ES2569940T3 - Adenosina desaminasa recombinante estable - Google Patents

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Abstract

Una adenosina desaminasa recombinante, en la que un resto de aminoácido oxidable expresado en el tipo silvestre de la adenosina desaminasa se sustituye por un resto de aminoácido no oxidable; en la que el resto de aminoácido no oxidable es serina, y el resto de aminoácido oxidable es cisteína, dicha cisteína se encuentra localizada en posición 74 de la proteína de adenosina desaminasa madura.

Description

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en lugar de lisina, alanina en posición 245 en lugar de treonina; arginina en posición 351 en lugar de glicina. Por tanto, se contempla que la muteína de ADA bovina recombinante en posición 74 según la invención también pueda tener sustituciones adicionales en una o más de las posiciones indicadas o análogos de esas posiciones: Gln en lugar de Lys198; Ala en lugar de Thr245; Arg en lugar de Gly351.
En un aspecto adicional de la invención, la presente invención proporciona ADN aislados que codifican la muteína ADA que tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 3 descrita en el presente documento. También se consideran dentro del alcance de la invención otros ADN que codifican la muteína ADA con una o más sustituciones: Gln en lugar de Lys198; Ala en lugar de Thr245; Arg en lugar de Gly351.
Se puede preparar un vector de expresión adecuado a partir de ADN genómico o ADNc que codifica rhADA o rbADA, respectivamente, que opcionalmente está bajo el control de un promotor adecuado inducible conectado de forma operable. El ADN preferentemente tiene los codones optimizados para la célula huésped apropiada y mutado por cualquier procedimiento conveniente conocido en la técnica, por ejemplo, por su alta eficiencia de mutagénesis dirigida por oligonucleótidos (Olsen DB y Eckstein F, Proc Natl Acad Sci USA 87: 1451-5; 1990), síntesis de genes completos con solapamiento de oligonucleótidos largos (Vasantha N y Filpula D, Gene 76: 53-60; 1989), síntesis de genes mediada por PCR (Jayaraman K y col., Proc Natl Acad Sci USA 88: 4084-88; 1991), PCR de solapamiento por extensión (Pogulis RJ y col., Methods Mol Biol 57: 167-76; 1996).
En general, se prefieren los procariotas para la clonación inicial de secuencias de ADN y la construcción de los vectores útiles en la invención. Por ejemplo, es particularmente útil la cepa K12 MM 294 de E. coli (ATCC n.º 31446). Otras cepas microbianas que se pueden utilizar, simplemente a modo de ejemplo, incluyen cepas de E. coli tales como E. coli B y E. coli X1776 (ATCC n.º 31537). Se pueden usar las cepas mencionadas anteriormente, así como, por ejemplo, las cepas de E. coli W3110 (F-, lambda-, prototrófica, ATCC n.º 27325), K5772 (ATCC n.º 53.635), y SR101, bacilos tales como Bacillus subtilis, y otras enterobacterias tales como Salmonella typhimurium o Serratia marcesans, y diversas especies de Pseudomonas.
Generalmente, se usan vectores plasmídicos que contienen secuencias de replicón y de control que proceden de especies compatibles con la célula huésped en conexión con estos huéspedes. Los vectores plasmídicos convencionales son moléculas de doble cadena de ADN circular preferentemente diseñadas con sitios de reconocimiento de enzimas adecuados para la inserción de secuencias de ADN exógeno, un gen de antibiótico seleccionable, un origen de replicación para la propagación autónoma en la célula huésped, y un gen para la discriminación o la selección de clones que contienen ADN inserto recombinante. Los vectores plasmídicos disponibles adecuados para su uso en E. coli incluyen, por ejemplo, pET3, pET9, pET11 y la serie pET extendida (catalogado por Novagen Corporation), pBAD, trc, phoA, trp, y los plásmidos OL/R/PL/R.
Simplemente a modo de ejemplo, normalmente E. coli se transforma usando pBR322, un plásmido derivado de una especie de E. coli (véase, por ejemplo, Bolivar y col., 1977, Gene, 2: 95). pBR322 contiene genes para resistencia a ampicilina y tetraciclina y por tanto proporciona medios fáciles para identificar las células transformadas. De manera similar, los plásmidos pUC proporcionan vectores de clonación convenientes con moléculas de ADN para su selección y replicación (Yanisch-Perron, y col., 1985, Gene 33: 103-119, cuya descripción se incorpora en su totalidad en el presente documento por referencia). El plásmido pBR322, u otro plásmido o fago microbiano, también debe contener, o puede estar modificado para que contenga, promotores que el organismo microbiano puede usar para la expresión de sus propias proteínas codificadas.
Esos promotores usados más habitualmente en la construcción de ADN recombinante incluyen la beta-lactamasa (penicilinasa) y sistemas promotores de lactosa (Chang y col., 1978, Nature, 375: 615; Itakura y col., 1977, Science,
198: 1056; Goeddel y col., 1979, Nature, 281: 544) y un sistema promotor de triptófano (trp) (Goeddel y col., 1980, Nucleic Acids Res., 8: 4057; EPO Appl Publ n.º 0036.776). Si bien estos son los usados más habitualmente, se han descubierto y se han usado otros promotores microbianos, y se han publicado los detalles concernientes a sus secuencias de nucleótidos, permitiendo que un trabajador experto pueda ligarlos funcionalmente con vectores conocidos de la técnica, por ejemplo, vectores plasmídicos.
Simplemente a modo de ejemplo, se puede conseguir la regulación de la transcripción en E. coli con cualquiera de los siguientes promotores inducibles: lac, trp, phoA, araBAD, T7, trc, y derivados de los promotores lambda PL y PR, así como otros muy conocidos en la técnica (por ejemplo, Makrides, 1996, Microbiol Rev. 60: 512-538, cuya descripción se incorpora en su totalidad en el presente documento por referencia).
Las condiciones inductoras adecuadas opcionalmente compatibles con el vector incluyen, por ejemplo, la inducción con arabinosa, lactosa, o calor, la limitación de fosfato, la limitación de triptófano, por nombrar solo unos pocos. Preferentemente, el elemento inductor es un operón Lac, que es inducible por tiogalactósido de isopropilo ("IPTG").
Una secuencia señal adecuada (péptido señal) se puede obtener de pelB, fd pIII, u ompA.
Los marcadores de selección de antibióticos adecuados son muy conocidos en la técnica e incluyen, por ejemplo, los que confieren resistencia a ampicilina, kanamicina, cloranfenicol, rifampicina, o tetraciclina, entre otros.
Las secuencias de origen de replicación adecuadas incluyen las que se encuentran en los siguientes plásmidos:
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varía de 2000 aproximadamente a 100.000 Da aproximadamente. Más preferentemente, los polímeros tienen un peso molecular promedio de 4000 Da aproximadamente a 45.000 Da aproximadamente, aún más preferentemente de 4000 Da a 20.000 Da aproximadamente. Más preferentemente, el PEG es de 5000 Daltons aproximadamente. También se contemplan otros pesos moleculares para acomodar las necesidades del experto.
Como alternativa, la parte del resto de polietilenglicol (PEG) de la invención puede estar representada por la estructura:
-Y11-(CH2CH2O)n-CH2CH2Y11-, -Y11-(CH2CH2O)n-CH2C(=Y12)-Y11-, -Y11-C(=Y12)-(CH2)a11-Y13-(CH2CH2O)n-CH2CH2-Y13-(CH2)a11-C(=Y12)-Y11-, -Y11-(CR11R12)a12-Y13-(CH2)b11-O-(CH2CH2O)n-(CH2)b11-Y13-(CR11R12)a12-Y11-, -Y11-(CH2CH2O)n-CH2CH2-, -Y11-(CH2CH2O)n-CH2C(=Y12)-, -C(=Y12)-(CH2)a11-Y13-(CH2CH2O)n-CH2CH2-Y13-(CH2)a11-C(=Y12)-,y -(CR11R12)a12-Y13-(CH2)b11-O-(CH2CH2)n-(CH2)b11-Y13-(CR11R12)a12-,
en la que:
Y11 e Y13 son independientemente O, S, SO, SO2, NR13 o un enlace; Y12 es O, S, o NR14; R11-14 se seleccionan independientemente entre hidrógeno, alquilo C1-6, alquenilo C2-6, alquinilo C2-6, alquilo C3-19 ramificado, cicloalquilo C3-8, alquilo C1-6 sustituido, alquenilo C2-6 sustituido, alquinilo C2-6 sustituido, cicloalquilo C3-8 sustituido, arilo, arilo sustituido, heteroarilo, heteroarilo sustituido, heteroalquilo C1-6, heteroalquilo C1-6 sustituido, alcoxi C1-6, ariloxi, heteroalcoxi C1-6, heteroariloxi, alcanoilo C2-6, arilcarbonilo, alcoxicarbonilo C2-6, ariloxicarbonilo, alcanoiloxi C2-6, arilcarboniloxi, alcanoilo C2-6 sustituido, arilcarbonilo sustituido, alcanoiloxi C2-6 sustituido, ariloxicarbonilo sustituido, arilcarboniloxi C2-6 sustituido y alcanoiloxi sustituido; (a11), (a12), y (b11) son independientemente cero o un número entero positivo, preferentemente 0-6, y más preferentemente 0, 1, o 2; y
(n) es un número entero de 10 aproximadamente a 2300 aproximadamente.
Como ejemplo, el PEG puede estar funcionalizado de la siguiente manera no limitante:
-C(=Y14)-(CH2)m-(CH2CH2O)n-, -C(=Y14)-Y-(CH2)m-(CH2CH2O)n-, -C(=Y14)-NR11-(CH2)m-(CH2CH2O)n-, -CR15R16-(CH2)m-(CH2CH2O)n
en la que
R11, R15 y R16 se seleccionan independientemente entre H, alquilos C1-6, arilos, arilos sustituidos, aralquilos, heteroalquilos, heteroalquilos sustituidos y alquilos C1-6 sustituidos;
(m)
es cero o es un número entero positivo, y preferentemente 1 o 2; Y14 es O o S; y
(n)
representa el grado de polimerización.
En estos aspectos, el polímero (grupo R) incluye un grupo de protección terminal, es decir, un grupo que se encuentra en el extremo del polímero. El grupo de protección terminal se puede seleccionar entre cualquiera de NH2, OH, SH, CO2H, alquilos C1-6, preferentemente metilo, como entienden por tales grupos los expertos en la materia.
En un aspecto adicional, la parte polimérica del conjugado puede ser una que ofrezca múltiples puntos de unión para la ADA. Por otra parte, pueden estar unidos varios PEG a la ADA.
La farmacocinética y otras propiedades de la ADA pegilada se pueden ajustar según sea necesario para una aplicación clínica deseada mediante la manipulación del peso molecular del PEG, la química del grupo de enlace y la proporción de cadenas de PEG a la enzima.
En estos aspectos, la ADA se puede unir al polímero no antigénico en forma liberable o no liberable a través de diversos grupos de enlace conocidos en la técnica.
Los sistemas de polímeros liberables pueden estar basados en la eliminación de bencilo o la lactonización de bloqueo con trimetilo. Los grupos de enlace de polímeros activados de los sistemas de polímeros liberables se pueden preparar según las patentes de Estados Unidos n.º 6.180.095, 6.720.306, 5.965.119, 6.624.142 y 6.303.569 cedidas en común, cuyos contenidos se incorporan en el presente documento por referencia. Como alternativa, los conjugados de ADA-polímero se preparan usando ciertos restos de polímeros de bicina tales como los descritos en las patentes de Estados Unidos n.º 7.122.189 y 7.087.229 cedidas en común y las solicitudes de patente de Estados Unidos n.º 10/557.522, 11/502.108 y 11/011.818, que se incorporan en el presente documento por referencia. También se describen otros sistemas de polímeros liberables contemplados en el documento PCT/US07/78600,
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cuyos contenidos se incorporan en el presente documento por referencia.
Ejemplos ilustrativos de conjugados de ADA-polímero liberables o no liberables contemplados en este documento se describen en la Solicitud de patente de Estados Unidos n.º 60/913.039, cuyos contenidos se incorporan en el presente documento por referencia.
La conjugación del polímero preferentemente es una reacción de pegilación, reacciones que son conocidas por los expertos en la materia. En pocas palabras, la muteína rbADA o rhADA se hace reaccionar con un polímero activado para formar conjugados ADA-polímero. En este sentido, se puede utilizar una amplia variedad de polietilenglicoles activados o funcionalizados, incluyendo los descritos, por ejemplo en las patentes de Estados Unidos n.º 5.122.614, 5.324.844, 5.612.460 y 5.808.096 cedidas en común (polietilenglicol activado por carbonato de succinimidilo (SC-PEG) y PEGs activados relacionados), la patente de Estados Unidos n.º 5.349.001 (PEG activados con imida tiona cíclica), la patente de Estados Unidos n.º 5.650.234, y otras conocidas por los expertos en la materia. La divulgación de cada una de las anteriores se incorpora en el presente documento por referencia. Véanse también los polímeros activados disponibles en Nektar/Shearwater Polymers. Los expertos pueden utilizar diversas formas activadas de los polímeros para su unión sin experimentación indebida.
Como apreciarán los expertos en la materia, dichas reacciones de conjugación normalmente se llevan a cabo en un tampón adecuado usando PEG activado en un exceso molar de varias veces. Algunos conjugados preferidos preparados con PEGs lineales como el SC-PEG anteriormente mencionado pueden contener, en promedio, de 10 aproximadamente a 80 cadenas de PEG aproximadamente por cada enzima ADA. En consecuencia, para estos, se pueden emplear excesos molares de varios cientos de veces, por ejemplo, 200-1000x. El exceso molar usado para el PEG ramificado y PEG unido a la enzima será menor y se puede determinar usando las técnicas descritas en las patentes y solicitudes de patentes que las describen que se mencionan en el presente documento.
En estos aspectos, el óxido de polialquileno se conjuga a la proteína mediante la química del grupo de enlace incluyendo, por ejemplo, grupos de enlace a base de carbonato de succinimidilo, tiazolidina tiona, uretano, y amida. Preferentemente, el óxido de polialquileno se une covalentemente a un grupo épsilon amino de una Lys en la ADA, aunque en la técnica son muy conocidos otros sitios para la unión covalente. Los conjugados poliméricos de la ADA pueden incluir al menos 5 cadenas de polietilenglicol unidas a grupos épsilon amino de la Lys en la enzima, pero, como alternativa, pueden incluir 11-18 cadenas de PEG aproximadamente unidas a los grupos épsilon amino de la Lys en la enzima.
Mientras que la ADA se conjuga con entre 11 aproximadamente y 18 moléculas de PEG aproximadamente por molécula de enzima, a través de los enlaces de lisina, la relación de PEG a ADA se puede variar con el fin de modificar las propiedades físicas y cinéticas del conjugado combinado para adaptarse a cualquier situación clínica particular.
De lo anterior será evidente que los aspectos adicionales de la invención incluyen el uso de cualquier PEG activado
o polímero similar presentados o disponibles en el mercado para conjugar la enzima ADA o un fragmento de la misma con el fin de proporcionar conjugados útiles para los procedimientos de tratamiento descritos en el presente documento. Véase, por ejemplo, el catálogo de pegilación avanzada de Nektar de 2004 (Nektar, San Carlos, California), que se incorpora en su totalidad en el presente documento por referencia.
Los PEG activados pueden incluir derivados lineales, ramificados o de U-PEG, tales como los descritos en las patentes de Estados Unidos n.º 5.681.567, 5.756.593, 5.643.575, 5.919.455, 6.113.906, 6.566.506, 6.153.655,
6.395.266 y 6.638.499, 6.251.382 y 6.824.766 (también incorporadas en el presente documento por referencia). Una lista no limitante de dichos polímeros corresponde a los sistemas de polímeros (i)-(vii) con las siguientes estructuras:
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o
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5 en las que:
(u') es un número entero de 10 aproximadamente a 570 aproximadamente, para proporcionar preferentemente polímeros que tienen un peso molecular total de 2000 Da aproximadamente a 100.000 Da aproximadamente, y preferentemente, de 4000 Da aproximadamente a 45.000 Da aproximadamente; y hasta 3 porciones terminales de los restos están protegidas terminalmente con un metilo u otro alquilo inferior.
10 En algunas realizaciones preferidas, los 4 brazos del PEG se convierten en grupos funcionales adecuados, es decir, SC, etc., para facilitar la unión a la proteína recombinante. Dichos compuestos antes de la conversión incluyen:
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limitante de dichos compuestos incluye:
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en la que (u) es un número entero para proporcionar preferentemente polímeros que tienen un peso molecular total 10 de 2000 Da aproximadamente a 100.000 Da aproximadamente.
En una realización preferida, el conjugado de PEG incluye
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en las que (u) es un número entero para proporcionar la parte polimérica que tiene un peso molecular de 2000 Da aproximadamente a 100.000 Da aproximadamente, y preferentemente de 4000 Da aproximadamente a 45.000 Da aproximadamente, aún más preferentemente de 5000 Da aproximadamente.
Los polímeros adecuados variarán sustancialmente en peso. Para los efectos de la presente invención se suelen seleccionar polímeros que tienen pesos moleculares promedio en número que oscilan entre 2000 aproximadamente y 100.000 aproximadamente. Se prefieren pesos moleculares de entre 4000 aproximadamente y 45.000 aproximadamente y se prefieren en particular entre 5000 y 12.000 aproximadamente. Las sustancias poliméricas incluidas preferentemente también son solubles en agua a temperatura ambiente. Una lista no limitante de dichos polímeros incluye homopolímeros de óxido de polialquileno tales como polietilenglicol (PEG) o polipropilenglicoles, polioles polioxietilenados, sus copolímeros y sus copolímeros en bloque, siempre que se mantenga la solubilidad en agua de los copolímeros en bloque. Además de mPEG, también son útiles polímeros terminados en alquilo C1-4.
Los procedimientos para preparar polímeros que tienen ácidos carboxílicos terminales de alta pureza se describen en la Solicitud de patente de Estados Unidos n.º 11/328.662, cuyos contenidos se incorporan en el presente documento por referencia. Los procedimientos incluyen primero la preparación de un éster de alquilo terciario de un óxido de polialquileno, seguido por la conversión en su derivado de ácido carboxílico. La primera etapa de la preparación de los ácidos carboxílicos de PAO del procedimiento incluye la formación de un intermedio tal como éster terc-butilo del ácido carboxílico de óxido de polialquileno. Este producto intermedio se forma por reacción de un PAO con un haloacetato de t-butilo en presencia de una base tal como t-butóxido de potasio. Una vez que se ha formado el intermedio de éster de t-butilo, se puede proporcionar fácilmente el derivado de ácido carboxílico del óxido de polialquileno con purezas superiores al 92 %, preferentemente superior al 97 %, más preferentemente superior al 99 % y más preferentemente superior al 99,5 % de pureza.
En otros aspectos alternativos, se pueden emplear polímeros que tienen grupos amino terminales para preparar los conjugados de la ADA. Los procedimientos de preparación de polímeros que contienen aminas terminales en alta pureza se describen en las Solicitudes de patente de Estados Unidos n.º 11/508.507 y 11/537.172, cuyos contenidos se incorporan por referencia. Por ejemplo, polímeros que tienen azidas reaccionan con un agente reductor a base de fosfina tal como trifenilfosfina o un agente reductor de borohidruro de un metal alcalino tal como NaBH4. Como alternativa, los polímeros que incluyen grupos salientes reaccionan con sales de amina protegida como la sal de potasio de imidodicarbonato de metil-terc-butilo (KNMeBoc) o la sal de potasio de imidodicarbonato de di-terc-butilo (KNBoc2), seguido de la desprotección del grupo amina protegida. La pureza de los polímeros que contienen las aminas terminales formadas por estos procedimientos es superior al 95 % aproximadamente y preferentemente superior al 99 %.
La ramificación proporcionada por los polímeros de la patente 6.153.655, citada anteriormente, permite la ramificación secundaria o terciaria como modo de incrementar la carga de polímero en una molécula biológicamente activa a partir de un único punto de unión. Se entenderá que el polímero soluble en agua se puede funcionalizar por unión a los grupos de enlace bifuncionales, si fuera necesario, sin experimentación indebida.
Las sustancias poliméricas incluidas en este documento preferentemente son solubles en agua a temperatura ambiente. Una lista no limitante de dichos polímeros incluye homopolímeros de óxido de polialquileno tales como polietilenglicol (PEG) o polipropilenglicoles, polioles polioxietilenados, sus copolímeros y sus copolímeros en bloque, siempre que se mantenga la solubilidad en agua de los copolímeros en bloque.
Como alternativa a los polímeros a base de PAO, se pueden usar materiales efectivamente no antigénicos tales como dextrano, polivinilpirrolidonas, poliacrilamidas tales como HPMA (hidroxipropilmetacrilamidas), alcoholes de polivinilo, polímeros a base de carbohidratos, copolímeros de los anteriores, y similares. Los expertos en la materia se darán cuenta de que la lista anterior es meramente ilustrativa y que se contemplan todos los materiales poliméricos que tienen las cualidades descritas en el presente documento. Para los fines de la presente invención, "esencial o efectivamente no antigénico" significa todos los materiales conocidos en la técnica como no tóxicos y que no provocan una respuesta inmunogénica apreciable en mamíferos.
D. Utilidad
El experto apreciará que la muteína ADA de la invención se emplea fácilmente en un entorno clínico para el tratamiento de cualquier enfermedad o trastorno sensible a la enzima ADA. Dicha enfermedad o trastorno es uno que responda a la reducción de los niveles de la adenosina o desoxiadenosina en tejido o sangre. Una enfermedad
o trastorno de este tipo puede incluir, por ejemplo, IDCG, enfermedades pulmonares, por ejemplo, asma, y cánceres que responden a la disminución de los niveles locales o sistémicos de adenosina o desoxiadenosina. Se proporcionan más detalles sobre el uso de ADA en el tratamiento de tumores o cánceres en la patente de Estados Unidos n.º 8.741.283 de propiedad conjunta presentada en la misma fecha que la presente (que reivindica el beneficio de prioridad de la Solicitud de patente provisional de Estados Unidos n.º de serie 60/913.039), titulada: "Terapia enzimática contra el cáncer“, e incorporada en su totalidad en el presente documento por referencia. El agente de tratamiento puede ser, por ejemplo, la enzima muteína rhADA o muteína rbADA. Preferentemente, la muteína rADA de tratamiento está conjugada con polímero, como se describe más arriba, por ejemplo, pegilada. La dosificación de la ADA o la ADA conjugada con polímero se individualiza dependiendo de la respuesta clínica del
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