KR20090023350A

KR20090023350A - 유전자 수송담체 제작방법

Info

Publication number: KR20090023350A
Application number: KR1020087027815A
Authority: KR
Inventors: 유코 시마타니; 요시노리 하마지; 히토미 마츠하시; 준 아마노; 이치로 타니구치; 미노루 후지모리
Original assignee: 가부시키가이샤 아네로파마·사이엔스
Priority date: 2006-05-24
Filing date: 2007-05-24
Publication date: 2009-03-04
Also published as: EP2468861B1; US8911721B2; PL2468861T3; DK2468861T3; EP2019138A1; CN101448940A; EP2019138A4; CN102747074A; CA2652689A1; SG172610A1; PT2468861E; ES2525174T3; CN102747074B; JPWO2007136107A1; JP5048661B2; KR101407975B1; EP2468861A1; CA2652689C; US20090169516A1; WO2007136107A1

Abstract

본 발명은, 형질전환에 의하여 도입한 유전자에 의해 발현되는 단백질의 활성 및 발현효율이 양호한 유전자 수송담체를 효율적으로 제작하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다. 또, 본 발명은, 상기 제작방법에 의하여 제작되는 유전자 수송담체를 함유하는 의약조성물, 및 상기 내성균을 함유하는 고형종양 치료제를 제공하는 것을 목적으로 하는 것이다. 혐기적 환경하에 있는 종양조직내에서 생육이 가능하며, 또한, (A) 항종양활성을 갖는 단백질, 또는, (B) 항종양물질 전구체를 항종양물질로 변환시키는 활성을 갖는 단백질을 발현시킬 수가 있는 혐기성 미생물로 이루어지는 유전자 수송담체에 있어서, 상기 목적단백질을 코드하는 DNA의 5'말단측에, 히스톤모양의 DNA결합단백질의 N말단의 1번째로부터 적어도 4번째까지의 아미노산 서열로 이루어지는 펩티드를 코드하는 염기서열을 포함하는 DNA의 단편을 더 구비시키는 것에 의하여, 본 발명의 과제를 해결한 것이다.

유전자 수송담체, 형질전환

Description

유전자 수송담체 제작방법{METHOD OF CONSTRUCTING GENE TRANSPORT SUPPORT}

본 발명은, 고형종양 치료제로서 유용한, 혐기적 환경하에 있는 종양조직내에서 생육이 가능하며, 또한, (A) 항종양활성을 갖는 단백질, 또는, (B) 항종양물질 전구체를 항종양물질로 변환시키는 활성을 갖는 단백질을 발현할 수가 있는 혐기성 미생물로 이루어지는 유전자 수송담체의 제작방법에 관한 것이다. 또, 본 발명은, 상기 방법에 의하여 제작되는 유전자 수송담체를 함유하는 의약조성물, 및 상기 유전자 수송담체를 함유하는 고형종양 치료제에 관한 것이다.

최근, 악성종양에 대한 유전자 수송담체를 사용하는 치료방법이 여러가지 연구되고 있으며, 예를 들면, 혐기성 균의 클로스트리듐(clostridium)에 대하여, 형질전환한 균을 사용한 종양부위로의 유전자 수송방법이 제안되어 있다(예를 들면, 특허문헌 1, 2 참조).

마찬가지로, 혐기성 균의 비피도박테리움에 대하여, 그 형질전환체가 프로바이오틱의 벡터와, 감염성 질환의 경구백신의 벡터로서의 응용이 기대되고 있으며(예를 들면, 특허문헌3 참조), 또, 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum)에 대하여, 전신투여후, 저산소의 고형종양에 축적하는 것에서, 고형종양에 대한 치료에 대한 응용이 시사되고 있다(예를 들면, 비특허문헌 1, 2 참조).

또, 본 발명자들은, 비피도박테리움 롱검 유래의 히스톤모양의 DNA결합단백질의 프로모터와 융합한 대장균 codA를 보유하는 재조합 플라스미드 pBLES100-S-eCD를 사용하여 형질전환하는 것에 의하여, 항종양활성을 갖는 5-플루오로우라실(이하, 「5-FU」로 약기한다)의 프로드러그(전구체)인 5-플루오로시토신(이하,「5-FC」로 약기한다)을 5-플루오로우라실로 변환하는 효소의 시토신 데아미나제(EC3. 5. 4. 1; 이하, 「CD」로 약기한다)를, 재조합 미생물에 있어서 발현시킬 수가 있는 것을 확인하고, 해당 재조합 미생물, 예를 들면 재조합 비피도박테리움 롱검이, 효소-프로드러그요법으로의 응용에 기대할 수 있다는 것을 보고하고 있다(예를 들면, 특허문헌4 및 비특허문헌3, 4 참조). 또한, 상기 CD발현유전자재조합 미생물을 효소-프로드러그요법으로 응용하기 위해서는, CD에 의하여 5-FC로부터 변환되는, 적어도 항종양활성 유효농도의 5-FU에 대한 내성을 갖고 있는 것이 요구되기 때문에, 그와 같은, CD를 발현하는 5-FU내성균의 제작방법을 개발하여 보고하고 있다(예를 들면, 특허문헌5 참조). 한편, 상기 CD에 대하여, 비특허문헌5에서는, 대장균에 있어서, CD를 코드하는 DNA에 있어서, 해당 CD의 314번째(본 발명의 서열번호 28에 있어서의 315번째에 대응)의 아미노산을 아스파라긴산으로부터 알라닌으로 치환하는 변이를 추가한 바, 변이 전의 야생형의 CD에 비하여, 변이형의 CD는, 5-FC를 5-FU로 변환하는 CD활성이 약 2.2배(50/23)로 증강된 것을 보고하고 있다(비특허문헌5 table1.의 중앙 참조).

악성종양에 대한 치료에 사용되는 재조합균의 형질전환방법에 대해서는 여러가지 보고되어 있으며, 상기 문헌에도, 각각의 형질전환균의 제작방법이 보고되어 있다.

예를 들면, 특허문헌3에는, 비피도박테리움 유래의 플라스미드와 대장균 유래의 플라스미드를 이용하여 비피도박테리움과 대장균으로 상호 복제되는 셔틀플라스미드를 제조하는 단계와, 상기 셔틀플라스미드에 목적단백질을 코딩하는 목적유전자를 결합시켜서 재조합 벡터를 제조하는 단계를 가지며, 상기 제조된 재조합 벡터로 형질전환시키기 위한 숙주세포로서, 상기 셔틀플라스미드의 제조에 이용된 비피도박테리움을 이용하는 것을 특징으로 하는 형질전환 방법이 보고되어 있다.

그 밖에, 예를 들면, 상기 재조합 플라스미드 pBLES100-S-eCD의 구축에 사용된 셔틀플라스미드 pBLES100의 제작방법에 대하여, 비피도박테리움 롱검 BK51의 pTB6과 대장균의 pBR322로부터 구축하는 제작장법이 보고되어 있다(예를 들면, 비특허문헌6 참조).

또한, 상기 셔틀플라스미드 pBLES100과 비교하여 100배를 초과하는 고효율로, 비피도박테리움 롱검을 형질전환할 수 있는 플라스미드 pAV001 및 pBRASTA101의 제작방법이 제안되고 있다(예를 들면, 비특허문헌7 참조).

이와 같이, 악성종양에 대한 치료에 유용한 유전자 수송담체의 제작방법에 대해서는 여러가지 보고되어 있으나, 모두 형질전환에 사용되는 미생물이나 플라스미드 등을 특정한 것으로서, 형질전환방법 자체는 통상의 형질전환기술을 사용한 것이며, 또, 목적으로 하는 유전자, 예를 들면 항종양활성을 갖는 단백질 또는 항종양물질 전구체를 항종양물질로 변환시키는 활성을 갖는 단백질을 발현하는 유전자를 표적환부에 있어서 발현시킬 수 있는 형질전환 미생물 자체의 제작을 목적으 로 한 방법이며, 목적으로 하는 유전자로부터 발현하는 단백질 자체의 활성 또는 발현효율의 향상을 목적으로 한 제작방법은 지금까지 보고되어 있지 않다.

특허문헌1 : 미국특허 제6416754호 공보

특허문헌2 : 미국특허 제6652849호 공보

특허문헌3 : 일본국 특표 2004-519236호 공보

특허문헌4 : 일본국 특개 2002-97144호 공보

특허문헌5 : 국제공개 2006/109619호 공보

비특허문헌1 : Yazawa et al. Cancer Gene Ther., 7, 269-274(2000)

비특허문헌2 : Yazawa et al. Breast Cancer Res. Treat., 66, 165-170(2001)

비특허문헌3 : Nakamura et al., Biosci. Biotechnol. Biochem., 66, 2362-2366(2002)

비특허문헌4 : Fujimori et al., Curr. Opin. Drug Discov. Devel., 5, 200-203(2002)

비특허문헌5 : Sheri et al., Protein Engineering, Design and Selection, 17(8):625-633(2004)

비특허문헌6 : Matsumura et al., Biosci. Biotechnol. Biochem., 61, 1211-1212(1997)

비특허문헌7 : Tanaka et al., Biosci Biotechnol Biochem.; 69(2):422-425(2005)

지금까지 보고되어 있는 악성종양의 치료에 유용한 유전자 수송담체의 제작방법은, 모두, 목적으로 하는 유전자, 예를 들면 항종양활성을 갖는 단백질 또는 항종양물질 전구체를 항종양물질로 변환시키는 활성을 갖는 단백질을 발현하는 유전자를, 표적환부에 있어서 발현할 수가 있는 재조합균 자체의 제작을 목적으로 한 방법이며, 목적으로 하는 유전자로부터 발현하는 단백질 자체의 활성 또는 발현효율의 향상을 목적으로 한 제작방법은 지금까지 보고되어 있지 않다.

그러나, 유전자 수송담체를 사용하는 치료방법에 있어서는, 형질전환 미생물에 도입된 유전자에 의하여 발현되는 단백질의 활성 및 발현효율은 중요한 문제이며, 해당 형질전환 미생물의 유전자에 의하여 발현되는 단백질이, 원래의 야생형 미생물이 보유하고 있던 유전자에 의하여 발현되는 단백질과 동일한 활성을 갖고 있는 것, 또, 원래의 미생물이 보유하고 있던 유전자와 동등 또는 그것 이상으로 발현할 수가 있는 것이 당연히 요구된다.

본 발명의 과제는, 형질전환에 의하여 도입한 유전자에 의하여 발현되는 단백질의 활성 및 발현효율이 양호한 유전자 수송담체를 효율적으로 제작하는 방법을 제공하는 것에 있다. 또, 본 발명의 과제는, 상기 제작방법에 의하여 제작되는 유전자 수송담체를 함유하는 의약조성물, 및 상기 내성균을 함유하는 고형종양 치료제를 제공하는데 있다.

본 발명자들은, 먼저, 목적유전자로서, 항종양물질 전구체를 항종양물질로 변환시키는 활성을 갖는 단백질 중의 CD를 발현하는 유전자를 선택하고, 해당 목적유전자를 결합하는 플라스미드로서, 해당 CD를 발현하는 유전자를 보유하고 있는 대장균의 플라스미드와, 비피도박테리움 롱검 유래의 플라스미드를 융합한 플라스미드 pBLES100-S-eCD를 제작하여, 이들을 사용하여 비피도박테리움 롱검 105A를 재조합한, 비피도박테리움 롱검 105A/pBLES100-S-eCD가 악성종양의 치료에 유용한 유전자 수송담체로서 기대할 수가 있다는 것을 발견하고, 그 제작방법으로서, 목적유전자를 결합시켜 해당 유전자 발현벡터를 제작하는 공정에 있어서, 비피도박테리움 롱검 유래의 히스톤모양의 DNA결합단백질(이하, 「HU단백질」로도 약기한다)을 코드하는 유전자의 발현에 관련되는 프로모터를 사용하여, 그 하류에 목적유전자를 결합시키는 것에 의하여, 목적으로 하는 유전자를 발현할 수 있는 형질전환 미생물을 제작하는 방법을 보고한바 있다(특허문헌4).

본 발명자들은, 상기의 방법에 대해서 더욱 예의 검토하여, 목적유전자를 결합시킨 융합플라스미드로서, 대장균 및 비피도박테리움 롱검 유래의 각각의 플라스미드 중의 해당 플라스미드 복제에 필수의 부분을 포함하여, 숙주영역 확대에 바람직하지 않은 부분을 포함하지 않는 단편을 융합하여 제작한 플라스미드를 사용하는 것에 의하여, 형질전환률을 높일 수 있다는 것을 발견하였다.

또, 해당 숙주로 하는 미생물의 히스톤모양의 DNA결합단백질을 코드하는 유전자의 발현에 관련되는 프로모터의 하류에 목적유전자를 결합시킬 때, 해당 목적유전자가, 해당 유전자의 5'말단측에, 상기 히스톤모양의 DNA결합단백질의 N말단영역을 코드하는 DNA단편을 갖는 것이 필요하며, 또한, 그 DNA단편으로서 적어도 4개의 아미노산을 코드하는 DNA단편을 포함하는 것이 필요하다는 것을 발견하였다.

더 구체적으로, 히스톤모양의 DNA결합단백질을 코드하는 유전자의 발현에 관련되는 프로모터의 하류에 목적유전자를 결합할 때에, 해당 목적유전자 DNA의 5'말단측에, 상기 히스톤모양의 DNA결합단백질의 N말단의 1번째로부터 적어도 4번째까지의 아미노산서열을 코드하는 염기서열을 포함하는 DNA단편을 결합시키는 것에 의하여, 해당 목적유전자의 채취원인 미생물에 있어서의 상기 유전자산물(단백질)과 동일한 활성을 갖는 단백질을, 채취원인 미생물과 동등 또는 그것 이상으로 발현할 수가 있는 미생물을 제작할 수가 있다는 것을 발견하였다.

또한, 본 발명자들은, 발현벡터의 제작공정에 있어서, 결합된 목적유전자의 DNA를 일부 변이화(變異化)하는 것에 의하여, 보다 높은 활성을 갖는 단백질을 산생시킬 수가 있다는 것을 발견하고, 또, 특히, 해당 목적유전자가 항종양물질 전구체를 항종양물질로 변환시키는 활성을 갖는 단백질 중의 CD를 발현하는 유전자인 경우, 숙주가 되는 혐기성 미생물로서, 적어도 항종양활성 유효농도의 5-플루오로우라실 내성능을 갖는 5-플루오로우라실 내성균을 사용하는 것에 의하여, 플라스미드 보유율이 높은, 유전자재조합 미생물을 제작할 수가 있다는 것을 발견하고, 본 발명을 완성하였다.

즉, 본 발명은,

[1] 혐기적 환경하에 있는 종양조직내에서 생육이 가능하며, 또한, (A) 항종양활성을 갖는 단백질, 또는, (B) 항종양물질 전구체를 항종양물질로 변환시키는 활성을 갖는 단백질을 발현할 수가 있는 혐기성물질로 이루어지는 유전자 수송담체의 제작방법에 있어서,

비피도박테리움속 세균의 플라스미드의 단편 및 대장균의 플라스미드의 단편을 갖는 융합플라스미드를 제작하는 공정(1)과,

상기 융합플라스미드에, 비피도박테리움속 세균 유래의, 히스톤모양의 DNA결합단백질을 코드하는 유전자의 프로모터 및 터미네이터를 포함하는 DNA단편을 결합시키는 공정(2)과,

상기 프로모터와 터미네이터의 사이에, (a) 항종양활성을 갖는 단백질을 코드하는 DNA, 또는, (b) 항종양물질 전구체를 항종양물질로 변환시키는 활성을 갖는 단백질을 코드하는 DNA를 결합시켜 발현벡터를 제작하는 공정(3)과,

상기 발현벡터를 사용하여 혐기성 미생물을 형질전환하는 공정(4)을 가지며,

상기 공정(3)의 발현벡터 제작공정에 있어서 결합되는, (a) 항종양활성을 갖는 단백질을 코드하는 DNA, 또는, (b) 항종양물질 전구체를 항종양물질로 변환시키는 활성을 갖는 단백질을 코드하는 DNA가, 그 5'말단측에, 상기 히스톤모양의 DNA결합단백질의 N말단의 1번째로부터 적어도 4번째까지의 아미노산 서열로 이루어지는 펩티드를 코드하는 염기서열을 포함하는 DNA의 단편을 더 구비하는 것을 특징으로 하는 유전자 수송담체의 제작방법과,

[2] 히스톤모양의 DNA결합단백질의 N말단의 1번째로부터 적어도 4번째까지의 아미노산 서열로 이루어지는 펩티드가, 서열번호29의 1번째로부터 4번째~18번째의 어느 하나까지의 아미노산 서열로 이루어지는 펩티드인, 상기 [1]에 기재된 유전자 수송담체의 제작방법과,

[3] (a) 항종양활성을 갖는 단백질을 코드하는 DNA, 또는, (b) 항종양물질 전구체를 항종양물질로 변환시키는 활성을 갖는 단백질을 코드하는 DNA를 변이화하는 공정(5)를, 공정(4)보다 앞서서 더 갖는, 상기 [1] 또는 [2]에 기재된 유전자 수송담체의 제작방법과,

[4] (a) 항종양활성을 갖는 단백질을 코드하는 DNA, 또는, (b) 항종양물질 전구체를 항종양물질로 변환시키는 활성을 갖는 단백질을 코드하는 DNA를 변이화하는 공정(5)이, 공정(3)에서 제작한 발현벡터에 결합된, (a) 항종양활성을 갖는 단백질을 코드하는 DNA, 또는, (b) 항종양물질 전구체를 항종양물질로 변환시키는 활성을 갖는 단백질을 코드하는 DNA를 변이화하는 공정(5')인, 상기 [3]에 기재된 유전자 수송담체의 제작방법과,

[5] 유전자 수송담체가, 혐기적 환경하에 있는 종양조직내에서 생육이 가능하며, 또한, 항종양물질 전구체를 항종양물질로 변환시키는 활성을 갖는 단백질을 발현할 수가 있는 혐기성 미생물로 이루어지는 유전자 수송담체인, 상기 [1]~[4] 중 어느 하나에 기재된 유전자 수송담체의 제작방법과,

[6] 항종양물질 전구체를 항종양물질로 변환시키는 활성을 갖는 단백질이, 시토신데아미나제인, 상기 [1]~[5] 중 어느 하나에 기재된 유전자 수송담체의 제작방법과,

[7] 혐기성 미생물로 이루어지는 유전자 수송담체가, 적어도 항종양활성 유효농도의 5-플루오로우라실 내성능을 갖는 시토신 데아미나제 발현 5-플루오로우라실 내성균인, 상기 [6]에 기재된 유전자 수송담체의 제작방법과,

[8] 적어도 항종양활성 유효농도의 5-플루오로우라실 내성능을 갖는 시토신 데아미나제 발현 5-플루오로우라실 내성균이, 적어도 항종양활성 유효농도의 5-플루오로우라실 내성균을 갖는 5-플루오로우라실 내성균을 숙주로서 사용하여 제작한 것을 특징으로 하는, 상기 [7]에 기재된 유전자 수송담체의 제작방법과,

[9] 히스톤모양의 DNA결합단백질의 N말단의 1번째로부터 적어도 4번째까지의 아미노산 서열로 이루어지는 펩티드를 코드하는 염기서열을 포함하는 DNA의 단편이, 서열번호14 또는 15의 1482번째로부터 적어도 1493번째까지의 염기서열을 포함하는 DNA의 단편인, 상기 [1]~[8] 중 어느 하나에 기재된 유전자 수송담체의 제작방법과,

[10] 서열번호14 또는 15의 1482번째로부터 적어도 1493번째까지의 염기서열을 포함하는 DNA의 단편이, 서열번호15의 1482번째로부터 1493번째~1535번째의 어느 하나까지의 염기서열을 포함하는 DNA의 단편인, 상기 [9]에 기재된 유전자 수송담체의 제작방법과,

[11] 혐기성 미생물이 박테리아인, 상기 [1]~[10] 중 어느 하나에 기재된 유전자 수송담체의 제작방법과,

[12] 박테리아가 장내세균인, 상기 [11]에 기재된 유전자 수송담체의 제작방법과,

[13] 장내세균이 비피도박테리움속 세균인, 상기 [12]에 기재된 유전자 수송담체의 제작방법과,

[14] 비피도박테리움속 세균이, 비피도박테리움 아돌레센티스(B. adolescentis), 비피도박테리움 아니말리스(B. animalis), 비피도박테리움 인판티스(B. infantis), 비피도박테리움 써모피럼(B. thermophilum), 비피도박테리움 슈도롱검(B. pseudolongum), 비피도박테리움 비피덤(B. bifidum), 비피도박테리움 브레베(B. breve), 및 비피도박테리움 롱검(B. longum)으로부터 선택되는 어느 하나의 비피도박테리움속 세균인, 상기 [13]에 기재된 유전자 수송담체의 제작방법과,

[15] 비피도박테리움속 세균이, 비피도박테리움 롱검인 것을 특징으로 하는, 상기 [13] 또는 [14]에 기재된 유전자 수송담체의 제작방법과,

[16] 상기 공정(4)의 형질전환에 사용되는 발현벡터가, 플라스미드 pAV001-HU-eCD의 1염기 변이도입(變異導入)플라스미드인, 상기 [1]~[15] 중 어느 하나에 기재된 유전자 수송담체의 제작방법과,

[17] 플라스미드 pAV001-HU-eCD의 1염기 변이도입 플라스미드에 있어서의 CD를 코드하는 염기서열이, 서열번호28에 기재된 대장균 CD의 아미노산 서열에 있어서의 315번째에 대응하는 아미노산의 아스파라긴산이 다른 아미노산으로 치환된 아미노산 서열을 코드하는 염기서열인, 상기 [16]에 기재된 유전자 수송담체의 제작방법과,

[18] 다른 아미노산이 알라닌인, 상기 [17]에 기재된 유전자 수송담체의 제작방법과,

[19] 플라스미드 pAV001-HU-eCD의 1염기 변이도입 플라스미드가, 플라스미드 pAV001-HU-eCD-M968인, 상기 [18]에 기재된 유전자 수송담체의 제작방법에 관한 것이다.

또, 본 발명은,

[20] 비피도박테리움속 세균의 플라스미드의 단편, 대장균의 플라스미드의 단편, 및 비피도박테리움속 세균 유래의, 히스톤모양의 DNA결합단백질을 코드하는 유전자의 프로모터 및 터미네이터를 포함하는 DNA단편을 가지며, 상기 프로모터와 터미네이터의 사이에, (a) 항종양활성을 갖는 단백질을 코드하는 DNA, 또는, (b) 항종양물질 전구체를 항종양물질로 변환시키는 활성을 갖는 단백질을 코드하는 DNA를 가지며, 또한, (a) 항종양활성을 갖는 단백질을 코드하는 DNA, 또는, (b) 항종양물질 전구체를 항종양물질로 변환시키는 활성을 갖는 단백질을 코드하는 DNA의 5'말단측에, 상기 히스톤모양의 DNA결합단백질의 N말단의 1번째로부터 적어도 4번째까지의 아미노산 서열로 이루어지는 펩티드를 코드하는 염기서열을 포함하는 DNA의 단편을 더 구비하는 발현벡터에서 형질전환된 혐기성 미생물로 이루어지는 유전자 수송담체와,

[21] 혐기적 환경하에 있는 종양조직내에서 생육이 가능하며, 또한, (a) 항종양활성을 갖는 단백질을 코드하는 DNA 또는, (b) 항종양물질 전구체를 항종양물질로 변환시키는 활성을 갖는 단백질을 코드하는 DNA를 갖는 혐기성 미생물의 유전자 수송담체이며, 상기 [1]~[19] 중 어느 하나에 기재된 제작방법으로 제작되는 유전자 수송담체와,

[22] 혐기성 미생물이 비피도박테리움속 세균인, 상기 [20] 또는 [21]에 기재된 유전자 수송담체와,

[23] 비피도박테리움속 세균이, 비피도박테리움 아돌레센티스, 비피도박테리움 아니말리스, 비피도박테리움 인판티스, 비피도박테리움 써모피럼, 비피도박테리움 슈도롱검, 비피도박테리움 비피덤, 비피도박테리움 브레베, 및 비피도박테리움 롱검으로부터 선택되는 어느 하나의 비피도박테리움속 세균인, 상기 [22]에 기재된 유전자 수송담체와,

[24] 비피도박테리움속 세균이, 비피도박테리움 롱검인, 상기 [22] 또는 [23]에 기재된 유전자 수송담체와,

[25] 혐기적 환경하에 있는 종양조직내에서 생육이 가능하며, 또한, 항종양물질 전구체를 항종양물질로 변환시키는 활성을 갖는 단백질을 발현할 수가 있는, 상기 [20]~[24] 중 어느 하나에 기재된 유전자 수송담체와,

[26] 항종양물질 전구체를 항종양물질로 변환시키는 활성을 갖는 단백질이 시토신 데아미나제인, 상기 [25]에 기재된 유전자 수송담체와,

[27] 적어도 항종양활성 유효농도의 5-플루오로우라실 내성능을 갖는 시토신 데아미나제 발현 5-플루오로우라실 내성균인, 상기 [26]에 기재된 유전자 수송담체와,

[28] 유전자 수송담체가, 비피도박테리움 롱검 105-A/pAV001-HU-eCD의 플라스미드 1염기 변이체인, 상기 [26] 또는 [27]에 기재된 유전자 수송담체와,

[29] 비피도박테리움 롱검 105-A/pAV001-HU-eCD의 플라스미드 1염기 변이체가, 비피도박테리움 롱검 105-A/pAV001-HU-eCD-M968인, 상기 [28]에 기재된 유전자 수송담체에 관한 것이다.

또한, 본 발명은,

[30] 상기 [20]~[29] 중 어느 하나에 기재된 유전자 수송담체를 함유하는 의약조성물과,

[31] 상기 [25]~[29] 중 어느 하나에 기재된 유전자 수송담체와, 상기 유전자 수송담체가 발현할 수가 있는 상기 단백질에 의하여 항종양물질로 변환되는 항종양물질 전구체를 결합시켜 이루어지는 의약조성물과,

[32] 유전자 수송담체가 상기 [25]~[29] 중 어느 하나에 기재된 유전자 수송담체이며, 항종양물질 전구체가 5-플루오로시토신인, 상기 [31]에 기재된 의약조성물에 관한 것이다.

또한, 본 발명은,

[33] 유효치료량의 항종양활성을 갖는 단백질을 발현시키기에 충분한 양의 상기 [20]~[24] 중 어느 하나에 기재된 유전자 수송담체를 함유하는 고형종양 치료제와,

[34] 항종양물질 전구체로부터 유효치료량의 항종양물질로 변환할 수 있는 양의 상기 단백질을 발현시키기에 충분한 양의 상기 [25]~[29] 중 어느 하나에 기재된 유전자 수송담체와, 상기 유전자 수송담체가 발현할 수가 있는 상기 단백질에 의하여 변환되며, 또한, 유효치료량의 항종양물질로 변환할 수 있는 양의 항종양물질 전구체를 조합시켜 이루어지는, 고형종양 치료제와,

[35] 상기 유전자 수송담체가 상기 [25]~[29] 중 어느 하나에 기재된 유전자 수송담체이며, 상기 항종양물질 전구체가 5-플루오로시토신인, 상기 [34]에 기재된 고형종양 치료제에 관한 것이다.

또, 본원 명세서에 있어서는, (a) 항종양활성을 갖는 단백질을 코드하는 DNA와 (b) 항종양물질 전구체를 항종양물질로 변환시키는 활성을 갖는 단백질을 코드하는 DNA를, 이하, 「목적단백질을 코드하는 DNA」로 약기하는 경우도 있다.

본 발명에 의하면, 고형종양 치료제로서 유용한, 혐기적 환경하에 있는 종양조직내에서 생육이 가능하며, 또한, 항종양활성을 갖는 단백질, 또는, 항종양물질 전구체를 항종양물질로 변환시키는 활성을 갖는 단백질을 발현할 수가 있는 혐기성 미생물로 이루어지는 유전자 수송담체에 있어서, 형질전환에 의하여 도입한 유전자에 의하여 발현되는 단백질의 활성 및 발현효율이 양호한 유전자 수송담체를 효율적으로 제작할 수가 있다.

본 발명에 있어서의 유전자 수송담체를 악성종양 등의 환자에게 투여하면, 본 발명의 유전자 수송담체인 혐기성 미생물이 종양내에서 증식하여, 거기서 목적단백질을 발현시킨다. 목적단백질이 항종양활성을 갖는 단백질인 경우는 그대로 항종양효과를 발휘하며, 한편, 목적단백질이 항종양물질 전구체를 항종양물질로 변환하는 활성을 갖는 단백질인 경우는, 유전자 수송담체와 항종양물질 전구체를 종양부위에 있어서 공존시키면, 상기 유전자 수송담체로부터 발현된 목적단백질이 항종양물질 전구체를 항종양물질로 변환시켜, 항종양효과를 발휘한다.

항종양물질 전구체를 항종양물질로 변환시키는 활성을 갖는 단백질이 CD인 경우, 항종양물질 전구체로서 5-FC가 바람직하게 사용된다. 5-FC는 CD에 의하여 5-FU로 변환되며, 5-FU는 우수한 항종양효과를 발휘한다. 전신투여에 의하여 충분한 항종양효과가 얻어지는 양의 5-FU를 전신에 투여하면, 전신성의 부작용이 발생하지만, 본 발명의 유전자 수송담체를 사용하면, 부작용을 그다지 발생하지 않는 5-FC를, 종양부위에서 특이적으로 5-FU로 변환시킬 수가 있기 때문에, 5-FU를 그대로 투여하는 경우에 비하여, 현격하게 높은 5-FU농도를 종양내에 있어서 실현하는 것이 가능하게 되며, 그 결과, 매우 우수한 항종양효과를 얻을 수 있다.

그러나, CD를 발현하는 유전자 수송담체를 이용하여 종양부위에 있어서 5-FC로부터 5-FU로 변환시키기만 하면, 그것으로 바로 실용화에 견딜 수 있는 레벨의 종양치료제가 얻어진다는 것은 아니다. 이와 같은 종양치료제의 항종양효과나 실용성은, 3개의 요소에 크게 좌우된다. 즉, 유전자 수송담체인 혐기성 미생물의 균체량, 상기 혐기성 미생물이 발휘하는 CD활성의 정도, 종양부위에 있어서의 5-FC의 농도이다. 5-FC 및 혐기성 미생물을 많이 투여하면 하는 만큼, 보다 강력한 항종양효과가 얻어지는 것은 당연하나, 부작용을 가능한 한 낮게 하는 관점에서는 필요한 항종양효과가 얻어지는 범위내에서 5-FC의 투여량을 가능한 한 소량으로 억제하는 것이 바람직하며, 적어도, 임상에서 인정되고 있는 용량보다도 적게 하는 것이 요망된다. 또, 혐기성 미생물에 대해서도, 아무리 독성이 낮은 것을 사용한다 하여도, 인체로의 영향을 최소한으로 하는 관점에서는, 필요한 항종양효과가 얻어지는 범위내에서 최대한 소량으로 억제하는 것이 바람직하다. 이와 같은 사항들을 기초로 하면, CD를 발현시키는 유전자 수송담체를 이용하여 종양부위에 있어서 5-FC로부터 5-FU로 변환하는 것을 이용한 종래의 항종양제는, 임상레벨에서의 실용성은 어느 경우에나 충분하다고는 말할 수 없었다.

예를 들면, 특허문헌4의 실시예4에 있어서, 마우스의 치료실험에 사용된 5-FC의 농도는 500mg/kg이며, 그 농도에 있어서 유효하고 충분한 항종양효과가 얻어지고 있다. 그러나, 쿄와약품공업주식회사의 심재성 진균증 치료제 ANCOTIL(일본약국방 플루시토신 500mg을 함유)의 용법 및 용량의 기재 「진균혈증, 진균성 수막염, 진균성 호흡기 감염증, 흑색진균증에는, 통상적으로, 플루오로시토신으로서, 1일 100~200mg/kg을 4회로 분할하여 경구투여한다. 요로진균증, 소화관 진균증에는, 통상적으로, 플루오로시토신으로서, 1일 50~100mg/kg을 4회로 분할하여 경구투여한다.」로부터도 알 수 있듯이, 임상시험에서 실제로 인정되고 있는 5-FC의 최대용량은 200mg/kg이다. 따라서, 특허문헌4의 실시예에서 사용한 실험계를 이용하여 5-FC의 임상용량(200mg/kg)으로 충분한 항종양효과를 얻기 위해서는, 적어도 2.5배(≒500/200)의 효소활성 증강이 필요하였다.

한편, 비특허문헌5는, 대장균에 있어서, CD를 코드하는 DNA에 있어서, 해당 CD의 314번째(본 발명의 서열번호28에 있어서의 315번째에 대응)의 아미노산을 아스파라긴산으로부터 알라닌으로 치환하는 변이를 추가한 바, 변이 전의 야생형의 CD에 비하여, 변이형의 CD는, 5-FC를 5-FU로 변환하는 CD활성(kcat/Km 값)이 약 2.2배(50/23)로 증강된 것을 보고하고 있는바, 이 증강효과는 상기 과제해결을 위해서는 아직 불충분하다. 그러나, 본 발명의 유전자 수송담체에 있어서 목적단백질인 CD를 코드하는 DNA의 5'말단측에, 상기 히스톤모양의 DNA결합단백질의 N말단의 1번째로부터 적어도 4번째까지의 아미노산서열로 이루어지는 펩티드를 코드하는 염기서열을 포함하는 DNA의 단편을 더 구비시키고, 또한, 상기 CD의, 상기 서열번호28에 있어서의 315번째의 아스파라긴산을 알라닌으로 치환시켰는바, 전혀 예상외로, 해당 CD활성이 약12배까지 증강되었다.

상기 CD활성의 12배의 증강을, 상기 실험결과를 기준으로 하여 계산하면, 5-FC투여량은 약42mg/kg, 즉 최소 임상용량(50mg/kg)이하에서도 만족하게 되며, 매우 높은 실용성을 기대할 수가 있는 것이다.

따라서, 본 발명의 유전자 수송담체 중, 목적단백질인 CD를 코드하는 DNA의 5'말단측에, 상기 히스톤모양의 DNA결합단백질의 N말단의 1번째로부터 적어도 4번째까지의 아미노산 서열로 이루어지는 펩티드를 코드하는 염기서열을 포함하는 DNA의 단편을 더 구비시키고, 또한, 상기 CD의, 상기 서열번호28에 있어서의 315번째의 아스파라긴산이 알라닌으로 치환된 유전자 수송담체(예를 들면, 비피도박테리움 롱검 105-A/pAV001-HU-eCD-M968)는, 특히 우수한 실용성이 기대된다.

실제에 있어서, 특허문헌4에서 사용된 변이화되어 있지 않은 CD를 갖는 유전자 수송담체(재조합 비피더스균)를, 인간유래의 유방암 세포주(KPL-1) 이식 누드마우스의 치료계에 사용한 경우, 5-FC로부터 유효농도의 5-FU로 종양내에서 변환하기에 필요한 균농도는 10⁷CFU/g이상인 것이 확인되고 있으나, 본 발명의 유전자 수송담체 중, 그리고 상기 CD의, 상기 서열번호28에 있어서의 315번째의 아스파라긴산이 알라닌으로 치환된 유전자 수송담체를 동일한 실험계에 사용한 경우, 상기의 균농도의 100분의 1의 농도인 10⁵CFU/g로, 동등한 종양내 5-FU농도를 얻을 수가 있다는 것이 본 발명자들의 실험에 의하여 확인되고 있다.

도 1은, 비피도박테리움 롱검 105A/pAV001-HU-eCD의 제작과정을 나타내는 도 면.

도 2는, 비피도박테리움 롱검 105A/pAV001-HU-eCD에 있어서의 CD활성(5-FC로부터 변환된 5-FU의 농도)를 나타내는 도면.

도 3은, HU단백질 N말단 2아미노산 부가 플라스미드의 구축과정을 나타내는 도면.

도 4는, 2종류의 5-FU내성으로 한 비피도박테리움 롱검 105A/pAV001-HU-eCD-M968의 플라스미드 유지율의 결과를 나타내는 도면.

본 발명의 유전자 수송담체의 제작방법은, 혐기적 환경하에 있는 종양조직내에서 생육이 가능하며, 또한, (A) 항종양활성을 갖는 단백질, 또는, (B) 항종양물질 전구체를 항종양물질로 변환시키는 활성을 갖는 단백질을 발현할 수가 있는 혐기성 미생물로 이루어지는 유전자 수송담체의 제작방법에 있어서,

상기 프로모터와 터미네이터의 사이에, (a) 항종양활성을 갖는 단백질을 코드하는 DNA, 또는, (b) 항종양물질 전구체를 항종양물질로 변환시키는 활성을 갖는 단백질을 코드하는 DNA를 결합하여 발현벡터를 제작하는 공정(3)과,

상기 발현벡터를 사용하여 혐기성 미생물을 형질전환시키는 공정(4)을 가지며,

상기 공정(3)의 발현벡터 제작공정에 있어서 결합되는, (a) 항종양활성을 갖는 단백질을 코드하는 DNA, 또는, (b) 항종양물질 전구체를 항종양물질로 변환시키는 활성을 갖는 단백질을 코드하는 DNA가, 그 5'말단측에, 상기 히스톤모양의 DNA결합단백질의 N말단의 1번째로부터 적어도 4번째까지의 아미노산 서열로 이루어지는 펩티드를 코드하는 염기서열을 포함하는 DNA의 단편을 더 구비하는 것을 특징으로 하는 것이다.

본 발명의 유전자 수송담체의 제작방법은, 비피도박테리움속 세균의 플라스미드의 단편 및 대장균의 플라스미드의 단편을 갖는 융합플라스미드를 제작하는 공정(1)과, 상기 융합플라스미드에, 비피도박테리움속 세균 유래의, 히스톤모양의 DNA결합단백질을 코드하는 유전자의 프로모터 및 터미네이터를 포함하는 DNA단편을 결합시키는 공정(2)과, 상기 프로모터와 터미네이터의 사이에, (a) 항종양활성을 갖는 단백질을 코드하는 DNA, 또는, (b) 항종양물질 전구체를 항종양물질로 변환시키는 활성을 갖는 단백질을 코드하는 DNA를 결합하여 발현벡터를 제작하는 공정(3)과, 상기 발현벡터를 사용하여 혐기성 미생물을 형질전환하는 공정(4)을 가지며, 상기 공정(3)의 발현벡터 제작공정에 있어서 결합되는, (a) 항종양활성을 갖는 단백질을 코드하는 DNA, 또는, (b) 항종양물질 전구체를 항종양물질로 변환시키는 활성을 갖는 단백질을 코드하는 DNA가, 그 5'말단측에, 상기 히스톤모양의 DNA결합단백질의 N말단의 1번째로부터 적어도 4번째까지의 아미노산 서열로 이루어지는 펩티 드를 코드하는 염기서열을 포함하는 DNA의 단편을 더 구비하는 것이라면 특별히 제한되지 않는다.

본 발명의 유전자 수송담체의 제작방법은, 상기 공정(1)~공정(4)를 갖고 있는 한 특별히 제한되지 않으며, 본 발명의 효과를 손상시키지 않는 한, 다른 임의의 공정을 가져도 좋다. 또, 본 발명의 유전자 수송담체의 제작방법에 있어서는, 공정(2)와 공정(3)의 순서의 전후는 불문하고, (1), (2), (3), (4)의 순서로 이들의 공정을 가지고 있어도 좋으며, (1), (3), (2), (4)의 순서로 이들 공정을 가지고 있어도 좋다. 이들 양쪽의 형태가, 본 발명의 유전자 수송담체의 제작방법에 적절하게 포함된다.

특히, 공정(3)의 발현벡터 제작공정에 있어서, 목적단백질을 코드하는 DNA를 결합시킬 때의, 상기 목적으로 하는 단백질을 코드하는 DNA의 5'말단측에 HU단백질의 N말단영역을 코드하는 DNA의 단편을 구비시키는 형태로서는 어떠한 형태라도 좋으며, 예를 들면, 목적단백질을 코드하는 DNA의 5'말단측에, 상기 HU단백질의 N말단영역을 코드하는 DNA의 단편을 붙여서 결합시키는 형태라도 좋으며, 목적단백질을 코드하는 DNA를, 상기 HU단백질을 코드하는 DNA의 중간위치에 결합시켜, HU단백질의 N말단영역을 코드하는 DNA와, HU단백질의 C말단영역을 코드하는 DNA로, 목적단백질을 코드하는 DNA를 끼워넣는 것과 같은 형태라도 좋다.

또한, 공정(3)의 발현벡터 제작공정에 있어서, 목적단백질을 코드하는 DNA의 5'말단측에 HU단백질의 N말단영역을 코드하는 DNA의 단편을 구비시킬 때의 순서는, 목적단백질을 코드하는 DNA의 5'말단측에 HU단백질의 N말단영역을 코드하는 DNA의 단편을 구비하고 있는 발현벡터가 얻어지는 한, 특별히 제한되지 않으며, 예를 들면, 목적단백질을 코드하는 DNA의 5'말단측에 HU단백질의 N말단영역을 코드하는 DNA의 단편을 구비시킨 후에 그 DNA를 융합플라스미드에 결합시켜도 좋으며, 목적단백질을 코드하는 DNA를 융합플라스미드에 결합시킨 후에, HU단백질의 N말단영역을 코드하는 DNA의 단편을, 목적단백질을 코드하는 DNA의 5'말단측에 결합시켜도 좋으며, HU단백질의 N말단영역을 코드하는 DNA의 단편을 융합플라스미드에 결합시킨 후에, 목적단백질을 코드하는 DNA를, HU단백질의 N말단영역을 코드하는 DNA의 단편의 3'말단측에 결합시켜도 좋다.

또, 본 발명의 효과가 얻어지는 한, HU단백질의 N말단영역을 코드하는 DNA의 단편의 3'말단측과, 목적단백질을 코드하는 DNA의 5'말단과는, 본 발명에 있어서의 발현벡터에 있어서 직접 결합하고 있지 않아도 좋으나, 직접 결합하고 있는 것이 바람직하다.

이 경우, 목적단백질을 코드하는 DNA의 5'말단측에 구비시키는, HU단백질의 N말단영역을 코드하는 DNA의 단편이 너무 길면, 발현하는 목적단백질의 성격이 변화해버릴 가능성이 있기 때문에, 이 관점에서는 HU단백질의 N말단영역을 코드하는 DNA의 단편은 가능한 한 짧은 편이 바람직하나, 그러나 너무 짧으면 단백질의 발현률이 낮아지기 때문에, 이들 양쪽의 관점에서 밸런스가 좋은 적당한 길이로 하는 것이 바람직하다.

구체적으로는, 상기 HU단백질의 N말단의 1번째로부터 적어도 4번째까지의 아미노산 서열로 이루어지는 펩티드를 코드하는 염기서열을 포함하는 DNA단편인 한, 특별히 제한되지 않으나, 상기 HU단백질의 N말단의 1번째로부터 4번째~18번째의 어느 하나까지의 아미노산 서열로 이루어지는 펩티드를 코드하는 염기서열을 포함하는 DNA단편인 것이 바람직하다. 또, HU단백질의 N말단의 1번째로부터 18번째까지의 아미노산 서열은, 서열번호29에 기재되어 있다. 서열번호29의 아미노산 서열은, 서열번호15의 1482번째로부터 1535번째의 염기서열에 의하여 코드되는 아미노산 서열이다.

HU단백질의 N말단의 1번째로부터 4번째까지의 아미노산 서열로 이루어지는 펩티드를 코드하는 염기서열을 포함하는 DNA단편을 갖는 플라스미드로서는, 예를 들면, pAV001-HU4aa-eCD(서열번호14)를 들 수가 있으며, HU단백질의 N말단의 1번째로부터 9번째까지의 아미노산 서열로 이루어지는 펩티드를 코드하는 염기서열을 포함하는 DNA단편을 갖는 플라스미드로서는, pAV001-HU-eCD(pAV001-HU9aa-eCD)를 들 수가 있으며, HU단백질의 N말단의 1번째로부터 18번째까지의 아미노산 서열로 이루어지는 펩티드를 코드하는 염기서열을 포함하는 DNA단편을 갖는 플라스미드로서는, pAV001-HU18aa-eCD(서열번호15)를 들 수가 있다.

HU단백질의 N말단영역의 길이를 변화시키는 방법으로서는 특별히 제한되지 않으며, 후술하는 실시예에서 실행하고 있는 바와 같이, HU단백질의 N말단영역의 서열에 기초하여 적당한 프라이머를 설계하여, 그들 프라이머를 사용한 PCR을 실시하는 것 등에 의하여, 소망하는 아미노산 수의 N말단영역의 서열을 용이하게 입수할 수가 있다.

또, 본 발명의 제작방법은, 공정(1)에 있어서, 비피도박테리움속 세균의 플 라스미드의 단편 및 대장균의 플라스미드의 단편을 갖는 융합플라스미드를 사용하는 것에 특징을 갖는 제작방법인바, 본 발명에 사용되는 비피도박테리움속 세균의 플라스미드의 단편으로서는 비피도박테리움 롱검 유래의 플라스미드의 단편이 바람직하며, 예를 들면, pTB6의 복제개시점(oriV)(서열번호14의 염기번호 3419~3778)-repB부분(서열번호14의 염기번호 3983~4676)을 포함하며, MembB, MobA, OrifI 및 oriT영역을 포함하지 않는 pTB6유래의 영역부분을 들 수가 있다.

또, 본 발명에 사용되는 대장균 플라스미드의 단편으로서는, 대장균의 복제개시점(ori)영역(서열번호14의 염기번호 6356~6999)을 포함하며, 암피실린 내성유전자(ampR)를 포함하지 않거나, 또는, 암피실린 내성유전자(ampR)의 발현산물인 β-락타마제 영역을 코드하는 DNA가 결실(缺失)되어 있는 플라스미드 단편을 들 수가 있다.

본 발명의 제작방법의 공정(2)에서 사용되는, 비피도박테리움속 세균 유래의, HU단백질을 코드하는 유전자의 프로모터 및 터미네이터는, 공지된 방법에 따라 입수할 수가 있다. 보다 구체적으로는, 비피도박테리움속 세균의 공지된 HU단백질의 서열에 근거하여, 그 비피도박테리움속 세균의 HU단백질을 코드하는 유전자 클론화하는 것에 의하여, 그 유전자의 프로모터 및 터미네이터를 입수할 수가 있다.

예를 들면, 비피도박테리움 롱검 유래의, HU단백질을 코드하는 유전자의 프로모터 및 터미네이터를 포함하는 서열로서, 각각, 서열번호14 또는 15의 염기번호234~1481에서 나타내는 DNA, 서열번호14의 염기번호 2979~3098(서열번호15의 염기번호 3021~3140)에서 나타내는 DNA를 바람직하게 예시할 수가 있다.

본 발명의 유전자 수송담체인 혐기성 미생물을 제작할 때에, 본 발명에 있어서의 발현벡터로 형질전환하는 혐기성 미생물로서는, 본 발명에 사용할 수 있는 한 특별히 제한되지 않으나, 혐기성 박테리아인 것이 바람직하며, 장내세균인 것이 보다 바람직하며, 비피도박테리움속 세균인 것이 더 바람직하다.

비피도박테리움속 세균으로서는, 예를 들면, 비피도박테리움 아돌레센티스, 비피도박테리움 아니말리스, 비피도박테리움 인판티스, 비피도박테리움 써모피럼, 비피도박테리움 슈도롱검, 비피도박테리움 비피덤, 비피도박테리움 브레베, 및 비피도박테리움 롱검을 들 수가 있으며, 비피도박테리움 롱검이 가장 바람직하다.

이들 균은, 모두 시판되고 있거나, 또는 기탁기관으로부터 용이하게 입수할 수가 있다. 예를 들면, 비피도박테리움 롱검 ATCC-15707, 비피도박테리움 비피덤 ATCC-11863, 비피도박테리움 인판티스 ATCC-15697 등은, ATCC(The American Type Culture Collection)로부터 용이하게 입수할 수가 있다.

또, 각각의 균의 주(株)에 대해서도 특별히 한정되지 않으며, 예를 들면, 비피도박테리움 롱검의 주에 대해서는, 비피도박테리움 롱검 105-A주, 비피도박테리움 롱검 aE-194b주, 비피도박테리움 롱검 bs-601주, 비피도박테리움 롱검 M101-2주를 들 수가 있으며, 그 중에서도 비피도박테리움 롱검 105-A주가 바람직하다.

비피도박테리움 브레베의 주에 대해서는, 예를 들면, 비피도박테리움 브레베 표준주(JCM1192), 비피도박테리움 브레베 aS-1주, 비피도박테리움 브레베 I-53-8W주를 들 수가 있으며, 그 중에서도, 비피도박테리움 브레베 표준주, 비피도박테리움 브레베 aS-1주, 비피도박테리움 브레베 I-53-8W주가 바람직하다.

비피도박테리움 인판티스의 주에 대해서는, 예를 들면, 비피도박테리움 인판티스 표준주(JCM1222), 비피도박테리움 인판티스 I-10-5주를 들 수가 있으며, 그 중에서도, 비피도박테리움 인판티스 표준주, 비피도박테리움 인판티스 I-10-5주가 바람직하다. 또, 비피도박테리움 락텐티스(B. lactentis)의 주에 대해서는, 예를 들면, 비피도박테리움 락텐티스 표준주(JCM1220)를 들 수가 있다.

본 발명에 있어서의 항종양활성을 갖는 단백질로서는, 예를 들면, 사이토카인을 들수가 있으며, 구체적인 사이토카인으로서는, 예를 들면, 인터페론(IFN)-α, β, γ, 과립구 마크로파지(macrophage) 콜로니 자극인자(GM-CSF), 인터로이킨(IL)-1α, 1β, 2, 3, 4, 6, 7, 10, 12, 13, 15, 18, 종양괴사인자(TNF)-α, 림포톡신(LT)-β, 과립구 콜로니 자극인자(G-CSF), 마크로파지 콜로니 자극인자(M-CSF), 마크로파지 유주(游走) 저지인자(MIF), 백혈병 저지인자(LIF), T세포활성화 공(共)자극인자 B7(CD80) 및 B7-2(CD86), 키트·리간도, 온코스타틴M 등을 들 수가 있다. 또, 엔도스타틴, 안지오스타틴, 크링글-1, 2, 3, 4, 5 등의 혈관 신생 억제물질도 들 수가 있다.

이들 단백질의 서열은 여러가지 생물에 있어서 알려져 있으며, 그 서열정보에 기초하여 PCR법 등의 공지된 방법을 이용하는 것에 의하여, 본 발명에 사용되는 항종양활성을 갖는 단백질을 코드하는 DNA를 입수할 수가 있다.

또, 본 발명에 있어서의 항종양물질 전구체를 항종양물질로 변환하는 활성을 갖는 단백질로서는, 5-FC를 항종양활성물질의 5-FU로 변환시키는 효소인 CD를 들 수가 있다.

본 발명의 유전자 수송담체의 공정(3)에 있어서 결합되는 DNA로서는, (a) 항종양활성을 갖는 단백질을 코드하는 DNA, 및 (b) 항종양물질 전구체를 항종양물질로 변환시키는 활성을 갖는 단백질을 코드하는 DNA 중 어느 하나의 DNA라도 좋으나, (b) 항종양물질 전구체를 항종양물질로 변환시키는 활성을 갖는 단백질을 코드하는 DNA가 바람직하며, 그 중에서도 특히, 항종양물질 전구체의 5-FC를 항종양물질의 5-FU로 변환시키는 효소의 CD를 코드하는 DNA가 바람직하다.

이와 같은 CD를 코드하는 DNA는, 예를 들면, 대장균 유래의 CD를 코드하는 DNA를 함유하는 플라스미드 pAdex 1 CSCD(이화학연구소 Gene Bank RDB No. 1591), 또는 동일하게 대장균 유래의 CD를 코드하는 DNA를 함유하는 플라스미드 pMK116으로부터 단리되는 것을 사용할 수가 있다(D. A. Mead et al., Protein Engineering 1:67-74(1986)).

대장균 유래의 CD를 코드하는 DNA로서는, 예를 들면, 서열번호14의 1494번째로부터 2774번째의 염기서열(서열번호15의 1536~2816번째의 염기서열)에 상당하며, 또, 그 아미노산 서열로서는 서열번호28의 아미노산 서열로부터 개시 메티오닌을 제거한 아미노산 서열에 상당한다.

본 발명에 있어서의 CD의 유래는 특별히 제한되지 않으며, 서열번호28의 아미노산 서열에 대하여 예를 들면 90%이상, 보다 바람직하게는 95%이상의 상동성을 가지며, 또한 CD활성을 갖는 아미노산 서열을 코드하는 DNA를 사용할 수도 있다.

본 발명에 있어서의 유전자 수송담체의 제작방법은, (a) 항종양활성을 갖는 단백질을 코드하는 DNA, 또는, (b) 항종양물질 전구체를 항종양물질로 변환시키는 활성을 갖는 단백질을 코드하는 DNA를 변이화하는 공정(5)를 갖지 않아도 좋으나, 보다 우수한 항종양활성 또는 항종양물질 전구체를 항종양물질로 변환시키는 활성을 얻는다는 관점에서, 공정(4)보다 앞서서 상기 공정(5)을 더 갖는 것이 바람직하다.

즉, 예를 들면, 목적유전자를 코드하는 DNA를 변이화한 후에, 공정(3)에 있어서 상기 변이화 DNA를 발현벡터에 결합시켜도 좋으며, 공정(3)에서 발현벡터를 제작한 후에, 상기 목적유전자를 코드하는 DNA부분을 변이화하여도 좋다. 공정(3)에서 발현벡터를 제작한 후에, 상기 목적유전자를 코드하는 DNA부분을 변이화하는 공정을 보다 구체적으로 설명하면, 공정(3)에서 제작한 발현벡터에 결합된, (a) 항종양활성을 갖는 단백질을 코드하는 DNA, 또는, (b) 항종양물질 전구체를 항종양물질로 변환시키는 활성을 갖는 단백질을 코드하는 DNA를 변이화하는 공정(5')이 된다.

변이화의 수단으로서는 특별히 제한되지 않으며, PCR을 이용한 부위특이적 변이법 등의 공지된 방법을 사용할 수가 있다.

변이화하는 바람직한 부위는, 목적단백질에 따라 다르기 때문에 일률적으로는 말할 수 없으나, 목적단백질이 대장균의 CD인 경우는, 서열번호14에 있어서의 2433~2435번째의 염기서열(서열번호15에 있어서의 2475~2477번째의 염기서열)에 코드되는 아스파라긴산을 다른 아미노산으로 치환하는 것이 바람직하며, 서열번호14에 있어서의 2433~2435번째의 염기서열(서열번호15에 있어서의 2475~2477번째의 염기서열)에 코드되는 아스파라긴산을 알라닌으로 치환하는 것이 보다 바람직하다. 또, 서열번호14에 있어서의 2433~2435번째의 염기서열(서열번호15에 있어서의 2475~2477번째의 염기서열)에 코드되는 아스파라긴산은, 서열번호28의 아미노산 서열의 315번째의 아스파라긴산에 상당한다.

상기의 치환에 의하여, 치환하지 않은 경우와 비교하여 현격하게 우수한 CD활성이 발휘된다.

본 발명에 있어서의 발현벡터로서는, 예를 들면, CD를 코드하는 DNA를 결합시킨, 비피도박테리움속 세균용의 CD발현벡터를 들 수가 있으며, 구체적으로 예를 들면, 비피도박테리움 롱검 hup 프로모터의 하류에 삽입한 대장균 codA를 보유하는 재조합 플라스미드 pBLES100-S-eCD(특허문헌4 및 비특허문헌3 참조)와, 상기 pBLES100-S-eCD를 개량한, 비피도박테리움 롱검이나 비피도박테리움 브레베를 형질전환할 수 있는 pAV001-HU-eCD(pAV001-HU9aa-eCD), 또는 이들 플라스미드의 변이체를 들 수가 있다.

여기서, 플라스미드의 변이체란, 플라스미드에 결합된 DNA, 예를 들면, CD를 코드하는 DNA를 변이화한 벡터이며, 변이화하고 있지 않은 원래의 벡터와 동일하거나 또는 보다 바람직하게 사용할 수가 있는 플라스미드를 의미한다. 예를 들면, pBLES100-S-eCD의 변이체란, pBLES100-S-eCD에서 유래하는 플라스미드 DNA의 변이체이며, 본 발명에 있어서 pBLES100-S-eCD와 동일하거나 또는 보다 바람직하게 사용될 수 있는 플라스미드를 의미한다. 또, pAV001-HU-eCD의 변이체란, pAV001-HU-eCD에 유래하는 플라스미드 DNA의 변이체이며, 본 발명에 있어서 pAV001-HU-eCD와 동일하거나 또는 보다 바람직하게 사용할 수 있는 플라스미드를 의미한다.

이와 같은, 플라스미드의 변이체로서, 플라스미드 pAV001-HU-eCD의 CD코드 영역에 1염기의 변이가 도입된 플라스미드인, 플라스미드 pAV001-HU-eCD-M968(서열번호27)을 적당하게 예시할 수가 있다. 플라스미드 pAV001-HU-eCD-M968은, 서열번호14에 있어서의 2433~2435번째의 염기서열에 코드되는 아스파라긴산이 알라닌으로 치환되어 있으며, 그 결과, CD활성이 현저하게 향상되어 있다.

본 발명의 유전자 수송담체는, 비피도박테리움속 세균의 플라스미드의 단편, 대장균의 플라스미드의 단편, 및 비피도박테리움속 세균 유래의, 히스톤모양의 DNA결합단백질을 코드하는 유전자의 프로모터 및 터미네이터를 포함하는 DNA단편을 가지며, 상기 프로모터와 터미네이터의 사이에, (a) 항종양활성을 갖는 단백질을 코드하는 DNA, 또는, (b) 항종양물질 전구체를 항종양물질로 변환시키는 활성을 갖는 단백질을 코드하는 DNA를 가지며, 또한, (a) 항종양활성을 갖는 단백질을 코드하는 DNA, 또는, (b) 항종양물질 전구체를 항종양물질로 변환시키는 활성을 갖는 단백질을 코드하는 DNA의 5'말단측에, 상기 히스톤모양의 DNA결합단백질의 N말단의 1번째로부터 적어도 4번째까지의 아미노산 서열로 이루어지는 펩티드를 코드하는 염기서열을 포함하는 DNA의 단편을 더 구비하는 발현벡터에서 형질전환된 혐기성 미생물로 이루어지는 유전자 수송담체인 한 특별히 제한되지 않는다.

본 발명의 유전자 수송담체는, 예를 들면 본 발명의 유전자 수송담체의 제조방법에 의하여 제작할 수가 있다.

또, 본 발명의 유전자 수송담체는, 목적단백질을 코드하는 DNA가 변이화되어 있지 않는 경우, 상기 단백질을 코드하는 DNA가 그 5'말단측에 구비하고 있는, HU 단백질의 N말단의 아미노산 서열로 이루어지는 펩티드를 코드하는 DNA는, HU단백질의 N말단의 1번째로부터 9번째까지의 아미노산 서열로 이루어지는 펩티드를 코드하는 DNA를 제외하여도 좋다.

또, 본 발명의 유전자 수송담체에 있어서의 (a) 항종양활성을 갖는 단백질을 코드하는 DNA, 또는, (b) 항종양물질 전구체를 항종양물질로 변환시키는 활성을 갖는 단백질을 코드하는 DNA는, 변이화되어 있지 않은 DNA라도 좋으나, 변이화된 DNA로서, 상기 변이화 DNA에 의하여 코드되는 단백질의 항종양활성 또는 항종양 전구체를 항종양물질로 변환시키는 활성이, 변이화 전의 DNA에 의하여 코드되는 단백질의 상기 활성에 비하여 향상되어 있는 것과 같은 변이화 DNA인 것이 바람직하다.

변이화된 목적단백질을 코드하는 DNA를 갖는 발현벡터를 사용하여 얻어진 본 발명의 유전자 수송담체로서, 비피도박테리움 롱검 105-A/pAV001-HU-eCD의 플라스미드 1염기 변이체를 들 수가 있으며, 그 중에서도 특히, 비피도박테리움 롱검 105-A/pAV001-HU-eCD-M968을 바람직하게 예시할 수가 있다.

본 발명의 유전자 수송담체의 제작방법은, 목적단백질을 코드하는 DNA가 결합된 발현벡터를 사용하여 혐기성 미생물을 형질전환시키는 공정을 갖는다.

형질전환 미생물의 제작은, 시판된 실험서, 예를 들면, 유전자 매뉴얼(고단샤), 타카기 야스타카 편 유전자조작실험법(고단샤), Molecular Cloning(Cold Spring Harbor Laboratory)(1982), Molecular Cloning, 2nd ed.(Cold Spring Harbor Laboratory)(1989), Methods in Enzymol., 194(1991), 등에 기재된 방법에 따라서 실시할 수가 있다.

또, 본 발명의 유전자 수송담체에 있어서의 (b) 항종양물질 전구체를 항종양물질로 변환시키는 활성을 갖는 단백질이 CD인 경우, 해당 CD발현 유전자재조합 미생물을 효소-프로드러그요법으로 응용하는데는, CD에 의하여 5-FC로부터 변환되는 5-FU에 대하여, 적어도 항종양활성 유효농도의 5-FU에 대한 내성을 갖고 있는 것이 요구된다. 그러나, CD를 발현하는 유전자재조합 미생물을 사용하여, 특허문헌5의 실시예1에 기재된 순치배양방법에 따라 5-FU내성균을 제작한 경우, 플라스미드 유지율이 저하하는 경향이 있었다. 그러나, 본 발명의 유전자 수송담체의 제작방법에 있어서, 특허문헌5의 실시예2에 기재된 순치배양방법에 따라, 먼저 숙주가 되는 혐기성 미생물로서, 적어도 항종양활성 유효농도의 5-FU내성능을 갖는 5-FU내성균을 제작하고, 이것을 숙주로서 사용하는 것에 의하여, 플라스미드 유지율이 높은, 유전자재조합 미생물을 제작할 수가 있다.

본 발명의 의약조성물은, 본 발명의 유전자 수송담체를 함유하고 있는 한 특별히 제한되지 않는다. 또, 본 발명의 고형종양 치료제는, 본 발명의 유전자 수송담체를 함유하고 있는 한 특별히 제한되지 않는다.

본 발명의 의약조성물이나 고형종양 치료제는, 본 발명의 유전자 수송담체의 1종 또는 2종 이상을 함유하고 있어도 좋다.

또, 본 발명의 의약조성물과 고형종양 치료제의 유전자 수송담체의 투여량은, 종양부위에 있어서 생육이 가능하며, 또한, 유효치료량의 항종양활성을 갖는 단백질을 발현시키기에 충분한 양, 또는, 항종양물질 전구체를 유효치료량의 항종양물질로 변환시킬 수 있는 양의 단백질을 발현하기에 충분한 양인 한 특별한 제한 은 두지 않으나, 경제적인 관점 및 부작용을 가능한 한 회피한다는 관점에서, 필요한 항종양활성이 얻어지는 범위에 있어서 가능한 한 적은 편이 바람직하다. 또, 본 발명의 의약조성물과 고형종양 치료제의 유전자 수송담체의 투여량은, 질환의 정도, 환자의 체중, 연령, 성별에 따라서 적절히 선택하여, 개선의 정도에 따라서 적절히 증감시키는 것도 가능하다.

또, 본 발명의 의약조성물과 고형종양 치료제는, 본 발명의 효과를 방해하지 않는 한, 본 발명의 유전자 수송담체 외에 임의의 성분을 함유하고 있어도 좋다. 그와 같은 임의의 성분으로서, 예를 들면 약리학적으로 허용되는 담체, 부형제, 희석제 등을 들 수가 있다.

본 발명의 유전자 수송담체와 고형종양 치료제가, 항종양물질 전구체를 항종양물질로 변환시키는 활성을 갖는 단백질을 발현할 수가 있는 유전자를 결합한 혐기성 균인 경우, 상기 유전자 수송담체를 활성성분으로서 함유하는 본 발명의 의약조성물과 고형종양 치료제는, 상기 유전자 수송담체에 의하여 발현되는 단백질에 의하여 유효량의 항종양물질로 변환시킬 수 있는 양의 항종양물질 전구체와 결합시켜 사용할 수가 있다. 이 항종양물질 전구체는 본 발명의 유전자 수송담체를 활성성분으로서 함유하는 의약조성물과 고형종양 치료제에 함유시켜도 좋으나, 해당 항종양물질 전구체를 함유하는 의약조성물로서, 본 발명의 유전자 수송담체를 활성성분으로서 함유하는 의약조성물과 고형종양 치료제와 결합시켜 사용하는 것이 바람직하다.

항종양물질 전구체의 투여량은, 결합시켜 사용하는 유전자 수송담체의 종양 조직에 있어서의 생육률 및 항종양물질 전구체로부터 항종양물질로의 변이효울에 따라서 적당히 선택할 수가 있다. 또, 유전자 수송담체의 투여량과 동일하게, 질환의 정도, 환자의 체중, 연령, 성별에 따라서 적당히 선택하여, 개선의 정도에 따라서 적당히 증감시킬 수도 있다.

이와 같이, 항종양물질 전구체와 결합시켜 본 발명의 의약조성물과 고형종양 치료제를 사용하는 경우, 본 발명의 의약조성물과 고형종양 치료제의 투여방법과, 항종양물질 전구체를 함유하는 의약조성물의 투여방법은 동일하여도 좋고 달라도 좋으며, 또, 투여도 동시에 하여도 좋고 격차를 두어도 좋으나, 항종양물질 전구체를 함유하는 의약조성물의 투여는, 본 발명의 의약조성물과 고형종양 치료제의 투여 후, 본 발명의 유전자 수송담체가 종양세포에서 충분하게 생육할 수 있는 시간을 둔 후에 투여하는 편이 바람직하다.

또, 본 발명에 있어서의 「X와 Y와 결합시켜 이루어지는」에는, X와 Y를 다른 형태로 한 것, X와 Y를 동일한 형태(예를 들면 X와 Y를 함유하는 형태)로 한 것 중 어느 하나의 경우라도 포함한다. 또, X와 Y를 다른 형태로 한 것인 경우, X, Y의 어느 것이라도 다른 성분을 더 함유하고 있는 경우도 포함된다.

본 발명의 의약조성물과 고형종양 치료제의 제형은 특별히 한정되지 않으나, 예를 들면, 본 발명의 유전자 수송담체를 함유하는 액제 또는 고형제제를 들 수가 있다. 액제는, 본 발명의 유전자 수송담체의 혐기성 균의 배양액을 정제하여, 이것에 필요에 따라 적당한 생리식염액 또는 보액 또는 의약첨가물을 첨가하여 앰플 또는 바이알병 등에 충전하는 것으로 제조할 수가 있다. 또, 고형제제는, 액제에 적 당한 보호제를 첨가하여 앰플 또는 바이알병 등에 충전한 후 동결건조 또는 L건조하거나, 액제에 적당한 보호제를 첨가하여 동결건조 또는 L건조한 후 이것을 앰플 또는 바이알병 등에 충전하는 것에 의하여 제조할 수가 있다. 본 발명의 의약조성물과 고형종양 치료제의 투여방법으로서는, 비경구투여가 바람직하며, 예를 들면 피하주사, 정맥주사, 국소주입, 뇌실내 투여 등을 들 수가 있으나, 정맥주사가 가장 바람직하다.

본 발명의 의약조성물과 고형종양 치료제는, 혐기적 환경을 갖는 종양, 바람직하게는 각종 고형암에 적용가능하다. 고형암으로서는, 예를 들면, 대장암, 뇌종양, 두경부암, 유방암, 폐암, 식도암, 위암, 간암, 담낭암, 담관암, 췌장암, 췌도세포암, 융모암, 결장암, 신세포암, 부신피질암, 방광암, 정소암, 전립선암, 고환종양, 난소암, 자궁암, 융모암, 갑상선암, 악성 카르시노이드 종양, 피부암, 악성흑색종, 골육종, 연부조직육종, 신경아세포종, 빌름스종양, 망막아세포종, 멜라노마, 편평상피암 등을 들 수가 있다.

이하, 실시예에 의하여 본 발명을 보다 구체적으로 설명한다. 다만, 본 발명의 기술적범위는 이들의 예시에 한정되는 것이 아니다.

[참조예1] 비피도박테리움 롱검 105-A/pAV001-HU-eCD의 제작

(1) 셔틀플라스미드 pAV001의 구축

(플라스미드의 구축)

비피도박테리움 롱검과 대장균의 셔틀플라스미드 pBLES100(특허문헌4 및 비특허문헌7 참조)로부터 엔테로코커스 패칼리스(Enterococcus Faecalis) 유래의 스 펙티노마이신 아데닐 트랜스 페라제(AAD카세트)를 포함하는 서열을 PCR에 의하여 증폭하며, PCR-BluntII-TOPO벡터(Invitrogen Corp. 제품)에 서브클로닝하여, PCRTOPO-ScaI-AAD-Eam1105I를 제작하였다. 또, 포워드 프라이머에 ScaI, 리버스 프라이머에 Eam1105I 제한효소 사이트를 각각 부가하였다.

도 1에 나타내는 바와 같이, Invitrogen사로부터 구입한 클로닝 벡터 pGFPuv(DEFINITION : Cloning vector pGFPuv. ACCESSION : U62636 VERSION : U62636.1 GI : 1490528)은 GFPuv유전자와 그 양단의 멀티클로닝사이트(Multi-Cloning Site, MCS), 암피실린 내성유전자, 대장균 플라스미드 복제 기점에 의해 구성되어 있다.

이 pGFPuv의 암피실린 내성유전자 부위를 제한효소 Eam1105I와 ScaI를 사용하여 절단하고, 제거된 긴 단편을 제작하였다. 동일하게 제한효소 Eam1105I와 ScaI를 사용하여, PCRTOPO-ScaI-AAD-Eam1105I를 절단한 AAD카세트를 포함하는 단편(약1100bp)을 제작하였다. 상기 2개의 단편을 T4DNA 리가아제를 사용하여 결합한 pGFPuv-SpR을 제작하였다. 또, 제작한 플라스미드 pGFPuv-SpR의 스펙티노마이신 내성형질 부여를, 또 동시에 암피실린 내성형질의 결실을 각각 대장균에서 확인하였다.

pGFPuv-SpR을 제한효소 SalI(GFPuv유전자 상류의 멀티클로닝사이트내에 존재)와 SpeI(GFPuv유전자 하류의 멀티클로닝사이트내에 존재)에서 소화하여, GFPuv유전자를 삭제한 플라스미드 pAVN을 제작하였다.

이어서, 비피도박테리움 롱검 유래의 플라스미드 pTB6의 모든 염기서열 정보 로부터 RepB, SDO, DDO, AT-rich repeats, DnaA-binding motifs를 포함하는 약 1900bp의 서열을 비피도박테리움 롱검의 플라스미드 복제 유니트로서 동정(同定)하였다. pTB6으로부터 비피도박테리움 롱검의 플라스미드 복제 유니트를 포함하는 약 1900bp를 PCR에 의하여 증폭하고, PCR-BluntII-TOPO벡터로 서브클로닝한 PCRTOPO-ApaI-1900-ScaI를 제작하였다. 또, 포워드 프라이머에 ApaI, 리버스 프라이머에 ScaI 제한효소 사이트를 각각 부가하였다.

pAVN을 제한효소 ApaI와 ScaI로 소화한 긴 단편(약 2400bp)과 동일하게 PCRTOPO-ApaI-1900-ScaI를 제한효소 ApaI와 ScaI로 소화한 짧은 단편(약 1900bp)을, T4DNA 리가아제를 사용하여 결합시킨, 비피도박테리움 롱검-대장균 셔틀플라스미드 pAV001(약 4300bp)를 제작하였다.

(2) CD유전자 발현벡터 pAV001-HU-eCD

(발현벡터의 구축)

이어서, pBLES100-S-eCD를 제한효소 Hind III과 SpeI로 절단하여, HU유전자 프로모터, 대장균 유래의 CD유전자와 HU유전자 터미네이터를 포함하는 약 2900bp를 발취하였다. 동일하게 셔틀플라스미드 pAV001을 멀티클로닝사이트내에 있는 제한효소 절단부위에서 Hind III과 SpeI로 절단한 긴 단편에, 상기의 약 2900bp단편을, T4DNA 리가아제를 사용하여 결합시킨 pAV001-HU-eCD(약 7100bp)를 제작하였다.

(3) CD유전자 발현벡터 pAV001-HU-eCD의 비피도박테리움속으로의 도입

야생형 비피도박테리움 롱검을 MRS배지 37℃ 혐기조건하에서 배양한 배양액으로부터 원심분리에 의하여 균체를 분리하고, 적당한 완충액으로 현탁시킨 균 현 탁액을 조제하였다. 이어서, 비특허문헌2와 3에 기재되어 있는 전기천공법(electroporation method)을 사용하여, CD유전자 발현벡터 pAV001-HU-eCD를 상기의 균 현탁액으로 도입하였다. 도입된 재조합 비피도박테리움 롱검(비피도박테리움 롱검/pAV001-HU-eCD)은 항생제 스펙티노마이신 함유 한천배지 상에서의 콜로니형성에 기초하여 선별하였다.

(4) 비피도박테리움 롱검/pAV001-HU-eCD에 있어서의 시토신 데아미나제 효소활성; 5-FC → 5-FU의 변환활성의 측정

비피도박테리움 롱검/pAV001-HU-eCD를 항생제 스펙티노마이신 함유 MRS배지 37℃ 혐기조건하에서 2일 이상 계대배양한 배양액으로부터 원심분리에 의하여 균체(2×10⁹CFU)를 분리하고, 4.5mL의 MRS배지에 다시 현탁하였다. 이어서 최종농도 2mg/mL이 되도록 0.5mL의 5-FC(20mg/mL)를 첨가하여 37℃ 혐기조건하에서 배양하였다. 0, 4, 8, 18, 24 시간마다 배양액으로부터, 원심분리에 의하여 균체를 제거한 상징액을 각각 회수하여, 가스크로마토그래피 분석(5-FU GC-MS methods, BML)에 의하여 변환된 5-FU농도를 측정하였다. 측정결과를 도 2에 나타낸다. 분석의 결과, 비피도박테리움 롱검/pAV001-HU-eCD에 있어서는 4시간후에 있어서는 72.5μg/mL, 24시간 후에 있어서는 165.4μg/mL의 5-FU가 검출되었다.

(실시예 1)

[HU-eCD플라스미드의 제작]

eCD의 N말단영역에 융합시키는 HU단백질의 N말단영역의 길이를, 2아미노산, 3아미노산, 4아미노산으로 변경한 플라스미드의 구축을 실시하였다(도 3).

동일한 방법으로 HU단백질의 N말단을 제거한 플라스미드의 구축도 실시하였다. 그때, 대장균 JM101주 유래 CD의 번역개시코돈인 ATG, 대장균 K12주 유래 CD의 번역개시코돈인 GTG의 2종을 제작하였다. 또, eCD의 N말단영역에 융합시키는 HU단백질의 N말단영역의 길이를 18아미노산으로 변경시킨 플라스미드도 구축하였다. 표1에 플라스미드의 구축부분의 서열을 나타낸다.

(1) HU단백질 N말단 2아미노산 부가 플라스미드 구축

pAV001-HU-eCD 50pg를 주형(틀)으로 하여, PrimeSTAR^TM HS DNA Polymerase(Takara Bio Inc. 제품)으로 PCR증폭을 실시하여, PCR단편A(약 1.3kbp) 및 PCR단편B(약 1.3kbp)을 얻었다. PCR단편A의 증폭에는, 서열번호1에서 나타내는 외측 프라이머 및, PCR단편B 말단과의 중복서열을 5'말단에 갖는 pAV001-HU-eCD와 상보적인 서열을 포함하는 서열번호2로 나타내는 내측 프라이머를 사용하였다.

PCR단편A는, 주형에서 유래하는 Hind III부위를 DNA말단에 포함한다. PCR단편B의 증폭에는, KspA I인식부위를 5'말단측에 갖는 pAV001-HU-eCD와 상보적인 서열을 포함하는 서열번호3으로 나타내는 외측 프라이머 및, PCR단편A 말단과의 중복서열을 5'말단측에 갖는 pAV001-HU-eCD와 상보적인 서열을 포함하는 서열번호4로 나타내는 내측 프라이머를 사용하였다.

HU단백 유래의 아미노산 서열의 변경은, 내측 프라이머에 의하여 실시하였다. 온도조건은, 98℃에서 10초, 55℃에서 5초, 72℃에서 1분 20초를 1사이클로 하여, 30사이클을 실시한 후, 72℃에서 30초간 보온하였다. PCR단편A 및 B를 QIAquick PCR Purification Kit(주식회사 QIAGEN 제품)로 정제한 후, 정제PCR단편A 및 B를 동등한 몰(mole)씩 혼합하였다.

정제PCR단편A와 B의 혼합물 1ng를 주형으로 하여, 1xPrimeSTAR^TMbuffer, 200μM dNTPs mix, 2.5uPrimeSTAR^TM HS DNA 폴리멜라아제 혼합액중에서, 프라이머를 넣지 않고, 98℃에서 10초, 72℃에서 1분 30초를 1사이클로 하여, 5사이클 반응을 실시하고 PCR단편A 및 B를 연결하였다. 그 후, 외측 프라이머(서열번호1 및 3)를 최종농도가 각 0.5μM이 되도록 첨가하여, 98℃에서 10초, 55℃에서 5초, 72℃에서 2분 40초를 1사이클로 하여, 25사이클 반응을 실시한 후, 72℃에서 30초 보온하여 연결PCR산물(약 2.6kbp)을 얻었다.

연결PCR산물을 1% SeaPlaque(R) GTG(R) Agarose겔(1xTAE buffer, 0.5μg/ml 에티듐 브로마이드)로 분리하여, 2.6kbp의 DNA단편을 절단하였다. QIAquick(R) Gel Extraction Kit로 겔로부터 연결PCR산물을 추출하고, Hind III(Fermentas UAB사 제품) 및 KspA I(Fermentas UAB사 제품)로 소화를 실시하였다. 1% SeaPlaque(R) GTG(R) Agarose겔(1xTAE buffer, 0.5μg/ml 에티듐 브로마이드)로 분리하여, 2.6kbp의 DNA밴드를 절단하였다. QIAquick(R) Gel Extraction Kit로 겔로부터 연결PCR산물을 추출하였다.

pAV001-HU-eCD벡터를 Hind III(Fermentas UAB사 제품) 및 KspA I(Fermentas UAB사 제품)로 소화한 후, 1% SeaPlaque(R) GTG(R) Agarose겔(1xTAE buffer, 0.5μg/ml 에티듐 브로마이드)로 분리하여, 4.6kbp의 DNA단편을 절단하였다. 이어서, QIAquick(R) Gel Extraction Kit로 겔로부터 벡터DNA를 추출하였다.

상기의 연결PCR산물을, 벡터와 연결PCR산물이 몰비로 1:3이 되도록 혼합하여, Rapid DNA Ligation Kit(Fermentas UAB사 제품)로 라이게이션을 실시하였다. 라이게이션 산물을 사용하여, 대장균 JM109의 형질전환을 실시하여, 30μg/ml의 스펙티노마이신을 포함하는 LB한천배지에 도포, 37℃에서 하룻밤 배양하여, 형질전환체를 얻었다. 형질전환체를, 30μg/ml의 스펙티노마이신을 포함하는 2×LB 액체배지 37℃에서 하룻밤 배양하여, QIAprep(R) Spin Miniprep Kit로 플라스미드 DNA(pAV001-HU2aa-eCD)를 추출하였다.

(2) HU단백질 N말단 3아미노산 부가 플라스미드 구축

PCR단편A 및 PCR단편B 증폭용 내측 프라이머로서, 각각 서열번호5 및 4에 나타내는 프라이머를 사용한 것 이외는, HU단백질 N말단 2아미노산 부가 플라스미드 구축과 동일한 방법으로, HU단백질 N말단 3아미노산 부가 플라스미드(pAV001-HU3aa-eCD)를 구축하였다.

(3) HU단백질 N말단 4아미노산 부가 플라스미드 구축

PCR단편A 및 PCR단편B 증폭용 내측 프라이머로서, 각각 서열번호6 및 7에 나타내는 프라이머를 사용한 것 이외는, HU단백질 N말단 2아미노산 부가 플라스미드 구축과 동일한 방법으로, HU단백질 N말단 4아미노산 부가 플라스미드(pAV001-HU4aa-eCD)를 구축하였다. pAV001-HU4aa-eCD의 서열을 서열번호14에 나타낸다.

(4) HU단백질 N말단을 포함하지 않고, 번역개시코돈을 ATG로 하는 플라스미드 구축

PCR단편A 및 PCR단편B 증폭용 내측 프라이머로서, 각각 서열번호8 및 9에 나타내는 프라이머를 사용한 것 이외는, HU단백질 N말단 2아미노산 부가 플라스미드 구축과 동일한 방법으로, HU단백질의 N말단을 포함하지 않는, 번역개시코돈을 ATG로 하는 플라스미드(pAV001-HU0aaATG-eCD)를 구축하였다.

(5) HU단백질 N말단을 포함하지 않고, 번역개시코돈을 GTG로 하는 플라스미드 구축

PCR단편A 및 PCR단편B 증폭용 내측 프라이머로서, 각각 서열번호10 및 11에 나타내는 프라이머를 사용한 것 이외는, HU단백질 N말단 2아미노산 부가 플라스미드 구축과 동일한 방법으로, HU단백질의 N말단을 포함하지 않고, 번역개시코돈을 GTG로 하는 플라스미드(pAV001-HU0aaGTG-eCD)를 구축하였다.

(6) HU단백질 N말단 18아미노산의 플라스미드 구축

상보적인 서열을 가지며, 5'말단의 인산화된 2종의 합성올리고DNA(서열번호12, 13)을 등몰씩 혼합하여, 0.1M NaCl존재하에서, 65℃에서 5분, 45℃에서 5분, 37℃에서 10분, 25℃에서 10분 단계적으로 온도를 저하시키는 것에 의하여 어닐링시켜 어댑터를 제작하였다. 어댑터의 말단은, Bsp 119 I부위로 되어 있다.

pAV001-HU-eCD벡터를 Bsp 119 I(Fermentas UAB사 제품)로 소화, CIAP(Fermentas UAB사 제품)로 DNA말단의 탈인산화 처리후, Rapid DNA Ligation Kit(Fermentas UAB사 제품)로 어댑터와의 라이게이션을 실시하였다. 라이게이션 산물을 사용하여, 대장균 JM109주의 형질전환을 실시하여, 30μg/ml의 스펙티노마이신을 포함하는 LB한천배지에 도포, 37℃에서 하룻밤 배양하여, 형질전환체를 얻었다. 형질전환체를, 30μg/ml의 스펙티노마이신을 포함하는 2×LB 액체배지에서 37℃에서 하룻밤 배양하여, QIAprep(R) Spin Miniprep Kit로 플라스미드 DNA(pAV001-HU18aa-eCD)를 추출하였다. pAV001-HU18aa-eCD의 서열을 서열번호15에 나타낸다.

(비피도박테리움 롱검 105A의 형질전환)

비피도박테리움 롱검 105A 컴피턴트셀 80μl과 플라스미드 DNA 5μl(500-1000ng)를 혼합하여, GENE PULSAR II Electroporation system（일본 Bio-RAD Laboratories, Inc. 제품）으로 형질전환을 실시하였다. 15% D-라피노오스, 30μg/ml 스펙티노마이신을 포함하는 IWATA한천배지에 도포한 후, 혐기적 조건하 37℃에서 이틀밤 배양하여, 형질전환체를 얻었다.

(비피도박테리움 롱검 105A 형질전환체로부터의 단백질 추출)

형질전환체를, MRS 액체배지(30μg/ml 스펙티노마이신, 시스테인·비타민C 혼합액을 포함한다) 5ml에 식균하고, 혐기적 조건하, 37℃에서 하룻밤 배양하였다. 배양액의 1%를 상기 배지에 이식하여, 혐기적 조건하, 37℃에서의 하룻밤 배양을 2회 반복하였다. 이 배양액 1%를 상기 배지에 첨가하여, 약 18시간 배양한 것을 사용하여 단백추출을 실시하였다. 배양액 1~4ml에, 트리스 완충액(0.5M Tris-HCl, 0.5% TritonX100, pH8.4)을 4ml첨가하여 혼합한 후, 13,000×g, 실온에서 15분간 원심분리를 실시하여, 상징액을 제거하였다. 균체에 상기 트리스 완충액 5ml을 첨가하여 현탁한 후 13,000×g, 실온에서 15분간 원심분리하여, 상징액을 제거하는 조작을 2회 반복하여 균체의 세정을 실시하였다. 세정균체를, 프로테아제 저해제(Sigma-Aldrich사 제품) 50μl을 포함하는 첨가된 트리스 완충액 1ml로 현탁하여, 초음파 파쇄를 빙냉하에서 5분간 실시하였다. 13,000×g, 4℃에서 20분간 원심분리하여, 상징액을 총 단백추출액으로서 CD활성의 측정에 제공하였다.

(CD활성의 측정)

총 단백량을 Lowry법의 변법으로 측정하여, 총 단백량 50μg에 상당하는 총 단백추출액에 완충액을 첨가하여 250μl로 하고, 40mM 5-FC 250μl과 혼합시킨 후 60℃에서 20분간 반응시켰다. 0.5M 트리클로로아세트산 250μl을 첨가하여 반응을 정지시키고, 얼음중에 방치하였다. 20,000×g, 4℃에서 20분간 원심분리를 실시하여, 상징액 450μl에 0.3M NaOH를 150μl 첨가하여 용액을 중화하였다.

중화한 샘플을 HPLC의 이동층에서 10배 희석하여, HPLC에서 5-FU 및 5-FC의 양을 측정하였다. 5-FC의 소비%를 CD활성으로 하였다. 활성측정결과를 표 2에 나타낸다.

HU단백질 N말단 유래의 아미노산의 eCD에로의 부가가, CD의 활성을 높이는 것이 명백하게 되었다. 부가하는 아미노산 수는, 2개 이하에서는 효과가 없으며, 3개에서 효과가 어느 정도 있으며, 4개 이상에서 비약적으로 증대하며, 4개~18개의 사이에서는 활성에 차이가 없었다.

(실시예 2)

[비피도박테리움 롱검 105-A/pAV001-HU-eCD 플라스미드 변이체의 제작]

플라스미드 pAV001-HU-eCD 상의 5개소에 변이도입을 실시하였다.

변이도입의 타입은, 3염기의 결실(deletion)과 1염기치환의 2종으로, 결실타입의 변이플라스미드를 pAV001-HU-eCD-D37과 pAV001-HU-eCD-D55, 염기치환타입의 변이플라스미드를 pAV001-HU-eCD-M450, pAV001-HU-eCD-M968, pAV001-HU-eCD-M1277로 하였다. 변이플라스미드의 제작방법을 이하에서 설명한다.

(1) 변이플라스미드(pAV001-HU-eCD-D37)의 구축

pAV001-HU-eCD 50pg를 주형으로 하여, PrimeSTAR^TM HS DNA Polymerase(Takara Bio Inc. 제품)로 PCR증폭을 실시하여, PCR단편A(약 1.3kbp) 및 PCR단편B(약 1.3kbp)를 얻었다. PCR단편A의 증폭에는, 서열번호1에 나타내는 외측 프라이머 및, PCR단편B 말단과의 중복서열을 5'말단측에 가지며, pAV001-HU-eCD와 상보적인 서열을 포함하는 서열번호16에 나타내는 내측 프라이머를 사용하였다. PCR단편A는, 주형에서 유래하는 Hind III부위를 DNA말단에 포함한다. PCR단편B의 증폭에는, KspA I 인식부위를 5'말단측에 가지며, pAV001-HU-eCD와 상보적인 서열을 포함하는 서열번호3에 나타내는 외측 프라이머 및, PCR단편A 말단과의 중복서열을 5'말단측에 갖는 pAV001-HU-eCD와 상보적인 서열을 갖는 서열번호17에 나타내는 내측 프라이머를 사용하였다. 플라스미드로의 변이도입은, 내측 프라이머에 의하여 실시하였다. 온도조건은, 98℃에서 10초, 55℃에서 5초, 72℃에서 1분 20초를 1사이클로 하여, 30사이클을 실시한 후, 72℃에서 30초간 보온하였다. PCR단편A 및 PCR단편B를 QIAquick PCR Purification Kit(주식회사 QIAGEN 제품)로 정제한 후, 정제 PCR단편A 및 단편B를 등몰씩 혼합하였다. 정제 PCR단편A와 PCR단편B의 혼합물 1ng를 주형으로 하여, 1xPrimeSTAR^TMbuffer, 200μM dNTPs mix, 2.5u PrimeSTAR^TM HS DNA 폴리멜라아제 혼합액중에서, 프라이머를 넣지 않고, 98℃에서 10초, 72℃에서 1분 30초를 1사이클로 하여, 5사이클 반응을 실시하여 PCR단편A 및 PCR단편B를 연결하였다. 그 후, 외측 프라이머(서열번호1 및 3)를 최종농도가 각 0.5μM이 되도록 첨가하여, 98℃에서 10초, 55℃에서 5초, 72℃에서 2분 40초를 1사이클로 하여, 25사이클 반응을 실시한 후, 72℃에서 30초 보온하여 연결PCR산물(약 2.6kbp)을 얻었다. 연결PCR산물을 1% SeaPlaque(R) GTG(R) Agarose겔(1xTAE buffer, 0.5μg/ml 에티듐 브로마이드)로 분리하여, 2.6kbp의 DNA밴드를 절단하였다. QIAquick(R) Gel Extraction Kit로 겔로부터 연결PCR산물을 추출하여, Hind III(Fermentas UAB사 제품) 및 KspA I(Fermentas UAB사 제품)로 소화를 실시하였다. 1% SeaPlaque(R) GTG(R) Agarose겔(1xTAE buffer, 0.5μg/ml 에티듐 브로마이드)로 분리하여, 2.6kbp의 DNA밴드를 절단하였다. QIAquick(R) Gel Extraction Kit를 사용하여 겔로부터 연결PCR산물을 추출하였다.

pAV001-HU-eCD벡터를 Hind III(Fermentas UAB사 제품) 및 KspA I(Fermentas UAB사 제품)로 소화한 후, 1% SeaPlaque(R) GTG(R) Agarose겔(1xTAE buffer, 0.5μg/ml 에티듐 브로마이드)로 분리하여, 4.6kbp의 DNA밴드를 절단하였다. QIAquick(R) Gel Extraction Kit로 겔로부터 벡터DNA를 추출하였다. 먼저 연결PCR산물을, 벡터와 연결PCR산물이 몰비로 1:3이 되도록 혼합하여, Rapid DNA Ligation Kit(Fermentas UAB사 제품)로 라이게이션을 실시하였다. 라이게이션 산물을 사용하여, 대장균 JM109의 형질전환을 실시하여, 30μg/ml의 스펙티노마이신을 포함하는 LB한천배지에 도포한 후, 37℃에서 하룻밤 배양하여, 형질전환체를 얻었다. 형질전환체를, 30μg/ml의 스펙티노마이신을 포함하는 2×LB 액체배지에서 37℃에서 하룻밤 배양하여, QIAprep(R) Spin Miniprep Kit로 플라스미드 DNA(pAV001-HU-eCD-D37)를 추출하였다.

또한, pAV001-HU-eCD-D37은, 서열번호14에 있어서의 1503~1505번째(서열번호 15에 있어서의 1545~1547번째)의 염기서열(서열번호28의 5번째의 알라닌을 코드하는 염기서열)이 결실된 CD를 갖고 있는 플라스미드이다.

(2) 변이플라스미드(pAV001-HU-eCD-D55)의 구축

PCR단편A 및 PCR단편B 증폭용 내측 프라이머로서, 각각 서열번호18, 19에 나타내는 프라이머를 사용한 것 이외는, pAV001-HU-eCD-D37의 플라스미드 구축과 동일한 방법으로, pAV001-HU-eCD-D55를 구축하였다.

또한, pAV001-HU-eCD-D55는, 서열번호14에 있어서의 1521~1523번째(서열번호15에 있어서의 1563~1565번째)의 염기서열(서열번호28의 11번째의 아스파라긴을 코드하는 염기서열)이 결실된 CD를 갖고 있는 플라스미드이다.

(3) 변이플라스미드(pAV001-HU-eCD-M450)의 구축

PCR단편A 및 PCR단편B 증폭용 내측 프라이머로서, 각각 서열번호20, 21에 나타내는 프라이머를 사용한 것과, PCR의 반응조건 이외는, pAV001-HU-eCD-D37의 플라스미드 구축과 동일한 방법으로, pAV001-HU-eCD-M450를 구축하였다.

PCR의 반응조건으로서는, PCR단편A 증폭의 반응온도조건을, 98℃ 10초, 55℃ 5초, 72℃ 1분 45초를 1사이클로 하여, 30사이클을 실시한 후, 72℃ 30초 보온으로 하여, PCR단편B 증폭의 반응온도조건을, 98℃ 10초, 55℃ 5초, 72℃ 1분을 1사이클로 하여, 30사이클을 실시한 후, 72℃에서 30초 보온으로 하였다. 또, PCR산물연결시의 반응온도를, 98℃에서 10초, 72℃에서 1분 45초를 1사이클로 하여, 5사이클 반응을 실시하였다.

또한, pAV001-HU-eCD-M450은, 서열번호14에 있어서의 1914~1916번째(서열번호15에 있어서의 1956~1958번째)의 염기서열(서열번호28의 142번째의 글루타민을 코드하는 염기서열)이 히스티딘으로 치환된 CD를 갖고 있는 플라스미드이다.

(4) 변이플라스미드(pAV001-HU-eCD-M968)의 구축

PCR단편A 및 PCR단편B 증폭용 내측 프라이머로서, 각각 서열번호22, 23에 나타내는 프라이머를 사용한 것, PCR단편B 증폭용 외측 프라이머로서 서열번호24로 나타내는 프라이머를 사용한 것, 및 PCR의 반응조건 이외는, pAV001-HU-eCD-D37의 플라스미드 구축과 동일한 방법으로, pAV001-HU-eCD-M968을 구축하였다.

PCR의 반응조건으로서는, PCR단편A 증폭의 반응온도조건을, 98℃ 10초, 55℃ 5초, 72℃ 2분 10초를 1사이클로 하여, 30사이클을 실시한 후, 72℃ 30초 보온으로 하고, PCT단편B 증폭의 반응온도조건을, 98℃ 10초, 55℃ 5초, 72℃ 45초를 1사이클로 하여, 30사이클을 실시한 후, 72℃ 30초 보온으로 하였다. 또, PCR산물 연결시의 반응온도를, 98℃에서 10초, 72℃에서 2분 10초를 1사이클로 하여, 5사이클 반응을 실시하였다. 연결PCR산물의 증폭에는, 서열번호1 및 24에 나타내는 프라이머를 사용하여, 98℃에서 10초, 55℃에서 5초, 72℃에서 3분을 1사이클로 하여, 25사이클 반응을 실시한 후, 72℃에서 30초 보온하여 연결PCR산물(약 2.9kbp)을 얻었다. 산물PCR산물의 벡터에는, pAV001-HU-eCD 벡터를 Hind III(Takara Bio Inc. 제품) 및 Spe I(Takara Bio Inc. 제품)로 소화하여, 아가로스겔로부터 추출한 단편(약 4.3kbp)을 사용하였다. 얻어진 pAV001-HU-eCD-M968의 서열을 서열번호27에 나타낸다.

또한, pAV001-HU-eCD-M968은, 서열번호14에 있어서의 2433~2435번째(서열번호15에 있어서의 2475~2477번째)의 염기서열(서열번호28의 315번째의 아스파라긴산을 코드하는 염기서열)이 알라닌으로 치환된 CD를 갖고 있는 플라스미드이다.

(5) 변이플라스미드(pAV001-HU-eCD-M1277)의 구축

PCR단편A 및 PCR단편B 증폭용 내측 프라이머로서, 각각 서열번호25, 26에 나타내는 프라이머를 사용한 것과, PCR의 반응조건 이외는, pAV001-HU-eCD-M968의 플라스미드 구축과 동일한 방법으로, pAV001-HU-eCD-M1277을 구축하였다.

PCR의 반응조건으로서는, PCR단편A 증폭의 반응온도조건을, 98℃ 10초, 55℃ 5초, 72℃ 2분 30초를 1사이클로 하여, 30사이클을 실시한 후, 72℃ 30초 보온으로 하고, PCR단편B 증폭의 반응온도조건을, 98℃ 10초, 55℃ 5초, 72℃ 30초를 1사이클로 하여, 30사이클을 실시한 후, 72℃에서 30초 보온으로 하였다. 또, PCR산물 연결시의 반응온도를, 98℃에서 10초, 72℃에서 2분 30초를 1사이클로 하여, 5사이클 반응을 실시하였다.

또한, pAV001-HU-eCD-M1277은, 서열번호14에 있어서의 2742~2744번째(서열번호15에 있어서의 2784~2786번째)의 염기서열(서열번호28의 418번째의 글루타민산을 코드하는 염기서열)이 글리신으로 치환된 CD를 갖고 있는 플라스미드이다.

(비피도박테리움 롱검 105A의 형질전환)

얻어진 변이플라스미드를 사용하여, 비피도박테리움 롱검 105A를, 실시예1과 동일하게 하여 형질전환하고, 그 형질전환체를 얻었다.

변이플라스미드를 사용하여 형질전환한 비피도박테리움 롱검 105A로부터, 실시예1과 동일하게 하여 단백질 추출액을 얻고, 그것을 CD활성의 측정으로 제공하였다.

(CD활성의 측정)

얻어진 단백추출액을 사용하여, 실시예1과 동일하게 하여 CD활성을 측정하였다. 활성측정결과를 표 3에 나타낸다.

변이한 pAV001-HU-eCD-M968로 형질전환한 비피도박테리움 롱검 105A/pAV001-HU-eCD-M968은, 변이화하고 있지 않는 pAV001-HU-eCD로 형질전환한 비피도박테리움 롱검 105A/pAV001-HU-eCD(콘트롤)에 비하여 CD활성이 약 12배까지 향상되어 있다.

한편, 변이화한 pAV001-HU-eCD-M450과 pAV001-HU-eCD-M1277에서 형질전환한 비피도박테리움 롱검 105A/pAV001-HU-eCD-M450 및 비피도박테리움 롱검 105A/pAV001-HU-eCD-M1277에서는, 변이도입에 의한 활성의 상승은 인정되지 않았다.

(실시예 3)

[5-FU 내성 비피도박테리움 롱검 105A/pAV001-HU-eCD 플라스미드 변이체의 제작]

(비피도박테리움 롱검 105A/pAV001-HU-eCD-M968의 5-FU 내성화)

실시예2에서 얻어진 비피도박테리움 롱검 105A/pAV001-HU-eCD-M968을, 특허문헌5의 실시예1에 기재된 방법에 준하여, 5-FU내성 변이체로 하였다.

즉, 실시예2에서 얻어진 비피도박테리움 롱검 105A/pAV001-HU-eCD-M968을 MRS배지 37℃ 혐기조건하에서 2일 이상 계대배양하였다. 이들의 배양액을 혐기성 희석액으로 희석한 후, 5-FU이 500μg/mL 포함되는 BL한천배지상에 도포하여, 37℃에서 2~3일간 혐기배양한 후의 생육균을 선택하여, 5-FU내성의 비피도박테리움 롱검 105A/pAV001-HU-eCD-M968(비피도박테리움 롱검 105A-R1/pAV001-HU-eCD-M968)을 제작하였다.

(5-FU내성 비피도박테리움 롱검 105A의 플라스미드 pAV001-HU-eCD-M968에 의한 형질전환)

실시예2에서 얻은 변이플라스미드 pAV001-HU-eCD-M968을 사용하여, 특허문헌5의 실시예2에 기재된 방법에 준하여 제작한 5-FU내성 비피도박테리움 롱검 105A를, 실시예1과 동일하게 하여 형질전환하고, 그 형질전환체를 얻었다.

즉, 비피도박테리움 롱검 105A를, 5-FU를 100μg/mL 포함하는 5mL의 MRS배지에 식균하여, 37℃ 혐기배양으로 1~5일간 배양하고, 그 탁도(OD=600nm)를 측정하여, 생육의 유무를 조사하고, 증식이 확인된 배양후의 배지를 1mL 꺼내서, 동일한 농도의 5-FU를 포함하는 9mL의 MRS배지에 각각 식균하여, 동일한 배양조건에서 24시간 배양하였다. 이 식균작업을 3회 반복 실시하는 것에 의하여, 5-FU 내성 비피도박테리움 롱검 105A를 제작하였다. 이어서, MRS배지에 상기 5-FU내성 비피도박테리움 롱검 105A를 식균하여, 배양후의 식균을 각각 250μg/mL의 5-FU를 포함하는 MRS배지에 식균하고, 24시간 후의 증식의 유무를 탁도(OD=600nm)를 사용하여 측정하고, 5-FU를 100μg/mL 포함하는 배지에서 제작한 5-FU내성 비피도박테리움 롱검 105A(비피도박테리움 롱검 105A-R2)를 형질전환용 숙주로서 사용하였다. 상기 비피도박테리움 롱검 105A-R2를, 실시예2에서 얻은 변이플라스미드 pAV001-HU-eCD-M968을 사용하여, 실시예1과 동일하게 하여 형질전환하고, 그 형질전환체 비피도박테리움 롱검 105A-R2/pAV001-HU-eCD-M968을 제작하였다.

(실시예 4)

(비피도박테리움 롱검 105A-R2/pAV001-HU-eCD-M968로부터의 단백질추출)

상기에서 얻어진 비피도박테리움 롱검 105A-R2/pAV001-HU-eCD-M968로부터, 실시예1과 동일하게 하여 단백질 추출액을 얻고, 그것을 CD활성의 측정에 제공하였다.

(CD활성의 측정)

얻어진 단백추출액을 사용하여, 실시예1과 동일하게 하여 CD활성을 측정한 결과, 표 4에 나타낸 바와 같이, 비피도박테리움 롱검 105A-R2/pAV001-HU-eCD-M968도, 실시예2의 형질전환 비피도박테리움 롱검 105A와 동일한 정도의 CD활성을 나타냈다.

(실시예 5)

(플라스미드 보유 안정성의 측정)

실시예3에서 얻은, 비피도박테리움 롱검 105A-R2/pAV001-HU-eCD-M968(R2주)와, 비피도박테리움 롱검 105A-R1/pAV001-HU-eCD-M968(R1주)에 대하여, 이하의 방법에 따라 플라스미드 보유 안정성을 측정한 결과, R2주는 R1주에 비하여, 도 4에 나타낸 바와 같이, 매우 양호한 플라스미드 보유 안정성을 나타냈다.

(플라스미드 보유 안정성 측정시험)

상기 플라스미드 보유 안정성의 측정은 이하의 시험방법에 따라 실시하였다. R2주와, R1주를 사용하여, 도입플라스미드의 선택마커인 항생물질(스펙티노마이신)을 첨가한 액체배지에서, 상기 형질전환 비피더스균 R2주와 R1주를 충분히 활성화 배양하였다. 상기 균액을 계대배양 0일째 균액으로 하였다. 이어서, 0일째 균액의 일부를 꺼내어, 스펙티노마이신을 포함하지 않는 액체배지에 식균하여 배양하였다. 상기 균액을 계대배양 1일째 균액으로 하였다. 동일하게, 1일째의 균액의 일부를 꺼내어, 스펙티노마이신을 포함하지 않는 액체배지에 식균하여 배양하고 계대배양 2일째 균액으로 하였다. 이하 동일하게 하여 5일째까지 연속적으로 계대배양을 실시하고, 계대배양 5일째 균액까지 제작하였다. 0일째 균액, 1일째 균액, 3일째 균액 및 5일째 균액을, 항생제를 포함하지 않는 평판배지(BL한천배지)에 도포하여, 콜로니를 형성시켰다. 생육한 콜로니 100개를 무작위로 선택하여, 스펙티노마이신을 포함하는 BL한천배지 및 스펙티노마이신을 포함하지 않는 BL한천배지로, 멸균한 이쑤시개 등을 사용하여 레플리카법(replica method)으로 양(兩) 배지에 식균하고, 이하의 수식에 의하여 0일째, 1일째, 3일째 및 5일째의 플라스미드 유지율을 계측하였다. 결과를 도 4에 나타낸다.

또한, 플라스미드 유지율은 이하의 식에 의하여 산출하였다.

본 발명에 의하면, 고형종양 치료제로서 유용한, 혐기적 환경하에 있는 종양조직내에서 생육이 가능하며, 또한, 항종양활성을 갖는 단백질, 또는, 항종양물질 전구체를 항종양물질로 변환시키는 활성을 갖는 단백질을 발현할 수가 있는 혐기성 미생물로 이루어지는 유전자 수송담체이며, 형질전환에 의하여 도입한 유전자에 의하여 발현되는 단백질의 활성 및 발현효율이 양호한 유전자 수송담체를 효율적으로 제작할 수가 있다.

<110> Anaeropharma Science Inc. <120> METHOD OF CONSTRUCTING GENE TRANSPORT SUPPORT <130> PI-8K1081JP <150> JP2006-144720 <151> 2006-05-24 <160> 29 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 1 tcacacagga aacagctatg acc 23 <210> 2 <211> 55 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 2 ggcgttaata attgtttgta aagcgttatt cgatgccata aagcatcctt cttgg 55 <210> 3 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 gaacacatcc tggaaggcgt taactcaac 29 <210> 4 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 tcgaataacg ctttacaaac aattattaac gcccggttac cag 43 <210> 5 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 5 ggcgttaata attgtttgta aagcgttatt cgagtatgcc ataaagcatc cttcttgg 58 <210> 6 <211> 54 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 6 ggcgttaata attgtttgta aagcgttatt cgagttgtat gccataaagc atcc 54 <210> 7 <211> 47 <212> DNA <213> 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cacgaccacg gcgttgttcg 4620 acgtgacggc cgcccgggct cacttcgacg gcaccgtgga ggccggggaa tgccgtttct 4680 gcgcgtttga cgcgcgcaac cgcgaacatc atgcgcggaa cgccggaagg ctgttctagc 4740 ggccgtgtcc gcgcctctgg ggcggttgcg cctgccatgg gtcgatctgc cgctgttcgg 4800 cctcacgctg gtctgtgcgc tgcctgatct ccctgagcag gtcggccttg gtcctggggg 4860 cgcttcgctc ctcgaacggg ccgctctccc ccaggtcctc gggctcgctc aggtccaacg 4920 gctcgtcacc ggacggctcg ggccggttct ctccctgtgc cgggttctcc gcctgtgcgc 4980 gttgttcggc catgcgcagt gcgagggcct tcacctgttc ggggcttagt acttgcatgc 5040 ctgcaggtcg attttcgttc gtgaatacat gttataataa ctataactaa taacgtaacg 5100 tgactggcaa gagatatttt taaaacaatg aataggttta cacttacttt agttttatgg 5160 aaatgaaaga tcatatcata tataatctag aataaaatta actaaaataa ttattatcta 5220 gataaaaaat ttagaagcca atgaaatcta taaataaact aaattaagtt tatttaatta 5280 acaactatgg atataaaata ggtactaatc aaaatagtga ggaggatata tttgaataca 5340 tacgaacaaa ttaataaagt gaaaaaaata cttcggagac atttaaaaaa taaccttatt 5400 ggtacttaca tgtttggatc aggagttgag agtggaccaa 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tttaaaagga tctaggtgaa 6300 gatccttttt gataatctca tgaccaaaat cccttaacgt gagttttcgt tccactgagc 6360 gtcagacccc gtagaaaaga tcaaaggatc ttcttgagat cctttttttc tgcgcgtaat 6420 ctgctgcttg caaacaaaaa aaccaccgct accagcggtg gtttgtttgc cggatcaaga 6480 gctaccaact ctttttccga aggtaactgg cttcagcaga gcgcagatac caaatactgt 6540 ccttctagtg tagccgtagt taggccacca cttcaagaac tctgtagcac cgcctacata 6600 cctcgctctg ctaatcctgt taccagtggc tgctgccagt ggcgataagt cgtgtcttac 6660 cgggttggac tcaagacgat agttaccgga taaggcgcag cggtcgggct gaacgggggg 6720 ttcgtgcaca cagcccagct tggagcgaac gacctacacc gaactgagat acctacagcg 6780 tgagctatga gaaagcgcca cgcttcccga agggagaaag gcggacaggt atccggtaag 6840 cggcagggtc ggaacaggag agcgcacgag ggagcttcca gggggaaacg cctggtatct 6900 ttatagtcct gtcgggtttc gccacctctg acttgagcgt cgatttttgt gatgctcgtc 6960 aggggggcgg agcctatgga aaaacgccag caacgcggcc tttttacggt tcctggcctt 7020 ttgctggcct tttgctcaca tgttctttcc tgcgttatcc cctgattctg tggataaccg 7080 tattaccgcc tttgagtgag ctgataccgc tcgccgcagc cgaacgaccg agcgcagcga 7140 gtcagtgagc gaggaagcgg aag 7163 <210> 28 <211> 427 <212> PRT <213> Escherichia coli <400> 28 Met Ser Asn Asn Ala Leu Gln Thr Ile Ile Asn Ala Arg Leu Pro Gly 1 5 10 15 Glu Glu Gly Leu Trp Gln Ile His Leu Gln Asp Gly Lys Ile Ser Ala 20 25 30 Ile Asp Ala Gln Ser Gly Val Met Pro Ile Thr Glu Asn Ser Leu Asp 35 40 45 Ala Glu Gln Gly Leu Val Ile Pro Pro Phe Val Glu Pro His Ile His 50 55 60 Leu Asp Thr Thr Gln Thr Ala Gly Gln Pro Asn Trp Asn Gln Ser Gly 65 70 75 80 Thr Leu Phe Glu Gly Ile Glu Arg Trp Ala Glu Arg Lys Ala Leu Leu 85 90 95 Thr His Asp Asp Val Lys Gln Arg Ala Trp Gln Thr Leu Lys Trp Gln 100 105 110 Ile Ala Asn Gly Ile Gln His Val Arg Thr His Val Asp Val Ser Asp 115 120 125 Ala Thr Leu Thr Ala Leu Lys Ala Met Leu Glu Val Lys Gln Glu Val 130 135 140 Ala Pro Trp Ile Asp Leu Gln Ile Val Ala Phe Pro Gln Glu Gly Ile 145 150 155 160 Leu Ser Tyr Pro Asn Gly Glu Ala Leu Leu Glu Glu Ala Leu Arg Leu 165 170 175 Gly Ala Asp Val Val Gly Ala Ile Pro His Phe Glu Phe Thr Arg Glu 180 185 190 Tyr Gly Val Glu Ser Leu His Lys Thr Phe Ala Leu Ala Gln Lys Tyr 195 200 205 Asp Arg Leu Ile Asp Val His Cys Asp Glu Ile Asp Asp Glu Gln Ser 210 215 220 Arg Phe Val Glu Thr Val Ala Ala Leu Ala His His Glu Gly Met Gly 225 230 235 240 Ala Arg Val Thr Ala Ser His Thr Thr Ala Met His Ser Tyr Asn Gly 245 250 255 Ala Tyr Thr Ser Arg Leu Phe Arg Leu Leu Lys Met Ser Gly Ile Asn 260 265 270 Phe Val Ala Asn Pro Leu Val Asn Ile His Leu Gln Gly Arg Phe Asp 275 280 285 Thr Tyr Pro Lys Arg Arg Gly Ile Thr Arg Val Lys Glu Met Leu Glu 290 295 300 Ser Gly Ile Asn Val Cys Phe Gly His Asp Asp Val Phe Asp Pro Trp 305 310 315 320 Tyr Pro Leu Gly Thr Ala Asn Met Leu Gln Val Leu His Met Gly Leu 325 330 335 His Val Cys Gln Leu Met Gly Tyr Gly Gln Ile Asn Asp Gly Leu Asn 340 345 350 Leu Ile Thr His His Ser Ala Arg Thr Leu Asn Leu Gln Asp Tyr Gly 355 360 365 Ile Ala Ala Gly Asn Ser Ala Asn Leu Ile Ile Leu Pro Ala Glu Asn 370 375 380 Gly Phe Asp Ala Leu Arg Arg Gln Val Pro Val Arg Tyr Ser Val Arg 385 390 395 400 Gly Gly Lys Val Ile Ala Ser Thr Gln Pro Ala Gln Thr Thr Val Tyr 405 410 415 Leu Glu Gln Pro Glu Ala Ile Asp Tyr Lys Arg 420 425 <210> 29 <211> 18 <212> PRT <213> Bifidobacterium longum <400> 29 Met Ala Tyr Asn Lys Ser Asp Leu Val Ser Lys Ile Ala Gln Lys Ser 1 5 10 15 Asn Leu

Claims

혐기적 환경하에 있는 종양조직내에서 생육이 가능하며, 또한, (A) 항종양활성을 갖는 단백질, 또는, (B) 항종양물질 전구체를 항종양물질로 변환시키는 활성을 갖는 단백질을 발현할 수가 있는 혐기성물질로 이루어지는 유전자 수송담체의 제작방법에 있어서,

비피도박테리움속 세균의 플라스미드의 단편 및 대장균의 플라스미드의 단편을 갖는 융합플라스미드를 제작하는 공정(1)과,

상기 융합플라스미드에, 비피도박테리움속 세균 유래의, 히스톤모양의 DNA결합단백질을 코드하는 유전자의 프로모터 및 터미네이터를 포함하는 DNA단편을 결합시키는 공정(2)과,

상기 프로모터와 터미네이터의 사이에, (a) 항종양활성을 갖는 단백질을 코드하는 DNA, 또는, (b) 항종양물질 전구체를 항종양물질로 변환시키는 활성을 갖는 단백질을 코드하는 DNA를 결합시켜 발현벡터를 제작하는 공정(3)과,

상기 발현벡터를 사용하여 혐기성 미생물을 형질전환하는 공정(4)을 가지며,

상기 공정(3)의 발현벡터 제작공정에 있어서 결합되는, (a) 항종양활성을 갖는 단백질을 코드하는 DNA, 또는, (b) 항종양물질 전구체를 항종양물질로 변환시키는 활성을 갖는 단백질을 코드하는 DNA가, 그 5'말단측에, 상기 히스톤모양의 DNA결합단백질의 N말단의 1번째로부터 적어도 4번째까지의 아미노산 서열로 이루어지는 펩티드를 코드하는 염기서열을 포함하는 DNA의 단편을 더 구비하는 것을 특징으 로 하는 유전자 수송담체의 제작방법.
제1항에 있어서,

히스톤모양의 DNA결합단백질의 N말단의 1번째로부터 적어도 4번째까지의 아미노산 서열로 이루어지는 펩티드가, 서열번호29의 1번째로부터 4번째~18번째의 어느 하나까지의 아미노산 서열로 이루어지는 펩티드인 것을 특징으로 하는 유전자 수송담체의 제작방법.
제1항 또는 제2항에 있어서,

(a) 항종양활성을 갖는 단백질을 코드하는 DNA, 또는, (b) 항종양물질 전구체를 항종양물질로 변환시키는 활성을 갖는 단백질을 코드하는 DNA를 변이화하는 공정(5)를, 공정(4)보다 앞서서 더 갖는 것을 특징으로 하는 유전자 수송담체의 제작방법.
제3항에 있어서,

(a) 항종양활성을 갖는 단백질을 코드하는 DNA, 또는, (b) 항종양물질 전구체를 항종양물질로 변환시키는 활성을 갖는 단백질을 코드하는 DNA를 변이화하는 공정(5)이, 공정(3)에서 제작한 발현벡터에 결합된, (a) 항종양활성을 갖는 단백질을 코드하는 DNA, 또는, (b) 항종양물질 전구체를 항종양물질로 변환시키는 활성을 갖는 단백질을 코드하는 DNA를 변이화하는 공정(5')인 것을 특징으로 하는 유전자 수송담체의 제작방법.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,

유전자 수송담체가, 혐기적 환경하에 있는 종양조직내에서 생육이 가능하며, 또한, 항종양물질 전구체를 항종양물질로 변환시키는 활성을 갖는 단백질을 발현할 수가 있는 혐기성 미생물로 이루어지는 유전자 수송담체인 것을 특징으로 하는 유전자 수송담체의 제작방법.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,

항종양물질 전구체를 항종양물질로 변환시키는 활성을 갖는 단백질이, 시토신데아미나제인 것을 특징으로 하는 유전자 수송담체의 제작방법.
제6항에 있어서,

혐기성 미생물로 이루어지는 유전자 수송담체가, 적어도 항종양활성 유효농도의 5-플루오로우라실 내성능을 갖는 시토신 데아미나제 발현 5-플루오로우라실 내성균인 것을 특징으로 하는 유전자 수송담체의 제작방법.
제7항에 있어서,

적어도 항종양활성 유효농도의 5-플루오로우라실 내성능을 갖는 시토신 데아미나제 발현 5-플루오로우라실 내성균이, 적어도 항종양활성 유효농도의 5-플루오 로우라실 내성능을 갖는 5-플루오로우라실 내성균을 숙주로서 사용하여 제작한 것을 특징으로 하는 유전자 수송담체의 제작방법.
제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,

히스톤모양의 DNA결합단백질의 N말단의 1번째로부터 적어도 4번째까지의 아미노산 서열로 이루어지는 펩티드를 코드하는 염기서열을 포함하는 DNA의 단편이, 서열번호14 또는 15의 1482번째로부터 적어도 1493번째까지의 염기서열을 포함하는 DNA의 단편인 것을 특징으로 하는 유전자 수송담체의 제작방법.
제9항에 있어서,

서열번호14 또는 15의 1482번째로부터 적어도 1493번째까지의 염기서열을 포함하는 DNA의 단편이, 서열번호15의 1482번째로부터 1493번째~1535번째의 어느 하나까지의 염기서열을 포함하는 DNA의 단편인 것을 특징으로 하는 유전자 수송담체의 제작방법.
제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서,

혐기성 미생물이 박테리아인 것을 특징으로 하는 유전자 수송담체의 제작방법.
제11항에 있어서,

박테리아가 장내세균인 것을 특징으로 하는 유전자 수송담체의 제작방법.
제12항에 있어서,

장내세균이 비피도박테리움속 세균인 것을 특징으로 하는 유전자 수송담체의 제작방법.
제13항에 있어서,

비피도박테리움속 세균이, 비피도박테리움 아돌레센티스(B. adolescentis), 비피도박테리움 아니말리스(B. animalis), 비피도박테리움 인판티스(B. infantis), 비피도박테리움 써모피럼(B. thermophilum), 비피도박테리움 슈도롱검(B. pseudolongum), 비피도박테리움 비피덤(B. bifidum), 비피도박테리움 브레베(B. breve), 및 비피도박테리움 롱검(B. longum)으로부터 선택되는 어느 하나의 비피도박테리움속 세균인 것을 특징으로 하는 유전자 수송담체의 제작방법.
제13항 또는 제14항에 있어서,

비피도박테리움속 세균이, 비피도박테리움 롱검인 것을 특징으로 하는 유전자 수송담체의 제작방법.
제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서,

상기 공정(4)의 형질전환에 사용되는 발현벡터가, 플라스미드 pAV001-HU-eCD 의 1염기 변이도입(變異導入) 플라스미드인 것을 특징으로 하는 유전자 수송담체의 제작방법.
제16항에 있어서,

플라스미드 pAV001-HU-eCD의 1염기 변이도입 플라스미드에 있어서의 CD를 코드하는 염기서열이, 서열번호28에 기재된 대장균 CD의 아미노산 서열에 있어서의 315번째에 대응하는 아미노산의 아스파라긴산이 다른 아미노산으로 치환된 아미노산 서열을 코드하는 염기서열인 것을 특징으로 하는 유전자 수송담체의 제작방법.
제17항에 있어서,

상기 다른 아미노산이 알라닌인 것을 특징으로 하는 유전자 수송담체의 제작방법.
제18항에 있어서,

플라스미드 pAV001-HU-eCD의 1염기 변이도입 플라스미드가, 플라스미드 pAV001-HU-eCD-M968인 것을 특징으로 하는 유전자 수송담체의 제작방법.
비피도박테리움속 세균의 플라스미드의 단편, 대장균의 플라스미드의 단편, 및 비피도박테리움속 세균 유래의, 히스톤모양의 DNA결합단백질을 코드하는 유전자의 프로모터 및 터미네이터를 포함하는 DNA단편을 가지며, 상기 프로모터와 터미네 이터의 사이에, (a) 항종양활성을 갖는 단백질을 코드하는 DNA, 또는, (b) 항종양물질 전구체를 항종양물질로 변환시키는 활성을 갖는 단백질을 코드하는 DNA를 가지며, 또한, (a) 항종양활성을 갖는 단백질을 코드하는 DNA, 또는, (b) 항종양물질 전구체를 항종양물질로 변환시키는 활성을 갖는 단백질을 코드하는 DNA의 5'말단측에, 상기 히스톤모양의 DNA결합단백질의 N말단의 1번째로부터 적어도 4번째까지의 아미노산 서열로 이루어지는 펩티드를 코드하는 염기서열을 포함하는 DNA의 단편을 더 구비하는 발현벡터로 형질전환된 혐기성 미생물로 이루어지는 유전자 수송담체.
혐기적 환경하에 있는 종양조직내에서 생육이 가능하며, 또한, (a) 항종양활성을 갖는 단백질을 코드하는 DNA 또는, (b) 항종양물질 전구체를 항종양물질로 변환하는 활성을 갖는 단백질을 코드하는 DNA를 갖는 혐기성 미생물의 유전자 수송담체로서, 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 기재된 제작방법으로 제작되는 유전자 수송담체.
제20항 또는 제21항에 있어서,

혐기성 미생물이 비피도박테리움속 세균인 것을 특징으로 하는 유전자 수송담체.
제22항에 있어서,

비피도박테리움속 세균이, 비피도박테리움 아돌레센티스, 비피도박테리움 아 니말리스, 비피도박테리움 인판티스, 비피도박테리움 써모피럼, 비피도박테리움 슈도롱검, 비피도박테리움 비피덤, 비피도박테리움 브레베, 및 비피도박테리움 롱검으로부터 선택되는 어느 하나의 비피도박테리움속 세균인 것을 특징으로 하는 유전자 수송담체.
제22항 또는 제23항에 있어서,

비피도박테리움속 세균이, 비피도박테리움 롱검인 것을 특징으로 하는 유전자 수송담체.
제20항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서,

혐기적 환경하에 있는 종양조직내에서 생육이 가능하며, 또한, 항종양물질 전구체를 항종양물질로 변환시키는 활성을 갖는 단백질을 발현할 수가 있는 것을 특징으로 하는 유전자 수송담체.
제25항에 있어서,

항종양물질 전구체를 항종양물질로 변환하는 활성을 갖는 단백질이 시토신 데아미나제인 것을 특징으로 하는 유전자 수송담체.
제26항에 있어서,

적어도 항종양활성 유효농도의 5-플루오로우라실 내성능을 갖는 시토신 데아 미나제 발현 5-플루오로우라실 내성균인 것을 특징으로 하는 유전자 수송담체.
제26항 또는 제27항에 있어서,

유전자 수송담체가, 비피도박테리움 롱검 105-A/pAV001-HU-eCD의 플라스미드 1염기 변이체인 것을 특징으로 하는 유전자 수송담체.
제28항에 있어서,

비피도박테리움 롱검 105-A/pAV001-HU-eCD의 플라스미드 1염기 변이체가. 비피도박테리움 롱검 105-A/pAV001-HU-eCD-M968인 것을 특징으로 하는 유전자 수송담체.
제20항 내지 제29항 중 어느 한 항에 기재된 유전자 수송담체를 함유하는 의약조성물.
제25항 내지 제29항 중 어느 한 항에 기재된 유전자 수송담체와, 상기 유전자 수송담체가 발현할 수가 있는 상기 단백질에 의하여 항종양물질로 변환되는 항종양물질 전구체를 결합시켜 이루어지는 의약조성물.
제31항에 있어서,

상기 유전자 수송담체가 제25항 내지 제29항 중 어느 한 항에 기재된 유전자 수송담체이며, 항종양물질 전구체가 5-플루오로시토신인 것을 특징으로 하는 의약조성물.
유효치료량의 항종양활성을 갖는 단백질을 발현시키기에 충분한 양의 제20항 내지 제24항 중 어느 한 항에 기재된 유전자 수송담체를 함유하는 고형종양 치료제.
항종양물질 전구체로부터 유효치료량의 항종양물질로 변환할 수가 있는 양의 상기 단백질을 발현시키기에 충분한 양의 제25항 내지 제29항 중 어느 한 항에 기재된 유전자 수송담체와, 상기 유전자 수송담체가 발현할 수가 있는 상기 단백질에 의하여 변환되며, 또한, 유효치료량의 항종양물질로 변환 할 수가 있는 양의 항종양물질 전구체를 조합시켜 이루어지는, 고형종양 치료제.
제34항에 있어서,

상기 유전자 수송담체가 제25항 내지 제29항 중 어느 한 항에 기재된 유전자 수송담체이며, 상기 항종양물질 전구체가 5-플루오로시토신인 것을 특징으로 하는 고형종양 치료제.