CN112029000A - 鸭干扰素α融合蛋白在制备抗鸭1型肝炎病毒的药物中的用途 - Google Patents

鸭干扰素α融合蛋白在制备抗鸭1型肝炎病毒的药物中的用途 Download PDF

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Abstract

本发明公开了鸭干扰素α融合蛋白在制备抗鸭1型肝炎病毒的药物中的用途，鸭干扰素α融合蛋白ELP‑DuIFNα是由类弹性蛋白多肽ELP和鸭干扰素α的蛋白氨基端融合得到的融合蛋白。表达的ELP‑DuIFNα安全无毒，半衰期长，在体内外均具有较强的抗病毒活性，可作为防治鸭病毒性肝炎的后备生物药物进一步研究。

Description

鸭干扰素α融合蛋白在制备抗鸭1型肝炎病毒的药物中的用途
技术领域
本发明属于兽药技术领域，具体涉及一种鸭干扰素α融合蛋白对鸭1型肝炎病毒的抗病毒作用，从而制备抗鸭1型肝炎病毒的药物。
背景技术
中国是世界水禽第一生产与消费大国，规模化鸭场近些年也在持续稳步增长，但是鸭的病毒性传染病却是困扰养鸭业的一大难题。鸭病毒性肝炎(DVH)是引起雏鸭致死的重要疫病之一，其病原为1型鸭肝炎病毒(DHAV-1)，主要攻击4周龄以内的雏鸭，致死率可高达90％。免疫接种是防治DHAV-1感染的主要方法，但变异毒株的出现降低了免疫效率甚至导致免疫失败，因此急需寻找防制DVH的新方法。
干扰素(Interferon,IFN)是一类具有广谱抗病毒、抗肿瘤和免疫调节等多种生物学功能的糖蛋白，主要有I型和II型，IFN-α属于Ⅰ型干扰素，其抗病毒活性在整个干扰素家族中最为突出。鸭IFN-α(DuckAlpha Interferon，DuIFNα)首次于1995年由Schultz等成功克隆，随后，相继有学者克隆出了不同品种鸭的IFN-α基因。
但是天然DuIFN-α来源有限、重组干扰素也存在表达量低、纯化难、半衰期短、活性低等缺点，尤其是半衰期短这一缺点，限制了DuIFNα的后续开发。聚乙二醇(PEG)法和人血清白蛋白(HSA)结合法，这两种延长半衰期的方法已被用于重组人IFN的制备并在临床得以应用。但是，聚乙二醇化存在效率低、临床疗效差、副作用明显等缺点，人血清白蛋白 (HSA)结合法虽然疗效好、副作用小，但是价格昂贵。如何降低DuIFN-α的纯化难度、延长DuIFN-α的半衰期并提高其功效是本领域技术人员需要解决的技术问题。
类弹性蛋白多肽(Elastin-like polypeptide，ELP)是一类根据体内弹性蛋白重复序列合成的五肽聚合物，具有温度敏感的可逆相变特性，外加其免疫原性低、生物相容性好而常被用于蛋白纯化和药物传递。因此，本发明将ELP应用于DuIFNα的纯化和半衰期延长，开展 ELP-DuIFNα对DHAV-1抗病毒作用研究。
发明内容
针对背景技术提出的技术问题，本发明的目的在于提供一种鸭干扰素α融合蛋白ELP- DuIFNα及其应用。
本发明的另一目的在于提供一种鸭干扰素α融合蛋白ELP-DuIFNα表达载体。
本发明的另一目的在于提供一种密码子优化的鸭干扰素α基因。
本发明的目的可以通过以下技术方案实现：
一种鸭干扰素α融合蛋白ELP-DuIFNα，它是由类弹性蛋白多肽ELP和鸭干扰素α的蛋白氨基端融合得到的融合蛋白。
上述的鸭干扰素α融合蛋白ELP-DuIFNα的制备方法为：依据大肠杆菌密码子的偏好性合成如SEQ ID NO：1所示的DuIFNα基因并在两端引入XhoI和SacI，合成的DuIFNα经XhoI和SacI双酶切，与同样经XhoI和SacI双酶切的pET30a-ELP载体连接后筛选得到重组载体pET30a-ELP-DuIFNα，将重组载体pET30a-ELP-DuIFNα转化感受态表达菌株获得表达工程菌，并进行诱导表达、纯化蛋白、去除内毒素得到融合蛋白ELP-DuIFNα。所述的表达菌株为BL21。
一种密码子优化的鸭干扰素α基因，其具有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。
一种鸭干扰素α融合蛋白ELP-DuIFNα表达载体，该表达载体的构建方法为：依据大肠杆菌密码子的偏好性合成如SEQ ID NO：1所示的DuIFNα基因并在两端引入XhoI和SacI，合成的DuIFNα经XhoI和SacI双酶切，与同样经XhoI和SacI双酶切的pET30a-ELP载体连接后筛选得到重组载体pET30a-ELP-DuIFNα。
含有上述鸭干扰素α融合蛋白ELP-DuIFNα表达载体的转基因细胞系或表达工程菌。
上述的鸭干扰素α融合蛋白ELP-DuIFNα在制备防治鸭病毒性肝炎药物中的用途。
上述的鸭干扰素α融合蛋白ELP-DuIFNα在制备抗鸭1型肝炎病毒的药物中的用途。
上述药物的给药方式优选为灌服给药。
本研究将DuIFN-α与ELP融合表达，旨在借助ELP能作为体内药物传送载体，克服鸭α-干扰素分子量较小，容易被蛋白酶降解和肾脏排出，体内半衰期短，不能发挥持久疗效的缺点，以达到稳定并缓释蛋白，延长ELP-DuIFNα半衰期，减少用药次数，降低应用成本的目的。从研究结果看，重组DuIFN-α在小鼠和雏鸭血浆中的半衰期均长于以往报道的12-25h，约为48h，在雏鸭体内半衰期可以达到60h，每48h给予一次干扰素即可有效保护动物免受病毒的攻击。重组ELP-DuIFNα可在细胞上表现出较高的抗病毒活性；在体内，可延缓发病时间，保护雏鸭免受DHAV-1感染，保护率可达到80％；而胚体回归试验及多重PCR检测结果，则进一步证实了重组ELP-DuIFNα对病毒的高效抑制作用。这一研究结果为重组鸭干扰素制剂研发，预防鸭其他疫病，降低养鸭业经济损失奠定了基础。
本发明的有益效果：
本发明的融合蛋白ELP-DuIFNα安全无毒，半衰期长，在体内外均具有较强的抗病毒活性，可作为防治鸭病毒性肝炎的后备生物药物进一步研究。
附图说明
图1为ELP与DuIFNα不同融合顺序的结果。
图2为纯化后ELP-DuIFNα的SDS-PAGE鉴定。
其中，M：Protein Marker；1：纯化的ELP-DuIFNα。
图3为未插入ELP的pET30a-DuIFNα载体的表达结果。
其中，M：Protein Marker；1：pET30a-DuIFNα上清；2：pET30a-DuIFNα沉淀；3：pET30a空载体对照。
图4为ELP-DuIFNα的体外半衰期分析图。
图5为ELP-DuIFNα在鸭体内的半衰期分析图。
图6为肝脏对比图。
图7为胚体及肝脏比对图。
图8为多重PCR鉴定结果图。
其中，M:1kb DNALadder；1-7:分别为试验组编号对应的尿囊液；8:已知DHAV-1；9:生理盐水。
具体实施方式
以下通过具体试验例对本发明进行进一步解释说明：
实施例1
1.材料与方法
1.1主要试剂
限制性内切酶XhoI和SacI、T4 DNA连接酶、1kb DNA Marker购自Fermentas公司；质粒小量提取试剂盒、胶回收试剂盒、Viral RNA/DNAExtraction Kit均购自TaKaRa公司；预染Protein分子量Marker购自生工生物工程(上海)股份有限公司；DMEM培养基、FM 培养基、胰酶、胎牛血清购自Thermo Fisher Scientific公司；MTS检测试剂盒、BCA蛋白定量检测试剂盒、SDS PAGE凝胶电泳试剂盒、Tris-Gly电泳缓冲液购自康为世纪有限公司。
1.2主要生物材料及试验动物
DH5α、BL21(DE3)大肠杆菌感受态细胞购自康为世纪公司；如SEQ ID NO：1所示的DuIFNα基因由生工生物工程(上海)股份有限公司合成；pET30a-ELP载体和VSV(水疱性口炎病毒)由扬州大学孙怀昌教授惠赠；pET30a-ELP载体的构建过程在公开文献 (Banki etal.,2005)中已经公开，本领域技术人员根据现有技术中公开的内容可以很容易获得pET30a-ELP载体。
鸭成纤维细胞(DEF)、犬肾细胞(MDCK)由江苏省兽用生物制药高技术研究重点实验室保存；DHAV-1(SH株)由中国农业科学院上海兽医研究所惠赠(公开于江苏农业科学2015年8期“鸭甲型肝炎病毒1型3C基因的原核表达与多抗的制备”)；4周龄雄性BALB/c 小鼠购于扬州大学比较医学中心；1日龄非免樱桃谷鸭购于泰州某鸭场。
1.3基因序列的设计与克隆
参考GenBank中已经发表的鸭α-干扰素基因序列(登录号：DQ861429)，生工生物工程 (上海)股份有限公司依据大肠杆菌密码子的偏好性合成如SEQ ID NO：1所示的DuIFNα基因并在两端引入XhoI和SacI。合成的DuIFNα经XhoI和SacI双酶切后，与同样经XhoI 和SacI双酶切的pET30a-ELP载体连接。16℃过夜后，采用热激法将连接产物转入DH5α感受态细胞，进行重组克隆的筛选。将经XhoI和SacI双酶切鉴定正确的重组克隆送生工生物工程(上海)股份有限公司进行序列测定，得到pET30a-ELP-DuIFNα。
ELP与DuIFNα不同融合顺序：在构建重组序列时，ELP与目的蛋白的N端(氨基端)或C端(羧基端)融合位置的选择主要取决于目的蛋白自身的表达量(如图1所示)。本研究预实验摸索ELP分别与重组鸭干扰素氨基端、羧基端融合之后的表达量，从而确定最优构建序列的先后顺序。pET30a-DuIFNα-ELP的构建过程为：依据大肠杆菌密码子的偏好性优化序列合成DuIFNα基因并在两端引入NdeI和BamHI(具体序列除两端酶切位点外与 SEQ ID NO：1相同)，合成的DuIFNα经NdeI和BamHI双酶切后，与同样经NdeI和 BamHI双酶切的pET30a-ELP载体连接筛选得到pET30a-DuIFNα-ELP。
以未插入ELP的pET30a-DuIFNα重组载体作为对照：构建pET30a-DuIFNα重组载体，生工生物工程(上海)股份有限公司依据大肠杆菌密码子的偏好性合成如SEQ ID NO：1所示的DuIFNα基因并在两端引入BamHI和NdeI。合成的DuIFNα经BamHI和NdeI双酶切后，与同样经BamHI和NdeI双酶切的pET30a载体连接。16℃过夜后，采用热激法将连接产物转入DH5α感受态细胞，进行重组克隆的筛选。将经BamHI和NdeI双酶切鉴定正确的重组克隆送生工生物工程(上海)股份有限公司进行序列测定，得到pET30a--DuIFNα。
1.4重组干扰素表达与纯化
参考文献方法进行pET30a-DuIFNα-ELP、pET30a-ELP-DuIFNα、pET30a-DuIFNα的诱导表达[17]，表达菌株为BL21，然后借助ELP的可逆相变特性，参考文献[18]运用ITC法纯化蛋白并用Triton X-114法去除内毒素，最后用10％SDS-PAGE胶分析蛋白纯度。蛋白经BCA 法测定后，0.22μm滤器过滤除菌，-80℃保存备用。
1.5重组干扰素安全性评价试验
1.5.1细胞毒性试验
将MDCK和DEF分别接种于96孔板，待细胞生长状态良好时每孔接入100μl由 DMEM和FM培养基10倍梯度稀释的重组蛋白ELP-DuIFNα(n＝6)，置于37℃、5％CO2的细胞培养箱培养，记录细胞生长变化情况。同时设不加蛋白的细胞为对照组。72h后用 MTS法检测各孔OD490nm值(n＝3)，参考文献方法[19]，根据生长抑制率(％)＝(对照组 OD490nm值-蛋白组OD490nm值)/对照组OD490nm值×100％，判断ELP-DuIFNα对MDCK、 DEF生长情况的影响。
1.5.2雏鸭毒性试验
参考文献描述的方法[20]，将45只4日龄的非免疫樱桃谷鸭随机分为空白对照组、足够剂量干扰素组(160μg/kg)和10倍稀释干扰素组，每组15只。干扰素通过灌服给药，空白对照组正常喂养。观察并记录鸭子的采食量、粪便形态、精神状态，同时测定体温。
1.6重组干扰素半衰期测定
参考文献报道的细胞病变试验法[13]，测定重组干扰素ELP-DuIFNα的体内外半衰期。即，将50％的BALB/c小鼠或樱桃谷鸭血浆与终浓度为10μg/ml的ELP-DuIFNα混匀，37℃水浴 0h、0.25h、0.5h、1h、3h、6h、12h、24h、48h后，在MDCK-VSV系统中根据细胞生长情况检测各时段血浆中干扰素的抗病毒活性(n＝3)，以判断体外半衰期；或者，检测非免疫樱桃谷鸭灌服ELP-DuIFNα后0h、6h、12h、24h、36h、48h、72h、96h的血浆在MDCK-VSV 系统中的抗病毒活性，以判断体内半衰期。设未加ELP-DuIFNα的血浆做空白对照。
1.7重组干扰素的体外抗病毒活性检测
1.7.1 VSV、DHAV-1 TCID50测定
参考中国兽药典有关TCID50测定方法要求[21]，将MDCK细胞和DEF细胞分别接种于96孔板，待细胞长成单层后，每孔接入100μl由DMEM和FM培养基10倍梯度稀释的 VSV(n＝6)。置于37℃、5％CO2细胞培养箱培养2h后弃掉细胞培养液，每孔接入100μl含 2％FBS的细胞维持液继续培养，同时设置不加病毒的细胞作为阴性对照。记录细胞病变情况，直至细胞状态不再变化时，根据Read-Muench法计算VSV的TCID50。同样的方法测定 DHAV-1在DEF细胞中的TCID50。
1.7.2抗病毒活性检测
待MDCK细胞和DEF细胞长成单层后，每孔分别加入10倍梯度稀释的ELP-DuIFNα (n＝6)，37℃、5％CO2条件下共孵育12h后弃掉培养液，再接入100TCID50的VSV；同时设蛋白对照组(只加ELP-DuIFNα)、病毒对照组(只加VSV)和细胞对照组(不加ELP- DuIFNα，也不加VSV)。24h后，以病毒对照组75％以上的细胞出现病变、试验组50％以上细胞不发生病变的最高稀释度作为一个活性单位(U)，根据Read-Muench法计算ELP- DuIFNα的抗病毒活性(n＝3)。同样的方法测定ELP-DuIFNα在DEF细胞中对DHAV-1的抗病毒活性(n＝3)。
1.8 DHAV-1的LD50测定
参考中国兽药典有关LD50测定方法要求[21]，将40只4日龄的樱桃谷鸭平均分为4组，分别按100μL/只的剂量灌服DHAV-1原液、10-1稀释液、10-2稀释液、10-3稀释液，观察并记录攻毒前后鸭的采食量、精神状态、体温、粪便等指标，记录出现DHAV-1典型发病症状 (精神沉郁、粪便稀软、嗜睡、抽搐、身体呈弩弓状)的数量、时间，并计算DHAV-1的 LD50。
1.9重组干扰素体内抗病毒试验
将35只4日龄的樱桃谷鸭平均分为7组，分别按表1的方式进行试验：其中DHAV-1的感染剂量是100LD50，ELP-DuIFNα的剂量按160μg/kg给予，每2d/次，连续3次。观察每组雏鸭的采食量、粪便形态、精神状态，同时测定体温，并记录每组病死鸭的数量、时间。采集病死鸭肝脏并观察病变情况。
表1体内抗病毒试验分组情况
Figure BDA0002649676690000051
Figure BDA0002649676690000061
1.10胚体回归试验
参考文献报道方法[20]，将25只9日龄SPF鸡胚分为空白对照组、阳性对照组、先药后毒组、先毒后药组和药毒同时组，分别经尿囊腔接种生理盐水和1.9中所有试验组鸭的灭菌肝脏悬液，100μl/只。观察并记录病死胚体的时间和数量，并比较胚体的大小和肝脏病变情况。收集未死亡胚的尿囊液，并按上述方法继续在9日龄SPF鸡胚上盲传3代，最后收集第3代鸡胚尿囊液。
1.11 PCR检测分析
按照病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒说明书，提取1.10中病死胚及未死胚盲传后第3 代胚的尿囊液总RNA，反转录后参考本实验室已经建立的多重PCR方法进行检测[22]，PCR 产物经1.2％的琼脂糖电泳鉴定分析。同时设生理盐水为阴性对照，已知DHAV-1为阳性对照。
2.结果
2.1重组干扰素纯化结果
SDS PAGE法检测经ITC法纯化的重组蛋白ELP-DuIFNα，结果如图2：在80ku处出现清晰的单一目的条带，纯度达90％以上。BCA法测得ELP-DuIFNα的浓度为2.2μg/μl，每升菌液的蛋白产量约为220mg，回收率达96％。
本研究预实验摸索ELP分别与重组鸭干扰素氨基端、羧基端融合之后的表达量，从而确定最优构建序列的先后顺序。结果表明：重组ELP-DuIFNα表达量较高且大部分可溶表达，通过ITC技术得到大量目的蛋白。因此本研究最终选择ELP与目的蛋白氨基端融合(即ELP-DuIFNα)为最优序列。以上表达结果推测可能是由于鸭干扰素自身表达量很低，将 ELP与目的蛋白氨基端融合，由于ELP可以在大肠杆菌中大量表达，借助ELP是高度可溶的蛋白，利用这一特性，先表达ELP再表达目的蛋白，进而实现促进外源蛋白的可溶性表达。DuIFNα-ELP可溶性目的蛋白含量较少，ELP-DuIFNα可溶性目的蛋白含量较多。说明 ELP和DuIFNα的融合顺序显著影响可溶性目的蛋白的表达量。
以未插入ELP的pET30a-DuIFNα重组载体作为对照的结果如图3所示：(1)pET30a-ELP-DuIFNα-BL21重组表达菌株能够表达，蛋白的产量约220mg/L，目的蛋白大小83kDa，且上清中的含量较多，而pET30a-ELP空载体对照在相应大小处没有出现条带；(2) pET30a-DuIFNα-BL21经诱导后蛋白主要是包涵体，蛋白产量约100mg/L，目的蛋白约 18.5kDa，pET30a空载体对照在相应大小处没有出现条带。说明ELP能够促进重组干扰素的可溶性表达。
将ELP与DuIFNα进行融合获得的ELP-DuIFNα融合蛋白能够：(1)促进可溶性表达；
(2)简化纯化(加入盐离子、经离心可以得到较纯的蛋白)；(3)延长重组干扰素半衰期。
2.2重组干扰素安全性评价结果
将梯度稀释的ELP-DuIFNα分别作用于MDCK和DEF上，72h后用MTS法检测细胞活性，并计算细胞生长抑制率。结果显示不同浓度的ELP-DuIFNα对细胞的生长抑制率为0，细胞能正常增殖。同时，雏鸭毒性试验结果也显示：灌服ELP-DuIFNα组和空白对照组的雏鸭均采食正常、粪便成型、精神状态良好，体温均在正常范围，重组蛋白安全无毒性。
2.3重组干扰素半衰期
通过干扰素在MDCK-VSV系统中的抗病毒活性检测判断ELP-DuIFNα在BALB/c小鼠和樱桃谷鸭血浆中的半衰期，结果如图4所示：重组ELP-DuIFNα在24h内一直保持较强的抗病毒活性，直至48h时活性仍大于50％，体外半衰期达48h。
同样在MDCK-VSV系统中检测灌服ELP-DuIFNα后不同时间点的鸭的抗凝血抗病毒活性，结果如图5：灌服ELP-DuIFNα后24h时抗病毒活性达到50％，之后活性持续上升， 36h时达到高峰，之后随时间延长活性逐渐降低，60h时降至50％，表明重组干扰素在体内半衰期约为60h。
2.4重组干扰素体外抗病毒活性
根据Read-Muench计算法则，VSV在MDCK细胞上的TCID50为10-6.83/0.1ml，在DEF 细胞上的TCID50为10-6.17/0.1ml；DHAV-1在DEF细胞上的TCID50为10-5.36/0.1ml。
细胞病变抑制法检测重组ELP-DuIFNα在不同细胞中的抗病毒活性，可见细胞对照组和蛋白对照组的细胞生长良好，而病毒对照组细胞病变明显，抗病毒试验组的细胞状态明显优于病毒对照组。经Read-Muench法计算，ELP-DuIFNα在不同系统中的抗病毒活性与比活性如表2，在DEF-VSV中的活性比MDCK-VSV中的高1个数量级，在DEF-DHAV-1中的活性略低，在MDCK和DEF上均具有抗病毒活性。
表2.ELP-DuIFNα体外抗病毒活性检测结果
Figure BDA0002649676690000071
2.5最佳给药途径
根据Read-Muench计算法则，DHAV-1在雏鸭体内的LD50为10-3.318/0.1ml。按照每只雏鸭灌服100LD50进行试验，结果如表3：阳性对照组的雏鸭48h内陆续出现精神沉郁、厌食、抽搐、身体呈弩弓状等临床症状，72h内全部死亡；肌注给药组有2只鸭在72h后出现临床症状并死亡，保护率为60％；灌服给药组仅有1只鸭在96h后出现临床症状并死亡，保护率为80％；空白对照组无死亡。表明重组蛋白可以延缓雏鸭发病甚至完全保护雏鸭感染，灌服给药方式优于肌注给药。采集病死鸭的肝脏，可见有明显出血点和坏死灶，如图6。
表3最佳给药途径分析
Figure BDA0002649676690000072
Figure BDA0002649676690000081
2.6重组干扰素体内抗病毒试验结果
以灌服给药方式进行雏鸭抗病毒试验，10d后统计结果见表4：阳性组雏鸭在48h内开始出现精神沉郁，厌食，头颈向后仰等临床症状，72h内全部死亡，病死鸭肝脏有明显的出血点和坏死灶；正常喂养的空白对照组精神状态、生长状态良好；先药后毒组和先毒后药组分别在72h起开始部分出现临床症状，先药后毒组、先毒后药组、药毒同时组的保护率分别为：60％、80％、80％。
表4.ELP-DuIFNα体内抗病毒试验结果
Figure BDA0002649676690000082
2.7胚体回归试验结果分析
将试验组鸭的肝脏研磨成匀浆后分别作100倍、1000倍稀释，并接种鸡胚。鸡胚病死情况见表5：接种了阳性组肝脏匀浆原液的鸡胚4d内全部死亡，100倍、1000倍稀释的胚体7d内全部死亡，死胚的胚体侏儒，且肝脏呈墨绿色；抗病毒试验组的胚体均未见死亡， 8d时处理未死的鸡胚，结果如图7及表5：与生理盐水对照组相比，胚体发育正常，仅有少数胚体肝脏有轻微出血。
表5.胚体回归试验结果
Figure BDA0002649676690000083
Figure BDA0002649676690000091
2.7 PCR鉴定结果
用实验室已经建立的多重PCR检测病死胚及未死胚盲传后第3代胚的尿囊液，PCR产物检测结果如图8所示：所有病死胚体尿囊液均可扩增出单一的360bp条带，与预期的检测条带一致，而经过3代盲传的尿囊液未扩增后任何条带。
3.讨论
由于目的蛋白的可溶性表达和纯化回收效率受多种因素，如外源蛋白所含疏水性氨基酸的数量、外源蛋白自身表达量以及外源蛋白跟ELP的融合顺序等的影响，所以在预试验中尝试将鸭干扰素(DuIFN-α)分别与ELP的C端和N端融合表达。结果显示，ELP的C端与DuIFN-α融合能较好地表达可溶性重组蛋白并便于ITC法纯化。本研究采用ELP C端融合方式获得的重组蛋白ELP-DuIFNα，不仅纯化简单、纯度好(大于达90％)、回收率高 (96％)、每升菌液的蛋白产量可达220mg，而且蛋白的的抗病毒活性最高达到 1.25×107U/mg，充分体现了ELP的功能优势。
本研究将DuIFN-α与ELP融合表达，旨在借助ELP能作为体内药物传送载体，克服鸭α-干扰素分子量较小，容易被蛋白酶降解和肾脏排出，体内半衰期短，不能发挥持久疗效的缺点，以达到稳定并缓释蛋白，延长ELP-DuIFNα半衰期，减少用药次数，降低应用成本的目的。从研究结果看，重组DuIFN-α在小鼠和雏鸭血浆中的半衰期均长于以往报道的12-25h，约为48h，在雏鸭体内半衰期可以达到60h，每48h给予一次干扰素即可有效保护动物免受病毒的攻击。
本研究在体内抗病毒试验时，参照程俊贞的方法，比较了重组蛋白在肌肉注射和灌服给药这两种不同给药途径时的作用效果，也比较了先药后毒、先毒后药以及药毒同时三种给药方式对重组蛋白活性的影响，结果表明：重组干扰素(融合蛋白ELP-DuIFNα)与病毒同时灌服或者先毒后药的抗病毒效果较好，但是同时给药可以减少动物的应激，是最佳给药方式。同时，这一给药方式也符合临床上方便快捷的基础要求，有利于这一重组蛋白的进一步开发应用。
引起鸭发病的病毒众多，但是大部分病毒不单独致病，仅在特定条件下才会让感染鸭表现出临床症状。而1型鸭肝炎病毒(DHAV-1)是一种可单独致雏鸭病死的病毒，主要侵害 4周龄以内的雏鸭，特别是不足1周龄的雏鸭最易感染，死亡率高达90％，是引起水禽疫病的代表性病毒。本研究选取DHAV-1为研究对象，评估重组ELP-DuIFNα的抗病毒作用，也具有代表性。为分析长效鸭干扰素α(DuIFNα)对鸭1型肝炎病毒(DHAV-1)的抗病毒作用，本研究对去除内毒素的原核表达产物ELP-DuIFNα进行可逆相变循环(ITC)纯化，和体内、体外安全性评价试验及半衰期检测；在MDCK和DEF上检测其对VSV的抗病毒活性，在 DEF和雏鸭体内分析其对DHAV-1的抗病毒活性；然后借助胚体回归试验和多重PCR方法验证ELP-DuIFNα的抗病毒活性。实验结果表明：纯化的ELP-IFNα纯度达90％以上，对细胞和雏鸭均没有毒副作用，体外半衰期达48h，体内半衰期可达60h，在MDCK-VSV、 DEF-VSV和DEF-DHAV-1系统中的抗病毒活性分别为1.25×106U/mg、1.25×107U/mg和 6.0×104U/mg，每48h给予一次ELP-DuIFNα即可有效保护DHAV-1对雏鸭的攻击，保护率大于80％。结果也显示，动物试验的最佳给药方式为灌服给药。
本发明研究结果表明：重组ELP-DuIFNα可在细胞上表现出较高的抗病毒活性；在体内，可延缓发病时间，保护雏鸭免受DHAV-1感染，保护率可达到80％；而胚体回归试验及多重 PCR检测结果，则进一步证实了重组ELP-DuIFNα对病毒的高效抑制作用。这一研究结果为重组鸭干扰素制剂研发，预防鸭其他疫病，降低养鸭业经济损失奠定了基础。
参考偏爱密码子优化后的干扰素序列：
TGCTCTCCGCTGCGTCTGCACGACTCTGCTTTCGCTTGGGACTCTCTGCAGCTGCTGCGT AACATGGCTCCGTCTCCGACCCAGCCGTGCCCGCAGCAGCACGCTCCGTGCTCTTTCCC GGACACCCTGCTGGACACCAACGACACCCAGCAGGCTGCTCACACCGCTCTGCACCTG CTGCAGCACCTGTTCGACACCCTGTCTTCTCCGTCTACCCCGGCTCACTGGCTGCACAC CGCTCGTCACGACCTGCTGAACCAGCTGCAGCACCACATCCACCACCTGGAACGTTGCT TCCCGGCTGACGCTGCTCGTCTGCACCGTCGTGGTCCGCGTAACCTGCACCTGTCTATCA ACAAATACTTCGGTTGCATCCAGCACTTCCTGCAGAACCACACCTACTCTCCGTGCGCTT GGGACCACGTTCGTCTGGAAGCTCACGCTTGCTTCCAGCGTATCCACCGTCTGACCCGT ACCATGCGTGGCGCGCCG
【参考文献】
[1]高华.鸭病流行呈现出的新特点及预防策略[J].吉林畜牧兽医,2018,39(10):30,32.
[2]DuH.,Bai J.,WangJ.,He M.,etal.Assessment ofthehepatocyteprotective effects ofgypenoside and its phos phorylated derivativeagainst DHAV- 1infection onduckembryonic hepatocytes.BMC VeterinaryResearch,2019,15(1):134-145.
[3]Gao Pei,Xiang Bin,Li Yulian,et al.Therapeutic Effect of DuckInterferon- AlphaAgainstH5N1 Highly Pathogenic Avian InfluenzaVirus Infectionin Peking Ducks.[J].Journal ofinterfero n&cytokine research:theofficialjournal ofthe International Society for Interferon and CytokineResearch,2018, 38(4):145-152.
[4]Narayan R,Buronfosse T,Schultz U,et al.Rise in gamma interferonexpression during resolution ofduckhep atitis B virus infection.[J]GenVirol.2006Nov；87(Pt 11):3225-3232.
[5]Schultz U,Summers J,Staeheli P,et al.Elimination of duck hepatitisB virus RNA- containingcapsids in duckinterferon-alpha-treatedhepatocytes.[J]Virol.1999Jul；73(7):5459-5465.
[6]高佩,黎玉莲,李亚玲,等.鸭干扰素研究进展与应用[J].养禽与禽病防治,2016,02:6-9.
[7]夏春,万建青,吴志光,等.北京鸭Ⅰ型干扰素基因分子克隆与序列分析[J].畜牧兽医学报,2000,06:567- 570.
[8]阮小飞,林常有,杨天耀,等.北京鸭干扰素-α基因的分子克隆与表达[J].中国兽医杂志,2004,12:11-13.
[9]Reddy K.R.,M.W.Modi,S.Pedder.Use of peginterferon alfa- 2a(40KD)(Pegasy)forthetreatmentofhepatitis C[J].Adv.DrugDeliv.Rev.,2002,54(4):571-586.
[10]WangY.S.,S.Yongster,M.Grace,et al.Structural andbiologicalcharacterization ofpegylated recombinant i nterferon alpha-2b anditstherapeutic applications[J].Adv.DrugDeliv.Rev.,2002,54(4):547-570.
[11]Walker A.,G.Dunlevy,D.Rycroft,et al.Anti- serum albumin domainantibodies in the development of highly potent,efficacious and long-actinginterferon[J].ProteinEng.Des.Sel.,2010,23(4):271-278.
[12]Gaberc- PorekarV.,I.Zore,B.Podobnik,et al.Obstades andpitfalls inthe PEGylation oftherapeutic proteins[J].Curr.Op in.DrugDiscov.Dev.,2008,11(2):242-250.
[13]Osborn,B.L.,Olsen,H.S.,Nardelli,B.,Murray,J.H.,Zhou,J.X.,Garcia,A.,Moody,G.,Zaritskaya,L.S.,Su ng,C.Pharmacokinetic an d pharmacodynamicstudies of a human serum albumin-interferon- alpha fusionprotein incynomolgus monkeys[J].J.Pharmacol.Exp.Ther.2002,303,540-548.
[14]Li Y.Self-cleaving fusiontags for recombinantproteinproduction[J].Biotechnol.Lett.,2011,33:869-881.
[15]Meyer D.E.,A.Chilkoti.Genetically encoded synthesis of protein-basedpolymers with precisely specifiedmolecular weight and sequence byrecursive directional ligation:example s fromthe elastin-like polypeptidesystem[J].Biomacromolecules,2002,3(2):357-367.
[16]Mackay J.A.,A.Chilkoti.Temperature sensitive peptides:engineeringhy-perthermia- directedtherapeutics[J].Int.J.Hyperthemia,2008,24:483-495.
[17]郭艳丽,朱善元,徐佳忆,等.重组鸭α-干扰素的表达与鉴定[J].中国家禽,2019,41(18):60-64.
[18]Zong Yang,Xiao Tan,Jingjing Xiao,Xinyu Zhang,Xiaoli Xia,HuaichangSun,Half- life extension of porcine interferon-a by fusion to the IgG-binding domain ofstreptococcal Gprotein.Protein Expression andPurification153(2019)53-58
[19]陈海媚,谢晓芳,彭成.中药毒理学研究中体外细胞毒性的评价指标及检测方法[J].中国实验方剂学杂志,2017,23(22):202-230.
[20]杨生梅.口服纳米二氧化钛的体外和体内安全性评价[D].石河子大学,2017.
[21]中国兽药典委员会.中华人民共和国兽药典2015版(三部)[M].北京:中国农业出版社,第5版.2016.
[22]Yongjuan Wang,Shanyuan Zhu,Weiwing Hong,Anping Wang,Weiyong Zuo Amultiplex PCR for detection ofsix viruses in ducks[J].Journal ofVirologicalMethods,2017,248(7):12-176.
序列表
<110> 南京农业大学
<120> 鸭干扰素α融合蛋白在制备抗鸭1型肝炎病毒的药物中的用途
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 492
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tgctctccgc tgcgtctgca cgactctgct ttcgcttggg actctctgca gctgctgcgt 60
aacatggctc cgtctccgac ccagccgtgc ccgcagcagc acgctccgtg ctctttcccg 120
gacaccctgc tggacaccaa cgacacccag caggctgctc acaccgctct gcacctgctg 180
cagcacctgt tcgacaccct gtcttctccg tctaccccgg ctcactggct gcacaccgct 240
cgtcacgacc tgctgaacca gctgcagcac cacatccacc acctggaacg ttgcttcccg 300
gctgacgctg ctcgtctgca ccgtcgtggt ccgcgtaacc tgcacctgtc tatcaacaaa 360
tacttcggtt gcatccagca cttcctgcag aaccacacct actctccgtg cgcttgggac 420
cacgttcgtc tggaagctca cgcttgcttc cagcgtatcc accgtctgac ccgtaccatg 480
cgtggcgcgc cg 492

Claims (8)

1.一种鸭干扰素α融合蛋白ELP-DuIFNα，其特征在于，它是由类弹性蛋白多肽ELP和鸭干扰素α的蛋白氨基端融合得到的融合蛋白。
2.根据权利要求1所述的鸭干扰素α融合蛋白ELP-DuIFNα，其特征在于，所述融合蛋白的制备方法为：依据大肠杆菌密码子的偏好性合成如SEQ ID NO：1所示的DuIFNα基因并在两端引入XhoI和SacI，合成的DuIFNα经XhoI和SacI双酶切，与同样经XhoI和SacI双酶切的pET30a-ELP载体连接后筛选得到重组载体pET30a-ELP-DuIFNα，将重组载体pET30a-ELP-DuIFNα转化感受态表达菌株获得表达工程菌，并进行诱导表达、纯化蛋白、去除内毒素得到融合蛋白ELP-DuIFNα。
3.一种密码子优化的鸭干扰素α基因，其具有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。
4.一种鸭干扰素α融合蛋白ELP-DuIFNα表达载体，其特征在于，该表达载体的构建方法为：依据大肠杆菌密码子的偏好性合成如SEQ ID NO：1所示的DuIFNα基因并在两端引入XhoI和SacI，合成的DuIFNα经XhoI和SacI双酶切，与同样经XhoI和SacI双酶切的pET30a-ELP载体连接后筛选得到重组载体pET30a-ELP-DuIFNα。
5.含有权利要求4所述鸭干扰素α融合蛋白ELP-DuIFNα表达载体的转基因细胞系或表达工程菌。
6.权利要求1所述的鸭干扰素α融合蛋白ELP-DuIFNα在制备防治鸭病毒性肝炎药物中的用途。
7.权利要求1所述的鸭干扰素α融合蛋白ELP-DuIFNα在制备抗鸭1型肝炎病毒的药物中的用途。
8.根据权利要求6或7所述的用途，其特征在于，所述药物的给药方式为灌服给药。
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Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106632682A (zh) * 2015-08-04 2017-05-10 清华大学 融合蛋白ifn-elp及其应用
CN107082814A (zh) * 2017-06-12 2017-08-22 扬州大学 一种长效干扰素及其制备方法
CN110179994A (zh) * 2019-04-30 2019-08-30 北京大学 一种温度和酶双重响应性蛋白质高分子偶联物及其制备方法与应用
CN110272480A (zh) * 2019-06-13 2019-09-24 江苏科技大学 鸭α干扰素及其突变体、制备方法和应用

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106632682A (zh) * 2015-08-04 2017-05-10 清华大学 融合蛋白ifn-elp及其应用
CN107082814A (zh) * 2017-06-12 2017-08-22 扬州大学 一种长效干扰素及其制备方法
CN110179994A (zh) * 2019-04-30 2019-08-30 北京大学 一种温度和酶双重响应性蛋白质高分子偶联物及其制备方法与应用
CN110272480A (zh) * 2019-06-13 2019-09-24 江苏科技大学 鸭α干扰素及其突变体、制备方法和应用

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ZHIHAO ZHANG等: "Anti-HBV effect of interferon-thymosin α1 recombinant proteins in transgenic Dunaliella salina in vitro and in vivo", 《EXPERIMENTAL AND THERAPEUTIC MEDICINE》 *
林衡等: "类弹性蛋白标签在重组蛋白分离纯化中的应用", 《生物技术通报》 *
王永娟等: "（"重组鸭α-干扰素的抗病毒活性"", 《江苏农业学报》 *
王永娟等: ""重组鸭γ-干扰素的表达与抗病毒活性分析"", 《中国预防兽医学报》 *
郭艳丽等: "重组鸭α-干扰素的表达与鉴定", 《中国家禽》 *

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