JPWO2007136107A1 - 遺伝子輸送担体作製方法 - Google Patents

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Abstract

本発明は、形質転換により導入した遺伝子によって発現される蛋白質の活性および発現効率が良好な遺伝子輸送担体を効率的に作製する方法を提供することを目的とする。また、本発明は、該作製方法によって作製される遺伝子輸送担体を含有する医薬組成物、及び該耐性菌を含有する固形腫瘍治療剤を提供することを目的とするものである。嫌気的環境下にある腫瘍組織内で生育でき、且つ、（Ａ）抗腫瘍活性を有する蛋白質、または、（Ｂ）抗腫瘍物質前駆体を抗腫瘍物質に変換する活性を有する蛋白質を発現することができる嫌気性微生物からなる遺伝子輸送担体において、前記目的蛋白質をコードするＤＮＡの５’末端側に、ヒストン様ＤＮＡ結合蛋白質のＮ末端の１番目から少なくとも４番目までのアミノ酸配列からなるペプチドをコードする塩基配列を含むＤＮＡの断片をさらに具有させることにより、本発明の課題を解決した。

Description

本発明は、固形腫瘍治療剤として有用な、嫌気的環境下にある腫瘍組織内で生育でき、且つ、（Ａ）抗腫瘍活性を有する蛋白質、又は、（Ｂ）抗腫瘍物質前駆体を抗腫瘍物質に変換する活性を有する蛋白質を発現することができる嫌気性微生物からなる遺伝子輸送担体の作製方法に関する。また、本発明は、該方法により作製される遺伝子輸送担体を含有する医薬組成物、及び該遺伝子輸送担体を含有する固形腫瘍治療剤に関する。
近年、悪性腫瘍に対する遺伝子輸送担体を用いる治療方法が種々研究されており、例えば、嫌気性菌のクロストリジウムについて、形質転換した菌を用いた腫瘍部位への遺伝子輸送方法が提案されている（例えば、特許文献１、２参照）。
同じく、嫌気性菌のビフィドバクテリウムについて、その形質転換体がプロバイオティクスのベクターや、感染性疾患の経口ワクチンのベクターとしての応用が期待されており（例えば、特許文献３参照）、また、ビフィドバクテリウム・ロンガムについて、全身投与後、低酸素の固形腫瘍に蓄積することから、固形腫瘍に対する治療への応用が示唆されている（例えば、非特許文献１、２参照）。
また、本発明者らは、ビフィドバクテリウム・ロンガム由来のヒストン様ＤＮＡ結合蛋白質のプロモーターと融合した大腸菌ｃｏｄＡを保有する組換えプラスミドｐＢＬＥＳ１００−Ｓ−ｅＣＤを用いて形質転換することにより、抗腫瘍活性を有する５−フルオロウラシル（以下、「５−ＦＵ」という）のプロドラッグ（前駆体）である５−フルオロシトシン（以下、「５−ＦＣ」という）を５−フルオロウラシルに変換する酵素のシトシン・デアミナーゼ（ＥＣ３．５．４．１；以下、「ＣＤ」という）を、組み換え微生物において発現させ得ることを確認し、当該組み換え微生物、例えば組み換えビフィドバクテリウム・ロンガムが、酵素−プロドラッグ療法への応用に期待できることを報告している（例えば、特許文献４及び非特許文献３、４参照）。さらに、このＣＤ発現遺伝子組み換え微生物を酵素−プロドラッグ療法へ応用するためには、ＣＤによって５−ＦＣから変換される、少なくとも抗腫瘍活性有効濃度の５−ＦＵに対する耐性を有していることが求められることから、そのような、ＣＤを発現する５−ＦＵ耐性菌の作製方法を開発し、報告している（例えば、特許文献５参照）。一方、このＣＤについて、非特許文献５は、大腸菌において、ＣＤをコードするＤＮＡにおいて、当該ＣＤの３１４番目（本発明の配列番号２８における３１５番目に対応）のアミノ酸をアスパラギン酸からアラニンに置換する変異を加えたところ、変異前の野生型のＣＤに比べて、変異型のＣＤは、５−ＦＣを５−ＦＵに変換するＣＤ活性が約２．２倍（５０／２３）に増強されたことを報告している（非特許文献５ Table1.の中央参照）。
悪性腫瘍に対する治療に用いられる組み換え菌の形質転換方法については種々報告されており、上記文献にも、それぞれの形質転換菌の作製方法が報告されている。
例えば、特許文献３には、ビフィドバクテリウム由来のプラスミドと大腸菌由来のプラスミドを利用してビフィドバクテリウムと大腸菌で相互複製されるシャトルプラスミドを製造する段階と、前記シャトルプラスミドに目的蛋白質をコーディングする目的遺伝子を結合させて組み換えベクターを製造する段階とを有し、前記製造された組み換えベクターに形質転換させるための宿主細胞として、前記シャトルプラスミドの製造に利用されたビフィドバクテリウムを利用することを特徴とする形質転換方法が報告されている。
そのほか、例えば、前記組み換えプラスミドｐＢＬＥＳ１００−Ｓ−ｅＣＤの構築に用いられたシャトルプラスミドｐＢＬＥＳ１００の作製方法について、ビフィドバクテリウム・ロンガムＢＫ５１のｐＴＢ６と大腸菌のｐＢＲ３２２とから構築する作製方法が報告されている（例えば、非特許文献６参照）。
さらに、このシャトルプラスミドｐＢＬＥＳ１００と比較して１００倍を超える高効率で、ビフィドバクテリウム・ロンガムを形質転換しうるプラスミドｐＡＶ００１及びｐＢＲＡＳＴＡ１０１の作製方法が提案されている（例えば、非特許文献７参照）。
このように、悪性腫瘍に対する治療に有用な遺伝子輸送担体の作製方法については種々報告されているが、いずれも形質転換に用いる微生物やプラスミドなどを特定したものであって、形質転換方法自体は通常の形質変換技術を用いたものであり、また、目的とする遺伝子、例えば抗腫瘍活性を有する蛋白質又は抗腫瘍物質前駆体を抗腫瘍物質に変換する活性を有する蛋白質を発現する遺伝子を標的患部において発現できる形質転換微生物自体の作製を目的とした方法であり、目的とする遺伝子から発現する蛋白質自体の活性あるいは発現効率の向上を目的とした作製方法はこれまで報告されていない。
米国特許第６４１６７５４号公報 米国特許第６６５２８４９号公報 特表２００４−５１９２３６号公報 特開２００２−９７１４４号公報 国際公開２００６／１０９６１９号公報 Yazawa et al. Cancer Gene Ther., 7, 269-274 (2000) Yazawa et al. Breast Cancer Res. Treat., 66, 165-170 (2001) Nakamura et al., Biosci. Biotechnol. Biochem., 66, 2362-2366(2002) Fujimori et al., Curr. Opin. Drug Discov. Devel., 5, 200-203(2002) Sheri et al., Protein Engineering, Design and Selection, 17(8):625-633 (2004) Matsumura et al., Biosci. Biotechnol. Biochem., 61, 1211-1212 (1997) Tanaka et al., Biosci Biotechnol Biochem.;69(2):422-425 (2005)
これまでに報告されている悪性腫瘍の治療に有用な遺伝子輸送担体の作製方法は、いずれも、目的とする遺伝子、例えば抗腫瘍活性を有する蛋白質又は抗腫瘍物質前駆体を抗腫瘍物質に変換する活性を有する蛋白質を発現する遺伝子を標的患部において発現できる組み換え菌自体の作製を目的とした方法であり、目的とする遺伝子から発現する蛋白質自体の活性あるいは発現効率の向上を目的とした作製方法はこれまで報告されていない。
しかしながら、遺伝子輸送担体を用いる治療方法においては、形質転換微生物に導入された遺伝子によって発現される蛋白質の活性及び発現効率は重要な問題であり、当該形質転換微生物の遺伝子によって発現される蛋白質が、元々の野生型微生物が保有していた遺伝子によって発現される蛋白質と同じ活性を有していること、さらに、元々の微生物が保有していた遺伝子と同等又はそれ以上に発現できることが当然求められる。
本発明の課題は、形質転換により導入した遺伝子によって発現される蛋白質の活性及び発現効率が良好な遺伝子輸送担体を効率的に作製する方法を提供することにある。また、本発明の課題は、該作製方法によって作製される遺伝子輸送担体を含有する医薬組成物、及び該耐性菌を含有する固形腫瘍治療剤を提供することにある。
本発明者らは、先に、目的遺伝子として、抗腫瘍物質前駆体を抗腫瘍物質に変換する活性を有する蛋白質の中のＣＤを発現する遺伝子を選択し、当該目的遺伝子を組みこむプラスミドとして、当該ＣＤを発現する遺伝子を保有している大腸菌のプラスミドと、ビフィドバクテリウム・ロンガム由来のプラスミドとを融合したプラスミドｐＢＬＥＳ１００−Ｓ−ｅＣＤを作製し、これを用いてビフィドバクテリウム・ロンガム１０５Ａを組換えた、ビフィドバクテリウム・ロンガム１０５Ａ／ｐＢＬＥＳ１００−Ｓ−ｅＣＤが悪性腫瘍の治療に有用な遺伝子輸送担体として期待できることを見出し、その作製方法として、目的遺伝子を組み込んで当該遺伝子発現ベクターを作製する工程において、ビフィドバクテリウム・ロンガム由来のヒストン様ＤＮＡ結合蛋白質（以下、「ＨＵ蛋白質」ともいう）をコードする遺伝子の発現に係るプロモーターを用い、その下流に目的遺伝子を組み込むことにより、目的とする遺伝子を発現できる形質転換微生物を作製する方法を報告している（特許文献４）。
本発明者らは、上記方法についてさらに鋭意検討を加え、目的遺伝子を組みこむ融合プラスミドとして、大腸菌及びビフィドバクテリウム・ロンガム由来のそれぞれのプラスミドの中の当該プラスミド複製に必須の部分を含み、宿主域拡大に好ましくない部分を含まない断片を融合して作製したプラスミドを用いることにより、形質転換率を高くできることを見出した。
また、当該宿主とする微生物のヒストン様ＤＮＡ結合蛋白質をコードする遺伝子の発現に係るプロモーターの下流に目的遺伝子を組み込む際、当該目的遺伝子が、当該遺伝子の５’末端側に、前記ヒストン様ＤＮＡ結合蛋白質のＮ末端領域をコードするＤＮＡ断片を有するものであることが必要であり、さらに、そのＤＮＡ断片として少なくとも４個のアミノ酸をコードするＤＮＡ断片を含むものであることが必要であることを見出した。
具体的には、ヒストン様ＤＮＡ結合蛋白質をコードする遺伝子の発現に係るプロモーターの下流に目的遺伝子を組み込む際に、当該目的遺伝子ＤＮＡの５’末端側に、前記ヒストン様ＤＮＡ結合蛋白質のＮ末端の１番目から少なくとも４番目までのアミノ酸配列をコードする塩基配列を含むＤＮＡ断片を組み込むことにより、当該目的遺伝子の採取源である微生物における該遺伝子産物（蛋白質）と同じ活性を有する蛋白質を、採取源である微生物と同等又はそれ以上に発現できる微生物を作製できることを見出した。
さらに、本発明者らは、発現ベクターの作製工程において、組み込まれた目的遺伝子のＤＮＡを一部変異化することにより、より高い活性を有する蛋白質を産生させることができることを見出し、さらにまた、特に、当該目的遺伝子が抗腫瘍物質前駆体を抗腫瘍物質に変換する活性を有する蛋白質の中のＣＤを発現する遺伝子の場合、宿主となる嫌気性微生物として、少なくとも抗腫瘍活性有効濃度の５−フルオロウラシル耐性能を有する５−フルオロウラシル耐性菌を用いることにより、プラスミド保持率の高い、遺伝子組み換え微生物が作製できることを見出し、本発明を完成した。
すなわち本発明は、
[１]嫌気的環境下にある腫瘍組織内で生育でき、且つ、（Ａ）抗腫瘍活性を有する蛋白質、又は、（Ｂ）抗腫瘍物質前駆体を抗腫瘍物質に変換する活性を有する蛋白質を発現することができる嫌気性微生物からなる遺伝子輸送担体の作製方法であって、
ビフィドバクテリウム属細菌のプラスミドの断片及び大腸菌のプラスミドの断片を有する融合プラスミドを作製する工程（１）と、
前記融合プラスミドに、ビフィドバクテリウム属細菌由来の、ヒストン様ＤＮＡ結合蛋白質をコードする遺伝子のプロモーター及びターミネーターを含むＤＮＡ断片を組み込む工程（２）と、
前記プロモーターとターミネーターの間に、（ａ）抗腫瘍活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ、又は、（ｂ）抗腫瘍物質前駆体を抗腫瘍物質に変換する活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡを組み込んで発現ベクターを作製する工程（３）と、
前記発現ベクターを用いて嫌気性微生物を形質転換する工程（４）とを有し、
前記工程（３）の発現ベクター作製工程において組み込まれる、（ａ）抗腫瘍活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ、又は、（ｂ）抗腫瘍物質前駆体を抗腫瘍物質に変換する活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡが、その５’末端側に、前記ヒストン様ＤＮＡ結合蛋白質のＮ末端の１番目から少なくとも４番目までのアミノ酸配列からなるペプチドをコードする塩基配列を含むＤＮＡの断片をさらに具有するものであることを特徴とする遺伝子輸送担体の作製方法や、
[２]ヒストン様ＤＮＡ結合蛋白質のＮ末端の１番目から少なくとも４番目までのアミノ酸配列からなるペプチドが、配列番号２９の１番目から４番目〜１８番目のいずれかまでのアミノ酸配列からなるペプチドである、上記[１]に記載の遺伝子輸送担体の作製方法や、
[３]（ａ）抗腫瘍活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ、又は、（ｂ）抗腫瘍物質前駆体を抗腫瘍物質に変換する活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡを変異化する工程（５）を、工程（４）より前にさらに有する、上記[１]又は[２]に記載の遺伝子輸送担体の作製方法や、
[４]（ａ）抗腫瘍活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ、又は、（ｂ）抗腫瘍物質前駆体を抗腫瘍物質に変換する活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡを変異化する工程（５）が、工程（３）で作製した発現ベクターに組み込まれた、（ａ）抗腫瘍活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ、又は、（ｂ）抗腫瘍物質前駆体を抗腫瘍物質に変換する活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡを変異化する工程（５’）である、上記[３]に記載の遺伝子輸送担体の作製方法や、
[５]遺伝子輸送担体が、嫌気的環境下にある腫瘍組織内で生育でき、且つ、抗腫瘍物質前駆体を抗腫瘍物質に変換する活性を有する蛋白質を発現することができる嫌気性微生物からなる遺伝子輸送担体である、上記[１]〜[４]のいずれかに記載の遺伝子輸送担体の作製方法や、
[６]抗腫瘍物質前駆体を抗腫瘍物質に変換する活性を有する蛋白質が、シトシンデアミナーゼである、上記[１]〜[５]のいずれかに記載の遺伝子輸送担体の作製方法や、
[７]嫌気性微生物からなる遺伝子輸送担体が、少なくとも抗腫瘍活性有効濃度の５−フルオロウラシル耐性能を有するシトシン・デアミナーゼ発現・５−フルオロウラシル耐性菌である、[６]に記載の遺伝子輸送担体の作製方法や、
[８]少なくとも抗腫瘍活性有効濃度の５−フルオロウラシル耐性能を有するシトシン・デアミナーゼ発現・５−フルオロウラシル耐性菌が、少なくとも抗腫瘍活性有効濃度の５−フルオロウラシル耐性能を有する５−フルオロウラシル耐性菌を宿主として用いて作製したことを特徴とする、［７］に記載の遺伝子輸送担体の作製方法や、
[９]ヒストン様ＤＮＡ結合蛋白質のＮ末端の１番目から少なくとも４番目までのアミノ酸配列からなるペプチドをコードする塩基配列を含むＤＮＡの断片が、配列番号１４又は１５の１４８２番目から少なくとも１４９３番目までの塩基配列を含むＤＮＡの断片である、上記[１]〜[８]のいずれかに記載の遺伝子輸送担体の作製方法や、
[１０]配列番号１４又は１５の１４８２番目から少なくとも１４９３番目までの塩基配列を含むＤＮＡの断片が、配列番号１５の１４８２番目から１４９３番目〜１５３５番目のいずれかまでの塩基配列を含むＤＮＡの断片である、上記[９]に記載の遺伝子輸送担体の作製方法や、
[１１]嫌気性微生物がバクテリアである、上記[１]〜[１０]のいずれかに記載の遺伝子輸送担体の作製方法や、
[１２]バクテリアが腸内細菌である、上記[１１]に記載の遺伝子輸送担体の作製方法や、
[１３]腸内細菌がビフィドバクテリウム属細菌である、上記[１２]に記載の遺伝子輸送担体の作製方法や、
[１４]ビフィドバクテリウム属細菌が、ビフィドバクテリウム・アドレッセンティス、ビフィドバクテリウム・アニマリス、ビフィドバクテリウム・インファンティス、ビフィドバクテリウム・サーモフィラム、ビフィドバクテリウム・シュードロンガム、ビフィドバクテリウム・ビフィダム、ビフィドバクテリウム・ブレーベ、およびビフィドバクテリウム・ロンガムから選ばれるいずれかのビフィドバクテリウム属細菌である、上記[１３]に記載の遺伝子輸送担体の作製方法や、
[１５]ビフィドバクテリウム属細菌が、ビフィドバクテリウム・ロンガムであることを特徴とする、上記[１３]又は[１４]に記載の遺伝子輸送担体の作製方法や、
[１６]工程（４）の形質転換に用いる発現ベクターが、プラスミドｐＡＶ００１−ＨＵ−ｅＣＤの一塩基変異導入プラスミドである、上記[１]〜[１５]のいずれかに記載の遺伝子輸送担体の作製方法や、
[１７]プラスミドｐＡＶ００１−ＨＵ−ｅＣＤの一塩基変異導入プラスミドにおけるＣＤをコードする塩基配列が、配列番号２８に記した大腸菌ＣＤのアミノ酸配列における３１５番目に対応するアミノ酸のアスパラギン酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列をコードする塩基配列である、上記[１６]に記載の遺伝子輸送担体の作製方法や、
[１８]他のアミノ酸がアラニンである、上記[１７]に記載の遺伝子輸送担体の作製方法や、
[１９]プラスミドｐＡＶ００１−ＨＵ−ｅＣＤの一塩基変異導入プラスミドが、プラスミドｐＡＶ００１−ＨＵ−ｅＣＤ−Ｍ９６８である、上記[１８]に記載の遺伝子輸送担体の作製方法に関する。
また、本発明は、
[２０]ビフィドバクテリウム属細菌のプラスミドの断片、大腸菌のプラスミドの断片、及びビフィドバクテリウム属細菌由来の、ヒストン様ＤＮＡ結合蛋白質をコードする遺伝子のプロモーター及びターミネーターを含むＤＮＡ断片を有し、前記プロモーターとターミネーターの間に、（ａ）抗腫瘍活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ、又は、（ｂ）抗腫瘍物質前駆体を抗腫瘍物質に変換する活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡを有し、且つ、（ａ）抗腫瘍活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ、又は、（ｂ）抗腫瘍物質前駆体を抗腫瘍物質に変換する活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡの５’末端側に、前記ヒストン様ＤＮＡ結合蛋白質のＮ末端の１番目から少なくとも４番目までのアミノ酸配列からなるペプチドをコードする塩基配列を含むＤＮＡの断片をさらに具有する発現ベクターで形質転換された嫌気性微生物からなる遺伝子輸送担体や、
[２１]嫌気的環境下にある腫瘍組織内で生育でき、且つ、（ａ）抗腫瘍活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ又は（ｂ）抗腫瘍物質前駆体を抗腫瘍物質に変換する活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡを有する嫌気性微生物の遺伝子輸送担体であって、上記[１]〜[１９]のいずれかの作製方法で作製される遺伝子輸送担体や、
[２２]嫌気性微生物がビフィドバクテリウム属細菌である、上記[２０]又は[２１]に記載の遺伝子輸送担体や、
[２３]ビフィドバクテリウム属細菌が、ビフィドバクテリウム・アドレッセンティス、ビフィドバクテリウム・アニマリス、ビフィドバクテリウム・インファンティス、ビフィドバクテリウム・サーモフィラム、ビフィドバクテリウム・シュードロンガム、ビフィドバクテリウム・ビフィダム、ビフィドバクテリウム・ブレーベ、及びビフィドバクテリウム・ロンガムから選ばれるいずれかのビフィドバクテリウム属細菌である、上記[２２]に記載の遺伝子輸送担体や、
[２４]ビフィドバクテリウム属細菌が、ビフィドバクテリウム・ロンガムである、上記[２２]又は[２３]に記載の遺伝子輸送担体や、
[２５]嫌気的環境下にある腫瘍組織内で生育でき、且つ、抗腫瘍物質前駆体を抗腫瘍物質に変換する活性を有する蛋白質を発現することができる、上記[２０]〜[２４]のいずれかに記載の遺伝子輸送担体や、
[２６]抗腫瘍物質前駆体を抗腫瘍物質に変換する活性を有する蛋白質が、シトシン・デアミナーゼである、上記[２５]に記載の遺伝子輸送担体や、
[２７]少なくとも抗腫瘍活性有効濃度の５−フルオロウラシル耐性能を有するシトシン・デアミナーゼ発現・５−フルオロウラシル耐性菌である、[２６]に記載の遺伝子輸送担体や、
[２８]遺伝子輸送担体が、ビフィドバクテリウム・ロンガム１０５−Ａ／ｐＡＶ００１−ＨＵ−ｅＣＤのプラスミド一塩基変異体である、上記[２６]または[２７]に記載の遺伝子輸送担体や、
[２９]ビフィドバクテリウム・ロンガム１０５−Ａ／ｐＡＶ００１−ＨＵ−ｅＣＤのプラスミド一塩基変異体が、ビフィドバクテリウム・ロンガム１０５−Ａ／ｐＡＶ００１−ＨＵ−ｅＣＤ−Ｍ９６８である、上記[２８]に記載の遺伝子輸送担体に関する。
さらに、本発明は、
[３０]上記[２０]〜[２９]のいずれかに記載の遺伝子輸送担体を含有する医薬組成物や、
[３１]上記[２５]〜[２９]のいずれかに記載の遺伝子輸送担体と、該遺伝子輸送担体が発現することができる前記蛋白質によって抗腫瘍物質に変換される抗腫瘍物質前駆体とを組み合わせてなる医薬組成物や、
[３２]遺伝子輸送担体が上記[２５]〜[２９]のいずれかに記載の遺伝子輸送担体であり、抗腫瘍物質前駆体が５−フルオロシトシンである、上記[３１]に記載の医薬組成物に関する。
またさらに、本発明は、
[３３]有効治療量の抗腫瘍活性を有する蛋白質を発現するに十分な量の上記[２０]〜[２４]のいずれかに記載の遺伝子輸送担体を含有する固形腫瘍治療剤や、
[３４]抗腫瘍物質前駆体から有効治療量の抗腫瘍物質に変換できる量の前記蛋白質を発現するに十分な量の上記[２５]〜[２９]のいずれかに記載の遺伝子輸送担体と、該遺伝子輸送担体が発現することができる前記蛋白質によって変換され、且つ、有効治療量の抗腫瘍物質に変換できる量の抗腫瘍物質前駆体とを組み合わせてなる、固形腫瘍治療剤や、
[３５]遺伝子輸送担体が上記[２５]〜[２９]のいずれかに記載の遺伝子輸送担体であり、抗腫瘍物質前駆体が５−フルオロシトシンである、上記[３４]に記載の固形腫瘍治療剤に関する。
なお、本願明細書においては、（ａ）抗腫瘍活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ、や（ｂ）抗腫瘍物質前駆体を抗腫瘍物質に変換する活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡを、以下、「目的蛋白質をコードするＤＮＡ」という場合もある。
本発明によると、固形腫瘍治療剤として有用な、嫌気的環境下にある腫瘍組織内で生育でき、且つ、抗腫瘍活性を有する蛋白質、又は、抗腫瘍物質前駆体を抗腫瘍物質に変換する活性を有する蛋白質を発現することができる嫌気性微生物からなる遺伝子輸送担体であって、形質転換により導入した遺伝子によって発現される蛋白質の活性及び発現効率が良好な遺伝子輸送担体を効率よく作製することができる。
本発明における遺伝子輸送担体を悪性腫瘍等の患者に投与すると、本発明の遺伝子輸送担体である嫌気性微生物が腫瘍内で増殖し、そこで目的蛋白質を発現する。目的蛋白質が抗腫瘍活性を有する蛋白質である場合はそのまま抗腫瘍効果を発揮し、一方、目的蛋白質が抗腫瘍物質前駆体を抗腫瘍物質に変換する活性を有する蛋白質である場合は、遺伝子輸送担体と抗腫瘍物質前駆体を腫瘍部位において共存させると、該遺伝子輸送担体から発現された目的蛋白質が抗腫瘍物質前駆体を抗腫瘍物質へと変換し、抗腫瘍効果を発揮する。
抗腫瘍物質前駆体を抗腫瘍物質に変換する活性を有する蛋白質がＣＤである場合、抗腫瘍物質前駆体として５−ＦＣが好ましく用いられる。５−ＦＣはＣＤにより５−ＦＵへと変換され、５−ＦＵは優れた抗腫瘍効果を発揮する。全身投与によって十分な抗腫瘍効果が得られる量の５−ＦＵを全身に投与すると、全身性の副作用が生じるが、本発明の遺伝子輸送担体を用いれば、副作用をあまり生じない５−ＦＣを、腫瘍部位特異的に５−ＦＵに変換することができるため、５−ＦＵをそのまま投与する場合に比べて、格段に高い５−ＦＵ濃度を腫瘍内において実現することが可能となり、その結果、極めて優れた抗腫瘍効果が得られる。
しかし、ＣＤを発現する遺伝子輸送担体を利用して腫瘍部位において５−ＦＣから５−ＦＵに変換しさえすれば、それで即実用化に耐えうるレベルの腫瘍治療剤が得られるというわけではない。このような腫瘍治療剤の抗腫瘍効果や実用性は、３つの要素に大きく左右される。すなわち、遺伝子輸送担体である嫌気性微生物の菌体量、該嫌気性微生物が発揮するＣＤ活性の程度、腫瘍部位における５−ＦＣの濃度である。５−ＦＣ及び嫌気性微生物を多く投与すればするだけ、より強力な抗腫瘍効果が得られるのは当然であるが、副作用をできるだけ低くする観点からは必要な抗腫瘍効果が得られる範囲内で５−ＦＣの投与量をできるだけ少量に抑えることが望ましく、少なくとも、臨床で認められている用量よりも少なくすることが求められる。また、嫌気性微生物についても、いかに毒性の低いものを使用したとしても、人体への影響を最小限にする観点からは、必要な抗腫瘍効果が得られる範囲内で極力少量に抑えることが望ましい。これらのことを踏まえれば、ＣＤを発現する遺伝子輸送担体を利用して腫瘍部位において５−ＦＣから５−ＦＵに変換することを利用した従来の抗腫瘍剤は、臨床レベルでの実用性はいずれも十分とはいえなかった。
例えば、特許文献４の実施例４において、マウスの治療実験に用いた５−ＦＣの濃度は５００ｍｇ／ｋｇであり、その濃度において有効かつ十分な抗腫瘍効果が得られている。しかし、共和薬品工業株式会社の深在性真菌症治療剤 アンコチルＡＮＣＯＴＩＬ（日局フルシトシン５００ｍｇを含有）の用法及び用量の記載「真菌血症、真菌性髄膜炎、真菌性呼吸器感染症、黒色真菌症には、通常、フルオロシトシンとして、１日１００〜２００ｍｇ／ｋｇを４回に分割経口投与する。尿路真菌症、消化管真菌症には、通常、フルオロシトシンとして、１日５０〜１００ｍｇ／ｋｇを４回に分割経口投与する。」からも分かるように、臨床試験で実際に認められている５−ＦＣの最大用量は２００ｍｇ／ｋｇである。したがって、特許文献４の実施例で用いた実験系を利用して５−ＦＣの臨床用量（２００ｍｇ／ｋｇ）で十分な抗腫瘍効果を得るためには、少なくとも２．５倍（≒５００／２００）の酵素活性増強が必要であった。
一方、非特許文献５は、大腸菌において、ＣＤをコードするＤＮＡにおいて、当該ＣＤの３１４番目（本発明の配列番号２８における３１５番目に対応）のアミノ酸をアスパラギン酸からアラニンに置換する変異を加えたところ、変異前の野生型のＣＤに比べて、変異型のＣＤは、５−ＦＣを５−ＦＵに変換するＣＤ活性（ｋｃａｔ／Ｋｍ値）が約２．２倍（５０／２３）に増強されたことを報告しているが、この増強効果は上記課題解決のためには未だ不十分である。ところが、本発明の遺伝子輸送担体において目的蛋白質であるＣＤをコードするＤＮＡの５’末端側に、前記ヒストン様ＤＮＡ結合蛋白質のＮ末端の１番目から少なくとも４番目までのアミノ酸配列からなるペプチドをコードする塩基配列を含むＤＮＡの断片をさらに具有させ、かつ、該ＣＤの、前記配列番号２８における３１５番目のアスパラギン酸をアラニンに置換させたところ、全く予想外に、当該ＣＤ活性が約１２倍にまでも増強された。
当該ＣＤ活性の１２倍の増強を、上記実験結果を基準として計算すると５−ＦＣ投与量は約４２ｍｇ／ｋｇ、すなわち最小臨床用量（５０ｍｇ／ｋｇ）以下で足りることとなり、極めて高い実用性が期待できるものである。
したがって、本発明の遺伝子輸送担体のうち、目的蛋白質であるＣＤをコードするＤＮＡの５’末端側に、前記ヒストン様ＤＮＡ結合蛋白質のＮ末端の１番目から少なくとも４番目までのアミノ酸配列からなるペプチドをコードする塩基配列を含むＤＮＡの断片をさらに具有させ、かつ、該ＣＤの、前記配列番号２８における３１５番目のアスパラギン酸がアラニンに置換された遺伝子輸送担体（例えばビフィドバクテリウム・ロンガム１０５−Ａ／ｐＡＶ００１−ＨＵ−ｅＣＤ−Ｍ９６８）は、特に優れた実用性が期待される。
実際、特許文献４で用いられた変異化されていないＣＤを有する遺伝子輸送担体（組換えビフィズス菌）を、ヒト由来乳ガン細胞株（ＫＰＬ−１）移植ヌードマウスの治療系に用いた場合、５−ＦＣから有効濃度の５−ＦＵへ腫瘍内で変換するのに必要な菌濃度は１０７ＣＦＵ／ｇ以上であることが確認されていたが、本発明の遺伝子輸送担体のうち、さらに該ＣＤの、前記配列番号２８における３１５番目のアスパラギン酸がアラニンに置換された遺伝子輸送担体を同じ実験系に用いた場合、上記の菌濃度の１００分の１の濃度である１０５ＣＦＵ／ｇで、同等の腫瘍内５−ＦＵ濃度を得られることが本発明者らの実験によって確認されている。
ビフィドバクテリウム・ロンガム１０５Ａ／ｐＡＶ００１−ＨＵ−ｅＣＤの作製過程を示す図である。 ビフィドバクテリウム・ロンガム１０５Ａ／ｐＡＶ００１−ＨＵ−ｅＣＤにおけるＣＤ活性（５−ＦＣから変換された５−ＦＵの濃度）を示す図である。 ＨＵ蛋白質Ｎ末端２アミノ酸付加プラスミドの構築過程を示す図である。 ２種類の５−ＦＵ耐性としたビフィドバクテリウム・ロンガム１０５Ａ／ｐＡＶ００１−ＨＵ−ｅＣＤ−Ｍ９６８のプラスミド保持率の結果を示す図である。
本発明の遺伝子輸送担体の作製方法は、嫌気的環境下にある腫瘍組織内で生育でき、且つ、（Ａ）抗腫瘍活性を有する蛋白質、又は、（Ｂ）抗腫瘍物質前駆体を抗腫瘍物質に変換する活性を有する蛋白質を発現することができる嫌気性微生物からなる遺伝子輸送担体の作製方法であって、
ビフィドバクテリウム属細菌のプラスミドの断片及び大腸菌のプラスミドの断片を有する融合プラスミドを作製する工程（１）と、
前記融合プラスミドに、ビフィドバクテリウム属細菌由来の、ヒストン様ＤＮＡ結合蛋白質をコードする遺伝子のプロモーター及びターミネーターを含むＤＮＡ断片を組み込む工程（２）と、
前記プロモーターとターミネーターの間に、（ａ）抗腫瘍活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ、又は、（ｂ）抗腫瘍物質前駆体を抗腫瘍物質に変換する活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡを組み込んで発現ベクターを作製する工程（３）と、
前記発現ベクターを用いて嫌気性微生物を形質転換する工程（４）とを有し、
前記工程（３）の発現ベクター作製工程において組み込まれる、（ａ）抗腫瘍活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ、又は、（ｂ）抗腫瘍物質前駆体を抗腫瘍物質に変換する活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡが、その５’末端側に、前記ヒストン様ＤＮＡ結合蛋白質のＮ末端の１番目から少なくとも４番目までのアミノ酸配列からなるペプチドをコードする塩基配列を含むＤＮＡの断片をさらに具有するものであることを特徴とするものである。
本発明の遺伝子輸送担体の作製方法は、ビフィドバクテリウム属細菌のプラスミドの断片及び大腸菌のプラスミドの断片を有する融合プラスミドを作製する工程（１）と、前記融合プラスミドに、ビフィドバクテリウム属細菌由来の、ヒストン様ＤＮＡ結合蛋白質をコードする遺伝子のプロモーター及びターミネーターを含むＤＮＡ断片を組み込む工程（２）と、前記プロモーターとターミネーターの間に、（ａ）抗腫瘍活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ、又は、（ｂ）抗腫瘍物質前駆体を抗腫瘍物質に変換する活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡを組み込んで発現ベクターを作製する工程（３）と、前記発現ベクターを用いて嫌気性微生物を形質転換する工程（４）とを有し、前記工程（３）の発現ベクター作製工程において組み込まれる、（ａ）抗腫瘍活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ、又は、（ｂ）抗腫瘍物質前駆体を抗腫瘍物質に変換する活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡが、その５’末端側に、前記ヒストン様ＤＮＡ結合蛋白質のＮ末端の１番目から少なくとも４番目までのアミノ酸配列からなるペプチドをコードする塩基配列を含むＤＮＡの断片をさらに具有するものであれば特に制限されない。
本発明の遺伝子輸送担体の作製方法は、上記工程（１）〜工程（４）を有している限り特に制限されず、本発明の効果を損なわない限り、他に任意の工程を有していてもよい。また、本発明の遺伝子輸送担体の作製方法においては、工程（２）と工程（３）の順序の前後は問わず、（１）、（２）、（３）、（４）の順序でこれらの工程を有していてもよいし、（１）、（３）、（２）、（４）の順序でこれらの工程を有していてもよい。これらの両方の態様が、本発明の遺伝子輸送担体の作製方法に便宜上含まれる。
特に、工程（３）の発現ベクター作製工程において、目的蛋白質をコードするＤＮＡを組み込む際の、当該目的とする蛋白質をコードするＤＮＡの５’末端側にＨＵ蛋白質のＮ末端領域をコードするＤＮＡの断片を具有させる態様としてはどのような態様であってもよく、例えば、目的蛋白質をコードするＤＮＡの５’末端側に、前記ＨＵ蛋白質のＮ末端領域をコードするＤＮＡの断片を付して組み込む態様であってもよく、目的蛋白質をコードするＤＮＡを、前記ＨＵ蛋白質をコードするＤＮＡの中間位置に組み込み、ＨＵ蛋白質のＮ末端領域をコードするＤＮＡと、ＨＵ蛋白質のＣ末端領域をコードするＤＮＡで、目的蛋白質をコードするＤＮＡを挟み込むような態様であってもよい。
なお、工程（３）の発現ベクター作製工程において、目的蛋白質をコードするＤＮＡの５’末端側にＨＵ蛋白質のＮ末端領域をコードするＤＮＡの断片を具有させる際の順序は、目的蛋白質をコードするＤＮＡの５’末端側にＨＵ蛋白質のＮ末端領域をコードするＤＮＡの断片を具有している発現ベクターが得られる限り、特に制限されず、例えば、目的蛋白質をコードするＤＮＡの５’末端側にＨＵ蛋白質のＮ末端領域をコードするＤＮＡの断片を具有させた後でそのＤＮＡを融合プラスミドに組み込んでもよいし、目的蛋白質をコードするＤＮＡを融合プラスミドに組み込んだ後に、ＨＵ蛋白質のＮ末端領域をコードするＤＮＡの断片を、目的蛋白質をコードするＤＮＡの５’末端側に組み込んでもよいし、ＨＵ蛋白質のＮ末端領域をコードするＤＮＡの断片を融合プラスミドに組み込んだ後に、目的蛋白質をコードするＤＮＡを、ＨＵ蛋白質のＮ末端領域をコードするＤＮＡの断片の３’末端側に組み込んでもよい。
また、本発明の効果が得られる限り、ＨＵ蛋白質のＮ末端領域をコードするＤＮＡの断片の３’末端側と、目的蛋白質をコードするＤＮＡの５’末端とは、本発明における発現ベクターにおいて直接結合していなくてもよいが、直接結合していることが好ましい。
この場合、目的蛋白質をコードするＤＮＡの５’末端側に具有させる、ＨＵ蛋白質のＮ末端領域をコードするＤＮＡの断片が長すぎると、発現する目的蛋白質の性格が変化してしまう可能性があるため、この観点からはＨＵ蛋白質のＮ末端領域をコードするＤＮＡの断片はできるだけ短いほうが好ましいが、短すぎると蛋白質の発現率が低くなるため、これらの両方の観点からバランスのよい適度な長さであることが好ましい。
具体的には、前記ＨＵ蛋白質のＮ末端の１番目から少なくとも４番目までのアミノ酸配列からなるペプチドをコードする塩基配列を含むＤＮＡ断片である限り特に制限されないが、前記ＨＵ蛋白質のＮ末端の１番目から４番目〜１８番目のいずれかまでのアミノ酸配列からなるペプチドをコードする塩基配列を含むＤＮＡ断片であることが好ましい。なお、ＨＵ蛋白質のＮ末端の１番目から１８番目までのアミノ酸配列は、配列番号２９に記載されている。配列番号２９のアミノ酸配列は、配列番号１５の１４８２番目から１５３５番目の塩基配列によりコードされるアミノ酸配列である。
ＨＵ蛋白質のＮ末端の１番目から４番目までのアミノ酸配列からなるペプチドをコードする塩基配列を含むＤＮＡ断片を有するプラスミドとしては、例えば、ｐＡＶ００１−ＨＵ４ａａ−ｅＣＤ（配列番号１４）を挙げることができ、ＨＵ蛋白質のＮ末端の１番目から９番目までのアミノ酸配列からなるペプチドをコードする塩基配列を含むＤＮＡ断片を有するプラスミドとしては、ｐＡＶ００１−ＨＵ−ｅＣＤ（ｐＡＶ００１−ＨＵ９ａａ−ｅＣＤ）を挙げることができ、ＨＵ蛋白質のＮ末端の１番目から１８番目までのアミノ酸配列からなるペプチドをコードする塩基配列を含むＤＮＡ断片を有するプラスミドとしては、ｐＡＶ００１−ＨＵ１８ａａ−ｅＣＤ（配列番号１５）を挙げることができる。
ＨＵ蛋白質のＮ末端領域の長さを変化させる方法としては特に制限されず、後述の実施例で行っているように、ＨＵ蛋白質のＮ末端領域の配列に基づいて適当なプライマーを設計し、それらのプライマーを用いたＰＣＲを行うこと等により、所望のアミノ酸数のＮ末端領域の配列を容易に入手することができる。
また、本発明の作製方法は、工程（１）において、ビフィドバクテリウム属細菌のプラスミドの断片及び大腸菌のプラスミドの断片を有する融合プラスミドを用いることに特徴を有する作製方法であるが、本発明に用いられるビフィドバクテリウム属細菌のプラスミドの断片としてはビフィドバクテリウム・ロンガム由来のプラスミドの断片が好ましく、例えば、ｐＴＢ６の複製開始点（ｏｒｉＶ）（配列番号１４の塩基番号３４１９〜３７７８）−ｒｅｐＢ部分（配列番号１４の塩基番号３９８３〜４６７６）を含み、ＭｅｍｂＢ、ＭｏｂＡ、ＯｒｉｆＩ及びｏｒｉＴ領域を含まないｐＴＢ６由来領域部分を挙げることができる。
また、本発明に用いられる大腸菌プラスミドの断片としては、大腸菌の複製開始点（ｏｒｉ）領域（配列番号１４の塩基番号６３５６〜６９９９）を含み、アンピシリン耐性遺伝子（ａｍｐＲ）を含まないか、又は、アンピシリン耐性遺伝子（ａｍｐＲ）の発現産物であるβ−ラクタマーゼ領域をコードするＤＮＡが欠失しているプラスミド断片を挙げることができる。
本発明の作製方法の工程（２）に用いる、ビフィドバクテリウム属細菌由来の、ＨＵ蛋白質をコードする遺伝子のプロモーター及びターミネーターは、公知の手法により入手できる。より具体的には、ビフィドバクテリウム属細菌の公知のＨＵ蛋白質の配列に基づいて、そのビフィドバクテリウム属細菌のＨＵ蛋白質をコードする遺伝子クローン化することにより、その遺伝子のプロモーター及びターミネーターを入手することができる。
例えば、ビフィドバクテリウム・ロンガム由来の、ＨＵ蛋白質をコードする遺伝子のプロモーター及びターミネーターを含む配列として、それぞれ、配列番号１４又は１５の塩基番号２３４〜１４８１で表されるＤＮＡ、配列番号１４の塩基番号２９７９〜３０９８（配列番号１５の塩基番号３０２１〜３１４０）で表されるＤＮＡを好ましく例示することができる。
本発明の遺伝子輸送担体である嫌気性微生物を作製する際に本発明における発現ベクターで形質転換する嫌気性微生物としては、本発明に用いうる限り特に制限されないが、嫌気性バクテリアであることが好ましく、腸内細菌であることがより好ましく、ビフィドバクテリウム属細菌であることがさらに好ましい。
ビフィドバクテリウム属細菌としては、例えばビフィドバクテリウム・アドレッセンティス、ビフィドバクテリウム・アニマリス、ビフィドバクテリウム・インファンティス、ビフィドバクテリウム・サーモフィラム、ビフィドバクテリウム・シュードロンガム、ビフィドバクテリウム・ビフィダム、ビフィドバクテリウム・ブレーベ、ビフィドバクテリウム・ロンガムが挙げられ、ビフィドバクテリウム・ロンガムが最も好ましい。
これらの菌は、いずれも市販されているか、又は寄託機関から容易に入手することができる。例えば、ビフィドバクテリウム・ロンガムＡＴＣＣ−１５７０７、ビフィドバクテリウム・ビフィダムＡＴＣＣ−１１８６３、ビフィドバクテリウム・インファンティスＡＴＣＣ−１５６９７等は、ＡＴＣＣ（The American Type Culture Collection ）から容易に入手することができる。
また、それぞれの菌の株についても特に限定されず、例えば、ビフィドバクテリウム・ロンガムの株については、ビフィドバクテリウム・ロンガム１０５−Ａ株、ビフィドバクテリウム・ロンガムａＥ−１９４ｂ株、ビフィドバクテリウム・ロンガムｂｓ−６０１株、ビフィドバクテリウム・ロンガムＭ１０１−２株を挙げることができ、中でもビフィドバクテリウム・ロンガム１０５−Ａ株が好ましい。
ビフィドバクテリウム・ブレーベの株については、例えば、ビフィドバクテリウム・ブレーベ標準株（ＪＣＭ１１９２）、ビフィドバクテリウム・ブレーベａＳ−１株、ビフィドバクテリウム・ブレーベＩ−５３−８Ｗ株を挙げることができ、中でも、ビフィドバクテリウム・ブレーベ標準株、ビフィドバクテリウム・ブレーベａＳ−１株、ビフィドバクテリウム・ブレーベＩ−５３−８Ｗ株が好ましい。
ビフィドバクテリウム・インファンティスの株については、例えば、ビフィドバクテリウム・インファンティス標準株（ＪＣＭ１２２２）、ビフィドバクテリウム・インファンティスＩ−１０−５株を挙げることができ、中でも、ビフィドバクテリウム・インファンティス標準株、ビフィドバクテリウム・インファンティスＩ−１０−５株が好ましい。また、ビフィドバクテリウム・ラクテンティスの株については、例えば、ビフィドバクテリウム・ラクテンティス標準株（ＪＣＭ１２２０）を挙げることができる。
本発明における抗腫瘍活性を有する蛋白質としては、例えばサイトカインが挙げられ、具体的なサイトカインとしては、例えば、インターフェロン（ＩＦＮ）−α、β、γ、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、インターロイキン（ＩＬ）−１α、１β、２、３、４、６、７、１０、１２、１３、１５、１８、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）−α、リンホトキシン（ＬＴ）−β、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、マクロファージ遊走阻止因子（ＭＩＦ）、白血病阻止因子（ＬＩＦ）、Ｔ細胞活性化共刺激因子Ｂ７（ＣＤ８０）及びＢ７−２（ＣＤ８６）、キット・リガンド、オンコスタチンＭ等が挙げられる。また、エンドスタチン、アンジオスタチン、クリングル−１、２、３、４、５等の血管新生抑制物質も挙げられる。
これらの蛋白質の配列は様々な生物において知られており、その配列情報に基づいてＰＣＲ法等の公知の手法を利用することにより、本発明に用いる抗腫瘍活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡを入手することができる。
また、本発明における抗腫瘍物質前駆体を抗腫瘍物質に変換する活性を有する蛋白質としては、５−ＦＣを抗腫瘍活性物質の５−ＦＵに変換する酵素であるＣＤを挙げることができる。
本発明の遺伝子輸送担体の工程（３）において組み込まれるＤＮＡとしては、（ａ）抗腫瘍活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ、及び（ｂ）抗腫瘍物質前駆体を抗腫瘍物質に変換する活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡのいずれのＤＮＡであってもよいが、（ｂ）抗腫瘍物質前駆体を抗腫瘍物質に変換する活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡが好ましく、中でも特に、抗腫瘍物質前駆体の５−ＦＣを抗腫瘍物質の５−ＦＵに変換する酵素のＣＤをコードするＤＮＡが好ましい。
このようなＣＤをコードするＤＮＡは、例えば、大腸菌由来のＣＤをコードするＤＮＡを含有するプラスミドｐＡｄｅｘ １ ＣＳＣＤ（理化学研究所 ジーンバンク ＲＤＢ Ｎｏ．１５９１）、又は同じく大腸菌由来のＣＤをコードするＤＮＡを含有するプラスミドｐＭＫ１１６から単離されるものを用いることができる（D．A．Mead et al.，Protein Engineering 1：67−74（1986））。
大腸菌由来のＣＤをコードするＤＮＡとしては、例えば配列番号１４の１４９４番目から２７７４番目の塩基配列（配列番号１５の１５３６〜２８１６番目の塩基配列）に相当し、また、そのアミノ酸配列としては配列番号２８のアミノ酸配列から開始メチオニンを除いたアミノ酸配列に相当する。
本発明におけるＣＤの由来は特に制限されず、配列番号２８のアミノ酸配列に対して例えば９０％以上、より好ましくは９５％以上の相同性を有し、かつＣＤ活性を有するアミノ酸配列をコードするＤＮＡを用いることもできる。
本発明における遺伝子輸送担体の作製方法は、（ａ）抗腫瘍活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ、又は、（ｂ）抗腫瘍物質前駆体を抗腫瘍物質に変換する活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡを変異化する工程（５）を有していなくてもよいが、より優れた抗腫瘍活性又は抗腫瘍物質前駆体を抗腫瘍物質に変換する活性を得る観点から、工程（４）より前に前記工程（５）をさらに有していることが好ましい。
すなわち、例えば、目的遺伝子をコードするＤＮＡを変異化した後で、工程（３）において該変異化ＤＮＡを発現ベクターに組み込んでもよいし、工程（３）で発現ベクターを作製した後で、該目的遺伝子をコードするＤＮＡ部分を変異化してもよい。工程（３）で発現ベクターを作製した後で、該目的遺伝子をコードするＤＮＡ部分を変異化する工程をより具体的に言えば、工程（３）で作製した発現ベクターに組み込まれた、（ａ）抗腫瘍活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ、又は、（ｂ）抗腫瘍物質前駆体を抗腫瘍物質に変換する活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡを変異化する工程（５’）となる。
変異化の手段としては特に制限されず、ＰＣＲを利用した部位特異的変異法等の公知の手法を用いることができる。
変異化すると好ましい部位は、目的蛋白質により異なるため一概には言えないが、目的蛋白質が大腸菌のＣＤである場合は、配列番号１４における２４３３〜２４３５番目の塩基配列（配列番号１５における２４７５〜２４７７番目の塩基配列）にコードされるアスパラギン酸を他のアミノ酸に置換することが好ましく、配列番号１４における２４３３〜２４３５番目の塩基配列（配列番号１５における２４７５〜２４７７番目の塩基配列）にコードされるアスパラギン酸をアラニンに置換することがより好ましい。なお、配列番号１４における２４３３〜２４３５番目の塩基配列（配列番号１５における２４７５〜２４７７番目の塩基配列）にコードされるアスパラギン酸は、配列番号２８のアミノ酸配列の３１５番目のアスパラギン酸に相当する。
前記の置換により、置換しない場合に比べて格段に優れたＣＤ活性が発揮される。
本発明における発現ベクターとしては、例えば、ＣＤをコードするＤＮＡを組み込んだ、ビフィドバクテリウム属細菌用のＣＤ発現ベクターを挙げることができ、具体的には、例えば、ビフィドバクテリウム・ロンガムｈｕｐプロモーターの下流に挿入した大腸菌ｃｏｄＡを保有する組換えプラスミドｐＢＬＥＳ１００−Ｓ−ｅＣＤ（特許文献４及び非特許文献３参照）や、このｐＢＬＥＳ１００−Ｓ−ｅＣＤを改良した、ビフィドバクテリウム・ロンガムやビフィドバクテリウム・ブレーベを形質転換しうるｐＡＶ００１−ＨＵ−ｅＣＤ（ｐＡＶ００１−ＨＵ９ａａ−ｅＣＤ）、又はこれらのプラスミドの変異体を挙げることができる。
ここで、プラスミドの変異体とは、プラスミドに組み込まれたＤＮＡ、例えば、ＣＤをコードするＤＮＡを変異化したベクターであって、変異化していない元のベクターと同様又はより好適に用いることができるプラスミドを意味する。例えば、ｐＢＬＥＳ１００−Ｓ−ｅＣＤの変異体とは、ｐＢＬＥＳ１００−Ｓ−ｅＣＤに由来するプラスミドＤＮＡの変異体であって、本発明においてｐＢＬＥＳ１００−Ｓ−ｅＣＤと同様又はより好適に用いることのできるプラスミドを意味する。また、ｐＡＶ００１−ＨＵ−ｅＣＤの変異体とは、ｐＡＶ００１−ＨＵ−ｅＣＤに由来するプラスミドＤＮＡの変異体であって、本発明においてｐＡＶ００１−ＨＵ−ｅＣＤと同様又はより好適に用いることのできるプラスミドを意味する。
このような、プラスミドの変異体として、プラスミドｐＡＶ００１−ＨＵ−ｅＣＤのＣＤコード領域に一塩基の変異が導入されたプラスミドである、プラスミドｐＡＶ００１−ＨＵ−ｅＣＤ−Ｍ９６８（配列番号２７）を好適に例示することができる。プラスミドｐＡＶ００１−ＨＵ−ｅＣＤ−Ｍ９６８は、配列番号１４における２４３３〜２４３５番目の塩基配列にコードされるアスパラギン酸がアラニンに置換されており、その結果、ＣＤ活性が顕著に向上している。
本発明の遺伝子輸送担体は、ビフィドバクテリウム属細菌のプラスミドの断片、大腸菌のプラスミドの断片、及びビフィドバクテリウム属細菌由来の、ヒストン様ＤＮＡ結合蛋白質をコードする遺伝子のプロモーター及びターミネーターを含むＤＮＡ断片を有し、前記プロモーターとターミネーターの間に、（ａ）抗腫瘍活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ、又は、（ｂ）抗腫瘍物質前駆体を抗腫瘍物質に変換する活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡを有し、且つ、（ａ）抗腫瘍活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ、又は、（ｂ）抗腫瘍物質前駆体を抗腫瘍物質に変換する活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡの５’末端側に、前記ヒストン様ＤＮＡ結合蛋白質のＮ末端の１番目から少なくとも４番目までのアミノ酸配列からなるペプチドをコードする塩基配列を含むＤＮＡの断片をさらに具有する発現ベクターで形質転換された嫌気性微生物からなる遺伝子輸送担体である限り特に制限されない。
本発明の遺伝子輸送担体は、例えば本発明の遺伝子輸送担体の製造方法により作製することができる。
なお、本発明の遺伝子輸送担体は、目的蛋白質をコードするＤＮＡが変異化されていない場合、該蛋白質をコードするＤＮＡがその５’末端側に具有している、ＨＵ蛋白質のＮ末端のアミノ酸配列からなるペプチドをコードするＤＮＡは、ＨＵ蛋白質のＮ末端の１番目から９番目までのアミノ酸配列からなるペプチドをコードするＤＮＡを除いてもよい。
また、本発明の遺伝子輸送担体における（ａ）抗腫瘍活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ、又は、（ｂ）抗腫瘍物質前駆体を抗腫瘍物質に変換する活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡは、変異化されていないＤＮＡであってもよいが、変異化されたＤＮＡであって、該変異化ＤＮＡによりコードされる蛋白質の抗腫瘍活性又は抗腫瘍前駆体を抗腫瘍物質に変換する活性が、変異化前のＤＮＡによりコードされる蛋白質の該活性に比べて向上しているような変異化ＤＮＡであることが好ましい。
変異化された目的蛋白質をコードするＤＮＡを有する発現ベクターを用いて得られた本発明の遺伝子輸送担体として、ビフィドバクテリウム・ロンガム１０５−Ａ／ｐＡＶ００１−ＨＵ−ｅＣＤのプラスミド一塩基変異体を挙げることができ、中でも特に、ビフィドバクテリウム・ロンガム１０５−Ａ／ｐＡＶ００１−ＨＵ−ｅＣＤ−Ｍ９６８を好適に例示することができる。
本発明の遺伝子輸送担体の作製方法は、目的蛋白質をコードするＤＮＡが組み込まれた発現ベクターを用いて嫌気性微生物を形質転換する工程を有する。
形質転換微生物の作製は、市販の実験書、例えば、遺伝子マニュアル（講談社）、高木康敬編遺伝子操作実験法（講談社）、モレキュラー・クローニング（Molecular Cloning）コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー（Cold Spring Harbor Laboratory）（1982）、モレキュラー・クローニング第２版（Molecular C1oning，2nd ed．）コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー（Cold Spring Harbor Laboratory）（1989）、メソッズ・イン・エンザイモロジー（Methodsin Enzymol．），194（1991）、等に記載された方法に従って行うことができる。
なお、本発明の遺伝子輸送担体における（ｂ）抗腫瘍物質前駆体を抗腫瘍物質に変換する活性を有する蛋白質がＣＤの場合、当該ＣＤ発現遺伝子組み換え微生物を酵素−プロドラッグ療法へ応用するには、ＣＤによって５−ＦＣから変換される５−ＦＵに対し、少なくとも抗腫瘍活性有効濃度の５−ＦＵに対する耐性を有していることが求められる。ところが、ＣＤを発現する遺伝子組み換え微生物を用いて、特許文献５の実施例１記載の馴致培養方法により５−ＦＵ耐性菌を作製した場合、プラスミド保持率が低下する傾向があった。しかしながら、本発明の遺伝子輸送担体の作製方法において、特許文献５の実施例２記載の馴致培養方法により、まず宿主となる嫌気性微生物として、少なくとも抗腫瘍活性有効濃度の５−ＦＵ耐性能を有する５−ＦＵ耐性菌を作製し、これを宿主として用いることにより、プラスミド保持率の高い、遺伝子組み換え微生物が作製できる。
本発明の医薬組成物は、本発明の遺伝子輸送担体を含有している限り特に制限はされない。また、本発明の固形腫瘍治療剤は、本発明の遺伝子輸送担体を含有している限り特に制限はされない。
本発明の医薬組成物や固形腫瘍治療剤は、本発明の遺伝子輸送担体の１種又は２種以上を含有していてもよい。
また、本発明の医薬組成物や固形腫瘍治療剤の遺伝子輸送担体の投与量は、腫瘍部位において生育でき、且つ、有効治療量の抗腫瘍活性を有する蛋白質を発現するのに十分な量、又は、抗腫瘍物質前駆体を有効治療量の抗腫瘍物質に変換できる量の蛋白質を発現するのに十分な量である限り特に制限はされないが、経済上の観点及び副作用を可能な限り回避する観点から、必要な抗腫瘍活性が得られる範囲においてできる限り少ない方が好ましい。また、本発明の医薬組成物や固形腫瘍治療剤の遺伝子輸送担体の投与量は、疾患の程度、患者の体重、年齢、性別に応じて適宜選択し、改善の度合いに応じて適宜増減することもできる。
さらに、本発明の医薬組成物や固形腫瘍治療剤は、本発明の効果を妨げない限り、本発明の遺伝子輸送担体のほかに任意の成分を含有していてもよい。そのような任意成分として、例えば、薬理学的に許容される担体、賦形剤、希釈剤等が挙げられる。
本発明の遺伝子輸送担体や固形腫瘍治療剤が、抗腫瘍物質前駆体を抗腫瘍物質に変換する活性を有する蛋白質を発現することができる遺伝子を組み込んだ嫌気性菌の場合、当該遺伝子輸送担体を活性成分として含有する本発明の医薬組成物や固形腫瘍治療剤は、当該遺伝子輸送担体によって発現される蛋白質によって有効量の抗腫瘍物質に変換できる量の抗腫瘍物質前駆体と組み合わせて使用することができる。この抗腫瘍物質前駆体は本発明の遺伝子輸送担体を活性成分として含有する医薬組成物や固形腫瘍治療剤に含有させてもよいが、当該抗腫瘍物質前駆体を含有する医薬組成物として、本発明の遺伝子輸送担体を活性成分として含有する医薬組成物や固形腫瘍治療剤と組み合わせて用いることが好ましい。
抗腫瘍物質前駆体の投与量は、組み合わせて使用する遺伝子輸送担体の腫瘍組織における生育率及び抗腫瘍物質前駆体から抗腫瘍物質への変換効率に応じて適宜選択することができる。また、遺伝子輸送担体の投与量と同様に、疾患の程度、患者の体重、年齢、性別に応じて適宜選択し、改善の度合いに応じて適宜増減することもできる。
このように、抗腫瘍物質前駆体と組み合わせて本発明の医薬組成物や固形腫瘍治療剤を用いる場合、本発明の医薬組成物や固形腫瘍治療剤の投与方法と、抗腫瘍物質前駆体を含有する医薬組成物の投与方法は同じであっても異なっていてもよく、また、投与も同時であってもよく隔時であってもよいが、抗腫瘍物質前駆体を含有する医薬組成物の投与は、本発明の医薬組成物や固形腫瘍治療剤の投与後、本発明の遺伝子輸送担体が腫瘍細胞で十分生育できる時間をおいた後に投与する方が好ましい。
なお、本発明における「ＸとＹと組み合わせてなる」には、ＸとＹを別の形態としたもの、ＸとＹを同一の形態（例えばＸとＹを含有する形態）としたもののいずれの場合も含む。また、ＸとＹを別の形態としたものの場合、Ｘ、Ｙのいずれも他の成分をさらに含有している場合も含まれる。
本発明の医薬組成物や固形腫瘍治療剤の剤型は特に制限されないが、例えば、本発明の遺伝子輸送担体を含有する液剤あるいは固形製剤を挙げることができる。液剤は、本発明の遺伝子輸送担体の嫌気性菌の培養液を精製し、これに必要に応じて適当な生理食塩液若しくは補液又は医薬添加物を加えてアンプル又はバイアル瓶などに充填することにより製造することができる。また、固形製剤は、液剤に適当な保護剤を添加してアンプル又はバイアル瓶などに充填した後凍結乾燥又はＬ乾燥するか、液剤に適当な保護剤を添加して凍結乾燥又はＬ乾燥した後これをアンプル又はバイアル瓶などに充填することにより製造することができる。本発明の医薬組成物や固形腫瘍治療剤の投与方法としては、非経口投与が好ましく、例えば皮下注射、静脈注射、局所注入、脳室内投与等を行うことができるが、静脈注射が最も好ましい。
本発明の医薬組成物や固形腫瘍治療剤は、嫌気的環境を有する腫瘍、好ましくは各種固形癌に適用できる。固形癌としては、例えば大腸癌、脳腫瘍、頭頚部癌、乳癌、肺癌、食道癌、胃癌、肝癌、胆嚢癌、胆管癌、膵癌、膵島細胞癌、絨毛癌、結腸癌、腎細胞癌、副腎皮質癌、膀胱癌、精巣癌、前立腺癌、睾丸腫瘍、卵巣癌、子宮癌、絨毛癌、甲状腺癌、悪性カルチノイド腫瘍、皮膚癌、悪性黒色腫、骨肉腫、軟部組織肉腫、神経芽細胞腫、ウィルムス腫瘍、網膜芽細胞腫、メラノーマ、扁平上皮癌などが挙げられる。
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。
[参考例１] ビフィドバクテリウム・ロンガム１０５−Ａ／ｐＡＶ００１−ＨＵ−ｅＣＤの作製
（１）シャトルプラスミドｐＡＶ００１の構築
（プラスミドの構築）
ビフィドバクテリウム・ロンガムと大腸菌のシャトルプラスミドｐＢＬＥＳ１００（特許文献４及び非特許文献７参照）よりエンテロコッカス・フェカリス由来のスペクチノマイシンアデニルトランスフェラーゼ（ＡＡＤカセット）を含む配列をＰＣＲにより増幅し、ＰＣＲ−ＢｌｕｎｔII−ＴＯＰＯベクター（Invitrogen株式会社製）にサブクローニングし、ＰＣＲＴＯＰＯ−ＳｃａＩ−ＡＡＤ−Ｅａｍ１１０５Ｉを作製した。なお、フォワードプライマーにＳｃａＩ、リバースプライマーにＥａｍ１１０５Ｉ制限酵素サイトをそれぞれ付加した。
図１に示すように、Invitrogen社より購入したクローニングベクターｐＧＦＰｕｖ（DEFINITION：Cloning vector pGFPuv. ACCESSION：U62636 VERSION：U62636.1 GI：1490528） はＧＦＰｕｖ遺伝子とその両端のマルチクローニングサイト（Multi-Cloning Site、MCS）、アンピシリン耐性遺伝子、大腸菌プラスミド複製起点より構成されている。
このｐＧＦＰｕｖのアンピシリン耐性遺伝子部位を制限酵素Ｅａｍ１１０５ＩとＳｃａＩを用いて切断し、取り除いた長断片を作製した。同様に制限酵素Ｅａｍ１１０５ＩとＳｃａＩを用いて、ＰＣＲＴＯＰＯ−ＳｃａＩ−ＡＡＤ−Ｅａｍ１１０５Ｉを切断したＡＡＤカセット含む断片（約１１００ｂｐ）を作製した。上記２つの断片をＴ４ＤＮＡ リガーゼを用いて結合したｐＧＦＰｕｖ−ＳｐＲを作製した。なお、作製したプラスミドｐＧＦＰｕｖ−ＳｐＲのスペクチノマイシン耐性形質付与を、また同時にアンピシリン耐性形質の欠失をそれぞれ大腸菌にて確認した。
ｐＧＦＰｕｖ−ＳｐＲを制限酵素ＳａｌＩ（ＧＦＰｕｖ遺伝子上流のマルチクローニングサイト内に存在）とＳｐｅＩ（ＧＦＰｕｖ遺伝子下流のマルチクローニングサイト内に存在）で消化し、ＧＦＰｕｖ遺伝子を削除したプラスミドｐＡＶＮを作製した。
次に、ビフィドバクテリウム・ロンガム由来プラスミドｐＴＢ６の全塩基配列情報より、ＲｅｐＢ，ＳＤＯ，ＤＤＯ，ＡＴ−rich repeats，ＤｎａＡ-binding motifsを含む約１９００ｂｐの配列をビフィドバクテリウム・ロンガムのプラスミド複製ユニットとして同定した。ｐＴＢ６よりビフィドバクテリウム・ロンガムのプラスミド複製ユニットを含む約１９００ｂｐをＰＣＲにより増幅し、ＰＣＲ−ＢｌｕｎｔII−ＴＯＰＯベクターへサブクローニングしたＰＣＲＴＯＰＯ−ＡｐａＩ−１９００−ＳｃａＩを作製した。なお、フォアードプライマーにＡｐａＩ、リバースプライマーにＳｃａＩ制限酵素サイトをそれぞれ付加した。
ｐＡＶＮを制限酵素ＡｐａＩとＳｃａＩで消化した長断片（約２４００ｂｐ）と同様にＰＣＲＴＯＰＯ−ＡｐａＩ−１９００−ＳｃａＩを制限酵素ＡｐａＩとＳｃａＩで消化した短断片（約１９００ｂｐ）を、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いて結合した、ビフィドバクテリウム・ロンガム−大腸菌シャトルプラスミドｐＡＶ００１（約４３００ｂｐ）を作製した。
（２）ＣＤ遺伝子発現ベクターｐＡＶ００１−ＨＵ−ｅＣＤ
（発現ベクターの構築）
次に、ｐＢＬＥＳ１００−Ｓ−ｅＣＤを制限酵素Ｈｉｎｄ IIIとＳｐｅＩで切断し、ＨＵ遺伝子プロモーター、大腸菌由来のＣＤ遺伝子とＨＵ遺伝子ターミネーター含む約２９００ｂｐを抜き出した。同様にシャトルプラスミドｐＡＶ００１をマルチクローニングサイト内にある制限酵素切断部位でＨｉｎｄ IIIとＳｐｅＩで切断した長断片に、上記の約２９００ｂｐ断片を、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いて結合したｐＡＶ００１−ＨＵ−ｅＣＤ（約７１００ｂｐ）を作製した。
（３）ＣＤ遺伝子発現ベクターｐＡＶ００１−ＨＵ−ｅＣＤのビフィドバクテリウム属への導入
野生型ビフィドバクテリウム・ロンガムをＭＲＳ培地３７℃嫌気条件下で培養した培養液から遠心分離により菌体を分離し、適当な緩衝液に懸濁した菌懸濁液を調製した。次に、非特許文献２や３に記されているエレクトロポレーション法を用いて、ＣＤ遺伝子発現ベクターｐＡＶ００１−ＨＵ−ｅＣＤを上記の菌懸濁液に導入した。導入された組換えビフィドバクテリウム・ロンガム（ビフィドバクテリウム・ロンガム／ｐＡＶ００１−ＨＵ−ｅＣＤ）は抗生剤スペクチノマイシン含有寒天培地上でのコロニー形成を元に選別した。
（４）ビフィドバクテリウム・ロンガム／ｐＡＶ００１−ＨＵ−ｅＣＤにおけるシトシン・デアミナーゼ酵素活性；５−ＦＣ→５−ＦＵの変換活性の測定
ビフィドバクテリウム・ロンガム／ｐＡＶ００１−ＨＵ−ｅＣＤを抗生剤スペクチノマイシン含有ＭＲＳ培地３７℃嫌気条件下で２日以上継代培養した培養液から遠心分離により菌体（２×１０９ＣＦＵ）を分離し、４．５ｍＬのＭＲＳ培地に再度懸濁した。次に最終濃度２ｍｇ／ｍＬとなるよう０．５ｍＬの５−ＦＣ（２０ｍｇ／ｍＬ）を添加し３７℃嫌気条件下で培養した。０、４、８、１８、２４時間ごとの培養液から、遠心分離により菌体を取り除いた上清をそれぞれ回収し、ガスクロマトグラフィー分析（５−ＦＵ ＧＣ−ＭＳ methods, ＢＭＬ）により変換された５−ＦＵ濃度を測定した。測定結果を図２に示す。分析の結果、ビフィドバクテリウム・ロンガム／ｐＡＶ００１−ＨＵ−ｅＣＤにおいては４時間後において７２．５μg ／ ｍＬ、２４時間後においては１６５．４μg ／ ｍＬの５−ＦＵが検出された。
［ＨＵ−ｅＣＤプラスミドの作製］
ｅＣＤのＮ末端領域に融合させるＨＵ蛋白質のＮ末端領域の長さを、２アミノ酸、３アミノ酸、４アミノ酸に変更したプラスミドの構築を行った（図３）。
同様の方法にてＨＵ蛋白質のＮ末端を除去したプラスミドの構築も行った。その際に、大腸菌ＪＭ１０１株由来ＣＤの翻訳開始コドンであるＡＴＧ、大腸菌Ｋ１２株由来ＣＤの翻訳開始コドンであるＧＴＧの２種作製した。また、ｅＣＤのＮ末端領域に融合させるＨＵ蛋白質のＮ末端領域の長さを１８アミノ酸に変更したプラスミドも構築した。表１にプラスミドの構築部分の配列を示す。
Figure 2007136107
（１）ＨＵ蛋白質Ｎ末端２アミノ酸付加プラスミド構築
ｐＡＶ００１−ＨＵ−ｅＣＤ ５０ｐｇを鋳型として、PrimeSTARTM HS DNA Polymerase(タカラバイオ株式会社製) にてＰＣＲ増幅を行い、ＰＣＲ断片Ａ（約１．３ｋｂｐ）及びＰＣＲ断片Ｂ（約１．３ｋｂｐ）を得た。ＰＣＲ断片Ａの増幅には、配列番号１で示す外側プライマー及び、ＰＣＲ断片Ｂ末端との重複配列を５’末端に有しｐＡＶ００１−ＨＵ−ｅＣＤと相補的な配列を含む配列番号２で示す内側プライマーを用いた。
ＰＣＲ断片Ａは、鋳型に由来するＨｉｎｄ III部位をＤＮＡ末端に含む。ＰＣＲ断片Ｂの増幅には、ＫｓｐＡ I認識部位を５’末端側に有しｐＡＶ００１−ＨＵ−ｅＣＤと相補的配列を含む配列番号３で示す外側プライマー及び、ＰＣＲ断片Ａ末端との重複配列を５’末端側に有しｐＡＶ００１−ＨＵ−ｅＣＤと相補的な配列を含む配列番号４で示す内側プライマーを用いた。
ＨＵタンパク由来のアミノ酸配列の変更は、内側プライマーにより行った。温度条件は、９８℃で１０秒、５５℃で５秒、７２℃で１分２０秒を１サイクルとして、３０サイクル行った後、７２℃で３０秒間保温した。ＰＣＲ断片Ａ及びＢをQIAquick ＰＣＲ Purification Kit（株式会社キアゲン製）にて精製後、精製ＰＣＲ断片Ａ及びＢを等モルずつ混和した。
精製ＰＣＲ断片ＡとＢの混和物１ｎｇを鋳型として、1xPrimeSTARTMbuffer、２００μＭ ｄＮＴＰｓ mix、２．５ｕPrimeSTARTM HS DNAポリメラーゼ混合液中で、プライマーを入れないで、９８℃で１０秒、７２℃で１分３０秒を１サイクルとして、５サイクル反応を行いＰＣＲ断片Ａ及びＢを連結した。その後、外側プライマー（配列番号１及び３）を最終濃度が各０．５μＭになるように添加し、９８℃で１０秒、５５℃で５秒、７２℃で２分４０秒を１サイクルとして、２５サイクル反応を行った後、７２℃で３０秒保温して連結ＰＣＲ産物（約２．６ｋｂｐ）を得た。
連結ＰＣＲ産物を１％ SeaPlaque(R) GTG(R) Agaroseゲル（1xTAE buffer、０．５ μｇ／ｍｌエチジウムブロマイド）にて分離し、２．６ｋｂｐのＤＮＡ断片を切り出した。QIAquick(R) Gel Extraction Kitにてゲルから連結ＰＣＲ産物を抽出し、Ｈｉｎｄ III (Fermentas UAB 社製)及びＫｓｐＡ I（Fermentas UAB 社製）にて消化を行った。１％ SeaPlaque(R) GTG(R) Agaroseゲル（1xTAE buffer、０．５μｇ／ｍｌエチジウムブロマイド）にて分離し、２．６ｋｂｐのＤＮＡバンドを切り出した。QIAquick(R) Gel Extraction Kitにてゲルから連結ＰＣＲ産物を抽出した。
ｐＡＶ００１−ＨＵ−ｅＣＤベクターをＨｉｎｄ III (Fermentas UAB 社製)及びＫｓｐＡ I（Fermentas UAB 社製）にて消化後、１％SeaPlaque(R) GTG(R) Agaroseゲル（1xTAE buffer、０．５μｇ／ｍｌエチジウムブロマイド）にて分離し、４．６ｋｂｐのＤＮＡ断片を切り出した。次いで、QIAquick(R) Gel Extraction KitにてゲルからベクターＤＮＡを抽出した。
先の連結ＰＣＲ産物を、ベクターと連結ＰＣＲ産物がモル比で１：３になるよう混和し、Rapid DNA Ligation Kit（Fermentas UAB 社製）にてライゲーションを行った。ライゲーション産物を用いて、大腸菌ＪＭ１０９の形質転換を行い、３０μｇ／ｍｌのスペクチノマイシンを含むＬＢ寒天培地に塗布、３７℃にて一晩培養し、形質転換体を得た。形質転換体を、３０μｇ／ｍｌのスペクチノマイシンを含む２×ＬＢ液体培地にて３７℃で一晩培養し、QIAprep(R) Spin Miniprep KitにてプラスミドＤＮＡ（ｐＡＶ００１−ＨＵ２ａａ−ｅＣＤ）を抽出した。
（２）ＨＵ蛋白質Ｎ末端３アミノ酸付加プラスミド構築
ＰＣＲ断片Ａ及びＰＣＲ断片Ｂ増幅用内側プライマーとして、それぞれ配列番号５及び４に示すプライマーを用いたこと以外は、ＨＵ蛋白質Ｎ末端２アミノ酸付加プラスミド構築と同様の方法にて、ＨＵ蛋白質Ｎ末端３アミノ酸付加プラスミド（ｐＡＶ００１−ＨＵ３ａａ−ｅＣＤ）を構築した。
（３）ＨＵ蛋白質Ｎ末端４アミノ酸付加プラスミド構築
ＰＣＲ断片Ａ及びＰＣＲ断片Ｂ増幅用内側プライマーとして、それぞれ配列番号６及び７に示すプライマーを用いたこと以外は、ＨＵ蛋白質Ｎ末端２アミノ酸付加プラスミド構築と同様の方法にて、ＨＵ蛋白質Ｎ末端４アミノ酸付加プラスミド（ｐＡＶ００１−ＨＵ４ａａ−ｅＣＤ）を構築した。ｐＡＶ００１−ＨＵ４ａａ−ｅＣＤの配列を配列番号１４に示す。
（４）ＨＵ蛋白質のＮ末端を含まず、翻訳開始コドンをＡＴＧとするプラスミド構築
ＰＣＲ断片Ａ及びＰＣＲ断片Ｂ増幅用内側プライマーとして、それぞれ配列番号８及び９に示すプライマーを用いたこと以外は、ＨＵ蛋白質Ｎ末端２アミノ酸付加プラスミド構築と同様の方法にて、ＨＵ蛋白質のＮ末端を含まず、翻訳開始コドンをＡＴＧとするプラスミド（ｐＡＶ００１−ＨＵ０ａａＡＴＧ−ｅＣＤ）を構築した。
（５）ＨＵ蛋白質のＮ末端を含まず、翻訳開始コドンをＧＴＧとするプラスミド構築
ＰＣＲ断片Ａ及びＰＣＲ断片Ｂ増幅用内側プライマーとして、それぞれ配列番号１０及び１１に示すプライマーを用いたこと以外は、ＨＵ蛋白質Ｎ末端２アミノ酸付加プラスミド構築と同様の方法にて、ＨＵ蛋白質のＮ末端を含まず、翻訳開始コドンをＧＴＧとするプラスミド（ｐＡＶ００１−ＨＵ０ａａＧＴＧ−ｅＣＤ）を構築した。
（６）ＨＵ蛋白質Ｎ末端１８アミノ酸のプラスミド構築
相補的な配列を有し、５’末端のリン酸化された２種の合成オリゴＤＮＡ（配列番号１２、１３）を等モルずつ混和し、０．１Ｍ ＮａＣｌ存在下で、６５℃で５分、４５℃で５分、３７℃で１０分、２５℃で１０分段階的に温度を低下させる事によりアニーリングさせアダプターを作製した。アダプターの末端は、Ｂｓｐ １１９ I 部位となっている。
ｐＡＶ００１−ＨＵ−ｅＣＤベクターをＢｓｐ １１９ I (Fermentas UAB 社製)にて消化、ＣＩＡＰ（Fermentas UAB 社製）にてＤＮＡ末端の脱リン酸化処理後、Rapid DNA Ligation Kit（Fermentas UAB 社製）にてアダプターとのライゲーションを行った。ライゲーション産物を用いて、大腸菌ＪＭ１０９株の形質転換を行い、３０μｇ／ｍｌのスペクチノマイシンを含むＬＢ寒天培地に塗布、３７℃にて一晩培養し、形質転換体を得た。形質転換体を、３０μｇ／ｍｌのスペクチノマイシンを含む２×ＬＢ液体培地にて３７℃で一晩培養し、QIAprep(R) Spin Miniprep KitにてプラスミドＤＮＡ（ｐＡＶ００１−ＨＵ１８ａａ−ｅＣＤ）を抽出した。ｐＡＶ００１−ＨＵ１８ａａ−ｅＣＤの配列を配列番号１５に示す。
（ビフィドバクテリウム・ロンガム １０５Ａの形質転換）
ビフィドバクテリウム・ロンガム １０５Ａコンピテントセル８０μｌとプラスミドＤＮＡ ５μｌ(５００−１０００ｎｇ)を混和し、ジーンパルサーIIエレクトロポレーションシステム（日本バイオ・ラッドラボラトリーズ株式会社製）にて形質転換を行った。１５％ Ｄ-ラフィノース、３０μｇ／ｍｌスペクチノマイシンを含むＩＷＡＴＡ寒天培地に塗布後、嫌気的条件下３７℃にて２晩培養し、形質転換体を得た。
（ビフィドバクテリウム・ロンガム １０５Ａ形質転換体からのタンパク質抽出）
形質転換体を、ＭＲＳ液体培地（３０μｇ／ｍｌスペクチノマイシン、システイン・ビタミンＣ混合液を含む）５ｍｌに植菌し、嫌気的条件下、３７℃にて一晩培養した。培養液の１％を同培地に植継ぎ、嫌気的条件下、３７℃での一晩培養を２回繰り返した。この培養液１％を同培地に加え、約１８時間培養したものを用いてタンパク抽出を行った。培養液１〜４ｍｌに、トリス緩衝液（０．５Ｍ Tris-HCl, ０．５％ TritonX100, ｐＨ８．４）を４ｍｌ加え混和後、１３，０００×ｇ、室温にて１５分間遠心分離を行い、上清を除去した。菌体に同トリス緩衝液５ｍｌを加え懸濁した後１３，０００×ｇ、室温にて１５分間遠心分離し、上清を除去する操作を２回繰り返し菌体の洗浄を行った。洗浄菌体を、プロテアーゼ阻害剤（シグマ・アルドリッチ）５０μｌを含む加えたトリス緩衝液１ｍｌにて懸濁し、超音波破砕を氷冷下で５分間行った。１３，０００×ｇ、４℃にて２０分間遠心分離し、上清を総タンパク抽出液としてＣＤ活性の測定に供した。
（ＣＤ活性の測定）
総タンパク量をLowry法変法にて測定し、総タンパク量５０μｇに相当する総タンパク抽出液に緩衝液を加え２５０μｌとし、４０ｍＭ ５−ＦＣ２５０μｌと混和後６０℃にて２０分間反応した。０．５Ｍ トリクロロ酢酸２５０μｌを添加し反応を停止させ、氷中に放置した。２０，０００×ｇ、４℃で２０分間遠心分離を行い、上清４５０μｌに０．３Ｍ ＮａＯＨを１５０μｌ加えて溶液を中和した。
中和したサンプルをＨＰＬＣの移動層にて１０倍希釈し、ＨＰＬＣにて５−ＦＵ及び５−ＦＣの量を測定した。５−ＦＣの消費％をＣＤ活性とした。活性測定結果を表２に示す。
Figure 2007136107
ＨＵ蛋白質Ｎ末端由来のアミノ酸のｅＣＤへの付加が、ＣＤの活性を高める事が明らかとなった。付加するアミノ酸数は、２個以下では効果がなく、３個で効果が幾分あがり、４個以上で飛躍的に増大し、４個〜１８個の間では活性に差は無かった。
［ビフィドバクテリウム・ロンガム１０５−Ａ／ｐＡＶ００１−ＨＵ−ｅＣＤプラスミド変異体の作製］
プラスミドｐＡＶ００１−ＨＵ−ｅＣＤ上の５箇所に変異導入を行った。
変異導入のタイプは、３塩基のデリーションと１塩基置換の２種で、デリーションタイプの変異プラスミドをｐＡＶ００１−ＨＵ−ｅＣＤ−Ｄ３７とｐＡＶ００１−ＨＵ−ｅＣＤ−Ｄ５５、塩基置換タイプの変異プラスミドをｐＡＶ００１−ＨＵ−ｅＣＤ−Ｍ４５０、ｐＡＶ００１−ＨＵ−ｅＣＤ−Ｍ９６８、ｐＡＶ００１−ＨＵ−ｅＣＤ−Ｍ１２７７とした。変異プラスミドの作製方法を以下に示す。
（１）変異プラスミド（ｐＡＶ００１−ＨＵ−ｅＣＤ−Ｄ３７）の構築
ｐＡＶ００１−ＨＵ−ｅＣＤ ５０ｐｇを鋳型として、PrimeSTARTM HS DNA Polymerase(タカラバイオ株式会社製) にてＰＣＲ増幅を行い、ＰＣＲ断片Ａ（約１．３ｋｂｐ）及びＰＣＲ断片Ｂ（約１．３ｋｂｐ）を得た。ＰＣＲ断片Ａの増幅には、配列番号１に示す外側プライマー及び、ＰＣＲ断片Ｂ末端との重複配列を５’末端側に有し、ｐＡＶ００１−ＨＵ−ｅＣＤと相補的な配列を含む配列番号１６に示す内側プライマーを用いた。ＰＣＲ断片Ａは、鋳型に由来するＨｉｎｄ III部位をＤＮＡ末端に含む。ＰＣＲ断片Ｂの増幅には、ＫｓｐＡ I認識部位を５’末端側に有し、ｐＡＶ００１−ＨＵ−ｅＣＤと相補的な配列を含む配列番号３に示す外側プライマー及び、ＰＣＲ断片Ａ末端との重複配列を５’末端側に有しｐＡＶ００１−ＨＵ−ｅＣＤと相補的な配列を有する配列番号１７に示す内側プライマーを用いた。プラスミドへの変異導入は、内側プライマーにより行った。温度条件は、９８℃で１０秒、５５℃で５秒、７２℃で１分２０秒を１サイクルとして、３０サイクル行った後、７２℃で３０秒間保温した。ＰＣＲ断片Ａ及びＰＣＲ断片ＢをQIAquick ＰＣＲ Purification Kit（株式会社キアゲン製）にて精製後、精製ＰＣＲ断片Ａ及び断片Ｂを等モルずつ混和した。精製ＰＣＲ断片ＡとＰＣＲ断片Ｂの混和物１ｎｇを鋳型として、1xPrimeSTARTMbuffer、２００μＭ dNTPs mix、２．５ｕ PrimeSTARTM HS DNAポリメラーゼ混合液中で、プライマーを入れないで、９８℃で１０秒、７２℃で１分３０秒を１サイクルとして、５サイクル反応を行いＰＣＲ断片Ａ及びＰＣＲ断片Ｂを連結した。その後、外側プライマー（配列番号１及び３）を最終濃度が各０．５μＭになるように添加し、９８℃で１０秒、５５℃で５秒、７２℃で２分４０秒を１サイクルとして、２５サイクル反応を行った後、７２℃で３０秒保温して連結ＰＣＲ産物（約２．６ｋｂｐ）を得た。連結ＰＣＲ産物を１％ SeaPlaque(R) GTG(R) Agaroseゲル（1xTAE buffer、０．５μｇ／ｍｌエチジウムブロマイド）にて分離し、２．６ｋｂｐのＤＮＡバンドを切り出した。QIAquick(R) Gel Extraction Kitにてゲルから連結ＰＣＲ産物を抽出し、Ｈｉｎｄ III (Fermentas UAB 社製)及びＫｓｐＡ I（Fermentas UAB 社製）にて消化を行った。１％ SeaPlaque(R) GTG(R) Agaroseゲル（1xTAE buffer、０．５ μｇ／ｍｌエチジウムブロマイド）にて分離し、２．６ｋｂｐのＤＮＡバンドを切り出した。QIAquick(R) Gel Extraction Kitにてゲルから連結ＰＣＲ産物を抽出した。
ｐＡＶ００１−ＨＵ−ｅＣＤベクターをＨｉｎｄ III (Fermentas UAB 社製)及びＫｓｐＡ I（Fermentas UAB 社製）にて消化後、１％ SeaPlaque(R) GTG(R) Agaroseゲル（1xTAE buffer、０．５μｇ／ｍｌエチジウムブロマイド）にて分離し、４．６ｋｂｐのＤＮＡバンドを切り出した。QIAquick(R) Gel Extraction KitにてゲルからベクターＤＮＡを抽出した。先の連結ＰＣＲ産物を、ベクターと連結ＰＣＲ産物がモル比で１：３になるよう混和し、Rapid DNA Ligation Kit（Fermentas UAB 社製）にてライゲーションを行った。ライゲーション産物を用いて、大腸菌ＪＭ１０９の形質転換を行い、３０μｇ／ｍｌのスペクチノマイシンを含むＬＢ寒天培地に塗布後、３７℃にて一晩培養し、形質転換体を得た。形質転換体を、３０μｇ／ｍｌのスペクチノマイシンを含む２×ＬＢ液体培地にて３７℃で一晩培養し、QIAprep(R) Spin Miniprep KitにてプラスミドＤＮＡ（ｐＡＶ００１−ＨＵ−ｅＣＤ−Ｄ３７）を抽出した。
なお、ｐＡＶ００１−ＨＵ−ｅＣＤ−Ｄ３７は、配列番号１４における１５０３〜１５０５番目（配列番号１５における１５４５〜１５４７番目）の塩基配列（配列番号２８の５番目のアラニンをコードする塩基配列）が欠失したＣＤを有しているプラスミドである。
（２）変異プラスミド（ｐＡＶ００１−ＨＵ−ｅＣＤ−Ｄ５５）の構築
ＰＣＲ断片Ａ及びＰＣＲ断片Ｂ増幅用内側プライマーとして、それぞれ配列番号１８、１９に示すプライマーを用いた以外は、ｐＡＶ００１−ＨＵ−ｅＣＤ−Ｄ３７のプラスミド構築と同様の方法にて、ｐＡＶ００１−ＨＵ−ｅＣＤ−Ｄ５５を構築した。
なお、ｐＡＶ００１−ＨＵ−ｅＣＤ−Ｄ５５は、配列番号１４における１５２１〜１５２３番目（配列番号１５における１５６３〜１５６５番目）の塩基配列（配列番号２８の１１番目のアスパラギンをコードする塩基配列）が欠失したＣＤを有しているプラスミドである。
（３）変異プラスミド（ｐＡＶ００１−ＨＵ−ｅＣＤ−Ｍ４５０）の構築
ＰＣＲ断片Ａ及びＰＣＲ断片Ｂ増幅用内側プライマーとして、それぞれ配列番号２０、２１に示すプライマーを用いたことと、ＰＣＲの反応条件以外は、ｐＡＶ００１−ＨＵ−ｅＣＤ−Ｄ３７のプラスミド構築と同様の方法にて、ｐＡＶ００１−ＨＵ−ｅＣＤ−Ｍ４５０を構築した。
ＰＣＲの反応条件としては、ＰＣＲ断片Ａ増幅の反応温度条件を、９８℃１０秒、５５℃５秒、７２℃１分４５秒を１サイクルとして、３０サイクル行った後、７２℃３０秒保温とし、ＰＣＲ断片Ｂ増幅の反応温度条件を、９８℃１０秒、５５℃５秒、７２℃１分を１サイクルとして、３０サイクル行った後、７２℃３０秒保温とした。また、ＰＣＲ産物連結時の反応温度を、９８℃で１０秒、７２℃で1分４５秒を１サイクルとして、５サイクル反応を行った。
なお、ｐＡＶ００１−ＨＵ−ｅＣＤ−Ｍ４５０は、配列番号１４における１９１４〜１９１６番目（配列番号１５における１９５６〜１９５８番目）の塩基配列（配列番号２８の１４２番目のグルタミンをコードする塩基配列）がヒスチジンに置換されたＣＤを有しているプラスミドである。
（４）変異プラスミド（ｐＡＶ００１−ＨＵ−ｅＣＤ−Ｍ９６８）の構築
ＰＣＲ断片Ａ及びＰＣＲ断片Ｂ増幅用内側プライマーとして、それぞれ配列番号２２、２３に示すプライマーを用いたこと、ＰＣＲ断片Ｂ増幅用外側プライマーとして配列番号２４に示すプライマーを用いたと、及びＰＣＲの反応条件以外は、ｐＡＶ００１−ＨＵ−ｅＣＤ−Ｄ３７のプラスミド構築と同様の方法にて、ｐＡＶ００１−ＨＵ−ｅＣＤ−Ｍ９６８を構築した。
ＰＣＲの反応条件としては、ＰＣＲ断片Ａ増幅の反応温度条件を、９８℃１０秒、５５℃５秒、７２℃２分１０秒を１サイクルとして、３０サイクル行った後、７２℃３０秒保温とし、ＰＣＲ断片Ｂ増幅の反応温度条件を、９８℃１０秒、５５℃５秒、７２℃４５秒を１サイクルとして、３０サイクル行った後、７２℃３０秒保温とした。また、ＰＣＲ産物連結時の反応温度を、９８℃で１０秒、７２℃で２分１０秒を１サイクルとして、５サイクル反応を行った。連結ＰＣＲ産物の増幅には、配列番号１及び２４に示すプライマーを用い、９８℃で１０秒、５５℃で５秒、７２℃で３分を１サイクルとして、２５サイクル反応を行った後、７２℃で３０秒保温して連結ＰＣＲ産物（約２．９ｋｂｐ）を得た。連結ＰＣＲ産物のベクターには、ｐＡＶ００１−ＨＵ−ｅＣＤベクターをＨｉｎｄ III (タカラバイオ株式会社製)及びSpe I（タカラバイオ株式会社製）にて消化し、アガロースゲルから切り出した断片（約４．３ｋｂｐ）を用いた。得られたｐＡＶ００１−ＨＵ−ｅＣＤ−Ｍ９６８の配列を配列番号２７に示す。
なお、ｐＡＶ００１−ＨＵ−ｅＣＤ−Ｍ９６８は、配列番号１４における２４３３〜２４３５番目（配列番号１５における２４７５〜２４７７番目）の塩基配列（配列番号２８の３１５番目のアスパラギン酸をコードする塩基配列）がアラニンに置換されたＣＤを有しているプラスミドである。
（５）変異プラスミド（ｐＡＶ００１−ＨＵ−ｅＣＤ−Ｍ１２７７）の構築
ＰＣＲ断片Ａ及びＰＣＲ断片Ｂ増幅用内側プライマーとして、それぞれ配列番号２５、２６に示すプライマーを用いたことと、ＰＣＲの反応条件以外は、ｐＡＶ００１−ＨＵ−ｅＣＤ−Ｍ９６８のプラスミド構築と同様の方法にて、ｐＡＶ００１−ＨＵ−ｅＣＤ−Ｍ１２７７を構築した。
ＰＣＲの反応条件としては、ＰＣＲ断片Ａ増幅の反応温度条件を、９８℃、１０秒、５５℃５秒、７２℃２分３０秒を１サイクルとして、３０サイクル行った後、７２℃３０秒保温とし、ＰＣＲ断片Ｂ増幅の反応温度条件を、９８℃１０秒、５５℃５秒、７２℃３０秒を１サイクルとして、３０サイクル行った後、７２℃で３０秒保温とした。また、ＰＣＲ産物連結時の反応温度を、９８℃で１０秒、７２℃で２分３０秒を１サイクルとして、５サイクル反応を行った。
なお、ｐＡＶ００１−ＨＵ−ｅＣＤ−Ｍ１２７７は、配列番号１４における２７４２〜２７４４番目（配列番号１５における２７８４〜２７８６番目）の塩基配列（配列番号２８の４１８番目のグルタミン酸をコードする塩基配列）がグリシンに置換されたＣＤを有しているプラスミドである。
（ビフィドバクテリウム・ロンガム １０５Ａの形質転換）
得られた変異プラスミドを用いて、ビフィドバクテリウム・ロンガム １０５Ａを、実施例１と同様にして形質転換し、その形質転換体を得た。
（ビフィドバクテリウム・ロンガム １０５Ａ形質転換体からのタンパク質抽出）
変異プラスミドを用いて形質転換したビフィドバクテリウム・ロンガム １０５Ａから、実施例１と同様にしてタンパク質抽出液を得、それをＣＤ活性の測定に供した。
（ＣＤ活性の測定）
得られたタンパク抽出液を用いて、実施例１と同様にしてＣＤ活性を測定した。活性測定結果を表３に示す。
Figure 2007136107
変異化したｐＡＶ００１−ＨＵ−ｅＣＤ−Ｍ９６８で形質転換したビフィドバクテリウム・ロンガム１０５Ａ／ｐＡＶ００１−ＨＵ−ｅＣＤ−Ｍ９６８は、変異化していないｐＡＶ００１−ＨＵ−ｅＣＤで形質転換したビフィドバクテリウム・ロンガム１０５Ａ／ｐＡＶ００１−ＨＵ−ｅＣＤ（コントロール）に比べてＣＤ活性が約１２倍にまで向上している。
一方、変異化したｐＡＶ００１−ＨＵ−ｅＣＤ−Ｍ４５０やｐＡＶ００１−ＨＵ−ｅＣＤ−Ｍ１２７７で形質転換したビフィドバクテリウム・ロンガム１０５Ａ／ｐＡＶ００１−ＨＵ−ｅＣＤ−Ｍ４５０及びビフィドバクテリウム・ロンガム１０５Ａ／ｐＡＶ００１−ＨＵ−ｅＣＤ−Ｍ１２７７では、変異導入による活性上昇は認められなかった。
［５−ＦＵ耐性ビフィドバクテリウム・ロンガム１０５−Ａ／ｐＡＶ００１−ＨＵ−ｅＣＤプラスミド変異体の作製］
（ビフィドバクテリウム・ロンガム１０５Ａ／ｐＡＶ００１−ＨＵ−ｅＣＤ−Ｍ９６８の５−ＦＵ耐性化）
実施例２で得られたビフィドバクテリウム・ロンガム１０５Ａ／ｐＡＶ００１−ＨＵ−ｅＣＤ−Ｍ９６８を、特許文献５の実施例１記載の方法に準じて、５−ＦＵ耐性変異体とした。
すなわち、実施例２で得られたビフィドバクテリウム・ロンガム１０５Ａ／ｐＡＶ００１−ＨＵ−ｅＣＤ−Ｍ９６８をＭＲＳ培地３７℃嫌気条件下で２日以上継代培養した。これらの培養液を嫌気性希釈液で希釈した後、５−ＦＵが５００μｇ／ｍＬ含まれるＢＬ寒天培地上に塗布し、３７℃で２〜３日間嫌気培養した後の生育菌を選択し、５−ＦＵ耐性のビフィドバクテリウム・ロンガム１０５Ａ／ｐＡＶ００１−ＨＵ−ｅＣＤ−Ｍ９６８（ビフィドバクテリウム・ロンガム１０５Ａ−Ｒ１／ｐＡＶ００１−ＨＵ−ｅＣＤ−Ｍ９６８）を作製した。
（５−ＦＵ耐性ビフィドバクテリウム・ロンガム １０５ＡのプラスミドｐＡＶ００１−ＨＵ−ｅＣＤ−Ｍ９６８による形質転換）
実施例２で得た変異プラスミドｐＡＶ００１−ＨＵ−ｅＣＤ−Ｍ９６８を用いて、特許文献５の実施例２記載の方法に準じて作製した５−ＦＵ耐性ビフィドバクテリウム・ロンガム １０５Ａを、実施例１と同様にして形質転換し、その形質転換体を得た。
すなわち、ビフィドバクテリウム・ロンガム１０５Ａを、５−ＦＵを１００μｇ／ｍＬ含む５ｍＬのＭＲＳ培地に植菌し、３７℃嫌気培養で１〜５日間培養し、その濁度（ＯＤ＝６００ｎｍ）を測定し、生育の有無を調べ、増殖が確認された培養後の培地を１ｍＬ取り出し、同じ濃度の５−ＦＵを含む９ｍＬのＭＲＳ培地にそれぞれ植菌し、同様の培養条件で２４時間培養した。この植菌作業を３回繰り返し行うことにより、５−ＦＵ耐性ビフィドバクテリウム・ロンガム１０５Ａを作製した。次に、ＭＲＳ培地にこの５−ＦＵ耐性ビフィドバクテリウム・ロンガム１０５Ａを植菌し、培養後の菌液をそれぞれ２５０μｇ／ｍＬの５−ＦＵを含むＭＲＳ培地に植菌し、２４時間後の増殖の有無を濁度（ＯＤ＝６００ｎｍ）を用いて測定し、５−ＦＵを１００μｇ／ｍＬ含む培地で作製した５−ＦＵ耐性ビフィドバクテリウム・ロンガム１０５Ａ（ビフィドバクテリウム・ロンガム１０５Ａ−Ｒ２）を形質転換用宿主として用いた。このビフィドバクテリウム・ロンガム１０５Ａ−Ｒ２を、実施例２で得た変異プラスミドｐＡＶ００１−ＨＵ−ｅＣＤ−Ｍ９６８を用いて、実施例１と同様にして形質転換し、その形質転換体ビフィドバクテリウム・ロンガム１０５Ａ−Ｒ２／ｐＡＶ００１−ＨＵ−ｅＣＤ−Ｍ９６８を作製した。
（ビフィドバクテリウム・ロンガム１０５Ａ−Ｒ２／ｐＡＶ００１−ＨＵ−ｅＣＤ−Ｍ９６８からのタンパク質抽出）
上記で得られたビフィドバクテリウム・ロンガム１０５Ａ−Ｒ２／ｐＡＶ００１−ＨＵ−ｅＣＤ−Ｍ９６８から、実施例１と同様にしてタンパク質抽出液を得、それをＣＤ活性の測定に供した。
（ＣＤ活性の測定）
得られたタンパク抽出液を用いて、実施例１と同様にしてＣＤ活性を測定した結果、表４に示すとおり、ビフィドバクテリウム・ロンガム１０５Ａ−Ｒ２／ｐＡＶ００１−ＨＵ−ｅＣＤ−Ｍ９６８も、実施例２の形質転換ビフィドバクテリウム・ロンガム １０５Ａと同程度のＣＤ活性を示した。
Figure 2007136107
（プラスミド保持安定性の測定）
実施例３で得た、ビフィドバクテリウム・ロンガム１０５Ａ−Ｒ２／ｐＡＶ００１−ＨＵ−ｅＣＤ−Ｍ９６８（Ｒ２株）と、ビフィドバクテリウム・ロンガム１０５Ａ−Ｒ１／ｐＡＶ００１−ＨＵ−ｅＣＤ−Ｍ９６８（Ｒ１株）について、以下の方法によりプラスミド保持安定性を測定した結果、Ｒ２株はＲ１株に比べて、図４に示すとおり、極めて良好なプラスミド保持安定性を示した。
（プラスミド保持安定性測定試験）
上記プラスミド保持安定性の測定は以下の試験方法により行った。Ｒ２株と、Ｒ１株とを用いて、導入プラスミドの選択マーカーである抗生物質（スペクチノマイシン）を添加した液体培地で、上記形質転換ビフィズス菌Ｒ２株とＲ１株を十分に活性化培養した。この菌液を継代培養０日目菌液とした。次に、０日目菌液の一部を取りだし、スペクチノマイシンを含まない液体培地へ植菌し培養した。この菌液を継代培養１日目菌液とした。同様に、１日目菌液の一部を取りだし、スペクチノマイシンを含まない液体培地へ植菌し培養し継代培養２日目菌液とした。以下同様にして５日目まで連続的に継代培養を行い、継代培養５日目菌液まで作製した。０日目菌液、１日目菌液、３日目菌液及び５日目菌液を、抗生剤を含まない平板培地（ＢＬ寒天培地）へ塗布し、コロニーを形成させた。生育したコロニー１００個を無作為に選択し、スペクチノマイシンを含むＢＬ寒天培地及びスペクチノマイシンを含まないＢＬ寒天培地へ、滅菌した爪楊枝などを用いてレプリカ法にて両培地に植菌し、以下の数式から０日目、１日目、３日目及び５日目のプラスミド保持率を計測した。結果を図４に示す。
なお、プラスミド保持率は以下の式により算出した。
Figure 2007136107
本発明によると、固形腫瘍治療剤として有用な、嫌気的環境下にある腫瘍組織内で生育でき、且つ、抗腫瘍活性を有する蛋白質、又は、抗腫瘍物質前駆体を抗腫瘍物質に変換する活性を有する蛋白質を発現することができる嫌気性微生物からなる遺伝子輸送担体であって、形質転換により導入した遺伝子によって発現される蛋白質の活性及び発現効率が良好な遺伝子輸送担体を効率よく作製することができる。

Claims (35)

  1. 嫌気的環境下にある腫瘍組織内で生育でき、且つ、（Ａ）抗腫瘍活性を有する蛋白質、又は、（Ｂ）抗腫瘍物質前駆体を抗腫瘍物質に変換する活性を有する蛋白質を発現することができる嫌気性微生物からなる遺伝子輸送担体の作製方法であって、
    ビフィドバクテリウム属細菌のプラスミドの断片及び大腸菌のプラスミドの断片を有する融合プラスミドを作製する工程（１）と、
    前記融合プラスミドに、ビフィドバクテリウム属細菌由来の、ヒストン様ＤＮＡ結合蛋白質をコードする遺伝子のプロモーター及びターミネーターを含むＤＮＡ断片を組み込む工程（２）と、
    前記プロモーターとターミネーターの間に、（ａ）抗腫瘍活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ、又は、（ｂ）抗腫瘍物質前駆体を抗腫瘍物質に変換する活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡを組み込んで発現ベクターを作製する工程（３）と、
    前記発現ベクターを用いて嫌気性微生物を形質転換する工程（４）とを有し、
    前記工程（３）の発現ベクター作製工程において組み込まれる、（ａ）抗腫瘍活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ、又は、（ｂ）抗腫瘍物質前駆体を抗腫瘍物質に変換する活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡが、その５’末端側に、前記ヒストン様ＤＮＡ結合蛋白質のＮ末端の１番目から少なくとも４番目までのアミノ酸配列からなるペプチドをコードする塩基配列を含むＤＮＡの断片をさらに具有するものであることを特徴とする遺伝子輸送担体の作製方法。
  2. ヒストン様ＤＮＡ結合蛋白質のＮ末端の１番目から少なくとも４番目までのアミノ酸配列からなるペプチドが、配列番号２９の１番目から４番目〜１８番目のいずれかまでのアミノ酸配列からなるペプチドである、請求項１に記載の遺伝子輸送担体の作製方法。
  3. （ａ）抗腫瘍活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ、又は、（ｂ）抗腫瘍物質前駆体を抗腫瘍物質に変換する活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡを変異化する工程（５）を、工程（４）より前にさらに有する、請求項１又は２に記載の遺伝子輸送担体の作製方法。
  4. （ａ）抗腫瘍活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ、又は、（ｂ）抗腫瘍物質前駆体を抗腫瘍物質に変換する活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡを変異化する工程（５）が、工程（３）で作製した発現ベクターに組み込まれた、（ａ）抗腫瘍活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ、又は、（ｂ）抗腫瘍物質前駆体を抗腫瘍物質に変換する活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡを変異化する工程（５’）である、請求項３に記載の遺伝子輸送担体の作製方法。
  5. 遺伝子輸送担体が、嫌気的環境下にある腫瘍組織内で生育でき、且つ、抗腫瘍物質前駆体を抗腫瘍物質に変換する活性を有する蛋白質を発現することができる嫌気性微生物からなる遺伝子輸送担体である、請求項１〜４のいずれかに記載の遺伝子輸送担体の作製方法。
  6. 抗腫瘍物質前駆体を抗腫瘍物質に変換する活性を有する蛋白質が、シトシンデアミナーゼである、請求項１〜５のいずれかに記載の遺伝子輸送担体の作製方法。
  7. 嫌気性微生物からなる遺伝子輸送担体が、少なくとも抗腫瘍活性有効濃度の５−フルオロウラシル耐性能を有するシトシン・デアミナーゼ発現・５−フルオロウラシル耐性菌である、請求項６に記載の遺伝子輸送担体の作製方法。
  8. 少なくとも抗腫瘍活性有効濃度の５−フルオロウラシル耐性能を有するシトシン・デアミナーゼ発現・５−フルオロウラシル耐性菌が、少なくとも抗腫瘍活性有効濃度の５−フルオロウラシル耐性能を有する５−フルオロウラシル耐性菌を宿主として用いて作製したことを特徴とする、請求項７に記載の遺伝子輸送担体の作製方法。
  9. ヒストン様ＤＮＡ結合蛋白質のＮ末端の１番目から少なくとも４番目までのアミノ酸配列からなるペプチドをコードする塩基配列を含むＤＮＡの断片が、配列番号１４又は１５の１４８２番目から少なくとも１４９３番目までの塩基配列を含むＤＮＡの断片である、請求項１〜８のいずれかに記載の遺伝子輸送担体の作製方法。
  10. 配列番号１４又は１５の１４８２番目から少なくとも１４９３番目までの塩基配列を含むＤＮＡの断片が、配列番号１５の１４８２番目から１４９３番目〜１５３５番目のいずれかまでの塩基配列を含むＤＮＡの断片である、請求項９に記載の遺伝子輸送担体の作製方法。
  11. 嫌気性微生物がバクテリアである、請求項１〜１０のいずれかに記載の遺伝子輸送担体の作製方法。
  12. バクテリアが腸内細菌である、請求項１１に記載の遺伝子輸送担体の作製方法。
  13. 腸内細菌がビフィドバクテリウム属細菌である、請求項１２に記載の遺伝子輸送担体の作製方法。
  14. ビフィドバクテリウム属細菌が、ビフィドバクテリウム・アドレッセンティス、ビフィドバクテリウム・アニマリス、ビフィドバクテリウム・インファンティス、ビフィドバクテリウム・サーモフィラム、ビフィドバクテリウム・シュードロンガム、ビフィドバクテリウム・ビフィダム、ビフィドバクテリウム・ブレーベ、およびビフィドバクテリウム・ロンガムから選ばれるいずれかのビフィドバクテリウム属細菌である、請求項１３に記載の遺伝子輸送担体の作製方法。
  15. ビフィドバクテリウム属細菌が、ビフィドバクテリウム・ロンガムであることを特徴とする、請求項１３又は１４に記載の遺伝子輸送担体の作製方法。
  16. 工程（４）の形質転換に用いる発現ベクターが、プラスミドｐＡＶ００１−ＨＵ−ｅＣＤの一塩基変異導入プラスミドである、請求項１〜１５のいずれかに記載の遺伝子輸送担体の作製方法。
  17. プラスミドｐＡＶ００１−ＨＵ−ｅＣＤの一塩基変異導入プラスミドにおけるＣＤをコードする塩基配列が、配列番号２８に記した大腸菌ＣＤのアミノ酸配列における３１５番目に対応するアミノ酸のアスパラギン酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列をコードする塩基配列である、請求項１６に記載の遺伝子輸送担体の作製方法。
  18. 他のアミノ酸がアラニンである、請求項１７に記載の遺伝子輸送担体の作製方法。
  19. プラスミドｐＡＶ００１−ＨＵ−ｅＣＤの一塩基変異導入プラスミドが、プラスミドｐＡＶ００１−ＨＵ−ｅＣＤ−Ｍ９６８である、請求項１８に記載の遺伝子輸送担体の作製方法。
  20. ビフィドバクテリウム属細菌のプラスミドの断片、大腸菌のプラスミドの断片、及びビフィドバクテリウム属細菌由来の、ヒストン様ＤＮＡ結合蛋白質をコードする遺伝子のプロモーター及びターミネーターを含むＤＮＡ断片を有し、前記プロモーターとターミネーターの間に、（ａ）抗腫瘍活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ、又は、（ｂ）抗腫瘍物質前駆体を抗腫瘍物質に変換する活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡを有し、且つ、（ａ）抗腫瘍活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ、又は、（ｂ）抗腫瘍物質前駆体を抗腫瘍物質に変換する活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡの５’末端側に、前記ヒストン様ＤＮＡ結合蛋白質のＮ末端の１番目から少なくとも４番目までのアミノ酸配列からなるペプチドをコードする塩基配列を含むＤＮＡの断片をさらに具有する発現ベクターで形質転換された嫌気性微生物からなる遺伝子輸送担体。
  21. 嫌気的環境下にある腫瘍組織内で生育でき、且つ、（ａ）抗腫瘍活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ又は（ｂ）抗腫瘍物質前駆体を抗腫瘍物質に変換する活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡを有する嫌気性微生物の遺伝子輸送担体であって、請求項１〜１９のいずれかの作製方法で作製される遺伝子輸送担体。
  22. 嫌気性微生物がビフィドバクテリウム属細菌である、請求項２０又は２１に記載の遺伝子輸送担体。
  23. ビフィドバクテリウム属細菌が、ビフィドバクテリウム・アドレッセンティス、ビフィドバクテリウム・アニマリス、ビフィドバクテリウム・インファンティス、ビフィドバクテリウム・サーモフィラム、ビフィドバクテリウム・シュードロンガム、ビフィドバクテリウム・ビフィダム、ビフィドバクテリウム・ブレーベ、及びビフィドバクテリウム・ロンガムから選ばれるいずれかのビフィドバクテリウム属細菌である、請求項２２に記載の遺伝子輸送担体。
  24. ビフィドバクテリウム属細菌が、ビフィドバクテリウム・ロンガムである、請求項２２又は２３に記載の遺伝子輸送担体。
  25. 嫌気的環境下にある腫瘍組織内で生育でき、且つ、抗腫瘍物質前駆体を抗腫瘍物質に変換する活性を有する蛋白質を発現することができる、請求項２０〜２４のいずれかに記載の遺伝子輸送担体。
  26. 抗腫瘍物質前駆体を抗腫瘍物質に変換する活性を有する蛋白質が、シトシン・デアミナーゼである、請求項２５に記載の遺伝子輸送担体。
  27. 少なくとも抗腫瘍活性有効濃度の５−フルオロウラシル耐性能を有するシトシン・デアミナーゼ発現・５−フルオロウラシル耐性菌である、請求項２６に記載の遺伝子輸送担体。
  28. 遺伝子輸送担体が、ビフィドバクテリウム・ロンガム１０５−Ａ／ｐＡＶ００１−ＨＵ−ｅＣＤのプラスミド一塩基変異体である、請求項２６または請求項２７に記載の遺伝子輸送担体。
  29. ビフィドバクテリウム・ロンガム１０５−Ａ／ｐＡＶ００１−ＨＵ−ｅＣＤのプラスミド一塩基変異体が、ビフィドバクテリウム・ロンガム１０５−Ａ／ｐＡＶ００１−ＨＵ−ｅＣＤ−Ｍ９６８である、請求項２８に記載の遺伝子輸送担体。
  30. 請求項２０〜２９のいずれかに記載の遺伝子輸送担体を含有する医薬組成物。
  31. 請求項２５〜２９のいずれかに記載の遺伝子輸送担体と、該遺伝子輸送担体が発現することができる前記蛋白質によって抗腫瘍物質に変換される抗腫瘍物質前駆体とを組み合わせてなる医薬組成物。
  32. 遺伝子輸送担体が請求項２５〜２９のいずれかに記載の遺伝子輸送担体であり、抗腫瘍物質前駆体が５−フルオロシトシンである、請求項３１に記載の医薬組成物。
  33. 有効治療量の抗腫瘍活性を有する蛋白質を発現するに十分な量の請求項２０〜２４のいずれかに記載の遺伝子輸送担体を含有する固形腫瘍治療剤。
  34. 抗腫瘍物質前駆体から有効治療量の抗腫瘍物質に変換できる量の前記蛋白質を発現するに十分な量の請求項２５〜２９のいずれかに記載の遺伝子輸送担体と、該遺伝子輸送担体が発現することができる前記蛋白質によって変換され、且つ、有効治療量の抗腫瘍物質に変換できる量の抗腫瘍物質前駆体とを組み合わせてなる、固形腫瘍治療剤。
  35. 遺伝子輸送担体が請求項２５〜２９のいずれかに記載の遺伝子輸送担体であり、抗腫瘍物質前駆体が５−フルオロシトシンである、請求項３４に記載の固形腫瘍治療剤。
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