CN102507463A - 一种定量检测硫代氧化型辅酶（Thio-NAD）的循环酶检测方法和试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种定量检测硫代氧化型辅酶(Thio-NAD)的循环酶检测方法，包括：配制pH8.5-10.50Tris-HCl缓冲液，其中含有一定量的辅酶I(NADH)、脱氧胆酸钠溶液、3α-羟类固醇脱氢酶(3α-HSD)、海藻糖，加入含有Thio-NAD的待测样品。3α-HSD将胆酸钠或脱氧胆酸钠脱氢氧化形成3α-酮类固醇，同时将Thio-NAD还原成还原型硫代辅酶(Thio-NADH)；在溶液中NADH的存在下，3α-HSD可将3α-酮类固醇重新还原成胆酸钠或其衍生物，同时将NADH脱氢氧化成NAD+。反应中生成的Thio-NADH在405nm处有最大吸收，通过测定37℃反应一段时间后特定波长下溶液的吸光度值，计算出待物中Thio-NAD的含量。该法绿色环保、测定试剂稳定，特别适合Thio-NAD的批量检测。
Description
技术领域
本发明涉及一种定量检测硫代氧化型辅酶(Thio-NAD)的循环酶检测方法和用于该方法的试剂盒。
背景技术
硫代氧化型辅酶I(Thio-NAD)，是辅酶I的一种衍生物，其经还原后形成硫代还原型辅酶I(Thio-NADH)。硫代氧化型辅酶作为一种化学原料在循环酶法测定胆汁酸测定试剂中有着重要的应用，其含量的高低显著影响胆汁酸测定试剂的灵敏度，是控制胆汁酸测定试剂批间差不可忽视的实验因素之一。
高效液相色谱法是测定Thio-NAD的常规方法，该法需标准品对照，步骤繁琐，实际不易推广。应用直接分光光度法测定Thio-NAD含量时，为避免产物对反应的反馈抑制，通常采用将产物进一步转化的方法，如专利200610050790.X所述的采用水合肼将产物固定，使反应向正方向进行。该法操作虽相对简便，但水合肼属高毒类化学品，急性毒性为LD50129mg/kg(大鼠经口)，遇明火、高热可燃，与氧化剂能发生强烈反应，引起燃烧或爆炸。
本发明的目的是为了解决上述技术的不足，通过3α-羟类固醇脱氢酶对酶反应产物的可逆催化，使产物重新转化为底物，从而保证正向反应的顺利进行。依据该法构建的测定试剂绿色、环保，实现一步法直接测定，测定试剂置2-8℃保存可稳定12个月，可以应用于目前广泛使用的临床生化自动分析仪，从而达到大规模测定样本的要求。
发明内容
本发明的目地在于提供一种定量检测硫代氧化型辅酶(Thio-NAD)的循环酶检测方法。
定量检测硫代氧化型辅酶(Thio-NAD)的循环酶检测方法：配制pH8.5-10.50 Tris-HCl缓冲液，其中含有一定量的辅酶I(NADH)、脱氧胆酸钠、3α-羟类固醇脱氢酶(3α-HSD)、海藻糖，加入含Thio-NAD的待测样品。3α-HSD将底物脱氢氧化形成3α-酮类固醇，同时将Thio-NAD还原成还原型硫代辅酶(Thio-NADH)；在溶液中NADH的存在下，3α-HSD可将3α-酮类固醇重新还原成胆酸钠或其衍生物使正向反应顺利进行，同时将NADH脱氢氧化成NAD+。反应中生成的Thio-NADH在405nm处有最大吸收，通过测定37℃反应一段时间后特定波长下溶液的吸光度值，计算出待物中Thio-NAD的含量。
上面所述的各物质最适浓度为：pH8.5-10.50Tris-HCl为20-2500mmol/L、NADH为2-6g/L、脱氧胆酸钠为25-100μmol/L、海藻糖为2-10％、3α-HSD为0.5-5KU/L、待测样品的浓度为5.0-1400mg/L。
所述的样品中Thio-NAD的计算公式为：待测样品中Thio-NAD含量(μmol/L)＝(A-A0)×V1×106/(ε×V2)，其中A为样品管反应吸光度值，A0为同体积的去离子水代替样品所测得的吸光度值，V1为总反应体积，V2为样品体积，ε为特定波长下Thio-NAD摩尔吸光值。
本发明所述的定量检测硫代氧化型辅酶(Thio-NAD)的循环酶检测方法采用的仪器可以为本领域常用的分析仪，如日立7080全自动生化分析仪、贝克曼LX20全自动生化分析仪、岛津UV-2550紫外可见分光光度计等，测定方法类型也是本领域常用的测定方法，如终点法等，测定温度为37℃。
本发明的另一个目的是提供一种用于定量检测硫代氧化型辅酶(Thio-NAD)的循环酶检测方法的试剂盒，其为含有一定量的辅酶I(NADH)、脱氧胆酸钠、3α-羟类固醇脱氢酶(3α-HSD)和海藻糖的pH8.5-10.50Tris-HCl缓冲液。该试剂盒中各物质的浓度为：pH8.5-10.50Tris-HCl缓冲液中Tris-HCl浓度为20-2500mmol/L、NADH的浓度为2-6g/L、脱氧胆酸钠浓度为25-100μmol/L、海藻糖为2-10％、3α-HSD的浓度为0.5-5KU/L。待测样品的浓度为5.0-1400mg/L。
利用本发明所述定量检测硫代氧化型辅酶(Thio-NAD)的循环酶检测方法，可以精确检测待测样品中含有的硫代氧化型辅酶(Thio-NAD)的范围为5.9-2000 μmol/L。
本发明所涉及的化学品均无毒、易得，符合发展绿色检测方法的要求。本检测方法与高效液相(HPLC)法及专利200610050790.X所述的脱氢酶酶化学比色法相比较结果见表1。
表1
具体实施方式
本发明测定原理：测定试剂中的3α-HSD将脱氧胆酸钠脱氢氧化形成3α-酮类固醇，同时将样本中的Thio-NAD还原成还原型硫代辅酶(Thio-NADH)；在溶液中NADH的存在下，3α-HSD可将3α-酮类固醇重新还原成脱氧胆酸钠使正向反应顺利进行，同时将NADH脱氢氧化成NAD+。反应中生成的Thio-NADH在405nm处有最大吸收，通过测定37℃反应一段时间后特定波长下溶液的吸光度值，计算出待物中Thio-NAD的含量。
样品液：精确称取0.1克左右样品，用去离子水定容至样品终浓度为5.0-1400mg/L的样品液。
样品液中Thio-NAD的计算公式：样品液Thio-NAD含量(μmol/L)＝(A-A0)×V1×106/(ε×V2)，其中A为样品管反应吸光度值，A0为同体积的去离子水代替样品所测得的吸光度值，V1为总反应体积，V2为样品体积，ε为特定波长下 Thio-NAD摩尔吸光值。
实施例1：
配制含NADH 4g/L、脱氧胆酸钠75μmol/L、3α-HSD 3KU/L、海藻糖5％的200mmol/L pH9.25Tris-HCl缓冲液为测定试剂，将该测定试剂用于测定样品液时，采用的仪器为日立7080全自动生化分析仪，测定方法类型为终点法，温度为37℃，V样本为4μl，V试剂为300μl，测定主/副波长为405/800nm，试剂加入样本后在测定温度反应300秒后读取吸光度。样品液中Thio-NAD的计算公式为：Thio-NAD含量(μmol/L)＝(A-A0)×V1×106/(11900×V2)，其中A为样品管反应吸光度值，A0为同体积的去离子水代替样品所测得的吸光度值，V1为总反应体积，V2为样品体积，11900为405nm下Thio-NAD摩尔吸光值。用本法和HPLC法同时测定了22例样品液中Thio-NAD含量。表2为本实施例所述方法测定的含Thio-NAD的样品液中Thio-NAD含量的测定值与HPLC法测定的Thio-NAD含量的值对照表，本实施例所述方法与HPLC法的相关系数r为0.9999，两者显示了极好的相关性。
表2
| 样品号 | HPLC法测定值(μmol/L) | 本法测定值(mol/L) |
| 1 | 10.6 | 10.1 |
| 2 | 51.4 | 50.3 |
| 3 | 99.5 | 101.3 |
| 4 | 203.5 | 200.8 |
| 5 | 302.6 | 299.1 |
| 6 | 400.4 | 402.5 |
| 7 | 503.5 | 501.3 |
| 8 | 597.8 | 602.5 |
| 9 | 704.2 | 698.3 |
| 10 | 800.9 | 816.3 |
[0022]
| 11 | 906.4 | 911.4 |
| 12 | 1012.5 | 1024.5 |
| 13 | 1104.4 | 1119.3 |
| 14 | 1198.3 | 1215.4 |
| 15 | 1306.4 | 1304.9 |
| 16 | 1403.4 | 1412.3 |
| 17 | 1512.6 | 1501.1 |
| 18 | 1605.3 | 1590.5 |
| 19 | 1708.3 | 1692.9 |
| 20 | 1800.1 | 1791.2 |
| 21 | 1905.7 | 1919.3 |
| 22 | 1998.5 | 1993.7 |
实施例2：
配制含NADH 6g/L、脱氧胆酸钠100μmol/L、3α-HSD 5KU/L、海藻糖10％的2500mmol/L pH9.25Tris-HCl缓冲液为测定试剂，将该测定试剂用于测定样品液时，采用的仪器为贝克曼LX20全自动生化分析仪，测定方法类型为终点法，温度为37℃，V样本为3μl，V试剂为225μl，，测定主/副波长为410/600nm，试剂加入样本后在测定温度反应180秒后读取吸光度并计算出样品液中Thio-NAD含量。样品液中Thio-NAD的计算公式为：Thio-NAD含量(μmol/L)＝(A-A0)×V1×106/(10850×V2)，其中A为样品管反应吸光度值，A0为同体积的去离子水代替样品所测得的吸光度值，V1为总反应体积，V2为样品体积，10850为410nm下Thio-NAD摩尔吸光值。
实施例3：
配制含NADH 2g/L、脱氧胆酸钠25μmol/L、3α-HSD 0.5KU/L、海藻糖2％的20mmol/L pH9.25Tris-HCl缓冲液为测定试剂，将该测定试剂用于测定样品液时，采用的仪器为岛津UV-2550紫外可见分光光度计，温度为37℃，V样本为40μl， V试剂为3000μl，测定波长为420nm，试剂加入样本后在测定温度反应20分钟后读取吸光度并计算出样品液中Thio-NAD含量。样品液中Thio-NAD的计算公式为：Thio-NAD含量(μmol/L)＝(A-A0)×V1×106/(9760×V2)，其中A为样品管反应吸光度值，A0为同体积的去离子水代替样品所测得的吸光度值，V1为总反应体积，V2为样品体积，9760为420nm下Thio-NAD摩尔吸光值。
上述实施例试剂的配制方法仅用于说明本发明的原理和其应用，但本发明绝不局限于上述例举的应用范围。
Claims (5)
1.一种定量检测硫代氧化型辅酶(Thio-NAD)的循环酶检测方法，其特征在于：配制pH8.5-10.50Tris-HCl缓冲液，其中含有一定量的辅酶I(NADH)、脱氧胆酸钠、3α-羟类固醇脱氢酶(3α-HSD)、海藻糖，加入含Thio-NAD的待测样品，反应中生成的Thio-NADH在405nm处有最大吸收，通过测定37℃反应一段时间后特定波长下溶液的吸光度值，计算出待测样品中Thio-NAD的含量。
2.根据权利要求1所述的一种定量检测硫代氧化型辅酶(Thio-NAD)的循环酶检测方法，其特征在于：pH8.5-10.50Tris-HCl缓冲液浓度为20-2500mmol/L、NADH的浓度为2-6g/L、脱氧胆酸钠浓度为25-100μmol/L、海藻糖为2-10％、3α-HSD的浓度为0.5-5KU/L、待测样品的浓度为5.0-1400mg/L。
3.据权利要求1或2所述的一种定量检测硫代氧化型辅酶(Thio-NAD)的循环酶检测方法，其特征在于：样品中Thio-NAD的计算公式为：待测样品中Thio-NAD含量(μmol/L)＝(A-A0)×V1×106/(ε×V2)，其中A为样品管反应吸光度值，A0为同体积的去离子水代替样品所测得的吸光度值，为V1总反应体积，V2为样品体积，ε为特定波长下Thio-NAD摩尔吸光值。
4.一种用于权利要求1-3所述的循环酶检测方法的检测试剂盒，其为含有一定量的辅酶I(NADH)、脱氧胆酸钠、3α-羟类固醇脱氢酶(3α-HSD)和海藻糖的pH8.5-10.50Tris-HCl缓冲液。
5.权利要求4所述的检测试剂盒，其中pH8.5-10.50Tris-HCl缓冲液浓度为20-2500mmol/L、NADH的浓度为2-6g/L、脱氧胆酸钠浓度为25-100μmol/L、海藻糖为2-10％、3α-HSD的浓度为0.5-5KU/L、待测样品的浓度为5.0-1400mg/L。
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