CN114264822A - 一种检测烟酰胺和烟酰胺单核苷酸绝对含量的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种检测烟酰胺(NAM)和烟酰胺单核苷酸(NMN)绝对含量的方法，能快速简便地检测NAM和NMN绝对含量，属于分子生物技术领域。本发明先选定NAM标准品浓度，与样本同时进行处理，数据分析时制作NAM标准曲线；对样品分离、裂解及/或内在酶反应阻断处理；然后向标准品、样品及空白中先后加入过量的甲基亚硝基脲(MNU)、苯乙酮、KOH及甲酸进行反应，最终获得荧光衍生物；用酶标仪检测荧光强度；最后数据分析，根据标准曲线计算样本NAM和NMN含量。本发明检测方法具有操作简单、成本低，准确快速、耗时短、高通量的优点。
Description
技术领域
本发明涉及分子生物学领域，特别涉及检测NAM和NMN含量。
背景技术
烟酰胺单核苷酸（NMN）和烟酰胺（NAM）是NAD+前体，属于维生素B3，存在于所有真核生物中。NAM已经用于治疗糙皮病，它是由于维生素B3缺乏造成的；而NMN对多种生理功能有好处，例如可增加胰岛素分泌。在细胞中，NAM和PRPP在NAMPT催化下生成NMN，然后，NMN在NMNAT催化作用下生成NAD+。体外采用酶催化方法检测NAM和NMN含量，价格较为昂贵；注意事项较多；可能有其他物质在酶催化下转化为目的产物，造成结果不准确。因此，很少用酶催化方法检测NAM和NMN含量。
目前，NMN和NAM检测方法主要是 LC-MS/MS、HPLC、同位素示踪法等，这些检测方法存在价格昂贵、流程复杂、耗时长的缺点。而本发明NMN和NAM检测原理如下:
烟酰胺与甲基亚硝基脲(MNU)在弱碱性条件下进行N-甲基化反应，生成NMN；NMN在碱性条件下与苯乙酮进行缩合反应，再经酸处理可得到荧光2,7-萘吡啶衍生物。此衍生物在382nm激发波长和445 nm发射波长下具有最强荧光强度。本发明方法具有操作简单、快速准确、成本低、耗时短、高通量的优点，有效地克服了上述检测方法的缺点。
发明内容
针对上述情况，为克服现有技术之缺陷，本发明之目的就是提供一种检测烟酰胺和烟酰胺单核苷酸绝对含量的方法，可有效快速检测样品中NAM和NMN含量。
本发明技术方案：先选定NAM标准品浓度，与样本同时进行处理，数据分析时制作标准曲线；对样品分离、裂解及/或内在酶反应阻断处理；然后向标准品、样品及空白中先后加入过量的MNU、苯乙酮、KOH及甲酸进行反应，最终获得荧光衍生物；用酶标仪检测荧光强度；最后进行数据分析，根据标准曲线计算样本中NAN和NMN含量。
本发明检测NAM和NMN绝对含量方法，包括以下步骤：
（1）制备标准曲线：选定NAM标准品浓度，与样本同时进行处理，最终数据分析时制作标准曲线；
（2）样品分离、裂解和/或内在酶反应阻断处理；
（3）样品及标准品中加试剂进行反应：取相同体积的NAM样品、NNM样品、各浓度标准品及空白，各2个副空，除了NNM样品加入1/2样品体积的水之外，其他皆分别加入1/2样品体积的0.5 mM KOH配制的25% MNU，室温静置30 min，都再各加入1/2样品体积的 20%苯乙酮和2M KOH，在冰上孵育10min，最后加入2.5倍样品体积的 88%甲酸，37℃孵育10min；
（4）样品及标准品荧光强度检测：将样品、标准品和空白反应液转移到黑色酶标板，用酶标仪测定在382nm激发波长和445nm发射波长条件下样品、标准品和空白的荧光强度；
（5）数据分析：根据NAM标准曲线，计算样品NAM和NMN含量；
（6）进一步的，所述步骤（2）的样品可以是动物细胞、动物组织、动物血液、NAMPT或NMNAT活性测定样本；
（7）进一步的，所述步骤（2）的样品裂解方法可用化学裂解、酶裂解和机械裂解法裂解细胞和组织，细胞和组织裂解时在低温下进行，防止其他物质转换为NAM和/或NMN以及二者间相互转换；
（8）进一步的，所述步骤（2）的酶反应阻断方法：向空白、标准品和样品中加入1/2体积1.2 M 预冷的HCIO4，冰上孵育，离心10min，吸取上清至新的EP管中；再向EP管中加入0.22倍上清体积的1M K2CO3，调整PH至7.4，-20℃孵育20 min，16000g，4 ℃离心10min，吸取上清至新的EP管中，备用；
（9）进一步的，所述步骤（2）的样品分离是NAMPT/NMNAT酶的分离纯化，也可以是血液中的血清、红细胞和白细胞分离。
本发明检测方法具有成本低、结果准确、操作简单、耗时短、快速可靠、适合大规模样本检测优点，有很强的实用价值，易于推广应用，经济和社会效益巨大。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
下面对本发明以检测全血NAM和NMN含量进行具体说明：
1、血液采集及分装：采集2ml外周血于新鲜抗凝管中，颠倒几下，放置于冰上，在冰上分装全血，每管450μl，液氮速冻，转至-80℃冰箱保存；
2、标准品浓度选择：制备适宜NAM浓度的标准品。根据目前全血中NAM和NMN含量相关报道，选用0.1μM、1μM、2μM、3μM、4μM、5μM NAM 进行试验，与样本同时进行处理；
3、样品裂解及酶反应阻断处理：对全血样本进行反复冻融，分别向400μl空白、标准品和样品中加入200μl 1.2 M 预冷的HCIO4，冰上孵育5 min，16000g，4℃离心10min，吸取550上清至新的EP管中；再向EP管中加入116.9 μl 1M K2CO3，调整PH至7.4，-20℃孵育20 min，16000g，4 ℃离心10min，吸取500上清至新的EP管中；
4、样品及标准品中加试剂进行反应：分别取50μl NAM样品、NMN样品、各浓度标准品与空白（水），副空各2个孔；NAM样品、各浓度标准品与空白（水）中都加入25μl 用0.5mM KOH配制的25%甲基亚硝基脲(MNU)，而NMN样品中加入25μl水，室温静置30min；都再加入25μl 20%乙酰苯（苯乙酮）和 25μl 2 M KOH，在冰上孵育10min；再加入125ul 88%甲酸，37℃孵育10min；
5、样品及标准品荧光强度检测：将反应液转移到黑色酶标板，离心机4℃瞬甩（2000g，4℃，2min），除去气泡。然后，用酶标仪检测在382nm激发波长和445nm发射波长条件下样品、标准品和空白的荧光强度；
6、数据分析：数值读取结束后，制作NAM标准品曲线，根据标准曲线可知不同NAM浓度所对应的荧光数值，再根据样品荧光强度值对照标准曲线计算NMN和NAM含量。
本技术领域技术人员可以理解，除非另外定义，这里使用的所有术语(包括技术术语和科学术语)具有与本发明所属领域中的普通技术人员的一般理解相同的意义。还应该理解的是，诸如通用字典中定义的那些术语应该被理解为具有与现有技术的上下文中的意义一致的意义，并且除非像这里一样定义，不会用理想化或过于正式的含义来解释。
最后所应说明的是：以上实施例仅用以说明而非限制本发明的技术方案，尽管参照上述实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应该理解：依然可以对本发明进行修改或者等同替换，而不脱离本发明的精神和范围的任何修改或局部替换，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。
Claims (5)
1.一种检测烟酰胺（NAM）和烟酰胺单核苷酸（NMN）绝对含量的方法，其特征在于，先选定NAM标准品浓度，与样本同时进行处理，数据分析时制作标准曲线；对样品分离、裂解及/或内在酶反应阻断处理；然后向标准品、样品及空白中先后加入过量的MNU、苯乙酮、KOH及甲酸进行反应，最终获得荧光衍生物；用酶标仪检测荧光强度；最后数据分析，根据标准曲线可知样本NAN和NMN含量，包括以下步骤：
制备标准曲线：选定NAM标准品浓度，与样本同时进行处理，最终数据分析获得标准曲线；
样品分离、裂解和/或内在酶反应阻断处理；
样品及标准品中加试剂进行反应：取相同体积的NAM样品、NMN样品、各浓度标准品及空白，各2个副空，除了NNM样品加入1/2样品体积的水之外，其他皆各加入1/2样品体积的0.5mM KOH配制的25% MNU，室温静置30min，都再各加入1/2样品体积的 20%苯乙酮和2 MKOH，在冰上孵育10min，最后加入2.5倍样品体积的 88%甲酸，37℃孵育10min；
样品及标准品荧光强度检测：将样品、标准品和空白反应液转移到黑色酶标板，用酶标仪检测在382nm激发波长和445nm发射波长条件下样品、标准品和空白的荧光强度；
数据分析：根据NAM标准曲线，计算样品NAM和NMN含量。
2.根据权利要求 1所述的方法，其特征在于，步骤（2）中的样品可以是动物细胞、动物组织、动物血液、NAMPT和NMNAT活性测定样本。
3. 根据权利要求 1所述的方法，其特征在于，步骤（2）中的样品裂解方法可用化学裂解、酶裂解和机械裂解法裂解细胞和组织，细胞和组织裂解时在低温下进行，防止其他物质转换为NAM和/或NMN以及二者间相互转换。
4. 根据权利要求 1所述的方法，其特征在于，步骤（2）中的酶反应阻断方法：向空白、标准品和样品中加入1/2样本体积的1.2 M 预冷的HCIO4，冰上孵育，离心10min，吸取上清至新的EP管中；再向EP管中加入0.22倍上清体积的1M K2CO3，调整PH至7.4，-20℃孵育20min，16000g，4 ℃离心10min，吸取上清至新的EP管中，备用。
5. 根据权利要求 1所述的方法，其特征在于，步骤（2）中的样品分离是NAMPT/NMNAT酶的分离纯化，也可以是血液中的血清、红细胞和白细胞分离。
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