CN113774110A - 一种基于wst-8检测nad+浓度的酶循环方法 - Google Patents

一种基于wst-8检测nad+浓度的酶循环方法 Download PDF

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Abstract

一种基于WST‑8检测NAD+浓度的酶循环方法，其特征在于：首先将样品进行酸化、中和、离心处理得到NAD+提取液，再进行酶循环反应；所述酶循环反应为乙醇在乙醇脱氢酶（ADH）的作用下氧化生成乙醛，同时NAD+被还原为NADH，生成的NADH在电子耦合试剂1‑mPMS的作用下将WST‑8还原生成橙黄色的甲臜，它在450nm左右有最大吸收峰。根据反应体系中生成甲臜的速率与NAD+量之间的线性关系，实现样品NAD+浓度的快速、准确定量。所述方法适用多种生物样本，包括血清、血浆、尿液、组织液、细胞培养基、细胞、动物组织块等。所述方法测定样品中NAD+浓度线性良好，且灵敏度高、准确度高、重复性好、检测成本低，有较高的科研与临床应用价值。

Description

一种基于WST-8检测NAD+浓度的酶循环方法
技术领域
本发明涉及分子生物技术和医学检测领域，具体而言，涉及一种基于WST-8检测NAD+浓度的酶循环方法。
背景技术
烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)是细胞氧化还原酶的辅助因子，因在氧化还原反应中的作用而广为人知。最近NAD+以信号分子的身份重新燃起了科学家的研究兴趣，它作为多种调控蛋白的辅助底物，控制从能量代谢到细胞存活的数百个关键过程。在哺乳动物中，NAD+主要通过信号蛋白Sirtuins和PARPs调控生命过程。NAD+水平随着年龄增长而下降，引起细胞核和线粒体功能下降，并导致许多与年龄相关的疾病发生，而补充关键的NAD+前体，能够提高机体NAD+水平，增强机体的恢复能力，改善年龄相关的功能缺陷，是一种有效的抗衰老干预措施。因此，提供一种能够准确检测生物样品中NAD+浓度的方法已经成为本领域亟待解决的技术问题。
目前，国内外检测生物样品中NAD+浓度的方法主要有高效液相色谱（HPLC）、高效液相色谱串联质谱（HPLC-MS）、液相二级质谱（HPLC-MS/MS）和酶循环法，前三种方法操作过程复杂、周期长、仪器昂贵且对操作人员要求较高，不适合大规模样本检测。目前，国内外有少量实验室基于MTT（3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴盐）染料建立酶循环法检测NAD+浓度，但是MTT生成的甲臜水溶性差，检测误差大，实验结果重复性较差，不适合批量样本检测。
发明内容
为了克服现有技术中NAD+浓度难以准确、快速、低成本、批量检测的问题，本发明在现有基于MTT检测NAD+的酶循环方法上进行改进，采用WST-8（2-（2-甲氧基-4-硝苯基）-3-（4-硝苯基）-5-（2,4-二磺基苯）-2H-四唑单钠盐）替代MTT染料，利用WST-8生成的甲臜为水溶性的特点，结合WST-8线性范围宽、灵敏度高、重复性好等特点，通过酶循环法实现生物样品中NAD+快速、准确定量。
为了达到上述目的，本发明采用以下方案：
一种基于WST-8检测NAD+浓度的酶循环方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）β-NAD标准品制备：制备不同浓度的β-NAD标准品；
（2）β-NAD质控品制备：制备高、中、低三个浓度的β-NAD质控品；
（3）NAD+提取：将β-NAD标准品、β-NAD质控品、待测生物样品及空白对照中加入NAD+提取液，处理样本，60℃孵育10min，迅速冰浴平衡10min，加入适量NAD+中和液，调整PH值至7.4，离心或超滤去除内源性干扰物质，得到NAD+提取液；
（4）NAD+检测：在酶标板相应孔中先加入β-NAD标准品、β-NAD质控品、待测生物样品及空白对照的NAD+提取液，后加入反应液，按酶标仪动力学模式检测；
（5）数据分析：先扣除空白对照OD值，绘制NAD+标准曲线，根据β-NAD的标准曲线，计算并校准生物样品中NAD+浓度。
进一步地，上述基于WST-8检测NAD+的酶循环方法，所述β-NAD标准品的浓度为250ng/ml、125ng/ml、62.5ng/ml、31.2ng/ml、15.6ng/ml、7.8ng/ml、3.9ng/ml、1.95ng/ml。
进一步地，上述基于WST-8检测NAD+的酶循环方法，所述β-NAD质控品的浓度为187.5ng/ml、125ng/ml、25ng/ml。
进一步地，上述基于WST-8检测NAD+的酶循环方法，所述待测生物样品为血清、血浆、尿液、组织液、细胞培养基、血液分离的白细胞和红细胞、组织培养细胞、动物组织块等。
进一步地，上述基于WST-8检测NAD+的酶循环方法，所述组织培养细胞为利用生物学细胞培养技术获得的动物细胞。
进一步地，上述基于WST-8检测NAD+的酶循环方法，所述空白对照为0.1%DEPC处理水。
进一步地，上述基于WST-8检测NAD+的酶循环方法，所述NAD+提取液为0.3N HCl，NAD+中和液为0.6 N KOH和0.36 N TEA-HCl的等比例混合液。
进一步地，上述基于WST-8检测NAD+的酶循环方法，所述处理样本，血清、血浆、尿液、组织液、细胞培养基，涡旋混匀；细胞，反复冻溶后涡旋混匀；动物组织块，匀浆后涡旋混匀。
进一步地，上述基于WST-8检测NAD+的酶循环方法，所述离心或超滤去除内源性干扰物质，血清、血浆、尿液、组织液、细胞培养基，16000g，4℃离心10min；细胞、动物组织块，先16000g，4℃离心10min，后10 kDa超滤管15000g，4℃离心30min。
进一步地，上述基于WST-8检测NAD+的酶循环方法，所述反应液为200mM KH2PO4-NaOH（PH8.0）、5%无水乙醇、6%WST-8、1U硫辛酰胺脱氢酶（diaphorase，DI）、125U乙醇脱氢酶、4%BSA溶液、0.1%DEPC处理水。
进一步地，上述基于WST-8检测NAD+的酶循环方法，所述酶标仪动力学模式，参数设置为反应温度25℃，检测波长450nm，检测时间30min。
进一步地，上述基于WST-8检测NAD+的酶循环方法，所述计算并校准生物样品中NAD+浓度，细胞、动物组织块NAD+浓度需要通过样本中蛋白浓度校准为 NAD+（ng/mgProtein）。
本发明的有益效果是：
1. 本发明所述的基于WST-8检测NAD+浓度的酶循环方法，采用乙醇脱氢酶（ADH）的催化特性及酶偶联反应的原理，使反应体系中的NAD+转化为NADH，通过氧化还原指示剂的介导作用，过度放大NAD+的信号，提高了检出能力，NAD+检测限低至1.95ng/ml（2.95nM），克服了生物样品中NAD+含量低，难以检测的问题；
2. 酶循环法本发明所述的基于WST-8检测NAD+浓度的酶循环方法，采用水溶性好、稳定性高的WST-8代替水溶性差、稳定性低的MTT，实验结果更加稳定，重复性更好，适合批量样本的检测；
3. 本发明所述的基于WST-8检测NAD+浓度的酶循环方法，采用β-NAD作为标准品，而传统NAD+/NADH检测试剂盒中采用NADH作为标准品，NADH在溶液中稳定性差，很难长时间保存，在使用上具有一定的局限性。β-NAD溶液稳定性好，且与待测生物样品同时酸化、中和、离心，反应条件一致，检测结果更加准确。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式，下面将对具体实施方式中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图：
图1为实验原理图；
图2为本发明具体实施方式β-NAD标准品的Time-OD图；
图3为本发明具体实施方式红细胞Time-OD图；
图4为本发明具体实施方式β-NAD标准曲线图；
图5为本发明具体实施方式红细胞NAD+浓度检测结果。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
下面对本发明检测人红细胞NAD+浓度进行具体说明。
1. 样本制备：
采集人体空腹状态下静脉血5ml，采用淋巴细胞分离液1000×g离心30min，分离红细胞和淋巴细胞，其中红细胞中加入10ml PBS，400g离心10min，弃上清，取适量红细胞沉淀用于检测。
2. 试剂制备：
（1）NAD+提取液：移取25.2ml浓HCl至适量0.1%DEPC处理水中，定容至1000ml，4℃保存；
（2）0.6 N KOH：称取33.6g KOH至适量0.1%DEPC处理水中，定容至1000ml，4℃保存；
（3） 0.36 N TEA-HCl ：称取66.8g TEA-HCl至适量0.1% DEPC处理水中，定容至1000ml，调整PH至7.4，4℃保存；
（4）NAD+中和液：0.6 N KOH和0.36 N TEA-HCl 等比例混合，4℃保存；
（5）反应液：按照下表体系配制反应液，现用现配。
Figure 241116DEST_PATH_IMAGE002
3. β-NAD 标准品制备：
（1）β-NAD 标准品原液：使用0.1% DEPC处理水配制β-NAD标准品原液，浓度为1 mg/mL，保存至-80℃；
（2）β-NAD 标准品工作液：使用0.1% DEPC处理水稀释β-NAD标准品原液至250ng/mL；
（3） 按照下表制备Standard 1~Standard 8，现用现配。
Figure 220573DEST_PATH_IMAGE004
4. β-NAD质控品制备：
（1）β-NAD 质控品原液：使用0.1% DEPC处理水配制β-NAD质控品原液，浓度为1 mg/mL，保存至-80℃；
（2）β-NAD 质控品工作液：使用0.1% DEPC处理水稀释β-NAD质控品原液至250ng/mL；
（3）按照下表制备高、中、低β-NAD质控品，现用现配。
Figure 62627DEST_PATH_IMAGE006
5. NAD+提取：
（1）各取300ulβ-NAD标准品、300ulβ-NAD质控品、300ul 0.1% DEPC处理水，加入300ulNAD+提取液，涡旋混匀；60℃孵育10min，迅速冰浴平衡10min；加入适量NAD+中和液，调整PH值至7.4；16000g ，4℃离心10min，取上清，得到NAD+提取液；
（2） 取适量红细胞沉淀加入300ul NAD+提取液，干冰20min，室温10min，循环两次，涡旋混匀；60℃孵育10min，迅速冰浴平衡10min；加入适量NAD+中和液，调整PH值至7.4；16000g ，4℃离心10min，取50ul上清用于蛋白浓度测定；剩余上清于10 kDa超滤管15000g，4℃离心30min，取超滤液，得到NAD+提取液。
6. NAD+检测：
在酶标板相应孔中各加入50 ulβ-NAD标准品、β-NAD质控品、红细胞及空白对照的NAD+提取液，再加入150 ul反应液，混匀，酶标仪上机检测，动力学参数设置为反应温度25℃，检测波长450nm，检测时间30min。
7. 数据分析：
先扣除空白对照OD值，绘制NAD+标准曲线，根据β-NAD的标准曲线，计算红细胞NAD+浓度。
8. 数据校准：
采用BCA蛋白浓度测定试剂盒测定红细胞样本中的蛋白浓度，红细胞NAD+浓度校准为NAD+（ng/mg）=NAD+（ng/ml）/Protein（mg/ml）。
本技术领域技术人员可以理解，除非另外定义，这里使用的所有术语(包括技术术语和科学术语)具有与本发明所属领域中的普通技术人员的一般理解相同的意义。还应该理解的是，诸如通用字典中定义的那些术语应该被理解为具有与现有技术的上下文中的意义一致的意义，并且除非像这里一样定义，不会用理想化或过于正式的含义来解释。
最后所应说明的是：以上实施例仅用以说明而非限制本发明的技术方案，尽管参照上述实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应该理解：依然可以对本发明进行修改或者等同替换，而不脱离本发明的精神和范围的任何修改或局部替换，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

Claims (12)

1.一种基于WST-8检测NAD+浓度的酶循环方法，其特征在于，包括以下步骤：
β-NAD标准品制备：制备不同浓度的β-NAD标准品；
β-NAD质控品制备：制备高、中、低三个浓度的β-NAD质控品；
NAD+提取：将β-NAD标准品、β-NAD质控品、待测生物样品及空白对照中加入NAD+提取液，处理样本，60℃孵育10min，迅速冰浴平衡10min，加入适量NAD+中和液，调整PH值至7.4，离心或超滤去除内源性干扰物质，得到NAD+提取液；
NAD+检测：在酶标板相应孔中先加入β-NAD标准品、β-NAD质控品、待测生物样品及空白对照的NAD+提取液，后加入反应液，按酶标仪动力学模式检测；
数据分析：先扣除空白对照OD值，绘制NAD+标准曲线，根据β-NAD的标准曲线，计算并校准生物样品中NAD+浓度。
2.根据权利要求 1 所述的方法，其特征在于，步骤（1）所述β-NAD标准品的浓度为250ng/ml、125ng/ml、62.5ng/ml、31.2ng/ml、15.6ng/ml、7.8ng/ml、3.9ng/ml、1.95ng/ml。
3.根据权利要求 1 所述的方法，其特征在于，步骤（2）所述β-NAD质控品的浓度为187.5ng/ml、125ng/ml、25ng/ml。
4.根据权利要求 1 所述的方法，其特征在于，步骤（3）所述待测生物样品为血清、血浆、尿液、组织液、细胞培养基、血液分离的白细胞和红细胞、组织培养细胞、动物组织块等。
5.根据权利要求 2所述的方法，其特征在于，所述组织培养细胞为利用生物学细胞培养技术获得的动物细胞。
6.根据权利要求 1 所述的方法，其特征在于，步骤（3）所述空白对照为0.1%DEPC处理水。
7.根据权利要求 1 所述的方法，其特征在于，步骤（3）所述NAD+提取液为0.3N HCl，NAD+中和液为0.6 N KOH和0.36 N TEA-HCl的等比例混合液。
8.根据权利要求 1 所述的方法，其特征在于，步骤（3）所述处理样本，血清、血浆、尿液、组织液、细胞培养基，涡旋混匀；细胞，反复冻溶后涡旋混匀；动物组织块，匀浆后涡旋混匀。
9.根据权利要求 1 所述的方法，其特征在于，步骤（3）所述离心或超滤去除内源性干扰物质，血清、血浆、尿液、组织液、细胞培养基，16000g，4℃离心10min；细胞、动物组织块，先16000g，4℃离心10min，后10 kDa超滤管15000g，4℃离心30min。
10.根据权利要求 1 所述的方法，其特征在于，步骤（4）所述反应液为200mM KH2PO4-NaOH（PH8.0）、5%无水乙醇、6%WST-8、1U硫辛酰胺脱氢酶（diaphorase，DI）、125U乙醇脱氢酶、4%BSA溶液、0.1%DEPC处理水。
11.根据权利要求 1 所述的方法，其特征在于，步骤（4）所述酶标仪动力学模式，参数设置为反应温度25℃，检测波长450nm，检测时间30min。
12.根据权利要求 1 所述的方法，其特征在于，步骤（5）所述计算并校准生物样品中NAD+浓度，细胞、动物组织块NAD+浓度需要通过样本中蛋白浓度校准为NAD+（ng/mgProtein）。
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