CN101688244A

CN101688244A - 稳定的重组腺苷脱氨酶

Info

Publication number: CN101688244A
Application number: CN200880021124A
Authority: CN
Inventors: 戴维·R·菲尔普拉; 斯蒂芬·K·扬斯特
Original assignee: Enzon Pharmaceuticals Inc
Current assignee: Unicris Inc.
Priority date: 2007-04-20
Filing date: 2008-04-18
Publication date: 2010-03-31
Anticipated expiration: 2028-04-18
Also published as: CA2684750A1; CN101688244B; HRP20160482T1; CA2684750C; SI2147116T1; AU2008242748A1; ES2569940T3; RU2009142844A; BRPI0810383A2; WO2008131208A1; AU2008242748B2; HUE027603T2; KR101499095B1; PL2147116T3; DK2147116T3; IL201592A; EP2147116A4; IL201592A0; BRPI0810383B1; MX2009011319A

Abstract

本发明公开了一种突变蛋白重组腺苷脱氨酶，其具有的任何可氧化的半胱氨酸残基被不可氧化的氨基酸残基所替代。本发明还公开了稳定的重组腺苷脱氨酶、聚合缀合物和使用它们治疗的方法。

Description

稳定的重组腺苷脱氨酶

相关申请的交叉引用

本申请要求2007年4月20日提交的美国临时专利申请序列号60/913,009的优先权，其内容在此引入作为参考。

技术领域

本发明提供突变以增强稳定性的重组腺苷脱氨酶。

背景技术

一段时间以来腺苷脱氨酶(ADA)已用于治疗酶缺陷疾病，该疾病称为重症联合免疫缺陷疾病(SCID)或″泡泡男孩(Bubble boy)″疾病。超过15年以前，Enzon Pharmaceuticals已制备治疗性ADA，其以使用牛源ADA酶制备的PEG化的ADA的形式给予患者。

最近，正尝试使用重组体来源的酶(recombinant source enzyme)(下文称″rADA″)代替牛来源酶。重组人(″rhADA″)和重组牛(″rbADA″)都被考虑作为纯化的天然牛ADA的代替品。该rbADA和rhADA酶相比目前使用的天然纯化的牛的酶有些不稳定。认为rhADA和rbADA以与半胱氨酸降解一致的方式降解：添加氧；二硫醇的形成；随着pH增加降解增加；沉淀，尤其当pH增加且样品浓缩时。在还原的状态(reduced state)，半胱氨酸包含反应性-SH基(巯基)，其为易于降解的形式。

有证据表明单一的、暴露的半胱氨酸可能是对于rbADA和rhADA两者所观察到的降解的原因。牛ADA(即，从牛来源纯化的天然牛ADA)具有与rhADA非常相似的结构：牛ADA和rhADA在基本序列的相同位置都具有相同数量的半胱氨酸。目前获得的重组人和重组牛ADA包含降解剂(degradants)/杂质(二硫醇)，其与半胱氨酸反应性一致。天然牛ADA在结构上不同于重组牛ADA，因为天然牛ADA具有单摩尔的半胱氨酸与每摩尔ADA键合。天然牛ADA也对高pH稳定，表明与ADA键合的半胱氨酸的功能为保护基。

一个稳定重组人和/或重组牛ADA的方法是用氧化的谷胱甘肽，碘乙酰胺，碘乙酸，胱氨酸，其它二硫醇中的任一种及其混合物封端该活性Cys残基(成熟rbADA和成熟rhADA两者的Cys 74)。该方法在共同拥有的美国专利申请序列号11/738,012中阐述，名称为，″Stabilized Proteins″，其内容以其整体在此引入作为参考。

尽管上述说法，但有利地是避免需要另外的通过修饰蛋白质结构而进行的封端步骤，从而提供在表达后立即具有的固有稳定性。美国专利号5,346,823描述了通过突变而进行的原核蛋白酶如枯草杆菌蛋白酶和中性蛋白酶的稳定化，其使用Ser和其它氨基酸残基代替去稳定Cys残基。然而，ADA中活性位点的突变分析显示替换Cys残基(Cys 262)导致具有活性显著降低的酶，Bhaumik等人1993，The J.of Biol Chem，268.(8)：5464-5470。因此，在本发明之前，并不知道通过用另一氨基酸残基代替活性的和暴露的Cys残基而稳定腺苷脱氨酶，同时保持最佳的可用酶活性。

因此，有利地是提供稳定的rbADA和rhADA，即，在储存过程和对酶最佳PEG化有用的pH水平下的加工过程中没有明显降解。

发明内容

因此，本发明提供重组ADA，相对于野生型ADA酶，其任何可氧化的半胱氨酸残基被不可氧化的(non-oxidizable)氨基酸残基代替。该突变蛋白ADA包含不可氧化的氨基酸残基，其为天然存在的L-氨基酸中的一种，例如，丙氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、赖氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、天冬酰胺、脯氨酸、谷氨酰胺、精氨酸、丝氨酸、苏氨酸、缬氨酸、色氨酸、酪氨酸和/或现有技术已知的天然存在的L-氨基酸的变体和衍生物，例如，2-氨基己二酸、3-氨基己二酸、β-丙氨酸、β-氨基丙酸、2-氨基丁酸、4-氨基丁酸、哌啶酸、6-氨基己酸、2-氨基庚酸、2-氨基异丁酸、3-氨基异丁酸、2-氨基庚二酸、2，4-二氨基丁酸、锁链素、2，2’-二氨基庚二酸、2，3-二氨基丙酸、N-乙基甘氨酸、N-乙基天冬酰胺、羟基赖氨酸、别羟基赖氨酸、3-羟基脯氨酸、4-羟基脯氨酸、异锁链素、别异亮氨酸、N-甲基甘氨酸、肌氨酸、N-甲基异亮氨酸、6-N-甲基赖氨酸、N-甲基缬氨酸、正缬氨酸、正亮氨酸和鸟氨酸等。任选地，避免蛋氨酸或色氨酸，因为这些是潜在可氧化的。

更优选地，该不可氧化的氨基酸残基为丝氨酸、丙氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、甘氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、酪氨酸和缬氨酸中的一种。最优选丝氨酸。在某些优选实施方案中，该可氧化的半胱氨酸位于成熟ADA蛋白的约74位。该重组ADA优选为重组牛ADA或重组人ADA，其例如，从根据SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4的DNA分子翻译，且其优选包含SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3。当重组ADA为根据SEQ ID NO：1的重组牛ADA时，该ADA任选以多态性(polymorphism)表达，该多态性选自Gln代替Lys₁₉₈；Ala代替Thr₂₄₅；和Arg代替Gly₃₅₁的一种或多种。

本发明还提供聚环氧烷-ADA缀合物(conjugate)，其中所述聚环氧烷优选为聚乙二醇。任选地，该聚乙二醇通过连接基化学物(linker chemistry)缀合至重组腺苷脱氨酶，该连接基化学物选自琥珀酰亚胺基碳酸酯(succinimidylcarbonate)，噻唑烷硫酮，尿烷，琥珀酰亚胺基琥珀酸酯，和基于酰胺的连接基。优选琥珀酰亚胺基碳酸酯。该聚乙二醇优选与重组腺苷脱氨酶的Lys的ε氨基共价连接。

该聚乙二醇-ADA缀合物包含至少1个(即，1个或多个)与ε氨基连接的聚乙二醇链，优选至少5个(即，5个或更多)与ε氨基连接的聚乙二醇链，或更优选地，约11至约18个与ε氨基连接的聚乙二醇链，所述ε氨基为重组ADA的Lys残基的ε氨基。

本发明缀合物的聚乙二醇的分子量为约2,000至约100,000kDa，或更优选约4,000至约45,000kDa。

本发明进一步提供纯化本发明的重组腺苷脱氨酶的方法。例如，该重组腺苷脱氨酶优选通过离子交换色谱法(例如，Capto Q，DEAE和SP色谱法)纯化，且SEQ ID NO：1的重组腺苷脱氨酶优选通过疏水作用色谱法纯化。

本发明进一步提供在哺乳动物中治疗ADA-介导的病症的方法，包括给药有效量的本发明的重组ADA。所述ADA-介导的病症包括，例如，SCID、癌症等。

发明详述

本发明提供稳定的重组腺苷脱氨酶。本发明的腺苷脱氨酶通过用可接受的可选氨基酸残基替换当酶在溶液中时经受氧化过程的半胱氨酸残基而提供，该可选氨基酸残基保留酶的活性、电荷和三级结构同时去除分解不稳定性的来源。

A.定义

为了对本发明提供清楚的说明，多个术语如下进行定义。

术语″重组体″是指一种蛋白质，其使用在天然状态不具有能表达蛋白质的DNA的内源性拷贝的细胞而产生。该细胞产生重组蛋白质，因为它们已通过引入合适分离的核酸序列而遗传性改变。该术语还涉及细胞，或核酸，或载体(Vector)，其已通过引入异源的(外源性或外来)核酸或将天然核酸改变成对于细胞而言非天然的形式而进行修饰，或该细胞是从如此修饰的细胞衍生而来。因此，例如，重组细胞表达天然(非重组)形式的细胞中没发现的基因，表达天然形式中发现的基因的突变体，或表达原本异常表达、表达不充足或根本不表达的天然基因。

如本文所述，″核酸″或″核酸序列″涉及单或双链形式的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸聚合物，且除非另有限定，包括以与天然存在的核苷酸类似的方式与核酸杂交的天然核苷酸的已知类似物。除非另有所述，具体的核酸序列包括其互补序列。

与特定核酸有关的术语″编码″，其包括涉及包含用于翻译成特定蛋白质的信息的核酸。该信息通过使用密码子而指定。

″宿主细胞″是一种细胞，其可支持表达载体的复制或表达。宿主细胞可为原核细胞如大肠杆菌，或真核细胞如酵母细胞，昆虫细胞，两栖动物细胞，或哺乳动物细胞。

如本文所述，″多肽″、″肽″和″蛋白质″可互换使用，且包括涉及氨基酸残基的聚合物。

术语″残基″或″氨基酸残基″或″氨基酸″包括涉及掺入至蛋白质、多肽或肽(统称为″肽″)的氨基酸。该氨基酸可为天然存在的氨基酸，且除非另有限定，可包括天然氨基酸的已知类似物，其可以与天然存在的氨基酸类似的方式起作用。

″转染″是指表达载体被宿主细胞吸收，无论任何编码序列是否实际被表达。本领域技术人员已知多种转染方法。例如，转染在表达载体和高浓度的磷酸钙的存在下，通过电穿孔，通过使用噬菌体或病毒表达载体以插入宿主细胞，通过机械插入核酸，甚至通过在未包装的(unpackaged)核酸片段的存在下培养宿主细胞而完成。通常当操作感兴趣的载体的任何指示在宿主细胞中出现时确认转染成功。

″转化″描述了将核酸引入至生物体中，使得核酸是可复制的，或者作为染色体外元件或通过整合进入宿主染色体。根据使用的宿主细胞，转化使用适合具体宿主细胞的本领域已知的方法而完成。使用氯化钙的钙处理，如描述于Cohen，S.N.Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)，69：2110(1972)和Mandel等人，J.Mol.Biol.53：154(1970)，通常用于原核生物或其它包封在细胞壁中的细胞(例如，许多细菌和/或植物细胞)。对于没有这样的细胞壁的哺乳动物细胞，优选Graham，F.和van der Eb，A.，Virology，52：456-457(1978)的磷酸钙沉淀法。哺乳动物细胞宿主体系转化的一般方面已描述于1983年8月16日授权的美国专利号4,399,216。引入到酵母的转化通常根据Van Solingen，P.，等人，J.Bact.，130：946(1977)和Hsiao，C.L.，等人，Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)76：3829(1979)的方法进行。然而，也可使用任何其他本领域已知的将核酸，例如，DNA，引入细胞的方法，如，例如，通过核注射，脂转染，或通过原生质体融合。

如本文所述，关于核酸的术语″互补″是指当使用第一核酸分子作为模板复制该分子以形成新的第二核酸链时产生的相反链(使用Watson-Crick碱基配对)。在本发明一个方面，当它们在严格条件下杂交或结合在一起时，认为两个核酸分子是彼此互补的。

″可操作连接(Operably linked)″是指组分(例如，调节区和可读框)的并置(juxtaposition)，使得可进行组分的正常功能。因此，″可操作连接″至控制序列的可读框是指一种构型，其中所述编码序列可在这些序列的控制下表达。

″控制序列″是指在具体宿主生物体中表达可操作连接的编码序列所需的核酸序列。适于原核生物的控制序列，例如，包括启动子，任选包括操纵基因序列(operator sequence)，核糖体结合位点，以及可能的其它仍然了解很少的序列。已知例如真核细胞使用这些控制序列作为启动子、聚腺苷酸化(polyadenylation)信号和增强子，仅举数例。

″表达体系″或″表达载体″是指以可操作的连接含有所需的编码序列和控制序列的核酸序列，以使得用这些序列转化的宿主能产生编码的蛋白质。为实现转化，该表达体系可包含在载体上；然而，相关核酸分子可随后也整合在宿主染色体中。

如本文所述，″细胞″、″细胞系″和″细胞培养物″可互换使用且所有这些名称包括子代。因此，″转化体″或″转化细胞″包括原代主体细胞(primarysubject cell)和其来源的培养物，而不考虑转移的次数。也应理解由于故意的或无意的突变，所有子代的基因组内含物可能不完全相同。包括与在原始转化细胞中筛选时具有相同功能的突变体子代。可以使用不同的名称，其从上下文看是清楚的。

就本发明而言，术语″残基″应理解是指化合物的部分，其涉及，例如，PEG、ADA、氨基酸，等，其在经历被另一化合物取代的反应后保留。

就本发明而言，术语″聚合物残基″例如，″PEG残基″每个应理解为聚合物或PEG的部分，其在经历与其它化合物、部分等反应后保留。

就本发明而言，本文使用的术语“烷基”是指饱和脂肪烃，包括直链，支链和环状烷基。术语“烷基”还包括烷基-硫基-烷基，烷氧基烷基，环烷基烷基，杂环烷基和C_1-6烷基羰基烷基。优选地，该烷基具有1至12个碳。更优选地，其为约1至7个碳的低级烷基，还更优选约1至4个碳。该烷基可为取代的或未取代的。当为取代的时，该取代的基团优选包括卤素、氧基、叠氮基、硝基、氰基、烷基、烷氧基、烷基-硫基、烷基-硫基-烷基、烷氧基烷基、烷基氨基、三卤代甲基、羟基、巯基、羟基、氰基、烷基硅烷基、环烷基、环烷基烷基、杂环烷基、杂芳基、烯基、炔基、C_1-6烃基(hydrocarbonyl)、芳基和氨基。

就本发明而言，本文使用的术语“取代”是指添加选自以下的一个基团或用选自以下的一个基团替换官能团或化合物中包含的一个或多个原子：卤素、氧基、叠氮基、硝基、氰基、烷基、烷氧基、烷基-硫基、烷基-硫基-烷基、烷氧基烷基、烷基氨基、三卤代甲基、羟基、巯基、羟基、氰基、烷基硅烷基、环烷基、环烷基烷基、杂环烷基、杂芳基、烯基、炔基、C_1-6烃基、芳基和氨基。

本文使用的术语“烯基”是指含至少一个碳-碳双键的基团，包括直链、支链和环状基团。优选地，该烯基具有约2至12个碳。更优选地，其为约2至7个碳的低级烯基，还更优选约2至4个碳。该烯基可为取代的或未取代的。当为取代的时，该取代的基团优选包括卤素、氧基、叠氮基、硝基、氰基、烷基、烷氧基、烷基-硫基、烷基-硫基-烷基、烷氧基烷基、烷基氨基、三卤代甲基、羟基、巯基、羟基、氰基、烷基硅烷基、环烷基、环烷基烷基、杂环烷基、杂芳基、烯基、炔基、C_1-6烷基羰基烷基、芳基和氨基。

本文使用的术语“炔基”是指含至少一个碳-碳三键的基团，包括直链、支链和环状基团。优选地，该炔基具有约2至12个碳。更优选地，其为约2至7个碳的低级炔基，还更优选约2至4个碳。该炔基可为取代的或未取代的。当为取代的时，该取代的基团优选包括卤素、氧基、叠氮基、硝基、氰基、烷基、烷氧基、烷基-硫基、烷基-硫基-烷基、烷氧基烷基、烷基氨基、三卤代甲基、羟基、巯基、羟基、氰基、烷基硅烷基、环烷基、环烷基烷基、杂环烷基、杂芳基、烯基、炔基、C_1-6烃基、芳基和氨基。″炔基″的实例包括炔丙基、丙炔和3-己炔。

就本发明而言，术语“芳基”是指包含至少一个芳环的芳香烃环体系。该芳环可任选与其它芳香烃环或非芳香烃环稠合或连接。芳基的实例包括，例如，苯基、萘基、1，2，3，4-四氢萘和联苯基。芳基的优选实例包括苯基和萘基。

就本发明而言，术语“环烷基”是指C_3-8环烃。环烷基的实例包括环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基和环辛基。

就本发明而言，术语“环烯基”是指包含至少一个碳-碳双键的C_3-8环烃。环烯基的实例包括环戊烯基、环戊二烯基、环己烯基、1，3-环己二烯基、环庚烯基、环庚三烯基和环辛烯基。

就本发明而言，术语“环烷基烷基”是指被C_3-8环烷基取代的烷基。环烷基烷基的实例包括环丙基甲基和环戊基乙基。

就本发明而言，术语“烷氧基”是指通过氧桥连接至母体分子部分的指定碳原子数的烷基。烷氧基的实例包括，例如，甲氧基、乙氧基、丙氧基和异丙氧基。

就本发明而言，“烷基芳基”是指被烷基取代的芳基。

就本发明而言，“芳烷基”是指被芳基取代的烷基。

就本发明而言，术语“烷氧基烷基”是指被烷氧基取代的烷基。

就本发明而言，术语“烷基-硫基-烷基”是指烷基-S-烷基硫醚，例如甲基硫基甲基或甲基硫基乙基。

就本发明而言，术语“氨基”是指现有技术已知的从氨衍生的含氮基团，其通过用有机基团代替一个或多个氢基而得到。例如，术语“酰基氨基”和“烷基氨基”分别是指具有酰基和烷基取代基的特定的N-取代的有机基团。

就本发明而言，术语“烷基羰基”是指被烷基取代的羰基。

就本发明而言，术语“卤素’或“卤”是指氟、氯、溴和碘。

就本发明而言，术语“杂环烷基”是指包含至少一个选自氮、氧和硫的杂原子的非芳环体系。该杂环烷基环可任选与其它杂环烷基环和/或非芳香烃环稠合至或连接。优选杂环烷基具有3至7元。杂环烷基的实例包括，例如，哌嗪、吗啉、哌啶、四氢呋喃、吡咯烷和吡唑。优选杂环烷基包括哌啶基、哌嗪基、吗啉基和吡咯烷基。

就本发明而言，术语“杂芳基”是指包含至少一个选自氮、氧和硫的杂原子的芳环体系。该杂芳基环可与一个或多个杂芳基环、芳香或非芳香烃环或杂环烷基环稠合或连接。杂芳基的实例包括，例如、吡啶、呋喃、噻吩、5，6，7，8-四氢异喹啉和嘧啶。杂芳基的优选实例包括噻吩基、苯并噻吩基、吡啶基、喹啉基、吡嗪基、嘧啶基、咪唑基、苯并咪唑基、呋喃基、苯并呋喃基、噻唑基、苯并噻唑基、异噁唑基、噁二唑基、异噻唑基、苯并异噻唑基、三唑基、四唑基、吡咯基、吲哚基、吡唑基和苯并吡唑基。

就本发明而言，术语“杂原子”是指氮、氧和硫。

在一些实施方案中，取代的烷基包括羧基烷基、氨基烷基、二烷基氨基、羟基烷基和巯基烷基；取代的烯基包括羧基烯基、氨基烯基、二烯基氨基、羟基烯基和巯基烯基；取代的炔基包括羧基炔基、氨基炔基、二炔基氨基、羟基炔基和巯基炔基；取代的环烷基包括基团如4-氯环己基；芳基包括基团如萘基；取代的芳基包括基团如3-溴苯基；芳烷基包括基团如甲苯基；杂烷基包括基团如乙基噻吩；取代的杂烷基包括基团如3-甲氧基-噻吩；烷氧基包括基团如甲氧基；且苯氧基包括基团如3-硝基苯氧基。卤素应理解为包括氟、氯、碘和溴。

就本发明而言，“正整数”应理解为包括等于或大于1的整数，且本领域技术人员应理解在合理的范围内。

就本发明而言，术语“连接”应理解为包括共价(优选)或非共价连接一个基团至另一个基团上，即，由于化学反应的结果。

术语″有效量″和“足够量”就本发明而言应是指达到所需效果或治疗效果的量，该效果是本领域普通技术人员所理解的。

就本发明而言，术语“腺苷”应理解为包括核苷腺苷和脱氧腺苷。腺苷还包括以AMP、ADP、ATP、dAMP、dADP或dATP形式存在的腺苷和脱氧腺苷。

就本发明而言，“腺苷介导的病症”或“腺苷脱氨酶-响应性病症(responsive condition)”应以广义理解，包括任何受益于给药ADA或其活性部分(active fraction)的疾病、病症或障碍等，且不考虑给药途径。

就本发明而言，“腺苷介导的病症的治疗”或“腺苷脱氨酶-响应性病症的治疗”如SCID应理解为是指当与在没有ADA治疗的情况下观察到的相比，该病症或疾病被避免、最小化或减轻。该治疗的病症可通过例如，腺苷的减少而证实。

广义上说，应认为腺苷介导的病症的成功治疗在获得所需临床响应时发生。或者成功的治疗可通过当与在没有ADA治疗的情况下观察到的相比时，获得至少20％或优选30％，更优选40％或更高(即，50％或80％)的腺苷减少而定义，包括本领域技术人员考虑的其它临床指标。

而且，单数术语在说明书中的方便使用决不是为了限制。因此，例如，包含酶(an enzyme)的组合物是指一个或多个分子的该酶。还应理解本发明不限于本文公开的具体构型、方法步骤和材料，这些构型、方法步骤和材料可稍加修改。

还应理解本文使用的术语仅是用于描述具体实施方案的目的，不是为了限制，因为本发明的范围将由所附权利要求和其等价物而限定。

B.重组产生的ADA酶

为获得重组ADA酶(包括由人或牛源基因表达的酶)的最初努力，揭露了之前在源自牛肠的天然ADA中未观察到的储存不稳定性。进行了rhADA和rbADA的分解产物的研究，且证实两种ADA酶以与半胱氨酸降解一致的方式降解。例如，向rhADA添加氧导致亲水性比rhADA更大的化合物的形成，该化合物的质量比rhADA高16和32Da。此外，这导致二硫醇的形成(通过添加二硫苏糖醇[“DTT”，将亚群的降解剂逆转而指示)；随着pH增加降解增加；沉淀，尤其是随pH增加且样品浓缩时，表明分子间二硫键形成产生不溶的聚集物。

我们已确定单一、暴露的半胱氨酸是观察到的rhADA降解的原因。牛ADA(未降解的)具有与rhADA非常类似的结构：牛ADA和rhADA在基本序列的相同位置都具有相同数量的半胱氨酸。rbADA还包含与半胱氨酸反应性一致的降解剂/杂质(二硫醇)。天然牛ADA在结构上不同于rbADA：天然牛ADA具有单摩尔的半胱氨酸键合至每摩尔ADA，且天然牛ADA对高pH稳定，表明键合至ADA的半胱氨酸的功能为保护基。键合至天然牛ADA的半胱氨酸可通过用还原剂，如巯基乙醇或DTT处理而去除。不希望被任何理论或假说束缚，这表明半胱氨酸基团通过二硫键缀合至ADA，如下所示：

ADA-S-S-半胱氨酸

其中ADA的基本序列中的一个半胱氨酸键合至半胱氨酸分子。该二硫键接合的半胱氨酸对第一段所述的氧化降解途径稳定。半胱氨酸残基出现在人和牛的成熟ADA的74，152，153，168和261位。对X射线晶体学得到的牛ADA的3-维结构的观察(Kinoshita等人，2005，Biochemistry，44：10562-10569)表明在74，152，153，168和261位的半胱氨酸没有机会接合形成分子内二硫键。已知结构几何位阻通常阻止附近的半胱氨酸残基接合形成二硫键，如出现在ADA的152和153位的那些。因此，所有半胱氨酸残基可能为还原状态，且因此是氧化降解反应的潜在候选位点。然而，可视观察上述牛ADA的3-维结构表明，相比另外4个半胱氨酸，半胱氨酸74以更大的程度清楚地暴露于溶剂，而且，似乎另外4个半胱氨酸以能防止与溶剂化的反应物的显著相互作用的程度埋藏在酶结构内(条件是蛋白质未变性)。单一反应性半胱氨酸残基的存在将解释天然牛腺苷脱氨酶的单衍生化(monoderivatization)，其可能是由于翻译后修饰的结果。

上述事实表明在74位的反应性半胱氨酸可能是在rhADA和rbADA中观察到降解的原因，且封端半胱氨酸的反应性-S-H基团将防止rhADA或rbADA经历对于那些重组酶观察到的明显的氧化降解途径。进行以下实验以确定是否是这种情况。在37℃将浓度为约0.6mg/mL的重组hADA与125mM碘乙酰胺(IAA)在pH 7.4的磷酸钠缓冲液中反应16小时。开始反应几分钟内，通过有UV和质谱检测的RP-HPLC的样品分析显示约70.9％的rhADA被IAA单衍生化，且17.2％在两个位点衍生化。在孵育2和16小时后，色谱图形没有明显变化，表明该衍生物对rhADA典型的氧化降解途径是稳定的。制备rhADA的类似样品(缺失IAA)，并类似地进行分析。在37℃和pH 7.4孵育16小时后，该rhADA蛋白降解至30％的程度(超过样品最初的降解)。该结果与单个、主要暴露的半胱氨酸一致，该半胱氨酸可通过用碘乙酰胺封端而保护。这些实验在共同拥有的美国专利申请序列号11/738,012中更详细的描述，其名称为，″Stabilized Proteins，″在此引入作为参考，如上引用。

尽管封端对消除ADA中反应性半胱氨酸的氧化降解有效，但使用这种封端的酶需要增加制备步骤。因此，对通过用不同的氨基酸代替从编码基因直接消除不稳定的Cys残基进行了研究。合适的替换氨基酸是不进行相同类型氧化的氨基酸，且其不会破坏折叠的ADA蛋白的三级结构，且在本发明的典型实施方案中，其经选择从而在缀合物形成的过程中不会随机缀合至活化的聚环氧烷(polyalkylene oxide)。根据本发明，认为任何满足该标准的现有技术已知的天然存在的氨基酸和/或非天然存在的氨基酸和/或其衍生物都适于代替可氧化的半胱氨酸。该氨基酸的示例性列表包括天然存在的L-氨基酸如：丙氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、赖氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、天冬酰胺、脯氨酸、谷氨酰胺、精氨酸、丝氨酸、苏氨酸、缬氨酸、色氨酸和酪氨酸。色氨酸和蛋氨酸相对容易氧化，在某些任选实施方案中，其为较不优选的。

在宿主细胞中位点特异性掺入非天然氨基酸的重组蛋白质的制备方法已在文献中有描述，例如，Liu等人，2007，Nat.Methods 4(3)：239-44，Xie等人，2006Nat.Rev.Mol.Cell.Biol.7(10)：775-82，Ryu等人，2006，Nat.Methods3(4)：263-65，Deiters等人，2004，Bioorg.Med.Chem Lett.14(23)：5743-5，Bogosian等人，1989，J.Biol.Chem.264(1)：531-9，Tang等人，2002，Biochemistry 41(34)：10635-45，Budisa等人，1995，Eur.J.Biochem.230(2)：788-96，和Randhawa等人，1994，Biochemistry，33(14)：4352-62。因此，替代氨基酸也可包括修饰的或较不典型的氨基酸，如：2-氨基己二酸、3-氨基己二酸、β-丙氨酸、β-氨基丙酸、2-氨基丁酸、4-氨基丁酸、哌啶酸、6-氨基己酸、2-氨基庚酸、2-氨基异丁酸、3-氨基异丁酸、2-氨基庚二酸、2，4二氨基丁酸、锁链素、2，2’-二氨基庚二酸、2，3-二氨基丙酸、N-乙基甘氨酸、N-乙基天冬酰胺、羟基赖氨酸、别羟基赖氨酸、3-羟基脯氨酸、4-羟基脯氨酸、异锁链素、别异亮氨酸、N-甲基甘氨酸、肌氨酸、N-甲基异亮氨酸、6-N-甲基赖氨酸、N-甲基缬氨酸、正缬氨酸、正亮氨酸和鸟氨酸。

在重组ADA中任选代替半胱氨酸的更优选的天然存在的氨基酸，包括，例如，丙氨酸、丝氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、甘氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、酪氨酸和缬氨酸。最优选丝氨酸，且在下文示例。

因此，获得表达野生型人和牛腺苷脱氨酶的DNA分子并进行密码子优化以在大肠杆菌中表达，且还进行突变以表达在各个成熟蛋白的74位(翻译的蛋白质的75位)各自含有Ser残基代替天然存在的Cys残基的突变蛋白rbADA和突变蛋白rhADA。这些分别为Ser₇₄-rbADA(SEQ ID NO：1)和Ser₇₄-rhADA(SEQ ID NO：3)。此外，应注意从牛肠分离的天然牛ADA也具有6个翻译后从C-末端去除的残基。本发明的Ser₇₄-rbADA表达没有所述6个C-末端残基(作为突变蛋白)，或被翻译后修饰以去除纯化的天然牛ADA缺少的相同的C-末端残基，这是本发明的任选特征。

还应注意，从牛肠分离的天然牛ADA具有多态性：关于SEQ ID NO：5，牛ADA多态性包括，例如，谷氨酰胺在198位代替赖氨酸、丙氨酸在245位代替苏氨酸；精氨酸在351位代替甘氨酸。因此认为本发明的重组74位突变蛋白牛ADA，还可在一个或多个所关注的位置或那些位置的类似位置具有其它取代：Gln代替Lys₁₉₈；Ala代替Thr₂₄₅；Arg代替Gly₃₅₁。

在本发明另一方面，本发明提供分离的DNAs，其编码具有本文所述的氨基序列SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3的突变蛋白ADA。其它用一种或多种取代而编码突变蛋白ADA的DNAs：Gln代替Lys₁₉₈；Ala代替Thr₂₄₅；Arg代替Gly₃₅₁也认为在本发明的范围内。

合适的表达载体可分别从编码rhADA或rbADA的基因组或cDNA制备，其任选在合适的可操作连接的诱导型启动子的控制下。该DNA优选是为合适的宿主细胞优化的密码子且通过任何现有技术已知的便利方法突变，例如，通过高效寡核苷酸-定向的诱变(Olsen DB和Eckstein F，Proc Natl Acad SciUSA 87：1451-5；1990)，具有重叠长寡核苷酸的全基因合成(Vasantha N和Filpula D，Gene 76：53-60；1989)，PCR介导的基因合成(Jayaraman K等人，Proc Natl Acad Sci USA 88：4084-88；1991)，或重叠延伸PCR(Pogulis RJ等人，Methods Mol Biol 57：167-76；1996)。

通常，原核生物对于初始克隆DNA序列和构建本发明使用的载体是优选的。例如，大肠杆菌K12菌株MM 294(ATCC号31，446)是特别有用的。可使用的其它微生物菌株，仅仅是作为实例，包括大肠杆菌菌株如大肠杆菌B和大肠杆菌X1776(ATCC号31，537)。可使用上述菌株，以及，例如，大肠杆菌菌株W3110(F-，λ-，原养型，ATCC号27,325)，K5772(ATCC号53,635)，和SR101，芽孢杆菌属如枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，和其他肠杆菌科如鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)或粘质沙雷氏菌(Serratia marcesans)和各种假单胞菌属菌种。

通常，含复制子和控制序列(其源自与宿主细胞相容的种类)的质粒载体与这些宿主关联使用。常规质粒载体是优选用下述酶识别位点工程化的双链环状DNA分子，该酶识别位点适于插入外源性DNA序列，抗生素可选基因，用于在宿主细胞中自主繁殖的复制起点，和用于鉴别或选择包含重组插入DNA的克隆的基因。适用于大肠杆菌的可用质粒载体包括，例如，pET3，pET9，pET11和延长的pET系列(由Novagen Corporation编目)，pBAD，trc，phoA，trp，和O_L/R/P_L/R质粒。

仅仅是作为实例，大肠杆菌通常使用由大肠杆菌菌种得到的质粒pBR322转化(参见，例如，Bolivar等人，1977，Gene，2：95)。pBR322包含氨苄青霉素和四环素抗性基因且因此提供鉴定转化细胞的简单方法。类似的，pUC质粒提供便利的克隆载体，其具有用于选择和复制的DNA分子(Yanisch-Perron，等人，1985，Gene 33：103-119，其公开内容以其整体在此引入作为参考)。该pBR322质粒，或其它微生物质粒或噬菌体，也必须包含，或被修饰而包含启动子，该启动子可被微生物有机体用于表达其自己的编码的蛋白质。

在重组DNA构建中最经常使用的那些启动子包括β-内酰胺酶(青霉素酶)和乳糖启动子体系(Chang等人，1978Nature，375：615；Itakura等人，1977，Science，198：1056；Goeddel等人，1979，Nature，281：544)和色氨酸(trp)启动子体系(Goeddel等人，1980，Nucleic Acids Res.，8：4057；EPO申请公开号0036,776)。尽管最经常使用这些，但已发现和使用其它微生物启动子，且关于它们的核苷酸序列的具体详情已被公开，使得技术人员可将它们与本领域已知的载体，例如，质粒载体功能性连接。

仅仅是作为实例，大肠杆菌中的转录调节可用任何以下诱导型启动子实现：lac，trp，phoA，araBAD，T7，trc，和λP_L和P_R启动子的衍生物，以及本领域已知的其它诱导型启动子(例如，Makrides，1996，Microbiol.Rev.60：512-538，其公开内容以其整体在此引入作为参考)。

任选与载体相容的合适的诱导子条件包括，例如，阿拉伯糖，乳糖，或热诱导，磷酸盐限制(phosphate limitation)，色氨酸限制(tryptophan limitation)，仅举数例。优选地，该诱导子元件为Lac操纵子，其可被异丙基硫代半乳糖苷(″IPTG″)诱导。

合适的信号序列(信号肽)可源自pelB，fd pIII或ompA。

合适的抗生素选择标记是本领域熟知的且包括，例如，赋予氨苄青霉素、卡那霉素、氯霉素、利福平或四环素抗性的那些，等。

合适的复制起点序列包括以下质粒中所发现的那些：pUC19，pACYC177，pUB110，pE194，pAMB1，pIJ702，pBR322，pBR327和pSC101。

合适的终止序列包括，例如，噬菌体fd主要终止子(major terminator)，TΦ和rrnB。

除了原核生物，还可使用真核微生物，如酵母培养物。酿酒酵母或普通的面包酵母是真核微生物中最经常使用的，虽然通常也可使用多种其它菌株。为在酵母属(Saccharomyces)中表达，通常使用质粒YRp7，例如(Stinchcomb等人，1979，Nature，282：39；Kingsman等人，1979，Gene，7：141；Tschemper等人，1980，Gene，10：157)。该质粒已包含trp1基因，该trp1基因提供用于缺乏在色氨酸中生长能力的酵母的突变株的选择标记，例如，ATCC号44,076或PEP4-1(Jones，1977，Genetics，85：12)。然后作为酵母宿主细胞基因组特征的trp1损伤的存在提供有效的环境用于通过在色氨酸不存在的情况下的生长来检测转化。

已显示巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)表达体系实现获得几种蛋白质的高水平产生(Cregg，J.M.等人，1993，Bio/Technology 11：905-910，其公开以其整体在此引入作为参考)，且可用于表达ADA作为在巴斯德毕赤酵母的细胞质中的可溶蛋白质。

酵母载体中合适的启动序列包括3-磷酸甘油酸激酶的启动子(Hitzeman等人，J.1980，Biol.Chem.，255：2073)或其它糖酵解酶(Hess等人，1968，J.Adv.Enzyme Reg.，7：149；Holland等人，1978，Biochemistry，17：4900)，如烯醇化酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、己糖激酶、丙酮酸脱羧酶、磷酸果糖激酶、葡萄糖-6-磷酸异构酶、3-磷酸甘油酸变位酶、丙酮酸激酶、磷酸丙糖异构酶、磷酸葡萄糖异构酶和葡糖激酶。在构建合适的表达质粒中，与这些基因相关的终止序列也连接至序列的表达载体3′，该序列需要被表达以提供mRNA的聚腺苷酸化和转录终止。其它具有由生长条件控制的转录的其它优点的启动子是以下的启动子区域：乙醇脱氢酶2(alcohol dehydrogenase 2)、异细胞色素C、酸性磷酸酶、与氮代谢相关的降解性酶、和上述甘油醛-3-磷酸脱氢酶，以及负责麦芽糖和半乳糖利用的酶。任何含与酵母相容的启动子、复制起点和终止序列的质粒载体都是适合的。

复制起点可通过构建载体以包括外源起点，如可源自SV40或其它病毒(例如，Polyoma，Adeno，VSV，BPV)来源的外源起点来提供，或可通过宿主细胞染色体复制机理而提供。如果载体整合入宿主细胞染色体中，后者通常是足够的。其它有用的质粒元件可包括表达的编码侣伴蛋白质、脯氨酸异构酶蛋白质或二硫键重排的(disulfide shuffling)蛋白质的基因。

C.聚合缀合物(polymer conjugate)

在本发明另一方面，该突变蛋白ADA如Ser₇₄-rbADA(SEQ ID NO：1)和Ser₇₄-rhADA(SEQ ID NO：3)蛋白质缀合至合适的聚合物以制备聚合缀合物。

在优选方面，该突变蛋白ADA多肽缀合至基本(substantially)非抗原性聚合物，优选聚环氧烷(″PAO″)。

该ADA-聚合缀合物通常相应于式(I)：

(I)[R-NH]_z-(ADA)

其中

(ADA)表示重组突变蛋白腺苷脱氨酶或其活性片段；

NH-为在用于连接至聚合物的突变蛋白ADA上的氨基酸的氨基；

(z)为正整数，优选约1至约80，更优选约5至约80，还更优选约11至约18；且

R包括基本非抗原性聚合物残基，其以可释放或不可释放的形式连接至ADA。

在更优选的方面，该聚合物包括聚乙二醇(PEG)，其中所述PEG可为直链、支链或多臂的PEG。通常，聚乙二醇具有下式：

-O-(CH₂CH₂O)_n-

其中(n)为正整数，优选约10至约2,300，更优选约40至约2,300。聚合物的平均分子量为约2,000至约100,000Da。更优选地，该聚合物的平均分子量为约4,000Da至约45,000Da，还更优选地，4,000Da至约20,000Da。最优选地，该PEG为约5,000道尔顿。其它分子量也在考虑范围内以满足技术人员的需要。

或者本发明的聚乙二醇(PEG)残基部分可由以下结构表示：

-Y₁₁-(CH₂CH₂O)_n-CH₂CH₂Y₁₁-，

-Y₁₁-(CH₂CH₂O)_n-CH₂C(＝Y₁₂)-Y₁₁-，

-Y₁₁-C(＝Y₁₂)-(CH₂)_a11-Y₁₃-(CH₂CH₂O)_n-CH₂CH₂-Y₁₃-(CH₂)_a11-C(＝Y₁₂)-Y₁₁-，

-Y₁₁-(CR₁₁R₁₂)_a12-Y₁₃-(CH₂)_b11-O-(CH₂CH₂O)_n-(CH₂)_b11-Y₁₃-(CR₁₁R₁₂)_a12-Y₁₁-，

-Y₁₁-(CH₂CH₂O)_n-CH₂CH₂-，

-Y₁₁-(CH₂CH₂O)_n-CH₂C(＝Y₁₂)-，

-C(＝Y₁₂)-(CH₂)_a11-Y₁₃-(CH₂CH₂O)_n-CH₂CH₂-Y₁₃-(CH₂)_a11-C(＝Y₁₂)-，和

-(CR₁₁R₁₂)_a12-Y₁₃-(CH₂)_b11-O-(CH₂CH₂O)_n-(CH₂)_b11-Y₁₃-(CR₁₁R₁₂)_a12-，

其中：

Y₁₁和Y₁₃独立地为O，S，SO，SO₂，NR₁₃或键；

Y₁₂为O，S，或NR₁₄；

R_11-14独立地选自氢、C_1-6烷基、C_2-6烯基、C_2-6炔基、C_3-19支链烷基、C_3-8环烷基、C_1-6取代的烷基、C_2-6取代的烯基、C_2-6取代的炔基、C_3-8取代的环烷基、芳基、取代的芳基、杂芳基、取代的杂芳基、C_1-6杂烷基、取代的C_1-6杂烷基、C_1-6烷氧基、芳基氧基、C_1-6杂烷氧基、杂芳基氧基、C_2-6烷酰基、芳基羰基、C_2-6烷氧基羰基、芳基氧基羰基、C_2-6烷酰基氧基、芳基羰基氧基、C_2-6取代的烷酰基、取代的芳基羰基、C_2-6取代的烷酰基氧基、取代的芳基氧基羰基、C_2-6取代的烷酰基氧基和取代的芳基羰基氧基；

(a11)，(a12)和(b11)独立地为0或正整数，优选0-6，且更优选0，1或2；和

(n)为约10至约2300的整数。

作为实例，该PEG可以以下述非限制性方式起作用：

-C(＝Y₁₄)-(CH₂)_m-(CH₂CH₂O)_n-，

-C(＝Y₁₄)-Y-(CH₂)_m-(CH₂CH₂O)_n-，

-C(＝Y₁₄)-NR₁₁-(CH₂)_m-(CH₂CH₂O)_n-，

-CR₁₅R₁₆-(CH₂)_m-(CH₂CH₂O)_n-

其中

R₁₁、R₁₅和R₁₆独立地选自H、C_1-6烷基、芳基、取代的芳基、芳烷基、杂烷基、取代的杂烷基和取代的C_1-6烷基；

(m)为0或为正整数，且优选1或2；

Y₁₄为O或S；且

(n)表示聚合度。

在这些方面，该聚合物(R基)包括封端基团，即，在聚合物的末端的基团。该封端基团可选自以下的任一种：NH₂、OH、SH、CO₂H、C_1-6烷基，优选甲基，这些基团是本领域技术人员所理解的。

在另一方面，该缀合物的聚合物部分可以是为ADA提供多个连接点中的一个。或者多个PEG可连接至ADA。

PEG化的ADA的药代动力学和其它特性可通过控制PEG分子量、连接基化学物(linker chemistry)和PEG链与酶的比例按需要调节以用于所需的临床应用。

在这些方面，该ADA可以以可释放或不可释放的形式通过本领域已知的多种连接基连接至非抗原性聚合物。

该可释放聚合物体系可基于苄基消除或三甲基锁内酯化(locklactonization)。可释放聚合物体系的活化的聚合物连接基可根据共同授让的美国专利号6,180,095，6,720,306，5,965,119，6,624,142和6,303,569而制备，其内容在此引入作为参考。或者该ADA聚合缀合物使用某些N-二(羟乙基)甘氨酸(bicine)聚合物残基制备，如描述于共同授让的美国专利号7,122,189和7,087,229和美国专利申请号10/557,522，11/502,108和11/011,818的那些，在此引入作为参考。其它考虑的可释放聚合物体系也描述于PCT/US07/78600，其内容在此引入作为参考。

本文考虑的可释放或不可释放ADA聚合缀合物的示例性实例描述于美国专利申请号60/913,039，其内容在此引入作为参考。

聚合物缀合优选为PEG化反应，这些反应对于本领域技术人员是已知的。简言之，突变蛋白rbADA或rhADA与活化的聚合物反应以形成ADA-聚合缀合物。在这点上，可使用多种活化的或官能化的(functionalized)聚乙二醇，包括描述于例如共同授让的美国专利号5,122,614，5,324,844，5,612,460和5,808,096(琥珀酰亚胺基碳酸酯-活化的聚乙二醇(SC-PEG)和相关活化的PEG′s)，美国专利号5,349,001(环状亚胺硫酮(cyclic imide thione)活化的PEG′s)，美国专利号5,650,234，和其它本领域技术人员已知的那些。上述每个的公开内容在此引入作为参考。还参见从Nektar/Shearwater Polymers得到的活化的聚合物。本领域技术人员可使用多种活化形式的用于连接的聚合物，而没有过多的实验。

如本领域技术人员所理解，这些缀合反应通常在合适的缓冲液中使用几倍摩尔过量的活化的PEG而进行。一些优选用直链PEG(如上述SC-PEG)制备的缀合物每个ADA酶可包含平均约10至约80个PEG链。因此，可使用几百倍摩尔过量，例如，200-1000倍。用于支链PEG和连接至酶的PEG的摩尔过量将是较低的，且可使用本文所述的描述它们的专利和专利申请中描述的技术而确定。

在这些方面，该聚环氧烷通过连接基化学物缀合至蛋白质，该连接基化学物包括，例如，琥珀酰亚胺基碳酸酯、噻唑烷硫酮、尿烷和基于酰胺的连接基。该聚环氧烷优选共价连接至ADA上的Lys的ε氨基，虽然其它共价连接的位点是本领域已知的。该ADA聚合缀合物可包括至少5个聚乙二醇链连接至酶上的Lys的ε氨基，但也可包括约11-18个PEG链连接至酶上的Lys的ε氨基。

尽管ADA每个酶分子通过赖氨酸连接缀合约11至约18个PEG分子，但可改变PEG与ADA的比例以修改组合的缀合物的物理和动力学特性以适合任何具体临床情形。

从上述可明显地是本发明的其它方面包括使用任何可商购的或报道的活化的PEG或类似聚合物缀合ADA酶或其片段，以提供本文所述的治疗方法中使用的缀合物。参见，例如，Nektar Advanced Pegylation目录，2004(Nektar，San Carlos，California)，以其整体在此引入作为参考.

活化的PEGs可包括直链、支链的或U-PEG衍生物如描述于美国专利号5,681,567，5,756,593，5,643,575，5,919,455，6,113,906，6,566,506，6,153,655，6,395,266和6,638,499，6,251,382和6,824,766的那些(也在此引入作为参考)。该聚合物的非限制性实例相应于具有以下结构的聚合物体系(i)-(vii)：

其中：

Y_61-62独立地为O，S或NR₆₁；

Y₆₃为O，NR₆₂，S，SO或SO₂

(w62)，(w63)和(w64)独立地为0或正整数，优选约0至约10，更优选约1至约6；

(w61)为0或1；

mPEG为甲氧基PEG

其中PEG如之前定义且聚合物部分的总分子量为约2,000至约100,000道尔顿；且

R₆₁和R₆₂独立地为与可用于R₁₁的相同的部分。

还应理解除了PEG-基聚合物，还可使用多种其它聚环氧烷。例如，本发明的缀合物可通过以下方法制备，其包括转化如以下描述的多臂PEG-OH和“星状(star)-PEG”产物：Shearwater Corporation’s 2001目录″PolyethyleneGlycol and derivatives for Biomedical Application″。还参见NOF Corp.DrugDelivery System目录，Ver.2006年4月8日。其每一个的公开在此引入作为参考。该多臂聚合物包含4个或更多个聚合物臂且优选4或8个聚合物臂。出于解释而不是限制的目的，该多臂聚乙二醇(PEG)残基可为下式：

其中：

(x)为0和正整数，即约0至约28；且

(n)为聚合度。

在本发明一个具体实施方案中，该多臂PEG具有以下结构：

其中(n)为正整数。在本发明一个优选实施方案中，该聚合物的总分子量为约2,000Da至约100,000Da，且优选4,000Da至45,000Da。

在另一具体实施方案中，该多臂PEG具有以下结构：

其中n为正整数。在本发明一个优选实施方案中，该聚合物的总分子量为约2,000Da至约100,000Da，且优选4,000Da至45,000Da.

该聚合物可转化为适当活化的聚合物，使用描述于美国专利号5,122,614或5,808,096的活化技术。具体地，该PEG可为下式：

其中：

(u’)为约10至约570的整数，以优选提供总分子量为约2,000Da至约100,000Da的聚合物，且优选地，约4,000Da至约45,000Da；且残基的至多3个末端部分被甲基或其它低级烷基封端。

在一些优选的实施方案中，PEG的所有4个臂转化为合适的官能团，即SC，等，以促进连接至重组蛋白质。该转化前的化合物包括：

在本发明最优选的方面，该活化的聚乙二醇提供与蛋白质的尿烷连接或酰胺-连接。

在其它方面，活化的聚合物可使用受阻的酯-基(hindered ester-based)连接基。参见PCT/US07/78593，名称为“polyalkylene Oxides Having HinderedEster-based Biodegradable Linkers”，其内容被引入作为参考。例如，该化合物的非限制性实例包括：

其中(u)为整数以优选提供总分子量为约2,000Da至约100,000Da的聚合物。

在一个优选实施方案中，该PEG缀合物包括

其中(u)为整数以提供聚合部分的分子量为约2,000Da至约100,000Da，且优选约4,000Da至约45,000Da，还更优选约5,000Da。

合适的聚合物的重量将明显改变。为了本发明的目的通常选择具有数均分子量为约2,000至约100,000的聚合物。优选分子量为约4,000至约45,000且特别优选5,000至约12,000。所包含的聚合物质还优选在室温是水溶性的。该聚合物的非限制性实例包括聚环氧烷均聚物，如聚乙二醇(PEG)或聚丙二醇，聚氧乙烯化多元醇，其共聚物及其嵌段共聚物，条件是保持嵌段共聚物的水溶性。除了mPEG，还可使用C_1-4烷基-末端的聚合物。

制备高纯度的具有末端羧酸的聚合物的方法描述于美国专利申请号11/328,662，其内容在此引入作为参考。该方法包括首先制备聚环氧烷的叔烷基酯，然后转化为其羧酸衍生物。该方法制备PAO羧酸的第一步骤包括形成中间体如聚环氧烷羧酸的叔丁基酯。该中间体通过将PAO与卤代乙酸叔丁酯在碱如叔丁醇钾的存在下反应而形成。一旦该叔丁基酯中间体形成，聚环氧烷的羧酸衍生物可易于以超过92％，优选超过97％，更优选超过99％且最优选超过99.5％的纯度形成。

在其它方面，可使用具有末端胺基团的聚合物以制备ADA缀合物。以高纯度制备含末端胺的聚合物的方法描述于美国专利申请号11/508,507和11/537,172中，其每个的内容被引入作为参考。例如，具有叠氮的聚合物与膦-基还原剂如三苯基膦或碱金属硼氢化物还原剂如NaBH₄反应。或者包含离去基团的聚合物与保护的胺盐如亚氨二甲酸甲基-叔丁基酯(methyl-tert-butylimidodicarbonate)的钾盐(KNMeBoc)或亚氨二甲酸二叔丁酯的钾盐(KNBoc₂)反应，然后脱保护受保护的胺基。由这些方法形成的含该末端胺的聚合物的纯度大于约95％且优选大于99％。

以上引用的6,153,655专利的聚合物具有的分支，提供了二级分支或三级分支，作为从连接的单点增加生物活性分子上的聚合物负载的方式。应理解如果需要水溶性聚合物可被官能化以连接至双官能连接基，而不需多余的实验。

在此包含的聚合物质优选在室温为水溶性。该聚合物的非限制性实例包括聚环氧烷均聚物如聚乙二醇(PEG)或聚丙二醇，聚氧乙烯化多元醇，其共聚物及其嵌段共聚物，条件是保持嵌段共聚物的水溶性。

作为PAO-基聚合物的替代物，可使用有效的非抗原性物质如葡聚糖，聚乙烯吡咯烷酮，聚丙烯酰胺如HPMA′s(羟基丙基甲基丙烯酰胺)，聚乙烯醇，碳水化合物-基聚合物，上述的共聚物等。本领域普通技术人员将认识到上述举例仅为解释性的，且所有具有本文所述性质的聚合物材料都在考虑范围。就本发明而言，“基本上或有效的非抗原性”是指本领域理解的所有材料都为无毒的且不在哺乳动物中引起可感知的免疫源应答。

D.应用

技术人员将理解本发明的突变蛋白ADA易于在临床环境使用，用于治疗对ADA酶响应的任何疾病或病症。该疾病或病症是响应于腺苷或脱氧腺苷的组织或血液水平减少的疾病。该疾病或病症可包括，例如，SCID，肺疾病，例如，哮喘和响应于局部或全身腺苷或脱氧腺苷水平降低的癌症。有关ADA在治疗肿瘤或癌症中的用途的更详细描述由同一天(even date)提交的共同拥有的美国序列号____提供(其要求美国临时专利申请序列号60/913,039的优先权的权益)，名称为：“Enzymatic Anticancer Therapy，且以其整体在此引入作为参考。治疗剂可为，例如，突变蛋白rhADA或突变蛋白rbADA酶。优选地，该治疗性突变蛋白rADA为聚合物-缀合的，如上所述，例如，PEG酰化的。ADA或聚合物-缀合的ADA的剂量根据肿瘤的临床响应和个体患者(无论动物或人)的副作用特性而不同。在以下提供的实施例研究中，最高剂量为耐受的最大可行剂量。

例如，

以250U牛ADA/mL商业提供。对于用0.2ml注射的约25g小鼠这相当于2000U/kg。当然，技术人员将理解聚合物-缀合的ADA的剂量也可根据具体聚合物大小、连接基化学物以及价态而调节。例如，对于每个聚合物包含两个或更多个ADA酶的聚合缀合物，其给药方案将根据任何具体的ADA聚合缀合物的每ml溶液中ADA的单位而调节。

在通过注射提供ADA或ADA PEG-缀合物时，最佳剂量范围优选通过血浆监测设定。通常需要向接受者提供以下剂量，其将保持血浆ADA活性(整体水平(trough levels))为约10至100μmol/hr/mL，优选约15至约35μmol/hr/mL(在37℃测试)；且证实红细胞腺苷的下降，即，在浓缩的红细胞(packed erythrocyte)中dATP至≤约0.001-0.057μmol/mL，优选约0.005-约0.015μmol/mL，或≤约1％的总红细胞腺苷(即，ATP+dATP含量)具有正常腺苷水平，如在预注射样品中测量的。dATP的正常值低于约0.001μmol/mL。

基于酶的量的剂量范围将为，例如，约0.10U/kg至约30U/kg，或更高，优选约0.5U/kg至约20U/kg，且更优选约0.5U/kg至约12U/kg(即每kg患者体重)如约0.5U/kg至约5U/kg。总周剂量可高达40U/kg，或更多，只要接受者耐受。5U/kg/周的进一步增加是允许的，直到最大单次剂量为30U/kg，或更多，只要接受者耐受。通常，以15U/kg每周注射

后，血浆中ADA活性的平均整体水平为20至25μmol/hr/mL。

应注意100U/kg的剂量为约12U/kg的临床儿童剂量的小鼠等效剂量。

ADA剂量信息的详情是现有技术已知的，如

(Enzon，Inc.)中的处方插页中所描述，其内容在此引入。

实施例

以下实施例用来提供对本发明的进一步理解，但不以任何方式限制本发明的有效范围。

实施例1

表达重组人ADA的大肠杆菌表达菌株的构建，其在成熟蛋白的74位具有Cys至Ser的变化

分析报道的人腺苷脱氨酶的363氨基酸序列(GenBank NP_000013，在此引入作为参考)的半胱氨酸密码子的存在。成熟(N-末端的Met被切割)多肽中的5个位置编码半胱氨酸(C74，C152，C153，C168，C261)。在表达人ADA的设计的和修饰的基因中，这5个半胱氨酸密码子中仅1个(半胱氨酸74，TGC)改变为丝氨酸密码子(TCC)(其为翻译的蛋白质的75位)。使用重叠寡核苷酸片段的标准化学合成，将限定的多肽序列(参见SEQ ID NO：3)提供给Blue Heron Corporation(Bothell，Washington，U.S.A.)用于新基因的全基因合成，该新基因具有为在大肠杆菌中表达而优化的密码子。简言之，按照大肠杆菌K12的标准细菌密码子优化该序列用于细菌表达，使用描述于以下的密码子数据：Grantham R.等人；1981，″Codon catalogue usage in genome strategymodulated for gene expressivity，″Nucleic Acid Res.9：r43-r47，和Lathe，R.1985，″Synthetic oligonucleotide probes deduced from amino acid sequence data，Theoretical and practical considerations.″J.Mol Biol；183：1-12。

然后分析相应的RNA序列的发夹结构的形成或环形成(loop formation)并进行最小自由能计算。侧翼限制位点NdeI和BamHI包含在基因的末端。在用限制酶NdeI和BamHI消化该合成DNA后，将1.1千碱基基因通过T4DNA连接酶连接至质粒载体pET-28a(Novagen Corporation)，该质粒载体pET-28a也已用这两种酶消化。使用BTX Electro Cell Manipulator 600根据制造商的说明通过电穿孔将重组质粒引入大肠杆菌菌株BLR(DE3)或HMS174(DE3)中。将转化混合物铺板于含卡那霉素(15μg/ml)的LB琼脂平板上，以允许选择含质粒pET-28a/ADAcysSer(命名为ADAc75s/pET28a：BLR(DE3)或ADAc75s/pET28a：HMS174(DE3))的菌落。该ADA变体基因核苷酸序列用ABI Prism 310 Genetic Analyzer使用Big Dye Terminators通过DNA序列分析证实。该编码Ser₇₄-rhADA可读框的DNA序列根据SEQ ID NO：4。

分离的菌落进一步通过铺板纯化并分析在LB培养基中异丙基β-D-1-硫代半乳吡喃糖苷(“IPTG”)可诱导的基因表达，其通过标准方法如描述于Novagen pET System Manual Ninth Edition的方法进行，在此引入作为参考。

检测了多个诱导参数，包括时间、温度和诱导剂浓度。优选条件是在25℃用50μM IPTG诱导12小时，其使得在宿主细菌的细胞质内以约总细胞蛋白质的约20％高水平产生ADA。表达的ADA蛋白在SDS PAGE分析中确证，显示正确分子量为约40kDa(数据未显示)。

实施例2

表达重组牛ADA的大肠杆菌表达菌株的构建，在成熟蛋白的74位具有Cys至Ser的变化

源自牛肠制备物的纯化的成熟ADA蛋白为从cDNA序列预测缺失N-末端蛋氨酸且还缺失最后6个C-末端残基的356氨基酸蛋白质(GenBankNP_776312，在此引入作为参考)。分析牛ADA氨基酸序列的半胱氨酸密码子的存在。成熟多肽中的5个位置编码半胱氨酸(C74，C152，C153，C168，C261)。在设计的和修饰的牛ADA合成基因中，这5个半胱氨酸位置中仅1个(半胱氨酸74)改变为丝氨酸残基。这通过插入丝氨酸密码子(TCC)在成熟多肽的74位(或翻译产物的75位)的代替正常半胱氨酸密码子而进行。该基因也是为在大肠杆菌中表达而优化的密码子。

简言之，将限定的多肽序列(参见SEQ ID NO：1)提供给BioCatalytics Inc.用于全基因合成新的基因，该基因具有为在大肠杆菌中表达而优化的密码子，使用包括化学合成重叠寡核苷酸片段的方法进行。BioCatalytics方法由美国专利号6,366,860更详细的描述，其内容以其整体在此引入作为参考.

在几种表达体系中研究牛ADA表达。例如，该侧翼限制位点NdeI和BamHI包含在基因的末端。在用限制酶NdeI和BamHI消化该合成DNA后，该1.1千碱基基因通过T4DNA连接酶连接入质粒载体pET-9d(NovagenCorporation)，该质粒载体pET-9d也已用这两种酶消化。使用BTX ElectroCcll Manipulator 600根据制造商的说明通过电穿孔将重组质粒引入大肠杆菌菌株BLR(DE3)或HMS174(DE3)中。将转化混合物铺板于含卡那霉素(15μg/ml)的LB琼脂平板上，以允许选择含质粒pET-9d/bADA的菌落(命名为bADA/pET9d：BLR(DE3)或bADA/pET9d：HMS174(DE3))。该ADA变体基因核苷酸序列用ABI Prism 310Genetic Analyzer使用Big Dye Terminators通过DNA序列分析证实。该编码突变蛋白ADA的DNA分子由SEQ ID NO：2所示。

分离的菌落进一步通过铺板纯化并用于分析在LB培养基中IPTG可诱导的基因表达，其通过标准方法如描述于Novagen pET System Manual NinthEdition的方法进行。检测了几个诱导参数，包括时间、温度和诱导剂浓度。优选条件是在37℃用0.3％乳糖诱导12小时，其使得在宿主细菌的细胞质内以约总细胞蛋白质的约20％高水平产生ADA。ADA产物在SDS PAGE分析中确证，显示正确分子量为约40kDa。

实施例3

纯化突变蛋白rhADA蛋白

突变蛋白rhADA的纯化以Enzon开发的3色谱规程进行。进行大肠杆菌的细菌发酵，所述大肠杆菌由宿主细胞HMS174(DE3)中质粒pET28a(Novagen)上的合成基因表达rhADA蛋白。将利福平(200μg/ml)和卡那霉素(30μg/ml)包括在补充有酵母提取物(30g/l)的基本甘油培养基中，且当添加诱导剂IPTG至5mM最终浓度时将细胞在28℃生长至OD₆₀₀为11。40小时后(OD₆₀₀～110)，通过离心收获细胞并在-20℃冷冻。简言之，将解冻的细胞浆(50g)重悬浮于10mM Tris缓冲液[三羟基甲基氨基甲烷]，1mM DTT，pH 8.0的1800ml缓冲液中，并用Tempest Virtis(Sentry^TM，Microprocessor，Boston，MA)以1200RPM匀浆10秒。将该悬浮液通过不锈钢筛网(开孔微米数(Opening micrometer)250μ，No.60，W.S Tyler)以去除大颗粒。将均匀的细胞悬浮液在15,000psi微流化3个循环(设备用冰浴冷却)(Micro Fluidizer，Microfluidics Corp.，Model#110Y，Boston，MA)。在微流化结束时，将200ml上述相同的缓冲液用于冲洗该设备，且将该溶液与上述悬浮液合并。来自细胞裂解物的可溶蛋白质通过以16,000rpm在4℃离心40分钟而提取(

RC 5C plus，转子SLA-1000)。小心收集上清液以避免不希望的混合。将pH调节至8.0，且添加1mM MgCl₂和20mg/mL DNase并在室温培养2小时。然后将pH用1N HCl调节至6.5。如上进行第二次离心，收集上清液，且调节至2mM EDTA，然后在

90mm过滤装置上过滤。过滤的上清液的体积为500ml，通过BCA方法测定的总蛋白质浓度为8.5mg/ml。

将细胞提取物(100ml)调节至pH 7.2、4.5mS/cm，并加载至

DEAE ff(ff”表示“快速流动”)上，20mM Bis-Tris，20mM NaCl，pH 6.5，并用20mM Bis-Tris，500mM NaCl，pH 6.5洗脱。峰级分用酶测试和SDS-PAGE鉴定且调节至20mM NaHPO₄中的1.5M硫酸铵pH 6.5中，并装载在HiTrapPhenyl ff柱上。蛋白质用梯度负载缓冲液和20mM NaHPO₄，pH 6.5洗脱。将峰级分(55ml；0.4mg/ml)相对20mM NaHPO₄，1mM EDTA，1mM DTT，pH6.5渗滤，并装载在HiTrap SP-Sepharose ff上并用20mM NaHPO₄，500mMNaCl，1mM EDTA，1mM DTT，pH 6.5洗脱。收集的级分包含纯化的ADA蛋白(77ml；0.1mg/ml)。

实施例4

纯化重组牛ADA蛋白

实施例2的克隆所表达的突变蛋白rbADA的纯化以Enzon开发的3色谱规程进行。简言之，将储存于-80℃的200g解冻的细胞浆(分别获自BlueHereon或Biocatalytics)重悬浮于1800ml的20mM Bis-Tris，1mM EDTA，pH7.4缓冲液，且用Tempest Virtis(Sentry^TM，Microprocessor，Boston，MA)在1200RPM匀浆5分钟。将该悬浮液通过不锈钢筛网(开孔微米数250μ，No.60，W.S Tyler)以去除大颗粒。将均浆的细胞悬浮液以15,000psi微流化3个循环(设备用冰浴冷却)(Micro Fluidizer，Microfluidics Corp.，型号#110Y，Boston，MA)。在微流化结束时，将200ml上述相同的缓冲液用于冲洗该设备，且将该溶液与上述悬浮液合并。来自细胞裂解物的可溶蛋白质通过以7100rpm(12000×g)在4℃离心60分钟而提取(Avanti J-201，Beckman Coulter；Rotor#JLA8.1000)。小心收集上清液以避免不希望的混合。

为去除该细胞提取物中的核苷酸，将聚乙烯亚胺(PEI)添加至上述上清液中(最终0.15％，wt/v)并通过搅拌充分混合10分钟。然后将该细胞提取物在4℃静置过夜。该过夜样品中的沉淀物通过以7100rpm(12000xg)在4℃离心60分钟而去除(Avanti J-201，Beckman Coulter；Rotor#JLA8.1000)。类似的，小心收集上清液以避免任何不希望的混合。为帮助ADA结合至第一柱，将10％PEG4600缓慢添加至该细胞提取物且将该细胞提取物的pH用1N NaOH和1N HCl缓慢调节至6.5。在装载至下一柱前，将该上清液以7100rpm(12000xg)在4℃再离心60分钟(Avanti J-201，Beckman Coulter；Rotor#JLA8.1000)。

将细胞提取物加载至以20mM Bis-Tris，1mM EDTA，pH 6.5的缓冲液预平衡的Capto Q柱(Cat# 17-5316-01，GE Healthcare，Piscataway，NJ)上。柱床体积350ml预装在XK-50柱中)。在以平衡缓冲液中的80mM NaCl将ADA从柱中洗脱前，首先进行60mM和70mM NaCl的洗脱以去除杂质。通过ADA活性、SDS-PAGE分析、蛋白质印记和RP-HPLC分析洗脱图。

经过Capto Q柱后，使用两个疏水作用色谱(“HIC”)纯化，一个接一个，以进一步提高蛋白质的纯度。第一个HIC为辛基琼脂糖(Octyl Sepharose)4FF(Cat#17-0946-02，GE Healthcare，Piscataway，NJ)。将来自Capto Q柱的ADA级分的汇集物(pool)用硫酸铵粉末直接调节至1.5M(NH₄)₂SO₄并将pH调节至6.5。将过滤的样品(Nalgene Nunc，CAT #540887，MEMB 0.2 PES，Rochester，NY)加载至第一HIC柱，该柱用1.5M(NH₄)₂SO₄，20mM磷酸钾，1mM EDTA，pH 6.5预平衡(柱床体积150ml，于XK-50中，GE Healthcare，Piscataway，NJ)。该ADA蛋白用硫酸铵梯度液洗脱且该洗脱物的纯度状况通过SDS-PAGE和RP-HPLC测定。汇集第一HIC柱的级分中的ADA蛋白且调节至1M(NH₄)₂SO₄并直接加载至第二HIC柱(柱床体积150ml，XK-50，HIC Phenyl HP，Cat#17-1082-01，Piscataway，NJ)，该柱用1M(NH₄)₂SO₄，20mM KH₂PO₄-K₂HPO₄，1mM EDTA，pH 6.5预平衡。ADA用20mMKH₂PO₄-K₂HPO₄，1mM EDTA，pH 6.5中的1M至300mM硫酸铵梯度洗脱。这些级分的ADA纯度通过SDS-PAGE和RP-HPLC分析。纯化的rbADA或rhADA进一步在LabScale^TM TFF系统(Membrane BioMax 5，Bedford，MA)中相对储存缓冲液(例如，100mM磷酸钠，1mM EDTA，pH 6.5)脱盐和浓缩。

实施例5

关于rbADA和Ser74-rbADA的稳定性研究

进行以下研究以证实rbADA对于氧化降解的稳定性确实通过将cys74突变成ser而改善。重组牛ADA(rbADA)和从cys74突变成ser74的重组牛ADA(Ser₇₄-rbADA)的浓度为约0.5mg/mL于磷酸钠缓冲液(pH 7.8)中的样品用于稳定性研究。稳定性通过反相HPLC(RP-HPLC)使用在220nm的UV检测和质谱检测(Micromass Q-TOF电喷雾质谱仪)而监测。该HPLC条件如下：

柱： Zorbax 300SB-C8(Agilent，250 x 4.6mm，300埃

孔径，5微米粒径)。

流动相A： 0.1％三氟乙酸于水中。

流动相B： 0.1％三氟乙酸于乙腈/水(80/20；v/v)中。

梯度：时间％流动相B

0 20

5 20

45 80

46 20

60 20

柱温： 40℃

流速： 1.0mL/min

注射体积：50μL。

化合物的纯度在稳定性研究开始进行的初始时间和多个时间点(包括研究开始后的第4、8和17天)通过RP-HPLC分析测定。应注意该rbADA(非突变蛋白)样品在该研究开始时为约2个月龄，且已经经历了一些降解。该Ser₇₄-rbADA样品是新鲜制备的且相对纯。然而，出于本研究的目的，在初始时间点和在25℃孵育17天后之间的纯度差异为检测的相关参数。

如表1所示，rbADA的纯度在初始时间点为83.7％且17天后下降至66.1％，表明17.6％的rbADA在该期间降解。色谱分离的峰的质谱分析表明在31.851分钟洗脱的主要降解物占30.5％的色谱面积，其质量比rbADA的质量高32Da。该质量变化与在rbADA的74位向rbADA添加2个氧以形成游离半胱氨酸的亚磺酸(sulfinic acid)降解物一致。在32.538分钟洗脱的较小的降解物峰的质量与在rbADA的74位向rbADA添加1个氧以形成游离半胱氨酸的次磺酸(sulfenic acid)降解物一致。具有丝氨酸残基替换反应性半胱氨酸74残基的Ser₇₄-rbADA在17天的期间几乎没有降解，其纯度在初始时间点(97.2％)和17天后(97.9％)基本相同。这证明半胱氨酸74确实是rbADA中发生的氧化降解的来源，且该残基到丝氨酸的突变对氧化不敏感，消除了降解。

表1.在磷酸钠缓冲液(pH 7.8)中在25℃的rbADA和Ser₇₄-rbADA的稳定性

实施例6

突变蛋白ADA蛋白在治疗ADA-缺失SCID患者中的用途

所述突变的ADA酶在目前使用ADAGEN的治疗环境中使用。该Ser₇₄-rb或rhADA可通过与聚乙二醇(PEG)缀合而修饰，例如，每个ADA蛋白11-17个PEG的5kDa聚合物。突变蛋白ADA的PEG化的制备物在pH 7.2-7.4的无菌盐水溶液中配制，且浓度为每毫升约250单位。将该PEG化的突变蛋白ADA通过胃肠外给药，如肌内给药，给予患者。受益于该治疗的患者包括患有由不足的ADA活性引起的严重联合免疫缺陷疾病(severecombined immunodeficiency)的那些。突变蛋白PEG-ADA的给药通常为每7天给药方案，为首次剂量10U/kg且维持剂量为每周20U/kg。该Ser₇₄-rb或rh PEG-ADA在2-8℃储存在水性溶液中，每1.5毫升小瓶仅具有一次剂量。设计该给药方案以保持血浆ADA活性水平在15-35μmol/hr/mL(在37℃测试)且减少红细胞dATP至≤0.005-0.015μmol/mL浓缩红细胞(packederythrocytes)。

实施例7

通过尿烷连接的PEG化的Ser₇₄-rbADA的制备

在轻微搅拌下将SC-PEG(N-羟基琥珀酰亚胺基碳酸酯-活化的聚乙二醇，0.084mmol)添加至Ser₇₄-rbADA(0.00027mmol)在3mL磷酸钠缓冲液(0.1M，pH 7.8)中的溶液中。该溶液在30℃搅拌30分钟。使用GPC柱(ZorbaxGF-450)监测PEG缀合。在反应结束时(通过天然酶的缺失证实)，该混合物用12mL配制缓冲液(0.05M磷酸钠，0.85％氯化钠，pH 7.3)稀释并用Centriprep浓缩器(Amicon)渗滤以去除未反应的PEG。渗滤按需要在4℃继续直到通过混合等量的滤液和0.1％PMA(0.1M HCl中的聚甲基丙烯酸)检测不到更多的游离PEG。

实施例8

通过尿烷连接的PEG化的Ser₇₄-rhADA的制备

使用与实施例7相同的条件使SC-PEG(0.084mmol)与Ser₇₄-rhADA(0.00027mmol)反应。

实施例9

通过酰胺连接的PEG化的Ser₇₄-rbADA的制备

在轻微搅拌下将SS-PEG(N-羟基琥珀酰亚胺基琥珀酸酯-活化的聚乙二醇，0.084mmol)添加至Ser₇₄-rbADA(0.00027mmol)在3mL磷酸钠缓冲液(0.1M，pH 7.8)中的溶液中。该溶液在30℃搅拌30分钟。使用GPC柱(Zorbax GF-450)监测PEG缀合。在反应结束时(通过天然酶的缺失证实)，该混合物用12mL配制缓冲液(0.05M磷酸钠，0.85％氯化钠，pH 7.3)稀释并用Centriprep浓缩器(Amicon)渗滤以去除未反应的PEG。渗滤按需要在4℃继续直到通过混合等量的滤液和0.1％PMA(0.1M HCl中的聚甲基丙烯酸)检测不到更多的游离PEG。

实施例10

通过酰胺连接的PEG化的突变蛋白rhADA的制备

使用与实施例9相同的条件使SS-PEG(0.084mmol)与突变蛋白rhADA(0.00027mmol)反应。

序列表

<110>安佐制药股份有限公司(ENZON PHARMACEUTICALS，INC.)

<120>稳定的重组腺苷脱氨酶

<130>213.1282-PCT

<140>未给出(Not yet assigned)

<141>在同一日(On even date herewith)

<150>PCT/US08/60805

<151>2008-04-18

<150>US 60/913,009

<151>2007-04-20

<160>5

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>356

<212>PRT

<213>牛(Bovine)

<220>

<221>misc_feature

<222>(74)..(74)

<223>Cys至Ser突变蛋白

<400>1

Ala Gln Thr Pro Ala Phe Asn Lys Pro Lys Val Glu Leu His Val His

1 5 10 15

Leu Asp Gly Ala Ile Lys Pro Glu Thr Ile Leu Tyr Tyr Gly Arg Lys

20 25 30

Arg Gly Ile Ala Leu Pro Ala Asp Thr Pro Glu Gln Leu Gln Asn Ile

35 40 45

Ile Gly Met Asp Lys Pro Leu Ser Leu Pro Glu Phe Leu Ala Lys Phe

50 55 60

Asp Tyr Tyr Met Pro Ala Ile Ala Gly Ser Arg Glu Ala Val Lys Arg

65 70 75 80

Ile Ala Tyr Glu Phe Val Glu Met Lys Ala Lys Asp Gly Val Val Tyr

85 90 95

Val Glu Val Arg Tyr Ser Pro His Leu Leu Ala Asn Ser Lys Val Glu

100 105 110

Pro Ile Pro Trp Asn Gln Ala Glu Gly Asp Leu Thr Pro Asp Glu Val

115 120 125

Val Ser Leu Val Asn Gln Gly Leu Gln Glu Gly Glu Arg Asp Phe Gly

130 135 140

Val Lys Val Arg Ser Ile Leu Cys Cys Met Arg His Gln Pro Ser Trp

145 150 155 160

Ser Ser Glu Val Val Glu Leu Cys Lys Lys Tyr Arg Glu Gln Thr Val

165 170 175

Val Ala Ile Asp Leu Ala Gly Asp Glu Thr Ile Glu Gly Ser Ser Leu

180 185 190

Phe Pro Gly His Val Lys Ala Tyr Ala Glu Ala Val Lys Ser Gly Val

195 200 205

His Arg Thr Val His Ala Gly Glu Val Gly Ser Ala Asn Val Val Lys

210 215 220

Glu Ala Val Asp Thr Leu Lys Thr Glu Arg Leu Gly His Gly Tyr His

225 230 235 240

Thr Leu Glu Asp Thr Thr Leu Tyr Asn Arg Leu Arg Gln Glu Asn Met

245 250 255

His Phe Glu Val Cys Pro Trp Ser Ser Tyr Leu Thr Gly Ala Trp Lys

260 265 270

Pro Asp Thr Glu His Pro Val Val Arg Phe Lys Asn Asp Gln Val Asn

275 280 285

Tyr Ser Leu Asn Thr Asp Asp Pro Leu Ile Phe Lys Ser Thr Leu Asp

290 295 300

Thr Asp Tyr Gln Met Thr Lys Asn Glu Met Gly Phe Thr Glu Glu Glu

305 310 315 320

Phe Lys Arg Leu Asn Ile Asn Ala Ala Lys Ser Ser Phe Leu Pro Glu

325 330 335

Asp Glu Lys Lys Glu Leu Leu Asp Leu Leu Tyr Lys Ala Tyr Gly Met

340 345 350

Pro Ser Pro Ala

355

<210>2

<211>1074

<212>DNA

<213>牛

<400>2

atggctcaga ccccggcttt caacaaaccg aaggtagaac tgcacgtaca cctggatggt 60

gctatcaaac cggagactat cctgtactat ggtcgtaagc gtggcatcgc tctgccggct 120

gacactccgg aagaactgca gaacatcatc ggcatggaca aaccgctgtc tctgccggaa 180

ttcctggcta aattcgacta ctacatgccg gctatcgctg gttctcgtga agcagtcaaa 240

cgtatcgctt acgaattcgt agaaatgaaa gctaaagatg gtgtagtata cgttgaagtt 300

cgttactctc cgcacctgct ggcaaactct aaagttgaac cgatcccgtg gaaccaggca 360

gaaggcgatc tgactccgga tgaagtagtt tctctggtta accagggtct gcaggagggt 420

gaacgcgatt tcggcgtaaa agttcgttct atcctgtgct gcatgcgcca ccagccgtct 480

tggtcttctg aagttgttga actgtgcaag aaataccgtg agcagaccgt agttgctatc 540

gatctggcag gtgatgaaac catcgaaggt tcttctctgt ttccgggtca cgtaaaggct 600

tatgctgaag ctgttaaatc tggcgtacac cgtactgtac acgcaggtga agttggttct 660

gctaacgttg ttaaagaagc tgttgacacc ctgaaaactg aacgcctggg tcacggctac 720

cacaccctgg aagacaccac cctgtacaac cgtctgcgtc aggaaaacat gcacttcgaa 780

gtttgtccgt ggtcctctta cctgactggt gcttggaaac cggacaccga acacccggtt 840

gttcgtttca aaaacgacca ggtaaactac tctctgaaca ctgacgatcc gctgatcttc 900

aaatctaccc tggacaccga ctaccagatg accaaaaacg aaatgggttt cactgaagaa 960

gaattcaaac gtctgaacat caacgctgct aagtcctctt ttctgccgga agatgagaaa 1020

aaagaactgc tggacctgct gtacaaggca tacggtatgc cgtctccggc ttaa 1074

<210>3

<211>362

<212>PRT

<213>人

<220>

<221>misc_feature

<222>(74)..(74)

<223>Cys至Ser突变蛋白

<400>3

Ala Gln Thr Pro Ala Phe Asp Lys Pro Lys Val Glu Leu His Val His

1 5 10 15

Leu Asp Gly Ser Ile Lys Pro Glu Thr Ile Leu Tyr Tyr Gly Arg Arg

20 25 30

Arg Gly Ile Ala Leu Pro Ala Asn Thr Ala Glu Gly Leu Leu Asn Val

35 40 45

Ile Gly Met Asp Lys Pro Leu Thr Leu Pro Asp Phe Leu Ala Lys Phe

50 55 60

Asp Tyr Tyr Met Pro Ala Ile Ala Gly Ser Arg Glu Ala Ile Lys Arg

65 70 75 80

Ile Ala Tyr Glu Phe Val Glu Met Lys Ala Lys Glu Gly Val Val Tyr

85 90 95

Val Glu Val Arg Tyr Ser Pro His Leu Leu Ala Asn Ser Lys Val Glu

100 105 110

Pro Ile Pro Trp Asn Gln Ala Glu Gly Asp Leu Thr Pro Asp Glu Val

115 120 125

Val Ala Leu Val Gly Gln Gly Leu Gln Glu Gly Glu Arg Asp Phe Gly

130 135 140

Val Lys Ala Arg Ser Ile Leu Cys Cys Met Arg His Gln Pro Asn Trp

145 150 155 160

Ser Pro Lys Val Val Glu Leu Cys Lys Lys Tyr Gln Gln Gln Thr Val

165 170 175

Val Ala Ile Asp Leu Ala Gly Asp Glu Thr Ile Pro Gly Ser Ser Leu

180 185 190

Leu Pro Gly His Val Gln Ala Tyr Gln Glu Ala Val Lys Ser Gly Ile

195 200 205

His Arg Thr Val His Ala Gly Glu Val Gly Ser Ala Glu Val Val Lys

210 215 220

Glu Ala Val Asp Ile Leu Lys Thr Glu Arg Leu Gly His Gly Tyr His

225 230 235 240

Thr Leu Glu Asp Gln Ala Leu Tyr Asn Arg Leu Arg Gln Glu Asn Met

245 250 255

His Phe Glu Ile Cys Pro Trp Ser Ser Tyr Leu Thr Gly Ala Trp Lys

260 265 270

Pro Asp Thr Glu His Ala Val Ile Arg Leu Lys Asn Asp Gln Ala Asn

275 280 285

Tyr Ser Leu Asn Thr Asp Asp Pro Leu Ile Phe Lys Ser Thr Leu Asp

290 295 300

Thr Asp Tyr Gln Met Thr Lys Arg Asp Met Gly Phe Thr Glu Glu Glu

305 310 315 320

Phe Lys Arg Leu Asn Ile Asn Ala Ala Lys Ser Ser Phe Leu Pro Glu

325 330 335

Asp Glu Lys Arg Glu Leu Leu Asp Leu Leu Tyr Lys Ala Tyr Gly Met

340 345 350

Pro Pro Ser Ala Ser Ala Gly Gln Asn Leu

355 360

<210>4

<211>1089

<212>DNA

<213>人

<400>4

atggctcaga cacccgcatt tgataaaccg aaagtggaac tgcatgtcca cctggatggt 60

agcatcaaac cggaaactat cttatattac ggtcggcgtc gtggtattgc gttgccggca 120

aacacggctg aaggtttgct gaacgtgatc ggcatggaca aaccgctgac cttgccggat 180

tttttggcga aatttgatta ttatatgccg gcgattgctg gttcccgcga ggcaatcaaa 240

cgcatcgcgt atgagtttgt tgaaatgaaa gcgaaagaag gcgttgtgta tgttgaggtc 300

cgttacagtc cgcatctgct ggctaacagc aaggtagaac ctatcccctg gaaccaagct 360

gaaggcgatc tgacgccgga tgaagtggtt gctctggtgg gtcagggttt acaggagggg 420

gagcgcgatt ttggcgttaa agctcgctct attttatgtt gcatgcgcca tcagcccaat 480

tggtccccga aagtggttga actttgtaaa aagtaccaac aacagaccgt tgtcgcgatt 540

gatttggcag gcgatgaaac aattccaggc agctccctgt tgccagggca cgtgcaagcg 600

taccaagaag cagtgaaaag cggcatccac cggactgtcc acgccggcga ggtcggtagc 660

gccgaggttg tgaaagaagc cgtggacatc ctgaaaaccg agcggctggg ccatgggtac 720

cacacactgg aggatcaggc attatataac cgcttacgcc aggaaaatat gcatttcgaa 780

atttgtccgt ggagtagtta cttaactggc gcgtggaaac cggataccga acatgcggtt 840

atccgcttaa agaatgatca agcaaattac agtctgaata cagatgatcc cctgattttc 900

aagtctaccc tggacacaga ttatcagatg acgaagcggg atatgggatt tacggaagaa 960

gaatttaagc gtctcaatat caatgcggcg aaatcttcat ttctgccgga agatgagaaa 1020

cgtgagttgc tggatcttct gtacaaggcc tacggtatgc cgccgagcgc atcggccggg 1080

cagaacctg 1089

<210>5

<211>356

<212>PRT

<213>牛

<400>5

Ala Gln Thr Pro Ala Phe Asn Lys Pro Lys Val Glu Leu His Val His

1 5 10 15

Leu Asp Gly Ala Ile Lys Pro Glu Thr Ile Leu Tyr Tyr Gly Arg Lys

20 25 30

Arg Gly Ile Ala Leu Pro Ala Asp Thr Pro Glu Glu Leu Gln Asn Ile

35 40 45

Ile Gly Met Asp Lys Pro Leu Ser Leu Pro Glu Phe Leu Ala Lys Phe

50 55 60

Asp Tyr Tyr Met Pro Ala Ile Ala Gly Cys Arg Glu Ala Val Lys Arg

65 70 75 80

Ile Ala Tyr Glu Phe Val Glu Met Lys Ala Lys Asp Gly Val Val Tyr

85 90 95

Val Glu Val Arg Tyr Ser Pro His Leu Leu Ala Asn Ser Lys Val Glu

100 105 110

Pro Ile Pro Trp Asn Gln Ala Glu Gly Asp Leu Thr Pro Asp Glu Val

115 120 125

Val Ser Leu Val Asn Gln Gly Leu Gln Glu Gly Glu Arg Asp Phe Gly

130 135 140

Val Lys Val Arg Ser Ile Leu Cys Cys Met Arg His Gln Pro Ser Trp

145 150 155 160

Ser Ser Glu Val Val Glu Leu Cys Lys Lys Tyr Arg Glu Gln Thr Val

165 170 175

Val Ala Ile Asp Leu Ala Gly Asp Glu Thr Ile Glu Gly Ser Ser Leu

180 185 190

Phe Pro Gly His Val Lys Ala Tyr Ala Glu Ala Val Lys Ser Gly Val

195 200 205

His Arg Thr Val His Ala Gly Glu Val Gly Ser Ala Asn Val Val Lys

210 215 220

Glu Ala Val Asp Thr Leu Lys Thr Glu Arg Leu Gly His Gly Tyr His

225 230 235 240

Thr Leu Glu Asp Thr Thr Leu Tyr Asn Arg Leu Arg Gln Glu Asn Met

245 250 255

His Phe Glu Val Cys Pro Trp Ser Ser Tyr Leu Thr Gly Ala Trp Lys

260 265 270

Pro Asp Thr Glu His Pro Val Val Arg Phe Lys Asn Asp Gln Val Asn

275 280 285

Tyr Ser Leu Asn Thr Asp Asp Pro Leu Ile Phe Lys Ser Thr Leu Asp

290 295 300

Thr Asp Tyr Gln Met Thr Lys Asn Glu Met Gly Phe Thr Glu Glu Glu

305 310 315 320

Phe Lys Arg Leu Asn Ile Asn Ala Ala Lys Ser Ser Phe Leu Pro Glu

325 330 335

Asp Glu Lys Lys Glu Leu Leu Asp Leu Leu Tyr Lys Ala Tyr Gly Met

340 345 350

Pro Ser Pro Ala

355

Claims

1.重组腺苷脱氨酶，其中以野生型腺苷脱氨酶表达的可氧化的氨基酸残基被不可氧化的氨基酸残基代替。

2.权利要求1的重组腺苷脱氨酶，其中所述可氧化的氨基酸残基为半胱氨酸、蛋氨酸或色氨酸，且所述不可氧化的氨基酸残基选自丙氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、赖氨酸、亮氨酸、天冬酰胺、脯氨酸、谷氨酰胺、精氨酸、丝氨酸、苏氨酸、缬氨酸、酪氨酸、2-氨基己二酸、3-氨基己二酸、β-丙氨酸、β-氨基丙酸、2-氨基丁酸、4-氨基丁酸、哌啶酸、6-氨基己酸、2-氨基庚酸、2-氨基异丁酸、3-氨基异丁酸、2-氨基庚二酸、2，4-二氨基丁酸、锁链素、2，2’-二氨基庚二酸、2，3-二氨基丙酸、N-乙基甘氨酸、N-乙基天冬酰胺、羟基赖氨酸、别羟基赖氨酸、3-羟基脯氨酸、4-羟基脯氨酸、异锁链素、别异亮氨酸、N-甲基甘氨酸、肌氨酸、N-甲基异亮氨酸、6-N-甲基赖氨酸、N-甲基缬氨酸、正缬氨酸、正亮氨酸和鸟氨酸。

3.权利要求1的重组腺苷脱氨酶，其中所述不可氧化的氨基酸残基选自丝氨酸、丙氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、甘氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、酪氨酸和缬氨酸。

4.权利要求1的重组腺苷脱氨酶，其中所述不可氧化的氨基酸残基为丝氨酸。

5.权利要求2的重组腺苷脱氨酶，其中所述可氧化的半胱氨酸位于成熟蛋白的约74位。

6.权利要求5的重组腺苷脱氨酶，其为重组人腺苷脱氨酶或重组牛腺苷脱氨酶。

7.权利要求6的重组腺苷脱氨酶，其从根据SEQ ID NO：2或SEQ IDNO：4的DNA分子翻译。

8.权利要求6的重组腺苷脱氨酶，其包含SEQ ID NO：1或SEQ IDNO：3。

9.权利要求8的重组腺苷脱氨酶，其包含具有选自以下的氨基酸取代的SEQ ID NO：1：Gln代替Lys₁₉₈；Ala代替Thr₂₄₅；Arg代替Gly₃₅₁，及其组合。

10.聚环氧烷-腺苷脱氨酶缀合物，其中所述腺苷脱氨酶为权利要求1的重组腺苷脱氨酶。

11.权利要求10的聚环氧烷-腺苷脱氨酶缀合物，其中所述聚环氧烷为聚乙二醇。

12.权利要求11的聚环氧烷-腺苷脱氨酶缀合物，其中所述聚乙二醇通过选自以下的连接基缀合至重组腺苷脱氨酶：琥珀酰亚胺基碳酸酯、噻唑烷硫酮、尿烷和基于酰胺的连接基。

13.权利要求11的聚环氧烷-腺苷脱氨酶缀合物，其中所述聚乙二醇与重组腺苷脱氨酶的Lys的ε氨基共价连接。

14.权利要求11的聚环氧烷-腺苷脱氨酶缀合物，其中所述重组腺苷脱氨酶包含一个或多个聚乙二醇链，所述聚乙二醇链与重组腺苷脱氨酶的一个或多个Lys残基的ε氨基连接。

15.权利要求11的聚环氧烷-腺苷脱氨酶缀合物，其中所述重组腺苷脱氨酶包含约11至约18个聚乙二醇链，所述聚乙二醇链与重组腺苷脱氨酶的一个或多个Lys残基的ε氨基连接。

16.权利要求11的聚环氧烷-腺苷脱氨酶缀合物，其中所述聚乙二醇通过琥珀酰亚胺基碳酸酯连接基缀合至重组腺苷脱氨酶。

17.权利要求10的聚环氧烷-腺苷脱氨酶缀合物，其中所述聚乙二醇的分子量为约2,000至约100,000。

18.权利要求10的聚环氧烷-腺苷脱氨酶缀合物，其中所述聚乙二醇的分子量为约4,000至约45,000。

19.在哺乳动物中治疗腺苷脱氨酶-介导的病症的方法，包括给药有效量的权利要求1的重组腺苷脱氨酶。

20.权利要求19的方法，其中所述腺苷脱氨酶-介导的病症为严重联合免疫疾病。

21.纯化权利要求10的重组腺苷脱氨酶的方法，包括通过离子交换色谱法纯化该蛋白质。

22.纯化包含SEQ ID NO：1的权利要求10的重组腺苷脱氨酶的方法，包括通过疏水作用色谱法纯化蛋白质。

23.通过权利要求21的方法制备的重组腺苷脱氨酶。

24.通过权利要求22的方法制备的重组腺苷脱氨酶。

25.分离的DNA，其编码具有氨基酸序列SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3的重组腺苷脱氨酶。

26.权利要求25的分离的DNA，其中所述重组腺苷脱氨酶具有选自以下的氨基酸取代：Gln代替Lys₁₉₈；Ala代替Thr₂₄₅；Arg代替Gly₃₅₁，及其组合。