt. Det således fremstilte røret ble utsatt for 20 timer sentrifugering ved 25000 omdreininger pr. minutt ved 20°C. Den resulterende pellet ble vasket 2 ganger med en liten mengde 80% etanol, oppløst i TE opplsøning, ekstrahert med fenol/kloroform (1:1) og så utsatt for etanolfelling med et 1/10 volum 3 M natriumacetat og 2,5 volum etanol. På denne måten ble det oppnådd omkring 2.5 mg totalt RNA fra omkring 108 celler.

Rensing av poly (A)+ RNA fra totalt RNA ble utført ved anvendelse av OligotexTM-dT30 (Super) (fremstilt av Japan Synthetic Rubber/Nippon Roche; oligo dT molekyler er immobilisert på latekspartikler ved kovalent binding og rensing av poly (A)+ RNA kan bli ivaretatt tilsvarende til anvendelse av en oligo dT kolonne som generelt blir benyttet for slike formål. Som resultat, ble 20 ng poly (A)+ RNA oppnådd fra omkring 500 ng totalt RNA.

(Eksempel 7)

Konstruksjon av rotte cDNA bibliotek

Dobbel-strenget cDNA med et EcoRI gjenkjenningssete ved dets 5'-merket ende og et Noti gjenkjenningssete ved 3-enden ble syntetisert fra 5 ng av poly (A)+ RNA fremstilt i eksempel 6 ved bruk av Time SaverTM cDNA syntesesett (fremstilt av Pharmacia; et cDNA syntesesett basert på den modifiserte fremgangsmåten til Okayama og Berg, Mol. Cell. Biol., vol. 2, s. 161-170,1982) og DIRECTIONAL CLONING TOOLBOX (fremstilt av Pharmacia; et sett av en primer 5-AACTGGAAGAATTCGCGGCCG-CAGGAA(T)18-3' (SEQ ID NO: 15) inneholdende en Noti gjenkjenningssete for anvendelse ved syntese av cDNA og adapter 5-AATTCGGCACGAG-3' (SEQ ID NO: 16) og 5-CTCGTGCCG-3' (SEQ ID NO: 17) for anvendelse i addisjonen av en EcoRI gjenkjenningssekvens). Det således fremstilte cDNA ble ligert med 1.2 ng av ekspresjonsvektoren pEF18S (se eksempel 5) som hadde blitt kuttet på forhånd med EcoRI og Noti og transformert inn i 8.4 ml av de ovennevnte Competent High E. coli DH5 (fremstilt av Toyobo Co., Ltd.). Som et resultat ble det oppnådd 5.3 x 105 transformanter.

(Eksempel 8)

Fremstilling (kloning) av rotte TPO cDNA fragment ved PCR

De 530.000 klonene av McA-RH8994 cDNA bibliotek konstruert i eksempel 7 ble dyrket over natten i 50 ml LB medium inneholdende 50 ng/ml ampicillin og McA-RH8994 cDNA bibliotekplasmider ble renset fra de resulterende cellene oppsamlet ved sentrifugering, ved anvendelse av QIAGEN-tiplOO (fremstilt av DIAGEN; en anionbyttesilikakolonne for DNA rensing). Omkring 200 ng plasmid DNA ble oppnådd.

To anti-sens nukleotidprimere AP8-1R og AP8-2R som tilsvarer aminosyresekvensene til peptidfragmentet AP8 beskrevet i eksempel 2 og to sens nukleotidprimere EPloc-1 og EFla-2 som tilsvarer det første intronet i den humane forlengelsesfaktor la av plasmidvektoren pEF-18S (se fig.6) benyttet for fremstilling av cDNA bibliotek, ble syntetisert. Syntese av disse primerene ble utført ved anvendelse av en 394DNA/RNA syntheisizer (fremstilt av Applied Biosystems; en syntetisator basert på B-cyanoetylamidit metoden) deres rensing ble utført ved anvendelse av en OPC kolonne for syntetisk DNA rensing (fremstilt av Applied Biosystems; en revers fase silikagelkolonne for anvendelse i rensingen av syntetisk DNA med tritylgrupper). Hver av de således syntetiserte og rensede DNA molekylene ble oppløst i TE oppløsning til en konsentrasjon på 50 (im og lagret ved -20°C inntil anvendelsen. Syntetisk mononukleotid er benyttet i de følgende prosedyrene ble syntetisert og renset på samme måte.

Primerene AP8-1R og AP8-2R er blandede primere omfattende 17 etterfølgende nukleotider i hviket deoksyinosin er innkorporerte som rapportert av Takahashi et al.

(Proe. Nati. Acad. Sei. USA, vol. 82, s. 1931-1935,1985).

Primerene EFla-1 og EFla-2 som henholdsvis består av 21 og 20 nukleotider, ble syntetisert basert på nukleotidsekvensen og delene 1491 til 1512 og 1513 til 1532 i den genomiske sekvensen rapportert av Uetsuki et al. (J. Biol. Chem. vol. 264, s. 5791-5798

(1989).

Ved bruk av 3 ug av McA-RH8994 cDNA bibliotekplasmidet som et templat, AP8-1R (500 pmol) og EFla-1 (100 pmol) som primere og Gene Amp™ PCR Reagent Kit med Amplitaq™ DNA polymerase (fremstilt av Takara Shuzo Co., Ltd.; et sett av en termo-stabil taql polymerase, en reaksjonsbuffer og dNTP for anvendelse i PCR), PCR ble utført av GeneAmp™ PCR system 9600 (fremstilt av Perkin-Elmer; et termisk apparat for PCR) (100 ni volum; oppvarmet til 95°C i 2 minutter, totalt av 35 sykluser, hver syklus omfattende denaturering ved 95°C i 1 minutt, annelering ved 40°C i 1 min. og syntese ved 72°C i 1 minutt og endelig inkubering ved 72°C i 7 minutter). For å forbedre spesifisiteten til de således forsterkede DNA fragmentene, ville PCR bli utført (100 (il volum; oppvarming til 95°C i 2 minutter, totalt 35 sykluser, hver syklus omfattet denaturering ved 95°C i 1 minutt, annelering ved 45°C i 1 minutt og syntese ved 72°C i 1 minytt og endelig inkubering ved 72°C i 7 minutter) ved bruk av 1 [il av den således fremstilte PCR reaksjonsoppløsning som templat, og EFla-2 (100 pmol) og AP8-2R (500 pmol) som primere.

Den således fremstilte reaksjonsoppløsningen ble utsatt for 2% agarosegel (fremstilt ved FMC BioProducts) elektroforese for å isolere et DNA fragment på omkring 330 bp som hovedproduktet fra PCR som deretter ble renset ved anvendelse av det ovennevnte Prep-A-Gene DNA rensesett (fremstilt av Bio- Rad Laboratories, Inc.). Ved bruk av T4 DNA ligase (fremstilt av Life Technologies) ble det således rensede DNA fragmentet subklonet inn i pCRTMU vektor (en vektor for anvendelse av TA kloning av PCR produkter, fremstilt av invitrogen). Da den termostabile polymerasen for anvendelse i PCR hadde en terminal transferaseaktivitet det forsterkede DNA fragmentet ble direkte subklonet inn i pCRTMU vektoren som har en 5'-dT kohesiv ende ved hjelp av enzymets evne til å legge til en deoksyadenylinsyre til 3'-enden av det PCR-forsterkede DNA. Plasmid DNA molekyler ble renset fra 28 kloner valgt tilfeldig fra de resulterende klonene ved bruk av QIAGEN- tipl00 (fremstilt av DIAGEN) og deres nukleotidsekvens ble bestemt ved en 373A DNA sekvens (en fluroescenssekvens, fremstilt av Applied Biosystems), ved anvendelse av et Taq Dye DeoxtTM Terminater Cycle Sequening Kit (fremstilt av Applied Biosystems; et sett for anvendelse i PCR-hjulpet nukleotidsekvens determinering ved anvendelse av fluroescensfarvestoffer, basert på dideoksy metoden ifølge Sanger et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA, vol. 74, s. 5463-5467,1977).

Når et DNA fragment som koder tre aminosyreresidier (UeAThr/Ser)-Val-Pro, av aminosyresekvensen fra AP8 vist ovenfor er naboliggende til AP8-2R primeren, ble valgt fra de således fremstilte DNA framentene og dets hele lengde ble sekvensert, den inneholdt cDNA med 261 bp. Posjon 173 til 175 av dette cDNA fragment kodet for etionin og koderammen samsvarte med aminosyrerammen til AP8. Da sekvensen i posisjon 173-175 i DNA fragmentet samsvarte med sekvensen ifølge Kozak (Kozak, M., Cell. vol. 44, s. 238-292, 1986) syntes det at dette cDNA fragmentet inneholder en translasjonsinitieringsregion som koder for N-terminalen til rotte TPO protein. Dette cDNA fragmentet ble gitt navnet Al. Nukleotidsekvensen til Al fragmentet eksklusive vektorsekvensen og en amniosyresekvens avledet derfra, vist den her vedlagte sekvenslistingen (SEQ ID NO: 1).

(Eksempel 9)

Screening av rotte TPO cDNA klonet ved PCR

Det ovennevnte cDNA bibliotek ble delt i pool på omkring 10.000 kloner, dyrket over natten i 1 ml av det ovennnevnte LB medium inneholdende 50 (Ag/ml ampicillin og så utsatt for plasmid DNA ekstraksjon ved anvendelse av automatisert plasmid isolerings apparatet Pl-100 (VER-3.0, fremstilt av Karabo Industries, Ltd.; et automatisert plasmid DNA ekstraksjons apparat basert på en modifisert fremgangsmåte av alkali SDS metoden beskrevet i Molecular Cloning, Sambrook et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989). Separat fra dette ble de to følgende oligonukleotidene syntetisert på basis av cDNA fragment Al og renset.

5'CGAGGGTGTACCTGGGTCCTG 3" (SEQ ID NO: 31) (en sens sekvens av posisjon 1 til 17 av sekvensen ifølge SEQ ID NO: 1;

CGAG står for en adaptersekvens)

5'CAGAGTTAGTCTTGCGGTGAG 3' (SEQ ID NO: 32) (en anti-senssekvens posisjon 212 til 232 av sekvensen ifølge SEQ ID NO: 1)

Ved bruk av 1/30 volum av hver plasmid DNA prøve oppnådd overfor samme templat, med de syntetiserte oligonukleotidene som primere og GeneAmp™ PCR Reagent Kit med AmpliTaq™ DNA Polymerase (fremstilt av Takara Shuzo Co., Ltd), ble PCR utført med GeneAmp™ PCR System 9600 (fremstilt av PERKIN- ELMER) (totalt 30 sykluser, hver syklus bestående av denaturering ved 94°C i 30 sekunder, annelering ved 66°C i 30 sekunder og syntese ved 72°C i 1 minutt). Som et resultat, ble et spesifikt bånd på 236 bp detektert i 3 av de 100 undersøkte forrådene. Når en av disse tre forrådene ble inndelt i under-forråd på omkring 900 kloner for å ekstrahere plasmid DNA og PCR ble utført på samme måte, ble et spesifikt bånd detektert i 3 av de 100 testede subforrådene. Når en av disse subforrådene ble ytterligere delt i forråd på 40 kloner og den samme screeningsprosessen ble utført, ble det spesifikke båndet funnet i 3 av de 100 testede forrådene. Etter at de aktuelle forrådene ble dyrket på en LB plate (LB medium inneholdende 15% agar) tilsatt 50 [ig/ml ampicillin og hver av de således dannede koloniene ble utsatt for plasmid DNA ekstraksjon og PCR på samme måte. Som et resultat, ble et positivt bånd detektert 2 av de 100 undersøkte klonene.

(Eksempel 10)

Sekvensering av rotte TPO cDNA

Rensing av plasmid DNA ble utført hovedsakelig ifølge prosedyren beskrevet i Molecular Cloning (Sambrook et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989). Hver av de to klonene oppnådd i eksempel 9 ble dyrket over natten i 50 ml LB medium inneholdende 50 [ig/ml ampicillin og omkring 300 [ig plasmid DNA ble oppnådd etter rensing på samme måte som beskrevet i eksempel 6.

Det således oppnådde plasmid DNA ble utsatt for sekvensering på samme måte som beskrevet i eksempel 8 ved bruk av Taq Dye DeoxyTM Terminator Cycle Sequening Kit (fremstilt av Applied Biosystems) for å bestemme fullstendig nukelotidsekvens inneholdende Al fragmentet. Som et resultat svarte nukleotidsekvensene av de to klonene fullstendig med hverandre noe som viser at de har den samme klonen. En av disse klonene ble valgt og plasmidet båret av denne klonen ble kaldt pEF18S- A20. Dets nukleotidsekvens og en aminosyresekvens avledet derfra viste i sekvensopplistingen (SEQ ID NO: 2).

Sekvensen vist i sekvensopplistingen (SEQ ID NO: 2) har distinkte karakteristikker. Sekvensen nedstrøms for den 172 bp 5' ikke-tranalaterte region koder for en aminosyresekvens rik på hydrofob aminosyre som er antatt å være en proteinsekresjons-signalsekvens bestående av 21 aminosyrer som starter med methionin. Dette proteinet inneholder 126 aminosyrerester og en 3' ikke-translasjonssekvens på 1025 nukleotider og en poly A hale som følger termineringskodonet (TAA). Dette proteinet inneholder en sekvens som tilsvarer til aminosyresekvensen AP8 analyser i eksempel 2 (aminosyre nr. 1 til 12 i SEQ ID NO: 2), men inneholder ikke en konsensussekvens for N-glykosylering. 1624 til 1629 nukleotidsekvensen lokalisert nær terminalen av 3' ikke-translasjonssekvensen er forskjellig fra konsensussekvensen, men synes å være en potensiell polyadenyleirngssekvens.

Vektoren pEF18S-A2a båret av en E. coli stamme DH5 har blitt deponert av foreliggende oppfinnere 14. februar 1994 under deponeringsnummer FERM BP-4565, i National Institute of Bioscience and Human Technology, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry, Japan.

(Eksempel 11)

Ekspresjon av rotte TPO cDNA i COS 1 celler og bekreftelse av TPO aktivitet Transfeksjon av plasmid pEF18S-A2a inn i COS 1 celler ble utført på følgende måte

ved svak modifisering av DEAE- dekstran metoden som omfatter kloroquin behandling (Sompayrac et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA, vol. 78, s. 7575-7578, 1981; Luthman et al., Nucl. Acids Res., vol. 11, s. 1295- 1308,1983). COS 1 celler (ATCC CRL1650) ble suspendert i det ovennevnte DMEM mediet inneholdende 10% FCS, puttet opp i 100

mm plastikk plastikkvevskulturskåler og dyrket ved 37°C i en 5% C02 inkubator inntil cellene oppnådde omkring 40% sammenflytning. Separat ble plasmig pEF18S-A26 (10 |ig) oppløst i 30 [il HBS (21 mM HEPES, 145 mM NaCl, pH 7.1) tilsatt til 4 ml av DMEM kulturmediet som hadde blitt tilsatt 500 [ig/ml DEAE-dekstran (fremstilt av Pharmacia), 80 [im kloroquin (fremstilt av Sigma Chemical Co.), 8% (v/v) av HBS og

9% (v/v) av Nu-serum (fremstilt av Collaborative Research, Inc.). Den således fremstilte blandingen ble tilsatt til de ovenfor dyrkede COSI cellene som hadde blitt vasket to ganger med DMEM kulturmedium og dyrking ble fortsatt i 5 timer ved 37°C i 5% C02 inkubatoren. Deretter ble kultursupernatanten i skålen fjernet ved sug og den gjenværende cellen i skålen ble vasket to ganger med DMEM kulturmedium, tilsatt 15 ml DMEM kulturmedium inneholdende 10% FCS og dyrket ved 37°C i 3 ti, 5 dager i 5% C02 inkubatoren for å gjenvinne den resulterende kultursupernatanten.

Den således oppnådde kultursupernatanten ble grundig dialysert mot IMDM kulturmedium og evaluert med rotte CFU-MK analysesystemet. TPO aktivitet ble funnet på en doseavhenig måte i kultursupernatanten av COS 1 cellene i hviket plasmidet pEF18S-A2cc ble uttrykt (fig. 7). Tilsvarende til tilfellet av XRP-avledet TPO dannet mange megakaryocyter forlengede cytoplasmiske prosesser på den fjerde dyrkningsdagen. Derimot ble TPO aktivitet ikke funnet i kultursupernatanten til COS 1 celler til hvilket plasmidet pEF18S alene var transfektert (fig. 7). I M-07e analysesystemet, ble M-07e celleproliferasjonsøkende aktivitet også funnet på en doseavhengig måte i kultursupernatanten av COS 1 celler i hvilket plasmidet pEF18S-A2oc ble uttrykt, men ikke i kultursupernatanten til COS 1 celler hvor plasmidet pEF18S alene ble uttrykt. Disse resultatene demonstrerer at A2a inneholder en cDNA som koder for et protein som har en TPO aktivitet.

Deretter ble en delvis renset TPO prøve fremstilt for åundersøke evnen til denne TPO aktiviteten til å fremme blodplateproduksjon in vivo. Først, ble COS 1 celler transfektert med plasmidet pEF18S-A2a, dyrket i tre dager i et serumfritt kulturmedium som hadde blitt tilsatt 0.2 ng BSA, hvorved det ble oppnådd 5.8 liter serumfri kultursupernatant. Proteasehemmer p-APMSF ble tilsatt til den serumfrie kultursupernataten til den endelige konsentrasjonen på 1 mM og blandingen ble filtrert ved bruk av et 0.22 jim filter.b Til 5.793 ml av det resulterende filtrat (proteinkonsentrasjon, 0.229 mg/ml; totalt protein, 1.326 mg; relativ aktivitet, 1000; total aktivitet 1.326.000) ble det tilsatt 0.85 mol NaCl for hver 1000 ml (288 g totalt), for å oppnå 5849 ml oppløsning inneholdende 0.822 M NaCl. Den således fremstilte oppløsning er forutsatt, med en strømningshastighet på 7 ml/min., på en TSK gel AF-BLUE 650 MH kolonne (fremstilt av Tosoh Corp., katalog nr. 08705; 5 cm diameter og 6 cm høyde) som hadde blitt ekvilibrert på forhånd med 20 mM natriumfosfat (pH 7.2) inneholdende 1 M NaCl. Etter fullførelse av prøveanvendelsen ble omkring 7.900 ml eluat passerte gjennom kolonnen, eluert med 20 mM natriumfosfat (pH 7.2) inneholdende 1 M NaCl. Dette eluatet ble oppsamlet og konsentrert ved anvendelse av ultrafiltreringsenhet (Omega Ultrasette, nominell molekylvekt cutoff på 8.000; fremstilt av Filtron), for derved å oppnå en gjennomstrømmet fraksjon Fl (460 ml; proteinkonsentrasjon, 2.11 mg/ml; total protein 973 mg; relativ aktivitet 16.3). Deretter ble elueringsoppløsningen forandret til 2M NaSCN og den således eluerte TSK-gel AF-BLUE 650MH-adsorberte TPO-aktive fraksjonen F2 (2840 ml) ble konsentrert til 6.81 ml anvendelse av en ultrafiltreringsenhet med YM 3 membran (76 mm diameter, fremstilt av Amicon Corp.). Totalprotein i denne TPO-aktive fraksjonen F2 var 12.5 mg og proteinutbytte av F2 i dette trinnet var 0.62%. Relativ aktivitet av TPO ble beregnet åvære 240. Deretter ble F2 satt på en HiLoad 26/60 Superdex 200 pg (fremstilt av Pharmacia Biotech, katalognr. 17-1071-01; 2.6 cm i diameter og 60 cm materialhøyde) og utviklet med 20 mM natriumacetat (pH 5.5) inneholdende 50 mM NaCl med en strømningshatiget på 1 ml/min. Etter avslutning av utviklingen, ble TPO aktiviteten funnet i eluatene i området fra 194 til 260 ml etter anvendelse. Disse eluatene ble oppsamlet for å oppnå en Superdex 200 pg TPO-aktiv fraksjon F2 (66 ml; proteinkonsentrasjon, 0.012 mg/ml; totalt protein 7.41 mg; relativ aktivitet, 142.860; total aktivitet 1.058.600). Deretter ble buffer A (20 mM natriumacetat, pH 5.5) og buffer B (20 mM natriumfosfat, pH 7.2, inneholdende 500 mM NaCl) ble fremstilt og den TPO-aktive fraksjonen ble satt på en strømnings-hastighet på 1 ml/min. på en sterk kationbyttekolonne RESOURCE S (fremstilt av Pharmacia Biotech, katalognr. 17-1178-01; 0.64 cm diameter og 3 cm materialhøyde) som på forhånd var ekvilibrert med 100% A. Deretter ble elueringen utført med en strømningshastighet på 0.3 mg/min. med 40 minutter lineærgradient fra 100% A til 100% B. Når alaysert ble TPO aktiviteten detektert i et bredt eluatområde (fra 5% B til 32%B). Disse TPO-aktive eluatene ble oppsamlet og konsentrert ved bruk av en ultrafiltreringsenhet med YM 3 membran (25 mm diameter, fremstilt av Amicon Corp.) for å oppnå en RESOURCE S TPO-aktiv fraksjon F2 (1.65 ml; proteinkonsentrasjon 4.74 mg/ml; total protein 7.82 mg; relativ aktivitet 71.400; total aktivitet 558.600).

Den delvis rensede TPO prøven ble administrert subkutant i 5 påfølgende dager (474 mg (100 |il)/mus/dag) til hannkjønn ICR mus (9 uker gamle) hvis blodplateantall hadde blitt målt dagen før administrasjon. Som en kontroll, ble BSA (200 [Ag (100 ul)/ mus/dag) eller en buffer benyttet som oppløsningsmiddel av det delvis rensede TPO (100 [il/mus/dag) administrert på samme måte. På dagen etter den siste administrasjonen ble blod samlet fra hjertet til hver mus for åmåle blodplatetelling ved anvendelse av hemocytometer (F800, fremstilt av Toa Iyo Denshi). I musene administrerte delvis renset TPO ble en økning i blodplatetelling med en faktor på omkring 2.14 observert sammenlignet med blodplatetelling før administrasjon. Når sammenlignet med kontroll-gruppene økte blodplatetellingene i den delvis rensede TPO-administrerte musen var omkring 1.74 ganger mer enn de musene som var adminisert BSA og omkring 1.90 ganger høyere enn de musene som var buffer-administrert. Disse resultatene viste at TPO fremmer blodplateproduksjon in vivo. I tillegg, der mengden av immunosuppresiv syreprotein (IAP), kjent som et akutt faseprotein fra mus, ikke bare levert i musene adrninistrerte delvis renset TPO, indikerte dette sterkt at TPO er forskjellig fra IL-6 og IL-11 hva angår induksjon av akutt faseprotein.

(Eksempel 12)

Deteksjon av TPO mRNA i rottevev

For å lokalisere rotte TPO mRNA uttrykkende vev i rottekroppen, ble RNA ekstrahert

fra forskjellige rottevev. Totalt 6 rotter ble utsatt for røntgenbestrålning på samme måte som beskrevet i eksempel 1 og forskjellig vev (hjerne, thymus, lunge, lever, hjerte, milt, tynntarm, nyre, testis og benmargceller) ble tatt ut fra rottene på den 11. til 14. dag etter røntgenstråle bestrålning og umiddelbart frosset i flytende nitrogen. Ekstraksjon av totalt RNA ble utført ved anvendelse av et RNA isolasjonsreagens ISOGEN (fremstilt av Wako Pure Chemical Industries, Ltd.). Mengden av ISOGEN som skal bli benyttet, ble bestemt ifølge vekten av hver frosset vevsprøve og den reagenstilsatte vevsprøven ble behandlet med homogenisator (PhyscotronR NS-60, fremstilt av NITI-ON Medical & Physical Instruments MFG. Co., LTD) inntil fullstendig disintegrering av vevet ble oppnådd (omkring 45 til 60 sekunder ved 10000 omdreininger pr minutt). Vevs-homogenisatet ble så utsatt for total RNA ekstraksjon ved anvendelse av en prosedyre basert på syreguanidiumfenolkloroform metoden ifølge Chomczynski et al. (Anal. Biochem., vol. 162, s. 156-159,1987). Som et resultat ble 1.1 til 5.6 mg totalt mRNA oppnådd fra respektive vev.

Ved bruk av OligotextM-dT20 (Super) (fremstilt av Japan Synthetic Rubber/Nippon Roche), ble 20 ng poly (A)+ RNA renset fra omkring 500 ng totalt RNA.

Ved bruk av random primer ble første streng av cDNA syntetisert fra 1 ng av poly (A)+ RNA fremstilt fra hvert av vevene. Det vil si 1 ng av poly (A)+ RNA ble oppløst i 10 ni sterilt vann, inkubert ved 70°C i 15 minutter så hurtig kjølt ned. Til dette ble det tilsatt 75 pmol random primer (takara Shuzo Co., Ltd.), 10 U RNase hemmer (Boehringer-Mannheim Corp.), 50 mM Tris-HCl (pH 8.3), 75 mM KC1,3 mM MgC12 og 200 U Super ScriptTM II (en revers transkriptase fremstilt av Life Technologies). Den således fremstilte oppløsningen (totalvolum 20 ni) ble inkubert ved 37°C i 1 time og den resulterende reaksjonsoppløsningen ble inkubert ved 70°C i 10 minutter for å inaktivere enzymet og lagret ved -20°C inntil dets anvendelse.

Nye primere for PCR ble syntetisert basert på rotte TPO cDNA sekvens oppnådd i eksempel 10. Sekvenser av de således syntetiserte primere er som følger.

rTPO-L 5'-CCT GTC CTG CTG CCT GCT GTG-3' (SEQ ID NO: 33)

(posisjoner 347 til 367 i SEQ ID NO: 2)

rTPO-N: 5'-TGA AGT TCG TCT CCA ACA ATC-3' (SEQ JD NO: 34)

(anti-sens primer tilsvarende til posisjon 1005 til 1025 i SEQ ID NO: 2).

Ved anvendelse av 1/10 volum av hver av de syntetisert cDNA oppløsningene som templat, 1 uM av hver av de således syntetiserte rTPO-I og rTPO-N som primere og GeneAmp™ PCR reagenssett med AmpliTaq™ DNA polymerase (fremstilt av Takara Shuzo Co., Ltd.), ble PCR utført i et volum på 100 [il ved bruk av et GeneAmp™ PCR system 9600 (fremstilt av PERKIN-ELMER) og oppvarming ved 95°C i 2 minutter, repetering av totalt 30 sykluser, hver syklus bestående av denaturering ved 95 °C i 1 minutt, annelering ved 57°C i 1 minutt og syntese ved 72°C i 1 minutt fulgt av den endelige inkuberingen ved 72°C i 7 minutter. Når hver av de således fremstilte reaksjonsoppløsningene ble utsatt for elektroforese ved bruk av 2% agarosegel (fremstilt av FMC BioProducts) og forsterkede bånd ble undersøkt, ble bånd som syntes å være spesifikke over TPO mRNA funnet på geler som var resultat fra hjerne, lever, tynntarm og nyre. Disse resultatene indikerer at ekspresjon av TPO mRNA hos rotter opptrer i disse organene, selv om dets ekspresjonsmengde ikke kan bli bedømt. Noen mulig eksistens av tilsvarende ekspresjonsmodus i den humane kropp og resultatene i eksempel 4 sammen blir vurdert, synes det at leveren er et passende startmateriale for anskaffelse av humant TPO cDNA.

(Eksempel 13)

Konstruksjon av humant normalt lever-avledet cDNA bibliotek

Basert på resultatene fra eksempel 12 ble leveren valgt som startmateriale for anvendelse av kloning av human TPO cDNA. På samme måte som beskrevet i eksempel 7 ble dobbeltstrenget cDNA med et EcoRI gjenkjenningssete på dets 5'-ende og et Noti gjenkjenningssete på dets 3'-ende, syntetisert fra 5 [ig kommersielt normal human leveravledet poly(A)+ RNA (fremstilt av Clontech; et produkt ekstrahert basert på syreguanidiniunrfenolkloroformmetoden til Chomczynski et al.,) ved anvendelse av Time SaverTM cDNA syntesesett (fremstilt av Pharmacia) og DIRECTIONAL CLONING TOOLBOX (fremstilt av Pharmacia). Det således syntetiserte cDNA ble ligert med 1,2 [ig av den ovenfor nevnte ekspresjonsvektoren pEF18S som hadde blitt kuttet på forhånd med EcoRI og Noti og transformert inn i 8.4 ml av den ovenfor nevnte Competent High E. coli DH5 (fremstilt av Toyobo Co., Ltd.). Som et resultat ble det oppnådd 1,2 x 106 transformanter.

(Eksempel 14)

Fremstilling (kloning) av human TPO cDNA fragment ved PCR

Bruk av random primer, ble den første strengen av cDNA syntetisert fra 1 ng av kommersielt normalt humant leveravledet poly(A)+ RNA (fremstilt av Clontech). Det vil si 1 [ig av poly(A)+ RNA ble oppløst i 10 [il sterilt vann, inkubert ved 70°C i 15 minutter og så hurtig avkjølt. Til dette ble det tilsatt 75 pmol random primer (Takara Shuzo Co.„ Ltd.), 10 U Rnase inhibitor (Boehringer Mannheim Corp), 50 mM Tris-HCl (pH 8.3), 75 mM KC1, 3 mM MgC12 og 200 U av revers transkriptase Super ScriptTM II (fremstilt av Life Technologies). Den således fremstilte oppløsningen (totalt volum 20 ul) ble inkubert ved 37°C i 1 time og den resulterende reaksjonsoppløsningen ble inkubert ved 70°C i 10 minutter ved å inaktivere enzymet og lagret ved -20°C til dets anvendelse.

Primere for PCR anvendelse ble syntetisert basert på rotte TPO cDNA sekvens (SEQ ID NO: 2). Sekvenser av den således syntetiserte primeren er som følger:

rTPO-AlN: 5'-ATG GAG CTG ACT GAT TTG CTC-3' (SEQ ID NO: 35)

(posisjoner 173 til 193 i SEQ ID NO: 2)

rTPO-N: 5'-TGA AGT TCG TCT CCA ACA ATC-3' (SEQ ID NO: 36)

(anti-sens primer tilsvarende til posisjonene 1005 til 1025 i SEQ ID NO: 2).

Ved bruk av 1/10 volum av det syntetiserte cDNA oppløsning som templat, 1 |iM av hver av disse syntetiserte rTPO-AIN og rTPO-N som primere og GeneAmp™ PCR reagenssett med AmpliTaq™ DNA polymerase (fremstilt av Takara Shuzo Co.), ble PCR utført på et volum på 100 ul ved bruk av GeneAmp™ PCR system 9600 (fremstilt av PERKIN-ELMER) og oppvarming ved 95°C i 2 minutter, gjentatt totalt i 35 sykluser, hver syklus omfattende denaturering ved 95 °C i 1 minutt, annelering ved 40°C i 1 minutt og syntese ved 72°C i 1 minutt fulgt av inkubering ved 72°C i 7 minutter.

Den således fremskaffede reaksjonsoppløsningen ble utsatt for 2% agarosegel (fremstilt av FMC BioProducts) elektroforese for å isolere et DNA fragment på rundt 620 bp og hovedproduktet fra PCR som deretter ble renset ved bruk av det ovennevnte Prep-A-Gene DNA rensesett (fremstilt av Bio-Rad Laboratories, Inc.). Nukleotidsekvensen og det således rensede DNA fragment ble direkte bestemt en 373A DNA sekvensator (fremstilt av Applied Biosystems) ved bruk av det ovennevnte Taq Dye Deoxy™ Terminater Cycle Sequening Kit (fremstilt av Applied Biosystems). Den således bestemte nukleotidsekvensen, eksklusive primerdelen og en aminosyresekvens avledet derfra, er vist i sekvenslistingen (SEQ ID NO: 3).

Dette DNA fragmentet, ekskluderte primersekvensen, har en lengde på 580 bp. Ved sammenligning, viser det humane cDNA en homologi på 86% med rotte cDNA nukleotidsekvensen noe som indikerer at dette DNA fragmentet koder for en del av humant TPO cDNA.

(Eksempel 15)

Screening av human TPO cDNA klon ved PCR

Humane TPO-korresponderende primere fra PCR ble syntetisert basert på SEQ DD NO: 3. Sekvenser for de således syntetiserte primerene som følger.

hTPO-I: 5'-TTG TGA CCT CCG AGT CCT CAG-3' (SEQ DD NO: 37)

(posisjoner 60 til 80 i SEQ DD NO: 3)

hTPO-J: 5'-TGA CGC AGA GGG TGG ACC CTC-3' (SEQ DD NO: 38)

(anti-sens primer tilsvarende posisjoner 479 til 499 i SEQ DD NO: 3).

Det humane cDNA biblioteket konstruert i eksempel 13 ble forsterket og delt i forråd (hvert forråd inneholdt omkring 100.000 kloner), dyrket over natten i 1 ml av den ovennevnte LB mediun inneholdende 50 mg/ml ampicillin også utsatt for plasmid DNA ekstraksjon ved bruk av et automatisert plasmid isoleringsapparat PI-100 (VER-3.0, fremstilt av Kurabo Industries, Ltd.). Det således ekstraherte DNA ble oppløst i TE oppløsning.

Ved bruk av 5% av det ekstraherte DNA prøven som templat, 1 \ im hver av de syntetiserte oligonukleotidene (hTPO-I og hTPO- J) som primer og GeneAmp TM PCR Reagent Kit med AmpliTaq™ DNA polymerase (fremstilt av Takara Shuzo Co., Ltd.), ble PCR utført i 20 ul volum ved GeneAmp™ PCR system 9600 (fremstilt av PERION-ELMER) (totalt 35 sykluser, hver syklus omfatter denaturering ved 95°C i 1 minutt, annelering ved 59°C i 1 minutt og syntede ved 72°C i 1 minutt fulgt av endelig inkubering ved 72°C i 7 minutter). Som et resultat ble et spesifikt bånd detektert i 3 av de 90 anvendte forrådene. En av disse forrådene ble delt inn i subforråd, hver inneholdende omkring 5000 kloner og plasmid DNA ble renset fra 90 subforråd før PCR på samme måte. Som et resultat, ble spesifikke bånd detektert i 5 sub-forråd. En av disse 5 forrådene ble delt i sub-forråd hver inneholdende 250 kloner og plasmid DNA ble ekstrahert fra 90 sub-forråd. Når disse ekstraherte prøvene ble utsatt for PCR på samme måte, ble et spesifikt bånd detektert i 3 sub-forråd. En av disse tre forrådene ble ytterligere delt i subforråd, hver inneholdende 30 kloner og plasmid DNA ble renset fra 90 sub-forråd for utførelse av PCR på samme måte. Som et resultat, ble et spesifikt bånd detektert i 3 sub-forråd. En av disse aktuelle forrådene ble dyrket til den ovennevnte LB platen inneholdende 50 [ig/ml ampicillin og hver av de således dannede koloniene ble utsatt for plasmid DNA ekstraksjon og PCR på samme måte. Som et resultat blir det til sist oppnådd en klon HL34.

(Eksempel 16)

Sekvensering av TPO cDNA

Rensing av plasmid DNA ble utført hovedsakelig ifølge prosedyren beskrevet i Molecular Cloning (Sambrook et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989). Klonen HL34 ble dyrket over natten i 50 ml av LB medium inneholdende 50 [ig/ml ampicillin og de resulterende cellene samlet ved sentrifugering ble suspendert i 4 ml av den ovennevnte TEG-lysozym oppløsning. Til dette ble det tilsatt 8 ml 0.2 N NaOH/1% SDS oppløsning og 6 ml 3 M kalium/5 M acetatoppløsning for åsuspendere cellene grundig. Etter sentrifugering av suspensjonen ble den resulterende supernatanten behandlet med fenol/kloroform (1:1) blandet med det samme volumet isopropanol og så sentrifugert. Den resulterende pelleten ble oppløst i TE oppløsning og behandlet med RNase og så med fenol/kloroform (1:1), fulgt av etanol presipitering. Den resulterende pellet ble igjen oppløst i TE oppløsning til hvilket det deretter blir tilsatt NaCl og polyetylenglykol 3000 til endelig konsentrasjon på henholdsvis 0,63 M og 7.5%. Etter sentrifugering ble pelleten oppløst i TE oppløsning og felt med etanol. På denne måten ble det oppnådd omkring 300 \ ig pEF18S-HL34 plasmid DNA.

Det således rensede DNA ble satt på den ovennevnte 373A DNA sekvensatoren (fremstilt av Applied Biosystems) for åbestemme dets fullstendige nukleotidsekvens ved anvendelse av den ovennevnte Taq Dye Deoxy™ Terminater Cycle Sequening Kit (fremstilt av Applied Biosystems). Den således bestemte nukleotidsekvensen og aminosyresekvensen avledet derav, er vist i sekvenslistingen (SEQ ID NO: 4). I dette

tilfellet, ble oligonukleotider syntetisert basert på nukleotidsekvensen ifølge SEQ JD

i NO: 3 og syntetiske oligonukleotider utformet basert på den interne sekvens oppnådd ved sekvensanalyse, benyttet i nukleotidsekvensbestemmelsen som primere.

Som et resultat, ble det bekreftet at plasmidklonen pEF18S- HL34 omfattet et cDNA fragment på 861 bp og som inneholdt høyt homologe sekvenser med aminosyre-sekvensen AP8 (aminosyre nr. 1 til 12 i SEQ ID NO: 4) og TP2/TP3 (aminosyre nr. 157 til 162 i SEQ ID NO: 4) analysert i eksempel 2. Dette DNA fragmentet synes å kode for en åpen leseramme med dets posisjon 25, men har ingen termineirngskodon og inneholder en poly A hale-lignende sekvens på 76 baser på sin 3'-ende. Dets

aminosyresekvens, bestående av 253 aminosyreestere rett før en poly A hale-lignende i sekvens, viste 84% homologi med den tilsvarende delen av rotte TPO cDNA (en aminosyresekvens del bestående av 147 rester vist i SEQ ID NO: 2). Følgelig, ble denne klonen funnet å være et DNA fragment som koder for en del av humant cDNA som tilsvarer rotte TPO cDNA. På grunn av fraværet av et termineirngskodon og nærværet av en poly A hale-lignende sekvens på dets 3'-ende, syntes denne klonen ikke å være et fullstendig DNA, men et kunstig produkt som er oppstått under prosedyren ved cDNA bibliotekkonstruksjon.

(Eksempel 17)

Ekspresjon av human TPo cDNA i COS 1 celler oe bekreftelse av TPO aktiviteten Transfeksjon av det således oppnådde plasmidklonet pEF18S- HL34 til COSI celler ble utført ifølge prosedyrene i eksempel 11. Det vil si transfeksjon ble utført med 10 jxg av plasmid DNA ved DEAE-dekstranmetoden som omfatter kloroquin behandling. COS 1 cellene ble dyrket i 3-5 dager ved 37°C og så ble supernatanten oppsamlet.

Den således oppnådde kultursupernatanten ble grundig dialysert mot IMDM kulturmedium og evaluert med rotte CFU-MK analyse systemet. TPO aktivitet ble detektert på en doseavhengig måte i kultursupernatanten i COSI celler hvor et plasmid pEF18S-HL34 var uttrykt (fig. 8). Etter 4 dagers dyrking formet mange megakaryocyter forlengede cytoplasmiske prosesser. Derimot, ble TPO aktivitet ikke funnet i kultursupernatanten i COSI celler i hvilke plasmid pEF18S alene ble uttrykt (fig. 8). I M-07e analysesystemet, ble M-07e celleprolifert søkende aktivtet funnet kun kultursupernatanten fra COS 1 celler som i hvilke plasmide pEF18S-HL34 ble uttrykt gjennom dets transfeksjon. Disse resultataene viste at pEF18S-HL34 inneholder et gen som koder for et protien med TPO aktivitet. I tillegg, ble det vist at humant TPO virker på rotte megakaryocytiske progenitorceller (ingen artsspesifisitet).

(Eksempel 18)

Ekspresjon av human TPO delesjonstvpe cDNA og bekreftelse av TPO aktivitet Klonen HL34 fremskaffet i eksempel 15 inneholdt cDNA omfattende en poly A lignende kontinuerlig sekvens på dets 3'-merkede side, som ikke eksisterte i rotte TPO cDNA og derfor syntes å være et kunstig produkt fra eksperimentet. Følgelig, ble et cDNA molekyl fra hvilket den poly A halelignende sekvensen har deletert fremstilt for å se et protein uttrykt ved delsjons cDNA hadde en TPO aktivitet. Delesjons cDNA ble fremstilt ved anvendelse av PCR. Sekvenser av primere benyttet for PCR er som følger, hvor et restriksjonsenzym gjenkjenningssete er tilsatt i 5'-ende av hver primer (EcoRI til

hTP05 og Noti og to stoppkodon TAA og TGA til hTP03).

hTP05: 5' TTT GAA TTC GGC CAG CCA GAC ACC CCG GCC-3' (SEQ ID NO:

170) (posisjoner 1 til 21 i SEQ ID NO: 4)

hTP03: 5'-TTT GCG GCC GCT CAT TAT TCG TGT ATC CTG TTC AGG TAT CC-3' (SEQ ID NO: 171) (anti-sens primer tilsvarende til posisjon 757 til 780 i SEQ ID NO: 4).

Ved bruk av 1 u.g av plasmid DNA fra plasmidklonet pEF18S-HL34 fremskaffet i eksempel 16 som templat, 10 \ im av hver av disse syntetiserte hTP05 og hTP03 som primere og GeneAmp<TMp>CR Reagent Kit med AmpliTaq<TM> DNA polymerase (fremstilt av Takara Shuzo Co., Ltd.), PCR ble utført i et volum på 100 ul ved anvendelse av GeneAmp™ PCR System 9600 (fremstilt av PERKLN-ELMER) og gjentagelse av totalt 15 sykluser, hver syklus omfatter denaturering ved 95°C i 1 minutt, annelering ved 65 °C i 1 minutt og syntese ved 72°C i 1 minutt fulgt av den endelige inkubering ved 72°C i 7 minutter. Et bånd på omkring 800 bp således fremstilt, ble kuttet med restriksjonsenzymer EcoRI og Noti, renset og subklonet inn i ekspresjonsvektoren pEF18S som hadde blitt behandlet på forhånd på samme måte med restriksjonsenzymer. Fra de resulterende transformantene ble kloner som inneholdt et DNA fragment på omkring 800 bp selektert til å fremstille store mengder plasmid DNA ifølge prosedyren beskrevet i eksempel 5. Hele lengden av forsterket region på omkring 800 bp av hvert plasmid ble utsatt for nukleotidsekvensanalyse for åfinne dets fullstendige identitet med nukleotidsekvensen analysert i eksempel 16 (posisjoner 1 til 780 i SEQ ID NO: 4).

Den således fremstilte plasmidklonen fikk navnet pHT 1-231. Vektoren pHT 1-231 går ut av en E. coli stamme DH5 har blitt deponert av foreliggende oppfinnere 14. februar 1994 under deponeringsnummer FERM BP-4564, i National Institute of Bioscence and Human Technology, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry, Japan.

Transfeksjon av således oppnådde plasmid til COSI celler ble utført ifølge prosedyren i eksempel 11. Det vil si, transfeksjon ble utført med 10 (ig plasmid DNA ved DEAE-dekstran fremgangsmåten som omfatter kloroquinbehandling. COSI cellene ble dyrket i 3 til 5 dager ved 37°C og supernatanten oppsamlet.

Den således fremstilte kultursupernatanten ble grundig dialysert mot IMDM kulturmedium og evaluert med rotte CFU-MK analysesystemet. TPO aktiviteten ble funnet i kultursupernatanten i COSI celler i hvilke plasmid pHT 1-231 ble uttrykt (fig. 9). På fjerde dag av dyrkingen dannet mange megakaryocyter forlengede cytoplasmiske prosesser. Derimot, ble TPO aktivitet ikke funnet i kultursupernatanten til COSI celler hvor plasmidet pEF18S alene ble uttrykt (fig. 9). I M-07e analysesystemet ble M-07e celleproliferasjon søkende aktivitet funnet kun i kultursupernatanten til COSI celler hvor plasmidet pHT 1-231 ble uttrykt. Disse resultatene viser at pHT 1-231 inneholder en cDNA som koder for et protein som har TPO aktivitet.

(Eksempel 19)

Fremstilling av 3'- merket enderegion av human TPO cDNA ved PCR

Klonen HL34 fremstilt i eksempel 15 inneholdende cDNA omfattende poly(A) hale-lignende sekvens slik at den antydet 3'-enderegionen var ufullstendig. Det blir derfor forsøkt åoppnå en full-lengde 3'-enderegion ved PCR. De følgende fire typene 5'-primer for PCR ble syntetisert på basis av sekvensene funnet i eksempel 16

hTPO-H: 5'-AGC AGA ACC TCT CTA GTC CTC-3' (SEQ ID NO: 39)

(posisjoner 574 til 594 i SEQ ID NO: 4)

hTPO-K: 5'-ACA CTG AAC GAG CTC CCA AAC-3' (SEQ ID NO: 40)

(posisjoner 595 til 615 i SEQ ID NO: 4)

hTPO-N: 5'-AAC TAC TGG CTC TGG GCT TCT-3' (SEQ ID NO: 41)

(posisjoner 660 til 680 i SEQ ID NO: 4)

hTPO-O: 5'-AGG GAT TCA GAG CCA AGA TTC-3' (SEQ ID NO: 42)

(posisjoner 692 til 712 i SEQ JD NO: 4).

Ved å følge 3-side primere inneholdende blandede nukleotider ved de fire basene av 3'-merket enden, ble syntetisert for åforsterké cDNA fra starten av poly (A) delen. En ankerprimer uten det blandede nukleotid ble også syntetisert.

Den første streng cDNA ble syntetisert fra 1 [ig og kommersiell normal leveravledet poly(A)<+>RNA (fremstilt av Clontech), slik som i eksempel 14, men ved anvendelse av 0.5 ug oligo dT primer (den er inkludert i TimeSaver™ cDNA Synthesis Kit fremstilt av Pharmacia). Ved anvendelse av 1/10 volum av sen syntetiserte cDNA oppløsning som en templat, 20 \ iM hTPO-H primeren og 10 [iM hTP03 blandeprimeren og GeneAmp PCR reagenssett med AmpliTaq TM DNA polymerase (fremstilt av Takara Shuzo Co., Ltd), PCR ble utført i et volum 50 (il ved anvendelse av GeneAmp™ PCR system 9600 (fremstilt av PERKIN- ELMER) og oppvarmet til 96°C i 2 minutter, gjentagelse av totalt 10 sykluser, hver syklus omfattet en varmedenaturering ved 96°C i 1 minutt, annelering ved 48°C i 1 minutt og syntese ved 72°C i 1 minutt fulgt av den endelige inkuberingen ved 72°C i 7 minutter.

Den andre PCR ble utført ved bruk av 1/10 volum av den resulterende oppløsningen fra den første PCR som templat, 20 [im hTPO-K primer og 10 [im av hTP03miks primeren med volum pp 50 ul, oppvarming til 96°C i 2 minutter, gjentagelse av totalt 10 sykluser, hver syklus bestående av oppvarmingsdenaturering ved 96°C i 1 minutt, anellering ved 63°C i 1 minutt og syntese i 72°C i minutt fulgt av den endelige inkuberingen ved 72°C i 7 minutter.

Den tredje PCR ble utført ved anvendelse av 1/10 volum av den resulterende oppløsningen fra den andre PCR som templat, 20 nm hTPO-N primer og 10 \ im hTP03miks primer med volum på 50 ul og oppvarming ved 96°C i 2 minutter, gjentagelse av totalt 10 sykluser, hver syklus omfattende ved varmedenaturering ved 96°C i 1 minutt, anellering ved 63°C i 1 minutt og en syntese ved 72°C i 1 minutt fulgt av den endelige inkuberingen ved 72°C i 7 minutter.

Den fjerde PCR ble utført ved anvendelse av 1/10 volum av den resulterende oppløsningen fra en tredje PCR som templat, 20 hTPO-0 primer og 10 nm hTP03miks primer med volum på 50 [il og oppvarming ved 96°C i 2 minutter, gjentagelse av totalt 10 sykluser, hver syklus omfattende ved varmedenaturering ved 96°C i 1 minutt, anellering ved 63°C i 1 minutt og en syntese ved 72°C i 1 minutt fulgt av den endelige inkuberingen ved 72°C i 7 minutter.

Den femte PCR ble utført ved anvendelse av 1/10 volum av den resulterende oppløsningen fra en fjerde PCR som templat, 20 hTPO-0 primer og 20 nm hTP03anker primer med volum på 50 ni og oppvarming ved 96°C i 2 minutter, gjentagelse av totalt 10 sykluser, hver syklus omfattende ved varmedenaturering ved 96°C i 1 minutt, anellering ved 63 °C i 1 minutt og en syntese ved 72°C i 1 minutt fulgt av den endelige inkuberingen ved 72°C i 7 minutter.

Den således oppnådde reaksjonsoppløsningen ble utsatt for 2% agarosegel (fremstilt av FMC BioProducts) elektroforese for åisolere et DNA fragment på omkring 600 bp som hovedproduktet av PCR som deretter ble renset ved anvendelse av det ovennevnte Prep-A-gen DNA resesett (fremstilt av BioRad Laboratories, Inc.). Nukleotidsekvens til det således rensede DNA fragment ble deretter bestemt ved hjelp av en 373A DNA sekvenserer (fremstilt av Applied Biosystems) ved anvendelse av den ovennevnte Taq Dye Deoxy Terminaler Cycle Sequening Kit (fremstilt av Applied Biosystems). Den således bestemte nukleotidsekvensen og aminosyresekvensen avledet derfra er vist i sekvenslisten (SEQ ID NO: 5).

Dette DNA fragment har en nukleotidsekvens kodende for 130 aminosyrer som starter med primeren hTPO-0 fulgt av en sekvens på mer enn 180 nukleotider med 3'-ende (nukleotidene etter posisjon 577 kunne ikke bli bestemt). Den 30 aminosyresekvensen starter med glycin som samsvarer med aminosyresekvensen i posisjon 203 til 232 i SEQ ID NO: 4. Nukleotidsekvensen i posisjon 1 til 94 samsvarer også med nukleotidsekvensen i posisjonene 692 til 785 i SEQ ID NO: 4.

Som et resultat av sekvensanalysen av cDNA fragmentet i eksempel 17 og PCR forsterket fragment i foreliggende eksempel, er det fornuftig å anslå at humant TPO protein består av 353 aminosyrer inneholdende 21 aminosyre signalsekvens som vist i

SEQ DD NO: 6.

(Eksempel 20)

Rekonstruksjon av humant normalt leveravledet cDNA bibliotek

Da klonen HL34 fremskaffet i eksempel 15 inneholdt den poly A halelignende sekvensen direkte for dets 3'-ende av dets åpne leseramme uten termineringskodon og syntes derfor å være et gunstig produkt av cDNA syntesen, ble et cDNA bibliotek rekonstruert ved anvendelse av 5 ng av kommersielt normalt humant leveravledet poly

(A)<+> RNA preparat (fremstilt av Clontech). Syntese av cDNA ble utført ved bruk av SuperScript™ Lambda System for cDNA syntese og ' Cloning Kit og SuperScript<TM> jj

RNase H" (begge fremstilt av LIFE TECHNOLOGIES). Poly (A)<+> RNA ble utsatt for varmedenaturering og så tilsatt 20 ul av en reaksjonsoppløsning inneholdende en Noti sekvens-inkludert oligo dT som en primer heftet til settet (50 mM Tris-HCl, pH 8.3,75 mM KCL, 3 mM MgCl2,1 mM DTT, 1 mM dNTP miks, 200 U SuperScript™ H RNase H~) fulgt av 60 minutter inkubering ved 37°C. Etter syntese av den andre cDNA strengen (2 timers inkubering ved 16°C i 150 ul av en reaksjonsoppløsning inneholdende 25 mM Tris-HCl, pH 8.3, 100 mM KC1, 5 mM MgCl2, 250 nm dNTP miks, 5 mM DTT, 40 U av E. coli DNA polymerase I, 2 TJ av E. coli RNase H og 10 U av E. coli DNA ligase), 10 TJ av T4 DNA polymerase ble tilsatt og den resulterende blandingen ble inkubert ved 16°C i 5 minutter. Reaksjonsoppløsningen ble oppvarmet ved 65°C i 10 timer og ekstrahert med det samme volumet fenol/kloroform, og cDNA molekyler med en lengde på mindre enn 400 bp ble fjernet ved bruk av SizeSep^2M 400 spunnet kolonne (en spunnet kolonne for fjerning av lav moelkylærvekt DNA, forbundet til TimeSaver TM cDNA syntesesett fremstilt av Pharmacia). Etter tilsetning av EcoRI adapter (bundet til Directional Cloning Toolbox fremstilt av Pharmacia), ble den således behandlede prøven kuttet med Noti og igjen tatt på SizSep™ 400 spunnet kolonne for å fjerne lav molekylær vekt DNA. De således syntetiserte 1,3 ng dobbeltstrenget cDNA som har en EcoRI gjenkjenningssekvens på dets 5'-ende og Noti gjenkjenningssekvens på dets 3'-ende ble ligert med ekspresjonsvektoren pEF18S som på forhånd er blitt kuttet med EcoRI og Noti og så transformert inn i 9,2 ml Competent High E. coli DH5 (fremstilt av Toyobo Co., Ltd.). Det således fremstilte humane cDNA bibliotek (hTPO-Fl) inneholdt 1.0 x 10<6> transformanter.

(Eksempel 21)

Screening av TPO cDNA klonet fra humant lever cDNA bibliotek hTPO- Fl

Humane TPO cDNA-tilsvarende primere fra PCR ble syntetisert basert på sekvens ID nr. 3 og 6 vist i sekvenslistingen. Sekvensene i de således syntetiserte primerene er som følger.

hTPO-I: 5'-TTG TGA CCT CCG AGT CCT CAG-3' (SEQ ID NO: 48)

(posisjoner 60 til 80 i SEQ ID NO: 3)

hTPO-KU: 5'-AGG ATG GGT TGG GGA AGG AGA-3' (SEQ ID NO: 49)

(anti-sens primer tilsvarende til sekvensen i posisjon 901 til 921 i SEQ ID NO: 6).

Humane lever cDNA bibliotek hTPO-Fl (1.0 x 10*> transformanter) konstruert i eksempel 20 ble delt i tre forråd (forråd nr. 1 til 3) og forrådene ble frosset. PCR ble utført ved bruk av 2 fig av plasmid DNA fremstilt fra hver av forrådene som et templat og 1 [im av hver av de syntetiserte oligonukleotidene (hTPO-I og hTPO-KU) som primere. Ved anvendelse av GeneAmp TM PCR Reagent Kit med AmpliTaq TM DNA polymerase (fremstilt av Takara Shuzo Co., Ltd.), ble PCR utført i 100 [il volum i GeneAmp™ PCR system 9600 (fremstilt av PERKIN-ELMER) (totalt 35 sykluser, hver syklus bestående av denaturering ved 95°C i 1 minutt, anellering ved 59°C i 1 minutt og syntese ved 72°C i 1 minutt fulgt av endelig inkubering ved 72°C i 1 minutt). Som et resultat, ble et DNA fragment med den forventede størrelse forsterket når plasmidet DNA fremstilt fra forråd nr. 3 ble benyttet. Forråd nr. 3 ble delt i subforråd hver inneholdende 15.000 transformanter og disse subforrådene ble dyrket over natt i 1 ml LB medium inneholdende 50 [ig/ml ampicillin fulgt av ekstraksjon av plasmid DNA ved anvendelse av automatisert plasmidisoleringsapparat PI-100. Det således ekstraherte DNA ble oppløst i TE oppløsning og 5% av den resulterende oppløsningen ble benyttet som templat ved utførelse av PCR ved bruk av de samme primere og under de samme betingelsene som beskrevet ovenfor. Som resultat, ble forsterkning av cDNA med den forventede størrelsen funnet i 6 av de 90 forrådene. Når et av disse positive forrådene ble delt i subforråd, hver inneholdende 1000 kloner og plasmid DNA ble ekstrahert og PCR ble utført på samme måte som beskrevet ovenfor, ble DNA forsterkning ikke observert. Densiteten til båndene på elektroforesegeler av DNA fragmenter forsterket med en serie PCR ble tynnere etter som underforrådene ble ytterligere oppdelt, noe som syntes å være forårsaket av lav gjenvinning av plasmid DNA på grunn av dårlig vekst av den aktuelle klonen. Derfra ble en andre screening utført ved hjelp av kolonihybridisering ved bruk av det opprinnelige nr. 3 forrådet.

Nr. 3 ble spredd på 100 LB agarplater med 15 cm diameter med en inokulum størrelse slik at 4100 kolonier vokste på hver LB agarplate. Etter preparering av en replikaplate fra hver av de således inokulerte platene, en av de duplikate platene dyrket ved 37°C i 6 timer for å gjenvinne kolonivekst på platen og for å ekstrahere plasmid DNA prøvene. Når PCR i disse DNA prøvene ble utført på samme måte som beskrevet ovenfor, ble forsterkning av et bånd ekvivalent til den forventede størrelsen observert i et av 100 subforråd. To replikafiltere ble fremstilt fra platen av dette subforrådet ved bruk av BIODYNE™ EN A TRANSFER MEMBRANE (fremstilt av PALL). Denaturering av filtrene ble utført ved utvikling av dem i 10% SDS i 10 minutter, i 0.5 N NaOH/1.5 M NaCl i 10 minutter og så 0.5 M tris-HCl (pH 8.0)/1.5 M NaCl i 10 minutter i den rekkefølge, fulgt av 30 minutter i en vakuumovn. De således dekkede filtrene ble vasket med 6 x SSC (fremstilt ved fortynning av 20 x SSC stamoppløsning omfattende 175.3

gram NaCl og 88.2 g Na sitrat oppløst i 1 liter vann, pH 7.0) tilsatt 1% SDS.

i Prehybridisering av de således vaskede filtrene ble utført ved inkubering av det ved 42°C i 30 minutter med risting i 30 ml og reaksjonsoppløsning omfattende 50% formamid, 5 x SSC, 5 x Denhardts oppløsning (fremstilt fra 50 x Denhardts oppløsning inneholdende 5 g Ficoll, 5 g polyvinylpyrrolidon og 5 g bovin serumalbumin fraksjon V i 500 ml vann), 1% SDS og 20 [ig/ml laksesperm DNA. Etter prehybridisering ble reaksjonsoppløsningen byttet med 30 ml av en hybridiseringsoppløsning med den samme sammensetning, blandet med en probe som hadde blitt merket med [6- <32p>] dCTP (fremstilt av Amersham) og så inkubert med risting ved 42°C i 20 timer. Den merkede proben benyttet i dette eksperimentet var EcoRI/BamHI fragment av plasmid

pEF18S- HL34, som hadde blitt anskaffet ved rensing av en del av SEQ ID NO: 4

i spennende fra dets 5-ende til basen i 458 posisjonen og ved merking av den rensede delen ved random primer teknikk med megaprime DNA Labelling System (et sett fremstilt av Amersham basert på fremgangsmåten beskrevet i Anal. Biochem., 132, 6-13,1983). De således behandlede filtrene ble vasket i 2 x SSC/0.1% SDS oppløsning ved 42°C i 30 minutter og så i 0.2 x SSC/0.01% SDS oppløsning ved 42°C i 30 minutter. Filtrene ble så utsatt for 16 timers autoradiografi ved -70°C ved anvendelse av en intensifiseirngsskjerm og en X-OMAT^<M> AR5 film (fremstilt av Eastman Kodak). Som et resultat, ble et enkelt signal som er ansett å være positivt, observert. Kolonier som omtrent tilsvarte til dette signalet ble oppsamlet fra den opprinnelige platen

inokulert igjen inn i et 10-cm LB agarplate. Totalt 50 kolonier dyrket på flaten ble

i separat dyrket og deres DNA prøver ble utsatt for PCR ved anvendelse av de ovennevnte primerene hTPO-I og hTPO-KU under de samme betingelsene som beskrevet ovenfor. Som et resultat, ble forsterking av et bånd ekvivalent til den forventede størrelsen, funnet på kun en klon, som ble betegnet pHTFl.

(Eksempel 22)

Bestemmelse av nukleotidsekvens til human TPO cDNA klonet pHTFl

Rensing av plasmid DNA ble utført hovedsakelig ifølge prosedyren beskrevet i Molecular Cloning (Sambrook et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989). Klonen pHTFl ble dyrket over natt i 50 ml av LB mediet inneholdende 50 [ig/ml ampicillin. De resulterende cellene ble samlet ved sentrifugering og suspendert i 4 ml av den ovennevnte TEG-lysozym oppløsningen. Til denne ble det tilsatt 8 ml 0.2 N NaOH/1% SDS oppløsning og så 6 ml 3 M kalium/5 M acetatoppløsning for å suspendere cellene grundig. Etter sentrifugering av suspensjonen ble den resulterende supernatanten behandlet med fenol/kloroform (1:1), blandet med det samme volumet isopropanol og så sentrifugert. Den resulterende pelleten ble oppløst i TE oppløsning behandlet med RNase og så med fenol/kloroform (1:1), fulgt av etanolfelling. Den resulterende pellet ble igjen oppløst i TE oppløsning som deretter ble tilsatt NaCl og polyetylenglykol 3000 til deres endelige konsentrasjon på henholdsvis 0.63 M og 7.5%. Etter sentrifugering ble pelleten oppløst i TE oppløsning og felt med etanol. På denne måten ble det oppnådd 300 |ig plasmid DNA pHTFl.

Det således rensede plasmid DNA ble satt på den ovennevnte 373A DNA sekvensatoren (fremstilt av Applied Biosystems) for å bestemme dets fullstendige nukleotidsekvens ved anvendelse av den ovennevnte Taq Dye Deoxy<TM> Terminaler Cycle Sequening Kit (fremstilt av Applied Biosystems). Den således bestemte nukleotidsekvensen og den avledede aminosyresekvensen ble vist i sekvenslisting (SEQ ID NO: 7). Oligonukleo-tidsyntesen basert på nukleotidsekvens SEQ DD NO: 6 og den indre sekvensen oppnådd ved deres sekvensreaksjonsanalyse ble benyttet i nukleotidsekvensbestemmelsen som primere.

Som resultat, ble det bekreftet at klonen pHTFl inneholder et cDNA fragment på 1.721 bp og en høy homologi med aminosyresekvens AP8 (aminosyrene 1-12 i SEQ DD NO: 7) og TP2/TP3 (aminosyresekvens nr. 157 til 162 i SEQ DD NO: 7) analysert i eksempel 2. Dette DNA fragmentet syntes å ha en 5' ikkekodende region pp 101 baser, en åpen leseramme omfattende 353 aminosyrerester, med start med en methioninrest podet ved 102 til 104 nukleotidposisjoner og avsluttet av en glycinrest kodet ved 1158 til 1160 nukleotidposisjonene, det følgende termineringskodonet (TAA), en 3' ikkekodende region på 531 baser og en poly A halsesekvens på 30 baser. Aminosyresekvensen av et protein ansett å være kodet av den åpne leserammen samsvarte fullstendig med den forutsatt aminosyresekvensen til human TPO vist i SEQ DD NO: 6. cDNA sekvensen til pHTFl har en større størrelse enn cDNA sekvensen vist i SEQ DD NO: 6 og inneholder 77 ytterligere baser ved 5' side og 347 ytterligere baser ved 3' siden i front av dets poly

A halesekvens. Nukleosidsekvensen også forskjellige fra SEQ DD NO: 6 ved 3

posisjoner. Det vil si A (posisjon 84), A (posisjon 740) og G (posisjon 1.198) i SEQ DD NO: 7 hvor henholdsvis C, T og A i SEQ DD NO: 6. Kun mutasjonen i posisjon 740 var inkludert i den protein-kodende regionen, men denne mutasjonen forårsaket ikke noen aminosyre utbytting på grunn av at både basene A og T var den tredje basen til

threoninkodon. Likevel var årsaken til disse basesubstitusjonene ikke klar på den tiden,

analysen av plasmidklonet pHTFl bekreftet at humant TPO protein omfatter 353 arnino-syrerester med 21 aminosyresignalsekvenser. Molekylvekt til det modne proteinet ekskluderer signalsekvensen, ble estimert å være 35.466.

Vektor pHTFl båret av en E. coli stamme DH5 har blitt deponert av foreliggende oppfinnere 24. mars 1994 under aksesjonsnr. FERM BP-4617, ved National Institute of Bioscence and Human-Technology, Acency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry, Japan.

(Eksempel 23)

Ekspresjonen av human TPO cDNA klonet pHTFl i COS 1 celler og bekreftelse av TPO aktivitet

Transfeksjon til COS 1 celler hadde av den således oppnådde plasmidklonet pHTFl ble utført ifølge prosedyren i eksempel 11. Det vil si transfeksjon ble utført med 10 |ig av plasmid DNA ved DEAE-dekstranmetoden som omfatter kloroquin behandling. De transfekterte COS 1 cellene ble dyrket i 3 dager ved 37°C og kultursupernatanten ble oppsamlet.

Kultursupernatanten ble grundig dialysert mot IMDM kulturmedium og evaluert ved rotte CFU-MK analysesystemet. TPO aktivitet ble detektert på en doseavhengig måte i

supernatanten i COS 1 celler i hvilke plasmid pHTFl var uttrykt (fig. 10a). Derimot, ble TPO aktivitet ikke funnet i kultursupernatanten til COS 1 celler hvor plasmidet pEF18S alene ble uttrykt (fig. 10a). Tilsvarende resultater ble oppnådd i M-07e analysesystemet. Supernatanten fra COS 1 cellene i hvilket plasmidet pHTFl var uttrykt, uttrykte

signifikant M-07e celleproliferasjon på doseavhengig måte (fig. 10b). Disse resultatene viste at pHTFl inneholder et gen som koder for et protein med TPO aktivitet.

(Eksempel 24)

Kloning av humant TPO kromosomalt DNA

Kloning av humant TPO kromosomalt DNA ble utført ved anvendelse av human TPO cDNA som probe. Et genomisk bibliotek benyttet i kloningen var en gave fra professor T. Yamamoto ved Gene Research Center, Tohoku University (biblioteket rapportert av Sakai et al. i Biol. Chem., 269,2173-2182,1994, konstruert ved delvis kutting av humant kromosomalt DNA med et restriksjonsenzym Sau3Al og ligering av det delvis kuttede til BamHI setet på fagvektorlambda EMBL3 fremstilt av Stratagene). Screening fra dette biblioteket ved bruk av human TPO cDNA som probe ble utført hovedsakelig ifølge prosedyren beskrevet i Molecular Cloning (Sambrook et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989). Ved bruk av E. coli LE392 som vert, ble biblioteket inokulert på en 15 cm plate inneholdende NZYM (10 g av NZ amin, 5 g NaCl, 5 g Bacto Yeast Extract, 2 g MgSC«4. 7H2O og 15 g agar i 1 liter vann, pH 7.0) i en slik inokulum størrelse at en plate inneholdt 30.000 fagpartikler. To replikafiltere ble fremstilt fra hver av de således preparerte 18 platene ved bruk av BIODYNE™ A TRANSFER MEMBRANE (fremstilt av PALL). Denaturering av filtreene ble utført ved dykking av dem i 0.5 N NaOH/1.5 M NaCl i 10 minutter og så 0.5 M tris-HCl (pH 8.0)/1.5 M NaCl i 10 minutter fulgt av 30 minutter lufttørking og påfølgende 1,5 timers steking ved 80°C i en vakuumovn. Prehybridisering ble utført ved inkubering av de således behandlede filtrene ved 42°C i 1 time i 500 ml reaksjonsoppløsning inneholdende 50% foramid, 5 x SSC, 5 x Denhardts oppløsning, 1% SDS og 20 [Ag/ml laksesperm DNA. For anvendelse som en probe, ble et humant TPO cDNA fragment (baseposisjon nr. 178 til 1.025 i SEQ ID NO; 7) forsterket ved PCR og renset og det rensede fragmentet ble merket med <32>p ved bruk av Random Primer Labelling Kit (et DNA merkesett fremstilt av Takara Shuzo basert på random primer metoden beskrevet i Anal. Biochem., 132,6-13, (1983). Sekvenser av primere benyttet i dette PCR er som følger.

hTPO-I: 5'-TTG TGA CCT CCG AGT CCT CAG-3' (SEQ ID NO: 50)

(posisjoner 178 til 198 i SEQ DD NO; 7)

hTPO-N: 5'-AGG GAA GAG CGT ATA CTG TCC-3' (SEQ DD NO: 51) (anti-sens primer tilsvarende til sekvensene i posisjonene 1.005 til 1.025 i SEQ DD NO: 7).

Ved anvendelse av den isotopmerkede proben, ble hybridisering utført ved 42°C i 20 timer i 500 ml reaksjonsoppløsning med den samme sammensetningen som prehybridiseringsoppløsning. De resulterende filtrene ble vasket tre ganger i 2 x SSC/0.1% SDS oppløsning ved romtemperatur i 5 minutter og en gang i 0.1 x SSC/0.1% SDS oppløsning ved 68°C i 1 time. Filtrene ble utsatt for 16 timers autoradiografi ved -70°C ved bruk av forsterkningsskjerm og X-OMAT^<M> AR5 film (fremstilt av Eastman Kodak). Som et resultat ble det oppnådd 13 positive signaler. Plakk som omtrent tilsvarte hver av de positive signalene ble oppsamlet fra de opprinnelige platene og inokulert igjen på 15 cm NZYM plater slik at det ble dannet en inokulumstørrelse på 1000 plakk på hver plate. To replikafiltere ble fremstilt fra hver av de resulterende platene for å utføre hybridisering ved de samme betingelsene som ovenfor. Som et resultat ble positive signaler detektert på alle filtrene i de 13 gruppene. Et enkelt plakk ble gjenvunnet fra hver av de resulterende platene for åfremstille fag DNA ble platelysatmetoden beskrevet i Molecular Cloning. Fag DNA prøver fremstilt slik fra 13 kloner ble sjekket for nærvær av cDNA kodende regionen ved PCR ved bruk av primeren med de følgende sekvenser.

hTPO-L: 5'-GGC CAG CCA GAC ACC CCG GCC-3' (SEQ DD NO: 52)

(posisjoner 1 til 21 i SEQ DD NO: 6)

hTPO-F: 5'-ATG GGA GTC ACG AAG CAG TTT-3' (SEQ DD NO: 53)

(anti-sens primer tilsvarende til sekvensen i posisjonene 127 til 147 i SEQ DD NO: 6)

hTPO-P: 5'-TGC GTT TCCTGA TGC TTG TAG-3' (SEQ ID NO: 54)

(posisjoner 503 til 523 i SEQ JD NO: 6)

hTPO-V: 5'-AAC CTT ACC CTT CCT GAG ACA-3' (SEQ ID NO: 55)

(anti-sens primer tilsvarende til sekvensen i posisjonene 1.070 til 1.090 i SEQ ID NO: 6).

Når PCR ble utført ved anvendelse av disse primerkombinasjonene, syntes 5 av 13

kloner å inneholde hele den aminosyrekodende regionen fra cDNA. Kromosomalt DNA målt i disse 5 klonene, hadde en tilsvarende lengde på omkring 20 kb og viste nesten det samme mønsteret når en preliminær restriksjonsenzym analyse ble utført. Derfor, ble en av disse klonene (klon HGT1) valgt og analysert ved Southern blotting. Det vil si 1 |ig av DNA fra klonen UGT1 ble kuttet fullstendig ved restriksjonsenzym EcoRI eller Hind Ul og satt på 0.8% agarosegel elektroforese og båndene på gelen ble overført på BIODYNE™ A TRANSFER MEMBRAN (fremstilt av PALL). Det resulterende filteret ble lufttørket i 30 minutter utsatt for 2 timers baking ved 80°C i en vakuumovn. Prehybridisering ble utført ved inkubering av det således behandlede filteret ved 42°C i 1 time i 50 ml reaksjonsoppløsning bestående av 50% formamid, 5 x SSC, 5 x Denhardts oppløsning, 1% SDS og 20 (ig/ml laksesperm DNA. For anvendelse som en probe ble humant TPO cDNA fragment (baseposisjonsnr. 178 til 1.025 i SEQ JD NO: 7) forsterket ved PCR og renset og det rensede fragmentet ble merket ved <32>p Ved anvendelse av Random Primer DNA Labelling Kit (fremstilt av Takara Shuzo). Ved anvendelse av den isotopmerkede proben ble hybridisering utført ved 42°C i 20 timer i 50 ml av en reaksjonsoppløsning med den samme sammensetningen av prehybridi-seringsoppløsningen. Det resulterende filteret ble vasket tre ganger i 2 x SSC/0.1% SDS oppløsning med romtemperatur i 5 minutter også igjen i 0.1 x SSC/0.1% SDS oppløsning ved 68°C i 1 time. Filteret ble så utsatt for 16 timers autoradiografi ved - 70°C ved anvendelse av en forsterkningsskjerm og X-OMAT^<M> ^R5 (fremstilt av Eastman Kodak). Som et resultat, ble et enkelt bånd på omkring 10 kb observert på HindJU kutting. Derfor, ble 10 ug av DNA fra klonene 'HGT1 kuttet med HindJU og utsatt for 0.8% agarosegelelektroforese og 10 kb bånd ble skåret ut fra gelen, renset ved bruk av Prep-A-Gene DNA Purification Kit (fremstilt av Bio-Rad) og subklonet inn i en kloningsvektor pUC13 (fremstilt av Pharmacia) som på forhånd var blitt kuttet med HindJU. I dette tilfellet ble Competent-High E. coli DH5 fremstilt av TOYOBO benyttet som vertsstammen.

Av de således oppnådde klonene ble en klone inneholdende 10 kb HindJU fragmentet valgt og betegnet pHGTl.

Et restriksjonskart av fag klone 'HGT1 er vist i fig. 11.

(Eksempel 25)

Bestemmelse av nukleotidsekvens av human TPO kromosomal klone pHGTl Dyrking av klon pHGTl og rensing av plasmid DNA ble utført faglig ifølge fremgangsmåten beskrevet i Molecular Cloning (Sambrook et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989). Klonen pHGTl ble dyrket over natt i 50 ul LB medium inneholdende 50 |xg/ml ampicillin. De resulterende cellene ble samlet med sentrifugering og suspendert i 4 ml av den ovennevnte TEG-lysozymoppløsningen. Til denne ble det tilsatt 8 ml 0.2 N NaOH/1% SDS oppløsning og så 6 ml 4 M kalium/5 N acetat oppløsning som suspenderer cellene grundig. Etter sentrifugering av suspensjonen ble den resulterende supernatanten behandlet med fenol/kloroform (1:1), blandet med det samme volumet isopropanol og så sentrifugert. Den resulterende pelleten ble oppløst i TE oppløsning og behandlet med RNase og så med fenol/kloroform (1:1), fulgt av etanolfelling. Den resulterende pellet ble igjen oppløst i TE oppløsning til hvilket det ble tilsatt NaCl og polyetylenglykol 3000 til den endelige konsentrasjonen på henholdsvis 0.63 M og 7.5%. Etter sentrifugering ble pelleten oppløst i TE oppløsning og felt med etanol. På denne måten ble omkring 300 |xg plasmid DNA pHGTl oppnådd.

Bruk av det ovennevnte Taq Dye Deoxy<TM> Terminaler Cycle Sequening Kit (fremstilt av Applied Biosystems), ble det således renset ved DNA satt på den ovennenvnte 373A DNA sekvensator (fremstilt av Applied Biosystems) for å bestemme dets nukleotidsekvens rundt den proteinkodende regionen fra cDNA nukleotidsekvensen. Den således bestemte nukelotidsekvensen og den avledede aminosyresekvensen er vist i sekvenslistingen (SEQ ID NO: 8). I dette tilfellet, ble oligonukleotider benyttet i eksempel 22 for nukleotidsekvensanalyse av cDNA og syntetiske oligonukleotider formet basert på den interne sekvens oppnådd ved deres sekvensreaksjonsanalyse, benyttet som primere i nukleotidsekvensbestemmelsen.

Som et resultat, ble kromosomalt DNA båret av plasmidklonen pGHTl funnet å inneholde hele den kodende regionen av aminosyresekvensen avledet fra SEQ ID NO: 6, og nukleotidsekvensen av den kodende regionen samsvarte fullstendig med den til SEQ ID NO: 6.1 tillegg, en region tilsvarende det aminosyrekodende ekson 4 introner med lengder på 231 bp, 286 bp. 1.932 bp og 236 bp i den rekkefølgen fra 5-enden (fig. 11). Nukleotidsekvensen var også forskjellig fra cDNA nukleotidsekvensen i SEQ ID NO: 7 ved 3 posisjoner som var den samme posisjon beskrevet i eksempel 22 (forskjellige posisjoner mellom SEQ ID NO: 6 og 7). Det vis si A (posisjon 84), A (posisjon 740) og G (posisjon 1.198) i SEQ ID NO: 7 var henholdsvis C, T og A i SEQ ID NO: 8. Det ble således avslørt at nukelotidsekvensen i den humane TPO cDNA klonen pHTFl oppnådd i eksempel 21 er forskjellig fra nukleotidsekvensen i det humane kromosomale DNA klonet pHGTl i 3 posisjoner. Derfor, for å analysere om disse mutasjonene i cDNA klonen pHGTl sekvensen gjenspeiler den kromosomale DNA sekvensen, nukleotidsekvensen til de andre fire klonene blant de fem kromosomale DNA klonene uavhengig valgt ved screening, bestemt. Sekvensanalysen ble utført ved direkte nukleotidsekvensbestemmelsesmetoden ved hjelp av en fag DNA prøve fremstilt ifølge platelysatmetoden beskrevet i Molecular Cloning. Sekvensering av hver klon ble utført ved forutsetning at den på den ovennevnte 373A DNA sekvensator (fremstilt av Applied Biosystems), ved anvendelse av sekvenseringsprimerene benyttet i eksempel 22 som hadde blitt syntetisert basert på sekvensporsjonene i de ovennevnte 3 mutasjonsposisjonene i nukleotidsekvensen kunne bli analysert og den ovennevnte Taq Dye Deoxy<TM> Terminaler Cycle Sequening Kit (fremstilt av Applied Biosystems). Det ble funnet at nukleotidsekvensene av alle fire klonene var identiske til den i SEQ JD NO: 6. Posisjon 84 og 740 tilsvarende til SEQ JD NO: 7 var erstattet med henholdsvis C og T i disse 4 klonene. Men posisjonen 1198 var G i 2 kloner og A i andre to kloner. Med andre ord, ble det avslørt at det er to typer nukleotidsekvenser inherente til det opprinnelige kromosomale DNA. Det er ikke klar om slike forskjeller i nukleotidsekvensene avledet fra homologe kromosomer eller fra flere gener. I tillegg, er det foreslått at forskjellen i nukleotidsekvensen kan ved raseforskjeller, da poly (A)<+ >RNA anskaffet fra Clontech er av en causasisk opprinnelse mens det kromosomale DNA er av japansk opprinnelse.

Vektoren pHGTl båret av E. coli stamme DH5 har blitt deponert av foreliggende oppfinnere 24. mars 1994 under aksesjonsnr. FERM BP-4616 ved the National Institute of Bioscince and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry, Japan.

(Eksempel 26)

Ekspresjon av human TPO kromosomalt DNA i COS 1 celler og bekreftelse av TPO aktivitet

Plasmidklonen pHGTl oppnådd ved subkloning inneholdt totalt 4 EcoRI gjenkjenningssekvenser, 3 i den innsatte gruppe og 1 i vektoren. Nukleotidsekvensanalysen avslørte at hele den humane TPO protein-kodende regionen var inkludert i et DNA fragment omkring 4.3 kbp som var tatt mellom EcoRI gjenkjenningssekvensen nærmest 5'-siden til innskuddet og EcoRI gjenkjenningssekvensen i vektoren. Dette fragmentet ble ligert med en Eco-RI behandlet ekspresjonsvektor pEF18S og ble oppnådd 4 humane TPO ekspresjonsplasmider pEFHGTE nr. 1-4 (se fig. 11). Rensing av plasmid DNA ble utført hovedsakelig ifølge prosedyren beskrevet i Molecular Cloning (Sambrook et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989), derved oppnå omkring 250 ng plasmid DNA.

Transfeksjon til COS 1 celler av de således oppnådde kloner pEFHGTE nr. 1-4 ble utført ifølge prosedyren i eksempel 11. Det vil transfeksjon ble utført med 10 ng plasmid DNA ved DEAE-dekstran metoden som omfatter kloroquinbehandling. De transfekterte COS 1 cellene ble inkubert i 3 dager ved 37°C og så ble kultursupernatanten oppsamlet.

Kultursupernatantene ble grundig dialysert mot IMDM kulturmedium og evaluert ved rotte CFU-MK analysesystemet. TPO aktivitet ble detektert på en doseavhengig måte i supernatanten av COS 1 celler i hvilken hver av de fire kloner (pEFHGTE nr. 1-4) var uttrykt. Derimot ble TPO aktivitet ikke runnet i supernatanten til COS 1 celler i hvilken plasmidet pEF18S alene ble uttrykt. Representative data med pEFHGTE nr. 1 er vist i fig. 12a. Tilsvarende resultater ble oppnådd i M- 07e analysesystemet. Supernatanten til COS 1 celler i hvilken hver av de fire klonene (pEFHGTE nr. 1-4) ble uttrykt, økte signifikant M-07e celleveksten på en doseavhengig måte. Representative måter med pEFHGTE nr. 1 er vist i fig. 12b.

Disse resultatene demonstrerte at plasmidklonene pEFHGT nr-1-4 bærer funksjonelle kromosomale DNA for humant TPO.

(Eksempel 27)

Preparering av human TPO delesionstvpe DNA og dets ekspresjon i COS 1 celler og bekreftelse av TPO aktivitet

Resultatene i eksempel 18 indikerer at human TPO kan vise sin biologiske aktivitet selv etter fjerning av dets karboksyl tredjedel. Således, for å ytterligere evaluere de biologisk aktive delene, ble delesjonsderivat eksperimenter utført. I dette eksempelet, ble TPO delesjonsderivater som manglet 20,40, 60 eller 68 aminosyrer fra den karboksylterminale enden av TPO proteinet (aminosyrene 1 til 231) kodet ved pHT 1-231 ble undersøkt for deres evne til å vise TPO in vitro biologisk aktivitet. Det korteste derivatet (aminosyrer 1-163) omfattet enda aminosyresekvensene tilsvarende TP2/3 av rotteplasma TPO beskrevet i eksempel 2. Delesjonsplasmidene ble fremstilt ved PCR ved bruk av DNA av plasmidklonet pHTl- 231 fremstilt i eksempel 18 som templat og syntetiserte oligonukleotider som primere. Sekvenser av primere benyttet fra PCR var som følger:

hTPO-5: 5'-TTT GAA TTC GGC CAG CCA GAC ACC CCG GCC-3'

(SEQ ID NO: 56) (fremstilt ved tilsetting av en EcoRI gjenkjenningssekvens til sekvensen i posisjonene 1 til 21 i SEQ ID NO: 4; dette er den identiske sekvensen som beskrevet i fig. 9);

hTPO-S: 5'-TTT GCG GCC GCT CAT TAG CTG GGG ACA GCT GTG GTG GGT-3'

(SEQ ID NO: 57) (en antisensprimer tilsvarende sekvensen i posisjonene 555 til 576 i SEQ ID NO: 4, fremstilt ved tilsetting av to terrnineringskodoner TAA og TGA og en Noti gjenkjenningssekvens for anvendelse i fremstilling av et delesjonsderivat som koder for posisjon 1 til 163 aminosyrerester);

hTPO-4:5'-TTT GCG GCC GCT CAT TAC AGT GTG AGG ACT AGA GAG GTT

CTG-3' (SEQ DD NO: 58) (en antisensprimer tilsvarende sekvensen i posisjonene 576 til 600 i SEQ DD NO: 4, fremstilt ved tilsetting av to terrnineringskodoner TAA og TGA og en Noti gjenkjenningssekvens for anvendelse i fremstilling av et delesjonsderivat som koder for posisjon 1 til 171 aminosyrerester);

hTPO-30: 5' TTT GCG GCC GCT CAT TAT CTG GCT GAG GCA GTG AAG TTT

CTG-3' (SEQ DD NO: 59) (en antisensprimer tilsvarende sekvensen i posisjonene 636 til 660 i SEQ DD NO: 4, fremstilt ved tilsetting av to terrnineringskodoner TAA og TGA og en Noti gjenkjenningssekvens for anvendelse i fremstilling av et delesjonsderivat som koder for posisjon 1 til 191 aminosyrerester); og

hTPO-2: 5'-TTT GCG GCC GCT CAT TAC AGA CCA GGA ATC TTG GCT CTG

AAT-3' (SEQ DD NO: 60) (en antisensprimer tilsvarende sekvensen i posisjonene 696 til 720 i SEQ DD NO: 4, fremstilt ved tilsetting av to terrnineringskodoner TAA og TGA og en Noti gjenkjenningssekvens for anvendelse i fremstilling av et delesjonsderivat som koder for posisjon 1 til 211 aminosyrerester).

Ved anvendelse av 1 [ig plasmid DNA av klonen pHT 1-231 oppnådd i eksempel 18 som templat, 10 [im av hver av de således syntetiserte hTPO-5 (for 5' setet) og hTPO-2, -3, - 4 og -S (for 3'-setet) som en primer og GeneAmp<TM><p>cr Reagent Kit med AmpliTaq<TM> DNA Polymerase (fremstilt av Takara Shuzo), ble PCR utført med et volum på 100 [il ved anvendelse av en GeneAmp<TM><p>cr System 9600 (fremstilt av PERIQN-ELMER) og gjentagelse av totalt 20 sykluser, hver syklus omfattende denaturering ved 95°C i 1 minutt, anellering ved 65°C i 1 minutt og syntetisering ved 72°C i 1 minutt, fulgt av den endelige inkubering ved 72°C i 7 minutter. Et interessant bånd således oppnådd ved PCR ble kuttet med restriksjonsenzymene EcoRI og Noti og resulterende produkt utsatt for 1% agarosegel (fremstilt av FMC BioProducts) elektroforese for åisolere et hoved DNA fragment med en forventet størrelse forsterket ved hver PCR. Det således isolerte DNA fragment ble renset ved bruk av Prep-A-Gene DNA Purification Kit (fremstilt av Bio-Rad) og deretter subklonet inn i ekspresjonsvektoren pEF18S som hadde på forhånd blitt behandlet med de samme restriksjonsenzymene. I dette tilfellet ble Competent-High E. coli DH5 fremstilt av TOYOBO benyttet som vertsstamme. Fra de resulterende transformantene som stammet fra hver PCR, ble 4 til 5 kloner inneholdende insertet av forventet størrelse utvalgt for å fremstille plasmid DNA prøver hovedsakelig ifølge prosedyren beskrevet i Molecular Cloning (Sambrook et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989). I en serie av slike operasjoner, ble plasmid DNA prøver oppnådd fra delesjonsderivatet som kodet for posisjonene 1 til 163 aminosyrerester (pHTl-163 nr. 1-5), et delesjonsderivat kodende for posisjon 1 til 171 aminosyrerester (pHTl-171 nr. 1-4) et delesjonsderivat som kodet for posisjonene 1 til 191 aminosyrerester (pHTl-171 nr. 1-4) og et delesjonsderivat som koder for posisjonene 1 til 211 aminosyrerester (pHTl-211 nr. 1-4). Hele lengden av de forsterkede regionene av hvert plasmid DNA ble utsatt for nukleotidsekvensanalyse for å finne dets fullstendige identitet med nukleotidsekvensen vist i SEQ ID NO: 4.

Transfeksjon til COS 1 celler av de således oppnådde kloner ble utført ifølge prosedyren i eksempel 11. Det vil si transfeksjon ble utført med 10 (xg av hver av plasmid DNA prøvene ved DEAE dekstranmetoden som omfatter kloroquinbehandling. De transfekterte COS 1 cellene ble dyrket i 3 dager og så ble kultursupernatanten gjenvunnet.

Kultursupernatantene ble grundig dialysert mot IMDM kulturmedium og evaluert ved rotte CFU-MK analysesystemet. TPO aktiviteten ble detektert på doseavhengig måte i supernatanten av COS 1 celler i hvilken pHTl-211, pHTl-191, pHTl-171 eller pHTl-163 hver var uttrykt. Representative data med pHTl-211 nr. 1, pHTl-191 nr. 1 og pHTl-171 nr. 2 er vist i fig. 13a og med pHTl-163 nr. 2 i fig. 13b. Tilsvarende resultater ble oppnådd i M-07e analysesystemet. Supernatanten fra COSI cellene hvor pHTl-211, pHTl-191, pHTl-171 eller pHTl-163 hver ble uttrykt, øket signifikant M-07e ceUeproliferasjon. Representative data med pHTl-211 nr. 1, pHTl-191 nr. 1, pHTl-171 nr. 2 eller pHTl-163 nr. 2 er vist i fig. 14.

Disse resultatene viste at human TPO fremdeles beholder dets in vitro biologiske aktivitet selv etter dens karboksylterminale halvdel forbi Ser (posisjon 163) er deletert og dette tyder sterkt på at de aktive delene med biologisk aktiv av human TPO er lokalisert i den arninoterminale halve ende ved Ser (posisjon 163).

(Eksempel 28)

Fremstilling av C- terminal delesjonstvpe human TPO og dets ekspresjon og aktivitet i COS 1 celler

For å analysere regionen som er nødvendig for human TPO protein som legges fram av dets aktivitet, ble de C-terminale aminosyrene ytterligere deletert fra delesjonsderivatene fremstilt i eksempel 27 og TPO aktiviteten uttrykt i COSI cellene ble undersøkt. Anvendelse av plasmidklonet pEF18S- HL34 oppnådd i eksempel 16, ble ekspresjonsplasmider fremstilt ved deletering av nukleotidsekvenser som koder for C-terminale aminosyrerester med start fra 163 posisjon serin. Konstruksjon av disse delesjonsplasrnidene ble utført ved anvendelse av PCR. Sekvenser av primere fremstilt for anvendelse i PCR er som følger: hTPO-5: 5'-TTT GAA TTC GGC CAG CCA GAC ACC CCG GCC-3' (SEQ ID NO: 61) (fremstilt ved tilsetting av en EcoRI gjenkjenningssekvens til sekvensen i posisjon 1 til 21 i SEQ ID NO: 4; den samme sekvensen er vist i eksempel 18);

hTPO-150:5'-TTT GCG GCC GCT CAT TAG AGG GTG GAC CCT CCT ACA AGC

AT-3' (SEQ ID NO: 62) (en antisensprimer tilsvarende til sekvensen i posisjon 514 til 537 i SEQ ID NO: 4; fremstilt ved addisjon av to termineirngskodon TAA og TGA og en Noti gjenkjenningssekvens for anvendelse i fremstilling av en delesjonsmutant som koder for posisjoner 1 til 150 aminosyrerester);

hTPO-151: 5'-TTT GCG GCC GCT CAT TAG CAG AGG GTG GAC CCT CCT ACA

A-3<1> (SEQ ID NO: 63) (en antisensprimer tilsvarende til sekvensen i posisjon 518 til 540 i SEQ ID NO: 4; fremstilt ved addisjon av to termineirngskodon TAA og TGA og en Noti gjenkjenningssekvens for anvendelse i fremstilling av en delesjonsmutant som koder for posisjoner 1 til 151 aminosyrerester);

hTPO-153: <5->TTT GCG GCC GCT CAT TAC CTG ACG CAG AGG GTG GAC CC-3' (SEQ ID NO: 64) (en antisensprimer tilsvarende til sekvensen i posisjon 526 til 546 i SEQ ID NO: 4; fremstilt ved addisjon av to termineirngskodon TAA og TGA og en Noti gjenkjenningssekvens for anvendelse i fremstilling av en delesjonsmutant som koder for posisjoner 1 til 153 aminosyrerester);

hTPO-154: 5'-TTT GCG GCC GCT CAT TAC CGC CTG ACG CAG AGG GTG GA-3' (SEQ ID NO: 65) (en antisensprimer tilsvarende til sekvensen i posisjon 529 til 549 i SEQ ID NO: 4; fremstilt ved addisjon av to termineirngskodon TAA og TGA og en Noti gjenkjenningssekvens for anvendelse i fremstilling av en delesjonsmutant som koder for posisjoner 1 til 154 aminosyrerester);

hTPO-155; 5'-TTT GCG GCC GCT CAT TAG GCC CGC CTG ACG CAG AGG GT-3' (SEQ ID NO: 66) (en antisensprimer tilsvarende til sekvensen i posisjon 532 til 552 i SEQ DD NO: 4; fremstilt ved addisjon av to termineringskodon TAA og TGA og en Noti gjenkjenningssekvens for anvendelse i fremstilling av en delesjonsmutant som koder for posisjoner 1 til 155 aminosyrerester);

hTPO-156: 5'-TTT GCG GCC GCT CAT TAT GGG GCC CGC CTG ACG CAG AG-3' (SEQ DD NO: 67) (en antisensprimer tilsvarende til sekvensen i posisjon 535 til 555 i SEQ DD NO: 4; fremstilt ved addisjon av to termineirngskodon TAA og TGA og en Noti gjenkjenningssekvens for anvendelse i fremstilling av en delesjonsmutant som koder for posisjoner 1 til 156 aminosyrerester); og

hTPO-157: 5'-TTT GCG GCC GCT CAT TAG GGT GGG GCC CGC CTG ACG CA-3' (SEQ DD NO: 68) (en antisensprimer tilsvarende til sekvensen i posisjon 538 til 558 i SEQ DD NO: 4; fremstilt ved addisjon av to termineirngskodon TAA og TGA og en

Noti gjenkjenningssekvens for anvendelse i fremstilling av en delesjonsmutant som koder for posisjoner 1 til 157 aminosyrerester).

PCR ble utført ved bruk av 1 (ig plasmid DNA fra klonen pEF18S-HL34 fremstilt i eksempel 16 som templat og 10 (im av hver av de således syntetiserte oligonukleotidene (hTPO-5 for 5'-sete og hTPO-150, -151, -153, -154, -155, -156 og -157 for 3'-sete) som primere. Bruk av GeneAmp<TM><p>cr Reagent Kit med AmpliTaq<TM> DNA polymerase (fremstilt av Takara Shuzo), ble PCR reaksjonen utført i 100 (il volum ved anvendelse av GeneAmp™ PCR System 9600 (fremstilt av PERKIN-ELMER) og gjentagelse av totalt 20 sykluser, hver syklus omfattende denaturering ved 95 °C i 1 minutt, anellering ved 66°C i 1 minutt og syntese ved 72°C i 1 minutt fulgt av den endelige inkuberingen ved 72°C i 7 minutter. Et bånd av interesse oppnådd slik ved hver PCR ble kuttet med restriksjonsenzym EcoRI og Noti og resulterende produkt ble utsatt for 1% agarosegel

(fremstilt av FMC BioProducts) elektroforese for åisolere et hoved DNA fragment med en størrelse forventet ved hver PCR. Det således isolerte DNA fragmentet ble renset ved bruk av Prep-A-Gene DNA Purification Kit (fremstilt av Bio- Rad) og så subklonet inn i ekspresjonsvektoren pEF18S som hadde blitt behandlet på forhånd med de samme restriksjonsenzymer. I dette tilfellet, ble Competent-High E. coli DH5 fremstilt av TOYOBO, benyttet som vertsstamme. Fra de resulterende transformantene som fremmet for hvert PCR eksperiment, ble 3 til 5 kloner innholdende insertet med forventet størrelse selektert fremstille plasmid DNA prøver hovedsakelig ifølge prosedyren beskrevet i Molecular Cloning (Sambrook et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989). Ved en serie slike operasjoner, ble det oppnådd DNA prøver fra et delesjonsderivat som kodet for posisjonene 1 til 150 aminosyrerester (pHTl-150 nr. 21, 22 og 25), et delesjonsderivat som koder for posisjonene 1 til 151 aminosyrerester (pHTl-151 nr. 16, 17 og 18), et delesjonsderivat som kodet for posisjonene 1 til 153 aminosyrerester (pHTl-153 nr. 1 til 5), et delesjonsderivat som kodet for posisjonene 1 til 154 aminosyrerester (pHTl-154 nr. 1 til 5), et delesjonsderivat som koder for posisjonene 1 til 155 aminosyrerester (pHTl-155 nr. 1 til 5), et delesjonsderivat som koder for posisjonene 1 til 156 aminosyrerester (pHTl-156 nr. 1 til 5) og et delesjonsderivat som koder for posisjonene 1 til 157 aminosyrerester (pHTl-157 nr. 1 til 5).

Av disse rensede plasmid DNA prøvene, ble sekvensen av pHTl-150 nr. 21,22 og 25 og pHTl-151 nr. 16,17 og 18 sjekket ved 373A DNA sekvenser fremstilt av Applied Biosystems ved anvendelse av Taq Dye Deoxy<TM> Terminater Cycle Sequening Kit (Applied Biosystems), for derved å bekrefte forventet TPO cDNA sekvenser med ingen substitusjoner over hele nukleotidsekvensen.

Transfeksjon av COS 1 celler med hver av de således oppnådde klonene ble utført ifølge prosedyren i eksempel 11. Det vil si, transfeksjon ble utført med 10 u.g av hver av plasmidprøvene ved DEAE-dekstranmetoden som omfatter kloroquinbehandling, og kultursupernatanten ble gjenvunnet etter 3 dager dyrking. De således oppnådde kultursupernatantene ble dialysen mot IMDM kulturmedium beskrevet ovenfor og evaluert med M-07e analysesystemet. TPO aktiviteter ble detektert i kultursupernatanten fra COS 1 celler transfektert med respektive kloner som kodet for C-terminale delesjonsderivater omfattende 1 til 151 posisjon aminosyrer, 1 til 153 posisjon aminosyrer, 1 til 154 posisjon aminosyrer, 1 til 155 posisjon aminosyrer, 1 til 156 posisjon aminosyrer eller 1 til 157 posisjon aminosyrer. Alle disse derivatene inneholder cysteinrest i posisjon 151. Imidlertid, ble ingen TPO aktivitet detektert i kultursupernatanten til COSI celler transfektert med noen som kodet for et C-terminalt sidedelesjonsderivat omfattende 1 til 150 posisjon aminosyrer hvis cysteinrest ved posisjon 151 også var deletert.

(Eksempel 29)

Preparerin<g> av N- terminal delesjonstvpe human TPI og dets ekspresjon og aktivitet i COS 1 celler

For å analysere regionen som var nødvendig for TPO proteinet for å vise dets biologiske aktivitet, ble aminosyrene på den ene terminale siden av delesjonsderivatene oppnådd i eksempel 28, ytterligere deletert og ekspresjonen av TPO aktivitet i de således fremstilte delesjonsderivatene ble undersøkt. Ved bruk av plasmidklonet pEF18S-HL34 oppnådd i eksempel 16 og plasmidklonet pHTl-163 oppnådd i eksempel 27, ble ekspresjonsplasmider fremstilt ved deletering av nukleotidsekvensen som kodet for N-terminal aminosyrerester etter signalsekvensen. Konstruksjon av disse delesjonsplasmidene ble utført ved anvendelse av PCR. Sekvenser av primere fremstilt for anvendelse i PCR er som følger: hTPO-5: 5' TTT GAA TTC GGC CAG CCA GAC ACC CCG GCC-3" (SEQ DD NO: 69) (fremstilt ved addisjon av en EcoRI gjenkjenningssekvens til sekvensen i posisjon 1 til 21 i SEQ DD NO: 4; den samme sekvensen vist i eksempel 18): hTP03:5'-TTT GCG GCC GCT CAT TAT TCG TGT ATC CTG TTC

AGG TAT CC-3' (SEQ DD NO: 70) (en antisens primer tilsvarende sekvensen i posisjonene 757 til 780 i SEQ DD NO: 4; fremstilt ved adisjon av to terminale kodoner TAA og TGA og Noti gjenkjenningssekvens; den samme sekvensen syntetisert for anvendelse i fremstillingen av et delesjonsderivat som koder for posisjonene 1 til 231 aminosyrerester);

hTPO-S: 5'-TTT GCG GCC GCT CAT TAG CTG GGG ACA GCT

GTG GTG GGT-3' (SEQ DD NO: 71) (en antisens primer tilsvarende sekvensen i posisjonene 555 til 576 i SEQ ID NO: 4; fremstilt av et delesjonsderivat som koder for posisjonene 1 til 163 aminosyrerester);

hTPO-13: 5*-AGT AAA CTG CTT CGT GAC TCC CAT GTC CTT

CAC AGC AGA CTG AGC CAG TG-3' (SEQ ID NO: 72) (posisjonene 124 til 173 i SEQ ID NO: 4; fremstilt for anvendelse ved fremstilling av et derivat hvor aminosyreresten i posisjon 1 til 12 er deletert);

hTPO-13R: 5'-CAT GGG AGT CAC GAA GCA GTT TAC TGG

ACA GCG TTA GCC TTG CAG TTA G-3' (SEQ ID NO: 73) (en antisensprimer tilsvarende til sekvensen i posisjonene 64 til 87 og 124 til 148 i SEQ ID NO: 4; fremstilt for anvendelse ved fremstilling av et derivat hvor aminosyrerestene i posisjon 1 til 12 er deletert);

hTPO-7: 5'-TGT GAC CTC CGA GTC CTC AGT AAA CTG CTT

CGT GAC TCC CAT GTC CTT C-3' (SEQ ID NO: 74) (posisjonene 106 til 154 i SEQ ID NO: 4; fremstilt for anvendelse ved fremstilling av et derivat hvor aminosyreresten i posisjon 1 til 6 er deletert);

hTPO-7R: 5'-TTT ACT GAG GAC TCG GAG GTC ACA GGA CAG

CGT TAG CCT TGC AGT TAG-3' (SEQ ID NO: 75) (en antisensprimer tilsvarende til sekvensen i posisjonene 64 til 87 og 106 til 129 i SEQ ID NO: 4; fremstilt for anvendelse ved fremstilling av et derivat hvor aminosyrerestene i posisjon 1 til 6 er deletert);

hTPO-8: 5'-GAC CTC CGA GTC CTC AGT AAA CTG CTT CGT GAC TCC CAT

GTC CTT CAC A-3' (SEQ ID NO; 76) (posisjonene 190 til 157 i SEQ ID NO: 4; fremstilt for anvendelse ved fremstilling av et derivat hvor aminosyreresten i posisjon 1 til 7 er deletert); og

hTPO-8R: 5'-CAG TTT ACT GAG GAC TCG GAG GTC GGA CAG

CGT TAG CCT TGC AGT TAG-3' (SEQ DD NO: 77) (en antisensprimer tilsvarende til sekvensen i posisjonene 64 til 87 og 109 til 132 i SEQ DD NO: 4; fremstilt for anvendelse ved fremstiUing av et derivat hvor aminosyrerestene i posisjon 1 til 7 er deletert). (1) Fremstilling av et derivat (pHT13-231) hvor aminosyreresten i posisjon 1 til 12 er deletert.

PCR ble utført ved anvendelse av 1.4 |xg plasmid DNA fra klonen pEF18S-HL34 fremstilt i eksempel 18 som templat og 5 |i,m av hver av de således syntetiserte oligonukleotidene (hTPO-13 og hTP03 i en kombinasjon og hTPO-5 og hTPO-13R i en annen kombinasjon) som primere. Ved bruk av GeneAmp<TM><p>cr Reagent Kit med AmpliTaq<TM> DNA polymerase (fremstilt av Takara Shuzo), ble PCR reaksjonen utført i 100 [il volum ved anvendelse av GeneAmp<TM> PCR System 9600 (fremstilt av PERKIN- ELMER) og, etter 5 minutter denaturering ved 95°C, ble repetisjon av totalt 30 sykluser, hver syklus omfattende denaturering ved 95°C i 1 minutt, anellering ved 65 °C i 1 minutt og syntese ved 72°C i 1 minutt, fulgt av den endelige inkuberingen i 72°C i 7 minutter, gjennomført. Hver av PCR produktene ble utsatt for 1.2% agarosegel (fremstilt av FMC BioProducts) elektroforese for å isolere et hoved DNA fragment med en forventet størrelse som deretter ble renset ved bruk av Prep-A-Gene DNA Purification Kit (fremstilt av Bio-Rad) og oppløst i 15 ul TE buffer. Deretter ble den andre PCR utført ved anvendelse av 1 [il porsjon av hver av de således fremstilte oppløsningene som templat. Den andre PCR ble utført ved anvendelse av 5 |im av hver av de syntetiserte primerene (hTPO-5 og hTP03). Ved bruk av GeneAmp™ PCR Reagent Kit med AmpliTaq™ DNA polymerase (fremstilt av Takara Shuzo), ble PCR reaksjonen utført i 100 ul volum ved anvendelse av GeneAmp™ PCR System 9600 (fremstilt av PERKIN-ELMER) og, etter 5 minutters denaturering ved 95°C, repetisjon av totalt 30 sykluser, hver syklus bestående av denaturering ved 96°C i 1 minutt, anellering ved 60°C i 1 minutt og syntese ved 72°C i 1 minutt, fulgt av den endelige inkuberingen ved 72°C i 7 minutter. Hver av PCR produktene ble utsatt for 1.2% agarosegel (fremstilt av FMC BioProducts) . elektroforese for åisolere et hoved DNA fragment med en forventet størrelse som deretter ble renset ved bruk av Prep-A-Gene DNA Purification Kit (fremstilt av Bio-Rad) og oppløst i 15 ul TE buffer. Etter kutting med restriksjonsenzymer EcoRI og Noti, ble den resulterende oppløsningen utsatt for ekstraksjon med det samme volum fenol/kloroform og påfølgende etanolfelling. Etter sentrifugering, ble den resulterende utfelling oppløst i 15 [il TE buffer og så subklonet inn i ekspresjonsvektor pEF18S som hadde blitt behandlet på forhånd med de samme restriksjonsenzymer. I dette tilfellet, ble Competent-High E. coli DH5 fremstilt av TOYOBO benyttet som vertsstamme. Fra resulterende transformanter ble 45 kloner inneholdende insertet ved forventet størrelse utvalgt for å fremstille plasmid DNA prøver hovedsakelig ifølge prosedyren beskrevet i Molecular Cloning (Sambrook et al., Cold Spring Harbor laboratory Press, 1989). På denne måten er det mulig å oppnå plasmid DNA av et delesjonsderivat (pHT13-231) som koder for et proteinmolekyl hvor aminosyreresten i posisjon 1 til 12 har blitt deletert fra den opprinnelige aminosyreresten i posisjon 1 til 231. Når disse 45 klonene blir utsatt for PCR ved bruk av primere hTPO-5 og hTP03, ble inserter med omkring forventet størrelse bekreftet i 8 kloner. Av disse, ble sekvensen i 3 kloner sjekket ved 373A DNA sekvenser fremstilt av Applied Biosystems ved anvendelse av Taq Dye Deoxy<TM> Terminaler Cycle Sequening Kit (Applied Biosystems) for derved å oppnå en klon pHT13-231 nr. 3 med en TPO cDNA sekvens ble utformet og en delesjon som forventet med ingen substitusjoner og lignende over hele nukleotidsekvensen. (2) Fremstilling av et derivat (pHT7-163) i hvilket aminosyreresten i posisjon 1 til 6 er deletert.

I dette tilfellet, ble aminosyren i posisjon 163 benyttet som C-terrriinal for fremstilling av delesjonsderivater, selv om aminosyren i 231 posisjon var vist som en C-terminal ende av TPO proteinet for fremstilling av delesjonsderivater i trinnet 1 ovenfor, ble det funnet at TPO aktiviteten kunne bli uttrykt selv når de C-terminale aminosyrene var ytterligere deletert. På basis av den samme begrunnelse, ble aminosyren i 163 posisjon benyttet som C-terminal også i påfølgende trinn (3). PCR ble utført ved bruk av 1.4 ng plasmid DNA av klon pHTl-163 oppnådd i eksempel 27 som templat og 5 (im av hver av de syntetiserte oligonukleotidene (hTPO-7 og hTPO-S i en kombinasjon og hTPO-5 og hTPO-7R i en annen kombinasjon) som primere. Ved bruk av GeneAmp<TM><p>cr Reagent Kit med AmpliTaq™^ DNA polymerase (fremstilt av Takara Shuzo), ble PCR reaksjonen utført i 100 (il volum ved anvendelse av GeneAmp™^ <p>cr System 9600 (fremstilt av PERKIN- ELMER) og, etter 5 minutters denaturering ved 95°C, repetisjon av totalt 30 sykluser, hver syklus omfattende denaturering ved 95 °C i 1 minutt, anellering ved 65°C i 1 minutt ved syntese i 72 minutter, fulgt av den endelige inkuberingen ved 72°C i 7 minutter. Hver av PCR produktene ble utsatt for 1.2% agarosegel (fremstilt av FMC BioProducts) elektroforese for å isolere hoved DNA fragmentet med en forventet størrelse som deretter blir renset ved bruk av Prep-A-Gene DNA Purification Kit (fremstilt av Bio-Rad) og oppløst i 15 ul TE buffer. Deretter ble en andre PCR utført ved bruk av 1 (il porsjon av hver fremstilte oppløsning som et templat.

Den andre PCR ble utført ved bruk av 5 (im av hver av de syntetiserte primerene (hTPO-5 og hTPO-S). Ved bruk av GeneAmp™ PCR Reagent Kit med AmpliTaq<TN >DNA polymerase (fremstilt av Takara Shuzo), ble PCR reaksjonen utført i 100 (il volum ved anvendelse av GeneAmp™ PCR System 9600 (fremstilt av PERKIN-ELMER) og, etter 5 minutter denaturering ved 95°C, repetisjon av totalt 30 sykluser, hver syklus omfattende denaturering ved 95 °C i 1 minutt, anellering ved 60°C i 1 minutt og syntese ved 72°C i 1 minutt, fulgt av den endelige inkuberingen ved 72°C i 7 minutter. Hver av PCR produktene ble utsatt for 1.2% agarosegel (fremstilt av FMC BioProducts) elektroforese for å isolere et hoved DNA fragment med en forventet størrelse som deretter ble renset ved bruk av Prep-A-Gene DNA Purification Kit (fremstilt av Bio-Rad) og oppløst i 15 (il TE buffer. Etter kutting med restriksjonsenzymer EcoRI og Noti ble den resulterende oppløsningen utsatt for ekstraksjon med det samme volumet fenol/kloroform og deretter etanolfelt. Etter sentrifugering ble det resulterende presipitatet oppløst i 15 (il TE buffer som så ble subklonet inn i ekspresjonsvektor pEF18S som hadde blitt behandlet på forhånd med de samme restriksjonsenzymene. I dette tilfellet ble Competent-High E. coli DH5 fremstilt av TOYOBO benyttet som vertsstamme. Fra de resulterende transformantene, 30 kloner inneholdende inserte med forventet størrelse, valgt for å fremstille plasmid DNA prøver hovedsakelig ifølge prosedyren beskrevet i Molecular Cloning (Sambrook et al., Cold Spring HArbor laboratory Press, 1989). På denne måten var det mulig å oppnå plasmid DNA av et delesjonsderivat (pHT7-163) som koder for et proteinmolekyl hvor aminosyreresten i posisjon 1 til 6 hadde blitt deletert fra de opprinnelige aminosyrerestene fra posisjon 1 til 163 i SEQ ID NO: 4. Når disse ble utsatt for PCR ved bruk av primere hTPO-5 og hTPO-S ble inserter med omkring forventet størrelse bekreftet i alle kloner. Av disse ble sekvensen til 3 kloner sjekket ved 373A DNA syntese fremstilt av Applied Biosystems ved bruk av Taq Dye Deoxy<TM> Terminater Cycle Sequening Kit (Applied Biosystems), og derved oppnå 2 kloner, pHT7-163 nr. 4 og nr. 29, hver med en TPO cDNA sekvens som angitt og en delesjon som forventet uten substitusjon og lignende over hele nukleotidsekvensen. (3) Fremstilling av et derivat ( pHT8- 163) i hvilken aminos<y>reresten i posisjon 1 til 7 er deletert Et derivat (pHT8-163) ble delesjon av aminosyrerester i posisjon 1 til 7 ble fremstilt hovedsakelig på samme måte som i tilfellet ovenfor for fremstilling av et derivat (pHT7-163) med delesjon av aminosyreresten i posisjon 1 til 6. PCR ble utført ved bruk av 1.4 \ ig plasmid DNA og klonet pHT 1-163 fremstilt i eksempel 27 som et templat og 5 nm av hver av de syntetiserte oligonukleotidene (hTPO-8 og hTPO-S) i en kombinasjon og hTPO-5 og hTPO-8R i en annen kombinasjon) som primere. Ved bruk av GeneAmp<TM><p>QR Reagent Kit med AmpliTaq<TM> DNA polymerase (fremstilt av Takara Shuzo), ble PCR reaksjonen utført i 100 ul volum ved anvendelse av GeneAmp™ PCR System 9600 (fremstilt av PERKJN-ELMER) og, etter 5 minutter denaturering ved 95 °C, repetisjon av totalt 3o sykluser, hver syklus omfattende denaturering ved 95°C i 1 minutt, anellering ved 65°C i 1 minutt og syntese ved 72°C i 1 minutt, fulgt av en endelig inkubasjon ved 72°C i 7 minutter. Hver av PCR produktene ble utsatt for 1.2% agarosgel (fremstilt av FMC BioProducts) elektroforese for åisolere et hoved DNA fragment med en forventet størrelse som deretter blir renset ved bruk av Prep-A-Gene DNA Purification Kit (fremstilt av BioRad) og oppløst i 15 ul TE buffer. Deretter ble den andre PCR utført ved anvendelse av 1 ul porsjon av hver av de således fremstilte oppløsningene av et templat.

Den andre PCR ble utført ved anvendelse av 5 \ im av hver av de syntetiserte primerene (hTPO-5 og hTPO-S). Ved bruk av GeneAmp™ PCR Reagent Kit med AmpliTaq™ DNA polymerase (fremstilt av Takara Shuzo), ble PCR reaksjonen utført i 100 (xl volum ved anvendelse av GeneAmp™ PCR System 9600 (fremstilt av PERKIN-ELMER) og, etter 5 minutter denaturering ved 95°C ble repetisjon av totalt 30 sykluser, hver syklus omfattende denaturering ved 95°C i 1 minutt, anellering ved 60°C i 1 minutt og syntese ved 72°C i 1 minutt, fulgt av den endelige inkubering ved 72°C i 7 minutter. Hver av PCR produktene ble utsatt for 1.2% agarosegel (fremstilt av FMC BioProducts) elektroforese for å isolere hoved DNA fragment med forventet størrelse som deretter ble renset ved bruk av Prep-A-Gene DNA Purification Kit (fremstilt av BioRad) og oppløst i 15 (il TE buffer. Etter kutting med restriksjonsenzym EcoRI og Noti ble den resulterende oppløsningen utsatt for ekstraksjon med det samme volum fenol/kloroform og deretter etanolfelt. Etter sentrifugering ble det resulterende presipitat oppløst i 15 (il TE buffer så subklonet inn i ekspresjonsvektoren pEF18S som hadde blitt behandlet på forhånd med de samme restriksjonsenzymer. I dette tilfellet ble Competent-High E. coli DH5 fremstilt ved TPYOBO benyttet som vertsstamme. Fra de resulterende transformantene ble 30 kloner inneholdende insertet med forventet størrelse valgt for å fremstille plasmid DNA prøver hovedsakelig ifølge prosedyren beskrevet i Molecular Cloning (Sambrook et al., Cold Spring HArbor Laboratory Pess, 1989). På denne måten ble det mulig å oppnå plasmid DNA av et delesjonsderivat (pHT8-163) som koder for et proteinmolekyl i hvilket aminosyrene i posisjon 1 til 7 har blitt deletert fra de opprinnelige aminosyrerestene i posisjon 1 til 163 i SEQ DD NO: 4. Når disse klonene ble utsatt for PCR ved bruk av primere hTPO-5 og hTPO-S, ble inserter med omkring forventet størrelse bekreftet i alle kloner. Av disse, ble sekvensen til 3 kloner sjekket med 373A DNA sekvenser fremstilt av Applied Biosystems ved anvendelse av Taq Dye Deoxy<TM> Terminater Cycle Sequening Kit (Applied Biosystems), for derved å oppnå 2 kloner, pHT8-163 nr. 33 og nr. 48, hver med en TPO cDNA sekvens som angitt og en delesjon som forventet med ingen substitusjoner og lignende over hele nukleotidsekvensen.

Ekspresjon av delesjonsderivater i COS 1 celler og bekreftelse av TPO aktivitet Transfeksjon av COS 1 celler med hver av de således oppnådd delesjonsklonene ble utført ifølge prosedyren i eksempel 11. Det vil si, transfeksjonen ble utført med 10 (ig av hver av plasmid DNA prøvene ved DEAE-dekstranmetoden som omfatter kloroquinbehandling og kultursupernatantene ble gjenvunnet etter 3 dager dyrking. De således oppnådde kultursupernatantene ble grundig dialysert mot IMDM-kulturmedium beskrevet i det foregående og evaluert med M-07e analysesystemet.

Som et resultat, ble svak, men signifikant TPO aktivitet detektert i kultursupernatanten av COS 1 celler transfektert med en klon som kodet for delesjonsderivatet bestående av 7 til 163 posisjon aminosyrer. Imidlertid, ble ingen TPO aktivitet detektert i kultursupernatanten fra COS 1 celler transfektert med kloner som kodet for delesjonsderivatene bestående av aminosyrene i posisjon 8 til 163 eller av aminosyrene i posisjon 13 til 231.

(Eksempel 30)

Fremstilling av fullstendig mengde av human TPO cDNA plasmid ( pHTPl)

En ekspresjonsvektor med alle aminosyrekodende regioner fra human TPO cDNA ifølge SEQ ID NO: 6 ble konstruert for ekspresjon i mamalske celler.

PCR ble utført på følgende måte for å fremstille et DNA fragment som dekker alle humane TPO cDNA kodende regioner.

Nukleotidsekvensen benyttet som primer er som følger:

hTPO-I: 5'-TTG TGA CCT CCG AGT CCT CAG-3' (SEQ ID NO: 78)

(posisjoner 105 til 125 i SEQ ID NO: 6);

SA:5'-CAG GTA TCC GGG GAT TTG GTC-3' (SEQ ID NO: 79) (en antisensprimer tilsvarende til sekvensen i posisjonene 745 til 765 i SEQ ID NO: 6);

hTPO-P: 5'-TGC GTT TCC TGA TGC TTG TAG-3' (SEQ ID NO:80)

(posisjoner 503 til 523 i SEQ ID NO: 6); og

hTPO-KO: 5<*->GAG AGA GCG GCC GCT TAC CCT TCC TGA GAC

AGA TT-3' (SEQ ID NO: 81) (en sekvens fremstilt ved addering av en gjenkjenningssekvens for restriksjonsenzym Noti og en GAGAGA sekvens (SEQ ID NO: 82) for å gi en antisens sekvens tilsvarende til sekvensen i posisjonene 1066 til 1086 i

SEQ ID NO: 6).

Den første PCR ble utført ved anvendelse av 300 ng av klonen pEF18S-HL34 fremstilt i eksempel 16 som templat. Ved anvendelse av 0.5 [im av hver av primerene hTPO-I og SA og 1 enhet av Vent R<TM> DNA polymerase (fremstilt av New England BioLabs), ble PCR (repetisjon av totalt 30 sykluser, hver syklus omfattende inkubering ved 96°C i 1 minutt, ved 62°C i 1 minutt og 72°C i 1 minutt, fulgt av en endelig inkubering ved 72°C i 7 minutter) ble utført. Sammensetningen av reaksjonsoppløsningen i endelig konsentrasjon er som følger: 10 mM KC1, 10 mM (NHtøSO^ 20 mM Tris-HCl (pH 8.8), 2 mM MgS04,0.1% Triton X-100 og 200 [im dNTP blanding.

En mikrogram porsjon er kommersielt tilgjengelig poly(A)<+> RNA preparat avledet fra en human normal lever (fremstilt av Clontech) ble oppvarmet til 70°C i 10 minutter, hurtig avkjølt på is og så blandet med 10 mM DTT, 500 [im dNTP blanding, 25 ng random primer (fremstilt av Takara Shuzo), 10 enheter RNase inhemmer (fremstilt av Boehringer-Mannheim) og 200 enheter av SuperScript^<M> jj RNase H" (fremstilt av LIFE TECHNOLOGIES), fulgt av 1 times inkubering ved 37°C for åutføre syntesen av cDNA. Deretter, ble en andre PCR (repetisjon av totalt 30 sykluser, hver syklus omfattende inkubering med 96°C i 1 minutt, ved 58°C i 1 minutt og ved 72°C i 1 minutt) ble utført ved anvendelse av 1/20 volum av rekasjonsoppløsningen av syntetisert cDNA som templat og 2.5 |xm av hver av primerene hTPO-P og hTPO-KO og 2.5 enheter AmpliTaq<TM> DNA polymerase (fremstilt av Takara Shuzo).

Hver av de resulterende oppløsningene av den første og andre PCR ble utsatt for 1% agarosegel elektroforese for å isolere resepektive hoved DNA fragmenter med forventet størrelse som deretter blir renset ved bruk av Prep-A-Gene DNA Purification Kit (fremstilt av Bio-Rad). Deretter ble PCR utført ved bruk av 1/20 volum av hver av de således fremstilte oppløsningene som et templat. Denne reaksjonen (oppvarming ved 96°C i 2 minutter fulgt av repetisjon av totalt 3 sykluser, hver syklus omfattende inkubering ved 96°C i 2 minutter og 72°C i 1 minutt og påfølgende inkubering ved 72°C i 7 minutter) ble utført ved bruk av en enhet av Vent R<TM> DNA polymerase (fremstilt av New England BioLabs). Den resulterende reaksjonsoppløsningen ble blandet med 1 Hm av hver av hTPO-I og hTPO-KO, oppvarmet ved 96°C i 2 minutter, utsatt for 25 sykluser reaksjon, hver syklus omfattende inkubering ved 96°C i 1 minutt, 62°C i 1 minutt og 72°C i 1 minutt og så inkubering med 72°C i 7 minutter. Den resulterende reaksjonsoppløsningen ble ekstrahert med det samme volum vannmettet fenol-kloroform og ble så med det samme volumet kloroform, ekstraktet ble utsatt for etanolfelling (2.5 volum av etanol i nærvær av 0.3 M natriumacetat og 0.5 ul glykogen fremstilt av Boehringer-Mannheim) for å gjenvinne DNA. Det således gjenvundne DNA ble kuttet med restriksjonsenzymer BamHI og Noti og utsatt for 1% agarosegel elektroforese og et hovedband med en forventet størrelse isolert slik, ble renset ved bruk av Prep-A-Gene DNA Purification Kit (fremstilt av Bio-Rad), ligert med pBluescript II SK<+> vektor (fremstilt av Stratagene) som hadde blitt kuttet på forhånd med restriksjonsenzymene BamHI og Noti og så transformert inn i Competent-High E. coli DH5 (fremstilt av TOYOBO). Fra de resulterende koloniene ble 4 kloner valgt for å fremstille plamid DNA prøver. Sekvensen av renset plasmid DNA prøver ble sjekket med 373A DNA sekvenser fremstilt av Applied Biosystems ved anvendelse av Taq Dye Deoxy<TM >Terminaler Cycle Sequening Kit (Applied Biosystems), for derved å oppnå en klon, pBLTP med en TPO cDNA sekvens som er utformet uten substitusjon i nukleotidsekvensen i regionen mellom BamHI og Noti.

Klonen pBLTP ble kuttet med restriksjonsenzymer EcoRI og BamHI og utsatt for 1% agarosegel elektroforese og et bånd med høy molekylvekt isolert slik, ble renset ved bruk av Prep-A-Gene DNA Purification Kit (fremstilt av Bio-Rad). På samme måte ble pEF18S-HL34 behandlet med restriksjonsenzymene for å rense et DNA fragment omkring 450 bp. Hver av de således oppnådde DNA prøvene ble utsatt for ligering og transformert inn i Competent-High E. coli DH5 (fremstilt av TOYOBO). Plasmid DNA prøver ble preparert fra de resulterende koloniene for å oppnå en klon, pBLTEN, inneholdende humane TPO cDNA insert. Det således oppnådde pBLTEN ble kuttet med restriksjonsenzymer EcoRI og Noti og utsatt for 1% agarosegel elektroforese og et DNA fragment på omkring 1200 bp ble således isolert ved anvendelse av Prep-A-Gene DNA Purification Kit (fremstilt av Bio-Rad), ligert med ekspresjonsvektoren pEF18S som t hadde blitt kuttet på forhånd med de samme restriksjonsenzymer og så transformert inn i Competent- High E. coli DH5 (fremstilt av TPYOBO). Plasmid DNA prøver ble

preparert fra de resulterende koloniene for å oppnå den interessante klonen pHTPl, som inneholder hele den humane TPO cDNA kodende regionen. Plasmid DNA ble fremstilt fra denne klonen i en stor mengde og benyttet i de følgende eksperimenter. Preparering av plasmid DNA ble utført hovedsakelig ifølge prosedyren beskrevet i Molecular Cloning (Sambrook et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989).

(Eksempel 31)

Kontraksjon av mammalsk ekspresjonsplasmid. pDEF202- hTPO- Pl. for ekspresjon av human TPO i kinesisk hamsterovarie ( CHO) celler

Et mikrogram plasmid pMGl inneholdende mus dihydrofolat reduktase (DHFR)

minigen ble kuttet med restriksjonsenzymer EcoRI og BamHi og utsatt for agarosegelelektroforese for åisolere et fragment (omkring 2.5 kb) inneholdende muse DHFR

minigenet. Det isolerte DNA fragment ble oppløst i 25 ml av en reaksjonsoppløsning sammensatt av 50 mM Tris-HCl (pH 7.5), 7 mM MgCl2,1 mM 2-merkaptoetanol og 0.2 mM dNTP blanding, blandet med 2 enheter Klenows fragment og så inkubert ved romtemperatur i 30 minutter for å danne butte ender ved begge endene av DNA

fragmentet. Etter fenol/kloroform behandling og etanolfelling ble det resulterende fragmentet oppløst i 10 ml av en TE oppløsning (10 mM Tris-HCl (pH 8.0)/l mM

EDTA). Den mammalske ekspresjonsvektoren pEG18S ble kuttet med restrik-

sjonsenzym Smal, defosforylert med alkalisk fosfatase (fremstilt av Takara Shuzo) og ligert med et DNA fragment inneholdende mus DHFR minigen ved anvendelse av T4

DNA ligase (fremstilt av Takara Shuzo) for å oppnå en ekspresjonsvektor pDEF202.

Deretter ble den konstruerte ekspresjonsvektoren pDEF202 kuttet med

restriksjonsenzymer EcoRI og Spel, og så utsatt for agarosegelelektroforese for å isolere et større DNA fragment. Humant TPO cDNA som hadde blitt oppnådd ved kutting av plasmid pHTPl inneholdende humant TPO cDNA (klon pl) når restriksjonsenzymer EcoRI og Spel, ble ligert med denne lineariserte pDEF202 vektoren ved anvendelse av T4 ligase (fremstilt av Takara Shuzo) for å oppnå et plasmid pDEF202- hTPO-Pl for ekspresjon av humant TPO cDNA. Dette konstruerte plasmidet inneholder SV40

replikasjonsorigo, human forlengelsesfaktor 1-a-promoter og SV40 tidlig polyadeny-leringssignal for transkripsjon av humant TPO cDNA, mus DHFR minigen og pUC18 replikasjonsorigo og fi-laktamase genet (Amp<1>).

(Eksempel 32)

Ekspresjon av human TPO i CHO celler

CHO celler (en DHFR-stamme; Urlaub og Chasein, Proe. NAtl. Acad. Sei. USA, vol. 77 (s4216,1980) ble opprettholdt i a-minimum essensielt medium (a-MEM(-), tilsatt hypoksanthin og thymidin) inneholdende 10% føtalt kalveserum (FCS) ved anvendelse av vevskulturskåler med diameter på 6 cm (av Falcon). Transformeringen av CHO celler med pDEF202-hTPO-Pl plasmid ble utført ved kalsiumfosfatmetode (CellPhect, fremstilt av Pharmacia) som beskrevet nedenfor. Ti mikrogram av plasmidet pDEF202-hTPO-Pl fremstilt i eksempel 31 ble blandet med 120 ml av buffer A og 120 ml H2O og den resulterende blandingen ble inkubert ved romtemperatur i 10 minutter. Oppløsningen ble videre blandet med 120 ml buffer B og satt ved romtemperatur i ytterligere 30 minutter. Denne DNA blandeoppløsningen ble så tilsatt til kulturen inkubert i 6 timer i en CO2 inkubator. Etter 6 timer ble kulturen vasket to ganger med serumfri oc-MEM(-), behandlet med a-MEM(-) inneholdende 10% dimetylsulfoksid i 2 minutter, og så inkubert i 2 dager i non-seleksjonsmedium) (a-MEM(-) tilsatt hypoksanthin og tymidin) inneholdende 10% dialysen FCS. Etter 2 dagers dyrking ble cellene selektert i et seleksjonsmedium (oc-MEM(-)) inneholdende 10% dialysen FCS. For seleksjon av transformerte celler med DHFR-positiv fenotype ble cellene behandlet med trypsin/EDTA oppløsning og resuspendert med et seleksjonsmedium. Cellene i 6 cm vevskulturplater ble delt i 5 10 cm vevskulturplater eller 12 24 brønners vevskulturplater og så dyrket i seleksjonsmediet. Kulturmediet ble byttet ved to dagers intervaller. Human TPO aktivitet i det dyrkede mediumet av CHO celler med DHFR- positiv fenotype ble målt ved CFU-MK analyse, M-07e analyse eller Ba/F3 analyse. Cellene som skiller human TPO i kulturmediet ble ytterligere selektert i seleksjonsmediet tilsatt 25 nM metotreksat for å isolere celleklonen som produserte en større mengde humant

TPO.

I dette tilfellet, kan transfeksjon av CHO celler også bli utført ved å utføre kotransfeksjon av CHO celler med pHTPl og pMGl plasmider.

CHO stamme (CHO-DUKXB11) transfektert med plasmid pDEF202- hTPO-Pl har blitt deponert av foreliggende søkere 31. januar 1995 under aksesjonsnummeret FERM BP-4988, ved National Institute of Bioscience and Human Technology, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Insustry, Japan.

(Eksempel 33)

Konstruksjon av en rekombinant vektor BMCHSneo- hTPO- Pl for anvendelse i X 63. 6. 5. 3. celler

Et mikrogram av en mammalsk ekspresjonsvektor pBMCGSneo ble kuttet med restriksjonsenzymer Xhol og Noti og utsatt for agarosegelelektroforese for å isolere vektor DNA delen. Dette DNA fragmentet og humant TPO cDNA (Pl klon) som hadde blitt oppnådd ved kutting av plasmidet pBLTEN inneholdende humant TPO cDNA med restriksjonsenzymer Xhol og Noti, ble ligert ved anvendelse av T4 ligase for å oppnå ekspresjonsvektoren av interesse, pBMCGSneo-hTPO-Pl. Dette ekspresjonsplasmidet inneholder cytomegalovirus tidlig promoter, deler av kanin B-globin genavledet intron og polyadenylert region for transkripsjon av humant TPO cDNA, human B globin gen, 69% av bovint papillomavirus 1 gen, thymidin i kinase promoter og polyadeny-leringsregion, fosfotransferase I gen (neomycinresistant gen) og pBR322 replikasjonsorigo og 8-laktamasegen (Amp<1>), human TPO cDNA ble ligert på et nedstrøms sete av cytomegalovirus promoter.

(Eksempel 34)

Ekspresjon i X 63. 6. 5. 3. celler

X 63.6.5.3. celler ble dyrket i Dulbeccos minimum essensielle medium (DME) inneholdende 10% føtalt bovint serum. Transfeksjon av X63.6.5.3. celler med BMCGSneo hTPO plasmid ble utført ved elektroforeringsmetoden beskrevet nedenfor. 20 mikrogram av plasmidet BMCGSneo-hTPO-Pl fremstilt i eksempel 33 ble tilsatt til 750 fil av DME mediet inneholdende 10^ celler og blandingen ble satt i en elektroporeirngskuvette med et gap på 4 mm og satt i 10 minutter ved 4°C. Kuverten ble så satt i et elektroporeirngsapparat (BTX 600, fremstilt av BTX) for å utføre genoverføring under betingelser på 380 V, 25 mF og 24 angstrøm. Etter genoverføring ble kuvetten igjen satt i 15 minutter ved 4°C og cellene ble så vasket med DEM inneholdende 10% føtalt bovinserum. De transfekterte cellene ble suspendert i 50 ml DEM inneholdende 10% føtalt bovinserum, suspendert i brønner på 5 96-brønners kulturplater og så dyrket i 2 dager i en CO2 inkubator. Etter 2 dagers dyrking ble kulturmediet byttet med DMEM inneholdende 10% føtalt bovinserum og 1 mg/ml G418 (fremstilt av GD3SCO) og mediebytting ble utført hver tredje dag deretter. Den humane TPO aktiviteten i kulturmediet av transformanter ble målt med CFU-MK, M-07e eller Ba/F3 analysen. Transformantene som skiller ut humant TPO i kulturmediet, ble klonet to ganger ved begrenset fortynning for å etablere en human TPO produserende cellelinje.

(Eksempel 35)

Storskala ekspresjon av human TPO i COS 1 celler

Transfeksjon av COS 1 celler ble utført ifølge DEAE-dekstran fremgangsmåten som omfatter kloroquinbehandling som beskrevet i eksempel 11. COS 1 celler (ATCC CRL1650) ble dyrket i IMDM inneholdende 10% (v/v) FCS for anvendelse av en kollagen belagt 175 cm<2> kulturflaske ved 37°C i 5% karbondioksid inkubator inntil cellene ble omtrent 100% sammenflytende. For å utføre kollagenbelegging av kultur-flasken ble 25 ml av en kollagenoppløsning (Cellmatrix type I-C, fremstilt av Iwaki) hvis konsentrasjon hadde blitt justert til 0.3 mg/ml med 1 mM HC1, ble tilsatt til hver 175 cm<2> kulturflaske, kollagenoppløsningen ble gjenvunnet etter 1 time ved henstand ved romtemperatur og så ble de således behandlede flaskene vasket en gang med 20 til 50 [il PBS. Transfeksjon ble utført ved blanding av 20 ml IMDM opplsøning inneholdende 250 [ig/ml DEAE-dekstran (fremstilt av Pharmacia), 60 [im kloroquin (fremstilt av Sigma) og 10% (v/v) Nu-serum (fremstilt av Collaborative) med plasmid pHTPl (40 [ig) som hadde blitt oppløst i 500 [il HBS, tilsetting av den resulterende blandingen til COS 1 cellene beskrevet ovenfor inneholdt en 175 cm<2> kulturflaske som hadde blitt vasket en gang med IMDM rett før transfeksjon, og så vasking av cellene i 3 timer ved 37°C i en 5% karbondioksidinkubator. Deretter ble kultursupernatanten fjernet ved sug og cellene ble vasket en gang med IMDM, blandet med 50 ml av et serumfritt medium og så dyrket i 5 dager ved 37°C i 5% karbondioksid inkubator for ågjenvinne kultursupernatanten. I en operasjon, ble 100 til 260 kulturflasker på 175 cm<2 >benyttet og 5 til 13 liter kultursupernatanten ble gjenvunnet. Det serumfrie mediet ble preparert ved tilsetting av IMDM med 5 [ig/ml insulin (fremstilt av Sigma), 5 [ig/ml transferrin (fremstilt av Sigma), 10 [im monoetanolamin (fremstilt av Wako Pure Chemical Industries), 25 nM natriumselenit (fremstilt av Sigma) og 200 |ig/ml BSA (et syrefritt høyrent bovint albumin, fremstilt av Nichirei).

(Eksempel 36)

Rensing av humant full- lengde TPO ( avledet fra ekspresjonsplasmid pHTPl. Pl klon) uttrykt i COS 1 celler og dets biologiske aktivitet

Nedenfor beskrives eksempler på aktiviteten og rensingen av humant full-lengde TPO (avledet fra ekspresjonsplasmid pHTPl) uttrykt i COS 1 celler. Et delvis renset produkt ble først fremstilt for å undersøke den blodplate økende aktiviteten og så ble rensingen utført for å oppnå et høy rent produkt. M- 07e analysesystemet ble hovedsakelig benyttet for målingen av TPO aktivitet i de følgende fremstillingstrinn. TPO aktivitet ble likeledes funnet i rotte CFU-MK analysesystemet. Ved utførelse av disse analysene ble humant serumalbumin (HSA) tilsatt til hver prøve til den endelige konsentrasjonen på 0.02 til 0.05%.

Først ble COS 1 celler transfektert med plasmidet pHTPl ifølge fremgangsmåten til Ohashi og Sudo (Hideya Ohashi and Tadashi Sudo, Biosci. Biotech. Biochem., 58 (4),

758-759,1994) ble dyrket i 5 dager ved 37°C i 5% CO2 ved anvendelse av et serumfritt IMDM kulturmedium inneholdende 0.2 g BSA, 5 mg bovint seruminsulin, 5 mg humant transferrin, 0.02 mM monoetanolamin og 25 nM natriumselenit, i et 1000 ml, for derved å oppnå omkring 7 liter serumfri kultursupernatant. Til den serumfrie kultursupernatanten ble det tilsatt proteolytiske enzymhemmere p-APMSF og Pefabloc SC (4-(2aminoetyl)-benzensulfonylfluoridhydroklorid, fremstilt av Merk, katalognr. 24839) til en endelig konsentrasjon på omkring 1 mM, fulgt ved filtrering ved anvendelse av et 0.2 (xm filter for å gjenvinne supernatanten. Dette ble konsentrert med en faktor på omkring 10 ved bruk av en ultrafiltreringsenhet (Omega Ultrasette, nominell molekylvekt cutoff er 8.000, fremstilt av Filtron; eller PLGC Pellicon Cassette, norninell molekylvekt cutoff er 10.000, fremstilt av Millipore), 723 ml av det således konsentrerte (proteinkonsentrasjon, 3.38 mg/ml; total protein, 2.445 mg; relativ aktivitet 43.000; og en total aktivitet på 105.100.000), ble blandet med 1.6 mol pr 1000 ml ammoniumsulfat (totalt 288g) for å oppnå 804 ml av oppløsningen inneholdende 1.5 M endelig konsentrasjon ammoniumsulfat og så ble den således fremstilte oppløsningen satt ved en strømningshastighet på 10 ml/min. på en Macro-Prep Methyl HIC kolonne (5 cm i diameter og 9 cm høyde, fremstilt av Bio-Rad, katalognr. 156-0080) som hadde blitt ekvilibrert på forhånd med 20 mM natriumcitratbuffer (pH 5.2) inneholdende 1.5 M ammoniumsulfat. Etter påsetting av prøven, ble eluering utført med en 20 mM natriumcitratbuffer (pH 5.2) inneholdende 1.25 M natriumsulfat for å oppnå direkte gjennomgående fraksjon Fl (2.384 ml; protein konsentrasjon, 0.864 mg/ml; total protein, 2.061 mg; og relativ aktivitet, 6.000).

Deretter ble elueringsoppløsningen forandret til 20 mM Na citrat, pH 5.8, for å oppsamle fraksjon F2 (1.092 ml; proteinkonsentrasjon, 0.766 mg/ml; total protein, 847 mg; og relativ aktivitet 150.000).

Den således oppnådde Macro-Prep Methyl HIC kolonnefraksjonen F2 (1.081 ml) ble satt på en strømningshastighet på 10 ml/minutt på en SP Sepharose Fast Flow kolonne (3 cm diameter og 10 cm lengde, fremstilt av Pharmacia Biotech, katalog nr. 17-0729-01) som hadde blitt ekvilibrert på forhånd med 20 mM natriumcitratbuffer (pH 5.8). Etter påsetting av prøven ble elueringen utført med 20 mM natriumcitratbuffer (pH 5.6) inneholdende 110 mM NaCl for å oppnå fraksjon Fl (2.266 ml, proteinkonsentrasjon 0.270 mg/ml; total protein 610 mg; og relativ aktivitet 30.000). Deretter ble eluer-ingsoppløsningen forandret til 20 mM natriumcitratbuffer (pH 5.4) inneholdende 400 mM NaCl for å oppsamle fraksjon F2 (856 ml; proteinkonsentrasjon, 0.189 mg/ml; total protein, 162 mg; og relativ aktivitet 300.000). Deretter ble elueringsoppløsningen forandret til 20 mM natriumcitratbuffer (pH 5.2) inneholdende 1000 mM NaCl for å oppsamle fraksjon F3 (370 ml; proteinkonsentrasjon 0.034 mg/ml; total protein 12.6 mg; og relativ aktivitet 150.000).

Hoved TPO aktiv fraksjon F2 (845 ml) fra SP Sepharose Fast Flow kolonnetrinnet ble blandet med omkring 10% i endelig konsentrasjon av 1-propanol og satt på en strømningshastighet på 3 ml/minutt på LA-WGA kolonne (2 cm diameter og 14 cm høyde) fremstilt av Honen, katalognr. WG-007) som hadde blitt ekvilibrert på forhånd med 20 mM natrumcitratbuffer (pH 5.4) inneholdende 400 mM NaCl. Etter påsetting av prøven ble eluering utført ved anvendelse av en blanding av 20 mM natriumcitratbuffer (pH 5.4) inneholdende 400 mM NaCl med 1- propanol (9:1) for å oppnå fraksjon Fl

(64.4 ml; protein konsentrasjon, 0.0178 mg/ml; total protein, 1.15 mg og relativ aktivitet 17.220). Deretter ble elueringsoppløsningen forandret til 20 mM natriumcitratbuffer (pH 6.1) inneholdende 0.4 M GlcNAc og 10% 1-propanol for å oppsamle eluerte fraksjon F2 (45 ml; proteinkonsentrasjon, 0.0104 mg/ml; total protein, 0.470 mg; og relativ aktivitet 675.000).

Hoved TPO aktiv fraksjon F2 (340 ml) fra LA-WGA kolonne operasjonen ble blandet med omkring 0.005% i endelig konsentrasjon av TFA og utsatt for YMC-Pack CN-AP (6 mm i diameter og 250 mm i høyde, fremstilt av YMC, (katalognr. AP-513) kolonnekromatografi. Det vil si ved bruk av 0.1% TFA som elueringsmiddel A og 1-propanol inneholdende 0.05% TFA som elueringsmiddel B, ble prøven satt på med en strømningshastighet på 0.6 ml/min. på EMC-Pack CN-AP kolonnen som hadde på forhånd blitt ekvilibrert med 15% B. Etter påsetting av prøven ble propanolkonsentrasjonen øket fra 15% B til 25% B og elueringen ble utført med med en lineær gradient fra 25% til 50% B i løpet av 65 minutter under oppsamling av eluatene i porsjoner på 1.5 ml (2.5 min.) porsjoner i polypropylenrør.

En 0.5 [il porsjon (1/3.000 fraksjon) av eluatet i hvert rør ble blandet med HSA konsentrert ved ultrafiltrering for åoppnå 0.25 ml av IMDM analysekulturoppløsning inneholdende 0.05% HSA for anvendelse i identifikasjon av TPO aktive fraksjoner ved analysen. Som resultatet, ble sterk TPO aktivitet, (relativ aktivitet på omkring 630.000 til 4.800.000) funnet i rørene nr. 24 til 30 (innen området 35.0 og 42.0% som propanolkonsentrasjon) som ble oppsamlet som TPO aktiv fraksjon FA (13.5 ml).

Fraksjonen FA oppnådd ved YMC-Pack CN-AP kolonnetrinnet ble utsatt for Capcell Pak Cl 300A (4.6 mm diameter og 150 mm høyde, fremstilt av Shiseido, katalog nr. CI TYPE:SG300A) kolonnekromatografi ved bruk av 0.1% TFA som elueringsmiddel A og 1-propanol inneholdende 0.05% TFA som elueringsmiddel B. En porsjon (8.9 ml) av fraksjon FA oppnådd ved YMC-Pack CN-AP kolonne operasjon ble blandet med 0.3 ml glycerol, konsentrert ved sentrifugeringsevaporasjon og så blandet med omkring 2.5 ml av 10% B, og den resulterende oppløsningen ble deretter satt på ved en strømnings-hastighet på 0,4 ml/min. på Capcell Pak Cl 300A kolonnen som hadde blitt ekvilibrert på forhånd med 20% B. Etter enkelpåsetting, ble elueringen utført først med 20% B i 5 minutter som en lineær gradient fra 20% B til 40% B i 50 minutter under oppsamling eluatene i 1 ml (2.5 minutter) porsjoner i polypropylenrør.

En 1 ni porsjon (1/1.000 fraksjon) av eluatet i hvert rør ble blandet med HSA konsentrert ultrafiltrering for å oppnå 0,25 ml IMDM analysekulturoppløsning inneholdende 0.05% HSA for anvendelse i identifikasjon av TPO aktive fraksjoner ved analysen. Som et resultat ble sterk TPO aktivitet (relativ aktivitet på omkring 3.000.000 til 22.500.000) funnet i rørene nr. 20 til 23 (innen området 28.5 og 32.5% som propanolkonsentrasjon) som ble oppsamlet som en høy aktivitetsfraksjon.

(Eksempel 37)

Molekylvekt måling av humant TPO uttrykt i COS 1 celler

Det ble antatt at molekylvekten fra human fullstendig full- lengde TPO (avledet fra ekspresjonsplasmidet pHTPl, Fl klon) uttrykt i COS 1 celler ville være større enn molekylvekten og kan antas fra størrelsen av peptidkjeden, på grunn av addisjonen av sukkerkjede. Som konsekvens, ble som et første trinn en delvis renset TPO fraksjon, fremstilt på følgende måte fra en kultursupernatant inneholdende det humane full-lengde TPO (avledet fra ekspresjonsplasmid pHTPl, Fl klon) uttrykt i COS 1 celler. Det vil si, ved anvendelse av elueringsmiddel A (0.1% trifluoreddiksyre (TFA)) og elueringsmiddel B (1-propanol inneholdende 0.05% TFA), ble en 0.3 ml porsjon av kultursupernatanten satt på YMC-Pack PROTEIN-RP (0.46 mm i diameter og 15 cm høyde, fremstilt av YMC, katalog nr. A-PRRP-33-46-25) kolonne som på forhånd hadde blitt ekvilibrert med 25% B, 25% B ble ledet gjennom kolonnen i 5 minutter med en strømningshastighet på 0,4 ml/min. og fraksjonering ble utført med lineær densitetsgradient fra 25% B til 50% B i løpet av 50 minutter. TPO aktivitet ble funnet i eluater i området fra 34.5% til 43.5% propanolkonsentrasjon og disse eluatene ble avdampet til tørrhet ved sentrifugeringsavdampning for å oppnå delvis renset prøve.

Deretter ble TPO aktiviteten undersøkt ved M-07e analysesystemet etter ekstraksjon av protein fra en gel av SDS-PAGE elektroforese utført under ikke reduserende betingelser som beskrevet i eksempel 1, eller molekylvekt ble målt basert på produksjonsbehandlet DPCHT. markører ved hjelp ay en western analyse som vil bli beskrevet senere i eksempel 45. Som et resultat, ble TPO aktivitet funnet i et bredt tilsynelatende molekylvekt område på omkring 69.000 til 94.000, for således å bekrefte variasjonen i molekylvekt. Tilsynelatende molekylvekt av TPO basert på reduksjonsbehandlet DPCJU markører etter dets N-glykosid bindingstype sukkerkjedekutting med N-glykanase (fremstilt av Genzyme, katalog nr. 1472-00) var således målt å være 36.000 til 40.000, noe som er større enn molekylvekten på omkring 3S.000 som er anslått fra størrelsen av peptidkjeden, noe som indikerer nærvær av også en O-glykosid bindingstype sukkerkjede.

På samme måte, ble tilsynelatende molekylvekt av den humane full-lengde TPO (avledet fra ekspresjonsplasmid pHTPl, Pl klon) uttrykt i COS 1 celler funnet å være 63.000 til 83.000.

(Eksempel 38)

Biologiske karakteristikker til human TPO

Effekter av human TPO på humane og rotte hematopoetiske celler ble undersøkt, hovedsakelig ved anvendelse av kultursupernatanter fra COS 1 celler transfektert med pHTFl.

I kolonianalysen ved anvendelse av CD34<+>DR<+> cellefraksjon fremstilt fra humant kordblod, stimulerte human TPO dannelsen av signifikant antall megakaryocytkolonier. For eksempel, ble 11.5 megakaryocytkolonier dannet av 6000 CD34<+>DR<+> celler i nærvær av 10% (v/v) kultursupernatant fra COS 1 celler transfektert med pHTl-231. For å undersøke effekten av human TPO på humane megakaryocytstamceller i perifert blod, CD34<+> celler ble fremstilt fra humant perifert blod som følger. En leukocyt-fraksjon oppnådd fra humant perifert blod ved en Ficoll-Paque densitetsgradient ble tømt for celler som hang fast til plastskåler. De ikke-vedhengende cellene ble deretter tømt for SB A (soyabønne agglutinin) positive celler ved panorering ved bruk av AIS Microselecter SBA (Asahi Medical). De resulterende cellene ble inkubert på AIS Microselecter CD34 og de adsorberte cellene, CD 34<+> celler, ble samlet når CD3<+ >cellene var dyrket i 10 dager i nærvær av kultursupernatant fra transfekterte COS 1 celler i et flytende medium, selektiv proliferasjon av stor størrelse Gpnb/DIa<+> celler ble observert og økning i ploidy ble funnet i disse GpIlb/IIIa<+> cellene. Disse resultatene antyder sterkt at human TPO utøver sin selektive virkning på humane megakaryocyt-linjer og stimulerer deres proliferasjon og differensiering.

I kolonianalysen anvendelse av GpIIb/IIIa<+> celler høyt anriket for CFU-MK fra rotte benmargsceller og plastiske ikke vedheftende celler oppnådd i de foregående trinn fra GpIIb/IIIa+ celler, indusert i human TPO dannelsen av et signifikant antall megakaryocytkolonier. For eksempel, ble 34,5 megakaryocytkolonier dannet av 1000 Gplm/nia<+ >celler og 28.5 megakaryotcytkolonier ble dannet fra 20.000 plastiske ikke-vedheftende celler i nærvær av 20% (v/v) kultursupernatant fra transfekterte COS 1 celler. I tillegg, mellom den plastiske ikke-vedheftende cellefraksjonen inneholder forskjellige hematopoetiske stamceller forskjellige fra CFU- MK, ble kun megakaryocytkolonier dannet i nærvær av human TPO, noe som sterkt antyder at human TPO utviser dets selektive virkning på stamceller av megakaryocytlinjen. Når GpIIb/nia<+> cellene oppnådd fra rotte benmarg ble dyrket i 3 til 5 dager i nærvær av 20% (v/v) kultursupernatant fra transfekterte COS 1 celler i en væskekultur, ble økningen i ploidy observert klart 5 dyrkningsdag.

(Eksmpel 39)

Konstruksjon av vektor for anvendelse i ekspresjonen av et fusjonsprotein ( heretter referert til som " GST- TPOQ- 174)") av glutation- S- transferase ( GST) og human TPO ( aminosyrerester 1 til 174) i E. coli

For å muliggjøre ekspresjon av human TPO i E. coli, ble et kunstig gen som kodet for human TPO og inneholder et E. coli preferansekodon, fremstilt. Nukleotidsekvensen til dette DNA inneholder et amino-terminalt methionin kodon (ATG) ved -1 posisjonen for anvendelse i translasjonsinitiering i E. coli.

Syntetiske oligonukleotider 1 til 12:

ble fremstilt ved hver av de syntetiske oligonukleotidene 2 til 11 ble fosforylert med T4 kinase (fremstilt av Pharmacia) i en oppløsning sammensetning av 1 mM ATP, 10 mM Tris-acetat, 10 mM Mg-acetat og 50 mM K-acetat. For å få disse syntetiske oligonukleotidene til 6 dobbeltstrengede DNA fragmenter, ble disse syntetiske oligonukleotidene til kombinasjoner av 1 og 2,3 og 4,4, 5 og 6, 7 og 8,9 og 10 og 11 og 12, hver kombinasjon ble utsatt for anellering i en oppløsning sammensatt av 10 mM Tris/HCl (pH 7.5), 10 mM MgCl2 og 50 mM NaCl. Deretter ble 3 dobbeltstrengede DNA fragmenter fra 1 og 2,3 og 4,5 og 6 og de andre 3 dobbeltstrengede DNA fragmentene fra 7 og 8,9 og 10 og 11 og 12, henholdsvis behandlet med T4 ligase (fremstilt av Life Technology), og disse to reaksjonsoppløsningene ble igjen behandlet med T4 ligase på samme måte. DNA fragmentet oppnådd ved ligeringsreaksjonen ble kuttet med BamHI (fremstilt av Boehringer- Mannheim) utsatt for 2% agarosegel elektroforese for ågjenvinne et fragment på omkring 390 til 400 bp deretter ble renset ved bruk av Prep-A-Gene DNA rensesett og subklonet inn i pUC18 som hadde på forhånd blitt kuttet med Xbal og BamHI (E. coli DH50 ble benyttet som vert). Fra de således oppnådde klonene, ble de utvalgte klonene med det kunstige genet som koder for human TPO og inneholder de følgende E. coli preferansekodon, utvalgt ved nukleotidsekvensanalyse og gitt navn pUC18(XB)(l-123). DNA sekvensen av den kodende kjeden er vist i sekverislisteri (SEQ ID NO: 9).

Enkelt-strenget cDNA ble syntetisert fra 1 ng av human normal lever avledet poly(A)<+ >RNA ved anvendelse av oligo dT primer og PCR ble utført ved anvendelse av 0.1 volum av cDNA syntesereaksjonsoppløsningen som et templat. PCR reaksjon (inkubering ved 96°C i 2 minutter, repetisjon av totalt 30 reaksjonssykluser, hver syklus bestående av inkubering ved 95°C i 1 minutt, ved 58°C i 1 minutt og 72°C i 1 minutt og endelig inkubering ved 72°C i 7 minutter) ble utført med et volum av 100 ni ved anvendelse av hTPO-C og hTPO-Z(EcoRl) som primere. Human TPO cNDA fragment oppnådd på denne måten ble kuttet med BamHI og EcoRI og utsatt for 2% agarosegel elektroforese for å gjenvinne et fragment på omkring 600 bp størrelse som deretter ble renset ved bruk av Prep-A-Gene DNA Purification Kit og subklonet inn i pUC18 som hadde blitt kuttet på forhånd med EcoRI og BamHI (E. coli DH56 ble benyttet som vert). Et klon som kodet for korrekt human TPO nukleotidsekvens, ble valgt ved nukleotidsekvensanalyse og gitt navnte pUC18(BE)(124-332). Oligonukleotidsekvensen til de benyttede primerene i PCR reaksjonen var som følger:

hTPO-C: 5--GGA GGA GAC CAA GGC ACA GGA-3'

(SEQ ID NO: 95) (posisjoner 329 til 349 pHTFl klon); og hTPO-Z(EcoRI): 5'-CCG GAA TTC TTA CCC TTC CTG AGA CAG ATT- 3' (SEQ ID NO: 96) (fremstilt ved

addisjon av EcoRI gjenkjenningssekvens til en antisensprimer tilsvarende til posisjonene 1.143 til 1.163 i pHTFl klonen).

Klon pUC18(BE)(124-332) ble kuttet med BamHI og EcoRI og utsatt for 2% agarosegel elektroforese for å gjenvinne en human TPO cDNA C-terminal sidefragment på omkring 600 bp i størrelse som deretter ble renset ved bruk av Prep-A-Gene DNA Purification Kit og subklonet inn i pUC18(XB)(l-123) som hadde blitt kuttet på forhånd med EcoRI og BamHI (E. coli DH50 ble benyttet som vert). En klon oppnådd på denne måten ble gitt navnet pUC18(XE)(1-332).

Ved narvær av human TPO aktivitet i det humane TPO peptidfragmentet av aminosyrene i 1 til 163 posisjon hadde blitt bekreftet med et eksempel i hvilket forskjellige C-terminale delesjonskonstrukter av human TPO cDNA ble fremstilt og uttrykt for å måle in vivo human TPO aktivitet, ble en ekspresjonsvektor inneholdende dette peptidfragmentet konstruert. I dette tilfellet, ble ekspresjon av DNA sekvensen som kodet for GST-TPO(l-174) utført.

Da en nukleotidsekvens tilsvarende til posisjonen 681 til 686 (aminosyrerestene i posisjon 173 og 174) av pHTFl klonen ble gjenkjent ved restriksjonsenzym SacL ble to terminale kodon introdusert ved anvendelse av to syntetiske oligonukleotider ved anvendelse av gjenkjenningssetet til dette restriksjonsenzymet. Det vil si, to syntetiske oligonukleotider SSE1 og SSE2 ble anellert i en oppløsning sammensatt av 10 mM Tris/HCl (pH 7.5), 10 mM MgCl2 og 50 mM NaCl og anvendelse av DNA Ligation Kit (fremstilt av Takara Shuzo), ble det således oppnådde dobbelt-strengede DNA fragmentet introdusert inn i pUC18(XE)(l-332) fra hvilket det humane TPO cDNA C-terminale fragment på omkring 480 bp hadde blitt fjernet ved dets kutting med SacI og EcoRI, for derved å oppnå en klon pUC19(XS)(l-174) (E. coli DH50 ble benyttet som vert). Sekvensen til det syntetiske oligonukleotidet benyttet her er som følger:

Klon pUC18(XS)(l-174) oppnådd ovenfor ble kuttet med Xbal og EcoRI og utsatt for 2% agarosegel elektroforese for ågjenvinne et fragment på omkring 600 bp størrelse som koder for aminosyrerester 1 til 174 av human TPO og dette fragmentet ble deretter renset ved bruk av Prep-A-Gene DNA Purification Kit og subklonet inn i Bluescript IISK<+> (fremstilt av Stratagene) som hadde blitt kuttet på forhånd med Xbal og EcoRI (E. coli DH50 ble benyttet som vert). En klon oppnådd på denne måten ble gitt navnetpBL(XS)(l-174). På samme måte ble klonen pBL(XS)(l-174) kuttet med Xbal og HindJJI for å gjenvinne et fragment på omkring 550 bp i størrelse som koder for aminosyreresten 1 til 174 av humant TPO og fragmentet ble deretter renset ved bruk av Prep-A-Gene DNA Purification Kit og subklonet inn i pCFM536 (EP-A-136490) som på forhånd var blitt kuttet med Xbal og HindUI (E. coli DHSO ble benyttet som vert). En klon oppnådd på denne måten ble gitt navnet pCFM536/hT(l-174).

De følgende eksperimenter ble utført for å effektuere ekspresjonen av GST-TPO(l-174) ved anvendelse av pGEX-2T (fremstilt av Pharmacia) som er en ekspresjonsvektor for glutation-S-transferase (GST) fusjonsprotein. PCR reaksjon (inkubering ved 96°C i 2 minutter, repetisjon av totalt 22 reaksjonssykluser, hver syklus omfattende inkubering ved 95 °C i 1 minutt, ved 41°C i 1 minutt og 72°C i 1 minutt og endelig inkubering ved 72°C i 7 minutter) ble utført ved anvendelse av pCFM536/hT(l-174) som et templat og to PCR primere GEZ1 og GEX3. Human TPO kodende fragmentet oppnådd på denne måten ble kuttet med Nael og EcoRI og utsatt for 2% agarosegel elektroforese for å gjenvinne et fragment på omkring 550 bp størrelse, fragmentet ble deretter renset ved bruk av Prep-A- Gene DNA Purification Kit og klonet inn i pGEX-2T som hadde blitt kuttet på forhånd med EcoRI og Smal (E. coli DH5 ble benyttet som vert) og så ble en klon, kalt pGEX-2T/hT(l-174), som koder for korrekt human TPO nukleotidsekvens, valgt ved nukleotidsekvensanalyse for fremstilling av transformant for anvendelse i ekspresjonen av GST-TPO(l-174). Oligonukleotidsekvens av primerene benyttet i PCR reaksjonen er som følger: GEX1:5'-ATC GCC GGC TCC GCC AGC TTG TGA C-3' (SEQ ID NO: 101) (fremstilt ved tilsetning av Nael gjenkjenningssekvens av sekvensen i posisjon 21 til 39 i SEQ ID NO: 10); og

GEX3: 5'-GCC GAA TTC TCA TTA GAG CTC GTT CAG TGT-3'

(SEQ ID NO: 102) (en antisensprimer tilsvarende til sekvensen i posisjon 523 til 549 i SEQ ID NO: 10).

Dette ekspresjonsplasmidet inneholder en DNA sekvens som koder GST proteinet fulgt av et trombin gjenkjenningspeptid og en human TPO (aminosyrerest 1 til 174). DNA sekvensen som koder for trombin gjenkjenningspeptidet og human TPO (aminosyrerest 1 til 174) er vist i sekvenslisten (SEQ ID NO: 10).

(Eksempel 40)

Ekspresjon av GST- TPOfl- 174') i E. coli

Transformanten fremstilt i eksempel 39 ble dyrket over natten ved 37°C i en rister ved bruk av 60 ml LB medium inneholdende 50 ug/ml ampicillin og 25 ml porsjon av den resulterende kultursuppen ble tilsatt til 1000 ml LB medium inneholdende 50 ug/ml ampicillin og dyrket ved 37°C på risteren inntil OD ved A( pQ nådde 0.7 til 0.8. Deretter ble IPTG tilsatt til kultursuppen til den endelige konsentrasjonen på 0.1 mM og kultur-ristingen ble fortsatt i ytterligere 3 timer for åindusere ekspresjonen av GST-TPO(l-174).

(Eksempel 41)

Rensing av GST- TPO( l- 174) uttrykt i E. coli og bekreftelse av dets biologiske aktivitet En 5.9 g porsjon av frosne celler av rekombinante stammer som produserer GST-TPO(l-174) avledet fra human TPO nukleotidsekvens-kodende klin pGEX-2T/hT(l-174) ble suspendert i 10 ml vann og ødelagt ved anvendelse av en høytrykksdisinte-grator. Ved å utsette suspensjonen for sentrifugering ble GST-TPO(l-174) gjenvunnet i den presipiterte fraksjonen og det meste av de kontaminerte proteinene, cellekomponentene og lignende ble fjernet. Deretter ble den således fremstilte utfelte fraksjon inneholdende GST-TPO(l-174), suspendert i 5 ml vann til hvilken det deretter ble tilsatt, under omrøring, 6 ml 1 M tris buffer (pH 8.5), 120 ml 10 M urea og 16 ml vann. Etter 5 minutters omrøring for å oppløse innholdet ble den resulterende oppløsningen likt delt i fire porsjoner for å utføre de følgende trinn (1) til (4).

(1) En av de oppdelte prøvene ble fortynnet med en faktor på 10 med 20 mM Tris buffer med en pH-verdi på 8.5. Til denne ble det tilsatt redusert type glutation og oksidert type glutation til respektive endelige konsentrasjoner på 5 mM og 0.5 mM, fulgt av inkubering over natt ved 4°C. Den således fremstilte blandingen ble utsatt for sentrifugering for ågjenvinne GST-TPO(l-174) som supernatantfluidet som deretter ble fortynnet med en faktor på to med 20 mM natriumcitratbuffer med en pH verdi på 5.5 og så justert til pH 5.5 med eddiksyre. GST-TPO(l-174) i oppløsningen ble satt på SP Sepharose Fast Flow (fremstilt av Pharmacia Biotech, katalognr. 17-0729-01) kationbytte kolonne som hadde blitt ekvilibrert på forhånd med 20 mM natriumcitratbuffer, pH 5.5. Etter vasking av kolonnen ved 20 mM natriumcitratbuffer, pH 5.5, ble eluering av GST-TPO(l-174) utført ved bruk av 20 mM natriumcitratbuffer, pH 5.5, inneholdende 50 mM natriumklorid. En 129 ml porsjon av eluatet ble blandet med 2.6 ml 1 M tris buffer, pH 8.5, og den resulterende blandingen ble en pH på 8.1 ble satt på glutation sepharose 4B (fremstilt av Pharmacia Biotech, katalog nr. 17-0756-01) kolonne for åadsorbere GST-TPO(l-174). Etter vasking av kolonnen med PBS, ble eluering av GST-TPO(l-174) utført ved anvendelse av 20 mM tris buffer, pH 8.5, inneholdende 10 mM av redusert type glutation. Resulterende eluat ble blandet med 37 NTH enheter trombin, satt i 4 timer ved romtemperatur, fortynnet med PBS med en faktor på 10 og satt på glutationse-pharose 4B kolonne for å adsorbere kuttet GST og gjenvinne TPO(l-174) i den ikke-adsorberte fraksjonen. Den således gjenvundne ikke adsorberte fraksjonen ble fortynnet med en faktor på 3 med 20 mM natriumcitratbuffer, pH 5,5, påsatt på SP Sepharose fast Flow kationbyttekolonne som hadde blitt ekvilibrert på forhånd med den samme buffer og den aktuelle forbindelsen ble eluert med en lineær densitetsgradient på 0 til 500 mM natriumklorid oppløst i den samme buffer.

(2) Alle operasjonene i trinn (1) ble utført i nærvær av 0,1% polysorbat 80.

(3) En av de oppdelte prøvene ble fortynnet med en faktor på 10 med 20 mM tris buffer med en pH på 8.5. Til denne ble det tilsatt redusert type glutation oksidert type glutation til den respektive endelige konsentrasjonen på 5 mM og 0.5 mM fulgt av henstand over natt ved 4°C. Den således fremstilte blandingen ble utsatt for sentrifugering for å gjenvinne GST- TPO(l-174) som supernatantfluid som deretter ble fortynnet med en faktor på 2 med 20 mM natriumcitratbuffer med en pH verdi på 5.5 og jusert til pH 5.5 med

eddiksyre. GST-TPO(l-174) i oppløsningen ble satt på SP Sepharose Fast Flow kation-bytteharpiks som hadde på forhånd blitt ekvilibrert med 20 mM natriumcitratbuffer, pH 5.5. Etter vasking av harpiksen med 20 mM natrumcitrat buffer, pH 5.5, ble eluering av GSTTPO(l-174) utført ved anvendelse av 20 mM natriumcitratbuffer, pH 5.5, inneholdende 500 mM natriumklorid. Eluatet ble justert til pH 8 med 1 M tris buffer, pH 8.5, blandet med 320 NTH enheter trombin for å fjerne GST polypeptidsekvens via spalting av trombin gjenkjenningspeptidlinker, satt i 4 timer ved romtemperatur, fortynnet med en faktor 5 med 20 mM natriumcitratbuffer, pH 5.5, og så satt på SP Sepharose Fast Flow kationbytte kolonne som hadde blitt ekvilibrert på forhand med den samme buffer og den aktuelle forbindelsen ble deretter eluert med en lineær densitetsgradient på 0 til 500 mM natriumklorid buffer oppløst i samme buffer.

(4) Alle operasjonene i trinn (3) ble utført i nærvær av 0.1% polysorbat 80.

Hver av fraksjonene eluert ved natriumklorid densiteter på omkring 200 til 400 mM ved SP Sepharose Fast Flow kationbyttekolonne kromatografi ble grundig dialysert med IMDM kulturmedium og så evaluert ved rotte CFU-MK analyse systemet. Fraksjonene ble så analysert med SDS-PAGE i nærvær av et reduksjonsmiddel, et bånd tilsvarende en molekylvekt på 19 kd ble detektert (renhet 1 til 20%) som en hovedpeptidbåndene til fraksjonen. Når N-terminal sekvensanalyse av dette båndet ble utført ved å utsette den for SDS-PAGE og PVDF membran overføring ifølge prosedyren beskrevet i eksempel 1, ble det bekreftet at dette båndet inneholdt en TPO sekvens for uttrykking som det pGEX-2T/hT(l-174)-avledede fusjonsproteinet. Den avledede aminosyresekvens til det resulterende TPO var [GlyljTPO gitt sekvensen til trombingjenkjenningspeptid-linkeren og den kjente aktiviteten til trombin på linkeren.

(Eksempel 42)

Konstruksjon av en vektor for anvendelse i E. coli ekspresjon av human TPO ( aminosyrerester 1 til 163) med substitusjon i posisjon 1 ( Ser - > Ala) og posisjon 3 ( Ala

- >Val)

Klon pUC18(XE)(l-332) fremstilt i eksempel 39 ble kuttet med Xbal og EcoRI og utsatt for 2% agarosegelelektroforese for ågjenvinne et fragment på omkring 1000 bp størrelse som koder for aminosyrerester 1 til 332 av humant TPO og fragmentet ble deretter renset ved bruk av Prep-A-Gene DNA Purification Kit og subklonet inn i pBluescript IJSK+ (fremstilt av Stratagene) som hadde blitt kuttet på forhånd med Xbal og EcoRI (E. coli DH5a ble benyttet som vert). En klon oppnådd på denne måten ble navngitt pBL(XE)(l-332). Deretter ble en region av klonen pBL(XE)(l-332) fra dets BamHI gjenkjenningssekvens til posisjon 163 aminosyre (posisjon 366 til 489) forandret til E. coli dominante kodon. Syntetiske oligonukleotider 13 til 20 vist nedenfor ble fremstilt og hvert par av de syntetiske oligonukleotidene 13 og 14,15 og 16 og 17 og 18 ble

fosforylert i det samme rør inneholdende en oppløsning sammensatt av 0,1 mM ATP, 10 i mM tris-acetat, 10 mM Mg-acetat og 50 mM K-acetat. Etter ytterliggere addisjon av 1/10 volum av en oppløsning sammensatt av 100 mM Tris/HCl (pH 7.5), 100 mM MgCl2 og 500 mM NaCl ble den resulterende oppløsningen oppvarmet i et kokende vannbad i 3 minutter og så avkjølt til romtemperatur for å oppnå dobbeltstrenget DNA fragment. Deretter ble de således oppnådde 3 parene av dobbeltstrenget DNA fragment omfattende 13 og 14,15 og 16 og 17 og 18 ligert ved anvendelse av DNA Ligation Kit (fremstilt av Takara Shuzo) og PCR ble utført ved anvendelse av de således ligerte

produktene som templat og de syntetiske oligonukleotidene 19 og 20 som primere. Det således fremstilte PCR produktet ble så kuttet med BamHI og HindUI og utsatt for 2% agarosegel elektroforese for å gjenvinne et fragment på omkring 130 bp lengde ved anvendelse av Prep-A- Gene DNA Purification Kit. Dette ble subklonet inn i pBL(XE)(l-332) som hadde blitt kuttet på forhånd med BamHI og Hindm (E. coli DH5 ble benyttet som vert). En klon med de følgende nukleotidsekvensene ble utvalgt fra de således oppnådde klonene med sekvensanalyse og navngitt pBL(XH)(l-163):

Ved formål å øke ekspresjonsmengden av human TPO (posisjon 1 til 163) og forventet hydrolyse av N-terminalen ved protease, en ekspresjonsvektor konstruert for anvendelse i ekspresjon av en mutat type human TPO (posisjoner 1 til 163) (heretter referert til som "h6T(l-163)") med substitusjoner ved posisjon 1 (Ser til Ala) og posisjon 3 (Ala til Val) av human TPO (posisjoner 1 til 163) [(Ala<1>, Val<3>]TPO(l-163)) og på samme tid, som koder for Lys ved -1 posisjonen og Met ved -2 posisjonen [(Met"<2>, Lys-<1>, Ala<1>, Val<3>]TPO(l-163)). Fire syntetiske oligonukleotider vist nedenfor blir fremstilt og syntetisk oligonukleotider 2-9 og 3-3 ble fosforylert med T4 kinase (fremstilt av Pharmacia) i en oppløsning sammensatt av 1 mM ATP, 10 mM Tris-acetat, 10 mM Mg-acetat og 50 mM K- acetat. For å gjøre disse syntetiske oligonukleotidene til dobbeltstrengede DNA fragmenter ble hvert par av enkelt- strenget DNA fragmenter 1-9 og 2-9 og 3-3 og 4-3 annelert i en oppløsning sammensatt av 10 mM tris/HCl (pH 7.5), 10 mM MgCl2 og 50 mM NaCl. Deretter ble de så oppnådde to parene av dobbelt-strengede DNA fragmenter omfattende 1-9 og 2-9 og 3-3 og 4-3 behandlet med DNA Ligation Kit (fremstilt av Takara Shuzo). Det således oppnådde DNA fragmentet ved ligeringsreaksjonen ble subklonet inn i pBL(XH)(l-163) som hadde blitt kuttet på forhånd med Xbal og Nrul og en klon korrekt substituert med det følgende syntetiske oligonukleotidet, ble utvalgt ved en sekvensanalyse (E. coli DH50 ble benyttet som vert) og gitt navnet pBL(XH)h6T(l-163):

Klon pBL(XH)(l-163) ble kuttet med Xbal og HindlH for ågjenvinne et fragment på omkring 500 bp størrelse som koder for aminosyrerester 1 til 163 av mutasjonstype human TPO og fragmentet ble deretter renset ved bruk av Prep-A-Gene DNA Purification Kit og klonet i pCFM536 (EP-A-I36490) som hadde blitt kuttet på forhånd med Xbal og HindUI (E. coli JM109 som hadde blitt transformert på forhånd med pMWl (ATCC nr. 39933) som ble benyttet som vert). En klon oppnådd på denne måten ble gitt navnet pCFM536/h6T(l-163) og en E. coli stamme med denne ekspresjonsvektoren ble benyttet som en transformant for anvendelse ved ekspresjonen av mutanttype human TPO, nemlig h6T(l-163). Dette ekspresjonsplasmidet inneholder DNA sekvensen vist i sekvenslistingen (SEQ ID NO: 11).

(Eksempel 43)

Ekspresjon av h6T( l- 163) i E. coli

Ekspresjon av ekspresjonsplasmidet pCFM536 er kontrollert av 'PL promoteren som i seg selv er under kontroll av cl857 repressorgen. Transformantene oppnådd i eksempel 42 ble dyrket over natt ved 30°C i en rest av anvendelse av 60 ml LB medium inneholdende 50 mg/ml ampicillin og 12.5 ug/ml tetracyklin og 25 ul porsjon av den resulterende kultursuppen ble tilsatt til 1000 ml LB medium inneholdende 5 ng/ml ampicillin og dyrket ved 37°C på risteren inntil OD ved AgQO oppnådde 1.0 til 1.2. Deretter ble omkring 330 ml LB medium oppvarmet til 65°C tilsatt til kultursuppen for å justere den endelige mediumtemperaturen til 42°C og ristingen av kulturen ble fortsatt i 3 timer ved 42°C for å indusere ekspresjonen av h6T(l-163).

(Eksempel 44)

Rensing av h6T( l- 163) uttrykt i E. coli og bekreftelse av dets biologiske aktivitet

En 3.6 porsjon av frosne celler av den h6T(l-163) produserende rekombinante stammen ble suspendert i 10 ml vann og splittet ved anvendelse av en høytrykkdisintegrator. Ved sentrifugering av suspensjonen ble den presipiterte fraksjonen gjenvunnet og det meste av kontaminerte proteiner, cellekomponenter og lignende ble fjernet. Den således gjenvundne presipiterte fraksjonen inneholdende h6T(l-163) ble suspendert i 7 ml vann og 3 ml 1 M tris buffer (pH 8.5) ble tilsatt til suspensjonen under omrøring, fulgt av ytterligere tilsetning av urea (endelig konsentrasjon, 8M), guanidin hydroklorid (endelig konsentrasjon 6M) og natrium N- lauroylsarcosinat (endelig konsentrasjon 2%). Etter 5 til 20 minutter omrøring ved romtemperatur for å oppløseliggjøre innholdet, ble den resulterende oppløsningen fortynnet 10 ganger med 20 mM tris buffer med en pH verdi på 8.5 og utsatt for protein tilbakefolding ved inkubering over natt ved 4°C. I dette tilfellet ble glutation og kobbersulft benyttet som additiver i tillegg til luftoksidering. Ved sentrifugering ble h6T-(l-163) gjenvunnet i supernatantfluidet. Når hver av de gjenvundne fraksjoner ble analysert ved SDS-PAGE i nærvær av reduksjonsmiddel, ble et bånd tilsvarende til en molekylvekt på 18 kd detektert (renhet, 30 til 40%) som hovedproteinbåndet i hver fraksjon. Når en terminal sekvensanalyse av dette båndet ble utført ved å utsette den for SDS-PAGE og PVDF membranoverføring ifølge prosedyren beskrevet i eksempel 1, ble det bekreftet at dette båndet inneholdt en TPO sekvens og ble uttrykt som pCMF536/h6T(l-163)-avledet mutasjonstype TPO. Når hver fraksjon ble grundig dialysert mot IMDM kulturmediet og evaluert med rotte CFU-MK analysesystem, ble TPO aktivitet funnet i alle fraksjonene på en doseavhengig måte.

EKSEMPEL 45

Fremstilling av anti-TPO peptidantistoff og deteksjon av TPO ved SDS-PAGE og westernanalyse

Vellykket preparering av anti-TPO peptid antistoff vil gjøre det mulig å detektere TPO protein ved immunologiske metoder. Treregioner som ser ut til å være relativt nyttige som antigener (se nedenfor) ble valgt fra de bekreftede TPO aminosyresekvensene, og et kvadruppel-trådet multippel antigenpeptid (MAP) type peptidble syntetisert i henhold til prosedyren til Tam (Proe. NatLAcad. Sei. USA, 85, 5409-5413,1988) ved anvendelse av hver av de selekterte regionene, og deretter ble hver av to kaniner immunisert 8 ganger med 100 ug hver av de på denne måten syntetiserte peptidene for å oppnå respektive antiserumprøver.

Aminosyresekvenser innbefattet i de syntetiserte peptidantigenene (a) Rotte TPO (9-28) (peptid RT1 region)

(R i posisjon 24 er opprinnelig S i aminosyreresidiene bestemtfra genet),

(b) Rotte TPO (46-66) (peptid RT2 region)

(c) Rotte TPO (163-180) (peptid RT4 region)

(LLD i posisjonene 178-180 er opprinnelig TSG i aminosyreresidiene bestemt utifrå genet). Deretter ble disse antiserumprøvene, anti-RTl peptid og anti-RT2peptid først utsatt for en protein A (PROSEP-A; fremstilt fra Bioprocessing Ltd, katalog nr 8427) kolonnekromatografi for ådanne IgG fraksjoner (henholdsvis 2,344 mg og 1,920 mg), og 54 mg og 32 mg deler av de respektive fraksjonene ble biotinylert ved deres kobling med aktiv type biotin (NHS-LC-Biotin II; fremstilt av PIERCE, katalog nr 21336). En rekombinant TPO inneholdende prøve ble utsatt for SDS-PAGE og deretter for elektroblotting på PVDF eller nitrocellulosemembran på samme måte som beskrevet i eksempel 1, og westernanalyse ble utført på vanlig måte ved anvendelse av disse biotinylerte antistoffene som førsteantistoffer.

Membranen etter blotting ble vasket med en oppløsning bestående av 20 mM Tris-HCl og 0,5 M NaCl (pH 7,5) (TBS) i 5 minutter og to ganger med 0,1 % Tween 20-inneholdende TBS (TTBS) i 5 minutter hver og deretter behandlet med et blokkeringsmiddel (BlockAce; fremstilt av Dainippon Pharmaceutical, katalog nr uk-B25) i 60 minutter. Deretter ble membranen behandlet i 60 minutter med TTBS oppløsning inneholdende 10 Mg/ml biotinylert anti-TPO peptidantistoff, 0,05 % BSA og 10 % BlockAce og deretter vasket med TTBS i 5 minutter hver. Deretter ble membranen behandlet i 30 minutter med en oppløsning fremstilt ved fortynning av alkaliskfosfatase-merket avidin (fremstilt av Leinco Technologies, katalognr Al 08) med en faktor på 5000 med TTBS oppløsning inneholdende 10 % BlockAce og vasket med to ganger med TTBS i 5 minutter og med TBS i 5 minutter og deretter ble farveutvikling oppnådd ved anvendelse av et alkalisk fosfatasesubstrat (fremstilt av Bio-Rad, katlog nr 170-6432). Westernanalysen beskrevet ovenfor ble utført ved romtemperatur.

Ut i fra resultatene var det mulig å gjenkjenne ikke bare forskjellige rekombinante rotte TPO proteiner uttrykt i COS 1 celler, men også forskjellige rekombinante humane TPO proteineruttrykt i COS 1 cellene og E.coli cellene (plasmid pHTPl - eller plasmid pHTFl-avledet human TPO uttrykt i COS 1 celler og N-glykosidisk bindingspaltet produkt derav, GST-TPO(l-174) uttrykt i E.coli og trombinspaltet produkt derav og h6T(l-163) som er en mutasjonstype TPO uttrykt i E.coli, som er blitt beskrevet i eksemplene). I tillegg har resultatene gjort det mulig å analysere disse forskjellige typene av rekombinant human TPO.

I tillegg til det ovennevnte ble muligheten for preparering avanti-humane TPO peptidantistoffer bekreftet. Antistoffene oppnådd ifølge disse teknikkene kan bli anvendt ikke bare for westernanalyser, men også for rensing av TPO ved antistoffkolonner og andre vanlige anvendte antistoff anvendende immunologiske metoder.

Seks regioner i den humane TPO aminosyresekvensen vist i SEQ IDNO: 7, som var ventet å ha relativt egnet antigenistet, ble valgt (se tabell 4). Tetrameriske multippel-antigenpeptid (MAP) typepeptider, som tilsvarer regionene, ble syntetisert. Hvert peptid ble immunisert i to kaniner, åtte ganger i en mengde på lOOmg/time.

Bortsett fra dette ble et monomerisk peptid hvor et cysteinresidie var blitt bundet til C-terminusen av hver peptidregion vist i tabell 4 også syntetisert. Dette peptidet ble deretter anvendt som et testantigen for å bestemme et antistofftiter ved anvendelse av enzymimmunoanalyse. Som et resultat av dette ble økningen av antistofftitere bekreftet for det ovenfor danne de sera slik at disse sera ble anvendt som antisera.

Antistoffene ble dannet ved immunisering av hvert antigene peptid i to kaniner for å produsere antisera rettet mot peptidet. De resulterende to anti-HTl peptidantistoffene blir referert til som anti-HTl-1 peptidantistoff og anti-HTl-2 peptidantistoff avhengig av de individuelle kaninene.

Et eksempel på rensing av anti-HTl-1 antistoffer vil bli illustrert nedenfor.

30 mg av et monomerisk peptid av HT1 hvor det var blitt bundet et cysteinresidie ble koblet til 12 ml Sulfo-Link koblingsgel (Pierce, Catalogue No. 44895). En peptid-oppløsning inneholdende antigenet ble koblet i 15 minutter til gelen ekvilibrert med en koblingsbuffer (50 mM Tris, 5 mM EDTA-Na pH 8,5) med 6 volum i forhold til gelvolumet. Etter inkubasjon i 30 minutter ble gelen deretter vasket med koblingsbuffere med 3 volum i forhold til gelvolumet. Koblingsbufferen inneholdende 0,05 M L-cystein-HC1 ble tilsatt til gelen i en mengde på 1 ml/ml gel for å blokkere ikke-reagerte radikaler

over 15 minutter. Etter inkubasjon i 30 minutter ble gelen vasket med koblingsbufferen med 8 volum i forhold til gelvolumet. Alle koblingsreaksjonene ble utført ved romtemperatur. Peptidet ble følgelig kovalentlig bundet til gelenved en koblingseffektivitet på 28,3 %, og deretter ble en antigenkolonne med 0,8 mg peptid/ml gel dannet. 76,7 ml (proteininnhold 3620 mg) av antiserumet inneholdende anti-HTl-1 peptidantistoff som var blitt blodtappet fra en av kaninene med en total mengde på 78,4 ml, ble applisert på antigenkolonnen pre-ekvilibrert med 50 mM fosfatbuffer (pH 8) inneholdende 150 mM NaCl og 0,05 % natriumazid, og deretter vasket med den samme bufferen for å<2>å tilveiebringe 105,9 ml av en gjennomstrømningsfraksjon (proteininnhold 3680 mg). Deretter ble den adsorberte fraksjonen eluert med 0,1 M sitratbuffer (pH 3,0) og øyeblikkelig nøytralisert med 21,1 ml 0,1 M karbonatbuffer (pH9,9), etterfulgt av konsentrering ved hjelp av ultrafiltrering (ved anvendelse av Amicon YM 30 membran) for å føre rensetanti-HTl-1 peptidantistoff i en oppløsning av 50 mM fosfatbuffer (pH 8) inneholdende 150 mM NaCl og 0,()5 % NaC13. Likeledes ble følgende antistoffer dannet: anti HT1-2 peptid antistoff (60,0 mg); anti-HT2-l peptidantistoff (18,8 mg); anti-HT2-2 peptidantistoff (8,2 mg); og lignende. Anti-HT3 til-HT6 peptidantistoffer kunne også bli dannet på en lignende måte. 3 mg affinitetrenset anti-HTl-1 peptidantistoff, anti-HTl-2peptidantistoff, anti-HT2-l peptidantistoff eller anti HT2-2- peptidantistoff ble biotinylert ved kobling til et aktivert biotin (Pierce, NHS-LC-Biotin II, Catalogue No. 21336).

Alle ovenfor angitte rensede antistoffene ble funnet å gjenkjenne og detektere human TPO ved westernblotting (på nitrocellulosefilter eller PVDF) eller SDS-PAGE av en rekombinanthuman TPO standard delvis renset fra kulrursuper-natanten til CHO celler hvor et gen kodende for aminosyrese-kvensen vist i tabell 4 var blitt introdusert og uttrykt.

Tabell 4

Humane TPA aminosyresekvenser innbefattet i tetramerisk MAP typesyntetisk peptidantigen

Human TPO (aminosyrenummerene 8-28) peptid HT1 region:

Human TPO (aminosyrenummerene 47-62) peptid HT2 region:

Human TPO (armnosyrenummerene 108-126) peptid HT3 region:

Human TPO (aminosyrenummerene 172-190) peptid HT4 region:

Human TPO (aminosyrenummerene 262-284) peptid HT5 region:

Human TPO (aminosyrenummerene 306-332) peptid HT6 region:

EKSEMPEL 46

Preparering av anti-TPO peptidantistoffkolonne

På grunn av at anti-rotte TPO peptidantistoffet oppnådd i eksempel 45 kunne gjenkjenne rotte og humane TOP molekyler ble immunoglobulin (IgG) fraksjoner av anti-RTl peptidantistoff og anti-RT2 peptidantistoff koblet til en kjemisk aktivert gelbærer på følgende måte for å danne anti-TPO peptidantistoffkolonner. Hver av de to antistoffene anvendt som materialer ble separat dannet fra sera til de to kaninene. Anti-RTl peptid-antistoffetpreparatet fra to kaniner ble henholdsvis betegnet anti-RTl-1 peptidantistoff og anti-RTl-2 peptidantistoff, og anti-RT2peptidantistoff preparert fra de andre to kaninene blehenholdsvis betegnet anti-RT2-l peptidanitstoff og anti-RT2-2peptidantistoff. På grunn av at disse antistoffene ble separat anvendt for antistoffkolonne preparering ble totalt 5 kolonner oppnådd, dvs to anti-RTl peptidantistoffkolonner (blir referert til som "anti-RTl-1 antistoffkolonne" og "anti-RTl-2 antistoffkolonne" nedenfor). To anti-RT2 peptidantistoffkolonner(blir nedenfor referert til som "anti-RT2-l antistoffkolonne" og"anti-RT2-2 antistoffkolonne" og en antistoffkolonne (anti-RTl-2+ 2-1 blandingsantistoffkolonne) som ble dannet ved blanding avanti-RTl-2 peptidantistoff med anti-RT2-l peptidanitstoff og kobling av blandingen med en gel.

Hvert antistoff ble løst opp i en oppløsning av 50 mM Na fosfat og 0,15 M NaCl (pH 8,0) til en sluttkonsentrasjon på 5 mg/ml (eller 2,5 mg/ml hver av blandet anti-RTl-2 peptidantistoff og anti-RT2-l peptidantistoff når det gjelder anti-RTl + 2 blandede antistoffkolonner), og en 2,3 ml del av den resulterende oppløsningen ble blandet med 1,54 ml i volum av en svellet formylaktivert gel (Formyl-Cellulofine, fremstilt av Chisso) og utsatt for 2 timers koblingsreaksjon ved 4 °C. Til dette ble dettilsatt 1,1 ml av en 10 mg/ml oppløsning av et reduksjonsmiddel (trimetylaminboran (TMAB); fremstilt av Seikagaku Kogyo, catalog No. 680246) etterfulgt av 6 timer med ytterligere koblingsreaksjon og påfølgende sentrifugering for å isolere geldelen. En 10 ml del av renset vann ble tilsatt til geldelensom ble isolert på ny ved sentrifugering, og ikke-reagerte antistoffmolekyler ble fjernet ved å gjenta dette trinnet fireganger. Deretter ble den resulterende gelen blandet med 4,6 ml av en blokkerings oppløsning (0,2 M Na fosfat og 1 M etanolamin, pH7,0) og 1,1 ml av reduksjonsmiddeloppløsningen og behandlet ved 4 °C i minst 2 timer for åutføre blokkering av aktive grupper av ureagert gel. Deretter ble gelen vasket med renset vann og DPBS ved anvendelse av en sentrifuge, pakket i et lite kolonnerør, vasket med en 3 M kaliumtiocyanatopp løsning og 1,0 , M glysin-HCl (pH 2,5) oppløsning, ekvilibrert med DPBS og deretter lagret. 15 anti-TPO peptidantistoffgeler av anti-RTl-1 antistoffkolonnen, anti-RTl-2 antistoffkolonnen, anti-RT2-l antistoffkolonnen, anti-RT2-2 antistoffkolonne og anti-RTl-2 + 2-1 blandingsantistoffkolonnen var'koblingseffekti vi teten tilrespektive IgG fraksjoner nådd. 97,4 %, 95,4 %, 98,4 %, 98,3 % og 99,4 %. I tillegg var mengder av IgG fraksjoner koblet pr gelvolum 5,6 mg/ml gel, 5,8 mg/ml gel, 5,7 mg/ml gel, 5,7 mg/ml gel og 2,9 mg/ml gel. På grunn av at det ble bekreftet at koblingseffektiviteten og koblings-mengden ikke signifikant varierer avhengig av opprinnelsen av antistoffet og forskjellen i antigenene ble eksperimentene vist i følgende eksempel 47 utført ved anvendelse av disse antistoffkolonnene.

EKSEMPEL 47

Rensing av TPO avledet fra kultursupernatant oppnådd ved transfektering av COS 1 celler med ekspresjonsvektor pHTPl, ved anvendelse av anti-TPO antistoffkolonne og deretter ved reversfasekolonnekromatografi og bekreftelse av dets biologiskeaktivitet M-07e analysesystemet ble anvendt som in vitro analyse for vurdering av følgende renseprøver. Delvis rensede prøver av TPO avledet fra kultursupernatanten oppnådd i eksempel 35 fra transfekterte COS 1 celler med ekspresjonsvektor pHTPl (fraksjoner forskjellig fra hoved TPO fraksjonen, dvs en gått igjennom fraksjon Fl og en fraksjon F3 eluert etter F2 ved vasking med 20 mM Na citrat, pH 5,8 Macro-Prep Methyl HIC kolonne og fraksjonene Fl og F3 til SP Sepharose Fast Flow kolonnen) ble kombinert for ådanne en TPO "subpool" fraksjon (5.463,79 ml; proteinkonsentrasjon 0,490 mg/ml; totalt protein 2.676 mg; relativ aktivitet, 12.000 og total aktivitet, 32.380.000) og konsentrert ved anvendelse av en ultrafiltreringsenhet (Omega Ultraset, nominell molekylvektsavspaltning på 8000, fremstilt av Filtron), oppløsningsmidlet til den konsentrerte fraksjonenble erstattet med DPBS og deretter ble prøven med et lite volumbehandlet med en YM 10 membranutstyrt ultrafiltreringsenhet (fremstilt av Amicon) for ågøre den til 120,2 ml en DPBS oppløsning inneholdende 0,05 % natriumazid. Deretter ble alle fem anti-TPO peptidantistoffgelene dannet i eksempel 46 blandet sammen og dannet til en enkelt antistoffkolonne (1,6 cm i diameter og 4,8 cm i sjikthøyde, referert til som anti-RTl + 2 blandingantistoffkolonne), og TPO "subpool" fraksjon ble applisert på kolonnen ved en strømningsrate på 0,033 ml/min. Etter endt prøvebelastning ble elueringen utført med DPBS for å oppsamle eluater helt til UV absorbsjonen ble tilstrekkelig liten, og de på denne måten oppsamlede eluatene ble konsentrert ved anvend-i elseav YM-10 membranutstyrt ultrafiltreringsenhet (fremstilt av Amicon) for å oppnå en gjennomløpende fraksjon Fl (82,62 ml; proteinkonsentrasjon, 14,3 mg/ml; total protein, I, 184 mg; relativ aktivitet, 67.500; og total aktivitet, 79.900.000). Deretter ble en kolonneadsorbert fraksjon F2 (92,97 ml;proteinkonsentrasjon, 0,12 mg/ml; total protein, II, 1 mg; relativaktivitet, 257.100; og total aktivtet, 2.860.000) eluert med en sur elueringsoppløsning (0,1 M glysin-HCl, pH 2,5). Til tross for at gjennomløpfraksjon Fl fortsatt inneholdt en TPO aktivitet ble antistoffkolonne adsorbert TPO ytterligere renset på grunn av at den viste omtrent 20 ganger økning i relativ aktivitet. Ved anvendelse av 0,1 % TFA som et utviklingsoppløsningsmiddel A og 1-propanol inneholdende 0,05 %

TFA som et utviklingsoppløsningsmiddel B, Capcell Pak Cl 300A (fremstilt av

i Shiseido, katalog No. Cl TYPE:SG300A; 4,6 mm 8 diameter og 150 mm i sjikthøyde,

koblet til en prekolonne med 4,6 mm i diameter og 75 mm i sjikthøyde) ble kolonnekromatografi utført ved blanding av fraksjon F2 oppnådd fra antistoffkolonnen med 1/10 volum av utviklingsoppløsningsmiddel B og applisering av blandingen ved en strøm-ningsrate på 0,4 ml/min på Capcell Pak Cl 300A kolonne som er blitt ekvilibrert på forhånd med 20 % B. Etter fullført prøvebelasting ble elueringen utført i 5 minutter med 20 % B og deretter i 50 minutter med en lineær tetthetsgradient på fra 20 % B til 40 % B, og eluatene ble samlet i polypropylenrør i 1 ml (2,5 min) porsjoner.

En 2 ul porsjon (1/500 fraksjon) av eluatet i hvert rør ble blandet med HSA og konsen-

i trert ved ultrafiltrering for å oppå 0,25 ml IMDM analysekulturoppløsning inneholdende 0,02 % HSA for anvendelse ved identifikasjon av TPO aktive fraksjoner ifølge analysen. Som resultat ble sterk TPO aktivitet funnet i prøver i rør med nummere 20 til 23 (innenfor området 28,5 og 32,5 % som propanolkonsentrasjon). I tillegg når disse prøvene ble utsatt for westernanalyser i henhold til prosedyren beskrevet i eksempel 45 ble tilstedeværelse av TPO bekreftet med tilsynelatende molekylvekt på 60.000 til 70.000 målt under en redusert tilstand basert på TPC Ul molekylvektmarkører, og også tilstedeværelse av andre molekyler med henholdsvis molekylvekter på 32.000 til 43.000 og 20.000 til 30.000.

EKSEMPEL 48

Bekreftelse på biologisk aktivitet til TPA avledet fra kultursupernatant oppnådd ved transfektering av COS 1 celler med ekspresjonsvektor pHTPl og renset frem til trinnet Capcell Pak C1300A kolonne

TPO aktive fraksjoner renset i eksempel 36, dvs rømummrene 20 til 23 (innenfor området 28,5 og 32,5 % som propanolkonsentrasjon) av Capcell Pak Cl 300A kolonne, ble slått sammen, blandet med 0,21 ml glyserol og deretter konsentrert ved sentrifugeringsavdampning. Dette ble blandet med 0,21 ml 6 M guanidinhydrokloridopp-løsning, fortynnet til et volum på 1 ml med DPBS, bufferskift med DPBS oppløsning inneholdende 0,01 % HSA ved Sephadex G25 kolonne (NAP-10, fremstilt av Pharmacia Biotech, katalognr 17-0854-01) og deretter blandet med 1,1 ml DPBS oppløsning inneholdende 0,01 % HSA, for derved å til slutt oppnå en TPO aktiv fraksjon FA (2,6 ml). For å undersøke den biologiske TPO aktiviteten til denne prøven ble in vivo analyse utført. Den aktive fraksjonen ble subkutant administrert til ICR hannmus (8 uker gamle) idet hver gruppe inkluderte 4 dyr, daglig i 5 dager i en dose på 100 fal (med en total aktivitet på 110.000 målt av M-07e analysesystemet) pr dyr. Som en kontroll ble 100 fil DPBS inneholdende 0,01 % HSA subkutant administrert på samme måte. Like før administreringen og på neste dag av endelig administrering, ble blod samlet fra øyehulen for å måle blodplatetallene ved anvendelse av en mikrocellteller (F800, fremstilt av Toa Iyo Denshi). I TPO behandlet gruppe økte platetallet med en faktor på omtrent 1,42 i gjennomsnitt etter fullført administrering sammenlignet med verdien for administrering og var 1,23 ganger høyere enn tilfellet var for kontrollgruppen med en signifikant forskjell (p <0,05 Student t-test) mellom dem. På grunnlag av disse resultatene ble det bekreftet at ovennevnte human TPO produsert av pattedyrcellene har evnen til å øke blodplatetallet in vivo.

EKSEMPEL 49

Bekreftelse av biologisk aktivitet til rå TPO fraksjon avledet fra 33 liter kultursupernatant oppnådd av transfekterte COS 1 celler med ekspresjonsvektor pHTPl og delvis renset ved kationbyttekolonne

(1) M-07e analysesystem ble anvendt som in vitro analyse for vurdering av følgende rensningsprøver. På samme måte som beskrevet i eksempel 36 ble totalt 33 liter serumfri kultursupernatant oppnådd ved transfektering av COS 1 celler med ekspresjonsvektor pHTPl og filtrert gjennom et 0,22 um filter for å isolere supernatanten. Dette ble konsentrert med en faktor på omtrent 10 med en ultrafiltreringsenhet (PLGC Pellicon Cassette, nominell molekylvektavspaltning på 10.000, fremstilt av Millipore) og blandet med omtrent 1 mM i sluttkonsentrasjon av en proteaseinhibitor p-APMSF for å oppnå en prøve på 2,018 ml i volum (proteinkonsentrasjon, 3,22 mg/ml; totalprotein, 6,502 mg; relativ aktivitet, 66.000; total aktivitet, 429.100.000). Deretter ble dette

konsentrert gjentatte ganger ved anvendelse av en ultrafiltreringsenhet (Omega Ultraset, nominell molekylvektavspaltning på 30.000; fremstilt av Filtron), for derved å oppnå en fraksjon på 30.000 eller mer i molekylvekt (volum, 1.190 ml; proteinkonsentasjon, 2,54 mg/ml; totalprotein, 3,020 mg; relativ aktivitet, 82.500; total aktivitet 249.000.000) og en fraksjon på 30.000 eller mindre i molekylvekt (volum, 2.947 ml; proteinkonsentrasjon, 0,471 mg/ml; total protein, 1,402 mg; relativ aktivitet, 4.500; totalaktivitet, 6.310.000). Tilstedeværelse av TPO aktivitet i fraksjon 30.000 eller mindre i molekylvekt indikerer en mulighet for at kultursupernatanten inneholder TPO hvor molekylvekten er blitt redusert i løpet av ekspresjonen i eller sekresjon fra dyrecellene. Derimot ble fraksjonen på 30.000 eller mere i molekylvekt bufferskiftet med 20 mm natriumsitratbuffer (pH 6,1) og applisert ved en strømningsrate på 5 ml/min på SP Sepharose Fast Flow (2,6 cm i diameter og 29 cm i sjikthøyde, fremstilt av Pharmacia Biotech, katalog No 17-0729-01) kolonne som var blitt ekvilibrert på forhånd med 20 mm natriumsitratbuffer (pH 6,1). Etter fullført prøveapplisering ble kolonnen vasket og eluert med 20 mm natriumsitratbuffer (pH 6,1). Deretter, ved anvendelse av 20 mm natriumsitratbuffer (pH 6,1) som et utviklingsoppløsningsmiddel A og en oppløsning bestående av utviklingsoppløsningsmiddel A og IM NaCl som et utviklingsoppløs-ningsmiddel B ble elueringen utført ved en strømningsrate på 3 ml/min med en lineær gradient på fra 0 % B til 50 % B i 215 minutter og deretter fra 50 % til 100 % B i 20 minutter, og deretter ble eluatene samlet i polypropylenrør i 30 ml (10 min) porsjoner. Når en porsjon av hver av disse eluatene ble undersøkt i M-07e analysesystemet for å undersøke fordelingen av aktiviteten ble eluering av TPO aktiviteten funnet innenfor et vidt områe. Som en konsekvens av dette ble fraksjoner eluert med en NaCl konsentrasjon på 50 mM eller lavere, inkludert gjennomløpfraksjon, slått sammen som en fraksjon Fl, og TPO fraksjonene eluert med 50 til 1000 mM NaCl som en fraksjon F2. Volumet til fraksjon Fl var 1,951 ml( proteinkonsentrasjon, 2,05 mg/ml; total protein 3.994 mg; relativ aktivitet, 13.500; total aktivitet 53.900.000) og den til F2 var 649,8 ml (proteinkonsentrasjon, 1,11 mg/ml; totaltprotein, 721 mg; relativ aktivitet, 268.000; total aktivitet 193.000.000).

(2) Bekreftelse på biologisk aktivitet til SP Sepharose Fast Flow fraksjon F2.

En 2,5 ml del av SP Sepharose Fast Flow fraksjon F2 separert i ovennevnte trinn 1 ble bufferutvekslet med 3,5 ml DPBS oppløsninginneholdende 0,01 % HSA ved Sephadex G25 kolonne (NAP-25, fremstilt av Pharmacia Biotech, katalog No. 17-0852-01), og biologisk TPO aktivitet til denne prøven (proteinkonsentrasjon, 1,46 mg/ml) ble under-søkt i en in vivo analyse. Den aktive fraksjonen ble administrert subkutant til ICR hannmus (8 uker gamle), idet hver gruppe innbefattet 4 dyr, daglig i 5 påfølgende dager i en dose på 100 ni (med en total aktivitet på 123.000 målt ved M-07e analysesystemet) pr dyr. Som en kontroll ble 100 ul DPBS inneholdende 0,01 % HSA administrert subkutant på samme måte. Like før administreringen og neste dag av den endelige administreringen, ble blod samlet fra øyehulen ("eyeground") for å måle blodplatetallet ved anvendelse av en mikrocellcounter (F800, fremstilt av Toa Iyo Denshi). I TPO administrert gruppe økte blodplatetallet med en faktor på omtrent 1,29 i gjennomsnitt etter endt administrering sammenlignet med verdien før administreringen og var 1,12 ganger høyere enn i kontrollgruppenmed en signifikant forskjell (p <0,0S, Student t-test) mellom dem. Disse resultatene demonstrerte at ovennevnte humane TPO produsert av pattedyrceller har evnen til å øke blodplatetallet.

EKSEMPEL 50

Konstruksjon av rekombinant vektor, pDEF202-ghTPO for anvendelse ved ekspresjon av humant TPO kromosomalt DNA i CHO celler

En vektor pDEF202 ble spaltet med restriksjonsenzymene Kpnl og Spel og deretter utsatt for agarosegelelektroforese for å isolere et fragment inneholdende muse DHFR minigen og SV40 polyadenuleirngsinnehold, og ekspresjonsvektoren pDEF202-ghTPO ble oppnådd ved ligering ved anvendelse av T4 DNA ligase (fremstilt av Takara Shuzo) og det på denne måten oppnådde fra<g>mentet med en vektor DNA som er blitt dannet ved fjerning av en SV40 polyadenyleringssignalinneholdnede region fra et plasmid pEFHGTE ved dets behandling med restriksjonsenzymene Kpnl og Spel. Dette plasmidet inneholder SV40 replikasjon til origo, human elongeringsfaktor l-a promotor, SV40 tidlig polyadenyleirngsregion for transkripsjon av humant TPO gen, museD HFR minigen, pUC 18 replikasjonsorigo og a-laktamasegen (Amp<1>) og humant TPO kromosomalt DNA er koblet til et nedstrømssete av human elongeringsfaktor l-a promotor.

EKSEMPEL 51

Ekspresjon av humant TPO kromosomalt DNA i CHO celler

CHO celler (en dhfr stamme; Uralub and Chasin, Proe. Nati. Sei. USA, vol. 77, p.4216, 1980) ble dyrket ved dyrking av disse i et a-minimumessensielt medium (a-MEM(-), supplementert med tymidin og hypoksantin) inneholdende 10 % føtalt bovint serum ved anvendelse av en skål med 6 cm i diameter (fremstilt av Falcon), og de resulterende cellene ble utsatt for transfeksjon ved hjelp av en kalsiumfosfatmetode (Cell Phect, fremstilt av Pharmacia). 10 ng av plasmidet pDEF202-ghTPO fremstilt i eksempel 50 ble blandet med 120 ul buffer A og 120 ni H2O og den resulterende blandingen ble inkubert ved romtemperatur 1 10 minutter. Denne oppløsningen ble ytterligere blandet med 120 ni buffer B og inkubert ved romtemperatur i ytterligere 30 minutter. Den på denne måten dannede DNA oppløsningen ble lagt i platen og dyrket i 6 timer i en CO2 inkubator. Etter fjerning av mediet og vasking av den resulternede platen to ganger med a-MEM(-), ble a-MEM(-) inneholdende 10 % dimetylsulfoksyd tilsatt til skålen og behandlet i 2 minutter ved romtemperatur. Deretter ble ikke-seleksjonsmedium (a-MEM(-) op.cit. supplementert med hypoksantin og tymidin) inneholdende 10 % dialysert føtalt bovint serum tilsatt og dyrket i 2 dager, og deretter ble seleksjon utført ved anvendelse av et seleksjonsmedium (a-MEM(-), fri for hypoksantin og tymidin) inneholdende 10 % dialysert føtalt bovint serum. Seleksjon ble utført ved behandling av cellene med trypsin, dispensering av de behandlede cellene i en skål med 6 cm i diameter til 5 skåler med 10 cm i diameter eller 20 skåler med 24 brønnskåler og fortsatt dyrking av cellene mens seleksjonsmediet blir skiftet hver andre dag. Tilstedeværelse av human TPO aktivitet ble bekreftet i kultursupernatanten i skåler eller brønner hvor proliferasjon av celler ble observert når human TPO aktivitet ble målt ifølge Ba/F3 analysen. I dette tilfelle kan transfeksjon av CHO celler også bli oppnådd ved å utføre kotransfeksjon av CHO celler med pEFHGTE og pMGl.

EKSEMPEL 52

Konstruksjon av vektor for anvendelse ved ekspresjon i E.coli av humant TPO protein (aminosyreresidiene i posisjonene 1 til 163) (referert til nedenfor som "hMKT(l-163)" hvor et Lys residie og Met residie ble henholdsvis tilsatt til -1 og - 2 posisjonene og bekreftelse av ekspresjonen

For å oppnå ekspresjon av et protein hvor 1- og 3-posisjonaminosyreresidiene er de samme som de til human TPO protein (aminosyreresidiene i posisjonene 1 til 163), en vektor pCFM536/hMKT(l-163), også refert til som [Met"<2>, Lys"<1>] TPO(l-163), ble konstruert for anvendelse ved ekspresjon av hMKT(l-163) i E.coli på samme måte som beskrevet i eksempel 42 ved anvendelse av følgende syntetiske oligonukleotider 1-13,2-13,3-3 og 4-3:

Dette ekspresjonsplasmidet inneholder en DNA sekvens vist i sekvenslisten (SEQ DD NO: 12). Deretter ble ekspresjon av hMKT(l-163) indusert på samme måte som beskrevet i eksempel 43.

Når det på denne måten oppnådde ekspresjonsprotein ble utsatt for SDS-PAGE, overført på en PCDF membran og deretter utsatt for N-terminal aminosyresekvensanalyse, ble det bekreftet at dette proteinet inneholder aminosyresekvensen til hMKT(l-163) som skal bli uttrykt.

EKSEMPEL 53

Refolding av human TPO, h6T(l-163), avledet fra human TPO uttrykt i E.coli ved anvendelse av guanidinhydroklorid og glutation, og rensing og bekreftelse av dets biologiske aktivitet

En 1,2 g del av frosne celler av h6T(l-163) produserendere kombinant stamme fremstilt i eksempel 43 ble suspendert i 3 ml vann og ødelagt ved anvendelse av en høytrykks-disintegrator. Ved å utsette suspensjonen for sentrifugering ble den presipiterte frak.? sjonen isolert og det meste av de kontaminerte proteinene, cellekomponentene og lignende ble fjernet. Den isolertepresipiterte fraksjonen inneholdende h6T(l-163) ble suspendert i 4 ml i sluttvolum vann. En 1 ml del av 1 M Tris buffer (pH 8,5) ble tilsatt til suspensjonen ved omrøring etterfulgt av ytterligere tilsetning av 20 ml 8 M guanidinhydroklorid og deretter 5 minutter omrøring ved romtemperatur for å oppløse innholdet. Den resulterende oppløsningen ble fortynnet 10 ganger med 20 mM Tris buffer (pH 8,5), 5 mM redusert type glutation og 0,5 mM oksydert type glutation ble oppløst i den fortynnede oppløsningen ved omrøring og deretter ble den på denne måten dannede opp-løsningen inkubert over natt ved 4 °C. Ved sentrifugering ble h6T(l-163) isolert i supernatantfluidet. En 160 ml del av det på denne måten oppnådde supernatantfluidet ble konsentrert ved anvendelse av YM 10 ultrafiltreirngsmembran (fremstilt av Amicon) og utsatt for bufferskift med DPBS for å oppnå 3,4 ml sluttvolum av en fraksjon (proteinkonsentrasjon, 2,18 mg/ml). Når denne fraksjonen ble grundig dialysert mot IMDM kulturmedium og vurdert ifølge rotte CFU-MK analysesystemet ble sterk TPO aktivitet (relativ aktivitet, 58.000) oppdaget.

Den TPO aktive fraksjonen dannet ovenfor ble utsatt for en in vivo analyse. Den aktive fraksjonen ble administrert subkutanttil IC hannmus (7 uker gamle), hver gruppe innbefattet 4 dyr, daglig i 5 påfølgende dager med en dose på 170 fil (med en totalaktivitet 22.000 målt ifølge rotte CFU-MK analysesystemer) pr dyr. Som en kontroll ble 170 fil DPBS administrert subkutant til hver av 6 dyr i kontrollgruppen på samme måte. Like før administreringen og på neste dag og 3 dager etter endt administrering, ble blod samlet fra øyehulen for å måle blodplatetallet ved anvendelse av en mikrocellteller F800, (fremstilt av Toa Iyo Denshi). I den TPO administrerte gruppen økte blodplatetallet med en faktor på omtrent 2,15 i gjennomsnitt på neste dag av endt administrering sammenlignet med verdien før administrering, og en slik effekt forble uforandret selv etter 3 dager av fullført administrering som viser en 2,13 ganger høyere verdi. Blodplatetellingene på neste dag og 3 dager etter endt administrering var 1,73 og 1,80 ganger høyere i TPO behandlet gruppe enn i kontrollgruppen med en signifikant forskjell (p<0,001, Stutent t-test) mellom dem. Disse resultatene demonstrerte at humant TPO produsert av E.coli og dannet ifølge ovennevnte metode har evnen til å øke blodplatetellingene in vivo.

EKSEMPEL 54

Refolding av human TPO, h6T(l-163) uttrykt i E.coli, ved anvendelse av natrin N-lauroylsarkosinat og kobbersulfat, og rensing og bekreftelse av dets biologiske aktivitet

En 0,6 g del av frosne celler av h6T(l-163) produserende rekombinant stamme dannet i eksempel 43 ble suspendert i 3 ml vann, ødelagt ved anvendelse av en høytrykks-disintegrator og deretter utsatt for sentrifugering for å isolere den presipiterte fraksjonen. Etter suspendering av den presipiterte fraksjonen i 3,1 ml vann ble 0,19 ml 1 M Tris buffer (pH 9,2), 11,25 ul 1 MDTT, 38 ul 0,5 M EDTA og 0,38 ml 10 % natriumdeoksy-cholatoppløsning tilsatt til suspensjonen med omrøring, og den resulterende blandingen ble omrørt ved romtemperatur i 40 minutter. Dette ble deretter utsatt for sentrifugering for å isolere den presipiterte fraksjonen og fjerning av det meste av de kontaminerte proteinene, cellekomponentene og lignende. Det resulterende presipitatet ble suspendert i 40 ml vann og utsatt for sentrifugering for å isolere den presipiterte fraksjonen inneholdende h6T(l-163). Den dermed isolerte presipiterte fraksjonen ble suspendert i 3,8 ml vann og 0,2 ml 1 M Tris buffer (pH 8) og 1 ml 10 % natrium N-lauroylsarkosinat ble tilsatt til suspensjonen med omrøring etterfulgt av 20 minutters omrøring ved romtemperatur for å solubilisere innholdet. Den resulterende oppløsningen ble blandet med 5 ni 1 % kobbersulfat og omrørt over natt (omtrent 20 timer ved romtemperatur). Den resulternde oppløsningen ble utsatt for sentrifugering for å isolere supernatantfraksjonen inneholdende h6T(l-163) og en 5 ml del av supernatanten ble blandet med 5 ml vann og 10 ml 20 Flow kationbyttekolonnekromatografi ble grundig dialysert mot IMDM kulturmedium og vurdert ifølge rotte CFU-MK analysesystemet ble sterk TPO aktivitet

(relativ aktivitet 19.000.000) funnet i en fraksjon eluert med en NaCl konsentrasjon på omtrent 100 mM. Denne fraksjonen ble konsentrert i 1,6 ganger (2,5 ml; proteinkonsentrasjon, 25 ng/ml) ved anvendelse av en ultrafiltreringsenhet (Ultra Free CL, nominell molekyllæravspaltning på 5.000, fremstilt av Millipore, katalog No. UFC4LCC25). Når den på denne måten konsentrerte fraksjon ble analysert ved SDS-PAGE i nærvær av et reduksjonsmiddel ble et bånd tilsvarende TPO detektert som hovedbånd (renhet 70 til 80 %).

TPO aktiv fraksjon dannet ifølge ovennevnte prosedyre ble undersøkt i en in vivo analyse. Den aktive fraksjonen ble administrert subkutant til ICR hannmus (8 uker gamle), hver gruppe innbefatter 4 dyr, daglig i 5 påfølgende dager i en dose på 100 ul (med en total aktivitet på 47.500 målt ifølge rotte CFU-MK analysesystemet) pr dyr. Som en kontroll ble 100 ul 20 mM Tris buffer (pH 7,7) inneholdende 100 mM NaCl administrert subkutant på samme måte. Like før administreringen og neste dag av fullført administrering ble blodprøver samlet fra øyengrunnen for å måle blodplatetallet ved anvendelse av en mikrocellteller (F800, fremstilt av Toa Iyo Denshi). ITPO-administrert gruppe økte blodplatetellingene med en faktor på omtrent 1,73 i gjennomsnitt etter endt administrering sammenlignet med antallet før administrering og var 1,59 ganger høyere enn i kontrollgruppen med en signifikant forskjell (p <0,01, Student t-test) mellom dem. Disse resultatene demonstrerte at human TPO produsert av E.coli og dannet ifølge ovennevnte prosedyre har evne til åøke blodplatetellingene in vivo.

EKSEMPEL 55

Storskaladyrking av CHO celler

Storskaladyrkning av human TPO produserende CO cellelinje (CHO 28-30 celle, resistent overfor 25 nM MTX) som var blitt oppnådd ved transfektering av human TPO ekspresjonsplasmid pDEF202-hTPO-Pl til CHO celler i eksempel 32 ble utført som følger. CHO cellelinjen ble dyrket og proliferert i DMEM/F-12 kulturmedium (GD3CO) inneholdende 25 nM MTX og 10 % FCS. Etter at cellene var løsnet med trypsinoppløsning ble 1 X 10<?> inokulert i en rulleflaske (ex Falcon, Falcon 3000) inneholdende 200 ml av samme medium og deretter dyrket ved 37 °C ved en ruUehastighet på 1 rpm i 3 dager. Etter 3 dagers kultur ble kultursupernatanten fjernet ved sug og adherente COH celler ble deretter skylt med 100 ml PBS. 200 ml DMEM/F-12 medium (GD3CO) inneholdende hvskaladyrkning av human TPO produserende CO cellelinje (CHO28-30 celle, resistent overfor 25 nM MTX) som var blitt oppnådd ved transfektering av human TPO ekspresjonsplasmid pDEF202-hTPO-Pl til CHO celler i eksempel 32 ble utført som følger. CHO cellelinjen ble dyrket og proliferert i DMEM/F-12 kulturmedium (GJJ3CO) inneholdende 25 nM MTX og 10 % FCS. Etter at cellene var løsnet med trypsinoppløsning ble 1X10^ inokulert i en rulleflaske (ex Falcon, Falcon 3000) inneholdende 200 ml av samme medium gjennom et 0,22 um filter for å oppnå filtratet som deretter ble konsentrert på en ultrafiltreringsenhet (PLTK Pelliconkassett, nominell molekylvekt avspaltning 30.000, ex Millipore). Etter erstatning av oppløsningsmidlet til konsentratet med rent vann, ble p-APMSF (Wako Pure Chemicals) and Pefabloc SC (Merck) som er proteinaseinhibitorer, tilsatt til den resulterende vandige oppløsningen ved sluttkonsentrasjoner på henholdsvis 1 mm og 0,35 mm for å oppnå 3628 ml av fraksjonen med molekylvekt på 30.000 eller høyere (proteinkonsentrasjon: 1,60 mg/ml; total protein: 5805 mg; relativ aktivitet; 1.230.000; total aktivitet: 7.149.000.000). Fraksjonen ble deretter utsatt for western blot analyse som beskrevet i eksempel 45. Som et resultat fremkom tilstedeværelse av TPO protein ved et molekylvektområde mellom 66.000 og 100.000. Ved granskning i mere detalj ble det oppdaget at TPO arter med lavere molekylvekt enn til ovennevnte TPO var innbefattet i gjennomstrørrmingsfraksjonen.

Ultrafiltratet som inneholdt TPO med en molekylvekt på ikke mer enn 30.000 ble separat konsentrert ved anvendelse av en ultrafiltreringsenhet (PLGC Pelliconkassett nominell molekylvektavspaltning 10.000, Millipore), for å oppnå en 1901 ml TPO fraksjon mellom molekylvekt (proteinkonsentrasjon: 0,36 mg/ml; total protein: 684 mg; relativ aktivtet: 245.500; total aktivitet: 167.900.000). Dette viser at TPO arter med lav molekylvekt ble dannet i løpet av celledyrkningen.

Deretter ble 3614 ml av fraksjonen inneholdende TPO med en molekylvekt på 30.000 eller mer ble det tilsatt 764 g ammoniumsulfat og 144,5 ml 0,5 M natriumsitratbuffer (pH 5,5) for å danne 4089 ml av oppløsningen inneholdende 1,41 M (sluttkonsentrasjon) ammoniumsulfat og 17,7 mM (sluttkonsentrasjon) natriumsitratbuffer. Etter at uopp-løselige forbindelser var fjernet fra oppløsningen ved sentrifugering ble den klare oppløsningen oppnådd.

Den klare oppløsningen ble deretter applisert på Macro-Prep Methyl HIC kolonne (Bio-Rad, Catalog No. 156-0080; diameter 5 cm, sjikthøyde 24,5 cm) som tidligere var blitt ekvilibrert med 20 mM natriumsitratbuffer (pH 5,5) inneholdende 1,2 M ammoniumsulfat ved en strømningsrate på 25 ml/min. Etter dette var avsluttet ble elueringen utført med 20 mM natriumsitratbuffer (pH 5,5) inneholdende 1,2 M natriumsulfat. Den eluerte fraksjon ble deretter konsentrert på ultrafiltreringsenhet (ex Filtron, Omega Ultrasette, nominell molekylvektavspaltning på 8.000) for å oppnå en gjermomstrømningsfraksjon Fl (4455 ml; proteinkonsentrasjon: 0,400 mg/ml; total protein: 1780 mg; relativ aktivitet: 1.831.000).

Deretter ble 20 mM Na sitrat (pH 6,0) som en elueringsbuffer sent gjennom kolonnen for å oppnå et eluat som deretter ble konsentrert ved anvendelse av samme ultrafiltreringsenhet (dvs Omgea Ultrasette, nominell molekylvektavspaltning 8.000) for å samle en fraksjon F2 (1457 ml; proteinkonsentrasjon: 0,969 mg/ml; total protein: 1411 mg; relativ aktivitet: 1.715.000). IF2 ble tilstedeværelse av et protein med en molekylvekt fra 66.000 til 100.000 bekreftet på SDS-PAGE. Som et resultat av Western analyser fremkom det at proteinet var TPO. F2 eluert fra Macro-Prep Methyl HIC kolonnen (1443 ml) ble applisert på SP Sepharose Fast Flow (Pharmacia Biotech, Catalog No. 17-0829-01; diameter 5 cm, sjikthøyde 12 cm) som tidligere var blitt ekvilibrert med 20 mM natriumsitratbuffer (pH 6,0) ved en strømningsrate på 15 ml/min. Etter dette var avslutet ble elueringen utført med 20 mM natriumsitratbuffer (pH 6,0) inneholdende 50 mM NaCl. Eluatet ble samlet og beteetter blekonsentrert ved anvendelse av samme ultrafiltreringsenhet (dvsOmgea Ultrasette, nominell molekylvektavspaltning 8.000) for å samle en fraksjon F2 (1457 ml; proteinkonsentrasjon: 0,969 mg/ml; total protein: 1411 mg; relativ aktivitet: 1.715.000). IF2 ble tilstedeværelse av et protein med en molekylvekt fra 66.000 till00.000 bekreftet på SDS-PAGE. Som et resultat av Westernanalyser fremkom det at proteinet var TPO.

F2 eluert fra Macro-Prep Methyl HIC kolonnen (1443 ml) ble applisert på SP Sepharose Fast Flow (Pharmacia Biotech, Catalog No. 17-0829-01; diameter 5 cm, sjikthøyde 12 cm) som tidligere var blitt ekvilibrert med 20 mM natriumsitratbuffer (pH 6,0) ved en sfrømningsrate på 15 ml/min. Etter dette var avslutet ble elueringen utført med 20 mM natriumsitratbuffer (pH 6,0) inneholdende 50 mM NaCl. Eluatet ble samlet og betegnet fraksjon Fl (3,007 ml; proteinkosentrasjon: 0,226 mg/ml; total protein 679 mg; relativ aktivitet: 88.830). Deretter ble elueringsbufferen erstattet med 20 mM natriumsitratbuffer (pH 5,4) inneholdende 750 mM NaCl for å samle fraksjon F2 som er blitt eluert (931 ml; proteinkonsentrasjon: 0,763 mg/ml; total protein: 710 mg; relativ aktivitet: 5.558.000) som deretter ble konsentrert til 202 ml ved anvendelse av ultrafiltrerings-enheter (Filtron, Omega Ultrasette, nominell molekylvektsavspaltning 8.000; og Amicon, YM3 membran).

Deretter ble den konsentrerte TPO aktivitetinneholdnede fraksjon F2 (197 ml) applisert på en molekylvekt på 66.000 til 1.000.000; F2 en TPO molekylart med en molekylvekt på 32.000 til 60.000; og F3 en TPO art med en molekylvekt på 32.000 til 42.000. Alle TPO molekylene hadde TPO aktivitet.

På grunnlag av resultatet av N-terminale aminosyresekvensering av TPO molekylet med en molekylvekt på 66.000 til 100.000 ble det bekreftet at TPO molekylet hadde aminosyresekvens til et humant TPO genkodet protein.

I tillegg ble TPO molekylet med en molekylvekt på 66.000-100.000 utsatt for enzymatisk spaltningseksperimenter ved anvendelse av glykosidaseenzymer bestående av N-glykanase (ex Genzyme, Catalog No. 1472-00), neuraminidase (Nakarai-Tesqu, Catalog No. 242-29SP), endo-l-N-acetylgalaktosaminidase (Seikagaku Kogyo, Catalog No. 100453) og O-glykosidase (Boehringer Mannheim Biochemica, Catalog No. 1347101) enkeltvis eller i kombinasjon, og deretter SDS-PAGE analyser. Som et resultat ble polypeptiddelen av TPO funnet å ha en molekylvekt på omtrent 36.000 som ventet utifrå den teoretiske molekylvekten og er et glykoprotein med både N- og O-koblede sukkerkjeder.

EKSEMPEL 57

Rensing av human TPO fra human TPO produserende CHO cellelinje

(1) Til 11 av serumfri kultursupernatant av CHO cellene oppnådd på samme måte som i eksempel 55 ble det tilsatt 211,4 g ammoniumsulfat og deretter ble blandingen filtrert gjennom et 0,2 nm filter (ex Gelman Science, Catalog No. 12992). Det oppnådde filtratet ble applisert på Macro-Prep Methyl HIC kolonne (Bio-Rad, Catalog No. 156-0081, diameter 50 mm, sjikthøyde 90 mm) er bestående av N-glykanase (ex Genzyme, Catalog No. 1472-00), neuraminidase (Nakarai-Tesqu, Catalog No. 242-29SP), endo-1-Nacetylgalaktosaminidase (Seikagaku Kogyo, Catalog No. 100453) og O-glykosidase (Boehringer Mannheim Biochemica, Catalog No. 1347101) enkeltvis eller i kombinasjon, og deretter SDS-PAGE analyser. Som et resultat blepolypeptiddelen av TPO funnet å ha en molekylvekt på omtrent 36.000 som ventet utifrå den teoretiske molekylvekten og er et glykoprotein med både N- og O-koblede buffer (pH 6,4) inneholdende 5 % etanol (referert til som "utviklingsoppløsningsmiddel A") i 15 min ble elueringen utført med en 66-min lineær gradient av fra utviklingsoppløsningsmiddel A til 10 mM Tris buffer (pH 6,4) inneholdende 94 % etanol (referert til som "utviklingsoppløsnings-middel B"). Kromatogrammet oppnådd er vist i fig 15. Som et resultat av SDS-PAGE

analysen fremkom molekylet som har en molekylvekt på 65.000-100.000 som var ventet å være TPO og som tilsvarte fraksjonen med retensjonstid 68-72 min etter tilsetning av prøve som et enkelt bånd på SDS-PAGE gelen (se fig 16). Westernanalyser viste videre at det oppnådde proteinet er TPO.

N-terminal aminosyreanalyse av proteinprøven viste at proteinet hadde aminosyre-sekvensen til human TPO genkodet protein.

EKSEMPEL 58

Fremstilling av rekombinant virus for human TPO ekspresjon i insektceller

Plasmid pHTPl fremstilt i eksempel 30 ble spaltet med restriksjonsenzymene EcoRI og Noti og deretter utsatt for 1 % agarosegelelektroforese for å oppnå et omtrent 1200 bp bånd som deretter ble renset ved anvendelse av Prep-A-Gen DNA rensningssettet. Renset DNA ble deretter ligert til en trasfervektor pVL 1393 (Invitrogen) forbehandlet med samme restriksjonsenzymer etterfulgt av transformasjon til kompetent høy E.coli DH5 (Toyo Boseki). Fra oppnådde kolonier ble det valgt en klon pVL1393/hTPO som inneholdten fullengdekodende region av human TPO cDNA. Plasmid DNA ble deretter dannet fra klonen ved hjelp av metoden beskrevet i Molecular Cloning (Sambrook et al, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) etterfulgt av transfeksjon inn i insektcelle Sf 21 (Invitrogen) ved anvendelse av BaculoGoldTM transfeksjonskit (Farmingen), og transfekterte celler ble dyrket i Sf-900 medium (Lifetechnology) ved 27 °C i 4 dager for å isolere supernatanten som inneholder virus. Supernatanten ble. deretter fortynnet till: 10/9 ~ 1:10/5 og omtrent 7 X 10/5 Sf 21 celler ble infisert med 1 ml av den fortynnede supernatanten ved 27 °C i en 1 time i en 35-mm (i diameter) flate. Etter fjerning av supernatanten ble 1 % varm agarose i Sf-900 medium plassert i kulturen og stivnet, etterfulgt av 6-dagers dyrking ved 27 °C i en fuktatmosfære. Ved enkelt plakk som ble dannet ble plukket opp og viruset ble frigjort i 200 ul Sf-900 medium. Sf 21 cellene ble infisert med den oppnådde virale klonen i en 24-brønnskål for åproliferere virus. En del av den virusinneholdende væsken fra enkeltplakk ble behandlet med fenol/kloroform etterfulgt av etanolpresipitering for å isolere viralt DNA som deretter ble anvendt som et templat for å utføre PCR ved anvendelse av primere spesifikke for human TPO cDNA. Rekombinant virusinneholdende human TPO cDNA ble valgt basert på amplifikasjon av spesifikk DNA fragment. Deretter ble Sf 21 celler infisert med supernatant inneholdende rekombinant virusinneholdende human TPO cDNA for å proliferere virus.

EKSEMPEL 59

Ekspresjon av human TPO i Sf 21 insektceller og identifikasjon av TPO aktivitet

Sf 21 cellene ble dyrket i en 175 cm kulturflaske for til omtrent 80 % sammenløp etterfulgt av infeksjon med human TPO cDNA inneholdende rekombinant virus dannet i eksempel 58 ved 27 °C i 1 time hvoretter de oppnådde cellene ble dyrket i Sf-900 medium ved 27 °C i 4 dager for å isolere supernatanten til kulturen. Den oppnådde kultursupernatanten ble erstattet med IMDM kulturmedium på NAPTM-5 kolonnen (Pharmacia). Signifikant TPO aktivitet i de resultene ble detektert på en dose-avhengig måte i både rotte CFU-MK analyse og M-07e analyse. Rekombinant human TPO uttrykt i Sf21 cellene ble identifisert ved hjelp av Westernanalyser som beskrevet i eksempel 45.

EKSEMPEL 60

Refolding av variant human TPO, h6T(l-163) avledet fra klon (pCFM536/h6T(l-163) inneholdende en human TPO basesekvens via ekspresjon derav i E.coli ved anvendelse av natrium N-lauroylsarkosinat og kuprisulfat og rensing av h6T(l-163)

30 g frossen h6T(l-163)-produsereerende rekombinantmikroorganisme dannet i eksempel 43 ble suspendert i 300 ml vann, ødelagt i en høytrykkødeleggende apparatur (10.000 psi, Rannie High Pressure Laboratory) og deretter sentrifugert for å isolere en sedimentert fraksjon. Den sedimenterte fraksjonen ble suspendert i 90 ml vann og vann ble tilsatt til den totale mengden av 150 ml med omrøring. Deretter ble det til blandingen tilsatt 9 ml 1 M Tris buffer (pH 9,2), 540 jil 1 M DTT, 1,8 ml 0,5 M EDTA og 18 ml 10 % natriumdeoksycholinsyre med omrøring etterfulgt av 30 min omrøring ved romtemperatur. Den sedimenterte fraksjon ble isolert ved sentrifugering og det meste av de kontaminerte proteinene og mikroorganismekomponentene ble fjernet. Til sedimentet ble det tilsatt 180 ml 5 mM DTT for å oppnå en suspensjon som deretter ble sentrifugert for å isolere den sedimenterte fraksjonen inneholdende h6T(l-163). Til det resulterende sedimentet ble det tilsatt 300 ml vann for å oppnå en suspensjon hvor det ble tilsatt vann til en væskemengde 570 ml med omrøring. 30 ml 1 M Tris buffer (pH 8), 150 ml 10 % natrium N-lauroylsarkosin ble tilsatt til blandingen ved romtemperatur med 20 min omrøring for å oppløse h6T(l-163). Til dette ble det ytterligere tilsatt 750 ul 1 % kuprisulfat og blandingen bleomrørt over natt (omtrent 201) ved romtemperatur. Etter at supernatantfraksjonen inneholdende h6T(l-163) ble isolert ved sentrifugering ble det til 750 ml av supernatanten tilsatt 750 ml vann og 1,500 ml 20 mM Tris buffer (pH 7,7) etterfulgt av tilsetning av 3 ml polysorbat 80 (Nikko Chemicals) med omrøring. Til den oppnådde oppløsningen ble det tilsatt 600 g Dowex 1-X4 (20-50 mesh, kloridform) ionebytteharpiks etterfulgt av 90 min omrøring ved romtemperatur. Følgende isolering av den ikke-adsorberte fraksjonen ved anvendelse av et glassfilter ble ione-byttehar-piksen vasket med 750 ml 20 mM Tris buffer (pH 7,7). Den kombinerte oppløsningen av den ikke-adsorberte og vaske fraksjonen ble justert til pH 9,2 med 2 N natrium-hydroksyd hvoretter den ble applisert på Q Sepharose Fast Flow anion-byttekolonne (ID 5 xm X 10 cm) ekvilibrert med 20 mM Tris buffer (pH 9,2) inneholdende 0,1 % polysorbat 80 for å isolere en ikke-adsorbert fraksjon. pH til den oppnådde ikke-adsorberte fraksjonen ble justert til 7,2 med saltsyre, applisert på SP Sepharose Fast Flow kationbyttekolonne (ID 5 cm X 10 cm) ekvilibrert med 20 mM Tris buffer (pH 7,2) inneholdende 0,1 % polysorbat 80 og deretter eluert med lineær gradient fra 0 M til 500 mM NaCl i samme buffer. De eluerte fraksjonene ble utsatt for SDS-PAGE analyse for å samle en TPO fraksjon hvortil trifluoreddiksyre ble tilsatt til en konsentrasjon på 0,1 %. Etter at den oppnådde oppløsningen ble applisert på Capcell Pak 5 nm 300A Cl klonne (ID 2,1 cm X 5 cm X 2, Shiseido) ble en reversfase HPLC utført ved lineær gradient-elueringsmetoden ved økning avl-propanolkonsentrasjonen i 0,1 % trifluoreddiksyre. Eluatet ble analysert på SDS-PAGE i fravær av et reduksjonsmiddel. Som et resultat ble tre fraksjoner separert basert på elueringsposisjonen i reversfase HPLC og hver fraksjon ble fortynnet tre ganger med 0,1 % trifluoreddiksyre. Hver fortynnede fraksjon ble applisert på ovennevnte reversfase HPLC kolonne på en lignende måte. De resulterende tre TPO fraksjonene som ble betegnet Fr. S-a, Fr. S-b og Fr. S-c avhengig av eluerings rekkefølgene på reversfase HPLC (se fig 17) ble analysert på SDS-PAGE i fravær av et reduksjonsmiddel. Som et resultat ble et enkelt bånd detektert veden molekylvekt på omtrent 18 kDa (Fr. S-a), omtrent 19 kDa (Fr.S-b) eller 18 kDa (Fr. S-c) (se fig 18). Ifølge aminosyreanalyser var hver av aminosyresammensetningene som ble bestemt nesten i samsvar med den tilsvarende teoretiske verdien vurdert ut i fra sekvens-informasjonen. I tillegg viste resultatene av N-terminalaminosyreanalyse at de var de ventede sekvensene. Proteinmengden til hver fraksjon som ble bestemt ved aminosyre-

analyser var 0,64 mg (Fr. S-a), 1,81 mg (Fr. S-b) eller 3,49 (Fr. S-c). Etter fulldialyse av hver fraksjon mot IMDM medium ble M-07e analyse utført. Som 64 mg (Fr. S-a), 1,81 mg (Fr. S-b) eller 3,49 (Fr. S-c). Etter fulldialyse av hver fraksjon mot IMDM medium ble M-07e analyse utført. Som et resultat var den TPO relative aktiviteten til hver fraksjon omtrent 1.620.000 (Fr. S-a), 23.500.000 (Fr. S-b) eller 746.000.000 (Fr. S-c).

EKSEMPEL 61

Refolding av variant human TPO, h6T(l-163) avledet fra klon pCFM536/h6T inneholdende human TPO basesekvens via ekspresjon i E.coli ved anvendelse av guanidinhydroklorid og cystein-cystein, og rensing av h6T(l-163) 50 g h6T(l-163)-produserende frossen rekombinant mikroorgansirne fremstilt i eksepel 43 ble tilsatt til 500 ml vann og suspendert, avbrudt ved anvendelse av en apparatur med høyt trykk (10.000 psi, Rannie High Pressure Laboratory), og deretter sentrifugert for å isolere en sedimentfraksjon. Sedimentfraksjonen ble suspendert i vann og den flytende væsken ble deretter justert til 250 ml ved tilsetning av vann med omrøring. Til dette ble det deretter tilsatt 15 ml 1 M Tris buffer (pH 9,2), 900 ni M DTT, 3 ml 0,5 M EDTA og 30 ml 10 % natriumdeoksycholinsyre og omrørt ved romtemperatur i 30 min. Etter sentrifugering ble den sedimentertefraksjon isolert mens de fleste kontaminerende proteinene, mikroorganismekomponentene og lignende ble fjernet. Til sedimentet ble det tilsatt 300 ml 5 mM DTT og suspendert og deretter ble den sedimenterte fraksjonen inneholdende h6T(l-163) isolert ved hjelp av sentrifugering. Den isolerte sedimenterte fraksjonen inneholdende h6T(l-163) ble suspendert i vann i et totalvolum på 104 ml. Til suspensjonen ble det tilsatt 20 ml 1 M Tris buffer (pH8,5) og deretter 376 ml 8 M guanidinhydroklorid med omrøring, og deretter omrørt ved romtemperatur i 10 min for å oppløse h6T(l-163). Til dette ble det tilsatt 2,500 ml 20 mM Tris buffer (pH 8,5) inneholdende 0,1 % polysorbat 80 og deretter 2,000 ml 20mM Tris buffer (pH 8,5) inneholdende 1 M guanidinhydroklorid med omrøring, etterfulgt av tilsetning av 5 mM cystein og 0,5 mM cystin. Den på denne måten oppnådde oppløsningen ble inkubert overnatt ved 4 °C og deretter sentrifugert for å isolere h6T(l-163) i supernatanten som deretter ble konsentrert ved anvendelse av PrepScale UF cartridge PLDC ultrafiltrerings-membran (Millipore). Bufferen til konsentratet ble erstattet med 20 mM Tris buffer (pH 9,2) inneholdende 0,1 % polysorbat 80 helt til det ble oppnådd et sluttvolum på 1,000 ml. Den oppnådde oppløsningen ble applisert på Q Sepharose Fast Flow anionisk byttekolonne (ID 5 cm X 10 cm) ekvilibrert med 20 mM Tris buffer (pH 9,2) inneholdende 0,1 % polysorbat 80, og deretter eluert med en lineær gradient fra 0 M til 500 mM NaCl i samme buffer hvorved fraksjonen (240 ml) eluerte ved omtrent 20 mM - og omtrent 150 mM NaCl ble isolert. Den resulterende fraksjonen ble fortynnet fire ganger med 20 mM Trisbuffer (pH 7,2) for å oppnå et totalt volum på 960 ml, og deretter justert til pH 7,2 med eddiksyre, applisert på SP Sepharose Fast Flow kationbyttekolonne (ID 5 cm X 10 cm) ekvilibrert med 20 mM Tris buffer (pH 7,2) inneholdende 0,1 % polysorbat 80, og deretter eluert med en lineær gradient fra 0 M til 500 mM NaCl i samme buffer. Eluatet ble analysert på SDS-PAGE for å samle en TPO fraksjon. Til TPO fraksjonen ble det tilsatt trifluoreddiksyre helt til sluttvolumet var 0,1 %. Den resulterende oppløsningen ble applisert på Capcell Pak 5 nm 300A Cl kolonne (ID 2,1 cm X 5 cm X2, Shiseido) og reversfase HPLC ble deretter utført ved lineær gradient-elueringsmetoden med økende 1-propanolkonsentrasjon i 0,1 % trifluoreddiksyre. Eluatet ble analysert ved SDS-PAGE i fravær av et reduksjonsmiddel og fraksjonert til to fraksjoner avhengig av den eluerte posisjonen i revers fase HPLC. De to TPO fraksjonene ble betegnet Fr. G-a og Fr. G-d basert på deres elueringsrekkefølge i revers fase HPLC (se fig 17). Hver fraksjon ble deretter analysert på SDS-PAGE i fravær av et reduksjonsmiddel. Som et resultat ble et enkelt bånd detektert ved en molekylvekt på omtrent 18 kDa (Fr. G-a) eller omtrent 32 kDa (Fr. G-d) (se fig 18). Videre viste SDS-PAGE analyse av ovennevnte fraksjoner i nærvær av et reduksjonsmiddel at i begge fraksjoneneble et enkelt bånd detektert ved en molekylvekt på omtrent 20 kDa. Resultatet av aminosyreanalysene av fraksjonene viste at hver av aminosyresammensetningene var nesten i samsvar med den tilsvarende teoretiske verdien vurdert utifrå sekvensinformasjon. I tillegg viste resultatene av N-terminal aminosyreanalyse at de var de ventede sekvensene. Proteinmengden av hver fraksjon bestemt utifrå resultatene av aminosyreanalysene var 2,56 mg (Fr. G-a) eller 1,16 mg (Fr. G-d). Etter full dialyse av hver fraksjon overfor IMDM medium ble M-07e analyse utført. Som et resultat hadde fraksjonen TPO relativ aktivitet på omtrent 3.960.000 (Fr. G-a) eller omtrent 7.760.000 (Fr. G-d).

EKSEMPEL 62

Konstruksjon av rekombinant vektor pDEF202-hTPO163 for ekspresjon av en dellengde human TPO (aminosyrene 1 til 163) nedenfor referert til som "hTP0163" innenfor CHO cellene

Vektoren pDEF202 konstruert i eksempel 31 ble behandlet med restriksjonsenzymene EcoRI og Spel etterfulgt av isolering av et stort vektorfragment ved anvendelse av agarosegelelektroforese. Fragmentet ble ligert ved T4 DNA ligase (Takara-Shuzo) med et hTPO 163 cDNA som var blitt dannet symbolbehandling av et plasmid pEF18S-hTP0163 inneholdende hTP0163 cDNA kodende for aminosyrene-21 til 163 (SEQ ID NO: 13) med restrsymbol EcoRI og Spel for å oppnå en ekspresjonsvektor pDEF202-hTP0163. Dette plasmidet inneholdt et replikasjonsorigsymbol til SV40, en human-elongeringsfaktor 1-promoter, et SV40 tidlig polyadenylseringssete, et murin DHFR minigen, et replikasjonsorigo til pUC18 og et laktamasegen (Amp<1>), hvori hTP0163 cDNA er koblet til symbol setet nedstrøms for den human elongeringsfaktorsymbol l-a promotoren.

EKSEMPEL 63

Ekspresjon av hTPO 163 i CHO celler

En CHO cellelinje (dhfr stamme, Urlaub and Chasin, Proe. NatLAcad. Sei. USA, 77, p 4216,1980) ble dyrket i minimalt essensielt medium (a-MEM(-) med tymidin og hypoksantin) inneholdende 10 % bovint føtalt serum i 6 cm skål (Falcon), og deretter transformert med et pDEF202-hTPO163 plasmid ved hjelp av tramfektummetoden (Seikagaku Kogyo K.K.). 10 ng av plasmidet pDEF202-hTPO163 dannet i eksempel 62 bleblandet med 240 ni 0,3 M NaCl og deretter med esymbol blanding av 20 ni transfektum og 220 ni H2O. Denne symbol oppløsningen ble dråpevis tilsatt til skålen etterfulgt av dyrking i 61 i en CO2 inkubator. Mediet ble fjernet fra skålen som deretter ble vasket to ganger med a-MEM(-) ettsymbol av tilsetning av 10 % DMSO inneholdende a-MEM(-) før inkubasjon i 2 minutter ved romtemperatur. Deretter ble det tilsatt til skålen 10 % dialysert bovint føtalt serum-inneholdende ikke-seleksjonsmedium (-MEM(-) med hypoksantin og tymidin) etterfulgt av to dagers dyrkning og deretter seleksjoni 10 % dialysert bovint føtalt serum-inneholdende seleksjonsmedium (a-MEM(-) uten hypoksantin og tymidin). Seleksjon ble utført ved trypsinering av cellene, deling av disse til fem 10 cm skåler eller tyve 24 brønnskåler pr ovennevnte 6 cm skål, og fortsatt dyrkning mens mediet ble skiftet med friskt seleksjonsmedium ved intervaller på to dager. Supernatantene fra skålene eller brønnene ble analysert for TPO aktivitet ved anvendelse av Ba/F3 analyse, derved ble TPO aktiviteten observert. Cellene hvori TPO aktivitetble observert i kultursupernatantene ble deretter overført til friske skåler eller brønner etter delt til en celle-konsentrasjon på 1:15 med seleksjonsmedium inneholdende 25 nM metotreksat, og deretter på ny dyrket for vekst og kloning av celler motstandsdyktig for metotreksat.

Alternativt kan transformasjon av CHO cellene bli utført ved ko-transfeksjon av pEF18S-hTP0163 og pMGl inn i CHO celler.

CHO stammen (CHO-DUKXB11) transfektert med plasmid pDEF202-hTPO163er blitt deponert av søkerene januar 31,1995 under aksesjonsnummer FERM BP-4989 til

National Institute of Bioscience and Human Technology, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry, Japan.

EKSEMPEL 64

Dyrking av CHO celler symbol stor skala

Dyrkning i stor skala av hTP0163-produserende CHO cellelinje (CHO109 celler, oppnådd ved ovennevnte seleksjon i 10 % dialysert bovint føtalt serum-inneholdende seleksjonsmedium [a-MEM" uten hypoksantin og tymidin) som var blitt oppnådd ved transfeksjon av hTP0163-ekspresjonsplasmid pDEF202-hTPO163 inn i CHO cellene i eksempel 63 ble utført som følger. CHO 109 cellene ble dyrket i DMEM/F-12 medium (GJBCO) med 10 % FCS. Etter at cellene var høstet (eller trypsinert) ved anvendelse av en trypsinoppløsning ble ti millioner celler inokulert i Falcon rulleflasker (Falcon 3000) inneholdende 200 ml av samme medium og deretter dyrket ved en rullehastighet på 1 rpm ved 37 °C i 3 dager. Kulturmediet ble fjernet under sug og overflaten av cellekulturen ble skylt med 100 ml PBS. Deretter ble det til cellekulturen tilsatt 200 ml DMEM/F-12 medium (GD3CO) uten 10 % FCS etterfulgt av 7 dagers dyrkning ved 37 °C ved 1 rpm. Den høstede kultursupernatanten ble anvendt som et utgangsmateriale for påfølgende rensningstrinn. Lignende prosedyre ble utført i 300 rulleflasker for å tilveiebringe 601 serum-fri kultursupernatant.

EKSEMPEL 65

Rensing av hTPO 163 fra hTP0163-produserende CHO cellelinje

(1) 601 serum-fri kultursupernatant oppnådd i eksempel 64 ble filtrert gjennom et 0,22 nm filtreringsfilter for å samle et filtrat som deretter ble konsentrert ved anvendelse av en ultrafiltreimgsenhet (Filtran, molekylvekt 10.000 avspaltning) for å oppnå en konsentrert fraksjon (600 ml, 11,2 mg protein/ml total protein 6430 mg). Ved Westernanalyser av denne fraksjonen ved anvendelse av anti-HTl peptidantistoff ble tilstedeværelse av hTP0163 protein uttrykt i et område på en tilsynelatende molekylvekt fra 20.000 til 26.000 vist.

Den resulterende konsentrerte kultursupernatanten (537 ml) ble behandlet på en Sephadex G-25 Fine column (Pharmacia-Biotech, Catalogue No. 17-0032-02; diameter 10 cm og sjikthøyde 30 cm) pre-ekvilibrert med 10 mM natriumfosfatbuffer (pH 6,8) for å oppnå en proteinfraksjon Fl (938 ml, proteinkonsentrasjon 4,9 mg/ml, total protein 4594 mg) som en oppløsning i 10 mM natriumfosfatbuffer (pH 6,8).

Denne proteinrfaksjonen (929 ml) fra Sephadex G-25 Fine kolonne ble applisert ved en strømningsrate på 15 ml/min på en SP Sepharose Fast Flow kolonne (Farmacia-Biotech, Catalogue No. 17-0729-01; diameter 5 cm og sjikthøyde 12 cm) preekvilibrert medlO mM natriumfosfatbuffer (pH 6,8) etterfulgt av eluering med 10 mM natriumfosfatbuffer (pH 6,8) og deretter samme bufferinneholdende 10 % etanol. Eluatene ble kombinert som en fraksjon Fl (1608 ml, proteinkonsentrasjon 2,13 mg/ml, totalprotein 3426 mg). Deretter ble den andre elueringen utført med 10 mM natriumfosfatbuffer (pH 6,8) inneholdende 750 mM NaCl og 25 % etanol for å samle et hoved hTP0163 eluat av fraksjon F2 (651 ml, proteinkonsentrasjon 1,67 mg/ml, totalprotein 1087 mg).

Til den TPO aktivitet-inneholdende fraksjon F2 (200 ml) fra SP Sepharose Fast Flow kolonnen ble det tilsatt etanol og renset vann for å danne 300 ml 45 % (sluttkonsentrasjon) etanoloppløsning. Uoppløselige materialer som fremkom etter tilsetning av etanol ble fjernet ved sentrifugering. Supernatanten ble injisert i SOURCE 15RPC kolonne

(Pharmacia-Biotech, Catalogue No. 17-0727-02; diameter 2 cm og sjikthøyde 20 cm)

preekvilibrert med 50 % oppløsningsmiddel A (10 mM natriumacetatbuffer, pH 6.7) pluss 50 % oppløsningsmiddel B (10 mM natriumacetatbuffer, pH 6.7, inneholdende 90 % etanol) ved en strømningsrate på 2 ml/min. Deretter ble kolonnen vasket med 55 % oppløsningsmiddel A pluss 45% oppløsningsmiddel B helt til de uabsorbérte forbind-elsene var nesten fullstendig eluert, hvoretter eluering ved en strømningsrate på 1.5 ml/min ble utført ifølge følgende elueringsprofil: 50 % B i 5 minutter; lineær gradient fra 50 % B til 100 % B over 140 minutter og deretter 100 % B i 35 minutter. Fraksjonene ble samlet i intervaller på 5 minutter (tilsvarende7.5 ml volum). Alle fraksjonene ble utsatt for SDS-PAGE og deretter for Westernanalyser for å undersøke et eluerings-område til hTPO 163. Som et resultat ble sterkt renset hTPO 163 med en tilsynelatende molekylvekt fra omtrent 20.000 til 26.000 funnet å bli eluert i et område fra 66 % til 87 % etanol. Blant disse hTP0163 proteinene ble hTP0163 med en som har en høyere molekylvekt eluert tidligere fra reversfasekolonne og dette tyder på at det glykosylerte hTPO 163 molekylet har en øket hydrofllisitet.

TII 88.8 ml hTP0163 elueringsfraksjon (dvs hTP0163 fraksjon (90ml) eluert i et område fra 68 % til 86,5 % etanol) fra SOURCE 15RPC kolonne ble det tilsatt CHAPS og blandingen ble konsentret og vasket for å oppnå 2,5 ml av et konsentrat inneholdende omtrent 5 % etanol og 4 mM CHAPS. Dette konsentratet ble deretter applisert på en Superdex 75 pg kolonne (Pharmacia-Biotech,Catalogue No. 17-1070-01; diameter 2,6 cm og sjikthøyde 60 cm) ekvilibrert med 10 mM natriumfosfatbuffer (pH 6.8) inneholdende 10 % etanol ved en strømningsrate på 1.5 ml/min. Fra tidspunktet 60 minutter etter applisering ble elueringsfraksjoner samlet i en mengde på 6 ml hver (dvs hver fjerde min). Som et resultat ble hTP0163 eluert i fraksjoner fra rør nr 16 minst rør nr 31 som bestemt ifølge SDS-PAGE. Denne elueringsposisjonen tilsvarer et molekylvekts-område fra omtrent 44.000 til omtrent 6.000 bestemt ifølge gelfiltrering ved anvendelse av en standardmolekylvektsmarkør (blanding av Bio-Rad, Gel Filtration Standard, Catalogue No. 151-1901; og Calbiochem, insulin, Catalogue No.407696). I tillegg så det ut som om disse hTPO 163 molekylene ble eluert i en rekke med reduserende grad av glykosylering. Alle hTPO 163 artene i området fra rør nummerene 16 til 31 (elueringsvolum: 108 til 276 ml) ble samlet som fraksjon FA. I tillegg til fraksjon FA ble fraksjonene med rør nummerene 16 til 18 (elueringsvolum: 180 til 198 ml), 19 til 24 (elueringsvolum: 198 til 234 ml) og 25 til 31 (elueringsvolum: 234 til 276 ml) separat samlet og betegnet som fraksjonene FH, FM og FL. Fraksjon FA ble videre dannet ved kombinering av delen av fraksjonene FH, FM og FL. Det ovennevnte er vist i fig 19.

(2) Deretter vil hTP0163 elueringsrfaksjonene FH, FM, FL og FA fra Superdex 75 pg kolonnen angitt i (1) bli illustrert i ytterligere detaljer. De N-terminale aminosyresekvensene til hTPO 163 artene oppnådd ovenfor ble bestemt ifølge samme fremgangsmåte som i eksempel 1, men de fleste N-terminale Ser residiene kunne ikke bli identifisert. Dette tyder på at en O-koblet sukkerforbindelse blir tilsatt til N-terminal Ser. Sekvensen etter N-terminal Ser ble bekreftet å være en aminosyresekvens hentet ut fra gensekvensen til hTPO. Konsentrasjonene til hTP0163 proteinene i FH, FM, FL og FA var 10,2 ng/ml, 6,2 ng/ml, 0,84 ng/ml og 3,2 ng/ml som bestemt ved aminosyreanalyse (AccQ. Tag method, Wasters), forutsatt at konsentrasjonene hadde peptiddeler som ikke inneholdt sukkerkjede. Disse fraksjonene (100 ng hver) ble utsatt for SDS-PAGE under ikke-reduserende betingelser ved anvendelse av en multigel 15/25 (Dai-ichi Kagaku

Yakuhin, 15 til 25 % forstøpt polyakrylamidgel) eller under reduserende betingelser ved anvendelse av DDT, etterfulgt av sølv-farving (Daiichi Pure Chemicals). Som et resultat ble hver av disse fraksjonene funnet å inneholde meget ren hTPO 163. Tilsynelatende molekylvekter til hTPO 163 i FH, FM, FL og FA, som beregnet ved anvendelse av DPCin molekylvektsmarkør (Daiichi Pure Chemicals) som en standard under reduserende betingelser var 24.000 til 21.500,23.000 til 21.000,23.000 til 20.500 og 23.500 til 20.500 (se fig 20). I tillegg var tilsynelatende molekylvekter til hTPO til FH, FM, FL og FA, beregnet ved anvendelse av biotin-merket SDS-PAGE standard (Bio-Rad, Biotynylated SDS-PAGE Standards, Broad Range: Catalogue No. 161-0319) under reduserende betingelser på Westernanalyse, 26.000 til 22.000,25.000 til 22.000,26.000 til 21.000 og 26.000 til 21.000. Heterogenisiteten blant molekylvektene til FH, FM, FLog FA kan være forårsaket av heterogenisiteten til O-kobletesukkerkjeder. Hver fraksjon av FH, FM, FL og FA ble spaltet med neuraminidase (Neuraminidase, Nacalai tesque, Catalogue No.242-29SP) redusert med DTT og deretter analysert på SDS-PAGE. Som et resultat var molekylvektene rundt 19.000 i alle fraksjonene og dette tyder på at heterogenisiteten til molekylvekten til hTPO er hovedsakelig forårsaket av heterogenisiteten til mengden av sialinsyre i sukkerkj edene koblet med hTPO 163 proteinet og at hTP0163 oppnådd ble uttrykt som et glykoprotein i CHO cellene. (3) Fraksjonene FH, FM, FL og FA oppnådd i (2) ble analysert forderes in vitro aktivitet ifølge M-07e analysesystemet. Som et resultat var den relative spesifikke aktiviteten 511.000.000, 775.000.000,1.150.000.000 og 715.000.000/mg hTP0163 protein (vekttil peptiddelen ikke inneholdende sukkervekt).

EKSEMPEL 66

Konstruksjon av E.coli vektor for ekspresjon av human TPO(aminsyrene 1 til 332) hvor Lys blir tilsatt i posisjon-1 og Met i posisjon-2 (nedenfor referert til som ,,hMKT(l-332)") og ekspresjon av hMKT(l-332)

For å uttrykke fullengdeaminosyresekvensen til human TPO i E.coli ble omvendte kodoner fra aminosyre 164 til aminosyre 332 erstattet med E.coli preferansekodoner som beskrevet nedenfor.

Syntetiske oligonukleotider: 21 og 22; 23 og 24; 27 og 28; 29 og30; 21 og 32; 33 og 34; 35 og 36; 37 og 38; eller 39 og 40 ble fosforylert i en oppløsning av 0,1 mm ATP, 10 mm Tris-acetat, 100 mm Mg-acetat, 50 mm K-acetat ved anvendelse av T4 kinase (Pharmacia) i samme rør. Deretter ble 1/10 volum av en oppløsningav 100 mm Tris/HCl (pH 7,5), 100 mm Mg CI2, 500 mm NaCl tilsatt til reaksjonsblandingen, kokt i 3 minutter i et vannbad og avkjølt for å danne et dobbelttrådet DNA. Fire sett av dobbel-trådete DNA, dvs oligonukleotidene 21 og 22/23 og 24 (kombinasjon-A); oligonukleotidene 25 og 26/27 og 28 (kombinasjon-B); oligonukleotidene 31 og 32/33 og 34 (kombinasjon-C) og oligonukleotidene 35 og 36/37 og 38/39 og 40 (kombinasjon-D), ble separert ligert med et DNA ligeringsanalysesett (Takara-Shuzo), og deretter ble kombinasjon-A ligert sammen med kombinasjon-B og likeledes kombinasjon-C med kombinasjon-D for å danne henholdsvis ligering-1 og ligering-2. Ved anvendelse av ligeringene -1 og -2 som templater ble PCR utført idet nukleotidene 41 og -42 for ligering-1, samt oligonukleotidene-43 og -44 for ligering-2, ble anvendt som primere. Produktene fra PCR til ligeringene-1 og -2 ble spaltet med SacI og EcoRV og med EcoRV og Hindin, etterfulgt av elektroforese på 2 % agarosegel og deretter rensing ved anvendelse av et Prep-A-Gene DNA rensningsanalysesett for å isolere omtrent 240 bp og 250 bp fragmenter. To fragmenter oppnådd på denne måten ble subklonet inn i pBluescript IIKS+ (Strategene) på forhånd spaltet med SacI og Hindin (E.coli DH5 ble anvendt som en vert). Av de resulterende klonene ble klonen som har basesekvensen vist i tabell 6 valgt for sekvensering og betegnet pBL(SH)(174-332) (se SEQ ID NO: 154).

Deretter ble pBL(XH)h6T(l-163) dannet i eksempel 42 som et templatutsatt for PCR i nærvær av følgende syntetiske oligonukleotider 45 og 46 som primere, og PCR produkte ble spaltet med BamHI og SacI etterfulgt av elektroforese på 6 % polyakrylamidgel for å isolere et fragment på omtrent 160 bp fra gelen.

Videre ble pBL(SH)(174-332) ble spaltet med SacI og Hindin og spaltningen ble deretter renset ved anvendelse av Prep-A-Gene DNA Purification analysesett for å tilveiebringe et fragment på omtrent 480 bp. De to fragmentene dannet ovenfor ble subklonet til pBluescript IIKS+ (Stratagene) på forhånd spaltet med BamHI og Hindin (E.coli DH5 ble anvendt som en vert).

Av de resulterende klonene ble klonen som har basesekvensen vist i tabell 7 valgt ved sekvensering og betegnet pBL(BH)(123-332) (seSEQ ID NO: 157). pBL(XH)h6T(l-163) fremstilt i eksempel 42 ble spaltet med BamHI og HindDI, og pBL(BH)(l23-332) fremstilt ovenfor ble likeledes spaltet for å produsere et fragment på omtrent 640 bp etter at de to fragmentene ble ligert sammen for å oppnå en klon pBL(XH)h6T(l-334). PCFM536/hMKT(l-163) fremstilt i eksempel 52 ble spaltet med Xbal og Sfil for å tilveiebringe et omtrent 270 bp fragment deretter ble ligert med pBL(XH)hMKT(1-334) spaltet med samme restriksjonsenzymer for å produsere en klon pBL(XH)hMKT(l-334). Etter pBL(XH)hMKT(1-334) var spaltet med Xbal og Hindin ble et omtrent 1040 bp fragment som koder for mutasjonstype human TPO aminosyrene 1-334 isolert og renset, og deretter klonet inn i pCFM536 (EP-A-136490) på forhånd spaltet med Xbal og Hindin (E.coli JM109 på forhånd transformert med pMWl (ATCC No. 39933) anvendt som en vert). Den resulterende klonen ble betegnet pCFM536/- hMKT(l-332) og E.coli stammen som inneholder denne ekspresjonsvektoren ble anvendt som en transformant for ekspresjon av mutasjonstypeprotein hMKT(l-332). Ekspresjonsplasmid pCFM536/hMKT(l-332) inneholder en DNA sekvens vist i SEQ ID NO: 14.

Ovennevnte tranformant ble dyrket i 60 ml LB medium inneholdende 50 ng/ml ampicillin og 12.5 ng/ml tetracyklin over natt ved 30 °C,og kulturen (25 ml) ble deretter tilsatt til 1000 ml LB mediuminneholdende 50 ng/ml ampicillin etterfulgt av risting av kulturen ved 36 °C helt til ODgQO nådde 1 0 nl 1 -2- Etter omtrent 330 ml LB medium ved 65 °C ble tilsatt til kulturen slik at den endelige temperaturen til kulturen ble 42 °C ble ristekulturen fortsatt i ytterligere 3 timer ved 42 °C for å indusere ekspresjon av varianthuman TPO, hMKT(l-332) protein, også referert til som [Met"<2>, Lys-^TPOØ-332).

Den oppnådde kulturen ble direkte utsatt for SDS-PAGE analyse. I SDS-PAGE analysen ble Multigel 15/25 (Dai-ichi Chemical Co) anvendt. Etter elektroforese og Coomassie Blue farving ble protein spesifikt for induksjon av ekspresjonen detektert ved en molekylvekt på omtrent 35 KD på gelen med hensyn på transformanten slik at ekspresjonen av hMKT(l-332) protein ble indusert. I tillegg etter SDS-PAGE og elektroblotting (ved anvendelse av nitrocellulosemembran) ble ovennevnte uttrykte protein omsatt med anti-HTl peptidantistoff dannet i eksempel 45. Etter farving ble et bånd detektert ved en molekylvekt på omtrent 35 kD som følgelig indikerer at hMKT(l-332) var uttrykt.

EKSEMPEL 67

Fremstilling av humane TPO substitusjons derivater, ekspresjon i COS7 celler og identifikasjon av aktivitet

Ifølge følgende prosedyrer om flere derivater av aminosyrene tilhuman TPO ble delvis substituert med andre aminosyrer er TPO aktiviteten blitt studert.

Vektor pSMT201 for ekspresjon i dyreceller, for anvendelse i dette eksemplet, ble konstruert som følger.

For det første ble ekspresjonsplasmid pCM-mEPORn som inneholder et cDNA for murin erytropoetinreseptor (oppnådd fra Dr D'Andrea i Dana Farbor Cancer Institute; Cell: 57,277-285 (1989)) behandlet med restriksjonsenzymene Kpnl og EcoRI og deretter elektroforesebehandlet på agarosegel for å isolere et pXM vektorfragment hvor cDNA for murin erytropoietinreseptor var fjernet. Deretter ble to oligonukleotider for innføring av forskjellige kloningsrestriksjonsseter inn i ovennevnte ekspresjonsvektor ble syntetisert ved anvendelse ay DNA synthesizer (ABI). Oligonukleotidene syntetisert hadde følgende grunnsekvens:

De to olgionukleotidene ble blandet og avkjølt for å danne en dobbelt nukleotid som deretter ble ligert med pXM vektoren oppnådd ovenfor i nærvær av T4 DNA ligase (Takara-Shuzo) for å gi en ekspresjonsvektor pDMT201. For å fjerne den murine DHFR cDMA inneholdende i pDMT201 fra pDMT201 ble vektorene pDMT201 og pEF18S separat spaltet med Noti og Hpal etterfulgt av agarosegelelektroforese for å isolere et stort fragment fra pDMT201 vektor DNA og et mindre fragment fra pEF18S vektor DNA. Deretter ble disse fragmentene ligert sammen ved anvendelse av T4 DNA ligase (Takara-Shuzo) for å produsere en ekspresjonsvektor pSMT201. pSMT201 som vist i fig 21 har et replikasjonsorigo til SV40, en enhancersekvens, adenovirus major late promotersekvens, et adenovirus tripatite ledersekvens, en spleisesignalsekvens, en SV 40 early polyadenyleringsetesekvens, et adnovirus VA RNA gensekvens, et replikasjonsorigo til pUC18 og et p-laktamasegen (Amp<1>), sammen med følgende restriksjons-seter for ligering av et ønsket gen: BgHI, PstI, Kpnl, Xhol, EcoRI, SmaL Spel og Noti seter. pHTP illustrert i eksempel 30 inneholdende fullengde human TPO cDNA ble spaltet med EcoRI og Spel for å tilveiebringe et fullengde human TPO cDNA fragment som deretter ble subklonet inn i en vektor pSMT201 på forhånd spaltet for å produsere et plasmid pSMT201-hTPO.

Ved anvendelse av det på denne måten oppnådde plasmid pSMT201-hTPO som et templat ble plasmid pGL-TPO/pBlue som ble anvendt som et templat for fremstilling av derivatene av interesse først konstruert som følger.

I pGL-TPO/pBlue ble tilsetning av kanin p-globinledersekvensen til S^ikke-transla-sjonssetet til human TPO forsøkt ifølge Annweilers method (Annweiler et al, Nucleic Acids Research, 19: 3750,1991). For dette formål ble følgende to DNA tråder som ble syntetisert kjemisk:

ligert med et fragment som var blitt oppnådd ved spaltning av vektoren Bluescript II SK+ (Toyo-boseki) med EcoRI og Smal for åprodusere en vektor pGL/pBlue hvor ledersekvensen var innskutt.

PCR ble utført ved anvendelse av følgende primersekvenser:

(dvs, 102-122 sekvens til SEQ ID NO. 7 hvortil Smal sekvensen var blitt ligert); og

(dvs, antisens til 1140-1160 sekvensen til SEQ ID NO:7, hvortil Spel og HindTfl sekvensene er blitt ligert).

PCR ble utført ved anvendelse av 1 ng av plasmidet pSMT201-hTPO DNA som et templat sammen med 10 nm syntetiske primere. Ved anvendelse av TaKaRa PCR Amplification Kit (Takara-Shuzo) og Programmable Thermal Controller (MJ Research) ble PCR utført i et volum på 100 ni under følgende betingelser: 3 sykluser med 94 °C 1 min, 55 °C 2 min og 72 °C 2 min/syklus; deretter 20 sykluser med 94 °C 45 sek, 55 °C 1 min og 72 °C 1 min/sykel. PCR produktet ble ekstrahert med kloroform og deretter metanol-presipitert to ganger etterfulgt av suspendering i 100 ni TE buffer.

Deretter ble PCR produktet utsatt for restriksjonsspaltning med Smal og Hindin ekstrahert med fenol/kloroform og presipitert med etanol. Det resulterende presipitatet ble løst opp i 10 ni TE buffer og deretter subklonet inn i vektor pGEL/pBlue som på forhånd var blitt spaltet med samme restriksjonsenzymer (Competent.High E.coli JM109 (Toyo-boseki) ble anvendt som en vert). Av oppnådde transformantceller ble 20 kloner valgt hvorifra plasmid DNA ble dannet vesentlig som beskrevet i Sambook et al, Molecular Cloning, Cold Spring Harbour Laboratory Press (1989). Renset plasmid DNA ble identifisert ved sekvensering ved anvendelse av Taq Dye Deoxy™ Terminaler Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems, Inc) og 373A DNA sekvenator (Applied Biosystems Inc). Som et resultat ble det bekreftet at plasmidet kodende for pGL-TPO/pBlue hadde ventet TPO cDNA sekvens uten noen substitusjon over hele lengden. Etter pGL-TPO/pBlue var spaltet med Bgffl og Spel ble spaltningen ekstrahert med fenol/kloroform og deretter etanol-presipitert. Det oppnådde presipitatet ble løst opp i 10 ni TE buffer og ble subklonet inn i vektor pSMT201 som var blitt spaltet med samme enzymer (CompitentHigh E.coli JM109 (Toyo-boseki) ble anvendt som en vert). I henhold til fremgangsmåten beskrevet i Molecular Cloning (Sambrook et al, supra) ble plasmid DNA dannet utifrå transformantceller. Den resulterende ekspresjonsvektoren pSMT/pGL-TPO hadde en struktur hvor p-globinledersekvensen og human TPO cDNA var koblet ved BglH/Spel restriksjonssetet nedstrøms for "sprice" signalsekvensen til pSMT201 vektoren som vist i fig 21. Denne pSMT/pGL-TPO vektoren ble anvendt for transfeksjon inn i COS celler.

For dannelse av humane TPO substitusjonsderivater ble PCR anvendt hvor metoden til Ito ble anvendt (Ito et al, Gene, 102:67-70,1991). To derivater av human TPO hvor Arg-25 og His-33 til human TPO er erstattet av Asn og Thr ble dannet for illustrering.

Disse derivatene kan bli referert til som [Asn<25>]TPO og [Thr<33>]TPO. I PCR ble følgende primere anvendt:

T7: 5-TAATACGACTCACTATAGGGCG-31 (SEQ ID NO: 164)

(tilsvarer T7 promotorregionen til Bluescript IISK+);

ABglH: 5'-AATTCCAAGATCACACACTTGC-3' (SEQ ID NO: 165)

(for substitusjon av BgHI gjenkjenningssekvensen);

ende: 5'-TCAAGCTTACTAGTCCCTTCCTGAGACAGATTCTG-3' (SEQ ID NO: 166)

(antisens til 1140-1160 til SEQ ID NO: 7 hvortil Spel og HindUJ sekvenser er blitt koblet);

N3: 5-TGGGCACTGGCTCAGGTTGCTGTGAAGGACATGGG-3' (SEQ ID NO:

167)

(Arg 25 -> Asn til SEQ ID NO: 7); og

09: 5-TGTAGGCAAAGGGGTAACCTCTGGGCA-31 (SEQ ID NO: 168)

(His-33 -> Thr of SEQ ID NO: 7).

Førstetrinn PCR ble utført ved anvendelse av 1 ng plasmid pVGL-TPO/pBlue DNA som et templat sammen med 10 ng av hver av de syntetiske primerene. Kombinasjoner av primerene var: [1] ABgUI og "ende" primerene; [2] T7 og N3; og [3] T7 og 09. Ved anvendelse av TaKaRa PCR Amplification Kit (Takara-Shuzo) og Programmable Thermal Controller (MJ Research) ble PCR utført i et volum på 100 ni under følgende betingelser: 3 sykluser med 94 °C 1 min, 55 °C 2 min og 72 °C 2 min/syklus; deretter 17 sykluser med 94 °C 1 min, 55 °C 2 min og 72 °C 2 min/syklus. Hver av PCR produktene ble ekstrahert med kloroform og presipitert to ganger med etanol, og presipitatet ble løst opp i 100 ni TE buffer. De resulterende PCR produktene (1 ni hver) ble deretter utsatt for en annen PCR. Kombinasjonene av templatene var: PCR produkter av [l]/[2] og PCR produkter av [l]/[3]. Med hensyn på primerene ble kombinasjonen av T7 og ende anvendt i to tilfeller. Etter inkubasjon ved 94 °C i 10 min og tilsetning av TaKaRa Taq ble PCR utført under følgende betingelser: 3 sykluser ved 94 °C 1 min, 55 °C 2 min og 72 °C 2 min/syklus; deretter 9 sykluser med 94 °C 45 sek, 45 °C 1 min og 72 °C 1 min/syklus. Til hver av de resulterende PCR produktene ble det tilsatt 1 ni proteinase K (5 mg/ml) 2 ni 0,5 M EDTA og 2 ni 20 % SDS, inkubert ved 37 °C i 30 min for å inaktivere Taq, ekstrahert med fenol/kloroform og etanol-presipitert. Deretter ble presipitatet løst opp i 20 ni sterilt vann og spaltet med BgJJI og Spel, etterfulgt av fenol/kloroformekstrahering og etanolpresipitering. Presipitatet oppnådd på denne måten ble løst opp i 10 ni TE buffer og deretter subklonet inn i ekspresjonsvektor pSMT201 som på forhånd var blitt spaltet med samme restriksjonsenzymer og behandlet med kalvetarmalkalisk fosfatase (Boehringer-Mannheim) (Competent High E.coli: JM109 ble anvendt som en vert). Av de oppnådde transformantcellene ble i hvert tilfelle to kloner valgt hvorifra plasmid DNA ble dannet vesentlig som beskrevet i Molecular Cloning (Sambook et al, supra). Rensede plasmid DNA ble sekvensert ved anvendelse av 373A DNA sekvenator og Taq Dye Deoxy™ Terminaler CYcle Sequencing Kit (begge Applied Biosystems Inc.).

Plasmid dannet ved PCR med anvendelse av primerene [1] og [3] inneholdt et cDNA kodende for et TPO substitusjonsderivat (09/TPO). Aminosyresubstitusjonen til His33(CAC) med Thr(ACC) og ekstensjon av opprinnelig C-terminus (Gly 332) ved tilsetning av aminosyresekvensen TSIGYPYDWDYAGVHHHHHH (SEQ ID NO: 169) ble bekreftet. Dette derivatet ble referert til som [Thr<33>, Thr333, Ser334, Ile335, Gly336, Tyr33? Pro338, Tyr33?, Asp340, Val341, Pro342, Asp343, Tyr344, Ala345, Gly346, Val347, His348, His34?, His35<0>, His35<1>, His3<52>, His<353>]TPO.

Plasmid dannet ifølge PCR med anvendelse av primerene [1] og [2] inneholdt derimot et cDNA kodende for et TPO substitusjonsderivat (N3/TPO). Aminosyresubstitusjonene til Arg25(AGA) med Asn(AAC) og Glu231(GAA) med Lys(AAA) og ekstensjon av opprinnelig C-terminus (Gly332) ved tilførsel av aminosyresekvensen TSIGYPYDWDYAGVHHHHHH ble bekreftet. Dette derivatet ble refert til som [Asn25, Lys231, Thr333, Ser334, Ile335, Gly336, Tyr337, Pro338, Tyr33? Asp340, Val34<*>, Pro342, Asp343, Tyr34<4>, Ala345, Gly346, Val34<7>, His348, His34? His350, His351, His35<2>, His<353>]TPO.

Transfeksjon inn i COS7 cellene til hver klon som ble oppnådd ble utført ifølge DEAE-dekstranmetoden inkludert kloroquinbehandling som beskrevet i eksempel 35. 40 ng av hver av plasmid DNA ble anvendt i transfeksjonen og etter 5 dager ble kultursupernatanten isolert og deretter konsentret til et volum på 1/20 ved anvendelse av Centricon-30 (Amicon) for å vurdere deres TPO aktivitet ifølge M-07e analysen. Som et resultat ble kultursupernatantene til COS7 cellene hvori plasmider inneholdende cDNA kodende for human TPO substitusjonsderivatene N3/TPO og 09/TPO ble transfektert ble TPO aktiviteten detektert på en dose-avhengig måte (se fig 22).

EKSEMPEL 68

Preparering av innskudd- eller delesjonderivater av human TPO, ekspresjon derav i COS7 celler og identifikasjon av TPO aktivitet

Dette eksemplet viser om innskudd eller delesjonsderivater av hTPO 163 har en TPO aktivitet.

Derivatene som ble dannet var et His33-delesjonsderivat ([AHis<33>]TPO(l-163), dH33); et Glyl 16-delesjonsderivat ([AGly<116>]TPO(l-163), dGl 16); et Argl 17-delesjonsderivat ([AArg<117>]TPO(l-163), dR116), et Thr-innskuddsderivat ([His<33>, Thr33', Pro34]TPO-(1-163), T33'), et Ala-innskuddsderivat ([His<33>, Ala<33>', Pro<34>]TPO(l-163), A33') og et Gly-innskuddsderivat ([His<33>, Gly33', Pro34, Ser<38>]TPO(l-163), G33) hvori Thr, Ala og Gly er blitt uavhengig skutt inn mellom His33 og Pro34; og et Asn-innskuddsderivat ([Gly116, Asn116', Arg117]TPO(l-163), NI 16'), et Ala-innskuddsderivat ([Gly116, Ala116', Arg117]TPO(l-163), Al 16') og et Gly-innskuddsderivat ([Gly116, Gly116', Arg<117>]TPO(l-163), Gl 16') hvori Asn, Ala og Gly uavhengig er blitt skutt inn mellom Glyl 16 og Argl 17, og alle sekvensene er basert på SEQ ID NO: 13.

Blant derivatene antas T331 og NI 16' å innføre mucintype og Asn-bindingstype sukkerkjeder.

Ovennevnte derivater ble dannet ved anvendelse av PCR ifølge metoden beskrevet av Ito et al (Gene, 102: 67-70,1991). Primersekvensene som ble anvendt i PCR er som følger: dH33: 5'-TGTAGGCAAAGGAACCTCTGGGCA-3' (SEQ ID NO: 172) (for preparering av His33-delesjonsderivatet basert på sekvensen vist i SEQ ID NO: 7); T33': 5'-TGTAGGCAAAGGAGTGTGAACCTCTGG-3' (SEQ ID NO: 173) (for preparering av Thr-innskuddsderivatet hvor Thr er skutt inn mellom His33 og Pro34 i sekvensen vist i SEQ ID NO: 7);

A33': 5-TGTAGGCAAAGGAGCGTGAACCTCTGG-31 (SEQ ID NO: 174) (for preparering av Ala-innskuddsderivatet hvor Ala er skutt inn mellom His33 og Pro34 i sekvensen vist i SEQ ID NO: 7);

G33': 5,-TGTAGGCAAAGGTCCGTGAACCTCTGG-3' (SEQ ID NO: 175) (for preparering av Gly-innskuddsderivatet hvor Gly er skutt inn mellom His33 og Pro34 i sekvensen vist i SEQ ID NO: 7);

dGl 16: 5'-AGCTGTGGTCCTCTGTGGAGGAAG-3' (SEQ ID NO: 176) (for preparering av Glyl 16-delesjonsderivatet basert på sekvensen vist i SEQ ID NO: 7); dRl 17: 5-GTGAGCTGTGGTGCCCTGTGGAGG-3* (SEQ ID NO: 117) (for preparering av Argl 17-delesjonsderivatet basert på sekvensen vist i SEQ ID NO: 7); NI 16': S^AGCTGTGGTCCTGTTGCCCTGTGGAGG-S' (SEQ ID NO: 178) (for preparering av Asn-innskuddsderivåtet hvor Asn er skutt inn mellom Glyl 16 og Argl 17 i sekvensen vist i SEQ ID NO: 7);

Al 16': 5-AGCTGTGGTCCTAGCGCCCTGTGGAGG-3' (SEQ ID NO: 179) (for preparering av Ala-innskuddsderivatet hvor Ala er skutt inn mellom Glyl 16 og Argl 17 i sekvensen vist i SEQ ID NO: 7);

Gl 16': 5'-AGCTGTGGTCCTTCCGCCCTGTGGAGG-3* (SEQ ID NO: 180) (for preparering av Gly-innskuddsderivåtet hvor Gly er skutt inn mellom Glyl 16 og Argl 17 1 seveksen vist i SEQ ID NO: 7);

dRI: 5-CGGGCTGCAGGATATCCAAGATCTCA-31 (SEQ ID NO: 181) (for substitusjon av en restriksjonsenzym EcoRI-gjenkjenningssekvens);

T7: 5'-TAATACGACTCACTATAGGGCG-3' (SEQ ID NO: 182) (tilsvarer T7 promotorregionen til BluescriptnSK<4>"); og endNotl: 5'-GGGCGGCCGCTCAGCTGGGGACAGCTGTGGTGGG-3' (SEQ ID NO: 183)

(antisens til 633-653 nukleotidsekvensen til SEQ ID NO: 7, hvor et termineringskodon og en Noti gjenkjenningssekvens er blitt tilsatt).

Et første trinn i PCR ble utført ved anvendelse, som et templat, 1 ng av plasmid pGL-TPO/pBlue DNA dannet i eksempel 67 og anvendelse av 10 ug syntetiske primere. Kombinasjonen av primere var: [1] dRI og endNotl eller [2] T7 og muterte primere (dH33, A33', G33', T33\ dGl 16, dRI 17, Al 16', Gl 16' og NI 16'). I PCR ble TaKaRa PCR Amplification Kit (Takara-Shuzo) og Programmable Thermal Controller (MJ Research) anvendt og PCR ble utført i et sluttvolum på 100 ul. I første PCR reaksjon ifølge [1] var en syklus 94 °C 1 min, 45 °C 2 min og 72 °C 2 min og 3 sykluser ble utført, etterfulgt av 17 sykluser hvor en syklus utgjorde 94 °C 45 sek, 45 °C 1 min og 72 °C 1 min. Derimot ble den første PCR reaksjon ifølge [2] utført under betingelser med 94 °C 1 min, 55 °C 2 min og 72 °C 2 min i 3 sykluser etterfulgt av 94 °C 45 sek, 55 °C 1 min og 72 °C 1 min i 17 sykluser. Hver av PCR produktene ble ekstrahert med kloroform før to etanolpresipiteringer, og deretter ble det resulterende presipitatet løst opp i 100 ul TE buffer.

Deretter ble et annet PCR trinn utført ved anvendelse av 1 ni av hver av PCR produktene ifølge [1] og [2]. Primerene som ble anvendt var en kombinasjon av T7 og EndNotl. Etter inkubasjon ved 94 °C i 10 min ble det til hver PCR reaksjonsblanding tilsatt TaKaRa Taq. Den andre PCR ble utført under betingelser med 94 °C 1 min, 55 °C 2 min og 72 °C 2 min i 3 sykluser etterfulgt av 94 °C 45 sek, 55 °C 1 min og 72 °C 1 min i 9 sykluser. Til hvert PCR produkt oppnådd på denne måten ble det tilsatt 1 ni 5 mg/ml proteinase K, 2 ni 0,5 M EDTA og 2 ni 20 % SDS, og blandingen ble oppbevart ved en temperatur på 37 °C i 30 min for å inaktivere Taq. PCR produktet ble ekstrahert med fenol/kloroform etterfulgt av etanol-presipitering, og det resulterende presipitatet ble deretter løst opp i 20 ni sterilt vann. Etter spaltning med EcoRI og Noti ble oppløs-ningen ekstrahert med fenol/kloroform og deretter presipitert med etanol. Det oppnådde presipitatet ble løst opp i 10 ni TE buffer, og subklonet inn i en ekspresjonsvektor pEF18S som på forhånd var blitt spaltet med samme restriksjonsenzymer og behandlet med alkalisk fosfatase (fra kalvetarm, Boehringer-Mannheim). En anvendt vertcelle var Competent-High E.coli JM109 (Toyo-Boseki). Fra transformanten oppnådd på denne måten ble et plasmid DNA dannet vesentlig ifølge metoden beskrevet i Molecular Cloning (Sambook et al, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)). Deretter ble

nukleotidsekvensen til renset plasmid DNA bekreftet ved anvendelse av Taq Dye

i Deoxy™ Terminaler Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems) og ved anvendelse av Applied Biosystems 373A DNA sequencer. Som et resultat ble det bekreftet at alle plasmidene som koder for dH33, A33', T33', dGl 16, dRI 17, Al 16', Gl 16' og NI 16' hadde ventet TPO cDNA sekvens uten noen substitusjon av en nukleotidsekvens ved

seter forskjellig fra de antatte setene. IG33' ble en basesubstitusjon [Pro38 (CCT) Ser (TCT)] forskjellig fra den som var ved det antatte setet observert.

Transfeksjon av hver klon oppnådd inn i COS7 celler ble utført i henhold til metoden i eksempel 11. Transfeksjonen ble utført ved anvendelse av 10 ng av hvert plasmid DNA

ifølge DEAE-dekstranmetoden inkludert kloroquinbehandling, og etter 4 til 5 dager ble i kultursupernatanten isolert og deretter vurdert ifølge M-07e analysesystemet. Som et resultat ble det i hver supematant av COS7 cellekulturene transfektert med plasmider kodende for et arninosyreinnskudd eller et delesjonsderivat detektert TPO aktivitet på en dose-avhengig måte (se fig 23). Derimot ble det ikke funnet TPO aktivitet i

supernatanten til COS7 cellekulturen som viser at ekspresjonsplasmid pEF18S ikke

i inneholdt et cDNA kodende for et TPO derivat som var blitt transfektert i og uttrykt.

EKSEMPEL 69

Preparering og rensing av anti-human TPO peptidantistoffer

(1)6 regioner (vist i tabell 8) som blir betraktet som relativt egnede som antigener ble

valgt utifrå aminosyresekvensen til human TPO ifølge SEQ ID NO: 191, hvorifra et 4-trådet peptid av et multipel antigenpeptid (MAP) type ble syntetisert ifølge Tams

metode (Proe. Nati. Acad. Sei., USA, 85,5409-5413,1988). To kaniner ble immunisert i åtte ganger hver med 100 ug av dette peptidet.

Enkelt-trådete peptider ble produsert ved binding av cysteinresidier til C-terminalen til hvert av peptidregionene vist ifølge SEQ ID NOS: 119-124 (disse er referert til som

peptidregion HT 1 til 6 regioner, som er delpeptider tilsvarende 8 til 28,47 til 62,108 til 126,172 til 190, 262 til 284 og 306 til 332, av sekvensen ifølge SEQ ID NO: 191). Ved anvendelse av disse som testantigener ble antistoffVerdiene i sera oppnådd fra de på denne måten immuniserte kaninene målt ifølge enzym-immunanalyse hvorifra økningen i antistoffVerdien ble bekreftet i alle sera som ble testet. Disse sera ble følgelig referert til som anti-sera.

I tillegg ble oven-nevnte enkelt-trådete syntetiske peptid med cysteinresidiet bundet til dets C-terminal anvendt også som et antigen for affinitetsrensing av anti-sera i følgende (2). (2) To kaniner ble hver immunisert med et av de ovennevnte antigenpeptidene og antistoffet avledet fra hver av alle på denne måten immuniserte kaniner ble dannet separat. For anti-HTl peptidantistoffer ble anti-HTl-1 peptidantistoff og anti-HTl-2 peptidantistoff avledet fra to immuniserte kaniner oppnådd.

Som et eksempel er rensing av anti-HTl-1 peptidantistoff illustrert nedenfor.

Først ble 30 mg av enkelt-trådet peptid av HT1 med cysteinresidie bundet dertil koblet til 12 ml Sulfo Link Coupling Gel (produsert av Pierce Co, ifølge katalog No. 44895). En peptidoppløsning inneholdende antigenet ble koblet til gelen som var blitt ekvilibrert med koblingsbuffer (50 mm Tris, 5 mm EDTA-Na, pH 8,5) med 6 ganger volumet av gelen, over en periode på 15 minutter. Etter å blitt latt stå statisk som den var i 30 minutter ble gelen vasket med koblingsbuffer tre ganger volumet av gelen. Deretter ble koblingsbuffer inneholdende 0,05 M L-cystein-HCl tilsatt til gelen i en rate på 1 ml/ml gel hvorved ikke-behandlede grupper ble blokkert over en periode på 15 minutter. Etter å ha blitt latt stå i 30 minutter ble gelen vasket med koblingsbuffer ved 8 ganger volumet av gelen. Ovennevnte koblingsoperasjon ble utført ved romtemperatur. På denne måten ble det antigenregion-inneholdende peptidet koblet på gelen ved kovalent binding, ved en koblingseffektivitet på 28.3 % for å danne en antigenpeptidgel med 0.8 mg av peptidet koblet på 1 ml gel, i antigenkolonnen. Etter å ha samlet alt blodet fra hver immuniserte kanin ble 78.4 ml anti-serum inneholdende anti-HTl-1 peptid antistoff oppnådd. 76.7 ml anti-serum (med et proteininnhold på 3620 mg) ble tilsatt til antigenkolonnen som på forhånd var blitt ekvilibrert med 50 mM fosfatbuffer (pH 8) inneholdende 150 mM NaCl og 0.05 % natriumazid og deretter ble kolonnen vasket med samme buffer. Følgelig ble 105.9 ml av en passerende fraksjon (med et proteininnhold på 3608 mg) oppnådd. Deretter ble den adosrberte fraksjonen eluert med 0.1 M sitronsyrebuffer (pH 3.0) som deretter øyeblikkelig ble nøytralisert ved tilsetning av 21.1 ml 0.1 M karbonatbuffer (pH 9.9), konsentrert ved ultrafiltrering (ved anvendelse av YM30 membran produsert av Amicon Co.) og renset i 50 mM fosfatbuffer (pH 8) inneholdende 150 mM NaCl og 0.05 % natriumazid. Følgelig ble 11.2 ml av et renset anti-HTl-1 peptidantistoff (med et proteininnhold på 77.7 mg) oppnådd i bufferen. På samme måte som ovenfor ble anti-HTl-2 peptidantistoff (60.0 mg), anti-HT2-l peptidantistoff (18.8 mg), anti-HT2-2 peptidantistoff (8.2 mg) osv oppnådd.

Anti-HT3 til anti-HT6 peptidantistoffer blir oppnådd på samme måte som ovenfor.

EKSEMPEL 70

Deteksjon av TPO Westernanalyser

(1) For å vurdere anti-sera oppnådd i eksempel 69 ble disse testet på samme måte som nevnt nedenfor.

En standardprøve av rekombinant human TPO som var blitt delvis renset fra supernatanten til kulturen til CHO celler hvori et gen kodende for aminosyrene -21 til 332 av SEQ ID NO:6 var blitt innført og uttrykt, ble utsatt for SDS-polyakrylamidelektroforese (SDS-PAGE) ifølge en vanlig metode og deretter elektrisk blottet på en PVDF eller nitrocellulosemembran. Etter blottingen ble membran vasket med 20 mM Tris-HCl og 0.5 M NaCl (pH 7.5) (TBS) i 5 minutter, deretter vasket to ganger hver med 0.1 % Tween 20 inneholdende TBS (TTBS) i 5 minutter og behandlet med et blokkeringsmiddel (Block Ace; produsert av Dai-Nippon Pharmacutical Co, som katalog No. UK-B25) i 60 minutter. Anti-sera hver inneholdende en av anti-HTl-1 peptidantistoff, anti-HT2-1 peptidantistoff, anti-HT3-2 peptidantistoff, anti-HT4-l peptidantistoff, anti-HT5-2 peptidantistoff og anti-HT6-l peptidantistoff ble hver fortynnet med TTBS oppløsning inneholdende 0.05 % BSA og 10 % Block Ace til 1/1000 fortynninger. De fortynnede antistoffene ble anvendt for Westernanalyse som primære antistoffer. Rekombinant human TPO prøve prosessert som ovenfor ble behandlet med TTBS oppløsning inneholdende anti-TPO peptidantistoff, 0.05 % BSA og 10 % Block Ace i 60 minutter og deretter vasket med TTBS i 5 minutter. Deretter ble dette behandlet med TTBS opp-løsning inneholdende anti-kanin (ab') geitebiotinert antistoff (produsert av Caltag Co. som katalog No. L43015), som sekundært antistoff, sammen med 0.05 % BSA og 10 % Block Ace, i 60 minutter og deretter vasket to ganger hver med TTBS i 5 minutter. Deretter ble dette behandlet med en 1/5000 fortynning av alkalisk fosfatase-merket avidin (produsert av Leinco Technologies Co. som katalog No. Al 08) fortynnet med 10 % Block Ace-inneholdende TTBS oppløsning, i 30 minutter, og deretter vasket to ganger hver med TTBS i 5 minutter og deretter med TBS i 5 minutter. Deretter ble dette utviklet ved anvendelse av et alkalisk fosfatasesubstrat (produsert av Bio-Rad Co., som katalog No. 170-6432). Ovennevnte Westernanalyse ble utført ved romtemperatur som verifiserte at human TPO var gjenkjent og detektert av anti-sera. (2) 3 mg av hver av anti-HTl-1 peptidantistoff, anti-HTl-2 peptidantistoff, anti-HT2-l peptidantistoff og anti-HT2-2 peptidantistoff som var blitt renset ved affinitetskromatografi i eksempel 69 ble veid og biotinert ved kobling av disse på aktivert biotin (NHS-LC-Biotin II, produsert av Pierce Co, som katalog No. 21336). Den samme standardprøven av rekombinant human TPO som den som ble anvendt i det foregående (1) ble utsatt for SDS-PAGE, deretter elektrisk blottet på en PVDF eller nitrocellulosemembran, og utsatt for vanlig Westernanalyse ved anvendelse av hver av disse bio-tinerte antistoffene som primære antistoffer. Øyeblikkelig etter blotting ble membranen vasket med TBS i 5 minutter og deretter vasket to ganger hver med TTBS i 5 minutter, og deretter ble dette behandlet med et blokkeringsmiddel (Block Ace) i 60 minutter. Deretter ble dette behandlet med TTBS oppløsning inneholdende 1 ng/ml biotinert anti-TPO peptidantistoff, 0.05 % BSA og 10 % Block Ace i 60 minutter og deretter vasket to ganger hver med TTBS i 5 minutter. Deretter ble dette behandlet med en 1/5000 fortynning av alkalisk fosfatase-merket avidin (produsert av Leinco Technologies Co. som katalog No. A108) fortynnet med 10 % Block Ace-innholdende TTBS oppløsning, i 30 minutter, og deretter vasket to ganger hver med TTBS i 5 minutter og deretter TBS i 5 minutter. Dette ble deretter utviklet ved anvendelse av et alkalisk fosfatasesubstrat

(produsert av Bio-Rad Co, som katalog No. 170-6432). Ovennevnte Westernanalyse ble utført ved romtemperatur som verifiserte at human TPO ble gjenkjent og detektert av rensede antistoffer.

EKSEMPEL 71

Preparering av anti-TPO peptidantistoffkolonner og deteksjon av human TPO

i

Humane TPO peptidantistoffer oppnådd i eksempel 69 ble verifisert for å gjenkjenne human TPO. Disse antistoffene ble separat koblet på en kromatografibærer for å danne anti-TPO peptidantistoffkolonner. Som et eksempel blir preparering av anti-HTl-2 peptidantistoffkolonner illustrert nedenfor.

(1) En oppløsning omfattende 50 mM Na fosfat og 0.15 M NaCl (pH 8.0) og inneholdende 5 mg/ml antistoff ble dannet. 0.8 ml av denne oppløsningen ble kombinert og koblet med 1.54 ml en svellet formyl-aktivert gel (Formyl-Gellulofine, produsert av

Chisso Co.) ved 4 °C i 2 timer. Deretter ble 1.1 ml av en oppløsning inneholdende 10 mg/liter av et reduksjonsmiddel (trimetylaminboran (TMAB) produsert av Seikagaku Kogyo K.K som katalog No. 680246) tilsatt og koblet videre i ytterligere 4 timer. Deretter ble bare geldelen isolert fra reaksjonsblandingen ved sentrifugering. 10 ml rent vann ble tilsatt og bare geldelen ble isolert fra dette ved sentrifugering. Denne prosessen ble gjentatt fire ganger hvorved det ikke-reagerte antistoffet ble fjernet. Deretter ble den på denne måten isolerte gelen behandlet med 2.1 ml av en blokkeringsbuffer 0.2 M Na fosfat, 1 M etanolamin, pH 7.0) og 1.1 ml av oppløsningen av reduksjonsmiddel som var blitt tilsatt dertil, ved 4 °C i 2 timer, hvorved de aktive gruppene i den ikke-reagerte gelen ble blokkert. Til slutt ble den resulterende gelen vasket med vann, 20 mM Tris-HCl og 0.15 M NaCl (pH 8.0) ved bruk av en sentrifuge. Dette ble fylt inn i et lite kolonnerør, som ble vasket med 3 M natriumtiocyanatoppløsning og 0.1 M glycin-HCl (pH 2.5) oppløsning og deretter på ny ekvilibrert med 20 mM Tris-HCl og 0.15 M NaCl (pH 8.0). Den på denne måten ekvilibrerte kolonnen ble lagret.

Anti-TPO peptidantistoffgelen i anti-HTl-2 antistoffkolonnen hadde en koblingseffektivitet på opptil 94,2 % for hver IgG fraksjon. Mengden av IgG fraksjonen koblet på gelen pr enhet volum av gelen var 1.9 mg/ml-gel. På samme måte som ovenfor ble en gel dannet hvor 21.8 mg, pr ml av gelen av IgG uten TPO som antigen var blitt koblet. Dette ble anvendt som en pre-kolonne (nedenfor referert til som en pre-antistoffkolonne) for å fjerne uspesifikt bundede molekyler fra TPO antistoffkolonnene, som nevnt i (2). (2) Et annet eksempel på preparering av en anti-HTl-2 antistoffkolonne er illustrert nedenfor.

En standard prøve av rekombinant human TPO som er blitt delvis renset fra supernatanten til kulturen av CHO cellene hvor et gen kodende for aminosyresekvensen til hvilke som helst av SEQ ID NOS: 119-124 var blitt introdusert og uttrykt ble tilsatt til pre-antistoffkolonnen (inneholdende 1 ml gel) preparert i (1), og 10 ganger volumet av gelen av 20 mM Tris-HCl (pH 8.0) og 0.15 M NaCl ble ført igjennom kolonnen, hvorved fraksjonen som går igjennom kolonnen ble samlet. Deretter ble fraksjonen adsorbert til pre-antistoffkolonnen eluert med 10 ganger volumet av gelen til et surt elueringsmiddel (0.1 M glycin-HCl, pH 2.5). Deretter ble fraksjonen som var gått igjennom preantistoffkolonnen tilsatt til anti-HTl-2 antistoffkolonnen (inneholdende 2 ml gel) preparert i (1) og kolonnen ble vasket med 10 ganger volumet av gelen bestående av 20 mM Tris-HCl (pH 8.0) og 0.15 M NaCl, mens fraksjonen som går igjennom anti-HTl-2 antistoffkolonnen blir samlet. Deretter ble fraksjonen adsorbert til anti-HTl-2 antistoffkolonnen eluert med 8 ganger volumet av gelen av et surt elueringsmiddel (0.1 M glycin-HCl, pH 2.5). Disse fraksjonene ble analysert ved SDS-PAGE som verifiserte at TPO ikke ble adsorbert til pre-antistoffkolonnen, men ble spesifikt bundet til anti-HTl-2 antistoffkolonne, og at nesten alt tilsatte TPO i prøven ble bundet til sistnevnte kolonne. Utifrå dette ble det bekreftet at minst fra 200 til 300 ug/ml gel TPO var bundet til gelen i sistnevnte kolonne.

EKSEMPEL 72

Virkning av TPO på økning av antallet blodplater

20 normale ICR stamme hannmus, 8 uker gamle (blod var allrede samlet fra deres orbitvener og antall blodplater ble målt ved anvendelse av en mikrocelleteller F-800 fremstilt av Toa Iyo Denshi) ble tilfeldig delt inn i fire grupper. En av de fire gruppene (en kontroll-iv gruppe) ble injisert med 100 \ A PBS intravenøst en gang daglig i 5 påfølgende dager. En av de andre gruppene (TPO-iv gruppe) ble injisert med 100 ni av en oppløsning) dannet ved erstatning av den konsentrerte oppløsningen av TPO aktiv fraksjon F2 til SP Sepharose Fast Flow oppnådd i eksempel 56 med PSB ved anvendelse av en NAP-25 kolonne (Pharmacia Biotech; Catalog No. 17-0852-02) etterfulgt av fortynning med PBS; inneholdende relativ aktivitet, 211,900 ifølge M-07e analyse) intravenøst en gang daglig i 5 påfølgende dager. En annen gruppe (kontroll-sc gruppe) ble injisert med 100 mikroliter PBS subkutant en gang daglig i 5 påfølgende dager mens den gjenværende gruppen (TPO-sc gruppen) ble injisert med 100 mikroliter en gang

daglig i 5 påfølgende dager på samme måte som i TPO-iv gruppen subkutant. Etter 6, 8, 10,13 og 15 dager fra begynnende administrering ble blod samlet fra orbitvenen til hver av musene og antall blodplater ble opptelt ved anvendelse av en mikrocelleteller (F-890; fremstilt av Toa Iyo Denshi). Forandringer i antall blodplater er angitt i fig 24.1

kontroll-iv gruppen ble blodplateantallet økt med 44 % sammenlignet med før administrering selv på dag 6 (dag 0 er adrninistreringsdagen) hvor blodplateantallet var høyest og, i kontroll-sc gruppen, ble en 47 % økning angitt selv på dag 8 hvor tallene var høyest. I TPO-iv gruppen ble en 177 % økning registrert på dag 6 sammenlignet med antallene før administrering og, i TPO-sc gruppen, ble en økning på 347 % angitt allerede på dag 6, og på dag 8 ble den høyeste økningen på 493 % oppnådd.

Utifrå ovennevnte resultater er det blitt bekreftet at human TPO øker antallet blodplater uavhengig av forskjell i type og også av administreringsvei.

EKSEMPEL 73

Virkning av TPO for økning av antallet blodplater

16 normale C3H/HeJ stamme hannmus, 11 uker gamle (blod var allerede tappet fra deres orbitvener og antall blodplater ble målt ved anvendelse av en mikrocelleteller type F-800 fremstilt av Toa Iyo Denshi) ble delt inn i fire tilfeldige grupper. En av fire gruppe (en kontrollgruppe) ble injisert med 100 mikroliter PBS subkutant en gang daglig i 5 påfølgende dager. En annen gruppe (TPO-1 gruppen) ble injisert subkutant med 100 mikroliter av en oppløsning (preparert ved substituering av TPO aktiv fraksjon Sepha cryl S-200HR oppnådd i eksempel 56 med PBS ved anvendelse av NAP-25 etterfulgt av fortynning med PBS; inneholdende relativ aktivitet, 83.000 ifølge M-07e

analyse) en gang daglig i 5 påfølgende dager. En annen gruppe (TPO-2 gruppen) ble

i injisert med 100 mikroliter av en oppløsning (dannet ved fortynning av den TPO aktive fraksjonen anvendt i TPO-1 gruppen med PBS i en grad på 2-ganger; inneholdende relativ aktivitet, 41.500 ifølge M-07e analyse) subkutant en gang daglig i 5 påfølgende dager. Den siste gruppen (TPO-3 gruppen) ble injisert med 100 mikroliter av en

oppløsning (dannet ved fortynning av den TPO aktive fraksjonen anvendt i TPO-2

> gruppen i en grad på 2-ganger; inneholdende relativ aktivitet, 20,750 ifølge M-07e analysen) subkutant en gang daglig i 5 påfølgende dager.

Blod ble samlet fra orbitvenene til mus på dag 6, 8,10 og 12 etter injeksjon og antall

blodplater ble opptelt ved anvendelse av en mikrocell teller (type F-800; fremstilt av

i Toa Iyo Denshi).

Forandringene i antall blodplater er gitt i fig 25.1 kontrollgruppen var det omtrent ingen forandringer i antall blodplater mens i grupper som ble injisert med TPO var det

økninger i antall blodplater i alle gruppene i den grad at antallene var høyere på dag 8 » etter injeksjon. Forskjell i dose-respons ble i tillegg bemerket blant gruppene. I TPO-1

gruppen ble følgelig en 200 % økning allerede registrert på dag 6 og økningen økte til omtrent 270 % på dag 8 og deretter ble en reduksjon bemerket, selv på dag 12, omtrent en 65 % økning var fortsatt merkbar idet det fortsatt var en signifikant forskjell fra

kontrollgruppen (p < 0,01; ifølge Dunnet multiple comparison test). I TPO-2 gruppen

i ble samme økning oppdaget og, til tross for at den økende virkningen var mindre enn TPO-1 gruppen, ble økning på omtrent 140 % og omtrent 160 % bemerket på dagene 6 og 8. På dag 12 ble antallet redusert til nesten det samme nivået som kontrollgruppen. Den økende virkningen til TPO-3 gruppen var svakere enn TPO-2 gruppen og på dag 8

var tallene høyest, omtrent en 110 % økning ble angitt og det var igjen en signifikant

i forskj ell (p < 0,01) fra kontrollgruppen.

Fra ovennevnte resultater er det blitt bekreftet at human TPO øker blodplatetallene uavhengig av musestamme og at dets virkning har en dose-reagerende egenskap.

EKSEMPEL 74

En inhiberende virkning av TPO på thrombocytopeni forårsaket av administrering av anti-cancermiddel

30ICR hannmus, 8 uker gamle, ble injisert med 200 mg/kg 5-FU intravenøst og tilfeldig delt inn i to grupper (hver gruppe omfatter 15 mus). Fra neste dag (dag 1) ble en av gruppene (kontrollgruppen) injisert med 100 mikroliter PBS subkutant en gang daglig i 5 påfølgende dager, mens en annen gruppe (TPO gruppe) ble injisert med 100 mikroliter TPO aktiv fraksjon anvendt i eksempel 72 (inneholdende relativ aktivitet, 211,900 ifølge M-07e analysen) subkutant en gang daglig i fem påfølgende dager. På dagene 4, 6 og 8 ble hver 5. mus tilfeldig valgt fra hver av gruppene og deretter ble blod samlet fra orbitvenene og antall blodplater ble opptelt ved hjelp av en mikrocelleteller (type E-2500; fremstilt av Toa Iyo Denshi). Forandringer i antall blodplater er gitt i fig 26.1 kontrollgruppen var antall blodplater etter administrering av 5-FU redusert ettersom

dagene gikk og på dag 6 var verdien lavest (omtrent 28 % av verdien for administrering av 5-FU), men på dag 8 ble det registrert en omtrent 1.3-ganger økning som reaksjon på reduksjonen. Selv når det gjelder en TPO gruppe var antall blodplater etter administrering av 5-FU redusert ettersom dagene gikk og på dag 6 var verdien lavest (omtrent 52 % av verdien før administrering av 5-FU). Forskjellen mellom antall blodplater på dagene 4 og 6 var meget små, og på dag 6 fremkom en signifikant (p < 0.05; ifølge en "Dunnet multiple comparison test") høy verdi sammenlignet med kontrollgruppen. På dag 8 var det økning på omtrent 200 % av verdien før 5-FU administrering.

Utifrå ovennevnte resultat er det blitt bekreftet at human TPO inhiberer reduksjonen av blodplatetallet forårsaket av anti-cancermidlet.

EKSEMPEL 75

En terapeutisk virkning av TPO for thrymbocytopenin

Nimustinhydroklorid (ACNU) (50 mg/kg) ble injisert intravenøst til hver av 36 ICR hannmus som var 7 uker gamle og deretter ble musene tilfeldig delt inn i to grupper (hver gruppe omfatter 18 mus). Fra neste dag (dag 1) ble en av gruppene (kontrollgruppen) injisert med 200 mikroliter PBS subkutant to ganger daglig i påfølgende dager, mens en annen gruppe (TPO gruppe) ble injisert med 200 mikroliter av TPO aktiv fraksjon anvendt i eksempel 73 (uten fortynning med PBS) hvortil 0,04 % Tween 80 var tilsatt (inneholdende relativ aktivitet, 380,000 ifølge M-07e analyse) subkutant to ganger daglig de påfølgende dager.

Etter injeksjon ble musene i hver gruppen tilfeldig delt inn i tre grupper og fra en gruppe ble blod samlet på dagene 5 og 12 og fra en annen gruppe på dagene 8 og 14 og fra gjenværende gruppe på dag 10. Blod ble samlet fra orbitvenene og antallet blodplater ble opptelt ved hjelp av en mikrocelleteller (type F-800; fremstilt av Toa Iyo Denshi). Forandringer i antall blodplater er gitt i fig 27.1 kontrollgruppen var antall blodplater etter administrering av ACNU redusert ettersom dagene gikk og på dagene 8-10 var verdien lavest (omtrent 29 % av verdien før administrering av ACNU) og oppnåelsen var bare omtrent 49 % og omtrent 74 % på henholdsvis dagene 12 og 14. Derimot ble det i TPO gruppen oppnådd en reduksjon til omtrent 38 % av verdien før ACNU administrering angitt på dag 5 og deretter forandret situasjonen seg til en økning. På dag 8 ble verdien til omtrent 63 % av verdien før ACNU administrering og på dag 10 og deretter var antall blodplater større enn før ACNU administrering. På dagene 12 og 14 ble økningen på opp til omtrent 300 % og omtrent 400 % angitt.

Som angitt ovenfor ble det på dagene 8-10 hvor økning ble registrert i kontrollgruppen observert en økning i TPO gruppen og på dag 10 var blodplatetallet høyere enn de før administrering av ACNU. Det er følgelig blitt bekreftet at human TPO fremmer helbredelse fra thrombocytopeni forårsaket av anti-cancermidlet.

Når resultatene ifølge eksempel 74 også tas med i betrakning antas det at human TPO inhiberer reduksjonen i antallet blodplater og fremmer helbredelsen fra thrombocytopeni uavhengig av type anti-cancermiddel.

EKSEMPEL 76

En terapeutisk virkning av TPO på thrombocytopeni etter BMT

48 hannmus av C3H/HeN stamme som var 7 uker gamle ble bestrålt med 10 Gy radioaktiv bestrålning på hele kroppen og øyeblikkelig deretter ble de injisert intravenøst med 1x10^ benmargceller fra mus av samme stamme. Musene ble deretter tilfeldig delt inn i to grupper og fra neste dag (dag 1) ble en av gruppene (kontrollgruppen) injisert med PBS mens en annen gruppe (TPO gruppen) ble injisert med TPO aktiv fraksjon anvendt i eksempel 73 (inneholdende relativ aktivitet 44.000 ifølge M-07e analysen) med en dose på 100 mikroliter hver subkutant en gang daglig i 20 påfølgende dager.

Etter initiering av injeksjon ble hver 6. mus tilfeldig valgt på dagene 5,10,14 og 21, blod ble samlet fra deres orbitvener og antall blodplater ble opptelt ved hjelp av en mikrocelleteller (type E-2500; fremstilt av Toa Iyo Denshi).

Forandringer i antall blodplater er angitt i fig 28.1 alle gruppene ble antall blodplater redusert etter dagene forløp etter anvendelse av BMT og på dag 10 var antallet lavest (omtrent 3 % av antallet før BMT anvendelse). Etter dette .ble en gradvis forbedring angitt og på dag 4 var antallet omtrent 11 % og omtrent 13 % i kontrollgruppen og i TPO gruppen. På dag 21 ble en 37 % helbredelse oppnådd i kontrollgruppen mens i TPO gruppen var helbredelsen omtrent 65 % mens en signifikant helbredelsesfremm-ende virkning var observert. Utifrå ovennevnte resultater er det blitt bekreftet at human TPO dannet som i eksempel 56 fremmer helbredelse av antallet blodplater etter applikasjon av BMT.

EKSEMPEL 77

En terapeutisk virkning av TPO for thrombocytopeni etter bestråling med radioaktive stråler

36 hannmus fra ICR stammen med alder på 8 uker ble bestrålt med røntgenstråler av 5 Gy på hele kroppen og tilfeldig delt inn i to grupper. Fra neste dag (dag 1) ble en av

gruppene (kontrollgruppen) injisert med PBS mens en annen gruppe (TPO gruppe) ble injisert med TPO aktiv fraksjon anvendt i eksempel 73 (inneholdende relativ aktivitet, 1.440.000 ifølge M-07e analyse) en gang daglig i 3 påffølgende dager subkutant og fra neste dag, relativ aktivitet 360,000 ifølge M-07e analyse ble injisert subkutant en gang daglig i 7 påfølgende dager. Etter at injeksjon var påbegynt ble hver i gruppen tilfeldig delt inn i 3 grupper, en gruppe hvor det var blitt tappet blod på dagene 4,11 og 21; en annen gruppe på dagene 7 og 13 og den gjenværende gruppen på dagene 9 og 15. Blodoppsamlingen ble utført fra orbitvenene og antall blodplater ble opptelt av en mikrocelleteller (type F-800; fremstilt av Toa Iyo Denshi). Forandringer i antall blodplater er angitt i fig 29.1 kontrollgruppen ble antall blodplater følgelig redusert når dagene passerte etter bestråling med røntgenstråler, og, på dag 9, var antallet minst (omtrent 25 % av antallet før bestråling med røntgenstråler). På dagene 11 og 13 ble oppnådde antall 38 % og omtrent 67 % og på dag 15 kom de tilbake til verdiene før bestrålning med røntgenstråler. I TPO gruppen ble antallet redusert til omtrent 24 % av det som var før bestråling med røntgenstråler på dag 7. Etter dette ble en økning

observert på dag 9 og antallet ble forbedret til omtrent 82 %. På dag 11 og deretter var blodplateantallet mere enn det som fremkom før bestrålning med røntgenstråler og helt til dag 21 ble denne tendensen opprettholdt. Som nevnt ovenfor på dag 9 hvor antallet ble redusert i kontrollgruppen ble antallet blodplater i TPO gruppen forandret til en økning og på dag 11 var antallet blodplater høyere enn før bestrålning med røntgen-stråler og forble høy deretter. Derimot var det i kontrollgruppen nødvendig med 15 dager for at antallet blodplater kom tilbake til samme nivå som før bestrålning med

røntgenstråler. Utifrå disse resultatene ble det bekreftet at human TPO produsert i eksempel 56 forkorter tiden nødvendig for å komme over reduksjonen i antallet blodplater etter bestrålning med røntgenstråler og utviser en terapeutisk virkning for thrombocytopeni etter bestrålning med røntgenstråler.

EKSEMPEL 78

Virkningen av hTP0163 for økning av antallet blodplater

15 friske hannmus av C3H/HeN stammen hvorifra blod allerede var blitt samlet fra deres orbitvener og utsatt for platetalltellinger ble målt ved hjelp av en mikrocelleteller (type F-800; fremstilt av Toa Iyo Denshi) ble tilfeldig delt inn i 4 grupper - en kontroll og gruppene A, B og C. Den første gruppen (kontrollgruppen) ble injisert subkutant med PBS inneholdende 0,1 % serum fira mus en gang daglig i 5 påfølgende dager. Gruppene A, B og C ble injisert med TPO aktiv fraksjon fra SP Sepharose Fast Flow oppnådd i eksempel 65 etterfulgt av fortynning med PBS inneholdende 0,1% museserum i doser på omtrent 40.000.000, omtrent 8.000.000 og omtrent 1.600.000 kg/kroppsvekt/dag med hensyn på relativ aktivitet til hTPO 163 ifølge M-07e analyse for 5 påfølgende dager subkutant.

På dagene 6, 8,10 og 12 etter injeksjon ble blod samlet fra orbitvenen til hver mus og antall blodplater ble opptelt ved hjelp av en mikrocelleteller (type F-800; fremstilt av Toa Iyo Denshi). Forandringene i antall blodplater er gitt i fig 30.

I kontrollgruppen var det omtrent ingen forandringer i antall blodplater mens, i gruppen gitt TPO fremkom økninger i antall blodplater i alle tilfellene med høyeste verdier på dag 8 etter injeksjon. Blant hver av gruppen som mottok TPO ble det bemerket et dose-responsforhold. I gruppe A ble følgelig økninger på omtrent 88 % og omtrent 100 % bemerket på henholdsvis dagene 6 og 8, selv på dag 10 ble en økning på omtrent 97 % opprettholdt idet alle data viste en betraktelig forskjell fra kontrollgruppen (p < 0.01 ifølge "Dunnet Multiple Comparison Test"). Lignende økninger fremkom også i gruppe B og til tross for at økningsgraden var lavere enn den til gruppe A ble økningen på omtrent 65 % og omtrent 84 % registrert på dagene 6 og 8 som viser en signifikant forskjell fra kontrollgruppen (p < 0.01 eller 0.05 ifølge en "Dunnet Multiple Comparison Test"). Den økende virkningen i gruppe C var lavere enn den i gruppe B. Den viste omtrent 31 % økning på dag 8 når de høyeste tallene ble registrert. Fra ovennevnte resultater er det blitt bekreftet at hTPO 163 produsert i eksempel 65 øker antallet blodplater og at virkningen viser et dose-responsforhold.

EKSEMPEL 79

En terapeutisk virkning av hTP0163 for thromobcytopeni

100 hannmus fra C3H/HeN stammen i alder på 8 uker ble injisert intravenøst med 50 mg/kg nimustinhydroklorid (ACNU) og deretter tilfeldig delt inn i fire grupper, en kontrollgruppe og gruppene A, B og C som hver omfatter 25 mus. Neste dag (dag 1) ble kontrollgruppen injisert subkutant med 5 ml/kg PBS en gang daglig i påfølgende dager, mens gruppene A, B og C ble injisert subkutant med TPO aktiv fraksjon fra SP Sepharose Fast Flow oppnådd i eksempel 65 fortynnet med PBS med en dose på omtrent 16.000.000, omtrent 48.000.000 og omtrent 160.000.000/kg kroppsvekt/dag, med hensyn på relativ aktivitet til hTPO 163 ifølge M-07e analysen en gang daglig i påfølgende dager.

Etter initiering av injeksjon ble mus i hver av gruppene tilfeldig delt inn i 5 grupper og blodet ble samlet på dagene 5, 8,10,12 og 14. Blodsamlingen ble utført fra orbitvenene og antall blodplater ble opptelt ved hjelp av en mikrocelleteller (type E-2500; fremstilt av Toa Iyo Denshi). Forandringer i antall blodplater er vist i fig 31.1 kontrollgruppen ble antall blodplater redusert ettersom dagene gikk etter administrering av ACNU idet laveste verdier (omtrent 15-16 % av den før ACNU administreringen) på dagene 8-10 og grad av helbredelse var så lite som omtrent 28 % og omtrent 51 % på dagene 12 og 14.1 gruppe A ble derimot antallet redusert til omtrent 25 % i forhold til de før ACNU administrering på dag 8. Etter dette ble det derimot en økning og oppnåelse av omtrent 34 % og omtrent 89 % på dagene 10 og 12. På dag 14 var antallet større enn før ACNU administreringen.

Som nevnt ovenfor ble de minste blodplateantallene registrert på dag 8 i alle gruppene til tross for at det i grupper som ble gitt human TPO var reduksjonen saktere enn kontrollgruppen som gir opphav til minste antall blodplater. I kontrollgruppen var det omtrent ingen oppnåelse av antall blodplater selv på dag 10 mens i gruppene når gitt human TPO ble oppnåelsen i antall blodplater registrert i alle gruppene til tross for at gradene varierte. I en gruppe som ble gitt 50 mikrogram/kg ble oppnåelse registrert på dag 12 som allerede ga høyere antall enn de før ACNU administrering. Når det blir sammenlignet med det faktum at i kontrollgruppen var oppnåelsen så Ute som omtrent 51 % sammenlignet med tilstanden før ACNU administrering selv på dag 14 er det nå klart at hTPO 163 produsert som i eksempel 65 fremmer helbredelse fra reduksjon i antall blodplater. hTPO 163 er følgelig blitt bekreftet å ha en terapeutisk virkning på thrombocytopeni forårsaket av anti-cancermidler.

Eksempler på farmasøytiske preparater er angitt nedenfor.

EKSEMPEL 80

Human TPO fraksjon oppnådd i eksempel 56 ble konsentrert, utsatt for aseptisk behandling og frosset ved -20 °C for å tilveiebringe et frossent produkt som blir anvendt som et injiserbart preparat.

EKSEMPEL 81

Human TPO fraksjon oppnådd i eksempel 56 ble konsentrert, 5 ml ble fylt inn i en 10 ml beholder ved anvendelse av aseptisk bearbeidning, frysetørket ved -20 °C og flasken ble påført en gummikork for å tilveiebringe en fryse-tørket forbindelse som kan bli anvendt som et injiserbart preparat.

EKSEMPEL 82

Den humane TPO fraksjonen oppnådd i eksempel 56 ble konsentrert, utsatt for aseptisk filtrering og fylt i en 10 ml beholder for å tilveiebringe et produkt som kan bli anvendt som et injiserbart preparat.

EKSEMPEL 83

hTPO 163 fraksjonen oppnådd i eksempel 65 ble konsentrert, utsatt for aseptisk behandling og frysetørket ved -20 °C for å tilveiebringe et frossent produkt som kan bli anvendt som et injiserbart preparat.

EKSEMPEL 84

hTPO 163 fraksjonen oppnådd i eksempel 65 ble konsentrert, 5 ml ble fylt inn i en 10 ml beholder ved anvendelse av aseptisk behandling, frysetørket ved -20 °C og flasken ble forseglet med en gummikork for å tilveiebringe et frysetørket produkt som kan bli anvendt som et injiserbart preparat.

EKSEMPEL 85

hTPO 163 fraksjonen oppnådd i eksempel 65 ble konsentrert, utsatt for aseptisk filtrering

og fylt inn i en 10 ml beholder for å tilveiebringe et produkt som kan bh anvendt som et i injiserbart preparat.

EKSEMPEL 86

Den humane TPO fraksjonen oppnådd i eksempel 57 ble konsentrert, utsatt for en

i aseptisk behandling og frosset ved -20 °C for å tilveiebringe et frossent produkt som kan bli anvendt som et injiserbart preparat.

EKSEMPEL 87

i Den humane TPO fraksjonen oppnådd i eksempel 57 ble konsentrert, 5 ml ble fylt inn i en 10 ml beholder ved anvendelse av aseptisk metode, frysetørket ved -20 °C og flasken ble forseglet med en gummikork for å tilveiebringe et frysetørket produkt som blir anvendt som et injiserbart preparat.

EKSEMPEL 88

Human TPO fraksjon oppnådd i eksempel 57 ble konsentrert, utsatt for aseptisk filtrering, fylt inn i en 10 ml beholder for å tilveiebringe et produkt som kan bli anvendt

som et injiserbart preparat.

i

EKSEMPEL 89

Aplastisk kaninplasma

Heparinisert aplastisk kaninplasma ("APK9") eller normal kaninplasma ("NK9") ble produsert som beskrevet [Mazur, E. og South, K. Exp. Hematol. 13:1164-1172 (1985);

Arriga, M., South K., Cohen J.L. og Mazur, E.M. Blood 69: 486-492 (1987); Mazur, E., Basilico, D., Newton, J.L., Cohen, J.L. Charland, C, Sohl, P.A. og Narendran, A. Blood

76: 1771-1782 (1990)] med unntakelse av at 450 rad av total kroppsbestråling ble påført i mottakerene.

EKSEMPEL 90

Human megakaryocytanalyse

Standardmetoder for mange av prosedyrene beskrevet i følgende eksempler, eller egnede alternative prosedyrer, er gitt i anerkjente manualer for molekylær biologi som f.eks Sambook et al (Eds.) Molecular Cloning, Second Edition, ColdSpring Harbor Laboratory Press (1987) og i Ausbel, et al, (Eds.), Current Protocols in Molecular Biology, Green associates/Wiley Interscience, New York (1990).

APK9 og fraksjonert APK9 ble analysert for evnen til å stimulere utvikling av humane megakaryocytter fra CD34<+> forløperceller. CD34- valgte celler ble oppnådd fra perifere blodceller som beskrevet (Hokom, M.H., Choi, E., Nichol, J.L., Hornkohl, A., Arakawa, T., og Hunt, P. Molecular Biology of Haematopiesis 3:15-31,1994) og ble inkubert i følgende kulturmedium: Iscoves modifiserte Dulbeccos medium (IMDM; GIBCO, Grand Islan, NY) supplementert med 1 % glutamin Pen-strep (Irvine Scientific, Santa Ana, CA) og 10 % heparinisert, blodplate-fattig, human AB plasma. Også innbefattet var 2-merkaptoetanol (IO-<4> M), pyrodruesyre (110 ug/ml), kolesterol (7,8 ug/ml), adenosinguanin, cytidin, uridin, thymedin, 2-deoksycytosin, 2-deoksyadenosin, 2-deoksyganosin (10 ng/ml hver, Sigma); human rekombinant insulin (10 ng/ml), human transferring (300 ng/ml), soyabønnelipider (1 %, Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN); human rekombinant basisk fibroblastvekstfaktor (2 ng/ml), Genzyme, Cambridge, MA); human rekombinant epidermalvekstfaktor (15 ng/ml), blodplate-avledet vekstfaktor (10 ng/ml, Amgen, INc, Thousand Oaks, CA). CD34-selekterte celler ble sådd ut i 2 x 10<5> ml kulturmedium, 15 ni totalvolum, i brønner i Terasaki-type mikrotiterskåler (Vanguard Inc, Neptune, NJ). Cellene ble inkubert ved 37 °C i 8 dager i fuktbokser i 5 % CO2 i luft, fiksert direkte til kulturbrønner med 1 % glutaraldehyd og inkubert med en monoklonal antistoffcocktail (anti-GPIb, anti-GPITB, (Biodesign) og anti-GPIb (Dako, Carpinteria, CA). Immunreaksjonen ble utviklet med et streptavidin-beta-galaktosidasedeteksjonssystem (HistoMark, Kirgegaard og Perry). Megakaryocytter identifisert ved hjelp av en blå farve ble opptelt med et invert fasemikroskop med 100 X forstørrelse. Resultatene ble presentert som gjennomsnittlig antall megakaryocytter pr brønn ± standardavvik av gjennomsnittet (SEM). I noen tilfeller ble data presentert med hensyn på "megacaryocyttenheter/mr<1> hvor graden hvorved en gitt prøve induserte megakaryocyttutvikling ble normalisert til positiv APK9 kontroll for eksperimentet. En enhet er definert som mengden av materiale som resulterer i samme antall megakaryocytter som 1 ni APK9 standard. Aktiviteten ble godkjent å være forårsaket av MPL ligand dersom den kunne bli blokkert med 5-10 ng/ml MPL-X (oppløselig Mpl reseptor).

APK9 er blitt demonstrert å inneholde faktorer som stimulerer utvikling av humane megakaryocytter i dette systemet. CD34-selekterte celler inkubert med 10 % NK9 i 8 dager viser et neglisjerbart antall av blå-farvede megakaryocytter, mens CD34-selekterte celler inkubert med 10 % APK9 i 8 dager viser et meget stort antall av blå-farvede megakaryocytter.

Figur 32 viser at økende konsentrasjoner av Mpl-X tilsatt til det humane megakaryo-cyttkultursystemet i økende grad blokkerer megakaryocyttutviklingen. Ved konsentrasjoner av Mpl-X høyere enn 5 ug/ml er inhibisjonen fullført. I dette eksperimentet ble CD34-selekterte celler stimulert med 5 % APK9. Dette demonstrerer at en aktivitet som reagerer med Mpl-X (presumtiv Mpl ligand) er nødvendig for utvikling av humane megakaryocytter og angir at MPI liganden er tilstede i selve APK9.

Det er videre blitt demonstrert heri at Mpl ligandaktiviteten nødvendig for utvikling av humane megakaryocytter er tilstede i APK9. APK9 (135 ml) ble fortynnet 6 ganger i Iscoves medium og applisert på en Mpl-X affinitetskolonne. Ubundet materiale (gjennomstrømning ble samlet og konsentrert til det opprinnelige volumet før analysen). Bundet materialet ble eluert i 10 ml 1 M NaCl og 20 % av blandingen ble diafiltrert og konsentrert 4 ganger for analyse. CD34-selekterte celler inkubert i bare medium ble ikke utviklet i megakaryocytter. Celler inkubert i 5 % APK9 (samme blanding som applisert på kolonnen) ble til 48 ± 8 megakaryocytter pr brønn. Celler inkubert i 10 % av det ubundede materialet ble ikke utviklet til megakaryocytter. Celler inkubert i 10 % av elueringsblandingen ble utviklet til 120 ± 44 megakaryocytter pr brønn. Både aktivitetene til kolonnebelastningen og elueringsblandingen ble vesentlig fullstendig inhibert med 5 ug/ml Mpl-X i analysen.

EKSEMPEL 91

Transfeksjon av murin eller human Mpl reseptor til en murin cellelinje

A. Murin Mpl reseptor

Fullengde murin Mpl resptor cDNA ble subklonet til en ekspresjonsvektor inneholdende ved en transkripsjonen promotor avledet fra LTR Moloney murin sarkomvirus. 5 ug av denne konstruksjonen og 1 ug av selekterbar markørplasmid pWLNeo (Stratagene) ble koelektroforert inn i en IL-3 avhengig murin cellelinje (32D, cline 23; Greenberger et al, PNAS 80: 2931-2936 (1983)). Cellene ble dyrket i 5 dager for å komme seg fra prosedyren og deretter inkubert i seleksjonsmedium innbefattende 800 ng/ ml Geneticin (G418, Sigma) og 1 ng/ml murin IL-3. Overlevende celler ble deretter delt inn i blandinger av 2 x IO<5> celler og dyrket helt til en populasjon fremkom som kunne bli ytterligere analysert. Seks populasjoner ble testet for overflateekspresjon av Mpl reseptor ved FACS analyser ved anvendelse av et polyklonalt kaninantipeptidserum. En populasjon ble valgt for FACS sortering ved avnendelse av samme antipeptidserum som før. Enkelt-cellekloner av opphavscellelinjen ble valgt ved vekst i 10 % APK9 og Geneticin. Etter seleksjon i APK9 i 35 dager ble cellene opprettholdt i 1 ng/ml murin IL-3. En av subklonene, 1 A6.1 ble anvendt for dette arbeidet.

B. Human Mpl reseptor

Fullengde human Mpl reseptorsekvens (Vigon, I. et al, PNAS 89: 5640-5644 (1992)) ble subklonet inn i en ekspresjonsvektor inneholdende transkripsjonen promoter til Maloney murin sarkomvirus (samme vektor som med murin reseptor). 6 ug av denne konstruksjonen og 6 ng av en amfotrofisk retroviral pakkekonstruksjon (Landau, N.R., Littman, D.R., J. Virology 66: 5110-5113 (1992)) ble transfektert inn i 3 x 10 IO6 293 celler ved anvendelse av et CaPC*4 pattedyrtransfeksjonsett, Stratagene. De samme cellene ble på ny transfektert etter 2 dager og på ny etter 4 dager. Dagen etter siste transfeksjon ble 293 cellene dyrket sammen med IL-3 avhengig murin cellelinje (32D, klon 23; Greenberger et al, PNAS 80: 2931-2936 (1983)). Etter 24 timer ble 32D cellene oppfanget og separert i en BSA gradient. (Path-o-cyte; Mills Inc.). Cellene ble formert i en 1 ng/ml murin JL-3 og deretter selektert for vekst i 20 % APK9. Cellene ble sortert etter celleoverflateekspresjon av reseptor ved FACS ved anvendelse av et polyklonalt kaninantipeptidserum. Disse cellene ble deretter anvendt i analysene.

EKSEMPEL 92

1 A6.1 analyse for Mpl ligand

1A6.1 celler ble vasket fri for kultur IL-3 og erstattet (1000 celler/15 ni total col/brønn) i Terasaki-type mikrotiterskåler i alfa MEM (Gibco) supplementert med 10 % føtalt kalveserum (FCS), Geneticin (800 ng/ml) og 1 % pen/strep (Gibco) i 1:1 seriefor-tynninger av testprøvene. Etter 48 timer ble antall levedyktige celler pr brønn bestemt mikroskopisk. En aktivitetsenhet ble definert som den mengden av aktivitet som resulterte i 200 levedyktige celler pr brønn. Aktiviteten ble definert som forårsaket av Mpl ligand dersom den kunne bli fullstendig blokkert ved innbefatting av 5-10 ng/ml Mpl-X i analysen. Mpl ligandaktivitet i APK9 var i gjennomsnitt 4400 ± 539 enheter/ml aplastisk plasma. Dersom ikke annet er angitt er enheter av Mpl ligandaktivitet definert i 1A6.1 analysen.

Analysene med celler transfektert med human Mpl reseptorgen ble utført vesentlig på samme måte som med 1A6.1 cellene.

EKSEMPEL 93

Demonstrering som omfatter at Mpl-liganden er tilstede i aplastisk plasma til sera fra mus, hund, gris og humane kilder

Mpl liganden er tilstede i aplastisk plasma eller sera fra murine, kanin, gris og humane kilder (tabell 9). Plasma ble samlet fra BDF1 mus på forhånd bestrålt og 12 dager etter bestrålning (500 rad). Plasma ble testet i 1A6.1 analysen hvor det ble demonstrert 2000 enheter/ml aktivitet som var vesentlig fullstendig inhiberbar med Mpl-X (10 ug/ml). Bestrålt museplasma var også positive i human megakaryocyttanalyse hvor det oppviste en aktivitet på 1833 enheter/ml. Plasma ble samlet fra hunder på forhånd bestrålt og 10 dager etter bestrålning (450 rad). Plasma ble testet både i 1 A6.1 analysen og humane megakaryocyttanalyser. Aktiviteten ble detektert og fullstendig inhibert av Mpl-X (10 ug/ml) i begge analysene. Plasma ble samlet fra griser på forhånd bestrålt og 10 dager etter bestrålning (650 rad). Plasma ble testet i både 1 A6.1 analysen og human megakaryocyttanalyser. I begge analysene ble det vist Mpl ligandaktivitet (inhiberbar av 10 ng/ml Mpl-X) som er sammenlignbart med det som ble funnet i aplastisk kaninplasma. Sera fra aplastiske mennesker ble oppnådd. Dette materialet ble samlet fra benmarg-transplanterte pasienter. Sera fra 6 pasienter ble analysert i 1A6.1 analysen hvor den viste en aktivitet på 903 enheter/ml, 88 % var forårsaket av Mpl ligand (inhiberbar med 10 ng/ml Mpl-X). Sera fra 14 aplastiske pasienter er også blitt testet i human megakaryocyttanalyse. Som en gruppe ble det oppnådd vesentlig aktivitet, 941 meg enheter/- ml, som var fullstendig inhiberbar med 10 ng/ml Mpl-X. Murine IL-3 data er innbefattet for å demonstrere spesifisiteten til 1 A6.1 analysen. Til tross for at dette rekombinante cytokinet induserer veksten til cellelinjen blir den ikke blokkert av 10 ng/ml Mpl-X.

EKSEMPEL 94

Preparering av humane TPO derivater uttrykt i E.coli systemet

I et forsøk på forbedre den biologiske aktiviteten, stabiliteten og oppløseligheten ble flere TPO derivater konstruert og uttrykt i E.coli. Derivatene ble dannet ved anvendelse av aminosyresekvensen som angitt i SEQ ID NO: 11, inkludert [Met-<2>, Lys"<1>, Ala<1>, Val3, Arg<12?>]TPO(l-163) hvor et arginin erstatter et leucin ved aminosyreposisjon 129 (også referert til som L129R), [Met"<2>, Lys"<1>, Ala<1>, Val<3>, Arg<133>]TPO(l-163) hvor et arginin erstatter et histidin ved aminosyreposisjon 133 (også referert til som H133R), [Met"2, Lys-1, Ala<1>, Val<3>, Arg<143>]TPO(l-163) hvor et arginin erstatter et metionin ved aminosyreposisjon 143 (også referert til som M143R) [Met"<2>, Lys"<1>, Ala<1>, Val<3>, Arg<82>]TPO(l-163) hvor et leucin erstatter et glysin ved aminosyreposisjon 82 (også referert til som G82L) [Met"<2>, Lys"<1>, Ala1, Val3, Arg<146>]TPO(l-163) hvor et leucin erstatter et glysin ved aminosyreposisjon 146 (også referert til som G146L) [Met-<2>, Lys" 1, Ala1, Val<3>, Arg<148>]TPO(l-163) hvor et prolin erstatter et serin ved aminosyreposisjon 148 (også referert til som S148P), [Met"<2>, Lys"<1>, Ala<1>, Val<3>, Arg59]TPO(l-163) hvor et arginin erstatter et lysin ved aminosyreposisjon 59 (også referert til som K59R), [Met"<2>, Lys"<1>, Ala<1>, Val<3>, Arg<115>]TPO(l-163) hvor et arginin erstatter et glutamin ved aminosyreposisjon 115 (også referert til som Ql 15R).

Ved dannelse av TPO derivatene ble h6T (1-163), beskrevet i eksempel 42, anvendt som templat, og oligonukleotidene som har følgende sekvenser ble syntetisert: L129R: 5'-ATCTTCCGTTCTTTCCAGCACCT-3' (for fremstilling av Arg-substitusjonsderivatet med Leu-129 substituert med Arg i sekvensen vist i SEQ ID NO: il);

H133R: 5-TCTTTCCAGCGTCTGCTGCGT-3' (forpreparering av Arg-substitusjonsderivatet med His-133 substituert med Arg i sekvensensen vist i SEQ TD NO: 11);

M143R: 5'-CGTTTCCTGCGTCTGGTTGGC-3' (for preparering av Arg-substitusjonsderivatet med Met-143 substituert med Arg i sekvensensen vist i SEQ TD NO: 11);

G82L: 5'-æCCAGCTTCTGCCGACCTGCCT-3' (for preparering av Leu-substitusjonsderivatet med Gly-82 substituert med Leu i sekvensensen vist i SEQ ID NO: 11);

G146L: S-ATGCTGGTTCTGGGTTCTACCCT-S' (for preparering av Leu-substitusjonsderivatet med Gly-146 substituert med Leu i sekvensensen vist i SEQ ID NO: 11);

S148P: 5'-GTTGGCGGTCCGACCCTGTGCG-3' (for preparering av Pro-substitusjonsderivatet med Ser-148 substituert med Pro i sekvensensen vist i SEQ ID NO: 11);

K59R: 5'-GAAGAGACCCGCGCTCAGGACATCC-3' (for preparering av Arg-substitusjonsderivatet med Lys-59 substituert med Arg i sekvensensen vist i SEQ ID NO: 11);

Q115R: 5,-CTGCCGCCACGTGGCCGTACCAC-3, (for preparering av Arg-substitusjonsderivatet med Gln-115 substituert med Arg i sekvensensen vist i SEQ ID NO: 11);

Mutante plasmider ble konstruert ved anvendelse av Sculptor in vitro mutagensesett (Amersham). Xbal-HindlJJ framgentet avledet fra pCFM536/h6T(l-163) beskrevet i eksempel 42 ble ført inn i Bluescript II SK(-) phagemid vector (Stratagene, California, USA) etter spaltning med Xbal og Hindin for å oppnå et plasmid pSKTPO som deretter ble transformert inn i E.coli JM109. Enkelttrådet DNA for mutagense ble dannet fra pSKTPO ved anvendelse av hjelpefag M13K07 (Takara Shuzo, Japan). Mutasjonene ble innført i TPO genet ifølge forhandlerens protokoller ved anvendelse av oligonukleotidene som angitt ovenfor. Sekvensanalyser ble utført med DNA sekvenseringsettet (Applied Biosystems, USA) ifølge forhandlerens protokoller og mutasjonene til TPO ble bekreftet.

Xbal-Hindm fragmentene dannet fra mutert pSKTPO ble ført inn i pCFM536 spaltet med Xbal og Hindin. Plasmidene pCFM536 som inneholder muterte gener ble transformert inn i E.coli nr 261 for å oppnå transformanten som uttrykker TPO derivat-genene.

Dyrking av E.coli nr 261 transformert med mutert pCFM 536 ble utført ifølge eksempel 43 som tidligere beskrevet. Cellepelleten til transformanten ble samlet og lagret i

fryseren i minst en dag. Frosset cellepellet (3 g) ble suspendert i 30 ml 20 mM Tris buffer (pH 8.5) inneholdende 10 mM EDTA, 10 mM DTT og 1 mM PMSF. Suspensjonen ble oppbevart på is og ble sonikert 5 ganger i 1 minutt (minst) intervaller. Sonikerte celler ble samlet ved sentrifugering ved 15000 rpm i 10 min.

Pelleten ble suspendert i 30 ml 10 mM Tris buffer (pH 8.7) inneholdende 8 M

guanidinklorid, 5 mM EDTA, 1 mM PMSF og redusert ved tilsetning av 50 mg DTT. Etter omrøring i 1-1,5 timer ble pH til oppløsningen justert til 5.0 ved anvendelse av fortynnet HC1 og ble deretter avkjølt til 4 °C før fortynning.

Samme oppløsning ble gradvis fortynnet i 1.5 110 mM CAPS buffer (pH 10.5) inneholdende 30 % glyserol, 3 M urea, 3 mM cystamin og 1 mM L-cystein over natt. Etter at prøven ble omrørt i minst 2 dager ble presipitatet fjernet ved sentrifugering ved 8000 rpm i 45 min. pH til oppløsningen ble justert til 6.8 med 6 M fosforsyre og fortynnet to ganger. Oppløsningen ble filtrert med 2 ark nr 2 filterpapir (ø-90 mm, Toyo filter paper, Japan) og deretter applisert på kolonnen (2.6 x 10 cm) CM-Sepharose Fast

Flow (Pharmacia). Kolonnen ble vasket med 400 ml 10 mM fosfatbuffer (pH 6.8)

i inneholdende 15 % glyserol og 1 M urea, og ekvilibrert med 10 mM fosfatbuffer (pH

7.2) inneholdende 15 % glyserol. Proteinet ble eluert fra kolonnen ved anvendelse av et lineært gradientsystem fra 10 mM fosfatbuffer (pH 7.2) inneholdende 15 % glyserol i samme buffer inneholdende 0.5 M NaCl ved strømningsrate på 1.0 ml/min. Protein-eluering ble registrert ved absorbanse ved 280 nm og fraksjonen inneholdende TPO derivatet ble bekreftet ved SDS-PAGE og oppsamlet.

Etter at TPO fraksjonen (omtrent 30 ml) ble konsentrert til 2 ml ved anvendelse av Centriprep 10 (Amicon) ble mutant TPO ytterligere renset ved revers fase HPLC (Waters) med en kolonne av uBondasphere C4 (3.9 x 150 mm). Proteinelueringen ble utført ved anvendelse av en lineær gradient fra 0.05 TFA i H2O til 2-propanol inneholdende 30 % CH3CN og 0.02 % TFA med en strømningsrate på 0.5 ml/min i 40 min. Under disse betingelsene ble TPO derivatene eluert etter omtrent 30 min.

For biologisk analyse ble TPO prøven som dermed er blitt renset dialysert to ganger mot 1110 mM fosfatbuffer i 2 dager. Etter konsentrering med Centriprep 10 (Amicon) til omtrent 0,1 mg/ml ble den biologiske aktiviteten til derivatene vurdert i M-07e analysesystemet som tidligere beskrevet. Det ble oppdaget at alle mutantene har nesten identisk aktivitet som h6T(l-163), referanseprøven til TPO (se figurene 33 og 34).

Deponeringsliste

Escherichia coli (pHTl-231/DH5): FERM BP-4564 og CCTCC-M95001 Escherichia coli (pEF18S-A2-o/DH5): FERM BP-4565 og CCTCC-M95002 Escherichia coli (pHGTl/DH5): FERM BP-4616 og CCTCC-M95003 Escherichia coli (pHTFl/DH5): FERM BP-4617 og CCTCC-M95004 Mouse-Mouse hybridoma P55: FERM BP-4563 og CCTCC-C95001 CH028/1/1/3-C6: FERM BP-4088 og CCTCC-C95004 CH0163T-63-79-C1: FERM BP-4989 og CCTCC-C95005

Claims (39)

1. Thrombopoietin (TPO) polypeptid, karakterisert ved at det har biologisk aktivitet som spesifikt stimulerer eller øker blodplateproduksjon og omfatter aminosyresekvensen 1 til 332 ifølge SEQ ID NO: 6 eller et polypeptid som er kodet for av et polynukleotid som hybridiserer under stringente betingelser med et polynukleotid som koder for aminosyre-sekvensen SEQ ID NO:6.

2. TPO polypeptidderivat, karakterisert ved at det består av aminosyresekvensen 1 til 163 ifølge SEQ ID NO: 6.

3. TPO polypeptidderivat, karakterisert ved at det består av aminosyresekvensen 1 til 232 ifølge SEQ ID NO: 6.

4. TPO polypeptidderivat, karakterisert ved at det består av aminosyresekvensen 1 til 151 ifølge SEQ ID NO: 6.

5. TPO polypeptidderivat ifølge krav 1,2 eller 3, karakterisert v e d at fra 1 til 6 aminoterminale aminosyrer er deletert.

6. TPO polypeptidderivat ifølge krav 2, karakterisert ved at det blir valgt fra gruppen bestående av [AHis<33>]TPO (1-163), [AArg<117>]TPO (1-163) og [AGly<116>]TPO (1-163).

7. TPO polypeptidderivat ifølge krav 2, karakterisert ved at det blir valgt fra gruppen bestående av [His<33>, Thr<33>', Pro<34>]TPO (1-163), [His<33>, Ala33', Pro34]TPO (1-163), [His33, Gly33', Pro3<4>, Ser3<8>]TPO (1-163), [Gly<116>, Asn116', Arg11<7>]TPO (1-163), [Gly11<6>, Ala11<6>', Arg^jTPO (1-163), [Gly<116>, Glyl \ 6\ Argl 17]Tpo (1-163) og [Ala1, Val<3>]TPO (1-163).

8. TPO polypeptidderivat ifølge krav l,karakterisert ved at det blir valgt fra gruppen bestående av [Thr<33>, Thr<333>, Ser334, Ile335, Gly336, Tyr337, Pro338, Tyr33?, Asp34(>, Val341, Pro342, Asp343, Tyr344, Ala345, Gly346, Val347, His34<8>, His34? His35<0>, His3<*!>, His3<52>, His<353>]TPO og [Asn25, Lys231, Thr333, Ser334, Ile335, Gly336, Tyr337, Pro338, Tyr33?, Asp34**, Val341, Pro342, Asp343, Tyr344, Ala345, Gly346, Val347, His348, His34?, His350, His35*, His352, His3<53>]TPO.

9. TPO polypeptidderivat ifølge krav l,karakterisert ved at det blir valgt fra gruppen bestående av [Asn<25>]TPO og [Thr<33>]TPO.

10. TPO polypeptidderivat ifølge krav 2, karakterisert ved at det blir valgt fra gruppen bestående av [Ala<1>, Val<3>, Arg<12?>]TPO (1-163), [Ala<1>, Val<3>, Arg133]TPO (1-163), [Ala<1>, Val<3>, Arg<143>]TPO (1-163), [Ala<1>, Val3, Leu82]TPO (1-163), [Ala<1>, Val<3>, Leu14<6>]TPO (1-163), [Ala1, Val<3>, Pro<148>]TPO (1-163), [Ala1, Val3, Arg5?]TPO (1-163) og [Ala<1>, Val<3>, Arg115]TPO (1-163).

11. TPO polypeptidderivat ifølge krav 2, karakterisert ved at det blir valgt fra gruppen bestående av [Arg<12?>]TPO (1-163), [Arg133]TPO (1-163), [Arg143]TPO (1-163), [Leu82]TPO (1-163), [Leu146]TPO (1-163), [Pro148]TPO (1-163), [Arg5?]TPO (1-163) og [Arg11<5>]TPO (1-163).

12. TPO polypeptid ifølge krav l,karakterisert ved at det er kovalent bundet til en polymer.

13. TPO polypeptid ifølge krav 12, karakterisert ved at nevnte polymer er polyetylenglykol.

14. TPO polypeptid ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til og med 13,karakterisert ved at det videre omfatter aminosyren Met"2-Lys" V

15. TPO polypeptid ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til og med 13,karakterisert ved at det videre omfatter Met" 1.

16. TPO polypeptid ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til og med 13, karakterisert ved at det videre omfatter Gly<1>.

17. Polypeptid, karakterisert ved at det består av den modne sekvensen ifølge aminosyrene i SEQ TD NO: 2,4 eller 6.

18. DNA, karakterisert ved at det koder for et TPO polypeptid ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til og med 11,14,15 og 17.

19. DNA sekvens, karakterisert ved at den er for anvendelse for å forsikre ekspresjon av et TPO polypeptid som har biologisk aktivitet som omfatter spesifikt stimulering eller øket blodplateproduksjon, som blir valgt fra gruppen bestående av: (a) DNA sekvensene vist i SEQ ID NOS: 194,195 eller 196 eller komplementære tråder derav; og (b) DNA sekvenser som hybridiserer under stringente betingelser til DNA sekvensene som definert i (a) eller fragmenter derav; og (c) DNA sekvenser som kan hybridisere til DNA sekvensene som definert i (a) og (b), unntatt degenerasjonen til den genetiske koden.

20. DNA sekvens ifølge krav 19, karakterisert ved at nevnte sekvens er cDNA.

21. DNA sekvens ifølge krav 19, karakterisert ved at nevnte sekvens er genomisk DNA.

22. DNA sekvens ifølge krav 19, karakterisert ved at nevnte sekvens er fremstilt DNA.

23. Fremgangsmåte for fremstilling av et TPO polypeptid, karakterisert ved at den omfatter følgede trinn: (a) uttrykking av et polypeptid som blir kodet av et DNA ifølge et hvilket som helst av kravene 18,19,20,21 eller 22 i en egnet vert og (b) isolering av nevnte TPO polypeptid.

24. Fremgangsmåte ifølge krav 23, karakterisert ved at TPO polypeptidet som blir uttrykt er et Mef^-Lys-1 polypeptid og innbefatter videre spaltning av Met'<2->Lys"<1> fra nevnte isolerte TPO polypeptid.

25. DNA sekvens ifølge krav 19, karakterisert ved at nevnte sekvens videre koder for et thrombingjenkjenningspeptid 5' for TPO polypeptidkodende sekvenser og koder for glutation S-transferase (GST) 5' til thrombingjenkjenningspeptidet.

26. DNA sekvens ifølge krav 25, karakterisert ved at den er for anvendelse for å forsikre ekspresjon av et TPO polypeptid bestående av aminosyresekvensen 1 til 174 ifølge SEQ ID NO: 6.

27. Fremgangsmåte for å produsere et TPO polypeptid med biologisk aktivitet omfattende spesifikt stimulerende eller økende blodplateproduksjon, karakterisert ved at den innbefatter følgende trinn: (a) uttrykking av et polypeptid som blir kodet av et DNA ifølge krav 25 eller krav 26 i en egnet vert, og (b) isolering av nevnte GST-(thrombingjenkjenningspeptid)-TPO polypeptid, (c) behandling av nevnte isolerte GST-(thrombingjenkjenningspeptid)-TPO polypeptid med thrombin og (d) isolering av et Glyl .jpo polypeptid.

28. Fremgangsmåte ifølge krav 27, karakterisert ved at Gly-^TPO polypeptidet er [Gly^TPO (1-174).

29. Fremgangsmåte ifølge krav 27 eller krav 28, karakterisert ved at det isolerte Gly1-TPO polypeptidet er et TPO deirvat bestående av aminosyresekvensen 1 til 174 ifølge SEQ ID NO: 6.

30. Proteinprodukt, karakterisert ved at det blir oppnådd ifølge fremgangsmåten i kravene 23,24,27,28 eller 29.

31. Prokaryot eller eukaryot vertcelle, karakterisert ved at den er transformert eller tranfektert med DNA sekvensen ifølge et hvilket som helst av kravene 18,19,20,21,22,25 eller 26 på en måte som muliggjør at nevnte vertcelle uttrykker et polypeptid som har biologisk aktivitet omfattende spesifikk stimulering eller økende blodplateproduksjon.

32. Farmasøytisk sammensetning, karakterisert ved at den omfatter en effektiv mengde av polypeptidet ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til og med 16 og 30 i kombinasjon med en farmasøytisk akseptabel bærer.

33. Farmasøytisk sammensetning ifølge krav 32, karakterisert ved at den er for anvendelse ved behandling av blodplateforstyrrelser.

34. Farmasøytisk sammensetning ifølge krav 32, karakterisert ved at den er for anvendelse ved behandling av thrombocytopeni.

35. Farmasøytisk sammensetning ifølge krav 34, karakterisert ved at den er for anvendelse ved behandling av thrombocytopeni indusert ved kjemoterapi, radioterapi eller benmargstransplantasjon.

36. Anvendelse av polypeptidet ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til og med 16 og 30 til fremstilling av et medikament til behandling av blodplateforstyrrelse hos en pasient.

37. Anvendelse ifølge krav 36, hvor blodplateforstyrrelsen er trombocytopeni.

38. Anvendelse ifølge krav 37, hvor nevnte trombocytopeni er indusert ved kjemoterapi, radioterapi eller benmargstransplantasjon.

39. Antistoff, karakterisert ved at det er spesifikt immunreaktivt med et polypeptid ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til og med 16 og 30.