JP4248496B2

JP4248496B2 - 結腸直腸癌に対するマーカーとしてのニコチンアミドｎ−メチルトランスフェラーゼの使用

Info

Publication number: JP4248496B2
Application number: JP2004561373A
Authority: JP
Inventors: ベルンツ，ペーター; ハグマン，マリー−ルイゼ; ランゲン，ハンノ; パルメ，シュテファン; レスラー，マルクス; ロリンガー，ウォルフガング; タッケ，ミヒァエル; ツォルク，ヴェルナー; カール，ヨハン; コット，テレーザ
Original assignee: F Hoffmann La Roche AG
Current assignee: F Hoffmann La Roche AG
Priority date: 2002-12-20
Filing date: 2003-12-19
Publication date: 2009-04-02
Anticipated expiration: 2023-12-19
Also published as: AU2003296684A1; DE60315715T2; CN1742204A; ATE370414T1; MXPA05006382A; BR0317394A; JP2006510889A; KR100711046B1; HK1088947A1; EP1579220A2; US20060003368A1; ES2291750T3; DE60315715D1; US7205118B2; KR20050114604A; CA2510377A1; CN100437115C; CA2510377C; WO2004057336A3; EP1579220B1

Description

発明の詳細な説明

本発明は、結腸直腸癌の診断に関する。本発明は、結腸直腸癌の診断におけるニコチンアミドN-メチルトランスフェラーゼ（＝NNMT）の使用を開示する。さらに、本発明は特に、個体由来の液体試料からの、該試料中のNNMTの測定による結腸直腸癌の診断方法に関する。NNMTの測定は、例えば結腸直腸癌の早期検出または診断に用いられ得る。

癌は、検出および治療の進歩にもかかわらず、未だ公衆の健康の課題である。種々の癌の中で、結腸直腸癌（＝CRC）は西欧世界において最も頻度の高い癌の一つである。

癌は早期に検出／診断されるほど、全体的な生存率はより良くなる。これは特にCRCについて言える。癌の進行期における予後は不良である。三分の一を超える患者が診断後5年以内に進行性の疾患で死亡し、5年で約40％の生存率に相当する。現在の治療はわずかな患者を治療するのみであり、明らかに疾患の早期に診断された患者に最大の効果がある。

公衆の健康問題としてのCRCに関して、結腸直腸癌に対するより効果的なスクリーニングおよび予防手段が開発されることが不可欠である。

結腸直腸癌に対する現在利用可能な最も早い検出手順は、便の血液に対する検査または内視鏡的手順を使用することを含む。しかしながら、便の血液が検出されるまでに、大きな腫瘍サイズが典型的に存在することが必要である。グアヤクベースの便潜血検査の感度は26％以下であり、このことは悪性の病変を有する患者の74％が検出されないままになるということを意味する（Ahlquist, D.A., Gastroenterol. Clin. North Am. 26 (1997) 41-55）。前癌および癌の病変の可視化は早期検出への最良のアプローチの代表であるが、結腸鏡検査は侵襲性であり、かなりのコスト、リスクおよび複雑性を伴う（Silvis, S.E.ら, JAMA 235 (1976) 928-930; Geenen, J.E.ら, Am. J. Dig. Dis. 20 (1975) 231-235; Anderson, W. F.ら, J. Natl. Cancer Institute 94(2002) 1126-1133）。

近年、途方もない量の、いわゆる結腸特異的または結腸直腸癌特異的とさえいわれる遺伝子が報告されている。対応する研究論文または特許出願の圧倒的多数は、異なる組織または隣接した正常な組織のそれぞれに対する、結腸（癌）組織におけるRNA発現パターンの分析から得られたデータに基づいている。かかるアプローチは、ディファレンシャルmRNAディスプレイ技術にまとめることができる。

mRNAディスプレイ技術から入手可能なデータの一例として、WO 第01/96390号に言及し、議論しよう。この出願は200を超える単離されたポリヌクレオチドおよび対応するポリペプチドそれ自体、ならびにCRCの検出におけるそれらの使用を記載および特許請求している。しかしながら、mRNAのレベルの差が、対応するタンパク質のレベルに正確に反映されないということは、一般的な知識である。希少なmRNAにコードされるタンパク質が非常に多量に見られ得、それにもかかわらず多量のmRNAにコードされるタンパク質が検出されにくく、全く見つからないことがあり得る。mRNAレベルとタンパク質レベルとの間のこの相関の欠如は、mRNA安定性、翻訳の効率、タンパク質の安定性等の理由による。

また、CRCの診断に用いられ得る候補となるマーカー分子を同定するために、異なる組織間または健康な組織と病変組織との間のタンパク質パターンの差を調査する最近のアプローチもある。Bruenagel, G.ら, Cancer Research 62 (2002) 2437-2442は7つの核基質タンパク質を同定し、これらは近隣の正常な組織と比較して、CRC組織により豊富にあるとわかった。個体から得られた液体試料からのデータは報告されていない。

WO第02/078636号は、表面増強レーザ脱離およびイオン化（SELDI）で見られるような9つの結腸直腸癌関連スポットについて報告している。これらのスポットは、健康な対照から得られる血清と比較して、CRC患者から得られる血清中により頻繁に見られる。しかしながら、かかるスポットに含まれる分子の同一性、例えばその（それらの配列）は知られていない。

CRCの分野における候補となるタンパク質マーカーのリストは多く、成長し続けているにもかかわらず、今日までこれらの分子の臨床的／診断的有用性は知られていない。臨床的に有用であるために、単一のマーカーとしての新規の診断用マーカーは、少なくとも当該分野で公知の最良の単一のマーカーと同様に優れているべきである。言い換えれば、新規のマーカーは単独で用いられるか、または一つ以上の他のマーカーと組み合わせて用いられるかのいずれかの場合に診断的感度および／または特異性の進展をもたらすべきである。検査の診断的感度および／または特異性は、後で詳述するその受信者動作特性によって最もよく評価される。

現在のところ、癌胎児抗原（CEA）、腫瘍関連糖タンパク質の検出に基づいた診断的な血液検査のみが、CRCの分野における診断を助けるのに利用可能である。CEAは結腸直腸癌、胃癌および膵臓癌の患者から得られた組織試料の95％、ならびに乳癌、肺癌および頭部および頚部の癌腫の大部分において増加している（Goldenberg, D.M.ら, J. Natl. Cancer Inst. (Bethesda) 57 (1976) 11-22）。CEAレベルの上昇は、悪性でない疾患の患者においても報告されており、結腸直腸癌の患者の多くは、特に疾患の初期段階の間に血清中の正常なCEAレベルを有する（Carriqury, L.A.およびPineyro, A., Dis. Colon Rectum 42 (1999) 921-929; Herrera, M.A.ら, Ann. Surg. 183 (1976) 5-9; Wanebo, H.J.ら, N. Engl. J. Med. 299 (1978) 448-451）。再発の検出において血清または血漿から評価されるCEAの有用性は、伝えるところによると論議の的となっており、未だ広く適用されなければならない（Martell, R.E.ら, Int. J. Biol. Markers 13 (1998) 145-149; Moertel, C.G.ら, JAMA 270 (1993) 943-947）。

入手可能なデータを考慮して、血清CEA測定は、無症候の集団における結腸直腸癌のスクリーニング検査としての使用を可能にする感度も特異性も有さない（Reynoso, G.ら, JAMA 220 (1972) 361-365; Sturgeon, C., Clinical Chemistry 48 (2002) 1151-1159）。

全血、血清または血漿は、臨床の慣例において最も広く用いられる、試料の供給源である。信頼できる癌の検出を可能にするか、または早期予後情報を提供する早期CRC腫瘍マーカーの同定は、この疾患の診断および管理において大いに助けとなる診断アッセイをもたらし得た。したがって、血液からのCRCの診断を改良する、差し迫った臨床的必要がある。早期に診断される患者にとって、疾患の進行した段階で診断された患者と比較して生存の可能性がかなり高いので、CRCの早期診断を改良することが特に重要である。

本発明の課題はCRC診断において助けとなり得る新規のマーカーが同定され得るかどうかを調べることであった。

驚いたことに、タンパク質NNMTの使用によって、現状から分かっている問題を少なくとも部分的に克服できることがわかった。

したがって、本発明は、a)個体から得られた液体試料を提供する工程、b)該試料と、NNMTに対して特異的な結合剤とを、該結合剤とNNMTとの間で複合体が形成されるのに適切な条件下で接触させる工程、およびc)(b)で形成された複合体の量を結腸直腸癌の診断と相関させる工程、を含む結腸直腸癌の診断方法に関する。

したがって、該方法が、工程(a)において個体から得られた液体試料を使用する工程を含むことが好ましい。

本発明の別の好ましい態様は、a)個体から得られた液体試料とNNMTに対して特異的な結合剤とを、該結合剤とNNMTとの間で複合体が形成されるのに適切な条件下で接触させる工程、およびb)(a)で形成された複合体の量を結腸直腸癌の診断と相関させる工程、を含む結腸直腸癌の診断方法である。

タンパク質ニコチンアミドN-メチルトランスフェラーゼ（NNMT）；（Swiss-PROT: P40261）は、配列番号：１に定められた配列によって特徴付けられる。NNMTは29.6 kDaの見かけ上の分子量および5.56の等電点を有する。

NNMTは、ニコチンアミドおよび他のピリジンのN-メチル化を触媒する。この活性は多くの薬物および生体異物化合物の生体内変化に重要である。このタンパク質は、主に肝臓で発現されると報告されており、細胞質中にある。NNMTはヒト肝臓由来のcDNAからクローン化され、264アミノ酸のタンパク質をコードする792ヌクレオチドのオープンリーディングフレームを含み、計算された分子量は29.6 kDaである（Aksoy, S.ら, J. Biol. Chem. 269 (1994) 14835-14840）。文献ではヒト癌における酵素の潜在的な役割について、あまり知られていない。ある論文では、肝臓のNNMTの酵素活性の増加がマウスにおける癌悪質液に対するマーカーとして報告されている（Okamura, A.ら, Jpn. J. Cancer Res. 89 (1998) 649-656）。最近の報告では、放射線感受性細胞系における、放射線に応じたNNMT遺伝子のダウンレギュレーションが示された（Kassem, H.ら, Int. J. Cancer 101 (2002) 454-460）。

当業者に明白なように、本発明は配列番号：１の全長タンパク質NNMTに限定されると解釈されるものではない。NNMTの生理的断片または人工の断片、NNMTの二次修飾、およびNNMTの対立遺伝子多型もまた、本発明に含まれる。人工の断片は、好ましくは、合成によって、または組み換え技術によって生成されたペプチドであって、配列番号：１に開示される配列に由来するような、少なくとも6つの連続したアミノ酸を含む診断対象のエピトープを少なくとも1つ含むペプチドを含む。かかる断片は、有利に、抗体の生成のために、またはイムノアッセイの標準として用いられ得る。さらに好ましくは、人工の断片は、サンドイッチイムノアッセイを構成するのに適切な対象のエピトープを少なくとも2つ含む。

好ましい態様において、新規のマーカーNNMTはモニタリングおよびスクリーニング目的に用いられ得る。

患者のモニタリングに用いられる場合、本発明の診断方法は腫瘍負荷、治療の効能および患者の追跡における腫瘍の再発を評価するのを助け得る。NNMTのレベルの増加は、腫瘍負荷に直接相関性がある。化学療法の後、NNMTの短期間（数時間〜14日）の増加は、腫瘍細胞の死の指標となり得る。患者の追跡（3ヵ月〜10年）において、NNMTの増加は腫瘍の再発の指標として用いられ得る。

好ましい態様において、本発明の診断方法はスクリーニング目的に用いられる。すなわち、これはNNMTのレベルを測定し、測定されたレベルをCRCの存在または非存在と相関させることによってCRCの事前の診断なしに被験体を評価するのに用いられる。

結腸直腸癌は、腺腫（ポリープ）から悪性癌腫へと進行する頻度が最も高い。CRCの種々の段階は、Dukeの病期A〜Dによって分類されていた。

癌の病期分類は、程度、進行及び重症度の点から見た疾患の分類である。これは、予後および療法の選択についての一般化がなされ得るように癌患者を分類する。

今日では、TNM系が最も広く用いられる解剖学的な癌の程度の分類である。これは国際的に認められた、一様な病期分類系の代表である。3つの基本的な変数：T（原発腫瘍の程度）、N（局所的なリンパ節の状態）およびM（遠隔転移の存在または非存在）がある。TNM判定基準はUICC（国際対癌連合）、Sobin, L.H., Wittekind, Ch.（編）, TNM Classification of Malignant Tumours, 第5版, 1997）により発行されている。

特に重要なのは、CRCの早期診断ははるかに良好な予後につながることである。結腸直腸の悪性腫瘍は良性腫瘍から、すなわち腺腫から生じる。したがって、腺腫期に診断された患者が、最も予後が良好である。T_is、N0、M0またはT1〜3期ほどの早期に診断された患者は、適切に治療されれば、遠隔転移がすでに存在しているときに診断された患者に対するわずか10％の5年生存率と比較して、診断から5年後に生存している可能性が90％を超える。

本発明の意味では、CRCの早期診断は、前悪性状態（腺腫）での、または転移が全く存在しない（近位でも遠位でもない）腫瘍期、すなわち腺腫、T_is、N0、M0またはT1〜4；N0；M0での診断に関する。T_isはインサイチューでの癌腫を表す。

好ましい態様において、NNMTは腺腫期ほどの早期にCRCを診断するのに用いられる。

さらに好ましいのは、CRCが腸壁を通して完全に成長するまでに診断され、そのため臓側腹膜は穿孔されず、他の器官または構造も侵されないことであり、すなわちT_is；N0；M0〜T3；N0；M0（＝T_is〜3；N0；M0）の任意の病期で診断されることである。

本発明の診断方法は個体由来の液体試料に基づく。当該分野で公知の方法と異なり、NNMTは特異的な結合剤の使用によってこの液体試料から特異的に測定される。

特異的な結合剤は、例えばNNMTに対する受容体、NNMTに結合するレクチンまたはNNMTに対する抗体である。当業者に理解されるように、用語特異的、は、試料中に存在する他の生体分子がNNMTに特異的な結合剤と有意には結合していないことを示すのに用いられる。5％未満の交差反応のレベルは有意でないと見なされる。

好ましい特異的な結合剤はNNMTと反応性のある抗体である。用語抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体およびかかる抗体の断片、ならびに抗体の結合ドメインを含む遺伝的構築物に関する。

抗体は従来技術の手法によって、例えばTijssen（Tijssen, P., Practice and theory of enzyme immunoassays 11 (1990)の本全体、特に43-78ページ; Elsevier, Amsterdam）に記載されているように生成される。さらに、抗体の特異的な単離に用いられ得るイムノソルベントに基づく方法は、当業者によく承知されている。これらの手段によって、ポリクローナル抗体の質、およびそのためイムノアッセイにおけるそれらの性能は増強され得る。（Tijssen, P., 前掲, 108-115ページ）。本発明に開示されるような達成のために、ウサギで惹起されたポリクローナル抗体が用いられた。しかしながら、明らかに、種々の種、例えばラットまたはモルモット由来のポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体も用いられ得る。モノクローナル抗体は任意の必要量を一定の性質で生成できるので、臨床的慣例の分析の開発における理想的な手段の代表である。本発明の方法におけるNNMTに対するモノクローナル抗体の生成および使用もまた、別の好ましい態様である。

当業者に理解されるように、NNMTがCRCの診断に有用なマーカーとして同定されたので、代替の方法を用いて本発明の達成に相当する結果に達し得る。例えば、抗体を生成する代替の戦略が用いられ得る。かかる戦略は、特に合成ペプチドの使用を含み、免疫化のためのNNMTのエピトープの代表である。あるいは、DNAワクチン接種としても知られるDNA免疫化が用いられ得る。

測定のために、個体から得られた液体試料をNNMTに対して特異的な結合剤とともに、結合剤NNMT複合体の形成に適切な条件下でインキュベートする。当業者が発明的努力なしに容易にかかる適切なインキュベーション条件を同定できるために、かかる条件は明記される必要がない。

本発明で開示される方法の最後の工程として、複合体の量を測定し、CRCの診断と相関させる。当業者に理解されるように、特異的な結合剤NNMT複合体の量を測定する方法は非常に多く、すべて関連性のある教科書（例えば、Tijssen P., 前掲、またはDiamandisら編(1996) Immunoassay, Academic Press, Boston参照）に詳細に記載されている。

好ましくは、NNMTはサンドイッチ式アッセイ形式で検出される。かかる分析において、一方で第一の特異的な結合剤はNNMTを捕捉するのに用いられ、もう一方で直接または間接的に検出可能に標識された第二の特異的な結合剤が用いられる。

上述したように、驚いたことに、NNMTが個体試料から得られた液体試料から測定できるということがわかった。CRCの診断において、マーカーNNMTを適用するのに組織も生検試料も必要ない。

好ましい態様において、本発明の方法は液体試料材料として血清を用いて実施される。

さらに好ましい態様において、本発明の方法は液体試料材料として血漿を用いて実施される。

さらに好ましい態様において、本発明の方法は液体試料材料として全血を用いて実施される。

さらに、当業者に公知な様々な方法で便を調製し、液体試料をもたらすこともできる。かかる便由来の液体試料もまた、本発明の好ましい態様の代表である。

通常のプロテオミクス法の組織試料への適用は選択された組織に対する多くの潜在的マーカー候補の同定をもたらすのに対し、本発明の発明者らは、驚いたことに、体液試料中のタンパク質NNMTを検出することができた。さらに驚いたことに、本発明者らは、個体から得られたかかる液体試料中のNNMTの存在は結腸直腸癌の診断と相関させられ得ることを証明した。

多大な利益を有するNNMTに対する抗体は、確立された手法において、例えば結腸直腸癌細胞のインサイチューでの、生検中での、または免疫組織学的手法での検出に用いられ得る。

好ましくは、NNMTに対する抗体は定性的な（NNMT存在または非存在）または定量的な（NNMTの量が検出される）イムノアッセイに用いられる。

タンパク質NNMTのレベルの測定はCRCの分野で非常に有利であると証明されている。したがって、さらに好ましい態様において、本発明は、個体から得られた液体試料からの結腸直腸癌の診断におけるマーカー分子としてのタンパク質NNMTの使用に関する。

用語マーカー分子は、個体の体液から測定されるような被検体NNMTのレベルの上昇がCRCの存在を示すことを示すのに用いられる。

新規のマーカーNNMTを結腸直腸癌の早期診断において使用するのが特に好ましい。

タンパク質NNMTそのものの使用は、CRC診断の難しい分野への著しい進展を表す。NNMTの測定と、CEAのような他の公知のマーカーまたはCRCの他のマーカーとを組み合わせることは未だ発見されておらず、さらなる改良をもたらす。したがって、さらに好ましい態様において、本発明は、個体から得られた液体試料からの結腸直腸癌の診断における、結腸直腸癌に対するマーカー分子としてのNNMTの、結腸直腸癌に対する別のマーカー分子と組み合わせた使用に関する。NNMTの測定と組み合わせられ得る好ましい選択された他のCRCマーカーは、CEA、CA 19〜9、CA 72〜4および／またはCA 242である。

イムノアッセイのような特異的結合分析の分野における診断的試薬は、通常、分析を実施するのに必要な特異的な結合剤および補助試薬を含むキットの形で最良に提供される。したがって本発明はまた、少なくとも1つのNNMTに対して特異的な結合剤およびNNMTの測定のための補助試薬を含む免疫学的キットに関する。

検査の正確さは、その受信者動作特性（ROC）によって最もよく記載されている（特にZweig, M.H.およびCampbell, G., Clin. Chem. 39 (1993) 561-577参照）。ROCグラフは、観察されるデータの全範囲に亘る継続的に変化する判定基準から生じる感度／特異性対の全てのプロットである。

実験室検査の臨床的性能はその診断の正確さ、つまり被験体を臨床的に関連のあるサブグループに正確に分類する能力に依存する。診断の正確さは検査の能力を評価し、調べられる被験体の2つの異なる状態を正確に区別する。かかる状態は、例えば健康および疾患または良性対悪性疾患である。

各場合において、ROCプロットは感度対1-特異性をプロットすることによって、判定基準の全範囲に対して2つの分布間の重複を描写する。感度、つまり真陽性分数〔（真陽性検査結果の数）（真陽性の数＋偽陰性検査結果の数）と定義される〕はy軸上である。これは疾患または状態存在下の明確さ（positivity）とも呼ばれる。これは罹患サブグループからのみ算出される。偽陽性分数、つまり1-特異性〔（偽陽性結果の数）／（真陰性の数＋偽陽性結果の数）と定義される〕はx軸上である。これは特異性の指標であり、非罹患サブグループから完全に算出される。真陽性および偽陽性分数は2つの異なるサブグループの検査結果を用いて完全に別々に算出されるため、ROCプロットは試料中の疾患の有病率から独立している。ROCプロットの各点は、特定の判定基準に対応する感度／-特異性対を表す。完全な差別化を用いた検査（2つの結果の分布に重複がない）は、左上角を通るROCプロットを有し、そこで真陽性分数は1.0、つまり100％（完全な感度）であり、偽陽性分数は0（完全な特異性）である。差別化のない検査のための理論プロット（2つのグループに対する結果の同一な分布）は左下角から右上角への45°対角線である。殆どのプロットはこれらの2つの端の間に入る。（ROCプロットが完全に45°対角線より下に入る場合、これは判定基準を「正確性」に対する判定基準を「〜より大きい」から「〜より小さい」に逆転させることによって容易に修正される。逆もまた同じ。）定性的に、プロットが左上角に近くなるほど、検査の全体的な正確性は高くなる。

実験室検査の診断の正確さを定量するためのある都合のよい目標は、その性能を単一の数字によって表すことである。最も一般的な世界的な測定基準はROCプロットの下の面積である。慣例により、この面積は常に0.5以上である（そうでない場合、そうなるように決定基準を逆転させることができる）。値は1.0（2つのグループの検査値の完全な分離）と0.5（2つのグループの検査値の間に明白な分布の差がない）の間に亘る。面積は、対角線に最も近い点または90％特異性の明確さ等のプロットの特定の部分のみによらず、プロット全体にもよる。これはROCプロットの完全なもの（面積＝1.0）への近さの定量的で、記述的な表現である。

新規のマーカーNNMTの臨床上の有用性は、受信者動作特性曲線（receiver operator curve）分析を用いた確立されたマーカーCEAと比較して、または組み合わせて評価されてきた（ROC; Zweig, M.H.およびCampbell, G., Clin. Chem. 39 (1993) 561-577）。この分析は、T1〜3；N0；M0、より進行した腫瘍、すなわちT4および／または様々な重症度の転移（N+および／またはM+）の患者、ならびに健康な対照のそれぞれからの、各50サンプルからなる明確な患者コホートに基づいてきた。

確立されたマーカーCEAのみと比較したNNMTのみの測定に基づく診断方法は、診断の正確さ（感度／特異性プロファイル）が曲線下の面積によって証明されるように少なくとも同程度良いということが分かった。

以下の実施例、参考文献、配列表および図は本発明の理解を助けるために提供され、この真の範囲は添付の特許請求の範囲に示される。本発明の精神を逸脱することなく、示された手法に変更が成され得ることは理解される。

略語
ABTS 2,2'-アジノ-ジ-[3-エチルベンズチアゾリンスルホン酸(6)]二アンモニウム塩
BSA ウシ血清アルブミン
cDNA 相補DNA
CHAPS (3-[(3-コールアミドプロピル)-ジメチルアンモニオ]-1-プロパン-スルホン酸)
DMSO ジメチルスルホキシド
DTT ジチオスレイトール
EDTA エチレンジアミン四酢酸
ELISA 酵素結合免疫吸着定量法
HRP ホースラディッシュペルオキシダーゼ
IAA ヨードアセタミド
IgG 免疫グロブリンG
IEF 等電点電気泳動法
IPG 固定化pH勾配
LDS 硫酸ドデシルリチウム
MALDI-TOF マトリックス支援レーザ脱離イオン化-飛行時間型質量分析
MES メシチル、2,4,6-トリメチルフェニル
OD 光学密度
PAGE ポリアクリルアミドゲル電気泳動
PBS リン酸緩衝生理食塩水
PI 等電点
RTS 迅速翻訳装置
SDS ドデシル硫酸ナトリウム

実施例１
潜在的な結腸直腸癌マーカーとしてのNNMTの同定
組織の供給源
結腸直腸癌の潜在的な診断用マーカーとして腫瘍特異的タンパク質を同定するために、プロテオミクス法を用いて３つの異なる種類の組織の分析を行った。

結腸直腸癌を患う全部で10名の患者に由来する組織標本を分析した。各患者から、３つの異なる組織型を治療的切除から収集した：腫瘍組織(>80％腫瘍)(T)、隣接する健康な組織(N)および隣接する健康な粘膜から細片化した粘膜(M)。後者の２つの組織型は、適合した健康な対照試料として働く。組織を切除後すぐにスナップ凍結し、処理前に-80℃で保存した。腫瘍を組織病理学的基準により診断した。

組織調製
0.8〜1.2gの凍結組織をモルタルに入れ、液体窒素により完全に凍結させた。組織をモルタル中で粉砕し、10倍容積(w/w)の溶解バッファー(40mMクエン酸Na、5mM MgCl₂、1%Genapol X-080、0.02%アジドNa、Complete(登録商標)EDTAフリー[Roche Diagnositc GmbH, Mannheim, Germany, カタログ番号.1 873 580])中で溶解させ、続いてWheaton(登録商標)グラスホモジナイザー(20xルーズフィッティング、20xタイトフィッティング)でホモジナイズした。3mlのホモジェネートを１時間4500x gでスクロース密度遠心分離(10〜60％スクロース)に供した。この遠心分離工程後、３つの画分を得た。グラジエントの上部の画分は、可溶性タンパク質を含み、さらなる精製のために使用した。

等電点電気泳動(IEF)およびSDS-PAGE
IEFのために、３mlの懸濁物を12mlの試料バッファー(7M尿素、2Mチオ尿素、2% CHAPS、0.4% IPGバッファーpH4〜7、0.5% DTT)と混合し、１時間インキュベートした。試料をAmicon(登録商標)Ultra-15デバイス(Millipore GmbH, Schwalbach, Germany)で濃縮し、Bio-Rad(登録商標)タンパク質アッセイ(カタログ番号.500-0006; Bio-Rad Laboratories GmbH, Muenchen, Germany)を用いて製造業者のマニュアルの指示に従ってタンパク質濃度を測定した。1.5mgのタンパク質に対応する容積に最終容積350μlまで試料バッファーを添加した。この溶液を用いてIPG条片pH4〜7(Amersham Biosciences, Freiburg, Germany)を一晩再水和させた。以下の勾配プロトコルを用いてIEFを行った：1.)500Vまで１分間；2.)3500Vまで２時間；3.)一定の3500Vで22時間、82kVhに増加させた。IEF後、条片を-80℃で保存するか、またはSDS-PAGEで直接使用した。

SDS-PAGEの前に、条片を平衡バッファー(6M尿素、50mM Tris/HCl、pH8.8、30%グリセロール、2% SDS)でインキュベートし、還元のためにDDT(15分、+50mg DTT/10ml)、およびアルキル化のためにIAA(15分、+235mgヨードアセトアミド/10ml)を添加した。条片を12.5％ポリアクリルアミドゲル上に置き、１W/ゲルで１時間、その後17W/ゲルで電気泳動に供した。続いて、ゲルを固定し(50％メタノール、10％酢酸塩)、Novex^TMColloidal Blue Stainingキット(Invitrogen, Karlsruhe, Germany, カタログ番号.LC6025, 45-7101)で一晩染色した。

結腸直腸癌の潜在的なマーカーとしてのNNMTの検出
各患者を、ProteomeWeaver(登録商標)ソフトウェア(Definiens AG, Germany, Muenchen)を用いてイメージ分析により別々に分析した。さらに、ゲルの全てのスポットを、ピッキングロボットにより切り出し、スポットに存在するタンパク質をMALDI-TOFマススペクトロメトリー(Ultraflex^TMTof/Tof, Bruker Daltonik GmbH, Bremen, Germany)により同定した。各患者について、腫瘍試料由来の４つのゲルを、隣接する正常な組織および細片化した粘膜組織由来の４つのゲルと比較し、差次的に発現したタンパク質に対応する独自のスポットについて分析した。この手段により、タンパク質NNMTが腫瘍組織中で特異的に発現するか、強く過剰発現するが、健康な対照組織では検出され得ないことが見出された。それ故、多くのタンパク質の中でもとりわけ、結腸直腸癌の診断に使用するための候補マーカーとして適切であった。

実施例２
結腸直腸癌マーカータンパク質NNMTに対する抗体の産生
結腸直腸癌マーカーたんぱく質NNMTに対するポリクローナル抗体を、免疫検出アッセイ、例えば、ウェスタンブロッティングおよびELISAによりNNMTの血清および血漿および血液レベルの測定における抗体のさらなる使用のために産生した。

大腸菌における組換えタンパク質発現
NNMTに対する抗体を産生するために、免疫原を得るために上記タンパク質の組換え発現を行った。発現は、RTS100発現系および大腸菌の組み合わせを適用することにより行った。第１の工程において、DNA配列を分析し、高収率cDNAサイレント変異バリアントおよび個々のPCRプライマー配列の推奨を「ProteoExper RTS E.coli HY」システムを用いて得た。これは、商用のウェブベースサービスである(www.proteoexpert.com)。推奨されたプライマー対を用いて、cDNAから直鎖PCRテンプレートを作製するため、ならびにNNMTタンパク質をコードするヌクレオチド配列のインビトロ転写および発現のために「RTS 100 E.coli Linear Template Generation Set, His-tag」(Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany カタログ番号.3186237)システムを使用した。ウェスタンブロット検出および後の精製のために、発現タンパク質はHis-タグを含んでいた。最良の発現バリアントを同定した。PCRから発現および検出までの全ての工程を製造業者の指示に従って行った。全ての必要なT7調節領域(プロモーター、リボソーム結合部位およびT7ターミネーター)を含む各々のPCR産物を、製造業者の指示に従ってpBAD TOPO(登録商標)ベクター(Invitrogen, Karlsruhe, Germany, カタログ番号. K 4300/01)にクローニングした。T7調節配列を用いる発現のために、構築物を大腸菌BL 21(DE3)(Studier, F.W.,ら、Methods Enzymol. 185 (1990)60-89)に形質転換し、形質転換細菌をタンパク質発現のために1lバッチ中で培養した。

His-NNMT融合タンパク質の精製は、以下の標準的な手順に従いNiキレートカラムにおいて行った。手短には、His-NNMT融合タンパク質の発現ベクターを含む1lの細菌培養物を遠心分離によりペレット化した。細胞ペレットを、リン酸塩、pH8.0、7M 塩酸グアニジン、イミダゾールおよびチオグリセロールを含有する溶解バッファーに再懸濁し、続いてUltra-Turrax(登録商標)を用いてホモジナイズした。不溶性物質を、高速遠心分離によりペレット化し、上清をNiキレートクロマトグラフィーカラムにアプライした。カラムを数ベッド容積の溶解バッファーで洗浄し、続いてリン酸塩、pH8.0および尿素を含むバッファーで洗浄した。最後に、結合した抗原を、酸性条件下でSDSを含むリン酸バッファーを用いて溶出した。

NNMTに対するモノクローナル抗体の産生
a)マウスの免疫化
12週齡のA/Jマウスを100μgのNNMTで腹腔内に初回免疫した。６週間後、一月間隔で２回のさらなる腹腔内免疫を行った。このプロセスにおいて、各マウスに、水酸化アルミニウムに吸着した100μgのNNMTおよび10⁹個の細菌のBordetella pertussisを投与した。続いて、最後の２回の免疫を、各々PBSバッファー中の100μgのNNMTを用いて融合の３日前および２日前に静脈内に行った。

b)融合およびクローニング
a)に従って免疫したマウスの脾臓細胞をGalfre, GおよびMilstein, C., Methods in Enzymology 73 (1981)3-46に従ってミエローマ細胞と融合する。このプロセスにおいて、免疫化マウスの1*10⁸個の脾臓細胞を2x10⁷個のミエローマ細胞(P3X63-Ag8-653, ATCC CRL1580)と混合し、遠心分離(300gおよび4℃で10分間)した。次いで、細胞を、ウシ胎仔血清(FCS)を含まないRPMI 1640培地で一回洗浄し、50mlコニカルチューブ中にて400gで再び遠心分離する。上清を廃棄し、細胞沈殿物をタッピングにより穏やかに解し、1mlのPEG(分子量4000, Merck, Darmstadt)を添加し、パイペッティングにより混合する。37℃の水浴中で１分間の後、４〜５分以内に室温でFCSを含まない5mlのRPMI 1640を滴下した。その後、10％FCSを含む5mlのRPMI1640を約１分以内に添加し、十分に混合し、培地(RPMI 1640+10% FCS)で50mlにし、続いて400gおよび4℃で10分間遠心分離する。沈殿した細胞を、10% FCSを含むRPMI1640培地中に溶かし、ヒドロキサンチン-アザセリン選択培地(RPMI 1640+10% FCS)中に100mmol/lヒポキサンチン、1μg/mlアザセリン)に播種する。100U/mlのインターロイキン６を成長因子として培地に添加する。

約10日後、初代培養物を特異的抗体について試験する。NNMT陽性初代培養物を、蛍光活性化細胞ソーターにより96ウェル細胞培養プレート中でクローニングする。このプロセスにおいて、再び100U/mlのインターロイキン6を成長添加物として培地に添加する。

c)細胞培養上清からの免疫グロブリンの単離
得られたハイブリドーマ細胞を、RPMI 1640培地において1x10⁵個の細胞の密度で播種し、発酵槽中で７日間増殖させる(Thermodux Co., Wertheim/Main, Model MCS-104XL, 注文番号144-050)。1ml当たり100μgの平均濃度のモノクローナル抗体が培養上清中に得られる。培養上清からのこの抗体の精製を、タンパク質化学における従来の方法(例えば、Bruck, C.ら、Methods in Enzymology 121 (1986) 587-695による)により行う。

ポリクローナル抗体の産生
a)免疫
免疫のために、1:1の比のタンパク質溶液(100μg/mlのタンパク質NNMT)およびフロイント完全アジュバントの新鮮なエマルジョンを調製した。各ウサギを1mlのエマルジョンで１、７、14および30、60および90日目に免疫した。血液を抜き取り、得られた抗NNMT血清を実施例３および４に記載されるようなさらなる実験のために使用した。

b)カプリル酸および硫酸アンモニウムを用いた連続沈殿によるウサギ血清からのIgG(免疫グロブリンＧ)の精製
１容積のウサギ血清を４容積の酢酸バッファー(60mM, pH4.0)で希釈した。pHを2M Tris-塩基で4.5に調整した。カプリル酸(25μl/mlの希釈試料)を激しい攪拌下で滴下した。30分後、試料を遠心分離(13000xg、30分間、４℃)し、ペレットを廃棄し、上清を収集した。上清のpHを2M Tris-塩基の添加により7.5に調整し、濾過した(0.2μm)。

上清の免疫グロブリンを、最終濃度2Mまでの4M硫酸アンモニウム溶液の滴下により激しい攪拌下で沈殿させた。沈殿した免疫グロブリンを遠心分離により収集した(8000xg、15分間、4℃)。

上清を廃棄した。ペレットを10mM NaH₂PO₄/NaOH、pH7.5、30mM NaCl中で溶解させ、完全に透析した。透析物を遠心分離(13000 x g、15分間、4℃)し、濾過した(0.2μm)。

ポリクローナルウサギIgGのビオチン化
ポリクローナルウサギIgGを、10mM NaH₂PO₄/NaOH、pH7.5、30mM NaCl中に10mg/mlにした。1mlのIgG溶液当たり、50μlのビオチン-N-ヒドロキシスクシニミド(DMSO中に3.6mg/ml)を添加した。室温で30分後、試料をSuperdex200(10mM NaH₂PO₄/NaOH、pH7.5、30mM NaCl)においてクロマトグラフを行った。ビオチン化IgGを含有する画分を収集した。モノクローナル抗体を同じ手順に従ってビオチン化した。

ポリクローナルウサギIgGのジゴキシゲニン化
ポリクローナルウサギIgGを10mM NaH₂PO₄/NaOH、30mM NaCl、pH7.5中に10mg/mlにした。IgG溶液1ml当たり50μlのジゴキシゲニン-3-O-メチルカルボニル-ε-アミノカプロン酸-N-ヒドロキシスクシニミドエステル(Roche Diagnostics, Mannheim, Germany, カタログ番号.1 333 054)(DMSO中に3.8mg/ml)を添加した。室温で30分後、試料をSuperdex(登録商標)200(10mM NaH₂PO₄/NaOH、pH7.5、30mM NaCl)においてクロマトグラフを行った。ジゴキシゲニン化IgGを含む画分を収集した。モノクローナル抗体を同じ手順にしたがってジゴキシゲニンで標識した。

実施例３
実施例２で産生したポリクローナル抗体を使用したヒト結腸直腸癌組織におけるNNMTの検出のためのウェスタンブロッティング
腫瘍試料に由来する組織溶解物および健康な対照試料を実施例１「組織調製」に記載されたように調製した。

SDS-PAGEおよびウェスタンブロッティングを、Invitrogen, Karlsruhe, Germanyの試薬および装置を使用して行った。試験した各組織試料について、10μgの組織溶解物を還元NuPAGE(登録商標)(Invitrogen)SDS試料バッファーに溶解させ、95℃で10分間過熱した。試料を、MESランニングバッファー系中の４〜12％ NuPAGEゲル(登録商標)(Tris-グリシン)において泳動した。ゲル分離したタンパク質混合物を、Invitrogen XCell II^TMBlot Module(Invitrogen)およびNuPAGE(登録商標)トランスファーバッファー系を用いてニトロセルロース膜にブロットした。膜をPBS/0.05% Tween-20で３回洗浄し、Roti(登録商標)-Blockブロッキングバッファー(A151.1; Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Germany)で２時間ブロッキングした。一次抗体、ポリクローナルウサギ抗NNMT血清(産生は実施例２に記載)をRoti(登録商標)-Blockブロッキングバッファーで1:10000に希釈し、膜と共に１時間インキュベートした。膜をPBS/0.05% Tween-20で６回洗浄した。特異的に結合した一次ウサギ抗体をPODコンジュゲートポリクローナルヒツジ抗ウサギIgG抗体で標識し、0.5xRoti(登録商標)-Blockブロッキングバッファーで10mU/mlに希釈した。１時間のインキュベーション後、膜をPBS/0.05% Tween-20で６回洗浄した。結合したPODコンジュゲート抗ウサギ抗体の検出のために、膜をLumi-Light^PLUSウェスタンブロッティング基質(注文番号2015196, Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany)と共にインキュベートし、オートラジオグラフフィルムに曝した。

実施例４
ヒト血清および血漿試料中のNNMTの測定のためのElISA
ヒト血清または血漿中のNNMTの検出のために、サンドウィッチELISAを開発した。抗原の捕捉および検出のために、抗NNMTポリクローナル抗体(実施例２参照)のアリコートをビオチンおよびジゴキシゲニンそれぞれとコンジュゲートした。

ストレプトアビジン被覆96ウェルマイクロタイタープレートを、10mMリン酸塩、pH7.4、1% BSA、0.9% NaClおよび0.1% Tween20中に10μg/mlの100μlビオチン化抗NNMTポリクローナル抗体と共に60分間インキュベートした。インキュベーション後、プレートを0.9% NaCl、0.1% Tween20で３回洗浄した。次いで、ウェルを、標準抗原としての組換えタンパク質(実施例２参照)の連続希釈物または患者由来の希釈した血漿試料のいずれかと共に２時間インキュベートとした。NNMTの結合後、プレートを0.9% NaCl、0.1% Tween20で３回洗浄した。結合NNMTの特異的検出のために、ウェルを、10mMリン酸塩, pH7.4, 1% BSA, 0.9% NaClおよび0.1% Tween20中に10μg/mlの100μlのジゴキシゲニン化抗NNMTポリクローナル抗体と共に60分間インキュベートした。その後、プレートを３回洗浄し、未結合の抗体を除去した。次の工程で、ウェルを、10mMリン酸塩、pH7.4、1%BSA、0.9% NaClおよび0.1% Tween20中の20mU/mlの抗ジゴキシゲニンPODコンジュゲート(Roche Diagnostic GmbH, Mannheim, Germany, カタログ番号1633716)と共に60分間インキュベートした。次いでプレートを同じバッファーで３回洗浄した。抗原-抗体複合体の検出のために、ウェルを100μlのABTS溶液(Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany, カタログ番号11685767)と共にインキュベートし、ODをELISAリーダーで405nmにて30〜60分後に測定した。

実施例５：
診断の正確度の点から臨床的有用性を評価するためのROC分析
正確度を、十分に特徴付けられた患者集団、すなわち結腸内視術を受け、腺腫またはCRCを有さないことが見出された50名の患者、診断され、CRCのT1-3、N0、M0のステージである50名の患者、および少なくとも１つの近位リンパ節における少なくとも腫瘍浸潤またはより重篤な形態の転移を有する進行したCRCを有すると診断された50名の患者それぞれから得られた個々の液体試料を分析することにより評価した。市販のアッセイ(Elecsys(登録商標)Systemsイムノアッセイアナライザ用のRoche Diagnostics, CEA-アッセイ(カタログ番号.1 173 1629))により測定されるCEAおよび上記のように測定したNNMTは、これらの個体の各々から得られた血清中で定量した。ROC-分析を、Zweig, M.H、およびCampbell、前出に従って行った。濃度曲線下面積により測定されるように、群T1-3、N0、M0の患者と健康な個体とを区別するための判別能力は、確立されたマーカーCEAと比べて少なくともNNMTについて良好であることが見出された。

予備データは、NNMTがまた手術後の患者の追跡に非常に役立つことを示す。

図１は、腫瘍試料（左側）をロードした二次元ゲルおよび隣接する健康な粘膜から得られた対応対照試料（右側）をロードしたゲルの典型的な例を示す。これらのゲルの拡大部分の中の円は、タンパク質NNMTに対する位置を示している。NNMTの見かけ上の分子量および等電点は、それぞれ29.6 kDAおよび5.56の理論値に対応する。このタンパク質は、健康な粘膜において同様の方法で検出できなかった。図２はウェスタンブロットの典型的な例を示す。ゲルに、4人の患者由来の結腸直腸腫瘍組織由来および隣接する健康な対照組織由来の組織溶解物をロードした（被験体27：直腸癌、Duke B；被験体29：直腸癌、Duke A；被験体39：結腸癌、Duke A；および被験体40：結腸癌、Duke B）。試料中のNNMTの存在は、ポリクローナルウサギ抗NNMT血清を用いて検査した。腫瘍溶解物を含むレーンは「T」で、正常な対照組織を含むレーンは「N」で示される。分子量タンパク質標準を含むマーカーレーンは「M」で示される。矢印はNNMTバンドのゲル中の位置を示す。全ての腫瘍試料はNNMTの位置に強いシグナルを発し、一方隣接する正常な対照組織由来の分解物ではシグナルは殆ど全く検出されなかった。結腸直腸癌患者由来の腫瘍組織中のNNMTのこの強い過剰発現は、検査された14人の患者のうち14人で見られた。

Claims

a) 個体から得られた液体試料を提供する工程、
b) 該試料とニコチンアミドN-メチルトランスフェラーゼ（NNMT）に対して特異的な結合剤とを、該結合剤とNNMTとの間で複合体が形成されるのに適切な条件下で接触させる工程、および
c) (b)で形成された複合体の量を、結腸直腸癌の検出と相関させる工程
を含む、結腸直腸癌の検出方法。
前記試料が血清であることをさらに特徴とする、請求項１記載の方法。
前記試料が血漿であることをさらに特徴とする、請求項１記載の方法。
個体から得られた液体試料からの結腸直腸癌の検出における、マーカー分子としてのタンパク質NNMTの使用。
個体から得られた液体試料からの結腸直腸癌の早期検出における、マーカー分子としてのタンパク質NNMTの使用。
腺腫期のCRC患者由来の試料で早期検出が行われる、請求項５記載の使用。
個体から得られた液体試料からの結腸直腸癌の検出における、結腸直腸癌に対するマーカー分子としてのタンパク質NNMTの、結腸直腸癌に対する別のマーカー分子と組み合わせた使用。