ES2525174T3 - Método de construcción de un soporte de transporte génico - Google Patents

Abstract

Primer fragmento de ADN que comprende un promotor y un terminador de un gen que codifica para una proteína de unión a ADN similar a histona derivado de una bacteria del género Bifidobacterium, y que tiene entre el promotor y el terminador un ADN en el que se fusiona un segundo fragmento de ADN que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica para un péptido que consiste en una secuencia de aminoácidos desde el 1er hasta uno cualquiera del 4º al 18º aminoácido en el extremo N-terminal de la proteína de unión a ADN similar a histona en el lado 5'-terminal de un ADN mutado que codifica para citosina desaminasa, en el que el ADN mutado que codifica para citosina desaminasa es (a) un ADN que codifica para la secuencia de aminoácidos mostrada como SEQ ID NO: 28 que tiene la metionina de iniciación excluida o (b) un ADN que codifica para la secuencia de aminoácidos mostrada como SEQ ID NO: 28 que tiene el ácido aspártico en la 315ª posición sustituido por alanina y la metionina de iniciación excluida.

Description

Método de construcción de un soporte de transporte génico

5 Campo técnico

La presente invención se refiere a un método de construcción de un portador de suministro génico que consiste en un microorganismo anaerobio que puede crecer en un tejido tumoral en un entorno anaerobio y que puede expresar citosina desaminasa que es útil como agente terapéutico para un tumor sólido. Además, la presente invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende un portador de suministro génico construido mediante el método.

Antecedentes de la técnica

15 En los últimos años, se han estudiado de diversas maneras, terapias para tumor maligno usando un portador de suministro génico. Por ejemplo, con respecto a una bacteria anaerobia Clostridium, se ha propuesto un método de transporte de un gen a un sitio tumoral usando una bacteria transformada (véanse por ejemplo, los documentos de patente 1 y 2).

Asimismo, con respecto a la bacteria anaerobia Bifidobacterium, se ha esperado que su transformante se aplique como vector para probióticos o vector para una vacuna oral para una enfermedad infecciosa (véase por ejemplo, el documento de patente 3). Además, con respecto a Bifidobacterium longum, se ha sugerido su aplicación al tratamiento de un tumor sólido, porque esta bacteria se acumula en un tumor sólido hipóxico tras una administración sistémica (véanse por ejemplo, los documentos no de patente 1 y 2).

25 Además, los presentes inventores han confirmado que, mediante transformación con un plásmido recombinante pBLES100-S-eCD que porta codA de Escherichia coli fusionado con un promotor de una proteína de unión a ADN similar a histona derivado de Bifidobacterium longum, citosina desaminasa (EC3.5.4.1; denominada “CD” a continuación en el presente documento) que es una enzima que convierte 5-fluorocitosina (denominada “5-FC” a continuación en el presente documento) como profármaco (precursor) de 5-fluorouracilo (denominado “5-FU” a continuación en el presente documento) que tiene actividad antitumoral, en 5-fluorouracilo, puede expresarse en un microorganismo recombinante, y han notificado que puede esperarse que el microorganismo recombinante, por ejemplo, Bifidobacterium longum recombinante, se aplique a terapias de enzima-profármaco (véanse por ejemplo, el documento de patente 4 y los documentos no de patente 3 y 4). Para aplicar este microorganismo modificado

35 genéticamente que expresa CD a terapias de enzima-profármaco, se requiere además que el microorganismo tenga resistencia a 5-FU a una concentración al menos eficaz para una actividad antitumoral, que se convierte a partir de 5-FC mediante CD. Por tanto, los presentes inventores han desarrollado y notificado un método de construcción de una bacteria resistente a 5-FU que expresa CD de este tipo (véase por ejemplo, el documento de patente 5). Por otro lado, con respecto a esta CD, el documento no de patente 5 ha notificado que cuando se añadía una mutación que sustituía ácido aspártico por alanina en el aminoácido 314 (correspondiente a la posición 315 en SEQ ID NO: 28 de la presente invención) de CD a ADN que codifica para CD en Escherichia coli, la CD mutante tenía la actividad de CD de convertir 5-FC en 5-FU que era aproximadamente 2,2 veces (50/23) superior a la de CD de tipo natural antes de la mutación (véase la sección del medio de la tabla 1 en documento no de patente 5).

45 Se han notificado diversos métodos de transformación en bacterias recombinantes usados en el tratamiento de tumor maligno. En los documentos descritos anteriormente, se han notificado sus respectivos métodos de preparación de una bacteria transformada.

Por ejemplo, el documento de patente 3 ha notificado un método de transformación que comprende las etapas de: producir un plásmido lanzadera que se replica de manera mutua tanto en una especie de Bifidobacterium como Escherichia coli, usando un plásmido derivado de una especie de Bifidobacterium y un plásmido derivado de Escherichia coli; y producir un vector recombinante ligando un gen de interés que codifica para una proteína de interés al plásmido lanzadera, en el que la especie de Bifidobacterium usada en la producción del plásmido lanzadera se usa como célula huésped que va a transformarse con el vector recombinante producido.

55 Además, por ejemplo, con respecto a un método de preparación de un plásmido lanzadera pBLES100 usado en la construcción del plásmido recombinante pBLES100-S-eCD, se ha notificado un método de preparación que comprende construir este plásmido lanzadera a partir de pTB6 de Bifidobacterium longum BK51 y pBR322 de Escherichia coli (véase por ejemplo, el documento no de patente 6).

Además, se han propuesto métodos de preparación de los plásmidos pAV001 y pBRASTA101, que pueden transformar Bifidobacterium longum con una eficacia de 100 veces o superior a la del plásmido lanzadera pBLES100 (véase por ejemplo, el documento no de patente 7).

65 Por tanto, se han notificado diversos métodos de construcción de un portador de suministro génico útil para el tratamiento de tumor maligno. Sin embargo, todos estos métodos han especificado microorganismos, plásmidos o

similares usados en la transformación y han usado técnicas de transformación habituales como método de transformación por sí mismo. Además, estos métodos están destinados a construir un microorganismo transformado que puede expresar por sí mismo, en una zona afectada diana, un gen de interés, por ejemplo, un gen para expresar una proteína que tiene una actividad antitumoral o una proteína que tiene la actividad de convertir un precursor de

5 sustancia antitumoral en una sustancia antitumoral. Ningún documento ha notificado hasta la fecha un método de construcción que esté destinado a mejorar la actividad o eficacia de expresión de una proteína expresada por sí misma a partir del gen de interés.

Documento de patente 1: Patente estadounidense n.º 6416754

Documento de patente 2: Patente estadounidense n.º 6652849

Documento de patente 3: Publicación nacional de solicitud de patente internacional n.º 2004-519236

15 Documento de patente 4: Patente japonesa abierta a consulta por el público n.º 2002-97144

Documento de patente 5: WO 2006/109619

Documento no de patente 1: Yazawa et al. Cancer Gene Ther., 7, 269-274 (2000)

Documento no de patente 2: Yazawa et al. Breast Cancer Res. Treat., 66, 165-170 (2001)

Documento no de patente 3: Nakamura et al., Biosci. Biotechnol. Biochem., 66, 2362-2366 (2002)

25 Documento no de patente 4: Fujimori et al., Curr. Opin. Drug Discov. Devel., 5, 200-203 (2002)

Documento no de patente 5: Sheri et al., Protein Engineering, Design and Selection, 17 (8): 625-633 (2004)

Documento no de patente 6: Matsumura et al., Biosci. Biotechnol. Biochem., 61, 1211-1212 (1997)

Documento no de patente 7: Tanaka et al., Biosci Biotechnol Biochem.; 69 (2): 422-425 (2005)

Descripción de la invención

35 Objeto que va a solucionarse mediante la invención

Todos los métodos notificados anteriormente de construcción de un portador de suministro génico útil para el tratamiento de tumor maligno están destinados a construir una bacteria transformada que puede expresar por sí misma, en una zona afectada diana, un gen de interés, por ejemplo, un gen para expresar una proteína que tiene una actividad antitumoral o una proteína que tiene la actividad de convertir un precursor de sustancia antitumoral en una sustancia antitumoral. Ningún documento ha notificado hasta la fecha un método de construcción que esté destinado a mejorar la actividad o eficacia de expresión de una proteína expresada por sí misma a partir del gen de interés.

45 Sin embargo, para terapias que usan un portador de suministro génico, la actividad y eficacia de expresión de una proteína expresada por un gen introducido en un microorganismo transformado son cuestiones importantes. Se requiere naturalmente que la proteína expresada por un gen en el microorganismo transformado tenga la misma actividad que la de una proteína expresada por un gen portado por el microorganismo de tipo natural original y, además, debe expresarse a un nivel igual a o superior al del gen portado por el microorganismo original.

Un objeto de la presente invención es proporcionar un método de construcción eficaz de un portador de suministro génico que tiene la actividad y eficacia de expresión favorables de una proteína expresada por un gen introducido mediante transformación. Además, un objeto de la presente invención es proporcionar una composición farmacéutica que comprende un portador de suministro génico construido mediante el método de construcción y un

55 agente terapéutico para tumor sólido que comprende la bacteria resistente.

Medios para solucionar los problemas

Los presentes inventores han seleccionado de antemano, como gen de interés, un gen que expresa CD entre proteínas que tienen la actividad de convertir un precursor de sustancia antitumoral en una sustancia antitumoral, y han construido, como plásmido al que se incorpora el gen de interés, un plásmido pBLES100-S-eCD que comprende un plásmido de Escherichia coli que porta el gen para expresar CD y un plásmido derivado de Bifidobacterium longum fusionado con el mismo. Los presentes inventores han encontrado que Bifidobacterium longum 105A/pBLES100-S-eCD obtenida modificando genéticamente Bifidobacterium longum 105A con este plásmido, 65 puede esperarse como portador de suministro génico útil para el tratamiento de tumor maligno, y han notificado un método de construcción del mismo que comprende, en la etapa de construir el vector de expresión génica mediante

la incorporación del gen de interés, usar un promotor implicado en la expresión de un gen que codifica para una proteína de unión a ADN similar a histona (también denominada “proteína HU” a continuación en el presente documento) derivado de Bifidobacterium longum e incorporar el gen de interés en el sentido de 3’ del promotor para construir de ese modo un microorganismo transformado que puede expresar el gen de interés (documento de

5 patente 4).

Los presentes inventores han realizado además estudios diligentes sobre el método anterior, y han encontrado que la frecuencia de transformación puede potenciarse usando, como plásmido de fusión al que se incorpora el gen de interés, un plásmido preparado fusionando fragmentos de plásmido derivados de Escherichia coli y derivados de Bifidobacterium longum que contienen porciones esenciales para sus replicaciones de plásmido y no contienen porciones desfavorables para la expansión de una gama de huéspedes.

Además, los presentes inventores han encontrado que para incorporar el gen de interés en el sentido de 3’ del promotor implicado en la expresión de un gen que codifica para una proteína de unión a ADN similar a histona del

15 microorganismo usado como huésped, se requiere que el gen de interés tenga, en el lado 5’-terminal del mismo, un fragmento de ADN que codifica para una región N-terminal de la proteína de unión a ADN similar a histona, y se requiere además que el fragmento de ADN comprenda un fragmento de ADN que codifica para al menos 4 aminoácidos.

Específicamente, los presentes inventores han encontrado que para incorporar el gen de interés en el sentido de 3’ del promotor implicado en la expresión de un gen que codifica para la proteína de unión a ADN similar a histona, puede incorporarse un fragmento de ADN que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica para una secuencia de aminoácidos desde el 1er hasta al menos el 4º aminoácido en el extremo N-terminal de la proteína de unión a ADN similar a histona en el lado 5’-terminal de ADN del gen de interés para construir de ese modo un

25 microorganismo que puede expresar una proteína que tiene la misma actividad que la del producto génico (proteína) en un microorganismo usado como fuente del gen de interés, a un nivel igual o superior al del microorganismo usado como fuente del gen de interés.

Los presentes inventores han encontrado además que puede producirse una proteína que tiene una actividad superior mutando parcialmente el ADN del gen de interés incorporado en la etapa de preparación del vector de expresión. Además, los presentes inventores han encontrado también que particularmente cuando el gen de interés es un gen para expresar CD entre proteínas que tienen la actividad de convertir un precursor de sustancia antitumoral en una sustancia antitumoral, puede construirse un microorganismo modificado genéticamente que tiene una alta tasa de retención del plásmido usando, como microorganismo anaerobio usado como huésped, una

35 bacteria resistente a 5-fluorouracilo que tiene resistencia a 5-fluorouracilo a una concentración al menos eficaz para una actividad antitumoral. Como resultado, se ha completado la presente invención.

Específicamente, la presente invención se refiere a:

[1] un primer fragmento de ADN que comprende un promotor y un terminador de un gen que codifica para una proteína de unión a ADN similar a histona derivado de una bacteria del género Bifidobacterium, y que tiene entre el promotor y el terminador un ADN en el que se fusiona un segundo fragmento de ADN que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica para un péptido que consiste en una secuencia de aminoácidos desde el 1er hasta uno cualquiera del 4º al 18º aminoácido en el extremo N-terminal de la proteína de unión a ADN similar a histona en el

45 lado 5’-terminal de un ADN mutado que codifica para citosina desaminasa, en el que el ADN mutado que codifica para citosina desaminasa es (a) un ADN que codifica para la secuencia de aminoácidos mostrada como SEQ ID NO: 28 que tiene la metionina de iniciación excluida o (b) un ADN que codifica para la secuencia de aminoácidos mostrada como SEQ ID NO: 28 que tiene el ácido aspártico en la 315ª posición sustituido por alanina y la metionina de iniciación excluida;

[2] el primer fragmento de ADN según [1], en el que la secuencia de nucleótidos que codifica para un péptido que consiste en una secuencia de aminoácidos desde el 1er hasta uno cualquiera del 4º al 18º aminoácido en el extremo N-terminal de la proteína de unión a ADN similar a histona es una secuencia de nucleótidos desde el 1482º hasta uno cualquiera del 1493er al 1535º nucleótido en SEQ ID NO: 15;

[3] el primer fragmento de ADN según [1] o [2], en el que el péptido que consiste en una secuencia de aminoácidos desde el 1er hasta uno cualquiera del 4º al 18º aminoácido en el extremo N-terminal de la proteína de unión a ADN similar a histona es un péptido que consiste en una secuencia de aminoácidos desde el 1er aminoácido hasta uno cualquiera del 4º al 18º aminoácido en SEQ ID NO: 29; y

[4] el primer fragmento de ADN según [3], en el que el péptido que consiste en una secuencia de aminoácidos desde el 1er hasta uno cualquiera del 4º al 18º aminoácido en SEQ ID NO: 29 es un péptido que consiste en una secuencia de aminoácidos desde el 1er hasta el 9º aminoácido en SEQ ID NO: 29.

65 Además, la presente invención se refiere a:

[5] un método de construcción de un portador de suministro génico que consiste en un microorganismo anaerobio que puede crecer en un tejido tumoral en un entorno anaerobio y que puede expresar citosina desaminasa, que comprende las etapas de:

5 (1) preparar un plásmido de fusión que tiene un fragmento de un plásmido de una bacteria del género Bifidobacterium y un fragmento de un plásmido de Escherichia coli;

(2)

incorporar un primer fragmento de ADN que comprende un promotor y un terminador de un gen que codifica para una proteína de unión a ADN similar a histona derivado de una bacteria del género Bifidobacterium, al plásmido de fusión;

(3)

incorporar, entre el promotor y el terminador, un ADN en el que se fusiona un segundo fragmento de ADN que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica para un péptido que consiste en una secuencia de aminoácidos desde el 1er hasta uno cualquiera del 4º al 18º aminoácido en el extremo N-terminal de la proteína de

15 unión a ADN similar a histona en el lado 5’-terminal de un ADN mutado que codifica para citosina desaminasa para preparar un vector de expresión; y

(4) transformar un microorganismo anaerobio con el vector de expresión, en el que el ADN mutado que codifica para citosina desaminasa es (a) un ADN que codifica para la secuencia de aminoácidos mostrada como SEQ ID NO: 28 que tiene la metionina de iniciación excluida o (b) un ADN que codifica para la secuencia de aminoácidos mostrada como SEQ ID NO: 28 que tiene el ácido aspártico en la 315ª posición sustituida por alanina y la metionina de iniciación excluida;

[6] el método de construcción de un portador de suministro génico según [5], en el que la secuencia de nucleótidos

25 que codifica para un péptido que consiste en una secuencia de aminoácidos desde el 1er hasta uno cualquiera del 4º al 18º aminoácido en el extremo N-terminal de la proteína de unión a ADN similar a histona es una secuencia de nucleótidos desde el 1482º hasta uno cualquiera del 1493er al 1535º nucleótido en SEQ ID NO: 15; y

[7] el método de construcción de un portador de suministro génico según [5] o [6], en el que el péptido que consiste en una secuencia de aminoácidos desde el 1er hasta uno cualquiera del 4º al 18º aminoácido en el extremo Nterminal de la proteína de unión a ADN similar a histona es un péptido que consiste en una secuencia de aminoácidos desde el 1er hasta uno cualquiera del 4º al 18º aminoácido en SEQ ID NO: 29.

Además, la presente invención se refiere a: 35

[8] un portador de suministro génico que consiste en un microorganismo anaerobio que puede crecer en un tejido tumoral en un entorno anaerobio, construyéndose el portador de suministro génico mediante un método de construcción según uno cualquiera de [5] a [7];

[9] el portador de suministro génico según [8], en el que la bacteria anaerobia es una bacteria del género Bifidobacterium;y

[10] el portador de suministro génico según [9], en el que la bacteria del género Bifidobacterium es cualquier bacteria del género Bifidobacterium seleccionada de Bifidobacterium adolescentis, Bifidobacterium animalis, Bifidobacterium

45 infantis, Bifidobacterium thermophilum, Bifidobacterium pseudolongum, Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium breve y Bifidobacterium longum.

Además, la presente invención se refiere a:

[11] una composición farmacéutica que comprende un portador de suministro génico según uno cualquiera de [8] a [10].

En la presente memoria descriptiva, el ADN que codifica para citosina desaminasa también se denomina “ADN que codifica para la proteína de interés” a continuación en el presente documento.

55 Según la presente invención, puede construirse eficazmente un portador de suministro génico que consiste en un microorganismo anaerobio que puede crecer en un tejido tumoral en un entorno anaerobio y que puede expresar citosina desaminasa, que es útil como agente terapéutico para tumor sólido y tiene la actividad y eficacia de expresión favorables de una proteína expresada mediante un gen introducido mediante transformación.

Mediante la administración del portador de suministro génico según la presente invención a un paciente con tumor maligno o similar, el microorganismo anaerobio como portador de suministro génico de la presente invención prolifera en el tumor y expresa la proteína de interés en el mismo. Puesto que la proteína de interés es una proteína que tiene la actividad de convertir un precursor de sustancia antitumoral en una sustancia antitumoral, la proteína de 65 interés expresada a partir del portador de suministro génico convierte un precursor de sustancia antitumoral en una sustancia antitumoral en la coexistencia del portador de suministro génico y el precursor de sustancia antitumoral en

el sitio tumoral, y la sustancia antitumoral presenta su efecto antitumoral.

Como proteína que tiene la actividad de convertir un precursor de sustancia antitumoral en una sustancia antitumoral es CD, se usa preferiblemente 5-FC como precursor de sustancia antitumoral. 5-FC se convierte en 5-FU mediante

5 CD, y este 5-FU presenta un efecto antitumoral excelente. La administración sistémica de 5-FU en una cantidad que produce un efecto antitumoral suficiente mediante la administración sistémica provoca efectos secundarios sistémicos. Sin embargo, el uso del portador de suministro génico de la presente invención puede convertir 5-FC con pocos efectos secundarios en 5-FU de una manera específica para un sitio tumoral. Por tanto, puede lograrse una concentración de 5-FU mucho más alta en el tumor que la lograda mediante la administración directa de 5-FU. Como resultado, se obtiene un efecto antitumoral extremadamente excelente.

Sin embargo, sólo la conversión de 5-FC en 5-FU en un sitio tumoral usando un portador de suministro génico que expresa CD no es suficiente para obtener un agente terapéutico para un tumor a un nivel que puede ponerse fácilmente en uso práctico. El efecto antitumoral o la funcionalidad de un agente terapéutico de este tipo para tumor 15 depende en gran medida de tres factores: el nivel de células de un microorganismo anaerobio como portador de suministro génico; el grado de actividad de CD presentado por el microorganismo anaerobio; y la concentración de 5-FC en un sitio tumoral. Cuanto mayores son las dosis de 5-FC y microorganismo anaerobio, más fuerte se hace el efecto antitumoral obtenido de manera natural. Desde el punto de vista de minimizar los efectos secundarios, se prefiere que la dosis de 5-FC se reduzca tanto como sea posible dentro de un intervalo que produce un efecto antitumoral necesario. Se requiere al menos que la dosis sea inferior a la aceptable clínicamente. Además, incluso si se usa un microorganismo anaerobio con la toxicidad más baja, se prefiere desde el punto de vista de minimizar la influencia sobre el cuerpo humano que su dosis se reduzca tanto como sea posible dentro de un intervalo que produce un efecto antitumoral necesario. En consideración a estas situaciones, ninguno de los agentes antitumorales convencionales que usan la conversión de 5-FC en 5-FU en un sitio tumoral usando un portador de

25 suministro génico que expresa CD tenía funcionalidad suficiente a nivel clínico.

Por ejemplo, en el ejemplo 4 en el documento de patente 4, la concentración de 5-FC usada en experimentos de tratamiento usando ratones era de 500 mg/kg, y se obtuvo un efecto antitumoral eficaz y suficiente a la concentración. Sin embargo, tal como puede observarse a partir de la descripción “para fungemia, meningitis fúngica, infección respiratoria micótica y cromomicosis, este fármaco se administra habitualmente por vía oral a cuatro dosis divididas de 100 a 200 mg/kg/día como fluorocitosina; para micosis del tracto urinario y micosis del tracto digestivo, este fármaco se administra habitualmente por vía oral a cuatro dosis divididas de 50 a 100 mg/kg/día como fluorocitosina” para la dosificación y administración del agente terapéutico ANCOTIL (que contiene 500 mg de flucitosina descrita en la farmacopea japonesa) para micosis profunda de Kyowa Pharmaceutical

35 Industry, Co., Ltd., la dosis máxima de 5-FC realmente aceptable en ensayos clínicos es de 200 mg/kg. Por tanto, para obtener un efecto antitumoral suficiente a la dosis clínica (200 mg/kg) de 5-FC usando el sistema experimental usado en el ejemplo en el documento de patente 4, se requería una actividad enzimática al menos 2,5 veces (≈ 500/200) superior.

Por otro lado, el documento no de patente 5 ha notificado que cuando se añadía una mutación que sustituía ácido aspártico por alanina en el 314º aminoácido (correspondiente a la 315ª posición en SEQ ID NO: 28 de la presente invención) de CD a ADN que codifica para CD en Escherichia coli, CD mutante tenía una actividad de CD (valor de kcat/Km) de conversión de 5-FC en 5-FU que era aproximadamente 2,2 veces (50/23) superior a la de CD de tipo natural antes de la mutación. Este efecto potenciado de producción de una actividad superior es todavía insuficiente

45 para lograr los objetos. Sin embargo, en el portador de suministro génico de la presente invención, se permitió que el ADN que codifica para CD como proteína de interés comprendiese adicionalmente, en el lado 5’-terminal del mismo, un fragmento de ADN que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica para un péptido que consiste en una secuencia de aminoácidos desde el 1er hasta al menos el 4º aminoácido en el extremo N-terminal de la proteína de unión a ADN similar a histona, y el ácido aspártico en la 315ª posición en SEQ ID NO: 28 de la CD se sustituyó por alanina. Como resultado, de manera totalmente inesperada, se obtuvo una actividad de CD que era incluso aproximadamente 12 veces superior.

A partir de esta actividad de CD 12 veces superior, se calculó que la dosis de 5-FC era de aproximadamente 42 mg/kg, con respecto a los resultados experimentales descritos anteriormente. Esto significa que una dosis clínica

55 mínima (50 mg/kg) o inferior es suficiente. Por tanto, puede lograrse una funcionalidad extremadamente alta.

Por tanto, entre los portadores de suministro génico de la presente invención, el portador de suministro génico (por ejemplo, Bifidobacterium longum 105-A/pAV001-HU-eCD-M968) de la presente invención, en el que se permite que el ADN que codifica para CD como proteína de interés comprenda adicionalmente, en el lado 5’-terminal del mismo, un fragmento de ADN que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica para un péptido que consiste en una secuencia de aminoácidos desde el 1er hasta uno cualquiera del 4º al 18º aminoácido en el extremo N-terminal de la proteína de unión a ADN similar a histona, y el ácido aspártico en la 315ª posición en SEQ ID NO: 28 de la CD se ha sustituido por alanina, puede esperarse particularmente que tenga una funcionalidad excelente.

65 De hecho, se ha confirmado que cuando se usa un portador de suministro génico que expresa CD no mutado (Bifidobacterium longum recombinante) usado en el documento de patente 4 en un sistema de tratamiento que usa

ratones desnudos trasplantados con una línea de células de cáncer de mama (KPL-1) derivada de ser humano, la concentración bacteriana requerida para convertir 5-FC en una concentración eficaz de 5-FU en el tumor es de 107 UFC/g o más. Se ha confirmado mediante los experimentos de los presentes inventores que cuando se usa el portador de suministro génico de la presente invención, en el que el ácido aspártico en la 315ª posición en SEQ ID

5 NO: 28 de la CD se ha sustituido por alanina, en el mismo sistema experimental, se obtiene una concentración de 5-FU equivalente en el tumor a una concentración bacteriana de 105 UFC/g, que es 1/100 de la concentración bacteriana descrita anteriormente.

Breve descripción de los dibujos

[Figura 1]

Es un diagrama que muestra el procedimiento de preparación de Bifidobacterium longum 105A/pAV001-HU-eCD.

15 [Figura 2]

Es un diagrama que muestra la actividad de CD (concentración de 5-FU convertido a partir de 5-FC) en Bifidobacterium longum 105A/pAV001-HU-eCD.

[Figura 3]

Es un diagrama que muestra el procedimiento de construcción de un plásmido que añade los 2 aminoácidos Nterminales de la proteína HU.

25 [Figura 4]

Es un diagrama que muestra los resultados de las tasas de retención de plásmidos de dos clases de Bifidobacterium longum 105A resistente a 5-FU/pAV001-HU-eCD-M968.

Mejor modo de llevar a cabo la invención

Un método de construcción de un portador de suministro génico según la presente invención, es un método de construcción de un portador de suministro génico que consiste en un microorganismo anaerobio que puede crecer en un tejido tumoral en un entorno anaerobio y que puede expresar citosina desaminasa, que comprende las etapas

35 de:

(1)

preparar un plásmido de fusión que tiene un fragmento de un plásmido de una bacteria del género Bifidobacterium y un fragmento de un plásmido de Escherichia coli;

(2)

incorporar un primer fragmento de ADN que comprende un promotor y un terminador de un gen que codifica para una proteína de unión a ADN similar a histona derivado de una bacteria del género Bifidobacterium, al plásmido de fusión;

(3)

incorporar, entre el promotor y el terminador, un ADN en el que se fusiona un segundo fragmento de ADN que

45 comprende una secuencia de nucleótidos que codifica para un péptido que consiste en una secuencia de aminoácidos desde el 1er hasta uno cualquiera del 4º al 18º aminoácido en el extremo N-terminal de la proteína de unión a ADN similar a histona en el lado 5’-terminal de un ADN mutado que codifica para citosina desaminasa para preparar un vector de expresión; y

(4) transformar un microorganismo anaerobio con el vector de expresión, en el que el ADN mutado que codifica para citosina desaminasa es (a) un ADN que codifica para la secuencia de aminoácidos mostrada como SEQ ID NO: 28 que tiene la metionina de iniciación excluida o (b) un ADN que codifica para la secuencia de aminoácidos mostrada como SEQ ID NO: 28 que tiene el ácido aspártico en la 315ª posición sustituido por alanina y la metionina de iniciación excluida.

55 El método de construcción de un portador de suministro génico según la presente invención no está limitado particularmente siempre que comprenda las etapas de: (1) preparar un plásmido de fusión que tiene un fragmento de un plásmido de una bacteria del género Bifidobacterium y un fragmento de un plásmido de Escherichia coli; (2) incorporar un primer fragmento de ADN que comprende un promotor y un terminador de un gen que codifica para una proteína de unión a ADN similar a histona derivado de una bacteria del género Bifidobacterium al plásmido de fusión; (3) incorporar, entre el promotor y el terminador, un ADN en el que se fusiona un segundo fragmento de ADN que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica para un péptido que consiste en una secuencia de aminoácidos desde el 1er hasta uno cualquiera del 4º al 18º aminoácido en el extremo N-terminal de la proteína de unión a ADN similar a histona en el lado 5’-terminal de un ADN mutado que codifica para citosina desaminasa para

65 preparar un vector de expresión; y (4) transformar un microorganismo anaerobio con el vector de expresión, en el que el ADN mutado que codifica para citosina desaminasa es (a) un ADN que codifica para la secuencia de

aminoácidos mostrada como SEQ ID NO: 28 que tiene la metionina de iniciación excluida o (b) un ADN que codifica para la secuencia de aminoácidos mostrada como SEQ ID NO: 28 que tiene el ácido aspártico en la 315ª posición sustituido por alanina y la metionina de iniciación excluida.

5 El método de construcción de un portador de suministro génico según la presente invención no está limitado particularmente siempre que comprenda las etapas (1) a (4). Puede comprender adicionalmente una etapa arbitraria a menos que se alteren los efectos de la presente invención. Además, en el método de construcción de un portador de suministro génico según la presente invención, el orden en el que se realizan las etapas (2) y (3) no está limitado particularmente. Puede comprender estas etapas en el orden de las etapas (1), (2), (3) y (4) o puede comprender estas etapas en el orden de las etapas (1), (3), (2) y (4). Ambos de estos aspectos se abarcan en el método de construcción de un portador de suministro génico según la presente invención por conveniencia.

Particularmente, para incorporar el ADN que codifica para la proteína de interés en la etapa (3) de preparación del vector de expresión, el aspecto de fusionar un fragmento de ADN que codifica para la región N-terminal de la

15 proteína HU en el lado 5’-terminal del ADN que codifica para la proteína de interés puede implicar: añadir el fragmento de ADN que codifica para la región N-terminal de la proteína HU al lado 5’-terminal del ADN que codifica para la proteína de interés, para incorporar de ese modo el fragmento de ADN en el mismo; o puede implicar la incorporación del ADN que codifica para la proteína de interés en la posición intermedia del ADN que codifica para la proteína HU de manera que el ADN que codifica para la proteína de interés se intercala entre el ADN que codifica para la región N-terminal de la proteína HU y el ADN que codifica para la región C-terminal de la proteína HU.

El orden en el que en la etapa (3) de preparación del vector de expresión, se permite que el ADN que codifica para la proteína de interés comprenda, en el lado 5’-terminal del mismo, un fragmento de ADN que codifica para la región N-terminal de la proteína HU, no está limitado particularmente siempre que se obtenga un vector de expresión que

25 comprende el fragmento de ADN que codifica para la región N-terminal de la proteína HU en el lado 5’-terminal del ADN que codifica para la proteína de interés. Por ejemplo, tras permitir que el ADN que codifica para la proteína de interés comprenda, en el lado 5’-terminal del mismo, el fragmento de ADN que codifica para la región N-terminal de la proteína HU, el ADN resultante puede incorporarse al plásmido de fusión. Alternativamente, tras incorporar el ADN que codifica para la proteína de interés al plásmido de fusión, el fragmento de ADN que codifica para la región Nterminal de la proteína HU puede incorporarse al lado 5’-terminal del ADN que codifica para la proteína de interés. O de lo contrario, tras incorporar el fragmento de ADN que codifica para la región N-terminal de la proteína HU al plásmido de fusión, el ADN que codifica para la proteína de interés puede incorporarse al lado 3’-terminal del fragmento de ADN que codifica para la región N-terminal de la proteína HU.

35 El fragmento de ADN que codifica para la región N-terminal de la proteína HU es un fragmento de ADN que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica para un péptido que consiste en una secuencia de aminoácidos desde el 1er aminoácido hasta uno cualquiera del 4º al 18º aminoácidos en el extremo N-terminal de la proteína HU. La secuencia de aminoácidos desde el 1er hasta el 18º aminoácido en el extremo N-terminal de la proteína HU se describe en SEQ ID NO: 29. La secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 29 es una secuencia de aminoácidos codificada por una secuencia de nucleótidos desde el 1482º hasta el 1535º nucleótido en SEQ ID NO:

15.

Los ejemplos de un plásmido que tiene un fragmento de ADN que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica para un péptido que consiste en una secuencia de aminoácidos desde el 1er hasta el 4º aminoácido en el

45 extremo N-terminal de la proteína HU, pueden incluir pAV001-HU4aa-eCD (SEQ ID NO: 14). Los ejemplos de un plásmido que tiene un fragmento de ADN que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica para un péptido que consiste en una secuencia de aminoácidos desde el 1er hasta el 9º aminoácido en el extremo N-terminal de la proteína HU, pueden incluir pAV001-HU-eCD (pAV001-HU9aa-eCD). Los ejemplos de un plásmido que tiene un fragmento de ADN que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica para un péptido que consiste en una secuencia de aminoácidos desde el 1er hasta el 18º aminoácido en el extremo N-terminal de la proteína HU, pueden incluir pAV001-HU18aa-eCD (SEQ ID NO: 15).

El método de cambio de la longitud de la región N-terminal de la proteína HU no está limitado particularmente. Tal como se realiza en los ejemplos descritos más adelante, se diseñan cebadores apropiados basándose en la

55 secuencia de la región N-terminal de la proteína HU, y puede obtenerse fácilmente la secuencia de una región Nterminal que tiene el número de aminoácidos deseado mediante PCR o similar usando esos cebadores.

Además, el método de construcción de la presente invención es un método de construcción método que usa un plásmido de fusión que tiene un fragmento de un plásmido de una bacteria del género Bifidobacterium y un fragmento de un plásmido de Escherichia coli en la etapa (1). El fragmento de un plásmido de una bacteria del género Bifidobacterium usado en la presente invención es preferiblemente un fragmento de un plásmido derivado de Bifidobacterium longum. Los ejemplos del mismo pueden incluir porciones de regiones derivadas de pTB6 que contienen un origen de replicación (oriV) de pTB6 (n.os de bases 3419 a 3778 de SEQ ID NO: 14)-porción de repB (n.os de bases 3983 a 4676 de SEQ ID NO: 14) y que no contienen regiones MembB, MobA, OrifI ni oriT.

65 Además, los ejemplos del fragmento de un plásmido de Escherichia coli usado en la presente invención pueden

incluir fragmentos de plásmidos que contienen una región de origen de replicación (ori) de Escherichia coli (n.os de bases 6356 a 6999 de SEQ ID NO: 14) y que no contienen un gen de resistencia a ampicilina (ampR) o que carecen de ADN que codifica para una región de β-lactamasa que es un producto de expresión del gen de resistencia a ampicilina (ampR).

5 Pueden obtenerse el promotor y el terminador de un gen que codifica para la proteína HU derivado de una bacteria del género Bifidobacterium, que se usan en la etapa (2) del método de construcción de la presente invención, mediante un enfoque conocido en la técnica. Más específicamente, basándose en la secuencia de una proteína HU de una bacteria del género Bifidobacterium conocida en la técnica, puede clonarse un gen que codifica para la

10 proteína HU de una bacteria del género Bifidobacterium para obtener de ese modo un promotor y un terminador del gen.

Por ejemplo, pueden facilitarse a modo de ejemplo preferiblemente secuencias que contienen el promotor y el terminador de un gen que codifica para la proteína HU derivado de Bifidobacterium longum mediante ADN tal como 15 se expone en los n.os de bases 234 a 1481 de SEQ ID NO: 14 o 15 y ADN tal como se expone en los n.os de bases 2979 a 3098 de SEQ ID NO: 14 (n.os de bases 3021 a 3140 de SEQ ID NO: 15), respectivamente.

El microorganismo anaerobio transformado con el vector de expresión según la presente invención para construir el microorganismo anaerobio como portador de suministro génico de la presente invención no está limitado

20 particularmente siempre que pueda usarse en la presente invención. Se prefiere que el microorganismo anaerobio sea una bacteria anaerobia, más preferiblemente una bacteria entérica, incluso más preferiblemente una bacteria del género Bifidobacterium.

Los ejemplos de la bacteria del género Bifidobacterium incluyen Bifidobacterium adolescentis, Bifidobacterium 25 animalis, Bifidobacterium infantis, Bifidobacterium thermophilum, Bifidobacterium pseudolongum, Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium breve y Bifidobacterium longum. La Bifidobacterium longum es la más preferida.

Todas estas bacterias están disponibles comercialmente o pueden obtenerse fácilmente de instituciones de depósito. Por ejemplo, Bifidobacterium longum ATCC-15707, Bifidobacterium bifidum ATCC-11863 y Bifidobacterium 30 infantis ATCC-15697 pueden obtenerse fácilmente de la ATCC (Colección Americana de Cultivos Tipo).

Además, las cepas de cada bacteria no están limitadas particularmente. Los ejemplos de cepas de Bifidobacterium longum pueden incluir las cepas Bifidobacterium longum 105-A, Bifidobacterium longum aE-194b, Bifidobacterium longum bs-601 y Bifidobacterium longum M101-2. Entre ellas, se prefiere la cepa Bifidobacterium longum 105-A.

35 Los ejemplos de cepas de Bifidobacterium breve pueden incluir una cepa de tipo Bifidobacterium breve (JCM1192) y las cepas Bifidobacterium breve aS-1 y Bifidobacterium breve I-53-8W. Entre ellas, se prefieren la cepa de tipo Bifidobacterium breve y las cepas Bifidobacterium breve aS-1 y Bifidobacterium breve I-53-8W.

40 Los ejemplos de cepas de Bifidobacterium infantis pueden incluir una cepa de tipo Bifidobacterium infantis (JCM1222) y una cepa Bifidobacterium infantis I-10-5. Entre ellas, se prefieren la cepa de tipo Bifidobacterium infantis y la cepa Bifidobacterium infantis I-10-5. Además, los ejemplos de cepas de Bifidobacterium lactentis pueden incluir una cepa de tipo Bifidobacterium lactentis (JCM1220).

45 En el portador de suministro génico de la presente invención, el ADN incorporado en la etapa (3) codifica para CD que es una enzima que convierte el precursor de sustancia antitumoral 5-FC en la sustancia antitumoral 5-FU.

El ADN aislado del plásmido pAdex1CSCD (Riken Gene Bank RDB n.º 1591) contiene ADN que codifica para CD derivada de Escherichia coli. El plásmido pMK116 también contiene ADN que codifica para CD derivada de 50 Escherichia coli (D.A. Mead et al., Protein Engineering 1: 67-74 (1986)).

El ADN que codifica para CD derivada de Escherichia coli corresponde a, por ejemplo, una secuencia de nucleótidos desde el 1494º hasta el 2774º nucleótido en SEQ ID NO: 14 (secuencia de nucleótidos desde el 1536º hasta el 2816º nucleótido en SEQ ID NO: 15). Además, su secuencia de aminoácidos corresponde a la secuencia de

55 aminoácidos de SEQ ID NO: 28 excepto por la metionina de iniciación.

El método de construcción de un portador de suministro génico según la presente invención puede implicar mutar el ADN que codifica para citosina desaminasa y luego incorporar el ADN mutado en un vector de expresión en la etapa (3). Alternativamente, tras preparar un vector de expresión en la etapa (3), puede mutarse la parte de ADN que

60 codifica para la proteína de interés. La etapa de mutación, tras preparar un vector de expresión en la etapa (3), la parte de ADN que codifica para la proteína de interés es más específicamente una etapa de mutación del ADN que codifica para citosina desaminasa que se ha incorporado en el vector de expresión preparado en la etapa (3).

El medio de mutación no está limitado particularmente, y puede usarse un enfoque conocido en la técnica tal como 65 mutagénesis específica de sitio usando PCR.

La proteína de interés es CD de Escherichia coli. Se prefiere que el ácido aspártico codificado por una secuencia de nucleótidos desde el 2433er hasta el 2435º nucleótido en SEQ ID NO: 14 (secuencia de nucleótidos desde el 2475º hasta el 2477º nucleótido en SEQ ID NO: 15) se sustituya por alanina. El ácido aspártico codificado por una secuencia de nucleótidos desde el 2433er hasta el 2435º nucleótido en SEQ ID NO: 14 (secuencia de nucleótidos

5 desde el 2475º hasta el 2477º nucleótido en SEQ ID NO: 15) corresponde a ácido aspártico en la 315ª posición en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 28.

Esta sustitución produce una actividad de CD mucho más excelente que la producida en ausencia de sustitución.

Los ejemplos del vector de expresión según la presente invención pueden incluir un vector de expresión de CD para una bacteria del género Bifidobacterium en el que se ha incorporado ADN que codifica para CD. Los ejemplos específicos de los mismos pueden incluir: un plásmido recombinante pBLES100-S-eCD que porta codA de Escherichia coli insertado en el sentido de 3’ de un promotor hup de Bifidobacterium longum (véanse el documento de patente 4 y el documento no de patente 3); pAV001-HU-eCD (pAV001-HU9aa-eCD) modificado a partir de este

15 pBLES100-S-eCD, que puede transformar Bifidobacterium longum o Bifidobacterium breve; y mutantes de estos plásmidos.

En este contexto, los mutantes de los plásmidos significan vectores en los que se ha mutado el ADN, por ejemplo, ADN que codifica para CD, incorporado en los plásmidos, que son plásmidos que pueden usarse de la misma manera como o más preferiblemente que los vectores originales mutados. Por ejemplo, un mutante de pBLES100-SeCD significa un mutante de ADN de plásmido derivado de pBLES100-S-eCD, que es un plásmido que puede usarse de la misma manera como o más preferiblemente que pBLES100-S-eCD en la presente invención. Alternativamente, un mutante de pAV001-HU-eCD significa un mutante de ADN de plásmido derivado de pAV001-HU-eCD, que es un plásmido que puede usarse de la misma manera como o más preferiblemente que pAV001-HU

25 eCD en la presente invención.

Tales mutantes de los plásmidos pueden facilitarse a modo de ejemplo preferiblemente mediante un plásmido pAV001-HU-eCD-M968 (SEQ ID NO: 27) que es un plásmido en el que se ha introducido una mutación de un único nucleótido en una región que codifica para CD del plásmido pAV001-HU-eCD. En el plásmido pAV001-HU-eCD-M968, se ha sustituido el ácido aspártico codificado por una secuencia de nucleótidos desde el 2433er hasta el 2435º nucleótido en SEQ ID NO: 14 por alanina. Como resultado, se mejora notablemente la actividad de CD.

El portador de suministro génico de la presente invención no está limitado particularmente siempre que sea un portador de suministro génico construido mediante el método de la presente invención.

35 Los ejemplos del portador de suministro génico de la presente invención obtenido usando un vector de expresión que tiene el ADN mutado que codifica para la proteína de interés, pueden incluir un plásmido mutante en un único nucleótido de Bifidobacterium longum 105-A/pAV001-HU-eCD. Particularmente, puede facilitarse a modo de ejemplo preferiblemente mediante Bifidobacterium longum 105-A/pAV001-HUeCD-M968.

Un método de construcción del portador de suministro génico de la presente invención comprende la etapa de transformar un microorganismo anaerobio con el vector de expresión en el que se ha incorporado el ADN que codifica para la proteína de interés.

45 La construcción del microorganismo transformado puede realizarse según un método descrito en manuales experimentales disponibles comercialmente, por ejemplo, Gene Manual (Kodansha Ltd.), Method for Experiments in Gene Manipulation ed. por Yasutaka Takagi (Kodansha Ltd.), Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory (1982), Molecular Cloning, 2ª ed., Cold Spring Harbor Laboratory (1989) o Methods in Enzymol., 194 (1991).

Puesto que la proteína es CD, se requiere para su aplicación a terapias de enzima-profármaco que el microorganismo modificado genéticamente que expresa CD tenga resistencia a 5-FU a una concentración al menos eficaz para una actividad antitumoral, que se convierte a partir de 5-FC mediante CD. Sin embargo, cuando se construyó una bacteria resistente a 5-FU mediante un método de cultivo en aclimatación descrito en el ejemplo 1 en el documento de patente 5 usando el microorganismo modificado genéticamente que expresa CD, la tasa de

55 retención del plásmido tendía a disminuir. Sin embargo, en el método de construcción de un portador de suministro génico según la presente invención, una bacteria resistente a 5-FU que tenía resistencia a 5-FU a una concentración al menos eficaz para una actividad antitumoral se construye en primer lugar como un microorganismo anaerobio usado como huésped mediante un método de cultivo en aclimatación descrito en el ejemplo 2 en el documento de patente 5. Esta bacteria puede usarse como huésped para construir de ese modo un microorganismo modificado genéticamente que tiene una alta tasa de retención del plásmido.

Una composición farmacéutica de la presente invención no está limitada particularmente siempre que comprenda el portador de suministro génico de la presente invención.

65 La composición farmacéutica de la presente invención puede comprender una clase o dos o más clases del/de los portador(es) de suministro génico de la presente invención.

Además, la dosis del portador de suministro génico en la composición farmacéutica de la presente invención no está limitada particularmente siempre que sea una cantidad suficiente para su crecimiento en un sitio tumoral y la expresión de una cantidad suficiente para la expresión de una proteína en una cantidad que puede convertir un

5 precursor de sustancia antitumoral en una cantidad terapéuticamente eficaz de una sustancia antitumoral. Desde un punto de vista económico y el punto de vista de sortear efectos secundarios tanto como sea posible, se prefiere que la dosis del portador de suministro génico sea tan pequeña como sea posible dentro de un intervalo que produce una actividad antitumoral necesaria. Además, la dosis del portador de suministro génico en la composición farmacéutica de la presente invención puede seleccionarse apropiadamente según la gravedad de la enfermedad y el peso corporal, la edad y el sexo de un paciente y también puede aumentarse o disminuirse apropiadamente según el grado de mejora.

Además, la composición farmacéutica de la presente invención puede contener componentes arbitrarios además del portador de suministro génico de la presente invención a menos que los efectos de la presente invención se alteren.

15 Los ejemplos de tales componentes arbitrarios incluyen portadores, excipientes y diluyentes farmacológicamente aceptables.

Como portador de suministro génico de la presente invención puede usarse una bacteria anaerobia que incorpora en la misma un gen a partir del cual puede expresarse una proteína que tiene la actividad de convertir un precursor de sustancia antitumoral en una sustancia antitumoral, comprendiendo la composición farmacéutica de la presente invención el portador de suministro génico como principio activo, en combinación con un precursor de sustancia antitumoral en una cantidad que puede convertirse en una cantidad eficaz de una sustancia antitumoral mediante una proteína expresada por el portador de suministro génico. Este precursor de sustancia antitumoral puede estar contenido en la composición farmacéutica que comprende el portador de suministro génico de la presente invención

25 como principio activo. Sin embargo, se prefiere que el precursor de sustancia antitumoral se use en forma de una composición farmacéutica que comprende el precursor de sustancia antitumoral, en combinación con la composición farmacéutica o el agente terapéutico para tumor sólido que comprende el portador de suministro génico de la presente invención como principio activo.

La dosis del precursor de sustancia antitumoral puede seleccionarse apropiadamente según la tasa de crecimiento del portador de suministro génico usado en combinación con el mismo en un tejido tumoral, y la eficacia de conversión del precursor de sustancia antitumoral en una sustancia antitumoral. Además, de manera similar con la dosis del portador de suministro génico, la dosis del precursor de sustancia antitumoral puede seleccionarse apropiadamente según la gravedad de la enfermedad y el peso corporal, la edad y el sexo de un paciente y también

35 puede aumentarse o disminuirse apropiadamente según el grado de mejora.

Por tanto, cuando la composición farmacéutica de la presente invención se usa en combinación con el precursor de sustancia antitumoral, el método de administración de la composición farmacéutica de la presente invención puede ser el mismo que o diferente del método de administración de la composición farmacéutica que comprende el precursor de sustancia antitumoral. Además, pueden administrarse simultáneamente o a intervalos de tiempo. Se prefiere que la composición farmacéutica que comprende el precursor de sustancia antitumoral se administre tras la administración de la composición farmacéutica de la presente invención de manera que el portador de suministro génico de la presente invención pueda crecer suficientemente en una célula tumoral.

45 La frase “que comprende X en combinación con Y” en la presente invención abarca tanto el caso en el que X e Y están en diferentes formas como el caso en el que X e Y están en la misma forma (por ejemplo, una forma que comprende tanto X como Y). Además, cuando X e Y están en diferentes formas, tanto X como Y pueden contener además otros componentes.

La forma farmacéutica de la composición farmacéutica de la presente invención no está limitada particularmente. Los ejemplos de la misma pueden incluir una preparación líquida o sólida que comprende el portador de suministro génico de la presente invención. La preparación líquida puede producirse: purificando una disolución de cultivo de la bacteria anaerobia como portador de suministro génico de la presente invención; si es necesario, añadiendo a la misma una disolución salina o aditivos farmacéuticos o de reemplazo de fluidos apropiados; y llenando con la

55 mezcla una ampolla o vial o similar. Además, la preparación sólida puede producirse añadiendo un agente protector apropiado a la preparación líquida, llenando con la mezcla una ampolla o vial o similar y entonces liofilizando o secando desde la fase líquida; o añadiendo un agente protector apropiado a la preparación líquida, liofilizando o secando desde la fase líquida la mezcla, y entonces llenando una ampolla o vial o similar. Un método de administración de la composición farmacéutica de la presente invención es preferiblemente administración parenteral. Por ejemplo, pueden realizarse inyección hipodérmica, inyección intravenosa, inyección local y administración intracerebroventricular. La inyección intravenosa es la más preferida.

La composición farmacéutica de la presente invención puede aplicarse a tumores que tienen un entorno anaerobio, preferiblemente, diversos tumores sólidos. Los ejemplos de los tumores sólidos incluyen cáncer de colon-recto, 65 tumor cerebral, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de mama, cáncer de pulmón, cáncer de esófago, cáncer gástrico, cáncer de hígado, cáncer de vesícula biliar, cáncer del conducto biliar, cáncer pancreático, cáncer de células de

islotes pancreáticos, coriocarcinoma, cáncer de colon, cáncer de células renales, cáncer de corteza suprarrenal, cáncer de vejiga urinaria, cáncer de testículos, cáncer prostático, tumor testicular, cáncer de ovario, cáncer uterino, coriocarcinoma, cáncer de tiroides, tumor carcinoide maligno, cáncer de piel, melanoma maligno, osteosarcoma, sarcoma de tejidos blandos, neuroblastoma, tumor de Wilms, retinoblastoma, melanoma y carcinoma de células

5 escamosas.

A continuación en el presente documento, la presente invención se describirá más específicamente con referencia a los ejemplos. Sin embargo, no se pretende que el alcance técnico de la presente invención se limite a estas ejemplificaciones.

[Ejemplo de referencia 1]

Preparación de Bifidobacterium longum 105-A/pAV001-HU-eCD (1) Construcción del plásmido lanzadera pAV001

15 (Construcción del plásmido)

Se amplificó una secuencia que contiene espectinomicina adeniltransferasa (casete de AAD) derivado de Enterococcus faecalis mediante PCR a partir de un plásmido lanzadera pBLES100 de Bifidobacterium longum y Escherichia coli (véanse el documento de patente 4 y el documento no de patente 7), y se subclonó el producto de PCR en un vector PCR-BluntII-TOPO (Invitrogen Corp.) para preparar PCRTOPO-ScaI-AAD-Eamll05I. Se añadieron los sitios de restricción ScaI y Eam1105I a los cebadores directo e inverso, respectivamente.

Tal como se muestra en la figura 1, el vector de clonación pGFPuv (DEFINICIÓN: vector de clonación pGFPuv. REGISTRO: U62636; VERSIÓN: U62636.1 GI: 1490528) adquirido de Invitrogen Corp. está compuesto por un gen

25 de GFPuv, sitios de clonación múltiples (MCS) en ambos extremos del mismo, un gen de resistencia a ampicilina y un origen de replicación de plásmido de Escherichia coli.

Se retiró el sitio de gen de resistencia a ampicilina en este pGFPuv mediante escisión con las enzimas de restricción Eam1105I y ScaI para preparar un fragmento largo. De manera similar, se escindió PCRTOPO-ScaI-AAD-Eam1105I con las enzimas de restricción Eam1105I y ScaI para preparar un fragmento (aproximadamente 1100 pb) que contenía el casete de AAD. Se ligaron estos dos fragmentos usando ADN ligasa de T4 para preparar pGFPuv-SpR. Se confirmaron respectivamente en Escherichia coli la adición del rasgo de resistencia a espectinomicina y la pérdida del rasgo de resistencia a ampicilina en el plásmido preparado pGFPuv-SpR.

35 Se digirió pGFPuv-SpR con las enzimas de restricción SalI (ubicada en el sitio de clonación múltiple en el sentido de 5’ del gen de GFPuv) y SpeI (ubicada en el sitio de clonación múltiple en el sentido de 3’ del gen de GFPuv) para preparar un plásmido pAVN del que se había delecionado el gen de GFPuv.

A continuación, a partir de la información sobre la secuencia de nucleótidos de longitud completa de un plásmido pTB6 derivado de Bifidobacterium longum, se identificó una secuencia de aproximadamente 1900 pb que contenía RepB, SDO, DDO, repeticiones ricas en AT y motivos de unión a ADNA como una unidad de replicación de plásmido de Bifidobacterium longum. Se amplificó la secuencia de aproximadamente 1900 pb que contenía la unidad de replicación de plásmido de Bifidobacterium longum mediante PCR a partir de pTB6, y se subclonó el producto de PCR en un vector PCR-BluntII-TOPO para preparar PCRTOPO-ApaI-1900-ScaI. Se añadieron los sitios de

45 restricción ApaI y ScaI a los cebadores directo e inverso, respectivamente.

Se ligaron el fragmento largo (aproximadamente 2400 pb) obtenido digiriendo pAVN con las enzimas de restricción ApaI y ScaI y un fragmento corto (aproximadamente 1900 pb) obtenido digiriendo PCRTOPO-ApaI-1900-ScaI con las enzimas de restricción ApaI y ScaI de la misma manera usando ADN ligasa de T4 para preparar un plásmido lanzadera pAV001 de Bifidobacterium longum-Escherichia coli (aproximadamente 4300 pb).

(2) Vector de expresión génica de CD pAV001-HU-eCD

(Construcción del vector de expresión)

55 A continuación, se escindió pBLES100-S-eCD con las enzimas de restricción HindIII y SpeI para extraer un fragmento de aproximadamente 2900 pb que contenía un promotor del gen HU, un gen de CD derivada de Escherichia coli y un terminador del gen HU. De manera similar, se escindió el plásmido lanzadera pAV001 con HindIII y SpeI en los sitios de restricción en los sitios de clonación múltiples. Se ligaron el fragmento largo obtenido y el fragmento de aproximadamente 2900 pb descritos anteriormente usando ADN ligasa de T4 para preparar pAV001-HU-eCD (aproximadamente 7100 pb).

(3) Introducción del vector de expresión génica de CD pAV001-HU-eCD en una bacteria del género Bifidobacterium

65 Se cultivó Bifidobacterium longum de tipo natural en medio MRS a 37ºC en condiciones anaerobias, y se separaron las células bacterianas de la disolución de cultivo mediante centrifugación y se suspendieron en una disolución

tampón apropiada para preparar una suspensión bacteriana. A continuación, se introdujo el vector de expresión génica de CD pAV001-HU-eCD en la suspensión bacteriana usando un método de electroporación descrito en los documentos no de patente 2 y 3. Se seleccionó la Bifidobacterium longum recombinante con la introducción (Bifidobacterium longum/pAV001-HU-eCD) basándose en la formación de colonias sobre un medio de agar que

5 contenía el antibiótico espectinomicina.

(4) Actividad enzimática citosina desaminasa en Bifidobacterium longum/pAV001-HU-eCD; medición de la actividad de conversión de 5-FC→5-FU

10 Se subcultivó Bifidobacterium longum/pAV001-HU-eCD en medio MRS que contenía el antibiótico espectinomicina a 37ºC durante 2 días o más en condiciones anaerobias, y se separaron las células bacterianas (2 X 109 UFC) de la disolución de cultivo mediante centrifugación y se suspendieron de nuevo en 4,5 ml de medio MRS. A continuación, se añadieron al mismo 0,5 ml de 5-FC (20 mg/ml), dando como resultado una concentración final de 2 mg/ml, y se cultivaron las células bacterianas a 37ºC en condiciones anaerobias. Tras 0, 4, 8, 18 y 24 horas, se recogieron

15 respectivamente los sobrenadantes de las disoluciones de cultivo a partir de las cuales se habían retirado las células bacterianas mediante centrifugación. Se midieron las concentraciones de 5-FU convertido mediante análisis de cromatografía de gases (métodos de CG-EM de 5-FU, BML). En la figura 2 se muestran los resultados de la medición. Como resultado del análisis, en Bifidobacterium longum/pAV001-HU-eCD, se detectó 5-FU a una concentración de 72,5 µg/ml tras 4 horas y a una concentración de 165,4 µg/ml tras 24 horas.

Ejemplo 1

[Preparación del plásmido HU-eCD]

25 Se construyeron plásmidos de manera que la longitud de la región N-terminal de una proteína HU fusionada a la región N-terminal de eCD se cambió a 2 aminoácidos, 3 aminoácidos o 4 aminoácidos (figura 3).

Se construyeron de la misma manera plásmidos de los que se delecionó la secuencia que codifica para el extremo N-terminal de una proteína HU. En este caso, se prepararon dos clases de plásmidos, uno con un codón de

30 iniciación de la traducción ATG de CD derivada de la cepa de Escherichia coli JM101, y el otro con un codón de iniciación de la traducción GTG de CD derivada de la cepa de Escherichia coli K12. Además, también se construyó un plásmido de manera que la longitud de la región N-terminal de una proteína HU fusionada a la región N-terminal de eCD se cambió a 18 aminoácidos. En la tabla 1 se muestran las secuencias de las partes construidas de los plásmidos.

35 [Tabla 1]

Tabla de construcción de plásmidos

Nombre del plásmido

Secuencia proximal al extremo N-terminal de CD

pAV001-HU0aaATG

pAV001-HU0aaGTG

pAV001-HU2aa-eCD

pAV001-HU3aa-eCD

pAV001-HU4aa-eCD

pAV001-HU-eCD (Control, pAV001-HU9aaeCD)

El término en negrita representa una secuencia añadida al extremo N-terminal de CD.

(1) Construcción del plásmido que añade los 2 aminoácidos N-terminales de la proteína HU

5 Se realizó amplificación por PCR usando 50 pg de pAV001-HU-eCD como molde y ADN polimerasa PrimeSTAR™ HS (Takara Bio Inc.) para obtener los fragmentos de PCR A (aproximadamente 1,3 kpb) y B (aproximadamente 1,3 kpb). Se usaron un cebador externo expuesto en SEQ ID NO: 1 y un cebador interno expuesto SEQ ID NO: 2 que tenían, en el extremo 5’-terminal, una secuencia solapante con el extremo terminal del fragmento de PCR B y

10 contenían una secuencia complementaria a pAV001-HU-eCD en la amplificación del fragmento de PCR A.

El fragmento de PCR A contiene un sitio HindIII derivado del molde en el extremo terminal de ADN. Se usaron un cebador externo expuesto en SEQ ID NO: 3 que tenía un sitio de reconocimiento de KspAI en el lado 5’-terminal y contenía una secuencia complementaria a pAV001-HU-eCD y un cebador interno expuesto en SEQ ID NO: 4 que

15 tenía una secuencia solapante con el extremo terminal del fragmento de PCR A en el lado 5’-terminal y contenía una secuencia complementaria a pAV001-HU-eCD en la amplificación del fragmento de PCR B.

Se realizó el cambio de la secuencia de aminoácidos derivada de la proteína HU mediante cebadores internos. Las condiciones de temperatura implicaron 30 ciclos que implicaban cada uno 98ºC durante 10 segundos, 55ºC durante

20 5 segundos y 72ºC durante 80 segundos, seguido por incubación a 72ºC durante 30 segundos. Se purificaron los fragmento de PCR A y B usando el kit de purificación de PCR QIAquick (QIAGEN), y entonces se mezclaron los fragmentos de PCR purificados A y B a moles iguales.

Se realizó la reacción a 5 ciclos que implicaban cada uno 98ºC durante 10 segundos y 72ºC durante 90 segundos en

25 ausencia de cebadores en una disolución de mezcla de tampón 1xPrimeSTAR™, mezcla de dNTP 200 µM y 2,5 u de ADN polimerasa PrimeSTAR™ HS usando 1 ng de la mezcla de los fragmentos de PCR purificados A y B como molde para ligar los fragmentos de PCR A y B. Entonces, se añadieron los cebadores externos (SEQ ID NO: 1 y 3) a lo mismo, dando como resultado cada concentración final de 0,5 µM, y se realizó la reacción a 25 ciclos que implicaban cada uno 98ºC durante 10 segundos, 55ºC durante 5 segundos y 72ºC durante 160 segundos, seguido

30 por incubación a 72ºC durante 30 segundos para obtener un producto de PCR ligado (aproximadamente 2,6 kpb).

Se separó el producto de PCR ligado en un gel de agarosa SeaPlaque(R) GTG(R) al 1% (tampón 1xTAE, bromuro de etidio 0,5 µg/ml) para cortar un fragmento de ADN de 2,6 kpb. Se extrajo el producto de PCR ligado del gel usando el kit de extracción de gel QIAquick(R) y se digirió con HindIII (Fermentas UAB) y KspAI (Fermentas UAB).

35 Se cortó una banda de ADN de 2,6 kpb mediante separación en un gel de agarosa SeaPlaque(R) GTG(R) al 1% (tampón 1xTAE, bromuro de etidio 0,5 µg/ml). Se extrajo el producto de PCR ligado del gel usando el kit de extracción de gel QIAquick(R).

Se digirió el vector pAV001-HU-eCD con HindIII (Fermentas UAB) y KspAI (Fermentas UAB). Entonces, se cortó un

40 fragmento de ADN de 4,6 kpb mediante separación en un gel de agarosa SeaPlaque(R) GTG(R) al 1% (tampón 1xTAE, bromuro de etidio 0,5 µg/ml). Posteriormente, se extrajo el ADN de vector del gel usando el kit de extracción de gel QIAquick(R).

Se mezcló el producto de PCR ligado con el vector en una razón de vector con respecto a producto de PCR ligado

45 de 1:3 en moles, y se realizó el ligamiento usando el kit de ligamiento de ADN rápido (Fermentas UAB). Se transformó Escherichia coli JM109 con el producto de ligamiento, y se sembraron en placa las cepas sobre medio de agar LB que contenía espectinomicina 30 µg/ml y se cultivó durante la noche a 37ºC para obtener transformantes. Se cultivaron los transformantes durante la noche a 37ºC en medio líquido 2 x LB que contenía espectinomicina 30 µg/ml, y se extrajo el ADN de plásmido (pAV001-HU2aa-eCD) usando el kit QIAprep(R) Spin Miniprep.

(2) Construcción del plásmido que añade los 3 aminoácidos N-terminales de la proteína HU

Se construyó un plásmido que añade los 3 aminoácidos N-terminales de la proteína HU (pAV001-HU3aa-eCD) de la misma manera que en la construcción del plásmido que añade los 2 aminoácidos N-terminales de la proteína HU

55 excepto porque se usaron los cebadores expuestos en SEQ ID NO: 5 y 4 como cebadores internos para la amplificación de los fragmentos de PCR A y B, respectivamente.

(3) Construcción del plásmido que añade los 4 aminoácidos N-terminales de la proteína HU

Se construyó un plásmido que añade los 4 aminoácidos N-terminales de la proteína HU (pAV001-HU4aa-eCD) de la misma manera que en la construcción del plásmido que añade los 2 aminoácidos N-terminales de la proteína HU 5 excepto porque se usaron los cebadores expuestos en SEQ ID NO: 6 y 7 para la amplificación de los fragmentos de PCR A y B, respectivamente. La secuencia de pAV001-HU4aa-eCD se muestra en SEQ ID NO: 14.

(4) Construcción del plásmido que carece de la secuencia que codifica para el extremo N-terminal de la proteína HU y que tiene el codón de iniciación de la traducción ATG

Se construyó un plásmido que carece del extremo N-terminal de la proteína HU y que tiene el codón de iniciación de la traducción ATG (pAV001-HU0aaATG-eCD) de la misma manera que en la construcción del plásmido que añade los 2 aminoácidos N-terminales de la proteína HU excepto porque se usaron los cebadores expuestos en SEQ ID NO: 8 y 9 como cebadores internos para la amplificación de los fragmentos de PCR A y B, respectivamente.

(5)

Construcción del plásmido que carece del extremo N-terminal de la proteína HU y que tiene el codón de iniciación de la traducción GTG

Se construyó un plásmido que carece del extremo N-terminal de la proteína HU y que tiene el codón de iniciación de la traducción GTG (pAV001-HU0aaGTG-eCD) de la misma manera que en la construcción del plásmido que añade los 2 aminoácidos N-terminales de la proteína HU excepto porque se usaron los cebadores expuestos en SEQ ID NO: 10 y 11 como cebadores internos para la amplificación de los fragmentos de PCR A y B, respectivamente.

(6)

Construcción del plásmido que añade los 18 aminoácidos N-terminales de la proteína HU

25 Se mezclaron dos clases de oligo-ADN sintéticos fosforilados de manera 5’-terminal (SEQ ID NO: 12 y 13) que tenían secuencias complementarias entre sí a moles iguales y se aparearon disminuyendo las temperaturas en fases hasta 65ºC durante 5 minutos, 45ºC durante 5 minutos, 37ºC durante 10 minutos y 25ºC durante 10 minutos en presencia de NaCl 0,1 M para preparar un adaptador. El extremo terminal del adaptador es un sitio Bsp119I.

Se digirió el vector pAV001-HU-eCD con Bsp119I (Fermentas UAB). Tras el tratamiento de desfosforilación del extremo terminal del ADN usando CIAP (Fermentas UAB), se ligó el fragmento de ADN resultante con el adaptador usando el kit de ligamiento de ADN rápido (Fermentas UAB). Se transformaron cepas de Escherichia coli JM109 con el producto de ligamiento, y se sembraron en placa las cepas sobre medio agar LB que contenía espectinomicina

35 30 µg/ml y se cultivaron durante la noche at 37ºC para obtener transformantes. Se cultivaron los transformantes durante la noche a 37ºC en medio líquido 2 x LB que contenía espectinomicina 30 µg/ml, y se extrajo el ADN de plásmido (pAV001-HU18aa-eCD) usando el kit QIAprep(R) Spin Miniprep. La secuencia de pAV001-HU18aa-eCD se muestra en SEQ ID NO: 15.

(Transformación de Bifidobacterium longum 105A)

Se mezclaron 80 µl de células competentes Bifidobacterium longum 105A y 5 µl (de 500 a 1000 ng) del ADN de plásmido, y se realizó la transformación usando un sistema de electroporación Gene Pulser II (Bio-Rad Laboratories, Inc., Japón). Se sembraron en placa las cepas sobre medio de agar IWATA que contenía D-rafinosa al 15% y

45 espectinomicina 30 µg/ml y entonces se cultivaron a 37ºC durante dos noches en condiciones anaerobias para obtener transformantes.

(Extracción de proteínas de transformantes de Bifidobacterium longum 105A)

Se inocularon los transformantes en 5 ml de medio líquido MRS (que contenía espectinomicina 30 µg/ml y una disolución de mezcla de cisteína-vitamina C) y se cultivaron durante la noche a 37ºC en condiciones anaerobias. Se inoculó un 1% de la disolución de cultivo en un medio que tenía la misma composición y se cultivó durante la noche a 37ºC en condiciones anaerobias. Se repitió esta etapa dos veces. Se realizó la extracción de proteínas usando un 1% de la disolución de cultivo inoculada en un medio que tenía la misma composición y se cultivó durante

55 aproximadamente 18 horas. Se añadieron 4 ml de una disolución de tampón Tris (Tris-HCl 0,5 M, Triton X-100 al 0,5%, pH 8,4) a de 1 a 4 ml de la disolución de cultivo y se mezclaron, seguido por centrifugación a 13.000 x g a temperatura ambiente durante 15 minutos para eliminar el sobrenadante. Se suspendieron las células bacterianas mediante la adición de 5 ml de una disolución de tampón Tris que tenía la misma composición, seguido por centrifugación a 13.000 x g a temperatura ambiente durante 15 minutos para eliminar el sobrenadante. Se repitió este procedimiento dos veces para lavar las células bacterianas. Se suspendieron las células bacterianas lavadas en 1 ml de una disolución de tampón Tris complementada con 50 µl de un inhibidor de proteasas (Sigma-Aldrich) y se rompieron de manera ultrasónica durante 5 minutos con enfriamiento con hielo. Tras la centrifugación a 13.000 x g a 4ºC durante 20 minutos, se sometió el sobrenadante a medición de la actividad de CD como extracto de proteína total.

(Medición de la actividad de CD)

Se midió la cantidad de la proteína total mediante una modificación del método de Lowry. Se añadió una disolución tampón al extracto de proteína total correspondiente a una cantidad de la proteína total de 50 µg para preparar

5 250 µl de una disolución, que entonces se mezcló con 250 µl de 5-FC 40 mM y entonces se hizo reaccionar a 60ºC durante 20 minutos. Se terminó la reacción mediante la adición de 250 µl de ácido tricloroacético 0,5 M, y se dejó el producto de reacción sobre hielo. Tras la centrifugación a 20.000 x g a 4ºC durante 20 minutos, se añadieron 150 µl de NaOH 0,3 Ma 450 µl del sobrenadante para neutralizar la disolución.

10 Se diluyó la muestra neutralizada 10 veces con una fase móvil de HPLC, y se midieron las cantidades de 5-FU y 5-FC mediante HPLC. Se usó el % de consumo de 5-FC como actividad de CD. En la tabla 2 se muestran los resultados de la medición de la actividad.

[Tabla 2] 15

Efecto de la adición de aminoácidos derivados del extremo N-terminal de la proteína HU a CD

Nombre del transformante

Actividad de CD, consumo de 5-FC (%)/50 µg de proteína total

B. longum 105A/pAV001-HU0aaATG

1,89

B. longum 105A/pAV001-HU0aaGTG

1,08

B. longum 105A/pAV001-HU2aa-eCD

0,64

B. longum 105A/pAV001-HU3aa-eCD

2,80

B. longum 105A/pAV001-HU4aa-eCD

6,35

B. longum 105A/pAV001-HU-eCD (control)

5,50

B. longum 105A/pAV001-HU18aa-eCD

6,48

Se demostró que la adición de aminoácidos derivados del extremo N-terminal de la proteína HU a eCD potencia la actividad de CD. Con respecto al número de aminoácidos añadidos, 2 o menos aminoácidos eran ineficaces; 3 aminoácidos produjeron algo de efecto; y 4 o más aminoácidos produjeron efectos drásticamente aumentados. No

20 se observó ninguna diferencia en la actividad entre 4 y 18 aminoácidos.

Ejemplo 2

[Preparación de Bifidobacterium longum 105-A/mutante de plásmido pAV001-HU-eCD]

25 Se introdujo una mutación en 5 sitios en el plásmido pAV001-HU-eCD.

Se introdujeron 2 tipos de mutaciones: una deleción de 3 nucleótidos y una sustitución de 1 nucleótido. Los plásmidos mutantes de tipo deleción eran pAV001-HU-eCD-D37 y pAV001-HU-eCD-D55, y los plásmidos mutantes

30 de tipo sustitución de nucleótido eran pAV001-HU-eCD-M450, pAV001-HU-eCD-M968 y pAV001-HU-eCD-M1277. Se muestran a continuación métodos de construcción de los plásmidos mutantes.

(1) Construcción de plásmido mutante (pAV001-HU-eCD-D37)

35 Se realizó la amplificación por PCR usando 50 pg de pAV001-HU-eCD como molde y ADN polimerasa PrimeSTAR™ HS (Takara Bio Inc.) para obtener los fragmentos de PCR A (aproximadamente 1,3 kpb) y B (aproximadamente 1,3 kpb). Se usaron un cebador externo expuesto en SEQ ID NO: 1 y un cebador interno expuesto en SEQ ID NO: 16 que tenían una secuencia solapante con el extremo terminal del fragmento de PCR B en el lado 5’-terminal y contenían una secuencia complementaria a pAV001-HU-eCD en la amplificación del fragmento de PCR A. El

40 fragmento de PCR A contiene, en el extremo terminal de ADN, un sitio HindIII derivado del molde. Se usaron un cebador externo expuesto en SEQ ID NO: 3 que tenía un sitio de reconocimiento KspAI en el lado 5’-terminal y contenía una secuencia complementaria a pAV001-HU-eCD y un cebador interno expuesto en SEQ ID NO: 17 que tenía, en el lado 5’-terminal, una secuencia solapante con el extremo terminal del fragmento de PCR A y contenía una secuencia complementaria a pAV001-HU-eCD en la amplificación del fragmento de PCR B. Se introdujo la

45 mutación en el plásmido mediante cebadores internos. Las condiciones de temperatura implicaban 30 ciclos que implicaban cada uno 98ºC durante 10 segundos, 55ºC durante 5 segundos y 72ºC durante 80 segundos, seguido por incubación a 72ºC durante 30 segundos. Se purificaron los fragmentos de PCR A y B usando el kit de purificación de PCR QIAquick (QIAGEN), y entonces se mezclaron los fragmentos de PCR purificados A y B a moles iguales. Se realizó una reacción a 5 ciclos que implicaban cada uno 98ºC durante 10 segundos y 72ºC durante 90 segundos en

50 ausencia de cebadores en una disolución de mezcla de tampón 1xPrimeSTAR™, mezcla de dNTP 200 µM y2,5u de ADN polimerasa PrimeSTAR™ HS usando 1 ng de la mezcla de los fragmentos de PCR purificados A y B como

molde para ligar los fragmentos de PCR A y B. Entonces, se añadieron a lo mismo los cebadores externos (SEQ ID NO: 1 y 3), dando como resultado cada concentración final de 0,5 µM, y se realizó una reacción a 25 ciclos que implicaban cada uno 98ºC durante 10 segundos, 55ºC durante 5 segundos y 72ºC durante 160 segundos, seguido por incubación a 72ºC durante 30 segundos para obtener un producto de PCR ligado (aproximadamente 2,6 kpb). 5 Se separó el producto de PCR ligado en un gel de agarosa SeaPlaque(R) GTG(R) al 1% (tampón 1xTAE, bromuro de etidio 0,5 µg/ml) para cortar una banda de ADN de 2,6 kpb. Se extrajo el producto de PCR ligado del gel usando el kit de extracción de gel QIAquick(R) y se digirió con HindIII (Fermentas UAB) y KspAI (Fermentas UAB). Se cortó una banda de ADN de 2,6 kpb mediante separación en un gel de agarosa SeaPlaque(R) GTG(R) al 1% (tampón 1xTAE, bromuro de etidio 0,5 µg/ml). Se extrajo el producto de PCR ligado del gel usando el kit de extracción de gel

10 QIAquick(R).

Se digirió el vector pAV001-HU-eCD con HindIII (Fermentas UAB) y KspAI (Fermentas UAB). Entonces, se cortó un fragmento de ADN de 4,6 kpb mediante separación en un gel de agarosa SeaPlaque(R) GTG(R) al 1% (tampón 1xTAE, bromuro de etidio 0,5 µg/ml). Se extrajo el ADN de vector del gel usando el kit de extracción de gel 15 QIAquick(R). Se mezcló el producto de PCR ligado con el vector a una razón de vector con respecto a producto de PCR ligado de 1:3 en moles, y se realizó el ligamiento usando el kit de ligamiento de ADN rápido (Fermentas UAB). Se transformó Escherichia coli JM109 con el producto de ligamiento, y se sembraron en placa las cepas sobre medio agar LB que contenía espectinomicina 30 µg/ml y entonces se cultivaron durante la noche a 37ºC para obtener transformantes. Se cultivaron los transformantes durante la noche a 37ºC en medio líquido 2 x LB que contenía

20 espectinomicina 30 µg/ml y se extrajo el ADN de plásmido (pAV001-HU-eCD-D37) usando el kit QIAprep(R) Spin Miniprep.

El pAV001-HU-eCD-D37 es un plásmido que tiene un gen de CD que carece de la secuencia de nucleótidos (secuencia de nucleótidos que codifica para alanina en la 5ª posición en SEQ ID NO: 28) desde el 1503er hasta el 25 1505º nucleótido en SEQ ID NO: 14 (del 1545º al 1547º nucleótido en SEQ ID NO: 15).

(2) Construcción de plásmido mutante (pAV001-HU-eCD-D55)

Se construyó pAV001-HU-eCD-D55 de la misma manera que en la construcción del plásmido pAV001-HUeCD-D37 30 excepto porque se usaron los cebadores expuestos en SEQ ID NO: 18 y 19 como cebadores internos para la amplificación de los fragmentos de PCR A y B, respectivamente.

El pAV001-HU-eCD-D55 es un plásmido que tiene un gen de CD que carece de la secuencia de nucleótidos (secuencia de nucleótidos que codifica para asparagina en la 11ª posición en SEQ ID NO: 28) desde el 1521er hasta 35 el 1523er nucleótido en SEQ ID NO: 14 (del 1563er al 1565º nucleótido en SEQ ID NO: 15).

(3) Construcción de plásmido mutante (pAV001-HU-eCD-M450)

Se construyó pAV001-HU-eCD-M450 de la misma manera que en la construcción del plásmido pAV001-HUeCD-D37 40 excepto porque se usaron los cebadores expuestos en SEQ ID NO: 20 y 21 como cebadores internos para la amplificación de los fragmentos de PCR A y B, respectivamente, y excepto por las condiciones de la reacción PCR.

Con respecto a las condiciones de la reacción PCR, las condiciones de temperatura de reacción para la amplificación del fragmento de PCR A implicaron 30 ciclos que implicaban cada uno 98ºC durante 10 segundos, 45 55ºC durante 5 segundos y 72ºC durante 105 segundos, seguido por incubación a 72ºC durante 30 segundos, y las condiciones de temperatura de reacción para la amplificación del fragmento de PCR B implicaron 30 ciclos que implicaban cada uno 98ºC durante 10 segundos, 55ºC durante 5 segundos y 72ºC durante 1 minuto, seguido por incubación a 72ºC durante 30 segundos. Además, para el ligamiento de los productos de PCR, se realizó una reacción a 5 ciclos que implicaban cada uno temperaturas de reacción de 98ºC durante 10 segundos y 72ºC durante

50 105 segundos.

El pAV001-HU-eCD-M450 es un plásmido que tiene un gen de CD en el que se ha sustituido la secuencia de nucleótidos (secuencia de nucleótidos que codifica para glutamina en la 142ª posición en SEQ ID NO: 28) desde el 1914º hasta el 1916º nucleótido en SEQ ID NO: 14 (del 1956º al 1958º nucleótido en SEQ ID NO: 15) por una

55 secuencia de nucleótidos que codifica para histidina.

(4) Construcción de plásmido mutante (pAV001-HU-eCD-M968)

Se construyó pAV001-HU-eCD-M968 de la misma manera que en la construcción del plásmido pAV001-HUeCD-D37

60 excepto porque se usaron los cebadores expuestos en SEQ ID NO: 22 y 23 como cebadores internos para la amplificación de los fragmentos de PCR A y B, respectivamente, y se usó el cebador expuesto en SEQ ID NO: 24 como cebador externo para la amplificación del fragmento de PCR B, y excepto por las condiciones de la reacción PCR.

65 Con respecto a las condiciones de la reacción PCR, las condiciones de temperatura de reacción para la

amplificación del fragmento de PCR A implicaron 30 ciclos que implicaban cada uno 98ºC durante 10 segundos, 55ºC durante 5 segundos y 72ºC durante 130 segundos, seguido por incubación a 72ºC durante 30 segundos, y las condiciones de temperatura de reacción para la amplificación del fragmento de PCR B implicaron 30 ciclos que implicaban cada uno 98ºC durante 10 segundos, 55ºC durante 5 segundos y 72ºC durante 45 segundos, seguido por 5 incubación a 72ºC durante 30 segundos. Además, para el ligamiento de los productos de PCR, se realizó una reacción a 5 ciclos que implicaban cada uno temperaturas de reacción de 98ºC durante 10 segundos y 72ºC durante 130 segundos. Para la amplificación del producto de PCR ligado, se realizó una reacción a 25 ciclos que implicaba cada uno 98ºC durante 10 segundos, 55ºC durante 5 segundos y 72ºC durante 3 minutos usando los cebadores expuestos en SEQ ID NO: 1 y 24, seguido por incubación a 72ºC durante 30 segundos para obtener un producto de

10 PCR ligado (aproximadamente 2,9 kpb). Se digirió el vector pAV001-HU-eCD con HindIII (Takara Bio Inc.) y Spel (Takara Bio Inc.), y se usó un fragmento (aproximadamente 4,3 kpb) cortado de un gel de agarosa como vector para el producto de PCR ligado. Se muestra la secuencia del pAV001-HU-eCD-M968 obtenido en SEQ ID NO: 27.

El pAV001-HU-eCD-M968 es un plásmido que tiene un gen de CD en el que se ha sustituido la secuencia de

15 nucleótidos (secuencia de nucleótidos que codifica para ácido aspártico en la 315ª posición en SEQ ID NO: 28) desde el 2433er hasta el 2435º nucleótido en SEQ ID NO: 14 (del 2475º al 2477º nucleótido en SEQ ID NO: 15) por una secuencia de nucleótidos que codifica para alanina.

(5) Construcción de plásmido mutante (pAV001-HU-eCD-M1277)

20 Se construyó pAV001-HU-eCD-M1277 de la misma manera que en la construcción del plásmido pAV001-HUeCD-M968 excepto porque se usaron los cebadores expuestos en SEQ ID NO: 25 y 26 como cebadores internos para la amplificación de los fragmentos de PCR A y B, respectivamente, y excepto por las condiciones de la reacción PCR.

25 Con respecto a las condiciones de la reacción PCR, las condiciones de temperatura de reacción para la amplificación del fragmento de PCR A implicaron 30 ciclos que implicaban cada uno 98ºC durante 10 segundos, 55ºC durante 5 segundos y 72ºC durante 150 segundos, seguido por incubación a 72ºC durante 30 segundos, y las condiciones de temperatura de reacción para la amplificación del fragmento de PCR B implicaron 30 ciclos que implicaban cada uno 98ºC durante 10 segundos, 55ºC durante 5 segundos y 72ºC durante 30 segundos, seguido por

30 incubación a 72ºC durante 30 segundos. Además, para el ligamiento de los productos de PCR, se realizó una reacción a 5 ciclos que implicaban cada uno temperaturas de reacción de 98ºC durante 10 segundos y 72ºC durante 150 segundos.

El pAV001-HU-eCD-M1277 es un plásmido que tiene un gen de CD en el que se ha sustituido la secuencia de

35 nucleótidos (secuencia de nucleótidos que codifica para ácido glutámico en la 418ª posición en SEQ ID NO: 28) desde el 2742º hasta el 2744º nucleótido en SEQ ID NO: 14 (del 2784º al 2786º nucleótido en SEQ ID NO: 15) por una secuencia de nucleótidos que codifica para glicina.

(Transformación de Bifidobacterium longum 105A)

40 Se transformó Bifidobacterium longum 105A con el plásmido mutante obtenido de la misma manera que en el ejemplo 1 para obtener sus transformantes.

(Extracción de proteínas de transformantes de Bifidobacterium longum 105A)

45 Se obtuvo un extracto de proteína de la Bifidobacterium longum 105A transformada con el plásmido mutante, de la misma manera que en el ejemplo 1, y se sometió el extracto de proteína a medición de la actividad de CD.

(Medición de la actividad de CD)

50 Se midió la actividad de CD de la misma manera que en el ejemplo 1 usando el extracto de proteína obtenido. En la tabla 3 se muestran los resultados de la medición de la actividad.

[Tabla 3] 55

Cambio en la actividad de CD provocado por la introducción de la mutación en pAV001-HU-eCD

Nombre del transformante

Actividad de CD, consumo de 5-FC (%)/50 µg de proteína total

B. longum 105A/pAV001-HU-eCD-M450

4,13

B. longum 105A/pAV001-HU-eCD-M968

65,8

B. longum 105A/pAV001-HU-eCD-M1277

5,30

B. longum 105A/pAV001-HU-eCD (Control)

5,50

Bifidobacterium longum 105A/pAV001-HU-eCD-M968 obtenida mediante transformación con el mutante pAV001HU-eCD-M968 tiene una actividad de CD mejorada en aproximadamente 12 veces con respecto a la de Bifidobacterium longum 105A/pAV001-HUeCD (control) obtenida mediante transformación con pAV001-HU-eCD no mutado.

5 Por otro lado, no se confirmó que Bifidobacterium longum 105A/pAV001-HU-eCD-M450 y Bifidobacterium longum 105A/pAV001-HU-eCD-M1277 obtenidas mediante transformación con los mutantes pAV001-HU-eCD-M450 y pAV001-HUeCD-M1277, respectivamente, tuviesen una elevación en la actividad debido a la introducción de la mutación.

Ejemplo 3

[Preparación de Bifidobacterium longum 105-A resistente a 5-FU/mutante de plásmido pAV001-HU-eCD]

15 (Adición de resistencia a 5-FU a Bifidobacterium longum 105A/pAV001-HU-eCD-M968)

La Bifidobacterium longum 105A/pAV001-HU-eCD-M968 obtenida en el ejemplo 2 se convirtió en un mutante resistente a 5-FU según el método descrito en el ejemplo 1 en el documento de patente 5.

20 Específicamente, se subcultivó la Bifidobacterium longum 105A/pAV001-HU-eCD-M968 obtenida en el ejemplo 2 en medio MRS a 37ºC durante 2 días o más en condiciones anaerobias. Se diluyó la disolución de cultivo con un diluyente anaerobio y entonces se sembró en placa sobre medio de agar BL que contenía 5-FU 500 µg/ml, y se cultivaron las bacterias de manera anaerobia a 37ºC durante 2 ó 3 días. Entonces, se seleccionaron las bacterias que crecieron para preparar Bifidobacterium longum 105A resistente a 5-FU/pAV001-HU-eCD-M968.

25 (Bifidobacterium longum 105A-R1/pAV001-HU-eCD-M968).

(Transformación de Bifidobacterium longum 105A resistente a 5-FU con el plásmido pAV001-HU-eCD-M968)

30 Se transformó Bifidobacterium longum 105A resistente a 5-FU preparada según el método descrito en el ejemplo 2 en el documento de patente 5 con el plásmido mutante pAV001-HU-eCD-M968 obtenido en el ejemplo 2, de la misma manera que en el ejemplo 1, y se obtuvieron transformantes de la misma.

Específicamente, se inoculó Bifidobacterium longum 105A en 5 ml de medio MRS que contenía 5-FU 100 µg/ml y se

35 cultivó de manera anaerobia a 37ºC durante de 1 a 5 días. Se midió la turbidez (DO=600 nm) del mismo para examinar la presencia o ausencia del crecimiento. Se recuperó 1 ml del medio tras el cultivo en el que se había confirmado el crecimiento y se inoculó en 9 ml de medio MRS que contenía la misma concentración de 5-FU, y se cultivaron las bacterias durante 24 horas en las mismas condiciones de cultivo. Se repitió este procedimiento de inoculación tres veces para preparar de ese modo Bifidobacterium longum 105A resistente a 5-FU. A continuación,

40 se inoculó esta Bifidobacterium longum 105A resistente a 5-FU en medio MRS. Se inoculó la disolución bacteriana tras el cultivo en medio MRS que contenía 5-FU 250 µg/ml. Tras 24 horas, se determinó la presencia o ausencia del crecimiento usando la turbidez (DO=600 nm). Se usó la Bifidobacterium longum 105A resistente a 5-FU preparada usando un medio que contenía 5-FU 100 µg/ml (Bifidobacterium longum 105A-R2) como huésped para la transformación. Se transformó esta Bifidobacterium longum 105A-R2 con el plásmido mutante pAV001-HU-eCD

45 M968 obtenido en el ejemplo 2, de la misma manera que en el ejemplo 1, y se preparó su transformante Bifidobacterium longum 105A-R2/pAV001-HU-eCD-M968.

Ejemplo 4

50 (Extracción de proteínas de Bifidobacterium longum 105A-R2/pAV001-HU-eCD-M968)

Se obtuvo un extracto de proteína de la Bifidobacterium longum 105A-R2/pAV001-HU-eCD-M968 así obtenida, de la misma manera que en el ejemplo 1, y se sometió el extracto de proteína a medición de la actividad de CD.

55 (Medición de la actividad de CD)

Como resultado de la medición de la actividad de CD de la misma manera que en el ejemplo 1 usando el extracto de proteína obtenido, la Bifidobacterium longum 105A-R2/pAV001-HU-eCD-M968 también presentaba una actividad de CD equivalente a la de la Bifidobacterium longum 105A transformada del ejemplo 2, como se muestra en la tabla 4.

60 [Tabla 4]

Bifidobacterium longum 105A/ pAV001-HU-eCD-M968

65,8

Bifidobacterium longum 105A-R2/ pAV001-HU-eCD-M968

62,4

Ejemplo 5

(Medición de la estabilidad de retención del plásmido)

5 Con respecto a la Bifidobacterium longum 105A-R2/pAV001-HU-eCD-M968 (cepa R2) y la Bifidobacterium longum 105A-Rl/pAV001-HU-eCD-M968 (cepa R1) obtenidas en el ejemplo 3, se midió la estabilidad de retención del plásmido mediante el método descrito a continuación. Como resultado, la cepa R2 presentaba una estabilidad de retención del plásmido mucho más favorable que la de la cepa R1, tal como se muestra en la figura 4.

10 (Prueba de medición de la estabilidad de retención del plásmido)

Se realizó la medición de la estabilidad de retención del plásmido mediante el siguiente método de prueba: se cultivaron por separado las cepas R2 y R1 en un medio líquido complementado con un antibiótico (espectinomicina)

15 como marcador selectivo para los plásmidos introducidos, para activar suficientemente las cepas R2 y R1 de Bifidobacterium longum transformadas. Se designó esta disolución bacteriana como disolución bacteriana de día de subcultivo 0. A continuación, se recuperó una alícuota de la disolución bacteriana de día 0 y se inoculó en un medio líquido libre de espectinomicina, seguido por cultivo. Se designó esta disolución bacteriana como disolución bacteriana de día de subcultivo 1. De manera similar, se recuperó una alícuota de la disolución bacteriana de día 1 y

20 se inoculó en un medio líquido libre de espectinomicina, seguido por cultivo para preparar una disolución bacteriana de día de subcultivo 2. Se realizó de manera continua el subcultivo del mismo modo hasta el día 5 para preparar disoluciones bacterianas hasta de día 3 a día 5. Se sembraron en placa por separado las disoluciones bacterianas de día 0, día 1, día 3 y día 5 sobre un medio de placa libre de antibióticos (medio de agar BL) para formar colonias. Se seleccionaron aleatoriamente 100 colonias que crecieron para cada cultivo y se inocularon en medios de agar BL

25 tanto que contenía espectinomicina como libre de espectinomicina mediante un método de réplica usando un palillo esterilizado o similar. Se midieron las tasas de retención del plásmido en el día 0, día 1, día 3 y día 5 a partir de la fórmula numérica descrita a continuación. Se muestran los resultados en la figura 4.

Se calcularon las tasas de retención del plásmido a partir de la siguiente fórmula: 30

El número de colonias en medio de agar BL que contiene espectinomicina

Tasa de retención del plásmido (%) = x 100

El número de colonias en medio de agar BL

Aplicabilidad industrial

35 Según la presente invención, puede construirse eficazmente un portador de suministro génico que consiste en un microorganismo anaerobio que puede crecer en un tejido tumoral en un entorno anaerobio y que puede expresar una proteína que tiene una actividad antitumoral o una proteína que tiene la actividad de convertir un precursor de sustancia antitumoral en una sustancia antitumoral, que es útil como agente terapéutico para tumor sólido y tiene la actividad y eficacia de expresión favorables de una proteína expresada por un gen introducido mediante

40 transformación.

Lista de secuencias

<110> Anaeropharma Science Inc. 45

<120> Método de construcción de un soporte de transporte génico

<130> P035501EPA

50 <150> Documento JP 2006-144720

<151>

<160> 43

55 <170> PatentIn versión 3.1

<210> 1

<211> 23

<212> ADN 60 <213> Secuencia artificial

<220> <223> cebador

5

<400> 1 tcacacagga aacagctatg acc 23

<210> 2 <211> 55 <212> ADN <213> Secuencia artificial

15

<220> <223> cebador <400> 2 ggcgttaata attgtttgta aagcgttatt cgatgccata aagcatcctt cttgg 55

<210> 3 <211> 29 <212> ADN <213> Secuencia artificial

25

<220> <223> cebador

<400> 3 gaacacatcc tggaaggcgt taactcaac

29

<210> 4 <211> 43 <212> ADN <213> Secuencia artificial

35

<220> <223> cebador

<400> 4 tcgaataacg ctttacaaac aattattaac gcccggttac cag

43

45

<210> 5 <211> 58 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> cebador

<400> 5 ggcgttaata attgtttgta aagcgttatt cgagtatgcc ataaagcatc cttcttgg

58

55

<210> 6 <211> 54 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> cebador

<400> 6 ggcgttaata attgtttgta aagcgttatt cgagttgtat gccataaagc atcc

54

65

<210> 7 <211> 47 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> cebador

5

<400> 7 caactcgaat aacgctttac aaacaattat taacgcccgg ttaccag 47

<210> 8 <211> 58 <212> ADN <213> Secuencia artificial

15

<220> <223> cebador <400> 8 gggcgttaat aattgtttgt aaagcgttat tcgacataaa gcatccttct tgggtcag 58

<210> 9 <211> 51 <212> ADN <213> Secuencia artificial

25

<220> <223> cebador

<400> 9 gctttatgtc gaataacgct ttacaaacaa ttattaacgc ccggttacca g

51

<210> 10 <211> 58 <212> ADN <213> Secuencia artificial

35

<220> <223> cebador

<400> 10 gggcgttaat aattgtttgt aaagcgttat tcgacacaaa gcatccttct tgggtcag

58

45

<210> 11 <211> 51 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> cebador

<400> 11 gctttgtgtc gaataacgct ttacaaacaa ttattaacgc ccggttacca g

51

55

<210> 12 <211> 27 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> oligonucleótido

<400> 12 cgaagatcgc ccagaagtcc aacctgt

27

65

<210> 13 <211> 27 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> oligonucleótido

5

<400> 13 cgacaggttg gacttctggg cgatctt 27

10

<210> 14 <211> 7148 <212> ADN <213> Bifidobacterium longum

<210> 15

<211> 7190

<212> ADN

<213> Bifidobacterium longum

5

<210> 16 <211> 40 <212> ADN <213> Secuencia artificial

10

<220> <223> cebador <400> 16 ccgggcgtta ataattgttt gtaagttatt cgaaacgagg 40

15

<210> 17 <211> 40 <212> ADN <213> Secuencia artificial

20

<220> <223> cebador

<400> 17 cctcgtttcg aataacttac aaacaattat taacgcccgg

40

25

<210> 18 <211> 46 <212> ADN <213> Secuencia artificial

30

<220> <223> cebador

35 40

<400> 18 ctggtaaccg ggcaataatt gtttgtaaag cgttattcga aacgag <210> 19 <211> 40 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> cebador 46

45

<400> 19 cgctttacaa acaattattg cccggttacc aggcgaagag 40

50

<210> 20 <211> 36 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> cebador

55

<400> 20

ccacggcgcg acttcatgct tcacttccag cattgc

36

5

<210> 21 <211> 40 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> cebador

<400> 21 ctggaagtga agcatgaagt cgcgccgtgg attgatctgc

40

15

<210> 22 <211> 36 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> cebador

<400> 22 cacggatcga agacagcatc gtgaccaaag cagacg

36

25

<210> 23 <211> 36 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> cebador

35

<400> 23 gctttggtca cgatgctgtc ttcgatccgt ggtatc <210> 24 <211> 27 <212> ADN <213> Secuencia artificial 36

<220> <223> cebador

45

<400> 24 gactagtccg gaataatacg gttggac 27

<210> 25 <211> 29 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> cebador

55

<400> 25 ggcttctggc tgccccagat atacggtgg 29

<210> 26 <211> 29 <212> ADN <213> Secuencia artificial

65

<220> <223> cebador <400> 26

ccaccgtata tctggggcag ccagaagcc 29

<210> 27

<211> 7163

<212> ADN

<213> Bifidobacterium longum

5 <210> 28

<211> 427

<212> PRT

<213> Escherichia coli

10 <400> 28

<210> 29

<211> 18

<212> PRT

<213> Bifidobacterium longum

<210> 30

<211> 12 15 <212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Constructo de plásmido 20

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(12)

<210> 31

<211> 4 10 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Constructo sintético 15

<210> 32 20 <211> 12

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220> 25 <223> Constructo de plásmido

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(12) 30

<400> 32

<210> 33 35 <211> 4

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220> 40 <223> Constructo sintético

45 <210> 34

<211> 15

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

50 <220>

<223> Constructo de plásmido

<220>

<221> CDS 55 <222> (1)..(15)

<210> 35

<211> 5

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Constructo sintético

<400> 35

<210> 36

<211> 18

<212> ADN 15 <213> Secuencia artificial

<220>

<223> Constructo de plásmido

20 <220>

<221> CDS

<222> (1)..(18)

<210> 37

<211> 6

<212> PRT 30 <213> Secuencia artificial

<220>

<223> Constructo sintético

<210> 38

<211> 21 40 <212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Constructo de plásmido 45

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(21)

50 <400> 38

<210> 39

<211> 7 55 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Constructo sintético 60

<400> 39

<210> 40

<211> 36 5 <212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Constructo de plásmido 10

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(36)

15 <400> 40

<210> 41

<211> 12 20 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Constructo sintético 25

<210> 42 30 <211> 63

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220> 35 <223> Constructo de plásmido

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(63) 40

<400> 42

<210> 43 45 <211> 21

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220> 50 <223> Constructo sintético

Claims (10)

1. REIVINDICACIONES

   1. Primer fragmento de ADN que comprende un promotor y un terminador de un gen que codifica para una proteína de unión a ADN similar a histona derivado de una bacteria del género Bifidobacterium, y que tiene entre el promotor

   5 y el terminador un ADN en el que se fusiona un segundo fragmento de ADN que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica para un péptido que consiste en una secuencia de aminoácidos desde el 1er hasta uno cualquiera del 4º al 18º aminoácido en el extremo N-terminal de la proteína de unión a ADN similar a histona en el lado 5’-terminal de un ADN mutado que codifica para citosina desaminasa, en el que el ADN mutado que codifica para citosina desaminasa es (a) un ADN que codifica para la secuencia de aminoácidos mostrada como SEQ ID NO: 28 que tiene la metionina de iniciación excluida o (b) un ADN que codifica para la secuencia de aminoácidos mostrada como SEQ ID NO: 28 que tiene el ácido aspártico en la 315ª posición sustituido por alanina y la metionina de iniciación excluida.
2. 2. Primer fragmento de ADN según la reivindicación 1, en el que la secuencia de nucleótidos que codifica para un

   15 péptido que consiste en una secuencia de aminoácidos desde el 1er hasta uno cualquiera del 4º al 18º aminoácido en el extremo N-terminal de la proteína de unión a ADN similar a histona es una secuencia de nucleótidos desde el 1482º hasta uno cualquiera del 1493er al 1535º nucleótido en SEQ ID NO: 15.

3. 3.

   Primer fragmento de ADN según la reivindicación 1 ó 2, en el que el péptido que consiste en una secuencia de aminoácidos desde el 1er hasta uno cualquiera del 4º al 18º aminoácido en el extremo N-terminal de la proteína de unión a ADN similar a histona es un péptido que consiste en una secuencia de aminoácidos desde el 1er aminoácido hasta uno cualquiera del 4º al 18º aminoácido en SEQ ID NO: 29.

4. 4.

   Primer fragmento de ADN según la reivindicación 3, en el que el péptido que consiste en una secuencia de

   25 aminoácidos desde el 1er hasta uno cualquiera del 4º al 18º aminoácido en SEQ ID NO: 29 es un péptido que consiste en una secuencia de aminoácidos desde el 1er hasta el 9º aminoácido en SEQ ID NO: 29.
5. 5. Método de construcción de un portador de suministro génico que consiste en un microorganismo anaerobio que puede crecer en un tejido tumoral en un entorno anaerobio y que puede expresar citosina desaminasa, que comprende las etapas de:

   (1) preparar un plásmido de fusión que tiene un fragmento de un plásmido de una bacteria del género Bifidobacterium y un fragmento de un plásmido de Escherichia coli;

   35 (2) incorporar un primer fragmento de ADN que comprende un promotor y un terminador de un gen que codifica para una proteína de unión a ADN similar a histona derivado de una bacteria del género Bifidobacterium al plásmido de fusión;

   (3) incorporar, entre el promotor y el terminador, un ADN en el que se fusiona un segundo fragmento de ADN que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica para un péptido que consiste en una secuencia de aminoácidos desde el 1er hasta uno cualquiera del 4º al 18º aminoácido en el extremo N-terminal de la proteína de unión a ADN similar a histona en el lado 5’-terminal de un ADN mutado que codifica para citosina desaminasa para preparar un vector de expresión; y

   45 (4) transformar un microorganismo anaerobio con el vector de expresión, en el que el ADN mutado que codifica para citosina desaminasa es (a) un ADN que codifica para la secuencia de aminoácidos mostrada como SEQ ID NO: 28 que tiene la metionina de iniciación excluida o (b) un ADN que codifica para la secuencia de aminoácidos mostrada como SEQ ID NO: 28 que tiene el ácido aspártico en la 315ª posición sustituido por alanina y la metionina de iniciación excluida.
6. 6. Método de construcción de un portador de suministro génico según la reivindicación 5, en el que la secuencia de nucleótidos que codifica para un péptido que consiste en una secuencia de aminoácidos desde el 1er hasta uno cualquiera del 4º al 18º aminoácido en el extremo N-terminal de la proteína de unión a ADN similar a histona es una secuencia de nucleótidos desde el 1482º hasta uno cualquiera del 1493er al 1535º nucleótido en SEQ ID NO: 15.

7. 7.

   Método de construcción de un portador de suministro génico según la reivindicación 5 ó 6, en el que el péptido que consiste en una secuencia de aminoácidos desde el 1er hasta uno cualquiera del 4º al 18º aminoácido en el extremo N-terminal de la proteína de unión a ADN similar a histona es un péptido que consiste en una secuencia de aminoácidos desde el 1er hasta uno cualquiera del 4º al 18º aminoácido en SEQ ID NO: 29.

8. 8.

   Portador de suministro génico que consiste en un microorganismo anaerobio que puede crecer en un tejido tumoral en un entorno anaerobio, construyéndose el portador de suministro génico mediante un método de construcción según una cualquiera de las reivindicaciones 5 a 7.

   65 9. Portador de suministro génico según la reivindicación 8, en el que la bacteria anaerobia es una bacteria del género Bifidobacterium.

9. 10.

   Portador de suministro génico según la reivindicación 9, en el que la bacteria del género Bifidobacterium es cualquier bacteria del género Bifidobacterium seleccionada de Bifidobacterium adolescentis, Bifidobacterium animalis, Bifidobacterium infantis, Bifidobacterium thermophilum, Bifidobacterium pseudolongum, Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium breve y Bifidobacterium longum.

10. 11.

    Composición farmacéutica que comprende un portador de suministro génico según una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 10.