BRPI0716611B1 - Anticorpo monoclonal e composição farmacêutica - Google Patents

Abstract

ANTICORPO MONOCLONAL QUIMÉRICO, ÁCIDO NUCLÉICO ISOLADO, CÉLULA ISOLADA, COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, E, MÉTODO PARA TRATAR UMA DOENÇA OU DISTÚRBIO. A presente invenção fornece versões quiméricas e humanizadas de anticorpos monoclonais de camundongo anti-CO 19. A invenção ainda diz respeito a composições farmacêuticas, composições imunoterapêuticas e métodos que usam anticorpos terapêuticos que ligam-se ao antígeno CD 19 humano e que pode mediar ADCC, CDC e/ou apoptose para o tratamento de doenças e distúrbios de célula B, tal como, mas não limitado a, malignidades de célula B, para o tratamento e prevenção de doença autoimune e para o tratamento e prevenção de doença enxerto-versushospedeiro (GVHD), rejeição humoral e distúrbio linfoproliferativo póstransplante em receptores de transplante humanos.

Description

1. INTRODUÇÃO

[001] A presente invenção diz respeito a anticorpos anti-CD19 humanos, humanizados ou quiméricos que se ligam ao antígeno de CD19 humano. A presente invenção também está direcionada a composições que compreendem anticorpos anti-CD19 humanos, humanizados ou quiméricos que podem mediar um ou mais dos seguintes: citotoxicidade mediada por célula dependente de complemento (CDC), citotoxicidade mediada por célula dependente de antígeno (ADCC) e morte celular programada (apoptose). A presente invenção ainda está direcionada a composições que compreendem anticorpos anti-CD19 humanos, humanizados ou quiméricos do isotipo humano IgG1 e/ou IgG3, bem como a composições que compreendem anticorpos anti-CD19 humanos, humanizados ou quiméricos do isotipo humano IgG2 e/ou IgG4 que pode mediar ADCC, CDC ou apoptose humanas.

[002] A presente invenção ainda está direcionada ao tratamento de distúrbios ou doenças de célula B em pacientes humanos, incluindo malignidades de célula B, usando-se os anticorpos anti-CD19 humanos, humanizados ou quiméricos terapêuticos que se ligam ao antígeno de CD19 humano. A presente invenção está direcionada a métodos para o tratamento e prevenção de doença auto-imune, bem como ao tratamento e prevenção da doença enxerto-versus- hospedeiro (GVHD), rejeição humoral e distúrbio linfoproliferativo pós- transplantate em receptores humanos de transplante usando-se anticorpos anti-CD19 humanos, humanizados ou quiméricos terapêuticos que se ligam ao antígeno de CD19 humano.

2. FUNDAMENTOS

[003] As células B expressam uma ampla série de moléculas de superfície celular durante sua diferenciação e proliferação. Os exemplos incluem os marcadores de superfície de leucócito CD10, CD19, CD20, CD21, CD22, CD23, CD24, CD37, CD53, CD72, CD74, CD75, CD77, CD79a, CD79b, CD80, CD81, CD82, CD83, CD84, CD85 e CD86. Estes marcadores, no geral, foram sugeridos como alvos terapêuticos para o tratamento de distúrbios ou doenças de célula B, tais como malignidades de célula B, doenças autoimunes e rejeição a transplante. Os anticorpos que ligam-se especificamente foram desenvolvidos e alguns foram testados como agente terapêutico para o tratamento de doenças e distúrbios.

[004] Por exemplo, terapias com base em anticorpo monoclonal (mAb) quimérico ou radiorrotulado direcionado contra a molécula de superfície celular CD20 específica para a maturação de células B e suas contrapartes malignas foram mostradas ser um tratamento in vivo eficaz contra o linfoma não Hodgkin (Tedder et al., Immunol. Today 15:450-454 (1994); Press et al., Hematology:221-240 (2001); Kaminski et al., N. Engl. J. Med. 329:459-465 (1993); Weiner, Semin. Oncol. 26:43-51 (1999); Onrust et al., Drugs 58:79-88 (1999); McLaughlin et al., Oncology 12:1763-1769 (1998); Reff et al., Blood 83:435-445 (1994); Maloney et al., Blood 90:2188-2195 (1997); Malone et al., J. Clin. Oncol. 15:3266-3274 (1997); Anderson et al., Biochem. Soc. Transac. 25:705-708 (1997)). A terapia de anticorpo monoclonal anti- CD20 também foi observada ser parcialmente eficaz na atenuação das manifestações de artrite reumatóide, lupus eritematoso sistêmico, púrpura trombocitopênica idiopática e anemia hemolítica, bem como outras doenças mediadas imunes (Silverman et al., Arthritis Rheum. 48:1484-1492 (2002); Edwards et al., Rheumatology 40:1-7 (2001); De Vita et al., Arthritis Rheumatism 46:2029-2033 (2002); Leandro et al., Ann. Rheum. Dis. 61:883-888 (2002); Leandro et al., Arthritis Rheum. 46:2673-2677 (2001)). O anticorpo anti-CD20 (IgG1), RITUXAN, foi usado de maneira bem sucedida no tratamento de certas doenças, tais como púrpura trombocitopênica imune do adulto, artrite reumatóide e anemia hemolítica autoimune (Cured et al., WO 00/67796). A despeito da eficácia destas terapias, a depleção de célula B pe menos eficaz quando as células B não expressam ou expressam CD20 em níveis baixos, (por exemplo, em pré-células B ou células B imaturas) ou que perderam a expressão de CD20 seguindo a imunoterapia de CD20 (Smith et al., Oncogene 22:7359-7368 (2003)).

[005] Os anticorpos anti-CD19 monoclonias de murino foram descritos na técnica, por exemplo, HD37 (IgG1, capa) (DAKO North America, Inc, Carpinteria, CA), BU12 (Callard et al., J. Immunology, 148(10):2983-7 (1992)), 4G7 (IgG1) (Meeker et al., Hybridoma, 3(4):305-20 (1984 Winter)), J4.119 (Beckman Coulter, Krefeld, Germany), B43 (PharMingen, San Diego, CA), SJ25C1 (BD PharMingen, San Diego, CA), FMC63 (IgG2a) (Zola et al., Immunol.Cell.Biol. 69(PT6): 411-22 (1991); Nicholson et al., Mol. Immunol., 34:1157-1165 (1997); Pietersz et al., Cancer Immunol. Immunotherapy, 41:53-60 (1995)), 89B(B4) (IgG1) (Beckman Coulter, Miami, FL; Nadler et al., J. Immunol., 131:244-250 (1983)), e/ou HD237 (IgG2b) (Fourth International Workshop on Human Leukocyte Differentiation Antigens, Vienna, Austria, 1989 e Pezzutto et al., J. Immunol., 138(9):2793-2799 (1987)). Os anticorpos anti-CD19 ou conjugados destes também mostraram potencial terapêutico em vários modelos animais de distúrbios ou doenças de célula B (Falvell et al., Br. J. Hematol. 134(2):157-70 (2006); Vallera et al., Clin. Cancer Res. 11(21):7920-8 (2005); Yazawa et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102(42):15178-83 (2005)).

[006] Em particular, os uso de anticorpos CD19 humanizados foi descrito para o tratamento de doença de célula B tal como linfoma, leucemia ou doença autominue (ver, Hansen U.S. Publicação de Pedido de Patente N° US2005/0070693).

[007] A despeito dos avanços recentes na terapia contra o câncer, as malignidades de célula B, tais como o os subtipos de célula B de linfomas não Hodgkin e leucemia linfocítica crônica são os contribuintes principais de mortes relacionadas com câncer. Consequentemente, existe uma grande necessidade para regimes terapêuticos melhorados adicionais para o tratamento de malignidades de célula B.

[008] Tanto a imunidade celular (mediada por célula T) quanto humoral (anticorpo, mediado por célula B ) são agora conhecidos desempenhar papéis significantes em rejeição de enxerto. Enquanto a importância de imunidade mediada por célula T na rejeição ao enxerto é bem estabelecida, o papel crítico da imunidade humoral na rejeição crônica ou aguda apenas recentemente, tornou-se evidente. Consequentemente, a maioria dos avanços no tratamento e prevenção de rejeição a enxerto desenvovleu-se a partir de agentes terapêuticos que alvejam a ativação de célula T. O primeiro anticorpo monoclonal terapêutico que foi aprovado pela FDA para o tratamento de rejeição a enxerto foi o anticorpo monoclonal de murino ORTHOCLONE-OKT3™ (muromonab-CD3), direcionado contra o receptor CD3 de células T. O OKT3 foi unido por diversos outros anticorpos direcionados anti- linfócito, incluindo os anticorpos monoclonais anti-CD52 CAMPATH™, CAMPATH-1G, CAMPATH-1H (alemtuzumab) e CAMPATH-1M ) e preparações de anticorpo anti-timócito policlonais (referidos como globulina anti-timócito ou “ATG,” também denominados “timoglobina” ou “timoglobulina”). Outros anticorpos de célula T aprovados para a prevenção da rejeição a transplante incluem o anticorpo monoclonal quimérico SIMULECT™ (basiliximab) e o anticorpo monoclonal humanizado ZENAPAX™ (daclizumab), ambos alvejando o receptor de IL-2 de afinidade alta de células T ativadas.

[009] A importância a imunidade humoral na rejeição a enxerto foi inicialmente pensada ser limitada à rejeição hiperaguda, em que o receptor do enxerto possui anticorpos HLA anti-doador antes do transplante, resultando na destruição rápida do enxerto na ausência de um regime terapêutico eficaz de supressão de anticorpo. Recentemente, tornou-se evidente que a imunidade humoral também é um fator importante que media tanto a rejeição aguda quanto crônica. Por exemplo, as observações clínicas demonstraram que a sobrevivência do enxerto em pacientes capazes de desenvolver aloanticorpos anti-HLA de classe I ou classe II (também referido como “aloanticorpos anti-MHC”) foi reduzido em comparação com a sobrevivência de enxerto em pacientes que não podem desenvolver tais anticorpos. Dados clínicos e experimentais também indicam que outros aloanticorpos e específicos de doador são mediadores críticos de rejeição. Para uma revisão da evidência que suporta um papel para anticorpos específicos de doador em rejeição de aloenxerto, ver Rifle et al., Transplantation, 79:S14-S18 (2005). Desta maneira, Devido à estimativa relativamente recente do papel da imunidade humoral em rejeição de enxerto aguda e crônica, agentes terapêuticos correntes e estratégias para alvejar a imunidade humoral são menos bem desenvolvidos do que aqueles para alvejar a imunidade celular. Consequentemente, existe uma necessidade na técnica de agentes e métodos melhorados para tratar e evitar a rejeição a enxerto, isto é, doença exerto-versus-hospedeiro (GVHD), rejeição humoral e distúrbio linfoproliferativo pós-transplante em receptores de transplante humanos.

[0010] As doenças autominunes, como um todo, causam morbidez e incpapacidade significante. Com base nos dados de incidência coletados de 1965 a 1995, foi estimado que aproximadamente 1,2 milhões de pessoas desenvolverão uma nova doença autoimune nos próximos cinco anos. Jacobsen et al. (Clin Immunol. Immunopathol. 84:223 (1997)) avaliado em 130 estudos publicados e estimado que em 1996, 8,5 milhões de pessoas nos Estados Unidos (3,2 % da população) tiveram pelo menos uma das 24 doenças autoimunes examinadas nestes estudos. Considerando o impacto principal de doenças autoimunes na saúde pública, tratamentos eficazes e seguros são necessários para tratar a carga destes distúrbios. Desta maneira, existe uma necessidade na técnica quanto a reagentes e métodos melhorados para tratar doença autoimune.

3. SUMÁRIO

[0011] A presente invenção diz respeito a anticorpos anti-CD19 humanos, humanizados ou quiméricos que ligam-se ao antígeno de CD19 humano, bem como às composições que compreendem aqueles anticorpos. Em uma forma de realização, a presente invenção fornece versões quiméricas e humanizadas de anticorpos monoclonais de camundongo anti-CD19, HB12A e HB12B.

[0012] Em uma outra forma de realização, os anticorpos anti-CD19 da invenção compreendem um, dois, três, quatro, cinco ou todos os seis dos CDRs de HB12A (clone B410F12-2-A6-C2 foi depositado com o American Type Culture Collection (“ATCC”) em 11 de fevereiro de 2005, Designação de Depósito de Patente ATCC: PTA-6580) ou HB12B (clone B43H12-3-B2-B6 foi depositado com o American Type Culture Collection (“ATCC”) em 11 de fevereiro de 2005, Designação de Depósito de Patente ATCC: PTA-6581).

[0013] As sequências de aminoácido para CDR1, CDR2 e CDR3 da região variável de cadeia pesada de HB12A definida de acordo com Kabat são identificados como SEQ ID N°: 6, SEQ ID N°: 8 e SEQ ID N°: 10, respectivamente. As sequências de aminoácido para CDR1, CDR2 e CDR3 da região variável de cadeia leve de HB12A definida de acordo com Kabat são identificados como SEQ ID N°: 12, SEQ ID N°: 14 e SEQ ID N°: 16, respectivamente.

[0014] As sequências de aminoácido para CDR1, CDR2 e CDR3 da região variável de cadeia pesada de HB12B definida de acordo com Kabat são identificados como SEQ ID N°: 22, SEQ ID N°: 24 e SEQ ID N°: 26, respectivamente. As sequências de aminoácido para CDR1, CDR2 e CDR3 da região variável de cadeia leve de HB12B definida de acordo com Kabat são identificados como SEQ ID N°: 28, SEQ ID N°: 30 e SEQ ID N°: 32, respectivamente.

[0015] Em uma forma de realização, um anticorpo anti-CD19 da invenção compreende um, dois, três, quatro, cinco ou seis CDRs tendo a sequência de aminoácido de uma CDR listada na Tabela 1, infra.

[0016] Em uma forma de realização, um anticorpo anti-CD19 da invenção pode compreender uma ou mais regiões de estrutura de HB12A ou HB12B. Em uma forma de realização, um anticorpo da invenção ainda pode compreender regiões de estrutura de cadeia pesada e/ou leve (FW) de um anticorpo humano (por exemplo, de uma sequência de anticorpo de linha germinal humana tal como VH3-72, JH4, Vk A10 ou Jk4), em que as ditas regiões de estrutura humana podem compreender uma ou mais mutações em que um resíduo de FW humano é substituído pelo resíduo correspondente presente na cadeia pesada ou leve de camundongo precursor (por exemplo, HB12A ou HB12B).

[0017] Em uma forma de realização, um anticorpo anti-CD19 da invenção pode compreender um ou mais CDRs tendo a sequência de aminoácido de um CDR listado na Tabela 1. supra e ainda pode compreender uma ou mais regiões de estrutura de cadeia pesada (FW) da região VH denominada HB12B-(3-72/JH4) (SEQ ID N°: 34). Em uma outra forma de realização, um anticorpo anti-CD19 da invenção compreende um ou mais CDRs tendo a sequência de aminoácido da um CDR listado na Tabela 1. supra e ainda compreende uma ou mais regiões de estrutura de cadeia pesada (FW) da região VH denominada HB12B-(3-72/JH4) (SEQ ID N°: 34). Em uma forma de realização, um anticorpo anti-CD19 da invenção pode compreender um ou mais CDRs tendo a sequência de aminoácido de um CDR listado na Tabela 1. supra e ainda pode compreender uma ou mais regiões de estrutura de cadeia leve (FW) da região VK denominada HB12B-(A10-Jk4) (SEQ ID N°: 52). Em uma forma de realização, um anticorpo anti-CD19 da invenção compreende um ou mais CDRs tendo a sequência de aminoácido de um CDR listado na Tabela 1. supra e ainda compreende um ou mais regiões de estrutura de cadeia leve (FW) da região VK denominada HB12B-(A10-Jk4) (SEQ ID N°: 52). Em uma outra forma de realização, um anticorpo anti- CD19 descrito neste pode compreender um ou mais CDRs tendo a sequência de aminoácido de um CDR listado na Tabela 1. supra, uma ou mais regiões de estrutura de cadeia leve da região VK denominada HB12B-(A10-Jk4) e uma ou mais regiões de estrutura de cadeia pesada da região VH denominada HB12B-(3-72/JH4). Em uma forma de realização adicional, um anticorpo anti-CD19 descrito neste compreende um ou mais CDRs tendo a sequência de aminoácido de um CDR listado na Tabela 1. supra, uma ou mais regiões de estrutura de cadeia leve da região VK denominada HB12B-(A10-Jk4) e um ou mais regiões de estrutura de cadeia pesada da região VH denominada HB12B-(3-72/JH4).

[0018] Por exemplo, em uma forma de realização um anticorpo anti-CD19 humanizado da invenção pode compreender uma região variável de cadeia pesada que compreende quatro regiões de estrutura, FW1, FW2, FW3 e FW4, em que FW1 compreende a sequência de aminoácido da SEQ ID N°: 36, FW2 compreende a sequência de aminoácido da SEQ ID N°: 38, FW3 compreende a sequência de aminoácido da SEQ ID N°: 40 e FW4 compreende a sequência de aminoácido da SEQ ID N°: 42. Em uma forma de realização, um anticorpo anti-CD19 humanizado da invenção compreende uma região variável de cadeia pesada que compreende quatro regiões de estrutura, FW1, FW2, FW3 e FW4, em que FW1 compreende a sequência de aminoácido da SEQ ID N°: 36, FW2 compreende a sequência de aminoácido da SEQ ID N°: 38, FW3 compreende a sequência de aminoácido da SEQ ID N°: 40 e FW4 compreende a sequência de aminoácido da SEQ ID N°: 42.

[0019] Além disso, um anticorpo monoclonal anti-CD19 humanizado da invenção pode compreender uma região variável de cadeia leve que compreende quatro regiões de estrutura, FW1, FW2, FW3 e FW4, em que FW1 compreende a sequência de aminoácido da SEQ ID N°: 54; aqueles em que FW2 compreende uma sequência de aminoácido selecionada do grupo que consiste de SEQ ID N°: 56, SEQ ID N°: 64 e SEQ ID N°: 72; aqueles em que FW3 compreende uma sequência de aminoácido selecionada do grupo que consiste de SEQ ID N°: 58 e SEQ ID N°: 66 e aqueles em que FW4 compreende a sequência de aminoácido da SEQ ID N°: 60. Em uma forma de realização, um anticorpo monoclonal anti-CD19 humanizado da invenção compreende uma região variável de cadeia leve que compreende quatro regiões de estrutura, FW1, FW2, FW3 e FW4, em que FW1 compreende a sequência de aminoácido da SEQ ID N°: 54; aqueles em que FW2 compreende uma sequência de aminoácido selecionada do grupo que consiste de SEQ ID N°: 56, SEQ ID N°: 64 e SEQ ID N°: 72; aqueles em que FW3 compreende uma sequência de aminoácido selecionada do grupo que consiste de SEQ ID N°: 58 e SEQ ID N°: 66 e aqueles em que FW4 compreende a sequência de aminoácido da SEQ ID N°: 60.

[0020] Em uma forma de realização, um anticorpo anti-CD19 da invenção pode compreender um VH que compreende a sequência de aminoácido da SEQ ID N°: 237 ou um VL que compreende a sequência de aminoácido da SEQ ID N°: 238, em que o dito anticorpo liga-se a antígeno de CD19 humano. Em uma outra forma de realização, um anticorpo anti-CD19 da invenção compreende um VH que compreende a sequência de aminoácido da SEQ ID N°: 237 e um VL que compreende a sequência de aminoácido da SEQ ID N°: 238.

[0021] Nas formas de realização particulares, um anticorpo anti- CD19 da invenção pode compreender uma região variável de cadeia leve selecionada do grupo que consiste de HB12B VK (SEQ ID N°: 20), HB12B-(A10-Jk4) (SEQ ID N°: 52), HB12B-364987 (SEQ ID N°: 62), HB12B-3649 (SEQ ID N°: 68), HB12B-36 (SEQ ID N°: 70), HB12A VK (SEQ ID N°: 4), 7E12 VK (SEQ ID N°: 110), 14H5 VK (SEQ ID N°: 111), 15D1 VK (SEQ ID N°: 112), 16C9 VK (SEQ ID N°: 113), 3C3 VK (SEQ ID N°: 193), 3E5 VK (SEQ ID N°: 194), 3D4 VK (SEQ ID N°: 195), 3F1 VK (SEQ ID N°: 196), 5B5 VK (SEQ ID N°: 197), 6F7 VK (SEQ ID N°: 198), 1C11 VK (SEQ ID N°: 199), 2B11 VK (SEQ ID N°: 200), 2D10 VK (SEQ ID N°: 201), 5C11 VK (SEQ ID N°: 202), 5D4 VK (SEQ ID N°: 203), 6C11 VK (SEQ ID N°: 204), 9G7 VK (SEQ ID N°: 205), 1H4 VK (SEQ ID N°: 206) e 5C4 VK (SEQ ID N°: 207.

[0022] Nas formas de realização específicas, a presente invenção ainda diz respeito a um anticorpo anti-CD19 que compreende uma região variável de cadeia pesada selecionada do grupo que consiste de HB12B VH (SEQ ID N°: 18), HB12B-(3-72/JH4) (SEQ ID N°: 34), HB12A VH (SEQ ID N°: 2), 7E12 VH (SEQ ID N°: 102), 14H5 VH (SEQ ID N°: 103), 15D1 VH (SEQ ID N°: 104), 15D7 VH (SEQ ID N°: 105), 16C4 VH (SEQ ID N°: 106), 14H5-YG (SEQ ID N°: 107), 14H5-DG (SEQ ID N°: 108), 14H5-LG (SEQ ID N°: 109), 1A7 VH (SEQ ID N°: 191), , 3C3 VH (SEQ ID N°: 191), 6C11 VH (SEQ ID N°: 191), 9G7 (SEQ ID N°: 191), 3B4 VH (SEQ ID N°: 236) e 3F11 VH (SEQ ID N°: 192).

[0023] Em uma forma de realização particular, um anticorpo anti- CD19 da invenção compreende o HB12B-3649 (SEQ ID N°: 68) região variável de cadeia leve e o HB12B-(3-72/JH4) (SEQ ID N°: 34) região variável de cadeia pesada. Um clone de DNA que compreende o anti- hCD19 VH HB12B-(3-72/JH4) humanizado foi depositado com o American Type Culture Collection (“ATCC”) em 26 de outubro de 2006. Um clone de DNA que compreende o anti-hCD19 VK HB12B-3649 humanizado foi depositado com o American Type Culture Collection (“ATCC”) em 26 de outubro de 2006.

[0024] Em uma forma de realização, um anticorpo anti-CD19 humanizado da invenção pode ligar-se ao CD19 humano com uma afinidade comparável àquela dos anticorpos monoclonais de camundongo HB12A e/ou HB12B ou com uma afinidade comparável àquela do anticorpo chHB12B que compreende HB12B VH (SEQ ID N°: 18) e HB12B VK (SEQ ID N°: 20).

[0025] A invenção ainda fornece polinucleotídeos que compreende uma sequência de nucleotídeo que codifica um anticorpo anti-CD19 humano, humanizado ou quimérico da invenção ou fragmentos destes. A invenção também abrange polinucleotídeos que hibridizam-se sob condições de hibridização estringentes ou com estringência inferior, como definido neste, a polinucleotídeos que codificam um anticorpo humano, humanizado ou quimérico que liga-se especificamente ao CD19 humano.

[0026] Uma outra forma de realização da invenção é um vetor que compreende uma ou mais sequências de nucleotídeo que codifica um anticorpo anti-CD19 humano, humanizado ou quimérico descrito neste ou fragmentos destes.

[0027] A presente invenção ainda diz respeito a uma célula isolada que compreende um vetor em que o dito vetor compreende uma ou mais sequências de nucleotídeo que codifica um anticorpo anti-CD19 humano, humanizado ou quimérico da invenção ou fragmentos destes.

[0028] Os anticorpos monoclonais anti-CD19 quiméricos, humanos e humanizados descrito neste incluem aqueles do isotipo humano IgG1, IgG2, IgG3 ou IgG4.

[0029] Em uma forma de realização, um anticorpo anti-CD19 humanizado descrito neste media a citotoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC), citotoxicidade mediada por célula dependente de complemento (CDC) e/ou apoptose.

[0030] Em uma forma de realização adicional, um anticorpo anti- CD19 humanizado descrito neste inibe proliferação de célula B estimulada por anti-IgM/CpG.

[0031] A presente invenção ainda diz respeito a composições farmacêuticas que compreendem um anticorpo anti-CD19 quimérico, humano e humanizado.

[0032] Ainda, em um outro aspecto, a presente invenção está direcionada a um método para tratar a malignidade de célula B em um ser humano, que compreende administrar a um ser humano em necessidade deste uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo monoclonal anti-CD19 quimérico, humano ou humanizado.

[0033] Em um outro aspecto, a presente invenção diz respeito a um método para tratar uma doença ou distúrbio automimune em um ser humano, que compreende administrar a um ser humano em necessidade deste uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo monoclonal anti-CD19 quimérico, humano ou humanizado.

[0034] A presente invenção ainda diz respeito a um método para tratar ou prevenir a rejeição humoral em um paciente de transplante humano, que compreende administrar a um ser humano em necessidade deste uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo monoclonal anti-CD19 quimérico, humano ou humanizado.

3.1. DEFINIÇÕES

[0035] Como usado neste, os termos “anticorpo” e “anticorpos” (imunoglobulinas) abrange anticorpos monoclonais (incluindo anrticorpos monoclonais de comprimento total), anticorpos policlonais, anticorpos multiespecíficos (por exemplo, anticorpos biespecíficos) formados a partir de pelo menos dois anticorpos intactos, anticorpos humanos, anticorpos humanizados, anticorpos camelizados, anticorpos quiméricos, Fvs de cadeia simples (scFv), anticorpos de cadeia simples, anticorpos de domínio simples, anticorpos de domínio, fragmentos Fab, fragmentos F(ab’)2, fragmentos de anticorpo que apresentam a atividade biológica desejada, Fvs ligados por bissulfeto (sdFv) e anticorpos anti-idiotípicos (anti-Id) (incluindo, por exemplo, anticorpos anti-Id a anticorpos da invenção), intracorpos e fragmentos de ligação de epítopo de qualquer um dos acima. Em particular, os anticorpos incluem moléculas de imunoglobulina e fragmentos imunologicamente ativos de moléculas de imunoglobulina, isto é, moléculas que contém um local de ligação de antígeno. As moléculas de imunoglobulina podem ser de qualquer tipo (por exemplo, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA e IgY), classe (por exemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 e IgA2) ou subclasse.

[0036] Os anticorpos naturais são usualmente glicoproteínas heterotetraméricas de cerca de 150.000 daltons, compostas de duas cadeias leves idênticas (L) e duas cadeias pesadas idênticas (H). Cada cadeia leve é ligada a uma cadeia pesada por uma ligação de bissulfeto covalente, enquanto o número de ligações de bissulfeto varia entre as cadeias pesadas de isotipos de imunoglobulina diferentes. Cada cadeia pesada e leve também tem pontes de bissulfeto regularmente intracadeia. Cada cadeia pesada tem, em uma extremidade, um domínio variável (VH) seguido por diversos domínios constantes. Cada cadeia leve tem um domínio variável em uma extremidade (VL) e um domínio constante em sua outra extremidade; o domínio constante da cadeia leve está alinhado com o primeiro domínio constante da cadeia pesada e o domínio variável de cadeia leve é alinhado com o domínio variável da cadeia pesada. As cadeias leves são classificadas como cadeias lambda ou cadeias capa com base na sequência de aminoácido da região constante de cadeia leve. O domínio variável de uma cadeia leve capa também pode ser indicada aqui como VK. O termo “região variável” também pode ser usado para descrever o domínio variável de uma cadeia pesada ou cadeia leve. Acredita-se que os resíduos de aminoácido particulares formem uma interface entre os domínios variáveis de cadeia leve e pesada. Tais anticorpos podem ser derivados de qualquer mamífero, incluindo, mas não limitado a, humanos, macacos, porcos, cavalos, coelhos, cães, gatos, camundongos, etc.

[0037] O termo “variável” refere-se ao fato que certas porções dos domínios variáveis diferem extensivamente em sequência entre os anticorpos e são responsáveis pela especificidade de ligação de cada anticorpo particular para seu antígeno particular. Entretanto, a variabilidade não é uniformemente distribuída através dos domínios variáveis de anticorpos. Esta é concentrada em Regiões Determinantes de Complementaridade (CDRs) tanto nos domínios de cadeia leve quanto de cadeia pesada. As porções mais altamente conservadas dos domínios variáveis são denominadas as regiões de estrutura (FW). Os domínios variáveis de cadeias leves e pesadas naturais, cada um compreende quatro regiões FW, adotando grandemente uma configuração de e-lâmina, conectada por três CDRs, que formam conexões de arcos e, em alguns casos formando parte da estrutura de e-lâmina. As CDRs em cada cadeia são mantidas juntas em proximidade próxima pelas regiões FW e, com as CDRs da outra cadeia, contribuem com a formação do local de ligação de antígeno de anticorpos (ver, Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5° Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)). Os domínios constantes, no geral, não estão envolvidos diretamente na ligação de antígeno, mas pode influenciar a afinidade de ligação de antígeno e pode apresentar várias funções atuadoras, tais como participação do anticorpo em ADCC, CDC e/ou apoptose.

[0038] O termo “região hipervariável” quando usada neste refere- se aos resíduos de aminoácido de um anticorpo que são associados com sua ligação ao antígeno. As regiões hipervariáveis abrangem os resíduos de aminoácido das “regiões determinantes de complementaridade” ou “CDRs” (por exemplo, resíduos 24-34 (L1), 50- 56 (L2) e 89-97 (L3) do domínio variável de cadeia leve e resíduos 3135 (H1), 50-65 (H2) e 95-102 (H3) do domínio variável de cadeia pesada; Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5° Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)) e/ou aqueles resíduos de um “arco hipervariável” (por exemplo, resíduos 26-32 (L1), 50-52 (L2) e 91-96 (L3) no domínio variável de cadeia leve e 26-32 (H1), 53-55 (H2) e 96-101 (H3) no domínio variável de cadeia pesada; Chothia and Lesk, J. Mol. Biol., 196:901-917 (1987)). Resíduos de “estrutura” ou “FW” são aqueles resíduos de domínio variável que flanqueiam os CDRs. Os resíduos de FW estão presentes em anticorpos de domínio, diacorpos, vacicorpos, anticorpos lineares e anticorpos biespecíficos quiméricos, humanizados, humanos.

[0039] O termo “anticorpo monoclonal” como usado neste refere- se a um anticorpo obtido de uma população de anticorpos substancialmente homogêneos, isto é, os anticorpos individuais que compreendem a população são idênticos exceto para mutações de ocorrência natural possível que podem estar presentes em quantidades menores. Os anticorpos monoclonais são altamente específicos, sendo direcionados contra um local antigênico simples. Além disso, em contraste com as preparações de anticorpo convencionais (policlonais) que incluem, tipicamente, anticorpos diferentes direcionados contra determinantes diferentes (epítopos), cada anticorpo monoclonal está direcionado contra um determinante simples no antígeno. Além de sua especificidade, os anticorpos monoclonais são vantajosos em que estes podem ser sintetizados por células de hibridoma que não estão contaminadas por outras células produtoras de imunoglobulina. Métodos de produção alternativos são conhecidos por aqueles treinados na técnica, por exemplo, um anticorpo monoclonal pode ser produzido por células estável ou aleatoriamente transfectadas com os genes de cadeia pesada e leve que codificam o anticorpo monoclonal.

[0040] O modificador “monoclonal” indica o caráter do anticorpo como sendo obtido de uma população substancialmente homogênea de anticorpos e não deve ser construído como requerindo o projeto do anticorpo por qualquer método particular. O termo “monoclonal” é usado aqui para referir-se a um anticorpo que é derivado de uma população clonal de células, incluindo qualquer clone eucariótico, procariótico ou de fago e não o método pelo qual o anticorpo foi projetado. Por exemplo, os anticorpos monoclonais a serem suados de acordo com a presente invenção podem ser feitos pelo método de hibridoma primeiro descrito por Kohler et al., Nature, 256:495 (1975) ou pode ser feito por qualquer método de DNA recombinante (ver, por exemplo, Patente U. S. N° 4,816,567), incluindo o isolamento de bibliotecas de anticorpo de fago usando-se as técnicas descritas em Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991) e Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991), por exemplo. Estes métodos podem ser usados para produzir anticorpos de domínio, diacorpos, vaccicorpos, linear anticorpos e anticorpos biespecíficos monoclonais mamíferos, quiméricos, humanizados, humanos.

[0041] O termo anticorpos “quiméricos” incluem anticorpos em que pelo menos uma porção da cadeia pesada e/ou leve é idêntica ou homóloga às sequências correspondentes em anticorpos derivados de uma espécies particular ou que pertencem a uma classe ou sub-classe de anticorpo particular e pelo menos uma outra porção das cadeias é idêntica ou homóloga às sequências correspondentes em anticorpos derivados de outras espécies ou que pertencem a uma outra classe ou subclasse de anticorpo bem como fragmentos de tais anticorpos, de modo que apresentam a atividade biológica desejada (Patente U. S. N° 4.816.567; Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851- 6855 (1984)). Os anticorpos quiméricos de interesse incluem anticorpos “primatizados” que compreendem sequências de ligação de antígeno de domínio variável derivado de um primata não humano (por exemplo, Macaco do Velho Mundo, tal como babuíno, réso ou macaco cinomolgo) e sequências de região constante humanas (Patente U. S. N° 5.693.780).

[0042] As formas “humanizadas” de anticorpos não humanos (por exemplo, murino) são anticorpos quiméricos que contém sequência mínima derivada de imunoglobulina não humana. Para a maior parte, os anticorpos humanizados são imunoglobulinas humanas (anticorpo receptor) em que os resíduos de CDR naturais são substituídos por resíduos a partir do CDR correspondente de uma espécie não humana (anticorpo doador) tal como camundongo, rato, coelho ou primata não humano tendo a especificidade, afinidade e capacidade desejadas. Em alguns exemplos, os resíduos de região FW da imunoglobulina humana são substituídas por resíduos não humanos correspondentes. Além disso, os anticorpos humanizados podem compreender resíduos que não são encontrados no anticorpo receptor ou no anticorpo doador. Estas modificações são feitas ainda para refinar o desempenho do anticorpo. No geral, uma cadeia pesada ou leve de anticorpo humanizado compreenderá, substancialmente, todos de pelo menos um ou mais domínios variáveis, em que todos ou, substancialmente todos os CDRs correspondem àqueles de uma imunoglobulina humana e todos ou substancialmente todos os FWs são aqueles de uma sequência de imunoglobulina humana. Em certas formas de realização, o anticorpo humanizado compreenderá, pelo menos uma porção de uma região constante de imunoglobulina (Fc), tipicamente aquela de uma imunoglobulina humana. Para detalhes adicionais, ver, Jones et al., Nature, 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332:323-329 (1988) e Presta, Curr. Op. Struct. Biol., 2:593-596 (1992).

[0043] Um “anticorpo humano” pode ser um anticorpo derivado de um anticorpo humano ou de um obtido de um organismo transgênico que foi “projetado” para a produção de anticorpos humanos específicos em resposta ao desafio antigênico e pode ser produzido por qualquer método conhecido na técnica. Em certas técnicas, elementos dos locais de cadeia pesada e leve humanos são introduzidos em cepas do organismo derivado de linhas de célula tronco embriônicas que contém rompimentos alvejados dos locais de cadeia pesada e de cadeia leve endógenos. O organismo transgênico pode sintetizar anticorpos humanos específicos para antígenos humanos e o organismo pode ser usado para produzir hibridomas que secretam anticorpo humano. Um anticorpo humano também pode ser um anticorpo em que as cadeias pesadas e leves são codificadas por uma sequência de nucleotídeo derivada de uma ou mais fontes de DNA humano. Um anticorpo humano total também pode ser construído pelos métodos de transfecção genéticos ou cromossômicos, bem como a tecnologia de apresentação de fago ou células B ativadas in vitro, todas as quais são conhecidas na técnica.

[0044] A “citotoxicidade mediada celular dependente de anticorpo” e “ADCC” refere-se a uma reação mediada por célula em que as células citotóxicas não específicas (por exemplo, células Natural Killer (NK), neutrófilos e macrófagos) reconhecem o anticorpo ligado em uma célula alvo e subsequentemente cauda a lise da célula alvo. Em uma forma de realização, tais células são células humanas. Enquanto não deseja-se estar ligado a qualquer mecanismo particular de ação, estas células citotóxicas que mediam ADCC no geral, expressam receptores de Fc (FcRs). As células primárias para mediar ADCC, células NK, expressam FCYRIII, visto que os monócitos expressam FCYRI, FcyRII, FCYRIII e/ou FCYRIV. A expressão de FcR em células hematopoiéticas é resumida em Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol., 9:457-92 (1991). Para estimar a atividade de ADCC de uma molécula, um ensaio ADCC in vitro, tal como aquele descrito em Patente U. S. N° 5.500.362 ou 5.821.337 pode ser realizada. As células atuadoras úteis para tais ensaios incluem células mononucleares de sangue periférico (PBMC) e células Natural Killer (NK). Alternativa ou adicionalmente, a atividade de ADCC das moléculas de interesse pode ser estimada in vivo, por exemplo, em um modelo animal, tal como aquele divulgado em Clynes et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 95:652-656 (1998).

[0045] “Citotoxicidade dependente de complemento” ou “CDC” refere-se à capacidade de uma molécula iniciar a ativação complementar e lisar um alvo na presença de um complememento. O caminho de ativação de complemento é iniciado pela ligação do primeiro componente do sistema de complemento (C1q) a uma molécula (por exemplo, um anticorpo) complexado com um antígeno cognato. para estimar a ativação de complemento, um ensaio de CDC, por exemplo, como descrito em Gazzano-Santaro et al., J. Immunol. Methods, 202:163 (1996), pode ser realizado.

[0046] As “células atuadoras” são leucócitos que expressam um ou mais FcRs e realizam funções atuadoras. As células expressam pelo menos FCYRI, FCYRII, FcyRIII e/ou FCYRIV e realizam a função atuadora ADCC. Os exemplos de leucócitos humanos que mediam ADCC incluem células mononucleares sanguíneas periféricas (PBMC), células matadoras naturais (NK), monócitos, células T citotóxicas e neutrófilos.

[0047] Os termos “receptor de Fc receptor” ou “FcR” são usados para descrever um receptor que liga-se à região Fc de um anticorpo. Em uma forma de realização, o FcR é um FcR humano de sequência natural. Além disso, em certas formas de realização, o FcR é um que liga um anticorpo IgG (um receptor gama) e inclui receptores das subclasses FCYRI, FCYRII, FCYRIII e FCYRIV, incluindo variantes alélicas e alternativamente formas unidas destes receptores. Os receptores de FcyRII incluem FcyRIIA (um “receptor ativador”) e FcyRIIB (um “receptor de inibição”), que tem sequências de aminoácido similares que diferem primariamente nos seus domínios citoplásmicos. O receptor de ativação FcyRIIA contém um motivo de ativação com base em tirosina de imuno-receptor (ITAM) em seu domínio citoplásmico. O receptor de inibição FcyRIIB contém um motivo de inibição com base em tirosina de imuno-receptor (ITIM) em seu domínio citoplásmico. (Ver, Daêron, Annu. Rev. Immunol., 15:203234 (1997)). Os FcRs são revisados em Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol., 9:457-92 (1991); Capel et al., Immunomethods, 4:2534 (1994) e de Haas et al., J. Lab. Clin. Med., 126:330-41 (1995). Outros FcRs, incluindo aqueles a serem identificados no futuro são abrangidos pelo termo “FcR” neste. O termo também inclui o receptor neonatal, FcRn, que é responsável pela transferência de IgGs maternais ao feto (Guyer et al., Immunol., 117:587 (1976) and Kim et al., J. Immunol., 24:249 (1994)).

[0048] O “Fv” é o fragmento de anticorpo mínimo que contém um local de reconhecimento e de ligação de antígeno completo. Esta região consiste de um dímero de um domínio variável de cadeia pesada e leve em associação, não covalente ou covalente firme. É nesta configuração que as três CDRs de cada domínio variável interagem para definir um local de ligação de antígeno na superfície do dímero VH-VL. Coletivamente, as seis CDRs conferem especificidade de ligação de antígeno ao anticorpo. Entretanto, mesmo um domínio variável simples (ou metade de um Fv que compreende apenas três CDRs específicas para um antígeno) tem a capacidade de reconhecer e ligar o antígeno, embora em uma afinidade menor do que o local de ligação todo.

[0049] A “afinidade” de um anticorpo a um epítopo a ser usada nos tratamentos descritos neste é um termo bem entendido na técnica e significa a extensão ou a força de ligação de anticorpo ao epítopo. A afinidade pode ser medida e/ou expressada de diversas maneiras conhecidas na técnica, que inclui, mas não limita-se a, constante de dissociação de equilíbrio (KD ou Kd), constante de dissociação de equilíbrio aparente (KD' ou Kd') e IC50 (quantidade necessária para afetar 50 % de inibição em um ensaio de competição). É entendido que, para os propósitos desta invenção, uma afinidade é uma afinidade média para uma dada população de anticorpos que liga-se a um epítopo. Os valores de KD' relatados neste em termos de mg de IgG por ml ou mg/ml indica mg de Ig por ml de sero, embora plasma possa ser usado. Quando a afinidade de anticorpo é usada como uma base para a administração dos métodos de tratamento descritos neste ou seleção para os métodos de tratamento descritos neste, a afinidade de anticorpo pode ser medida antes e/ou durante o tratamento e os valores obtidos podem ser usados pelo médico na estimativa de como um paciente humano é um candidato apropriado para o tratamento.

[0050] Como usado neste, o termo “avidez” é uma medida da força de ligação total (isto é, ambos os braços de anticorpo) com a qual um anticorpo liga um antígeno. A avidez do anticorpo pode ser determinada medindo-se a dissociação da ligação antígeno-anticorpo em excesso de antígeno usando-se qualquer meio conhecido na técnica, tal como, mas não limitado pela modificação de anticorpo fluorescente indireto como descrito por Gray et al., J. Virol. Meth., 44:11-24. (1993)

[0051] Um “epítopo” é um termo bem entendido na técnica e significa qualquer porção química que apresenta a ligação específica a um anticorpo. Um “antígeno” é uma porção ou molécula que contém um epítopo e, como tal, também liga-se especificamente ao anticorpo.

[0052] Um “marcador de superfície de célula B” como usado neste é um antígeno expressado na superfície de uma célula B que pode ser alvejada com um agente que liga-se a este. Os marcadores de superfície de célula B incluem os marcadores de superfície de leucócito CD10, CD19, CD20, CD21, CD22, CD23, CD24, CD25, CD37, CD53, CD72, CD73, CD74, CD75, CD77, CD79a, CD79b, CD80, CD81, CD82, CD83, CD84, CD85 e CD86. Um marcador de superfície de célula B de interesse particular é preferivelmente expressado em células B em comparação com outros tecidos que não células B de um mamífero e pode ser expressado tanto em células B precursoras quanto células de linhagem B maduras. Em uma forma de realização, o marcador CD19, que é observado em células B em vários estágios de diferenciação.

[0053] O termo “vida média do anticorpo” como usado neste significa uma propriedade farmacocinética de um anticorpo que é uma medida de tempo de sobrevivência média de moléculas de anticorpos seguindo sua administração. A vida média do anticorpo pode ser expressada como o tempo requerido para eliminar 50 por cento de uma quantidade conhecida de imunoglobulina do corpo do paciente ou um compartimento específico deste, por exemplo, como medido no soro ou plasma, isto é, a vida média de circulação o uem outros tecidos. A vida média pode variar de uma imunoglobulina ou de uma classe de imunoglobulinas para a outra. No geral, um aumento na vida média do anticorpo resulta em um aumento no tempo de residência médio (MRT) na circulação para o anticorpo administrado.

[0054] O termo “isotipo” refere-se à classificação de uma região constante de cadeia pesada ou leve de anticorpo. Os domínios constantes de anticorpos não estão envolvidos na ligação a antígeno, mas apresenta várias funções atuadoras. Dependendo da sequência de aminoácido da região constante de cadeia pesada, um dado anticorpo humano ou imunoglobulina pode ser designado a uma de cinco classes principais de imunoglobulinas: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM. Diversas destas classes ainda podem ser divididas em subclasses (isotipos), por exemplo, IgG1 (gama 1), IgG2 (gama 2), IgG3 (gama 3) e IgG4 (gama 4) e IgA1 e IgA2. As regiões constantes de cadeia pesada que correspondem à classes diferentes de imunoglobulinas são denominadas α, δ, ε, Y e μ, respectivamente. As estruturas e as configurações tridimensionais de classes diferentes de imunoglobulinas são bem conhecidas. Das várias classes de imunoglobulina humana, apenas IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 e IgM humanos são conhecidos ativar o complemento. IgG1 e IgG3 humanos são conhecidos mediar ADCC em seres humanos. As regiões constantes de cadeia leve humana podem ser classificadas em duas classes principais, capa e lambda

[0055] Como usado neste, o termo “imunogenicidade” significa que um composto é capaz de provocar uma resposta imune (estimulando a produção de anticorpos específicos ou e/ou proliferação de células T específicas).

[0056] Como usado neste, o termo “antigenicidade” significa que um composto é reconhecido por um anticorpo ou pode ligar-se a um anticorpo e induzir uma resposta imune.

[0057] Pelos termos “tratar”, “tratando” ou “tratamento de” (ou termos gramaticamente equivalentes) é entendido eu a gravidade da condição do paciente é reduzida ou, pelo menos, parcialmente intensificada ou melhorada e/ou que algum alívio, mitigação ou diminuição em pelo menos um sintoma clínico é atingido e/ou existe uma inibição ou atraso na progressão da condição e/ou prevenção e/ou atraso do início de uma doença ou enfermidade. Desta maneira, os termos “tratar”, “tratando” ou “tratamento de” (ou termos gramaticamente equivalentes) referem-se tanto a regimes de tratamento profiláticos e terapêuticos.

[0058] Como usado neste, uma “quantidade suficiente” ou “uma quantidade suficiente para” atingir um resultado particular refere-se a uma quantidade de um anticorpo ou composição da invenção que é eficaz para a produção de um efeito desejado, que é, opcionalmente, um efeito terapêutico (isto é, pela administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz). Por exemplo, uma “quantidade suficiente” ou “uma quantidade suficiente para” pode ser uma quantidade que é eficaz para esgotar as células B.

[0059] Uma quantidade “terapeuticamente eficaz” como usada neste é uma quantidade que fornece alguma melhora ou benefício para o paciente. Estabelecido de uma outra maneira, uma quantidade “terapeuticamente eficaz” é uma quantidade que fornece algum alívio, mitigação e/ou diminuição em pelo menos um sintoma clínico. Os sintomas clínicos associados com os distúrbios que podem ser tratados pelos métodos da invenção são bem conhecidos pelas pessoas habilitadas na técnica. Além disso, aqueles habilitados na técnica estimarão que os efeitos terapêuticos não sejam completos ou curativos, contanto que algum benefício é fornecido ao paciente.

4. BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[0060] Figura 1A-B: (A) Alinhamento de sequência de aminoácido das regiões variáveis de cadeias leves HB12B VK (SEQ ID N°: 20), HB12B-(A10-Jk4) (SEQ ID N°: 52), HB12B-364987 (SEQ ID N°: 62), HB12B-3649 (SEQ ID N°: 68) e HB12B-36 (SEQ ID N°: 70). Os resíduos de sequência são numerados de acordo com Kabat. Os resíduos de CDR, definidos de acordo com Kabat, são. resíduos boxed Vernier, Intercadeia e Canônicos de HB12B VK (SEQ ID N°: 20) são destacados em cinza claro. As substituições de aminoácido de HB12B- 364987 (SEQ ID N°: 62) (Y40F, K53H, Y91F), HB12B-3649 (SEQ ID N°: 68) (Y40F, K53H) e HB12B-36 (SEQ ID N°: 70) (Y40F) com relação ao domínio variável de anticorpo enxertado HB12B-(A10-Jk4) (SEQ ID N°: 52) são destacados em cinza escuro. (B) Alinhamento de sequência de aminoácido da região variável de cadeias pesadas HB12B VH (SEQ ID N°: 18), HB12B-(3-72/JH4) (SEQ ID N°: 34) e HB12B-9m (SEQ ID N°: 44). Os resíduos de sequência são numerados de acordo com Kabat. Os resíduos de CDR, definidos de acordo com Kabat, são boxed. Os resíduos Vernier, Intercadeia e Canônicos of HB12B VH são destacados em cinza claro. As substituições de aminoácido de HB12B-9m (SEQ ID N°: 44) (L20I, F27Y, T28A, R38I, V49I, F67A, R71A, L80M, ,I91Y) com relação ao domínio variável de anticorpo enxertado HB12B-(3-72/JH4) (SEQ ID N°: 34) são destacados em cinza escuro.

[0061] Figura 2. Perfil de ligação de anticorpo anti-CD19 humanizado #1, que compreende HB12B-(3-72/JH4) VH (SEQ ID N°: 34) e HB12B-364987 VK (SEQ ID N°: 62), para o CD19 humano recombinante que expressa células 300B4 em um ensaio de ELISA com base em célula. Leituras OD450 para anticorpo anti-CD19 humanizado #1 são marcadas com um quadrado aberto. Anticorpo HB12B quimérico que compreende HB12B VH (SEQ ID N°: 18) e HB12B VK (SEQ ID N°: 20) foi usado como um padrão de referência (círculo fechado). Um anticorpo IgG1 humano de especificidade irrelevante foi incluído no ensaio como um controle negativo (círculo aberto). O perfil de ligação de anticorpo anti-CD19 humanizado #1 iguala-se intimamente com aquele do anticorpo anti-CD19 quimérico.

[0062] Figura 3. Perfil de ligação de anticorpo anti-CD19 humanizado #1, #2, and #3 para o CD19 humano recombinante que expressa células 300B4 em um ensaio de ELISA com base em célula. Anticorpo anti-CD19 humanizado #1 compreende HB12B-(3-72/JH4) VH (SEQ ID N°: 34) e HB12B-364987 VK (SEQ ID N°: 62). Anticorpo anti-CD19 humanizado #2 compreende HB12B-(3-72/JH4) VH (SEQ ID N°: 34) e HB12B-3649 VK (SEQ ID N°: 68). Anticorpo anti-CD19 humanizado #3 compreende HB12B-(3-72/JH4) VH (SEQ ID N°: 34) e HB12B-36 VK (SEQ ID N°: 70). O perfil de ligação de anticorpo anti- CD19 humanizado #1, #2, and #3 é marcado com quadrados abertos, círculo abertos e círculos fechados, respectivamente. O anticorpo HB12B quimérico que compreende HB12B VH (SEQ ID N°: 18) e HB12B VK (SEQ ID N°: 20) foi usado como padrão de referência (quadrado fechado). O perfil de ligação de anticorpo anti-CD19 humanizado #1 e #2 iguala-se intimamente com aquele do anticorpo anti-CD19 quimérico. A ligação de anticorpo anti-CD19 humanizado #3 para o CD19 humano recombinante que expressa células 300B4 é significantemente mais fraca do que aquele do anticorpo HB12B quimérico.

[0063] Figura 4. SDS/PAGE tingido com Coomassie de anticorpos anti-hCD19 purificados. 1 e 5 microgramas de anticorpo anti-CD19 humanizado fucosilado (3649) e afucosilado (3649-aFuc) purificado #2 foi analisado por SDS/PAGE. As preparações purificadas são substancialmente isentas de proteínas contaminantes.

[0064] Figura 5. (A) Significa intensidade de fluorescência de células de Daudi imunotingidas incubadas com concentrações diferentes de anticorpo anti-CD19 humanizado #2. As células Daudi foram incubadas com concentrações diferentes de anticorpo anti-CD19 #2 fucosilado (3649) ou afucosilado (3649 aFuc-1 and 3649 aFuc-2). As células foram subsequentemente tingidas com IgG F(ab)’2 anti- humano de cabra conjugado com RPE e analisado em um citômetro de fluxo seguindo os protocolos padrão. As células Daudi incubadas com um anticorpo anti-CD20 foram incluídos como controle positivo. As preparações fucosiladas e afucosiladas de anticorpo anti-CD19 humanizado #2 que apresenta perfis de tingimento de sobreposição. A intensidade de fluorescência média de células tingidas anti-CD19 é menor do que aquela de células tingidas anti-CD20 em todas as concentrações de anticorpos testadas. (B) A atividade de ADCC in vitro de anticorpos humanizados anti-CD19 . A atividade de ADCC in vitro de preparações fucosiladas (3649) w afucosiladas (3649-aFuc1 and 3649-aFuc2) de anticorpo anti-CD19 humanizado #2 foi submetida a ensaio usando o kit CytoTox 96™ (Promega) seguindo as instruções do fabricante. As células Daudi foram usadas como alvos. O ensaio também foi realizado usando-se um anticorpo anti-CD20 de controle positivo. Tanto as preparações afucosiladas de anticorpo anti-CD19 humanizado #2, quanto o anticorpo anti-CD20 de controle positivo apresentaram, atividade de ADCC robusta similar. A atividade de ADCC do anticorpo anti-CD19 fucosilada #2 é inferior sob as condições usadas.

[0065] Figura 6. A atividade ADCC in vitro de anticorpos humanizados anti-CD19. A atividade de ADCC in vitro de anticorpo anti-CD19 humanizado fucosiladas (3649) e afucosiladas (3649-aFuc) #2 foi estimada usando-se o kit CytoTox 96™ (Promega) seguindo as instruções do fabricante. As células Daudi serviram como alvos. Um anticorpo anti-CD20 foi usado como controle positivo. Uma variante de Fc do anticorpo anti-CD19 #2 (3649-TM) com ADCC abolido foi usado como o controle negativo. O anticorpo anti-CD19 humanizado #2 (3649-aFuc) afucozilado e o anticorpo anti-CD20 de controle positivo apresentaram atividade de ADCC robusta similar. A atividade de ADCC do anticorpo anti-CD19 humanizado fucosilada #2 (3649) é menor sob as condições usadas. O anticorpo anti-CD19 variante de Fc de controle negativo #2 não apresentou ADCC sob as condições usadas.

[0066] Figura 7. Perfil de expressão CD19, CD20 e CD22 de células Raji, Ramos, Daudi e Namalwa. As células Raji, Ramos, Daudi e Namalwa foram imunotingidas com anti-CD19, anti-CD20 ou anti- CD22 primário e anticorpos secundários de IgG anti-camundongo de cabra conjugado com PE e subsequentemente analisado em um citômetro de fluxo. O gráfico de barras representa a taxa de fluorescência de canal média obtida com anticorpo imunotingido e secundário apenas amostras de controle tingidas. A linha celular de mieloma múltiplo RPMI 8226 que não expressa CD19, CD20 ou CD22 foi incluída com o controle negativo. A expressão de superfície significante de todas as três moléculas é detectada em células Raji, Ramos e Daudi. As células Namalwa apresentava CD19 e CD22, mas não CD20 na superfície celular.

[0067] Figura 8. A suscetibilidade da célula Raji (A), Daudi (B), Ramos (C) e Namalwa (D) a ADCC mediado por anti-CD19 #2. Os ensaios de ADCC foram realizados usando-se o kit CytoTox 96™ (Promega) seguindo as instruções do fabricante. Os anticorpos usados são: (i) o anti-CD19 #2 (3649-aFuc) afucosiladas, (ii) a variante 3M Fc de anti-CD19 #2 (3649-3M) e (iii) um controle anti-CD20. O atador para alvejar a taxa foi de 2,5 a 1. Todas as quatro linhas celulares são susceptíveis a ADCC mediado por anti-CD19 #2. Apenas das células Raji, Daudi e Ramos são suscetíveis ao ADCC mediado por anti- CD20.

[0068] Figura 9. A suscetibilidade de célula B tonsilar fresca a ADCC mediado por anti-CD19 #2. Os ensaios de ADCC foram realizados usando-se o kit CytoTox 96 ™ (Promega) seguindo as instruções do fabricante. Os anticorpos usados são: (i) o anti-CD19 afucosilado #2 (3649-aFuc), (ii) a variante de 3M Fc de anti-CD19 #2 (3649-3M) e (iii) um controle de anti-CD20. O atuador para alvejar a taxa foi de 2 a 1. A célula B tonsilar são suscetíveis a ADCC mediado por três anticorpos testados.

[0069] Figura 10. Os linfócitos circulantes foram C57Bl6 hCD19 tg +/- de forma isolada, camundongos C57Bl6 hCD19 tg +/+, Balb/c hCD20 tg+/- e Balb/c. As células isoladas foram tingidas com CD19 anti-camundongo conjugado por PerCP (a-mCD19), anti- CD3conjugado por PE conjugado, anti-CD19 humano conjugado com Alexa488 (a-hCD19) e anticorpos CD20 anti-humano conjugado com Alexa647 (a-hCD20). n igual o número de animais analisados de cada grupo. (A) A intensidade de fluorescência média de células CD3 medidas nos canais específicos de hCD19, hCD20 e mCD19 é apresentada em um formato de gráfico de barras. (B) Porcentagem de linfócitos CD3- mCD19+ em vários fundamentos genéticos.

[0070] Figura 11. A depleção de célula B in vivo B por anticorpo anti-CD19 #2. Os animais (A) C57Bl6 hCD19 tg +/+ e (B) C57Bl6 hCD19 tg +/- foram tratados com uma dose i.v. simples de 250 ou 50 mg de anticorpo anti-CD19 #2 (3649). Os anticorpos de controle negativo usados são (i) a variante de Fc comprometida com ADCC #2 (3649 TM) e (ii) um anticorpo de especificidade irrelevante (R347). Os linfócitos circulantes foram isolados 7 dias após tratamento. As células foram tingidas com CD19 anti-camundongo conjugado com PerCP (a- mCD19) e anticorpos anti-CD3 conjugados com PE. A porcentagem de células mCD19+ CD3- B é apresentada. n igual o número de animais analisados de cada grupo. Um tratamento com uma dose simples de anticorpo anti-CD19 #2 resultou em uma depleção quase completa de células B.

[0071] Figura 12. A depleção de célula B in vivo por anticorpo anti- CD19 #2. Os animais C57Bl6 hCD19 tg +/+ e C57Bl6 hCD19 tg +/- foram tratados com uma dose i.v. simples de 250 ou 50 mg de anticorpo anti-CD19 #2 (3649). Os anticorpos de controle negativo usados são (i) a variante de Fc comprometido com ADCC de #2 (3649 TM) e (ii) um anticorpo de especificidade irrelevante (R347). As células de baço foram isoladas 7 dias após o tratamento. As células foram tingidas com CD-19 anti-camundongo conjugado com PerCP (a- mCD19) e anticorpos anti-CD3 conjugados com PE. A porcentagem de células B (mCD19+ CD3-) entre os linfócitos de baço é apresentada. n iguala o número de animais analisados de cada grupo. Um tratamento com uma dose simples de anticorpo anti-CD19 #2 resultou em uma depleção quase completa de células B.

[0072] Figura 13. O anticorpo Anti-CD19 #2 reduz significantemente o desenvolvimento do tumor em um sistema de modelo in vivo. Os camundongos de CB17 SCID foram injetados s.c. no flanco traseiro com 5 x 106 célula de Raji no dia 1. Os animais foram tratados com cinco doses quinzenais de 10 mg/kg de anticorpo começando no dia 4. Os anticorpos usados são: (i) anti-CD19 #2 (3649), (ii) variante Fc de anti-CD19 #2 com atividade ADCC reduzida (3649-TM), (iii) anti-CD20, e (iv) controle de isotipo de especificidade irrelevante (R347). A um grupo de animais de controle foi dado apenas PBS. O tamanho de tumor foi medido duas vezes por semana usando- se os procedimentos padrão.

[0073] Figura 14. Anticorpo anti-CD19 #2 reduz significantemente o desenvolvimento do tumor em um sistema de modelo in vivo. Os camundongos CB17 SCID foram injetados s.c. o flanco traseiro com 5 x 106 células de Raji no dia 1. Os animais foram tratados com cinco doses quinzenais de 10 mg/kg ou 2,5 mg/kg de anticorpo começando no dia 4. Os anticorpos usados são: (i) anti-CD19 #2 em 10 mg/kg ou 2,5 mg/kg (3649 10 mg/kg e 3649* 2,5 mg/kg), (ii) a variante Fc de anti-CD19 #2 com atividade de ADCC reduzida em 10 mg/kg (3649- TM), (iii) a variante Fc de anti-CD19 #2 com atividade de ADCC humana intensificada em 10 mg/kg (3649-3M), (iv) anti-CD20 em 10 mg/kg e (v) controle de isotipo de especificidade irrelevante em 10 mg/kg (R347). A um grupo de animais de controle foi dado apenas PBS. O tamanho do tumor foi medido duas vezes por semana usando- se os procedimentos padrão.

[0074] Figura 15. Perfil de ligação de anticorpos anti-CD19 3649, 3649-3M, e 3649-aFuc ao alelo 158V de FcgRIIIA como determinado por ELISA. Um anticorpo anti-CD20 foi incluído no ensaio como um controle de referência. A afinidade de ligação do anticorpo variante de 3649-3M Fc e o anticorpo 3649-aFuc afucosilado ao FcgRIIIA é muito mais alto do que aquele do anticorpo 3649 fucosilado. O 3649 e os anticorpos anti-CD20 tiveram perfis de ligação idênticos.

[0075] Figura 16. O genotipo de FcgRIIIA das células atuadoras influencia a atividade ADCC in vitro do anticorpo anti-CD19 #2. Os ensaios de ADCC foram realizados usando-se o kit CytoTox 96™ (Promega) seguindo as instruções do fabricante. Os anticorpos usados são: (i) o anti-CD19 afucosilado #2 (3649-aFuc), (ii) a variante 3M Fc de anti-CD19 #2 (3649-3M) e (iii) um controle anti-CD20. As células Daudi serviram como alvo. Uma linha celular NK (A) ou células NK recentemente isoladas (B-E) foram usadas como células atuadoras. A célula NK com genotipo V158/V158 (C), V158/F158 (D) e F158/F158 (E) FcgRIIIA foram testados. As células NK que compreendem pelo menos uma cópia da isoforma de afinidade alta de receptor de FcgRIIIA (genotipos V158/V158 e V158/F158) são células atuadoras mais eficientes do que as células NK homozigotas para os alelos de afinidade baixa (genotipo F158/F158). A atividade de ADCC observada do anticorpo fucosilado (3649) mediado por células NK V158/V158 ou V158/F158 (C, D) é comparável à atividade de ADCC do anticorpo afucosilado (3649-aFuc) mediado por células NK F158/F158 (E).

[0076] Figura 17. O Esquema de identificação de (A) circulação, (B) esplênica, (C) medula óssea e (D) subséries de célula B peritoneal com base em fenotipo de expressão de antígeno de superfície celular. As populações de celulares isoladas tingidas Fluorescentemente foram analisadas em um citômetro de fluxo. As subséries de célula B foram identificadas e medidas através do uso sequencial de válvulas. O fluxo do processo é indicado por setas cinzas em negrito. Por exemplo, as células B foliculares do baço foram identificadas como segue: (i) As células vivas são registradas em tingimento de 7AAD baixo, (ii) os linfócitos da fração de célula viva são identificados com base em seu fenotipo de FSC e SSC característico, (iii) As células B entre os linfócitos vivos são identificados usando-se o tingimento anti-mCD19 e anti-B220, (iv) as células B1a são separadas de células B com base em diferenças em expressão de B220, (v) as populações de célula B madura e transicional são distinguidas uma da outra com base em expressão diferencial de CD93, (vi) a sub-população de célula B folicular de células B maduras é separada da fração de célula B de zona marginal com base em diferenças na expressão de CD23.

[0077] Figura 18. Perfil de ligação de fragmentos anti-CD19 de anticorpo 3649 maturado por afinidade Fab para o CD19 humano recombinante que expressa células 300B4 em um ensaio de ELISA com base em célula. Os resultados obtidos com uma amostra representativa de Fabs que compreende substituições de aminoácidos simples no VH CDR3 são mostrados. O 3649 anti-CD19 Fab (3649 peri) foi usado como padrão de referência. A afinidade de 4G6 e 4B7 Fabs para o CD19 humano recombinante que expressa células 300B4 é significantemente mais alta do que aquele do 3649 Fab controle. Todos os outros Fabs testados tiveram afinidades similares àquela do 3649 Fab controle.

[0078] Figura 19. Perfil de ligação de fragmentos de anti-CD19 anticorpo 3649 naturados por afinidade Fab para o CD19 humano recombinante que expressa células 300B4 em um ensaio de ELISA com base em célula. os Fabs caracterizados foram identificados a partir de uma biblioteca que compreende todas as combinações possíveis das substituições de aminoácido simples benéficas identificadas em avaliações específicas de CDR prévias. O perfil de ligação de seis Fabs com a afinidade mais alta com CD19 humano recombinante que expressa células 300B4 é mostrado. O 3649 anti- CD19 Fab (3649 peri) foi usado como padrão de referência. A afinidade com CD19 humano recombinante que expressa células 300B4 de todos os seis Fabs maturados por afinidade é maior do que aquela do 3649 Fab controle.

[0079] Figura 20. Perfil de ligação de anticorpos 3649 anti-CD19 maturados por afinidade para o CD19 humano recombinante que expressa células 300B4 em um ensaio de ELISA com base em célula. O anticorpo 3649 anti-CD19 foi usado como padrão de referência. O perfil de ligação de 16C9 IgG é similar àquela dos anticorpos de controle 3649. A afinidade de ligação de anticorpo maturados por afinidade 14H5, 15D1, 15D7, 16C4 e 7E12 é mais alta do que aquela do anticorpo 3649 controle.

[0080] Figura 21. Perfil de ligação de anticorpo 3649 anti-CD19 maturados por afinidade a CD19 que expressa células de Raji em um ensaio de ELISA com base em célula. O anticorpo 3649 anti-CD19 foi usado como padrão de referência. A afinidade de ligação de todos os seis anticorpos (14H5, 15D1, 15D7, 16C4, 16C9 and 7E12) é mais alta do que aquele do anticorpo 3649 controle.

[0081] Figura 22. Perfil de ligação de anticorpo 3649 anti-CD19 maturados por afinidade a CD19 que expressa células Daudi em um ensaio de ELISA com base em célula. O anticorpo 3649 anti-CD19 foi usado como padrão de referência. A afinidade de ligação de todos os seis anticorpos (14H5, 15D1, 15D7, 16C4, 16C9 and 7E12) é mais alta do que aquele do anticorpo 3649 controle.

[0082] Figura 23. Perfil de ligação de anticorpo 3649 anti-CD19 maturados por afinidade para o CD19 humano recombinante que expressa células 300B4 em um ensaio de ELISA com base em célula. 14H5-YG, 14H5-DG e 14H5-LG são variantes de substituição de aminoácido simples do anticorpo 3649 anti-CD19 maturado por afinidade 14H5. Os anticorpo 3649 anti-CD19 maturados por afinidade 14H4 e 16C4 foram usados como padrão de referência. A afinidade de ligação de anticorpos 14H5-YG, 14H5-DG e 14H5-LG é menor do que aquela dos anticorpos de controle 14H5 e 16C4.

[0083] Figura 24. Comparação fora de taxa de cinética de anticorpos 3649 anti-CD19 maturados por afinidade. (A) As células de Ramos foram incubadas com anticorpos anti-CD19 maturados por afinidade, lavados e ainda incubados a 37° C por 0, 30 ou 60 minutos. As células foram tingidas com um anticorpo secundário fluorescente no final do período de incubação e analisados em um citômetro de fluxo. A intensidade fluorescente média de células após 0, 30 e 60 minutos de incubação é mostrada. A intensidade de fluorescência média (MFI) observada no tempo 0 é ajustada a 100 % para cada anticorpo estudado. O anticorpo 3649 anti-CD19 e um anticorpo anti- CD20 foram usados como padrões de referência. A eliminação de todos os seis anticorpo 3649 anti-CD19 maturados por afinidade (14H5, 15D1, 15D7, 16C4, 16C9 e 7E12) da superfície celular é menor do que aquele dos padrões de referência. (B) As células de Ramos com um anticorpo anti-CD19 HB12B, 3649, ou 16C4 conjugado com Alexa 647, lavado e ainda incubado a 37° C por 0, 30 ou 60 minutos. As células foram analisadas em citômetro de fluxo no final do período de incubação. Um anticorpo anti-CD20 diretamente conjugado foi incluído no experimento como um controle de referência. A intensidade de fluorescência média (MFI) detectada após vários períodos de incubação é expressada como a razão de MFI vista no tempo 0. A perda de MFI após o tingimento com o anticorpo anti-CD19 maturado por afinidade 16C4 é muito mais lenta do que a perda de sinal vista com os anticorpos com os anticorpos anti-CD19 3649 e HB12B.

[0084] Figura 25. Perfil de ligação de anticorpo 3649 anti-CD19 maturados por afinidade to células Daudi. As células Daudi foram tingidas com os anticorpos anti-CD19 14H5, 15D1, 15D7, 16C4, 16C9 ou 7E12 maturados por afinidade e um anticorpo secundário fluorescentemente rotulado. O anticorpo 3649 anti-CD19 foi usado como padrão de referência. As células tingidas foram analisadas em um citômetro de fluxo. A intensidade de fluorescência média (FI médio) observada em várias concentrações de anticorpo é apresentada em um gráfico. O FI médio para os anticorpos 3649 anti-CD-19 maturados por afinidade foi mais alto do que aquele do padrão de referência.

[0085] Figura 26. A atividade ADCC in vitro de anticorpos 3649 anti-CD19 maturados por afinidade. (A) A atividade ADCC in vitro dos anticorpos anti-CD19 14H5, 14H5-DG e 16C4 maturados por afinidade foram submetidos a ensaio usando-se células alvo de Daudi. O anticorpo 3649 anti-CD-19 foi usado como padrão de referência. A atividade ADCC de todos os três anticorpos maturados por afinidade é mais alta do que aquele do padrão de referência em concentração de anticorpo baixa (0,01 e 0,1 μg/ml de anticorpo). A atividade de ADCC de todos os três anticorpos maturados por afinidade paralela à atividade do padrão de referência em concentrações de anticorpo altas (1 e 10 mg/ml de anticorpo). (B) A atividade de ADCC do anticorpo 16C4 afucosilado (16C4-aFuc) foi determinado em um ensaio in vitro usando-se as células alvo de Daudi. A atividade ADCC de 16C4-aFuc é significantemente mais alta do que aquela do controle de referência 3649-aFuc, anticorpos de referência 16C4 anti-CD20 e fucosiladas.

[0086] Figura 27. IEF-PAGE tingido com Coomassie de anticorpos maturados por afinidade anti-CD19. O ponto isoelétrico de anticorpos 16C4, 16C9, 7E12, 14H5, 15D7, 15D1, 14H5-DG e 3649 é 7,83, 8,04, 7,69, 7,76, 7,61, 7,72, 7,48, and 7,75, respectivamente.

[0087] Figura 28. A depleção de célula B in vivo pelo anticorpo 3649 anti-CD19 afucosilado. Os animais C57Bl6 hCD19 tg +/- foram tratados com uma dose i.v. simples de 10, 50, ou 250 mg de anticorpo 3649 anti-CD19 fucosilado (3649) ou anticorpo 3649 anti-CD19 afucosilado (3649-aFuc). Os animais de controle negativos foram tratados com (i) a variante Fc comprometida com ADCC de anticorpo 3649 anti-CD19 (3649 TM) ou (ii) um anticorpo de especificidade irrelevante (R347). Os linfócitos circulantes (A) ou linfócitos esplênicos (B) foram isolados 7 dias 7 após o tratamento com anticorpo. As células isoladas foram imunotingidas como descrito na Tabela 5 para identificar várias populações de célula B. A porcentagem de células B220+ CD19+ B é apresentada. O anticorpo 3649 anti-CD19 afucosilado atinge uma depleção significantemente mais alta de células B do que a mesma quantidade de anticorpo anti-CD19 fucosilado. Nenhuma depleção de célula B é detectada em animais tratados com anticorpo de controle 3649TM.

[0088] Figura 29. Ativação de célula NK intensificada em camundongo tratado com anticorpo 3649 anti-CD19 afucosilado. Os animais C57Bl6 hCD19 tg +/- animais foram tratados com uma dose i.v. simples de 10 μg de anticorpo 3649 anti-CD19 fucosilado (3649) ou anticorpo 3649 anti-CD19 afucosilado (3649-aFuc). Os animais de controle negativos foram tratados com a mesma quantidade de um anticorpo de especificidade irrelevante comparado por isotipo (R347). Os linfócitos circulantes foram isolados 7 dias após o tratamento com anticorpo. As células isoladas foram tingidas com anti-corpos anti- NK1.1, anti-DX5 e anti-CD107a fluorescentemente rotulado. A plotagem CD107a vs. NK1.1 de NK1.1+, linfócitos vivos auxiliados por DX5+ é apresentada. Uma porcentagem mais alta de células NK isoladas de animais tratados com anticorpo 3649 anti-CD19 afucosilado apresenta CD107a em sua superfície celular mais alta do que as células NK isoladas de animais tratados com anticorpo 3649 anti-CD19 fucosilado.

[0089] Figura 30. O anticorpo anti-CD19 #2 afucosilado (3649- aFuc) reduz significantemente o tamanho do tumor em um sistema de modelo in vivo. Os camundongos CB17 SCID foram injetados s.c. no flanco traseiro com 5 x 106 células de Raji no dia 1. Os animais foram tratados com cinco doses quinzenais de 10 mg/kg ou 2,5 mg/kg de anticorpo começando no dia 4. Os anticorpos usados são: (i) anti- CD19 #2 fucosilado em 10 mg/kg de (3649), (ii) anti-CD19 #2 afucosilado em 10 mg/kg ou 2,5 mg/kg de (3649-aFuc), (iii) anti-CD20 em 10 mg/kg e (iv) anticorpo de especificidade irrelevante de controle de isotipo em 10 mg/kg (R347). A um grupo de animais de controle foi dado apenas PBS. O tamanho do tumor foi medido duas vezes por semana usando-se procedimentos.

[0090] A Figura 31. A depleção de célula B in vivo usando-se os anticorpos anti-CD19 maduros por afinidade 16C4 and 14H5. Os animais C57Bl6 hCD19 tg +/- foram tratados com uma dose i.v. simples de 10, 50 ou 250 μg de anticorpo anti-CD19 fucosiladas maturado por afinidade 16C4 fucosilado (16C4) ou anticorpo anti- CD19 maturado por afinidade 14H5DG (14H5DG). Os animais de controle de referência foram tratados com (i) anticorpo 3649 anti-CD19 (3649), (ii) a variante Fc intensificada com ADCC de anticorpo 3649 anti-CD19 (3649 3M) e (iii) anticorpo 3649 anti-CD19 afucosilado (3649-aFuc). Os animais de controle negativo foram tratados com (i) a variante Fc comprometida com ADCC de anticorpo 3649 anti-CD19 (3649 TM) ou (ii) um anticorpo de especificidade irrelevante (R347). Os linfócitos circulantes (A) ou os linfócitos esplênicos (B) foram isolados 7 dias após o tratamento com anticorpo. As células isoladas foram imunotingidas como descrito na Tabela 5 para identificar várias populações de célula B. A porcentagem de células B220+ CD19+ B é apresentada. O anticorpo anti-CD19 maturado por afinidade de 16C4 atingiu uma depleção levemente mais alta de células B do que o anticorpo 3649 anti-CD19 precursor. Os anticorpos 3649-aFuc e 3649 3M atingiu depleção melhor do que o anticorpo maturado por afinidade 16C4. O anticorpo anti-CD19 maturado por afinidade 14H5DG é menos eficiente na depleção de células B do que o anticorpo 3649 anti-CD19 precursor. Os valores dentro do painel (A) são aqueles da depleção percentual atingidos por um dado anticorpo.

[0091] Figura 32. A atividade de ligação do Fab maturado por afinidade 64D4 para o CD19 humano recombinante que expressa células 300B4 em um ensaio de ligação com base celular (Lu et al., J. Immunol. Methods 314:74-79 (2006)). 64D4 é uma variante do anticorpo anti-CD19 16C4 que compreende uma substituição de aminoácido simples no VH CDR2. O 16C4 and 3649 anti-CD19 Fabs (16C4sup e 3649sup, respectivamente) foram usados como padrões de referência. A afinidade do 64D4 Fab para o CD19 humano recombinante que expressa células 300B4 é significantemente maior do que aquele do 16C4 e 3649 Fabs controle.

[0092] Figura 33. Caracterização do anti-CD19 Fabs variante maturado por afinidade isolado da biblioteca de apresentação de fago combinatório. Perfil de ligação de variantes maturadas por afinidade do 16C4 Fab para o antígeno que apresentou superfície celular de CD19 humano foi medido em um ensaio de ligação com base celular usando-se (A) 300B4 e (B) células de Raji (Lu et al., J. Immunol. Methods 314:74-79 (2006)). O 16C4 e 3649 anti-CD19 Fabs (16C4sup e 3649sup, respectivamente) foram usados como padrões de referência. A afinidade de ligação de Fabs maturados por afinidade 6C11, 2B11, 3B4, 5C11, 3C3, 9G7, 1H4 e 5C4 à células 300B4 e de Raji é mais alta do que aquele de 3649 e 16C4 Fabs controle. (C) A sequência de aminoácido dos clones de Fab maturados por afinidade foi determinada usando-se os métodos laboratoriais padrão. A sequência de CDR de clones de Fab únicos é apresentada. Os resíduos de aminoácido diferentes daqueles da sequência de 16C4 parental são impressos usando-se códigos de aminoácido de letra única; os resíduos idênticos à sequência parental são marcados com um “-“.

[0093] Figura 34. Perfil de ligação dos anticorpos anti-CD19 de IgG maturado por afinidade 2B11, 3C3, 5C4, 6C11, 6F7 e 9G7 para o CD19 humano recombinante que expressa células 300B4. A atividade de ligação foi medida usando-se um ensaio com base celular (Lu et al., J. Immunol. Methods 314:74-79 (2006)). Os anticorpos anti-CD19 16C4 e 3649 foram usados como padrões de referência. A afinidade de ligação dos anticorpos maturados por afinidade anti-CD19 testados quanto às células 300B4 é maior do que aquela dos anticorpos 16C4 e 3649.

[0094] Figura 35. Perfil de ligação de anticorpos anti-CD19 16C4 maturados por afinidade com as (A) células de Raji e (B) células de Daudi. As células foram tingidas com os anticorpos maturados por afinidade anti-CD19 3C3, 6C11 ou 9G7 e um anticorpo secundário fluorescentemente rotulado. O anticorpo anti-CD19 16C4 foi usado como padrão de referência. As células tingidas foram analisadas em um citômetro de fluxo. A intensidade de fluorescência mediana (FI Mediano) observado em várias concentrações de anticorpos é apresentada. O FI mediano de células tingidas com os anticorpos anti- CD19 variantes 16C4 maturados por afinidade foi maior do que aquelas células tingidas com o padrão de referência em 0,0625 a 0,125 μg/ml de concentração de anticorpo primário. O FI mediano obtido usando-se anticorpos maturados por afinidade foi substancialmente o mesmo como aquele para o anticorpo de referência na faixa de 0,25 a 10 μg/ml.

[0095] Figura 36. A atividade in vitro ADCC de anticorpos anti- CD19 variantes 16C4 maturados por afinidade. A atividade de ADCC in vitro dos anticorpos maturados por afinidade anti-CD19 3C3, 6C11 ou 9G7 foi estimada usando as células alvo de Raji. O anticorpo anti- CD19 16C4 foi usado como padrão de referência. A atividade ADCC de todos os três anticorpos maturados por afinidade é substancialmente a mesma como aquela do padrão de referência em todas as concentrações testadas (0,01 a 10 μg/ml).

[0096] Figura 37. A atividade ADCC in vitro de anticorpos anti- CD19 variantes 16C4 maturados por afinidade. A atividade de ADCC in vitro dos anticorpos maturados por afinidade anti-CD19 3C3, 6C11 ou 9G7 foi estimada suando-se as células alvo de Daudi. O anticorpos 16C4 anti-CD-19 foi usado como padrão de referência. A atividade ADCC de todos os três anticorpos maturados por afinidade é substancialmente a mesma como aquela do padrão de referência em todas as concentrações testadas (0,01 a 10 μg/ml).

[0097] Figura 38. Recuperação de longo prazo de células B e níveis de imunoglobulina do soro seguindo a depleção da célula B com uma dose simples de anticorpo anti-CD19 16C4 afucosilado administrado i. v. (A) protocolo experimental. Aos grupos de quatro ou cinco camundongos huCD19 tg+/- foi administrada uma dose i. v. simples de 250, 50 ou 10 μg de anticorpo anti-CD19 16C4 afucosilado (16C4 aFuc). Os grupos de controle foram tratados com PBS ou 250 μg de anticorpo controle de especificidade irrelevante (R347). Os animais foram sangrados uma vez a cada duas semanas; o primeiro sangramento foi realizados sete dias antes da administração da depleção do anticorpo. As descobertas das primeiras 11 semanas são resumidas nos painéis. (B) O peso corporal dos animais em todos os grupos permaneceu normal. Os níveis de célula B no sangue são expressados como (C) a fração de linfócitos ou como (D) o número de célula B por microlitro de sangue. Todas as três doses de anticorpo 16C4 atingiram a depleção de célula B completa. A recuperação de célula B completou-se na semana 5 e na semana 9 em animais que receberam 10 e 50 μg de anticorpo 16C4 aFuc, respectivamente. A recuperação de célula B ainda foi incompleta 11 semanas após a administração de 250 μg de anticorpo 16C4 aFuc. (E) IgM, (F) IgG1 e (G) IgG2b do soro não foi substituído seguindo a administração de 50 ou 250 μg de 16C4 aFuc. Os níveis de imunoglobulina no soro foram aumentados seguindo a administração de 10 μg de anticorpo 16C4 aFuc ou o anticorpo de controle R347 ou PBS. Os dados indicam que o 16C4 aFuc suprimiu inicialmente a produção de imunoglobulina, mas teve impacto mínimo na imunoglobulina pré-existente no soro.

[0098] Figura 39. O anticorpo anti-CD19 induziu a sinalização intracelular. (A-B) o tratamento com anticorpo 3649, 3649-TM, 36493M, 3649-aFuc ou 16C4 aumenta significantemente o nível de fosforilação de tirosina de CD19 em células de Raji. (C-D) O tratamento com anticorpo anti-CD19 não inibe a fosforilação de ERK1/2 induzida pelo tratamento com anti-IgM.

[0099] Figura 40. O tratamento com o anticorpo anti-CD19 inibe a proliferação de célula B mediada por anti-IgM/CD40.

[00100] Figura 41. O tratamento com o anticorpo anti-CD19 inibe a proliferação induzida por anti-IgM/CpG de células B periféricas purificadas. (A) O perfil de intensidade de fluorescência de células B de sangue periférico purificado tingido com CFSE seguindo 4 dias de incubação na presença de anti-IgM (1 μg/ml) e CpG (2 μg/ml). Os perfis de CFSE de uma população celular de primeiro controle não estimulado e um CpG estimulou apenas a Segunda população celular de controle estão incluídos como padrões de referência. (B) os perfis de CFSE de células B seguindo os 4 dias de estímulo com anti- IgM/CpG na presença de 16C4 anti-CD19 ou anticorpo de controle R347. A proliferação de célula B induzida por anti-IgM/CpG é significantemente reduzida na presença de anticorpo 16C4.

[00101] Figura 42. O anticorpo anti-CD19 variante de Fc 3649-3M é um inibidor mais eficaz de proliferação de célula B induzida por anti- IgM/CpG do que o anticorpo variante de Fc 3649-TM. Os perfis de CFSE de células B seguindo os 4 dias de estímulo por anti-IgM/CpG na presença de (A) controle R347, (B) 3649-TM anti-CD19 ou (C) anticorpo anti-CD19 3649-3M.

[00102] Figura 43. O anticorpo 3649-3M induziu a sinalização através dos receptores de CD19 e os receptores FcgamaRIIB inibem sinergisticamente a proliferação de célula B mediada por anti- IgM/CpG.

[00103] Figura 44. O anticorpo anti-CD19 ligado à superfície é eficientemente internalizado pelas células de Raji. 35 % de 16C4 ligado à superfície e 55 % de HB12B ligado à superfície e o anticorpo 3649 anti-CD19 é internalizado seguindo 60 minutos de incubação a 37° C.

[00104] Figura 45. A expressão de superfície de CD19 é significantemente reduzida seguindo 24 horas de tratamento com anticorpo anti-CD19. A expressão de superfície celular de CD19 é reduzida por 55 a 90 % em (A) as células de Raji e as (B) células B purificadas periféricas seguindo 24 horas de incubação na presença de anticorpo anti-CD19 3649, 3649-TM, 3649-3M, 3649-aFuc ou 16C4. 5.

DESCRIÇÃO DETALHADA

[00105] A presente invenção diz respeito a anticorpos anti-CD19 humanos, humanizados ou quiméricos que ligam-se ao antígeno de CD19 humano, bem como a composições que compreendem aqueles anticorpos. Em certas formas de realização, um anticorpo anti-CD19 humano, humanizado ou quimérico pode mediar a citotoxicidade mediada por célula dependente de antígeno (ADCC). Em outras formas de realização, a presente invenção é direcionada a composições que compreendem um anticorpo anti-CD19 humano, humanizado ou quimérico do isotipo humano IgG1 e/ou IgG3, bem como a um anticorpo anti-CD19 humano, humanizado ou quimérico do isotipo humano IgG2 e/ou IgG4, que pode mediar o ADCC humano, CDC e/ou apoptose. Em formas de realização adicionais, um anticorpo anti-CD19 humano, humanizado ou quimérico pode apresentar a proliferação de célula B estimulada por anti-IgM/CpG.

[00106] A presente invenção fornece versões quiméricas e humanizadas dos anticorpos monoclonais de camundongo anti-CD19 HB12A e HB12B. Em uma forma de realização, um anticorpo anti- CD19 humanizado da invenção pode ligar-se ao CD19 humano com uma afinidade comparável à afinidade de ligação of HB12A ou HB12B ou comparável à afinidade de ligação de um anticorpo HB12B quimérico.

[00107] Em uma forma de realização, um anticorpo monoclonal anti-CD19 humanizado da invenção pode compreender um VH e um VK, em que o VH compreende as quatro regiões de estrutura, FW1, FW2 e FW3 do segmento VH da linha germinal humana de V3-72 (descrito como DP29 em Tomlinson, I. M. et al., (1992) J. Mol. Biol., 227, 776-798) e FW4 do segmento JH4 da linha germinal humana (Mattila, P. S. et al., (1995) Eur. J. Immunol., 25, 2578-2582) e as três sequências de VH CDR do anticorpo HB12B, CDR1 (SEQ ID N°: 22), CDR2 (SEQ ID N°: 24) e CDR3 (SEQ ID N°: 26) e o VK compreende as quatro regiões de estrutura, FW1, FW2, FW3 do segmento V capa da linha germinal humana A10 (Straubinger, B. I et al., (1988) Biol. Chem. Hoppe-Seyler, 369, 601-607) e FW4 do segmento capa J4 de imunoglobulina da linha germinal humana (Hieter, P. A. et al., (1982) J. Biol. Chem., 257, 1516-1522) e as três sequências de VK CDR do anticorpo HB12B, CDR1 (SEQ ID N°: 28), CDR2 (SEQ ID N°: 30) e CDR3 (SEQ ID N°: 32). Em uma forma de realização, um anticorpo anti-CD19 da invenção pode compreender um VH e um VK, em que o VH compreende as quatro regiões de estrutura, FW1, FW2 e FW3 do segmento VH da linha germinal humana de V3-72 (descrito como DP29 em Tomlinson, I. M. et al., (1992) J. Mol. Biol., 227, 776-798) e FW4 do segmento J4 da linha germinal humana (Mattila, P. S. et al., (1995) Eur. J. Immunol., 25, 2578-2582) e pelo menos um CDR tendo a sequência de aminoácido de um CDR listado na tabela 1 supra e o VK compreende as quatro regiões de estrutura, FW1, FW2, FW3 do segmento V capa da linha germinal humana A10 (Straubinger, B. I et al., (1988) Biol. Chem. Hoppe-Seyler, 369, 601-607) e FW4 do segmento capa J4 de imunoglobulina da linha germinal humana (Hieter, P. A. et al., (1982) J. Biol. Chem., 257, 1516-1522) e pelo menos um CDR tendo a sequência de aminoácido de um CDR listado na Tabela 1 supra. Em uma forma de realização, este anticorpo pode compreender uma ou mais mutações da estrutura de VK selecionada do grupo que consiste de Y40F, K53H e Y91F. Em uma forma de realização, a região de estrutura de VK pode conter cada uma das mutações de ponto Y40F, K53H e Y91F. Em uma outra forma de realização, a região de estrutura de VK pode conter apenas as mutações de ponto Y40F e K53H. Em uma outra forma de realização a estrutura de VK pode compreender apenas a mutação de ponto Y40F.

5.1.1. Regiões de CDR de anticorpos anti-CD19

[00108] Em certas formas de realização, um anticorpo anti-CD19 da invenção pode compreender uma região variável de cadeia pesada, VH, que compreende pelo menos um CDR tendo a sequência de aminoácido selecionada do grupo que consiste de SEQ ID N°: 22, SEQ ID N°: 24 e SEQ ID N°: 26 e ainda pode compreender pelo menos uma região FW tendo a sequência de aminoácido selecionada do grupo que consiste de SEQ ID N°: 36, SEQ ID N°: 38, SEQ ID N°: 40 e SEQ ID N°: 42. Em uma outra forma de realização, um anticorpo anti-CD19 da invenção pode compreender uma região variável de cadeia pesada, VH, que compreende pelo menos um CDR tendo a sequência de aminoácido selecionada do grupo que consiste de SEQ ID N°: 22, SEQ ID N°: 24 e SEQ ID N°: 121 e ainda pode compreender pelo menos uma região FW tendo a sequência de aminoácido selecionada do grupo que consiste de SEQ ID N°: 36, SEQ ID N°: 38, SEQ ID N°: 40 e SEQ ID N°: 42. Em uma forma de realização adicional, um anticorpo anti-CD19 da invenção pode compreender uma região variável de cadeia pesada, VH, que compreende pelo menos um CDR tendo a sequência de aminoácido selecionada do grupo que consiste de SEQ ID N°: 22, SEQ ID N°: 116 e SEQ ID N°: 121 e ainda pode compreender pelo menos uma região FW tendo a sequência de aminoácido selecionada do grupo que consiste de SEQ ID N°: 36, SEQ ID N°: 38, SEQ ID N°: 40 e SEQ ID N°: 42. Em uma forma de realização adicional, um anticorpo anti-CD19 da invenção pode compreender uma região variável de cadeia pesada, VH, que compreende pelo menos um CDR tendo a sequência de aminoácido selecionada do grupo que consiste de SEQ ID N°: 208, SEQ ID N°: 116 e SEQ ID N°: 121 e ainda pode compreender pelo menos uma região FW tendo a sequência de aminoácido selecionada do grupo que consiste de SEQ ID N°: 36, SEQ ID N°: 38, SEQ ID N°: 40 e SEQ ID N°: 42. Em uma forma de realização adicional, um anticorpo anti- CD19 da invenção pode compreender uma região variável de cadeia pesada, VH, que compreende pelo menos um CDR tendo a sequência de aminoácido selecionada do grupo que consiste de SEQ ID N°: 208, SEQ ID N°: 210 e SEQ ID N°: 121 e ainda pode compreender pelo menos uma região FW tendo a sequência de aminoácido selecionada do grupo que consiste de SEQ ID N°: 36, SEQ ID N°: 38, SEQ ID N°: 40 e SEQ ID N°: 42. Em uma outra forma de realização, um anticorpo anti-CD19 da invenção pode compreender uma região variável de cadeia pesada, VH, que compreende pelo menos um CDR tendo a sequência de aminoácido da a VH CDR1, VH CDR2, ou VH CDR3 listado na Tabela 1 supra; e ainda pode compreender pelo menos uma região FW tendo a sequência de aminoácido selecionada do grupo que consiste de SEQ ID N°: 36, SEQ ID N°: 38, SEQ ID N°: 40 e SEQ ID N°: 42.

[00109] Em outras formas de realização, um anticorpo anti-CD19 da invenção pode compreender uma região variável de cadeia pesada, VH, que compreende pelo menos uma sequência de CDR selecionada do grupo que consiste de SEQ ID N°: 22, SEQ ID N°: 24 e SEQ ID N°: 26.

[00110] Em formas de realização adicionais, um anticorpo anti- CD19 pode compreender uma região variável de cadeia pesada, VH, que compreende pelo menos uma sequência de CDR selecionada do grupo que consiste de SEQ ID N°: 6, SEQ ID N°: 8 e SEQ ID N°: 10.

[00111] Em uma forma de realização, um anticorpo anti-CD19 da invenção pode compreender uma região variável de cadeia pesada, VH, que compreende pelo menos um CDR tendo a sequência de aminoácido selecionada do grupo que consiste de SEQ ID N°: 22, SEQ ID N°: 24 e SEQ ID N°: 121. Em uma outra forma de realização, um anticorpo anti-CD19 da invenção pode compreender uma região variável de cadeia pesada, VH, que compreende pelo menos um CDR tendo a sequência de aminoácido selecionada do grupo que consiste de SEQ ID N°: 22, SEQ ID N°: 116 e SEQ ID N°: 121. Em uma outra forma de realização, um anticorpo anti-CD19 da invenção pode compreender uma região variável de cadeia pesada, VH, que compreende pelo menos um CDR tendo a sequência de aminoácido selecionada do grupo que consiste de SEQ ID N°: 208, SEQ ID N°: 116 e SEQ ID N°: 121. Em uma outra forma de realização, um anticorpo anti-CD19 da invenção pode compreender uma região variável de cadeia pesada, VH, que compreende pelo menos um CDR tendo a sequência de aminoácido selecionada do grupo que consiste de SEQ ID N°: 208, SEQ ID N°: 210 e SEQ ID N°: 121.

[00112] Em uma outra forma de realização, um anticorpo anti-CD19 da invenção pode compreender uma região variável de cadeia pesada, VH, que compreende pelo menos um CDR tendo a sequência de aminoácido da a VH CDR1, VH CDR2 ou VH CDR3 listado na Tabela 1 supra.

[00113] Em uma outra forma de realização, um anticorpo anti-CD19 da invenção pode compreender uma região variável de cadeia pesada, VH, que compreende as sequências de aminoácido de um VH CDR1, VH CDR2 e VH CDR3 de qualquer um dos anticorpos listado na Tabela 1 supra. O anticorpo anti-CD19 da invenção ainda pode compreender uma região variável de cadeia leve, VL.

[00114] Em uma outra forma de realização, um anticorpo anti-CD19 da invenção pode compreender uma região variável de cadeia leve, VL, que compreende as sequências de aminoácido de um VL CDR1, VL CDR2 e VL CDR3 de qualquer um dos anticorpos listado na Tabela 1 supra. O anticorpo anti-CD19 da invenção ainda pode compreender uma região variável de cadeia pesada, VH.

[00115] Em uma outra forma de realização, um anticorpo anti-CD19 da invenção pode compreender as sequências de aminoácido de um VH CDR1, VH CDR2, VH CDR3, VL CDR1, VL CDR2 e VL CDR3 de qualquer um dos anticorpos listado na Tabela 1 supra.

[00116] Em certas formas de realização, um anticorpo anti-CD19 pode compreender a sequência de domínio de VH do VH humanizado denominado HB12B-(3-72/JH4) (SEQ ID N°: 34).

[00117] Em uma forma de realização, um anticorpo anti-CD19 descrito neste pode compreender uma região variável de cadeia pesada, VH, tendo a sequência de aminoácido selecionada do grupo que consiste de SEQ ID N°: 103, 106, 191 e 192. Em uma outra forma de realização, um anticorpo anti-CD19 descrito neste pode compreender uma região variável de cadeia pesada, VH, tendo a sequência de aminoácido da um domínio de VH listado na Tabela 1. supra.

[00118] Em certas formas de realização, um anticorpo anti-CD19 da invenção pode compreender uma região variável de cadeia leve, VK, que compreende pelo menos um CDR tendo uma sequência de aminoácido selecionada do grupo que consiste de SEQ ID N°: 28, SEQ ID N°: 30 e SEQ ID N°: 32 e ainda pode compreender pelo menos uma região FW tendo uma sequência de aminoácido selecionada do grupo que consiste de SEQ ID N°: 54, SEQ ID N°: 56, SEQ ID N°: 72, SEQ ID N°: 82, SEQ ID N°: 64, SEQ ID N°: 58, SEQ ID N°: 66 e SEQ ID N°: 60.

[00119] Em uma forma de realização, um anticorpo anti-CD19 da invenção pode compreender uma região variável de cadeia leve, VK, que compreende pelo menos um CDR tendo uma sequência de aminoácido selecionada do grupo que consiste de SEQ ID N°: 28, SEQ ID N°: 125 e SEQ ID N°: 32 e ainda pode compreender pelo menos uma região FW tendo uma sequência de aminoácido selecionada do grupo que consiste de SEQ ID N°: 54, SEQ ID N°: 56, SEQ ID N°: 72, SEQ ID N°: 82, SEQ ID N°: 64, SEQ ID N°: 58, SEQ ID N°: 66 e SEQ ID N°: 60. Em uma forma de realização adicional, um anticorpo anti-CD19 da invenção pode compreender uma região variável de cadeia leve, VK, que compreende pelo menos um CDR tendo uma sequência de aminoácido selecionada do grupo que consiste de SEQ ID N°: 211, SEQ ID N°: 218 e SEQ ID N°: 222 e ainda pode compreender pelo menos uma região FW tendo uma sequência de aminoácido selecionada do grupo que consiste de SEQ ID N°: 54, SEQ ID N°: 56, SEQ ID N°: 72, SEQ ID N°: 82, SEQ ID N°: 64, SEQ ID N°: 58, SEQ ID N°: 66 e SEQ ID N°: 60. Em uma forma de realização adicional, um anticorpo anti-CD19 da invenção pode compreender uma região variável de cadeia leve, VK, que compreende pelo menos um CDR tendo uma sequência de aminoácido selecionada do grupo que consiste de SEQ ID N°: 28, SEQ ID N°: 220 e SEQ ID N°: 229 e ainda pode compreender pelo menos uma região FW tendo uma sequência de aminoácido selecionada do grupo que consiste de SEQ ID N°: 54, SEQ ID N°: 56, SEQ ID N°: 72, SEQ ID N°: 82, SEQ ID N°: 64, SEQ ID N°: 58, SEQ ID N°: 66 e SEQ ID N°: 60. Em uma forma de realização adicional, um anticorpo anti-CD19 da invenção pode compreender uma região variável de cadeia leve, VK, que compreende pelo menos um CDR tendo uma sequência de aminoácido selecionada do grupo que consiste de SEQ ID N°: 215, SEQ ID N°: 221 e SEQ ID N°: 222 e ainda pode compreender pelo menos uma região FW tendo uma sequência de aminoácido selecionada do grupo que consiste de SEQ ID N°: 54, SEQ ID N°: 56, SEQ ID N°: 72, SEQ ID N°: 82, SEQ ID N°: 64, SEQ ID N°: 58, SEQ ID N°: 66 e SEQ ID N°: 60. Em uma outra forma de realização, um anticorpo anti-CD19 da invenção pode compreender uma região variável de cadeia leve, VK, que compreende pelo menos um CDR tendo uma sequência de aminoácido de um VK CDR1, VK CDR2 ou VK CDR3 listado na Tabela 1 supra e ainda pode compreender pelo menos uma região FW tendo uma sequência de aminoácido selecionada do grupo que consiste de SEQ ID N°: 54, SEQ ID N°: 56, SEQ ID N°: 72, SEQ ID N°: 82, SEQ ID N°: 64, SEQ ID N°: 58, SEQ ID N°: 66 e SEQ ID N°: 60.

[00120] Em outras formas de realização, um anticorpo anti-CD19 da invenção pode compreender uma região variável de cadeia leve, VK, que compreende pelo menos uma sequência de CDR selecionada do grupo que consiste de SEQ ID N°: 28, 30 e 32.

[00121] Em outras formas de realização, um anticorpo anti-CD19 da invenção pode compreender uma região variável de cadeia leve, VK, que compreende pelo menos uma sequência de CDR selecionada do grupo que consiste de SEQ ID N°: 12, 14 e 16.

[00122] Em uma forma de realização, um anticorpo anti-CD19 da invenção pode compreender uma região variável de cadeia leve, VK, que compreende pelo menos um CDR tendo uma sequência de aminoácido selecionada do grupo que consiste de SEQ ID N°: 28, SEQ ID N°: 125 e SEQ ID N°: 32. Em uma forma de realização, um anticorpo anti-CD19 da invenção pode compreender uma região variável de cadeia leve, VK, que compreende pelo menos um CDR tendo uma sequência de aminoácido selecionada do grupo que consiste de SEQ ID N°: 211, SEQ ID N°: 218 e SEQ ID N°: 222. Em uma forma de realização, um anticorpo anti-CD19 da invenção pode compreender uma região variável de cadeia leve, VK, que compreende pelo menos um CDR tendo uma sequência de aminoácido selecionada do grupo que consiste de SEQ ID N°: 28, SEQ ID N°: 220 e SEQ ID N°: 229. Em uma forma de realização, um anticorpo anti-CD19 da invenção pode compreender uma região variável de cadeia leve, VK, que compreende pelo menos um CDR tendo uma sequência de aminoácido selecionada do grupo que consiste de SEQ ID N°: 215, SEQ ID N°: 221 e SEQ ID N°: 222. Em uma outra forma de realização, um anticorpo anti-CD19 da invenção pode compreender uma região variável de cadeia leve, VK, que compreende pelo menos um CDR tendo uma sequência de aminoácido de um VK CDR1, VK CDR2 ou VK CDR3 listado na Tabela 1 supra.

[00123] Em certas formas de realização, um anticorpo anti-CD19 pode compreender a sequência de domínio VK humanizado selecionada de um grupo que consiste de HB12B-(A10-Jk4) (SEQ ID N°: 52), HB12B-364987 (SEQ ID N°: 62), HB12B-3649 (SEQ ID N°: 68), HB12B-36 (SEQ ID N°: 70), 7E12 VK (SEQ ID N°: 110), 14H5 VK (SEQ ID N°: 111), 16C9 VK (113), 15D1 VK (SEQ ID N°: 112), 3C3 VK (SEQ ID N°: 193), 6C11 VK (SEQ ID N°: 204) e 9G7 VK (SEQ ID N°: 205).

[00124] A presente invenção abrange anticorpos que ligam-se ao CD19 humano, que compreende derivados dos domínios de VH, VH CDR1s, VH CDR2s, VH CDR3s, domínios VK, VK CDR1s, VK CDR2s ou VK CDR3s descritos neste que podem ligar-se ao CD19 humano (ver, por exemplo, as variantes listadas na Tabela 1. supra). As técnicas padrão conhecidas por aqueles de habilidade na técnica podem ser usadas para a introdução de mutações (por exemplo, adições, anulações e/ou substituições) na sequência de nucleosídeo que codifica um anticorpo, incluindo, por exemplo, mutagênese direcionada ao local e mutagênese mediada por PCR que são rotineiramente usadas para a geração de substituições de aminoácido. Em uma forma de realização, os derivados de VH e/ou VK CDRs pode incluir menos do que 25 substituições de aminoácido, menos do que 20 substituições de aminoácido, menos do que 15 substituições de aminoácido, menos do que 10 substituições de aminoácido, menos do que 5 substituições de aminoácido, menos do que 4 substituições de aminoácido, menos do que 3 substituições de aminoácido, menos do que 2 substituições de aminoácido ou 1 substituição de aminoácido com relação ao VH e/ou VK CDRs originais do anticorpo HB12A ou HB12B anti-CD19. Em uma outra forma de realização, os derivados de VH e/ou VK CDRs podem ter substituições de aminoácido conservativas (por exemplo, supra) feitas em um ou mais resíduos de aminoácido não essenciais preditos (isto é, resíduos de aminoácido que não são críticos para o anticorpo para ligar-se especificamente ao CD19 humano). As mutações também podem ser introduzidas aleatoriamente ao longo de todas ou de parte das sequências codificadoras de VH e/ou VK CDR, tal como pela mutagênese por saturação e os mutantes resultantes podem ser avaliados para a atividade biológica para identificar mutantes que retêm atividade. Seguindo a mutagênese, o segundo anticorpo pode ser expressado e a atividade do anticorpo pode ser determinada. Em uma forma de realização, os anticorpos da invenção divulgados neste pode excluir o VH CDR1 e o VH CDR2 do anticorpo hA19 descrito em US20050070693A1.

[00125] Em uma forma de realização, um anticorpo anti-CD19 humano ou humanizado descrito neste pode compreender uma variante de qualquer um dos VH CDRs listados na Tabela 1 supra em que a dita variante de VH CDR compreende uma substituição de aminoácido. Em uma forma de realização específica, um anticorpo anti-CD19 da invenção compreende uma variante de um VH CDR listado na Tabela 1 em que a dita variante VH CDR compreende um ou mais dos seguintes resíduos de aminoácido naturais ou substituídos: uma treonina (T) na posição 32 de VH CDR1, uma tirosina (Y) na posição 60 de VH CDR2, um ácido aspártico (D) na posição 60 de VH CDR2, uma leucina (L) na posição 60 de VH CDR2, uma alanina (A) na posição 61 de VH CDR2, uma valina (V) na posição 61 de VH CDR2, uma tirosina (Y) na posição 100B de VH CDR3, uma arginina (R) na posição 100B de VH CDR3 e uma asparagina (N) na posição 100B de VH CDR3, numerado de acordo com Kabat.

[00126] Em uma forma de realização, um anticorpo anti-CD19 humano ou humanizado descrito neste pode compreender uma variante de um VH CDR listado na Tabela 1 em que a dita variante VH CDR compreende um ou mais dos seguintes resíduos de aminoácido naturais ou substituídos: um ácido glutâmico (E) na posição 33 de VH CDR1, uma leucina (L) na posição 33 de VHCDR1, fenilalanina (F) na posição 35 de VH CDR1, uma tirosina (Y) na posição 35 de VH CDR1, um ácido aspártico (D) na posição 35 de VH CDR1, uma leucina (L) na posição 35 de VH CDR1, uma serina (S) na posição 57 de VH CDR2, uma prolina (P) na posição 57 de VH CDR2, uma asparagina (N) na posição 57 de VH CDR2, uma histidina (H) na posição 100B de VH CDR3, uma fenilalanina (F) na posição 100B de VH CDR3 e uma prolina (P) na posição 99 de VH CDR3, numerado de acordo com Kabat.

[00127] Em uma forma de realização, um anticorpo anti-CD19 humano ou humanizado descrito neste pode compreender uma variante de um VH CDR listado na Tabela 1 em que a dita variante VH CDR compreende um ou mais dos seguintes resíduos de aminoácido naturais ou substituídos: uma valina (V) na posição 32 de VH CDR1 e uma leucina (L) na posição 52A de VHCDR2, numerado de acordo com Kabat.

[00128] Em uma outra forma de realização, um anticorpo anti-CD19 humano ou humanizado da invenção pode compreender uma variante de um VK CDR listado na Tabela 1 em que o dito VK CDR compreende um ou mais dos seguintes resíduos de aminoácido naturais ou substituídos: uma histidina (H) na posição 27D de VK CDR1, uma isoleucina (I) na posição 33 de VK CDR1, um ácido glutâmico (E) na posição 50 de VK CDR2, uma treonina (T) na posição 91 em VK CDR3 e uma isoleucina (I) na posição 96 de VK CDR3, numerado de acordo com Kabat.

[00129] Em uma outra forma de realização, um anticorpo anti-CD19 humano ou humanizado da invenção pode compreender uma variante de um VK CDR listado na Tabela 1 em que o dito VK CDR compreende um ou mais dos seguintes resíduos de aminoácido naturais ou substituídos: uma isoleucina (I) na posição 27C de VK CDR1, uma leucina (L) na posição 30 de VK CDR1, uma arginina (R) na posição 33 de VK CDR1, uma treonina (T) na posição 33 de VK CDR1, uma tirosina (Y) na posição 50 de VK CDR2, uma treonina (T) na posição 54 de VK CDR2, uma prolina (P) na posição 54 de VK CDR2, uma tirosina (Y) na posição 55 de VK CDR2 e uma asparagina (N) na posição 96 de VK CDR3, numerado de acordo com Kabat.

[00130] Em uma outra forma de realização, um anticorpo anti-CD19 humano ou humanizado da invenção pode compreender uma variante de um VK CDR listado na Tabela 1 em que o dito VK CDR compreende um ou mais dos seguintes resíduos de aminoácido naturais ou substituídos: uma arginina (R) na posição 54 de VK CDR2, uma treonina (T) na posição 54 de VK CDR2, uma alanina (A) na posição 54 de VK CDR2 e uma alanina (A) na posição 89 de VK CDR3, numerado de acordo com Kabat.

[00131] A presente invenção ainda abrange anticorpos que ligam-se ao CD19 humano, os ditos anticorpos ou fragmentos de anticorpo que compreendem um ou mais CDRs em que os ditos CDRs compreendem uma sequência de aminoácido que é pelo menos 45 %, pelo menos 50 %, pelo menos 55 %, pelo menos 60 %, pelo menos 65 %, pelo menos 70 %, pelo menos 75 %, pelo menos 80 %, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou pelo menos 99 % idêntica a uma sequência de aminoácido de um ou mais CDRs do anticorpo HB12A ou HB12B anti-CD19. A identidade percentual de duas sequências de aminoácido podem ser determinadas por qualquer método conhecido de uma pessoa habilitada na técnica, incluindo, mas não limitado a, pesquisas de proteína BLAST.

5.1.2. Regiões de estrutura de anticorpos anti-CD19

[00132] Em uma forma de realização, o VH de um anticorpo monoclonal anti-CD19 humanizado da invenção pode compreender uma região de estrutura que tem uma identidade de sequência de aminoácido com as regiões de estrutura correspondentes (isto é, FW1 de anticorpo X em comparação com o FW1 do anticorpo Y) de HB12B- (3-72/JH4) VH (SEQ ID N°: 34) dentro da faixa de cerca de 64 % a cerca de 100 %. Em certos aspectos desta forma de realização, as regiões de estrutura de VH humanas ou humanizadas de anticorpos descritos neste podem ter uma identidade de sequência de aminoácido com o HB12B-(3-72/JH4) VH (SEQ ID N°: 34) que é pelo menos 64 %, pelo menos 70 %, pelo menos 75 %, pelo menos 80 %, pelo menos 85 %, pelo menos 90 % ou pelo menos 95 %.

[00133] Nas formas de realização particulares, as regiões de estrutura de VH humanas ou humanizadas de anticorpos anti-CD19 descritos neste podem ter uma identidade de sequência de aminoácido com as regiões de estrutura de HB12B-(3-72/JH4) VH (SEQ ID N°: 34) de pelo menos 56 fora dos 87 aminoácidos (56/87). Nas formas de realização particulares, a identidade de sequência de aminoácido de estrutura pode ser de pelo menos 56/87, 57/87, 58/87, 59/87, 60/87, 61/87, 62/87, 63/87, 64/87, 65/87, 66/87, 67/87, 68/87, 69/87, 70/87, 71, 87, 72/87, 73/87 74/87, 75/87, 76/87, 77.87, 78/87, 79/87, 80/87, 81/87, 82/87, 83/87, 84/87, 85/87, 86/87 ou 87/87 aminoácidos. As sequências de VH de anticorpos anti-CD19 descritas neste podem ter identidade de sequência alta aos resíduos de aminoácido de Vernier de HB12B-(3-72/JH4), por exemplo uma identidade de sequência de Vernier de pelo menos 10 fora dos 16 (10/16), pelo menos 11/16, pelo menos 12/16, pelo menos 13/16, pelo menos 14/16 ou pelo menos 15/16 resíduos de Vernier. Em uma outra forma de realização, o desacordo de resíduo de aminoácido de Venier pode ser uma substituição de aminoácido conservativa. Um desacordo que é uma substituição conservativa de aminoácido é um em que o aminoácido em desacordo têm propriedades físicas e químicas similares ao aminoácido Vernier, por exemplo, o resíduo em desacordo tem características similares depolaridade (polar ou não polar), acidez (ácido ou básico), estrutura de cadeia secundária (por exemplo, reto ou ramificado ou que compreende um anel de fenila, uma porção de hidroxila ou uma porção de enxofre) ao resíduo de Vernier.

[00134] Em outras formas de realização, o desacordo de um resíduo de aminoácido de Vernier pode ser uma substituição de aminoácido não conservativas. Um desacordo que é uma substituição de aminoácido não conservativa é um em que o aminoácido em desacordo não tem propriedades físicas e químicas similares ao aminoácido Vernier, por exemplo, o resíduo em desacordo em uma estrutura de polaridade, acidez ou de cadeia secundárias diferentes (por exemplo, reto ou ramificado ou que compreende um anel de fenila, uma porção de hidroxila ou uma porção de enxofre) em comparação como o resíduo de Vernier a ser substituído.

[00135] Em outras formas de realização, um anticorpo anti-CD19 humano ou humanizado da invenção pode compreender regiões de estrutura de VH em que as ditas regiões de estrutura de VH pode compreender um ou mais dos seguintes resíduos: uma leucina (L) na posição 20 de região de estrutura 1, uma fenilalanina (F) na posição 27 da região de estrutura 1, uma treonina (T) na posição 28 da região de estrutura 1, uma arginina (R) na posição 38 na região de estrutura 2, uma valina (V) na posição 48 da região de estrutura 2, uma fenilalanina (F) na posição 67 da região de estrutura 3, uma arginina (R) na posição 71 da região de estrutura 3, uma leucina (L) na posição 80 da região de estrutura 3 e uma tirosina (Y) na posição 91 da região de estrutura 3, numerado de acordo com Kabat.

[00136] A numeração de Kabat é fundamentado no trabalho seminal de Kabat et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Publicação N° 91-3242, publicado como um ajuste de três volumes pelo National Institutes of Health, National Technical Information Service (hereinafter “Kabat”). Kabat fornece alinhamentos de sequência múltiplos de cadeias de imunoglobulinas de isotipos de anticorpos de espécies numerosas. As sequências alinhadas são numeradas de acordo com um sistema de numeração simples, o sistema de numeração de Kabat. As sequências de Kabat foram atualizados desde a publicação de 1991 e são disponíveis como um banco de dados de sequência eletrônica (última versão baixável de 1997). Qualquer sequência de imunoglobulina pode ser numerada de acordo com Kabat realizando um alinhamento com a sequência de referência de Kabat. Consequentemente, o sistema de numeração de Kabat fornece um sistema uniforme para numerar as cadeias de imunoglobulina. A não ser que indicado de outra maneira, todas as sequências de aminoácido de imunoglobulina descrito neste são numerados de acordo com o sistema de numeração de Kabat. Similarmente, todas as posições de aminoácido simples referidas aqui neste são numerados de acordo com o sistema de numeração de Kabat.

[00137] Em outras formas de realização particulares, as regiões de estrutura de VH humanas ou humanizadas de anticorpos anti-CD19 descritos neste podem ter regiões de estrutura selecionadas para a identidade ou desacordos conservativos em um ou mais das seguintes posições de resíduo de Vernier, Interface ou Canônica: 20, 22, 24, 26, 27, 28, 29, 30, 36, 37, 39, 45, 47, 48, 49, 67, 69, 71, 73, 78, 80, 90, 91, 92, 93, 94 e 103. Um ou mais dos resíduos de Vernier, Interface e Canônicos em desacordo podem ser mudados, por exemplo, por mutagênese, para comparar o resíduo de aminoácido correspondente da região de estrutura de VH HB12A ou HB12B.

[00138] Em uma forma de realização da invenção, as regiões de estrutura VK humanas ou humanizadas de anticorpos anti-CD19 descritas neste podem ter uma identidade de sequência de aminoácido comas regiões de estrutura de HB12B-(A10-Jk4) VK (SEQ ID N°: 52) dentro da faixa de cerca de 65 % a cerca de 100 %. Em certos aspectos desta forma de realização, as regiões de estrutura VK humanas ou humanizadas de anticorpos descritos neste podem ter uma identidade de sequência de aminoácido com o HB12B-(A10-Jk4) anticorpo VK que é pelo menos 65 %, pelo menos 70 %, pelo menos 75 %, pelo menos 80 %, pelo menos 85 %, pelo menos 90 % ou pelo menos 95 %.

[00139] Nas formas de realização particulares, as regiões de estrutura VK humanas ou humanizadas de anticorpos descritos neste podem ter uma identidade de sequência de aminoácido com as regiões de estrutura correspondentes (isto é, FW1 de anticorpo X em comparação com FW1 de anticorpo Y) de HB12B-(A10-Jk4) VH (SEQ ID N°: 52) de pelo menos 52 fora dos 80 aminoácidos (52/80) Nas formas de realização particulares, a identidade de sequência de aminoácido de estrutura VK podem ser pelo menos 52/80, 53/80, 54/80, 55/80, 56/80, 57/80, 58/80, 59/80, 60/80, 61/80, 62/80, 63/80, 64/80, 65/80, 66/80, 67/80, 68/80, 69/80, 70/80, 71, 80, 72/80, 73/80 74/80, 75/80, 76/80, 77/80, 78/80, 79/80 ou 80/80, aminoácido. As sequências VK de anticorpos anti-CD19 descrito neste podem ter identidade de sequência alta aos resíduos de aminoácido de Vernier de HB12B (ver Figura 1), por exemplo, uma identidade de sequência de Vernier de pelo menos 9 fora dos 14 (9/14), pelo menos 10/14, pelo menos 11/14, pelo menos 12/14, pelo menos 13/14 resíduos de Vernier. Em uma outra forma de realização, o desacordo de um resíduo de aminoácido de Vernier pode ser uma substituição de aminoácido conservativa. Um desacordo que é uma substituição de aminoácido conservativa é um em que o aminoácido em desacordo tem propriedades físicas e químicas similares ao aminoácido Vernier, por exemplo, o resíduo em desacordo tem características similares de polaridade (polar ou não polar), acidez (ácido ou básico), estrutura de cadeia simples (por exemplo, reto ou ramificado, ou que compreende um anel de fenila, uma porção de hidroxila ou uma porção de enxofre) ao resíduo de Vernier.

[00140] Em outras formas de realização, o desacordo de um resíduo de aminoácido de Vernier pode ser uma substituição de aminoácido não conservativas. Um desacordo que é uma substituição de aminoácido não conservativa é um em que um aminoácido em desacordo não tem propriedades físicas e químicas similar ao aminoácido Vernier, por exemplo, o resíduo em desacordo tem uma polaridade, acidez ou estrutura de cadeia simples diferentes (por exemplo, reto ou ramificado, ou que compreende um anel de fenila, uma porção de hidroxila ou uma porção de enxofre) em comparação com o resíduo de Vernier a ser substituído.

[00141] Em outras formas de realização, as regiões de estrutura VK humanas ou humanizadas descrito neste pode compreender um ou mais dos seguintes resíduos: uma fenilalanina (F) na posição 36 da região de estrutura 2, uma histidina (H) na posição 49 da região de estrutura 2 e uma fenilalanina (F) na posição 87 da região de estrutura 3, numerado de acordo com Kabat.

[00142] Em outras formas de realização particulares, as regiões de estrutura VK humanas ou humanizadas de anticorpos descritos nestes podem ter regiões de estrutura selecionados para desacordos de identidades ou conservativos em um ou mais das seguintes posições de resíduo de Vernier, Interface ou Canônicos: 2, 3, 4, 23, 35, 36, 38, 44, 56, 47, 48, 49, 64, 66, 68, 69, 71, 87, 88 e 98. Um ou mais dos resíduos de Vernier, Interface e Canônicos em desacordo podem ser mudados, por exemplo, por mutagênese, para comparar o resíduo de aminoácido correspondente da região de estrutura HB12A ou HB12B.

[00143] Nas formas de realização particulares, uma cadeia pesada que compreende um VH humanizado da invenção pode ser expressado com uma cadeia leve que compreende um VK humanizados da invenção para produzir um anticorpo anti-CD19 humanizado. Em uma forma de realização específica, um anticorpo anti-CD19 humanizado da invenção pode compreender uma sequência de VH selecionada do grupo que consiste das sequências denominadas HB12B-(3-72/JH4) (SEQ ID N°: 34), 7E12 VH (SEQ ID N°: 102), 14H5 VH (SEQ ID N°: 103), 15D1 VH (SEQ ID N°: 104), 15D7 VH (SEQ ID N°: 105), 16C4 VH (SEQ ID N°: 106), 14H5-YG (SEQ ID N°: 107), 14H5-DG (SEQ ID N°: 108), 14H5-LG (SEQ ID N°: 109), 1A7 VH (SEQ ID N°: 191), 3C3 VH (SEQ ID N°: 191), 6C11 VH (SEQ ID N°: 191), 9G7 (SEQ ID N°: 191), 3B4 VH (SEQ ID N°: 236) e 3F11 VH (SEQ ID N°: 192) e ainda pode compreender uma sequência de VK selecionada do grupo que consiste das sequências denominadas HB12B-(A10/JK4) (SEQ ID N°: 52); HB12B-364987 (ou 364987) (SEQ ID N°: 62); HB12B-3649 (ou 3649) (SEQ ID N°: 68); HB12B-36 (ou 36) (SEQ ID N°: 70), 7E12 VK (SEQ ID N°: 110), 14H5 (SEQ ID N°: 111), 15D1 (SEQ ID N°: 112), 16C9 (SEQ ID N°: 113), 3C3 VK (SEQ ID N°: 193), 3E5 VK (SEQ ID N°: 194), 3D4 VK (SEQ ID N°: 195), 3F1 VK (SEQ ID N°: 196), 5B5 VK (SEQ ID N°: 197), 6F7 VK (SEQ ID N°: 198), 1C11 VK (SEQ ID N°: 199), 2B11 VK (SEQ ID N°: 200), 2D10 VK (SEQ ID N°: 201), 5C11 VK (SEQ ID N°: 202), 5D4 VK (SEQ ID N°: 203), 6C11 VK (SEQ ID N°: 204), 9G7 VK (SEQ ID N°: 205), 1H4 VK (SEQ ID N°: 206) e 5C4 VK (SEQ ID N°: 207). Em uma forma de realização particular, um anticorpo anti-CD19 humanizado compreende a sequência VH HB12B-(3-72/JH4) (SEQ ID N°: 34) e a sequência VK HB12B-364987 (SEQ ID N°: 62). Em uma forma de realização particular, um anticorpo anti-CD19 humanizado compreende a sequência VH HB12B-(3-72/JH4) (SEQ ID N°: 34) e a sequência VK HB12B-3649 (SEQ ID N°: 68). Ainda em uma outra forma de realização, um anticorpo anti-CD19 humanizado compreende a sequência VH HB12B-(3-72/JH4) (SEQ ID N°: 34) e a sequência VK HB12B-36 (SEQ ID N°: 70).

[00144] Em uma forma de realização específica, um anticorpo anti- CD19 da invenção compreende a sequência VH 7E12 VH (SEQ ID N°: 102) e a sequência VK 7E12 VK (SEQ ID N°: 110). Em uma forma de realização específica, um anticorpo anti-CD19 da invenção compreende a sequência VH 14H5 VH (SEQ ID N°: 103) e a sequência VK 14H5 VK (SEQ ID N°: 111). Em uma forma de realização específica, um anticorpo anti-CD19 da invenção compreende a sequência VH 14H5-YG VH (SEQ ID N°: 107) e a sequência VK 14H5 VK (SEQ ID N°: 111). Em uma forma de realização específica, um anticorpo anti-CD19 da invenção compreende a sequência VH 14H5-DG VH (SEQ ID N°: 108) e a sequência VK 14H5 VK (SEQ ID N°: 111). Em uma forma de realização específica, um anticorpo anti-CD19 da invenção compreende a sequência VH 14H5-LG VH (SEQ ID N°: 109) e a sequência VK 14H5 VK (SEQ ID N°: 111). Em uma forma de realização específica, um anticorpo anti-CD19 da invenção compreende a sequência VH 14H5 VH (SEQ ID N°: 103) e a sequência VK 16C9 VK (SEQ ID N°: 113). Em uma forma de realização específica, um anticorpo anti-CD19 da invenção compreende a sequência VH 15D1 VH (SEQ ID N°: 104) e a sequência VK 15D1 VK (SEQ ID N°: 112). Em uma forma de realização específica, um anticorpo anti-CD19 da invenção compreende a sequência VH 15D7 VH (SEQ ID N°: 105) e a sequência VK 14H5 VK (SEQ ID N°: 111). Em uma forma de realização específica, um anticorpo anti-CD19 da invenção compreende a sequência VH 16C4 VH (SEQ ID N°: 106) e a sequência VK 14H5 VK (SEQ ID N°: 111). Em uma forma de realização específica, um anticorpo anti-CD19 da invenção compreende a sequência VH 1A7 VH (SEQ ID N°: 191) e a sequência VK 14H5 VK (SEQ ID N°: 111). Em uma forma de realização específica, um anticorpo anti-CD19 da invenção compreende a sequência VH 1A7 VH (SEQ ID N°: 191) e a sequência VK 3C3 VK (SEQ ID N°: 193). Em uma forma de realização específica, um anticorpo anti-CD19 da invenção compreende a sequência VH 1A7 VH (SEQ ID N°: 191) e a sequência VK 3E5 VK (SEQ ID N°: 194). Em uma forma de realização específica, um anticorpo anti-CD19 da invenção compreende a sequência VH 1A7 VH (SEQ ID N°: 191) e a sequência VK 3D4 VK (SEQ ID N°: 195). Em uma forma de realização específica, um anticorpo anti-CD19 da invenção compreende a sequência VH 1A7 VH (SEQ ID N°: 191) e a sequência VK 5B5 VK (SEQ ID N°: 197). Em uma forma de realização específica, um anticorpo anti-CD19 da invenção compreende a sequência VH 1A7 VH (SEQ ID N°: 191) e a sequência VK 6F7 VK (SEQ ID N°: 198). Em uma forma de realização específica, um anticorpo anti-CD19 da invenção compreende a sequência VH 1A7 VH (SEQ ID N°: 191) e a sequência VK 2D10 VK (SEQ ID N°: 201). Em uma forma de realização específica, um anticorpo anti-CD19 da invenção compreende a sequência VH 1A7 VH (SEQ ID N°: 191) e a sequência VK 5C11 VK (SEQ ID N°: 202). Em uma forma de realização específica, um anticorpo anti-CD19 da invenção compreende a sequência VH 1A7 VH (SEQ ID N°: 191) e a sequência VK 9G7 VK (SEQ ID N°: 205). Em uma forma de realização específica, um anticorpo anti-CD19 da invenção compreende a sequência VH 1A7 VH (SEQ ID N°: 191) e a sequência VK 1H4 VK (SEQ ID N°: 206). Em uma forma de realização específica, um anticorpo anti-CD19 da invenção compreende a sequência VH 1A7 VH (SEQ ID N°: 191) e a sequência VK 5C4 VK (SEQ ID N°: 207). Em uma forma de realização específica, um anticorpo anti-CD19 da invenção compreende a sequência VH 3B4 VH (SEQ ID N°: 236) e a sequência VK 14H5 VK (SEQ ID N°: 111). Em uma forma de realização específica, um anticorpo anti-CD19 da invenção compreende a sequência VH 3F11 VH (SEQ ID N°: 192) e a sequência VK 3F11 VK (SEQ ID N°: 196). Em uma forma de realização específica, um anticorpo anti-CD19 da invenção compreende a sequência VH 16C4 VH (SEQ ID N°: 106) e a sequência VK 1C11 VK (SEQ ID N°: 199). Em uma forma de realização específica, um anticorpo anti-CD19 da invenção compreende a sequência VH 16C4 VH (SEQ ID N°: 106) e a sequência VK 2B11 VK (SEQ ID N°: 200). Em uma forma de realização específica, um anticorpo anti-CD19 da invenção compreende a sequência VH 16C4 VH (SEQ ID N°: 106) e a sequência VK 5D4 VK (SEQ ID N°: 203). Em uma forma de realização específica, um anticorpo anti-CD19 da invenção compreende a sequência VH 16C4 VH (SEQ ID N°: 106) e a sequência VK 6F7 VK (SEQ ID N°: 198). Em uma forma de realização específica, um anticorpo anti-CD19 da invenção compreende a sequência VH 3F11 VH (SEQ ID N°: 192) e a sequência VK 6C11 VK (SEQ ID N°: 204). Em uma forma de realização específica, um anticorpo anti-CD19 da invenção compreende qualquer combinação de um VH and a VL listado na Tabela 1.

[00145] Em certas formas de realização, uma cadeia leve que compreende um VK humanizado da invenção pode ser expressada com uma cadeia pesada que compreende um VH humanizado da invenção para produzir um anticorpo anti-CD19 humanizado. Em uma forma de realização, um anticorpo anti-CD19 humanizado descrito neste compreende a sequência VK selecionada do grupo que consiste das sequências denominadas HB12B-(A10/JK4) (SEQ ID N°: 52); HB12B-364987 (ou 364987) (SEQ ID N°: 62); HB12B-3649 (ou 3649) (SEQ ID N°: 68); HB12B-36 (ou 36) (SEQ ID N°: 70), 7E12 VK (SEQ ID N°: 110), 14H5 (SEQ ID N°: 111), 15D1 (SEQ ID N°: 112), 16C9 (SEQ ID N°: 113), 3C3 (SEQ ID N°: 193), 3E5 (SEQ ID N°: 194), 3D4 (SEQ ID N°: 195), 3F11 (SEQ ID N°: 196), 5B5 (SEQ ID N°: 197), 6F7 (SEQ ID N°: 198), 1C11 (SEQ ID N°: 199), 2B11 (SEQ ID N°: 200), 2D10 (SEQ ID N°: 201), 5C11 (SEQ ID N°: 202), 5D4 (SEQ ID N°: 203), 6C11 (SEQ ID N°: 204), 9G7 (SEQ ID N°: 205), 1H4 (SEQ ID N°: 206) e 5C4 (SEQ ID N°: 207). A sequência VK mencionada acima podem estar em pares com a sequência VH que compreende uma sequência de aminoácido em sua região de estrutura selecionada do grupo que consiste de SEQ ID N°: 36, 38, 40 e 42.

[00146] Em certas formas de realização, uma cadeia pesada que compreende um VH humanizado da invenção pode ser expressada com uma cadeia leve que compreende um VK humanizado da invenção para produzir um anticorpo anti-CD19 humanizado. Em uma forma de realização, um anticorpo anti-CD19 humanizado descrito neste compreende a sequência VH selecionada do grupo que consiste das sequências denominadas HB12B-(3-72/JH4) (SEQ ID N°: 34), 7E12 VH (SEQ ID N°: 102), 14H5 VH (SEQ ID N°: 103), 15D1 VH (SEQ ID N°: 104), 15D7 VH (SEQ ID N°: 105), 16C4 VH (SEQ ID N°: 106), 14H5-YG (SEQ ID N°: 107), 14H5-DG (SEQ ID N°: 108), 14H5- LG (SEQ ID N°: 109), 1A7 (SEQ ID N°: 191), 3C3 VH (SEQ ID N°: 191), 6C11 VH (SEQ ID N°: 191), 9G7 (SEQ ID N°: 191), 3B4 VH (SEQ ID N°: 236) e 3F11 VH (SEQ ID N°: 192). A sequência VH mencionada acima pode estar em par com uma sequência VK que compreende uma sequência de aminoácido em sua região de estrutura selecionada do grupo que consiste de SEQ ID N°: 54, SEQ ID N°: 56, SEQ ID N°: 72, SEQ ID N°: 82, SEQ ID N°: 64, SEQ ID N°: 58, SEQ ID N°: 66 e SEQ ID N°: 60.

[00147] Em certas formas de realização, um VH humanizado ou VK derivado do hibridoma HB12A ou HB12B parental pode ser expressado como uma cadeia leve de imunoglobulina quimérica ou uma cadeia pesada de imunoglobulina quimérica para produzir um anticorpo anti-CD19 quimérico. Em uma forma de realização particular, um VH humanizado pode ser expressado como um anticorpo quimérico que compreende o HB12A VK (SEQ ID N°: 4) ou HB12B VK (SEQ ID N°: 20). Em uma outra forma de realização particular, um VK humanizado pode ser expressado como um anticorpo quimérico que compreende o HB12A VH (SEQ ID N°: 2) ou HB12B VH (SEQ ID N°: 18). Em uma outra forma de realização, um anticorpo anti-CD19 quimérico pode compreender a sequência VK de HB12A VK (SEQ ID N°: 4) ou HB12B VK (SEQ ID N°: 20) e ainda pode compreender a sequência VH de HB12A VH (SEQ ID N°: 2) ou HB12B VH (SEQ ID N°: 18).

[00148] Em uma forma de realização particular, um VH humanizado da invenção ainda pode compreender uma sequência líder de MGDNDIHFAFLSTGVHS (SEQ ID N°: 83).

[00149] Em uma outra forma de realização, um VK humanizado da invenção ainda pode compreender uma sequência líder MDMRVPAQLLGLLLLWLPGAKC (SEQ ID N°: 84) selecionada do peptídeo líder do gene VKI-L12 humano.

[00150] Os anticorpos anti-CD19 descrito neste podem ter uma afinidade de ligação alta para o antígeno de CD19 humano (hCD19). Por exemplo, um anticorpo descrito neste podem ter uma constante de taxa de associação ou taxa kon (anticorpo (Ab) + antígeno (Ag)kon ^ Ab- Ag) de peio menos 2 X 105 M-1s-1, pelo menos 5 X 105 M- 1s-1, pelo menos 106 M-1s-1, pelo menos 5 X 106 M-1s-1, pelo menos 107 M-1s-1, pelo menos 5 X 107 M-1s-1 ou pelo menos 108 M-1s-1.

[00151] Em uma outra forma de realização, um anticorpo anti-CD19 da invenção podem ter uma taxa de koff ((Ab- Ag)kof ^ anticorpo (Ab) + antígeno (Ag)) de menos do que 5 x 10-1 s-1, menos do que 10-1 s-1, menos do que 5 x 10-2 s-1, menos do que 10-2 s-1, menos do que 5 x 103 s-1, menos do que 10-3 s-1, menos do que 5 x 10-4 s-1 ou menos do que 10-4 s-1. Em uma outra forma de realização, um anticorpo da invenção tem um koff de menos do que 5 x 10-5 s-1, menos do que 10-5 s-1, menos do que 5 x 10-6 s-1, menos do que 10-6 s-1, menos do que 5 x 10-7 s-1, menos do que 10-7 s-1, menos do que 5 x 10-8 s-1, menos do que 10-8 s- 1, menos do que 5 x 10-9 s-1, menos do que 10-9 s-1 ou menos do que 10-10 s-1.

[00152] Em uma outra forma de realização, um anticorpo anti-CD19 da invenção podem ter uma constante de afinidade ou Ka (kon/koff) de pelo menos 102 M-1, pelo menos 5 X 102 M-1, pelo menos l03 M-1, pelo menos 5 X 103 M-1, pelo menos 104 M-1, pelo menos 5 X 104 M-1, pelo menos 105 M-1, pelo menos 5 X 105 M-1, pelo menos 106 M-1, pelo menos 5 X 106 M-1, pelo menos 107 M-1, pelo menos 5 X 107 M-1, pelo menos 108 M-1, pelo menos 5 X 108 M-1, pelo menos l09 M-1, pelo menos 5 X l09 M-1, pelo menos 1010 M-1, pelo menos 5 X 1010 M-1, pelo menos 1011 M-1, pelo menos 5 X 1011 M-1, pelo menos 1012 M-1, pelo menos 5 X 1012 M-1, pelo menos 1013 M-1, pelo menos 5 X l013 M-1, pelo menos 1014 M-1, pelo menos 5 X 1014 M-1, pelo menos l015 M-1 ou pelo menos 5 X l015 M-1. Ainda em uma outra forma de realização, um anticorpo anti-CD19 da invenção podem ter uma constante de dissociação ou Kd (koff/kon) de menos do que 5 x 10-2 M, menos do que 10-2 M, menos do que 5 x 10-3 M, menos do que l0-3 M, menos do que 5 x 10-4 M, menos do que 10-4 M, menos do que 5 x 10-5 M, menos do que 10-5 M, menos do que 5 x 10-6 M, menos do que 10-6 M, menos do que 5 x 10-7 M, menos do que 10-7 M, menos do que 5 x 10-8 M, menos do que 10-8 M, menos do que 5xl0-9 M, menos do que l0-9 M, menos do que 5 x 10-10 M, menos do que 10-10 M, menos do que 5 x 10-11 M, menos do que 10-11 M, menos do que 5 x 10-12 M, menos do que 10-12 M, menos do que 5 x 10-13 M, menos do que l0-13 M, menos do que 5 x 10-14 M, menos do que 10-14 M, menos do que 5xl0-15 M ou menos do que l0-15 M.

[00153] Em uma forma de realização, um anticorpo da invenção usada de acordo com um método descrito neste pode ligar-se imunoespecificamente ao CD19 humano e podem ter uma constante de dissociação (Kd) de menos do que 3000 pM, menos do que 2500 pM, menos do que 2000 pM, menos do que 1500 pM, menos do que 1000 pM, menos do que 750 pM, menos do que 500 pM, menos do que 250 pM, menos do que 200 pM, menos do que 150 pM, menos do que 100 pM, menos do que 75 pM como estimado usando-se um método descrito neste ou conhecido por uma pessoa habilitada na técnica (por exemplo, um ensaio BIAcore, ELISA) (Biacore International AB, Uppsala, Sweden). Em uma forma de realização específica, um anticorpo da invenção usado de acordo com um método descrito neste pode ligar-se imunoespecificamente ao antígeno de CD19 humano e podem ter uma constante de dissociação (Kd) entre 25 e 3400 pM, 25 to 3000 pM, 25 e 2500 pM, 25 e 2000 pM, 25 e 1500 pM, 25 e 1000 pM, 25 e 750 pM, 25 e 500 pM, 25 e 250 pM, 25 e 100 pM, 25 e 75 pM, 25 e 50 pM como estimado usando-se um método descrito neste ou conhecido por uma pessoa habilitada na técnica (por exemplo, um ensaio BIAcore, ELISA). Em uma outra forma de realização, um anticorpo anti-CD19 da invenção usado de acordo com um método descrito neste pode ligar-se imunoespecificamente ao hCD19 e podem ter uma constante de dissociação (Kd) de 500 pM, 100 pM, 75 pM ou 50 pM como estimado usando-se um método descrito neste ou conhecido por uma pessoa habilitada na técnica (por exemplo, um ensaio BIAcore, ELISA).

[00154] A invenção ainda fornece polinucleotídeos que compreende uma sequência de nucleotídeo que codifica um anticorpo anti-CD19 humano, humanizado ou quimérico descrito neste ou fragmentos destes. A invenção também abrange polinucleotídeos que hibridizam- se sob condições de hibridização estringentes ou com estringência inferior, por exemplo, como definido neste, polinucleotídeos que codificam um anticorpo humano, humanizado ou quimérico descrito neste que ligam-se a hCD19.

[00155] As condições de hibridização estringente incluem, mas não limitam-se a, hibridização ao DNA ligado por filtro em 6X de cloreto de sódio/citrato de sódio (SSC) em torno de 45° C seguido por uma ou mais lavagens com 0,2X de SSC/0,1 % de SDS em torno de 50 a 65° C, condições altamente estringentes, tais como hibridização ao DNA ligado por filtro em 6X de SSC em torno de 45° C seguido por uma ou mais lavagens em 0,1X SSC/0,2 % de SDS em torno de 60° C ou quaisquer outras condições de hibridização estringentes conhecido por aqueles habilitados na técnica (ver, por exemplo, Ausubel, F.M. et al., eds. 1989 Current Protocols in Molecular Biology, vol. 1, Green Publishing Associates, Inc. and John Wiley and Sons, Inc., NY nas páginas 6.3.1 a 6.3.6 e 2.10.3).

[00156] Os polinucleotídeos podem ser obtidos e a sequência de nucleotídeo dos polinucleotídeos determinados, por qualquer método conhecido na técnica. Por exemplo, se a sequência de nucleotídeo do anticorpo for conhecida, um polinucleotídeo que codifica o anticorpo pode ser montado a partir de oligonucleotídeos quimicamente sintetizados (por exemplo, como descrito em Kutmeier et al., BioTechniques 17:242 (1994)), que, resumindamente, envolve a síntese de que sobrepõe oligonucleotídeos contendo porções da sequência que codifica o anticorpo, recozimento e ligação daqueles oligonucleotídeos e então a amplificação dos oligonucleotídeos ligados por PCR.

[00157] A polinucleotídeo que codifica um anticorpo também pode ser gerado a partir do ácido nucléico de uma fonte adequada. Se um clone contendo um ácido nucléico que codifica um anticorpo particular não está disponível, mas a sequência da molécula de anticorpo é conhecida, um ácido nucléico que codifica a imunoglobulina pode ser quimicamente sintetizado ou obtido a partir de uma fonte adequada de uma fonte adequada (por exemplo, uma biblioteca de cDNA de anticorpo ou uma biblioteca de cDNA gerada de ou ácido nucléico, preferivelmente polyA+RNA, isolado de, quaisquer tecidos ou células que expressam o anticorpo, tais como células de hibridoma para expressar um anticorpo) por amplificação de PCR usando-se iniciadores sintéticos hibridizáveis às extremidades 3' e 5' da sequência ou pela clonagem usando-se uma sonda de oligonucleotídeo para a sequência de gene particular para identificar, por exemplo, um clone de cDNA de uma biblioteca de cDNA que codifica o anticorpo. Os ácidos nucléicos amplificados gerados por PCR podem ser então clonados nos vetores de clonagem replicáveis usando-se quaisquer métodos bem conhecidos na técnica.

[00158] A presente invenção também fornece sequências de polinucleotídeo que codificam as regiões de estrutura VH e VK e CDRs de anticorpos descritos neste bem como vetores de expressão para a sua expressão eficiente em células de mamíferos.

[00159] A presente invenção ainda fornece anticorpos que podem esgotar eficientemente as células B que expressa uma molécula recombinante de CD19 humana em um sistema de modelo de camundongo transgênico hCD19 (ver, Yazawa et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 102(42):15178-83 (2005)). Em uma forma de realização específica, um anticorpo anti-CD-19 da invenção pode atingir a depleção da célula B que é pelo menos 20 %, pelo menos 30 %, pelo menos 40 %, pelo menos 50 %, pelo menos 60 %, pelo menos 70 %, pelo menos 80 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou pelo menos 100 % da depleção atingida pelo anticorpo HB12B monoclonal. Em uma forma de realização adicional, um anticorpo anti-CD19 da invenção pode atingir a depleção de célula B que é mais completa do que a depleção atingida pelo anticorpo HB12B. Em uma forma de realização, um anticorpo anti-CD19 da invenção pode esgotar as células B circulantes, as células B sanguíneas, células B esplênicas, células B de zona marginal, células B foliculares, células B peritoneais e/ou células B de medula óssea. Em uma forma de realização, um anticorpo anti-CD19 da invenção pode atingir uma depleção de células B progenitoras, as células pró-B precoces, células pró-B tardias, células pré-B grandes, células pré-B pequenas, célula B imaturas, células B maduras, células B estimuladas por antígeno e/ou células de plasma. Em uma forma de realização, depleção de célula B por um anticorpo anti-CD19 da invenção podem persistir por pelo menos 1 dia, pelo menos 2 dias, pelo menos 3 dias, pelo menos 4 dias, pelo menos 5 dias pelo menos 6 dias, pelo menos 7 dias, pelo menos 8 dias, pelo menos 9 dias, pelo menos 10 dias, pelo menos 15 dias, pelo menos 20 dias, pelo menos 25 dias ou pelo menos 30 dias. Em uma outra forma de realização, depleção de célula B por um anticorpo anti-CD19 da invenção pode persistir por pelo menos 1 semana, pelo menos 2 semanas, pelo menos 3 semanas, pelo menos 4 semanas, pelo menos 5 semanas, pelo menos 6 semanas, pelo menos 7 semanas, pelo menos 8 semanas, pelo menos 9 semanas ou pelo menos 10 semanas. Em uma forma de realização adicional, depleção de célula B por um anticorpo anti-CD19 da invenção pode persistir por pelo menos 1 mês, pelo menos 2 meses, pelo menos 3 meses, pelo menos 4 meses, pelo menos 5 meses, pelo menos 6 meses, pelo menos 7 meses, pelo menos 8 meses, pelo menos 9 meses, pelo menos 10 meses, pelo menos 11 meses ou pelo menos 12 meses.

[00160] A presente invenção também fornece anticorpos eu esgota eficazmente as células B em um paciente humano. Em uma forma de realização específica, um anticorpo anti-CD-19 da invenção pode atingir a pelo menos cerca de 20 %, pelo menos cerca de 30 %, pelo menos cerca de 40 %, pelo menos cerca de 50 %, pelo menos cerca de 60 %, pelo menos cerca de 70 %, pelo menos cerca de 80 %, pelo menos cerca de 90 %, pelo menos cerca de 95 % ou cerca de 100 % depleção de célula B. Em uma outra forma de realização, um anticorpo anti-CD19 da invenção pode esgotar as sub-séries de célula B em um paciente humano.

[00161] Em uma forma de realização específica, um anticorpo anti- CD19 da invenção pode esgotar as células B circulantes, células B sanguíneas, células B esplênicas, células B de zona marginal, células B foliculares, células B peritoneais e/ou células B de medula óssea. O CD19 está presente na superfície de células B em todos os estágios de desenvolvimento. Um anticorpo anti-CD19 portanto, pode esgotar células B de todos os estágios de desenvolvimento. Em uma forma de realização específica, um anticorpo anti-CD19 da invenção pode atingir uma depleção de células B progenitoras, célula pró-B precursoras, células pró-B posteriores, célula pré-B grandes, células pré-B pequenas, células B imaturas, células B maduras, células B estimuladas por antígeno e/ou células de plasma. A depleção de células B pode persistir por períodos estendidos de tempo. Em uma forma de realização, depleção de célula B por um anticorpo anti-CD19 da invenção pode persistir por pelo menos 1 dia, pelo menos 2 dias, pelo menos 3 dias, pelo menos 4 dias, pelo menos 5 dias pelo menos 6 dias, pelo menos 7 dias, pelo menos 8 dias, pelo menos 9 dias, pelo menos 10 dias, pelo menos 15 dias, pelo menos 20 dias, pelo menos 25 dias ou pelo menos 30 dias. Em uma outra forma de realização, depleção de célula B por um anticorpo anti-CD19 da invenção pode persistir por pelo menos 1 semana, pelo menos 2 semanas, pelo menos 3 semanas, pelo menos 4 semanas, pelo menos 5 semanas, pelo menos 6 semanas, pelo menos 7 semanas, pelo menos 8 semanas, pelo menos 9 semanas ou pelo menos 10 semanas. Em uma forma de realização adicional, depleção de célula B por um anticorpo anti-CD19 da invenção pode persistir por pelo menos 1 mês, pelo menos 2 meses, pelo menos 3 meses, pelo menos 4 meses, pelo menos 5 meses, pelo menos 6 meses, pelo menos 7 meses, pelo menos 8 meses, pelo menos 9 meses, pelo menos 10 meses, pelo menos 11 meses ou pelo menos 12 meses. Em uma forma de realização, um anticorpo anti-CD19 da invenção esgota pelo menos cerca de 20 %, pelo menos cerca de 30 %, pelo menos cerca de 40 %, pelo menos cerca de 50 %, pelo menos cerca de 60 %, pelo menos cerca de 70 %, pelo menos cerca de 80 %, pelo menos cerca de 90 %, pelo menos cerca de 95 % ou cerca de 100 % de células B circulantes. Em uma forma de realização, um anticorpo anti-CD19 da invenção esgota pelo menos cerca de 20 %, pelo menos cerca de 30 %, pelo menos cerca de 40 %, pelo menos cerca de 50 %, pelo menos cerca de 60 %, pelo menos cerca de 70 %, pelo menos cerca de 80 %, pelo menos cerca de 90 %, pelo menos cerca de 95 % ou cerca de 100 % de células B sanguíneas. Em uma forma de realização, um anticorpo anti-CD19 da invenção esgota pelo menos cerca de 20 %, pelo menos cerca de 30 %, pelo menos cerca de 40 %, pelo menos cerca de 50 %, pelo menos cerca de 60 %, pelo menos cerca de 70 %, pelo menos cerca de 80 %, pelo menos cerca de 90 %, pelo menos cerca de 95 % ou cerca de 100 % de células B esplênicas. Em uma forma de realização, um anticorpo anti-CD19 da invenção esgota pelo menos cerca de 20 %, pelo menos cerca de 30 %, pelo menos cerca de 40 %, pelo menos cerca de 50 %, pelo menos cerca de 60 %, pelo menos cerca de 70 %, pelo menos cerca de 80 %, pelo menos cerca de 90 %, pelo menos cerca de 95 % ou cerca de 100 % de células B de zona marginal. Em uma forma de realização, um anticorpo anti-CD19 da invenção esgota pelo menos cerca de 20 %, pelo menos cerca de 30 %, pelo menos cerca de 40 %, pelo menos cerca de 50 %, pelo menos cerca de 60 %, pelo menos cerca de 70 %, pelo menos cerca de 80 %, pelo menos cerca de 90 %, pelo menos cerca de 95 % ou cerca de 100 % de células B foliculares. Em uma forma de realização, um anticorpo anti-CD19 da invenção esgota pelo menos cerca de 20 %, pelo menos cerca de 30 %, pelo menos cerca de 40 %, pelo menos cerca de 50 %, pelo menos cerca de 60 %, pelo menos cerca de 70 %, pelo menos cerca de 80 %, pelo menos cerca de 90 %, pelo menos cerca de 95 % ou cerca de 100 % de células B peritoneais. Em uma forma de realização, um anticorpo anti-CD19 da invenção esgota pelo menos cerca de 20 %, pelo menos cerca de 30 %, pelo menos cerca de 40 %, pelo menos cerca de 50 %, pelo menos cerca de 60 %, pelo menos cerca de 70 %, pelo menos cerca de 80 %, pelo menos cerca de 90 %, pelo menos cerca de 95 % ou cerca de 100 % de células B de medula óssea. Em uma forma de realização, um anticorpo anti- CD19 da invenção esgota pelo menos cerca de 20 %, pelo menos cerca de 30 %, pelo menos cerca de 40 %, pelo menos cerca de 50 %, pelo menos cerca de 60 %, pelo menos cerca de 70 %, pelo menos cerca de 80 %, pelo menos cerca de 90 %, pelo menos cerca de 95 % ou cerca de 100 % de células B progenitoras. Em uma forma de realização, um anticorpo anti-CD19 da invenção esgota pelo menos cerca de 20 %, pelo menos cerca de 30 %, pelo menos cerca de 40 %, pelo menos cerca de 50 %, pelo menos cerca de 60 %, pelo menos cerca de 70 %, pelo menos cerca de 80 %, pelo menos cerca de 90 %, pelo menos cerca de 95 % ou cerca de 100 % de células pró-B precoces. Em uma forma de realização, um anticorpo anti-CD19 da invenção esgota pelo menos cerca de 20 %, pelo menos cerca de 30 %, pelo menos cerca de 40 %, pelo menos cerca de 50 %, pelo menos cerca de 60 %, pelo menos cerca de 70 %, pelo menos cerca de 80 %, pelo menos cerca de 90 %, pelo menos cerca de 95 % ou cerca de 100 % de células pró-B posteriores. Em uma forma de realização, um anticorpo anti-CD19 da invenção esgota pelo menos cerca de 20 %, pelo menos cerca de 30 %, pelo menos cerca de 40 %, pelo menos cerca de 50 %, pelo menos cerca de 60 %, pelo menos cerca de 70 %, pelo menos cerca de 80 %, pelo menos cerca de 90 %, pelo menos cerca de 95 % ou cerca de 100 % de células pré-B grandes. Em uma forma de realização, um anticorpo anti-CD19 da invenção esgota pelo menos cerca de 20 %, pelo menos cerca de 30 %, pelo menos cerca de 40 %, pelo menos cerca de 50 %, pelo menos cerca de 60 %, pelo menos cerca de 70 %, pelo menos cerca de 80 %, pelo menos cerca de 90 %, pelo menos cerca de 95 % ou cerca de 100 % de células pré- B pequenas. Em uma forma de realização, um anticorpo anti-CD19 da invenção esgota pelo menos cerca de 20 %, pelo menos cerca de 30 %, pelo menos cerca de 40 %, pelo menos cerca de 50 %, pelo menos cerca de 60 %, pelo menos cerca de 70 %, pelo menos cerca de 80 %, pelo menos cerca de 90 %, pelo menos cerca de 95 % ou cerca de 100 % de células B imaturas. Em uma forma de realização, um anticorpo anti-CD19 da invenção esgota pelo menos cerca de 20 %, pelo menos cerca de 30 %, pelo menos cerca de 40 %, pelo menos cerca de 50 %, pelo menos cerca de 60 %, pelo menos cerca de 70 %, pelo menos cerca de 80 %, pelo menos cerca de 90 %, pelo menos cerca de 95 % ou cerca de 100 % de células B maduras. Em uma forma de realização, um anticorpo anti-CD19 da invenção esgota pelo menos cerca de 20 %, pelo menos cerca de 30 %, pelo menos cerca de 40 %, pelo menos cerca de 50 %, pelo menos cerca de 60 %, pelo menos cerca de 70 %, pelo menos cerca de 80 %, pelo menos cerca de 90 %, pelo menos cerca de 95 % ou cerca de 100 % de células B estimuladas por antígeno. Em uma forma de realização, um anticorpo anti-CD19 da invenção esgota pelo menos cerca de 20 %, pelo menos cerca de 30 %, pelo menos cerca de 40 %, pelo menos cerca de 50 %, pelo menos cerca de 60 %, pelo menos cerca de 70 %, pelo menos cerca de 80 %, pelo menos cerca de 90 %, pelo menos cerca de 95 % ou cerca de 100 % de células de plasma. A depleção de células B pode persistir por períodos estendidos de tempo. Em uma forma de realização, depleção de célula B por um anticorpo anti-CD19 da invenção pode persistir por pelo menos 1 dia, pelo menos 2 dias, pelo menos 3 dias, pelo menos 4 dias, pelo menos 5 dias pelo menos 6 dias, pelo menos 7 dias, pelo menos 8 dias, pelo menos 9 dias, pelo menos 10 dias, pelo menos 15 dias, pelo menos 20 dias, pelo menos 25 dias ou pelo menos 30 dias. Em uma outra forma de realização, depleção de célula B por um anticorpo anti-CD19 da invenção pode persistir por pelo menos 1 semana, pelo menos 2 semanas, pelo menos 3 semanas, pelo menos 4 semanas, pelo menos 5 semanas, pelo menos 6 semanas, pelo menos 7 semanas, pelo menos 8 semanas, pelo menos 9 semanas ou pelo menos 10 semanas. Em uma forma de realização adicional, a depleção de célula B por um anticorpo anti-CD19 da invenção pode persistir por pelo menos 1 mês, pelo menos 2 meses, pelo menos 3 meses, pelo menos 4 meses, pelo menos 5 meses, pelo menos 6 meses, pelo menos 7 meses, pelo menos 8 meses, pelo menos 9 meses, pelo menos 10 meses, pelo menos 11 meses ou pelo menos 12 meses.

[00162] As malignidades de célula B são caracterizados pela expansão patológica de sub-séries de célula B específicas, por exemplo, leucemia linfoblástica aguda de célula B precursora são caracterizadas pela expansão anormal de células B que correspondem aos estágios de desenvolvimento de célula pró-B/pré-B. As células B malignas mantém a expressão da superfície celular de marcadores celulares normais, tais CD19. Um anticorpo anti-CD19 portanto, pode esgotar as células B malignas em um paciente humano. Em uma forma de realização específica, um anticorpo anti-CD19 da invenção pode atingir pelo menos 20 %, pelo menos 30 %, pelo menos 40 %, pelo menos 50 %, pelo menos 60 %, pelo menos 70 %, pelo menos 80 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou pelo menos 100 % de depleção de células B malignas em um paciente humano.

[00163] Em uma forma de realização, um anticorpo anti-CD19 humanizado descrito neste media a citotoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC), a citotoxicidade mediada por célula dependente de complemento (CDC) e/ou apoptose. Em uma forma de realização, um anticorpo anti-CD19 humanizado da invenção media a citotoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC) e/ou apoptose. Em uma forma de realização, um anticorpo anti-CD19 da invenção intensificou a citotoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC). Em uma forma de realização, um anticorpo anti-CD19 da invenção compreende uma região de Fc variante que media a citotoxicidade celular intensificada dependente de anticorpo (ADCC). Em uma forma de realização, um anticorpo anti-CD19 da invenção compreende uma região Fc tendo as cadeias de açúcar ligadas por N-glicosídeo complexas ligadas a Asn297 em que a fucose não é ligada à N- acetilglucosamina na extremidade redutora, em que a dita região Fc media a citotoxicidade celular intensificada dependente de anticorpo (ADCC).

[00164] A presente invenção ainda fornece anticorpos anti-CD19 que podem inibir eficazmente a proliferação de célula B estimulada in vitro. A proliferação de células B periféricas isoladas pode ser induzida por vários estímulos, por exemplo, mas não limitado ao estímulo pelo anticorpo anti-IgM, CD40 ou CpG. Estes estímulos podem ser liberados sozinhos ou em combinação um com o outro.

[00165] Em uma forma de realização, um anticorpo anti-CD19 da invenção inibe a proliferação de célula B estimulada in vitro. Em uma outra forma de realização, um anticorpo anti-CD19 descrito neste inibe a proliferação de célula B in vitro induzida por estímulo de anti- IgM/CpG ou anti-IgM/CD40. Em uma forma de realização, um anticorpo anti-CD19 da invenção inibe a proliferação de célula B estimulada in vitro por pelo menos cerca de 10 %, pelo menos cerca de 20 %, pelo menos cerca de 30 %, pelo menos cerca de 40 %, pelo menos cerca de 50 % ou pelo menos cerca de 75 %.

[00166] Em uma forma de realização, um anticorpo variante de Fc anti-CD19 da invenção inibe a proliferação de célula B in vitro induzida por estímulo de anti-IgM/CpG ou anti-IgM/CD40, em que a dita variante de Fc alterou a afinidade de ligação a um ou mais ligandos de Fc com relação a uma molécula não variante comparável. Em uma forma de realização específica, um anticorpo variante de Fc anti-CD19 da invenção inibe a proliferação de célula B in vitro induzida por estímulo de anti-IgM/CpG ou anti-IgM/CD40, em que a dita variante de Fc intensificou a ligação ao receptor gama Fc IIB com relação a um domínio Fc não variante comparável. Em uma outra forma de realização específica, um anticorpo variante de Fc anti-CD19 da invenção inibe a proliferação de célula B estimulada in vitro por pelo menos cerca de 10 %, pelo menos cerca de 20 %, pelo menos cerca de 30 %, pelo menos cerca de 40 %, pelo menos cerca de 50 % ou pelo menos cerca de 75 %. Em uma outra forma de realização, um anticorpo variante de Fc anti-CD19 da invenção inibe a proliferação de célula B estimulada in vitro, em que o dito domínio de variante Fc tem uma afinidade ao receptor gama Fc IIB que é pelo menos 2 vezes ou pelo menos 3 vezes ou pelo menos 5 vezes ou pelo menos 7 vezes ou pelo menos 10 vezes ou pelo menos 20 vezes ou pelo menos 30 vezes ou pelo menos 40 vezes ou pelo menos 50 vezes ou pelo menos 60 vezes ou pelo menos 70 vezes ou pelo menos 80 vezes ou pelo menos 90 vezes ou pelo menos 100 vezes ou pelo menos 200 vezes maior do que aquela de um domínio Fc não variante comparável.

[00167] A presente invenção também diz respeito a um método para tratar uma malignidade de célula B em um ser humano que compreende administrar a um ser humano em necessidade deste, um anticorpo anti-CD19 humano, humanizado ou quimérico que pode mediar a citotoxicidade celular dependente de anticorpo humano (ADCC), citotoxicidade mediada por célula dependente de complemento (CDC), e/ou apoptose em uma quantidade suficiente para esgotar as células B circulantes. Em um aspecto particular, a presente invenção também diz respeito a métodos de tratar uma malignidade de célula B em um ser humano que compreende a administração de um regime terapeuticamente eficaz de um anticorpo anti-CD19 humano, humanizado ou quimérico, que é do Isotipo humano IgG1 ou IgG3.

[00168] A presente invenção ainda diz respeito a um método para tratar uma doença ou distúrbio automimune em um ser humano que compreende administrar a um ser humano em necessidade deste um anticorpo anti-CD19 humano, humanizado ou quimérico que pode mediar ADCC, CDC, e/ou apoptose humanas em uma quantidade suficiente para esgotar as células B circulantes. A presente invenção também diz respeito a métodos de tratar distúrbios autoimunes que compreendem a administração de um regime terapeuticamente eficaz de um anticorpo anti-CD19 humano, humanizado ou quimérico que é do isotipo humano IgG1 ou IgG3.

[00169] A presente invenção também fornece métodos para tratar ou prevenir a rejeição humoral em um receptor de transplante humano em necessidade deste que compreende administrar ao receptor um anticorpo anti-CD19 humano, humanizado ou quimérico da invenção em uma quantidade que pode esgotar as células B circulantes ou imunoglobulina circulante ou ambos. Em outras formas de realização, a invenção fornece métodos para prevenir a rejeição a enxerto ou a doença enxerto versus hospedeiro em um receptor de transplante humano em necessidade deste que compreende contatar um enxerto antes do transplante com uma quantidade de um anticorpo anti-CD19 humano, humanizado ou quimérico que pode esgotar as células B do enxerto.

5.2. PRODUÇÃO DE ANTICORPOS ANTI-CD19 HUMANIZADOS

[00170] Os anticorpos humanizados descrito neste podem ser produzidos usando-se uma variedade de técnicas conhecidas na técnica, que inclui, mas não limita-se a, enxerto de CDR (ver, por exemplo, Patente Européia N° EP 239,400; Publicação Internacional N° WO 91/09967 e Patente U. S. N° 5.225.539, 5.530.101 e 5.585.089, cada um dos quais é incorporado neste em sua totalidade por referência), polindo-se ou dando-se nova superfície (ver, por exemplo, Patente européia N° EP 592.106 e EP 519.596; Padlan, 1991, Molecular Immunology 28(4/5):489-498; Studnicka et al., 1994, Protein Engineering, 7(6):805-814 e Roguska et al., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. , 91:969-973, cada um dos quais é incorporado neste em sua totalidade por referência), mudança de cadeia (ver, por exemplo, Patente U. S. N° 5,565,332, que é incorporada neste em sua totalidade por referência) e técnicas divulgadas em, por exemplo, Patente U. S. N° 6.407.213, Patente U. S. N° 5.766.886, Publicação Internacional N° WO 9317105, Tan et al., J. Immunol., 169:1119-25 (2002), Caldas et al., Protein Eng., 13(5):353-60 (2000), Morea et al., Methods, 20(3):267-79 (2000), Baca et al., J. Biol. Chem., 272(16):10678-84 (1997), Roguska et al., Protein Eng., 9(10):895-904 (1996), Couto et al., Cancer Res., 55 (23 Supp):5973s-5977s (1995), Couto et al., Cancer Res., 55(8):1717-22 (1995), Sandhu JS, Gene, 150(2):409-10 (1994) e Pedersen et al., J. Mol. Biol., 235(3):959-73 (1994), cada um dos quais é incorporado neste em sua totalidade por referência. Frequentemente, os resíduos de FW nas regiões FW serão substituídos com o resíduo correspondente do anticorpo doador de CDR para alterar, preferivelmente, melhorar a ligação de antígeno. Estas substituições de FW são identificadas por métodos bem conhecidos na técnica, por exemplo, pela modelagem das interações dos resíduos de CDR e FW para identificar os resíduos de FW importantes para a ligação de antígeno e comparação de sequência para identificar resíduos FW não usuais em posições particulares. (ver, por exemplo, Queen et al., Patente U. S. N° 5,585,089 e Riechmann et al., 1988, Nature, 332:323, que são incorporados neste por referência em suas totalidades).

[00171] Um anticorpo anti-CD19 humanizado tem um ou mais resíduos de aminoácido introduzido neste a partir de uma fonte que é não humana. Estes resíduos de aminoácido não humanos são frequentemente referidos como resíduos de “importação”, que são tipicamente retirados de um domínio variável de “importação”. Desta maneira, os anticorpos humanizados compreendem um ou mais CDRs de moléculas de imunoglobulina não humanas e regiões de estrutura humanas. A humanização de anticorpos é bem conhecida na técnica e pode ser essencialmente realizada seguindo os métodos de Winter e colaboradores (Jones et al., Nature, 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332:323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science, 239:1534-1536 (1988)), substituindo-se as sequências de CDRs ou CDR de roedores para as sequências correspondentes de um anticorpo humano, isto é, enxerto de CDR (EP 239.400; Publicação PCT N° WO 91/09967 e Patente U. S. N° 4.816.567; 6.331.415; 5.225.539; 5.530.101; 5.585.089; 6.548.640, cujos conteúdos são incorporados por referência em sua totalidade). Em tais anticorpos quiméricos humanizados, substancialmente menos do que um domínio variável humano intacto foi substituído pela sequência correspondente de uma espécie não humana. Na prática, os anticorpos humanizados são tipicamente anticorpos humanos em que alguns resíduos de CDR e possivelmente alguns resíduos de FW são substituídos por resíduos a partir de locais análogos em anticorpos de roedores. A humanização de anticorpos anti-CD19 também pode ser atingida polindo-se ou dando-se nova superfície (EP 592,106; EP 519,596; Padlan, 1991, Molecular Immunology 28(4/5):489-498; Studnicka et al., Protein Engineering, 7(6):805-814 (1994) e Roguska et al., Proc. Natl. Acad. Sci. , 91:969-973 (1994)) ou mudança de cadeia (Patente U. S. N° 5,565,332), cujos conteúdos são incorporados neste por referência em sua totalidade.

[00172] A escolha de domínios variáveis humanos, tanto leve quanto pesado, a serem usados na fabricação dos anticorpos humanizados deve reduzir a antigenicidade. De acordo com o método denominado “melhor-ajuste”, a sequência do domínio variável de um anticorpo de roedor e avaliado contra a biblioteca inteira de sequências de domínio variável humanas conhecidas. As sequências humanas que estão mais intimamente relacionadas àquela dos roedores são avaliadas quanto às presenças de resíduos específicos que pdoem ser críticos para a ligação do antígeno, formação estrutural e/ou estabilidade apropriada do mAb humanizado pretendido (Sims et al., J. Immunol., 151:2296 (1993); Chothia et al., J. Mol. Biol., 196:901 (1987), cujos conteúdos são incorporados neste por referência em sua totalidade). As sequências FW resultantes que comparam os critérios desejados devem ser usados como as regiões doadoras de FW humanas para o anticorpo humanizado.

[00173] Um outro método usa um FW particular derivado da sequência de consenso de todos os anticorpos humanos de um subgrupo particular particular de cadeias leves ou pesadas. O mesmo FW pode ser usado para diversos anticorpos humanizados anti-CD19 diferentes (Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992); Presta et al., J. Immunol., 151:2623 (1993), cujos conteúdos são incorporados neste por referência em sua totalidade).

[00174] Anticorpos anti-CD19 podem ser humanizados com retenção de afinidade alta para CD19 e outras propriedades biológicas favoráveis. De acordo com um aspecto da invenção, os anticorpos humanizados são preparados por um processo de análise das sequências precursoras e vários produtos humanizados conceituais usando-se modelos tridimensionais das sequências parentais e humanizadas. Modelos de imunoglobulina tridimensionais estão comumente disponíveis e são familiares para aqueles habilitados na técnica. Os programas de computador que estão disponíveis ilustram e apresentam as estruturas conformacionais tridimensionais prováveis de sequências de imunoglobulina candidatas selecionadas. A inspeção destas apresentações permite a análise do papel provável dos resíduos no funcionamento da sequência de imunoglobulina candidata, isto é, a análise de resíduos que influenciam a capacidade da imunoglobulina candidata ligar a CD19. Desta maneira, os resíduos de FW também podem ser selecionados e combinados a partir das sequências reeptoras e de importação de modo que a característica de anticorpo desejada, por exemplo, afinidade à CD19, seja atingida. No geral, os resíduos de CDR estão diretamente e mais substancialmente envolvidos na influência da ligação de antígeno.

[00175] Um anticorpo “humanizado” pode reter uma especificidade antigênica similar como o anticorpo original, isto é, na presente invenção, a capacidade de ligar o antígeno de CD19 humano. Entretanto, usando-se certos métodos de imunização, a afinidade e/ou especifidade de ligação do anticorpo ao antígeno de CD19 humano podem ser alterados usando-se métodos de “evolução direcionada,” como descrito por Wu et al., J. Mol. Biol., 294:151 (1999), cujos conteúdos são incorporados neste por referência em sua totalidade.

[00176] Os anticorpos humanizados anti-CD19 descritos nestes podem ser construídos pela seleção de regiões de estrutura humanas distintas para o enxerto das regiçoes determinadoras de complementaridade de HB12A ou HB12B ou “CDR’s” como descrito nas seções que seguem. A invenção abrange diversas versões humanizadas do camundongo HB12A e do anticorpo HB12B bem como versões quiméricas, denominadas chHB12A e chHB12B.

5.3. ANTICORPOS MONOCLONAIS ANTI-CD19

[00177] Um anticorpo anti-CD19 monoclonal apresenta especificidade de ligação ao antígeno de CD19 humano e pode mediar os mecanismos de ADCC, CDC e/ou apoptóticos humanos. Um tal anticorpo pode ser gerado usando-se uam ampla variedade de técnicas conhecidas na técnica que inclui o uso de hibridoma, recombinante e tecnologias de apresentação de fago ou uma combinação destes. Os anticorpos são altamente específicos sendo direcionados contra um local antigênico simples. Um anticorpo anti- CD19 projetado podem ser produzido por quaisquer meios conhecidos na técnica, que inclui, mas não limita-se àquelas técnicas descritas abaixo e melhoras daquelas técnicas. A produção de rendimento alto em grande escala, tipicamente, envolve cultivar uma célula hospedeira que produz o anticorpo anti-CD19 projetado e recuperação do anticorpo anti-CD19 da cultura de célula hospedeira.

5.3.1. TÉCNICA DE HIBRIDOMA

[00178] Os anticorpo monoclonais podem ser produzidos usando-se técnicas de hibridoma que incluem aqueles conhecidos na técnica e explicados, por exemplo, em Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed. 1988); Hammerling et al., in Antibodies monoclonals and T Cell Hybridomas, 563-681 (Elsevier, N.Y., 1981) (ditas referências incorpoadas neste por referência em suas totalidades). Por exemplo, no método do hibridoma, um camundongo ou outro animal hospedeiro apropriado, tal como um hamster ou um macaco, é imunizado para evocar os linfócitos que produzem ou que são capazes de produzir anticorpos que ligar-se-ão especificamente à proteína usada para a imunização. Os linfócitos também podem ser imunizados in vitro. Os linfócitos então, são fundidos com células de mieloma usando-se um agente de fusão adequado, tal como polietileno glicol, para a formação de uma célula de hibridoma (Goding, Antibody monoclonals: Principles and Practice, pp. 59-103 (Academic Press, 1986)).

[00179] As células de hibridoma preparadas desta maneira são semeadas e desenvolvidas em um meio de cultura adequado que contém uma ou mais substâncias que inibem o desenvolvimento ou a sobrevivência das células de mieloma precursoras não fundidas. Por exemplo, se as células de mieloma precursoras perdem a enzima hipoxantina guanina fosforibosil transferase (HGPRT ou HPRT), o meio de cultura para os hibridomas tipicamente incluirão hipoxantina, aminopterina e timidina (meio HAT), cujas substâncias evitam o desenvolvimento de células deficientes em HGPRT.

[00180] As formas de realização específicas utilizam células de mieloma que fundem-se eficazmente, suportam produção de alto nível estável de anticorpo pelas células produtoras de anticorpo selecionadas e são sensíveis a um meio tal como o meio HAT. Entre estas linhas celulares de mieloma são linhas de mieloma de murino, tais como aquelas derivadas de tumores de camundongo MOPC-21 e MPC-11 disponíveis da Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, CA, USA e células SP-2 ou X63-Ag8.653 disponíveis da American Type Culture Collection, Rockville, MD, USA. As linhas celulares de mieloma humano e de heteromieloma de camundongo- humano também foram descritas para a produção de anticorpos monoclonais humanos (Kozbor, J. Immunol., 133:3001 (1984); Brodeur et al., Antibody monoclonal Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987)).

[00181] O meio de cultura em que as células de hibridoma estão se desenvolvendo é estimado para a produção de anticorpos monoclonais direcionados contra o antígeno de CD19 humano. A especificidade de ligação de anticorpos monoclonais produzidos por células de hibridoma pode ser determinada por imunoprecipitação ou por um ensaio de ligação, tal como radioimunoensaio (RIA) ou ensaio imunoabsorvente ligado por enzima (ELISA).

[00182] Após as células de hibridoma serem identificadas produzindo anticorpos da especificidade, afinidade e/ou atividade desejadas, os clones podem ser subclonados pela limitação dos procedimentos de diluição e desenvolvidos por métodos padrão (Goding, Antibody monoclonals: Principles and Practice, pp. 59-103 (Academic Press, 1986)). Os meios de cultura adequados para este propósito incluem, por exemplo, meio D-MEM ou RPMI 1640. Além disso, as células de hibridoma podem ser desenvolvidas in vivo como tumores de ascite em um animal.

[00183] Os anticorpos monoclonais secretados pelos subclones são adequadamente operados a partir do meio de cultura, fluido de ascite ou soro pelos procedimentos de purificação de imunoglobulina convencionais, tais como, por exemplo, proteína A-Sepharose, cromatografia de hidroxilapatita, eletroforese em gel, diálise ou cromatografia por afinidade. 5.3.2. TÉCNICAS DE DNA RECOMBINANTES

[00184] O DNA que codifica um anticorpo anti-CD19 descrito neste já é isolado e sequenciado usando-se procedimentos convencionais (por exemplo, usando-se sondas de oligonucleotídeos que são capazes de ligar-se especificamente aos genes que codificam as cadeias pesadas e leves de anticorpos anti-CD19). As células de hibridoma serve como uma fonte de tal DNA. Uma vez isolado, o DNA pode ser colocado em vetores de expressão, que são então transfectados em célula hospedeiras, tais como célula de E. coli, células COS de símio, células de ovário de hamster chinês (CHO) ou células de mieloma que, de outra maneira, não produzem a proteína de imunoglobulina, para obter a síntese de anticorpos anti-CD19 nas células hospedeiras recombinantes.

[00185] Nos métodos de apresentação de fago, os domínios de anticorpo funcionais são apresentados na superfície de partículas de fago que carregam as sequências de polinucleotídeo que os codificam. Em particular, as sequências de DNA que codificam domínios de VH e VL são amplificadas a partir das bibliotecas de cDNA animal (por exemplo, bibliotecas de cDNA humano ou murino de tecidos afetados). O DNA que codifica os domínios de VH e VL são recombinados juntos com um ligador de scFv por PCR e clonado em um vetor de fagomida. O vetor é eletroporado em E. coli e o E. coli é infectado com o fago auxiliar. O fago usado nestes métodos é tipicamente filamentoso incluindo fd e M13 e os domínios VH e VL são, usualmente, fundidos recombinantemente ao gene III ou gene VIII de fago. O fago que expressa um domínio de ligação de antígeno que liga-se a um antígeno particular pode ser selecionado ou identificado com o antígeno, por exemplo, usando-se antígeno rotulado ou antígeno ligado ou capturado a uma superfície sólida ou conta. Os exemplos de métodos que apresentam fagos que pdoem ser usados para a fabricação de anticorpos da presente invenção incluem aqueles divulgados em Brinkman et al., 1995, J. Immunol. Methods, 182:41-50; Ames et al., 1995, J. Immunol. Methods, 184:177-186; Kettleborough et al., 1994, Eur. J. Immunol., 24:952-958; Persic et al., 1997, Gene, 187:9-18; Burton et al., 1994, Advances in Immunology, 57:191-280; Pedido Internacional N° PCT/GB91/O1 134; Publicação Internacional N° WO 90/02809, WO 91/10737, WO 92/01047, WO 92/18619, WO 93/11236, WO 95/15982, WO 95/20401, e WO97/13844 e Patente U. S. N° 5.698.426, 5.223.409, 5.403.484, 5.580.717, 5.427.908, 5.750.753, 5.821.047, 5.571.698, 5.427.908, 5.516.637, 5.780.225, 5.658.727, 5.733.743 e 5.969.108; cada um dos quais é incorporado neste por referência em sua totalidade.

[00186] Como descrito nas referências acima, após a seleção do fago, as regiões codificadoras de anticorpo do fago podem se risoladas e usadas para a geração de anticorpos totais, que incluem anticorpos humanos ou qualquer outro fragmento de ligação de antígeno desejado e expressado em qualquer hospedeiro desejado, incluindo células de mamíferos, células de inseto, células vegetais, levedura e bactérias, por exemplo, como descrito abaixo. As técnicas para produzir recombinantemente fragmentos de Fab, Fab' e F(ab')2 também podem ser utilizadas usando-se métodos conhecidos na técnica tais como aqueles divulgados na Publicação PCT N° WO 92/22324; Mullinax et al., 1992, BioTechniques, 12(6):864-869; Sawai et al., 1995, AJRI, 34:26-34 e Better et al., 1988, Science, 240:10411043 (as ditas referências incorporadas por referência em suas totalidades).

[00187] Os anticorpos podem ser isolados das bibliotecas de fago de anticorpo gerados usando-se as técnicas descritas em McCafferty et al., Nature, 348:552-554 (1990). Clackson et al., Nature, 352:624628 (1991). Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991) descrevem o isolamento de anticorpos murinos e humanos, respectivamente, usando-se bibliotecas de fago. As mudança de cadeia podem ser usadas na produção de anticorpos humanos de afinidade alta (faixa nM) (Marks et al., Bio/Technology, 10:779-783 (1992)), bem como infecção combinatória e recombinação in vivo como uma estratégia para a construção de bibliotecas de fago muito grandes (Waterhouse et al., Nuc. Acids. Res., 21:2265-2266 (1993)). Desta maneira, estas técnicas são alternativas viáveis às técnicas de hibridoma monoclonal de anticorpo tradicional para o isolamento de anticorpos anti-CD19.

[00188] Para gerar anticorpos totais, os iniciadores de PCR que incluem sequências de nucleotídeo VH ou VL, um local de restrição e uma sequência de flanqueamento para proteger o local de restrição pode ser usada para amplificar as sequências de VH ou VL em clones scFv. Utilizando-se as técnicas de clonagem conhecidas por aqueles habilitados na técnica, os domínios VH amplificados por PCR podem ser clonados em vetores que expressam uma região constante de cadeia pesada, por exemplo, a região constante de gama 4 humana e os domínios VL amplificados por PCR podem ser clonados em vetores que expressam uma região constante de cadeia leve, por exemplo, regiões constantes de capa e lambda humanas. Os vetores que expressam os domínios VH ou VL podem compreender um promotor EF-1α, um sinal de secreção, um local de clonagem para o domínio variável, domínios constantes e um marcador de seleção, tal como neomicina. Os domínios VH e VL também podem ser clonados em um vetor que expressa as regiões constantes necessárias. Os vetores de conversão de cadeia pesada e os vetores de conversão de cadeia leve são então co-transfectados em linhas celulares para a geração de linhas celulares estáveis ou transitórias eu expressam os anticorpos de comprimento total, por exemplo, IgG, usando-se técnicas conhecidas por aqueles habilitados na técnica.

[00189] O DNA também pode ser modificado, por exemplo, substituindo-se a sequência codificadora para os domínios contantes de cadeia pesada e leve humanos no lugar das sequências de murino homólogas (Patente U. S. N° 4,816,567; Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851 (1984)) ou pela união covalente à sequência codificadora de imunoglobulina toda ou em parte da sequência codificadora para um polipeptídeo não-imunoglobulina.

5.4. ANTICORPOS QUIMÉRICOS

[00190] Os anticorpos anti-CD19, especificamente aqui, incluem anticorpos quiméricos (imunoglobulinas) em que uma porção da cadeia pesada e/ou leve é idêntica a ou homóloga às sequências correspondentes em anticorpos derivados de uma espécie particular ou que pertence a uma classe ou subclasse de anticorpo particular, enquanto uma outra porção das cadeias é idêntica a ou homóloga a sequências correspondentes em anticorpos derivados de outras espécies ou que pertencem a uma outra classe ou subclasse de anticorpo, bem como fragmentos de tais anticorpos, de modo que estes apresentem a atividade biológica desejada (Patente U. S. N° 4,816,567; Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855 (1984)). Os Anticorpos quiméricos de interesse aqui, incluem anticorpos “primatizados” que compreendem sequências de ligação de antígeno de domínio variável derivado de um primata não humano (por exemplo, Old World Monkey, tais como babuíno, réso ou macaco cinomolgo) e sequências de região constante humanas (Patente U. S. N° 5.693.780).

5.4. ANTICORPOS ALTERADOS/MUTANTES

[00191] Os anticorpos anti-CD19 de composições e métodos descritos neste podem ser anticorpos mutantes. Como usado neste, “anticorpo mutante” ou “anticorpo alterado” refere-se a uma sequência de aminoácido variante de um anticorpo anti-CD19 em que um ou mais dos resíduos de aminoácido de um anticorpo anti-CD19 foi modificado. As modificações para a sequência de aminoácido de um anticorpo anti-CD19 incluem modificações à sequência que pode melhorar a afinidade ou a avidez do anticorpo para seu antígeno e/ou modificações à porção Fc do anticorpo que pode melhorar a função atuadora.

[00192] A presente invenção, portanto, diz respeito a anticorpos anti-CD19 humanos, humanizados e quiméricos divulgados neste, bem como, derivados alterados/mutantes destes, que inclui, mas não limita-se a uns que apresentam características de ligação de CD19 humano alterado; por exemplo, constantes de associação alteradas kON, constantes de dissociação kOFF e/ou constante de equilíbrio ou afinidade de ligação, KD. Em certas formas de realização, o KD de um anticorpo anti-CD19 descrito neste ou um derivado alterado/mutante deste, para CD19 humano pode ser de não mais do que cerca de 106M, 10-7M, 10-8M ou 10-9M. Os métodos e os regentes adequados para a determinação de tais características de ligação de um anticorpo da presente invenção ou um derivado alterado/mutante deste, são conhecidos na técnica e/ou estão comercialmente disponíveis (ver acima e, por exemplo, Patente U. S. N° 6.849.425, Patente U. S. N° 6.632.926, Patente U. S. N° 6.294.391 e Patente U. S. N° 6.143.574, cada um dos quais é incorporado neste por referência em sua totalidade). Além disso, o equipamento e o software projetados para tal análise cinética estão comercialmente disponíveis (por exemplo, Biacore® A100 e Biacore® 2000 instruments; Biacore International AB, Uppsala, Suécia).

[00193] As modificações podem ser feitas de acordo com quaisquer anticorpos anti-CD19 conhecidos ou anticorpos anti-CD19 identificados como descrito neste. Tais anticorpos alterados têm, necessariamente menos do que 100 % de identidade ou similaridade de sequência com um anticorpo anti-CD19 conhecido. Por meio de exemplo, um anticorpos alterado pode ter uma sequência de aminoácido eu está dentro da faixa de cerca de 25 % a cerca de 95 % idêntico ou similar à sequência de aminoácido da do domínio variável de cadeia pesada ou leve de um anticorpo anti-CD19 como descrito neste. Um anticorpos alterado pode ter uma sequência de aminoácido tendo pelo menos 25 %, 35 %, 45 %, 55 %, 65 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 % ou 95 % de identidade ou similaridade de sequência de aminoácido com uma sequência de aminoácido do domínio variável de cadeia pesada ou leve de um anticorpo anti-CD19 como descrito neste. Em uma outra forma de realização, um anticorpo alterado podem ter uma sequência de aminoácido tendo pelo menos 25 %, 35 %, 45 %, 55 %, 65 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 % ou 95 % de identidade ou similaridade de sequência de aminoácido com a sequência de aminoácido do CDR1, CDR2 ou CDR3 de cadeia pesada de um anticorpo anti-CD19 como descrito neste. Em uma forma de realização, um anticorpo alterado pode manter a capacidade de ligação de CD 19. Em certas formas de realização, um anticorpo anti- CD19 como descrito neste pode compreender um VH que é pelo menos ou cerca de 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % ou mais idêntico a uma sequência de aminoácido da HB12B-(3-72/JH4) (SEQ ID N°: 34), HB12A VH (SEQ ID N°: 2) HB12B VH (SEQ ID N°: 18), 7E12 VH (SEQ ID N°: 102), 14H5 VH (SEQ ID N°: 103), 15D1 VH (SEQ ID N°: 104), 15D7 VH (SEQ ID N°: 105), 16C4 VH (SEQ ID N°: 106), 14H5-YG (SEQ ID N°: 107), 14H5-DG (SEQ ID N°: 108), 14H5- LG (SEQ ID N°: 109), 1A7 VH, 3C3 VH, 3E5 VH, 3D4 VH, 9G7 VH (SEQ ID N°: 191), 3B4 VH (SEQ ID N°: 236), 3F11 VH ou 6C11 VH (SEQ ID N°: 192). Em certas formas de realização, um anticorpo anti- CD19 como descrito neste pode compreender um VH que é pelo menos ou cerca de 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % ou mais idêntica a uma sequência de aminoácido de qualquer um dos domínios de VH, VL ou CDRs listados na Tabela 1.

[00194] Em uma outra forma de realização, um anticorpo alterado podem ter uma sequência de aminoácido tendo pelo menos 25 %, 35 %, 45 %, 55 %, 65 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 % ou 95 % de identidade ou similaridade de sequência de aminoácido com a sequência de aminoácido das regiões FW1, FW2, FW3 ou FW4 de HB12B-(3- 72/JH4) (SEQ ID N°: 34), HB12A VH (SEQ ID N°: 2) HB12B VH (SEQ ID N°: 18), 7E12 VH (SEQ ID N°: 102), 14H5 VH (SEQ ID N°: 103), 15D1 VH (SEQ ID N°: 104), 15D7 VH (SEQ ID N°: 105), 16C4 VH (SEQ ID N°: 106), 14H5-YG (SEQ ID N°: 107), 14H5-DG (SEQ ID N°: 108), 14H5-LG (SEQ ID N°: 109), 1A7 VH, 3C3 VH, 3E5 VH, 3D4 VH, 9G7 VH (SEQ ID N°: 191), 3B4 VH (SEQ ID N°: 236), 3F11 VH ou 6C11 VH (SEQ ID N°: 192). Em uma outra forma de realização, um anticorpo alterado podem ter uma sequência de aminoácido tendo pelo menos 25 %, 35 %, 45 %, 55 %, 65 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 % ou 95 % de identidade ou similaridade de sequência de aminoácido com a sequência de aminoácido da FW1, FW2, FW3 ou FW4 de qualquer um dos domínios VH ou VL listado na Tabela 1.

[00195] Em uma outra forma de realização, um anticorpo alterado podem ter uma sequência de aminoácido tendo pelo menos 25 %, 35 %, 45 %, 55 %, 65 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 % ou 95 % de identidade ou similaridade de sequência de aminoácido com a sequência de aminoácido do CDR1, CDR2 ou CDR3 de cadeia leve de um anticorpo anti-CD19 como descrito neste. Em certas formas de realização, um anticorpo anti-CD19 da invenção pode compreender a VL que é pelo menos ou cerca de 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % ou mais idêntico a uma sequência de aminoácido de HB12A VK (SEQ ID N°: 4), HB12B VK (SEQ ID N°: 20), HB12B-(A10-Jk4) (SEQ ID N°: 52), HB12B-364987 (ou 364987) (SEQ ID N°: 62), HB12B-3649 (ou 3649) (SEQ ID N°: 68), HB12B-36 (ou 36) (SEQ ID N°: 70), 7E12 VK (SEQ ID N°: 110), 14H5 (SEQ ID N°: 111), 15D1 (SEQ ID N°: 112), 16C9 (SEQ ID N°: 113), 3C3 VK (SEQ ID N°: 193), 3E5 VK (SEQ ID N°: 194), 3D4 VK (SEQ ID N°: 195), 3F1 VK (SEQ ID N°: 196), 5B5 VK (SEQ ID N°: 197), 6F7 VK (SEQ ID N°: 198), 1C11 VK (SEQ ID N°: 199), 2B11 VK (SEQ ID N°: 200), 2D10 VK (SEQ ID N°: 201), 5C11 VK (SEQ ID N°: 202), 5D4 VK (SEQ ID N°: 203), 6C11 VK (SEQ ID N°: 204), 9G7 VK (SEQ ID N°: 205), 1H4 VK (SEQ ID N°: 206) ou 5C4 VK (SEQ ID N°: 207).

[00196] Em uma outra forma de realização, um anticorpo alterado podem ter uma sequência de aminoácido tendo pelo menos 25 %, 35 %, 45 %, 55 %, 65 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 % ou 95 % de identidade ou similaridade de sequência de aminoácido com a sequência de aminoácido de regiões FW1, FW2, FW3 ou FW4 de HB12A VK (SEQ ID N°: 4), HB12B VK (SEQ ID N°: 20), HB12B-(A10-Jk4) (SEQ ID N°: 52), HB12B-364987 (ou 364987) (SEQ ID N°: 62), HB12B-3649 (ou 3649) (SEQ ID N°: 68), HB12B-36 (ou 36) (SEQ ID N°: 70), 7E12 VK (SEQ ID N°: 110), 14H5 (SEQ ID N°: 111), 15D1 (SEQ ID N°: 112), 16C9 (SEQ ID N°: 113), 3C3 VK (SEQ ID N°: 193), 3E5 VK (SEQ ID N°: 194), 3D4 VK (SEQ ID N°: 195), 3F1 VK (SEQ ID N°: 196), 5B5 VK (SEQ ID N°: 197), 6F7 VK (SEQ ID N°: 198), 1C11 VK (SEQ ID N°: 199), 2B11 VK (SEQ ID N°: 200), 2D10 VK (SEQ ID N°: 201), 5C11 VK (SEQ ID N°: 202), 5D4 VK (SEQ ID N°: 203), 6C11 VK (SEQ ID N°: 204), 9G7 VK (SEQ ID N°: 205), 1H4 VK (SEQ ID N°: 206) ou 5C4 VK (SEQ ID N°: 207).

[00197] A identidade ou a similaridade com respeito a uma sequência é definida neste como a porcentagem de resíduos de aminoácido na sequência candidata que são idênticos (isto é, mesmo resíduo) ou similar (isto é, resíduo de aminoácido a partir do mesmo grupo em propriedades de cadeia secundária comuns, ver abaixo) com resíduos de anticorpo anti-CD19, após alinhar as sequências e introduzir fendas, se necessário, atingir a identidade de sequência percentual máxima. Nenhuma das extensões, anulações ou inserções de terminal N, terminal C ou internas na sequência de anticorpo fora do domínio variável devem ser construídas afetando a identidade ou a similaridade de sequência.

[00198] “ % de identidade,” como conhecido na técnica, é uma medida da relação entre dois polinucleotídeos ou dois polipeptídeos como determinado pela comparação de suas sequências. No geral, as duas sequências a serem comparadas são alinhadas para dar uma correlação máxima entre as sequências. O alinhamento das duas sequências é examinado e o número de posições dando uma correspondência de aminoácido ou de nucleotídeo exata entre as duas sequências determinadas, dividido pelo comprimento total do alinhamento e multiplicado por 100 para dar uma figura de % de identidade. Esta figura de % de identidade pode ser determinada sobre o comprimento total das sequências a serem comparadas, o que é particularmente adequado para as sequências do mesmo comprimento ou muito similar e que são altamente homólogas ou sobre os comprimentos definidos mais curtos, eu é mais adequado para o comprimento desigual ou que tem um nível mais baixo de homologia.

[00199] Por exemplo, as sequências podem ser alinhadas com o software clustalw sob Unix que gera um arquivo com uma extensão “.aln”, este arquivo pode ser então importado no programa Bioedit (Hall, T.A. 1999, BioEdit: a user-friendly biological sequence alignment editor and analysis program for Windows 95/98/NT. Nucl. Acids. Symp. Ser. 41:95-98) que abre o arquivo .aln. Na janela Bioedit, pode-se escolher sequências individuais (duas de uma vez) e alinhá-las. Este método permite a comparação da sequência inteira.

[00200] Os métodos para a comparação da identidade de duas ou mais sequências são bem conhecidos na técnica. Desta maneira, por exemplo, os programas estão disponíveis em Wisconsin Sequence Analysis Package, versão 9.1 (Devereux J. et al., Nucleic Acids Res., 12:387-395, 1984, disponível da Genetics Computer Group, Madison, WI, USA). A determinação da identidade percentual entre as duas sequências pode ser realizada usando-se um algoritmo matemático. Por exemplo, os programas BESTFIT e GAP, podem ser usados para determinar a % de identidade entre os dois polinucleotídeos e a % de identidade entre as duas sequências de polipeptídeo. BESTFIT usa o algoritmo de “homologia local” de Smith and Waterman (Advances in Applied Mathematics, 2:482-489, 1981) e encontra a melhor região simples de similaridade entre duas sequências. BESTFIT é mais adequada para a comparação de duas sequências de polinucleotídeos ou de polipeptídeo que são dissimilares em comprimento, o programa assumindo que a sequência mais curta representa uma porção da mais longa. Em comparação, o GAP alinha duas sequências que encontram uma “similaridade máxima” de acordo com o algoritmo de Neddleman and Wunsch (J. Mol. Biol., 48:443-354, 1970). O GAP é mais adequado para a comparação das sequências que são aproximadamente do mesmo comprimento e um alinhamento é esperado sobre o comprimento total. Preferivelmente, os parâmetros “Gap Weight “ e “Length Weight” usados em cada programa são 50 e 3 para os polinucleotídeos e 12 e 4 para os polipeptídeos, respectivamente. Preferivelmente as % de identidades e similaridades são determinadas quando as duas sequências sendo comparadas são otimamente alinhadas.

[00201] Outros programas para determinar a identidade e/ou a similaridade entre as sequências também são conhecidos na técnica, por exemplo, a família BLAST de programas (Karlin & Altschul, 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:2264-2268, modificado como em Karlin & Altschul, 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:5873-5877, disponível do National Center for Biotechnology Information (NCB), Bethesda, MD, USA e acessível através da home page do NCBI em www.ncbi.nlm.nih.gov). Estes programas são exemplos não limitantes de um algoritmo matemático utilizado para a comparação de duas sequências. Um tal algoritmo é incorporado nos programas NBLAST e XBLAST de Altschul et al., 1990, J. Mol. Biol., 215:403-410. As pesquisas de nucleotídeo BLAST pdoem ser realizadas com o programa NBLAST, registro = 100, comprimento de palavra = 12 para obter sequências de nucleotídeo homólogas a uma molécula de ácido nucléico que codifica todos ou uma porção de um anticorpo anti-CD19 da invenção. As pesquisas de proteína BLAST podem ser realizadas com o programa XBLAST, registro = 50, comprimento de palavra = 3 para obter sequências de aminoácido homólogas a uma molécula de proteína da invenção. Para obter alinhamentos abertos para comparação, o Gapped BLAST pode ser utilizado como descrito em Altschul et al., 1997, Nucleic Acids Res., 25:3389-3402. O PSI-Blast também pode ser usado para realizar uma pesquisa interada que detecta relações distantes entre as moléculas (Id.). quando utiliza-se programas BLAST, Gapped BLAST e PSI-Blast, os parâmetros de default dos programs respectivos (por exemplo, XBLAST e NBLAST) podem ser usados. Ver, http://www.ncbi.nlm.nih.gov.

[00202] Um outro exemplo não limitante de um programa para determinar a identidade e/ou similaridade entre as sequências conhecidas na técnica é FASTA (Pearson W.R. and Lipman D.J., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85:2444-2448, 1988, disponível como parte do Wisconsin Sequence Analysis Package). Preferivelmente, a matriz de substituição de aminoácido BLOSUM62 (Henikoff S. and Henikoff J.G., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:10915-10919, 1992) é usada nas comparações de sequência de polipeptídeo que inclui quando as sequências de nucleotídeo são primeiro traduzidas em sequências de aminoácido antes da comparação.

[00203] Ainda, um outro exemplo não limitante de um programa conhecido na técnica para a determinação da identidade e/ou similaridade entre as sequências de aminoácido é o SeqWeb Software (uma interface com base na rede para o GCG Wisconsin Package: programa Gap) que é utilizado com o algoritmo de default e ajustes de parâmetro do programa: blosum62, peso da abertura 8, peso do comprimento 2.

[00204] A identidade percentual entre as duas sequências pode ser determinada usando-se as técnicas similares àquelas descritas acima, com ou sem a permissão de aberturas. No cálculo da identidade percentual, tipicamente, comparações exatas são contadas.

[00205] Preferivelmente, o programa BESTFIT é suado para determinar o % de identidade de uma sequência de polinucleotídeo ou de um polipeptídeo em questão com respeito a uma sequência de polinucleotídeo ou de polipeptídeo da presente invenção, a sequência em questão e a de referência sendo otimamente alinhadas e os parâmetros do programa ajustados como o valor default.

[00206] Para gerar um anticorpo alterado, uma ou mais alterações de aminoácido (por exemplo, substituições) são introduzidos em uma ou mais das regiões hipervariáveis do anticorpo dependente de espécie. Uma ou mais alterações (por exemplo, substituições) da região de resíduos de estrutura podem ser introduzidas em um anticorpo anti-CD19 onde estas resultam em uma melhora na afinidade de ligação do anticorpo mutante para oantígeno da segunda espécie de mamífero. Os exemplos de resíduos de região de estrutura para modificação incluem aqueles que, não covalentemente, ligam o antígeno diretamente (Amit et al., Science, 233:747-753 (1986)); interage com/realiza a conformação de um CDR (Chothia et al., J. Mol. Biol., 196:901-917 (1987)); e/ou participa da interface VL-VH (EP 239 400B1). Em certas formas de realização, a modificação de um ou mais tais resíduos de formação de região de estrutura resulta em uma intensificação de uma afinidade de ligação do anticorpo para o antígeno da Segunda espécie de mamífero. Por exemplo, de cerca de um a cerca de cinco resíduos de estrutura podem ser alterados nesta forma de realização da invenção. Algumas vezes, isto pode ser suficiente para a produção de um anticorpo mutante adequado para o uso em teste pré-clínicos, mesmo quando nenhum dos resíduos de região hipervariável foram alterados. Normalmente, entretanto, um anticorpo alterado compreenderá alterações de região hipervariável adicionais.

[00207] Os resíduos de regiões hipervariáveis que são alterados podem ser mudados aleatoriamente, especialmente quando a afinidade de ligação inicial de um anticorpo anti-CD19 para o antígeno da segunda espécie de mamífero é tal que tal anticorpo alterado aleatoriamente produzido pode ser facilmente avaliado.

[00208] Um procedimento útil para gerar um tal anticorpo alterado é denominado “mutagênese de varredura de alanina” (Cunningham and Wells, Science, 244:1081-1085 (1989)). Aqui, um ou mais dos resíduos de região hipervariável são substituídos por resíduos de alanina ou polialanina para afetar a interação dos aminoácidos com o antígeno da segunda espécie de mamífero. Aqueles resíduos de região hipervariável demonstram sensibilidade funcional às substituições são então refinados pela introdução adicional ou outras mutações em ou para os locais de substituição. Desta maneira, enquanto o local para a introdução de uma sequência de aminoácido é predeterminado, a natureza da mutação per se não necessita ser pré- determinada. Os mutantes Ala produzidos desta maneira são avaliados quanto à sua atividade biológica como descrito neste.

[00209] Um outro procedimento para gerar um tal anticorpo alterado envolve a maturação por afinidade usando-se a apresentação de fago (Hawkins et al., J. Mol. Biol., 254:889-896 (1992) e Lowman et al., Biochemistry, 30(45):10832-10837 (1991)). Resumidamente, diversos locais de região hipervariável (por exemplo, 6 a 7 locais) são mutados para a geração de todas as substituições de aminoácido possíveis em cada local. Os anticorpos mutantes gerados desta maneira são apresentados de uma maneira monovalente a partir de partículas de fago filamentosas como fusões ao produto de gene III de M13 embalado dentro de cada partícula. Os mutantes apresentados por fago são então avaliados quanto à sua atividade biológica (por exemplo, afinidade de ligação) como divulgado neste.

[00210] As mutações em sequências de anticorpo podem incluir substituições, anulações, incluindo anulações internas, adições, incluindo adições que produzem proteínas de fusão ou substituições conservativas de resíduos de aminoácido dentro e/ou adjacente à sequência de aminoácido, mas que resulta em uma mudança “silenciosa”, em que a mudança produz um anticorpo anti-CD19 funcionalmente equivalente. As substituições de aminoácido conservativas podem ser feitas na base de similaridade em polaridade, carga, solubilidade, hidrofobicidade, hidrofilicidade e/ou a natureza anfipática dos resíduos envolvidos. Por exemplo, os aminoácidos não polares (hidrofóbicos) incluem alanina, leucina, isoleucina, valina, prolina, fenilalanina, triptofano e metionina; aminoácidos polares neutros incluem glicina, serina, treonina, cisteína, tirosina, asparagina e glutamina; aminoácidos positivamente carregados (básicos) incluem arginina, lisina e histidina e aminoácidos negativalente carregados (ácidos) incluem ácido aspártico e ácido glutâmico. Além disso, glicina e prolina são resíduos que podem influenciar a orientação de cadeia. As substituições não conservativas vincularão a troca de um membro de uma destas classes por um membro de uma outra classe. Além disso, se desejado, aminoácidos não clássicos ou análogos de aminoácido químicos podem ser introduzidos como uma substituição ou adição na sequência de anticorpo. Os aminoácidos não clássicos incluem, mas não limitam-se aos D-isômeros dos aminoácidos comuns, ácido α-amino isobutírico, ácido 4-aminobutírico, Abu, ácido 2-amino butírico, Y—Abu, ε-Ahx, ácido 6-amino hexanóico, Aib, ácido 2- amino isobutírico, ácido 3-amino propiônico, ornitina, norleucina, norvalina, hidroxiprolina, sarcosina, citrulina, ácido cistéico, t- butilglicina, t-butilalanina, fenilglicina, ciclohexilalanina, β-alanina, fluoro-amino ácidos, aminoácidos designer trais como β-metil aminoácidos, Cα-metil amino ácidos, Nα-metil amino ácidos e análogos de aminoácido no geral.

[00211] Em uma outra forma de realização, os locais selecionados para a modificação são maturados por afinidade usando-se a apresentação de fago (ver acima).

[00212] Qualquer técnica para a mutagênese conhecida na técnica pode ser usada para modificar nucleotídeos individuais em uma sequência de DNA, para os propósitos de realizar as substituições de aminoácido na sequência de anticorpo ou para criar/anular locais de restrição para facilitar manipulações adicionais. Tais técnicas incluem, mas não limitam-se à mutagênese química, in vitro mutagênese direcionada ao local (Kunkel, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82:488 (1985); Hutchinson, C. et al., J. Biol. Chem., 253:6551 (1978)), mutagênese direcionada a nucleotídeo (Smith, Ann. Rev. Genet., 19:423-463 (1985); Hill et al., Methods Enzymol., 155:558-568 (1987)), extensão de sobreposição com base em PCR (Ho et al., Gene, 77:5159 (1989)), mutagênese de iniciador com base em PCR (Sarkar et al., Biotechniques, 8:404-407 (1990)), etc. as modificações podem ser confirmadas pelo sequenciamento de DNA de didesóxi de filamnto duplo.

[00213] Em certas formas de realização da invenção, um anticorpo anti-CD19 pode ser modificado para produzir proteínas de fusão; isto é, o anticorpo ou um fragmento do mesmo, fundido a uma proteína heteróloga, polipeptídeo ou peptídeo. Em certas formas de realização, a proteína fundida à porção de um anticorpo anti-CD19 é um componente de enzima de Terapia de Pró-medicamento Direcionada a Anticorpo (ADEPT). Os exemplos de outras proteínas ou polipeptídeos que podem ser projetados como uma proteína de fusão com um anticorpo anti-CD19 incluem, mas não limitam-se a toxinas, tais como ricina, abrina, ribonuclease, DNase I, Staphylococcal enterotoxina-A, proteína anti-viral de erva dos cancros, gelonina, toxina de difterina, Pseudomonas exotoxina e Pseudomonas endotoxina. Ver, por exemplo, Pastan et al., Cell, 47:641 (1986) e Goldenberg et al., Cancer Journal for Clinicians, 44:43 (1994). As toxinas enzimaticamente ativas e fragmentos destas que pdoem ser usadas incluem cadeia de difteria A, fragmwentos ativos de não ligação de toxina da difteria, cadeia de exotoxina A (de Pseudomonas aeruginosa), cadeia de ricina A, cadeia de abrina A, cadeia de modecina A, alfa-sarcina, proteínas de Aleurites fordii, proteínas de diantina, proteínas de Phytolaca americana (PAPI, PAPII e PAP-S), inibidor de momordica charantia, curcina, crotina, inibidor de sapaonaria officinalis, gelonina, mitogelina, restrictocina, fenomicina, enomicina e os tricothecenes. Ver, por exemplo, WO 93/21232 publicado em 28 de outubro de 1993.

[00214] As proteínas de fusão adicionais podem ser geradas através das técnicas de mistura de gene, mistura de motivo, mistura de éxon e/ou mistura de códon (coletivamente referido como “mistura de DNA”). A mistura de DNA pode ser utilizada para alterar as atividades do anticorpo antiCD19 ou fragmentos destes (por exemplo, um anticorpo ou um fragmento do mesmos com afinidades mais altas e taxas de dissociação mais baixas). Ver, no geral, Patente U. S. N° 5.605.793; 5.811.238; 5.830.721; 5.834.252 e 5.837.458 e Patten et al., 1997, Curr. Opinion Biotechnol., 8:724-33 ; Harayama, 1998, Trends Biotechnol. 16(2):76-82; Hansson et al., 1999, J. Mol. Biol., 287:265-76 e Lorenzo and Blasco, 1998, Biotechniques 24(2):308- 313 (cada uma destas patentes e publicações são, desse modo, incorporadas por referência em sua totalidade). o anticorpo ainda pode ser uma proteína de fusão de imunoglobulina do domínio de ligação como descrito em Publicação U. S. 20030118592, Publicação U. S. 200330133939 e Publicação PCT WO 02/056910, todas concedidas a Ledbetter et al., que são incorporadas neste por referência em suas totalidades.

5.6. ANTICORPOS DE DOMÍNIO

[00215] Os anticorpos anti-CD19 de composições e métodos da invenção podem ser anticorpos de domínio, por exemplo, anticorpos contendo as unidades de ligação funcionais pequenas de anticorpos, que correspondem a regiões variáveis das cadeias pesadas (VH) ou leves (VL) de anticorpos humanos. O exemplos de anticorpos de domínio incluem, mas não limita-se àqueles disponíveis da Domantis Limited (Cambridge, UK) e Domantis Inc. (Cambridge, MA, USA) que são específicos para alvos terapêuticos (ver, por exemplo, WO04/058821; WO04/003019; Patente U. S. N° 6.291.158; 6.582.915; 6.696.245 e 6.593.081). as bibliotecas comercialmente disponíveis de anticorpos de domínio podem ser usados para identificar anticorpos anti-CD19 de domínio. Em certas formas de realização, os anticorpos anti-CD19 compreendem uma unidade de ligação funcional de CD19 e uma unidade de ligação funcional de receptor gama Fc.

[00216] Em uma forma de realização, um anticorpo de domínio anti- CD19 pode compreender qualquer um de ou qualquer combinação dos CDRs das cadeias pesadas ou leves dos anticorpos HB12A ou HB12B monoclonais.

[00217] Em uma outra forma de realização, um anticorpo de domínio anti-CD19 pode compreender CDR3 de HB12A ou HB12B VHs junto com qualquer combinação dos CDRs copreendidos pelas regiões variáveis de cadeias pesadas ou leves dos anticorpos HB12A ou HB12B monoclonais. Um anticorpo de domínio anti-CD19 também pode compreender CDR3 de HB12A ou HB12B VKs junto com qualquer combinação dos CDRs compreendidos pelas regiões variáveis de cadeias pesadas ou leves do anticorpos HB12A ou HB12B monoclonais.

[00218] Ainda, em uma outra forma de realização, um anticorpo de domínio anti-CD19 pode compreender CDR3 de HB12A ou HB12B VHs. Um anticorpo de domínio anti-CD19 também pode compreender CDR3 de HB12A ou HB12B VKs.

5.7. DIACORPOS

[00219] Em certas formas de realização da invenção, os anticorpos anti-CD19 são “diacorpos”. O termo “diacorpos” refere-se a fragmentos de anticorpo pequenos com dois locais de ligação de antígeno, cujos fragmentos compreendem um domínio variável de cadeia pesada (VH) conectado a um domínio variável de cadeia leve (VL) na mesma cadeia de peptídeo (VH-VL). usando-se um ligador que é muito curto para permitir a formação de pares entre os dois domínios na mesma cadeia, os domínios são forçados aos pares com os domínios complementares de uma outra cadeia e criam dois locais de ligação de antígeno. Os diacorpos são descrito, mais totalmente, em, por exemplo, EP 404,097; WO 93/11161 e Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993).

5.8. VACICORPOS

[00220] Em certas formas de realização da invenção, os anticorpos anti-CD19 são Vacicorpos. Os vacicorpos são polipeptídeos diméricos. Cada monômero de um vacicorpo consiste de um scFv com especificidade para uma molécula de superfície em APC conectado através de uma região de junta e um domínio CY3 a um segundo scFv. Em outras formas de realização da invenção, os vacicorpos contendo em cada um dos scFv’s, um fragmento de anticorpo anti-CD19 pode ser usado para justapor aquelas células B a serem destruídas e uma célula atuadora que media ADCC. Por exemplo, ver, Bogen et al., Publicação U. S. de Pedido de Patente N° 20040253238.

5.9. ANTICORPOS LINEARES

[00221] Em certas formas de realização da invenção, os anticorpos anti-CD19 são anticorpos lineares. Os anticorpos lineares compreendem um par de segmentos Fd tandem (VH-CH1-VH-CH1) que forma um par de regiões de ligação de antígeno. Os anticorpos lineares podem ser biespecíficos ou monoespecíficos. Ver, Zapata et al., Protein Eng., 8(10):1057-1062 (1995).

5.10. ANTICORPO+ PRECURSOR

[00222] Em certas formas de realização da invenção, O anticorpo anti-CD19 é um anticorpo precursor. Um “anticorpo precursor” é um anticorpo que compreende uma sequência de aminoácido que pode precisar ou pode ser deficiente de um ou mais resíduos de aminoácido em ou adjacente a ums ou mais regiões hipervariáveis destes em comparação com um anticorpo alterado/mutante como divulgado aqui. Desta maneira, o anticorpo precursor pode ter uma região hipervariável mais curta do que a região hipervariável correspondente de um anticorpo mutante como divulgado neste. O polipeptídeo precursor pode compreender uma sequência de anticorpo natural (isto é, uma ocorrência natural, que inclui uma variante alélica de ocorrência natural) ou uma sequência de anticorpo com modificações de sequência de aminoácido pré-existente (tais como outras inserções, anulações e/ou substituições) de uma sequência de ocorrência natural. O anticorpo precursor pode ser um anticorpo humanizado ou um anticorpo humano.

5.11. FRAGMENTOS DE ANTICORPO

[00223] Os “fragmentos de anticorpo” compreendem uma porção de um anticorpo de comprimento total, no geral, a ligação do antígeno ou a região variável deste. Os exemplos de fragmentos de anticorpo incluem fragmentos Fab, Fab', F(ab')2 e Fv; diacorpos; anticorpos lineares; moléculas de anticorpo de cadeia simples e anticorpos multiespecíficos formados de fragmentos de anticorpo.

[00224] Tradicionalmente, estes fragmentos foram derivados por intermédio da digestão proteolítica de anticorpos intactos (ver, por exemplo, Morimoto et al., Journal of Biochemical and Biophysical Methods, 24:107-117 (1992) e Brennan et al., Science, 229:81 (1985)). Entretanto, estes fragmentos podem ser agora produzidos diretamente pelas células hospedeiras recombinantes. Por exemplo, os fragmentos de anticorpo podem ser isolados das bibliotecas de fago de anticorpo debatido acima. Os fragmentos de Fab'-SH também podem ser diretamente recuperados de E. coli e quimicamente ligados para formar fragmentos F(ab’)2 (Carter et al., Bio/Technology, 10:163-167 (1992)). De acordo com um outro método, os fragmentos F(ab’)2 podem ser isolados diretamente da cultura de célula hospedeira recombinante. Outras técnicas para a produção de fragmentos de anticorpo estarão evidentes para o prático habilitado. Em outras formas de realização, o anticorpo de escolha é um fragmento Fv de cadeia simples. Ver, por exemplo, WO 93/16185. Em certas formas de realização, o anticorpo não é um fragmento Fab.

5.12. ANTICORPOS BIESPECÍFICOS

[00225] Os anticorpos biespecíficos são anticorpos que tem especificidades de ligação para pelo menos dois epítopos diferentes. Os anticorpos biespecíficos exemplares podem ligar-se aos dois epítopos diferentes de marcador de superfície de célula B. Outros tais anticorpos podem ligar um primeiro marcador de célula B e ainda ligar um segundo marcador de superfície de célula B. Um membro de ligação de marcador anti-célula B também pode ser combinado com um membro que liga-se a uma molécula disparadora em um leucócito, tal como uma molécula receptora de célula T (por exemplo, CD2 ou CD3) ou receptores de Fc para IgG (FCYR), a fim de focar os mecanismos de defesa celular à célula B. Os anticorpos biespecíficos também podem ser usados para a localização de agentes citotóxicos à célula B. Estes anticorpos possuem um membro de ligação de marcador de célula B que liga o agente citotóxico (por exemplo, saporina, anti-interferon-α, vinca alcalóide, cadeia de ricina A, metola- exato ou hapteno de isótopo radioativo). Os anticorpos biespecíficos podem ser preparados como anticorpos de comprimento total ou fragmentos de anticorpo (por exemplo, F(ab'): anticorpos biespecíficos).

[00226] Os métodos para a fabricação de anticorpos biespecíficos são conhecidos na técnica. (Ver, por exemplo, Millstein et al., Nature, 305:537-539 (1983); Traunecker et al., EMBO J., 10:3655-3659 (1991); Suresh et al., Methods in Enzymology, 121:210 (1986); Kostelny et al., J. Immunol., 148(5):1547-1553 (1992); Hollinger et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993); Gruber et al., J. Immunol., 152:5368 (1994); Patente U. S. N° 4.474.893; 4.714.681; 4.925.648; 5.573.920; 5.601.81; 95.731.168; 4.676.980 e 4,676,980, WO 94/04690; WO 91/00360; WO 92/200373; WO 93/17715; WO 92/08802 e EP 03089.)

[00227] Em uma forma de realização, quando um anticorpo anti- CD19 de composições e métodos da invenção é biespecífico, o anticorpo anti-CD19 pode ser humano ou humanizado e pode Ter especificidade para o CD19 humano e um epítopo em uma célula T pode ser capaz de ligação a uma célula atuadora humana, tal como, por exemplo, um monócito/macrófago e/ou uma célula matadora natural para realizar a morte celular.

[00228] Em uma forma de realização, um anticorpo anti-CD19 da invenção é um anticorpo biespecífico capaz de ligar-se especificamente a um primeiro e a um segundo antígeno, em que o dito primeiro antígeno é CD19 humano e o dito segundo antígeno é um receptor gama Fc selecionado do grupo que consiste de FCYRI, FCYRIIA, FCYRIIB, FCYRIIIA e/ou FCYRIV. Em uma forma de realização adicional, um anticorpo anti-CD19 da invenção é um anticorpo biespecífico capaz de ligar-se especificamente ao CD19 humano e FCYRIIB. Em uma outra forma de realização, um anticorpo anti-CD19 da invenção é um anticorpo biespecífico capaz de ligar-se especificamente a CD19 humano e FcyRIIB humano.

5.13. REGIÕES VARIANTES DE Fc

[00229] A presente invenção fornece formulações de proteína que compreendem uma região de Fc variante. Isto é, uma região Fc que não ocorre naturalmente, por exemplo, uma região Fc que compreende um ou mais resíduos de aminoácido que não ocorrem naturalmente. Também abrangido pelas regiões Fc variantes da presente invenção são as regiões Fc que compreendem anulações, adições e/ou modificações de aminoácido.

[00230] Será entendido que a região de Fc como usada neste inclui os polipeptídeos que compreendem a região constante de um anticorpo que exclui o primeiro domínio de imunoglobulina de região constante. Desta maneira, o Fc refere-se a pelo menos dois domínios de imunoglobulina de região constante de IgA, IgD e IgG e os últimos três domínios de imunoglobulina de região constante de IgE e IgM e o terminal N de junta flexível para estes domínios. Para IgA e IgM, o Fc pode incluir a cadeia J. Para IgG, Fc compreende os domínios de imunoglobulina Cgamma2 e Cgamma3 (Cy2 e Cy3) e a junta entre Cgamma1 (Cy1) e Cgamma2 (Cy2). Embora as fronteiras da região Fc possa variar, a região Fc de cadeia pesada de IgG humano é usualmente definida para compreender os resíduos de C226 ou P230 a seu terminal de carboxila, em que a numeração está de acordo com o índice EU como em Kabat et al. (1991, NIH Publication 91-3242, National Technical Information Service, Springfield, VA). O “índice EU como apresentado em Kabat” refere-se à numeração do resíduo do anticorpo IgG1 EU humano como descrito em Kabat et al. supra. O Fc pode referir ao seu isolamento ou sua região no contexto de um anticorpo, fragmento de anticorpo ou proteína de fusão de Fc. Uma variante de proteína Fc pode ser um anticorpo, fusão de Fc ou qualquer proteína ou domínio de proteína que compreende uma região de Fc incluindo, mas não limita-se a, proteínas que compreendem regiões Fc variantes que não são variantes de ocorrência natural de um Fc. Nota: Os polimorfismos foram observados em diversas posições Fc, que inclui mas não limita-se a Kabat 270, 272, 312, 315, 356 e 358 e, desta maneira, diferenças leves entre a sequência apresentada e as sequências na técnica anterior podem existir.

[00231] A presente invenção abrange proteínas de variante de Fc que alteraram as propriedades de ligação a um ligando de Fc (por exemplo, um receptor de Fc, C1q) com relação a uma molécula comparável (por exemplo, uma proteína tendo a mesma sequência de aminoácido exceto tendo uma região Fc do tipo selvagem). Os exemplos de propriedades de ligação incluem mas não limita-se à especificidade de ligação, constante de dissociação de equilíbrio (KD), taxas de dissociação e de associação (koff e kon respectivamente), a afinidade de ligação e/ou avidez. No geral, é entendido que uma molécula de ligação (por exemplo, a proteína variante de Fc, tal como um anticorpo) com um KD baixo pode ser preferível para uma molécula de ligação com um KD alto. Entretanto, em alguns exemplos, o valor do kon ou koff pode ser mais relevante do que o valor do KD. uma pessoa habilitada na técnica pode determinar que o parâmetro cinético é mais importante para uma dada aplicação de anticorpo.

[00232] As afinidades e as propriedades de ligação de um domínio para seu ligando pode ser determinado por uma variedade de métodos de ensaio in vitro (ensaios com base bioquímica ou imunológica) conhecidos na técnica para determinar as interações de FC-FCYR, isto é, ligação específica de uma região Fc a um FCYR que inclui mas não limita-se aos métodos de equilíbrio (por exemplo, ensaio imunoabsorvente ligado por enzima (ELISA), ou radioimunoensaio (RIA)) ou cinéticas (por exemplo, análise BIACORE®) ou outros métodos, tais como ensaios de ligação indireta, ensaios de inibição competitiva, transferência de energia de ressonância por fluorescência (FRET), eletroforese em gel e cromatografia (por exemplo, filtração em gel). Estes e outros métodos podem utilizar um rótulo em um ou mais dos componentes sendo examinados e/ou utilizam uma variedade de métodos de detecção que incluem mas não limitam-se a rótulos cromogênicos, fluorescentes, luminescentes ou isotópicos. Uma descrição detalhada de afinidades de ligação e cinéticas pode ser observado em Paul, W. E., ed., Fundamental Immunology, 4° Ed., Lippincott-Raven, Philadelphia (1999), que foca nas interações anticorpo-imunogênio.

[00233] Em uma forma de realização, a variante de proteína Fc intensificou a ligação ao um ou mais ligando de Fc com relação a uma molécula comparável. Em uma outra forma de realização, a variante de proteína Fc tem uma afinidade ao ligando de Fc que é pelo menos 2 vezes ou pelo menos 3 vezes ou pelo menos 5 vezes ou pelo menos 7 vezes ou pelo menos 10 vezes ou pelo menos 20 vezes ou pelo menos 30 vezes ou pelo menos 40 vezes ou pelo menos 50 vezes ou pelo menos 60 vezes ou pelo menos 70 vezes ou pelo menos 80 vezes ou pelo menos 90 vezes ou pelo menos 100 vezes ou pelo menos 200 vezes maior do que aquela de uma molécula comparável. Em uma forma de realização específica, a variante de proteína Fc intensificou a ligação ao receptor de Fc. em uma outra forma de realização específica, a variante de proteína Fc intensificou a ligação ao receptor de Fc FCYRIIIA. Em uma outra forma de realização específica, a variante de proteína Fc intensificou a ligação ao receptor de Fc FcyRIIB. Ainda, em uma outra forma de realização específica, a variante de proteína Fc intensificou a ligação ao receptor de Fc FcRn. Ainda, em uma outra forma de realização específica, a variante de proteína Fc intensificou a ligação ao C1q com relação a uma molécula comparável.

[00234] Em uma forma de realização, um anticorpo anti-CD19 da invenção compreende um domínio de variante Fc em que o dito domínio de variante Fc tem afinidade de ligação intensificada ao receptor gama Fc IIB com relação a um domínio Fc não variante comparável. Em uma forma de realização adicional, um anticorpo anti- CD19 da invenção compreende um domínio de variante Fc em que o dito domínio de variante Fc tem uma afinidade ao receptor gama Fc IIB que é pelo menos 2 vezes ou pelo menos 3 vezes ou pelo menos 5 vezes ou pelo menos 7 vezes ou pelo menos 10 vezes ou pelo menos 20 vezes ou pelo menos 30 vezes ou pelo menos 40 vezes ou pelo menos 50 vezes ou pelo menos 60 vezes ou pelo menos 70 vezes ou pelo menos 80 vezes ou pelo menos 90 vezes ou pelo menos 100 vezes ou pelo menos 200 vezes maior do que aquela de um domínio Fc não variante comparável.

[00235] A vida média do soro em proteínas que compreendem as regiões de Fc pode ser aumentada aumentando-se a afinidade de ligação da região Fc para FcRn. Em uma forma de realização, a variante de proteína Fc intensificou a vida média do soro com relação à molécula comparável.

[00236] “Citotoxicidade mediada por célula dependente de anticorpo” ou “ADCC” refere-se a uma forma de citotoxicidade em que o Ig secretado ligado nos receptores de Fc (FcRs) presentes em certas células citotóxicas (por exemplo, células Matadoras Naturais (NK), neutrófilos e macrófagos) permite que estas células atuadoras citotóxicas liguem-se especificamente a uma célula alvo que carrega antígeno e mata subsequentemente a célula alvo com citotoxinas. Os anticorpos de IgG de alta afinidade específicos direcionados para a superfície de células alvo “arma” as células citotóxicas e são absolutamente requeridas para tal morte. A lise da célula alvo é extracelular, requer o contato célula-a-célula direta e não envolve complemento. É considerado que, além dos anticorpos, outras proteínas que compreendem as regiões de Fc, especificamente as proteínas de fusão de Fc, tendo a capacidade de ligar-se especificamente a uma célula alvo que carrega antígeno será capaz de realizar a citotoxicidade mediada por célula. Para simplicidade, a citotoxicidade mediada por célula que resulta da atividade de uma proteína de fusão de Fc também é referida aqui como atividade de ADCC.

[00237] A capacidade de qualquer variante de proteína Fc particular em mediar a lise da célula alvo por ADCC pode ser estimada. Para estimar a atividade de ADCC uma variante de proteína Fc de interesse é adicionada às células alvo em combinação com as células atuadoras imunes, que pdoem ser atingidas pelos complexos de antígeno anticorpo resultando na citose da célula alvo. A citólise é, no geral, detectada pela liberação de rótulo (por exemplo, substratos radioativos, pigmentos fluorescentes ou proteínas intracelulares naturais) a partir das células lisadas. As células atuadoras úteis para tais ensaios incluem células mononucleares sanguíneas periféricas (PBMC) e células matadoras naturais (NK). Os exemplos específicos de ensaios ADCC in vitro são descritos em Wisecarver et al., 1985 79:277-282; Bruggemann et al., 1987, J Exp Med 166:1351-1361; Wilkinson et al., 2001, J Immunol Methods 258:183-191; Patel et al., 1995 J Immunol Methods 184:29-38. A atividade de ADCC de uma variante de proteína Fc de interesse também pode ser estimada in vivo, por exemplo, em um modelo animal, tal como aquele divulgado em Clynes et al., 1998, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:652-656.

[00238] Em uma forma de realização, uma variante de proteína Fc tem atividade de ADCC intensificada com relação a uma molécula comparável. Em uma forma de realização específica, uma variante de proteína Fc tem atividade de ADCC que é pelo menos 2 vezes ou pelo menos 3 vezes ou pelo menos 5 vezes ou pelo menos 10 vezes ou pelo menos 50 vezes ou pelo menos 100 vezes maior do que aquela de uma molécula comparável. Em uma outra forma de realização específica, uma variante de proteína Fc intensificou a ligação ao receptor de Fc FCYRIIIA e tem atividade de ADCC intensificada com relação a uma molécula comparável. Em outras formas de realização, a variante de proteína Fc tem tanto atividade de ADCC intensificada quanto vida média de soro intensificada com relação a uma molécula comparável.

[00239] Em uma forma de realização, uma variante de proteína Fc reduziu a atividade de ADCC com relação a uma molécula comparável. Em uma forma de realização específica, uma variante de proteína Fc tem atividade de ADCC que é pelo menos 2 vezes ou pelo menos 3 vezes ou pelo menos 5 vezes ou pelo menos 10 vezes ou pelo menos 50 vezes ou pelo menos 100 vezes menor do que aquele de uma molécula comparável. Em uma outra forma de realização específica, uma variante de proteína Fc reduziu a ligação ao receptor de Fc FCYRIIIA e reduziu a atividade de ADCC com relação a uma molécula comparável. Em outras formas de realização, a variante de proteína Fc tanto reduziu a atividade de ADCC quanto intensificou a vida média do soro com relação a uma molécula comparável.

[00240] "Citotoxicidade dependente de complemento" e "CDC" refere-se à lise de uma célula alvo na presença de uma célula alvo na presença de complemento. O caminho de ativação de complemento é iniciado por uma ligação do primeiro componente do sistema de complemento (C1q) a uma molécula, um anticorpo por exemplo, complexado com um antígeno cognado. Para estimar a ativação de complemento, um ensaio de CDC, por exemplo, como descrito em Gazzano-Santoro et al., 1996, J. Immunol. Methods, 202:163, pode ser realizado. Em uma forma de realização, uma variante de proteína Fc tem atividade de CDC intensificada com relação a uma molécula comparável. Em uma forma de realização específica, uma variante de proteína Fc tem atividade de CDC que é pelo menos 2 vezes ou pelo menos 3 vezes ou pelo menos 5 vezes ou pelo menos 10 vezes ou pelo menos 50 vezes ou pelo menos 100 vezes maior do que aquela de uma molécula comparável. Em outras formas de realização, a variante de proteína Fc tem tanto intensificado a atividade de CDC quanto intensificado a vida média do soro com relação a uma molécula comparável.

[00241] Em uma forma de realização, a variante de proteína Fc reduziu a ligação a um ou mais ligandos de Fc com relação a uma molécula comparável. Em uma outra forma de realização, a variante de proteína Fc tem uma afinidade ao ligando de Fc que é pelo menos 2 vezes ou pelo menos 3 vezes ou pelo menos 5 vezes ou pelo menos 7 vezes ou pelo menos 10 vezes ou pelo menos 20 vezes ou pelo menos 30 vezes ou pelo menos 40 vezes ou pelo menos 50 vezes ou pelo menos 60 vezes ou pelo menos 70 vezes ou pelo menos 80 vezes ou pelo menos 90 vezes ou pelo menos 100 vezes ou pelo menos 200 vezes menor do que aquele de uma molécula comparável. Em uma forma de realização específica, a variante de proteína Fc reduziu a ligação a um receptor de Fc receptor. Em uma outra forma de realização específica, a variante de proteína Fc reduziu a ligação ao receptor de Fc FCYRIIIA. Em uma outra forma de realização específica, uma variante de Fc descrito neste tem uma afinidade ao receptor de Fc FCYRIIIA que é pelo menos cerca de 5 vezes menor do que aquele de uma molécula comparável, em que a dita variante de Fc tem uma afinidade ao receptor de Fc FcyRIIB que está dentro de cerca de 2 do que aquele da molécula comparável. Ainda, em uma outra forma de realização específica, a variante de proteína Fc reduziu a ligação ao receptor de Fc FcRn. Ainda, em uma outra forma de realização específica, a variante de proteína Fc reduziu a ligação a C1q com relação a uma molécula comparável.

[00242] Em uma forma de realização, a presente invenção fornece variantes de Fc, em que a região Fc compreende um resíduo de aminoácido que não ocorre naturalmente em uma ou mais posições selecionadas do grupo que consiste de 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 243, 244, 245, 247, 251, 252, 254, 255, 256, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 268, 269, 279, 280, 284, 292, 296, 297, 298, 299, 305, 313, 316, 325, 326, 327, 328, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 339, 341, 343, 370, 373, 378, 392, 416, 419, 421, 440 e 443 como numerado pelo índice EU como apresentado em Kabat. Opcionalmente, a região Fc pode compreender um resíduo de aminoácido que não ocorre naturalmente em posições adicionais e/ou alternativas conhecidas por uma pessoa habilitada na técnica (ver, por exemplo, Patentes U. S. 5.624.821; 6.277.375; 6.737.056; Publicações de Patente PCT WO 01/58957; WO 02/06919; WO 04/016750; WO 04/029207; WO 04/035752; WO 04/074455; WO 04/099249; WO 04/063351; WO 05/070963; WO 05/040217, WO 05/092925 e WO 06/020114).

[00243] Em uma forma de realização, a presente invenção fornece formulações, em que a região Fc compreende um resíduo de aminoácido que não ocorre naturalmente em uma ou mais posições selecionadas do grupo que consiste de 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 243, 244, 245, 247, 251, 252, 254, 255, 256, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 268, 269, 279, 280, 284, 292, 296, 297, 298, 299, 305, 313, 316, 325, 326, 327, 328, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 339, 341, 343, 370, 373, 378, 392, 416, 419, 421, 440 e 443 como numerado pelo índice EU como apresentado em Kabat. Opcionalmente, a região Fc pode compreender um resíduo de aminoácido que não ocorre naturalmente em posições adicionais e/ou alternativas conhecidas por uma pessoa habilitada na técnica (ver, por exemplo, Patentes U. S. 5.624.821; 6.277.375; 6.737.056; Publicações de Patente PCT WO 01/58957; WO 02/06919; WO 04/016750; WO 04/029207; WO 04/035752; WO 04/074455; WO 04/099249; WO 04/063351; WO 05/070963; WO 05/040217, WO 05/092925 e WO 06/020114).

[00244] Em uma forma de realização específica, a presente invenção fornece uma variante Fc, em que a região Fc compreende pelo menos um resíduo de aminoácido de ocorrência não natural selecionado do grupo que consiste de 234D, 234E, 234N, 234Q, 234T, 234H, 234Y, 234I, 234V, 234F, 235A, 235D, 235R, 235W, 235P, 235S, 235N, 235Q, 235T, 235H, 235Y, 235I, 235V, 235F, 236E, 239D, 239E, 239N, 239Q, 239F, 239T, 239H, 239Y, 240I, 240A, 240T, 240M, 241W, 241 L, 241Y, 241E, 241 R. 243W, 243L 243Y, 243R, 243Q, 244H, 245A, 247L, 247V, 247G, 251F, 252Y, 254T, 255L, 256E, 256M, 262I, 262A, 262T, 262E, 263I, 263A, 263T, 263M, 264L, 264I, 264W, 264T, 264R, 264F, 264M, 264Y, 264E, 265G, 265N, 265Q, 265Y, 265F, 265V, 265I, 265L, 265H, 265T, 266I, 266A, 266T, 266M, 267Q, 267L, 268E, 269H, 269Y, 269F, 269R, 270E, 280A, 284M, 292P, 292L, 296E, 296Q, 296D, 296N, 296S, 296T, 296L, 296I, 296H, 269G, 297S, 297D, 297E, 298H, 298I, 298T, 298F, 299I, 299L, 299A, 299S, 299V, 299H, 299F, 299E, 305I, 313F, 316D, 325Q, 325L, 325I, 325D, 325E, 325A, 325T, 325V, 325H, 327G, 327W, 327N, 327L, 328S, 328M, 328D, 328E, 328N, 328Q, 328F, 328I, 328V, 328T, 328H, 328A, 329F, 329H, 329Q, 330K, 330G, 330T, 330C, 330L, 330Y, 330V, 330I, 330F, 330R, 330H, 331G, 331A, 331L, 331M, 331F, 331W, 331K, 331Q, 331E, 331S, 331V, 331I, 331C, 331Y, 331H, 331R, 331N, 331D, 331T, 332D, 332S, 332W, 332F, 332E, 332N, 332Q, 332T, 332H, 332Y, 332A, 339T, 370E, 370N, 378D, 392T, 396L, 416G, 419H, 421K, 440Y e 434W como numerado pelo índice EU como apresentado em Kabat. Opcionalmente, a região Fc pode compreender resíduos de aminoácido de ocorrência não natural adicional ou alternativo conhecidas por uma pessoa habilitada na técnica (ver, por exemplo, Patentes U. S. 5.624.821; 6.277.375; 6.737.056; Publicações de Patente PCT WO 01/58957; WO 02/06919; WO 04/016750; WO 04/029207; WO 04/035752 e WO 05/040217).

[00245] Em uma forma de realização específica, a presente invenção fornece uma formulação de variante de proteína Fc, em que a região Fc compreende pelo menos um resíduo de aminoácido de ocorrência não natural selecionado do grupo que consiste de 234D, 234E, 234N, 234Q, 234T, 234H, 234Y, 234I, 234V, 234F, 235A, 235D, 235R, 235W, 235P, 235S, 235N, 235Q, 235T, 235H, 235Y, 235I, 235V, 235F, 236E, 239D, 239E, 239N, 239Q, 239F, 239T, 239H, 239Y, 240I, 240A, 240T, 240M, 241W, 241 L, 241Y, 241E, 241 R. 243W, 243L 243Y, 243R, 243Q, 244H, 245A, 247L, 247V, 247G, 251F, 252Y, 254T, 255L, 256E, 256M, 262I, 262A, 262T, 262E, 263I, 263A, 263T, 263M, 264L, 264I, 264W, 264T, 264R, 264F, 264M, 264Y, 264E, 265G, 265N, 265Q, 265Y, 265F, 265V, 265I, 265L, 265H, 265T, 266I, 266A, 266T, 266M, 267Q, 267L, 268E, 269H, 269Y, 269F, 269R, 270E, 280A, 284M, 292P, 292L, 296E, 296Q, 296D, 296N, 296S, 296T, 296L, 296I, 296H, 269G, 297S, 297D, 297E, 298H, 298I, 298T, 298F, 299I, 299L, 299A, 299S, 299V, 299H, 299F, 299E, 305I, 313F, 316D, 325Q, 325L, 325I, 325D, 325E, 325A, 325T, 325V, 325H, 327G, 327W, 327N, 327L, 328S, 328M, 328D, 328E, 328N, 328Q, 328F, 328I, 328V, 328T, 328H, 328A, 329F, 329H, 329Q, 330K, 330G, 330T, 330C, 330L, 330Y, 330V, 330I, 330F, 330R, 330H, 331G, 331A, 331L, 331M, 331F, 331W, 331K, 331Q, 331E, 331S, 331V, 331I, 331C, 331Y, 331H, 331R, 331N, 331D, 331T, 332D, 332S, 332W, 332F, 332E, 332N, 332Q, 332T, 332H, 332Y, 332A, 339T, 370E, 370N, 378D, 392T, 396L, 416G, 419H, 421K, 440Y e 434W como numerado pelo índice EU como apresentado em Kabat. Opcionalmente, a região Fc pode compreender resíduos de aminoácido de ocorrência não natural adicional ou alternativo conhecidos por uma pessoa habilitada na técnica (ver, por exemplo, Patentes U. S. 5,624,821; 6,277,375; 6,737,056; Publicações de Patente PCT WO 01/58957; WO 02/06919; WO 04/016750; WO 04/029207; WO 04/035752 e WO 05/040217).

[00246] Em uma outra forma de realização, a presente invenção fornece uma variante Fc, em que a região Fc compreende pelo menos um aminoácido de ocorrência não natural em uma ou mais posições selecionadas do grupo que consiste de 239, 330 e 332, como numerado pelo índice EU como apresentado em Kabat. Em uma forma de realização específica, a presente invenção fornece uma variante Fc, em que a região Fc compreende pelo menos um aminoácido de ocorrência não natural selecionado do grupo que consiste de 239D, 330L and 332E, como numerado pelo índice EU como apresentado em Kabat. Opcionalmente, a região Fc ainda pode compreender um aminoácido de ocorrência não natural adicional em uma ou mais posições selecionadas do grupo que consiste de 252, 254 e 256, como numerado pelo índice EU como apresentado em Kabat. Em uma forma de realização específica, a presente invenção fornece uma variante Fc, em que a região Fc compreende pelo menos um aminoácido de ocorrência não natural selecionado do grupo que consiste de 239D, 330L e 332E, como numerado pelo índice EU como apresentado em Kabat e pelo menos uma um aminoácido de ocorrência não natural em uma ou mais posições selecionadas do grupo que consiste de 252Y, 254T e 256E, como numerado pelo índice EU como apresentado em Kabat.

[00247] Em uma outra forma de realização, a presente invenção fornece uma variante Fc, em que a região Fc compreende pelo menos um aminoácido de ocorrência não natural em uma ou mais posições selecionadas do grupo que consiste de 234, 235 e 331, como numerado pelo índice EU como apresentado em Kabat. Em uma forma de realização específica, a presente invenção fornece uma variante Fc, em que a região Fc compreende pelo menos um aminoácido de ocorrência não natural selecionado do grupo que consiste de 234F, 235F, 235Y e 331S, como numerado pelo índice EU como apresentado em Kabat. Em uma outra forma de realização específica, uma variante de Fc da invenção compreende os resíduos de aminoácido de ocorrência não natural 234F, 235F e 331S, como numerado pelo índice EU como apresentado em Kabat. Em uma outra forma de realização específica, uma variante de Fc da invenção compreende os resíduos de aminoácido de ocorrência não natural 234F, 235Y e 331S, como numerado pelo índice EU como apresentado em Kabat. Opcionalmente, a região Fc ainda pode compreender um aminoácido de ocorrência não natural adicional em uma ou mais posições selecionadas do grupo que consiste de 252, 254 e 256, como numerado pelo índice EU como apresentado em Kabat. Em uma forma de realização específica, a presente invenção fornece uma variante Fc, em que a região Fc compreende pelo menos um aminoácido de ocorrência não natural selecionado do grupo que consiste de 234F, 235F, 235Y e 331S, como numerado pelo índice EU como apresentado em Kabat e pelo menos um aminoácido de ocorrência não natural em uma ou mais posições são selecionados do grupo que consiste de 252Y, 254T e 256E, como numerado pelo índice EU como apresentado em Kabat.

[00248] Em uma outra forma de realização, a presente invenção fornece uma formulação de variante de proteína Fc, em que a região Fc compreende pelo menos a um aminoácido de ocorrência não natural em uma ou mais posições selecionadas do grupo que consiste de 239, 330 and 332, como numerado pelo índice EU como apresentado em Kabat. Em uma forma de realização específica, a presente invenção fornece uma formulação de variante de proteína Fc, em que a região Fc compreende pelo menos um aminoácido de ocorrência não natural selecionado do grupo que consiste de 239D, 330L e 332E, como numerado pelo índice EU como apresentado em Kabat. Opcionalmente, a região Fc ainda pode compreender um aminoácido de ocorrência não natural adicional em uma ou mais posições selecionadas do grupo que consiste de 252, 254, e 256, como numerado pelo índice EU como apresentado em Kabat. Em uma forma de realização específica, a presente invenção fornece uma formulação de variante de proteína Fc, em que a região Fc compreende pelo menos um aminoácido de ocorrência não natural selecionado do grupo que consiste de 239D, 330L e 332E, como numerado pelo índice EU como apresentado em Kabat and pelo menos uma um aminoácido de ocorrência não natural em uma ou mais posições are selecionada do grupo que consiste de 252Y, 254T e 256E, como numerado pelo índice EU como apresentado em Kabat.

[00249] Em uma outra forma de realização, a presente invenção fornece uma formulação de variante de proteína Fc, em que a região Fc compreende pelo menos um aminoácido de ocorrência não natural em uma ou mais posições selecionadas do grupo que consiste de 234, 235 e 331, como numerado pelo índice EU como apresentado em Kabat. Em uma forma de realização específica, a presente invenção fornece uma formulação de variante de proteína Fc, em que a região Fc compreende pelo menos um aminoácido de ocorrência não natural selecionado do grupo que consiste de 234F, 235F, 235Y e 331S, como numerado pelo índice EU como apresentado em Kabat. Opcionalmente, a região Fc ainda pode compreender um aminoácido de ocorrência não natural adicional em uma ou mais posições selecionadas do grupo que consiste de 252, 254 e 256, como numerado pelo índice EU como apresentado em Kabat. Em uma forma de realização específica, a presente invenção fornece uma formulação de variante de proteína Fc, em que a região Fc compreende pelo menos um aminoácido de ocorrência não natural selecionado do grupo que consiste de 234F, 235F, 235Y e 331S, como numerado pelo índice EU como apresentado em Kabat e pelo menos um aminoácido de ocorrência não natural em uma ou mais posições are selecionada do grupo que consiste de 252Y, 254T e 256E, como numerado pelo índice EU como apresentado em Kabat.

[00250] Em uma forma de realização, as variantes Fc da presente invenção podem ser combinadas com outras variantes Fc conhecidas, tais como aquelas divulgadas em Ghetie et al., 1997, Nat Biotech. 15:637-40; Duncan et al, 1988, Nature 332:563-564; Lund et al., 1991, J. Immunol 147:2657-2662; Lund et al, 1992, Mol Immunol 29:53-59; Alegre et al, 1994, Transplantation 57:1537-1543; Hutchins et al., 1995, Proc Natl. Acad Sci U S A 92:11980-11984; Jefferis et al, 1995, Immunol Lett. 44:111-117; Lund et al., 1995, Faseb J 9:115-119; Jefferis et al, 1996, Immunol Lett 54:101-104; Lund et al, 1996, J Immunol 157:4963-4969; Armour et al., 1999, Eur J Immunol 29:26132624; Idusogie et al, 2000, J Immunol 164:4178-4184; Reddy et al, 2000, J Immunol 164:1925-1933; Xu et al., 2000, Cell Immunol 200:16- 26; Idusogie et al, 2001, J Immunol 166:2571-2575; Shields et al., 2001, J Biol Chem 276:6591-6604; Jefferis et al, 2002, Immunol Lett 82:57-65; Presta et al., 2002, Biochem Soc Trans 30:487-490); Patente U. S. N° 5.624.821; 5.885.573; 5.677.425; 6.165.745; 6.277.375; 5.869.046; 6.121.022; 5.624.821; 5.648.260; 6.528.624; 6.194.551; 6.737.056; 6.821.505; 6.277.375; Publicação de Patente U. S. N°. 2004/0002587 e Publicações PCT WO 94/29351; WO 99/58572; WO 00/42072; WO 02/060919; WO 04/029207; WO 04/099249; WO 04/063351. Também abrangidos pela presente invenção estão as regiões Fc que compreendem anulações, adições e/ou modificações. Ainda, outras modificações/substituições/adições/anulações do domínio Fc estarão facilmente evidentes a uma pessoa habilitada na técnica.

[00251] Os métodos para gerar regiões Fc de ocorrência não natural são conhecidos na técnica. Por exemplo, as substituições e/ou anulações de aminoácido podem ser geradas por métodos de mutagênese, que inclui, mas não limita-se a, mutagênese direcionada ao local (Kunkel, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:488-492 (1985)), mutagênese de PCR (Higuchi, in "PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications", Academic Press, San Diego, pp. 177-183 (1990)) e mutagênese de cassete (Wells et al., Gene 34:315-323 (1985)). Preferivelmente, a mutagênese direcionada ao local é realizada pelo método de PCR de sobreposição-extensão (Higuchi, in "PCR Technology: Principles and Applications for DNA Amplification'', Stockton Press, New York, pp. 61-70 (1989)). A técnica de PCR de sobreposição-extensão (Higuchi, ibid.) também pode ser usada para a introdução de quaisquer mutações desejadas em uma sequência alvo (o DNA de partida). Por exemplo, a primeira série de PCR no método de sobreposição-extensão envolve amplificar a sequência alvo com um iniciador externo (iniciador 1) e um iniciador de mutagênese interno (iniciador 3) e separadamente com um segundo iniciador externo (iniciador 4) e um iniciador interno (iniciador 2), que produz dois segmentos de PCR (segmentos A e B). O iniciador de mutagênese interno (iniciador 3) é projetado para conter desacordos à sequência alvo que especifica as mutações desejadas. Na segunda série de PCR, os produtos da primeira série de PCR (segmentos A e B) são amplificados por PCR usando-se os dois iniciadores externos (iniciadores 1 and 4). O segmento de PCR de comprimento total resultante (segmento C) é digerido com enzimas de restrição e ofragmento de restrição resultante é clonado em um vetor apropriado. Como a primeira etapa de mutagênese, o DNA de partida (por exemplo, que codifica uma proteína de fusão Fc, um anticorpo ou, simplesmente uma região de Fc), é operacionalmente clonado em um vetor de mutagênese. Os iniciadores são projetados para refletir a substituição de aminoácido desejada. Outros métodos úteis para a geração de regiões de Fc variantes são conhecidos na técnica (ver, por exemplo, Patente U. S. N° 5.624.821; 5.885.573; 5.677.425; 6.165.745; 6.277.375; 5.869.046; 6.121.022; 5.624.821; 5.648.260; 6.528.624; 6.194.551; 6.737.056; 6.821.505; 6.277.375; Publicação de Patente U. S. N° 2004/0002587 e Publicações PCT WO 94/29351; WO 99/58572; WO 00/42072; WO 02/060919; WO 04/029207; WO 04/099249; WO 04/063351).

[00252] Em algumas formas de realização, uma variante de proteína Fc compreende uma ou mais glicoformas projetadas, isto é, uma composição de carboidrato que é covalentemente ligada à molécula que compreende uma região Fc. As glicoformas projetadas podem ser úteis para uma variedade de propósitos, que inclui mas não limita-se a intensificar ou reduzir a função atuadora. As glicoformas projetadas podem ser geradas por qualquer método conhecido por uma pessoa habilitada na técnica, por exemplo, usando-se cepas de expressão projetada ou variante, pela co-expressão com uma ou mais enzimas, por exemplo, DI N-acetilglucosaminiltransferase III (GnTI11), pelo qual expressa uma molécula que compreende uma região de Fc em vários organismos ou linhas celulares de vários organismos ou pela modificação de carboidratos após a molécula que compreende a região de Fc ser expressada. Os métodos para gerar glicoformas projetadas são conhecidas na técnica e inclui mas não limita-se àqueles descritos em Umana et al, 1999, Nat. Biotechnol 17:176-180; Davies et al., 20017 Biotechnol Bioeng 74:288-294; Shields et al, 2002, J Biol Chem 277:26733-26740; Shinkawa et al., 2003, J Biol Chem 278:3466-3473) Patente U. S. N° 6.602.684; U. S. Ser. N° 10/277.370; U. S. Ser. N° 10/113.929; PCT WO 00/61739A1; PCT WO 01/292246A1; PCT WO 02/311140A1; PCT WO 02/30954A1; tecnologia Potillegent™ (Biowa, Inc. Princeton, N.J.); tecnologia de projeto de glicosilação GlycoMAb™ (GLYCART biotechnology AG, Zurich, Switzerland). Ver, por exemplo, WO 00061739; EA01229125; US 20030115614; Okazaki et al., 2004, JMB, 336: 1239-49.

[00253] É considerado que uma variante de Fc descrita neste pode ser gerada de ou uma região de variante Fc descrita neste pode ser introduzida em qualquer anticorpo descrito na técnica que inclui mas não limita-se ao anticorpo monoclonal anti-fluoresceína, 4-4-20 (Kranz et al., 1982 J. Biol. Chem. 257(12): 6987-6995), um anticorpo anti- TAG72 humanizado (CC49) (Sha et al., 1994 Cancer Biother. 9(4): 341-9), um anticorpo que liga especificamente um Receptor Eph que inclui, mas não limita-se àqueles divulgados na Publicação PCT N°. WO 04/014292, WO 03/094859 e Pedido de Patente U. S. Série N° 10/863,729, anticorpos que ligam especificamente Integrina αVβ3 que inclui, mas não limita-se a, LM609 (Scripps), o LM609 monoclonal murino (publicação PCT WO 89/015155 e Patente U. S. N° 5.753.230); o anticorpo humanizado monoclonal MEDI-522 (a.k.a. VITAXIN®, MedImmune, Inc., Gaithersburg, MD; Wu et al., 1998, PNAS USA 95(11): 6037-6042; publicações PCT WO 90/33919 e WO 00/78815), um anticorpo contra interferon alfa como divulgado em WO/2005/05059106, um anticorpo contra o receptor de interferon 1 como divulgado em WO/2006/059106, Erbitux™ (também conhecido como IMC-C225) (ImClone Systems Inc.), um anticorpo monoclonal quimerizado contra EGFR; HERCEPTIN® (Trastuzumab) (Genentech, CA) que é um anticorpo monoclonal anti-HER2 humanizado para o tratamento de pacientes com câncer de mama metastático; REOPRO® (abciximab) (Centocor) que é um receptor anti- glicoproteína IIb/IIIa nas plaquetas para a prevenção de formação de coágulo; ZENAPAX® (daclizumab) (Roche Pharmaceuticals, Switzerland) que é um anticorpo monoclonal anti-CD25 imunosupressivo humanizado para a prevenção de rejeição a aloenxerto renal agudo. Outros exemplos são um anti-CD18 F(ab‘)2 humanizado (Genentech); CDP860 que é um anti-CD18 F(ab‘)2 humanizado (Celltech, UK); PRO542 que é um anticorpo anti-HIV gp120 fundido com CD4 (Progenics/Genzyme Transgenics); C14 que é um anti-CD14 anticorpo (ICOS Pharm); um anticorpo anti-VEGF IgG1 humanizado (Genentech); OVAREX™ que é um anticorpo anti- CA 125 murino (Altarex); PANOREX™ que é um anticorpo de antígeno IgG2a de superfície celular anti-17-IA murino (Glaxo Wellcome/Centocor); IMC-C225 que é um anticorpo IgG anti-EGFR IgG quimérico (ImClone System); VITAXIN™ que é um anticorpo humanizado anti-αVβ3 integrina (Applied Molecular Evolution/MedImmune); Campath 1H/LDP-03 que é um anticorpo humanizado anti CD52 IgG1 (Leukosite); Smart M195 que é um anticorpo humanizado anti-CD33 IgG (Protein Design Lab/Kanebo); RITUXAN™ que é um anticorpo quimérico anti-CD20 IgG1 (IDEC Pharm/Genentech, Roche/Zettyaku); LYMPHOCIDE™ que é um anticorpo humanizado anti-CD22 IgG (Immunomedics); Smart ID10 que é um anticorpo humanizado anti-HLA (Protein Design Lab); ONCOLYM™ (Lym-1) é um anticorpo radiorrotulado murino anti-HLA DR (Techniclone); anti-CD11a é um anticorpo humanizado IgG1 (Genetech/Xoma); ICM3 é um anticorpo humanizado anti-ICAM3 (ICOS Pharm); IDEC-114 é um anticorpo primatizado anti-CD80 (IDEC Pharm/Mitsubishi); ZEVALIN™ é um anticorpo radiorrotulado murino anti-CD20 (IDEC/Schering AG); IDEC-131 é um anticorpo humanizado anti-CD40L (IDEC/Eisai); IDEC-151 é um anticorpo primatizado anti- CD4 (IDEC); IDEC-152 é um anticorpo primatizado anti-CD23 (IDEC/Seikagaku); SMART anti-CD3 é um anti-CD3 IgG humanizado (Protein Design Lab); 5G1.1 é um anticorpo de fator 5 anti- complemento humanizado (C5) (Alexion Pharm); IDEC-151 é um anticorpo primatizado anti-CD4 IgG1 (IDEC Pharm/SmithKline Beecham); MDX-CD4 é um anticorpo humano anti-CD4 IgG (Medarex/Eisai/Genmab); CDP571 é um anticorpo humanizado anti- TNF-α IgG4 (Celltech); LDP-02 é um anticorpo humanizado anti-α4β7 (LeukoSite/Genentech); OrthoClone OKT4A é um anticorpo humanizado anti-CD4 IgG (Ortho Biotech); ANTOVA™ é um anticorpo humanizado anti-CD40L IgG (Biogen); ANTEGREN™ é um anticorpo humanizado anti-VLA-4 IgG (Elan); MDX-33 é um anticorpo humano anti-CD64 (FCYR) (Medarex/Centeon); rhuMab-E25 é um anticorpo humanizado anti-IgE IgG1 (Genentech/Norvartis/Tanox Biosystems); IDEC-152 é um anticorpo primatizado anti-CD23 (IDEC Pharm); ABX- CBL é um anticorpo murino anti CD-147 IgM (Abgenix); BTI-322 é um anticorpo de rato anti-CD2 IgG (Medimmune/Bio Transplant); Orthoclone/OKT3 é um anticorpo murino anti-CD3 IgG2a (ortho Biotech); SIMULECT™ é um anticorpo quimérico anti-CD25 IgG1 (Novartis Pharm); LDP-01 é um anticorpo humanizado anti-β2- integrina IgG (LeukoSite); Anti-LFA-1 é um anticorpo murino anti CD18 F(ab‘)2 (Pasteur-Merieux/Immunotech); CAT-152 é um anticorpo humano anti-TGF-β2 (Cambridge Ab Tech) e Corsevin M é um anticorpo quimérico anti-Fator VII (Centocor).

[00254] Os anticorpos adicionais que pdoem compreender uma variante de região Fc descrita neste pode ligar especificamente a um antígeno de câncer ou de tumor por exemplo, que inclui, mas não limita-se a, antígeno KS 1/4 pan-carcinoma (Perez and Walker, 1990, J. Immunol. 142: 3662-3667; Bumal, 1988, Hybridoma 7(4): 407-415), antígeno de carcinoma ovariano (CA125) (Yu et al., 1991, Cancer Res. 51(2): 468-475), fosfato ácido protático (Tailor et al., 1990, Nucl. Acids Res. 18(16): 4928), antígeno específico de próstata (Henttu and Vihko, 1989, Biochem. Biophys. Res. Comm. 160(2): 903-910; Israeli et al., 1993, Cancer Res. 53: 227-230), antígeno associado com melanoma p97 (Estin et al., 1989, J. Natl. Cancer Instit. 81(6): 445-446), antígeno de melanoma gp75 (Vijayasardahl et al., 1990, J. Exp. Med. 171(4): 1375-1380), antígeno de melanoma de peso molecular alto (HMW- MAA) (Natali et al., 1987, Cancer 59: 55-63; Mittelman et al., 1990, J. Clin. Invest. 86: 2136-2144), antígeno de membrana específico de próstata, antígeno carcinoembriônico (CEA) (Foon et al., 1994, Proc. Am. Soc. Clin. Oncol. 13: 294), antígeno de mucina epitelial polimórfico, antígeno de glóbulo de gordura de leite humano, antígenos associados com tumor colorretal tais como: CEA, TAG-72 (Yokata et al., 1992, Cancer Res. 52: 3402-3408), CO17-1A (Ragnhammar et al., 1993, Int. J. Cancer 53: 751-758); GICA 19-9 (Herlyn et al., 1982, J. Clin. Immunol. 2: 135), CTA-1 e LEA, antígeno- 38.13 de linfoma de Burkitt, CD19 (Ghetie et al., 1994, Blood 83: 13291336), antígeno-CD20 de linfoma B humano (Reff et al., 1994, Blood 83:435-445), CD33 (Sgouros et al., 1993, J. Nucl. Med. 34:422-430), antígenos específicos de melanoma tais como gangliosídeo GD2 (Saleh et al., 1993, J. Immunol., 151, 3390-3398), gangliosídeo GD3 (Shitara et al., 1993, Cancer Immunol. Immunother. 36:373-380), gangliosídeo GM2 (Livingston et al., 1994, J. Clin. Oncol. 12: 10361044), gangliosídeo GM3 (Hoon et al., 1993, Cancer Res. 53: 52445250), tipo de transplante específico de tumor de antígeno de superfície celular (TSTA) tal como antígenos tumorais viralmente induzidos que incluem vírus tumorais de DNA de antígeno T e antígenos de Envelope de vírus tumorais de RNA, fetoproteína de antígeno-alfa oncofetal tal como CEA de cólon, antígeno oncofetal de tumor de bexiga (Hellstrom et al., 1985, Cancer. Res. 45:2210-2188), antígeno de diferenciação, tal como antígeno de carcinoma de pulmão humano L6, L20 (Hellstrom et al., 1986, Cancer Res. 46: 3917-3923), antígenos de fibrosarcoma, antígeno de célula T de leucemia humana Gp37 (Bhattacharya-Chatterjee et al., 1988, J. of Immun. 141:13981403), neoglicoproteína, esfingolipídeos, antígeno de câncer de mama tal como EGFR (receptor do fator de crescimento epidérmico), antígeno de HER2 (p185HER2), mucina epitelial polimórfica (PEM) (Hilkens et al., 1992, Trends in Bio. Chem. Sci. 17:359), antígeno de linfócito humano maligno APO-1 (Bernhard et al., 1989, Science 245: 301-304), antígeno de diferenciação (Feizi, 1985, Nature 314: 53-57) tal como o antígeno I encontrado em eritrocitos fetais, antígeno I de endoderma primário encontrados em eritrócitos adultos, embriões de pré-implante, I(Ma) encontrado em adenocarcinomas gástricos, M18, M39 encontrado em epitélio de mama, SSEA-1 encontrado em células mielóides, VEP8, VEP9, Myl, VIM-D5, D156-22 encontrado em câncer colorretal, TRA-1-85 (grupo sanguíneo H), C14 encontrado em adenocarcinoma colônico, F3 encontrado em adenocarcinoma de pulmão, AH6 encontrado em câncer gástrico, Y hapteno, Ley encontrado em células de carcinoma embriônico, TL5 (grupo sanguíneo A), receptor de EGF encontrado em células A431, séries E1 (grupo sanguíneo B) encontrado em câncer pancreático, FC10.2 encontrado em células de carcinoma embrional, antígeno de adenocarcinoma gástrico, CO-514 (grupo sanguíneo Lea) encontrado em Adenocarcinoma, NS-10 encontrado em adenocarcinomas, CO-43 (grupo sanguíneo Leb), G49 encontrado em receptor de EGF de células A431, MH2 (grupo sanguíneo ALeb/Ley) encontrado em adenocarcinoma colônico, 19.9 encontrado em câncer de cólon, mucinas de câncer gástrico, T5A7 encontrado em células mielóides, R24 encontrado em melanoma, 4.2, GD3, D1.1, OFA-1, GM2, OFA-2, GD2 e M1:22:25:8 encontrado em células de carcinoma embrional e SSEA-3 e SSEA-4 encontrado em embriões de estágio celular de 4 a 8. Em uma forma de realização, o antígeno é um peptídeo derivado de receptor de célula T de um linfoma de célula T cutânea (ver, Edelson, 1998, The Cancer Journal 4:62).

[00255] Uma variante de Fc descrita neste pode ser gerada de ou uma variante de região Fc descrita neste pode ser introduzida em qualquer anticorpo. Além disso, uma variante de região Fc descrita neste pode ser utilizada para gerar uma proteína de fusão de Fc. Consequentemente, virtualmente qualquer molécula pode ser alvejada por e/ou incorporada em um anticorpo e/ou proteína de fusão Fc que compreende uma variante de Fc descrita neste que inclui, mas não limita-se à seguinte lista de proteínas, bem como subunidades, domínios, motivos e epítopos que pertencem à seguinte lista de proteínas: renina; um hormônio de desenvolvimento, que inclui hormônio de crescimento humano e hormônio de crescimento bovino; fator de liberação de hormônio de desenvolvimento; hormônio de paratiróide; hormônio de estímulo de tiróide; lipoproteínas; alfa-1- antitripsina; cadeia de insulina A; cadeia de insulina B; proinsulina; hormônio estimulador de folículo; calcitonina; hormônio de luteinização; glucagon; fatores de coagulação, tais como o fator VII, fator VIIIC, fator IX, fator de tecido (TF) e fator de von Willebrands; fatores anticoagulantes, tais como Proteína C; fator natriurético atrial; tensoativo de pulmão; um ativador de plasminogênio, tal como urocinase ou utina humana ou ativador de plasminogênio do tipo tecido (t-PA); bombesina; trombina; fator de desenvolvimento hemopoiético; fator alfa e beta de necrose de tumor; encefalinase; RANTES (regulado na ativação de célula T normalmente expressada e secretada); proteína inflamatória de macrófago humano (MIP-1-alfa); uma albumina de soro, tal como albumina de soro humano; substância de inibição de Muellerian; cadeia de relaxina A; cadeia de relaxina B; prorelaxina; peptídeo associado com a gonadotropina de camundongo; uma proteína microbiana, tal como beta-lactamase; DNase; IgE; um antígeno associado com T-linfócito citotóxico (CTLA), tal como CTLA- 4; inibina; activina; fator de crescimento endotelial vascular (VEGF); receptores para hormônuios ou fatores de crescimento, tais como, por exemplo, EGFR, VEGFR; interferons, tais como alfa interferon (α-IFN), beta interferon (β-IFN) e gama interferon (Y-IFN); componentes de receptor de interferon, tais como receptor de interferon 1; proteína A ou D; fatores reumatóides; um fator neurotrófico, tal como fator neurotrófico derivado de osso (BDNF), neurotrofin-3,-4,-5 ou -6 (NT-3, NT-4, NT-5, ou NT-6) ou um fator de desenvolvimento de nervo; fator de desenvolvimento de plaqueta (PDGF); fator de desenvolvimento de fibroblasto, tal como αFGF e βFGF; fator de desenvolvimento epidérmico (EGF); fator de desenvolvimento transformante (TGF) tal como TGF-alfa e TGF-beta, que inclui TGF-1, TGF-2, TGF-3, TGF-4, ou TGF-5; fator-I e -II de desenvolvimento semelhante a insulina (IGF- I e IGF-II); des (1-3)-IGF-I (IGF-I cerebral), proteína de ligação do fator de desenvolvimento semelhnte a insulina; proteínas CD, tais como CD2, CD3, CD4, CD 8, CD11a, CD14, CD18, CD19, CD20, CD22, CD23, CD25, CD33, CD34, CD40, CD40L, CD52, CD63, CD64, CD80 e CD147; eritropoietina; fatores osteoindutivos; imunotoxinas; uma proteína morfogenética óssea (BMP); um interferon, tal como interferon-alfa, -beta e -gama; fatores estimuladores de colônia (CSFs), tais como M-CSF, GM-CSF e G-CSF; interleucinas (ILs), por exemplo, IL-1 a IL-13; TNFα, HMGB1; HMGB2; superóxido dismutase; receptores de célula T; proteínas de membrana de superfície; fator de aceleração emd eclínio; antígeno viral, tal como, por exemplo, uma porção do envelope de AIDS, por exemplo, gp120; proteínas de transporte; receptores de retorno à origem; adressinas; proteínas reguladoras; moléculas de adesão celular, tais como LFA-1, Mac 1, p150.95, VLA-4, ICAM-1, ICAM-3 e VCAM, a4/p7 integrina e (Xv/p3 integrina que inclui a ou subunidades destes, subunidades de integrina alfa, tais como CD49a, CD49b, CD49c, CD49d, CD49e, CD49f, alfa7, alfa8, alfa9, alfaD, CD11a, CD11b, CD51, CD11c, CD41, alfaIIb, alfaIELb; subunidades de integrina beta, tais como, CD29, CD 18, CD61, CD104, beta5, beta6, beta7 e beta8; combinações de subunidade de Integrina que incluem mas não limitam-se a, αVβ3, αVβ5 e α4β7; diversos caminhos de apoptose; IgE; antígenos de grupo sanguíneo; receptor de flk2/flt3; receptor de obesidade (OB); receptor de mpl; CTLA-4; proteína C; uma quitinase ou molécula semelhante à quitinase, tal como YKL-40 e AMCase; um receptor de Eph, tal como EphA2, EphA4, EphB2, etc.; um antígeno de leucócito humano (HLA) tal como HLA-DR; proteínas de complemento, tais como receptor de complemento CR1, C1Rq e outros fatores de complemento, tais como C3 e C5; um receptor de glicoproteína, tal como GpIbα, GPIIb/IIIa e CD200; moléculas co-estimuladoras, tais como CD28/CTLA-4, ICOS/AILIM, PD-1.

[00256] As molécuals adicionais que podem compreender uma região Fc variante neste são aquelas que ligam especificamente antígenos de câncer que incluem, mas não limitam-se a, receptor de ALK (receptor de pleiotrofina), pleiotrofina, antígeno KS 1/4 pan- carcinoma; antígeno de carcinoma ovariano (CA125); fosfato ácido prostático; antígeno específico de próstata (PSA); antígeno associado com melanoma p97; antígeno de melanoma gp75; antígeno de melanoma de peso molecular alto (HMW-MAA); antígeno de membrana específico de próstata; antígeno carcinoembriônico (CEA); antígeno de mucina epitelial polimórfico; antígeno de glóbulo de gordura de leite humano; antígenos associados com o tumor colorretal, tais como: CEA, TAG-72, CO17-1A, GICA 19-9, CTA-1 e LEA; antígeno-38.13 de linfoma de Burkitt; CD19; antígeno-CD20 de linfoma B Bhumano; CD33; antígenos específicos de melanoma, tais como gangliosídeo GD2, gangliosídeo GD3, gangliosídeo GM2 e gangliosídeo GM3; tipo de transplante específico de antígeno de superfície de célula tumoral (TSTA); antígenos tumorais induzidos viralmente que incluem o antígeno T, vírus de tumor de DNA e antígenos de Envelope de vírus tumorais de RNA; antígeno-alfa- fetoproteína oncofetal, tal como CEA de cólon, glicoproteína de tromboplasto oncofetal 5T4 e antígeno oncofetal de câncer de bexiga; antígeno de diferenciação, tal como antígenos de carcinoma de pulmão humano L6 e L20; antígenos de fibrosarcoma; antígeno-Gp37 de célula T de leucemia humana; neoglicoproteína; esfingolipídeos; antígenos de câncer de mama, tais como EGFR (receptor do fator de desenvolvimento epidérmico); antígeno NY-BR-16; NY-BR-16 e HER2 (p185HER2); mucina epitelial polimórfica (PEM); antigen-APO-1 de linfócito humano maligno; antígeno de diferenciação, tal como o antígeno I encontrado em eritrócitos fetais; antígeno I de endoderma primário encontrado em eritrócitos adultos; embriões pré-implantação; I(Ma) encontrado em adenocarcinomas gástricos; M18, M39 encontrado em epitélio mamário; SSEA-1 encontrado em células mielóides; VEP8; VEP9; Myl; VIM-D5; D156-22 encontrado em câncer colorretal; TRA-1-85 (grupo sanguíneo H); SCP-1 encontrado em câncer de testículos e de ovário; C14 encontrado em adenocarcinoma colônico; F3 encontrado em adenocarcinoma pulmonar; AH6 encontrado em câncer gástrico; Y hapteno; Ley encontrado em células de carcinoma embrional; TL5 (grupo sanguíneo A); receptor de EGF encontrado em células A431; séries E1 (grupo sanguíneo B) encontrado em câncer pancreático; FC10.2 encontrado em células de carcinoma embriônico; antígeno de adenocarcinoma gástrico; CO-514 (grupo sanguíneo Lea) encontrado em Adenocarcinoma; NS-10 encontrado em adenocarcinomas; CO-43 (grupo sanguíneo Leb); G49 encontrado em EGF receptor de células A431; MH2 (grupo sanguíneo ALeb/Ley) encontrado em adenocarcinoma colônico; 19.9 encontrado em câncer de cólon; mucinas de câncer gástrico; T5A7 encontrado em células mielóides; R24 encontrado em melanoma; 4.2, GD3, D1.1, OFA-1, GM2, OFA-2, GD2, e M1:22:25:8 encontrado em células de carcinoma embriônico e SSEA-3 e SSEA-4 encontrado em embriões de estágio de 4 a 8; antígeno de linfoma de célula T cutânea; antígeno MART-1; antígeno Sialy Tn (STn); antígeno de câncer de cólon NY- CO-45; antígeno de câncer de pulmão NY-LU-12 variante A; antígeno de adenocarcinoma ART1; antígeno de câncer de cérebro-testículo paraneoplástico associado (antígeno onconeuronal MA2; antígeno neuronal paraneoplástico); antígeno ventral neuro-oncológico 2 (NOVA2); gene de antígeno de carcinoma hepatocelular 520; ANTÍGENO ASSOCIADO COM TUMOR CO-029; antígenos associados com tumor MAGE-C1 (antígeno de câncer/testículos CT7), MAGE-B1 (antígeno MAGE-XP), MAGE-B2 (DAM6), MAGE-2, MAGE- 4a, MAGE-4b e MAGE-X2; antígeno de câncer-testículos (NY-EOS-1); YKL-40 e fragmentos de qualquer um dos polipeptídeos listados acima.

5.14. GLICOSILAÇÃO DE ANTICORPOS

[00257] Ainda em uma outra forma de realização, a glicosilação de anticorpos utilizados de acordo com a invenção é modificada. Por exemplo, um anticorpo aglicosilado pode ser feito (isto é, o anticorpo precisa de glicosilação). A glicosilação pode ser alterada para, por exemplo, aumentar a afinidade do anticorpo para um antígeno alvo. Tais modificações de carboidrato podem se realizadas por, por exemplo, alteração de um ou mais locais de glicosilação dentro da sequência de anticorpo. Por exemplo, uma ou mais substituições de aminoácido podem ser feitas resultando na eliminação de um ou mais locais de glicosilação de estrutura de região variável para, desse modo, eliminar a glicosilação naquele local. Tal aglicosilação pode aumentar a afinidade do anticorpo ao antígeno. Um tal método ainda é descrito em detalhes na Patente U. S. N° 5.714.350 e 6.350.861. Uma ou mais substituições de aminoácido também podem ser feitas resultando na eliminação de um local de glicosilação presente em uma região Fc (por exemplo, Asparagine 297 de IgG). Além disso, os anticorpos aglicosilados podem ser produzidos em células bacterianas que precisam do maquinário de glicosilação necessário.

[00258] Um anticorpo também pode ser feito tendo um tipo alterado de glicosilação, tal como um anticorpo hipofucosilado tendo quantidades reduzidas de resíduos de fucosila ou um anticorpo tendo estruturas de GlcNAc de divisão aumentada. Tais padrões de glicosilação alterados foram demonstrados aumentar a capacidade de ADCC de anticorpos. Tais modificações de carboidrato podem ser realizadas, por exemplo, expressando o anticorpo em uma célula hospedeira com maquinário de glicosilação alterado. As células com maquinário de glicosilação alterado foi descrito na técnica e pode ser usado como células hospedeiras em que expressam os anticorpos recombinantes da invenção para, desse modo produzir um anticorpo com glicosilação alterada. Ver, por exemplo, Shields, R.L. et al. (2002) J. Biol. Chem. 277:26733-26740; Umana et al. (1999) Nat. Biotech. 17:176-1, bem como, patente U. S. N° US 6.946.292; Patente Européia N° EP 1.176.195; publicações PCT WO 03/035835; WO 99/54342 cada um dos quais é incorporado neste por referência em sua totalidade.

5.15. FUNÇÃO ATUADORA DE PROJETO

[00259] Pode ser desejável modificar um anticorpo anti-CD19 da invenção com respeito à função atuadora, a fim de intensificar a eficácia do anticorpo no tratamento de malignidades de célula B, por exemplo. Por exemplo, resíduos de cisteína podem ser introduzidos na região Fc, desse modo permitindo a formação de ligação de bissulfeto intercadeia em sua região. O anticorpo homodimérico gerado desta maneira podem ter capacidade de internalização melhorada e/ou morte celular mediada por complemento aumentada e/ou citotoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC). Ver, Caron et al., J. Exp Med., 176:1191-1195 (1992) and Shopes, B., J. Immunol., 148:2918-2922 (1992). Os anticorpos homodiméricos com atividade anti-tumor intensificada também podem ser preparados usando-se reticuladores heterobifuncionais como descrito em Wolff et al., Cancer Research, 53:2560-2565 (1993). Um anticorpo também pode ser projetado tendo regiões de Fc duplas e pode, desse modo, Ter lise de complementar intensificada e capacidades de ADCC. Ver, Stevenson et al., Anti-Cancer Drug Design, 3:219-230 (1989).

[00260] Outros métodos de projetar regiões de Fc de anticorpos a fim de alterar as unções atuadoras são conhecidas na técnica (por exemplo, Publicação de patente U. S. N° 20040185045 e Publicação PCT N° WO 2004/016750, ambas concedidas a Koenig et al., que descreve a alteração de uma região Fc para intensificar a afinidade de ligação for FCYRIIB em comparação com uma afinidade de ligação para FCYRIIA; ver também, Publicação PCT N°. WO 99/58572 concedida a Armour et al., WO 99/51642 concedida a Idusogie et al., e U. S. 6.395.272 concedida a Deo et al.; cujas divulgações são incorporadas neste em suas totalidades). Métodos de modificar a região Fc para diminuir a afinidade de ligação ao FCYRIIB também são conhecidos na técnica (por exemplo, Publicação de patente U. S. N° 20010036459 e Publicação PCT N° WO 01/79299, ambas concedidas a Ravetch et al., cujas divulgações são incorporadas neste em suas totalidades). Os anticorpos modificados tendo regiões de Fc variantes com afinidade de ligação intensificada para FCYRIIIA e/ou FCYRIIA em comparação com uma região Fc do tipo selvagem também foi descrita (por exemplo, Publicação PCT N°. WO 2004/063351, concedida a Stavenhagen et al., cuja divulgação é incorporada neste em sua totalidade).

[00261] Os ensaios in vitro conhecidos na técnica podem ser usados para determinar quando os anticorpos anti-CD19 usados nas composições e métodos da invenção são capazes de mediar ADCC, tal como aqueles descritos neste.

5.16. FABRICAÇÃO/PRODUÇÃO DE ANTICORPOS ANTI-CD19

[00262] Uma vez que um anticorpo anti-CD19 desejado é projetado, o anticorpo anti-CD19 pode ser produzido em uma escala comercial usado-se métodos que são bem conhecidos na técnica para a fabricação em grande escala de anticorpos. Por exemplo, isto pode ser realizado usando-se sistemas de expressão recombinantes tais como, mas não limitando-se àqueles descritos abaixo.

5.17. SISTEMAS DE EXPRESSÃO RECOMBINANTES

[00263] A Expressão recombinante de um anticorpo ou variante destes, no geral, requer a construção de um vetor de expressão contendo um polinucleotídeo que codifica o anticorpo. Uma vez que um polinucleotídeo codifica uma molécula de anticorpo ou uma cadeia pesada ou leve de um anticorpo ou uma porção deste, foi obtido, o vetor para a produção da molécula de anticorpo pode ser produzido pela tecnologia de DNA recombinante usando-se as técnicas bem conhecidas na técnica. Ver, por exemplo, Patente U. S. N° 6.331.415, que é incorporada neste por referência em sua totalidade. Desta maneira, métodos para a preparação uma proteína que expressa um polinucleotídeo contendo um anticorpo que codifica a sequência de nucleotídeos são descritos neste. Os métodos que são bem conhecidos por aqueles habilitados na técnica podem ser usados para construir vetores de expressão contendo sequências codificadoras de anticorpo e sinais de controle de transcrição e de tradução apropriados. Estes métodos incluem, por exemplo, técnicas de DNA recombinante in vitro, técnicas sintéticas e recombinação genética in vivo. A invenção, desta maneira, fornece vetores replicáveis que compreendem uma sequência de nucleotídeo que codifica uma molécula de anticorpo, a cadeia pesada ou leve de um anticorpo, um domínio variável de cadeia pesada ou leve de um anticorpo ou uma porção destes ou um CDR de cadeia pesada ou leve, operacionalmente ligado a um promotor. Tais vetores podem incluir a sequência de nucleotídeo que codifica a região constante da molécula de anticorpo (ver, por exemplo, Publicação Internacional N° WO 86/05807 e WO 89/01036 e Patente U. S. N° 5,122,464) e o domínio variável do anticorpo pode ser clonado em um tal vetor para a expressão da cadeia pesada total e da cadeia leve total ou ambas as cadeias pesadas e leves inteiras.

[00264] Em uma outra forma de realização, os anticorpos anti-CD19 podem ser feitos usando-se a recombinação homóloga alvejada para produzir todos ou porções dos anticorpos anti-CD19 (ver, Patente U. S. N° 6,063,630, 6,187,305, e 6,692,737). Em certas formas de realização, os anticorpos anti-CD19 podem ser feitos usando-se técnicas de recombinação aleatórias para produzir todos ou porções dos anticorpos anti-CD19 (ver, Patente U. S. N° 6,361,972, 6,524,818, 6,541,221 e 6,623,958). Os anticorpos anti-CD19 também podem ser produzidos em células que expressam um anticorpo de uma sequência genômica da célula que compreende um local de imunoglobulina modificado usando-se a recombinação homóloga específica de local mediada por Cre (ver, Patente U. S. N° 6,091,001). A linha de célula hospedeira pode ser derivada de espécies humanas e não humanas que inclui mas não limita-se a um camundongo e a um hamster chinês. Quando a produção de anticorpo humano ou humanizado é desejada, a linha de célula hospedeira deve ser uma linha celular humana. Estes métodos podem ser vantajosamente usados para projetar linhas celulares estáveis que expressam permanentemente a molécula de anticorpo.

[00265] Uma vez que o vetor de expressão é transferido a uma célula hospedeira por técnicas convencionais, as células transfectadas são então cultivadas por técnicas convencionais para produzir um anticorpo. Desta maneira, a invenção inclui células hospedeiras contendo um polinucleotídeo que codifica um anticorpo da invenção ou fragmentos destes ou uma cadeia pesada ou leve destes ou uma porção deste ou um anticorpo de cadeia simples da invenção, operacionalmente ligado a um promotor heterólogo. Em certas formas de realização, para a expressão de anticorpos de cadeia dupla, os vetores que codificam tanto as cadeias leves quanto as cadeias pesadas podem ser co-expressados na célula hospedeira para a expressão da molécula de imunoglobulina total, como detalhado abaixo.

[00266] Uma variedade de sistemas de vetor de expressão de hospedeiro pode ser utilizada para a expressão de um anticorpo anti- CD19 ou porções destes que podem ser usadas no projeto e geração de anticorpos anti-CD19 (ver, por exemplo, Patente U. S. N° 5,807,715). Por exemplo, as células de mamíferos, tais como as células de ovário de hamster chinês (CHO), em conjunção com um vetor, tal como o elemento do promotor de gene precoce intermediário principal de citomegalovírus humano em um sistema de expressão eficaz para anticorpos (Foecking et al., Gene, 45:101 (1986) e Cockett et al., Bio/Technology, 8:2 (1990)). Além disso, uma cepa de célula hospedeira pode ser escolhida modulando a expressão de sequências de anticorpo ou modifica ou processa o produto de gene de anticorpo da maneira específica desejada. Tais modificações (por exemplo, glicosilação) e processamento (por exemplo, clivagem) de produtos de proteína podem ser importantes para a função da proteína. As células hospedeiras diferentes tem mecanismos característicos e específicos para o processo e modificação pós-tradução de proteínas e produtos de gene. As linhas celulares apropriadas ou sistemas hospedeiros podem ser escolhidos para garantir a modificação e o processamento corretos do anticorpo ou porção deste expressado. Para este fim, as células hospedeiras eucarióticas que possuem o maquinário celular para o processamento apropriado da transcrição primária, glicosilação e fosforilação do produto de gene podem ser usadas. Tais células hospedeiras de mamífero incluem mas não limitam-se a CHO, VERY, BHK, Hela, COS, MDCK, 293, 3T3, W138, BT483, Hs578T, HTB2, BT2O e T47D, NS0 (uma linha celular de mieloma de murino que não produz endogenamente quaisquer cadeias de imunoglobulina funcionais), células CRL7O3O e HsS78Bst.

[00267] Em uma forma de realização, as linhas celulares humanas que se desenvolveram pela imortalização de linfócitos humanos podem ser usados para produzir, recombinantemente os anticorpos monoclonais humanos anti-CD19. Em uma forma de realização, a linha celular humana PER.C6. (Crucell, Netherlands) podem ser usados para a produção recombinante de anticorpos monoclonais humanos anti-CD19.

[00268] em sistemas bacterianos, diversos vetores de expressão podem ser vantajosamente selecionados dependendo do uso pretendido da molécula de anticorpo sendo expressada. Por exemplo, quando uma quantidade grande de um tal anticorpo deve ser produzida, para a geração de composições farmacêuticas que compreendem um anticorpo anti-CD19, vetores que direcionam a expressão de níveis altos de produtos de proteína de fusão que são facilmente purificados podem ser desejados. Tais vetores incluem, mas não limita-se ao vetor de expressão de E. coli pUR278 (Ruther et al., EMBO, 12:1791 (1983)), em que a sequência codificadora de anticorpo pode ser ligada individualmente no vetor na estrutura com a região codificadora lac Z de modo que uma proteína de fusão seja produzida; vetores pIN (Inouye & Inouye, 1985, Nucleic Acids Res. 13:3101-3109 (1985); Van Heeke & Schuster, 1989, J. Biol. Chem., 24:5503-5509 (1989)) e outros. Os vetores pGEX também podem ser usados para a expressão de polipeptídeos estranhos como proteínas de fusão com glutationa-S-transferase (GST). No geral, tais proteínas de fusão são solúveis e podem ser facilmente purificadas pela absorção e ligação à matriz de afinidade de glutationa-agarose seguido pela eluição na presença de glutationa livre. Os vetores pGEX são projetados para introduzir atrombina e/ou locais de clivagem de fator Xa protease no polipeptídeo expressado de modo que o produto de gene alvo clonado pode ser liberado da porção GST.

[00269] Em um sistema de inseto, o vírus da poliedrose nuclear de Autographa californica (AcNPV) é suado como um vetor para a expressão de genes estranhos. O vírus desenvolve-se em células de Spodoptera frugiperda. A sequência codificadora de anticorpo pode ser clonada de maneira individual em regiões não essenciais (por exemplo, o gene de poliedrina) do vírus e colocado sob controle de um promotor AcNPV (por exemplo, o promotor de poliedrina).

[00270] Em células hospedeiras de mamífero, diversos sistemas de expressão com base em vírus podem ser utilizados. Em casos onde um adenovírus é usado como um vetor de expressão, a sequência que codifica o anticorpo de interesse pode ser ligada a um complexo de controle de transcrição/tradução de adenovírus, por exemplo, o último promotor e a sequência líder tripartida. Este gene quimérico pode ser então inserido no genoma do adenovírus pela recombinação in vitro ou in vivo. A inserção em uma região não essencial do genoma viral (por exemplo, região El ou E3) resultará em um vírus recombinante que é viável e capaz de expressar a molécula de anticorpo em hospedeiros infectados (por exemplo, ver, Logan & Shenk, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:355-359 (1984)). Os sinais de iniciação específicos também podem ser requeridos para a tradução eficiente sequências codificadoras de anticorpo inserido. Estes sinais incluem o códon de iniciação de ATG e as sequências adjacentes. Além disso, o códon de iniciação, no geral, deve estar na estrutura com a estrutura de leitura da sequência codificadora desejada para garantir a tradução da inserção inteira. Estes sinais de controle de tradução exógenos e os códons de iniciação podem ser de uma variedade de origens, tanto naturais quanto sintéticas. A eficiência de expressão pode ser intensificada pela inclusão de elementos intensificadores de transcrição apropriados, terminadores de transcrição, etc. (ver, por exemplo, Bittner et al., Methods in Enzymol., 153:51-544(1987)).

[00271] A expressão estável pode ser suada para a produção de rendimento alto de longo prazo de proteínas recombinantes. Por exemplo, as linhas celulares que expressam estavelmente a molécula de anticorpo podem ser geradas. As células hospedeiras podem ser transformadas com um vetor apropriadamente projetado que compreende os elementos de controle de expressão (por exemplo, intensificador de promotor, intensificador, terminadores de transcrição, locais de poliadenilação, etc.) e um gene marcador selecionável. Seguindo a introdução de DNA estranho, as células podem ser deixadas desenvolver por 1 a 2 dias em um meio enriquecido e que é trocado por um meio seletivo. O marcador selecionável no plasmídeo recombinante confere resistência à seleção e permite que as células integram-se estavelmente ao plasmídeo em seu cromossomos para se desenvolver e formar focos que, por sua vez, podem ser clonados e expandidos em linhas celulares. Os plasmídeos que codificam um anticorpo anti-CD19 podem ser usados para a introdução do gene/cDNA em qualquer linha celular adequada para a produção na cultura.

[00272] Diversos sistemas de seleção podem ser usados, que incluem, mas não limitam-se aos genes de timidina cinase do vírus do herpes simples (Wigler et al., Cell, 11:223 (1977)), hipoxantinoguanina fosforibosiltransferase (Szybalska & Szybalski, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 48:202 (1992)) e adenina fosforibosiltransferase (Lowy et al., Cell, 22:8-17 (1980)) podem ser utilizados em células tk-, hgprt- ou aprT-, respectivamente. Também, a resistência a antimetabólito pode ser usada como a base de seleção para os genes seguintes: dhfr, que confere resistência ao metotrexato (Wigler et al., Natl. Acad. Sci. USA, 77:357 (1980); O’Hare et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78:1527 (1981)); gpt, que confere resistência ao ácido micofenólico (Mulligan & Berg, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78:2072 (1981)); neo, que confere resistência ao aminoglicosídeo G-418 (Wu and Wu, Biotherapy 3:87-95 (1991); Tolstoshev, Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 32:573-596 (1993); Mulligan, Science 260:926-932 (1993) e Morgan and Anderson, Ann. Rev. Biochem. 62:191-217 (1993); May, TIB TECH 11(5):l55-2 15 (1993)) e hygro, que confere resistência à higromicina (Santerre et al., Gene, 30:147 (1984)). Os métodos comumente conhecidos na técnica de tecnologia de DNA recombinante podem ser rotineiramente aplicados para selecionar o clone recombinante desejado e tais métodos são descritos, por exemplo, em Ausubel et al. (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY (1993); Kriegler, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY (1990) e nos capítulos 12 e 13, Dracopoli et al. (eds.), Current Protocols in Human Genetics, John Wiley & Sons, NY (1994); Colberre-Garapin et al., 1981, J. Mol. Biol., 150:1, que são incorporados por referência neste em suas totalidades.

[00273] Os níveis de expressão de uma molécula de anticorpo podem ser aumentados pela amplificação de vetor (para uma revisão ver, Bebbington and Hentschel, The use of vectors based on gene amplification for the expression of cloned genes in mammalian cells in DNA cloning, Vol. 3. Academic Press, New York (1987)). Quando um marcador no sistema de vetor que expressa anticorpo é amplificável, o aumento no nível de inibidor presente na cultura de célula hospedeira aumenta o número de cópias do gene marcador. Visto que a região amplificada está associada com o gene do anticorpo, a produção do anticorpo também aumentará (Crouse et al., Mol. Cell. Biol., 3:257 (1983)). Os níveis de expressão de anticorpo podem ser amplificados através do uso de métodos e ferramentas recombinantes conhecidos por aqueles habilitados na técnica da produção de proteína recombinante, que inclui tecnologias que remodelam a cromatina circundante e intensifica a expressão de transgene na forma de um domínio transcripcional artificial ativo.

[00274] A célula hospedeira pode ser co-transfectada com dois vetores de expressão, o primeiro vetor codificando um polipeptídeo derivado de cadeia pesada e o segundo vetor codificando um polipeptídeo derivado de cadeia leve. Os dois vetores podem conter marcadores selecionáveis idênticos ou diferentes. Um vetor simples que codifica e que é capaz de expressar, tanto polipeptídeos de cadeia pesada quanto de cadeia leve também pode ser usado. Em tais situações, a cadeia leve deve ser colocada 5’ com relação à cadeia pesada para evitar um excesso de cadeia pesada isenta de tóxicos (Proudfoot, Nature 322:562-65 (1986) e Kohler, 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:2197 (1980)). As sequências codificadoras para as cadeias pesadas e leves podem compreender cDNA ou DNA genômico.

[00275] Uma vez que uma molécula de anticorpo foi produzida pela expressão recombinante, esta pode ser purificada por qualquer método conhecido na técnica para a purificação de uma molécula de imunoglobulina, por exemplo, pela cromatografia (por exemplo, troca iônica, afinidade, particularmente pela afinidade aos antígenos específicos Proteína A ou Proteína G e cromatografia de coluna de dimensionamento), centrifugação, solubilidade diferencial ou por qualquer outra técnica padrão para a purificação de proteínas. Além disso, os anticorpos da presente invenção ou fragmentos destes podem ser fundidos a sequências de polipeptídeo heterólogas descritas neste ou de outra maneira conhecidos na técnica para facilitar a purificação.

5.17.1. PURIFICAÇÃO E ISOLAMENTO DE ANTICORPO

[00276] Quando usa-se técnicas recombinantes, o anticorpo pode ser produzido de maneira intracelular, no espaço periplásmico ou diretamente secretado no meio. Se o anticorpo for produzido de maneira intracelular, como uma primeira etapa, os escombros particulados, células hospedeiras ou fragmentos lisados, são removidos, por exemplo, pela centrifugação ou ultrafiltração. Carter et al., Bio/Technology, 10:163-167 (1992) descreve um procedimento para isolar os anticorpos que são secretados no espaço periplásmico de E. coli. Resumidamente, a pasta celular é descongelada na presença de acetato de sódio (pH 3,5), EDTA e fluoreto de fenilmetilsulfonila (PMSF) em cerca de 30 minutos. Os escombros celulares podem ser removidos por centrifugação. Quando o anticorpo mutante é secretado no meio, os sobrenadantes para tais sistemas de expressão são, no geral, primeiro concentrados usando-se o filtro de concentração de proteína comercialmente disponível, por exemplo, uma unidade de ultrafiltração Amicon ou Millipore Pellicon. Um inibidor de protease, tal como PMSF pode estar incluído em qualquer uma das etapas precedentes para inibir a proteólise e os anticorpos podem ser incluídos para evitar o desenvolvimento de contaminantes adventícios contaminantes.

[00277] A composição de anticorpo preparada a partir das células pode ser purificada usando-se, por exemplo, cromatografia de hidroxilapatita, cromatografia de interação hidrofóbica, cromatografia trocadora de íons, eletroforese em gel, diálise e/ou cromatografia de afinidade sozinho ou em combinação com outras etapas de purificação. A adequabilidade da proteína A como um ligando de afinidade depende das espécies e do isotipo de qualquer domínio de imunoglobulina Fc que está presente no anticorpo mutante. A proteína A pode ser usada para a purificação de anticorpos que são fundamentados em cadeias pesadas de y1, Y 2 ou Y 4 humanas (Lindmark et al., J. Immunol. Methods, 62:1-13 (1983)). A proteína G é recomendada para todos os isotipos de camundongos e para o y3 humano (Guss et al., EMBO J., 5:15671575 (1986)). A matriz cujo ligando de afinidade é ligado é mais frequentemente agarose, mas outras matrizes estão disponíveis. As matrizes mecanicamente estáveis, tais como vidro com poro controlado ou poli(estirenodivinil)benzeno permite taxas de fluxo mais rápidas e tempos de processamento mais curtos do que pode ser atingido com agarose. Quando o anticorpo compreende um domínio CH3, a resina Bakerbond ABX (J. T. Baker, Phillipsburg, NJ) é útil para a purificação. Outras técnicas para a purificação, tais como o fracionamento em uma coluna de troca iônica, precipitação de etanol, HPLC de Fase Reversa, cromatografia em sílica, cromatografia em heparina, SEPHAROSE cromatografia em uma resina trocadora de ânion ou cátion (tal como uma cluna de ácido poliaspártico), cromatofocalização, SDS-PAGE e precipitação de sulfato de amônio também estão disponíveis dependendo do anticorpo a ser recuperado.

[00278] Seguindo quaisquer etapas de purificação preliminares, a mistura que compreende o anticorpo de interesse e os contaminantes podem ser submetidos à cromatografia de interação hidrofóbica de Ph baixo usando-se um tampão de eluição em um pH entre cerca de 2,5 e 4,5 e realizado em concentrações com baixo teor de sal (por exemplo, de cerca de 0 a 0,25 M de sal).

5.18. ANTICORPOS ANTI-CD19 TERAPÊUTICOS

[00279] Um anticorpo anti-CD19 usado nas composições e métodos da invenção pode ser uma anticorpo humano ou um anticorpo humanizado que pode mediar a apoptose da linhagem de célula B e/ou o ADCC humano ou pode ser selecionado de anticorpos anti- CD19 conhecidos que pdoem mediar a apoptose de célula de linhagem B e/ou ADCC humano. Em certas formas de realização, os anticorpos anti-CD19 podem ser anticorpos quiméricos. Em certas formas de realização, um anticorpo anti-CD19 pode ser um anticorpo monoclonal anti-CD19 humano, humanizado ou quimérico. Um anticorpo anti-CD19 usado nas composições e métodos da invenção podem ser um anticorpo humano ou um anticorpo humanizado do isotipo humano IgG1 ou IgG3 ou qualquer alelo de IgG1 ou IgG3 encontrado na população humana. Em outras formas de realização, um anticorpo anti-CD19 usado nas composições e métodos da invenção pode ser um anticorpo humano ou um anticorpo humanizado do isotipo humano de IgG2 ou IgG4 ou qualquer alelo IgG2 ou IgG4 encontrado na população humana.

[00280] Enquanto tais anticorpos podem ser gerados usando-se as técnicas, em outras formas de realização da invenção, os anticorpos HB12A e HB12B de murino como descrito neste ou outros anticorpos anti-CD19 comercialmente disponíveis podem ser quimerizado, humanizados ou feitos em humanos.

[00281] Por exemplo, os anticorpos anti-CD19 conhecidos que podem ser usados incluem, mas não limitam-se a, HD37 (IgG1, capa) (DAKO North America, Inc,, Carpinteria, CA), BU12 (Callard et al., J. Immunology, 148(10):2983-7 (1992) ), 4G7 (IgG1) (Meeker et al., Hybridoma, 3(4):305-20 (1984 Winter) ), J4.119 (Beckman Coulter, Krefeld, Germany), B43 (PharMingen, San Diego, CA), SJ25C1 (BD PharMingen, San Diego, CA), FMC63 (IgG2a) (Zola et al., Immunol.Cell.Biol. 69(PT6): 411-22 (1991); Nicholson et al., Mol. Immunol., 34:1157-1165 (1997); Pietersz et al., Cancer Immunol. Immunotherapy, 41:53-60 (1995)), 89B(B4) (IgG1) (Beckman Coulter, Miami, FL; Nadler et al., J. Immunol., 131:244-250 (1983)), e/ou HD237 (IgG2b) (Fourth International Workshop on Human Leukocyte Differentiation Antigens, Vienna, Austria, 1989 e Pezzutto et al., J. Immunol., 138(9):2793-2799 (1987)).

[00282] Em certas formas de realização, o anticorpo é uma variante substituída por isotipo de um anticorpo conhecido (por exemplo, a um isotipo humano IgG1 ou IgG3) tal como aqueles descritos acima.

[00283] Um anticorpo anti-CD19 usado nas composições e métodos da invenção podem ser anticorpos, imunoconjugados ou proteínas de fusão nus. Os anticorpos anti-CD19 descritos acima para o uso nas composições e métodos da invenção podem ser capazes de reduzir ou anular as células B e circular imunoglobulina em um ser humano ratado com este. A depleção de células B pode ocorrer em células B circulantes, ou em tecidos particulares, tais como, mas não limitando- se a, medula óssea, baço, tecidos linfóides associados com o intestino e/ou linfonodos. Tal depleção pode ser atingida por intermédio de vários mecanismos, tais como citotoxicidade mediada por célula dependente de anticorpo (ADCC) e/ou pelo bloqueio da interação com CD19 com seu ligando pretendido e/ou citotoxicidade dependente de complemento (CDC), inibição de proliferação de célula B e/ou indução de morte de célula B (por exemplo, por intermédio da apoptose). Por “depleção” de células B é entendida uma redução em células B circulantes e/ou células B em tecidos particulares por pelo menos cerca de 25 %, 40 %, 50 %, 65 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % ou mais. Nas formas de realização particulares, virtualmente, todas as células B detectáveis são esgotadas para a circulação e/ou tecidos particulares. Por “esgotamento” de imunoglobulina circulante (Ig) é entendida uma redução por pelo menos cerca de 25 %, 40 %, 50 %, 65 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % ou mais. Nas formas de realização particulares, virtualmente, todos os Ig detectáveis são esgotados para a circulação.

5.18.1. AVALIAÇÃO DE ANTICORPOS PARA A LIGAÇÃO DE CD19 HUMANO

[00284] Os ensaios de ligação podem ser usados para identificar anticorpos que ligam o antígeno de CD19 humano. Os ensaios de ligação podem ser realizados como ensaios de ligação direta ou como ensaios de ligação de competição. A ligação pode ser detectada usando-se ELISA padrão ou ensaios de citometria de fluxo padrão. Em um ensaio de ligação direta, um anticorpo candidato é testado para a ligação ao antígeno de CD19 humano. Em certas formas de realização, os ensaios de avaliação compreendem, em uma Segunda etapa, determinar a capacidade de fazer com que a morte celular ou a apoptose de células B que expressam CD19 humano. Os ensaios de ligação por competição, por outro lado, estiam a capacidade de um anticorpo candidato competir com um anticorpo anti-CD19 conhecido ou outro composto que liga o CD19 humano.

[00285] Em um ensaio de ligação direta, o antígeno de CD19 humano é contatado com um anticorpo candidato sob condições que permitem a ligação do anticorpo candidato ao antígeno de CD19 humano. A ligação acontece na solução ou em uma superfície sólida. O anticorpo candidato podem ser previamente rotulado para a detecção. Qualquer composto detectável pode ser usado para a rotulação, tal como, mas não limitando-se ao isótopo luminescente, fluorescente ou radioativo ou grupo contendo o mesmo ou um rótulo não isotópico, tal como uma enzima ou um pigmento. Após um período de incubação suficiente para a ligação acontecer, a reação é exposta a condições e manipulações que removem o excesso ou, não especificamente, ligam o anticorpo. Tipicamente, este envolve a lavagem com um tampão apropriado. Finalmente, a presença de um complexo de anticorpo CD19é detectada.

[00286] em um ensaio de ligação por competição, um anticorpo candidato é avaliado quanto à sua capacidade de inibir ou substituir a ligação de um anticorpo anti-CD19 conhecido (ou outro composto) ao antígeno de CD19 humano. Um aglutinante rotulado conhecido de CD19 pode ser misturado com o anticorpo candidato e colocado sob condições em que a interação entre estes deve, ocorrer normalmente, com e sem a adição do anticorpo candidato. A quantidade de aglutinante conhecido rotulado de CD19 que liga o CD19 humano pode ser comparado com a quantidade ligada na presença ou ausência do anticorpo candidato.

[00287] Em uma forma de realização, o ensaio de ligação é realizado com um ou mais componentes imobilizados em uma superfície sólida para facilitar a formação e a detecção do complexo de antígeno de anticorpo. Em várias formas de realização, o suporte sólido pode ser, mas não é restrito a, fluoreto de polivinilideno, policarbonato, poliestireno, polipropileno, polietileno, vidro, nitrocelulose, dextrano, náilon, poliacrilamida e agarose. A configuração de suporte pode incluir contas, membranas, micropartículas, a superfície interior de um recipiente de reação, tal como uma placa microtituladora, tubo de teste ou outro recipiente de reação. A imobilização do CD19 ou outro componente pode ser atingida através, de ligações covalentes ou não covalentes. Em uma forma de realização, a ligação pode ser indireta, isto é, através de um anticorpo ligado. Em uma outra forma de realização, o antígeno de CD19 humano e os controles negativos são alvejados com um epítopo, tal como glutationa S-transferase (GST) de modo que a ligação à superfície sólida possa ser mediada por um anticorpo comercialmente disponível, tal como anti-GST (Santa Cruz Biotechnology).

[00288] Por exemplo, um tal ensaio de ligação por afinidade pode ser realizado usando-se o antígeno de CD19 humano que é imobilizado a um suporte sólido. Tipicamente, o componente não imobilizado da reação de ligação, neste caso, o anticorpo anti-CD19 candidato, é rotulado para permitir a detecção. Uma variedade de métodos de rotulação está disponível e pode ser usada, tal como isótopo luminescente, cromoforo, fluorescente ou radioativo ou grupo contendo o mesmo e rótulos não isotópicos, tais como enzimas ou pigmentos. Em uma forma de realização, o anticorpo anti-CD19 candidato é rotulado com um fluoroforo, tal como isotiocianato de fluoresceina (FITC, disponível da Sigma Chemicals, St. Louis). Um tal ensaio de ligação por afinidade pode ser realizado usando-se o antígeno de CD19 humano imobilizado em uma superfície sólida. Os anticorpos anti-CD19 são então incubados com o antígeno e a ligação específica de anticorpos é detectada pelos métodos conhecidos na técnica que inclui, mas não limita-se a, métodos BiaCore Analyses, ELISA, FMET e RIA.

[00289] Finalmente, o rótulo remanescente na superfície sólida pode ser detectada por qualquer método de detecção conhecidos na técnica. Por exemplo, se o anticorpo anti-CD19 candidato for rotulado com um fluoroforo, um fluorímetro pode ser usado para a detecção de complexos.

[00290] O antígeno de CD19 humano pode ser adicionado aos ensaios de ligação na forma de células intactas que expressam antígeno de CD19 humano ou membranas isoladas contendo antígeno de CD19 humano. Desta maneira, o direcionamento da ligação ao antígeno de CD19 humano pode ser estimado em células intactas na cultura ou em modelos animais na presença e na ausência do anticorpo anti-CD19 candidato. Um anticorpo anti-CD19 candidato rotulado pode ser misturado com as células que expressam antígeno de CD19 humano ou com extratos brutos obtidos a partir de tais células e o anticorpo anti-CD19 candidato pode ser adicionado. As membranas isoladas pdoem ser usadas para a identificação de anticorpos anti-CD19 candidatos que interagem com CD19 humano. Por exemplo, em um experimento típico usando-se membranas isoladas, as células podem ser geneticamente projetadas para a expressão do antígeno de CD19 humano. As membranas podem ser coletadas pelas técnicas padrão e usadas em um ensaio de ligação in vitro. O anticorpo anti-CD19 candidato rotulado (por exemplo, anticorpo rotulado fluorescente) é ligado à membranas e estimado quanto à atividade específica; a ligação específica é determinada pela comparação com os ensaios de ligação realizados na presença de excesso (frio) de anticorpo anti-CD19 candidato não rotulado. O antígeno de CD19 humano solúvel também pode ser recombinantemente expressado e utilizado em ensaios com base não celular para a identificação de anticorpos que ligam-se ao antígeno de CD19 humano. Os polipeptídeos humanos CD19 recombinantemente expressados podem ser usados nos ensaios de avaliação com base não celular. Os peptídeos que correspondem a uma ou mais das porções de ligação de antígeno de CD19 humano ou proteínas de fusão contendo uma ou mais das porções de ligação de antígeno de CD19 humano também podem ser usados em sistemas de ensaio com base não celular para a identificação de anticorpos que ligam-se à porções de antígeno de CD19 humano. Em ensaios com base não celular o CD19 humano recombinantemente expressado é ligado a um substrato sólido tal como um tubo de teste, reservatório microtitulador ou uma coluna, por meios bem conhecidos por aqueles na técnica (ver, Ausubel et al., supra). Os anticorpos de teste são então estimados quanto à sua capacidade de ligação ao antígeno de CD19 humano.

[00291] A reação de ligação também pode ser realizada na solução. Neste ensaio, o componente rotulado é deixado interagir com seus parceiros de ligação na solução. Se as diferenças de tamanho entre o componente rotulado e seus parceiros de ligação permitirem uma tal separação, a separação pode ser atingida passando-se os produtos da reação de ligação através de um ultrafiltro cujos poros permitem a passagem do componente rotulado não ligado mas não de seus parceiros de ligação ou do componente rotulado ligado a seus parceiros. A separação também pode ser atingida usando-se qualquer reagente capaz de capturar um parceiro de ligação do componente rotulado da solução, tal como um anticorpo contra o parceiro de ligação e assim por diante.

[00292] Em uma forma de realização, por exemplo, uma biblioteca de fago pode ser avaliada pela passagem do fago a partir de uma biblioteca de apresentação de fago contínua através de uma coluna contendo antígeno de CD19 humano purificado ou derivado, análogo, fragmento ou domínios destes lisados a uma fase sólida, tais como contas plásticas. Alterando-se a estringência do tampão de lavagem, é possível enriquecer o fago que expressa os peptídeos com afinidade alta ao antígeno de CD19 humano. O fago isolado da coluna pode ser clonado e as afinidades podem ser medidas diretamente. Conhecendo-se que os anticorpos e as suas sequências de aminoácido conferem a ligação mais forte ao antígeno de CD19 humano, modelos computadorizados podem ser usados para identificar os contatos moleculares entre o antígeno CD19 e o anticorpo candidato.

[00293] Em uma outra forma de realização específica, o suporte sólido é membrana contendo o antígeno de CD19 humano ligado a uma placa microtituladora. Os anticorpos candidatos, por exemplo, podem ligar as células que expressam anticorpos cultivados sob condições que permitem a expressão dos membros de biblioteca na placa microtituladora. Os membros de biblioteca que ligam-se ao CD19 humano são coletados. Tais métodos, são, no geral, descritos por meio de exemplo em Parmley and Smith, 1988, Gene, 73:305-318; Fowlkes et al., 1992, BioTechniques, 13:422-427; Publicação PCT N° WO94/18318 e em referências citadas anteriormente. Os anticorpos identificados ligando-se ao antígeno de CD19 pode ser de qualquer um dos tipos ou modificações de anticorpos descritos acima.

5.18.2. AVALIAÇÃO DE ANTICORPOS PARA A FUNÇÃO ATUADORA DE ADCC HUMANA

[00294] Os anticorpos da classe de IgG humano, que têm características funcionais, tais como características funcionais, tais como vida média longa no soro e a capacidade de mediar várias funções atuadoras são usados em certas formas de realização da invenção (Antibody monoclonals: Principles and Applications, Wiley- Liss, Inc., Chapter 1 (1995)). O anticorpo da classe IgG humana ainda é classificado nas seguintes 4 subclasses: IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4. Um grande número de estudos foram conduzidos até agora ADCC e CDC como funções atuadoras do anticorpo de classe IgG e foi relatado que entre os anticorpos da classe de IgG humano, a subclasse de IgG1 tem a atividade de ADCC e atividade CDC mais altas em seres humanos (Chemical Immunology, 65, 88 (1997)).

[00295] A expressão da atividade de ADCC e atividade de CDC dos anticorpos da sub-classe de IgG1 humano, no geral, envolve a ligação da região de Fc do anticorpo a um receptor para um anticorpo (a seguir referido como “FCYR”) que existe na superfície de células atuadoras, tais como células matadoras, células matadoras naturais ou macrófgos ativados. Vários componentes complementares podem ser ligados. Com respeito à ligação, foi sugerido que diversos resíduos de aminoácido na região de junta e o segundo domínio de região C (a seguir referido como “domínio CY2”) do anticorpo são importantes (Eur. J. Immunol., 23, 1098 (1993), Immunology, 86, 319 (1995), Chemical Immunology, 65, 88 (1997)) e que uma cadeia de açúcar o domínio CY2 (Chemical Immunology, 65, 88 (1997)) também é importante.

[00296] Os anticorpos anti-CD19 podem ser modificados com respeito à função atuadora, por exemplo, a fim de intensificar ADCC e/ou citotoxicidade dependente de complemento (CDC) do anticorpo. Isto pode ser atingido pela introdução de uma ou mais substituições de aminoácido na região Fc de um anticorpo. Os resíduos de cisteína também podem ser introduzidos na região de Fc, permitindo a formação de ligação de bissulfeto intercadeia em sua região. Desta maneira, um anticorpo homodimérico que pode ser gerado pode ter capacidade de internalização melhorada e/ou morte celular mediada por complemento aumentada e ADCC (Caron et al., J. Exp. Med., 176:1191-1195 (1992) and Shopes, J. Immunol., 148:2918-2922 (1992)). Os reticuladores heterobifuncionais também podem ser usados para a geração de anticorpos homodiméricos com atividade anti-tumoral intensificada (Wolff et al., Cancer Research, 53:2560-2565 (1993)). Os anticorpos também podem ser projetados para Ter duas ou mais regiões de Fc em lise de complemento intensificada e capacidades de ADCC (Stevenson et al., Anti-Cancer Drug Design, (3)219-230 (1989)).

[00297] Outros métodos de projetar regiões de Fc de anticorpos a fim de alterar as funções atuadoras são conhecidos na técnica (por exemplo, Publicação de patente U. S. N° 20040185045 e Publicação PCT N° WO 2004/016750, ambas concedidas a Koenig et al., que descreve a alteração de uma região Fc para intensificar a afinidade de ligação para FCYRIIB em comparação com um afinidade de ligação para FCYRIIA; ver também Publicação PCT N°. WO 99/58572 concedida a Armour et al., WO 99/51642 concedida a Idusogie et al., e U. S. 6,395,272 concedida a Deo et al.; cujas divulgações são incorporadas neste em suas totalidades). Os métodos de modificar a região Fc para diminuir a afinidade de ligação ao FCYRIIB também são conhecidos na técnica (por exemplo, Publicação de patente U. S. N° 20010036459 e Publicação PCT N° WO 01/79299, ambas concedidas a Ravetch et al., cujas divulgações são incorporadas neste em suas totalidades). Os anticorpos modificados tendo regiões de Fc variantes com afinidade de ligação intensificada para FcyRIIIA e/ou FcyRIIA em comparação com uma região Fc do tipo selvagem também foram descritos (por exemplo, Publicação PCT N° WO 2004/063351, concedida a Stavenhagen et al.; cuja divulgação é incorporada neste em sua totalidade).

[00298] Pelo menos quatro tipos diferentes de FcyR foram observados, que são respectivamente denominados FcyRI (CD64), FCYRII (CD32), FcyRIII (CD16) e FCYRIV. Em humanos, FCYRII e FCYRIII ainda são classificados em FcYRIIa e FcYRIIb, e FcYRIIIa e FcYRIIIb, respectivamente. FCYR é uma proteína de membrana que pertence à superfamília da imunoglobulina, FCYRII, FCYRIII e FCYRIV têm uma cadeia α tendo uma região extracelular contendo dois domínios semelhantes à imunoglobulina, FcyRI tem uma cadeia α tendo uma região extracelular contendo três domínios semelhantes à imunoglobulina, como um componente de constituição e a cadeia α está envolvida na atividade de ligação de IgG. Além diso, FcyRI e FCYRIII tem uma cadeia Y ou cadeia Z como um componente de constituição que tem uma função de sinal de transdução em associação com a cadeia α (Annu. Rev. Immunol., 18, 709 (2000), Annu. Rev. Immunol., 19, 275 (2001)). O FcyRIV foi descrito concedida a Bruhns et al., Clin. Invest. Med., (Canadá) 27:3D (2004).

[00299] para estimar a atividade de ADCC de um anticorpo anti- CD19 de interesse, um ensaio ADCC in vitro pode ser usado, tal como aquele descrito na Patente U. S. N° 5,500,362 ou 5,821,337. O ensaio também pode ser realizado usando-se um kit comercialmente disponível, por exemplo, CytoTox 96 ® (Promega). As células atuadoras úteis para tais ensaios incluem, mas não limitam-se à células mononucleares sanguíneas periféricas (PBMC), células matadoras naturais (NK) e linhas celulares NK. As linhas celulares NK que expressam um receptor transgênico de Fc (por exemplo, CD16) e polipeptídeo de sinalização associado (por exemplo, FCεRI-y) também podem servir como células atuadoras (ver, por exemplo, WO 2006/023148 A2 concedido a Campbell). Por exemplo, a capacidade de qualquer anticorpo particular mediar a lise da célula alvo pela ativação de complemento e/ou ADCC pode ser estimada. As células de interesse são desenvolvidas e rotuladas in vitro; o anticorpo é adicionado à cultura celular em combinação com as células imunes que pdoem ser ativadas pelos complexos de anticorpo de antígeno; isto é, as células atuadoras envolvidas na resposta de ADCC. O anticorpo também pode ser testado para ativação de complemento. Em cada caso, a citólise das células alvo é detectada pela liberação do rótulo a partir das células lisadas. A extensão da lise da célula alvo também pode ser determinadas detectando-se a liberação de proteínas citoplásmicas (por exemplo, LDH) no tensoativo. De fato, os anticorpos podem ser avaliados usado-se o soro do próprio paciente como uma fonte de células complementares e/ou imunes. Os anticorpos que são capazes de mediar o ADCC humano no teste in vitro podem ser então usados terapeuticamente naquele paciente particular. A atividade de ADCC da molécula de interesse também pode ser estimada in vivo, por exemplo, em um modelo animal, tal como aquele divulgado em Clynes et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 95:652-656 (1998). Além disso, as técnicas para a modulação (isto é, aumento ou diminuição) do nível de ADCC e opcionalmente atividade de CDC, de um anticorpo são bem conhecidos na técnica. Ver, por exemplo, Patente U. S. N° 6,194,551. Os anticorpos da presente invenção podem ser capazes ou podem ser modificadas para Ter a capacidade de induzir ADCC e/ou CDC. Os ensaios para a determinação da função de ADCC podem ser praticados usando-se as células atuadoras humanas para estimar a função de ADCC humana. Tais ensaios também podem incluir aqueles pretendidos para a avaliação de anticorpos que induzem, mediam, intensificam, bloqueiam a morte celular por mecanismos necróticos e/ou apoptóticos. Tais métodos que incluem ensaios utilizam pigmentos viáveis, métodos de detectar e analisar caspases e ensaios que medem as quebras de DNA podem ser usados para estimar a atividade apoptótica de células cultivadas in vitro com um anticorpo anti-CD19 de interesse.

[00300] Por exemplo, ensaios de rotulação de extremidade de corte de dUTP mediado por Annexin V ou TdT (TUNEL) pode ser realizado como descrito em Decker et al., Blood (USA) 103:2718-2725 (2004) para detectar a atividade apoptótica. O ensaio TUNEL envolve cultivar a célula de interesse com dUTP rotulado por fluoresceína para a incorporação em quebras de filamento de DNA. As células são então processadas para a análise por citometria de fluxo. O ensaio de Annexin V detecta o aparecimento de fosfatidilserina (PS) no exterior da membrana de plasma de células apoptóticas usando-se uma Annexin V conjugada por fluoresceína que, especificamente, reconhece as moléculas PS expostas. Concorrentemente, um pigmento viável, tal como iodeto de propídio pode ser usado para excluir as células apoptóticas tardias. As células são tingidas com a Annexin V rotulada e são analisadas pela citometria de fluxo.

5.18.3. IMUNOCONJUGADOS E PROTEÍNAS FUSÃO

[00301] De acordo com certos aspectos da invenção, agentes terapêuticos ou toxinas podem ser conjugados a anticorpos quimerizados, humanos ou humanizados anti-CD19 para o uso nas composições e métodos da invenção. Em certas formas de realização, estes conjugados podem ser gerados como proteínas de fusão. Os exemplos de agentes terapêuticos e toxinas incluem, mas não limitam- se a, membros da família de enediina de moléculas, tais como caliqueamicina e esperamicina. As toxinas químicas também podem ser retiradas do grupo que consiste de duocarmicina (ver, por exemplo, Patente U. S. N° 5,703,080 e Patente U. S. N° 4,923,990), metotrexato, doxorubicina, melfalana, clorambucila, ARA-C, vindesina, mitomicina C, cis-platina, etoposida, bleomicima e 5-fluorouracila. Os exemplosd e agentes quimioterapêuticos também incluem Adriamicina, Doxorubicin, 5-Fluorouracil, Citosina arabinosida (Ara-C), Ciclofosfamida, Thiotepa, Taxotere (docetaxel), Busulfan, Cytoxin, Taxol, Methotrexate, Cisplatin, Melphalan, Vinblastine, Bleomicina, Etoposide, Ifosfamide, Mitomycin C, Mitoxantrone, Vincreistine, Vinorelbine, Carboplatin, Teniposide, Daunomicina, Carminomicina, Aminopterin, Dactinomicina, Mitomycins, Esperamicins (ver, Patente U. S. N° 4,675,187), Melphalan, e outras nitrogeno mostardas relacionadas.

[00302] Em certas formas de realização, os anticorpos anti-CD19 são conjugados com um agente citostático, citotóxico ou imunossupressor em que o agente citotóxico é selecionado do grupo que consiste de uma enodiina, um lexitropsin, um duocarmicina, um taxano, um puromicina, um dolastatin, um maitansinóide e um vinca alcalóide. Em certas formas de realização mais específicas, o agente citotóxico é paclitaxel, docetaxel, CC-1065, SN-38, topotecan, morfolino-doxorubicin, rizoxin, cianomorfolino-doxorubicin, dolastatin- 10, equinomicina, combretastatin, caliqueamicin, maitansina, DM-1, auristatin E, AEB, AEVB, AEFP, MMAE (ver, Pedido de Patente US N° 10/983,340) ou netropsina.

[00303] Em certas formas de realização, o agente citotóxico de um agente citotóxico de anticorpo anti-CD19 conjugado da invenção é um agente anti-tubulina. Nas formas de realização específicas, o agente citotóxico é selecionado do grupo que consiste de um vinca alcalóide, uma podofilotoxina, um taxano, um derivado de bacatina, uma criptofisina, um maitansinóide, um combretastatin e um dolastatin. Em outras formas de realização, o agente citotóxico em vincristine, vinblastine, vindesine, vinorelbine, VP-16, camptothecin, paclitaxel, docetaxel, epithilone A, epithilone B, nocodazol, coichicine, colcimid, estramustine, cemadotin, discodermolide, maytansine, DM-1, AEFP, auristatin E, AEB, AEVB, AEFP, MMAE ou eleuterobin.

[00304] Nas formas de realização específicas, um anticorpo anti- CD19 é conjugated ao agente citotóxico por intermédio de um ligador, em que o ligador é um ligador de peptídeo. Em outras formas de realização, um anticorpo anti-CD19 é conjugado ao agente citotóxico por intermédio de um ligador, em que o ligador é um ligador val-cit, um ligador phe-lys, um ligador de hidrazona ou um ligador de bissulfeto.

[00305] Em certas formas de realização, o anticorpo anti-CD19 de um conjugado de agente citotóxico de anticorpo anti-CD19 é conjugado ao agente citotóxico por intermédio de um ligador, em que o ligador é hidrolisável em um pH menor do que 5,5. Em uma forma de realização específica o ligador é hidrolisável em um pH menor do que 5,0.

[00306] Em certas formas de realização, o anticorpo anti-CD19 de um conjugado de agente citotóxico de anticorpo anti-CD19 é conjugado ao agente citotóxico por intermédio de um ligador, em que o ligador é clivável por uma protease. Em uma forma de realização específica, a protease é uma protease lisossômica. Em outras formas de realização, a protease é, inter alia, uma protease associada à membrana, uma protease intracelular ou uma protease endossômica.

[00307] Outras toxinas que podem ser usadas em imunoconjugados da invenção incluem lecitinas venenosas, toxinas vegetais, tais toxinas de ricina, abrina, modecina, botulina e difteria. É claro, combinações, das várias toxinas também podem ser ligadas a uma molécula de anticorpo, desse modo, acomodando a citotoxicidade variável. O ilustrativo das toxinas que são adequadamente utilizadas em terapias de combinação da invenção são toxina de ricina, abrina, ribonuclease, DNase I, enterotoxina-A a de Staphylococcal, proteína anti-viral de erva dos cancros, gelonina, difterina, exotoxina de Pseudomonas e endotoxina de Pseudomonas. Ver, por exemplo, Pastan et al., Cell, 47:641 (1986) e Goldenberg et al., Cancer Journal for Clinicians, 44:43 (1994). As toxinas enzimaticamente ativas e fragmentos destas incluem cadeia de difteria A, fragmentos ativo que não de ligação de toxina de difteria, cadeia de exotoxina A (de Pseudomonas aeruginosa), cadeia de ricina A, cadeia de abrina A, cadeia de modecina A, alfa-sarcina, proteínas de Aleurites fordii, proteínas de diantina, proteínas de Phytolaca americana (PAPI, PAPII, e PAP-S), inibidor de Momordica charantia, curcina, crotina, inibidor de Sapaonaria officinalis, gelonina, mitogelina, restrictocina, fenomicina, enomicina e os tricotecenos. Ver, por exemplo, WO 93/21232 publicada em 28 de outubro de 1993.

[00308] As toxinas adequadas e os quimioagentes terapêuticos são descritos em Remington’s Pharmaceutical Sciences, 19° Ed. (Mack Publishing Co. 1995) e em Goodman And Gilman’s The Pharmacological Basis of Therapeutics, 7° Ed. (MacMillan Publishing Co. 1985). Outras toxinas adequadas e/ou agentes quimioterapêuticos são conhecidos por aqueles habilitados na técnica.

[00309] A presente invenção ainda abrange anticorpos (que incluem fragmentos de anticorpo ou variantes destes) que compreendem ou conjugados com um agente radioativo adequado para os propósitos de diagnóstico. Os exemplos de materiais radioativos adequados incluem, mas não limitam-se a, iodino (.sup.121I, .sup.123I, .sup.125I, .sup.131I), carbono (.sup.14C), enxofre (.sup.35S), trítio (.sup.3H), índio (.sup.111In, .sup.112In, .sup.113mIn, .sup.115mIn), tecnécio (.sup.99Tc, .sup.99mTc), tálio (.sup.201Ti), gálio (.sup.68Ga, .sup.67Ga), paládio (.sup.103Pd), molibdênio (.sup.99Mo), xenônio (.sup.135Xe), flúor (.sup.18F), .sup.153Sm, .sup.177Lu, .sup.159Gd, .sup.149Pm, .sup.140La, .sup.175Yb, .sup.166Ho, .sup.90Y, .sup.47Sc, .sup.186Re, .sup.188Re, .sup.142Pr, .sup.105Rh e .sup.97Ru.

[00310] Além disso, um anticorpo anti-CD19 da invenção (que inclui um scFv ou outra molécula que compreende ou, alternativamente, que consiste de, fragmentos de anticorpo ou variantes destes), pode ser ligado ou conjugado a um íon metálico radioativo utilizado para os propósitos terapêuticos. Os exemplos de íons radioativos adequados incluem, mas não limitam-se a, alfa-emissores, tais como .sup.213Bi ou outros radioisótopos, tais como .sup.103Pd, .sup.135Xe, .sup.131I, .sup.68Ge, .sup.57Co, .sup.65Zn, .sup.85Sr, .sup.32P, .sup.35S, .sup.90Y, .sup.153Sm, .sup.153Gd, .sup.169Yb, .sup.51Cr, .sup.54Mn, .sup.75Se, .sup.113 Sn, .sup.90Y, .sup.117Tin, .sup.186Re, .sup.188Re e .sup.166Ho. Nas formas de realização específicas, um anticorpo ou fragmento do mesmo é ligado a queladores macrolíticos que realizam a quelação de íons radiometálicos, que inclui mas não limita-se a, .sup.177Lu, .sup.90Y, .sup.166Ho e .sup.153Sm, a polipeptídeos. Nas formas de realização específicas, o quelador macrocíclico é ácido 1,4,7,10-tetraazaciclododecano-N,N',N",N'"-tetra- acético (DOTA). Em outras formas de realização específicas, o DOTA é ligado a um anticorpo da invenção ou fragmento do mesmo por intermédio de uma molécula ligadora. Os exemplos de moléculas ligadoras úteis para a conjugação DOTA a um polipeptídeo são comumente conhecidos na técnica - ver, por exemplo, DeNardo et al., Clin Cancer Res 4(10):2483-90, 1998; Peterson et al., Bioconjug Chem 10(4):553-7, 1999 e Zimmerman et al., Nucl Med Biol 26(8):943-50, 1999 que são incorporados neste por referência em sua totalidade.

[00311] Um anticorpo anti-CD19 da presente invenção também pode ser usado em ADEPT pela conjugação do anticorpo a uma enzima ativadora de pró-medicamento que converte um pró- medicamento (por exemplo, um agente quimioterapêutico de peptidila, ver, WO81/01145) a um medicamento anti-câncer. Ver, por exemplo, WO 88/07378 e Patente U. S. N° 4,975,278. O componente de enzima do imunoconjugado útil para ADEPT inclui qualquer enzima capaz de atuar em um pró-medicamento de uma tal maneira a fim de convertê-lo em sua forma citotóxica mais ativa.

[00312] As enzimas que são úteis nos métodos desta invenção incluem, mas não limitam-se a, fosfatase alcalina útil para converter pró-medicamentos contendo fosfato em medicamentos livres; arilsulfatase útil para converter pró-medicamentos contendo sulfatos em medicamentos livres; citosina desaminase útil para converter 5- fluorocitosina não tóxica no medicamento anti-câncer, 5-fluorouracila; proteases, tais como serratia protease, termolisina, subtilisina, carboxipeptidases e catepsinas (tais como catepsinas B e L), que são úteis para a conversão de pró-medicamentos contendo peptídeo em medicamentos livres; D-alanilcarboxipeptidases, úteis para converter pró-medicamentos que contém substituintes de D-aminoácido; enzimas clivadoras de carboidrato, tais como β-galactosidase e neuraminidase úteis para converter produtos glicosilados em medicamentos livres; β-lactamase útil para converter medicamentos derivados com α-lactamas em medicamentos livres e penicilina amidases, tais como penicilina V amidase ou penicilina G amidase, útil para converter medicamentos derivados em seus amino nitrogênios com grupos fenoxiacetila ou fenilacetila, respectivamente, em medicamentos livres. Os anticorpos com atividades enzimáticas, também conhecido na técnica como “abzimas,” também podem ser usadas para converter os pró-medicamentos em medicamentos ativos livres (ver, por exemplo, Massey, Nature 328:457-458 (1987)). Os conjugados de abzima de anticorpo podem ser preparados como descrito neste para a liberação da abzima como desejado para porções de um humano afetado por uma malignidade de célula B.

[00313] Os anticorpos desta invenção podem ser covalentemente ligados às enzimas pelas técnicas bem conhecidas na técnica, tal como o uso dos reagentes de reticulação heterobifuncionais debatidos acima. As proteínas de fusão que compreendem pelo menos a região de ligação de antígeno de um anticorpo anti-CD19 ligado a pelo menos uma porção funcionalmente ativa de uma enzima também podem ser construídas usando-se técnicas de DNA recombinantes bem conhecidas na técnica (ver, por exemplo, Neuberger et al., Nature, 312:604-608 (1984)).

[00314] As modificações covalentes de um anticorpo anti-CD19 estão incluídos dentro do escopo da invenção. Estes podem ser feitos pela síntese química ou pela clivagem enzimática ou química do anticorpo, se aplicável. Outros tipos de modificações covalentes de um anticorpo anti-CD19 são introduzidos na molécula pela reação de resíduos de aminoácido alvejados do anticorpo com um agente de derivação orgânico que é capaz de reagir com cadeias secundárias selecionadas ou os resíduos de terminal N ou C.

[00315] Os resíduos de cisteinila mais comumente são reagidos com α-haloacetatos (e aminas correspondentes), tais como ácido cloroacético ou cloroacetamida, para dar derivados de carboximetila ou carboxiamidometila. Similarmente, os reagentes de iodo também podem ser usados. Os resíduos de cisteinila também são derivados pela reação com bromotrifluoroacetona, ácido α-bromo-β-(5- imidozoil)propiônico, fosfato de cloroacetila, N-alquilmaleimidas, dissulfeto de 3-nitro-2-piridila, bissulfeto de metil 2-piridila, p- cloromercuribenzoato, 2-cloromercuri-4-nitrofenol ou cloro-7- nitrobenzo-2-oxa-1,3-diazol.

[00316] Os resíduos de histidila são derivados pela reação com dietilpirocarbonato em pH 5,5 a 7,0 porque seu agente é relativamente específico para a cadeia secundária de histidila. Brometo de para- bromofenacila também é útil; a reação pode ser realizada em 0,1 M de cacodilato de sódio em pH 6,0.

[00317] Lisila e resíduos de terminal amino são reagidos com anídrido succínico ou outro de ácido carboxílico. A derivação com estes agentes tem o efeito de reverter a carga dos resíduos de lisinila. Outros reagentes adequados para a derivação de resíduos contendo α-amino e/ou resíduos contendo ε-amino incluem imidoésteres, tais como picolinimidato de metila, piridoxal fosfato, piridoxal, cloroboroidreto, ácido trinitrobenzenossulfônico, 0-metilisouréia, 2,4- pentanodiona e reação catalisada por transaminase com glioxilato.

[00318] Os resíduos de arginila são modificados pela reação com um ou diversos reagentes convencionais, entre estes fenilglioxal, 2,3- butanediona, 1,2-cicloexanodiona e ninidrina. A derivação de resíduos de arginila, no geral, requer que a reação seja realizada em condições alcalinas por causa do pKa alto do grupo funcional de guanidina. Além disso, estes reagentes podem reagir com os grupos ε-amino de lisina bem como o grupo de arginina épsilon-amino.

[00319] A modificação específica de resíduos de tirosila pode ser feita, com interesse particular na introdução de rótulos espectrais em resíduos de tirosila pela reação com compostos de diazônio aromáticos ou tetranitrometano. Mais comumente, N-acetilimidizol e tetranitrometano são usados para a formação de espécies de O-acetil tirosila e derivados de 3-nitro, respectivamente. Os resíduos de tirosila são iodados usando-se 125I ou 131I para a preparação de proteínas rotuladas para o uso em radioimunoensaio.

[00320] os grupos secundários de carboxila (aspartila ou glutamila) são seletivamente modificados pela reação com carbodiimidas (R-- N=C=N--R’), onde R e R’ são grupos alquila diferentes, tais como 1- cicloexil-3-(2-morfolinil-4-etil) carbodiimida ou 1-etil-3-(4-azônia-4,4- dimetilpentil) carbodiimida. Além disso, os resíduos de aspartila e glutamila são convertidos a resíduos de asparaginila e glutaminila pela reação com íons de amônio.

[00321] os resíduos de glutaminila e asparaginila são frequentemente desamidados aos resíduos de glutamila e aspartila correspondentes, respectivamente. Estes resíduos são desamidados sob condições neutras ou básicas. A forma desamidada destes resíduos está dentro do escopo desta invenção.

[00322] Outras modificações incluem hidroxilação de prolina e lisina, fosforilação de grupos hidroxila de resíduos de serila ou treonila, metilação dos grupos α-amino de lisina, arginina e cadeias secundárias de histidina (T. E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W.H. Freeman & Co., San Francisco, pp. 79-86 (1983)), acetilação da amina de terminal N e amidação de qualquer grupo carboxila de terminal C.

[00323] Um ouro tipo de modificação covalente envolve ligar quimicamente ou enzimaticamente glicosídeos ao anticorpo. Estes procedimentos são vantajosos em que não requer a produção do anticorpo em uma célula hospedeira que tem capacidades de glicosilação para a glicosilação ligada por N ou O. Dependendo do modo de ligação usado, os açúcares podem ser ligados (a) arginina e histidina, (b) grupos carboxila livres, (c) grupos sulfidrila livres, tais como aqueles de cisteína, (d) grupos hidroxila livres, tais como aqueles de serina, treonina ou hidroxiprolina, (e) resíduos aromáticos, tais como aqueles de fenilalanina, tirosina ou triptofano ou (f) o grupo amida de glutamina. Estes métodos são descritos em WO 87/05330 publicados em 11 de setembro de 1987 e em Aplin and Wriston, CRC Crit. Rev. Biochem., pp. 259-306 (1981).

5.19. Combinações Quimioterapêuticas

[00324] Em outras formas de realização, um anti-CD19 mAb pode ser administrado em combinação com um ou mais agentes quimioterapêuticos adicionais. Por exemplo, “CVB” (1.5 g/m2 de ciclofosfamida, 200-400 mg/m2 de etoposida e 150-200 mg/m2 de carmustina) pode ser suado em terapias de combinação da invenção. O CVB é um regime usado para tratar linfoma não Hodgkin (Patti et al., Eur. J. Haematol., 51:18 (1993)). Outros regimes quimioterapêuticos de combinação adequados são bem conhecidos por aqueles de habilidade comum na técnica. Ver, por exemplo, Freedman et al., “Non-Hodgkin’s Lymphomas,” em Cancer Medicine, Volume 2, 3° Edição, Holland et al. (eds.), pp. 2028-2068 (Lea & Febiger 1993). Como uma ilustração, os regimes quimioterapêuticos de primeira geração para o tratamento de linfoma não Hodgkin de grau intermediário inclui C-MOPP (ciclofosfamida, vincristina, procarbazina e prednisona) e CHOP (ciclofosfamida, doxorubicina, vincristina e prednisona). Um regime quimioterapêutico de Segunda geração útil é m-BACOD (metotrexato, bleomicina, doxorubicina, ciclofosfamida, vincristina, dexametasona, e leucovorina), enquanto um regime de terceira geração adequado é MACOP-B (metotrexato, doxorubicina, ciclofosfamida, vincristina, prednisona, bleomicina e leucovorina). Os medicamentos úteis adicionais incluem butirato de fenila e brostatin-1.

[00325] De acordo com a invenção, o câncer ou um ou mais sintomas deste pode ser evitado, tratado, controlado ou melhorado pela administração de um anti-CD19 mAb em combinação com a administração de uma ou mais terapias, tais como, mas não limitando- se a, quimioterapias, terapias de radiação, terapias hormonais e/ou terapias biológicas/imunoterapias.

[00326] Em uma forma de realização específica, os métodos da invenção abrangem a administração de um ou mais antagonistas de angiogênese, tais como mas não limita-se a: Angiostatina (fragmento de plasminogênio); antitrombin angiogênica III; Angiozyme; ABT-627; Bay 12-9566; Benefin; Bevacizumab; BMS-275291; inibidor derivado de cartilagem (CDI); CAI; fragmento de complemento CD59; CEP- 7055; Col 3; Combretastatin A-4; Endostatin (fragmento de colágeno XVIII); fragmento de Fibronectina; Gro-beta; Halofuginona; Heparinases; fragmento de Heparina hexasacarídeo; HMV833; gonadotropina coriônica humana (hCG); IM-862; Interferon alfa/beta/gama; proteína indutível por Interferon (IP-10); Interleucina- 12; Kringle 5 (fragmento de plasminogênio); Marimastat; inibidores de Metaloproteinase (TIMPs); 2-Metoxiestradiol; MMI 270 (CGS 27023A); MoAb IMC-1C11; Neovastat; NM-3; Panzem; PI-88; inibidor de ribonuclease Placental; inibidor do ativador de Plasminogênio; fator-4 de plaqueta (PF4); Prinomastat;fragmento de Prolactina 16kD; proteína relacionada com Proliferin (PRP); PTK 787/ZK 222594; Retinóides; Solimastat; Squalamine; SS 3304; SU 5416; SU6668; SU11248; Tetraidrocortisol-S; tetratiomolibdato; talidomida; Trombospondin-1 (TSP-1); TNP-470; Transformação do fator-beta de desenvolvimento (TGF-b); Vasculostatin; Vasostatin (fragmento de calreticulina); ZD6126; ZD 6474; inibidores de farnesil transferase (FTI) e bisfosfonatos (tal como mas não limita-se a, alendronato, clodronato, etidronate, ibandronato, pamidronato, risedronato, tiludronato e zoledronato).

[00327] Em uma forma de realização específica, os métodos da invenção abrangem a administração de um ou mais agentes imunomoduladores, tal como mas não limita-se a, agentes quimioterapêuticos e agentes imunomoduladores não quimioterapêuticos. Os exemplos não limitantes de agentes quimioterapêuticos incluem metotrexato, ciclosporina A, leflunomida, cisplatina, ifosfamida, taxanos, tais como taxol e paclitaxol, inibidores de topoisomerase I (por exemplo, CPT-11, topotecan, 9-AC e GG- 211), gemcitabina, vinorelbina, oxaliplatina, 5-fluorouracila (5-FU), leucovorina, vinorelbina, temodal, citocalasina B, gramicidina D, emetina, mitomicina, etoposida, tenoposida, vincristina, vinblastina, colquicina, doxorubicina, daunorubicina, diidróxi antracin diona, mitoxantrona, mitramicina, actinomicina D, 1-desidrotestosterona, glicocorticóides, procaína, tetracaína, lidocaína, propranolol e homólogos de puromicina e citoxana. Os exemplos de agentes imunomoduladores não quimioterapêuticos incluem, mas não limitam- se a, anticorpos de receptor anti-célula T (por exemplo, anticorpos anti-CD4 (por exemplo, cM-T412 (Boeringer), IDEC-CE9.1® (IDEC e SKB), mAB 4162W94, Orthoclone e OKTcdr4a (Janssen-Cilag)), anticorpos anti-CD3 (por exemplo, Nuvion (Product Design Labs), OKT3 (Johnson & Johnson) ou Rituxan (IDEC)), anticorpos anti-CD5 (por exemplo, um imunoconjugado ligado por ricina anti-CD5), anticorpos anti-CD7 (por exemplo, CHH-380 (Novartis)), anticorpos anti-CD8, anticorpos monoclonais de ligando anti-CD40 (por exemplo, IDEC-131 (IDEC)), anticorpos anti-CD52 (por exemplo, CAMPATH 1H (Ilex)), anticorpos anti-CD2 (por exemplo, MEDI-507 (MedImmune, Inc., Publicação Internacional N° WO 02/098370 e WO 02/069904), anticorpos anti-CD11a (por exemplo, Xanelim (Genentech)) e anticorpos anti-B7 (por exemplo, IDEC-114) (IDEC)); anticorpos receptores anti-citocina (por exemplo, anticorpos de receptor anti-IFN, anticorpos de receptor anti-IL-2 (por exemplo, Zenapax (Protein Design Labs)), anticorpos de receptor anti-IL-4, anticorpos de receptor anti-IL-6, anticorpos de receptor anti-IL-10 e anticorpos de receptor anti-IL-12), anticorpos anti-citocina (por exemplo, anticorpos anti-IFN, anticorpos anti-TNF-α, anticorpos anti-IL-1β, anticorpos anti-IL-6, anticorpos anti-IL-8 (por exemplo, ABX-IL-8 (Abgenix)), anticorpos anti- IL-12 e anticorpos anti-IL-23)); CTLA4-imunoglobulina; LFA-3TIP (Biogen, Publicação Internacional N° WO 93/08656 e Patente U. S. N° 6,162,432); receptores de citocina solúveis (por exemplo, o domínio extracelular de um receptor de TNF-α ou um fragmento do mesmos, o domínio extracelular de um receptor de IL-1β ou um fragmento do mesmos, e o domínio extracelular de um receptor IL-6 ou um fragmento do mesmos); citocinas ou fragmentos destes (por exemplo, interleucina (IL)-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL- 12, IL-15, IL-23, TNF-α, TNF-β, interferon (IFN)-α, IFN-β, IFN-Y e GM- CSF) e anticorpos anti-citocina (por exemplo, anticorpos anti-IL-2, anticorpos anti-IL-4, anticorpos anti-IL-6, anticorpos anti-IL-10, anticorpos anti-IL-12, anticorpos anti-IL-15, anticorpos anti-TNF-α e anticorpos anti-IFN-Y) e anticorpos que ligam-se imunoespecificamente aos antígenos associados com o tumor (por exemplo, Herceptin®). Em certas formas de realização, um agente imunomodulador é um outro agente imunomodulador que não um agente quimioterapêutico. Em outras formas de realização um agente imunomodulador é um outro agente imunomodulador que não uma citocina ou hemapoiético, tal como IL-1, IL-2, IL-4, IL-12, IL-15, TNF, IFN-α, IFN-β, IFN-Y, M-CSF, G-CSF, IL-3 ou eritropoietina. Ainda, em uma outra forma de realização, um agente imunomodulador é um outro agente que não um agente quimioterapêutico e uma citocina ou fator hemapoiético.

[00328] Em uma forma de realização específica, os métodos da invenção abrangem a administração de um ou mais agentes anti- inflamatórios, tais como mas não limitando-se a, medicamentos anti- inflamatórios não esteroidais (NSAIDs), medicamentos anti- inflamatórios esteroidais, beta-agonistas, agentes anticolinérgicos e metil xantinas. Os exemplos de NSAIDs incluem, mas não limitam-se a, aspirina, ibuprofen, celecoxib (CELEBREX™), diclofenac (VOLTAREN™), etodolac (LODINE™), fenoprofen (NALFON™), indometacina (INDOCIN™), ketoralac (TORADOL™), oxaprozin (DAYPRO™), nabumentona (RELAFEN™), sulindac (CLINORIL™), tolmentin (TOLECTIN™), rofecoxib (VIOXX™), naproxen (ALEVE™, NAPROSYN™), ketoprofen (ACTRON™) e nabumetona (RELAFEN™). Tais NSAIDs funcionam inibindo uma enzima de ciclooxigenase (por exemplo, COX-1 e/ou COX-2). Os exemplos de medicamentos anti-inflamatórios esteroidais incluem, mas não limitam- se a, glicocorticóides, dexametasona (DECADRON™), cortisona, hidrocortisona, prednisona (DELTASONE™), prednisolona, triamcinolona, azulfidina e eicosanoidas, tais como prostaglandinas, tromboxanos e leucotrienos.

[00329] Em uma outra forma de realização específica, os métodos da invenção abrangem a administração de um ou mais agentes antivirais (por exemplo, amantadina, ribavirina, rimantadina, aciclovir, famciclovir, foscarnet, ganciclovir, trifluridina, vidarabina, didanosina, stavudina, zalcitabina, zidovudina, interferon), antibióticos (por exemplo, dactinomicina (primeiramente actinomicina), bleomicina, mitramicina e antramicina (AMC)), anti-eméticos (por exemplo, alprazolam, dexametoasona, domperidona, dronabinol, droperidol, granisetron, haloperidol, haloperidol, iorazepam, metilprednisolona, metoclopramida, nabilona, ondansetron, proclorperazina), agentes anti-fúngicos (por exemplo, anfotericina, clotrimazol, econazol, fluconazol, flucytosine, griseofulvin, itraconazol, cetoconazol, miconazol e nistatina), agentes anti-parasita (por exemplo, desidroemetina, furoato de diloxanida, emetina, mefloquina, melarsoprol, metronidazol, nifurtimox, paromomicina, pentabidina, pentamidina isetionato, primaquina, quinacrina, quinidina) ou uma combinação destes.

[00330] Os exemplos específicos de agentes anti-câncer que podem ser usados em várias formas de realização da invenção, que inclui composições farmacêuticas e formas de dosagem e kits, incluem, mas não limita-se a: acivicina; aclarubicina; acodazol cloridreto; acronina; adozelesina; aldesleucina; altretamina; ambomicina; ametantrone acetato; aminoglutetimida; amsacrina; anastrozol; antramicina; asparaginase; asperlina; azacitidina; azetepa; azotomicina; batimastat; benzodepa; bicalutamida; bisantreno cloridreto; bisnafida dimesilato; bizelesina; bleomicin sulfato; brequinar sódico; bropirimina; busulfan; cactinomicina; calusterona; caracemida; carbetimer; carboplatina; carmustina; carubicin cloridreto; carzelesina; cedefingol; clorambucila; cirolemicina; cisplatina; cladribina; crisnatol mesilato; ciclofosfamida; citarabina; dacarbazina; dactinomicina; daunorubicin cloridreto; decitabina; dexormaplatina; dezaguanina; dezaguanina mesilato; diaziquona; docetaxel; doxorubicina; doxorubicin cloridreto; droloxifeno; droloxifene citrato; dromostanolona propionato; duazomicina; edatrexato; eflornitina cloridreto; elsamitrucina; enloplatina; enpromato; epipropidina; epirubicina cloridreto; erbulozol; esorubicina cloridreto; estramustina; estramustina fosfato sódico; etanidazol; etoposida; etoposida fosfato; etoprina; fadrozol cloridreto; fazarabina; fenretinida; floxuridina; fludarabine fosfato; fluorouracil; flurocitabina; fosquidona; fostriecin sódico; gemcitabina; gemcitabina cloridreto; hidroxiuréia; idarubicin cloridreto; ifosfamida; ilmofosina; interleucina II (que inclui interleucina II recombinante ou rIL2), interferon alfa-2a; interferon alfa- 2b; interferon alfa-n1; interferon alfa-n3; interferon beta-I a; interferon gamma-I b; iproplatina; irinotecan cloridreto; lanreotida acetato; letrozol; leuprolida acetato; liarozol cloridreto; lometrexol sódico; lomustina; losoxantrona cloridreto; masoprocol; maitansina; mecloretamina cloridreto; megestrol acetato; melengestrol acetato; melfalan; menogaril; mercaptopurina; metotrexato; metotrexato sódico; metoprina; meturedepa; mitindomida; mitocarcina; mitocromina; mitogilina; mitomalcina; mitomicina; mitosper; mitotano; mitoxantrona cloridreto; ácido micofenólico; nocodazol; nogalamicina; ormaplatina; oxisuran; paclitaxel; pegaspargase; peliomicina; pentamustina; peplomicin sulfato; perfosfamida; pipobroman; piposulfan; piroxantrona cloridreto; plicamicina; plomestane; porfimer sódico; porfiromicina; prednimustina; procarbazina cloridreto; puromicina; puromicin cloridreto; pirazofurina; riboprina; rogletimida; safingol; safingol cloridreto; semustina; simtrazene; sparfosato sódico; sparsomicina; spirogermâniocloridreto; spiromustina; spiroplatina; streptonigrina; streptozocina; sulofenur; talisomicina; tecogalan sódico; tegafur; teloxantrone cloridreto; temoporfina; teniposida; teroxirona; testolactona; tiamiprina; tioguanina; tiotepa; tiazofurina; tirapazamina; toremifeno citrato; trestolona acetato; triciribina fosfato; trimetrexato; trimetrexate glucuronato; triptorelina; tubulozol cloridreto; uracil mustard; uredepa; vapreotida; verteporfina; vinblastina sulfato; vincristina sulfato; vindesina; vindesina sulfato; vinepidina sulfato; vinglicinata sulfato; vinleurosina sulfato; vinorelbina tartarato; vinrosidine sulfato; vinzolidine sulfato; vorozol; zeniplatina; zinostatina; zorubicin cloridreto. Outros medicamentos antuicâncer incluem, mas não limita-se a: 20-epi-1,25 diidroxivitamina D3; 5- etiniluracila; abiraterona; aclarubicina; acilfulveno; adecipenol; adozelesina; aldesleucina; antagonistas de ALL-TC; altretamina; ambamustina; amidox; amifostina; ácido aminolevulínico; amrubicina; amsacrina; anagrelida; anastrozol; andrografolida; inibidores de angiogênese; antagonista D; antagonista G; antarelix; proteína-1 morfogenética anti-dorsalizante; antiandrogênio, carcinoma prostático; antiestrogênio; antineoplaston; oligonucleotídeos anti-sentido; afidicolina glicinato; moduladores de gene da apoptose; reguladores da apoptose; ácido apurínico; ara-CDP-DL-PTBA; arginina desaminase; asulacrina; atamestano; atrimustina; axinastatin 1; axinastatin 2; axinastatin 3; azasetron; azatoxina; azatirosina; derivados de bacatina III; balanol; batimastat; antagonistas de BCR/ABL; benzocloros; benzoilstaurosporina; derivados de beta lactam; beta-aletina; betaclamicin B; ácido betulínico; inibidor de bFGF; bicalutamida; bisantreno; bisaziridinilspermina; bisnafida; bistrateno A; bizelesina; breflato; bropirimina; budotitano; butionina sulfoximina; calcipotriol; calfostina C; derivados de camptotecina; canaripox IL-2; capecitabina; carboxamida-amino-triazol; carboxiamidotriazol; CaRest M3; CARN 700; inibidor derivado de cartilagem; carzelesina; inibidores de caseína cinase (ICOS); castanospermina; cecropina B; cetrorelix; cloros; cloroquinoxalina sulfonamida; cicaprost; cis-porfirina; cladribina; análogos de clomifeno; clotrimazol; colismicina A; colismicina B; combretastatina A4; análogo de combretastatina; conagenina; crambescidina 816; crisnatol; criptoficina 8; derivados de criptoficina A; curacina A; ciclopentantraquinonas; cicloplatam; cipemicina; citarabina ocfosfato; fator citolítico; citostatina; dacliximab; decitabina; desidrodidemnin B; deslorelina; dexametasona; dexifosfamida; dexrazoxana; dexverapamil; diaziquona; didemnin B; didox; dietilnorspermina; diidro-5-azacitidina; diidrotaxol, 9-; dioxamicina; difenil spiromustina; docetaxel; docosanol; dolasetron; doxifluridina; droloxifeno; dronabinol; duocarmicin SA; ebselen; ecomustina; edelfosina; edrecolomab; eflornitina; elemeno; emitefur; epirubicina; epristerida; análogo de estramustina; agonistas de estrogênio; antagonistas de estrogênio; etanidazol; etoposida fosfato; exemestano; fadrozol; fazarabina; fenretinida; filgrastim; finasterida; flavopiridol; flezelastina; fluasterona; fludarabina; fluorodaunorunicina cloridreto; forfenimex; formestano; fostriecina; fotemustina; gadolínio texafirina; nitrato de gálio; galocitabina; ganirelix; inibidores de gelatinase; gemcitabina; inibidores de glutationa; hepsulfam; heregulina; hexametileno bisacetamida; hipericina; ácido ibandrônico; idarubicina; idoxifeno; idramantona; ilmofosina; ilomastat; imidazoacridonas; imiquimod; peptídeos imunostimulantes; inibidor do receptor de fator-1 de desenvolvimento semelhante à insulina; agonistas de interferon; interferons; interleucinas; iobenguano; iododoxorubicina; ipomeanol, 4-; iroplact; irsogladina; isobengazol; isohomohalicondrin B; itasetron; jasplacinolida; caalaleto F; lamelarin-N triacetato; lanreotida; leinamicina; lenograstim; lentinan sulfato; leptolstatina; letrozol; fator de inibição de leucemia; alfa interferon de leucócito; leuprolida+estrogênio+progesterona; leuprorelina; levamisol; liarozol; análogo de poliamina linear; dissacarídeo peptídeo lipofílico; compostos de platina lipofílicos; lissoclinamida 7; lobaplatina; lombricina; lometrexol; lonidamina; losoxantrona; inibidor de redutase HMG-CoA (tal como mas não limita-se a, Lovastatin, Pravastatin, Fluvastatin, Statin, Simvastatin e Atorvastatin); loxoribina; lurtotecan; lutécio texafirina; lisofilina; peptídeos líticos; maitansina; manostatina A; marimastat; masoprocol; maspina; inibidores de matrilisina; inibidores da metaloproteinase de matriz; menogaril; merbarona; meterelina; metioninase; metoclopramida; inibidor de MIF; mifepristona; miltefosina; mirimostima; RNA de filamento duplo em desacordo; mitoguazona; mitolactol; análogos de mitomicina; mitonafida; fator de desenvolvimento de mitotoxina fibroblasto-saporina; mitoxantrona; mofarotena; molgramostim; anticorpo monoclonal, gonadotrophina coriônica humana; parede celular de monofosforil lipídeo A+miobactéria sc; mopidamol; inibidor do gene de resistência a medicamnto múltiplo; terapia com base em supressor de tumor múltiplo 1; agente anti-câncer de mostarda; micaperoxida B; extrato da parede celular micobacteriana; miriaporona; N-acetildinalina; benzamidas N-substituídas; nafarelina; nagrestip; naloxona+pentazocina; napavina; nafterpina; nartograstim; nedaplatina; nemorubicina; ácido neridrônico; endopeptidase neutra; nilutamida; nisamicina; moduladores de óxido nítrico; antioxidante de nitróxido antioxidante; nitrulina; O6-benzilguanina; octreotida; ocicenona; oligonucleotídeos; onapristona; ondansetron; ondansetron; oracina; indutor de citocina oral; ormaplatina; osaterona; oxaliplatina; oxaunomicina; paclitaxel; análogos de paclitaxel; derivados de paclitaxel; palauamina; palmitoilrizoxina; ácido pamidrônico; panaxitriol; panomifeno; parabactina; pazeliptina; pegaspargase; peldesina; pentosan polissulfato sódico; pentostatina; pentrozol; perflubron; perfosfamida; perilil álcool; fenazinomicina; fenilacetato; inibidores de fosfatase; picibanil; pilocarpina cloridreto; pirarubicina; piritrexim; placetin A; placetin B; inibidor do ativador de plasminogênio; complexo de platina; compostos de platina; complexo de platina-triamina; porfimer sódico; porfiromicina; prednisona; propil bis-acridona; prostaglandina J2; inibidores de proteasoma; modulador imune com base em proteína A; inibidor da proteína cinase C; inibidores da proteína cinase C, microalgas; inibidores da fosfatase de tirosina de proteína; inibidores de purina nucleosida fosforilase; purpurinas; pirazoloacridina; conjugado de hemoglobina polioxietileno piridoxilado; antagonistas de raf; raltitrexed; ramosetron; inibidores da transferase de proteína ras farnesil; inibidores de ras; inibidor de ras-GAP; reteliptina desmetilada; rênio Re 186 etidronato; rizoxina; ribozimas; RII retinamida; rogletimida; rohitucina; romurtida; roquinimex; rubiginona B1; ruboxil; safingol; saintopina; SarCNU; sarcofitol A; sargramostim; Sdi 1 miméticos; semustina; inibidor derivado de senescência 1; oligonucleotídeos sentido; inibidores de transdução de sinal; moduladores da transdução de sinal; proteína de ligação de antígeno de cadeia simples; sizofiran; sobuzoxano; borocaptato sódico; fenilacetato sódico; solverol; proteína de ligação somatomedina; sonermina; ácido sparfósico; spicamicina D; spiromustina; splenopentina; spongistatina 1; squalamina; inibidor de célula tronco; inibidores de divisão de célula tronco; stipiamida; inibidores de stromelisina; sulfinosina; antagonista de peptídeo intestinal vasoativo superativo; suradista; suramina; swainsonina; glicosaminoglicanos sintéticos; talimustina; tamoxifen metiodida; tauromustina; tazarotena; tecogalan sódico; tegafur; telurapirílio; inibidores de telomerase; temoporfina; temozolomida; teniposida; tetrachlorodecaoxida; tetrazomina; taliblastina; tiocoralina; trombopoietina; trombopoietina mimética; timalfasina; agonista do receptor de timopoietina; timotrinan; hormônio estmulador de tiróide; estanho etil etiopurpurina; tirapazamina; titanoceno bicloreto; topsentina; toremifeno; fator de célula tronco totipotente; inibidores de tradução; tretinoina; triacetiluridina; triciribina; trimetrexato; triptorelina; tropisetron; turosterida; inibidores de tirosina cinase; tirfostinas; inibidores de UBC; ubenimex; fator inibidor de desenvolvimento derivado do sino urogenital; antagonistas do receptor de urocinase; vapreotida; variolina B; sistema de vetor, terapia de gene de eritrócito; velaresol; veramina; verdinas; verteporfina; vinorelbina; vinxaltina; Vitaxin®; vorozol; zanoterona; zeniplatina; zilascorb e zinostatina stimalamer. Os medicamentos anti- câncer adicionais são 5-fluorouracila e leucovorina. Estes dois agentes podem ser úteis quando usados nos métodos que utilizam talidomida e um inibidor de topoisomerase. Nas formas de realização específicas, um agente anti-câncer não é um a gente quimioterapêutico.

[00331] Em formas de realização mais particulares, a presente invenção também compreende a administração de um anti-CD19 mAb em combinação com a administração de uma ou mais terapias, tais como, mas não limita-se a, agentes anti-câncer, tais como aqueles divulgados na Tabela 1, para o tratamento de cânceres de mama, ovário, melanoma, próstata, cólon e de pulmão como descrito acima. Quando usado em uma terapia de combinação, as dosagens e/ou a frequência de administração listadas na Tabela 2 podem ser diminuídas. Tabela 2. Agentes Anti-câncer

[00332] A invenção também abrange a administração de um anti- CD19 mAb em combinação com a terapia de radiação que compreende o uso de raios x, raios gama e outras fontes de radiação para a destruição das células cancerígenas. Nas formas de realização particulares, o tratamento com radiação é administrado como radiação de raio externo ou teleterapia em que a radiação é direcionada a partir de uma fonte remota. Em outras formas de realização, o tratamento com radiação é administrado como a terapia interna ou braquiterapia em que uma fonte radioativa é colocada dentro do corpo próximo às células cancerígenas ou massa tumoral.

[00333] As terapias contra o câncer e suas dosagens, vias de administração e uso recomendado são conhecidos na técnica e foram descritos em tal literatura como o Physician’s Desk Reference (56° ed., 2002).

5.20. COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS

[00334] A invenção também diz respeito a composições e métodos imunoterapêuticos para o tratamento de doenças e distúrbios da célula B nos pacientes humanos, tal como, mas não limita-se a, nocividades da célula B, por composições e métodos imunoterapêuticos para o tratamento e prevenção de GVHD, rejeição do enxerto, e distúrbio proliferativo do linfócito pós-transplante em recipientes de transplantes humanos, e por composições e métodos imunoterapêuticos para o tratamento de doenças e distúrbios autoimunes nos pacientes humanos, usando os anticorpos terapêuticos que ligam-se ao antígeno CD19 e pode mediar o ADCC humano.

[00335] A presente invenção diz respeito a composições farmacêuticas que compreendem os anticorpos anti-CD19 humanos, humanizados ou quiméricos do isotipo IgG1 ou IgG3 humano. A presente invenção também diz respeito a composições farmacêuticas que compreendem anticorpos humanos ou humanizados anti-CD19 do isotipo humano IgG2 ou IgG4 que pode mediar o ADCC humano. Em certas formas de realização, a presente invenção também diz respeito a composições farmacêuticas que compreendem anticorpos anti-CD19 quimerizados, humanizados, humanos ou monoclonais que podem ser produzidos pelo meio conhecido na técnica.

[00336] As formulações e regimes terapêuticos são descritos para tratar os pacientes humanos diagnosticados com as nocividades da célula B que derivam da células B e seus precursores, que inclui mas não limita-se a, leucemias linfoblásticas agudas (ALL), linfomas de Hodgkin, não linfomas de Hodgkin, leucemias do linfócito crônico da célula B (CLL), mieloma múltiplo, linfoma folicular, linfoma celular de manta, leucemias pró-linfomas, leucemias de células capilares, leucemias do linfócito agudo comum e algumas leucemias linfoblásticas agudas nulas.

[00337] Em uma outra forma de realização particular, os anticorpos anti-CD19 podem mediar o ADCC, citotoxicidade celular dependente do complemento, ou apoptose. As composições e métodos da presente invenção também tem uma vantagem do alvejamento de uma população mais ampla de células B do que outras imunoterapias direcionadas às células B. Por exemplo, os anticorpos anti-CD19 da presente invenção podem ser efetivos para as células alvo de medula óssea, células B circulantes, e maduras, células B que secretam o anticorpo. Consequentemente, os métodos e composições da invenção podem ser efetivos para reduzir ou esgotar as células B circulantes bem como a imunoglobulina de circulação.

[00338] Consequentemente, em um aspecto, a invenção fornece composições e métodos para o tratamento e prevenção de GVHD, rejeição do enxerto, e distúrbio linfoproliferativo de pós-transplante, que são associados com menos e/ou menores complicações diversas do que os agentes e regimes terapêuticos menos alvejados. Em uma forma de realização, as composições e métodos da invenção são usados com doses inferiores de agentes terapêuticos tradicionais do que seria possível na ausência dos métodos e composições da invenção. Em uma outra forma de realização, as composições e métodos da invenção removem a necessidade por uma forma mais diversa de terapia, tal como terapia de radiação, quimioterapia de alta dosagem, ou esplenectomia.

[00339] Em certas formas de realização, os anticorpos anti-CD19 e as composições podem ser administrados por um paciente do recipiente de transplante antes ou seguinte a transplantação, sozinho ou em combinação com outros agentes ou regimes terapêuticos para o tratamento ou prevenção de GVHD e rejeição do enxerto. Por exemplo, os anticorpos anti-CD19 e as composições podem ser usadas para esgotar os aloanticorpos a partir de um recipiente de transplante antes ou seguinte a transplantação de um enxerto alogenéico. Os anticorpos anti-CD19 e as composições também podem ser usados para esgotar as células que produzem os anticorpos a partir de um enxerto ex vivo, antes da transplantação, ou no doador, ou como profilaxia contra GVHD e rejeição do enxerto.

5.21. FORMULAÇÕES FARMACÊUTICAS, ADMINISTRAÇÃO E DOSAGEM

[00340] As formulações farmacêuticas da invenção contém como o ingrediente ativo os anticorpos anti-CD19 humanos, humanizados ou quiméricos. As formulações contém anticorpo nu, imunoconjugado, ou proteína de fusão em uma quantidade efetiva para a produção da resposta desejada em uma unidade de peso ou volume adequado para a administração por um paciente humano, e são preferivelmente estéreis. A resposta pode, por exemplo, ser medida pela determinação dos efeitos fisiológicos da composição do anticorpo anti-CD19, tal como, mas não limita-se a, depleção da circulação da célula B, depleção do tecido da célula B, regressão de uma nocividade da célula B, ou diminuição dos sintomas da doença. Outros ensaios serão conhecidos por uma pessoa comum habilitada na técnica e pode ser utilizado para medir o nível da resposta.

5.21.1. FORMULAÇÕES FARMACÊUTICAS

[00341] Uma composição do anticorpo anti-CD19 pode ser formulado com um carreador farmaceuticamente aceitável. O termo “farmaceuticamente aceitável” significa um ou mais materiais não tóxicos que não interferem com a efetividade da atividade biológica dos ingrediente ativos. Tais preparações podem conter rotineiramente sais, agentes de tamponação, conservantes, carreadores compatíveis, e opcionalmente outros agentes terapêuticos. Tais preparações farmaceuticamente aceitável também pode conter rotineiramente os enchedores líquidos ou sólidos compatíveis, diluentes ou substâncias encapsuladas que são adequadas para a administração em um humano. Quando usado na medicina, os sais devem ser farmaceuticamente aceitável, mas não sais farmaceuticamente aceitáveis podem ser convenientemente usado para preparar os sais farmaceuticamente aceitáveis destes e não são excluídos a partir do escopo da invenção. Tais sais farmacologicamente e farmaceuticamente aceitáveis incluem, mas não limita-se a, aqueles preparados a partir dos seguintes ácidos: clorídrico, brômico, sulfúrico, nítrico, fosfórico, maléico, acético, salicílico, cítrico, bórico, fórmico, malônico, succínico, e outros. Também, os sais farmaceuticamente aceitáveis podem ser preparados como metais alcalinos ou sais terrosos alcalinos, tal como sais de sódio, potássio ou cálcio. O termo “carreador” significa um ingrediente orgânico ou inorgânico, natural ou sintético, com que o ingrediente ativo é combinado para facilitar a aplicação. Os componentes das composições farmacêuticas também são capazes de ser co-misturados com os anticorpos da presente invenção, e com cada um outro, em uma tal maneira que não existe a interação que diminuiria substancialmente a eficácia farmacêutica desejada.

[00342] De acordo com certos aspectos da invenção, as composições do anticorpo anti-CD19 podem ser preparados para armanezar pela misturação do anticorpo ou imunoconjugado tendo o grau desejado de pureza com carreadores, excipientes ou estabilizadores opcionais aceitáveis fisiologicamente (Remington’s Pharmaceutical Sciences, 16° edição, Osol, A. Ed. (1999)), na forma de formulações liofilizadas ou soluções aquosas. Os carreadores, excipientes ou estabilizadores aceitáveis não são tóxicos aos recipientes nas dosagens e concentrações utilizadas, e incluem tampões tal como fosfato, citrato, e outros ácidos orgânicos; antioxidantes que inclui ácido ascórbico e metionina; conservantes (tal como cloreto de amônio octadecildimetilbenzila; cloreto de hexametônio; cloreto de benzalcônio, cloreto de benzetônio; fenol, álcool butílico ou benzílico; parabenos de alquila tal como parabeno de metila ou propila; catequol; resorcinol; ciclohexanol; 3-pentanol e m- cresol); polipeptídeo de peso molecular baixo (menos do que cerca de 10 resíduos); proteínas, tal como albumina do soro, gelatina, ou imunoglobulinas; polímeros hidrofílicos tal como polivinilpirolidona; aminoácidos tal como glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina, ou lisina; monossacarídeos, dissacarídeos, e outros carboidratos que inclui glicose, manose, ou dextrinas; agentes de quelação tal como EDTA; açúcares tal como sacarose, manitol, trealose ou sorbitol; íons contadores que formam o sal tal como sódio; complexos metálicos (por exemplo, complexos da proteína Zn); e/ou tensoativos não iônicos tal como TWEEN, PLURONICS™ ou polietileno glicol (PEG).

[00343] A composições do anticorpo anti-CD19 também podem conter, opcionalmente, conservantes adequados, tal como: cloreto de benzalcônio; clorobutanol; parabenos e timerosal.

[00344] As composições do anticorpo anti-CD19 podem ser convenientemente presentes em uma forma de dosagem de unidade e pode ser preparada por qualquer um dos métodos bem conhecidos na técnica de farmácia. Todos os métodos incluem a etapa de colocar o agente ativo em associação com um carreador que constitui um ou mais ingredientes acessórios. No geral, as composições dos anticorpo anti-CD19 são preparadas pela uniformidade e colocar intimamente o composto ativo em associação com um carreador líquido, um carreador sólido finamente dividido, ou ambos, e então, se necessário, formar o produto.

[00345] As composições adequadas para a administração parenteral convenientemente compreende uma preparação aquosa estéril ou não estéril do anticorpo anti-CD19, que é preferivelmente isotônico com os sangues dos recipientes. Esta preparação pode ser formulada de acordo com os métodos conhecidos usando a dispersão adequada ou agentes de umectação e agentes de suspensão. A preparação injetável estéril também pode ser uma solução ou injeção injetável estéril em um diluente ou solvente não tóxico aceitável parenteralmente, por exemplo, como uma solução em 1,3-butanodiol. Entre os veículos e solventes aceitáveis que podem ser utilizados são água, solução de Ringer, e solução de cloreto de sódio isotônico. Além disso, os óleos estéreis, fixados são convencionalmente utilizados como um solvente ou meio de suspensão. Para este propósito qualquer óleo fixado suave pode ser utilizado que inclui mono ou di- glicerídeos sintéticos. Além disso, os ácidos graxos tal como ácido oléico pode ser usado na preparação dos injetáveis. A formulação do carreador adequado para a administração oral, subcutânea, intravenosa, intramuscular, etc. pode ser encontrado em Remington’s Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, PA. Em certas formas de realização, a formulação do carreador adequada por várias vias de administração pode ser o mesmo ou similar aquele descrito por RITUXAN™. Ver, Physicians’ Desk Reference (Medical Economics Company, Inc., Montvale, NJ, 2005), páginas 958 a 960 e 1354 a 1357, que é incorporada neste por referência em sua totalidade. Em certas formas de realização da invenção, as composições do anticorpo anti-CD19 são formulados pela administração intravenosa com cloreto de sódio, citrato de sódio diidratado, polisorbato 80, e água estéril onde o pH da composição é ajustado por aproximadamente 6,5. Aqueles habilitados na técnica estão cientes que a injeção intravenosa fornece um modo útil de administração devido à eficácia da circulação em anticorpos de rápida distribuição. O administração intravenosa, entretanto, é submetido a limitação pela barreira vascular que compreende as células endoteliais da vasculatura e a matriz sub- endotelial. Ainda, a barreira vascular é um problemas mais notável para a retirada dos anticorpos terapêuticos por tumores sólidos. Os linfomas tem taxas de fluxo sanguíneas relativamente altas, contribuindo para a liberação do anticorpo efetivo. As vias intralinfáticas de administração, tal como injeção subcutânea ou intramuscular, ou pela cateterização de vasos linfáticos, também fornecem um significado útil do tratamento dos linfomas da célula B. Em certas formas de realização, os anticorpos anti-CD19 das composições e métodos da invenção são subcutaneamente administrada por si só. Em tal forma de realização, a composição é formulada como um medicamento liofilizado ou em um tampão líquido (por exemplo, PBS e/ou citrato) em torno de 50 mg/mL.

[00346] A formulação neste também pode conter mais do que um composto ativo como necessário para a indicação particular a ser tratada, preferivelmente aqueles com atividades complementares que não afetam adversamente cada outro. Por exemplo, este pode ser desejável por ainda fornecer um agente imunosupressivo. Tais moléculas estão adequadamente presentes em combinação nas quantidades que são efetivas para o propósito pretendido.

[00347] Os ingrediente ativos também podem ser presos nas microcápsulas preparadas, por exemplo, pelas técnicas de co- acervação ou pela polimerização interfacial, por exemplo, hidroximetilcelulose ou microcápsula de gelatina e microcápsula de poli-(metilmetacilato), respectivamente, nos sistemas de liberação de medicamento coloidal (por exemplo, lipossomas, microesferas de albumina, microemulsões, nano-partículas e nanocápsulas) ou em macroemulsões. Tais técnicas são divulgados em Remington’s Pharmaceutical Sciences 16° edição, Osol, A. Ed. (1980).

[00348] As formulações a serem usados para administração in vivo são tipicamente estéreis. Este é prontamente realizado pela filtração através das membranas de filtração estéreis.

[00349] As preparações liberadas sustentadas podem ser preparadas. Exemplos adequados das preparações liberadas sustentadas incluem matrizes semi-permeáveis de polímeros hidrofóbicos sólidos contendo um anticorpo anti-CD19, pelo qual as matrizes são na forma de artigos formados, por exemplo, películas, ou microcápsula. Exemplos de matrizes liberadas sustentadas incluem poliésteres, hidrogéis (por exemplo, poli(2-hidroxietil-metacrilato), ou poli(álcool vinílico)), polilactídeos (Patente U.S. N° 3.773.919), copolímeros de ácido L-glutâmico e Y—etil—L—glutamato, acetato de etileno vinila não degradável, copolímeros ácidos de ácido glucólico láctico degradável tal como o LUPRON DEPOT™ (microesferas injetáveis compostas de copolímero ácido do ácido glicólico láctico e acetato de leuprolídeo) e ácido poli—D—(—)—3—hidroxibutírico. Enquanto os polímeros tal como acetato de etileno—vinila e ácido do ácido glicólico láctico capaz de liberar as moléculas em 100 dias, certas proteínas que liberam hidrogéis por curtos períodos de tempo. Quando os anticorpos encapsulados permanecem no corpo por um longo tempo, este podem desnaturar ou agregrar como um resultado da exposição da umidade a 37° C, resultado na perda da atividade biológica e mudanças possíveis na imunogeneicidade. As estratégias racionais podem ser desviada para a estabilização dependendo do mecanismo envolvildo. Por exemplo, se o mecanismo de agregação é descoberto ser intermolecular da formação de ligação S-S através do intercâmbio de tio-bissulfeto, a estabilização pode ser atingida pela modificação dos resíduos de sulfidrila, liofilização de soluções ácidas, controle do conteúdo da umidade, usando aditivos apropriados, e desenvolvimento das composições de matriz de polímero. Em certas formas de realização, os carreadores farmaceuticamente aceitáveis usados nas composições da invenção não afetam o ADCC ou CDC humano.

[00350] As composições do anticorpo anti-CD19 divulgados neste também podem ser formulados como imunolipossomas. Um “lipossoma” é uma pequena vesícula composta de vários tipos de lipídeos, fosfolipídeos e/ou tensoativo que é útil para a liberação de um medicamento (tal como anticorpos anti-CD19 debatidos neste) por um humano. Os componentes dos lipossomas são comumente arranjados em uma formação de bi-camada, similar ao arranjo de lipídeo das membranas bilógicas. Os lipossomas contendo os anticorpos da invenção são preparados pelos métodos conhecidos na técnica, tal como descritos em Epstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82:3688 (1985); Hwang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4030 (1980) e Patente U. S. N° 4.485.045 e 4.544.545. Os lipossomas com o tempo de circulação intensificados são divulgados na Patente U. S. N° 5.013.556. Particularmente os lipossomas úteis podem ser gerados pelo método de evaporação de fase reversa com uma composição de lipídeo que compreende fosfatidilcolina, colesterol e fosfatidiletanolamina derivados por PEG (PEG-PE). Os lipossomas são expelidos através dos filtros do tamanho do poro definido para produzir os lipossomas com os diâmetros desejados. O anticorpo da presente invenção pode ser conjugado aos lipossomas como descrito em Martin et al., J. Biol. Chem., 257:286-288 (1982) por intermédio de uma reação de inetercâmbio de bissulfeto. Um agente terapêutico também pode ser contido dentro do lipossoma. Ver, Gabizon et al., J. National Cancer Inst., (19)1484 (1989).

[00351] Algumas das formulações farmacêuticas incluem, mas não limita-se a: (a) Um concentrado líquido livre de conservante estéril pela administração intravenosa (i.v.) do anticorpo anti-CD19, fornecido em uma concentração de 10 mg/ml em 100 mg (10 mL) ou 500 mg (50 mL) por vias de uso simples. O produto pode ser formulado pela adminitração intra venosa usando o cloreto de sódio, citrato de sódio diidratado, polisorbato e água estéril para a injeção. Por exemplo, o produto pode ser formulado em 9,0 mg/mL de cloreto de sódio, 7,35 mg/mL de citrato de sódio diidratado, 0,7 mg/mL de polisorbato 80, e água estéril para a injeção. O pH é ajustado por 6,5. (b) Um pó liofilizado estéril em um frasco de vidro de uso simples para a injeção subcutânea (s.c.). O produto pode ser formulado com sacarose, monoidrato de cloridreto de histidina L, histidina L e polisorbato 20. Por exemplo, cada frasco de uso simples pode conter 150 mg do anticorpo anti-CD19, 123,2 mg de sacarose, 6,8 mg de monoidrato de cloroidreto de histidina L, 4,3 mg de histidina L, e 3 mg de polisorbato 20. A reconstituição do frasco de uso simples com 1,3 ml por água estéril para a injeção produzindo aproximadamente 1,5 ml de solução para liberar 125 mg por 1,25 ml (100 mg/ml) de anticorpo. (c) Um pó liofilizado livre de conservante estéril para a administração intravenosa (i.v.). O produto pode ser formulado com diidratado α-trealose, HCl de histidina L, histidina e polisorbato 20 USP. Por exemplo, cada frasco pode conter 440 mg de anticorpo anti- CD19, 400 mg α, diidrato de α-trealose, 9,9 mg de HCl de histidina L, 6,4 mg de histidina L, e 1,8 mg de polisorbato 20, USP. A reconstituição com 20 ml de água bacterioestática para a injeção (BWFI), USP, contendo 1,1 % de álcool benzílico como um conservante, produzindo uma solução multi-dose contendo 21 mg/ml do anticorpo em um pH de aproximadamente 6. (d) Um pó liofilizado estéril para a infusão intravenosa em que um anticorpo anti-CD19 é formulada com a sacarose, polisorbato, monoidrato de fosfato de sódio monobásico, e diidrato de fosfato de sódio dibásico. Por exemplo, cada frasco de uso simples pode conter 100 mg de anticorpo, 500 mg de sacarose, 0,5 mg de polisorbato 80, 2,2 mg de monoidrato de fosfato de sódio monobásico, e 6,1 mg de diidrato de fosfato de sódio dibásico. Nenhum conservante estão presentes. A reconstituição seguinte com 10 ml de água estéril para a injeção, USP, o pH resultante é aproximadamente 7,2. (e) Uma solução livre de conservante estéril para a administração subcutânea fornecido em uma dose simples, 1 ml de seringa pré-enchida. O produto pode ser formulado com cloreto de sódio, diidrato de fosfato de sódio monobásico, diidrato de fosfato de sódio dibásico, citrato de sódio, monoidrato de ácido cítrico, manitol, polisorbato 80 e água para a injeção, hidróxido de sódio USP. Pode ser adicionado para ajustar o pH a cerca de 5,2.

[00352] Por exemplo, cada seringa pode ser formulada para liberar 0,8 ml (40 mg) do produto do medicamento. Cada 0,8 ml contendo 40 mg do anticorpo anti-CD19, 4,93 mg de cloreto de sódio, 0,69 mg de diidrato de fosfato sódio monobásico, 1,22 mg de diidrato de fosfato sódio dibásico, 0,24 mg de citrato de sódio, 1,04 de monoidrato de ácido cítrico, 9,6 mg de manitol, 0,8 mg de polisorbato 80 e água para a injeção, USP. (f) Um pó liofilizado livre de preservativo estéril contendo um frasco de uso simples que é reconstituído com água estéril para a injeção (SWFI), USP, e administrado como uma injeção subcutânea (s.c.). O produto pode ser formulado com sacarose, monoidrato de cloridreto de histidina, histidina L, e polisorbato. Por exemplo, um frasco de 75 mg pode conter 129,6 mg ou 112,5 mg de um anticorpo anti-CD19, 93,1 mg de sacarose, 1,8 mg de monoidrato de cloridreto de histidina L, 1,2 mg de histidina L, e 0,3 mg de polisorbato 20, e é projetado para liberar 75 mg do anticorpo na reconstituição depois de 0,6 ml com 0,9 ml de SWFI, USP. Um frasco 150 mg pode conter 202,5 mg ou 175 mg do anticorpo anti-CD19, 145,5 mg de sacarose, 2,8 mg de monoidrato de cloriidreto de histidina L, 1,8 mg de histidina L, e 0,5 mg de polisorbato 20, e é projetado para liberar 150 mg do anticorpo na reconstituição de 1,2 ml depois com 1,4 ml de SWFI, USP. (g) Um produto liofilizado estéril para a reconstituição com a água estéril para a injeção. O produto pode ser formulado como frascos pelo uso simples para a injeção intramuscular (IM) usando o manitol, histidina e glicina. Por exemplo, cada frasco de uso simples pode conter 100 mg do anticorpo anti-CD19, 67,5 mg de manitol, 8,7 mg de histidina e 0,3 mg de glicina, e é projetado para liberar 100 mg do anticorpo em 1,0 ml quando reconstituído com 1,0 ml de água estéril para a injeção. Como um outro exemplo, cada frasco de uso simples pode conter 50 mg de anticorpo anti-CD19, 40,5 mg de manitol, 5,2 mg de histidina e 0,2 mg de glicina, e é projetado para liberar 50 mg de anticorpo quando reconstituído com 0,6 ml da água estéril para a injeção. (h) Uma solução livre de conservante estéril para a injeção intramuscular (IM), fornecido em uma concentração de 100 mg/ml. O produto pode ser formulado em um frasco de uso simples com histidina, glicina, e água estéril para a injeção. Por exemplo, cada frasco de uso simples pode ser formulado com 100 mg do anticorpo, 4,7 mg de histidina, e 0,1 mg de glicina em um volume de 1,2 ml projetado para liberar 100 mg do anticorpo em 1 ml. Como um outro exemplo, cada frasco de uso simples pode ser formulado com 50 mg do anticorpo, 2,7 mg de histidina e 0,08 mg de glicina em um volume de 0,7 ml ou 0,5 ml projetado por liberar 50 mg do anticorpo em 0,5 ml.

[00353] Em certas formas de realização, uma composição farmacêutica da invenção é estável em 4° C. Em certas formas de realização, a composição farmacêutica da invenção é estável em temperatura ambiente.

5.21.2. VIDA MÉDIA DO ANTICORPO

[00354] Em certas formas de realização, a vida média de um anticorpo anti-CD19 das composições e métodos da invenção é pelo menos cerca de 4 a 7 dias. Em certas formas de realização, o meio da vida média de um anticorpo anti-CD19 das composições e métodos da invenção é pelo menos cerca de 2 a 5 dias, 3 a 6 dias, 4 a 7 dias, 5 a 8 dias, 6 a 9 dias, 7 a 10 dias, 8 a 11 dias, 8 a 12, 9 a 13, 10 a 14, 11 a 15, 12 a 16, 13 a 17, 14 a 18, 15 a 19, ou 16 a 20 dias. Em outras formas de realização, o meio da vida média de um anticorpo anti-CD19 das composições e métodos da invenção é pelo menos cerca de 17 a 21 dias, 18 a 22 dias, 19 a 23 dias, 20 a 24 dias, 21 a 25, dias, 22 a 26 dias, 23 a 27 dias, 24 a 28 dias, 25 a 29 dias, ou 26 a 30 dias. Ainda em uma forma de realização a vida média de um anticorpo anti-CD19 das composições e métodos da invenção pode ser até cerca de 50 dias. Em certas formas de realização, as vidas médias dos anticorpos das composições e métodos da invenção podem ser prolongados pelos métodos conhecidos na técnica. Tal prolongação pode ser rotacionado para reduzir a quantidade e/ou a frequência da dosagem das composições do anticorpo. Os anticorpos com vidas-médias melhoradas in vivo e métodos para a preparação de si próprio e são divulgados na Patente U. S. N° 6.277.375 e Publicação Internacional N° WO 98/23289 e WO 97/3461.

[00355] A circulação do soro dos anticorpos anti-CD19 in vivo também pode ser prolongado pela ligação das moléculas de polímero inerte tal como alto peso molecular alto do polietilenoglicol (PEG) aos anticorpos com ou sem um ligador multifuncional através da conjugação específica local do PEG ao terminal N ou C dos anticorpos ou por intermédio dos grupos amino epsilon presente nos resíduos de lisila. A derivação do polímero linear ou ramificado que resulta na perda mínima da atividade biológica será usada. O grau de conjugação pode ser monitorado fechadamente por SDS-PAGE e a espectrometria de massa para garantir a própria conjugação das moléculas PEG aos anticorpos. O PEG não reagido pode ser separado a partir do anticorpo-PEG conjugado pela exclusão de tamanho ou pela cromatografia trocadora de íon. Os anticorpos derivados de PEG podem ser testados para a atividade da ligação bem como para a eficácia in vivo usando métodos conhecidos por aqueles habilitados na técnica, por exemplo, pelo imunoensaio descrito neste.

[00356] Ainda, os anticorpos das composições e métodos da invenção podem ser conjugados por albumina a fim de fazer o anticorpo mais estável in vivo ou tem uma vida-média mais longa in vivo. As técnicas são reservatórios conhecidos na técnica, ver, por exemplo, Publicação Internacional N° WO 93/15199, WO 93/15200, e WO 01/77137 e Patente Européia N° EP 413, 622, todos de que são incorporados neste por referência.

5.21.3. ADMINISTRAÇÃO E DOSAGEM

[00357] A administração das composições da invenção por um paciente humano pode ser por qualquer via, incluindo mas não limitando a administração intravenosa, intradérmica, transdérmica, subcutânea, intramuscular, inalação (por exemplo, via de um pulverizador), bucal (por exemplo, sub-lingual), tópico (isto é, tanto as superfícies mucosais quanto a da pele, incluindo superfícies aéreas), intratecal, intraarticular, intraplural, intracerebral, intra-arterial, intraperitoneal, oral, intralinfática, intranasal, retal ou vaginal, pela perfusão através de um catéter regional, ou pela injeção intralesional direta. Em uma forma de realização, as composições da invenção são administradas pelo esforço intravenoso ou infusão intravenosa dada em períodos definidos (por exemplo, 0,5 a 2 horas). As composições da invenção podem ser liberadas por meios peristálticos ou na forma de um depósito, embora a via mais adequada em qualquer caso dado dependerá, como é bem conhecido na técnica, em tais fatores como as espécies, idade, condição de gênero ou total do paciente, a natureza e a gravidade da condição sendo tratada e/ou na natureza da composição particular (isto é, dosagem, formulação) que está sendo administrada. Nas formas de realização particulares, a via de administração é a via de bolo ou infusão contínua durante um período de tempo, uma vez ou duas vezes na semana. Em outra forma de realização particular, a via de administração é pela injeção subcutânea, opcionalmente uma vez ou duas vezes semanalmente. Em uma forma de realização, as composições, e/ou métodos da invenção são administrados em uma base de paciente de ambulatório.

[00358] Em certas formas de realização, a dose da composição que compreende anticorpo anti-CD19 é medido em unidades de mg/kg do peso corporal do paciente. Em outra forma de realização, a dose da composição que compreende anticorpo anti-CD19 é medido em unidades de mg/kg do peso corporal inclinado do paciente (isto é, peso corporal menos teor de gordura corporal). Já em outra forma de realização, a dose da composição que compreende anticorpo anti- CD19 é medido em unidades de mg/m2 da área de superfície corporal do paciente. Já em outra forma de realização, a dose da composição que compreende anticorpo anti-CD19 é medido em unidades de mg por dose administrada a um paciente. Qualquer medida de dosagem pode ser usada na conjunção com as composições e métodos da invenção e as unidades de dosagem podem ser convertidas por meios padrão na técnica.

[00359] Aquele habilitado na técnica estimará que as dosagens podem ser selecionadas com base em diversos fatores incluindo a idade, sexo, espécies e condição do paciente (por exemplo, estágio da nocividade da célula B), o grau desejado da depleção celular, a doença a ser tratada e/ou o anticorpo particular ou fragmento de ligação por antígeno sendo usado e pode ser determinado por uma pessoa habilitada na técnica. Por exemplo, as quantidades efetivas das composições da invenção podem ser extrapoladas a partir das curvas de resposta da dosagem derivadas dos sistemas de teste in vitro ou a partir dos sistemas de teste de modelo animal (por exemplo, o rato do algodão ou macaco). Os modelos e métodos para a avaliação dos efeitos dos anticorpos são conhecidos na técnica (Wooldridge et al., Sangue, 89(8): 2994-2998 (1997)), incorporado por referência neste em sua totalidade). Em certas formas de realização, para as nocividades de célula B particular, o regime terapêutico padrão na técnica para a terapia de anticorpo pode ser usada com as composições e métodos da invenção.

[00360] Exemplos de regime de dosagem que podem ser usados em métodos da invenção incluem, mas não são limitados a, diariamente, três vezes por semana (intermitente), semanalmente, ou a cada 14 dias. Em certas formas de realização, o regime de dosagem inclui, mas não são limitados a, dosagem mensalmente ou a dosagem a cada 6 a 8 semanas.

[00361] Aquele habilitado na técnica estimará que as dosagens são no geral mais altas e/ou a frequência da administração maior para o tratamento inicial como comparado com os regimes de manutenção.

[00362] Em algumas formas de realização da invenção, os anticorpos anti-CD19 ligam-se as células B e podem resultar na depleção eficiente (isto é, em baixa dosagem) das células B (como descrito neste). Os graus mais altos de ligação podem ser atingidos onde a densidade do CD19 humano na superfície de uma célula B do paciente é alta. Em certas formas de realização, as dosagens do anticorpo (opcionalmente em um carreador aceitável farmaceuticamente como parte de uma composição farmacêutica) são pelo menos de cerca de 0,0005, 0,001, 0,05, 0,075, 0,1, 0,25, 0,375, 0,5, 1, 2,5, 5, 10, 20, 37,5, ou 50 mg/m2 e/ou menos do que cerca de 500, 475, 450, 425, 400, 375, 350, 325, 300, 275, 250, 225, 200, 175, 150, 125, 100, 75, 60, 50, 37,5, 20, 15, 10, 5, 2,5, 1, 0,5, 0,375, 0,1, 0,075 ou 0,01 mg/m2. Em certas formas de realização, a dosagem é entre cerca de 0,0005 a cerca de 200 mg/m2, entre cerca de 0,001 e 150 mg/m2, entre cerca de 0,075 e 125 mg/m2, entre cerca de 0,375 e 100 mg/m2, entre cerca de 2,5 e 75 mg/m2, entre cerca de 10 e 75 mg/m2, e entre cerca de 20 e 50 mg/m2. Em uma forma de realização relatada, a dosagem do anticorpo anti-CD19 usado é pelo menos de cerca de 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 1,5, 2, 2,5, 3, 3,5, 4, 4,5, 5, 5,5, 6, 6,5, 7, 7,5, 8, 8,5, 9, 9,5, 10, 10,5, 11, 11,5, 12, 12,5, 13, 13,5, 14, 14,5, 15, 15,5, 16, 16,5, 17, 17,5, 18, 18,5, 19, 19,5, 20, 20,5 mg/kg do peso corporal de um paciente. Em certas formas de realização, a dose do anticorpo anti-CD19 nu usado é pelo menos de cerca de 1 a 10, 5 a 15, 10 a 20, ou 15 a 25 mg/kg do peso corporal de um paciente. Em certas formas de realização, a dose do anticorpo anti-CD19 usado é pelo menos de cerca de 1 a 20, 3 a 15, ou 5 a 10 mg/kg do peso corporal de um paciente. Em outra forma de realização, a dose do anticorpo anti-CD19 usado é pelo menos de cerca de 5, 6, 7, 8, 9, ou 10 mg/kg do peso corporal de um paciente. Em certas formas de realização, uma unidade de dosagem simples do anticorpo (opcionalmente em um carreador aceitável farmaceuticamente como parte de uma composição farmacêutica) pode ser pelo menos de cerca de 0,5, 1, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158, 160, 162, 164, 166, 168, 170, 172, 174, 176, 178, 180, 182, 184, 186, 188, 190, 192, 194, 196, 198, 200, 204, 206, 208, 210, 212, 214, 216, 218, 220, 222, 224, 226, 228, 230, 232, 234, 236, 238, 240, 242, 244, 246, 248, ou 250 microgramas/m2. Em outra forma de realização, a dose é até 1 g por unidade de dosagem simples.

[00363] Todos das dosagens acima são exemplares e podem ser usado na conjunção com as composições e métodos da invenção, entretanto onde um anticorpo anti-CD19 é usado na conjunção com uma toxina ou agente de radioterapia em doses inferiores descritas acima podem ser preferidas. Em certas formas de realização, onde o paciente tem níveis baixos da densidade de CD19, as doses inferiores descritas acima podem ser preferidas.

[00364] Em certas formas de realização da invenção onde os anticorpos quiméricos anti-CD19 são usados, a dose ou quantidade do anticorpo quimérico é maior do que cerca de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, ou 16 mg/kg do peso corporal do paciente. Em outra forma de realização da invenção onde os anticorpos quiméricos anti-CD19 são usados, a dose ou quantidade do anticorpo quimérico é menos do que cerca de 1, 0,9, 0,8, 0,7, 0,6, 0,5, 0,4, 0,3, 0,2, ou 0,1 mg/kg do peso corporal do paciente.

[00365] Em algumas formas de realização dos métodos desta invenção, os anticorpos e/ou as composições desta invenção podem ser administradas em uma dose inferior do que cerca de 375 mg/m2; em uma dose inferior do que cerca de 37,5 mg/m2; em uma dose inferior do que cerca de 0,375 mg/m2; e/ou em uma dose entre cerca de 0,075 mg/m2 e cerca de 125 mg/m2. Em certas formas de realização dos métodos da invenção, o regime de dosagem compreende baixas doses, administradas em intervalos repetidos. Por exemplo, em uma forma de realização, as composições da invenção podem ser administradas em uma dose inferior do que cerca de 375 mg/m2 em intervalos de aproximadamente em cada 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 125, 150, 175, ou 200 dias.

[00366] A dosagem especificada pode resultar na depleção da célula B no humano tratado usando as composições e métodos da invenção por um período de pelo menos de cerca de 1, 2, 3, 5, 7, 10, 14, 20, 30, 45, 60, 75, 90, 120, 150 ou 180 dias ou mais. Em certas formas de realização, pré-células B (não expressam imunoglobulina de superfície) são esgotadas. Em certas formas de realização, as células B maduras (que expressam a imunoglobulina de superfície) são esgotadas. Em outra forma de realização, todos os tipos não malignos das células B podem exibir a depleção. Qualquer destes tipos das células B podem ser usados para medir a depleção da célula B. A depleção da célula B pode ser medido em fluidos corpóreos tal como soro sanguíneo, ou nos tecidos tal como medula óssea. Em certas formas de realização dos métodos da invenção, as células B são esgotadas por pelo menos 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, ou 100 % em comparação aos níveis de célula B no paciente sendo tratado antes do uso das composições e métodos da invenção. Em outra forma de realização dos métodos da invenção, as células B são esgotadas por pelo menos 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, ou 100 % em comparação aos níveis de célula B de padrão típico para humanos. Em uma forma de realização relatada, os níveis da célula B de padrão típico para humanos são determinados usando os pacientes comparados ao paciente sendo tratado com relação a idade, sexo, peso, e outros fatores.

[00367] Em certas formas de realização da invenção, a dosagem de cerca de 125 mg/m2 ou menos de um anticorpo ou fragmento de ligação por antígeno resulta na depleção da célula B por um período de pelo menos de cerca de 7, 14, 21, 30, 45, 60, 90, 120, 150, ou 200 dias. Em uma outra forma de realização representativa, a dosagem de cerca de 37,5 mg/m2 ou menos células B esgotadas por um período de pelo menos de cerca de 7, 14, 21, 30, 45, 60, 90, 120, 150, ou 200 dias. Ainda em outra forma de realização, a dosagem de cerca de 0,375 mg/m2 ou menos resulta na depleção das células B por pelo menos de cerca de 7, 14, 21, 30, 45 ou 60 dias. Em uma outra forma de realização, a dosagem de cerca de 0,075 mg/m2 ou menos resulta na depleção das células B por um período de pelo menos de cerca de 7, 14, 21, 30, 45, 60, 90, 120, 150, ou 200 dias. Já em outra forma de realização, a dosagem de cerca de 0,01 mg/m2, 0,005 mg/m2 ou ainda 0,001 mg/m2 ou menos resulta na depleção das células B por pelo menos de cerca de 3, 5, 7, 10, 14, 21, 30, 45, 60, 90, 120, 150, ou 200 dias. De acordo com escumo para formas de realização, a dosagem pode ser administrada por qualquer via adequada, mas é opcionalmente administrada por uma via subcutânea.

[00368] Como um outro aspecto, a invenção fornece a descoberta que a depleção da célula B e/ou tratamento de distúrbio das células B podem ser atingidos em dosagens inferiores do anticorpo ou fragmento de anticorpo do que utilizado em métodos disponíveis correntemente. Deste modo, em uma outra forma de realização, a invenção fornece um método % da depleção da células B e/ou tratamento de um distúrbio da célula B, que compreende administrar a um humano, uma quantidade efetiva de um anticorpo que liga-se especificamente a CD19, em que a dosagem de cerca de 500, 475, 450, 425, 400, 375, 350, 325, 300, 275, 250, 225, 200, 175, 150, 125, 100, 75, 60, 50, 37,5, 20, 10, 5, 2.5, 1, 0,5, 0,375, 0,25, 0,1, 0,075, 0,05, 0,001, 0,0005 mg/m2 ou menos resulta na depleção das células B (circulação e/ou células B do tecido) de 25 %, 35 %, 50 %, 60 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 98 % ou mais por um período de pelo menos cerca de 3, 5, 7, 10, 14, 21, 30, 45, 60, 75, 90, 120, 150, 180, ou 200 dias ou mais. Em forma de realização representativa, a dosagem de cerca de 125 mg/m2 ou 75 mg/m2 ou menos resulta em pelo menos de cerca de 50 %, 75 %, 85 % ou 90 % da depleção das células B por pelo menos de cerca de 7, 14, 21, 30, 60, 75, 90, 120, 150 ou 180 dias. Em outra forma de realização, a dosagem de cerca de 50, 37,5 ou 10 mg/m2 resulta em pelo menos de cerca de a 50 %, 75 %, 85 % ou 90 % da depleção das células B por pelo menos de cerca de 7, 14, 21, 30, 60, 75, 90, 120 ou 180 dias. Ainda em outra forma de realização, a dosagem de cerca de 0,375 ou 0,1 mg/m2 resulta em pelo menos cerca de a 50 %, 75 %, 85 % ou 90 da depleção das células B por pelo menos de cerca de 7, 14, 21, 30, 60, 75 ou 90 dias. Ainda na forma de realização, a dosagem de cerca de 0,075, 0,01, 0,001, ou 0,0005 mg/m2 resulta em pelo menos cerca de a 50 %, 75 %, 85 % ou 90 da depleção das células B por pelo menos de cerca de 7, 14, 21, 30 ou 60 dias.

[00369] Em certas formas de realização da invenção, a dose pode ser escalado ou reduzida para manter uma dose constante no sangue ou em um tecido, tal como, mas não limitando a, medula óssea. Em uma forma de realização relatada, a dose é escalado ou reduzida por cerca de 2 %, 5 %, 8 %, 10 %, 15 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, e 95 % a fim de manter um nível desejado de um anticorpo das composições e métodos da invenção.

[00370] Em certas formas de realização, a dosagem pode ser ajustada e/ou a taxa de infusão pode ser reduzida com base na resposta imunogênica de paciente por composições e métodos da invenção.

[00371] De acordo com um aspecto dos métodos da invenção, a dosagem carregada de um anticorpo anti-CD19 e/ou composição da invenção pode ser administrada primeiro seguindo por uma dose de manutenção até a nocividade da célula B sendo tratada progressiva ou seguido pelo curso do tratamento definido (por exemplo, CAMPATH™, MYLOTARG™, ou RITUXAN™, o último pelo qual permite aos pacientes a serem tratados por diversos números de doses que tem aumentada como os dados adicionais foram gerados).

[00372] De acordo com um outro aspecto dos métodos da invenção, um paciente pode ser pré-tratado com as composições e métodos da invenção para detectar, resposta imunogênica minimizada, ou efeitos adversos minimizados das composições e métodos da invenção.

5.21.4 TESTE DE TOXICIDADE

[00373] A tolerância, toxicidade e/ou eficácia das composições e/ou regime de tratamento da presente invenção pode ser determinado por procedimentos farmacêuticos padrões em culturas celulares ou animais experimentais, por exemplo, para determinação de LD50 (a dose letal por 50 % da população), o ED50 (a dose terapeuticamente efetiva em 50 % da população) e IC50 (a dose efetiva para atingir uma inibição de 50%). Em uma forma de realização, a dose é uma dosagem efetiva para atingir pelo menos a 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, ou 99 % da depleção da circulação das células B ou circulação da imunogloblulina, ou ambas. A razão da dose entre os efeitos tóxicos e terapêuticos é o índice terapêutico e este pode ser expressado como a razão LD50/ED50, as terapias que exibem amplos índices terapêuticos podem ser preferidas. Enquanto as terapias que exibem os efeitos secundários tóxicos podem ser usados, a atenção deve ser tomada para projetar um sistema de liberação que alveja tais agentes por células que expressam CD19 a fim de minimizar o dano potencial por células negativas CD19 e, por meio disso, reduzir os efeitos secundários.

[00374] Os dados obtidos a partir do ensaio de cultura celular e os estudos de animais podem ser usados na formulação de uma faixa das dosagens das composições e/ou regime de tratamento para o uso em humanos. A dosagem de tais agentes pode posicionar dentro de uma faixa das concentrações de circulação que incluem o ED50 com pouca ou nenhuma toxicidade. A dosagem pode variar dentro desta faixa dependendo da forma de dosagem utilizada e a via de administração utilizada. Para qualquer terapia usada em métodos da invenção, a dose efetiva terapeuticamente pode ser apreciada por modelos de animais apropriados. Dependendo das espécies do modelo animal, a dose pode ser escalada para o uso em humanos de acordo com as fórmulas aceitáveis na técnica, por exemplo, como fornecidas por Freireich et al., Quantitative comparison of toxicity of anticancer agents in mouse, rat, monkey, dog, e human, Cancer Chemoterapy Reports, NCI 1966 40:219-244. Os dados obtidos a partir dos ensaios da cultura celular podem ser úteis para predizer o petencial da toxicidade. Os estudos dos animais podem ser usados para formualar uma dose específica para atingir a circulação da faixa de concentração de plasma que inclui o IC50 (isto é, a concentração do composto do teste que atingi uma inibição média-máxima dos sintomas) como determinado na cultura celular. Tal informação pode ser usada por mais exatamente doses úteis determinadas em humanos. Os níveis de medicamento de plasma podem ser medidos, por exemplo, pelo alto desempenho de cromatografia líquida, ELISA, ou por ensaios com base celular.

5.22. DIAGNÓSTICO DO PACIENTE, ESTÁGIO E O REGIME ONCOLOGICO TERAPÊUTICO

[00375] De acordo com certos aspectos da invenção, o regime de tratamento e a dose usada com as composições e métodos da invenção é escolhida com base em diversos fatores incluindo, mas não limitando a, o estágio da doença ou distúrbio da célula B sendo tratada. O regime de tratamento apropriado pode ser determinado por uma pessoa habilitada na técnica pra os estágios particulares de uma doença ou distúrbio da célula B em um paciente ou população de paciente. As curvas de resposta da dosagem podem ser geradas usando protocolos padrões na técnica a fim de determinar a quantidade efetiva das composições da invenção para o tratamento dos pacientes tendo estágios diferentes de uma doença ou distúrbio da célula B. No geral, os paciente tendo mais estágios avançados de uma doença ou distúrbio da célula B requerirão doses mais altas e/ou mais doses frequentes que podem ser administradas em períodos mais longos de tempo em comparação aos pacientes tendo uma doença ou distúrbio da célula B de estágio precoce.

[00376] Os anticorpos anti-CD19, as composições e métodos da invenção podem ser praticada por tratar as doenças de células B, incluindo nocividade da célula B. O termo “nocividade da célula B” inclui qualquer nocidade que é derivada a partir de uma célula da linhagem da célula B. A nocividade da célula B exemplar inclui, mas não são limitados a: linfoma de Hodgkin de nenhum sub-tipo da célula B (NHL) incluindo NHL de grau baixo/folicular, NHL de pequenos linfócitos (SL), NHL de grau/folicular intermediário, NHL difuso de grau intermediário, NHL imunoblástico de alto grau, NHL linfoblástico de alto grau, NHL celular pequeno não clivado de alto grau; linfoma celular de manta, e NHL de doença volumosa; linfoma de Burkitt; mieloma múltiplo; leucemia linfoblástica pré-aguda B e outras nocividades que derivam a partir dos precursores da célula B precoce; leucemia linfócita aguda comum (ALL); leucemia linfócita crônica (CLL) incluindo CLL mutado por imunoglobulina e CLL não mutado por imunoglobulina; leucemia de células capilares; leucemia linfoblástica aguda nula; macroglobulinemia de Waldenstrom; linfoma da célula B amplo difuso (DLBCL) incluindo DLBCL (GCB) semelhante à célula B do centro germinal, DLBCL (ABC) semelhante à célula B ativada, e DLBCL de tipo 3; leucemia pró-linfócito; doença de cadeia leve; plasmacitoma; mieloma osteosclerótica; leucemia celular de plasma; gamopatia monoclonal de significância indeterminada (MGUS); combustão lenta de mieloma múltiplo (SMM); mieloma múltiplo indolente (IMM); linfoma de Hodgkin incluindo tipo pré-dominante de linfócito clássico e de nódulo; linfoma linfoplasmamacítico (LPL) e linfoma da zona marginal incluindo linfoma (MALT) de tecido linfóide associado à mucosa gástrica.

[00377] Em uma forma de realização adicional a invenção pode ser utilizada para tratar a nocividade da célula B madura (isto é, superfície celular no Ig expresso) incluindo mas não limitando um linfoma folicular, linfoma celular de manta, linfoma de Burkitt, mieloma múltiplo, linfoma da célula B ampla difusa (DLBCL) incluindo DLBCL (GCB) semelhante à célula B do centro germinal, DLBCL (ABC) semelhante à célula B ativada, e DLBCL de tipo 3, linfoma de Hodgkin incluindo tipo pré-dominante de linfócito clássico e de nódulo, linfoma linfoplasmamacítico (LPL), linfoma da zona marginal incluindo linfoma (MALT) de tecido linfóide associado à mucosa gástrica, e leucemia linfócita crônica (CLL) incluindo CLL mutado por imunoglobulina e CLL não mutado por imunoglobulina.

[00378] Além disso, o CD19 é expressado precocemente no desenvolvimento da célula B do que, por exemplo, CD20, e é por esta razão particularmente adequado para o tratamento da pré-célula B e uma nocividade da célula B madura (isto é, superfície celular de nenhum Ig expresso), por exemplo, na medula óssea. A pré-célula B ilustrativa e uma nocividade da célula B madura incluem, mas não são limitados a, leucemia linfoblástica aguda.

[00379] Em outra forma de realização particular, a invenção pode ser praticada por tratar tumores extranodais.

5.22.1 DIAGNÓSTICO E ESTÁGIO DAS NOCIVIDADES DA CÉLULA B

[00380] A progressão do câncer, tal como uma doença ou distúrbio da célula B capaz de formação de tumor (por exemplo, linfoma não Hodgkin, linfoma da célula B amplo difuso, linfoma folicular, e linfoma de Burkitt) é tipicamente caracterizado pelo grau que o câncer tem expandido através do corpo e é frequentemente quebrado nos quatro estágios seguintes que são prognósticos do resultado. Estágio I: O câncer é localizado por um tecido particular e não tem expansão aos linfonodos. Estágio II: O câncer tem expandido aos próximos linfonodos, isto é, metástase. Estágio III: O câncer é observado nos linfonodos nas regiões do corpo fora do tecido de origem e pode compreender uma massa ou tumores múltiplos como oposto por um. Estágio IV: O câncer tem expandido a uma parte distante do corpo. O estágio do câncer pode ser determinado pelas observações clínicas e os métodos de teste que são bem conhecidos aqueles habilitados na técnica. Os estágios do câncer descritos acima são tradicionalmente usado na conjunção com o diagnóstico clínico dos cânceres caracterizados pela formação de tumor, e pode ser usada na conjunção com as composições e métodos da presente invenção para tratar as doenças e distúrbios da célula B. A doença de estágio precoce tipicamente significa que a doença permanece localizada a uma porção de um corpo do paciente ou não tem metastatizado.

[00381] Com respeito as doenças e distúrbios que não forma tumor da célula B tal como, mas não limitando a, mieloma múltiplo, o critério para determinação do estágio diferencia a doença. The Durie-Salmon Staging System foi amplamente usado. Neste sistema de estágio, o estágio clínico da doença (estágio I, II, ou III) é baseado nas diversas medições, incluindo os níveis de proteína M, diversas lesões ósseas líticas, valores de hemoglobina, e níveis de cálcio do soro. Os estágios ainda são divididos de acordo pela função renal (rim) (classificado como A ou B). De acordo com o estágio I Durie-Salmon Staging System (massa baixa celular) é caracterizado por todos dos seguintes: valor de hemoglobina >10 g/dL; normal valor de cálcio do soro ou < 12 mg/dL; raio X do osso, estrutura óssea normal (escala 0) ou plasmacitoma óssea solitária apenas e baixa da taxa de produção do componente M: valor de IgG < 5 g/dL, valor de IgA < 3 g/d, proteína de Bence Jones < 4 g/24 horas. Os pacientes do estágio I tipicamente não tem dano ou sintomas de órgão relatado ou tecido. O estágio II (massa celula intermediária) é caracterizada pelo ajuste de nenhum estágio I nem estágio III. O estágio III (massa alta celular) é caracterizado por um ou mais dos seguintes: valor de hemoglobina < 8,5 g/dL; valor de cálcio de soro > 12 mg/dL; lesões ósseas líticas avançadas (escala 3); taxa de produção de alto componente M: valor de IgG > 7 g/dL, valor de IgA > 5 g/dL, sub-classificação da proteína de Bence Jones > 12 g/24 horas (A ou B), onde A é relativamente da função renal normal (valor de creatinica de soro < 2,0 mg/dL) e B é a função renal anormal (valor de creatinica de soro > 2,0 mg/dL).

[00382] Um outro sistema de estágio para o mieloma é o Sistema de Estágio Internacional (ISS) para o mieloma. Este sistema pode mais efetivamente discriminar entre os grupos de estágio e é a base do soro facilmente medido os níveis de beta 2-microglobulina (β2-M) e albumina. De acordo com o ISS para o mieloma, o estágio I é caracterizado por β2-M < 3,5 e albumina > 3,5, o estágio II é caracterizado por β2-M < 3,5 e albumina < 3,5 ou β2-M 3,5 - 5,5, e o estágio III é caracterizado por β2-M > 5,5 (Mieloma múltiplo Research Foundation, New Canaan, CT).

[00383] O estágio da nocividade da célula B em um paciente é uma determinação clínica. Como indicado acima, com relação aos tumores sólidos, a expansão, localização, e diversos tumores são os valores primários na determinação clínico de estágio. A determinação de estágio em pacientes com nocividade de não tumor de formação da célula B pode ser mais complexo que requer as medições de nível de soro como descrito acima.

[00384] As descrições dos estágios das doenças e distúrbios da célula B acima não são limitantes. Outras características conhecidas na técnica para o diagnóstico da doença e distúrbio da célula B pode ser usado como critério para os pacientes para determinar os estágios das doenças ou distúrbios da células B.

5.22.2 CRITÉRIO CLÍNICO PARA O DIAGNÓSTICO DAS NOCIVIDADES DA CÉLULA B

[00385] O critério do diagnóstico para a nocividade diferente da célula B e são conhecidos na técnica. Historicamente, a diagnose é tipicamente baseada em uma combinação de aparência microscópia e imunofenotipo. Mais recentemente, as técnicas moleculares tal como perfil de expressão do gene foi aplicado por desenvolver as definições moleculares da nocividade da célula B (ver, por exemplo, Shaffer et al., Nature 2:920-932 (2002)). Os métodos exemplares para a diagnose clínica da nocividade particular da célula B e são fornecidos abaixo. Outros métodos adequados será aparente àquele habilitado na técnica.

5.22.2.1. NHL FOLICULAR

[00386] No geral, mais NHL (com a excessão do linfoma celular de manta) tem genes de imunoglobulina altamente mutados que parecem ser os resultados da hipermutação somática (SHM). As anormalidades genéticas mais comuns em NHL são as translocações e mutações do gene BCL6.

[00387] O NHL folicular é frequentemente um linfoma de célula B indolente com uma origem de desenvolvimento folicular. Este é o segundo linfoma mais comum nos Estados Unidos e Europa Ocidental. A idade média em que a doença presente é 60 anos e houve uma predominância feminina leve. A linfadenopatia indolor é o sintoma mais comum. Frequentemente o teste indica o envolvimento de medula sanguínea e às vezes o sangue periférico. O NHL folicular é dividido em graus citológicos com base na proporção de amplas células no folículo com os graus que formam uma série contínua a partir de células clivadas de foliculares pequenos por ampla predominância celular. (Ver, S. Freedman, et al., Follicular Lymphoma, páginas 367 a 388, In lynphoma non-Hodgkins, P. Mauch et al., eds., Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, PA (2004); T. Lister et al., Follicular Lymphoma, páginas 309 a 324, In Malignant Lymphoma, B. Hancock et al., eds., Oxford University Press, New York, N.Y. (2000)).

[00388] O NHL mais folicular é caracterizado pela translocalização entre cromossomos 14 e 18 resultando na super-expressão de BCL2. O NHL folicular também é caracterizado por tanto o SHM quanto ao avanço de SHM e um perfil da expressão do gene similar por células B do centro germinal (GC) (ver, por exemplo, Shaffer et al., Nature 2:920-932 (2002)), que são as células putativas de origem para esta nocividade. As recomposições de cadeia leve e pesada são típicas. As células de tumor desta doença expressa a imunoglobulina monoclonal de superfície com mais que expressa IgM. Próximo as todos os NHL das células de tumor foliculares que expressam os antígenos CD19, CD20,CD22, CD79a, CD21, CD35 e CD10 mas falta a expressão de CD5 e CD43. A infiltração paratrabecular com pequenas células clivadas é observado na medula óssea. (Ver, S. Freedman et al., Follicular Lymphoma, páginas 367 a 388, In lynphoma non-Hodgkins, P. Mauch et al., eds., Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, PA (2004); T. Lister et al., Follicular Lymphoma, páginas 309-324, In Malignant Lymphoma, B. Hancock et al., eds., Oxford University Press, New York, N.Y. (2000)).

[00389] A diagnose de NHL folicular no geral alivia a biopsia de um nó taxável a fim de avaliar a arquitetura do tecido e as característica citotológica. As aspirações de fina agulha não são usualmente adequados visto que este procedimento é menos prontamente para fornecer o tecido que pode ser avaliado e este falta fornecer o tecido suficiente para os testes adicionais. As biopsias de medula óssea bilateral também são indicados visto que o envolvimento pode ser irregular. Os procedimentos diagnósticos adicionais incluem varreduras computadas por tomografia (CT) de raio X de tórax, peito, abdome, pescoço e pélvis, contagem sanguínea completa, e perfil químico. A citometria de fluxo e imunohistoquímica podem ser usados para distinguir entre o NHL folicular e outros linfomas da célula B madura. (Ver, S. Freedman et al., Follicular Lymphoma, páginas 367 a 388, In lynphoma non-Hodgkins, P. Mauch et al., eds., Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, PA (2004); T. Lister et al., Follicular Lymphoma, páginas 309 a 324, In Malignant Lymphoma, B. Hancock et al., eds., Oxford University Press, New York, N.Y. (2000)).

5.22.2.2. LINFOMA CELULAR DE MANTA

[00390] O linfoma celular de manta localiza à região de manta dos folículos secundários e é caracterizado por uma origem de desenvolvimento nodular e/ou difuso. Os pacientes de linfoma da célula de manta tem idade média de 60 a 65 anos com uma doença que afeta predominantemente machos. Para os propósitos do diagnóstico, a característica presente usual é um linfadenopatia generalizada. Adicionalmente, o baço é frequentemente estendido. Este linfoma da célula B é associado com um t(11;14) entre o local de IgH e gene D1 de ciclina, que resulta na super-expressão de D1 de ciclina. mais do que 50 % dos casos mostram as anormalidades cromossômicas adicionais. O linfoma celular de manta é tipicamente não caracterizado por SHM. (Ver, W. Hiddemann et al., Mantle cell lynphoma, páginas 461 a 476, In lynphoma non-Hodgkins, P. Mauch et al., eds., Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, PA (2004); D. Weisenburger et al., Mantle cell lynphoma, páginas 28 a 41, In Malignant Lymphoma, B. Hancock et al., eds., Oxford University Press, New York, N.Y. (2000)).

[00391] A imunohistoquímica da imunofenotipagem (a citometria de fluxo ou seção congelada) de células de linfoma celular de manta mostra por ele próprio ser sempre monoclonal, IgM de superfície de carregamento. As células de linfoma celular de manta também foi notado por carregar o IgD de superfície. As células que expressam os antígenos CD19, CD20, CD22 e CD24, mas não CD23. Estes também expressam os antígenos de superfície CD5 mas não para CD10, distinguindo então a partir do linfomas celular do centro do folículo certo que são quase sempre CD5 negativo. Frequentemente, o envolvimento extranodal é observado incluindo a infiltração e tumores da medula óssea do fígado e trato gastrointestinal. A expressão de anemia leve e leucêmica não é comum com linfoma celular de manta. (Ver, A. Lal et al., Role of Fine Needle Aspiração in Lymphoma, páginas 181-220, In W. Finn et al., eds., Hematopathology in Oncology, Kluwer Academic Publishers, Norwell, MA (2004); W. Hiddemann et al., Mantle cell lynphoma, páginas 461-476, In lynphoma non-Hodgkins, P. Mauch et al., eds., Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, PA (2004)).

[00392] A diagnose do linfoma celular de manta envolve a examinação do sangue periférico bem como medula óssea e biópsias de linfodos. Além disso, os estudos citogenéticos e imunofenotipagem são úteis em uma diagnose diferencial. (Ver, W. Hiddemann, et al., Mantle cell lynphoma pp. 461-476, In lynphoma non-Hodgkins, P. Mauch, et al., eds., Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, PA (2004); D. Weisenburger, et al., Mantle cell lynphoma, páginas 28 a 41, In Malignant Lymphoma, B. Hancock, et al., eds., Oxford University Press, New York, N.Y. (2000)).

5.22.2.3. LINFOMA DE BURKITT

[00393] O linfoma de Burkitt é um linfoma da célula B agressivo tipicamente observado em criança e adultos jovens e é usualmente associado com a doença volumosa do maxilar e/ou abdome. Aproximadamente 20 % dos pacientes tem envolvimento da medula óssea. Uma forma edêmica do linfoma de Burkitt envolve a infecção do vírus Epstein-Barr (EBV) das células malignas; a forma esporádica é independente da infecção EBV. A translocalização de c-myc por local da imunoglobulina, que resulta na desregulação do gene c-myc, é característico desta doença (t(8;14)(q24;q32)). De maneira interessante, as anulações das sequências c-myc parecem ser envolvidas na forma esporádica da doença, enquanto a forma edêmica usualmente envolve mutações ou inserções por ponto. (Ver, V. Pappa, et al., Molecular Biology, páginas 133 a 157, In Malignant Lymphoma, B. Hancock, et al., eds., Oxford University Press, New York, N.Y. (2000)). O linfoma de Burkitt também é caracterizado por SHM, e as células malignas tem um perfil da expressão do gene similar à células B GC, sugerindo que esta nocividade é derivada a partir das células B GC.

[00394] O imunofenotipo do linfoma de Burkett mostra as células desta doença que expressam CD19, CD20, CD22 e CD79a, mas não CD5, CD23, ciclina D ou transferase deoxinucleotidila terminal. Frequentemente, estas células são positivas para CD10 e BCL6 e usualmente negativas para o BCL2. (Ver, I. Magrath, et al., Burkitt’s Lymphoma, páginas 477 a 501, In lynphoma non-Hodgkins, P. Mauch, et al., eds., Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, PA (2004)).

[00395] O linfoma semelhante ao Burkitt da célula B de alto grau é um limite do linfoma entre o linfoma de Burkitt e o amplo linfoma da célula B. As células deste linfoma que expressam os CD19,CD20 e CD22 mas a expressão do CD10, que está próxima sempre presente no linfoma de Burkitt certo, é frequentemente ausente. Por esta razão e outras características, alguns acreditam que este linfoma deve ser classificado como um linfoma da célula B ampla difuso. (Ver, K. Maclennan, Diffuse Aggressive célula B Lymphoma, páginas 49 a 54, In Malignant Lymphoma, B. Hancock, et al., eds., Oxford University Press, New York, N.Y. (2000)).

[00396] A diagnose do linfoma de Burkitt no geral alivia a detecção da translocalização associada com este linfoma; deste modo, a análise citogenética convencional é usualmente realizada. As técnicas de reação da cadeia de polimerase de longa distância e fluorescente no local da hibridização (FISH) foi usado para detectar as junções de Ig- myc nas translocalizações e outras alterações genéticas associadas com esta doença. (Ver, R. Siebert, et al., Sangue 91:984-990 (1998); T. Denyssevych, et al., Leukemia, 16:276-283 (2002)).

5.22.2.4. LINFOMA DE CÉLULA B AMPLA DIFUSA (DLBCL)

[00397] O DLBCL não é o linfoma de Hodgkin mais comum e pode originar-se a partir de pequenos linfomas da célula B, linfoma folicular ou linfoma de zona marginal. Tipicamente, os pacientes presentes com linfadenopatia; entretanto, uma ampla porcentagem dos pacientes presentes também nos locais extranodais, com envolvimento gastrointestinal sendo o mais comum. O envolvimento da medula óssea é observado em cerca de 15 % dos pacientes. (Ver, Armitage, et al., Diffuse Large Cell B Lymphoma, páginas 427 a 453, In lynphoma non-Hodgkins, P. Mauch, et al., eds., Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, PA (2004)). A heterogeneidade nas características morfológicas, biológicas e clínicas feitas deste grupo dos linfomas dificultam a sub-classificação. Entretanto, dois subgrupos distintos foram identificados com um gene característico que expressa as células B do centro germninal (GC-DLBCL) e os outros genes que super-expressam nas células B do sangue periférico. As taxas de sobrevivência são significantemente melhores para os pacientes com GC-DLBCL do que aqueles com o tipo da célula B ativada (ABC)-DLBCL. (Ver, W. Chan, Archives of Pathology and Laboratory Medicine 128(12):, 1379-1384 (2004)).

[00398] Os DLBCLs que expressam as células dos antígenos de superfície CD19, CD20, CD22 e CD79a. O CD10 é expressado na grande maioria dos casos e a expressão CD5 é observada em cerca de 10 % dos casos. (Ver, K. Maclennan, Diffuse Aggressive célula B Lymphoma, páginas 49 a 54, In Malignant Lymphoma, B. Hancock, et al., eds., Oxford University Press, New York, N.Y. (2000)). O DLBCL é frequentemente marcado pelas anomalias de BCL6 e/ou translocalização de BCL2 ao local de IgH. O DLBCL (GC) semelhante a célula B GC é caracterizado por SHM com genes de imunoglobulina altamente mutados e o avanço de SHM em clones malignos com um perfil da expressão do gene semelhante à célula B GC. Mais DLBCL GC tem sofrido agitação da classe de imunoglobulina. O ABC-DLBCL é caracterizado pela expressão de alta nível de genes alvo NF-KB incluindo BCL2, fator 4 regulador de interferon, CD44, FLIP e ciclina D. SHM, não mais avanço de SHM, está presente, e ABC-DLBCL não tem um perfil da expressão do gene da célula B GC. Quase todos os ABC-DLBCL expressam um alto nível de IgM.

5.22.2.5. LINFOMA DA ZONA MARGINAL EXTRADONAL

[00399] O linfoma da zona marginal extranodal é um linfoma extradonal que ocorre em órgãos normalmente em falta do tecido linfóide organizado (por exemplo, estômago, glândulas salivares, pulmões e glândulas de tireóide). Esta é amplamente uma doença que afeta adultos mais velhos com uma idade média entre 60 anos. Frequentemente, os processos de inflamação crônica ou autoimune precede o desenvolvimento do linfoma. O linfoma (MALT) do tecido linfóide associado pela mucosa gástrica, o tipo mais comum do linfoma da zona marginal, é associado com a infecção Helicobacter pylori. Os estudos foram mostrados e uma resolução dos sintomas com a exterminação da infecção H. pylori seguindo um regime de antibiótico. Os sintomas presentes para o linfoma MALT gástrico incluem dispepsia não específica, dor epigástrica, náusea, hemorragia gastrointestinal e anemia. Os sintomas sistêmicos não são comuns, como são elevados os níveis de desidrogenase do lactato ácido. (Ver, J. Yahalom, et al., Extralinfoma da célula B de zona marginal nodal of Mucosa- Associada Lymphoid Tissue, páginas 345 a 360, In lynphoma non-Hodgkins, P. Mauch, et al., eds., Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, PA (2004); J. Radford, Outros Low-Grade Non-Linfoma de hodgkins, páginas 325 a 330, In Malignant Lymphoma, B. Hancock, et al., eds., Oxford University Press, New York, N.Y. (2000). Os sintomas B sistêmicos incluem febres maiores do que 38° C por mais do que 2 semanas sem o sinal da infecção, transpiração noturna, fatiga extrema ou perda de peso não intencional maior do que ou igual a 10 % do peso corporal durante os 6 meses prévios).

[00400] O immunofenotipo do linfoma MALT é caracterizado pela expressão de CD19, CD20, CD79a, CD21 e CD35 e perda da expressão de CD5, CD23 e CD10. Quase metade dos linfomas MALTs que expressam CD43. A imunoglobulina tipicamente expressada nas células de tumor desta doença é IgM enquanto IgD não é expressado. Estas características são críticas em distinguir este linfoma a partir de outros pequenos linfomas das células B tal como linfoma celular de manta, linfoma linfócito e linfoma folicular. A trisomia 3 foi relatada em 60 % dos casos de linfoma MALT. Em 25 a 40 % dos linfomas MALT gástrico e pulmonar em t(11;18) é observado. Esta translocalização é observada muito menos frequentemente em outros linfomas MALT. O t(11;18) é associado com a expressão nuclear de BCL10, (ver, J. Yahalom, et al., Extralinfoma da célula B de zona marginal nodal of Mucosa- Associada Lymphoid Tissue, páginas 345 a 360, In lynphoma non-Hodgkins, P. Mauch, et al., eds., Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, PA (2004)). Os linfomas de zonas marginais são no geral caracterizado por SHM e o avanço de SHM.

[00401] Os procedimentos de diagnóstico incluem imunofenotipagem ou uma citometria de fluxo para determinar a identidade dos marcadores da superfície celular. Além disso, a análise genética molecular deve ser feita para determinar a presença de t(11;18) como este é o indicador que uma doença não responderá aos antibióticos. A histologia pode ser usada para determinar a presença de H. pylori. os testes adicionais devem incluir a contagem sanguínea completa, os testes bioquímicos básicos incluindo que para a desidrogenase do lactato ácido; as varreduras de CT da biopsia do abdome, peito e pélvis e da medula óssea. (Ver, J. Yahalom, et al., Extralinfoma da célula B de zona marginal nodal of Mucosa- Associada Lymphoid Tissue, páginas 345 a 360, In lynphoma non-Hodgkins, P. Mauch, et al., eds., Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, PA (2004)).

5.22.2.6. LINFOMA DA CÉLULA B DE ZONA MARGINAL NODAL

[00402] O linfoma da célula B de zona marginal nodal é um linfoma classificado novo relativamente deste modo pouco foi publicado deste. Este é um linfoma de célula B nodal primário dividindo as características morfológicas e genéticas com linfomas de zona marginal esplênica e extranodal, mas não localiza-se no baço ou extranodalmente. O vírus de Hepatite C foi relatado ser associado com este linfoma como tem a síndrome de Sjogren. (Ver, F. Berger, et al., Nodal Marginal Zone B Cell Lymphoma, páginas 361 a 365, In lynphoma non-Hodgkins, P. Mauch, et al., eds., Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, PA (2004)).

[00403] O linfoma de zona marginal nodal tem uma morfologia e citologia heterogêneas. Devido a esta alta proporção relativamente de amplas células este linfoma, diferente de outros linfomas marginais (esplênico e extranodal), não pode ser classificado como certo linfoma da célula B de baixo grau. O fenotipo genético e imunológico do linfoma de zona marginal nodal inclui a expressão de CD19, CD20, CD22, BCL2, sIgM e IgG citoplásmico (cIg). Estas células não expressam CD5, CD10, CD23, CD43 ou ciclina D1. A característica da translocalização do linfoma MALT, t(11;18), não é observado pelo linfoma de zona marginal nodal. Estas características ajudam no diferencial de uma diagnose deste linfoma a partir de outros pequenos linfomas das células B. (Ver, F. Berger, et al., Nodal Marginal Zone B Cell Lymphoma, páginas 361 a 365, In lynphoma non-Hodgkins, P. Mauch, et al., eds., Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, PA (2004)).

5.22.2.7. LINFOMA DE ZONA MARGINAL ESPLÊNICA

[00404] O linfoma de zona marginal esplênica é um linfoma da célula B micro-nodular indolente com uma apresentação clínica característica de esplenomegalia e infiltração saliente do sangue periférico e da medula óssea. Além disso, um alto nível relativamente do envolvimento do fígado foi relatado. Um papel para o vírus de Hepatite C foi estipulado por este linfoma. O immunofenotipo do linfoma de zona marginal esplênica é tipicamente CD19+ ,CD20+, IgD+, BCL2+, p27+, CD3-, CD5-,CD10-, CD23-, CD38-, CD43-, BCL-6-, e ciclina D1-. As características genéticas incluem uma anulação de 7q, alterações de p53 e SHM. (Ver, M. Piris, et al., Splenic Marginal Zone Lymphoma, páginas 275 a 282, In lynphoma non-Hodgkins, P. Mauch, et al., eds., Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, PA (2004)).

[00405] A diagnose no geral alivia a imunofenotipagem para determinar a identidade dos marcadores da superfície celular. A análise genética e bioquímica, em combinação com os dados nos marcadores da superfície celular, ajudam a diferenciar este linfoma a partir de outros pequenos linfomas das células B. (Ver, M. Piris, et al., Splenic Marginal Zone Lymphoma, páginas 275 a 282, In lynphoma non-Hodgkins, P. Mauch, et al., eds., Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, PA (2004)).

5.22.2.8. LEUCEMIA LINFOCPITICA (CÉLULA B) AGUDA (ALL)

[00406] O ALL é um neoplasma com base na medula amplamente afetando as crianças com a maior incidência entre 1 a 5 anos. Mais sintomas comuns em apresentação incluem fadiga, apatia, febre e dor no osso e junta. A fadiga e a apatia correlacionam com o grau da anemia presente. Uma contagem de célula sanguínea enquanto elevada é comum na apresentação. As radiografias do tórax frequentemente mostra as lesões do esqueleto. A expansão extramedular é comum e envolve o sistema nervoso central, testes, linfonodos, fígado, baço e rim. As massas mediastinais anteriores são observadas em apenas cerca de 5 a 10 % dos casos diagnosticados novamente. (Ver, J. Whitlock, et al., Agudo Lymphocytic Leukemia, páginas 2241 a 2271, In Wintrobe’s Clinical Hematology, 10° edição, G. Lee, et al., eds. Williams & Wilkins, Baltimore, MD (1999)).

[00407] O immunofenotipo de ALL é CD10+, CD19+, CD20+, CD22 e CD24+. A célula ALL das pré-células B que expressam o citoplásmico mas não imunoglobulina de superfície, enquanto o ALL de célula B madura (que conta por apenas 1 a 2 % dos casos de ALL) é distinguido a partir de outras leucemias da linhagem da célula B pela expressão da imunoglobulina de superfície. As características citogenéticas de ALL incluem t(8;14), t(2;8) e t(8;22). Embora raramente detectado no nível citogenético t(12;21) pode ser a anomalia mais comum citogenética associado com ALL na infância (observado em cerca de 25 % dos casos). (Ver, M. Kinney, et al., Classification and Differentiation of the Agudo Leukemias, páginas 2209 a 2240, In Wintrobe’s Clinical Hematology, 10° edição, G. Lee, et al., eds. Williams & Wilkins, Baltimore, MD (1999); J Whitlock, et al., Agudo Lymphocytic Leukemia, páginas 2241 a 2271; In Wintrobe’s Clinical Hematology, 10° edição, G. Lee, et al., eds. Williams & Wilkins, Baltimore, MD, (1999)).

[00408] A diagnose precisa da leucemia aguda usualmente alivia uma biopsia e aspiração óssea. As manchas aspiradas são usadas para a avaliação morfológica, imunológica e citológica. A demonstração dos linfoblastos na medula óssea é diagnóstico de ALL. A presença de maior do que 5 % de células linfoblásticas leucêmicas na medula óssea confirmam uma diagnose de ALL mais requerem maior do que 25 % por uma diagnose definitiva. A perfuração da veia é usada para a diagnose do envolvimento do sistema nervoso central. Os níveis ácidos úricos de soro e os níveis de desidrogenase de lactato de soro foi observado ser elevado em ALL. (Ver, M. Kinney, et al., Classification and Differentiation of the Agudo Leukemias, páginas 2209 a 2240, In Wintrobe’s Clinical Hematology, 10° edição, G. Lee, et al., eds. Williams & Wilkins, Baltimore, MD (1999); J. Whitlock, et al., Agudo Lymphocytic Leukemia, páginas 2241 a 2271; In Wintrobe’s Clinical Hematology, 10° edição, G. Lee, et al., eds. Williams & Wilkins, Baltimore, MD, (1999)).

5.22.2.9. LEUCEMIA LINFOCÍTICA CRÔNICA (CLL)/PEQUENO LIFÓCITO DE LINFOMA DA CÉLULA B (SLL)

[00409] O CLL/SLL é o tipo mais comum de leucemia. Quando uma doença envolve o sangue periférico e a medula óssea esta é referida como CLL. Entretanto, quando os linfonodos e outros tecidos são infiltrados pelas células que são imunológica e morfologicamente idênticas àqueles em CLL, mas onde as características leucêmicas da doença são ausentes, então a doença é referida como SLL. Esta doença amplamente afligi a idade avançada com uma maior incidência da doença que ocorre em homem do que em mulher. A linfadenopatia indolor é a mais comum descoberta em apresentação. A Hipogamaglobulinemia é comum com mais casos de CLL/SLL exibindo os níveis reduzidos de todas as imunoglobulinas antes do que qualquer sub-classe particular de imunoglobulinas. Os paciente sintomáticos são frequentemente diagnosticados durante a contagem sanguínea de rotina (contagem de linfócito acima de 5000 x 109/L). Muitos, tanto quanto 20 % dos casos CLL/SLL relatam os sintomas B. Uma característica diagnóstica adicional é a infiltração da medula óssea por mais do que 30 % por linfócitos imaturos. As biópsias de linfonodos no geral mostram a infiltração dos nós envolvidos com linfócitos bem diferenciados. O fenômeno autoimune é frequentemente associado com CLL/SLL incluindo anemia hemolítica autoimune e trombocitopenia imune. (Ver, J. Gribben, et al., Small B Cell Lymphocitic Lymphoma/Crônico Lymphocitic Leukemia and Prolymphocytic Leukemia, páginas 243 a 261, In lynphoma nonHodgkins, P. Mauch, et al., eds., Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, PA (2004); K. Maclennan, Diffuse Indolente célula B Neoplasms, páginas 43 a 47, In Malignant Lymphoma, B. Hancock, et al., eds., Oxford University Press, New York, N.Y. (2000); Clinical Oncology, A. Neal, et al., Neal, Hoskin and Oxford University Press, co-publ., New York, NY (2003)).

[00410] Em contraste com muitos do baixo grau de nocividade da célula B, a translocalização recíproca não aleatória são raramente observadas em CLL/SLL. Entretanto, outras anomalias citogenéticas como para as relatadas incluindo anulações em 13q14, 11q22-23 e 17q13, com os dois últimos envolvendo o local p53. Aproximadamente 20 % dos casos exibem a trisomia 12. Um nível elevado de β-2 microglobulina, mais altos níveis da expressão CD38 e a produção de fator-alfa de necrose de tumor são todos característicos de CLL/SLL. O imunofenotipo de CLL/SLL é cada diagnóstico e inclui a fraca expressão de imunoglobulina de superfície usualmente IgM, ou IgM e IgG, bem como a expressão dos antígenos celulares CD19, CD22, CD20 e usualmente CD5 e CD23. (Ver, J. Gribben, et al., Small B Cell Lymphocitic Lymphoma/Crônico Lymphocitic Leukemia and Prolymphocytic Leukemia, páginas 243 a 261, In lynphoma nonHodgkins, P. Mauch, et al., eds., Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, PA (2004); K. Maclennan, Diffuse Indolente célula B Neoplasms, páginas 43 a 47, In Malignant Lymphoma, B. Hancock, et al., eds., Oxford University Press, New York, N.Y. (2000)).

5.22.2.10. LEUCEMIA PROLINFOCÍTICA DA CÉLULA B (PLL)

[00411] O PLL, uma vez considerando uma variante de CLL, é agora entendido ser uma doença distinta. O PLL é no geral uma doença de homem de idade mais avançada e é caracterizado por uma exata alta contagem de célula sanguíneas brancas (maiores do que 200 x 109/L) e esplenomegalia. Os sintomas adicionais incluem anemia e trombocitopenia. O pro-linfócitos em PLL compreendem mais do que 55 % das células no sangue e na medula óssea. Em contraste com o CLL, o fenômeno autoimune são raramente observados em PLL. (Ver, J. Gribben, et al., Small B Cell Lymphocitic Lymphoma/Crônico Lymphocitic Leukemia and Prolymphocytic Leukemia, páginas 243 a 261, In lynphoma non-Hodgkins, P. Mauch, et al., eds., Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, PA (2004)).

[00412] O imunofenotipo de PLL é caracterizado pela expressão de CD19, CD21, CD22, CD24 e FMC7. As células de PLL que não expressam CD23 e que a maioria não expressa CD5. As células de PLL exibem o complexo de anomalias cromossômicas, com anulações em 13q14 e 11q23 sendo algumas das mais frequentes. A origem da mutação p53 nas células PLL é diferente de que observado por CLL. A diagnose diferencial usualmente alivia na contagem sanguínea completa, análise histológica, imunofenotípica, e genética. (Ver, J. Gribben, et al., Small B Cell Lymphocitic Lymphoma/Crônico Lymphocitic Leukemia and Prolymphocytic Leukemia, páginas 243 a 261, In lynphoma non-Hodgkins, P. Mauch, et al., eds., Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, PA (2004)).

5.22.2.11. LEUCEMIA CELULAR HAIRY (HCL)

[00413] O HCL é uma rara, leucemia crônica indolente que afeta mais os homens do que as mulheres e amplamente aqueles de meia idade. Os sintomas típicos incluem esplenomegalia pesada e pancitopenia. O sangue periférico e a medula óssea contém as “células hairy,” típicas que são linfócitos B com projeções citoplásmicas. Em 90 % dos pacientes de HCL tem a infiltração da medula óssea. (Ver, Clinical Oncology, A. Neal, et al., Neal, Hoskin and Oxford University Press, co-publ., New York, NY (2003); J. Johnston, Hairy Cell Leukemia, páginas 2428 a 2446, In Wintrobe’s Clinical Hematology, 10° edição, G. Lee et al., eds. Williams & Wilkins, Baltimore, MD (1999)).

[00414] A análise citogenética tem mostrado que as anomalias clonais está presentes em 19 % dos casos e envolvem anomalias de cromossomos numéricas e estruturais 5, 7 e 14. O nível de soro de TNF-α é elevado em leucemia celular hairy e correlacionado com a carga do tumor. As células da leucemia celular hairy que expressam as imunoglobulinas de superfície (IgG e IgM) e CD11c, CD19, CD20, CD22 e tipicamente CD25. Além disso, FMC7, HC-2 e CD103 são expressados. As células HCL que não expressam CD5 ou CD10. A diagnose no geral envolve o uso da aspiração da medula óssea, citogenéticas, manchas de sangue e imunofenotipagem. (Ver, Clinical Oncology, A. Neal, et al., Neal, Hoskin and Oxford University Press, co-publ., New York, NY (2003); J. Johnston, hairy Cell Leukemia, páginas 2428 a 2446, In Wintrobe’s Clinical Hematology, 10° edição, G. Lee et al., eds. Williams & Wilkins, Baltimore, MD (1999)).

5.22.2.12. LINFOMA LINFOBLÁSTICA DA CÉLULA B PRECURSORA/LEUCEMIA LINFOBLÁSTICA AGUDA DA PRÉ- CELULA B/LINFOMA LINFOBLÁSTICO

[00415] O linfoma linfoblástico da célula B precursora/leucemia linfoblástica aguda da pré-célula B/Linfoma linfoblástico é uma doença de precursor T ou células B. Os linfomas linfoblásticos das células T e B são morfologicamente idênticos, mas as distinções clínicas podem ser feitas com base no grau da infiltração da medula óssea ou envolvimento da medula óssea. 85 a 90 % dos linfomas linfoblásticos são células T derivadas com o remanescente sendo derivados de célula B. O linfoma linfoblástico tem uma idade média de 20 anos com uma predominância masculina. O envolvimento do linfonodo periférico é uma característica comum na apresentação, que ocorre especialmente nas regiões cervicais, supraclaviculares e axilares. Esta doença frequentemente está presente com o envolvimento da medula óssea. O sistema nervoso central é menos comum na apresentação mas frequentemente aparece nos casos de reincidência. Outros locais de envolvimento podem incluir fígado, baço, osso, pele, faringe e testes (ver, J. Sweetenham, et al., Precursor B- and T-Cell Limphoblastic Lymphoma, páginas 503 a 513, In lynphoma nonHodgkins, P. Mauch, et al., eds., Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, PA (2004)).

[00416] O linfoma linfoblástico da célula B precursora que expressa os marcadores imaturos dos marcadores celulares B tal como CD99, CD34 e transferase desoxinucleotidila terminal. Estas células também expressam CD79a, CD19, CD22 e algumas vezes CD20 e faltam tipicamente a expressão de CD45 e imunoglobulina de superfície. as translocalizações em 11q23, bem como t(9;22)(q34;q11.2) e t(12;21)(p13;q22), foram associadas com prognose deficiente. A prognose boa é associada com cariotipo hiperdiplóide, especialmente que associado com trisomia 4, 10, e 17 e t(12;21)(p13;q22). (Ver, J. Sweetenham, et al., Precursor B- and T-Cell Limphoblastic lymphoma, páginas 503 a 513, In lynphoma non-Hodgkins, P. Mauch, et al., eds., Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, PA (2004)).

[00417] Os testes de diagnósticos incluem as biópsias de linfonodos, testes sanguíneos, raio X, varreduras de CT, e a perfuração da veia para examinar o fluido cerebroespinal por células malignas.

5.22.2.13. LINFOMA DE CÉLULA B AMPLO MEDIASTINAL PRIMÁRIO

[00418] O linfoma de célula B amplo mediastinal primário é um linfoma da célula B amplo difuso que ocorre predominantemente em mulheres jovens e caracterizado por uma massa mediastinal anterior de local invasivo que origina-se no timo. A expansão distante por nó periférico e envolvimento da medula óssea não é usual. Os sintomas sistêmicos são comuns. Enquanto esta doença assemelha-se aos linfomas celulares anteriores nodais, este tem caracteristícas genética distinta, imunológica, e morfológica.

[00419] O imunofenotipo das células de tumor do linfoma de célula B amplo mediastinal primário são frequentemente imunoglobulina de superfície negativo mas que expressam tal célula B associada aos antígenos como CD19, CD20, CD22 e CD79a. Os CD10 e BCL6 também são comumente expressados. A expressão dos marcadores associados por células de plasma CD15, CD30, antígeno de membrana epitelial (EMA) é raro. As disposições de BCL6 e o gene c- myc também não são comuns. A presença de re-disposições de imuniglobulina clonal, região cariável de imunoglobulina e hipermutação do gene junto com hipermutação BCL6 sugere que este linfoma derive de um centro germinal maduro ou célula B do centro pós-germinal. As translocalizações cromossômicas que são vistas associadas com tumores desta doença são similares àquelas observadas em outro como para as de linfoma celular amplo difuso. (Ver, P. Zinzani, et al., Primary Mediastinal Large Cell B Lymphoma, páginas 455 a 460, In lynphoma non-Hodgkins, P. Mauch, et al., eds., Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, PA (2004)).

[00420] A avaliação diagnóstica por linfoma de célula B amplo mediastinal primário no geral inclui uma examinação física completa, análise bioquímica e hematológica completa, tomografia computadorizada total do corpo e biopsia de medula óssea. A varredura do Gálio-67 é um teste útil para as respostas dos estágios para o tratamento e para a avaliação de reincidência. (Ver, P. Zinzani et al., Primary Mediastinal Large Cell B lymphoma, páginas 455 a 460, In lynphoma non-Hodgkins, P. Mauch, et al., eds., Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, PA (2004)).

5.22.2.14. LINFOMA LINFOPLASMACÍTICO (LPL)/IMUNOCITOMA LINFOPLASMACÍTICO/MACROGLOBULINEMIA WALDSTROM’S

[00421] O LPL/imunocitoma linfoplasmacítico/macroglobulinemia Waldstrom’s é um linfoma nodal que é usualmente indolente, e frequentemente envolve a medula óssea, linfonodos e baço. Este é no geral uma doença de adultos mais velhos com leve predominância em machos. Mais pacientes tem paraproteína IgM monoclonal em seu soro (> 3g/dL) resultando em hiperviscosidade do soro. As células do tumor tem uma morfologia plasmacítica. Uma sub-série de LPL é caracterizado por translocalizações recorrentes entre os cromossomos 9 e 14, que envolve o PAX5 e local de cadeia pesada de imunoglobulina. O LPL é caracterizado por SHM bem como avanço de SHM, e é acreditado ser derivado de pós-células B GC. (Ver, A. Rohatiner, et al., Limphoplasmacytic Lymphoma and Waldstrom’s Macroglobulinemia, páginas 263 a 273, In lynphoma non-Hodgkins, P. Mauch, et al., eds., Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, PA (2004); K. Maclennan, Diffuse Indolente célula B Neoplasms, páginas 43 a 47, In Malignant Lymphoma, B. Hancock, et al., eds., Oxford University Press, New York, N.Y. (2000); A. Lal, et al., Role of Fine Needle Aspiração in Lymphoma, páginas 181 a 220, In W. Finn, et al., eds., Hematopathology in Oncology, Kluwer Academic Publishers, Norwell, MA (2004)).

[00422] O imunofenotipo desta doença mostra expressão dos antígenos associados por célula B CD19, CD20, CD22 e CD79a e uma falha da expressão de CD5, CD10 e CD23. A presença de forte imunoglobulina de superfície e CD20, a falta da expressão de CD5 e CD23 e a presença de imunoglobulina citoplásmica são caracteristícas que ajudam em distinguir esta doença de leucemia linfócita crônica. Também o diagnóstico desta doença é t(9;14)(p13;q32). (Ver, A. Rohatiner, et al., Limphoplasmacytic Lymphoma and Waldstrom’s Macroglobulinemia, páginas 263 a 273, In lynphoma non-Hodgkins, P. Mauch, et al., eds., Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, PA (2004); K. Maclennan, Diffuse Indolente célula B Neoplasms, páginas 43 a 47, In Malignant Lymphoma, B. Hancock, et al., eds., Oxford University Press, New York, N.Y. (2000); R. Chaganti, et al., Cytogenetics of Lymphoma, páginas 809 a 824, In lynphoma non-Hodgkins, P. Mauch, et al., eds., Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, PA (2004)).

[00423] Os testes de diagnósticos tipicamente incluem uma contagem sanguínea completa, testes de função renal e fígado, varreduras de CT, biopsia e aspiração da medula óssea, eletroforese de proteína para quantificar e caracterizar a paraproteína e a viscosidade do soro. A medição de β2-microglobulina é usada como um teste prognóstico. (Ver, A. Rohatiner, et al., Limphoplasmacytic Lymphoma and Waldstrom’s Macroglobulinemia, páginas 263 a 273, In lynphoma non-Hodgkins, P. Mauch, et al., eds., Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, PA (2004)).

5.22.2.15. LEUCEMIA LINFOBLÁSTICA AGUDA NULA

[00424] A leucemia linfoblástica aguda nula é uma sub-série ALL que falta caracteristícas das células B ou T. A análise fenotípica de blastos leucêmicos mostram uma origem ALL nula típica, isto é, CD10 (antígeno ALL comum) negativo, HLA-DR- fortemente positivo e CD19 (B4)-positivo (ver Katz et al. (1988) Sangue 71(5):1438-47).

5.22.2.16. LINFOMA DE HODGKIN

[00425] O linfoma de Hodgkin usualmente origina-se nos linfonodos de adultos jovens. Este pode ser dividido em sub-tipo clássico e um sub-tipo predominante de linfócito nodular menor comum. O tipo clássico exibe SHM, não mais avanço de SHM, e não tem um perfil da expressão do gene da célula B GC. O tipo predominante de linfócito nodular, em contraste, é caracterizado por SHM e o avanço de SHM e um perfil da expressão do gene da célula B GC. Enquanto os dois tipos diferem-se clinicamente e biologicamente, estes fazem divisão de certas características tal como uma falta de células neoplásticas dentro de um fundamento de células inflamatórias benignas. B. Schnitzer et al., Hodgkin Lymphoma, páginas 259 a 290, In W. Finn and L. Peterson, eds., Hematopathology in Oncology, Kluwer Academic Publishers, Norwell, MA (2004)).

[00426] As características mais comuns em apresentação são as ampliações indolores de linfonodos, usualmente no pescoço, mas ocasionalmente na região iguinal. Waxing and waning dos nódulos também é característico desta doença. O sintomas B é observado em cerca de um terço dos pacientes. O envolvimento extranodal isolado é raro e em casos onde a disseminação tem ocorrido o envolvimento extranodal sendo observado cerca de 10 a 20 % do tempo. (Ver, P. Johnson et al., Hodgkin’s Disease: As características clínicas, páginas 181 a 204, In Malignant Lymphoma, B. Hancock, et al., eds., Oxford University Press, New York, N.Y. (2000)).

[00427] As células de Reed-Sternberg (RS) são as células malignas do linfoma de Hodgkin. As células RS e suas variantes que expressam CD15, CD25, CD30 e o receptor de transferina. Além disso, estas células expressam a imunoglobulina citoplásmica policlonal. Em mais casos do linfoma de Hodgkin as células RS que não expressam CD45, uma característica que ajuda em distinguir esta doença do não linfoma de hodgkins. O vírus Epstein Barr foi demonstrado estar presente em células Reed-Sternberg de cerca de uma metade dos casos do linfoma de Hodgkin mas este papel não é claro.

[00428] A diagnose é mais frequentemente feita pela biópsia de linfonodo. Os testes de diagnósticos adicionais incluem uma contagem sanguínea total (frequentemente testes hematológicos são normais; contagem das células sanguíneas brancas de menos do que 1,0 x 109/L são vistas em cerca de 20 % dos casos), taxa de sedimentação eritócita (frequentemente elevada em estágios avançados da doença), testes bioquímicos incluindo eletrólitos, uréia, creatinina, urato, cálcio (hipercalcemia é raro mas quando presente é associada com envolvimento ósseo extensivo), testes sanguíneos do fígado, desidrogenase de lactato (níveis elevados frequentemente associados com doença avançada), albumina e beta2-microglobulina (β2-M). Os linfanigiogramas e raio X de tórax e as varreduras de CT do tórax, abdome e pélvis são importantes na identificação de linfonodos anormais e a extensão do envolvimento extranodal. As biopsias da medula óssea são tipicamente consideradas opcionais no envolvimento da medula óssea que não é usual e que resulta de tais biopsias não parecem afetar a administração ou prognose clínica. As esplenectomias não são usualmente realizadas neste dia como esta administração de influências raramente e imagem CT ou MRI fornece a informação no estado esplênico. Os níveis elevados significantemente de p55, TNF e sICAM-1 são correlacionados ao estágio da doença, presença dos sintomas e taxa de resposta completa. (Ver, P. Johnson, et al., Hodgkin’s Disease: As características clínicas, páginas 181 a 204, In Malignant Lymphoma, B. Hancock, et al., eds., Oxford University Press, New York, N.Y. (2000); Clinical Oncology, A. Neal, et al., Neal, Hoskin and Oxford University Press, co-publ., New York, NY (2003); R. Stein, Hodgkin’s Disease, páginas 2538 a 2571, In Wintrobe’s Clinical Hematology, 10° edição, G. Lee et al., eds. Williams & Wilkins, Baltimore, MD (1999)).

5.22.2.17. MIELOMA MÚLTIPLO

[00429] O mieloma múltiplo é uma nocividade de células de plasma. As células neoplásticas são localizados na medula óssea, e osteolesões ósseas líticas são características. As translocalizações cromossomais recíprocas entre uma de um local de imunoglobulina e uma variedade de outros genes, por exemplo, ciclina D1, ciclina D3, c- MAF, MMSET (proteína do domínio de SET de mieloma múltiplo) ou receptor 3 de fator de desenvolvimento fibroblasto são acreditados ser os eventos oncogênicos primários. O mieloma múltiplo é caracterizado por SHM, e a célula putativa de origem é uma pós-célula B GC. O mieloma múltiplo é tipicamente primeiro identificado pelos sintomas tal como infecção recorrente, fadiga, dor, e problemas no rim e é confirmado com teste clínico (ver, por exemplo, Cancer: Principles and Practice of Oncology. 6° edição. DeVita, V.T., Hellman, S. and Rosenberg, S. A. editores. 2001 Lippincott Williams and Wilkins Philadelphia, PA 19106 pp. 2465-2499).

[00430] Em certas formas de realização, os pacientes pelo qual são candidatos para o tratamento pelas composições e métodos da invenção ainda pode sofrer testes de diagnósticos no sangue e/ou urina para confirmar a diagnose ou suspeita de mieloma múltiplo incluindo, mas não limitando a, testes de contagem sanguínea completa (CBC) determinando se os tipos de células relatadas no CBC estão dentro de suas faixas normais que são bem conhecidas na técnica, perfil químico sanguíneo determinando se os níveis de vários componentes sanguíneos, tal como albumina, úreia nitrogênio sanguíneo (BUN), cálcio, creatinina, e desidrogenase de lactato (LDH), separa-se dos valore padrões. Os níveis do soro beta2-microglobulina (β2-M) também podem ser examinados e os marcadores substituídos por IL-6, um fator de desenvolvimento para as células de mieloma. A análise de urina pode ser usada para medir os níveis de proteína na urina. A eletroforese pode ser usada para medir os níveis de várias proteínas, incluindo proteína M no sangue (denominado eletroforese de proteína do soro, ou SPEP) ou urina (denominado eletroforese de urina, ou UEP). Um teste adicional, denominado eletroforese de imunofixação (IFE) ou imunoeletroforese, também pode ser realizada fornecendo mais informação específica sobre o tipo de proteínas do anticorpo anormal presente. As mudanças e as proporções avaliadas de várias proteínas, particularmente proteína M, pode ser usada para localizar a progressão da doença e resposta do mieloma para regime de tratamento. O mieloma múltiplo é caracterizado por um amplo aumento na proteína M que é secretada pelo mieloma das células do tumor.

[00431] Os testes de diagnósticos no osso também podem ser conduzidos para confirmar a diagnose ou suspeita de mieloma múltiplo incluindo, mas não limitando a, raio X e outros teste de imagem incluindo uma visão geral do osso (esqueleto), imagem de resonância magnética (MRI) e tomografia axial computadorizada (CAT), também conhecidas como tomografias computadas (CT) - podem avaliar as mudanças na estrutura óssea e determinar o número e tamanho dos tumores no osso. A aspiração da medula óssea ou bipsia da medula óssea pode ser usada para detectar um aumento nas diversas células de plasma na medula óssea. A aspiração requer uma amostra do líquido da medula óssea, e biopsia requer uma amostra do sólido do tecido ósseo. Em ambos os testes, as amostras pode ser retiradas da pélvis (osso do quadril). O esterno (osso do tórax) também pode ser usado para a aspiração da medula óssea.

[00432] Os pacientes com mieloma múltiplo são tipicamente categorizados nos três grupos seguintes que ajudam a definir o regime efetivo de tratamento. A gamopatia monoclonal de significância indeterminada (MGUS) é tipicamente caracterizada por um nível da proteína M do soro de menos do que 3 g/dL, das células de plasma clonais da medula óssea de menos do que 10 %, nenhuma evidência de outros distúrbio das células B, e no órgão relatado ou dano no tecido, tal como hipercalcemia (níveis aumentados de cálcio do soro), função de dano no rim notado pelo soro de creatinina aumentado, anemia, ou lesões ósseas. Os mielomas sintomáticos são tipicamente de estágio I e inclui combustão lenta de mieloma múltiplo (SMM) e mieloma múltiplo indolente (IMM). O SMM é caracterizado pela proteína M de soro maior do que ou igual a 3 g/dL e IMM é caracterizado por células de plasma da medula óssea clonal maiores do que ou igual a 10 % das células da medula óssea. O mieloma sintomático é caracterizado pela proteína M no soro e/ou urina e inclui o estágio II de mieloma múltiplo caracterizado pela presença das células de plasma da medula óssea clonal ou plasmacitoma e o estágio III de mieloma múltiplo caracterizado pelo órgão relatado ou dano no tecido.

[00433] O mieloma osteosclerótico é um componente de síndrome POEMS rara (polineuropatia, ouganomegalia, endocrinopatia, gamopatia monoclonal e lesões da pele). A incidência de pico está em 40 a 50 anos de idade. As características sistêmicas incluem lesões do esqueleto, células de plasma de tutano < 5 %, um CBC normal, plaquetas aumentadas, e organomegalia. O CSF tem uma alta proteína com nenhuma célula presente. Os níveis de pronteína são baixos (< 3g/dl, média = 1,1 g/dl); classe de cadeia pesada - usualmente α ou Y; classe de cadeia leve - usualmente À; rara urina monoclonal e crioglobulinemia ocasional. A neuropatia ocorre em 50 % dos pacientes com debilidade tanto próximo quanto distal, perda sensorial é maior na extensão do que nas pequenas fibras e desmielinação e latência distal longa.

[00434] Os pacientes de mieloma múltiplo Smoldering no geral presentes com a doença estável por meses/anos; nenhuma anemia, lesões ósseas, insuficiência renal ou hipercalcemia; tem >10 % de células de plasma na medula óssea e proteína do soro monoclonal. O critério para a combustão lenta de mieloma múltiplo é compatível com a diagnose do mieloma múltiplo; entretanto, não existe evidência do curso progressivo. Estes são casos com uma progressão lenta, a massa celular do tumor é baixa na diagnose e a porcentagem da medula óssea das células de plasma na fase S é baixa (< 0,5 %). A característica clínica característica inclui: proteína M de níveis do soro > 3 g/dL e/ou células de plasma da medula óssea > 10 %; ausência de anemia, deficiência renal, hipercalcemia, lesões ósseas líticas.

[00435] O mieloma múltiplo indolente (ou sintomático) é um mieloma múltiplo diagnosticado pela possibilidade na ausência dos sintomas, usualmente depois da avaliação dos estudos do laboratório. O mieloma múltiplo indolente é similar ao mieloma smoldering mas com poucas lesões ósseas e anemia suave. Mais casos de mieloma múltiplo indolente desenvolvem evidente o mieloma múltiplo dentro de 3 anos. O critério do diagnóstico são os mesmos como para o mieloma múltiplo exceto: nenhuma lesões ósseas ou uma lesão lítica sintomática (Visão geral do raio X); nível do componente M < 3 g/dL por IgG, 2 g/dL por IgA cadeia leve de urina < 4 g/24 horas; hemoglobina > 10 g/dl, soro normal de cálcio, soro de creatinina < 2 mg/dL, e nenhuma infecção.

5.22.2.18. PLASMACITOMA SOLITÁRIO

[00436] O plasmacitoma solitário é um de um espectro do neoplasma das células de plasma que varia de gamopatia monoclonal benigna à plasmacitoma solitário pelo mieloma múltiplo. Aproximadamente setenta por cento de todos os casos de plasmacitoma solitário eventualmente resultam em mieloma múltiplo. Estas doenças são caracterizadas pela proliferação das células B que produzem a paraproteína característica. O plasmacitoma solitário resulta na proliferação das células de plasma clonais em um local solitário, usualmente um osso simples ou local do tecido extramedular. O critério do diagnóstico do plasmacitoma solitário inclui uma lesão simples confirmada histologicamente, biopsia normal óssea, avaliação esquelética negativa, nenhuma anemia, função renal e normal de cálcio. Mais casos exibem o mínimo do soro elevado da proteína M (paraproteína). A idade média na diagnose é de 50 a 55, cerca de 5 a 10 anos mais jovem do que a idade média para o mieloma múltiplo. (Ver, C. Wilson, The Plasma Cell Dycrasias, páginas 113 a 144, In W. Finn and L. Peterson, eds., Hematopathology in Oncology, Kluwer Academic Publishers, Norwell, MA (2004), S. Chaganti, et al., Cytogenetics of Lymphoma, páginas 809 a 824, In Non-lymphoma de hodgkins, P. Mauch, et al., eds., Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, PA, (2004)).

[00437] As características imunofenotípicas e genéticas do plasmacitoma parece ser similar ao mieloma múltiplo.

5.22.2.19. DOENÇA DA CADEIA LEVE/DOENÇA DA DEPOSIÇÃO DA CADEIA LEVE (LCDD)

[00438] O LCDD é um distúrbio de dycrasias da célula de plasma causada pela sub-síntese das cadeia leves de imunoglobulina (usualmente níveis de cadeia capa) que são depositadas nos tecidos. Os pacientes comumentes presentes com disfunção do órgão, debilidade, fadiga e perda de peso. Em aproximadamente 80 % dos casos de LCDD uma imunoglobulina monoclonal é detectada. A detecção de níveis de cadeia capa monoclonais usando técnicas imunofluorescentes é limitada pela tendência das cadeias leves para dar manchamento do fundo em excesso, portanto, a rotulação immunogold ultra-estrutural pode ser necessária. (Ver, C. Wilson, The Plasma Cell Dycrasias, páginas 113 a 144, In W. Finn and L. Peterson, eds., Hematopathology in Oncology, Kluwer Academic Publishers, Norwell, MA (2004)).

5.22.2.20. LEUCEMIA DA CÉLULA DE PLASMA (PCL),

[00439] O PCL, uma dycrasias da célula de plasma, é uma variante agressiva rara de mieloma múltiplo. O critério para a leucemia celular de plasma é uma contagem da célula de plasma absoluta de sangue periférico de maior do que 2 x 109/L ou células de plasma maiores do que 20 % das células sanguíneas brancas. A determinação da presença de uma população CD138+ com a restrição da cadeia leve citoplásmica pela citometria de fluxo distinguirá o PCL a partir do neoplasma linfóide com características plasmacíticas. As células de PCL também são caracterizadas pela falta da cadeia leve de superfície, expressão CD19 e CD22, e nenhuma ou fraca expressão de CD45. Cerca de 50 % dos casos de PCL expressam CD20 e cerca de 50 % da falta de expressão de CD56. As anomalias genéticas observadas em pacientes PCL são os mesmos daqueles observados por pacientes com mieloma múltiplo mas estes são observados em mais alta frequência em PCL. (Ver, C. Wilson, The Plasma Cell Dycrasias, páginas 113 a 144, In W. Finn and L. Peterson, eds., Hematopathology in Oncology, Kluwer Academic Publishers, Norwell, MA, (2004)).

[00440] A leucemia da célula de plasma tem duas formas: se uma diagnose inicial é baseada na fase leucêmica do mieloma então a forma primária está presente, caso contrário este é secundária. A leucemia celular de plasma primária é associada com a mais jovem idade, hepatoesplenomegalia, linfadenopatia, e menos lesões ósseas líticas mas prognose deficientes do que a forma secundária. O sangue periférico dos pacientes leucêmicos da célula de plasma tem maiores do que 20 % de células de plasma com contagem absoluta de 2000/ml ou mais.

5.22.2.21. GAMOPATIA MONOCLONAL DE SIGNIFICÂNCIA CONHECIDA (MGUS)

[00441] O MGUS é uma condição relativamente comum caracterizado pela presença de imunoglobulinas homogêneas eletroforeticamente ou componentes M begninos. A ocorrência desta condição parece aumentar com a idade. Mais indivíduos carregam os componentes M nunca desenvolvendo dycrasias de célula de plasma maligna, tal como mieloma múltiplo. Entretanto, alguns indivíduos com esta condição tem associado condições malignas. Quando sintomático, os paciente podem ter fígado ou baço estendido e pleuroneuropatia. (Ver, J. Foerster, Plasma Cell Dycrasias: General Considerations, páginas 2612 a 2630, In Wintrobe’s Clinical Hematology, 10° edição, G. Lee et al., eds. Williams & Wilkins, Baltimore, MD (1999)).

[00442] O MGUS pode ser diferenciado a partir de mieloma múltiplo pela presença de diversas células monoclonais aumentadas de circulação de plasma no sangue periférico. As caracteristícas serológicas dos componentes M são idênticas por outras condições de dycrasias de célula de plasma, entretanto, a concentração total do componente M é usualmente menos do que 30 g/L. A paraproteína é usualmente IgG; entretanto paraproteínas múltiplas podem estar presentes incluindo IgG, IgA, IgM. A quantidade relativa de cada um dos indivíduos das classes de imunoglobulina é tipicamente proporcional aquela observada no soro normal. A proteinemia ou proteinuria é raro. As medições em série dos níveis da proteína M no sangue e urina, e monitoramente continuado das características clínicas e de laboratório (incluindo eletroforese de proteína) é o método mais seguro da diferenciação de MGUS a partir do estágio precoce da dycrasias de célula de plasma. In Wintrobe’s Clinical Hematology, 10° edição, G. Lee et al., eds. Williams & Wilkins, Baltimore, MD (1999)).

5.22.2.22. NOCIVIDADES DA CÉLULA B MADURA:

[00443] Em uma forma de realização adicional a invenção pode ser praticada por tratar a nocividade da célula B madura incluindo mas não limitando a linfoma folicular, linfoma celular de manta, linfoma de Burkitt, mieloma múltiplo, linfoma da célula B ampla difusa (DLBCL) incluindo DLBCL (GCB) semelhante à célula B do centro germinal, DLBCL (ABC) semelhante à célula B ativada, e DLBCL de tipo 3, linfoma de Hodgkin incluindo tipo pré-dominante de linfócito clássico e de nódulo, linfoma linfoplasmamacítico (LPL), linfoma da zona marginal incluindo linfoma (MALT) de tecido linfóide associado à mucosa gástrica, e leucemia linfócita crônica (CLL) incluindo CLL mutado por imunoglobulina e CLL não mutado por imunoglobulina.

5.22.2.23. NOCIVIDADES DA PRÉ-CÉLULA B:

[00444] Além disso, o CD19 é expressado precocemente no desenvolvimento da célula B do que, por exemplo, CD20, e é por esta razão particularmente adequado para o tratamento da pré-célula B e uma nocividade da célula B madura, por exemplo, na medula óssea. A Pré-célula B representativo e uma nocividade da célula B madura incluem mas não são limitados a linfoma celular de manta, leucemia linfoblástica aguda da pré-célula B, linfoma linfoblástica da célula B precursora, e outras nocividades caracterizadas pela expressão CD19.

5.23. DIAGNOSE DO PACIENTE E A TRANSPLANTAÇÃO DO REGIME TERAPÊUTICO

[00445] De acordo com certos aspectos da invenção, o regime de tratamento e a dose usada com as composições e métodos da invenção é escolhida com base em diversos fatores incluindo, por exemplo, manifestação clínica que deixa um paciente em risco para o desenvolvimento de uma rejeição humoral, ou evidência clínica que uma tal rejeição é desenvolvida. Os termos “humoral” e “mediado pelo anticorpo” são usados permutáveis neste.

[00446] O critério para uma avaliação o risco que um paciente desenvolverá a rejeição humoral são estabilizados de acordo com o entendimento e habilidade na técnica. Em uma forma de realização, uma citoxicidade dependente do complemento positivo ou citoxicidade dependente do crossmatch do complemento intensificado antiglobulina que indica um paciente está em alto risco para a rejeição humoral. Em uma forma de realização, um crossmatch positivo ou antes uma citoxicidade dependente do complemento positivo ou citoxicidade dependente de crossmatch do complemento intensificado de antiglobulina que indica um paciente está em um risco intermediário para a rejeição humoral. Em uma forma de realização, um crossmatch negativo que indica um paciente está em um baixo risco para a rejeição humoral.

[00447] Em uma outra forma de realização, um reservatório de transplante em necessidade de profilaxia contra a rejeição de enxerto pode ser identificado como um paciente ou população de paciente tendo circulação detectável de aloanticorpos anti-HLA antes da transplantação. Em um outro exemplo, o paciente ou a população de pacientes é identificado como tendo anticorpos reativos de painel antes da transplantação. A presença da circulação detectável de aloanticorpos anti-HLA em um reservatório de transplante pós- transplantação também pode ser usado para identificar o paciente ou a população de paciente em necessidade de tratamento para a rejeição humoral de acordo com a invenção. O paciente ou a população de paciente em necessidade de tratamento para a rejeição humoral também pode ser identificado de acordo com outros critérios clínicos que indicam que um reservatório de transplante está em risco para o desenvolvimento da rejeição humoral ou já tem desenvolvido a rejeição humoral. Por exemplo, um reservatório de transplante em necessidade de tratamento de rejeição humoral pode ser identificado como um paciente ou a população em um estágio precoce da rejeição humoral, tal como uma resposta humoral latente caracterizada pela circulação de aloanticorpos anti-doador. Um estágio precoce da rejeição humoral também pode ser uma reação silenciosa caracterizada pela circulação de aloanticorpos anti-doador e a deposição C4d, ou uma rejeição subclínica caracterizada pela circulação de aloanticorpos anti-doador, deposição C4d, e patologia do tecido. Em estágios posteriores, o reservatório é identificado como um paciente ou a população de paciente que apresenta com indicações clínicas de rejeição humoral caracterizada de acordo com o entendimento e habilidade na técnica, por exemplo, pela circulação de aloanticorpos anti-doador, deposição C4d, patologia do tecido, e disfunção de enxerto.

[00448] A presente invenção fornece as composições, formulações terapêuticas, métodos e regimes efetivos reduzindo a incidência, gravidade, ou duração de GVHD, um episódio de rejeição, ou distúrbio linfoproliferativo pós-transplante. Em certas formas de realização, as composições e métodos da invenção são efetivas para atenuar a resposta hospedeira por dano por reperfusão esquêmica de um tecido sólido ou enxerto do órgão. Em uma forma de realização, as composições e métodos da invenção são efetivos para prolongar a sobrevivência de um enxerto em um reservatório de transplante.

[00449] A presente invenção abrange os enxertos que são autólogos, alogênicos, ou xenogenético ao reservatório. Os tipos de enxertos abrangidos pela invenção incluem enxertos de tecido e órgão, incluindo mas não limitando a, enxertos da medula óssea, enxertos celular da haste periférico, enxertos de pele, enxertos arteriais e venosos, enxertos celulares de ilha pancreática, e transplantes de rim, fígado, pâncreas, tireóide, e coração. Os termos “enxerto” e “transplante” são usados permutavelmente neste. Em uma forma de realização, os enxertos autólogos é um enxerto de medula óssea, um enxerto arterial, um enxerto venoso ou um enxerto de pele. Em uma forma de realização, o aloenxerto é um enxerto da medula óssea, um enxerto córneo, um transplante de rim, um transplante celular de ilha pancreática, ou um transplante combinado e um rim e pâncreas. Em uma forma de realização, o enxerto é um xenoenxerto, em que os doadores animais possíveis incluem, mas não são limitados a porcos. As composições e métodos da presente invenção também podem ser usados para eliminar uma resposta imune nociva por um enxerto ou implante não biológico, incluindo mas não limitando a uma junta artificial, um estentor, ou um dispositivo de marca passo.

[00450] Os anticorpos anti-CD19, as composições, e métodos da invenção podem ser usados para tratar ou evitar GVHD, rejeição humoral, ou distúrbio linfoproliferativo pós-transplante sem relação à indicações particulares inicialmente dando elevação à necessidade para o transplante ou o tipo particular de tecido transplantado.

[00451] As formulações e regimes terapêuticos da presente invenção são descritos para o tratamento de pacientes humanos diagnosticados com doenças e distúrbios autoimunes, incluindo mas não limitando a, artrite reumatóide, SLE, ITP, distúrbios relacionado ao pênfigo, diabetes, e esclerodermia.

[00452] O regime de tratamento apropriado pode ser determinado por uma pessoa habilitada na técnica pelo paciente particular ou população de paciente. Nas formas de realização particulares, o regime de tratamento é um regime de condicionamento pré- transplante, um regime de manutenção pós-transplante, ou regime de tratamento pós-transplante para uma rejeição crônica e aguda. Em certas formas de realização, o regime particular é variado por um paciente cujo é avaliado como sendo em um alto ou intermediário risco de desenvolvimento de uma resposta humoral, comparado com o regime por um paciente cujo é avaliado como sendo em um baixo risco de desenvolvimento de uma resposta humoral.

[00453] Em certas formas de realização, o regime particular é variado de acordo com o estágio da rejeição humoral, com a terapia mais agressiva sendo indicado para os pacientes em estágios posteriores de rejeição. Os estágios de rejeição humoral podem ser classificados de acordo com o entendimento e habilidade na técnica. Por exemplo, os estágios de rejeição humoral podem ser classificado como um dos estágios I ao IV de acordo com o seguinte critério: Resposta latente do estágio I, caracterizado pela circulação do aloanticorpos anti-doador, especialmente anticorpos anti-HLA; reação silenciosa do estágio II, caracterizado pela circulação do aloanticorpos anti-doador, especialmente anticorpos anti-HLA, e deposição C4d, mas sem mudanças histológicas ou disfunção de enxerto; rejeição subclínica do estágio III: caracterizado pela circulação do aloanticorpos anti-doador, especialmente anticorpos anti-HLA, deposição C4d, e patologia do tecido, mas sem disfunção de enxerto; rejeição humoral do estágio IV: caracterizado pela circulação do aloanticorpos anti- doador, especialmente anticorpos anti-HLA, deposição C4d, patologia do tecido, e disfunção de enxerto.

[00454] As curvas de resposta da dosagem podem ser geradas usando protocolos padrões na técnica a fim de determinar a quantidade efetiva das composições da invenção para o uso em um regime particular, por exemplo, em regimes de condicionamento antes da transplantação, e em regimes pós-transplantação por profilaxia e tratamento de GVHD, rejeição humoral, ou distúrbio linfoproliferativo de pós-transplantação. No geral, os pacientes em alto risco para o desenvolvimento de uma rejeição humoral e aqueles já exibiram um ou mais indicadores clínicos de rejeição requerirão doses mais altas e/ou mais doses frequentes que podem ser administradas em períodos mais longos de tempo em comparação aos pacientes pelo qual não estão em alto risco ou pelo qual não exibem quaisquer indicações de rejeição ativa.

[00455] Os anticorpos anti-CD19, as composições e métodos da invenção podem ser praticadas por tratar ou evitar GVHD, rejeição humoral, ou distúrbio linfoproliferativo de pós-transplantação, sozinho ou em combinação com outros agentes terapêuticos ou regime de tratamento. Outro regime terapêutico para o tratamento ou evitação de GVHD, rejeição humoral, ou distúrbio linfoproliferativo de pós- transplantação pode compreender, por exemplo, um ou mais das terapias anti-linfócitos, terapia de tireóide, terapia % da depleção de anticorpo, terapia imunossupressão, e plasmaferese.

[00456] A terapia anti-linfócito pode compreender a administração ao reservatório do transplante de globulinas anti-timócito, também referido como timoglobulina. A terapia anti-linfócito também pode compreender a administração de um ou mais anticorpos monoclonais direcionados contra a célula T dos antígenos de superfície. Exemplos de tais anticorpos incluem, sem limitação, OKT3™ (muromonab-CD3), CAMPATH™-1H (alemtuzumab), CAMPATH™ -1G, CAMPATH™ -1M, SIMULECT™ (basiliximab) e ZENAPAX™ (daclizumab). Em uma forma específica de realização, a terapia anti-linfócito compreende um ou mais anticorpos adicionados direcionados contra as células B, incluindo, sem limitação, RITUXAN™ (rituximab).

[00457] A terapia de tireóide pode compreender administração ao reservatório do transplante de um ou mais esteróides selecionados do grupo que consiste de cortisol, prednisona, metil prednisolona, dexametazona, e indometacina. Um ou mais dos esteróides podem ser corticoesteróides, incluindo sem limitação, cortisol, prednisona, e metilprednisolona.

[00458] A terapia % da depleção de anticorpo pode incluir, por exemplo, a administração ao reservatório do transplante de imunoglobulina intravenosa. A terapia % da depleção de anticorpo também pode compreender terapia de imunoabsorção aplicada ao enxerto ex vivo, antes da transplantação. A imunoabsorção pode ser realizada usando qualquer técnica adequada, por exemplo, afinidade por proteína A, ou anticorpo baseado em técnicas de afinidade usando anticorpos direcionados contra os marcadores de superfície da célula T ou célula B tal como anticorpos anti-CD3, anticorpos anti-CD19, anticorpos anti-CD20, e anticorpos anti-CD19.

[00459] A terapia de imunossupressão pode compreender a administração de um ou mais agentes imunosupressivos tal como inibidores de transcrição de citocina (por exemplo, ciclosporina A, tacrolimus), síntese de nucleotídeo (por exemplo, azatiopurina, micofenolato de mofetila), transdução de sinal do fator de desenvolvimento (por exemplo, sirolimus, rapamicina) e o receptor 2 de interleucina de célula T (por exemplo, daclizumab, basiliximab). Em uma forma de realização particular, um agente imunosupressante usado em combinação com as composições e métodos da invenção incluem um ou mais dos seguintes: adriamicina, azatiopurina, busulfan, ciclofosfamida, ciclosporina A (“CyA”), citoxina, fludarabina, 5-fluorouracila, metotrexato, micofenolato de mofetila (MOFETIL), anti- inflamatórios não esteroidais (NSAIDs), rapamicina, e tacrolimus (FK506). Os agentes imunosupressantes também podem compreender inibidores de complemento, por exemplo, receptor 1 de complemento solúvel, anticorpo anti-C5, ou um pequeno inibidor de molécula de C1s, por exemplo como descrito em Buerke et al. (J. Immunol., 167:5375-80 (2001).

[00460] Em uma forma de realização, as composições e métodos da invenção são usados em combinação com um ou mais dos regimes terapêuticos para suprimir a rejeição humoral, incluindo, sem limitação, tacrolimus e terapia de micofenolato de mofetila, imunoabsorção, terapia de imunoglobulina intravenosa, e plasmaferese.

5.23.1. DIAGNOSE E CRITÉRIO CLÍNICO

[00461] A presente invenção fornece anticorpos, composições e métodos para o tratamento e prevenção GVHD, rejeição humoral, e distúrbio linfoproliferativo pós-transplante em recipientes de transplante humano. As composições e métodos da invenção podem ser usados com respeito das indicações particulares que dão elevação à necessidade para um transplante. Similarmente, o uso de composições e métodos da invenção para o tratamento e prevenção de GVHD, rejeição humoral, e distúrbio linfoproliferativo pós- transplantes não é limitado pelo tipo particular de tecido que é pretendido para a transplantação ou que foi transplantado.

[00462] Em uma forma de realização, a invenção fornece composições e métodos para a prevenção da rejeição humoral em um reservatório de transplante em ser humano em que o reservatório de transplante é identificado como um paciente ou população de paciente em risco aumentado para o desenvolvimento de uma rejeição humoral. Tais pacientes também podem ser referidos como “sensibilizados.” O critério para à identificação dos pacientes sensibilizados é conhecido ao clínico habilitado. Tal critério pode incluir, por exemplo, pacientes tendo níveis detectáveis da circulação de anticorpos contra antígenos de HLA, por exemplo, aloanticorpos anti-HLA. Tal critério também pode incluir os pacientes pelo qual tem sofrido prévias transplantações, uma gravidez, ou transfusões sanguíneas múltiplas. Os pacientes pelo qual estão em um risco aumentado para a rejeição humoral também inclui aqueles tendo comparação HLA de reservatório de doador imperfeito, e aquelas transplantações que são incompatíveis com ABO. Os indivíduos sensibilizados são candidatos para o pré-tratamento ou condicionamento antes da transplantação. Os indivíduos sensibilizados também são candidatos para a pós- transplantação mantendo os regimes para a prevenção da rejeição humoral.

[00463] Em uma forma de realização, anticorpos, composições, e métodos da invenção compreendem ou são usados em combinação com um regime terapêutico para o tratamento de uma rejeição crônica ou aguda. Nas formas de realização particulares, a rejeição é caracterizada como uma rejeição humoral do Estágio I, Estágio II, Estágio III, ou Estágio IV.

[00464] Em uma forma de realização, anticorpos, composições, e métodos da invenção compreendem ou são usados em combinação com um regime terapêutico para o tratamento de um estágio precoce de rejeição humoral. Nas formas de realização particulares, o estágio precoce da rejeição humoral é uma rejeição de Estágio I, II, ou III. As indicações clínicas de uma rejeição humoral de um estágio precoce são determinados de acordo com o entendimento e habilidade na técnica e pode incluir, por exemplo, o desenvolvimento no paciente da circulação de anticorpos anti-HLA específicos por doadores, a presença de marcadores de complemento da atividade do anticorpo tal como depósitos C4d e C3d nas biopsias do enxerto, e a presença de anticorpos anti-HLA nas biopsias do enxerto. Outros indicadores de um estágio precoce de rejeição humoral são conhecidos aos clínicos habilitados e pode incluir, por exemplo, o desenvolvimento de anticorpos anti-endoteliais, especialmente anticorpos antivimentina, e o desenvolvimento dos aloanticorpos de cadeia A relatada da classe I MHC não clássica (MICA).

[00465] Em uma forma de realização, composições e métodos da invenção compreendem ou são usados em combinação com um regime terapêutico para o tratamento de rejeição humoral caracterizada em parte pela disfunção de enxerto. Nas formas de realização particulares, o paciente ou população de paciente em necessidade de tratamento para a rejeição humoral é identificado de acordo com o critério conhecido na técnica para a disfunção de enxerto. Exemplos de tal critério para os tipos particulares de enxertos e são fornecidos nas seções que seguem. Em outra forma de realização, o paciente ou população de paciente em necessidade de tratamento para a rejeição humoral é identificado de acordo com outros critérios que são particulares ao tipo de enxerto do tecido, tal como critério histológico. Exemplos de tal critério também é fornecido nas seções que seguem. 1.1.2. . TRANSPLANTES DA MEDULA ÓSSEA

[00466] As composições e métodos da invenção são úteis para o tratamento e para evitar GVHD, rejeição humoral, e distúrbio linfoproliferativo pós-transplante no reservatório de transplante de medula óssea. Em uma forma de realização, composições e métodos da invenção compreendem ou são usados em combinação com um regime de condicionamento de pré-transplante.

[00467] Em uma forma de realização, composições e métodos da invenção são usados para esgotar as células B a partir de um enxerto da medula óssea antes da transplantação. O enxerto pode ser de qualquer fonte adequada, por exemplo, células de haste sanguínea de corda, células de haste do sangue periférico, ou uma pancada na medula óssea. As células de haste do sangue periférico podem ser coletadas a partir do sangue do doador seguindo um regime de condicionamento adequado. Os regimes adequados são conhecidos na técnica e podem incluir, por exemplo, a administração de um ou mais dos seguintes antes do doador para a coleta do sangue do doador: NEUPOGEN, citocinas tal como GM-CSF, regime quimioterapêutico de baixa dosagem, e terapia de quimiocina. O enxerto pode ser alogênico ou autólogo ao reservatório do transplante. O enxerto também pode ser um xenoenxerto.

[00468] As composições e métodos podem ser úteis nos diversos contextos em que aqui é uma indicação hematopoiética para a transplantação da medula óssea. Em uma forma de realização, um enxerto de medula óssea autóloga é indicado para uma leucemia ou linfoma da célula B, incluindo, mas não limitando a leucemia linfoblástica aguda (“ALL”) ou linfoma não Hodgkins, e composições e métodos da invenção podem ser usados para a depleção das células malignas residuais contendo o enxerto. Em uma forma de realização, um transplante autólogo de medula óssea é indicado para os pacientes incapaz de clarear uma infecção viral, por exemplo uma infecção viral associada com o vírus Epstein Barr (EBV), vírus de imunodeficiência humana (HIV), ou citomegalovírus (CMV) e composições e métodos da invenção podem ser usados para esgotar o enxerto das células B que podem abrigar o vírus. Em uma outra forma de realização, o enxerto é um enxerto alogênico e as composições e métodos da invenção podem ser usados para o esgotamento das células B do doador a partir do enxerto como profilaxia contra GVHD.

[00469] Em uma forma de realização, a indicação é uma célula B associada a condição e composições e métodos autoimunes da invenção podem ser usados para esgotar as células B danosas a partir do paciente sem a necessidade para a quimioterapia ou regimes de condicionamento de terapia de radiação. Em uma forma de realização, as composições da invenção são administradas em combinação com uma quimioterapia ou regime de terapia de radiação, que compreende o regime em uma dosagem inferior de um ou mais agentes quimioterapêuticos, ou uma dosagem inferior de radiação, do que a dosagem que é administrada na ausência das composições da invenção. Em uma forma de realização, o paciente recebe um enxerto autólogo da medula óssea subseqüente para a terapia de quimioterapia ou radiação, em que o enxerto é esgotado das células B nocivas antes da transplantação usando as composições e métodos descrito neste.

[00470] Um paciente ou população de paciente em necessidade de, ou semelhante ao benefício de, um transplante de medula óssea é identificada de acordo com o entendimento e habilidade na técnica. Os exemplos dos pacientes que podem ser candidatos para a transplantação da medula óssea incluem pacientes pelo qual tem sofrido terapia de quimioterrapia ou radiação para o tratamento de um câncer ou uma doença ou distúrbio autoimune, e pacientes pelo qual são incapazes de clarear uma infecção viral residindo em células do sistema imune.

5.23.3. TRANSPLANTES DO FÍGADO

[00471] As composições e métodos da invenção são úteis para o tratamento e para evitar GVHD, rejeição humoral, e distúrbio linfoproliferativo pós-transplante em um reservatório de transplante do fígado. Nas formas de realização particulares, a rejeição é uma rejeição aguda ou uma crônica. Em uma forma de realização, composições e métodos da invenção são usados para a prevenção de GVHD, rejeição humoral, e distúrbio linfoproliferativo pós-transplante em um reservatório de transplante de fígado. Em uma forma de realização, composições e métodos da invenção compreendem ou são usados em combinação com um regime de condicionamento de pré- transplante. Em uma forma de realização, composições da invenção são administradas ao reservatório do transplante. Em uma forma de realização, as composições da invenção são contactadas com o enxerto, ex vivo, antes da transplantação.

[00472] O transplante do fígado pode ser de qualquer fonte adequada como determinado de acordo com o entendimento e habilidade na técnica. Em uma forma de realização, o fígado é um enxerto alogênico comparado por HLA. Em uma outra forma de realização, o fígado é um xenoenxerto a partir de um porco doador. Em uma forma de realização, o fígado é usado ex vivo para filtrar o sangue do paciente, por exemplo, perfusão extracorporal. A perfusão extracorporal é uma forma da diálise do fígado em que o paciente é cirurgicamente conectado a um fígado mantido fora do corpo. Este procedimento é algumas vezes referidos como “fígado bioartificial.” De acordo com esta forma de realização, as composições e métodos da invenção são usadas para evitar o desenvolvimento dos anticorpos contra os antígenos do fígado que pode contaminar o sangue do paciente.

[00473] Em uma forma de realização, as composições e métodos da invenção compreendem um regime terapêutico melhorado para o tratamento e prevenção de GVHD, rejeição humoral, e distúrbio linfoproliferativo pós-transplante. Em uma forma de realização particular, as composições e métodos da invenção compreendem um regime terapêutico melhorado, em que as posições melhoradas na incidência diminuída e/ou gravidade das complicações associados com agentes imunosupressivos tradicionais. Em uma forma de realização, a incidência e/ou gravidade de nefrotoxicidade, hepatotoxicidade, e hirsutismo é reduzido comparado com os regimes tradicionais que contam ciclosporina A ou outros inibidores de calcinuerina. Em uma forma de realização, a incidência e/ou gravidade da obesidade, osteodistrofia, diabetes mellitus e suscetibilidade por infecções bacterianas e virais é reduzido comparado com os regimes tradicionais que contam em corticoesteróides.

[00474] Em uma forma de realização, composições e métodos da invenção são usados em combinação com doses inferiores de um ou mais agentes imunosupressivos tradicionais do que as doses que são usados na ausência de terapia de anticorpo anti-linfócito. As dosagens inferiores podem resultar na incidência diminuída e/ou gravidade de um ou mais complicações associadas com um ou mais agentes imunosupressivos tradicionais.

[00475] Um paciente ou população de paciente em necessidade de, ou semelhante ao benefício de, um transplante de fígado é identificado de acordo com o entendimento e habilidade na técnica. Exemplos dos pacientes que podem ser candidatos para a transplantação do fígado incluem indivíduos tendo um ou mais das seguintes condições, doenças, ou distúrbios: deficiência aguda do fígado, amiloidose, distúrbios de excreção de bilirubina, atresia biliar, síndrome de Budd- Chiari, hepatite autoimune ativa crônica, cirrose (associado com hepatite viral incluindo hepatite B e hepatite C, cirrose alcóolica, ou cirrose biliar primária), colangite, fator congênito VIII ou distúrbio IX, distúrbios do metabolismo de cobre, fibrose cística, glicogênese, hipercolesterolemia, lipidoses, mucopolissacaridose, colangite que causa esclerose primária, distúrbios do metabolismo de porfirina, distúrbios de metabolismo de purina e pirimidina, e neoplasma maligno e benigno primário, especialmente do fígado e dutos de bílis intra- hepáticos, sistema biliar, passagens biliar, ou sistema digestivo.

[00476] O critério clínico para a identificação de um paciente ou população de paciente em necessidade de, ou semelhante ao benefício de, um transplante de fígado pode ser determinado de acordo com o entendimento e habilidade na técnica. Tal critério pode incluir, por exemplo, um ou mais dos seguintes sintomas: fadiga, perda de peso, dor superior abdominal, purezas, icterícias, dilatação do fígado, deslocamento da urina, fosfatase alcalina elevada, e atividade glutamilpeptidase de gama, níveis de bilirubina elevados, akbumina de soro diminuída, enzimas específicas do fígado elevado, produção baixa da bílis, nitrogênio de uréia sanguíneo aumentado, creatinina aumentada e/ou presença de tituladores de anticorpos citoplásmicos anti-neutrofila (ANCA), hemorragia de varicela recorrente, ascites intratáveis, peritonite bacteriana espontânea, encefalopatia refratória, diversas icterícias, disfunção sintética exacerbada, deterioração fisiológica repentina, e deficiência hepática fulminante.

5.23.4. TRANSPLANTES DE RIM (RENAL)

[00477] As composições e métodos da invenção são úteis para o tratamento e para evitar GVHD, rejeição humoral, e distúrbio linfoproliferativo pós-transplante em um reservatório de transplante renal. Como usado neste, o termo “transplante renal” abrange o transplante e um rim e o transplante combinado e um rim e o pâncreas. Nas formas de realização particulares, a rejeição é caracterizado como uma rejeição aguda ou uma rejeição crônica.

[00478] Em uma forma de realização, composições e métodos da invenção compreendem ou são usadas em combinação com um regime de condicionamento de pré-transplante. Em uma forma de realização, a dosagem simples de um ou mais das composições da presente invenção é efetiva reduzindo anticorpos reativos de painel e células B esgotadas no paciente ou população de paciente. Em uma outra forma de realização, dosagens múltiplas de um ou mais das composições da invenção são efetivas reduzindo anticorpos reativos de painel e células B esgotadas no paciente ou população de paciente. Em uma forma de realização, uma dosagem simples de um ou mais das composições da presente invenção é administrada em combinação com um ou mais agentes imunosupressivos e é efetiva reduzindo anticorpos reativos de painel e células B esgotadas no paciente ou população de paciente.

[00479] Em certas formas de realização, composições e métodos da invenção são para o tratamento e para evitar GVHD e rejeição de enxerto em um paciente tendo recebido um transplante renal. Em uma forma de realização, o paciente já não tem exibido sinais clínicos de rejeição. Em uma forma de realização relatada, composições e métodos da invenção compreendem ou são usadas em combinação com um regime de manutenção para a prevenção da rejeição de enxerto no reservatório de transplante. Em uma forma de realização, composições e métodos da invenção são para o tratamento de uma rejeição humoral subclínica. em uma forma de realização relatada, o paciente ou população de paciente em necessidade de tratamento para um rejeição humoral subclínica é indicado pela detecção de deposição de Cd4 na biopsia a partir do enxerto ou pela detecção da circulação dos anticorpos anti-HLA.

[00480] Em uma forma de realização, composições e métodos da invenção compreendem ou são usados em combinação com um regime terapêutico para o tratamento de um episódio de rejeição crônica ou aguda em um reservatório de transplante. Em uma forma de realização, o paciente ou população de paciente em necessidade de tratamento para um episódio de rejeição crônico ou agudo é identificado pela detecção de um ou mais indicadores clínicos de rejeição. Nas formas de realização específicas, um ou mais indicadores clínicos de rejeição são detectados de uma a seis semanas pós-transplantação. Em uma forma de realização, um ou mais indicadores clínicos de rejeição são detectados 6, 12, 18, 24, 36, 48, ou 60 meses pós-transplantação. Em uma forma de realização, a rejeição aguda é a rejeição humoral aguda confirmada pela biopsia.

[00481] Em uma forma de realização, um ou mais das composições da invenção compreendem um regime terapêutico para o tratamento de rejeição aguda. Em uma forma de realização particular, o regime terapêutico ainda compreende um ou mais dos seguintes: plasmaferese, tacrolimus/micofenolato, imunglobulina intravenosa, imunoabsorção com protein A, e anticorpo anti-CD20. Em uma forma de realização, o paciente foi em um protocolo imunosupressivo antes do desenvolvimento da rejeição. Em uma forma de realização particular, o protocolo imunosupressivo inclui um ou mais de ciclosporina, azatioprina, e terapia de tireóide.

[00482] Os indicadores clínicos da rejeição humoral aguda são conhecidos na técnica e incluem, por exemplo, uma deterioração diversa repentina da função renal, o desenvolvimento de oliguria, e perfusão renal compromissada. Os indicadores adicionais incluem, por exemplo, células inflamatórias em capilares peritubular em biopsia e aloanticorpos específicos de doadores de circulação. Em uma forma de realização, o paciente presente com um ou mais dos seguintes critérios do diagnóstico para um rejeição humoral de um aloenxerto renal: (1) evidência morfológica de dano do tecido agudo; (2) evidência da ação do anticorpo, tal como depósitos C4d ou imunoglobulina e complemento em necrose fibrinóide arterial e (3) circulação detectável de anticorpos contra antígenos de HLA de doadores ou antigenos endoteliais de doadores. Em uma forma de realização, o paciente presente com todos os três dos critérios acima do diagnóstico.

[00483] Em uma forma de realização, o paciente presente com um ou mais dos critérios precedentes do diagnóstico da rejeição humoral aguda e composições da presente invenção são usados em combinação com um ou mais dos seguintes agentes imunosupressivos para tratar a rejeição humoral aguda: imunglobulina intravenosa, globulinas anti-timócito, anticorpo anti-CD20, micofenolato de mofetila, ou tacrolimus. Em uma outra forma de realização, as composições da invenção são usadas em combinação com um ou mais agentes imunosupressivos e um procedimento para a remoção de todos os anticorpos a partir do paciente, tal como plasmaferese ou imunoabsorção.

[00484] Em uma forma de realização, as composições e métodos da invenção compreendem ou são usados em combinação com um regime terapêutico para o tratamento de uma alorejeição renal crônica de enxerto. Em uma forma de realização, um ou mais das composições da invenção são usados sozinho ou em combinação com um ou mais agentes imunosupressivos, incluindo por exemplo, anti- CD154 (CD40L), tacrolimus, sirolimus, e mizoribina. Em uma forma de realização, um ou mais do anticorpos anti-CD19 são usados em combinação com tacrolimus e micofenolato.

[00485] Os indicadores clínicos da rejeição crônica nos rins são conhecidos na técnica e podem incluir, por exemplo, fibrose íntima arterial com células mononucleares íntimas (vasculopatia de aloenxerto crônico), duplicação das membranas com fundamento glomerular (glomerulopatia de aloenxerto crônico), laminação da membrana fundamental pertitubular, C4d em capilares peritubular, e circulação detectável de anticorpos reativos HLA de doador. Em uma forma de realização, composições e métodos da invenção compreendem ou são usados em combinação com um regime terapêutico para tratar da rejeição crônica antes do desenvolvimento das lesões de enxerto.

[00486] Em uma outra forma de realização, o paciente ou população de paciente em necessidade de tratamento é identificado como tendo um ou mais indicadores clínicos de glomerulopatia de transplante. Em uma forma de realização relatada, as composições da invenção compreendem ou são usadas em combinação com um regime terapêutico que compreende um ou mais agentes terapêuticos. Em certas formas de realização, o regime terapêutico é efetivo para estabilizar a função renal e inibir a rejeição de enxerto. Em uma forma de realização particular, um ou mais agentes terapêuticos incluem inibidores de enzima que convertem angiotensina (ACE) e/ou antagonistas receptores, imunglobulina intravenosa, globulinas anti- timócito, anticorpo anti-CD20, micofenolato de mofetila, ou tacrolimus. Os anticorpos anti-CD19 podem ser usados em combinação com micofenolato de mofetila e tacrolimus, com ou sem outros agentes terapêuticos. O plasmaferese também pode ser usado como parte do regime terapêutico.

[00487] Um paciente ou população de paciente em necessidade de, ou semelhante ao benefício de, um transplante renal é identificado de acordo com o entendimento e habilidade na técnica. Exemplos dos pacientes que podem ser candidatos para a transplantação renal incluem pacientes diagnosticados com amiloidose, diabetes (tipo I ou tipo II), doença glomerular (por exemplo, glomerulonefrite), gota, síndrome urêmica hemolítica, HIV, doença renal hereditária (por exemplo, doença renal policística, uropatia obstrutiva congênita, cistinose, ou síndrome de prune bell), outras doenças renais (por exemplo, nefropatia obstrutiva adquirida, necrose tubular aguda, nefrite intersititial aguda), artrite reumatóide, lupus eritematoso sistêmico, ou anemia celular de sickle. Outros candidatos para o transplante renal incluem pacientes tendo deficiência de insulina, alta pressão sanguínea, diversos danos ou queimaduras, maior cirurgia, doença do coração ou ataque do coração, doença do fígado ou deficiência do fígado, doença vascular (por exemplo, esclerose sistêmica progressiva, trombose da artéria renal, esclerodermia), refluxo vesicoureteral, e certos cânceres (por exemplo, carcinoma incidental, linfoma, mieloma múltiplo, carcinoma celular renal, tumor de Wilms). Outros candidatos para o transplante renal pode incluir, por exemplo, usuários de heroína, indivíduos pelo qual foi rejeitado um prévio rim ou enxerto de pâncreas, e indivíduos que sofrem um regime terapêutico que compreende antibióticos, ciclosporina, ou quimioterapia.

[00488] O critério clínico para a identificação de um paciente ou população de paciente em necessidade de, ou semelhante ao benefício de, um transplante de rim pode ser determinado de acordo com o entendimento e habilidade na técnica. Tal critério pode incluir, por exemplo, um ou mais dos seguintes: problemas urinários, hemorragia, contusão fácil, fadiga, confusão, náusea e vômito, perda de apetite, pele pálida (de anemia), dor nos músculos, juntas, flancos, e tórax, dor e fratura óssea, e coceira.

5.23.5 TRANSPLANTES CARDÍACOS

[00489] As composições e métodos da invenção são úteis para o tratamento e para evitar GVHD, rejeição humoral, e distúrbio linfoproliferativo pós-transplante em um reservatório de transplante cardíaco. Nas formas de realização particulares, a rejeição é uma rejeição aguda ou uma crônica. Em uma forma de realização, as composições e métodos da invenção compreendem ou são usados em combinação com um regime de condicionamento de pré-transplante.

[00490] Em certas formas de realização, composições e métodos da invenção compreendem ou são usados em combinação com um regime terapêutico para o tratamento de rejeição humoral aguda em um reservatório de transplante cardíaco. Em uma forma de realização particular, o regime terapêutico ainda compreende um ou mais dos seguintes: plasmaferese, imunglobulina intravenosa, e terapia de anticorpo anti-CD20. O paciente ou população de paciente em necessidade de tratamento para uma rejeição humoral aguda é identificado pela detecção de um ou mais das indicações clínicas da rejeição humoral aguda. Exemplos de indicadores clínicos da rejeição humoral aguda pode incluir um ou mais dos seguintes: disfunção hemodinâmica, definido pelo choque, hipotensão, produção cardíaca diminuída, e um aumento da cunha capilar ou pressão da artéria pulmonar. Em uma forma de realização particular, a rejeição humoral aguda é diagnosticado dentro de 6, 12, 18, 24, 36, 48, ou 60 meses pós-transplantação.

[00491] Em uma forma de realização, composições e métodos da invenção compreendem ou são usados em combinação com um regime terapêutico para a prevenção de rejeição em um reservatório de transplante cardíaco. Em uma forma de realização, o reservatório de transplante em necessidade de profilaxia contra rejeição é identificado como um paciente ou população de paciente tendo um ou mais dos seguintes dos fatores de risco: sexo feminino, seropositividade citomegalovírus, resposta elevada ou anticorpos reativos de painel, crossmatch pós e/ou pré-transplante positivos, e pré-sensibilização com agentes imunosupressivos.

[00492] Em uma forma de realização, composições e métodos da invenção são para o tratamento ou evitação da deterioração do enxerto no reservatório de transplante do coração. Em uma forma de realização, o reservatório de transplante em necessidade de tratamento por, ou profilaxia contra, deterioração do enxerto é identificado como um paciente ou população de paciente tendo um ou mais das seguintes indicações clínicas da rejeição humoral: deposição da imunoglobulina, C1q, C3, e/ou C4d em capilares, evidência da células positiva CD68 dentro dos capilares, e a evidência da infiltração do enxerto pelas células inflamatórias na biopsia. Em uma forma de realização, composições da presente invenção são usados em combinação com um ou mais dos seguintes agentes imunosupressivos para tratar a deterioração do enxerto no reservatório de transplante do coração: imunglobulina intravenosa, globulinas anti-timócito, anticorpo anti-CD20, micofenolato de mofetila, ou tacrolimus. Em uma outra forma de realização, composições de anticorpo anti-CD19 podem ser usados em combinação com um ou mais agentes imunosupressivos e um procedimento para a remoção de todos os anticorpos a partir do paciente, tal como plasmaferese ou imunoabsorção.

[00493] Em uma forma de realização, composições e métodos da invenção compreendem ou são usados em combinação com um regime terapêutico para o tratamento de rejeição cardíaca crônica, por exemplo vasculopatia de aloenxerto crônico, também referido como transplante da doença da artéria coronária. Em uma outra forma de realização, composições e métodos da invenção compreendem ou são usados em combinação com um regime terapêutico para a prevenção do transplante da doença da artéria coronária em um paciente ou população de paciente em risco. O critério para a identificação de um paciente ou população de paciente em risco de desenvolvimento do transplante da doença da artéria coronária são conhecidos na técnica e pode incluir, por exemplo, pacientes tendo transplantes comparados indispostos, pacientes pelo qual o desenvolvimento da circulação dos anticorpos anti-HLA, e os pacientes pelo qual desenvolvem um ou mais indicações clínicas da rejeição humoral precocemente depois do transplante cardíaco.

[00494] Um paciente ou população de paciente em necessidade de, ou semelhante ao benefício de, um transplante cardíaco é identificado de acordo com o entendimento e habilidade na técnica. Exemplos dos pacientes que podem ser candidatos para a transplantação do coração incluem aqueles pelo qual foram diagnosticados com qualquer das seguintes doenças e distúrbios: doença da artéria coronária, cardiomiopatia (doença não inflamatória do coração), doença da válvula do coração com deficiência do coração congestivo, ritmos cardíacos anormais que ameaça a vida que não responde à outras terapias, cardiomiopatia idiopática, cardiomiopatia esquêmica, cardiomiopatia dilatada, cardiomiopatia esquêmica, e doença cardíaca congênita para que nenhuma terapia convencional existe ou para que a terapia convencional tem falhado.

[00495] O critério clínico para a identificação de um paciente ou população de paciente em necessidade de, ou semelhante ao benefício de, um transplante cardíaco pode ser determinado de acordo com o entendimento e habilidade na técnica. Tal critério pode incluir, por exemplo, um ou mais dos seguintes: fração de deposição menos do que 25 %, angina intratável ou arritmia cardíaca maligna não responsiva pela terapia convencional, e a resistência vascular pulmonar de menos do que 2 unidades de Wood. Além disso, o paciente ou população de paciente em necessidade de um transplante cardíaco pode ser identificado pela realização de uma série de teste de acordo com o entendimento e habilidade na técnica. Tais testes incluem, por exemplo, ecocardiogramas de tensão e latente, EKG, ensaio de níveis de creatinina sanguínea, arteriografia coronária, e avaliação cardiopulmonar incluindo cateterização cardíaca direita e esquerda.

5.23.6. TRANSPLANTE DE PULMÃO

[00496] As composições e métodos da invenção são úteis para o tratamento e para evitar GVHD, rejeição humoral, e distúrbio linfoproliferativo pós-transplante no reservatório de transplante de pulmão. Nas formas de realização particulares, a rejeição é caracterizado como uma rejeição crônica ou aguda. Em uma forma de realização, composições e métodos da invenção compreendem ou são usados em combinação com um regime de condicionamento de pré- transplante.

[00497] Um paciente ou população de paciente em necessidade de, ou semelhante ao benefício de, um transplante de pulmão é identificado de acordo com o entendimento e habilidade na técnica. Exemplos dos pacientes que podem ser candidatos para a transplantação de pulmão incluem pacientes tendo um dos seguintes doenças ou condições: bronquietase, doença pulmonar obstrutiva crônica, fibrose cística, síndrome Eisenmenger ou doença cardíaca congênita com síndrome Eisenmenger. Enfisema, granuloma eosinofílico do pulmão, ou histiocitose X, trauma de inalação/queimadura, linfangioleiomiomatose (LAM), hipertensão pulmonar primária, fibrose pulmonar (varredura do pulmão), ou sarcoidose.

[00498] O critério clínico para a identificação de um paciente ou população de paciente em necessidade de, ou semelhante ao benefício de, um transplante de pulmão pode ser determinado de acordo com o entendimento e habilidade na técnica. Tal critério pode incluir, por exemplo, um ou mais dos seguintes: doença pulmonar obstrutiva crônica (COPD) e enfisema de deficiência anti-tripsina alfa1 caracterizada por um ou mais dos seguintes indicadores: FEV1 pós- broncodilatador de menos do que 25 % predito, hipoxemia latente, isto é, PaO2 de menos do que 55 a 60 mm Hg, hipercapnia. A hipertensão pulmonar secundária, uma taxa rápida de declínio em FEV1, ou exacerbações que ameaça a vida; fibrose cística caracterizada por um ou mais dos seguintes indicadores: FEV1 pós-broncodilatador de menos do que 30 % predito, hipoxemia latente, hipercapnia, ou frequência aumentada e gravidade da exacerbações; fibrose pulmonar idiopática caracterizada por um ou mais dos seguintes indicadores: capacidade vital (VC) e TLC de menos do que 60 a 65 % predito, e hipoxemia latente; hipertensão pulmonar secundária caracterizado pela progressão clínica, radiográfica, ou fisiológica enquanto em terapia médica; hipertensão pulmonar primária caracterizada por um ou mais dos seguintes indicadores: classe III ou IV funcional de NYHA, meio da pressão atrial direita de maior do que 10 mm Hg , meio de pressão arterial pulmonar de maior do que 50 mm Hg, índice cardíaco de menos do que 2,5 L/minuto/m2, e deficiência da terapia com infusão prostaciclina de termo longo.

5.23.7 DISTÚRBIO LINFOPROLIFERATIVO PÓS-TRANSPLANTE

[00499] A imunossupressão necessária para a transplantação bem sucedida pode dar a elevação por um distúrbio linfoproliferativo pós- transplante da origem da célula B. No geral, um distúrbio linfoproliferativo pós-transplante é associado com as células infectadas de vírus Epstein-Barr. O distúrbio linfoproliferativo pós-transplante (PTLD) pode variar na gravidade de uma síndrome semelhante a mononucleose limitante pelo próprio benigno por um linfoma não agressivo de Hodgkins. As composições e métodos da presente invenção podem ser usados para tratar PTLD origina-se de qualquer transplante. O transplante podem ser um transplante de órgão sólido, por exemplo um transplante cardíaco, um transplante de fígado, um transplante de rim, ou um transplante de rim-pâncreas combinadas. Em uma forma de realização, composições e métodos da invenção são usados para tratar PTLD como parte de um regime terapêutico que inclui uma suspensão ou redução temporária de outras terapias imunosupressivas.

[00500] Em uma forma de realização, as composições de anticorpo anti-CD19 são administradas como parte de um regime terapêutico incluindo um ou mais dos seguintes: alta dose da globulina de gama intravenosa, uma citocina, um agente anti-viral, e um anticorpo anti- CD20 monoclonal. O regime terapêutico pode incluir uma suspensão ou redução temporária de terapia imunossupressão. Em uma forma de realização, a globulina de gama intravenosa é administrada em uma dose diária de 0,4 g/kg por 1 a 5 dias, preferivelmente por 3 dias, e a citocina é o alfa interferon administrado por pelo menos 7 dias. Em uma forma de realização, uma ou mais citocinas é usada no regime. Em uma forma de realização, um ou mais agentes anti-virais é usado no regime. O agente anti-viral pode ser selecionado de qualquer agente anti-viral adequado conhecido aqueles habilitados na técnica. Em uma forma de realização, o agente anti-viral é aciclovir ou ganciclovir. O agente anti-viral pode ser administrado por pelo menos uma ou duas semanas. O agente anti-viral também pode ser administrado por mais períodos, por exemplo, 1 mês, 2 meses, 3 meses, 4 meses, ou 5 meses.

5.24. DIAGNOSE DO PACIENTE E O REGIME TERAPÊUTICO: DOENÇA AUTOIMUNE

[00501] De acordo com certos aspectos da invenção, o regime de tratamento e a dose usada com as composições e métodos da invenção é escolhida com base em diversos fatores incluindo, mas não limitando a, o estágio da doença ou distúrbio autoimune sendo tratado. O regime de tratamento apropriado pode ser determinado por uma pessoa habilitada na técnica para os estágios particulares de uma doença ou distúrbio autoimune em um paciente ou população de paciente. As curvas de resposta da dosagem pode ser gerada usando protocolos padrões na técnica a fim de determinar a quantidade efetiva das composições da invenção para o tratamento dos pacientes tendo estágios diferentes da doença ou distúrbio autoimune. No geral, os paciente tendo mais atividade da doença ou distúrbio autoimune requerirão doses mais altas e/ou mais doses frequentes que podem ser administradas em períodos mais longos de tempo em comparação aos pacientes tendo perda da atividade de uma doença ou distúrbio autoimune.

[00502] Os anticorpos anti-CD19, composições e métodos descritos neste podem ser praticados por tratar uma doença ou distúrbio autoimune. O termo “doença ou distúrbio autoimune” refere-se a uma condição no paciente caracterizado por dano celular, tecido e/ou órgão causado por uma reação imunológica do paciente por estas células possuídas, tecidos e/ou órgãos. O termo “doença inflamatória” é usada permutavelmente com o termo “doença inflamatória” por referir por uma condição no paciente caracterizado pela inflamação, incluindo, mas não limitando uma inflamação crônica. Os distúrbios autoimunes podem ou não podem ser associados com inflamação. Além disso, a inflamação pode ou não pode ser causada por um distúrbio autoimune. Deste modo, certos distúrbios podem ser caracterizados tanto distúrbio autoimune quanto inflamatório. As doenças e distúrbios autoimunes exemplares incluem, mas não são limitados a: alopecia areata, enpondilite endurecida, síndrome de antifosfolipídio, doença autoimune de Addison, doença autoimune de glândula adrenal, anemia hemolítica autoimune, hepatite autoimune, ooforite e orquite autoimune, trombocitopenia autoimune, doença de Behcet, penfigóide bolhosa, cardiomiopatia, dermatite de psilose celíaco, síndrome de disfunção imune de fadiga crônica (CFIDS), polineuropatia desmielinação inflamatório crônico, síndrome de Churg-Strauss, penfigóide de cicatriz, síndrome de CREST, doença de aglutinina do resfriado, doença de Crohn, lupus discóide, crioglobulinemia misturada essencial, diabetes, fascite eosinofílica, fibromialgia-fibromiosite, glomerulonefrite, doença de Graves, Guillain-Barre, tireóide de Hashimoto, púrpura de Henoch-Schonlein, fibrose pulmonar iodiopática, púrpura autoimune idiopática/trombocitopenia (ITP), neuropatia de IgA, artrite juvenil, lichen planus, lupus eritematoso, doença de Ménière, doença do tecido conectivo misturado, esclerose múltipla, mellitus de diabetes mediadas por tipo 1 ou imunes, miastenia grave, distúrbios relacionados ao pênfigo (por exemplo, pênfigo vulgar), anemia perniciosa, poliartrite nodosa, policondrite, síndrome poliglandular, polimialgia reumática, polimiosite e dermatomiosite, agamaglobulinemia primária, cirrose biliar primária, psoríase, artrite psoriática, fenômeno de Raynauld, síndrome de Reiter, artrite reumatóide, sarcoidose, esclerodermia, síndrome de Sjogren, síndrome de stiff-man, lupus eritematoso sistêmico (SLE), síndrome de Sweet, doença de Still, eritematose de lupus, artrite de takayasu, artrite temporal/artrite celular gigante, colite ulcerativa, uveíte, vascularidades tal como vasculite herpetiforme dermatite, vitiligo, e granulomatose de Wegener. Exemplos de distúrbios inflamatórios incluem, mas não são limitados a, asma, encefalite, doença inflamatória do intestino, doença pulmonar obstrutiva crônica (COPD), distúrbios alérgicos, choque séptico, fibrose pulmonar, espondiloartropatia não diferenciada, artropatia não diferenciada, artrite, osteolise inflamatória, enxerto versos doença hospedeira, urticária, síndrome de Vogt-Koyanagi-Hareda e inflamação crônica resultando de infecções bacterianas e virais crônicas.

[00503] A imunoterapia anti-CD19 abrange a administração de um anticorpo anti-CD19 como um agente terapêutico simples para o tratamento de uma doença ou distúrbio autoimune. Em uma forma de realização, uma imunoterapia anti-CD19 da invenção abrange a administração de um anticorpo anti-CD19 capaz de inibição da proliferação da célula B estimulada in vitro. Em uma outra forma de realização, uma imunoterapia anti-CD19 da invenção abrange a administração de um anticorpo anti-CD19 da variante Fc em que a dita variante Fc tem uma afinidade de ligação alterada por um ou mais ligando Fc relativa à molécula de variante não comparável. Em uma forma específica de realização, uma imunoterapia anti-CD19 da invenção abrange a administração de um anticorpo anti-CD19 da variante Fc em que a dita variante Fc tem intensificado a ligação pelo IIB receptor de gama Fc relativo ao domínio Fc de variante não comparável.

[00504] A imunoterapia anti-CD19 ainda abrange a administração de um anticorpo biespecífico anti-CD19 como um agente terapêutico simples para o tratamento de uma doença ou distúrbio autoimune. Em uma forma de realização, uma imunoterapia anti-CD19 da invenção abrange a administração de um anticorpo biespecífico anti-CD19 capaz especificamente de ligar-se a um antígeno primeiro e segundo, em que o dito primeiro antígeno é CD19 humano e o dito segundo antígeno é um receptor de gama Fc selecionado do grupo que consiste de FCYRI, FCYRIIA, FCYRIIB, FCYRIIIA e/ou FCYRIV. Em uma forma de realização adicional, uma imunoterapia anti-CD19 da invenção abrange a administração de um anticorpo biespecífico anti- CD19 capaz especificamente da ligação pelo CD19 humano e FcyRIIB.

[00505] O CD19 é expressado em células B maduras, portanto um mAb anti-CD19 que pode ser particularmente adequado para o esgotamento da pré-célula B e uma células B maduras, por exemplo, na medula óssea. 1.24.1. DIAGNOSE DAS DOENÇAS OU DISTÚRBIOS AUTOIMUNES

5.24.1 DIAGNOSE DAS DOENÇAS OU DISTÚRBIOS AUTOIMUNES

[00506] A diagnose de uma doença ou distúrbio autoimune é complicado em que cada tipo da doença ou distúrbio autoimune manifesta diferentemente entre os pacientes. Esta heterogeneidade dos sintomas significa que fatores múltiplos são tipicamente usados para atingir em uma diagnose clínica. No geral, os clínicos usam os fatores, tal como, mas não limitando a, a presença de autoanticorpos, níveis de citocina elevada, disfunção do órgão específico, erupções da pele, inchaço da junta, dor, remodelagem óssea, e/ou perda do movimento como indicadores primariamente de uma doença ou distúrbio autoimune. Por certas doenças e distúrbios autoimunes, tal como RA e SLE, os padrões para uma diagnose são conhecidos na técnica. Por certas doenças e distúrbios autoimunes, os estágios da doença foram caracterizados e são bem conhecidos na técnica. Estes métodos de técnicas reconhecidas para o diagnóstico da doença e distúrbio autoimune bem como os estágios da doença e as escalas da atividade e/ou gravidade da doença que são bem conhecidas na técnica e podem ser usados para identificar os pacientes e populações de pacientes em necessidade de tratamento para uma doença ou distúrbio autoimune usando as composições e métodos da invenção.

5.24.2. CRITÉRIO CLÍNICO PARA O DIAGNÓSTICO DAS DOENÇAS OU DISTÚRBIOS AUTOIMUNES

[00507] O critério do diagnóstico para doenças e distúrbios autoimunes diferentes são conhecidos na técnica. Historicamente, a diagnose é tipicamente baseada em uma combinação de sintomas físicos. Mais recentemente, as técnicas moleculares tal como perfil de expressão do gene foi aplicado por desenvolver definições moleculares das doenças e distúrbios autoimunes. Os métodos exemplares para a diagnose clínica das doenças e distúrbios autoimunes particulares são fornecidos abaixo. Outros métodos adequados será aparente àquele habilitado na técnica.

[00508] Em certas formas de realização, os pacientes com baixos níveis da atividade da doença autoimune ou pacientes com um estágio precoce de uma doença autoimune (por doenças onde os estágios são reconhecidos) pode ser identificado para o tratamento usando composições e métodos do anticorpo anti-CD19. A diagnose precocemente da doença autoimune é difícil devido aos sintomas gerais e sobrepondo os sintomas entre as doenças. Em tal forma de realização, um paciente tratado em um estágio precoce ou com baixos níveis de uma atividade da doença autoimune tem sintomas que compreendem pelo menos um sintoma de uma doença ou distúrbio autoimune. Em uma forma de realização relatada, um paciente tratado em um estágio precoce ou com baixos níveis de uma doença autoimune tem sintomas que compreendem pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, ou 15 sintomas de uma doença ou distúrbio autoimune. Os sintomas podem ser de qualquer doença e distúrbio autoimune ou uma combinação deste. Exemplos dos sintomas das doenças e distúrbios autoimunes são descritos abaixo.

5.24.3. ARTRITE REUMATÓIDE

[00509] A artrite reumatóide é uma doença crônica, principalmente caracterizado pela inflamação do revestimento, ou synovium, das juntas. Este pode levar ao dano da junta de termo longo, resultando em dor crônica, perda da função e incapacidade. A identificação dos pacientes ou população de pacientes em necessidade de tratamento para artrite reumatóide é um processo. Não existe um teste definitivo que fornece uma diagnose positiva ou negativa de artrite reumatóide. Os clínicos confiam em um número de instrumentos incluindo, histórias médicas, exames físicos, testes de laboratório, e raio X.

[00510] Os sintomas físicos variam amplamente entre os pacientes e comumente incluem, mas não são limitados a, inchaço da junta, sensibilidade da junta, perda do movimento nas juntas, mal alinhamento das juntas, remodelagem óssea, fadiga, inflexibilidade (particularmente na manhã e quando ao lugar por longos períodos de tempo), debilidade, sintomas semelhantes à influenza (incluindo uma febre de grau baixo), dor associada com o local prolongado, a ocorrência da dilatação da atividade da doença seguido pela remissão ou inatividade da doença, nódulos reumatóides ou inchaços do tecido sob a pele (tipicamente observados nos cotovelos, estes podem indicar mais diversas atividades da doença), dor muscular, perda de apetite, depressão, perda de peso, anemia, mãos e pés frios e/ou suados, e o envolvimento das glândulas ao redor dos olhos e boca, causando produção diminuída de lágrimas e salivas (síndrome de Sjogren). Para a síndrome de Sjogren especificamente, as referências seguintes podem ser usadas, Fox et al. Arthritis Rheum. (1986) 29:577-586, e Vitali et al. Ann. Rheum. Dis. (2002). 61:554-558.

[00511] Uma forma a parte os sintomas físicos, os clínicos comumente usam testes, tal como, mas não limitando a, contagem sanguínea completa, taxa de sedimentação eritócita (ESR ou taxa de sedimentação), proteína reativa C, fator reumatóide, anticorpos anti- DNA, anticorpos antinuclear (ANA), anticorpos anti-cardiolipina, estudos da imagem, como radiografias (raio X), imagem de resonância magnética (MRI) de juntas ou órgãos, ultra-som da junta, varreduras ósseas, e densitometria óssea (DEXA). Estes testes são exemplos de testes que podem ser usados na conjunção com as composições e métodos da invenção para checar as anomalias que podem existir (isto é, identificar os pacientes ou população de pacientes em necessidade de tratamento) ou para monitorar os efeitos colaterais de medicamentos e o progresso checado.

[00512] Os sintomas precocemente da artrite reumatóide comumente são observados nas pequenas juntas dos dedos, mãos e pulsos. O envolvimento da junta é usualmente simétrica, significando que se uma dor na junta na mão direita, as mesmas juntas afligirão a mão direita. No geral, mais desgastes da junta indicam mais diversas atividades da doença.

[00513] Os sintomas de mais atividades das doenças avançadas incluem danos a cartilagem, tendões, ligamentos e osso, que causam a deformidade e instabilidade nas juntas. os danos pode levar a faixa limitada de movimento, resultando em tarefas diárias (grasping a fork, combing hair, buttoning a shirt) tornando-se mais difícil. As úlceras de pele, as maiores suscetibilidade para a infecção, e um declínio geral na saúde também são indicadores de mais atividades das doenças avançadas.

[00514] A progressão de artrite reumatóide é comumente dividida em três estágios. O primeiro estágio é o inchaço do revestimento sinovial, causando dor, quentura, inflexibilidade, vermelhidão e inchaço em volta da junta. segundo é a divisão rápida e desenvolvimento das células, ou pannus, que causam o synovium para engrossar. No terceiro estágio, as enzimas liberam as células inflamadas que pode dissolver o osso e cartilagem, frequentemente causando a junta envolvida pela perda desta forma e alinhamento, mais dor, e perda do movimento.

[00515] As técnicas moleculares também podem ser usadas para identificar os pacientes ou população de pacientes em necessidade de tratamento. Por exemplo, a artrite reumatóide foi mostrado ser associado com polimorfismo alélico dos genes do antígeno de leucócito humano (HLA)-DR4 e HLA-DRB1 (Ollier and Winchester, 1999, Genes and Genetics of Autoimmunity. Basel, Switzerland; Stastny, 1978, N. Engl J Med 298:869-871 e Gregersen et al., 1987, Arthritis Rheum 30:1205-1213). Os pacientes de artrite reumatóide frequentemente que expressam duas doenças associadas por alelos HLA-DRB1*04 (Weyand et al., 1992 Ann Intern Med 117:801-806). Os pacientes podem ser testados para polimorfismos alélicos usando métodos padrão na técnica. Os genes MHC não são apenas os genes que codificam a linha germinativa que influenciam a suscetibilidadepor RA que podem ser usados para a diagnose ou identificar os pacientes ou população de pacientes em necessidade de tratamento. O sexo feminino precocemente aumenta o risco, e pacientes fêmeas desenvolvem um fenotipo diferente da doença do que dos pacientes machos. Quaisquer indicadores moleculares de artrite reumatóide podem ser usados para identificar os pacientes ou população de pacientes em necessidade de tratamento com uma composição ou método do anticorpo anti-CD19.

[00516] Os métodos para a determinação da atividade de artrite reumatóide em um paciente em relação à escala da atividade são bem conhecidas na técnica e podem ser usados em conexão com as composições farmacêuticas e métodos da invenção. Por exemplo, a American College of Rheumatologists Score (contagem ACR) pode ser usado para determinar a atividade de artrite reumatóide de um paciente ou uma população do paciente. De acordo com este método, os pacientes estão dando uma contagem que dizem respeito ao melhoramento. Por exemplo, os pacientes com uma melhoria de 20 % nos fatores definidos pelo ACR seria dado uma contagem ACR20.

[00517] Inicialmente, um paciente que exibe os sintomas de artrite reumatóide pode ser tratado com um analgésico. Em outra forma de realização, um paciente diagnosticado com ou exibição dos sintomas de artrite reumatóide é inicialmente tratado com compostos anti- inflamtórios não esteroidais (NSAID). Os progressos da doença e/ou os sintomas que aumentam a gravidade, artrite reumatóide pode ser tratado pela administração de esteróides tal como mas não limitando a dexametasona e prednisona. Em mais diversos casos, um agente quimioterapêutico, tal como mas não limitando a metotrexato ou citoxina podem ser administrados para aliviar os sintomas da artrite reumatóide.

[00518] Em certos exemplos, a artrite reumatóide pode ser tratada pela administração de ouro, enquanto em outro exemplo um biológico, tal como um anticorpo ou um receptor (ou análogo do receptor) pode ser administrado. Exemplos de tais anticorpos terapêuticos são Rituxina e Remicade. Um exemplo ilustrativo de um receptor solúvel que pode ser administrado para tratar a artrite reumatóide é Enbrel.

[00519] Extremamente em diversos casos de artrite reumatóide, cirurgia que pode ser indicado. Os métodos cirúrgicos podem incluir, mas não são limitados a: sinovectomia reduzindo a quantidade do tecido inflamatório pela remoção de uma doença synovium ou revestindo às juntas; cirurgia artroscópico retirados da amostra de tecido, removem a cartilagem liberta, lágrimas retiradas, alisamento de uma superfície áspera ou remove o tecido sinovial da doença; osteotomia, significando “corte do osso,” este procedimento é usado para aumentar a estabilidade pela redistribuição do peso na junta; cirurgia de substituição na junta ou artroplastia para a reconstrução cirúrgica ou substituição da junta; ou arthrodesis ou fusão para fundir dois ossos juntos.

[00520] Em certas formas de realização dos métodos da invenção, um paciente pode ser tratado com um anticorpo anti-CD19 antes, concorrente, ou subsequente a qualquer das terapias divulgadas acima. Além disso, os anticorpos anti-CD19 da presente invenção podem ser administradas em combinação com qualquer dos analgésicos, NSAID, esteróide, ou agentes quimioterapêuticos notados acima, bem como em combinação com uma administração biológica para o tratamento da artrite reumatóide.

5.24.4. LUPUS ERITEMATOSO SISTÊMICO (SLE)

[00521] A lupus eritematoso sistêmico (SLE) é uma doença reumática crônica (permanente longo) que afetam as juntas, músculos e outras partes do corpo. Os pacientes ou população de pacientes em necessidade de tratamento por SLE pode ser identificado pelo exame dos sintomas físicos e/ou resultados do teste de laboratório. Os sintomas físicos variam amplamente entre os pacientes. Por exemplo, em SLE, tipicamente 4 dos seguintes 11 sintomas existem antes de um paciente que é diagnosticado com SLE: 1) erupção malar: erupção de pele nas faces; 2) erupções discóides: sinais vermelhos em vermelho; 3) fotosensibilidade: reação a luz solar, resultando no desenvolvimento ou aumento na erupção da pele; 4) úlceras orais: as úlceras no nariz ou boca, usualmente indolor; 5) artrite: artrite não erosiva que envolve duas ou mais juntas periféricas (artrite em volta dos ossos das juntas que não tornar-se destruídas); 6) serosite pleurite ou pericardite: (inflamação do revestimento do pulmão ou coração); 7) distúrbio renal: proteína excessiva na urina (maiores do que 0,5 gm/dia ou 3+ em bastões de teste) e/ou casts celular (elementos anormais da urina, derivadas de células brancas e/ou vermelhas e/ou células do túbulo renal); 8) distúrbio neurológico: doença repentina (convulsões) e/ou psicose na ausência de medicamentos ou distúrbios metabólicos que são conhecidos por causar tais efeitos; 9) distúrbio hematológico: anemia hemolítica ou leucopenia (contagem sanguínea branca abaixo de 4.000 células por milímetro cúbico) ou linfopenia (menos do que 1.500 linfócitos por milímetro cúbico) ou trombocitopenia (menos do que 100.000 plaquetas por milímetro cúbico) (A leucopenia e linfopenia pode ser detectado em dois ou mais ocasiões. A trombocitopenia pode ser detectada na ausência de medicamentos conhecidos por induzir este); 10) anticorpo antinuclear: teste positivo para anticorpos antinucleares (ana) na ausência de medicamentos conhecidos por induzir este; e/ou 11) distúrbio imunológico: teste anti-DNA anti- filamento duplo positivo, teste anti-sm positivo, anticorpo antifosfolipídeo positivo tal como anticardiolipina, ou teste sífilis positivo falso (vdrl).

[00522] Outros sintomas físicos que podem ser indicativos de SLE incluem, mas não são limitados a, anemia, fadiga, febre, erupção da pele, dores musculares, náusea, vômito e diarréia, glândulas inchadas, perda de apetite, sensibilidade ao frio (fenômeno de Raynaud) e perda de peso.

[00523] Os testes de laboratório também podem ser usados para identificar os pacientes ou população de pacientes em necessidade de tratamento. Por exemplo, um teste sanguíneo pode ser usado para detectar um autoanticorpos observados no sangue de quase todos as pessoas com SLE. Tais testes podem incluir mas não são limitados a testes para anticorpos antinucleares (ANA) na ausência de medicamentos conhecidos por induzir este (Rahman, A. and Hiepe, F. Lupus. (2002). 11(12):770-773), anti-DNA anti-filamento duplo (Keren, D.F. Clin. Lab. Med. (2002) 22(2):447-474.), anti-Sm, anticorpo antifosfolipídeo tal como anticardiolipina (Gezer, S. Dis. Mon. 2003. 49(12):696-741), ou teste sífilis positivo falso (VDRL).

[00524] Outros testes podem incluir um teste complementar (C3, C4, CH50, CH100) podem ser usados para medir a quantidade de proteínas complementares na circulação do sangue (Manzi et al. Lupus 2004. 13(5):298-303), uma taxa de sedimentação (ESR) ou proteína reativa C (CRP) podem ser usados para medir os níveis de inflamação, a análise da urina podem ser usados para detectar os problemas renais, raio X de tórax podem ser tirado para detectar danos no pulmão, e um EKG pode ser usado para detectar problemas cardíacos.

[00525] O SLE crônico é associado com a acumulação do dano colateral pelo órgão envolvido, particularmente o rim. Consequentemente, a intervenção terapêutica precoce é desejável, isto é antes de, por exemplo, deficiência renal. Os tratamentos disponíveis por SLE são similares àqueles disponíveis para a artrite reumatóide. Estes incluem tratamentos iniciais, com um analgésico ou um composto anti-inflamatório não esteroidal (NSAID). O progresso da doença e/ou os sintomas aumentam na gravidade, SLE pode ser tratado pela administração de esteróides tal como mas não limitando a dexametasona e prednisona.

[00526] Em mais diversos casos, um agente quimioterapêutico, tal como mas não limitando a metotrexato ou citoxina podem ser administrados para aliviar os sintomas de SLE. Entretanto, este método não é preferido onde o paciente é uma fêmea de idade infantil. Em tais exemplos, aqueles métodos terapêuticos que não interferem com a capacidade reprodutiva do paciente são preferidos.

[00527] Em certos exemplos, o SLE pode ser tratado pela administração de um biológico, tal como um anticorpo ou um receptor (ou análogo receptor). Exemplos de tais anticorpos terapêuticos são Rituxina e Remicade. Um exemplo ilustrativo de um receptor solúvel para uma citocina inflamatória que pode ser administrada para tratar SLE é Enbrel.

[00528] Em certas formas de realização dos métodos da invenção, um paciente pode ser tratado com um anticorpo anti-CD19 antes, concorrente, ou subsequente a qualquer das terapias divulgadas acima que são usadas para o tratamento de SLE. Além disso, os anticorpos anti-CD19 da presente invenção podem ser administrados em combinação com qualquer dos analgésicos, NSAID, esteróide, ou agentes quimioterapêuticos notados acima, bem como em combinação com uma administração biológica para o tratamento da SLE.

5.24.5.IDIOPÁTICA/PÚRPURA AUTOIMUNE DE TROMBOCITOPENIA (ITP)

[00529] A idiopática/púrpura autoimune de trombocitopenia (ITP) é um distúrbio do sangue caracterizado pela autoanticorpos de imunoglobulina G (IgG) que interagem com as células das plaquetas e resultam na destruição daquelas células das plaquetas. Tipicamente, os anticorpos são específicos por glicoproteínas da membrana da plaqueta. O distúrbio pode ser agudo (temporário, durável, menos do que 2 meses) ou crônico (persistindo por mais do que 6 meses). Os pacientes ou população de pacientes em necessidade de tratamento por ITP podem ser identificados pelo exame uma histórico médico do paciente, os sintomas físicos, e/ou resultados dos testes de laboratório. (Provan, D., e Newle, A., Br. J. Haematol. (2002) 118(4):933-944; George, J.N. Curr. Hematol. (2003) 2(5):381-387; Karptkin, S. Autoimmunity. (2004) 37(4):363-368; Cines, D.B., e Blanchette, V. S., N. Engl. J. Med. (2002) 346(13)995-1008).

[00530] Os sintomas físicos incluem áreas com aparência apurpurado da pele e membranas mucosais (tal como o revestimento da boca) onde a hemorragia tem ocorrido como um resultado de uma diminuição de diversas células das plaquetas. O principal sintoma é a hemorragia, que pode incluir bruising (“equimose”) e pontos vermelhos muito pequenos na pele ou nas membranas mucosais (“petéquia”). Em alguns exemplos a hemorragia a partir do nariz, gengiva, tratos urinários ou digestivos também podem ocorrer. Raramente, a hemorragia ocorre dentro do cérebro. Os sinais comuns, sintomas, e fatores de precipitação também incluem, mas não são limitados a, choque repentino (ITP na infância), choque gradual (ITP no adulto), petéquia não palpável, púrpura, menorragia, epistaxe, hemorragia gengival, bullae hemorrágica em membranas mucosais, sinais de hemorragia GI, menometrorragia, evidência da hemorragia intracraniana, baço não palpável, hemorragias das retina, imunização do vírus vivo recente (ITP na infância), doença viral recente (ITP na infância), hemorragia espontânea quando a contagem das plaquetas é menos do que 20.000/mm3, e tendência a bruising.

[00531] O teste de laboratório que pode ser usado para diagnose de ITP incluem, mas não são limitados a, uma contagem sanguínea de teste completo, ou um exame na medula óssea para verificar que aqui estão as células que formam as plaquetas adequadas (megacariócito) na medula e para determinar outras doenças tais como câncer metastático e leucemia. A trombocitopenia isolada é a chave da descoberta que diz respeito a avaliação do laboratório. As plaquetas gigantes em manchas periféricas são indicativos de trombocitopenia congênita. Uma varredura CT da cabeça pode ser autorizada se existir interesse com respeito à hemorragia intracraniana.

[00532] Os tratamentos correntes para o ITP incluem, transfusões e esplenectomia de plaqueta. Outros tratamentos incluem, a administração de glucocorticóides, administração de agentes imunosupressivos, administração de agentes que intensificam a produção de plaquetas, tal como IL-11, e os agentes que ativam os megacariócitos para produzir plaquetas, tal como trombopoietina (TPO).

[00533] Em mais diversos casos, um agente quimioterapêutico, tal como mas não limitando a vincristina e vinblastina podem ser administradas para aliviar os sintomas de ITP. Entretanto, este método não é preferido onde o paciente é uma fêmea de idade infantil. Em tais exemplos, aqueles métodos terapêuticos que não interferem com a capacidade reprodutiva do paciente são preferidos.

[00534] Em certos exemplos, o ITP pode ser tratado pela administração de um biológico, tal como um anticorpo ou um receptor (ou análogo receptor). Exemplos de tal anticorpos terapêuticos são anticorpos anti-CD20, tal como, Rituximab.

[00535] Em certas formas de realização dos métodos da invenção, um paciente pode ser tratado com um anticorpo anti-CD19 antes, concorrente, ou subsequente por qualquer das terapias divulgadas acima que são usadas para o tratamento de ITP. Além disso, os anticorpos anti-CD19 da presente invenção podem ser administradas em combinação com qualquer dos agentes notados acima, bem como em combinação com uma administração biológica para o tratamento da ITP.

5.24.6. PÊNFIGO E DISTÚRBIOS RELATADOS POR PENFIGÓIDE

[00536] Tanto o pênfigo quanto os distúrbios relatados por penfigóides são um grupo heterogêneo da doença autoimune caracterizada pela condição bolhosa da pele e/ou superfícies mucosais. Em ambas doenças, a bolha é causada pelos anticorpos autoimunes que reconhecem várias proteínas expressadas na superfície das células epiteliais na derme e/ou epiderme.

[00537] Em pacientes com a doença relatada por pênfigo, a bolha ocorre dentro da epiderme e é devido à ligação dos autoanticorpos específicos por desmogleina 1 (Dsg1) e/ou desmogleina 3 (Dsg3). Os subtipos clássicos de pênfigo podem ser distinguidos de acordo com as especificidades de anticorpo anti-desmogleina. Os pacientes com foliáceo pênfigo (PF) produzem apenas anticorpos anti-Dsg1. Os pacientes com pênfigo vulgar (PV) e pênfigo paraneoplástico (PNP) produzem os anticorpos anti-Dsg3 se suas lesões são restritas pelos tecidos mucosais. Em contraste, o PV e PNP dos pacientes com lesões na pele e mucosa produzem tanto autoanticorpos anti-Dsg1 quanto Dsg3. (Nagasaka, T., et al. J. Clin.Invest. 2004. 114:1484-1492; Seishema, M., et al. Arch Dermatol. 2004. 140(12):1500-1503; Amagai, M., J. Dermatol. Sci. 1999. 20(2):92-102)

[00538] Em pacientes com a doença relatada por penfigóide incluindo mas não limitando a, penfigóide bolhosa, penfigóide de urticária bolhosa, penfigóide de cicatriz, epidermolise bulhosa acquisita, e dermatose bolhosa IgA linear, a bolha ocorre na interface da derme com a epiderme. A forma mais comum da doença penfogóide é a penfigóide bolhosa (BP) que é caracterizada pela presença de autoanticorpos que ligam-se ao antígeno de penfigóide bolhoso 180 (BP180), antígeno de penfigóide bolhoso 230 (BP230), laminina 5, e/ou integrina 4 beta. (Fontao, L., et al. Mol. Biol. Cell. 2003) 14(5):1978-1992; Challacombe, S. J., et al Acta Odontol. Scand. (2001). 59(4):226-234.)

[00539] Os pacientes ou a população de pacientes em necessidade de tratamento para os distúrbios de pênfigo ou relatados por penfigóide podem ser identificados pelo exame de uma histórico médico do paciente, os sintomas físicos, e/ou resultados do teste de laboratório (revisado em: Mutasim, D.F. Drugs Aging. (2003).20(9):663-681; Yeh, S.W. et al. Dermatol. Ther. (2003). 16(3):214-223; Rosenkrantz, W.S. Vet. Dermatol. 15(2):90-98.).

[00540] Tipicamente, a diagnose destes distúrbios relatados por pênfigo ou penfigóide é feito pela biopsia da pele. A amostra da biopsia da pele é examinada microscopicamente para determinar o local anatômico da bolha (por exemplo epiderme ou entre a derme e epiderme). Estas descobertas são correlacionadas com as análises imunohistoquímica direta ou indireta para detectar a presença de autoanticorpos no local da lesão. As amostras do soro a partir dos pacientes também podem ser examinados por uma presença da circulação de autoanticorpos usando um teste com base em ELISA por proteínas específicas. Diversos ensaios com base em ELISA foram descritos para uma detecção de anticorpos de desmogleina em amostras humanas (Hashimoto, T. Arch. Dermatol. Res. (2003) 295 Suppl.1:S2-11). A presença destes autoanticorpos de desmogleina nas amostras da biopsia é o diagnóstico do pênfigo.

[00541] Clinicamente, o pênfigo vulgar pode ser diagnosticado pela a presença de bolhas na boca. A inflamação ou erosão também pode estar presente no revestimento dos olhos e pálpebras, e as membranas do nariz ou trato genital. Metade dos pacientes também desenvolvem bolhas ou erosões na pele, frequentemente na virilha, axilas, face, couro cabeludo e áreas do peito. O foliáceo pênfigo é uma forma branda relativamente superficial de pênfigo. Este usualmente manifesta na face e couro cabeludo, mas também envolve as costas e peito. As lesões não ocorrem na boca. As bolhas são mais confinadas às superfície externa e com frequente coceira. O pênfigo paraneoplástico é mais raro e no geral ocorre em pessoas que tem câncer. As lesões são dolorosas e afetam a boca, lábios e esôfago (tubo de absorção) bem como a pele. Devido ao envolvimento das vias aéreas, sinais de doença respiratória pode ocorrer e pode estar ameaçando a vida.

[00542] Os tratamentos correntes por pênfigo ou doença relatada por penfigóide incluem a administração tópica de cremes e unguentos para aliviar o desconforto associado com a condição da pele, a administração de agentes anti-inflamatórios ou a administração dos agentes imunosupressivos.

[00543] Em certas formas de realização dos métodos da invenção, um paciente pode ser tratado com um anticorpo anti-CD19 antes, concorrente, ou subsequente por qualquer das terapias divulgadas acima que são usados para o tratamento de penfigóide ou doença relatada por penfigóide. Além disso, os anticorpos anti-CD19 da presente invenção podem ser administrados em combinação com qualquer dos agentes notados acima.

5.24.7. DIABETE AUTOIMUNE

[00544] De acordo com certos aspectos da invenção, um paciente em necessidade de tratamento para diabete autoimune, também conhecidas como diabetes tipo 1A, podem ser tratadas com composições e métodos do anticorpo anti-CD19. A diabete tipo 1A é uma doença autoimune causada pelos efeitos sinérgicos dos fatores genéticos, ambientais, e imunológicos que ultimamente destroem as células beta pancreáticas. As consequências da destruição da célula beta pancreática são uma diminuição na massa da célula beta, uma produção/secreção de insulina reduzida e uma subida gradual nos níveis de glicose sanguínea.

[00545] Os pacientes ou população de pacientes em necessidade de tratamento por diabete tipo 1A podem ser identificados pelo exame de um histórico médico do paciente, os sintomas físicos, e/ou resultados dos testes de laboratório. Os sintomas mais frequentes surgem repentinamente e incluem, mas não são limitados a, níveis de insulina sanguínea baixa ou não existentes, sede aumentada, urinação aumentada, fome constante, perda de peso, visão obscura, e/ou fadiga. As diabetes evidentes não usualmente tornam-se evidentes até uma maioria de células beta serem destruídas (> 80 %). Tipicamente, a diabete é clinicamente diagnosticada se um paciente tem uma concentração de glicose sanguínea aleatória (sem relação ao tempo desde a última refeição) > 11,1 mmol/L (200 mg/dL) e/ou uma glicose de plasma de jejum (nenhuma entrada calórica por pelo menos 8 horas) > 7,0 mmol/L (126 mg/dI) e/ou uma glicose de plasma de 2 horas > 11,1 mmol/L (200mg/dL). Idealmente, estes testes devem ser repetidos em dias diferentes com resultados comparáveis antes da diagnose ser confirmada. (Harrison’s Principles of Internal Medicine, 16° ed./editors, Dennis L. Kasper, et al. The McGraw-Hill Companies, Inc. 2005 New York, New York).

[00546] Embora a etiologia precisa do diabete tipo 1A seja conhecida, aqui existem ligação genética clara por serotipos HLA específicos. Em particular, as diabetes autoimunes são associadas com serotipos HLA DR3 e DR4. A presença tanto de DR3 quanto de DR4 confere-se aos maiores riscos genéticos conhecidos. A susceptibilidade às diabetes autoimunes também é ligada à classe II HLA (HLA-DQB1*0302. Em contraste, os haplotipos HLA com DRB1- 1501 e DQA1-0102-DQB1-0602 são associados com proteção a partir do diabete tipo 1A (Redondo, M. J., et al. J. Clin. Endocrinol. Metabolism (2000) 10:3793-3797.)

[00547] A destruição da produção de insulina das células em ilhas beta podem ser acompanhadas pelos autoanticorpos das células em ilhas, linfócitos ativados infiltrados no pâncreas e drenagem dos linfonodos, linfócitos T susceptíveis às proteínas de células em ilhas, e liberação de citocinas inflamatórias dentro das ilhas (Harrison’s Principles of Internal Medicine, 16° ed./editors, Dennis L. Kasper, et al. The McGraw-Hill Companies, Inc. 2005 New York, New York).

[00548] Os autoanticorpos associados com a diabete tipo 1A incluem mas não são limitados a anticorpos que ligam-se a insulina, descarboxilase de ácido glutâmico (GAD), ICA-512/IA-2, fogrina, gangliosídeo em ilhas e carboxipeptidase H (Gianani, R. and Eisenbarth, G.S. Immunol. Rev. (2005) 204:232-249; Kelemen, K. et al, J. Immunol. (2004) 172(6):3955-3962); Falorni, A. and Borozzetti, A. Best Pract. Res. Clin. Endocrinol. Metab. 2005. 19(1):119-133.)

[00549] Os tratamentos correntes para diabetes autoimunes incluem a administração de vitamina D, corticoesteróides, agentes que controlam a pressão sanguínea e agentes que controlam a glicemia (níveis de açúcar no sangue).

[00550] Em certas formas de realização dos métodos da invenção, um paciente pode ser tratado com um anticorpo anti-CD19 antes, concorrente, ou subsequente por qualquer das terapias divulgadas acima que são usadas para o tratamento de diabetes autoimunes. Além disso, os anticorpos anti-CD19 da presente invenção podem ser administrados em combinação com qualquer dos agentes notados acima.

5.24.8. ESCLEROSE SISTÊMICA (ESCLERODERMIA) E DISTÚRBIOS RELATADOS

[00551] A esclerose sistêmica também é conhecida como esclerodermia abrangendo um grupo heterogêneo de doenças incluindo mas não limitando a, doença cutânea limitada, doença cutânea difusa, esclerodermia por tempo indeterminado, doença do tecido conectivo não diferenciado, síndromes sobrepostas, esclerodermia localizada, Mórfea, esclerodermia linear, En coup de saber, escleredema de adulto de Buschke, escleromixedema, enxerto crônico versos doença hospedeira, fasciitis eosinofílicas, esclerose digital em diabetes, e aniloidose anylooidosisand primária associada com mieloma múltiplo. (Revisado em: Harrison’s Principles of Internal Medicine, 16° ed./editors, Dennis L. Kasper, et al. The McGraw-Hill Companies, Inc. 2005 New York, New York).

[00552] As características clínicas associadas com esclerodermia podem incluir fenômeno de Raynaud, espessamento da pele, calcinose subcutânea, telangiectasia, artralgia/artrite, miopatia, desmotilidade esofágica, fibrose pulmonar, hipertensão arterial pulmonar isolada, deficiência do coração congestivo e crise renal. A extensão a que um paciente apresenta um ou mais destas manifestações das doenças podem influenciar na diagnose e plano do tratamento potencial.

[00553] Os autoanticorpos incluem: anti-topioisomerase 1, anticentromera, polimerase anti-RNA I, II, e/ou III, anti-Th RNP, anti-U, RNP (anti-fibrilarina), anti-PM/Sci, anti-anticorpos nucleares (ANA).

[00554] A identificação dos pacientes e populações de pacientes em necessidade de tratamento de esclerodermia pode ser baseado no histórico clínico e descobertas físicas. Os pacientes ou população de pacientes em necessidade de tratamento para a esclerodermia podem ser identificados pelo exame um histórico médico do paciente, os sintomas físicos, e/ou resultados do teste de laboratório. A diagnose pode ser atrasada em pacientes sem espessamento significante da pele. Testes de função do laboratório, raio X, pulmonar, e biopsias de pele ou renal (rim) podem ser usados para determinar a extensão e a gravidade do órgão interno envolvido.

[00555] Nos meses precoces ou anos do choque da doença, a esclerodermia pode ser parecida com muitas outras doenças do tecido conectivo, tal como, mas não limitando a, lupus eritematoso sistêmico, polimiosite, e artrite reumatóide.

[00556] O sintoma mais clássico da esclerose sistêmica (esclerodermia) é sclerodactyly. Os sintomas iniciais incluem mãos inchadas, que algumas vezes o progresso desta deformidade semelhante a ferir-se e diminuição da força. Cada um não com esclerodermia desenvolvem este grau de endurecimento da pele. Outros sintomas podem incluir mórfea, sclerodactyly linear (dedos endurecidos), síndrome de Raynaud, calcinose, e telangiectasia.

[00557] Os testes sanguíneos tal como os testes de anticorpo antinuclear (ANA) podem ser usados na diagnose da esclerodermina tanto localizada quanto sistêmica. Por exemplo, os anticorpos de anti- centromera (ACA) e anticorpos anti-Scl-70 são indicativos dos pacientes em necessidade de tratamento por esclerose sistêmica (Ho et al., 2003, Arthritis Res Ther. 5:80-93); o anticorpo anti-topo II alfa são indicativos dos pacientes em necessidade de tratamento para o local de esclerodermia e anticorpo anti-topo I alfa são indicativos dos pacientes em necessidade de tratamento para a esclerodermia sistêmica. Diversos tipos de esclerodermia e métodos para o diagnóstico destes tipos são reconhecidos e bem conhecidos na técnica, incluindo, mas não limitando a, esclerodermia juvenil (Foeldvari, Curr Opin Rheumatol 14:699-703 (2002); Cefle et al., Int J Clin Pract. 58:635-638 (2004)); esclerodermia localizada; Esclerodermia nodular (Cannick, J Rheumatol. 30:2500-2502 (2003)) e esclerodermia sistêmica, incluindo, mas não limitando a, Calcinose, Raynaud, Esogágica, Sclerodactyly, e Telangiectasia (CREST), esclerodermia sistêmica limitada, e esclerodermia sistêmica difusa. A esclerodermia sistêmica também é conhecida como a esclerose sistêmica (SSc). Este também pode ser referido como esclerose sistêmica progressiva (PSSc), ou esclerose sistêmica progressiva familiar (FPSSc) (Nadashkevich et al., Med Sci Monit. 10:CR615-621 (2004); Frances et al., Rev Prat. 52:1884-90 (2002)). A esclerose sistêmica é um distúrbio de multi-sistemas caracterizada pela presença da esclerose do tecido conectivo, anomalias vasculares relativo a artérias de pequenos tamanhos e a microcirculação, e mudanças autoimunes.

[00558] O tipo de esclerodermia sistêmica conhecidas como CREST não é caracterizada por qualquer contração da pele. O CREST é caracterizado por calcinose (depósitos de cálcio), usualmente nos dedos; Raynaud; perda do controle muscular do esôfago, que pode causar dificuldade em engolir; Sclerodactyly, uma deformidade na diminuição da força dos ossos dos dedos e telangiectasia, pequenas manchas vermelhas na pele dos dedos, face, ou no interior da boca. Tipicamente dois destes sintomas é suficiente para uma diagnose de CREST. O CREST pode ocorrer sozinho, ou em combinação com qualquer outras formas de esclerodermia ou com outras doenças autoimunes.

[00559] A esclerodermia limitada é caracterizada por pele firme limitada aos dedos, junto com úlceras digitais corrosivas (secundária por Raynaud) e/ou fibrose do pulmão. A pele da face e do pescoço também pode ser incluído na esclerodermia limitada.

[00560] A esclerodermia difusa é diagnosticada quando existe pele firme próxima. Próxima significa localizada muito próximo ao ponto de referência. A pele firme próxima pode ser a tensão da pele acima dos pulsos ou acima dos cotovelos. Tipicamente, um paciente com tensão da pele apenas entre seus cotovelos e seus pulsos receberão uma diagnose de esclerodermia sistêmica difusa ou limitada, dependendo do que significar o próximo uso clínico diagnosticado.

[00561] As terapias correntes para a esclerodermia incluem fotoforese extracorpórea seguido pelo 6-metoxipsoraleno, e autólogos de transplante celular de haste.

[00562] Os tratamentos correntes para a esclerodermia incluem a administração dos seguintes agentes, penicilamina, colquicina, alfa interferon, gama interferon, clorambucila, ciclosporina, 5-fluorouracila, ciclofosfamida, minociclina, talidomida, etanorcepto, ou metotrexato.

[00563] Em certas formas de realização dos métodos da invenção, um paciente pode ser tratado com um anticorpo anti-CD19 antes, concorrente, ou subsequente por qualquer das terapias divulgadas acima que são usadas para o tratamento de diabetes autoimunes. Além disso, os anticorpos anti-CD19 da presente invenção podem ser administrados em combinação com qualquer dos agentes notados acima.

5.25. DETERMINAÇÃO DA DENSIDADE CD19 NA AMOSTRA OU PACIENTE

[00564] Enquanto não requerido, os ensaios para a densidade CD19 podem ser utilizados ainda para caracterizar a diagnose de um paciente. Os métodos da determinação da densidade dos anticorpos da ligação pelas células são conhecidos àqueles habilitado na técnica (ver, por exemplo, Sato et al., J. Immunology 165:6635-6643 (2000); que divulga um método de avaliação da densidade da superfície celular dos antígenos CD específicos). Outros métodos padrões incluem análise de Scatchard. Por exemplo, o anticorpo ou fragmento pode ser isolado, radiorotulado, e a atividade especificada do anticorpo radiorotulado determinado. O anticorpo é então contactado com uma célula alvo que expressa CD19. A radioatividade associada com a célula pode ser medida e, baseada na atividade especificada, a quantidade de anticorpo ou fragmento de anticorpo ligado à célula determinada.

[00565] A fluorescência ativada na citometria de fluxo também pode ser utilizada. No geral, o anticorpo ou fragmento de anticorpo é ligado a uma célula alvo que expressa CD19. Um segundo reagente que ligase ao anticorpo é então adicionado, por exemplo, um anticorpo anti- imunoglobulina rotulado por flourocromo. O tingimento de flourocromo pode então ser medido e usado para determinar a densidade do anticorpo ou fragmento de anticorpo da ligação pela célula.

[00566] Como um outro método adequado, o anticorpo ou fragmento de anticorpo pode ser diretamente rotulado com um rótulo detectável, tal como um fluorophore, e ligando-se a uma célula alvo. A razão do rótulo para a proteína é determinada e comparada com glóbulos padrão com quantidades conhecidas da ligação deste rótulo. A comparação da quantidade do rótulo ligado à célula com os padrões conhecidos podem ser usados para calcular a quantidade de anticorpo ligado à célula.

[00567] Já em um outro aspecto, a presente invenção fornece um méto para detectar a presença e/ou densidade in vitro ou in vivo de uma amostra ou indivíduo de CD19. Este também pode ser útil para o monitoramento das doenças e efeitos de tratamento e para a determinação e ajuste da dosagem do anticorpo a ser administrado. O método in vivo pode ser realizado usando as técnicas de imagem tal como PET (tomografoa de emissão de pósitron) ou SPECT (tomografoa computadorizada de emissão de fóton simples). Um rótulo de um anticorpo anti-CD19 também pode com índio usando um quelador de ligação covalentemente. Os anticorpos resultantes podem ser imaginados usando câmeras de padrão gama da mesma maneira como ZEVALIN™ (anti-CD20 mAb rotulado por índio) (Biogen Idec, Cambridge MA) é usado para imaginar o antígeno CD20.

[00568] Em uma forma de realização, o método in vivo pode ser realizado pelo conexão de uma amostra a ser testada, opcionalmente junto com uma amostra de controle, com um anticorpo anti-humano humano CD19 sob condições deixadas para a formação de um complexo entre um anticorpo da invenção e o antígeno de CD19 humano. O complexo de formação é então detectado (por exemplo, usando citometria de fluxo fluorescente ativada ou blotting Western). Quando usado uma amostra de controle junto com a amostra testada, um complexo é detectado em ambas amostras e qualquer diferença significante estatisticamente na formação dos complexos entre as amostras é indicativo da presença do CD19 humano na amostra testada.

[00569] Em outra forma de realização, a intensidade da fluorescência significa que pode ser usada como uma medida da densidade de CD19. Em tal forma de realização, as células B são removidas a partir de um paciente e tingidas com anticorpos CD19 que foram rotulados com um rótulo fluorescente e a intensidade da fluorescência é medida usando a citometria de fluxo. As intensidades da fluorescência podem ser medidas e expressadas como uma média da intesidade por célula B. Usando tais métodos, as intensidades da fluorescência significam que são representativas da densidade de CD19 que podem ser comparadas por um paciente antes e depois do tratamento usando os métodos e as composições da invenção, ou entre pacientes e os níveis normais de hCD19 em células B.

[00570] Nos pacientes onde a densidade da expressão CD19 na células B foi determinado, a densidade de CD19 pode influenciar a determinação e/ou ajuste da dosagem e/ou regime de tratamento usado com um anticorpo anti-CD19 das composições e métodos da invenção. Por exemplo, onde a densidade de CD19 é alta, este pode ser possível para o uso de anticorpos anti-CD19 que tem menos eficiência mediada por ADCC em humanos. Em certas formas de realização, onde o paciente tratado usando as composições e métodos da invenção tem uma densidade CD19 baixa, as mais altas dosagens de um anticorpo anti-CD19 das composições e métodos da invenção podem ser usados. Em outra forma de realização, onde o paciente tratado usando as composições e métodos da invenção tem uma densidade CD19 baixa, a dosagem baixa de um anticorpo anti-CD19 das composições e métodos da invenção podem ser usados. Em certas formas de realização, onde o paciente tratado usando as composições e métodos da invenção tem uma alta densidade CD19, uma dosagem inferior de um anticorpo anti-CD19 das composições e métodos da invenção podem ser usadas. Em certas formas de realização, a densidade CD19 pode ser comparado pela densidade CD20 em um paciente, a densidade CD19 pode ser comparada por uma média da densidade CD19 para humanos ou para uma população de pacientes em particular, ou a densidade CD19 pode ser comparada por níveis CD19 nos pacientes antes da terapia ou antes do choque de uma doença ou distúrbio da célula B. Em certas formas de realização, o paciente tratado usando as composições e métodos da invenção tem uma nocividade da célula B onde CD19 está presente na superfície das células B.

5.26. PROTOCOLOS IMUNOTERAPÊUTICOS

[00571] As composições do anticorpo anti-CD19 são usadas no regime terapêutico/protocolos, referidos neste como “imunoterapia anti-CD19” que pode ser anticorpos nús, imunoconjugados e/ou proteínas de fusão. As composições da invenção podem ser usadas como uma terapia de agente simples ou em combinação com outros agentes terapêuticos ou regimes. Os anticorpos anti-CD19 ou imunoconjugados podem ser administrados antes de, concorrentemente com, ou seguido pela administração de um ou mais agentes terapêuticos. Os agentes terapêuticos que podem ser usados em combinação com o regime terapêutico com as composições da invenção incluem qualquer substância que inibem ou evitam a função das células e/ou casos de destruição das células. Os exemplos incluem, mas não são limitados a, isotipos radioativos, agentes quimioterapêuticos, e toxinas tal como toxinas ativas enzimaticamente de origem bacteriana, fúngica, vegetal ou animal, ou fragmentos destes.

[00572] O regime terapêutico descrito neste, ou qualquer regime desejado de tratamento pode ser testado para a eficácia usando um modelo de animal transgênico que expressa o antígeno de CD19 humano no lugar do antígeno CD19 nativo. Deste modo, um anticorpo anti-CD19 de regime de tratamento pode ser testado em um modelo animal para determinar a eficácia antes da administração por um humano.

[00573] Os anticorpos anti-CD19, composições e métodos podem ser praticadas por tratar as doenças da células B, incluindo a nocividade da célula B. O termo “nocividade da célula B” inclui qualquer nocidade que é derivada a partir de uma célula da linhagem da célula B. A nocividade da célula B exemplar inclui, mas não são limitados a: linfoma de Hodgkin de nenhum sub-tipo da célula B (NHL) incluindo gra/folicular baixo, NHL, NHL de pequenos linfócitos (SL), NHL de grau/folicular intermediário, NHL difuso de grau intermediário, NHL imunoblásticode alto grau, NHL linfoblástico de alto grau, NHL celular pequeno não clivado de alto grau; linfoma celular de manta, e NHL de doença volumosa; linfoma de Burkitt; mieloma múltiplo; leucemia linfoblástica pré-aguda B e outras nocividades que derivam a partir dos precursores da célula B precoce; leucemia linfócita aguda comum (ALL); leucemia linfócita crônica (CLL) incluindo CLL mutado por imunoglobulina e CLL não mutado por imunoglobulina; leucemia celular hairy; leucemia linfoblástica aguda nula; macroglobulinemia de Waldenstrom; linfoma da célula B ampla difusa (DLBCL) incluindo DLBCL (GCB) semelhante à célula B do centro germinal, DLBCL (ABC) semelhante à célula B ativada, e DLBCL de tipo 3; leucemia pró-linfócita; doença de cadeia leve; plasmacitoma; mieloma osteosclerótica; leucemia celular de plasma; gamopatia monoclonal de significância indeterminada (MGUS); combustão lenta de mieloma múltiplo (SMM); mieloma múltiplo indolente (IMM); linfoma de Hodgkin incluindo tipo pré-dominante de linfócito clássico e de nódulo; linfoma linfoplasmamacítico (LPL) e linfoma da zona marginal incluindo linfoma (MALT) do tecido linfóide associado à mucosa gástrica.

[00574] Em uma forma de realização adicional a invenção pode ser utilizada para tratar a nocividade da célula B madura (isto é, superfície celular no Ig expresso) incluindo mas não limitando a linfoma folicular, linfoma celular de manta, linfoma de Burkitt, mieloma múltiplo, linfoma da célula B ampla difusa (DLBCL) incluindo DLBCL (GCB) semelhante à célula B do centro germinal, DLBCL (ABC) semelhante à célula B ativada, e DLBCL de tipo 3, linfoma de Hodgkin incluindo tipo pré- dominante de linfócito clássico e de nódulo, linfoma linfoplasmamacítico (LPL), linfoma da zona marginal incluindo linfoma (MALT) de tecido linfóide associado à mucosa gástrica, e leucemia linfócita crônica (CLL) incluindo CLL mutado por imunoglobulina e CLL não mutado por imunoglobulina.

[00575] Além disso, o CD19 é expressado precocemente no desenvolvimento da célula B do que, por exemplo, CD20, e é por esta razão particularmente adequado para o tratamento da pré-célula B e uma nocividade da célula B madura (isto é, superfície celular de nenhum Ig expresso), por exemplo, na medula óssea. A pré-célula B ilustrativa e uma nocividade da célula B madura incluem mas não são limitados a leucemia linfoblástica aguda.

[00576] Em outra forma de realização particular, a invenção pode ser praticada por tratar tumores extranodais.

5.27. IMUNOTERAPIA ANTI-CD19

[00577] De acordo com a presente invenção “imunoterapia anti- CD19” abrange a administração de qualquer do anticorpos anti-CD19 da invenção de acordo com qualquer regime terapêutico descrito neste. Os anticorpos anti-CD19 podem ser administrados como anticorpos nus, ou imunoconjugados ou proteínas de fusão.

[00578] A imunoterapia anti-CD19 abrange a administração de um anticorpo anti-CD19 como um agente terapêutico simples para o tratamento da nocividade da célula B. A imunoterapia anti-CD19 abrange métodos de tratamento de um estágio de doença precoce resultando de uma nocividade da célula B. A imunoterapia anti-CD19 abrange um método de tratamento da nocividade da célula B em que um ADCC é mediado pelo anticorpo anti-CD19. A imunoterapia anti- CD19 abrange os métodos de tratamento da nocividade da célula B em que um anticorpo anti-CD19 é administrado antes que o paciente tem recebido qualquer tratamento para a nocividade, se para a terapia é quimioterapia, radioquimioterapia baseada na terapia ou terapia cirúrgica.

[00579] Em uma forma de realização, um paciente humano tendo a nocividade da célula B pode ser tratado pela administração de um anticorpo humano ou humanizado que pode ser capaz de mediar o ADCC humano. Em casos das doenças de estágio precoce, ou terapias de agente simples, qualquer anticorpo anti-CD19 que possa mediar ADCC pode ser usados nos pacientes humanos (incluindo murina e anticorpos quiméricos); entretanto, os anticorpos humanos e humanizados podem ser preferidos.

[00580] Os anticorpos de IgG1 ou IgG3 de isotipos humanos são em algumas casos preferidos para a terapia. Entretanto, os isotipos humanos IgG2 ou IgG4 podem ser usados também, fornecidos por estes que tem a função efetiva relevante, por exemplo ADCC humano. Tal função efetiva pode ser avaliada pela medição da capacidade do anticorpo em questão para mediar a lise da célula alvo pelas células efetivas in vitro ou in vivo.

[00581] Em uma forma de realização, a dose do anticorpo usado deve ser suficiente para esgotar a circulação das células B. O progresso da terapia pode ser monitorado no paciente pela análise das amostras sanguíneas. Outros sinais de melhoramento clínico podem ser usados para monitorar a terapia.

[00582] Os métodos para a medição da depleção das células B que podem ser usadas em conexão com as composições e métodos da invenção são bem conhecidas na técnica e incluem, mas não são limitados a serem seguidas pelas formas de realização. Em uma forma de realização, a circulação da depleção das células B podem ser medidas com a citometria de fluxo usando um reagente de outros do que um anticorpo anti-CD19 que ligam-se as células B para definir a quantidade das células B. Em outra forma de realização, os níveis de célula B no sangue podem ser monitoradas usando a análise de soro padrão. Em tal forma de realização, a depleção da célula B é indiretamente medida pela definição da quantidade por um anticorpo conhecido por produzir as células B. O nível de que o anticorpo é então monitorado para determinar a depleção e/ou depleção funcional das células B. Em uma outra forma de realização, a depleção da célula B pode ser medida pelo tingimento imunoquímica para identificar as células B. Em tal forma de realização, as células B ou tecidos ou soro que compreende as células B extraídas de um paciente podem ser colocadas em lâminas microscópicas, rotuladas e examinadas para a presença ou ausência. Em uma forma de realização relatada, uma comparação é feita entre as células B extraídas antes da terapia e depois da terapia para determinar as diferenças na presença das células B.

[00583] A carga do tumor pode ser medido e usado em conexão com as composições e métodos da invenção. Os métodos para medir a carga do tumor são bem conhecidos na técnica e incluem, mas não são limitados seguido pela forma de realização. Em certas formas de realização, as varreduras de PET podem ser usados para medir a atividade metabólica e identificar áreas de mais altas atividades que são indicativos de tumores. As varreduras de CT e MRI também podem ser usados para examinar tecido macio para um presença e tamanho dos tumores. Em outra forma de realização, a varredura óssea pode ser usada para medir o volume do tumor e localização. Já em outra forma de realização, a carga do tumor pode ser medido pelo exame do fluxo sanguíneo dentro e fora de um tumor usando tecnologia doppler (por exemplo, ultra-som). Em tal forma de realização, as mudanças no fluxo sanguíneo em tempo ou separação a partir do fluxo sanguíneo no tecido apropriado de um paciente pode ser usado para calcular, uma estimativa para a carga do tumor. Tais métodos para medir a carga do tumor pode ser usado antes e seguido pelos métodos do tratamento da invenção.

[00584] Em certas formas de realização dos métodos da invenção as células B são esgotadas e/ou a carga do tumor é diminuída enquanto a função ADCC é mantida.

[00585] Na forma de realização da invenção onde um anticorpo anti-CD19 é administrado como uma terapia de agente simples, a invenção considera o uso de regime diferente de tratamento.

[00586] De acordo com certos aspectos da invenção, um anticorpo anti-CD19 usado em composições e métodos da invenção, é um anticorpo nu. Em uma forma de realização relatada, a dose do anticorpo anti-CD19 nu usada é pelo menos de cerca de 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 1,5, 2, 2,5, 3, 3,5, 4, 4,5, 5, 5,5, 6, 6,5, 7, 7,5, 8, 8,5, 9, 9,5, 10, 10,5, 11, 11,5, 12, 12,5, 13, 13,5, 14, 14,5, 15, 15,5, 16, 16,5, 17, 17,5, 18, 18,5, 19, 19,5, 20, 20,5 mg/kg do peso corporal de um paciente. Em certas formas de realização, a dose do anticorpo anti-CD19 nu usado é pelo menos de cerca de 1 a 10, 5 a 15, 10 a 20, ou 15 a 25 mg/kg do peso corporal de um paciente. Em certas formas de realização, a dose do anticorpo anti-CD19 nu usado é pelo menos de cerca de 1 a 20, 3 a 15, ou 5 a 10 mg/kg do peso corporal de um paciente. Em outra forma de realização, a dose do anticorpo anti-CD19 nu usado é pelo menos de cerca de 5, 6, 7, 8, 9, ou 10 mg/kg do peso corporal de um paciente.

[00587] Em certas formas de realização, a dosagem compreende cerca de 375 mg/m2 do anticorpo anti-CD19 administrados semanalmente por 4 a 8 semanas consecutivas. Em certas formas de realização, a dosagem é pelo menos de cerca de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, ou 15 mg/kg do peso corporal do paciente administrado semanalmente por 4 a 8 semanas consecutivas.

[00588] As dosagens exemplares do anticorpo anti-CD19 descritos acima podem ser administrados como descrito na seção 5.21.3. Em uma forma de realização, as dosagens acima são injeções de dosagens simples. Em outra forma de realização, as doses são administradas durante um período de tempo. Em outra forma de realização, as doses são administradas em múltiplas vezes durante um período de tempo. O período de tempo pode ser medido em dias, semanas, ou meses. As doses múltiplas de um anticorpo anti-CD19 podem ser administradas em intervalos adequados para atingir um benefício terapêutico enquanto balançando os efeitos secundários tóxicos. Por exemplo, onde as dosagens múltiplas são usadas, este pode ser preferido por período de intervalos para permitir a recuperação da contagem do paciente antes do tratamento repetido com o anticorpo. Este regime de dosagem otimizará a eficiência do tratamento, visto que a população de monócito reflete a função ADCC no paciente.

[00589] Em certas formas de realização, composições da invenção são administrados por um paciente humano tão longo quanto o paciente seja susceptível a terapia. Em outra forma de realização, composições da invenção são administradas por um paciente humano tão longo quanto as doenças do paciente não avançam. Em uma forma de realização relatada, as composições da invenção são administradas por um paciente humano até uma doença do paciente que não avança ou não tenha progredido por um período de time, então o paciente não é administrado nas composições da invenção a não ser uma doença recorrente ou começando a progredir mais uma vez. Por exemplo, um paciente pode ser tratado com qualquer das dosagens acima por cerca de 4 a 8 semanas, durante o período que o paciente é monitorado pela progressão da doença. Se parada ou reversa da progressão da doença, então o paciente não será administrada as composições da invenção até que a reincidência do paciente, isto é, a doença sendo tratada recorrente ou progressiva. Nesta recorrência ou progressão, o paciente pode ser tratado mais uma vez com o mesmo regime de dosagem inicialmente usado ou usando outras doses descritas acima.

[00590] Em certas formas de realização, composições da invenção podem ser administradas como uma dosagem carregada seguido pela dosagens múltiplas inferiores (manutenção das doses) durante um período de tempo. Em tal forma de realização, as doses podem ter um período e uma quantidade ajustada para manter os efetivos A % da depleção da célula B. Em certas formas de realização, a dosagem carregada é de cerca de 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, ou 18 mg/kg do peso corporal do paciente e a manutenção da dose é pelo menos de cerca de 5 a 10 mg/kg do peso corporal do paciente. Em outra forma de realização, a manutenção da dose é administrada em intervalos de cada 7, 10, 14 ou 21 dias. A manutenção da dose pode ser contida indefinitivamente, até a toxicidade está presente, até a diminuição da contagem de plaquetas, até não existe nenhuma progressão da doença, até um paciente exibir a imunogeneicidade, ou até os progressos da doença por um estado terminal. Já em outra forma de realização, as composições da invenção são administradas por um paciente humano até o progresso da doença a um estágio terminal.

[00591] Em uma forma de realização da invenção onde os níveis de monócito de circulação de um paciente são monitorados como parte de um regime de tratamento, doses do anticorpo anti-CD19 administrados e podem ser espaçados para permitir a recuperação da contagem do monócito. Por exemplo, a composição da invenção pode ser administrada em intervalos de cada 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, ou 30 dias.

[00592] Em uma forma de realização da invenção onde um anticorpo anti-CD19 é conjugado por ou administrado em conjunção com uma toxina, uma pessoa habilitada na técnica estimará que a dosagem do anticorpo anti-CD19 pode ser ajustada com base na dosagem da toxina e que a dosagem da toxina dependerá do tipo de toxina específica sendo usado. Tipicamente, onde a toxina é usada, a dosagem do anticorpo anti-CD19 será menos do que a dosagem usada como um anticorpo anti-CD19 nu. A dosagem apropriada pode ser determinada para uma toxina particular usando técnicas bem conhecidas na técnica. Por exemplo, um estudo de faixa de dosagem pode ser conduzido para determinar a dosagem tolerada máxima do anticorpo anti-CD19 quando administradas com ou conjugado por uma toxina.

[00593] Em uma forma de realização da invenção onde um anticorpo anti-CD19 é conjugado por ou administrado em conjunção com um agente radioterapêutico, a dosagem do anticorpo anti-CD19 variará dependendo do radioterapêutico usado. Em certas formas de realização, um processo de duas etapas é usada. Primeiro, o paciente humano é administrado uma composição que compreende um anticorpo anti-CD19 nu e cerca de 6, 7, 8, 9, ou 10 dias depois de uma pequena quantidade de radioterapêutico é administrado. Segundo, visto que a tolerância, distribuição, e liberação da baixa terapia de dosagem foi determinada, o paciente é administrado uma dose do anticorpo anti-CD19 nu seguido pela quantidade terapêutica do radioterapêutico é administrado. Tal regime de tratamento são similares àquelas aprovados para o não tratamento de linfoma de Hodgkin usando ZEVALIN™ (anti-CD20 mAb rotulado por índio) (Biogen Idec) ou BEXXAR™ (GSK, Coulter Pharmaceutical).

5.28. COMBINAÇÃO COM AGENTES QUIMIOTERAPÊUTICOS

[00594] A imunoterapia anti-CD19 (usado no anticorpo nu, imunoconjugado, ou proteínas de fusão) pode ser usado na conjunção com outras terapias incluindo mas não limitando a, quimioterapia, radioimunoterapia (RIT), quimioterapia e radiação de suporte externo (terapia de modalidade combinada, CMT), ou radioimunoterapia de modalidade combinada (CMRIT) sozinho ou em combinação, etc. Em certas formas de realização, uma terapia de anticorpo anti-CD19 da presente invenção pode ser administrado em conjunção com CHOP (Ciclofosfamida-Hidroxidoxorubicina-Oncovina (vincristina)- Prednisolona), o regime de quimioterapia mais comum para o não tratamento de linfoma de Hodgkin. Como usado neste, o termo “administrado em conjunção com” significa que uma imunoterapia anti- CD19 pode ser administrada antes, durante, ou subsequente à outras terapias utilizadas.

[00595] Em certas formas de realização, uma imunoterapia anti- CD19 está em conjunção com uma radionucleotídeo citotóxico ou isótopo radioterapêutico. Por exemplo, um isótopo que emite alfa tal como 225Ac, 224Ac, 211At, 212Bi, 213Bi, 212Pb, 224Ra, ou 223Ra. O radionucleotíodeo citotóxico também pode ser um isótopo que emite beta tal como 186Re, 188Re, 90Y, 131I, 67Cu, 177Lu, 153Sm, 166Ho, ou 64Cu. Além disso, o radionucleotíodeo citotóxico pode emitir Auger e elétrons de baixa energia e incluem os isótopos 125I, 123I ou 77Br. Em outra forma de realização o isótopo pode ser 198Au, 32P, e outros. Em certas formas de realização, a quantidade do radionucleotídeo administrado ao paciente é entre cerca de 0,001 mCi/kg e cerca de 10 mCi/kg.

[00596] Em algumas formas de realização, a quantidade do radionucleotíodeo administrado ao paciente é entre cerca de 0,1 mCi/kg e cerca de 1,0 mCi/kg. Em outra forma de realização, a quantidade do radionucleotíodeo administrado ao paciente é entre cerca de 0,005 mCi/kg and 0,1 mCi/kg.

[00597] Em certas formas de realização, uma imunoterapia anti- CD19 é em conjunção com um toxina química ou agente quimioterapêutico. A toxina química ou agente quimioterapêutico podem ser selecionados do grupo que consiste de uma enedina tal como caliqueamicina e esperamicina; duocarmicina, metotrexato, doxorubicina, melfalan, clorambucila, ARA-C, vindesina, mitomicina C, cis-platina, etopósido, bleomicina e 5-fluorouracila.

[00598] As toxinas químicas adequadas ou agentes quimioterapêuticos que podem ser usados em combinação de terapias com uma imunoterapia anti-CD19 incluem membros da família de enediina de moléculas, tal como caliqueamicina e esperamicina. As toxinas químicas também podem ser retirados do grupo que consiste de duocarmicina (ver, por exemplo, Patente U.S. N°. 5.703.080 e Patente U.S. N°. 4.923.990), metotrexato, doxorubicina, melfalan, clorambucila, ARA-C, vindesina, mitomicina C, cis-platina, etopósido, bleomicina e 5-fluorouracila. Exemplos dos agentes quimioterapêuticos também incluem Adriamicina, Doxorubicina, 5-Fluorouracila, Arabinosídeo de citosina (“Ara-C”), Ciclofosfamida, Tiotepa, Taxotero (docetaxel), Busulfan, Citoxina, Taxol, Metotrexato, Cisplatina, Melfalan, Vinblastina, Bleomicina, Etopósido, Ifosfamida, Mitomicina C, Mitoxantrona, Vincreistina, Vinorelbina, Carboplatina, Teniposídeo, Daunomicina, Carminomicina, Aminopterina, Dactinomicina, Mitomicinas, Esperamicinas (ver, Patente U.S. N°. 4.675.187), Melfalan e outras mostardas de nitrogênio relatada.

[00599] Em outra forma de realização, por exemplo, “CVB” (1,5 g/m2 de ciclofosfamida, 200 a 400 mg/m2 de etopósido, e 150 a 200 mg/m2 de carmustina) podem ser usadas em combinação com as terapias da invenção. O CVB é um regime usado para não tratar os linfoma de Hodgkin. Patti et al., Eur. J. Haematol. 51:18 (1993). Outra combinação do regime quimioterapêutico são bem conhecidos por aqueles habilitados na técnica. Ver, por exemplo, Freedman et al., “Non-Hodgkin’s Lymphoma,” em CANCER MEDICINE, VOLUME 2, 3° Edição, Holland et al. (eds.), páginas 2028 a 2068 (Lea & Febiger 1993). Como uma ilustração, primeira geração do regime quimioterapêutico para o tratamento do grau não intermediário do linfoma de Hodgkin incluem C-MOPP (ciclofosfamida, vincristina, procarbazina e prednisona) e CHOP (ciclofosfamida, doxorubicina, vincristina, e prednisona). Uma segunda geração útil do regime quimioterapêutico é m-BACOD (metotrexato, bleomicina, doxorubicina, ciclofosfamida, vincristina, dexametasona e leucovorina), enquanto uma terceira geração do regime adequado é MACOP-B (metotrexato, doxorubicina, ciclofosfamida, vincristina, prednisona, bleomicina e leucovorina). Os medicamentos úteis adicionais incluem butirato de fenila e broestatina-1. Em uma terapia multimodal, ambos medicamentos quimioterapêuticos e as citocinas são co-administradas com um anticorpo, imunoconjugado ou proteína de fusão de acordo com a presente invenção. As citocinas, medicamentos quimioterapêuticos e anticorpos, imunoconjugados ou proteínas de fusão podem ser administrados em qualquer ordem, ou juntos.

[00600] Outras toxinas que podem ser usadas em composições e métodos da invenção incluem lectinas venenosas, toxinas de plantas tal como toxinas de ricina, abrina, modeccina, botulina e difteria. De curso, as combinações de várias toxinas também podem ser ligadas por uma molécula de anticorpo por meio disso acomodando a citotoxicidade variável. O ilustrativo das toxinas que são adequadamente utilizados em terapias de combinação da invenção são toxinas de ricina, abrina, ribonuclease, DNase I, enterotoxina-A Staphylococcal, proteína antiviral de ervas dos cancros, gelonina, difterina, Pseudomonas de exotoxina, e Pseudomonas de endotoxina. Ver, por exemplo, Pastan et al., Cell 47:641 (1986) e Goldenberg et al., Cancer Journal for Clinicians 44:43 (1994). As toxinas ativas enzimaticamente e os fragmentos destes que podem ser usados incluem cadeia A de difteria, fragmentos ativos de não ligação de toxina de difteria, cadeia de exotoxina A (a partir de Pseudomonas aeruginosa), cadeia de ricina A, cadeia de abrina A, cadeia de modeccina A, alfa-sarcina, proteínas de Aleuritesfordii, proteínas de diantina, proteínas de Phytolaca americana (PAPI, PAPII, e PAP-S), inibidor de momordica charantia, curcina, crotina, inibidor de sapaonaria officinalis, gelonina, mitogelina, restrictocina, fenomicina, enomicina e os tricotecenos. Ver, por exemplo, WO 93/21232 publicado em 28 de Outubro de 1993.

[00601] As toxinas e agentes quimioterapêuticos adequados são descritos em REMINGTON’S PHARMACEUTICAL SCIENCES, 19° Ed. (Mack Publishing Co. 1995) e em GOODMAN AND GILMAN’S THE PHARMACOLOGICAL BASIS OF THERAPEUTICS, 7° Ed. (MacMillan Publishing Co. 1985). Outras toxinas e/ou agentes quimioterapêuticos adequados são conhecidos por aqueles habilitados na técnica.

[00602] Uma imunoterapia anti-CD19 da presente invenção também pode ser em conjunção com uma enzima de ativação do pró- medicamento que converte um pró-medicamento (por exemplo, um agente quimioterapêutico de peptidila, ver, WO81/01145) por um medicamento anti-câncer ativo. Ver, por exemplo, WO 88/07378 e Patente U. S. N° 4.975.278. O componente da enzima de tal combinação inclui qualquer enzima capaz de atuar em um pró- medicamento em uma tal maneira de modo a converter nesta forma citotóxica ativa. O termo “pró-medicamento” como usados nesta aplicação refere-se a um precursor ou formas derivadas de uma substância ativa farmaceuticamente que é menos citotóxica pelas células do tumor comparado ao medicamento de origem e é capaz de ser enzimaticamente ativado ou convertido na origem da forma mais ativa. Ver, por exemplo, Wilman, “Prodrugs in Cancer Chemotherapy” Biochemical Society Transactions, 14, páginas 375 a 382, 615° Meeting Belfast (1986) e Stella et al., “Prodrugs: A Chemical Approach to Targeted Drug Delivery,” directed Drug Delivery, Borchardt et al. (ed.), páginas 247 a 267, Humana Press (1985). Os pró-medicamentos que podem ser usados em combinação com anticorpos anti-CD19 incluem, mas não são limitados a, pró-medicamentos contendo fosfato, pró-medicamentos contendo tiofosfato, pró-medicamentos contendo sulfato, pró-medicamentos contendo peptídeo, Pró-medicamentos modificados por aminoácido D, pró-medicamentos glicosilados, pró- medicamentos contendo um α-lactamo, opcionalmente pró- medicamentos contendo a fenoxiacetamida substituída ou opcionalmente pró-medicamentos contendo a fenoxiacetamida substituída, 5-fluorocitosina e outros pró-medicamentos de 5- fluorouridina que pode ser convertido nos mais medicamentos livres citotóxicos ativos. Exemplos de medicamentos citotóxicos que podem ser derivados na forma de pró-medicamento para o uso nesta invenção incluem, mas não são limitados a, aqueles agentes quimioterapêuticos descritos acima.

[00603] Em certas formas de realização, a administração das composições e métodos da invenção podem capacitar o adiamento da terapia tóxica e podem ajudar a evitar os efeitos colaterais não necessários e os riscos das complicações associados com a quimioterapia e o desenvolvimento do atraso da resistência pela quimioterapia. Em certas formas de realização, as terapias tóxicas e/ou resistência pelas terapias tóxicas é atrasada nos pacientes administrados das composições e métodos da invenção atrasados por a cerca de 6 meses, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ou 10 anos.

5.29. COMBINAÇÃO COM ANTICORPOS TERAPÊUTICOS

[00604] Uma imunoterapia anti-CD19 descrita neste pode ser administrada em combinação com outros anticorpos, incluindo, mas não limitando a, anti-CD20 mAb, anti-CD52 mAb, anticorpo anti-CD22, e anticorpos anti-CD20, tal como RITUXAN™ (C2B8; RITUXIMAB™; IDEC Pharmaceuticals). Outros exemplos de anticorpos terapêuticos que podem ser usados em combinação com anticorpos da invenção ou usados nas composições da invenção incluem, mas não são limitados a, HERCEPTIN™ (Trastuzumab; Genentech), MYLOTARG™ (Gemtuzumab ozogamicin; Wyeth Pharmaceuticals), CAMPATH™ (Alemtuzumab; Berlex), ZEVALIN™ (Ipritumomab tiuxetan; Biogen Idec), BEXXAR™ (Tositumomab; GlaxoSmithKline Corixa), ERBITUX™ (Cetuximab; Imclone) e AVASTIN™ (Bevacizumab; Genentech).

[00605] Uma imunoterapia anti-CD19 descrita neste pode ser administrada em combinação com um anticorpo específico para um receptor Fc selecionado do grupo que consiste de FCYRI, FCYRIIA, FCYRIIB, FCYRIII e/ou FCYRIV. Em uma forma específica de realização, uma imunoterapia anti-CD19 descrito neste pode ser administrado em combinação com um anticorpo específico por FcyRIIB. O anticorpo anti- FcyRIIB adequado para este propósito foram descritos na Publicação do Pedido de Patente U.S. N°. 2004185045, Publicação PCT N°. WO05051999A, WO05018669 e WO04016750,

[00606] Em certas formas de realização, um anti-CD19 e um anti- CD20 e/ou um anti-CD22 mAb e/ou um anti-CD52 mAb pode ser administrado, opcionalmente na mesma composição farmacêutica, em qualquer razão adequada. Para ilustrar, a razão do anti-CD19 e o anticorpo anti-CD20 pode ser uma razão de cerca de 1000:1, 500:1, 250:1, 100:1, 90:1, 80:1, 70:1, 60;1, 50:1, 40:1, 30:1. 20:1, 19:1, 18:1, 17:1, 16:1, 15:1, 14:1, 13:1, 12:1, 11:1, 10:1, 9:1, 8:1, 7:1, 6:1, 5:1, 4:1, 3:1, 2:1, 1:1, 1:2, 1:3,1:4, 1:5, 1:6, 1:7, 1:8, 1:9, 1:10, 1:11, 1:12, 1:13, 1:14, 1:15, 1:16, 1:17, 1:18, 1:19, 1:20, 1:30, 1:40, 1:50, 1:60, 1:70, 1:80, 1:90, 1:100, 1:250, 1:500 ou 1:1000 ou mais. De outra maneira, a razão do anticorpo anti-CD19 e anti-CD22 pode ser uma razão de cerca de 1000:1, 500:1, 250:1, 100:1, 90:1, 80:1, 70:1, 60;1, 50:1, 40:1, 30:1. 20:1, 19:1, 18:1, 17:1, 16:1, 15:1, 14:1, 13:1, 12:1, 11:1, 10:1, 9:1, 8:1, 7:1, 6:1, 5:1, 4:1, 3:1, 2:1, 1:1, 1:2, 1:3,1:4, 1:5, 1:6, 1:7, 1:8, 1:9, 1:10, 1:11, 1:12, 1:13, 1:14, 1:15, 1:16, 1:17, 1:18, 1:19, 1:20, 1:30, 1:40, 1:50, 1:60, 1:70, 1:80, 1:90, 1:100, 1:250, 1:500 ou 1:1000 ou mais. Similarmente, a razão do anticorpo anti-CD19 e anti-CD52 pode ser uma razão de cerca de 1000:1, 500:1, 250:1, 100:1, 90:1, 80:1, 70:1, 60;1, 50:1, 40:1, 30:1. 20:1, 19:1, 18:1, 17:1, 16:1, 15:1, 14:1, 13:1, 12:1, 11:1, 10:1, 9:1, 8:1, 7:1, 6:1, 5:1, 4:1, 3:1, 2:1, 1:1, 1:2, 1:3,1:4, 1:5, 1:6, 1:7, 1:8, 1:9, 1:10, 1:11, 1:12, 1:13, 1:14, 1:15, 1:16, 1:17, 1:18, 1:19, 1:20, 1:30, 1:40, 1:50, 1:60, 1:70, 1:80, 1:90, 1:100, 1:250, 1:500 ou 1:1000 ou mais.

5.30. COMPOSTOS DE COMBINAÇÃO QUE INTENSIFICAM A FUNÇÃO DO MONÓCITO OU MACRÓFAGO

[00607] Em certas formas de realização dos métodos da invenção, um composto que intensifica a função do monócito ou macrófago (por exemplo, pelo menos de cerca de 25 %, 50 %, 75 %, 85 %, 90 %, 95 % ou mais) pode ser usado na conjunção com uma imunoterapia anti- CD19. Tais compostos são conhecidos na técnica e incluem, sem limitação, citocinas tal como interleucinas (por exemplo, IL-12) e interferons (por exemplo, interferon alfa ou gama).

[00608] O composto que intensifica a função do monócito ou macrófago ou o intensificador pode ser formulado na mesma composição farmacêutica como o anticorpo, imunoconjugado ou fragmento de ligação por antígeno. Quando administrado separadamente, o anticorpo/fragmento e o composto pode ser administrado concorrentemente (dentro de um período de horas de cada outro), pode ser administrado durante o mesmo curso da terapia, ou pode ser administrado sequencialmente (isto é, primeiro o paciente recebe um curso do tratamento do anticorpo/fragmento e então um curso do composto que intensifica a função do macrófago/monócito ou vice versa). Em tal forma de realização, o composto que intensifica a função do monócito ou macrófago é administrado ao paciente humano antes de, concorrentemente com, ou seguido pelo tratamento com outro regime terapêutico e/ou composições da invenção. Em uma forma de realização, o paciente humano tem uma contagem de leucócito sanguíneo, monócito, neutrófila, linfócito, e/ou basófila que é dentro da faixa normal para os humanos. As faixas normais para os leucócitos sanguíneos humanos (total) é de cerca de 3,5 a cerca de 10,5 (109/L). As faixas normais para as neutrófilas sanguíneas humanas é de cerca de 1,7 a cerca de 7,0 (109/L), monócitos é de cerca de 0,3 a cerca de 0,9 (109/L), os linfócitos são de cerca de 0,9 a cerca de 2,9 (109/L), as basófilas é de cerca de 0 a cerca de 0,3 (109/L) e esonófilas é de cerca de 0,05 a cerca de 0,5 (109/L). Em outra forma de realização, o paciente humano tem uma contagem de leucócito sanguíneo que é menos do que a faixa normal para humanos, por exemplo pelo menos de cerca de 0,01, 0,05, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, ou 0,8 (109/L) de leucócitos.

[00609] Esta forma de realização da invenção pode ser praticada com os anticorpos, imunoconjugados ou fragmentos de anticorpos da invenção ou com outros anticorpos conhecidos na técnica e é particularmente adequado para os pacientes que são resistentes ao anti-CD22, anti-CD52 e/ou terapia de anticorpo anti-CD20 (por exemplo, terapia com anticorpos que existe tal como C2B8), os pacientes que são correntemente sendo ou tendo previamente tratado com quimioterapia, os pacientes que tiveram um relapso no distúrbio da célula B, os pacientes que são imunocomprometidos, ou pacientes que de outra maneira tem um dano na função do macrófago ou monócito. A prevalência dos pacientes que são resistentes a terapia ou tem um relapso no distúrbio da célula B podem ser atribuídos, pelo menos em parte, por um dano na função do macrófago ou monócito. Deste modo, a invenção fornece métodos de intensificar a função ADCC e/ou macrófago e/ou monócito a ser usada na conjunção com os métodos da administração dos anticorpos anti-CD19 e fragmento de ligação por antígenos.

5.31. COMBINAÇÃO COM AGENTES IMUNORREGULADORES

[00610] Uma imunoterapia anti-CD19 da invenção também pode ser em conjunção com um agente imunorregulador. Neste método, um anticorpo anti-CD19 quimérico, humano ou humanizado pode ser usado. O termo “agente imunorregulador” como usado neste pela terapia de combinação refere-se as substâncias que atuam para eliminar, mascarar, ou intensificar o sistema imune do hospedeiro. Este incluiria as substâncias que suprem a produção de citocina, sub- regulam ou suprem a expressão pelo próprio antígeno, ou mascaram os antígenos MHC. Exemplos de tais agentes incluem 2-amino-6-aril- 5-substituídos por pirimidinas (ver, Patente U.S. N°. 4.665.077), azatioprina (ou ciclofosfamida, se existe uma reação adversa por azatioprina); bromocriptina; glutaraldeído (que mascara os antígenos MHC, como descrito em Patente U.S. N°. 4.120.649); anticorpos anti- idiotípicos para os antígenos MHC e fragmentos MHC; ciclosporina A; esteróides tal como glucocorticoesteróides, por exemplo, prednisona, metilprednisolona, e dexametasona; citocina ou receptores antagonistas de citocina incluindo anti-interferon-Y, anticorpos -β, ou - α; anticorpos de factor-α anti-necrose do tumor; anticorpos de factor-β anti-necrose do tumor; anticorpos anti-interleucina-2 e anticorpos receptores anti-IL-2; anticorpos anti-L3T4; globulina anti-linfócito heteróloga; anticorpos pan-T, por exemplo anticorpos anti-CD3 ou anti- CD4/CD4a; peptídeo solúvel contendo um domínio de ligação LFA-3 (WO 90/08187 publicado em 26 de Julho de 1990); estreptocinase; TGF-β; estreptodornase; RNA ou DNA a partir do hospedeiro; FK506; RS-61443; desoxiespergualina; rapamicina; receptor de célula T (Patente U.S. N°. 5.114.721); fragmentos do receptor de célula T (Offner et al., Science 251:430-432 (1991); WO 90/11294 e WO 91/01133) e anticorpos do receptor de célula T (EP 340,109) tal como T10B9. Exemplos de citocinas incluem, mas não são limitados a linfocinas, monocinas, e hormônios de polipeptídeo tradicional. Entre os incluídos as citocinas são hormônios desenvolvidos tal como hormônios humanos desenvolvidos, hormônios humanos desenvolvidos N-metionila, e hormônios desenvolvidos bovinos; hormônio paratireóide; tiroxina; insulina; proinsulina; relaxina; prorelaxina; hormônios de glicoproteína tal como hormônios que estimulam os folículos (FSH), hormônios que estimulam a tireóide (TSH) e hormônios que formam o corpo lúteo (LH); fator de desenvolvimento hepático; fator de desenvolvimento fibroblasto; prolactina; lactogênio placental; factor-α de necrose de tumor; substância que inibe a muleriana; peptídeo associado por gonadotropina de camundongo; inibina; ativina; fator de desenvolvimento endotelial vascular; integrina; trombopoiotina (TPO); fatores de desenvolvimento nervoso tal como NGF-α; fator de desenvolvimento de plaqueta; fatores de desenvolvimento de transformação (TGFs) tal como TGF-α e TGF- α; fator I e II de desenvolvimento semelhante à insulina; eritropoietina (EPO); fatores osteoindutivos; interferons; fatores de estimulação da colônia (CSFs) tal como macrófago-CSF (M-CSF); granulócito-macrófago-CgP (GM- CSP) e granulócito-CSF (G-CSF); interleucinas (ILs) tal como IL-1, ILla, IL-2, 1L-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-1 I, IL-12, IL-15; um fator de necrose de tumor tal como TNF-α ou TNF-β e outros fatores de polipeptídeo incluindo LIF e ligando do kit (KL). Como usado neste, o termo citocina incluem proteínas de fontes naturais ou de cultura celular recombinante e equivalentes ativos biologicamente das citocinas de sequência natural. Em certas formas de realização, os métodos ainda incluem a administração ao paciente um ou mais agentes imunomoduladores, por exemplo uma citocina. As citocinas adequadas podem ser selecionadas do grupo que consiste de interleucina-1 (IL-1), IL-2, IL-3, IL-12, IL-15, IL-18, G-CSF, GM-CSF, trombopoietina, e interferon Y.

[00611] Estes agentes imunorreguladores são administrados ao mesmo tempo ou em tempos separados de um anticorpos anti-CD19. O agente imunorregulador preferido dependerá em muitos fatores, incluindo o tipo de distúrbio sendo tratado, bem como o histórico do paciente, mas o agente que frequentemente pode ser selecionado de ciclosporina A, a glucocorticoesteróide (por exemplo prednisona ou metilprednisolona), anticorpo monoclonal OKT-3, azatioprina, bromocriptina, globulina anti-linfócito heteróloga, ou uma mistura destes.

5.32. COMBINAÇÃO COM OUTROS AGENTES TERAPÊUTICOS

[00612] Os agentes que atuam na neovasculatura do tumor também podem ser usadas na conjunção com a imunoterapia anti-CD19 e incluem agentes de ligação por tubulina tal como combrestatina A4 (Griggs et al., Lancet Oncol. 2:82, (2001)) e angiostatina e endoestatina (revisado em Rosen, Oncologist 5:20 (2000), incorporado por referência neste). Os imunomoduladores adequados para o uso em combinação com anticorpos anti-CD19 incluem, mas não são limitados a, de α-interferon, Y-interferon, e fator alfa de necrose de tumor (TNFα). Em certas formas de realização, os agentes terapêuticos usados em terapias de combinação usando as composições e métodos da invenção são peptídeos.

[00613] Em certas formas de realização, uma imunoterapia anti- CD19 está em conjunção com um ou mais moléculas de caliqueamicina. A família de caliqueamicina de antibióticos são capazes de produzir os DNA de filamento duplo quebrando em concentrações sub-picomolar. Os análogos estruturais de caliqueamicina que podem ser usados incluem, mas não são limitados a, Y1I, Y 2I, Y3I, N-acetil- Y1I, PSAG e 011 Hinman et al., Cancer Research 53:3336-3342 (1993) e Lode et al., Cancer Research 58: 2925-2928 (1998)).

[00614] Uma proteína de fusão que compreende um anticorpo anti- CD19 e um agente citotóxico também pode ser feito, por exemplo, pelas técnicas recombinantes ou síntese de peptídeos.

[00615] Já em uma outra forma de realização, um anticorpo anti- CD19 pode ser conjugado por um “receptor” (tal como estreptavidina) pela utilização no pré-alvejamento do tumor em que o conjugado receptor-antagonista é administrado ao paciente, seguido pela remoção do conjugado não ligado a partir da circulação usando um agente de clareamento e então a administração de um “ligando” (por exemplo, avidina) que é conjugado ao agente terapêutico (por exemplo, um radionucleotídeo).

[00616] Em certas formas de realização, um regime de tratamento inclui compostos que aliviam os efeitos citotóxicos de uma composição do anticorpo anti-CD19. Tais compostos incluem analgésicos (por exemplo, acetaminofeno), bisfosfonatos, anti-istaminas (por exemplo, maleato de clorfeniramina) e esteróides (por exemplo, dexametasona, retinóides, deltóides, betametasona, cortisol, cortisona, prednisona, desidrotestosterona, glucocorticóides, mineralocorticóides, estrogênio, testosterona, progestinas).

[00617] Em certas formas de realização, o agente terapêutico usado em combinação com uma imunoterapia anti-CD19 é uma pequena molécula (isto é, compostos inorgânicos ou orgânicos tendo um peso molecular de menos do que cerca de 2500 daltons). Por exemplo, as bibliotecas de pequenas moléculas podem ser comercialmente obtidas de Specs and BioSpecs B.V. (Rijswijk, The Netherlands), Chembridge Corporation (San Diego, CA), Comgenex USA Inc. (Princeton, NJ) e Maybridge Chemicals Ltd. (Cornwall PL34 OHW, United Kingdom).

[00618] Em certas formas de realização uma imunoterapia anti- CD19 pode ser administrada em combinação com um agente anti- bacteriano. Exemplos não limitantes de agentes anti-bacterianos incluem proteínas, polipeptídeos, peptídeos, proteínas de fusão, anticorpos, moléculas de ácido nucléico, moléculas orgânicas, moléculas inorgânicas, e pequenas moléculas que inibim e/ou reduzem uma infecção bacteriana, inibim e/ou reduzem a replicação da bactéria, ou inibim e/ou reduzem uma expansão da bactéria a outras células ou pacientes. Os exemplos específicos de agentes anti- bacterianos incluem, mas não são limitados a, antibióticos tal como penicilina, cefalosporina, imipenem, axtreonam, vancomicina, cicloserina, bacitracina, cloramfenicol, eritromicina, clindamicina, tetraciclina, estreptomicina, tobramicina, gentamicina, amicacina, kanamicina, neomicina, espectinomicina, trimetoprima, norfloxacina, rifampina, polimixina, amfotericina B, niestatina, quetocanazol, isoniazida, metronidazol, e pentamidina.

[00619] Em certas formas de realização uma imunoterapia anti- CD19 pode ser administrada em combinação com um agente anti- fúngico. Os exemplos específicos de agentes anti-fúngicos incluem, mas não são limitados a, medicamentos de azol (por exemplo, miconazol, quetoconazol (NIZORAL®), acetato de caspofungina (CANCIDAS®), imidazol, triazóis (por exemplo, fluconazol (DIFLUCAN®)) e itraconazol (SPORANOX®)), polieno (por exemplo, nitatina, amfotericina B (FUNGIZONE®), complexo de lipídeo de amfotericina B (“ABLC”) (ABELCET®), dispersão coloidal de amfotericina B (“ABCD”) (AMPHOTEC®), amfotericina B lipossômica (AMBISONE®)), iodeto de potássio (KI), pirimidina (por exemplo, flucitosina (ANCOBON®) e voriconazol (VFEND®)). A administração de agente anti-bacterianos e anti-fúngicos podem aliviar os efeitos ou extensão da doença infecciosa que pode ocorrer nos métodos da invenção onde uma células B dos pacientes são significantemente esgotadas.

[00620] Em certas formas de realização da invenção, uma imunoterapia anti-CD19 pode ser administrada em combinação com um ou mais dos agentes descritos acima por aliviar os efeitos secundários tóxicos que podem acompanhar a administração das composições da invenção. Em outra forma de realização, uma imunoterapia anti-CD19 pode ser administrada em combinação com um ou mais agentes que são bem conhecidos na técnica para o uso de aliviar os efeitos colaterais de administração do anticorpo, quimioterapia, toxinas, ou medicamentos.

[00621] Em certas formas de realização da invenção onde uma imunoterapia anti-CD19 é administrada para tratar mieloma múltiplo, as composições da invenção podem ser administradas em combinação com ou em regime de tratamento com alta dosagem de quimioterapia (melfalan, melfalan/prednisona (MP), vincristina/doxorubicina/dexametasona (VAD), doxorubicina/vincristina lipossômico, dexametasona (DVd), ciclofosfamida, etopósido/dexametasona/citarabina, cisplatina (EDAP)), transplante celular de hastes (por exemplo, transplantação celular de haste de autólogos ou transplantação celular de haste de alogênicos, e/ou transplantação celular de haste mini-alogênicos (não mieloablativo)), terapia de radiação, esteróides (por exemplo, corticoesteróides, dexametasona, talidomida/dexametasona, prednisona, melfalan/prednisona), terapia de suporte (por exemplo, bisfosfanatos, fatores de desenvolvimento, antibióticos, imunglobulina intravenosa, baixa dosagem de radioterapia, e/ou intervenções ortopédicas), THALOMID™ (talidomida, Celgene), e/ou VELCADE™ (bortezomib, Millennium).

[00622] Em uma forma de realização da invenção onde uma imunoterapia anti-CD19 é administrada em combinação com um outro anticorpo ou anticorpos e/ou agente, o anticorpo adicional ou anticorpos e/ou agentes podem ser administrados em qualquer seqüência relativa a administração do anticorpo desta invenção. Por exemplo, o anticorpo adicional ou anticorpos podem ser administrados antes, concorrentemente com, e/ou subsequente à administração de um anticorpo anti-CD19 ou imunoconjugado ao paciente humano. O anticorpo adicional ou anticorpos podem estar presentes nas mesmas composições farmacêuticas como um anticorpo da invenção, e/ou presente na composição farmacêutica diferente. A dosagem e modo de administração de um anticorpo desta invenção e uma dosagem do anticorpo adicional ou anticorpos podem ser os mesmos ou diferentes, de acordo com qualquer das técnicas da quantidade de dosagem e modos de administração como fornecido nesta aplicação e como são bem conhecidas na técnica.

5.33. USO DE ANTICORPOS ANTI-CD19 NO DIAGNÓSTICO DA NOCIVIDADES DA CÉLULA B

[00623] A presente invenção também abrange anticorpos anti- CD19, e composições destes, que imunoespecificamente ligam-se ao antígeno de CD19 humano, que os anticorpos anti-CD19 são conjugados por um agente diagnosticado ou detectável. Em certas formas de realização, os anticorpos são humanos ou anticorpos humanizados anti-CD19. Tais anticorpos anti-CD19 podem ser úteis para o monitoramento ou prognóstico do desenvolvimento ou progressão da nocividade da célula B como parte de um procedimento do teste clínico, tal como determinação da eficácia de uma terapia particular. Uma tal diagnose e a detecção podem ser realizadas pela ligação de um anticorpo anti-CD19 que ligam-se imunoespecificamente ao antígeno de CD19 humano por um substância detectável incluindo, mas não limitando a, várias enzimas, tal como mas não limitando a, peroxidase de rábano silvestre, fosfatase acalina, beta-galactosidase, ou acetilcolinesterase; grupos prostéticos, tal como mas não limitando a, estreptavidina/biotina e avidina/biotina; materiais fluorescentes, tal como mas não limitando a, umbeliferona, fluoresceina, isotiocinato de fluoresceina, rodamina, diclorotriazinilamina fluoresceina, cloreto de dansila ou ficoeritrina; materiais luminescentes, tal como mas não limitando a, luminol; materiais bioluminescentes, tal como mas não limitando a, luciferase, luciferina, e aequorina; materiais radioativos, tal como mas não limitando a iodo (131I, 125I, 123I, 121I,), carbono (14C), enxofre (35S), trítio (3H), índio (115In, 113In, 112In, 111In,) e tecnétio (99Tc), tálio (201Ti), gálio (68Ga, 67Ga), paládio (103Pd), molibdênio (99Mo), xenônio (133Xe), flúor (18F), 153Sm, 177Lu, 159Gd, 149Pm, 140La, 175Yb, 166Ho, 90Y, 47Sc, 186Re, 188Re, 142Pr, 105Rh, 97Ru, 68Ge, 57Co, 65Zn, 85Sr, 32P, 153Gd, 169Yb, 51Cr, 54Mn, 75Se, 113Sn, e 117Tin; metais que emitem pósitron usando várias tomografias de emissão de pósitron, íons metálicos paramagnéticos não radioativos, e moléculas que são radiorotuladas ou conjugadas por radioisotopos específicos. Qualquer rótulo detectável que pode ser realmente medido pode ser conjugado por um anticorpo anti-CD19 e usado no diagnóstico da nocividade da célula B. A substância detectável pode ser ligada ou conjugada diretamente por um anticorpo ou indiretamente, através de um intermediário (tal como, por exemplo, um ligador conhecido na técnica) usando técnicas conhecidas na técnica. Ver, por exemplo, Patente U. S. N° 4.741.900 por íons metálicos que podem ser conjugados por anticorpo para o uso como um diagnóstico de acordo com a presente invenção. Em certas formas de realização, a invenção fornece para kits de diagnósticos que compreendem um anticorpo anti-CD19 conjugado por um agente diagnóstico ou detectável.

5.34. USO DE ANTICORPOS ANTI-CD19 NO MONITORAMENTO DA RECONSTITUIÇÃO IMUNE

[00624] A presente invenção também abrange anticorpos anti- CD19, e composições destes, que imunoespecificamente ligam-se ao antígeno de CD19 humano, que os anticorpos anti-CD19 são conjugados por um agente diagnóstico ou detectável. Em certas formas de realização, os anticorpos são humanos ou anticorpos humanizados anti-CD19. Tais anticorpos anti-CD19 podem ser úteis para o monitoramento da reconstituição do sistema imune seguido pelas terapias imunosupressivas ou transplantação da medula óssea. Tal monitoramento pode ser realizado pela ligação de um anticorpo anti-CD19 que ligam-se imunoespecificamente ao antígeno de CD19 humano por uma substância detectável incluindo, mas não limitando a, várias enzimas, tal como, mas não limitando a, peroxidase de rábano silvestre, fosfatase alcalina, beta-galactosidase, ou acetilcolinesterase; grupos prostéticos, tal como, mas não limitando a, estreptavidina/biotina e avidina/biotina; materiais fluorescentes, tal como, mas não limitando a, umbeliferona, fluoresceina, isoticianato de fluoresceina, rodamina, diclorotriazinilamina fluoresceina, cloreto de dansila ou ficoeritrina; materiais luminescentes, tal como, mas não limitando a, luminol; materiais bioluminescentes, tal como, mas não limitando a, luciferase, luciferina, e aequorina; materiais radioativos, tal como, mas não limitando a, iodo (131I, 125I, 123I, 121I,), carbono (14C), enxofre (35S), trítio (3H), índio (115In, 113In, 112In, 111In,) e tecnétio (99Tc), tálio (201Ti), gálio (68Ga, 67Ga), paládio (103Pd), molibdênio (99Mo), xenônio (133Xe), flúor (18F), 153Sm, 177Lu, 159Gd, 149Pm, 140La, 175Yb, 166Ho, 90Y, 47Sc, 186Re, 188Re, 142Pr, 105Rh, 97Ru, 68Ge, 57Co, 65Zn, 85Sr, 32P, 153Gd, 169Yb, 51Cr, 54Mn, 75Se, 113Sn, e 117Tin; metais que emitem pósitron usando várias tomografias de emissão de pósitron, íons metálicos paramagnéticos não radioativos, e moléculas que são radiorotuladas ou conjugadas por radioisotopos específicos. Qualquer rótulo detectável que pode ser realmente medido pode ser conjugado por um anticorpo anti-CD19 e usado no diagnóstico de uma doença ou distúrbio autoimune. A substância detectável pode ser ligada ou conjugado diretamente por um anticorpo ou indiretamente, através de um intermediário (tal como, por exemplo, um ligador conhecido na técnica) usando técnicas conhecidas na técnica. Ver, por exemplo, Patente U.S. N° 4.741.900 por íons metálicos que podem ser conjugados por anticorpos para o uso como um diagnóstico de acordo com a presente invenção. Em certas formas de realização, a invenção fornece para kits de diagnósticos que compreendem um anticorpo anti- CD19 conjugado por um agente diagnóstico ou detectável.

5.35. USO DE ANTICORPOS ANTI-CD19 NO DIAGNÓSTICO DAS DOENÇA OU DISTÚRBIOS AUTOIMUNES

[00625] A presente invenção também abrange anticorpos anti- CD19, e as composições destes, que imunoespecificamente ligam-se ao antígeno de CD19 humano, que os anticorpos anti-CD19 são conjugados por um agente diagnóstico ou detectável. Em certas formas de realização, os anticorpos são humanos ou anticorpos humanizados anti-CD19. Tais anticorpos anti-CD19 podem ser úteis para o monitoramento ou prognóstico do desenvolvimento ou progressão de uma doença ou distúrbio autoimune como parte de um procedimento de teste clínico, tal como a determinação da eficácia de uma terapia particular. Uma tal diagnose e a detecção podem ser realizadas pela ligação de um anticorpo anti-CD19 que ligam-se imunoespecificamente ao antígeno de CD19 humano por uma substância detectável incluindo, mas não limitando a, várias enzimas, tal como mas não limitando a, peroxidase de rábano silvestre, fosfatase alcalina, beta-galactosidase, ou acetilcolinesterase; grupos prostéticos, tal como mas não limitando a, estreptavidina/biotina e avidina/biotina; materiais fluorescentes, tal como mas não limitando a, umbeliferona, fluoresceina, isotiocinato de fluoresceina, rodamina, diclorotriazinilamina fluoresceina, cloreto de dansila ou ficoeritrina; materiais luminescentes, tal como mas não limitando a, luminol; materiais bioluminescentes, tal como mas não limitando a, luciferase, luciferina, e aequorina; materiais radioativos, tal como mas não limitando a iodo (131I, 125I, 123I, 121I,), carbono (14C), enxofre (35S), trítio (3H), índio (115In, 113In, 112In, 111In,) e tecnétio (99Tc), tálio (201Ti), gálio (68Ga, 67Ga), paládio (103Pd), molibdênio (99Mo), xenônio (133Xe), flúor (18F), 153Sm, 177Lu, 159Gd, 149Pm, 140La, 175Yb, 166Ho, 90Y, 47Sc, 186Re, 188Re, 142Pr, 105Rh, 97Ru, 68Ge, 57Co, 65Zn, 85Sr, 32P, 153Gd, 169Yb, 51Cr, 54Mn, 75Se, 113Sn, e 117Tin; metais que emitem pósitron usando várias tomografias de emissão de pósitron, íons metálicos paramagnéticos não radioativos, e moléculas que são radiorotuladas ou conjugadas por radioisotopos específicos. Qualquer rótulo detectável que pode ser realmente medido pode ser conjugado por um anticorpo anti-CD19 e usado no diagnóstico de uma doença ou distúrbio autoimune. A substância detectável pode ser ligada ou conjugada diretamente por um anticorpo ou indiretamente, através de um intermediário (tal como, por exemplo, um ligador conhecido na técnica) usando técnicas conhecidas na técnica. Ver, por exemplo, Patente U.S. N° 4.741.900 por íons metálicos que podem ser conjugados por anticorpos para o uso como um diagnóstico de acordo com a presente invenção. Em certas formas de realização, a invenção fornece para kits de diagnósticos que compreendem um anticorpo anti-CD19 conjugado por um agente diagnóstico ou detectável.

5.36. KITS

[00626] A invenção fornece uma embalagem ou kit farmacêutico que compreende um ou mais recipientes enchedores com a composição da invenção para a prevenção, tratamento, administração ou melhoramento da nocividade da célula B, ou um ou mais sintomas destes, potencialmente por ou em potencial pela nocividade da célula B.

[00627] A presente invenção fornece kits que podem ser usados nos métodos descritos acima. Em uma forma de realização, um kit compreende a composição da invenção, em um ou mais recipientes. Em uma outra forma de realização, um kit compreende a composição da invenção, em um ou mais recipientes, e um ou mais outros agentes terapêuticos ou profiláticos úteis para a prevenção, administração ou tratamento da nocividade da célula B, ou um ou mais sintomas destes, potencialmente por ou em potencial da nocividade da célula B em um ou mais outros recipientes. O kit ainda pode compreender as instruções para evitar, tratar, administrar ou melhorar a nocividade da célula B, bem como os efeitos colaterais e a informação da dosagem para o método da administração. Opcionalmente associado com tais recipientes podem ser uma notícia em uma forma determinada pela agência governamental que regula a fabricação, o uso ou venda dos produtos farmacêuticos ou biológicos, que a notícia reflete na aprovação pela agência de fabricação, uso ou venda para administração humana. 6. FORMA DE REALIZAÇÃO ESPECÍFICA 1. Um anticorpo quimérico, humanizado ou humano ou fragmento do mesmos que ligam-se ao antígeno de CD19 humano. 2. O anticorpo da forma de realização 1 que compreende pelo menos um CDR que compreende uma sequência de aminoácido selecionada do grupo que consiste de: SEQ ID N°: 6, 8, 10, 12, 14, 16, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, e 127. 3. O anticorpo da forma de realização 1 que compreende pelo menos um região estrutural do HB12B-(A10-Jk4), HB12B-3649, ou HB12B-364987 de região variável de cadeia leve. 4. O anticorpo da forma de realização 1 que compreende pelo menos uma região estrutural de HB12B-(3-72\JH4) ou HB12B-9m de região variável de cadeia pesada. 5. O anticorpo da forma de realização 1 que compreende pelo menos uma cadeia pesada de polipeptídeo que compreende a sequência de aminoácido selecionada do grupo que consiste de: SEQ ID N°: 2, 18, 34, 44, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, e 109. 6. O anticorpo da forma de realização 1 que compreende pelo menos uma cadeia leve de polipeptídeo que compreende uma sequência de aminoácido selecionada do grupo que consiste de: SEQ ID N°: 4, 20, 52, 62, 68, 70, 110, 111, 112, e 113. 7. O anticorpo da forma de realização 5 que ainda compreende pelo menos uma cadeia leve de CDR que compreende a sequência de aminoácido selecionada do grupo que consiste de: SEQ ID N°: 12, 14, 16, 28, 30, 32, 123, 124, 125, 126, e 127. 8. O anticorpo da forma de realização 3 que ainda compreende pelo menos uma cadeia pesada de CDR que compreende a sequência de aminoácido selecionada do grupo que consiste de: SEQ ID N°: 6, 8, 10, 22, 24, 26, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, e 122. 9. O anticorpo da forma de realização 1 que compreende pelo menos uma cadeia pesada de polipeptídeo que compreende a sequência de aminoácido selecionada do grupo que consiste de: SEQ ID N°: 2, 18, 34, 44, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, e 109, e pelo menos uma cadeia leve de polipeptídeo que compreende uma sequência de aminoácido selecionada do grupo que consiste de: SEQ ID N°: 4, 20, 52, 62, 68, 70, 110, 111, 112, e 113. 10. O anticorpo da forma de realização 1 que compreende pelo menos uma cadeia leve de polipeptídeo e pelo menos uma cadeia pesada de polipeptídeo em que a dita cadeia leve de polipeptídeo compreende uma sequência de aminoácido selecionada do grupo que consiste de: HB12A VK (SEQ ID N°: 4) e HB12B VK (SEQ ID N°: 20) e em que a dita cadeia pesada de polipeptídeo compreende uma sequência de aminoácido selecionada do grupo que consiste de: HB12A VH (SEQ ID N°: 2) e HB12B VH (SEQ ID N°: 18). 11. O anticorpo da forma de realização 1 que compreende o HB12B-(3-72\JH4) da região variável de cadeia pesada e o HB12B- 3649 da região variável de cadeia leve. 12. O anticorpo da forma de realização 1 que compreende um VH e um VK, em que o dito VH compreende a sequência de aminoácido da SEQ ID N°: 106, e em que o dito VK compreende a sequência de aminoácido da SEQ ID N°: 111. 13. Um ácido nucléico que codifica um polipeptídeo que compreende uma sequência de aminoácido selecionada do grupo que consiste de: SEQ ID N°: 2, 18, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, e 109. 14. Um ácido nucléico que codifica um polipeptídeo que compreende uma sequência de aminoácido selecionada do grupo que consiste de: SEQ ID N°: 4, 20, 52, 62, 64, 66, 68, 70, 110, 111, 112, e 113. 15. Um vetor que compreende o ácido nucléico da forma de realização 13 e/ou 14. 16. Uma célula isolada que compreende o vetor da forma de realização 15. 17. Uma célula isolada que expressa o anticorpo como em qualquer da forma de realização 1 a 12. 18. Um método de produção de um anticorpo que compreende a cultura da célula isolada da forma de realização 17 sob as condições suficientes para a produção do anticorpo e recuperação do anticorpo a partir da cultura. 19. A composição farmacêutica que compreende o anticorpo como em qualquer da forma de realização 1 a 12 no carreador aceitável farmaceuticamente. 20. A composição farmacêutica da forma de realização 19, em que o anticorpo é do isotipo humano IgG1, IgG2, IgG3, ou IgG4. 21. Um método para tratar a nocividade da célula B em um ser humano que compreende administrar a um ser humano em necessidade desta quantidade terapeuticamente eficaz do anticorpo como em qualquer da forma de realização 1 a 12. 22. Um método para tratar uma doença ou distúrbio autoimune em um ser humano, que compreende administrar a um ser humano em necessidade desta quantidade terapeuticamente eficaz do anticorpo como em qualquer da forma de realização 1 a 12. 23. Um método para tratar ou prevenir a rejeição humoral em um paciente de transplante humano, que compreende administrar a um ser humano em necessidade desta quantidade terapeuticamente eficaz do anticorpo como em qualquer da forma de realização 1 a 12. 24. O anticorpo como em qualquer da forma de realização 1 a 12, em que o dito anticorpo das células B esgotadas com a mesma eficiência como do anticorpo HB12B monoclonal de murino. 25. O anticorpo como em qualquer da forma de realização 1 a 12, em que o dito anticorpo induz a apoptose da célula B. 26. O anticorpo como em qualquer da forma de realização 1 a 12, em que o dito anticorpo tem cadeias de açúcar ligado ao glicosídeo do complexo N que ligam-se à região Fc em que a fucose não é ligada por N-acetilglucosamina no final da redução da cadeia de açúcar. 27. O anticorpo como em qualquer da forma de realização 1 a 12, em que o dito anticorpo é uma variante do anticorpo Fc em que a dita variante Fc compreende as mutações que resultam na atividade ADCC intensificada. 28. Um método % da depleção das células B em um paciente ser humano que compreende administrar a um ser humano em necessidade desta quantidade terapeuticamente eficaz do anticorpo como em qualquer da forma de realização 24 a 27. 29. O anticorpo como em qualquer da forma de realização 1 a 12, em que o dito anticorpo é uma variante do anticorpo Fc em que a dita variante Fc tem uma afinidade para o receptor Fc FCYRIIIA que é pelo menos de cerca de 5 vezes menor do que de uma molécula comparável, em que a dita variante Fc tem uma afinidade para o receptor Fc FcyRIIB que está dentro de cerca de 2 vezes do que da molécula comparável. 30. Um método % da depleção das células B em um paciente ser humano que compreende administrar a um ser humano em necessidade desta quantidade terapeuticamente eficaz do anticorpo da forma de realização 29.

7. EXEMPLOS 7.1. CONSTRUÇÃO, EXPRESSÃO E CARACTERÍSTICAS DA LIGAÇÃO DOS ANTICORPOS HUMANIZADOS ANTI-CD19

[00628] Seguido pela seção que descreve o projeto e a construção da variante quimérica do anticorpo HB12B parenteral (chHB12B) em que a cadeia pesada de camundongo e as regiões constantes de cadeia leve foram substituídas com IgHYl humano e regiões de IgLK humano, respectivamente. Estas seções também descrevem as estratégias para a geração da variante humanizada de HB12B pesado e a região variável de cadeias leves.

[00629] A atividade da ligação CD19 dos anticorpos produzidos de várias combinações de pesado (quimérico ou humanizado) e região variável de cadeia leve também é descrita. Por exemplo, as formas humanizadas de HB12B que exibem um perfil da ligação CD19 comparável aqueles de chHB12B que estão descritos.

[00630] As seções abaixo também descrevem as diversas mutações nas regiões estruturais humanas que, quando introduzidos em certos anticorpos humanizados anti-CD19, o resultado em ligação humana CD19 comparável àquela dos anticorpos de referência, chHB12B que compreende HB12B VH e HB12B VK. No VK estes resíduos compreendem, por exemplo, os resíduos Vernier F36 e H49 e resíduo Interchain F87.

7.1.1. SESSÃO DO GENE E CLONAGEM DE EXPRESSÃO

[00631] As construções foram geradas por um PCR com base na sessão do método do gene primeiro descrito por Stemmer (Stemmer, W. P. et al. 1995 Gene, 164:49-53). Este método consiste de quatro etapas: oligosíntese de nucleotídeo; sessão do gene; amplificação do gene e clonagem. Oito iniciadores específicos por genes foram sintetizados para cada segmentos VH e VK. O iniciador representativo apresenta a sessão da região HB12B-(3-72/JH4) VH e o HB12B-(A10- Jk4) VK são mostrados na Tabela 3; os iniciadores apresentam regiões de variante VH e VK que compreendem substituições de aminoácido específico e foram gerados pela modificação da sequência do ácido nucléico dos iniciadores que codificam o dado resíduo do aminoácido. Os iniciadores foram projetados para sobrepor pelos nucleotídeos 15 a 20 e foram ligados na região variável completo durante o ciclo térmico. No caso de VH, um vetor adicional de iniciadores específicos (Universal VH FW na Tabela 3.) foi incluído na sessão mediada por PCR do processo do gene. Os iniciadores externos 5’ e 3’ para a região VH incorporado em um único local de reconhecimento para a endonuclease de restrição XbaI e ApaI, respectivamente, para ajudar com as etapas de clonagem subsequente. Os iniciadores externos 5’ e 3’ para o VK incorporado em um único local de reconhecimento para a endonuclease de restrição XmaI e BsiWI, respectivamente, para ajudar com as etapas de clonagem subsequente. Os produtos de PCR do tamanho correto foram de restrição digerida e ligado na estrutura e um vetor de expressão em que as regiões VH foram digeridas com XbaI e ApaI, e as regiões VK foram digeridas com XmaI e BsiWI de acordo com as instruções do fabricante. O vetor usado para a cadeia pesada na sessão que compreende os elementos de controle da transcrição eucariótica operavelmente ligada ao polinucleotídeo que codifica o líder MGDNDIHFAFLSTGVHS VH (SEQ ID N°: 83) e uma região constante humana IgHYl em que os ditos elementos de controle de transcrição que compreende um promotor precocemente imediato por CMV e um sinal de adição poli A SV40. Os usos de iniciadores projetados apropriadamente para a sessão VH garantida que a seqüência de polinucleotídeo que codifica o líder VH, região VH e região constante IgHYl foram ligadas na estrutura dentro da cadeia final pesada do vetor de expressão. O vetor para a sessão da cadeia leve compreende elementos de controle da transcrição eucariótica operavelmente ligada ao polinucleotídeo que codifica o líder VKI-L12 humano (sequência de aminoácido MDMRVPAQLLGLLLLWLPGAKC (SEQ ID N°: 84); Bentley, D. L. & Rabbitts, T. H., Nature 288,730-733 (1980)) e uma região constante humano IgLK em que o dito elemento de controle de transcrição compreende um promotor precocemente imediato por CMV e um sinal adicional de poli A SV40. O uso de iniciadores projetados apropriadamente para a sessão VK garantida que as sequências de polinucleotídeos que codificam o líder VKI-L12, a região VK e a região constante IgLK foram ligadas na estrutura dentro da cadeia final leve do vetor de expressão. O produto de ligação como usado para transformar as células DH10B competentes de E. coli de acordo com os protocolos dos fabricantes. As colônias contendo o plasmídeo e um suplemento de tamanho correto pode ser identificado usando vários métodos conhecidos na técnica (por exemplo restrição digesta da preparação do vetor de DNA, amplificação de PCR das sequências do vetor). Os clones do plasmídio com suplemento do tamanho correto foram sequenciados usando a reação de sequenciamento de dideóxi (por exemplo, BigDye® Terminator v3.0 Cycle Sequencing Ready Reaction Kit, ABI). O DNA do plasmídio foi preparado de clones selecionados usando o kit de plasmídio QIAGEN Mini e Maxi de acordo com os protocolos dos fabricantes.

[00632] Os pares do plasmídio de DNA das preparações do vetor de expressão que codificam uma imunoglobulina humanizada ou quimérica de cadeia pesada e uma imunoglobulina humanizada ou quimérica de cadeia leve e foram usadas para co-transfectar as células HEK293. Estas células co-transfectadas HEK293 e foram cultivadas por três dias para produzirem o meio condicionado contendo o anticorpo adequado para a determinação das concentrações IgG totais e atividade de ligação CD19.

[00633] As concentrações Ig totais no sobrenadante da célula HEK293 foram quantificados usando um ensaio ELISA de captura. As moléculas de IgG foram capturadas em uma placa de 96 reservatórios por intermédio de um anticorpo específico IgG H+L anti-humano de cabra imobilizado, e detectado com um anticorpo de cadeia leve de capa anti-humano conjugado por HRP. O ensaio foi ajustado usando um IgG1 mAb de referência de especificidade irrelevante.Tabela 3. O iniciador representativo apresenta a região HB12B-(3- 72/JH4) VH e a sessão da região HB12B-(A10-Jk4) VK. Os nucleotídeos específicos do gene são marcados na parte superior, os nucleotídeos específicos pelo vetor são marcados em casos inferiores. O local de reconhecimentos para a endonuclease da restrição usado para a clonagem do fragmento VH e VK são sublinhados.

7.1.2. O ENSAIO DE LIGAÇÃO 300B4-CD19

[00634] A atividade de ligação CD19 foi avaliada usando um ensaio de ELISA humano de CD19 recombinante com base na célula em que o dito ensaio foi realizado usando as concentrações equivalentes de cada anticorpo humanizado ou quimérico, por meio disso facilitando as comparações diretas entre as versões humanizadas alternativas do anticorpo HB12B e chHB12B.

[00635] A capacidade de chHB12B e estas variantes humanizadas por ligar-se ao hCD19 foi avaliada no ensaio de ligação de CD19 com base na célula utilizando as células 300B4 que expressam o CD19 de superfície celular recombinante humano como um agente de captura. As células 300B4 foram cultivadas de acordo com protocolos padrões no meio RPMI 1640 contendo L-glutamina e suplementado com 10 % de soro de bezerro fetal, β-mercaptoetanol na presença de 1mg/ml de G418. Um protocolo de padrão ELISA pode ser usado por uma célula com base no ensaio de ligação CD19. Por exemplo, os reservatórios individuais de uma placa com fundo em U com 96 reservatórios são semeados com células 1 x 10e5 300B4 e incubadas durante a noite. As células são lavadas uma vez com tampão de ELISA antes da incubação em gelo com anticorpos humanos, humanizados, ou quiméricos HB12B. As reações de ligação são realizadas em triplos para cada concentração de anticorpo testado. Os reservatório de controle negativo usando um isotipo comparado ao anticorpo de especificidade irrelevante que deve ser incluído no ensaio. Seguido pela incubação com o anticorpo 300B4 das células e são lavadas três vezes com 200 microlitro de tampão de ELISA. A quantidade de anticorpos humanos anti-CD19 quiméricos, humanizados ou humanos ligam-se as células 300B4 e podem detectados usando um anticorpo de capa anti-humano de cabra conjugado com peroxidase de rábano silvestre de acordo com os protocolos padrões.

7.1.3. CONSTRUÇÃO, EXPRESSÃO E CARACTERÍSTICAS DA LIGAÇÃO DE chHB12B

[00636] Um vetor de expressão que codificam a cadeia pesada chHB12B que compreende o HB12B VH de murino e as regiões constantes IgHYl humanas e foi construída de acordo com os métodos descritos na sessão 6.1. Um vetor de expressão que codifica a cadeia leve chHB12B que compreende o HB12B VK de murino e as regiões constantes de IgLK humanos foram construídos de acordo com os métodos descritos na sessão 6.1.

[00637] As células HEK293 foram co-transfectadas simultaneamente com o vetor de expressão que codifica as cadeias leves e pesadas chHB12B. Estas células transfectadas foram cultivadas por três dias para permitir uma produção de anticorpo. O meio de cultura contendo anticorpo solúvel, secretado por chHB12b foi coletado, e a concentração do anticorpo chHB12B como determinado de acordo com o método descrito na sessão 6.1.

[00638] A ligação chHB12B pelo CD19 humano foi avaliada usando o ensaio ELISA com base na célula 300B4 descrito na sessão 6.2. Um anticorpo humano comparado pelo isotipo de especificidade irrelevante foi incluído no ensaio como um controle negativo. Os resultados obtidos usando um ensaio ELISA com base na célula mostrou que para as concentrações do anticorpo acima de 100 ng/ml, aqui foi uma ligação significante de anticorpo quimérico pelo CD19 humano recombinante expressado na superfície das células 300B4, indicando que o chHB12B tem mantido a atividade de ligação hCD19 (Figura 2).

7.1.4. CONSTRUÇÃO DO HB12B VH HUMANIZADO QUE CODIFICA A EXPRESSÃO DO VETOR

[00639] Seguido pela seção descrevem o projeto das variantes humanizadas da região HB12B VH que compreende as regiões CDR de HB12B de murino e as regiões estruturais humanas substancialmente ou humanas adequadas. Estas seções também descrevem as estratégias para a geração de variantes de cadeias pesadas HB12B Ig humanizadas.

7.1.4.1. Identificação de regiões estruturais aceitáveis de cadeia pesada

[00640] Uma sequência de banco de dados de aminoácidos contendo os resíduos estruturais de todos as regiões de cadeia pesada de imunoglobulina da linha germinativa humana V, D, e J foram compiladas. A informação necessária pode ser obtida de uma variedade de fontes, por exemplo base V: os banco de dados dos genes dos anticorpos humanos (http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/). Os banco de dados foram requeridos para os segmentos da linha germinativa humana V e J que apresentam a similaridade das sequências com as regiões estrutural correspondente do HB12b VH de murino em resíduos chaves, por exemplo resíduos canônicos, interchain e Vernier.

[00641] Os segmentos das linhas germinativas humanas V3-72 (Tomlinson, I. M. et al., J. Mol. Biol., 227:776-798 (1992)) e JH4 (Ravetch, J. V. et al., Cell 27: 583-591 (1981)) foram selecionados por servir como uma estrutura aceitável para a humanização do anticorpo anti-CD19 HB12B de murino.

7.1.4.2. GERAÇÃO DE CADEIAS PESADAS HB12B HUMANIZADOS

[00642] O HB12B-(3-72/JH4) VH (SEQ ID N°: 34) foi projetado pela combinação dos CDRs de HB12B VH com os resíduos estruturais das regiões da linha germinativa humana V3-72/JH4. Um vetor de expressão que compreende HB12B-(3-72/JH4) VH foi gerado de acordo com os métodos descritos na sessão 6.1.

[00643] O HB12B-9m VH (SEQ ID N°: 44) é uma variante de HB12B-(3-72/JH4) VH que compreende o seguido pelas nove substituições de aminoácido: L20I, F27Y, T28A, R38I, V49I, F67A, R71A, L80M, ,I91Y (resíduos numerados de acordo com Kabat). Os iniciadores específicos pelo gene por HB12B-9m foram projetados como descrito na seção 6.1. Um vetor de expressão que compreende HB12B-9m VH foi gerado de acordo com os métodos descritos na sessão 6.1.

7.1.5. Construção de HB12B Ig humanizado de cadeia leve que codifica os vetores de expressão

[00644] Seguido pela seção descrevem o projeto das variantes humanizadas da região HB12B VK que compreende as regiões HB12B CDR de murino e regiões estruturais substancialmente humanas ou humanas adequadas. Esta seção também descreve a estratégia para a geração de variantes de HB12B Ig humanizado de cadeia leve.

7.1.5.1. IDENTIFICAÇÃO DAS REGIÕES ESTRUTURAIS ACEITÁVEIS DA CADEIA LEVE HUMANA

[00645] Uma sequência de banco de dados de aminoácidos contendo os resíduos estruturais de todos as regiões de cadeia leve de imunoglobulina da linha germinativa humana V e J foram compiladas. A informação necessária pode ser obtida de uma variedade de fontes, por exemplo da base V: os bancos de dados de genes de anticorpo humano (http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/). Os bancos de dados foram requeridos para os segmentos da linha germinativa humana V e J que apresentam a similaridade das sequências com as regiões estruturais correspondentes dos resíduos chaves em HB12B VK de murino, por exemplo resíduos canônicos, interchain e Vernier.

[00646] Os segmentos das linhas germinativas humanas Vk A10 (Straubinger, B. et al., Biol. Chem. Hoppe-Seyler 369:601-607 (1988)) e Jk4 (Hieter, P. A. et al., J. Biol. Chem.257:1516-1522 (1982)) foram selecionados por servir como uma estrutura aceitável para a humanização do anticorpo anti-CD19 HB12B de murino.

7.1.5.2. GERAÇÃO DE CADEIAS LEVES HB12B HUMANIZADAS

[00647] O HB12B-(A10-Jk4) VK (SEQ ID N°: 52) foi projetado pela combinação dos CDRs HB12B VK com os resíduos estruturais das regiões da linhas germinativa humana A-10/Jk4. Um vetor de expressão que compreende HB12B-(A10-Jk4) VK foi gerado de acordo com o método descritos na sessão 6.1.

[00648] O HB12B-364987 VK (SEQ ID N°: 62) é uma variante de HB12B-(A10-Jk4) VK que compreende o seguido pelas substituições de três aminoácidos: Y40F, K53H, Y91F (resíduos numerados de acordo com Kabat). Os iniciadores específicos pelo gene por HB12B- 364987 foram projetados como descrito na seção 6.1. Um vetor de expressão que compreende HB12B-364987 VK foi gerado de acordo com o métodos descritos na sessão 6.1.

7.1.6. Caracteristícas de ligação dos anticorpos HB12B humanizados

[00649] Os pares do plasmídio das preparações do vetor de DNA de expressão que codificam as cadeias de imunoglobulina pesada e leve (humanizado ou quimérico) foram usados para transferir as células HEK293. Estas células transfectadas HEK293 foram cultivadas por três dias para produzirem o meio condicionado contendo o anticorpo adequado para a determinação da concentrações IgG totais e a atividade de ligação CD19.

[00650] A atividade de ligação humana CD19 de anticorpos HB12B humanizado e quimérico foi avaliado usando um ensaio de ELISA com base na célula 300B4 descritos na sessão 6.2. Um anticorpo humano comparado ao isotipo de especificidade irrelevante foi incluído no ensaio como um controle negativo. Como mostrado na Figura 2, a ligação de um anticorpo quimérico que compreende a cadeia pesada chHB12B e leve chHB12B e o anticorpo novo humanizado #1 que compreende HB12B-(3-72/JH4) VH e regiões HB12B-364987 VK foram observados serem comparáveis. Para as concentrações de anticorpo acima de 100 ng/ml, aqui foi uma ligação específica significante de ambos os anticorpos por CD19, indicando que o anticorpo anti-CD19 humanizado #1 que compreende as regiões HB12B-(3-72/JH4) VH e HB12B-364987 VK tem mantido a atividade de ligação CD19. Inesperadamente, os anticorpos humanizados que compreendem a região HB12B-9m VH apresentou uma perda significante em CD19 comparado ao controle chHB12B.

[00651] Os pares dos níveis de cadeias pesadas e leves quiméricas ou humanizadas HB12B foram testadas e seus CD19 da atividade de ligação humana é resumida na Tabela 4. Tabela 4. Ligação de CD19 de anticorpos HB12B humanizados e quiméricos. A atividade de ligação CD19 de vários anticorpos quiméricos e humanizados HB12B foram avaliados usando um ensaio ELISA com base celular. As combinações VH-VK que apresentam a atividade de ligação significante são marcados com “++”. As combinações VH-VK com nenhuma ligação significante pelo CD19 humano são marcados com “-“.

7.1.7. CONSTRUÇÃO, EXPRESSÃO E CARACTERÍSTICAS DA LIGAÇÃO DAS CADEIAS LEVES HB12B HUMANIZADAS

[00652] Os protocolos da humanização do anticorpo no geral tentar limitar os diversos resíduos estruturais não humanos a fim de minimizar a resposta HAMA. Consequentemente, as variantes adicionais do HB12B VK humanizado foram gerados e suas atividades de ligação hCD19 foi avaliada.

[00653] O HB12B-3649 VK (SEQ ID N°: 68) é uma variante de HB12B-(A10-Jk4) VK que compreende o seguido pelas duas substituições de aminoácido: Y40F, K53H (numeração de acordo com Kabat). Um vetor de expressão que compreende HB12B-3649 VK foi gerado por intermédio de um local direcionado a mutagênese usando o kit QuickChange (Stratagene, La Jolla, CA) em uma preparação de DNA de um vetor de expressão que compreende HB12B-364987 VK de acordo com as instruções do fabricante.

[00654] O HB12B-3687 VK (SEQ ID N°: 74) é uma variante de HB12B-(A10-Jk4) VK que compreende o seguido pelas duas substituições de aminoácidos: Y40F, e Y91F (numeração de acordo com Kabat). Um vetor de expressão que compreende HB12B-3687 VK foi gerado por intermédio de um local direcionado à mutagênese usando o kit QuickChange (Stratagene, La Jolla, CA) em uma preparação de DNA de um vetor de expressão que compreende HB12B-364987 VK de acordo com as instruções do fabricante.

[00655] O HB12B-4987 VK (SEQ ID N°: 76) é uma variante de HB12B-(A10-Jk4) VK que compreende o seguido pelas duas substituições de aminoácidos: K53H, e Y91F (numeração de acordo com Kabat). Um vetor de expressão que compreende HB12B-4987 VK foi gerado por intermédio de um local direcionado a mutagênese usando o kit QuickChange (Stratagene, La Jolla, CA) em uma preparação de DNA de um vetor de expressão que compreende HB12B-364987 VK de acordo com as instruções do fabricante.

[00656] O HB12B-36 VK (SEQ ID N°: 70) é uma variante de HB12B-(A10-Jk4) VK que compreende a seguinte substituição do ácido: Y40F (numeração de acordo com Kabat). Um vetor de expressão que compreende HB12B-36 VK foi gerado pelo intermédio de um local direcionado a mutagênese usando o kit QuickChange (Stratagene, La Jolla, CA) em uma preparação de DNA de um vetor de expressão que compreende HB12B-(A10-Jk4) VK de acordo com as instruções do fabricante.

[00657] O HB12B-49 VK (SEQ ID N°: 80) é uma variante de HB12B-(A10-Jk4) VK que compreende a seguinte substituição de aminoácido: K53H (numeração de acordo com Kabat). Um vetor de expressão que compreende HB12B-49 VK foi gerado por intermédio de um local direcionado a mutagênese usando o kit QuickChange (Stratagene, La Jolla, CA) em uma preparação de DNA de um vetor de expressão que compreende HB12B-(A10-Jk4) VK de acordo com as instruções do fabricante.

[00658] O HB12B-87 VK (SEQ ID N°: 78) é uma variante de HB12B-(A10-Jk4) VK que compreende a seguinte substituição de aminoácido: Y91F (numeração de acordo com Kabat). Um vetor de expressão que compreende HB12B-87 VK foi gerado por intermédio de um local direcionado a mutagênese usando o kit QuickChange (Stratagene, La Jolla, CA) em uma preparação de DNA de um vetor de expressão que compreende HB12B-(A10-Jk4) VK de acordo com as instruções do fabricante.

[00659] Os pares do plasmídio de preparações do DNA do vetor de expressão que codifica uma cadeia pesada que compreende HB12B- (3-72/JH4) VH e cada uma das variantes VK descritos na sessão 6.1.7. foram usados para co-transfectar as células HEK293. Estes células co-transfectadas HEK293 foram cultivadas por três dias para produzirem o meio condicionado humanizado contendo o anticorpo adequado para a determinação das concentrações IgG totais e a atividade de ligação hCD19.

[00660] A atividade de ligação humana CD19 do anticorpos HB12B humanizados foi avaliado usando um ensaio ELISA com base na célula 300B4 descrito na sessão 6.1.2. O chHB12B foi incluído no ensaio como um controle positivo. Como mostrados na Figura 3, a ligação do anticorpo chHB12B que compreende chHB12B VH e chHB12B VK e o novo anticorpo HB12B humanizado #2 que compreende HB12B-(3-72/JH4) VH e HB12B-3649 VK foram observados serem comparáveis. Para as concentrações de anticorpo acima de 100 ng/ml, aqui foi uma ligação específica significante de ambos anticorpos por hCD19, indicando que o anticorpo humanizado que compreende HB12B-(3-72/JH4) VH e HB12B-3649 VK retenedo a atividade de ligação hCD19. O anticorpo HB12B humanizado #1 que compreende o HB12B-364987 VK também apresentou a ligação do CD19 humano. O anticorpo HB12B humano #3 que compreende HB12B-36 VK exibiram significantemente a redução da ligação pelo hCD19 comparado à ligação do anticorpo do controle chHB12B.

[00661] Retirado junto, estas datas indicam que diversas versões humanizadas das cadeias HB12B VH e VK foram criadas para reter que as propriedades da ligação dos derivados do anticorpo de camundongo parenteral a partir do hibridoma HB12B.

7.2. ATIVIDADE ADCC IN VITRO DOS ANTICORPOS HUMANIZADOS ANTI-CD19 .

[00662] Seguido pela seção que descreve a caracterização da atividade ADCC in vitro dos anticorpos humanizados anti-CD19 .

7.2.1. PREPARAÇÕES DE ANTICORPO ANTI-CD19 HUMANIZADOS.

[00663] O anticorpo anti-CD19 #2 humanizado purificado que compreende a região constante da cadeia pesada HB12B-(3-72/JH4) VH, HB12B-3649 VK, e IgG1 (depois disso referido como “anticorpo 3649” ou “3649”) é preparado usando as técnicas padrões. Resumidamente, um plasmídio da preparação do vetor de DNA da expressão que codifica os níveis de cadeia pesada e leve de 3649 é usada para transferir as células HEK293F. As células transfectadas são alimentadas no dia 3 e 6 e o meio condicionado contendo o anticorpo é coletado no dia 9. O anticorpo é purificado a partir do meio condicionado usando uma coluna de proteína A pré-emitida (GE Healthcare). O anticorpo é eluído a partir da coluna com baixo tampão de pH, neutralizado, e dialisado contra PBS. A concentração do anticorpo purificado é calculado a partir da densidade óptica de solução em 280 nm.

[00664] Um anticorpo do vetor de expressão que codifica uma variante 3649 Fc que compreende S239D, A330L, e I332E nas substituições de aminoácido (depois disso referido como “3649-3M”) é gerada usando os métodos descritos em US 2004/0132101 e US 2005/0054832, ambos por Lazar et al.. Resumidamente, o anticorpo de vetor de expressão que codifica 3649 é modificado usando um local direcionado ao kit de mutagênese (por exemplo, QuickChange (Promega)) pela introdução das substituições de nucleotídeo necessária na seqüência de polinucleotídeo que codifica a região constante da cadeia pesada para gerar o anticorpo 3649-3M do vetor de expressão. O anticorpo 3649-3M purificado é gerado pela transfecção das células HEK239F com o anticorpo do vetor de expressão 3649-3M. As células transfectadas são alimentadas no dia 3 e 6 e o meio condicionado contendo o anticorpo é coletado no dia 9. O anticorpo é purificado a partir do meio condicionado usando uma coluna de proteína A de pré-emissão (GE Healthcare). O anticorpo é eluído a partir da coluna com baixo tampão de pH, neutralizado, e dialisado contra PBS. A concentração do anticorpo purificado é calculado a partir da densidade óptica de solução em 280 nm.

[00665] Um anticorpo do vetor de expressão que codifica uma variante 3649 Fc que compreende o L234F, L235E, e substituições do aminoácido P331S (depois disso referido como “3649-TM”) é gerado usando os métodos descritos em US 2004/0132101 e US 2005/0054832, ambos por Lazar et al., cada um que é incorporado neste pela referência em sua totalidade. Resumidamente, o anticorpo do vetor de expressão que codifica 3649 é modificado usando um local direcionado ao kit de mutagênese (por exemplo, QuickChange (Promega)) pela introdução das substituições do resíduo de nucleotídeo necessário na seqüência do polinucleotídeo que codifica a região constante da cadeia pesada para gerar o anticorpo do vetor de expressão 3649-TM. O anticorpo 3649-TM purificado é gerado pela transfecção das células HEK239F com o anticorpo 3649-TM do vetor de expressão. As células transfectadas são alimentadas no dia 3 e 6 e o meio condicionado contendo o anticorpo é coletado no dia 9. O anticorpo é purificado a partir do meio condicionado usando uma coluna de proteína A de pré-emissão (GE Healthcare). O anticorpo é eluído a partir da coluna com baixo tampão de pH, neutralizado, e dialisado contra PBS. A concentração do anticorpo purificado é calculado a partir da densidade óptica de solução em 280 nm.

[00666] Uma composição de anticorpo 3649 (depois disso referido como 3649-aFuc) que compreende uma pluralidade dos anticorpos tendo as cadeias dos açúcares ligados ao complexo do glicosídeo N ligado ao Asn297 da região Fc em que a fucose não é ligada pelo N- acetilglucosamina no final da redução foi preparado de acordo com os métodos apresentados em US 6.946.292 por Kanda et al., que é incorporado neste pela referência em sua totalidade. Resumidamente, as células CHO eliminadas por fucosiltransferase são transfectadas com o plasmídio do vetor de DNA da preparação da expressão que codifica os níveis das cadeias pesadas e leves de 3649. As células transfectadas são alimentadas no dia 3 e 6 e o meio condicionado contendo o anticorpo é coletado no dia 9. O anticorpo é purificado a partir do meio condicionado usando uma coluna de proteína A de pré- emissão (GE Healthcare). O anticorpo é eluído a partir da coluna com baixo tampão de pH, neutralizado, e dialisado contra PBS. A concentração do anticorpo purificado é calculado a partir da densidade óptica da solução em 280 nm.

[00667] As preparações do anticorpo foram substancialmente puras a partir das proteínas de contaminação como demonstrado na Figura 4. A afinidade de ligação por antígeno de 3649-aFuc é comparável aquele 3649 como mostrados na Figura 5.

7.2.2. ENSAIO ADCC IN VITRO

[00668] O ensaio de citoxicidade não radioativa CytoTox 96® (Promega) é uma alternativa colorimétrica pelos ensaios de citoxicidade de liberação 51Cr. O ensaio de CytoTox 96® quantitativamente mede a desidrogenase de lactato (LDH), um enzima citosólica estável que é liberada na lise da célula. O LDH liberado nos sobrenadantes de cultura é medido com um ensaio enzimático ligado por 30 minutos, que resulta na conversão de um sal de tetrazólio (INT) no produto formazan vermelho. A quantidade da cor formada é proporcional a diversas células lisadas.

[00669] Os ensaios são realizados de acordo com as direções do fabricante. Resumidamente, o alvo das células são lavadas com PBS, recolocados em suspensão pelo meio livre de fenol RPMI-5 em uma densidade celular de 0,4 x 106 /ml. As células efetivas NK são lavadas uma vez em PBS e recolocados em suspensão no meio livre de fenol RPMI-5 em uma densidade celular 1 x 106 /ml. Os ensaios são realizados nas placas da parte funda em U de 96 reservatórios. Cada placa do ensaio inclui uma combinação de recipientes experimentais e de controle. Os recipientes experimentais são apresentados pela combinação de 50 μl da diluição do anticorpo apropriado, 50 ul da suspensão celular alvo e 50 ul da suspensão celular efetiva. As densidades das células descritas acima resultam em um alvo 1:2,5 para a razão celular efetiva; estoque celular efetivo ainda pode ser diluído ou concentrado se um alvo diferente para a razão efetiva seja desejado. Os diversos tipos diferentes de recipientes de controle são usados para contar para (i) as células alvo da forma de liberação de LDH espontâneas (alvo espontâneo), (ii) as células efetivas a partir da liberação de LDH espontânea (efetivos espontâneos), (iii) a liberação LDH máxima a partir das células alvos (alvo máximo) e (iv) a presença de contaminantes no meio de cultura (fundamento). Todos os recipientes no uso em uma placa de 96 reservatórios contém o mesmo volume final. As reações são apresentadas em triplos. Seguido pela placas de apresentação são rotacionados em 120 x g por 3 minutos pelos grânulos das células. As placas incubadas em 37° C/ 5 % de CO2 por 4 horas. Quarenta e cinco minutos antes do final da incubação 15 μl do tampão de lise fornecido pelo fabricante é adicionado ao reservatório de controle de liberação máximo da célula alvo. Depois da incubação a placa é centrifugada em 120 x g por 4 minutos. 50 μl do sobrenadante a partir de cada reservatório é transferido por uma nova placa de 96 reservatórios de fundo plano. 50 μl da mistura de substrato reconstitutivo (reunido a partir dos componentes fornecidos pelo fabricante) é adicionado e a placa é incubada em temperatura ambiente de 10 a 20 minutos protegidos da luz. 50 μl do tampão de interrupção fornecido pelo fabricante é adicionado e a absorbância em 490 ou 492 nm é medido em um leitor de placa. Iguais as % da citotoxicidade (efetivo experimentos espontâneos - alvo espontâneo)/(alvo máximo - alvo espontâneo). Antes de calcular todos os % da citotoxicidade, outros valores são reduzidos pelo fundamento.

[00670] O 3649 eficientemente recruta as células efetivas por células de alvo que expressam o CD20 humano em um ensaio ADCC. A atividade ADCC da forma afucosilada (3649-aFuc) ainda é mais robusto. Os Fcs das variantes com a afinidade aumentada ou diminuída (3649-3M) (3649-TM) pelos receptores Fcy que apresenta aumento ou diminuição, respectivamente, a atividade ADCC como esperado. A atividade ADCC foi observado com ambas células alvos humanas isoladas imortalizadas e recente. Uma amostra representativa dos dados experimentais que suportam estas declarações está presente nas Figuras 5 a 9.

7.2.3. ANTICORPO ANTI-CD19 IN VITRO MEDIADO POR ADCC É INFLUENCIADO PELA AFINIDADE DE REGIÃO FC PELO RECEPETOR FcyRIIIA.

[00671] A afinidade de ligação relativa de vários anticorpos anti- CD19 humanizados para as preparações pelo receptor FcyRIIIA humano (CD16) podem ser determinado usando um ensaio de ELISA. As placas de microlitros são revestidas com 50 μl da preparação do anticorpo (50 μg/ml) em 4° C durante a noite. Quaisquer locais de ligação remanescentes são bloqueados com 4 % de leite desnatado em tampão PBS (tampão bloqueado) por 1 hora a 37° C. Depois das lavagens nos reservatórios, 50 μl da proteína de FcYRIIIA-flag monomérico diluído em séries e é adicionado para cada reservatório e incubado por 60 minutos em 37° C. 50 μl de 2,5 μg/ml de anti-flag-ME- biotina (Sigma) é adicionado para cada reservatório e incubado por 30 minutos a 37° C. Os reservatórios são lavados entre a incubação com cada um dos seguintes reagentes. 50 μl de 0,1 μg/ml de HRP conjugado por avidina (PIERCE) é adicionado para cada reservatório e incubado por 30 minutos a 37° C. a detecção é realizada pela adição de 30 μl de substrato de tetrametilbenzidina (TMB) (Pierce) seguido pela neutralização com 30 μl de 0,2 M de H2SO4. A absorbânciafoi lido em 450 nm.

[00672] Como mostrado na Figura 15, a afinidade de ligação da variante ADCC intensificada do anticorpo Fc 3649 (3649-3M) e anticorpo 3649 afucosilado (3649-aFuc) por FcgRIIIA é mais altas do que dos anticorpos do tipo selvagem 3649 fucosilados. O experimento foi realizado usando uma proteína FcYRIIIA-flag que compreende o domínio extracelular da alta afinidade V158 de isoformas de FCYRIIIA humanos.

[00673] A interação da região Fc do receptor Fc, e deste modo a função efetiva de um anticorpo, também são influenciado pelas variações alélicas no receptor Fc. O efeito da alta afinidade e baixa afinidade dos receptores FcgRIIIA em ADCC e podem ser estudados pela realização das reações ADCC com células efetivas recentemente isoladas NK que compreendem os receptores das variantes alélicas diferentes. A Figura 16 resume o resultado de um tal experimento. As reações ADCC são realizadas como descrito acima usando as células alvo Daudi. Os anticorpos anti-CD19 #2 tanto fucosilados (3649) quanto afucosilados (3649-aFuc) são testados. As reações de controle são feitas usando um anticorpo anti-CD20. As células efetivas de NK são isoladas a partir dos doadores saudáveis seguido pelos protocolos padrões. O genotipo da célula NK pode ser determinado utilizando as reações PCR específicos alélicos (ver, Leppers-van de Straat et al., J Immunol Methods. 242(1-2):127-32 (2000)). A Figura 16 A e B mostram que todos os três anticorpos testados apresentam a atividade ADCC sob uma condição de reação usada. A atividade ADCC é detectável usando uma linha celular NK (A) ou células recentemente isoladas de NK (B) como efetivas. As células de NK que compreendem pelo menos uma cópia de isoformas de alta afinidade do receptor FcyRIIIA (genotipos V158/V158 e V158/F158) são mais eficiente das células efetivas do que dos homozigotos das células NK para os alelos receptores de baixa afinidade (genotipo F158/F158) (Figura 16C a E). A perda da fucosilação aumenta a atividade ADCC de um anticorpo com respeito do genotipo FcyRIIIA de células efetivas. A atividade ADCC observada do anticorpo fucosilado (3649) mediado pelas células NK V158/V158 ou V158/F158 (C, D) é comparável à atividade ADCC do anticorpo afucosilado (3649-aFuc) mediado pelas células NK F158/F158 NK (E).

7.3. ANTICORPOS E ANÁLISES IMUNOFLUORESCENTES

[00674] Os anticorpos anti-CD19 descritos acima, que ligam-se ao antígeno de CD19 humano, pode ser usado nos métodos divulgados abaixo. Outros anticorpos, podem ser utilizados nos experimentos descritos abaixo incluem anticorpos anti-CD22 de camundongo monoclonal que ligam-se ao CD22 de camundongo, por exemplo HIB22 (Abcam; Dorken B et al., J Immunol 136:4470-9 (1986)); anticorpos específicos por CD20 de camundongo monoclonal (Uchida et al., Intl. Immunol., 16:119-129 (2004)); anticorpo B220 RA3-6B2 (DNAX Corp., Palo Alto, CA); e anticorpos CD5, CD43 e CD25 (BD PHARMINGEN™, Franklin Lakes, NJ). Anticorpos IgM ou Ig de anti- camundongo e específico pelo isotipo pode ser obtido de Southern Biotechnology Associates, Inc. (Birmingham, AL).

[00675] As linhas da pré-célula B de camundongo, transfectadas com hCD19 cDNA, que pode ser desenvolvido usando métodos e materiais conhecidos na técnica (ver por exemplo Alt et al., Cell, 27:381-388 (1981) e Tedder e Isaacs, J. Immunol., 143:712-717 (1989)), ou suspensão de leucócito celular simples, estão tingidos em gelo usando as ótimas concentrações pré-determinadas, de cada anticorpo rotulado fluorescentemente por 20 a 30 minutos de acordo com métodos estabilizados (Zhou et al., Mol. Cell. Biol., 14:3884-3894 (1994)). As células com o avanço e as propriedades dispersas de luz secundária dos linfócitos e podem ser então analisados em FACSCAN® ou citrômetros de fluxo FACSCALIBUR® (Becton Dickinson, San Jose, CA). O tingimento do fundamento seria determinado usando os anticorpos de controle não reativo (CALTAG™ Laboratories, Burlingame, CA) com passagem posicionadas para excluir as células não viáveis. Para cada amostra examinada, dez mil células com o avanço e as propriedades dispersas de luz secundária das células mononucleares são analisados quando possível, com as intensidades de fluorescência mostrados na escala de log de quatro décadas.

[00676] Camundongos. Os camundongos transgênicos que expressam hCD19 e seus littermates de tipo selvagem (WT) podem ser produzidos como descritos na técnica (Zhou et al., Mol. Cell. Biol., 14:3884-3894 (1994)). Por exemplo, os camundongos hCD19tg podem ser gerados de criadores hCD19 originais (por exemplo C57BL/6 x B6/SJL) e então cruzados em um fundamento de C57BL/6 por pelo menos 7 gerações. Depois de múltiplas gerações de backcrossing, os camundongos seriam obtidos em que suas células B expressariam a densidade da superfície celular do CD19 humano a cerca da mesma densidade observada nas células B humanas.

[00677] A família de camundongos com FcR (receptor Fc) de camundongos deficientes de cadeia Y comum (FCRY) (FcRY-/-, B6.129P2-Fcerg1tm1) são disponíveis de Taconic Farms (Germantown, NY) e pode ser usado para gerar littermates de hCD19+/- FcRy-/- e WT. Os camundongos hemizigotos para um transgene c-Myc (Eμ-cMycTG, C57Bl/6J-TgN(IghMyc); The Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME) são descritos na técnica (Harris et al., J. Exp. Med., 167:353 (1988) e Adams et al., Nature, 318:533 (1985)). Os camundongos c-MycTG (fundamento B6/129) pode ser cruzado com os camundongos hCD19tg para gerar hCD19tg cMycTG+/- a descendência de hemizigotos que podem ser identificados pela avaliação de PCR. Os camundongos Rag1-/- (B6.129S7-Rag1tm1Mom/J) são disponíveis de The Jackson Laboratory. Os camundongos deficientes macrófagos podem ser gerados pelas injeções nas veias da cauda de lipossomas encapsulados por clodronato (0,1 mL/10 grama do peso corporal; Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) em camundongos C57BL/6 no dia 2, 1 e 4 de acordo com os métodos padrões (Van Rooijen and Sanders, J. Immunol. Methods, 174:83-93 (1994)). Todos os camundongos devem ser usados em uma facilidade do limite livre da patogenia específico e primeiro usado em 6 a 9 semanas de idade.

[00678] ELISAs. As concentrações de Ig de soro são determinadas por ELISA usando IgM, IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3, e IgA de camundongo purificado por afinidade (Southern Biotechnology Associates, Inc., Birmingham, AL) para gerar curvas padrões como descrito (Engel et al., Immunity, 3:39 (1995)). Níveis de autoanticorpo IgM e IgG de soro contra dsDNA, ssDNA e histona são determinados por ELISA usando DNA de filamento duplo de timos de bezerro (ds) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO), DNA de timo de bezerro fervido (que contém DNA de filamento duplo (ss)) ou histona (Sigma-Aldrich) revestida com placas de microlitros como descrito (Sato et al., J. Immunol., 157:4371 (1996)).

[00679] Imunoterapia. O anti-CD19 estéril e não reativo, anticorpos de controle d isotipo (0,5 a 250 μg) em 200 μL de solução salina tamponada por fosfato (PBS) são injetadas através das veias da cauda laterais. Por exemplo, os experimentos usariam uma quantidade fixada (por exemplo 250 μg) de anticorpo. Os números de leucócito sanguíneo são quantificados pelo hemocitômetro seguido pela lise celular vermelha, frequências da célula B B220+ são determinadas pelo tingimento de imunofluorescência com a análise de citometria de fluxo. As doses do anticorpo em humanos e camundongos seriam comparados usando a calculadora de dosagem de ferramenta da Oncologia (www.fda.gov/cder/cancer/animalframe.htm).

[00680] Imunizações. Os camundongos de dois meses de idade WT são imunizados intra peritoneal com 50 μg de lipopolisacarídeo conjugado por 2,4,6-trinitrofenila (TNP) (LPS) (Sigma, St. Louis, MO) ou 25 μg de 2,4-dinitrofenol-conjugado em solução salina (DNP)- FICOLL® (Biosearch Technologies, San Rafael, CA). Os camundongos também são imunizados intra peritoneais com 100 μg de hemocianina keyhole limpet conjugado por DNP (DNP-KLH, CALBIOCHEM®- NOVABIOCHEM® Corp., La Jolla, CA) em adjuvante completo de Freund e são impulsionados 21 dias depois com DNP-KLH rm adjuvante de Freund incompleto. Os camundongos são sangrados antes e depois das imunizações como indicado. O titulador do anticorpo específico por DNP ou TNP nas amostras individuais do soro são medidas em duplas usando as placas revestidas de ELISA com DNP-BSA (CALBIOCHEM®-NOVABIOCHEM® Corp., La Jolla, CA) ou TNP-BSA (Biosearch Technologies, San Rafael, CA) de acordo com os métodos padrão (Engel et al., Immunity, 3:39-50 (1995)). Os camundongos imunizados a partir do TNP-LPS do soro são diluídos 1:400, com DNP-FICOLL® a partir do soro e os camundongos imunizados DNP-BSA diluídos por 1:1000 para a análise de ELISA.

[00681] Análise estatística. Todos os dados seriam mostrados como significa ± SEM com o teste t dos estudantes usados para determinar a significância das diferenças entre os meios de amostra.

7.4. Expressão do CD19 humano nos camundongos transgênicos

[00682] Os camundongos hCD19tg transgênicos, que podem ser desenvolvidos como descrito neste, ou outros animais transgênicos que expressam o CD19 humano e podem ser usados para avaliar o regime terapêutico diferente que compreende os anticorpos anti-CD19, tal como as variações na concentração da dosagem, quantidade, e tempo. A eficácia nos pacientes humanos do regime terapêutico diferente pode ser predito usando os dois indicadores descritos abaixo, isto é, a depleção da célula B em certos fluidos corpóreos e/ou tecidos e a capacidade de um anticorpo anti-CD19 monoclonal humano ou humanizado por ligar-se as células B. Nas formas de realização particulares, o regime de tratamento que são efetivos nos CD19 humanos dos camundongos transgênicos podendo ser usados com as composições e métodos da invenção para tratar o distúrbio e doenças das células B humanas e incluindo, mas não limitando a, nocividade da célula B e as doenças e distúrbios autoimunes.

[00683] A fim de determinar se o CD19 humano é expressado nas células B a partir dos camundongos transgênicos (hCD19tg) que expressam o transgene de CD19 humano, as células B seria extraído a partir da medula óssea, sangue, baço e lavagem peritoneal destes camundongos. O CD19 humano e a expressão de CD19 de camundongo seria avaliado nestas células pela conexão das células com anticorpos anti-CD19 que especificamente ligam-se ao CD19 humano ou CD19 (mCD19) de camundongo. A ligação do anticorpo às células de linhagem B seriam detectadas usando duas cores de tingimento imunofluorescente com a análise da citometria de fluxo. A expressão relativa dos níveis de mCD19 e hCD19, seriam avaliados pela medição da intensidade da fluorescência do meio (anti-hCD19 por hCD19 e anti-mCD19 por mCD19) respectivamente.

[00684] O nível de expressão de um transgene CD19 humano e CD20 humano como determinado essencialmente como descrito acima. A circulação dos linfócitos são de forma isolada C57Bl6 hCD19 tg +/-, C57Bl6 hCD19 tg +/+, Balb/c hCD20 tg+/- e Balb/c de camundongos de tipo selvagem usando procedimentos padrões. Os animais foram alojados em uma facilidade livre de patogenia. A idade e o número de animais usados a partir de cada genotipo é listado na Figura 10, as células isoladas são tingidas com anti-camundongo CD19 conjugado por PerCP Cy5,5 (clone 1D3, BD Biosciences), anti- CD3 conjugado por PE (por exemplo, clone 17A2, BD Biosciences), Alexa Fluor® 488 conjugado por anti-CD19 humano (clone HIB19, BD Biosciences) e Alexa Fluor® 647 conjugado por anticorpos CD20 anti- humanos (por exemplo, clone 2H7, AbD serotec). As células imunotingidas são analisadas em um citômetro de fluxo. A população de célula B é definida como células anti-camundongo CD19 +, anti- CD3-. A intensidade de fluorescência do meio de anti-camundongo CD19 +, células anti-CD3- detectados nos canais hCD19 e hCD20 é descrito na Figura 10 A. A expressão do CD19 humano é detectado apenas em células hCD19 transgênicas como esperado. A expressão hCD19 é uma dose dependente; os níveis de tingimento em tg+/+ é aproximadamente duas vezes vistos em células B tg+/-. O nível de expressão hCD19 foi estável em todos os grupos de idade examinados.

[00685] O percentual das células B entre os linfócitos de circulação foi calculado para todas as amostras. As células B foram definidas como anti-camundongo CD19 +, células anti-CD3- para o propósito do cálculo. Os resultados são apresentados na Figura 10 B. Os animais com um transgene hCD19 tem números da célula B reduzida entre a circulação dos linfócitos. A redução nos números das célula B são mais pronunciadas em animais hCD19 tg+/+. Estes resultados são em autorização com as observações previamente publicadas em (Zhou et al., Mol. Cell. Biol., 14:3884-3894 (1994)).

7.5. ANTICORPO ANTI-CD19 MEDIADO PELA DEPLEÇÃO DAS CÉLULAS B IN VIVO

[00686] Os anticorpos anti-CD19 da invenção, que ligam-se ao CD19 humano, pode ser avaliado para sua capacidade de esgotar o sangue hCD19tg, baço, e células B linfonodo in vivo. Por exemplo, cada anticorpo seria dado aos camundongos em 250 ou 50 μg/camundongo, uma dosagem simples de cerca de 10 a 50 vezes menor do que a dose de 375 mg/m2 principalmente dado quatro vezes para a terapia anti-CD20 em humanos (Maloney et al., J. Clin. Oncol., 15:3266-74 (1997) e McLaughlin et al., Clinical status and optimal use of rituximab for cell B lymphomas, Oncology (Williston Park), 12:1763-9 (1998)). A depleção da célula B de sangue, baço e linfonodos dos camundongos hCD19tg seria determinado pelo tingimento imunofluorescência com a análise da citometria de fluxo. O resultado dos anticorpos anti-CD19 usados identificado como capazes da depleção das células B e podem ser correlacionados pelo uso em humanos e anticorpos com propriedades dos anticorpos identificados e podem ser usados nas composições e métodos da invenção para o tratamento do distúrbio das células B humanas e distúrbios incluindo, mas não limitando a, nocividade da célula B e as doenças e distúrbios autoimunes.

[00687] O anticorpo anti-CD19 3649 humanizado foi testado na depleção do ensaio da célula B essencialmente como descrito acima. Os C57Bl6 hCD19 tg +/- e C57Bl6 hCD19 tg +/+ de camundongos são dados uma simples dose intra-venosa de 50 ou 250 μg do anticorpo 3649. Dois grupos de controle são usados. Os membros do primeiro grupo recebem 50 ou 250 μg do anticorpo R347 da especificidade irrelevante; os membros do segundo grupo recebem 50 ou 250 μg da variante Fc 3649-TM com atividade ADCC diminuída (ver Figura 6). Os números de animais de cada grupo são descritos na Figura 11 e 12. Os animais são alojados em uma facilidade livre de patogenia. As células mononucleares pós 7 dias de tratamento são isolados a partir da circulação sanguínea e baço. As células isoladas estão tingidas com anti- CD19 de camundongo conjugado por PerCP Cy5,5 (clone 1D3, BD Biosciences) e anticorpos de anti-B220 de camundongo conjugado por Apc-Cy5,5 (cloneRA3-6B2, Invitrogen). As mostras imunotingidas são analisadas em um citometria de fluxo. As células B são definidas como anti- CD19+ de camundongo, células anti-B220+ de camundongo para os propósitos deste experimento. A porcentagem das células B entre a circulação de linfócitos está apresentada na Figura 11. A porcentagem e número absoluto das células B entre as células do baço que é descrita na Figura 12. Uma dosagem simples de 50 mg de anticorpo 3649 anti-CD19 é suficiente para atingir a depleção significante da circulação e células B esplênicas. O nível % da depleção é influenciado pela dosagem de anticorpo e a densidade da superfície hCD19. A depleção é mais completa em animais hCD19 tg+/+ recebendo dos anticorpos 250 μg. a depleção é mais extensivo entre a circulação dos linfócitos do que no baço em todos os animais testados.

[00688] Um estudo separado também foi realizado para medir a capacidade de várias preparações de anticorpo anti-CD19 3649 para esgotar as subpopulações das células B da circulação, esplênica, peritoneal e medula óssea em um animal hCD19 tg+/-. O experimento foi realizado como os seguintes: Três a quatro meses de idade o sexo comparado ao C57Bl6 hCD19 tg+/- dos camundongos foram injetados através das veias da cauda lateral com as preparações do anticorpo anti-CD19 livre da endotoxina estéril diluído em PBS a 10, 50 ou 250 ug por doses de camundongos. O anticorpo anti-CD19 seguinte foram testados: anticorpo fucosilado anti-CD19 #2 (3649), anticorpo afucosilado anti-CD19 #2 (3649-aFuc), anticorpo anti-CD19 #2 intensificado pela variante Fc ADCC (3649-3M) e reduzida pela variante Fc ADCC do anticorpo anti-CD19 #2 (3649-TM). Um grupo de animais de controle foram injetados com um isotipo comparado de anticorpo de controle de especificidade irrelevante (R347). Sete dias pós-injeção, os camundongos foram sacrificados e as células sanguíneas, baço, medula óssea e cavidade peritoneal foram coletadas. As células vermelhas foram lisadas seguido pelos protocolos padrões e a contagem da célula viável total como determinado usando uma máquina de contagem celular automática por intermédio da células. As suspensões da célula simples isoladas foram imunotingidas e analisadas em um citômetro de fluxo seguido pelos protocolos padrões. Os anticorpos usado para o imunotingimento são listado na Tabela 5. A depleção resultada são resumidas nas Tabelas 6 a 21. A depleção resultada obtida usando o anticorpo anti-CD19 #2 afucosilada (3649-aFuc) está presente na Figura 28. A ativação celular NK do fenotipo de animais tratados com o anticorpo anti-CD19 #2 afucosilado ou fucosilado (3649-aFuc ou 3649, respectivamente) está presente na Figura 29. As definições da sub- série da célula B usadas durante a análise são como as seguintes: Sangue: células B: B220+, camundongo CD19+ Baço: células B: B220+, camundongo CD19+ células B transicionais: depois abrindo nas células B, CD93+ células B transicionais 1 (T1) : IgM+CD23- células B transicionais 1 (T2) : IgM+CD23+ células B transicionais 1 (T3) : IgMlowCD23+ células B maduras: depois abrindo na células B, CD93- células B foliculares: IgM+CD23+ células B da zona marginal: IgMhighCD23- Medula óssea: células B: B220+, camundongo CD19+ Pró-células B: depois abrindo na células B, CD43+IgM- Pré-células B: depois abrindo na células B, CD43-IgM- células B maduras e imaturas: depois abrindo na células B, CD43-IgM+ células B imaturas : CD43-IgM+CD93+ células B maduras: CD43-IgM+CD93+baixa/- Cavidade Peritoneal : células B: IgM+ Tabela 5. Anticorpos usado para a identificação da célula B em experimentos da depleção in vivo. As células mortas foram detectadas pelo tingimento 7-AAD. Tabela 6. Resumo dos resultados da circulação da depleção da célula 8. o anticorpo 3649, 3649-3M, 3649-TM ou controle R347 foi administrado por camundongos hCD19tg+/- seguido pelo protocolo descrito acima. % da célula B é definido como o B220+, camundongo CD19+ fração de sangue linfócitos; população de linfócito é detectado com base na característica avançada e perfil de dispersão secundária (ver Figura 17 A por detalhes). A depleção foi calculada como 100 x ( % da célula B (anticorpo de controle) - % da célula B (anticorpo experimental))/% da célula B (anticorpo do controle). Os números da depleção negativa são usados quando os tamanhos de uma população celular no animal tratado foi maior do que o tamanho correspondente no controle do animal. Tabela 7. Resumo dos resultados da depleção da célula B esplênica. O anticorpo 3649, 3649-3M, 3649-TM, ou controle R347 foi administrado por hCD19tg+/- de camundongos seguido pelos protocolos descritos acima. % da célula B é definido como a fração B220+, camundongo CD19+ dos linfócitos (ver Figura 17 B por detalhes). A depleção foi calculada como 100 x (número celular (anticorpo de controle) - Número celular (anticorpo experimental))/número celular (anticorpo de controle). Os números da depleção negativa são usados quando os tamanhos de uma população celular no tratado animal foi maior do que o tamanho correspondente no controle animal. Anticorpo Dose (μg/camundongo) % célula B Número celular/ animal % % da Tabela 8. Resumo dos resultados da depleção transicional esplênica da célula B. O anticorpo 3649, 3649-3M, 3649-TM, ou controle R347 foi administrado por hCD19tg+/- de camundongos seguido pelos protocolos descritos acima. % das células B transicionais são definidos como a fração CD93+ das células B (ver Figura 17B por detalhes). % % da depleção foi calculado como 100 x (Número celular (anticorpo de controle) - número celular (anticorpo experimental))/número celular (anticorpo de controle). Tabela 9. Resumo dos resu tados da depleção esplênica T1 da célula B. o anticorpo 3649, 3649-3M, 3649-TM, ou controle R347 foi administrado por hCD19tg+/- de camundongos seguido pelos protocolos descritos acima. As células B T1 são definidas como o IgM+, fração CD23- das células B transicionais (ver Figura 17B por detalhes). % % da depleção foi calculado como 100 x (número celular (anticorpo de controle) - número celular (anticorpo experimental))/número celular (anticorpo de controle). Tabela 10. Resumo dos resultados da depeleção das células B T2 esplênicas. O anticorpo 3649, 3649-3M, 3649-TM, ou controle R347 foi administrado por hCD19tg+/- de camundongos seguido pelo protocolo descrito acima. As células B T2 são definidas como a fração IgM+, CD23+ das células B transicionais (ver Figura 17B por detalhes). % da depleção foi calculada como 100 x (número celular (anticorpo de controle) - número celular (anticorpo experimental))/número celular (anticorpo de controle). Tabela 11. Resumo dos resultados da depleção da célula B T3 esplênico. O anticorpo 3649, 3649-3M, 3649-TM, ou controle R347 foi administrado por hCD19tg+/- de camundongos seguido pelo protocolo descrito acima. As células B T3 são definidas como uma fração CD93+, IgM baixa, CD23+ das células B transicionais (ver Figura 17B por detalhes). % da depleção foi calculada como 100 x (número celular (anticorpo de controle) - número celular (anticorpo experimental))/número celular (anticorpo de controle). Números da depleção negativa são usados quando os tamanhos de uma população celular no animal tratado foi maior do que o tamanho correspondente no controle do animal. Tabela 12. Resumo dos resultados da depleção da cé ula B madura esplênica. O anticorpo 3649, 3649-3M, 3649-TM, ou controle R347 foi administrado por hCD19tg+/- de camundongos seguido pelo protocolo descrito acima. As células B maduras são definidas como a fração CD93- das células B (ver Figura 17B por detalhes). % da depleção foi calculada como 100 x (número celular (anticorpo de controle) - número celular (anticorpo experimental))/número celular (anticorpo de controle). Os números da depleção negativa são usados quando os tamanhos de uma população celular no animal tratado foi maior do que o tamanho correspondente no controle do animal. Tabela 13. Resumo dos resultados na depleção da cé ula B folicular esplênica. O anticorpo 3649, 3649-3M, 3649-TM, ou controle R347 foi administrado por hCD19tg+/- de camundongos seguido pelo protocolo descrito acima. As células B foliculares são definidas como a fração IgM+, CD23+ das células B maduras (ver Figura 17B por detalhes). % da depleção foi calculada como 100 x (número celular (anticorpo de controle) - número celular (anticorpo experimental))/número celular (anticorpo de controle). Os números da depleção negativa são usados quando os tamanhos de uma população celular no animal tratado foi maior do que o tamanho correspondente no controle do animal. Tabela 14. Resumo dos resultados da depleção da célula B da zona marginal. O anticorpo 3649, 3649-3M, 3649-TM, ou controle R347 foi administrado por hCD19tg+/- de camundongos seguido pelo protocolo descrito acima. As células B da zona marginal são definidas como uma alta fração IgM, CD23- das células B maduras (ver Figura 17B por detalhes). % da depleção foi calculada como 100 x (número celular (anticorpo de controle) - número celular (anticorpo experimental))/número celular (anticorpo de controle). Os números da depleção negativa são usados quando os tamanhos de uma população celular no animal tratado foi maior do que o tamanho correspondente no controle do animal. Tabela 15. Resumo dos resultados da dep eção da célula B da medula óssea. O anticorpo 3649, 3649-3M, 3649-TM, ou controle R347 foi administrado por hCD19tg+/- de camundongos seguido pelo protocolo descrito acima. As células B são definidas como a B220+, a fração de camundongo CD19+ dos linfócitos (ver Figura 17C por detalhes). % da depleção foi calculada como 100 x (número celular (anticorpo de controle) - número celular (anticorpo experimental))/número cellular (anticorpo de controle). Tabela 16. Resumo dos resultados da pró-depleção da célula B da medula óssea. O anticorpo 3649, 3649-3M, 3649-TM, ou controle R347 foi administrado por hCD19tg+/- de camundongos seguido pelo protocolo descrito acima. As pró-células B são definidas como a CD43+, a fração das células B IgM (ver Figura 17C por detalhes). % da depleção foi calculada como 100 x (número celular (anticorpo de controle) - número celular (anticorpo experimental))/número celular (anticorpo de controle). Os números da depleção negativa são usados quando os tamanhos de uma população celular no animal tratado foi maior do que o tamanho correspondente no controle do animal. Tabela 17. Resumo dos resultados da pré-depleção das células B da medula óssea. O anticorpo 3649, 3649-3M, 3649-TM, ou controle R347 foi administrado por hCD19tg+/- de camundongos seguido pelo protocolo descrito acima. As pré-células B são definidas como uma fração CD43-, IgM- das células B (ver Figura 17C por detalhes). % da depleção foi calculada como 100 x (número celular (anticorpo de controle) - número celular (anticorpo experimental))/número cellular (anticorpo de controle). Tabela 18. Resumo dos resultados c a depleção da célula B madura/imatura da medula óssea. O anticorpo 3649, 3649-3M, 3649- TM, ou controle R347 foi administrado por hCD19tg+/- de camundongos seguido pelo protocolo descrito acima. As células B maduras/imaturas são definidas como uma fração CD43-, IgM+ das células B (ver Figura 17C por detalhes). % da depleção foi calculada como 100 x (número celular (anticorpo de controle) - número celular (anticorpo experimental))/número celular (anticorpo de controle). Os números da depleção negativa são usados quando os tamanhos de uma população celular no animal tratado foi maior do que o tamanho correspondente no controle do animal. Tabela 19. Resumo dos resultados da dep eção da célula B imatura da medula óssea. O anticorpo 3649, 3649-3M, 3649-TM, ou controle R347 foi administrado por hCD19tg+/- de camundongos seguido pelo protocolo descrito acima. As células B imaturas são definidas como uma fração CD93+ das células B maduras/imaturas (ver Figura 17C por detalhes). % da depleção foi calculada como 100 x (número celular (anticorpo de controle) - número celular (anticorpo experimental))/número celular (anticorpo de controle). Os números da depleção negativa são usados quando os tamanhos de uma população celular no animal tratado foi maior do que o tamanho correspondente no controle do animal. Tabela 30. Resumo dos resultados da dep eção da célula B madura da medula óssea. O anticorpo 3649, 3649-3M, 3649-TM, ou controle R347 foi administrado por hCD19tg+/- de camundongos seguido pelo protocolo descrito acima. As células B maduras são definidas como uma fração baixa CD93 das células B maduras/imaturas (ver Figura 17C por detalhes). % da depleção foi calculada como 100 x (número celular (anticorpo de controle) - número celular (anticorpo experimental))/número celular (anticorpo de controle). números da depleção negativa são usados quando os tamanhos de uma população celular no animal tratado foi maior do que o tamanho correspondente no controle do animal. Tabela 31. Resumo dos resultados da depleção da célula B da cavidade peritoneal. O anticorpo 3649, 3649-3M, 3649-TM, HB12B ou controle R347 foi administrado por hCD19tg+/- de camundongos seguido pelo protocolo descrito acima. As células B da cavidade peritoneal são definidas como a fração IgM+ dos linfócitos peritoneais (ver Figura 17D por detalhes). % da depleção foi calculada como 100 x ( % célula B (anticorpo de controle) - % célula B(anticorpo experimental))/% célula B (anticorpo de controle). Os números da depleção negativa são usados quando os tamanhos de uma população celular no animal tratado foi maior do que o tamanho correspondente no controle do animal.

7.5.1. INFLUÊNCIA DA DENSIDADE CD19 DA EFETIVIDADE DA DEPLEÇÃO DA CÉLULA B INDUZIDA PELO ANTICORPO CD19

[00689] Para determinar se um anticorpo anti-CD19 é capaz para esgotar as células B é dependente da densidade CD19, os anticorpos anti-CD19 da invenção podem ser administrados por camundongos tendo variação dos níveis da expressão hCD19. O resultado obtido demonstrará se a densidade CD19 humana nas células B e isotipo de anticorpo pode influenciar a depleção das células B na presença de um anticorpo anti-CD19. Os mesmos ensaios podem ser usados para determinar se outros anticorpos anti-CD19 podem efetivamente esgotar as células B. Os resultados podem ser correlacionados pelo tratamento de pacientes humanos com variação dos níveis da expressão CD19. Deste modo, os métodos para o exame da presença de CD19 e da densidade, descrito neste, pode ser usado em pacientes humanos para identificar os pacientes ou população de pacientes para que certos anticorpos anti-CD19 pode esgotar as células B e/ou determinar as dosagens adequadas.

[00690] Para determinar se as influências da densidade CD19 da efetividade do anticorpo anti-CD19 induzido pela depleção da célula B representativa sanguínea e depleção da célula B do baço pode ser examinado nos hCD19tg de camundongos depois do tratamento com os anticorpos anti-CD19 da invenção (7 dias, 250 μg/camundongo). Os resultados são esperados para demonstrar que a influência da densidade CD19 da eficiência da depleção da célula B pelos anticorpos anti-CD19 in vivo. Por exemplo, a expressão do baixo nível de CD19 em hCD19tg de camundongos seria esperado por ter uma influência marcada na circulação ou na depleção da célula B do tecido pelos anticorpos administrados. A liberação da célula B pode ser avaliado 24 horas depois do controle anti-CD19 ou mAb do tratamento de camundongos individuais.

7.5.2. DETERMINAÇÃO SE A DEPLEÇÃO DA CÉLULA B DO TECIDO É DEPENDENTE DE FCYR

[00691] A administração deve um resultado de mAb anti-CD19 da invenção na depleção da célula B do tecido, os seguintes ensaios podem ser usados para demonstrar a dependência da expressão FCYR. Através de um processo de cruzamentos de híbridos hCD19tg de camundongos com camundongos em falta da expressão de certos camundongos FCYR, e podem ser gerados para expressar hCD19 e a perda da expressão de certos FCYR. Tais camundongos podem ser usados em ensaios para avaliar a capacidade dos anticorpos anti- CD19 para esgotar as células B através do caminho que envolve a expressão FcyR, por exemplo, ADCC. Deste modo, os anticorpos anti- CD19 identificados nestes ensaios podem ser usados para projetar anticorpos humanizados anti-CD19, quiméricos ou humanos usando as técnicas descritas acima. Tais anticorpos podem ser rotacionados usados nas composições e métodos da invenção para o tratamento de distúrbio das células B humanas e doenças incluindo, mas não limitando a, doença e distúrbio autoimune.

[00692] O sistema imune inato mediado pela depleção da célula B seguindo o tratamento do anticorpo anti-CD20 através dos processos dependentes de FCYR. As células efetivas de camundongo que expressam quatro diferentes classes de FCYR por IgG, a alta afinidade FCYRI (CD64) e a baixa afinidade das moléculas FCYRII (CD32), FcyRIII (CD16) e FcyRIV. O FcyRI, FcyRIII e FcyRIV são complexos hetero-oligoméricos em que a ligação do ligando respectivo das cadeias α associados com a cadeia y comum (FcRy). A expressão da cadeia FcRy é requerida pela sessão FcyR e para a trituração por FcyR das funções efetivas, incluindo fagocitose por macrófagos. Visto que os camundongos FcRy-/- perdem a alta afinidade FcyRI (CD64) e baixa afinidade de moléculas FcyRIII (CD16) e FcyRIV, camundongos FcRy-/- que expressam hCD19 e podem ser usados para avaliar o papel do FcyR na depleção da célula B do tecido seguindo o tratamento do anticorpo anti-CD19.

7.5.3. DURABILIDADE DO ANTICORPO ANTI-CD19 INDUZIDO PELA DEPLEÇÃO DA CÉLULA B

[00693] Para avaliar a eficácia e a duração da depleção da célula B, hCD19tg dos camundongos podem ser administrados em uma dose da injeção inferior simples (por exemplo 250 μg) do anticorpo anti- CD19 e a duração e a resposta da dosagem da depleção da célula B seguido como uma função de tempo. Os resultados são esperados para demonstrar que a circulação das células B são esgotados para a quantidade substancial do tempo (por exemplo uma semana a seis meses), seguido por uma recuperação gradual das células B carregadas pelo sangue.

7.6. PERSISTÊNCIA DO CD19 NA SUPERFÍCIE DAS CÉLULAS B DEPOIS DA ADMINISTRAÇÃO DO ANTICORPO ANTI-CD19

[00694] Se a internalização CD19 influenciará a depleção da célula B in vivo pode ser avaliada pela comparação da expressão CD19 da superfície celular seguindo a administração do anticorpos anti-CD19 da presente invenção. Por exemplo, a expressão CD19 da superfície celular e a liberação da célula B nos camundongos hCD19tg tratados com um anticorpo anti-CD19 da presente invenção ou anticorpo de controle comparado ao isotipo (250 μg) in vivo pode ser estudado como uma função de tempo. Deste modo, as células B do baço podem ser coletadas e submetidas ao ensaio para CD19 no tempo zero (antes da administração anti-CD19) e em 1, 4, e 24 horas pós- administração do anticorpo. As células B isoladas também podem ser tratadas in vitro com as concentrações de saturação de cada anticorpo anti-CD19 mais o anticorpo secundário específico por isotipo in vitro com a análise da citometria de fluxo para visualizar a expressão CD19 da superfície celular total. Onde o CD19 na superfície das células B é mantida, este indicará a contida suscetibilidade por ADCC, CDC, e apoptose. Se o CD19 persiste na superfície celular seguido pela ligação de um anticorpo anti-CD19, a célula B permanecerá acessível à atividade apoptótica de ADCC, CDC. Tais resultados demonstrariam, em parte, porque os anticorpos anti-CD19 e o regime de tratamento da invenção seriam eficazes em fornecer a terapia para o distúrbio e doenças das células B humanas incluindo, mas não limitando a, rejeição de transplante e doença e distúrbio autoimune.

7.7. TRATAMENTO DO ANTICORPO ANTI-CD19 PODE ANULAR A IMUNIDADE E AUTOIMUNIDADE HUMORAL

[00695] No evento da terapia de CD19 a representação da célula B diminuída, então os ensaios descritos neste exemplo pode ser usado para demonstrar que os anticorpos anti-CD19 da invenção são capazes de eliminar ou atenuar as respostas imunes. Estes ensaios também podem ser usados para identificar outros anticorpos anti- CD19 que podem ser usados para projetar anticorpos humanizados anti-CD19, quiméricos ou humanos usando as técnicas descritas acima. Tais anticorpos podem ser rotacionados usando as composições e métodos da invenção para o tratamento de doença e distúrbio autoimune em humanos, bem como para a terapia de transplantação.

[00696] O efeito do anticorpo anti-CD19 induz a depleção da célula B nos níveis do anticorpo do soro e podem ser avaliados pelos hCD19tgcamundongos dados a uma injeção simples do anticorpo anti- CD19 e então avaliados na redução dos níveis de imunoglobulina naqueles camundongos. Por exemplo, littermates de dois meses de idade podem ser tratados com a injeção simples de um anticorpo anti- CD19 da presente invenção ou um anticorpo de controle (por exemplo 250 μg) no dia 0, os níveis dos anticorpo são então determinados por ELISA. Este é esperado que o resultado mostrará que depois de 1 a 2 semanas, os níveis do anticorpo do soro IgM, IgG2b, IgG3, e IgA são significantemente reduzidos, e permanecem reduzidos por pelo menos de 10 semanas.

[00697] A influência da depleção da célula B na célula T independente das respostas dos anticorpos do tipo 1 (TI-1) e tipo 2 (TI- 2) também podem ser avaliadas pela imunização dos camundongos hCD19tg com TNP-LPS ou DNP-Ficoll (no dia 0), 7 dias depois do tratamento do anticorpo anti-CD19 ou anticorpo de controle. As respostas dos anticorpos específicos IgM, IgG, e IgA casualmente significam que são esperados não serem observados no anticorpo anti-CD19 tratado dos camundongos imunizados com o antígeno. As respostas do anticorpo à célula T dependente de Ag (TD), DNP-KLH, também podem ser avaliadas usando os camundongos tratados com os anticorpos anti-CD19 em 7 dias antes da imunização, onde este é esperado que os camundongos DNP-KLH imunizados tratados com os anticorpo anti-CD19 mostrarão a imunidade humoral reduzida.

7.8. TRATAMENTO DO ANTICORPO ANTI-CD19 EM CONJUNÇÃO COM O TRATAMENTO DO ANTICORPO ANTI-CD22

[00698] O ensaio descrito neste pode ser usado para determinar se as terapias de combinação, por exemplo, os anticorpos anti-CD19 em combinação com quimioterapia, terapia de toxina ou radioterapia, tem efeitos benéficos, tal como um aditivo ou mais que a depleção aditiva nas células B. O resultado das terapias de combinação testadas em modelos de animais podem ser correlacionados por humanos por meios bem conhecidos na técnica.

[00699] Os anticorpos anti-CD20 são efetivos na depleção humana e células B in vivo de camundongo. Portanto, o benefício de tratamento simultâneo com um anticorpo anti-CD19 da presente invenção e anticorpos anti-CD20 (por exemplo, MB20-11; ver, Yazawa et al., Proc Natl Acad Sci USA. 102(42):15178-83 (2005)) podem ser avaliados para determinar se este intensificará a depleção da célula B. Os camundongos podem ser tratados com doses sub-ótimas (por exemplo 2 μg, 5 μg, 10 μg, 20 μg, ou 50 μg) de cada um anticorpo individualmente, ou como uma combinação de ambos anticorpos. Este é esperado que o resultado demonstrará que tratamentos de anticorpo anti-CD19 e anti-CD20 simultâneos são benéficos. Em uma maneira similar, a eficácia pode ser para determine o tratamento com a combinação de um anticorpo anti-CD19 da presente invenção com um anticorpo anti-CD22, ou uma combinação de um anticorpo anti-CD19 da presente invenção, um anticorpo anti-CD20, e um anticorpo anti- CD22.

7.9. EFICÁCIA TERAPÊUTICA DA ADMINISTRAÇÃO SUBCUTÂNEA (S.C.) DE UM ANTICORPO ANTI-CD19 DA INVENÇÃO

[00700] O ensaio descrito neste pode ser usado para determinar se uma via subcutânea de administração de um anticorpo anti-CD19 da invenção pode esgotar efetivamente as células B. O resultado da eficácia de vias de liberação diferentes testadas em modelos de animais podem ser correlacionadas por humanos por meios bem conhecidos na técnica.

[00701] Por exemplo, os camundongos hCD19tg podem ser tratados com um anticorpo anti-CD19 da invenção em 250 μg pela administração subcutânea (s.c.), intraperitoneal (i.p.) ou intravenosa (i.v.). Os valores são determinados pelo meio de (±SEM) sangue (por mL), medula óssea, baço, linfonodo, e cavidade peritoneal do número das células B B220+ no dia 7 como avaliado usando a citometria de fluxo. Os resultados são esperados para demonstrar que a administração subcutânea (s.c.), intraperitoneal (i.p.) e intravenosa (i.v.) de um anticorpo anti-CD19 da invenção esgotará efetivamente a circulação e as células B do tecido in vivo.

[00702] A presente invenção não é limitada no escopo pela forma de realização específica descrito neste. Realmente, várias modificações da invenção em adição àquelas descritas aparecerá àqueles habilitados na técnica a partir do precedente da descrição e Figuras que acompanham. Tais modificações são pretendidas ficar dentro do escopo das reivindicações anexadas.

7.10. OS ANTICORPOS ANTI-CD19 REDUZEM O DESENVOLVIMENTO DO TUMOR EM UM MODELO DE LINFOMA IN VIVO.

[00703] Os anticorpos anti-CD19 da invenção, que ligam-se ao CD19 humano, podem ser avaliados por sua capacidade de reduzir o desenvolvimento do tumor em modelos de animais in vivo. Por exemplo, os camundongos SCID seriam injetados com as linhas celulares humanas para estabilizar um xenoenxerto do tumor (por exemplo, a injeção subcutânea das células de Raji). Subsequentemente, os camundongos seriam dados diversas doses de um anticorpo anti-CD19 da invenção (por exemplo, 5 vezes de 100 μg de anticorpo/camundongo). O desenvolvimento do tumor seria seguido usando métodos padrões (por exemplo, volume do tumor, peso do animal, paralisia). O efeito do tratamento anti-CD19 no desenvolvimento do tumor pode ser determinado pela comparação de animais que recebem anti-CD19 ou tratamento de controle de anticorpo. Os resultados obtidos usando anticorpos anti-CD19 identificados como capazes de reduzir o desenvolvimento do tumor podem ser correlacionados ao uso em humanos, e anticorpos capazes de reduzir o desenvolvimento do tumor podem ser usados nas composições e métodos da invenção para o tratamento do distúrbio e doença das células B humanas incluindo, mas não limitando a, nocividade da célula B.

[00704] Para determinar se um anticorpo anti-CD19 é capaz de reduzir o desenvolvimento do tumor é dependente da densidade CD19, as linhas celulares do tumor com perfis de expressão de CD19 diferentes podem ser testados nos descritos acima no ensaio do desenvolvimento do tumor in vivo. Por exemplo, células Daudi, Raji, Namalwa, e Ramos todos tem níveis significantes de CD19 em sua superfície; linha celular de mieloma múltiplo RPMI 8226 em outra maneira não expressam o CD19. Os resultados obtidos podem demonstrar se a densidade do CD19 humano na superfície celular do tumor pode influenciar a atividade da redução do desenvolvimento do tumor de um anticorpo anti-CD19. O resultado pode ser correlacionado pelo tratamento dos pacientes humanos com a variação nos níveis da expressão CD19. Deste modo, os métodos para o exame da presença e densidade de CD19, descrito neste, pode ser usado em pacientes humanos para identificar os pacientes ou população de pacientes para que certos anticorpos anti-CD19 possam reduzir o desenvolvimento das células B malignas e/ou para determinar as dosagens adequadas.

[00705] Para determinar se um anticorpo anti-CD19 é capaz de reduzir o desenvolvimento do tumor é dependente do FCYR, o ensaio do desenvolvimento do tumor in vivo descrito acima e seria realizado usando os camundongos SCID com atividade do receptor Fcy compromissado (por exemplo, FCRY-/-), através de um processo de camundongos interbreeding SCID com camundongos em falta da expressão de certos FCYR. Os camundongos SCID podem ser gerados também pela falta da expressão de certos FCYR (por exemplo, camundongos SCID, FCRY-/-). Tais camundongos podem ser usados em ensaios para avaliar a capacidade dos anticorpos anti-CD19 de reduzir o desenvolvimento do tumor através de caminhos que envolvem a expressão FcyR, por exemplo, ADCC. Com base na resultado, os anticorpos anti-CD19 com ADCC aumentado pode ser projetado usando as técnicas descritas acima. Tais anticorpos pode ser rotacionados usando as composições e métodos da invenção para o tratamento de distúrbio e doenças das células B humanas incluindo, mas não limitando a, nocividade da célula B.

[00706] Seguido pelo detalhes de que os experimentos demonstram a capacidade do anticorpo anti-CD19 humanizado 3649 reduzir o desenvolvimento do tumor em um modelo animal in vivo. No dia 1 do experimento, 4 a 6 semanas de idade a fêmea dos camundongos CB- 17 SCID são injetadas subcutaneamente com 5 x 106 de células de linfoma humanas de Raji em seu flanco traseiro. As células Raji que expressam os níveis significantes de CD19 em sua superfície e são sensíveis aos 3649 direcionados por ADCC (ver, Figura 7 e 8). Os grupos das células de 10 Raji injetadas em animais são tratadas com um anticorpo anti-CD19 humanizado, anticorpo de controle anti-CD20, anticorpo de isotipo de controle de especificidade irrelevante. As dosagens diferentes múltiplas de um anticorpo podem ser testadas lado a lado. Um exemplo não limitante para a listagem de tratamento é 5 doses intraperitoneal bi-semanalmente de 10 mg/kg do anticorpo de partida no dia 4. Um grupo de controle adicional de animais que recebem PBS apenas é incluído também. O volume do tumor é medido usando métodos padrões. Os animais com o volume do tumor maior do que 2000 mm3 ou com sinais significantes de morbidez são eutanizados humanamente. O desenvolvimento do tumor é plotado por tempo.

[00707] No experimento resumido na Figura 13, dez células de Raji injetadas em animais de cada foram tratadas com doses intraperitoneal 5 bi-semanalmente de 10 mg/kg (i) anticorpo anti-CD20, (ii) variante Fc 3649-TM com ADCC reduzido, (iii) anticorpo 3649, ou (iv) anticorpo de controle de partida R347 no dia 4. Um grupo de controle adicional de 10 animais que receberam apenas PBS. O tratamento com o anticorpo 3649 anti-CD19 e o anticorpo de controle anti-CD20 positivo significantemente reduz o desenvolvimento do tumor. A separação padrão no tamanho do tumor para os grupos que receberam 3649 ou anticorpo anti-CD20 aumentados com o tempo pela razão da presença de indivíduos livres de tumor completamente em ambos grupos de tratamento. A variante Fc 3649-TM não tem um efeito significante no desenvolvimento do tumor, sugerindo que o desenvolvimento do tumor reduza o efeito do anticorpo anti-CD19 humanizado 3649 que é mediado através de ADCC.

[00708] No experimento resumido na Figura 14, dez células de Raji injetadas em animais de cada foram tratadas com 5 doses intraperitoneais bi-semanalmente de (i) anticorpo anti-CD20 em 10 mg/kg (anti-CD20), (ii) variante Fc 3649-TM com ADCC reduzido em 10 mg/kg (3649TM), (iii) anticorpo 3649 em 10 mg/kg (3649), (iv) anticorpo 3649 em 2,5 mg/kg (3649*) ou (v) anticorpo R347 de controle em 10 mg/kg de partida no dia 4. O tratamento com o anticorpo 3649 anti-CD19, 3649-3M ADCC humano que intensifica o anticorpo anti-CD-19 e anticorpo de controle anti-CD20 positivo significantemente reduzindo o desenvolvimento do tumor. A variante Fc 3649-TM do anticorpo anti-CD19 não tem um efeito significante no desenvolvimento do tumor, sugerindo que o efeito da redução do desenvolvimento do tumor de 3649 é mediado através de ADCC.

[00709] No experimento resumido na Figura 30, as dez células de Raji injetadas nos animais cada um foi tratado com 5 doses intraperitoniais bi-semanalmente (i) anticorpo anti-CD20 em 10 mg/kg (anti-CD20), (ii) anticorpo 3649 em 10 mg/kg (3649), (iii) anticorpo 3649 afucosilado em 2,5 ou 10 mg/kg (3649-aFuc) ou (iv) anticorpo R347 de controle em 10 mg/kg de partida no dia 4. O tratamento com anticorpo 3649 anti-CD19, anticorpo anti-CD19 3649-aFuc e anticorpo de controle anti-CD20 positivo significantemente reduz o desenvolvimento do tumor.

7.11. AFINIDADE DE ANTICORPOS ANTI-CD19 3649 MADUROS

[00710] Seguido pela que descreve a identificação da afinidade das variantes CDR maduras dos anticorpos anti-CD19 3649 que apresentam uma afinidade de ligação aumentada em direção a superfície celular que apresenta um antígeno de CD19 humano comparado ao anticorpo 3649 anti-CD19 parental. A seção também descreve a caracterização in vitro dos anticorpos anti-CD-19 maduros por afinidade.

7.11.1. IDENTIFICAÇÃO DOS ANTICORPOS DA VARIANTE 3649 COM AFINIDADE AUMENTADA.

[00711] Os anticorpos anti-CD19 3649 das variantes foram identificado pela avaliação das bibliotecas de fragmento de Fab que compreendem as sequências CDR das variantes (ver, Publicação do Pedido de Patente U.S. N°. US2006/0121042; Wu, H., Methods Mol Biol., 207:197-212 (2003); Wu & An, Methods Mol Biol., 207:213-33 (2003); Wu et al., J. Mol. Biol., 350:126-144 (2005); Wu et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:6037-6042 (1998)).

[00712] Reagentes: Todas as químicas foram de um grau analítico. As enzimas de restrição, as enzimas que modificam o DNA, a ligase T4 e a polimerase de DNA T7 foram adquiridas de New England Biolabs, Inc. (Beverly, MA). Os oligonucleotídeos de costume foram sintetizados por Operon (Huntsville, AL). Os glóbulos magnéticos de estreptavidina foram adquiridas de Dynal (Lake Success, NY).

[00713] A construção do vetor de expressão de fago 3649 Fab: Polinucleotídeos que codificam os domínios VH e VK do anticorpo antiCD-19 3649 foram clonados em um vetor de expressão de fago com base em M13 que facilita a expressão de fragmentos Fab sob um controle do promotor lacZ (Dall’Acqua et al., Methods 36:43-60 (2005)). O vetor compreende a primeira região constante da cadeia pesada y humana, o domínio constante de uma cadeia leve humana de capa (K) e dois locais de recozimento para a clonagem dos genes VH e VK. A clonagem foi realizada pela mutagênese de hibridização (Kunkel et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 4778-82 (1985)) como descrito em Wu & An, Methods Mol Biol., 207:213-33 (2003). Resumidamente, os polinucleotídeos que codificam a região VH e VK do 3649 foram amplificados usando aproximadamente 0,5 pmol de cada um dos seguintes iniciadores de oligonucleotídeo específico por gene: 3649 VH Fab Fw (SEQ ID N°: 128), 3649 VH Fab Rev (SEQ ID N°: 129), 3649 VK Fab Fw (SEQ ID N°: 130) e 3649 VK Fab Rev (SEQ ID N°: 131) (ver Tabela 32). A seqüência de nucleotídeo 5’ de cada um dos iniciadores compreendem as sequências específicas pelo vetor M13 para permitir para um recozimento entre os produtos de PCR e o vetor de filamento simples. A sequência de nucleotídeo dos iniciadores de 3649 VH Fab Fw (SEQ ID N°: 128) e 3649 VK Fab Fw (SEQ ID N°: 130) compreendem uma seqüência de nucleotídeo 28/25, respectivamente, correspondente ao gene M13 da seqüência 3 líder. A seqüência de nucleotídeo 5’ de iniciadores de 3649 VH Fab Rev (SEQ ID N°: 129) e 3649 VK Fab Rev (SEQ ID N°: 131) compreendem uma seqüência de nucleotídeo 28/30 correspondente à primeira região constante da cadeia pesada humana y e o domínio constante de uma cadeia leve humana de capa (K), respectivamente. Os iniciadores avançados 3649 VH Fab Fw (SEQ ID N°: 128) e 3649 VK Fab Fw (SEQ ID N°: 130) foram biotinilados para ajudar o isolamento de menos filamentos dos fragmentos de PCR. Os polinucleotídeos que codificam os genes 3649 VH e VK foram amplificados por PCR a partir de construções de expressão correspondentes 3649 IgG descritas acima usando as combinações dos iniciadores 3649 VH Fab Fw (SEQ ID N°: 128)/ 3649 VH Fab Rev (SEQ ID N°: 129) e 3649 VK Fab Fw (SEQ ID N°: 130)/ 3649 VK Fab Rev (SEQ ID N°: 131), respectivamente. Os produtos de PCR foram purificados pela eletroforese em gel de agarose/eletroeluição, e subsequentemente fosforilados usando cianse de polinucleotídeo T4 (Roche). Menos filamentos dos fragmentos de PCR foram isolados pela dissociação do produto PCR de filamento duplo com hidróxido de sódio, depleção do filamento mais biotinilado usando glóbulos magnéticos revestidos por espreptavidina, e a recuperação de menos filamentos pela precipitação de etanol. As quantidades equimolares de menos filamentos isolados de fragmentos de PCR VH e VK foram recozidos ao filamento simples uridinilado do modelo M13 MD101-5A, e tratado com a polimerase de DNA T4 (Roche), ligase de DNA T4 (Roche) seguido pelas instruções do fabricante. As sequências de nucleotídeos específicos por M13 incorporados nos filamentos menos isolados VH e VK de polinucleotídeos especificamente recozem estas duas regiões separadas do vetor de DNA M13, cada um que contém um arco palindrômico que compreende o local de reconhecimento para a endonuclease de restrição Xba I. Porque os arcos palindrômicos recozem por si só ainda na presença de sequências VH ou VK recozidas, a digestão de XbaI da polimerase de DNA T4 recozida/ complexos de DNA tratados pela ligase de DNA T4 permitem a seleção de filamentos do vetor menos sintetizado novamente que compreende ambos os domínios VH e VK fundidos na estrutura com a região constante de capa humana K e a primeira região constante humana Y, respectivamente, na perda do modelo parenteral digerido mais o filamento. O produto de reação foi digerido com XbaI, o calor inativado e eletroporado nas células B DH10. As células B transformadas DH10 foram tituladas em placas bacterianas com um tecido de Escherichia coli XL-1 Blue. O DNA de fago isolado a partir de diversas placas independentes foram sequenciados para ajudar na identificação de um clone que codifica o fragmento 3649 Fab. Tabela 32. Iniciadores de PCR usados para gerar 3649 VH e VK que codificam os polinucleotídeos usado para a mutagênese de hibridização. Os resíduos específicos 3649 estão sublinhados.

[00714] A geração do CDR simples focado nas bibliotecas de Fab: duas bibliotecas de substituição de aminoácido simples separado foram preparados para cada uma das seis regiões de CDR do anticorpo 3649. As bibliotecas de “NSS” compreendidas de todos as variantes substituídas por aminoácido simples possível do CDR dado em que os aminoácidos substituídos são qualquer um dos oito aminoácidos codificados pelo códon degenerado de NSS. As bibliotecas de “NWS” compreende todas as variantes substituídas por aminoácidos simples possíveis de um CDR dado em que os aminoácidos substituídos são qualquer um dos doze aminoácidos codificados pelo códon degenerado de NWS. As bibliotecas individuais foram preparadas pela mutagênese de hibridização do Fab 3649 que codificam o vetor de fago descrito acima (Kunkel et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 4778-82 (1985); Wu & An, Methods Mol Biol., 207:213-33 (2003)). Resumidamente, duas séries de oligonucleotídeos de filamentos menos degenerados foram preparados para cada um dos seis CDRs. As séries de “NSS” e “NWS” compreendidos de todas as substituições de códon simples possíveis de uma região CDR com o NSS e NWS, respectivamente, o códon degenerado. As séries de oligonucleotídeos usados para a preparação da bibliotecas focadas de cadeia pesada CDR1 são listadas na Tabela 33 como um exemplo. Cada oligonucleotídeo de filamento menos degenerado foi fosforilado antes do recozimento em uma razão molar de 10:1 por um DNA de modelo de fago Fab 3649 de filamento simples uridinilado. A temperatura da reação do recozimento foi baixada de 95° C a 55° C em 1 hora. A ligase T4 e a polimerase de DNA T7 foi adicionado ao material recozido e incubado por 1,5 horas em 37° C. Os produtos da síntese de filamento negativo final obtidos usando oligonucleotídeos diferentes de uma série específica de CDR simples foram unidas; os grupos de NSS e NWS, entretanto, foram mantidos separadamente e avaliados independentemente. Tipicamente, um μl da reação da síntese de filamento negativo unido foi eletroporado em XL1-Blue pela formação de placa em tecido bacteriano XL1-Blue. Os clones de fago individuais são eluídos a 200 μl de 10 mM de Tris (pH 7,4), 100 mM de tampão de NaCl e armazenado a 4° C. A biblioteca pode ser caracterizada pelo sequenciamento 24 aleatoriamente selecionados pelos clones de fagos para determinar a distribuição de mutações dentro do CDR bem como a calcular a taxa de mutagênese. Tabela 33. Oligonucleotídeos usados para a geração de bibliotecas focadas em CDR1 de cadeia pesada 3649. Os códons NSS e NWS que compreendem os oligonucleotídeos foram usados para à geração de bibliotecas “NSS” e “NWS” separadas. Os nucleotídeos que codificam os resíduos de CDR estão sublinhados.

[00715] A avaliação primária das bibliotecas de Fab focadas por CDR simples: a avaliação primária consiste de uma ELISA de ponto simples (SPE) realizada usando o Fab secretado contendo o sobrenadante de culturas de 1 ml de fago e CD19 recombinante humano que expressa as células 300B4 como um agente de captura. Uma avaliação exaustiva de uma biblioteca pode ser usualmente atingida pelo teste de diversos clones individuais que três vezes iguais ao tamanho da taxa de contagem de retirada da biblioteca da mutagênese. Por exemplo, exaustão de uma biblioteca de substituição VH CDR1 (5 resíduos do aminoácidos) “NSS” (8 aminoácidos possíveis codificados pelo códon NSS degenerado) com uma taxa de 50 % da mutagênese que pode ser atingida pela avaliação 5 x 8 x 2 = 80 aleatoriamente selecionados de clones individuais. No experimento descrito neste ~400 clones foram avaliados, entretanto, para cada biblioteca com respeito ao comprimento do CDR, ou eficiência da síntese. O sobrenadante de pequenas escalas de culturas de fago foram isoladas como descrito em Wu & An, Methods Mol Biol., 207:213-33 (2003). Resumidamente, 0,75 mL do desenvolvimento exponencial de células TG1 são inoculadas com 75 μl de estoque de fago eluído na presença de 0,5 mM de IPTG e incubado a 37° C por 1 hora na placa de 96 reservatórios. As culturas de placa são movimentadas pela temperatura ambiente e desenvolvidas durante a noite em um agitador orbital. As bactérias de 0,36 ml de culturas durante a noite são coletadas pela filtração através de uma membrana de náilon de ligação de baixa proteína (por exemplo, placa de avaliação Silent de Nalgene) e tratado no filtro com 200 μl de tampão TES (30 mM de Tris pH 8,0, 2 mM de EDTA, 20 % de sacarose) com 2 mg/ml de lisozima por 10 minutos em temperatura ambiente para liberar o Fab secretado a partir do espaço periplásmico. O fragmento de Fab contendo os extratos são coletados pela filtração. A concentração do fragmento de Fab no extrato é determinado usando ensaios padrões. ELISA com base na célula 300B4 foi realizada como descritos acima. O Fab 3649 parental que expressa o clone de fago foi incluído nos ensaios de ELISA com base na célula como um controle positivo. A afinidade de ligação relativa dos fragmentos Fab da variante foi comparado pela plotagem do sinal de ELISA contra a concentração Fab. Por exemplo, a Figura 18 mostra o resultado obtido com os Fabs 3649 da variante que compreendem uma substituição de aminoácido simples aleatória dentro de VH CDR3. Os Fabs 4B7 e 4G6 apresentam significantemente a afinidade de ligação aumentada pelo CD19 humano que expressa as células 300B4 comparadas àquela dos 3649 Fab parentais .

[00716] A avaliação secundária das bibliotecas de Fab focadas por CDR simples: Um clone de Fab de variante de CDR com a avaliação primária do sinal de ELISA de pelo menos 10 % mais altas do que do Fab 3649 parental foram re-desenvolvidas em uma escala de 15 ml, e re-submetidas ao ensaio pela mesma ELISA com base na célula 300B4 em reservatórios duplos para confirmar o resultado positivo. O extrato Fab de escala 15 ml foram preparados seguido pelo protocolo descrito em Wu, H., Methods Mol Biol., 207:197-212 (2003). A concentração de Fab como determinado usando os ensaios padrão. ELISA com base na célula 300B4 foi realizada como descritos acima. O Fab 3649 parental foi incluído no ensaio como um controle positivo. Os clones com um sinal de avaliação secundária de pelo menos 10 % mais altas do que do controle 3649 Fab foram sequenciados para determinar a identidade das substituições de aminoácido levadas ao antígeno aumentado de CD19 de ligação humana. As substituições de aminoácido identificados pelo sequenciamento da afinidade isolada melhorada por clones Fab anti-CD19 são listado na Tabela 34. Tabela 34. Lista de substituições de aminoácidos simples benéficos isolados das bibliotecas Fab focadas em CDR simples. As posições de aminoácido são numeradas de acordo com Kabat.

[00717] A geração da biblioteca de Fab combinatorial duas bibliotecas combinatoriais que compreendem todas as combinações possíveis de substituições de aminoácidos simples benéficos identificados a partir das bibliotecadas focadas por CDR e foram geradas pela mutagênese de hibridização. A primeiro biblioteca combinatorial foi gerada usando uma série de olugonucleotídeos degenerados que codificam ambos os resíduos 3649 parenterais bem como as substituições de aminoácido simples benéfico identificado (Tabela 35). Uma segunda biblioteca combinatorial foi gerada usando uma série separada de oligonucleotídeos degenerados que codificam apenas os resíduos de substituições de aminoácidos mais benéficas simples mas não os resíduos 3649 parentais (Tabela 36). As duas bibliotecas foram gerados e avaliados separadamente. A geração da biblioteca foi feita como descrito em Wu, H., Methods Mol Biol., 207:197-212 (2003); Wu & An, Methods Mol Biol., 207:213-33 (2003). Resumidamente, os iniciadores degenerados apresentam os sintetizados e fosforilados. A mutagênese de hibridização foi realizada pelo uso de todos os iniciadores em um recozimento simples e reação da síntese. A geração da biblioteca, teste e avaliação foram realizadas como descritos acima. O perfil de ELISA de seis clones Fabs combinatoriais com a afinidade de mais alta ligação para o CD19 recombinante humano que expressa as células 300B4 é mostrado na Figura 19. O Clone 7E12 foi recuperado a partir da primeira biblioteca combinatorial gerado com oligonucleotídeos degenerados que codificam ambos os resíduos de substituição parenteais e benéficos de CDR. Os clones 14H5, 15D7, 15D1, 16C9, e 16C4 foram recuperados a partir da segunda biblioteca combinatorial gerada com oligonucleotídeos degenerados que codificam apenas os resíduos de substituição mais benéfico de CDR. Todos pelos clones de fagos listados na Figura 19 foram sequenciados para determinar a sequência de aminoácido das regiões da variante CDR com afinidade de ligação de CD19 humano aumentada. Tabela 35. Oligonucleotídeos degenerados para a geração da biblioteca de fago combinatorial. A série de oligonucleotide listada neste codifica tanto os resíduos parenterais quanto os resíduos de substituição benéficas identificado a partir das bibliotecas de substituição simples focadas em CDR. Tabela 36. Os oligonucleotídeos degenerados para a geração da biblioteca de fator combinatorial. As série de oligonucleotídeos listados neste codificam apenas os resíduos de substituição mais benéficos identificados a partir das bibliotecas de substituição simples focadas em CDR.

7.11.2. CARACTERIZAÇÃO DE ANTICORPOS ANTI-CD19 PELA VARIANTE DE AFINIDADE AUMENTADA

[00718] Os polinucleotídeos que codificam as regiões variáveis das variantes de Fab 7E12, 14H5, 15D7, 15D1, 16C9, e 16C4 com atividade de ligação anti-CD19 melhorada foram amplificadas por PCR a partir de uma região V correspondentes que codifica o vetor de fagos M13 usando a polimerase de DNA de pfu (ver, Dall’Acqua et al., Methods 36:43-60 (2005)). Os polinucleotídeos foram então clonados individualmente nos mamíferos dos vetores de expressão que codificam um intensificador precocemente imediato pelo maior citomegalovírus humanos (hCMVie), promotor e região 5' não traduzida (M. Boshart, et al., Cell 41:521-530 (1985)). Neste sistema, uma cadeia y humana é secretada junto com uma cadeia K humana (S. Johnson, et al., Infect. Dis. 176:1215-1224 (1997)). As construções diferentes foram expressadas transitoriamente em células HEK-293 e coletadas 72 e 144 horas pós-transfecção. Os IgG1s secretados, humanos solúveis foram purificados a partir do meio condicionado diretamente usando 1 ml das colunas de proteína A de HiTrap de acordo com as instruções do fabricante (APBiotech, Inc., Piscataway, NJ). IgG1s purificados humanos (tipicamente > 95 % de homogeneidade, como julgado por SDS-PAGE) foram dialisados contra a solução salina tamponada de fosfato (PBS), congelado repentinamente e armazenado a - 70oC.

7.11.2.1. ENSAIOS ELISA COM BASE CELULAR

[00719] A capacidade de 7E12, 14H5, 15D7, 15D1, 16C9, e 16C4 IgG dos anticorpos por ligar-se ao CD19 humano foi avaliada nos ensaios de ligação CD19 com base celular. Três diferentes linhas celulares foram usadas como reagentes de captura: (i) CD19 recombinante humano que expressam as células 300B4 (Figura 20,), (ii) células de Raji (Figura 21.) e (iii) células de Daudi (Figura 22.). todas as três linhas celulares foram cultivadas de acordo com protocolos padrões. Um procedimento ELISA padrão pode ser usado por um ensaio de ligação CD19 com base celular. Por exemplo, os reservatórios individuais de uma placa funda em U de 96 reservatórios são semeados com 1 x 10e5 das células 300B4 e incubadas durante a noite. As células são lavadas uma vez com tampão de ELISA antes de incubação em gelo com várias quantidades de anticorpos anti-CD19. As reações de ligação são realizadas em triplos para cada concentração de anticorpo testadas. Os reservatórios de controle positivo usando anticorpo anti-CD19 3649 são incluídos no ensaio. Seguido pela incubação com o anticorpo, as células 300B4 são lavadas três vezes com 200 microlitro do tampão de ELISA. Os anticorpos de ligação da superfície celular anti-CD19 são detectados usando um anticorpos de capa anti-humano de cabra conjugado com a peroxidase de rábano silvestre de acordo com protocolos padrões.

[00720] As curvas de ligação de ELISA de anticorpos 3649, 7E12, 14H5, 15D7, 15D1, 16C9, e 16C4 anti-CD19 IgG usando as células 300B4, células de Raji, ou células de Daudi como os reagentes de captura são mostrados nas Figuras 20 a 22. Todos dos anticorpos testados exceto pelo 16C9 e 15D1 apresentam significantemente mais altas afinidades de ligação para a superfície celular apresentada por CD19 humano do que os anticorpos de controle 3649. A afinidade de ligação de 16C9 e 15D1 comparados ao anticorpo 3649 quando as células 300B4 são usadas como reagentes de captura. Uma afinidade de ligação dos anticorpos 16C9 e 15D1 por CD19 humano é mais altas do que do anticorpo de controle 3649 quando as células Raji ou células de Daudi são usados como reagentes de captura.

7.11.2.2. VARIANTES DO ANTICORPO ANTI-CD19 14H5 COM LOCAL DE DESAMIDAÇÃO MODIFICADO.

[00721] A sequência primária de aminoácido dos anticorpos 3649, 7E12, 14H5, 15D7, e 16C9 compreendem um motivo de desamidação NG (resíduos 60 a 61 de VH CDR2). Três desamidações menos variantes de 14H5 foram gerados pela mudança do resíduo de asparagina (N) na posição Kabat 60 por tirosina (Y), ácido aspártico (D), ou leucina (L). as regiões Y60, D60, e L60 que compreendem a variante 14H5 VH são desiguinadas como 14H5-YG (SEQ ID N°: 107), 14H5-DG (SEQID NO:108) e 14H5-LG (SEQ ID N°: 109), respectivamente. Os anticorpo dos vetores de expressão que compreendem os polinucleotídeos que codificam a desamidação menos das variantes 14H5 foram gerados usando técnicas de clonagem moleculares padrões. Transitoriamente expressados os 14H5-YG, 14H5-DG, e 14H5-LG anti-CD19 IgG foram purificados como descrito acima. Uma afinidade por ligação dos anticorpos 14H5- YG, 14H5-DG, e 14H5-LG foram determinados usando um ensaio ELISA com base na célula utilizando o CD10 recombinante humano que expressa as células 300B4 como um reagente de captura. Os anticorpos 14H5 e 16C4 anti-CD10 foram utilizados como controles positivos. Os resultados obtidos são apresentados na Figura 23. Uma afinidade por ligação dos anticorpos 14H5-YG, 14H5-DG, e 14H5-LG pelo CD19 recombinante humano que expressam as células 300B4 é inferior do que dos anticorpos 14H5 ou 16C4.

7.11.2.3. TAXA CINÉTICA DA AFINIDADE DOS ANTICORPOS ANTI- CD19 MADUROS.

[00722] A taxa cinética dos anticorpos 7E12, 14H5, 15D7, 15D1, 16C9, e 16C4 anti-CD19 IgG foi determinada pela seguinte eliminação pelo período de tempo de anticorpos de ligação da superfície celular anti- CD19. Resumidamente, as células de Ramos foram incubadas com o anticorpo anti-CD19 7E12, 14H5, 15D7, 15D1, 16C9, ou 16C4 maduro por afinidade seguido pelos protocolos de tingimento padrão. As células foram lavadas seguidas pela incubação para eliminar qualquer não ligação primária do anticorpo e ainda incubada a 37° C por 0, 30, ou 60 minutos. No final do período de incubação, as células foram tingidas com um fragmento IgG Fc RPE anti-humano de camundongo conjugado pelo reagente secundário seguido pelos protocolos padrões e analisados na citometria de fluxo. Os banhos de controle das células foram incubadas com o anticorpo anti-CD19 3649 ou um anticorpo de referência de controle anti-CD20 antes de incubação a 37° C. A intensidade do meio de fluorescência medida em vários pontos de tempo usando os anticorpos diferentes é apresentado na Figura 24 A. 100 % da intensidade do meio de fluorescência corresponde à intensidade de tingimento visto no tempo 0 com um dado anticorpo.

[00723] A perda da intensidade do meio de fluorescência observado com a afinidade madura de anticorpos anti-CD19 7E12, 14H5, 15D7, 15D1, 16C9, e 16C4 é inferior do que do observado com o anticorpo de controle anti-CD20 de referência. Em contraste, o anticorpo 3649 anti-CD19 tingido por células de Ramos apresentam uma rápida perda da intensidade do meio de fluorescência que as células tingidas com o anticorpo de referência de controle anti-CD20 (Figura 24A).

[00724] Em um experimento separado, as células de Ramos foram tingidas com um Alexa 647 conjugado pelo anticorpo CD-19 16C4, 3649, ou HB12B seguido pelos protocolos padrões. Seguido pelo tingimento, as células foram lavadas para remover o anticorpo não ligado e ainda incubado a 37° C por 0, 30, ou 60 minutos. As células foram subsequentemente analisadas em um citômetro de fluxo. Um anticorpo anti-CD20 fluorescentemente conjugado foi incluído no experimento como um controle de referência. A intensidade do meio de fluorescência (MFI) visto em vários pontos de tempo é mostrado na Figura 24B. O MFI é expressado como uma fração do valor MFI visto no tempo 0, perda de MFI detectado com o anticorpo maduro por afinidade 16C4 anti-CD19 é significantemente mais lento do que a perda da MFI vista com os anticorpos 3649 ou HB12B anti-CD19. O anticorpo anti-CD20 da referência de controle apresenta as mesmas taxas como os anticorpos 3649 e HB12B anti-CD19.

7.11.2.4. TINGIMENTO DA SUPERFÍCIE CELULAR POR ANTICORPOS ANTI-CD19 DE AFINIDADES MADURAS

[00725] As células de Daudi foram imunotingidas com 7E12, 14H5, 15D7, 15D1, 16C9, e 16C4 anticorpos anti-CD19 e um fragmento RPE conjugado pelo IgG (Fab’)2 anti-humano de cabra de reagente secundário de acordo com os protocolos padrões. As células imunotingidas foram analisadas em um citômetro de fluxo. O meio de intensidade da fluorescência (MFI) das células tingidas em várias concentrações primárias do anticorpo é plotada na Figura 25. As células tingidas com o anticorpo 3649 anti-CD19 foram incluídas como referência de controle. A intensidade do tingimento detectado com os anticorpos 7E12, 14H5, 15D7, 16C9, e 16C4 anti-CD19 foi mais alto do que do anticorpo 3649 das células tingidas em todas as concentrações testadas. A intensidade do tingimento detectado com o 15D1 foi similar à intensidade de tingimento detectado com o anticorpo 3649 em baixas concentrações de anticorpos (0,5 mg/ml ou inferiores). MFI de células tingidas 15D1 foi mais alta, entretanto, do que do anticorpo 3649 das células tingidas em concentrações do anticorpo elevado (1 mg/ml ou maiores).

7.11.2.5. ATIVIDADE ADCC IN VITRO DE ANTICORPOS ANTI-CD19 MADUROS POR AFINIDADE.

[00726] A atividade ADCC in vitro dos anticorpos maduros por afinidade anti-CD19 foi medido usando os ensaios descritos neste. Por exemplo, os resultados obtidos com os anticorpos 16C4, 14H5, e 14H5-DG usando as células alvos Daudi são apresentadas na Figura 26. O anticorpo anti-CD19 3549 como usado como um controle de referência. Todos os três anticorpos maduros por afinidade apresentaram atividade ADCC aumentada nas concentrações dos anticorpos de 0,1 mg/ml ou menos comparados à referência do anticorpo de controle 3649. A atividade ADCC dos anticorpos 16C4, 14H5, e 14H5-DG comparados à atividade do anticorpo 3649 em 1 mg/ml oi anticorpos mais altos das concentrações do anticorpo.

[00727] A atividade ADCC in vitro dos anticorpos afucosilados maduros por afinidade anti-CD19 também foi medido usando os ensaios descritos neste. Por exemplo, o anticorpo afucosilado 16C4 (16C4-aFuc) mediado por ADCC foi medido usando as células alvo Daudi (Figura 26). Os experimentos também incluem 16C4, 3649- aFuc, e anticorpos anti-CD20 como controles de referência. O ADCC de 16C4-aFuc é significantemente mais alto do que dos anticorpos 3649-aFuc, anti-CD20, ou 16C4 referência fucosilada. O ADCC mediado por 16C4-aFuc é comparável àqueles dos anticorpos.

[00728] A atividade ADCC in vitro de anticorpos 16C4, 16C4-aFuc, e 3649-aFuc anti-CD19 foram ainda caracterizados em um ensaio padronizado ADCC in vitro usando uma variedade de células alvos. Um anticorpo anti-CD20 foi incluído no ensaio como um controle. As células alvos usadas representam uma variedade da nocividade da célula B bem como densidades de CD19 da superfície celular diferentes (Tabela 37). A expressão da superfície relativa de CD19 e CD20 das células alvos como determinado pela citometria de fluxo seguido pelos protocolos padrões.

[00729] A Tabela 37 lista o meio da intensidade da fluorescência (MFI) das células alvos tingidas com anticorpos anti-CD20 ou 16C4 anti-CD19 rotulados fluorescentemente. As reações de ADCC foram realizadas seguidas pelos protocolos descritos acima. As reações foram apresentadas em triplos usando 50.000 células efetivas e 20.000 células alvos para atingir uma razão de E:T de 2.5:1. As células NK transgênicas que expressam CD16 e polipeptídeo de sinalização associado por FCεRI-y servidos como células efetivas. As reações ADCC foram deixadas proceder por 4 horas a 37° C. A atividade ADCC como determinado em concentrações de vários anticorpos. Os dados foram plotados como % da citoxicidade como uma função da concentração do anticorpo. A morte celular máxima e os valores EC50 (concentrações do anticorpo requeridos pela metade máxima da citotoxicidade sob as condições usadas) foram estabilizadas por célula alvo/combinações de anticorpos usando métodos padrões. A Tabela 37 apresenta o resultado final. As células Oci-LY19, KArpas-422, Nalm-6, e Namalwa requer apresentam DLCL, NHL, ALL, e linfoma de Burkitt, respectivamente, e foram sensíveis a citoxicidade mediada pelo anticorpo 16C4-aFuc mas não amplamente sensível ao anti-CD20 mediado por ADCC. As células de Daudi, Toledo, RL e Raji foram significantemente mais sensíveis ao anticorpo 16C4-aFuc mediado pela citotoxicidade do que por anti-CD20 mediado por ADCC. Tabela 37. Avaliação quantitativa de anticorpos 16C4, 16C4-aFuc, e 3649-aFuc anti-CD19 mediados por ADCC.

7.11.2.6. DEPLEÇÃO DA CÉLULA B IN VITRO PELOS ANTICORPOS ANTI-CD19 MADUROS POR AFINIDADE

[00730] Os anticorpos anti-CD19 maduros por afinidade foram testados na depleção dos ensaios das células B esencialmente como descrito acima. Os animais C57Bl6 hCD19 tg +/- foram tratados com uma dose simples de intravenosa de 10, 50, ou 250 μg de 16C4 de anticorpo anti-CD19 maduro por afinidade (16C4) ou 14H5DG anticorpo anti-CD19 maduro por afinidade (14H5DG). A referência dos animais de controle foram tratados com (i) anticorpo anti-CD19 3649 (3649), (ii) variante Fc que intensifica ADCC dos anticorpos anti-CD19 3649 (3649 3M) e (iii) anticorpo anti-CD19 3649 afucosilados (3649- aFuc). Os animais de controle negativo foram tratados com (i) a variante Fc compromissada por ADCC do anticorpo anti-CD19 3649 3649 (3649 TM) ou (ii) um anticorpo de especificidade irrelevante (R347). A circulação dos linfócitos e linfócitos esplênicos foram isolados 7 dias depois do tratamento do anticorpo. As células isoladas foram imunotingidas como descritos na Tabela 5 para identificar várias populações de células B. as amostras foram analisadas em um citômetro de fluxo seguido pelos protocolos padrões.

[00731] O anticorpo anti-CD19 16C4 maduro por afinidade de uma depleção levemente mais alta das células B do que do anticorpo de origem 3649 anti-CD19. Os anticorpos 3649-aFuc e 3649 3M atingindo maior depleção do que o anticorpo 16C4 maduro por afinidade. O anticorpo anti-CD19 14H5DG maduro por afinidade é menos eficiente em esgotar as células B do que do anticorpo de origem 3649 anti- CD19.

7.11.2.7. RECUPERAÇÃO DE TERMO LONGO DOS LINFÓCITOS B SEGUINDO A ADMINISTRAÇÃO DE UMA DOSE DE ESGOTAMENTO SIMPLES DOS ANTICORPOS ANTI-CD19 MADUROS POR AFINIDADE.

[00732] A recuperação do termo longo dos compartimentos da célula B foi estudado seguido pela administração de uma dose esgotada simples de anticorpo anti-CD19 16C4-aFuc monoclonal. Vinte e cindo C57Bl6 hCD19 tg +/- de camundongos (13 machos, 12 fêmeas, 2,5 a 3 meses de idade) foram separados em 5 grupos. Uma semana antes da administração do anticorpo experimental (semana - 1) os animais foram examinados pelo saúde total, pesados e uma pequena alíquota de sangue foi coletada para cada uma destas análises. No dia 0 do experimento 250 μg de 16C4-aFuc mAb, 50 μg de 16C4-aFuc mAb, 10 μg de 16C4-aFuc mAb, 250 mg of R347 anticorpo de controle de especificidade irrelevante, ou PBS foram administrados intravenosamente aos animais nos grupos 1,2, 3, 4, e 5, respectivamente. No dia 7 (semana 1) e em intervalos semanalmente subsequentes, os camundongos em cada grupo foram examinados e sangrados. As amostras de sangue foram submetidos à citometria de fluxo para determinar a célula B, a célula T, célula T NK, neutrófila, monócito e número celulares dendríticos. As amostras sanguíneas foram ainda analisadas para determinar a concentração do soro de IgM, IgG1, IgG2b, IgG2c, IgG3, IgA, anti-dsDNA IgM, anti-dsDNA IgG, anti-ssDNA IgM, anti-ssDNA IgG bem como os níveis do soro IL-7, CXCL12, CXCL13 e BAFF. As medições foram realizadas seguidas pelos procedimentos padrões. O resumo do experimento e o resultado obtido são apresentados na Figura 38.

[00733] Nenhum efeito adverso óbvio foi observado seguido pelo tratamento do medicamento. Os animais em todos os grupos experimentais mantidos os níveis de atividade normal e peso (Figura 38B). Os níveis da célula B de animais que recebem o anticorpo anti- CD19 16C4-aFuc foi significantemente inferior do que dos animais de controle (Figura 38C e D). A depleção da célula B ainda foi completa em animais que recebem 10 mg de 16C4-aFuc. A duração da depleção da célula B foi dependendo da dosagem; a duração % da depleção aumentada com mais altas dose do anticorpo 16C4-aFuc. As células B em animais que receberam 10 μg 16C4-aFuc iniciam a recuperação pela semana 3 e atingem os níveis normais pela semana 5. A recuperação dos animais que recebem 50 μg de partes 16C4- aFuc de 9 semanas. Os animais que recebem 250 mg de 16C4-aFuc ainda foram quase completamente sem as células B na semana 11 do experimento. A concentração sanguínea da célula Ts, célula Ts NK, células NK, células dentríticas, neutrofilas, e monócitos não foram afetados pelo anticorpo 16C4-aFuc (dados não mostrados). Os níveis do soro IgM, IgG1 e IgG2b foram também reduzidos pelo tratamento do anticorpo 16C4-aFuc (Figuras 38E a G). a redução nos níveis de imunoglobulina foi a dose sensível; redução significante nos níveis foi apenas visto em animais tratados com 50 ou 250 μg do anticorpo 16C4-aFuc. A recuperação nos níveis de imunoglobulina amplamente recuperam o caminho do compartimento da célula B.

7.11.2.8. ANÁLISE IEF-PAGE DOS ANTICORPOS ANTI-CD19.

[00734] A análise de eletroforese em gel de poliacrilamina com foco em isolitérica natural (IEF-PAGE) foi realizada em anticorpos anti- CD19 16C4, 16C9, 7E12, 14H5, 15D7, 15D1, 14H5-DG, e 3649 seguido pelos protocolos padrões. Os géis de amfolina pré-fundida (Amersham Biosciences, faixa de pI 3,5 a 9,5) foram carregadas com 8 μg da proteína purificada. As amostras das proteínas foram dialisadas em 10 mM de Histidina do tampão de pH 6,0 antes do carregamento do gel. A larga faixa dos marcadores padrões de pI (Amersham, faixa de pI 3 a 10, 8 μL) foram usados para determinar os valores relativos de pI. A eletroforese foi realizada em 1500 V, 50 mA por 105 minutos. O gel foi fizado por 45 minutos e tingidos durante a noite em temperatura ambiente usando tingimento Simply Blue (Invitrogen). O não tingimento foi realizado com etanol a 25 %, 8 % de solução de ácido acético. Os pontos isoelétricos foram determinados usando um densitômetro Bio-Rad GS-800 com software Quantity One Imaging. O gel tingido por Coomassie é mostrado na Figura 27. O ponto isoelétrico dos anticorpos 16C4, 16C9, 7E12, 14H5, 15D7, 15D1, 14H5-DG, e 3649 é de 7,83, 8,04, 7,69, 7,76, 7,61, 7,72, 7,48, e 7,75, respectivamente.

7.11.3. ANTICORPOS ANTI-CD19 MADUROS POR AFINIDADE DA VARIANTE Fc

[00735] Os vetores de expressão dos anticorpos que codificam uma variante Fc do anticorpo 16C4 que compreende as substituições de aminoácidos L234F/L235F/P331S ou L234F/L235Y/P331S (depois disso referido como “16C4-235F” ou “16C4-235Y”) é gerado usando métodos descritos nas US 2004/0132101 e US 2005/0054832, ambas por Lazar et al.. Resumidamente, o vetor de expressão do anticorpo que codifica 16C4 é modificado usando um local direcionado ao kit da mutagênese (por exemplo, QuickChange (Promega)) pela introdução das substituições do resíduo do nucleotídeo necessário nas sequências de polinucleotídeos que codificam a região constante de cadeia pesada para gerar o vetor de expressão do anticorpo 16C4- 235F ou 16C4-235Y. A variante Fc do anticorpo 16C4 purificado é gerado pela transfecção das células HEK239F com o anticorpo apropriado do vetor de expressão. As células transfectadas são alimentadas no dia 3 e 6 e o meio condicionado contendo o anticorpo é coletado no dia 9. O anticorpo é purificado a partir do meio condicionado usando uma coluna de proteína A de pré-emissão (GE Healthcare). O anticorpo é eluído a partir da coluna com baixo tampão de pH, neutralizado, e dialisado contra PBS. A concentração do anticorpo purificado é calculado a partir da densidade óptica de solução em 280 nm.

[00736] A medição de constantes ligações de equilíbrio (KD): as constantes ligações de equilíbrio de todos os receptores Fcy (FcyRI humano, FcyRIIA, FcyRIIB, FcyRIIIA-V158, bem como FcyRIIB de murino, FcyRIII e FcyRIV) a 16C4 e esta variante Fcs foi medida em um instrumento BIAcore 3000 (Uppsala, Sweden). Resumidamente, todos os IgGs foram imobilizados em células de fluxo separadas de dois chips sensores CM5 usando a química de ligação amino padrão como recomendado pelo fabricante. Os níveis IgG imobilizados variam de 8194 a 8725 RUs. As soluções de estoque dos domínios extracelulares expressados recombinantemente de todos FcyRs em 4000 ou 16000 nM foram preparados e então periodicamente diluídos abaixo das concentrações desejadas usando o tampão de instrumento (50 mM de HBS contendo 0,01 M de HEPES, pH 7,4, 0,15 M de NaCl, 3 mM de EDTA e 0,005 % de P-20). A cópia das injeções de cada uma concentração de FcyR foram então injetadas totais das superfícies IgG em uma taxa de fluxo de 5 μL/min. Os dados de ligação foram coletados por aproximadamente 50 minutos, seguido por um pulso de 30 segundos de 5 mM de HCl entre as injeções para regenerar as superfícies IgG. As diversas injeções de tampão foram também intercaladas completamente nas séries das injeções. Uma destas injeções de tampão como usado junto com os dados celulares de referência para corrigir as séries de dados brutos. Depois de todos os dados da ligação foram coletados, as séries de dados individuais foram mediados para cada y de concentração, então ajustado por 1:1 da ligação isotérmica de constantes ligações de equilíbrio, KD, foram derivadas. Este foi realizado usando o software BIAevaluation, v. 4.1. valores KD (nM) são apresentados na Tabela 38. Tabela 38. Afinidades de ligação (KD, nM) de vários IgG1s humanos por humanos e FcyR de camundongo.

7.12. ISOLAMENTO DA AFINIDADE DAS VARIANT ES MADURAS DO ANTICORPO ANTI-CD19 16C4

[00737] As variantes maduras por afinidade do anticorpo 16C4 foram identificadas usando os protocolos descrito neste. A avaliação consiste de dois estágios. O primeiro estágio focado na identificação da variante Fabs 16C4 que compreende a substituição de aminoácido simples que resultou na atividade de ligação aumentada pela superfície celular apresentada pelos anticorpos humanos CD19. A variante Fabs 16C4 que compreende uma substituição de aminoácido simples benéfica foi identificada por intermédio da avaliação simples de CDR focado nas bibliotecas que apresentam os fagos. O segundo estágio da avaliação consiste da avaliação de uma biblioteca combinatória de clones de Fab que requer apresentam todas as combinações possíveis da substituição de aminoácido simples benéfico identificado (i) no primeiro estágio do processo de maturação por afinidade 16C4 ou (ii) durante o processo de maturação por afinidade do anticorpo anti-CD19 3649.

[00738] As bibliotecas apresentam os fagos específicos por CDR e foram gerados como descrito acima. As bibliotecas foram avaliadas pelo teste de um amplo número de clones de fagos (aproximadamente 400 clones por biblioteca) em células de ponto simples com base no ensaio de ligação (Lu et al., J. Immunol. Methods 314:74-79 (2006)). Os reagentes e disponíveis foram adquiridos de Meso Scale Discovery; ensaios foram realizados seguido pelas instruções do fabricante. Resumidamente, 5.000 células de Raji ou 300B4 /reservatório foram colocadas e incubadas por 1 hora em temperatura ambiente em 25 μl de 1X de PBS; os reservatórios foram bloqueados com 25 μl de 30 % de FBS por 20 minutos em temperatura ambiente; o sobrenadante é descartado; 25 μl de anti-CD19 Ab adicionado para cada reservatório e incubado por 1 hora em temperatura ambiente; os reservatórios são lavados 3 x com 1X de PBS; adicionados 25 μl de 0,25 μg/ml de Fab’2-MSDTag anti-humano de cabra para cada reservatório e incubado por 1 hora em temperatura ambiente; os reservatórios lavados 3 X com 1 X de PBS; o sinal é lido com 150 μl de 1X de tampão T Read. A curva da ligação de um clone representativo que compreende um benefício da substituição de aminoácido em VH CDR2 é mostrados na Figura 32. O benefício da substituição de aminoácido simples identificado a partir das bibliotecas específicas por 16C4 CDR são listadas na Tabela 39. Tabela 39. Benefícios da substituição de aminoácido simples identificados a partir do anticorpo 16C4 com base nas bibliotecas que apresentam os fagos específicos por CDR.

[00739] As bibliotecas que apresentam os fagos combinatórios foram preparadas como descrito acima. Os oligonucleotídeos específicos por 16C4 Fab usados para a geração da biblioteca são listados na Tabela 40. Os clones Fab individuais a partir da biblioteca combinatória foram testados para à ligação de células 300B4 e Raji (Lu et al., J. Immunol. Methods 314:74-79 (2006)). As curvas de ligação dos clones de Fab representativos são mostrados na Figura 33 A e B. Os clones de Fab com a atividade de ligação aumentada por células 300B4, células de Raji, ou ambas foram sequenciadas usando métodos padrões. Um resumo das mudanças dos aminoácidos observados nas sequências CDR de clones Fab únicos está apresentada na Figura 33C. Tabela 40. Oligonucleotídeos degenerados para a geração de biblioteca de fago combinatório.

[00740] Seis clones de variante Fc 16C4 maduras por afinidade com atividade de ligação melhorada para a superfície celular apresentou um antígeno de CD19 humano e foram transformadas em anticorpos IgG1 totais usando métodos descrito neste. A ligação atividade de anticorpos anti-CD19 3C3, 6F7, 2B11, 6C11, 9G7, e 5C4 maduros por afinidade foram caracterizados em vários ensaios com base celular. A Figura 34 apresenta o resultado obtido usando as células 300,B4 em um ensaio ECL de base celular (Lu et al., J. Immunol. Methods 314:74-79 (2006)). A atividade de ligação CD19 dos anticorpo de variante 16C4 maduros por afinidade são mais altos do que dos anticorpos 16C4 ou 3649 de controle.

[00741] O tingimento da superfície celular pelo anticorpos anti- CD19 maduros por afinidade. As células Daudi e Raji foram imunotingidas com os anticorpos anti-CD19 3C3, 6C11, e 9G7 e um fragmento IgG (Fab’)2 anti-humano de cabra conjugado por RPE de reagente secundário de acordo com protocolos padrões. As células imunotingidas foram analisadas em um citômetro de fluxo. O meio de intensidade da fluorescência (MFI) de células tingidas em várias concentrações primárias de anticorpos são plotadas na Figura 35. As células tingidas com o anticorpo anti-CD19 16C4 foram incluídas como um controle de referência. A intensidade do tingimento detectado com os anticorpos 3C3 e 6C11 maduros por afinidade e células Raji de 0,0625 a 0,25 μg/ml da concentração do anticorpo é mais alto do que dos detectados com o controle 16C4. A intensidade do tingimento da célula Raji dos anticorpos maduros por afinidade e anticorpo de controles são os mesmo em 0,5 a 10 μg/ml da concentração do anticorpo. O tingimento da célula Raji pelo anticorpo 9G7 é similar ao anticorpo de controle em concentração inferior (0,0625 a 0,25 μg/ml) dos anticorpos e mais fraco do que o controle em (0,5 a 10 μg/ml) concentração do anticorpos mais altas. O meio FI das células 9G7 e 6C11 Daudi tingidas é mais alta do que das células 16C4 tingidas. O meio FI das células 3C3 Daudi tingidas é mais altas do que das células de controle em 0,0625 e 0,125 μg/ml da concentração do anticorpo e substancialmente as mesmos do que as célula do controle em 0,25 a 10 μg/ml da concentração do anticorpo.

[00742] A atividade ADCC da maduros por afinidade in vitro dos anticorpos anti-CD19 das variantes 16C4. A atividade ADCC maduros por afinidade in vitro dos anticorpos anti-CD19 foi medida usando os ensaios descritos neste. Por exemplo, o resultado obtido com os anticorpos 3C3, 6C11, e 9G7 usando as células alvos Raji e Daudi são apresentadas nas Figuras 36 e 37, respectivamente. O anticorpo anti- CD19 16C4 como usado como um controle de referência. Todos os três anticorpos maduros por afinidade apresentados substancialmente nas mesmas atividades ADCC como o controle em uma faixa de concentração testada de 90.0001 a 10 μg/ml).

[00743] Este é entendido por indivíduos habilitados na técnica que as variantes maduras por afinidade do anticorpo anti-CD19 16C4 podem ser ainda modificados de acordo com os protocolos descrito neste. Especificamente, os anticorpos 3C3, 6C11, e 9G7 podem ser modificados para compreender qualquer uma das regiões das variantes Fc descritas neste. Uma versão afucosilada dos anticorpos também podem ser preparadas. Os anticorpos maduros por afinidade também podem ser caracterizados usando os ensaios descritos neste. Especificamente, a capacidade dos anticorpos 3C3, 6C11, e 9G7 mediar o ADCC, por esgotar as células B in vivo, reduzindo o tamanho dos xenoenxertos do tumor, para inibir a proliferação de célula B estimulada por anti-IgM/CpG e pode ser testada seguida pelos protocolos descritos neste.

7.13. ANTICORPO ANTI-CD19 MEDIADO PELA INIBIÇÃO DA PROLIFERAÇÃO DA CÉLULA B 7.13.1. TRATAMENTO DO ANTICORPO ANTI-CD19 INDUZIDO POR FOSFORILAÇÃO CD19

[00744] Dez milhões de células foram incubadas por 15 minutos na presença de 5 μg/ml de 3649, 3649-3M, 3649-aFuc, 3649-TM ou anticorpos anti-CD19 16C4. As células de controle tratadas com o anticorpo R347 de especificidade irrelevante bem como as células de controle sem o tratamento do anticorpo foram incluídas no experimento como controle negativo. Seguido pela incubação, os lisados celulares foram preparados e submetidos à imunoprecipitação de acordo com protocolos padrões. O material imunoprecipitado e a entrada da célula lisada foi separada em um Laemmli SDS-PAGE, transferido pelo suporte sólido (Nitrocellulose Invitrogen Cat# LC2001) e submetido ao Western blotting. A imunoprecipitação foi realizada com 2 μg do anticorpo anti-CD19 HB12B seguido pelos protocolos padrões. A proteína CD19 total e os níveis CD19 fosforilados foram detectados no material imunoprecipitado por Western blotting usando o anticorpo (1:1000) anti-CD19 (Cell Signaling Technology #3574) ou (1:250) anti-fosfotirosina (PY20) (Santa Cruz Biotechnology #sc-508 HRP), respectivamente. A proteína Erk1/2 fosforilada e os níveis de proteína Erk1/2 totais na entrada a célula lisada foram detectados por Western blotting usando o anticorpo (1:2000) anti-fosfo Erk1/2 (Cell Signaling Technology #9106S) e (1:1000) anti-Erk1/2 (Cell Signaling Technology #9102), respectivamente.

[00745] A Figura 39A mostra o resultado da imunoprecipitação HB12B seguido por Western blotting. Além disso as amostras imunoprecipitadas a partir de vários experimentos (“3649”, “3649-3M”, “3649-aFuc”, “3649-TM” ou “16C4”) e lisados celulares de controle (“nil” e “R347”), a membrana também contida em um anticorpo HB12B apenas o caminho de controle (“Ab sozinho”). Os níveis de proteínas CD19 totais foram substancialmente idênticas em todas as amostras imunoprecipitadas. Os níveis de CD19 fosforilados foram significantemente mais altos nas amostras imunoprecipitadas a partir dos lisados celulares preparados das células tratadas por anti-CD19 do que nas amostras de controle. A Figura 39B mostra o resultado por Western blot em lisados celulares totais. Os níveis de proteínas Erk1/2 total foram substanciamente idênticas em todos os lisados celulares. Os níveis Erk1/2 fosforilados foram significantemente mais altos nos lisados celulares preparados a partir das células tratadas por anti- CD19 do que nas amostras de controle.

7.13.2. TRATAMENTO ANTI-CD19 NÃO INIBE ANTI-IgM MEDIADO PELA ATIVAÇÃO Erk1/2.

[00746] Um milhão de células foram estimuladas com 5 μg/ml do anticorpo anti-IgM ou PMA (50 ng/ml)/ionomicina (1 μM) por cinco ou dez minutos na presença de 10 μg/ml do anticorpo anti-CD19 3648-3M ou 10 μg/m do anticorpo de controle R347. As células com apenas o tratamento 3649 ou R347 foram incluídas como controle. As células foram coletadas e lisadas no final do período de incubação. As células lisadas totais foram separadas em um Laemmli SDS-PAGE, transferidas por uma membrana de suporte de nitrocelulose e submetidas a Western blotting seguido pelos protocolos padrões. O Western blotting usando anticorpo anti-fosfo Erk1/2 e anticorpo anti- Erk1/2 foi realizado para detectar o Erk1/2 fosforilado e os níveis totais de Erk1/2, respectivamente, no lisado celular. Os resultados são mostrados na Figura 39C a D.

[00747] Os níveis Erk1/2 totais foram substancialmente idênticos em todos os lisados celulares. O nível da linha de base Erk1/2 fosforilada no anticorpo 3649 apenas de células tratadas foi mais alto do que das células tratadas apenas por R347. A estimulação anti-IgM ou PMA/ionomicina dos níveis de Erk1/2 fosforilado aumentado acima da linha de base tanto nas células tratadas 3649 quanto nas R347. O nível de fosforilação de Erk1/2 foi significantemente mais alto seguido pela estimulação PMA/ionomicina do que depois da estimulação com o anticorpo anti-IgM.

7.13.3. TRATAMENTO DO ANTICORPO ANTI-CD19 QUE INIBE A PROLIFERAÇÃO DA CÉLULA B INDUZIDA POR ANTI-IgM/CD40.

[00748] As células B periféricas são purificadas a partir de 200 ml do sangue usando um kit de isolamento da célula B (Miltenyi Biotec # 130-091-151). As 100.000 células são semeadas em uma placa funda em U de 96 reservatórios (100 ul de 1 x 106 célula/ml). Depois, a concentração apropriada do anticorpo é adicionado às células em um volume de 50 ul. A placa é retornada à incubadora por 15 minutos. Então, o estímulo é adicionado como por células em um volume de 50 ul. O volume final da mistura de células/anticorpo/estímulo é de 200ul. As células são incubadas por três dias. Os números celulares são lidos no dia três usando um ensaio de viabilidade celular luminescente CellTiter-Glo® (Promega). Os experimentos nas linhas celulares imortalizadas foram semeados com 10.000 células por reservatórios.

[00749] O efeito do tratamento do anticorpo anti-CD19 em anti- IgM/CD40 induzido pela proliferação da célula B é mostrado na Figura 40. As células B foram colocadas na presença de 10 μg/ml do anticorpo anti-CD193649, 3649-TM, e 3649-3M. As células após 15 minutos de células B foram estimuladas com anti-IgM (5 μg/ml) sozinho, anti-IgM (5 μg/ml)/CD40 (1 μg/ml), ou CpG (1 μg/ml) sozinho. A estimulação da célula B foi deixada proceder por três dias. O número de células viáveis foram medidas no final do experimento usando um ensaio de viabilidade celular luminescente CellTiter-Glo® (Promega). As células tratadas com o anticorpo R347 da especificidade irrelevante foram incluídas como controle. O número de células viáveis foram aumentadas pela estimulação anti-IgM/CD40 ou CpG, mas não pela estimulação IgM sozinha. A proliferação celular induzida por anti-IgM/CD40 foi significantemente inibida pelo tratamento do anticorpo anti-CD19. O nível de inibição (40 %) foi idêntico por todos os anticorpos anti-CD19 testados. A proliferação celular induzida por CpG não foi afetada pelo tratamento do anticorpo anti-CD19.

7.13.4. TRATAMENTO DO ANTICORPO ANTI-CD19 QUE INIBE A PROLIFERAÇÃO DA CÉLULA B INDUZIDA POR ANTI- IgM/CpG.

[00750] A proliferação celular em resposta a vários estímulos foi avaliada usando o ensaio CFSE. Resumidamente, as células B purificadas são recolocadas em suspensão em solução salina tamponada por fosfato (PBS) em aproximadamente 10 milhões de células por mililitro. Para que um volume igual de 1uM de CFSE em PBS seja adicionado. a concentração final de CFSE é de 5 uM e as células são em 5 milhões por mililitro. A suspensão é mantida no escuro por 10 minutos. Um volume igual do soro de bezerro fetal (FCS) é adicionado à mistura para apagar o CFSE extracelular. As células são lavadas e diluídas no meio. As 100.000 células CFSE rotuladas são semeadas em uma placa funda em U de 96 reservatórios (100 ul de 1 x 106 células/ml). Depois, a concentração apropriada do anticorpo é adicionada às células em um volume de 50 ul. A placa é retornada à incubadora por 15 minutos. Depois, o estímulo é adicionado às células em um volume de 50 ul. O volume final da mistura célula/anticorpo/estímulo é de 200 ul. As células são incubadas por quatro dias. No final da incubação, as células são lavadas, tingidas com 7-amino actinomicina D (7-AAD) (BD Bioscience) e analisadas em um citômetro de fluxo. O sinal de CFSE das células vivas é detectada. O sinal CFSE diminui no perfil CFSE de uma população celular é a divisão celular indicativa. A extensão do sinal CFSE diminui correlacionado com níveis de proliferação celular.

[00751] A célula B periférica purificada foi estimulada com anti-IgM (1 μg/ml)/ CpG (2 μg/ml) ou CpG (2 μg/ml) sozinho por quatro dias. A proliferação celular é avaliada usando o ensaio CFSE. A Figura 41A mostra o perfil de CFSE das células de controle estimuladas e não estimuladas. O sinal CFSE de IgM (1 μg/ml)/ CpG (2 μg/ml) das células estimuladas é significantemente inferior do que as células de controle que indicam que a estimulação do IgM (1 μg/ml)/ CpG (2 μg/ml) resultou na proliferação celular extensiva. O perfil CFSE de CpG apenas das células estimuladas indicam apenas a proliferação celular limitada.

[00752] O anticorpo anti-CD19 16C4 inibe a proliferação da célula B induzida por anti-IgM/CpG. As células B periféricas purificadas foram estimuladas com anti-IgM (1 μg/ml)/ CpG (2 μg/ml) na presença de 5 μg/ml do anticorpo de controle R347 ou 5 μg/ml do anticorpo anti- CD19 16C4 por quatro dias. A proliferação celular é avaliada usando o ensaio CFSE. A Figura 41B mostra o perfil CFSE das células B estimuladas com IgM (1 μg/ml)/ CpG (2 μg/ml) na presença do anticorpo R347 ou 16C4. O perfil CFSE das células B estimuladas com anti-IgM (1 μg/ml)/ CpG (2 μg/ml) na presença do anticorpo R347 é indicativo da proliferação celular extensiva. O perfil CFSE das células B estimuladas com anti-IgM (1 μg/ml)/ CpG (2 μg/ml) na presença do anticorpo 16C4 anti-CD19 é indicativo de menos proliferação celular extensiva do que das vistas nas células de controle.

7.13.5. ANTICORPOS ANTI-CD19 DA VARIANTE Fc QUE APRESENTAM PROPRIEDADES INIBIDORAS ALTERADAS.

[00753] As células B periféricas purificadas foram estimuladas por quatro dias com anti-IgM (1 μg/ml)/ CpG (2 μg/ml) na presença de 5 μg/ml do anticorpo de controle R347, variante Fc do anticorpo anti- CD19 3649-3M ou variante Fc do anticorpo anti-CD19 3649-TM. A proliferação celular é avaliada usando o ensaio CFSE. A Figura 42A mostra o perfil de CFSE das células B estimuladas com anti-IgM (1 μg/ml)/ CpG (2 μg/ml) na presença do anticorpo de controle R347. O perfil CFSE mostra que 23,5+26,5+23,2=73,2 % das células B que sofrem de pelo menos um ciclo da divisão celular. As Figuras 42B e C mostram o perfil de CFSE das células B estimuladas com anti-IgM (1 μg/ml)/ CpG (2 μg/ml) na presença de variante Fc 3649-TM e 3649-3M dos anticorpo anti-CD19, respectivamente. Os perfis de CFSE mostram que 44,8 % e 30,3 % das células B estimuladas na presença da variante Fc 3649-TM e 3649-3M do anticorpo anti-CD19, respectivamente, que sofrem pelo menos um ciclo da divisão celular durante os quatro longos dias do período de incubação. A inspeção fecha todos os três perfis CFSE que revelam não apenas diversas células que sofrem de pelo menos uma divisão, mas também diversas células que sofrem mais do que uma gota da divisão com maior e menor proliferação celular visto na presença de R347 e 3649-3M, respectivamente. O tratamento com 3649-TM inibe a proliferação celular menos efetivamente do que tratamento com 3649-3M.

[00754] As células B purificadas foram estimuladas por quatro dias com anti-IgM (5 μg/ml)/ CpG (1 μg/ml) na presença de 5 μg/ml da variante Fc R347, R347-3M, 3649, 3649-3M, ou variante Fc 3649-TM dos anticorpos. A proliferação celular é avaliada usando o ensaio CFSE. O perfil CFSE das células B estimuladas na presença de R347 é incluída em todos os painéis como uma referência padrão. Os perfis CFSE das células B estimuladas na presença da variante Fc R347-3M, 3649, 3649-3M, e variante Fc 3649-TM dos anticorpos é mostrado nos painéis A a D. A proliferação celular na presença da variante Fc R347- 3M é a mesma como uma vista na presença da referência R347 padrão. A proliferação celular é inibida por todos os três anticorpos anti-CD19. O tipo selvagem 3649 e a variante Fc 3649-TM do anticorpos inibiu a proliferação celular para a mesma extensão. O 3649-3M foi mais efetivos na inibição da proliferação da célula B do que os anticorpos 3649 ou 3649-TM.

[00755] O sinergismo inibidor de anti-CD19 e o receptor dos anticorpos anti-Fc de gama IIB (FcyRIIb ou CD32b): seguido pelo projeto experimental ainda testará se existe uma interação sinergística entre o anticorpo anti-CD32b e anti-CD19 mediando as inibições das proliferações da célula B. A células B purificada será estimulada por quatro dias com anti-IgM (2 μg/ml)/ CpG (2 μg/ml) na presença de (i) um anticorpo anti-CD32b (por exemplo, AT10), (ii) um anticorpo anti- CD19 ou (iii) tanto o anticorpo anti-CD32b quanto o CD19. A proliferação celular será avaliada usando o ensaio CFSE. O sinergismo entre anti-CD32b e o anticorpo anti-CD19 mediou a inibição da proliferação da célula B que é esperada levar menor proliferação a célula B na presença de ambos os anticorpos do que a proliferação celular vista na presença do anticorpo sozinho.

7.13.6. ANTICORPOS ANTI-CD19 SÃO EFICIENTEMENTE INTERNALIZADOS.

[00756] O ensaio de internalização do anticorpo: as células são incubadas com 5 μg/ml de anticorpos rotulados por Alexa Flour 488 a 37° C por até 60 minutos. Uma alíquotas das células são removidas em intervalos de 10 minutos, lavadas, dividida em duas partes, e colocadas no gelo. Uma metade da alíquota é levada em gelo não tratado. A segunda metade da alíquota é tratado em gelo por 45 segundos com um pH baixo (2,0) da solução de PBS contendo 0,03M de sacarose e 10 % de FCS para retirar todas as ligações da superfície celular da molécula de anticorpos. Tanto as amostras do ácido tratado quanto o não tratado são lavados, fixados com 4 % de paraformaldeído, e analisados em um citômetro de fluxo. % do anticorpo internalizado é calculado como uma razão do sinal de fluorescência das células lavadas por ácido (sinais internos apenas) e que as células não tratadas (sinal total de compartimentos da superfície celular e interna).

[00757] A Figura 44 mostra a internalização dos anticorpos HB12B, 3649, e 16C4 pela célula Rajis em um período de tempo de 60 minutos. As curvas de internalização mostram que o anti-CD19 retirado atinge o máximo cerca de 20 a 30 minutos. A internalização máxima é de cerca de 50 % para os anticorpos HB12B e 3649 e ~30 % para o anticorpo 16C4.

7.13.7. PERDA DO CD19 A PARTIR DA SUPERFÍCIE CELULAR SEGUIDO PELO TRATAMENTO DO ANTICORPO ANTI-CD19 24 HORAS.

[00758] As células são incubadas na presença de um anticorpo anti-CD19 por 24 horas. Uma população celular de controle é incubada na presença do anticorpo R347 de especificidade irrelevante. Seguido pela incubação, as células são coletadas, lavadas e incubadas em gelo por 10 minutos na solução de tingimento que compreende 5 μg/ml do anticorpo anti-CD19 por 10 minutos. O anticorpo anti-CD19 de ligação da superfície é detectado pelo tingimento das células por 10 minutos com a anticorpo secundário IgG anti-humano de cabra conjugado por PE. As células imunotingidas são fixadas em 4 % de paraformaldeído e analisadas em um citômetro de fluxo. A perda da superfície de CD19 é calculada pela comparação do meio da intensidade de fluorescência (MFI) do anticorpo anti-CD19 das células tratadas ao MFI das células tratadas imunotingidas por R347 (0 % de perda da superfície) e anticorpo secundário apenas as células tratadas tingidas por R347 (100 % da perda da superfície).

[00759] A Figura 45 apresenta a perda da superfície CD19 na célula Rajis e nas células B primárias seguido pela incubação por 24 horas na presença de 5 μg/ml de anticorpos anti-CD19 3649, 3649-3M, 3649-TM, 3648-aFuc, e 16C4. Uma perda de 55 a 70 % e de 65 a 90 % a expressão da superfície de CD19 é detectada em célula Rajis e células B primárias, respectivamente, seguido pelo tratamento com anticorpos anti-CD19.

[00760] Aquele habilitado na técnica reconhecerá, ou será capaz de determinar o uso no mais do que a experimentação de rotina, muitos equivalentes da forma de realização específica da invenção descritos neste. Tais equivalentes são pretendidos ser abrangidos pela seguintes reinvidicações.

[00761] Várias publicações são citadas neste, a divulgação de que são incorporados por referência em sua totalidade para todos os propósitos. A divulgação dos Pedidos Condicionais U.S. N°. 60/842.935 depositado em 8 de Setembro de 2006, 60/866.917, depositado em 22 de Novembro de 2006, 60/911.397, depositado em 12 de Abril de 2007, 60/915.309, depositado em 1° de Maio de 2007, e 60/939.429, depositado em 22 de Maio de 2007 e são incorporados por referência neste em sua totalidade para todos os propósitos.

[00762] Embora o precedente da invenção foi descrito em alguns detalhes pelo meio da ilustração e exemplos para o propósito da clareza e do entendimento, este será óbvio que certas mudanças e modificações podem ser praticadas dentro do escopo das reivindicações anexadas.

Claims (8)

1. Anticorpo monoclonal ou fragmento do mesmo, caracterizado pelo fato de que compreende a. uma região determinande de complementariedade (CDR) 1 de VH que compreende a seqüência de aminoácido da SEQ ID N°: 22, b. uma CDR2 de VH que compreende a seqüência de aminoácido da SEQ ID N°: 116, c. uma CDR3 de VH que compreende a seqüência de aminoácido da SEQ ID N°: 121, d. uma CDR1 de VL que compreende a seqüência de aminoácido da SEQ ID N°: 28, e. uma CDR2 de VL que compreende a seqüência de aminoácido da SEQ ID N°: 125, e f. uma CDR3 de VL que compreende a seqüência de aminoácido da SEQ ID N°: 32, em que o dito anticorpo liga-se a antígeno de CD19 humano.

2. Anticorpo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o dito anticorpo compreende um dompinio VH que compreende a seqüência de aminoácido da SEQ ID N°: 106 e um dompinio VL que compreende a seqüência de aminoácido da SEQ ID N°: 111.

3. Anticorpo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o dito anticorpo tem cadeias de açúcar ligadas por N- glicosídeo complexas ligadas à região Fc em que a fucose não é ligada à N-acetilglucosamina na extremidade de redução na cadeia de açúcar.

4. Anticorpo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o dito anticorpo é uma variante de Fc, em que a dita variante Fc compreende substituições de aminoácidos L234F/L235F/P331S.

5. Anticorpo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o dito anticorpo é uma variante de Fc, em que a dita variante de Fc compreende substituições de aminoácidos L234F/L235Y/P331S.

6. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende o anticorpo de acordo com a reivindicação 1 em um carreador farmaceuticamente aceitável.

7. Anticorpo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que dito anticorpo é um anticorpo quimérico.

8. Anticorpo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que dito anticorpo é um anticorpo humanizado.