CN116794321A - 蛋白质组合在制备对肝细胞癌患者精准预后分层试剂盒中的应用 - Google Patents
蛋白质组合在制备对肝细胞癌患者精准预后分层试剂盒中的应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN116794321A CN116794321A CN202310033577.1A CN202310033577A CN116794321A CN 116794321 A CN116794321 A CN 116794321A CN 202310033577 A CN202310033577 A CN 202310033577A CN 116794321 A CN116794321 A CN 116794321A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- expression
- patients
- prognosis
- mpo
- application
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 206010073071 hepatocellular carcinoma Diseases 0.000 title claims abstract description 49
- 238000004393 prognosis Methods 0.000 title claims abstract description 35
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 title claims abstract description 25
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 25
- 231100000844 hepatocellular carcinoma Toxicity 0.000 title claims abstract description 16
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title description 3
- 102000003896 Myeloperoxidases Human genes 0.000 claims abstract description 14
- 108090000235 Myeloperoxidases Proteins 0.000 claims abstract description 14
- 102000013009 Pyruvate Kinase Human genes 0.000 claims abstract description 11
- 108020005115 Pyruvate Kinase Proteins 0.000 claims abstract description 11
- 201000007270 liver cancer Diseases 0.000 claims abstract description 10
- 208000014018 liver neoplasm Diseases 0.000 claims abstract description 10
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 10
- 238000011532 immunohistochemical staining Methods 0.000 claims description 9
- 238000001819 mass spectrum Methods 0.000 claims description 9
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 claims description 5
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 claims description 4
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims description 4
- 238000007405 data analysis Methods 0.000 claims description 2
- 102100034911 Pyruvate kinase PKM Human genes 0.000 abstract description 34
- 210000000440 neutrophil Anatomy 0.000 description 23
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 17
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 15
- 238000001764 infiltration Methods 0.000 description 13
- 230000008595 infiltration Effects 0.000 description 12
- 238000000034 method Methods 0.000 description 9
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 8
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 6
- 238000010837 poor prognosis Methods 0.000 description 6
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 6
- WZUVPPKBWHMQCE-UHFFFAOYSA-N Haematoxylin Chemical compound C12=CC(O)=C(O)C=C2CC2(O)C1C1=CC=C(O)C(O)=C1OC2 WZUVPPKBWHMQCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 4
- 238000011161 development Methods 0.000 description 4
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 4
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 4
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 4
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 4
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 4
- 239000000047 product Substances 0.000 description 4
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 4
- ATRRKUHOCOJYRX-UHFFFAOYSA-N Ammonium bicarbonate Chemical compound [NH4+].OC([O-])=O ATRRKUHOCOJYRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229910000013 Ammonium bicarbonate Inorganic materials 0.000 description 3
- CTQNGGLPUBDAKN-UHFFFAOYSA-N O-Xylene Chemical compound CC1=CC=CC=C1C CTQNGGLPUBDAKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 235000012538 ammonium bicarbonate Nutrition 0.000 description 3
- 239000001099 ammonium carbonate Substances 0.000 description 3
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 3
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 3
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 3
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 3
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 3
- 239000008399 tap water Substances 0.000 description 3
- 235000020679 tap water Nutrition 0.000 description 3
- 239000008096 xylene Substances 0.000 description 3
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N Ammonia Chemical compound N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000010824 Kaplan-Meier survival analysis Methods 0.000 description 2
- 206010061309 Neoplasm progression Diseases 0.000 description 2
- 108010033276 Peptide Fragments Proteins 0.000 description 2
- 102000007079 Peptide Fragments Human genes 0.000 description 2
- 108010026552 Proteome Proteins 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 238000001294 liquid chromatography-tandem mass spectrometry Methods 0.000 description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 2
- 230000010287 polarization Effects 0.000 description 2
- 230000002980 postoperative effect Effects 0.000 description 2
- 238000007781 pre-processing Methods 0.000 description 2
- 238000000751 protein extraction Methods 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 2
- 230000005751 tumor progression Effects 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000005600 Cathepsins Human genes 0.000 description 1
- 108010084457 Cathepsins Proteins 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000010834 Extracellular Matrix Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010037362 Extracellular Matrix Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 description 1
- 229940122907 Phosphatase inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 229940124158 Protease/peptidase inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 1
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 1
- 230000006978 adaptation Effects 0.000 description 1
- 229910021529 ammonia Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000033115 angiogenesis Effects 0.000 description 1
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 description 1
- 238000009835 boiling Methods 0.000 description 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000007810 chemical reaction solvent Substances 0.000 description 1
- 238000002512 chemotherapy Methods 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 210000002249 digestive system Anatomy 0.000 description 1
- 239000012470 diluted sample Substances 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 238000004043 dyeing Methods 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 238000001976 enzyme digestion Methods 0.000 description 1
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 210000002744 extracellular matrix Anatomy 0.000 description 1
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 1
- 230000006870 function Effects 0.000 description 1
- 238000009650 gentamicin protection assay Methods 0.000 description 1
- 210000003714 granulocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000003364 immunohistochemistry Methods 0.000 description 1
- 230000001506 immunosuppresive effect Effects 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000009545 invasion Effects 0.000 description 1
- PGLTVOMIXTUURA-UHFFFAOYSA-N iodoacetamide Chemical compound NC(=O)CI PGLTVOMIXTUURA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 1
- 230000003211 malignant effect Effects 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 1
- 239000000137 peptide hydrolase inhibitor Substances 0.000 description 1
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 1
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- 239000012151 protein quantification reagent Substances 0.000 description 1
- 238000012113 quantitative test Methods 0.000 description 1
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 1
- 238000005932 reductive alkylation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000008439 repair process Effects 0.000 description 1
- 238000002271 resection Methods 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 238000007789 sealing Methods 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 238000013517 stratification Methods 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 1
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000005748 tumor development Effects 0.000 description 1
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
- G01N33/6893—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to diseases not provided for elsewhere
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/573—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for enzymes or isoenzymes
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
- G01N33/57407—Specifically defined cancers
- G01N33/57438—Specifically defined cancers of liver, pancreas or kidney
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
- G01N33/6803—General methods of protein analysis not limited to specific proteins or families of proteins
- G01N33/6848—Methods of protein analysis involving mass spectrometry
Abstract
本发明公开了蛋白质组合在制备对肝细胞癌患者精准预后分层试剂盒中的应用。本发明发现肝细胞癌患者肝癌组织中髓过氧化物酶(MPO)和丙酮酸激酶(PKM)的表达量可以用于肝细胞癌患者的预后或精准预后分层，在MPO高表达患者中，仅PKM同时高表达的HCC患者预后较差,而当PKM低表达时，患者的预后仍然较好。本发明可利用MPO和PKM对肝细胞癌患者精准预后分层。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药领域中，蛋白质组合在制备对肝细胞癌患者精准预后分层试剂盒中的应用。
背景技术
中性粒细胞在肿瘤进展中作用的两面性越来越被研究者们所关注，因此提出了中性粒细胞的两种极化状态以区分肿瘤相关中性粒细胞(TANs)的不同功能——抗肿瘤中性粒细胞(N1)和促肿瘤中性粒细胞(N2)1(类似不同极化状态的巨噬细胞)。近年来一系列研究表明TANs通过直接促进肿瘤细胞增殖及侵袭、加强胞外基质重构及血管生成、维持免疫抑制性微环境等方式促进肿瘤进展2-4。然而，目前关于是否存在真正意义的N1、N2中性粒细胞亚群，及其在肿瘤发展和预后中的意义仍存有争议，并且，中性粒细胞的动态异质性受其定植的组织微环境影响很大，这进一步限制了其作为标志物应用于肿瘤诊疗。
近年来研究发现，恶性HCC患者外周血中心粒细胞与淋巴细胞比值(NLR)增高5，并且患者肝癌组织中会出现大量弥散性中性粒细胞浸润6，因此，2019年最新版WHO肿瘤分类(消化系统)指南定义了一种新的HCC病理亚型——中性粒细胞浸润型，并将中性粒细胞作为患者不良预后的标志物。然而，按照指南标准(中性粒细胞浸润比例>50％)，该型HCC患者在总患者人群中占比<1％，这大大限制了在临床实践中将中性粒细胞作为标志物应用于HCC诊疗，并且其中并没有考虑到中性粒细胞异质性对患者预后的不同意义7。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是如何对中性粒细胞高浸润HCC患者预后实施精准分层。
为解决上述技术问题，本发明首先提供了检测蛋白质组合表达量的物质在制备肝细胞癌患者预后或精准预后分层试剂盒中的应用，所述蛋白质组合为髓过氧化物酶(MPO,Uniprot编号：P05164)和/或丙酮酸激酶(PKM，Uniprot编号：P14618)。
其中，精准预后分层是指利用MPO与PKM表达丰度对肝细胞癌患者的生存期或不同时间(如12个月、24个月、60个月等)内的生存率进行预后分析。
上述应用中，所述检测蛋白质组合表达量的物质可包括通过质谱和/或免疫组织化学染色检测髓过氧化物酶和丙酮酸激酶表达量的物质。
所述质谱可为数据依赖型串联质谱。
上述应用中，免疫组织化学染色检测所用物质可为髓过氧化物酶特异性抗体和/或丙酮酸激酶特异性抗体。
上述应用中，所述髓过氧化物酶的表达量可为其在肝癌组织中的表达量。
上述应用中，所述丙酮酸激酶的表达量可为其在肝癌组织中的表达量。
上述应用中，所述检测蛋白质组合表达量的物质还可包括数据分析模型，所述数据分析模型用于将所述蛋白质组合表达量数据输入COX回归模型，根据模型结果将患者分为高风险组或低风险组。
本发明中，肝细胞癌预后分层方法可通过将无标定量质谱(或免疫组化)检测的MPO表达量和PKM表达量输入Cox回归模型获得。
本发明中，无标定量质谱蛋白表达量可通过如下方法获得：
1.数据产生方法
首先获取肝细胞癌患者的样本队列以及预后随访数据，同时获取手术切除的肝细胞癌组织样本，将样本进行蛋白提取、酶解后，通过iBAQ无标定量方法进行高通量样本制备，随后通过数据依赖性质谱采集技术获取质谱数据，谱图原始文件使用MaxQuant软件进行定量解析，得到样本蛋白质组定量信息结果。
2.数据预处理方法
对于得到的蛋白质表达矩阵，使用R语言软件程序包limma中的quantile算法进行标准化，对于缺失值使用全局最小值进行插补。
本发明发现，在MPO高表达患者中，仅PKM同时高表达的HCC患者预后较差,而当PKM低表达时，患者的预后仍然较好。可利用MPO和PKM对肝细胞癌患者精准预后分层利用联合标志物MPO和PKM精准分层中性粒细胞高浸润HCC患者的预后，从而补充现行基于中性粒细胞诊断HCC患者预后的临床指南。
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术
人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
附图说明
图1为流程分析图。
图2为独立HCC人群中MPO低表达HCC、MPO高表达HCC、以及MPO高表达HCC中PKM高表达、低表达HCC患者的Kaplan-Meier生存分析。
图3为IHC检测MPO低表达HCC、MPO高表达HCC、以及MPO高表达HCC中PKM达高表、低表达HCC患者的Kaplan-Meier生存分析。
具体实施方式
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂、仪器等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
实施例1、利用MPO+PKM组合标志物精准筛选预后不良的中性粒细胞高浸润HCC患者分析流程如图1所示。
1、样本纳入
经患者知情同意，从复旦大学中山医院和北京大学肿瘤医院收集接受了外科手术切除的早期肝细胞癌患者。排除标准如下：(1)术前接受了化疗或放疗；(2)非初次手术；(3)非巴塞罗那分期0期或A期；(4)存在HCV感染；(5)失访或临床资料不全。最终共纳入101例肝细胞癌患者，纳入标准如下：(1)巴塞罗那分期0期或A期肝细胞癌患者；(2)切除组织足够可以进行蛋白质组学数据产出；(3)随访信息与临床资料齐全。本研究得到了复旦大学中山医院和北京大学肿瘤医院伦理委员会的批准。
术后对患者进行随访，如死亡，预后时间记录为术后到死亡的时间间隔，若未死亡，预后时间记录为术后到最后一次随访的时间间隔，作为右删失数据。
2、蛋白质组学数据获取及预处理
肝癌组织蛋白提取。取肝细胞癌患者的的冷冻肿瘤组织，加入含蛋白酶抑制剂(Roche，货号为04693116001)和磷酸酶抑制剂(Roche，货号为04906837001)的T-PER组织蛋白提取试剂(Thermo，货号为78510)裂解蛋白，经超声破碎仪(Scientz)破碎组织(25％振幅超声1min,其中超声3秒，间断3秒)，之后将所得液体在4度以16000g离心10分钟，取上清液作为组织蛋白提取物，使用Bradford蛋白定量试剂(Thermo，货号为23246)测定蛋白浓度。
超滤管辅助的组织蛋白酶切及酶切后肽段冻干。具体步骤如下：取500μg上述肝癌组织蛋白提取物用8M尿素溶液(用0.1M Tris-HCl配置，pH8.5)稀释至500μL，将稀释后的样本溶液置于30kDa超滤管(Millipore，货号为UFC503096)中离心20分钟，然后向超滤管中加入200μL含10mM二硫苏糖醇的尿素溶液，37度孵育4小时进行还原烷基化反应。孵育结束后通过离心弃去反应溶剂，然后向超滤管中加入含50mM碘乙酰胺的尿素溶液，室温避光孵育30分钟。然后依次用200μL尿素溶液、200μL50 mM碳酸氢铵溶液分别洗涤超滤管三次，每次洗涤后以14000g室温离心15分钟。之后向超滤管中加入100μL含0.1μg/μL胰蛋白酶(Promega，货号为V528A)的50mM碳酸氢铵溶液，37度孵育12小时。酶切结束后，以14000g离心15分钟收集酶切后肽段，并用100μL 50mM碳酸氢铵溶液洗涤两次，离心收集洗涤液与前一步收集的肽段混合，用NanoDrop 2000C(Thermo)测定肽段浓度。使用真空离心浓缩仪(Eppendorf)将酶切后肽段冻干后置于-80度储存。质谱检测前，将所得肽段样品用氨水(pH10)中重新溶解，使用液相色谱串联质谱(LC-MS/MS)检测系统进行检测。通过数据依赖性质谱采集技术获取iBAQ无标定量质谱数据，谱图原始文件使用MaxQuant软件进行定量解析，得到样本蛋白质组定量信息结果。对于得到的蛋白质表达矩阵，使用R语言软件程序包limma中的quantile算法进行标准化，对于缺失值使用全局最小值进行插补。
3、利用MPO+PKM组合标志物精准筛选预后不良的中性粒细胞高浸润HCC患者
提取蛋白质表达矩阵中的髓过氧化物酶(MPO,Uniprot编号：P05164)与丙酮酸激酶(PKM，Uniprot编号：P14618)的定量数据，首先将MPO表达量输入Cox回归模型，根据MPO表达量以及Cox回归的结果，将24例(23.8％)HCC患者定义为MPO高表达组(中性粒细胞高浸润组)，剩余77例(76.2％)定义为MPO低表达组(中性粒细胞低浸润组)。定义方法如下：将蛋白丰度取以2为底的对数，MPO丰度值大于等于22的为高表达组，低于22的为低表达组。
在24例MPO高表达HCC患者中，根据无标定量质谱检测的PKM表达量以及Cox回归模型结果，将16例(66.7％)HCC患者定义为高风险，8例(33.3％)定义为低风险。定义方法如下：将蛋白丰度取以2为底的对数，PKM丰度值大于等于28.5的为高表达组，低于28.5的为低表达组。
各患者的MPO和PKM表达以及预后信息见表1。
表1、患者的MPO和PKM表达情况以及预后分析
Kaplan-Meier生存分析结果显示，对于所有入选患者，MPO高表达的24例患者存活12个月的生存率为87.5％，存活24个月的生存率为75.0％，存活60个月的生存率为75％。MPO低表达的77例患者存活12个月的生存率为98.7％，存活24个月的生存率为94.8，存活60个月的生存率为89.6％。MPO高表达预后风险比为2.63(95％ CI：0.911-7.57)，p值为6.47e-02。
对于MPO高表达的24例患者，PKM高表达的16例患者存活12个月的生存率为81.3％，存活24个月的生存率为62.5％，存活60个月的生存率为62.5％。PKM低表达的8例患者在随访时间内均存活。PKM高表达预后风险比为1.06e+09(95％ CI：0-Inf)，p值为2.86e-02。
以上结果表明，联合使用MPO和PKM可将中性粒细胞高浸润HCC患者区分为预后截然不同的两群，MPO和PKM同时高表达的HCC患者预后最差，而MPO高表HCC中的PKM低表者的预后仍然比较好(图2)。
2、免疫组织化学染色验证
选用上海芯超生物科技有限公司商品化的HCC组织芯片(HLivH180Su11，HLivH180Su18)对HCC组织进行免疫组织化学染色验证，具体检测步骤如下：(1)脱蜡：依次将切片放入二甲苯Ⅰ15min，二甲苯Ⅱ15min，二甲苯III 15min，无水乙醇Ⅰ5min，无水乙醇Ⅱ5min，85％乙醇5min，75％乙醇5min，蒸馏水清洗。(2)抗原修复：将组织切片置于盛满EDTA抗原修复缓冲液(pH9.0)的修复盒中于微波炉内进行抗原修复：中火9min至沸，停火7min，保温再转中低火6min，待自然冷却后将玻片置于PBS中清洗3次，每次5min。(3)封闭：用3％H2O2(中杉金桥，货号为PV-6001)阻断内源过氧化物酶活性，并用正常羊血清(中杉金桥，货号为ZLI-9056)室温封闭20min。(4)一抗：用即用型兔抗MPO抗体(中杉金桥，货号为ZA-0197)或鼠抗PKM2抗体(Proteintech,货号为60268-1-Ig,1:40000使用)于4度孵育过夜。(5)二抗：将玻片置于PBS中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。切片稍甩干后滴加与一抗相应种属的HRP标记二抗(中杉金桥，货号为PV-6001、6002)覆盖组织，室温孵育50min。(6)DAB显色及复染：将玻片置于PBS中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。切片稍甩干后在圈内滴加新鲜配制的DAB显色液(Servicebio，货号为G1211)，显微镜下控制显色时间，阳性为棕黄色，自来水冲洗切片终止显色。然后用苏木素(Servicebio，货号为G1004)复染3min左右，自来水清洗，苏木素分化液(Servicebio，货号为G1039)分化数秒，自来水冲洗，苏木素返蓝液(Servicebio，货号为G1040)返蓝，流水冲洗。(7)封片：用中性树胶(Servicebio，货号为G1403)封片。(8)图像采集及结果判读：利用NanoZoomer 2.0-RS扫片机(HAMAMATSU)进行图片采集，然后依据PKM的染色比例积分(少于5％计0分；5％-25％计1分；26％-50％计3分；51％-75％计3分；大于75％计4分)与染色强度积分(阴性计0分；弱阳性计1分；中阳性计2分；强阳性计3分)的乘积计算PKM的染色积分。MPO染色强度通过直接计数HCC间质MPO阳性细胞数获得。
各患者的MPO和PKM免疫组织化学染色情况以及预后信息见表2。
表2、患者的MPO和PKM免疫组织化学染色情况以及预后分析
/>
/>
/>
/>
对HCC组织MPO及PKM的免疫组织化学染色结果的Kaplan-Meier生存分析显示，对于所有患者，MPO高表达的52例患者存活12个月的生存率为61.5％，存活24个月的生存率为51.9％，存活60个月的生存率为28.8％。MPO低表达的121例患者存活12个月的生存率为78.5％，存活24个月的生存率为62.0％，存活60个月的生存率为47.9％。MPO高表达预后风险比为1.68(95％ CI：1.12-2.53)，p值为1.13e-02。
对于MPO高表达的52例患者，PKM高表达的37例患者存活12个月的生存率为59.4％，存活24个月的生存率为45.9％，存活60个月的生存率为18.9％。PKM低表达的15例患者存活12个月的生存率为66.7％，存活24个月的生存率为66.7％，存活60个月的生存率为53.3％。PKM高表达预后风险比为1.68(95％ CI：1.12-2.53)，p值为1.13e-02。
以上免疫组织化学染色结果验证了MPO+PKM组合标志物对于中性粒细胞高浸润HCC的精准预后诊断，进一步证实MPO高表达HCC患者具有显著预后差异。虽然同为MPO高表达患者，但是仅PKM同时高表达的HCC患者预后较差,而当PKM低表达时，患者的预后仍然较好(图3)。
以上结果不但进一步证明中性粒细胞浸润对于HCC患者预后的不同意义，也为临床提供一种可转化应用的策略来精准筛选中性粒细胞高浸润的预后不良HCC患者。
参考文献：
1.Coffelt,S.B.,Wellenstein,M.D.&de Visser,K.E.Neutrophils in cancer:neutral no more.Nat.Rev.Cancer16,431-446(2016).
2.Geh,D.et al.Neutrophils as potential therapeutic targets inhepatocellular carcinoma.Nat.Rev.Gastroenterol.Hepatol.19,257-273(2022).
3.Zhou,S.L.et al.A Positive Feedback Loop Between Cancer Stem-LikeCells and Tumor-Associated Neutrophils Controls Hepatocellular CarcinomaProgression.Hepatology70,1214-1230(2019).
4.Donne,R.&Lujambio,A.The liver cancer immune microenvironment:Therapeutic implications for hepatocellular carcinoma.Hepatologyhttps://doi.org/10.1002/hep.32740(2022).
5.Chu,H.H.et al.Neutrophil-to-Lymphocyte Ratio as a BiomarkerPredicting Overall Survival after Chemoembolization for Intermediate-StageHepatocellular Carcinoma.Cancers(Basel)13,2830(2021).
6.Torbenson,M.S.Morphologic Subtypes of Hepatocellular Carcinoma.Gastroenterol.Clin.North.Am.46,365-391(2017).
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。
Claims (7)
1.检测蛋白质组合表达量的物质在制备肝细胞癌患者预后或精准预后分层试剂盒中的应用，所述蛋白质组合为髓过氧化物酶和/或丙酮酸激酶。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述检测蛋白质组合表达量的物质包括通过质谱和/或免疫组织化学染色检测髓过氧化物酶和丙酮酸激酶表达量的物质。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述质谱为数据依赖型串联质谱。
4.根据权利要求2或3所述的应用，其特征在于：免疫组织化学染色检测所用物质为髓过氧化物酶特异性抗体和/或丙酮酸激酶特异性抗体。
5.根据权利要求1-4中任一所述的应用，其特征在于：所述髓过氧化物酶的表达量为其在肝癌组织中的表达量。
6.根据权利要求1-5中任一所述的应用，其特征在于：所述丙酮酸激酶的表达量为其在肝癌组织中的表达量。
7.根据权利要求1-6中任一所述的应用，其特征在于：所述检测蛋白质组合表达量的物质还包括数据分析模型，所述数据分析模型用于将所述蛋白质组合表达量数据输入COX回归模型，根据模型结果将患者分为高风险组或低风险组。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202310033577.1A CN116794321A (zh) | 2023-01-10 | 2023-01-10 | 蛋白质组合在制备对肝细胞癌患者精准预后分层试剂盒中的应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202310033577.1A CN116794321A (zh) | 2023-01-10 | 2023-01-10 | 蛋白质组合在制备对肝细胞癌患者精准预后分层试剂盒中的应用 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN116794321A true CN116794321A (zh) | 2023-09-22 |
Family
ID=88048728
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202310033577.1A Pending CN116794321A (zh) | 2023-01-10 | 2023-01-10 | 蛋白质组合在制备对肝细胞癌患者精准预后分层试剂盒中的应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN116794321A (zh) |
-
2023
- 2023-01-10 CN CN202310033577.1A patent/CN116794321A/zh active Pending
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN101460630B (zh) | He4与其它生化标记物在卵巢癌评估中的应用 | |
| CN101598731B (zh) | 一种用于肿瘤病理诊断用途的免疫组织化学诊断试剂盒 | |
| EP2698634A1 (en) | Biomarker for breast cancer | |
| CN104316685B (zh) | 一种二乙酰精胺的检测试剂盒及制备方法和应用 | |
| AU632469B2 (en) | A method for early detection of lung cancer | |
| Streckfus et al. | Salivary protein profiles among HER2/neu-receptor-positive and-negative breast cancer patients: Support for using salivary protein profiles for modeling breast cancer progression | |
| US20120295814A1 (en) | CA-125 Immune Complexes as Biomarkers of Ovarian Cancer | |
| CN102298053B (zh) | 原发性肝细胞肝癌术后复发风险评估的组合抗体试剂盒 | |
| CN102504027A (zh) | 一种多表位tk1抗体的制备及其在人群体检筛查中早期肿瘤检测和风险预警中的应用 | |
| US20210190780A1 (en) | Serum thymidine kinase 1 detection kit based on automatic chemiluminescence analyzer | |
| Chen et al. | Novel circulating tumor cell-based blood test for the assessment of PD-L1 protein expression in treatment-naive, newly diagnosed patients with non-small cell lung cancer | |
| CN112379096B (zh) | 一种外泌体膜蛋白作为结肠癌诊断标志物的应用以及结肠癌早期诊断试剂盒 | |
| WO2014100220A2 (en) | Antibody cocktail systems and methods for classification of histologic subtypes in lung cancer | |
| AU2008238258B2 (en) | Autoimmune regulation of prostate cancer by annexin A3 | |
| CN105588944A (zh) | 检测agp1、serpina3和cdh1含量的系统在筛查活动性结核病患者中的应用 | |
| JP6423092B2 (ja) | 血漿免疫標識物−ｖｅｇｆｒ１自己抗体の検出に用いる抗原ポリペプチド及び応用 | |
| CN109975549A (zh) | 肿瘤来源IgG在胰腺癌诊断或预后中的用途 | |
| CN104345154B (zh) | 一种检测多肿瘤相关“多肽-蛋白组合式标志物”的双抗体夹心试剂盒 | |
| CN109270276A (zh) | 卵巢癌的尿液蛋白标志物及其诊断用途 | |
| Yamamoto et al. | Variability in measuring the Ki-67 labeling index in patients with breast cancer | |
| CN108398556A (zh) | 用于肝癌切除术后预后的双抗体联合荧光检测试剂盒 | |
| Kaira et al. | 18F-FDG uptake on PET in primary mediastinal non-thymic neoplasm: a clinicopathological study | |
| Luo et al. | Thymidine kinase activity in serum of renal cell carcinoma patients is a useful prognostic marker | |
| CN113687085A (zh) | 一种评估实体肿瘤Claudin18.2蛋白表达的方法和应用 | |
| CN104066749B (zh) | 用于特异性识别人肝羧酸酯酶1的单克隆抗体、生成单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其用途 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination |