PL179884B1 - Protein of tpo activity - Google Patents

Description

Przedmiotem wynalazku są: polipeptyd TPO lub jego pochodna, tzn. trombopoetyna o aktywności biologicznej swoiście stymulującej lub zwiększającej produkcję płytek krwi, a ponadto DNA kodujący polipeptyd TPO lub jego pochodne, sekwencja DNA i/lub genomowego DNA i/lub syntetycznego DNA, sekwencja cDNA, sposób otrzymywania polipeptydu TPO, sposób rozwoju prokariotycznych lub eukariotycznych komórek gospodarzy oraz preparat farmaceutyczny do leczenia zaburzeń płytek krwi i małopłytkowości.

Megakariocyty są to duże wielojądrowe komórki o dużej zawartości cytoplazmy, wytwarzające płytki krwi i występujące przede wszystkim w szpiku kostnym. Megakariocyty powstąją z wieloczynnościowych krwiotwórczych komórek pnia w szpiku kostnym. Pierwotne wieloczynnościowe komórki pnia różnicują się do pewnego stopnia w komórki progenitorowe megakariocytów, które dająpoczątek linii megakariocytów. Komórki progenitorowe megakariocytów rozmnażająsię i różnicują w megakariocyty. Następnie dokonuje się poliploidacja megakariocy179 884 tów oraz dojrzewanie cytoplazmatyczne, wreszcie uwolnienie do obiegu pozbawionych jąder fragmentów cytoplazmy, czyli płytek krwi. Jeden dojrzały megakariocyt wytwarza średnio dwa do cztery tysiące płytek. Jakkolwiek mechanizm powstawania płytek jest w wielu punktach ciągle nieznany, rozważa się możliwość typowej lokalizacji megakariocytów w białkowej powierzchni zatoki śródbłonka w szpiku kostnym i rozszerzanie się wywoływanych przez nie procesów cytoplazmatycznych na zatokę, w której megakariocyty uwalniają płytki.

Jest wiele niejasności co do mechanizmu wytwarzania płytek krwi, jednak wydaje się prawdopodobne, że megakariocyty występują miejscowo w naskórkowej warstwie zatoki żylnej szpiku kostnego, a cytoplazma przechodząca przez tę warstwę tworzy powrózkowatą strukturę na wewnętrznej ścianie zatoki żylnej, przy czym następuje oddzielenie płytek.

Sugeruje się istnienie szczególnej funkcji służącej do wytwarzania i kontroli wytwarzania płytek przez megakariocyty. U zdrowych ludzi i zwierząt utrzymuje się odpowiednia liczba płytek krwi, lecz wiadomo np., że podawanie zdrowym zwierzątom przeciwciał antypłytkowych powoduje, iż liczba płytek gwałtownie maleje, a następnie zaczyna przejściowo wzrastać do liczby większej niż zazwyczaj, by w końcu powrócić do normalnego poziomu. Również w dziedzinie zagadnień klinicznych znane są takie zjawiska jak zmniejszenie liczby płytek, małopłytkowość i nadpłytkowość, nawet gdy liczba erytrocytów i leukocytów utrzymuje się na normalnym poziome.

Najważniejszą funkcją płytek krwi jest wytwarzanie skrzepimy w mechanizmie hemostatycznym. Jeśli mechanizm hemostatyczny nie funkcjonuje właściwie z powodu zmniejszenia liczby płytek, pojawiają się zaburzenia krzepliwości.

Sugeruje się obecność swoistego mechanizmu regulacji związanego z megakariocytopoeząi trombopoezą. U zdrowych ludzi i zwierząt liczba płytek utrzymuje się na właściwym poziomie. Wiadomo jednak, że podawanie zdrowym zwierzętom przeciwciał antypłytkowych powoduje w krótkim okresie gwałtowny spadek liczby płytek, a następnie jej wzrost przekraczający poziom normalny, wreszcie powrót do normalnego poziomu. Z doświadczeń klinicznych wynika, że zmniejszenie liczby płytek (trombocytopenia) lub jej wzrost trombocytoza) występuje nawet przy normalnym poziomie erytrocytów i leukocytów. Dotychczas jednak brak doniesień o skutecznej izolacji i identyfikacji swoistego regulatora uczestniczącego w wytwarzaniu płytek (jak np. erytropoetyna w przypadku wytwarzania erytrocytów).

Najważniejsząfunkcjąpłytekjest tworzenie skrzepimy w mechanizmie hemostatycznym. Gdy normalne funkcjonowanie mechanizmu hemostatycznego jest zakłócone przez trombocytopenię, występuje tendencja do krwawienia. W przypadku radioterapii i chemoterapii nowotworów, trombocytopenia spowodowana zahamowaniem czynności szpiku kostnego jest powikłaniem śmiertelnym. Aby zapobiec tendencji do krwawienia stosuje się wówczas transfuzję płytek. Transfuzję płytek stosuje się również u pacjentów po transplantacji szpiku kostnego lub w przypadku niedokrwistości aplastycznej.

Płytki przeznaczone do transfuzji otrzymuje się z płytek wydzielonych z krwi zdrowych dawców, jednak takie płytki mająkrótki czas przeżycia, a ponadto istnieje możliwość przeniesienia infekcji bakteryjnej. Transfuzja płytek może również stanowić niebezpieczeństwo wskutek narażenia pacjentów na kontakt z niebezpiecznymi wirusami, np. wirusem nabytego braku odporności (HIV) czy różnymi wirusami zapalenia wątroby, a także przez indukcję przeciwciał specyficznych dla głównego antygenu zgodności tkankowej (HLA) przetaczanych płytek oraz wywoływanie reakcji GVHD (reakcja przeszczepu przeciw gospodarzowi) wskutek zanieczyszczenia limfocytami płytek użytych do transfuzji.

Bardzo korzystne byłoby zatem umożliwienie wewnętrznej stymulacji wytwarzania płytek u pacjentów z trombocytopenią przy jednoczesnym zmniejszeniu ich uzależnienia od transfuzji. Ponadto możliwość leczenia lub zapobiegania trombocytopenii u pacjentów z chorobą nowotworową, poddawanych radio- i chemoterapii może przyczynić się do zwiększenia bezpieczeństwa i zintensyfikowania terapii, i w związku z tym do poprawy efektów leczenia nowotworów.

179 884

Z tych przyczyn przeprowadzono wiele intensywnych badań nad izolacją i identyfikacją specyficznych regulatorów, uczestniczących w produkcji megakariocytów i płytek krwi. Według badań in vitro ogólnie można wyróżnić dwa niżej wymienione czynniki regulujące megakariocytopoezę (patrz Williams i in., J. Cieli. Physiol., tom 110, s. 101-104, 1982). Czynnik stymulujący tworzenie kolonii megakariocytów (Meg-CSF) jest regulatorem stymulującym proliferację i różnicowanie CFU-MK do postaci kolonii megakariocytów w półstałej pożywce. Drugi regulator, zwany czynnikiem pobudzającym megakariocyty (Meg-Pot), stymulującym megakariocyty, stymulującym trombopoezę itp., działa głównie na niedojrzałe lub dojrzałe megakariocyty, pobudzające ich różnicowanie i dojrzewanie.

Czynnik Meg-Pot można w niektórych przypadkach wykryć w połączeniu z aktywnością Meg-CSF. Ponieważ liczba płytek w mm³ wzrasta po podaniu zdrowym zwierzętom surowicy lub plazmy pobranej od zwierząt z doświadczalnie wywołaną trombocytopenią przepuszczalnie istnieje czynnik humoralny, nazwany trombopoetyną o właściwościach pobudzających wytwarzanie płytek in vivo.

W ostatnich latach badaniom w kierunku właściwości stymulowania megakariocytopoezy i trombopoezy poddano niektóre cytokiny, których geny były klonowane. Ludzka IL-3 stymulowała powstawanie kolonii ludzkich megakariocytów (Bruno i in., Exp. Hematol., tom 16, s. 371-377,1988) i powodowała, przynajmniej u małpy, wzrost liczby płytek w mm³ (Donahue i in., Science, tom 24, s. 1820,1988). Jednakże, ponieważ IL-3 jest czynnikiem wpływającym na proliferację i różnicowanie się wszystkich komórek krwiotwórczych, należy odróżnić go od swoistych regulatorów kontrolujących powstawanie megakariocytów i płytek krwi. Ludzka IL-6 nie wykazywała aktywności Meg-CSF, lecz działała na niedojrzałe megakariocyty i pobudzała ich różnicowanie w formę dojrzałą (Willims i in., Exp. Hematol., t. 18, s. 69, 1990). Zastosowanie IL-6 in vivo wywoływało wytwarzanie płytek krwi i pobudzało zarówno dojrzewanie jak i poliploidie megakariocytów w szpiku kostnym u naczelnych, lecz powodowało również działanie uboczne w postaci spadku masy ciała i wywoływania produkcji białek ostrej fazy (Asno i in., Blood, t. 75, s. 1602-1605,1990; Stahl i in., Blood, t. 78, s. 1467-1475,1991). Ludzka IL-11 nie wykazywała aktywności Meg-CSF, lecz wywierała działanie Meg-Pot i wzmagała wytwarzanie płytek u myszy (Neben i in., Blood, t. 81, s. 901-908,1993). Ponadto ludzki LIF znacząco zwiększył liczbę płytek u naczelnych (Mayer i in., Blood, t. 81, s. 3226-3233, 1993), lecz jego oddziaływanie na megakariocyty in vitro było słabe (Burstein i in., J. Celi.Physiol., t. 153, s. 305-312, 1992).

Chociaż możliwe jest kliniczne zastosowanie tych cytokin jako czynników zwiększających liczbę płytek krwi, ich funkcje nie są specyficzne dla linii megakariocytów, a ponadto powodują działanie uboczne. Dlatego w dziedzinie klinicznej istnieje zapotrzebowanie na czynnik zwiększający liczbę płytek, specyficzny dla układu megakariocyt-płytka i powodujący zmniejszenie działań ubocznych.

Aktywność typu Mef-CSF, Meg-Pot i TPO stwierdzono w surowicy, w osoczu krwi i moczu pacjentów i zwierząt z małopłytkowościąoraz w nasączu z hodowli niektórych linii komórek ludzkich. Nie wiadomo jednak, czy aktywność ta jest przejawem obecności jednego czynnika czy też współwystępowania kilku czynników czy różnią się one od znanych cytokin.

Hoffman i in. stwierdzili, że surowica pacjentów z anemiąaplastycznąi amegakariocytową plamicą małopłytkową wykazywała aktywność Meg-CSF, znacząco pobudzającą tworzenie kolonii megakariocytów ludzkich (Hoffman i in., N. Eng. J. Med., tom 305, s. 533-538, 1981). Mazur i in. wykazali później, że aktywność typu Meg-CSF w surowicy pacjentów z anemią aplastyczną była odmienna niż aktywność IL-3 oraz GM-CSF (Mazur i in., Blood, t. 73, s. 290-297, 1990). Podobną aktywność Meg-CSF stwierdzono u pacjentów z chorobą nowotworową, poddawanych intensywnej chemoterapii cytotoksycznej i u pacjentów po przeszczepie szpiku kostnego (Mazur i in., Exp. Hematol., t. 12, s. 624-628, 1984; de Alarcon i Schmieder, Próg. Clin.bio. Res., t. 215, s. 335-340,1986). Hoffman i in. donosząc oczyszczeniu Meg-CSF o pozornej masie cząsteczkowej 46,000 z osocza pacjentów z trombocytopeniąhipomegakariocytową (Hoffman i in., J. Clin. Invest., t. 75, s. 1174-1182,1985), lecz dalsze badania wykazały, że

179 884 poziom czystości materiału nie pozwala na dokładne określenie sekwencji aminokwasów (Hoffman, Blood, t. 74, s. 1196-1212,1989). Z osocza pacjentów z małopłytkowością i moczu pacjentów z samoistną plamicą małopłytkową (ITP) częściowo oczyszczono substancję o aktywności TPO-podobnej, która zwiększyła inkorporację⁷⁵Selenenometioniny do nowopowstających płytek. Pozorną masę cząsteczkową czynnika otrzymanego z osocza określono jako 40,000 (Grossi in., Hematologica, tom 72, s. 291-295, 1987; Vannucchi i in., Leukemia, t. 2, s. 236-240, 1988).

Aktywność Meg-CSF i TPO-podobną stwierdzono także w próbkach moczu pacjentów z anemiąaplastycznąi ostrąlTP (Kawakita i in., Br. J. Haematol., tom 48, s. 609-615,1981; Kawakita i in., Blood, s. 556-560, 1983). Kawakita i in. wykazali również, że aktywność Meg-CSF stwierdzona w wyciągu moczu pacjentów z anemią aplastyczną charakteryzuje się pozorną masą cząsteczkową 45,000, oznaczoną za pomocą filtracji żelowej w stanie dysocjacji (Kawakita in., „Blood Celi Growth Factors: their present and futurę use in hematology and oncology”, wyd. Murphy, AlphaMed Press, Dayton, Ohio, s. 204-220,1992). Turner i in. oczyścili czynnik stymulujący megakariocyty (MSF) o aktywności Meg-CSF z moczu pacjentów po przeszczepie szpiku kostnego i klonowali jego gen (Turner i in., Blood, t. 78, s. 1106 279a, 1991, (abstr., supple. 1)). Czynnik MSF posiada masę cząsteczkową od 28,000 do 35,000. Do wyjaśnienia pozostaje tożsamość tego czynnika z Meg-CSF odkrytym wcześniej w surowicy i osoczu pacjentów z małopłytkowością oraz jego działanie zwiększające liczbę płytek.

Substancje o aktywności TPO-podobnej i masie cząsteczkowej 32,000 oczyszczono z nadsącza hodowli linii komórkowej pochodzącej z nerki płodu ludzkiego (komórki HEK), a jej właściwości biologiczne i biochemiczne poddano szczegółowym badaniom. Jej struktura pozostaje jednak w dalszym ciągu nieznana (McDonald i in., J. Lab. Clin. Med., t. 106, s. 162-174, 1985; McDonald, Int. J. Celi Cloning, t. 7, s. 139-155,1989). Inni autorzy twierdzą natomiast, że główna aktywność komórek HEK, pobudzająca dojrzewanie megakariocytów in vitro w warunkach hodowli jest spowodowana przez znane cytokiny, mianowicie IL-6 i EPO (Withy i in., J. Celi. Physiol, t. 15, s. 362-372, 1992).

Jeśli chodzi o czynniki pochodzenia zwierzęcego, Evatt i in. wykazali, że aktywność TPO-podobna, zwiększająca inkorporacje ⁷⁵Seselenometioniny do nowopowstałych płytek u królika i myszy występuje w osoczu królików z trombocytopenią wywołaną wstrzyknięciem surowicy antypłytkowej (Evett i in., J. Lab. Clin. Med., tom 83, s, 364-371, 1974). Ponadto wiele podobnych badań przeprowadzono w latach 60-tych i 70-tych (np. Odęli i in., Proc. Soc. Biol. Med., t. 108, s. 428-431,1961; EvattiLevin, J. Clin. Invest., t. 48, s. 1615-1626,1969; Harker, J. Physiol., t. 218, s. 1376-1380,1970; Shreiner i Levin, J. Clin. Invest., t. 49, s. 1709-1713, 1970 oraz Penington, Br. Med. J. t. 1, s. 606-608, 1070). Evatt i in., Hill i Levin przeprowadzili częściowe oczyszczanie czynnik o aktywności TPO-podobnej z osocza królików z trombocytopenią(Evatt i in., Blood, t. 54, s. 377-388,1979, Hill i Levin, Exp. Hematol., T. 14; s. 752-759,1986). Oczyszczanie kontynuowano, poddając stałej obserwacji aktywność wpływającą na różnicowanie i dojrzewanie megakariocytów in vitro, czyli aktywność Meg-Pot, przy czym stwierdzono, że aktywność ta wykazuje pozorną masę cząsteczkową 40,000 do 46,000, określoną za pomocą filtracji żelowej (Keller i in., Exp. Hematol., t. 6, s. 262-267,1988; Hilliin.,£x/?. Hematol., t. 20, s. 354-360, 1992). Ponieważ w osoczu królików z ciężką ostrą trombocytopenią, wywołaną wstrzyknięciem surowicy antypłytkowej, nie wykryto aktywności IL-6, przypuszcza się, że aktywność TPO-podobna została wywołana innym czynnikiem niż IL-6 (Hill i in., Blood, t. 80, s. 346-351, 1992).

Tayrien i Rosenberg również oczyścili czynnik o pozornej masie cząsteczkowej 15,000 z plazmy królika z trombocytopenią i z nadsącza hodowli komórek HEK, stymulujący wytwarzanie czynnika płytkowego 4 w linii komórkowej megakariocytów szczura, lecz nie podali informacji o jego strukturze (Tayrien i Rosenberg, J. Biol. Chem., t. 262, s. 3262-3268, 1987).

Ponadto Nakeff wykrył aktywność Meg-CSF w surowicy myszy z małopłytkowością indukowana wstrzyknięciem surowicy antypłytkowej (Nakeff, „Experimental Hematology Today”, wyd. Baum and Ledney, Springer-Verlag, NY, s. 111-123, 1977). Również surowica królików z trombocytopeniązwiększyła dojrzewanie megakariocytów (Keller i in., Exp. Hema

179 884 tol., 1.16, s. 262-267,1988; Hill i in., Exp. Hematol., t. 17, s. 903-907,1989) i stymulowała zmianę morfologicznąmegakariocytów w płytki krwi (Leven i Yee, Blood, t. 69, s. 1046-1052,1989), lecz nie stwierdzono w niej aktywności Meg-CSF.

Miura i in. wykryli aktywność Meg-CSG w plazmie szczurów z trombocytopenią wywołaną napromieniowaniem całego organizmu dawką subletalną (Miura i in., Blood, t. 63, s. 1060-1066, 1985). Sugerują oni, że indukcja aktywności Meg-CSG in vivo jest związana ze zmniejszoną liczbąmegakariocytów przy niezmniejszonej liczbie płytek, ponieważ aktywność ta nie zmienia się transfuzji płytek (Miura i in., Exp. Hematol., t. 16, s. 139-144, 1988). Mazur i South wykryli aktywność MegCSF w surowicy subletalnie napromieniowanych psów i za pomocą filtracji żelowej wyznaczyli pozorną masę cząsteczkową jako 175,000 (Mazur i South, Exp., Hematol., t. 15, s. 657-663, 1987).

Jak wynika z powyższych danych, w próbkach biologicznych, pochodzących od pacjentów i zwierząt z trombocytopenią wykryto różne czynniki aktywne, stymulujące megakariopoezę i trombopoezę, lecz ze względu na ekstremalnie małą zawartość w naturalnych źródłach nie powiodła się ich izolacja oraz identyfikacja właściwości biologicznych i biochemicznych.

Istota polipeptydu TPO lub jego pochodnej, o aktywności biologicznej swoiście stymulującej lub zwiększającej produkcję płytek krwi, polega na tym, że zawiera sekwencję aminokwasów 1 do 332 SEQ ID nr 6 lub jej modyfikację.

Korzystnym jest gdy polipeptyd TPO jest konwalencyjnie związany z polimerem, zwłaszcza z glikolem polietylenowym.

Korzystnym jest także gdy polipeptyd TPO zawiera dodatkowo aminokwas Met^-Lys'¹.

Z kolei korzystnym jest gdy polipeptyd TPO zawiera dodatkowo aminokwas Met’¹.

Ponadto korzystnym jest gdy polipeptyd TPO zawiera dodatkowo także aminokwasGly’¹.

Dodatkowo korzystnym jest gdy polipeptyd TPO zawiera dojrzałą sekwencję aminokwasów SEQ ID nr 2, 4 lub 6.

Dalej korzystnym jest gdy pochodna polipeptydu TPO składa się z sekwencji aminokwasów 1 do 163 SEQ ID nr 6.

Korzystnym jest także gdy pochodna polipeptydu TPO składa się z sekwencji aminokwasów 1 do 232 SEQ ID nr 6.

Dalej korzystnym jest gdy pochodna polipeptydu TPO składa się z sekwencji aminokwasów 1 do 151 SEQ ID nr 6.

Ponadto korzystnym jest gdy pochodna polipeptydu TPO jest wybrana z grupy składającej się z [Thr³³, Thr³³³, Ser³³⁴, Ile³³⁵, Gly³³⁶, Tyi³³⁷, Pro³³⁸, Tyr³³⁹, Asp³⁴⁰, Val³⁴¹, Pro³⁴², Asp³⁴³, Tyr³⁴⁴, Ala³⁴⁵, Gly³⁴⁶, Val³⁴⁷, His³⁴⁸, His³⁴⁹, His³⁵⁰, His³⁵¹, His³⁵², His³⁵³]TPO i [Asn²⁵, Lys²³¹, Thr³³³, Ser³³⁴, Ile³³⁵, Gly³³⁶, Tyr³³⁷, Pro³³⁸, Tyr³³⁹, Asp³⁴⁰, Val³⁴¹, Pro³⁴², Asp³⁴³, Tyr³⁴⁴, Ala³⁴⁵, Gly³⁴⁶, Val³⁴⁷, His³⁴⁸, His³⁴⁹, His³⁵⁰, His³⁵¹, His³⁵², His³⁵³]TPO.

Następnie korzystnym jest gdy pochodna polipeptydu TPO jest wybrana z grupy składającej się z [Asn²⁵]TPO i [Thr³³]TPO.

Także korzystnym jest gdy pochodna polipeptydu TPO jest wybrana z grupy składającej się z [AHis³³]TPO (1-163), [AArg¹¹⁷]TPO (1-163) i [AGly¹¹⁶]TPO (1-163).

Również korzystnym jest gdy pochodna polipeptydu TPO jest wybrana z grupy składającej się z [His³³, Thr³³', Pro³⁴]TPO (1-163), [His³³, Ala³³', Pro³⁴]TPO (1-163), [His³³, Gly³³', Pro³⁴, Ser³⁸]TPO (1-163), [Gly¹¹⁶, Asn¹¹⁶', Arg¹¹⁷]TPO (1-163), [Gly¹¹⁶, Ala¹¹⁶', Arg¹¹⁷]TPO (1-163), [Gly¹¹⁶, Gly¹¹⁶', Arg¹¹⁷]TPO (1-163) i [Ala¹, TPO jest Val³]TPO (1-163).

Następnie korzystnym jest gdy pochodna polipeptydu TPO jest wybrana z grupy składającej się z [Ala¹, Val³, Arg¹²⁹]TPO (1-163), [Ala¹, Val³, Arg¹³³]TPO (1-163), [Ala¹, Val³, Arg¹⁴³]TPO (1-163), [Ala¹, Val³, Leu⁸²]TPO (1-163), [Ala¹, Val³, Leu¹⁴⁶]TPO (1-163), [Ala¹, Val³, Pro¹⁴⁸]TPO (1-163), [Ala¹, Val³, Arg⁵⁹]TPO (1-63) i [Ala¹, Val³. Arg¹¹⁵]TPO (1-163).

Także korzystnym jest gdy pochodna polipeptydu TPO jest wybrana z grupy składającej się z [Arg¹²⁹]TPO (1-163), [Arg¹³³]TPO (1-163), [Arg¹⁴³]TPO (1-163), [Leu⁸²]TPO (1-163), [Leu¹⁴⁶]TPO (1-163), [Pro¹⁴⁸]TPO (1-163), [Arg⁵⁹]TPO (1-163) i [Arg¹¹⁵]TPO (1-163).

179 884

Z kolei korzystnym jest gdy pochodna polipeptydu TPO zawiera dodatkowo aminokwas Met^-Lys’¹.

Również korzystnym jest gdy pochodna polipeptydu TPO zawiera dodatkowo aminokwas Met¹.

Także korzystnym jest gdy pochodna polipeptydu TPO zawiera dodatkowo aminokwas Gly'¹.

Z kolei korzystnym jest gdy pochodna polipeptydu TPO jest pozbawiona od 1 do 6 aminokwasów amino-końcowych.

Następnie korzystnym jest gdy pozbawiona od 1 do 6 aminokwasów amino-końcowych pochodna polipeptydu TPO zawiera dodatkowo aminokwas Met^-Lys'¹.

Również korzystnym jest gdy pochodna polipeptydu TPO pozbawiona od 1 do 6 aminokwasów amino-końcowych pochodna polipeptydu TPO zawiera dodatkowo aminokwas Met^-1.

Także korzystnym jest gdy pochodna polipeptydu TPO pozbawiona od 1 do 6 aminokwasów amino-końcowych pochodna polipeptydu TPO zawiera dodatkowo aminokwas Gly’¹.

Kolejna istota wynalazku polega na tym, że DNA kodujący polipeptyd TPO lub jego pochodne, charakteryzujące się aktywnością biologiczną swoiście stymulującą lub zwiększającą produkcje płytekkrwi, zawiera sekwencje nukleotydów kodującąpozycję sekwencji aminokwasów polipeptydu TPO lub jego pochodnych według SEQ ID nr 2,4 lub 6, a także według częściowych, nie naruszających aktywności biologicznej, modyfikacji tych sekwencji.

Korzystnym jest gdy DNA kodujący polipeptyd TPO lub jego pochodne zawiera sekwencję nukleotydów kodującąpozycję sekwencji aminokwasów 1 do 332, a w tym także 1 do 232, 1 do 163 ŚEQ ID nr 6, jak również ich sekwencji bez 1-6 aminokwasów amino-końcowych, lub też 1 do 151 SEQ ID nr 6, przy czym polipeptyd TPO lub jego pochodne mogą dodatkowo zawierać aminokwas Met^-Lys'¹, Met'¹ lub Gly'¹.

Kolejna istota wynalazku polega na tym, że sekwencja DNA i/lub genomowego DNA i/lub syntetycznego DNA, zapewniająca ekspresję polipeptydu TPO lub jego pochodnych, charakteryzujących się aktywnością biologiczną swoiście stymulującą lub zwiększającą produkcję płytek krwi, jest wybrana z grupy składającej się z:

a) sekwencji DNA według SEQ ID nr 194,195,196 lub ich łańcuchów komplementarnych; oraz

b) sekwencji DNA, które hybrydyzując w ściśle określonych warunkach, tworzą sekwencje DNA określone w (a) lub ich fragmenty; oraz

c) sekwencji DNA mogących hybrydyzować do sekwencji DNA określonych w (a) lub (b), powodując przy tym degeneracje w sekwencji nukleotydów.

Kolejna istota wynalazku polega na tym, że sekwencja cDNA zapewniająca ekspresję polipeptydu TPO lub jego pochodnych, charakteryzujących się aktywnością biologiczną swoiście stymulującą lub zwiększającą produkcję płytek krwi, jest wybrana z grupy składającej się z:

d) sekwencji DNA według SEQ ID nr 194, 195, 196 lub ich łańcuchów komplementarnych; oraz

e) sekwencji DNA, które hybrydyzując w ściśle określonych warunkach, tworzą sekwencje DNA określone w (a) lub ich fragmenty; oraz

f) sekwencji DNA mogących hybrydyzować do sekwencji DNA określonych w (a) lub (b), powodując przy tym degenerację w sekwencji nukleotydów.

Kolejna istota wynalazku polega na tym, ze realizację sposobu otrzymywania polipeptydu TPO, zawierającego sekwencję aminokwasów 1 do 332 SEQ ID nr 6 i charakteryzującego się aktywnością biologiczną swoiście stymulującą lub zwiększającąprodukcję płytek krwi, prowadzi się w co najmniej dwóch następujących etapach:

1/ dokonanie, w komórkach gospodarza, ekspresji kodowanego przez DNA polipeptydu TPO z wykorzystaniem sekwencji DNA i/lub cDNA i/lub genomowego DNA i/lub syntetycznego DNA wybranych z grupy zawierającej:

a) sekwencje DNA według SEQ ID nr 194, 195, 196 lub ich łańcuchy komplementarne; oraz .

b) sekwencje DNA, które hybrydyzując w ściśle określonych warunkach, tworzą sekwencje DNA określone w (a) lub ich fragmenty; oraz

179 884

c) sekwencje DNA mogące hybrydyzować do sekwencji DNA określonych w (a) lub (b) powodując przy tym degenerację sekwencji nukleotydów.

11/ wyizolowanie polipeptydu TPO.

Korzystnym jest gdy w tym sposobie, polipeptydem TPO podlegającym ekspresji jest polipeptyd Met^-Lys’¹, przy czym w drugim etapie (II) dokonuje się oddzielenia Mef²-Lys'' od wyizolowanego polipeptydu TPO.

Dalej korzystnym jest, gdy sposób ten zawiera dwa dodatkowe etapy, przy czym poszczególne etapy obejmują:

1/ dokonanie, w komórkach gospodarza, ekspresji polipeptydu przy użyciu DNA kodującego peptyd rozpoznania trombiny końca 5' sekwencji kodujących polipeptyd TPO oraz S-transferazę glutationową (GST)5' dla peptydu rozpoznania trombiny,

II/ wyizolowanie polipeptydu GST - TPO,

111/ traktowanie trombiną wyizolowanego polipeptydu GST - TPO,

IV/ wyizolowanie polipeptydu Gly'¹ - TPO.

Z kolei korzystnym jest gdy w czwartym etapie (IV) dokonuje się izolacji polipeptydu [Gly^TPO (1-174).

Także korzystnym jest gdy w czwartym etapie (IV) dokonuje się izolacji pochodnej polipeptydu TPO, która składa się z aminokwasów 1 do 174 SEQ ID nr 6.

Kolejną istotą wynalazku jest sposób rozwoju prokariotycznych lub eukariotycznych komórek gospodarzy, według którego komórki te transformuje się lub transfekuje sekwencjąDNA i/lub cDNA i/lub genomowego DNA i/lub syntetycznego DNA, wybrana z grupy zawierającej:

a) sekwencje DNA według SEQ ID nr 194, 195, 196 lub ich łańcuchy komplementarne; oraz

b) sekwencje DNA, które hybrydyzując w ściśle określonych warunkach, tworzą sekwencje DNA określone w (a) lub ich fragmenty; oraz

c) sekwencje DNA mogące hybrydyzować do sekwencji DNA określonych w (a) lub (b) powodując przy tym degenerację sekwencji nukleotydów.

Ostatnią istotą wynalazku jest preparat farmaceutyczny do leczenia zaburzeń płytek krwi i małopłytkowości, zwłaszcza wywołanej chemioterapią, radioterapia lub transplantacją szpiku kostnego, składający się z polipeptydu TPO lub jego pochodnych, zawierających sekwencje aminokwasów 1 do 332 SEQ ID nr 6 i/lub jej modyfikację i/lub dojrzałą sekwencję aminokwasów SEQ ID nr 2, 4 lub 6 oraz charakteryzujących się aktywnością biologiczną swoiście stymulującą lub zwiększającąprodukcję płytek krwi, w połączeniu z farmaceutycznie dopuszczalnym nośnikiem.

Korzystnym jest gdy, w preparacie polipeptyd TPO jest konwalencyjnie związany z polimerem, korzystnie z glikolem polietylenowym, i/lub zawiera dodatkowo aminokwas Met^-Lys^-1 i/lub Met^-1 i/lub Gly^-1.

Także korzystnym jest gdy preparat zawiera pochodnąpolipeptydu TPO, która składa się z sekwencji aminokwasów 1 do 163 lub 1 do 232 lub 1 do 151 SEQ ID nr 6, i/lub zawiera dodatkowo aminokwas Met^-Lys'¹ i/lub Met'¹ i/lub Gly'¹.

Efektem wynalazku jest izolacja z naturalnych źródeł, oraz identyfikacja polipeptydu TPO o działaniu stymulującym i zwiększającym produkcje płytek krwi in vivo i/lub pobudzającym proliferacje oraz różnicowanie komórek progenitorowych megakariocytów- tzw. „aktywność TPO”, a także izolacja genu kodującego polipeptyd TPO i sposób wytwarzania tego polipeptydu o jednorodnej jakości i w dużych ilościach, przy wykorzystaniu technik rekombinacji DNA. Osiągnięcie tych celów spowoduje zastąpienie lub ograniczenie częstotliwości stosowanej dotąd transfuzji płytek krwi. Polipeptyd według wynalazku może być również stosowany w diagnozowaniu i leczeniu zaburzeń płytkowych.

Dalsze zalety wynalazku zostały przedstawione w opisie przykładów wykonania.

Figura 1 przedstawia chromatografie żelową w kolumnie Sephacryl S-200HR frakcji F2 pochodzącej z XRP uzyskanej na Fenylosefarozie 6 FF/LS.

179 884

Figura 2 przedstawia chromatografię z odwróconymi fazami w kolumnie Capcell Pak Cl frakcji o aktywności TPO pochodzącej z małocząsteczkowej próbki TPO, uzyskanej w kolumnie Sephacryl S-200 HR jako frakcja F3 z XRP.

Figura 3 przedstawia analizę SDS-PAGE frakcji FA o aktywności TPO uzyskanej w kolumnie Capcell Cl i pochodzącej z małocząsteczkowej próbki TPO pochodzącej z XRP.

Figura 4 przedstawia mapy peptydów uzyskane za pomocą chromatografii Cl8 HPLC z odwróconymi fazami z TPO szczura, wyizolowanej metodą SDS-PAGE. Fragmenty peptydowe uzyskano przez systematyczną hydrolizę przy użyciu trzech proteaz.

Figura 5 przedstawia aktywność TPO pochodzącą z XRP w systemie analizy z zastosowaniem CFU-MK szczura.

Figura 6 przedstawia konstrukcję wektora ekspresji pEF18S.

Figura 7 przedstawia aktywność TPO w nadsączu z hodowli komórek COSI, do których wprowadzono pEF185-A2a w systemie analizy z zastosowaniem CFU-MK szczura.

Figura 8 przedstawia aktywność TPO w nadsączu z hodowli komórek COSI, do których wprowadzono pEF18S-E!L34 w systemie analizy z zastosowaniem CFU-MK szczura.

Figura 9 przedstawia aktywność TPO w nadsączu z hodowli komórek COSI, do których wprowadzono pHT 1-231 w systemie analizy z zastosowaniem CFU-MK szczura.

Figura lOa przedstawia aktywność TPO w nadsączu z hodowli komórek COS 1, do których wprowadzono pHTFl w systemie analizy z zastosowaniem CFU-MK szczura.

Figura 1 Ob przedstawia aktywność TPO w nadsączu z hodowli komórek COS 1, do których wprowadzono pHTFl w systemie analizy z zastosowaniem M-07.

Figura 11 przedstawia masę restrykcji klonuZHGTl i konstrukcję pHGTl i PEFHGTH (E: EcoRI, H:HindIII, S:SaII).

Figura 12a przedstawia aktywność TPO w nadsączu z hodowli komórek COS 1, do których wprowadzono pEFHGTE w systemie analizy z zastosowaniem CFU-MK szczura.

Figura 12b przedstawia aktywność TPO w nadsączu z hodowli komórek COS 1, do których wprowadzono pEFHGTE w systemie analizy z zastosowaniem M-07e.

Figura 13a przedstawia aktywność TPO w nadsączu z hodowli komórek COS 1, do których wprowadzono pHT 1 -163# 1, pHT 1 -191 # 1 lub pHT 1 -171 #2 w systemie analizy z zastosowaniem CFU-MK szczura.

Figura 13b przedstawia aktywność TPO w nadsączu z hodowli komórek COS 1, do których wprowadzono pHTl-163#2 systemie analizy z zastosowaniem CFU-MK szczura.

Figura 14 przedstawia aktywność TPO w nadsączu z hodowli komórek COSI, do których wprowadzono pHT 1 -211 # 1, pHT 1 -191 # 1, pHT 1 -171 #2 lub pHT 1 -163#2 w systemie analizy z zastosowaniem M-07e.

Figura 15 jest chromatogramem chromatografii z odwróconymi fazami (w kolumnie Vydac C4) przeprowadzonej w celu oczyszczenia ludzkiej TPO z nadsącza hodowli komórek CHO, do których wprowadzono pDEF2020hTPO-Pl, umożliwiając ekspresję TPO.

Figura 16 jest fotografią przedstawiającą oddzielenie na SDS-PAGR ludzkiej TPO oczyszczonej z nadsącza hodowli komórek CHO, do których wprowadzono pDEF202-hTPO-P 1, umożliwiając ekspresje TPO.

Figura 17 jest chromatogramem chromatografii z odwróconymi fazami przeprowadzonej w celu oczyszczenia ludzkiej TPO z E. coli, do której wprowadzono pCFM536/h6T(l-163), umożliwiając ekspresję TPO.

Figura 18 jest fotografią przedstawiającą oddzielenie na SDS-PAGE wariantu ludzkiej TPO, hGT(l-163), wyizolowanego i oczyszczonego z E. coli, do której wprowadzono pCFM536(h6T(l-163), umożliwiając ekspresję TPO.

Figura 19 przedstawia wzór elucji hTPO163 w kolumnie Superdex 75 pg, z uwzględnieniem oczyszczenia hTPO163 z nadsącza hodowli, jako materiału wyjściowego, uzyskanego przez transfekcję plazmidu z ekspresją ludzkiej TPO, pDEF202-hTPO163, do komórek CHO. Ilość protein określono na 220 nm.

179 884

Figura 20 przedstawia analizę SDS-PAGE wzorowego hTPO163 eluowanego z kolumny Superdex 75 pg po oczyszczeniu hTPO163 z nadsącza z hodowli jako materiału wyjściowego, uzyskanego przez transfekcję plazmidu z ekspresją ludzkiej TPO, pDEF202-hTPO163, do komórek CHO. Na żelu uzyskano srebrne zabarwienie hTPO163.

Figura 21 przedstawia budowę wektora ekspresji pSMT201.

Figura 22 przedstawia wykres aktywności TPO, wyznaczonej w teście z zastosowaniem M-07e, w nadsączu z hodowli komórek COS7, do których wprowadzono ulęgające późniejszej ekspresji pGL-TPO, N3/TPO lub 09/TPO.

Figura 23 jest wykresem aktywności TPO, wyznaczonej w teście z zastosowaniem M-07e, w nadsączach hodowli komórek COS7, do których wprowadzano pochodną ludzkiej TPO uzyskaną przez insercję lub delecję.

Figura 24 przedstawia wzrost liczby płytek krwi u myszy po podaniu TPO w postaci wstrzyknięcia dożylnego lub podskórnego.

Figura 25 przedstawia zależny od dawki wzrost liczby płytek u myszy po podskórnym wstrzyknięciu TPO.

Figura 26 przedstawia indukowany przez TPO wzrost liczby płytek u myszy po podaniu 5-FU w celu wywołania trombocytopenii.

Figura 27 przedstawia indukowany przez TPO wzrost liczby płytek krwi po podaniu chlorowodorku nimustyny w celu wywołania trombocytopenii.

Figura 28 przedstawia indukowany przez TPO wzrost liczby płyteku myszy z trombocytopeniąpo przeszczpie szpiku kostnego.

Figura 29 przedstawia indukowany przez TPO wzrost liczby płytek u myszy po naświetleniu promieni X w celu wywołania trombocytopenii.

Figura 30 przedstawia zależność wzrostu płytek od dawki po podaniu przeciętnej prostopadle do powierzchni TPO (aminokwasy 1-163 w SEQ ID nr 6).

Figura 31 przedstawia wzrost liczby płytek w następstwie podania przeciętej prostopadle do powierzchni TPO (aminokwasy 1-163 w SEQ ID nr 6) po wywołaniu trombocytopenii przy użyciu chlorowodorku nimustyny.

Figura 32 ukazuje hamowanie rozwoju megakariocytów pod wpływem wzrastającego stężenia Mpl-X dodawanego do układu hodowli megakariocytów ludzkich.

Figura 33 przedstawia określoną w teście z zastosowaniem M-07e aktywność pochodnych TPO: [Met², Lys'¹, Ala¹, Val³, Alg¹³³], [Met’², Lys'¹, Ala¹, Val³, Pro¹⁴⁸] TPO(1-163) i [Met'², Lys'¹, Ala¹, Val³, Arf¹¹⁵] TPO91-163) z ekspresjąE. coli.

Figura 34 przedstawia określonąw teście z zastosowaniem M-07e aktywność pochodnych TPO [Met'², Lys'¹, Ala¹, Val³, Alg¹²⁹] TPO (1-163), [Met², Lys’¹, Ala¹, Val³, Arg¹⁴³] TPO (1-163), [Met'², Lys'¹, Ala¹, Val³, Leu⁸²] TPO 91-163) [Met’², Lys’¹, Ala¹, Val³, Leu¹⁴⁶] TPO (1-163) i [Met², Lys'¹, Ala¹, Val³, Arg⁵⁹] TPO (1-163) z ekspresją w E. coli.

Przedstawiony wynalazek obejmuje wyszczególnione polipeptydy trombopoetyny (TPO) o biologicznych właściwościach specyficznej stymulacji lub zwiększania produkcji płytek, posiadające sekwencje aminokwasów od 1 do 332 według SEQ ID nr 6 lub ich pochodne. Ilustrujące polipeptydy składają się z sekwencji aminokwasów 1 do 163 według SEQ ID nr 6, 2 do 232 według SEQ ID nr 6, 1 do 151 według SEQ ID nr 6 oraz dojrzałej sekwencji aminokwasów według SEQ ID nr: 2,4 i 6, łącznie z tymi, z których usunięto od 1 do 6 NH₂ końcowych aminokwasów. Dodatkowe ilustrujące polipeptydy według wynalazku stanowią [Thr³³, Thr³³³, Ser³³⁴, Ile³³⁵, Gly³³⁶, Tyr³³⁷, Pro³³⁸, Tyr³³⁹, Asp³⁴⁰, Val³⁴¹, Pro³⁴², Asp³⁴³, Tyr³⁴⁴, Ala³⁴⁵, Gly³⁴⁶, Val³⁴⁷, His³⁴⁸, His³⁴⁹, His³⁵⁰, His³⁵¹, His³⁵², His³⁵³] TPO, [Asn²⁵, Lys²³¹, Thr³³³, Ser³³⁴, Ile³³⁵, Gly³³⁶, Tyr³³⁷, Pro³³⁸, Tyr³³⁹, Asp³⁴⁰, Val³⁴¹, Pro³⁴², Asp³⁴³, Tyr³⁴⁴, Ala³⁴⁵, Gly³⁴⁶, Val³⁴⁷, His³⁴⁸, His³⁴⁹, His³⁵⁰, His³⁵¹, His³⁵², His³⁵³] TPO, [Asn²⁵] TPO i [Thr³³] TPO. Inne polipeptydy według wynalazku stanowią pochodne polipeptydów TPO: [AHis³³] TPO (1-163), [AArg¹¹⁷] TPO (1-163), [AGly¹¹⁶]TPO (1-163), [His³³, Thr³³', Pro³⁴] TPO (1-163), [His³³, Thr³³', Pro³⁴] TPO (1-163), [His³³, Ala³³', Pro³⁴] TPO (1-163), [His³³, Gly³³', Pro³⁴, Ser³⁸] TPO (1-163), [Gly¹¹⁶, Asn¹¹⁶', Arg¹¹⁷] TPO (1-163), [Gly¹¹⁶, Ala¹¹⁶', Arg¹¹⁷] TPO (1-163) [Gly¹¹⁶, Gly¹¹⁶', Arg¹¹⁷] TPO (1-163),

179 884

[Ala¹, Val³, Arg¹²⁹] TPO (1-163), [Ala¹, Val³, Leu³, Leu⁸²] TPO (1-163), [Ala¹, Val³, Arg⁵⁹] TPO (1-163) oraz [Ala¹, Val³, Arg¹¹⁵] TPO (1-163).

Polipeptydy TPO według wynalazku są również polipepty darni kowalencyjnie związanymi z polimerem, najlepiej glikolem polietylenowym. Polipeptydy według wynalazku mogą ponadto zawierać aminokwasy [Met'², Lys'²], [Met'¹] lub [Gly'¹]. Kwasy DNA będące przedmiotem wynalazku obejmująDNA kodujące polipeptydy TPO i pochodne opisane powyżej, określone odpowiednio jako cDNA, DNA genomowe i DNA przemysłowe.

Wynalazek obejmuje również sposoby otrzymywania polipeptydu TPO jak opisano powyżej, obejmujące etapy ekspresji polipeptydu zakodowanego w DNA według wynalazku w odpowiednim organizmie gospodarza oraz izolacje uzyskanego polipeptydu TPO. Jeżeli polipeptyd TPO ulega ekspresji jako polipeptyd Met^-Lys'¹, sposób otrzymywania może obejmować dalszy etap odłączenia Met^-Lys'¹ od wyizolowanego polipeptydu TPO.

Ponadto wynalazek obejmuje sposoby otrzymywania polipeptydów TPO takich jak połączone polipeptydy transferazy S-glutationowej (GST). DNA kodujący aminowy koniec polipeptydu GST, peptyd rozpoznawczy trombiny i polipeptyd TPO wprowadza się do odpowiedniego gospodarza, izoluje połączony polipeptyd i usuwa cząstkę GST przy pomocy trombiny. Ostatecznie polipeptydy TPO mają strukturę [Gly'¹].

Wynalazek dotyczy także prokariotycznych i eukariotycznych komórek macierzystych transformowanych lub transfekowanych sekwencją DNA według wynalazku w sposób umożliwiający w komórkach macierzystych ekspresję polipeptydu o biologicznej aktywności stymulującej lub zwiększającej produkcję płytek.

Preparaty farmaceutyczne według wynalazku zawierające efektywną ilość polipeptydu TPO lub jego pochodnej w połączeniu z dopuszczalnym w farmacj i nośnikiem, mogąbyć wykorzystywane w leczeniu zaburzeń płytkowych, zwłaszcza trombocytopenii, np. wywołanej przez chemoterapię, radioterapię lub transplantację szpiku kostnego. Wynalazek obejmuje również związane z tym metody leczenia.

Wynalazek obejmuje ponadto przeciwciała, szczególnie imunoreaktywne z polipeptydarni TPO i ich pochodnymi, opisanymi powyżej. Przeciwciała te wykorzystuje się w sposobach izolacji i oznaczania ilościowego polipeptydów TPO według wynalazku.

W zakres wynalazku wchodzi również nowa sekwencja DNA, kodującąproteinę o aktywności TPO (zwanądalej „sekwencjąDNA według wynalazku”). Sekwencja DNA według wynalazku obejmuje sekwencję DNA kodującą sekwencje aminokwasów według SEQ ID nr: 2,4 i 6 w załączonym spisie sekwencji.

W sekwencji DNA według wynalazku zawiera siew również sekwencja DNA, kodująca częściowo zmodyfikowaną (przez substytucję, delecję, insercję lub addycję) wersję wyżej wspomnianej sekwencji aminokwasu według SEQ ID nr: 2,4 lub 6, pod warunkiem, że takie modyfikacje nie naruszają aktywności TPO. Tym samym wynalazek obejmuje sekwencje DNA kodujące pochodne TPO.

Inaczej mówiąc, sekwencja DNA według wynalazku obejmuje sekwencje DNA, kodujące cząsteczki proteiny, której sekwencje aminokwasów sązasadniczo sekwencjami aminokwasów według SEQ ID nr: 2,4 lub 6. Użyte tutaj wyrażenie „sekwencje aminokwasów sązasadniczo sekwencjami aminokwasów według SEQ ID nr: 2, 4 lub 6”oznacza, że wspomniane sekwencje aminokwasów obejmują sekwencje reprezentowane przez SEQ ID nr 2, 4 lub 6 oraz częściowo zmodyfikowane, np. przez podstawienie, delecję, insercję, addycję itp., sekwencje aminokwasów reprezentowane przez SEQ ID nr 2,4 lub 6, pod warunkiem, że modyfikacje te nie naruszają aktywności TPO.

Ponadto sekwencja DNA według wynalazku składa się głównie z sekwencji DNA kodującej proteinę o aktywności TPO.

Wyrażenie „sekwencja DNA, kodująca sekwencję aminokwasów” oznacza również wszystkie sekwencje DNA, w których może występować degeneracja sekwencji nukleotydów.

179 884

Sekwencja DNA według wynalazku obejmuje także następujące sekwencje:

(a) sekwencje DNA reprezentowane przez SEQ ID nr 7: 194, 195 i 196 lub ich łańcuch komplementarny, (b) sekwencje DNA, które w ściśle określonych warunkach hybrydyzujątworząc sekwencje DNA określone w (a) lub ich fragmenty, (c) sekwencje DNA, które mogąhybrydyzować, tworząc sekwencje DNA określone w (a) lub (b), lecz powoduje to degenerację kodu genetycznego.

Inaczej mówiąc, sekwencja DNA według wynalazku obejmuje również następujące sekwencje:

(a) sekwencję DNA, zintegrowaną z wektorem pEF18S-A2a (depozyt nr FERM BP-4565), przenoszonym przez szczep DH5 E. coli, wektorem pHTl-231 (depozyt nr FERM BP-4564), przenoszonym przez szczep DH5 E. coli, wektorem pHTFl (depozyt nr FERM BP-4617), przenoszonym przez szczep DH5, E. coli, wektorem pHGTl (depozyt nr FERM BP-4616), przenoszonym przez szczep DH5 E. coli, kodującą sekwencję aminokwasów proteiny o aktywności TPO; albo (b) sekwencje DNA, które (w ściśle określonych warunkach) hybrydyzują, tworząc sekwencję DNA zdefiniowanąw (a) lub jej fragmenty, kodujące sekwencje aminokwasów proteiny o aktywności TPO.

„Ściśle określone warunki” hybrydyzacji oznaczają w tym przypadku warunki zastosowane w przykładach dotyczących amplikacji PCR kwasów DNA według wynalazku przy użyciu primerów oligonukleotydowych o zdegenerowanej i/lub unikalnej sekwencji. Porównaj m.in. rozdziały 11 i 14 Molecular Cloning (Sambrook i in., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) i paragraf 2.10 Current Protocols in Molecular Biology, (Asubel i in. Eds., Current Protocols, USA 1993.

Sekwencja DNA według wynalazku obejmuje również sekwencję DNA kodującąproteinę o aktywności TPO, zawierającą sekwencję nukleotydów kodującąpozycję 1-163 sekwencji aminokwasów według SEQ ID nr 6.

Takie sekwencje DNA mogą być uzupełnione o miejsce rozszczepienia enzymu restrykcyjnego i/lub dodatkową sekwencję DNA w pozycji początkowej, końcowej lub pośredniej, co ułatwia konstruowanie wektorów łatwo podlegających ekspresji. W przypadku gospodarza, który nie jest ssakiem, można inkorporować preferowany kodon dla wywołania ekspresji genu u gospodarza.

Przykładem sekwencji DNA według wynalazku jest cząsteczka cDNA, którą uzyskuje się przez spreparowanie mRNA z komórek ssaków, również ludzi, a następnie screening cDNA powszechnie stosowanym sposobem z biblioteki cDNA sporządzonej znaną metodą. Źródła mRNA w tym przypadku obejmują szczurze komórki linii McA-RH8994 pochodzącej z hepatocytów, komórki HTC, komórki H4-II-E, wątrobę, nerki, mózg, jelito cienkie, wątroby ludzkąitp.

Innym przykładem sekwencji DNA według wynalazku jest genomowa cząsteczka DNA otrzymywana powszechnie stosowanym sposobem przez skreening biblioteki genomowej komórek ssaków, w tym również człowieka, przygotowanej znaną metodą. Źródła genomowego DNA obejmują w tym przypadku chromosomowe preparaty DNA uzyskiwane z organizmu człowieka, szczura, myszy itp.

Sekwencję DNA, kodująca pochodną TPO można uzyskać z otrzymanych sekwencji cDNA, kodujących proteinę o aktywności TPO przez modyfikacje sekwencji znanym sposobem ukierunkowanej mutagenezy, powodującej częściową modyfikację odpowiedniej sekwencji aminokwasów.

Jeżeli określona jest sekwencja aminokwasów lub sekwencja DNA proteiny o aktywności TPO według wynalazku, łatwo można uzyskać przez syntezę chemiczną sekwencję DNA, kodującą częściowo zmodyfikowaną sekwencję aminokwasów.

Sekwencja DNA według wynalazku stanowi użyteczny materiał do produkcji na dużą skalę proteiny o aktywności TPO przy pomocy różnych technik rekombinacji DNA.

179 884

Sekwencja DNA według wynalazku jest również użyteczna jako znakowana sonda do izolacji genu, kodującego proteinę pokrewną TPO oraz cDNA i genomowego DNA, kodującego TPO innych gatunków ssaków. Może być również wykorzystana w terapii genowej człowieka i innych gatunków ssaków. Ponadto, sekwencja DNA według wynalazku może być zastosowana w hodowli transgenowych gatunków ssaków, które mogą spełniać funkcję eukariotycznego gospodarza w produkcji TPO na dużą skalę (Pahniter i in., Science, t. 22 s. 809-814, 1983).

Wynalazek obejmuje również wektor, z którym zintegrowana jest wspomniana wyżej sekwencja DNA, kodująca proteinę o aktywności TPO, a także komórki gospodarze transformowane przy pomocy tego wektora oraz sposób wytwarzania proteiny o aktywności TPO, obejmujący hodowlę komórek gospodarzy oraz oddzielanie i oczyszczanie podlegającej ekspresji proteiny o aktywności TPO.

Przykłady komórek gospodarzy stosowanych w tym przypadku obejmują komórki prokariontów np. E. coli i eukariontów, np. drożdży, owadów, ssaków itp. Ilustrujące przykłady komórek ssaków stanowią komórki COS, komórki jajnika chomika chińskiego (CHO), komórki C-127, komórki nerki noworodka chomika (BHK) itp. Ilustrujące przykłady drożdży stanowią drożdże spożywcze (Saccharomyces cerevisiae), drożdże asymilujące metanol (Pichiapastoris) itp. Ilustrujące przykłady komórek owadów stanowią hodowle komórkowe jedwabnika itp.

Jeżeli chodzi o wektory używane w transformacji komórek gospodarzy, do transformacji komórek E. coli można zastosować pKC30 (Shimatake H. i M. Rosenberg, Naturę, 292, 128-132,1981, pTrc99A AmannE. i in. Gene, 69,301-315,1988) itp. Do transformacji komórek ssaków można zastosować pSV2-neo (Southewm i Berg. J. Mol,Appl:Genet., 1,327-341,1982), pCAGGS (Niwa i in., Gene, 108,193-200,1991), pcDLSRa292 (Takebe i in., Mol. Celi. Biol., 8, 466-472,1988) itp. Dla komórek drożdży można zastosować pG-1 (Schena M. Yamamoto K.R., Science, 241,965-967,1988) itp. W transformacji komórek jedwabnika można wykorzystać jako wektor transferowy do konstrukcji rekombinowanego wirusa np. pAc373 (Lucków i in. Bio/Technology, 6, 47-55).

W razie potrzeby każdy z tych wektorów może zawierać początek źródła replikacji, marker(y) selekcji, promot itp. oraz miejsce przyłączenia RN A, sygnał poliadenylacji itp. w przypadku wektorów stosowanych w komórkach eukariontów.

Jeśli chodzi o źródła replikacji, w wektorach dla komórek ssaków można wykorzystać sekwencję pochodzącą np. z SV40, z adenowirusa, wirusa brodawczaka bydlęcego itp. Sekwencja pochodząca z CO1E1, czynnika R, czynnika F itp. może być wykorzystana w wektorach dla komórek E. coli. Sekwencja pochodząca z 2 μτη DNA, ARS1 itp. może być wykorzystana w wektorach dla komórek drożdży.

Jako promotory ekspresji genów mogą być wykorzystane promotory pochodzące np. z retrowirusa, wirusa polioma, adenowirusa, SV40 itp. Promotor pochodzący z bakteriofaga λ, np. promotor trp, Ipp, lac lub tac, może być wykorzystany z wektora dla komórek E. coli. Promotory ADH, PHO5, GPD, PGK lub MAFa mogą być wykorzystane w wektorach dla komórek drożdży spożywczych, a promotor ΑΟΧ1 itp. w wektorach dla komórek drożdży asymilujących metanol. Promotor pochodzący z jądrowego wirusa polihedrozy może być wykorzystany w wektorach dla komórek j edwabnika.

Typowe przykłady markerów selekcji stosowane w wektorach dla komórek ssaków stanowią gen oporności na neomecynę, gen kinazy tymidynowej (TK), gen reduktazy dwuwodorofolianu (DHFR), gen ksantyno-guanino-fosforybozylotransferazy E. coli (Ecogypt). Ilustrujące przykłady markerów selekcji stosowanych w wektorach dla komórek E. coli stanowią gen oporności na kanamycynę, gen oporności na ampicylinę, gen oporności na tetracyklinę itp., a dla komórek drożdży - Leu2, Trpl, Ura3 i tym podobne geny.

Wytwarzanie proteiny o aktywności TPO z wykorzystaniem odpowiednich kombinacji systemów gospodarz-wektor może dokonać się przez transformację odpowiednich komórek gospodarzy rekombinowanym DNA, polegającą na umieszczeniu genu według wynalazku w odpowiednim miejscu wymienionego wyżej wektora, hodowlę otrzymanego transformanta, a

179 884 następnie oddzielenie i oczyszczenie pożądanego peptydu z otrzymanych komórek lub pożywki lub przesączu. W procesie można wykorzystać łącznie powszechnie stosowane środki i sposoby.

W przypadku ekspresji genu będącego przedmiotem zainteresowania, oryginalna sekwencja sygnałowa może być zmodyfikowana lub zastąpiona przez sekwencję sygnalną pochodzącą od innej proteiny w celu uzyskania jednorodnej końcówki N produktu podlegającego ekspresji. Ujednolicenie końcówki N można uzyskać przez modyfikacje (podstawienie lub addycję) reszty aminokwasowej w końcówce N lub jej otoczeniu. W przypadku ekspresji przy użyciu E. coli jako komórek gospodarza reszty lizyny mogą być następnie dołączane do reszt metioniny.

Nowa proteina według wynalazku wykazująca aktywność TPO (nazywana dalej „proteiną według wynalazku”) obejmuje proteiny, z których każda posiada sekwencję aminokwasów według SEQ ID nr: 2, 4 lub 6. Pochodne TPO, których sekwencje aminokwasów są częściowo zmodyfikowane (przez substytucję, delecję, insercję lub addycję) są również objęte niniejszym wynalazkiem pod warunkiem, że aktywność TPO nie jest naruszana przez tę modyfikację.

Inaczej mówiąc, proteinę według wynalazku stanowią cząsteczki proteiny, których sekwencje aminokwasów są zasadniczo sekwencjami aminokwasów przedstawionymi w SEQ ID nr: 2, 4 lub 6.

Użyte tutaj wyrażenie „sekwencje aminokwasów są zasadniczo sekwencjami aminokwasów przedstawionymi w SEQ ID nr 2,4 lub 6” oznacza, że dane sekwencje aminokwasów obejmują sekwencje przedstawione w SEQ ID nr 2,4 łub 6 oraz częściowo zmodyfikowane, np. przez substytucję, delecję, insercję, addycję itp.) sekwencje przedstawione w SEQ ID nr 2,4 lub 6 pod warunkiem, że modyfikacje te nie naruszają aktywności TPO.

Proteina według wynalazku obejmuje proteinę zawierającą pozycje 7-151 sekwencji aminokwasów według SEQ ID nr 6 i posiadającą aktywności TPO. Proteina według wynalazku obejmuje również proteinę o aktywności TPO zawierającą pozycje 1-163 sekwencji aminokwasów według SEQ ID nr 6.

Przykłady innych pochodnych TPO według wynalazku stanowią: pochodna, której trwałość i wytrzymałość in vivo została udoskonalona przez modyfikację (substytucję, delecję, insercję lub addycję), pochodna, w której przynajmniej jedna potencjalna glikozylacja została zmieniona przez delecję lub addycję, pochodna, w której przynajmniej jedna reszta cysteiny została wyłączona lub podstawiona przez innąresztę aminokwasu, np. (resztę alaniny lub seryny).

Preferowana proteina według wynalazku jest znamienna tym, że została wydzielona i oczyszczona z komórek gospodarzy, przekształconych przez rekombinowany wektor zawieraj ący cząsteczkę cDNA, cząsteczkę genomowego DNA lub fragment DNA uzyskany przez syntezę chemiczną.

Jeżeli przy użyciu bakterii, np. E. coli, jako gospodarza następuje ekspresja wewnątrzkomórkowa, uzyskuje się proteinę, w której początkowa reszta metioniny dodana jest do końcówki N cząsteczki proteiny o aktywności TPO, będącą również przedmiotem wynalazku. W zależności od gospodarza, uzyskana proteina o aktywności TPO może ulegać lub nie ulegać glikozylowamu. Obydwa przypadki są zastrzeżone dla proteiny według wynalazku.

Proteina według wynalazku obejmuje również naturalnie występujące proteiny o aktywności TPO oczyszczone i wyizolowane z naturalnych źródeł, takich jak pożywka hodowlana o aktywności TPO lub ludzki mocz, surowica, osocze.

Sposób oczyszczania TPO z naturalnych źródeł wchodzi również w zakres wynalazku. Proces oczyszczania można przeprowadzić przy pomocy jednego lub kilku stosowanych zazwyczaj etapów oczyszczania protein, takich jak chromatografia jonowymienna, chromatografia powinowactwa lektyny, chromatografia powinowactwa barwnika triazynowego, chromatografia interakcji hydrofobowej, chromatografia żelowa, chromatografia z odwróconymi fazami, chromatografia powinowactwa heparyny, chromatografia na żelu siarczanowym, chromatografia z hydroksyalpatytem, chromatografia ogniskowania izoelektrycznego, chromatografia chelatacji metalu, elektroforeza preparaty wna, elektroforeza żelowa z ogniskowaniem izoelektrycznym. Wynalazek obejmuje również proces oczyszczania, w którym wymienione techniki stosuje się w kombinacji, wykorzystując właściwości fizykochemiczne TPO, które można

179 884 wywnioskować z przykładów niniejszego opisu. Można również stosować chromatografię powinowactwa przeciwciał z wykorzystaniem przeciwciał rozpoznających TPO. Stwierdzono ponadto, że TPO jest ligandem dlaMpl (de Sauvage i in., Naturę 369; 533-538 (1994); Barley i in., Celi, 77, 1117-1124 (1994); Kaushansky i in., Naturę 369, 565-568 (1904); dzięki czemu TPO można oczyścić przy użyciu żelowej kolumny powinowactwa, w której Mpl połączono z żywicą. Dokładniej, przykładem takiej kolumny, jest kolumna Mpl-X, przygotowana przez połączenie żywicy z zewnątrzkomórkowym obszarem Mpl (Mpl-X), który uzyskano przez techniki rekombinacji DNA przy użyciu komórek CHO jako gospodarzy (Bartley i in. (1994, op cit).

Stwierdzono, że polipeptydy TPO według wynalazku charakteryzują się ponadto zdolnością wiązania z receptorem Mpl, a zwłaszcza z jego obszarem zewnątrzkomórkowym (rozpuszczalnym).

Niniejszy wynalazek obejmuje również proteinę, zakodowaną w części DNA, komplementarną wobec kodującego proteiny łańcucha ludzkiego cDNA lub sekwencji genomowego DNA genu TPO, czyli „komplementarną proteinę odwróconą”, opisaną przez Tramontano i in. (Nuci,. Acids Res., t. 12, s. 5049-5059, 1984).

Wynalazek obejmuje również proteinę według wynalazku, znakowaną wykrywalnym markerem, np. za pomocą ¹²⁵1 lub biotynylacji, umożliwiającą dostarczenie odczynnika do wykrywania i oznaczania ilościowego TPO lub komórek podlegających ekspresji TPO w receptorze w próbkach stałych, np. w tkance i w próbkach płynnych, takich jak krew, mocz itp.

Biotynylowana proteina według wynalazku może być wykorzystana w przypadku wiązania z unieruchomioną streptawidyną w celu usunięcia megakarioblastów ze szpiku kostnego podczas transplantacji autogenicznego szpiku kostnego. Może być również -wykorzystana w przypadku wiązania z streptrowidyną do zagęszczenia autogenicznych lub allogenicznych komórek megakariocytów podczas autogenicznej lub allogenicznej transplantacji szpiku kostnego. Sprzężenie TPO z toksyną, takąjak rycyna, toksyna błonicy itp. lub z radioaktywnym izotopem może być wykorzystane w terapii przeciwnowotworowej i w przygotowywaniu transplantacji szpiku kostnego.

Przedstawiony wynalazek obejmuje również kwas nukleinowy, wykorzystywany przy oznaczaniu wykrywalnym markerem radioaktywnym lub nieradioaktywnym, takim jak biotyna lub stosowany w procesie hybrydyzacji w celu określenia pozycji genu ludzkiej TPO i/lub pokrewnej rodziny genów na mapie chromosomów. Materiał ten może być ponadto wykorzystany do wykrywania zaburzeń genu ludzkiej TPO na poziomie DNA oraz jako marker genowy do wykrywania przylegających genów i ich zaburzeń.

Przedstawiony wynalazek obejmuje również preparat farmaceutyczny, zawierający terapeutycznie skuteczną ilość proteiny według wynalazku wraz z zastosowanym skutecznym rozcieńczalnikiem, środkiem antyseptycznym, środkiem solubilizującym, emulsyfikatorem, środkiem pomocniczym i/lub nośnikiem. Użyty tutaj termin „terapeutycznie skuteczna ilość” oznacza ilość, zapewniającąefekt terapeutyczny dla specyficznych warunków i sposobów podawania. Preparat może być stosowany w postaci płynu, produktu liofilizowanego lub suszonego i zawierać rozcieńczalnik wybrany spośród różnych buforów (np. Tns-HCl, octan i fosforan) o różnych współczynnik pH i mocy jonowej, środek pomocniczy zapobiegający adsorpcji powierzchniowej, taki jak albumina lub żelatyna, składnik powierzchniowo czynny, np. Tween 20, Tween 80, Pluronic F68 lub sól kwasu żółciowego, czynnik solubilizujący, np. glicerol lub polietylen glikolu, przeciwutleniacz, np. kwas askorbowy lub pirosiarczyn sodowym, czynnik antyseptyczny, np. timerosal, alkohol benzylowy lub paraben oraz nośnik, jak np. laktoza lub mannitol. Stosuje się również preparat zawierający wiązanie kowalentne proteiny według wynalazku z polimerem takim jak glikol polietylenowy, chelację proteiny z jonami metalu, inkorporację proteiny w granulacie lub na powierzchni, którą stanowi związek polimerowy, taki jak kwas pohmlekowy, kwas poliglikolowy lub hydrożel lub inkorporacje proteiny w liposomach, mikroemulsjach i micelach, pojedynczych lub wielowarstwowych pęcherzykach, plamach likwacyjnych krwinek czerwonych lub sferoplastach. Taki preparat będzie wywierał wpływ na właściwości fizyczne TPO, jej rozpuszczalność, trwałość, stopień uwalniania in vivo oraz dostę

179 884 pność in vivo. Wyboru składu preparatu można dokonać w zależności od cech fizykochemicznych zastosowanej proteiny o aktywności TPO. Wynalazek obejmuje również preparat granulowany, w którym granulki są powlekane polimerem, takim jak np. poloksamer lub poloksamina oraz TPO, która wiąże się z przeciwciałami specyficznych receptorów tkankowych, ligandów lub antygenów albo ze ligandami specyficznych receptorów tkankowych. Inne przykłady preparatów według wynalazku stanowią preparaty w postaci granulek z powłoczką ochronną zawierające inhibitor proteazy lub czynnik wspomagający przenikanie, wykorzystywane w różnych sposobach podawania, np. pozajelitowe, płucne, donosowo lub doustnie.

Preparat farmaceutyczny zawierający proteinę według wynalazku może być podawany kilka razy dziennie, zwykle w ilości 0,05 pg/kg do 1 mg/kg (w przeliczeniu na proteinę TPO) masy ciała w zależności od stanu zdrowia i płci pacjenta, sposobu podawania itp.

Preparat farmaceutyczny zawierający proteinę według wynalazku może być stosowany w dawce 25,000-500,000,000 składnika czynnego (w jednostkach aktywności względnej określonej w analizie z zastosowaniem M-07e, która zostanie omówiona później) na kg masy ciała raz lub kilka razy dziennie w ciągu jednego lub siedmiu dni w tygodniu w zależności od objawów, płci i sposobu stosowania.

Autorzy wynalazku stwierdzili, że ze względu na C-końcowe położenie ludzkiej TPO, jej aktywność jest zachowana nawet gdy reszty aminokwasowe lub 152-giej sekwencji aminokwasów według SEQ ID nr 6 zostanąusunięte i że ze względu na jej N-końcowe położenie aktywność jest zachowana nawet gdy zostanąusunięte reszty aminokwasowe do szóstej sekwencji aminokwasów.

Zgodnie z powyższym, proteina o aktywności TPO zawierająca sekwencje aminokwasów od siódmej do 151 według SEQ ID nr 6, modyfikowana (przez substytucję, delecję, insercję lub addycję) w innych częściach może być również stosowana jako efektywny składnik niniejszego wynalazku. Preferuje się pochodne TPO o sekwencjach aminokwasów od 1 do 163 według SEQ ID nr 6.

Wynalazek obejmuje również preparat zawierający przynajmniej jeden z dodatkowych czynników hematopoetycznych, takich jak EPO, G-CSF, GM-CSF, M-CSF, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, LIF i SCF oprócz proteiny według wynalazku.

Proteina według wynalazku może być stosowana w leczeniu zaburzeń z trombocytopenią zarówno pojedynczo jak i innymi czynnikami hematopoetycznymi. Przykłady innych dodatkowych czynników hematopoetycznych stanowią EPO, G-CSF, GM-CSF, M-CSF, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, LIF i SCF.

Jest wiele chorób związanych z zaburzeniami płytek, np. małopłytkowość spowodowana zaburzeniami wytwarzania płytek lub zmniejszeniem ich długości życia (wskutek destrukcji i zużycia), które można leczyć zapomocąproteiny według wynalazku. Można jąstosować np. w celu pobudzenia odbudowy płytek u pacjentów z trombocytopenią wrodzona anemiąFanconiego lub anemia aplastyczną wywołaną przez chemoterapię lub naświetlanie, zespołem mielodysplatycznym, ostrą białaczką szpikową, przełomem apalstycznym po przeszczepie szpiku kostnego. Jest również użyteczna w leczeniu trombocytopenii powstałej na skutek zmniejszonej produkcji TPO, trombocytopenii powstałej na skutek skróconego czasu życia płytek lub megakariocytów, łącznie z samoistną plamicą małopłytkową (ITP), anemią hipoplastyczną, zespołem nabytego braku odporności (AIDS), zespołem wewnątrznaczyniowego krzepnięcia rozsianego oraz małopłytkowościątrombotyczną. Ponadto przedstawiony wynalazek można wykorzystać w przypadkach autotransfuzji płytek, kiedy pacjentowi podaje się TPO przed zabiegiem chirurgicznym w celu zwiększenia ilości własnych płytek, które następnie używa się do transfuzji podczas operacji.

Inne zastosowanie proteiny według wynalazku stanowi leczenie chorób spowodowanych okresowym usunięciem lub zniszczeniem płytek wskutek działania innych środków chemicznych lub farmaceutycznych lub zabiegów leczniczych TPO można wykorzystać w celu pobudzenia uwalniania nowych „nienaruszonych” płytek.

Wynalazek dotyczy również specyficznych przeciwciał TPO. Proteina według wynalazku może być zastosowana w roli antygenów i odpowiadających im przeciwciał, w tym przeciwciał

179 884 monoklonalnych i poliklonalnych oraz chimerycznych, mianowicie przeciwciał „rekombinowanych”, uzyskiwanych konwencjonalnymi metodami. W celu uzyskania przeciwciał anty-TPO można użyć ludzkiej TPO jako antygenu lub alternatywnie wykorzystać jako antygen cześć peptydu ludzkiej TPO. Jeżeli stosuje się przeciwciało antygenu peptydu, determinanta antygenowa może być określona przez specyfikacje regionu antygenowego. Jeżeli natomiast wykorzystuje się przeciwciało proteiny antygenowej (TPO), region antygenu można określić przez analizę determinanty antygenowej przeciwciał. W takich przypadkach przeciwciała o określonej w ten sposób determinancie antygenowej mogą być wykorzystane do frakcjonowania, wykrywania, oznaczania ilościowego i oczyszczania różnych TPO o odmiennych właściwościach, takich jak rodzaj dodanych łańcuchów cukrowych, długość łańcucha peptydowego, itp.

Peptyd TPO zawierający wyselekcjonowane w ten sposób sekwencje aminokwasów jest syntetyzowany i wiązany z odpowiednim nośnikiem proteinowym, np. albuminą, KLH („kluczdziurka limpetomocyjaninowa) itp. wiązaniem kowalentym w celu uzyskania antygenu immunoreaktywnego. Alternatywnie otrzymuje się peptyd typu MAP (peptyd wielokrotnego antygenu), z którego wytwarza się antygen metodą Tama (Proc. Natl. Acad. Sco (USA), 85:5408-5413, 1988). Tak przygotowanym antygenem wraz z środkiem pomocniczym itp. immunizuje się ssaki, ptaki itp., które są ogólnie używane do wytwarzania przeciwciał, np. króliki, myszy, szczury, kozy, owce, kurczęta, chomiki, konie, świnki morskie itp. Z immunizowanego zwierzęcia odzyskano jego przeciwsurowicę i komórki, z których otrzymuje się poliklonalne przeciwciało. Jeżeli jako antygen używa się peptydu, determinanta antygenowa może być określona przez specyfikację regionu antygenowego. W tym przypadku regiony różnych cząsteczek TPO wykazujące różną masę cząsteczkową są poddawane screeningowi i identyfikowane przez inżynierię immunologiczną. Można np. poddawać screeningowi i identyfikacji region o zdelecjonowanych peptydach. Dodatkowo gen przeciwciała lub część genu klonuje się z komórek, w których poszukiwane przeciwciało podlega ekspresji w celu uzyskania cząsteczki przeciwciała, podlegającego ekspresji w warunkach inżynierii genetycznej.

W porównaniu z przeciwciałem poliklonalnym, które z reguły zawiera różne przeciwciała dla różnych determinant antygenowych, przeciwciało monoklonalne jest specyficzne dla jednej determinanty antygenowej. Swoistne przeciwciało TPO może być wykorzystane dla zwiększenia selektywności i specyfiki diagnozy z zastosowaniem reakcji antygen-przeciwciało i analitycznej metody testowej oraz do oddzielania i oczyszczania TPO. Ponadto takie przeciwciała można wykorzystać do neutralizacji lub usuwania TPO z surowicy. Przeciwciała monoklonalne sąrównież użyteczne w wykrywaniu i oznaczaniu ilościowym TPO np. w surowicy pełnej krwi.

Przeciwciało ludzkiej TPO według wynalazku może być zastosowane jako ligand w chromatografii powinowactwa do oczyszczania i izolacji ludzkiej TPO. W celu utrwalenia przeciwciała, które ma być wykorzystane w chromatografii powinowactwa można zastosować jakąkolwiek metodę konwencjonalną utrwalania różnych enzymów. Stosuje się np. metodę z zastosowaniem nośnika aktywowanej za pomocą CNbr Sephrozy 4B (firmy Pharmacia Fine Chemicals Co.), itp. W celu właściwego oczyszczenia ludzkiej TPO przy użycia utrwalonego przeciwciała ludzkiej TPO, przeciwciało to wprowadza się do kolumny, a ciecz zawierającą ludzkąTPO przepuszcza się przez kolumnę. W wyniku tej operacji znaczna ilość ludzkiej TPO jest adsorbowana przez nośnik w kolumnie. Jako rozpuszczalnika do wymywania używa się np. bufora glicyna-HCl (pH 2,5), roztworu chlorku sodowego, kwasu priopionowego, dioksanu, glikolu etylenowego, soli chaotropowej, chlorowodorku guanidyny, mocznika, itp. Przez elucję takimi rozpuszczalnikami wymywa się TPO ludzką o wysokim stopniu czystości.

Przeciwciało według wynalazku może być zastosowane do oznaczania ludzkiej TPO w immunochemicznej analizie ilościowej, zwłaszcza w reakcjach immunoenzymatycznych, sterowanych przez reakcję sandwiczową w fazie stałej.

W przypadku przeciwciał monoklonalnych korzystna jest możliwość ich wytwarzania w komórkach hybrydoma w pożywce, nie zawierającej innych cząsteczek immunologlobulin. Monoklonalne przeciwciała można otrzymywać z nadsącza hodowli komórek hybrydoma lub z wodobrzusza myszy indukowanego dootrzewnowym wstrzyknięciem komórek hybrydoma. Te

179 884 chnika z użyciem komórek hybrydoma, którązastosowali po raz pierwszy Kohler i Milstein (Eur. J. Immunol. 6: 511 -519,1976) może być szeroko stosowana do tworzenia hybrydowych linii komórkowych o wysokim poziomie monoklonalnych przeciwciał dla wielu specyficznych antygenów.

W celu wyizolowania przez oczyszczenie danego przeciwciała, np. przeciw surowicy, z uzyskanego jak wyżej materiału zawierającego przeciwciała, można zastosować jedną lub kilka połączonych metod, które stosuje się powszechnie do oczyszczania protein (chromatografia powinowactwa, np. białka A lub białka G, chromatografia na żelu awidynowym, chromatografia na żelu utrwalonym antyimmunoglobulinąitd., a także chromatografia kationowymienna, chromatografia anionowymienna, chromatografia powinowactwa lektyny, chromatografia z adsorpcją barwnika, chromatografia z interakcją hydrofobową, chromatografia żelowo-permeacyjna, chromatografia z odwróconymi fazami, chromatografia fluoroapatytowa, chromatografia chelacji metalu, chromatografia punktu izoelektrycznego, elektroforeza, elektroforeza punktu izoelektrycznego itd.). Oprócz tych metod można stosować oczyszczanie z powinowactwem antygenowym, w którym przygotowuje się żelowy nośnik lub membranę związaną chemicznie z proteiną ludzkiej TPO lub peptydem zawierającym region antygenu lub część regionu, czyli cząsteczkę zdolną do rozpoznania poszukiwanego przeciwciała, następnie dodaje materiał zawierający przeciwciała, powodując adsorpcję poszukiwanego przeciwciała na nośniku lub membranie, wreszcie adsorbowane przeciwciało wymywa się i odzyskuje w odpowiednich warunkach.

Przedstawiony wynalazek pozwala również na zastosowanie endogennej sekwencji DNA kodującej polipeptyd TPO do wytwarzania dużych ilości produktów peptydowych. Można np. wykorzystać procesy homologicznych rekombinacji in vitro i ex vivo do transformacji komórek gospodarzy w celu uzyskania lub wzmożenia ekspresji polipeptydów. Preferowanymi komórkami gospodarzami sąkomórki ludzkie (np. wątroby, szpiku kostnego itp.), do których wprowadza się sekwencje promotora lub czynnika wspomagającego, wykorzystując sekwencje położone po obu stronach, homologiczne do obszaru docelowego w genomie komórkowym, co powoduje wystąpienie lub wzmocnienie ekspresji polipeptydu TPO. Porównaj np. U.S. Letters Patent 5,272,071, opublikowany w PCT WO 90/14092, WO 91/06666 i WO91/09955.

Wynalazek obejmuje również sposoby otrzymywania polipeptydu TPO, opisane powyżej, obejmujące etapy ekspresji polipeptydu zakodowanego w DNA według wynalazku w odpowiednim gospodarzu oraz izolowania wymienionego polipeptydu TPO.

Wynalazek obejmuje także metody wytwarzania polipeptydów TPO o strukturze [Gly^-1], na które składają się następujące etapy: wprowadzanie w odpowiednich komórkach macierzystych DNA kodującego polipeptyd 5' transferazy-S-glutationowej (GST) do sekwencji kodującej polipeptyd TPO oraz sekwencji kodujących polipeptyd GST i TPO wydzielonych przez kwas DNA kodujący polipeptyd rozpoznania trombiny, izolowanie produktu ekspresji GST-TPO i traktowanie podlegającego ekspresji polipeptydu trombinąw celu usunięcia aminokwasów GST. Uzyskane polipeptydy TPO posiadają strukturę [Gly’¹].

Poniżej przedstawiono szczegółowy opis wynalazku.

(A) Oczyszczanie szczurzej TPO, analiza częściowych sekwencji aminokwasów oczyszczonej TPO szczura oraz analiza właściwości biologicznych oczyszczonej TPO szczura

Twórcy wynalazku po raz pierwszy próbowali oczyścić proteinę (TPO szczurzą) o działaniu zwiększającym proliferację i różnicowanie szczurzego CFU-MK. W badaniach nad oczyszczaniem posługiwano się wielokrotnie metodąprób i błędów, m.in. przy wyborze różnych naturalnych źródeł występowania, wyborze żelu do chromatografii czy sposobów izolacji. W rezultacie twórcom wynalazku udało się oczyścić proteinę o aktywności TPO z osocza krwi szczurów z trombocytopenią indukowaną naświetlaniem promieniami X lub γ, posługując się aktywnościąTPO jako markerem w oparciu o analizę szczurzego CFU-MK opisanego później w <Przykładzie Uzupełniającym> oraz określić częściowe sekwencje aminokwasów oczyszczonej proteiny <Przykłady 1 i 2>.

Zbadano również właściwości biologiczne szczura TPO pochodzącej z osocza <Przykład 3 >.

Poniżej przedstawiono' w zarysie postępowanie od oczyszczenia szczurzej TPO do oznaczenia częściowych sekwencji aminokwasów oczyszczonej proteiny.

179 884 (i) Sporządzono próbkę osocza krwi z około 1100 szczurów z trombocytopeniąpo napromieniowaniu promieniami X i γ i poddano ją chromatografii w kolumnie Sephadex G-25, chromatografii anionowymiennej (Q-Sepharose FF) oraz chromatgrafii powinowactw lektyny (WGA-Agarose) w celu uzyskania frakcji o aktywności TPO adsorbowanej na WGA-Agarozie.

(ii) Uzyskaną w ten sposób frakcję o aktywności TPO, adsorbowaną na WGA-Agarozie poddawano kolejno chromatografii powinowactwa barwnika triazynowego (TSK AF-BLUE 650 MH), chromatografii z interakcjąhydrofobową(Phenyl Sepharose 6 FF/LS) i chromatografu żelowej (Sephacryl S-200 HR). Ponieważ aktywność TPO w chromatografii żelowej w kolumnie Sephacryl S-200 HR utworzyła cztery piki (FI jako frakcja o najwyższej masie cząsteczkowej, następnie F2, F3 i F4), frakcje aktywnąF2 i F3 zagęszczano w celu uzyskania dużej masy cząsteczkowej próbki TPO F2 i małej masy cząsteczkowej próbki TPO F3, wykorzystanych oddzielnie w kolejnych etapach oczyszczania.

(iii) Próbkę TPO F3 o małej masie cząsteczkowej poddawano kolejno preparatywnej chromatografii z odwróconymi fazami (YMC-Pack PROTEIN-RP), chromatografii z odwróconymi fazami (YMC-Pack CN-AP) i kolejnej chromatografii z odwróconymi fazami (Capcell Pack Cl). Po poddaniu uzyskanej w ten sposób frakcji o aktywności TPO elektroforezie dodecylosiarczanu sodu (SDS) na żelu poliakrylamidowym (SDS-PAGE) i wyekstrahowaniu z żelu substancję o aktywności TPO, potwierdzono obecność aktywności TPO w paśmie odpowiadającym pozornej masie cząsteczkowej około 17,000 do 19,000 w warunkach nieredukcyjnych.

(iv) W konsekwencji wszystkie frakcje o aktywności TPO zostały naniesione na SDS-PAGE w warunkach nieredukcyjnych i przeniesione na membranę PVDF. Podczas systematycznej ograniczonej hydrolizy enzymatycznej na membranie PVDF, rozkładającej proteiny na fragmenty peptydowe oznaczano częściowe sekwencje aminokwasów proteiny szczurzej TPO. Korzystając z informacji o sekwencji aminokwasów dwóch fragmentów peptydowych, przeprowadzono klonowanie genu szczurzej TPO.

Próbkę TPO F2 o dużej masie cząsteczkowej, uzyskaną w kolumnie Sephacryl S-200 HR poddawano oddzielnie oczyszczaniu w taki sam sposób jak próbkę TPO F3 o małej masie cząsteczkowej. Po poddaniu frakcji o aktywności TPO, uzyskanej w ostatnim etapie chromatografii z odwróconymi fazami (Capcell Pack Cl) procesowi SDS-PAGE i wyekstrahowaniu z żelu substancję o aktywności TPO, potwierdzono obecność aktywności TPO w paśmie odpowiadającym pozornej masie cząsteczkowej około 17,000 do 19,000 w warunkach nieredukcyjnych.

(B) Specjalizacja komórek produkujących szczurząTPO, sporządzanie rnRNA i tworzenie biblioteki szczurzego cDNA

Skoro oczyszczona w powyższy sposób szczurza TPO pochodziła z osocza krwi, niezbędny okazał się screening organów i komórek jako potencjalnych źródeł mRNA do wykorzystania w klonowaniu cDNA. W związku z tym przedmiotem badań screeningowych była aktywność TPO w różnych narządach i nadsączach z hodowli komórek na podstawie właściwości biologicznych TPO pochodzącej z osocza szczura. W rezultacie aktywności TPO niemal równe działaniu TPO uzyskanej z osocza szczura stwierdzono w nadsączu z hodowli linii komórkowych McA-RH8994, HTC i H4-H-E pochodzących z hepatocytów szczura oraz w nadsączu z hodowli pierwotnych hepatocytów szczura < Przykład 4 >.

Skonstruowano ponadto wektor ekspresji pEFl 8S z dwóch wektorów ekspresji, pMEl 8S i pEFBOS <Przykład 5 >. Konstrukcja tego wektoru ułatwia klonowanie cDNA przy użyciu wektora o wysokiej skuteczności ekspresji z miejscami wielokrotnego klonowania, które mogą być wykorzystane do wprowadzania wstawek.

Oprócz powyższego wektora ekspresji w sporządzaniu bibliotek cDNA wykorzystuje się głównie wektory plazmidowe oparte na pUC i pBR oraz wektory fagowe oparte na λ.

Komórki McA-RH8994 hodowano, homogenizowano przez dodanie roztworu tiocyjanianu guanidyny, a następnie poddawano wirowaniu w gradiencie gęstości CsCl w celu uzyskania całkowitego RNA < Przykład 6 >.

Preparowanie DNA jest możliwe również metodą gorącego fenolu, metodą kwasu-soli guanidyny-fenolu-chloroformu itp.

179 884

Po oczyszczeniu poli (A)⁺ RNA z całkowitego RNA za pomocą oligo dT-immunobilizowanych cząsteczek lateksu, pierwszy łańcuch cDNA syntetyzowano przez działanie odwrotnej transkryptazy, wykorzystując dT jako „prymer”, do którego dodano sekwencję rozpoznającą enzym restrykcyjny Notl, a następnie dokonywano syntezy drugiego łańcucha cDNA przy użyciu RNazy H u polimerazy I DNA E. coli. Do otrzymanego cDNA o podwójnym łańcuchu dodawano czynnik adaptujący EcoRI, uzyskany cDNA łączono z wektorem ekspresji pEF 185 komórki ssaka skonstruowanym w przykładzie 5, który został rozłożony przez Notl i EcoRI, a następnie tak związany cDNA przenoszono do odpowiednich komórek szczepu DH5 E. coli w celu stworzenia bibliotek cDNA < Przykład 7 >.

(C) Preparowanie (klonowanie fragmentu cDNA szczurzej TPO za pomocą PCR

Z częściowej sekwencji aminokwasów szczurzej TPO, oczyszczonej z osocza krwi szczura, wprowadzono sekwencję DNA w celu zsyntetyzowania zdegenerowanych primerów, wykorzystywanych w reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR). Potrzebne primery można uzyskać również w oparciu o sekwencję aminokwasów różną od pozycji zastosowanych tutaj primerów. Wysoce zdegenerowane primery mogąbyć używane również bez stosowania inozyny. Można też zaprojektować primery o mniejszej degeneracji, używając kodonu o wielkim zastosowaniu u szczura (Wada i in., Nucleic Acids Res., t. 18, s. 2367-2411, 1990).

Po wyekstrahowaniu plazmidu DNA z całkowitej puli biblioteki cDNA, sporządzonej jak wyżej i przeprowadzeniu PCR z wykorzystaniem wyekstrahowanego DNA jako matrycy, wykryto pasmo około 330 bp, które następnie oznaczono za pomocą analizy sekwencji nukleotydów jako fragment DNA (fragment Al), kodujący część szczurzej TPO <Przykład 8>.

(D) Screening cDNA szczurzej TPO za pomocą PCR, sekwencja cDNA szczurzej TPO i potwierdzenie aktywności TPO

Bibliotekę cDNA przygotowaną] ak wyżej podzielono na pule, z których każda zawierała około 10,000 klonów i ekstrahowano DNA plazmidu z każdej ze 100 puli. Po wykonaniu PCR przy użyciu każdej puli plazmidu DNA jako matrycy i zsyntetyzowanych przedtem primerów w oparciu o sekwencje nukleotydów fragmentu Al w trzech pulach stwierdzono pasma, uznane za specyficzne. Jedną z pul podzielono na podpule o zawartości około 900 klonów i oczyszczano DNA plazmidu ze 100 podpul w celu przeprowadzenia PCR w ten sam sposób. W rezultacie rozpoznano specyficzne pasmo w 3 pulach. Każdą z tych pul podzielono na podpule, zawierające po 40 klonów, a następnie każdy klon przebadano za pomocą PCR w ten sam sposób. W rezultacie wyizolowano klon pEF18S-A2o, który prawdopodobnie koduje cDNA szczurzej TPO <Przykłady 9 i 10>

Analiza sekwencji nukleotydów tego klonu wykazała, że koduje on częściową sekwencję aminokwasów proteiny oczyszczonej z osocza krwi szczura, co potwierdza możliwość, że klon ten zawiera cDNA szczurzej TPO < Przykład 10>.

Po oczyszczeniu DNA plazmidu z klonu pEF 18S-A2a, uzyskanego jak wyżej i transfekcji do komórek COS 1, stwierdzono aktywność TPO w nadsączu z hodowli transfekowanych komórek. W rezultacie potwierdzono, że klon pEF18S-A2a zawiera cDNA, kodujący szczurzą TPO < Przykład 11 >.

(E) Wykrywanie mRNA TPO w różnych tkankach szczura

Ekspresję mRNA TPO w tkankach szczura analizowano przez PCR i stwierdzono specyficzną ekspresję w mózgu, wątrobie, jelicie cienkiem i nerce < Przykład 12>.

(F) Tworzenie biblioteki ludzkiego cDNA

Na podstawie wyników przykładów 4 i 12 wybrano wątrobę jako wyjściowy materiał tkankowy do klonowania cDNA ludzkiej TPO. Sporządzono bibliotekę cDNA przy użyciu handlowego mRNA uzyskanego z wątroby zdrowego człowieka. Przy pomocy pEF-Ι 8S jako wektora, j ak w przypadku biblioteki szczurzej, syntetyzowano cDNA tym samym sposobem j ak w przypadku szczura w celu uzyskania kierunkowo sklonowanej biblioteki cDNA, wykorzystując enzymy restrykcyjne Notl i EcoRI. Biblioteka sporządzona przez wprowadzenie związanego z. wektorem cDNA do szczepu DH% E.coli zawierała około 1,200,000 klonów < Przykład 13 >.

179 884 (G) Preparowanie (klonowanie) fragmentu cDNA ludzkiej TPO przy pomocy PCR

W oparciu o sekwencję nukleotydów klonu pEF18S-A2ot, kodującego cDNA szczurzej TPO syntetyzowano kilka prymerów do PCR. Po dokonaniu syntezy cDNA przy użyciu handlowego mRNA pochodzącego z wątroby zdrowego człowieka i po przeprowadzeniu PCR z zastosowaniem otrzymanych primerów i cDNA jako matrycy zaobserwowano pasmo około 620 bp. Analiza sekwencji nukleotydów wykazała, że klon ten zawiera fragment DNA, w 86% homologiczny w stosunku do cDNA szczurzej TPO, co potwierdza przypuszczenie, że jest to cześć genu kodującego TPO ludzką<Przykład 14>.

(H) Screening cDNA ludzkiej TPO za pomocąPCR, sekwencja cDNA ludzkiej TPO i potwierdzenie aktywności TPO

Biblioteka ludzkiego cDNA przygotowań jak wyżej została zamplifikowana, podzielona na pule, z których każda zawierała około 100,000 klonów. Z każdej z 90 puli ekstrahowano DNA plazmidu. Po wykonaniu PCR przy użyciu każdej puli cząsteczek plazmidu DNA jako matrycy i zsyntetyzowanych uprzednio primerów na podstawie sekwencji nukleotydów fragmentu ludzkiej TPO zprzykładu 14 wykryto w trzech pulach potencjalne pasma. Jedną z pul podzielono na podpule, z których każda zawierała 5,000 klonów. Z każdej z 90 podpul oczyszczano DNA plazmidu. Po wykonaniu w ten sam sposób PCR z wykorzystaniem każdej pudpuli DNA plazmidu jako matrycy stwierdzono w 5 podpulach potencjalne pasma. Po podzieleniu jednej z pul na podpule, każda po 250 klonów, i oczyszczeniu DNA plazmidu z każdej z 90 podpul w trzech podpulach wykryto potencjalne pasma. Po podzieleniu jednej z tych pul na podpule, każda po 30 klonów i oczyszczeniu DNA plazmidu z każdej z 90 podpul i wykonaniu PCR potencjalne pasma stwierdzono w 3 podpulach. Następnie z jednej z podpul wyizolowano 90 kolonii, a DNA plazmidu oczyszczonego z każdej kolonii poddano PCR, uzyskując klon nazwany HL34 <Przykład 15 >.

Analiza sekwencji nukleotydów DNA plazmidu w tym klonie wykazała, że klon ten zawiera cDNA w 84% homologiczny z sekwencją nukleotydów cDNA szczurzej TPO.

Po oczyszczeniu sklonowanego DNA plazmidu i transfekowaniu do komórek COS 1 w nadsączu z hodowli transfekowanych komórek stwierdzono aktywność TPO. W rezultacie potwierdzono, że ten klon plazmidu zawiera cDNA, kodujący ludzką TPO < Przykład 17 >.

Ten cDNA wydaje się jednak sztucznym produktem klonowania, ponieważ w klonie nie stwierdzono kodonu końcowego, a w końcówce 3' odkryto sekwencje quasi-końcową poli A. Skonstruowano zatem wektor ekspresji, kodujący sekwencje aminokwasów łącznie z odpowiednią częścią sekwencji quasi końcowej poli A. Po ekspresji skonstruowanego w ten sposób wektora w komórkach COS 1, stwierdzono aktywność TPO w nadsączu z hodowli < Przykład 18>.

Za pomocą PCR uzyskano fragment DNA w regionie końcówki 3' ludzkiej TPO w celu przeanalizowania struktury cDNA o pełnej długości.

Na podstawie sekwencji nukleotydów tego fragmentu stwierdzono, że częściowo pokrywa się on z cDNA przenoszonym przez klon HL34 uzyskany w przykładzie 15. Zakładano również, że pełnej długości cDNA ludzkiej TPO może zawierać otwartą strukturę czytającą i kod proteiny składającej się z 353 aminokwasów. Sugeruje się zatem, że ludzka TPO składa się z 353 aminokwasów z sekwencją sygnałową 21 aminokwasów < Przykład 19>.

Oprócz powyższej metody klonowania, klonowanie cDNA ludzkiej TPO jest możliwe przez hybrydyzację kolonii lub hybrydyzację płytkową z wykorzystaniem fragmentu cDNA szczurzej TPOjako sondy iposługując się biblioteką sporządzoną przy użyciu wektora plazmidowego w oparciu o pUC i pBR, wektora fagowego w oparciu o λ itp. Do sporządzenia sondy degeneracyjnej można użyć inozyny dla zmniejszenia stopnia degeneracji. Jeśli dostępna jest metoda analizy do wykrywania aktywności TPO w specyficzny sposób lub z wysoką dokładnością, możliwe jest przeprowadzenie klonowania ekspresyjnego z zastosowaniem biblioteki ekspresji jak w przedstawionym wynalazku.

Jednakże, ponieważ zawartość RNA kodującego ludzką TPO w wątrobie zdrowego człowieka wydaje się ekstremalnie niska, co opisano później w przykładzie 15 (zawartość obliczona na podstawie wyniku tego przykładu pozostawała w stosunku jednego do trzech milionów), skreening hybrydyzacji, w którym jako sondy używane są syntetyzowane oligonukleotydy

179 884 lub fragment cDNA szczurzej lub ludzkiej TPO okazuje się nadzywaczaj trudny ze względu na ogromną liczbę klonów lub płytek do przebadania, a czułość i specyficzność hybrydyzacji jest mniejsza niż dla metody PCR. Twórcy wynalazku przeprowadzili wprawdzie hybrydyzację kolonii dwóch milionów klonów w przygotowanej według przykładu 15 bibliotece cDNA wątroby zdrowego człowieka z zastosowaniem fragmentu cDNA szczurzej TPO jako sondy, lecz nie uzyskali klonu cDNA ludzkiej TPO.

(I) Rekonstrukcja cDNA pochodzącego z normalnej wątroby ludzkiej

Ponieważ klon HL34, uzyskany w przykładzie 15 wydaje się zawierać niekompletny cDNA, w celu uzyskania kompletnego cDNA ludzkiej TPO dokonano rekonstrukcji biblioteki cDNA przy użyciu handlowego preparatu poli (A⁺) RNA pochodzącego z normalnej wątroby ludzkiej. Biblioteka (hTPO-Fl) sporządzona przez wprowadzenie związanego z wektorem cDNA do szczepu DH5 E. coli zawierała 1,0 χ 10⁶ transformantów < Przykład 20 >.

(J) Screening klonu cDNA TPO, określenie sekwencji i ekspresja cDNA ludzkiej TPO oraz potwierdzenie aktywności TPO

Na podstawie sekwencji nukleotydów (SEQ ID nr 3) częściowego cDNA, uzyskanego w przykładzie 14 i sekwencji nukleotydów (SEQ ID nr 196) kompletnego cDNA ludzkiej TPO przewidywanej w przykładzie 19 syntetyzowano primery do reakcji PCR.

Bibliotekę cDNA ludzkiej wątroby (hTPO-Fl) sporządzoną według przykładu 20 podzielono na 3 pule (pule #1-3). Przeprowadzono PCR z wykorzystaniem DNA plazmidu otrzymanego z każdej puli jak matrycy i syntetyzowanych primerów. W rezultacie amplifikowano DNA o oczekiwanym rozmiarze, stosując DNA plazmidu otrzymanego z puli # 3. Pulę # 3 podzielono na podpule, z których każdy zawierał 15,000 transformantów i przeprowadzono screening z zastosowaniem PCR. W rezultacie amplifikacj ę DNA o oczekiwanym rozmiarze wykryto w 6 spośród 90 pul. Po podzieleniu jednej z dodatnich pul na podpule, z których każda zawierała 1000 klonów i po ekstrakcji DNA plazmidu i wykonaniu PCR znanym sposobem nie stwierdzono amplifikacji DNA. Przypuszczano, że było to spowodowane niską wydajnością DNA plazmidu ze względu na gorszy wzrost interesującego klonu niż innych. W związku z tym oryginalnąpulę # 3 naniesiono na 100 płytek LB przy gęstości posiewu 4,100 kolonii na każdej płytce. Z każdej posiewanej płytki sporządzono replikę. Po wykonaniu w opisany wyżej sposób PCR przy użyciu kwasów DNA ekstrahowanych z kolonii rozwijających się na płytce LB stwierdzono amplifikacj ę oczekiwanego pasma w jednej spośród 100 podpul.

Z płytki tej podpuli przygotowano dwie kopie filtrów i przeprowadzono hybrydyzację kolonii przy użyciu sondy znacznikowej (fragment EcoRI/BamHI plazmidu pEFl 8S-HL34). W rezultacie zauważono pojedynczy sygnał, który można uznać za dodatni. Kolonie zebrano z oryginalnej płytki i posiewano ponownie na płytkę LB. Z ogółu 50 kolonii, wyhodowanych na płytce przygotowano próbki DNA i poddano je PCR, uzyskując klon, nazwany pHTFl <Przykład 21 >. W screeningu klonu cDNA stosowano głównie takie metody jak hybrydyzacja, PCR i klonowanie ekspresji. Połączenie tych metod zwiększało skuteczność i dokładność badań, zmniejszając przy tym nakład pracy. Po określeniu sekwencji nukleotydów otrzymanego klonu pHTFl okazało się, że posiada on otwartą strukturę czytającą, a sekwencja aminokwasów proteiny zakodowanej prawdopodobnie w otwartej strukturze czytającej była w pełni zgodna z wywnioskowaną sekwencją aminokwasów (SEQ ID nr 6) ludzkiej TPO. Sekwencja nukleotydów różniła się od wywnioskowanej (SEQ ID nr 196) w trzech pozycjach, lecz różnice te nie powodowały wymiany aminokwasów. Potwierdza to, że proteina ludzkiej TPO zawiera reszty 353 aminokwasów o 21 sygnałowych sekwencjach aminokwasów. PO otrzymaniu DNA plazmidu z uzyskanego klonu pHTFl i transfekowaniu go do komórek COS 1 stwierdzono aktywność TPO w nadsączu z hodowli komórkowej.

(K) Bibliotekę genomową, otrzymaną od prof. T Yamamoto z Centrum Badań Genetycznych Uniwersytetu Tohoku posiewano na 18 płytkach NZYM przy gęstości posiewu 30,000 cząstek fagowych na jedną płytkę. Z każdej z tak przygotowanych 18 płytek przygotowano po dwie kopie filtrów. Fragment cDNA ludzkiej TPO (podstawowe numery pozycji 178 do 1,025 w SEQ ID nr 7) amplifikowano przez PCR i oczyszczano. Przy użyciu oczyszczonego fragmentu

179 884 znaczonego ³²P jako sondy przeprowadzono hybrydyzację płytek. W rezultacie otrzymano 13 pozytywnych sygnałów. Osady zebrano z początkowych płytek i posiewano ponownie na płytkach NZYM przy gęstości zasiewu 1,000 na każdej płytce. Z każdej płytki przygotowano dwie kopie filtrów w celu przeprowadzenia hybrydyzacji w takich samych warunkach jak podano wyżej . W rezultacie pozytywne sygnały wykryto we wszystkich filtrach 13 grup. Z każdej płytki odzyskiwano pojedynczy osad w celu sporządzenia fagowego DNA. Otrzymane z 13 klonów próbki fagowego DNA badano za pomocąPCR pod względem obecności cDNA kodującego region. Pięć spośród 13 klonów zawierało prawdopodobnie cały region kodujący aminokwasy cDNA. Jeden z uzyskanych klonów (klon ZHGT) wyizolowano i przeanalizowano metodą Southern blotting (przy użyciu wspomnianej wyżej sondy). Ponieważ w przypadku rozkładu za pomocą HindUI zaobserwowano pojedyncze pasmo około 10 kb, DNA klonu ZHGTl rozkładano za pomocą HindUI i poddawano elektroforezie na żelu agarozowym. Pasmo 10 kb odcięto od żelu, oczyszczono i subklonowano do wektora klonowania pUC13, otrzymując klon, nazwany pHGTl < Przykład 24 >.

Po określeniu sekwencji nukleotydów otrzymanego klonu pHGTl stwierdzono, że DNA chromosomów przenoszone przez klon zawiera cały region kodujący proteiny, przewidywany w przykładzie 19, a sekwencja nukleotydów regionu kodującego jest całkowicie zbieżna z przewidywaną sekwencją nukleotydów (SEQ ID nr 196).

Ponadto region odpowiadający egzonowi kodującemu aminokwasy zawierał 4 introny, a sekwencja nukleotydów była różna od sekwencji całkowitego cDNA przenoszonego przez klon pHTFl, otrzymany w przykładzie 21 (SEQ ID nr 7).

Po określeniu sekwencji nukleotydów czterech pozostałych klonów spośród 5 chromosomowych DNA, wyselekcjonowanych niezależnie w wyniku screeningu, stwierdzono, że dwa spośród 4 klonów są identyczne z klonem pHGTl, a dwa pozostałe są niemal identyczne z klonem pHGTl, lecz posiadały inny nukleotyd wewnątrz 3' niekodującego regionu niż stwierdzono w klonie pHTF 1 < Przykład 25 >.

Fragment EcoRI w uzyskanym klonie plazmidu pHGT 1 został związany z wektorem ekspresji pEF18S w celu uzyskania plazmidu ekspresji ludzkiej TPO, pEFGTE. Po otrzymaniu DNA plazmidu (pEFHGTE) i transfekowaniu do komórek COSI, stwierdzono aktywność TPO w nadsączu z hodowli komórek < Przykład 26 >.

(L) Otrzymywanie pochodnych delecji ludzkiej TPO, ich ekspresja w komórkach COS i potwierdzenie aktywności TPO

Wynik przykładów 18 i 22 wskazują, że proteina ludzkiej TPO może wykazywać aktywność biologiczną nawet po usunięciu trzeciego końca karboksylowego. Dlatego w celu dalszej analizy części biologicznie czynnych przeprowadzono doświadczenia z delecją pochodnych. Otrzymywano serie plazmidów ekspresji za pomocą PCR, stosując DNA klonu plazmidu pHTl-231, uzyskanego w przykładzie 18 jako matrycę i syntetyzowane oligonukleotydy jako primery.

Uzyskano plazmidy ekspresji, zawierające DNA kodujący pochodne delecji ludzkiej TPO pozbawione regionu końca karboksylowego proteiny TPO, czyli pochodne delecji kodujące pozycje 1-211, 1-191, 1-171 i 1-163 sekwencji aminokwasów.

Po otrzymaniu DNA z każdego z tych klonów i transfekowaniu do komórek COS 1 w nadsączu każdej hodowli wykryto aktywność TPO < Przykład 27 >.

Po zaprojektowaniu pochodnych z seriami delecji reszt aminokwasowych C-końcówek aż do pozycji 151 oraz innych pochodnych z delecjąkońcówki N reszt aminokwasowych aż do pozycji 6, 7 i 12 i wykonaniu pomiaru aktywności po ekspresji w komórkach COS 1 w celu dalszej analizy regionu o aktywności TPO, aktywność okazała się niewykrywalna, gdy reszty aminokwasowe końcówki N zdelecjonowano do 7 pozycji lub reszty aminokwasowe końcówki C zdelecjowano do 151 pozycji < Przykłady 28 i 29 >.

Pochodne proteiny posiadającej aktywność biologiczną TPO mogą być otrzymywane przez modyfikację (delecję, substytucję, insercję lub addycję) cDNA kodującego proteinę.

179 884

W celu dokonania modyfikacji można stosować takie metody jak PCR, ukierunkowana mutageneza i synteza chemiczna.

(M) Ekspresja cDNA ludzkiej TPO w komórkach CHO i oczyszczanie TPO

Skonstruowano wektor ekspresji pHTPl, który może powodować ekspresję cDNA kodującego wyprowadzoną sekwencję aminokwasów ludzkiej TPO, pokazanąw SEQ ID nr 6 w komórkach zwierzęcych < Przykład 30 >.

Region cDNA TPO w pHTPl zastosowano do konstrukcji wektora pDEF202-htPO-Pl w celu ekspresji w komórkach CHO < Przykład 31 >.

W wyniku transfekcji wektora do komórek CHO, a następnie selekcji transfekowanych komórek uzyskano transfekowane komórki, w których wektor ekspresji będący nośnikiem cDNA ludzkiej TPO został zintegrowany z chromosomem komórek CHO < Przykład 32 >.

W przykładzie 32 przeprowadzono na duża skalę hodowlę linii komórkowej CHO produkującej ludzką TPO (komórki 28-30 CHO, odporne na 25 nM ΜΤΧ) i uzyskanej przez transfekcję plazmidu ekspresji TPO pDEF202-hTPO-Pl do komórek CHO < Przykład 55 >.

Z nadsącza z hodowli 100 L oczyszczano ludzką TPO < Przykład 56 >.

Alternatywnie oczyszczano ludzką TPO z nadsącza hodowli z przykładu 55 innym sposobem < Przykład 57 >.

(N) Ekspresja cDNA ludzkiej TPO w komórkach Χ63.6.5.3 i potwierdzenie aktywności

Przy pomocy regionu cDNA TPO zakodowanego w plazmidzie pBLTEN, uzyskanym w przykładzie 30 skonstruowano wektor ekspresji BMCGSneo-h-tPO-Pl do wykorzystania w komórkach Χ63.6.5.3. <Przykład 33 >

Po transfekcji komórek Χ63.6.5.3 tym wektorem uzyskano komórki transformowane, w których wektor ekspresji kodujący ludzki cDNA został zintegrowany z ich chromosomami. W nadsączu z hodowli tych komórek wykryto aktywność TPO < Przykład 34 >.

(O) Ekspresja dużych ilości ludzkiej TPO w komórkach COSI, oczyszczanie, obliczanie masy cząsteczkowej i właściwości biologiczne

Wektor ekspresji pHTPl uzyskany w przykładzie 30 transfekowano do komórki COSI w celu uzyskania dużych ilości (w sumie około 40 litrów) nadsączu z hodowli zawierającego produkt podlegający ekspresji < Przykład 35 >.

Przeprowadzono oczyszczanie TPO z około 7 litrów nie zawierającego surowicy nadsącza z hodowli komórek COS 1, uzyskanego w przykładzie 35 i zawierającego TPO pochodzącego z wektora ekspresji pHTPl. Możliwe okazało się uzyskanie TPO o wysokiej aktywności za pomocąetapów chromatografii z interakcjąhydrofobową chromatografiąkationowymienną chromatografią na WG A i chromatografią z odwróconymi fazami < Przykład 36 >.

Częściowo oczyszczoną TPO z nadsącza hodowli komórek COS 1 poddano pomiarom masy cząsteczkowej i analizom właściwości biologicznych <Przykłady 37 i 38>.

(P) Ekspresja ludzkiej TPO w E. coli

Skonstruowano wektor pGEX-2T/hT(l-l74) w celu ekspresji w. E. coli połączonej proteiny transferazy-S-glutationowej i TPO ludzkiej, nazywanej dalej „GST-TPO (1-174)” (reszty aminokwasów w pozycjach 1 do 174). W tym przypadku część sekwencji nukleotydów cDNA ludzkiej TPO (około połowy regionu 5') zamieniono na kodony preferencyjne E. coli <Przykład 39>.

GST-TPO (1-174) podlegała ekspresji w E. coli, powstałe komórki dezintegrowano, a następnie solubilizowano GSP-TPO(1-174) zawartą we frakcji osadu.

Następnie, w wyniku kombinacji różnych etapów, w tym badanie warunków rozwijania TPO, badanie warunków oczyszczania (kolumna powinowactwa glutationu, kolumna kationowymienna itp.) i rozkładu regionu GST proteiny trombiną możliwe było dokonanie zaplanowanego częściowego oczyszczenia proteiny zawierającej sekwencję aminokwasów TPO. Potwierdziło się, że proteina ta wykazuje aktywność TPO w systemie analizy z zastosowaniem CFU-MK szczura < Przykłady 43 i 44 >.

Skonstruowano także wektor pCFM536/h6T(l-163) w celu wykorzystania do ekspresji w E. coli zmutowanego typu proteiny ludzkiej TPO (zwanej „h6T(1 -163), w której reszta Ser w pozycji 1 i reszta Ala w pozycji 3 ludzkiej TPO (pozycje aminokwasów 1 do 163) były zastępowane

179 884 odpowiednio przez resztę Ala i resztę VA1, natomiast resztę Lys i resztę Met dodawano do pozycji -1 i -2. Całą grupę sekwencji nukleotydów cDNA ludzkiej TPO (odpowiadającą resztom aminokwasowym 1 do 163) przenoszonąprzez skonstruowany wektor wymieniano na kodony preferencyjne E. coli < Przykład 42 >.

W E. coli ekspresji ulegał h6T(l-163), utworzone komórki poddawano lizie strukturalnej, a następnie badano rozpuszczalność h6T(l -163) obecnego w wytrąconej frakcji i warunki rozwijania proteiny. Zgodnie z założeniem uzyskano częściowe oczyszczenie proteiny zawierającej sekwencje aminokwasowe TPO. Potwierdziło się, proteina wykazuje aktywność TPO w systemie analizy z zastosowaniem szczurzego CGU-MK< Przykłady 43 i 44 >.

Ponadto skonstruowano wektor pCFM436/hMKT(l-163) w celu uzyskania ekspresji w E. coli zmutowanego typu proteiny ludzkiej TPO (zwanej „hMKT 1-163”), w której reszty Lys i reszty Met zostały dodane odpowiednio do pozycji -1 i -2. W sposób opisany w przykładzie 43 hMKT(l-163) podlegał ekspresji w E. coli. Proteinę ekspresji wprowadzano do SDS-PAGE, przenoszono na membranę PVDF i poddawano analizie N-końcowej sekwencji aminokwasów, potwierdzając, że badana proteina zawiera zaprojektowaną sekwencję aminokwasów <Przy kład 52>.

Skonstruowano także wektor pCFM536/hMKT (1-332) dla ekspresji w E. coli zmutowanego typu proteiny ludzkiej TPO, w której resztę Lys dodaje się do pozycji -1, a resztę Met do pozycji -2 ludzkiej TPO (pozycje aminokwasów od 1 do 332), zwanej ,,HMKT(l-332)”). W taki sam sposób jak w przykładzie 42 następowała ekspresja w E. coli. Ekspresja ta została potwierdzona metodą Western blotting przy użyciu peptydowego przeciwciała przeciw ludzkiej TPO, otrzymanego w przykładzie 45, zamieszczonym poniżej < Przykład 66 >.

(Q) Otrzymywanie peptydowego przeciwciała anty-TPO i kolumna peptydowego przeciwciała anty-TPO

Polikolonalne przeciwciała anty-TPO pochodzące z królika otrzymywano przy pomocy syntetyzowanych peptydów odpowiadających trzem częściowym regionom sekwencji aminokwasów TPO szczura, określonej w przykładzie 10. Potwierdziło się, że przeciwciała te mają zdolność rozpoznawania cząsteczek szczurzej i ludzkiej TPO. Syntetyzowano również peptydy odpowiadające sześciu częściowym regionom sekwencji aminokwasów ludzkiej TPO według SEQ ID nr 6 (lub SEQ ID nr 7), a następnie włączano do uzyskanych poliklonalnych króliczych przeciwciał peptydowych anty-TPO. Potwierdziło się, że przeciwciała będące produktem tej reakcji rozpoznają ludzką TPO < Przykład 45 >.

Możliwe jest oczyszczenie TPO za pomocą kolumnowej chromatografii powinowactwa, stosując kolumnę wypełnioną cząsteczkami o powinowactwie wiązania TPO, takimi jak przeciwciała anty-TPO, receptory TPO itp. Po raz pierwszy sporządzono kolumnę przeciwciał anty-TPO przez wiązanie przeciwciała peptydowego anty-TPO, uzyskanego w przykładzie 45 < Przykład 46 >.

(R) Oczyszczanie ludzkiej TPO podlegającej ekspresji w komórkach COS 1 z zastosowaniem kolumny przeciwciał peptydowych anty-TPO oraz jej masa cząsteczkowa i właściwości biologiczne

Przy użyciu nadsącza z komórek COS 1 transfekowanych wektorem ekspresji pHTP 1 jako materiału wyjściowego otrzymywano częściowo oczyszczoną TPO, którą umieszczano w kolumnie przeciwciał anty-TPO. Po stwierdzeniu aktywności TPO w adsorbowanej frakcji, frakcję tę poddawano chromatografii kolumnowej z odwróconymi fazami w celu oczyszczenia proteiny i określenia jej masy cząsteczkowej oraz właściwości biologicznych < Przykład 47 >.

(S) Potwierdzenie aktywności częściowo oczyszczonej próbki ludzkiej TPO podlegającej ekspresji w komórkach COS 1

Aktywną frakcję TPO oczyszczoną w przykładzie 36, mianowicie próbkę TPO oczyszczoną do poziomu kolumny Capcell Pak CI 300A z nadsącza, uzyskanego przez transfekcję komórek COS 1 wektorem ekspresji pHTPl, badano pod względem jej właściwości biologicznych w celu stwierdzenia, czy wywiera ona działanie zwiększające liczbę płytek krwi w żywym organizmie < Przykład 48 >.

179 884

Również surową frakcję TPP uzyskaną przez kolumnę kati ono wymienną z 33 litrów nadsączu hodowli otrzymanej przez transfekcję komórek COS 1 wektorem ekspresji pHTPl badano pod względem właściwości biologicznych, aby stwierdzić, że powoduje ona zwiększenie liczby płytek krwi w organizmie < Przykład 49 >.

(T) Ekspresja ludzkiej TPO w DNA chromosomów komórek CHO i potwierdzenie jej aktywności

Skonstruowano wektor pDEF202-ghTPO dla wykorzystania w ekspresji chromosomów z TPO ludzką w komórkach CHO < Przykład 50 >.

Po wprowadzeniu wektora do komórek CHO otrzymywano komórki transformowane, w których wektor ekspresji kodujący DNA chromosomów z ludzkąTPO był złączony z chromosomem. Po wyhodowaniu klonów tych komórek, stwierdzono aktywność TPO w nadsączu z hodowli < Przykład 51 >.

(U) Częściowe oczyszczanie i potwierdzenie aktywności mutacji ludzkiej TPO manifestowanej w E. coli

Typ mutacji ludzkiej TPO pochodzący z klonu kodującego sekwencję nukleotydów ludzkiej TPO, pCFM53 6/h6T( 1 -163) i podlegający ekspresji w E. coli rozkładano przy pomocy chlorowodorku guanidyny i glutationu, a następnie poddawano chromatografii kationowymiennej, w wyniku której stwierdzono, że oczyszczona h6T powoduje wzrost liczby płytek krwi w żywym organizmie < Przykład 53 >.

Typ mutacji ludzkiej TPO pochodzący z klonu kodującego sekwencję nukleotydów ludzkiej TPO, pCFM536/h6T(l-163) i podlegający ekspresji w E. coli rozkładano przy pomocy N-lauroilosarkozynianu sodu i siarczanu miedzi, a następnie poddawano chromatografii kationowymiennej, w wyniku której stwierdzono, że oczyszczona h6T powoduje wzrost liczby płytek krwi w żywym organizmie. < Przykład 54 >.

Dodatkowo rozkładano i oczyszczano mutację ludzkiej TPO, h6T (1-163) innymi sposobami. < Przykłady 60 i 61 >.

(V) Ekspresja cDNA z ludzkąTPO w komórkach owadzich i stwierdzenie aktywności TPO

Dla ekspresji ludzkiej TPO w komórkach owadzich spreparowano rekombinowany wirus < Przykład 58>, który ujawnił się w komórkach owadzich Sf21, a następnie zidentyfikowano aktywność TPO w nadsączu hodowli < Przykład 59 >.

(W) Ekspresja ludzkiej TPO (pozycje aminokwasów 1 do 163) w komórkach CHO i jej oczyszczanie

Skonstruowano wektor pDEF202-h TPO 163 dla ekspresji proteiny ludzkiej TPO (nazywanej dalej „hTPO163”) posiadającej aminokwasy 1 do 163 w sekwencji aminokwasów ludzkiej TPO przedstawionej w SEQ ID NO: 7. Wektor ekspresji pDEF202-hTPO163 poddano transie kcji do komórek CHO, a uzyskane w ten sposób linie komórek CHO produjących hTPO163 hodowano na większą skalę. Z nadsącza komórek oczyszczano hTPO 163. <Przykłady 62 do 65 >.

(X) Otrzymywanie pochodnych ludzkiej TPO przez podstawienie

Sporządzono pochodną ludzkiej TPO (nazywaną dalej „N3/TPO”), w której ARg-25 i Glu-231 zastąpiono odpowiednio przez Asn i Lys oraz pochodną (nazwaną „09/TPO”), w której His-33 zastąpiono przez Thr.

Kodowanie plazmidów dla każdej pochodnej przenoszono do komórek COS 7, które później hodowano. W nadsączach hodowli stwierdzono aktywność TPO. < Przykład 67 >.

Przy użyciu systemu ekspresji E. coli otrzymywano pochodne, w których jeden z aminokwasów h6T(l-163) zastępowano innym. W każdej pochodnej stwierdzono aktywność TPO. < Przykład 94 >.

(Y) Otrzymywanie pochodnych ludzkiej TPO przez wstawianie lub usuwanie

Do hTPO 163 wstawiano lub usuwano z niej aminokwas w celu uzyskania pochodnych przez wstawianie lub usuwanie, a następnie komórki COS7 transfekowano plazmidami kodującymi powstałe pochodne. W nadsączu hodowli komórek COS7 stwierdzono aktywność TPO. < Przykład 68 >.

Metodę pomiaru aktywności TPO (system oznaczania in vitro), zastosowaną w przedstawionym wynalazku opisano poniżej jako „Przykład Uzupełniający”.

179 884 (Z) Otrzymywanie i oczyszczanie przeciwciał ludzkiej TPO

Przy użyciu fragmentów peptydów ludzkiej TPO uzyskano poliklonalne przeciwciała < Przykład 69 >, które następnie wykorzystywano do pomocy analizy Westema blotting oraz przez konstrukcję kolumny powinowactwa przeciwciał TPO < Przykład 71 >.

(AA) Aktywność ludzkiej TPO in vivo

Oczyszczoną ludzką TPO podawano myszom z indukowaną trombocytopenią i kontrolowano zmiany zawartości płytek krwi w porównaniu z grupą kontrolną < Przykłady 72 do 79 >. Opisano preparaty farmaceutyczne jako potencjalnie użyteczne w leczeniu trombocytopenii. < Przykłady 80 do 89 >.

(BB) Aktywność TPO jako funkcja wiązania receptorów MLP

Przeprowadzono oznaczenie, w którym aktywność TPO określono w terminach swoistej interakcji wiązania z receptorem Mpl. < Przykłady 90 do 93 >

Przykład uzupełniający

E. System oznaczania komórek progenitora megakariocytów szczura (oznaczania CFU-MK) (system hodowli płynnej)

Megakariocyty wchłaniają i magazynują serotoninę w zagęszczonych ziarnach cytoplazmy w wyniku aktywnego procesu energetycznego (Fedorko, Lab. lnvest., tom 36, s. 310-320, 1970). Zjawisko to można zaobserwować już w małych jednojądro wy ch komórkach dodatnio reagujących na acetylocholinoesterazę, które umiejscawia się pomiędzy CFU-MK a rozpoznawalnymi megakariocytami (Bricker i Zuckerman, Exp. Hematol., tom 12, s. 672, 1984). Poziom wchłanianej serotoniny zwiększa się wraz ze wzrostem wielkości megakariocytów (Schick i Weinstein, J.Lab. Clin.Med., tom 98, s. 607-615,1981). Ponadto wiadomo, że zjawisko to jest specyficzne jedynie dla megakariocytów spośród komórek szpiku kostnego (Schick i Weinstein, J.Lab. Clin.Med., tom 98, s. 607-615, 1981). W omawianym systemie oznaczania mocno wzbogacone komórki CFU-MK szczura (frakcja GpIIb/ΙΠ a⁺ CFU-MK, która zostanie opisana później) hoduje się w obecności próbek przeznaczonych do analizy i oznacza inkorporację ¹⁴C-serotoniny (siarczanu ¹⁴C-hydroksytryptaminokreatyniny; ¹⁴C-5HT) w megakariocytach rozwijających się z CFU-MK.

Korzystna w tym systemie oznaczania jest możliwość ograniczenia pośredniego oddziaływania współwystepujących komórek (np. aktywności Meg-CSF współwystępujących komórek stymulowanych przez inne substancje niż badany czynnik lub wytwarzanie przez skażone komórki jakiegoś czynnika współdziałającego z czynnikiem badanym), ponieważ procentowa zawartość CFU-MK w komórkach frakcji GPIIb/IIIa⁺jest bardzo wysoka (patrz [metoda oznaczania]), natomiast liczba współwystępujących komórek jest niewielka. Ponadto w stosunkowo długim okresie można utrzymać właściwe warunki hodowli, ponieważ całkowita ilość posianych komórek w jednym naczyniu jest niewielka. Inna korzyść polega na tym, że liczba dojrzałych megakariocytów o dużych rozmiarach rozwijających się z CFU-MK w obecności aktywnej próbki w okresie trwania hodowli może być obserwowana pod mikroskopem z kontrastem fazowym, co umożliwia jakościowe stwierdzenie obecności i stopnia aktywności. Wyniki oceny jakościowej w znacznym stopniu odpowiadają wynikom oznaczania ilościowego na podstawie inkorporacji ¹⁴C-serotoniny. Oznaczanie ilościowe można więc dodatkowo zweryfikować, wspomagając je oceną jakościową.

Metoda oznaczania:

Znacznie wzbogacone komórki CFU-MK (frakcji GpIIb/IHa⁺CFU-MK) zastosowane do analizy przygotowano nieco zmodyfikowaną metodą Miyazaki i in. (Exp. Hematol., tom 20, s. 855-861, 1992).

Streszczając: szczurom rasy Wistar (samce w wieku 8 do 12 tygodni) usuwa się kość udową i piszczel w celu sporządzenia zawiesiny komórek szpiku kostnego. Do przygotowania zawiesiny stosuje się pożywkę zawiesinotwórczą(roztwór składający się z 13,6 mM cytrynianu trójsodowego, 11,1 mM glukozy, 1 mM adenozyny, 1 mM teofiliny, 10 mM HEPES (pH 7,25), 0,5% albuminy osocza bydlęcego (dalej nazywane „BSA”) (Path-O-Cyte 4; Seikagaku Kogyo Co., Ltd.) oraz roztwór swobodnie zrównoważonych metodąHanksa soli Ca²⁺ i Mg⁺²: nazywany

179 884 dalej „roztworem HATCH”), które jest nieco zmodyfikowaną wersją pożywki do rozdziału megakariocytów według Levine i Fedoroko (Levine and Fedoroko, Blood, tom 50, s. 713-725, 1977). Otrzymaną zawiesinę komórek szpiku kostnego umieszcza się w roztworze Percolla o nieciągłym gradiencie gęstości (gęstość: 1.050 g/ml/1.063 g/ml./1.082 g/ml), uzyskanym przez rozcieńczenie roztworu Percolla (produkowanego przez firmę Pharmacia) roztworem HATCH i odwirowuje w temperaturze 20°C przy 400 x g przez 20 minut. Po odwirowaniu odzyskuje się komórki o gęstości pomiędzy 1.063 g/ml do 1.082 g/ml. Po wypłukaniu odzyskane komórki zawiesza się w modyfikowanej według Iscove'a pożywce Dulbecco (nazywanej dalej „pożywką IMDM”), zawierającej 10% surowicy płodu cielęcego (nazywanej dalej „FCS”), umieszcza w 100 mm plastikowych poj emnikach i hoduj e w temperaturze 3 7°C przez 1 godzinę w inkubatorze z 5% CO₂. Po inkubacji odzyskuje się komórki nieadherentae, które są znowu hodowane w plastikowych pojemnikach w temperaturze 37°C przez 1 godzinę. Komórki nieadhezyjne zawiesza się w roztworze HATCH i poddaje inkubacji przez 1 godzinę na 100 mm bakteriologicznych płytkach Petriego, na których uprzednio zostały adsorbowane mysie monoklonalne przeciwciała płytek krwi szczura GpIIb/IIIa, przeciwciała P55 (Miyazaki e in., Thromb. Res., tom 59, s. 941-953, 1990). Po inkubacji nieadherentae komórki usuwa się przez wymywanie roztworem HATCH, a pozostałe komórki adsorbowane przez unieruchomione przeciwciała P55 oddziela się pipetą. W sumie z jednego szczura uzyskuje się 3-4 χ 10⁵ komórek. Uzyskana frakcja komórek zawiera znacznie wzbogacone CFU-MK szczura (dalej nazywane „frakcją GpIIb/IIIa⁺ CFU-MK). Na podstawie pomiaru za pomocą systemu oznaczania kolonii w obecności nasyconego stężenia IL-3 szczura, wiadomo, że frakcja ta zawiera około 5 do 10% CFU-MK. Hybrydy zdolne do wytwarzania wymienionych wyżej przeciwciał P55 zostały zdeponowane 14 lutego 1994 jako depozyt nr FERM BP-4563 w Narodowym Instytucie Biotechnologii, National Institute of Bioscience and Humań Technology, Agency of Industrial Science and Technology. Ministry of International Trade and Industry.

Następnie komórki uzyskanej frakcji GpIIb/IIIa⁺ CFU-MK zawiesza się w pożywce IMDM zawierającej 10% FCS i rozdziela w porcjach po 10⁴ komórek na jeden zbiorniczek spośród 96 na płytce do hodowli tkankowej. Do każdego zbiorniczka dodaje się następnie próbkę wzorcową (dalej opisaną dokładnie) lub próbkę przeznaczoną do analizy, uzupełniając ostateczną objętość pożywki do 200 pi w każdym zbiorniczku. Tak przygotowaną płytkę umieszcza się w inkubatorze z CO₂ i poddaje inkubacji przez 4 dni w temperaturze 37°C. W czwartym dniu inkubacji do każdego zbiorniczka na trzy godziny przed zakończeniem hodowli dodaje się 0,1 pCi (3,7 KBq) ¹⁴C-serotoniny i kontynuuje inkubację w temperaturze 37°C. Po trzech godzinach inkubacji płytkę odwirowuje się przez trzy minuty z prędkością 1,000 obrotów na minutę i usuwa przez odsysanie pozostały nadsącz. Do każdego zbiorniczka dodaje się porcję 200 μΐ PBS zawierającą 0,05% EDTA, płytkę odwirowuje w celu wypłukania pozostałego płynnego nadsącza. Etap wymywania powtarza się jeszcze raz. Do otrzymanej w ten sposób grudki komórek w każdym zbiorniczku dodaje się porcję 200 μΐ 2% Tritonu X-100 i wytrząsa płytkę w mieszarce płytowej przez około 5 do 10 minut w celu całkowitego rozdzielenia komórek. Porcję 150 μΐ otrzymanego lizatu komórkowego przenosi się do stamdardowego stałego scyntylatora w kształcie kołpaka (Ready Cap; produkcji Beckmana) i pozostawia przez noc w piecu w temperaturze 50°C do wysuszenia lizatu. Następnego dnia Ready Cap umieszcza się w szklanym pojemniku w celu wykonania pomiaru radioaktywności ¹⁴C za pomocą cieczowego licznika scyntylacyjnego.

W tym przypadku prawie takie same wyniki jak na podstawie oznaczania inkorporacji ¹⁴C-serotoniny można uzyskać przez pomiar aktywności acetylocholinoesterazy w opisanym wcześniej lizacie komórkowym metodą Ishibashi i Bursteina (Blood, tom 67, s. 1512-1514, 1986).

Próbka wzorcowa:

Najpierw przygotowano w opisany poniżej sposób plazmę krwi szczurów z trombocytopenią do wykorzystania w sporządzaniu próbki wzorcowej.

179 884

W zdrowych samców szczura rasy Wistar (w wieku 7 do 8 tygodni) wywołano trombocytopenię przez dożylne podawanie wyżej wymienionego przeciwciała P55 w dawce 0,5 mg na jednego osobnika, dwukrotnie w odstępie około 24 godzin. Około 24 godziny po drugim podaniu pobrano krew z aorty brzusznej pod znieczuleniem eterowym używając strzykawki o pojemności 10 ml, do której wprowadzono 1 ml 3,8% (v/v) roztworu cytrynianu trój sodowego jako środka przeciwkrzepliwego. Pobrane próbki krwi umieszczano w plastikowych probówkach w wirówce i odwirowywano przez 10 minut przy 1,200 x g w celu odzyskania frakcji plazmy krwi. Odzyskaną frakcję plazmy krwi odwirowywano ponownie przy 1,200 x g przez 10 minut, przy czym starano się uniknąć powstawania zlepków komórek, płytek itp. i odkładano do przechowania. (Uzyskana w ten sposób plazma krwi jest nazywana dalej „TRP”.) TRP traktowaną wapniem (próbka wzorcowa C), frakcję aktywną w kolumnie WGA-Agarose (próbka wzorcowa W) lub frakcję aktywną w kolumnie Phenyl Sepharose 6 FF/LS (frakcja wzorcowa P) uzyskane z TRP według sposobu z przykładu 1 dializowano rozlegle w stosunku do odpowiedniej objętości pożywki IMDM i stosowano jako wzorce do analizy.

W procesie oczyszczania TPO szczura, opisanym w przykładzie I, we wczesnym etapie stosowano próbkę wzorcową C, która w połowie procesu zastępowano próbką wzorcową W, a następnie próbką wzorcową P. Swoistą aktywność próbki wzorcowej C zdefiniowano wstępnie jako 1, a względne aktywności próbek wzorcowych W i P obliczono na podstawie definicji. Względna aktywność każdej próbki przeznaczonej do analizy była oznaczana przez porównanie krzywej dawki/reakcji próbki wzorcowej z krzywą próbki analizowanej. Względną aktywność próbki analizowanej zdefiniowano jako n, gdy jej aktywność jest n razy wyższa niż aktywność próbki wzorcowej C.

B. System analizy kolonii

W tym systemie analizy hodowano komórki szpiku kostnego w półstałej pożywce w obecności próbki przeznaczonej do analizy i dokonywano pomiaru aktywności Meg-CSF, obliczając liczbę kolonii megakariocytów utworzonych przez proliferację i różnicowanie CFU-MK.

Metoda oznaczania:

(a) W przypadku zastosowania nierozdzielonych komórek szpiku kostnego szczura itp.

ml ostatecznej objętości pożywki IMDM zawierającej nierozdzielone komórki szpiku kostnego szczura, uzyskane w każdym etapie rozdziału GpIIb/IIIa⁺ CFU-MK omówionego wcześniej systemu analizy A lub komórki frakcji GpIIb/nia⁺ CFU-MK wraz z 10% FCS, 2 rnM glutaminy, 1 mM pirogronianu sodu, 50 μΜ 2-merkaptoetanolu i 0,3% agaru (AGARNOBLE firmy DIFCO) umieszczono w 35 mm plastikowym naczyniu do hodowli tkankowej i po zestaleniu w temperaturze pokojowej hodowano w 37°C w inkubatorze z CO₂. W sumie liczba komórek w jednym naczyniu została ustalona na 2-4 χ 10⁵ dla nierozdzielonych komórek szpiku kostnego, 2-5 χ 10⁴ dla komórek w fazie gradientu gęstości Percolla lub w fazie utraty adherencji oraz 0,5-2 χ 10³ dla komórek frakcji GpIIb/IIIa⁺ CFU-MK. Po 6 do 7 dniach hodowli z naczyń wyjmowano krążki agarowe i umieszczano na szklanych płytkach (76 mm x 52 mm). W celu osuszenia krążków agarowych kolejno nakładano na żel nylonową siateczkę o wielkości oczek 50 pm i bibułę filtracyjną. Osuszone szkiełka z agarem hartowano przez 5 minut w 50°C na gorącej płycie, a następnie zanurzano na 2 do 4 godzin w roztworze barwiącym acetylocholinoesterazy sporządzonym metodą Jacksona Blood, tom 42, s. 413-421,1973). Po uzyskaniu odpowiedniego zabarwienia megakariocytów szkiełka agarowe płukano wodą suszono, barwiono ponownie roztworem hematoksyliny Harrisa przez 30 sekund, płukano wodą i suszono na powietrzu. Jako kolonie megakariocytów potraktowano 3 lub więcej ściśle zgrupowanych komórek o dodatniej reakcji na acetylocholinoesterazę.

(b) W przypadku zastosowania nierozdzielonych komórek szpiku kostnego myszy Oznaczanie kolonii może być przeprowadzone w taki sam sposób jak opisana powyżej procedura (a) przy użyciu 2-4 χ 10⁵ komórek na jedno naczynie (c) W przypadku zastosowania komórek szpiku ludzkiego lub komórek krwi ludzkiego rdzenia kręgowego

179 884

Ludzkie komórki szpiku kostnego lub krwi rdzenia kręgowego mogąbyć zastosowane jako takie lub jako frakcje CFU-MK wzbogacone w opisany poniżej sposób.

Najpierw płyn szpiku kostnego lub krew rdzenia kręgowego rozdziela się w aparacie Lymphoprep (produkcji Daiichi Kagaku Co., Ltd.) i odwirowuje, odzyskując łączną frakcję leukocytów. Z otrzymanej frakcji komórek za pomocą połączonych z awidyną ogniw magnetycznych usuwa się komórki związane z biotynylowanymi monoklonalnymi przeciwciałami swoistymi dla ludzkich antygenów powierzchniowych (CD2, CD lici CD 19). Komórkami usuwanymi metodą ogniw magnetycznych sąprzede wszystkim komórki B, komórki T, makrofagi i część granulocytów. Pozostałe komórki barwi się przeciwciałem CD34 znakowanym FITC i przeciwciałem HLA-DR znakowanym PE, a następnie frakcje reagujące dodatnio na CD34 i HLA-DR usuwa się za pomocą sortownika komórek (np. ELITE produkcji firmy COULTER). We frakcji tej (nazywanej dalej frakcją„CD34⁺DR⁺ CFU-MK”) skoncentrowane sąkomórki CFU-MK. Oznaczanie kolonii komórek ludzkich może być przeprowadzane w taki sam sposób jak opisano powyżej dla komórek szpiku kostnego szczura, z wyjątkiem tego, że w jednym zbiorniczku znajduje się 3-5 χ 10³ komórek frakcji CD34⁺DR⁺ CFU-MK, a zamiast 10% FCS stosuje się mieszaninę 12,5% plazmy ludzkiej AB i 12,5% FCS. Czas trwania hodowli do wytworzenia kolonii megakariocytów wynosi 12 do 14 dni. Do wykrywania megakariocytów ludzkich przeprowadza się barwienie immunologiczne megakariocytów za pomocą fosfatazy alkalicznej z przeciwciałem fosfatazy alkalicznej przy użyciu monoklonalnych przeciwciał mysich specyficznych dla antygenu powierzchniowego megakariocytów GPIIb/IIIa (np. Teramura i in., Exp. Hematol., tom 16, s. 843-848, 1988), a następnie liczy kolonie składające się z 3 lub więcej megakariocytów.

C. System oznaczania z zastosowaniem linii komórkowej megakarioblastów ludzkich (oznaczanie M-07e)

Komórki M-07e, linia komórkowa megakarioblastów ludzkich ulega proliferacji pod wpływem GM-CSF, IL-3, SCF, IL-2 itp. (Avanzi i in. J. Celi. Physiol., tom 145, s. 458-464, 1990). Ponieważ komórki te reagują również na TPO, mogąbyć stosowane w systemie oznaczania zastępczym dla systemu oznaczania CFU-MK szczura.

Metoda oznaczania:

Komórki M-07e pozostające w obecności GM-CSF odzyskuje się, dokładnie wypłukuje, a następnie zawiesza w pożywce IMDM zawierającej 10% FCS. Uzyskaną zawiesinę komórek M-07e umieszcza się w porcjach po 10⁴ komórek w każdym z 96 zbiorniczków płytki do hodowli tkankowej i dodaje do każdego zbiorniczka próbkę wzorcową lub próbkę do oznaczania, uzupełniając objętość do 200 pl w każdym zbiorniczku. Przygotowaną w ten sposób płytkę wkłada się do inkubatora z 5% CO₂ i poddaje inkubacji przez 3 dni w temperaturze 37°C. Po 3 dniach hodowli na 4 godziny przed jej zakończeniem do każdego zbiorniczka dodaje się 1 pCi (37 KBq) ³H-tymidyny. Po zakończeniu hodowli komórki umieszcza się za pomocą zbieracza na sączku z włókna szklanego w celu wykonania pomiaru radioaktywności ³H przy użyciu cieczowego licznika scyntylacyjnego (np. Beta Platę firmy Pharmacia).

D. System oznaczania (oznaczanie z Ba/F3) z zastosowaniem linii komórek pro-B myszy

Wiadomo, że linia komórek pro-B myszy Ba/F3 ulega proliferacji pod wpływem IL3, IL4 itp. (Palacios i in. Celi, tom 41, s. 721-734). Ponieważ jej subszczepBF-TE22jest zdolny do proliferacji nie tylko pod wpływem IL3 i IL4, ale również TPO, może być stosowany w systemie oznaczania zamiennym dla systemu oznaczania z CFU-MK szczura lub oznaczania z wykorzystaniem linii komórek megakarioblastów ludzkich (oznaczanie z M-07e) zgodnie z poniższym opisem. Streszczając: komórki BF-TE33 rozwijające się w zmodyfikowanej pożywce DME Iscove'a (IMDM:GIBCO) w obecności 1 ng/ml mysiej IL-3 odzyskuje się, wymywa 3 razy za pomocą IMDM i zawiesza w pożywce IMDM, zawierającej 10% FCS. Następnie zawiesinę komórkową rozdziela się do 96 zbiorniczków płytki do hodowli tkankowej, zachowując gęstość 1 χ 10⁴ komórek na jeden zbiorniczek. Następnie każdy zbiorniczek dopełnia się roztworem wzorcowej TPO lub próbką do testowania, uzyskując ostateczną objętość 200 pl w każdym zbiorniczku. Tak przygotowaną płytkę poddaje się inkubacji przez 2 do 3 dni w inkubatorze z CO₂. Na drugi lub trzeci dzień do każdego zbiorniczka dodaje się 1 pCi (37 KBq) ³H-tymidyny i kontynu

179 884 uje hodowlę przez dalsze 4 godziny. Następnie komórki umieszcza się za pomocą zbieracza na sączku z włókna szklanego w celu dokonania pomiaru radioaktywności ³H przy użyciu cieczowego licznika scyntylacyjnego. W tym systemie oznaczania prawie wszystkie komórki hodowane w pożywkach nie wykazujących aktywności TPO umierają, a zatem nie wchłaniają ³H-tymidyny. Komórki hodowane w pożywkach wykazujących aktywność TPO ulęgają natomiast aktywnej proliferacji w stopniu zależnym od stężenia TPO i wchłaniają ³H-tymidynę. Ponadto wyniki tego oznaczania są zbieżne z wynikami oznaczeń z zastosowaniem M-07e i CFU-MK.

Dla dalszego zilustrowania niniejszego wynalazku wykonano następujące przykłady.

Przykład 1-1. Oczyszczanie TPO szczurzej z plazmy krwi szczurów z trombocytopenią indukowaną podawaniem przeciwciała płytek

Przygotowanie plazmy krwi szczurów z trombocytopenią indukowaną przez podawanie przeciwciała płytek

Jako źródło oczyszczania przygotowano TRP z 1000 szczurów zgodnie z procedurą opisaną w przedstawionym wyżej „Przykładzie Uzupełniającym” A, w systemie oznaczania komórek prekursorów megakariocytów szczura.

Oczyszczanie TPO szczura z TRP

Na wstępie przeprowadzono oczyszczanie przy użyciu TRP z około 1000 szczurów, zakładając że zawartość TPO w TRP będzie wynosić najwyżej jeden na trzy miliony i uzyskano nieco poniżej 1 pmola częściowo oczyszczanej TPO szczurzej. Mimo ogólnych trudności spróbowano przeanalizować częściowe sekwencje aminokwasów, uzyskując trzy częściowe sekwencje, lecz z niewielką dokładnością. Sekwencje te są zbieżne lub podobne do sekwencji aminokwasów inhibitora proteazy seryny (SPI) produkowanego w wątrobie. Na podstawie uzyskanych wyników nie można stwierdzić, czy TPO ma strukturę podobną do inhibitora proteazy seryny czy sekwencje te pochodzą od współwystępujących protein innych niż TPO. Przy użyciu tych niepewnych sekwencji przeprowadzono klonowanie genu TPO zbiblioteki cDNA szczura, lecz nie uzyskano potencjalnych genów kodujących TPO. Przeprowadzono dalsze intensywne badania przyjmując, że niepowodzenie wynikało z niedostatecznej czystości i zbyt małej ilości analizowanej próbki. W celu uzyskania maksymalnie oczyszczonej próbki niezbędnej do analizy aminokwasów przeprowadzono oczyszczanie metodą opisaną poniżej w przykładzie 1-2. Wbrew oczekiwaniom na podstawie wyników przykładu 1-2 stwierdzono, że zawartość TPO w TRP lub XRP (opisanej poniżej) utrzymywała się na skrajnie niskim poziomie jeden na sto milionów do jednego miliarda wszystkich protein plazmy, a zatem całkowite oczyszczenie okazało się niezmiernie trudne.

Przykład 1-2. Oczyszczanie TPO szczurzej z plazmy krwi szczurów z trombocytopenią indukowaną naświetlaniem całego organizmu promieniami X lub γ. [Przygotowanie plazmy krwi szczurów z trombocytopenią indukowaną naświetlaniem całego organizmu promieniami X lub γ],

U zdrowych szczurów rasy Wistar (w wieku 7 do 8 tygodni) wywoływano trombocytopenię przez naświetlanie całego organizmu promieniami X lub γ w dawce subletalnej (6 do 7 Gy). Czternastego dnia po naświetlaniu szczurom pobierano krew i sporządzano frakcję plazmy krwi (nazywanej dalej „XRP”) w taki sam sposób jak opisano dla sporządzania TRP.

W tym przypadku jako źródło oczyszczania zastosowano XRP (około 8 1) uzyskaną z łącznej liczby około 1000 szczurów.

Oczyszczanie TPO szczurzej z XRP

Próbka plazmy krwi z około 1000 szczurów była zbyt duża do zastosowania naraz, ponieważ zawartość sumy protein sięgała 493,000 mg. W związku z tym próbkę plazmy krwi w przedstawionych poniżej etapach oczyszczania (1) do (4) podzielono na 11 serii, z których każda pochodziła od około 100 szczurów. W dodatkowych etapach oczyszczania (5) do (7) próbkę podzielono na 6 porcji. W trakcie i po etapie (8) oczyszczania zastosowano wstępnie oczyszczoną próbkę z całkowitego osocza krwi około 1100 szczurów. Poniżej opisano typowy przykład każdego etapu oczyszczania w przypadku serii (XW9) i porcji (Χ.Β6).

We wszystkich etapach oczyszczania badano aktywność szczurzej TPO przy użyciu systemu oznaczania z zastosowaniem CFU-MK opisanego w „Przykładzie Uzupełniającym”. Jeżeli

179 884 nie podano inaczej, wszystkie etapy oczyszczania były przeprowadzane w temperaturze 4°C z wyjątkiem chromatografii z odwróconymi fazami oraz chromatografii żelowej na Superdexie 7.5 pg w obecności związku powierzchniowo czynnego, które odbywały się w temperaturze pokojowej. Oznaczanie protein przeprowadzano przy pomocy analizy wiązania barwnika Coomassie (system odczynników produkcji PIERCE, numer katalogowy 23236Χ) lub metodą z użyciem kwasu bicynchoninowego (system odczynników produkcji PIERCE, nr katalogowy 23225).

Schemat oczyszczania pokazano w tabeli 1.

Tabela 1

Oczyszczanie TPO plazmy szczura

Etap	Suma protein (mg)	Aktywność względna	Aktywność całkowita	Przywrócenie aktywności (%)
	plazma całkowita	493000	-	-	-
plazma traktowana wapniem/G25	480300	2	864600	100
< wymiana jonowa >	Q-Sepharose FF	314400	9	704000	313
< lektynapard $E >	WGA-Agarose	15030	132	1987000	230
< barwnik triazynowy >	TSK-gel AF-Blue 650MH	4236	905	3834000	443
< hydrofobia >	Phenyl-Sepharose 6 FF/LS	2762	847	2339000	271
< chromatogr. żelowa >	S-200HR F3 (TPO małocząsteczk.)	51	20000	1020000	118
S-200HR F2 (TPO wielkocząsteczk.)	262	7838	2055000	238

TPO małocząsteczkowa (z S-200HR F3)

Etap	Suma protein (mg)	Aktywność względna	Aktywność całkowita	Przywrócenie aktywności (%)
< chromatograf, żelowa >	S-200HR F3 (TPO małocząst.)	50.3300	20000	1007000	116
< faza odwrócona >	YMC Protein-RP prep	2.8540	130000	371000	43
< faza odwrócona >	YMC CN-AP	0.3730	800000	298400	35
< faza odwrócona >	Capcell Pak Cl	0.0396	4890000	193600	22
< elektroforeza >	15% SDStPAGE (w warunkach nieredukcyjnych)	0.0017	149000000	2503000	29

TPO wielkocząsteczkowa (z S-200HR F2)

Etap	Suma protein (mg)	Aktywność względna	Aktywność całkowita	Przywrócenie aktywności (%)
< chromatogr. żelowa >	S-200HR F2 (TPO wielkocząst.)	257.0000	7840	2015000	233
<faza odwrócona >	YMC Protein-RP prep	11.4000	227000	2588000	300
< chromatogr. żelowa >	Supradex 75pg/CHAPS	1.1660	1750000	2041000	236
<faza odwrócona >	Capcell Pak C1	0.0630	20000000	1260000	146
< elektroforeza >	15% SDS-PAGE (w warunkach nieredukcyjnych)	0.0030	330000000	990000	117

179 884

1) Traktowanie plazmy krwi szczura chlorkiem wapniowym, odwirowywanie i traktowanie inhibitorem proteazy

W przypadku serii nr XW9

XRP (742 ml; stężenie protein, 54,8 mg/ml; suma protein, 40,686 mg), w ilości odpowiadającej około 100 szczurom, przechowywaną w temperaturze -80°C, rozmrażano i rozdzielano do propylenowych pojemników wirówki (firmy Nalgene). Do każdego naczynia dodawano sproszkowany chlorek wapniowy, do uzyskania ostatecznego stężenie 100 mM. Po inkubacji przez noc w temperaturze 4°C uzyskaną mieszaninę odwirowywano prze 60 minut z prędkością 8,000 obrotów na minutę. Do otrzymanego przedsączu, wykazującego aktywność TPO (742 ml; stężenie protein, 54,9 mg/ml; suma protein 40,740 mg) dodawano inhibitor proteazy p-APMSF (fluorochlorowodorek (p-aminodifenylo)metanosulfonylowy, produkowany przez Wako Pure Chemical Industries, Ltd., nr katalogowy 010-10393) do uzyskania ostatecznego stężenia 1 mM. Otrzymane próbki używano w opisanym poniżej etapie wymiany buforowej w kolumnie Sephadex Gt25.

Całąilość XRP uzyskanąz około 1100 szczurów (całkowita objętość 8,184 ml; suma protein 493,000 mg) traktowano chlorkiem wapniowym i p-APMSF po podzieleniu na 11 serii, z których każdą opowiadającą około 100 szczurom, traktowano osobno. Uzyskane 11 próbek poddawano oddzielnie procesowi w kolumnie Sephadex G-25.

2) „Wymiana bufora” na Sephadexie G-25 w przypadku serii nr XW9

Ciecz sklarowaną nad osadem po dodaniu wapnia w etapie (1) (742 ml; stężenie protein, 54,9 mg/ml; suma protein, 40,740 mg) wlewano z prędkością 40 do 70 ml/min do kolumny Sephadex G-25 (firmy Pharmacia Biotech, nr katalogowy 17-0033-03; średnica 11.3 sm; wysokość złoża, 47 cm), którą uprzednio zrównoważono przy użyciu 20 mM Tris-HCL, pH 8. Wymywanie przeprowadzono przy pomocy tego samego bufora. Przed elucjąprotein oddzielono porcję 1,300 ml eluatu. Po stwierdzeniu absorpcji UV w eluatach, frakcje przetrzymywano dopóki przewodnictwo elektryczne nie osiągnęło 500 pS/cm, odzyskując przy tym frakcję proteinową o aktywności TPO wymienioną przez 20 Mm Tris-HCl, pH 8 (1,377 ml; stężenie protein 27,56 mg/ml; suma proteina 37,882 mg; wydajność protein 93%). Względna aktywność TPO we frakcji wynosiła 2.3.

W wyniku procesu w kolumnie Sephasex G-25, któremu poddano wszystkie serie próbek, uzyskano w sumie 21,117 ml frakcji o aktywności TPO w kolumnie Sephadex G-25 (suma protein 480,300 mg: średnia aktywność względna 2; całkowita aktywność 864,600).

(3) <Chromatografia silnie anionowymienna> na Q-Sepharozie FF w przypadku serii nr XW9

Frakcję o aktywności TPO uzyskaną w powyższym etapie (2) przez traktowanie Sepharozą G-25 (1,377 ml; stężenie protein 27.5 mg/ml; suma protein 37,841 mg; aktywność względna 2.3) umieszczano w Q-Sepharozie FF (firmy Pharmacia Biotech, nr katalogowy 17-0510-01; średnica, 5 cm, wysokość złoża, 27 cm) z prędkością przepływu 40 ml/min, wymywano 20 mM Tris-HCl (pH 8) i zbierano frakcję FI, która przeszła przez kolumnę (3,949 ml; stężenie protein 0,98 mg/ml; suma protein 3,870 mg; aktywność względna 0).

Następnie zmieniano bufor na 20 mM Tris-HCl (pH 8) o zawartości 175 mM NaCl w celu elucji frakcji F2 o aktywności TPO (4,375 ml; stężenie protein, 5,36 mg/ml).

Wreszcie przy użyciu 20 mM Tris-HCl (pH 8) o zawartości 1,000 mM NaCl wymywano frakcję F3 (1,221 ml; stężenie protein 3.9 mg/ml; suma protein 4,789 mg; aktywność względna 3.8). Suma protein frakcji F2 o aktywności TPO wynosiła 23,440 mg, a wydajność protein frakcji F2 w tym etapie stanowiła 61,9%. Ponadto względna aktywność TPO wzrosła do 6,8.

W wyniku poddania wszystkich próbek frakcji o aktywności TPO z kolumny Sephadex G-25 działaniu Q-Sepharozy FF uzyskano łącznie 35,842 ml frakcji F2 o aktywności TPO na Q-Sepharozie FF (suma protein 314,384 mg; średnia aktywność względna 9; aktywność całkowita 2,704,000).

(4) < Chromatografia z powinowactwem lektyny> na agarozie z aglutyniny kiełków pszenicznych (WGA-Agarose) w przypadku serii nr XW9

Frakcję F2 o aktywności TPO uzyskaną w powyższym etapie (3) na Q-Sepharozie FF podzielono na 3 części i umieszczono w WGA-Agarozie (firmy Honen Corp., nr katalogowy

179 884

800273; średnica, 5 cm; wysokość złoża 22,5 cm) z prędkością przepływu 5 ml/min, a następnie wymywano izotonicznym buforem fosforanowym według Dulbecco (DPBS). Zebrano frakcję FI, która przechodziła przez kolumnę (9,36 ml; stężenie proteinę, 2,30 mg/ml; suma protein, 21,407 mg; aktywność względna, 6.9).

Następnie bufor wymieniano na bufor 20 mM fosforanu sodowego (pH 7.2), zawierający 0.2 M N-acetylo-D-glukozaminę (GlcNAc, firmy Nacalai tesque, nr katalogowy 005-20), 150 mM NaCl i 0,02% azydku sodowego, uzyskane eluaty zbierano i stężano za pomocą urządzenia do ultrafiltracji (Omega Ultrasette, nominalny spadek masy cząsteczkowej 8,000, produkcji firmy Filtron), uzyskując frakcję F2 o aktywności TPO adsorbującąWGA-Agarozę (2,993 ml; stężenie protein, 0,376 mg/ml).

Suma protein we frakcji F2 o aktywności TPO wynosiła 1,125 mg, wydajność protein z frakcji F2 w tym etapie stanowiła 4,8%. Ponadto względna aktywność TPO wzrosła do 1Ό1. Uzyskaną frakcję F2 przechowywano w temperaturze -80°C.

W wyniku poddania wszystkich serii frakcji F2 o aktywności TPO uzyskanych na Q-Sepharozie działaniu WGA-Agarozy uzyskano w sumie 33,094 ml frakcji F2 o aktywności TPO na WGA-Agarozie (suma protein, 15,030 mg; średnia aktywność względna, 132; aktywność całkowita, 1,987,000).

(5) <Chromatografia z powinowactwem do barwnika triazynowego> na żelu TSK-gel AF-BLUE 650 MH w przypadku partii nr ΧΒ6

Adsorbująca WGA-Agarozę frakcja o aktywności TPO z serii nr XW8 oraz absorbująca WGA-Agarozę frakcja F2 o aktywności TPO z serii nr XW9, uzyskane w powyższym etapie (4) z XRP w ilości odpowiadającej 215 szczurom, zostały połączone w partię nr ΧΒ6 (5,947 ml, stężenie protein, 0,388 mg/ml; suma protein, 2,319 mg; aktywność względna, 150).

Porcję 5,974 ml połączonej próbki mieszano z 0,85 molami NaCl na 1,000 ml ( w sumie 296,76) w celu uzyskania 6,132 ml roztworu, którego ostateczne stężenie wynosiło 0,822 M. Uzyskany roztwór wlewano z prędkością 7 ml/min do kolumny TSK-gel AF-BLUE 650 MH (TOSOH CORP., nr katalogowy 08705; średnica, 5 cm; wysokość złoża, 23 cm), którą uprzednio zrównoważono 20 mM bufora fosforanu sodu (pH 7.2) o zawartości 1 M NaCl.

Po wypełnieniu kolumny proteiny wymywano przy użyciu 20 mM bufora fosforanu sodu (pH 7.2) o zawartości 1M NaCl z prędkością 10 ml/min. Otrzymane eluaty zbierano i zagęszczano przy pomocy urządzenia do ultrafiltracji (Omega Ultrasette, nominalna utrata masy cząsteczkowej 8,000), uzyskując przechodzącą przez kolumnę frakcję FI (543 ml; stężenie protein 2.05 mg/ml; suma protein 1,112 mg, aktywność względna 31).

Następnie bufor elucyjny wymieniono na 2 M NaSCN w celu wyeluowania frakcji F2 absorbującej TSK-gel AF-BLUE 650 MH (1,427 ml; stężenie protein, 0,447 mg/ml).

Suma protein we frakcji F2 o aktywności TPO wynosiła 638 mg, a wybajność protein z F2 w tym etapie stanowiła 27,5%. Ponabto względna aktywność TPO wzrosła do 1,500.

W wyniku naniesienia wszystkich partii frakcji F2 o aktywności TPO adsorbujących WGA-Agarozę na żel TSK-gel AF-BLUE 650 MH uzyskano w sumie 10,655 ml frakcji F2 o aktywności TPO na żelu TSK-gel AF-BLUE 650 MH (suma protein 4,236 mg; średnia aktywność względna 905, aktywność całkowita 3,834,000).

(6) < Chromatografia interakcji hydrofobowe j> na Fenylosefarozie 6FF/LS w przypadku partii nr ΧΒ6

Porcję 1,424 ml frakcji F2 o aktywności TPO na żelu TSK-gel AF-BLUE 650 MH (1,424 ml; stężenie protein 0,447 mg/ml; sumaprotein638mg; aktywność względna 1,500) mieszano z 1,5 mola sproszkowanego siarczanu amonu na 1,000 ml (w sumie 282,2 g) w celu uzyskania 1,581 ml roztworu o ostatecznym stężeniu siarczanu amonu 1,35 M.

Otrzymany roztwór wprowadzano z prędkością 7 ml/min do kolumny Phenyl Sepharose 6 FF (Low Sub) (Pharmacia Biotech, nr katalogowy 17-0965-05; średnica, 5 cm; wysokość złoża, 10 cm), którą uprzednio zrównoważono buforem 50 mM fosforanu sodowego (pH 7.2) zawierającego 1.5 M siarczanu amonu. Po zakończeniu wypełniania kolumny przeprowadzono eluację z prędkością 10 ml/min przy użyciu bufora 36 mM fosforanu sodowego o zawartości

179 884

0.8 M siarczanu amonu. Uzyskane elusty (około 3.160 ml) zbierano i zagęszczano przy użyciu urządzenia do ultrafiltracji (Omega Ultrasette, nominalna strata masy cząsteczkowej 8,000), uzyskując frakcję FI (485 ml; stężenie protein 0.194 mg/ml; suma protein 94.2 mg; aktywność względna 0).

Następnie bufor eluacyjny wymieniano na bufor 20 mM fosforany sodu (pH 7.2) w celu wyeluowania frakcji F2 o aktywności TPO (około 3,500 ml). Uzyskaną frakcje zagęszczano przy użyciu urządzenia do ultrafiltracji (Omega Ultrasette, nominalny spadek masy cząsteczkowej 8,000) i pobierano próbkę do analizy. W tej fazie stężenie protein i suma protein frakcji F2 o aktywności TPO (220 ml) wynosiły odpowiednio 1.45 mg/ml i 319 mg, a wydajność protein z F2 w tym etapie stanowiła 50,0%. Względna aktywność TPO wynosiła 1,230.

W wyniku naniesienia wszystkich partii frakcji F2 o aktywności TPO uzyskanych na żelu TSK-gel AF-BLUE 650 MH na Fenylosefarozę 6 FF/LS otrzymano w sumie 1,966 ml frakcji F2 o aktywności TPO na Fenylosefarozie 6 FF/LS (suma protein, 2,762 mg; średnia aktywność względna, 847; aktywność całkowita 2,339,000).

(7)<Chromatografiażelowa>na Sephacrylu S-200 HRwprzypadkupartii nrΧΒ6 (por. fig. 1).

Frakcję F2 o aktywności TPO na Fenylosefarozie 6 FF//LS (217 ml; stężenie protein, 1,45 mg/ml; suma protein, 315 mg; aktywność względna, 1,230) mieszano z 144,8 ml roztworu 5 M NaCl w celu uzyskania 362 roztworu o ostatecznym stężeniu 2 M NaCl, uzyskany roztwór stężano do około 50 ml przy użyciu urządzenia do ultrafiltracji z membraną YM3 (76 m średnicy, produkcji Amicon Corp.).

Do tego dodawano taką samą objętość (50 ml) 8 M mocznika, otrzymując około 100 ml roztworu o ostatecznym stężenia 1 M Na Cl i 4 M mocznika. Roztwór stężono do około 80 ml, wykonano próbkę 88.78 ml i wprowadzono do kolumny Sephacryl S-200 HR (firmy Pharmacia Biotech, nr katalogowy 17-0584-01; 7,5 cm średnicy i 100 cm wysokości złoża).

Następnie przeprowadzono eluację przy pomocy DPBS z prędkością 3 ml/min a eluaty o objętości pustek poniżej 1,200 ml zbierano w porcjach 45 ml w 60 pojemnikach polipropylenowych. Przeprowadzono analizę co drugiego pojemnika, a resztę przechowywano w temperaturze -85°C do zakończenia procesu na Sephacrylu S-200 HR dla wszystkich próbek uzyskanych z 1100 szczurów. Na podstawie wyników analizy frakcje z porcji nr ΧΒ6 pogrupowano w poniższy sposób:

(FI) pojemniki nr 1 do 15 (frakcje wokół objętości pustek; masa cząsteczkowa 94,000 i więcej (F2) pojemniki nr 16 do 26 (masa cząsteczkowa 94,000 do 33,000) (F3) pojemniki nr 27 do 44 (masa cząsteczkowa 33,000 do 3,000) (F4) pojemniki nr 45 do 55 (masa cząsteczkowa, 3,000 lub mniej)

W ten sposób wszystkie partie frakcji F2 o aktywności TPO uzyskane na Fenylosefarozie 6 FF/LS nanoszono osobno na Sephacryl S-200 HR, analizowano i przechowywano w -85°C. Po poddaniu wszystkich partii działaniu S-200 HR i bezpośrednio przed następującym procesem chromatografii z odwróconymi fazami (YMC-Pack PROTEIN-RP) przechowywano próbki rozmnażano i stężano za pomocą urządzenia do ultrafiltracji z membraną YM 3 (76 mm średnicy,, produkcja Amicon Corp.) w celu uzyskania kolejnych dwóch próbek. Stężona próbka frakcji F2 o aktywności TPO uzyskana na Sephacrylu S-200 HR jest nazywana dalej „wielkocząsteczkową próbką TPO F2”, natomiast próbka frakcji F3 „małocząsteczkowąpróbką TPO-F3”.

Wielkocząsteczkowa próbka TPO F2 i małocząsteczkowąpróbka TPO F3 stanowią frakcje zbierane dowolnie z różnych obszarów elucji w chromatografii żelowej i określenie „wielkocząsteczkowa” i „małocząsteczkową” nie musi oznaczać rzeczywistej masy cząsteczkowej.

wielocząsteczkowa próbka małocząsteczkową próbka

TPO F2

TPO F3 masa cząsteczek, objętość całkow. objętość całkow.

94,000 - 33,000

3,420 ml

293 ml

33,000 - 3,000

6,480 ml

280 ml (po stężeniu) suma protein

262 mg

51,3 mg

179 884 średnia aktywność względna 7,838 aktywność całkowita 2,055,000

20,000

1,020,000

Małocząsteczkowąpróbkę TPO F3 i wielkocząsteczkowąpróbkę TPO F2 poddawano osobno kolejno etapom oczyszczania.

Oczyszczanie małocząsteczkowej próbki TPO F3 opisano w kolejnych etapach (8) do (11).

(8) < Chromatografia z odwróconymi fazami > na podłożu YMC-Pack PROTEIN-RP

Małocząsteczkowąpróbkę TPO F3 (suma protein, 50.3 mg; stężenie protein, 0.184 mg/ml; aktywność względna, 20,000; aktywność całkowita, 1,007,000; objętość całkowita, 274 ml) uzyskanąw powyższym etapie (7) mieszano z rozpuszczalnikiem A (0.025% kwasu trifluorooctowego (TFA) i rozpuszczalnikiem Β (1-propanol zawierający 0.025% TFA) w celu uzyskania roztworu o całkowitej objętości 508.63 ml i ostatecznym stężeniu propanolu, TFA i protein odpowiednio około 20,0.012% i 0.0989 mg/ml. Materiały nierozpuszczalne powstałe w trakcie sporządzania roztworu rozdzielano przez odwirowanie, a uzyskaną ciecz sklarowaną nad osadem podzielono na dwie porcje 254.3 ml (25.2 mg proteiny) i wprowadzono z prędkością 2 ml/min do kolumny z wypełnieniem YMC-Pack PROTEIN-RP (firmy YMC, nr katalogowy A-PRRP-33-15; średnica 3 cm, wysokość złoża 7,5 cm), która uprzednio zrównoważono przy pomocy 30% B. Osad powstały przez odwirowanie rozpuszczano w 20 ml 20 mM octanu sodu (pH 5.5) zawierający 5 mM CHAPS (sulfonian 3-[3-cholamidopropyl)dimetyl-ammonio]-l-propanowy, produkcji Dojindo Laboratories, nr katalogowy 75612-03-3) i również wprowadzano do kolumny.

Po umieszczeniu próbki w kolumnie przeprowadzono przez nią około 50 ml rozpuszczalnika (rozpuszczalniki A:B = 3:1) w celu uzyskania frakcji przepływowej. Następnie rozpoczęto program rowijania (120 min linearnego gradientu z 30% B do 45% B), a eluaty zbierano w 36 polipropylenowych probówkach w 10 ml porcjach. Proces ten powtórzono dla pozostałych próbek używając tych samych naczyń. W sumie uzyskano 36 probówek po 20 ml eluatu. Frakcję przepływową zagęszczano bezpośrednio do 20 ml przy użyciu urządzenia do ultrafiltracji z membraną YM 3 (76 mm średnicy, produkcji Amicon Corp.).

0.1 ml z każdej porcji frakcji przepływowej i 20 ml frakcji z probówek nr 1 do 36 mieszano z 20 μΐ 5% BSA, suszono przez odparowywanie, rozpuszczono w 0.25 ml pożywki hodowli testowej IMDM, a następnie oznaczano frakcje o aktywności TPO. Aktywność TPO stwierdzono we frakcji z probówek nr 17 do 27 (stężenie propanolu w zakresie 36.0 do 43.0%), które połączono i zastosowano jako frakcję F2 o aktywności TPO na podłożu YMCPack PROTEIN-RP, pochodzącą z małocząsteczkowej próbki TPO F3. Frakcję te przechowywano w temperaturze -85°C do czasu zastosowania w następnym etapie na podłożu YMC-Pack CN-AP.

Frakcja F2 o aktywności TPO na podłożu YMC-Pack PROTEIN-RP uzyskana z małocząsteczkowej próbki TPO F3 objętość całkowita 220 ml stężenie protein 0.00130 mg/ml suma protein 2.85 mg aktywność względna 130.000 aktywność całkowita 371,000 (9) < Chromatografia z odwróconymi fazami > na podłożu YMC-Pack CN-AP

Porcję 214,9 ml frakcji F2 o aktywności TPO na podłożu YMC-Pack PROTEIN-RP, pochodzącej z niskocząsteczkowej próbki TPO F3 (suma protein, 2.79 mg; stężenie protein, 0.0130 mg/ml; aktywność względna, 130,000; aktywność całkowita, 36,300) uzyskanej w powyższym etapie (8) mieszano z 0.6 ml 50% glicerolu i zagęszczano do 1.8 ml. Objętość koncentratu uzupełniano ostatecznie do 5 ml zawierających 20% lub mniej propanolu oraz około 6% glicerolu.

179 884

Koncentrat podzielono na 5 porcji w celu zastosowania ich w operacji kolumnowej (0.555 mg proteiny i 1 ml objętości na każdą operację. Każdąz tak podzielonych próbek dostarczano z prędkością 0.6 ml/min do kolumny z wypełnieniem YMC-Pack CN-AP (firmy YMC, nr katalogowy AP-513; 6 mm średnicy i 250 mm wysokości złoża), którą uprzednio zrównoważono z 15% B, stosując 0.1% TFAjako rozpuszczalnik A i 0.05% 1-propanolu zawierającego TFAjako rozpuszczalnik B. W rezultacie stężenie propanolu wzrosło z 15% B do 25% B, po czym przeprowadzono przez 65 min liniowy gradient z 25% B do 50% B. Po zakończeniu ostatniej (piątej) operacji 1 ml roztworu o takim samym składzie z wyjątkiem protein wprowadzano do kolumny i rozwijano w ten sam sposób w celu odzyskania aktywności TPO pozostałej w kolumnie. Ponieważ do zbierania eluatów z 6 operacji zastosowano takie same probówki, uzyskano w sumie 44 probówki o zawartości 7.2 ml eluatu każda.

Porcje 30 μΐ każdej z uzyskanych w ten sposób frakcji (1/240 każdej frakcji) mieszano z 20 pl 5% BSA, suszono przez odparowywanie, rozpuszczano w 0.24 ml pożywki hodowli testowej IMDM, a następnie oznaczano frakcje o aktywności TPO. W rezultacie silna aktywność TPO stwierdzono we frakcjach z probówek nr 28 do 33 (stężenie propanolu w zakresie 37.0 do 42.0%), które połączono i zastosowano jako frakcję o głównej aktywności TPO na podłożu YMC-Pack CN-AP, pochodzącą z małocząsteczkowej próbki TPO F3.

Frakcja FA o aktywności TPO na podłożu YMC-Pack CN-AP pochodząca z małocząsteczkowej próbki TPO F3 objętość całkowita stężenie protein suma protein aktywność względna aktywność całkowita

43.20 ml

0.00863 mg/ml 0.373 mg 800,000 298,400 (10) <Końcowa chromatografia z odwróconymi fazami> na podłożu Capcell Pack C1 3 00

Porcję 43.12 ml frakcji FA o aktywności TPO, pochodzącej z małocząsteczkowej próbki TPO F3 (suma protein, 0.372 mg; stężenie protein, 0.00863 mg/ml; aktywność względna, 800,000; aktywność całkowita, 297,500), uzyskanej w powyższym etapie (9) mieszano z 0.2 ml 50% glicerolu i zagęszczano do uzyskania 0.1 ml roztworu glicerolu.

Roztwór ten mieszano z 2 ml roztworu rozpuszczalnika A (0.1% TFA): rozpuszczalnika B (1-propanol zawierający 0.05% TFA) = 85:15 (15% B) w celu uzyskania 2.1 ml próbki zawierającej około 14% propanolu, około 4,8% glicerolu i 0.177 mg/ml protein. Sporządzoną w ten sposób próbkę wprowadzano do kolumny z wypełnieniem Capcell Pak Cl 300A (firmy Shiseido Co., Ltd., nr katalogowy Cl TYPE:SG300A; 4.6 mm średnicy i 250 mm wysokości złoża), którą uprzednio zrównoważono z 15% B i rozwijano przez 65 minut liniowego gradientu z 27% B do 38% B prędkości przepływu 0.4 ml/min. Eluaty zebrano do 72 polipropylenowych probówek w porcjach po 0.6 ml.

Porcję 3 pl każdej z otrzymanych frakcji (1/200 każdej frakcji) mieszano z 20 μΐ 5% BSA, środowisko wymieniano na 225 pl pożywki hodowli testowej IMDM i analizowano 7 5 razy rozcieńczoną frakcję.

Porcję 1 pl każdej frakcji (1/600) frakcji podwielokrotniono w celu poddania elektroforezie, suszono przez odparowywanie i w temperaturze 95°C traktowano przez 5 minut 10 pl nieredukującego bufora próbki dla SDS-PAGE. Przygotowaną w ten sposób próbkę poddawano SDS-PAGE przy użyciu 15-25% żelu SDS-polialaylamid precast (firmy Daiichi Pure Chemicals Co., Ltd), a następnie barwiono zestawem barwników srebrnych 2D-Silver Stain II „DAIICHI” (firmy Daiichi Pure Chemicals Co., Ltd., nr katalogowy 167997; nazywanych dalej „zestawem barwników srebrnych”). Jako markery masy cząsteczkowej zastosowano {DAIICHI}-III Low

179 884

Molecular Weight Markers (firmy Daiichi Pure Chemicals Co., Ltd., nr katalogowy 181061; nazywane dalej „DPCIII”.

W wyniku powyższej analizy stwierdzonono znaczącą aktywność TPO we frakcjach z probówek nr 35 do 43 (stężenie propanolu w zakresie 30,0 do 32.5%). Zostały one połączone z frakcjami z probówek nr 36 do 42 (stężenie propanolu 30.5 do 32.0%) i zastosowane jako główna frakcja FA o aktywności TPO. Wyniki pokazano na fig. 2.

Porównując zawartość protein określoną na podstawie chromatogramu z wynikami analizy, stwierdzono że uzyskana frakcja zawiera 39,6 pg sumy protein, stężenie protein wynosi 9.4 pg/ml, aktywność względna 4,890,000 a aktywność całkowita 193,600. Badanie wzorców SDS-PAGE frakcji o aktywności TPO z probówek nr 36 do 42 wykazało obecność pasma, którego gęstość zabarwienia odpowiadała sile aktywności. Ponadto stwierdzono, że masa cząsteczkowa tego niezredukowanego pasma wynosiła 17,000 do 19,000, porównując z proteinami o wzorcowej masie cząsteczkowej na tym samym żelu, które zostały zredukowane, co świadczy, że pasmo to stanowi prawdopodobnie TPO.

(11) Ekstrakcja protein o aktywności TPO zapomocąelektroforezy nażelu< 15% SDS-PAGE> 4,200 μΐ frakcji FA o aktywności TPO, pochodzącej z małocząsteczkowej próbki TPO F3 (suma protein, 39,6 pg; stężenie protein, 9,4 pg/ml; aktywność względna, 4,890,000; suma aktywności 193,600), uzyskanej w powyższym etapie (10), 5,5 pl (1/764 frakcji) do użycia w ekstrakcji aktywnych protein oraz 2,5 pl (1/1680 frakcji) do użycia w barwieniu srebrem przeniesiono do odpowiednich probówek, suszono przez odparowanie, poddano reakcji z 10 pl nieredukującego bufora próbki dla SDS-PAGE w temperaturze 37°C przez jedną godzinę, a następnie pozostawiono w temperaturze pokojowej na 18 godzin, kiedy dokonywała się reakcja z SDS.

Uprzednio zabarwiony Low Rangę Marker (firmy Bio-Rad Laboratories, Inc., 161 -0305) i opisany wcześniej DPCIII zostały użyte jako markery masy cząsteczkowej. Z wykorzystaniem mikropłytkowego żelu przeprowadzono elektroforezę próbek przy użyciu 15% SDS-PAGE przy pomocy powszechnie stosowanej procedury (Laemmli, Naturę, to, 227. s. 689-685, 1970)., Po zakończeniu elektroforezy, porcje żelu przeznaczone do barwienia srebrem natychmiast odcinano nożem, umieszczano w roztworze utrwalającym i barwiono za pomocą przedstawionego wyżej zestawu barwników srebrnych.

Osobno odcięto nożem 34 płatki żelu ze wszystkich zakresów masy cząsteczkowej przeznaczonych do analizy aktywności. Każdy płatek żelu o szerokości 1.5 do 2.5 mm rozdrabniano nieco zmodyfikowaną metodą według Kobayashi (Kobayashi, M., Seikagaku (Biochemistry), tom 59, nr 9,1987, wyd. Japanese Biochemical Society). Każdy dokładnie rozdrobniony płatek żelu mieszano z 0.3 ml buforu ekstrakcyjnego (20 mM Tris-HCl, pH 8, 500 mM NaCl, 0.05% BSA) i wytrząsano przez 6 godzin w celu dokonania ekstrakcji.

Dodając do tego 500 M fosforanu potasu (pH 6.8) uzupełniono stężenie do 20 mM. Po 1 godzinie wytrząsania w temperaturze 4°C uzyskaną mieszaninę przeniesiono do urządzenia filtracyjnego Ultra Free C3GV 0.22 pm (firmy Millpore Corp., UFC3 OGV OS) i odwirowywano przy 1,000 x g (4,000 obrotów na minutę) przez 15 minut w celu usunięcia wytrąconego SDS i odzyskania sklarowanej cieczy. Filtrat przeniesiono do urządzenia do ultrafiltracji Ultra Free C3-LGC (nominalny spadek masy cząsteczkowej 10,000 firmy Millipore Corp., UFC3 LGC 00) i odwirowywano przy 3,000 x g (7,000 obrotów na minutę). Gdy objętość stężonego roztworu osiągnęła około 50 pg, dodano 300 pg buforu 20 mM fosforanu sodu (pH 7.2) i ponownie poddano ultrafiltracji.

Ultrafiltracja przy użyciu 300 pg buforu 20 mM fosforany sodu była powtarzana dwukrotnie w celu usunięcia pozostałości SDS. Następnie powtórzono podobny etap w celu wymiany na pożywkę hodowli testowej dla przygotowania próbki (300 pl), którą następnie wyjałowiono i poddano analizie aktywności TPO.

Dzięki zabarwieniu srebrem wyraźnie stwierdzono obecności trzech pasm protein, których masę cząsteczkową przy użyciu markerów masy cząsteczkowej DPCIII określono na około 17,000 do 19,000, 14,000 i 11,000

W poprzednim etapie (10) pasmo wykazujące korelację pomiędzy siłą aktywności, a gęstością zabarwienia i przypuszczalna masę cząsteczkową około 17,000 do 19,000 stwierdzono na

179 884 podstawie elektroforezy frakcji o aktywności TPO w kolumnie Capcell Pak C1. W doświadczeniu tego etapu (11) aktywności TPO stwierdzono również w paśmie o przypuszczalnej masie cząsteczkowej około 17,000 do 19,000 (por. fig. 3).

Na podstawie powyższych wyników potwierdzono, że proteina o aktywności TPO była oczyszczana w aktywnej frakcji w kolumnie Capcell Pak Cl 300 A do poziomu wykrywalnego na żelu w elektroforezie. Na podstawie gęstości zabarwienia srebrem pasma uzyskanego za pomocą 15% SDS-PAGE określono poziom potencjalnej proteiny TPO (przypuszczalna masa cząsteczkowa około 17,000 do 19,000) w całkowitej frakcji o aktywności TPO na około 1.7 pg.

Oczyszczanie wysokocząsteczkowej próbki TPO F2 opisano w kolejnych etapach (12) do (15).

(12) < Chromatografia z odwróconymi fazami > na podłożu YMC-Pack PROTEIN-RP Wielkocząsteczkową próbkę TPO F2 (suma protein 257 mg; stężenie protein, 0.894 mg/ml; aktywność względna 7,840; aktywność całkowita, 2,015,000; objętość całkowita, 287 ml), uzyskaną w powyższym etapie (7) mieszano z 95.8 ml (1/3 objętości próbki) rozpuszczalnika B (1 -propanol zawierający 0.025% TFA) w celu uzyskania roztworu o całkowitej objętości 3 83 ml oraz ostatecznym stężeniu propanolu, TFA i protein odpowiednio 25% 0.006% i 0.671 mg/ml. Do rozpuszczalnika A użyto roztwór 0.025% TFA. Substancje nierozpuszczalne powstałe podczas przygotowywania wsadowej oddzielano przez odwirowywanie, a sklarowaną ciecz podzielono na sześć porcji po 62,3 ml (42,8 mg protein) i wprowadzono z prędkością 2 ml/min do kolumny z wypełnieniem YMC-Pack PROTEIN-RP (firmy YMC, nr katalogowy A-PRRP-33-03-15, 3 cm średnicy i 7.5 cm wysokości złoża), którą uprzednio zrównoważono z 30% B. Osad powstały przez odwirowywanie rozpuszczano w 10 ml 20 mM octanu sodowego (pH 5.5) zawierającego 5 mM CHAPS i również wprowadzano do kolumny.

Po załadowaniu próbki przepuszczano przez kolumnę około 50 ml rozpuszczalnika (rozpuszczalniki A:B = 3:1) w celu uzyskania frakcji przepływowej. Następnie rozpoczęto program rozwijania (120 minut liniowego gradientu z 30% B do 45% B), a eluaty zbierano w 24 propylenowych probówkach w porcjach po 15 ml. Proces ten powtórzono dla 6 oddzielnych próbek, używając tych samych pojemników i otrzymano w sumie 24 probówki frakcyjne, z których każda zawierała 90 ml eluatu. Frakcję przepływową! frakcję z probówki nr 1 połączono i bezpośrednio zagęszczono do 90 ml stosując urządzenia do ultrafiltracji z membraną YM3 (76 mm średnicy, firmy Amicon Corp.).

Porcje 0.3 ml z frakcji przepływowej i frakcji z probówki nr 1 oraz z frakcji z probówek nr 2 do 24 mieszano z 10 μΐ 5% BSA, suszono przez odparowywanie, rozpuszczano w 0.30 ml pożywki hodowli testowej i oznaczano frakcję o aktywności TPO. Aktywność TPO stwierdzono we frakcjach z probówek 10 do 15 (zakres stężenia propanolu 34.0 do 39.5%), które połączono i zastosowano jako frakcję F2 o aktywności TPO na podłożu YMC-Pack PROTEIN-RP pochodzącą z wielkocząsteczkowej próbki TPO F2. Frakcję tę przechowywano w temperaturze -85°C do czasu jej użycia w następnym etapie na podłożu YMC Pack CN-AP.

Frakcja F2 o aktywności TPO pochodząca z wielkocząsteczkowej próbki TPO F2 objętość całkowita stężenie protein suma protein aktywność względna aktywność całkowita

540 ml

0.021 mg/ml 11.4 mg 227,000 2,588,000 (13) < Chromatografia żelowa w obecności CHAPS > na podłożu Superdex 75 pg

Porcję 538.2 ml frakcji F2 o aktywności TPO na podłożu YMC-Pack PROTEIN-RP, pochodzącej z wielkocząsteczkowej próbki TPO F2 (suma protein, 11.3 mg; stężenie protein, 0.021 mg/ml; aktywność względna, 227,000; aktywność całkowita, 2,565,000), uzyskanej w powy

179 884 ższym etapie (12) mieszano z 0.6 ml 50% glicerolu i zagęszczano przez odparowywanie. Dodano do tego 18 ml 20 mM CHAPS, następnie mieszano i poddano inkubacji przez 41 godzin w temperaturze 4°C. Pierwszą próbkę wprowadzono do kolumny z wypełnieniem HilLoad 26/60 Superdex 75 pg (firmy Pharmacia Biotech, nr katalogowy 17-1070-01; 2.6 cm średnicy i 60 cm wysokości złoża) i wymywano za pomocąDPBS o zawartości 5 mM CHAPS CHAPS z prędkością 1 ml/min. Do kolumny wprowadzono porcje 4 ml z każdej próbki (stężenie protein, 0,466 mg/ml; proteiny, 1.86 mg).

W tym przypadku operację w kolumnie Superdex 75 powtarzano trzy razy, dzieląc na sześć części całą frakcję o aktywności TPO na podłożu YMC-Pack PROTEIN-RP. Eluaty z każdej operacji zbierano w 5 ml porcjach do 45 probówek. Po zakończeniu 5 operacji kolumnowych uzyskano 45 frakcji po 30 ml eluatu.

Porcje 0.1 ml z każdej z otrzymanych frakcji mieszano z 10 μΐ 5% BSA, suszono przez odparowywanie, rozpuszczano w 0.25 ml pożywki hodowli testowej, a następnie oznaczano frakcje o aktywności TPO. Aktywność TPO stwierdzono we frakcjach z probówek nr 13 do 31 (masa cząsteczkowa od 78,000 do 3,000), które połączono i zastosowano jako frakcję F2 o aktywności TPO na Superdexie 75 pg, pochodną wielkocząsteczkowej próbki TPO F2.

Frakcja F2 o aktywności TPO na Superdexie 75 pg, pochodna wielkocząsteczkowej próbki TPO F2 objętość całkowita stężenie protein suma protein aktywność względna aktywność całkowita

540 ml

0.00216 mg/ml

1.17 mg

1,750,000

2,041,000 (14) < Chromatografia z odwróconymi fazami > na podłożu YMC-Pack CN-AP

Porcję 513.2 ml z 540 ml frakcji F2 o aktywności TPO na Superdexie 75 pg, pochodną wielkocząsteczkowej próbki TPO F2 (masa cząsteczkowa 78,000-3000) (suma protein 1.11 mg, stężenie protein 0.00216 mg/ml; aktywność względna 1,750,000; aktywność całkowita 1,943,000), uzyskanej w powyższym etapie (13) mieszano z 1/10 objętości rozpuszczalnika Β (1-propanol zawierający 0.05% TFA) i wprowadzono z prędkością 0.6 ml/min do kolumny z wypełnieniem YMC-Pack CN-AP (firmy YMC, nr katalogowy AP-513; 6 mm średnicy i 250 mm wysokości złoża), którą uprzednio zrównoważono z 15% B, używając rozpuszczalnika A (0.1% TFA) i rozpuszczalnika B. Po wprowadzeniu stężenie propanolu wzrosło z 15 B do 25% B, po czym przeprowadzono przez 65 minut liniowy gradient z 25% B do 50% B.

Przed rozpoczęciem chromatografii kolumnowej na podłożu YMC-Pack CN-AP 1/20 część całej próbki wsadowej poddawano operacji próbnej w celu zweryfikowania wielkości aktywności odzyskanej. Następnie pozostałe 19/20 podzielono na 2 próbki i dwukrotnie przeprowadzono operację. Inaczej mówiąc, operacja kolumnowa była przeprowadzana trzykrotnie. Ponieważ do zbierania eluatów z trzech operacji użyto takich samych 44 probówek poliropylenowych, uzyskano w sumie 44 probówki, z których każda zawierała 3.6 ml eluatu.

Porcję 5 μΐ każdej z otrzymanych frakcji (1/720 część każdej frakcji) mieszano z 0.25 ml pożywki testowej i oznaczano frakcje o aktywności TPO. Znacząco silna aktywność TPO stwierdzono we frakcjach z probówek 24 do 30 (stężenie propanolu 36.0 do 42.0%), które połączono i zastosowano jako główną frakcję o aktywności TPO na podłożu YMC-pack CN-AP, pochodną wielkocząsteczkowej próbki TPO F2.

179 884

Frakcja FA o aktywności TPO na podłożu YMC-Pack, pochodna wielkocząsteczkowej próbki TPO F2.

objętość całkowita stężenie protein suma protein aktywność względna aktywność całkowita

25.20 ml

0.0246 mg/ml 0.620 mg 700,000

434,000 (15) <Ostateczna chromatografia z odwróconymi fazami> na podłożu Capcell Pak C1 3 00A

Porcję 24.66 ml z 25.20 ml frakcji o aktywności TPO na podłożu YMC-Pack CN-AP, pochodnej wielkocząsteczkowej próbki TPO F2 (suma protein 0.606 mg; stężenie protein 0.0246 mg/ml; aktywność względna 700,000; aktywność całkowita 424,000), uzyskanej w powyższym etapie (14) mieszano z 0,4 ml 50% glicerolu i zagęszczano przez odparowywanie.

Uzyskano w ten sposób 2 ml zagęszczone próbki o kilkuprocentowym stężeniu propanolu, 10% stężeniu glicerolu i stężeniu protein 0.303 mg/ml. Próbkę te wprowadzono do kolumny z wypełnieniem Capcell Pak Cl 300 A (firmy Shiseido Co., Ltd., nr katalogowy Cl TYPE.SG300A; średnica 4,6 mm, wysokość złoża 250 mm), którą uprzednio zrównoważono z 15% B, używając rozpuszczalnika A (0.1% TFA) i rozpuszczalnika B (1-propanol zawierający TFA) i rozwijano w ciągu 65 minut liniowego gradientu z 27% B do 38% B z prędkością przepływu 0.4 ml/min. Eluaty zbierano w 72 probówkach polipropylenowych w porcjach 0.6 μΐ.

Porcję 0.75 μΐ każdej z uzyskanych frakcji (1/800 część każdej frakcji) mieszano z 20 μΐ 5% BSA, pożywkę wymieniano na 225 μΐ pożywki testowej IMDM i analizowaną frakcję rozcieńczoną 300 razy.

Porcję 2μ1 każdej frakcji (1/300 frakcji) pobierano w celu zastosowania do elektroforezy, suszono przez odparowywanie i przez 5 minut w temperaturze 95°C 10 μΐ poddawano działaniu nieredukującego bufora próbki dla SDS-PAGE. Traktowane w ten sposób próbki poddawano działaniu SDS-PAGE, stosując 15-25% prefabrykowanego żelu SDS-poliakrylamidowego (firmy Daiichii Pure Chemicals Co., Ltd.), a następnie barwiono przy użyciu wyżej wspomnianego zestawu barwników srebrnych. Jako markery masy cząsteczkowej zastosowano opisane wcześniej DPCIII.

W wyniku powyższej analizy stwierdzono znaczącą aktywność TPO we frakcjach z probówek nr 33 do 39 (zakres stężenia propanolu 29.5 do 31.5%). Spośród nich frakcje z probówek nr 34 do 39 (zakres stężenia propanolu 30.0 do 31.5%) połączono jako główną frakcje FA o aktywności TPO. Badanie wzorów SDS-PAGE głównej frakcji o aktywności TPO wykazało obecność pasma, którego gęstość zabarwienia odpowiadała sile aktywności, a pozorna masa cząsteczkowa wynosiła 17,000 do 19,000 w stanie nieredukcyjnym, a zatem podobnie jak w przypadku frakcji o aktywności TPO, pochodnej niskocząsteczkowej próbki TPO F3 opisanej w powyższym etapie (10).

<Przykład2> Analiza częściowych sekwencji aminokwasów oczyszczonej TPO szczura

Analizę sekwencji aminokwasów potencjalnej TPO szczura w frakcji FA o aktywności TPO w kolumnie Capcell Pak 300 A, uzyskanej w etapie oczyszczania (10) przykładu 1 przeprowadzono zgodnie z procedurą Iwamatsu (Iwamatsu i in., „Shin Kiso Seikagaku Jikken-ho (New Basic Biochemical Experiments)”, tom 4, s. 33-84, wyd. Maruzen; Iwamatsu, A., Seikagaku (Biochemistry), tom 63, s. 142-147,1992). Próbkę poddawano działaniu SDS-PAGE i za pomocą elektryczności przenosozno na membranę z dwufluorku poliwinylidenu (PVDF). Po redukcji i S-alkilacji protein na membranie PVDF przygotowaną w ten sposób proteinę rozkładano na fragmenty peptydowe przez systematyczną! stopniowąograniczającąhydrolizę enzymatyczną in situ z trzema proteazami, a uzyskane fragmenty peptydowe z każdego etapu rozkładu oddzielano i oczyszczano za pomocą chromatografii z odwróconymi fazami oraz ana

179 884 lizowano pod względem sekwencji aminokwasów za pomocą metody oznaczania sekwencji aminokwasów o znacznej dokładności. Poniżej opisano ten proces w szczegółach.

Przykład analizy potencjalnej proteiny TPO we frakcji FA o aktywności TPO na podłożu Capcell Pak Cl 300A, pochodnej małocząsteczkowej próbki TPO F3 (1) Zagęszczanie frakcji FA o aktywności TPO w kolumnie Capcell Pak Cl 300 A (probówki nr 36 do 42)

Z 4,200 μΐ frakcji FA o aktywności TPO w kolumnie Capcell Pak Cl 300A, pochodnej niskocząsteczkowej próbki TPO F3 (probówki nr 36 do 42), uzyskanej w etapie oczyszczania (10) przykładu 1 (suma protein 39.6 pg; stężenie protein 9,4 pg/ml; aktywność względna 4,890,000; suma aktywności 193,600) 4,151 pl (98,8% całej frakcji) użyto do analizy sekwencji aminokwasów. Suma protein obliczona na podstawie chromatogramu wynosiła 39,1 pg z czego około 1.6 pg stanowiła potencjalna proteina TPO barwiona srebrem po poddaniu SDS-Page o pozornej masie cząsteczkowej około 17,000 do 19,000.

Próbkę te mieszano z glicerolem i zagęszczano przez odparowywanie do uzyskania 5 pl roztworu glicerolu. Do tego dodawano nieredujący bufor dla SDS-PAGE i 1 M Tris-Hcl (pH 8) w celu ustalenia pH, z czego uzyskano około 25 pi próbki zawierającej 200 mM Tris-HCl (pH 8.0), 50 mM Tris-Hcl (pH 6.8), 1,1% SDS, 2mM EDTA, 0.02% błękitu bromofenolowego i 30% glicerolu.

Przygotowaną w ten sposób próbkę pozostawiono w temperaturze pokojowej na 14 godzin, a następnie przez 5 minut ogrzewano w 60°C w celu uzyskania właściwej reakcji z SDS bez nadmiaru ciepła.

(2) Elektroforeza

Sporządzono żele mikropłytkowe (4,0% akrylamidowy żel nawarstwiający i 15% akrylamidowy żel rozdzielający) i przeprowadzono proces SDS-PAGE w temperaturze pokojowej przez dwie godziny w prądzie stałym 12,5 mA, a następnie 17.5 mA. Jako markery masy cząsteczkowej zastosowano zabarwione wstępnie markery Low Rangę Marker (Bio-Rad, 161-0305) i DOCIIL Bezpośrednio po elektroforezie uzyskane cząsteczki protein przenoszono na membranę PVDF (patrz kolejny etap).

Cześć próbki zastosowano również w innej elektroforezie przy użyciu 15-25% poliakrylamidowego żelu prefabrykowanego (Multi Gel 15/25 firmy Daiichi Pure Chemicals Co., Ltd.nr katalogowy 211072) w warunkach nieredukcyjnych lub po redukcji próbki ditiotreitolem (DTT). Po zabarwieniu uzyskanego żelu za pomocą opisanego wcześniej zestawu barwników srebrnych potwierdzono, że pasmo protein, którym jest prawdopodobnie TPO posiada masę cząsteczkową około 19,000 w stanie redukcyjnym, a czystość potencjalnej proteiny TPO w kolumnie Caocell Pak C1 3 00A wynosiła kilka procent. Ponadto, ponieważ ruchliwość pasma była różna w warunkach nieredukcyjnych i redukcyjnych, przedmiotowa proteina zawiera prawdopodobnie przynajmniej jedno wiązanie dwusiarczkowe.

(3) Trans frer proteiny na membranę PVDF za pomocą osuszania elektrycznego i wykrywanie pasma

Przenoszenie proteiny na membranę PCDF (ProBlott, firmy Applied Biosystems; nr katalogowy 400944) przeprowadzano w ciągu 1 godziny przy prądzie stałym 160 mA (11 do 17 V) przy pomocy półsuchego aparatu transferowego (ModelKS-8460, firmy Marysol). Roztwór zawierający 0.3M Tris i 20% metanolu (pH 10.4) zastosowano jako anolit, roztwór zawierający 25 mM Tris i 20% metanolu (pH 20.4) jako roztwór membrany transferowej, a roztwór zawierający 25 mM Tris, 40 mM kwasu aminonokapronowego i 20% metanolu (pH 10.4) jako katolit.

Po zabarwieniu membrany transferowej roztworem barwiącym Ponceau S (o. 1 g Ponceau S i 1 ml kwasu octowego w 100 ml wody) stwierdzono liczne pasma, z których jedno, będące potencjalną poszukiwaną proteiną miało masę cząsteczkową około 19.000. Pasmo to odcięto do wykorzystania w kolejnym etapie tworzenia fragmentów peptydowych.

179 884 (4) Tworzenie fragmentów peptydowych, odwzorowanie peptydów i analiza sekwencji aminokwasów

W celu przeprowadzenia systematycznej fragmentacji potencjalnej proteiny TPO, którą przeniesiono i poddano S-alkilacji po redukcji na membranie PVDF, dokonano stopniowej restryktywnej hydrolizy enzymatycznej z zastosowaniem poniższych trzech proteaz.

Pierwszy rozkład: Ednopeptydaza lizylowa (Achromobacter łyticus m497-l, produkcja Wako Pure Chemical Industries, Ltd., nr katalogowy 129-02541)

Drugi rozkład: Endoproteinaza Asp-N (produkcja Boehriger-Mannheim Corp., nr katalogowy 1054 589)

Trzeci rozkład: Trypsyna TPCK (produkcja Worthington Biochemical, nr katalogowy 3740)

Fragmenty peptydowe uzyskane z każdego rozkładu enzymatycznego odzyskiwano, wprowadzano do kolumny z odwróconymi fazami Wakosil-Π 5C18 C18 (produkcji Wako Pure Chemical Industries, Ltd., 2.0 mm średnicy i 150 mm długości) i wymywano przy użyciu rozpuszczalnika A (0.05% TFA) i rozpuszczalnika B (izopropanokacetonitryl = 7:3, 0,02% TFA) podczas 30 min liniowego gradientu z 1% B do 50% B przy prędkości przepływu 0,25 ml/min w temperaturze kolumny 30°C. W ten sposób wykonano odwzorowanie peptydów (patrz fig. 4). Otrzymane fragmenty peptydów odzyskiwano i poddawano degradacji Edmana przy użyciu sekwensera aminokwasów z fazą gazową (PPSQ-2, firmy Shimadzu Corp.). Następnie każdy aminokwas odzyskany kolejno z sekwensera, którego grupa końcowa N była połączona z PTH, identyfikowano za pomocą chromatografii kolumnowej Cl 8 z odwróconymi fazami z zastosowaniem elucji izokratycznej. Wyniki podsumowano poniżej.

Sekwencje aminokwasów fragmentów peptydowych uzyskanych z pierwszego rozkładu za pomocą endopeptydazy lizylowej

Fragment Sekwencja aminokwasów

AP3 (K)XYYESZ (X jest A, S, G, M lub Q i Z jest E lub K SEQ ID NO: 184)

AP6 (K)XRAAZ (X jest E lub Q i Z jest E lub N) SEQ ID NO: 185)

AP7 (K)AGXCSG (nie zidentyfikowane w całości) (SEQ ID NO: 186)

AP8 (K)XPVPPACDPRLL (X jest I, T lub S) (SEQ ID NO: 187)

AP12 (K)DSFLADVK (SEQ ID NO: 188)

AP5 (nie zidentyfikowano)

AP20 (nie zidentyfikowano)

AP21 (nie zidentyfikowano)

AP23 (nie zidentyfikowano)

Sekwencje aminokwasów fragmentów peptydowych uzyskanych z drugiego rozkładu

przy pomocy endoproteinazy Asp-N
Fragment	sekwencja aminokwasów
ASP-1	(nie zidentyfikowano)
AP5	(nie zidentyfikowano)
ASP6	(nie zidentyfikowano)
ASP 11	(nie zidentyfikowano)

179 884

Sekwencje aminokwasów fragmentów peptydowych uzyskanych z trzeciego rozkładu przy pomocy trypsyny-TPCK

Fragment sekwencja aminokwasów

TP2 (K lub R)TLPTXAVP (SEQ ID NO; 189)

TP3 (K lub R)TLPTXAVP

W powyższych sekwencjach w nawiasach zapisano pozostałości aminokwasowe w krańcowych grupach N, które można określić na podstawie systematycznego rozkładu enzymatycznego.

(5) < Badanie homologii > uzyskanych sekwencji aminokwasów

W celu stwierdzenia, czy uzyskane sekwencje aminokwasów zawierają się w opisanej wcześniej proteiny lub czy istnieje proteina o podobnych sekwencjach, analizowano je przy użyciu programu komputerowego do analizy sekwencji Mac Vector (Kodak International Biotechnologies, Inc.). Informacje o znanych proteinach i znanych genach zaczerpnięto z bazy danych Entrez wersja 6 (National Center for Biotechnology Information, National Library of Medicine, National Institute of Health, USA, udostępniona z 15 sierpnia 1993). Poniżej podano zawarte w niej podbazy.

Baza Entrez wersja 6

NCBI GenBank, 15 sierpnia 1993 (wersja 78.0)

EMBL, 15 lipca 1993 (wersja 35.0 plus uaktualnienia)

DDBJ, 15 lipca 1993

SWISS-PROT, kwiecień 1993 (wersja 25.0)

PDB, czerwiec 1993

PRF, maj 1993 dbEST, 15 lipca 1993 (wersja 1.10)

U.S. and European Patents

Okazało się, że sekwencja (K)DSFLADVK fragmentu AP12 jest całkowicie zgodna z wewnętrzną sekwencją KDSFLADVK prekursora globuliny wiążącej kortykosteroidy u szczura (CBG) [baza danych PIR, pozycjanr A40066; Smith and Hammond; „Ratmessengerribonucleic acid levels in the liver under different physiologicał conditions.:, Mol. Endocrinol., (1989), 3, 420-426],

Dalsze szczegółowe badania wykazały, że sekwencja KQYYESE (SEQ ID NO: 193) wykazująca znaczne podobieństwo do sekwencji (K)XYYESZ (X jest A, S, G, M lub Q, a Z jest E lub K) fragmentu AP3 zawiera się w sekwencji aminokwasu w CBG szczura. W CBG szczura sekwencje odpowiadające AP12 i AP3 są ze sobą połączone, tworząc wewnętrzną sekwencję aminokwasową KDSFLADVKQYYESE (SEQ ID NO: 190).

Analiza sekwencji aminokwasów fragmentów innych niż AP12 i AP3 nie wykazała protein ani genów o dostrzegalnym podobieństwie.

<Przykład 3> Analiza właściwości biologicznych TPO pochodzącej z plazmy krwi szczurów z trombocytopenią (1) W systemie oznaczania z CFU-MK (system hodowli płynnej)

Jako typowy przykład fig. 5 pokazuje krzywą zależności reakcji od dawki w przypadku zastosowania próbki TPO częściowo oczyszczonej z plazmy szczurów z trombocytopenią (frakcja F2 o aktywności TPO z kolumny YMC Pack Protein-RP opisana w etapie oczyszczania (8) przykładu 1-2). Podczas okresowej obserwacji hodowli komórek pod mikroskopem rozpoznawano powstawanie i dojrzewanie megakariocytów, mianowicie zwiększenie rozmiarów komórek, prawdopodobnie związane ze wzrostem liczby megakariocytów. Czwartego dnia, czyli ostatniego dnia hodowli zaobserwowano szczególnie istotną zmianę stadium rozwojowego megakariocytów (słabo zauważalną trzeciego dnia). Stadium to jest nazywane stadium powstawania cytoplazmy (Leven and Yee, Blood, tom 69, s. 1046-1052, 1987) lub powstawania zaczątków płytek krwi (proplatelet) (Topp i in., Blood, tom 76, s. 912-924,1990), uważanych za

179 884 struktury pierwotne płytek krwi różnicujących się później z dojrzałych megakariocytów i ostatnie stadium różnicowania megakariocytów zaobserwowano dotychczas in vitro. Ponieważ taką zmianę morfologiczną obserwowano z dużą częstotliwością, używając wyłącznie próbki TPO, można sądzić, że jedynie ten czynnik może stymulować proliferacje i różnicowanie CFU-MK, wytwarzać dojrzałe megakariocyty i ostatecznie uwalniać płytki.

(2) W systemie oznaczania kolonii

Badanie próbki TPO częściowo oczyszczonej z plazmy krwi szczurów z trombocytopenią w systemie oznaczania kolonii z zastosowaniem nieoddzielonych komórek szpiku kostnego, komórek z każdego etapu rozdzielania/zagęszczania lub frakcji GpIIb/IIIa⁺ CFU-MKwykazało, że TPO pochodząca z plazmy szczura stymuluje powstawanie kolonii megakariocytów. W porównaniu do kolonii megakariocytów indukowanych przez inne cytokiny, np. IL-3 szczura GM-CSF myszy lub ludzka EPO, kolonie megakariocytów indukowane przez TPO charakteryzują się tym, że każda kolonia składa się z niewielkiej liczby megakariocytów, lecz każdy megakariocyt ma większe wymiary, co oznacza zaawansowaną dojrzałość. Ponadto, ponieważ TPO nie wytwarza lub wytwarza tylko nieliczne kolonie innych szczepów, wykazywaną przez TPO aktywność Meg-CSF może być uznana za swoistą dla megakariocytów. Wobec powyższych faktów jest oczywiste, że TPO posiada odmienne właściwości biologiczne niż inne cytokiny, takie jak IL-3 szczura, GM-CSF myszy i ludzka EPO i wywiera unikalne działanie Meg-CSF.

Próbka TPO częściowo oczyszczona z plazmy krwi szczurów z trombocytopenią wywierała również aktywność Meg-CSF na frakcje komórek CD34⁺, DR⁺ pochodzące z komórek ludzkiego szpiku kostnego lub komórek krwi ludzkiego rdzenia kręgowego, co wskazuje, że czynnik ten nie wykazuje specyfiki gatunkowej.

<Przykład 4 > Specyfikacja komórek produkujących TPO szczura (1) Screening narządów produkujących TPO szczura

Screening i specyfikacje narządów produkujących TPO szczura przeprowadzono w celu zapewnienia źródła mRNA do klonowania genów tPO szczura. Najpierw pobierano stopniowo od szczurów z trombocytopenią wywołaną podawaniem przeciwciała P55 szpik kostny, płuca wątrobę i śledzionę, a ich komórki (w przypadku płuc i wątroby wycinki narządów) hodowano i badano aktywność w uzyskanej z hodowli sklarowanej cieczy w systemie analizy z CFU-MK. Pierwsza próba nie dała jednak wyraźnych rezultatów. Podjęto zatem dalsząpróbę hodowli hepatocytów uzyskanych przez perfuzję kolagenazy z wątroby szczurów z trombocytopenią wywołaną podawaniem przeciwciała P55, uwzględniając doniesienie, w którym wskazuje się na związek pomiędzy wątrobą, a wytwarzaniem TPO u szczurów (Siemensma i in., J. Lab. Clin. Med., t. 86. s. 817-833,1975). Po wprowadzeniu uzyskanej z hodowli sklarowanej cieczy do kolumny WGA-Agarose, a następnie frakcjonowaniu adsorbowanej frakcji w kolumnie z odwróconymi fazami Vydac phenyl reverse phase stwierdzono w tym samym położeniu bardzo znaczące podobieństwo aktywności do aktywności TPO pochodzącej z plazmy szczura w systemie analizy w CFU-MK. Słabą lecz taką samą aktywność stwierdzono również w cieczy z hodowli hepatocytów szczurów normalnych. Wyniki te przemawiają za tym, że wątroba jest przypuszczalnie jednym z narządów wytwarzających TPO.

(2) Screening linii komórkowych wytwarzających TPO

Na podstawie powyższych wyników przeprowadzono screening linii komórkowych szczura produkujących TPO. Najpierw każdą z 20 linii komórkowych pochodzących z wątroby szczura hodowano w osobnej płynnej pożywce subkultury aż komórki osiągnęły stan prawie konfluentny, następnie każdą pożywkę wymieniano odpowiednio na taką samą z dodatkiem 5% FCS i hodowlę kontynuowano przez 3 dni. Po częściowym oczyszczeniu sklarowanej cieczy zgodnie ze sposobem postępowania opisanym powyżej jako etap (1) w celu wykrycia produkcji TPO, aktywność TPO stwierdzono wyraźnie w trzech liniach komórkowych pochodzących z linii komórkowych miąższu wątroby szczura, mianowicie w komórkach McARH8994 (ATCC, depozyt nr CRE 1602; Becker i in., „Oncodevelopmental Gene Expression”, wyd. Fishman and Sell, Academic Press, NY, s. 259-270, 1976; publikacja uzyskana z Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd), komórkach H4-II-E (ATCC, depozyt nr CRL1548, Pitot i in., Nat. Cancer Inst. Mo

179 884 nogr., tom 13. s. 229-245,1964; publikacja uzyskana z Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd)oraz komórkachHTC (Thompson i in., Proc. NatlAcad. Sci. USA, tom. 56, s. 296-303,1966; publikacja uzyskana z Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd.).

(3) Szczegółowa analiza aktywności TPO w komórkach McA-RH8994, H4-II-E i HTC

Badano szczegółowo właściwości biochemiczne i biologiczne protein o aktywności TPO wyizolowanych z tych trzech linii komórek szczura i porównywano z właściwościami TPO pochodzącej z plazmy szczura.

Komórki McA-RH8994 zawieszono w pożywce płynnej alfa-Mem(-) zawierającej 10% FCS i w ilości 10⁶ umieszczono w plastikowej kolbie do hodowli tkankowej wielkości 175 cm². Po trzech dniach hodowli w temperaturze 37°C w inkubatorze z 5% CO2 pożywkę wymieniano na pożywkę IMDM zawierającą 5% FCS i po kolejnych 3 dniach hodowli odzyskiwano sklarowaną ciecz. Komórki H4-II zawieszono w pożywce płynnej Eagle, tj. zmodyfikowanej pożywce według Dulbecco (zawartość glukozy 4.5 g/l, dalej nazywanej „DMEM”), zawierającej 10% FCS i w ilości 5 χ 10⁵ umieszczono w plastikowej kolbie do hodowli tkankowej. Po trzech dniach hodowli w temperaturze 37°C w inkubatorze z 5% CO2 pożywkę wymieniano na pożywkę IMDM zawierającą 5% FCS i po kolejnych trzech dniach hodowli odzyskiwano sklarowaną ciecz. Również komórki HTC zawieszono w pożywce płynnej DMEM, zawierającej 5% FCS i w ilości 2.5 χ 10⁵ umieszczono w plastikowej kolbie do hodowli tkankowej. Po trzech dniach hodowli w temperaturze 37°C w inkubatorze z 5% CO₂ pożywkę wymieniano na pożywkę IMDM zawierającą 5% FCS i po kolejnych trzech dniach hodowli odzyskiwano sklarowaną ciecz.

Przy użyciu dwulitrowej porcji uzyskanej sklarowanej cieczy z każdej z trzech linii komórkowych przeprowadzano częściowe oczyszczanie TPO pochodzącej z linii komórkowych według sposobu postępowania opisanego w przykładzie 1 -2 dla oszczyszczania TPO z XRP. Poniżej opisano uzyskane wyniki.

Najpierw sklarowaną ciecz z każdej pożywki zagęszczano sześć razy przy pomocy aparatu do ultrafiltracji i przy pomocy kolumny Sephadex G-25 wymieniano pożywkę na bufor 20 mM Tris-HCl. Uzyskany eluat wprowadzano do kolumny Q-Sepharose FF, kolumnę wymywano 20 mM Tris-HCl (pH 8.0), następnie adsorbowanąfrakcję wymywano 20 mM Tris-HCl (pH 8.0) o zawartości 175 mM NaCl. Otrzymaną frakcję wprowadzano do kolumny WGA-Agarose, kolumnę wymywano PBS, adsorbowanąfrakcję wymywano 20 mM fosforanu sodu (pH 7.2) o zawartości 0.2 M GlcNac i 0.15 M NaCl. Otrzymany eluat wprowadzano do kolumny z żelem TSk-gel AF-BLUE 650 MH, kolumnę wymywano 20 mM fosforanu sodu (pH 7.2) o zawartości 1 M NaCl, a następnie adsorbowanąfrakcję wymywano 2 M NaSCN. Otrzymany eluant wprowadzano do kolumny Phenyl-Sepharose 6 FF/LS, kolumnę wymywano 50 mM fosforanu sodu (pH 7.2) o zawartości 1.5 M siarczanu amonu, a następnie 0.8 M siarczanu amonu o zawartości 36 mM fosforanu sodu. Adsorbowanąfrakcję wymywano 20 mM fosforanu sodu (pH 7.2). Otrzymaną frakcję adsorpcyjną zagęszczano i frakcjonowano przy użyciu kolumny Vydac Protein C4 z odwróconymi fazami (produkcji The Separations Group, nr katalogowy 214TP51015; średnica 1 cm, wysokość złoża 15 cm). Następnie próbkę wprowadzano do kolumny C4, która uprzednio zrównoważono z 20% B, a następnie przeprowadzano elucję podczas 90 minut liniowego gradientu z 20% B do 40% B z prędkością przepływu 1 ml/min, stosując 0.1% TFA w rozpuszczalniku rozwij aj ącym A i 1 -propanol zawieraj ący 0.05% TFA w rozpuszczalniku rozwij aj ącym B. W rezultacie każda z protein o aktywności TPO pochodząca z tych linii komórkowych była wymywana przy stężeniu 1-propanolu 30 do 43%.

Wyniki pomiaru aktywności TPO w próbkach z każdego etapu oczyszczania w systemie oznaczania z CFU-MK wykazały, że aktywność TPO trzech linii komórkowych wykazuje podobne wzorce jak aktywność TPO pochodzącej z XRP (patrz przykład 1 -2). Aktywność względna, poziom aktywności itp. każdego etapu oczyszczania analizowane w systemie oznaczania z CFU-MK szczura pokazano w tabeli 2. Ponadto przy pomiarze aktywności TPO w eluatach z ostatniej kolumny z odwróconymi fazami w systemie oznaczania z CFU-KM szczura stwierdzono, że aktywność TPO trzech linii komórkowych i TPO pochodzącej z XRP znajdująsię w zakresie tego samego piku. Po przeprowadzeniu analizy kolonii frakcji o aktywności TPO z kolumny z

179 884 odwróconymi fazami przy użyciu nieadhezyjnych komórek uzyskanych w etapie pozbawiania adherencji do rozdziału i stężenia GPIIb/IIIa⁺ CFU-MK stwierdzono, że wzorce elucji aktywności Meg-CSF bardzo przypominają wzorce aktywności TPO analizowane w systemie oznaczania z CFU-MK szczura (patrz tabela 3). Ponadto, podobnie jak w przypadku TPO pochodzącej z XRP, każda z aktywności TPO z 3 linii komórkowych wytwarzała co najwyżej kilka kolonii innych szczepów komórkowych.

Każda z zebranych aktywnych frakcji z kolumny o odwróconych fazach była poddawana SDS-PAGE zgodnie ze sposobem postępowania opisanym w przykładzie 1-2. Po ekstrakcji proteiny z otrzymanego żelu i pomiarze aktywności TPO w systemie oznaczania z CFU-MK szczura, pozorna masa cząsteczkowa TPO pochodzącej z XRP, TPO pochodzącej z komórek McA-RH8994 i TPO pochodzącej z komórek Η4-Π-Ε wynosiła odpowiednio 17,000 do 22,000, 33,000 do 39,000 i 31,000 do 38,000, a TPO pochodząca z komórek HTC wykazywała pozorną masę cząsteczkową 17,000 do 22,000 oraz 28,000 do 35,000.

Wyniki te wskazują, że proteiny TPO wytwarzane przez komórki Mca-RH8994, H$-II-E i HTC sąrównoważne względem TPO pochodzącej z XRP, jeśli chodzi io ich właściwości biologiczne, natomiast ich właściwości biochemiczne nieco się różnią, jeśłi chodzi o pozorną masę cząsteczkową. Znaczącym odkryciem w przedstawionym wynalazku jest stwierdzenie, że cząsteczki proteinowe o aktywności TPO występujące we krwi mogąbyć produktem częściowego rozkładu ich specyficznego lub nieregularnego siedliska w wytwarzających je komórkach lub po wydzieleniu z wytwarzających je komórek. Świadczy to również o możliwości występowania genów TPO (mRNA i cDNA) o różnej długości.

Tabela 2

Oczyszczanie TPO z linii komórkowych szczura

Linia komórkowa	McA-RH8994	HTC	H4-II-E
etap	TP*' (mg)	RA*2	TA3	TP (mg)	RA	TA	TP (mg)	RA	TA
nadsącz	4806	8	38450	5760	5	28800	4087	5	20440
Sephadex G25	4824	16	77180	6458	12	77500	4011	5	20050
Q-Sepharose FF	1973	20	39460	3112	15	46680	1821	15	20050
WGA-Agarose	76.0	1350	102600	132.0	250	33000	80.0	90	7200
TSK-gel AF-BLUE	5.0	12500	62500	9.2	7500	69000	5.4	150	810
Phenyl-S epharose 6 FF/s	14.7	500	7350	13.1	2500	32750	11.4	170	1940
Vydac Protem C4	0.23	-	-	0.75	-	-	0.11	-	—

T suma protein; 2 aktywność względna; *3 aktywność całkowita

Tabela 3

Tworzenie kolonii megakariocytów przez TPO szczura (frakcja z odwróconymi fazami kolumny C4)

Wymywanie propanolem	kolonie XRP	kolonie McA-RH8994	kolonie HTC	kolonie H4-H-E
30.0 - 32.6%	0	33	4	18
32.6 - 34.7%	0	132	19	50
34.7 - 36.7%	67	290	291	230
36.7 - 38.8%	70	214	183	103
38.8 - 40.9%	2	15	5	28
40.9-43.0%	0	4	0	4

179 884 <Przykład 5 > Konstrukcja wektora ekspresji (pEF 18 S) dla biblioteki cDNA

W celu wykorzystania w klonowaniu i ekspresji cDNA TPO skonstruowano wektor, do którego łatwo przyłączyć fragment cDNA i który z dużą skutecznością wykazuje ekspresje klonowanego DNA. Dokładniej, wektor ekspresji pEF18S skonstruowano z wektora ekspresji pME18S, zastępując promotor SRa promotorem czynnika wydłużania la (EF la), który znany jest jako promotor wysokiej ekspresji (patrz fig. 6). Promotor czynnika wydłużania lauzyskano przez częściowe trawienie 1 pg wektora ekspresji pEF-BOS (Mizushima i in., NucleicAcidsR.es., tom 18, s. 5322,1990) enzymami restrykcyjnymi HindlHi EcoRI, poddanie produktu trawieniu elektroforezie na 2% żelu agarozowym (firmy FMC BioProducts) w celu wyizolowania fragmentu DNA długości około 1200 bp i oczyszczanie fragmentu DNA przy użyciu zestawu do oczyszczania DNA Prep-A-Gene (firmy Bio-Rad Laboratories, Inc.; zestaw stosowany w selektywnym oczyszczaniu DNA, polegającym na adsorpcji DNA przez porowate podłoże krzemionkowe, opracowany sposobem przedstawionym przez Willisa i in. w Bio Techniąues, tom 9, s. 92-99,1990). 100 ng uzyskanego w ten sposób fragmentu DNA podwiązano do 50 ng wektora ekspresji pME18S(Liu i in., Proc. Natl.Acad. Sci. USA. t.90,s. 8957-8961,1993), który wcześniej trawiono Hindlll i EcoRI. Komórki handlowego szczepu gospodarza, Competent Hinh E. coli DH5 (produkcji Toyobo Co., Ltd.; kompetentny szczep E. coli otrzymany zmodyfikowaną metodąHanahana i in., J. Mol. Biol., 1.166, s. 557-580,1983) poddawano transformacji przy pomocy skonstruowanego wektora. Transformowane komórki hodowano, a następnie wybrano losowo 12 kolonii i z każdej oczyszczano DNA plazmidu. Przez analizę wzorów trawienia tych cząsteczek DNA enzymem restrykcyjnym otrzymano w sumie 10 klonów zawierających plazmid stanowiący przedmiot badania (pEFl 8S). Następnie wybrany klon hodowano w celu otrzymania dużej ilości DNA plazmidu.

Oczyszczanie DNA plazmidu przeprowadzono według sposobu opisanego w Molekular Cloning (Sambrook i in., Gold Spring Harbor Laboratory Press, 1989). Dokładniej, klon pEF18S, uzyskany jak wyżej, hodowano przez noc w temperaturze 37°C w 50 ml pożywki LB (1% Bactotryptonu, 0,5% ekstraktu Bacto-drożdżowego, 0,5% NaCl), zawierającej 50 pg/ml ampicyliny a powstałe komórki, zebrane przez odwirowywanie, zawieszono w 4 ml roztworu TEG-lizozymu (25 mM Tris-HCl, pH 8 < 10 mM EDTA, 50 mM glukozy, 0,5% lizozymu). Dodano 8 ml 0,2 N roztworu NaOH/1% SDS, a następnie 6 ml roztworu 5M potasu/5M octanu w celu dokładnego zawieszenia komórek. Po odwirowaniu zawiesiny sklarowaną ciecz traktowano mieszaniną fenolu/chloroformu (1:1), mieszanąz tą samą ilością izopropanolu i odwirowywano. Powstałą granulkę rozpuszczano w roztworze TE (10 mM TrisHCl, pH 7,5, 1 mM EDTA) i traktowano RNazą, a następnie znów mieszaninąfenolu/chloroformu (1:1), po czym wytrącano etanolem. Otrzymaną granulkę ponownie rozpuszczano w roztworze TE, do którego kolejno dodawano NaCl i glikol polietylenowy 3000 do uzyskania ostatecznego stężenia odpowiednio 0,63 M i 7,5%. Po odwirowaniu granulkę rozpuszczano w roztworze TE i wytrącano etanolem. W ten sposób uzyskano około 300 pg DNA plazmidu. 100 pg DNA zostało całkowicie strawione przez enzymy restrykcyjne EcoRI i Notl i poddane elektroforezie na 0,8% żelu agarozowym (firmy FMC BioProducts). Odzyskane fragmenty wektora oczyszczano przy użyciu zestawu do oczyszczania DNA Prep-A-Gene (firmy Bio-Rad Laboratories, Inc.), uzyskując około 55 pg DNA plazmidu, który wykorzystano do budowy kolejnej biblioteki cDNA.

<Przykład 6 > Oczyszczanie mRNA z komórek McA-RH8994

Komórki McA, które wykazywały stosunkowo dużą aktywność w analizie, kolonii przykładu 4 wyselekcjonowano jako materiał do klonowania cDNA szczurzej TPO i poddano następującym doświadczeniom.

Przeprowadzono izolację całkowitego RNA sposobem opisanym w Molecular Cloning (Sambrook i in., Cold Spring Harbor Laboratory Press. 1989). Komórki McA-RH8994 wzrastały do konfluencji w 15 naczyniach o średnicy 90 mm. Po usunięciu płynnej pożywki, komórki w każdym naczyniu dokładnie zawieszono w 0,8 ml 5M roztworu guanidyny (5M tiocyjanianu guanidyny, 5 mM cytrynianu sodowego (pH 7,0), 0,1 M β-merkaptoetanolu, 0,5% sarkozylosiarczanu sodowego). Otrzymane w każdym naczyniu zawiesiny zbierano do jednej probówki i uzupełnia179 884 no objętość roztworem guanidyny do 20 ml. Otrzymaną mieszaninę, która wskutek rozerwania komórek nabrała lepkości, poddawano około 20 razy zabiegowi odsysania/wydzielania przy użyciu 20 ml strzykawki z igłą grubości 18G, a następnie 2 IG, dopóki mieszanina prawie całkowicie nie utraciła lepkości.

ml 5.7 M CSCL-0.1 M EDTA (pH 7.5) zastosowano jako wyściółkę poliallomerowej probówki przeznaczonej do wirnika Beckmana SW28. Około 20 ml wyżej wspomnianej mieszaniny delikatnie nanoszono na wyściółkę, aby nie zniszczyć warstw przy niemal całkowitym wypełnieniu probówki. Tak przygotowano probówkę odwirowywano przez 20 godzin przy 25000 obrotach na minutę w temperaturze 20°C. Otrzymaną granulkę dwukrotnie przemywano niewielką ilością 80% etanolu, rozpuszczano w roztworze TE, ekstrahowano mieszaniną fenolu/chloroformu (1:1), a następnie wytrącano etanolem przy użyciu 1/10 objętości 3 M octanu sodowego i 2.5 objętości etanolu.

W ten sposób z około 10⁸ komórek otrzymano około 2.5 mg całkowitego RNA.

Poli (A)⁺ RNA oczyszczano z całkowitego RNA, stosując Oligotex™ -dT 30 (Super) (produkcji Japan Synthetic Rubber/Nippon Roche: na cząstkach lateksu unieruchomione są wiązaniem kowalencyjnym cząsteczki oligo dT, poli(A)⁺ RNA oczyszcza się podobnie jak przy użyciu kolumny oligo dT, która jest przeważnie stosowania do tego celu). W rezultacie uzyskano 20 μΐ poli(A)⁺ RNA z około 500 pg całkowitego RNA.

<Przykład 7 > Sporządzanie biblioteki cDNA szczura

Podwójny łańcuch cDNA, posiadający miejsce rozpoznaniaEcoRI przy końcu 5' i miejsce rozpoznania Notl przy końcu 3' syntetyzowano z 5 pg poli (A)⁺RNA, uzyskanego w przykładzie 6, przy użyciu zestawu do syntezy cDNA Time Saver™ (firmy Pharmacia, zestaw do syntezy cDNA opartej na zmodyfikowanej metodzie Okayamy i Berga, Mol. Celi. Biol., t. 2, s. 161-170, 1982) i oraz zestawu DIRECTIONAL CLONING TOOLBOX (firmy Pharmacia, składa się z primeru 5'-AACTGGAAGAATTCGCGGCCGCAGGAA(T)₁₈-3' (SEQ ID nr 15), zawierającego sekwencję rozpoznania Notl stosowaną w systemie cDNA oraz adaptery 5'AATTCGGCACGAG-3' (SEQ ID nr 16) i 5'-CTCGTCCG-3' (SEQ ID nr 17) stosowane do przyłączenia sekwencji rozpoznania£coRI). /syntetyzowany cDNA podwiązano do 1,2 pg wektora ekspresji pEF 18S (patrz przykład 5), który uprzednio poddano trawieniu przez EcoRI i Notl i transformowano do 8.4 ml wyżej wspomnianego szczepu Competent High E. coli DH 5 (produkcji Toyobo Co., Ltd.). W rezultacie uzyskano 5.3 χ 10⁵ transformantów. , <Przykład8> Sporządzanie (klonowanie) fragmentu cDNA szczurzej TPO za pomocą PCR 530000 klonów z biblioteki McA-RH8994 cDNA utworzonej w przykładzie 7 hodowano przez noc w 50 ml pożywki LB zawierającej 50 pg/ml ampicyliny. Plazmidy Mc ARH8994 z biblioteki cDNA oczyszczano z otrzymanych komórek przez wirowanie przy użyciu kolumny Q1AGEN-tip 100 (Firmy DIAGEN, kolumna krzemionkowa anionowymienna do oczyszczania DNA). Uzyskano około 200 pg plazmidu.

/syntetyzowano dwa antysensy nukleotydowe AP8-IR i AP8-2R, które odpowiadają sekwencji aminokwasów fragmentu peptydu AP8 opisanego w przykładzie 2 i dwa sensy nukleotydowe EFla-1. i EFla-2, które odpowiadają pierwszemu intronowi ludzkiego czynnika wydłużania la wektora plazmidowego pEF-Ι 8S (patrz fig. 6) wykorzystanego do sporządzenia biblioteki cDNA. Syntezy tych primerów dokonano przy pomocy syntetyzatora 394 DNA/RNA (produkcji Applied Biosystems; syntetyzator oparty na metodzie β-cyjanoetyloamidytowej), a ich oczyszczanie przeprowadzono w kolumnie OPC do oczyszczania syntetycznego DNA (produkcji Applied Biosystems, kolumna z odwróconymi fazami z żelem krzemionkowym stosowana do oczyszczania syntetycznego DNA z grupami tritylowymi). Każdą zsyntetyzowaną i oczyszczoną cząsteczkę DNA rozpuszczano w roztworze TE do uzyskania stężenia 50 μΜ i przechowywano w temperaturze -20°Ć do czasu jej użycia. Syntetyczne oligonukleotydy użyte w kolejnym procesie syntetyzowano i oczyszczano w ten sam sposób.

Primery AP8-IR i AP8-2R sąprimerami mieszanymi, składającymi się z 17 ciągłych nukleotydów, do których inkorporowanajest dezoksyinozyna, jak to zostało opisane przez Takashi i in. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA. tom 82. s. 1931-1935, 1985)

179 884

Primery EFla-1 i EFla-2, składające się odpowiednio z 21 i 20 nukleotydów systetyzowano w oparciu o sekwencję nukleotydów pozycji 1491 do 151211513 do 1532 sekwencji genomowej opisanej przez Uetsuki i in. (J. Biol. Chem., t. 264. s. 5791-5798, 1989).

AP8: Ile Pro Val Pro Ala Cys Asp Pro Arg Leu Leu Thr Ser	(SEQlDnr 18) (SEQIDnr 19) (SEQ ID nr 20)
AP8-IR: 3'-ACG CGR GGG GCI GAI GA-5' A A AT A A T C	(SEQ ID nr 21) (SEQ ID nr 22) (SEQ ID nr 23) (SEQ ID nr 24)
AP8-2R: 3'-GGG GGG CGG ACG CTG GG-5' A A A AA T T T CCC	(SEQ ID nr 25) (SEQ ID nr 26) (SEQ ID nr 27) (SEQ ID nr 28)
EFla-1: 5'-GGATCT TGG TTC AAT CTC AAG-3' EFla-2: 5'-CCT CAG ACA GTC GTT CAA AG-3'	(SEQ ID nr 29) (SEQ ID nr 30)

Stosując 3 ug plazmidu McA-RH8994 z biblioteki cDNA jako matrycę, AP8-1R (500 pmol) i EFla-1 (100 pmol) jako primery oraz zestaw odczynników PCR GeneAmp™ z polimeraząDNA AmpliTaą™ (firmy Takara Shuzo Co., Ltd.; zestaw składa się z termo stabilnej polimerazy Taql, buforu reakcyjnego i dNTP dla PCR, przeprowadzono PCR przy użyciu systemu PCR GeneAmp™ 9600 (firmy Perkin-Elmer, cykler termiczny dla PCR) (objętość 100 μΐ; ogrzewanie w temperaturze 95°C przez 2 minuty, ogółem 35 cykli, z których każdy obejmuje denaturację w 95°C przez 1 minutę, wyżarzanie w 40°C przez 1 minutę i syntezę w 72° przez jedną minutę oraz końcową inkubację w 72°C przez 7 minut). W celu udoskonalenia selektywności tak zamplifikowanych fragmentów DNA wykonano kolejnąPCR (objętość 100 μΐ; ogrzewanie w temperaturze 95°C przez 2 minuty, ogółem 35 cykli, z których każdy obejmuje denaturację w 95°C przez 1 minutę, wyżarzanie w 45°C przez 1 minutę i syntezę w 72° przez jednąminutę oraz końcowąinkubację w 72°C przez 7 minut), stosując roztwór otrzymany z reakcji PCRjako matrycę oraz EG1 a-2 (100 pmol) i AP8-2R (500 pmol) jako primery.

Otrzymany roztwór reaktywny poddawano elektroforezie na 2% żelu agarozowym (produkcji FMC BioProducts) w celu wyizolowania fragmentu DNA długości około 330 bp jako głównego produktu PCR, który następnie oczyszczano przy użyciu wspomnianego zestawu do oczyszczania DNA Prep-A-Gene (produkcji Bio-Rad Laboratories, Inc.). Za pomocą ligazy T4 DNA (produkcji Life Technologies) oczyszczony fragment DNA subklonowano do wektora pCR™ II (wektor stosowany do klonowania TA produktów PCR, firmy Invitrogen). Ponieważ termostabilna polimeraza stosowana w PCR ma aktywność końcowej transferazy, zamplifikowany fragment DNA jest bezpośrednio subklonowany do wektora pCR™II, który posiada koniec 5' spójny z dl, przy wykorzystaniu właściwości enzymu do dodania jednego kwasu dezoksyadenylowego do końca 3' DNA zampkikowanego przez PCR. Cząsteczki DNA plazmidu oczyszczono z 28 klonów wybranych losowo z otrzymanych klonów przy użyciu QIAGENtip 100 (produkcji DIAGEN), a ich sekwencje nukleotydowe oznaczono za pomocą sekwencjonera DNA 373 A (sekwencjoner fluorescencyjny, produkcji Applied Biosystems), używając zestaw Taq Dye Dooxy™ Terminater Cycle Sequening Kit (produkcji Applied Biosystems, zestaw stosowany w PRC do oznaczania sekwencji nukleotydów przy użyciu barwników fluorescencyjnych w oparciu o metodę podwójnej dezoksydacji Sangera i in., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, tom 74, s. 5463-5467, 1977).

179 884

Po wyselekcjonowaniu fragmentu DNA kodującego trzy reszty aminokwasowe, (Ile/Thr/SEr)-Val-Pro, sekwencji aminokwasowej AP8 opisanej powyżej, przyległej do primera AP8-2R i sekwencjonowaniu całej jego długości, zawierał on cDNA o długości 261 bp. Pozycje 173 do 175 fragmentu cDNA kodowały metioninę, a struktura kodująca była zgodna ze strukturą aminokwasów AP8. Ponieważ sekwencja wstawiona pomiędzy pozycje 173-175 fragmentu DNA była zgodna z sekwencją Kozaka (Kozak, M., Celi, t. 44, s. 238-293), 1986) wydaje się, że ten fragment cDNA zawiera początkowy region translacji, kodujący końcówkę N szczurzej proteiny TPO.

Ten fragment cDNA nazwano Al. Sekwencja nukleotydów fragmentu Al bez sekwencji wektora i wywnioskowana na tej podstawie sekwencja aminokwasów przedstawione są w załączonym Wykazie Sekwencji (SEQ ID nr 1).

<Przykład 9 > Screening klonu cDNA szczurzej TPO za pomocą PCR

Wspomnianą bibliotekę cDNA podzielono na pule składające się z około 10000 klonów, hodowano przez noc w 1 ml wspomnianej pożywki LB, zawierającej 50 pg/ml ampicyliny, a następnie przeprowadzano ekstrakcj ę DNA plazmidu przy użyciu aparatu do automatycznej ekstrakcji DNA plazmidu w oparciu o zmodyfikowaną metodę zasadowego SDS opisana w Molecular Cloning, Sambrook i in., Cold Harbor Laboratory Press, 1989). Oddzielnie syntetyzowano w oparciu o fragment Al CDN i oczyszczano poniższe dwa nukleotydy:

5' CGAGGGTGTACCTGGGTCCTG 3' (SEQ ID nr 31) (sekwencja sensów pozycji 1 do 17 sekwencji SEQ ID nr 1, CGAG reprezentują sekwencję adaptera)

5' CAGAGTTAGTCTTGCGGTGAG 3' (SEQ ID nr 32) (sekwencja antysensów pozycji 212 do 232 sekwencji SEQ ID nr 1).

Przy użyciu jako matrycy 1/30 objętości każdej próbki DNA plazmidu uzyskanej powyżej, zsyntetyzowanych oligonukleotydów jako primerów i zestawu odczynników do CPR GeneAmp™ z polimeraząDNA AmliTaą™ (firmy Takara Shuzo Co., Ltd.), przeprowadzono PCR za pomocą systemu GeneAmp™ PCR 9600 (firmy PERKIN-ELMER) (ogółem 30 cykli, z których każdy obejmował denaturację w 94°C przez 30 sekund, wyżarzanie w 66°C przez 30 sekund i syntezę w 72°C przez 1 minutę). W rezultacie wykryto specyficzne pasmo 236 bp w 3 spośród 100 badanych pul. Po podzieleniu jednej z tych pul w celu wyekstrahowania DNA plazmidu na subpule zawierające około 900 klonów i wykonaniu PCR w ten sam sposób, wykryto specyficzne pasmo w 3 spośród przebadanych 100 podpul. Po dalszym podziale jednej z podpul na pule po 40 klonów i przeprowadzeniu takiego samego screeningu wykryto specyficzne pasmo w 3 na sto testowanych pul. Jedną z przewidzianych pul hodowano na płytce LB (pożywka LB zawierająca 15% agaru) z dodatkiem 50 pg ampicyliny, a każdą z utworzonych kolonii poddawano ekstrakcji DNA plazmidu i PCR w ten sam sposób. W rezultacie w 2 na 100 przebadanych klonach wykryto pasmo dodatnie.

<Przykład 10> Sekwencing cDNA szczurzej TPO

Oczyszczanie DNA plazmidu wykonano według sposobu opisanego w Molecular Cloning (Sambrook i in., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989). Każdy z dwóch klonów uzyskanych w przykładzie 9 hodowano przez noc w 50 ml pożywki LB zawierającej 50 pg/ml ampicyliny. Po oczyszczeniu sposobem opisanym w przykładzie 6 otrzymano około 300 pg DNA plazmidu.

Uzyskany DNA plazmidu sekwencjonowano w sposób opisany w przykładzie 8 przy użyciu zestawu TAq Dye Deoxy™ Terminated Cycle Sequening Kit (produkcji Applied Biosystems) w celu oznaczenia całkowitej sekwencji nukleotydów zawierającej fragment Al. Uzyskane sekwencje nukleotydów obydwu klonów całkowicie pokrywały się, co wskazuje, że jest to ten sam klon. Wybrano jeden z klonów, a jego plazmid nazwano pEF18S-A2a. Jego sekwencja nukleotydów i sekwencja aminokwasów wywnioskowana na tej podstawie jest przedstawiona w Wykazie Sekwencji (SEQ ID nr 2).

Sekwencja przedstawiona w Wykazie Sekwencji (SEQ ID nr 2) ma szczególne właściwości. Dolna sekwencja regionu nietranslacyjnego 5' długości 172 bp koduje sekwencję aminokwasów o dużej zawartości aminokwasów hydrofobowych, która jest przypuszczalnie sekwencją

179 884 sygnałową wydzielania proteiny składającą się z 21 aminokwasów zaczynających się od metioniny. Proteina ta zawiera 126 reszt aminokwasów i sekwencję nietranslacyjnąŚ' 1025 nukleotydów oraz końcówkę poli A następującą po kodonie kończącym (TAA). Proteina ta zawiera również sekwencję zgodną z sekwencją aminokwasów AP8 analizowaną w przykładzie 2 (aminokwasy numer 1 do 12 w SEQ ID nr 2), lecz nie zawiera sekwencji zgodnej dla N-glikozylowania. Sekwencja nukleotydów 1624-1629 zlokalizowana blisko końca sekwencji nietranslacyjnej 3' różni się od sekwencji zgodnej, lecz wydaje się być potencjalną sekwencją poliadenylacji.

Wektor pEF18S-A2a przenoszony przez szczep DH5 E. coli został zdeponowany przez twórców wynalazku 14 lutego 1994 jako depozyt nr FERM BP2565 w Państwowym Instytucie Biotechnologii, National Institute of Bioscience and Humań Technology, Agency of Industrial Science and Technology, japońskiego Ministerstwa Handlu Zagranicznego i Przemysłu.

<Przykład 11> Ekspresja cDNA szczurzej TPO w komórkach COS 1 i potwierdzenie aktywności TPO

Transfekcji plazmidu pEF 18S-A2a do komórek COS 1 dokonano w poniższy sposób nieco zmodyfikowaną metodą DEAE-dekstranu obejmującą traktowanie chlorochiną (Sompayrac i m.,Proc. Natl, Acad. Sci. USA, tom 78. s. 7575-7578,1981: Luthmaniin.,M/c/. AcidsRes., 1.11, s. 1295-1308,1983. Komórki COS 1 (ATCCCRL1650) zawieszono w wyżej wspomnianym środowisku DMEM, zawierającym 10% FCS, umieszczono w 100 milimetrowym naczyniu do hodowli tkankowej i hodowano w 37°C w inkubatorze z 5% CO₂, dopóki komórki nie osiągnęły stanu 40% konfluencji. Osobno do 4 ml pożywki DMEM uzupełnionej 500 pg/ml DEAE-dekstranu (firmy Pharmacia) 80 pg chlorochiny (firmy Sigma Chemical CO.). 8% (v/v) HBS i 9% (v/v) Nu-Serum (firmy Callaborative Research, Inc.) dodawano plazmid pEF 18S-A2a rozpuszczony w 30 pl HBS (21 mM HEPES, 145 mMNaCl, pH 7.1). Tak przygotowaną mieszaninę dodawano do wyhodowanych jak wyżej komórek COS 1, które dwukrotnie przemywano pożywką DMEM i hodowano przez. 5 godzin w temperaturze 37°C w inkubatorze z CO₂. Następnie nadsącz odsysano z naczynia, a pozostałe w naczyniu komórki dwukrotnie przemywano pożywką DMEM, zawierającą 10% FCS i hodowano w temperaturze 37°C przez 3 do 5 dni w inkubatorze z 5% CO₂ w celu odzyskania powstałego nadsączu.

Nadsącz z hodowli poddawano rozległej dializie w stosunku do pożywki IMDM i analizowano w systemie z zastosowaniem CFU-MK. Aktywność TPO stwierdzono w stopniu zależnym od dawki w nadsączu hodowli komórek COS 1, w których występowała ekspresj a plazmidu pEF 18S-A2a(fig. 7). Podobnie jak w przypadku TPO pochodzącej z XRP, liczne megakariocyty w ciągu 4 dni hodowli tworzyły wydłużone wypustki cytoplazmatyczne. Nie stwierdzono natomiast aktywności TPO w nadsączu hodowli komórek COS 1, do których transfekowano jedynie plazmid pEF18S (fig. 7). W systemie testowym z zastosowaniem M-07e stwierdzono także działanie zwiększające proliferację komórek M-07e w stopniu zależnym do dawki nadsączu z hodowli komórek COS 1, w których dokonywała się ekspresja plazmidu pEF 18S-A2o, nie zaobserwowano jej natomiast w nadsączu hodowli komórek COS 1, w których ekspresji podlegał tylko plazmid pEF18S. Wyniki te świadczą o tym, że A2a zawiera cDNA, kodujący proteinę o aktywności TPO.

Następnie przygotowano próbkę częściowo oczyszczonej TPO w celu sprawdzenia zdolności aktywności TPO do pobudzania produkcji płytek in vivo. Najpierw komórki COS 1 transfekowane plazmidem pEF18S-A2a hodowano przez 3 dni w pozbawionej surowicy pożywce wzbogaconej 0.2 mg BSA, uzyskując około 5,8 litra wolnego od surowicy nadsączu z hodowli. Do pozbawionego surowicy nadsącza dodawano inhibitora proteazy p-APMSF do uzyskania ostatecznego stężenia 1 mM i przesączano mieszaninę przy użyciu filtru 0.22 pm. Do 5793 ml otrzymanego przesączu (stężenie protein 0.229 mg/ml; suma protein 1216 mg; aktywność względna 1000; aktywność całkowita 1326000) dodawano 0.85 molaNaCl na 1000 ml (w sumie 288 g), uzyskując 5849 ml roztworu zawierającego 0,822 M NaCl. Otrzymany roztwór nanoszono z prędkością 7 ml/min do kolumny TSK-gel AF-BLUE 650 MH (firmy Tosoh Corp., numer katalogowy 08705; 5 cm średnicy i 6 cm wysokości złoża), którą uprzednio zrównoważono 20 mM fosforanu sodu (pH 7,2) zawierającego IMNaCl. Po wprowadzeniu próbki przepuszczano

179 884 przez kolumnę około 7900 ml eluatu, wymywanego 20 mM fosforanu sodu (pH 7,2) zawierającego 1 M NaCl. Eluat zbierano i zagęszczano przy użyciu aparatu do ultrafiltracji (Omega Utrasette, nominalny spadek masy cząsteczkowej 8000, firmy Filtron), uzyskując wyeluowaną frakcję FI (460 ml; stężenie protein 2,11 mg/ml; suma protein 973 mg; aktywność względna 16,3). Następnie roztwór wymywający wymienioną na 2 M NaSCN, a uzyskaną frakcję F2 o aktywności TPO adsorbowanąna żelu TSK AF-BLUE 650 MH (2840 ml) zagęszczano do 6,81 ml przy pomocy aparatu do ultrafiltracji z membraną YM 3 (76 mm średnicy, firmy Amicon Corp.). Suma protein we frakcji F2 o aktywności TPO wynosiła 12,5 mg, a wydajność proteiny z F2 stanowiła w tym etapie 0,62%. Względna aktywność TPO została oszacowana na 240. Następnie F2 wprowadzano do kolumny HiLoad 26/60 Superdex 200 pg (firmy Pharmacia Biotech, numer katalogowy 17-1071-01; 2,6 cm średnicy i 60 cm wysokości złoża) i rozwijano za pomocą 20 mM octanu sodu (pH 5,5) zawierającego 50 mM NaCl z prędkością przepływu 1 ml/min. Po rozpoczęciu rozwijania aktywność TPO stwierdzono w eluatach w zakresie od 194 do 260 ml. Eluaty te zbierano w celu uzyskania frakcji F2 o aktywności TPO w kolumnie Superdex 100 pg (66 ml; stężenie protein 7,41 mg, aktywność względna 142860, aktywność całkowita 1058600). Następnie sporządzono bufor A (20 mM octanu sodowego, pH 5,5) i bufor B (20 mM fosforanu sodowego, pH 7,2 zawierającego 500 mM NaCl) i frakcję o aktywności TPO wprowadzano z prędkością 1 ml/min do silnie kationowymiennej kolumny RESOURCE S (firmy Pharmacia Biotech, numer katalogowy 17-1178-01; 0,64 cm średnicy i 3 cm wysokości złoża), którą uprzednio zrównoważono 100% A. Przeprowadzono elucjęprzy prędkości przepływu 0.3 ml/min z 40-minutowym linearnym gradientem od 100% A do 100% B. W wyniku analizy stwierdzono aktywność TPO w szerokim zakresie eluatów (od 5% B do 32% B). Eluaty o aktywności TPO zbierano i zagęszczano przy użyciu aparatu do ultrafiltracji z membraną YM 3 (25 mm średnicy, firmy Amicon Corp.) w celu uzyskania frakcji F2 o aktywności TPO w kolumnie RESOURCE S (1,65 ml; stężenie protein 4,74 mg/ml; suma protein 7,2 mg; aktywność względna 71400, aktywność całkowita 558600).

Częściowo oczyszczoną próbkę TPO wstrzykiwano podskórnie przez 5 kolejnych dni samcom myszy rasy ICR w wieku 9 tygodni (474 pg (100 μΐ dziennie na jednego osobnika), u których poprzedniego dnia badano liczbę płytek krwi. W ten sam sposób dla kontroli podawano BSA (200 pg (100 pl dziennie na jednego osobnika) lub bufor stosowany jako rozpuszczalnik częściowo oczyszczonej TPO (100 pl dziennie na jednego osobnika). Następnego dnia po ostatnim podaniu pobierano krew z serca każdej myszy w celu oznaczenia liczby płytek przy użyciu hemocytometru (F800, firmy Toa lyo Denshi). U myszy po podaniu częściowo oczyszczonej TPO zaobserwowano zwiększenie liczby płytek o współczynnik około 2,14 w porównaniu z liczbąpłytek przed zabiegiem. W porównaniu z grupą kontrolną wzrost liczby płytek u myszy po podaniu częściowo oczyszczonej TPO był około 1,74 razy większy niż u myszy po podaniu BSA i około 1.74 razy większy niż u myszy po podaniu bufora. Wyniki te wskazują że TPO pobudza produkcję płytek in vivo. Ponadto, ponieważ poziom immunosupresyjny proteiny kwasowej (IAP), znanej jako białko fazy u myszy, nie zwiększył się po podaniu myszom częściowo oczyszczonej TPO, jest wysoce prawdopodobne, że TPO różni się od IL-6 i IL-11 pod względem oddziaływania na indukcję białka ostrej fazy.

<Przykład 12 > Wykrywanie mRNA TPO w tkankach szczura

W celu zlokalizowania tkanek w organizmie szczura, w których występuje ekspresja mRNA szczurzej TPO, ekstrahowano RNA z różnych tkanek szczura. Naświetlaniu promieniami X sposobem opisanym w przykładzie 1 poddano ogółem 6 szczurów, z których 11 i 14 dni po naświetlaniu pobrano różne tkanki (komórki mózgu, grasicy, płuc, wątroby, serca, śledziony, jelita cienkiego, nerki, jądra i komórki szpiku kostnego), które natychmiast zamrażano w płynnym azocie. Ekstrakcji całkowitego RNA dokonywano przy użyciu odczynnik do izolacji RNA ISOGEN (firmy Wako Pure Chemical Industries, Ltd.). Potrzebnąilość ISOGENu określono na podstawie wagi każdej zamrożonej próbki tkanki. Próbkę tkanki z dodatkiem odczynnika traktowano homogenizatorem (Physcotron^R NS-60, firmy NINI-ON Medical & Physical Instruments MFG. Co., LTD) aż do całkowitej dezintegracji tkanki (w przybliżeniu 45 do 60 sekund

179 884 przy 1000 obrotów na minutę). Homogenizat tkankowy poddawano całkowitej ekstrakcji RNA w oparciu o metodę Chomczyńskiego i in. kwas-guanidyna-fenol-chloroform (Anal. Biochem., tom 162, s. 156-159, 1987). W rezultacie z odpowiednich tkankach uzyskano 1.1 do 5.6 mg całkowitego RNA.

Stosując Ologotex™-dT30 (Super) (firmy Japan Synthetic Rubber/Nippon Roche) oczyszczono 20 pg poli (A)⁺ RNA z około 500 pg całkowitego RNA.

Za pomocą losowo wybranego primeru syntetyzowano pierwszy łańcuch cDNA z 1 pgpoli (A)⁺ RNA uzyskanego z każdej tkanki. Dokładnie, 1 pg poli (A)⁺ DNA rozpuszczano w 10 pl jałowej wody, inkubowano w temperaturze 70°C przez 15 minut, a następnie gwałtownie schładzano. Do tego dodawano 75 pmoli losowo wybranego primeru (Takara Shuzo Co., Ltd.), 10 U inhibitora RNazy (Boehringer-Mannheim Corp.), 50 mM Tris-HCl (ph 8.3), 75 mM KC1, 3 mM MgCl₂ i 200 U Super Script™H (odwrotna transkryptaza firmy Life Technologies). Tak przygotowany roztwór (całkowita objętość 20 pl) inkubowano w 37°C przez 1 godzinę, a otrzymany roztwór reaktywny inkubowano w temperaturze 70°C przez 10 minut do inaktywacji enzymu i przechowywano w temperaturze -20°C do czasu użycia.

Nowe primery syntetyzowano w oparciu o sekwencję cDNA szczurzej TPO uzyskaną w przykładzie 10. Sekwencje otrzymanych primerów są następujące:

rTPO-I: 5'CCT GTX CTG CTG CCT GCT GTG-3' (SEQ ID nr 33) (pozycje 347 do 367 w SEQ ID nr 2) rTPO-N: 5'-TGA AGT TCG TCT CCA ACA ATC-3' (SEQ ID nr 34) (antysens odpowiadający pozycjom 1005 do 1025 w SEQ ID nr 2) Stosując 1/10 pojemności każdego roztworu zsyntetyzowanego cDNA jako matrycę po 1 pM zsyntetyzowanych rTPO-I i rTPO-N jako primery oraz zestaw odczynników PCR GeneAmp™ zpolimeraząDNA AmpliTaą™ (firmy Takara Shuzo Co., Ltd.), przeprowadzono PCR w objętości 100 pi przy użyciu systemu PCR GeneAmp™ 9600 (firmy Perkin-Elmer), ogrzewając w temperaturze 95°C przez 2 minuty, ogółem wykonując 35 cykli, z których każdy obejmował denaturację w 95°C przez 1 minutę, wyżarzanie w 57°C przez 1 minutę i syntezę w 72° przez jedną minutę oraz końcową inkubację w 72°C przez 7 minut). Po poddaniu każdego z otrzymanych roztworów reaktywnych elektroforezie na 2% żelu agarozowym (produkcji FMC BioProducts) i zbadaniu zamplifikowanych pasm, pasma, które wydawały się specyficzne dla mRNA TPO stwierdzono na żelach pochodzących z mózgu, wątroby, jelita cienkiego i nerki. Wyniki te wskazują, że ekspresja mRNA TPO u szczura występuje w tkankach tych narządów, jednak nie można określić wielkości tej ekspresji. Biorąc pod uwagę możliwości występowania podobnego rodzaju ekspresji w organizmie ludzkim, oraz wyniki przykładu 4, można przypuszczać, że wątroba jest właściwym materiałem wyjściowym dla gromadzenia cDNA ludzkiej TPO.

<Przykład 13> Konstrukcja biblioteki cDNA pochodzącego ze zdrowej wątroby ludzkiej W oparciu o wyniki przykładu 12 wybrano wątrobę jako materiał wyjściowy do klonowania cDNA ludzkiej TPO. W sposób opisany w przykładzie 7 z 5 pg handlowego poli (A)⁺ RNA pochodzącego ze zdrowej wątroby ludzkiej (produkcji Clontech; produkt ekstrahowany w oparciu o metodę Chomczyńskiego kwas-guanidyna-fenol-chloroform) syntetyzowano cDNA o podwójnym łańcuchu z miejscem rozpoznania EcoRI na końcu 5' i miejscem rozpoznania Notl na końcu 3' przy użyciu zestawu do syntezy cDNA TimeSaver™ (firmy Pharmacia) i DIRECTIONAL CLONING TOOLBOX (firmy Pharmacia). Tak zsyntetyzowany cDNA związano z 1.2 pg wymienionego wyżej wektora pEF 18S, który uprzednio był trawiony przez EcoBA i Notl i poddawano transformacji do 8.4 ml wspomnianego wyżej szczepu Competent High E. coli DH5 (firmy Toyobo Co., Ltd). W sumie uzyskano 1.2 χ 10⁶ transformantów.

<Przykład 14> Otrzymywanie (klonowanie) fragmentu cDNA ludzkiej TPO za pomocąPCR

Za pomocą losowo wybranych primerów syntetyzowano pierwszy łańcuch cDNA z 1 pg handlowego poli (A)⁺ RNA uzyskanego ze zdrowej wątroby ludzkiej (produkcji Clontech). Dokładnie, 1 pg poli (A)⁺ DNA rozpuszczano w 10 pl jałowej wody, inkubowano w temperaturze 70°C przez 15 minut, a następnie gwałtownie schładzano. Do tego dodawano 75 pmoli losowo wybranych primerów (Takara Shuzo Co., Ltd.), 10 U inhibitora RNazy (Boehringer-Mannheim

179 884

Corp.), 50 mM Tris-HCl (ph 8.3), 75 mM KC1,3 mM MgCl₂ i 200 U odwrotnej transkryptazy Super Script™II (firmy Life Technologies). Tak przygotowany roztwór (całkowita objętość 20 μΐ) inkubowano w 37°C przez 1 godzinę, a otrzymany roztwór reaktywny inkubowano w temperaturze 70°C przez 10 minut do inaktywacji enzymu i przechowywano w temperaturze -20°C do czasu użycia.

Primery zastosowane w PCR syntetyzowano w opraciu o sekwencję cDNA szczurzej TPO (SEQ ID nr 2). Sekwencje otrzymanych primerów są następujące:

rTPO-AIN: 5'-ATG GAG CTG ACT GAT TTG CTC-3' (SEQ IN nr 35) (pozycje 173 do 193 w SEQ ID nr 2) rTPO-N: 5'-TGA AGT TCG TCT CC A AC A ATF-3' (SEQ ID nr 36) (antysens odpowiadający pozycjom 1005 do 1025 w SEQ ID nr 2)

Stosując 1/10 pojemności roztworu zsyntetyzowanego cDNA jako matrycę, po 1 pMzsyntetyzowanych rTPO-AIN i rTPO-N jako primery oraz zestaw odczynników PCR GeneAmp™ z polimeraząDNA AmpliTaą™ (firmy Takara Shuzo Co., Ltd.), przeprowadzono PCR w objętości 100 μΐ przy użyciu systemu PCR GeneAmp™ 9600 (firmy Perkin-Elmer, ogrzewając w temperaturze 95°C przez 2 minuty, ogółem wykonując 35 cykli, z których każdy obejmował denaturację w 95°C przez 1 minutę, wyżarzanie w 40°C przez 1 minutę i syntezę w 72° przez jedna minutę oraz końcową inkubację w 72°C przez 7 minut).

Otrzymany roztwór reaktywny poddawano elektroforezie na 2% żelu agarozowym (produkcji FMC BioProducts) w celu wyizolowania fragmentu DNA długości około 620 bp jako głównego produktu PCR, który następnie oczyszczano przy użyciu wspomnianego zestawu do oczyszczania DNA Prep-A-Gene (produkcji Bio-Rad Laboratories, Inc.). Sekwencję nukleotydów oczyszczonego fragmentu DNA oznaczono bezpośrednio za pomocą sekwencjonera DNA 373 A (sekwencjoner fluorescencyjny, produkcji Applied Biosystems), używając wspomnianego wyżej zestawu Taq Dye Dooxy™ Terminater Cycle Seąuening Kit (produkcji Applied Biosystems). Oznaczoną sekwencję nukleotydów bez części primerowej oraz sekwencję aminokwasów, wywnioskowana na tej podstawie przedstawiono w Wykazie Sekwencji (SEQ ID nr 3).

Ten fragment DNA, bez sekwencji primerowych ma długość 580 bp. Porównanie wykazało, że ludzki cDNA posiada 86% homologię z sekwencją nukleotydów CDNA szczura, co wskazuje, że ten fragment DNA koduje cześć cDNA ludzkiej TPO.

<Przykład 15> Screening klonu cDNA ludzkiej TPO za pomocą PCR

Primery odpowiadające ludzkiej TPO przeznaczone do PCR syntetyzowano na podstawie SEQ ID nr 3. Sekwencje otrzymanych primerów są następujące:

hTPO-I: 5'-TTG TGA CCT CCG AGT CCT CAG-3' (SEQ ID nr 37) (pozycje 60 do 80 w SEQ ID nr 3) hTPO-J: 5'-TGA CGC AGA GGG TGG ACC CTC-3' SEQ ID nr 38) (antysens odpowiadający pozycjom 479 do 499 w SEQ ID nr 3)

Bibliotekę cDNA sporządzoną w przykładzie 13 ampflifikowano i dzielono na pule (z których każda zawierała około 100000 klonów), które hodowano przez noc w 1 ml wspomnianej wyżej pożywki LB zawierającej 50 pg/ml ampicyliny, a następnie ekstrahowano DNA plazmidu przy użyciu automatycznego izolatora plazmidu PI-100 (VER-3.0 firmy Kurabo Industries, Ltd.). Wyekstrahowany DNA rozpuszczano w roztworze TE.

Przy użyciu jako matrycy 5% próbki wyekstrahowano DNA, po 1 pg każdego ze zsyntetyzowanych oligonukleotydów (htPO-I i hTPO-J) jako primerów oraz zestawu odczynników do PCR GeneAmp™ z polimeraząDNA AmliTaą™ (firmy Takara Shuzo Co., Ltd.), przeprowadzono PCR w objętości 20 pl za pomocą systemu GeneAmp™ PCR 9600 (firmy PERKIN-ELMER) (ogółem 35 cykli, z których obejmował denaturację w 95°C przez 1 minutę, wyżarzanie w 59°C przez 1 minutę i syntezę w 72°C przez 1 minutę oraz końcową inkubację w 72°C przez 7 minut). W rezultacie wykryto specyficzne pasmo w 3 spośród 90 badanych pul. Jedna z tych trzech pul podzielono na subpule, z których każda zawierała około 5000 klonów z 90 podpul oczyszczano DNA plazmidu w celu przeprowadzenia PCR w ten sam sposób wykryto specyficzne pasmo w 3 spośród przebadanych 100 podpul. Specyficzne pasmo wykryto w 5 podpulach. Jednąz tych pię

179 884 ciu pul podzielono na podpule pod 250 klonów i z 90 podpól oczyszczano DNA plazmidu w celu wykonania PCR w ten sam sposób. Specyficzne pasmo stwierdzono w 3 podpulach. Jednąz przewidzianych pul hodowano na opisanej wyżej płytce LB zawierającej 50 pg/ml ampicyliny, a każdą z utworzonych 90 kolonii poddawano ekstrakcji DNA plazmidu i PCR w ten sam sposób. Ostatecznie uzyskano klon HL 34.

<Przykład 16> Sekwencing cDNA ludzkiej TPO

Oczyszczanie DNA plazmidu przeprowadzono zasadniczo według sposobu opisanego w Molecular Cloning (Sambrook i in., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989). Dokładniej, klon HL 34, hodowano przez noc w 50 ml pożywki LB, zawierającej 50 pg/ml ampicyliny, a powstałe komórki, zebrane przez odwirowywanie zawieszono w 4 ml wspomnianego wyżej roztworu TEG - lizosomów. Dodano 8 ml 0.2 N roztworu NaOH/1% SDS, a następnie 6 ml roztworu 5M potasu/5M octanu w celu dokładnego zawieszenia komórek. Po odwirowaniu zawiesiny sklarowaną ciecz traktowano mieszaniną fenolu/chloroformu (1:1), mieszano z tą samą ilością izopropanolu i odwirowywano. Powstałą granulkę rozpuszczano w roztworze TE i traktowano RNazą, a następnie znów mieszaniną fenolu/chloroformu (1:1), po czym wytrącano etanolem. Otrzymaną granulkę ponownie rozpuszczano w roztworze TE, do którego kolejno dodawano NaCl i glikol polietylenowy 3000 do uzyskania ostatecznego stężenia odpowiednio 0.63 M i 7.5%. Po odwirowaniu granulkę rozpuszczano w roztworze TE i wytrącano etanolem. W ten sposób uzyskano około 300 pg DNA plazmidu pEF18S-HL34.

Tak oczyszczony DNA plazmidu wprowadzono do wspomnianego wyżej analizatora sekwencji DNA 373 A (firmy Applied Biosystems) w celu określenia całkowitej sekwencji nukleotydów przy użyciu wspomnianego wyżej zestawu Taq Dye Deoxy™ Terminater Cycle Sequening (firmy Applied Biosystems). Oznaczona w ten sposób sekwencja nukleotydów i wywnioskowana na tej podstawie sekwencja aminokwasów są przedstawione w Wykazie Sekwencji (SEQ ID nr 4). W tym przypadku oligonukleotydy syntetyzowane w oparciu o sekwencje nukleotydów SEQ ID nr 3 i wewnętrzną sekwencję uzyskaną w wyniku analizy sekwencyjnej wykorzystano jako primery do oznaczania sekwencji nukleotydów.

W rezultacie potwierdzono, że klon plazmidu pEF 18S-HL34 zawiera fragment cDN A wielkości 861 bp i wykazuje znacznąhomologię z sekwencjami aminokwasów AP8 (numery aminokwasów 1 do 12 w SEQ ID nr 4) i TP2/TP3 (numery aminokwasów 157 do 162 w SEQ ID nr 7) analizowanymi w przykładzie 2. Ten fragment DNA prawdopodobnie koduje otwarta strukturę czytającą począwszy od pozycji 25, lecz nie posiada kodonu kończącego i zawiera poli (A) końcową sekwencję 76 zasad na końcu 3'. Jego sekwencja aminokwasowa, składająca się z 253 reszt aminokwasowych bezpośrednio przed sekwencjąkońcowąpoli A, wykazywała 84% homologię z odpowiadającą częścią cDNA szczurzej TPO (sekwencja aminokwasowa złożona ze 147 reszt przedstawiona w SEQ ID nr 2). Na tej podstawie stwierdzono, że klon ten jest fragmentem DNA, kodującym część ludzkiego cDNA zgodną z cDNA szczurzej TPO. Ze względu na brak kodonu kończącego i obecność sekwencji końcowej poli (A) na jego końcu 3', klon ten prawdopodobnie nie jest całkowitym cDNA, lecz sztucznym produktem uzyskanym w procesie sporządzania biblioteki cDNA.

<Przykład 17 > Ekspresja cDNA ludzkiej TPO w komórkach COS 1 i potwierdzenie aktywności TPO

Transfekcję otrzymanego klonu plazmidu pEF18S-HL34 do komórek COS 1 przeprowadzano według sposobu przykładu 11, tzn. dokonywano transfekcji 10 pg DNA plazmidu metodą DEAE-dekstran, obejmującą traktowanie chlorochiną. Komórki COS 1 hodowano przez trzy do pięciu dni w temperaturze 37°C i zbierano nadsącz z hodowli.

Nadsącz z hodowli poddawano rozległej dializie w stosunku do pożywki IMDM i analizowano w systemie z zastosowaniem CFU-MK. Aktywność TPO stwierdzono w stopniu zależnym od dawki w nadsączu hodowli komórek COS 1, w których występowała ekspresja plazmidu pEFl 8S-HL34 (fig. 8). Po 4 dniach hodowli liczne megakariocyty formowały wydłużone wypustki cytoplazmatyczne. Nie stwierdzono natomiast aktywności TPO w nadsączu hodowli komórek COS 1, w którym ekspresji podlegał jedynie plazmid pEFl 8S (fig. 8). W systemie analizy z

179 884 wykorzystaniem M-07e aktywność zwiększaj ącąproliferację komórek M-07e stwierdzono jedynie w nadsączu z hodowli komórek COS 1, w których poprzez transfekcję następowała ekspresja plazmidu pEF18S-HL34. Wyniki te świadczą o tym, że pEF18S-HL34 zawiera gen, kodujący proteinę o aktywności TPO. Ponadto wykazano, że ludzka TPO działa na komórki progenitorowe megakariocytów (bez selektywności gatunkowej).

< Przykład 18> Ekspresj a cDNA ludzkiej TPO typu delecj i i potwierdzenie aktywności TPO

Klon HL34 uzyskany w przykładzie 15 zawierał cDNA z ciągłąsekwencjąkońcowąpoli A na końcu 3', nie występujący w cDNA szczurzej TPO i dlatego uważany za sztuczny produkt doświadczenia. Z tego względu przygotowano cząsteczkę cDNA, z której usunięto sekwencję końcową poli (A) w celu sprawdzenia, czy proteina podlegająca ekspresji w de fetowanym cDNA wykazuje aktywność TPO. Deletowany cDNA uzyskano za pomocą PCR. Sekwencje primerów wykorzystanych w PCR podano poniżej, przy czym do końca 5' każdego primeru dodano miejsce rozpoznania enzymu restrykcyjnego (EcoRI do htPO5 i Notl oraz dwa kodony przystankowe TAA i TGA do hTPO3).

hTPO5: 5-TTT GAA TTC GGC CAG CCA GAC ACC CCG GCC-3' (SEQ ID nr 170) (pozycje 1 do 21 w SEQ ID nr 4) hTPO3: 5-TTTGCGGCCGCT ACTTATTCGTGT ATCCTGTTC AGGTATCC-3' (SEQ ID nr 171) (antysens odpowiadający pozycjom 757 do 780 w SEQ ID nr 4) Stosując 1 pg DNA klonu plazmidu pEFl 8S-HL34 uzyskanego w przykładzie 16 jako matrycę, po 10 μΐ zsyntetyzowanych wcześniej hTPO5 i hTPO3 jako primery oraz zestaw odczynników PCR GeneAmp™ z polimerazą DNA AmpliTaq^rM (firmy Takara Shuzo Co., Ltd) przeprowadzono PCR w objętości 100 pl przy użyciu systemu Gene Amp™ PCR System 9600 (firmy PERKIN-ELMER), powtarzając ogółem 35 cykli, z których każdy obejmuje denaturację w 95°C przez 1 minutę, wyżarzanie w 65°C przez 1 minutę i syntezę w 72° przez jedną minutę oraz końcową inkubację w 72°C przez 7 minut. Uzyskane pasmo długości około 800 bp było trawione enzymami restrykcyjnymi AcoRI i Notl, oczyszczane a następnie subklonowane do wektora ekspresji pEF18S, który uprzednio traktowano tymi samymi enzymami restrykcyjnymi. Z otrzymanych transformantów wybrano 5 klonów, które zawierały fragment DNA długości około 800 bp w celu uzyskania dużej ilości DNA plazmidu według sposobu opisanego w przykładzie 5. Całą długość zamplifikowanego regionu około 800 bp każdego plazmidu poddawano analizie sekwencji nukleotydów, stwierdzając jego całkowitą tożsamość z sekwencjąnukleotydów analizowaną w przykładzie 16 (pozycje 1 do 780 w SEQ ID nr 4). Uzyskany klon plazmidu nazwano pHT 1 -231. Wektor pHTF 1-231 przenoszony przez szczep DH E. coli został zdeponowany przez twórców wynalazku 14 lutego 1994 pod nr FERM BP-4617 w Państwowym Instytucie Biotechnologii. Institute of Bioscience and Humań Technology, Agency of Industrial Science and Technology japońskiego Ministerstwa Handlu Zagranicznego i Przemysłu.

Transfekcje otrzymanego klonu plazmidu pEF18S-HL34 do komórek COS 1 przeprowadzano według sposobu przykładu 11, tzn. dokonywano transfekcji 10 pg DNA plazmidu metodą DEAE-dekstran, obejmującą traktowanie chlorochiną,. Komórki COS 1 hodowano przez trzy do pięciu dni w temperaturze 37°C, a następnie zbierano nadsącz z hodowli.

Nadsącz z hodowli poddawano rozległej dializie w stosunku do pożywki IMDM i analizowano w systemie z zastosowaniem CFU-MK. Aktywność TPO stwierdzono w nadsączu hodowli komórek COS 1, w których występowała ekspresja plazmidu pHTl-231 (fig. 9). Po 4 dniach hodowli liczne megakariocyty formowały wydłużone wypustki cytoplazmatyczne. Nie stwierdzono natomiast aktywności TPO w nadsączu hodowli komórek COS 1, w którym ekspresji podlegał jedynie plazmid pEF18S (fig. 9). W systemie analizy z wykorzystaniem M-07e aktywność zwiększaj ącąproliferację komórekM-07e stwierdzono jedynie w nadsączu z hodowli komórek COS 1, w których następowała ekspresja plazmidu pHT 1-231. Wyniki te świadczą o tym, że pHT 1 -231 zawiera cDNA, kodujący proteinę o aktywności TPO.

<Przykład 19> Otrzymywanie regionu końca 3' sDNA ludzkiej TPO za pomocąPCR

Klon HL34 uzyskany w przykładzie 15 zawierał cDNA o sekwencji końcowej poli(A), co sugerowało, że region jego końca 3'jest niekompletny. Dlatego za pomocąPRC próbowano uzy

179 884 skać region końca 3' o pełnej długości. Poniższe cztery rodzaje primera strony 5' dla PCR syntetyzowano w oparciu o sekwencje oznaczone w przykładzie 16 hTPO-H: 5'-AGC AGA ACC TCT CTA GTC CTC-3' (SEQ ID nr 39) (pozycje 574 di 594 w SEQ ID nr 4) hTPO-K: 5'-ACA CTG AAC GAG CTC CCA AAC-3' (SEQ ID nr 40) (pozycje 595 do 615 w SEQ ID nr 4) hTPO-N: 5'-AAC TAC TGG CTC TGG GCT TCT-3' (SEQ ID nr 41) (pozycje 660 do 680 w SEQ ID nr 4) hTPO-O: 5'-AGG GAT TC A GAG CCA AGA TTC-3' (SEQ ID nr 42) (pozycje 692 do 712 w SEQ ID nr 4)

Następujące primery strony 3' zawierające mieszane nukleotydy przy czterech zasadach końca 3' syntetyzowano w celu zamplifikowania cDNA od początku części poli (A), /syntetyzowano również primer kotwiczny bez mieszanych nukleotydów. hTP03mix: 5'-TAG CGG CCG C(T)₁₇-G GGG-3'

A AAA-3'

C TTT-3'

CCC-3' hTPO3anchor: 5'-TAG CGG CCG C(t)_n-3' (SEQ ID nr 43) (SEQ ID nr 44) (SEQ ID nr 45) (SEQ ID .nr 46) (SEQ ID nr 47)

Pierwszy łańcuch cDNA syntetyzowano z 1 pg handlowego poli (A)⁺ RNA (firmy Clontech) otrzymanego ze zdrowej wątroby ludzkiej, jak w przykładzie 14), lecz przy użyciu 0.5 pg oligo dT primeru (znajdującego się w zestawie TimeSaver™CDA Synthesis Kit firmy Pharmacia). Przy użyciu jako matrycy 1/10 objętości syntetyzowanego roztworu cDNA, 20 pM primeru hTPO-H i 10 pM primeru hTPO3mix oraz zestawu odczynników GeneAmp™PCR Reagent Kit z polimerazą AmpliTaą™ DNA (firmy Takara Shuzo Co.,Ltd.) przeprowadzono PCR dla objętości 50 pl, stosując GeneAmp™ PCR System 9600 (firmy PERKIN-ELMER) i ogrzewając w temperaturze 96°C przez dwie minuty, powtarzając całośc 1 cykli, z których każdy składał się z denaturacji na gorąco w temperaturze 95°C, wyżarzania w 48°C przez 1 minutę i syntezy w 72°C przez przez 1 minutę, a następnie końcowej inkubacji w 72°C przez 7 minut.

Drugą PCR przeprowadzono przy użyciu jako matrycy 1/10 objętości roztworu uzyskanego w pierwszej PCR, 20 pM primeru hTPO-K i 10 pM primeru hTPO3mix dla objętości 50 pl, ogrzewając w 96°C przez dwie minuty i powtarzając wszystkie 10 cykli, z których każdy składał się z denaturacji na gorąco w 96°C przez 1 minutę, wyżarzanie w 63°C przez 1 minutę i syntezy w 72°C przez 1 minutę, a następnie końcowej inkubacji przez 7 minut.

Trzecią PCR przeprowadzono przy użyciu jako matrycy 1/10 objętości roztworu uzyskanego w drugiej PCR, 20 pM primeru hTPO-N i 10 pM primeru hTPO3mix dla objętości 50 pl, ogrzewając w 96°C przez dwie minuty i powtarzając wszystkie 10 cykli, z których każdy składał się denaturacji na gorąco w 96°C przez 1 minutę, wyżarzanie w 63°C przez 1 minutę i syntezy w 72°C przez 1 minutę, a następnie końcowej inkubacji przez 7 minut.

Czwartą PCR przeprowadzono przy użyciu jako matrycy 1/10 objętości roztworu uzyskanego w trzeciej PCR, 20 pM primeru hTPO-O i 10 pM primeru hTPO3mix dla objętości 50 pl, ogrzewając w 96°C przez dwie minuty i powtarzając wszystkie 10 cykli, z których każdy składał się denaturacji na gorąco w 96°C przez 1 minutę, wyżarzanie w 63°C przez 1 minutę i syntezy w 72°C przez 1 minutę, a następnie końcowej inkubacji przez 7 minut.

PiątąPCR przeprowadzono przy użyciu jako matrycy 1/10 objętości roztworu uzyskanego w czwartej PCR, 20 pM primeru hTPO-O i 10 pM primeru hTPO3anchor dla objętości 50 pl, ogrzewając w 96°C przez dwie minuty i powtarzając wszystkie 10 cykli, z których każdy składał się z denaturacji na gorąco w 96°C przez 1 minutę, wyżarzania w 5 8°C przez 1 minutę i syntezy w 72°C przez 1 minutę, a następnie końcowej inkubacji przez 7 minut. ‘

Uzyskane roztwory reaktywne poddawano elektroforezie na 2% żelu agarozy (firmy FMC BioProducts) w celu wyizolowania fragmentu około 600 bp DNA jako głównego produktu PCR, który następnie oczyszczano przy użyciu wspomnianego wyżej zestawu do oczyszczania DNA Prep-A-Gene (firmy Bio-Rad Laboratories. Inc.). Sekwencję nukleotydów w oczyszczonym fra

179 884 gmencie DNA oznaczano bezpośrednio przy pomocy analizatora sekwencji DNA 373 A (firmy Applied Biosystems), stosując wspomniany wyżej zestaw Taq Dye Deoxy™ Terminater Cycle Seąueninig (firmy Applied Biosystems). Określoną w ten sposób sekwencję nukleotydów i sekwencje aminokwasów wyznaczoną na tej podstawie przedstawiono w Wykazie Sekwencji (SEQ ID nr 5).

Fragment ten ma kodowanie sekwencji nukleotydów dla 130 aminokwasów zaczynając od primeru htPO-O, po którym następuje sekwencja ponad 180 nukleotydów przy końcu 3' (nukleotydy po 577 pozycji nie zostały oznaczone). Sekwencja 30 aminokwasów zaczynająca się od gliceryny pokrywała się z sekwencją aminokwasów pozycji 203 do 232 w SEQ ID nr 4. Sekwencja nukleotydów pozycji 1 do 94 również pokrywała się z sekwencją nukleotydów pozycji 692 do 785 w SEQ ID nr 4.

Na podstawie analizy sekwencji fragmentu cDNA w przykładzie 17 i amplifikowanego przez PCR fragmentu w niniejszym przykładzie, logicznie wywnioskowano, że ludzka proteina TPO składa się z 353 aminokwasów zawierających sekwencję sygnałową21 aminokwasów co pokazano w SEQ ID nr 6.

<Przykład 20 > Rekonstrukcjabiblioteki cDNA pochodzącego ze zdrowej wątroby ludzkiej

Ponieważ klon HL34, uzyskany w przykładzie 15 zawierał końcową sekwencję poli A bezpośrednio przy końcu 3' otwartej struktury czytającej bez kodonu kończącego i dlatego wydawał się sztucznym produktem syntezy cDNA, bibliotekę cDNA rekonstruowano przy użyciu 5 pg handlowego preparatu poli (A⁺) RNA, otrzymanego ze zdrowej wątroby ludzkiej (firmy Clontech). Syntezę cDNA przeprowadzono przy użyciu systemu Super Script™ Lambda System for cDNA Synthesis oraz λ Cloning Kit i SuperScript™ II RNase H' (obydwa zestawy firmy LIFE TECHNOLOGIES). Kwas poli (A⁺) RNA poddawano denaturacji na gorąco i dodawano do 20 μ1 roztworu reaktywnego, zawierającego o ligo dT, włączony w sekwencję Notl, jako primer dołączony do zestawu (50 mM Tris-HCl, pH 8.3, 75 mM KC1, 3 mM MgCl₂, ImM DTT, 1 mM dNTP mix, 200 U SuperScript™ II RNase H ), a następnie przeprowadzono inkubację przez 60° minut w temperaturze 37°C. Po syntezie drugiej nitki cDNA (2 godziny inkubacji w 16°C w 150 μΐ roztworu reaktywnego zawierającego 25 mM Tris-HCl, pH 8.3,100 mM KC1,5 mM MgCl₂,250 pg dNTP mix, 5 mM DTT, 40 U polimerazy I DNA E. coli, 2 U RNazy Η E. coli i 10 U ligazy DNA E. coli, dodawano 10 U polimerazy DNA T4, a otrzymaną mieszaninę poddawano inkubacji w 1 6°C przez 5 minut. Roztwór reaktywny ogrzewano w 65°C przez 10 minut i ekstrahowano taką samą objętością fenolu/chloroformu. Cząsteczki cDNA o długości poniżej 400 bp usuwano za pomocą kolumny wirowanej SizeSep™ 400 (kolumna wirowana do usuwania małocząsteczkowego DNA, dołączona do zestawu TimeSaver™ cDNA Synthesis Kit Firmy Pharmacia). Po dodaniu adaptora EcoRI (dołączonego do zestawu Directional Cloning Toolbox firmy Pharmacia) traktowane w ten sposób próbki poddawano trawieniu przez Notl i ponownie wprowadzano do kolumny wirowanej SizeSep™ 400 w celu usunięcia małocząsteczkowego DNA. Zsyntetyzowane 1.3 pg dwułańcuchowego cDNA z sekwencją rozpoznawania EcoRJ na końcu 5' i sekwencją rozpoznawania Notl na końcu 3' podwiązano do wektora ekspresji pEF18S, który uprzednio trawiono za pomocąEcoRI i Notl, a następnie przenoszono do 9.2 ml Competent High E. coli DH5 (firmy Toyobo Co., Ltd). Uzyskana biblioteka cDNA wątroby ludzkiej (hTPO-Fl) zawierała 1.0 χ 10⁶ transformantów.

<Przykład 21 >

Screening klonów TPO w cDNA z biblioteki cDNA wątroby ludzkiej hTPO-Fl

Primery ludzkiej TPO dla PCR odpowiadające cDNA syntetyzowano według sekwencji ID nr 3 i 6, przedstawionych w Wykazie Sekwencji. Sekwencje zsyntetyzowanych primerów były następujące:

hTPO-I: 5-TTG TGA CCT CCG AGT CCT CAG-3' (SEQ ID nr 48) (pozycje 60 do 80 w SEQ ID nr 3) hTPO-KU: 5'-AGG ATG GGT TGG GGA AGG AGA-3' (SEQ ID nr 49) (antysens odpowiadający sekwencji pozycji 901 do 921 w SEQ ID nr 6)

179 884

Bibliotekę hTPO-Fl cDNA wątroby ludzkiej (1,0 χ 10⁶ transformantów) sporządzoną w przykładzie 20 podzielono na 3 pule (pule # 1 -3), które zostały zamrożone. Przeprowadzono PCR przy użyciu 2 pg DNA plazmidu sporządzonego z każdej puli jako matrycy i 1 μΜ każdego z zsyntetyzowanych oligonukleotydów (hTPO-I i htPO-KU) jako primerów. Przy użyciu zestawu GeneAmp™ PCR Reagent Kit z polimerazą DNA AmpliTaą™ (firmy Takara Shuzo Co., Ltd) przeprowadzono PCR w 100 pl objętości za pomocą systemu GeneAmp™ PCR System 9600 (firmy PERKINELMER) (w sumie 35 cykli, każdy składający się z denaturacji w 95°C przez jedną minutę, wyżarzania w 59°C przez jedna minutę i syntezy przy 72°C przez jedną minutę, po których dokonano końcowej inkubacji w 72°C przez 7 minut). Po zastosowaniu DNA plazmidu sporządzonego z puli # 3 następowała amplifikacja fragmentu DNA przewidywanej wielkości. Pulę # 3 podzielono na podpule, z których każda zawierała 15000 transformantów. Podpule hodowano przez noc w 1 ml pożywki LB zawierającej 50 pg/ml ampicyliny, a następnie ekstrahowano DNA plazmidu przy użyciu automatycznego izolatora plazmidu PI-100. Wyekstrahowany DNA rozpuszczano w roztworze TE. 5% otrzymanego roztworu stosowano jako matryce do przeprowadzenia PCR przy użyciu opisanych wyżej primerów w opisanych wyżej warunkach. Amplifikacja DNA przewidywanej wielkości występowała w 6 spośród 90 puli. Po podzieleniu puli dodatnich na podpule, z których każda zawierała 1000 klonów, wyekstrahowaniu DNA plazmidu i przeprowadzeniu PCR w opisany wyżej sposób, nie stwierdzono amplifikacji DNA. Gęstość pasm na żelu do elektroforezy fragmentów DNA amplifikowanych w seriach PCR zmniejszyła się, gdy podpulę podzielono kolejny raz, co jest prawdopodobnie spowodowane niską wydajnością DNA plazmidu ze względu na słaby wzrost badanego klonu. W związku z tym przeprowadzono inny screening za pomocąhybrydyzacji kolonii przy użyciu oryginalnej puli # 3.

Pulę # 3 nałożono na 100 płytek agarowych LB średnicy 15 cm przy gęstości posiewu 4100 kolonii na każdej płytce agarowej LB. Po sporządzeniu kopii każdej z posiewanych płytek jeden z duplikatów hodowano w 37°C przez 6 godzin w celu odzyskania kolonii rozwijających się na płytce i wyekstrahowania próbek DNA plazmidu. Po przeprowadzeniu PCR próbek DNA w opisany wyżej sposób stwierdzono amplifikację pasma równoważnego przewidywanej wielkości w jednej ze 100 podpul. Z płytki tej podpuli sporządzono kopie filtrów przy pomocy BIODYNE™ A TRANSFER MEMBRANĘ (firmy PALL). Denaturację filtrów przeprowadzono przez zanurzenie ich kolejno na lOminutw 10% SDS,na 10minutw0,5NNaOH/l,5MNaClina lOminut w 0,5 M Tris-HCl (pH 8,0) 1,5 MNaCl, a następnie suszenie na powietrzu przez 30 minut i wypiekanie w 80°C przez jedna godzinę w piecu próżniowym. Po wypiekaniu filtry wymywano 6 x SSC (otrzymanym przez rozcieńczenie 20 x roztworu podstawowego SSC, składającego się z 175,3 g NaCl i 88,2 g cytrynianu sodu rozpuszczonego w 1 litrze wody, pH 7,0), uzupełnionym 1% SDS. Przeprowadzono prehybrydyzację wymywanych filtrów przez inkubację w 42°C przez 30 minut z wstrząsaniem w 30 ml roztworu reaktywnego, składającego się z 50% formamidu, 5 x SSC, 5 x roztworu Denhardta (otrzymanego z 50 x roztworu Denhardta zawierającego 5 g Ficollu, 5 g poliwinylopirolidonu i 5 g frakcji V albuminy surowicy bydlęcej w 500 ml wody), 1% SDS i 20 pg/ml DNA nasienia łososia. Po prehybrydyzacji roztwór reaktywny wymieniano na 30 ml roztworu hybrydyzacji o tym samym składzie, mieszano z sondąznakowaną [a-³²P] dCTP (firmy Amersham) i poddawano inkubacji, wytrząsając w 42°C przez 20 godzin. Znakowana sonda użyta w tym doświadczeniu była fragmentem EcoRAJBamW. plazmidu pEF18S-HL34, uzyskanego przez oczyszczenie części SEQ ID nr 4 sięgającej od końca 5' do zasady na 458 pozycji i przez znakowanie oczyszczonej części techniką losowych primerów z zastosowaniem Megaprime DNA Labelling System (zestaw firmy Amersham oparty na metodzie wyjaśnionej w Anal. Blochem., 132, 6-13, 1983). Po tych zabiegach filtry poddawano przez 16 godzin autoradiografii w temperaturze -70°C przy użyciu ekranu wzmacniającego i filmu Χ-ΟΜΑΤ™ ARS (produkcji Eastman Kodak). W rezultacie zaobserwowano pojedynczy sygnał uznany za dodatni. Kolonie w przybliżeniu odpowiadające temu sygnałowi zbierano z oryginalnej płytki i posiewano ponownie na 10-centymetrową płytkę agarową LB, 50 kolonii rozwijających się na płytce hodowano osobno, a ich próbki DNA poddawano PCR przy użyciu wymienionych wyżej primerów htPO-I i

179 884

HTPO-KU w warunkach opisanych powyżej. Amplifikację pasma równoważnego przewidywanej wielkości stwierdzono w tylko jednym klonie, który oznaczono jako pHTFl.

<Przykład 22>

Oznaczanie sekwencji nukleotydów w klonie pHTFl cDNA ludzkiej TPO

Oczyszczanie DNA plazmidu przeprowadzono zasadniczo według sposobu opisanego w Molecular Cloning (Sambrook i in., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989). Klon pHTFl hodowano przez noc w 50 ml pożywki LB zawierającej 50 pg/ml ampicyliny. Uzyskane komórki zbierano przez odwirowywanie i zawieszono w 4 ml wymienionego wyżej roztworu lizosomów TEG. Dodawano 8 ml roztworu 0,2 NNaOH/1% SDS, a następnie 6 ml roztworu 3 Mpotasu/5 M octanu w celu dokładnego zawieszenia komórek. Po odwirowaniu zawiesiny powstały nadsącz traktowano fenolem/chloroformem (1:1), mieszano z takąsamąobjętościąizopropanolu, a następnie odwirowywano. Uzyskaną granulkę rozpuszczano w roztworze TE i traktowano RNazą a następnie fenolem/chloroformem (1:1), wytrącano etanolem. Otrzymaną granulkę ponownie rozpuszczano w roztworze TE, do którego następnie dodawano NaCl i glikol polietylenowy 3000, uzyskując ostatecznie stężenie odpowiednio 0,63 M i 7,5%. Po odwirowaniu granulkę rozpuszczano w roztworze TE i wytrącano etanolem. W ten sposób uzyskano około 300 pg pHTFl DNA plazmidu.

Tak oczyszczony DNA plazmidu wprowadzono do wspomnianego wyżej analizatora sekwencji DNA 373A (firmy Applied Biosystems) w celu określenia całkowitej sekwencji nukleotydów przy użyciu wspomnianego wyżej zestawu Taq Dye Deoxy™ Terminater Cycle Sequening (firmy Applied Biosystems). Oznaczona w ten sposób sekwencja nukleotydów i wywnioskowana na tej podstawie sekwencja aminokwasów są przedstawione w Wykazie Sekwencji (SEQII nr 7). Oligonukleotydy syntetyzowane w oparciu o sekwencję nukleotydów SEQ ID nr 6 i wewnętrzną sekwencję uzyskana w wyniku analizy sekwencyjnej wykorzystano jako primery do oznaczania sekwencji nukleotydów.

W rezultacie potwierdzono, że klon pGTFl zawiera fragment cDNA wielkości 1721 bp i wykazuje znacznąhomologię z sekwencjami aminokwasów AP8 (numery 1 do 12 w SEQ ID nr 7) i TP2/TP3 (numery aminokwasów 157 do 162 w SEQ ID nr 7) analizowanymi w przykładzie 2. Fragment DNA posiada prawdopodobnie region niekodujący 5'dla 101 zasad, otwartą strukturę czytającą złożoną z 353 reszt aminokwasowych, rozpoczynającą się od reszty metioninowej kodowanej w pozycjach nukleotydów 102 do 104 i zakończoną resztą glicynową kodowaną w pozycjach nukleotydów 1158 do 1160, dalszy kodon kończący (TAA), niekodującego region 3' dla 531 zasad i sekwencję końcowąpoli (A) z 30 zasad. Sekwencja aminokwasów proteiny, przypuszczalnie kodowanej przez otwartą strukturę czytającą jest w pełni zgodna z przewidywaną sekwencją aminokwasów ludzkiej TPO, przedstawioną w SEQ ID nr 6. Sekwencja cDNA pHTFl jest dłuższa niż przypuszczalna sekwencja cDNA przedstawiona w SEQ ID nr 6 i zawiera o 77 więcej dodatkowych zasad po stronie 5' i o 347 więcej dodatkowych zasad po stronie 3'przed sekwencjąkońcowąpoli A. Sekwencja nukleotydów także różniła się od SEQ ID nr 6 w pozycji 3. Dokładnie: A (pozycja 84), A (pozycja 740) i G (pozycja 1) w SEQ ID nr 7 odpowiadały kolejno C, T i A w SEQ ID nr 6. Jedynie mutacja w pozycji 740 została włączona w region kodujący proteinę, lecz mutacja ta nie powodowała wymiany aminokwasów, ponieważ zasady A i T były trzecimi zasadami kodony treoniny. Choć przyczyna zastępowania zasad nie była wówczas wiadoma, analiza klonu plazmidu pHTFl potwierdziła, że ludzka proteina TPO zawiera reszty 353 aminokwasów z sekwencją sygnałową 21 aminokwasów. Masę cząsteczkową dojrzałej proteiny bez sekwencji sygnałowej wyznaczono na 35466.

Wektor pHTF 1 przenoszony przez szczep DH5 E. coli został zdeponowany przez twórców wynalazku pod nr FERM BP-4617 w Państwowym Instytucie Biotechnologii, Institute of Bioscience and Humań Technology. Agency of Industrial Science and Technology japońskiego Ministerstwa Handlu Zagranicznego i Przemysłu.

179 884 <Przykład 23>

Ekspresja klonu pHTFl cDNA ludzkiej TPO w komórkach COS 1 i potwierdzenie aktywności TPO

Transfekcję otrzymanego klonu plazmidu pHTFl do komórek COS 1 przeprowadzono według sposobu przykładu 11, tzn. dokonywano transfekcji 10 pg plazmidu metodą DEAE-dekstran, obejmującą traktowanie chlorochiną. Transfekowane komórki COS 1 hodowano przez trzy dni w temperaturze 37°C i zbierano nadsącz z hodowli.

Nadsącz z hodowli poddawano rozległej dializie w stosunku do pożywki IMDM i analizowano w systemie z zastosowaniem CFU-MK. Aktywność TPO stwierdzono w stopniu zależnym od dawki w nadsączu hodowli komórek COS 1, w których występowała ekspresja plazmidu pHTFl (fig. lOa). Nie stwierdzono natomiast aktywności TPO w nadsączu hodowli komórek COS 1, wktórymekspresjipodlegałjedynieplazmidpEF18S (fig. lOa). Podobne wyniki uzyskano w systemie analizy z wykorzystaniem M-07e. Nadsącz komórek COS 1, w którym następowała ekspresja plazmidu pFTF, znacząco zwiększał proliferację komórek M-07e w stopniu zależnym od dawki (fig. 1 Ob). Wyniki świadcząc tym, że pHTF 1 zawiera gen, kodujący proteinę o aktywności TPO.

<Przykład 24>

Klonowanie DNA chromosomów ludzkiej TPO

Klonowanie DNA chromosomów ludzkiej TPO przeprowadzano przy użyciu cDNA ludzkiej TPO jako sondy. Bibioteka genomowa używana do klonowania była darem prof. T. Yamamoto z Gene Research Centre Uniwersytetu Tohoku (biblioteka, którą omówili Sakai i in. w J. Biol. Chem., 269,2173-2182,1994, została sporządzona przez częściowe trwanie DNA chromosomów ludzkich enzymem restrykcji Saw3AI i wiązaniu produktu częściowego trawienia ze stroną BaraHI wektora fagowego Lambda EMBL3 firmy Stratagene). Screening tej biblioteki przy pomocy cDNA ludzkiej TPO jako sondy przeprowadzano sposobem opisanym w Molecular Cloning (Sambrook i in., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989). Przy użyciu Szczepu E. coli LE392 jako gospodarza, bibliotekę posiewano na 15-centymetrową płytę zawierającą NZYM(10g aminy NZ, 5 gNaCl, 5 g Bacto Yeast Extract, 2 g Mg SO₄-7H₂O i 15 g agaru w 1 litrze wody, pH 7,0) przy gęstości posiewu 30000 cząsteczek fagowych na płytce. Z każdej z tak przygotowanych 18 płytek sporządzano dwie kopie filtrów przy użyciu BIODYNE™ A TRANSFER MEMBRANĘ (firmy PALL). Denaturację filtrów przeprowadzano przez zanurzenie 0,5 NNaOH/1,5 M NaCl na 10 minut, a następnie w 0,5 M Tris-HCl (pH 8,0)/1,5 M NaCl na 10 minut oraz suszenie na powietrzu przez 30 minut i dalsze wypiekanie w ciągu 1,5 godziny w temperaturze 80°C w piecu próżniowym. Przeprowadzono prehybrydyzację za pomocą inkubacji tak przygotowanych filtrów w temperaturze 42°C przez 1 godzinę w 500 ml roztworu reaktywnego, składającego się z 50% formamidu, 5 x SSC, 5 x roztworu Denhardta, 1 % SDS i 20 pg/ml DNA nasienia łososia. W celu zastosowania w roli sondy fragment cDNA ludzkiej TPO (numery pozycji zasad 178 do 1025 w SEQ ID nr 7) amplifikowano za pomocąPRC i oczyszczano. Oczyszczony fragment znaczono³² P, stosując Random Primer DNA Labelling Kit (zestaw firmy Takara Shuzo do znaczenia DNA metodą losowo wybranych primerów omówioną w Anal. Biochem., 132, 6-13, 1983). Sekwencje primerów zastosowanych w PCR były następujące:

hTPO-I: 5'-TTG TGA CCT CCG AGT CCT CAG-3' (SEQ ID nr 50) (pozycje 178 do 198 w SEQ ID nr 7) hTPO-N: 5-AGG GAA GAG CGT ATA TCC-4' (SEQ ID nr 51) (antysensy odpowiadające sekwencją pozycji 1005 do 1025 w SEQ ID nr 7).

Przy użyciu sondy znaczonej izotopem przeprowadzono hybrydyzację w temperaturze 42°C przez 20 godzin w 500 ml roztworu reaktywnego o takim samym składzie jak roztwór do prehybrydyzacji. Uzyskane filtry wymywano trzykrotnie w 2 x SSC/0,1% roztworu SDS w temperaturze pokojowej przez 5 minut, a następnie jeden raz w 0,1 x SSC/0,1% roztworu SDS w temperaturze 68°C przez 1 godzinę. Filtry poddawano następnie przez 16 godzin autoradiografii w temperaturze -70°C przy użyciu ekranu wzmacniającego i filmu Χ-ΟΜΑΤ™ ARS (produkcji Eastman Kodak). W rezultacie uzyskano 13 sygnałów dodatnich. Osady w przybliżeniu odpo

179 884 wiadające każdemu z sygnałów dodatnich zbierano z oryginalnych płytek i posiewano ponownie na 15-centymetrowe płytki NZYM przy gęstości posiewu 1000 na każdą płytkę. Z każdej tak przygotowanej płytki sporządzono dwie kopie filtrów w celu przeprowadzenia hybrydyzacji w warunkach jak opisano powyżej. W rezultacie sygnały dodatnie stwierdzono na wszystkich filtrach z 13 grup. Z każdej tak uzyskanej płytki odzyskiwano pojedynczy osad w celu sporządzenia DNA fagowego metodą lizatu płytki opisaną w Molecular Cloning. Próbki DNA fagowego uzyskane z 13 klonów badano na obecność regionu kodującego cDNA przy użyciu primerów o następujących sekwencjach:

hTPO-L: 5'-GGC CAG CCA GAC ACC CCG GCC-3' (SEQ ID nr 52) (pozycje 1 do 21 w SEQ ID nr 6) hTPO-F: 5-ATG GGA GTC ACG AAG CAG TTT-3'(SEQ ID nr 53) (antysens odpowiadający sekwencji pozycji 127 do 147 w SEQ ID nr 6) hTPO-P: 5TGC GTT TCC TGA TGC TTG TAG-3' (SEQ ID nr 54) (pozycje 503 do 523 w SEQ ID nr 6) hTPO-V: 5'-AAC CTT ACC CTT CCT GAG ACA-3' (SEQ ID nr 55) (antysens odpowiadający sekwencji pozycji 1070 do 1090 w SEQ ID nr 6) Po przeprowadzeniu PCR przy użyciu powyższej kombinacji primerów stwierdzono, że 5 do 13 klonów prawdopodobnie zawiera całkowity region kodujący aminokwasy przewidywany w cDNA. Cząsteczki chromosomowego DNA zawarte w tych trzech klonach miały podobną długość około 20 kb i wykazywały prawie identyczne wzory w wyniku wstępnej analizy z zastosowaniem enzymów restrykcyjnych. Jeden z klonów (klon kHGTl) wybrano i analizowano metodą Southern blotting. Dokładniej, 1 pg DNA klony p-HTTl został kompletnie strawiony enzymami restrykcyjnymi EcoRI i Hindm i poddany elektroforezie na 0,8% żelu agarozowym, a pasma na żelu przeniesiono na BIODYNE™ A TRANSFER MEMBRANĘ (firmy PALL). Uzyskane filtry suszono na powietrzu przez 30 minut i wypiekano w ciągu 2 godzin w temperaturze 80°C w piecu próżniowym. Przeprowadzono prehybrydyzację za pomocą inkubacji tak przygotowanych filtrów w temperaturze 42°C przez 1 godzinę w 50 ml roztworu reaktywnego, składającego się z 50% formamidu, 5 x SSC, 5 x roztworu Denhardta, 1% SDS i 20 pg/ml DNA nasienia łososia. W celu zastosowania w roli sondy fragment cDNA ludzkiej TPO (numery pozycji zasad 178 do 1025 w SEQ ID nr 7) amplifikowano za pomocąPRC i oczyszczano. Oczyszczony fragment znaczono ³² P, stosując Random Primer DNA Labelling Kit (firmy Takara Shuzo). Uzyskane filtry wymywano trzykrotnie w 2 x SSC/0,1% roztworu SDS w temperaturze pokojowej przez 5 minut, a następnie jeden raz w 0,1 x SSC/0,1% roztworu SDS w temperaturze 68°C przez 1 godzinę. Filtry poddawano następnie przez 16 godzin autoradiografii w temperaturz -70°C przy użyciu ekranu wzmacniającego i filmu Χ-ΟΜΑΤ™ ARS (produkcji Eastman Kodak). Uzyskano pojedyncze pasmo długości około 10 kb w przypadku trawienia przez HindJII. 10 pg DNA klonu λ-HGTl było zatem trawione przez Hindlll i poddawane elektroforezie na 0,8% żelu agarozowym, z którego odcinano pasmo 10 kb, oczyszczano przy pomocy zestawu Prep-A-Gene DNA Purification Kit (firmy Bio-Rad) i subklonowano do wektora klonującego pUC13 (firmy Pharmacia), który uprzednio był trawiony przez /ΤζπίΖΠΙ. W tym przypadku jako szczep gospodarza zastosowano Competent-High E. coli DH5 firmy TOYOBO.

Z otrzymanych powyżej klonów wybrano klon zawierający fragment HindtW długości 10 kb, który nazwano pHGTl.

Mapę restrykcji klonu fagowego λ-HGTl przedstawia fig. 11.

<Przykład 25>

Oznaczanie sekwencji nukleotydów chromosomowego klonu pFIGTl ludzkiej TPO

Hodowanie klonu pHFT 1 i oczyszczanie DNA plazmidu przeprowadzono według sposobu opisanego w Molekular Cloning (Sambrook i in., Gold Spring Harbor Laboratory Press, 1989). Klon pHGTl hodowano przez noc 50 ml pożywki LB, zawierającej 50 pg/ml ampicyliny. Powstałe komórki, zebrane przez odwirowywanie, zawieszono w 4 ml roztworu TEG-lizozymu. Dodano 8 ml 0,2 N roztworu NaOH/1% SDS, a następnie 6 ml roztworu 5 M potasu/5 M octanu w celu dokładnego zawieszenia komórek. Po odwirowaniu zawiesiny nadsącz traktowano miesza

179 884 niną fenohi/chloroformu (1:1), mieszaną z tą samą ilością izopropanolu i odwirowywano. Powstałą granulkę rozpuszczano w roztworze TE i traktowano RNazą, a następnie znów mieszaniną fenolu/chloroformu (1:1), po czym wytrącano etanolem. Otrzymaną granulkę ponownie rozpuszczano w roztworze TE, do którego kolejno dodawano NaCl i glikol polietylenowy 3000 do uzyskania ostatecznego stężenia odpowiednio 0,63 M i 7,5%. Po odwirowaniu granulkę rozpuszczano w roztworze TE i wytrącano etanolem. W ten sposób uzyskano około 300 pg DNA plazmidu pHGTl.

Przy użyciu wspomnianego wyżej zestawu Taq Dye Deoxy™ Terminater Cycle Seąuening Kit (firmy Applied Biosystems) oczyszczony DNA plazmidu wprowadzono do wspomnianego wyżej analizatora sekwencji DNA 373A (firmy Applied Biosystems) w celu określenia całkowitej sekwencji nukleotydów wokół regionu kodującego proteiny, spodziewanej na podstawie sekwencji nukleotydów cDNA. Oznaczona w ten sposób sekwencja nukleotydów i wywnioskowana na tej podstawie sekwencja aminokwasów są przedstawione w Wykazie Sekwencji (SEQ ID nr 8). W tym przypadku oligonukleotydy, zastosowane w przykładzie 22 do analizy sekwencji nukleotydów cDNA i syntetyczne nukleotydy zaprojektowane w oparciu o wewnętrzną sekwencję uzyskaną w wyniku analizy sekwencyjnej wykorzystano jako primery do oznaczania sekwencji nukleotydów.

Stwierdzono, że chromosomowy DNA przenoszony przez klon plazmidu pHGTl zawiera całkowity region kodowania sekwencji aminokwasów wywnioskowany na podstawie SEQ ID nr 6, a sekwencja nukleotydów regionu kodującego jest całkowicie zgodna z sekwencją SEQ ID nr 6. Ponadto, region odpowiadający egzonowi kodującemu aminokwasy zawiera 4 introny o długości kolejno 231 bp, 286 bp, 1932 bp i 236 bp licząc od końca 5' (fig. 11). Sekwencja nukleotydów różniła się od sekwencji nukleotydów SEQ ID nr 7 w trzech pozycjach, identycznych z pozycjami opisanymi w przykładzie 22 (odmienne pozycje pomiędzy SEQ ID nr 6 i 7). Dokładnie, A (pozycja 84), A (pozycja 740) i G (pozycja 1198) w SEQ ID nr 7 były odpowiednio C, T i A w SEQ ID nr 8. Wyjaśniono zatem, że sekwencja nukleotydów cDNA ludzkiej TPO klonu pHTFl uzyskana w przykładzie 21 różni się od sekwencji nukleotydów klonu pHGTl chromosomowego DNA ludzkiego w trzech pozycjach. W celu sprawdzenia, czy te mutacje sekwencji klonu pHTF 1 cDNA odzwierciedlają sekwencję chromosomowego DNA oznaczano sekwencje nukleotydów innych 4 klonów spośród 5 klonów chromosomowego DNA niezależnie wybranych przez screening. Przeprowadzono analizę sekwencji metodąbezpośredniego oznaczania sekwencji nukleotydów przy użyciu próbki DNA fagowego sporządzonej metodą lizatu płytki opisaną w Molecular Cloning. Sekwencing każdego klonu wykonywano, wprowadzając go do wspomnianego wyżej analizatora sekwencji DNA 373A (firmy Applied Biosystems) przy pomocy primerów zastosowanych w przykładzie 22, które syntetyzowano w oparciu o części sekwencji, umożliwiające analizę wspomnianych wyżej 3 pozycji mutacji w sekwencji nukleotydów oraz wspomnianego wyżej zestawu Taq Dye Deoxy™ Terminater Cycle Seąuening Kit (firmy Applied Biosystems). Stwierdzono, że sekwencje nukleotydów wszystkich 4 klonów są identyczne z SEQ ID nr 6. Pozycja 84 i 740 odpowiadające SEQ ID nr 7 były w tych 4 klonach podstawione odpowiednio przez C i T. Pozycja 1198 była w dwóch klonach G, a w dwóch pozostałych A. Inaczej mówiąc, wyjaśniono, że istniejądwa typy sekwencji nukleotydów właściwe dla oryginalnego DNA chromosomów. Obecnie nie wiadomo jeszcze, czy takie różnice w sekwencji nukleotydów pochodzą od homologicznego chromosomu czy od wielu genów. Ponadto sugeruje się, że różnice w sekwencji nukleotydów mogąbyć spowodowane różnicąrasową, ponieważ poli (A)⁺ RNA zakupiony w Clontechu jest pochodzenia kaukaskiego, a DNA chromosomowy - pochodzenia japońskiego.

Wektor pHGTl, przenoszony przez szczep DH5 E. coli został zdeponowany przez twórców wynalazku 24 marca 1994 jako depozyt nr FERM BP-2565 w Państwowym Instytucie Biotechnologii, National Institute of Bioscience and Humań Technology, Agency of Industrial Science and Technology, japońskiego Ministerstwa Handlu Zagranicznego i Przemysłu.

179 884

67.

<Przykład 26>

Ekspresja chromosomowego DNA ludzkiej TPO w komórkach COS 1 i potwierdzenie aktywności TPO

Klon plazmidu pHGT 1 uzyskany przez subklonowanie zawierał w sumie 4 sekwencje rozpoznania EcoRI, 3 w części wstawionej i 1 w wektorze. Sekwencja nukleotydów wskazuje, że do fragmentu DNA został włączony cały region kodujący ludzka proteiną TPO długości około 4,3 kbp, umiejscowiony pomiędzy sekwencja rozpoznania EcoRI najbliższą strony 5' w części wstawionej a sekwencja rozpoznania EcoRI w wektorze. Fragment ten podwiązywano do traktowanego EcoRI wektora ekspresji pEF18S, uzyskując 4 plazmidy ekspresji ludzkiej TPO, pEFHGTE#l-4 (patrz fig. 11). Przygotowując DNA tego plazmidu przeprowadzono doświadczenie ekspresji. Oczyszczanie DNA plazmidu wykonano zasadniczo według sposobu opisanego w Molecular Cloning (Sambrook i in., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989), uzyskując około 250 pg DNA plazmidu.

Transfekcję otrzymanych klonów pEFGTE#l-4 do komórek COS 1 przeprowadzano według sposobu przykładu 11, tzn. dokonywano transfekcji 10 pg DNA plazmidu metodą DEAE-dekstran, obejmującą traktowanie chlorochiną. Transfekowane komórki COS 1 poddawano inkubacji przez trzy dni w temperaturze 37°C i zbierano nadsącz z hodowli.

Nadsącz z hodowli poddawano rozległej dializie w stosunku do pożywki IMDM i analizowano w systemie z zastosowaniem CFU-MK. Aktywność TPO stwierdzono w stopniu zależnym od dawki w nadsączu hodowli komórek COS 1, w których występowała ekspresja każdego z czterech klonów (pEFHGTE#l-4). Nie stwierdzono natomiast aktywności TPO w nadsączu z hodowli komórek COS 1, w którym ekspresji podlegał jedynie plazmid pEF 18S. Dane dla pEFHGTE#1 przedstawia fig. 12a. Podobne wyniki uzyskano w systemie analizy z zastosowaniem M-07e. Nadsącz z hodowli komórek COS 1, w którym ekspresji podlegał każdy z czterech klonów (pEFHGTE# 1 -4) znacząco pobudzał wzrost komórek M-07e w stopniu zależnym od dawki. Dane dla pEFHGTE# 1 przedstawia fig. 12b.

Powyższe wyniki wskazują że klony plazmidu pEFHGTE#l-4 przenoszą czynnościowy chromosomowy DNA ludzkiej TPO.

<P rzykład 27>

Przygotowanie DNA ludzkiej TPO typu delecji i jego ekspresja w komórkach COS 1 oraz potwierdzenie aktywności TPO

Wyniki przykładu 18 świadczą że ludzka TPO może wywierać aktywność biologiczną nawet po usunięciu jej trzeciej części karboksylowej. W celu dalszej analizy części biologicznie czynnych przeprowadzono doświadczenia z pochodnymi delecji. W tym przykładzie pochodne delecji TPO z brakującymi 20, 40, 60 lub 68 aminokwasami z końca karboksylowego proteiny TPO (aminokwasy 1-231) zakodowane przez pHT 1-231 badano pod względem zdolności wywierania aktywności biologicznej TPO in vitro. Najkrótsza pochodna (aminokwasy 1-163) nadal zawierała sekwencje aminokwasów odpowiadające TP2/3 TPO osocza szczurzego opisane w przykładzie 2. Plazmidy delecji sporządzono przy pomocy PCR, stosując DNA klonu plazmidu pHTl -231 uzyskanego w przykładzie 18 jako matrycę i syntetyzowane oligonukleotydy jako primery. Sekwencje primerów zastosowanych w PCR były następujące:

hTPO-5: 5'-TTT GAA TTC GGC CAG CCA GAC ACC CCG GCC-3' (SEQ ID nr 56) (uzyskano przez dodanie sekwencji rozpoznania EcoRI do sekwencji pozycji 1 do 21 w SEQ ID nr 4; jest to sekwencja identyczna z sekwencją opisaną w fig. 9);

hTPO-S: 5'-TTT GCG GCC GCT CAT TAG CTG GGG ACA GCT GTG GTG GGT-3' (SEQ ID nr 57) (antysens odpowiadający sekwencji pozycji 555 do 576 w SEQ ID nr 4, otrzymany przez dodanie dwóch kodonów kończących, TAA i TGA, oraz sekwencji rozpoznania Notl w celu uzyskania pochodnej delecji kodującej pozycje 1 do 163 reszt aminokwasowych);

hTPO-4: 5' TTT GCG GCC GCT CAT TAC AGT GTG AGG ACT AGA GAG GTT CTG-3' (SEQ ID nr 58) (antysens odpowiadający sekwencji pozycji 576 do 600 w SEQ ID nr 4; otrzymany przez dodanie dwóch kodonów kończących, TAA i TGA, oraz sekwencji rozpo

179 884 znania Not! w celu uzyskania pochodnej delecji kodującej pozycje 1 do 171 reszt aminokwasowych);

hTPO-3O: 5'-TTT GCG GCC GCT CAT TAT CTG GCT GAG GCA GTG AAG TTT GTC-3' (SEQ ID nr 59) (antysens odpowiadający sekwencji pozycji 636 do 660 w SEQ ID nr 4; otrzymany przez dodanie dwóch kodonów kończących, TAA i TG A, oraz sekwencji rozpoznania Notl w celu uzyskania pochodnej delecji kodującej pozycje 1 do 191 reszt aminokwasowych); oraz hTPO-2: 5'-TTT GCG GCC GCT CAT TAC AGA CCA GGA ATC TTG GCT CTG AAT-3' (SEQ ID nr 60) (antysens odpowiadający sekwencji pozycji 696 do 720 w SEQ ID nr 4; otrzymany przez dodanie dwóch kodonów kończących, TAA i TGA, oraz sekwencji rozpoznania Notl w celu uzyskania pochodnej delecji kodującej pozycje 1 do 211 reszt aminokwasowych).

Stosując 1 pg DNA klonu plazmidu pHT 1-231 uzyskanego w przykładzie 18 jako matrycę, po 10 pl zsyntetyzowanych wcześniej hTPO-5 (dla strony 5') i hTPO-2, -3, -4 i -S (dla strony 3') j ako primery oraz zestaw odczynników PCR GeneAmp™ z polimerazą DNA AmpliTaą™ (firmy Takara Shuzo Co., Ltd) przeprowadzono PCR w objętości 100 pl przy użyciu systemu Gene Amp™ PCR System 9600 (firmy PERKIN-ELMER), powtarzając ogółem 20 cykli, z których każdy obejmuje denaturację w 95°C przez 1 minutę, wyżarzanie w 65°C przez 1 minutę i syntezę w 72° przez jednąminutę oraz końcową inkubację w 72°C przez 7 minut. Pasmo, stanowiące przedmiot zainteresowania, uzyskane z każdej PCR było trawione enzymami restrykcyjnymi £coRI i Notl, a produkt trawienia poddawano elektroforezie na 1% żelu agarozowym (firmy FMC Bio Products) w celu wyizolowania głównego fragmentu DNA przewidywanej wielkości, amplifikowanego w każdej PCR. Wyizolowany fragment DNA oczyszczano przy użyciu zestawu Prep-A-Gene DNA Purification Kit (firmy Bio-Rad), a następnie subklonowano do wektora ekspresji pEF 18S, który uprzednio traktowano tymi samymi enzymami restrykcyjnymi. W tym przypadku jako szczep gospodarza zastosowano Competent-High E. coli DH5 firmy TOYOBO. Z otrzymanych transformantów, pochodzących z każdej PCR, wybrano 4 do 5 klonów, które zawierały wstawkę przewidywanej wielkości w celu uzyskania próbek DNA plazmidu zasadniczo według sposobu opisanego w Molecular Cloning (Sambrook i in., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989). W serii takich operacji otrzymywano próbki DNA plazmidu z pochodnych delecji kodujących pozycje 1 do 163 reszt aminokwasowych (pHTl-163#l-5), pochodnych delecji kodujących pozycje 1 do 191 reszt aminokwasowych (pHTl-191#l-4) oraz pochodnych delecji kodujących pozycje 1 do 211 reszt aminokwasowych (pHTl-211#1 -4). Całą długość zamplifikowanego regionu każdego plazmidu poddawano analizie sekwencji nukleotydów, stwierdzając jako całkowitą tożsamość z sekwencją nukleotydów przedstawioną w SEQ ID nr 4).

Transfekcję otrzymanych klonów do komórek COS 1 przeprowadzano według sposobu przykładu 11, tzn. dokonywano transfekcji 10 pg każdej próbki DNA plazmidu metodą DEAEdekstran, obejmującą traktowanie chlorochiną. Transfekowane komórki COS 1 hodowano przez trzy dni, a następnie odzyskiwano nadsącze z hodowli.

Nadsącze z hodowli poddawano rozległej dializie w stosunku do pożywki IMDM i analizowano w systemie z zastosowaniem CFU-MK. Aktywność TPO stwierdzono w stopniu zależnym od dawki w nadsączu hodowli komórek COS 1, w których ekspresja każdego z klonów pHTl-211, pHTl-191, pHTl-171 lub pHTl-163. Dane dla pHtl-211#l, pH Tl-191#l i pHTl-171#2 przedstawia fig. 13a. Podobne wyniki uzyskano w systemie analizy z zastosowaniem M-07e. Nadsącz z hodowli komórek COS 1, w którym ekspresji podlegały pHT 1-211, pHTl-191, pHTl-171 lub pHTl-163 znacząco pobudzał proliferację komórek M-07. Dane dla pHTl-211#l, pHTl-191#l, pHTl-171#2 lub pHTl#2 przedstawia fig. 14.

Powyższe wyniki wskazują, że TPO ludzka zachowuje nadal aktywność biologicznąin vitro nawet po usunięciu jej połowy końcówki karboksylowej po Ser (pozycja 163) i świadczą najprawdopodobniej, że części biologicznie czynne ludzkiej TPO mieszczą się w połowie końcówki aminowej zakończonej przez Ser (pozycja 163).

179 884 <Przykład 28>

Otrzymywanie ludzkiej TPO typu delecji końcówki C i jej ekspresja oraz aktywność w komórkach COS 1

W celu przeprowadzenia analizy regionu niezbędnego do wywierania aktywności ludzkiej proteiny TPO, usunięto aminokwasy końcówki C z pochodnych delecji uzyskanych w przykładzie 27 i badano aktywność TPO podlegającą ekspresji w komórkach COS 1, Przy użyciu klonu plazmidu pEF18S-HL34 uzyskanego w przykładzie 16 sporządzono plazmidy ekspresji, usuwając sekwencje nukleotydów kodujących reszty aminokwasowe końcówki C, poczynając od seryny na pozycji 163. Plazmidy delecji uzyskano za pomocą PCR. Sekwencje primerów sporządzonych do wykorzystania w PCR są następujące:

hTPO-5: 5'-TTT GAA TTC GGC CAG CCA GAC ACC CCG GCC-3' (SEQ ID nr 61) (otrzymana przez dodanie sekwencji rozpoznaniaEcoRI do sekwencji pozycji 1 do 21 w SEQ ID' nr 4; tę samą sekwencję pokazano w przykładzie 18);

hTPO-150: 5' ITT GCG GCC GCT CAT TAG AGG GTG GAC CCT CCT AC A AGT AT-3' (SEQ ID nr 62) (antysens odpowiadający sekwencji pozycji 514 do 537 w SEQ ID nr 4; otrzymany przez dodanie dwóch kodonów kończących TAA i TGA oraz sekwencji rozpoznania Notl w celu uzyskania mutanta delecji kodującego pozycje 1 do 150 reszt aminokwasowych);

hTPO-151: 5'-TTT GCG GCC GCT CAT TAG CAG AGG GTG GAC CCT AC A A-3' (SEQ ID nr 63) (antysens odpowiadający sekwencji pozycji 518 do 540 w SEQ ID nr 4; otrzymany przez dodawanie dwóch kodonów kończących, TAA i TGA oraz sekwencji rozpoznania Notl w celu uzyskania pochodnych delecji kodujących pozycje 1 do 151 reszt aminokwasowych);

hTPO-153:5'-TTT GCG GCC GCT CAT TAC CTG ACG CAG AGG GTG CC-3' (SEQ ID nr 64) (antysens odpowiadający sekwencji pozycji 526 do 546 w SEQ ID nr 4; otrzymany przez dodawanie dwóch kodonów kończących TAA i TGA oraz sekwencji rozpoznania Notl w celu uzyskania pochodnych delecji kodujących pozycje 1 do 153 reszt aminokwasowych);

hTPO-154: 5'-TTT GCG GCC GCT CAT TAC CGC CTG ACG CAG AGG GTG GA-3' (SEQ ID nr 65) (antysens odpowiadający sekwencji pozycji 529 do 5349 w SEQ ID nr 4; otrzymany przez dodanie dwóch kodonów kończących TAA i TGA oraz sekwencji rozpoznania Notl w celu uzyskania pochodnych delecji kodujących pozycje 1 do 154 reszt aminokwasowych);

hTPO-155: 5'-TTT GCG GCC GCT CAT TAG GCC CGC CTG ACG CAG AGG GT-3' (SEQ ID nr 66) (antysens odpowiadający sekwencji pozycji 532 do 552 w SEQ ID nr 4; otrzymany przez dodanie dwóch kodonów kończących TAA i TGA oraz sekwencji rozpoznania Notl w celu uzyskania pochodnych delecji kodujących pozycje 1 do 155 reszt aminokwasowych);

hTPO-165: 5'-TTT GCG GCC GCT CAT TAT GGG GCC CGC CTG ACG CAG AG-3' (antysens odpowiadający sekwencji pozycji 535 do 555 w SEQ ID nr 4; otrzymany przez dodawanie dwóch kodonów kończących TAA i TGA oraz sekwencji rozpoznania Notl w celu uzyskania pochodnych delecji kodujących pozycje 1 do 156 reszt aminokwasowych);

hTPO-157: 5'-TTT GCG GCC GCT CAT TAG GGT GGG GCC CGC ACG CA-3' (SEQ ID nr 68) (antysens odpowiadający sekwencji pozycji 538 do 558 w SEQ ID nr 4; otrzymany przez dodawanie dwóch kodonów kończących TAA i TGA oraz sekwencji rozpoznania Notl w celu uzyskania, a pochodnych delecji kodujących pozycje 1 do 157 reszt aminokwasowych).

Wykonano PCR stosując 1 pg DNA klonu plazmidu pEF18S-HL34, uzyskanego w przykładzie 16 jako matrycę i po 10 pl zsyntetyzowanych wcześniej oligonukleotydów (hTPO-5 dla strony 5'i hTPO-150, -151, -153, -154, -155, -156 i -157 dla strony 3' jakoprimery. Przy użyciu zestawu odczynników PCR GeneAmp™ z polimeraząDNA AmpliTaą™ (firmy Takara Shuzo Co., Ltd.) przeprowadzono PCR w objętości 100 pl za pomocą systemu Gene Amp™ PCR. System 9600 (firmy PERKIN-ELMER), powtarzając ogółem 20 cykli, z których każdy obejmuje denaturację w 95°C przez 1 minutę, wyżarzanie w 66°C przez 1 minutę i syntezę w 72° przez jednąminutę oraz końcową inkubację w 72°C przez 7 minut. Pasmo, stanowiące przedmiot zainteresowania, uzyskane z każdej PCR było trawione enzymami restrykcyjnymi EcoRI i Notl, a produkt trawienia poddawano elektroforezie na 1 % żelu agarozowym (firmy FMC Bio Products) w celu wyizolowania w każdej PCR głównego fragmentu DNA przewidywanej wielkości. Wy

179 884 izolowany fragment DNA oczyszczano przy użyciu zestawu Prep-A-Gene DNA Purification Kit (firmy Bio-Rad), a następnie subkolowane do wektora ekspresji pEFl 8S, który uprzednio traktowano tymi samymi enzymami restrykcyjnymi. W tym przypadku jako szczep gospodarza zastosowano Competent-High E. coli DH5 firmy TOYOBO. Z otrzymanych transformantów.pochodzących z każdej PCR, wybrano 3 do 5 klonów, które zawierały wstawkę przewidywanej wielkości w celu uzyskania próbek DNA plazmidu zasadniczo według sposobu opisanego W Molecular Cloning (Sambrook i in., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989). W serii takich operacji otrzymywano próbki DNA plazmidu pochodnych delecji kodujących pozycje 1 do 150 reszt aminokwasowych (pHTl-150#21, 22 i 25), pochodnych delecji kodujących pozycje 1 do 151 reszt aminokwasowych (pHTl-151#16,17 i 18), pochodnych delecji kodujących pozycje do 153 reszt aminokwasowych (pHTl-153#l do 4), pochodnych delecji kodujących pozycje 1 do 154 reszt aminokwasowych (pHTl-154#l do 5), pochodnych delecji kodujących pozycje 1 do 155 reszt aminokwasowych (pHTl-155# 1 do 5), pochodnych delecji kodujących pozycje 1 do 156 reszt aminokwasowych (pHTl-156# 1 do 5) i pochodnych delecji kodujących pozycje 1 do 157 reszt aminokwasowych (pHTl-157# 1 do 5).

Z oczyszczonych próbek DNA plazmidu sekwencje pHTl-150#21, 22 i 25 oraz pHTl-151#16,17 i 18 badano za pomocą analizatora sekwencji 373A DNA Seąuencer firmy Applied Biosystems przy pomocy zestawu Taq Dye Deoxy™ Terminater Cycle Sequening Kit (Applied Biosystems), przy czym potwierdzono przewidywane sekwencje cDNA TPO bez substytucji w pełnych sekwencjach nukleotydów.

Transfekcję każdego z otrzymanych klonów do komórek COS 1 przeprowadzano według sposobu przykładu 11, tzn. dokonywano transfekcji 10 pg każdej próbki DNA plazmidu metodą DEAE-dekstran, obejmującą traktowanie chlorochinąi po trzech dniach zbierano nadsącz z hodowli. Uzyskany nadsącz poddawano dializie w stosunku do pożywki IMDM opisanej powyżej i analizowano w systemie z zastosowaniem M-07e. Aktywność TPO stwierdzono w nadsączu z hodowli komórek COS 1 z odpowiednimi klonami kodującymi pochodne delecji końcówki C, składające się z pozycji aminokwasów 1 do 151, pozycji aminokwasów 1 do 153, pozycji aminokwasów 1 do 154, pozycji aminokwasów 1 do 155, pozycji aminokwasów 1 do 156 lub pozycji aminokwasów 1 do 157. Wszystkie te pochodne zawierają resztę cysteiny na pozycji 151. Aktywności TPO nie stwierdzono natomiast w nadsączu hodowli komórek COS 1 transfekowanych klonem kodującym pochodne delecji strony końcówki C składające się z pozycji aminokwasów 1 do 150, w których usunięto również resztę cysternową na pozycji 151.

<Przykład 29>

Otrzymywanie ludzkiej TPO typu delecji końcówki N oraz ich ekspresja i aktywność w komórkach COS 1

W celu przeprowadzenia analizy regionu niezbędnego do wywierania aktywności ludzkiej proteiny TPO, usunięto aminokwasy końcówki strony N z pochodnych delecji uzyskanych w przykładzie 28 i badano aktywność TPO otrzymanych w ten sposób pochodnych delecji. Przy użyciu klonu plazmidu pEF18S-HL34, uzyskanego w przykładzie 16 oraz klonu plazmidu pHTl-163, uzyskanego w przykładzie 27 sporządzono plazmidy ekspresji, usuwając sekwencje nukleotydów kodujących reszty aminokwasowe końcówki N za sekwencją sygnałową. Plazmidy delecji uzyskano za pomocą PCR. Sekwencje primerów sporządzonych do wykorzystania PCR są następujące:

hTPO-5: 5'-TTT GAA TTC GGC CAG CC A GAC ACC CCG GCC-3' (SEQ ID nr 69) (uzyskano przez dodanie sekwencji rozpoznania EcoRI do sekwencji pozycji 1 do 21 w SEQ ID nr 4: taką samą sekwencję pokazano w przykładzie 18);

hTPO3: 5'-TTT GCG GCC GCT ACT TAT TCG TGT ATC CTG TTC AGG TAT CC-3' (SEQ ID nr 70) (antysens odpowiadający sekwencji pozycji 757 do 780 w SEQ ID nr 4; otrzymany przez dodanie dwóch kodonów kończących, TAA i TGA, oraz sekwencji rozpoznania Notl, taką samą sekwencję syntetyzowano w celu uzyskania pochodnej delecji kodującej pozycje 1 do 231 reszt aminokwasowych);

179 884 hTPO-S: 5'-TTT GCG GCC GCT CAT TAG CTG GGG ACA GCT GTG GTG GGT-3' (SEQ ID nr 71) (antysens odpowiadający sekwencji pozycji 555 do 576 w SEQ ID nr 4; otrzymany w celu uzyskania pochodnej delecji kodującej pozycje 1 do 231 reszt aminokwasowych);

hTPO-13: 5'-CAT GGG AGT CAC GAA GCA GTT TAC TGG ACA GCG TTA GCC TTG CAG TTA G-3' (SEQ ID nr 72) (pozycje 124 do 173 w SEQ ID nr 4; otrzymany w celu uzyskania pochodnej, z której usunięto reszty aminokwasowe pozycji 1 do 12);

hTPO-13R: 5'-CAT GGG AGT CAC GAA GCA GTT TAC TGG ACA GCG TTA GCC TTG CAG TTA G-3' (SEQ ID nr 73) (antysens odpowiadający sekwencji pozycji 64 do 87 oraz 124 do 148 w SEQ ID nr 4; otrzymany w celu uzyskania pochodnej, z której usunięto reszty aminokwasowe pozycji 1 do 12);

hTPO-7: 5'-TGT GAC CTC CGA GTC CTC AGT AAA CTG CTT CGT GAC TCC CAT GTC CTT C-3' (SEQ ID nr 74) (pozycje 106 do 154 w SEQ ID nr 4; otrzymany w celu uzyskania pochodnej, z której usunięto reszty aminokwasowe pozycji 1 do 6);

hTPO-7R: 5'-TTT ACT GAG GAC TCG GAG GTC ACA GGA CAG CGT TAG CCT TGC AGT TAG-3' (SEQ ID nr 75) (antysens odpowiadający sekwencji pozycji 64 do 87 oraz 106 do 129 w SEQ ID nr 4; otrzymany w celu uzyskania pochodnej, z której usunięto reszty aminokwasowe pozycji 1 do 6);

hTPO-8: 5'-GAC CTC CGA GTC CTC AGT AAA GTC CTT CGT GAC TCC CAT CTC CTT CAC A-3' (SEQ ID nr 76) (pozycje 109 do 157 w SEQ ID nr 4; otrzymany w celu uzyskania pochodnej, z której usunięto reszty aminokwasowe pozycji 1 do 6); oraz hTPO-8R: 5'-CAG TTT ACT GAG GAC TCG GAG GTC GGA CAG CGT TAG CCT TGC AGT TAG-3' (SEQ ID nr 77) (antysens odpowiadający sekwencji pozycji 64 do 87 oraz 109 do 132 w SEQ ID nr 4; otrzymany w celu uzyskania pochodnej, z której usunięto reszty aminokwasowe pozycji 1 do 7);

(1) Otrzymywanie pochodnej (pHTl 3-231), w której zostały usunięte reszty aminokwasowe pozycji 1 do 12.

PCR wykonano, stosując 1,4 pg DNA plazmidu klonu pEF18S-HL34 uzyskanego w przykładzie. 18 jako matrycę, po 5 pl zsyntetyzowanych wcześniej oligonukleotydów (hTPO-13 i hTPO-3 w jednej kombinacji oraz hTPO-5 i HTPO-13R w drugiej kombinacji) jako primery. Przy użyciu zestawu odczynników PCR GeneAmp™ z polimeraząDNA AmpliTaą™ (firmy Takara Shuzo Co., Ltd) przeprowadzono PCR w objętości 100 pl przy użyciu systemu Gene Amp™ PCR System 9600 (firmy PERKIN-ELMER) i po 5 minutach denaturacji w 96°C powtarzano ogółem 30 cykli, z których każdy obejmuje denaturację w 95°C przez 1 minutę, wyżarzanie w 65°C przez 1 minutę i syntezę w 72° przez jedną minutę oraz końcową inkubację w 72°C przez 7 minut. Każdy z produktów PCR poddawano elektroforezie na 1 % żelu agarozowym (firmy FMC Bio Products) w celu wyizolowania głównego fragmentu DNA przewidywanej wielkości, który następnie oczyszczano przy użyciu Prep-A-Gene DNA Purification Kit (firmy Bio-Rad) i rozpuszczano w 15 pl bufora TE. Następnie wykonywano drugą PCR przy użyciu 1 pg z każdego tak otrzymanego roztworu jako matrycy.

DrugąPCR wykonano, stosując po 5 pl zsyntetyzowanych primerów (hTPO-5 i hTPO-3). Przy użyciu zestawu odczynników PCR GeneAmp™ z polimeraząDNA AmpliTaą™ (firmy Takara Shuzo Co., Ltd.) przeprowadzono PCR w objętości 100 pl przy użyciu systemu Gene Amp™ PCR System 9600 (firmy PERKIN-ELMER) i po 5 minutach denaturacji w 96°C powtarzano ogółem 30 cykli, z których każdy obejmuje denaturację w 95°C przez 1 minutę, wyżarzanie w 60°C przez 1 minutę i syntezę w 72° przez jedną mi nutę oraz końcową inkubację w 72°C przez 7 minut. Każdy z produktów PCR poddawano elektroforezie na 1,2% żelu agarozowym (firmy FMC Bio Products) w celu wyizolowania głównego fragmentu DNA przewidywanej wielkości, który następnie oczyszczano przy użyciu Prep-A-Gene DNA Purification Kit (firmy Bio-Rad) i rozpuszczano w 15 pl bufora TE. Po trawieniu enzymami restrykcyjnymi EcoRI i Notl uzyskany roztwór poddawano ekstrakcji taką sama objętością fenolu/chloroformu, a następnie wytrącano etanolem. Po odwirowaniu uzyskany osad rozpuszczano w 15 pl bufora TE i subklonowano do wektora ekspresji pEFl 8S, który uprzednio traktowano tymi samymi enzymami restrykcyjnymi.

179 884

W tym przypadku jako szczep gospodarza zastosowano Competent-High E. coli DH5 firmy TOYOBO. Z otrzymanych transformantów wybrano 45 klonów, które zawierały wstawkę przewidywanej wielkości w celu uzyskania próbek DNA plazmidu zasadniczo według sposobu opisanego w Molecular Cloning (Sambrook i in., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989). W ten sposób było możliwe uzyskanie DNA plazmidu pochodnej delecji (pHT13-231) kodującej cząsteczkę proteiny, w której usunięto reszty aminokwasowe pozycji 1 do 12 z wyjściowych reszt aminokwasowych pozycji 1 do 231. Po poddaniu tych 45 klonów reakcji PCR przy użyciu primerów hTPO-5 i hTPO-3, potwierdzono w 8 klonach istnienie wstawek wielkości w przybliżeniu zgodnej z oczekiwaniami. Sekwencje 3 spośród tych klonów analizowano przy pomocy analizatora sekwencji 373A DNA Seąuencer firmy Applied Biosystems przy użyciu zestawu Taq Dye Deoxy™ Terminator Cycle Sequening Kit (Applied Biosystems), uzyskując klon pHT13-231#3 o zaprojektowanej sekwencji cDNA TPO i spodziewanej delecji bez uzupełnień itp. w całej sekwencji nukleotydów.

(2) Otrzymywanie pochodnej (pHT7-163), w której usunięto reszty aminokwasowe pozycji 1 do 6

W tym przypadku zastosowano aminokwas 163 pozycji jako końcówkę C w celu uzyskania pochodnych delecji, ponieważ - mimo że w poprzednim etapie (1) końcówkę C proteiny TPO dla otrzymywania pochodnych delecji wyznaczono aminokwas pozycji 231, stwierdzono jednak, że aktywność PTO może podlegać ekspresji nawet po dalszym usunięciu aminokwasów końcówki C. Z tego samego powodu zastosowano aminokwas pozycji 163 jako końcówkę C również w następnym etapie (3). PCR wykonano, stosując 1,4 pg DNA plazmidu klonu pHT 1-163 uzyskanego w przykładzie 27 j ako matrycę, po 5 μΐ zsyntetyzowanych oligonukleotydów (hTPO-7 i hTPO-S w jednej kombinacji oraz hTPO-5 i HTPO-7R w drugiej kombinacji) jako primery. Przy użyciu zestawu odczynników PCR GeneAmp™ z polimerazą DNA AmpliTaq™ (firmy Takara Shuzo Co., Ltd.) przeprowadzono PCR w objętości 100 μΐ przy użyciu systemu Gene Amp™ PCR System 9600 (firmy PERKIN-ELMER) i po 5 minutach denaturacji w 96°C powtarzano ogółem 30 cykli, z których każdy obejmuje denaturacj ę w 95°C przez 1 minutę, wyżarzanie w 65°C przez 1 minutę i syntezę w 72° przez jedną minutę oraz końcową inkubację w 72°C przez 7 minut. Każdy z produktów PCR poddawano elektroforezie na 1,2% żelu agarozowym (firmy FMC Bio Products) w celu wyizolowania głównego fragmentu DNA przewidywanej wielkości, który następnie oczyszczano przy użyciu Prep-A-Gene DNA Purification Kit (firmy Bio-Rad) i rozpuszczano w 15 μΐ bufora TE. Następnie wykonywano drugąPCR przy użyciu 1 pg z każdego tak otrzymanego roztworu jako matrycy.

DrugąPCR wykonano, stosując po 5 pl zsyntetyzowanych primerów (hTPO-5 i hTPO-S). Przy użyciu zestawu odczynników PCR GeneAmp™ z polimeraząDNA AmpliTaq™ (firmy Takara Shuzo Co., Ltd.) przeprowadzono PCR w objętości 100 pl przy użyciu systemu Gene Amp^rM PCR System 9600 (firmy PERKIN-ELMER) i po 5 minutach denaturacji w 95°C powtarzano ogółem 30 cykli, z których każdy obejmuje denaturację w 95°C przez 1 minutę, wyżarzanie w 60°C przez 1 minutę i syntezę w 72° przez jedną minutę oraz końcową inkubację w 72°C przez 7 minut. Każdy z produktów PCR poddawano elektroforezie na 1,2% żelu agarozowym (firmy FMC Bio Products) w celu wyizolowania głównego fragmentu DNA przewidywanej wielkości, który następnie oczyszczano przy użyciu Prep-A-Gene DNA Purification Kit (firmy Bio-Rad) i rozpuszczano w 15 pl bufora TE. Po trawieniu enzymami restrykcyjnymi EcoRI i Notl uzyskany roztwór poddawano ekstrakcji taką samą objętością fenolu/chloroformu, a następnie wytrącano etanolem. Po odwirowaniu uzyskany osad rozpuszczano w 15 pl bufora TE i subklonowano do wektora ekspresji pEF 18S, który uprzednio traktowano tymi samymi enzymami restrykcyjnymi. W tym przypadku jako szczep gospodarza zastosowano Competent-High E. coli DH5 firmy TOYOBO. Z otrzymanych transformantów wybrano 30 klonów, które zawierały wstawkę przewidywanej wielkości w celu uzyskania próbek DNA plazmidu zasadniczo według sposobu opisanego w Molecular Cloning (Sambrook i in., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989). W ten sposób było możliwe uzyskanie DNA plazmidu pochodnej delecji (pHT7-163) kodującej cząsteczkę proteiny, w której usunięto reszty aminokwasowe pozycji 1 do 6 z wyjściowych reszt

179 884 aminokwasowych pozycji 1 do 163. Po poddaniu tych klonów reakcji PCR przy użyciu primerów hTPO-5 i hTPO-S, potwierdzono we wszystkich klonach istnienie wstawek wielkości w przybliżeniu zgodnej z oczekiwaniami. Sekwencje 3 spośród tych klonów analizowano przy pomocy analizatora sekwencji 373A DNA Seąuencer firmy Applied Biosystems przy użyciu zestawu Taq Dye Deoxy™ Terminator Cycle Sequening Kit (Applied Biosystems), uzyskując dwa klony pHT7-163#4 i #29, każdy z zaprojektowaną sekwencji cDNA TPO i spodziewaną delecja bez uzupełnień itp. w całej sekwencji nukleotydów.

(3) Otrzymywanie pochodnej (pHT8-163), w której usuniętą reszty aminokwasowe pozycji 1 do 7

Pochodną(pFT8-163) o usuniętych resztach aminokwasowych pozycji 1 do 7 sporządzono zasadniczo w sposób opisany powyżej dla sporządzenia pochodnej (pHT7-163) o usuniętych resztach aminokwasowych pozycji 1 do 6. PCR wykonano, stosując 1,4 pg DNA plazmidu klonu pHT 1-163 uzyskanego w przykładzie 27 j ako matrycę, po 5 μΐ zsyntetyzowanych oligonukleotydów (hTPO-8 i hTPO-S w jednej kombinacji oraz hTPO-5 i HTPO-8R w drugiej kombinacji) jako primery. Przy użyciu zestawu odczynników PCR GeneAmp™ z polimerazą DNA Amp li Taq™ (firmy Takara Shuzo Co., Ltd.) przeprowadzono PCR w objętości 100 μΐ przy użyciu systemu Gene Amp™ PCR System 9600 (firmy PERKIN-ELMER) i po 5 minutach denaturacji w 95°C powtarzano ogółem 30 cykli, z których każdy obejmuje denaturację w 95°C przez 1 minutę, wyżarzanie w 65°C przez 1 minutę i syntezę w 72° przez jedną minutę oraz końcową inkubację w 72°C przez 7 minut. Każdy z produktów PCR poddawano elektroforezie na 1,2% żelu agarozowym (firmy FMC Bio Products) w celu wyizolowania głównego fragmentu DNA przewidywanej wielkości, który następnie oczyszczano przy użyciu Prep-A-Gene DNA Purification Kit (firmy Bio-Rad) i rozpuszczano w 15 μΐ bufora TE. Następnie wykonywano drugąPCR przy użyciu 1 pg z każdego tak otrzymanego roztworu jako matrycy.

DrugąPCR wykonano, stosując po 5 pl zsyntetyzowanych primerów (hTPO-5 i hTPO-S). Przy użyciu zestawu odczynników PCR GeneAmp™ z polimeraząDNA AmpliTaq™ (firmy Takara Shuzo Co., Ltd.) przeprowadzono PCR w objętości 100 μΐ przy użyciu systemu Gene Amp™ PCR System 9600 (firmy PERKIN-ELMER) i po 5 minutach denaturacji w 95°C powtarzano ogółem 30 cykli, z których każdy obejmuje denaturację w 95°C przez 1 minutę, wyżarzanie w 60°C przez 1 minutę i syntezę w 72° przez jedną minutę oraz końcową inkubację w 72°C przez 7 minut. Każdy z produktów PCR poddawano elektroforezie na 1,2% żelu agarozowym (firmy FMC Bio Products) w celu wyizolowania głównego fragmentu DNA przewidywanej wielkości, który następnie oczyszczano przy użyciu Prep-A-Gene DNA Purification Kit (firmy Bio-Rad) i rozpuszczano w 15 μΐ.bufora TE. Po trawieniu enzymami restrykcyjnymi EcoRI i Notl uzyskany roztwór poddawano ekstrakcji taką samą objętością fenolu/chloroformu, a następnie wytrącano etanolem. Po odwirowaniu uzyskany osad rozpuszczano w 15 μΐ bufora TE i subklonowano do wektora ekspresji pEF18S, który uprzednio traktowano tymi samymi enzymami restrykcyjnymi. W tym przypadku jako szczep gospodarza zastosowano Competent-High E. coli DH5 firmy TOYOBO. Z otrzymanych transformantów wybrano 30 klonów, które zawierały wstawkę przewidywanej wielkości w celu uzyskania próbek DNA plazmidu zasadniczo według sposobu opisanego w Molecular Cloning (Sambrook i in., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989). W ten sposób było możliwe uzyskanie DNA plazmidu pochodnej delecji(pHT7-163)kodującej cząsteczkę proteiny, w której usunięto reszty aminokwasowe pozycji 1 do 7 z wyjściowych reszt aminokwasowych pozycji 1 do 163 w SEQID nr 4. Po poddaniu tych klonów reakcji PCR przy użyciu primerów hTPO-5 i hTPO-S, potwierdzono we wszystkich klonach istnienie wstawek wielkości w przybliżeniu zgodnej z oczekiwaniami. Sekwencje 3 spośród tych klonów analizowano przy pomocy analizatora sekwencji 373A DNA Seąuencer firmy Applied Biosystems przy użyciu zestawu Taq Dye Deoxy™ Terminator Cycle Sequening Kit (Applied Biosystems), uzyskując dwa klony pHT8-163#33 i #48, każdy z zaprojektowaną sekwencji cDNA TPO i spodziewaną delecjąbez uzupełnień itp. w całej sekwencji nukleotydów.

179 884 (4) Ekspresja pochodnej delecji w komórkach COS 1 i potwierdzenie aktywności TPO Transfekcję każdego z otrzymanych klonów do komórek COS 1 przeprowadzano według sposobu przykładu 11, tzn. dokonywano transfekcji 10 pg każdej próbki DNA plazmidu metodą DEAE-dekstran, obejmującą traktowanie chlorochinąi po trzech dniach zbierano nadsącze z hodowli. Uzyskany nadsącz poddawano dokładnej dializie w stosunku do pożywki IMDM opisanej powyżej i analizowano w systemie z zastosowaniem M-07e

Stwierdzono słabą, lecz znaczącą aktywność TPO w nadsączu hodowli komórek COS transfekowanych klonem kodującym pochodną delecji składającą się z aminokwasów 7 do 163 pozycji. Aktywności TPO nie stwierdzono natomiast w nadsączy komórek COSI transfekowanych klonem kodującym pochodna delecji, składającą się z aminokwasów 8 do 163 pozycji lub aminokwasów 13 do 231 pozycji.

<Przykład 30>

Otrzymywanie pełnej długości plazmidu cDNA ludzkiej TPO (pHTPl)

W celu ekspresji w komórkach ssaków skonstruowano wektor ekspresji posiadający wszystkie regiony kodujące aminokwasy cDNA ludzkiej TPO przewidywane w SEQ ID nr 6.

Przeprowadzono PCR sposobem opisanym poniżej w celu uzyskania fragmentu DNA, który zawiera wszystkie regiony kodujące cDNA ludzkiej TPO.

Sekwencje nukleotydów użytych jako primery są następujące:

hTPO-I: 5'-TTG TGA CCT CCG AGT CCT CAG-3' (SEQ ID nr 78) (pozycje 105 do 125 w SEQ ID nr 6);

SA: 5'-CAG GTA TCC GGG GAT TTG GTC-3' (SEQ ID nr 79) (antysens odpowiadający sekwencji pozycji 745 do 767 w SEQ ID nr 6);

hTPO-P: 5'-TGC GTT TCC TGA TGC TTG TAG-3' (SEQ ID nr 80) (pozycje 503 do 523 w SEQ ID nr 6); oraz hTPO-KO: 5'-GAG AGA GCG GCC GCT TAC CCT TCC TGA GAC AGA TT-3' (SEQ ID nr 81) (sekwencja uzyskana przez dodanie sekwencji rozpoznania enzymu restrykcji Notl i sekwencji GAGAGA (SEQ ID nr 82) do sekwencji antysensu odpowiadającej sekwencji pozycji 1066 do 1086 w SEQ ID nr 6)

Pierwszą PCR przeprowadzono przy użyciu 300 ng klonu pEF18SHL34 uzyskanego w przykładzie 16 jako matrycy. Przy użyciu po 0,5 pMprimerówhTPO-l oraz SA i jednej jednostki Vent R™ polimerazy DNA (firmy New England BioLabs) wykonano PCR (powtórzenie łącznie 30 cykli, z których każdy składał się z inkubacji w 96°C przez 1 minutę, w 62° przez 1 minutę i w 72°C przez 1 minutę, a następnie końcowej inkubacji w 72°C przez 7 minut). Skład roztworu reaktywnego w końcowym stężeniu był następujący: 10 mM KC1, 10 mM (NH₄)₂ SO₄, 20 mM Tris-HCI (pH 8,8), 2 mM MgSO₄, 0,1% Triton Χ-100 i 200 μΜ dTTP mix.

Jeden mikrogram dostępnego w handlu preparatu poli (A)⁺ RNA pochodzącego ze zdrowej wątroby ludzkiej (produkcji Clontech) ogrzewano w temperaturze 70°C przez 10 minut, gwałtownie schładzano w lodzie, a następnie mieszano z 10 mM DTT, 500 μΜ dNTP mix, 25 ng losowo wybranego primeru (firmy Takara Shuzo), 10 jednostkami inhibitora RNazy (firmy BoehringerMannheim) i 200 jednostkami SuperScriptTM II RNase H' (firmy LIFE TECHNOLOGIES), a następnie poddawano inkubacji przez jednągodzinę w temperaturze 37°C w celu /syntetyzowania cDNA. Następnie wykonano drugąPCR (powtórzenie łącznie 30 cykli, z których każdy obejmował inkukację w temperaturze 96°C przez 1 minutę, w 58°C przez 1 minutę i w 72°C przez 1 minutę) przy użyciu 1/20 objętości roztworu reaktywnego syntetyzowanego cDNA jako matrycy i po 2,5 μΜ primerów hTPO-P i hTPO-KO oraz 2,5 jednostek polimerazy DNA AmpliTaąTM (firmy Takara Shuzo).

Każdy z roztworów uzyskanych w pierwszej i drugiej PCR poddawano elektroforezie na 1 % żelu agarozowym w celu wyizolowania odpowiednich fragmentów głównego DNA przewidywanej wielkości, które następnie oczyszczano przy użyciu Prep-A-Gene DNA Purification Kit (firmy Bio-Rad). Następnie przeprowadzono trzeciąPCR przy użyciu 1/20 objętości każdego z uzyskanych roztworów jak matrycy. Tę reakcję (ogrzewanie w 96°C przez dwie minuty, a następnie powtórzenie 3 cykli, z których każdy obejmował inkubację w 96°C przez dwie minuty i w 72°

179 884 przez 2 minuty i kolejną inkubację w 72°C przez 7 minut) przeprowadzono przy użyciu 1 jednostki polimerazy DNA Vent R™ (firmy New England BioLabs). Uzyskany roztwór reaktywny mieszano z 1 μΜ hTPO-I i 1 pM hTPO-KO, ogrzewano w 96°C przez 1 minutę, w 62°C przez 1 minutę i w 72°C przez jedną minutę, a następnie poddawano inkubacji w 72°C przez 7 minut. Uzyskany roztwór reaktywny ekstrahowano taką sama objętością fenolu/chloroformu nasyconych wodą, a następnie tą samą objętością chloroformu i poddawano ekstrakt wytrącaniu etanolem (2,5 objętości etanolu w obecności 0,3 M octanu sodu i 0,5 pl glikogenu firmy Boehringer-Mannheim) w celu odzyskania DNA. Odzyskany DNA był trawiony enzymami restrykcji Ra/nHI i Notl i poddawany elektroforezie na 1% żelu agarozowym, a wyizolowane w ten sposób pasmo o oczekiwanych wymiarach oczyszczano przy użyciu Prep-A-Gene DNA Purification Kit (firmy Bio-Rad), wiązano z wektorem pBluescript II SK⁺ (firmy Stratagene), który uprzednio trawiono enzymami restrykcyjnymi BamHI i Notl, a następnie transformowano do szczepu Competent-High E. coli DH5 (firmy TOYOBO). Z uzyskanych kolonii wybrano cztery w celu sporządzenia próbek DNA plazmidu. Sekwencję próbek oczyszczonego DNA plazmidu badano przy pomocy analizatora sekwencji 373A DNA Seąuencer firmy Applied Biosystems, stosując Taq Dye Deoxy™ Terminater Cycle Seąuening Kit (Applied Biosystems), uzyskując klon pBLTP o zaprojektowanej sekwencji cDNA TPO bez podstawienia w sekwencji nukleotydowej całego regionu pomiędzy BamHI i Notl.

Klon pBLTP trawiono enzymami restrykcyjnymi EcoRI i Βατή HI i poddawano elektoforezie na 1% żelu agarozowym, a wyizolowane pasmo o dużej masie cząsteczkowej oczyszczano przy użyciu Prep-A-Gene DNA Purification Kit (firmy Bio-Rad). W ten sam sposób traktowano enzymami restrykcyjnymi pEF18S-HL34 w celu oczyszczenia fragmentu DNA długości około 450 bp. Każdąz uzyskanych próbek DNA poddawano ligacji i transformowano do szczepu Competent-High E. coli DH5 (firmy TOYOBO). Z otrzymanych kolonii sporządzano próbki plazmidu DNA w celu uzyskania klonu pBLTEN, zawierającego wstawkę cDNA ludzkiej TPO. Uzyskany pBLTEN trawiono enzymami restrykcyjnymi EcoRI i Notl i poddawano elektroforezie na 1 % żelu agarozowym, a wyizolowany fragment DNA długości około 1200 bp oczyszczano przy użyciu Prep-A-Gene DNA Purification Kit (firmy Bio-Rad) związywano z wektorem ekspresji pEF18S, który uprzednio trawiono tymi samymi enzymami restrykcyjnymi, a następnie transformowano do szczepu Competent-High E. coli DH5 (firmy TOYOBO). Z uzyskanych kolonii sporządzano próbki DNA plazmidu w celu uzyskania pożądanego klonu pHTPl, który zawiera cały region kodowania cDNA ludzkiej TPO. DNA plazmidu uzyskano z klonu w dużych ilościach i wykorzystano do poniższych doświadczeń. Otrzymywanie DNA plazmidu przebiegało zasadniczo według sposobu opisanego w Molecular Cloning (Sambrook i in., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989).

<Przykład 31>

Otrzymywanie plazmidu ekspresji ssaków, pDEF202-hTPO-Pl do ekspresji ludzkiej TPO w komórkach jajnika chomika chińskiego (CHO)

Jeden mikrogram plazmidu pMGl zawierającego minigen reduktazy dihydrofolianowej (DHFR) trawiono enzymami restrykcyjnymi EcoRi i BamHi i poddawano elektroforezie na żelu agarozowym w celu wyizolowania fragmentu (około 2,5 kb), zawierającego minigen DHRF mysiej. Wyizolowany fragment DNA rozpuszczano w 25 ml roztworu reaktywnego, złożonego z mieszaniny 50 mM Tris-HCl (pH 7,5), 7 mM MgCl₂,1 mM 2-merkaptoetanolu i 0,2 mM dNTP, mieszano z dwoma jednostkami fragmentu Klenowa, a następnie poddawano inkubacji w temperaturze pokojowej przez 30 minut do wytworzenia tępych zakończeń z obu stron fragmentu DNA. Po traktowaniu fenolem/chloroformem i wytrącaniu etanolem, uzyskany fragment rozpuszczano w 10 ml roztworu TE (10 mM Tris-HCl (pH 8,0)/1 mM EDTA). Wektor ekspresji ssaków pEF18S trawiono enzymem restrykcyjnym Smal, defosforylowano fosfatazą alkaliczną (firmy Takara Shuzo) i wiązano z fragmentem DNA zawierającym minigen DHRF mysiej za pomocąhgazy T4 DNA (firmy Takara Shuzo) w celu uzyskania wektora ekspresji pDEF202.

Następnie utworzony wektor ekspresji pDEF202 trawiono enzymami restrykcyjnymi, EcoRI i Spel i poddawano elektroforezie na żelu agarozowym w celu wyizolowania większego

179 884 fragmentu DNA. Przez trawienie plazmidu pHTP 1 zawieraj ącego cDNA ludzkiej TPO (klon p 1) enzymami restrykcyjnymi EcoRI i SpeR otrzymano cDNA ludzkiej TPO, który związano z linearyzowanym wektorem pDEF202 przy użyciu ligazy T4 DNA (firmy Takara Shuzo) w celu uzyskania plazmidu pDEF202-h TPO-P1 dla ekspresji cDNA ludzkiej TPO. Ten skonstruowany plazmid zawiera początek replikacji SV40, ludzki czynnik wydłużania promotor la oraz wczesny sygnał poliadenylacji dla transkrypcji cDNA ludzkiej TPO, minigen DHRF mysiej i początek replikacji pUC18 oraz gen β-laktamazy (Amp^T).

<Przykład 32>

Ekspresja ludzkiej TPO w komórkach CHO

Komórki CHO (szczep DHRF: Urlaub i Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. t. 77. s. 4216, 1980) przechowywano w pożywce podstawowej α-minimum (a-MEM)(-), wzbogacona hipoksantyną i tymidyną), zawierającą 10% osocza płodu cielęcego (FCS), używając 6 cm płytki do hodowli tkankowej (Falcona). Transformacji komórek CHO plazmidem pDEF202-h TPO-P1 dokonywano metodą fosforanu wapnia (CellPhect, firmy Pharmacia), opisaną poniżej, 10 mikrogramów plazmidu pDEF202-h TPO-P1 sporządzonego w przykładzie 31 mieszano ze 120 ml bufora A i 120 ml H₂O, a uzyskaną mieszaninę poddawano inkubacji w temperaturze pokojowej przez 10 minut. Roztwór mieszano następnie ze 120 ml bufora B i pozostawiono w temperaturze pokojowej na dalsze 30 minut. Ten mieszany roztwór DNA dodawano następnie do hodowli i poddawano inkubacji przez 6 godzin w inkubatorze z CO₂. Po 6 godzinach hodowlę wymywano dwukrotnie pożywką a-MEM(-) pozbawioną osocza, traktowano przez dwie minuty pożywce a-MEM(-), zawierają 10% sulfotlenku dimetyłowego, a następnie poddawano inkubacji przez dwa dni w nieselektywnej pożywce (a-MEM(-) wzbogaconej hipoksantynąi tymidyną), zawierającej 10% dializowanego FCS. Po 2 dniach hodowli komórki selekcjonowano w pożywce selektywnej (a-MEM(-)), zawierającej 10% dializowanej FCS. W celu selekcji transformowanych komórek o fenotypie DHRF-dodatnim, komórki traktowano roztworem trypsyny/EDTA i powtórnie zawieszano w pożywce selektywnej. Komórki na 6 cm płytce do hodowli tkankowej rozdzielono na pięć 10 cm płytek lub 12 płytek po 24 zbiorniczki i hodowano w pożywce selektywnej. Pożywkę wymieniono co dwa dni. Aktywność ludzkiej TPO w pożywce hodowli komórek CHO o fenotypie DHRF-dodatnim oznaczano za pomocą analizy z zastosowaniem CFU-MK, analizy z zastosowaniem M-07e lub z zastosowaniem Ba/F3. Komórki wydzielające TPO ludzką do pożywki selekcjonowano następnie w pożywce selektywnej wzbogaconej 25 nM metotreksanu w celu wyizolowania klonu komórek produkującego większe ilości ludzkiej TPO.

W tym przypadku transfekcję komórek CHO można przeprowadzić również przez kotransfekcję komórek CHO plazmidami pHTPl i pMGl.

Szczep CHO (CHO-DUKXB11) transfekowany plazmidem pDEF202-h TPO-P 1 został zdeponowany przez zgłaszających wynalazek 31 stycznia 1995 jako depozyt nr FERM BP2565 w Państwowym Instytucie Biotechnologii, National Institute of Bioscience and Humań Technology. Agency of Industrial Science and Technology, japońskiego Ministerstwa Handlu Zagranicznego i Przemysłu.

<Przykład 33>

Konstrukcja wektora rekombinowanego BMCGSneo-hTPO-Pl do zastosowania w komórkach X 63.6.5.3.

Jeden mikrogram wektora ekspresji ssaków pBMCGSneo trawiono enzymami restrykcyjnymi, Xhoi i Notl i poddawano elektroforezie na żelu agarozowym w celu wyizolowania części DNA wektora. Ten fragment DNA i cDNA ludzkiej TPO (klon PI), uzyskany przez trawienie plazmidu pBLTEN zawierającego cDNA ludzkiej TPO enzymami restrykcyjnymi XhoR i Notl, wiązano przy użyciu ligazy T4 DNA w celu uzyskania poszukiwanego wektora ekspresji pBMCGSneo-hTPO-Pl. Ten plazmid ekspresji, zawierający wczesny promotor cytomegalowirusa, części intronu pochodzącego z genu β-globiny królika i region poliadenylowany dla transkrypcji cDNA ludzkiej TPO, gen β-globiny ludzkiej, 69% genu wirusa brodawczaka bydlęcego 1, promotor kinazy tymidynowej i region poliadenylowy, gen fosfotransferazy I (gen oporności na

179 884 neomycynę) i początek replikacji pBT 322 oraz gen β-laktamazy (Amp^T) i cDNA ludzkiej TPO wiązano z dolną strona promotora cytomegalowirusa.

<Przykład 34>

Ekspresja w komórkach X 63.6.5.3.

Komórki X 63.6.5.3. hodowano w minimalnej pożywce podstawowej Dulbecco (DME), zawierającej 10% osocza płodu bydlęcego. Transfekcję komórek X 63.6.5.3. plazmidem BMCGSneo hTPO wykonywano metodą elektroporacji opisaną poniżej.

mikrogramów plazmidu BMCGSneo-hTPO-Pl opisanego w przykładzie 33 dodawano do 750 μΐ pożywki DME zawierającej 10⁷ komórek i umieszczano w kuwecie do elektroporacji z otworem 4 mm, pozostawiając na 10 min w temperaturze 4°C. Kuwetę umieszczano następnie w aparacie do elektroporacji (ΒΤΧ 600 firmy ΒΤΧ) w celu przeprowadzenia transferu genów przy 380 V, 25 mF i 24 angstromach. Po transferze genów kuwetę ponownie pozostawia na 15 minut w temperaturze 4°C i wymywano komórki jeden raz pożywkę DEM zawierającą 10% osoczu płodu bydlęcego. Transfekowane komórki zawieszano w 50 ml DEM, zawierającej 10% osocza płodu bydlęcego rozdzielano do zbiorniczków na pięciu płytkach do hodowli tkankowej z 96 zbiorniczkami i hodowano przez 2 dni w inkubatorze z CO₂. Po dwóch dniach hodowli, pożywkę wymieniano na DEM, zawierającą 10% osocza płodu bydlęcego i 1 mg/ml G418 (firmy GIBSCO, przy czym wymianę pożywki przeprowadzano co trzy dni. Aktywność ludzkiej TPO w pożywce transformantów oznaczano zapomocąanalizy z CFU-MK, M-07e lub Ba/F3. Transformanty wydzielające ludzką TPO do pożywki klonowano dwukrotnie za pomocą rozcieńczania granicznego w celu uzyskania linii komórek wytwarzających ludzką TPO.

<Przykład 35>

Ekspresja ludzkiej TPO w komórkach COS 1 na dużą skalę

Transfekcji komórek COS 1 dokonywano metodą DEAE-dekstran obejmującą traktowanie chlorochiną, jak opisano w przykładzie 11. Komórki COS 1 (ATCC CRL 1650) hodowano w IMDM, zawierającej 10% (v/v) FCS w powlekanej kolagenem kolbie 175 cm² w temperaturze 37°C w inkubatorze z 5% dwutlenkiem węgla do uzyskania około 100% konfluencji komórek. W celu uzyskania powłoki kolagenowej kolby 25 ml roztworu kolagenu (Cellmatrix typ 1-C firmy Iwaki), którego stężenie ustalono na 0,3 mg/ml z 1 mM HC1 dodawano do każdej kolby wielkości 175 cm², roztwór kolagenu odzyskiwano po 1 godzinie pozostawiania w temperaturze pokojowej, a następnie tak przygotowaną kolbę wymywano j eden raz 20 do 5 0 ml PB S. Transfekcj ę wykonywano przez mieszanie 20 ml roztworu IMDM zawierającego 250 pg/ml DEAE-dekstranu (firmy Pharmacia), 60 μΜ chlorochiny (firmy Sigma) i 10% (v/v)Nu-Serum (firmy Collaborative) z plazmidem pHTPl (40 pg), który rozpuszczano w 500 μΐ HBS, dodawanie uzyskanej mieszaniny do komórek COS opisanych powyżej i znajdujących się w jednej 175 cm² kolbie, którą wymywano jeden raz pożywką IMDM bezpośrednio przed transfekcj ą, a następnie hodowanie komórek przez 3 godziny w temperaturze 37°C w inkubatorze z 5% dwutlenku węgla. Następnie przez odsysanie usuwano nadsącz z hodowli i wymywano komórki jeden raz pożywką IMDM, mieszano z 50 ml pożywki pozbawionej osocza i hodowano przez 5 dni w temperaturze 37°C w inkubatorze z 5% dwutlenkiem węgla w celu odzyskania nadsączu z hodowli. Do jednej operacji użyto 100 do 260 kolb wielkości 175 cm² i odzyskano 5 do 13 litrów nadsączu z hodowli. Pożywkę pozbawioną osocza sporządzano przez wzbogacenie IMDM 5 pg/ml insuliny (firmy Sigma), 5 pg/ml transferyny (firmy Sigma), 10 μΜ monoetanolaminy (firmy Wako Pure Chemical Industries), 25 nM seleninu sodowego (firmy Sigma) i 200 μg/ml BSA (albumina bydlęca o dużej czystości pozbawiona kwasów tłuszczowych, firmy Nichirei).

<Przykład 36>

Oczyszczanie pełnej długości ludzkiej TPO (pochodzącej z plazmidu ekspresji pHTPl, klonu PI) podlegającej ekspresji w komórkach COS i jej aktywność biologiczna

Poniżej opisano przykłady aktywności i oczyszczania ludzkiej TPO pełnej długości (pochodzącej z plazmidu ekspresji pHTPl) podlegającej ekspresji w komórkach COS 1. Najpierw przygotowywano produkt częściowo oczyszczony w celu zbadania aktywności powodującej przyrost płytek, a następnie przeprowadzono oczyszczanie dla uzyskania produktu wysokiej

179 884 czystości. Do pomiaru aktywności TPO używano głównie systemu analizy z zastosowaniem M-07e w opisanych poniżej etapach. Podobną aktywność TPO stwierdzono w systemie analizy z zastosowaniem DFU-MK. W analizach tych do każdej próbki dodawano albuminę osocza ludzkiego (HSA) do uzyskania ostatecznego stężenia 0,02 do 0,05%.

Najpierw komórki COS 1 transfekowane plazmidem pHTPl metodąOhashi i Sudo (Hideya Ohashi i Tadashi Sudo, Biosci. Biotech. Biochem., 58 (4), 758-759, 1994) hodowano przez 5 dni w temperaturze 37°C w 5% CO₂, stosując pozbawioną osocza pożywkę IMDM, zawierającą w 1000 ml 0,2 g BSA, 5 mg insuliny bydlęcej, 5 mg transferyny ludzkiej, 0,02 mM monoetanolaminy i 25 nM selenu sodowego, z czego uzyskano około 7 litrów pozbawionego osocza nadsączu z hodowli. Do pozbawionego osocza nadsączu dodawano inhibitory enzymów proteolitycznych p-APMSF i Pefabloc SC (fluorochlorowodorku4-(2-aminoetylo)-benzenosulfonylowego, firmy Merk, nr katalogowy 24839) do uzyskania stężenia około 1 mM, a następnie przeprowadzano filtrację przy użyciu filtru 0,2 pm w celu odzyskania nadsączu. Nadsącz zagęszczano około dziesięciokrotnie przy pomocy aparatu do ultrafiltracji (Omega Ultrasette, spadek nominalnej masy cząsteczkowej 8000, firmy Filtron; lub PLGC Pellicon Cassette, spadek nominalnej masy cząsteczkowej 1000, firmy Miliipore), 723 ml uzyskanego koncentratu (stężenie protein 3,38 mg/ml, suma protein 2445 mg, aktywność względna 43000, aktywność całkowita 105.100.000) mieszano z 1,6 moli na 1000 ml siarczanu amonu (w sumie 288 g) w celu uzyskania 804 ml roztworu zawierającego 1,5 M w ostatecznym stężeniu siarczanu amonu, a następnie tak uzyskany roztwór wprowadzano z prędkością przepływu 10 ml/min do kolumny Macro-Prep Methyl HIC (5 cm średnicy i 9 cm wysokości złoża, firmy Bio-Rad, nr katalogowy 156-0080), którą uprzednio zrównoważono buforem 20 mM cytrynianu sodu (pH 5,2) zawierającym 1,5 M siarczanu amonu. Po wprowadzeniu próbki dokonywano wymywania buforem 20 mM cytrynianu sodu (pH 5,2) zawierającego 1,25 M siarczanu amonu w celu uzyskania przechodzącej przez kolumnę frakcji FI (2384 ml; stężenie protein 0,864 mg/ml; suma protein 2061 mg; aktywność względna 6000).

Następnie roztwór do elucji wymieniano na 20 mM cytrynianu NA, pH 5,8 w celu uzyskania frakcji F2 (1092 ml; stężenie protein 0,776 mg/ml; suma protein 847 mg; aktywność względna 150000).

Uzyskaną frakcję F2 z kolumny Macro-Prep Methyl HIC (1081 ml) wprowadzano z prędkością przepływu 10 ml/min do kolumny SP Sepharose Fast Flow (3 cm średnicy i 10 cm wysokości złoża, firmy Pharmacia Biotech, numer katalogowy 17-0729-01), którą uprzednio zrównoważono buforem 20 mM cytrynianu sodu (pH 5,8). Po wprowadzeniu próbki przeprowadzano elucję buforem 20 mM cytrynianu sodu (pH 5,6), zawierającym 110 mM NaCl w celu uzyskania frakcji FI (2262 ml; stężenie protein 0,270 mg/ml; suma protein 610 mg; aktywność względna 30,000). Następnie roztwór do elucji wymieniano na bufor 20 mM cytrynianu sodu (pH 5,4), zawierający 400 mM NaCl w celu uzyskania frakcji F2 (856 ml; stężenie protein 0,189 mg/ml; suma protein 162 mg; aktywność względna 30,000). Następnie roztwór do elucji wymieniano na bufor 20 mM cytrynianu sodu (pH 5,2), zawierający 1000 mM NaCl w celu uzyskania wyeluowanej frakcji F3 (370 ml; stężenie protein 0,034 mg/ml; suma protein 12,6 mg; aktywność względna 150000).

Główną frakcję F2 TPO (845 ml) z etapu kolumny Sepharose Fast Flow mieszano z około 10% w ostatecznym stężeniu 1-propanolu i wprowadzano z prędkością przepływu 3 ml/min do kolumny LA-WGA (2 cm średnicy i 14 cm wysokości złoża, firmy Honen, numer katalogowy WG-007), którą uprzednio zrównoważono buforem 20 mM cytrynianu sodu (pH 5,4), zawierającym 400 mM NaCl. Po wprowadzeniu próbki wykonywano elucję przy użyciu mieszaniny bufora 20 mM cytrynianu sodu (pH 5,4), zawierającego 400 mM NaCl z 1-propanolem (9:1) w celu uzyskania frakcji F1 (64,4 ml; stężenie protein 0,0178 mg/ml; suma protein 1,15 mg; aktywność względna 17220). Następnie roztwór do elucji wymieniano na bufor 20 mM cytrynianu sodu (pH 6,1), zawierający 0,4 MGlcNAc i l-% 1-propanolu w celu uzyskania wyeluowan ej frakcji F2 (45 ml; stężenie protein 0,0104 mg/ml; suma protein 0,470 mg; aktywność względna 675000).

179 884

Główną frakcję F2 o aktywności TPO (340 ml) z operacji w kolumnie LA-WGA mieszano z około 0,005% w końcowym stężeniu TFA i poddawano chromatografii kolumnowej w kolumnie YMC-Pack CN-AP (6 mm średnicy o 250 mm wysokości złoża, firmy YMC, numer katalogowy AP-513). Przy użyciu 0,1% TFA jako rozpuszczalnika rozwijającego A i 1-propanololu, zawierającego 0,05% TFA jako rozpuszczalnika rozwijającego B wprowadzono próbkę z prędkością przepływu 0,6 ml/min do kolumny YMC-Pack CN-Ap, którą uprzednio zrównoważono 15% B. Po wprowadzeniu próbki zwiększano stężenie propanolu z 15% B do 25% i przeprowadzano elucję z gradientem liniowym z 25% B do 50% B przez 65 minut, zbierając eluaty w porcjach 1,5 ml (2,5 min) do próbek polipropylenowych.

Porcję 0,5 μΐ (1/300 frakcji) eluatu w każdej probówce mieszano z HSA i zagęszczano przez ultrafiltrację w celu uzyskania 0,25 ml roztworu hodowli testowej w IMDM, zawierającego 0,05% HSA w celu wykorzystania do identyfikacji frakcji o aktywności TPO. Silną aktywność TPO (aktywność względna około 630,000 do 4,800,00) stwierdzono w probówkach nr 25 do 30 (w zakresie stężenia propanolu 35,0 do 42,0%), które zebrano jako frakcję FA o aktywności TPO (13,5 ml).

Frakcje FA uzyskaną w etapie kolumny YMC-Pack CN-AP poddawano chromatografii kolumnowej w kolumnie Capcell Pack CI 300A (4,6 mm średnicy i 150 mm wysokości złoża, firmy Shiseido, katalog nr CI ΤΥΡΕ: SG300A) przy użyciu 0,1 % TFA jako rozpuszczalnik rozwijający Ai 1-propanol zawierający 0,05% TFAjako rozpuszczalnik rozwijający B. Porcję (8,9 ml) frakcji FA uzyskanej w operacji w kolumnie YMC-Pack CN-AP mieszano z 0,3 ml glicerolu, zagęszczano przez odparowywanie z wirowaniem i mieszano z około 2,5 ml 10% B, a uzyskany roztwór wprowadzano następnie z prędkością0,4 ml/mg do kolumny Capcell Pak CI 300A, którą uprzednio zrównoważono 20% B. Po wprowadzeniu próbki wykonywano wymywanie najpierw 20% B przez 5 minut, potem liniowym gradientem z 20% B do 40% B przez 50 minut, zbierając eluaty w porcjach po 1 ml (2,5 min) do probówek polipropylenowych.

Porcje 1 μΐ (1/1000 frakcji) eluatu w każdej probówce mieszano z HSA i zagęszczano przez ultrafiltrację w celu uzyskania 0,25 ml roztworu hodowli testowej w IMDM, zawierającego 0,05% HSA w celu wykorzystania do identyfikacji frakcji o aktywności TPO. Silną aktywność TPO (aktywność względna około 3,000,000 do 22,500,00) stwierdzono w probówkach nr 20 do 23 (w zakresie stężenia propanolu 28,5 do 32,5%), które zebrano jako frakcje wysokiej aktywności.

<Przykład 37>

Pomiar masy cząsteczkowej ludzkiej TPO podlegającej ekspresji w komórkach COS 1

Przypuszczano, że masa cząsteczkowa całkowitej długości ludzkiej TPO (pochodzącej z plazmidu ekspresji pHTPl, klon FI), podlegająca ekspresji w komórkach COS 1, powinna być większa niż masa cząsteczkowa wywnioskowana na podstawie wielkości łańcucha peptydowego ze względu na dodanie łańcucha cukrowego. W związku z tym, w pierwszym etapie przygotowano częściowo oczyszczoną frakcję TPO w podany poniżej sposób z nadsączu hodowli zawierającego ludzkąTPO całkowitej długości (pochodzącąz plazmidu ekspresji pHTPl, klon FI), podlegającą ekspresji w komórkach COS 1. Przy użyciu rozpuszczalnika rozwijającego A (0,1% kwasu trifhiorooctowego (TFA) i rozpuszczalnika rozwijającego B (1-propanol zwierający 0,05% TFA) i 0,3 ml nadsącz z hodowli wprowadzano do kolumny YMC-Pack PROTEIN-RP (0,46 cm średnicy i 15 cm złoża, firmy YMC, nr katalogowy A-PRRP-33-46-25), którą uprzednio zrównoważono 25% B, 25%B przepuszczano przez kolumnę przez 5 minut z prędkościąprzepływu 0,4 ml/min, a następnie przeprowadzano frakcjonowanie przy liniowym gradiencie gęstości z 25% do 50% B w ciągu 50 minut. Aktywność TPO stwierdzono w eluatach w zakresie 34,5% i 43,5% stężenia propanolu. Eluaty te odparowywano do sucha przez odwirowanie w celu uzyskania próbki częściowo oczyszczonej.

Następnie badano aktywność TPO w systemie analizy z zastosowaniem M-07e po ekstrakcji proteiny z żelu elektroforezy SDS-PAGE przeprowadzonej w warunkach nieredukcyjnych, jak opisano w przykładzie 1 lub mierzono masę cząsteczkową na podstawie zredukowanych markerów DPCin przy pomocy analizy zachodniej, która zostanie opisana później w przykładzie 45. Stwierdzono aktywność TPO w szerokim zakresie pozornej masy cząsteczkowej od mniej więcej

179 884

69000 do 94000, co potwierdza zmienność masy cząsteczkowej. Pozorna masa cząsteczkowa TPO na podstawie zredukowanych markerów DPCIII po trawieniu N-glikanazą (firmy Genzyme, nr katalogowy 1472-00) łańcucha cukrowego z wiązaniemN-glikozydowym oszacowano na 36000 do 40000, czyli więcej niż masa cząsteczkowa 35000 przewidywana na podstawie wielkości łańcucha peptydowego, co dobitnie wskazuje również na obecność łańcucha cukrowego z wiązaniem typu 0-glikozydowego.

W ten sam sposób określono pozorną masę cząsteczkową całkowitej długości ludzkiej TPO (uzyskanej z plazmidu ekspresji pHTPl, klon Pl), podlegającego ekspresji w komórkach COS 1 jako 63000 do 83000.

<Przykład 38>

Właściwości biologiczne ludzkiej TPO

Badano wpływ ludzkiej TPO na krwiotwórcze komórki ludzkie i szczurze, głównie przy użyciu nadsączu z hodowli komórek COS 1 transfekowanych pHTFl.

W analizie kolonii przy użyciu frakcji komórek CD34⁺DR⁺, otrzymanej z krwi rdzenia kręgowego człowieka ludzka TPO stymulowała powstawanie znaczącej liczby kolonii megakariocytów. Na przykład, 11,5 kolonii megakariocytów zostało utworzonych przez 6000 komórek CD34⁺DR⁺ w obecności 10% (v/v) nadsączu z hodowli komórek COS 1 transfekowanych pHT 1 -231. W celu zbadania wpływu ludzkiej TPO na komórki progenitorowe megakariocytów ludzkich w krwi obwodowej, otrzymywano w podany poniżej sposób komórki CD34⁺ z ludzkiej krwi obwodowej. Frakcję leukocytów uzyskaną z ludzkiej krwi obwodowej zapomocągradientu gęstości Ficolla-Paque'a pomniejszono a komórki przylepiające się do plastikowych naczyń. Komórki nieadherentne pozbawiono następnie komórek o dodatniej reakcji na aglutyninę sojową (SB A) za pomocą selektora AIS Microselecter SBA (Asahi Medical). Uzyskane komórki poddawano inkubacji w mikrosełektorze AIS CD 34 i zbierano adsorbowane komórki CD34⁺, podczas gdy komórki CD3⁺ hodowano przez 10 dni w obecności nadsączu z hodowli transfekowanych komórek COS 1 w płynnej pożywce. Stwierdzono selektywną proliferację komórek GpIIb/IIIa⁺ o dużych rozmiarach oraz wzrost ploidalności komórek GpHbIIIa⁺. Wyniki wskazują dobitnie, że ludzka TPO wywiera selektywne działanie na komórki progenitorowe megakariocytów ludzkich oraz stymuluje ich proliferację i różnicowanie.

W analizie kolonii z zastosowaniem komórek GpIIb/IIIa⁺ mocno wzbogaconych w CFU-MK komórki szpiku kostnego szczura i komórki GpIIB/IIIa⁺nieprzyklejające się do plastiku uzyskane w poprzednim etapie, ludzka TPO pobudzała tworzenie się znaczącej liczby kolonii megakariocytów. Na przykład 34,5 kolonii megakariocytów zostało utworzonych przez 1000 komórek GpIIb/IIIa⁺, a 28,5 kolonii megakariocytów zostało utworzonych przez komórki nieprzylepiające się do plastiku w obecności 20% (v/v) nadsączu z hodowli transfekowanych komórek COS 1. Ponadto, chociaż frakcja komórek nieprzylepnych do plastiku zawiera progenitory różnych komórek krwiotwórczych inne niż CFU-MK, w obecności ludzkiej TPO tworzyły się jedynie kolonie megakariocytów, co wyraźnie sugeruje, że ludzka TPO wywiera selektywne działanie na komórki progenitorowe linii megakariocytów. Przy trzech do pięciu dniach hodowli komórek GpIIB/IIIa⁺ uzyskanych ze szpiku kostnego szczura w obecności 20% (v/v) nadsączu z hodowli transfekowanych komórek COS 1 w płynnej pożywce, obserwowano wyraźny wzrost ploidalności w piątym dniu hodowli.

<Przykład 39>

Konstrukcja wektora stosowanego do ekspresji proteiny łączonej (zwanej dalej “GST-TPO (1-174)”) składającej się z S-transferazy glutationowej (GST) i ludzkiej TPO (reszty aminokwasowej 1 do 174) w E. coli

W celu ułatwienia ekspresji ludzkiej TPO w E. coli sporządzono sztuczny gen kodujący ludzkąTPO i zawierający kodon preferencyjny E. coli. Sekwencja nukleotydów DNA zawiera w tym przypadku kodon końcówki aminowej metoniny (ATG) w pozycji -1 wykorzystywany do zapoczątkowania translacji w E. coli.

179 884

Sporządzono syntetyczne oligonukleotydy 1 do 12:

1: 5'-CTAGAAAAAACCAAGGAGGTAATAAATAATGAGCCC

GGCTCCGCCAGCTTGTGACCTTCGTGTTCTGTCT-3' (SEQ ID nr 83);

2: 5'-CAGTTTAGACAGAACACGAAGGTCACAAGTGGCGG

AGCCGGGCTCATTATTTATTACCTCCTTGGTTTTTT-3' (SEQ ID nr 84);

3:5-AAACTGCTTCGCGACTCTC ACGTGCTGCACTCTCG

TCTGTCCCAGTGCCCGGAAGTTCACCCGCTGCCG-3' (SEQ ID nr 85);

4: 5'-CGGGGTCGGCAGCGGGTGAACTTCCGGGCACTGGG

ACAGACGAGAGTGCAGCACGTGAGAGTCGCGAAG-3' (SEQ ID nr 86);

5: 5'-ACCCCGGTTCTGCTTCCGGCTGTCGACTTCTCCCT

GGGTGAATGGAAAACCCAGATGGAAGAGACCAAA-3' (SEQ ID nr 87);

6: 5'-CTGAGCTTTGGTCTCTTCCATTCTGGGTTTTCCATT

CACCCAGGGAGAAGTCGACAGCCGGAAGCAGAAC-3' (SEQ ID nr 88);

7: 5'-GCTCAGGACATCCTGGGTGCAGTAACTCTGCTTCT

GGAAGGCGTTATGGCTGCACGTGGCCAGCTTGGC-3' (SEQ ID nr 89);

8: 5'-GGTCGGGCCAAGCTGGCCACGTGCAGCCATAACGC

CTTCCAGAAGCAGAGTTACTGCACCCAGGATGTC-3' (SEQ ID nr 90);

9: 5'-CCGGCCTGCCTGTCTTCCCTGCTTGGCCAGCTGTC

TGGCCAGGTTCGTCTGCTGCTCGGCGCTCTGCAG-3' (SEQ ID nr 91);

10: 5'-C AG AG ACTGC AGAGCGCCGAGC AGACGAACCTGGC

CAGACAGCTGGCCAAGCAGGGAAGACAGGCA-3' (SEQ ID nr 92);

11: 5'-TCTCTGCTTGGCACCCAGCTGCCGCCACAGGGCCG

TACCACTGCTCACAAGGATCCGAACGCTATCTTCC-3' (SEQ ID nr 93);

12: 5'-AAGACAGGAAGATAGCGTTCGGATCCTTGTGAGCA

GTGGTACGGCCCTGTGGCGGCAGCTGGGTGCCAAAG-3' (SEQ ID nr 94);

spośród których syntetyczne oligonukleotydy 2 do 11 forsforylowano kinaząT4 (firmy Pharmacia) w roztworze złożonym z 1 mM ATP, 10 mM octanu Tris, 10 mM octanu magnezu i 50 mM octanu potasu. W celu wbudowania tych syntetycznych oligonukleotydów w 6 fragmentów dwułańcuchowych DNA, syntetyczne oligonukleotydy połączono w kombinacje 1 i 2,3 i 4,5 i 6, 7 i 8,9 i 10,11 i 12, a każdąz kombinacji wyżarzano w roztworze składającym się z lOmtris/HCl (pH 7,5), 10 mM MgCh i 50 mM NaCl. Następnie 3 fragmenty dwułańcuchowego DNA 1 i 2, 3 i 4,5 i 6 i dalsze trzy fragmenty dwułańcuchowego DNA 7 i 8,9 i 10,11 i 12 traktowano odpowiednio ligaząT4 (firmy Life Technology), a następnie w ten sam sposób traktowano ligaząT4 uzyskane roztwory reaktywne. Fragment DNA uzyskany przez reakcję ligacji trawiono BawHI (firmy Boehriger-Mannheim) i poddawano elektroforezie na 2% żelu agarozowym w celu odzyskania fragmentu wielkości około 390 do 400bp, który następnie oczyszczano przy użyciu Prep-A-Gene DNA Purification Kit i poddawano subklonowaniu do pUC 18, uprzednio trawionego ΤδαΙ i BawHI (j ako gospodarza użyto szczep E. coli DH5a). Z uzyskanych klonów wybrano przy pomocy analizy sekwencji nukleotydów klon posiadający sztuczny gen, kodujący ludzkąTPO i zawierający poniższe kodony preferencyjne i nazwano go pUC 18(XB)( 1-123). Sekwencje DNA łańcucha kodującego przedstawiono w Wykazie Sekwencji (SEQ ID nr 9).

CTAOAAAAAA CCAAOGAGGT AATAATAAT GAGCCCGGCT CCGCCAGCTT OTOACCTTCG

ΤυΠϋΠΠϋΓ

AACTOCTfC

GCGACTCTCA cgtgctocac iciuŁncriur

CCCAOTCCCC

ACAAGACAOA TTTUACGAAO CGCTOAGAGT GCACGACOTO AOAOCAGACA GGOTCACCGG

179 884

OGAAOTTCAC	130	CCGCTOCCGA	140	150	i	160	arcaAcrrcr	170	180
CCCCGUnUJ*	ULTIOUUUUT	ŁWlOJniA
CCTTCAAGTO	190	GecoAcaacr	aGGGCCAAOA CGAAGGCCGA CAGCTGAAGA <XSGACCCACT i 200 210 220 Z. 230	GGGGGACCCACT 240
AIUUAAAAUU		CAOAT3OAAG		ACłACCAAAGC		TCAGOACATC		CTGGuTuCA		rAAClUlULT
TACCTTriUU TCTGGAAGGC	250	GTCTACCTTC	250	luiuurriuo	270	AUIOOIUIAU	280	GACccAoarc &	290	ATTOAaACGA Ł 300
	GITATCGCTiJ		CACOIWCA		gctkjgcccg		Auuiuuuiur		CTTCCCTGCT
AGAUCTIUUU	310	CAATACCGAC	320	OTGCACCOnr	330	CGAACKKJCC	340	TDGACGOACA	350	GAAGGGACGA in. 360
1UUCUAUCTO ACOGOTCGAC	1U1UUUUAUG AGACCGGTCC		TTCGTCGCT AAOCAOA0OA		ucmuuuuur OOAGCCOCOA		CTOCAGTCTC GACGTCAGAG		'lUdlUUUAU ACGAAOCGTG

11 370	380 390 400 410 420
CCAGCTGCCG	CCACAGGGCC GTACCACTGC TCACAAGGAT CCGAACGCTA TCTTCC
GGTCGACOGC	GararcocaG catogtoacg auiuhuuta gultiuuuat agaaggacag aa
12.	BwbHI

Z 1 pg poli (A)⁺RNA pochodzącego ze zdrowej wątroby ludzkiej przy użyciu primeru oligo dT syntetyzowano cDNA o pojedynczym łańcuchu przy użyciu primeru oligo dT. Wykonano PCR, stosując 0,1 objętości roztworu z reakcji syntezy cDNA jako matrycę. Reakcję PCR (inkubacja 96°C przez dwie minuty, powtórzenie łącznie 30 cykli reakcji, z których każdy obejmował inkubację w 95°C przez 1 minutę, w 58°C przez 1 minutę i w 72°C przez 1 minutę oraz końcową inkubację w 72°C przez 7 minut) przeprowadzono w objętości 100 pl przy użyciu hTPO-C i HTPO-Z(EcoRI) jako primerów. Uzyskany fragment cDNA ludzkiej TPO trawiono RawHI i EcoRI i poddawano elektroforezie na 2% żelu agarozowym w celu odzyskania fragmentu wielkości około 600 bp, który następnie oczyszczano przy użyciu Prep-A-Gene DNA Purification Kit i subklonowano do pUC18, który uprzednio trawiono £cć»RI i Ra/nHI (jako gospodarza użyto

179 884 szczep E. coli DH5a). Za pomocą analizy sekwencji nukleotydów wyselekcjonowano klon kodujący prawidłową sekwencję nukleotydów ludzkiej TPO i nazwano go pUC18(BE)(124-332). Sekwencje oligonukleotydów primerów zastosowanych w reakcji PCR były następujące:

hTPO-C: 5'-GGA GAC CAA GGC ACA GGA-3' (SEQ ID nr 95) (pozycje 329 do 349 klonu pHTFl); oraz hTPO-Z(EcoRI): 5'-CCG GAA TTC TTA CCC TTC CTG AG AC AG ATT-3' (SEQ ID nr 96) (uzyskano przez dodanie sekwencji rozpoznania EcoRA do antysensu odpowiadającego pozycjom 1143 d 01163 klonu pHTFl).

Klon pUC 18(BE)(124-332) trawiono BamHI i EcoRI i poddawano elektroforezie na 2% żelu agarozowym w celu odzyskania fragmentu strony końcówki C cDNA ludzkiej TPO wielkości około 600 bp, który następnie oczyszczano przy użyciu Prep-A-Gene DNA Purification Kit i subklonowano do pUCl 8(XB)( 1-123), który trawiono uprzednio EcoRI iEawHI (jako gospodarza użyto szczep E. coli DH5a). Uzyskany klon nazwano pUC18(XE)(l-332).

Ponieważ obecność aktywności ludzkiej TPO we fragmencie peptydowym ludzkiej TPO o pozycjach reszt aminokwasowych 1 do 163 potwierdzono w przykładzie, w którym sporządzono różne konstrukty z delecjąkońcówek cDNA ludzkiej TPO, które poddawano ekspresji dla określenia aktywności ludzkiej TPO in vitro, sporządzono wektor ekspresji zawierający ten fragment peptydowy. W tym przypadku przeprowadzono ekspresję sekwencji DNA kodującej GST-TPO(1-174).

Ponieważ sekwencję nukleotydów odpowiadającą pozycjom 681 do 686 (reszty aminokwasowe pozycji 173 i 174) klonu pHTFl rozpoznano przy pomocy enzymu restrykcyjnego Sad, wprowadzono dwa kodony kończące przy użyciu 2 syntetycznych nukleotydów, wykorzystując miejsce rozpoznania tego enzymu restrykcyjnego. Dokładnie, dwa syntetyczne oligonukleotydy SSE1 i SSE2 wyżarzano w roztworze złożonym z 10mMTris/HCl(pH7,5), 10mMMgCl₂i50mM NaCl i przy pomocy zestawu DNA Ligation Kit (firmy Takara Shuzo) wprowadzano uzyskany fragment dwułańcuchowego DNA do pUC18(XE)( 1-332), z którego za pomocą trawienia Sad i EcoRI usunięto fragment końcówki C cDNA ludzkiej TPO wielkości około 480 bp, otrzymując klon pUC18(XS)(l-174) (jako gospodarza użyto szczep E. coli DH5oc. Zastosowane sekwencje syntetycznych oligonukleotydów były następujące:

SSE1: CTAATGAG (SEQ ID nr 97)

SSE2: AAATTCTCATTAGAGCT (SEQ ID nr 98)

SacI SSE1 EcoRI

5'-CTAATGAG-3' (SEQ ID nr 99)

3'-TCGAGATTACTCTTAA-5' (SEQ ID nr 100)

SSE2

Uzyskany powyżej klon pUC 18(XS) (1-174) trawiono Xbal i EcoRA i poddawano elektroforezie na 2% żelu agarozowym w celu odzyskania fragmentu około 600 bp kodującego reszty aminokwasowe 1 do 174 ludzkiej TPO, który następnie oczyszczano przy użyciu Prep-A-Gene DNA Purification Kit i subklonowano do pBluescript HSK+ (firmy Stratagene), który trawiono uprzednio Xbal i EcoRI (jako gospodarza użyto szczep E. coli DH5a). Uzyskany klon nazwano pCFM536/hT(l -174). W ten sam sposób klonpBL(XS)(l -174) trawiono Xbal i HindllI w clu odzyskania fragmentu wielkości około 550 bp kodującego reszty aminokwasowe pozycji 1 do 174 ludzkiej TPO, fragment ten następnie oczyszczano przy użyciu Prep-A-Gene DNA Purification Kit i subklonowano do pCFM536 (EP-A-136490), który uprzednio trawiono Xbal i Hindl II (jako gospodarza użyto szczep E. coli DH5a). Klon uzyskany tym sposobem nazwano pCFM536/hT (1-174).

W celu uzyskania ekspresji GST-TPO(1-174) przeprowadzono poniższe doświadczenie przy użyciu pGEX-2T (firmy Pharmacia), który jest wektorem ekspresji połączonej proteiny S-transferazy glutationowej (GST). Przeprowadzono reakcję PCR (inkubacja 96°C przez dwie minuty, powtórzenie łącznie 22 cykli reakcji, z których każdy obejmował inkubację w 95°C przez 1 minutę, w 41 °C przez 1 minutę i w 72°C przez 1 minutę oraz końcową inkubację w 72°C przez 7 minut) przy użyciu pCFM536/hT(l-174) jako matrycy oraz dwóch primerów PCR:

179 884

GEZ1 i GEX1. Uzyskany fragment kodujący ludzką TPO trawiono Μαβί i EcoRl i poddawano elektroforezie na 2% żelu agarozowym w celu odzyskania fragmentu wielkości około 550 bp, który następnie oczyszczano przy użyciu Prep-A-Gene DNA Purification Kit i klonowano do pGEX-2T, który uprzednio trawiono EcoRI i Smal (jako gospodarza użyto szczep E. coli DH5). Za pomocą analizy sekwencji nukleotydów wyselekcjonowano klon, nazwany pGEX-2T/hT(l-174), kodujący prawidłową sekwencję nuldeotydów ludzkiej TPO i zastosowany do otrzymywania transformantów dla ekspresji GST-TPO(1-174). Sekwencje oligonukleotydów primerów zastosowanych w reakcji PCR są następujące:

GEX1: 5-ATC GCC GGC TCC GCC AGC TTG TGA C-3' (SEQ ID nr 101) (otrzymano przez dodanie sekwencji rozpoznania Nael do sekwencji pozycji 21 do 39 w SEQ ID nr 10).

GEX3:5-GĆC GAA TTC TC A TTA GAG CTC GTT C AG TGT-3' (SEQ ID nr 102) (antysens odpowiadający sekwencji pozycji 523 do 549 w SEQ ID nr 10).

Ten plazmid ekspresji zawiera sekwencję DNA kodującąproteinę GST, po której następuje peptyd rozpoznania trombiny i ludzka TPO (reszty aminokwasowe 1 do 174). Sekwencja DNA kodująca peptyd rozpoznania trombiny i ludzkąTPO (reszty aminokwasowe 1 do 174) sąprzedstawione w Wykazie Sekwencji (SEQ ID nr 10).

<Przykład 40>

Ekspresja GST-TPO (1-174) w E. coli

Transformant uzyskany w przykładzie 39 był hodowany przez noc na wstrząsarce w temperaturze 37°C przy użyciu 60 ml pożywki LB zawierający 50 pg/ml ampicyliny, po czym 25 ml uzyskanej zawiesiny dodawano do 1000 ml pożywki LB zawierającej 50 pg/ml ampicyliny po czym 25 ml uzyskanej zawiesiny dodawano do 1000 ml pożywki LB zawierającej 50 pg/ml ampicyliny i hodowano na wstrząsarce w temperaturze 37°C aż OD przy A₆₀₀ osiągnęło 0,7 do 0,8. Następnie do zawiesiny dodawano IPTG do uzyskania ostatecznego stężenia 0,1 mM i kontynuowano hodowlę ze wstrząsaniem przez dalsze 3 godziny w celu wywołania ekspresj i GST-TPO (1-174).

<Przykład 41>

Oczyszczanie GST-TPO (1-174) podlegającej ekspresji w E. coli oraz potwierdzenie jej aktywności biologicznej

5,9 g zarażonych komórek rekombinowanego szczepu produkującego GST-TPO (1-174) pochodzącego z klonu pGEX-2T/hT(l-174) kodującego sekwencję nukleotydów ludzkiej TPO zawieszono w 10 ml wody i rozrywano przy pomocy wysokociśnieniowego dezyntegratora. W wyniku odwirowania zawiesiny odzyskano GST-TPO (1-174) w strącanej frakcji oraz usuwano większość współwystępujących protein, składników komórek itp. Następnie uzyskaną frakcję strąceniową zawierającą GST-TPO (1-174) zawieszano w 5 ml wody do której, mieszając dodawano 6 ml bufora 1 M Tris (pH 8,5), 120 ml 10 M mocznika i 16 ml wody. Po 5 minutach mieszania w celu rozpuszczenia zawartości, uzyskany roztwór podzielono na cztery równe części w celu przeprowadzenia poniższych etapów (1) do (4).

(1) Jedną z podzielonych próbek rozcieńczano dziesięciokrotnie 20 mM bufora Tris o wartości pH 8,5. Do tego dodawano glutation typu redukcyjnego i glutation typu utlenionego do uzyskania stężenia odpowiednio 5 mM i 9,5 mM, a następnie przeprowadzano inkubację przez noc w temperaturze 4°C. Uzyskaną mieszaninę odwirowywano w celu odzyskania GST-TPO( 1-174) w nadsączu z hodowli, który następnie rozcieńczano dwukrotnie 20 mM bufora cytrynianu sodowego o wartości pH 5,5, a następnie kwasem octowym ustalano pH 5,5. GST-TPO(1 -174) w roztworze wprowadzano do kolumny kationowymiennej SP Sepharose FastFlow (firmy Pharmacia Biotech, numer katalogowy 17-0729-01), którą uprzednio zrównoważono przy pomocy 20 mM bufora cytrynianu sodowego o pH 5,5. Po wypłukaniu kolumny buforem 20 mM cytrynianu sodowego o pH 5,5 przeprowadzano elucję GST-TPO(1-174) przy użyciu bufora 20 rnM o pH 5,5 zawierającego 500 mM chlorku sodowego, 129 ml eluatu mieszano z 2,6 ml 1 M bufora Tris o pH 8,5, auzyskanąmieszaninę o wartości p 8,1 wprowadzano do kolumny Glutathione Sepharose 4B (firmy Pharmacia Biotech, nr katalogowy 17-0756-01) dla adsorpcji GST-TPO( 1 -174). Po wypłukiwaniu kolumny za pomocą PBS przeprowadzono elucję GST-TPO(1-174) przy użyciu 20 mM bufora Tris o pH 8,5 zawierającego 10 mM glutationu typu redukcyjnego. Uzyskany eluat

179 884 mieszano z 37 jednostkami NIH trombiny, pozostawiano na 4 godziny w temperaturze pokojowej , rozcieńczano dziesięciokrotnie za pomocąPBS, a następnie wprowadzano do kolumny Glutathione Sepharose 4B w celu adsorpcji wytrawionej GST i odzyskania TPO(1-174) we frakcji nie adsorbowanej. Tę nie adsorbowanąfrakcję rozpuszczano trzyktomie 20 mM bufora cytrynianu sodu pH o 5,5 i wprowadzano do kolumny kationowymiennej SP Sepharose Fast Flow, którą uprzednio zrównoważono tym samy buforem, pożądany składnik eluowano z linearnym gradientem gęstości 0 do 500 mM chlorku sodowego rozpuszczonego w tym samy buforze.

(2) Wszystkie operacje etapu (1) przeprowadzano w obecności 0,1% polisorbatu 80.

(3) Jedną z podzielonych próbek rozcieńczano dziesięciokrotnie 20 mM bufora Tris o wartości pH 8,5. Do tego dodawano glutation typu redukcyjnego i glutation typu utlenionego do uzyskania stężenia odpowiednio 5 mM i 9,5 mM, a następnie przeprowadzano inkubację przez noc w, temperaturze 4°C. Uzyskaną mieszaninę odwirowano w celu odzyskania GST-TPO(1-174) w nadsączu z hodowli, który następnie rozcieńczono dwukrotnie 20 mM bufora cytrynianu sodu o wartości pH 5,5, a następnie kwasem octowym ustalano pH 5,5 GST-TPO(1-174) w roztworze wprowadzano do żywicy kationowymiennej SP Sepharose Fast Flow, którą uprzednio zrównoważona przy pomocy 20 mM bufora cytrynianu sodowego o pH 5,5. Po wypłukaniu kolumny buforem 20 mM cytrynianu sodowego o pH 5,5 przeprowadzano elucję GST-TPO(1-174) przy użyciu bufora 20 mM o pH 5,5 zawierającego 500 mM chlorku sodowego. Przy pomocy 1 M bufora Tris o pH 8,5 ustalano pH eluatu do wartości pH 8, mieszano z 320 jednostkami NIH trombiny w celu usunięcia sekwencji polipeptydów GST przez rozbicie wiązania peptydowego rozpoznania trombiny, pozostawiono na 4 godziny w temperaturze pokojowej, rozcieńczano pięciokrotnie 20 mM bufora cytrynianu sodowego o pH 5,5, a następnie wprowadzano do kolumny kationowymiennej SP Sepharose Fast Flow, którą uprzednio zrównoważono tym samym buforem, a pożądany składnik eluowano z linearnym gradientem o gęstości 0 do 500 mM chlorku sodowego rozpuszczonego w tym samym buforze.

(4) Wszystkie operacje etapu (3) przeprowadzano w obecności 0,1% polisorbatu 80.

Każdą frakcję eluowanąprzy gęstości chlorku sodowego około 200 do 400 mM za pomocą chromatografii w kolumnie kationowymiennej SP Sepharose Fast Flow dokładnie dializowano w stosunku do pożywki IMDM i analizowano w systemie z zastosowaniem CFU-MK. Analiza przy pomocy SDS-PAGE w obecności czynnika redukującego wykazała pasmo odpowiadające masie cząsteczkowej 19 kd (czystości 1 do 20%) jako jeden z głównych pasm proteinowych frakcji. Analiza sekwencji końcówki N tego pasma przeprowadzona przez poddawanie go SDS-PAGE i przeniesienie na membranę PVDF według sposobu opisanego w przykładzie 1 potwierdziła, że pasmo to zawiera sekwencję TPO podlegającą ekspresji jako proteina mieszana pochodząca z pGEX-2T/hT(l-174). Sekwencję aminokwasów uzyskanej TPO określono jako [Gly ']TPO z podaniem sekwencji wiązania peptydowego rozpoznania trombiny i znaną aktywnościątrombiny na wiązaniu.

<Przykład 42>

Konstrukcja wektora stosowanego do ekspresji w E. coli ludzkiej TPO (reszty aminokwasowej 1 do 163) o podstawieniach w pozycji 1 (Ser -> Ala) i pozycji 3 (Ala -> Val)

Klon pUC18(XE)(l-332), otrzymany w przykładzie 39 trawionoXbal i AcoRI i poddawano elektroforezie na 2% żelu agarozowym w celu odzyskania fragmentu około 1000 bp kodującego reszty aminokwasowe 1 do 332 ludzkiej TPO, który następnie oczyszczano przy użyciu Prep-A-Gene DNA Purification Kit i subklonowano do pBluescript IISK+ (firmy Stratagene), który trawiono uprzednioXbal i £coRI (jako gospodarza użyto szczep E. coli DH5a). Uzyskany klon nazwano pBL(XE)(1-332). Następnie region klonu pBL(XE)(l-332) od sekwencji rozpoznania BamHI do pozycji 163 aminokwasu (pozycje 366 do 489) wymieniano na dominujące kodony E. coli. Sporządzono syntetyczne oligonukleotydy 13 do 20, przedstawione poniżej i każdą z par syntetycznych nukleotydów, tj. 13 i 14,15 i 16,17 i 18 forsforylowano w tej samej probówce zawierającej roztwór składający się z 0,1 mM ATP, 10 mM octanu Tris, 10 mM octanu magnezu i 50 mM octanu potasu. Po dodaniu 1/10 objętości roztworu składającego się ze 100 mM Tris/HCl (pH 7,5), 100 mM MgCl₂ i 500 mM NaCl otrzymany roztwór ogrzewano w kąpieli we wrzącej

179 884 wodzie przez 3 minuty, a następnie schładzano do temperatury pokojowej w celu uzyskania fragmentu dwułańcuchowego DNA. Uzyskane trzy pary fragmentów dwułańcuchowego DNA, składające się z 13 i 14,15 i 16 oraz 17 i 18 poddawano ligacj i za pomocą zestawu DNA Ligation Kit (firmy Takara Shuzo) i przeprowadzano PCR przy użyciu produktu ligacji jako matrycy i syntetycznych oligonukleotydów 19 i 20 j ako primerów. Produkt PCR trawiono Xba\ i Hind\\\ i poddawano elektroforezie na 2% żelu agarozowym w celu odzyskania fragmentu wielkości około 130 bp przy użyciu Prep-A-Gene DNA Purification Kit, który poddawano subklonowaniu do pBL(XE)(l-332), uprzednio trawionego Ba/nHI i HindUI (jako gospodarza użyto szczep E. coli DH5o). Z uzyskanych klonów wybrano przy pomocy analizy sekwencji klon o poniższych sekwencjach nukleotydów i nazwano go pBL(XH)(l-163).

13: 5'-GATCCGAACGCTATCTTCCTGTCTTTCCAGCACCTGCTGCGT-3 '(SEQ ID nr 103);

14: 5'-GGCAAAGTTCGTTTCCTGATGCTGGTTGGCGGTTCTACCCTG-3' (SEQ ID nr 104);

15: 5-GGC AAAGTTCGTTTCCTGATGCTGGTTGGCGGTTCTACCCTG-3' (SEQ ID nr 105);

16: 5'-ACGCAC AGGCTAG AACCGCC AACC AGC ATCAGGA A AC AGAC-3' (SEQ ID nr 106);

17: 5'-TGCGTTCTGCGGGCGCCGCCAACCACTGCTGTTCCGTCTTAATGAA-3' (SEQ ID nr 107);

18: 5'-AGCTTTCATTAAGACGGAACAGCAGTGGTTGGCGGCGCCCGACGA-3' (SEQ ID nr 108);

19: 5'-AAGGATCCGAACGCTATCTTCCTG-3' (SEQ ID nr 109);

oraz

20: 5'-AGAAGCTTTCATTAAGACGGAACA-3' (SEQ ID nr 110).

W celu zwiększenia ekspresji ludzkiej TPO (pozycje 1 do 163) i uniknięcia hydrolizy końcówki N przez proteazę skonstruowano wektor ekspresji do ekspresji ludzkiej TPO typu zmutowanego (pozycje 1 do 163) (zwanej dalej “h6T(l-163))” o podstawieniach w pozycji 1 (Ser do Ala) i pozycji 3 (Alado Val) ludzkiej TPO (pozycje 1 do 163) ([Ala¹, Val³]TPO(l -163), kodującej zarazem Lys w pozycji -1 i Met w pozycji -2 ([Met’², Lys'¹, Ala¹, Val³]TPO(l-163). Sporządzono cztery syntetyczne oligonukleotydy, przedstawione poniżej, syntetyczne nukleotydy 2-9 i 3-3 fosforylowano kinaząT4 (firmy Pharmacia) w roztworze składającym się z 1 mM ATP, 10 mM octanu Tris, 10 mM octanu magnezu i 50 mM octanu potasu. W celu wbudowania tych syntetycznych oligonukleotydów we fragmenty dwułańcuchowego DNA, każdą parę fragmentów jednołańcuchowego DNA 1-9, 2-9, 3-3 i 4-3 wyżarzano w roztworze składającym się z 10 mM Tris/HCl (pH 7,5), 10 mM MgCl₂ i 50 mM NaCl. Następnie tak uzyskane dwie pary fragmentów dwułańcuchowego DNA, składające się z 1-9,2-9,3-3 i 4-3 traktowano zestawem DNA Ligation Kit (firmy Takara Shuzo). Fragment DNA uzyskany przez reakcję ligacji subklonowano do pBL(XH)( 1-163), który uprzednio trawiono Xba\ i NnA za pomocą analizy sekwencyjnej wyselekcjonowano klon prawidłowo podstawiony przez poniższe syntetyczne oligonukleotydy (jako gospodarza użyto szczep E. coli DH5o), który nazwano pBL(XH)h6T(l-163):

1-9: 5'-CTAGAAAAAACCAAGGAGGTAATAAATAATGAAAGCACCTGTACCA-3' (SEQIDnrlll);

2-9: 5'-CAGOTGGTACAGOTGCITrCATrATrrATTACCTCCTTGGrTTTTr-3' (SEQ ID nr 112);

179 884

3-3: 5’-CCTGCATGTGA1TTACGGGrCCTGrCTAAACTGCTGCG-3' (SEQ ID nr 113);

4-3: 5’-CGCAGCAGTTTAGACAGGACCCGTAAATCACATG-3’ (SEQIDnrll3)

1-9 20 3040

CTAGAAAAAA CCAAGGAGGT AATAAATAAT GAAAGCACCT

TTTTTTT GGTTCCTCCA ΤΤΑΤΊΤΑΤΤΑ CTTTCGTGGA

Xbal2=2

60 3-3 7080

GTACCACCTG CATGTGATTT ACGGGTCCTG TCTAAACTGC TGCG

CATGGTGGAC GTACACTAAA TGCCCAGGAC AGATTTGACG ACGC (SEQIDm 115)

Klon pBL(XH)(l-163) trawiono Xbal i HindlU w celu odzyskania fragmentu wielkości około 500 bp, kodującego reszty aminokwasowe 1 do 163, typu mutacji ludzkiej TPO. Fragment ten następnie oczyszczano przy użyciu Prep-A-Gene DNA Purification KIT i klonowano do pCFM536 (EP-A-136490), który uprzednio trawiono Xbal i 7/ζη<ΛΙΙ (jako gospodarza użyto szczep E. coli JM109, który uprzednio transformowano za pomocąpMWl). Klon uzyskany tym sposobem nazwano pCGM536/h6T(l-163), a szczep E. coli o wektorze ekspresji zastosowano jako transformant do ekspresji ludzkiej TPO typu mutacji, mianowicie h6T( 1 -163). Plazmid ekspresji zawiera sekwencję DNA pokazaną w Wykazie Sekwencji (SEQ ID nr 11).

<Przykład 43>

Ekspresja h6T(l-163) W E. coli

Ekspresja plazmidu ekspresji cCFM536 jest kontrolowana przez promotor EPL, który pozostaje pod kontrolą genu represji c 1857. Transformant uzyskany w <przykładzie 42> był hodowany przez noc na wstrząsarce w temperaturze 37°C przy użyciu 60 ml pożywki LB zawierającej 50 pg/ml ampicyliny i 12,5 pg tetracykliny, po czym 25 ml uzyskanej zawiesiny dodawano do 1000 ml pożywki LB zawierającej 50 pg/ml ampicyliny i hodowano na wstrząsarce w temperaturze 37°C aż OD przy A₆₀₀ osiągnęło 1,0 do 1,2. Następnie do zawiesiny dodawano około 330 ml pożywki LB ogrzanej do 65°C do uzyskania ostatecznej temperatury pożywki 42°C kontynuowano hodowlę ze wstrząsaniem przez 3 godziny w celu wywołania ekspresji GST-TPO (1-174).

<Przykład 44>

Oczyszczanie h6T(l-163) podlegającego ekspresji wE. coli potwierdzenie jego aktywności biologicznej

3,6 g zamrożonych komórek rekombinowanego szczepu produkującego h6T(l-163) zawieszono w 10 ml wody i rozrywano przy pomocy wysokociśnieniowego dezyntegratora. W wyniku odwirowania zawiesiny odzyskiwano wytrącaną frakcję oraz usuwano większość współwystępujących protein, składników komórek itp. Następnie uzyskaną frakcję strąceniową

179 884 zawierającąh6T(l-163) zawieszano w 7 ml wody, do której, mieszając, dodawano 3 ml bufora 1 M Tris (pH 8,5), a następnie mocznik (ostateczne stężenie 8 M), chlorowodorek guanidyny (ostateczne stężenie 6 M) i N-lauroilo-sarkozynian sodu (ostateczne stężenie 2%). Po 5 minutach mieszania w celu rozpuszczenia zawartości uzyskany roztwór rozcieńczano dziesięciokrotnie buforem 20 mM Tris o wartości pH 8,5 i rozkładano proteinę podczas inkubacji przez noc w temperaturze 4°C. W tym przypadku jako dodatki zastosowano glutation i siarczan miedzi w połączeniu z utlenianiem tlenowym. Przez odwirowanie odzyskiwano h6T( 1 -163) w płynnym nadsączu. Analiza każdej odzyskanej frakcji przy pomocy SDS-PAGE w obecności czynnika redukującego wykazała pasmo odpowiadające masie cząsteczkowej 18 kd (czystości 30 do 40%) jako główne pasmo proteinowe każdej frakcji. Analiza sekwencji końcowej N tego pasma przeprowadzona według sposobu opisanego w przykładzie 1 potwierdziła, że pasmo to zawiera sekwencję TPO podlegającą ekspresji jako typ mutacji TPO, pochodzący z pCMF536/h6T(l-163). Dokładna dializa każdej frakcji względem pożywki IMDM oraz ocena za pomocą systemu analizy z zastosowaniem CFU-MK wykazała aktywność TPO we wszystkich frakcjach w stopniu zależnym od dawki.

<Przykład 45>

Sporządzenie peptydowego przeciwciała anty-TPO i wykrywanie TPO za pomocą SDS-PAGE i analizy kroplowej

Otrzymanie peptydowego przeciwciała anty-TPO miało umożliwić wykrywanie aktywności TPO metodami immunologicznymi. Wybrano zatem spośród potwierdzonych sekwencji aminokwasów TPO trzy regiony, które wydawały się stosunkowo korzystne jako antygeny (patrz poniżej) i według sposobu Tama (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85, 5409-5413,1988), syntetyzowano peptyd typu czterołańcuchowego wielokrotnego antygenu peptydowego (MAP), wykorzystując każdy z wybranych regionów, a następnie ośmiokrotnie uodpamiano dwa króliki ze 100 pg każdego syntetyzowanego peptydu w celu uzyskania odpowiednich próbek przeciwsurowicy.

Sekwencje aminokwasów występujące w syntetyzowanych antygenach peptydowych (a) Szczurza TPO(9-28) (Region RTl peptydu)

PRLLNKLLRDS YLLHRRLSO (SEQ ID nr 116) (R na pozycji 24 jest w oryginale S w reszcie aminokwasowej oznaczonej z genu).

(b) Szczurza TPO(46-66) (Region RT2 peptydu)

FSLGEWKTQTEQSIKAQOILGA (SEQ ID nr 117) (c) Szczurza TPO (163-180) (Region RT4 peptydu)

SRTSQLLTLNKFPNRLLD (SEQ ID nr 118) (LLD na pozycjach 178-180 jest w oryginale TSG w resztach aminokwasowych oznaczanych z genu).

Następnie poddawano najpierw peptydy anty-RTI i anty-RT2 chromatografii kolumnowej proteiny A (PROSEP-A; firmy Bioprocessing Ltd., numer katalogowy 8427 w celu uzyskania obu frakcji IgG (odpowiednio 2,344 mg i 1920 mg). Po 54 i 32 mg z każdej frakcji biotynowano, wiążąc z biotyną typu aktywnego (NHS-LC-Biotin II; firmy PIERCE, katalog nr 21336). Rekombinowaną próbkę o zawartości TPO poddawano SDS-PAGE, a następnie elektrokroplowąna PVDF lub membranie nitrocelulozowej w sposób opisany w przykładzie 1 i przeprowadzano analizę zachodnią w zwykły sposób, stosując jako pierwsze przeciwciała biotynowane.

Po skropieniu membranę przemywano roztworem zawierającym 20 mM Tris-HCl i 0,5 M NaCl (pH 7,5) (TBS) przez 5 minut i dwuktomie po 5 minut roztworem TBS zawierającym 0,1 % Tween 20 (TTBS), a następnie traktowano blokerem (BlockAce; firmy Dainippon Pharmaceutical, nr katalogowy uK-B25) przez 60 minut. Następnie membranę traktowano przez 60 minut roztworem TTBS zawierającym 10 pg/ml biotynowanego przeciwciała peptydowego anty-TPO, 0,05% BSA i 10% BlockAce, a następnie dwukrotnie po 5 minut przemywano TTBS. Dalej membranę traktowano przez 30 minut roztworem sporządzonym przez rozcieńczenie awidyny znaczonej fosfatazą alkaliczną (firmy Leinco Technologies, nr katalogowy A108) 500 razy roztworem TTBS zawierającym 10% BlockAce i przemywano dwa razy po 5 minut TTBS i 5 minut TBS, a na

179 884 stępnie rozwijano barwę przy użyciu substratu fosfatazy alkaliczne (firmy Bio-Rad, numer katalogowy 170-6432). Opisana wyżej analizę przeprowadzano w temperaturze pokojowej.

W efekcie możliwe było rozpoznanie nie tylko różnych rekombinowanych szczurzych protein TPO podlegających ekspresji w komórkach COS 1, lecz także różnych rekombinowanych ludzkich protein TPO podlegających ekspresji w komórkach COS 1 i komórkach E. coli (przykładowo ludzka TPO pochodząca z plazmidów pHTP 1 lub pHTF 1 podlegająca ekspresji w komórkach COS 1 i produkt rozbicia jej wiązania N-glikozydowego, GST-TPO(1-174), podlegający ekspresji w E. coli i produkt jego trawienia trombinąi h6T(l -163), który jest typem mutacji TPO podlegającym ekspresji w E. coli, opisanym w przykładach ). Ponadto wyniki umożliwiły również analizę tych różnych typów ludzkiej TPO.

Potwierdzono także możliwość uzyskania przeciwciał peptydowych ludzkiej TPO. Przeciwciała uzyskane tymi technikami można poddawać nie tylko analizie zachodniej, ale i oczyszczaniu TPO w kolumnach przeciwciał i każdej powszechnie stosowanej metodzie immunologicznej z zastosowaniem przeciwciał.

Wybrano sześć regionów w sekwencji aminokwasów przedstawionych w SEQ ID nr 7, które przypuszczalnie wykazują stosunkowo dogodną anty genowość (patrz tabela 4). Syntetyzowano tetramerowe peptydy typu wielokrotnego antygenu peptydowego (MAP), które odpowiadały kolejnym regionom. Każdy peptydy immunizowano ośmiokrotnie w ilości 100 mg na raz u dwóch królików.

Osobno syntetyzowano monomerowy peptydy, w którym reszta cysteina została związana z końcówką C każdego regionu peptydu pokazanego w tabeli 4. Peptyd ten stosowano następnie jako antygen testowy do oznaczania miana przeciwciała przy użyciu analizy immunologicznej. Potwierdzono wzrost miana przeciwciała dla uzyskanych wyżej surowic, które w związku z tym mogą być stosowane jako przeciwsurowice. Przeciwciała sporządzono przez immunizowanie dwóch królików każdym z peptydów antygenowych w celu wytworzenia przeciwciał skierowanym przeciw danemu peptydowi. Uzyskane dwa przeciwciała peptydowe anty-HT 1 nazwano dla odróżnienia w zależności od osobnika przeciwciałem peptydowym anty-Hl-1 i przeciwciałem peptydowym anty HI-2.

Przykład oczyszczania przeciwciał peptydowych anty-HTl-1 przedstawiono poniżej.

Najpierw 30 mg monomerowego peptydu HT1, z którymi związano resztę cysternową sprzęgano z 12 ml żelu Sulfo-Link (Pierce, numer katalogowy 44895). Streszczając, roztwór peptydowy, zawierający antygen sprzęgano przez 15 minut z żelem zrównoważonym buforem sprzęgającym (50 mM Tris, 5 mM EDTA-Na pH 8,5) w objętości 6 razy większej od objętości żelu. Bufor sprzęgający zawierający 0,05 M L-cysteiny-HCl dodawano do żelu w ilości 1 ml/ml żelu w celu zablokowania nieprzereagowanych rodników przez 15 minut. Po inkubacji przez 30 minut żel przemywano buforem sprzęgającym w objętości 8 razy większej od objętości żelu. Wszystkie reakcje sprzęgania przeprowadzano w temperaturze pokojowej. Peptyd wiązano kowalentnie z żelem przy wydajności sprzęgania 28,3%, a następnie przygotowano kolumnę antygenową z 0,8 mg peptydu/ml żelu.

76,7 ml (zawartość protein 3620 mg) przeciwsurowicy, zawierających przeciwiciało peptydowe anty-HTl-1 pobrane od jednego z królików w łącznej ilości 78,4 ml, wprowadzano do kolumny antygenowej uprzednio zrównoważonej 50 mM bufora fosforanowego (pH 8) zawierającego 150 mM i NaCl i 0,05% azydku sodowego i przepłukiwano tym samym buforem w celu uzyskania 105,9 ml frakcji przepływowej (zawartość protein 3680 mg). Następnie adsorbowaną frakcję wymywano 0,1M buforem cytrynowym (pH 3,0) i natychmiast zobojętniano 21,1 ml 0,1 M bufora węglanowego (pH 9,9), a później zagęszczano za pomocąultrafiltracji (przy pomocy membrany Amicon YM 30) w celu uzyskania oczyszczonego przeciwciała peptydowego anty-HTl-1 w roztworze 50 mM bufora fosforanowego (pH 8) zawierającego 150 mM NaCl i 0,05% NaN₃.

Podobnie przygotowano następujące przeciwciała: przeciwciało peptydowe anty-HT 1-2 (60,0mg);przeciwciałopeptydowe anty-HT2-l (18,8 mg),przeciwciałopeptydowe anty-HT2-2

179 884 (8,2 mg), itp. W podobny sposób można również przygotować przeciwciała peptydowe anty-HT3 do -HT6.

Trzy mg oczyszczonego przez powinowactwo przeciwciała peptydowego anty-HTl-1, przeciwciała peptydowego anty-HTl-2, przeciwciała peptydowego anty-HT2-l lub przeciwciała peptydowego anty-HT2-2 biotynowano przez sprzęganie z aktywowaną biotyną (Pierce, NHS-LC-Biotin II, numer katalogowy 21336).

Stwierdzono, że wszystkie oczyszczone jak wyżej przeciwciała mogą rozpoznawać i wykrywać ludzkąTPO w analizie kropelkowej (na filtrze nitrocelulozowym lub PCDF), a następnie SDS-PAGE próbki rekombinowanej ludzkiej TPO częściowo oczyszczonej z nadsączu hodowli komórek COS, do których wprowadzono podlegający ekspresji gen kodujący sekwencję aminokwasów pokazana w tabeli 4.

Tabela 4

Sekwencje aminokwasów ludzkiej TPO wchodzące w skład syntetycznego antygenu peptydowego typu tetrametrycznego MAP ludzka TPO (liczby aminokwasów 8-28) region peptydowy HT1:

DLRCLSKLLRDSHVLHSRLSQ (SEQ ID nr 119) ludzka TPO (liczby aminokwasów 47-62) region peptydowy HT2:

SLGEWKTQOEETKAQD (SEQ ID nr 120) ludzka TPO (liczby aminokwasów 108-126) region peptydowy HT3:

LGTQLPPQGRTTAHKDPNA (SEQ ID nr 121) ludzka TPO (liczby aminokwasów 172-190) region peptydowy HT4: NELPNRTSGLLETNFTASA (SEQ ID nr 122) ludzka TPO (liczby aminokwasów 262-284) region peptydowy HT5: SLPPNLQPGYSPSPTHPPTGQYT (SEQ ID nr 123) ludzka TPO (liczby aminokwasów 306-332) region peptydowy HT6: PSAPTPTPTSPLLNTSYTHSQNLSQEG (SEQ ID nr 124) <Przykład 46>

Sporządzanie kolumny przeciwciał peptydowych anty-TPO

Ponieważ przeciwciało peptydowe szczurzej TPO uzyskane w przykładzie 45 miało zdolność rozpoznawania cząsteczek szczurzej i ludzkiej TPO frakcje immunoglobuliny (IgG) przeciwciała peptydowego anty-RTl i przeciwciała peptydowego anty-RT2 związanego z chemicznie aktywowanym żelem dostarczonym w poniżej opisany sposób w celu sporządzenia kolumn przeciwciał peptydowych anty-TPO. Obydwa przeciwciała zastosowane jako materiał sporządzano osobno z surowicy dwóch królików. Przeciwciało peptydowe anty-RTl uzyskane z dwóch królików nazwano odpowiednio przeciwciałem peptydowym anty-RTl-1 i przeciwciałem peptydowym anty-RTl-2, natomiast przeciwciało peptydowe anty-RT2, uzyskane z dwóch innych królików nazwano odpowiednio przeciwciałem peptydowym anty-RT2-l i anty-RT2-2. Ponieważ przeciwciała te stosowano oddzielnie do przygotowania kolumn przeciwciał uzyskano w sumie pięć takich kolumn, mianowicie dwie kolumny przeciwciał peptydowych anty-RTl (zwanej dalej “kolumna przeciwciała anty-RTl-1 i kolumna przeciwciała anty-RTl-1), dwie kolumny przeciwciał peptydowych anty-RT-2 zwane dalej kolumna przeciwciała anty-RT2-l i “kolumna przeciwciała anty-RT2-2 oraz jedna kolumnę przeciwciał (kolumna przeciwciała anty-RTl-2 + 2-1 mix), uzyskana przez mieszanie przeciwciała peptydowego anty-RTl-2 z przeciwciałem peptydowym anty-RT2-l i sprzęganie mieszaniny z żelem.

179 884

Każde przeciwciało rozpuszczano w roztworze 50 mM fosforanu sodu i 0,15 M NaCl (pH 8,0) do ostatecznego stężenia 5 mg/ml (lub po 2,5 mg/ml wymieszanych w równych ilościach przeciwciała peptydowego anty-RTl-2 i przeciwciała peptydowego anty-RT2-l w przypadku kolumny przeciwciała anty-RTl + 2 mix), 2,31 ml otrzymanego roztworu mieszano z 1,54 ml objętości spęczniałego żelu aktywowanego formylem (Formyl-Cellulofine, firmy Chisso) i poddawano na dwie godziny reakcji sprzęgania w 4°C. Do tego dodawano 1,1 ml roztworu 10 mg/ml czynnika redukującego (boran trimetyloaminy (TMAB); firmy Seikagaku Kogyo, numer katalogowy 680246), a następnie przez 6 godzin poddawano dodatkowej reakcji sprzęgania i odwirowywano w celu odzyskania części żelu. 10 ml oczyszczonej wody dodawano do części żelu odzyskanej przez wirowanie, nieprzereagowane cząsteczki przeciwciała usuwano, powtarzając ten etap cztery razy. Następnie uzyskany żel mieszano z 4,6 ml roztworu blokującego (0,2 M fosforanu sodu i 1 M etanolaminy, pH 7,0) i 1,1 ml roztworu czynnika redukującego i traktowano w temperaturze 4°C przez co najmniej dwie godziny do zablokowania grup aktywnych nieprzereagowanego żelu. Następnie żel przemywano oczyszczoną wodą i DPBS przy użyciu wirówki, wypełniano nim rurkę kolumny, przemywano 3 M roztworu tiocyjanianu potasu i 0,1 M roztworu glicyny-HCl (pH 2,5), zrównoważonego DPBS i przechowywano.

W 5 żelach przeciwciała peptydowego anty-TPO kolumny przeciwciała anty-RT 1 -1, kolumny przeciwciała anty-RT2-2, kolumny przeciwciała anty-RT2-l, kolumny przeciwciała anty-RT 2-2 i kolumny przeciwciała anty-RT 1-2 + 2-1 mix, skuteczność sprzężania frakcji IgG sięgała odpowiednio 97,4%, 95,45, 98,4%, 98,3% i -4%. Poziom frakcji IgG sprzężony z żelem wynosił w objętości żelu odpowiednio 5,6 mg/ml, 5,8, ,7 mg/ml, 5,7 mg/ml i 2,9 mg/ml. Ponieważ potwierdziło się, że wydajność sprzęgania i jakość sprzęgania nie zmienia się znacząco w zależności od pochodzenia przeciwciała i różnic antygenu, wykonano doświadczenia przedstawione w poniższym przykładzie 47, stosując opisane kolumny przeciwciał.

<Przykład 47>

Oczyszczanie TPO pochodzącej z nadsączu hodowli uzyskanego przez transfekcję komórek COS wektorem ekspresji pHTP 1 przy użyciu kolumny przeciwciał anty-TPO oraz chromatografii kolumnowej z odwróconymi fazami oraz potwierdzenie jej aktywności biologicznej.

Do oceny poniższych oczyszczonych próbek zastosowano system analizy in vitro z wykorzystaniem M-07e. Częściowo oczyszczone próbki TPO z uzyskanego w przykładzie 35 nadsączu z hodowli komórek COS 1 transfekowanych wektorem ekspresji pHTPl (frakcje inne niż główna frakcja TPO, mianowicie frakcja przepływowa FI i frakcja 3 eluowana po F2 przez wymywanie 20 mM cytrynianu sodu, pH 5,8 z kolumny Macro-Prep Methyl HIC i frakcja F1 i F3 z kolumny SP Sepharose Fast Flow) łączono w celu otrzymania frakcji podpuli TPO (5463,79 ml; stężenie protein 0,490 mg/ml; suma protein 2676 mg; aktywność względna 12100; aktywność całkowita 32.380.000) i zagęszczano przy użyciu aparatu do ultrafiltracji (Omega Ultraset, spadek nominalnej masy cząsteczkowej 8000, firmy Filtron), rozpuszczalnik zagęszczonej frakcji wymieniano na DPBS, a próbkę o małej objętości poddawano działaniu aparatu do ultrafiltracji wyposażonego w membranę YM-10 (firmy Amicon) w celu ostatecznego umieszczenia jej w 120,2 ml roztworu DPBS zawierającego 0,05% azydku sodowego. Następnie wszystkie pięć przeciwciałpeptydowego anty-TPO, otrzymanych w przykładzie 46 mieszano i umieszczano w pojedynczej kolumnie przeciwciała (1,6 cm średnicy i 4,8 cm wysokości złoża, nazywanej dalej kolumną przeciwciała anty-RTl + w mix), a frakcję TPO z subpuli wprowadzano do kolumny z prędkością 0,033 ml/min. Po wypełnieniu kolumny przeprowadzano elucję za pomocą DPBS w celu zebrania eluatów dopóki absorpcja UV nie zmniejszyła się dostatecznie. Zebrane eluaty zagęszczano przy pomocy aparatu do ultrafiltracji wyposażonego w membranę YM-10 (firmy Amicon) w celu uzyskania frakcji przepływowej F1 (82,62 ml; stężenie protein 1184 mg; aktywność względna 67500; aktywność całkowita 79900000). Następnie frakcję F2, adsorbowaną przez kolumnę (92,97 ml; stężenie protein 0,12 mg/ml; suma protein 11,1 mg; aktywność względna 257100 i aktywność całkowita 2860000) wymywano kwaśnym roztworem elucyjnym (0,1 M glicyny-HCL, pH 2,5). Choć frakcj a przepływowa F1 nadal wykazywała aktywność TPO, w dalszym ciągu oczyszczano TPO adsorbowaną przez kolumnę przeciwciała, ponieważ wyka

179 884 zywała ona dwudziestokrotny wzrost aktywności względnej. Przy użyciu 0,1% TFA jako roztworu rozwijającego A i 1-propanolu zawierającego 0,05% TFA jako roztworu rozwijającego B przeprowadzono chromatografię w kolumnie Capcell Pak Cl 300A (firmy Shiseido, numer katalogowy Cl TYPE: SG300A; 4,6 mm średnicy i 150 mm wysokości złoża, połączona z prekolumną 4,6 średnicy i 35 mm wysokości złoża), mieszając frakcję F2 uzyskaną z kolumny przeciwciała z 1/10 objętości rozpuszczalnika rozwijającego B i wprowadzając mieszaninę z prędkością przepływu 0,4 ml/min do kolumny Capcell Pak CL 300A, którą uprzednio zrównoważono 20% B. Po wypełnieniu kolumny przeprowadzano wymywanie przez 5 minut przy użyciu 20% B, a następnie przez 50 min z liniowym gradientem gęstości z 20% B d o40% B, a eluaty zbierano do polipropylenowych probówek w porcjach po 1 ml (2,5 min).

μΐ (1/500 frakcji) eluatu w każdej probówce mieszano z HSA i zagęszczano przez ultrafiltrację w celu uzyskania 0,25 ml pożywki lestowej zawierającej 0,02% HSA używanej w analizie do identyfikacji frakcji o aktywności TPO. W rezultacie silną aktywność TPO stwierdzono w próbkach z probówek nr 20 do 23 (zakres stężenia propanolu 28,5 i 32,5%). Ponadto po poddaniu próbek analizie zachodniej według sposobu opisanego w przykładzie 45 potwierdzono obecność TPO o pozornej masie cząsteczkowej 60000 do 70000 mierzonej w warunkach redukcyjnych w oparciu o markery masy cząsteczkowej DPC m oraz obecność innych cząsteczek o masie cząsteczkowej odpowiednio 32000 do 43000 i 20000 do 30000.

<Przykład 48>

Potwierdzenie biologicznej aktywności TPO pochodzącej z nadsączu komórek COS 1 transfekowanych wektorem ekspresj i pHTP 1 i oczyszczanych do etapu kolumny Capcell Pak Cl 300A.

Frakcje o aktywności TPO oczyszczane w przykładzie 36, mianowicie probówki o numerach 20 do 23 (zakres stężenia propanolu 28,5 do 32,4%) z kolumny Capcell Pak Cl 300A zbierano, mieszano z 0,21 ml glicerolu i zagęszczano, odparowując przez wirowanie. Następne mieszano z 0,21 ml roztworu 6 M chlorowodorku guanidyny, rozcieńczano do objętości 1 ml przy pomocy DPBS, wymieniano bufor na roztwór DPBS zawierający 0,01% HSA przy użyciu kolumny Sephadex G25 (NAP-10, firmy Pharmacia Biotech, nr katalogowy 17-0854-1) i mieszano z 1,1 ml roztworu DPBS zawierającego 0,01% HSA, uzyskując ostatecznie frakcje FA o aktywności TPO (2,6 ml). W celu zbadania próbki pod względem aktywności biologicznej TPO przeprowadzono analizę in vivo. Frakcję aktywną podawano podskórnie samcom myszy rasy ICR (w wieku 8 tygodni) w grupach po 4 osobniki przez 5 dni w dawce 100 μΐ na każdego (aktywność całkowita mierzona za pomocą systemu z zastosowaniem M-07e wynosiła 110000). Dla kontroli podawano podskórnie w ten sam sposób 100 μΐ DPBS zawierającego 0,01% HSA. Bezpośrednio przed zabiegiem i dzień po ostatnim podaniu pobierano krew z dna okna do pomiaru liczby płytek przy użyciu licznika mikrokomórkowego (F800, firmy Toa lyo Denshi). W grupie traktowanej TPO liczba płytek wzrosła średnio o współczynnik około 1,42 po zakończeniu doświadczenia w porównaniu z wartością przed doświadczeniem i była 1,23 razy wyższa niż w przypadku grupy kontrolnej ze znaczącą różnicą (p <0,05 w teście Studenta) pomiędzy nimi. Na podstawie tych wyników potwierdzono, że omówiona wyżej ludzka TPO produkowana w komórkach ssaków ma właściwość zwiększania liczby płytek in vivo.

<Przykład 49>

Potwierdzenie aktywności biologicznej surowej frakcji TPO uzyskanej z 33 litrów nadsączu z hodowli transfekowanych komórek COS 1 z wektorem ekspresji pHTPl i częściowe oczyszczanie za pomocą kolumny kationowymiennej.

(1) Do oceny wymienionych poniżej oczyszczonych próbek zastosowano system analizy z użyciem M-07e. W sposób opisany w przykładzie 36 uzyskano łącznie 33 litry pozbawionego surowicy nadsączu z hodowli komórek COS 1 transfekowanych wektorem ekspresji pHTPl i sączonych przez filtr 0,22 μΐ dla odzyskania nadsączu. Nadsącz zagęszczano około dziesięć razy za pomocą aparatu do ultrafiltracji (PLGC pellicon Cassette, spadek nominalnej masy cząsteczkowej 10000, firmy Milipore) i mieszano z około 1 mM w ostatecznym stężeniu inhibitora proteazy p-APMSF w celu uzyskania próbki 2018 ml w objętości (stężenie protein 3,22 mg/ml; suma protein 6502 mg; aktywność względna 66000, aktywność całkowita 429 100 000). Następnie

179 884 całość ponownie zagęszczano przy pomocy aparatu do ultrafiltracji (Omega Ultraset, spadek nominalnej masy cząsteczkowej 30000, firmy Filtron), uzyskując frakcję o masie cząsteczkowej 30000 lub mniej (objętość 1190 ml, stężenie protein 2,54 mg/ml; suma protein 1402 mg; aktywność względna 4500; aktywność całkowita 6 310 000). Obecność aktywności TPO we frakcji o masie cząsteczkowej 30000 lub mniej wskazuje na możliwość, że nadsącz z hodowli komórek zawiera TPO, której masa cząsteczkowa została zredukowana podczas ekspresji lub wydzielania z komórek zwierzęcych. Frakcję z masie cząsteczkowej 30000 i więcej wymieniano z buforem 20 mM cytrynianiu sodu (pH 6,1) i wprowadzano z prędkością przepływu 4 ml min do kolumny SP Sepharose Fast Flow (2,6 cm średnicy i 29 cm wysokości złoża, firmy Pharmacia Biotech, nr katalogowy 17-0729-01), którą uprzednio zrównoważono 20 mM bufora cytrynianu sodowego (pH 6,1). Po wprowadzeniu próbki kolumnę przepłukiwano i eluowano buforem 20 mM cytrynianu sodowego (pH 6,1). Następnie, przy użyciu 20 mM bufora cytrynianu sodowego jako rozpuszczalnika rozwijającego A i roztworu złożonego z rozpuszczalnika rozwijającego A i 1 M NaCl jako rozpuszczalnika rozwijającego B, przeprowadzano elucję z prędkościąprzepływu 3 ml/min z liniowym gradientem od 0% B do 50% B przez 215 minut, a następnie z 50% B do 100% B w ciągu 20 minut. Eluaty zbierano do polipropylenowych probówek po 30 ml (10 min). Po przebadaniu każdego z eluatów za pomocą systemu z zastosowaniem M-07e w celu sprawdzenia rozmieszczenia aktywności stwierdzono aktywność TPO w szerokim zakresie. W związku z tym frakcje eluowane za pomocą NaCl w stężeniu 50 mM i niższym, zawierające frakcję przepływową gromadzono jako frakcję FI, a główne frakcje TPO eluowane za pomocą 50 do 1000 mM NaCl jako frakcję F2. Objętość frakcji FI wynosiła 1’951 ml (stężenie protein 2,05 mg/ml; suma protein 3994 mg; aktywność względna 13500; aktywność całkowita 53 900000), objętość frakcji F2 wynosiła 649,8 (stężenie protein 1,11 mg/ml; suma protein 721 mg; aktywność względna 268000; aktywność całkowita 193 000000).

(2) Potwierdzenie aktywności biologicznej frakcji F2 z kolumny SP Sepharose Fast Flow

2,5 ml frakcji F2 z kolumny SP Sepharose Fast Flow, wydzielonej w powyższym etapie (1) poddawano wymianie buforowej z 3,5 ml roztworu DPBS zawierającego 0,01 % HSA w kolumnie Sephadex G25 (NAP-25, firmy Pharmacia Biotech, nr katalogowy 17-0852-01) i badano in vivo biologiczną aktywność TPO tej próbki (stężenie protein 1,46 mg/ml). Frakcję aktywnąpodawano podskórnie samcom myszy rasy ICR (w wieku 8 tygodni) w grupach po 4 osobniki przez 5 dni w dawce 100 pl każdego (aktywność całkowita mierzona przy pomocy systemu z zastosowaniem M-07e wynosiła 123000). Dla kontroli podawano podskórnie w ten sam sposób 100 pl DPBS zawierającego 0,01% HSA. Bezpośrednio przed zabiegiem i dzień po ostatnim podaniu pobierano krew z dna oka do pomiaru liczby płytek przy użyciu licznika mikrokomórkowego (F800, firmy Toa lyo Denshi). W grupie traktowanej TPO liczba płytek wzrosła średnio o współczynnik około 1,29 po zakończeniu doświadczenia w porównaniu z wartością przed doświadczeniem i była 1,12 razy wyższa niż w przypadku grupy kontrolnej ze znaczącą różnicą (p <0,05 w teście Studenta) pomiędzy nimi. Napodstawie tych wyników potwierdzono, że omówiona wyżej ludzka TPO produkowania w komórkach ssaków ma właściwość zwiększania liczby płytek.

<Przykład 50>

Konstrukcja rekombinowanego wektora pDEF202-ghTPO stosowanego do ekspresji chromosomowego DNA ludzkiej TPO w komórkach COS

Wektor pDEF202 trawiono enzymami restrukcyjnymi KpnY i Spel i poddawano elektroforezie na żelu agarozowym w celu wyizolowania fragmentu zawierającego minigen mysiej DHFR i sygnał poliadenylacji SV40. Przez ligacje przy użyciu ligazy DNA T4 (firmy Takara Shuzo) otrzymywano wektor pDEF202-ghTPO i uzyskano fragment z wektorem DNA, który sporządzono przez usunięcie regionu zawierającego sygnał poliadenylacji SV40 z plazmidu pEFHGTE przez traktowanie enzymami restrykcyjnymi KpnI i Spel. Plazmid ten zawiera początek replikacji SV40, promotor la ludzkiego czynnika wydłużania, wczesny region poliadenylacji SV40 dla transkrypcji genu ludzkiej TPO, minigen mysiej DHRF, początek replikacji pUC 18 i gen β-la

179 884 ktamazy (Amp^T) a chromosomowy DNA ludzkiej TPO połączony jest z dolną stroną promotora a ludzkiego czynnika wydłużania.

<Przykład 51>

Ekspresja chromosomowego DNA ludzkiej TPO w komórkach CHO

Komórki CHO (szczep DHRF, Urlaub i Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, t. 77, s. 4216, 1980) wzrastały przez hodowlę w pożywce podstawowej α-minimum (a-MEM)(-), wzbogacona hipoksantyną i tymidyną, zawierającą 10% osocza płodu bydlęcego, używając płytki do hodowli tkankowej o średnicy 6 cm (firmy Falcon), a otrzymane komórki poddawano transfekcji metodą fosforanu wapnia (CellPhect, firmy Pharmacia).

mikrogramów plazmidu pDEF202-ghTPO sporządzonego w przykładzie 50 mieszano ze 120 ml bufora A i 120 ml H₂O, a uzyskaną mieszaninę poddawano inkubacji w temperaturze pokojowej przez 10 minut. Roztwór mieszano następnie ze 120 pl bufora B i poddawano inkubacji w temperaturze pokojowej przez dalsze 10 minut. Otrzymany roztwór DNA nanoszono na płytkę i hodowano przez 6 godzin w inkubatorze z CO₂. Po usunięciu pożywki i dwukrotnym przepłukaniua-MEM(-) dodawano do płytki a-MEM(-), zawierającą 10% sulfotlenku dimetylowego i traktowano przez dwie minuty w temperaturze pokojowej. Następnie dodawano nieselektywną pożywkę (a-MEM(-) op. cit. wzbogacona hipoksantyną i tymidyną), zawierającą 10% dializowanej surowicy płodu bydlęcego i hodowano przez dwa dni. Następnie dokonano selekcj i przy użyciu selektywnej pożywki a-MEM(-) bez hipoksantyny i tymidyny, zawierającej 10% dializowanego FCS. Przeprowadzono selekcję, traktując komórki trypsynąi rozmieszczając traktowane komórki z płytki o średnicy 6 cm na pięciu płytkach o średnicy 10 cm lub na 20 płytkach po 24 zbiorniczki i kontynuowano hodowlę komórek, wymieniając pożywkę co dwa dni. Obecność aktywności ludzkiej TPO potwierdzono w nadsączu z hodowli na płytkach lub w zbiorniczkach, w których obserwowano proliferację komórek, mierząc aktywność ludzkiej TPO z zastosowaniem analizy przy użyciu Ba/F3. Komórki wydzielaj ące TPO ludzką do pożywki selekcjonowano następnie w pożywce selektywnej wzbogaconej 25 nM metotreksanu w celu wyizolowania klonu komórek produkującego większe ilości ludzkiej TPO.

W tym przypadku transfekcję komórek CHO można przeprowadzić również przez kotransfekcję komórek CHO plazmidami pEFHGTE i pMGl.

< Przykład 52>

Konstrukcja wektora stosowanego do ekspresji w E. coli ludzkiej proteiny TPO (reszty aminokwasowe w pozycjach 1 do 163) (zwanego dalej “hMKT(l-l 63)”, w którym dodane sąodpowiednio reszta Lys i reszta Met w pozycji -1 i pozycji - 2 oraz potwierdzenie jego ekspresji

W celu wywoływania ekspresji proteiny, której reszty aminokwasowe na pozycjach 1 i 3 są takie same jak ludzkiej proteiny TPO (reszty aminokwasowe pozycji 1 do 163) skonstruowano wektor pCFM536/hMKT(l-163), zwany również [Met'², Lys’¹]TPO(l-163) stosowany do ekspresji hMKT( 1 -163) w E. coli w sposób opisany w przykładzie 42 przy użyciu poniższych syntetycznych nukleotydów 1-13, 2-13, 3-3 i 4-3:

1-13: 5'-CTAGAAAAAACCAAGGAGGTAATAAATAATGAAATCTCCTGCACCA-3' (SEQ ID nr 125);

2-13: ^'-CAGGTGGITKIAGGAGAITTCAITAITTATTAC^ (SEQIDnr 126);

3-3: 5'-CCΊGCATGTOAITΓACGGGTCCΊGTCTAAACTGCΓGCG-3^, (SEQ ID nr 127);

4-3: 5'-CGCAGCAGTTTAGACAGGACCCGTAAATCACATG-3 (SEQIDnr 128);

179 884

1-13 20 3040

CTAGAAAAAA CCAA.GGAGGT ΑΑΤΑΑΑΤΑΑΓ GAAATCTCCT

ΤΤΊΊΊΤ GGTTCCTCCA ΊΤΑΠΤΑΤΓΑ CTTTAGAGGA

Zha2-13

60 3-3 7080

GCACCACCTG CATGTGATTT ACGGGTCCTG TCTAACTGC TGCG

CGTGGTGGAC GTACACTAAA TGCCCAGGAC AGATTTGACG ACGC.

4-3 (3EQIDnrl29)

Ten plazmid ekspresji zawiera sekwencję DNA przedstawioną w Wykazie Sekwencji (SEQ ID nr 12). Następnie wywołano ekspresję hMKT(l-163) jak w przykładzie 43.

Badanie uzyskanej proteiny podlegającej ekspresji za pomocą SDS-PAGE oraz transfer na membranę PVDF i analiza sekwencji aminokwasów końcówki N wykazały, że proteina ta zawiera sekwencję aminokwasów hMKT(l-163).

<Przykład 53>

Rozkładanie ludzkiej TPO, h6T(l-163) pochodzącej z ekspresji ludzkiej TPO w E. coli przy pomocy chlorowodorku guanidyny i glutationu oraz oczyszczanie i potwierdzenie jej aktywności biologicznej

1,2 g zamrożonych komórek rekombinowanego szczepu produkującego h6T(l-163) uzyskanego w przykładzie 43 zawieszono w 3 ml wody i rozrywano przy użyciu wysokociśnieniowego dezyntegratora. Przez odwirowanie zawiesiny odzyskano strąconą frakcję i usunięto większość współwystępujących protein, składników komórek itp. Odzyskana frakcję strąceniowa zawierającah6T(l-163) zawieszono w 4 ml w końcowej objętości wody, 1 ml bufora 1 MTris (pH 8,5) dodawano do zawiesiny, mieszając, a następnie dodano 20 ml 8 M chlorowodorku guanidyny i mieszano przez pięć minut w temperaturze pokojowej do rozpuszczenia zawartości. Uzyskany roztwór rozcieńczano 10 razy w buforze 20 ml Tris (pH 8,5), w rozcieńczonym roztworze rozpuszczano, mieszając, 5 mM glutationu typu redukcyjnego i 0,5 mM glutationu typu utlenionego, a następnie tak przygotowany roztwór poddawano inkubacji przez noc w temperaturze 4°C. Przez odwirowanie odzyskano h6T( 1 -163) w płynnym nadsączu, 160 ml odzyskanego nadsączu zagęszczano przy użyciu membrany do ultrafiltracj i YM10 (firmy Amicon) i poddawano wymianie buforowej z DPBS w celu uzyskania końcowej objętości 3,4 ml frakcji (stężenie protein 2,18 mg/ml). Po dokładnej dializie w stosunku do pożywki IMDM i ocenie systemem z zastosowaniem CFU-MK szczura stwierdzono silną aktywność TPO (aktywność względna58000).

Frakcję o aktywności TPO przygotowaną]ak wyżej analizowano in vivo. Frakcję aktywną podawano podskórnie samcom myszy rasy ICR (w wieku 7 tygodni) w grupach po 4 osobniki

179 884 przez 5 kolejnych dni w dawce 170 μΐ na każdego (aktywność całkowita mierzona przy pomocy systemu z zastosowaniem CFU-MK szczura wynosiła 22000). Dla kontroli podawano podskórnie w ten sam sposób 170 μΐ DPBS zawierającego 0,01% HSA każdemu z 6 zwierząt w grupie kontrolnej. Bezpośrednio przed zabiegiem oraz jeden dzień i trzy dni po ostatnim podaniu pobierano krew z dna oka do pomiaru liczby płytek przy użyciu licznika mikrokomórkowego (F800, firmy Toa lyo Denshi). W grupie traktowanej TPO liczba płytek wzrosła średnio o współczynnik około 2,15 po zakończeniu doświadczenia w porównaniu z wartością przed doświadczeniem, a efekt ten nie zmienił się nawet trzy dni po zakończeniu doświadczenia, wykazując wartość 2,13 razy wyższą. Liczba płytek następnego dnia i trzy dni po zakończeniu doświadczenia była 1,73 do 1,80 raza wyższa w grupie traktowanej TPO niż w przypadku grupy kontrolnej ze znaczącąróżnicą(p<0,001 w teście Studenta) pomiędzy nimi. Na podstawie tych wyników potwierdzono, że ludzka TPO produkowana przez E. coli i przygotowana powyższym sposobem ma właściwość zwiększania liczby płytek in vivo .

<Przykład 54>

Rozkładanie ludzkiej TPO, h6T(l-163), podlegającej ekspresji w E. coli, przy pomocy N-lauroilosarkozynianu sodu i siarczanu miedzi oraz oczyszczanie i potwierdzenie jej aktywności biologicznej

0,6 g zamrożonych komórek rekombinowanego szczepu produkującego h6T(l-163), otrzymanego w przykładzie 43, zawieszono w 3 ml wody i rozrywano przy pomocy wysokociśnieniowego dezyntegratora, a następnie odwirowywano w celu odzyskania wytrąconej frakcji. Po zawieszeniu frakcji strąceniowej w 3,1 ml wody, do zawiesiny dodawano, mieszając, 0,19 ml bufora 1 M Tris (pH 9,2), 11,25 μΐ 1 M DTT, 38 μΐ 0,5 M EDTA i 0,38 ml 10% roztworu dezoksycholanu sodowego, a następnie mieszano przez 40 minut w temperaturze pokojowej. Mieszaninę odwirowywano w celu odzyskania frakcji strąceniowej i usunięcia większości współwystępujących protein, składników komórek itp. Uzyskany osad zawieszono w 4 ml wody i odwirowywano w celu odzyskania frakcji strąceniowej zawierającej h6T(l-163). Odzyskaną frakcję strąceniowązawieszano w 3,8 ml wody i dodawano, mieszając, 0,2 ml bufora 1 M Tris (pH 8) i 1 ml 10% i N-lauroilo-sarkozynianu sodu i mieszano przez 20 minut w temperaturze pokojowej do rozpuszczenia zawartości. Uzyskany roztwór mieszano z 5 μΐ 1% siarczanu miedzi i mieszano przez noc (około 20 godzin) w temperaturze pokojowej. Uzyskany roztwór odwirowywano w celu odzyskania frakcji nadsączu zawierającej h6T( 1 -163) i mieszano 5 ml nadsączu z 5 ml wody i 10 ml bufora 20 mM Tris (pH 7,7), a następnie z 2,6 g żywicy jonowymiennej postaci chlorkowej Dowex l-x4 (sito 20-50) i mieszano przez 90 minut. Żywicę jonowymienną usuwano przy pomocy filtra szklanego w celu usunięcia frakcji nie adsorbowanej przez żywicę. Frakcję tę odwirowywano w celu odzyskania płynnego nadsączu. Odzyskany nadsącz wprowadzano do kolumny kationowymiennej SP Sepharose Fast Flow, którą uprzednio zrównoważono 20 mM bufora Tris (pH 7,7) i wymywano tym samym buforem z liniowym gradientem od 0 do 500 mM NaCl. Po poddaniu dokładnej dializie w stosunku do pożywki IMDM każdej wyeluowanej frakcji chromatografii kationowymiennej w kolumnie SP Sepharose Fast Flow i ocenie za pomocą analizy z zastosowaniem CFU-MK szczura stwierdzono silną aktywność TPO (aktywność względna 19 000000) we frakcji wyeluowanej ze stężenia NaCl około 100 mM. Frakcję tę zagęszczano 1,6 raza (2,5 ml; stężenie protein 25 pg/ml) przy pomocy aparatu do ultrafiltracji (Ultra Free CL, nominalny spadek masy cząsteczkowej 5000, firmy Millipore, nr katalogowy UFC4LCC25). Analiza zagęszczonej frakcji przy pomocy SDS-PAGE w obecności czynnika redukującego wykazała pasmo odpowiadające TPO jako pasmo główne (czystość 70 do 80%).

Frakcję o aktywności TPO przygotowaną] ak wyżej analizowano in vivo. Frakcję aktywną podawano podskórnie samcom myszy rasy ICR (w wieku 8 tygodni) w grupach po 4 osobniki przez 5 kolejnych dni w dawce 100 μΐ na każdego (aktywność całkowita mierzona za pomocą systemu z zastosowaniem CFU-MK szczura wynosiła 475000). Dla kontroli podawano podskórnie w ten sam sposób 100 μΐ bufora 20 mM Tris (pH 7,7), zawierającego 100 mM NaCl. Bezpośrednio przed zabiegiem i dzień po ostatnim podaniu pobierano krew z dna oka do pomiaru liczby płytek przy użyciu licznika mikrokomórkowego (F800, firmy Toa lyo Denshi). W grupie trakto

179 884 wanej TPO liczba płytek wzrosła średnio o współczynnik około 1,73 po zakończeniu doświadczenia w porównaniu z wartością przed doświadczeniem i była 1,59 razy wyższa niż w przypadku grupy kontrolnej ze znaczącą różnicą (p <0,01 w teście Studenta) pomiędzy nimi. Na podstawie tych wyników potwierdzono, że ludzka TPO produkowana przez E. coli i przygotowana jak wyżej ma właściwość zwiększania liczby płytek in vivo .

<Przykład 55>

Hodowla komórek CHO na dużą skalę

Hodowla na dużą skalę linii komórek CHO produkujących ludzką TPO (CHO 28-30, odporne na 25 mM ΜΤΧ) uzyskana przez transfekcję plazmdu ekspresji ludzkiej TPO, pDEF202hTPO-Pl do komórek CHO w przykładzie 32 przebiegała następująco: Linia komórek CHO byłą hodowana i rozmnażała się w pożywce DMEM/F-12 (GIBCO), zawierającej 25 nM ΜΤΧ i 10% FCS. Po oddzieleniu komórek roztworem trypsyny, 1 χ 10⁷ komórek posiewano w obrotowym naczyniu (ex Falcon, Falcon 3000) zawierającym 200 ml tej samej pożywki i hodowano w 37°C z prędkościąobrotów 1 rpm przez 3 dni. Po trzech dniach hodowli usuwano przez odsysanie nadsącz z hodowli, a komórki aldherentne CHO przepłukiwano 100 ml PBS. 200 ml pożywki DMEM/F-12 (GIBCO) nie zawierającej 25 η ΜΤΧ ani 10% FCS dodawano do naczynia i hodowano komórki w 37°C z prędkościąobrotów 1 rpm przez 7 dni. Po siedmiu dniach hodowli odzyskiwano nadsącz jako materiał wyjściowy do dalszego procesu oczyszczania. Omówione powyżej procesy przeprowadzano w 500 obrotowych naczyniach w celu uzyskania 100 1 nadsączu z hodowli.

<Przykład 56>

Oczyszczanie ludzkiej TPO z linii komórkowej CHO produkującej ludzką TPO (1) Około 100 1 pozbawionego osocza nadsączu z hodowli komórkowej, uzyskanego w przykładzie 55, filtrowano przy użyciu filtra 0,22 pm w celu otrzymania filtratu, który następnie zagęszczano przy pomocy aparatu do ultrafiltracji (PLTK Pellicon Millipore). Po zastąpieniu rozpuszczalnika koncentratu wodą czystą do otrzymanego roztworu dodawano inhibitory proteinazy, p-APMSF (Wako Pure Chemicals) i Pefabloc SC (Merck), w ostatecznym stężeniu odpowiednio 1 mM i 0,35 mM w celu uzyskania 3628 ml frakcji o masie cząsteczkowej 30000 lub więcej (stężenie protein 1,60 mg/ml; suma protein 5805 g; aktywność względna 1,230,000; aktywność całkowita 7,149,000,000). Frakcję poddawano następnie analizie kroplowej opisanej w przykładzie 45. Stwierdzono obecność proteiny TPO o masie cząsteczkowej pomiędzy 66,000 a 100,000). W bardziej szczegółowych badaniach okazało się, że odmiany TPO o mniejszej masie cząsteczkowej niż wyżej wymieniona znajdowały się we frakcji przepływowej.

Ultrafiltrat zawierający TPO o masie cząsteczkowej nie większej niż 30,000 zagęszczano osobno przy użyciu aparatu do ultrafiltracji (PLGC Pellicon casette, nominalny spadek masy cząsteczkowej 10,000, Millipore) w celu uzyskania 1901 ml frakcji TPO o niskiej masie cząsteczkowej (stężenie protein: 0,36 mg/ml; suma protein: 684 mg, aktywność względna: 245,500; aktywność całkowita 17,900,000). Świadczy to o generacji odmian TPO o niskiej masie cząsteczkowej w trakcie hodowli komórek.

Następnie do 3614 ml frakcji zawierającej TPO o masie cząsteczkowej 30,000 lub więcej dodawano 764 g siarczanu amonu i 144,5 ml bufora 0,5 M cytrynianu sodu (pH 5,5) w celu uzyskania 4089 ml roztworu, zawierającego 1,41 M (ostateczne stężenie) siarczanu amonu i 17,7 mM (ostateczne stężenie) bufora cytrynianu sodu. Po usunięcia z roztworu substancji nierozpuszczalnych przez odwirowanie, uzyskiwano roztwór sklarowany.

Czysty roztwór wprowadzano do kolumny Macro-Prep Methyl HIC (Bio-Rad, nr katalogowy 156-0080; średnica 5 cm, wysokość złoża 24,5 cm), którą uprzednio zrównoważono buforem 20 mM cytrynianu sodu (pH 5,5) zawierającym 1,2 M siarczanu amonu, a prędkością przepływu 25 ml/min. Po wypełnieniu kolumny przeprowadzano elucję buforem 20 mM cytrynianu sodu (pH 5,5) zawierającym 1,2 M siarczanu amonu. Wyeluowanąfrakcję zagęszczano następnie za pomocą aparatu do ultrafiltracji (ex Filtron, Omega Ultrasette, nominalny spadek masy cząsteczkowej 8,000) w celu uzyskania frakcji przepływowej F1 (4455 ml; stężenie protein 0,400 mg/ml; suma protein 1780 mg; aktywność względna 1,831,000).

179 884

Następnie 20 mM cytrynianu sodu (pH 6,0) jako bufor wymywający przepuszczano przez kolumnę w celu uzyskania eluatu, który następnie zagęszczano za pomocą tego samego aparatu do ultrafiltracji (tj. Omega Ultrasette, nominalny spadek masy cząsteczkowej 8,000) i zbierano frakcję F2 (1457 ml; stężenie protein 0,969 mg/ml; suma protein 1411 mg; aktywność względna 1,715,000). We frakcji F2 potwierdzono za pomocą SDS-PAGE obecność proteiny o masie cząsteczkowej 66,000 do 100,000. Analiza kroplowa wykazała, że jest to proteina TPO.

Następnie frakcję F2, wyeluowanąz kolumny Macro-Prep Methyl HIC (1443 ml) wprowadzano z prędkością przepływu 15 ml/min do kolumny SP Sepharose Fast Flow (5 cm średnicy i 12 cm wysokości złoża, firmy Pharmacia Biotech, numer katalogowy 17-0729-01), którą uprzednio zrównoważono buforem 20 mM cytrynianu sodu (pH 6,0). Po wprowadzeniu próbki przeprowadzano elucję buforem 20 mM cytrynianu sodu (pH 6,0), zawierającym 50 mM NaCl. Eluat zebrano i nazwano frakcją FI (3,007 ml; stężenie protein 0,226 mg/ml; suma protein 679 mg; aktywność względna 88,830). Następnie roztwór do elucji wymieniano na bufor 20 mM cytrynianu sodu (pH 5,4), zawierający 750 mM NaCl w celu uzyskania wyeliminowanej frakcji F2 (931 ml; stężenie protein 0,763 mg/ml; suma protein 710 mg, aktywność względna 5,558,000), którą zagęszczano do 202 ml przy użyciu aparatu do ultrafiltracji (Filtron, Omega Ultrasette, nominalny spadek masy cząsteczkowej 8,000 oraz Amicon, membrana YM 3). .

Następnie stężoną frakcję F2 o aktywności TPO (197 ml) wprowadzano do kolumny filtracyjnej żelowej Sephacryl S-200HR (Pharmacia Biotech, nr katalogowy 17-0584-05; średnica 7,5 cm, wysokość złoża 100 cm) z prędkością przepływu 2 ml/min. Eluaty w objętości 1,200-1,785 ml, 1,785-2,010 ml, 2,010-2,280 ml i 2,280-3,000 ml zbierano osobno w celu uzyskania frakcji odpowiednio FI (585 mg; stężenie protein 1,00 mg/ml; suma protein 589 mg, aktywność względna 4,118,000), F2 (225 ml; stężenie protein 0,263 mg/ml; suma protein 592 mg; aktywność względna 2,509,000), F3 (270 ml; stężenie protein 0,119 mg/ml; suma protein 32,1 mg; aktywność względna 2,535,000). Filtracja żelowa wykazała, że aktywność frakcjonowanej TPO występuje w szerokim zakresie masy cząsteczkowej. Po SDS-PAGE uzyskanych frakcji i analizie kropelkowej okazało się, że FI zawiera głównie cząsteczki TPO o masie cząsteczkowej 66,000 do 1,000,000, F2 cząsteczki TPO o masie cząsteczkowej 32,000 do 60,000,. a F3 cząsteczki TPO o masie cząsteczkowej 32,000 do 42,000. Wszystkie cząsteczki TPO posiadały aktywność TPO.

Na podstawie wyników sekwencj onowania aminokwasów końcówki N cząsteczki TPO o masie cząsteczkowej 66,000 do 100,000 potwierdzono, że cząsteczka TPO ma sekwencję aminokwasów proteiny kodowanej przez ludzkiej TPO.

Ponadto cząsteczkę TPO o masie cząsteczkowej 66,000-100,000 poddawano trawieniu enzymatycznemu przy użyciu enzymów glikozydazy, N-glikanazy (ex Genzyme, nr katalogowy 1470-00), neuraminidazy (Nakarai-Tesqu, nr katalogowy 242-29SP), endo-a-N-acetylogalaktozaminidazy (Seikagaku Kogyo, nr katalogowy 100453) i 0-glikozydazy (Boehringer Mannheim Biochemica, nr katalogowy 1347101) pojedynczo lub w kombinacji, a następnie analizie SDS-PAGE. Stwierdzono, że polipeptydowa część TPO posiada masę cząsteczkową36,000 jak przypuszczano na podstawie teoretycznej masy cząsteczkowej i jest glikoproteiną zawierającą łańcuchy cukrowe zarówno z wiązaniem N, jak i z wiązaniem O.

<Przykład 57>

Oczyszczanie ludzkiej TPO z linii komórek CHO produkujących ludzką TPO (1) Do 1 1 pozbawionego osocza nadsączu hodowli komórek CHO uzyskanego jak w przykładzie 55 dodawano 211,4 g siarczanu amonu, po czym mieszaninę filtrowano za pomocą filtra 0,2 pg (ex Gelman Science, nr katalogowy 12992). Uzyskany filtrat wprowadzano z prędkością 15 ml/min do kolumny Macro-Prep Methyl HIC (Bio-Rad, nr katalogowy 156-0081, średnica 50 mm, wysokość złoża 90 mm, którą uprzednio zrównoważono buforem 20 mM octanu sodu (pH 5,6) zawierającym 1,2 M siarczanu amonu. Po napełnieniu kolumny przeprowadzono elucję 450 ml bufora 20 mM octanu sodu (pH 5,6) zawierającego 1,2 siarczanu amonu. Wyeluowana frakcje wprowadzano następnie z prędkością0,75 ml/min, do kolumny z odwróconymi fazami Vydac C4 (The Separations Group, nr katalogowy 214BTP54, średnica 4,6 mm, wysokość

179 884 złoża 250 mm). Po wypłukaniu kolumny buforem 10 mM Tris (pH 6,4) zawierającym 5% etanolu (zwanym “rozpuszczalnikiem rozwijającym A”) przez 15 minut, przeprowadzono elucję podczas 66 minut liniowego gradientu od rozpuszczalnika rozwijającego A do 10 mM bufora Tris (pH 6,4) zawierającego 94% etanolu (zwanego rozpuszczalnikiem rozwijającym B). Uzyskany chrómatogram przedstawia fig. 15. W wyniku analizy SDS-PAGE, cząsteczka o masie cząsteczkowej 65,000-100,000, którą uważa się za TPO i która odpowiada frakcji z czasem retencji 68-72 min po dodaniu próbki ujawniała się na żelu SDS-PAGE jako pojedyncze pasmo (patrz fig. 16). Analiza kroplowa potwierdziła, że otrzymaną proteiną jest TPO.

Analiza aminokwasów końcówki N próbki proteinowej wykazała, że proteina ma sekwencję aminokwasów proteiny kodowanej przez gen ludzkiej TPO.

<Przykład 58>

Otrzymywanie rekombinowanego wirusa stosowanego do ekspresji ludzkiej TPO w komórkach owadzich

Plazmid pHTPl otrzymany w przykładzie 30 trawiono enzymami restrykcyjnymi EcoRI i Notl, a następnie poddawano elektroforezie na 1% żelu agarozowym w celu uzyskania pasa około 1200 bp, które oczyszczano za pomocą zestawu do oczyszczania DNA Prep-A-Gene. Oczyszczony DNA związano z wektorem transfekcji pVL 1393 (Invitrogen), traktowanym uprzednio tymi samymi enzymami restrykcyjnymi, a następnie transformowano do szczepu Competent High E. coli DH5 (Toyo Boseki). Z uzyskanych koloni wyselekcjonowano klon pVLl 393/hTPO, zawierający pełną długość regionu kodującego cDNA ludzkiej TPO. Następnie z klonu uzyskiwano DNA plazmidu metoda opisana w Molecular Cloning (Sambrook i in., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) i transfekowano do komórek owadzich Sf 21 (Invitrogen) przy użyciu zestawu do transfekcji BaculoGold™ (Farmingen), a traksfekowane komórki hodowano w pożywce Sf-900 (Lifetechnology) w temperaturze 27°C przez 4 dni do odzyskania nadsączu zawierającego wirus. Nadsącz rozcieńczano następnie do 1:10⁹ ~ 1:10⁵. Około 7 χ 10⁵ komórek infekowano przy użyciu 1 ml rozcieńczonego nadsączu w temperaturze 27°C przez jedną godzinę na płytce średnicy 35 mm. Po usunięciu nadsączu do hodowli dodawano 1% gorącej agarozy w pożywce Sf-99 i pozostawiano do zestalenia, a następnie przeprowadzano hodowlę przez 6 dni w temperaturze 27°C w wilgotnej atmosferze. Utworzony pojedynczy osad zbierano i uwalniano z niego wirusa w 200 μΐ pożywki Sf-900. Komórki Sf 21 infekowano uzyskanym klonem wirusa na płytce o 24 zbiorniczkach w celu rozmnożenia wirusa. Część cieczy zawierającej wirus z pojedynczego osadu traktowano fenolem/chloroformem, a następnie wytrącano etanolem w celu odzyskana DNA wirusa, który następnie zastosowano jako matrycę dla PCR przy użyciu swoistych primerów dla cDNA ludzkiej TPO. Rekombinowany wirus zawierający cDNA ludzkiej TPO wyselekcjonowano na podstawie amplikacji specyficznego fragmentu DNA. Następnie komórki Sf 21 infekowano nadsączem zawierającym rekombinowany wirus przenoszący cDNA ludzkiej TPO w celu rozmnożenia wirusa.

<Przykład 59>

Ekspresja ludzkiej TPO w komórkach owadzich Sf 21 i identyfikacja aktywności TPO

Komórki Sf 21 hodowano w naczyniu wielkości 175 cm² do uzyskania około 80% konfluencji, a następnie infekowano otrzymanym w przykładzie 58 rekombinowanym wirusem przenoszącym cDNA ludzkiej TPO w temperaturze 27°C przez 4 dni w celu odzyskania nadsączu z hodowli. Uzyskany nadsącz zastępowano pożywkąIMDM w kolumnie NAP™-5 (Pharmacia). W uzyskanych nadsączach stwierdzono znaczną aktywność TPO w stopniu zależnym od dawki zarówno w systemie analizy z zastosowaniem CFU-MK szczura, jak i analizy z zastosowaniem komórekM-07e. Rekombinowaną ludzką TPO podlegającą ekspresji w komórkach Sf 21 zidentyfikowano również za pomocą analizy kroplowej opisanej w przykładzie 45.

100

179 884 <Przykład 60>

Rozkładanie wariantowej ludzkiej TPO, h6t(l-163), pochodzącej z klonu pCFM536/h6T(l-163) przenoszącego zasadową sekwencję ludzkiej TPO przez ekspresję w £. coli przy użyciu N-lauroilosarkozynianu i siarczanu miedziowego oraz oczyszczanie h6T(l-163) g zamrożonego rekombinowanego drobnoustroju wytwarzającego h6T(l-163), otrzymanąw przykładzie 43, zawieszano w 300 ml wody, rozrywano w wysokociśnieniowym dezyntegratorze (10,000 psi, Rannie High Pressure Laboratory) i odwirowywano w celu odzyskania frakcji osadowej. Frakcję osadową zawieszano w 90 ml wody, do której następnie dodawano wody, mieszając, do uzyskania ostatecznej objętości 150 ml. Do mieszaniny dodawano, mieszając, 9 ml bufora IM Tris (pH 9,2), 540 μΐ 1M DTT, 38 μΐ 1,8 0,5 M EDTA i 18 ml 10% roztworu dezoksycholanu sodowego, a następnie mieszano przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Frakcję osadową odzyskiwano przez odwirowywanie, usuwając większość współwystępujących protein, składników drobnoustrojowych itp. Do osadu dodawano 180 ml 5 mM DDT w celu uzyskania zawiesiny, którą następnie odwirowywano, odzyskując frakcję osadową, zawierającąh6T(l-163). Do otrzymanego osadu dodawano 300 ml wody w celu uzyskania zawiesiny, do której, mieszając, dodawano wody, do uzyskania objętości cieczy 570 ml. Do mieszaniny dodawano trzydzieści ml bufora 1 M Tris (pH 8), 150 ml 10% N-lauroilosarkozynianu sodu, mieszając przez 20 min w temperaturze pokojowej w celu rozpuszczenia h6T(l-163). Następnie dodawano 750 μΐ 1% siarczanu miedziowego i mieszano przez noc (około 20 godzin w temperaturze pokojowej). Po uzyskaniu przez odwirowanie frakcji nadsączu zawierającej h6T( 1 -163) do 750 ml nadsączu dodawano 750 ml wody i 1,500 ml bufora 20 mM Tris (pH 7,7), a następnie 3 ml polisorbatu 80 (Nikko Chemicals). Do uzyskanego roztworu dodawano 600 g żywicy jonowymiennej DoweX 1-Χ4 (sito 20-50, forma chlorkowa), a następnie mieszano w temperaturze pokojowej. Po odzyskaniu frakcji nie adsorbowanej przy użyciu filtra szklanego, żywicę jonowymienną przemywano 750 ml bufora 20 mM Tris (pH 7,7). Połączony roztwór frakcji nie adsorbowanej i wymywanej sprowadzono do pH 9,2 przy pomocy 2 N wodorotlenku sodu, po czym wprowadzano do kolumny anionowymiennej Q Sepharose Fast Flow (ID 5 cm X 10 cm) zrównoważonej 20 mM bufora Tris (pH 9,2) zawierającego 0,1% polisorbatu 80 w celu odzyskania frakcji nie adsorbowanej. Przy pomocy kwasu chlorowodorowego ustalono wartość pH 7,2 uzyskanej frakcji nie adsorbowanej, którą wprowadzano do kolumny kationowymiennej SP Sepharose Fast Flow (ID 5 cm X 10 cm) zrównoważonej 20 mM bufora Tris (pH 7,2) zawierającego 0,2% polisorbatu 80 i wymywano z liniowym gradientem od 0 M do 500 mM NaCl w tym samym buforze. Wyeluowaną frakcję poddawano analizie SDS-PAGE w celu zebrania frakcji TPO, do której dodawano kwas trifluorooctowy do uzyskania stężenia 0,1%. Po wprowadzeniu uzyskanego roztworu do kolumny Capcell Pak 5μΐ 300A C1 (ID 2,1 cm X 5 cm X 2, Shiseido) przeprowadzono HPLC z odwróconymi fazami metodą elucj i liniowego gradientu z rosnącym stężeniem 1-propanolu w 0,1% kwasu trifluorooctowego. Ełuat analizowano przy pomocy SDS-PAGE bez czynnika redukującego. W efekcie frakcjonowano trzy frakcje na podstawie miejsca elucji w HPLC z odwróconymi fazami. Każdąz tych frakcji rozcieńczano trzykrotnie 0,1% kwasem trifluorooctowym. Każdą rozcieńczoną frakcję wprowadzano w podobny sposób do wspomnianej wyżej kolumny HPLC z odwróconymi fazami. Uzyskane trzy frakcje TPO, oznaczone jako Fr. S-a, Fr S-b i Fr. S-c w kolejności elucji w HPLC z odwróconymi fazami (patrz fig. 17), analizowano przy pomocy SDS-PAGE bez czynnika redukującego. Wykryto pojedyncze pasmo o masie cząsteczkowej około 18 kDa (Fr. S-a), około 19 kDa (Fr. S-b) lub 18 kDa (Fr. S-c) (patrz fig. 19). Zgodnie z analizą ich aminokwasów, każdy oznaczony skład aminokwasów był prawie identyczny z odpowiednimi wartościami teoretycznymi uzyskanymi na podstawie informacji o sekwencjach. Ponadto wyniki analizy aminokwasów końcówki N wskazują, że są to przewidywane sekwencje. Poziom protein każdej frakcji oznaczony za pomocą analizy aminokwasów wynosił 0,64 mg (Fr. S-a), 1,81 mg (Fr. S-b) lub 3,49 mg (Fr. S-c). Po pełnej dializie każdej frakcji wobec pożywki IMDM przeprowadzano analizę z zastosowaniem M-07e. Względna aktywność każdej frakcji wynosiła około 1,620,000 (Fr. S-a), 23,500,000 (Fr. S-b) lub 746,000,000 (Fr. S-c).

179 884

101 <Przykład 61 >

Rozkładanie wariantowej ludzkiej TPO, h6t( 1 -163), pochodzącej z klonu pCFM536/h6T przenoszącego sekwencję zasad ludzkiej TPO drogą ekspresji w E. coli, przy użyciu chlorodoworku guanidyny i cysteiny-cystyny oraz oczyszczanie h6T(l-163) g zamrożonego rekombinowanego drobnoustroju produkującego h6T(l-163), uzyskanąw przykładzie 43, dodawano do 500 ml wody, tworząc zawiesinę, rozrywano przy użyciu wysokociśnieniowego dezyntegratora (10,000 psi, Rannie High Pressure Laboratory) i odwirowywano w celu odzyskania frakcji osadowej. Frakcję osadu zawieszano w wodzie i mieszając, dodawano wody do osiągnięcia objętości płynu 250 ml. Następnie dodawano 15 ml bufora 1 M Tris (pH 9,2), 900 μΐ 1 M DTT, 3 μΐ 0,5 M EDTA i 30 ml 10% kwasu dezoksycholowego i mieszano w temperaturze pokojowej przez 30 minut. Po odwirowaniu frakcję osadu odzyskiwano, usuwając większość współwystępujących protein, składników drobnoustrojowych itp. Do osadu dodawano 399 ml 5 mM DDT i tworząc zawiesinę, po czym frakcję osadową zawierającą h6T(l-163) odzyskiwano przez odwirowanie. Odzyskaną frakcję osadową zawierającąh6T91-163) zawieszano w wodzie w ostatecznej objętości 104 ml. Do zawiesiny dodawano, mieszając 20 mM bufora 1 M Tris (pH 8,5) i 376 ml 8 M chlorowodorku guanidyny, a następnie mieszano w temperaturze pokojowej przez 10 min w celu rozpuszczenia h6T(l-163). Dodawano 2,500 ml bufora 20 mM Tris (pH 8,5) zawierającego 0,1% polisorbatu 80, a następnie, mieszając 2,000 ml bufora 20 mM (pH 8,5) zawierającego 1 M chlorowodorku guanidyny, wreszcie 5 mM cysteiny i 0,5 mM cystyny. Uzyskany roztwór poddawano inkubacji przez noc w temperaturze 4°C i odwirowywano w celu odzyskania h6T(l-163) w nadsączu, który następnie zagęszczano przy użyciu membrany do ultrafiltracji Prep Scalę UF cartridge PLDC (Millipore). Bufor koncentratu zastępowano 20 mM bufora Tris (pH 9,2) zawierającego 0,1% polisorbatu 80 do osiągnięcia ostatecznej objętości 1,000 ml. Uzyskany roztwór wprowadzano do kolumny anionowymiennej Q Sepharose Fast Flow (ID 5 cm X 10 cm), zrównoważonej 20 mM Tris (pH 9,2) zawierającym 0,1% polisorbatu 80 i eluowano z liniowym gradientem od 0 M do 500 mM NaCl w tym samym buforze, przy czym z frakcją (240 ml) eluowanąprzy około 20 mM odzyskiwano około 250 mM Na Cl. Otrzymana frakcje rozcieńczano czterokrotnie buforem 20 mM Tris (pH 7,2) do uzyskania całkowitej objętości 960 ml i za pomocą kwasu octowego ustalono pH 7,2. Następnie wprowadzono ją do kolumny katibnowymiennej SP Sepharose Fast Flow (ID 5 cm X 10 cm) zrównoważonej buforem 20 mM Tris (pH 7,2) zawierającym 0,1% polisorbatu 80 i wymywano z liniowym gradientem od 0 M do 500 mM NaCl w tym samym buforze. Eluat analizowano za pomocą SDS-PAGE i zbierano frakcję TPO. Do frakcji TPO dodawano kwas trifluorooctowy do ostatecznej objętości 0,1%. Uzyskany roztwór wprowadzano do kolumny Capcell Pak 5 pm 3000 A Cl (ID 2,1 cm X 5 cm X 2, Shiseido) i przeprowadzano HPLC z odwróconymi fazami metodą elucji liniowego gradientu z rosnącym stężeniem 1-propanolu w 0,1% kwasu trifluorooctowego. Eluat analizowano przy pomocy SDS-PAGE bez czynnika redukującego i frakcjonowano na dwie frakcje w zależności od miejsca alucji w HPLC z odwróconymi fazami. Dwie frakcje TPO oznaczono jako Fr. G-a i Fr. G-d na podstawie kolejności elucji w HPLC z odwróconymi fazami (patrz, fig. 17). Każdą frakcję analizowano przy pomocy SDS-PAGE bez czynnika redukującego. Wykrywano pojedyncze pasmo o masie cząsteczkowej około 18 kDa (Fr. G-a) lub około 32 kDa (Fr. G-d) (patrz fig. 18). Ponadto analiza SDS-PAGE powyższych frakcji w obecności czynnika redukującego wykazała w obu frakcjach obecność pojedynczego pasma o masie cząsteczkowej około 20 kDa. Wyniki analizy aminokwasów frakcji wskazują, że każdy skład aminokwasów j est niemal identyczny z odpowiednimi wartościami teoretycznymi, ustalonymi na podstawie informacji o sekwencjach. Wyniki analizy aminokwasów końcówki N potwierdzaj ąprzewidywane sekwencje. Poziom protein każdej frakcji oznaczony na podstawie wyników analizy aminokwasów wynosił 2,56 mg (Fr. G-a) lub 1,16 mg (Fr. G-d). Po pełnej dializie każdej frakcji w stosunku do pożywki IMDM przeprowadzano analizę z zastosowaniem M-07e. Stwierdzono, że względna aktywność TPO frakcji wynosiła około 3,960,000 (Fr. G-a) lub około 7,760,000 (Fr. G-d).

102

179 884 <Przykład 62>

Konstrukcja rekombinowanego wektora pDEF202-hTPO163 dla ekspresji częściowej długości ludzkiej TPO (aminokwasy 1 do 163) (zwanej dalej “hTPO 163) w komórkach CHO

Wektor pDEF202 skonstruowany w przykładzie 31 traktowano enzymami restrykcyjnymi EcoRl i Spel, a następnie odzyskiwano dłuższy fragment wektora przy pomocy elekroforezy na żelu agarozowym. Fragment ten związano przy użyciu ligazy DNA T4 (Takara-Shuzo) z cDNA hTPO163, uzyskanym przez traktowanie plazmidu pEF18S-htPO163, zawierającego cDNA hTPO kodujący aminokwasy 21 do 163 (SEQ ID nr 13), enzymami restrykcyjnymi EcoRI i SpeL otrzymując wektor ekspresji pDEF202-hTPO163. Plazmid ten zawierał początek replikacji SV40, ludzki promotor la czynnika wydłużania, początek replikacji pUC18 i gen β-laktamazy (Amp¹), w którym cDNA hTPO 163 jest związany z dolną stroną ludzkiego promotora la czynnika, wydłużania.

<Przykład 63>

Ekspresja hTPO 163 w komórkach CHO

Linię komórek CHO (szczep DHRF, Urlaub i Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, p 4216,1980) hodowano w pożywce podstawowej α-minimum (a-MEM(-) z tymidynąi hipoksantyną) zawierającą 10% surowicy płodu bydlęcego w 6-centymetrowym naczyniu (Falcon), a następnie transformowano za pomocą plazmidu pDEF202-hTPO163 metodą transfectum (Seikagaku Kogyo K.K.).

Streszczając, 10 pg plazmidu pDEF202-hTPO 163, otrzymanego w przykładzie 62 mieszano z 240 μ! 0,3 M NaCl, a następnie z mieszaniną 20 μΐ transfectum i 220 μΐ H₂O. Ten roztwór DNA nanoszono kroplami na płytkę, na której przeprowadzano dalsząhodowlę przez 6 godzin w inkubatorze z CO₂. Pożywkę usuwano z płytki, którą następnie dwukrotnie przepłukiwano a-MEM(-), a następnie, przed dwuminutową inkubacją w temperaturze pokojowej, dodawano 10% DMSO zawierającego a-MEM(-). Do płytki dodawano 10% nie selektywnej pożywki zawierającej 10% dializowanej surowicy płodu bydlęcego a-MEM(-) z hipoksantyną i tymidyną), przeprowadzano hodowlę przez dwa dni i selekcję w pożywce selektywnej zawierającej 10% dializowanej surowicy płodu bydlęcego (a-MEM(-) bez hipoksantyny i tymidyny). Selekcji dokonywano przez trypsynizowanie komórek, podział na 5 płytek 10-centymetrowych lub 20 płytek z 24 zbiorniczkami na płytce wielkości ponad 6 cm i dalsząhodowlę z wymianą pożywki na świeżą pożywkę selektywną w odstępach dwudniowych. Nadsącz z płytek lub zbiorniczków badano pod względem aktywności TPO, stosując test Ba/F3, przy czym stwierdzono aktywność TPO. Komórki, w których zaobserwowano aktywność TPO w nadsączach z hodowli, przenoszono na świeże płytki lub do zbiorników po podzieleniu ich do uzyskania gęstości 1:15 w stosunku do pożywki zawierającej 25 nM metotreksanu i kontynuowano hodowlę w celu rozmnożenia i klonowania komórek odpornych na metotreksan.

Alternatywnie, transformację komórek CHO można przeprowadzać przez kotransfekcję pEF 18S-hTPO163 i pMGl do komórek CHO.

Szczep CHO (CHO-DUKXB11) transfekowany plazmidem pDEF202-hTPO163 został zdeponowany przez twórców wynalazku 31 stycznia 1995 jako depozyt nr FERM BP4989 w Państwowym Instytucie Biotechnologii, National Institute of Bioscience and Humań Technology, Agency of Industrial Science and Technology, japońskiego Ministerstwa Handlu Zagranicznego i Przemysłu.

cPrzykład 64 >

Hodowla na dużą skalę komórek CHO

Hodowla na dużą skalę linii komórkowej CHO produkującej hTPO 163 (komórki CHO 109, uzyskane przez opisaną wyżej selekcję w selektywnej pożywce z 10% dializowanej surowicy bydlęcej [α-MEM' bez hipoksantyny i tymidyny], którą uzyskano przez transfekcję plazmidu ekspresji hTPO163, pDEF202-hTPO163 do komórek CHO w przykładzie 63, odbywała się następująco: Komórki CHO 109 wzrastały w pożywce DMEM/F-12 (GIBCO) z 10% FCS. Po zebraniu (lub trypsynizowaniu) komórek przy użyciu roztworu trypsyny dziesięć milionów komórek posiewano w obrotowej probówce (Falcon 3000) zawierającej 200 ml tej samej pożyw

179 884

103 ki i hodowano z prędkością obrotów 1 rpm w temperaturze 37°C przez trzy dni. Pożywkę usuwano przez odsysanie i powierzchnię hodowli zwilżano 100 ml PBS. Następnie do hodowli komórkowej dodawano 200 ml pożywki DMEM/F-12 (GIBCO) bez 10% FCS i kontynuowano hodowlę przez 7 dni w temperaturze 37°C przy 1 rpm. Zebrany nadsącz z hodowli zastosowano jako materiał wyjściowy do następnego etapu oczyszczania. Podobne procesy przeprowadzono w 300 obrotowych probówkach, uzyskując 60 1 nadsączu bez surowicy.

<Przykład 65>

Oczyszczanie hTPO163 z linii komórkowej CHO produkującej hTPO163 (1) 601 nadsączu bez surowicy, uzyskanego w przykładzie 64 filtrowano przez filtr 0,22 pm, zbierając filtrat, który zagęszczano przy pomocy aparatu do ultrafiltracji (Filtron, spadek masy cząsteczkowej 10,000), uzyskując stężoną frakcję (600 ml; 11,2 mg protein/ml; suma protein 6430 mg). Za pomocą analizy kroplowej tej frakcji przy użyciu przeciwciała peptydowego anty-HTl wykazano obecność proteiny hTPO163 podlegającej ekspresji w zakresie pozornej masy cząsteczkowej od 20,000 do 26,000.

Uzyskany stężony nadsącz (537 ml) wprowadzano do kolumny Sephadex G-25 Fine (Pharmacia-Biotech), nr katalogowy 17-0032-03; średnica 10 cm, wysokość złoża 30 cm), zrównoważonej uprzednio buforem 10 mM fosforanu sodu (pH 6,8) w celu uzyskania frakcji proteinowej FI (938 ml; stężenie protein 4,9 mg/ml; suma protein 4594 mg) jako roztwór w buforze lOmM fosforanu sodu (pH 6,8).

Frakcję proteinową (929 ml) z kolumny Sephadex G-25 Fine wprowadzano z prędkością 15 ml/min do kolumny SP Sepharose Fast Flow (Pharmacia-Biotech, nr katalogowy 17-0729-01; średnica 5 cm, wysokość złoża 12 cm), zrównoważonej uprzednio buforem 10 mM fosforanu sodu (pH 6,8), a następnie eluowano buforem 10 mM fosforanu sodu (pH 6,8) oraz tym samym buforem z 10% etanolu. Eluaty połączono w frakcję FI (1608 ml; stężenie protein 2,13 mg/ml; suma protein 3426 mg). Drugą elucję przeprowadzano buforem 10 mM fosforanu sodu (pH 6,8), zawierającym 750 mM NaCl i 25% etanolem w celu uzyskania głównego eluatu hTPO 163 frakcji F2 (651 ml; stężenie protein 1,67 mg/ml; suma protein 1087 mg).

Do frakcji F2 o aktywności TPO (200 ml) z kolumny SP Sepharose Fast Flow dodawano etanol i oczyszczano wodą w celu uzyskania 300 ml 45% (ostateczne stężenie) roztworu etanolu. Substancje nierozpuszczalne, powstałe wskutek dodania etanolu usuwano przez odwirowywanie. Nadsącz wstrzykiwano do kolumny SOURCE 15RPC (Pharmacia-Biotech, nr katalogowy 17-0727-02; średnica 2 cm, wysokość złoża 20 cm), zrównoważonej uprzednio 50% rozpuszczalnika A (bufor 10 mM octanu sodowego, pH 6,7) plus 50% rozpuszczalnika B (bufor 10 mM octanu sodowego, pH 6,7, zawartość etanolu 90%) z prędkością przepływu 2 ml/min. Kolumnę przepłukiwano 55% rozpuszczalnika A plus 45% rozpuszczalnika B do prawie całkowitego wyeluowania nieadsórbowanych substancji, po czym przeprowadzono elucję przy prędkości przepływu 1,5 ml/min zgodnie z następującym schematem: 50% B przez 5 minut; gradient liniowy z 50% B do. 100% B przez 140 minut, następnie 100% B przez 35 minut. Frakcję zbierano co 5 minut (odpowiednio 7,5 ml objętości). Wszystkie frakcje poddawano analizie SDS-PAGE i kroplowej w celu zbadania zakresu elucji hTPO 163. Stwierdzono, że wysoko oczyszczona hTPO 163 o pozornej masie cząsteczkowej od około 20,000 do 26,000 do 26,000 została wyeluowana w zakresie stężenia 66% do 87% etanolu. Spośród protein hTPO 163 wcześniej z kolumny z odwróconymi fazami wyeluowana została hTPO163 o większej masie cząsteczkowej, co sugeruje, że glikozylowane cząsteczki hTPO 163 maja zwiększoną hydrofilność.

Do 88,8 ml frakcji elucyjnej hTPO163 (tj. frakcji hTPO163 (90 ml) wyeluowanej w zakresie od 68% do 86,5% etanolu) z kolumny SOURCE 15RPC dodano CHAPS, mieszaninę zagęszczano i przepłukiwano, otrzymując 2,5 ml koncentratu o zawartości 5% etanolu i 4 mM CHAPS. Koncentrat ten wprowadzano następnie do kolumny Superdex 75 pg (Pharmacia Biotech, nr katalogowy 17-1017-01; średnica 2,6 cm, wysokość złoża 60 cm) zrównoważonej buforem lOmM fosforanu sodu (pH 6,8) zawierającego 10% etanolu z prędkościąprzepływu 1,5 ml/min. Po 60 minutach od wprowadzenia próbki zaczęto zbierać eluowane frakcje po 6 ml każda (tj. co czte

104

179 884 ry minuty). W efekcie wyeluowano hTPO163 we frakcjach z probówek od nr 16 do co najmniej 31, jak wykazała analiza SDS-PAGE. To miejsce elucji odpowiada zakresowi masy cząsteczkowej od około 44,000 do około 6,000, co stwierdzono za pomocą filtracji żelowej przy użyciu standardowego markera masy cząsteczkowej (mieszanina Bio-Rad, Gel Filtration Standard, nr katalogowy 151-1901 oraz Calbiochem, insulina, nr katalogowy 407696). Ponadto, cząsteczki hTPO 163 wydająsię eluowane w kolejności według malejącego stopnia glikozylacji. Wszystkie odmiany hTPO w zakresie numerów probówek od 16do31 (objętość elucji; 180 do 276ml) zbierano jako frakcję FA. Oprócz frakcji A zebrano osobno frakcje z probówek nr 16 do 18 (objętość elucji: 180 do 198 ml), 19 do 24 (objętość elucji: 198 do 234 ml) i 25 do 31 (objętość elucji 234 do 276 ml) i oznaczono odpowiednio jako FH, FM i FL. Frakcję uzyskiwano również przez połączenie części frakcji FH, FM i FI. Przedstawia to fig. 19.

(2) Frakcje FH, FM, FL i FA wyeluowane z kolumny Superdex 75 pg, jak opisano powyżej, zostaną scharakteryzowane bardziej szczegółowo. Sekwencje aminokwasów końcówki N odmian hTPO 163 uzyskanych powyżej oznaczano według sposobu z przykładu 1, lecz nie zidentyfikowano większości reszt Ser końcówki N. Jest prawdopodobne, że do Ser w końcówce N dodany jest cukier o wiązaniu O. Ponadto potwierdziło się, że sekwencja następująca po Ser końcówki N jest sekwencją aminokwasów spodziewaną na podstawie sekwencji genowej hTPO. Stężenia protein hTPO163 w FH, FM, FL i FA wynosiły odpowiednio 10,2 ng/ml, 6,2 mg/ml, 0,84 ng/ml i 3,2 ng/ml, oznaczone za pomocą analizy aminokwasów (AccQ, metoda Taga, Wastersa) z zastrzeżeniem, że są to stężenia części peptydowych nie zawierających łańcucha cukrowego. Frakcje te (100 ng każda) poddawano analizie SDS-PAGE w warunkach nieredukcyjnych przy użyciu multiżelu 15/25 (Dai-ichi Kagaku Yakuhin, 15 do 25% prefabrykowanego żelu poliakrylamidowego) lub w warunkach redukcyjnych za pomocąDTT, a następnie barwienia srebrem (Daiichi Pure Chemicals). Stwierdzono, że każda z tych frakcji zawiera wysoko oczyszczonąhTPO 163. Pozorna masa cząsteczkowa hTPO 163 w FH, FM, FL i FA obliczona przy użyciu markera masy cząsteczkowej DPCIII (Daiichi Pure Chemicals) jako wzorca w warunkach redukcyjnych, wynosiła odpowiednio 24,000 do 21,500, 23,000 do 21,000, 23,000 do 20,500 i 23,500 do 20,500 (patrz fig. 20). Natomiast pozorna masa cząsteczkowa hTPO w FH, FM, FL i FA obliczona przy użyciu wzorca SDS-PAGE znaczonego biotyną (Bio-Rad, Biotynylated SDS-PAGE Standards, Broad Rangę: nr katalogowy 161-0319) w warunkach redukcyjnych analizy kroplowej wynosiła odpowiednio 26,000 do 22,000,25,000 do 22,000, 26,000 do 21,000 i 26,000 do 21,000). Niejednorodność masy cząsteczkowej FH, FM, FL i FA może być związana z niejednorodnością łańcuchów cukrowych z wiązaniem O. Każdą z frakcji FH, FM, FL i FA trawiono neuraminidazą(Neuraminidase, Necalai tesąue, nr katalogowy 242-29SP), zredukowaną przy użyciu DTT i analizowano za pomocą SDS-PAGE. We wszystkich frakcjach pozorna masa cząsteczkowa wynosiła około 19,000, co wskazuje, że niejednorodność masy cząsteczkowej hTPO jest spowodowana przede wszystkim zróżnicowaną ilością kwasu sialowego w łańcuchach cukrowych połączonych z proteiną hTPO 163 i że uzyskana hTPO163 podlegała ekspresji w komórkach CHO jako glikoproteina.

(3) Frakcje FH, FM, FL i FA uzyskane w (2) analizowano pod względem ich aktywności in vitro w systemie z zastosowaniem M-07e. Swoista względna aktywność wynosiła 511,000,000, 775,000,000 i 1,150,000,000 i 715,000,000/mg proteiny hTPO163 (masa części peptydowej nie obejmuje masy cukru).

<Przykład 66>

Konstrukcja wektora E. coli dla ekspresji ludzkiej TPO (aminokwasy 1 do 332), w której dodano odpowiednio Lys napozycji-1 i Metnapozycji-2 (zwanej dalej “hMKT(l-332)” i ekspresja hMKT(l-332)

W celu ekspresji pełnej długości sekwencji aminokwasów ludzkiej TPO w E. coli kodony aminokwasów od 164 do 332 wymieniono na kodony preferencyjne E. coli,iak opisani poniżej.

179 884

105

Tabela 5

21: 5’-CTCCCGAACCGTACCAGCGGCCTGCTGGAAACCAACITTACCGCCGAG-3' (SEQIDnrl30)

22: 5^,-GGTAAAGTTGGTΊTCCAGCAGGCCGCTGGTACGGITCGGGAGCTCGT-3^, (SEQIDnr 131)

23: 5^,-CGCGCGTACCACCGGCAGCGGCCrGCTGAAArGGCAGCAGGGCTTTCGT--3' (SEQIDnrl32)

24: 5’-AGCCCTGCTGCCAnTCAGCAGGCCGCTGCCGGTGGTACGCGCGCTCGC”3’ (SEQIDnrl33)

25: 5'-GCGAAAATCCCGGGCCTGCIXjAACCAGACCAGCCGTAGCCTGGATCAGAT-3' (3EQIDnrl34)

26;5'-ATCCAGGCTACGGCTGGTCTGGTTCAGGCCCGGGATTTTCGCACGAAr3' (3EQIDnrl35)

27:5’-CCCGGGCTATCTGAACCGTArCCATGAACTGCTGAACGGCACCCGIG-3’ (SEQIDnrl36)

28:5'-GTGCCGTTCAGCAGTTCATGGATACGGTTCAGATAGCCCGGGATCTG-3' (SEQIDnrl37)

29: 5'-GCCTGITTCAGCAGTTCATGGArACGGTTCAGATAGGCCGGGATCTG-3' (SEQIDnrl38)

30: S^ArCCGGCGCGCCCAGGGTGCGACGGCTCGGGCCCGGAAACAGGCCACGG-S' (SEQIDnrl39)

31:5'-ArCAGCTCrGCACCAGCGATACCGGCAGCCTGCCGCCGAACCTGCAGCC-3' (3EQIDnrl40)

32: 5^,-CAGGTTCGGCGGCAGGCTGCCGGTAΓCGCTGGTGCCAGAG€TGAΓAΓCCG-.3^, (SEQIDnr 141)

33: S^GGGCTATAGCCCGAGCCCGACCCATCCGCCGACCGGCCAGTATACCCTGTT-S' (SEQIDnrl42)

106

179 884

34: 5'-GGTATACnXjGCCGGTCGGCGGATGGGTCGGGCTCGGGCTATAGCCCGGCTG-3' (3EQIDnrl43)

5: 3'-IGCGCIGCCGCCGACCCTGCCGACCCCGGTGG1TCAGCrGCATCCGCTGC-3’ (3EQIDnrl44)

36: 5^,-GGAΓGCAGCTGAACCACCGGGGTCGGCAGGGTCGGCGGCAGCGGAAACAG-3^, (3EQIDnrl45)

37:5'-TGCCGGATCCGAGCGCGCCGACCCCGACCCCGACCAGCCCGCTGCTGAACA-3’ (SEQIDnr 146)

38: 5'-AGCAGCGGGCTGGTCGGGGTCGGGGTCGGCGCGCTCGGATCCGGCAGCAGC-3’ (SEQIDnrl47)

39: 5'-CCAGCTATACCCATAGCCAGAACCTGAGCCAGGAAGGCTAATGAAGAAGCTTGA-3' (SEQIDnrl48)

40: 5'-CHTCATTAGCCnTCCTGGCTCAGGITUIGGCTATGGGTATAGCIGGIGTTC“3' (3EQIDnrl49)

41: 5’-ACGAGCTCCCGAACCGTACCA-3' (3EQIDnrl50)

42:5^,-σreATATCCGGCGCGCCCAGG-3^, (SEQIDnrl51) ^'-CGGATATCAGCTCTGGCACCA-S' (3EQIDnrl52)

44;5'-TCAAGCITCATTAGCCTrCCT-3' (SEQIDnrl53)

Syntetyczne oligonukleotydy: 21 i 22; 23 i 24; 25 i 26; 27 i 28; 29 i 30; 31 i 32, 33 i 34; 35 i 36; 37 i 38; lub 39 i 40 fosforylowano w roztworze 0,1 mM ATP, lOmM octanu Tris, lOmM octanu magnezowego, 50 mM octanu potasowego przy użyciu kinazy T4 (Pharmacia) w tej samej probówce. Następnie 1/10 objętości roztworu 100 mM Tris/HCl (pH 7,5), 100 mM MgCl₂, 500 mM NaCl dodawano do reaktywnej mieszaniny, gotowano przez 3 minuty w kąpieli wodnej i pozostawiano do wystygnięcia w celu utworzenia DNA o podwójnym łańcuchu. Cztery wersje DNA o podwójnym łańcuchu, tj. oligonukleotydy 21 i 22/23 i 24 (kombinacja A); oligonukleotydy 25 i 26/27 i 28 (kombinacja B); oligonukleotydy 31 i 32/33 i 34 (kombinacja C); oraz oligonu

179 884

107 kleotydy 3 5 i 3 6/3 7 i 3 8/3 9 i 40 (kombinacj a D) poddawano osobno ligacj i za pomocą zestawy do ligacji DNA (Takara-Shuzo), a następnie kombinację A wiązano z kombinacjąB, a kombinację C z kombinacją D, tworząc odpowiednio ligację 1 i ligację 2. Przy użyciu ligacji 1 i ligacji 2 jako matrycy przeprowadzono PCR, w której oligonukleotydy 41 i 42 dla ligacji 1 oraz oligonukleotydy 43 i 44 dla ligacji 2 zastosowano jako primery. Produktu PCR ligacji 1 i ligacji 2 trawiono odpowiednio Sad i EcoRI oraz EcoRI i Hindlll, a następnie poddawano elektroforezie na 2% żelu agarozowym i oczyszczano przy użyciu Prep-A-Gene DNA Purification Kit, otrzymując fragmenty o długości odpowiednio 240 bp i 250 bp. Obydwa uzyskane fragmenty subklonowano do pBluescript II KS+ (Stratagene), uprzednio trawionego Sad i 77ζη<ΛΠ (jako gospodarza użyto szczepu E. coli DH5). Z uzyskanych kolonii wyselekcyjonowano za pomocą analizy sekwencji klon o sekwencji zasadowej przedstawionej w tabeli 6 i nazwano go pBL(SH)(l74-332) (patrz SEQ ID nr 154).

Tabela 6

CTC CCG AAC CGT ACC AGC GGC CTG CTG GAA ACC ACC TTT ACC GCG AGC

Leu Pro Asn Arg Thr Ser Gly Leu Leu Glu Thr Asn Phe Thr Ala Ser

174180

GCG CGT ACC ACC GGC AGC GGC CTG CTG AAA TGG CAG CAG GGC TTTCGT

Ala Arg Thr Thr Gly Ser Gly Leu Leu Lys Trp Gin Gin Gly PheArg

190200

GCG AAA ATC CCG GGC CTG CTG AAC CAG ACC AGC CGT AGC CTG GATCAG

Ala Lys Ile Pro Gly Leu Leu Asn Gin Thr Ser Arg Ser Leu AspGin

210220

ATC CCG GGC TAT CTG AAC CGT ATC CAT GAA CTG CTG AAC GGC ACC CGT

Ile Pro Gly Tyr Leu Asn Arg Ile His Glu Leu Leu Asn Gly Thr Arg

230

GGC CTG TTT CCG GGC CCG AGC CGT CGC ACC CTG GGC GCG CCG GAT ATC

Gly Leu Phe Pro Gly Pro Ser Arg Arg Thr Leu Gly Ala Pro AspIle

240250

AGC TCT GGC ACC AGC GAT ACC GGC AGC CTG CCG CCG AAC CTG CAGCCG

Ser Ser Gly Thr Ser Asp Thr Gly Ser Leu Pro Pro Asn Leu Gin Pro

260

GGC TAT AGC CCG AGC CCG ACC CAT CCG CCG ACC GGC CAG TAT ACC CTG

Gly Tyr Ser Pro Ser Pro Thr His Pro Pro Thr Gly Gin Tyr Thr Leu

108

179 884

270280

TTT CCG CTG CCG CCG ACC CTG CCG ACC CCG CTG GTT CAG CTG CĄT.CCG

Phe Pro Leu Pro Pro Thr Leu Pro Thr Pro Val Val Gin Leu HisPro

290300

CTG CTG CCG GAT CCG AGC GCG CCG ACC CCG ACC CCG ACC AGC CCG CTG

Leu Leu Pro Asp Pro Ser Ala Pro Thr Pro Thr Pro Thr Ser Pro Leu

310

CTG AAC ACC AGC TAT ACC CAT AGC CAG AAC CTG AGC CAG GAA GGC TAA

Leu Asn Thr Ser Tyr Thr His Ser Gin Asn Leu Ser Gin Glu Gly

320 330 332

TGA AGC TTG A

Następnie pBL(XH)h6T(l-163) otrzymany w przykładzie 42 jako matryca został poddany PCR w obecności następujących syntetycznych oligonukleotydów 45 i 46 jako primery, a produkt PCR trawiono BawHI i Sad i poddawano elektroforezie na 6% żelu poliakrylamidowym w celu odzyskania fragmentu około 160 bp.

45: 5-AAGGATCCGAACGCTATCTTCCTG-3' (SEQ ID nr 155)

46: 5'-GGGAGCTCGTTCAGGGTCAGAACCAGA

GAGGTACGAGACGGAACAGCAGTGGTTGG-3' (SEQ ID nr 156)

Następnie pBL(SH)(174-332) trawiono Sad i HindSL, a produkt oczyszczano przy użyciu Prep-A-Gene DNA Purification Kit w celu uzyskania fragmentu około 480 bp. Dwa fragmenty przygotowane powyżej subklonowano do pBluescript IIKS+ (Stratagene) po uprzednim trawieniu RawHI i Hindlll (jako gospodarza użyto szczep E. coli DHS).

Spośród uzyskanych klonów za pomocą analizy sekwencji wyselekcjonowano klon o sekwencji zasadowej przedstawionej w tabeli 7 i nazwano go pBL(BH)(123-332) (patrz SEQ ID nr 157).

Tabela 7

G GAT CCG AAC ATC TTC CTG TCT TTC CAG CAC CTG CTG CTG GGC

Asp Pro Asn Ala Ile Phe Leu Ser Phe Gin His Leu Leu Arg Gly

123 130

AAA GTT CGT TTC CTG ATG CTG GTT GGC GGT TCT ACC CTG TGC GTT CGT

Lys Val Arg Phe Leu Met Leu Val Gly Gly Ser Thr Leu Cys Val Arg

140 150

CGG GCG CCG CCA ACC ACT GCT GTT CCG TCT CGT ACC TCT CTG GTT CTG

179 884

109

Arg Ala Pro Pro Thr Thr Ala Val Pro Ser Arg Thr Ser Leu Val Leu

160

ACC CTG AAC GAG CTC

Thr Leu Asn Glu Leu

170 174

Klony pBL(XL)h6T(l-163) sporządzone w przykładzie 42 trawiono enzymami RawHI i HindlU, a klon otrzymany pBL(BH)(123-332) otrzymany powyżej trawiono podobnie w celu uzyskania fragmentu około 640 bp, po czym oba fragmenty związano ze sobą uzyskując klon pł(XH)h6T(l-334). Następnie PCFM536/hMKT(l-163) sporządzony w przykładzie 52 trawiono Xbal i Sfil do otrzymania fragmentu około 270 bp, który związano z pBL(XH)h6T( 1 -3 34) trawionym tymi samymi enzymami restrykcyjnymi, uzyskując klon pBL(XH)hMKT(l-334). Po wytrawieniu pBL(XH)hMKT( 1-3 34) enzymami Xbal i HindlU odzyskiwano i oczyszczano fragment około 1040 bp, kodujący aminokwasy 1-332 ludzkiej TPO typu mutacji, a następnie klonowano do pCFM536 (EP-A-136490), trawionego uprzednio Xbal i HindlU. (Jako gospodarza użyto szczep E. coli JM109 transformowany uprzednio za pomocą pMWl (ATCC nr 39933). Uzyskany klon nazwano pCFM536/hMKT(l-332), a szczep E. coli przenoszący ten wektor ekspresji zastosowano jako transformant dla ekspresji proteiny typu mutacji hMKT( 1 -332). Plazmid ekspresji pCFN536/hMKT( 1-332) zawierają sekwencję DNA przedstawioną w SEQ ID nr 14.

Powyższy transformant był hodowany przez noc w 60 ml pożywki LB zawierającej 50 pg/ml ampicyliny i 12,5 pg/ml tetracykliny w temperaturze 30°C, a następnie hodowlę (25 ml) dodawano do 1000 ml pożywki LB zawierającej 50 pg/ml ampicyliny i wytrząsano w temperaturze 36°C aż OD₆₀₀ osiągnęło 1,0 do 1,2. Następnie, po dodaniu do hodowli około 330 ml pożywki LB w temperaturze 65°C, tak że ostateczna temperatura hodowli wynosiła 42°C, wytrząsanie kontynuowano przez kolejne trzy godziny w temperaturze 42°C, wytrząsanie kontynuowano przez kolejne trzy godziny w temerpaturze 42°C w celu wywołania ekspresji wariantowej ludzkiej TPO, proteiny hMKT(l-332), zwanej również [Met^-2, Lys'¹]TPO(l-332).

Otrzymaną hodowlę poddawano bezpośrednio analizie przy pomocy SDS-PAGE. W analizie SDS-PAGE zastosowano Multigel 15/25 (Daiichi Chemical Co.). Po elektroforezie i barwieniu barwnikiem Coomassie Blue stwierdzono na żelu obecność proteiny specyficznej dla indukcji ekspresji o masie cząsteczkowej około 35 KD, co potwierdza ekspresję proteiny hMKT(l-332) przy pomocy transformanta. Ponadto kolejna SDS-PAGE i elektroanaliza kroplowa (przy użyciu membrany mikrocelulozowej) wykazały, że powyższa proteina podlegająca ekspresji reagowała z przeciwciałem peptydowym anty-HTl z przykładu 45. Po zabarwieniu wykryto pasmo o masie cząsteczkowej około 35 kD, co wskazuje na ekspresję hMKT(l-332).

<Przykład 67>

Otrzymywanie pochodnych substancji ludzkiej TPO, ich ekspresja w komórkach COS7 i identyfikacja aktywności

Zgodnie z podanymi niżej sposobami, badano czy różne pochodne, w których aminokwasy ludzkiej TPO zostały częściowo zastąpione innymi aminokwasami wykazują również aktywność TPO.

Wektor pSMT stosowany do ekspresji w komórkach zwierzęcych, użyty w tym przykładzie skonstruowano w następujący sposób.

Najpierw plazmid ekspresji ρΧΜ-mEPORn, zawierający cDNA receptora erytropoetyny mysiej (uzyskany od dr DAndrea z Dana Farbor Cancer Institute; komórka: 57,277-285 (1989)) traktowano enzymami restrykcyjnymi Kpnl i EcoRI, a następnie poddano elektroforezie na żelu agarozowym dla odzyskania fragmentu wektora pXM, z którego usunięto cDNA receptora erytropoetyny mysiej. Następnie przy użyciu syntetyzatora DNA syntetyzowano dwa oligonukleo

110

179 884 tydy dla wprowadzenia miejsc restrykcji różnych klonów do powyższego wektora ekspresji (ABI). Syntetyzowane oligonukleotydy miały następujące sekwencje zasadowe:

primer 1:

5'-CCTCGAGGAATTCCTGCAGCCCGG<GACTAGTATCGGCTACCCCTACGACGTCCCCGACTACG

CCGGCGIUCATCACCATCACCATCACTGAGCGGCCG€C-3' (SEQ ID nr 158) primer 2:

5-AATTGGCGGCCGCTCAGTGATGGTGATGGTGATGAGCGCCGGCGTAGTCGGGGACGTCGTG

GGGTAGCCGATACTAGTCCCGGGCTGCAGGAATrCCTCGAGGGTAC-3' (3EQ ID nr 159)

Dwa oligonukleotydy mieszano i wyżarzano, tworząc oligonukleotyd o podwójnym łańcuchu, który następnie związano z wektorem pXM opisanym powyżej w obecności ligazy DNA T4 (Takara-Shuzo), tworząc wektor ekspresji pDMT201. W celu usunięcia cDNA DHRF mysiej z pDMT201, wektory pDMT201 i pEF18S trawiono osobno enzymami Notl i Hpal, a następnie poddawano elektroforezie na żelu agarozowym w celu odzyskania większego fragmentu DNA wektora pDMT201 i niniejszego fragmentu DNA wektora pEF18S. Następnie fragmenty te związano ze sobą przy użyciu ligazy DNA T4 (Takara-Shuzo), uzyskując wektor ekspresji pSMT201. Wektor pSMT201, jak pokazuje fig. 21 ma początek replikacji SV40, sekwencję wzmacniacza, sekwencję głównego późnego promotora adenowirusa, trzyczęściową sekwencję prowadzącą adenowirusa, łączącą sekwencję sygnałową, sekwencję miejsca wczesnej poliadenylacji SV 40, sekwencję genu RNA adenowirusa VA, początek replikacji pUC18 i gen β-laktamanazy (Amp^r) oraz następujące miejsca restrykcji dla ligacji pożądanych genów: miejsca EgUI, Pstl, KpnI, XhoK, Smal, Spel i Notl. Przedstawiony w przykładzie 30 pHTP przenoszący cDNA pełnej długości ludzkiej TPO w celu uzyskania fragmentu cDNA pełnej długości ludzkiej TPO, który następnie subklonowano do wektora pSMT201 trawionego uprzednio podobnie w celu wytworzenia plazmidu psMT201-hTPO.

Przy użyciu otrzymanego plazmidu pSMT201-hTPO jako matrycy skonstruowano plazmid β-GL-TPO/pBlue, który zastosowano jako matrycę do otrzymywania w poniższy sposób testowanych pochodnych.

W β-GLTPO/pBlue dokonano addycji sekwencji prowadzącej β-globuliny królika do miejsca nietranslacyjnego końca 5' ludzkiej TPO metodą Annweilera (Annweiler i in. Nuci. Acid Res., 19,3750,1991). W tym celu syntetyzowano chemicznie następujące dwa łańcuchy DNA 5'-AATTCCAAGATCTCACACTTGCTTTTGACACAAC

TGTGTTACTTGCAATCCCCCAAAACAGACAGACCC-3' (SEQ ID nr 160); oraz

5'-GGGTCTGTCTGTTTTGGGGGATTGCAAGTAAACA

CAGTTGTGTCAAAAGCAAGTGTGAGATCTTGG-3' (SEQIDnr 161) związano z fragmentem, uzyskanym przez trawienie wektora Bluescript IISK+ (Toyo-boseki) enzymami EcoRI i Smal w celu uzyskania wektora β-GL/pBlue, w który włączono sekwencję prowadzącą.

Przeprowadzono PCR przy pomocy następujących sekwencji primerów:

Sma-ATG: 5'-GGCCCGGGATGGAGCTGACTGAATTGCTC-3' (SEQ ID nr 162) (tzn. sekwencje 102-122 SEQ ID nr 7, do których dołączono sekwencję Smali)·, oraz koniec: 5'-TCAAGCTTACTAGTCCCTTCCTGAGACAGATTCTG-3' (SEQIDnr 163) (tj. antysens sekwencj i 1140-1160 SEQ ID nr 7, do którego dołączono sekwencje Spel i Hindlll).

179 884

111

Przeprowadzono PCR przy użyciu 1 ng DNA plazmidu pSMT201-hTPO DNA jako matrycy oraz 10 μΜ syntetycznych primerów. PCR wykonano stosując zestaw TaKaRa PCR Amplifikaton Kit (Takara Shuzo) oraz programowany kontroler termiczny (MJ Research) w objętości 100 pl w następujących warunkach: 3 cykle, każdy w 94°C przez 1 minutę, w 55°C przez 2 minuty i w.72°C przez 2 minuty, a następnie 20 cykli, każdy w 94°C przez 45 sekund, w 55°C przez 1 minutę i w 72°C przez jedna minutę. Produkt PCR ekstrahowano chloroformem i dwukrotnie strącano etanolem, a następnie zawieszono w 100 pl bufora TE.

Produkt PCR poddawano następnie trawieniu restrykcyjnemu enzymami Smal i Hindlll, ekstraktowano fenolem/chloroformem i strącano etanolem. Uzyskany osad rozpuszczano w 10 pl bufora TE, po czym subklonowano do wektora β-GL/pBlue, trawionego uprzednio tymi samymi enzymami restrykcyjnymi (jako gospodarza użyto szczep Competent High E. coli JM109 (Toyo-boseki)). Z transformowanych komórek wybrano 20 klonów z których otrzymywano DNA plazmidu zasadniczo w sposób opisany w Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989), Sambook i in. Oczyszczony DNA plazmidu identyfikowano przez sekwencjonowanie przy użyciu TAQ Dye Deoxy™ Terminater Cycle Seąencing Kit (Applied Biosystems, Inc.) i analizatora sekwencji DNA 373 A (AppliedBiosystems, Inc.). Potwierdzono, że plazmid kodujący β-GL-TPO/pBlue posiada przewidywaną sekwencję cDNA TPO bez żadnej substancji na całej długości. Następnie, po wytrawieniu pGL-TPO/pBlue enzymami Bglll i Spel, produkt trawienia ekstrahowano fenolem/chloroformem i strącano etanolem. Uzyskany osad rozpuszczano w 10 pl bufora TE i subklonowano do wektora pSMT201, który trawiono tymi samymi enzymami (jako gospodarza użyto szczepu Competent High E. coli JM 109 (Toyo-boseki). Metodą opisaną w Molecular Cloning (Sambrook i in., op. cit.) uzyskano DNA plazmidu z transformowanych komórek. Otrzymany wektor ekspresji pSMT/pGL-TPO posiadał strukturę z przyłączoną sekwencją prowadzącą β-globiny i cDNA ludzkiej TPO w dolnym miejscu restrykcji Bgili/Spel i łączącą sekwencję sygnałową wektora pSMT201, co przedstawia fig. 21. Wektor pSMT/pGL-TPO wykorzystano w transfekcji do komórek COS.

W celu uzyskania pochodnych substytucji ludzkiej TPO, przeprowadzono PCR z zastosowaniem metody Ito (Ito i in., Gene, 102; 67-70,1991). Dokładniej, dla przykładu sporządzono dwie pochodne ludzkiej TPO, w których Arg-25 i His-33 zastąpiono odpowiednio przez Asn i Thr. Pochodne te mogą być również określane jako [Asn²⁵]TPO i [Thr³³]TPO. Do PCR użyto następujących primerów:

T7: 5 '-TAATACGACTCACTATAGGGCG-3' (SEQ ID nr 164) (odpowiadający regionowi promotora T7 Bluescript II SK+);

ABgni: 5'-AATTCCAAGATCACACACTTGC-3' (SEQ ID nr 165) (do substytucji sekwencji rozpoznania BgUI);

koniec: 5'-TCAAGCTTACTAGTCCCTTCCTGAGACAGATTCTG-3' (SEQ ID nr 166) (antysens 1140-1160 SEQ ID nr 7, do którego dołączono sekwencje Spel i Hindlll)·, N3: 5'-TGGCACTGGCTCAGGTTGCTGTGAAGGACATGGG-3' (SEQ ID nr 167) (Arg 25 - > Asn z SEQ ID nr 7); oraz

09:5'-TGTAGGCAAAGGGGTAACCTCTGGGCA-3' (SEQ ID nr 168) (His-33 -> Thr z SEQ ID nr 7)

Pierwszy etap PCR przeprowadzono przy użyciu 1 ng DNA plazmidu β-GL-TPO/pBLUE jako matrycy oraz po 10 pg każdego z syntetycznych primerów. Kombinacje primerów były następujące: [1] ABglll i primery “końca”; [2] T7 i N3; oraz [3] T7 i 09. Przy użyciu zestawu TaKaRa PCR Amplification Kit (Takara-Shuzo) i programowanego kontrolera tenninczego (MJ Research) wykonano PCR w objętości 100 pl w następujących warunkach: 3 cykle, każdy w 94°C przez 1 minutę, w 55°C przez 2 minuty i w 72°C przez 2 minuty, a następnie 17 cykli, każdy w94°Cprzez45 sekund, w 55°C przez 1 minutęiw72°Cprzezjedna minutę. Każdy z produktów PCR ekstrahowano chloroformem i dwukrotnie strącano etanolem, a następnie zawieszono w 100 pl bufora TE. Uzyskane produkty PCR (po 1 pl) poddawano kolejnej PCR. Zastosowano następujące kombinacje matryc: produkty PCR [ 1 ]/[2] i produkty PCR [ 1 ]/[3]. Jeśli chodzi o primery w obu przypadkach zastosowano kombinację T7 i końca. Po inkubacji w 94°C przez 10 minut i

112

179 884 dodaniu TaKaRa Taq przeprowadzono PCR w następujących warunkach: 3 cykle, każdy w 94°C przez 1 minutę, w 55°C przez 2 minuty i w 72°C przez 2 minuty, a następnie 9 cykli, każdy w 94°C przez 45 sekund, w 55°C przez 1 minutę i w 72°C przezjednąminutę. Do każdego z uzyskanych produktów PCR dodawano 1 μΐ proteinazy K (5 mg/ml), 2 μΐ 0,5 EDTA i 2 μΐ 20% SDS, poddawano inkubacji w 37°C przez 30 minut w celu inaktywacji Taq, ekstrahowano fenolem/chloroformem i strącano etanolem. Następnie osad rozpuszczano w 20 μΐ jałowej wody i trawiono BgUI i Spei, a następnie ekstrahowano fenolem/chloroformem i wytrącano etanolem. Uzyskany osad rozpuszczano w 10 μΐ bufora TE, subklonowano do wektora ekspresj i pSMT201, trawionego uprzednio tymi samymi enzymami restrykcyjnymi i traktowano fosfatazą alkaliczną jelita cielęcego (Boehringer-Mannheim). (Jako gospodarza użyto szczepu Competent-High E. coli JM109). Z transformowanych komórek wybrano w każdym przypadku po 2 klony, z których otrzymywano DNA plazmidu zasadniczo w sposób opisany w Molecular Cloning, Cold Sprong Harbor Laboratory Press (1989), Sambook i in. Oczyszczony DNA plazmidu identyfikowano przez sekwencjonowanie przy użyciu TAQ Dye Deoxy™ Terminater Cycle Seąencing Kit i analizatora sekwencji DNA 373 A (oba Applied Biosystems, Inc.).

Plazmid otrzymany przez PCR za pomocąprimerów [1] i [3] zawierał cDNA kodujący pochodną substytucji TPO (O9/TPO). Potwierdzono substytucję aminokwasów His33(CAC) przez Tht(ACC) i rozwinięcie początku końcówki C (Gly 332) przez dodanie sekwencji aminokwasów TSIGYPYDVPDYAGVHHHHHH (SEQ ID nr 169). Pochodną tę określono jako [Thr³³, Thr³³³, Ser³³⁴, Ile³³⁵, Gly³³⁶, Tyr³³⁷, Pro³³⁸, Tyr³³⁹, Asp³⁴⁰, Val³⁴¹, Pro³⁴², Asp³⁴³, Tyr³⁴⁴, Ala³⁴⁵, Gly³⁴⁶, Val³⁴⁷, His³⁴⁸, His³⁴⁹, His³⁵⁰, His³⁵¹, His³⁵², His³⁵³]TPO.

Ponadto plazmid otrzymany przez PCR przy użyciu primerów [ 1 ] i [2] zawierał cDNA kodujący pochodną subsytucji TPO (N3/TPO). Potwierdzono substytucje aminokwasów Arg259(AGA) przez Asn(AAC) i Glu231(GAA) przez Lys (AAA) i rozwinięcie początku końcówki C (Gly 332) przez dodanie sekwencji aminokwasów TSIGYPYDVPDYAGVHHHHHH. Pochodną tę określono jako [Ans²⁵, Lys²³¹, Thr³³³, Ser³³⁴, Ile³³⁵, Gly³³⁶, Tyr³³⁷, Pro³³⁸, Tyr³³⁹, Asp³⁴⁰, Val³⁴¹, Pro³⁴², Asp³⁴³, Tyr³⁴⁴, Ala³⁴⁵, Glu³⁴⁶, Val³⁴⁷, His³⁴⁸, His³⁴⁹, HIS³⁵⁰, HIS³⁵¹, His³⁵², His³⁵³]TPO.

Transfekcję każdego klonu do komórek COS7 przeprowadzono metodą DEAE-dekstranu obejmującą traktowanie chlorochinąjak opisano w przykładzie 35. Streszczając, do transfekcji użyto 40 pg każdego plazmidu DNA, po pięciu dniach odzyskano nadsącz z hodowli, który następnie zagęszczano do objętości 1/20, stosując Centricon-30 (Amicon) w celu oznaczenia aktywności TPO w analizie z zastosowaniem M-07e. W nadsączach z hodowli komórek COS7, do których transfekowano odpowiednio plazmidy zawierające cDNA, kodujące pochodne substytucji ludzkiej TPO, N3/TPO i 09/TPO, stwierdzono aktywność TPO w stopniu zależnym od dawki (patrz fig. 22).

<Przykład 68>

Otrzymywanie pochodnych insercji lub delecji ludzkiej TPO, ich ekspresja w komórkach COS7 i identyfikacja aktywności TPO

W przykładzie tym sprawdzano, czy pochodne insercji lub delecji hTPO163 wykazują aktywność TPO.

Otrzymano pochodną delecji His33 ([AHis³³]TPO(l-163), dH33); pochodną delecji Glyll6 ([AGly¹¹⁶]TPO(l-163), dG116); pochodną delecji Argll7 ([AArg¹¹⁷]TPO(l-163), dR116); pochodną insercji Thr ([His³³, Thr³³', Pro³⁴]TPO(l-163), 7339, pochodną insercji Ala ([His³³, Ala³³', Pro³⁴]TPO(l-163), A33') i pochodną insercji Gly ([His³³, Gly³³', Pro³⁴, Ser³⁸]TPO(l-163), w których Thr, Ala i Gly wstawiono niezależnie pomiędzy His33 a Pro34; oraz pochodnąinsercji Asn 9[Gly¹¹⁶, Asn¹¹⁶', Arg¹¹⁷]TPO(l-163), NI 16¾ pochodnąinsercji Ala ([Gly¹¹⁶, Ala¹¹⁶’, Arg¹¹⁷]TPO(l-163), Alló*) i pochodną insercji Gly ([Gly¹¹⁶, Gly¹¹⁶', Arg¹¹⁷]TPO(l-163), 0116¾ w których Asn, Ala i Gly wstawiono niezależnie pomiędzy Gly 116 a Arg 117, wszystkie sekwencje na podstawie SEQ ID nr 13.

Spośród tych pochodnych T33' i NI 16' wykazywały właściwość wprowadzania łańcuchów cukrowych, odpowiednio typu mycyny i typu z wiązaniem Asn.

179 884

113

Wymienione wyżej pochodne sporządzono za pomocą PCR metodą opisaną przez Ito i in. (Gene, 102, 67-70, 1991). Sekwencje zastosowanych primerów były następujące:

dH33: 5'-TGTAGGCAAAGGAACCTCTGGGCA-3'(SEQ ID nr 172) (do otrzymania pochodnej delecji His33 na podstawie sekwencji przedstawionej w SEQ ID nr 7);

T33: 5'-TGTAGGCAAAGGAGTGTGAACCTCTGG-3' (SEQ ID nr 173) (do otrzymywania pochodnej insercji Thr z Thr wstawioną pomiędzy His33 a Pro34 w sekwencji przedstawionej w SEQ ID nr 7);

A33': 5'-TGTAGGCAAAGGAGCGTGAACCTCTGG-3' (SEQ ID nr 174) (do otrzymywania pochodnej insercji Ala z Ala wstawionąpomiędzy His33 a Pro 34 w sekwencji przedstawionej w SEQ ID nr 7);

G33': 5'-TGTAGGCAAAGGTCCGTGAACCTCTGG-3' (SEQ ID nr 175) (do otrzymywania pochodnej insercji Gly z Gly wstawionąpomiędzy His33 i Pro34 w sekwencji przedstawionej w SEQ ID nr 7);

dG116: 5'-AGCTGTGGTCCTCTGTGGAGGAAG-3' (SEQ ID nr 176) (do otrzymywania pochodnej delecji Glylló na podstawie sekwencji przedstawionej w SEQ ID nr 7);

dRI 17: 5'-GTGAGCTGTGGTGCCCTGTGGAGG-3' (SEQ ID nr 177) (do otrzymywania pochodnej delecji Argll7 na podstawie sekwencji przedstawionej w SEQ ID nr 7);

N116: 5-AGCTGTGGTCCTGTTGCCCTGTGGAGG-3' (SEQ ID nr 178) (do otrzymywania pochodnej insercji Asn z Ans wstawionąpomiędzy Glyl 16 a Argll7 w sekwencji przedstawionej w SEQ ID nr 7);

Al 16': 5'-AGCTGTGGTCCTAGCGCCCTGTGGAGG-3' (SEQ ID nr 179) (do otrzymywania pochodnej insercji Ala z Ala wstawionąpomiędzy Glyl 16 a Argl 17 w sekwencji przedstawionej w SEQ ID nr 7);

Gil6': 5'-AGCTGTGGTCCTTCCGCCCTGTGGAGG-3' (SEQ ID nr 180) (do otrzymywania pochodnej insercji Gly z Gly wstawionąpomiędzy Glylló a Argl 17 w sekwencji przedstawionej w SEQ ID nr 7);

dRI: 5'-CGGGCTGCAGGATATCCAAGATCTCA-3' (SEQ ID nr 182) (do substytucji sekwencji rozpoznania enzymu restrykcyjnego EcoRI);

T7: 5'-TAATACGACTCACTATAGGGCG-3' (SEQ ID nr 182) (odpowiadający regionowi promotora T7 BluescriptIISK+); oraz endWI: 5'-GGGCGGCCGCTCAGCTGGGGACAGCTGTGGTGGG-3' (SEQ ID nr 183) (antysens sekwencji nukleotydów 633-653 SEQ ID nr 7; do którego dodano kodon kończący i sekwencję rozpoznania NotT).

Pierwszy etap PCR przeprowadzono przy użyciu 1 ng DNA plazmidu β-GL-TPO/pBLUE, uzyskanego w przykładzie 67 jako matrycy oraz 10 pg syntetycznych primerów. Kombinacja primerów była następująca: [1] dRI i endNotl lub [2[ T7 i primery mutowane (dH33, A33', G33', T33', dG116, dR117, A116', G116' i N116'). Przy użyciu zestawu TaKaRa PCR Amplification Kit (Takara-Shuzo) i programowanego kontrolera termicznego (MJ Research) przeprowadzono PCT w objętości 100 pl. W pierwszej reakcji PCR dla [1] wykonano 3 cykle, każdy w 94°C przez 1 minutę, w 45°C przez 2 minuty i w 72°Ć przez 2 minuty, a następnie 17 cykli, każdy w 94°C przez 45 sekund, w 45°C przez 1 minutę i w 72°C przez jedną minutę. Pierwszą reakcję PCR dla [2] przeprowadzono w następujących warunkach: 3 cykle, każdy w 94°C przez 1 minutę, w55°C przez 2 minuty i w 72°C przez 2 minuty, a następnie 17 cykli, każdy w 94°C przez 45 sekund, w 55°C przez 1 minutę i w 72°C przez jedną minutę. Każdy z produktów PCR ekstrahowano chloroformem i dwukrotnie strącano etanolem, a następnie rozpuszczono w 100 pl bufora TE.

Następnie przeprowadzono drugi etap PCR przy użyciu 1 pl każdego z produktów PCR [ 1 ] i [2], Zastosowano kombinację primerów T7 i endNotl. Po inkubacji w 94°C przez 10 minut dodano do TaKaRa Taq do każdej mieszaniny reakcji PCR. Drugą PCR przeprowadzono w następujących warunkach: 3 cykle, każdy w 94°C przez 1 minutę, w 55°C przez 2 minuty i w 72°C przez 2 minuty, a następnie 9 cykli, każdy w 94°C przez 45 sekund, w 55°C przez 1 minutę i w

114

179 884

72°Cprzezjednąminutę. Do każdego z uzyskanych produktów PCR dodawano 1 μΐ proteinazy K (5 mg/ml), 2 μΐ 0,5 EDTA i 2 μΐ 20% SDS, mieszaninę pozostawiono w 37°C przez 30 minut w celu inaktywacji Taq. Produkt PCR ekstrahowano fenolem/chloroformem i strącano etanolem. Następnie osad rozpuszczano w 20 μ1 jałowej wody. Po trawieniu EcoRI iNotl, roztwór ekstrahowano fenolem/chloroformem i wytrącano etanolem. Uzyskany osad rozpuszczano w 10 μΐ bufora TE, subklonowano do wektora ekspresji pEF 18S, trawionego uprzednio tymi samymi enzymami restrykcyjnymi i traktowano fosfatazą alkaliczną jelita cielęcego (Boehringer-Mannheim). Jako gospodarza użyto szczepu Competent-High E. coli JM109(Toyo-Boseki). Z uzyskanych transformantów otrzymywano DNA plazmidu zasadniczo w sposób opisany w Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989), Sambook i in. Sekwencję nukleotydową oczyszczonego DNA plazmidu potwierdzono przy użyciu TAQ Dye Deoxy™ Terminater Cycle Seqencing Kit (Applied Biosystems) i analizatora sekwencji DNA 373 A. Potwierdzono, że wszystkie plazmidy kodującego dH33, A33', T33', dGl 16, dRl 17,Ali 6', G116'iN116' miały przewidywane sekwencje cDNA TPO bez żadnej substancji sekwencji nukleodytów w innych miejscach niż zamierzone. W G33' zaobserwowano natomiast zastąpienie zasady [Pro38 (CCT)-> Ser (TCT)] w innym miejscu niż przewidywane.

Transfekcję każdego klonu do komórek COS7 przeprowadzono sposobem z przykładu 11. Streszczając, do transfekcji 10 pg każdego DNA plazmidu dokonano metodą DEAE-dekstranu obejmującą traktowanie chlorochiną. Po pięciu dniach odzyskiwano nadsącz z hodowli, który następnie poddawano analizie z zastosowaniem M-07e. W każdym nadsączu z hodowli komórek COS7, do których transfekowano plazmidy kodujące pochodne insercji lub delecji stwierdzono aktywność TPO w stopniu zależnym od dawki (patrz fig. 22). Nie stwierdzono natomiast aktywności TPO w nadsączu z hodowli komórek COS7, do których transfekowano plazmid ekspresji pEF18S nie zawierający cDNA kodującego pochodne TPO.

<Przykład 69>

(1) Z sekwencji aminokwasów ludzkiej TPO, SEQ ID nr 119, wybrano sześć regionów (przedstawionych w tabeli 8), które wydawały się stosunkowo korzystne jako antygeny i według sposobu Tama {Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85, 5409-5413, 1988) syntetyzowano z nich czterołańcuchowy peptyd typu wielokrotnego antygenu peptydowego (MAP). Stosując 100 pg każdego syntetyzowanego peptydu ośmiokrotnie uodpamiano nim dwa króliki.

Ponadto otrzymano jednołańcuchowe peptydy przez wiązanie reszty cysteinowej z końcówką C każdego regionu peptydowego spośród przedstawionych w SEQ IDnrll9-1214, które są częściowymi peptydami odpowiadającymi pozycjom 8 do 28, 47 do 62, 108 do 126, 172 do 190,262 do 284 i 306 do 332 sekwencji SEQ ID nr 191). Stosując je jako antygeny testowe mierzono za pomocą analizy immunologicznej poziom przeciwciał w surowicach, uzyskanych z immunizowanych królików, potwierdzając wzrost poziomu przeciwciał we wszystkich testowanych próbkach surowicy. Surowice te określono jako przeciwsurowice.

Ponadto wymieniony wyżej jednołańcuchowy syntetyczny peptyd z resztą cysteinową związaną z końcówką C zastosowano również jako antygen do oczyszczania z powinowactwem przeciwciał w następujący sposób (2).

(2) Dwa króliki immunizowano jednym z wymienionych wyżej peptydów antygenowych i osobno sporządzano przeciwciała pochodzące z każdego z immunizowanych królików. Konkretnie, dla przeciwciał anty-HT 1 utworzono przeciwciało peptydowe anty-HT 1 -1 i anty-HT 1 -2, pochodzące od dwóch immunizowanych królików.

Jeden z przykładów oczyszczania przeciwciała peptydowego anty-HTl-1-1 przedstawiono poniżej.

Najpierw 30 mg jednołańcuchowego peptydu HT1, z którym związano resztę cysteinową sprzęgano z 12 ml żelu Sulfo-Link (Pierce Co., numer katalogowy 44895). Dokładniej, roztwór peptydowy, zawierający antygen sprzęgano przez 15 minut z żelem zrównoważonym buforem sprzęgającym (50 mM Tris, 5 mM EDTA-Na pH 8,5) w objętości 6 razy większej od objętości żelu. Następnie, po pozostawieniu na 30 minut do uzyskania stanu statycznego żel przemywano buforem sprzęgającym w trzykrotnej objętości żelu. Bufor sprzęgający zawierający 0,05 M

179 884

115

L-cysteiny-HCl dodawano do żelu w ilości 1 ml/ml żelu w celu zablokowania nieprzereagowanych rodników przez 15 minut. Po pozostawieniu przez 30 minut do uzyskania stanu statycznego żel przemywano buforem sprzęgającym w objętości 8 razy większej od objętości żelu. Operację sprzęgania przeprowadzano w temperaturze pokojowej. Peptyd wiązano kowalentnie z żelem przy wydajności sprzęgania 28,3%, a następnie przygotowywano kolumnę antygenowąz 0,8 mg peptydu sprzężonymi z 1 ml żelu. Po pobraniu krwi od każdego z immunizowanych królików uzyskano 78,4 ml przeciwsurowicy zawierającej przciwciało peptydowe anty-HTl-1. 76,4 ml przeciwsurowicy (zawartość protein 3620 mg), wprowadzano do kolumny antygenowej uprzednio zrównoważonej 50 mM bufora fosforanowego (pH 8) zawierającego 150 mM NaCl i 0,05% azydku sodowego i przepłukiwano kolumnę tym sam buforem. Uzyskano 105,9 ml frakcji przepływowej (zawartość protein 3680 mg). Następnie adsorbowaną frakcję wymywano 0,1 M buforem kwasu cytrynowego (pH 3,0) i natychmiast zoboj ętniano 21,1 ml 0,1M bufora węglanowego (pH 9,9), a później zagęszczano za pomocąultrafiltracji (przy pomocy membrany YM30, produkcji Amicon Co.) i oczyszczano w roztworze 50 mM bufora fosforanowego (pH 8) zawierającego 150 mM NaCl i 0,05% azydku sodowego). W buforze otrzymano 11,2 ml oczyszczonego przeciwciała peptydowego anty-HTl-1 (o zawartości protein 77,7 mg). W powyższy sposób uzyskiwano przciwciało peptydowe anty-HTl-2 (60,0 mg), przeciwciało peptydowe anty-HT2-l (18,8 mg), przeciwciało peptydowe anty-HT2-2 (8,2 mg) itp.

W powyższy sposób można też otrzymać przeciwciała peptydowe anty-HT3 do anty HT6.

<Przykład 70>

Wykrywanie TPO metodą analizy kroplowej (1) Przeciwsurowice uzyskane w przykładzie 69 testowano w poniższy sposób.

Wzorcową próbkę rekombinowanej ludzkiej TPO, częściowo oczyszczonej z nadsączu hodowli komórek CHO, do których wprowadzono podlegający ekspresji gen kodujący aminokwasy 21 do 332 z SEQ ID nr 6, poddano elektroforezie na poliakrylamidzie SDS (SDS-PAGE) powszechnie stosowano metodą a następnie za pomocąurządzenia elektrycznego nanoszono na PVDF lub membranę nitrocelulozową Po skropleniu membrany przemywano ją 20 mM Tris-HCl i 0,5 M NaCl (pH 7,5) (TBS) przez pięć minut, następnie dwa razy przez pięć minut 0,1% preparatem Tween 20 zawierającym TBS (TTBS) i traktowano czynnikiem blokującym (Błock Ace; produkcji Dai-Nippon Pharmaceutical Co., nr katalogowy UK-B25) przez 60 minut. Przeciwsurowice, z których każda osobno zawierała jedno z przeciwciał peptydowych: anty-HT 1 -1, anty-HT2-1, anty-HT3-2, anty-HT4-1, anty-HT5-2 i anty-HT6-1, rozcieńczano kolejno w roztworze TTBS zawierającym 0,05% BSA i 10% Błock Ace, tworząc rozcieńczenia 1/1000. Rozcieńczone przeciwciała poddano analizie kroplowej jako przeciwciała pierwotne. Dokładniej, próbkę rekombinowanej ludzkiej TPO, uzyskanąjak wyżej traktowano roztworem TTBS zawierającym przeciwciało peptydowe anty-TPO, 0,05% BSA i 10% Błock Ace przez 60 minut, a następnie przemywano TTBS przez 5 minut. Całość traktowano przez 60 minut roztworem TTBS z 0,05% BSA i 10% Błock Ace, zawierającym jako wtórne przeciwciało biotynowane przeciwciało kozie (produkcji Caltag Co., nr katalogowy L43015), a następnie przemywano TTBS dwa razy przez 5 minut. Następnie traktowano 1/5000 rozcieńczeniem awidyny znaczonej fosfatazą alkaliczną (produkcji Leinco Technologies Co., nr katalogowy Al 08), rozcieńczonym 10% roztworem TTBS zawierającym 10% Błock Ace przez 30 minut o przemywano dwa razy TTBS przez 5 minut, a następnie jeden raz TBS przez 5 minut. Za pomocą substratu alkalicznej fosfatazy (produkcji Bio-Rad Co., nr katalogowy 170-6432) próbkę rozwijano. Analiza kroplowa została przeprowadzona w temperaturze pokojowej i potwierdziła, że ludzka TPO jest rozpoznawana i wykrywana przez przeciwsurowice.

(2) 3 mg każdego z przeciwciał peptydowych anty-HTl-1, anty-HTl-2, anty-HT2-l i anty-HT2-2, oczyszczonych przez chromatografię powinowactwa w przykładzie 69 odważano i biotynowano, sprzęgając z aktywowanąbiotyną(NHS-LC-Biotin II, produkcji Pierce Co., nr katalogowy 21336). Te samą wzorcową próbkę rekombinowanej ludzkiej TPO, którą zastosowano poprzednio (1) poddawano SDS-PAGE, a następnie nanoszono za pomocąurządzenia elektrycznego na PVDF lub membranę nitrocelulozową! poddawano konwencjonalnej analizie kroplowej

116

179 884 przy użyciu każdego z biotynowanych przeciwciał jako przeciwciała pierwotne. Natychmiast po skropleniu membranę przemywano TBS przez 5 minut i dwukrotnie po 5 minut TTBS, a następnie traktowano blokerem (BlockAce) przez 60 minut. Następnie membranę traktowano przez 60 minut roztworem TTBS zawierającym 1 pg/ml biotynowanego przeciwciała peptydowego anty-TPO, 0,05% B SA i 10% Błock Ace, a następnie dwukrotnie po 5 minut przemywano TTB S. Dalej membranę traktowano przez 30 minut rozcieńczeniem 1/5000 awidyny znakowanej fosfatazą (firmy Leinco Technologies, nr katalogowy Al08) rozcieńczoną roztworem TTBS zawierającym 10% Błock Ace i przemywano dwa razy po 5 minut TTBS i 5 minut TBS, a następnie rozwijano barwę przy użyciu substratu fosfatazy alkalicznej (firmy Bio-Rad, numer katalogowy 170-6432). Opisaną wyżej analizę przeprowadzano w temperaturze pokojowej, potwierdzając że ludzka TPO jest rozpoznawana i wykrywana w oczyszczonych przeciwciałach.

<P r z y kła d 71 >

Otrzymywanie kolumny przeciwciał peptydowych anty-TPO i wykrywanie ludzkiej TPO

Potwierdzono, że przeciwciała peptydowe ludzkiej TPO, uzyskane w przykładzie 69 rozpoznaj ą ludzkąTPO. Przeciwciała te sprzęgano osobno z nośnikiem chromatograficznym w celu sporządzenia kolumn przeciwciał peptydowych. Przykład sporządzania kolumny przeciwciała peptydowego anty-HTl-2 przedstawiono poniżej.

(1) Sporządzono roztwór składający się z 50 mM fosforanu sodu i 0,15 M NaCl (pH 8,0) i zawierający 5 mg/ml przeciwciała, 0,8 ml roztworu łączono i sprzęgano z 1,54 ml spęczniałego żelu aktywowanego formylem (Fonnyl-Gllulofine, produkcji Chisso Co.) w temperaturze 4°C przez 2 godziny. Następnie dodano 1,1 ml roztworu zawierającego 10 mg/ml reduktora (boran trimetyloaminy (TMAB), firmy SeikagakuKogyo K.K., numer katalogowy 680246) i sprzęgano przez dalsze 4 godziny. Jedynie część żelu odzyskano przez wirowanie. Dodano 10 ml czystej wody i odzyskano przez odwirowanie również jedynie część żelu. Proces powtarzano czterokrotnie, usuwając nieprzereagowane przeciwciało. Następnie odzyskany żel traktowano przez 2 godziny w temperaturze 4°C 2,1 ml bufora blokującego (0,2 M Na fosfatazy, 1 M etanolaminy, pH 7,0) i 1,1 ml roztworu czynnika redukującego, który uprzednio dodawano, przez co blokowano aktywne grupy w nieprzereagowanym żelu. Wreszcie uzyskany żel przemywano wodą 20 mM Tris-HCl i 0,15 M NaCl (pH 8,0) przy użyciu wirówki. Umieszczano go w naczyniu małej kolumny, którą przemywano 3 M roztworu tiocyjaniany sodu i 0,1 M glicyny-HCl oraz 0,15 M NaCl (pH 8,0). Tak zrównoważoną kolumnę przechowywano.

Żel przeciwciała peptydowego anty-TPO w kolumnie przeciwciała anty-HT 1 -2 ma wydaj ność sprzęgania powyżej 94,2% dla każdej frakcji IgG. Poziom frakcji IgG sprzężonych z żelem na jednostkę objętości żelu wynosił 1,9 mg/ml żelu. W ten sam sposób sporządzono żel, z którym sprzęgano, w ilości 21,8 mg na ml żelu, IgG bez aktywności TPO jako antygen. Został on zastosowany jako pierwotna kolumna (dalej zwana kolumną przed-przeciwciała) w celu usunięcia nieswoiście związanych cząsteczek z kolumny przeciwciała TPO, jak wyjaśniono w (2).

Poniżej przedstawiono inny przykład otrzymywania kolumny przeciwciała HT1-2

Wzorcową próbkę rekombinowanej ludzkiej TPO, częściowo oczyszczonej z nadsączu hodowli komórek CHO, do których wprowadzono podlegający ekspresji gen kodujący jedną z sekwencji aminokwasów SEQ ID nr 119-124 dodano do kolumny przed-przeciwciała (zawieraj ącej 1 ml żelu), sporządzonej w (1) i przepuszczano przez kolumnę w dziesięciokrotnej obj ętości żelu, składającego się z 20 mM Tris-HCl (pH 8,0) i 0,15 M NaCl, zbierając frakcję przepływową. Następnie frakcję adsorbowaną przez kolumnę przed-przeciwciała wymywano kwasowym eluentem (0,1 M glicyny-HCl, pH 2,5) w dziesięciokrotnej objętości żelu. Frakcję przechodzącą przez kolumnę przed-przeciwciała dodawano do kolumny przeciwciała anty-HT 1-2 (zawierającej 2 ml żelu) sporządzonej w (1) i przepuszczano przez kolumnę w dziesięciokrotnej objętości żelu, składającego się z 20 mM Tris-HCl (pH 8,0) i 0,15 M NaCl, zbierając frakcję przepływową. Następnie frakcję adsorbowaną przez kolumnę przeciwciała anty-HT 1-2 wymywano kwasowym eluentem (0,1 M glicyny-HCl, pH 2,5) w ośmiokrotnej objętości żelu. Frakcje te analizowano za pomocą SDS-PAGE, potwierdzając, że TPO nie była ad

179 884

117 sorbowana przez kolumnę przed-przeciwciała, lecz specyficznie związana z kolumną przeciwciała anty-HTl -2 i że prawie wszystkie dodawane próbki TPO wiązały się z tą kolumną.

<Przykład 72>

Wpływ TPO na wzrost liczby płytek krwi

Dwadzieścia normalnych samców myszy szczepu ICR w wieku ośmiu tygodni (po pobraniu krwi z żyły oczodołu i zmierzeniu liczby płytek przy pomocy licznika mikrokomórkowego F-800 firmy Toa lyo Denshi) podzielono losowo na cztery grupy. Jednej z czterech grup (grupa kontrolna iv) wstrzykiwano dożylnie 100 mikrolitrów PBS raz dziennie przez pięć kolejnych dni. Jeden z pozostałych grup (grupa TPO-iv) wstrzykiwano dożylnie 100 mikrolitrów roztworu (uzyskanego przez zastąpienie za pomocą PBS przy użyciu kolumny NAP-25 [Pharmacia Biotech; nr katalogowy 17-0852-02] stężonego roztworu uzyskanej w przykładzie 56 frakcji F2 o aktywności TPO w kolumnie SP Sepharose Fast Flow i jego rozcieńczenie przy pomocy PBS; i wykazującego aktywność względną 211,900 w analizie z zastosowaniem M-07e) raz dziennie przez 5 kolejnych dni. Następnej grupie (grupa kontrolna-sc) wstrzykiwano podskórnie 100 mikrolitrów PBS raz dziennie przez pięć kolejnych dni, grupy ostatniej natomiast (grupa TPO-sc) wstrzykiwano podskórnie raz dziennie przez pięć kolejnych grup to samo, co grupie TPO-iv. Po 6, 8,10,13 i 15 dniach od rozpoczęcia zabiegów, pobierano krew każdej myszy z żyły oczodołu i obliczano liczbę płytek przy użyciu licznika mikrokomórkowego (F-890, firmy Toa lyo Denshi). Zmiany liczby płytek przedstawia fig. 24. W grupie kontrolnej-iv szóstego dnia, gdy poziom płytek był najwyższy (dzień zabiegu oznaczono jako dzień 0) liczba płytek wzrosła tylko o 44% w porównaniu z poziomem przed zabiegiem, w grupie kontrolnej-sc zanotowano tylko 47% wzrost nawet 8 dnia, kiedy liczba płytek była najwyższa. W grupie TPO-iv natomiast szóstego dnia zanotowano wzrost o 177% w porównaniu z liczbą płytek przed zabiegiem, a w grupie TPO-sc już szóstego dnia wzrost osiągnął 347% ósmego dnia, kiedy poziom płytek był najwyższy obserwowano wzrost o 493%.

Powyższe rezultaty potwierdzają, że ludzka TPO zwiększa liczbę płytek niezależnie od typu i sposobu podania.

<Przykład 73>

Wpływ TPO na wzrost liczby płytek krwi

Szesnaście normalnych samców myszy szczepu C3H/HeJ w wieku 11 tygodni (po pobraniu krwi z żyły oczodołu i pomiarze liczby płytek przy użyciu licznika mikrokomórego typu F-800 firmy Toa lyo Denshi) podzielono losowa na cztery grupy. Jednej z czterech grup (grupa kontrolna) wstrzykiwano 100 mikrolitrów PBS podskórnie raz dzienne w ciągu pięciu kolejnych dni. Drugiej grupie (grupa TPO-1) wstrzykiwano podskórnie 100 mikrolitrów roztworu (otrzymanego przez substancję za pomocą PBS przy użyciu kolumny NAP-25 uzyskanej w przykładzie 5 6 frakcj i o aktywności TPO na Sephacrylu S-200HR oraz rozcieńczenie j ej przy pomocy PB S; o aktywności względnej 83000, ustalonej na podstawie analizy z zastosowaniem M-07e) raz dziennie przez 5 kolejnych dni. Następnie grupie (grupa TPO-2) wstrzykiwano 100 mikrolitrów roztworu (otrzymanego przez dwukrotne rozcieńczenie frakcji o aktywności TPO, zastosowanej dla grupy TPO-1, za pomocą PBS i posiadającego aktywność względną 41,500, ustaloną na podstawie analizy z zastosowaniem M-07e) podskórnie raz dziennie przez pięć kolejnych dni.

Ostatniej grupie (grupa TPO-3) wstrzykiwano 100 mikrolitrów roztworu (otrzymanego przez dwukrotne rozcieńczenie frakcji o aktywności TPO, zastosowanej dla grupy TPO-2 o aktywności względnej 20,750, ustalonej na podstawie analizy z zastosowaniem M-07e) podskórnie raz dziennie przez pięć kolejnych dni.

Po 6,8,10 i 12 dniach od rozpoczęcia zabiegów, pobierano myszom krew z żyły oczodołu i obliczano liczbę płytek przy użyciu licznika mikrokomórkowego (F-890, firmy Toa lyo Denshi).

Zmiany liczby płytek przedstawia fig. 24. W grupie kontrolnej nie stwierdzono prawie żadnych zmian w liczbie płytek krwi, natomiast we wszystkich grupach, którym wstrzykiwano TPO nastąpił wzrost liczby płytek, osiągający najwyższy poziom ósmego dnia po zabiegu. W grupach notowano też zależność reakcji od dawki. W grupie TPO-1 już szóstego dnia stwierdzono około 200% wzrost, który zwiększył się do około 270% ósmego dnia, później natomiast notowano spa

118

179 884 dek aż do dnia 12, w którym obserwowano jeszcze spadek o 65%, przy czym istniała znacząca różnica w stosunku do grupy kontrolnej (p <0,01 w teście wielokrotnego porównania Dunneta). W grupie ΤΡΟ-2-stwierdzono również wzrost , choć mniejszy niż w grupie TPO-1, jednak osiągnął około 140 i około 160% odpowiednio dnia 5 i dnia 8. Dnia 12 nastąpił spadek do poziomu zbliżonego do grupy kontrolnej. Wzrost w grupie TPO-3 był słabszy niż w grupie TPO-2 i wynosił ósmego dnia, kiedy wartości były najwyższe, około 110%, co również stanowiło znaczącą różnicę w stosunku do grupy kontrolnej (p <0,01).

Powyższe rezultaty potwierdzają że ludzka TPO zwiększa liczbę płytek krwi niezależnie od szczepu myszy, a jej działanie zależy od dawki.

<Przykład 74>

Hamujący wpływ TPO na małopłytkowość wywołaną podawaniem czynnika przeciwnowotworowego

Trzydziestu samcom myszy szczepu ICR w wieku ośmiu tygodni, którym wstrzykiwano dożylnie 200 mg/kg 5-FU, podzielono losowo na dwie grupy (każda po 15 osobników). Począwszy od następnego dnia (dzień 1) jednej grupie (grupa kontrolna) wstrzykiwano podskórnie 100 mikrolitrów PBS raz dziennie przez 5 kolejnych dni, drugiej grupie natomiast (grupa TPO) wstrzykiwano 100 mikrolitrów frakcji o aktywności TPO, stosowanej w przykładzie 72 (o aktywności względnej 211,900, ustalonej za pomocą analizy z zastosowaniem M-07e) podskórnie raz dziennie przez pięć kolejnych dni. W dniach 4,6 i 8 z każdej grupy wybrano losowo cztery osobniki, którym pobierano krew z żyły oczodołu i za pomocą licznika mikrokomórkowego (typ E-2500, firmy Toa lyo Denshi) obliczano liczbę płytek krwi. Zmiany liczby płytek przedstawia fig. 25. W grupie kontrolnej liczba płytek po podaniu 5-FU zmniejszała się z każdym dniem, przy czym dnia 6 wartość była najniższa około 28 wartości przed podaniem 5-FU, dnia 8 natomiast jako reakcję na spadek zaobserwowano wzrost około 1,3 raza. Również w przypadku grupy TPO liczba płytek po podaniu 5-FU malała z każdym dniem, a dnia 6 osiągnęła wartość najniższą (około 52% wartości przed podaniem 5-FU). Jednak różnica pomiędzy liczbą płytek dnia 4 i 6 była bardzo mała, a dnia 6 stwierdzono znacząco (p < 0,05 w teście wielokrotnego porównania Dunneta) wysoką wartość w porównaniu z grupąkontrolną. Dnia 8 nastąpił wzrost o około 200% wartości przed podaniem 5-FU.

Powyższe wyniki potwierdzają że TPO hamuje spadek liczby płytek spowodowany czynnikiem przeciwnowotworowym.

<P r z y kła d 75>

Terapeutyczny wpływ TPO na małopłytkowość

Każdemu z 36 samców myszy rasy ICR w wieku siedmiu tygodni wstrzykiwano dożylnie chlorowodorek nimustyny (ACNU), a następnie podzielono myszy losowo na dwie grupy (każda po 18 osobników). Począwszy od następnego dnia (dzień 1) jednej z grup (grupa kontrolna) wstrzykiwano 200 mikrolitrów PBS podskórnie dwa razy dziennie przez kolejne dni, podczas gdy grupie drugiej (grupa TPO) wstrzykiwano 200 mikrolitrów frakcji o aktywności TPO, zastosowanej w przykładzie 73 (bez rozcieńczenia PBS), do której dodano 0,04% Tween 80 (o aktywności względnej 380,000, określonej w teście z zastosowaniem M-07e) podskórnie dwa razy dziennie przez kolejne dni.

Po zastrzyku myszy z każdej grupy podzielono losowo na trzy grupy - z jednej pobierano krew dnia 5 i 12, z drugiej dnia 8 i 14, a z kolejnej dnia 10. Kres pobierano z żyły oczodołu i obliczano liczbę płytek za pomocą licznika mikrokomórkowego (typ F-800, firmy Toa lyo Denshi). Zmiany liczby płytek przedstawia fig. 27. W grupie kontrolnej liczba płytek po podaniu ACNU malała z każdym dniem, osiągając w dniach 8-10 poziom najniższy (około 20% wartości przed podaniem ACNU), a regeneracja wynosiła tylko około 49% i około 74% odpowiednio w dniach 12 i 14. W grupie TPO natomiast zaobserwowano dnia 5 spadek do około 38% wartości przed podaniem ACNU i od tej pory następował wzrost. Dnia 8 wartość zwiększyła się do około 63% wartości przed podaniem ACNU, dnia 10 i później liczba płytek była większa niż przed podaniem ACNU. Dnia 12 i 14 zanotowano odpowiednio wzrost odpowiednio do około 300% i około 400%.

179 884

119

Jak stwierdzono powyżej, w dniach 8-10, gdy w grupie kontrolnej notowano spadek, w grupie TPO następował już wzrost, a dnia 10 liczba płytek była większa niż przed podaniem ACNU. W związku z tym potwierdziło się, że ludzka TPO pobudza regeneracj ę przy małopłytkowości wywołanej czynnikiem przeciwnowotworowym.

Biorąc pod uwagę również wyniki przykładu 74, można przypuszczać, że ludzka TPO hamuje spadek liczby płytek i pobudza regenerację przy trombocytopenii niezależnie od typu środka przeciwnowotworowego.

<Przykład 76>

Działanie terapeutyczne TPO na małopłytkowość po podaniu BMT

Czterdzieści osiem samców myszy szczepu C3H/HeN w wieku 7 tygodni naświetlano 10 Gy promieni radioaktywnych na całym ciele, a bezpośrednio pó tym wstrzykiwano im dożylnie 1 χ 10⁶ komórek szpiku kostnego myszy tego samego szczepu. Następnie zwierzęta podzielono losowo na dwie grupy i począwszy od następnego dnia (dzień 1) wstrzykiwano jednej grupie (grupa kontrolna) PBS, drugiej grupie (grupa TPO) wstrzykiwano natomiast frakcję o aktywności TPO zastosowaną w przykładzie 73 (o aktywności względnej 44,000, obliczonej na podstawie testu z zastosowaniem M-07e) w dawce 100 mikrolitrów podskórnie raz dziennie przez dwadzieścia kolejnych dni.

Po rozpoczęciu zastrzyków wybrano losowo po sześć myszy w dniach 5, 10,14 i 31 i pobrano im krew z żyły oczodołu oraz obliczano liczbę płytek za pomocą licznika mikrokomórkowego (typ E-200, firmy Toa lyo Denshi).

Zmiany w liczbie płytek przedstawia fig. 28. W obu grupach liczba płytek malała z każdym dniem po zastosowaniu BMT. Dnia 10 wartość osiągnęła minimum (około 3% liczby przed zastosowaniem BMT). Następnie obserwowano stopniowy wzrost. Dnia 4 liczba płytek stanowiła około 11% i około 13% odpowiednio w grupie kontrolnej i w grupie TPO. Dnia 21 zanotowano jedynie 37% regenerację w grupie kontrolnej, natomiast w grupie TPO regeneracja stanowiła około 65%, po czym obserwowano znaczący efekt pobudzający regenerację. Powyższe wyniki potwierdzają, że ludzka TPO, otrzymana w przykładzie 56 pobudza regenerację poziomu płytek krwi po zastosowaniu BMT.

<Przykład 77>

Terapeutyczne działanie TPO na małopłytkowość po naświetleniu promieniami radioaktywnymi '

Trzydzieści sześć samców myszy szczepu ICR w wieku ośmiu tygodni naświetlano 5 Gy promieni X na całym ciele, a następnie podzielono losowo na dwie grupy. Począwszy od następnego dnia (dzień 1) jednej z grup (grupa kontrolna) wstrzykiwano PBS, drugiej grupie natomiast (grupa TPO) wstrzykiwano frakcję o aktywności TPO zastosowaną w przykładzie 73 (o aktywności względnej 1,440,000 w teście z zastosowaniem M-07e) raz dziennie podskórnie przez trzy kolejne dni, a od następnego dnia frakcję o aktywności względnej 360,000 w teście z zastosowaniem M-07e również podskórnie raz dziennie przez siedem kolejnych dni. Po zapoczątkowaniu zastrzyków każdą grupę podzielono losowo na trzy grupy - jednej pobierano krew dnia 4,11 i 21; drugiej dnia 7 i 13; a ostatniej dnia 9 i 15. Krew pobierano z żyły oczodołu i badano liczbę płytek krwi przy pomocy licznika mikrokomórkowego typ F-800; firmy Toa lyo Denshi). Zmiany liczby płytek przedstawia fig. 29. W grupie kontrolnej liczba płytek malała z każdym dniem po naświetlaniu promieniami X, przy czym dnia 9 liczba ta była najmniejsza (około 25% liczby przed naświetlaniem promieniami X). Dnia 11 i 13 liczba płytek wzrosła odpowiednio do około 3 8% i około 67%, natomiast dnia 15 osiągnęła wartość sprzed naświetlania promieniami X. W grupie TPO liczba płytek malała do poziomu w siódmym dniu około 24% wartości przed naświetlaniem promieniami X. Potem obserwowano wzrost, a dnia 9 regeneracja sięgnęła około 82%. Dnia 11 i później liczba płytek była większa niż przed naświetlaniem promieniami X, a tendencja ta utrzymała się do dnia 21. Jak wspomniano, dnia 9, w którym liczba płytek w grupie kontrolnej wykazywała tendencję spadkową, w grupie TPO zaczynała już wzrastać, a dnia 11 była wyższa niż przed naświetlaniem promieniami X i pozostawała dłużej na wysokim poziomie. W grupie kontrolnej natomiast dopiero po 15 dniach liczba płytek powróciła do stanu sprzed naświetlania pro

120

179 884 mieniami X. Wyniki te potwierdzają, że ludzka TPO, uzyskana w przykładzie 56 skraca czas potrzebny do regeneracji obniżonego poziomu płytek po naświetlaniu promieniami X i wykazuje efekty terapeutyczne w przypadku małopłytkowości po naświetlaniu promieniami X.

<P r z y kła d 78>

Wpływ hTPO163 na wzrost liczby płytek krwi

Piętnaście zdrowych samców myszy szczepu C3h/HeN, którym pobrano krew z żyły oczodołu i obliczono liczbę płytek za pomocą licznika mikrokomórkowego (typ F-800, firmy Toa lyo Denshi) podzielono losowo na cztery grupy - grupę kontrolną oraz grupy A, B i C. Pierwszej grupie (grupa kontrolna) wstrzykiwano podskórnie PBS z0,l% surowicy mysiej jeden raz dziennie przez pięć kolejnych dni. Grupom A, B i C wstrzykiwano podskórnie przez 5 kolejnych dni frakcję o aktywności TPO w kolumnie Sepharose Fast Flow, uzyskaną w przykładzie 56 i rozcieńczoną PBS o zawartości 0,1% surowicy mysiej w dawkach odpowiednio około 40,000,000, około 8,000,000 i około 1,600,000/kg masy ciała dziennie w przeliczeniu na względną aktywność hTPO163 w teście z zastosowaniem M-07e.

Dnia 6,8,10 i 12 po zastrzyku pobierano krew z żyły oczodołu każdej myszy i obliczano liczbę płytek za pomocą licznika mikrokomórkowego (typ F-800; firmy Toa Yio Denshi). Zmiany liczby płytek przedstawia fig. 30.

W grupie kontrolnej nie nastąpiła prawie żadna zmiana w licznie płytek, natomiast w grupach, w których stosowano TPO zanotowano wzrost we wszystkich przypadkach z najwyższym poziomem ósmego dnia po zastrzyku. W grupach TPO zanotowano zależność między dawką a reakcją. W grupie A zanotowano wzrost o około 88% i około 100% odpowiednio w dniach 6 i 8, a w dniu 10 utrzymujący się około 97%, przy czym wszystkie dane wykazują znaczącą różnicę w stosunku do grupy kontrolnej (p <0,01 w teście wielokrotnego porównania Dunneta). Podobny wzrost notowano w grupie B i choć stopień wzrostu był niższy niż w grupie A, w dniach 6 i 8 obserwowano odpowiednio wzrost o około 65% i około 84%, co wskazuje na istotną różnicę w stosunku do grupy kontrolnej (p 0,01 lub 0,05 w teście wielokrotnego porównania Dunneta). Wzrost w grupie C był niższy niż w grupie B. Jednak dnia 8, gdy notowano najwyższą liczbę płytek, wynosił około 31%. Powyższe wyniki potwierdziły, że hTPO 163 otrzymana w przykładzie 65 powoduje wzrost liczby płytek krwi, a działanie to wykazuje zależność między dawką a reakcją.

<Przykład 79>

Działanie terapeutyczne hTPO 163 na małopłytkowość

Sto samców myszy rasy C3H/HeN w wieku ośmiu tygodni, którym wstrzykiwano dożylnie 50 mg/kg chlorowodorku nimustyny (ACNU) podzielono losowo na cztery grupy - grupę kontrolną i grupy A, B i C - każda po 25 osobników. Począwszy od następnego dnia (dzień 1) grupie kontrolnej wstrzykiwano podskórnie 5 ml/kg raz dziennie przez kolejne dni, grupom A, B i C wstrzykiwano natomiast podskórnie raz dziennie przez kolejne dni frakcję o aktywności TPO, uzyskanąz kolumny SP Sepharose Fast Flow w przykładzie 65, rozcieńczoną za pomocą PBS, w dawkach odpowiednio około 16,000,000, około 48,000,000 i około 160,000,000 kg masy ciała dziennie w przeliczeniu na aktywność względną hTPO 163 w teście z zastosowaniem M-07e.

Po rozpoczęciu zastrzyków każdą z grup podzielono losowo na pięć grup, w których pobierano krew dnia 5, 8,10,12 i 14. Krew pobierano z żyły oczodołu i obliczano liczbę płytek za pomocą licznika mikrokomórkowego (typ E-2500, firmy Toa lyo Denshi). Zmiany liczby płytek przedstawiono na fig. 31. W grupie kontrolnej liczba płytek malała z każdym dniem po podaniu ACNU, osiągając najniższy poziom (około 15-16% wartości przed podaniem ACNU) w dniach 8-10, regeneracja wynosiła zaledwie około 28% i około 51% odpowiednio w dniach 12 i 14. W grupie A natomiast liczba płytek zmalała dnia 8 do około 25% wartości przed podaniem ACNU. Następnie zaczęła się zwiększać, wykazując regenerację około 35% i około 89% odpowiednio dnia 10 i 12. Dnia 14 liczba płytek była większa niż przed podaniem ACNU.

Jak wspomniano powyżej, najmniejszą liczbę płytek zanotowano dnia 8 we wszystkich grupach, jednak w grupach, którym podawano TPO spadek był wolniejszy niż w grupie kontrolnej, gdzie liczba płytek zmniejszyła się najbardziej. W grupie kontrolnej regeneracja liczby płytek była znikoma nawet 10 dnia, natomiast w grupach, którym podawano ludzką TPO, rege

179 884

121 neracja liczby płytek następowała w każdej grupie, choć w różnym stopniu. W grupie, której podawano 50 mikrogramów na kilogram liczba płytek dnia 12 przewyższyła poziom przed podaniem ACNU. W porównaniu z faktem, że w grupie kontrolnej nawet 14 dnia regeneracja wynosiła zaledwie około 51% w stosunku do liczby przed podaniem ACNU okazuje się, że hTPO 163 otrzymana w przykładzie 65 pobudza regenerację liczby płytek krwi. W związku z tym potwierdza się, że hTPO 163 wywiera efekt terapeutyczny na małopłytkowość wywołaną czynnikami przeciwnowotworowymi.

Przykłady preparatów farmaceutycznych podano poniżej.

<Przykład 80>

Frakcję ludzkiej TPO otrzymaną w przykładzie 56 zagęszczano, wyjaławiano i zamrażano w -20°C w celu uzyskania mrożonego produktu, stosowanego jako preparat do iniekcji.

<Przykład 81>

Frakcję ludzkiej TPO uzyskanąw przykładzie 56 zagęszczano, w warunkach aseptycznych wlewano 5 ml do 10-mililitrowej fiolki, suszono przez zamrażanie w -20°C i zamykano fiolkę gumowym korkiem, otrzymując liofilizowaną substancję stosowaną jako preparat do iniekcji.

<Przykład 82>

Frakcję ludzkiej TPO uzyskaną w przykładzie 56 zagęszczano, filtrowano w sterylnych warunkach i wlewano do 10-mililitrowej fiolki, uzyskując produkt stosowany jako preparat do iniekcji.

<Przykład 83>

Frakcję hTPO 163 otrzymaną w przykładzie 65 zagęszczano, wyjaławiano i suszono przez zamrażanie w -20°C w celu uzyskania mrożonego produktu, stosowanego jako preparat do iniekcji.

<P r z y kła d 84>

Frakcję hTPO163 uzyskanąw przykładzie 65 zagęszczano, w warunkach aseptycznych wlewano 5 ml do 10-mililitrowej fiolki, suszono przez zamrażanie w -20°C i zamykano fiolkę gumowym korkiem, otrzymując liofilizowany produkt stosowany jako preparat do iniekcji.

<Przykład 85>

Frakcję hTPO 163 uzyskanąw przykładzie 65 zagęszczano, w warunkach aseptycznych wlewano 5 ml do 10-mililitrowej fiolki, suszono przez zamrażanie w -20°C i zamykano fiolkę gumowym korkiem, otrzymując liofilizowany produkt stosowany jako preparat do iniekcji.

<Przykład 86>

Frakcję ludzkiej TPO otrzymaną w przykładzie 57 zagęszczano, wyjaławiano i zamrażano w -20°C w celu uzyskania mrożonego produktu, stosowanego jako preparat do iniekcji.

<Przykład 87>

Frakcję ludzkiej TPO uzyskanąw przykładzie 57 zagęszczano, w warunkach aseptycznych wlewano 5 ml do 10-mililitrowej fiolki, suszono przez zamrażanie w -20°C i zamykano fiolkę gumowym korkiem, otrzymując liofilizowany produkt stosowany jako preparat do iniekcji.

<Przykład 88>

Frakcję ludzkiej TPO uzyskanąw przykładzie 57 zagęszczano, filtrowano w sterylnych warunkach i wlewano do 10-mililitrowej fiolki, uzyskując produkt stosowany jako preparat do iniekcji.

<Przykład 89>

Aplastyczne osocze psa

Heparynizowane aplastyczne osocze psa (“APK9) lub normalne osocze psa (”NK9) otrzymywano opisanymi metodami [Mazur, E. i South, K. Exp. Hematol. 13,1164-1172 (1985); Arriaga, M., South, K., Cohen, J.L. i Mazur E.M. Blood69,486-492 (1987); Mazur, E., Basilico, D., Newton, J.L., Cohen, J.L., Charland, C., Sohl, P.A., Narendran, A., Blood Ί6, 1771-1782 (1990)], z tym, że stosowano dawki napromieniowania 450 radów na całe ciało.

<Przykład 90>

Test megakariocytów ludzkich

Standardowe metody wielu procesów opisanych w poniższych przykładach lub dogodnych procesów alternatywnych podano w powszechnie znanych podręcznikach biologii moleku

122

179 884 lamej, takich jak np. Sambrook i in., (red.), Molecular Cloning, wyd. drugie, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1987) i Ausubel i in. (red.) Current Protocols in Molecular Biology, Grenn associates/Wiley Interscience, New York (1990).

APK9 i frakcjonowane APK9 badano pod względem właściwości stymulowania rozwoju ludzkich megakariocytów z komórek progenitorowych CD34⁺. Wyselekcjonowane komórki CD34 uzyskiwano z komórek krwi obwodowej jak opisano w literaturze (Hokom, M.H., Choi, E., Nichol, J.L., Homkohl, A., Arakawa, T. i Hunt, P. Molecular Biology of Haematopoesis 3: 15-31,1994) i poddawano inkubacji w następującej pożywce: zmodyfikowana pożywka Dulbecco (IMDM; GIBCO; Grand Island, NY) wzbogacona 1% Glutaminę Pen-strep (Irvine Scientific, Santa Ana, CA) i 10% heparynizowanego osocza ludzkiego AB o małej zawartości płytek. Innymi składnikami były 2-merkaptoetanol (10⁴ M), kwas pirogronowy (110 pg/ml), cholesterol (7,8 pg/ml), adenozyna, guanidyna, cytydyna, urydyna, tymidyna, 2-dezoksycytozyna, 2-dezoksyadenozyna, 2-dezoksyguanozyna (10 pg/ml każdej, Sigma), rekombinowana insulina ludzka (10 pg/ml), transferyna ludzka (300 pg/ml), lipidy sojowe (1% Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN), ludzki rekombinowany podstawowy czynnik wzrostu fibroblastów (2 ng/ml, Genzyme, Cambridge, MA), ludzki rekombinowany czynnik wzrostu naskórka (15 ng/ml), czynnik wzrostu pochodzący z płytek (10 ng/ml, Amgen, Inc., Thousand Oaks, CA). Wyselekcjonowane komórki CD34 w ilości 2x10⁵ na mililitr pożywki, ostateczna objętość 15 pl umieszczono w zbiorniczkach płytek mikromiareczkowych typu Terasaki (Vanguard, Inc. Neptune, NJ). Komórki poddawano inkubacji w 37°C przez 8 dni w nawilżanych pojemnikach z 5% CO₂ w powietrzu, przenoszono bezpośrednio do zbiorników hodowlanych z 1% aldehydem glutarowym i poddawano inkubacji z mieszaninąprzeciwciał monoklonowych (anty-GPIb, anty-GPIIB (Biodesign) i anty-GPIb (Dako, Carpinteria, CA). Przy pomocy systemu wykrywania ze streptrawidyno-betagalaktozydazą (HistoMark, Kirgegaard i Perry) rozwinięto reakcję immunologiczną. Megakariocyty, identyfikowane przez niebieskie zabarwienie, liczono za pomocą mikroskopu z odwróconymi fazami przy powiększeniu 100x. Wyniki przedstawiono jako średnią liczbę megakariocytów na jeden zbiorniczek +/- błąd standardowy (SEM). W niektórych przypadkach dane przedstawiono jako “jednostki megakariocytów/ml”, gdzie stopień w jakim dana próbka pobudza rozwój megakariocytów został dla celów doświadczenia znormalizowany do jednoznacznie wymuszonej kontroli APK9. Jedna jednostka została określona jako ilość materiału, która daje taką samą liczbę megakariocytów jak 1 μΐ wzorca APK9. Przyjęto, że aktywność jest spowodowana przez ligand MPL, jeśli może być zablokowana przez 5-10 pg/ml MPL-X (receptor rozpuszczalnego Mpl).

Wykazano, że APK9 zawiera czynnik(i) stymulujące rozwój megakariocytów ludzkich w tym systemie. Wyselekcjonowane komórki CD34 poddawane inkubacji z 10% NK9 przez 8 dni wykazywały nieznaczną liczbę niebiesko zabarwionych megakariocytów, natomiast wyselekcjonowane komórki CD34 poddawane inkubacji z 10% APK9 wykazywały dużą liczbę niebiesko zabarwionych megakariocytów.

Figura 32 pokazuje, że Mpl-X dodawany w rosnącym stężeniu do systemu hodowli megakariocytów ludzkich blokuje coraz bardziej rozwój megakariocytów. W stężeniu Mpl-X większym od 5 pg/ml blokada jest kompletna. W tym doświadczeniu wyselekcjonowane komórki CD34 stymulowano 5% APK9. Świadczy to o tym, że aktywność wchodząca w interakcję z MplX (przypuszczalnym ligandem Mpl) jest niezbędna dla rozwoju megakariocytów ludzkich i wskazuje, że ligand Mpl jest zawarty w samym APK9.

Następnie wykazano, że aktywność ligandu Mpl niezbędna dla rozwoju megakariocytów ludzkich występuje w APK9. APK9 (135 ml) rozcieńczono sześciokrotnie w pożywce Iscove'a i wprowadzono do kolumny powinowactwa Mpl-X. Materiał niezwiązany, przepływający przez kolumnę zbierano i zagęszczano do początkowej objętości przed doświadczeniem. Materiał związany eluowano w 10 ml 1 M NaCl, 20% puli filtrowano i zagęszczano czterokrotnie dla celów analizy. Wyselekcjonowane komórki CD34 poddawane inkubacji w samej pożywce nie roz

179 884

123 wijały się w megakariocyty. Komórki poddawane inkubacji w 5% APK9 (taka sama pula, jak wprowadzona do kolumny) rozwijały się w 48 +/- 8 megakariocytów na jeden zbiorniczek. Komórki poddawane inkubacji w 10% materiału niezwiązanego nie rozwijały się w megakariocyty. Komórki poddawane inkubacji w 10% puli elucji rozwijały się w 120 +/- 44 megakariocyty na jeden zbiorniczek. Zarówno aktywność wsadu kolumny, jak i puli elucji zostały w tej próbie całkowicie zahamowane 5 pg/ml Mpl-X.

<Przykład 91 >

Transfekcja mysiego lub ludzkiego receptora Mpl do mysiej linii komórkowej A. Mysi receptor Mpl

Pełnej długości cDNA mysiego receptora Mpl subklonowano do wektora ekspresji zawierającego promotor transkrypcyjny uzyskany z LTR wirusa Moloneya mięsaka mysiego. 5 pg tego konstruktu i 1 pg plazmidu selektywnego markera pWLNeo (Stratagene) wprowadzano łącznie za pomocąelektroporacji do mysiej linii komórkowej zależnej od IL-3 (32D, klon 23; Greenberger i in., PNAS 80,2931-2936 (1983)). Komórki hodowano przez 5 dni do odzyskania z procesu, następnie poddawano inkubacji w selektywnej pożywce zawierającej 800 pg/ml genetycyny (G418, Sigma) i 1 ng/ml mysiej IL-3. Żywe komórki podzielono następnie na pule po 2xl0⁵ komórek i hodowano do wzrostu populacji, umożliwiającego dalszą analizę. Sześć populacji testowano pod względem ekspresji powierzchniowej receptora Mpl metodą analizy FACS przy pomocy poliklonalnej przeciwpeptydowej surowicy królika. Wybrano jedną populację do sortowania w FACS przy użyciu tej samej co poprzednio surowicy przeciwpeptydowej. Pojedynczokomórkowe klony z linii komórek rodzicielskich wyselekcjonowano przy wzroście w 10% APK9 i genetycyny. Po selekcji w APK9 przez 35 dni komórki przetrzymywano w 1 ng/ml mysiej IL-3. Jeden z subklonów, 1A6.1., został wykorzystany do dalszych doświadczeń.

B. Ludzki receptor Mpl

Pełnej długości sekwencję ludzkiego receptora Mpl (Vigon, I. i in., PNAS, 89, 5640-5644 (1992)) subklonowano do wektora ekspresji zawierającego promotor transkrypcyjny wirusa Moloneya mięsaka mysiego (o takim samym wektorze jak receptor mysi). 6 pg tego konstruktu i 6 pg amfotroficznego konstruktu zawierającego retrowirusy (Landau, N.R., Littman, D.R., J. Virology 66,5.110-5113(1992)) transfekowano do 3 χ 10⁶ 293 komórek przy użyciu zestawu do transfekcji komórek ssaków firmy Stratagene, zawierającego CaPO₄. Te same komórki retransfekowano po dwóch dniach, a następnie znowu po czterech dniach. Dzień po ostatniej transfekcji 293 komórki hodowano razem z liniąkomórek mysich zależną od IL-3 (32D, klon 23; Greenberger i in., PNAS 80, 2931-2936 (1983)). Po 24 godzinach komórki 32D uwalniano i wiązano w gradiencie BSA (Path-c-cyte; Mills Inc.). Komórki umieszczano w 1 ng/ml mysiej IL-3, a następnie selekcjonowano do hodowli w 20% APK9. Komórki sortowano ze względu na ekspresję receptora na powierzchni komórki przy pomocy FACS z zastosowaniem poliklonalnej surowicy przeciwpeptydowej królika. Komórki te zostały wykorzystane w dalszych badaniach.

<Przykład 92>

Testowanie ligandu Mpl za pomocą komórek 1A6.1

Komórki 1A6.1 wymywano z hodowli IL-3 i przenoszono (1000 komórek/15 pl całkowitej zawartości zbiorniczka) na płytki mikromiareczkowe z pożywką alfa MEM (Gibco) wzbogaconą 10% surowicy płodu cielęcego (FCS), genetycyny (800 pg/ml) i 1% pen/strep (Gibco) w rozcieńczeniach seryjnych testowanych próbek 1:1. Po 48 godzinach oznaczano mikroskopowo liczbę żywych komórek na jeden zbiorniczek. Jedną jednostkę aktywności zdefiniowano jako poziom aktywności, którego skutkiem jest 200 żywych komórek na jeden zbiorniczek. Przyjęto, że aktywność jest spowodowana przez ligand MPL, jeśli może być całkowicie zablokowana przez wprowadzenie do doświadczenia 5-10 pg/ml MPL-X. Aktywność ligandu Mpl w APK9 wynosiła średnio 4400 +/- 539 jednostek/ml aplastycznego osocza. Jeśli nie wskazano inaczej, jednostki aktywności ligandu Mpl określono na podstawie testu z zastosowaniem komórek 1A6.1.

124

179 884

Próby z komórkami transfekowanymi genem receptora ludzkiego Mpl przeprowadzano zasadniczo w ten sam sposób jak z komórkami 1A.61.

<Przykład 93 >

Wykazanie obecności ligandu Mpl w aplastycznym osoczu surowicy pochodzącej od myszy, psa, świni i człowieka

Ligand Mpl występuje w aplastycznym osoczu lub surowicy pochodzącej od myszy, psa, świni i człowieka (tabela 9). Osocze pobierano od myszy BDF1 przed naświetlaniem i 12 dni po naświetlaniu (500 rad). Osocze testowano za pomocąpróby z komórkami 1A6.1, która wykazała 200 jednostek aktywności na ml, w zasadzie całkowicie hamowanej przez mpl-X (10 pg/ml). Osocze naświetlanych myszy reagowało również dodatnio w próbie z megakariocytami ludzkimi, wykazując aktywność 1833 jednostek/ml. Osocze pobierano od psów przed naświetlaniem i 10 dni po naświetlaniu (450 rad). Osocze testowano w próbkach zarówno z komórkami 1A6.1, jak i z megakariocytami ludzkimi. W obu próbach wykazano aktywność całkowicie hamowaną przez Mpl-X (10 pg/ml). Osocze pobierano od świń przed naświetlaniem i 10 dni po naświetlaniu (650 rad). Osocze testowano w próbach zarówno z komórkami 1A6.1, jak i z megakariocytami ludzkimi. W obu próbach wykazywało ono aktywność ligandu Mpl (hamowaną przez 10 pg/ml Mpl-X) porównywalną do stwierdzonej w aplastycznym osoczu psa. Pobierano aplastyczną surowicę ludzką. Materiał ten pobierano od pacjentów po transplantacji szpiku kostnego. Surowice sześciu pacjentów testowano w próbie z komórkami 1A6.1, wykazując aktywność 903 jednostek/ml, z czego 88% było związane z ligandem Mpl (hamowane przez 10 pg/ml Mpl-X). Surowice czternastu aplastycznych pacjentów testowano w próbie z megakariocytami ludzkimi. W grupie tej stwierdzono wyraźną aktywność 941 jednostek meg/ml, całkowicie hamowano przez 10 pg/ml Mpl-X. W celu wykazania specyficzności próby z komórkami 1A6.1 wprowadzono dane dotyczące IL-3 mysiej. Choć ta rekombinowana cytokina pobudzała wzrost linii komórkowej, nie była blokowana przez 10 pg/ml Mpl-X.

Tabela 9

	Próba z komórkami 1A6.1 (jednostki/ml)	Próba z megakariocytami ludzkimi (jednostki meg/ml)
pochodzenie	wynik	+MPL-X	wynik	+Mpl-X
mysie normalne	0+/-0	0+/-0	0+/-0	0+/0
mysie aplastyczne	2000	0	1833	brak danych
psie normalne	0+/-0	0+/-0	0+/-0	0+/-0
psie aplastyczne	4400 +/-539	0+/-0	792+/-128	0+/-0
świńskie normalne	0+/-0	0+/-0	0+/0	0+/-0
świńskie aplastyczne	3866+/-1136	0+/-0	1284+/-182	10 +/-10
ludzkie normalne	0+/-0	0+/-0	0+/-0	0+/-0
ludzkie aplastyczne	903 +/-64	114+/-33	0+/0	0+/-0
mysie 1L3	6000 +/-565	6000 +/-565	brak danych	brak danych

<Przykład 94>

Otrzymywanie pochodnych ludzkiej TPO podlegających ekspresji w systemie E. coli

W celu określenia aktywności biologicznej, trwałości i rozpuszczalności utworzono kilka pochodnych TPO, podlegających ekspresji w E. coli. Pochodne tworzono, wykorzystując sekwencję aminokwasów, przedstawioną w SEQ ID nr 11, obejmującą [Met’², Lys^-1, Ala¹, Val³, Argⁱ²⁹]TPO(l-163), gdzie arginina zastępuje leucynę na pozycji aminokwasu 129 (zwana dalej L129R), [Met'², Lys'¹, Ala¹, Val³, Arg¹³³]TPO(l-163), gdzie arginina zastępuje histydynę na pozycji aminokwasu 133 (zwana dalej H133R), [Met'², Lys'¹, Ala¹, Val³, Agr¹⁴³]TPO, gdzie argini

179 884

125 na zastępuje metioninę na pozycji aminokwasu 143 (zwana dalej M143R). [Met^-2, Lys'¹, Ala¹, Val³, Leu⁸³]TPO(l-163), gdzie leucyna zastępuje glicynę na pozycji aminokwasu 82 (zwana dalej G82L), [Met^-2, Lys’¹, Ala¹, Val³, Leu¹⁴⁶ ]TPO(1-163), gdzie leucyna zastępuje glicynę na pozycji aminokwasu 146 (zwana dalej G146L), [Met'², Lys'¹, Ala¹, Val³, Pro¹⁴⁸]TPO(l-163), gdzie prolina zastępuje serynę na pozycji aminokwasu 148 (zwana dalej S148P), [Met^-2, Lys^-1, Ala¹, Val³, Arg⁵⁹]TPO(l-163), gdzie arginina zastępuje lizynę na pozycji aminokwasu 59 (zwana dalej K59R), [Met’², Lys’¹, Ala¹, Val³, Arg¹¹⁵]TPO(l-163), gdzie arginina zastępuje glutaminian w pozycji aminokwasów 115 (zwana dalej Q115R).

Do sporządzania pochodnych TPO zastosowano h6T (1-163), opisaną w przykładzie 42 i syntetyzowano oligonukleotydy o następujących sekwencjach:

L129R: 5'-ATCTTCCGTTCYYYCCAGCACCT-3' (do otrzymywania pochodnej substytucji Arg z Leu-129 zastąpioną przez Arg w sekwencji przedstawionej w SEQ ID nr 11);

H133R; 5'-TCTTTCCAGCGTCTGCTGCGT-3'(do otrzymywania pochodnej substytucji Arg z His zastąpioną przez Arg w sekwencji przedstawionej w SEQ ID nr 11);

M143R: 5'-CGTTTCCTGCGTCTGGTTGGC-3' (do otrzymywania pochodnej substytucji Arg z Met-143 zastąpioną przez Arg w sekwencji przedstawionej w SEQ ID nr 11);

G82L: 5'-GGCCAGCTTCTGCCGACCTGCCT-3' (do otrzymywania pochodnej substytucji Leu z Gly-82 zastąpioną przez Leu w sekwencji przedstawionej w SEQ ID nr 11);

G146L: 5'-ATGCTGGTTCTGGGTTCTACCCT-3' (do otrzymywania pochodnej substytucji Leu z Gly-146 zastąpioną przez Leu w sekwencji przedstawionej w SEQ ID nr 11);

S148P: 5'-GTTGGCGGTCCGACCCTGTGCG-3'(do otrzymywania pochodnej substytucji Pro z Ser-148 zastąpioną przez Pro w sekwencji przedstawionej w SEQ ID nr 11); oraz

K59R: 5'-GAAGAGACCCGCGCTCAGGACATCC-3' (do otrzymywania pochodnej substytucji Arg z Lys-59 zastąpioną przez Arg w sekwencji przedstawionej w SEQ ID nr 11);

Q115R: 5'-CTGCCGCCACGTGGCCGTACCAC-3' (do otrzymywania pochodnej substytucji Arg z Gln-115 zastąpioną przez Arg w sekwencji przedstawionej w SEQ ID nr 11).

Mutanty plazmidów konstruowano przy użyciu zestawu do mutagenezy in vitro Sculptor (Amersham). Fragment Xbal - Hind III pochodzący z pCFM536/h6T(l-163) opisanego w przykładzie 42 wprowadzano do wektora fagemidowego Bluescript II SK(-) (Stratagene, Califomia USA) po trawieniu enzymami Xba\ i HindW. w celu uzyskania plazmidu pSKTPO, który transformowano do E. coli JM 109. Przy użyciu pomocniczego faga Μ13KO7 (Takara Shuzo, Japonia) otrzymywano z pSKTPO jednołańcuchowy DNA do mutagenezy. Mutacje wprowadzano do genu TPO zgodnie z protokołami dostawcy przy użyciu wyżej wymienionych oligonukleotydów. Analizę sekwencji przeprowadzano za pomocą zestawu do sekwencjonowania DNA (Applied Biosystems, USA) zgodnie z protokołami dostawcy, przy czym potwierdzono mutacj e TPO.

Fragmenty Xbal - Hindlll otrzymane ze zmutowanego pSKTPO wprowadzano do pCFM536 trawionego enzymami Xbal i Hindlll. Plazmidy pCFM536 przenoszące zmutowane geny transformowano do E. coli #261 w celu uzyskania transformanta, w którym podlegają ekspresji geny pochodnej TPO.

Hodowla E. coli #261 transformowanego zmutowanym pCFM 536 odbywa się według zasad opisanych w przykładzie 46. Granulkę komórek transformanta pobierano i przechowywano w zamrażarce przynajmniej przez jeden dzień. Zamrożona granulkę komórek (3 g) zawieszono w 30 ml bufora 20 mM Tris (pH 8,5) zawierającego 10 mM EDTA, 10 mM DTT i 1 mM PMSF. Zawiesinę trzymano na lodzie i pięciokrotnie poddawano ultradźwiękom w odstępach (co najmniej) jednominutowych. Komórki zbierano przez odwirowywanie przy 15000 rpm przez 10 minut.

Granulkę zawieszono w 30 ml bufora 10 mM Tris (pH 8,7) zawierającego 8 M chlorku guanidyny, 5 mM EDTA, 1 mM PMSF i redukowanego przez dodanie 50 mg DTT. Po wymieszaniu przez 1-1,5 godziny ustalono, przy pomocy rozcieńczonego HC1, pH roztworu na 5,0 i schłodzono do 4°C, a następnie rozcieńczano.

Roztwór próbki rozcieńczano stopniowo przez noc w 1,51 bufora 10 mM CFLAPS (pH 10,5) zawierającego 30% glicerolu, 3 M mocznika, 3 mM cystaminy i 1 mM L-cysteiny. Po poddaniu

126

179 884 próbki mieszaniu przez co najmniej dwa dni usuwano osad przez odwirowanie przy 8000 przez 45 min. Przy pomocy kwasu fosforowego ustalono pH roztworu na 6,8, a następnie rozcieńczano go dwa razy. Roztwór przesączano przez dwa arkusze bibuły filtracyjnej #2 (0=90 mm, bibuła filtracyjna Toyo, Japonia) i wprowadzano do kolumny (2,6 x 10 cm) CM-Sepharose Fast Flow (Pharmacia). Kolumnę przepłukiwano 400 ml bufora 10 mM fosforanu (pH 6,8) zawierającego 15% glicerolu i 1 M mocznika i zrównoważono buforem 10 mM fosforanu (pH 7,2) zawierającego 15% glicerolu. Proteinę eluowano z kolumny przy pomocy systemu liniowego gradientu z 10 mM bufora fosforanowego (pH 7,2) zawierającego 15% glicerolu do tego samego bufora zawierającego 0,5 M NaCl przy prędkości przepływu 1,0 ml/min. Elucję protein kontrolowano przy absorbancji 280 nm, za pomocą SD S-PAGE potwierdzono, że zebrana frakcji zawiera TPO.

Po zagęszczeniu frakcji TPO (około 30 ml) do 2 ml przy użyciu Centriprep 10 (Amicon) zmutowaną TPO oczyszczano dalej za pomocą HPLC z odwróconymi fazami (Waters) z kolumną pBondasphere C4 (3,9 χ 150 mm). Proteinę wymywano przy pomocy liniowego gradientu z 0,05% TFA w H₂O do 2-propanolu zawierającego 30% CH₃CN i 0,02% TFA z prędkością przepływu 0,5 ml/min przez 40 minut. W tych warunkach pochodne TPO zostały wyeluowane po około 30 minutach.

Dla celów analizy biologicznej oczyszczoną próbkę TPO dializowano dwukrotnie w stosunku do 11 bufora 10 mM fosforanowego przez dwa dni. Po stężeniu za pomocą Centriprep 10 (Amicon) do około 0,1 mg/ml badano aktywność biologicznąpochodnych w systemie z zastosowaniem M-07e w sposób opisany powyżej. Stwierdzono, że wszystkie mutanty mająprawie taką samą aktywność jak h6T(l-163), próbka odniesienia dla TPO (patrz fig. 33 i 34).

Spis depozytów

Escherichia coli (pHTl-231/Dh5):

FERM BP-4564 i CCTCC-M95001

Escherichia coli (pEF18S-A2a/DH5):

FERM BP-4565 i CCTCC-M95002

Escherichia coli (pHGTl/DH5):

FERM BP-4616 i CCTCC-M95003

Escherichia coli (pHTFl/DH5):

FERM BP-4617 i CCTCC-M95004

Hybrydomy mysie P55:

FERM BP-4563 i CCTCC-C95OO1

CHO28/1/1/3-C6

FERM BP-4988 I CCTCC-C95004

CHO 163T-63-79-C1

FERM BP-4989 I CCTCC-C95005

179 884

127

Wykaz sekwencji (1) INFORMACJA OGÓLNA:

(i) AUTORZY: MIYAZAKI, Hiroshi KATO, Takashi OHGAMI, Kinya IWAMATSU, Akihiro AKAHORI, Hiromichi SHIMIZU, Toshiyuki MUTO, Takanori (ii) TYTUŁ WYNALAZKU: PROTEINA O AKTYWNOŚCI TPO (iii) LICZBA SEKWENCJI: 197 (iv) ADRES DLA KORESPONDENCJI:

(A) ADRES: Marshall, 0’Toole, Gerstein, Murray & Borun (B) ULICA: 6300 Sears Tower, 233 South Wacker Drive (C) MIASTO: Chicago (D) STAN: Illinois (E) PAŃSTWO: Stany Zjednoczone Ameryki (F) KOD: 60606-6402 (v) FORMA INFORMACJI KOMPUTEROWEJ:

(A) NOŚNIK: dyskietka elastyczna (B) KOMPUTER: kompatybilny z IBM PC (C) SYSTEM OPERACYJNY: PC-DOS/MS-DOS (D) PROGRAM: Patentln Edycja #1.0, Wersja #1.25 (vi) DANE AKTUALNEGO ZGŁOSZENIA:

(A) NUMER ZGŁOSZENIA:

(B) DATA ZGŁOSZENIA:

(C) KLASYFIKACJA:

(vii) DANE POPRZEDNIEGO ZGŁOSZENIA:

(A) NUMER ZGŁOSZENIA: JP 39090/94 (B) DATA ZGŁOSZENIA: 14 lutego 1994 (vii) DANE POPRZEDNIEGO ZGŁOSZENIA:

(A) NUMER ZGŁOSZENIA: JP 79842/94 (B) DATA ZGŁOSZENIA: 25 marca 1994 (vii) DANE POPRZEDNIEGO ZGŁOSZENIA:

(A) NUMER ZGŁOSZENIA: JP 155126/94 (B) DATA ZGŁOSZENIA: 01 stycznia 1994 (vii) DANE POPRZEDNIEGO ZGŁOSZENIA:

(A) NUMER ZGŁOSZENIA: JP 165328/94 (B) DATA ZGŁOSZENIA: 15 czerwca 1994 (vii) DANE POPRZEDNIEGO ZGŁOSZENIA:

(A) NUMER ZGŁOSZENIA: JP 227159/94 (B) DATA ZGŁOSZNIA: 17 sierpnia 1994 (vii) DANE POPRZEDNIEGO ZGŁOSZENIA:

(A) NUMER ZGŁOSZENIA: JP 304167/94 (B) DATA ZGŁOSZENIA: 01 listopada 1994

128

179 884 (vii) DANE POPRZEDNIEGO ZGŁOSZENIA:

(A) NUMER ZGŁOSZENIA: JP nieznany (B) DATA ZGŁOSZENIA: 28 grudnia 1994 (vii) DANE POPRZEDNIEGO ZGŁOSZENIA:

(A) NUMER ZGŁOSZENIA: JP 193169/94 (B) DATA ZGŁOSZENIA: 17 sierpnia 1994 (vii) DANE POPRZEDNIEGO ZGŁOSZENIA:

(A) NUMER ZGŁOSZENIA: JP 97842/94 (B) DATA ZGŁOSZENIA: 14 marca 1994 (vii) DANE POPRZEDNIEGO ZGŁOSZENIA:

(A) NUMER ZGŁOSZENIA: JP 298669/94 (B) DATA ZGŁOSZENIA: 01 grudnia 1994 (vii) DANE POPRZEDNIEGO ZGŁOSZENIA:

(A) NUMER ZGŁOSZENIA: JP 193916/94 (B) DATA ZGŁOSZENIA: 18 sierpnia 1994 (vii) DANE POPRZEDNIEGO ZGŁOSZENIA:

(A) NUMER ZGŁOSZENIA: US 08/212,164 (B) DATA ZGŁOSZENIA: 14 marca 1994 (vii) DANE POPRZEDNIEGO ZGŁOSZENIA:

(A) NUMER ZGŁOSZENIA: US 08/278,083 (B) DATA ZGŁOSZENIA: 20 czerwca 1994 (vii) DANE POPRZEDNIEGO ZGŁOSZENIA:

(A) NUMER ZGŁOSZENIA: US 08/320,300 (B) DATA ZGŁOSZENIA: 11 listopada 1994 (vii) DANE POPRZEDNIEGO ZGŁOSZENIA:

(A) NUMER ZGŁOSZENIA: US 08/361,811 (B) DATA ZGŁOSZENIA: 22 grudnia 1994 (vii) DANE POPRZEDNIEGO ZGŁOSZENIA:

(A) NUMER ZGŁOSZENIA: US 08/320,300 (B) DATA ZGŁOSZENIA: II listopada 1994 (viii) INFORMACJA O PEŁNOMOCNICTWIE:

(A) NAZWISKO: BORUN, Michael F.

(B) NUMER REJESTRU: 25,447 (C) NUMER AKT: 01017/32425 (ix) INFORMACJA O TELEKOUNIKACJI:

(A) TELEFON: 312/474-6300 (B) TELEFAK: 312/474-0448 (2) INFORMACJA DLA SEQ ID NR 1:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 261 par zasadowych (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ŁAŃCUCHOWOŚĆ: podwójna (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA do mRNA

179 884

129 (vi) ŹRÓDŁO POCHODZENIA:

(A) ORGANIZM: Rattus norvegicus (H) LINIA KOMÓRKOWA: McA-RH8994 (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ IND NR: 1

GGTGTACCTG	GGTCCTGAAG CCCTTCTTCA	CCTGGATAGA	TTCCTTGGCC	CACCTGTCCC	60
CACCCCACTC	TGTGCAGAGG TACAAAAGCT	CAAGCCGTCT	CCATGGCCCC	AGGAAAGATT	120
CAGGGGAGAG	GCCCCACACA GGGAGCCACT	GCAGTCAGAC	ACCCTGGGCA	GA	172

ATG Met 1

GAG Glu

CTG Leu

ACT Thr

GAT Asp 5

TTG Leu

CTC Leu

CTG Leu

GTG Val

GCC ATA Ala Ile 10

CTT Leu

CTC Leu

CTC Leu

ACC Thr 15

GCA Ala

220

AGA

CTA

CTG

TCC

AGC

CCA

GTT

CCT

CCC

GCC

TGT

GAC

CC

261

Arg

Leu

Thr

Leu

Ser

Ser

Pro

Val

Pro

Pro

Ala

Cys

Asp

20

25

(2) INFORMACJA DLA SEQ ID 2:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 147 aminokwasów (B) TYP: aminokwas (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: proteina (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NR 2:

Met Glu Leu Thr Asp Leu Leu Leu Val Ala Ile Leu Leu Leu Thr Ala

-21 -20 -15-10

Arg leu Thr Leu Ser Ser Pro Val Pro Pro Ala Cys Asp Pro Arg Leu -5 1510

Leu Asn Lys Leu Leu Arg Asp Ser Tyr Leu Leu His Ser Arg Leu Ser 15 2025

Gin Cys Pro Asp Val Asn Pro Leu Ser Ile Pro Val Leu Leu Pro Ala 30 3540

Val Asp Phe Ser Leu Gly Glu Trp Lys Thr Gin Thr Glu Gin Ser Lys 45 5055

Ala Gin Asp Ile Leu Gly Ala Val Ser Leu Leu Leu Glu Gly Val Met 60 65 7075

Ala Ala Arg Gly Gin Leu Glu Pro Ser Cys Leu Ser Ser Leu Leu Gly 80 8590

Gin Leu Ser Gly Gin Val Arg Leu Leu Leu Gly Ala Leu Gin Gly Leu 95 100105

Leu Gly Thr Gin Val Ser Pro Gin Thr Tyr Arg Asn Tyr Pro Leu Thr 110 115120

Gin Phe Leu 125

130

179 884 (2) INFORMACJA DLA SEQ ID NR 3:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 580 par zasadowych (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ŁAŃCUCHOWOŚĆ: podwójna (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA do mRNA (vi) ŹRÓDŁO POCHODZENIA:

(A) ORGANIZM: Homo Sapiens (F) TYP TKANKI: wątroba (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NR 3:

CTC Leu 1

GTG Val

GTC ATG

CTT Leu 5

CTC Leu

CTA ACT Leu Thr

GCA Ala

AGG CTA

ACG CTG

TCC Ser

AGC Ser 15

CCG Pro

48

Val

Met

Arg 10

Leu

Thr

Leu

GTC

CCT

CCT

GCT

TGT

GAC

CTC CGA

GTC

CTC

AGT

AAA

CTG

CTT

CGT

GAC

96

Ala

Pro

Pro

Ala

Cys

Asp

Leu Arg

Val

Leu

Ser

Lys

Leu

Leu

Arg

Asp

20

25

30

TCC

CAT

GTC

CTT

CAC

AGC

AGA CTG

AGC

CAG

TGC

CCA

GAG

GTT

CAC

CCT

144

Ser

His

Val

Leu

His

Ser

Arg Leu

Ser

Gin

Cys

Pro

Glu

Val

His

Pro

35

40

45

TTG

CCT

ACA

CCT

GTC

CTG

CTG CCT

GCT

GTG

GAC

TTT

AGC

TTG

GGA

GAA

192

Leu

Pro

Thr

Pro

Val

Leu

Leu Pro

Ala

Val

Asp

Phe

Ser

Leu

Gly

Glu

50

55

60

TGG

AAA

ACC

CAG

ATG

GAG

GAC ACC

AAG

GCA

CAG

GAC

ATT

CTG

GGA

GCA

240

Trp

Lys

Thr

Gin

Met

Glu

Glu Thr

Lys

Ala

Gin

Asp

Ile

Leu

Gly

Ala

65

70

75

80

GTG

ACC

CTT

CTG

CTG

GAG

GGA GTG

ATG

GCA

GCA

CGG

GGA

CAA

CTG

GGA

288

Val

Thr

Leu

Leu

Leu

Glu

Gly Val

Met

Ala

Ala

Arg

Gly

Gin

Leu

Gly

85

90

95

CCC

ACT

TGC

CTG

TCA

TCC

CTG CTG

GGG

CAG

CTT

TCT

GGA

CAG

GTC

CGT

336

Pro

Thr

Cys

Leu

Ser

Ser

Leu Leu

Gly

Gin

Leu

Ser

Gly

Gin

Val

Arg

100

105

110

CTC

CTC

CTT

GGG

GCC

CTG

CAG AGC

CTC

CTT

GGA

ACC

CAG

NNN

NNN

NNN

384

Leu

Leu

Leu

Gly

Ala

Leu

Gin Ser

Leu

Leu

Gly

Thr

Gin

Xaa

Xaa

Xaa

115

120

125

NNN

NNN

NNN

NCC

ACA

GCT

CAC AAG

GAT

CCC

ATT

GCC

ATC

TTC

CTG

AGC

432

Xaa

Xaa

Xaa

Xaa

Thr

Ala

His Lys

Asp

Pro

Asn

Ala

Ile

Phe

Leu

Ser

130

135

140

TTC

CAA

CAC

CTG

CTC

CGA

GGA AAG

GTG

CGT

TTC

CTG

ATG

CTT

GTA

GGA

480

Phe

Gin

His

Leu

Leu

Arg

Gly Lys

Val

Arg

Phe

Leu

Met

Leu

Val

Gly

145

150

155

160

GGG

TCC

ACC

CTG

TGC

GTC

AGG CGG

GCC

CCA

CCC

ACC

ACA

GCT

GTC

CCC

528

Gly

Ser

Thr

Leu

Cys

Val

Arg Arg

Ala

Pro

Pro

thr

Thr

Ala

Val

Pro

165

170

175

AGC

AGA

ACC

TCT

CTA

GTC

CTC ACA

CTG

MXC

GAG

CTC

CCA

AAC

AGG

ACT

576

179 884

131

Ser Arg Thr Ser Leu Val Leu Thr Leu Asn glu Leu Pro Asn Arg Thr

180 185 190

TCT G Ser (2) INFORMACJA DLA SEQ ID NR 4:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 253 aminokwasy (B) TYP: aminokwas (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: proteina (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NR 4

Met Glu Leu Thr Glu Leu Leu Leu Val Val Met Leu Leu Leu Thr Ala

-21 -20 -15-10

Arg Leu Thr Leu Ser Ser Pro Ala Pro Pro Ala Cys Asp Leu Arg Val

-5 1510

Leu Ser Lys Leu Leu Arg Asp Ser His Val Leu His Ser Arg Leu Ser 15 2025

Gin Cys Pro Glu Val His Pro Leu Pro Thr Pro Val Leu Leu Pro Ala 30 3540

Val Asp Phe Ser Leu Gly Glu Trp Lys Thr Gin Met Glu Glu Thr Lys 45 5055

Ala Gin Asp Ile leu Gly Ala Val Thr Leu Leu Leu Glu Gly Val Met 60 65 7075

Ala Ala Arg Gly Gin Leu Gly Pro Thr Cys Leu Ser Ser Leu Leu Gly 80 8590

Gin Leu Ser Gly Gin Val Arg Leu Leu Leu Gly Ala Leu Gin Ser Leu 95 100105

Leu Gly Thr Gin Leu Pro Pro Gin Gly Arg Thr Thr Ala His Lys Asp 110 115120

Pro Asn Ala Ile Phe Leu Ser Phe Gin His Leu Leu Arg Gly Lys Val 125 130135

Arg Phe Leu Met Leu Val Gly Gly Ser Thr Leu Cys Val Arg Arg Ala 140 145150

Pro Pro Thr Thr Ala Val Pro Ser Arg Thr Ser Leu Val Leu Thr Leu 160 165170

Asn Glu Leu Pro Asn Arg Thr Ser Gly Leu Leu Glu Thr Asn Phe Thr 175 180185

Ala Ser Ala Arg Thr Thr Gly Ser Gly Leu Leu Lys Trp Gin Gin Gly 190 195200

Phe Arg Ala Lys Ile Pro Gly Leu Leu Asn Gin Thr Ser Arg Ser Leu 205 210215

132

179 884

Asp Gin Ile Pro Gly Tyr Leu Asn Arg Ile His Glu Leu 220 225 230 (2) IFORMACJA DLA SEQ ID NR 5:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: .576 par zasadowych (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ŁAŃCUCHOWOŚĆ: podwójna (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA do mRNA (vi) ŹRÓDŁO POCHODZENIA:

(A) ORGANIZM: Homo sapiens (F) TYP TKANKI: wątroba (xi) OPIS CZĄSTECZKI: SEQ IN NR 5:

AG GGA TTC AGA GCC AAG ATT CCT GGT CTG CTG AAC CAA ACC TCC AGG 47

Gly Phe Arg Ala Lys Ile Pro Gly Leu Leu Asn Gin Thr Ser Arg

5 10 15

TCC CTG GAC

CAA ATC Gin Ile 20

CCC GGA TAC

CTG AAC AGG

ATA CAC GAA CTC TTG

95

Ser

Leu

Asp

pro

Gly

tyr

Leu

Asn Arg 25

Ile His

Glu Leu 30

Leu

AAT

GGA

ACT

CGT

CGA

CTG

TTT

CCT

GGA

CCC

TCA

CGC

AGG

ACC

CTA

GGA

143

Asn

Gly

Thr

Arg

Gly

Leu

Phe

Pro

Gly

Pro

Ser

Arg

Arg

Thr

Leu

Gly

GCC

CCG

GAC

ATT

TCC

TCA

GGA

ACA

TCA

GAC

ACA

GGC

TCC

CTG

CCA

CCC

191

Ala

Pro

Asp 50

Ile

Ser

Ser

Gly

Thr 55

Ser

Asp

Thr

Gly

Ser 60

Leu

Pro

Pro

AAC

CTC

CAG

CCT

GGA

TAT

TCT

CCT

TCC

CCA

ACC

CAT

CCT

CCT

ACT

GGA

239

Asn

Leu 65

Gin

Pro

Gly

Tyr 85

Ser

Pro

Ser

Pro

Thr 90

His

Pro

Pro

Thr

Gly 95

CAG

CTG

CAC

CCC

CTG

CTT

CTT

GAC

CCT

TCT

GCT

CCA

ACG

CCC

ACC

CCT

335

Gin

Leu

His

Pro

Leu 100

Leu

Pro

Asp

Pro

Ser 105

Ala

Pro

Thr

Pro

Thr 110

Pro

ACC

AGC

CCT

CTT

CTA

AAC

ACA

TCC

TAC

ACC

CAC

TCC

CAG

AAT

CTG

TCT

383

Thr CAG Gin

Ser GAA Glu

Pro GGG Gly 130

Leu Leu Asn Thr Ser Tyr Thr His Ser Gin Asn 115 120 125 TAAGGTTCTC AGACACTGCC GACATCAGCA TTGTCTCATG

Leu

Ser

432

TACAGCTCCC TTCCCTGCAG GGCGCCCCTG GGAGĄCAACT

GGACAAGATT TCCTACTTTC

492

TCCTGAAACC CAAAGCCCTG GTAAAAGGGA TACACAGGAC ACTGTACATT ATAAAACCTTC AGAA

TGAAAAGGGA ATCATTTTC

552 576

(2) INFORMACJA DLA SEQ ID NR 6:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 353 aminokwasy (B) TYP: aminokwas

179 884

133 (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: proteina (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NR 6:

Met Glu Leu Thr Glu Leu Leu Leu Val Val Met Leu Leu Leu Thr Ala

-21 -20 -15-10

Arg Leu Thr Leu Ser Ser Pro Ala Pro Pro Ala Cys Asp Leu Arg Val

-5 1510

Leu Ser Lys Leu Leu Arg Asp Ser His Val Leu His Ser Arg Leu Ser 15 2025

Gin Cys Pro Glu Val His Pro Leu Pro Thr Pro Val Leu Leu Pro Ala 30 3540

Val Asp Phe Ser Leu Gly Glu Trp Lys Thr Gin Met Glu Glu Thr Lys 45 5055

Ala Gin Asp Ile Leu Gly Ala Val Thr Leu Leu Leu Glu Gly Val Met 60 65 7075

Ala Ala Arg Gly Gin Leu Gly Pro Thr Cys Leu Ser Ser Leu Leu Gly 80 8590

Gin Leu Ser Gly Gin Val Arg Leu Leu Leu Gly Ala Leu Gin Ser Leu 95 100105

Leu Gly Thr Gin Leu Pro Pro Gin Gly Arg Thr Thr Ala His Lys Asp 110 115120

Arg Phe Leu Met Leu Val Gly Gly Ser Thr Leu Cys Val Arg ArgAla

140 145 150155

Pro Pro Thr Thr Ala Val Pro Ser Arg Thr Ser Leu Val Leu ThrLeu

160 165170

Asn Glu Leu Pro Asn Arg Thr Ser Gly Leu Leu Glu Thr Asn Phe Thr 175 180185

Ala Ser Ala Arg Thr Thr Gly Ser Glu Leu Leu Lys Trp Gin Gin Gly 190 195200

Phe Arg Ala Lys Ile Pro Gly Leu Leu Asn Gin Thr Ser Arg Ser Leu 205 210215

Asp Gin Ile Pro Gly Tyr Leu Asn Arg Ile His Glu Leu Leu AsnGly

220 225 230235

Thr Arg Gly Leu Phe Pro Gly Pro Ser Arg Arg Thr Leu Glu AlaPro

240 245250

Asp Ile Ser Ser Gly Thr Ser Asp Thr Gly Ser Leu Pro Pro Asn Leu 255 260265

Gin Pro Gly Tyr Ser Pro Ser Pro Thr His Pro Pro Thr Gly Gin Tyr 270 275280

134

179 884

Thr Leu

Phe

Pro

Leu

Pro

Pro Thr 290

Leu

Pro

Thr

Pro 295

Val

Val

Gin

Leu

285

His

Pro

Leu

Leu

Pro

Asp

Pro Ser

Ala

Pro

Thr

Pro

Thr

Pro

Thr

Ser

300

305

310

315

Pro

Leu

Leu

Asn

Thr

Ser

Tyr Thr

His

Ser

Gin

Asn

Leu

Ser

Gin

Glu

320

325

330

Gly (2) INFORMACJA DLA SEQ ID NR 7:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 1721 par zasadowych (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ŁAŃCUCHOWOŚĆ: podwójna (D) TOPOLOGIA; liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA do mRNA (vi) ŹRÓDŁO POCHODZENIA:

(A) ORGANIZM: Homo sapiens (F) TYP TKANKI: wątroba (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NR 7:

GCGGCACGAG GGGGGTGTCT GGCTGGCGTG GCTCCCTGTT TGGGGCCTCT CCCTGAATC

CTTCCTGGGG CCATGGAGGC CAGACAGACA CCCCGGCCAG A ATG GAG CTG ACT

Met Glu Leu Thr

GAA TTG CTC CTC GTG GTC ATG CCT CTC CTA ACT GCA AGG CTA ACG CTA Glu Leu Leu Leu Val Val Met Leu Leu Leu Thr Ala Arg Leu Thr Leu -15 -10-5

TCC AGC CCG GCT CCT CCT GCT TGT GAC CTC CGA GTC CTC AGT AAACTG

Ser Ser Pro Ala Pro Pro Ala Cys Asp Leu Arg Val Leu Ser LysLeu

1015

CTT CGT GAC TCC CAT GTC CTT CAC AGC AGA CTG AGC CAG TGC CCAGAG

Leu Arg Asp Ser His Val Leu His Ser Arg Leu Ser Gin Cys PtoGlu

4045

TTG GGA GAA TGG AAA ACC CAG ATG GAG GAG ACC AGG GCA CAG GACATT

Leu Gly Glu Trp Lys Thr Gin Met Glu Glu Thr Lys Ala Gin AspIle

5560

CTG GGA GCA GTC ACC CTT CTG CTG GAG GGA GTC ATG GCA GCA CGGGGA

Leu Gly Ala Val Thr Leu Leu Leu Glu Glu Val Met Ala Ala ArgGly

7075

CAA CTG GGA CCC ACT TGC CTC TCA TCC CTC CTG GGG CAG CTT TCTGGA

Gin Leu Gly Pro Thr Cys Leu Ser Ser Leu Leu Gly Gin Leu SerGly

85 9095

CAG GTC CGT CTC CTG CTT GGG GCC CTG CAG AGC CTC CTT GGA ACCCAG

Gin Val Arg Leu Leu Leu Gly Ala Leu Gin Ser Leu Leu Gly ThrGin

100 105110

CTT CCT CCA CAG GGC AGG ACC ACA GCT CAC AAG GAT CCC AAT GCC ATC

113

161

209

257

353

401

449

497

545

179 884

135

Leu

Pro

Pro

Gin 115

Gly

Arg

Thr

Thr

Ala 120

His

Lys

Asp

Pro

Asn 125

Ala

Ile

TTC

CTG

AGC

TTC

CAA

CAC

CTG

CTC

CGA

GGA

AAG

GTG

CGT

TTC

CTG

ATG

593

Phe

Leu

Ser 130

Phe

Gin

His

Leu

Leu 135

Arg

Gly

Lys

Val

Arg 140

Phe

Leu

Met

CTT

GTA

GGA

GGG

TCC

ACC

CTC

TGC

GTC

AGG

CGG

GCC

CCA

CCC

ACC

ACA

641

Leu

Val 145

Gly

Gly

Ser

Thr

Leu 150

Cys

Val

Arg

Arg

Ala 155

Pro

Pro

Thr

Thr

GCT

GTC

CCC

AGC

AGA

ACC

TCT

CTA

GTC

CTC

ACA

CTG

AAC

GAG

CTC

CCA

689

Ala 160

Val

Pro

Ser

Arg

Thr 16'

Ser

Leu

Val

Leu

Thr 170

Leu

Asn

Glu

Leu

Pro

AAC

AGG

ACT

TCT

GGA

TTG

TTG

GAG

ACA

AAC

TTC

ACT

GCC

TCA

GCC

AGA

737

Asn

Arg

Thr

Ser

Gly 180

Leu

Leu

Glu

Thr

Asn 185

Phe

Thr

Ala

Ser

Ala 190

Arg

ACA

ACT

GGC

TCT

GGG

CTT

CTG

AAG

TGG

CAG

CAG

GGA

TTC

AGA

GCC

AAG

785

Thr

Thr

Gly

Ser 195

Gly

Leu

Leu

Lys

Trp 200

Gin

Gin

Gly

Phe

Arg 205

Ala

Lys

ATT

CCT

GGT

CTG

CTG

AAC

CAA

ACC

TCC

AGG

TCC

CTG

GAC

CAA

ATC

CCC

833

Ile

Pro

Gly 210

Leu

Leu

Asn

Gin

Thr 215

Ser

Arg

Ser

Leu

Asp 220

Gin

Ile

Pro

GGA

TAC

CTG

AAC

AGG

ATA

CAC

GAA

CTC

TTG

AAT

GGA

ACT

CGT

GGA

CTC

881

Gly

Tyr 225

Leu

Asn

Arg

Ile

His 230

Glu

Leu

Leu

Asn

Gly 235

Thr

Arg

Gly

Leu

TTT

CCT

GGA

CCC

TCA

CGC

AGG

ACC

CTA

GGA

GCC

CCG

GAC

ATT

TCC

TCA

929

Phe 240

Pro

Gly

Pro

Ser

Arg 245

Arg

Thr

Leu

Gly

Ala 250

Pro

Asp

Ile

Ser

Ser 255

GGA

ACA

TCA

GAC

ACA

GGC

TCC

CTG

CCA

CCC

AAC

CTC

CAG

CCT

GGA

TAT

977

Gly

Thr

Ser

Asp

Thr 260

Gly

Ser

Leu

Pro

Pro 265

Asn

Leu

Gin

Pro

Gly 270

Tyr

TCT

CCT

TCC

CCA

ACC

CAT

CCT

CCT

ACT

GGA

CAG

TAT

ACG

CTC

TTC

CCT

1025

Ser

Pro

Ser

Pro 275

Thr

His

Pro

Pro

Thr 280

Gly

Gin

Tyr

Thr

Leu 285

Phe

Pro

CTT

CCA

CCC

ACC

TTG

CCC

ACC

CCT

GTG

GTC

CAG

CTC

CAC

CCC

CTG

CTT

1073

Leu

Pro

Pro 290

Thr

Leu

Pro

Thr

Pro 295

Val

Val

Gin

Leu

His 300

Pro

Leu

Leu

CCT

GAC

CCT

TCT

GCT

CCA

ACG

CCC

ACC

CCT

ACC

AGC

CCT

CCT

CTA

AAC

1121

Pro

Asp 305

Pro

Ser

Ala

Pro

Thr 31(

Pro

Thr

Pro

Thr

Ser 315

Pro

Leu

Leu

Asn

ACA Thr 320

TCC Ser

TAC Tyr

ACC Thr

CAC His

TCC Ser 325

CAG Gin

AAT Asn

CTG Leu

TCT Ser

CAG Gin 330

GAA Glu

GGG Gly

TAAGGTTCTC

1170

AGACACTGCC GACATCAGCA TTGTCTCGTG TACAGCTCCC TTCCCTGCAG GGCGCCCCTG 1230

GGAGACAACT GGACAAGATT TCCTACTTTC TCCTGAAACC CAAAGCCCTG GTAAAAGGGA 1290

TACACAGGAC TGAAAAAGGGA ATCATTTTC ACTGTACATT ATAAACCTTC AGAAGCTATT

1350

136

179 884

TTTTTAAGCT ATCAGCAATA CTCATCAGAG CAGCTAGCTC TTTGGTCTAT TTTCTGCAGA1410

AATTTGCAAC TCACTGATTC TCTACATGCT CTTTTTCTGT GATAACTCTG CAAAGGCCTG1470

GGCTGGCCTG GCAGTTGAAC AGAGGGAGAG ACTAACCTTG AGTCAGAAAA CAGAGAAAGG1530

GTAATTTCCT TTGCTTCAAA TTCAAGGCCT TCCAACGCCC CCATCCCCTT TACTATCATT1590

CTCAGTGGGA CTCTGATCCC ATATTCTTAA CAGATCTTTA CTCTTGAGAA ATGAATAAGC1650

TTTCTCTCAG AAATGCTGTC CCTATACACT AGACAAAACT GAAAAAAAAA AAAAAAAAAA 1710

AAAAAAAAAA A1721 (2) INFORMACJA DLA SEQ ID NR 8:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ; 4506 par zasadowych (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ŁAŃCUCHOWOŚĆ: podwójna (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: genomowy DNA (vi) ŹRÓDŁO POCHODZENIA: Homo sapiens (A) ORGANIZM: Homo sapiens (B) TYP KOMÓREK: leukocyty obwodowe (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NR 8:

GAATTCAGGG CTTTGGCAGT TCCAGGCTGG TCAGCATCTC AAGCCCCTCCC CAGCATCTGT60

TCACCCTGCC AGGCAGTCTC TTCCTAGAAA CTTGGTTAAA TGTTCACTCT TCTTGCTACT120

TTCAGGATAG ATTCCTCACC CTTGGCCCGC CTTTGCCCCA CCCTACTCTG CCCAGAAGTG180

CAAGAGCCTA AGCCGCCTCC ATGGCCCCAG GAAGGATTCA GGGGAGAGGC CCCAAACAGG240

GAGCCACGCC AGCCAGACAC CCCGGCCAGA ATG GAG CTG ACT G GTGAGAACAC293

Met Glu Leu Thr -21 -20

ACCTGAGGGG CTAGGGCCAT ATGGAAACAT GACAGAAGGG GAGAGAGAAA GGAGACACGC353

TGCAGGGGGC AGGAAGCTGG GGGAACCCAT TCTCCCAAAA ATAAGGGGTC TGAGGGGTGG413

ATTCCCTGGG TTTCAGGTCT GGGTCCTGAA TGGGAATTCC TGGAATACCA GCTGACAATG473

ATTTCCTCCT CATCTTTCAA CCTCACCTCT CCTCATCTAA G AA TTG CTC CTC525

Glu Leu Leu Leu

GTG GTC ATG CTT CTC CTA ACT GCAAAG CTA ACT CTG TCC AGC CCG GCT573

Val Val Met Leu Leu Leu Thr Ala Arg Leu Thr Leu Ser Ser ProAla

-10 -51

CCT CCT GCT TGT GAC CTC CGA GTC CTC AGT ΆΆΆ CTG CTT CGT GAC TCC621

Pro Pro Ala Cys Asp Leu Arg Val Leu Ser Lys Leu Leu Arg AspSer

1015

CAT GTC CTT CAC AGC AGA CTG GTGAGAACTC CCAACATTAT CCCCTTTATC

672

179 884

137

His Val Leu His Ser Arg Leu 2025

CGCGTAACTG GTAAGACACC CATACTCCCA GGAAGACACC ATCACTTCCT CTAACTCCTT732

GACCCAATGA CTATTCTTCC CATATTGTCC CCACCTACTG ATCACACTCT CTGACAAGGA792

TTATTCTTCA CAATACAGCC CGCATTTAAA AGCTCTCGTC TAGAGATAGT ACTCATGGAC852

GACTAGCCTG CTTATTAGGC TACCATAGCT CTCTCTATTT CAGCTCCCTT CTCCCCCCAC912

CAATCTTTTT CAACAG AGC CAG TGC CCA GAG GTT CAC CCT TTG CCT ACA961

Ser Gin Cys Pro Glu Val His Pro Leu Pro Thr

3036

CCT GTC CTG CTG CCT GCT GTG GAC TTT AGC TTG GGA GAA TGG AAA ACC1009

Pro Val Leu Leu Pro Ala Val Asp Phe Ser Leu Gly Glu Trp Lys Thr

4550

CAG ATG GTAAGAAAGC CATCCCTAAC CTTGGCTTCC CTAAGTCCTG TCTTCAGTTT1065

Gin Met 55

CCCACTGCTT CCCATGGATT CTCCAACATT CTTGAGCTTT TTAAAAATAT CTCACCTTCA1125

GCTTGGCCAC CCTAACCCAA TCTACATTCA CCTATGATGA TAGCCTGTGG ATAAGATGAT1185

GGCTTGCAGG TCCAATATGT GAATAGATTT GAAGCTGAAC ACCATGAAAA GCTGGAGAGA1245

AATCGCTCAT GGCCATGCCT TTGACCTATT CCTGTTCAGT CTTCTTAAAT TGGCATGAAG1305

AAGCAAGACT CATATGTCAT CC AC AGAT GA CACAAAGCTG GGAAGTACCA CTAAAATAAC1365

AAAAGACTGA ATCAAGATTC AAATCACTGA AAGACTAGGT CAAAAACAAG GTGAAACAAC1425

AGAGATATAA ACTTCTACAT GTGGGCCGGG GGCTCACGCC TGTAATCCCA GCACTTTGGG1485

AGGCCGAGGC AGGCAGATCA CCTGAGGGCA GGAGTTTGAG AGCAGCCTGG CCAACATGGC1545

GAAACCCCGT CTCTACTAAG AATACAAAAT TAGCCGGGCA TGGTAGTGCA TGCCTGTAAT1605

CCCAGCTACT TGGAAGGCTG AAGCAGGAGA ATCCCTGAA CCCAGGAGGT GGAGGTTGTA1665

GTGAGCTGAG ATCATGCCAA TGCACTCCAG CCTGGGTGAC AAGAGCAAA CTCCGTCTCA1725

AAAAGAAAAA AAAATTCTAC ATGTGTAAAT TAATGAGTAA AGTCCTATTC CAGCTTTCAG1785

GCCACAATGC CCTGCTTCCA TCATTTAAGC CTCTGGCCCT AGCACTTCCT ACGAAAAGGA1845

TCTGAGAGAA TTAAATTGCC CCCAAACTTA CCATGTAACA TTACTGAAGC TGCTATTCTT1905

AAAGCTAGTA ATTCTTGTCT GTTTGATGTT TAGCATCCCC ATTGTGGAAA TGCTCGTACA1965

GAACTCTATT CCGAGTGGAC TACACTTAAA TATACTGGCC TGAACACCGG ACATCCCCCT2025

GAAGACATAT GCTAATTTAT TAAGAGGGAC CATATTAAAC TAACATGTGT CTAGAAAGCA2085

GCAGCCTGAA CAGAAAGAGA CTAGAAGCAT GTTTTATGGG CAATAGTTTA AAAAACTAAA2145

ATCTATCCTC AAGAACCCTA GCGTCCCTTC TTCCTTCAGG ACT^AGTCAG GGAAGAAGGG2205

138

179 884

CAGTTCCTAT GGGTCCCTTC TAGTCCTTTC TTTTCATCCT TATGATCATT ATGGTAGAGT2265

CTCATACCTA CATTTAGTTT ATTTATTATT ATTATTTGAG ACGGAGTCTC ACTCTATCCC2325

CCAGGCTGGA GTGCAGTGGC ATGATCTCAA CTCACTGCAA CCTCAGCCTC CCGGATTCAA2385

GCGATTCTCC TGCCTCAGTC TCCCAAGTAG CTGGGATTAC AGGTGCCCAC CGCCATGCCC2445

AGCTAATTTT TGTATTTTTG GTAGAGATGG GGTTTCACCA TGTTGGCCAG GCTGATCTTG2505

AACTCCTGAC CTCAGGTGAT CCACCTGCCT CAGCCTCCCA AAGTCGTGGG ATTACAGGCG2565

TGAGCCACTG CACCCAGCCT TCATTCAGTT TAAAAATCAA ATGATCCTAA GGTTTTGCAG2625

CAGAAAGAGT AAATTTGCAG CACTAGAACC AAGAGGTAAA AGCTGTAACA GGGCAGATTT2685

CAGCAACGTA AGAAAAAAGG AGCTCTTCTC ACTGAAACCA AGTGTAAGAC CAGGCTGGAC2745

TAGAGGACAC GGGAGTTTTT GAAGCAGAGG CTGATGACCA GCTGTCGGGA GACTGTGAAG2805

GAATTCCTGC CCTGGGTGGG ACCTTGGTCC TGTCCAGTTC TCAGCCTGTA TGATTCACTC2865

TGCTGGCTAC TCCTAAGGCT CCCCACCCGC TTTTAGTGTG CCCTTTGAGG CAGTGCGCTT2925

CTCTCTTCCA TCTCTTTCTC AG GAG GAG ACC AAG GCA CAG GAC ATT CTG GGA 2977 Glu Glu Thr Lys Ala Gin Asp Ile Leu Gly

6(	) 65
GCA GTG ACC CTT CTG CTG GAG GGA GTG ATG GCA	GCA CGG GGA CAA CTG	3025
Ala Val Thr Leu Leu Leu Glu Gly Val Met Ala 70 75	Ala Arg Gly Gin Leu 80
GGA CCC ACT TGC CTC TCA TCC CTC CTG GGG CAG	CTT TCT GGA CAG GTC	3073
Gly Pro Thr Cys Leu Ser Ser Leu Leu Gly Gin 85 90	Leu Ser Gly Gin Val 95
CGT CTC CTC CTT GGG GCC CTG CAG AGC CTC CTT Arg Leu Leu Leu Gly Ala Leu Gin Ser Leu Leu 100 105	GGA ACC CAG Gly Thr Gin 110	3115
GTAAGTCCCC AGTCAAGGGA TCTGTAGAAA CTGTTCTTTT	CTGACTCAGT CCCCCTAGAA	3175
GACCTGAGGG AAGAAGGGCT CTTCCAGGGA GCTCAAGGGC	AGAAGAGCTG ATCTACTAAG	3235
AGTGCTCCCT GCCAGCCACA ATGCCTGGGT ACTGGCATCC	TGTCTTTCCT ACTTAGACAA	3295
GGGAGGCCTG AGATCTGGCC CTGGTGTTTG GCCTCAGGAC	CATCCTCTGC CCTCAG	3351
CTT CCT CCA CAG GGC AGG ACC ACA GCT CAC AAG	GAT CCC AAT GCC ATC	3399
Leu Pro Pro Gin Gly Arg Thr Thr Ala His Lys 115 120	Asp Pro Asn Ala Ile 125
TTC CTG AGC TTC CAA CAC CTG CTC CGA GGA AAG	GTG CGT TTC CTG ATG	3447
Phe Leu Ser Phe Gin His Leu Leu Arg Gly Lys 130 135	Val Arg Phe Leu Met 140
CTT GTA GGA GGG TCC ACC CTC TGC GTC AGG CGG	GCC ACC CCC ACC ACA	3495
Leu Val Gly Gly Ser Thr Leu Cys Val Arg Arg 145 150	Ala Pro Pro Thr Thr 155
GCT GTC CCC AGC AGA ACC TCT CTA GTC CTC ACA	CTG AAC GAG CTC CCA	3543

179 884

139

Ala 160

Val

Pro

Ser

Arg

Thr Ser 165

Leu Val

Leu

Thr 170

Leu

Asn

Glu

Leu

Pro 175

AAC

AGG

ACT

TCT

GGA

TTG

TTG

GAG

ACA

AAC

TTC

ACT

GCC

TCA

GCC

AGA

3591

Asn

Arg

Thr

Ser

Gly 180

Leu

Leu

Glu

Thr

Asn 185

Phe

Thr

Ala

Ser

Ala 190

Arg

ACT

ACT

GGC

TCT

GGG

CTT

CTG

AAG

TGG

CAG

CAG

GGA

TTC

AGA

GCC

AGG

3639

Thr

Thr

Gly 195

Ser

Gly

Leu

Leu

Lys

Trp 200

Gin

Gin

Gly

Phe

Arg 205

Ala

Lys

ATT

CTT

GGT

CTG

CTG

AAC

CAA

ACC

TCC

AGG

TCC

CTG

GAC

CAA

ATC

CCC

3687

Ile

Pro

Gly 210

Leu

Leu

Asn

^Gln

Thr 21'

Ser

Arg

Ser

Leu

Asp 220

Gin

Ile

Pro

GGA

TAC

CTG

AAC

AGG

ATA

CAC

GAA

CTC

TTG

AAT

GGA

ACT

CGT

GGA

CTC

3735

Gly

Tyr 225

Leu

Asn

Arg

Ilę

His 230

Glu

Leu

Leu

Asn

Gly 235

Thr

Arg

Gly

Leu

TTT

CTT

GGA

CCC

TCA

CGC

AGG

ACC

CTA

GGA

GCC

CCG

GAC

ATT

TCC

TCA

3783

Phe 240

Pro

Gly

Pro

Ser

Arg 245

Arg

Thr

Leu

Glu

Ala 250

Pro

Asp

Ile

Ser

Ser 255

GGA

ACA

TCA

GAC

ACA

GGC

TCC

CTG

CCA

CCC

AAC

CTC

CAG

CCT

GGA

TAT

3831

Gly

Thr

Ser

Asp

Thr Gly 260

Ser

Leu

Pro

Pro 265

Asn

Leu

Gin

Pro

Gly 270

Tyr

TCT

CCT

TCC

CCA

ACC

CAT

CCT

CCT

ACT

GGA

CAG

TAT

ACG

CTC

TTC

CCT

3879

Ser

Pro

Ser

Pro 275

Thr

His

Pro

Pro

Thr 280

Gly

Gin

Tyr

Thr

Leu 285

Phe

Pro

CTT

CCA

CCC

ACC

TTG

CCC

ACC

CCT

GTG

GTC

CAG

CTC

CAC

CCC

CTG

CTT

3927

Leu

Pro

Pro 290

Thr

Leu

Pro

Thr

Pro 295

Val

Val

Gin

Leu

His 300

Pro

Leu

Leu

CCT

GAC

CCT

TCT

GCT

CCA

ACG

CCC

ACC

CCT

ACC

AGC

CCT

CTT

CTA

AAC

3975

Pro

Asp 305

Pro

Ser

Ala

Pro

Thr Pro 310

Thr

Pro

Thr

Ser Pro 315

Leu

Leu

Asn

ACA Thr 320

TCC Ser

TAC Tyr

ACC thr

CAC His

TCC Ser 325

CAG Gin

AAT Asn

CTG Leu

TCT Ser

CAG Gin 330

GAA GGG Glu Gly

TAAGGTTCTC

4024

AGACACTGCC GACATCAGCA TTGTCTCATG TACAGCTCCC TTCCCTGCAG GGCGCCCCTG4084

GGAGACAACT GGACAAGATT TCCTACTTTC TCCTGAAACC CAAAGCCCTG GTAAAAGGGA4144

TACACAGGAC TGAAAAGGGA ATCATTTTC ACTGTACATT ATAAACCTTC AGAAGCTATT4204

TTTTTAAGCT ATCAGCAATA CTCATCAGAG CAGCTAGCTC TTTGGTCTAT TTTCTGCAGA4264

AATTTGCAAC TCACTGATTC TCTACATGCT CTTTTTCTGT GATAACTCTG CAAAGGCCTG4324

GGCTGGCCTG GCAGTTGAAC AGAGGGAGAG ACTAACCTTG AGTCAGAAAA CAGAGAAAGG4384

GTAATTTCCT TTGCTTCAAA TTCAAGGCCT TCCAACGCCC CCATCCCCTT TACTATCATT4444

CTCAGTGGGA CTCTGATCCC ATATTCTTAA CAGATCTTTA CTCTTGAGAA ATGAATAAGC4504

TT

4506 (2) INFORMACJA DLA SEQ ID NR 9:

140

179 884 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 416 par zasadowych (B)TYP: kwas nukleinowy (C) ŁAŃCUCHOWOŚĆ: podwójna (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: syntetyczny DNA

(xi)	OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NR 9:
CTAGAAAAAA	CCAAGGAGGT	AATAAATAAT	GAGCCCGGCT	CCGCCAGCTT	GTGACCTTCG	60
TGTTCTGTCT	AAACTGCTTC	GCGACTCTCA	CGTGCTGCAC	TCTCGTCTGT	CCCAGTGCCC	120
GGAAGTTCAC	CCGCTGCCGA	CCCCGGTTCT	GCTTCCGGCT	GTCGACTTCT	CCCTGGGTGA	180
ATGGAAAACC	CAGATGGAAG	AGACCAAAGC	TCAGGACATC	CTGGGTGCAG	TAACTCTGCT	240
TCTGGAAGGC	GTTATGGCTG	CACGTGGCCA	GCTTGGCCCG	ACCTGCCTGT	CTTCCCTGCT	300
TGGCCAGCTG	TCTGGCCAGG	TTCGTCTGCT	GCTCGGCGCT	CTGCAGTCTC	TGCTTGGCAC	360
CCAGCTGCCG	CCACAGGGCC	GTACCACTGC	TCACAAGGAT	CCGAACGCTA	TCTTCC	416

(2) INFORMACJA DLA SEQ ID NR 10:

(i)

CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 179 aminokwasów (B) TYP: aminokwas (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) (xi)

Leu Val I -5

Leu Ser Lys Leu

Gin Cys Pro Glu 30

Val Asp Phe Ser 45

Ala Gin Asp Ile 60

Ala Ala Arg Gly

TYP CZĄSTECZKI: proteina

OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NR 10:

Arg Gly Ser Pro Ala 1

Leu Arg Asp Ser

Pro Pro Ala Cys Asp Leu Arg Val 5 10

Gin Leu Ser Gly 95

Leu Gly Thr Gin 110

Val His Pro Leu 35

Leu Gly Glu Trp 50 leu Gly Ala Val 65

Gin Leu Gly Pro 80

Gin Val Arg Leu

Leu Pro Pro Gin

115

His Val Leu His Ser Arg Leu Ser 20 23

Pro Thr Pro Val Leu Leu Pro Ala 40

Lys Thr Gin Met Glu Glu Thr Lys 55

Thr Leu Leu Leu Glu Gly Val Met 7075

Thr Cys Leu Ser Ser Leu Leu Gly 8590

Leu Leu Gly Ala Leu Gin Ser Leu 100105

Gly Arg Thr Thr Ala His Lys Asp 120

Pro Asn Ala Ile Phe Leu Ser Phe Gin His Leu Leu Arg Gly Lys Val

125 130 135

179 884

141

Arg Phe Leu Met Leu Val	Gly Gly Ser Thr Leu Cys Val Arg Arg Ala
140	145	150	155
Pro Pro Thr Thr Ala 160 Asn Glu Leu	Val	Pro Ser Arg Thr Ser Leu Val Leu Thr 165 170	Leu

(2) INFORMACJA DLA SEQ ID NR 11:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI (A) DŁUGOŚĆ: 535 par zasadowych (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ŁAŃCUCHOWOŚĆ: podwójna (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: syntetyczny DNA (vi) ŹRÓDŁO POCHODZENIA: Homo Sapiens (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NR 11:

CTAGAAAAAA CCAAGGAGGT AATAAATA ATG AAA GCA CCT GTA CCA CCT GCA 52

Met Lys Ala Pro Val Pro Pro Ala

-2 1 5

TGT Cys

GAT TTA

CGG Arg 10

GTC Val

CTG TCT

AAA Lys

CTG CTG CGC

GAC Asp

TCT Ser

CAC His 20

GTG Val

CTG Leu

100

Asp

Leu

Leu

Ser

Leu Leu 15

Arf

CAG

TCT

CGT

CTG

TCC

CAG

TGC

CCG

GAA GTT

CAC

CCG

CTG

CCG

ACC

CCG

148

His

Ser

Arg

Leu

Ser

Gin

Cys

Pro

Glu Val

His

Pro

Leu

Pro

Thr

Pro

25

30

35

GTT

CTG

CTT

CCG

GCT

GTC

GAC

TTC

TCC CTG

GGT

GAA

TGG

AAA

AGC

CAG

196

Val

Leu

Leu

Pro

Ala

Val

Asp

Phe

Ser Leu

Gly

Glu

Trp

Lys

Thr

Gin

40

45

50

ATG

GAA

GAG

ACC

AAA

GCT

CAG

GAC

ATC CTG

GGT

GCA

GTA

ACT

CTG

CTT

244

Met

Glu

Glu

Thr

Lys

Ala

Gin

Asp

Ile Leu

Gly

Ala

Val

Thr

Leu

Leu

55

60

65

70

CTG

GAA

GGC

GTT

ATG

GCT

GCA

CGT

GGC CAG

CTT

GGC

CCG

ACC

TGC

CTG

292

Leu

Glu

Gly

Val

Met

Ala

Ala

Arg

Gly Gin

Leu

Gly

Pro

Thr

Cys

Leu

75

80

85

TCT

TCC

CTG

CTT

GGC

CAG

CTG

TCT

GGC CAG

GTT

CGT

CTG

CTG

CTC

GGC

340

Ser

Ser

Leu

Leu

Gly

Gin

Leu

Ser

Gly Gin

Val

Arg

Leu

Leu

Leu

Gly

90

95

100

GCT

CTG

CAG

TCT

CTG

CTT

GGC

ACC

CAG CTG

CCG

CCA

CAG

GGC

CGT

ACC

388

Ala

Leu

Gin

Ser

Leu

Leu

Gly

Thr

Gin Leu

Pro

Pro

Gin

Gly

Arg

Thr

105

110

115

ACT

GCT

CAC

AAG

GAT

CCG

AAC

GCT

ATC TTC

CTG

TCT

TTC

CAG

CAC

CTG

436

Thr

Ala

His

Lys

Asp

Pro

Asn

Ala

Ile Phe

Leu

Ser

Phe

Gin

His

Leu

120

125

130

CTG

CGT

GGC

AAA

GTT

CGT

TTC

CTG

ATG CTG

GTT

GGC

GGT

TCT

ACC

CTG

484

Leu

Arg

Gly

Lys

Val

Arg

Phe

Leu

Met Leu

Val

Gly

Gly

Ser

Thr

Leu

135

140

145

150

142

179 884

TGC GTT CGT CGG GCG CCG CCA ACC ACT GCT GTT CCG TCT TAATGAAAGC533

Cys Val Arg Arg Ala Pro Pro Thr Thr Ala Val Pro Ser

155160

TT535 (2) INFORMACJA DLA SEQ ID NR 12:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 535 par zasadowych (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ŁAŃCUCHOWOŚĆ: podwójna (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: syntetyczny DNA (vi) ŹRÓDŁO POCHODZENIA:

(A) ORGANIZM: Homo Sapiens (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NR 12:

CTAGAAAAAA CCAAGGAGGT AATAAATA ATG AAA TCT CCT GCA CCA CCT GCA 52

Met Lys Ser Pro Ala Pro Pro Ala

-2 1 5

TGT Cys

GAT TTA

CGG Arg 10

GTC Val

CTG Leu

TCT AAA

CTG Leu 15

CTG Leu

CGC Arg

GAC Asp

TCT Ser

CAC His 20

GTG Val

CTG Leu

100

Asp

Leu

Ser

Lys

CAC

TCT

CGT

CTG

TCC

CAG

TGC

CCG

GAA

GTT

CAC

CCG

CTG

CCG

ACC

CCG

148

His

Ser

Arg 25

Leu

Ser

Gin

Cys

Pro 30

Glu

Val

His

Pro

Leu 35

Pro

Thr

Pro

GTT

CTG

CTT

CCG

GCT

GTC

GAC

TTC

TTC

CTG

GGT

GAA

TGG

AAA

ACC

CAG

196

Val

Leu 40

Leu

Pro

Ala

Val

Asp 45

Phe

Ser

Leu

Gly

Glu 50

Trp

Lys

Thr

Gin

ATG

GAA

GAC

ACC

AAA

GCT

CAG

GAC

ATC

CTG

GGT

GCA

GTA

ACT

CTG

CTT

244

Met 55

Glu

Glu

Thr

Lys

Ala 60

Gin

Asp

Ile

Leu

Gly 65

Ala

Val

Thr

Leu

Leu 70

CTG

GAA

GGC

GTT

ATG

GCT

GCA

CGT

GGC

CAG

CTT

GGC

CCG

ACC

TGC

CTG

292

Leu

Glu

Gly

Val

Met 75

Ala

Ala

Arg

Gly

Gin 80

Leu

Gly

Pro

Thr

Cys 85

Leu

TCT

TCC

CTG

CTT

GGC

CAG

CTG

TCT

GGC

CAG

GTT

CGT

CTG

CTG

CTC

GGC

340

Ser

Ser

Leu

Leu 90

Gly

Gin

Leu

Ser

Gly 9!

Gin

Val

Arg

Leu

Leu 100

Leu

Gly

GCT

CTG

CAG

TCT

CTG

CTT

GGC

ACC

CAG

CTG

CCG

CCA

CAG

GGC

CGT

ACC

388

Ala

Leu

Gin 105

Ser

Leu

Leu

Gly 95

Thr

Gin

Leu

Pro

Pro

Gin 115

Gly

Arg

Thr

ACT

GCT

CAC

AAG

GAT

CCG

AAC

GCT

ATC

TTC

CAT

TCT

TTC

CAG

CAG

CTG

436

Thr

Ala 120

His

Lys

Asp

Pro

Asn 125

Ala

Ile

Phe

Leu

Ser 130

Phe

gin

His

Leu

CTG

CGT

GGC

AAA

GTT

CGT

TTC

CTG

ATG

CTG

GTT

GGC

GGT

TCT

ACC

CTG

484

Leu 135

Arg

Gly

Lys

Val

Arg 140

Phe

Leu

Met

Leu

Val 145

Gly

Gly

Ser

Thr

Leu

179 884

143

TGC GTT CGT CGG GCG CCG CCA ACC ACT GCT GTT CCG TCT TAATGAAAGC533

Cys Val Arg Arg Ala Pro Pro Thr Thr Ala Val Pro Ser

155160

TT535 (2) INFORMACJA DLA SEQ ID NR 13:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 555 par zasadowych (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ŁAŃCUCHOWOŚĆ: podwójna (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA do mRNA (vi) ŹRÓDŁO POCHODZENIA:

(A) ORGANIZM: Homo Sapiens (F) TYP TKANKI: wątroba (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NR 13:

ATG Met -21

GAG Glu -20

CTG Leu

ACT Thr

GAA TTG CTC

CTC Leu

GTG GTC Val Val

ATG Met

CTT Leu -10

CTC Leu

CTA Leu

ACT Thr

GCA Ala

48

Glu

Leu

Leu -15

AGG

CTA

ACG

CTG

TCC

AGC

CCG

GCT

CCT CCT

GCT

TGT

GAC

CTG

CGA

GTC

96

Arg

Leu

Thr

Leu

Ser

Ser

Pro

Ala

Pro Pro

Ala

Cys

Asp

Leu

Arg

Val

-5

1

5

10

CTG

AGT

AAA

CTG

CTT

CGT

GAC

TCC

CAT GTC

CTT

CAC

AGC

AGA

CTG

AGC

144

Leu

Ser

Lys

Leu

Leu

Arg

Asp

Ser

His Val

Leu

His

Ser

Arg

Leu

Ser

15

20

25

CAG

TGC

CCA

GAG

GTT

CAC

CTT

TTG

CCT ACA

CCT

GTC

CTG

CTG

CCT

GCT

192

Gin

Cys

Pro

Glu

Val

His

Pro

Leu

Pro Thr

Pro

Val

Leu

Leu

Pro

Ala

30

35

40

GTG

GAC

TTT

AGC

TTG

GGA

GAA

TGG

AAA ACC

CAG

ATG

GAG

GAG

ACC

AAG

240

Val

Asp

Phe

Ser

Leu

Gly

Glu

Trp

Lys thr

Gin

Met

Glu

Glu

Thr

Lys

45

50

55

GCA

CAG

GAC

ATT

CTG

GGA

GCA

GTG

ACC CTT

CTG

CTG

GAG

GGA

GTG

ATG

288

Ala

Gin

Asp

Ile

Leu

Gly

Ala

Val

Thr Leu

Leu

Leu

Glu

Gly

Val

Met

60

65

70

75

GCA

GCA

CGG

GGA

CAA

CTG

GGA

CCC

ACT TGC

CTC

TCA

TCC

CTC

CTG

GGG

336

Ala

Ala

Arg

Gly

Gin

Leu

Gly

Pro

Thr Cys

Leu

Ser

Ser

Leu

Leu

Gly

80

85

90

CAG

CTT

TCT

GGA

CAG

GTC

CGT

CTC

CTC CTT

GGG

GCC

CTG

CAG

AGC

CTC

384

Gin

Leu

Ser

Gly

Gin

Val

Arg

Leu

Leu Leu

Gly

Ala

Leu

Gin

Ser

Leu

95

100

105

CTT

GGA

ACC

CAG

CTT

CCT

CCA

CAG

GGC AGG

ACC

ACA

GCT

CAC

AAG

GAT

432

Leu

Gly

Thr

Gin

Leu

Pro

Pro

Gin

Gly Arg

Thr

Thr

Ala

His

Lys

Asp

110

115

120

CCC

AAT

GCC

ATC

TTC

CTG

AGC

TTC

CAA CAC

CTG

CTC

CGA

GGA

AAG

GTG

480

Pro

Asn

Ala

Ile

Phe

Leu

Ser

Phe

Gin His

Leu

Leu

Arg

Gly

Lys

Val

144

179 884

125 130 135

CGT TTC CTG ATG CTT GTA GGA GGG TCC ACC CTC TGC GTC AGG CGG GCC 528

Arg Phe Leu Met Leu Val Gly Gly Ser Thr Leu Cys Val Arg Arg Ala

140 145 150 155

CCA CCC ACC ACA GCT GTC CCC AGC TGA

Pro Pro Thr Thr Ala Val Pro Ser 160 (2) INFORMACJA DLA SEQ ID NR 14:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ; 1043 par zasadowych (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ŁAŃCUCHOWOŚĆ: podwójna (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: syntetyczny DNA (vi) ŹRÓDŁO POCHODZENIA: (A) ORGANIZM: Homo Sapiens (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NR 14:

CTAGAAAAAA CCAAGGAGGT AATAAATA ATG AAA AGT CCT GCA CCA CCT GCA 52

Met Lys Ser Pro Ala Pro Pro Ala

-2 1 5

TGT Cys

GAT Asp

TTA CGG Leu Arg 10

GTC Val

CTG Leu

TCT Ser

AAA CTG

CTG Leu

CGC Arg

GAC Asp

TCT Ser

CAC His 20

GTC Val

CTG Leu

100

Lys

Leu 15

CAC

TCT

CGT CTG

TCC

CAG

TGC

CCG

GAA

GTT

CAC

CCG

CTG

CCG

ACC

CCG

148

His

Ser

Arg Leu

Ser

Gin

Cys

Pro

Glu

Val

His

Pro

Leu

Pro

Thr

Pro

25

30

35

GTT

CTG

CTT CCG

GCT

GTC

CAC

TTC

TCC

CTG

GGT

GAA

TGG

AAA

ACC

CAG

196

Val

Leu

Leu Pro

Ala

Val

Asp

Phe

Ser

Leu

Gly

Glu

Trp

Lys

Thr

Gin

40

45

50

ATG

GAA

GAG ACC

AAA

GCT

CAG

GAC

ATC

CTG

GGT

GCA

GTA

ACT

CTG

CTT

244

Met

Glu

Glu Thr

Lys

Ala

Gin

Asp

Ile

Leu

Gly

Ala

Val

Thr

Leu

Leu

55

60

65

70

CTG

GAA

GGC CTT

ATG

CTG

GCA

CGT

GGC

CAG

CTT

GGC

CCG

ACC

TGC

CTG

292

Leu

Glu

Gly Val

Met

Ala

Ala

Arg

Gly

Gin

Leu

Gly

Pro

Thr

Cys

Leu

75

80

85

TCT

TCC

CTG CTT

GGC

CAG

CTG

TCT

GGC

CAG

GTT

CGT

CTG

CTG

CTC

GGC

340

Ser

Ser

Leu Leu

Gly

Gin

leu

Ser

Gly

Gin

Val

Arg

Leu

Leu

Leu

Gly

90

95

100

GCT

CTG

CAG TCT

CTG

CTT

GCC

ACC

CAG

CTG

CCG

CCA

CAG

GGC

CGT

ACC

388

Ala

Leu

Gin Ser

Leu

Leu

Gly

Thr

Gin

Leu

Pro

Pro

Gin

Gly

Arg

Thr

105

110

115

ACT

GCT

CAC AAG

GAT

CCG

AAC

GCT

ATC

TTC

CTG

TCT

TTC

CAG

CAG

CTG

436

Thr

Ala

His Lys

Asp

Pro

Asn

Ala

Ile

Phe

Leu

Ser

Phe

Gin

His

Leu

120

125

130

179 884

145

CTG CGT

GGC Gly

AAA GTT Lys Val

CGT Arg 140

TTC Phe

CTG ATG

CTG Leu

GTT Val 145

GGC Gly

GGT Gly

TCT Ser

ACC Thr

CTG Leu 150

484

Leu 135

Arg

Leu

Met

TGC

GTT

CGT

CGG GCG

CCG

CCA

ACC

ACT

GCT

GTT

CCG

TCT

CGT

ACC

TCT

532

Cys

Val

Arg

Arg Ala 155

Pro

Pro

Thr

Thr

Ala 160

Val

Pro

Ser

Arg

Thr 165

Ser

CTG

GTT

CTG

ACC CTG

AAC

GAG

CTC

CCG

AAC

CGT

ACC

AGC

GGC

CTG

CTG

580

Leu

Val

Leu

Thr Leu 170

Asn

Glu

Leu

Pro 175

Asn

Arg

Thr

Ser

Gly 180

Leu

Leu

GAA

ACC

AAC

TTT ACC

GCG

AGC

GCG

CGT

ACC

ACC

GGC

AGC

GGC

CTG

CTG

628

Glu

Thr

Asn 185

Phe Thr

Ala

Ser

Ala 190

Arg

thr

Thr

Gly

Ser 195

Gly

Leu

Leu

AAA

TGG

CAG

CAG GGC

TTT

CGT

GCG

AAA

ATC

CCG

GGC

CTG

CTG

AAC

CAG

676

Lys

Trp 200

Gin

Gin Gly

Phe

Arg 205

Ala

Lys

Ile

Pro

Gly 210

Leu

Leu

Asn

Gin

ACC

AGC

CGT

AGC CTG

GAT

CAG

ATC

CCG

GGC

TAT

CTG

AAC

CGT

ATC

CAT

724

Thr 215

Ser

Arg

Ser Leu

Asp 220

Gin

Ile

Pro

Gly

Tyr 225

Leu

Asn

Arg

Ile

His 230

GAA

CTG

CTG

AAC GGC

ACC

CGT

GGC

CTG

TTT

CCG

GGC

CCG

AGC

CGT

CGC

772

Glu

Leu

Leu

Asn Gly 235

Thr

Arg

Gly

Leu

Phe 240

Pro

Gly

Pro

Ser

Arg 245

Arg

ACC

CTG

GGC

GCG CCG

GAT

ATC

AGC

TCT

GGC

ACC

AGC

GAT

ACC

GGC

AGC

820

Thr

Leu

Gly

Ala Pro 250

Asp

Ile

Ser 255

Ser

Gly

Thr

Ser

Asp

Thr 260

Gly

SEr

CTG

CCG

CCG

AAC CTG

CAG

CCG

GGC

TAT

AGC

CCG

AGC

CCG

ACC

CAT

CCG

868

Leu

Pro

Pro 265

Asn Leu

Gin

Pro

Gly 270

Tyr

Ser

Pro

Ser

Pro 275

Thr

His

Pro

CCG

ACC

GGC

CAG TAT

ACC

CTG

TTT

CCG

CTG

CCG

CCG

ACC

CTG

CCG

ACC

916

Pro

Thr 280

Gly

Gin Tyr

Thr 285

Leu

Phe

Pro

Leu

Pro

Pro Thr 290

Leu

Pro

Thr

CCG

GTG

GTT

CAG CTG

CAT

CCG

CTG

CTG

CCG

GAT

CCG

AGC

GCG

CCG

ACC

964

Pro 295

Val

Val

Gin Leu

His 300

Pro

Leu

Leu

Pro

Asp 305

Pro

Ser

Ala

Pro

Thr

CCG

ACC

CCG

ACC AGC

CCG

CTG

CTG

AAC

ACC

AGC

TAT

ACC

CAT

AGC

CAG

1012

Pro AAC Asn

Thr CTG Leu

Pro AGC Ser

Thr Ser 315 CAG GAA Gin Glu

Pro GGC Gly

Leu Leu Asn TAATGAAGCT 1

Thr 320 ?GA

Ser

Tyr

Thr

His

Ser

Gin

1043

330 (2) INFORMACJA DLA SEQ ID NR 15:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 45 par zasadowycy (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ŁAŃCUCHOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy

146

179 884 (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NR 15:

AACTGGAAGA ATTCGCGGCC GCAGGAATTT TTTTTTTTTT TTTTT 45 (2) INFORMACJA DLA SEQ ID NR 16:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 13 par zasadowych (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ŁAŃCUCHOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NR 16

AATTCGGCAC GAG 13 (2) INFORMACJA DLA SEQ ID NR 17:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 9 par zasadowych (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ŁAŃCUCHOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NR 17:

CTCGTGCCG (2) INFORMACJA DLA SEQ ID NR 18:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 12 aminokwasów (B) TYP: aminokwas (C) ŁAŃCUCHOWOŚĆ:

(D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: peptyd (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NR 18:

Ile Pro Val Pro Pro Ala Cys Asp Pro Arg Leu Leu

10 (2) INFORMACJA DLA SEQ ID NR 19:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 12 aminokwasów (B) TYP: aminokwas (C) ŁAŃCUCHOWOŚĆ:

(D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: peptyd (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NR 19:

Thr Pro Val Pro Pro Ala Cys Asp Pro Arg Leu Leu

10

179 884

147 (2) INFORMACJA DLA SEQ ID NR 20:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 12 aminokwasów (B) TYP: aminokwas (C) ŁAŃCUCHOWOŚĆ:

(D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: peptyd (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NR 20:

Ser Pro Val Pro Pro Ala Cys Asp Pro Arg Leu Leu

10 (2) INFORMACJA DLA SEQ ID NR 21:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 17 par zasadowych (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ŁAŃCUCHOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy (ix) CECHY:

(A) NAZWA/KLUCZ: modyfikowana zasada (B) LOKALIZACJA: 12 & 15 (D) INNE INFORMACJE: mod_base= i (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NR 21:

ACGCTGGGGG CNGANGA 17 (2) INFORMACJA DLA SEQ ID NR 22:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 17 par zasadowych (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ŁAŃCUCHOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy (ix) CECHY:

(A) NAZWA/KLUCZ: modyfikowana zasada (B) LOKALIZACJA: 12 & 15 (D) INNE INFORMACJE: mod_base= i (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NR 22:

ACACTAGGAT CNAANAA 17 (2) INFORMACJA DLA SEQ ID NR 23:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 17 par zasadowych (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ŁAŃCUCHOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa

148

179 884 (ii) TYP CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy (ix) CECHY:

(A) NAZWA/KLUCZ: modyfikowana zasada (B) LOKALIZACJA: 12 & 15 (D) INNE INFORMACJE: mod_base= i (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NR 23:

ACGCTGGGTG CNGANGA 17 (2) INFORMACJA DLA SEQ ID NR 24:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 17 par zasadowych (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ŁAŃCUCHOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy (ix) CECHY:

(A) NAZWA/KLUCZ: modyfikowana zasada (B) LOKALIZACJA: 12 & 15 (D) INNE INFORMACJE: mod_base= i (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NR 24:

ACGCTGGGCG CNGANGA 17 (2) INFORMACJA DLA SEQ ID NR 25:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 17 par zasadowych (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ŁAŃCUCHOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NR 25:

GGGGGGCGGA CGCTGGG (2) INFORMACJA DLA SEQ ID NR 26:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 17 par zasadowych (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ŁAŃCUCHOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NR 26:

GGAGGACGAA CACTAGG 17 (2) INFORMACJA DLA SEQ ID NR 27:

179 884

149 (i) CHARAKTERYSTYKA SEWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 17 par zasadowych (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ŁAŃCUCHOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NR 27: GGTGGTCGTA CGCTGGG (2) INFORMACJA DLA SEQ ID NR 28:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 17 par zasadowych (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ŁAŃCUCHOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NR 28:

GGCGGCCGCA CGCTGGG 17 (2) INFORMACJA DLA SEQ ID NR 29:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 21 par zasadowych (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ŁAŃCUCHOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NR 29:

GGATCTTGGT TCATTCTCAA G 21 (2) INFORMACJA DLA SEQ ID NR 30:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 20 par zasadowych (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ŁAŃCUCHOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy (Xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NR 30: 20

CCTCAGACAG TGGTTCAAAG (2) INFORMACJA DLA SEQ ID NR 31:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 21 par zasadowych (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ŁAŃCUCHOWOŚĆ: pojedyncza

150

179 884 (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NR 31: CGAGGGTGTA CCTGGGTCCT G 21 (2) INFORMACJA DLA SEQ ID NR 32: (i) CHARAKTERYSTYKA SEWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 21 par zasadowych (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ŁAŃCUCHOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NR 32: CAGAGTTAGT CTTGCGGTGA G 21

2) INFORMACJA DLA SEQ ID NR 33:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 21 par zasadowych (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ŁAŃCUCHOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NR 33: CCTGTCCTGC TGCCTGCTGT G 21 (2) INFORMACJA DLA SEQ ID NR 34:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 21 par zasadowych (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ŁAŃCUCHOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NR 34: TGAAGTTCGT CTCCAACAAT C 21

2) INFORMACJA DLA SEQ ID NR 35:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 21 par zasadowych (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ŁAŃCUCHOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NR 35:

179 884

151

ATGGAGCTGA CTGATTTGCT C 21

2) INFORMACJA DLA SEQ ID NR 36:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEWENCJI:

	(A) (B) (C) (D)	DŁUGOŚĆ: 21 par zasadowych TYP: kwas nukleinowy ŁAŃCUCHOWOŚĆ: pojedyncza TOPOLOGIA: liniowa
(ii)	TYP	CZĄSTECZKI:	inny kwas nukleinowy
(xi)	OPIS	SEKWENCJI:	SEQ ID NR 36:
TGAAGTTCGT	CTCCAACAAT C

2) INFORMACJA DLA SEQ ID NR 37:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 21 par zasadowych (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ŁAŃCUCHOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NR 37: TTGTGACCTC CGAGTCCTCA G 21

2) INFORMACJA DLA SEQ ID NR 38:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 21 par zasadowych (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ŁAŃCUCHOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NR 38: TGACGCAGAG GGTGGACCCT C 21

2) INFORMACJA DLA SEQ ID NR 39:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 21 par zasadowych (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ŁAŃCUCHOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NR 39: AGCACGAACCT CTCTAGTCCT C 21

2) INFORMACJA DLA SEQ ID NR 40:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEWENCJI:

152

179 884 (A) DŁUGOŚĆ: 21 par zasadowych (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ŁAŃCUCHOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NR 40:

ACACTGAACG AGCTCCCAAA C 21 (2) INFORMACJA DLA SEQ ID NR 41:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI (A) DŁUGOŚĆ: 21 par zasadowych (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ŁAŃCUCHOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NR 41:

AACTACTGGC TCTGGGCTTC T 21 (2) INFORMACJA DLA SEQ ID NR 42:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI (A) DŁUGOŚĆ: 21 par zasadowych (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ŁAŃCUCHOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NR 42:

AGGGATTCAG AGCCAAGATT C 21 (2) INFORMACJA DLA SEQ ID NR 43:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI (A) DŁUGOŚĆ: 31 par zasadowych (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ŁAŃCUCHOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NR 43:

TAGCGGCCGC ψΤΤΤΤΤΤΤΤΤ TTTTTTTTGGG G (2) INFORMACJA DLA SEQ ID NR 44:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI (A) DŁUGOŚĆ: 31 par zasadowych (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ŁAŃCUCHOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa

179 884

153 (ii) TYP CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NR 44:

TAGCGGCCGC TTTTTTTTTT TTTTTTTAAA A 31 (2) INFORMACJA DLA SEQ ID NR 45:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI (A) DŁUGOŚĆ: 31 par zasadowych (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ŁAŃCUCHOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NR 45:

TAGCGGCCGC TTTTTTTTTTT TTTTTTTCTT T 31 (2) INFORMACJA DLA SEQ ID NR 46:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI (A) DŁUGOŚĆ: 31 par zasadowych (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ŁAŃCUCHOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NR 46:

TAGCGGCCGC TTTTTTTTTT TTTTTTTGCC C 31 (2) INFORMACJA DLA SEQ ID NR 47:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI (A) DŁUGOŚĆ: 21 par zasadowych (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ŁAŃCUCHOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NR 47:

TAGCGGCCGC TTTTTTTTTT T 21 (2) INFORMACJA DLA SEQ ID NR 48:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI (A) DŁUGOŚĆ: 21 par zasadowych (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ŁAŃCUCHOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NR 48:

TTGTGACCTC CGAGTCCTCA G

154

179 884 (2) INFORMACJA DLA SEQ ID NR 49:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI (A) DŁUGOŚĆ: 21 par zasadowych (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ŁAŃCUCHOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NR 49:

AGGATGGGTT GGGAAGGAG A 21 (2) INFORMACJA DLA SEQ ID NR 50:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI (A) DŁUGOŚĆ: 21 par zasadowych (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ŁAŃCUCHOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NR 50:

TTGTGACCTC CGAGTCCTCA G 21 (2) INFORMACJA DLA SEQ ID NR 51:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI (A) DŁUGOŚĆ: 21 par zasadowych (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ŁAŃCUCHOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NR 51: AGGGAAGAGC GTATACTGTC C 21 (2) INFORMACJA DLA SEQ ID NR 52:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI (A) DŁUGOŚĆ: 21 par zasadowych (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ŁAŃCUCHOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NR 52:

GGCCAGCCAG ACACCCCGGC C 21 (2) INFORMACJA DLA SEQ ID NR 53:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI (A) DŁUGOŚĆ: 21 par zasadowych

179 884

155 (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ŁAŃCUCHOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NR 53:

ATGGGAGTCA CGAAGCAGTT T 21 (2) INFORMACJA DLA SEQ ID NR 54:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI (A) DŁUGOŚĆ: 21 par zasadowych (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ŁAŃCUCHOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NR 54:

TGCGTTTCCT GATGCTTGTA G (2) INFORMACJA DLA SEQ ID NR 55:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI (A) DŁUGOŚĆ: 21 par zasadowych (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ŁAŃCUCHOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NR 55:

AACCTTACCC TTCCTGAGAC A 21 (2) INFORMACJA DLA SEQ ID NR 56:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI (A) DŁUGOŚĆ: 30 par zasadowych (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ŁAŃCUCHOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NR 56:

TTTGAATTCG GCCAGCCAGA CACCCCGGCC 30 (2) INFORMACJA DLA SEQ ID NR 57:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI (A) DŁUGOŚĆ: 39 par zasadowych (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ŁAŃCUCHOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy

156

179 884 (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NR 57:

TTTGCGGCCG CTCATTAGCT GGGGACAGCT GTGGTGGGT 39 (2) INFORMACJA DLA SEQ ID NR 58:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI (A) DŁUGOŚĆ: 42 pary zasadowe (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ŁAŃCUCHOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NR 58:

TTTGCGGCCG CTCATTACAG TGTGAGGACT AGAGAGGTTC TG 42 (2) INFORMACJA DLA SEQ ID NR 59:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI (A) DŁUGOŚĆ: 42 pary zasadowe (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ŁAŃCUCHOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NR 59:

TTTGCGGCCG CTCATTATCT GGCTGAGGCA GTGAAGTTT G TC 42 (2) INFORMACJA DLA SEQ ID NR 60:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI (A) DŁUGOŚĆ: 42 pary zasadowe (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ŁAŃCUCHOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NR 60:

TTTGCGGCCG CTCATTACAG ACCAGGAATC TTGGCTCTGAA T 42 (2) INFORMACJA DLA SEQ ID NR 61:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI (A) DŁUGOŚĆ: 30 par zasadowych (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ŁAŃCUCHOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NR 61:

tttgAattcg GCCAGCCAGA CACCCCGGCC 30

179 884 157 (2) INFORMACJA DLA SEQ ID NR 62:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI (A) DŁUGOŚĆ: 41 par zasadowych (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ŁAŃCUCHOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NR 62:

TTTGCGGCCG CTCATTAGAG GGTGGACCCT CCTACAAGCA T 41 (2) INFORMACJA DLA SEQ ID NR 63:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI (A) DŁUGOŚĆ: 40 par zasadowych (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ŁAŃCUCHOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NR 63:

TTTGCGGCCG CTCATTAGCA GAGGGTGGAC CCTCCTACAA 40 (2) INFORMACJA DLA SEQ ID NR 64:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI (A) DŁUGOŚĆ: 38 par zasadowych (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ŁAŃCUCHOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NR 64:

TTTGCGGCCG CTCATTACCT GACGCAGAGG GTGGACCC 38 (2) INFORMACJA DLA SEQ ID NR 65:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI (A) DŁUGOŚĆ: 38 par zasadowych (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ŁAŃCUCHOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NR 65:

TTTGCGGCCG CTCATTACCG CCTGACGCAG AGGGTGGA 38 (2) INFORMACJA DLA SEQ ID NR 66:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI (A) DŁUGOŚĆ: 38 par zasadowych (B) TYP: kwas nukleinowy

158

179 884 (C) ŁAŃCUCHOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NR 66:

TTTGCGGCCG CTCATTAGGC CCGCCTGACG CAGAGGGT 38 (2) INFORMACJA DLA SEQ ID NR 67:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI (A) DŁUGOŚĆ: 38 par zasadowych (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ŁAŃCUCHOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NR 67:

TTTGCGGCCG CTCATTATGG GGCCCGCCTG ACGCAGAG 38 (2) INFORMACJA DLA SEQ ID NR 68:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI (A) DŁUGOŚĆ: 38 par zasadowych (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ŁAŃCUCHOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NR 68: TTTGCGGCCG CTCATTAGGG TGGGGCCCGC CTGACGCA 38 (2) INFORMACJA DLA SEQ ID NR 69:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI (A) DŁUGOŚĆ: 30 par zasadowych (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ŁAŃCUCHOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NR 69:

TTTGAATTCG GCCAGCCAGA CACCCCGGCC 30 (2) INFORMACJA DLA SEQ ID NR 70:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI (A) DŁUGOŚĆ: 41 par zasadowych (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ŁAŃCUCHOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy

179 884

159 (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NR 70:

TTTGCGGCCG CTCATTATTC GTGTATCCTG TTCAGGTATC C 41 (2) INFORMACJA DLA SEQ ID NR 71:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI (A) DŁUGOŚĆ: 39 par zasadowych (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ŁAŃCUCHOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NR 71:

TTTGCGGGCCG CTCATTAGCT GGGGACAGCT GTGGTGGGT 39 (2) INFORMACJA DLA SEQ ID NR 72:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI (A) DŁUGOŚĆ: 50 par zasadowych (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ŁAŃCUCHOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NR 72: AGTAAACTGC TTCGTGACTC CCATGTCCTT CACAGCAGAC TGAGCCAGTG 50 (2) INFORMACJA DLA SEQ ID NR 73:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI (A) DŁUGOŚĆ: 49 par zasadowych (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ŁAŃCUCHOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NR 73: CATGGGAGTC ACGAAGCAGT TTACTGGACA GCGTTAGCCT TGCAGTTAG 49 (2) INFORMACJA DLA SEQ ID NR 74:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI (A) DŁUGOŚĆ: 49 par zasadowych (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ŁAŃCUCHOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NR 74:

TGTGACCTCC GAGTCCTCAG TAAACTGCTT CGTGACTCCC ATGTCCTTC 49 (2) INFORMACJA DLA SEQ ID Ńk 75:

160

179 884 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI (A) DŁUGOŚĆ: 48 par zasadowych (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ŁAŃCUCHOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NR 75:

TTTACTRGAGG ACTCGGAGGT CACAGGACAG CGTTAGCCTT GCAGTTAG 48 (2) INFORMACJA DLA SEQ ID NR 76:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI (A) DŁUGOŚĆ: 49 par zasadowych (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ŁAŃCUCHOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NR 76:

GACCTCCGAG TCCTCAGTAA ACTGCTTCGT GACTCCCATG TCCTTCACA 49 (2) INFORMACJA DLA SEQ ID NR 77:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI (A) DŁUGOŚĆ: 48 par zasadowych (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ŁAŃCUCHOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NR 77:

CAGTTTACTG AGGACTCGGA GGTCGGACAG CGTTAGCCTT GCAGTTAG 48 (2) INFORMACJA DLA SEQ ID NR 78:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI (A) DŁUGOŚĆ: 21 par zasadowych (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ŁAŃCUCHOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NR 78:

TTGTGACCTC CGAGTCCTCA G 21 (2) INFORMACJA DLA SEQ ID NR 79:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI (A) DŁUGOŚĆ: 21 par zasadowych (fe) TYP: kwas nukleinowy (C) ŁAŃCUCHOWOŚĆ: pojedyncza

179 884

161 (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NR 79:

CAGGTATCCG GGGATTTGGT C 21 (2) INFORMACJA DLA SEQ ID NR 80:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI (A) DŁUGOŚĆ: 21 par zasadowych (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ŁAŃCUCHOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NR 80:

TGCGTTTCCT GATGCTTGTA G 21 (2) INFORMACJA DLA SEQ ID NR 81:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI (A) DŁUGOŚĆ: 35 par zasadowych (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ŁAŃCUCHOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NR 81:

GAGAGAGCGG CCGCTTACCC TTCCTGAGAC AGATT 35 (2) INFORMACJA DLA SEQ ID NR 82:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI (A) DŁUGOŚĆ: 6 par zasadowych (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ŁAŃCUCHOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NR 82:

GAGAGA 6 (2) INFORMACJA DLA SEQ ID NR 83:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI (A) DŁUGOŚĆ: 70 par zasadowych (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ŁAŃCUCHOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liriiowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy (xi) OPIS SEKWENCJI: S&Q ID NR 83:

162

179 884

CTAGAAAAAA CCAAGGACCT AATAAATAAT GAGCCCGGCT CCGCCAGCTT GTGACCTTCG 60

TGTTCTGTCT 70 (2) INFORMACJA DLA SEQ ID NR 84:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI (A) DŁUGOŚĆ: 72 pary zasadowe (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ŁAŃCUCHOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NR 84:

CAGTTTAGAC AGAACACGAA GGTCACAAGC TGGCGGAGCC GGGCTCATTA TTTATTACCT 60

CCTTGGTTTT TT 72 (2) INFORMACJA DLA SEQ ID NR 85:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI (A) DŁUGOŚĆ: 69 par zasadowych (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ŁAŃCUCHOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NR 85:

AAACTGCTTC GCGACTCTCA CGTGCTGCAC TCTCGTCTGT CCCAGTGCCC GGAAGTTCAC 60

CCGCTGCCG 69 (2) INFORMACJA DLA SEQ ID NR 86:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI (A) DŁUGOŚĆ: 69 par zasadowych (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ŁAŃCUCHOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NR 86:

CGGGGTCGGC AGCCGGTGAA CTTCCGGGCA CTGGGACAGA CGAGAGTGCA GCACGTGAGA 60

GTCGCGAAG 69 (2) INFORMACJA DLA SEQ ID NR 87:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI (A) DŁUGOŚĆ: 69 par zasadowych (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ŁAŃCUCHOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa

179 884

163 (ii) TYP CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NR 87:

ACCCCGGTTC TGCTTCCGGC TGTCGACTTC TCCCTGGGTG AATGGAAAAC CCAGATGGAA 60

GAGACCAAA 69 (2) INFORMACJA DLA SEQ ID NR 88:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI (A) DŁUGOŚĆ: 69 par zasadowych (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ŁAŃCUCHOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NR 88:

CTGAGCTTG GTCTCTTCCA TCTGGGTTTT CCATTCACCC AGGGAGAAGT CGACAGCCGG 60

AAGCAGAAC 69 (2) INFORMACJA DLA SEQ ID NR 89:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI (A) DŁUGOŚĆ: 69 par zasadowych (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ŁAŃCUCHOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NR 89:

GCTCAGGACA TCCTGGGTGC AGTAACTCTG CTTCTGGAAG GCGTTATGGC TGCACGTGGC 60

CAGCTTGGC 69 (2) INFORMACJA DLA SEQ ID NR 90:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI (A) DŁUGOŚĆ: 69 par zasadowych (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ŁAŃCUCHOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NR 90:

GCTCGGGCCA AGCTGGCCAC GTGCAGCCAT AACGCCTTCC AGAAGCAGAG TTACTGCACC 60

CAGGATGTC 69 (2) INFORMACJA DLA SEQ ID NR 91:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI (A) DŁUGOŚĆ: 69 par zasadowych (B) TYP: kwas nukleinowy

164

179 884 (C) ŁAŃCUCHOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NR 91:

CCGACCTGCC TGTCTTCCCT GCTTGGCCAG CTGTCTGGCC AGGTTCGTCT GCTGCTCGGC 60

GCTCTGCAG 69 (2) INFORMACJA DLA SEQ ID NR 92:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI (A) DŁUGOŚĆ: 21 par zasadowych (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ŁAŃCUCHOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NR 92:

CAGAGACTGC AGAGCGCCGA GCAGACGAAC CTGGCCAGAC AGCTGGCCAA GCAGGGAAGA 60

CAGGCA 66 (2) INFORMACJA DLA SEQ ID NR 93:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI (A) DŁUGOŚĆ: 70 par zasadowych (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ŁAŃCUCHOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NR 93:

TCTCTGCTTG GCACCCAGCT GCCGCCACAG GGCCGTACCA CTGCTCACAA GGATCCGAAC 60

GCTATCTTCC 70 (2) INFORMACJA DLA SEQ ID NR 94:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI (A) DŁUGOŚĆ: 70 par zasadowych (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ŁAŃCUCHOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NR 94:

AAGACAGGAA GATAGCGTTC GGATCCTTGT GAGCAGTGGT ACGGCCCTGT GGCGGCAGCT 60

GGGTGCCAAG 70 (2) INFORMACJA DLA SEQ ID NR 95:

179 884

165 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI (A) DŁUGOŚĆ: 21 par zasadowych (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ŁAŃCUCHOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NR 95:

GGAGGAGACC AAGGCACAGG A 21 (2) INFORMACJA DLA SEQ ID NR 96:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI (A) DŁUGOŚĆ: 30 par zasadowych (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ŁAŃCUCHOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NR 96:

CCGGAATTCT TACCCTTCCT GAGACAGATT 30 (2) INFORMACJA DLA SEQ ID NR 97:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI (A) DŁUGOŚĆ: 8 par zasadowych (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ŁAŃCUCHOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NR 97:

CTAATGAG 8 (2) INFORMACJA DLA SEQ ID NR 98:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI (A) DŁUGOŚĆ: 16 par zasadowych (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ŁAŃCUCHOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NR 98:

AATTCTCATT AGAGCT 16 (2) INFORMACJA DLA SEQ ID NR 99:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI

166

179 884 (A) DŁUGOŚĆ: 8 par zasadowych (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ŁAŃCUCHOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NR 99: CTAATGAG (2) INFORMACJA DLA SEQ ID NR 100:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI (A) DŁUGOŚĆ: 16 par zasadowych (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ŁAŃCUCHOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NR 100:

AATTCTCATT AGAGCT 16 (2) INFORMACJA DLA SEQ ID NR 101:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI (A) DŁUGOŚĆ: 25 par zasadowych (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ŁAŃCUCHOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NR 101: ATCGCCGGCT CCGCCAGCTT GTGAC 25 (2) INFORMACJA DLA SEQ ID NR 102:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI (A) DŁUGOŚĆ: 30 par zasadowych (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ŁAŃCUCHOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NR 40: GCCGAATTCT CATTAGCAGCT CGTTCAGTGT 30 (2) INFORMACJA DLA SEQ ID NR 103:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI (A) DŁUGOŚĆ: 42 pary zasadowe (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ŁAŃCUCHOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa

179 884

167 (ii) TYP CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NR 103:

GATCCGAACG CTATCTTCCT GTCTTTCCAG CACCTGCTGC GT 42 (2) INFORMACJA DLA SEQ ID NR 104:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI (A) DŁUGOŚĆ: 44 pary zasadowe (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ŁAŃCUCHOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NR 104:

TTTGCCACGC AGCAGGTGCT GGAAAGACAG GAAGATAGCG TTCG 44 (2) INFORMACJA DLA SEQ ID NR 105:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI (A) DŁUGOŚĆ: 21 par zasadowych (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ŁAŃCUCHOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NR 105:

GGCAAAGTTC GTTTCCTGAT GCTGGTTGGC GGTTCTACCC TG 42 (2) INFORMACJA DLA SEQ ID NR 106:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI (A) DŁUGOŚĆ: 41 par zasadowych (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ŁAŃCUCHOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NR 106:

ACGCACAGGG TAGAACCGCC AACCAGCATC AGGAAACGAA C 41 (2) INFORMACJA DLA SEQ ID NR 107:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI (A) DŁUGOŚĆ: 46 par zasadowych (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ŁAŃCUCHOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NR 107:

TGCGTTCGTC GGGCGCCGCC AACCACTGCT GTTCCGTCTT AATGAA

168

179 884 (2) INFORMACJA DLA SEQ ID NR 108:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI (A) DŁUGOŚĆ: 45 par zasadowych (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ŁAŃCUCHOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NR 108:

AGCCTTTCATT AAGACGGAAC AGCAGTGGTT GGCGGCGCCC GACGA 45 (2) INFORMACJA DLA SEQ ID NR 109:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI (A) DŁUGOŚĆ: 24 pary zasadowe (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ŁAŃCUCHOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NR 109:

AAGGATCCGA ACGCTATCTT CCTG 24 (2) INFORMACJA DLA SEQ ID NR 110:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI (A) DŁUGOŚĆ: 24 pary zasadowe (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ŁAŃCUCHOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NR 110:

AGAAGCTTTC ATTAAGACGG AACA 24 (2) INFORMACJA DLA SEQ ID NR 111:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI (A) DŁUGOŚĆ: 46 par zasadowych (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ŁAŃCUCHOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NR 111:

CTAGAAAAAA CCAAGGAGGT AATAAATAAT GAAAGCACCT GTACCA 46 (2) INFORMACJA DLA SEQ ID NR 112:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI

179 884

169 (A) DŁUGOŚĆ: 46 par zasadowych (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ŁAŃCUCHOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NR 112:

CAGGTGGTAC AGGTGCTTTC ATTATTTATT ACCTCCTGG TTTTT 46 (2) INFORMACJA DLA SEQ ID NR 113:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI (A) DŁUGOŚĆ: 38 par zasadowych (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ŁAŃCUCHOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NR 113:

CCTGCATGTG ATTTACGGGT CCTGTCTAAA CTGCTGCG 38 (2) INFORMACJA DLA SEQ ID NR 114:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI (A) DŁUGOŚĆ: 34 pary zasadowe (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ŁAŃCUCHOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NR 114:

CGCAGCAGTT TAGACAGGAC CCGTAAATCA CATG 34 (2) INFORMACJA DLA SEQ ID NR 115:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI (A) DŁUGOŚĆ: 84 pary zasadowe (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ŁAŃCUCHOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NR 115:

CTAGAAAAA CCAAGGAGGT AATAAATAAT GAAAGCACCT GTACCACCTG CATGTGATTT 60

ACGGGTCCTG TCTAAACTGC TGCG 84 (2) INFORMACJA DLA SEQ ID NR 116:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI (A) DŁUGOŚĆ: 20 aminokwasów (B) TYP: aminokwas

170

179 884 (C) ŁAŃCUCHOWOŚĆ:

(D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: peptyd (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NR 116:

Pro Arg Leu Leu Asn Lys Leu Leu Arg Asp Ser Tyr Leu Leu His Arg 15 10 15

Arg Leu Ser Gin 20 (2) INFORMACJA DLA SEQ ID NR 117:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI (A) DŁUGOŚĆ: 21 aminowasów (B) TYP: aminokwas (C) ŁAŃCUCHOWOŚĆ:

(D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: peptyd (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NR 117:

Phe Ser Leu Gly Glu Trp Lys Thr Gin Thr Glu Gin Ser Lys Ala Gin 15 10 15

Asp Ile Leu Gly Ala (2) INFORMACJA DLA SEQ ID NR 118:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI (A) DŁUGOŚĆ: 18 aminowasów (B) TYP: aminokwas (C) ŁAŃCUCHOWOŚĆ: (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: peptyd (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NR 118:

Ser Arg Thr Ser Gin Leu Leu Thr Asn Lys Phe Pro Asn Arg Leu 1 5 10 15

Leu Asp (2) INFORMACJA DLA SEQ ID NR 119:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI (A) DŁUGOŚĆ: 21 aminowasów (B) TYP: aminokwas (C) ŁAŃCUCHOWOŚĆ: (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: peptyd (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NR 119:

179 884

171

Asp Leu Arg Val Leu Ser Lys Leu Leu Arg Asp Ser His Val Leu His 15 10 15

Ser Arg Leu Ser Gin 20 (2) INFORMACJA DLA SEQ ID NR 120:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI (A) DŁUGOŚĆ: 16 aminowasów (B) TYP: aminokwas (C) ŁAŃCUCHOWOŚĆ:

(D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: peptyd (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NR 120:

Ser Leu Gly Glu Trp Lys Thr Gin Met Glu Glu Thr Lys Ala Gin Asp 15 10 15 (2) INFORMACJA DLA SEQ ID NR 121:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI (A) DŁUGOŚĆ: 19 aminowasów (B) TYP: aminokwas (C) ŁAŃCUCHOWOŚĆ:

(D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: peptyd (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NR 121:

Leu Gly Thr Gin Leu Pro Pro Gin Gly Arg Thr Thr Ala His Lys Asp 15 10 15

Pro Asn Ala (2) INFORMACJA DLA SEQ ID NR 122:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI (A) DŁUGOŚĆ: 19 aminowasów (B) TYP: aminokwas (C) ŁAŃCUCHOWOŚĆ:

(D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: peptyd (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NR 122:

Asn Gly Leu Pro Asn Arg Thr Ser Gly Leu Leu Glu Thr Asn Phe Thr 15 10 15

Ala Ser Ala (2) INFORMACJA DLA SEQ ID NR 123:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI (A) DŁUGOŚĆ: 23 aminowasów (B) TYP: aminokwas

172

179 884 (C) ŁAŃCUCHOWOŚĆ:

(D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: peptyd (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NR 123:

Ser Leu Pro Pro Asn Leu Gin Pro Gly Tyr Ser Pro Ser Thr His 15 10 15

Pro Pro Thr Gly Gin Tyr Thr 20 (2) INFORMACJA DLA SEQ ID NR 124:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI (A) DŁUGOŚĆ: 27 aminowasów (B) TYP: aminokwas (C) ŁAŃCUCHOWOŚĆ:

(D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: peptyd (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NR 124:

Pro Ser Ala Pro Thr Pro Thr Pro Thr Ser Pro Leu Leu Asn Thr Ser 15 10 15

Tyr Thr His Ser Gin Asn Leu Ser Gin Glu Gly 20 25 (2) INFORMACJA DLA SEQ ID NR 125:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI (A) DŁUGOŚĆ: 46 par zasadowych (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ŁAŃCUCHOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NR 125:

CTAGAAAAAA CCAAGGAGGT AATAAATAAT GAAATCTCCT GCACCA 46 (2) INFORMACJA DLA SEQ ID NR 126:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI (A) DŁUGOŚĆ: 46 par zasadowych (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ŁAŃCUCHOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NR 126:

CAGGTGGTGC AGGAGATTTC ATTATTTATT ACCTCCTTGG TTTTTT (2) INFORMACJA DLA SEQ ID NR 127:

179 884

173 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI (A) DŁUGOŚĆ: 38 par zasadowych (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ŁAŃCUCHOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NR 127:

CCTGCATGTG ATTTACGGGT CCTGTCTAAA CTGCTGCG 38 (2) INFORMACJA DLA SEQ ID NR 128:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI (A) DŁUGOŚĆ: 34 pary zasadowe (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ŁAŃCUCHOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NR 128:

CGCAGCAGTT TAGACAGGAC CCGTAAATCA CATG 34 (2) INFORMACJA DLA SEQ ID NR 129:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI (A) DŁUGOŚĆ: 84 pary zasadowe (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ŁAŃCUCHOWOŚĆ: podwójna (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NR 129: CTAGAAAAAA CCAAGGAGGT AATAAATAAT GAAATCTCCT GCACCACCTG CATG^GATTT 60 ACGGGTCCTG TCTAAACTGC TGCG 84 (2) INFORMACJA DLA SEQ ID NR 130:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI (A) DŁUGOŚĆ: 47 par zasadowych (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ŁAŃCUCHOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NR 127:

CTCCCGAACC GTACCAGCGG CCTGCTGGAA ACCAACTTTA CCGCGAG 47 (2) INFORMACJA DLA SEQ ID NR 131:

174

179 884 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI (A) DŁUGOŚĆ: 47 par zasadowych (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ŁAŃCUCHOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NR 131:

GGTAAAGTTG GTTTCCAGCA GGCCGCTGGT ACGGTTCGGG AGCTCGT 47 (2) INFORMACJA DLA SEQ ID NR 132:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI (A) DŁUGOŚĆ: 49 par zasadowych (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ŁAŃCUCHOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NR 132: CGCGCGTACC ACCGGCAGCG GCCTGCTGAA ATGGCAGCAG GGCTTTCGT 4 9 (2) INFORMACJA DLA SEQ ID NR 133:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI (A) DŁUGOŚĆ: 49 par zasadowych (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ŁAŃCUCHOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NR 133: AGCCCTGCTG CCATTTCAGC AGGCCGCTGC CGGTGGTACG CGCGCTCGC 49 (2) INFORMACJA DLA SEQ ID NR 134:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI (A) DŁUGOŚĆ: 50 par zasadowych (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ŁAŃCUCHOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NR 134: GCGAAAATCC CGGGCCTGCT GAACCAGACC AGCCGTAGCC TGGATCAGAT 50 (2) INFORMACJA DLA SEQ ID NR 135:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI (A) DŁUGOŚĆ: 50 par zasadowych (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ŁAŃCUCHOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa

179 884

175 (ii) TYP CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NR 135:

ATCCAGGCTA CGGCTGGTCT GGTTCAGGAG GCCCGGGATT TTCGCACGAA 50 (2) INFORMACJA DLA SEQ ID NR 136:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI (A) DŁUGOŚĆ: 47 par zasadowych (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ŁAŃCUCHOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NR 136:

CCCGGGCTAT CTGAACCGTA TCCATGAACT GCTGAACGGC ACCCGTG 47 (2) INFORMACJA DLA SEQ ID NR 137:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI (A) DŁUGOŚĆ: 47 par zasadowych (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ŁAŃCUCHOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NR 137:

GTGCCGTTCA GCAGTTCATG GATACGGTTC AGATAGCCCG GGATCTG 47 (2) INFORMACJA DLA SEQ ID NR 138:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI (A) DŁUGOŚĆ: 49 par zasadowych (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ŁAŃCUCHOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NR 138:

GCCTGTTTCC GGGCCCGAGC CGTCGCACCC TGGGCGCGCC GGATATCAG 49 (2) INFORMACJA DLA SEQ ID NR 139:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI (A) DŁUGOŚĆ: 49 par zasadowych (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ŁAŃCUCHOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NR 139:

176

179 884

ATCCGGCGCG CCCAGGGTGC GACGGCTCGG GCCCGGAAAC AGGCCACGG 49 (2) INFORMACJA DLA SEQ ID NR 140:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI (A) DŁUGOŚĆ: 50 par zasadowych (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ŁAŃCUCHOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NR 140:

ATCAGCTCTG GCACCAGCGA TACCGGCAGC CTGCCGCCGA ACCTGCAGCC 50 (2) INFORMACJA DLA SEQ ID NR 141:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI (A) DŁUGOŚĆ: 50 par zasadowych (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ŁAŃCUCHOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NR 141:

CAGGTTCGGC GGCAGGCTGC CGGTATCGCT GGTGCCAGAG CTGATATCCG 50 (2) INFORMACJA DLA SEQ ID NR 142:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI (A) DŁUGOŚĆ: 51 par zasadowych (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ŁAŃCUCHOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NR 142:

GGGCTATAGC CCGAGCCCGA CCCATCCGCC GACCGGCCAG TATACCCTGT T 51 (2) INFORMACJA DLA SEQ ID NR 143:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI (A) DŁUGOŚĆ: 51 par zasadowych (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ŁAŃCUCHOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NR 143:

GGTATACTGG CCGGTCGGCG GATGGGTCGG GCTCGGGCTA TAGCCCGGCT G 51 (2) INFORMACJA DLA SEQ ID NR 144:

179 884

177 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI (A) DŁUGOŚĆ: 50 par zasadowych (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ŁAŃCUCHOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NR 144:

TCCGCTGCCG CCGACCCTGC CGACCCCGGT GGTTCAGCTG CATCCGCTGC 50 (2) INFORMACJA DLA SEQ ID NR 145:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI (A) DŁUGOŚĆ: 50 par zasadowych (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ŁAŃCUCHOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NR 145:

GGATGCAGCT GAACCACCGG GGTCGGCAGG GTCGGCGGCA GCGGAAACAG 50 (2) INFORMACJA DLA SEQ ID NR 146:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI (A) DŁUGOŚĆ: 51 par zasadowych (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ŁAŃCUCHOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NR 146:

TGCCGGATCC GAGCGCGCCG ACCCCGACCC CGACCAGCCC GCTGCTGAAC A 51 (2) INFORMACJA DLA SEQ ID NR 147:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI (A) DŁUGOŚĆ: 51 par zasadowych (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ŁAŃCUCHOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NR 147:

AGCAGCGGGC TGGTCGGGGT CGGGGTCGGC GCGCTCGGAT CCGGCAGCAG C 51 (2) INFORMACJA DLA SEQ ID NR 148:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI (A) DŁUGOŚĆ: 51 par zasadowych (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ŁAŃCUCHOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa

178

179 884 (ii) TYP CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NR 148: CCAGCTATAC CCATAGCCAG AACCTGAGCC AGGAAGGCTA ATGAAGCTTG A 51 (2) INFORMACJA DLA SEQ ID NR 149:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI (A) DŁUGOŚĆ: 51 par zasadowych (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ŁAŃCUCHOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NR 149:

CTTCATTAGC CTTCCTGGCT CAGGTTCTGG CTATGGGTAT AGCTGGTGTT C 51 (2) INFORMACJA DLA SEQ ID NR 150:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI (A) DŁUGOŚĆ: 21 par zasadowych (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ŁAŃCUCHOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NR 150: ACGAGCTCCC GAACCGTACC A 21 (2) INFORMACJA DLA SEQ ID NR 151:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI (A) DŁUGOŚĆ: 21 par zasadowych (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ŁAŃCUCHOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NR 151: CTGATATCCG GCGCGCCCAG G 21 (2) INFORMACJA DLA SEQ ID NR 152:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI (A) DŁUGOŚĆ: 21 par zasadowych (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ŁAŃCUCHOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NR 152:

179 884

179

CCGATATCAG CTCTGGCACC A 21 (2) INFORMACJA DLA SEQ ID NR 153:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI (A) DŁUGOŚĆ: 21 par zasadowych (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ŁAŃCUCHOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NR 153:

TCAAGCTTCA TTAGCCTTCC T 21 (2) INFORMACJA DLA SEQ ID NR 154:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI (A) DŁUGOŚĆ: 490 par zasadowych (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ŁAŃCUCHOWOŚĆ: podwójna (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NR 154:

CTC Leu 1

CCG Pro

AAC Asn

CGT Arg

ACC Thr 5

AGC Ser

GGC Gly

CTG Leu

CTG Leu

GAA Glu 10

ACC Thr

AAC Asn

TTT Phe

ACC Thr

GCG Ala 15

AGC Ser

48

GCG Ala

CGT Arg

ACC Thr

ACC Thr 20

GGC Gly

AGC Ser

GGC Gly

CTG Leu

CTG Leu 25

AAA Lys

TGG Trp

CAG Gin

CAG Gin

GGC Gly

TTT Phe

CGT Arg

96

GCG Ala

AAA Lys

ATC Ile 35

CCG Pro

GGC Gly

CTG Leu

CTG Leu

AAC Asn 40

CAG Gin

ACC Thr

AGC Ser

CGT Arg

AGC Ser 45

CTG Leu

GAT Asp

CAG Gin

144

ATC Ile

CCG Pro 50

GGC Gly

TAT Tyr

CTG Leu

AAC Asn

CGT Arg 55

ATC Ile

CAT His

GAA Glu

CTG Leu

CTG Leu 60

AAC Asn

GGC Gly

ACC Thr

CGT Arg

192

GGC Gly 65

CTG Leu

TTT Phe

CCG Pro

GGC Gly

CCG Pro 70

AGC Ser

CGT Arg

CGC Arg

ACC Thr

CTG Leu 75

GGC Gly

GCG Ala

CCG Pro

GAT Asp

ATC Ile 80

240

AGC Ser

TCT Ser

GGC Gly

ACC Thr

AGC Ser 85

GAT Asp

ACC Thr

GGC Gly

AGC Ser

CTG Leu 90

CCG Pro

CCG Pro

AAC Asn

CTG Leu

CAG Gin 95

CCG Pro

288

GGC Gly

TAT Tyr

AGC Ser

CCG Pro 100

AGC Ser

CCG Pro

ACC Thr

CAT His

CCG Pro 105

CCG Pro

ACC Thr

GGC Gly

CAG Gin

TAT Tyr 110

ACC Thr

CTG Leu

336

TTT Phe

CCG Pro

CTG Leu 115

CCG Pro

CCG Pro

ACC Thr

CTG Leu

CCG Pro 120

ACC Thr

CCG Pro

GTG Val

GTT Val

CAG Gin 125

CTG Leu

CAT His

CCG Pro

384

CTG

CTG

CCG

GAT

CCG

AGC

GCG

CCG

ACC

CCG

ACC

CCG

ACC

AGC

CCG

CTG

432

180

179 884

Leu

Leu 130

Pro

Asp

Pro

Ser

Ala 135

Pro

Thr

Pro

Thr

Pro 140

Thr

Ser

Pro

Leu

CTG

AAC

ACC

AGC

TAT

ACC

CAT

AGC

CAG

AAC

CTG

AGC

CAG

GAA

GGC

TAA 480

Leu

Asn

Thr

Ser

Tyr

Thr

His

Ser

Gin

Asn

Leu

Ser

Gin

Glu

Gly

145

145

150

TGAAGCTTGA 490 (2) INFORMACJA DLA SEQ ID NR 155:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI (A) DŁUGOŚĆ: 24 pary zasadowe (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ŁAŃCUCHOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NR 155:

AAGGATCCGA ACGCTATCTT CCTG 24 (2) INFORMACJA DLA SEQ ID NR 156:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI (A) DŁUGOŚĆ: 56 par zasadowych (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ŁAŃCUCHOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NR 156:

GGGAGCTCGT TCAGGGTCAG AACCAGAGAG GTACGAGACG GAACAGCAGT GGTTGG 56 (2) INFORMACJA DLA SEQ ID NR 156:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI (A) DŁUGOŚĆ: 56 par zasadowych (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ŁAŃCUCHOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NR 156:

GGGAGCTCGT TCAGGGTCAG AACCAGAGAG GTACGAGACG GAACAGCAGT GGTTGG 56 (2) INFORMACJA DLA SEQ ID NR 157:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI (A) DŁUGOŚĆ: 157 par zasadowych (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ŁAŃCUCHOWOŚĆ: podwójna (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy

179 884

181

	(xi)	OPIS SEKWENCJI: SEQ ID	NR	157:
G GAT	CCG	AAC GCT ATC TTC CTG TCT	TTC	CAG	CAG	CTG	CTG	CTG	GGC	46
Asp	Pro	Asn Ala Ile Phe Leu Ser	Phe	Gin	His	Leu	Leu	Arg	Gly
1		5		10					15

AAA Lys

GTT Val

CGT Arg

TTC Phe

CTG Leu 20

ATG Met

CTG Leu

GTT Val

GGC Gly

GGT TCT

ACC Thr

CTG Leu

TGC Cys

GTT Val 30

CGT Arg

94

Gly 25

Ser

CGG

GCG

CCG

CCA

ACC

ACT

GCT

GTT

CCG

TCT

CGT

ACC

TCT

CTG

GTT

CTG

142

Arg

Ala

Pro

Pro

Thr

Thr

Ala

Val

Pro

Ser

Arg

Thr

Ser

Leu

Val

Leu

35

40

45

ACC CTG AAC GAC CTC

Thr Leu Asn Glu Leu 157

2) INFORMACJA DLA SEQ ID NR 158:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI (A) DŁUGOŚĆ: 100 par zasadowych (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ŁAŃCUCHOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NR 158:

CCTCGAGGAA TTCCTGCAGC CCGGGACTAG TATCGGCTAC CCCTACGACG TCCCCGACTA 60

CGCCGGCGTC CATCACCATC ACCATCACTG AGCGGCCGCC 100

2) INFORMACJA DLA SEQ ID NR 159:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI (A) DŁUGOŚĆ: 108 par zasadowych (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ŁAŃCUCHOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NR 159:

AATTGGCGGC CGCTCAGTGA TGGTGATGGT GATGAGCGCC GGCGTAGTCG GGGACGTCGT 60

AGGGGTAGCC GATACTAGTC CCGGGCTGCA GGAATTCCTC GAGGGTAC 108

2) INFORMACJA DLA SEQ ID NR 160:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI (A) DŁUGOŚĆ: 70 par zasadowych (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ŁAŃCUCHOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NR 160:

182

179 884

AATTCCAAGA TCTCACACTT GCTTTTGACA CAACTGTGTT TACTTGCAAT CCCCCAAAAC 60

AGACAGACCC 70

2) INFORMACJA DLA SEQ ID NR 161: (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI (A) DŁUGOŚĆ: 66 par zasadowych (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ŁAŃCUCHOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NR 161: GGGTCTGTCT GTTTTGGGGG ATTGCAAGTA AACACAGTTG TGTCAAAAGC AAGTGTGAGA 60

TCTTGG 66

2) INFORMACJA DLA SEQ ID NR 162:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI (A) DŁUGOŚĆ: 29 par zasadowych (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ŁAŃCUCHOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NR 162:

GGCCCGGGAT GGAGCTGACT GAATTGCTC 29

2) INFORMACJA DLA SEQ ID NR 163:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI (A) DŁUGOŚĆ: 35 par zasadowych (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ŁAŃCUCHOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NR 163:

TCAAGCTTAC TAGTCCCTTC CTGAGACAGA TTCTG 35

2) INFORMACJA DLA SEQ ID NR 164: (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI (A) DŁUGOŚĆ: 22 pary zasadowe (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ŁAŃCUCHOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NR 164:

179 884

183

TAATACGACT CACTATAGGG CG 22

2) INFORMACJA DLA SEQ ID NR 165: (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI (A) DŁUGOŚĆ: 22 pary zasadowe (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ŁAŃCUCHOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NR 165:

AATTCCAAGA TCACACACTT GC 22

2) INFORMACJA DLA SEQ ID NR 166:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI (A) DŁUGOŚĆ: 35 par zasadowych (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ŁAŃCUCHOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NR 166: TCAAGCTTAC TAGTCCCTTC CTGAGACAGA TTCTG 35

2) INFORMACJA DLA SEQ ID NR 167:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI (A) DŁUGOŚĆ: 35 par zasadowych (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ŁAŃCUCHOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NR 167:

TGGGCACTGG CTCAGGTTGC TGTGAAGGAC ATGGG 35

2) INFORMACJA DLA SEQ ID NR 168:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI (A) DŁUGOŚĆ: 27 par zasadowych (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ŁAŃCUCHOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NR 168: TGTAGGCAAA GGGGTAACCT CTGGGCA 27

2) INFORMACJA DLA SEQ ID NR 169:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI

184

179 884 (A) DŁUGOŚĆ: 21 aminokwasów (B) TYP: aminokwas (C) ŁAŃCUCHOWOŚĆ: (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: peptyd (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NR 169:

Thr Ser Ile Gly Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala Gly Val His 15 10 15

Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 20

2) INFORMACJA DLA SEQ ID NR 170:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI (A) DŁUGOŚĆ: 30 par zasadowych (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ŁAŃCUCHOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NR 170:

TTTGAATTCG GCCAGCCAGA CACCCCGGCC 30

2) INFORMACJA DLA SEQ ID NR 171:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI (A) DŁUGOŚĆ: 41 par zasadowych (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ŁAŃCUCHOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NR 171:

TTTGCGGCCG CTCATTATTC GTGTATCCTG TTCAGGTATC C 41

2) INFORMACJA DLA SEQ ID NR 172:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI (A) DŁUGOŚĆ: 24 par zasadowych (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ŁAŃCUCHOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NR 172:

TGTAGGCAAA GGAACCTCTG GGCA 24

2) INFORMACJA DLA SEQ ID NR 173:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI (A) DŁUGOŚĆ: 27 par zasadowych

179 884

185 (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ŁAŃCUCHOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NR 173:

TGTAGGCAAA GGAGTGTGAA CCTCTGG 27

2) INFORMACJA DLA SEQ ID NR 174:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI (A) DŁUGOŚĆ: 27 par zasadowych (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ŁAŃCUCHOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NR 174:

TGTAGGCAAA GGAGCGTGAA CCTCTGG 27

2) INFORMACJA DLA SEQ ID NR 175:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI (A) DŁUGOŚĆ: 27 par zasadowych (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ŁAŃCUCHOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NR 175:

TGTAGGCAAA GGTCCGTGAA CCTCTGG 27

2) INFORMACJA DLA SEQ ID NR 176:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI (A) DŁUGOŚĆ: 24 pary zasadowe (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ŁAŃCUCHOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NR 176:

AGCTGTGGTC CTCTGTGGAG GAAG 24

2) INFORMACJA DLA SEQ ID NR 177:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI (A) DŁUGOŚĆ: 24 par zasadowych (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ŁAŃCUCHOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy

186

179 884 (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NR 177:

GTGAGCTGTG GTGCCCTGTG GAGG 24

2) INFORMACJA DLA SEQ ID NR 178:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI (A) DŁUGOŚĆ: 27 par zasadowych (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ŁAŃCUCHOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NR 178: AGCTGTGGTC CTGTTGCCCT GTGGAGG 27

2) INFORMACJA DLA SEQ ID NR 179:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI (A) DŁUGOŚĆ: 27 par zasadowych (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ŁAŃCUCHOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NR 179: AGCTGTGGTC CTAGCGCCCT GTGGAGG 27

2) INFORMACJA DLA SEQ ID NR 180:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI (A) DŁUGOŚĆ: 27 par zasadowych (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ŁAŃCUCHOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NR 180: AGCTGTGGTC CTTCCGCCCT GTGGAGG 27

2) INFORMACJA DLA SEQ ID NR 181:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI (A) DŁUGOŚĆ: 26 par zasadowych (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ŁAŃCUCHOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NR 181:

CGGGCTGCAG GATATCCAAG ATCTCA 26

179 884

187

2) INFORMACJA DLA SEQ ID NR 182:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI (A) DŁUGOŚĆ: 22 pary zasadę (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ŁAŃCUCHOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NR 182:

TAATACGACT CACTATAGGG CG

2) INFORMACJA DLA SEQ ID NR 183:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI (A) DŁUGOŚĆ: 34 pary zasadowye (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ŁAŃCUCHOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NR 183:

GGGCGGCCGC TCAGCTGGGG ACAGCTGTGG TGGG

2) INFORMACJA DLA SEQ ID NR 184:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI (A) DŁUGOŚĆ: 7 aminokwasów (B) TYP: aminokwas (C) ŁAŃCUCHOWOŚĆ:

(D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: peptyd (ix) CECHY:

(A) NAZWA/KLUCZ: misc_feature (D) INNE INFORMACJE:

/UWAGA= Aminokwasem na pozycji 2 jest Ala, Ser, Gly lub Lys.

(xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NR 184:

Lys Xaa Tyr Tyr Glu Ser Xaa 1 5

2) INFORMACJA DLA SEQ ID NR 185:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI (A) DŁUGOŚĆ: 6 aminokwasów (B) TYP: aminokwas (C) ŁAŃCUCHOWOŚĆ: (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: peptyd (ix) CECHY:

188

179 884 (A) NAZWA/KLUCZ: misc_feature (D) INNE INFORMACJE:

/UWAGA= Aminokwasem na pozycji 6 jest Glu lub Asp.

(xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NR 185:

Lys Glx Arg Ala Ala Xaa 1 5

2) INFORMACJA DLA SEQ ID NR 186:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI (A) DŁUGOŚĆ: 7 aminokwasów (B) TYP: aminokwas (C) ŁAŃCUCHOWOŚĆ: (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: peptyd (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NR 186:

Lys Ala Gly Xaa Cys Ser Gly 1 5

2) INFORMACJA DLA SEQ ID NR 187:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI (A) DŁUGOŚĆ: 13 aminokwasów (B) TYP: aminokwas (C) ŁAŃCUCHOWOŚĆ: (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: peptyd (ix) CECHY: (A) NAZWA/KLUCZ: misc_feature (D) INNE INFORMACJE:

/UWAGA= Aminokwasem na pozycji 2 jest Ile, Thr lub Ser.

(xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NR 187:

Lys Xaa Pro Val Pro Pro Ala Cys Asp Pro Arg Leu Leu 15 10

2) INFORMACJA DLA SEQ ID NR 188:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI (A) DŁUGOŚĆ: 9 aminokwasów (B) TYP: aminokwas (C) ŁAŃCUCHOWOŚĆ: (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: peptyd (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NR 188:

Lys Asp Ser Phe Leu Ala Asp Val Lys

179 884

189

2) INFORMACJA DLA SEQ ID NR 189:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI (A) DŁUGOŚĆ: 9 aminokwasów (B) TYP: aminokwas (C) ŁAŃCUCHOWOŚĆ:

(D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: peptyd (ix) CECHY:

(A) NAZWA/KLUCZ: misc_feature (D) INNE INFORMACJE:

/UWAGA= Aminokwasem na pozycji 1 jest lizyna lub arginina.

(xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NR 189:

Xaa Thr Leu Pro Thr Xaa Ala Val Pro 1 5

2) INFORMACJA DLA SEQ ID NR 190:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI (A) DŁUGOŚĆ: 15 aminokwasów (B) TYP: aminokwas (C) ŁAŃCUCHOWOŚĆ: (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: peptyd (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NR 190:

Lys Asp Ser Phe Leu Ala Asp Val Lys Gin Tyr Tyr Glu Ser Glu 15 10 15

2) INFORMACJA DLA SEQ ID NR 191:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI (A) DŁUGOŚĆ: 332 aminokwasy (Β) TYP: amino kwa s (C) ŁAŃCUCHOWOŚĆ: (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: proteina (vi) ŹRÓDŁO POCHODZENIA: (A) ORGANIZM: Homo Sapiens (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NR 191:

Ser Pro Ala Pro Pro Ala Cys Asp Leu Arg Val Leu Ser Lys Leu Leu 15 10 15

Arg Asp Ser His Val Leu His Ser Arg Leu Ser Gin Cys Pro Glu Val 20 25 30

His Pro Leu Pro Thr Pro Val Leu Leu Pro Ala Val Asp Phe Ser Leu

190

179 884

40 45

Gly Glu

Trp

Lys

Thr Gin

Met 55

Glu

Glu

Thr

Lys

Ala 60

Gin

Asp

Ile

Leu

50

Gly 65

Ala

Val

Thr

Leu

Leu 70

Leu

Glu

Gly

Val

Met 75

Ala

Ala

Arg

Gly

Gin 80

Leu

Gly

Pro

Thr

Cys Leu 85

Ser

Ser

Leu

Leu Gly 90

Gin

Leu

Ser

Gly 95

Gin

Val

Arg

Leu 100

Leu

Leu

Gly

Ala

Leu

Gin 105

Ser

Leu

Leu

Gly

Thr 110

Gin

Leu

Pro

Pro

Gin Gly 115

Arg

Thr

Thr

Ala 120

His

Lys

Asp

Pro

Asn 125

Ala

Ile

Phe

Leu

Ser 130

Phe

Gin

His

Leu

Leu 135

Arg

Gly

Lys

Val

Arg 140

Phei

r Leu Met Leu

Val 145

Gly

Gly

Ser

Thr

Leu 150

Cys

Val

Arg

Arg

Ala 155

Pro

Pro

Thr

Thr

Ala 160

Val

Pro

Ser

Arg

Thr 165

Ser

Leu

Val

Leu

Thr 17(

Leu 1

Asn

Glu

Leu

Pro 175

Asn

Arg

Thr

Ser

Gly 180

Leu

Leu

Grill

Thr

Asn 185

Phe

Thr

Ala

Ser

Ala 190

Arg

Thr

Thr

Gly

Ser 195

Gly

Leu

Leu

Lys

Trp 200

Gin

Gin

Gly

Phe

Arg 205

Ala

Lys

Ile

Pro

Gly 210

Leu

Leu

Asn

Gin

Thr 215

Ser

Arg

Ser

Leu

Asp 220

Gin

Ile

Pro

Gly

Tyr 225

Leu

Asn

Arg

Ile

His 230

Glu

Leu

Leu

Asn

Gly 235

Thr

Arg

Gly

Leu

Phe 240

Pro

Gly

Pro

Ser

Arg 245

Arg

Thr

Leu

Gly

Ala 250

Pro

Asp

Ile

Ser

Ser 255

Gly

Thr

Ser

Asp

Thr 260

Gly

Ser

Leu

Pro

Pro 265

Asn

Leu

Gin

Pro

Gly 270

Tyr

Ser

Pro

Ser

Pro 275

Thr

His

Pro

Pro

Thr 280

Gly

Gin

Tyr

Thr

Leu 285

Phe

Pro

Leu

Pro

Pro 290

Thr

Leu

Pro

Thr

Pro 295

Val

Val

Gin

Leu

His 300

Pro

Leu

Leu

Pro

Asp 305 Ser

Pro Tyr

Ser Thr

Ala His

Pro Ser 325

Thr 310 Gin

Pro Asn

Thr Leu

Pro Ser

Thr Gin 330

Ser 315 Glu

Pro Gly

Leu

Leu

Asn

Thr 320

2) INFORMACJA DLA SEQ ID NR 192:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI (A) DŁUGOŚĆ: 1086 par zasadowych (B) TYP: kwas nukleinowy

179 884

191 (C) ŁAŃCUCHOWOŚĆ: podwójna (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA do mRNA (vi) ŹRÓDŁO POCHODZENIA:

(A) ORGANIZM: Homo Sapiens (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NR 192:

GGCCAGCCAG ACACCCCGGC CAGA ATG GAG CTG ACT GAA TTG CTC CTC GTG51

Met Glu Leu Thr Glu Leu Leu Leu Val

-21 -20-15

GTC ATG CCT CTC CTA ACT GCA AGG CTA ACG CTG TCC AGC CCG GCT CCT99

Val Met Leu Leu Leu Thr Ala Arg Leu Thr Leu Ser Ser Pro AlaPro

-10 -51

CCT GCT TGT GAC CTC CGA GTC CTC AGT AAA CTG CTT CGT GAC TCC CAT147

Pro Ala Cys Asp Leu Arg Val Leu Ser Lys Leu Leu Arg Asp SerHis

10 1520

GTC CTT CAC AGC AGA CTG AGC CAG TGC CCA GAG GTT CAC CCT TTG CCT195

Val Leu His Ser Arg Leu Ser Gin Cys Pro Glu Val His Pro LeuPro

3035

ACA CCT GTC CTG CTG CCT GCT GTG GAC TTT AGC TTG GGA GAA TGG AAA243

Thr Pro Val Leu Leu Pro Ala Val Asp Phe Ser Leu Gly Glu TrpLys

4550

ACC CAG ATG GAG GAG ACC AAG GCA CAG GAC ATT CTG GGA GCA GTC ACC291

Thr Gin Met Glu Glu Thr Lys Ala Gin Asp Ile Leu Gly Ala ValThr

6065

CTT CTG CTG GAG GGA GTG ATG GCA GCA CGG GGA CAA CTG GGA CCC ATG339

Leu Leu Leu Glu Gly Val Met Ala Ala Arg Gly Gin Leu Gly ProThr

7580

TGC CTC TCA TCC CTC CTG GGG CAG CTT TCT GGA CAG GTC CGT CTC CTC387

Cys Leu Ser Ser LeJ Leu Gly Gin Leu Ser Gly Gin Val Arg LeuLeu

99 95100

CTT GGG GCC CTG CAG AGC CTC CTT GAA ACC CAG CTT CCT CCA CAG GGC435

Leu Gly Ala Leu Gin Ser Leu Leu Gly Thr Gin Leu Pro Pro GinGly

105 210115

AGG ACC ACA GCT CAC AAG GAT CCC AAT GCC ATC TTC CTG AGC TTC CAA4 83

Arg Thr Thr Ala His Lys Asp Pro Asn Ala Ile Phe .Leu Ser PheGin

120 125130

CAC CTG CTC CGA GGA AAG GTG CGT TTC CTG ATG CTT GTA GGA GGG TCC531

His Leu Leu Arg Gly Lys Val Arg Phe Leu Met Leu Val Gly GlySer

135 140145

ACC CTC TGC GTC AGG CGG GCC CCA CCC ACC ACA GCT GTC CCC AGC AGA579

Thr Leu Cys Val Arg Arg Ala Pro Pro Thr Thr Ala Val Pro SerArg

150 155160

ACC TCT CTA GTC CTC ACA CTG AAC GAG CTC CCA AAC AGG ACT TCT GGA627

Thr Ser Leu Val Leu Thr Leu Asn Glu Leu Pro Asn Arg Thr SerGly

165 170 175180

192

179 884

TTG Leu

TTG Leu

GAG Glu

ACA Thr

AAC TTC Asn Phr 185

ACT Thr

GCC Ala

TCA Ser

GCC AGA Ala Arg 190

ACT Thr

ACT Thr

GGC Gly

TCT GGG Ser Gly 195

675

CTT

CTG

AAG

TGG

CAG

CAG

GGA

TTC

AGA

GCC

AAG

ATT

CCT

GGT

CTG

CTG

723

Leu

Leu

Lys

Trp 200

Gin

Gin

Gly

Phe

Arg 205

Ala

Lys

Ile

Pro

Gly 210

Leu

Leu

AAC

CAA

ACC

TCC

AGG

TCC

CTG

GAC

CAA

ATC

CCC

GGA

TAC

CTG

AAC

AGG

771

Asn

Gin

Thr 215

Ser

Arg

Ser

Leu

Asp 220

Gin

Ile

Pro

Gly

Tyr 225

Leu

Asn

Arg

ATA

CAC

GAA

CTC

TTG

AAT

GGA

ACT

CGT

GGA

CTC

TTT

CCT

GGA

CCC

TCA

819

Ile

His 230

Glu

Leu

Leu

Asn

Gly 235

Thr

Arg

Gly

Leu

Phe 240

Pro

Gly

Pro

Ser

CGC

AGG

ACC

CTA

GGA

GCC

CCG

GAC

ATT

TCC

TCA

GGA

ACA

TCA

GAC

ACA

867

Arg 245

Arg

Thr

Leu

Gly

Ala 250

Pro

Asp

Ile

Ser

Ser 255

Gly

Thr

Ser

Asp

Thr 260

GGC

TCC

CTG

CCA

CCC

AAC

CTC

CAG

CCT

GGA

TAT

TCT

CCT

TCC

CCA

ACC

915

Gly

Ser

Leu

Pro

Pro 265

Asn

Leu

Gin

Pro

Gly 270

Tyr

Ser

Pro

Ser

Pro 275

Thr

CAT

CCT

CCT

ACT

GGA

CAG

TAT

ACG

CTC

TTC

CCT

CCA

CTT

CCC

ACC

TTG

963

His

Pro

Pro

Thr 280

Gly

Gin

Tyr

Thr

Leu 285

Phe

Pro

Leu

Pro

Pro 290

Thr

Leu

CCC

ACC

CCT

GTG

GTC

CAG

CTC

CAC

CCC

CTG

CTT

CCT

GAC

CCT

TCT

GCT

1011

Pro

Thr

Pro 295

Val

Val

Gin

Leu

His 300

Pro

Leu

Leu

Pro

Asp 305

Pro

Ser

Ala

CCA

ACG

CCC

ACC

CCT

ACC

AGC

CCT

CTT

CTA

AAC

ACA

TCC

TAC

ACC

CAC

1059

Pro TCC Ser 325

Thr 310 CAG Gin

Pro AAT Asn

Thr CTG Leu

Pro TCT Ser

Thr CAG Gin 330

Ser 315 GAA Glu

Pro GGG Gly

Leu TAA

Leu

Asn

Thr 320

Ser

tyr

Thr

His

1086

2) INFORMACJA DLA SEQ ID NR 193:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI (A) DŁUGOŚĆ: 7 aminokwasów (B) TYP: aminokwas (C) ŁAŃCUCHOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: peptyd (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NR 193:

Lys Gin Tyr Tyr Glu Ser Glu

5

2) INFORMACJA DLA SEQ ID NR 194:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI (A) DŁUGOŚĆ: 1663 pary zasadowe (B) TYP: kwas nukleinowy

179 884

193 (C) ŁAŃCUCHOWOŚĆ: podwójna (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA do mRNA (vi) ŹRÓDŁO POCHODZENIA:

(A) ORGANIZM: Rattus norvegicus (H) LINIA KOMÓRKOWA: MCA-RH8994 (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NR 194:

GGTGTACCTG GGTCCTGAAG CCCTTCTTCA CCTGGATAGA TTCCTTGGCC CACCTGTCCC	60
CACCCCACTC TGTGCAGAGG TACAAAAGCT CAAGCCGTCT CCATGGCCCC AGGAAAGATT	120
CAGGGGAGAG GCCCCACACA GGGAGCCACT GCAGTCAGAC ACCCTGGGCA GA ATG Met -21	175
GAG CTG ACT GAT TTG CTC CTG GTG GCC ATA CTT CTC CTC ACC GCA AGA	223
Glu Leu Thr Asp Leu Leu Leu Val Ala Ile Leu Leu Leu Thr Ala Arg -20 -15 -10 -5
CTA ACT CTG TCC AGC CCA GTT CCT CCC GCC TGT GAC CCC AGA CTC CTA	271
Leu Thr Leu Ser Ser Pro Val Pro Pro Ala cys Asp Pro Arg Leu Leu 15 10
AAT AAA CTG CTT CGT GAC TCC TAC CTC CTT CAC AGC CGA CTG AGT CAG	319
Asn Lys Leu Leu Arg Asp Ser Tyr Leu Leu His Ser Arg Leu Ser Gin 15 20 25
|TGT CCT GAC GTC AAC CCT TTG TCT ATC CCT GTC CTG CTG CCT GCT GTC	367
Cys Pro Asp Val Asn Pro Leu Ser Ile Pro Val Leu Leu Pro Ala Val 30 35 40
GAC TTT AGC CTG GGA GAA TGG AAA ACC CAG ACG GAA CAG AGC AAG GCA	415
Asp Phe Ser Leu Gly Glu Trp Lys Thr Gin Thr Gly Gin Ser Lys Ala 45 50 55 60
CAG GAC ATT CTA GGG GCA GTG TCC CTT CTA CTG GAG GGG GTG ATG GCA	463
Gin Asp Ile Leu Gly Ala Val Ser Leu Leu Leu Glu Gly Val Met Ala 65 70 75
GCA CGA GGA CAG TTG GAA CCCTCC TGC CTC TCA TCC CTC CTG GGA CAG	511
Ala Arg Gly Gin Leu Glu Pro Ser Cys Leu Ser Ser Leu Leu Gly Gin 80 85 90
CTT TCT GGT CAG GTT CGC CTC CTC TTG GGA GCC CTG CAG GGC CTC CTA	559
Leu Ser Gly Gin Val Arg Leu Leu Leu Gly Ala Leu Gin Gly Leu Leu 95 100 105
GGA ACC CAG GTA AGT CCC CAG ACC TAT AGA AAC TAC CCT CTT ACT CAG	607
Gly Thr Gin Val Ser Pro Gin thr Tyr Arg Asn Tyr Pro Leu Thr Gin 110 115 120
TTC CTC TAAGGACCTG GGAAAAGACA AGGGATTCTA GATTCTAGGT GTCTTCAGTG Phe Leu 125	663

TATGAAAGCT GGTCTATACG GAGTGATGCT TCTCAGCCAC AATACCTGGG TGCTGGCAGT 723

194

179 884

AAATCTTTCC ACCTTAGTGA GAAGAGGCCT GATATGTGGG CCAACTCACT GGCCTCAGGC783

CCATCCTCTG CCTTCAGCTT CCTCCACAGG GCAGGACCAC AGCTCACAAG GACCCCAGT843

CCCTCTTCTT GAGCTTGCAA CAACTGCTTC GGGGAAAGGT GCGCTTCCTG CTGCTGGTAG903

AAGGTCCCGC CCTCTGTGTC AGACGGACCC TTCCCACCAC AGCTGTCCCA AGCAGAACCT963

CTCAACTCCT CACACTAAAC AAGTTCCCAA ACAGACTTCT GGATTGTTGG AGACGAACTT1023

CAGTGTTGTA GCCAGAACTG CTGGCCCTGG ACTTCTGAAC AGGCTTCAAG GATTCAGAGC1083

CAAGATTATT CCTGGTCAGC TAAATCAAAC CTCCGGGTCC TTAGACCAAA TCCCTGGATA1143

CCTGAACGGG ACACACGAAC CTGTGAATGG AACTCATGGG CTCTTTGCTG GGACCTCACT1203

ACAGACCCTG GAAGCCCCAG ACGTTGTGCC AGGAGCTTTC AACAAAGGCT CCTTGCCACT1263

CAACCTCCAG AGTGGACTTC CTCCTATCCC AAGCCTTGCT GCTGATGGAT ACACACTTTT1323

CCCTCCTTCA CCTACCTTCC CCACCCCTGG GTCTCCACCC CAGCTCCCCC CCGTTTCCTG1383

ACCCCTCCAC CACCATACCT AACTCTACCA ACCCTCATCC AGGACTTGGT CTCAGTAAGC1443

GTCCCGTGCA CTGGCACGGA GCGCGATCGT CTGCAACATC TCTCAGGGGC AAGCTTCCTC1503

AGGAAGGCTC TGAGGCAGCT CACTAGACAT CCTGCTCTCG TTTTTTCTTA ACCTATCAAC1623

AATATTCATC AGAGCAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA1663

2) INFORMACJA DLA SEQ ID NR 195:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI (A) DŁUGOŚĆ: 1086 par zasadowych (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ŁAŃCUCHOWOŚĆ: podwójna (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA do mRNA (vi) ŹRÓDŁO POCHODZENIA:

(A) ORGANIZM: Homo Sapiens (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NR 195:

INFORMACJA DLA SEQ ID NR 195:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI (A) DŁUGOŚĆ: 861 par zasadowych (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ŁAŃCUCHOWOŚĆ: podwójna (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA do mRNA (vi) ŹRÓDŁO POCHODZENIA:

(A) ORGANIZM: Homo Sapiens (H) TYP TKANKI: wątroba (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NR 195:

179 884

195

GGCCAGCCAG ACACCCCGGC CAGA ATG GAG CTG ACT GAA TTG CTC CTG GTG51

Met Glu Leu Thr Glu Leu Leu Leu Val -21 -20-15

GTC Val

ATG Met

CTT Leu -10

CTC Leu

CTA ACT

GCA Ala

AGG Arg -5

CTA Leu

ACG CTG TCC

AGC Ser 1

CCG Pro

GTC Ala

CCT Pro

99

Leu

Thr

Thr

Leu

Ser

CCT

GCT

TGT

GAC

CTC

CGA

GTC

CTC

AGT

AAA

CTG

CTT

CGT

GAC

TCC

CAT

195

Val

Leu

His

Ser

Arg 25

Leu

Ser

gin

Cys

Pro 30

Glu

Val

His

Pro

Leu 35

Pro

ACA

CCT

GTC

CTG

CTG

CCT

GCT

GTG

GAC

TTT

AGC

TTG

GGA

GAA

TGG

AAA

243

Thr

Pro

Val

Leu Leu 40

Pro

Ala

Val

Asp 45

Phe

Ser

Leu

Gly

Glu 50

Trp

Lys

ACC

CAG

ATG

GAG

GAG

ACC

AAG

GCA

CAG

GAC

ATT

CTG

GGA

GCA

GTG

ACC

291

Thr

Gin

Met 55

Glu

Glu

Thr

Lys

Ala 60

Gin

Asp

Ile

Leu

Gly 65

Ala

Val

Thr

CTT

CTG

CTG

GAG

GGA

GTG

ATG

GCA

GCA

CGG

GGA

CAA

CTG

GGA

CCC

ACT

339

Leu

Leu 70

Leu

Glu

Gly

Val

Met 75

Ala

Ala

Arg

Gly

Gin 80

Leu

Gly

Pro

Thr

TGC

CTC

TCA

TCC

CTC

CTG

GGG

CAG

CTT

TCT

GGA

CAG

GTC

CGT

CTC

CTC

387

Cys 85

Leu

Ser

Ser

Leu

Leu 90

Gly

Gin

Leu

Ser·

Gly 95

Gin

Val

Arg

Leu

Leu 100

CTT

GGG

GCC

CTG

CAG

AGC

CTC

CTT

GGA

ACC

CAG

CTT

CCT

CCA

CAG

GGC

435

Leu

Gly

Ala

Leu

Gin 105

Ser

Leu

Leu

Gly

Thr 110

Gin

Leu

Pro

Pro

Gin 115

Gly

AGG

ACC

ACA

GCT

CAC

AAG

GAT

CCC

AAT

GCC

ATC

TTC

CTG

AGC

TTC

CAA

483

Arg

Thr

Thr

Ala 120

His

Lys

Asp

Pro

Asn 125

Ala

Ile

Phe

Leu

Ser 130

Phe

Gin

CAC

CTG

CTC

CGA

GGA

AAG

GTG

CGT

TTC

CTG

ATG

CTT

GTA

GGA

GGG

TCC

531

His

Leu

Leu 135

Arg

Gly

Lys

Val

Arg 140

Phe

Leu

Met

Leu

Val 145

Gly

Gly

Ser

ACC

CTC

TGC

GTC

AGG

CGG

GCC

CCA

CCC

ACC

ACA

GCT

GTC

CCC

AGC

AGA

579

Thr

Leu 150

Cys

Val

Arg

Arg

Ala 155

Pro

Pro

thr

Thr

Ala 160

Val

Pro

Ser

Arg

ACC

TCT

CTA

GTC

CTC

ACA

CTG

AAC

GAG

CTC

CCA

AAC

AGG

ACT

TCT

GGA

627

Leu

Leu

Glu

Thr

Asn 185

Phe

Thr

Ala

Ser

Ala 190

Arg

thr

Thr

Gly

Ser 195

Gly

CTT

CTG

AAG

TGG

CAG

CAG

GGA

TTC

AGA

GCC

AAG

ATT

CCT

GGT

CTG

CTG

723

Leu

Leu

Lys

Trp 200

Gin

Gin

Gly

Phe

Arg 205

Ala

Lys

Ile

Pro

Gly 21(

Leu )

Leu

AAC

CAA

ACC

TCC

AGG

TCC

CTG

GAC

CAA

ATC

CCC

GGA

TAC

CTG

AAC

AGG

771

Asn

Gin

Thr 215

Ser

Arg

Ser

Leu

Asp 220

Gin

Ile

Pro

Gly

Tyr 225

Leu

Asn

Arg

ATA CAC GAA CTC TTAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA823

Ile His Glu Leu

230

AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAA

861

196

179 884

INFORMACJA DLA SEQ ID NR 196:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI (A) DŁUGOŚĆ: 1267 par zasadowych (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ŁAŃCUCHOWOŚĆ: podwójna (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA do mRNA (vi) ŹRÓDŁO POCHODZENIA:

(A) ORGANIZM: Homo Sapiens (F) TYP TKANKI: wątroba (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NR 196:

GGCCAGCCAG ACACCCCGGC CAGA ATG GAG CTG ACT GAA TTG CTC CTC GTG Met Glu Leu Thr Glu Leu Leu Leu Val

51

-21 -20

-15

GTC

ATG

CTT

CTC

CTA

ACT

GGA

AGG

CTA

ACG

CTG

TCC

AGC

CCG

GCT

CCT

99

Val

Met

Leu -10

Leu

Leu

Thr

Ala

Arg -5

Leu

Thr

Leu

Ser

Ser 1

Pro

Ala

Pro

CCT

GCT

TGT

GAC

CTC

CGA

GTC

CTC

AGT

AAA

CTG

CTT

CGT

GAC

TCC

CAT

147

Pro 5

Ala

Cys

Asp

Leu

Arg 10

Val

Leu

Ser

Lys

Leu

Leu 15

Arg

Asp

Ser

His 20

GTC

CTT

CAC

AGC

AGA

CTG

AGC

CAG

TGC

CCA

GAC

GTT

CAC

CCT

TTG

CCT

195

Val

Leu

His

Ser

Arg 25

Leu

Ser

Gin

Cys

Pro 30

Glu

Val

His

Pro

Leu 35

Pro

ACA

CCT

GTC

CTG

CTG

CCT

GCT

GTG

GAC

TTT

AGC

TTG

GGA

GAA

TGG

AAA

243

Thr

Pro

Val

Leu 40

Leu

Pro

Ala

Val

Asp 45

Phe

Ser

Leu

Gly

Glu 50

Trp

Lys

ACC

CAG

ATG

GAG

GAG

ACC

AAG

GCA

CAG

GAC

ATT

CTG

GGA

GCA

GTG

ACC

291

Thr

Gin

Met 55

Glu

Glu

Thr

Lys

Ala 60

Gin

Asp

lie

Leu

Gly 65

Ala

Val

Thr

CTT

CTG

CTG

GAG

GGA

GTG

ATG

GCA

GCA

CGG

GGA

CAA

CTG

GGA

CCC

ACT

339

Leu

Leu 70

Leu

Glu

Gly

Val

Met 75

Ala

Ala

Arg

Gly

Gin 80

Leu

Glu

Pro

Thr

TGC

CTC

TCA

TCC

CTC

CTG

GGG

CAG

CTT

TCT

GGA

CAG

GTC

CGT

CTC

CTC

387

Cys 85

Leu

Ser

Ser

Leu

Leu 90

Gly

Gin

Leu

Ser

Gly 95

Gin

Val

Arg

Leu

Leu 100

CTT

GGG

GCC

CTG

CAG

AGC

CTC

CTT

GGA

ACC

CAG

CTT

CTT

CCA

CAG

GGC

435

Leu

Gly

Ala

Leu

Gin 105

Ser

Leu

Leu

Gly

Thr 110

Gin

Leu

Pro

Pro

Gin 115

Gly

AGG

ACC

ACA

GCT

CAC

AAG

GAT

CCC

AAT

GCC

ATC

TTC

CTG

AGC

TTC

CZKA

483

Arg

Thr

Thr

Ala 120

His

Lys

Asp

Pro

Asn 125

Ala

Ile

Phe

Leu

Ser 130

Phe

Gin

CAC

CTG

CTC

CGA

GGA

AAG

GTG

CGT

TTC

CTG

ATG

CTT

GTA

GGA

GGG

TCC

531

His

Leu

Leu 135

Arg

Gly

Lys

Val

Arg 140

Phe

Leu

Met

Leu

Val 145

Gly

Gly

Ser

179 884

197

ACC Thr

CTC TGC

GTC Val

AGG Arg

CGG Arg

GCC Ala 155

CCA CCC

ACC ACA

GCT Ala 160

GTC Val

CCC Pro

AGC Ser

AGA Arg

579

Leu 150

Cys

Pro

Pro

thr

Thr

ACC

TCT

CTA

GTC

CTC

ACA

CTG

AAC

GAG

CTC

CCA

7XAC

AGG

ACT

TCT

GGA

627

Thr 165

Ser

Leu

Val

Leu

Thr 170

Leu

Asn

Glu

Leu

Pro 175

Asn

Arg

Thr

Ser

Gly 180

TTG

TTG

GAG

ACA

AAC

TTC

ACT

GCC

TCA

GCC

AGA

ACT

ACT

GGC

TCT

GGG

675

Leu

Leu

Glu

Thr

Asn 185

Phe

Thr

Ala

Ser

Ala 190

Arg

Thr

Thr

Gly

Ser 195

Gly

CTT

CTG

AAG

TGG

CAG

CAG

GGA

TTC

AGA

GCC

AAG

ATT

CCT

GGT

CTG

CTG

723

Leu

Leu

Lys

Trp 200

Gin

Gin

Gly

Phe

Arg 205

Ala

Lys

Ile

Pro

Gly 210

Leu

Leu

AAC

CAA

ACC

TCC

AGG

TCC

CTG

GAC

CAA

ATC

CCC

GGA

TAC

CTG

AAC

AGG

771

Asn

Gin

Thr 215

Ser

Arg

Ser

Leu

Asp 220

Gin

Ile

Pro

Gly

Tyr 225

Leu

Asn

Arg

ATA

CAC

GAA

CTC

TTG

AAT

GGA

ACT

CGT

GGA

CTC

TTT

CCT

GGA

CCC

TCA

819

Ile

His 230

Glu

Leu

Leu

Asn

Gly 235

Thr

Arg

Gly

Leu

Phe 240

Pro

Gly

Pro

Ser

CGC

AGG

ACC

CTA

GGA

GCC

CCG

GAC

ATT

TCC

TCA

GGA

ACA

TCA

GAC

ACA

867

Arg 245

Arg

Thr

Leu

Gly

Ala 250

Pro

Asp

Ile

Ser

Ser 255

Gly

Thr

Ser

Asp

Thr 260

GGC

TCC

CTG

CCA

CCC

AAC

CTC

CAG

CCT

GGA

TAT

TCT

CCT

TCC

CCA

ACC

915

Gly

Ser

Leu

Pro

Pro 265

Asn

leu

Gin

Pro

Gly 270

Tyr

Ser

Pro

Ser

Pro 275

Thr

CAT

CCT

CCT

ACT

GGA

CAG

TAT

ACG

CTC

TTC

CCT

CTT

CCA

CCC

ACC

TTG

963

His

Pro

Pro

Thr 280

Gly

Gin

Tyr

Thr

Leu 285

Phe

Pro

Leu

Pro

Pro 290

Thr

Leu

CCC

ACC

CCT

GTG

GTC

CAG

CTC

CAC

CCC

CTG

CTT

CCT

GAC

CCT

TCT

GCT

1011

Pro

Thr

Pro 295

Val

Val

Gin

Leu

His 300

Pro

Leu

Leu

Pro

Asp 305

Pro

Ser

Ala

CCA

ACG

CCC

ACC

CCT

ACC

AGC

CCT

CTT

CTA

AAC

ACA

TCC

TAC

ACC

CAC

1059

Pro

Thr 310

Pro

Thr

Pro

Thr

Ser 315

Pro

Leu

Leu

Asn

Thr 320

Ser

Tyr

Thr

His

TCC CAG AAT CTG TCT CAG GAA GGG TAAGGTTCTC AGACACTGCC GACATCAGCA 1113 Ser Gin Asn Leu Ser Gin Glu Gly 325330

TTGTCTCATG TACAGCTCCC TTCCCTGCAG GGCGCCCCTG GGAGACAACT GGACAAGATT1173

TCCTACTTTC TCCTGAAACC CAAAGCCCTG GTAAAAGGGA TACACAGGAC TGAAAAGGGA1233

ATCATTTTTC ACTGTACATT ATAAACCTTC AGAA1267 (2) INFORMACJA DLA SEQ IN NR 197:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI (A) DŁUGOŚĆ: 549 par zasadowych (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ŁAŃCUCHOWOŚĆ: podwójna (D) TOPOLOGIA: liniowa

198

179 884 (ii) TYP CZĄSTECZKI: syntetyczny DNA (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NR 197:

CTG Leu -5

GTT Val

CCG CGT

GGA Gly

TCC Ser 1

CCG Pro

GCT Ala

CCG Pro

CCA Pro 5

GCT Ala

TGT Cys

GAC Asp

CTT Leu

CGT Arg 10

GTT Val

48

Pro

Arg

CTG

TCT

AAA

CTG

CTT

CGC

GAC

TCT

CAC

GTG

CTG

CAC

TCT

CGT

CTG

TCC

96

Leu

Ser

Lys

Leu 15

Leu

Arg

Asp

Ser

His 20

Val

Leu

His

Ser

Arg 25

Leu

Ser

CAG

TGC

CCG

GAA

GTT

CAC

CCG

CTG

CCG

ACC

CCG

GTT

CTG

CTT

CCG

GCT

144

Gin

Cys

Pro 30

Glu

Val

His

Pro

Leu 35

Pro

Thr

Pro

Val

Leu 40

Leu

Pro

Ala

GTC

GAC

TTC

TCC

CTG

GGT

GAA

TGG

AAA

ACC

CAG

ATG

GAA

GAG

ACC

AAA

192

Val

Asp 45

Phe

Ser

Leu

Gly

Glu 50

Trp

Lys

Thr

Gin

Met 55

Glu

Glu

Thr

Lys

GCT

CAG

GAC

ATC

CTG

GGT

GCA

GTA

ACT

CTG

CTT

CTG

GAA

GGC

GTT

ATG

240

Ala 60

Gin

Asp

Ile

Leu

Gly 65

Ala

Val

Thr

Leu

Leu 70

Leu

Glu

Gly

Val

Met 75

GCT

GCA

CGT

GGC

CAG

CTT

GGC

CCG

ACC

TGC

CTG

TCT

TCC

CTG

CTT

GGC

288

Ala

Ala

Arg

Gly

Gin 80

Leu

Gly

Pro

Thr

Cys 85

Leu

Ser

Ser

Leu

Leu 90

Gly

CAG

CTG

TCT

GGC

CAG

GTT

CGT

CTG

CTG

CTC

GGC

GCT

CTG

CAG

TCT

CTG

336

Gin

Leu

Ser

Gly 95

Gin

Val

Arg

Leu

Leu 100

Leu

Gly

Ala

Leu

Gin 105

Ser

Leu

CTT

GGC

ACC

CAG

CTG

CCG

CCA

CAG

GGC

CGT

ACC

ACT

GCT

CAC

AAG

GAT

384

Leu

Gly

Thr 110

Gin

Leu

Pro

Pro

Gin 115

Gly

Arg

Thr

Thr

Ala 120

His

Lys

Asp

CCC

AAT

GCC

ATC

TTC

CTG

AGC

TTC

CAA

CAC

CTG

CTC

CGA

GGA

AAG

GTG

432

Pro

Asn 125

Ala

Ile

Phe

Leu

Ser 130

Phe

Gin

His

Leu

Leu 135

Arg

Gly

Lys

Val

CTG

TTC

CTG

ATG

CTT

GTA

GGA

GGG

TCC

ACC

CTC

TGC

GTC

AGG

CGG

GCC

480

Arg 140

Phe

Leu

Met

Leu

Val 145

Gly

Gly

Ser

Thr

Leu 150

Cys

Val

Arg

Arg

Ala 155

CCA

CCC

ACC

ACA

GCT

GTC

CCC

AGC

AGA

ACC

TCT

CTA

GTC

CTC

ACA

CTG

528

Pro AAC Asn

Pro GAG Glu

Thr CTC Leu

Thr Ala Val 160 TAATGAGAAT r

pro rc

Ser

Arg

Thr 165

Ser

Leu

Val

Leu

Thr 170

Leu

549

179 884 wchłanianie C-5HT (CPM)

- 20000

Absorbancja przy 280 nm pojemność elucji (ml)

Fig. 1

179 884 wchłanianie ¹⁴C 5HT (CPM)

01-0 0

czas retencji (min) absorbancja przy 280 nm

Fig. 2

179 884

Elektroforeza 15¾ SDS-PAGE frakcji FA z kolumny Capcell Pak Cl FA (#36-42)

Fig. 3

179 884

Fig. 4

179 884

DDDB

, χ

Inkorporacja C-5HT (cpm)

TPO (frakcja F2 z kolumny YMC-Pack z odwróconymi fazami)(>ig/ml)

Fig. 5

179 884

HindnUEcoRI część wektora bez części promotora SR alpha

Fig. 6

179 884

inkorporacja ^⁴C-5HT (cpm) nadsącz z hodowli komórek COSI (v/v) (%)

14000

Fig. 7

179 884

nadsącz z hodowli komórek COSI (v/v) (%) οοοοι

Λ inkorporacja C-5HT (cpn)

Fig. 8

179 884

OODDl

nadsącz z hodowli komórek COSI (v/v) (%) inkorporacja C-5HT (cpm)

Fig. 9

179 884

inkorporacja C-5HT (cpm)

Fig. lOa

179 884

Ahgti

Fig. 11

179 884

Fig. 12a

o ------------------------------------------------------------I 10 toc nadsącz z hodowli komórek COSI (v/v) (%)

Fig. 12b

179 884

nadsącz z hodowli komórek C01 (v/v) (%)

Fig. 13a

Fig. 13b

179 884

20000

Fig. 14

179 884 elektroforeza 20% SDS-PAGE

absorbancja przy 280 nm

Fig. 15 ^Fig· ¹⁶

179 884

Α2ΰθ

czas (min)

Fig. 17

179 884

2 3 4 5 6 7 8 9 10

1-5, DTT+, 6-1 ΰ DTT1,6 : S-a

2,7 : S-b

3,B : S-c

4,9 : G-a

5,10 : G-d

Fig. 18

179 884

absorbancja przy 220 nm numer frakcji

Fig. 19

179 884

Fig. 20

179 884

BamHI 10OG Nhel 1925

Fig. 21

179 884 η ci

Ο ąP

ΟΟΟΟΡ

0.001 0.01 inkorporacja H-TdR (cpm)

Fig. 22

179 884

(cpm) inkorporacja

ZL ΙΗΡ

9L19P .9LLN .91IV i9l-LO εεΗρ .εει .εεν .εεο (M30W)S8T53d

00009

HTdR

Fig. 23

179 884

0.01)

grupa kontrolna TPO - dożylnie grupa kontrolna TPO - podskórnie dożylnie podskórnie (Τ^/ΟΟΟΟΙ χ)

Aązoyi jejtuod

Fig. 24

179 884

(Irt/00001 x) ijsąZfd Xqzofx jepuod

Fig. 25

179 884

kolejny dzień podskórnej injekcji rekombinowanej TPO ludzkiej (IWOOOOI ιρίΧγά Xqz3jT jerwod

Fig. 26

179 884

kolejny dzień podawania TPO (injekcja podskórna dwa razy dziennie) (Τ^/ΟΟΟΟΤ *) Xqzon aefmod

Fig. 27

179 884

kolejny dzień podskórnej injekcji TPO ··· kontrola (l^rf/00001 *) ąsgAld AązoTl aejuiod

Fig. 28

179 884

kolejny dzień podskórnej injekcji TPO

Fig. 29

179 884 kontrola

kolejny dzień podskórnej injekcji ludzkiej TPO (1-163)

Fig. 30

179 884

ACNU kolejny dzień podawania ludzkiej TPO (1-1&3) (injekcja dożylna) (injekcja podskórna)

Fig. 31

179 884

MPL - X całkowicie blokuje zdolność APK9 do induckji rozwoju megakariocytów megakariocyty na jedno naczynie

Fig. 32

179 884 h6T(1-163)

stężenie TPO (ng/ml)

Fig. 33

179 884 h6T(1-163)

stężenie TPO ng/ml inkorporacja H-TdR (cpm)

Fig. 34

179 884

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 70 egz. Cena 6,00 zł.

Claims (3)

Zastrzeżenia patentowe

1/ dokonanie, w komórkach gospodarza, ekspresji polipeptydu przy użyciu DNA kodującego peptyd rozpoznania trombiny końca 5' sekwencji kodujących polipeptyd TPO oraz S-transferazę glutationowa (GST)5' dla peptydu rozpoznania trombiny,

II/ wyizolowanie polipeptydu GST-TPO,

ΙΠ/ traktowanie trombiną wyizolowanego polipeptydu GST - TPO,

IV/ wyizolowanie polipeptydu Gly'¹ - TPO.

30. Sposób według zastrz. 29, znamienny tym, że w czwartym etapie (IV) dokonuje się izolacji polipeptydu [Gly^TPO (1-174).

31. Sposób według zastrz. 29, znamienny tym, że w czwartym etapie (IV) dokonuje się izolacji pochodnej polipeptydu TPO, która składa się z sekwencji aminokwasów 1 do 174 SEQ ID nr 6.

32. Sposób rozwoju prokariotycznych lub eukariotycznych komórek gospodarzy, znamienny tym, że komórki te transformuje się lub transfekuje sekwencją DNA i/lub cDNA i/lub genomowego DNA i/lub syntetycznego DNA, wybraną z grupy zawierającej:

a) sekwencje DNA według SEQ ID nr 194, 195, 196 lub ich łańcuchy komplementarne; oraz

b) sekwencje DNA, które hybrydyzując w ściśle określonych warunkach, tworzą sekwencję DNA określone w (a) lub ich fragmenty; oraz

c) sekwencje DNA mogące hybrydyzować do sekwencji określonych w (a) lub (b) powodując przy tym degeneracje sekwencji nukleotydów.

33. Preparat farmaceutyczny do leczenia zaburzeń płytekkrwi i małopłytkowości, zwłaszcza wywołanej chemioterapią radioterapią lub transplantacją szpiku kostnego, znamienny tym, że składa się z polipeptydu TPO lub jego pochodnych, zawierających sekwencję aminokwasów 1 do 332 SEQ ID nr 6 i/lub jej modyfikację i/lub dojrzałą sekwencję aminokwasów SEQ ID nr 2,4 lub 6, charakteryzujących się aktywnością biologiczną swoiście stymulującą lub zwiększającą produkcję płytek krwi, w połączeniu z farmaceutycznie dopuszczalnym nośnikiem.

34. Preparat według zastrz. 33, znamienny tym, że polipeptyd TPO jest konwalencyjnie związany z polimerem, korzystnie z glikolem polietylenowym, i/lub dodatkowo zawiera aminokwas MeU-Lys'¹ i/lub Met'¹ i/lub Gly'¹.

1/dokonanie, w komórkach gospodarza, ekspresji kodowanego przez DNA polipeptydu TPO z wykorzystaniem sekwencji DNA i/lub cDNA i/lub genomowego DNA i/lub syntetycznego DNA wybranych z grupy zawierającej:

a) sekwencje DNA według SEQ ID nr 194, 195, 196 lub ich łańcuchy komplementarne; oraz

b) sekwencje DNA, które hybrydyzując w ściśle określonych warunkach, tworzą sekwencje DNA określone w (a) lub ich fragmenty; oraz

c) sekwencje DNA mogące hybrydyzować do sekwencji DNA określonych w (a) lub (b) powodując przy tym degenerację sekwencji nukleotydów.

II/ wyizolowanie polipeptydu TPO.

179 884

28. Sposób według zastrz. 27, znamienny tym, że polipeptydem TPO podlegającym ekspresji jest polipeptyd Met²-Lys ', przy czym w drugim etapie (II) dokonuje się oddzielenia MeU-Lys'¹ od wyizolowanego polipeptydu TPO.

29. Sposób według zastrz. 27, znamienny tym, że zawiera dwa dodatkowe etapy, przy czym poszczególne etapy obejmują:

1. Polipeptyd TPO lub jego pochodna, o aktywności biologicznej swoiście stymulującej lub zwiększającej produkcję płytek krwi, zawierający sekwencję aminokwasów 1 do 332 SEQ ID nr 6 lub jej modyfikację.

2. Polipeptyd TPO według zastrz. 1, konwalencyjnie związany z polimerem, korzystnie z glikolem polietylenowym.

3. Polipeptyd TPO według zastrz. 1 albo 2, zawierający dodatkowo aminokwas Met^-Lys’¹.

4. Polipeptyd TPO według zastrz. 1 albo 2, zawierający dodatkowo aminokwas Mef¹.

5. Polipeptyd TPO według zastrz. 1 albo 2, zawierający dodatkowo aminokwas Gly'¹.

6. Polipeptyd TPO według zastrz. 1, zawierający dojrzałą sekwencję aminokwasów SEQ ID nr 2, 4 lub 6.

7. Pochodna polipeptydu TPO według zastrz. 1, składająca się z sekwencji aminokwasów 1 do 163 SEQ ID nr 6.

8. Pochodna polipeptydu TPO według zastrz. 1, składająca się z sekwencji aminokwasów 1 do 232 SEQ ID nr 6.

9. Pochodna polipeptydu TPO według zastrz. 1, składająca się z sekwencji aminokwasów 1 do 151 SEQID nr 6.

10. Pochodna polipeptydu TPO według zastrz. 1, wybrana z grupy składającej się z [Thr³³, Thr³³³’, Ser³³⁴, Ile³³⁵, Gly³³⁶, Tyr³³⁷, Pro³³⁸, Tyr³³⁹, Asp³⁴⁰, Val³⁴¹, Pro³⁴², Asp³⁴³, Tyr³⁴⁴, Ala³⁴³, Gly³⁴⁶, Val³⁴⁷, His³⁴⁸, His³⁴⁹, His³⁵⁰, His³⁵¹, His³⁵², His³⁵³]TPO i [Asn²⁵, Lys²³¹, Thr³³³, Ser³³⁴, Ile³³⁵, Gly³³⁶, Tyr³³⁷, Pro³³⁸, Tyr³³⁹, Asp³⁴⁰, Val³⁴¹, Pro³⁴², Asp³⁴³, Tyr³⁴⁴, Ala³⁴⁵, Gly³⁴⁶, Val³⁴⁷, His³⁴⁸, His³⁴⁹, His³⁵⁰, His³⁵¹, His³⁵², His³⁵³]TPO.

11. Pochodna polipeptydu TPO według, zastrz. 1, wybrana z grupy składającej się z [Asn²⁵]TPO i [Thr³³]TPO.

12. Pochodna polipeptydu TPO według zastrz. 7, wybrana z grupy składającej się z [AHis³³]TPO (1-163), [AArg¹¹⁷]TPO (1-163) i [AGly¹¹⁶]TPO (1-163).

13. Pochodna polipeptydu TPO według zastrz. 7, wybrana z grupy składającej się z [His³³, Thr³³', Pro³⁴]TPO (1-163), [His³³, Ala³³', Pro³⁴]TPO (1-163), [His³³, Gly³³', Pro³⁴, Ser³⁸]TPO (1-163), [Gly¹¹⁶, Asn¹¹⁶', Arg¹¹⁷]TPO (1-163), [Gly¹¹⁶, Ala¹¹⁶', Argll7]TPO (1-163), [Gly¹¹⁶, Gly¹¹⁶', Arg¹¹⁷jTPO (1-163) i [Ala¹, Val³]TPO (1-163).

14. Pochodna polipeptydu TPO według zastrz. 7, wybrana z grupy składającej się z [Ala¹, Val³, Arg¹²⁹]TPO (1-163), [Ala¹, Val³, Arg¹³³]TPO (1-163), [Ala¹, Val³, Arg¹⁴³]TPO (1-163), [Ala¹, Val³, Leu⁸²]TPO (1-163), [Ala¹, Val³, Leu¹⁴⁶]TPO (1-163), [Ala¹, Val³, Pro¹⁴⁸]TPO (1-163), [Ala¹, Val³, Arg⁵⁹]TPO (1-163) i [Ala¹, Val³, Arg¹¹⁵]TPO (1-163).

15. Pochodna polipeptydu TPO według zastrz. 7, wybrana z grupy składającej się z [Arg¹²⁹]TPO (1-163), [Arg¹³³]TPO (1-163), [Arg¹⁴³]TPO (1-163), [Leu⁸²]TPO (1-163), [Leu¹⁴⁶]TPO (1-163), [Pro¹⁴⁸]TPO (1-163), [Arg⁵⁹]TPO (1-163) i [Arg¹¹⁵]TPO (1-163).

16. Pochodna polipeptydu TPO według zastrz. 1, albo 7, albo 8, albo 9, albo 10, albo 11, albo 12, albo 13, albo 14, albo 15, zawierająca dodatkowo aminokwas Met^-Lys'¹.

179 884

17. Pochodna polipeptydu TPO według zastrz. 1, albo 7, albo 8, albo 9, albo 10, albo 11, albo 12, albo 13, albo 14, albo 15, zawierająca dodatkowo aminokwas Met'¹.

18. Pochodna polipeptydu TPO według zastrz. 1, albo 7, albo 8, albo 9, albo 10, albo 11, albo 12, albo 13 , albo 14, albo 15, zawierająca dodatkowo aminokwas Gly’¹.

19. Pochodna polipeptydu TPO według zastrz. 1, albo 7, albo 8, pozbawiona od 1 do 6 aminokwasów amino-końcowych.

20. Pochodna polipeptydu TPO według zastrz. 19, zawierająca dodatkowo aminokwas MeU-Lys'¹.

21. Pochodna polipeptydu TPO według zastrz. 19, zawierająca dodatkowo aminokwas Met’¹.

22. Pochodna polipeptydu TPO według zastrz. 19, zawierająca dodatkowo aminokwas Gly’¹.

23. DNA kodujący polipeptyd TPO lub jego pochodne, charakteryzujące się aktywnością biologiczną swoiście stymulującą lub zwiększającą produkcję płytek krwi, zawierający sekwencję nukleotydów kodującą pozycję sekwencji aminokwasów polipeptydu TPO lub jego pochodnych według SEQ ID nr 2,4 lub 6, a także według częściowych, nie naruszających aktywności biologicznej, modyfikacji tych sekwencji.

24. DNA według zastrz. 23, zawierający sekwencję nukleotydów kodującą pozycję sekwencji aminokwasów 1 do 332, a w tym także 1 do 232,1 do 163 SEQ ID nr 6, jak również ich sekwencji bez 1 - 6 aminokwasów amino-końcowych, lub też 1 do 151 SEQ ID nr 6, przy czym polipeptyd TPO lub jego pochodne mogą dodatkowo zawierać aminokwas MeU-Lys’¹, Met’¹ lub Gly’¹.

25. Sekwencja DNA i/lub genomowego DNA i/lub syntetycznego DNA, zapewniająca ekspresję polipeptydu TPO lub jego pochodnych, charakteryzujących się aktywnością biologiczną swoiście stymulującą lub zwiększającą produkcję płytek krwi, wybrana z grupy składającej się z:

a) sekwencji DNA według SEQIDnr 194,195,196 lub ich łańcuchów komplementarnych, oraz

b) sekwencji DNA, które hybrydyzując w ściśle określonych warunkach, tworzą sekwencje DNA określone w (a) lub ich fragmenty; oraz

c) sekwencji DNA mogących hybrydyzować do sekwencji DNA określonych w (a) lub (b), powodując przy tym degenerację w sekwencji nukleotydów.

26. Sekwencja cDNA, zapewniająca ekspresję polipeptydu TPO lub jego pochodnych, charakteryzujących się aktywnością biologiczną swoiście stymulującą lub zwiększającą produkcję płytek krwi, wybrana z grupy składającej się z:

a) sekwencji DNA według SEQ ID nr 194,195,196 lub ich łańcuchów komplementarnych; oraz

b) sekwencji DNA, które hybrydyzując w ściśle określonych warunkach, tworzą sekwencje DNA określone w (a) lub ich fragmenty; oraz

c) sekwencji DNA mogących hybrydyzować do sekwencji DNA określonych w (a) lub (b) powodując przy tym degenerację w sekwencji nukleotydów.

27. Sposób otrzymywania polipeptydu TPO, zawierającego sekwencję aminokwasów 1 do 332 SEQ ID nr 6 i charakteryzującego się aktywnością biologiczną swoiście stymulującą lub zwiększającą produkcję płytek krwi, znamienny tym, że jego realizację prowadzi się w co najmniej dwóch następujących etapach:

3 5. Preparat według zastrz. 33, znamienny tym, że pochodna polipeptydu TPO składa się z sekwencji aminokwasów 1 do 163 lub 1 do 232 lub 1 do 151 SEQ ID nr 6 i/lub dodatkowo zawiera aminokwas MeU-Lys'¹ i/lub Met'¹ i/lub Gly'¹.

* * *