CN101534859B - 人源化抗cd19抗体及其在治疗癌症、移植病和自身免疫病中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供嵌合和人源化的抗CD19小鼠单克隆抗体。本发明还涉及使用结合人CD19抗原并可能介导ADCC、CDC和/或凋亡的治疗抗体的药物组合物、免疫治疗组合物和方法，它们可用于治疗B细胞疾病和失调，例如但不限于B细胞恶性肿瘤，治疗和预防自身免疫病，治疗和预防人类移植物接受者的移植物抗宿主病(GVHD)、体液排斥和移植后淋巴增殖性疾病。

Description

人源化抗CD19抗体及其在治疗癌症、移植病和自身免疫病中 的应用

1.介绍

本发明涉及结合于人CD19抗原的人、人源化或嵌合的抗CD19抗体。本发明也涉及包含可介导以下一种或多种反应的人、人源化或嵌合的抗CD19抗体的组合物：补体依赖性细胞介导的细胞毒性(CDC)、抗原依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)和程序性细胞死亡(凋亡)。本发明还涉及含有IgG1和/或IgG3人同种型的人、人源化或嵌合的抗CD19抗体的组合物，以及含有可介导人ADCC、CDC或凋亡的IgG2和/或IgG4人同种型的人、人源化或嵌合的抗CD19抗体的组合物。

本发明还涉及使用能够结合人CD19抗原的治疗性人、人源化或嵌合的抗CD19抗体治疗人类对象的B细胞失调或疾病，包括B细胞恶性肿瘤的方法。本发明涉及使用能够结合人CD19抗原的治疗性人、人源化或嵌合的抗CD19抗体治疗和预防自身免疫病，以及治疗和预防人类移植物接受者的移植物抗宿主病(GVHD)、体液排斥和移植后淋巴增殖性疾病的方法。

2.背景

B细胞在其分化和增殖期间表达各种细胞表面分子。例子包括CD10、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD24、CD37、CD53、CD72、CD74、CD75、CD77、CD79a、CD79b、CD80、CD81、CD82、CD83、CD84、CD85和CD86白细胞表面标记物。这些标记物通常被认为是治疗B细胞失调或疾病如B细胞恶性肿瘤，自身免疫病和移植排斥的治疗靶点。开发了与它们特异性结合的抗体，一些经测定成为治疗疾病和失调的治疗剂。

例如，针对成熟B细胞及其恶性对应物的特异性CD20细胞表面分子的嵌合或放射性标记的单克隆抗体(mAb)疗法能够在体内有效治疗非霍奇金淋巴瘤(Tedder等，Immunol.Today 15:450-454(1994)；Press等，Hematology:221-240(2001)；Kaminski等，N.Engl.J.Med.329:459-465(1993)；Weiner，Semin.Oncol.26:43-51(1999)；Onrust等，Drugs 58:79-88(1999)；McLaughlin等，Oncology 12:1763-1769(1998)；Reff等，Blood83:435-445(1994)；Maloney等，Blood 90:2188-2195(1997)；Malone等，J.Clin.Oncol.15:3266-3274(1997)；Anderson等，Biochem.Soc.Transac.25:705-708(1997))。也已发现，抗-CD20单克隆抗体治疗在减轻类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、特发性血小板减少性紫癜和溶血性贫血以及其它免疫介导疾病表现的方面部分有效(Silverman等，ArthritisRheum.48:1484-1492(2002)；Edwards等，Rheumatology 40:1-7(2001)；De Vita等，Arthritis Rheumatism 46:2029-2033(2002)；Leandro等，Ann.Rheum.Dis.61:883-888(2002)；Leandro等，Arthritis Rheum.46:2673-2677(2001))。抗-CD20(IgG1)抗体利妥昔(RITUXAN)已成功用于治疗某些疾病，如成人免疫血小板减少性紫癜、类风湿性关节炎和自身免疫性贫血(Cured等，WO 00/67796)。尽管这些治疗有效，但B细胞不表达或低水平表达CD20时(如前B细胞或未成熟B细胞)或经过CD20免疫治疗后CD20表达缺失(Smith等，Oncogene 22:7359-7368(2003))的情况下，消耗B细胞的有效性降低。

本领域已经描述了鼠单克隆抗CD19抗体，例如HD37(IgG1，κ)(加州卡皮特利亚的大科北美公司(DAKO North America，Inc，Carpinteria，CA))、BU12(Callard等，J.Immunology，148(10):2983-7(1992))、4G7(IgGl)(Meeker等，Hybridoma，3(4):305-20(1984年冬))、J4.119(德国克雷费尔德的贝克曼库尔特公司(Beckman Coulter，Krefeld，Germany))、B43(加州圣地亚哥的法明基公司(PharMingen，San Diego))、SJ25C1(加州圣地亚哥的BD法明基公司(BD PharMingen，San Diego))、FMC63(IgG2a)(Zola等，Immunol.Cell.Biol.69(PT6)：411-22(1991)；Nicholson等，Mol.Immunol，34:1157-1165(1997)；Pietersz等，Cancer Immunol.Immunotherapy，41:53-60(1995))，89B(B4)(IgG1)(佛罗里达州迈阿密的贝克曼库尔特公司(Beckman Coulter，Miami，FL)；Nadler等，J.Immunol，131:244-250(1983))和/或HD237(IgG2b)(第四届国际人白细胞分化抗原研习会(Fourth International Workshop on Human Leukocyte DifferentiationAntigens)，奥地利维也纳，1989；和Pezzutto等，J.Immunol，138(9):2793-2799(1987))。在各种B细胞失调和疾病的动物模型中，抗CD19抗体或其偶联物也显示出治疗潜能(Falvell等，Br.J.Hematol.134(2):157-70(2006)；Vallera等，Clin.Cancer Res.11(21):7920-8(2005)；Yazawa等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 102(42)：15178-83(2005))。

具体说，已经描述过人源化CD19抗体在治疗B细胞疾病如淋巴瘤、白血病或自身免疫病中的应用(参见Hansen，美国专利申请公开号US2005/0070693)。

尽管近年来癌症治疗取得很多进展，但B细胞恶性肿瘤，如非霍奇金淋巴瘤的B细胞亚型和慢性淋巴细胞性白血病仍然是主要的癌症相关死亡原因。因此，非常需要进一步改进的治疗方案来治疗B细胞恶性肿瘤。

目前已知细胞(T细胞介导的)和体液(抗体，B细胞介导的)免疫在移植物排斥中起到重要作用。虽然已经充分了解移植物排斥中T细胞介导的免疫的重要性，但最近才逐步了解急性和慢性排斥中体液免疫的重要作用。因此，治疗和预防移植物排斥中的大部分进展是从靶向T细胞活化的治疗剂开始的。FDA批准用于治疗移植物排斥的第一种治疗性单克隆抗体是鼠单克隆抗体ORTHOCLONE-OKT3^TM(莫罗单抗-CD3)，其针对T细胞的CD3受体。OKT3与许多其它抗淋巴细胞导向抗体相连接，这些抗淋巴细胞导向抗体包括单克隆抗-CD52CAMPATH^TM抗体、CAMPATH-1G、CAMPATH-1H(阿来组单抗)和CAMPATH-1M)，以及多克隆抗-胸腺细胞抗体制剂(称为抗胸腺细胞球蛋白或"ATG"，也称为"胸腺珠蛋白(thymoglobin)"或"即复宁(thymoglobulin)")。批准用于预防移植排斥的其它T细胞抗体包括嵌合单克隆抗体SIMULECT^TM(巴利昔单抗)和人源化单克隆抗体ZENAPAX^TM(达珠单抗)，它们均靶向活化T细胞的高亲和IL-2受体。

最初认为，移植物排斥中体液免疫的重要性仅限于超急性排斥，其中移植物接受者在移植前具有抗-供体HLA抗体，导致在没有给予有效的抗体抑制治疗方案时移植物被快速破坏。近年来，越来越多的证据表明：体液免疫也是介导急性和慢性排斥的重要因素。例如，临床观察证明，能够产生I类或II类抗-HLA同种抗体(也称为"抗-MHC同种抗体")的患者中的移植物存活率比无法产生这类抗体的患者中的移植物存活率低。临床和实验数据也表明，其它供体特异性的同种抗体和自身抗体是重要的排斥介导物。最近支持供体特异性抗体在同种移植物排斥中的作用的综述可参见Rifle等，Transplantation，79:S14-S18(2005)。因此，由于近年来对体液免疫在急性和慢性移植物排斥中的作用的理解，与靶向细胞免疫的治疗剂和方案相比，目前对靶向体液免疫的治疗剂和方案的开发不足。因此，本领域需要治疗和预防人类移植物接受者的移植物排斥，即移植物抗宿主病(GVHD)、体液排斥和移植后淋巴增殖性疾病的改进的试剂和方法。

自身免疫病整体而言发病率和残疾率都很高。根据1965-1995收集的发病率数据，估计在接下来的五年中约有一百二十万新生自身免疫病患者。Jacobsen等(ClinImmunol.Immunopathol.84:223(1997))对超过130篇发表的研究作出评价并估计，在1996年美国有八百五十万人(占人群的3.2％)患有这些研究中检测的24种自身免疫病中的至少一种。鉴于自身免疫病对公众健康的显著影响，需要安全有效的治疗来解决这些疾病的负担。因此，本领域需要治疗自身免疫病的改进的试剂和方法。

3.发明内容

本发明涉及结合人CD19抗原的人、人源化或嵌合的抗CD19抗体，以及含有这些抗体的组合物。在一个实施方式中，本发明提供嵌合和人源化的抗CD19小鼠单克隆抗体HB12A和HB12B。

在另一实施方式中，本发明抗CD19抗体包含HB12A(克隆B410F12-2-A6-C2于2005年2月11日保藏于美国典型培养物保藏中心("ATCC")，ATCC专利保藏号：PTA-6580)或HB12B(克隆B43H12-3-B2-B6于2005年2月11日保藏于美国典型培养物保藏中心("ATCC")，ATCC专利保藏号：PTA-6581)的CDR中的一个、两个、三个、四个、五个或所有六个。

按照Kabat确定的HB12A重链可变区的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别被鉴定为SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：10。按照Kabat确定的HB12A轻链可变区的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别被鉴定为SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：14和SEQ ID NO：16。

按照Kabat确定的HB12B重链可变区的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别被鉴定为SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：24和SEQ ID NO：26。按照Kabat确定的HB12B轻链可变区的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别被鉴定为SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：30和SEQ ID NO：32。

在一个实施方式中，本发明抗CD19抗体包含具有表1(见下)所列CDR的氨基酸序列的一个、两个、三个、四个、五个或六个CDR。

在一个实施方式中，本发明抗CD19抗体可包含一个或多个HB12A或HB12B的构架区。在一个实施方式中，本发明抗体还可包含人抗体(如，人种系抗体序列如VH3-72、JH4、VkA10或Jk4)的重链和/或轻链构架(FW)区，其中所述人构架区可包含一个或多个突变，其中人FW残基被更换为亲代小鼠(如HB12A或HB12B)重链或轻链中出现的对应残基。

在一个实施方式中，本发明抗CD19抗体可包含具有表1(同上)所列CDR氨基酸序列的一个或多个CDR，还可包含称为HB12B-(3-72/JH4)的VH区(SEQ ID NO：34)的一个或多个重链构架(FW)区。在另一实施方式中，本发明抗CD19抗体包含具有表1(同上)所列CDR氨基酸序列的一个或多个CDR，还包含称为HB12B-(3-72/JH4)的VH区(SEQ ID NO：34)的一个或多个重链构架(FW)区。在一个实施方式中，本发明抗CD19抗体可包含具有表1(同上)所列CDR氨基酸序列的一个或多个CDR，还可包含称为HB12B-(A10-Jk4)的VK区(SEQ ID NO：52)的一个或多个轻链构架(FW)区。在一个实施方式中，本发明抗CD19抗体包含具有表1(同上)所列CDR氨基酸序列的一个或多个CDR，还包含称为HB12B-(A10-Jk4)的VK区(SEQ ID NO：52)的一个或多个轻链构架(FW)区。在另一实施方式中，本文所述抗CD19抗体可包含具有表1(同上)所列CDR氨基酸序列的一个或多个CDR，称为HB12B-(A10-Jk4)的VK区的一个或多个轻链构架区和称为HB12B-(3-72/JH4)的VH区的一个或多个重链构架区。在另一个实施方式中，本文所述抗CD19抗体包含具有表1(同上)所列CDR氨基酸序列的一个或多个CDR，称为HB12B-(A10-Jk4)的VK区的一个或多个轻链构架区和称为HB12B-(3-72/JH4)的VH区的一个或多个重链构架区。

例如，在一个实施方式中，本发明人源化抗CD19抗体可包含含有四个构架区FW1、FW2、FW3和FW4的重链可变区，其中FW1包含氨基酸序列SEQ ID NO：36，FW2包含氨基酸序列SEQ ID NO：38，FW3包含氨基酸序列SEQ ID NO：40，FW4包含氨基酸序列SEQ ID NO：42。在一个实施方式中，本发明人源化抗CD19抗体包含含有四个构架区FW1、FW2、FW3和FW4的重链可变区，其中FW1包含氨基酸序列SEQ ID NO：36，FW2包含氨基酸序列SEQ ID NO：38，FW3包含氨基酸序列SEQ ID NO：40，FW4包含氨基酸序列SEQ ID NO：42。

此外，本发明人源化抗CD19单克隆抗体可包含含有四个构架区FW1、FW2、FW3和FW4的轻链可变区，其中FW1可包含氨基酸序列SEQ ID NO：54；FW2可包含选自SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：64或SEQ ID NO：72的氨基酸序列；FW3可包含选自SEQ ID NO：58或SEQ ID NO：66的氨基酸序列；FW4可包含氨基酸序列SEQ ID NO：60。在一个实施方式中，本发明人源化抗CD19单克隆抗体包含含有四个构架区FW1、FW2、FW3和FW4的轻链可变区，其中FW1可包含氨基酸序列SEQ ID NO：54；FW2可包含选自SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：64或SEQ ID NO：72的氨基酸序列；FW3可包含选自SEQ ID NO：58或SEQ ID NO：66的氨基酸序列；FW4可包含氨基酸序列SEQ ID NO：60。

在一个实施方式中，本发明抗CD19抗体可包含含有氨基酸序列SEQ ID NO：237的VH或含有氨基酸序列SEQ ID NO：238的VL，其中所述抗体能结合人CD19抗原。在另一实施方式中，本发明抗CD19抗体包含含有氨基酸序列SEQ ID NO：237的VH或含有氨基酸序列SEQID NO：238的VL。

在具体实施方式中，本发明抗CD19抗体可包含选自下组的轻链可变区：HB12B VK(SEQ ID NO：20)、HB12B-(A10-Jk4)(SEQ ID NO：52)、HB12B-364987(SEQ ID NO：62)、HB12B-3649(SEQ ID NO：68)、HB12B-36(SEQ ID NO：70)、HB12A VK(SEQ ID NO：4)、7E12VK(SEQ ID NO：110)、14H5VK(SEQ ID NO：111)、15D1VK(SEQ ID NO：112)、16C9VK(SEQ ID NO：113)、3C3VK(SEQ ID NO：193)、3E5VK(SEQ ID NO：194)、3D4VK(SEQ ID NO：195)、3F1VK(SEQID NO：196)、5B5VK(SEQ ID NO：197)、6F7VK(SEQ ID NO：198)、1C11VK(SEQ ID NO：199)、2B11VK(SEQ ID NO：200)、2D10VK(SEQ ID NO：201)、5C11VK(SEQ ID NO：202)、5D4VK(SEQID NO：203)、6C11VK(SEQ ID NO：204)、9G7VK(SEQ ID NO：205)、1H4VK(SEQ ID NO：206)和5C4VK(SEQ ID NO：207)。

在特定实施方式中，本发明还涉及包含选自下组的重链可变区的抗CD19抗体：HB12B VH(SEQ ID NO：18)、HB12B-(3-72/JH4)(SEQ ID NO：34)、HB12A VH(SEQ ID NO：2)、7E12VH(SEQ ID NO：102)、14H5VH(SEQ ID NO：103)、15D1VH(SEQ ID NO：104)、15D7VH(SEQID NO：105)、16C4VH(SEQ ID NO：106)、14H5-YG(SEQ ID NO：107)、14H5-DG(SEQ ID NO：108)、14H5-LG(SEQ ID NO：109)、1A7VH(SEQ ID NO：191)、3C3VH(SEQ ID NO：191)、6C11VH(SEQ ID NO：191)、9G7(SEQ ID NO：191)、3B4VH(SEQ ID NO：236)和3F11VH(SEQ ID NO：192)。

在具体实施方式中，本发明抗CD19抗体包含HB12B-3649轻链可变区(SEQ ID NO：68)和HB12B-(3-72/JH4)重链可变区(SEQ ID NO：34)。包含人源化抗-hCD19VH HB12B-(3-72/JH4)的DNA克隆于2006年10月26日保藏于美国典型培养物保藏中心("ATCC")。包含人源化抗-hCD19VK HB12B-3649的DNA克隆于2006年10月26日保藏于美国典型培养物保藏中心("ATCC")。

在一个实施方式中，本发明的人源化抗CD19抗体可结合于人CD19，其亲和力相当于小鼠单克隆抗体HB12A和/或HB12B，或相当于含有HB12B VH(SEQ ID NO：18)和HB12B VK(SEQ ID NO：20)的chHB12B抗体。

本发明还提供包含编码本发明人、人源化或嵌合的抗CD19抗体或其片段的核苷酸序列的多核苷酸。本发明也包括在本文所述的严谨或较低严谨杂交条件下与编码特异性结合人CD19的人、人源化或嵌合抗体的多核苷酸杂交的多核苷酸。

本发明的另一实施方式是包含编码本文所述人、人源化或嵌合的抗CD19抗体或其片段的一种或多种核苷酸序列的载体。

本发明还涉及包含载体的分离细胞，其中所述载体包含编码本发明的人、人源化或嵌合的抗CD19抗体或其片段的一种或多种核苷酸序列。

本文所述的嵌合、人和人源化抗CD19单克隆抗体包括IgG1、IgG2、IgG3或IgG4人同种型的抗体。

在一个实施方式中，本文所述的人源化抗CD19抗体介导抗体依赖性细胞毒性(ADCC)、补体依赖性细胞介导的细胞毒性(CDC)和/或凋亡。

在另一个实施方式中，本文所述的人源化抗CD19抗体抑制抗-IgM/CpG刺激的B细胞增殖。

本发明还涉及包含嵌合、人和人源化抗CD19抗体的药物组合物。

在另一方面，本发明涉及治疗人的B细胞恶性肿瘤的方法，所述方法包括给予需要的人治疗有效量的嵌合、人或人源化抗CD19单克隆抗体。

另一方面，本发明涉及治疗人的自身免疫疾病或失调的方法，所述方法包括给予需要的人治疗有效量的嵌合、人或人源化抗CD19单克隆抗体。

本发明还涉及治疗或预防人类移植患者的体液排斥的方法，所述方法包括给予需要的人治疗有效量的嵌合、人或人源化抗CD19单克隆抗体。

3.1.定义

本文所用术语“抗体”(免疫球蛋白)包括单克隆抗体(包括全长单克隆抗体)、多克隆抗体、由至少两种完整抗体形成的多特异性抗体(如双特异性抗体)、人抗体、人源化抗体、骆驼化(camelised)抗体、嵌合抗体、单链Fv(scFv)、单链抗体、单域抗体、域抗体、Fab片段、F(ab')2片段、具有所需生物学活性的抗体片段、二硫键连接的Fv(sdFv)和抗独特型(抗-Id)抗体(包括例如，本发明抗体的抗-Id抗体)、细胞内抗体和上述物质的表位结合片段。具体说，抗体包括免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫学活性片段，即含有抗原结合位点的分子。免疫球蛋白分子可以是任何类型(如IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY)、类(如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)或子类。

天然抗体通常是约150,000道尔顿的异源四聚体糖蛋白，它们由两个相同的轻链(L)和两个相同的重链(H)组成。各轻链通过一个共价二硫键与重链相连，而不同免疫球蛋白同种型的重链之间的二硫键连接数不同。各重链和轻链也具有规则间隔的链内二硫桥键。各重链的一端具有可变区(VH)，后接若干恒定区。各轻链的一端具有可变区(VL)，另一端具有恒定区，轻链的恒定区与重链的第一恒定区对应排列，轻链可变区与重链可变区对应排列。根据轻链恒定区的氨基酸序列，将轻链分为λ链或κ链。在本文中，κ轻链的可变区也可被称为VK。术语“可变区”也可用于描述重链或轻链的可变域。相信某些特定氨基酸残基会形成轻链和重链可变域之间的界面。这类抗体可衍生自任何哺乳动物，包括但不限于人、猴、猪、马、兔、犬、猫、小鼠等。

术语“可变”指以下事实：不同抗体之间可变域的某些部分的序列广泛不同，这些序列负责产生各种具体抗体与其特定抗原的结合特异性。然而，可变性并不是均匀地分布在抗体的可变域上。在轻链和重链可变域中称为互补决定区(CDR)的区段比较集中。可变区中高度保守的部分称为构架区(FW)。天然重链和轻链的可变域各自包含四个FW区，主要采取β-片层构型，通过三个CDR连接，形成环连接β-片层结构，在一些情况下形成β-片层结构的一部分。各链中的CDR被FW区聚集在一起，紧密相邻，与另一条链的CDR一起形成抗体的抗原结合位点(参见Kabat等，《免疫学感兴趣的蛋白质的序列》(Sequences of Proteins ofImmunological Interest)，第5版，公共卫生服务部(Public Health Service)，国立卫生研究院(National Institutes of Health)，美国马里兰州贝塞斯达(Bethesda，MD)(1991))。恒定区通常不直接参与抗原结合，但可能影响抗原结合亲和力，并可能具有各种效应功能，如抗体参与ADCC、CDC和/或凋亡。

本文所用术语“高变区”指抗体中与抗原结合有关的氨基酸残基。高变区包括“互补决定区”或“CDR”的氨基酸残基(如轻链可变域的残基24-34(L1)、50-56(L2)和89-97(L3)以及重链可变域的残基31-35(H1)、50-65(H2)和95-102(H3)；Kabat等，《免疫学感兴趣的蛋白质的序列》(Sequences of Proteins of Immunological Interest)，第5版，公共卫生服务部(Public Health Service)，国立卫生研究院(National Institutes of Health)，美国马里兰州贝塞斯达(Bethesda，MD)(1991))和/或来自“高变环”的残基(如轻链可变域中的残基26-32(L1)、50-52(L2)和91-96(L3)以及重链可变域中的26-32(H1)、53-55(H2)和96-101(H3)；Chothia和Lesk，J.Mol.Biol.，196:901-917(1987))。“构架”或“FW”残基是侧接CDR的可变域残基。FW残基存在于嵌合、人源化、人、域抗体、双抗体、疫苗抗体(vaccibody)、线性抗体和双特异性抗体中。

本文所用术语“单克隆抗体”指获自基本均一的抗体群体的抗体，即该群体中除了可能少量出现的天然产生的突变外，各抗体相同。单克隆抗体具有高度特异性，针对单个抗原位点。而且，与一般包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的常规(多克隆)抗体制剂不同，各单克隆抗体针对抗原上的某一个决定簇。除了特异性以外，单克隆抗体的优点还在于，它们可通过未被其它免疫球蛋白生产细胞污染的杂交瘤细胞合成。本领域技术人员了解其它生产方法，例如，可通过稳定或瞬时转染编码该单克隆抗体的重链和轻链基因的细胞产生单克隆抗体。

修饰词“单克隆”表明获自基本均一的抗体群体且不认为需要用任何特定方法对该抗体进行工程改造的抗体的特征。本文所用术语“单克隆”指衍生自克隆的细胞群，包括任何真核、原核或噬菌体克隆的抗体，而不是工程改造该抗体的方法。例如，本发明所用的单克隆抗体可通过首先由Kohler等在Nature，256:495(1975)中描述的杂交瘤方法制备，或者可通过任何重组DNA方法制备(参见例如，美国专利号4,816,567)，包括利用Clackson等在Nature，352:624-628(1991)中和Marks等在J.Mol.Biol.，222:581-597(1991)中所述的技术由噬菌体抗体文库分离。可采用这些方法生产单克隆哺乳动物、嵌合、人源化、人、域抗体，双抗体，疫苗抗体，线性抗体和双特异性抗体。

术语“嵌合”抗体包括重链和/或轻链的至少一部分与衍生自特定物种或属于特定抗体类或子类的抗体中的相应序列相同或同源，链的至少另一部分与衍生自另一物种或属于另一抗体类型或子类的抗体中的相应序列相同或同源的抗体，以及这类抗体的片段，只要它们具有所需生物学活性(美国专利号4,816,567；Morrison等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，81:6851-6855(1984))。感兴趣的嵌合抗体包括包含衍生自非人灵长动物(例如，旧大陆猴，如狒狒、恒河猴或猕猴)的可变域抗原结合序列和人恒定区序列(美国专利号5,693,780)的“灵长化”抗体。

非人(如鼠)抗体的“人源化”形式是包含最少衍生自非人免疫球蛋白的序列的嵌合抗体。在大多数情况下，人源化抗体是天然CDR残基被具有所需特异性、亲和力和容量的非人物种(供体抗体)如小鼠、大鼠、兔或非人灵长动物的相应CDR残基所取代的人免疫球蛋白(接受抗体)。在一些例子中，人免疫球蛋白的FW区残基被相应的非人残基所取代。而且，人源化抗体可包含接受抗体或供体抗体中不存在的残基。进行这些修饰，以便进一步改善抗体性能。通常，人源化抗体重链或轻链包含基本上所有至少一个或多个可变区，其中所有或基本上所有CDR对应于非人免疫球蛋白的CDR，所有或基本上所有FW均为人免疫球蛋白序列。在某些实施方式中，人源化抗体包含免疫球蛋白，一般是人免疫球蛋白的恒定区(Fc)的至少一部分。其它细节参见Jones等，Nature，321:522-525(1986)；Riechmann等，Nature，332:323-329(1988)；和Presta，Curr.Op.Struct.Biol.，2:593-596(1992)。

“人抗体”可以是衍生自人的抗体或经“工程改造”能对抗原刺激反应产生特异性人抗体的转基因生物体产生的抗体以及可通过本领域任何方法产生的抗体。在某些技术中，将人重链和轻链基因座的元件引入衍生自内源性重链和轻链基因座被靶向破坏的胚胎干细胞系的生物体品系。该转基因生物体可合成人抗原特异性的人抗体，该生物体可用于生产分泌人抗体的杂交瘤。人抗体也可以是重链和轻链由衍生自一种或多种人DNA来源的核苷酸序列编码的抗体。完全人抗体也可通过遗传或染色体转染方法，以及噬菌体展示技术或体外激活的B细胞构建，这些方法都是本领域已知的。

“抗体依赖性细胞介导的细胞毒性”和“ADCC”指非特异性细胞毒性细胞(如自然杀伤(NK)细胞、嗜中性粒细胞和巨噬细胞)识别靶细胞上的结合抗体，随后导致靶细胞裂解的细胞介导的反应。在一个实施方式中，这类细胞是人细胞。虽然不希望受任何特定作用机制的限制，但介导ADCC的这些细胞毒性细胞通常表达Fc受体(FcR)。主要介导ADCC的细胞NK细胞表达FcγRIII，而单核细胞表达FcγRI、FcγRII、FcγRIII和/或FcγRIV。造血细胞上的FcR表达情况的小结参见Ravetch和Kinet，Annu.Rev.Immunol.，9:457-92(1991)。为了评估分子的ADCC活性，可进行体外ADCC实验，如美国专利号5,500,362或5,821,337所述。可用于这类实验的效应细胞包括外周血单核细胞(PBMC)和自然杀伤(NK)细胞。或者或此外，可以在体内，例如利用动物模型评估感兴趣分子的ADCC活性，如Clynes等，Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)，95:652-656(1998)所述。

“补体依赖性细胞毒性”或“CDC”指分子启动补体激活和在补体存在下裂解靶标的能力。补体激活途径是通过补体系统的第一组分(C1q)与关联抗原的分子(如抗体)复合体的结合启动的。为了评估补体激活，可进行CDC实验，如Gazzano-Santaro等，J.Immunol.Methods，202:163(1996)所述。

“效应细胞”是表达一种或多种FcR并执行效应功能的白细胞。该细胞至少表达FcγRI、FCγRII、FcγRIII和/或FcγRIV，并执行ADCC效应功能。介导ADCC的人白细胞的例子包括外周血单核细胞(PBMC)、自然杀伤(NK)细胞、单核细胞、细胞毒性T细胞和嗜中性粒细胞。

术语“Fc受体”或“FcR”用于描述与抗体Fc区结合的受体。在一个实施方式中，FcR是天然序列的人FcR。而且，在某些实施方式中，FcR是结合IgG抗体的FcR(γ受体)，包括FcγRI、FcγRII、FcγRIII和FcγRIV子类的受体，包括这些受体的等位基因变体和另路剪接形式。FcγRII受体包括FcγRIIA(“激活受体”)和FcγRIIB(“抑制受体”)，它们具有相似的氨基酸序列，主要区别是其胞质结构域。激活受体FcγRIIA的胞质结构域中含有基于免疫受体酪氨酸的激活基序(ITAM)。抑制受体FcγRIIB的胞质结构域中含有基于免疫受体酪氨酸的抑制基序(ITIM)。(参见Annu.Rev.Immunol.，15:203-234(1997))。FcR的综述参见Ravetch和Kinet，Annu.Rev.Immunol.，9:457-92(1991)；Capel等，Immunomethods，4:25-34(1994)；和de Haas等，J.Lab.Clin.Med.，126:330-41(1995)。本文所用术语“FcR”包括其它FcR，包括将来可能鉴定到的FcR。该术语也包括新生儿受体FcRn，其负责将母体IgG转移给胎儿(Guyer等，Immunol.，117:587(1976)和Kim等，J.Immunol.，24:249(1994))。

“Fv”是含有完整的抗原识别位点和结合位点的最小抗体片段。该区域由一个重链和一个轻链可变域紧密、非共价或共价结合的二聚体组成。在这种构型中，各可变区的三个CDR相互作用，以确定VH-VL二聚体表面上的抗原-结合位点。总之，六个CDR产生该抗体的抗原结合特异性。然而，即使单个可变区(或仅含三个抗原特异性CDR的Fv的一半)也能够识别和结合抗原，虽然其亲和力低于整个结合位点。

在本文所述治疗中使用的抗体与表位的“亲和力”是本领域熟知的术语，指抗体与表位的结合程度或强度。可利用本领域已知的许多方式测定和/或表示亲和力，这些方式包括但不限于：平衡解离常数(KD或Kd)、表观平衡解离常数(KD'或Kd')和IC50(在竞争实验中实现50％抑制所需的量)。应理解，出于本发明目的，亲和力是结合表位的给定抗体群体的平均亲和力。本文报道的以mg IgG/mL或mg/mL表示的KD'值表明每毫升血清(但也可使用血浆)中的Ig毫克数。使用抗体亲和力作为给予本文所述治疗方法，或选择本文所述治疗方法的基础时，可以在治疗前和/或期间测定抗体亲和力，临床医生可使用获得的值评估病人是否是该治疗的合适的候选对象。

本文所用术语“亲合力”是抗体结合抗原的整体结合强度的衡量(即两个抗体臂)。可利用本领域已知的任何方式测定抗原过量情况下抗原-抗体结合的解离，从而确定抗体亲合力，这些方式例如但不限于：如Gray等，J.Virol.Meth.，44:11-24(1993)所述通过修饰间接荧光抗体。

“表位”是本领域熟知的术语，指能够与抗体特异性结合的任何化学部分。“抗原”是含有表位的部分或分子，同样也能与抗体特异性结合。

本文所用的“B细胞表面标记”是B细胞表面上表达的抗原，可用与其结合的物质靶向B细胞。B细胞表面标记包括CD10、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD24、CD25、CD37、CD53、CD72、CD73、CD74、CD75、CD77、CD79a、CD79b、CD80、CD81、CD82、CD83、CD84、CD85和CD86白细胞表面标记。与哺乳动物的其他非B细胞组织相比，B细胞上优先表达特别感兴趣的B细胞表面标记，这些表面标记可以在前体B细胞和成熟B谱系细胞上表达。在一个实施方式中，该标记是CD19，它出现在不同分化阶段的B细胞上。

本文所用术语“抗体半衰期”指衡量给予后抗体分子平均存活时间的抗体的药代动力学特性。抗体半衰期可表示为从患者体内或特定腔室内消除50％已知量免疫球蛋白所需的时间，例如，衡量血清或血浆中消除50％的时间，即循环半衰期，或者衡量其他组织中消除50％的时间。半衰期可能因免疫球蛋白的种类或类型不同而不同。通常，抗体半衰期延长导致所给抗体在循环系统中的平均停留时间(MRT)延长。

术语“同种型”指抗体重链或轻链恒定区的分类。抗体恒定区不参与抗原结合，但具有各种效应功能。根据重链恒定区的氨基酸序列，可以将给定的人抗体或免疫球蛋白分为五种主要免疫球蛋白类型之一，这五种类型是IgA、IgD、IgE、IgG和IgM。其中几种类型还可以进一步分为子类(同种型)，如IgG1(γ1)、IgG2(γ2)、IgG3(γ3)和IgG4(γ4)，以及IgA1和IgA2。对应于不同免疫球蛋白类型的重链恒定区分别称为α、δ、ε、γ和μ。不同免疫球蛋白类型的结构和三维构型是已知的。各种人免疫球蛋白类型中，已知只有人IgG1、IgG2、IgG3、IgG4和IgM能激活补体。在人体中，已知人IgG1和IgG3介导ADCC。人轻链恒定区可分为两种主要类型，κ和λ。

本文所用术语“免疫原性”指化合物能够引起免疫应答(刺激产生特定抗体和/或特定T细胞增殖)。

本文所用术语“抗原性”指化合物被抗体识别或可结合于抗体并诱导免疫应答。

术语“治疗”(或其语法等同形式)指对象病症的严重程度减轻或者至少部分改善或缓解作用和/或至少一种临床症状得到减轻、缓解或减少和/或病症的进展被抑制或延迟和/或防止或延迟疾病或病症的发生。因此，术语“治疗”(或其语法等同形式)指预防性和治疗性治疗方案。

本文所用术语实现特定结果的“足量”或“足以…的量”指能有效产生所需效果的本发明抗体或组合物用量，所述效果任选为疗效(即通过给予治疗有效量)。例如，“足量”或“足以…的量”可以是有效消耗B细胞的量。

本文所用的“治疗有效”量是向所述对象提供一些改进或益处的用量。换言之，“治疗有效”量是减轻、缓解和/或减少至少一种临床症状的用量。可用本发明方法治疗的疾病的相关临床症状是本领域技术人员熟知的。另外，本领域技术人员应理解，疗效不一定是完全或治愈性的，只要所述对象获得一些益处即可。

4.附图简要说明

图1A-B：(A)HB12B VK(SEQ ID NO：20)、HB12B-(A10-Jk4)(SEQ ID NO：52)、HB12B-364987(SEQ ID NO：62)、HB12B-3649(SEQ ID NO：68)和HB12B-36(SEQ ID NO：70)轻链可变区的氨基酸序列比对。按照Kabat对序列残基编号。框中显示按照Kabat确定的CDR残基。用浅灰色特别标明HB12B VK(SEQ ID NO：20)的游标(Vernier)、链间和经典残基。用深灰色特别标明HB12B-364987(SEQ ID NO：62)(Y40F、K53H、Y91F)、HB12B-3649(SEQ ID NO：68)(Y40F、K53H)和HB12B-36(SEQ ID NO：70)(Y40F)相对于移植抗体HB12B-(A10-Jk4)(SEQ IDNO：52)的氨基酸取代。(B)HB12B VH(SEQ ID NO：18)、HB12B-(3-72/JH4)(SEQ ID NO：34)和HB12B-9m(SEQ ID NO：44)重链可变区的氨基酸序列比对。按照Kabat对序列残基编号。框中显示按照Kabat确定的CDR残基。用浅灰色特别标明HB12B VH的游标、链间和经典残基。用深灰色特别标明HB12B-9m(SEQ ID NO：44)(L20I、F27Y、T28A、R38I、V49I、F67A、R71A、L80M、I91Y)相对于移植抗体HB12B-(3-72/JH4)(SEQ ID NO：34)可变区的氨基酸取代。

图2.在基于细胞的ELISA实验中，含有HB12B-(3-72/JH4)VH(SEQ ID NO：34)和HB12B-364987VK(SEQ ID NO：62)的人源化抗-CD19抗体#1与表达重组人CD19的300B4细胞的结合概况。用空心方框表示人源化抗-CD19抗体#1的OD450读数。包含HB12B VH(SEQ IDNO：18)和HB12B VK(SEQ ID NO：20)的嵌合HB12B抗体被用作参比标准品(实心圆圈)。该实验中包含具有无关特异性的人IgG1抗体作为阴性对照(空心圆圈)。人源化抗-CD19抗体#1的结合概况与嵌合抗-CD19抗体的情况非常接近。

图3.在基于细胞的ELISA实验中，人源化抗-CD19抗体#1、#2和#3与表达重组人CD19的300B4细胞的结合概况。人源化抗-CD19抗体#1包含HB12B-(3-72/JH4)VH(SEQ IDNO：34)和HB12B-364987VK(SEQ ID NO：62)。人源化抗-CD19抗体#2包含HB12B-(3-72/JH4)VH(SEQ ID NO：34)和HB12B-3649VK(SEQ ID NO：68)。人源化抗-CD19抗体#3包含HB12B-(3-72/JH4)VH(SEQ ID NO：34)和HB12B-36VK(SEQ ID NO：70)。分别用空心方框、空心圆圈和实心圆圈表示人源化抗-CD19抗体#1、#2和#3的结合概况。包含HB12B VH(SEQ ID NO：18)和HB12B VK(SEQ ID NO：20)的嵌合HB12B抗体用作参比标准(实心方框)。人源化抗-CD19抗体#1和#2的结合概况与嵌合抗-CD19抗体的情况非常接近。人源化抗-CD19抗体#3与表达重组人CD19的300B4细胞的结合明显低于嵌合HB12B抗体。

图4.纯化抗-hCD19抗体的考马斯蓝染色的SDS/PAGE。利用SDS/PAGE分析1和5微克岩藻糖化(3649)和非岩藻糖化(3649-aFuc)的纯化的人源化抗-CD19抗体#2。纯化制剂基本不含污染的蛋白质。

图5.(A)用不同浓度的人源化抗-CD19抗体#2培育的道迪细胞经免疫染色后的平均荧光强度。利用不同浓度的岩藻糖化(3649)或非岩藻糖化(3649aFuc-1和3649aFuc-2)的抗-CD19抗体#2培育道迪细胞。随后用RPE偶联的山羊抗人IgG F(ab)’2对细胞染色，然后按照标准方法用流式细胞仪分析。用抗-CD20抗体培育的道迪细胞用作阳性对照。人源化抗-CD19抗体#2的岩藻糖化和非岩藻糖基化制剂显示出重叠的染色概况。在所有检测的抗体浓度下，抗-CD19染色细胞的平均荧光强度低于抗-CD20染色细胞。(B)人源化抗-CD19抗体的体外ADCC活性。利用CytoTox 96^TM试剂盒(普洛麦格公司(Promega))，按照生产商说明书测定人源化抗-CD19抗体#2的岩藻糖化(3649)和非岩藻糖化(3649-aFuc1和3649-aFuc2)制剂的体外ADCC活性。道迪细胞用作靶点。也利用阳性对照抗-CD20抗体进行该实验。两种人源化抗-CD19抗体#2的非岩藻糖化制剂以及阳性对照抗-CD20抗体显示出相似的强ADCC活性。在所用条件下，岩藻糖化抗-CD19抗体#2的ADCC活性较低。

图6.人源化抗-CD19抗体的体外ADCC活性。利用CytoTox 96^TM试剂盒(普洛麦格公司)，按照生产商说明书测定岩藻糖化(3649)和非岩藻糖化(3649-aFuc)人源化抗-CD19抗体#2的体外ADCC活性。道迪细胞用作靶点。抗-CD20抗体用作阳性对照。ADCC活性消除的抗-CD19抗体#2的Fc变体(3649-TM)用作阴性对照。非岩藻糖化人源化抗-CD19抗体#2(3649-aFuc)和阳性对照抗-CD20抗体显示出相似的强ADCC活性。在所用条件下岩藻糖化人源化抗-CD19抗体#2(3649)的ADCC活性较低。阴性对照抗-CD19抗体#2的Fc变体在所用条件下无ADCC活性。

图7.拉吉细胞、拉莫斯细胞、道迪细胞和纳玛瓦细胞的CD19、CD20和CD22表达概况。利用抗-CD19、抗-CD20或抗-CD22第一抗体，以及PE偶联的山羊抗-小鼠IgG第二抗体对拉吉细胞、拉莫斯细胞、道迪细胞和纳玛瓦细胞进行免疫染色，随后在流式细胞仪上分析。直方图代表免疫染色和只用第二抗体染色的对照样品获得的平均通道荧光的比例。不表达CD19、CD20或CD22的RPMI 8226多发性骨髓瘤细胞系用作阴性对照。在拉吉细胞、拉莫斯细胞和道迪细胞表面上检测到所有三种分子均有显著表达。纳玛瓦细胞的细胞表面上表达CD19和CD22，但不表达CD20。

图8.拉吉细胞(A)、道迪细胞(B)、拉莫斯细胞(C)和纳玛瓦细胞(D)对抗-CD19#2介导的ADCC的易感性。利用CytoTox 96^TM试剂盒(普洛麦格公司)，按照生产商说明书进行ADCC实验。所用抗体是：(i)非岩藻糖化抗-CD19#2(3649-aFuc)，(ii)抗-CD19#2的3M Fc变体(3649-3M)和(iii)抗-CD20对照。效应物:靶点之比为2.5:1。所有四种细胞系均易于发生抗-CD19#2介导的ADCC。只有拉吉细胞、道迪细胞和拉莫斯细胞易于发生抗-CD20介导的ADCC。

图9.新鲜扁桃体B细胞对抗-CD19#2介导的ADCC的易感性。利用CytoTox 96^TM试剂盒(普洛麦格公司)，按照生产商说明书进行ADCC实验。所用抗体是：(i)非岩藻糖化抗-CD19#2(3649-aFuc)，(ii)抗-CD19#2的3M Fc变体(3649-3M)和(iii)抗-CD20对照。效应物:靶点之比为2:1。扁桃体B细胞易于发生所有三种测试抗体介导的ADCC。

图10.由C57Bl6hCD19tg+/-、C57Bl6hCD19tg+/+、Balb/c hCD20tg+/-和Balb/c小鼠分离循环淋巴细胞。用PerCP偶联的抗-小鼠CD19(α-mCD19)、PE偶联的抗-CD3、Alexa488偶联的抗人CD19(α-hCD19)和Alexa647偶联的抗人CD20抗体(α-hCD20)对分离细胞进行染色。n等于各组分析的动物数。(A)用直方图形式表示在hCD19、hCD20和mCD19特定通道中测定的CD3细胞的平均荧光强度。(B)各种遗传背景下CD3-mCD19+淋巴细胞的百分数。

图11.抗-CD19抗体#2在体内消耗B细胞。(A)C57Bl6hCD19tg+/+和(B)C57Bl6hCD19tg+/-动物用单一i.v.剂量250或50μg抗-CD19抗体#2(3649)治疗。所用阴性对照抗体是(i)ADCC削弱的#2的Fc变体(3649TM)和(ii)具有无关特异性的抗体(R347)。治疗后7天，分离循环的淋巴细胞。用PerCP偶联的抗-小鼠CD19(α-mCD19)和PE偶联的抗-CD3抗体对细胞染色。显示了mCD19+CD3-B细胞的百分数。n等于各组中分析的动物数。用单次剂量的抗-CD19抗体#2治疗导致B细胞几乎被完全耗尽。

图12.抗-CD19抗体#2在体内消耗B细胞。用单一i.v.剂量的250或50μg抗-CD19抗体#2(3649)治疗C57Bl6hCD19tg+/+和C57Bl6hCD19tg+/-动物。所用阴性对照抗体是(i)ADCC削弱的#2的Fc变体(3649TM)和(ii)具有无关特异性的抗体(R347)。治疗后7天，分离脾细胞。用PerCP偶联的抗-小鼠CD19(α-mCD19)和PE偶联的抗-CD3抗体对细胞染色。显示了脾淋巴细胞中B细胞(mCD19+CD3-)的百分数。n等于各组中分析的动物数。用单次剂量的抗-CD19抗体#2治疗导致B细胞几乎被完全耗尽。

图13.抗-CD19抗体#2能显著降低体内模型系统的肿瘤生长。在第1天，用5x10⁶拉吉细胞皮下注射在CB17SCID小鼠后胁处。从第4天开始，每两周给予10mg/kg抗体，共给五次，以治疗动物。所用抗体是：(i)抗-CD19#2(3649)，(ii)ADCC活性降低的抗-CD19#2的Fc变体(3649-TM)，(iii)抗-CD20和(iv)具有无关特异性的同种型对照(R347)。一组对照动物只给予PBS。用标准方法每周测定肿瘤尺寸两次。

图14.抗-CD19抗体#2能显著降低体内模型系统的肿瘤生长。在第1天，用5x10⁶拉吉细胞皮下注射在CB17SCID小鼠后胁处。从第4天开始，每两周给予10mg/kg或2.5mg/kg抗体，共给五次，以治疗动物。所用抗体是：(i)10mg/kg或2.5mg/kg抗-CD19#2(3649 10mg/kg和3649*2.5mg/kg)，(ii)10mg/kg ADCC活性降低的抗-CD19#2的Fc变体(3649-TM)，(iii)10mg/kg人ADCC活性提高的抗-CD19#2的Fc变体(3649-3M)，(iv)10mg/kg抗-CD20和(v)10mg/kg具有无关特异性的同种型对照(R347)。一组对照动物只给予PBS。用标准方法每周测定肿瘤尺寸两次。

图15.经ELISA测定3649、3649-3M和3649-aFuc抗-CD19抗体与FcγRIIIA的158V等位基因的结合概况。该实验包括抗-CD20抗体作为参比对照。3649-3M Fc变异抗体和3649-aFuc非岩藻糖化抗体与FcγRIIIA的结合亲和力比岩藻糖化3649抗体高得多。3649和抗-CD20抗体具有相同的结合概况。

图16.效应细胞的FcγRIIIA基因型影响抗-CD19#2抗体的体外ADCC活性。利用CytoTox 96^TM试剂盒(普洛麦格公司)，按照生产商说明书进行ADCC实验。所用抗体是：(i)非岩藻糖化抗-CD19#2(3649-aFuc)，(ii)抗-CD19#2的3M Fc变体(3649-3M)和(iii)抗-CD20对照。道迪细胞用作靶点。NK细胞系(A)或新鲜分离的NK细胞(B-E)用作效应细胞。检测具有V158/V158(C)、V158/F158(D)和F158/F158(E)FcγRIIIA基因型的NK细胞。与低亲和力等位基因纯合的NK细胞(F158/F158基因型)相比，包含至少一个拷贝的FcγRIIIA受体高亲和力同种型的NK细胞(V158/V158和V158/F158基因型)是更有效的效应物细胞。所观察到的V158/V158或V158/F158NK细胞介导的岩藻糖化抗体(3649)的ADCC活性(C，D)与F158/F158NK细胞介导的岩藻糖化抗体(3649-aFuc)的ADCC活性(E)相当。

图17.基于细胞表面抗原表达表型的(A)循环、(B)脾、(C)骨髓和(D)腹膜B细胞亚组的鉴定方案。用流式细胞仪分析荧光染色的分离的细胞群。通过连续设定门鉴定和检测B细胞亚组。用粗体灰色箭头表示流程。例如，脾脏的滤泡B细胞的鉴定方法如下：(i)根据低7AAD染色门选活细胞，(ii)根据特征性FSC和SSC表型鉴定活细胞组分中的淋巴细胞，(iii)利用抗-mCD19和抗-B220染色鉴定活淋巴细胞中的B细胞，(iv)根据B220表达差异分离B细胞中的B1a细胞，(v)根据CD93的差异表达区分成熟和移行B细胞群，(vi)根据CD23表达差异从边缘区B细胞组分中分离成熟B细胞的滤泡B细胞亚群。

图18.在细胞ELISA实验中亲和成熟的3649抗-CD19抗体Fab片段与表达重组人CD19的300B4细胞的结合概况。显示了用VH CDR3中含有单个氨基酸取代的代表性Fab样品获得的结果。3649抗CD19Fab(3649周质(3649peri))用作参比标准品。4G6和4B7Fab与表达重组人CD19的300B4细胞的亲和力明显高于对照3649Fab。所有其它检测的Fab的亲和力均与对照3649Fab相似。

图19.在细胞ELISA实验中亲和成熟的3649抗-CD19抗体Fab片段与表达重组人CD19的300B4细胞的结合概况。由包括以前CDR特定筛选中鉴定的有益单氨基酸取代的所有可能组合的文库鉴定本文表征的Fab。显示了与表达重组人CD19的300B4细胞结合亲和力最高的六种Fab的结合概况。3649抗CD19Fab(3649周质)用作参比标准品。所有六种亲和成熟的Fab与表达重组人CD19的300B4细胞的亲和力均高于对照3649Fab。

图20.在细胞ELISA实验中亲和成熟的3649抗-CD19抗体与表达重组人CD19的300B4细胞的结合概况。3649抗CD19抗体用作参比标准品。16C9IgG的结合概况与3649对照抗体相似。14H5、15D1、15D7、16C4和7E12亲和成熟抗体的结合亲和力高于对照3649抗体。

图21.在细胞ELISA实验中亲和成熟的3649抗-CD19抗体与表达CD19的拉吉细胞的结合概况。3649抗CD19抗体用作参比标准品。所有六种抗体(14H5、15D1、15D7、16C4、16C9和7E12)的结合亲和力均高于对照3649抗体。

图22.在细胞ELISA实验中亲和成熟的3649抗-CD19抗体与表达CD19的道迪细胞的结合概况。3649抗CD19抗体用作参比标准品。所有六种抗体(14H5、15D1、15D7、16C4、16C9和7E12)的结合亲和力均高于对照3649抗体。

图23.在细胞ELISA实验中亲和成熟的3649抗-CD19抗体与表达重组人CD19的300B4细胞的结合概况。14H5-YG、14H5-DG和14H5-LG是14H5亲和成熟的3649抗-CD19抗体的单氨基酸取代变体。14H4和16C4亲和成熟3649抗-CD19抗体用作参比标准品。14H5-YG、14H5-DG和14H5-LG抗体的结合亲和力低于14H5和16C4对照抗体。

图24.亲和成熟的3649抗CD19抗体的动力学解离速率比较。(A)拉莫斯细胞与亲和成熟的抗CD19抗体一起培育，洗涤，再于37℃培育0、30或60分钟。在培育结束时，用荧光第二抗体将细胞染色，用流式细胞仪分析。显示了培育0、30和60分钟后细胞的平均荧光强度。将时间0点观察到的平均荧光强度(MFI)设定为所研究各抗体的100％。3649抗CD19抗体和抗CD20抗体用作参比标准品。消除细胞表面上所有六种亲和成熟的3649抗-CD19抗体(14H5、15D1、15D7、16C4、16C9和7E12)的速度比参比标准品慢。(B)利用Alexa 647偶联的HB12B、3649或16C4抗CD19抗体对拉莫斯细胞染色，洗涤，再于37℃培育0、30或60分钟。在培育结束时用流式细胞仪分析细胞。该实验中包括直接偶联的抗CD20抗体，用作参比对照。不同培育时间后检测的平均荧光强度(MFI)表示为与时间0点的MFI的比值。用16C4亲和成熟的抗CD19抗体染色后MFI的下降比利用3649和HB12B抗CD19抗体观察到的信号下降慢得多。

图25.亲和成熟的3649抗CD19抗体与道迪细胞的结合概况。利用14H5、15D1、15D7、16C4、16C9或7E12亲和成熟的抗CD19抗体和荧光标记的第二抗体对道迪细胞染色。3649抗CD19抗体用作参比标准品。用流式细胞仪分析染色细胞。用表格列出不同抗体浓度下观察到的平均荧光强度(平均FI)。亲和成熟的3649抗CD19抗体的平均FI高于参比标准品。

图26.亲和成熟的3649抗CD19抗体的体外ADCC活性。(A)利用道迪靶细胞测定14H5、14H5-DG和16C4亲和成熟的抗CD19抗体的体外ADCC活性。3649抗CD19抗体用作参比标准品。在低抗体浓度(0.01和0.1μg/ml)下，所有三种亲和成熟抗体的ADCC活性均高于参比标准品。在高抗体浓度(1和10μg/ml)下，所有三种亲和成熟抗体的ADCC活性与参比标准品的活性相当。(B)利用道迪靶细胞在体外实验中测定非岩藻糖化16C4抗体(16C4-aFuc)的ADCC活性。16C4-aFuc的ADCC活性明显高于参比对照3649-aFuc、抗CD20和岩藻糖化16C4参比抗体。

图27.亲和成熟的抗CD19抗体的考马斯蓝染色的IEF-PAGE。16C4、16C9、7E12、14H5、15D7、15D1、14H5-DG和3649抗体的等电点分别是7.83、8.04、7.69、7.76、7.61、7.72、7.48和7.75。

图28.非岩藻糖化3649抗CD19抗体在体内消耗B细胞。用10、50或250μg岩藻糖化3649抗-CD19抗体(3649)或非岩藻糖化3649抗-CD19抗体(3649-aFuc)的单次i.v.剂量治疗C57Bl6hCD19tg+/-动物。利用(i)ADCC削弱的3649抗CD19抗体的Fc变体(3649TM)或(ii)具有无关特异性的抗体(R347)治疗阴性对照动物。在抗体治疗7天后，分离循环淋巴细胞(A)或脾淋巴细胞(B|)。如表5所述，对分离细胞进行免疫染色，以鉴定不同B细胞群。显示B220+CD19+B细胞的百分数。非岩藻糖化3649抗CD19抗体对B细胞的消耗能力明显高于相同量的岩藻糖化抗CD19抗体。在3649TM对照抗体治疗的动物中，没有检测到B细胞的消耗。

图29.非岩藻糖化3649抗-CD19抗体治疗的小鼠中NK细胞激活增强。用10μg岩藻糖化3649抗-CD19抗体(3649)或非岩藻糖化3649抗-CD19抗体(3649-aFuc)的单次i.v.剂量治疗C57Bl6hCD19tg+/-动物。用相同量具有无关特异性的同种型匹配抗体(R347)治疗阴性对照动物。在抗体治疗7天后，分离循环淋巴细胞。用荧光标记的抗-NK1.1、抗-DX5和抗-CD107a抗体对分离细胞进行染色。显示了NK1.1+、DX5+门选活淋巴细胞的CD107a与NK1.1图。与岩藻糖化3649抗-CD19抗体治疗的动物分离的NK细胞相比，由非岩藻糖化3649抗-CD19抗体治疗的动物分离的NK细胞中较多细胞的细胞表面上显示有CD107a。

图30.非岩藻糖化抗-CD19抗体#2(3649-aFuc)显著降低了体内模型系统的肿瘤生长。在第1天，用5x10⁶拉吉细胞皮下注射在CB17SCID小鼠后胁处。从第4天开始，每两周给予10mg/kg或2.5mg/kg抗体，共给五次，以治疗动物。所用抗体是：(i)10mg/kg岩藻糖化抗-CD19#2(3649)，(ii)10mg/kg或2.5mg/kg非岩藻糖化抗-CD19#2(3649-aFuc)，(iii)10mg/kg抗-CD20和(iv)10mg/kg具有无关特异性的同种型对照抗体(R347)。对照动物组仅给予PBS。利用标准方法每周测定肿瘤尺寸两次。

图31.利用16C4和14H5亲和成熟抗CD19抗体在体内消耗B细胞。用10、50或250μg岩藻糖化16C4亲和成熟的抗-CD19抗体(16C4)或14H5DG亲和成熟的抗-CD19抗体(14H5DG)的单次i.v.剂量治疗C57Bl6hCD19tg+/-动物。用(i)3649抗-CD19抗体(3649)、(ii)ADCC增强的3649抗CD19抗体的Fc变体(3649 3M)和(iii)非岩藻糖化3649抗-CD19抗体(3649-aFuc)治疗参比对照动物。利用(i)ADCC削弱的3649抗CD19抗体的Fc变体(3649TM)或(ii)具有无关特异性的抗体(R347)治疗阴性对照动物。在抗体治疗7天后，分离循环淋巴细胞(A)或脾淋巴细胞(B)。如表5所述，对分离细胞进行免疫染色，以鉴定不同B细胞群。显示B220+CD19+B细胞的百分数。16C4亲和成熟的抗CD19抗体对B细胞的消耗略高于3649抗-CD19亲本抗体。3649-aFuc和3649 3M抗体的消耗能力优于16C4亲和成熟抗体。14H5DG亲和成熟的抗CD19抗体对B细胞的消耗效率略低于3649抗-CD19亲本抗体。图(A)中的数值是给定抗体实现的消耗百分数。

图32.在细胞结合实验中64D4亲和成熟Fab与表达重组人CD19的300B4细胞的结合活性(Lu等，J.Immunol.Methods 314:74-79(2006))。64D4是VH CDR2中含有一个氨基酸取代的16C4抗-CD19抗体的变体。16C4和3649抗-CD19Fab(分别为16C4上清液和3649上清液)用作参比标准品。64D4Fab与表达重组人CD19的300B4细胞的亲和力明显高于对照16C4和3649Fab。

图33.由组合噬菌体展示文库分离的抗CD19Fab的亲和成熟变体的表征。利用(A)300B4和(B)拉吉细胞，在细胞结合实验中检测16C4Fab的亲和成熟变体与细胞表面表达的人CD19抗原的结合概况(Lu等，J.Immunol.Methods 314:74-79(2006))。16C4和3649抗-CD19Fab(分别为16C4上清液和3649上清液)用作参比标准品。6C11、2B11、3B4、5C11、3C3、9G7、1H4和5C4亲和成熟的Fab与300B4和拉吉细胞的结合亲和力高于对照3649和16C4Fab。(C)利用标准实验室方法检测亲和成熟的Fab克隆的氨基酸序列。提出了独特Fab克隆的CDR序列。用单字母氨基酸代码打印出与亲本16C4序列不同的氨基酸序列；用“-”标明与亲本序列相同的残基。

图34.2B11、3C3、5C4、6C11、6F7和9G7亲和成熟的IgG抗-CD19抗体与表达重组人CD19的300B4细胞的结合概况。利用基于细胞的实验测定结合活性(Lu等，J.Immunol.Methods 314:74-79(2006))。16C4和3649抗CD19抗体用作参比标准品。检测的亲和成熟的抗CD19抗体与300B4细胞的结合亲和力高于16C4和3649参比抗体。

图35.亲和成熟的16C4抗CD19抗体与(A)拉吉细胞和(B)道迪细胞的结合概况。用3C3、6C11或9G7亲和成熟的抗CD19抗体和荧光标记的第二抗体对细胞染色。16C4抗CD19抗体用作参比标准品。用流式细胞仪分析染色细胞。列出不同抗体浓度下观察到的平均荧光强度(平均FI)。在第一抗体浓度为0.0625-0.125μg/ml时，用亲和成熟的抗CD19抗体的16C4变体染色细胞的中值FI高于参比标准品染色的细胞。在0.25-10μg/ml范围内，利用亲和成熟的抗体获得的中值FI与参比抗体的中值FI基本相同。

图36.亲和成熟的抗CD19抗体16C4变体的体外ADCC活性。用拉吉靶细胞测定3C3、6C11或9G7亲和成熟的抗CD19抗体的体外ADCC活性。16C4抗CD19抗体用作参比标准品。在所有检测浓度(0.01-10μg/ml)下，所有三种亲和成熟抗体的ADCC活性与参比标准品基本相同。

图37.亲和成熟的抗CD19抗体16C4变体的体外ADCC活性。用道迪靶细胞测定3C3、6C11或9G7亲和成熟的抗CD19抗体的体外ADCC活性。16C4抗CD19抗体用作参比标准品。在所有检测浓度(0.01-10μg/ml)下，所有三种亲和成熟抗体的ADCC活性与参比标准品基本相同。

图38.单次i.v.给予非岩藻糖化16C4抗CD19抗体消耗B细胞后，B细胞的长期恢复和血清免疫球蛋白水平。(A)实验方案。向四只或五只huCD19tg+/-小鼠的小组给予单次i.v.剂量250、50或10μg的非岩藻糖化16C4抗-CD19抗体(16C4aFuc)。对照组用PBS或250μg具有无关特异性的对照抗体(R347)治疗。动物每两周取血一次；第一次取血是在给予消耗性抗体之前7天进行的。图中总结了前11周获得的结果。(B)所有小组的动物体重均保持正常。血液B细胞水平表示为(C)淋巴细胞所占分数或(D)每微升血液中的B细胞数。所有三种16C4aFuc抗体均能完全耗尽B细胞。在接受10和50μg 16C4aFuc抗体的动物中，分别在第5周和第9周B细胞完全恢复。给予250μg 16C4aFuc抗体后11周，B细胞恢复仍旧不完全。给予50或250μg 16C4aFuc后，血清(E)IgM、(F)IgG1和(G)IgG2b未改变。给予10μg 16C4aFuc抗体或对照抗体R347或PBS后，血清免疫球蛋白水平升高。数据表明，16C4aFuc能抑制正在进行的免疫球蛋白生产，但对血清中现有的免疫球蛋白影响甚微。

图39.抗CD19抗体诱导胞内信号转导。(A-B)3649、3649-TM、3649-3M、3649-aFuc或16C4抗体治疗能明显提高拉吉细胞中CD19的酪氨酸磷酸化水平。(C-D)抗-CD19抗体治疗不抑制抗-IgM治疗诱导的ERK1/2磷酸化。

图40.抗CD19抗体治疗抑制抗IgM/CD40介导的B细胞增殖。

图41.抗-CD19抗体治疗抑制抗-IgM/CpG诱导的纯化外周B细胞增殖。(A)在抗-IgM(1μg/ml)和CpG(2μg/ml)存在下培育4天后，CFSE染色的纯化外周血B细胞的荧光强度概况。包括未刺激的第一种对照细胞群和仅用CpG刺激的第二种对照细胞群的CFSE概况，用作参比标准。(B)在16C4抗-CD19或R347对照抗体存在下，用抗-IgM/CpG刺激4天后，B细胞的CFSE概况。在16C4抗体存在下，抗-IgM/CpG诱导的B细胞增殖明显降低。

图42.与抗体的3649-TM Fc变体相比，抗-CD19抗体的3649-3M Fc变体能更有效地抑制抗-IgM/CpG诱导的B细胞增殖。在(A)R347对照、(B)3649-TM抗-CD19或(C)3649-3M抗CD19抗体存在下，用抗-IgM/CpG刺激4天后B细胞的CFSE概况。

图43. 3649-3M抗体通过CD19和FcγRIIB受体诱导的信号转导能协同地抑制抗-IgM/CpG介导的B细胞增殖。

图44.表面结合的抗CD19抗体能被拉吉细胞有效内化。37℃培育60分钟后，35％表面结合的16C4和55％表面结合的HB12B和3649抗CD19抗体被内化。

图45.抗CD19抗体治疗24小时后，CD19的表面表达明显降低。在3649、3649-TM、3649-3M、3649-aFuc或16C4抗CD19抗体存在下培育24小时后，(A)拉吉细胞和(B)纯化的外周B细胞中CD19的细胞表面表达降低55-90％。

5.发明详述

本发明涉及结合人CD19抗原的人、人源化或嵌合的抗-CD19抗体，以及含有这些抗体的组合物。在某些实施方式中，人、人源化或嵌合的抗-CD19抗体可介导抗原依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)。在其它实施方式中，本发明涉及包含可介导人ADCC、CDC和/或凋亡的IgG1和/或IgG3人同种型的人、人源化或嵌合的抗-CD19抗体，以及IgG2和/或IgG4人同种型的人、人源化或嵌合抗-CD19抗体的组合物。在其它实施方式中，人、人源化或嵌合的抗-CD19抗体可抑制抗-IgM/CpG刺激的B细胞增殖。

本发明提供嵌合和人源化的抗-CD19小鼠单克隆抗体HB12A和HB12B。在一个实施方式中，本发明的人源化抗-CD19抗体可结合人CD19，其亲和力与HB12A或HB12B的结合亲和力相当，或与嵌合HB12B抗体的结合亲和力相当。

在一个实施方式中，本发明的人源化抗-CD19单克隆抗体可包含VH和VK，其中VH包含四个构架区，即V3-72的人种系VH区段的FW1、FW2和FW3(如Tomlinson，I.M.等，(1992)J.Mol.Biol.，227，776-798所述的DP29)和人种系JH4区段的FW4(Mattila，P.S.等，(1995)Eur.J.Immunol.，25，2578-2582)；以及三个HB12B抗体的VH CDR序列，即CDR1(SEQ ID NO：22)、CDR2(SEQ ID NO：24)和CDR3(SEQ ID NO：26)；VK包含四个构架区，即人种系Vκ区段A10的FW1、FW2、FW3(Straubinger，B.I.等，(1988)Biol.Chem.Hoppe-Seyler，369，601-607)和人种系免疫球蛋白κJ4区段的FW4(Hieter，P.A.等，(1982)J.Biol.Chem.，257，1516-1522)；以及三个HB12B抗体的VK CDR序列，即CDR1(SEQ ID NO：28)、CDR2(SEQ ID NO：30)和CDR3(SEQ ID NO：32)。在一个实施方式中，本发明的抗-CD19抗体可包含VH和VK，其中VH包含四个构架区，即V3-72的人种系VH区段的FW1、FW2和FW3(如Tomlinson，I.M.等，(1992)J.Mol.Biol.，227，776-798所述的DP29)和人种系JH4区段的FW4(Mattila，P.S.等，(1995)Eur.J.Immunol.，25，2578-2582)；以及至少一个具有表1(同上)所列CDR的氨基酸序列的CDR；VK包含四个构架区，即人种系Vκ区段A10的FW1、FW2、FW3(Straubinger，B.I.等，(1988)Biol.Chem.Hoppe-Seyler，369，601-607)和人种系免疫球蛋白κJ4区段的FW4(Hieter，P.A.等，(1982)J.Biol.Chem.，257，1516-1522)；以及至少一个具有表1(同上)所列CDR的氨基酸序列的CDR。在一个实施方式中，此种抗体可包含一个或多个选自下组的VK构架突变：Y40F、K53H和Y91F。在一个实施方式中，VK构架区可包含每一种Y40F、K53H和Y91F点突变。在另一实施方式中，VK构架区可以只包含Y40F和K53H点突变。在另一实施方式中，VK构架区可只包含Y40F点突变。

5.1.1.抗-CD19抗体的CDR区

在某些实施方式中，本发明抗-CD19抗体可包含重链可变区VH，其包含至少一个具有选自下组的氨基酸序列的CDR：SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：24和SEQ ID NO：26；还可包含至少一个具有选自下组的氨基酸序列的FW区：SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：40和SEQ ID NO：42。在另一实施方式中，本发明抗-CD19抗体可包含重链可变区VH，其包含至少一个具有选自下组的氨基酸序列的CDR：SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：24和SEQ ID NO：121；还可包含至少一个具有选自下组的氨基酸序列的FW区：SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：38、SEQID NO：40和SEQ ID NO：42。在另一实施方式中，本发明抗-CD19抗体可包含重链可变区VH，其包含至少一个具有选自下组的氨基酸序列的CDR：SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：116和SEQID NO：121；还可包含至少一个具有选自下组的氨基酸序列的FW区：SEQ ID NO：36、SEQ IDNO：38、SEQ ID NO：40和SEQ ID NO：42。在另一实施方式中，本发明抗-CD19抗体可包含重链可变区VH，其包含至少一个具有选自下组的氨基酸序列的CDR：SEQ ID NO：208、SEQ ID NO：116和SEQ ID NO：121；还可包含至少一个具有选自下组的氨基酸序列的FW区：SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：40和SEQ ID NO：42。在另一实施方式中，本发明抗-CD19抗体可包含重链可变区VH，其包含至少一个具有选自下组的氨基酸序列的CDR：SEQ ID NO：208、SEQ ID NO：210和SEQ ID NO：121；还可包含至少一个具有选自下组的氨基酸序列的FW区：SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：40和SEQ ID NO：42。在另一实施方式中，本发明抗-CD19抗体可包含重链可变区VH，其包含至少一个具有表1(同上)所列VH CDR1、VH CDR2或VH CDR3的氨基酸序列的CDR；还可包含至少一个具有选自下组的氨基酸序列的FW区：SEQID NO：36、SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：40和SEQ ID NO：42。

在其它实施方式中，本发明抗-CD19抗体可包含重链可变区VH，其包含至少一个选自下组的CDR序列：SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：24和SEQ ID NO：26。

在其它实施方式中，抗-CD19抗体可包含重链可变区VH，其包含至少一个选自下组的CDR序列：SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：10。

在一个实施方式中，本发明抗-CD19抗体可包含重链可变区VH，其包含至少一个具有选自下组的氨基酸序列的CDR：SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：24和SEQ ID NO：121。在另一实施方式中，本发明抗-CD19抗体可包含重链可变区VH，其包含至少一个具有选自下组的氨基酸序列的CDR：SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：116和SEQ ID NO：121。在另一实施方式中，本发明抗-CD19抗体可包含重链可变区VH，其包含至少一个具有选自下组的氨基酸序列的CDR：SEQID NO：208、SEQ ID NO：116和SEQ ID NO：121。在另一实施方式中，本发明抗-CD19抗体可包含重链可变区VH，其包含至少一个具有选自下组的氨基酸序列的CDR：SEQ ID NO：208、SEQID NO：210和SEQ ID NO：121。

在另一实施方式中，本发明抗-CD19抗体可包含重链可变区VH，其包含至少一个具有表1(同上)所列VH CDR1、VH CDR2或VH CDR3的氨基酸序列的CDR。

在另一实施方式中，本发明抗-CD19抗体可包含重链可变区VH，其包含表1(同上)所列任一抗体的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3的氨基酸序列。本发明抗-CD19抗体还可包含轻链可变区VL。

在另一实施方式中，本发明抗-CD19抗体可包含轻链可变区VL，其包含表1(同上)所列任一抗体的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3的氨基酸序列。本发明抗-CD19抗体还可包含重链可变区VH。

在另一实施方式中，本发明抗-CD19抗体可包含表1(同上)所列任一抗体的VHCDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3的氨基酸序列。

在某些实施方式中，抗-CD19抗体可包含称为HB12B-(3-72/JH4)的人源化VH的VH结构域序列(SEQ ID NO：34)。

在一个实施方式中，本文所述的抗-CD19抗体可包含重链可变区VH，其具有选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO：103、106、191和192。在另一实施方式中，本文所述的抗-CD19抗体可包含重链可变区VH，其具有表1(同上)所列VH结构域的氨基酸序列。

在某些实施方式中，本发明抗-CD19抗体可包含轻链可变区VK，其包含至少一个具有选自下组的氨基酸序列的CDR：SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：30和SEQ ID NO：32；还可包含至少一个具有选自下组的氨基酸序列的FW区：SEQ ID NO：54、SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：72、SEQ ID NO：82、SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:66和SEQ ID NO:60。

在一个实施方式中，本发明抗-CD19抗体可包含轻链可变区VK，其包含至少一个具有选自下组的氨基酸序列的CDR：SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：125和SEQ ID NO：32；还可包含至少一个具有选自下组的氨基酸序列的FW区：SEQ ID NO：54、SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：72、SEQ ID NO：82、SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:66和SEQ ID NO:60。在另一实施方式中，本发明抗-CD19抗体可包含轻链可变区VK，其包含至少一个具有选自下组的氨基酸序列的CDR：SEQ ID NO：211、SEQ ID NO：218和SEQ ID NO：222；还可包含至少一个具有选自下组的氨基酸序列的FW区：SEQ ID NO：54、SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：72、SEQ ID NO：82、SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:66和SEQ ID NO:60。在另一实施方式中，本发明抗-CD19抗体可包含轻链可变区VK，其包含至少一个具有选自下组的氨基酸序列的CDR：SEQID NO：28、SEQ ID NO：220和SEQ ID NO：229；还可包含至少一个具有选自下组的氨基酸序列的FW区：SEQ ID NO：54、SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：72、SEQ ID NO：82、SEQ ID NO:64、SEQID NO:58、SEQ ID NO:66和SEQ ID NO:60。在另一实施方式中，本发明抗-CD19抗体可包含轻链可变区VK，其包含至少一个具有选自下组的氨基酸序列的CDR：SEQ ID NO：215、SEQ IDNO：221和SEQ ID NO：222；还可包含至少一个具有选自下组的氨基酸序列的FW区：SEQ IDNO：54、SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：72、SEQ ID NO：82、SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:58、SEQ IDNO:66和SEQ ID NO:60。在另一实施方式中，本发明抗-CD19抗体可包含轻链可变区VK，其包含至少一个具有表1(同上)所列VK CDR1、VK CDR2或VK CDR3的氨基酸序列的CDR；还可包含至少一个具有选自下组的氨基酸序列的FW区：SEQ ID NO：54、SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：72、SEQ ID NO：82、SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:66和SEQ ID NO:60。

在其它实施方式中，本发明抗-CD19抗体可包含轻链可变区VK，其包含至少一个选自下组的CDR序列：SEQ ID NO：28、30和32。

在其它实施方式中，本发明抗-CD19抗体可包含轻链可变区VK，其包含至少一个选自下组的CDR序列：SEQ ID NO：12、14和16。

在一个实施方式中，本发明抗-CD19抗体可包含轻链可变区VK，其包含至少一个具有选自下组的氨基酸序列的CDR：SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：125和SEQ ID NO：32。在一个实施方式中，本发明抗-CD19抗体可包含轻链可变区VK，其包含至少一个具有选自下组的氨基酸序列的CDR：SEQ ID NO：211、SEQ ID NO：218和SEQ ID NO：222。在一个实施方式中，本发明抗-CD19抗体可包含轻链可变区VK，其包含至少一个具有选自下组的氨基酸序列的CDR：SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：220和SEQ ID NO：229。在一个实施方式中，本发明抗-CD19抗体可包含轻链可变区VK，其包含至少一个具有选自下组的氨基酸序列的CDR：SEQ ID NO：215、SEQ ID NO：221和SEQ ID NO：222。在另一实施方式中，本发明抗-CD19抗体可包含轻链可变区VK，其包含至少一个具有表1(同上)所列VK CDR1、VK CDR2或VK CDR3的氨基酸序列的CDR。

在某些实施方式中，抗-CD19抗体可包含选自下组的人源化VK结构域序列：HB12B-(A10-Jk4)(SEQ ID NO：52)、HB12B-364987(SEQ ID NO：62)、HB12B-3649(SEQ ID NO：68)、HB12B-36(SEQ ID NO：70)、7E12VK(SEQ ID NO：110)、14H5VK(SEQ ID NO：111)、16C9VK(113)、15D1VK(SEQ ID NO：112)、3C3VK(SEQ ID NO：193)、6C11VK(SEQ ID NO：204)和9G7VK(SEQ ID NO：205)。

本发明包括结合人CD19的抗体，其含有本文所述可结合人CD19的VH结构域VHCDR1、VH CDR2、VH CDR3，VK结构域VK CDR1、VK CDR2或VK CDR3的衍生物(参见例如，表1(同上)所列的变体)。本领域技术人员知道可用于在编码抗体的核苷酸序列中引入突变的标准技术(如加入、缺失和/或取代)包括例如，通常用于产生氨基酸取代的定位诱变和PCR介导的诱变。在一个实施方式中，相对于HB12A或HB12B抗-CD19抗体的初始VH和/或VK CDR，VH和/或VK CDR衍生物可包含少于25个氨基酸取代、少于20个氨基酸取代、少于15个氨基酸取代、少于10个氨基酸取代、少于5个氨基酸取代、少于4个氨基酸取代、少于3个氨基酸取代、少于2个氨基酸取代或1个氨基酸取代。在另一实施方式中，VH和/或VK CDR衍生物可以在一个或多个预测的非必需氨基酸残基(即，抗体与人CD19特异性结合中不那么至关重要的氨基酸残基)上发生保守性氨基酸取代(同上)。也可沿所有或一部分VH和/或VK CDR编码序列随机引入突变(例如通过饱和诱变)，可筛选所得突变体的生物学活性，以鉴定保持活性的突变体。诱变后，可表达编码的抗体，并可测定该抗体的活性。在一个实施方式中，本文所述的本发明抗体可排除US20050070693A1所述hA19抗体的VH CDR1和VH CDR2。

在一个实施方式中，本文所述的人或人源化抗-CD19抗体可包含表1(同上)所列任一VH CDR的变体，其中所述VH CDR变体包含氨基酸取代。在一个具体实施方式中，本发明抗-CD19抗体包含表1所列VH CDR的变体，VH CDR变体包含以下一个或多个天然或取代的氨基酸残基：VH CDR1的32位上的苏氨酸(T)，VH CDR2的60位上的酪氨酸(Y)，VH CDR2的60位上的天冬氨酸(D)，VH CDR2的60位上的亮氨酸(L)，VH CDR2的61位上的丙氨酸(A)，VH CDR2的61位上的缬氨酸(V)，VH CDR3的100B位上的酪氨酸(Y)，VH CDR3的100B位上的精氨酸(R)和VH CDR3的100B位上的天冬酰胺(N)，它们是按照Kabat编号的。

在一个实施方式中，本文所述的人或人源化抗-CD19抗体可包含表1所列VH CDR的变体，其中所述VH CDR变体包含以下一个或多个天然或取代的氨基酸残基：VH CDR1的33位上的谷氨酸(E)，VH CDR1的33位上的亮氨酸(L)，VH CDR1的35位上的苯丙氨酸(F)，VH CDR1的35位上的酪氨酸(Y)，VH CDR1的35位上的天冬氨酸(D)，VH CDR1的35位上的亮氨酸(L)，VH CDR2的57位上的丝氨酸(S)，VH CDR2的57位上的脯氨酸(P)，VH CDR2的57位上的天冬酰胺(N)，VH CDR3的100B位上的组氨酸(H)，VH CDR3的100B位上的苯丙氨酸(F)和VH CDR3的99位上的脯氨酸(P)，它们是按照Kabat编号的。

在一个实施方式中，本文所述的人或人源化抗-CD19抗体可包含表1所列VH CDR的变体，其中所述VH CDR变体包含以下一个或多个天然或取代的氨基酸残基：VH CDR1的32位上的缬氨酸(V)和VH CDR2的52A位上的亮氨酸(L)，它们是按照Kabat编号的。

在另一实施方式中，本发明的人或人源化抗-CD19抗体可包含表1所列VK CDR的变体，其中所述VK CDR包含以下一个或多个天然或取代的氨基酸残基：VK CDR1的27D位上的组氨酸(H)，VK CDR1的33位上的异亮氨酸(I)，VK CDR2的50位上的谷氨酸(E)，VK CDR3的91位上的苏氨酸(T)和VK CDR3的96位上的异亮氨酸(I)，它们是按照Kabat编号的。

在另一实施方式中，本发明的人或人源化抗-CD19抗体可包含表1所列VK CDR的变体，其中所述VK CDR包含以下一个或多个天然或取代的氨基酸残基：VK CDR1的27C位上的异亮氨酸(I)，VK CDR1的30位上的亮氨酸(L)，VK CDR1的33位上的精氨酸(R)，VK CDR1的33位上的苏氨酸(T)，VK CDR2的50位上的酪氨酸(Y)，VK CDR2的54位上的苏氨酸(T)，VK CDR2的54位上的脯氨酸(P)，VK CDR2的55位上的酪氨酸(Y)和VK CDR3的96位上的天冬酰胺(N)，它们是按照Kabat编号的。

在另一实施方式中，本发明的人或人源化抗-CD19抗体可包含表1所列VK CDR的变体，其中所述VK CDR包含以下一个或多个天然或取代的氨基酸残基：VK CDR2的54位上的精氨酸(R)，VK CDR2的54位上的苏氨酸(T)，VK CDR2的54位上的丙氨酸(A)和VK CDR3的89位上的丙氨酸(A)，它们是按照Kabat编号的。

本发明进一步包括结合人CD19的抗体，所述抗体或抗体片段含有一个或多个CDR，其中所述CDR包含与HB12A或HB12B抗-CD19抗体的一个或多个CDR的氨基酸序列有至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％相同的氨基酸序列。可利用本领域技术人员已知的任何方法测定两个氨基酸序列的相同性百分数，这些方法包括但不限于：BLAST蛋白质搜索。

5.1.2抗-CD19抗体的构架区

在一个实施方式中，本发明人源化抗-CD19单克隆抗体的VH可包含与HB12B-(3-72/JH4)VH(SEQ ID NO：34)的相应构架区的氨基酸序列相同性(即与抗体Y的FW1相比抗体X的FW1)约为64％-100％的构架区。在该实施方式的某些方面，本文所述抗体的人或人源化VH构架区与HB12B-(3-72/JH4)VH(SEQ ID NO：34)氨基酸序列相同性可以是至少64％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％。

在具体实施方式中，本发明抗CD19抗体的人或人源化VH构架区与HB12B-(3-72/JH4)VH(SEQ ID NO：34)的相应构架区的氨基酸序列相同性为87个氨基酸中至少56个氨基酸相同(56/87)。在具体实施方式中，VH构架区的氨基酸序列相同性可以是至少56/87、57/87、58/87、59/87、60/87、61/87、62/87、63/87、64/87、65/87、66/87、67/87、68/87、69/87、70/87、71、87、72/87、73/8774/87、75/87、76/87、77.87、78/87、79/87、80/87、81/87、82/87、83/87、84/87、85/87、86/87或87/87个氨基酸。本文所述抗-CD19抗体的VH序列可能与HB12B-(3-72/JH4)的游标(Vernier)氨基酸残基具有高序列相同性，例如游标序列相同性为16个残基中至少10个残基(10/16)、至少11/16、至少12/16、至少13/16、至少14/16或至少15/16个游标残基。在另一实施方式中，游标氨基酸残基的错配可能是保守性氨基酸取代。作为保守性氨基酸取代的错配是指错配氨基酸的物理和化学特性类似于游标氨基酸，如错配残基与游标残基的极性特征(极性或非极性)、酸性特征(酸性或碱性)、侧链结构(如，支链或直链，或含有苯环、羟基部分或硫部分)相似的情况。

在其它实施方式中，游标氨基酸残基的错配可能是非保守的氨基酸取代。作为非保守性氨基酸取代的错配是指错配氨基酸的物理和化学特性与游标氨基酸不相似，例如，与被取代的游标残基相比错配残基的极性、酸性或侧链结构(如，支链或直链，或含有苯环、羟基部分或硫部分)不同的情况。

在其它实施方式中，本发明的人或人源化抗-CD19抗体可包含VH构架区，其中所述VH构架区可包含一个或多个以下残基：构架区1的20位上的亮氨酸(L)，构架区1的27位上的苯丙氨酸(F)，构架区1的28位上的苏氨酸(T)，构架区2的38位上的精氨酸(R)，构架区2的48位上的缬氨酸(V)，构架区3的67位上的苯丙氨酸(F)，构架区3的71位上的精氨酸(R)，构架区3的80位上的亮氨酸(L)和构架区3的91位上的酪氨酸(Y)，它们是按照Kabat编号的。

Kabat编号方案基于Kabat等的开创性工作(1991)《免疫学感兴趣的蛋白质的序列》(Sequences of Proteins of Immunological Interest)，出版号91-3242，由国立卫生研究院(National Institutes of Health)国家技术信息服务中心(National TechnicalInformation Service)出版为三卷丛书(下面称为“Kabat”)。Kabat能够对来自许多物种的抗体同种型的免疫球蛋白链进行多序列比对。按照一种编号系统，即Kabat编号系统对比对序列进行编号。自1991年公开以来，Kabat序列已经升级，可以电子序列数据库的形式获得(最新可下载版本为1997版)。任何免疫球蛋白序列均可通过与Kabat参比序列的比对进行Kabat编号。因此，Kabat编号系统为免疫球蛋白链的编号提供了一个统一的系统。除非另有说明，本文所述的所有免疫球蛋白氨基酸序列均按照Kabat编号系统编号。相似地，本文提及的所有单个氨基酸位置也是按照Kabat编号系统编号的。

在其它具体实施方式中，本文所述抗-CD19抗体的人或人源化VH构架区可具有经选择在一个或多个以下游标、界面或经典(Canonical)残基位置上相同或发生保守性错配的构架区：20、22、24、26、27、28、29、30、36、37、39、45、47、48、49、67、69、71、73、78、80、90、91、92、93、94和103。可通过(例如)诱变改变一个或多个错配的游标、界面和经典残基，以便匹配HB12A或HB12B VH构架区的相应氨基酸残基。

在本发明的一个实施方式中，本文所述抗-CD19抗体的人或人源化VK构架区与HB12B-(A10-Jk4)VK(SEQ ID NO：52)的构架区的氨基酸序列相同性可以是约65％-100％。在该实施方式的某些方面，本文所述抗体的人或人源化VK构架区与HB12B-(A10-Jk4)抗体VK氨基酸序列相同性可以是至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％。

在具体实施方式中，本文所述抗体的人或人源化VK构架区与HB12B-(A10-Jk4)VH(SEQ ID NO：52)相应构架区的氨基酸序列相同性(即与抗体Y的FW1相比抗体X的FW1)可以是80个氨基酸中至少52个氨基酸相同(52/80)。在具体实施方式中，VH构架区的氨基酸序列相同性可以是至少52/80、53/80、54/80、55/80、56/80、57/80、58/80、59/80、60/80、61/80、62/80、63/80、64/80、65/80、66/80、67/80、68/80、69/80、70/80、71、80、72/80、73/8074/80、75/80、76/80、77/80、78/80、79/80或80/80个氨基酸。本文所述抗-CD19抗体的VK序列可能与HB12B(参见图1)的游标氨基酸残基具有高序列相同性，例如游标序列相同性为14个残基中至少9个残基(14/9)、至少10/14、至少11/14、至少12/14、至少13/14游标残基。在另一实施方式中，游标氨基酸残基的错配可能是保守性氨基酸取代。作为保守性氨基酸取代的错配是指错配氨基酸的物理和化学特性类似于游标氨基酸，如错配残基与游标残基的极性特征(极性或非极性)、酸性特征(酸性或碱性)、侧链结构(如，支链或直链，或含有苯环、羟基部分或硫部分)相似的情况。

在其它实施方式中，游标氨基酸残基的错配可能是非保守的氨基酸取代。作为非保守性氨基酸取代的错配是指错配氨基酸的物理和化学特性与游标氨基酸不相似，例如，与被取代的游标残基相比错配残基的极性、酸性或侧链结构(如，支链或直链，或含有苯环、羟基部分或硫部分)不同的情况。

在其它实施方式中，本文所述的人或人源化VK构架区可包含一个或多个以下残基：构架区2的36位上的苯丙氨酸(F)，构架区2的49位上的组氨酸(H)和构架区3的87位上的苯丙氨酸(F)，它们是按照Kabat编号的。

在其它具体实施方式中，本文所述抗体的人或人源化VK构架区可具有经选择在一个或多个以下游标、界面或经典残基位置上相同或发生保守性错配的构架区：2、3、4、23、35、36、38、44、56、47、48、49、64、66、68、69、71、87、88和98。可通过(例如)诱变改变一个或多个错配的游标、界面和经典残基，以便匹配HB12A或HB12B构架区的相应氨基酸残基。

在具体实施方式中，含有本发明人源化VH的重链可以与含有本发明人源化VK的轻链一起表达，以产生人源化抗-CD19抗体。在一个具体实施方式中，本发明人源化抗-CD19抗体可包含选自下组的VH序列：HB12B-(3-72/JH4)(SEQ ID NO：34)、7E12VH(SEQ ID NO：102)、14H5VH(SEQ ID NO：103)、15D1VH(SEQ ID NO：104)、15D7VH(SEQ ID NO：105)、16C4VH(SEQ ID NO：106)、14H5-YG(SEQ ID NO：107)、14H5-DG(SEQ ID NO：108)、14H5-LG(SEQ IDNO：109)、1A7VH(SEQ ID NO：191)、3C3VH(SEQ ID NO：191)、6C11VH(SEQ ID NO：191)、9G7(SEQ ID NO：191)、3B4VH(SEQ ID NO：236)和3F11VH(SEQ ID NO：192)；还可包含选自下组的VK序列：HB12B-(A10/JK4)(SEQ ID NO：52)；HB12B-364987(或364987)(SEQ ID NO：62)；HB12B-3649(或3649)(SEQ ID NO：68)；HB12B-36(或36)(SEQ ID NO：70)、7E12VK(SEQ IDNO：110)、14H5(SEQ ID NO：111)、15D1(SEQ ID NO：112)、16C9(SEQ ID NO：113)、3C3VK(SEQID NO：193)、3E5VK(SEQ ID NO：194)、3D4VK(SEQ ID NO：195)、3F1VK(SEQ ID NO：196)、5B5VK(SEQ ID NO：197)、6F7VK(SEQ ID NO：198)、1C11VK(SEQ ID NO：199)、2B11VK(SEQ IDNO：200)、2D10VK(SEQ ID NO：201)、5C11VK(SEQ ID NO：202)、5D4VK(SEQ ID NO：203)、6C11VK(SEQ ID NO：204)、9G7VK(SEQ ID NO：205)、1H4VK(SEQ ID NO：206)和5C4VK(SEQ IDNO：207)。在具体实施方式中，人源化抗-CD19抗体包含VH序列HB12B-(3-72/JH4)(SEQ IDNO：34)和VK序列HB12B-364987(SEQ ID NO：62)。在具体实施方式中，抗-CD19抗体包含VH序列HB12B-(3-72/JH4)(SEQ ID NO：34)和VK序列HB12B-3649(SEQ ID NO：68)。在又一实施方式中，抗-CD19抗体包含VH序列HB12B-(3-72/JH4)(SEQ ID NO：34)和VK序列HB12B-36(SEQID NO：70)。

在一个具体实施方式中，本发明抗-CD19抗体包含VH序列7E12VH(SEQ ID NO：102)和VK序列7E12VK(SEQ ID NO：110)。在一个具体实施方式中，本发明抗-CD19抗体包含VH序列14H5VH(SEQ ID NO：103)和VK序列14H5VK(SEQ ID NO：111)。在一个具体实施方式中，本发明抗-CD19抗体包含VH序列14H5-YG VH(SEQ ID NO：107)和VK序列14H5VK(SEQ ID NO：111)。在一个具体实施方式中，本发明抗-CD19抗体包含VH序列14H5-DG VH(SEQ ID NO：108)和VK序列14H5VK(SEQ ID NO：111)。在一个具体实施方式中，本发明抗-CD19抗体包含VH序列14H5-LG VH(SEQ ID NO：109)和VK序列14H5VK(SEQ ID NO：111)。在一个具体实施方式中，本发明抗-CD19抗体包含VH序列14H5VH(SEQ ID NO：103)和VK序列16C9VK(SEQ IDNO：113)。在一个具体实施方式中，本发明抗-CD19抗体包含VH序列15D1VH(SEQ ID NO：104)和VK序列15D1VK(SEQ ID NO：112)。在一个具体实施方式中，本发明抗-CD19抗体包含VH序列15D7VH(SEQ ID NO：105)和VK序列14H5VK(SEQ ID NO：111)。在一个具体实施方式中，本发明抗-CD19抗体包含VH序列16C4VH(SEQ ID NO：106)和VK序列14H5VK(SEQ ID NO：111)。在一个具体实施方式中，本发明抗-CD19抗体包含VH序列1A7VH(SEQ ID NO：191)和VK序列14H5VK(SEQ ID NO：111)。在一个具体实施方式中，本发明抗-CD19抗体包含VH序列1A7VH(SEQ ID NO：191)和VK序列3C3VK(SEQ ID NO：193)。在一个具体实施方式中，本发明抗-CD19抗体包含VH序列1A7VH(SEQ ID NO：191)和VK序列3E5VK(SEQ ID NO：194)。在一个具体实施方式中，本发明抗-CD19抗体包含VH序列1A7VH(SEQ ID NO：191)和VK序列3D4VK(SEQID NO：195)。在一个具体实施方式中，本发明抗-CD19抗体包含VH序列1A7VH(SEQ ID NO：191)和VK序列5B5VK(SEQ ID NO：197)。在一个具体实施方式中，本发明抗-CD19抗体包含VH序列1A7VH(SEQ ID NO：191)和VK序列6F7VK(SEQ ID NO：198)。在一个具体实施方式中，本发明抗-CD19抗体包含VH序列1A7VH(SEQ ID NO：191)和VK序列2D10VK(SEQ ID NO：201)。在一个具体实施方式中，本发明抗-CD19抗体包含VH序列1A7VH(SEQ ID NO：191)和VK序列5C11VK(SEQ ID NO：202)。在一个具体实施方式中，本发明抗-CD19抗体包含VH序列1A7VH(SEQ ID NO：191)和VK序列9G7VK(SEQ ID NO：205)。在一个具体实施方式中，本发明抗-CD19抗体包含VH序列1A7VH(SEQ ID NO：191)和VK序列1H4VK(SEQ ID NO：206)。在一个具体实施方式中，本发明抗-CD19抗体包含VH序列1A7VH(SEQ ID NO：191)和VK序列5C4VK(SEQID NO：207)。在一个具体实施方式中，本发明抗-CD19抗体包含VH序列3B4VH(SEQ ID NO：236)和VK序列14H5VK(SEQ ID NO：111)。在一个具体实施方式中，本发明抗-CD19抗体包含VH序列3F11VH(SEQ ID NO：192)和VK序列3F11VK(SEQ ID NO：196)。在一个具体实施方式中，本发明抗-CD19抗体包含VH序列16C4VH(SEQ ID NO：106)和VK序列1C11VK(SEQ ID NO：199)。在一个具体实施方式中，本发明抗-CD19抗体包含VH序列16C4VH(SEQ ID NO：106)和VK序列2B11VK(SEQ ID NO：200)。在一个具体实施方式中，本发明抗-CD19抗体包含VH序列16C4VH(SEQ ID NO：106)和VK序列5D4VK(SEQ ID NO：203)。在一个具体实施方式中，本发明抗-CD19抗体包含VH序列16C4VH(SEQ ID NO：106)和VK序列6F7VK(SEQ ID NO：198)。在一个具体实施方式中，本发明抗-CD19抗体包含VH序列3F11VH(SEQ ID NO：192)和VK序列6C11VK(SEQ ID NO：204)。在一个具体实施方式中，本发明抗-CD19抗体包含表1所列的VH和VL的任何组合。

在某些实施方式中，含有本发明人源化VK的轻链可以与含有本发明人源化VH的重链一起表达，以产生人源化抗-CD19抗体。在一个实施方式中，本文所述的人源化抗-CD19抗体包含选自下组的VK序列：HB12B-(A10/JK4)(SEQ ID NO：52)；HB12B-364987(或364987)(SEQ ID NO：62)；HB12B-3649(或3649)(SEQ ID NO：68)；HB12B-36(或36)(SEQ ID NO：70)、7E12VK(SEQ ID NO：110)、14H5(SEQ ID NO：111)、15D1(SEQ ID NO：112)、16C9(SEQ ID NO：113)、3C3(SEQ ID NO：193)、3E5(SEQ ID NO：194)、3D4(SEQ ID NO：195)、3F11(SEQ ID NO：196)、5B5(SEQ ID NO：197)、6F7(SEQ ID NO：198)、1C11(SEQ ID NO：199)、2B11(SEQ IDNO：200)、2D10(SEQ ID NO：201)、5C11(SEQ ID NO：202)、5D4(SEQ ID NO：203)、6C11(SEQID NO：204)、9G7(SEQ ID NO：205)、1H4(SEQ ID NO：206)和5C4(SEQ ID NO：207)。上述VK序列可以与构架区中含有选自SEQ ID NO：36、38、40和42的氨基酸序列的VH序列配对。

在某些实施方式中，含有本发明人源化VH的重链可以与含有本发明人源化VK的轻链一起表达，以产生人源化抗-CD19抗体。在一个实施方式中，本文所述人源化抗-CD19抗体包含选自下组的VH序列：HB12B-(3-72/JH4)(SEQ ID NO：34)、7E12VH(SEQ ID NO：102)、14H5VH(SEQ ID NO：103)、15D1VH(SEQ ID NO：104)、15D7VH(SEQ ID NO：105)、16C4VH(SEQID NO：106)、14H5-YG(SEQ ID NO：107)、14H5-DG(SEQ ID NO：108)、14H5-LG(SEQ ID NO：109)、1A7(SEQ ID NO：191)、3C3VH(SEQ ID NO：191)、6C11VH(SEQ ID NO：191)、9G7(SEQ IDNO：191)、3B4VH(SEQ ID NO：236)和3F11VH(SEQ ID NO：192)。上述VH序列可以与构架区含有选自下组的氨基酸序列的VK序列配对：SEQ ID NO：54、SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：72、SEQID NO：82、SEQ ID NO：64、SEQ ID NO：58、SEQ ID NO：66和SEQ ID NO：60。

在某些实施方式中，衍生自亲本HB12A或HB12B杂交瘤的VH或VK可表达为嵌合免疫球蛋白轻链或嵌合免疫球蛋白重链，以产生嵌合抗-CD19抗体。在具体实施方式中，人源化VH可表达为含有HB12A VK(SEQ ID NO：4)或HB12B VK(SEQ ID NO：20)的嵌合抗体。在另一具体实施方式中，人源化VK可表达为含有HB12A VH(SEQ ID NO：2)或HB12B VH(SEQ ID NO：18)的嵌合抗体。在另一实施方式中，嵌合抗-CD19抗体可包含HB12A VK(SEQ ID NO：4)或HB12B VK(SEQ ID NO：20)的VK序列，还可包含HB12A VH(SEQ ID NO：2)或HB12B VH(SEQ IDNO：18)的VH序列。

在具体实施方式中，本发明人源化VH还可包含前导序列MGDNDIHFAFLSTGVHS(SEQID NO：83)。

在另一实施方式中，本发明VK还可包含选自人VKI-L12基因的前导肽的前导序列MDMRVPAQLLGLLLLWLPGAKC(SEQ ID NO：84)。

本文所述的抗-CD19抗体与人CD19(hCD19)抗原的结合亲和力可能很高。例如，本文所述抗体的结合速率常数或k_结合速率为至少2X10⁵M^{- 1}s^-1、至少5X10⁵M^-1s^-1、至少10⁶M^-1s^-1、至少5X10⁶M^-1s^-1、至少10⁷M^-1s^-1、至少5X10⁷M^-1s^-1或至少10⁸M^-1s^-1。

在另一实施方式中，本发明抗-CD19抗体的k_解离速率 可能小于5x10^-1s^-1、小于10^-1s^-1、小于5x10^-2s^-1、小于10^-2s^-1、小于5x10^-3s^-1、小于10^-3s^-1、小于5x10^-4s^-1或小于10^-4s^-1。在另一实施方式中，本发明抗体的k_解离小于5x10^-5s^-1、小于10^-5s^-1、小于5x10^-6s^-1、小于10^-6s^-1、小于5x10^-7s^-1、小于10^-7s^-1、小于5x10^-8s^-1、小于10^{- 8}s^-1、小于5x10^-9s^-1、小于10^-9s^-1或小于10^-10s^-1。

在另一实施方式中，本发明抗-CD19抗体的亲和常数或K_a(k_结合/k_解离)可以是至少10²M^-1、至少5X10²M^-1、至少10³M^-1、至少5X10³M^-1、至少10⁴M^-1、至少5X10⁴M^-1、至少10⁵M^-1、至少5X10⁵M^-1、至少10⁶M^-1、至少5X10⁶M^-1、至少10⁷M^-1、至少5X10⁷M^-1、至少10⁸M^-1、至少5X10⁸M^-1、至少10⁹M^-1、至少5X10⁹M^-1、至少10¹⁰M^-1、至少5X10¹⁰M^-1、至少10¹¹M^-1、至少5X10¹¹M^-1、至少10¹²M^-1、至少5X10¹²M^-1、至少10¹³M^-1、至少5X10¹³M^-1、至少10¹⁴M^-1、至少5X10¹⁴M^-1、至少10¹⁵M^-1或至少5X10¹⁵M^-1。在又一实施方式中，本发明抗-CD19抗体的解离常数或K_d(k_解离/k_结合)可能小于5x10^-2M、小于10^-2M、小于5x10^-3M、小于10^-3M、小于5x10^-4M、小于10^-4M、小于5x10^-5M、小于10^{- 5}M、小于5x10^-6M、小于10^-6M、小于5x10^-7M、小于10^-7M、小于5x10^-8M、小于10^-8M、小于5x10^-9M、小于10^-9M、小于5x10^-10M、小于10^-10M、小于5x10^-11M、小于10^-11M、小于5x10^-12M、小于10^-12M、小于5x10^-13M、小于10^-13M、小于5x10^-14M、小于10^-14M、小于5x10^-15M或小于10^-15M。

在一个实施方式中，本文所述方法所用的本发明抗体可能与人CD19发生免疫特异性结合，利用本文所述或本领域技术人员已知的方法(如BIAcore试验、ELISA)(瑞典乌普萨拉的比亚科国际公司(Biacore International AB，Uppsala，Sweden))评估，其解离常数(Kd)可能小于3000pM、小于2500pM、小于2000pM、小于1500pM、小于1000pM、小于750pM、小于500pM、小于250pM、小于200pM、小于150pM、小于100pM、小于75pM。在一个具体实施方式中，本文所述方法所用的本发明抗体可能与人CD19发生抗原免疫特异性结合，利用本文所述或本领域技术人员已知的方法(如BIAcore试验、ELISA)评估，其解离常数(K_d)可以是25-3400pM、25-3000pM、25-2500pM、25-2000pM、25-1500pM、25-1000pM、25-750pM、25-500pM、25-250pM、25-100pM、25-75pM、25-50pM。在另一实施方式中，本文所述方法所用的本发明抗-CD19抗体可与hCD19发生免疫特异性结合，利用本文所述或本领域技术人员已知的方法(如BIAcore试验、ELISA)评估，其解离常数(Kd)可以是500pM、100pM、75pM或50pM。

本发明还提供包含编码本文所述的人、人源化后嵌合的抗-CD19抗体或其片段的核苷酸序列的多核苷酸。本发明还包括在严谨性或严谨性较低的杂交条件(如本文所述)下，与编码本文所述与hCD19结合的人、人源化或嵌合抗体的多核苷酸杂交的多核苷酸。

严谨性杂交条件包括但不限于：在6X氯化钠/枸橼酸钠(SSC)中，约45℃下与滤膜结合的DNA杂交，然后用0.2X SSC/0.1％SDS在约50-65℃下洗涤一次或多次，高度严谨条件例如，在6X SSC中，约45℃下与滤膜结合的DNA杂交，然后用0.1XSSC/0.2％SDS在约60℃下洗涤一次或多次，或者是本领域技术人员已知的任何其它严谨性杂交条件(参见例如，Ausubel，F.M.等编，1989《新编分子生物学实验指南》(Current Protocols in MolecularBiology)，第1卷，格林出版联合公司(Green Publishing Associates，Inc.)和约翰韦利森公司(John Wiley and Sons，Inc.)，NY，第6.3.1-6.3.6和2.10.3页)。

可通过本领域已知的任何方法获得多核苷酸，并测定多核苷酸的核苷酸序列。例如，如果抗体的核苷酸序列已知，则可由化学合成的寡核苷酸组装编码该抗体的多核苷酸(如Kutmeier等，BioTechniques 17:242(1994)所述)，简言之，该方法包括合成含有编码该抗体的序列的某部分的重叠寡核苷酸，使这些寡核苷酸退火和连接，然后通过PCR扩增连接的寡核苷酸。

也可由合适来源的核酸产生编码抗体的多核苷酸。如果无法获得含有编码特定抗体的核酸的克隆，但该抗体分子的序列已知，则可通过化学合成或利用可与该序列3'和5'端杂交的合成引物进行PCR扩增、或利用具体基因序列的特异性寡核苷酸探针进行克隆以鉴定cDNA文库中编码该抗体的cDNA克隆，由合适来源(如抗体cDNA文库，或由表达该抗体的任何组织或细胞，如选择表达抗体的杂交瘤细胞分离的核酸，优选聚A+RNA产生的cDNA文库)获得编码该免疫球蛋白的核酸。然后，可利用本领域熟知的任何方法将PCR产生的扩增核酸克隆到可复制克隆载体中。

本发明也提供编码本文所述抗体的VH和VK构架区以及CDR的多核苷酸序列，还提供使它们在哺乳动物细胞中有效表达的表达载体。

本发明还提供可在hCD19转基因小鼠模型系统中有效消耗表达重组人CD19分子的B细胞的抗体(参见Yazawa等，Proc Natl Acad Sci USA.102(42):15178-83(2005))。在一个具体实施方式中，本发明抗-CD-19抗体实现的B细胞消耗相当于HB12B单克隆抗体的至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少100％。在另一实施方式中，与HB12B抗体相比，本发明抗-CD19抗体对B细胞的消耗更完全。在一个实施方式中，本发明抗-CD19抗体可消耗循环B细胞、血液B细胞、脾B细胞、边缘区B细胞、滤泡B细胞、腹膜B细胞和/或骨髓B细胞。在一个实施方式中，本发明抗-CD19抗体可消耗祖B细胞、早期祖B细胞、晚期祖B细胞、大前B细胞、小前B细胞、未成熟B细胞、成熟B细胞、抗原刺激的B细胞和/或浆细胞。在一个实施方式中，本发明抗-CD19抗体的B细胞消耗作用可能持续至少1天、至少2天、至少3天、至少4天、至少5天、至少6天、至少7天、至少8天、至少9天、至少10天、至少15天、至少20天、至少25天或至少30天。在另一实施方式中，本发明抗-CD19抗体的B细胞消耗作用可持续至少1周、至少2周、至少3周、至少4周、至少5周、至少6周、至少7周、至少8周、至少9周或至少10周。在另一实施方式中，本发明抗-CD19抗体的B细胞消耗作用可持续至少1个月、至少2个月、至少3个月、至少4个月、至少5个月、至少6个月、至少7个月、至少8个月、至少9个月、至少10个月、至少11个月或至少12个月。

本发明也提供能有效消耗人体B细胞的抗体。在一个具体实施方式中，本发明抗-CD-19抗体可消耗至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％或约100％的B细胞。在另一实施方式中，本发明抗-CD19抗体可消耗人体的B细胞亚类。在一个具体实施方式中，本发明抗-CD19抗体可消耗循环B细胞、血液B细胞、脾B细胞、边缘区B细胞、滤泡B细胞、腹膜B细胞和/或骨髓B细胞。CD19存在于所有发育阶段的B细胞表面上。因此，抗-CD19抗体可消耗所有发育阶段的B细胞。在一个具体实施方式中，本发明抗-CD19抗体可消耗祖B细胞、早期祖B细胞、晚期祖B细胞、大前B细胞、小前B细胞、未成熟B细胞、成熟B细胞、抗原刺激的B细胞和/或浆细胞。可以在延长的时间内持续消耗B细胞。在一个实施方式中，本发明抗-CD19抗体的B细胞消耗作用可能持续至少1天、至少2天、至少3天、至少4天、至少5天、至少6天、至少7天、至少8天、至少9天、至少10天、至少15天、至少20天、至少25天或至少30天。在另一实施方式中，本发明抗-CD19抗体的B细胞消耗作用可持续至少1周、至少2周、至少3周、至少4周、至少5周、至少6周、至少7周、至少8周、至少9周或至少10周。在另一实施方式中，本发明抗-CD19抗体的B细胞消耗作用可持续至少1个月、至少2个月、至少3个月、至少4个月、至少5个月、至少6个月、至少7个月、至少8个月、至少9个月、至少10个月、至少11个月或至少12个月。

在一个实施方式中，本发明抗-CD19抗体消耗至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％或约100％的循环B细胞。在一个实施方式中，本发明抗-CD19抗体消耗至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％或约100％的血液B细胞。在一个实施方式中，本发明抗-CD19抗体消耗至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％或约100％的脾B细胞。在一个实施方式中，本发明抗-CD19抗体消耗至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％或约100％的边缘区B细胞。在一个实施方式中，本发明抗-CD19抗体消耗至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％或约100％的滤泡B细胞。在一个实施方式中，本发明抗-CD19抗体消耗至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％或约100％的腹膜B细胞。在一个实施方式中，本发明抗-CD19抗体消耗至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％或约100％的骨髓B细胞。在一个实施方式中，本发明抗-CD19抗体消耗至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％或约100％的祖B细胞。在一个实施方式中，本发明抗-CD19抗体消耗至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％或约100％的早期祖B细胞。在一个实施方式中，本发明抗-CD19抗体消耗至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％或约100％的晚期祖B细胞。在一个实施方式中，本发明抗-CD19抗体消耗至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％或约100％的大前B细胞。在一个实施方式中，本发明抗-CD19抗体消耗至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％或约100％的小前B细胞。在一个实施方式中，本发明抗-CD19抗体消耗至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％或约100％的未成熟B细胞。在一个实施方式中，本发明抗-CD19抗体消耗至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％或约100％的成熟B细胞。在一个实施方式中，本发明抗-CD19抗体消耗至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％或约100％抗原刺激的B细胞。在一个实施方式中，本发明抗-CD19抗体消耗至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％或约100％的浆细胞。可以在延长的时间内持续消耗B细胞。在一个实施方式中，本发明抗-CD19抗体的B细胞消耗作用可能持续至少1天、至少2天、至少3天、至少4天、至少5天、至少6天、至少7天、至少8天、至少9天、至少10天、至少15天、至少20天、至少25天或至少30天。在另一实施方式中，本发明抗-CD19抗体的B细胞消耗作用可持续至少1周、至少2周、至少3周、至少4周、至少5周、至少6周、至少7周、至少8周、至少9周或至少10周。在另一实施方式中，本发明抗-CD19抗体的B细胞消耗作用可持续至少1个月、至少2个月、至少3个月、至少4个月、至少5个月、至少6个月、至少7个月、至少8个月、至少9个月、至少10个月、至少11个月或至少12个月。

B细胞恶性肿瘤的特征是特定B细胞亚类的病理性扩增，例如，前体B细胞急性淋巴细胞性白血病的特征是对应于祖B细胞/前B细胞发育阶段的B细胞的异常扩增。恶性B细胞的细胞表面保持表达正常B细胞标记，如CD19。因此，抗-CD19抗体可消耗人体的恶性B细胞。在一个具体实施方式中，本发明抗-CD19抗体可消耗人体至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少100％的恶性B细胞。

在一个实施方式中，本文所述的人源化抗-CD19抗体介导抗体依赖性细胞毒性(ADCC)、补体依赖性细胞介导的细胞毒性(CDC)和/或凋亡。在一个实施方式中，本发明人源化抗-CD19抗体介导抗体依赖性细胞毒性(ADCC)和/或凋亡。在一个实施方式中，本发明抗-CD19抗体的抗体依赖性细胞毒性(ADCC)增强。在一个实施方式中，本发明抗-CD19抗体包含介导增强的抗体依赖性细胞毒性(ADCC)的变异Fc区。在一个实施方式中，本发明抗-CD19抗体包含N-糖苷连接的复合糖链连接于Asn297的Fc区，其中岩藻糖不结合还原端的N-乙酰基葡糖胺，其中所述Fc区介导增强的抗体依赖性细胞毒性(ADCC)。

本发明还提供可有效抑制体外刺激的B细胞增殖的抗-CD19抗体。可通过各种刺激诱导分离的外周B细胞的增殖，这些刺激例如但不限于抗-IgM抗体、CD40或CpG的刺激。这些刺激可以单独递送或联合给予。

在一个实施方式中，本发明抗-CD19抗体能抑制体外刺激的B细胞增殖。在另一实施方式中，本文所述的抗-CD19抗体能抑制抗-IgM/CpG或抗-IgM/CD40刺激诱导的体外B细胞增殖。在一个实施方式中，本发明抗-CD19抗体能将体外刺激的B细胞增殖抑制至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％或至少约75％。

在一个实施方式中，本发明抗-CD19抗体的Fc变体能抑制抗-IgM/CpG或抗-IgM/CD40刺激诱导的体外B细胞增殖，其中相对于相应的非变体分子，所述Fc变体与一种或多种Fc配体的结合亲和力改变。在一个具体实施方式中，本发明抗-CD19抗体的Fc变体能抑制抗-IgM/CpG或抗-IgM/CD40刺激介导的体外B细胞增殖，其中相对于相应的非变异Fc区，所述Fc变体与Fcγ受体IIB的结合增强。在另一个具体的实施方式中，本发明抗-CD19抗体的Fc变体将体外刺激的B细胞增殖抑制至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％或至少约75％。在另一实施方式中，本发明抗-CD19抗体的Fc变体能抑制体外刺激的B细胞增殖，其中所述变异Fc区与Fcγ受体IIB的亲和力是相应非变异Fc区的至少2倍、至少3倍、至少5倍、至少7倍、至少10倍、至少20倍、至少30倍、至少40倍、至少50倍、至少60倍、至少70倍、至少80倍、至少90倍、至少100倍或至少200倍。

本发明也涉及一种治疗人的B细胞恶性肿瘤的方法，所述方法包括向需要的人给予足以消耗循环B细胞用量的人、人源化或嵌合的抗-CD19抗体，它们可介导人抗体依赖性细胞毒性(ADCC)、补体依赖性细胞介导的细胞毒性(CDC)和/或凋亡。在一个具体方面，本发明也涉及治疗人的B细胞恶性肿瘤的方法，所述方法包括给予IgG1或IgG3人同种型的人、人源化或嵌合的抗-CD19抗体的治疗有效方案。

本发明还涉及一种治疗人的自身免疫性疾病或失调的方法，所述方法包括向需要的人给予足以消耗循环B细胞用量的人、人源化或嵌合的抗-CD19抗体，所述抗体可介导人ADCC、CDC和/或凋亡。本发明也涉及治疗自身免疫病的方法，所述方法包括给予IgG1或IgG3人同种型的人、人源化或嵌合的抗-CD19抗体的治疗有效方案。

本发明也提供治疗或预防人移植物接受者的体液排斥的方法，所述方法包括给予所述接受者可消耗循环B细胞或循环免疫球蛋白或二者的量的本发明人、人源化或嵌合的抗-CD19抗体。在其它实施方式中，本发明提供预防人移植物接受者的移植物排斥或移植物抗宿主病的方法，所述方法包括在移植前，使移植物接触可消耗该移植物产生B细胞用量的人、人源化或嵌合的抗-CD19抗体。

5.2.人源化的抗-CD19抗体的产生

可利用本领域已知的各种技术产生本文所述的人源化抗体，这些技术包括但不限于：CDR移植(参见例如，欧洲专利EP 239,400；国际公开WO 91/09967；和美国专利5,225,539、5,530,101和5,585,089，以上各篇文献的全文通过引用纳入本文)，镶面(veneering)或表面再造(resurfacing)(参见例如欧洲专利EP 592,106和EP 519,596；Padlan，1991，Molecular Immunology 28(4/5):489-498；Studnicka等，1994，Protein Engineering，7(6):805-814；和Roguska等，1994，Proc.Natl.Acad.Sci.，91:969-973，以上各篇文献的全文通过引用纳入本文)，链改组(参见例如美国专利5,565,332，其全文通过引用纳入本文)以及以下文献所述的技术：美国专利6,407,213，美国专利5,766,886，国际公开WO9317105，Tan等，J.Immunol.，169:1119-25(2002)，Caldas等，Protein Eng.，13(5):353-60(2000)，Morea等，Methods，20(3):267-79(2000)，Baca等，J.Biol.Chem.，272(16):10678-84(1997)，Roguska等，Protein Eng.，9(10):895-904(1996)，Couto等，Cancer Res.，55(23Supp):5973s-5977s(1995)，Couto等，Cancer Res.，55(8):1717-22(1995)，Sandhu JS，Gene，150(2):409-10(1994)和Pedersen等，J.Mol.Biol.，235(3):959-73(1994)，以上各篇文献的全文通过引用纳入本文。FW区中的FW残基常常被CDR供体抗体的相应残基取代，以改变、优选改进抗原结合。通过本领域熟知方法鉴定这些FW取代，例如通过对CDR和FW残基相互作用建模来鉴定对抗原结合至关重要的FW残基，并进行序列比较以鉴定特定位置上的不寻常FW残基。(参见例如，Queen等，美国专利号5,585,089；和Riechmann等，1988，Nature，332:323，其全文通过引用纳入本文)。

人源化抗-CD19抗体具有从非人来源引入了一个或多个氨基酸残基。这些非人氨基酸残基常常称为“输入”残基，它们一般取自“输入”可变区。因此，人源化抗体包含一个或多个来自非人免疫球蛋白分子的CDR和来自人的构架区。本领域熟知抗体的人源化方法，基本如以下文献所述：Winter和同事(Jones等，Nature，321:522-525(1986)；Riechmann等，Nature，332:323-327(1988)；Verhoeyen等，Science，239:1534-1536(1988))，用啮齿动物CDR或CDR序列取代人抗体的相应序列，即CDR-移植(EP 239,400；PCT公开WO 91/09967；和美国专利4,816,567；6,331,415；5,225,539；5,530,101；5,585,089；6,548,640，其全文通过引用纳入本文)。在这类人源化嵌合抗体中，明显小于完整的人可变区被来自非人物种的相应序列所取代。在实践中，人源化抗体一般是一些CDR残基，可能是一些FW残基被啮齿动物抗体中相似位点的残基所取代的人抗体。抗-CD19抗体的人源化也可通过镶面或表面再造(EP 592,106；EP 519,596；Padlan，1991，Molecular Immunology 28(4/5)：489-498；Studnicka等，Protein Engineering，7(6)：805-814(1994)；和Roguska等，Proc.Natl.Acad.Sci.，91:969-973(1994))或链改组(美国专利号5,565,332)进行，其全文通过引用纳入本文。

用于制备人源化抗体的人轻链和重链可变区的选择原则是降低抗原性。按照所谓的“最佳拟合”方法，用啮齿动物可变区的序列筛选整个已知人可变区序列的文库。然后，筛选与啮齿动物最密切相关的人序列中存在对抗原结合、合适的结构形成和/或所需mAb的稳定性至关重要的特定残基的序列(Sims等，J.Immunol.，151:2296(1993)；Chothia等，J.Mol.Biol.，196:901(1987)，其全文通过引用纳入本文)。然后，将满足所需标准的所得FW序列用作该人源化抗体的人供体FW区。

另一种方法使用衍生自特定轻链或重链亚组的所有人抗体的共有序列的特定FW。相同FW可用于数种不同的抗-CD19抗体(Carter等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，89:4285(1992)；Presta等，J.Immunol.，151:2623(1993)，其全文通过引用纳入本文)。

抗-CD19抗体可以在保留与CD19的高亲和力和其它优良的生物学特性的情况下进行人源化。按照本发明的一个方面，利用亲本序列和人源化序列的三维模型分析亲本序列和各种概念人源化产物，以制备人源化抗体。本领域技术人员通常可获得并且熟悉三维免疫球蛋白模型。也可利用计算机程序说明和显示所选的免疫球蛋白序列候选物的可能的三维构象结构。检查这些显示能够分析所述残基在免疫球蛋白序列候选物功能中的可能作用，即分析影响免疫球蛋白候选物结合CD19的能力的残基。可以此方式由接受者和输入序列选择和组合FW残基，以便获得所需的抗体特征，如实现对CD19的亲和力。通常，CDR残基直接，或主要参与影响抗原结合。

“人源化”抗体可能保持与原始抗体相似的抗原特异性，即在本发明中，保持结合人CD19抗原的能力。然而，使用某些人源化方法，可采用“定向演化”方法改变抗体与人CD19抗原结合的亲和力和/或特异性，如Wu等，J.Mol.Biol.，294:151(1999)所述，其全文通过引用纳入本文。

可通过选择用于移植HB12A或HB12B互补决定区或“CDR”(如以下章节所述)的不同人构架区，构建本文所述的抗-CD19抗体。本发明包括多种小鼠HB12A和HB12B抗体，以及称为chHB12A和chHB12B的嵌合抗体的人源化版本。

5.3单克隆抗-CD19抗体

单克隆抗-CD19抗体与人CD19抗原有结合特异性，可介导人ADCC、CDC和/或凋亡机制。可采用本领域已知的各种技术产生这种抗体，这些技术包括使用杂交瘤、重组技术和噬菌体展示技术，或它们的组合。抗体具有针对某一抗原性位点的高度特异性。可通过本领域已知的任何方法产生工程改造的抗-CD19抗体，这些方法包括但不限于：下述技术及其改进形式。大规模高产率生产一般包括培养产生工程改造的抗CD19抗体的宿主细胞和由所述宿主细胞培养物回收抗CD19抗体。

5.3.1杂交瘤技术

可采用杂交瘤技术产生单克隆抗体，该技术是本领域已知的，参见例如Harlow等，Antibodies：A Laboratory Manual(抗体：实验室手册)，(Cold Spring HarborLaboratory Press(冷泉港实验室出版社)，第2版，1988)；Hammerling等，刊于：MonoclonalAntibodies and T-Cell Hybridomas(单克隆抗体和T细胞杂交瘤)563-681(艾思威尔出版社(Elsevier)，纽约，1981)，其全文通过引用纳入本文)。例如，在杂交瘤方法中，对小鼠或其它合适的宿主动物(如仓鼠或猕猴)进行免疫，以引发产生或能够产生特异性结合免疫所用蛋白质的抗体的淋巴细胞。淋巴细胞也可体外免疫。然后，用合适的融合试剂如聚乙二醇使淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合，形成杂交瘤细胞(Goding，单克隆抗体：原理和实践(Monoclonal Antibodies:Principles and Practice)，第59-103页(学术出版社(Academic Press)，1986))。

将如此制备的杂交瘤细胞进行接种，并用含有一种或多种能够抑制未融合的亲本骨髓瘤细胞生长或存活的物质的合适培养基进行培养。例如，如果亲本骨髓瘤细胞缺少次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(HGPRT或HPRT)，则杂交瘤培养基一般包含次黄嘌呤、氨蝶呤和胸苷(HAT培养基)，这些物质能防止HGPRT-缺陷细胞的生长。

特定实施方式采用能够有效融合、支持由所选抗体生产细胞稳定高水平产生抗体且对培养基(如HAT培养基)敏感的骨髓瘤细胞。这些骨髓瘤细胞系包括鼠骨髓瘤细胞系，如衍生自MOPC-21和MPC-11小鼠肿瘤的细胞系(获自美国加州圣地亚哥的索尔克细胞销售中心(Salk Institute Cell Distribution Center，San Diego，CA，USA))和SP-2或X63-Ag8.653细胞(获自美国马里兰州罗克维尔的美国典型培养物保藏中心(American TypeCulture Collection，Rockville，MD，USA))的细胞系。也记载过将人骨髓瘤和小鼠-人异源骨髓瘤细胞系用于生产人单克隆抗体(Kozbor，J.Immunol.，133:3001(1984)；Brodeur等，单克隆抗体生产技术和应用(Monoclonal Antibody Production Techniques andApplications)，第51-63页(纽约MD公司(Marcel Dekker，Inc.，New York)，1987))。

检测培养杂交瘤细胞的培养基中是否产生人CD19抗原的单克隆抗体。杂交瘤细胞产生的单克隆抗体的结合特异性可通过免疫沉淀或体外结合试验，例如放射性免疫试验(RIA)或酶联免疫吸附实验(ELISA)测定。

鉴定到产生具有所需特异性、亲和力和/或活性的抗体的杂交瘤细胞后，可通过有限稀释步骤和标准方法培养对该克隆进行亚克隆(Goding，单克隆抗体：原理和实践(Monoclonal Antibodies:Principles and Practice)，第59-103页，(学术出版社，1986))。适用于此种目的培养基包括例如，D-MEM或RPMI 1640培养基。此外，杂交瘤细胞可以作为腹水瘤在动物体内培养。

通过常规免疫球蛋白纯化方法，例如蛋白A-琼脂糖、羟基磷灰石色谱、凝胶电泳、透析或亲和色谱，适当地由培养基、腹水或血清分离所述亚克隆分泌的单克隆抗体。

5.3.2重组DNA技术

不难用常规方法(例如，使用能够特异性结合编码抗CD19抗体的重链和轻链的基因的寡核苷酸探针)对编码本文所述的抗-CD19抗体的DNA进行分离和测序。杂交瘤细胞用作这类DNA的来源。一旦分离后，则可将该DNA设置到表达载体中，然后转移到宿主细胞如大肠杆菌(E.coli)细胞、猿COS细胞、中华仓鼠卵巢(CHO)细胞或不产生免疫球蛋白的骨髓瘤细胞中，在重组宿主细胞中合成抗-CD19抗体。

在噬菌体展示法中，功能性抗体结构域展示在携带编码它们的多核苷酸序列的噬菌体颗粒表面上。具体说，由动物cDNA文库(如人或鼠患病组织的cDNA文库)扩增编码V_H和V_L结构域的DNA序列。通过PCR将编码V_H和V_L结构域的DNA与scFv接头重组在一起，克隆到噬菌粒载体中。将该载体电穿孔到大肠杆菌中，用辅助噬菌体感染该大肠杆菌。用于这些方法的噬菌体一般是丝状噬菌体，包括fd和M13，通常将V_H和V_L结构域重组融合于噬菌体基因III或基因VIII。可以利用抗原，如标记抗原或者结合或捕获在固体表面或珠上的抗原来选择或鉴定表达能够结合特定抗原的抗原结合域的噬菌体。可用于制备本发明抗体的噬菌体展示法的例子包括Brinkman等，1995，J.Immunol.Methods 182:41-50；Ames等，1995，J.Immunol.Methods 184:177-186；Kettleborough等，1994，Eur.J.Immunol.24:952-958；Persic等，1997，Gene 187:9-18；Burton等，1994，Advances in Immunology 57:191-280；国际申请号PCT/GB91/01134；国际公开号WO90/02809、WO91/10737、WO92/01047、WO92/18619、WO93/11236、WO95/15982、WO95/20401和WO97/13844；以及美国专利号5,698,426、5,223,409、5,403,484、5,580,717、5,427,908、5,750,753、5,821,047、5,571,698、5,427,908、5,516,637、5,780,225、5,658,727、5,733,743和5,969,108所述的方法，上述文献全文通过引用纳入本文。

如上述参考文献所述，噬菌体选择后，可分离噬菌体的抗体编码区，用于产生完整抗体，包括人抗体或任何其它所需的抗原结合片段，在任何所需宿主，包括哺乳动物细胞、昆虫细胞、植物细胞、酵母和细菌中表达，如下所述。也可采用通过本领域已知方法，例如PCT公开号WO 92/22324；Mullinax等，1992，BioTechniques 12(6)：864-869；Sawai等，1995，AJRI 34:26-34；和Better等，1988，Science 240:1041-1043所公开的方法，采用重组产生Fab、Fab’和F(ab’)₂片段的技术(所述文献通过引用以全文纳入本文)。

可以从McCafferty等，Nature，348:552-554(1990)所述技术产生的抗体噬菌体文库分离抗体。Clackson等，Nature，352:624-628(1991)；Marks等，J.Mol.Biol.，222:581-597(1991)分别记载了利用噬菌体文库分离鼠和人抗体的方法。可以采用链改组产生高亲和(nM范围)人抗体(Marks等，Bio/Technology，10:779-783(1992))，联合感染和体内重组作为构建非常大的噬菌体文库的方案(Waterhouse等，Nuc.Acids.Res.，21:2265-2266(1993))。因此，这些技术是用于分离抗-CD19抗体的传统单克隆抗体杂交瘤技术的可选替代方案。

为了产生完整抗体，可采用PCR引物，包括VH或VL核苷酸序列、限制性位点和用来保护限制性位点的侧接序列，来扩增scFv克隆中的VH或VL序列。可利用本领域技术人员已知的克隆技术将PCR扩增的VH结构域克隆到表达重链恒定区，如人γ4恒定区的载体中，可将PCR扩增的VL结构域克隆到表达轻链恒定区，如人κ或λ恒定区的载体中。用于表达VH或VL结构域的载体可包含EF-1α启动子、分泌信号、可变区、恒定区的克隆位点和选择性标记如新霉素。也可将VH和VL结构域克隆到一个表达所需恒定区的载体中。然后，用本领域技术人员已知的技术将重链转化载体和轻链转化载体共转染到细胞系中，产生表达全长抗体如IgG的稳定或瞬时细胞系。

也可以(例如)利用同源鼠序列代替人重链和轻链恒定区的编码序列(美国专利号4,816,567；Morrison等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，81:6851(1984))或将免疫球蛋白编码序列与非免疫球蛋白多肽的全部或一部分编码序列共价连接，对DNA进行修饰。

5.4.嵌合抗体

本文所述的抗-CD19抗体具体包括重链和/或轻链的一部分与衍生自特定物种或属于特定抗体类型或子类的抗体的相应序列相同或同源，而该链的另一部分与衍生自另一物种或属于另一抗体类型或子类的抗体的相应序列相同或同源的嵌合抗体(免疫球蛋白)，以及这种抗体的片段，只要它们具有所需生物学活性(美国专利号4,816,567；Morrison等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，81:6851-6855(1984))。本文感兴趣的嵌合抗体包括含有来自非人灵长动物的可变区抗原结合序列(例如，旧大陆猴，如狒狒、恒河猴或猕猴)和人恒定区序列(美国专利号5,693,780)“灵长动物化”抗体。

5.5改变/突变的抗体

本文所述的组合物和方法中的抗-CD19抗体可以是突变抗体。本文所用属于“抗体突变体”或“改变的抗体”指抗-CD19抗体的一个或多个氨基酸残基被修饰的抗-CD19抗体的氨基酸序列变体。对抗-CD19抗体氨基酸序列的修饰包括可提高抗体与抗原的亲和力和/或亲合力的序列修饰，和/或可提高效应功能的抗体Fc部分的修饰。

因此，本发明涉及本文所述人、人源化和嵌合的抗-CD19抗体，及其改变/突变的衍生物，包括但不限于人CD19结合特性改变的衍生物；如结合常数k_结合、解离常数k_解离和/或平衡常数或结合亲和力K_D改变的衍生物。在某些实施方式中，本文所述抗-CD19抗体，或其改变/突变的衍生物与人CD19的K_D可以不超过约10^-6M、10^-7M、10^-8M或10^-9M。适用于测定本发明抗体或其改变/突变的衍生物的这种结合特征的方法和试剂是本领域熟知和/或可购得的(见上，例如，美国专利号6,849,425、美国专利号6,632,926、美国专利号6,294,391和美国专利号6,143,574，各文献通过引用全文纳入本文)。而且，可购得设计用于进行这种动力学分析的设备和软件(如A100和2000设备；瑞典乌普萨拉的比亚科国际公司(Biacore International AB，Uppsala，Sweden))。

可对任何已知抗-CD19抗体或本文鉴定的抗-CD19抗体进行修饰。这种改变的抗体与已知抗CD19抗体的序列相同性或相似性必定小于100％。例如，改变的抗体可具有与本文所述抗-CD19抗体的重链或轻链可变区的氨基酸序列约25％-95％相同或相似的氨基酸序列。改变的抗体可具有与本文所述抗CD-19抗体的重链或轻链可变区的氨基酸序列的相同性或相似性为至少25％、35％、45％、55％、65％、75％、80％、85％、90％或95％的氨基酸序列。在另一实施方式中，改变的抗体可具有与本文所述抗CD-19抗体的重链CDR1、CDR2或CDR3的氨基酸序列的相同性或相似性为至少25％、35％、45％、55％、65％、75％、80％、85％、90％或95％的氨基酸序列。在一个实施方式中，改变的抗体可保持人CD19结合能力。在某些实施方式中，本文所述的抗-CD19抗体可包含与HB12B-(3-72/JH4)(SEQ ID NO：34)、HB12A VH(SEQ ID NO：2)HB12B VH(SEQ ID NO：18)、7E12VH(SEQ ID NO：102)、14H5VH(SEQID NO：103)、15D1VH(SEQ ID NO：104)、15D7VH(SEQ ID NO：105)、16C4VH(SEQ ID NO：106)、14H5-YG(SEQ ID NO：107)、14H5-DG(SEQ ID NO：108)、14H5-LG(SEQ ID NO：109)、1A7VH、3C3VH、3E5VH、3D4VH、9G7VH(SEQ ID NO：191)、3B4VH(SEQ ID NO：236)、3F11VH或6C11VH(SEQ ID NO:192)的氨基酸序列的相同性为至少约10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或更高的VH。在某些实施方式中，本文所述抗-CD19抗体可包含与表1所列的任何VH结构域、VL结构域或CDR的氨基酸序列的相同性为至少约10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或更高的VH。

在另一实施方式中，改变的抗体可具有与HB12B-(3-72/JH4)(SEQ ID NO:34)、HB12A VH(SEQ ID NO:2)HB12B VH(SEQ ID NO:18)、7E12VH(SEQ ID NO:102)、14H5VH(SEQID NO:103)、15D1VH(SEQ ID NO:104)、15D7VH(SEQ ID NO:105)、16C4VH(SEQ ID NO:106)、14H5-YG(SEQ ID NO:107)、14H5-DG(SEQ ID NO:108)、14H5-LG(SEQ ID NO:109)、1A7VH、3C3VH、3E5VH、3D4VH、9G7VH(SEQ ID NO:191)、3B4VH(SEQ ID NO:236)、3F11VH或6C11VH(SEQ ID NO:192)的FW1、FW2、FW3或FW4区的氨基酸序列的相同性或相似性为至少25％、35％、45％、55％、65％、75％、80％、85％、90％或95％的氨基酸序列。在另一实施方式中，改变的抗体可具有与表1所列的任何VH或VL结构域的FW1、FW2、FW3或FW4区的氨基酸序列的相同性或相似性为至少25％、35％、45％、55％、65％、75％、80％、85％、90％或95％的氨基酸序列。

在另一实施方式中，改变的抗体可具有与本文所述抗CD-19抗体的轻链CDR1、CDR2或CDR3的氨基酸序列的相同性或相似性为至少25％、35％、45％、55％、65％、75％、80％、85％、90％或95％的氨基酸序列。在某些实施方式中，本发明抗-CD19抗体可包含与HB12AVK(SEQ ID NO：4)、HB12B VK(SEQ ID NO：20)、HB12B-(A10-Jk4)(SEQ ID NO：52)、HB12B-364987(或364987)(SEQ ID NO：62)、HB12B-3649(或3649)(SEQ ID NO：68)、HB12B-36(或36)(SEQ ID NO：70)、7E12VK(SEQ ID NO：110)、14H5(SEQ ID NO：111)、15D1(SEQ ID NO：112)、16C9(SEQ ID NO：113)、3C3VK(SEQ ID NO：193)、3E5VK(SEQ ID NO：194)、3D4VK(SEQID NO：195)、3F1VK(SEQ ID NO：196)、5B5VK(SEQ ID NO：197)、6F7VK(SEQ ID NO：198)、1C11VK(SEQ ID NO：199)、2B11VK(SEQ ID NO：200)、2D10VK(SEQ ID NO：201)、5C11VK(SEQID NO：202)、5D4VK(SEQ ID NO：203)、6C11VK(SEQ ID NO：204)、9G7VK(SEQ ID NO：205)、1H4VK(SEQ ID NO：206)或5C4VK(SEQ ID NO：207)的氨基酸序列的相同性为至少或约10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或更高的VL。

在另一实施方式中，改变的抗体可具有与HB12A VK(SEQ ID NO：4)、HB12B VK(SEQID NO：20)、HB12B-(A10-Jk4)(SEQ ID NO：52)、HB12B-364987(或364987)(SEQ ID NO：62)、HB12B-3649(或3649)(SEQ ID NO：68)、HB12B-36(或36)(SEQ ID NO：70)、7E12VK(SEQ IDNO：110)、14H5(SEQ ID NO：111)、15D1(SEQ ID NO：112)、16C9(SEQ ID NO：113)、3C3VK(SEQID NO：193)、3E5VK(SEQ ID NO：194)、3D4VK(SEQ ID NO：195)、3F1VK(SEQ ID NO：196)、5B5VK(SEQ ID NO：197)、6F7VK(SEQ ID NO：198)、1C11VK(SEQ ID NO：199)、2B11VK(SEQ IDNO：200)、2D10VK(SEQ ID NO：201)、5C11VK(SEQ ID NO：202)、5D4VK(SEQ ID NO：203)、6C11VK(SEQ ID NO：204)、9G7VK(SEQ ID NO：205)、1H4VK(SEQ ID NO：206)或5C4VK(SEQ IDNO：207)的FW1、FW2、FW3或FW4区的氨基酸序列的相同性或相似性为至少25％、35％、45％、55％、65％、75％、80％、85％、90％或95％的氨基酸序列。

序列的相同性或相似性在本文中的定义为：经过比对序列和引入缺口(如果必要)以最大程度提高序列相同性百分数)后，候选序列中与抗-CD19抗体残基相同(即相同残基)或相似(即侧链特性相同的同一组的氨基酸残基，见下)的氨基酸残基的百分数。可变区外抗体序列的N-末端、C-末端或内部的延伸、缺失或插入均不应被认为会影响序列相同性或相似性。

本领域已知的“％相同性”是通过比较序列确定的两种多核苷酸或两种多肽的关系的衡量。通常，比对待比较的两个序列，以得到序列之间的最大相关性。检测两个序列的比对，将两个测定序列之间氨基酸或核苷酸精确对应的位置数量除以比对总长度并乘以100，得到％相同性数值。可以在整个待比较序列长度上确定此种％相同性数值，这特别适合长度相同或非常相似且高度同源的序列，或者可以在较短的确定长度上确定此种％相同性数值，这更适合长度不同或或具有较低同源性的序列。

例如，可以用Unix平台下的软件clustalw比对序列，该软件产生以“.aln”为扩展名的文件，然后，可将此文件输入Bioedit程序(Hall，T.A.1999，BioEdit：用于Windows 95/98/NT的用户友好型生物序列比对编辑器和分析程序，Nucl.Acids.Symp.Ser.41:95-98)，该程序能打开.aln文件。在Bioedit窗口中，可选择单独的序列(一次两个)并进行比对。此种方法能够比较整个序列。

本领域熟知比较两个或多个序列的相同性的方法。因此，例如，可以获得威斯康星序列分析软件包9.1版中的程序(Devereux J.等，Nucleic Acids Res.，12:387-395，1984，可获自美国威斯康星州麦迪逊的遗传学计算机组(Genetics Computer Group，Madison，WI，USA))。可采用数学算法确定两个序列的相同性百分数。例如，可采用程序BESTFIT和GAP测定两个多核苷酸的％相同性和两个多肽序列的％相同性。BESTFIT使用Smith和Waterman的“局部同源性”算法(Advances in Applied Mathematics，2:482-489，1981)，发现两个序列之间相似性最高的单个区域。BESTFIT更适合比较长度不同的两个多核苷酸或两个多肽序列，该程序假定较短的序列代表较长序列的一部分。相比而言，GAP按照Neddleman和Wunsch的算法(J.Mol.Biol.，48:443-354，1970)比对两个序列，发现“最高相似性”。GAP更适合比较长度大致相同的序列，预计在整个长度上进行比对。优选地，各程序中所用的参数“缺口权重”和“长度权重”对多核苷酸而言分别是50和3，对多肽而言分别是12和4。优选地，测定当两个比较序列最优比对时的％相同性和相似性。

本领域也了解确定序列之间相同性和/或相似性的其它程序，例如BLAST程序系列(Karlin和Altschul，1990，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，87:2264-2268，如Karlin和Altschul，1993，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，90:5873-5877所述进行改进，可由美国马里兰州贝塞斯达的国家生物技术信息中心(NCB，Bethesda，MD，USA)获得，可以在NCBI的主页www.ncbi.nlm.nih.gov上找到)。这些程序是用于比较两个序列的数学算法的非限制性例子。将这类算法结合到Altschul等，1990，J.Mol.Biol.，215:403-410的NBLAST和XBLAST程序中。可以用NBLAST程序进行BLAST核苷酸搜索(评分＝100，字长＝12)，以获得与编码所有或一部分本发明抗CD19抗体的核酸分子同源的核苷酸序列。可利用XBLAST程序进行BLAST蛋白质搜索(评分＝50，字长＝3)，以获得与本发明蛋白质分子同源的氨基酸序列。为了进行缺口比对(出于比较目的)，可如Altschul等，1997，Nucleic Acids Res.，25:3389-3402所述利用缺口BLAST。也可利用PSI-Blast进行迭代搜索，其用来检测分子之间的远近关系(Id.)。利用BLAST、缺口BLAST和PSI-Blast程序时，可使用各程序(如XBLAST和NBLAST)的默认参数。参见http://www.ncbi.nlm.nih.gov。

本领域已知的确定序列间相同性和/或相似性的程序的另一非限制性例子是FASTA(Pearson W.R.和Lipman D.J.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，85:2444-2448，1988，可以作为威斯康星序列分析软件包的一部分获得)。优选地，将BLOSUM62氨基酸取代矩阵(Henikoff S.和Henikoff J.G.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，89:10915-10919，1992)用于多肽序列比较，包括在比较前先将核苷酸序列翻译成氨基酸序列。

本领域已知用于测定氨基酸序列的相同性和/或相似性的程序的另一个非限制性例子是SeqWeb软件(GCG威斯康星软件包：缺口程序中基于网页的界面)，该软件采用默认算法和参数设定：blosum 62，缺口权重8，长度权重2。

可利用与上述技术相似的允许或不允许出现缺口的技术确定两个序列的相同性百分数。在相同性百分数的计算中，一般对精确匹配进行计数。

优选用程序BESTFIT确定查询的多核苷酸或多肽序列与本发明多核苷酸或多肽序列的％相同性，查询序列和参比序列进行优化比对，程序参数设定为默认值。

为了产生改变的抗体，将一个或多个氨基酸改变(如取代)引入物种依赖性抗体的一个或多个高变区。也可将构架区残基的一个或多个改变(如取代)引入抗-CD19抗体，这导致抗体突变体与来自第二哺乳动物种类的抗原的结合亲合力提高。准备修饰的构架区残基的例子包括：非共价直接结合抗原的残基(Amit等，Science，233:747-753(1986))；作用于/影响CDR构型的残基(Chothia等，J.Mol.Biol.，196:901-917(1987))；和/或参与V_L-V_H界面(EP 239 400B1)的残基。在某些实施方式中，对一个或多个这类构架区残基的修饰导致抗体与来自第二哺乳动物物种的抗原的结合亲合力提高。例如，在本发明的这个实施方式中，可改变约1-5个构架区残基。有时，这可能足以产生适用于临床前试验的抗体突变体，即使没有改变高变区残基。然而，改变的抗体通常包含另外的高变区改变。

改变的高变区残基可以随机改变，特别是抗-CD19抗体与来自第二哺乳动物物种的抗原的初始结合亲合力使得能够容易地筛选这种随机产生的改变的抗体。

可用于产生这类改变抗体的一种方法被称为“丙氨酸扫描诱变”(Cunningham和Wells，Science，244:1081-1085(1989))。在本文中，一个或多个高变区残基被丙氨酸或聚丙氨酸残基取代，以影响氨基酸与来自第二哺乳动物物种的抗原的相互作用。随后，通过在取代位点上或为取代位点引入额外或其它突变，改良在功能上对该取代敏感的高变区残基。因此，虽然预先确定引入氨基酸序列变异的位点，但不需要预先确定突变本身的性质。如本文所述，筛选以此方式产生的Ala突变体的生物学活性。

产生这种改变抗体的另一种方法包括利用噬菌体展示的亲和力成熟(Hawkins等，J.Mol.Biol.，254:889-896(1992)和Lowman等，Biochemistry，30(45):10832-10837(1991))。简要说，突变几个高变区位点(如，6-7个位点)，以便在各位点上产生所有可能的氨基酸取代。如此产生的抗体突变体以单价方式由丝状噬菌体颗粒展示为包装在各颗粒内的M13基因III产物的融合物。然后，如本文所述筛选噬菌体展示突变体的生物学活性(如结合亲和力)。

抗体序列中的突变可包括氨基酸序列内部或相邻位置上氨基酸残基的取代、缺失(包括内部缺失)、加入(包括产生融合蛋白的加入)或保守取代，但它们产生的是“沉默”改变，因为这种改变产生功能等同的抗-CD19抗体。可根据所涉及残基的极性、电荷、溶解度、疏水性、亲水性和/或两亲特性的相似性，进行保守性氨基酸取代。例如，非极性(疏水性)氨基酸包括丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和甲硫氨酸；极性中性氨基酸包括甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺和谷胺酰胺；带正电(碱性)氨基酸包括精氨酸、赖氨酸和组氨酸；带负电(酸性)氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸。此外，甘氨酸和脯氨酸是可以影响链取向的残基。非保守取代指将一种类型的成员更换为另一种类型的成员。而且，如果需要，可以将非经典氨基酸或化学氨基酸类似物以取代或加入形式引入抗体序列。非经典氨基酸一般包括但不限于：普通氨基酸的D-异构体、α-氨基异丁酸、4-氨基丁酸、Abu、2-氨基丁酸、γ-Abu、ε-Ahx、6-氨基己酸、Aib、2-氨基异丁酸、3-氨基丙酸、鸟氨酸、正亮氨酸、正缬氨酸、羟基脯氨酸、肌氨酸、瓜氨酸、磺基丙氨酸、叔丁基甘氨酸、叔丁基丙氨酸、苯基甘氨酸、环己基丙氨酸、β-丙氨酸、氟代-氨基酸、设计氨基酸如β-甲基氨基酸、Cα-甲基氨基酸、Nα-甲基氨基酸和氨基酸类似物。

在另一实施方式中，选择修饰的位点是利用噬菌体文库经亲和力成熟的(见上)。

可利用本领域已知的诱变技术修饰DNA序列中的单个核苷酸，以便在抗体序列中产生氨基酸取代，或产生/消除限制性位点以利于进一步操作。这些技术包括但不限于：化学诱变，体外定位诱变(Kunkel，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，82:488(1985)；Hutchinson，C.等，J.Biol.Chem.，253:6551(1978))，寡核苷酸定向诱变(Smith，Ann.Rev.Genet.，19:423-463(1985)；Hill等，Methods Enzymol.，155:558-568(1987))，基于PCR的重叠延伸(Ho等，Gene，77:51-59(1989))，基于PCR的兆引物(megaprimer)诱变(Sarkar等，Biotechniques，8:404-407(1990))等。可通过双链双脱氧DNA测序验证修饰。

在本发明的某些实施方式中，可修饰抗-CD19抗体以产生融合蛋白；即与异源蛋白质、多肽或肽融合的抗体或其片段。在某些实施方式中，与抗CD19抗体的一部分融合的蛋白质是抗体-导向的酶前药治疗(ADEPT)的酶组分。可工程改造为与抗CD19抗体的融合蛋白形式的其它蛋白质或多肽的例子包括但不限于：毒素如蓖麻毒蛋白、相思豆毒蛋白、核糖核酸酶、DNA酶I、葡萄球菌肠毒素-A、美洲商陆抗-病毒蛋白、白树毒素、白喉毒素、假单胞菌外毒素和假单胞菌内毒素。参见例如，Pastan等，Cell，47:641(1986)，Goldenberg等，CancerJournal for Clinicians，44:43(1994)。可以使用的酶活性毒素及其片段包括白喉A链、白喉毒素的非结合活性片段、外毒素A链(来自绿脓假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa))、蓖麻毒蛋白A链、相思豆毒蛋白A链、蒴莲根毒素A链、α-帚曲菌素、油桐(Aleurites fordii)蛋白、石竹素蛋白、美洲商陆(Phytolaca americana)蛋白(PAPI、PAPII和PAP-S)、苦瓜(Momordica charantia)抑制剂、麻疯树毒蛋白、巴豆毒蛋白、肥皂草(Sapaonariaofficinalis)抑制剂、白树毒素、迈托毒素(mitogellin)、局限曲菌素、酚霉素、依诺霉素和单端孢霉烯族毒素(tricothecenes)。参见例如，1993年10月28日公开的WO 93/21232。

可通过基因改组、基序改组、外显子改组和/或密码子改组(总称为“DNA改组”)的技术产生其它融合蛋白。可利用DNA改组改变抗CD19抗体或其片段的活性(如具有较高亲合力和较低解离速率的抗体或其片段)。通常参见美国专利5,605,793；5,811,238；5,830,721；5,834,252；和5,837,458和Patten等，1997，Curr.Opinion Biotechnol.，8:724-33；Harayama，1998，Trends Biotechnol.16(2):76-82；Hansson等，1999，J.Mol.Biol.，287:265-76；和Lorenzo和Blasco，1998，Biotechniques 24(2):308-313(这些专利和发表物各自通过引用纳入本文)。该抗体还可以是结合域免疫球蛋白融合蛋白，如Ledbetter等在美国公开号20030118592、美国公开号200330133939和PCT公开WO 02/056910中所述，它们通过引用全文纳入本文。

5.6.域抗体

本发明组合物和方法的抗-CD19抗体可以是域抗体，如含有抗体的小功能结合单元、对应于人抗体的重链(V_H)或轻链(V_L)可变区的抗体。域抗体的例子包括但不限于：获自多玛提斯有限公司(Domantis Limited)(英国剑桥(Cambridge，UK))和多玛提斯公司(Domantis Inc)(美国马萨诸塞州剑桥(Cambridge，MA，USA))的治疗靶点特异性抗体(参见例如，WO04/058821；WO04/003019；美国专利6,291,158；6,582,915；6,696,245；和6,593,081)。可利用市售的域抗体文库鉴定抗-CD19域抗体。在某些实施方式中，抗-CD19抗体包含CD19功能结合单位和Fcγ受体功能结合单位。

在一个实施方式中，抗-CD19域抗体可包含HB12A或HB12B单克隆抗体重链或轻链的CDR中的任何一个或任意组合。

在另一实施方式中，抗-CD19域抗体可包含HB12A或HB12B VH的CDR3以及HB12A或HB12B单克隆抗体的重链或轻链可变区组成的任何CDR组合。抗-CD19域抗体也可包含HB12A或HB12B VK的CDR3以及HB12A或HB12B单克隆抗体的重链或轻链可变区组成的任何CDR组合。

在又一实施方式中，抗-CD19域抗体可包含HB12A或HB12B VH的CDR3。抗-CD19域抗体也可包含HB12A或HB12B VK的CDR3。

5.7.双抗体

在本发明的某些实施方式中，抗-CD19抗体是“双抗体”。术语“双抗体”指具有两个抗原-结合位点的小抗体片段，该片段包含在同一多肽链中相互连接的重链可变区(V_H)和轻链可变区(V_L)(V_H-V_L)。使用长度过短以至于无法在同一条链的两个结构域之间形成配对的接头时，该结构域与另一条链的互补结构域配对，产生两个抗原-结合位点。有关双抗体的更详细说明参见例如，EP 404,097；WO 93/11161；和Hollinger等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，90:6444-6448(1993)。

5.8.疫苗抗体

在本发明的某些实施方式中，抗-CD19抗体是疫苗抗体。疫苗抗体是二聚体多肽。免疫抗体的各个单体由通过绞链区和Cγ3结构域与第二scFv连接的对APC上的表面分子有特异性的scFv组成。在本发明的其它实施方式中，可利用含有作为scFv之一的抗-CD19抗体片段的疫苗抗体，将被破坏的B细胞和介导ADCC的效应细胞并列安置。参见例如Bogen等，美国专利申请公开号20040253238。

5.9.线性抗体

在本发明的某些实施方式中，抗-CD19抗体是线性抗体。线性抗体包含一对串联Fd区段(V_H-C_H1-V_H-C_H1)，其形成一对抗原结合区。线性抗体可以是双特异性或单特异性。参见Zapata等，Protein Eng.，8(10):1057-1062(1995)。

5.10.亲本抗体+

在本发明的某些实施方式中，抗-CD19抗体是亲本抗体。“亲本抗体”是与本文所述的改变/突变的抗体相比，其一个或多个高变区中或其附近的一个或多个氨基酸残基可能发生缺失或缺陷的氨基酸序列的抗体。因此，亲本抗体的高变区可能比本文所述抗体突变体的相应高变区要短。亲本多肽可包含天然抗体序列(即天然产生的，包括天然产生的等位基因变体)或预先存在天然产生序列的氨基酸序列修饰(如其它插入、缺失和/或取代)的抗体序列。亲本抗体可以是人源化抗体或人抗体。

5.11.抗体片段

“抗体片段”是全长抗体的一部分，通常是其抗原结合区或可变区。抗体片段的例子包括Fab、Fab'、F(ab')₂和Fv片段；双抗体；线性抗体；单链抗体分子；和抗体片段形成的多特异性抗体。

传统上，这些片段是通过蛋白酶水解消化完整抗体产生的(参见例如，Morimoto等，Journal of Biochemical and Biophysical Methods，24:107-117(1992)和Brennan等，Science，229:81(1985))。然而，现在这些片段可以通过重组宿主细胞直接产生。例如，可以由上述抗体噬菌体文库分离抗体片段。Fab'-SH片段也可由大肠杆菌直接回收，并经化学偶联形成F(ab')₂片段(Carter等，Bio/Technology，10:163-167(1992))。按照另一种方法，F(ab')₂片段可由重组宿主细胞培养物直接分离。本领域技术人员明白产生抗体片段的其它技术。在其它实施方式中，所选抗体是单链Fv片段(scFv)。参见例如，WO 93/16185。在某些实施方式中，抗体不是Fab片段。

5.12.双特异性抗体

双特异性抗体是对至少两种不同表位具有结合特异性的抗体。示范性双特异性抗体可结合于B细胞表面标记的两种不同表位。其它这类抗体可结合第一种B细胞标记，进一步结合第二种B细胞表面标记。抗B细胞标记结合臂也可与结合白细胞上的引发分子如T细胞受体分子(如CD2或CD3)或IgG的Fc受体(FcγR)的臂联合，以便将细胞防御机制集中于B细胞。也可利用双特异性抗体将细胞毒剂定位于B细胞。这些抗体具有B细胞标记结合臂和结合细胞毒剂(如皂草毒蛋白、抗-干扰素-α、长春花生物碱、蓖麻毒蛋白A链、甲氨蝶呤(metholaexate)或放射性同位素半抗原)的臂。可以全长抗体或抗体片段的形式制备双特异性抗体(如，F(ab'):双特异性抗体)。

制备双特异性抗体的方法是本领域已知的。(参见例如Millstein等，Nature，305:537-539(1983)；Traunecker等，EMBO J.，10:3655-3659(1991)；Suresh等，Methods inEnzymology，121:210(1986)；Kostelny等，J.Immunol.，148(5):1547-1553(1992)；Hollinger等，Proc.Natl Acad.Sci.USA，90:6444-6448(1993)；Gruber等，J.Immunol.，152:5368(1994)；美国专利4,474,893；4,714,681；4,925,648；5,573,920；5,601,81；95,731,168；4,676,980；和4,676,980，WO 94/04690；WO 91/00360；WO 92/200373；WO 93/17715；WO 92/08802；以及EP 03089)。

在一个实施方式中，当本发明组合物和方法的抗-CD19抗体为双特异性抗体时，该抗-CD19抗体可以是人或人源化抗体，并可具有对人CD19和T细胞上表位的特异性，或者能够结合人效应细胞，如单核细胞/巨噬细胞和/或天然杀伤细胞，以实现细胞死亡。

在一个实施方式中，本发明的抗-CD19抗体是能够特异性结合第一种和第二种抗原的双特异性抗体，其中所述第一种抗原是人CD19，所述第二种抗原是选自下组的Fcγ受体：FcγRI、FcγRIIA、FcγRIIB、FcγRIIIA和/或FcγRIV。在另一实施方式中，本发明抗-CD19抗体是能够特异性结合人CD19和FcγRIIB的双特异性抗体。在另一实施方式中，本发明抗-CD19抗体是能够特异性结合人CD19和人FcγRIIB的双特异性抗体。

5.13变异Fc区

本发明提供了含有变异Fc区的蛋白质的制剂。就是说，非天然产生的Fc区，如含有一个或多个非天然氨基酸残基的Fc区。本发明变异Fc区也包括具有氨基酸缺失、加入和/或修饰的Fc区。

应理解，本文所用的Fc区包括含有除第一恒定区免疫球蛋白结构域之外的抗体恒定区的多肽。因此，Fc指IgA、IgD和IgG的后两个恒定区免疫球蛋白结构域，IgE和IgM的后三个恒定区免疫球蛋白结构域，以及这些结构域N末端的弹性绞链区。对IgA和IgM而言，Fc可包括J链。就IgG而言，Fc包括免疫球蛋白结构域Cγ2和Cγ3以及Cγ1和Cγ2之间的绞链区。虽然Fc区的边界可变，但人IgG重链Fc区通常被定义为羧基端包括残基C226或P230，其中编号是按照Kabat等所述的EU索引进行的。(1991，NIH出版物91-3242，弗吉尼亚州斯普林菲尔德的国家技术信息服务中心(National Technical Information Service，Springfield，VA))。“Kabat所述的EU索引”指Kabat等，同上所述的人IgG1EU抗体的残基编号。Fc可单独指这个区域，或抗体、抗体片段或Fc融合蛋白中的这个区域。Fc变异蛋白可以是抗体、Fc融合物或包含Fc区的任何蛋白质或蛋白质结构域，包括但不限于：含有变异Fc区，即Fc的非天然变体的蛋白质。注：在许多Fc位置上观察到多态性，这些位置包括但不限于Kabat 270、272、312、315、356和358，因此所述序列和现有技术的序列之间可能存在略微差异。

本发明包括相对于比较分子(如除含有野生型Fc区域外其它氨基酸序列相同的蛋白质)对Fc配体(如Fc受体，C1q)的结合特性改变的Fc变异蛋白。结合特性的例子包括但不限于：结合特异性、平衡解离常数(K_D)、解离和结合速率(分别是K_解离和K_结合)、结合亲和力和/或亲合力。通常应理解，具有低K_D的结合分子(例如Fc变异蛋白，如抗体)可能比具有高K_D的结合分子更优选。然而，在一些情况下，K_解离和K_结合值可能比K_D值更相关。本领域技术人员可确定对给定抗体应用而言哪一个动力学参数最重要。

可通过本领域已知用于测定Fc-FcγR相互作用，即Fc区与FcγR的特异性结合的各种体外测定法(生化或免疫测定法)确定Fc区与其配体的亲和力和结合特性，这些方法包括但不限于：平衡法(如酶联免疫吸附实验(ELISA)；或放射性免疫实验(RIA))或动力学方法(如分析)，以及其它方法，如直接结合实验、竞争性抑制实验、荧光共振能量转移(FRET)、凝胶电泳和色谱法(如凝胶过滤)。这些和其它方法可利用所检测的一种或多种组分上的标记和/或利用各种检测方法，包括但不限于显色、荧光、发光或同位素标记。有关结合亲和力和动力学的详细描述可参见Paul，W.E.编，Fundamental Immunology(基础免疫学)，第4版，Lippincott-Raven，费城(1999)，其关注于抗体-免疫原相互作用。

在一个实施方式中，相对于比较分子，Fc变异蛋白对一种或多种Fc配体的结合增强。在另一实施方式中，Fc变异蛋白与Fc配体的亲和力是比较分子的至少2倍、至少3倍、至少5倍、至少7倍、至少10倍、至少20倍、至少30倍、至少40倍、至少50倍、至少60倍、至少70倍、至少80倍、至少90倍、至少100倍或至少200倍。在一个具体实施方式中，Fc变异蛋白与Fc受体的结合增强。在另一具体实施方式中，Fc变异蛋白与Fc受体FcγRIIIA的结合增强。在另一具体实施方式中，Fc变异蛋白与Fc受体FcγRIIB的结合增强。在另一具体实施方式中，Fc变异蛋白与Fc受体FcRn的结合增强。在另一具体实施方式中，与比较分子相比，Fc变异蛋白与C1q的结合增强。

在一个实施方式中，本发明抗-CD19抗体包含变异Fc区，其中与比较的非变异Fc区相比，所述变异Fc区与Fcγ受体IIB的结合亲和力增强。在另一实施方式中，本发明抗-CD19抗体包含变异Fc区，其中所述变异Fc区与Fcγ受体IIB的亲和力是比较非变异Fc区的至少2倍、至少3倍、至少5倍、至少7倍、至少10倍、至少20倍、至少30倍、至少40倍、至少50倍、至少60倍、至少70倍、至少80倍、至少90倍、至少100倍或至少200倍。

可通过提高Fc区与FcRn的结合亲和力来延长含有Fc区的蛋白质的血清半衰期。在一个实施方式中，与比较分子相比，Fc变异蛋白的血清半衰期延长。

“抗体依赖性细胞介导的细胞毒性”或“ADCC”指分泌的Ig与某些细胞毒细胞(如天然杀伤(NK)细胞、中性粒细胞和巨噬细胞)上的Fc受体(FcR)结合，使得这些细胞毒效应物细胞特异性结合于携带抗原的靶细胞，随后用细胞毒素杀死该靶细胞的细胞毒形式。靶向靶细胞表面的特异性高亲和力IgG抗体将细胞毒细胞“武装”起来，是进行这种杀伤作用绝对需要的。靶细胞裂解是细胞内过程，需要直接的细胞间接触，并且不涉及补体。认为除抗体外，能够特异性结合携带抗原的靶细胞的含有Fc区的其它蛋白，特别是Fc融合蛋白也能够实施细胞介导的细胞毒作用。简要说，因Fc融合蛋白的活性所致的细胞介导的细胞毒作用在本文中称为ADCC活性。

可测得任何具体Fc变异蛋白通过ADCC介导靶细胞裂解的能力。为了评价ADCC活性，将感兴趣的Fc变异蛋白和免疫效应物细胞一起加到靶细胞中，通过抗原抗体复合物可激活该效应物细胞，进而导致该靶细胞裂解。通常通过裂解细胞释放的标记(如放射性底物、荧光染料或天然的细胞内蛋白质)来检测细胞裂解。可用于这类测得的效应细胞包括外周血单核细胞(PBMC)和天然杀伤(NK)细胞。体外ADCC试验的具体例子参见Wisecarver等，1985 79：277-282；Bruggemann等，1987，J Exp Med 166:1351-1361；Wilkinson等，2001，JImmunol Methods 258:183-191；Patel等，1995J Immunol Methods 184:29-38。也可在体内评价感兴趣的Fc变异蛋白的ADCC活性，例如在如Clynes等，1998，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95:652-656所述的动物模型中进行评价。

在一个实施方式中，与比较分子相比，Fc变异蛋白的ADCC活性增强。在一个具体实施方式中，Fc变异蛋白的ADCC活性是比较分子的至少2倍、至少3倍、至少5倍、至少10倍、至少50倍或至少100倍。在另一具体实施方式中，与比较分子相比，Fc变异蛋白与Fc受体FcγRIIIA的结合水平提高且ADCC活性增强。在其它实施方式中，与比较分子相比，Fc变异蛋白的ADCC活性提高、血清半衰期延长。

在一个实施方式中，与比较分子相比，Fc变异蛋白的ADCC活性降低。在一个具体实施方式中，Fc变异蛋白的ADCC活性是比较分子的至多1/2、至多1/3、至多1/5、至多1/10、至多1/50或至多1/100。在另一具体实施方式中，与比较分子相比，Fc变异蛋白与Fc受体FcγRIIIA的结合水平降低且ADCC活性降低。在其它实施方式中，与比较分子相比，Fc变异蛋白的ADCC活性降低、血清半衰期延长。

“补体依赖性细胞毒性”和“CDC”指在补体存在下裂解靶细胞。通过补体系统第一组分(C1q)与复合关联抗原的分子(例如抗体)结合，启动补体激活途径。为了评估补体激活，可进行CDC测定，如Gazzano-Santoro等，1996，J.Immunol.Methods，202:163所述。在一个实施方式中，与比较分子相比，Fc变异蛋白的CDC活性增强。在一个具体实施方式中，Fc变异蛋白的CDC活性是比较分子的至少2倍、至少3倍、至少5倍、至少10倍、至少50倍或至少100倍。在其它实施方式中，与比较分子相比，Fc变异蛋白的CDC活性提高、血清半衰期延长。

在一个实施方式中，相对于比较分子，Fc变异蛋白对一种或多种Fc配体的结合水平降低。在另一实施方式中，Fc变体蛋白与Fc配体的亲和力是比较分子的至多1/2、至多1/3、至多1/5、至多1/7、至多1/10、至多1/20、至多1/30、至多1/40、至多1/50、至多1/60、至多1/70、至多1/80、至多1/90、至多1/100或至多1/200。在一个具体实施方式中，Fc变体蛋白与Fc受体的结合水平降低。在另一具体实施方式中，Fc变体蛋白与Fc受体FcγRIIIA的结合水平降低。在一个具体实施方式中，本文所述的Fc变体与Fc受体FcγRIIIA的亲和力是比较分子的至多约1/5，其中所述Fc变体与Fc受体FcγRIIB的亲和力是比较分子亲和力的约2倍以下。在另一具体实施方式中，Fc变体蛋白与Fc受体FcRn的结合水平降低。在另一具体实施方式中，与比较分子相比，Fc变异蛋白与C1q的结合水平降低。

在一个实施方式中，本发明提供Fc变体，其中Fc区在一个或多个选自下组的位置上包含非天然产生的氨基酸残基：234、235、236、237、238、239、240、241、243、244、245、247、251、252、254、255、256、262、263、264、265、266、267、268、269、279、280、284、292、296、297、298、299、305、313、316、325、326、327、328、329、330、331、332、333、334、339、341、343、370、373、378、392、416、419、421、440和443，它们是按照Kabat所述EU索引编号的。任选地，Fc区可在本领域技术人员已知的其它和/或另选的位置上包含非天然产生的氨基酸残基(参见例如，美国专利5,624,821；6,277,375；6,737,056；PCT专利公开WO 01/58957；WO 02/06919；WO 04/016750；WO 04/029207；WO 04/035752；WO 04/074455；WO 04/099249；WO 04/063351；WO 05/070963；WO 05/040217；WO 05/092925和WO 06/020114)。

在一个实施方式中，本发明提供制剂，其中Fc区在一个或多个选自下组的位置上包含非天然产生的氨基酸残基：234、235、236、237、238、239、240、241、243、244、245、247、251、252、254、255、256、262、263、264、265、266、267、268、269、279、280、284、292、296、297、298、299、305、313、316、325、326、327、328、329、330、331、332、333、334、339、341、343、370、373、378、392、416、419、421、440和443，它们是按照Kabat述EU索引编号的。任选地，Fc区可在本领域技术人员已知的其它和/或另选的位置上包含非天然产生的氨基酸残基(参见例如，美国专利5,624,821；6,277,375；6,737,056；PCT专利公开WO 01/58957；WO 02/06919；WO 04/016750；WO 04/029207；WO 04/035752；WO 04/074455；WO 04/099249；WO 04/063351；WO 05/070963；WO 05/040217；WO 05/092925和WO 06/020114)。

在一个具体实施方式中，本发明提供Fc变体，其中Fc区包含至少一个选自下组的非天然产生的氨基酸残基：234D、234E、234N、234Q、234T、234H、234Y、234I、234V、234F、235A、235D、235R、235W、235P、235S、235N、235Q、235T、235H、235Y、235I、235V、235F、236E、239D、239E、239N、239Q、239F、239T、239H、239Y、240I、240A、240T、240M、241W、241L、241Y、241E、241R.243W、243L243Y、243R、243Q、244H、245A、247L、247V、247G、251F、252Y、254T、255L、256E、256M、262I、262A、262T、262E、263I、263A、263T、263M、264L、264I、264W、264T、264R、264F、264M、264Y、264E、265G、265N、265Q、265Y、265F、265V、265I、265L、265H、265T、266I、266A、266T、266M、267Q、267L、268E、269H、269Y、269F、269R、270E、280A、284M、292P、292L、296E、296Q、296D、296N、296S、296T、296L、296I、296H、269G、297S、297D、297E、298H、298I、298T、298F、299I、299L、299A、299S、299V、299H、299F、299E、305I、313F、316D、325Q、325L、325I、325D、325E、325A、325T、325V、325H、327G、327W、327N、327L、328S、328M、328D、328E、328N、328Q、328F、328I、328V、328T、328H、328A、329F、329H、329Q、330K、330G、330T、330C、330L、330Y、330V、330I、330F、330R、330H、331G、331A、331L、331M、331F、331W、331K、331Q、331E、331S、331V、331I、331C、331Y、331H、331R、331N、331D、331T、332D、332S、332W、332F、332E、332N、332Q、332T、332H、332Y、332A、339T、370E、370N、378D、392T、396L、416G、419H、421K、440Y和434W，它们是按照Kabat所述EU索引编号的。任选地，Fc区可包含本领域技术人员已知的其它和/或另选的非天然产生的氨基酸残基(参见例如，美国专利5,624,821；6,277,375；6,737,056；PCT专利公开WO 01/58957；WO 02/06919；WO 04/016750；WO04/029207；WO 04/035752和WO 05/040217)。

在一个具体实施方式中，本发明提供Fc变异蛋白制剂，其中Fc区包含至少一个选自下组的非天然产生的氨基酸残基：234D、234E、234N、234Q、234T、234H、234Y、234I、234V、234F、235A、235D、235R、235W、235P、235S、235N、235Q、235T、235H、235Y、235I、235V、235F、236E、239D、239E、239N、239Q、239F、239T、239H、239Y、240I、240A、240T、240M、241W、241L、241Y、241E、241R.243W、243L243Y、243R、243Q、244H、245A、247L、247V、247G、251F、252Y、254T、255L、256E、256M、262I、262A、262T、262E、263I、263A、263T、263M、264L、264I、264W、264T、264R、264F、264M、264Y、264E、265G、265N、265Q、265Y、265F、265V、265I、265L、265H、265T、266I、266A、266T、266M、267Q、267L、268E、269H、269Y、269F、269R、270E、280A、284M、292P、292L、296E、296Q、296D、296N、296S、296T、296L、296I、296H、269G、297S、297D、297E、298H、298I、298T、298F、299I、299L、299A、299S、299V、299H、299F、299E、305I、313F、316D、325Q、325L、325I、325D、325E、325A、325T、325V、325H、327G、327W、327N、327L、328S、328M、328D、328E、328N、328Q、328F、328I、328V、328T、328H、328A、329F、329H、329Q、330K、330G、330T、330C、330L、330Y、330V、330I、330F、330R、330H、331G、331A、331L、331M、331F、331W、331K、331Q、331E、331S、331V、331I、331C、331Y、331H、331R、331N、331D、331T、332D、332S、332W、332F、332E、332N、332Q、332T、332H、332Y、332A、339T、370E、370N、378D、392T、396L、416G、419H、421K、440Y和434W，它们是按照Kabat所述EU索引编号的。任选地，Fc区可包含本领域技术人员已知的其它和/或另选的非天然产生的氨基酸残基(参见例如，美国专利5,624,821；6,277,375；6,737,056；PCT专利公开WO 01/58957；WO 02/06919；WO 04/016750；WO 04/029207；WO 04/035752和WO 05/040217)。

在另一实施方式中，本发明提供Fc变体，其中所述Fc区在选自239、330或332的一个或多个位置上包含至少一个非天然产生的氨基酸，它们是按照Kabat所述EU索引编号的。在一个具体实施方式中，本发明提供Fc变体，其中Fc区包含至少一个选自239D、330L或332E的非天然产生的氨基酸，它们是按照Kabat所述EU索引编号的。任选地，所述Fc区在选自252、254或256的一个或多个位置上还可包含其它非天然产生的氨基酸，它们是按照Kabat所述EU索引编号的。在一个具体实施方式中，本发明提供Fc变体，其中Fc区包含至少一个选自239D、330L或332E(按照Kabat所述EU索引编号)的非天然产生的氨基酸，并且在选自252Y、254T或256E(按照Kabat所述EU索引编号)的一个或多个位置上包含至少一个非天然产生的氨基酸。

在另一实施方式中，本发明提供Fc变体，其中所述Fc区在选自234、235或331的一个或多个位置上包含至少一个非天然产生的氨基酸，它们是按照Kabat所述EU索引编号的。在一个具体实施方式中，本发明提供Fc变体，其中Fc区包含至少一个选自234F、235F、235Y或331S的非天然产生的氨基酸，它们是按照Kabat所述EU索引编号的。在另一个具体实施方式中，本发明Fc变体包含234F、235F和331S非天然产生的氨基酸残基，它们是按照Kabat所述EU索引编号的。在另一个具体实施方式中，本发明Fc变体包含234F、235Y和331S非天然产生的氨基酸残基，它们是按照Kabat所述EU索引编号的。任选地，所述Fc区在选自252、254或256的一个或多个位置上还可包含其它非天然产生的氨基酸，它们是按照Kabat所述EU索引编号的。在一个具体实施方式中，本发明提供Fc变体，其中Fc区包含至少一个选自234F、235F、235Y或331S(按照Kabat所述EU索引编号)的非天然产生的氨基酸，并且在选自252Y、254T或256E(按照Kabat所述EU索引编号)的一个或多个位置上包含至少一个非天然产生的氨基酸。

在另一实施方式中，本发明提供Fc变异蛋白制剂，其中所述Fc区在选自239、330或332的一个或多个位置上包含至少一个非天然产生的氨基酸，它们是按照Kabat所述EU索引编号的。在一个具体实施方式中，本发明提供Fc变异蛋白制剂，其中Fc区包含至少一个选自239D、330L或332E的非天然产生的氨基酸，它们是按照Kabat所述EU索引编号的。所述Fc区在选自252、254或256的一个或多个位置上还可包含其它非天然产生的氨基酸，它们是按照Kabat所述EU索引编号的。在一个具体实施方式中，本发明提供Fc变异蛋白制剂，其中Fc区包含至少一个选自239D、330L或332E(按照Kabat所述EU索引编号)的非天然产生的氨基酸，并且在选自252Y、254T或256E(按照Kabat所述EU索引编号)的一个或多个位置上包含至少一个非天然产生的氨基酸。

在另一实施方式中，本发明提供Fc变异蛋白制剂，其中所述Fc区在选自234、235或331的一个或多个位置上包含至少一个非天然产生的氨基酸，它们是按照Kabat所述EU索引编号的。在一个具体实施方式中，本发明提供Fc变异蛋白制剂，其中Fc区包含至少一个选自234F、235F、235Y或331S的非天然产生的氨基酸，它们是按照Kabat所述EU索引编号的。任选地，所述Fc区在选自252、254或256的一个或多个位置上还可包含其它非天然产生的氨基酸，它们是按照Kabat所述EU索引编号的。在一个具体实施方式中，本发明提供Fc变异蛋白制剂，其中Fc区包含至少一个选自234F、235F、235Y或331S(按照Kabat所述EU索引编号)的非天然产生的氨基酸，并且在选自252Y、254T或256E(按照Kabat所述EU索引编号)的一个或多个位置上包含至少一个非天然产生的氨基酸。

在一个实施方式中，本发明Fc变体可与其它已知Fc变体组合，例如以下文献中所述的Fc变体：Ghetie等，1997，Nat Biotech.15:637-40；Duncan等，1988，Nature 332:563-564；Lund等，1991，J.Immunol 147:2657-2662；Lund等，1992，Mol Immunol 29:53-59；Alegre等，1994，Transplantation 57:1537-1543；Hutchins等，1995，Proc Natl.Acad SciU S A 92:11980-11984；Jefferis等，1995，Immunol Lett.44:111-117；Lund等，1995，Faseb J 9:115-119；Jefferis等，1996，Immunol Lett 54:101-104；Lund等，1996，JImmunol 157:4963-4969；Armour等，1999，Eur J Immunol 29:2613-2624；Idusogie等，2000，J Immunol 164:4178-4184；Reddy等，2000，JImmunol 164:1925-1933；Xu等，2000，Cell Immunol 200:16-26；Idusogie等，2001，J Immunol 166:2571-2575；Shields等，2001，J Biol Chem 276:6591-6604；Jefferis等，2002，Immunol Lett 82:57-65；Presta等，2002，Biochem Soc Trans 30:487-490)；美国专利5,624,821；5,885,573；5,677,425；6,165,745；6,277,375；5,869,046；6,121,022；5,624,821；5,648,260；6,528,624；6,194,551；6,737,056；6,821,505；6,277,375；美国专利公开2004/0002587和PCT公开WO 94/29351；WO 99/58572；WO 00/42072；WO 02/060919；WO 04/029207；WO 04/099249；WO 04/063351。本发明也包括含有缺失、加入和/或修饰的Fc区。本领域技术人员可以明显看出还可对Fc区进行其它修饰/取代/加入/缺失。

产生非天然产生的Fc区的方法是本领域众所周知的。例如，可通过诱变法产生氨基酸取代和/或缺失，诱变法包括但不限于：定位诱变(Kunkel，Proc.Natl.Acad.Sci.USA82:488-492(1985))、PCR诱变(Higuchi，刊于"PCR Protocols:A Guide to Methods andApplications"(《PCR实验方案：方法和应用指南》)，Academic Press(学术出版社)，圣地亚哥，第177-183页(1990))和盒式诱变(Wells等，Gene 34:315-323(1985))。优选地，通过重叠延伸PCR方法进行定位诱变(Higuchi，刊于"PCR Technology:Principles andApplications for DNA Amplification”(《PCR技术：用于DNA扩增的原理和应用》)，纽约斯托克顿出版社(Stockton Press，New York)，第61-70页(1989))。可利用重叠衍生PCR的技术(Higuchi，同上)，将任何所需突变引入靶序列(初始DNA)。或者，重叠延伸法中的第一轮PCR包括用外部引物(引物1)和内部诱变引物(引物3)扩增靶序列，分别用第二种外部引物(引物4)和内部引物(引物2)扩增，产生两种PCR节段(节段A和B)。设计内部诱变引物(引物3)，以使靶序列含有指向所需突变的错配。在第二轮PCR中，用两种外部引物(引物1和4)借助PCR扩增第一轮PCR的产物(节段A和B)。用限制性酶消化得到的全长PCR节段(节段C)，将得到的限制性片段克隆入合适载体中。诱变的第一个步骤是，将初始DNA(如编码Fc融合蛋白、抗体或Fc区的DNA)操作性克隆到诱变载体中。设计引物，以反应所需的氨基酸取代。本领域已知用于产生变异Fc区的其它方法(参见例如，美国专利5,624,821；5,885,573；5,677,425；6,165,745；6,277,375；5,869,046；6,121,022；5,624,821；5,648,260；6,528,624；6,194,551；6,737,056；6,821,505；6,277,375；美国专利公开号2004/0002587和PCT公开WO 94/29351；WO 99/58572；WO 00/42072；WO 02/060919；WO 04/029207；WO 04/099249；WO 04/063351)。

在一些实施方式中，Fc变异蛋白包含一种或多种工程改造的糖形，即共价连接于含有Fc区的分子的糖组分。工程改造的糖形可用于各种目的，包括但不限于提高或降低效应功能。工程改造的糖形可通过本领域技术人员已知的任何方法产生，例如，采用工程改造或变异的表达株，与一种或多种酶如DI N-胰腺葡糖胺基转移酶III(GnTI11)共同表达，在各种生物体或来自各种生物体的细胞系中表达含有Fc区的分子，或者在含有Fc区的分子表达后修饰糖。本领域已知产生工程改造的糖形的方法，包括但不限于Umana等，1999，Nat.Biotechnol 17:176-180；Davies等，20017Biotechnol Bioeng 74:288-294；Shields等，2002，J Biol Chem 277:26733-26740；Shinkawa等，2003，J Biol Chem 278:3466-3473；美国专利号6,602,684；美国序列号10/277,370；美国序列号10/113,929；PCT WO 00/61739A1；PCT WO 01/292246A1；PCT WO 02/311140A1；PCT WO 02/30954A1所述的方法；Potillegent^TM技术(新泽西州普林斯顿的波娃公司(Biowa，Inc.Princeton，N.J.))；GlycoMAb^TM糖基化工程技术(瑞士苏黎世的GLYCART生物技术公司(GLYCART biotechnologyAG，Zurich，Switzerland))。参见例如WO 00061739；EA01229125；US 20030115614；Okazaki等，2004，JMB，336:1239-49。

考虑到，本文所述Fc变体可来自本领域所述的任何抗体，或者可将本文所述的变异Fc区引入本领域所述的任何抗体中，这些抗体包括但不限于：抗-荧光素单克隆抗体4-4-20(Kranz等，1982J.Biol.Chem.257(12):6987-6995)，人源化抗-TAG72抗体(CC49)(Sha等，1994Cancer Biother.341-9)，特异性结合Eph受体的抗体，包括但不限于PCT公开WO 04/014292、WO 03/094859和美国专利申请序列号10/863,729所述的抗体，特异性结合整联蛋白αVβ3的抗体，包括但不限于LM609(Scripps)，鼠单克隆抗体LM609(PCT公开WO 89/015155和美国专利号5,753,230)；人源化单克隆抗体MEDI-522(也称为维他辛米迪缪尼公司(MedImmune，Inc.)，马里兰州盖瑟斯堡(Gaithersburg，MD)；Wu等，1998，PNAS USA95(11)：6037-6042；PCT公开WO 90/33919和WO 00/78815)，如WO/2005/05059106所述的干扰素α的抗体，如WO/2006/059106所述的干扰素受体1的抗体，艾比特斯(Erbitux^TM)(也称为IMC-C225)(因克隆系统公司(ImClone Systems Inc.))，EGFR的嵌合单克隆抗体；(曲妥珠单抗)(加州基因泰克公司(Genentech，CA))，它是用于治疗转移性乳腺癌患者的人源化抗-HER2单克隆抗体；(阿昔单抗)(森托克公司(Centocor))，它是用于预防形成血凝块的血小板上的抗糖蛋白IIb/IIIa受体；(达珠单抗)(瑞士的罗氏制药(Roche Pharmaceuticals，Switzerland))，它是用于预防急性肾脏同种异体移植排斥的免疫抑制性人源化抗-CD25单克隆抗体。其它例子是人源化抗-CD18F(ab′)2(基因泰克公司)；CDP860，它是人源化抗-CD18F(ab′)2(英国的赛尔泰克公司(Celltech，UK))；PRO542，它是与CD4融合的抗-HIV gp120抗体(普洛基尼公司/基甾转基因技术公司(Progenics/Genzyme Transgenics))；C14，它是抗-CD14抗体(ICOS制药公司(ICOSPharm))；人源化抗-VEGF IgG1抗体(基因泰克公司)；OVAREX^TM，它是鼠抗-CA 125抗体(奥特来克司公司(Altarex))；PANOREX^TM，它是鼠抗-17-IA细胞表面抗原IgG2a抗体(葛兰素史克(Glaxo Wellcome)/森托克公司)；IMC-C225，它是嵌合抗-EGFR IgG抗体(因克隆系统公司(ImClone System))；维他辛(VITAXIN)^TM，它是人源化抗-αVβ3整联蛋白抗体(应用分子演化公司/米迪缪尼(Applied Molecular Evolution/MedImmune))；坎帕斯(Campath)1H/LDP-03，它是人源化抗CD52IgG1抗体(刘克赛特公司(Leukosite))；Smart M195，它是人源化抗-CD33IgG抗体(蛋白质设计实验室(Protein Design Lab)/钟纺制药公司(Kanebo))；利妥昔(RITUXAN^TM)，它是嵌合抗-CD20IgG1抗体(IDEC制药公司/基因泰克公司，罗氏/泽塔(Zettyaku))；LYMPHOCIDE^TM，它是人源化抗-CD22IgG抗体(因缪麦迪公司(Immunomedics))；Smart ID10，它是人源化抗-HLA抗体(蛋白质设计实验室)；ONCOLYM^TM(Lym-1)，它是放射性标记的鼠抗-HLA DR抗体(特尼克隆公司(Techniclone))；抗-CD11a，它是人源化IgG1抗体(基因泰克/索马公司(Xoma))；ICM3，它是人源化抗-ICAM3抗体(ICOS制药公司)；IDEC-114，它是灵长化抗-CD80抗体(IDEC制药公司/三菱公司(Mitsubishi))；ZEVALIN^TM，它是放射性标记的鼠抗-CD20抗体(IDEC/舍林公司(Schering AG))；IDEC-131，它是人源化抗-CD40L抗体(IDEC/卫材公司(Eisai))；IDEC-151，它是灵长化抗-CD4抗体(IDEC)；IDEC-152，它是灵长化抗-CD23抗体(IDEC/塞卡库公司(Seikagaku))；SMART抗-CD3，它是人源化抗-CD3IgG(蛋白质设计实验室)；5G1.1，它是人源化抗-补体因子5(C5)抗体(阿来克申制药公司(Alexion Pharm))；IDEC-151，它是灵长化抗-CD4IgG1抗体(IDEC制药公司/史可必成公司(SmithKline Beecham))；MDX-CD4，它是人抗-CD4IgG抗体(麦得莱克斯公司(Medarex)/卫材公司/基麦公司(Genmab))；CDP571，它是人源化抗-TNF-αIgG4抗体(赛尔泰克公司)；LDP-02，它是人源化抗-α4β7抗体(刘克赛特公司/基因泰克公司)；OrthoClone OKT4A，它是人源化抗-CD4IgG抗体(奥索生物科技(Ortho Biotech))；ANTOVA^TM，它是人源化抗CD40L IgG抗体(百集公司(Biogen))；ANTEGREN^TM，它是人源化抗-VLA-4IgG抗体(伊兰公司(Elan))；MDX-33，它是人抗-CD64(FcγR)抗体(麦得莱克斯公司/森替昂公司(Centeon))；rhuMab-E25，它是人源化抗-IgE IgG1抗体(基因泰克公司/诺华公司(Norvartis)/谭诺生物系统公司(Tanox Biosystems))；IDEC-152，它是灵长化抗-CD23抗体(IDEC制药公司)；ABX-CBL，它是鼠抗CD-147IgM抗体(阿布吉尼公司(Abgenix))；BTI-322，它是大鼠抗-CD2IgG抗体(米迪缪尼公司/生物移植公司(Bio Transplant))；奥索克隆/OKT3(Orthoclone/OKT3)，它是鼠抗-CD3IgG2a抗体(奥索生物科技公司(ortho Biotech))；SIMULECT^TM，它是嵌合抗-CD25IgG1抗体(诺华制药)；LDP-01，它是人源化抗-β2-整联蛋白IgG抗体(刘克赛特公司)；抗-LFA-1，它是鼠抗CD18F(ab′)2(PM公司(Pasteur-Merieux)/因缪泰克公司(Immunotech))；CAT-152，它是人抗-TGF-β2抗体(剑桥科技公司(Cambridge Ab Tech))；和Corsevin M，它是嵌合抗-因子VII抗体(森托克公司)。

可包含本文所述Fc变异区的其它抗体可特异性结合癌或肿瘤抗原，包括例如但不限于：KS 1/4泛癌抗原(Perez和Walker，1990，J.Immunol.142:3662-3667；Bumal，1988，Hybridoma 7(4):407-415)，卵巢癌抗原(CA125)(Yu等，1991，Cancer Res.468-475)，前列腺酸性磷酸酶(prostatic acid phosphatase)(Tailor等，1990，Nucl.Acids Res.4928)，前列腺特异性抗原(Henttu和Vihko，1989，Biochem.Biophys.Res.Comm.160(2):903-910；Israeli等，1993，Cancer Res.227-230)，黑色素瘤-相关抗原p97(Estin等，1989，J.Natl.Cancer Instit.445-446)，黑色素瘤抗原gp75(Vijayasardahl等，1990，J.Exp.Med.171(4):1375-1380)，高分子量黑色素瘤抗原(HMW-MAA)(Natali等，1987，Cancer 59:55-63；Mittelman等，1990，J.Clin.Invest.86:2136-2144)，前列腺特异性膜抗原，癌胚抗原(CEA)(Foon等，1994，Proc.Am.Soc.Clin.Oncol.13:294)，多态性上皮粘蛋白抗原，人乳脂球状抗原，结直肠肿瘤-相关抗原，例如：CEA，TAG-72(Yokata等，1992，CancerRes.52：3402-3408)，CO17-1A(Ragnhammar等，1993，Int.J.Cancer 53：751-758)；GICA 19-9(Herlyn等，1982，J.Clin.Immunol.2：135)，CTA-1和LEA、伯基特淋巴瘤抗原-38.13、CD19(Ghetie等，1994，Blood 83：1329-1336)，人B-淋巴瘤抗原-CD20(Reff等，1994，Blood 83:435-445)，CD33(Sgouros等，1993，J.Nucl.Med.34:422-430)，黑色素瘤特异性抗原，如神经节苷脂GD2(Saleh等，1993，J.Immunol.，151，3390-3398)，神经节苷脂GD3(Shitara等，1993，Cancer Immunol.Immunother.36:373-380)，神经节苷脂GM2(Livingston等，1994，J.Clin.Oncol.12：1036-1044)，神经节苷脂GM3(Hoon等，1993，Cancer Res.53：5244-5250)，肿瘤特异性移植类型的细胞表面抗原(TSTA)，如病毒诱导的肿瘤抗原，包括DNA肿瘤病毒的T-抗原和RNA肿瘤病毒的包膜抗原，癌胚抗原-甲胎蛋白如结肠癌CEA、膀胱肿瘤癌胚抗原(Hellstrom等，1985，Cancer Res.45:2210-2188)，分化抗原如人肺癌抗原L6，L20(Hellstrom等，1986，Cancer Res.46：3917-3923)，纤维肉瘤抗原，人白血病T细胞抗原-Gp37(Bhattacharya-Chatterjee等，1988，J.of Immun.141:1398-1403)，新糖蛋白，鞘脂，乳腺癌抗原，如EGFR(表皮生长因子受体)、HER2抗原(p185HER2)、多态性上皮粘蛋白(PEM)(Hilkens等，1992，Trends in Bio.Chem.Sci.17:359)，恶性人淋巴细胞抗原-APO-1(Bernhard等，1989，Science 245：301-304)，分化抗原(Feizi，1985，Nature 314：53-57)，如胎儿红细胞中发现的I抗原，成年人红细胞中发现的原内胚层I抗原，着床前胚胎，胃腺癌中发现的I(Ma)，乳腺上皮中发现的M18、M39，骨髓细胞中发现的SSEA-1，结直肠癌中发现的VEP8、VEP9、Myl、VIM-D5、D156-22，TRA-1-85(血型H)，结肠腺癌中发现的C14，肺腺癌中发现的F3，胃癌中发现的AH6，Y半抗原，胚胎癌细胞中发现的Ley，TL5(血型A)，A431细胞中发现的EGF受体，胰腺癌中发现的E1系列(血型B)，胚胎癌细胞中发现的FC10.2、胃腺癌抗原，腺癌中发现的CO-514(血型Lea)，腺癌中发现的NS-10，CO-43(血型Leb)，A431细胞EGF受体中发现的G49，结肠腺癌中发现的MH2(血型ALeb/Ley)，结肠癌中发现的19.9，胃癌粘蛋白，骨髓细胞中发现的T5A7，黑色素瘤中发现的R24，胚胎癌细胞中发现的4.2、GD3、D1.1、OFA-1、GM2、OFA-2、GD2和M1:22:25:8；4至8细胞胚胎阶段中发现的SSEA-3和SSEA-4。在一个实施方式中，抗原是来自皮肤T细胞淋巴瘤的T细胞受体衍生肽(参见Edelson，1998，The CancerJournal 4:62)。

本文所述的Fc变体可来自任何抗体，或者本文所述的变异Fc区可引入任何抗体。而且，本文所述的变异Fc区可用于产生Fc融合蛋白。因此，基本上任何分子均可被包含本文所述Fc变体的抗体和/或Fc融合蛋白靶定和/或掺入，所述抗体和/或Fc融合蛋白包括但不限于以下蛋白质列表以及属于以下蛋白质列表的亚基、结构域、基序和表位：肾素；生长激素，包括人生长激素和牛生长激素；生长激素释放因子；甲状旁腺激素；促甲状腺激素；脂蛋白；α-1-抗胰蛋白酶；胰岛素A-链；胰岛素B-链；胰岛素原；促卵泡激素；降钙素；黄体生成素；胰高血糖素；凝集因子，如因子VII、因子VIIIC、因子IX、组织因子(TF)和血管性血友病因子(von Willebrands factor)；抗凝集因子，如蛋白质C；心房钠元素；肺表面活性剂；纤溶酶原激活物，如脲激酶或人尿或组织型纤溶酶原激活物(t-PA)；铃蟾肽；凝血酶；造血生长因子；肿瘤坏死因子-α和-β；脑啡肽酶；RANTES(活化后可调节的、正常T细胞表达和分泌的因子)；人巨噬细胞炎性蛋白(MIP-1-α)；血清白蛋白如人血清白蛋白；苗勒管抑制物；松弛素A-链；松弛素B-链；松弛素原；小鼠促性腺素-相关肽；微生物蛋白质，如β-内酰胺酶；DNA酶；IgE；细胞毒性T-淋巴细胞相关抗原(CTLA)，如CTLA-4；抑制素；活化素；血管内皮生长因子(VEGF)；激素或生长因子受体，例如EGFR、VEGFR；干扰素如α干扰素(α-IFN)、β干扰素(β-IFN)和γ干扰素(γ-IFN)；干扰素受体组分，如干扰素受体1；蛋白质A或D；类风湿性因子；神经营养因子，如骨衍生的神经营养因子(BDNF)，神经营养因子-3、-4、-5或-6(NT-3、NT-4、NT-5或NT-6)，或者神经生长因子；血小板衍生生长因子(PDGF)；成纤维细胞生长因子，如αFGF和βFGF；表皮生长因子(EGF)；转化生长因子(TGF)，如TGF-α和TGF-β，包括TGF-1、TGF-2、TGF-3、TGF-4或TGF-5；胰岛素样生长因子-I和-II(IGF-I和IGF-II)；脱(1-3)-IGF-I(脑IGF-I)，胰岛素样生长因子结合蛋白；CD蛋白，如CD2、CD3、CD4、CD8、CD11a、CD14、CD18、CD19、CD20、CD22、CD23、CD25、CD33、CD34、CD40、CD40L、CD52、CD63、CD64、CD80和CD147；红细胞生成素；骨诱导因子；免疫毒素；骨形态发生蛋白(BMP)；干扰素，如干扰素-α、-β和-γ；集落刺激因子(CSF)，如M-CSF、GM-CSF和G-CSF；白介素(IL)，如IL-1至IL-13；TNFα；HMGB1；HMGB2；超氧化物歧化酶；T-细胞受体；表面膜蛋白；衰变加速因子；病毒抗原，例如，AIDS包膜的一部分，如gp120；转运蛋白；归巢受体；地址素；调节蛋白；细胞粘着分子，如LFA-1、Mac1、p150.95、VLA-4、ICAM-1、ICAM-3和VCAM，a4/p7整联蛋白和(Xv/p3整联蛋白，包括其一个或多个亚基，整联蛋白α亚基例如CD49a、CD49b、CD49c、CD49d、CD49e、CD49f、α7、α8、α9、αD、CD11a、CD11b、CD51、CD11c、CD41、αIIb、αIELb；整联蛋白β亚基例如CD29、CD18、CD61、CD104、β5、β6、β7和β8；整联蛋白亚基组合包括但不限于：αVβ3、αVβ5和α4β7；凋亡途径的成员；IgE；血型抗原；flk2/flt3受体；肥胖(OB)受体；mpl受体；CTLA-4；蛋白C；壳多糖酶或壳多糖酶样分子，如YKL-40和AMC酶；Eph受体，如EphA2、EphA4、EphB2等；人白细胞抗原(HLA)，如HLA-DR；补体蛋白，如补体受体CR1、C1Rq和其它补体因子，如C3和C5；糖蛋白受体如GpIbα、GPIIb/IIIa和CD200；共同刺激分子如CD28/CTLA-4、ICOS/AILIM、PD-1。

可包含本文所述变异Fc区的其它分子是能特异性结合癌抗原的分子，这些癌抗原包括但不限于：ALK受体(多效生长因子受体)，多效生长因子，KS 1/4泛癌抗原；卵巢癌抗原(CA125)；前列腺酸性磷酸酶；前列腺特异性抗原(PSA)；黑色素瘤-相关抗原p97；黑色素瘤抗原gp75；高分子量黑色素瘤抗原(HMW-MAA)；前列腺特异性膜抗原；癌胚抗原(CEA)；多态性上皮粘蛋白抗原；人乳脂球状抗原；结直肠肿瘤-相关抗原，如CEA、TAG-72、CO17-1A、GICA19-9、CTA-1和LEA；伯基特淋巴瘤抗原-38.13；CD19；人B-淋巴瘤抗原-CD20；CD33；黑色素瘤特异性抗原，如神经节苷脂GD2、神经节苷脂GD3、神经节苷脂GM2和神经节苷脂GM3；肿瘤特异性移植型细胞表面抗原(TSTA)；病毒诱导的肿瘤抗原，包括DNA肿瘤病毒的T抗原和RNA肿瘤病毒的包膜抗原；癌胚抗原-甲胎蛋白，如结肠癌CEA、5T4癌胚滋养层糖蛋白和膀胱肿瘤癌胚抗原；分化抗原如人肺癌抗原L6和L20；纤维肉瘤抗原；人白血病T细胞抗原-Gp37；新糖蛋白；鞘脂；乳腺癌抗原，如EGFR(表皮生长因子受体)；NY-BR-16；NY-BR-16和HER2抗原(p185HER2)；多态性上皮粘蛋白(PEM)；恶性人淋巴细胞抗原-APO-1；分化抗原胎儿红细胞中发现的I抗原，成年人红细胞中发现的原内胚层I抗原；着床前胚胎；胃腺癌中发现的I(Ma)，乳腺上皮中发现的M18、M39，骨髓细胞中发现的SSEA-1，结直肠癌中发现的VEP8、VEP9、Myl、VIM-D5、D156-22；TRA-1-85(血型H)；睾丸癌和卵巢癌中发现的SCP-1；结肠腺癌中发现的C14；肺腺癌中发现的F3；胃癌中发现的AH6；Y半抗原；胚胎癌细胞中发现的Ley；TL5(血型A)；A431细胞中发现的EGF受体；胰腺癌中发现的E1系列(血型B)；胚胎癌细胞中发现的FC10.2；胃腺癌抗原；腺癌中发现的CO-514(血型Lea)；腺癌中发现的NS-10；CO-43(血型Leb)；A431细胞EGF受体中发现的G49；结肠腺癌中发现的MH2(血型ALeb/Ley)；结肠癌中发现的19.9；胃癌粘蛋白；骨髓细胞中发现的T5A7；黑色素瘤中发现的R24；胚胎癌细胞中发现的4.2、GD3、D1.1、OFA-1、GM2、OFA-2、GD2和M1:22:25:8；4至8细胞胚胎阶段中发现的SSEA-3和SSEA-4；皮肤T细胞淋巴瘤抗原；MART-1抗原；唾液酸Tn(STn)抗原；结肠癌抗原NY-CO-45；肺癌抗原NY-LU-12变体A；腺癌抗原ART1；癌旁相关性脑-睾丸-癌抗原(癌神经元抗原MA2；癌旁神经元抗原)；神经-肿瘤腹抗原2(NOVA2)；肝细胞癌抗原基因520；肿瘤相关抗原CO-029；肿瘤相关抗原MAGE-C1(癌症/睾丸抗原CT7)、MAGE-B1(MAGE-XP抗原)、MAGE-B2(DAM6)、MAGE-2、MAGE-4a、MAGE-4b和MAGE-X2；癌症-睾丸抗原(NY-EOS-1)；YKL-40以及上述多肽的片段。

5.14.抗体的糖基化

在另一个实施方式中，本发明中使用的抗体的糖基化可被改变。例如，可制备无糖基化抗体(即没有糖基化的抗体)。可改变糖基化状态，以(例如)提高抗体对靶抗原的亲和力。可通过(例如)改变抗体序列中一个或多个糖基化位点来进行这种糖修饰。例如，可进行一个或多个氨基酸取代，以消除一个或多个可变区构架糖基化位点，从而消除该位点上的糖基化。这种无糖基化(状态)可提高抗体对抗原的亲和力。这类方法详见美国专利号5,714,350和6,350,861。也可进行一个或多个氨基酸取代，以消除Fc区中存在的糖基化位点(如IgG的天冬酰胺297)。而且，可在缺乏必要的糖基化机器的细菌细胞中产生无糖基化抗体。

也可制备糖基化类型改变的抗体，例如岩藻糖残基数量减少的低岩藻糖基化抗体或截开型GlcNAc结构增加的抗体。已证明，这类改变的糖基化模式能提高抗体的ADCC能力。可通过例如在糖基化机器改变的宿主细胞中表达该抗体来实现这类糖修饰。本领域已经描述过糖基化机器改变的细胞，它们可用作表达本发明重组抗体，从而产生糖基化改变的抗体的宿主细胞。参见例如，Shields，R.L.等(2002)J.Biol.Chem.277:26733-26740；Umana等(1999)Nat.Biotech.17:176-1，以及美国专利US 6,946,292；欧洲专利EP 1,176,195；PCT公开WO 03/035835；WO 99/54342，各篇文献的全文通过引用纳入本文。

5.15.工程改造效应功能

可能需要根据效应功能修饰本发明抗-CD19抗体，以便提高(例如)该抗体在治疗B细胞恶性肿瘤中的有效性。例如，可将半胱氨酸残基引入Fc区，从而在该区域中形成链间二硫键。如此产生的同源二聚体抗体可能具有改善的内化能力和/或提高的补体介导的细胞杀伤和/或抗体依赖性细胞毒性(ADCC)。参见Caron等，J.Exp Med.，176:1191-1195(1992)和Shopes，B.，J.Immunol.，148:2918-2922(1992)。也可利用如Wolff等，Cancer Research，53:2560-2565(1993)所述的异源双功能交联剂制备抗肿瘤活性提高的同源二聚体抗体。也可工程改造具有双Fc区的抗体，从而其补体裂解能力和ADCC能力得到提高。参见Stevenson等，Anti-Cancer Drug Design，3:219-230(1989)。

本领域了解工程改造抗体Fc区以改变效应功能的其它方法(例如，Koenig等的美国专利公开号20040185045和PCT公开号WO 2004/016750，它们描述了改变Fc区，以便与FCγRIIA结合亲和力相比，提高与FcγRIIB的结合亲和力；也参见Armour等的PCT公开号WO99/58572、Idusogie等的WO 99/51642和Deo等的美国6,395,272；通过引用将其全文纳入本文)。本领域也了解修饰Fc区以降低与FcγRIIB的结合亲和力的方法(例如，Ravetch等的美国专利公开号20010036459和PCT公开号WO 01/79299，通过引用将其全文纳入本文)。也记载过具有与野生型Fc区相比，与FcγRIIIA和/或FcγRIIA结合亲和力提高的变异Fc区的修饰抗体(如，Stavenhagen等的PCT公开号WO 2004/063351，通过引用将其全文纳入本文)。

可利用本领域已知的体外试验测定本发明组合物和方法所用的抗-CD19抗体是否能够介导ADCC，如本文所述。

5.16.抗-CD19抗体的制造/生产

一旦工程改造得到所需的抗-CD19抗体，则可利用本领域熟知的大规模抗体生产方法以商业规模生产抗-CD19抗体。例如，可利用重组表达系统，例如但不限于以下所述的系统来实现这种生产。

5.17.重组表达系统

抗体或其变体的重组表达通常需要构建含有编码抗体的多核苷酸的表达载体。一旦获得了编码抗体分子或者抗体的重链或轻链或其一部分的多核苷酸，就可利用本领域熟知的技术，通过重组DNA技术产生用于生产该抗体分子的载体。参见例如，美国专利号6,331,415，通过引用全文纳入本文作参考。因此，本文描述了通过表达含有编码抗体的核苷酸序列的多核苷酸制备蛋白质的方法。可利用本领域技术人员熟知的方法构建含有抗体编码序列和合适的转录和翻译控制信号的表达载体。这些方法包括例如，体外重组DNA技术、合成技术和体内遗传重组。因此，本发明提供包含操作性连接于启动子的编码抗体分子、抗体的重链或轻链、抗体的重链或轻链可变区或其一部分、或重链或轻链CDR的核苷酸序列的可复制载体。这种载体可包含编码抗体分子恒定区的核苷酸序列(参见例如，国际公开号WO86/05807和WO 89/01036；和美国专利号5,122,464)，可将抗体可变区克隆到这种载体中，以表达整个重链、整个轻链或整个重链和轻链。

在另一个实施方式中，可利用靶向同源重组产生抗CD19抗体，以产生完整或一部分抗CD19抗体(参见美国专利6,063,630、6,187,305和6,692,737)。在某些实施方式中，可利用随机重组技术制备抗-CD19抗体，以产生完整或一部分抗-CD19抗体(参见美国专利6,361,972、6,524,818、6,541,221和6,623,958)。也可以在由包含修饰的免疫球蛋白基因座的细胞基因组序列表达抗体的细胞中，利用Cre-介导的定点同源重组产生抗-CD19抗体(参见美国专利号6,091,001)。宿主细胞系可衍生自人或非人物种，包括但不限于：小鼠和中华仓鼠。需要产生人或人源化抗体时，宿主细胞系应该是人细胞系。可有益地利用这些方法工程改造永久表达该抗体分子的稳定细胞系。

一旦通过常规技术将表达载体转移到宿主细胞中后，就可用常规技术培养转染细胞，以产生抗体。因此，本发明包括含有编码本发明抗体或其片段、或其重链或轻链、或某部分、或本发明单链抗体的多核苷酸的宿主细胞，所述多核苷酸操作性连接于异源启动子。在某些实施方式中，为了表达双链抗体，可以在宿主细胞中共同表达编码重链和轻链的载体，以表达整个免疫球蛋白分子，如下所详述。

可利用各种宿主-表达载体系统表达抗-CD19抗体或其某部分，以用于工程改造和产生抗-CD19抗体(参见例如，美国专利号5,807,715)。例如，哺乳动物细胞如中华仓鼠卵巢细胞(CHO)与某载体如来自人巨细胞病毒的主要中间体早期基因启动子元件联用，是抗体的有效表达系统(Foecking等，Gene 45:101(1986)；和Cockett等，Bio/Technology 8:2(1990))。此外，可选择调节插入抗体序列的表达、或以所需的特定方式修饰和加工该抗体基因产物的宿主细胞系。对蛋白质产物的这种修饰(如糖基化)和加工(如切割)可能对蛋白质功能至关重要。不同宿主细胞具有对蛋白质和基因产物进行翻译后加工和修饰的特征性和特定机制。可选择合适的细胞系或宿主系统，以保证对所表达的抗体或其部分进行正确修饰和加工。至此，可采用包含能适当地加工初始转录物、对基因产物进行糖基化和磷酸化的细胞机器的真核宿主细胞。这类哺乳动物宿主细胞包括但不限于：CHO、VERY、BHK、Hela、COS、MDCK、293、3T3、WI38、BT483、Hs578T、HTB2、BT2O和T47D、NS0(不会内源性产生任何功能性免疫球蛋白链的鼠骨髓瘤细胞系)、CRL7O3O和HsS78Bst细胞。

在一个实施方式中，可利用通过永生化人淋巴细胞产生的人细胞系，以重组方式产生单克隆人抗-CD19抗体。在一个实施方式中，可利用人细胞系PER.C6.(Crucell，荷兰)以重组方式产生单克隆人抗-CD19抗体。

在细菌系统中，可根据所表达抗体分子的指定应用对许多表达载体进行有利地选择。例如，准备产生大量这类抗体时，为了产生含有抗-CD19抗体的药物组合物，可能需要能够介导易于纯化的融合蛋白产物高水平表达的载体。这类载体包括但不限于：大肠杆菌表达载体pUR278(Ruther等，EMBO，12:1791(1983))，其中抗体编码序列可单独连接到载体内，与lacZ编码区位于同一读框内，以产生融合蛋白；pIN载体(Inouye和Inouye，1985，NucleicAcids Res.13:3101-3109(1985)；Van Heeke和Schuster，1989，J.Biol.Chem.，24:5503-5509(1989))；等等。也可采用pGEX载体表达外来多肽与谷胱甘肽-S-转移酶(GST)的融合蛋白。通常，这类融合蛋白可溶，并可通过以下方法容易地由裂解细胞纯化：吸附和结合于谷胱甘肽琼脂糖亲和基质，然后在游离谷胱甘肽的存在下洗脱。设计pGEX载体，将凝血酶和/或因子Xa蛋白酶切割位点引入表达的多肽中，以便由GST部分释放克隆的靶基因产物。

在昆虫系统中，苜蓿银纹夜蛾(Autographa californica)核多面体病病毒(AcNPV)用作表达外来基因的载体。该病毒在草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)细胞中生长。可将抗体编码序列单独克隆到病毒的非必需区(如多角体蛋白基因)中，并置于AcNPV启动子(如多角体蛋白启动子)的控制下。

在哺乳动物宿主细胞中，可利用许多基于病毒的表达系统。在腺病毒用作表达载体的情况下，可将感兴趣的抗体编码序列连接于腺病毒转录/翻译控制复合物，例如晚期启动子和三联前导序列。然后，可通过体外或体内重组将该嵌合基因插入腺病毒基因组中。插入病毒基因组的非必需区(如E1或E3区)会产生活的并且能够在感染宿主中表达抗体分子的重组病毒(参见例如Logan和Shenk，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81 1:355-359(1984))。为使插入的抗体编码序列能够有效翻译，可能还需要特定的起始信号。这些信号包括ATG启动密码子和相邻序列。另外，该启动密码子通常应该与所需编码序列在同一阅读框内，以保证完整插入物的翻译。这些外源性翻译控制信号和启动密码子可以是各种天然和合成来源。可通过包含合适的转录增强子元件、转录终止子等提高表达效率(参见例如Bittner等，Methods in Enzymol.153:51-544(1987))。

可利用稳定表达来长期、高产率地产生重组蛋白。例如，可产生稳定表达抗体分子的细胞系。可利用适当工程改造的载体转化宿主细胞，所述载体包含表达控制元件(如启动子、增强子、转录终止子、聚腺苷酸化位点等)和选择性标记基因。引入外来DNA后，使细胞在富营养培养基中生长1-2天，然后换到选择性培养基中。重组质粒中的选择性标记对选择产生抗性，使得将该质粒稳定整合到其染色体中的细胞生长形成细胞灶，进而可克隆并扩增成细胞系。可利用编码抗-CD19抗体的质粒将基因/cDNA引入适合培养生产的任何细胞系。

可采用许多选择系统，包括但不限于可分别用于tk^-、hgprt^-或aprt^-细胞的单纯疱疹病毒胸苷激酶(Wigler等，Cell 11:223(1977))、次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(Szybalska和Szybalski，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 48:202(1992))和腺嘌呤磷酸核糖基转移酶(Lowy等，Cell 22:8-17(1980))基因。另外，抗代谢剂抗性可用作选择以下基因的基础：dhfr，产生甲氨蝶呤抗性(Wigler等，Natl.Acad.Sci.USA，77:357(1980)；O’Hare等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，78:1527(1981))；gpt，产生霉酚酸抗性(Mulligan和Berg，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，78:2072(1981))；neo，产生氨基糖苷G-418抗性(Wu和Wu，Biotherapy 3:87-95(1991)；Tolstoshev，Ann.Rev.Pharmacol.Toxicol.32:573-596(1993)；Mulligan，Science 260:926-932(1993)；和Morgan和Anderson，Ann.Rev.Biochem.62:191-217(1993)；May，TIB TECH 11(5):l55-2 15(1993))；和hygro，产生潮霉素抗性(Santerre等，Gene，30:147(1984))。通常应用重组DNA技术领域公知的方法以选择所需的重组克隆，这些方法参见例如：Ausubel等(编)，《新编分子生物学实验指南》(Current Protocols in Molecular Biology)，约翰韦利森公司(John Wiley&Sons)，NY(1993)；Kriegler，《基因转移和表达，实验室手册》(Gene Transfer and Expression，ALaboratory Manual)，斯托克顿出版社(Stockton Press)，NY(1990)；和Dracopoli等(编)，《新编人类基因组实验指南》(Current Protocols in Human Genetics)的第12和13章，约翰韦利森公司，NY(1994)；Colberre-Garapin等，1981，J.Mol.Biol.，150:1，通过引用将其全文纳入本文。

可通过载体扩增提高抗体分子的表达水平(综述参见Bebbington和Hentschel，The use of vectors based on gene amplification for the expression of clonedgenes in mammalian cells in DNA cloning(在DNA克隆中基于基因扩增使用载体表达哺乳动物细胞中克隆的基因)，第3卷(学术出版社(Academic Press)，纽约，1987))。当表达抗体的载体系统中的标记可扩增时，宿主细胞培养物中存在的抑制剂水平提高会提高标记基因的拷贝数。由于扩增区域与抗体基因相连，所以也会提高抗体的产量(Crouse等，Mol.Cell.Biol.3:257(1983))。可使用重组蛋白生产领域技术人员已知的重组方法和工具来提高抗体表达水平，这些方法和工具包括重塑周围染色质和提高活性人工转录域形式的转基因表达的技术。

可利用两个表达载体共同转染宿主细胞，第一个载体编码重链衍生的多肽，第二个载体编码轻链衍生的多肽。这两个载体可包含相同或不同的选择性标记。也可使用编码且能够表达重链和轻链多肽的单一载体。在这种情况下，轻链应位于重链5’侧，以避免产生过多有毒的游离重链(Proudfoot，Nature 322:562-65(1986)；和Kohler，1980，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，77:2197(1980))。重链与轻链的编码序列可包括cDNA或基因组DNA。

一旦通过重组表达产生抗体分子后，可通过本领域已知的任何免疫球蛋白分子纯化方法进行纯化，这些方法包括例如层析(如离子交换层析，亲和力层析，特别是对特定抗原蛋白A或蛋白G的亲和力层析，以及大小柱层析)、离心、差异溶解度或任何其它蛋白质纯化标准技术。另外，本发明抗体或其片段可与本文所述或本领域已知的异源多肽序列融合，以利于纯化。

5.17.1.抗体纯化和分离

使用重组技术时，可以在胞内、壁膜间隙产生抗体，或者抗体可直接分泌到培养基中。如果在胞内产生抗体，那么第一个步骤是通过(例如)离心或超滤去除颗粒碎片，不论是宿主细胞或是裂解片段。Carter等，Bio/Technology，10:163-167(1992)记载了分离分泌到大肠杆菌壁膜间隙中的抗体的方法。简要说，将细胞糊在乙酸钠(pH 3.5)、EDTA和苯基甲磺酰氟(PMSF)存在下解冻约30分钟。离心去除细胞碎片。如果抗体突变体分泌到培养基中，那么通常先采用市售蛋白质浓缩滤器，例如阿米康(Amicon)或MP(Millipore Pellicon)超滤装置浓缩这类表达系统的上清液。任何上述步骤中可包含蛋白酶抑制剂如PMSF以抑制蛋白酶解，还可包含抗生素以防止外来污染物的生长。

可单独利用或与其它纯化步骤联用羟基磷灰石色谱、疏水相互作用色谱、离子交换色谱、凝胶电泳、透析和/或亲和色谱，纯化由细胞制备的抗体组合物。蛋白A作为亲和配体的适当性取决于抗体突变体中的免疫球蛋白Fc区的种类和同种型。可利用蛋白A纯化基于人γ1、γ2或γ4重链的抗体(Lindmark等，J.Immunol.Methods，62:1-13(1983))。蛋白G推荐用于所有小鼠同种型和人γ3(Guss等，EMBO J.，5:15671575(1986))。最常见的连接亲和配体的基质是琼脂糖，但也可采用其它基质。与琼脂糖相比，机械稳定的基质如孔径受控的玻璃或聚(苯乙烯二乙烯基)苯可实现较快的流动速率和较短的加工时间。抗体包含CH₃结构域时，可使用Bakerbond ABX树脂(新泽西州菲利浦斯勃格的J.T.B.公司(J.T.Baker，Phillipsburg，NJ))进行纯化。根据待回收抗体，也可使用其它蛋白质纯化技术，例如在例子交换柱上分离、乙醇沉淀、反相HPLC、二氧化硅色谱、肝素色谱、在阴离子或阳离子交换树脂(如聚天冬氨酸柱)上进行琼脂糖色谱、色谱聚焦、SDS-PAGE和硫酸铵沉淀。

初步纯化步骤后，对包含感兴趣抗体和污染物的混合物进行低pH疏水相互作用色谱纯化，该色谱使用pH为约2.5-4.5的洗脱缓冲液，在低盐浓度下进行(如约0-0.25M盐)。

5.18治疗性抗-CD19抗体

本发明组合物和方法所用的抗-CD19抗体可以是可介导B细胞谱系凋亡和/或人ADCC的人抗体或人源化抗体，或者可选自可介导B细胞谱系细胞凋亡和/或人ADCC的已知抗-CD19抗体。在某些实施方式中，抗-CD19抗体可以是嵌合抗体。在某些实施方式中，抗-CD19抗体可以是单克隆人、人源化或嵌合的抗-CD19抗体。本发明组合物和方法所用的抗-CD19抗体可以是IgG1或IgG3人同种型、或者人群中发现的任何IgG1或IgG3等位基因的人抗体或人源化抗体。在其它实施方式中，本发明组合物和方法所用的抗-CD19抗体可以是IgG2或IgG4人同种型、或者人群中发现的任何IgG2或IgG4等位基因的人抗体或人源化抗体。

虽然可利用上述技术产生这类抗体，但在本发明其它实施方式中，本文所述的鼠抗体HB12A和HB12B或其它市售抗-CD19抗体可被嵌合化、人源化或制成人抗体。

例如，已知的可使用的抗-CD19抗体包括但不限于：HD37(IgG1，κ)(加州卡皮特亚的大科北美公司(DAKO North America，Inc.，Carpinteria，CA))、BU12(Callard等，J.Immunology，148(10):2983-7(1992))、4G7(IgG1)(Meeker等，Hybridoma，3(4):305-20(1984年冬))、J4.119(德国克雷费尔德的贝克曼库尔特公司)、B43(加州圣地亚哥的法明基公司)、SJ25C1(加州圣地亚哥的BD法明基公司)、FMC63(IgG2a)(Zola等，Immunol.Cell.Biol.69(PT6):411-22(1991)；Nicholson等，Mol.Immunol.，34:1157-1165(1997)；Pietersz等，Cancer Immunol.Immunotherapy，41:53-60(1995))、89B(B4)(IgG1)(佛罗里达州迈阿密的贝克曼库尔特公司；Nadler等，J.Immunol.，131:244-250(1983))和/或HD237(IgG2b)(第四届国际人白细胞分化抗原研习会，奥地利维也纳，1989；和Pezzutto等，J.Immunol.，138(9):2793-2799(1987))。

在某些实施方式中，该抗体是已知抗体(如IgG1或IgG3人同种型)的同种型交换变体，如上所述。

本发明组合物和方法所用的抗-CD19抗体可以是裸露抗体、免疫偶联物或融合蛋白。如上所述本发明组合物和方法所用的抗-CD19抗体可能能够减少或消耗用该抗体治疗的个体中的B细胞和循环免疫球蛋白。B细胞消耗可以是循环B细胞的消耗，或特定组织，例如但不限于骨髓、脾、肠相关的淋巴组织和/或淋巴结中B细胞的消耗。这种消耗可通过各种机制实现，这些机制包括例如，抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)和/或阻断CD19与其配体的相互作用，和/或补体依赖性细胞毒性(CDC)，抑制B细胞增殖和/或诱导B细胞死亡(如通过凋亡)。B细胞的“消耗”指循环B细胞和/或特定组织中的B细胞减少至少约25％、40％、50％、65％、75％、80％、85％、90％、95％或更多。在具体实施方式中，可消耗循环系统或特定组织中几乎所有可检测的B细胞。循环免疫球蛋白(Ig)的“消耗”指减少至少约25％、40％、50％、65％、75％、80％、85％、90％、95％或更多。在具体实施方式中，可消耗循环系统中基本上所有可检测的Ig。

5.18.1.筛选结合人CD19的抗体

可利用结合试验鉴定结合人CD19抗原的抗体。结合试验可以是直接结合试验或竞争结合试验。可利用标准ELISA或标准流式细胞术检测结合。在直接结合试验中，检测候选抗体与人CD19抗原的结合。在某些实施方式中，筛选试验包括在第二个步骤中，测定导致表达人CD19的B细胞发生细胞死亡或凋亡的能力。另一方面，竞争结合试验能评价候选抗体与已知抗-CD19抗体或结合人CD19的其它化合物竞争的能力。

在直接结合试验中，在允许候选抗体结合人CD19抗原的条件下使人CD19抗原与候选抗体相接触。这种结合可以在溶液中或固体表面上发生。之前对候选抗体进行标记以便检测。可使用分化任何可检测化合物进行标记，例如但不限于发光标记、荧光标记或放射性同位素或含有它们的基团，或非同位素标记，如酶或染料。培育一段时间以便发生结合之后，对该反应施以一定的条件或操作，以去除过量或未特异性结合的抗体。该条件或操作通常包括用合适的缓冲液洗涤。最终，检测到存在CD19-抗体复合物。

在竞争结合试验中，评价候选抗体抑制或取代已知抗-CD19抗体(或其它化合物)与人CD19抗原结合的能力。标记的CD19已知结合物可与候选抗体混合，置于通常可发生相互作用的条件下，加入或不加入候选抗体。可将标记的CD19已知结合物(结合人CD19)的用量与存在或不存在候选抗体时结合的量作比较。

在一个实施方式中，在一种或多种组分被固定在固体表面上以利于抗体抗原复合物形成和检测的条件下进行结合试验。在各种实施方式中，固体支持物可以是但不限于：聚偏氟乙烯、聚碳酸酯、聚苯乙烯、聚丙烯、聚乙烯、玻璃、硝基纤维素、右旋糖苷、尼龙、聚丙烯酰胺和琼脂糖。支持物构型可包括珠，膜，微粒，反应容器如微孔板、试管或其它反应容器的内表面。可通过共价或非共价连接固定人CD19或其它组分。在一个实施方式中，连接可以是间接连接，即通过连接的抗体进行连接。在另一实施方式中，用表位，如谷胱甘肽S-转移酶(GST)标记人CD19抗原和阴性对照，以便由市售抗体如抗-GST(圣克鲁斯生物技术公司(Santa Cruz Biotechnology))介导固体表面的连接。

例如，可利用固定于固体支持物的人CD19抗原进行这种亲和结合试验。一般，对结合反应的非固定组分，在本例中是候选抗-CD19抗体进行标记，以便检测。可获得各种标记方法，这些方法可采用例如，发光标记、生色团、荧光标记或放射性同位素，或者含有它们的基团，以及非同位素标记，如酶或染料。在一个实施方式中，用荧光团如异硫氰酸荧光素(FITC，购自圣路易斯的西格玛化学品公司(Sigma Chemicals，St.Louis))标记候选抗-CD19抗体。可利用固定于固体表面上的人CD19抗原进行这种亲和结合试验。然后，将抗-CD19抗体与抗原一起培育，利用本领域已知方法检测抗原的特异性结合，这些方法包括但不限于：BiaCore分析、ELISA、FMET和RIA方法。

最后，可通过本领域已知的任何检测方法检测残留在固体表面上的标记。例如，如果用荧光团标记候选抗CD-19抗体，则可用荧光计检测复合物。

可将表达人CD19抗原的完整细胞形式或含有人CD19抗原的分离膜形式的人CD19抗原加入结合试验中。因此，可以在存在和不存在候选抗-CD19抗体的条件下，在培养物或动物模型的完整细胞中测定与人CD19抗原的直接结合。标记的候选抗-CD19抗体可与表达人CD19抗原的细胞，或由这类细胞获得的粗提物混合，并可加入候选抗-CD19抗体。可利用分离膜鉴定与人CD19相互作用的候选抗-CD19抗体。例如，在使用分离膜的典型实验中，可遗传改造细胞使其表达人CD19抗原。膜可通过标准技术收获，并可用于体外结合实验。标记的候选抗-CD19抗体(如荧光标记的抗体)结合于膜，测定比活；通过与存在过量未标记(冷)候选抗-CD19抗体时进行的结合实验作比较确定特异性结合。也可通过重组方式表达可溶性人CD19抗原，用于无细胞实验，以鉴定结合人CD19抗原的抗体。重组表达的人CD19多肽可用于无细胞筛选实验。也可将对应于人CD19抗原的一个或多个结合部分的肽，或含有人CD19抗原的一个或多个结合部分的融合蛋白用于无细胞实验体系，以鉴定结合人CD19抗原某部分的抗体。在无细胞实验中，可通过本领域熟知的方式将重组表达的人CD19连接于固体基材，如试管、微孔板孔或柱(参见Ausubel等，同上)。然后，测定受试抗体结合人CD19抗原的能力。

结合反应也可以在溶液中进行。在此实验中，使标记组分与其结合配偶体(binding partner)在溶液中相互作用。如果能够根据标记组分与其结合配偶体的大小差异进行分离，则使结合反应产物通过超滤器可实现分离，所述超滤器的孔隙允许未结合的标记组分通过，而不允许其结合配偶体或结合于其配偶体的标记组分通过。也可利用能够在溶液中捕获标记组分的结合配偶体的任何试剂，如结合配偶体的抗体等进行分离。

在一个实施方式中，例如，通过以下方法筛选噬菌体文库：将来自连续噬菌体展示文库的噬菌体通过含有纯化的人CD19抗原或其衍生物、类似物、片段或结构域的柱，所述人CD19抗原或其衍生物、类似物、片段或结构域连接于固定相如塑料珠。通过改变洗涤缓冲液的严谨性，可富集表达对人CD19抗原有高亲和力的肽的噬菌体。从柱分离的噬菌体可进行克隆，并直接测定亲和力。了解与人CD19抗原结合力最强的是哪种抗体及其氨基酸序列后，可利用计算机模型确定CD19抗原和候选抗体之间的分子接触。

在另一具体实施方式中，固体支持物是附着于微量滴定皿的含有人CD19抗原的膜。例如，候选抗体可结合表达文库抗体的细胞，这些细胞在能够在微量滴定皿中表达文库成员的条件下培养。收获结合人CD19的文库成员。这类方法通常参见例如：Parmley和Smith，1988，Gene，73:305-318；Fowlkes等，1992，BioTechniques，13:422-427；PCT公开号WO94/18318；和其中引用的参考文献。鉴定为能与人CD19抗原结合的抗体可以是上述任何类型的抗体或抗体修饰形式。

5.18.2筛选抗体的人ADCC效应功能

在本发明的某些实施方式中，使用具有功能特征，如血清半衰期长和能够介导各种效应功能的人IgG类型的抗体(单克隆抗体:原理和应用(Monoclonal Antibodies:Principles and Applications)，威利斯公司(Wiley-Liss，Inc.)，第1章(1995))。人IgG类抗体还可分为以下四种子类：IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。迄今为止，进行了有关IgG类抗体效应物功能ADCC和CDC的大量研究，曾报道在IgG类抗体中，IgG1子类在人体中的ADCC活性和CDC活性最高(Chemical Immunology，65，88(1997))。

人IgG1子类抗体的ADCC活性和CDC活性的表现通常包括抗体Fc区与效应细胞如杀伤细胞、天然杀伤细胞或活化的巨噬细胞的表面上的该抗体受体(下文中称为“FcγR”)的结合。可结合各种补体组分。关于结合，有文献提示抗体的绞链区和C区第二结构域(下文中称为“Cγ2结构域”)中的若干氨基酸残基至关重要(Eur.J.Immunol.，23，1098(1993)，Immunology，86，319(1995)，Chemical Immunology，65，88(1997))，Cγ2结构域中的糖链也很重要(Chemical Immunology，65，88(1997))。

可调节抗-CD19抗体的效应功能，以提高该抗体的ADCC和/或补体依赖性细胞毒性(CDC)。可通过在抗体Fc区中引入一个或多个氨基酸取代实现这一目的。也可将半胱氨酸残基引入Fc区，从而在该区域中形成链间二硫键。这样，可产生内化能力提高和/或补体介导的细胞杀伤能力和ADCC增强的同源二聚体抗体(Caron等，J.Exp.Med.，176:1191-1195(1992)和Shopes，J.Immunol.，148:2918-2922(1992))。也可利用异源双功能交联剂产生抗肿瘤活性提高的同源二聚体抗体(Wolff等，Cancer Research，53:2560-2565(1993))。也可工程改造抗体，使其具有两个或多个Fc区，导致补体裂解和ADCC能力增强(Stevenson等，Anti-Cancer Drug Design，(3)219-230(1989))。

本领域了解工程改造抗体Fc区以改变效应功能的其它方法(例如，Koenig等的美国专利公开号20040185045和PCT公开号WO 2004/016750，它们描述了改变Fc区以便与FCγRIIA结合亲和力相比，提高与FcγRIIB的结合亲和力；也参见Armour等的PCT公开号WO 99/58572、Idusogie等的WO 99/51642和Deo等的美国6,395,272；通过引用将其全文纳入本文)。本领域也了解修饰Fc区以降低与FcγRIIB的结合亲和力的方法(例如，Ravetch等的美国专利公开号20010036459和PCT公开号WO 01/79299，通过引用将其全文纳入本文)。也记载过具有与野生型Fc区相比，与FcγRIIIA和/或FcγRIIA结合亲和力提高的变异Fc区的修饰抗体(如，Stavenhagen等的PCT公开号WO 2004/063351，通过引用将其全文纳入本文)。

已发现至少四种不同类型的FcγR，它们分别称为FcγRI(CD64)、FcγRII(CD32)、FcγRIII(CD16)和FcγRIV。在人中，FcγRII和FcγRIII还分别分为FcγRIIa和FcγRIIb，以及FcγRIIIa和FcγRIIIb。FcγR是属于免疫球蛋白超家族的膜蛋白，FcγRII、FcγRIII和FcγRIV具有胞外区含有两个免疫球蛋白样结构域的α链作为结构组分，FcγRI具有胞外区含有三个免疫球蛋白样结构域的α链作为结构组分，α链与IgG结合活性有关。此外，FcγRI和FcγRIII具有γ链或ζ链结构组分，其具有与α链相关的信号转导功能(Annu.Rev.Immunol.，18，709(2000)，Annu.Rev.Immunol.，19，275(2001))。Bruhns等，Clin.Invest.Med.(加拿大)27:3D(2004)记载了FcγRIV。

为了评估感兴趣抗-CD19抗体的ADCC活性，可采用体外ADCC实验，如美国专利号5,500,362或5,821,337所述。也可采用市售试剂盒，如CytoTox(普洛麦格公司(Promega))进行该实验。可用于这类测得的效应物细胞包括但不限于：外周血单核细胞(PBMC)、天然杀伤(NK)细胞和NK细胞系。表达转基因Fc受体(如CD16)和相关信号转导多肽(如FCεRI-γ)的NK细胞系也可用作效应细胞(参见例如Campbell的WO 2006/023148A2)。例如，可测定特定抗体通过补体活化和/或ADCC介导靶细胞裂解的能力。在体外培养和标记感兴趣的细胞；将抗体与免疫细胞加入细胞培养物中，所述免疫细胞可以是由抗原抗体复合物激活的免疫细胞，即参与ADCC应答的效应细胞。也可检测抗体的补体激活。在任一种情况下，通过裂解细胞释放的标记来检测靶细胞的细胞裂解。可通过检测释放到上清液中的胞质蛋白(如LDH)来确定靶细胞裂解程度。实际上，可利用患者自身的血清作为补体和/或免疫细胞来源来筛选抗体。然后，将能够在体外实验中介导人ADCC的抗体用于治疗该特定患者。也可在体内评价感兴趣分子的ADCC活性，例如在Clynes等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA95:652-656(1998)所述的动物模型中进行评价。而且，调节(即提高或降低)抗体的ADCC水平和任选的CDC活性的技术是本领域熟知的。参见例如，美国专利号6,194,551。本发明抗体可能能够或可能经修饰而能够诱导ADCC和/或CDC。可利用人效应细胞进行测定ADCC功能的实验，以评估人ADCC功能。这类实验也可包括用于筛选通过坏死和/或凋亡机制诱导、介导、增强、阻断细胞死亡的抗体的实验。这类方法包括利用活细胞染料的实验、检测和分析胱冬酶的方法以及测定DNA断裂的实验，它们可用于评估与感兴趣抗CD19抗体一起体外培养的细胞的凋亡活性。

例如，可以如Decker等，Blood(USA)103:2718-2725(2004)所述进行膜联蛋白V或TdT-介导的dUTP切口末端标记(TUNEL)实验来检测凋亡活性。TUNEL实验包括将培养感兴趣细胞与荧光素标记的dUTP一起培养，使荧光素标记的dUTP掺入DNA链断裂处。然后加工处理细胞，以便用流式细胞术进行分析。膜联蛋白V实验利用偶联荧光素的膜联蛋白V检测凋亡细胞的质膜外侧出现的磷脂酰丝氨酸(PS)，所述偶联荧光素的膜联蛋白V能特异性识别暴露的PS分子。可并行使用活细胞染料如碘化丙锭，以排除晚期凋亡细胞。用标记的膜联蛋白V对细胞染色并用流式细胞术进行分析。

5.18.3.免疫偶联物和融合蛋白

按照本发明的某些方面，可将治疗剂或毒素偶联于嵌合的人或人源化抗-CD19抗体，以用于本发明的组合物和方法。在某些实施方式中，这些偶联物可以融合蛋白的形式出现。治疗剂和毒素的例子包括但不限于：烯二炔类分子，如卡奇霉素和埃斯培拉霉素(esperamicin)。化学毒素也可选自：多卡霉素(duocarmycin)(参见例如，美国专利号5,703,080和美国专利号4,923,990)、甲氨蝶呤、多柔比星、美法仑、苯丁酸氮芥、ARA-C、长春地辛、丝裂霉素C、顺铂、依托泊甙、博来霉素或5-氟尿嘧啶。化疗药的例子也包括：阿霉素、多柔比星、5-氟尿嘧啶、胞嘧啶阿糖胞苷(Ara-C)、环磷酰胺、硫替派、泰索帝(多西他赛)、白消安、赛多辛(Cytoxin)、紫杉醇、甲氨蝶呤、顺铂、美法仑、长春碱、博来霉素、依托泊甙、异环磷酰胺、丝裂霉素C、米托蒽醌、长春新碱、长春瑞滨、卡铂、替尼泊苷、道诺霉素、洋红霉素、氨蝶呤、放线菌素D、丝裂霉素、埃斯培拉霉素(参见美国专利号4,675,187)、美法仑及其它相关氮芥。

在某些实施方式中，将抗-CD19抗体偶联于细胞抑制剂、细胞毒剂或免疫抑制剂，其中细胞毒剂选自：烯二炔、偏端霉素(lexitropsin)、多卡霉素(duocarmycin)、紫杉烷、嘌呤霉素、多拉司他汀、类美坦西醇或长春花生物碱。在某些更具体的实施方式中，细胞毒剂是紫杉醇、多西他赛、CC-1065、SN-38、拓扑替康、吗啉代-多柔比星、根霉素、氰基吗啉代-多柔比星、多拉司他汀-10、棘霉素、考布他汀、卡奇霉素、美登素、DM-1、耳他汀(auristatin)E、AEB、AEVB、AEFP、MMAE(参见美国专利申请10/983,340)或纺锤菌素。

在某些实施方式中，本发明抗-CD19抗体-细胞毒剂偶联物中的细胞毒剂是抗微管蛋白剂。在特定实施方式中，细胞毒剂选自长春花生物碱、鬼臼毒素、紫杉烷、浆果赤霉素衍生物、隐花素(cryptophysin)、类美坦西醇、考布他汀或多拉司他汀。在其它实施方式中，细胞毒剂是长春新碱、长春碱、长春地辛、长春瑞滨、VP-16、喜树碱、紫杉醇、多西他赛、埃博霉素(epithilone)A、埃博霉素B、诺考达唑、秋水仙素、可西米(colcimid)、雌莫司汀、西马多丁、淅皮海绵内酯(discodermolide)、美登素、DM-1、AEFP、耳他汀E、AEB、AEVB、AEFP、MMAE或艾榴塞洛素(eleutherobin)。

在特定实施方式中，抗-CD19抗体通过接头偶联于细胞毒剂，其中所述接头是肽接头。在其它实施方式中，抗-CD19抗体通过接头偶联于细胞毒剂，其中所述接头是val-cit接头、phe-lys接头、腙接头或二硫键接头。

在某些实施方式中，抗-CD19抗体-细胞毒剂偶联物的抗-CD19抗体通过接头偶联于细胞毒剂，其中所述接头在pH小于5.5时可水解。在一个特定实施方式中，所述接头在pH小于5.0时可水解。

在某些实施方式中，抗-CD19抗体-细胞毒剂偶联物的抗-CD19抗体通过接头偶联于细胞毒剂，其中所述接头可被蛋白酶切割。在一个具体实施方式中，所述蛋白酶是溶酶体蛋白酶。在其它实施方式中，所述蛋白酶是膜结合蛋白酶、胞内蛋白酶或内涵体蛋白酶等。

可用于本发明免疫偶联物的其它毒素包括：有毒的凝集素、植物毒素如蓖麻毒蛋白、相思豆毒蛋白、蒴莲根毒素、肉毒杆菌毒素和白喉毒素。当然，也可将各种毒素的组合偶联于一个抗体分子，从而获得可变的细胞毒性。适合用于本发明联合治疗的毒素的例子是蓖麻毒蛋白、相思豆毒蛋白、核糖核酸酶、DNA酶I、葡萄球菌肠毒素-A、美洲商陆抗-病毒蛋白、白树毒素、白喉毒素、假单胞菌外毒素和假单胞菌内毒素。参见例如，Pastan等，Cell，47:641(1986),Goldenberg等，Cancer Journal for Clinicians，44:43(1994)。可以使用的酶活性毒素及其片段包括白喉A链、白喉毒素的非结合活性片段、外毒素A链(来自绿脓假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa))、蓖麻毒蛋白A链、相思豆毒蛋白A链、蒴莲根毒素A链、α-帚曲菌素、油桐(Aleurites fordii)蛋白、石竹素蛋白、美洲商陆(Phytolacaamericana)蛋白(PAPI、PAPII和PAP-S)、苦瓜(Momordica charantia)抑制剂、麻疯树毒蛋白、巴豆毒蛋白、肥皂草(Sapaonaria officinalis)抑制剂、白树毒素、迈托毒素(mitogellin)、局限曲菌素、酚霉素、依诺霉素和单端孢霉烯族毒素(tricothecenes)。参见例如，1993年10月28日公开的WO 93/21232。

合适的毒素和化疗药参见《雷明顿药物科学》(Remington’s PharmaceuticalSciences)，第19版(马克出版公司(Mack Publishing Co.)，1995)以及Goodman和Gilman的《治疗的药理学基础》(The Pharmacological Basis of Therapeutics)，第7版(麦克米兰出版公司(MacMillan Publishing Co.)1985)。本领域技术人员了解其它合适的毒素和/或化疗药。

本发明还包括含有或偶联适用于诊断目的的放射性物质的抗体(包括抗体片段或其变体)。合适的放射性物质的例子包括但不限于：碘(¹²¹I、¹²³I、¹²⁵I、¹³¹I)、碳(¹⁴C)、硫(³⁵S)、氚(³H)、铟(¹¹¹In、¹¹²In、^113mIn、^115mIn)、锝(⁹⁹Tc、^99mTc)、铊(²⁰¹Ti)、镓(^68Ga、⁶⁷Ga)、钯(¹⁰³Pd)、钼(⁹⁹Mo)、氙(¹³⁵Xe)、氟(¹⁸F)、¹⁵³Sm、¹⁷⁷Lu、¹⁵⁹Gd、¹⁴⁹Pm、¹⁴⁰La、¹⁷⁵Yb、¹⁶⁶Ho、⁹⁰Y、⁴⁷Sc、¹⁸⁶Re、¹⁸⁸Re、¹⁴²Pr、¹⁰⁵Rh和⁹⁷Ru。

另外，本发明抗-CD19抗体(包括scFv或者包含或可选地由抗体片段或其变体组成的其它分子)可偶联或连接放射性金属离子，用于治疗目的。合适的放射性离子的例子包括但不限于：α-发射体，如²¹³Bi，或其它放射性同位素，如¹⁰³Pd、¹³⁵Xe、¹³¹I、⁶⁸Ge、⁵⁷Co、⁶⁵Zn、⁸⁵Sr、³²P、³⁵S、⁹⁰Y、¹⁵³Sm、¹⁵³Gd、¹⁶⁹Yb、⁵¹Cr、⁵⁴Mn、⁷⁵Se、¹¹³Sn、⁹⁰Y、¹¹⁷Tin、¹⁸⁶Re、¹⁸⁸Re和¹⁶⁶Ho。在特定实施方式中，抗体或其片段连接于能螯合放射性金属离子与多肽的大环螯合剂，这些金属离子包括但不限于：¹⁷⁷Lu、⁹⁰Y、¹⁶⁶Ho和¹⁵³Sm。在特定实施方式中，所述大环螯合剂是1,4,7,10-四氮杂环十二烷-N,N',N",N'"-四乙酸(DOTA)。在其它特定实施方式中，DOTA通过接头分子连接于本发明抗体或其片段。本领域通常了解用于将DOTA与多肽偶联的接头分子的例子--参见例如，DeNardo等，Clin Cancer Res 4(10):2483-90，1998；Peterson等，BioconjugChem 10(4):553-7，1999；和Zimmerman等，Nucl Med Biol 26(8):943-50，1999，其全文通过引用纳入本文。

将抗体偶联于前药激活酶，所述前药激活酶能将前药(如肽酰化疗药，参见WO81/01145)转变为活性抗癌药，从而使本发明抗-CD19抗体也可用于ADEPT。参见例如，WO 88/07378和美国专利号4,975,278。用于ADEPT的免疫偶联物的酶组分包括能够作用于前药，并使其转变为更具活性的细胞毒性形式的任何酶。

可用于本发明方法的酶包括但不限于：用于将含磷酸前药转变为游离药物的碱性磷酸酶；用于将含硫酸前药转变为游离药物的芳基硫酸酯酶；用于将无毒性5-氟胞嘧啶转变为抗癌药5-氟尿嘧啶的胞嘧啶脱氨酶；用于将含肽前药转变为游离药物的蛋白酶，如沙雷菌蛋白酶、嗜热菌蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶、羧基肽酶和组织蛋白酶(如组织蛋白酶B和L)；用于转变含有D-氨基酸取代基的前药的D-丙氨酰羧基肽酶；用于将糖基化的前药转变为游离药物的糖切割酶如β-半乳糖苷酶和神经氨酸酶；用于将α-内酰胺衍生药物转变为游离药物的β-内酰胺酶；和分别用于将在胺氮上用苯氧基乙酰基或苯基乙酰基衍生的药物转变为游离药物的青霉素酰胺酶，如青霉素V酰胺酶或青霉素G酰胺酶。在本领域中称为“抗体酶”的具有酶活性的抗体也可用于将前药转变为游离的活性药物(参见例如，Massey，Nature 328:457-458(1987))。可以如本文所述制备抗体-抗体酶偶联物，以便按需将该抗体酶递送至患有B细胞恶性肿瘤的人体部位。

本发明抗体可通过本领域熟知技术共价结合于酶，这些技术包括例如，使用上述异源双功能交联剂。也可利用本领域熟知的重组DNA技术构建至少包含至少连接于酶的功能活性部分的抗-CD19抗体的抗原结合区的融合蛋白(参见例如，Neuberger等，Nature，312:604-608(1984))。

抗-CD19抗体的共价修饰也包括在本发明范围内。可通过化学合成或者对抗体进行酶学或化学切割(如果可能)实现共价修饰。抗CD19抗体的其它类型的共价修饰可通过使抗体的靶定氨基酸残基与有机衍生剂反应而引入分子内，所述有机衍生剂能够与所选侧链或者N-或C-末端残基反应。

最常见的是，半胱氨酸残基与α-卤代乙酸酯(和相应的胺)，如氯代乙酸或氯代乙酰胺反应，得到羧甲基或羧基酰氨基甲基衍生物。相似地，也可采用碘化试剂。也可通过与以下物质的反应使半胱氨酸残基衍生化：溴代三氟丙酮、α-溴-β-(5-咪唑基(imidozoyl))丙酸、氯乙酰基磷酸酯、N-烷基马来酰亚胺、3-硝基-2-吡啶基二硫化物、甲基2-吡啶基二硫化物、对氯汞苯甲酸酯、2-氯汞-4-硝基苯酚或氯代-7-硝基苯并-2--1,3-二唑。

在pH 5.5-7.0下与二乙基焦碳酸酯反应以便使组氨酰残基衍生化，因为这种物质对组氨酰侧链的特异性相对较高。也可使用对-溴苯甲酰甲基溴；可以在0.1M甲胂酸钠中，pH 6.0条件下进行该反应。

赖氨酰和氨基末端残基与琥珀酸或其它羧酸酐反应。用这些试剂衍生化具有逆转赖氨酸残基电荷的作用。适用于衍生化含α-氨基的残基和/或含ε-氨基的残基的其它试剂包括亚氨酸酯，如甲基吡啶亚氨酸甲酯(methyl picolinimidate)、磷酸吡哆醛、吡哆醛、氯代氢化硼(chloroborohydride)、三硝基苯磺酸、邻甲基异脲、2,4-戊二酮和转氨酶-催化的与乙醛酸的反应。

通过与一种或多种常规试剂反应来修饰精氨酰残基，这些试剂是苯甲酰甲醛、2,3-丁二酮、1,2-环己二酮和茚三酮。精氨酰残基的衍生化通常需要在碱性条件下进行反应，因为胍官能团的pKa高。而且，这些试剂可能与赖氨酸的ε-氨基以及精氨酸的ε-氨基发生反应。

可以对酪氨酰残基进行特定修饰，特别感兴趣的是通过与芳族重氮化合物或四硝基甲烷的反应将光谱标记引入酪氨酰残基。最常见的是，利用N-乙酰基咪唑(N-acetylimidizole)和四硝基甲烷分别形成O-乙酰基酪氨酰物质和3-硝基衍生物。利用¹²⁵I或¹³¹I碘化酪氨酰残基，以制备用于放射性免疫实验的标记蛋白。

通过与碳二亚胺(R--N＝C＝N--R’)反应选择性修饰羧基侧基(天冬氨酰或谷氨酰)，碳二亚胺中的R和R’是不同的烷基，如1-环己基-3-(2-吗啉基--4-乙基)碳二亚胺或1-乙基-3-(4-氮-4,4-二甲基戊基)碳二亚胺。而且，通过与铵离子反应将天冬氨酰和谷氨酰残基转变为天冬酰胺酰和谷氨酰胺酰残基。

谷氨酰胺酰和天冬酰胺酰残基常常脱酰胺，分别形成谷氨酰和天冬氨酰残基。这些残基在中性或碱性条件下脱酰胺。这些残基的脱酰胺形式落入本发明的范围。

其它修饰包括脯氨酸和赖氨酸的羟基化，丝氨酰或苏氨酰残基羟基的磷酸化，赖氨酸、精氨酸和组氨酸侧链的α-氨基的甲基化(T.E.Creighton，《蛋白质：结构和分子特性》(Proteins:Structure and Molecular Properties)，圣弗朗西斯科的WHF公司(W.H.Freeman and Co.，San Francisco)，第79-86页(1983))，N末端胺的乙酰化和C-末端羧基的酰胺化。

另一种类型的共价修饰包括通过化学或酶学方式将糖苷偶联于抗体。这些方法的优点在于：它们不需要在具有用于N-或O-连接糖基化的糖基化能力的宿主细胞中产生抗体。根据所用偶联方式，可将糖连接于(a)精氨酸和组氨酸，(b)游离羧基，(c)游离巯基，如半胱氨酸的游离巯基，(d)游离羟基，如丝氨酸、苏氨酸或羟基脯氨酸的游离羟基，(e)芳族残基，如苯丙氨酸、酪氨酸或色氨酸的芳族残基，或者(f)谷胺酰胺的酰胺基团。这些方法可参见1987年9月11日公开的WO 87/05330以及Aplin和Wriston，CRC Crit.Rev.Biochem.，第259-306页(1981)。

5.19.联合化疗

在其它实施方式中，抗-CD19mAb可与一种或多种其它化疗药联合给药。例如，“CVB”(1.5g/m²环磷酰胺，200-400mg/m²依托泊甙和150-200mg/m²卡莫司汀)可与本发明治疗联合使用。CVB是用于治疗非霍奇金淋巴瘤的方案(Patti等，Eur.J.Haematol.，51:18(1993))。本领域技术人员了解其它合适的联合化疗方案。参见例如Freedman等，“Non-Hodgkin’s Lymphomas(非霍奇金淋巴瘤)”，刊于《癌症医药》(Cancer Medicine)，第2卷，第3版，Holland等(编)，第2028-2068页(Lea和Febiger 1993)。例如，用于治疗中期非霍奇金淋巴瘤的第一代化疗方案包括C-MOPP(环磷酰胺、长春新碱、丙卡巴肼和氯泼尼松)和CHOP(环磷酰胺、多柔比星、长春新碱和氯泼尼松)。有用的第二代化疗方案是m-BACOD(甲氨蝶呤、博来霉素、多柔比星、环磷酰胺、长春新碱、地塞米松和甲酰四氢叶酸)，而合适的第三代方案是MACOP-B(甲氨蝶呤、多柔比星、环磷酰胺、长春新碱、氯泼尼松、博来霉素和甲酰四氢叶酸)。其它有用的药物包括丁酸苯酯和草苔虫内酯(brostatin)-1。

按照本发明，可通过联合给予抗-CD19mAb与一种或多种治疗来预防、治疗、控制或改善癌症或其一种或多种症状，所述一种或多种治疗包括化疗、放疗、激素治疗和/或生物治疗/免疫治疗。

在一个具体实施方式中，本发明方法包括给予一种或多种血管新生拮抗剂，例如但不限于：血管他丁(纤溶酶原片段)；抗血管新生性抗凝血酶III；新生血管酶(Angiozyme)；ABT-627；Bay 12-9566；贝尼芬(Benefin)；贝伐单抗；BMS-275291；软骨衍生的抑制剂(CDI)；CAI；CD59补体片段；CEP-7055；Col 3；考布他汀A-4；内皮他汀(胶原XVIII片段)；纤连蛋白片段；Gro-β；卤夫酮；肝素酶；肝素己糖片段；HMV833；人绒毛膜促性腺素(hCG)；IM-862；干扰素α/β/γ；干扰素诱导蛋白(IP-10)；白介素-12；Kringle 5(纤溶酶原片段)；马立马司他；金属蛋白酶抑制剂(TIMPs)；2-甲氧基雌二醇；MMI 270(CGS 27023A)；MoAb IMC-1C11；新伐司他(Neovastat)；NM-3；盘泽(Panzem)；PI-88；胎盘核糖核酸酶抑制剂；纤溶酶原激活物抑制剂；血小板因子-4(PF4)；普啉司他；促乳素16kD片段；多育曲菌素-相关蛋白(PRP)；PTK 787/ZK 222594；类视黄醇；索利司他；角鲨胺；SS 3304；SU 5416；SU6668；SU11248；四氢皮质醇-S；四硫钼酸盐；沙利度胺；血小板反应蛋白-1(TSP-1)；TNP-470；转化生长因子-β(TGF-b)；血管抑制素(Vasculostatin)；血管抑制因子(Vasostatin)(钙网织蛋白片段)；ZD6126；ZD 6474；法尼基转移酶抑制剂(FTI)；和二膦酸盐(bisphosphonate)(例如但不限于：阿伦膦酸盐、氯屈膦酸盐、依替膦酸盐、伊班膦酸盐、帕米膦酸、利塞膦酸盐、替鲁膦酸盐和唑来膦酸盐)。

在一个具体实施方式中，本发明方法包括给予一种或多种免疫调节剂，例如但不限于：化疗剂和非化疗免疫调节剂。化疗剂的非限制性例子包括甲氨蝶呤、环孢菌素A、来氟米特、顺铂、异环磷酰胺、紫杉烷如泰素和紫杉醇、拓扑异构酶I抑制剂(如CPT-11、拓扑替康、9-AC和GG-211)、吉西他滨、长春瑞滨、奥沙利铂、5-氟尿嘧啶(5-FU)、甲酰四氢叶酸、长春瑞滨、替莫唑胺(temodal)、松胞菌素B、短杆菌肽D、吐根碱、丝裂霉素、依托泊甙、替尼泊甙、长春新碱、长春碱、秋水仙素、多柔比星、道诺霉素、二羟基炭疽菌素二酮、米托蒽醌、光神霉素、放线菌素D、1-去氢睾酮、糖皮质激素类、普鲁卡因、丁卡因、利多卡因、普萘洛尔和嘌呤霉素同系物以及环磷酰胺。非化疗性免疫调节剂的例子包括但不限于：抗-T细胞受体抗体(例如，抗-CD4抗体(如cM-T412(波林格公司(Boeringer))，(IDEC和SKB)，mAB 4162W94，奥索克隆(Orthoclone)和OKTcdr4a(JC公司(Janssen-Cilag)))，抗-CD3抗体(如努为昂(Nuvion)(产品设计实验室(Product Design Labs))，OKT3(强生公司(Johnson&Johnson))或利妥昔(IDEC))，抗-CD5抗体(如抗-CD5蓖麻毒蛋白-连接的免疫偶联物)，抗-CD7抗体(如CHH-380(诺华公司))，抗-CD8抗体，抗CD40配体单克隆抗体(如IDEC-131(IDEC))，抗-CD52抗体(如坎帕斯1H(Ilex))，抗-CD2抗体(如MEDI-507(米迪缪尼公司，国际公开号WO 02/098370和WO 02/069904)，抗-CD11a抗体(如仙耐林(Xanelim)(基因泰克公司))和抗-B7抗体(如IDEC-114)(IDEC))；抗-细胞因子受体抗体(如抗-IFN受体抗体、抗-IL-2受体抗体(如Zenapax(蛋白质设计实验室))，抗-IL-4受体抗体，抗-IL-6受体抗体，抗-IL-10受体抗体和抗-IL-12受体抗体)，抗-细胞因子抗体(如抗-IFN抗体、抗-TNF-α抗体、抗-IL-1β抗体、抗-IL-6抗体、抗-IL-8抗体(如ABX-IL-8(阿布基尼克斯公司(Abgenix)))、抗-IL-12抗体和抗-IL-23抗体))；CTLA4-免疫球蛋白；LFA-3TIP(百集公司，国际公开号WO93/08656和美国专利号6,162,432)；可溶性细胞因子受体(如TNF-α受体的胞外结构域或其片段、IL-1β受体的胞外结构域或其片段和IL-6受体的胞外结构域或其片段)；细胞因子或其片段(如白介素(IL)-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-15、IL-23、TNF-α、TNF-β、干扰素(IFN)-α、IFN-β、IFN-γ和GM-CSF)；和抗-细胞因子抗体(如抗-IL-2抗体、抗-IL-4抗体、抗-IL-6抗体、抗-IL-10抗体、抗-IL-12抗体、抗-IL-15抗体、抗-TNF-α抗体和抗-IFN-γ抗体)和免疫特异性结合肿瘤相关抗原的抗体(如)。在某些实施方式中，免疫调节剂是除化疗药以外的免疫调节剂。在其它实施方式中，免疫调节剂是除细胞因子或造血因子，如IL-1、IL-2、IL-4、IL-12、IL-15、TNF、IFN-α、IFN-β、IFN-γ、M-CSF、G-CSF、IL-3或红细胞生成素以外的免疫调节剂。在其它实施方式中，免疫调节剂是除化疗药和细胞因子或造血因子以外的物质。

在一个具体实施方式中，本发明方法包括给予一种或多种抗炎剂，例如但不限于：非甾体抗炎药(NSAID)、甾体抗炎药、β-激动剂、抗胆碱能药和甲基黄嘌呤。NSAID的例子包括但不限于：阿司匹林、布洛芬、塞来考昔(CELEBREX^TM)、双氯芬酸(VOLTAREN^TM)、依托度酸(LODINE^TM)、非诺洛芬(NALFON^TM)、吲哚美辛(INDOCIN^TM)、酮咯酸(ketoralac)(TORADOL^TM)、奥沙普秦(DAYPRO^TM)、萘丁美酮(RELAFEN^TM)、舒林酸(CLINORIL^TM)、托马酸(tolmentin)(TOLECTIN^TM)、罗非考昔(VIOXX^TM)、萘普生(ALEVE^TM、NAPROSYN^TM)、酮洛芬(ACTRON^TM)和萘丁美酮(RELAFEN^TM)。这类NSAID通过抑制环加氧酶(如COX-1和/或COX-2)起作用。甾体抗炎药的例子包括但不限于：糖皮质激素类、地塞米松(DECADRON^TM)、可的松、氢化可的松、氯泼尼松(DELTASONE^TM)、泼尼松龙、曲安西龙、柳氮磺吡啶和类花生酸，如前列腺素、血栓烷和白三烯。

在另一具体实施方式中，本发明方法包括给予一种或多种抗病毒剂(例如，金刚烷胺、利巴韦林、金刚乙胺、阿昔洛韦、泛昔洛韦、膦甲酸、更昔洛韦、三氟尿苷、阿糖腺苷、去羟肌苷、司他夫定、扎西他滨、齐多夫定、干扰素)；抗生素(如放线菌素d(以前称为放线菌素)、博来霉素、光神霉素和氨茴霉素(AMC))；止吐剂(如阿普唑仑、地塞米松、多潘立酮、屈大麻酚、氟哌利多、格拉司琼、氟哌啶醇、氟哌啶醇、劳拉西泮(iorazepam)、甲泼尼龙、甲氧氯普胺、大麻隆、昂丹司琼、丙氯拉嗪)；抗真菌剂(如两性霉素、克霉唑、益康唑、氟康唑、氟代胞嘧啶、灰黄霉素、伊曲康唑、酮康唑、咪康唑和制霉菌素)；抗寄生虫药(如脱氢吐根碱、糠酸二氯尼特、吐根碱、甲氟喹、美拉胂醇、甲硝唑、硝呋替莫、巴龙霉素、喷他必定(pentabidine)、羟乙磺酸喷他脒、伯氨喹、阿的平、奎尼丁)或它们的组合。

可用于本发明各种实施方式，包括药物组合物、剂型和药盒的抗癌剂的具体例子包括但不限于：阿西维辛；阿柔比星；盐酸阿考达唑；阿克罗宁；阿多来新；阿地白介素；六甲蜜胺；安波霉素；乙酸阿美蒽醌；氨鲁米特；安吖啶；阿那曲唑；氨茴霉素；天冬酰胺酶；曲林菌素；阿扎胞苷；阿扎替派；阿佐霉素；巴马司他；苯佐替派；比卡鲁胺；盐酸比生群；二甲磺酸双奈法德；比折来新；硫酸博来霉素；布喹那钠；溴匹立明；白消安；放线菌素c；卡普睾酮；卡醋胺；卡贝替姆；卡铂；卡莫司汀；盐酸卡柔比星；卡折来新；西地芬戈；苯丁酸氮芥；西罗霉素；顺铂；克拉屈滨；甲磺酸克立那托；环磷酰胺；阿糖胞苷；达卡巴嗪；放线菌素d；盐酸道诺霉素；地西他滨；右奥马铂；地扎胍宁；甲磺酸地扎胍宁；地吖醌；多西他赛；多柔比星；盐酸多柔比星；屈洛昔芬；柠檬酸屈洛昔芬；丙酸屈他雄酮；达佐霉素；依达曲沙；盐酸依氟鸟氨酸；依沙芦星；恩洛铂；恩普氨酯；依匹哌啶；盐酸表柔比星；厄布洛唑；盐酸依索比星；雌莫司汀；雌莫司汀磷酸钠；依他硝唑；依托泊甙；磷酸依托泊甙；氯苯乙嘧胺；盐酸法倔唑；法扎拉滨；芬维A胺；氟尿苷；磷酸氟达拉滨；氟尿嘧啶；氟西他滨；磷喹酮；福司曲星钠；吉西他滨；盐酸吉西他滨；羟基脲；盐酸黄胆素；异环磷酰胺；伊莫福新；白介素II(包括重组白介素II或rIL2)，干扰素α-2a；干扰素α-2b；干扰素α-n1；干扰素α-n3；干扰素β-Ia；干扰素γ-Ib；异丙铂；盐酸伊立替康；兰乙酸瑞肽；来曲唑；乙酸亮丙瑞林；盐酸利阿唑；洛美曲索钠；洛莫司汀；盐酸洛索蒽醌；马索罗酚；美登素；盐酸双氯乙基甲胺；乙酸甲地孕酮；乙酸美仑孕酮；美法仑；美诺立尔；巯基嘌呤；甲氨蝶呤；甲氨蝶呤钠；氯苯氨啶；美妥替哌；米丁度胺；米托卡星；丝裂红素；丝林霉素；米托马星；丝裂霉素；米托司培；米托坦；盐酸米托蒽醌；霉酚酸；诺考达唑；诺拉霉素；奥马铂；奥昔舒仑；紫杉醇；培门冬酶；培利霉素；溴新斯的明；硫酸培洛霉素；培磷酰胺；哌泊溴烷；哌泊舒凡；盐酸吡罗蒽醌；普卡霉素；普洛美坦；卟菲尔钠钠；泊非霉素；泼尼莫司汀；盐酸丙卡巴肼；嘌呤霉素；盐酸嘌呤霉素；吡唑呋喃菌素；利波腺苷；罗谷亚胺；沙芬戈；盐酸沙芬戈；司莫司汀；辛曲秦；磷乙酰天冬氨酸钠；司帕霉素；盐酸锗螺胺；螺莫司汀；螺铂；链黑霉素；链佐星；磺氯苯脲；他利霉素；替可加兰钠；替加氟；盐酸替洛蒽醌；替莫泊芬；替尼泊苷；替罗昔隆；睾内酪；硫咪嘌呤；硫鸟嘌呤；硫替派；噻唑呋林；替拉扎明；柠檬酸托瑞米芬；乙酸曲托龙；磷酸曲西立滨；三甲曲沙；葡糖醛酸三甲曲沙；曲普瑞林；盐酸妥布氯唑；乌拉莫司汀；乌瑞替派；伐普肽；维替泊芬；硫酸长春碱；硫酸长春新碱；长春地辛；硫酸长春地辛；硫酸长春匹定；硫酸长春甘酯；硫酸长春罗新；酒石酸长春瑞滨；硫酸长春罗定；硫酸长春利定；伏氯唑；折尼铂；净司他丁；盐酸佐柔比星。其它抗癌药包括但不限于：20-表-1,25二羟基维生素D3；5-乙炔基尿嘧啶；阿比特龙；阿柔比星；酰基富烯；腺环戊醇(adecypenol)；阿多来新；阿地白介素；ALL-TK拮抗剂；六甲蜜胺；氨莫司汀；阿米多斯(amidox)；氨磷汀；氨基乙酰丙酸；氨柔比星；安吖啶；阿那格雷；阿那曲唑；穿心莲内酯；血管新生抑制剂；拮抗剂D；拮抗剂G；安雷利克斯；抗背部化形态发生蛋白-1；抗雄激素物质，前列腺癌；抗雌激素物质；抗癌肽；反义寡核苷酸；甘氨酸阿非迪霉素；凋亡基因调节剂；凋亡调节剂；脱嘌呤核酸；阿糖(ara)-CDP-DL-PTBA；精氨酸脱氨酶；阿苏克膦(asulacrine)；阿他美坦；阿莫司汀；阿西他汀(axinastatin)1；阿西他汀2；阿西他汀3；阿扎司琼；阿扎毒素；重氮酪氨酸；浆果赤霉素III衍生物；巴拉醇(balanol)；巴马司他；BCR/ABL拮抗剂；苯并二氢卟酚(benzochlorin)；苯甲酰星孢素；β内酰胺衍生物；β-阿里辛(β-alethine)；贝塔克拉霉素(betaclamycin)B；桦木酸；bFGF抑制剂；比卡鲁胺；比生群；双氮丙啶精胺；双奈法德；比特迪尼(bistratene)A；比折来新；贝伏特(breflate)；溴匹立明；布度钛；丁基硫堇亚胺；卡泊三醇；卡弗他丁(calphostin)C；喜树碱衍生物；金丝雀痘IL-2；卡培他滨；羧酰胺-氨基-三唑；羧基酰胺三唑；CaRest M3；CARN 700；软骨衍生的抑制剂；卡折来新；酪蛋白激酶抑制剂(ICOS)；澳粟精胺；杀菌肽B；西曲瑞克；双氢叶吩(chlorlns)；氯代喹喔啉磺酰胺；西卡前列素；顺-卟啉；克拉屈滨；恩氯米芬类似物；克霉唑；克利霉素(collismycin)A；克利霉素B；考布他汀A4；考布他汀类似物；克纳宁(conagenin)；科莱贝司丁(crambescidin)816；克立那托；自念珠藻环肽(cryptophycin)8；自念珠藻环肽A衍生物；麻疯树毒蛋白(curacin)A；环戊蒽醌(cyclopentanthraquinone)；环普拉坦(cycloplatam)；塞培霉素(cypemycin)；阿糖胞苷十八烷基磷酸钠；细胞裂解因子；磷酸己烷雌酚(cytostatin)；达昔单抗；地西他滨；脱氢代代宁B；地洛瑞林；地塞米松；右异环磷酰胺；右雷佐生；右维拉帕米；地吖醌；代代宁B；二羟基苯并氧肟酸(didox)；二乙基正精胺；二氢-5-氮杂胞苷；二氢紫杉醇，9-；二氧霉素(dioxamycin)；二苯基螺莫斯汀；多西他赛；二十二烷醇；多拉司琼；去氧氟尿苷；屈洛昔芬；屈大麻酚；多卡霉素SA；依布硒；依考莫司汀；依地福新；依决洛单抗；依氟鸟氨酸；榄香烯；乙嘧替氟；表柔比星；依立雄胺；雌莫司汀类似物；雌激素激动剂；雌激素拮抗剂；依他硝唑；磷酸依托泊甙；依西美坦；法倔唑；法扎拉滨；芬维A胺；非格司亭；非那雄胺；黄皮酮(flavopiridol)；氟卓斯汀；夫卢丝龙(fluasterone)；氟达拉滨；盐酸氟代柔红霉素(fluorodaunorunicin)；福酚美克；福美坦；福司曲星；福莫司汀；德卟啉钆(gadolinium texaphyrin)；硝酸镓；加洛他滨；加尼瑞克；明胶酶抑制剂；吉西他滨；谷胱甘肽抑制剂；赫舒反(hepsulfam)；调蛋白；环己基双乙酰胺；金丝桃蒽酮；伊班膦酸；黄胆素；艾多昔芬；伊决孟酮；伊莫福新；伊洛马司他；咪唑并吖啶酮；咪喹莫特；免疫刺激肽；胰岛素样生长因子-1受体抑制剂；干扰素激动剂；干扰素；白介素；碘苄胍；碘阿霉素；甘薯苦醇，4-；伊罗普拉；伊索拉定；异本格唑(isobengazole)；异高软海绵素(isohomohalicondrin)B；伊他司琼；结丝立得(jasplakinolide)；卡哈拉得(kahalalide)F；片螺素(lamellarin)-N三乙酸；兰瑞肽；雷纳霉素(leinamycin)；来格司亭；硫酸蘑菇多糖；莱托斯汀(leptolstatin)；来曲唑；白血病抑制因子；白细胞α干扰素；亮丙瑞林+雌激素+孕酮；亮丙瑞林；左旋咪唑；利阿唑；直链多胺类似物；亲脂性二糖肽；亲脂性铂化合物；利索纳得(lissoclinamide)7；洛铂；胍乙基磷酸丝氨酸；洛美曲索；氯尼达明；洛索蒽醌；HMG-CoA还原酶抑制剂(例如但不限于，洛伐他汀，普伐他汀，氟伐他汀，他汀，辛伐他汀和阿托伐他汀)；洛索立宾；勒托替康；德卟啉镥(lutetium texaphyrin)；莱索菲林(lysofylline)；细胞裂解肽；美坦新；慢诺他汀(mannostatin)A；马立马司他；马索罗酚；马斯平(maspin)；基质溶解因子抑制剂；基质金属蛋白酶抑制剂；美诺立尔；硫巴妥苯胺；美替瑞林；甲硫氨酸酶；甲氧氯普胺；MIF抑制剂；米非司酮；米替福新；米立司亭；错配的双链RNA；米托胍腙；二溴卫矛醇；丝裂霉素类似物；米托萘胺；米托毒素(mitotoxin)成纤维细胞生长因子-皂草毒蛋白；米托蒽醌；莫法罗汀；莫拉司亭；单克隆抗体，人绒毛膜促性腺激素；单磷酰基脂质A+分枝杆菌细胞壁骨架；莫哌达醇；多药耐药基因抑制剂；基于多肿瘤抑制物1的治疗；芥类抗癌剂；印度洋海绵(mycaperoxide)B；分枝杆菌细胞壁提取物；米亚普龙(myriaporone)；N-乙酰基地那林；N-取代的苯甲酰胺；那法瑞林；那瑞替喷(nagrestip)；纳洛酮+镇痛新；纳帕英(napavin)；萘萜二醇(naphterpin)；那托司亭；奈达铂；奈莫柔比星；奈立膦酸；中性内肽酶；尼鲁米特；尼萨霉素(nisamycin)；氮氧化物调节剂；硝基氧抗氧化剂；尼多林(nitrullyn)；O6-苄基鸟嘌呤；奥曲肽；奥可斯酮(okicenone)；寡核苷酸；奥那司酮；昂丹司琼；昂丹司琼；奥莱辛(oracin)；口服细胞因子诱导物；奥马铂；奥沙特隆；奥沙利铂；氧杂奥诺霉素(oxaunomycin)；紫杉醇；紫杉醇类似物；紫杉醇衍生物；帕劳胺(palauamine)；棕榈酰根霉素；帕米磷酸；人参炔三醇；帕诺米芬；副菌铁素(parabactin)；帕折普汀；培门冬酶；培得星；戊聚硫钠；喷司他丁；喷托唑(pentrozole)；全氟溴烷；培磷酰胺；紫苏子醇；苯那霉素(phenazinomycin)；乙酸苯酯(phenylacetate)；磷酸酶抑制剂；皮西巴尼(picibanil)；盐酸匹鲁卡品；吡柔比星；吡曲克辛；胎盘素(placetin)A；胎盘素B；纤溶酶原激活物抑制剂；铂络合物；铂化合物；铂-三胺络合物；卟菲尔钠；泊非霉素；氯泼尼松；丙基双吖啶酮；前列腺素J2；蛋白酶体抑制剂；基于蛋白A的免疫调节剂；蛋白激酶C抑制剂；蛋白激酶C抑制剂，微藻(microalgal)；蛋白质酪氨酸磷酸酶抑制剂；嘌呤核苷磷酸化酶抑制剂；红紫素；吡唑啉吖啶；吡哆醛化的血红蛋白聚氧乙烯偶联物；raf拮抗剂；雷替曲塞；雷莫司琼；ras法尼基蛋白转移酶抑制剂；ras抑制剂；ras-GAP抑制剂；去甲基化的瑞替普汀；依替膦酸铼Re186；根霉素；核酶；RII维甲酰胺(retinamide)；罗谷亚胺；罗希吐碱(rohitukine)；罗莫肽；罗喹美克；卢比格酮(rubiginone)B1；卢伯西(ruboxyl)；沙芬戈；伞托平(saintopin)；SarCNU；萨可菲醇(sarcophytol)A；沙格司亭；Sdi 1模拟物；司莫司汀；衰老衍生的抑制剂1；有义寡核苷酸；信号转导抑制剂；信号转导调节剂；单链抗原结合蛋白；西佐喃；索布佐生；硼卡钠；苯基乙酸钠；索尔醇(solverol)；生长调节素结合蛋白；索纳明；膦门冬酸；斯卡霉素(spicamycin)D；螺莫司汀；脾脏五肽(splenopentin)；海绵他汀(spongistatin)1；角鲨胺；干细胞抑制剂；干细胞分裂抑制剂；斯提酰胺(stipiamide)；基质分解素抑制剂；斯菲诺辛(sulfinosine)；强效血管活性肠肽拮抗剂；素拉迪塔(suradista)；苏拉明；苦马豆碱；合成粘多糖；他莫司汀；他莫昔芬甲碘化物；牛磺莫司汀；他扎罗汀；替可加兰钠；替加氟；碲吡喃洋(tellurapyrylium)；端粒酶抑制剂；替莫泊芬；替莫唑胺；替尼泊苷；十氧化四氯(tetrachlorodecaoxide)；四佐胺(tetrazomine)；泰立拉汀(thaliblastine)；噻可拉林；血小板生成素；血小板生成素模拟物；胸腺法新；胸腺生成素受体激动剂；胸腺曲南；促甲状腺激素；本紫红素乙酯锡；替拉扎明；二氯环戊二烯钛；拓扑森汀(topsentin)；托瑞米芬；全能干细胞因子；翻译抑制剂；维甲酸；三乙酰基尿苷；曲西立滨；三甲曲沙；曲普瑞林；托烷司琼；妥罗雄脲；酪氨酸激酶抑制剂；酪氨酸磷酸化抑制剂(tyrphostin)；UBC抑制剂；乌苯美司；泌尿生殖窦衍生的生长抑制因子；脲激酶受体拮抗剂；伐普肽；瓦立奥林(variolin)B；载体系统，红细胞基因治疗；维拉雷琐；藜芦明；瓦尔丁(verdins)；维替泊芬；长春瑞滨；威科萨汀(vinxaltine)；维他辛伏氯唑；扎诺特隆；折尼铂；亚苄维C；和净司他丁斯酯。其它抗癌药是5-氟尿嘧啶和甲酰四氢叶酸。这两种药物可用于使用沙利度胺和拓扑异构酶抑制剂的方法。在特定实施方式中，抗癌剂不是化疗药。

在更具体的实施方式中，本发明也包括联合给予抗-CD19 mAb和一种或多种治疗，以治疗乳腺癌、卵巢癌、黑色素瘤，前列腺癌、结肠癌和肺癌(如上所述)，这些治疗包括但不限于：如表1所示的抗癌剂。用于联合治疗时可降低表2所列的给药剂量和/或给药频率。

表2：抗癌剂

本发明也包括联合给予抗-CD19mAb和放疗，放疗包括使用X射线、γ射线和其它放射来源，以摧毁癌细胞。在具体实施方式中，以外束放疗或远距治疗形式给予放疗，其中射线由远程源发出。在其它实施方式中，以内部治疗或近程治疗的形式给予放疗，其中放射源放置在体内接近癌细胞或肿瘤的地方。

本领域了解癌症治疗和其剂量、给药途径和推荐用法，这类文献包括例如《医师案头参考》(Physician’s Desk Reference)(第56版，2002)。

5.20.药物组合物

本发明也涉及治疗人对象的B细胞疾病和失调(包括例如但不限于B细胞恶性肿瘤)的免疫治疗性组合物和方法，涉及治疗和预防人体移植物接受者的GVHD、移植物排斥和移植后淋巴细胞增殖性疾病的免疫治疗性组合物和方法，涉及治疗人对象的自身免疫疾病和失调的免疫治疗性组合物和方法，这些组合物和方法包括利用结合CD19抗原并可介导人ADCC的治疗性抗体。

本发明涉及含有IgG1或IgG3人同种型的人、人源化或嵌合的抗-CD19抗体的药物组合物。本发明也涉及包含可介导人ADCC的IgG2或IgG4人同种型的人或人源化抗-CD19抗体的药物组合物。在某些实施方式中，本发明也涉及包含可由本领域已知方式产生的人、人源化或嵌合的单克隆抗-CD19抗体的药物组合物。

描述了用于治疗诊断患有衍生自B细胞和其前体的B细胞恶性肿瘤的人对象的治疗制剂和方案，所述B细胞恶性肿瘤包括但不限于：急性淋巴细胞性白血病(ALL)、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、B细胞慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、多发性骨髓瘤、滤泡性淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、幼淋巴细胞白血病、多毛细胞白血病、普通急性淋巴细胞性白血病和一些非急性淋巴细胞性白血病。

在其它具体实施方式中，抗-CD19抗体可介导ADCC、补体依赖性细胞毒性凋亡。与其它B细胞导向的免疫治疗相比，本发明组合物和方法也具有靶向更广泛B细胞群的优点。例如，本发明抗-CD19抗体可以有效靶向骨髓细胞、循环B细胞和成熟的抗体分泌型B细胞。因此，本发明方法和组合物可有效减少或消耗循环B细胞以及循环免疫球蛋白。

因此，在一个方面，本发明提供用于治疗和预防GVHD、移植物排斥和移植后淋巴增生性疾病的组合物和方法，与靶向性较低的治疗剂和方案相比，所述组合物和方法的并发症较少和/或严重程度较低。在一个实施方式中，与不使用本发明方法和组合物时相比，使用本发明组合物和方法时传统治疗剂的剂量较低。在另一实施方式中，本发明组合物和方法不需要较为严苛的治疗形式，如放疗、高剂量化疗或脾切除术。

在某些实施方式中，可在移植之前或之后，单独给予或与治疗或预防GVHD和移植物排斥的其它治疗剂或方案联合给予移植物接受者抗CD19抗体和组合物。例如，可以在植入同种移植物之前或之后，利用抗CD19抗体和组合物消耗移植物接受者的同种抗体。还可利用抗-CD19抗体和组合物在移植前离体消耗移植物中产生抗体的细胞，或在供体中消耗，或预防GVHD和移植物排斥。

5.21.药物制剂、给药和剂量

本发明药物制剂含有人、人源化或嵌合的抗-CD19抗体作为活性成分。该制剂含有裸露抗体、免疫偶联物或融合蛋白，其含量能以适合给予人患者的重量或体积单位有效产生所需反应，该制剂优选无菌。所述反应可通过(例如)测定抗-CD19抗体组合物的生理作用进行确定，例如但不限于：循环B细胞消耗、组织B细胞消耗、B细胞恶性肿瘤消退或疾病症状减轻。其它分析是本领域普通技术人员已知的，也可用于测定该反应的水平。

5.22.药物制剂

可利用药学上可接受的载体配制抗-CD19抗体组合物。术语“药学上可接受的”指不干扰活性成分生物学活性的有效性的一种或多种无毒物质。这类制剂通常可含有盐、缓冲剂、防腐剂、相容性载体和任选的其它治疗剂。这类药学上可接受的制剂通常也可包含适合给予人的相容性固体或液体填料、稀释剂或包囊材料。用于医药时，盐应该是药学上可接受的盐，但可方便地使用非药学上可接受的盐来制备药学上可接受的盐，不能将它们排除在本发明范围以外。这类药理学和药学上可接受的盐包括但不限于由以下酸制备的盐：氢氯酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸、马来酸、乙酸、水杨酸、柠檬酸、硼酸、甲酸、丙二酸、琥珀酸等。药学上可接受的盐也可制备成碱金属盐或碱土金属盐，如钠盐、钾盐或钙盐。术语“载体”指有机或无机的天然或合成成分，将载体与活性成分混合以便于应用。药物组合物的各组分也能够与本发明抗体混合或互相混合，使其相互作用基本上不会削弱所需的药学功效。

按照本发明的某些方面，可将具有所需纯度的抗体或免疫偶联物与任选的生理学可接受载体、赋形剂或稳定剂(《雷明顿药物科学》(Remington’s PharmaceuticalSciences)，第16版，Osol，A.编(1999))混合，以制备用于储存的冻干制剂或水溶液形式的抗-CD19抗体组合物。在所用剂量和浓度下，可接受的载体、赋形剂或稳定剂对接受者无毒，包括：缓冲剂如磷酸盐、柠檬酸盐和其它有机酸缓冲剂；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(如十八烷基二甲基苄基氯化铵；氯化六烃季铵；苯扎氯铵、苄索氯铵；苯酚、丁基或苄基醇；对羟基苯甲酸烷酯，如对羟基苯甲酸甲酯或丙酯；邻苯二酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚)；低分子量(小于约10个残基)的多肽；蛋白质，如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，如甘氨酸、谷胺酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其它糖，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，如EDTA；糖，如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨糖醇；形成盐的抗衡离子，如钠；金属络合物(如Zn-蛋白质络合物)；和/或非离子型表面活性剂，如吐温、普罗流尼克(PLURONICS)^TM或聚乙二醇(PEG)。

任选地，抗-CD19抗体组合物也含有合适防腐剂，如苯扎氯铵；氯丁醇；对羟基苯甲酸酯类和硫柳汞。

抗-CD19抗体组合物可以是方便的单位剂型，可通过药学领域熟知的任何方法制造。所有方法均包括使活性成分与一种或多种构成附加成分的载体相结合的步骤。通常，使活性化合物与液体载体、细分固体载体或二者均均且紧密地结合，然后在需要时使该产品成型，从而制备抗-CD19抗体组合物。

适合胃肠道外给药的组合物通常包括水性或非水性的抗-CD19抗体无菌制剂，其优选与接受者血液等渗。可利用合适的分散剂或湿润剂和助悬剂，按照已知方法配制该制剂。该无菌注射剂也可以是胃肠外可接受的无毒稀释剂或溶剂配制的无菌注射溶液或混悬液，例如，1,3-丁二醇配制的溶液。可以使用的可接受的运载体和溶剂是水、林格溶液和等张氯化钠溶液。此外，通常采用无菌非挥发油作为溶剂或悬浮介质。出于此种目的，可采用任何刺激性小的非挥发油，包括合成的甘油单酯或甘油二酯。此外，注射剂中也可使用脂肪酸如油酸。适合口服、皮下、静脉内、肌内等给药途径的载体制剂可参见《雷明顿药物科学》(Remington’s Pharmaceutical Sciences)，宾夕法尼亚州伊斯顿的马克出版公司(MackPublishing Co.，Easton，PA)。在某些实施方式中，适合各种给药途径的载体制剂可能与利妥昔^TM所述相同或相似。参见《医师案头参考》(新泽西州蒙特威尔的医学经济学公司(Medical Economics Company，Inc.，Montvale，NJ)，2005)，第958-960页和第1354-1357页，通过参考全文纳入本文。在本发明的某些实施方式中，将抗-CD19抗体组合物与氯化钠、二水合枸橼酸钠、聚山梨酯80和无菌水配制在一起，用于静脉内给药，其中将所述组合物的pH调节为约6.5。本领域技术人员了解，静脉内注射是一种使抗体快速分布在整个循环系统中的有用的给药方式。然而，静脉内给药受到包括血管内皮细胞和皮下基质的血管屏障的限制。另外，对实体瘤摄入治疗性抗体而言，血管屏障是更显著的问题。淋巴瘤的血液流动速度较高，有利于抗体的有效递送。淋巴内给药途径，如皮下或肌内注射，或淋巴管插管，也提供了一种可用于治疗B细胞淋巴瘤的有用方式。在某些实施方式中，本发明组合物和方法中的抗-CD19抗体是自身皮下给予的。在这类实施方式中，将该组合物配制成冻干药物或配制在液体缓冲液(如PBS和/或柠檬酸盐缓冲液)中，浓度约为50mg/mL。

根据所治疗特定适应症的需要，本文制剂也可含有一种以上活性化合物，优选相互间不会产生不良影响的具有补充活性的化合物。例如，可能还需要提供免疫抑制剂。这种分子适合以有效用于所需目的的用量联合存在。

活性成分也可包入通过(例如)凝聚技术或界面聚合制备的微胶囊中，例子分别是羟甲基纤维素或明胶-微胶囊和聚-(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊，或包入胶体药物递送系统(例如脂质体、白蛋白微球、微乳、纳米颗粒和纳米胶囊)或包入大乳液(macroemulsion)中。这类技术可参见《雷明顿药物科学》第16版，Osol，A.编(1980)。

用于体内给药的制剂一般是无菌的。这不难通过无菌滤膜过滤来实现。

可制备缓释制剂。缓释制剂的合适例子包括含有抗-CD19抗体的固体疏水性聚合物的半渗透基质，该基质是成型制品形式，例如膜或微胶囊。缓释基质的例子包括聚酯、水凝胶(例如，聚(2-羟乙基-甲基丙烯酸酯)或聚(乙烯醇))，聚丙交酯(美国专利号3,773,919)，L-谷氨酸和γ-乙基-L-谷氨酸的共聚物，不可降解的乙烯-乙酸乙烯酯，可降解的乳酸-乙醇酸共聚物如LUPRON DEPOT^TM(由乳酸-乙醇酸共聚物和乙酸亮丙瑞林组成的可注射微球)和聚-D-(-)-3-羟基丁酸。虽然诸如乙烯-乙酸乙烯酯和乳酸-乙醇酸等聚合物能够在超过100天中释放分子，但某些水凝胶能在较短时间内释放蛋白质。包入胶囊的抗体长期留存于体内时，它们可能因接触37℃和水分而变性或聚集，导致生物学活性降低、免疫原型可能改变。可设计合理方案，以依据所涉及的机理实现稳定化。例如，如果发现聚集机制是分子间通过巯基-二硫键互换形成S-S键，则可通过修饰巯基残基、由酸性溶液冻干、控制水分含量、使用合适添加剂和开发特定聚合物基质组成来实现稳定化。在某些实施方式中，用于本发明组合物的药学上可接受的载体不影响人ADCC或CDC。

本文所述的抗-CD19抗体组合物也可配制成免疫脂质体。“脂质体”是由不同类型的脂质、磷脂和/或表面活性剂组成的小囊泡，它可用于向人递送药物(如本文所述的抗-CD19抗体)。脂质体的组分通常排列成双层形式，类似于生物膜的脂质排列。可通过本领域已知方法制备含有本发明抗体的脂质体，这些方法参见例如Epstein等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，82:3688(1985)；Hwang等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，77:4030(1980)；和美国专利4,485,045和4,544,545。循环时间延长的脂质体参见美国专利号5,013,556。可通过反相蒸发方法，利用包含磷脂酰胆碱、胆固醇和PEG-衍生的磷脂酰乙醇胺(PEG-PE)的液体组合物产生特别有用的脂质体。使脂质体通过孔隙大小确定的滤器挤出，以得到具有所需直径的脂质体。可以如Martin等，J.Biol.Chem.，257:286-288(1982)所述，通过二硫互换反应将本发明抗体偶联于脂质体。脂质体中也可含有治疗剂。参见Gabizon等，J.National Cancer Inst.，(19)1484(1989)。

一些药物制剂包括但不限于：

(a)静脉内(i.v.)给予抗-CD19抗体的无菌、无防腐剂的浓缩液，浓度为10mg/ml，装在100mg(10mL)或500mg(50mL)单次使用药瓶中。可利用氯化钠、二水合枸橼酸钠、聚山梨酯和无菌注射用水配制用于静脉内给药的产品。例如，可利用9.0mg/mL氯化钠、7.35mg/mL二水合柠檬酸钠、0.7mg/mL聚山梨酯80和无菌注射用水配制该产品。将pH调整为6.5。

(b)装在单次使用玻璃药瓶中，用于皮下(s.c.)注射的无菌冻干粉末。可利用蔗糖、一水合L-组氨酸盐酸盐、L-组氨酸和聚山梨酯20配制该产品。例如，各单次使用的药瓶可含有150mg抗-CD19抗体、123.2mg蔗糖、6.8mg一水合L-组氨酸盐酸盐、4.3mg L-组氨酸和3mg聚山梨酯20。用1.3ml无菌注射用水重建单次使用的药瓶，得到约1.5ml溶液，每1.25ml溶液递送125mg抗体(100mg/ml)。

(c)静脉内(i.v.)给药的无菌、无防腐剂冻干粉末。可利用二水合α-海藻糖、L-组氨酸HCl、组氨酸和聚山梨酯20USP配制该产品。例如，各药瓶可含有440mg抗-CD19抗体、400mg二水合α,α-海藻糖、9.9mg L-组氨酸HCl、6.4mg L-组氨酸和1.8mg聚山梨酯20，USP。利用含1.1％苯甲醇作防腐剂的20ml抑菌性注射用水(BWFI)，USP重建后得到含有21mg/ml抗体的多剂量溶液，其pH约为6。

(d)静脉内输注的无菌冻干粉末，其中将抗-CD19抗体与蔗糖、聚山梨酯、一水合磷酸二氢钠和二水合磷酸氢二钠配制在一起。例如，各单次使用的药瓶可含有100mg抗体、500mg蔗糖、0.5mg聚山梨酯80、2.2mg一水合磷酸二氢钠和6.1mg磷酸氢二钠。不含防腐剂。用10ml无菌注射用水，USP重建后，得到的pH约为7.2。

(e)皮下给药的无菌、无防腐剂溶液，其装在单次使用的1ml预填充的注射器中。可用氯化钠、二水合磷酸二氢钠、二水合磷酸氢二钠、枸橼酸钠、一水合柠檬酸、甘露醇、聚山梨酯80和注射用水，USP配制该产品。可加入氢氧化钠，将pH调节至约5.2。

例如，可将各注射器配制成能递送0.8ml(40mg)药品。每0.8ml包含40mg抗-CD19抗体、4.93mg氯化钠、0.69mg二水合磷酸二氢钠、1.22mg二水合磷酸氢二钠、0.24mg柠檬酸钠、1.04一水合柠檬酸、9.6mg甘露醇、0.8mg聚山梨酯80和注射用水，USP。

(f)装在单次使用药瓶中的无菌、无防腐剂的冻干粉末，用无菌注射用水(SWFI)，USP重建后，通过皮下(s.c.)注射给药。可用蔗糖、一水合组氨酸盐酸盐、L-组氨酸和聚山梨酯配制该产品。例如，75mg药瓶中可装有129.6mg或112.5mg抗-CD19抗体、93.1mg蔗糖、1.8mg一水合L-组氨酸盐酸盐、1.2mg L-组氨酸和0.3mg聚山梨酯20，经设计用0.9ml SWFI，USP重建后0.6ml递送75mg抗体。150mg药瓶可装有202.5mg或175mg抗-CD19抗体、145.5mg蔗糖、2.8mg一水合L-组氨酸盐酸盐，1.8mg L-组氨酸和0.5mg聚山梨酯20，经设计用1.4mlSWFI，USP重建后1.2ml递送150mg抗体。

(g)用无菌注射用水重建的无菌冻干产品。可利用甘露醇、组氨酸和甘氨酸将该产品配制成单次使用的药瓶，用于肌内(IM)注射。例如，各单次使用的药瓶可装有100mg抗-CD19抗体、67.5mg甘露醇、8.7mg组氨酸和0.3mg甘氨酸，经设计用1.0ml注射用水重建后1.0ml递送100mg抗体。例如，各单次使用的药瓶可装有50mg抗-CD19抗体、40.5mg甘露醇、5.2mg组氨酸和0.2mg甘氨酸，经设计用0.6ml注射用水重建后递送50mg抗体。

(h)用于肌内(IM)注射的无菌、无防腐剂溶液，浓度为100mg/ml。可利用组氨酸、甘氨酸和无菌注射用水在单次使用的药瓶中配制该产品。例如，各单次使用的药瓶中可装有体积为1.2ml的100mg抗体、4.7mg组氨酸和0.1mg甘氨酸，经设计在1ml中递送100mg抗体。例如，各单次使用的药瓶可装有体积为0.7ml或0.5ml的50mg抗体、2.7mg组氨酸和0.08mg甘氨酸，经设计0.5ml递送50mg抗体。

在某些实施方式中，本发明药物组合物在4℃下稳定。在某些实施方式中，本发明药物组合物在室温下稳定。

5.21.2.抗体半衰期

在某些实施方式中，本发明组合物和方法的抗CD19抗体的半衰期为至少约4-7天。在某些实施方式中，本发明组合物和方法的抗CD19抗体的平均半衰期为至少约2-5天，3-6天，4-7天、5-8天、6-9天、7-10天、8-11天、8-12、9-13、10-14、11-15、12-16、13-17、14-18、15-19或16-20天。在其它实施方式中，本发明组合物和方法的抗CD19抗体的平均半衰期为至少约17-21天、18-22天、19-23天、20-24天、21-25天、22-26天、23-27天、24-28天、25-29天或26-30天。在其它实施方式中，本发明组合物和方法的抗CD19抗体的半衰期可以是至多约50天。在某些实施方式中，可通过本领域已知方法延长本发明组合物和方法的抗体的半衰期。进而，这种延长可降低抗体组合物的给药量和/或给药频率。体内半衰期改善的抗体及其制备方法参见美国专利号6,277,375；和国际公开号WO 98/23289和WO 97/3461。

也可利用或不用多功能接头，通过PEG与抗体N末端或C末端的位点特异性偶联或通过赖氨酰残基上的ε-氨基，将惰性聚合物分子如高分子量聚乙二醇(PEG)连接于抗体，从而延长抗CD19抗体的体内血清循环时间。可利用导致生物活性损失最小的线型或分支聚合物衍生化。通过SDS-PAGE和质谱密切监测偶联程度，以确保PEG分子适当地偶联于所述抗体。可通过大小排阻或离子交换层析将未反应的PEG与抗体-PEG偶联物分离开。可利用本领域技术人员已知的方法，例如本文所述的免疫实验检测PEG-衍生抗体的结合活性及体内功效。

另外，可将本发明组合物和方法的抗体与白蛋白偶联，以制备在体内更稳定或体内半衰期更长的抗体。本领域熟知这些技术，参见例如国际公开号WO 93/15199、WO 93/15200和WO 01/77137；和欧洲专利号EP 413,622，通过引用将所有这些文献纳入本文。

5.21.3给药和剂量

可通过任何途径将本发明组合物给予人患者，这些途径包括但不限于：静脉内、皮内、透皮、皮下、肌内、吸入(如通过气雾剂)、含服(如舌下)、局部(即皮肤和粘膜表面，包括气道表面)、鞘内、关节内、胸膜内、大脑内、动脉内、腹膜内、口服、淋巴内、鼻内、直肠或阴道给药，通过局部导管灌注或病损内直接注射。在一个实施方式中，通过在给定时间(0.5-2小时)内静脉内推注或静脉内输注给予本发明组合物。可通过蠕动泵，或以长效制剂形式递送本发明组合物，但如本领域所了解的那样，在任何给定情况下最合适的途径取决于以下因素，例如对象的种类、年龄、性别和总体健康状况，所治疗疾病的特性和严重程度和/或所给予的特定组合物(即剂量、剂型)的特性。在具体实施方式中，给药途径是在一段时间，每周一次或每周两次推注或连续输注。在其它特定实施方式中，给药途径是皮下注射，任选每周一次或两次。在一个实施方式中，对门诊患者给予本发明的组合物和/或方法。

在某些实施方式中，包含抗CD19抗体的组合物的剂量以mg/kg患者体重为单位计量。在其它实施方式中，包含抗CD19抗体的组合物的剂量以mg/kg患者去脂体重(即体重减去体脂含量)为单位计量。在其它实施方式中，包含抗CD19抗体的组合物的剂量以mg/m²患者体表面积为单位计量。在其它实施方式中，包含抗CD19抗体的组合物的剂量以mg/给予患者的剂量为单位计量。任何剂量衡量方法均可与本发明组合物和方法联用，可通过本领域标准方式转换剂量单位。

本领域技术人员应理解，可根据多种因素选择剂量，包括对象的年龄、性别、种类和病症(如B细胞恶性肿瘤的分期)，所需的细胞消耗程度，所治疗疾病和/或所用的特定抗体或抗原结合片段，剂量可由本领域技术人员进行确定。例如，可由来自体外检测系统或动物模型(如棉鼠或猴)检测系统的剂量反应曲线外推得到本发明组合物的有效量。本领域了解评估抗体作用的模型和方法(Wooldridge等，Blood，89(8)：2994-2998(1997))，通过引用全文纳入本文)。在某些实施方式中，对特定B细胞恶性肿瘤而言，本领域的标准抗体治疗方案可用于本发明组合物和方法。

可用于本发明方法的给药方案的例子包括但不限于：每天、每周三次(间歇性)、每周或每14天。在某些实施方式中，给药方案包括但不限于：每月给药或每6-8周给药。

本领域技术人员应理解，与维持方案相比，初始治疗的剂量通常较高和/或给药频率较高。

在本发明的一些实施方式中，抗CD19抗体能结合B细胞，可导致B细胞有效消耗(即，低剂量下)(如本文所述)。当患者B细胞表面上的人CD19密度较高时，可实现较高的结合程度。在某些实施方式中，抗体(任选在药学上可接受的载体中，作为药物组合物的一部分)剂量为至少约0.0005、0.001、0.05、0.075、0.1、0.25、0.375、0.5、1、2.5、5、10、20、37.5或50mg/m²和/或小于约500、475、450、425、400、375、350、325、300、275、250、225、200、175、150、125、100、75、60、50、37.5、20、15、10、5、2.5、1、0.5、0.375、0.1、0.075或0.01mg/m²。在某些实施方式中，剂量为约0.0005-200mg/m²，约0.001-150mg/m²，约0.075-125mg/m²，约0.375-100mg/m²，约2.5-75mg/m²，约10-75mg/m²，约20-50mg/m²。在相关实施方式中，所用的抗CD19抗体剂量为至少约0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5、10、10.5、11、11.5、12、12.5、13、13.5、14、14.5、15、15.5、16、16.5、17、17.5、18、18.5、19、19.5、20、20.5mg/kg患者体重。在某些实施方式中，所用的裸露抗CD19抗体的剂量为至少约1-10、5-15、10-20或15-25mg/kg患者体重。在某些实施方式中，所用抗CD19抗体的剂量为至少约1-20、3-15或5-10mg/kg患者体重。在其它实施方式中，所用抗CD19抗体的剂量为至少约5、6、7、8、9或10mg/kg患者体重。在某些实施方式中，抗体(任选在药学上可接受的载体中，作为药物组合物的一部分)的单个剂量单位可以是至少约0.5、1、2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174、176、178、180、182、184、186、188、190、192、194、196、198、200、204、206、208、210、212、214、216、218、220、222、224、226、228、230、232、234、236、238、240、242、244、246、248或250微克/米²。在其它实施方式中，剂量为至多1克/单个剂量单位。

所有上述剂量均为示范性的，可用于本发明组合物和方法，然而当抗CD19抗体与毒素或放疗剂联合使用时，可能优选上述剂量中的较低剂量。在某些实施方式中，当患者的CD19密度水平较低时，可能优选上述剂量中的较低剂量。

在本发明的某些实施方式中，使用嵌合抗CD19抗体时，嵌合抗体的剂量或用量高于约2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或16mg/kg患者体重。在本发明的其它实施方式中，使用嵌合抗CD19抗体时，嵌合抗体的剂量或用量小于约1、0.9、0.8、0.7、0.6、0.5、0.4、0.3、0.2或0.1mg/kg患者体重。

在本发明方法的一些实施方式中，本发明抗体和/或组合物的给药剂量低于约375mg/m²；低于约37.5mg/m²；低于约0.375mg/m²；和/或约0.075mg/m²-125mg/m²。在本发明方法的某些实施方式中，剂量方案包括以重复间隔给予的低剂量。例如，在一个实施方式中，本发明组合物的给药剂量可低于约375mg/m²，给药间隔约为每1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、125、150、175或200天。

特定剂量可导致用本发明组合物和方法治疗的人的B细胞消耗持续至少约1、2、3、5、7、10、14、20、30、45、60、75、90、120、150或180天或更长时间。在某些实施方式中，消耗前B细胞(不表达表面免疫球蛋白)。在某些实施方式中，消耗成熟B细胞(表达表面免疫球蛋白)。在其它实施方式中，所有非恶性类型的B细胞均可被消耗。可利用这些类型的B细胞的任一种来测定B细胞消耗。可测定体液(如血清)或组织(如骨髓)中的B细胞消耗。在本发明方法的某些实施方式中，与使用本发明组合物和方法之前所治疗患者的B细胞水平相比，B细胞被消耗了至少30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％。在本发明方法的其它实施方式中，与人体典型的B细胞标准水平相比，B细胞被消耗了至少30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％。在相关实施方式中，利用年龄、性别、体重和其它因素与治疗患者相仿的患者测定人体典型的B细胞标准水平。

在本发明的某些实施方式中，约125mg/m²或较低剂量的抗体或抗原结合片段导致B细胞消耗持续至少约7、14、21、30、45、60、90、120、150或200天。在另一代表性实施方式中，约37.5mg/m²或更低的剂量使得B细胞消耗持续至少约7、14、21、30、45、60、90、120、150或200天。在其它实施方式中，约0.375mg/m²或更低剂量导致B细胞消耗持续至少约7、14、21、30、45或60天。在另一实施方式中，约0.075mg/m²或更低的剂量导致B细胞消耗持续至少约7、14、21、30、45、60、90、120、150或200天。在其它实施方式中，约0.01mg/m²、0.005mg/m²或甚至0.001mg/m²或更低的剂量导致B细胞消耗持续至少约3、5、7、10、14、21、30、45、60、90、120、150或200天。根据这些实施方式，可通过任何合适的途径给予该剂量，但任选通过皮下途径给予。

另一方面，本发明提供了以下发现：可以低于当前所用方法的剂量，使用抗体或抗体片段消耗B细胞和/或治疗B细胞疾病。因此，在另一实施方式中，本发明提供消耗B细胞和/或治疗B细胞疾病的方法，所述方法包括给予人有效量的特异性结合CD19的抗体，其中约500、475、450、425、400、375、350、325、300、275、250、225、200、175、150、125、100、75、60、50、37.5、20、10、5、2.5、1、0.5、0.375、0.25、0.1、0.075、0.05、0.001、0.0005mg/m²或更低的剂量导致B细胞(循环和/或组织B细胞)在至少约3、5、7、10、14、21、30、45、60、75、90、120、150、180或200天或更长时间中被消耗25％、35％、50％、60％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或更多。在代表性实施方式中，约125mg/m²或75mg/m²或更低的剂量导致B细胞在至少约7、14、21、30、60、75、90、120、150或180天中被消耗至少约50％、75％、85％或90％。在其它实施方式中，约50、37.5或10mg/m²的剂量导致B细胞在至少约7、14、21、30、60、75、90、120或180天中被消耗至少约50％、75％、85％或90％。在其它实施方式中，约0.375或0.1mg/m²的剂量导致B细胞在至少约7、14、21、30、60、75或90天中被消耗至少约50％、75％、85％或90％。在其它实施方式中，约0.075、0.01、0.001或0.0005mg/m²的剂量导致B细胞在至少约7、14、21、30或60天中被消耗至少约50％、75％、85％或90％。

在本发明的某些实施方式中，可提高或降低剂量，以便在血液或组织(例如但不限于骨髓)中维持恒定剂量。在相关实施方式中，将剂量提高或降低约2％、5％、8％、10％、15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％和95％，以维持本发明组合物和方法的所需抗体水平。

在某些实施方式中，可根据患者对本发明组合物和方法的免疫应答来调节剂量和/或降低输注速率。

根据本发明方法的一个方面，可以先给予本发明抗CD19抗体和/或组合物的加载剂量，随后给予维持剂量直到所治疗的B细胞恶性肿瘤发生进展或者随后给予确定的疗程(如CAMPATH(坎帕斯)^TM、MYLOTARG(麦罗塔)^TM或RITUXAN(利妥昔)^TM，后者允许向待治疗的患者给予确定数量的剂量，该剂量数量根据额外产生的数据而增加)。

根据本发明方法的另一方面，可利用本发明组合物和方法预治疗患者，以检测、最大程度降低免疫应答，或最大程度减少本发明组合物和方法的不良作用。

5.21.4.毒性测试

可通过标准的药学方法，在细胞培养物或实验动物中测定本发明组合物和/或治疗方案的耐受性、毒性和/或功效，例如，用于检测LD50(使50％群体死亡的剂量)、ED50(在50％群体中治疗有效的剂量)和IC50(实现50％有效抑制的剂量)。在一个实施方式中，该剂量是至少消耗60％、70％、80％、90％、95％或99％循环B细胞或循环免疫球蛋白或二者的有效剂量。毒性和疗效的剂量比是治疗指数，可表示为LD50/ED50。优选治疗指数大的疗法。虽然可采用存在毒副作用的治疗，但应仔细设计使这类药物靶向表达CD19的细胞的递送系统，以最大程度降低对CD19阴性细胞的潜在损伤，从而降低副作用。

可利用获自细胞培养实验和动物研究的数据制定人用组合物和/或治疗方案的一系列剂量。这类药物的剂量可属于毒性很小或无毒性的包含ED50在内的循环浓度范围。该剂量可根据所用剂型和所用给药途径在此范围内变化。在本发明方法中使用的任何治疗中，可通过合适的动物模型估计治疗有效剂量。根据动物模型的种类，按照本领域接受的公式，依比例确定人用剂量，如Freireich等，抗癌剂在小鼠、大鼠、猴、犬和人中的毒性的定量比较(Quantitative comparison of toxicity of anticancer agents in mouse，rat，monkey，dog，and human)，Cancer Chemotherapy Reports，NCI 1966 40:219-244所述。获自细胞培养实验的数据可用于预测潜在毒性。可利用动物研究确定具体剂量，以实现包括IC50(即，受试化合物实现半数最大症状抑制的浓度)的循环血浆浓度范围(经细胞培养测定)。可利用这些信息更精确地确定人用剂量。可通过例如高效液相色谱、ELISA或细胞实验测定血浆药物水平。

5.22.患者诊断、分期和治疗方案

肿瘤学

按照本发明的某些方面，根据许多因素选择用于本发明组合物和方法的治疗方案和剂量，这些因素包括但不限于所治疗的B细胞疾病或失调的分期。本领域技术人员可根据患者或患者群体中B细胞疾病或失调的特定分期确定合适的治疗方案。可利用本领域标准方法产生剂量反应曲线，以确定本发明组合物治疗患有不同分期B细胞疾病或失调的患者的有效量。与患有早期B细胞疾病或失调的患者相比，患有较晚期B细胞疾病或失调的患者通常需要较高的剂量和/或较高的给药频率，且给药期间可能较长。

可实施本发明抗CD19抗体、组合物和方法以治疗B细胞疾病，包括B细胞恶性肿瘤。术语“B细胞恶性肿瘤”包括任何衍生自B细胞谱系细胞的恶性肿瘤。示范性B细胞恶性肿瘤包括但不限于：B细胞亚型非霍奇金淋巴瘤(NHL)，包括低级/滤泡性NHL，小淋巴细胞性(SL)NHL，中级/滤泡性NHL，中级弥散性NHL，高级免疫母细胞性NHL，高级免疫母细胞性NHL，高级小非裂解细胞NHL；套细胞淋巴瘤和巨大疾病NHL；伯基特淋巴瘤；多发性骨髓瘤；前B急性淋巴细胞性白血病和早期B细胞前体产生的其它恶性肿瘤；普通急性淋巴细胞性白血病(ALL)；慢性淋巴细胞性白血病(CLL)，包括免疫球蛋白-突变的CLL和免疫球蛋白-未突变的CLL；多毛细胞白血病；非急性淋巴细胞性白血病；瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症；弥散性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)，包括生发中心B细胞样(GCB)DLBCL，活化的B细胞样(ABC)DLBCL和3型DLBCL；幼淋巴细胞白血病；轻链疾病；浆细胞瘤；骨硬化性骨髓瘤；浆细胞白血病；意义未明的单克隆丙种球蛋白病(MGUS)；郁积型多发性骨髓瘤(SMM)；无痛性多发性骨髓瘤(IMM)；霍奇金淋巴瘤，包括经典和结节状淋巴细胞优势型；淋巴浆细胞增多型淋巴瘤(LPL)；以及边缘区淋巴瘤，包括胃粘膜-结合性淋巴组织(MALT)淋巴瘤。

在另一个实施方式中，可利用本发明治疗成熟B细胞恶性肿瘤(即，在细胞表面上表达Ig)，所述恶性肿瘤包括但不限于：滤泡性淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、多发性骨髓瘤、弥散性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)，包括生发中心B细胞样(GCB)DLBCL，活化的B细胞样(ABC)DLBCL和3型DLBCL，霍奇金淋巴瘤，包括经典和结节状淋巴细胞优势型，淋巴浆细胞增多性淋巴瘤(LPL)，边缘区淋巴瘤，包括胃粘膜结合性淋巴组织(MALT)淋巴瘤以及慢性淋巴细胞性白血病(CLL)，包括免疫球蛋白突变的CLL和免疫球蛋白未突变的CLL。

另外，在B细胞发育过程中，CD19的表达比(例如)CD20早，因此特别适合治疗(例如)骨髓中的前B细胞和未成熟B细胞恶性肿瘤(即，不在细胞表面上表达Ig)。前B细胞和未成熟B细胞恶性肿瘤的例子包括但不限于：急性淋巴细胞性白血病。

在其它具体实施方式中，可实施本发明以治疗节外肿瘤。

5.22.1.B细胞恶性肿瘤的诊断和分期

能够形成肿瘤的癌症，如B细胞疾病或失调(如非霍奇金淋巴瘤、弥散性大B细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤和伯基特淋巴瘤)的进程特征通常是该癌症在体内扩散的程度，常常分为以下四个分期以便于预测疗效。I期：该癌症局限在特定组织内，尚未扩散到淋巴结。II期：该癌症扩散到附近的淋巴结，即转移。III期：在远离组织源的体内区域的淋巴结中发现癌症，且可能包括一团或多个肿瘤而非一个。IV期：癌症已扩散到身体远端部位。可通过临床观察和本领域技术人员熟知的检测方法确定癌症分期。上述癌症分期通常与以肿瘤形成为特征的临床癌症诊断联合使用，并且可与本发明组合物和方法联合使用以治疗B细胞疾病和失调。疾病早期通常指该疾病仍然位于患者身体某部分或尚未转移。

对不形成肿瘤的B细胞疾病或失调(例如但不限于多发性骨髓瘤)而言，确定疾病分期有不同标准。DS分期系统(Durie-Salmon Staging System)已广泛使用。在此分期系统中，疾病的临床分期(I、II或III期)是基于以下数种测量值，包括M蛋白水平、溶解性骨损伤的数量、血红蛋白数值和血清钙水平。按照肾功能对其进行进一步分期(分为A或B期)。按照DS分期系统，I期(细胞数量少)具有以下特征：血红蛋白值>10g/dL；血清钙值正常或≤12mg/dL；骨x-射线，正常骨结构(0级)或只有骨浆细胞瘤；和M-组分产生速率低：IgG值<5g/dL，IgA值<3g/d，本斯-琼斯蛋白<4g/24小时。I期患者通常没有发生相关的器官或组织损伤或症状。II期(细胞数量中等)的特征是既不符合I期，又不符合III期。III期(细胞数量多)具有以下一种或多种特征：血红蛋白值<8.5g/dL；血清钙值>12mg/dL；晚期溶解性骨损伤(3级)；M组分产生速率高：IgG值>7g/dL，IgA值>5g/dL，本斯-琼斯蛋白蛋白>12g/24h子类(A或B)，其中A是相对正常的肾功能(血清肌酸酐值<2.0mg/dL)和B是异常的肾功能(血清肌酸酐值≥2.0mg/dL)。

另一种骨髓瘤分期系统是骨髓瘤国际分期系统(ISS)。该系统能更有效地区别分期类群，其基于容易测定的β2-微球蛋白(β2-M)和白蛋白的血清水平。按照骨髓瘤ISS，I期的特征是β2-M<3.5和白蛋白≥3.5，II期的特征是β2-M<3.5和白蛋白<3.5或β2-M 3.5–5.5，III期的特征是β2-M>5.5(康涅狄格州纽卡纳安的多发性骨髓瘤研究基金会(MultipleMyeloma Research Foundation，New Canaan，CT))。

对患者B细胞恶性肿瘤的分期是一种临床决策。如上所述，提到实体瘤，肿瘤的扩散、位置和数量是临床上确定分期的主要因素。在不形成肿瘤的B细胞恶性肿瘤患者中确定分期可能较为复杂，要求测定血清水平，如上所述。

上文中对B细胞疾病和失调的分期的描述并非限制性。本领域已知用于诊断B细胞疾病和失调的其它特征可用作确定患者的B细胞疾病或失调的分期的标准。

5.22.2.诊断B细胞恶性肿瘤的临床标准

本领域了解不同B细胞恶性肿瘤的诊断标准。历史上，诊断通常基于显微图像和免疫表型的组合。更近一段时间以来，已将分子技术如基因表达概况分析应用于开发B细胞恶性肿瘤的分子定义(参见例如，Shaffer等，Nature 2:920-932(2002))。下面提供特定B细胞恶性肿瘤的临床诊断方法的例子。本领域技术人员了解其它合适的方法。

5.22.2.1.滤泡性NHL

通常，大部分NHL(套细胞淋巴瘤除外)中免疫球蛋白基因高度突变，这似乎是体细胞高度突变(SHM)的结果。NHL中最常见的遗传异常是BCL6基因的易位和突变。

滤泡NHL常常是具有滤泡生长模式的无痛性B细胞淋巴瘤。它在美国和西欧是第二大常见淋巴瘤。出现该疾病的中位年龄是60岁，女性患者略多。无痛性淋巴结病是最常见的症状。检测常常表明，该病变涉及血液骨髓，有时是外周血。根据滤泡中大细胞所占比例，将滤泡性NHL分成若干细胞学级别，所述级别形成从滤泡性小裂解细胞到大细胞优势型的连续谱。(参见S.Freedman等，滤泡性淋巴瘤(Follicular Lymphoma)，367-388，刊于《非霍奇金淋巴瘤》(Non-Hodgkin’s Lymphomas)，P.Mauch等编，Lippincott Williams和Wilkins，宾夕法尼亚州费城(Philadelphia，PA)(2004)；T.Lister等，滤泡性淋巴瘤，第309-324页，刊于《恶性淋巴瘤》(Malignant Lymphoma)，B.Hancock等编，纽约州纽约的牛津大学出版社(Oxford University Press，New York，N.Y.)(2000))。

大部分滤泡性NHL的特征是染色体14和18之间发生易位，导致BCL2过度表达。滤泡性NHL的特征还有SHM以及基因表达概况与生发中心(GC)B细胞类似的正在发生的SHM(参见例如，Shaffer等，Nature 2:920-932(2002))，它们是这种恶性肿瘤的推定来源细胞。一般还有重链和轻链重排。此种疾病的肿瘤细胞表达单克隆表面免疫球蛋白，大部分表达IgM。几乎所有滤泡性NHL肿瘤细胞均表达抗原CD19、CD20、CD22、CD79a、CD21、CD35和CD10，但不表达CD5和CD43。在骨髓中观察到小裂解细胞的骨小梁旁浸润。(参见S.Freedman等，滤泡性淋巴瘤(Follicular Lymphoma)，367-388，刊于《非霍奇金淋巴瘤》(Non-Hodgkin’sLymphomas)，P.Mauch等编，Lippincott Williams和Wilkins，宾夕法尼亚州费城(Philadelphia，PA)(2004)；T.Lister等，滤泡性淋巴瘤(Follicular Lymphoma)，第309-324页，刊于《恶性淋巴瘤》(Malignant Lymphoma)，B.Hancock等编，纽约州纽约的牛津大学出版社(Oxford University Press，New York，N.Y.)(2000))。

滤泡性NHL的诊断通常依赖于切除的淋巴结的活检，以评价组织结构和细胞学特征。细针抽吸通常不适用，因为这种方法不大可能提供可用于评价的组织，并且它无法提供足够组织进行额外测试。也可进行双侧骨髓生物活检，因为病变可能是局部的(patchy)。其它诊断方法包括胸部X射线，胸部、腹部、颈部和骨盆的计算机断层(CT)扫描，全血计数和化学概况分析。可利用流式细胞术和免疫组织化学来区别滤泡性NHL和其它成熟B细胞淋巴瘤。(参见S.Freedman等，滤泡性淋巴瘤(Follicular Lymphoma)，367-388，刊于《非霍奇金淋巴瘤》(Non-Hodgkin’s Lymphomas)，P.Mauch等编，Lippincott Williams和Wilkins，宾夕法尼亚州费城(Philadelphia，PA)(2004)；T.Lister等，滤泡性淋巴瘤，第309-324页，刊于《恶性淋巴瘤》(Malignant Lymphoma)，B.Hancock等编，纽约州纽约的牛津大学出版社(Oxford University Press，New York，N.Y.)(2000))。

5.22.2.2.套细胞淋巴瘤

套细胞淋巴瘤位于二级淋巴滤泡(secondary follicle)的套膜节处，其特征是结节性和/或弥散性生长方式。套细胞淋巴瘤患者的中位年龄为60-65岁，患者主要为男性。出于诊断目的，通常呈现的特征是全身性淋巴结病。此外，常常发生脾肿大。这种B细胞淋巴瘤与IgH基因座和细胞周期蛋白D1基因之间的t(11；14)有关联，导致细胞周期蛋白D1过度表达。超过50％病例显示出其它染色体异常。套细胞淋巴瘤的特征一般不是SHM。(参见W.Hiddemann等，套细胞淋巴瘤(Mantle Cell Lymphoma)，461-476，刊于《非霍奇金淋巴瘤》(Non-Hodgkin’s Lymphomas)，P.Mauch等编，Lippincott Williams和Wilkins，宾夕法尼亚州费城(Philadelphia，PA)(2004)；D.Weisenburger等，套细胞淋巴瘤，第28-41页，刊于《恶性淋巴瘤》(Malignant Lymphoma)，B.Hancock等编，纽约州纽约的牛津大学出版社(OxfordUniversity Press，New York，N.Y.)(2000))。

对套细胞淋巴瘤细胞进行免疫表型分析(流式细胞术或冷冻切片)免疫组织化学显示它们几乎全为单克隆，携带表面IgM。也注意到套细胞淋巴瘤细胞携带表面IgD。该细胞表达抗原CD19、CD20、CD22和CD24，但不表达CD23。它们也表达表面抗原CD5，但不表达CD10，这使得它们与几乎全是CD5阴性的真正滤泡中心细胞淋巴瘤区别开来。常常发现节外病变包括骨髓浸润以及肝脏和胃肠道肿瘤。套细胞淋巴瘤中常常出现中度贫血和白血病表达。(参见A.Lal等，细针吸出在淋巴瘤中的作用(Role of Fine Needle Aspiration inLymphoma)，第181-220页，刊于W.Finn等编辑的《肿瘤学中的血液病理学》(Hematopathology in Oncology)，克鲁学术出版社(Kluwer Academic Publishers)，马萨诸塞州诺尔维(Norwell，MA)(2004)；W.Hiddemann等，套细胞淋巴瘤(Mantle CellLymphoma)，第461-476页，刊于《非霍奇金淋巴瘤》(Non-Hodgkin’s Lymphomas)，P.Mauch等编，Lippincott Williams和Wilkins，宾夕法尼亚州费城(Philadelphia，PA)(2004))。

套细胞淋巴瘤的诊断包括检测外周血以及骨髓和淋巴结活检样品。此外，细胞遗传研究和免疫表型分析可用于不同的诊断。(参见W.Hiddemann等，套细胞淋巴瘤(MantleCell Lymphoma)，461-476，刊于《非霍奇金淋巴瘤》(Non-Hodgkin’s Lymphomas)，P.Mauch等编，Lippincott Williams和Wilkins，宾夕法尼亚州费城(Philadelphia，PA)(2004)；D.Weisenburger等，套细胞淋巴瘤，第28-41页，刊于《恶性淋巴瘤》(Malignant Lymphoma)，B.Hancock等编，纽约州纽约的牛津大学出版社(Oxford University Press，New York，N.Y.)(2000))。

5.22.2.3.伯基特淋巴瘤

伯基特淋巴瘤是一般在儿童和青年中出现的侵袭性B细胞淋巴瘤，通常与颚和/或腹部的巨大疾病相关联。约20％患者出现骨髓病变。地方性形式的伯基特淋巴瘤涉及恶性细胞爱波斯坦-巴尔病毒(EBV)感染；偶发性形式与EBV感染无关。c-myc易位至免疫球蛋白基因座，导致c-myc基因失调，这是这种疾病的特征(t(8；14)(q24；q32))。有趣的是，c-myc序列缺失似乎与这种疾病的偶发性形式有关，而地方性形式通常与点突变或插入有关。(参见V.Pappa等，Molecular Biology，第133-157页，刊于《恶性淋巴瘤》(MalignantLymphoma)，B.Hancock等编，纽约州纽约的牛津大学出版社(Oxford University Press，New York，N.Y.)(2000))。伯基特淋巴瘤的特征还有SHM，恶性细胞的基因表达概况类似于GC B细胞，提示这种恶性肿瘤衍生自GC B细胞。

伯基特淋巴瘤的免疫表型显示这种疾病的细胞表达CD19、CD20、CD22和CD79a，但不表达CD5、CD23、细胞周期蛋白D或末端脱氧核苷酸转移酶。这些细胞常常是CD10和BCL6阳性细胞，并且通常是BCL2阴性。(参见I.Magrath等，伯基特淋巴瘤(Burkitt’s Lymphoma)，第477-501页，刊于《非霍奇金淋巴瘤》(Non-Hodgkin’s Lymphomas)，P.Mauch等编，Lippincott Williams和Wilkins，宾夕法尼亚州费城(Philadelphia，PA)(2004))。

高级B细胞伯基特样淋巴瘤是伯基特淋巴瘤和大B细胞淋巴瘤之间的淋巴瘤边界。这种淋巴瘤的细胞表达CD19、CD20和CD22，但常常不表达CD10，而真正的伯基特淋巴瘤几乎全都表达CD10。由于这种和其它特征，一些人相信，这种淋巴瘤应被分为弥散性大B细胞淋巴瘤。(参见K.Maclennan，弥散性侵袭性B细胞淋巴瘤(Diffuse Aggressive B cellLymphoma)，第49-54页，刊于《恶性淋巴瘤》(Malignant Lymphoma)，B.Hancock等编，纽约州纽约的牛津大学出版社(Oxford University Press，New York，N.Y.)(2000))。

伯基特淋巴瘤的诊断通常依赖于检测与此种淋巴瘤有关的易位；因此，通常进行常规的细胞遗传分析。已利用远程聚合酶链反应技术和荧光原位杂交(FISH)检测与此疾病有关的易位和其它遗传改变中的Ig-myc结合。(参见R.Siebert等，Blood 91:984-990(1998)；T.Denyssevych等，Leukemia，16:276-283(2002))。

5.22.2.4.弥散性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)

DLBCL是最常见的非霍奇金淋巴瘤，可能由小B细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤或边缘区淋巴瘤产生。患者一般患有淋巴结病；然而，大部分患者也出现节外部位的病变，最常见的是胃肠道病变。约15％患者中出现骨髓病变。(参见Armitage等，弥散性大B细胞淋巴瘤(Diffuse Large B cell Lymphoma)，第427-453页，刊于《非霍奇金淋巴瘤》(Non-Hodgkin’s Lymphomas)，P.Mauch等编，Lippincott Williams和Wilkins，宾夕法尼亚州费城(Philadelphia，PA)(2004))。临床、生物学和形态学特征的异质性使得难以对这类淋巴瘤进行细分。然而，已鉴定到两种独特的亚型，一种表达生发中心B细胞(GC-DLBCL)的特征性基因，另一种在外周血液B细胞中过度表达基因。GC-DLBCL患者的存活率明显高于活化B细胞型(ABC)-DLBCL。(参见W.Chan，病理学和实验室医学档案(Archives of Pathology andLaboratory Medicine)128(12)，1379–1384(2004))。

DLBCL表达细胞表面抗原CD19、CD20、CD22和CD79a。在大部分情况下表达CD10，在约10％病例中观察到CD5表达。(参见K.Maclennan，弥散性侵袭性B细胞淋巴瘤(DiffuseAggressive B cell Lymphoma)，第49-54页，刊于《恶性淋巴瘤》(Malignant Lymphoma)，B.Hancock等编，纽约州纽约的牛津大学出版社(Oxford University Press，New York，N.Y.)(2000))。DLBCL的特征常常是BCL6异常和/或BCL2易位至IgH基因座。GC B细胞样(GC)DLBCL的特征是免疫球蛋白基因高度突变的SHM，和具有GC B细胞样基因表达概况的恶性克隆中正在进行的SHM。大部分GC DLBCL已经过免疫球蛋白类别转换。ABC-DLBCL的特征是NF-κB靶基因，包括BCL2、干扰素调节因子4、CD44、FLIP和细胞周期蛋白D的高水平表达。存在SHM，而不是正在进行的SHM，ABC-DLBCL不具有GC B细胞基因表达概况。几乎所有ABC-DLBCL均表达高水平的IgM。

5.22.2.5.节外边缘区淋巴瘤

节外边缘区淋巴瘤是通常缺少机化性淋巴组织的器官(如胃、唾液腺、肺和甲状腺)中发生的节外淋巴瘤。这种疾病的主要患者是中位年龄超过60岁的老年人。在发生淋巴瘤之前常常发生慢性炎症或自身免疫过程。胃粘膜相关性淋巴组织(MALT)淋巴瘤是最常见的边缘区淋巴瘤类型，它与幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)感染有关。研究证明，抗生素方案能缓解症状，根除幽门螺杆菌感染。胃MALT淋巴瘤中出现的症状包括非特异性消化不良、上腹部疼痛、恶心、胃肠道出血和贫血。全身症状不常见，乳酸脱氢酶水平升高也不常见。(参见J.Yahalom等，粘膜相关淋巴组织的节外边缘区B细胞淋巴瘤(ExtranodalMarginal Zone B cell Lymphoma of Mucosa-Associated Lymphoid Tissue)，第345-360页，刊于《非霍奇金淋巴瘤》(Non-Hodgkin’s Lymphomas)，P.Mauch等编，LippincottWilliams和Wilkins，宾夕法尼亚州费城(Philadelphia，PA)(2004)；J.Radford，其它低级非霍奇金淋巴瘤(Other Low-Grade Non-Hodgkin’s Lymphomas)，第325-330页，刊于《恶性淋巴瘤》(Malignant Lymphoma)，B.Hancock等编，纽约州纽约的牛津大学出版社(OxfordUniversity Press，New York，N.Y.)(2000))。全身性B症状包括在之前6个月中出现超过38℃的发热持续2周以上而无感染迹象、盗汗、极度疲劳或无意识体重降低10％或以上。

MALT淋巴瘤的免疫表型的特征是表达CD19、CD20、CD79a、CD21和CD35；不表达CD5、CD23和CD10。大约一半的MALT淋巴瘤表达CD43。这种疾病的肿瘤细胞中通常表达的免疫球蛋白是IgM，而不表达IgD。区分此种淋巴瘤与其它小B细胞淋巴瘤如套细胞淋巴瘤、淋巴细胞性淋巴瘤和滤泡性淋巴瘤时，这些特征至关重要。在60％MALT淋巴瘤病例中出现三体性3。在25-40％胃和肺MALT淋巴瘤中观察到t(11；18)。在其它MALT淋巴瘤中观察到此种易位的频率低得多。T(11；18)与BCL10的核表达有关。(参见J.Yahalom等，粘膜相关淋巴组织的节外边缘区B细胞淋巴瘤(Extranodal Marginal Zone B cell Lymphoma of Mucosa-Associated Lymphoid Tissue)，第345-360页，刊于《非霍奇金淋巴瘤》(Non-Hodgkin’sLymphomas)，P.Mauch等编，Lippincott Williams和Wilkins，宾夕法尼亚州费城(Philadelphia，PA)(2004))。边缘区淋巴瘤的特征通常是SHM和正在进行的SHM。

诊断方法包括免疫表型分析或流式细胞术，以测定细胞表面标记的种类。此外，应进行分子遗传分析，以确定是否存在t(11；18)，因为这是该疾病对抗体无反应的指标。可利用组织学方法确定是否存在幽门螺杆菌。其它检测应包括全血计数、基本生化检测(包括对乳酸脱氢酶的基本生化检测)；腹部、胸部和骨盆的CT扫描以及骨髓生物活检分析。(参见J.Yahalom等，粘膜相关淋巴组织的节外边缘区B细胞淋巴瘤(Extranodal Marginal ZoneB cell Lymphoma of Mucosa-Associated Lymphoid Tissue)，第345-360页，刊于《非霍奇金淋巴瘤》(Non-Hodgkin’s Lymphomas)，P.Mauch等编，Lippincott Williams和Wilkins，宾夕法尼亚州费城(Philadelphia，PA)(2004))。

5.22.2.6结节状边缘区B细胞淋巴瘤

结节状边缘区B细胞淋巴瘤是新近分类的淋巴瘤，因此有关发表刊物较少。它是具有与节外和脾边缘区淋巴瘤相同的遗传和形态学特征的原发性结节状B细胞淋巴瘤，但不限于脾脏或节外。已报道丙型肝炎病毒与此种淋巴瘤有关，如斯耶格伦综合征。(参见F.Berger等，结节状边缘区B细胞淋巴瘤(Nodal Marginal Zone B cell Lymphoma)，第361-365页，刊于《非霍奇金淋巴瘤》(Non-Hodgkin’s Lymphomas)，P.Mauch等编，Lippincott Williams和Wilkins，宾夕法尼亚州费城(Philadelphia，PA)(2004))。

结节状边缘区淋巴瘤具有异质性细胞学和形态学特征。由于不像其它边缘淋巴瘤(脾和节外)那样，这种淋巴瘤中大细胞比例相对较高，所以无法将其分类为真正的低级B细胞淋巴瘤。结节状边缘区淋巴瘤的遗传和免疫表型包括表达CD19、CD20、CD22、BCL2、sIgM和胞质IgG(cIg)。这些细胞不表达CD5、CD10、CD23、CD43或细胞周期蛋白D1。在结节状边缘区淋巴瘤中没有观察到MALT淋巴瘤的易位特征t(11；18)。这些特征有助于将这种淋巴瘤与其它小B细胞淋巴瘤区别开诊断。(参见F.Berger等，结节状边缘区B细胞淋巴瘤(NodalMarginal Zone B cell Lymphoma)，第361-365页，刊于《非霍奇金淋巴瘤》(Non-Hodgkin’sLymphomas)，P.Mauch等编，Lippincott Williams和Wilkins，宾夕法尼亚州费城(Philadelphia，PA)(2004))。

5.22.2.7.脾边缘区淋巴瘤

脾边缘区淋巴瘤是无痛性微结B细胞淋巴瘤，其特征性临床表现是明显脾肿大以及外周血和骨髓浸润。此外，还报道肝脏病变程度相对较高。假定丙型肝炎病毒在此种淋巴瘤中起作用。脾边缘区淋巴瘤的免疫表型一般是CD19⁺、CD20⁺、IgD⁺、BCL2⁺、p27⁺、CD3^-、CD5^-、CD10^-、CD23^-、CD38^-、CD43^-、BCL-6^-和细胞周期蛋白D1^-。遗传特征包括7q缺失、p53改变和SHM。(参见M.Piris等，脾边缘区淋巴瘤(Splenic Marginal Zone Lymphoma)，第275-282页，刊于《非霍奇金淋巴瘤》(Non-Hodgkin’s Lymphomas)，P.Mauch等编，LippincottWilliams和Wilkins，宾夕法尼亚州费城(Philadelphia，PA)(2004))。

诊断通常依赖于免疫表型分析，以确定细胞表面标记的种类。遗传和生化分析与细胞表面标记有关数据联合使用能帮助区分这种淋巴瘤与其它小B细胞淋巴瘤。(参见M.Piris等，脾边缘区淋巴瘤(Splenic Marginal Zone Lymphoma)，第275-282页，刊于《非霍奇金淋巴瘤》(Non-Hodgkin’s Lymphomas)，P.Mauch等编，Lippincott Williams和Wilkins，宾夕法尼亚州费城(Philadelphia，PA)(2004))。

5.22.2.8.急性(B细胞)淋巴细胞性白血病(ALL)

ALL是基于骨髓的肿瘤，它主要影响儿童，在1-5岁时发病率最高。出现的大部分常见症状包括疲劳、嗜睡、发热以及骨和关节痛。疲劳和嗜睡与出现的贫血程度有关联。白细胞计数升高很常见。胸透照片常常显示骨骼损伤。髓外传播很常见，包括中枢神经系统、睾丸、淋巴结、肝、脾和肾。仅在约5-10％新诊断的病例中观察到前纵膈肿块。(参见J.Whitlock等，急性淋巴细胞性白血病(Acute Lymphocytic Leukemia)，第2241-2271页，刊于《温车泊临床血液学》(Wintrobe’s Clinical Hematology)，第10版，G.Lee等编，Williams和Wilkins，马里兰州巴尔的摩(Baltimore，MD)(1999))。

ALL的免疫表型是CD10⁺、CD19⁺、CD20⁺、CD22和CD24⁺。前B细胞ALL细胞表达胞质而非表面免疫球蛋白，而成熟B细胞ALL(仅占所有ALL病例的1-2％)与其它B细胞谱系白血病的不同之处在于表达表面免疫球蛋白。ALL的细胞遗传学特征包括t(8；14)、t(2；8)和t(8；22)。虽然在细胞遗传水平上很少检测到，但t(12；21)可能是与儿童ALL相关联的最常见的细胞遗传异常(在约25％病例中观察到)。(参见M.Kinney等，急性白血病的分类和区分(Classification and Differentiation of the Acute Leukemias)，第2209-2240页，刊于《温车泊临床血液学》(Wintrobe’s Clinical Hematology)，第10版，G.Lee等编，Williams和Wilkins，马里兰州巴尔的摩(Baltimore，MD)(1999))；J Whitlock等，急性淋巴细胞性白血病(Acute Lymphocytic Leukemia)，第2241-2271页；刊于《温车泊临床血液学》，第10版，G.Lee等编，Williams和Wilkins，马里兰州巴尔的摩(Baltimore，MD)(1999))。

急性白血病的准确诊断通常依赖于骨抽吸和生物活检。利用吸出物涂片进行形态学、免疫学和细胞学评估。如果骨髓中出现淋巴母细胞，则能诊断出ALL。骨髓中出现5％以上白血病淋巴母细胞则能确证ALL诊断，但大部分情况下需要25％以上才能作确定性诊断。利用腰椎穿刺诊断中枢神经系统病变。发现ALL中的血清尿酸水平和血清乳酸脱氢酶水平升高。(参见M.Kinney等，急性白血病的分类和区分(Classification andDifferentiation of the Acute Leukemias)，第2209-2240页，刊于《温车泊临床血液学》(Wintrobe’s Clinical Hematology)，第10版，G.Lee等编，Williams和Wilkins，马里兰州巴尔的摩(Baltimore，MD)(1999))；J Whitlock等，急性淋巴细胞性白血病(AcuteLymphocytic Leukemia)，第2241-2271页；刊于《温车泊临床血液学》，第10版，G.Lee等编，Williams和Wilkins，马里兰州巴尔的摩(Baltimore，MD)(1999))。

5.22.2.9.慢性淋巴细胞性白血病(CLL)/小B细胞淋巴细胞性淋巴瘤(SLL)

CLL/SLL是最常见的白血病类型。当该疾病涉及外周血和骨髓时，它被称为CLL。然而，当淋巴结和其它组织被免疫学和形态上与CLL细胞相同的细胞浸润但不存在该疾病的白血病特征时，该疾病被称为SLL。该疾病主要影响老年人，该疾病在男性中的发病率高于女性。无痛性淋巴结病是最常见的特征。在大部分CLL/SLL病例中，均出现低丙球蛋白血症，他们的所有免疫球蛋白分子而非任何特定的免疫球蛋白亚型的水平降低。无症状患者常常是在常规血液计数中诊断出来的(淋巴细胞计数超过5000x10⁹/L)。高达20％CLL/SLL病例报道有B症状。其它诊断特征是超过30％骨髓被未成熟淋巴细胞浸润。淋巴结生物活检分析显示，患病淋巴结被良好分化的淋巴细胞浸润。自身免疫现象常常与CLL/SLL相关联，包括自身免疫性溶血和免疫血小板减少。(See，J.(参见J.Gribben等，小B细胞淋巴细胞性淋巴瘤/慢性淋巴细胞性白血病和幼淋巴细胞性白血病(Small B cell LymphocyticLymphoma/Chronic Lymphocytic Leukemia and Prolymphocytic Leukemia)，第243-261页，刊于《非霍奇金淋巴瘤》(Non-Hodgkin’s Lymphomas)，P.Mauch等编，LippincottWilliams和Wilkins，宾夕法尼亚州费城(Philadelphia，PA)(2004)；K.Maclennan，弥散性无痛性B细胞肿瘤(Diffuse Indolent B cell Neoplasms)，第43-47页，刊于《恶性淋巴瘤》(Malignant Lymphoma)，B.Hancock等编，纽约州纽约的牛津大学出版社(OxfordUniversity Press，New York，N.Y.)(2003))。

与许多低级B细胞恶性肿瘤不同，在CLL/SLL中非随机交互易位很少见。然而，报道了其它细胞遗传异常，包括13q14、11q22-23和17q13上的缺失，后两种包括p53基因座。约20％病例具有三体性12。提高的β-2微球蛋白水平、较高的CD38表达水平和肿瘤坏死因子-α的产生都是CLL/SLL的特征。CLL/SLL的免疫表型非常具有诊断价值，包括表面免疫球蛋白(通常是IgM，或IgM和IgG)的弱表达，以及细胞抗原CD19、CD22、CD20及CD5和CD23的表达。(参见J.Gribben等，小B细胞淋巴细胞性淋巴瘤/慢性淋巴细胞性白血病和幼淋巴细胞性白血病(Small B cell Lymphocytic Lymphoma/Chronic Lymphocytic Leukemia andProlymphocytic Leukemia)，第243-261页，刊于《非霍奇金淋巴瘤》(Non-Hodgkin’sLymphomas)，P.Mauch等编，Lippincott Williams和Wilkins，宾夕法尼亚州费城(Philadelphia，PA)(2004)；K.Maclennan，弥散性无痛性B细胞肿瘤(Diffuse Indolent Bcell Neoplasms)，第43-47页，刊于《恶性淋巴瘤》(Malignant Lymphoma)，B.Hancock等编，纽约州纽约的牛津大学出版社(Oxford University Press，New York，N.Y.)(2000))。

5.22.2.10.B细胞幼淋巴细胞性白血病(PLL)

一度被认为是CLL变体的PLL现在被理解为一种不同的疾病。PLL通常是老年人的疾病，其特征是白细胞计数非常高(大于200x10⁹/L)和脾肿大。其它特征包括贫血和血小板减少。PLL中，幼淋巴细胞占血液和骨髓中细胞的55％以上。与CLL相反，在PLL中很少观察到自身免疫现象。(参见J.Gribben等，小B细胞淋巴细胞性淋巴瘤/慢性淋巴细胞性白血病和幼淋巴细胞性白血病(Small B cell Lymphocytic Lymphoma/Chronic LymphocyticLeukemia and Prolymphocytic Leukemia)，第243-261页，刊于《非霍奇金淋巴瘤》(Non-Hodgkin’s Lymphomas)，P.Mauch等编，Lippincott Williams和Wilkins，宾夕法尼亚州费城(Philadelphia，PA)(2004)。

PLL的免疫表型的特征是表达CD19、CD21、CD22、CD24和FMC7。PLL的细胞不表达CD23，大部分不表达CD5。PLL细胞出现复杂的染色体异常，13q14和11q23的缺失是最常见的一些类型。PLL细胞中的p53突变模式与CLL不同。区别诊断通常依赖于全血计数、组织学、免疫表型和遗传分析。(参见J.Gribben等，小B细胞淋巴细胞性淋巴瘤/慢性淋巴细胞性白血病和幼淋巴细胞性白血病(Small B cell Lymphocytic Lymphoma/Chronic LymphocyticLeukemia and Prolymphocytic Leukemia)，第243-261页，刊于《非霍奇金淋巴瘤》(Non-Hodgkin’s Lymphomas)，P.Mauch等编，Lippincott Williams和Wilkins，宾夕法尼亚州费城(Philadelphia，PA)(2004)。

5.22.2.11.多毛细胞白血病(HCL)

HCL是罕见的无痛性慢性白血病，与女性相比更多地影响男性，大部分患者是中年人。典型症状包括严重脾肿大和全血细胞减少症。外周血和骨髓含有典型的“多毛细胞”，多毛细胞是具有胞质突起的B淋巴细胞。超过90％HCL患者发生骨髓浸润。(参见，《临床肿瘤学》(Clinical Oncology)，A.Neal等，尼尔、霍斯金和牛津大学出版社(Neal，Hoskin andOxford University Press)共同出版，纽约州纽约(New York，NY)(2003)；J.Johnston，多毛细胞白血病(Hairy Cell Leukemia)，第2428-2446页，刊于《温车泊临床血液学》(Wintrobe’s Clinical Hematology)，第10版，G.Lee等编，Williams和Wilkins，马里兰州巴尔的摩(Baltimore，MD)(1999))。

细胞遗传分析证明，在19％病例中出现克隆异常，包括染色体5、7和14的数量和结构异常。在多毛细胞白血病中TNF-α血清水平升高，这与肿瘤负荷(tumor burden)有关。多毛细胞白血病细胞表达表面免疫球蛋白(IgG和IgM)以及CD11c、CD19、CD20、CD22和CD25。此外，还表达FMC7、HC-2和CD103。HCL细胞不表达CD5或CD10。诊断通常包括使用骨髓抽吸、细胞遗传学、血涂片和免疫表型分析。(参见，《临床肿瘤学》(Clinical Oncology)，A.Neal等，尼尔、霍斯金和牛津大学出版社(Neal，Hoskin and Oxford University Press)共同出版，纽约州纽约(New York，NY)(2003)；J.Johnston，多毛细胞白血病(Hairy Cell Leukemia)，第2428-2446页，刊于《温车泊临床血液学》(Wintrobe’s Clinical Hematology)，第10版，G.Lee等编，Williams和Wilkins，马里兰州巴尔的摩(Baltimore，MD)(1999))。

5.22.2.12.前体B细胞淋巴母细胞淋巴瘤/前B细胞急性淋巴细胞性白血病/淋巴母细胞淋巴瘤

前体B细胞淋巴母细胞淋巴瘤/前B细胞急性淋巴细胞性白血病/淋巴母细胞淋巴瘤是前体T或B细胞的疾病。T和B细胞淋巴母细胞淋巴瘤在形态上相同，但可根据骨髓浸润或骨髓病变程度在临床上加以区分。85-90％淋巴母细胞淋巴瘤是T细胞衍生的，其余是B细胞衍生的。淋巴母细胞淋巴瘤患者的中位年龄为20岁，主要是男性。外周淋巴结病变是共同特征，特别是在颈部、锁骨上区域和腋区的淋巴结中。这种疾病常常伴有骨髓病变。中枢神经系统病变较少见，但复发的情况下常常出现中枢神经系统病变。其他病变部位可包括肝脏、脾脏、骨、皮肤、咽喉和睾丸(参见J.Sweetenham等，前体B-和T-细胞淋巴母细胞淋巴瘤(Precursor B-and T-Cell Lymphoblastic Lymphoma)，第503-513页，刊于《非霍奇金淋巴瘤》(Non-Hodgkin’s Lymphomas)，P.Mauch等编，Lippincott Williams和Wilkins，宾夕法尼亚州费城(Philadelphia，PA)(2004))。

前体B细胞淋巴母细胞淋巴瘤表达未成熟标记B细胞标记，如CD99、CD34和末端脱氧核苷酸转移酶。这些细胞也表达CD79a、CD19、CD22，有时也表达CD20，一般不表达CD45和表面免疫球蛋白。11q23上的易位以及t(9；22)(q34；q11.2)和t(12；21)(p13；q22)与预后差相关联。良好预后与超二倍体核型相关联，特别是与三体性4、10和17以及t(12；21)(p13；q22)相关联。(参见J.Sweetenham等，前体B-和T-细胞淋巴母细胞淋巴瘤(Precursor B-andT-Cell Lymphoblastic Lymphoma)，第503-513页，刊于《非霍奇金淋巴瘤》(Non-Hodgkin’sLymphomas)，P.Mauch等编，Lippincott Williams和Wilkins，宾夕法尼亚州费城(Philadelphia，PA)(2004))。

诊断测试包括淋巴结活检、血液检测、X射线、CT扫描和腰椎穿刺，以检测脑脊液中的恶性细胞。

5.22.2.13.原发性纵膈大B细胞淋巴瘤

原发性纵膈大B细胞淋巴瘤是弥散性大B细胞淋巴瘤，主要发生于年轻女性，其特征是胸腺中产生的局部侵袭性前纵膈肿块。向外周淋巴结的远距离扩散和骨髓病变不常见。常见全身症状。虽然这种疾病类似结节状大细胞淋巴瘤，但它具有独特的遗传学、免疫学和形态学特征。

原发性纵膈大B细胞淋巴瘤的肿瘤细胞的免疫表型常常是表面免疫球蛋白阴性，但表达B细胞相关抗原如CD19、CD20、CD22和CD79a。通常还表达CD10和BCL6。浆细胞结合标记CD15、CD30、上皮膜抗原(EMA)的表达很少见。BCL6和c-myc基因排列也不常见。出现克隆免疫球蛋白重排、免疫球蛋白可变区和基因高度突变以及BCL6高度突变提示，该淋巴瘤衍生自成熟生发中心或后生发中心B细胞。似乎与这种疾病的肿瘤有关的染色体易位类似于在其它形式的弥散性大细胞淋巴瘤中观察到的情况。(参见P.Zinzani等，原发性纵膈大B细胞淋巴瘤(Primary Mediastinal Large B cell Lymphoma)，第455-460页，刊于《非霍奇金淋巴瘤》(Non-Hodgkin’s Lymphomas)，P.Mauch等编，Lippincott Williams和Wilkins，宾夕法尼亚州费城(Philadelphia，PA)(2004))。

原发性纵膈大B细胞淋巴瘤的诊断评估通常包括彻底的身体检查、全面的血液学和生化分析、全身计算机化断层扫描和骨髓活检。镓-67扫描可用于进行疾病分期、测定治疗反应和评估复发的检测。(参见P.Zinzani等，原发性纵膈大B细胞淋巴瘤(PrimaryMediastinal Large B cell Lymphoma)，第455-460页，刊于《非霍奇金淋巴瘤》(Non-Hodgkin’s Lymphomas)，P.Mauch等编，Lippincott Williams和Wilkins，宾夕法尼亚州费城(Philadelphia，PA)(2004))。

5.22.2.14.淋巴浆细胞性淋巴瘤(LPL)/淋巴浆细胞性免疫细胞瘤/瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症

LPL/淋巴浆细胞性免疫细胞瘤/瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症是通常无痛的结节状淋巴瘤，常常涉及骨髓、淋巴结和脾脏。它通常是老年人的疾病，男性略多。大部分患者的血清中含有单克隆IgM副蛋白(>3g/dL)，导致血清粘度过高。肿瘤细胞具有浆细胞形态。LPL亚型的特征是染色体9和14之间反复易位，涉及PAX5和免疫球蛋白重链基因座。LPL的特征是SHM以及正在进行的SHM，相信它来自后-GC B细胞。(参见A.Rohatiner等，淋巴浆细胞性淋巴瘤和瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症(Lymphoplasmacytic Lymphoma andMacroglobulinemia)，第263-273页，刊于《非霍奇金淋巴瘤》(Non-Hodgkin’s Lymphomas)，P.Mauch等编，Lippincott Williams和Wilkins，宾夕法尼亚州费城(Philadelphia，PA)(2004)；K.Maclennan，弥散性无痛性B细胞肿瘤(Diffuse Indolent B cell Neoplasms)，第43-47页，刊于《恶性淋巴瘤》(Malignant Lymphoma)，B.Hancock等编，纽约州纽约的牛津大学出版社(Oxford University Press，New York，N.Y.)(2000)；A.Lal等，细针吸出在淋巴瘤中的作用，第181-220页，刊于W.Finn等编辑的《肿瘤学中的血液病理学》(Hematopathology in Oncology)，克鲁学术出版社(Kluwer Academic Publishers)，马萨诸塞州诺尔维(Norwell，MA)(2004))。

这种疾病的免疫表型显示出表达B细胞相关抗原CD19、CD20、CD22和CD79a，不表达CD5、CD10和CD23。强表面免疫球蛋白和CD20的存在、CD5和CD23表达的缺失以及胞质免疫球蛋白的存在是有助于将这种疾病与慢性淋巴细胞性白血病区别开的特征。该疾病的其它诊断特征是t(9；14)(p13；q32)。(参见A.Rohatiner等，淋巴浆细胞性淋巴瘤和瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症(Lymphoplasmacytic Lymphoma andMacroglobulinemia)，第263-273页，刊于《非霍奇金淋巴瘤》(Non-Hodgkin’s Lymphomas)，P.Mauch等编，Lippincott Williams和Wilkins，宾夕法尼亚州费城(Philadelphia，PA)(2004)；K.Maclennan，弥散性无痛性B细胞肿瘤(Diffuse Indolent B cell Neoplasms)，第43-47页，刊于《恶性淋巴瘤》(Malignant Lymphoma)，B.Hancock等编，纽约州纽约的牛津大学出版社(Oxford University Press，New York，N.Y.)(2000)；R.Chaganti等，淋巴瘤的细胞遗传学(Cytogenetics of Lymphoma)，第809-824页，刊于《非霍奇金淋巴瘤》(Non-Hodgkin’sLymphomas)，P.Mauch等编，Lippincott Williams和Wilkins，宾夕法尼亚州费城(Philadelphia，PA)(2004))。

诊断检测一般包括全血计数、肾和肝功能检测、CT扫描、骨髓活检和抽吸、蛋白质电泳，以定量测定和表征副蛋白和血清粘度。β₂-微球蛋白的测定可用作预后检测。(参见A.Rohatiner等，淋巴浆细胞性淋巴瘤和瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症(LymphoplasmacyticLymphoma andMacroglobulinemia)，第263-273页，刊于《非霍奇金淋巴瘤》(Non-Hodgkin’s Lymphomas)，P.Mauch等编，Lippincott Williams和Wilkins，宾夕法尼亚州费城(Philadelphia，PA)(2004))。

5.22.2.15.非急性淋巴细胞性白血病

非急性淋巴细胞性白血病是缺少B或T细胞特征的ALL亚型。白血病母细胞的表型分析显示出典型的非ALL模式，即CD10(普通ALL抗原)阴性，强HLA-DR-阳性和CD19(B4)-阳性(see Katz等，(1988)Blood 71(5):1438-47)。

5.22.2.16.霍奇金淋巴瘤

霍奇金淋巴瘤通常在青年的淋巴结中产生。它可分成经典亚型和较不常见的结节状淋巴细胞优势亚型。该经典型具有SHM，但没有正在进行的SHM，不具有GC B细胞基因表达概况。相反，结节状淋巴细胞优势型的特征是SHM和正在进行的SHM以及GC B细胞基因表达概况。虽然这两种类型在临床和生物学上不同，但它们的某些特征相同，例如在良性炎症细胞背景中缺少肿瘤细胞。B.Schnitzer等，霍奇金淋巴瘤(Hodgkin Lymphoma)，第259-290页，刊于W.Finn和L.Peterson编辑的《肿瘤中的血液病理学》(Hematopathology inOncology)，克鲁学术出版社(Kluwer Academic Publishers)，马萨诸塞州诺尔维(Norwell，MA)(2004))

最常见的特征是淋巴结，通常是颈部，偶尔是腹股沟区淋巴结发生无痛性肿大。淋巴结的消长变化也是该疾病的特征。在大约三分之一的患者中观察到B症状。单独的节外病变很少见，在发生散布的情况下则观察到约10-20％的节外病变。(参见P.Johnson等，《霍奇金病：临床特征》(Hodgkin’s Disease:Clinical Features)，第181-204页，刊于《恶性淋巴瘤》(Malignant Lymphoma)，B.Hancock等编，纽约州纽约的牛津大学出版社(OxfordUniversity Press，New York，N.Y.)(2000))。

里-施(RS)细胞是霍奇金淋巴瘤的恶性细胞。RS细胞及其变体表达CD15、CD25、CD30和转铁蛋白受体。此外，这些细胞表达多克隆胞质免疫球蛋白。在大部分霍奇金淋巴瘤病例中，RS细胞不表达CD45，此特征有利于将该疾病与非霍奇金淋巴瘤区分开。已证明爱波斯坦-巴尔病毒存在于约一半霍奇金淋巴瘤病例的里-施细胞中，但其作用尚不明了。

常常通过淋巴结活检进行诊断。其它诊断检测包括：全血计数(血液检测常常正常；在约20％病例中观察到白细胞计数小于1.0x10⁹/L)，红细胞沉降率(在疾病晚期常常升高)，生化检测，包括电解质、尿素、肌酸酐、尿酸、钙(高钙血症很罕见，但出现时与广泛性骨病变有关)，肝脏血液检测，乳酸脱氢酶(水平升高常常与疾病晚期有关)，白蛋白和β₂-微球蛋白(β2-M)。淋巴血管图(Lymphanigiograms)和胸透照片以及胸部、腹部和骨盆的CT扫描在鉴定异常淋巴结和节外病变程度中非常重要。一般认为骨髓活检是任选的，因为骨髓病变不常见，且这类活检的结果似乎不影响临床控制或预后。目前，不大进行脾脏切除术，因为它对疾病控制的影响很小，且CT或MRI成像能够提供有关脾脏状态的信息。p55、TNF和sICAM-1水平显著升高与疾病状态、症状的存在和完全反应率相关联。(参见P.Johnson等，《霍奇金病：临床特征》(Hodgkin’s Disease:Clinical Features)，第181-204页，刊于《恶性淋巴瘤》(Malignant Lymphoma)，B.Hancock等编，纽约州纽约的牛津大学出版社(OxfordUniversity Press，New York，N.Y.)(2000)；《临床肿瘤学》(Clinical Oncology)，A.Neal等，尼尔、霍斯金和牛津大学出版社(Neal，Hoskin and Oxford University Press)共同出版，纽约州纽约(New York，NY)(2003)；R.Stein，《霍奇金病》(Hodgkin’s Disease)，第2538-2571页，刊于《温车泊临床血液学》(Wintrobe’s Clinical Hematology)，第10版，G.Lee等编，Williams和Wilkins，马里兰州巴尔的摩(Baltimore，MD)(1999))。

5.22.2.17.多发性骨髓瘤

多发性骨髓瘤是浆细胞恶性肿瘤。肿瘤细胞位于骨髓中，其特征是溶骨性骨病变。相信免疫球蛋白基因座之一与各种其它基因，如细胞周期蛋白D1、细胞周期蛋白D3、c-MAF、MMSET(多发性骨髓瘤SET-结构域蛋白)或成纤维细胞生长因子受体3之间的染色体相互易位是主要的致癌事件。多发性骨髓瘤的特征是SHM，推定的来源细胞是后-GC B细胞。通常，首先通过症状鉴定多发性骨髓瘤，症状包括例如，反复感染、疲劳、疼痛和肾病，并用临床检测进行验证(参见例如，癌症：肿瘤学原理和实践(Cancer:Principles and Practice ofOncology)，第6版，DeVita，V.T.，Hellman，S.和Rosenberg，S.A.编，2001LippincottWilliams和Wilkins，宾夕法尼亚州费城(Philadelphia，PA)，19106第2465-2499页)。

在某些实施方式中，还可对作为用本发明组合物和方法治疗的候选者的患者进行血液和/或尿液的诊断检测，以确认多发性骨髓瘤的诊断或怀疑，这些检测包括但不限于：全血计数(CBC)检测，以测定CBC中报道的细胞类型是否在本领域公知的正常范围内；血液化学概况检测，以确定各种血液组分，如白蛋白、血液尿素氮(BUN)、钙、肌酸酐和乳酸脱氢酶(LDH)的水平是否偏离标准值。也可检测β₂-微球蛋白(β₂-M)的血清水平，以及IL-6的替代标记、骨髓瘤细胞的生长因子。可利用尿分析确定尿中的蛋白质水平。可利用电泳测定各种蛋白质水平，这些蛋白质包括血液(称为血清蛋白质电泳或SPEP)或尿(称为尿电泳或UEP)中的M蛋白。也可进行另一种称为免疫固定电泳(IFE)或免疫电泳的测试，以提供有关异常抗体蛋白类型的更具体的信息。可通过评估各种蛋白质，特别是M蛋白的改变和比例，追踪骨髓瘤疾病的进程和对治疗方案的反应。多发性骨髓瘤的特征是骨髓瘤肿瘤细胞分泌的M蛋白大量增加。

也可进行骨诊断检测，以确认多发性骨髓瘤的诊断或怀疑，这些检测包括但不限于：X射线和其它成像检查-包括骨(骨骼)检查、磁共振成像(MRI)和计算机轴向断层成像(CAT)(也称为计算机断层成像(CT))-可评估骨结构改变和确定骨中的肿瘤数量和大小。可利用骨髓抽吸或骨髓活检检测骨髓中的浆细胞数量增加。抽吸需要液体骨髓样品，活检需要固体骨组织样品。在这两项检查中，可从骨盆(髋骨)取得样品。也可利用胸骨抽吸骨髓。

多发性骨髓瘤患者一般分为以下三类，这种分类的目的是帮助确定有效的治疗方案。意义未明的单克隆丙种球蛋白病(MGUS)的典型特征是血清M蛋白水平小于3g/dL、骨髓克隆浆细胞小于10％、没有其它B细胞疾病迹象、且没有相关的器官或组织损伤，如高钙血症(血钙水平升高)、通过血清肌酸酐升高观察到的肾功能受损、贫血或骨损伤。无症状骨髓瘤一般是I期，包括郁积型多发性骨髓瘤(SMM)和无痛性多发性骨髓瘤(IMM)。SMM的特征是血清M蛋白水平大于或等于3g/dL，IMM的特征是骨髓克隆浆细胞大于或等于10％骨髓细胞。有症状骨髓瘤的特征是血清和/或尿中的M蛋白，包括以存在骨髓克隆浆细胞或浆细胞瘤为特征的II期多发性骨髓瘤和以相关器官或组织损伤为特征的III期多发性骨髓瘤。

骨硬化骨髓瘤是罕见POEMS综合征(多神经病、器官巨大症、内分泌病、单克隆丙种球蛋白病和皮肤病变)的组成部分。发病峰值出现在40-50岁。全身特征包括骨骼损伤、骨髓浆细胞<5％、正常CBC、血小板增加和器官巨大症。CSF含有大量蛋白，但不存在细胞。M-蛋白水平低(<3g/dl，中值＝1.1g/dl)；重链类型-通常为α或γ；轻链类型-通常为λ；尿单克隆罕见，偶见冷球蛋白血症。50％患者发生神经病，包括近端和远端神经衰弱，与小纤维相比较大神经纤维的感觉损失更多；脱髓鞘和远端潜伏期长。

郁积型多发性骨髓瘤患者的疾病状况通常会稳定数月/数年；没有贫血、骨损伤、肾功能不全或高钙血症；骨髓中含有>10％浆细胞以及单克隆血清蛋白。郁积型多发性骨髓瘤的标准与多发性骨髓瘤的诊断是相容的；然而，没有进行性过程的证据。这些是缓慢进展的情况，肿瘤细胞量在诊断时很低，处于S期的骨髓浆细胞的比例很低(<0.5％)。特征性临床特征包括：血清M蛋白水平>3g/dL和/或骨髓浆细胞≥10％；不存在贫血、肾衰竭、高钙血症、溶解性骨损伤。

无痛性(或无症状)多发性骨髓瘤是在没有出现症状的情况下，通常在实验室筛选研究后偶然诊断出的多发性骨髓瘤。无痛性多发性骨髓瘤类似于郁积型骨髓瘤，但骨损伤少且发生中度贫血。大部分无痛性多发性骨髓瘤的病例在3年内发生明显的多发性骨髓瘤。除以下内容外，诊断标准与多发性骨髓瘤基本相同，这些内容是：没有骨损伤或一个无症状溶解性损伤(X射线检查)；IgG的M组分水平<3g/dL，IgA的M组分水平2g/dL，尿轻链<4g/24h；血红蛋白>10g/dl，血清钙正常，血清肌酸酐<2mg/dL，无感染。

5.22.2.18.孤立性浆细胞瘤

孤立性浆细胞瘤是范围从良性单克隆丙种球蛋白病到孤立性浆细胞瘤到多发性骨髓瘤的浆细胞肿瘤谱中的一种。所有孤立性浆细胞瘤病例中大约70％的病例最终发生多发性骨髓瘤。这些疾病的特征是B细胞增殖，产生特征性副蛋白。孤立性浆细胞瘤导致孤立部位克隆浆细胞的增殖，这种增殖通常发生在单独的骨位点或髓外组织位点。孤立性浆细胞瘤的诊断标准包括：组织学验证的单一损伤、正常骨活检、阴性骨骼检查、无贫血、正常的钙水平和肾功能。大部分病例的血清M-蛋白(副蛋白)升高很少。诊断的中位年龄为50-55岁，比多发性骨髓瘤的中位年龄小5-10岁。(参见C.Wilson等，浆细胞失调(The PlasmaCell Dycrasias)，第113-144页，刊于W.Finn和L.Peterson编辑的《肿瘤学中的血液病理学》(Hematopathology in Oncology)，克鲁学术出版社(Kluwer Academic Publishers)，马萨诸塞州诺尔维(Norwell，MA)(2004)；S.Chaganti等，淋巴瘤的细胞遗传学(Cytogenetics of Lymphoma)，第809-824页，刊于《非霍奇金淋巴瘤》(Non-Hodgkin’sLymphomas)，P.Mauch等编，Lippincott Williams和Wilkins，宾夕法尼亚州费城(Philadelphia，PA)(2004))。

浆细胞瘤的免疫表型和遗传特征似乎与多发性骨髓瘤相似。

5.22.2.19.轻链疾病/轻链沉积病(LCDD)

LCDD是免疫球蛋白轻链(通常是κ轻链)过度合成，沉积在组织中引起的浆细胞失调病。患者通常出现器官功能障碍、虚弱、疲劳和体重降低。在约80％LCDD病例中检测到单克隆免疫球蛋白。利用免疫荧光技术检测单克隆κ轻链受限于轻链会产生过多背景染色的倾向，因此，可能需要利用超结构免疫金标记。(参见C.Wilson等，浆细胞失调(The PlasmaCell Dycrasias)，第113-144页，刊于W.Finn和L.Peterson编辑的《肿瘤学中的血液病理学》(Hematopathology in Oncology)，克鲁学术出版社(Kluwer Academic Publishers)，马萨诸塞州诺尔维(Norwell，MA)(2004))。

5.22.2.20.浆细胞白血病(PCL)

浆细胞失调PCL是多发性骨髓瘤的罕见侵袭性变型。浆细胞白血病的标准是外周血绝对浆细胞计数大于2x10⁹/L，或浆细胞占白细胞的20％以上。通过流式细胞术确定存在胞质轻链限制的CD138⁺群体后，能够将PCL与具有浆细胞特征的淋巴瘤区别开。PCL细胞的特征还有缺少表面轻链、CD19和CD22表达，以及CD45无表达或表达很少。约50％PCL病例表达CD20，约50％不表达CD56。PCL患者中观察到的遗传学异常与多发性骨髓瘤患者相同，但PCL中频率较高(参见C.Wilson，浆细胞失调(The Plasma Cell Dycrasias)，第113-144页，刊于W.Finn和L.Peterson编辑的《肿瘤中的血液病理学》(Hematopathology inOncology)，克鲁学术出版社(Kluwer Academic Publishers)，马萨诸塞州诺尔维(Norwell，MA)(2004))。

浆细胞白血病有两种形式：如果最初诊断是基于骨髓瘤的白血病阶段，则是原发形式，否则是继发形式。原发性浆细胞白血病与较小的年龄、肝脾肿大、淋巴结病和溶解性骨损伤较少相关联，但预后比继发形式差。浆细胞白血病患者的外周血中含有20％以上浆细胞，其绝对计数为2000/ml或更多。

5.22.2.21.意义未明的单克隆丙种球蛋白病(MGUS)

MGUS是相对常见的疾病，其特征是存在电泳均一的免疫球蛋白或良性M组分。这种病症的发病率似乎随年龄增长而提高。大部分携带M组分的个体从未发生恶性浆细胞失调，如多发性骨髓瘤。然而，一些有此状况的个体患有相关恶性病症。有症状时，患者可能发生肝或脾的肿大以及多神经病(pleuroneuropathy)。(参见J.Foerster，浆细胞失调：总体考虑(Plasma Cell Dycrasias:General Considerations)，第2612-2630页，刊于《温车泊临床血液学》(Wintrobe’s Clinical Hematology)，第10版，G.Lee等编，Williams和Wilkins，马里兰州巴尔的摩(Baltimore，MD)(1999))。

可通过外周血中循环的单克隆浆细胞数量增加，将MGUS与多发性骨髓瘤区分开。M-组分的血清学特征与其它浆细胞失调状况相同，然而，M组分的总浓度通常小于30g/L。副蛋白通常是IgG；然而可存在多种副蛋白，包括IgG、IgA、IgM。各种单独免疫球蛋白类型的相对量一般与正常血清中发现的相对量成正比。蛋白血症或蛋白尿较少见。连续测定血液和尿液中的M-蛋白水平和连续监测临床和实验室特征(包括蛋白质电泳)是最可靠的区别MGUS与早期浆细胞失调的方法。刊于《温车泊临床血液学》(Wintrobe’s ClinicalHematology)，第10版，G.Lee等编，Williams和Wilkins，马里兰州巴尔的摩(Baltimore，MD)(1999)。

5.22.2.22.成熟B细胞恶性肿瘤：

在另一实施方式中，可实施本发明以治疗成熟B细胞恶性肿瘤，这些恶性肿瘤包括但不限于：滤泡性淋巴瘤，套细胞淋巴瘤，伯基特淋巴瘤，多发性骨髓瘤，弥散性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)，包括生发中心B细胞样(GCB)DLBCL、活化的B细胞样(ABC)DLBCL和3型DLBCL，霍奇金淋巴瘤，包括经典和结节状淋巴细胞优势型，淋巴浆细胞性淋巴瘤(LPL)，边缘区淋巴瘤，包括胃粘膜相关性淋巴组织(MALT)淋巴瘤，以及慢性淋巴细胞性白血病(CLL)，包括免疫球蛋白突变的CLL和免疫球蛋白未突变的CLL。

5.22.2.23.前B细胞恶性肿瘤:

另外，在B细胞发育过程中，CD19的表达比(例如)CD20早，因此特别适合治疗(例如)骨髓中的前B细胞和未成熟B细胞恶性肿瘤。代表性前B细胞和未成熟B细胞恶性肿瘤包括但不限于：套细胞淋巴瘤、前B细胞急性淋巴细胞性白血病、前体B细胞淋巴母细胞淋巴瘤和特征是表达CD19的其它恶性肿瘤。

5.23.患者诊断和治疗方案移植

按照本发明的某些方面，根据许多因素选择使用本发明组合物和方法的治疗方案和剂量，这些因素包括例如，将患者置于发生体液排斥的风险中的临床表现，或这种排斥正在发生的临床证据。术语“体液”和“抗体介导”在本文中可互换使用。

按照本领域的知识和技术建立评估患者发生体液排斥的风险的标准。在一个实施方式中，补体依赖性细胞毒性或抗球蛋白增强的补体依赖性细胞毒性交叉匹配阳性表明该患者发生体液排斥的风险较高。在一个实施方式中，交叉匹配阳性或在先补体依赖性细胞毒性或抗球蛋白增强的补体依赖性细胞毒性交叉匹配阳性表明，该患者发生体液排斥的风险中等。在一个实施方式中，交叉匹配阴性表明该患者发生体液排斥的风险低。

在另一实施方式中，需要预防移植物排斥的移植物接受者可鉴定为在移植前具有可检测的循环抗-HLA同种抗体的患者或患者群体。在另一个例子中，患者或患者群体被鉴定为在移植前具有组反应性抗体的患者或患者群体。也可利用移植后移植物接受者体内存在可检测的循环抗-HLA同种抗体来鉴定需要按照本发明进行体液排斥治疗的患者或患者群体。也可按照其它临床标准鉴定需要进行体液排斥治疗的患者或患者群体，这些标准用于说明移植物接受者处于发生体液排斥的风险中或已经发生体液排斥。例如，需要治疗体液排斥的移植物接受者可被鉴定为处于体液排斥早期阶段，如特征是循环中存在抗供体同种抗体的潜在体液应答的患者或群体。体液排斥的早期阶段也可以是特征是循环抗供体同种抗体和C4d沉积的沉默反应，或者是特征是循环抗供体同种抗体、C4d沉积和组织病理的亚临床排斥。在晚期阶段，接受者被鉴定为出现按本领域知识和技术鉴定的体液排斥临床症状，例如，循环抗供体同种抗体、C4d沉积、组织病理和移植物功能障碍的患者或患者群体。

本发明提供了能有效降低GVHD的发病率、严重程度或持续时间，排斥发作或移植后淋巴增殖性疾病的组合物、治疗性制剂、方法和方案。在某些实施方式中，本发明的组合物和方法能有效减轻宿主对实体组织或器官移植物缺血性再灌注损伤的反应。在一个实施方式中，本发明组合物和方法能有效延长移植物在移植物接受者中的存活时间。

本发明包括接受者自体移植物、同种异体移植物或异种移植物。本发明包括的移植物类型包括组织和器官移植物，包括但不限于：骨髓移植物、外周干细胞移植物、皮肤移植物、动脉和静脉移植物、胰岛细胞移植物以及肾、肝、脾、甲状腺和心脏移植体。术语“移植物”和“移植体”在本文中可互换使用。在一个实施方式中，自体移植物是骨髓移植物、动脉移植物、静脉移植物或皮肤移植物。在一个实施方式中，同种移植物是骨髓移植物、角膜移植物、肾移植体、胰岛细胞移植体或者肾和胰腺的联合移植体。在一个实施方式中，移植物是异种移植物，其中可能的供体动物包括但不限于猪。也可利用本发明组合物和方法抑制对非生物移植物或植入物，包括但不限于人工关节、支架或起搏器装置的有害免疫应答。

可利用本发明的抗CD19抗体、组合物和方法来治疗或预防GVHD、体液排斥或移植后淋巴增殖性疾病，而不用考虑最初需要移植物或需要植入的特定组织类型的具体适应症。

描述了用于治疗诊断患有自身免疫疾病或失调的人对象的本发明的治疗性制剂和方案，所述自身免疫疾病或失调包括但不限于：类风湿性关节炎、SLE、ITP、天疱疮相关疾病、糖尿病和硬皮病。

本领域技术人员可为特定患者或患者群体确定合适的治疗方案。在具体实施方式中，治疗方案是急性或慢性排斥的移植前调节方案、移植后维持方案或移植后治疗方案。在某些实施方式中，与评估为处于发生体液应答低风险中的患者的方案相比，根据评估为处于发生体液应答高度或中等风险中的患者改变具体方案。

在某些实施方式中，按照体液排斥的分期改变具体方案，对较晚期的排斥使用更具攻击性的治疗。可按照本领域知识和技术对体液排斥进行分期。例如，可按照以下标准将体液排斥分为I-IV期。I期潜伏应答，特征是循环抗供体同种抗体，特别是抗-HLA抗体；II期沉默反应，特征是循环抗供体同种抗体，特别是抗-HLA抗体和C4d沉积，但没有组织学改变或移植物功能障碍；III期亚临床排斥：特征是循环抗供体同种抗体，特别是抗-HLA抗体、C4d沉积和组织病理，但无移植物功能障碍；IV期体液排斥：特征是循环抗供体同种抗体，特别是抗-HLA抗体、C4d沉积、组织病理和移植物功能障碍。

可利用本领域已知的标准方法产生剂量反应曲线，以确定用于特定方案，例如移植前调节方案和移植后方案，以便预防和治疗GVHD、体液排斥或移植后淋巴增殖性疾病的本发明组合物的有效量。通常，与不处于高风险中或未表现出任何主动排斥迹象的患者相比，处于发生体液排斥高风险中和已经产生一种或多种临床排斥迹象的患者需要较高剂量和/或更频繁的给药，并且可能在较长时间内给药。

可单独使用或与其他治疗剂或治疗方案联合实施本发明的抗CD19抗体、组合物和方法以治疗或预防GVHD、体液排斥或移植后淋巴增殖性疾病。治疗或预防GVHD、体液排斥或移植后淋巴增殖性疾病的其它治疗方案可包括，例如，一种或多种抗-淋巴细胞治疗、类固醇治疗、抗体消耗治疗、免疫抑制治疗和血浆去除术。

抗-淋巴细胞治疗可包括给予移植物接受者以抗-胸腺细胞球蛋白，也称为即复宁。抗-淋巴细胞治疗也可包括给予一种或多种T细胞表面抗原的单克隆抗体。这类抗体的例子包括但不限于：OKT3^TM(莫罗单抗-CD3)、坎帕斯^TM-1H(阿来组单抗)、坎帕斯^TM-1G、坎帕斯^TM-1M、SIMULECT^TM(巴利昔单抗)和赛尼哌(ZENAPAX)^TM(达珠单抗)。在一个具体实施方式中，抗-淋巴细胞治疗包括一种或多种其它导向B细胞的抗体，包括但不限于：利妥昔^TM(利妥昔单抗)。

类固醇治疗可包括给予移植物接受者一种或多种类固醇，所述类固醇选自：氢化可的松、氯泼尼松、甲泼尼龙、地塞米松和吲哚美辛。一种或多种类固醇可以是皮质类固醇，包括但不限于：氢化可的松、氯泼尼松和甲泼尼龙。

抗体消耗治疗可包括例如，静脉内给予移植物接受者免疫球蛋白。抗体消耗治疗也可包括在移植之前离体应用于移植物的免疫吸附治疗。可利用T细胞或B细胞表面标记的抗体如抗-CD3抗体、抗CD19抗体、抗-CD20抗体和抗CD19抗体，通过任何合适的技术，例如蛋白A亲和技术或抗体亲和技术进行免疫吸附。

免疫抑制治疗可包括给予一种或多种免疫抑制剂，如细胞因子转录抑制剂(如环孢菌素A、他克莫司)、核苷酸合成抑制剂(如硫唑嘌呤、麦考酚酸吗乙酯)、生长因子信号转导抑制剂(如西罗莫司、雷帕霉素)和T细胞白介素2受体抑制剂(如达珠单抗、巴利昔单抗)。在具体实施方式中，与本发明组合物和方法联合使用的免疫抑制剂包括以下一种或多种药剂：阿霉素、硫唑嘌呤、白消安、环磷酰胺、环孢菌素A(“CyA”)、赛多辛、氟达拉滨、5-氟尿嘧啶、甲氨蝶呤、麦考酚酸吗乙酯(MOFETIL)、非类固醇消炎药(NSAID)、雷帕霉素和他克莫司(FK506)。免疫抑制剂也可包括补体抑制剂，如可溶性补体受体-1、抗-C5抗体或C1的小分子抑制剂，如Buerke等(J.Immunol.，167:5375-80(2001)所述。

在一个实施方式中，本发明组合物和方法与一种或多种治疗方案联用以抑制体液排斥，这些方案包括但不限于：他克莫司和麦考酚酸吗乙酯治疗、免疫吸附、静脉内免疫球蛋白治疗和血浆去除术。

5.23.1.诊断和临床标准

本发明提供了治疗和预防人移植物接受者的GVHD、体液排斥和移植后淋巴增殖性疾病的抗体、组合物和方法。不管需要移植的具体情况如何，均可使用本发明的组合物和方法。相似地，本发明组合物和方法在治疗和预防GVHD、体液排斥和移植后淋巴增殖性疾病中的应用不受准备进行移植或已经移植的具体组织类型的限制。

在一个实施方式中，本发明提供了在人移植物接受者中预防体液排斥的组合物和方法，其中所述移植物接受者被鉴定为发生体液排斥风险提高的患者或患者群体。这类患者也可称为“敏化”患者。本领域技术人员了解鉴定敏化患者的标准。这种标准可包括，例如，患者具有可检测水平的HLA抗原的循环抗体，如抗-HLA同种抗体。这类标准也可包括，患者之前经历过移植、怀孕或多次输血。体液排斥风险提高的患者也包括供体-接受者HLA匹配不良的患者和ABO非相容性移植。敏化个体是在移植前预先治疗或进行调节的候选个体。敏化个体也是预防体液排斥的移植后维持方案的候选个体。

在一个实施方式中，本发明的抗体、组合物和方法包括治疗急性或慢性排斥的治疗方案，或者与此种方案联用。在具体实施方式中，排斥被表征为I期、II期、III期或IV期体液排斥。

在一个实施方式中，本发明的抗体、组合物和方法包括治疗早期体液排斥的治疗方案，或者与此种方案联用。在具体实施方式中，早期体液排斥是I、II或III期排斥。按照本领域知识和技术确定早期体液排斥的临床指示，这些临床指示可包括例如，患者中出现循环的供体特异性抗-HLA抗体，出现具有抗体活性的补体标记如移植物活检样品中的C4d和C3d沉积物，和移植物活检样品中出现抗-HLA抗体。本领域技术人员了解早期体液排斥的其它指标，可包括例如，出现抗内皮抗体，特别是抗波形蛋白抗体，出现非经典MHC I类-相关链A(MICA)同种抗体。

在一个实施方式中，本发明的组合物和方法包括治疗特征部分地是移植物功能障碍的体液排斥的治疗方案，或者与此种方案联用。在具体实施方式中，按照本领域已知的移植物功能障碍的标准鉴定需要治疗体液排斥的患者或患者群体。在以下章节提供对特定移植物类型而言这类标准的例子。在其它实施方式中，按照对应于具体组织移植物类型的其它标准，如组织学标准鉴定需要治疗体液排斥的患者或患者群体。以下章节也提供了这类标准的例子。

5.23.2.骨髓移植物

本发明的组合物和方法可用于治疗或预防骨髓移植接受者的GVHD、体液排斥和移植后淋巴增殖性疾病。在一个实施方式中，本发明的组合物和方法包括移植前调节方案，或与其联用。

在一个实施方式中，可在移植前利用本发明的组合物和方法消耗骨髓移植物中的B细胞。该移植物可来自任何合适的来源，例如，脐带血干细胞、外周血干细胞或骨髓穿刺液。外周血干细胞可以在进行合适的调节方案后由供体血液收集。本领域了解合适的方案，可包括例如，在收集供体血液之前将以下一种或多种物质给予供体：非格司亭(NEUPOGEN)、细胞因子如GM-CSF、低剂量化疗方案和趋化因子治疗。移植物可以是移植物接受者同种异体移植物或是自体移植物。移植物也可以是异种移植物。

组合物和方法可用于存在骨髓移植的造血适应症的多种情况。在一个实施方式中，自体骨髓移植物适用于B细胞白血病或淋巴瘤，包括但不限于：急性淋巴细胞性白血病(“ALL”)或非霍奇金淋巴瘤，本发明组合物和方法可用于消耗污染该移植物的残留恶性细胞。在一个实施方式中，自体骨髓移植适用于无法清除病毒感染，例如与爱波斯坦-巴尔病毒(EBV)、人体免疫缺陷病毒(HIV)或巨细胞病毒(CMV)有关的病毒感染的患者，本发明组合物和方法可用于消耗移植物中的可能携带病毒的B细胞。在另一实施方式中，移植物是同种移植物，本发明组合物和方法可用于消耗移植物中的供体B细胞以预防GVHD。

在一个实施方式中，适应症是B细胞相关性自身免疫病，本发明组合物和方法可用于消耗无需化疗或放疗调节方案的患者体内的有害B细胞。在一个实施方式中，本发明组合物与化疗或放疗方案联合给予，所述方案包括与不存在本发明组合物时给予的剂量相比，较低剂量的一种或多种化疗药，或较低剂量的放疗。在一个实施方式中，患者在化疗或放疗后接受自体骨髓移植，其中在移植之前利用本发明组合物和方法消耗移植物中有害的B细胞。

按照本领域的知识和技术鉴定需要骨髓移植或可能从中获益的患者或患者群体。可能成为骨髓移植候选者的患者的例子包括：为治疗癌症或自身免疫疾病或失调接受过化疗或放疗的患者，无法清除免疫系统细胞中存留的病毒感染的患者。

5.23.3.肝脏移植物

本发明的组合物和方法可用于治疗或预防肝脏移植接受者的GVHD、体液排斥和移植后淋巴增殖性疾病。在具体实施方式中，所述排斥是急性或慢性排斥。在一个实施方式中，本发明的组合物和方法可用于预防肝脏移植接受者的GVHD、体液排斥和移植后淋巴增殖性疾病。在一个实施方式中，本发明的组合物和方法包括移植前调节方案，或与其联用。在一个实施方式中，将本发明组合物给予移植物接受者。在一个实施方式中，在移植前将本发明组合物与移植物离体接触。

肝脏移植物可以来自按照本领域知识和技术确定的任何合适的来源。在一个实施方式中，肝脏是HLA匹配的同种移植物。在另一实施方式中，肝脏是来自猪供体的异种移植物。在一个实施方式中，离体使用肝脏以过滤患者血液，如体外灌注。体外灌注是一种肝脏透析形式，其中患者通过外科手术连接在体外维持的肝脏。该方法有时被称为“生物人工肝”。按照这个实施方式，本发明的组合物和方法可用于防止可能污染患者血液的肝抗原抗体的产生。

在一个实施方式中，本发明的组合物和方法包括用于治疗和预防GVHD、体液排斥和移植后淋巴增殖性疾病的改进治疗方案。在具体实施方式中，本发明的组合物和方法包括一种改进的治疗方案，其中所述改进是与传统免疫抑制剂有关的并发症的发病率和/或严重程度降低。在一个实施方式中，与依赖环孢菌素A或其它神经钙蛋白抑制剂的传统方案相比，中毒性肾损害、肝毒性和多毛症的发生率和/或严重程度降低。在一个实施方式中，与依赖皮质类固醇的传统方案相比，肥胖症、骨营养不良、糖尿病以及细菌和病毒感染的易感性的发生率和/或严重程度降低。

在一个实施方式中，与不用抗-淋巴细胞抗体治疗情况下所用剂量相比，本发明的组合物和方法可与较低剂量的一种或多种传统免疫抑制剂联用。该较低剂量可导致与一种或多种传统免疫抑制剂有关的一种或多种并发症的发生率和/或严重程度降低。

按照本领域的知识和技术鉴定需要肝脏移植或可能从中获益的患者或患者群体。可能成为肝脏移植候选者的患者的例子包括患有以下一种或多种病症、疾病或失调的人：急性肝衰竭，淀粉样变、胆红素排泄病、胆管闭锁、巴-希二氏综合征、慢性活动性自身免疫肝炎、硬化(病毒性肝炎包括乙型肝炎和丙型肝炎相关性硬化、酒精性硬化或原发性胆汁性肝硬化)、胆管炎、先天因子VIII或IX失调、铜代谢病、囊性纤维化病、糖原生成、高胆固醇血症、脂肪沉积症、粘多糖贮积症、原发性硬化性胆管炎、卟啉代谢病、嘌呤和嘧啶代谢病以及良性和恶性的原发性肿瘤，特别是肝和肝内胆管、胆管系统、胆汁通道或消化系统的肿瘤。

按照本领域的知识和技术，可确定鉴定需要肝脏移植或可能从中获益的患者或患者群体的临床标准。这类标准可包括例如，以下一种或多种症状：疲劳、体重降低、上腹部疼痛、苍白(purities)、黄疸、肝肿大、变色尿、碱性磷酸酶和γ谷氨酰肽酶活性升高、胆红素水平身高、血清白蛋白减少、肝特异性酶升高、胆汁产量低、血液尿素氮升高、肌酸酐升高和/或存在抗-嗜中性粒细胞胞质抗体(ANCA)效价、反复性静脉曲张出血、顽固性腹水、自发性细菌性腹膜炎、难治性脑病、严重黄疸、合成功能障碍恶化、突发性生理衰退和急性肝衰竭。

5.23.4.肾移植物

本发明的组合物和方法可用于治疗或预防肾脏移植接受者的GVHD、体液排斥和移植后淋巴增殖性疾病。本文所用术语“肾移植物”包括肾脏移植物以及肾脏和胰腺的联合移植物。在具体实施方式中，所述排斥的特征是急性或慢性排斥。

在一个实施方式中，本发明的组合物和方法包括移植前调节方案，或与其联用。在一个实施方式中，一种或多种本发明组合物的一个剂量能有效降低组反应性抗体并消耗患者或患者群体的B细胞。在另一实施方式中，一种或多种本发明组合物的多个剂量能有效降低组反应性抗体并消耗患者或患者群体的B细胞。在一个实施方式中，一种或多种本发明组合物的一个剂量与一种或多种免疫抑制剂联合给药，能有效降低组反应性抗体并消耗患者或患者群体的B细胞。

在某些实施方式中，将本发明的组合物和方法用于治疗或预防接受肾脏移植的患者的GVHD和移植物排斥。在一个实施方式中，该患者尚未出现临床排斥迹象。在相关实施方式中，本发明的组合物和方法包括用于预防移植物接受者的移植物排斥的维持方案，或与其联用。在一个实施方式中，本发明的组合物和方法可用于治疗亚临床体液排斥。在相关实施方式中，需要治疗亚临床体液排斥的患者或患者群体可通过检测移植物活检样品中的Cd4沉积或检测循环抗-HLA抗体来鉴别。

在一个实施方式中，本发明的组合物和方法包括用于治疗移植物接受者的急性或慢性排斥事件的治疗方案，或者与此种方案联用。在一个实施方式中，通过检测一种或多种临床排斥指标鉴定需要治疗急性或慢性排斥事件的患者或患者群体。在特定实施方式中，在移植后1-6周检测所述一种或多种临床排斥指标。在一个实施方式中，在移植后6、12、18、24、36、48或60个月检测所述一种或多种临床排斥指标。在一个实施方式中，所述急性排斥是生物活检确认的急性体液排斥。

在一个实施方式中，一种或多种本发明组合物包括用于治疗急性排斥的治疗方案。在具体实施方式中，该治疗方案还包括一种或多种以下治疗：血浆去除术、他克莫司/霉酚酸酯、静脉内免疫球蛋白、蛋白A和抗-CD20抗体的免疫吸附。在一个实施方式中，在发生排斥之前，该患者已经接受免疫抑制方案。在具体实施方式中，免疫抑制方案包括环孢霉素、硫唑嘌呤和类固醇治疗中的一种或多种。

本领域已知急性体液排斥的临床指标，包括例如，突发性严重肾功能衰退、发生少尿和肾灌注缺陷。其它指标包括例如，活检样品的肾小管周围毛细血管中的炎性细胞和循环的供体特异性同种抗体。在一个实施方式中，患者出现一种或多种以下用于肾同种移植物体液排斥的诊断标准：(1)急性组织损伤的形态学证据；(2)抗体作用证据，如动脉纤维蛋白样坏死中的C4d沉积物或免疫球蛋白和补体；和(3)可检测水平的供体HLA抗原或供体内皮抗原的循环抗体。在一个实施方式中，患者出现上述所有三种诊断标准。

在一个实施方式中，患者出现一种或多种上述急性体液排斥的诊断标准，将本发明组合物与一种或多种以下免疫抑制剂联用以治疗急性体液排斥：静脉内免疫球蛋白、抗-胸腺细胞球蛋白、抗-CD20抗体、麦考酚酸吗乙酯或他克莫司。在另一实施方式中，将本发明组合物与一种或多种免疫抑制剂和去除患者的同种抗体的方法，如血浆去除术或免疫吸附法联用。

在一个实施方式中，本发明的组合物和方法包括用于治疗慢性肾脏同种移植物排斥的治疗方案，或者与此种方案联用。在一个实施方式中，将一种或多种本发明组合物单独使用或与以下一种或多种免疫抑制剂联合使用，这些免疫抑制剂包括例如，抗-CD154(CD40L)、他克莫司、西罗莫司和咪唑立宾。在一个实施方式中，将一种或多种抗CD19抗体与他克莫司和霉酚酸酯联合使用。

本领域了解慢性肾脏排斥的临床指标，可包括例如，具有内膜单核细胞的动脉内膜纤维化(慢性同种移植物血管病)、肾小球基底膜增厚(慢性同种移植物肾小球病)、肾小管周围基底膜分层、肾小管周围毛细血管中的C4d和可检测水平的循环供体HLA反应性抗体。在一个实施方式中，本发明的组合物和方法包括在移植物损伤发生之前治疗慢性排斥的治疗方案，或者与此种方案联用。

在另一实施方式中，根据一种或多种移植肾小球病的临床指标鉴定需要治疗的患者或患者群体。在相关实施方式中，本发明组合物包括含有一种或多种治疗剂的治疗方案，或者与其联用。在某些实施方式中，该治疗方案能有效稳定肾功能并能抑制移植物排斥。在具体实施方式中，所述一种或多种治疗剂包括血管紧张素转化酶(ACE)抑制剂和/或受体拮抗剂、静脉内免疫球蛋白、抗-胸腺细胞球蛋白、抗-CD20抗体、麦考酚酸吗乙酯或他克莫司。抗CD19抗体可与麦考酚酸吗乙酯和他克莫司联用，包括或不包括其它治疗剂。也可将血浆去除术用作治疗方案的一部分。

按照本领域的知识和技术鉴定需要肾脏移植或可能从中获益的患者或患者群体。可能成为肾移植候选者的患者的例子包括：诊断患有淀粉样变、糖尿病(I型或II型)、肾小球病(如肾小球肾炎)、痛风、溶血尿毒症综合征、HIV、遗传性肾病(如多囊性肾病、先天性梗阻性尿路病、胱氨酸贮积症或干梅腹综合征)、其它肾病(如获得性阻塞性肾病、急性肾小管坏死、急性间质性肾炎)、类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮或镰状细胞贫血的患者。其它肾移植候选者包括患有胰岛素缺陷、高血压、严重损伤或烧伤、大手术、心脏病或心脏病发作、肝病或肝衰竭、血管病(如进行性全身硬化病、肾动脉血栓形成、硬皮病)、膀胱输尿管反流和某些癌症(如偶发癌、淋巴瘤、多发性骨髓瘤、肾细胞癌、肾母细胞瘤)的患者。其它肾移植候选者可包括例如，海洛因使用者、曾发生过肾或胰腺移植排斥的人和正在接受包括抗生素、环孢菌素或化疗等治疗方案的人。

按照本领域的知识和技术，可确定鉴定需要肾脏移植或可能从中获益的患者或患者群体的临床标准。这类标准可包括例如，以下一种或多种症状：排尿问题、出血、容易瘀青、疲劳、意识错乱、恶心和呕吐、食欲下降、皮肤苍白(贫血所致)，肌肉、关节、胁部和胸部疼痛，骨痛或骨折，以及瘙痒。

5.23.5.心脏移植物

本发明的组合物和方法可用于治疗或预防心脏移植接受者的GVHD、体液排斥和移植后淋巴增殖性疾病。在具体实施方式中，所述排斥是急性或慢性排斥。在一个实施方式中，本发明的组合物和方法包括移植前调节方案，或与其联用。

在一个实施方式中，本发明的组合物和方法包括用于治疗心脏移植接受者的急性体液排斥的治疗方案，或者与此种方案联用。在具体实施方式中，该治疗方案还包括一种或多种以下治疗：血浆去除术、静脉内免疫球蛋白和抗-CD20抗体治疗。通过检测一种或多种急性体液排斥的临床指标鉴定需要治疗急性体液排斥的患者或患者群体。急性体液排斥的临床指标的例子可包括以下一种或多种指标：血液动力学功能障碍，其表现为休克、低血压、心输出量减少以及毛细血管楔嵌压或肺动脉压上升。在具体实施方式中，在移植后6、12、18、24、36、48或60个月内诊断急性体液排斥。

在一个实施方式中，本发明的组合物和方法包括用于预防心脏移植接受者的排斥的治疗方案，或者与此种方案联用。在一个实施方式中，需要预防排斥的移植物接受者被鉴定为具有以下一种或多种风险因子的患者或患者群体：女性、巨细胞病毒血清阳性、对组反应性抗体的反应提高、移植前和/或后交叉匹配阳性和用免疫抑制剂预敏化。

在一个实施方式中，本发明的组合物和方法可用于治疗或预防心脏移植接受者的移植物衰退。在一个实施方式中，需要治疗或预防移植物衰退的移植物接受者被鉴定为具有以下一种或多种体液排斥的临床指标的患者或患者群体：免疫球蛋白、C1q、C3和/或C4d在毛细血管中沉积，CD68-阳性细胞在毛细血管中沉积的证据和生物活检中移植物被炎性细胞浸润的证据。在一个实施方式中，本发明组合物与以下一种或多种免疫抑制剂联用，以治疗心脏移植接受者的移植物衰退：静脉内免疫球蛋白、抗-胸腺细胞球蛋白、抗-CD20抗体、麦考酚酸吗乙酯或他克莫司。在另一实施方式中，将本发明抗CD19抗体组合物与一种或多种免疫抑制剂和去除患者的同种抗体的方法，如血浆去除术或免疫吸附法联用。

在一个实施方式中，本发明的组合物和方法包括治疗慢性心脏排斥，例如慢性同种移植物血管病，也称为移植性冠心病的治疗方案，或者与其联用。在另一实施方式中，本发明的组合物和方法包括预防风险患者或患者群体的移植性冠心病的治疗方案，或者与其联用。本领域了解鉴定处于发生移植性冠心病的风险中的患者或患者群体的标准，可包括例如，患者移植了匹配较差的移植物，患者产生循环抗-HLA抗体，患者在心脏移植后不久就出现了一种或多种体液排斥的临床指标。

按照本领域的知识和技术鉴定需要心脏移植或可能从中获益的患者或患者群体。可以称为心脏移植候选者的患者的例子包括已被诊断为患有以下疾病和失调的患者：冠心病、心肌病(非炎性心脏病)、发生充血性心力衰竭的心脏瓣膜病、对其它治疗无反应的危及生命的心律异常、特发性心肌病、缺血性心肌病、扩张型心肌病、缺血性心肌病和尚不存在常规治疗或常规治疗无效的先天性心脏病。

按照本领域的知识和技术，可确定鉴定需要心脏移植或可能从中获益的患者或患者群体的临床标准。这类标准可包括例如，以下一种或多种症状：射血分数小于25％、对常规治疗无反应的顽固性心绞痛或恶性心律失常，以及肺血管阻力小于2伍德单位(Woodunits)。此外，可按照本领域知识和技术进行一系列测试，以鉴定需要心脏移植的患者或患者群体。这类测试包括例如，静息和应激超声心动图、EKG、血液肌酸酐水平检测、冠状动脉造影术和心肺评估，包括右侧和左侧心脏导管插入术。

5.23.6.肺移植物

本发明的组合物和方法可用于治疗或预防肺移植接受者的GVHD、体液排斥和移植后淋巴增殖性疾病。在具体实施方式中，所述排斥的特征是急性或慢性排斥。在一个实施方式中，本发明的组合物和方法包括移植前调节方案，或与其联用。

按照本领域的知识和技术鉴定需要肺移植或可能从中获益的患者或患者群体。可能成为肺移植候选者的患者的例子包括患有以下一种或多种疾病或病症的患者：支气管扩张、慢性阻塞性肺病、囊性纤维化病、艾森门格综合征或具有艾森门格综合征的先天性心脏病、肺气肿、肺嗜酸细胞性肉芽肿或组织细胞增多病X、吸入/烧伤型外伤、淋巴管平滑肌增多症(LAM)、原发性肺动脉高压、肺纤维化(肺疤痕化)或结节病。

按照本领域的知识和技术，可确定鉴定需要肺移植或可能从中获益的患者或患者群体的临床标准。这类标准可包括例如以下一种或多种症状：具有以下一种或多种特征的慢性阻塞性肺病(COPD)和α1-抗胰蛋白酶缺陷肺气肿：支气管扩张药用药后FEV1不到预测值的25％、静息低氧血即PaO₂小于55-60mm Hg、高碳酸血症、继发性肺动脉高压、FEV1快速下降或威胁生命的加剧；具有以下一种或多种特征的囊性纤维化病：支气管扩张药用药后FEV1不到预测值的30％、静息低氧血、高碳酸血症或者恶化的频率和严重程度提高；具有以下一种或多种特征的特发性肺纤维化：肺活量(VC)和TLC不到预测值的60-65％和静息低氧血；具有以下特征的继发性肺动脉高压：医学治疗过程中在临床、X光照片或生理学上有进展；具有以下一种或多种特征的原发性肺动脉高压：NYHA功能类型III或IV、平均右心房压大于10mmHg、平均肺动脉压大于50mmHg、心脏指数小于2.5升/分钟/米²、长期前列环素输注治疗无效。

5.23.7.移植后淋巴增殖性疾病

成功移植所必需的免疫抑制可在移植后导致B细胞来源的淋巴增殖性疾病。通常，移植后淋巴增殖性疾病与爱波斯坦-巴尔病毒感染细胞有关。根据严重程度，移植后淋巴增殖性疾病(PTLD)的范围可以从良性自身限制性单核细胞增多样综合征到侵袭性非霍奇金淋巴瘤。本发明的组合物和方法可用于治疗由任何移植物引起的PTLD。移植物可以是实体器官移植物，例如心脏移植物、肝移植物、肾移植物或肾脏-胰腺联合移植物。在一个实施方式中，将本发明的组合物和方法作为治疗方案的一部分治疗PTLD，该治疗方案包括临时停止或减少其它免疫抑制治疗。

在一个实施方式中，抗CD19抗体组合物作为治疗方案的一部分给药，所述治疗方案包括以下一种或多种物质：高剂量静脉内γ球蛋白、细胞因子、抗病毒剂和抗-CD20单克隆抗体。该治疗方案可包括临时停止或减少免疫抑制治疗。在一个实施方式中，静脉内γ球蛋白以日剂量0.4g/kg给药1-5天，优选3天，细胞因子是给予至少7天的干扰素α。在一个实施方式中，该方案中采用一种或多种细胞因子。在一个实施方式中，该方案中采用一种或多种抗病毒剂。所述抗病毒剂可选自本领域技术人员已知的任何合适的抗病毒剂。在一个实施方式中，所述抗病毒剂是阿昔洛韦或更昔洛韦。所述抗病毒剂可给予至少一周或两周。所述抗病毒剂也可给予较长时间，例如，1个月、2个月、3个月、4个月或5个月。

5.24.患者诊断和治疗方案：

自身免疫病

按照本发明的某些方面，根据许多因素选择用于本发明组合物和方法的治疗方案和剂量，这些因素包括但不限于：所治疗的自身免疫疾病或失调的阶段。本领域技术人员可根据患者或患者群体中自身免疫疾病或失调的特定阶段确定合适的治疗方案。可利用本领域标准方法得到剂量反应曲线，以确定本发明组合物治疗患有不同阶段自身免疫疾病或失调的患者的有效量。与自身免疫疾病或失调活性较低的患者相比，所患自身免疫疾病或失调活性较高的患者通常需要较高的剂量和/或较高的给药频率，且给药周期可能较长。

可实施本文所述的抗CD19抗体、组合物和方法，以治疗自身免疫疾病或失调。术语“自身免疫疾病或失调”指特征是对象对其自身的细胞、组织和/或器官产生免疫反应而引起的细胞、组织和/或器官损伤的对象病症。术语“炎性疾病”可与术语“炎性失调”互换使用，指特征是炎症，包括但不限于慢性炎症的对象病症。自身免疫病可能与或不与炎症相关联。而且，炎症可能是或不是由自身免疫病引起的。因此，某些疾病既可被鉴定为自身免疫病，又可被鉴定为炎性疾病。示范性的自身免疫疾病或失调包括但不限于：斑秃、强直性脊柱炎、抗磷脂综合征(antiphospholipid syndrome)、自身免疫性艾迪森病、肾上腺的自身免疫病、自身免疫性溶血性贫血、自身免疫肝炎、自身免疫性卵巢炎和睾丸炎、自身免疫性血小板减少、贝切特综合征、大疱型类天疱疮、心肌病、口炎性腹泻-皮炎、慢性疲劳免疫功能障碍综合征(CFIDS)、慢性炎性脱髓鞘多神经病、丘-施二氏综合征、疤痕性类天疱疮、CREST综合征、冷凝集素病、克罗恩氏病、盘状狼疮、特发性混合型冷球蛋白血症、糖尿病、嗜酸细胞性筋膜炎(eosinophilic fascites)、纤维肌痛-纤维肌炎、肾小球肾炎、格拉夫斯病、格-巴二氏综合征、桥本甲状腺炎、亨-舍二氏紫癜、特发性肺纤维化、特发性/自身免疫血小板减少性紫癜(ITP)、IgA神经病、青少年关节炎、扁平苔藓、红斑狼疮、美尼尔综合征、混合型结缔组织病、多发性硬化、1型或免疫介导的糖尿病、重症肌无力、天疱疮相关疾病(如寻常性天疱疮)、恶性贫血、结节性多动脉炎、多软骨炎(polychrondritis)、多腺体综合征、风湿性多肌痛、多肌炎和皮肌炎、原发性无γ球蛋白血症、原发性胆汁性肝硬化、牛皮癣、牛皮癣关节炎、雷氏现象(Raynaud’s phenomenon)、莱特尔综合征、类风湿性关节炎、结节病、硬皮病、斯耶格伦综合征、全身肌强直综合征、系统性红斑狼疮(SLE)、斯维特综合征、斯提耳病、红斑狼疮、高安动脉炎、暂时性动脉炎/巨细胞动脉炎、溃疡性结肠炎、葡萄膜炎、血管炎如疱疹样皮炎血管炎、白癜风和韦格纳肉芽肿病。炎性疾病的例子包括但不限于：哮喘、肠炎、炎性肠病、慢性阻塞性肺病(COPD)、过敏性疾病、感染性休克、肺纤维化、未分化的脊椎关节病、未分化的关节病、关节炎、炎性骨质溶解、移植物抗宿主病、荨麻疹、VKH综合征(Vogt-Koyanagi-Haredasyndrome)和慢性病毒或细菌感染所致的慢性炎症。

抗-CD19免疫治疗包括以单一药物的形式给予抗CD19抗体，以治疗自身免疫疾病或失调。在一个实施方式中，本发明的抗-CD19免疫治疗包括给予能够抑制体外刺激的B细胞增殖的抗CD19抗体。在另一实施方式中，本发明的抗-CD19免疫治疗包括给予Fc变异抗CD19抗体，其中与相应的非变异分子相比，所述Fc变体与一种或多种Fc配体的结合亲和力改变。在一个具体实施方式中，本发明抗-CD19免疫治疗包括给予Fc变异抗CD19抗体，其中与相应的非变异Fc结构域相比，所述Fc变体与Fcγ受体IIB的结合力增强。

抗-CD19免疫治疗还包括以单一药物的形式给予抗-CD19双特异性抗体，以治疗自身免疫疾病或失调。在一个实施方式中，本发明的抗-CD19免疫治疗包括给予能够特异性结合第一种和第二种抗原的抗CD-19双特异性抗体，其中所述第一种抗原是人CD19，所述第二种抗原是选自下组的Fcγ受体：FcγRI、FcγRIIA、FcγRIIB、FcγRIIIA和/或FcγRIV。在另一实施方式中，本发明抗-CD19免疫治疗包括给予能够特异性结合人CD19和FcγRIIB的抗-CD19双特异性抗体。

CD19在未成熟B细胞上表达，因此抗-CD19mAb可能特别适合消耗前B细胞和未成熟B细胞，例如在骨髓中。

5.24.1.自身免疫疾病或失调的诊断

自身免疫疾病或失调的诊断很复杂，因为各种类型的自身免疫疾病或失调在不同患者中表现不同。这种症状的复杂性意味着一般得使用多种因素来进行临床诊断。通常，临床医生使用以下因素作为自身免疫疾病或失调的主要指标，这些因素例如但不限于，自身抗体的存在、细胞因子水平升高、特定器官功能障碍、皮肤红疹、关节肿胀、疼痛、骨重塑和/或丧失运动能力。对某些自身免疫疾病或失调(如RA和SLE)而言，诊断标准是本领域已知的。对于某些自身免疫疾病或失调而言，疾病分期已有记载且为本领域所熟知。本领域公知的诊断自身免疫疾病和失调以及疾病分期和活性标尺和/或疾病严重程度的这些方法可用于鉴定需要利用本发明的组合物和方法治疗自身免疫疾病或失调的患者和患者群体。

5.24.2.诊断自身免疫疾病或失调的临床标准

本领域了解不同自身免疫疾病或失调的诊断标准。历史上，诊断通常基于各种身体症状的组合。近年来，已利用分子技术如基因表达概况分析来开发自身免疫疾病或失调的分子定义。下面提供了特定自身免疫疾病或失调的临床诊断方法的例子。本领域技术人员了解其它合适的方法。

在某些实施方式中，可将自身免疫病活性水平低的患者或患早期自身免疫病(对可分期疾病而言)的患者鉴定为适合用本发明抗CD19抗体组合物和方法治疗。因为症状普通和疾病间的症状重叠，自身免疫病难以早期诊断。在这类实施方式中，所治疗的早期或自身免疫病活性水平低的患者具有多种症状，其中包括自身免疫疾病或失调的至少一种症状。在相关实施方式中，所治疗的早期或自身免疫病活性水平低的患者具有多种症状，其中包括自身免疫疾病或失调的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15种症状。这些症状可以是任何自身免疫疾病和失调的症状，或其组合。自身免疫疾病和失调症状的例子见下。

5.24.3.类风湿性关节炎

类风湿性关节炎是一种慢性疾病，主要特征是关节的衬里或滑膜的炎症。它可引起长期关节损伤，导致慢性疼痛、功能丧失和残废。鉴定需要治疗类风湿性关节炎的患者或患者群体是一个过程。没有确定的测试能对类风湿性关节炎作出阳性或阴性诊断。临床医生依赖于许多工具，包括病史、体检、实验室检测和X光片。

不同患者的身体症状各不相同，通常包括但不限于：关节肿胀、关节触痛、关节活动能力丧失、关节排列不齐、骨重塑、疲劳、僵硬(特别是早晨和久坐后)、虚弱、流感样症状(包括低热)、久坐相关性疼痛、疾病活性突然提高随后疾病消退或失活、皮下组织的类风湿性结节或肿块(常见于肘部、它们可能表明较严重的疾病活性)、肌肉疼痛、食欲缺乏、抑郁、体重降低、贫血、手脚冰冷和/或多汗以及眼和口周围腺体病变，引起泪液和唾液产量下降(斯耶格伦综合征)。就斯耶格伦综合征而言，具体使用以下参考文献，Fox等，ArthritisRheum.(1986)29:577-586和Vitali等.Ann.Rheum.Dis.(2002)61:554-558。

除身体症状外，临床医生通常使用以下检测，例如但不限于：全血计数、红细胞沉降率(ESR或沉降速率)、C-反应性蛋白、类风湿性因子、抗-DNA抗体、抗核抗体(ANA)、抗-心磷脂抗体、成像研究、放射性成像(X射线)、关节或器官的磁共振成像(MRI)、关节超声、骨扫描和骨密度测定(DEXA)。这些检测是可与本发明的组合物和方法联合使用，以检查可能存在的异常(即鉴别需要治疗的患者或患者群体)或监测药物副作用和检查进程的例子。

类风湿性关节炎的早期症状通常出现在手指、手和腕的较小关节处。关节病变通常是对称的，这意味着如果左手某关节疼痛，则右手的相同关节也会疼痛。通常，关节侵蚀越多表明较严重的疾病活性。

疾病活性较晚期的症状包括对软骨、肌腱、韧带和骨的损伤，它们会引起关节变形和不稳定。这种损伤可能导致运动范围受限，导致日常活动(握住刀叉、梳头、扣上衬衫)变得更加困难。皮肤溃疡、易感染性较高和总体健康水平下降也是较晚期疾病活性的指标。

类风湿性关节炎的进程通常分为三个阶段。第一个阶段是滑膜衬里的肿胀，引起关节周围疼痛、发热、僵硬、发红和肿胀。第二个阶段是细胞的快速分裂和生长或血管翳，引起滑膜增厚。在第三阶段，炎症细胞释放可消化骨和软骨的酶，常常引起病变关节变形和排列不齐，疼痛加剧和丧失运动能力。

也可利用分子技术鉴定需要治疗的患者或患者群体。例如，已证明类风湿性关节炎与人白细胞抗原(HLA)-DR4和HLA-DRB1基因的等位基因多态性有关联(Ollier和Winchester，1999，自身免疫的基因和遗传学(Genes and Genetics of Autoimmunity)，瑞士巴塞尔(Basel，Switzerland)；Stastny，1978，N.Engl J Med 298:869-871；和Gregersen等，1987，Arthritis Rheum 30:1205-1213)。类风湿性关节炎患者常常表达两种疾病相关性HLA-DRB1*04等位基因(Weyand等，1992Ann Intern Med 117:801-806)。也可利用本领域标准方法检测患者的等位基因多态性。MHC基因并不是唯一的影响RA易感性的种系编码基因，可用于诊断或鉴定需要治疗的患者或患者群体。女性的患病风险明显较高，与男性患者相比，女性患者的疾病表型不同。可利用任何类风湿性关节炎的分子指标来鉴定需要用本发明抗CD-19抗体组合物或方法治疗的患者或患者群体。

相对于活性标尺确定患者的类风湿性关节炎活性的方法是本领域公知的，该方法可与本发明药物组合物和方法联用。例如，可利用美国风湿病学家学院评分(AmericanCollege of Rheumatologists Score，ACR评分)确定患者或患者群体的类风湿性关节炎活性。根据这种方法，给予患者对应于改善的评分。例如，对ACR所定义的因子改善20％的患者给予ACR20评分。

最初，可用止痛剂治疗出现类风湿性关节炎症状的患者。在其它实施方式中，诊断患有或出现类风湿性关节炎症状的患者最初用非甾体抗炎(NSAID)化合物治疗。随着疾病进展和/或症状严重程度的提高，可通过给予类固醇，例如但不限于地塞米松和氯泼尼松来治疗类风湿性关节炎。在大多数严重病例中，可给予化疗药，例如但不限于甲氨蝶呤或赛多辛，以缓解类风湿性关节炎的症状。

在某些情况下，可通过给予金来治疗类风湿性关节炎，而在其它情况下，可给予生物制剂，如抗体或受体(或受体类似物)。这类治疗性抗体的例子是利妥昔和英利昔(Remicade)。可用来治疗类风湿性关节炎的可溶性受体的说明性例子是依坦西普(Enbrel)。

在极严重的类风湿性关节炎病例中，可能需要手术治疗。手术方法可包括但不限于：滑膜切除术，通过切除关节的病变滑膜或衬里以减少炎症组织的量；关节镜手术以取得组织样品、去除疏松软骨、修复破损、使粗糙表面平滑或去除病变的滑膜组织；截骨术，指“切骨”，该方法通过重新分配关节上的重量提高稳定性；关节置换术或关节成形术，用于手术重建或置换关节；或者关节融合术或融合术，将两块骨融合在一起。

在本发明方法的某些实施方式中，在上述任何治疗之前、同时或之后，可利用抗CD19抗体治疗患者。而且，本发明抗CD19抗体可与任何上述止痛剂、NSAID、类固醇或化疗药联用，以及与治疗类风湿性关节炎的生物制剂联用。

5.24.4.系统性红斑狼疮(SLE)

系统性红斑狼疮(SLE)是影响关节、肌肉和身体其它部分的慢性(长期)风湿性疾病。可通过检查身体症状和/或实验室检测结果鉴定需要治疗SLE的患者或患者群体。不同患者的身体症状有很大不同。例如，在SLE中，如果以下11种症状中出现4中，则该患者被诊断为SLE:1)颊部红疹：脸颊上出现红疹；2)盘状红疹：红色凸起的斑块；3)光敏感性：对日光发生反应，导致发生皮肤红疹或皮肤红疹增加；4)口腔溃疡：鼻腔或口腔溃疡，通常无痛；5)关节炎：涉及两个或多个周围关节的非侵蚀性关节炎(关节周围的骨不被破坏的关节炎)；6)浆膜炎性胸膜炎(serositis pleuritis)或心包炎：(肺或心脏衬里的炎症)；7)肾病：尿中蛋白质过多(大于0.5克/天或测试棒3+)和/或细胞管型(尿的异常元素，衍生自红细胞和/或白细胞和/或肾小管细胞)；8)神经病：癫痫发作(惊厥)和/或精神病，但不存在可能引起这种作用的药物或代谢紊乱；9)血液病：溶血性贫血或白细胞减少症(白细胞计数低于4,000细胞/立方毫米)或淋巴细胞减少(小于1,500个淋巴细胞/立方毫米)或血小板减少(小于100,000个血小板/立方毫米)(白细胞减少症和淋巴细胞减少必须检测到两次或更多次。血小板减少必须在不存在已知能诱导血小板减少的药物的情况下检测)；10)抗核抗体：在不存在诱导性药物的情况下抗核抗体(ana)测试阳性；和/或11)免疫疾病：抗-双链抗-DNA检测阳性、抗-sm检测阳性、抗磷脂抗体如抗心磷脂抗体阳性或梅毒检测(vdrl)假阳性。

可能表明SLE的其它身体症状包括但不限于：贫血、疲劳、发热、皮肤红疹、肌肉痛、恶心、呕吐和腹泻、腺体肿胀、食欲缺乏、对冷敏感(雷氏现象)和体重降低。

还可利用实验室检测鉴定需要治疗的患者或患者群体。例如，可进行血液检查，检测到几乎所有SLE患者的血液中都有自身抗体。这类检查可包括但不限于：在不存在已知诱导性药物的情况下检查抗核抗体(ANA)(Rahman，A.和Hiepe，F.Lupus(2002)，11(12):770-773)，检查抗双链抗-DNA(Keren，D.F.Clin.Lab.Med.(2002)22(2):447-474.)，检查抗-Sm，检查抗磷脂抗体如抗心磷脂抗体(Gezer，S.Dis.Mon.2003.49(12):696-741)，或梅毒假阳性检测(VDRL)。

其它检测可包括补体检测(C3、C4、CH50、CH100)，可用其测定血液中循环的补体蛋白的含量(Manzi等，Lupus 2004.13(5):298-303)；可利用沉降速率检测(ESR)或C-反应性蛋白(CRP)测定炎症水平，可利用尿分析检测肾问题，可利用X线照片检测肺损伤，可利用EKG检测心脏问题。

慢性SLE与病变器官(特别是肾)累积的附带损伤有关联。因此，需要早期，即在(例如)肾衰竭之前进行治疗介入。SLE的可用治疗类似于类风湿性关节炎的可用治疗。它们包括利用止痛剂或非甾体抗炎(NSAID)化合物进行初步治疗。随着疾病进展和/或症状严重程度的提高，通过给予类固醇，例如但不限于地塞米松和氯泼尼松来治疗SLE。

在大多数严重病例中，可给予化疗药，例如但不限于甲氨蝶呤或赛多辛以缓解SLE的症状。然而，如果患者是育龄女性则不优选这种方法。在这种情况下，优选不干扰患者生殖能力的治疗方法。

在某些情况下，可通过给予生物制剂，如抗体或受体(或受体类似物)来治疗SLE。这类治疗性抗体的例子是利妥昔和英利昔(Remicade)。可用来治疗SLE的炎性细胞因子的可溶性受体的说明性例子是依坦西普(Enbrel)。

在本发明方法的某些实施方式中，可以在利用上述任何方法治疗SLE之前、同时或之后，用抗CD19抗体治疗患者。而且，本发明抗CD19抗体可与任何上述止痛剂、NSAID、类固醇或化疗药联用，以及与治疗SLE的生物制剂联用。

5.24.5.特发性/自身免疫血小板减少紫癜(ITP)

特发性/自身免疫血小板减少紫癜(ITP)是一种血液病，其特征是与血小板细胞相互作用并导致血小板细胞被破坏的免疫球蛋白G(IgG)自身抗体。抗体一般是血小板膜糖蛋白的特异性抗体。该疾病可以是急性(暂时性，持续时间小于2个月)或慢性(持续时间大于6个月)。可通过检查患者病史、身体症状和/或实验室检测结果来鉴定需要治疗ITP的患者或患者群体。(Provan，D.和Newland，A.，Br.J.Haematol.(2002)118(4)：933-944；George，J.N.Curr.Hematol.(2003)2(5)：381-387；Karptkin，S.Autoimmunity.(2004)37(4):363-368；Cines，D.B.和Blanchette，V.S.，N.Engl.J.Med.(2002)346(13)995-1008)。

身体症状包括皮肤和粘膜中由于血小板细胞数量下降导致的略呈紫色的出血区域(如口腔内壁)。主要症状是出血，可包括皮肤或粘膜上出现瘀青(“出血斑”)和小红点(“瘀点”)。在一些情况下，也可能发生鼻腔、牙龈、消化道或尿道出血。脑出血很少见。常见的迹象、症状和诱发因素还包括但不限于：突然发作(儿童ITP)、逐渐发作(成年人ITP)、不可触及的淤点、紫癜、月经过多、鼻衄、牙龈出血、粘膜上的出血疱、GI出血迹象、月经频多、颅内出血的证据、不可触及的脾脏、视网膜出血、近期活病毒免疫(儿童ITP)、近期病毒性疾病(儿童ITP)、血小板计数小于20,000/mm³时自发性出血和瘀青倾向。

可用于诊断ITP的实验室检测包括但不限于：全血计数检测或骨髓检查，以验证骨髓中是否有足够的血小板形成细胞(巨核细胞)，并排除其它疾病如转移性癌症和白血病。单纯性血小板减少是有关实验室评价的关键发现。外周血涂片上的巨大血小板表明发生充血性血小板减少。如果关心是否发生颅内出血，则可进行头部CT扫描。

当前的ITP治疗包括血小板输血和脾切除术。其它治疗包括，给予糖皮质激素类，给予免疫抑制剂，给予能提高血小板产量的物质，如IL-11，以及能激活巨核细胞产生血小板的物质，如血小板生成素(TPO)。

在更严重的病例中，可给予化疗药，例如但不限于长春新碱和长春碱以缓解ITP的症状。然而，如果患者是育龄女性则不优选这种方法。在这种情况下，优选不干扰患者生殖能力的治疗方法。

在某些情况下，可通过给予生物制剂，如抗体或受体(或受体类似物)治疗ITP。这类治疗性抗体的例子是抗-CD20抗体，如利妥昔单抗。

在本发明方法的某些实施方式中，可以在利用上述任何方法治疗ITP之前、同时或之后，用抗CD19抗体治疗患者。而且，本发明抗CD19抗体可与任何上述药物联用，以及与治疗ITP的生物制剂联用。

5.24.6.天疱疮和类天疱疮相关性疾病

天疱疮-和类天疱疮相关疾病是一大类自身免疫病，其特征是皮肤和/或粘膜表面出现水泡症状。在这两种疾病中，水泡是由识别真皮和/或表皮中上皮细胞表面上表达的各种蛋白质的自身免疫抗体引起的。

在天疱疮-相关疾病的患者中，水泡出现在表皮中，是自身抗体与桥粒核心糖蛋白1(Dsg1)和/或桥粒核心糖蛋白3(Dsg3)特异性结合的结果。可按照抗-桥粒核心糖蛋白抗体特异性区别天疱疮的经典亚型。落叶型天疱疮(PF)患者只产生抗-Dsg1抗体。如果损伤仅限于粘膜组织，那么寻常性天疱疮(PV)和副肿瘤性天疱疮(PNP)患者产生抗-Dsg3抗体。相反，发生皮肤和粘膜损伤的PV和PNP患者能产生抗-Dsg1和-Dsg3自身抗体。(Nagasaka，T.等，J.Clin.Invest.2004.114:1484-1492；Seishema，M.等，Arch Dermatol.2004.140(12):1500-1503；Amagai，M.，J.Dermatol.Sci.1999.20(2):92-102)。

在类天疱疮相关疾病的患者中，水泡发生在真皮与表皮的交界处，这些疾病包括但不限于：大疱型类天疱疮，荨麻疹大疱型类天疱疮，瘢痕性类天疱疮，获得性大疱性表皮松解症和线性IgA大疱性皮肤病。类天疱疮疾病的最常见形式是大疱型类天疱疮(BP)，其特征是存在结合大疱型类天疱疮抗原180(BP180)、大疱型类天疱疮抗原230(BP230)、层粘连蛋白5和/或β4整联蛋白的自身抗体。(Fontao，L.等，Mol.Biol.Cell.2003)14(5):1978-1992；Challacombe，S.J.等，Acta Odontol.Scand.(2001)，59(4):226-234)。

可通过检查患者病史、身体症状和/或实验室检测结果鉴定需要治疗天疱疮或类天疱疮相关疾病的患者或患者群体(综述参见：Mutasim，D.F.Drugs Aging.(2003).20(9):663-681；Yeh，S.W.等，Dermatol.Ther.(2003).16(3):214-223；Rosenkrantz，W.S.Vet.Dermatol.15(2):90-98)。

一般地，这些天疱疮-或类天疱疮相关疾病的诊断依赖于皮肤活检。对皮肤活检样品进行显微镜检，以确定水泡的解剖学位置(如表皮或真皮和表皮之间)。将这些发现与直接或间接的免疫组化分析联系起来，以检测损伤部位是否存在自身抗体。也利用ELISA检测检查患者的血清样品中是否存在针对特定蛋白质的循环自身抗体。已经记载过数种ELISA实验用于检测人样品中的桥粒核心糖蛋白抗体(Hashimoto，T.Arch.Dermatol.Res.(2003)295增刊1:S2-11)。如果活检样品中存在这些桥粒核心糖蛋白自身抗体，则可诊断患有天疱疮。

在临床上，可通过口腔内出现水泡来诊断寻常性天疱疮。炎症或侵蚀也可能出现在眼睛和眼睑的衬里，以及鼻腔或生殖道的膜中。一半患者常常在腹股沟、腋下、面部、头皮和胸部中也发生皮肤水泡或侵蚀。落叶型天疱疮是形式相对温和的浅表天疱疮。它常常表现在面部和头皮，但也可能涉及背部和胸部。口腔中不发生损伤。水泡更多地局限于最外层表面，常常很痒。副肿瘤性天疱疮非常罕见，通常发生在癌症患者身上。其损伤很疼，影响口腔、嘴唇和食道(吞咽管)以及皮肤。由于气道的病变，可能发生呼吸疾病的迹象，并且可能危及生命。

目前，天疱疮或类天疱疮相关疾病的治疗包括外用给予乳膏剂和软膏剂以缓解与皮肤病症相关的不适，给予消炎剂或给予免疫抑制剂。

在本发明方法的某些实施方式中，可以在利用上述任何方法治疗天疱疮或类天疱疮相关疾病之前、同时或之后，用抗CD19抗体治疗患者。而且，本发明抗CD19抗体可与上述任何药物联用。

5.24.7.自身免疫性糖尿病

按照本发明的某些方面，需要治疗自身免疫性糖尿病(也称为1A型糖尿病)的患者可用抗CD19抗体的组合物和方法加以治疗。1A型糖尿病是遗传、环境和免疫因素协同作用引起的自身免疫病，最终破坏胰腺β细胞。胰腺β细胞破坏的结果是β细胞量减少、胰岛素产量/分泌量降低、血糖水平逐渐升高。

可通过检查患者病史、身体症状和/或实验室检测结果鉴定需要治疗1A型糖尿病的患者或患者群体。症状常常突然出现，包括但不限于：血胰岛素水平低或不存在、口渴加剧、排尿增多、经常饥饿、体重降低、视力模糊和/或疲劳。通常，直到大部分β细胞被破坏(>80％)，这种糖尿病的表现才变得明显。通常，如果患者的随机(对上一次进食以来的时间不作要求)血糖浓度≥11.1mmol/L(200mg/dL)和/或禁食(至少8小时不摄入热量)血浆葡萄糖≥7.0mmol/L(126mg/dI)和/或两小时血浆葡萄糖≥11.1mmol/L(200mg/dL)，则在临床上将其诊断为糖尿病。理想情况下，应在不同日期重复进行这些检测，如果获得的结果相当，才能确证此诊断。(Harrison的《内科学原理》(Principles of Internal Medicine)，第16版/Dennis L.Kasper等编，MH公司(The McGraw-Hill Companies，Inc.)，2005，纽约州纽约)。

虽然1A型糖尿病的确切病因未知，但对特定HLA血清型而言存在明显的遗传连锁。具体说，自身免疫性糖尿病与HLA DR3和DR4血清型相关联。已知DR3和DR4同时存在时遗传风险最高。自身免疫性糖尿病的易感性也与II型HLA(HLA-DQB1*0302)有关。相反，具有DRB1-1501和DQA1-0102-DQB1-0602的HLA单体型与不发生1A型糖尿病相关联(Redondo，M.J.等，J.Clin.Endocrinol.Metabolism(2000)10:3793-3797)。

生产胰岛素的β胰岛细胞被破坏可能伴有以下情况：胰岛细胞自身抗体、活化的淋巴细胞浸润胰腺和引流淋巴结、对胰岛细胞蛋白质起反应的T淋巴细胞和胰岛内释放炎性细胞因子(Harrison的《内科学原理》(Principles of Internal Medicine)，第16版/Dennis L.Kasper等编，MH公司(The McGraw-Hill Companies，Inc.)，2005，纽约州纽约)。

与1A型糖尿病有关的自身抗体包括但不限于：结合胰岛素、谷氨酸脱羧酶(GAD)、ICA-512/IA-2、福格林(phogrin)、胰岛神经节苷脂和羧基肽酶H的抗体(Gianani，R.和Eisenbarth，G.S.Immunol.Rev.(2005)204:232-249；Kelemen，K.等，J.Immunol.(2004)172(6)：3955-3962)；Falorni，A.和Borozzetti，A.BestPract.Res.Clin.Endocrinol.Metab.2005，19(1):119-133)。

目前，自身免疫性糖尿病的治疗包括给予维生素D、皮质类固醇、控制血压的药物和控制血糖(血糖水平)的药物。

在本发明方法的某些实施方式中，可以在利用上述任何治疗治疗自身免疫性糖尿病之前、同时或之后，用抗CD19抗体治疗患者。而且，本发明抗CD19抗体可与上述任何药物联用。

5.24.8.系统性硬化病(硬皮病)和相关疾病

系统性硬化病也称为硬皮病，包括一大类疾病，包括但不限于：限制性皮肤病、弥散性皮肤病、无皮肤硬化的硬皮病，未分化结缔组织病，重叠综合征，局限性硬皮病，硬斑病，线形硬皮病，类军刀伤(En coup de saber)，布施克成人硬化病，苔癣性粘液水肿，慢性移植物抗宿主病，嗜酸细胞性筋膜炎，糖尿病的指状硬化(Digital sclerosis)以及原发性淀粉样变和与多发性骨髓瘤相关的淀粉样变。(综述参见：Harrison的《内科学原理》(Principles of Internal Medicine)，第16版/Dennis L.Kasper等编，MH公司(TheMcGraw-Hill Companies，Inc.)，2005，纽约州纽约)。

与硬皮病有关的临床特征可包括：雷氏现象、皮肤增厚、皮下钙质沉着症、毛细管扩张、关节痛/关节炎、肌病、食道运动功能障碍、肺纤维化、单纯性肺动脉高压、充血性心力衰竭和肾危象。患者出现一种或多种这些疾病表现的程度可影响诊断和可能的治疗计划。

自身抗体包括：抗拓扑异构酶1抗体，抗着丝粒抗体，抗-RNA聚合酶I、II和/或III抗体，抗-Th RNP抗体，抗-U，RNP抗体(抗纤维蛋白抗体)，抗-PM/Sci抗体，抗核抗体(ANA)。

可根据临床病史和身体检查鉴定需要治疗硬皮病的患者和患者群体。可通过检查患者病史、身体症状和/或实验室检测结果鉴定需要治疗硬皮病的患者或患者群体。在没有出现明显皮肤增厚的患者中，诊断可能被延迟。可利用实验室、X射线、肺功能检查以及皮肤或肾活检确定内部器官病变的程度和严重性。

在疾病发病的前几个月或前几年，硬皮病可能类似于许多其它结缔组织病，例如但不限于：系统性红斑狼疮、多肌炎和类风湿性关节炎。

系统性硬化病(硬皮病)的最经典的症状是指端硬化。最初的症状包括手肿胀，有时发展成尖圆形和爪状变形。不是所有硬皮病患者都会发展到此种皮肤硬化程度。其它症状可包括硬斑病、线性指端硬化(手指硬化)、雷氏综合征(Raynaud's syndrome)、钙质沉着症和毛细管扩张。

可利用血液检查如抗核抗体(ANA)检查来诊断局限性和系统性硬皮病。例如，抗着丝粒抗体(ACA)和抗-Scl-70抗体表明患者需要治疗系统性硬化病(Ho等，2003，ArthritisRes Ther.5:80-93)；抗拓扑异构酶IIα抗体表明患者需要治疗局部硬皮病；抗拓扑异构酶Iα抗体则表明患者需要治疗系统性硬皮病。几种硬皮病的类型及诊断这些类型的方法是本领域了解和公知的，包括但不限于：青少年硬皮病(Foeldvari，Curr Opin Rheumatol 14:699-703(2002)；Cefle等，Int J Clin Pract.58:635-638(2004))；局限性硬皮病；结节性硬皮病(Cannick，J Rheumatol.30:2500-2502(2003))；和系统性硬皮病，包括但不限于：钙质沉着症、雷氏综合征(Raynaud’s)、食道(Esophagus)、指端硬化和毛细管扩张(CREST)、限制性系统性硬皮病和弥散性系统性硬皮病。系统性硬皮病也称为系统性硬化病(SSc)。也称为进行性系统性硬化病(PSSc)或家族性进行性系统性硬化病(FPSSc)(Nadashkevich等，Med Sci Monit.10:CR615-621(2004)；Frances等，Rev Prat.52:1884-90(2002))。系统性硬化病是多系统疾病，特征是存在结缔组织硬化、与小动脉和微循环有关的血管异常以及自身免疫改变。

称为CREST的系统性硬皮病类型没有任何皮肤紧缩的特征。CREST的特征是：钙质沉着(钙沉积)，通常发生于手指；雷氏现象；丧失食道的肌肉控制，可能引起吞咽困难；指端硬化，手指骨头的尖圆形变形；和毛细管扩张，手指、面部或口腔内皮肤上的小红点。通常，出现两种上述症状就足以作出CREST的诊断。CREST可能单独发生，或者与任何其它形式的硬皮病或其它自身免疫病一同发生。

限制性硬皮病的特征是仅限于手指的皮肤紧缩，以及压凹性指状溃疡(雷氏现象的继发性症状)和/或肺纤维化。限制性硬皮病中，面部和颈部的皮肤也可能病变。

出现近端皮肤紧缩时，即可作出弥散性硬皮病的诊断。近端指最接近参考点的位置。近端紧缩皮肤可以是手腕以上或肘部以上的皮肤紧缩。通常，只有肘部和腕部之间的皮肤紧缩的患者将被诊断为弥散性或限制性系统性硬皮病，这取决于诊断的临床医生所适用的近端的含义。

目前，硬皮病治疗包括在给予6-甲氧基补骨脂素后进行体外光泳和自体干细胞移植。

目前，硬皮病的治疗包括给予以下药物：青霉胺、秋水仙素、干扰素α、干扰素γ、苯丁酸氮芥、环孢霉素、5-氟尿嘧啶、环磷酰胺、米诺环素、沙利度胺、依那西普或甲氨蝶呤。

在本发明方法的某些实施方式中，可以在利用上述任何治疗治疗自身免疫性糖尿病之前、同时或之后，用抗CD19抗体治疗患者。而且，本发明抗CD19抗体可与上述任何药物联用。

5.25.测定样品或对象中的CD19密度

虽然不需要，但可利用CD19密度实验进一步表征患者诊断结果。本领域技术人员已知测定结合于细胞的抗体密度的方法(参见例如，Sato等，J.Immunology 165:6635-6643(2000)；其公开了评价特定CD抗原的细胞表面密度的方法)。其它标准方法包括斯卡查德(Scatchard)分析。例如，可分离抗体或片段，进行放射性标记，并测定放射性标记抗体的比活。然后，使抗体与表达CD19的靶细胞相接触。测定与细胞相关联的放射性，根据比活，确定结合于细胞的抗体或抗体片段的量。

也可利用荧光活化的流式细胞术。通常，抗体或抗体片段结合于表达CD19的靶细胞。然后加入结合抗体的第二种试剂，例如荧光染料标记的抗-免疫球蛋白抗体。然后检测荧光染料的染色，用于确定结合于细胞的抗体或抗体片段的密度。

作为另一种合适的方法，可利用可检测的标记，如荧光团直接标记抗体或抗体片段，并使抗体或抗体片段结合于靶细胞。测定标记与蛋白质的比例，与结合有已知数量的标记的标准珠作比较。可通过比较结合于细胞的标记量与已知标准来计算结合于细胞的抗体量。

另一方面，本发明提供在体外或体内检测样品或个体中CD19的存在和/或密度的方法。这种方法可用于监测疾病和疗效，并用于确定和调节所给抗体的剂量。可利用成像技术如PET(正电子成象术)或SPECT(单光子发射计算体层成像术)进行体内方法。也可通过共价连接的螯合剂，用铟标记抗CD19抗体。可利用标准γ相机使所得抗体成像，其方式与利用ZEVALIN^TM(铟标记的抗-CD20mAb)(马萨诸塞州剑桥的百集公司(Biogen Idec，CambridgeMA))对CD20抗原成像相同。

在一个实施方式中，可通过使待测样品，任选的对照样品，与人抗CD19抗体在一定条件下相接触进行体内方法，所述条件能够使本发明抗体和人CD19抗原形成复合物。然后检测复合物的形成(例如，利用荧光活化的流式细胞术或Western印迹)。使用对照样品与受试样品时，两种样品中都检测到复合物，样品之间形成复合物的任何统计学显著性差异表明受试样品中存在人CD19。

在其它实施方式中，可利用平均荧光强度检测CD19密度。在这种实施方式中，取出患者的B细胞，用有荧光标记的CD19抗体染色，利用流式细胞术测定荧光强度。可检测荧光强度，表示为每个B细胞的强度平均值。可使用这种方法比较在利用本发明方法和组合物治疗前和治疗后，或者患者和正常B细胞的hCD19水平之间，代表CD19密度的平均荧光强度。

在已测定B细胞上CD19表达密度的患者中，CD19的密度可能影响使用本发明组合物和方法的抗CD19抗体的剂量和/或治疗方案的确定和/或调整。例如，当CD19密度高时，可使用在人中介导ADCC效率较低的抗CD19抗体。在某些实施方式中，使用本发明的组合物和方法治疗的患者CD19密度低时，可使用较高剂量的本发明组合物和方法的抗CD19抗体。在其它实施方式中，使用本发明的组合物和方法治疗的患者CD19密度低时，可使用低剂量的本发明组合物和方法的抗CD19抗体。在某些实施方式中，使用本发明的组合物和方法治疗的患者CD19密度高时，可使用较低剂量的本发明组合物和方法的抗CD19抗体。在某些实施方式中，可比较患者的CD19密度与CD20密度，可将CD19密度与人或特定患者群体的平均CD19密度作比较，或者可将CD19密度与治疗前或发生B细胞疾病或失调之前患者的CD19水平作比较。在某些实施方式中，用本发明的组合物和方法治疗的患者患有B细胞表面上存在CD19的B细胞恶性肿瘤。

5.26.免疫治疗方案

在本文中称为“抗-CD19免疫治疗”的治疗方案/方法中所用的抗CD19抗体组合物可以是裸露的抗体、免疫偶联物和/或融合蛋白。本发明组合物可用作单一药物治疗或与其它治疗剂或方案联用。可以在给予一种或多种治疗剂之前、同时或之后给予抗CD19抗体或免疫偶联物。可与本发明组合物联合治疗的治疗剂包括能抑制或防止细胞功能和/或引起细胞破坏的任何物质。例子包括但不限于：放射性同位素、化疗药和毒素，如细菌、真菌、植物或动物来源的酶活性毒素，或其片段。

可利用表达人CD19抗原而不是天然CD19抗原的转基因动物模型来检测本文所述治疗方案或任何所需治疗方案的功效。因此，可在给予人之前，在动物模型中检测抗CD19抗体治疗方案以确定功效。

可实施抗-CD19抗体、组合物和方法，以治疗B细胞疾病，包括B细胞恶性肿瘤。术语“B细胞恶性肿瘤”包括衍生自B细胞谱系细胞的任何恶性肿瘤。示范性B细胞恶性肿瘤包括但不限于：B细胞亚型非霍奇金淋巴瘤(NHL)，包括低级/滤泡性NHL，小淋巴细胞性(SL)NHL，中级/滤泡性NHL，中级弥散性NHL，高级免疫母细胞性NHL，高级免疫母细胞性NHL，高级小非裂解细胞NHL；套细胞淋巴瘤和巨大疾病NHL；伯基特淋巴瘤；多发性骨髓瘤；前B急性淋巴细胞性白血病和早期B细胞前体产生的其它恶性肿瘤；普通急性淋巴细胞性白血病(ALL)；慢性淋巴细胞性白血病(CLL)，包括免疫球蛋白-突变的CLL和免疫球蛋白-未突变的CLL；多毛细胞白血病；非急性淋巴细胞性白血病；瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症；弥散性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)，包括生发中心B细胞样(GCB)DLBCL，活化的B细胞样(ABC)DLBCL和3型DLBCL；幼淋巴细胞白血病；轻链疾病；浆细胞瘤；骨硬化性骨髓瘤；浆细胞白血病；意义未明的单克隆丙种球蛋白病(MGUS)；郁积型多发性骨髓瘤(SMM)；无痛性多发性骨髓瘤(IMM)；霍奇金淋巴瘤，包括经典和结节状淋巴细胞优势型；淋巴浆细胞增多型淋巴瘤(LPL)；以及边缘区淋巴瘤，包括胃粘膜-结合性淋巴组织(MALT)淋巴瘤。

在另一个实施方式中，可利用本发明治疗成熟B细胞恶性肿瘤(即，在细胞表面上表达Ig)，所述恶性肿瘤包括但不限于：滤泡性淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、多发性骨髓瘤、弥散性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)，包括生发中心B细胞样(GCB)DLBCL，活化的B细胞样(ABC)DLBCL和3型DLBCL，霍奇金淋巴瘤，包括经典和结节状淋巴细胞优势型，淋巴浆细胞增多性淋巴瘤(LPL)，边缘区淋巴瘤，包括胃粘膜结合性淋巴组织(MATL)淋巴瘤以及慢性淋巴细胞性白血病(CLL)，包括免疫球蛋白突变的CLL和免疫球蛋白未突变的CLL。

另外，在B细胞发育过程中，CD19的表达比(例如)CD20早，因此特别适合治疗(例如)骨髓中的前B细胞和未成熟B细胞恶性肿瘤(即，不在细胞表面上表达Ig)。前B细胞和未成熟B细胞恶性肿瘤的例子包括但不限于：急性淋巴细胞性白血病。

在其它具体实施方式中，可实施本发明以治疗节外肿瘤。

5.27.抗-CD19免疫治疗

按照本发明，“抗-CD19免疫治疗”包括按照本文所述的任何治疗方案给予本发明抗CD19抗体。给予的抗CD19抗体可以是裸露抗体、免疫偶联物或融合蛋白。

抗-CD19免疫治疗包括以单一药物的形式给予抗-CD19抗体，以治疗B细胞恶性肿瘤。抗-CD19免疫治疗包括治疗B细胞恶性肿瘤产生的早期疾病的方法。抗-CD19免疫治疗包括治疗B细胞恶性肿瘤的方法，其中抗CD19抗体介导ADCC。抗-CD19免疫治疗包括治疗B细胞恶性肿瘤的方法，其中在患者接受任何恶性肿瘤治疗之前给予抗CD19抗体，所述治疗是化疗、放射化学治疗或手术治疗。

在一个实施方式中，可通过给予能够介导人ADCC的人或人源化抗体治疗患有B细胞恶性肿瘤的人对象。在早期疾病或单一药物治疗的情况下，可介导ADCC的任何抗CD19抗体均可用于人对象(包括鼠和嵌合抗体)；然而，可能优选人和人源化抗体。

在某些情况下，优选用IgG1或IgG3人同种型的抗体治疗。然而，也可使用IgG2或IgG4人同种型，只要它们具有相关效应功能，如人ADCC。可通过测定所研究抗体通过效应细胞在体外或体内介导靶细胞裂解的能力来评估这类效应功能。

在一个实施方式中，所用抗体的剂量应足以消耗循环B细胞。可通过分析血液样品监测该治疗的进程。也可利用其它临床改善迹象监测治疗。

可与本发明的组合物和方法联用的测定B细胞消耗的方法是本领域众所周知的，包括但不限于以下实施方式。在一个实施方式中，可通过流式细胞术，利用除抗CD19抗体以外结合B细胞以确定B细胞量的试剂来测定循环B细胞的消耗。在其它实施方式中，可利用标准血清分析监测血液B细胞水平。在这种实施方式中，通过确定已知由B细胞产生的抗体量，间接测定B细胞消耗。然后监测抗体水平，以确定B细胞的消耗和/或功能性消耗。在另一实施方式中，可通过免疫化学染色鉴定B细胞来测定B细胞的消耗。在这类实施方式中，将由患者提取的B细胞或包含B细胞的组织或血清置于显微镜载玻片上，进行标记并检测是否存在。在相关实施方式中，比较治疗前和治疗后提取的B细胞，以确定B细胞的存在的差异。

可检测肿瘤负荷，并与本发明的组合物和方法联合使用。本领域已知测定肿瘤负荷的方法，包括但不限于以下实施方式。在某些实施方式中，可利用PET扫描测定代谢活性，并鉴定活性较高(表明有肿瘤)的区域。还可利用CT扫描和MRI检测软组织中肿瘤的存在和大小。在其它实施方式中，可利用骨扫描测定肿瘤体积和位置。在其它实施方式中，可利用多普勒技术(如超声波)检测流入和流出肿瘤的血液，从而测定肿瘤负荷。在这类实施方式中，可通过血流随时间的改变或与患者适当组织的正常血流的偏差估算肿瘤负荷。可以在实施本发明治疗方法之前或之后利用这种方法测定肿瘤负荷。

在本发明方法的某些实施方式中，在消耗B细胞和/或降低肿瘤负荷的同时维持ADCC功能。

在抗CD19抗体作为单一药物治疗给予的本发明实施方式中，本发明考虑使用不同的治疗方案。

按照本发明某些方面，本发明的组合物和方法所用的抗CD19抗体是裸露的抗体。在相关实施方式中，所用的裸露抗CD19抗体剂量为至少约0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5、10、10.5、11、11.5、12、12.5、13、13.5、14、14.5、15、15.5、16、16.5、17、17.5、18、18.5、19、19.5、20、20.5mg/kg患者体重。在某些实施方式中，所用的裸露抗-CD19抗体的剂量为至少约1-10、5-15、10-20或15-25mg/kg患者体重。在某些实施方式中，所用的裸露抗-CD19抗体的剂量为至少约1-20、3-15或5-10mg/kg患者体重。在其它实施方式中，所用的裸露抗-CD19抗体的剂量为至少约5、6、7、8、9或10mg/kg患者体重。

在某些实施方式中，剂量包括每周给予约375mg/m²抗CD19抗体，连续给予4-8周。在某些实施方式中，剂量是每周给予至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15mg/kg患者体重，连续给予4-8周。

可以如章节5.21.3所述，给予上述抗CD19抗体的示范性剂量。在一个实施方式中，上述剂量是单次注射剂量。在其它实施方式中，可以在一段时间内给予多个剂量。在其它实施方式中，可以在一段时间内多次给予多个剂量。所述时间可以天、周或月计算。可以能够适合实现疗效、同时能平衡毒副作用的间隔给予多个剂量的抗CD19抗体。例如，使用多个剂量时，可能优选调整时间间隔，以便在用抗体重复治疗之前恢复患者的单核细胞计数。此种给药方案能优化治疗效率，因为单核细胞群体反映出患者的ADCC功能。

在某些实施方式中，将本发明组合物给予人患者，只要该患者对治疗起反应。在其它实施方式中，将本发明组合物给予人患者，只要该患者的疾病不进展。在相关实施方式中，将本发明组合物给予人患者，直到患者的疾病不进展或已经在一段时间内不进展，然后不给予该患者本发明组合物，除非该疾病复发或重新开始进展。例如，用任何上述剂量治疗患者约4-8周，在此期间监测患者的疾病进展。如果疾病的发展停止或逆转，则不给予该患者本发明组合物，直到该患者复发，即所治疗的疾病复发或进展。发生复发或进展后，可以利用最初使用的相同给药方案或上述其它剂量再次治疗该患者。

在某些实施方式中，可将本发明组合物作为加载剂量给药，然后在一段时间内给予多个较低的剂量(维持剂量)。在这种实施方式中，可定期给药，调节剂量以维持有效的B细胞消耗。在某些实施方式中，加载剂量为约10、11、12、13、14、15、16、17或18mg/kg患者体重，维持剂量为至少约5-10mg/kg患者体重。在其它实施方式中，以每7、10、14或21天的间隔给予维持剂量。维持剂量可无限地持续下去，直到出现毒性，直到血小板计数降低，直到疾病不进展，直到患者出现免疫原性，或者直到疾病进展至终末期。在其它实施方式中，将本发明组合物给予人患者，直到疾病进展至终末期。

在本发明的一些实施方式中，治疗方案的一部分是监测患者的循环单核细胞水平，抗CD19抗体剂量可间隔给予，以便使单核细胞计数得以恢复。例如，可以每8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30天的间隔给予本发明组合物。

在本发明的一些实施方式中，抗CD19抗体偶联于毒素或与毒素联用，本领域技术人员应理解，可根据毒素剂量调整抗CD19抗体的剂量，毒素剂量取决于所用毒素的具体类型。一般地，使用毒素时，抗CD19抗体剂量小于裸露抗CD19抗体所用的剂量。可利用本领域熟知技术确定特定毒素的合适剂量。例如，可进行剂量范围研究，以确定与毒素联用或偶联于毒素时抗CD19抗体的最大耐受剂量。

在本发明实施方式中，抗CD19抗体偶联于放疗剂或与放疗剂联用时，抗CD19抗体的剂量取决于所用的放疗剂。在某些实施方式中，使用两步法。首先，给予人患者包含裸露抗CD19抗体的组合物，约6、7、8、9或10天后，给予少量放疗剂。第二步，一旦测定到低剂量治疗的耐受、分布和清除，则给予患者一剂裸露的抗CD19抗体，然后给予治疗量的放疗剂。这种治疗方案类似于批准用ZEVALIN^TM(铟标记的抗-CD20mAb)(百集公司)或BEXXAR^TM(GSK库尔特制药公司(GSK，Coulter Pharmaceutical))治疗非霍奇金淋巴瘤的治疗方案。

5.28.与化疗药联合用药

抗-CD19免疫治疗(使用裸露抗体、免疫偶联物或融合蛋白)可与其它治疗联用，这些治疗包括但不限于：单独或组合的化疗、放射性免疫治疗(RIT)、化疗和外束放疗(联合治疗方案，CMT)或联合的放射性免疫治疗方案(CMRIT)等。在某些实施方式中，本发明抗CD19抗体治疗可与CHOP(环磷酰胺-羟基多柔比星-安可平(长春新碱)-泼尼松龙)联用，CHOP是最常见的治疗非霍奇金淋巴瘤的化疗方案。本文所用术语“联合给药”指可以在采用其它治疗之前、期间或之后给予抗-CD19免疫治疗。

在某些实施方式中，抗-CD19免疫治疗与细胞毒性放射性核素或放射治疗性同位素联合给药。例如，同位素可以是α-发射性同位素，如²²⁵Ac、²²⁴Ac、²¹¹At、²¹²Bi、²¹³Bi、²¹²Pb、²²⁴Ra或²²³Ra。细胞毒性放射性核素也可以是β-发射性同位素，如¹⁸⁶Re、¹⁸⁸Re、⁹⁰Y、¹³¹I、⁶⁷Cu、¹⁷⁷Lu、¹⁵³Sm、¹⁶⁶Ho或⁶⁴Cu。另外，细胞毒性放射性核素可能发射俄歇电子和低能电子，包括同位素¹²⁵I、¹²³I或⁷⁷Br。在其它实施方式中，同位素可以是¹⁹⁸Au、³²P等。在某些实施方式中，给予对象的放射性核素的用量为约0.001mCi/kg至10mCi/kg。

在一些实施方式中，给予对象的放射性核素的用量为约0.1mCi/kg至1.0mCi/kg。在其它实施方式中，给予对象的放射性核素的用量为约0.005mCi/kg至0.1mCi/kg。

在某些实施方式中，抗-CD19免疫治疗与化学毒素或化疗药联合给药。化学毒素或化疗药可选自：烯二炔，如卡奇霉素和埃斯培拉霉素(esperamicin)；多卡霉素(duocarmycin)、甲氨蝶呤、多柔比星、美法仑、苯丁酸氮芥、ARA-C、长春地辛、丝裂霉素C、顺铂、依托泊甙、博来霉素或5-氟尿嘧啶。

适合与抗-CD19免疫治疗联用的化学毒素或化疗药包括烯二炔分子类成员，如卡奇霉素和埃斯培拉霉素。化学毒素也可选自：多卡霉素(duocarmycin)(参见例如，美国专利号5,703,080和美国专利号4,923,990)、甲氨蝶呤、多柔比星、美法仑、苯丁酸氮芥、ARA-C、长春地辛、丝裂霉素C、顺铂、依托泊甙、博来霉素或5-氟尿嘧啶。化疗药的例子也包括阿霉素、多柔比星、5-氟尿嘧啶、胞嘧啶阿糖胞苷(Ara-C)、环磷酰胺、硫替派、泰索帝(多西他赛)、白消安、赛多辛(Cytoxin)、紫杉醇、甲氨蝶呤、顺铂、美法仑、长春碱、博来霉素、依托泊甙、异环磷酰胺、丝裂霉素C、米托蒽醌、长春新碱、长春瑞滨、卡铂、替尼泊苷、道诺霉素、洋红霉素、氨蝶呤、放线菌素D、丝裂霉素、埃斯培拉霉素(参见美国专利号4,675,187)、美法仑和其它相关氮芥。

在其它实施方式中，例如，“CVB”(1.5g/m²环磷酰胺，200-400mg/m²依托泊甙和150-200mg/m²卡莫司汀)可与本发明治疗联合使用。CVB是用于治疗非霍奇金淋巴瘤的方案。Patti等，Eur.J.Haematol.51:18(1993)。本领域技术人员了解其它合适的联合化疗方案。参见例如Freedman等，“Non-Hodgkin’s Lymphomas(非霍奇金淋巴瘤)”，刊于《癌症医药》(Cancer Medicine)，第2卷，第3版，Holland等(编)，第2028-2068页(Lea和Febiger 1993)。例如，用于治疗中期非霍奇金淋巴瘤的第一代化疗方案包括C-MOPP(环磷酰胺、长春新碱、丙卡巴肼和氯泼尼松)和CHOP(环磷酰胺、多柔比星、长春新碱和氯泼尼松)。有用的第二代化疗方案是m-BACOD(甲氨蝶呤、博来霉素、多柔比星、环磷酰胺、长春新碱、地塞米松和甲酰四氢叶酸)，而合适的第三代方案是MACOP-B(甲氨蝶呤、多柔比星、环磷酰胺、长春新碱、氯泼尼松、博来霉素和甲酰四氢叶酸)。其它有用的药物包括丁酸苯酯和草苔虫内酯(brostatin)1。在多模式治疗中，化疗药和细胞因子与本发明抗体、免疫偶联物或融合蛋白并行给予。细胞因子、化疗药和抗体、免疫偶联物或融合蛋白可以任何顺序给药，或一起给药。

可用于本发明组合物和方法的其它毒素包括有毒的凝集素、植物毒素如蓖麻毒蛋白、相思豆毒蛋白、蒴莲根毒素、肉毒杆菌毒素和白喉毒素。当然，可将各种毒素的组合偶联于一个抗体分子，从而获得可变的细胞毒性。适合用于本发明联合治疗的毒素的例子是蓖麻毒蛋白、相思豆毒蛋白、核糖核酸酶、DNA酶I、葡萄球菌肠毒素-A、美洲商陆抗-病毒蛋白、白树毒素、白喉毒素、假单胞菌外毒素和假单胞菌内毒素。参见例如，Pastan等，Cell，47:641(1986)，Goldenberg等，Cancer Journal for Clinicians，44:43(1994)。可以使用的酶活性毒素和其片段包括白喉A链、白喉毒素的非结合活性片段、外毒素A链(来自绿脓假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa))、蓖麻毒蛋白A链、相思豆毒蛋白A链、蒴莲根毒素A链、α-帚曲菌素、油桐(Aleurites fordii)蛋白、石竹素蛋白、美洲商陆(Phytolaca americana)蛋白(PAPI、PAPII和PAP-S)、苦瓜(Momordica charantia)抑制剂、麻疯树毒蛋白、巴豆毒蛋白、肥皂草(Sapaonaria officinalis)抑制剂、白树毒素、迈托毒素(mitogellin)、局限曲菌素、酚霉素、依诺霉素和单端孢霉烯族毒素(tricothecenes)。参见例如，1993年10月28日公开的WO 93/21232。

合适的毒素和化疗药参见《雷明顿药物科学》(Remington’s PharmaceuticalSciences)，第19版(马克出版公司(Mack Publishing Co.)，1995)以及Goodman和Gilman的《治疗的药理学基础》(The Pharmacological Basis of Therapeutics)，第7版(麦克米兰出版公司(MacMillan Publishing Co.)1985)。本领域技术人员了解其它合适的毒素和/或化疗药。

本发明抗-CD19免疫治疗也可与前药激活酶联用，所述前药激活酶能将前药(如肽酰化疗药，参见WO81/01145)转变为活性抗癌药。参见例如，WO 88/07378和美国专利号4,975,278。这种联合用药的酶组分包括能够作用于前药，并使其转变为更具活性的细胞毒性形式的任何酶。本申请所用术语“前药”指药学活性物质的前体或衍生物形式，与母体药物相比它对肿瘤细胞的毒性较低，能够被酶激活或转变为更具活性的母体形式。参见例如，Wilman，“癌症化疗中的前药”(Prodrugs in Cancer Chemotherapy)，生化协会会刊(Biochemical Society Transactions)，14，第375-382页，第615届贝尔法斯特会议(1986)和Stella等，“前药：靶向药物递送的化学方法”(Prodrugs:A Chemical Approach toTargeted Drug Delivery)，定向药物递送(Directed Drug Delivery)，Borchardt等(编)，第247-267页，休曼出版社(Humana Press)(1985)。可与抗CD19抗体联用的前药包括但不限于：含磷酸的前药、含硫代磷酸的前药、含硫酸的前药、含肽前药、D-氨基酸修饰的前药、糖基化的前药、含α-内酰胺的前药、含任选取代的苯氧基乙酰胺的前药或含任选取代的苯基乙酰胺的前药、5-氟胞嘧啶和其它5-氟尿苷前药，它们可转变为更具活性的细胞毒性游离药物。可衍生为本发明所用前药形成的细胞毒性药物的例子包括但不限于上述化疗药。

在某些实施方式中，给予本发明的组合物和方法能推迟毒性治疗，并且可能帮助避免不必要的副作用和化疗相关性并发症的风险并延迟化疗耐受性的发生。在某些实施方式中，在给予本发明的组合物和方法的患者中，毒性治疗和/或毒性治疗耐受性被延迟最多约6个月，1、2、3、4、5、6、7、8、9或10年。

5.29.与治疗性抗体联合给药

本文所述的抗-CD19免疫治疗可与其它抗体联合给药，这些抗体包括但不限于：抗-CD20mAb、抗-CD52mAb、抗-CD22抗体和抗-CD20抗体，如利妥昔^TM(C2B8；利妥昔单抗^TM；IDEC制药公司)。可与本发明抗体联用或用于本发明组合物的治疗性抗体的其它例子包括但不限于：贺赛汀^TM(曲妥珠单抗；基因泰克公司)、麦罗塔(MYLOTARG)^TM(吉姆单抗奥佐米星；惠氏制药公司(Wyeth Pharmaceuticals))、坎帕斯^TM(阿来组单抗；泊来克斯公司(Berlex))、ZEVALIN^TM(替伊莫单抗；百集公司)、BEXXAR^TM(托西莫单抗；葛兰素史克公司(GlaxoSmithKline Corixa))、艾比特斯^TM(西妥昔单抗；因克隆公司(Imclone))和阿瓦斯丁(AVASTIN)^TM(贝伐单抗；基因泰克公司)。

本文所述的抗-CD19免疫治疗可与Fc受体的特异性抗体联合给药，所述Fc受体选自FcγRI、FcγRIIA、FcγRIIB、FcγRIII和/或FcγRIV。在一个具体实施方式中，本文所述的抗-CD19免疫治疗可与FcγRIIB的特异性抗体联合给药。适合此种目的的抗-FcγRIIB抗体参见美国专利申请公开号2004185045，PCT公开号WO05051999A、WO05018669和WO04016750。

在某些实施方式中，可任选用同一种药物组合物，以任何合适比例给予抗-CD19和抗-CD20和/或抗-CD22mAb和/或抗-CD52mAb。为了说明，抗-CD19和抗-CD20抗体的比例可以是约1000:1、500:1、250:1、100:1、90:1、80:1、70:1、60:1、50:1、40:1、30:1、20:1、19:1、18:1、17:1、16:1、15:1、14:1、13:1、12:1、11:1、10:1、9:1、8:1、7:1、6:1、5:1、4:1、3:1、2:1、1:1、1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9、1:10、1:11、1:12、1:13、1:14、1:15、1:16、1:17、1:18、1:19、1:20、1:30、1:40、1:50、1:60、1:70、1:80、1:90、1:100、1:250、1:500或1:1000或更高。同样，抗-CD19和抗-CD22抗体的比例可以是约1000:1、500:1、250:1、100:1、90:1、80:1、70:1、60；1、50:1、40:1、30:1.20:1、19:1、18:1、17:1、16:1、15:1、14:1、13:1、12:1、11:1、10:1、9:1、8:1、7:1、6:1、5:1、4:1、3:1、2:1、1:1、1:2、1:3,1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9、1:10、1:11、1:12、1:13、1:14、1:15、1:16、1:17、1:18、1:19、1:20、1:30、1:40、1:50、1:60、1:70、1:80、1:90、1:100、1:250、1:500或1:1000或更高。相似地，抗-CD19和抗-CD52抗体的比例可以是约1000:1、500:1、250:1、100:1、90:1、80:1、70:1、60；1、50:1、40:1、30:1.20:1、19:1、18:1、17:1、16:1、15:1、14:1、13:1、12:1、11:1、10:1、9:1、8:1、7:1、6:1、5:1、4:1、3:1、2:1、1:1、1:2、1:3,1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9、1:10、1:11、1:12、1:13、1:14、1:15、1:16、1:17、1:18、1:19、1:20、1:30、1:40、1:50、1:60、1:70、1:80、1:90、1:100、1:250、1:500或1:1000或更高。

5.30.增强单核细胞或巨噬细胞功能的化合物组合

在本发明方法的某些实施方式中，增强单核细胞或巨噬细胞功能(如至少约25％、50％、75％、85％、90％、95％或更多)的化合物可与抗-CD19免疫治疗联用。本领域已知这类化合物，包括但不限于：细胞因子如白介素(如IL-12)和干扰素(如α或γ干扰素)。

增强单核细胞或巨噬细胞功能的化合物可与抗体、免疫偶联物或抗原结合片段配制在同一药物组合物中。分开给药时，抗体/片段和化合物可同时给药(在几个小时内)，可以在同一疗程过程中给药，或者可依次给药(即，患者首先接受一个疗程的抗体/片段治疗，然后接受一个疗程的增强巨噬细胞/单核细胞功能的化合物治疗，反之亦然)。在这种实施方式中，在用其它治疗方案和/或本发明组合物治疗之前、同时或之后将增强巨噬细胞/单核细胞功能的化合物给予人对象。在一个实施方式中，人对象的血液中白细胞、单核细胞、嗜中性粒细胞、淋巴细胞、和/或嗜碱性白细胞计数属于人体正常范围。人白细胞(全部白细胞)的正常范围约为3.5-10.5(10⁹/L)。人血嗜中性粒细胞的正常范围约为1.7-7.0(10⁹/L)，单核细胞约为0.3-0.9(10⁹/L)，淋巴细胞约为0.9-2.9(10⁹/L)，嗜碱性细胞约为0-0.3(10⁹/L)，嗜酸性细胞约为0.05-0.5(10⁹/L)。在其它实施方式中，人对象血液中的白细胞计数小于人体正常范围，例如至少约0.01、0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7或0.8(10⁹/L)个白细胞。

可利用本发明的抗体、免疫偶联物或抗体片段，或者用本领域已知的其它抗体实施本发明此种实施方式，该实施方式特别适合对抗-CD22、抗-CD52和/或抗-CD20抗体治疗(例如，用现有抗体如C2B8治疗)产生耐受性的对象、目前正在进行化疗或曾经接受过化疗的对象、B细胞疾病复发的对象、免疫削弱的对象或者巨噬细胞或单核细胞功能受损的对象。对治疗产生耐受性和B细胞疾病复发的患者的普遍存在至少部分归因于巨噬细胞或单核细胞功能受损。因此，本发明提供了与给予抗CD19抗体和抗原结合片段的方法联用、增强ADCC和/或巨噬细胞和/或单核细胞功能的方法。

5.31.与免疫调节剂联合用药

本发明抗-CD19免疫治疗也可与免疫调节剂联合使用。在此种方法中，可采用嵌合、人或人源化抗CD19抗体。用于联合治疗的本文所用术语“免疫调节剂”指用于抑制、遮蔽或增强宿主免疫系统的物质。这包括抑制细胞因子产生、下调或抑制自身抗原表达，或遮蔽MHC抗原的物质。这类药物的例子包括：2-氨基-6-芳基-5-取代的嘧啶(参见美国专利4,665,077)、硫唑嘌呤(或环磷酰胺，如果对硫唑嘌呤存在不良反应)；溴隐亭；戊二醛(遮蔽MHC抗原，如美国专利4,120,649所述)；MHC抗原和MHC片段的抗-独特型抗体；环孢菌素A；类固醇，如糖皮质类固醇，如氯泼尼松、甲泼尼龙和地塞米松；细胞因子或细胞因子受体拮抗剂，包括抗干扰素-γ、-β或-α抗体；抗-肿瘤坏死因子-α抗体；抗-肿瘤坏死因子-β抗体；抗-白介素-2抗体和抗-IL-2受体抗体；抗-L3T4抗体；异源抗-淋巴细胞球蛋白；泛T抗体，如抗-CD3或抗-CD4/CD4a抗体；含有LFA-3结合域的可溶性肽(1990年7月26日公开的WO 90/08187)；链激酶；TGF-β；链道酶；来自宿主的RNA或DNA；FK506；RS-61443；脱氧精胍菌素；雷帕霉素；T-细胞受体(美国专利5,114,721)；T细胞受体片段(Offner等，Science 251:430-432(1991)；WO 90/11294；和WO 91/01133)；和T-细胞受体抗体(EP 340,109)如T10B9。细胞因子的例子包括但不限于：淋巴因子、单核因子和传统多肽激素。细胞因子包括：生长激素，如人生长激素、N-甲硫氨酰基人生长激素和牛生长激素；甲状旁腺激素；甲状腺素；胰岛素；胰岛素原；松弛素；松弛素原；糖蛋白激素，如促卵泡激素(FSH)、促甲状腺激素(TSH)和黄体生成素(LH)；肝脏生长因子；成纤维细胞生长因子；促乳素；胎盘催乳素；肿瘤坏死因子-α；苗勒管抑制剂；小鼠促性腺素-相关肽；抑制素；活化素；血管内皮生长因子；整联蛋白；血小板生成素(TPO)；神经生长因子，如NGF-α；血小板-生长因子；转化生长因子(TGF)，如TGF-α和TGF-α；胰岛素样生长因子-I和-II；红细胞生成素(EPO)；骨诱导因子；干扰素；集落刺激因子(CSF)，如巨噬细胞-CSF(M-CSF)；粒细胞-巨噬细胞-CgP(GM-CSP)；和粒细胞-CSF(G-CSF)；白介素(IL)，如IL-1、IL-la、IL-2、1L-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-1I、IL-12、IL-15；肿瘤坏死因子，如TNF-α或TNF-β；以及其它多肽因子，包括LIF和kit配体(KL)。本文所用术语“细胞因子”包括天然来源或重组细胞培养物来源的蛋白质，以及天然序列细胞因子的生物活性等同物。在某些实施方式中，该方法还包括给予所述对象一种或多种免疫调节剂，例如细胞因子。合适的细胞因子可选自白介素-1(IL-1)、IL-2、IL-3、IL-12、IL-15、IL-18、G-CSF、GM-CSF、血小板生成素或γ干扰素。

这些免疫调节剂可以与抗CD19抗体在同一时间或不同时间给药。优选的免疫调节剂将取决于许多因素，包括所治疗疾病的类型以及患者病史，但该药物常常可选自环孢菌素A、糖皮质类固醇(如氯泼尼松或甲泼尼龙)、OKT-3单克隆抗体、硫唑嘌呤、溴隐亭、异源抗-淋巴细胞球蛋白或其混合物。

5.32.与其它治疗剂联用

作用于肿瘤新生血管的药物也可与抗-CD19免疫治疗联用，这类药物包括微管结合剂，如考布他汀(combrestatin)A4(Griggs等，Lancet Oncol.2:82，(2001))和血管他丁和内皮他丁(综述参见Rosen，Oncologist 5:20(2000)，通过引用纳入本文)。适合与抗CD19抗体联用的免疫调节剂包括但不限于：α-干扰素、γ-干扰素和肿瘤坏死因子α(TNFα)。在某些实施方式中，与本发明的组合物和方法联合使用的治疗剂是肽。

在某些实施方式中，抗-CD19免疫治疗与一种或多种卡奇霉素分子联用。卡奇霉素抗生素类能够在亚皮摩尔浓度导致双链DNA断裂。可以使用的卡奇霉素结构类似物包括但不限于：γ1^I、γ2^I、γ3^I、N-乙酰基-γ1^I、PSAG和011(Hinman等，Cancer Research 53:3336-3342(1993)和Lode等，Cancer Research 58:2925-2928(1998))。

也可通过，例如重组技术或肽合成制备包含抗CD19抗体和细胞毒剂的融合蛋白。

在又一实施方式中，抗CD19抗体可偶联于“受体”(如链霉亲和素)以便预先靶向肿瘤，其中将拮抗剂-受体偶联物给予患者，然后用清除剂去除循环系统中未结合的偶联物，接着给予治疗剂(如放射性核苷酸)和“配体”(如亲和素)的偶联物。

在某些实施方式中，治疗方案包括减轻抗CD19抗体组合物的细胞毒作用的化合物。这类化合物包括：镇痛药(如、对乙酰氨基酚)、二膦酸盐、抗组胺剂(如马来酸氯苯那敏)和类固醇(如地塞米松、类视黄醇、类三角醇(deltoids)、倍他米松、氢化可的松、可的松、氯泼尼松、去氢睾酮、糖皮质激素类、电解质代谢皮质激素、雌激素、睾酮、孕激素)。

在某些实施方式中，与抗-CD19免疫治疗联用的治疗剂是小分子(即，分子量小于约2500道尔顿的无机或有机物)。例如，可以从SB公司(Specs and BioSpecs B.V.)(荷兰利兹维克(Rijswijk，The Netherlands))，卡布基公司(Chembridge Corporation)(加州圣地亚哥)，科际美国公司(Comgenex USA Inc.)(新泽西州普林斯顿(Princeton，NJ))和美布基化学品有限公司(Maybridge Chemicals Ltd.)(英国康沃尔PL34OHW(Cornwall PL34OHW，United Kingdom))购得小分子文库。

在某些实施方式中，抗-CD19免疫治疗可与抗菌剂联合给药。抗菌剂的非限制性例子包括能抑制和/或减少细菌感染、抑制和/或减少细菌复制或者抑制和/或减少细菌向其它细胞或对象传播的蛋白质、多肽、肽、融合蛋白、抗体、核酸分子、有机分子、无机分子和小分子。抗菌剂的具体例子包括但不限于：抗生素，如青霉素、头孢菌素、亚胺培南、奥克特南(axtreonam)、去甲万古霉素、环丝氨酸、杆菌肽、氯霉素、红霉素、克林霉素、四环素、链霉素、妥布拉霉素、庆大霉素、阿米卡星、卡那霉素、新霉素、大观霉素、甲氧苄啶、诺氟沙星、利福平、多粘菌素、两性霉素B、制霉菌素、酮康唑、异烟肼、甲硝唑和喷他脒。

在某些实施方式中，抗-CD19免疫治疗可与抗真菌剂联合给药。抗真菌剂的具体例子包括但不限于：唑类药物(如咪康唑、酮康唑乙酸卡泊芬净咪唑、三唑(如氟康唑)和伊曲康唑)、多烯(如制霉菌素、两性霉素B两性霉素B脂质复合物(“ABLC”)两性霉素B胶体分散体(“ABCD”)脂质体两性霉素B)、碘化钾(KI)、嘧啶(如、氟胞嘧啶和伏立康唑)。给予抗菌剂和抗真菌剂可减轻感染性疾病的影响或恶化，这种影响或恶化是本发明方法中患者B细胞被明显消耗时可能发生的情况。

在本发明的某些实施方式中，抗-CD19免疫治疗可与一种或多种上述药剂联合给药，以减轻给予本发明组合物可能伴有的毒副作用。在其它实施方式中，抗-CD19免疫治疗可与本领域熟知能减轻抗体给药、化疗、毒素或药物的副作用的一种或多种药剂联合给药。

在本发明的某些实施方式中，给予抗-CD19免疫治疗治疗多发性骨髓瘤时，本发明组合物可与高剂量化疗联合给药或用于包含高剂量化疗的治疗方案，所述化疗是，例如，美法仑、美法仑/氯泼尼松(MP)、长春新碱/多柔比星/地塞米松(VAD)、脂质体多柔比星/长春新碱、地塞米松(DVd)、环磷酰胺、依托泊甙/地塞米松/阿糖胞苷、顺铂(EDAP))、干细胞移植物(如自体干细胞移植或同种异体干细胞移植和/或小-同种异体(非骨髓消融性)干细胞移植)、放疗、类固醇(如皮质类固醇、地塞米松、沙利度胺/地塞米松、氯泼尼松、美法仑/氯泼尼松)、支持性治疗(如二膦酸盐、生长因子、抗生素、静脉内免疫球蛋白、低剂量放疗和/或矫形介入)、THALOMID^TM(沙利度胺，塞尔基因公司(Celgene))和/或VELCADE^TM(硼替佐米，千年公司(Millennium))。

在本发明的实施方式中，抗-CD19免疫治疗与其它抗体和/或药物联合给药，其它抗体和/或药物可以相对于本发明抗体给药的任何顺序给药。例如，可以在给予人对象抗CD19抗体或免疫偶联物之前、同时和/或之后给予其它抗体。其它抗体可与本发明抗体配制在同一药物组合物中，和/或配制在不同药物组合物中。按照本申请和本领域熟知的有关剂量和给药方式的教导，本发明抗体的剂量和给药方式以及其它抗体的剂量和给药方式可能相同或不同。

5.33.用抗CD19抗体诊断B细胞恶性肿瘤

本发明也包括免疫特异性结合人CD19抗原的抗CD19抗体和其组合物，其中抗CD19抗体偶联于诊断或检测性试剂。在某些实施方式中，抗体是人或人源化的抗CD19抗体。这类抗CD19抗体可作为临床检测的一部分用来监测或预测B细胞恶性肿瘤的发生或进展，例如测定特定疗法的功效。可通过将免疫学特异性结合人CD19抗原的抗CD19抗体偶联于可检测物质进行这类诊断和检测，所述可检测物质包括但不限于：各种酶，例如但不限于辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β半乳糖苷酶或乙酰胆碱酯酶；修复基团，例如但不限于链霉亲和素/生物素和亲和素/生物素；荧光物质，例如但不限于伞形酮、荧光素、荧光素异硫氰酸酯、罗丹明、二氯三嗪基胺荧光素、丹酰氯或藻红蛋白；发光物质，例如但不限于，鲁米诺；生物发光物质，例如但不限于荧光素酶、萤光素和发光蛋白；放射性物质，例如但不限于碘(¹³¹I、¹²⁵I、¹²³I、¹²¹I)、碳(¹⁴C)、硫(³⁵S)、氚(³H)、铟(¹¹⁵In、¹¹³In、¹¹²In、¹¹¹In)和锝(⁹⁹Tc)、铊(²⁰¹Ti)、镓(⁶⁸Ga、⁶⁷Ga)、钯(¹⁰³Pd)、钼(⁹⁹Mo)、氙(¹³³Xe)、氟(¹⁸F)、¹⁵³Sm、¹⁷⁷Lu、¹⁵⁹Gd、¹⁴⁹Pm、¹⁴⁰La、¹⁷⁵Yb、¹⁶⁶Ho、⁹⁰Y、⁴⁷Sc、¹⁸⁶Re、¹⁸⁸Re、¹⁴²Pr、¹⁰⁵Rh、⁹⁷Ru、⁶⁸Ge、⁵⁷Co、⁶⁵Zn、⁸⁵Sr、³²P、¹⁵³Gd、¹⁶⁹Yb、⁵¹Cr、⁵⁴Mn、⁷⁵Se、¹¹³Sn和¹¹⁷锡；采用各种正电子发射层析成像的正电子发射金属，无放射性(noradioactive)顺磁金属离子和放射性标记或偶联于特定同位素的放射性分子。容易测定的任何可检测标记都可偶联于抗CD19抗体，并用于诊断B细胞恶性肿瘤。凭借本领域已知技术，可将可检测物质直接连接或偶联于抗体，或者通过中间体(如本领域已知的接头)间接连接或偶联于抗体。参见例如，美国专利号4,741,900中可按照本发明进行诊断的偶联于抗体的金属离子。在某些实施方式中，本发明提供包含偶联于诊断或检测性试剂的抗CD19抗体的诊断试剂盒。

5.34.用抗CD19抗体监测免疫重建

本发明也包括免疫特异性结合人CD19抗原的抗CD19抗体和其组合物，其中抗CD19抗体偶联于诊断或检测性试剂。在某些实施方式中，抗体是人或人源化的抗CD19抗体。在免疫抑制治疗或骨髓移植后，可利用这类抗CD19抗体监测免疫系统的重建。可通过将免疫学特异性结合人CD19抗原的抗CD19抗体偶联于可检测物质进行这种监测，所述可检测物质包括但不限于：各种酶，例如但不限于辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β半乳糖苷酶或乙酰胆碱酯酶；修复基团，例如但不限于链霉亲和素/生物素和亲和素/生物素；荧光物质，例如但不限于伞形酮、荧光素、荧光素异硫氰酸酯、罗丹明、二氯三嗪基胺荧光素、丹酰氯或藻红蛋白；发光物质，例如但不限于，鲁米诺；生物发光物质，例如但不限于荧光素酶、萤光素和发光蛋白；放射性物质，例如但不限于碘(¹³¹I、¹²⁵I、¹²³I、¹²¹I)、碳(¹⁴C)、硫(³⁵S)、氚(³H)、铟(¹¹⁵In、¹¹³In、¹¹²In、¹¹¹In)和锝(⁹⁹Tc)、铊(²⁰¹Ti)、镓(⁶⁸Ga、⁶⁷Ga)、钯(¹⁰³Pd)、钼(⁹⁹Mo)、氙(¹³³Xe)、氟(¹⁸F)、¹⁵³Sm、¹⁷⁷Lu、¹⁵⁹Gd、¹⁴⁹Pm、¹⁴⁰La、¹⁷⁵Yb、¹⁶⁶Ho、⁹⁰Y、⁴⁷Sc、¹⁸⁶Re、¹⁸⁸Re、¹⁴²Pr、¹⁰⁵Rh、⁹⁷Ru、⁶⁸Ge、⁵⁷Co、⁶⁵Zn、⁸⁵Sr、³²P、¹⁵³Gd、¹⁶⁹Yb、⁵¹Cr、⁵⁴Mn、⁷⁵Se、¹¹³Sn和¹¹⁷锡；采用各种正电子发射层析成像的正电子发射金属，无放射性(noradioactive)顺磁金属离子和放射性标记或偶联于特定同位素的放射性分子。容易测定的任何可检测标记都可偶联于抗CD19抗体，并用于诊断自身免疫疾病或失调。凭借本领域已知技术，可将可检测物质直接连接或偶联于抗体，或者通过中间体(如本领域已知的接头)间接连接或偶联于抗体。参见例如，美国专利号4,741,900中可按照本发明进行诊断的偶联于抗体的金属离子。在某些实施方式中，本发明提供包含偶联于诊断或检测性试剂的抗CD19抗体的诊断试剂盒。

5.35.用抗CD19抗体诊断自身免疫疾病或失调

本发明也包括免疫特异性结合人CD19抗原的抗CD19抗体和其组合物，其中抗CD19抗体偶联于诊断或检测性试剂。在某些实施方式中，抗体是人或人源化的抗CD19抗体。这类抗CD19抗体可作为临床检测的一部分用来监测或预测自身免疫疾病或失调的发生或进展，例如测定特定疗法的功效。可通过将免疫学特异性结合人CD19抗原的抗CD19抗体偶联于可检测物质进行这类诊断和检测，所述可检测物质包括但不限于：各种酶，例如但不限于辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β半乳糖苷酶或乙酰胆碱酯酶；修复基团，例如但不限于链霉亲和素/生物素和亲和素/生物素；荧光物质，例如但不限于伞形酮、荧光素、荧光素异硫氰酸酯、罗丹明、二氯三嗪基胺荧光素、丹酰氯或藻红蛋白；发光物质，例如但不限于，鲁米诺；生物发光物质，例如但不限于荧光素酶、萤光素和发光蛋白；放射性物质，例如但不限于碘(¹³¹I、¹²⁵I、¹²³I、¹²¹I)、碳(¹⁴C)、硫(³⁵S)、氚(³H)、铟(¹¹⁵In、¹¹³In、¹¹²In、¹¹¹In)和锝(⁹⁹Tc)、铊(²⁰¹Ti)、镓(⁶⁸Ga、⁶⁷Ga)、钯(¹⁰³Pd)、钼(⁹⁹Mo)、氙(¹³³Xe)、氟(¹⁸F)、¹⁵³Sm、¹⁷⁷Lu、¹⁵⁹Gd、¹⁴⁹Pm、¹⁴⁰La、¹⁷⁵Yb、¹⁶⁶Ho、⁹⁰Y、⁴⁷Sc、¹⁸⁶Re、¹⁸⁸Re、¹⁴²Pr、¹⁰⁵Rh、⁹⁷Ru、⁶⁸Ge、⁵⁷Co、⁶⁵Zn、⁸⁵Sr、³²P、¹⁵³Gd、¹⁶⁹Yb、⁵¹Cr、⁵⁴Mn、⁷⁵Se、¹¹³Sn和¹¹⁷锡；采用各种正电子发射层析成像的正电子发射金属，无放射性(noradioactive)顺磁金属离子和放射性标记或偶联于特定同位素的放射性分子。容易测定的任何可检测标记都可偶联于抗CD19抗体，并用于诊断自身免疫疾病或失调。凭借本领域已知技术，可将可检测物质直接连接或偶联于抗体，或者通过中间体(如本领域已知的接头)间接连接或偶联于抗体。参见例如，美国专利号4,741,900中可按照本发明进行诊断的偶联于抗体的金属离子。在某些实施方式中，本发明提供包含偶联于诊断或检测性试剂的抗CD19抗体的诊断试剂盒。

5.36.药盒

本发明提供装有一个或多个容器的药物包装或药盒，所述容器中装有本发明组合物，用于预防、治疗、控制或改善B细胞恶性肿瘤或者B细胞恶性肿瘤导致或导致B细胞恶性肿瘤的一种或多种症状。

本发明提供了可用于上述方法的药盒。在一个实施方式中，药盒中所装的一个或多个容器中包含本发明组合物。在另一实施方式中，药盒中所装的一个或多个容器中包含本发明组合物，以及一种或多种其它预防剂或治疗剂，用于预防、治疗、控制或改善B细胞恶性肿瘤或者B细胞恶性肿瘤导致或导致B细胞恶性肿瘤的一种或多种症状。该药盒还可包括有关预防、治疗、控制或改善B细胞恶性肿瘤，以及副作用和给药方法剂量信息的说明书。所述容器任选粘附有管理药品或生物制品的生产、使用或销售的政府机构颁发的告知书，该告知书反映出生产、使用或销售管理机构批准其用于人体。

6.具体实施方式

1.一种结合人CD19抗原的嵌合、人源化或人单克隆抗体或其片段。

2.如实施方式1所述的抗体，其包含至少一个含有选自下组的氨基酸序列的CDR：SEQ ID NO：6、8、10、12、14、16、22、24、26、28、30、32、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126和127。

3.如实施方式1所述的抗体，其包含至少一个HB12B-(A10-Jk4)、HB12B-3649或HB12B-364987轻链可变区的构架区。

4.如实施方式1所述的抗体，其包含至少一个HB12B-(3-72\JH4)或HB12B-9m重链可变区的构架区。

5.如实施方式1所述的抗体，其包含至少一个含有选自下组的氨基酸序列的重链多肽：SEQ ID NO：2、18、34、44、102、103、104、105、106、107、108和109。

6.如实施方式1所述的抗体，其包含至少一个含有选自下组的氨基酸序列的轻链多肽：SEQ ID NO：4、20、52、62、68、70、110、111、112和113。

7.如实施方式5所述的抗体，其还包含至少一个含有选自下组的氨基酸序列的轻链CDR：SEQ ID NO：12、14、16、28、30、32、123、124、125、126和127。

8.如实施方式3所述的抗体，其还包含至少一个含有选自下组的氨基酸序列的重链CDR：SEQ ID NO：6、8、10、22、24、26、114、115、116、117、118、119、120、121和122。

9.如实施方式1所述的抗体，其包含至少一个重链多肽和至少一个轻链多肽，所述重链多肽含有选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO：2、18、34、44、102、103、104、105、106、107、108和109，所述轻链多肽含有选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO：4、20、52、62、68、70、110、111、112和113。

10.如实施方式1所述的抗体，其包含至少一个轻链多肽和至少一个重链多肽，其中所述轻链多肽包含选自下组的氨基酸序列：HB12A VK(SEQ ID NO：4)；和HB12B VK(SEQID NO：20)；所述重链多肽含有选自下组的氨基酸序列：HB12A VH(SEQ ID NO：2)；和HB12BVH(SEQ ID NO：18)。

11.如实施方式1所述的抗体，其包含所述HB12B-(3-72\JH4)重链可变区和所述HB12B-3649轻链可变区。

12.如实施方式1所述的抗体，其包含VH和VK，其中所述VH含有氨基酸序列SEQ IDNO：106，所述VK含有氨基酸序列SEQ ID NO：111。

13.一种编码多肽的核酸，所述多肽包含选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO：2、18、34、36、38、40、42、44、102、103、104、105、106、107、108和109。

14.一种编码多肽的核酸，所述多肽包含选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO：4、20、52、62、64、66、68、70、110、111、112和113。

15.一种载体，其包含实施方式13和/或14所述的核酸。

16.一种分离细胞，其包含实施方式15所述的载体。

17.一种分离细胞，其表达实施方式1-12中任一项所述的抗体。

18.一种产生抗体的方法，所述方法包括在足以产生所述抗体和从培养物中回收所述抗体的条件下培养实施方式17所述的分离细胞。

19.一种药物组合物，其包含药学上可接受的载体中的实施方式1-12中任一项所述的抗体。

20.如实施方式19所述的药物组合物，其中所述抗体是IgG1、IgG2、IgG3或IgG4人同种型。

21.一种治疗人的B细胞恶性肿瘤的方法，所述方法包括给予需要的人治疗有效量的实施方式1-12中任一项所述的抗体。

22.一种治疗人的自身免疫疾病或失调的方法，所述方法包括给予需要的人治疗有效量的实施方式1-12中任一项所述的抗体。

23.一种治疗或预防人移植患者的体液排斥的方法，所述方法包括给予需要的人治疗有效量的实施方式1-12中任一项所述的抗体。

24.如实施方式1-12中任一项所述的抗体，其中所述抗体消耗B细胞的效率与鼠单克隆HB12B抗体相同。

25.如实施方式1-12中任一项所述的抗体，其中所述抗体诱导B细胞凋亡。

26.如实施方式1-12中任一项所述的抗体，其中所述抗体的Fc区结合有N-糖苷连接的复合糖链，其中岩藻糖不结合于糖链还原端中的N-乙酰基葡糖胺。

27.如实施方式1-12中任一项所述的抗体，其中所述抗体是Fc变异抗体，其中所述Fc变体含有导致ADCC活性增强的突变。

28.一种消耗人患者的B细胞的方法，所述方法包括给予需要的人治疗有效量的实施方式24-27中任一项所述的抗体。

29.如实施方式1-12中任一项所述的抗体，其中所述抗体是Fc变异抗体，其中所述Fc变体与Fc受体FcγRIIIA的亲和力是比较分子的至多约1/5，所述Fc变体与Fc受体FcγRIIB的亲和力是比较分子亲和力的约2倍以下。

30.一种消耗人患者B细胞的方法，所述方法包括给予需要的人治疗有效量的实施方式29所述的抗体。

7.实施例

7.1.人源化抗-CD19抗体的构建、表达和结合特征

以下章节描述了亲本HB12B抗体(chHB12B)的嵌合变体的设计和构建，其中分别用人IgHγ1和人IgLκ区替换小鼠重链和轻链恒定区。这些章节也描述了产生HB12B重链和轻链可变区的人源化变体的方案。

也描述了产自不同重链和轻链可变区组合(嵌合或人源化)的抗体与CD19的结合活性。例如，描述了具有相当于chHB12B形式的CD19结合特性的HB12B的人源化形式。

下述章节也描述了在人构架区内的数种突变，当在某种人源化抗CD19抗体中引入这些突变时导致其与人CD19的结合能力相当于含有HB12B VH和HB12B VK的参比抗体chHB12B。VK中这些残基包括例如，游标残基F36和H49以及链间残基F87。

7.1.1基因组装和克隆表达

通过Stemmer(Stemmer，W.P.等1995Gene，164:49-53)首先描述的基于PCR的基因组装方法产生构建物。该方法包括四步：寡核苷酸合成、基因组装、基因扩增和克隆。合成针对每一VH和VK区段的八个基因特异性引物。表3列出用于HB12B-(3-72/JH4)VH区和HB12B-(A10-Jk4)VK组装的代表性引物组；通过修饰编码给定氨基酸残基的引物的核酸序列产生包含特定氨基酸取代的变异VH和VK区的引物组。设计有15-20个氨基酸交叠的引物并在热循环中将其连接入完整可变区。如果是VH，则在PCR介导的基因组装过程中包含其它载体特异性引物(表3中的通用VH FW)。分别在VH区域外部5’和3’引物中掺入XbaI和ApaI限制性核酸内切酶的独特识别位点，以助于后续克隆步骤。分别在VK外部5’和3’引物中掺入XmaI和BsiWI限制性核酸内切酶的独特识别位点，以助于后续克隆步骤。将大小正确的PCR产物限制性消化并连接入表达载体的框内，其中根据生产商说明书利用XbaI和ApaI消化VH区域，利用XmaI和BsiWI消化VK区域。用于重链组装的载体包含可操作地连接于编码MGDNDIHFAFLSTGVHS VH前导物(SEQ ID NO：83)和人IgHγ1恒定区的多核苷酸的真核转录控制元件，其中所述转录控制元件包含CMV立即早期启动子和SV40聚A附加信号。使用为VH组装适当设计的引物保证了编码VH前导物、VH区和IgHγ1恒定区的多核苷酸序列被连接到最终重链表达载体的框内。用于轻链组装的载体包含操作性连接于编码人VKI-L12前导物(氨基酸序列MDMRVPAQLLGLLLLWLPGAKC(SEQ ID NO：84)；Bentley，D.L.和Babbitts，T.H.，Nature 288,730-733(1980))和人IgLκ恒定区的多核苷酸的真核转录控制元件，其中所述转录控制元件包含CMV立即早期启动子和SV40聚A附加信号。使用为VK组装适当设计的引物保证了编码VKI-L12前导物、VK区域和IgLκ恒定区的多核苷酸被连接到最终轻链表达载体的框内。根据生产商方案用连接产物转化DH10B感受态大肠杆菌(E.coli)细胞。可用本领域多种方法(如对载体DNA制备物限制性消化，PCR扩增载体序列)鉴别包含质粒和正确大小插入物的菌落。用双脱氧测序反应(如Terminator v3.0循环测序即用型反应试剂盒(Cycle Sequencing Ready Reaction Kit)，ABI公司)对具有正确大小插入物克隆的质粒进行测序。利用凯杰公司(QIAGEN)小抽和大抽质粒试剂盒根据生产商方案从所选克隆中制备质粒DNA。

用成对的编码人源化或嵌合免疫球蛋白重链和人源化或嵌合免疫球蛋白轻链的DNA质粒表达载体制备物共转染HEK293细胞。将这些共转染的HEK293细胞培养三天，产生适用于测定总IgG浓度和CD19结合活性的含抗体的条件培养基。

利用捕获ELISA实验定量测定HEK293细胞上清液中的总Ig浓度。用固定的山羊抗-人IgG H+L特异性抗体在96孔板上捕获抗体IgG分子，并用HRP偶联的抗-人κ轻链抗体进行检测。使用具有无关特异性的参比IgG1mAb校正该实验。

表3：HB12B-(3-72/JH4)VH区和HB12B-(A10-Jk4)VK区组装的代表性引物组。基因特异性核苷酸以大写字母表示，载体特异性核苷酸以小写字母表示。以下划线表示VH和VK片段克隆中使用的限制性内切酶的识别位点。

7.1.2. 300B4-CD19结合实验

利用基于细胞的重组人CD19ELISA实验测定CD19结合活性，其中在所述实验中使用的每一人源化或嵌合抗体浓度相同，因而利于在另选的人源化HB12B抗体和chHB12B之间进行直接比较。

使用基于细胞的CD19结合实验测定chHB12B及其人源化变体与hCD19结合的能力，该实验使用表达重组细胞表面人CD19的300B4细胞作为捕获试剂。根据标准实验方法在含L-谷胺酰胺、10％胎牛血清、β-巯基乙醇以及1mg/ml G418的RPMI 1640中培养300B4细胞。可利用标准的ELISA方法进行基于细胞的CD19结合试验。例如，将1x10⁵个300B4细胞接种到96孔U形底平板的每个孔中，培育过夜。用ELISA缓冲液洗涤细胞一次，然后在冰上用人、人源化或嵌合的HB12B抗体培育。在所检测的各抗体浓度下，一式三份地进行结合反应。在实验中应包括使用无关特异性的同种型匹配抗体的阴性对照孔。用抗体培育后，用200微升ELISA缓冲液洗涤300B4细胞三次。可根据标准实验方案，用偶联辣根过氧化物酶的山羊抗-人κ抗体检测与300B4细胞结合的嵌合、人源化或人抗CD19抗体的量。

7.1.3.chHB12B的构建、表达和结合特征

根据6.1章所述方法构建编码含鼠HB12B VH和人IgHγ1恒定区的chHB12B重链的表达载体。根据6.1章所述方法构建编码含鼠HB12B VK和人IgLκ恒定区的chHB12B轻链的表达载体。

用编码chHB12B重链和轻链的表达载体同时共转染HEK293细胞。将转染细胞培养3天以产生抗体。收集含有可溶性分泌chHB12b抗体的培养基，并利用6.1章所述方法检测chHB12B抗体的浓度。

利用6.2章所述基于300B4细胞的ELISA实验测定chHB12B与人CD19的结合。在实验中包括具有无关特异性的同种型匹配的人抗体作为阴性对照。用基于细胞的ELISA实验获得的结果显示抗体浓度超过100ng/ml时，嵌合抗体与表达于300B4细胞表面的重组人CD19显著结合，表明chHB12B保持了hCD19的结合活性(图2)。

7.1.4.构建编码人源化HB12B VH的表达载体

以下章节描述了含有鼠HB12B CDR区和合适的人构架区或基本人构架区的HB12BVH区的人源化变体设计。这些章节也描述了产生人源化HB12B Ig重链的变体的方案。

7.1.4.1.人重链接受体构架区的鉴定

对含有所有人种系免疫球蛋白重链V、D和J区域的构架残基的氨基酸序列数据库进行汇编。可从数种来源获取必需的信息，如V Base:人抗体基因数据库(http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/)。在数据库中查询人种系V和J区段，这些区段与鼠HB12b VH的对应构架区在关键残基，如规范、链间和游标残基上显示出序列相似性。

选择人种系V3-72(Tomlinson，I.M.等，J.Mol.Biol.，227:776-798(1992))和JH4(Ravetch，J.V.等，Cell 27：583-591(1981))区段作为人源化HB12B鼠抗CD19抗体的接受体框架。

7.1.4.2.产生人源化HB12B重链

通过合并HB12B VH的CDR与人种系V3-72/JH4区的框架残基设计HB12B-(3-72/JH4)VH(SEQ ID NO：34)。根据6.1章所述方法产生含HB12B-(3-72/JH4)VH的表达载体。

HB12B-9m VH(SEQ ID NO：44)是HB12B-(3-72/JH4)VH的一个变体，含有下列9个氨基酸取代：L20I、F27Y、T28A、R38I、V49I、F67A、R71A、L80M、I91Y(根据Kabat对残基进行编号)。如6.1章所述设计针对HB12B-9m的基因特异性引物。根据6.1章所述方法产生含HB12B-9m VH的表达载体。

7.1.5构建编码人源化HB12B Ig轻链的表达载体

以下章节描述了含有鼠HB12B CDR区和合适的人构架区或基本人构架区的HB12BVK区的人源化变体设计。这些章节也描述了产生人源化HB12B Ig轻链的变体的方案。

7.1.5.1.人轻链接受体构架区的鉴定

对含有所有人种系免疫球蛋白轻链V和J区域的构架残基的氨基酸序列数据库进行汇编。可从数种来源获取必需的信息，如V Base:人抗体基因数据库(http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/)。在数据库中查询人种系V和J区段，这些区段与鼠HB12B VK的对应构架区在关键残基，如规范、链间和游标残基上显示出序列相似性。

选择人种系Vk A10(Straubinger，B.等，Biol.Chem.Hoppe-Seyler 369:601-607(1988))和Jk4(Hieter，P.A.等，J.Biol.Chem.257:1516-1522(1982))区段作为人源化HB12B鼠抗CD19抗体的接受体框架区。

7.1.4.2.产生人源化HB12B轻链

通过合并HB12B VK的CDR与人种系A-10/Jk4区的框架残基设计HB12B-(A10-Jk4)VK(SEQ ID NO：52)。根据6.1章所述方法产生含HB12B-(A10-Jk4)VK的表达载体。

HB12B-364987VK(SEQ ID NO:62)是HB12B-(A10-Jk4)VK的变体，其包含以下三个氨基酸取代：Y40F、K53H、Y91F(根据Kabat对残基进行编号)。如6.1章所述设计针对HB12B-364987的基因特异性引物。根据6.1章所述方法产生含HB12B-364987VK的表达载体。

7.1.6.人源化HB12B抗体的结合特性

使用编码(人源化或嵌合)重链和轻链免疫球蛋白链的成对DNA质粒表达载体制备物转染HEK293细胞。将这些转染的HEK293细胞培养三天，以产生适用于测定总IgG浓度和CD19结合活性的含抗体的条件培养基。

利用6.2章所述基于300B4细胞的ELISA实验测定嵌合和人源化HB12B抗体与人CD19的结合活性。在实验中包括具有无关特异性的同种型匹配的人抗体作为阴性对照。如图2所示，含有chHB12B重链和chHB12B轻链的嵌合抗体与含HB12B-(3-72/JH4)VH和HB12B-364987VK区的新型人源化抗体#1的结合活性相当。当抗体浓度大于100ng/ml时，两个抗体与CD19具有显著特异性结合，表明含HB12B-(3-72/JH4)VH和HB12B-364987VK区的人源化抗-CD19抗体#1保留了CD19结合活性。令人吃惊的是，与chHB12B对照相比，含HB12B-9m VH区域的人源化抗体的CD19结合能力明显降低。

检测成对的嵌合或人源化HB12B重链和轻链，并在表4中归纳其与人CD19的结合活性。

表4：嵌合和人源化HB12B抗体与CD19的结合。利用基于细胞的ELISA实验测定不同嵌合和人源化HB12B抗体与CD19的结合活性。具有显著结合活性的VH-VK组合用“++”标明。与人CD19没有显著结合的VH-VK组合用“-”标明。

	chHB12B VH	HB12B-(3-72/JH4)VH	HB12B-9m VH
				chHB12B VK	++	++	-
HB12B-(A10-Jk4)VK	-	-	-
				HB12B-364987VK	++	++	-

7.1.7人源化HB12B轻链的构建、表达和结合特征

抗体人源化实验方案通常尝试限制非人框架残基的数目，以最大程度降低HAMA反应。因此，产生其它人源化HB12B VK变体并测定它们的hCD19结合活性。

HB12B-3649VK(SEQ ID NO:68)是HB12B-(A10-Jk4)VK的变体，其包含以下两个氨基酸取代：Y40F、K53H(根据Kabat对残基进行编号)。根据生产商说明书，利用快变试剂盒(QuickChange kit)(加利福尼亚州拉霍亚的司查塔基公司(Stratagene，La Jolla，CA))在包含HB12B-364987VK的表达载体的DNA制备物上通过定点诱变产生包含HB12B-3649VK的表达载体。

HB12B-3687VK(SEQ ID NO:74)是HB12B-(A10-Jk4)VK的变体，其包含以下两个氨基酸取代：Y40F和Y91F(根据Kabat对残基进行编号)。根据生产商说明书，利用快变试剂盒(QuickChange kit)(加利福尼亚州拉霍亚的司查塔基公司(Stratagene，La Jolla，CA))在包含HB12B-364987VK的表达载体的DNA制备物上通过定点诱变产生包含HB12B-3687VK的表达载体。

HB12B-4987VK(SEQ ID NO:76)是HB12B-(A10-Jk4)VK的变体，其包含以下两个氨基酸取代：K53H和Y91F(根据Kabat对残基进行编号)。根据生产商说明书，利用快变试剂盒(QuickChange kit)(加利福尼亚州拉霍亚的司查塔基公司(Stratagene，La Jolla，CA))在包含HB12B-364987VK的表达载体的DNA制备物上通过定点诱变产生包含HB12B-4987VK的表达载体。

HB12B-36VK(SEQ ID NO:70)是HB12B-(A10-Jk4)VK的变体，其包含以下氨基酸取代：Y40F(根据Kabat对残基进行编号)。根据生产商说明书，利用快变试剂盒(QuickChangekit)(加利福尼亚州拉霍亚的司查塔基公司(Stratagene，La Jolla，CA))在包含HB12B-(A10-Jk4)VK的表达载体的DNA制备物上通过定点诱变产生包含HB12B-36VK的表达载体。

HB12B-49VK(SEQ ID NO:80)是HB12B-(A10-Jk4)VK的变体，其包含以下氨基酸取代：K53H(根据Kabat对残基进行编号)。根据生产商说明书，利用快变试剂盒(QuickChangekit)(加利福尼亚州拉霍亚的司查塔基公司(Stratagene，La Jolla，CA))在包含HB12B-(A10-Jk4)VK的表达载体的DNA制备物上通过定点诱变产生包含HB12B-49VK的表达载体。

HB12B-87VK(SEQ ID NO:78)是HB12B-(A10-Jk4)VK的变体，其包含以下氨基酸取代：Y91F(根据Kabat对残基进行编号)。根据生产商说明书，利用快变试剂盒(QuickChangekit)(加利福尼亚州拉霍亚的司查塔基公司(Stratagene，La Jolla，CA))在包含HB12B-(A10-Jk4)VK的表达载体的DNA制备物上通过定点诱变产生包含HB12B-87VK的表达载体。

使用6.1.7章所述的编码含有HB12B-(3-72/JH4)VH和各VK变体的重链的成对DNA质粒表达载体制备物共转染HEK293细胞。将这些共转染的HEK293细胞培养三天，以产生适用于测定总IgG浓度和hCD19结合活性的含人源化抗体的条件培养基。

利用6.1.2章所述基于300B4细胞的ELISA实验测定人源化HB12B抗体与人CD19的结合活性。实验中包括作为阳性对照的chHB12B。如图3所示，含chHB12B VH和chHB12B VK的chHB12B抗体的结合水平与含HB12B-(3-72/JH4)VH和HB12B-3649VK的新型人源化HB12B抗体#2相当。当抗体浓度大于100ng/ml时，两个抗体与hCD19都有显著的特异性结合，表明含HB12B-(3-72/JH4)VH和HB12B-3649VK的人源化抗体保持了hCD19结合活性。含HB12B-364987VK的人源化HB12B抗体#1也能与人CD19结合。与chHB12B对照抗体结合相比，含HB12B-36VK的人源化HB12B抗体#3与hCD19的结合显著减弱。

综上所述，这些数据表明创造了数种不同版本的人源化HB12B VH和VK链，它们保持了衍生自HB12B杂交瘤的亲本小鼠抗体的结合特性。

7.2.人源化抗CD19抗体的体外ADCC活性

以下章节描述了人源化抗CD19抗体的体外ADCC活性的鉴定。

7.2.1.人源化抗CD19抗体制剂

利用标准技术制备包含HB12B-(3-72/JH4)VH、HB12B-3649VK和IgG1重链恒定区的纯化的人源化抗CD19抗体#2(下文中称为“3649抗体”或“3649”)。简要说，用编码3649重链和轻链的DNA质粒表达载体制剂转染HEK293F细胞。在第3天和第6天给转染细胞补料(feed)，在第9天收获含抗体的条件培养基。利用预制蛋白A柱(GE医疗保健公司(GEHealthcare))，从条件培养基中纯化抗体。用低pH缓冲液洗脱柱上的抗体，中和，并用PBS透析。通过溶液在280nm的光密度计算纯化抗体的浓度。

利用Lazar等的US 2004/0132101和US 2005/0054832所述的方法产生编码包含S239D、A330L和I332E氨基酸取代的3649Fc变体的抗体表达载体(下文中称为“3649-3M”)。简要说，利用定位诱变试剂盒(如，快速改变试剂盒(QuickChange)(普洛麦格公司(Promega)))将必需核苷酸残基取代引入编码重链恒定区的多核苷酸序列以修饰编码3649的抗体表达载体，从而产生3649-3M抗体表达载体。用3649-3M抗体表达载体转染HEK239F细胞，从而产生纯化的3649-3M抗体。在第3天和第6天给转染细胞补料(feed)，在第9天收获含抗体的条件培养基。利用预制蛋白A柱(GE医疗保健公司(GE Healthcare))，从条件培养基中纯化抗体。用低pH缓冲液洗脱柱上的抗体，中和，并用PBS透析。通过溶液在280nm的光密度计算纯化抗体的浓度。

利用Lazar等的US 2004/0132101和US 2005/0054832(各自通过引用全文纳入本文)所述的方法产生编码包含L234F、L235E和P331S氨基酸取代的3649Fc变体的抗体表达载体(下文中称为“3649-TM”)。简要说，利用定位诱变试剂盒(如，快速改变试剂盒(QuickChange)(普洛麦格公司(Promega)))将必需核苷酸残基取代引入编码重链恒定区的多核苷酸序列以修饰编码3649的抗体表达载体，从而产生3649-TM抗体表达载体。用3649-TM抗体表达载体转染HEK239F细胞，从而产生纯化的3649-TM抗体。在第3天和第6天给转染细胞补料(feed)，在第9天收获含抗体的条件培养基。利用预制蛋白A柱(GE医疗保健公司(GE Healthcare))，从条件培养基中纯化抗体。用低pH缓冲液洗脱柱上的抗体，中和，并用PBS透析。通过溶液在280nm的光密度计算纯化抗体的浓度。

按照通过引用全文纳入本文的Kanda等的US 6,946,292所述方法制备包含多种抗体的3649抗体组合物(下文中称为3649-aFuc)，所述抗体中N-糖苷连接的复合糖链连接于Fc区的Asn297，其中岩藻糖不结合还原端的N-乙酰基葡糖胺。简要说，用编码3649重链和轻链的DNA质粒表达载体制剂转染岩藻糖基转移酶敲除的CHO细胞。在第3天和第6天给转染细胞补料(feed)，在第9天收获含抗体的条件培养基。利用预制蛋白A柱(GE医疗保健公司(GEHealthcare))，从条件培养基中纯化抗体。用低pH缓冲液洗脱柱上的抗体，中和，并用PBS透析。通过溶液在280nm的光密度计算纯化抗体的浓度。

抗体制剂基本不含污染蛋白质，如图4所示。3649-aFuc的抗原结合亲和力与3649相当，如图5所示。

7.2.2体外ADCC实验

CytoTox非放射性细胞毒试验(普洛麦格公司)是基于比色的⁵¹Cr释放细胞毒试验的替代方式。CytoTox试验能定量检测乳酸脱氢酶(LDH)，它是细胞裂解时释放的稳定的细胞溶胶酶。利用30分钟偶联的酶学实验测定培养物上清液中释放的LDH，该实验导致四唑盐(INT)转化为红色甲产物。形成的颜色深浅与裂解细胞数量成正比。

按照生产商说明进行该实验。简要说，靶细胞用PBS洗涤，重悬于RPMI-5无苯酚培养基，细胞密度为0.4x10⁶/ml。NK效应细胞用PBS洗涤一次，重悬于RPMI-5无苯酚培养基，细胞密度为1x10⁶/ml。在U形底96孔板中进行实验。各实验板包括实验孔和对照孔的组合。通过混合50μl合适的抗体稀释液、50μl靶细胞悬液和50μl效应细胞悬液建立实验孔。上述细胞密度导致靶细胞与效应细胞的比例为1:2.5；如果需要不同的靶细胞与效应细胞的比值，可进一步稀释或浓缩效应细胞母液。利用几种不同类型的对照孔计算(i)靶细胞的自发性LDH释放(靶细胞自发值)，(ii)效应细胞的自发性LDH释放(效应细胞自发值)，(iii)靶细胞的LDH释放最大值(靶细胞最大值)和(iv)培养基中存在污染物(背景)。96孔板上所用的所有孔所含的最终体积相同。一式三份地进行反应。建立反应后，以120x g离心该板3分钟以沉淀细胞。37℃/5％CO₂培育该板4小时。停止培育前45分钟，将15μl生产商提供的裂解缓冲液加入靶细胞最大释放对照孔中。培育后，120x g离心该板4分钟。从各孔中取出50μl上清液，转移到新的平底96孔板中。加入50μl重建的底物混合物(由生产商提供的组分混合而成)，室温下避光培育该平板10-20分钟。加入50μl生产商提供的终止缓冲液，用酶标仪测定490或492nm的吸光度。％细胞毒性＝(实验值-效应细胞自发值–靶细胞自发值)/(靶细胞最大值–靶细胞自发值)。计算％细胞毒性之前，所有其它数值均要减去背景。

在ADCC实验中，3649能将效应细胞有效征集到表达人CD20的靶细胞上。非岩藻糖化形式(3649-aFuc)的ADCC活性甚至更强。不出所料，与Fcγ受体亲和力提高(3649-3M)或降低(3649-TM)的Fc变体也分别显示出提高或降低的ADCC活性。永生化和新鲜分离的人靶细胞都观察到ADCC活性。支持这些论断的实验数据的代表性例子见图5-9。

7.2.3.体外抗CD19抗体介导的ADCC受到与FcγRIIIA受体的Fc区亲和力的影响。

可利用ELISA实验确定各种人源化抗CD19抗体制剂与人FcγRIIIA受体(CD16)的相对结合亲和力。微量滴定板用50μl抗体制剂(50μg/ml)在4℃包被过夜。用4％脱脂奶粉的PBS缓冲液(封闭缓冲液)在37℃封闭任何剩余的结合位点1小时。洗涤各孔后，向各孔中加入50μl连续稀释的单体FcγRIIIA-flag蛋白，37℃培育60分钟。各孔中加入50μl 2.5μg/ml抗-flag-ME-生物素(西格玛公司(Sigma))，37℃培育30分钟。在每次培育之间用以下各试剂洗涤各孔。将50μl 0.1μg/ml亲和素偶联的HRP(皮尔斯公司(PIERCE))加入各孔，37℃培育30分钟。加入30μl四甲基联苯胺(TMB)底物(皮尔斯公司)，然后用30μl 0.2M H₂SO₄中和，以便进行检测。在450nm读出吸光度。

如图15所示，ADCC增强的Fc变异3649抗体(3649-3M)和非岩藻糖化3649抗体(3649-aFuc)与FcgRIIIA的结合亲和力高于岩藻糖化野生型3649抗体。利用FcγRIIIA-flag蛋白进行实验，该蛋白包含人FcγRIIIA的V158高亲和同种型的胞外结构域。

Fc受体-Fc区相互作用因而导致抗体的效应功能，也受Fc受体中等位基因变异的影响。可通过用新鲜分离的包含不同等位基因变异受体的NK效应细胞进行ADCC反应，研究高亲和和低亲和FcgRIIIA受体对ADCC的影响。图16小结了这种实验的结果。如上所述，利用道迪靶细胞进行ADCC反应。检测了岩藻糖化(3649)和非岩藻糖化(3649-aFuc)抗CD19抗体#2。利用抗-CD20抗体进行对照反应。按照标准方法，由健康供体分离NK效应细胞。可利用等位基因特异性PCR反应确定NK细胞基因型(参见Leppers-van de Straat等，J ImmunolMethods.242(1-2):127-32(2000))。图16A和B显示，所检测的所有三种抗体在所用反应条件下均有ADCC活性。可利用NK细胞系(A)或新鲜分离的NK细胞(B)作为效应物，检测ADCC活性。与低亲和受体等位基因纯合的NK细胞(F158/F158基因型)相比，包含至少一个拷贝的FcγRIIIA受体的高亲和同种型的NK细胞(V158/V158和V158/F158基因型)是更有效的效应细胞(图16C-E)。不管效应细胞的FcγRIIIA基因型如何，岩藻糖化作用的缺失能提高抗体的ADCC活性。V158/V158或V158/F158NK细胞介导的岩藻糖化抗体(3649)的ADCC活性(C，D)与F158/F158NK细胞介导的非岩藻糖化抗体(3649-aFuc)的ADCC活性(E)相当。

7.3.抗体和免疫荧光分析

上述结合人CD19抗原的抗CD19抗体可用于下述方法。可用于下述实验的其它抗体包括结合小鼠CD22的单克隆小鼠抗-CD22抗体，如HIB22(Abcam；Dorken B等，J Immunol136:4470-9(1986))；单克隆小鼠CD20-特异性抗体(Uchida等，Intl.Immunol.，16:119-129(2004))；B220抗体RA3-6B2(加利福尼亚州帕洛阿尔托的DNAX公司(DNAX Corp.，PaloAlto，CA))；和CD5，CD43和CD25抗体(BD法明基(BD PHARMINGEN^TM)，新泽西州富兰克林湖(Franklin Lakes，NJ))。同种型特异性和抗小鼠Ig或IgM抗体可获自南方生物技术联合公司(Southern Biotechnology Associates，Inc.)(亚拉巴马州伯明翰(Birmingham，AL))。

用hCD19cDNA转染的小鼠前-B细胞系(可利用本领域已知的方法和材料开发)(参见例如，Alt等，Cell，27:381-388(1981)以及Tedder和Isaacs，J.Immunol.，143:712-717(1989))或者单细胞白细胞悬液，均可按照已建立方法用预定的最优浓度的荧光标记抗体冰上染色20-30分钟(Zhou等，Mol.Cell.Biol.，14:3884-3894(1994))。然后，用或流式细胞仪(加州圣何塞的贝克顿迪金森公司(BectonDickinson，San Jose，CA))分析具有淋巴细胞的正面和测面光散射特性的细胞。利用非反应性对照抗体(加州伯林格姆的卡尔塔实验室公司(CALTAG^TM Laboratories，Burlingame，CA))确定背景染色，适当设置门以排除无活力细胞。对所检测各样品而言，可能时分析具有单核细胞的正面和侧面光散射特性的一万个细胞，以4-以10为底的对数标度(four-decadelog scale)表示荧光强度。

小鼠.可以如本领域所述生产表达hCD19的转基因小鼠和其野生型(WT)同胞仔(Zhou等，Mol.Cell.Biol.，14:3884-3894(1994))。例如，可由原始hCD19创始小鼠产生hCD19tg小鼠(如C57BL/6x B6/SJL)，然后杂交到C57BL/6背景上，产生至少7代。经过多代回交后，获得其B细胞表面表达人CD19的密度与人B细胞上的密度大致相同的小鼠。

与FcR(Fc受体)普通γ链(FcRγ)-缺陷型小鼠(FcRγ^-/-，B6.129P2-Fcerg1^tm1)杂交的小鼠可获自塔科尼农场(Taconic Farms)(纽约州德国城(Germantown，NY))，可用于产生hCD19^+/-FcRγ^-/-和WT同胞仔。本领域记载了c-Myc转基因半合小鼠(Eμ-cMycTG，C57Bl/6J-TgN(IghMyc)；缅因州巴港的杰克逊实验室公司(The Jackson Laboratory，BarHarbor，ME))(Harris等，J.Exp.Med.，167:353(1988)和Adams等，Nature，318:533(1985))。可以将c-MycTG小鼠(B6/129背景)与hCD19tg小鼠杂交，产生可通过PCR筛选鉴定的hCD19tgcMycTG+/-半合子后代。Rag1^-/-(B6.129S7-Rag1^tm1Mom/J)小鼠可获自杰克逊实验室公司。可在第-2、1和4天，按照标准方法(Van Rooijen和Sanders，J.Immunol.Methods，174:83-93(1994))，通过给C57BL/6小鼠尾静脉注射氯屈膦酸盐包囊脂质体(0.1毫升/10克体重；密苏里州圣路易斯的西格玛化学品公司(Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO))，产生巨噬细胞-缺陷型小鼠。所有小鼠均应饲养在无特定病原体的屏障设施中，最初在6-9周龄时使用。

ELISA.利用亲和纯化的小鼠IgM、IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3和IgA通过ELISA测定血清Ig浓度(亚拉巴马州伯明翰的南方生物技术联合公司)，如下所述产生标准曲线(Engel等，Immunity，3:39(1995))。利用牛胸腺双链(ds)DNA(密苏里州圣路易斯的西格玛-奥德里奇公司(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO))、煮沸的牛胸腺DNA(含有单链(ss)DNA)或组蛋白(西格玛-奥德里奇公司)包被的微量滴定板通过ELISA测定针对dsDNA、ssDNA和组蛋白的血清IgM和IgG自身抗体水平，如下所述(Sato等，J.Immunol.，157:4371(1996))。

免疫治疗.通过侧尾静脉注射200μL磷酸盐缓冲盐水(PBS)配制的无菌抗-CD19和非反应性同种型对照抗体(0.5-250μg)。例如，实验使用固定量(如250μg)的抗体。在红细胞溶解后通过血球计数器确定血液中的白细胞数量，通过流式细胞术分析免疫荧光染色确定B220⁺B细胞频率。利用肿瘤学工具剂量计算器(Oncology Tool Dose Calculator)(www.fda.gov/cder/cancer/animalframe.htm)比较人和小鼠的抗体剂量。

免疫.用盐水配制的50μg 2,4,6-三硝基苯基(TNP)偶联的脂多糖(LPS)(密苏里州圣路易斯的西格玛公司)或25μg 2,4-二硝基酚偶联的(加州圣拉斐尔的生物搜索技术公司(Biosearch Technologies，San Rafael，CA))对两月龄WT小鼠进行腹膜内免疫。也用完全弗氏佐剂中的100μg DNP-偶联的钥孔血蓝素(DNP-KLH，加利福尼亚州拉霍亚(La Jolla，CA)的公司)腹膜内免疫小鼠，21天后用不完全弗氏佐剂中的DNP-KLH加强免疫。按照指示，在免疫前后对小鼠取血。利用ELISA平板一式两份地测定单个血清样品中的DNP-或TNP-特异性抗体效价，所述平板按照标准方法(Engel等，Immunity，3:39-50(1995))包被有DNP-BSA(加利福尼亚州拉霍亚的公司)或TNP-BSA(加州圣拉斐尔的生物搜索技术公司)。1:400稀释TNP-LPS免疫小鼠的血清，1:1000稀释和DNP-BSA免疫小鼠的血清，以便进行ELISA分析。

统计学分析.所有数据均表示为平均值±SEM，用斯氏t检验(Student’s t-test)确定样品平均值之间的差异的显著性。

7.4.转基因小鼠中的人CD19表达

可利用转基因hCD19tg小鼠(可以如本文所述制得)或表达人CD19的其它转基因动物评估包括抗CD19抗体的不同治疗方案，如给药浓度、剂量和给药时间的变化。可利用下述两个指标预测不同治疗方案对人患者的功效，即某些体液和/或组织中B细胞的消耗和单克隆人或人源化抗CD19抗体结合B细胞的能力。在具体实施方式中，在人CD19转基因小鼠中有效的治疗方案可与本发明的组合物和方法一起使用，以治疗人B细胞失调和疾病，所述失调和疾病包括但不限于：B细胞恶性肿瘤和自身免疫疾病或失调。

为了确定表达人CD19转基因的转基因小鼠(hCD19tg)的B细胞上是否表达人CD19，提取这些小鼠的骨髓、血液、脾脏和腹腔灌洗液中的B细胞。使细胞与特异性结合人CD19或小鼠CD19(mCD19)的抗CD19抗体相接触，以评估这些细胞中的人CD19和小鼠CD19表达。利用流式细胞术分析进行双色免疫荧光染色，检测抗体与B谱系细胞的结合。通过测定平均荧光强度分别评估mCD19和hCD19的相对表达水平(抗-hCD19测定hCD19，抗-mCD19测定mCD19)。

人CD19和人CD20转基因的表达水平的测定方法基本如上所述。利用标准方法从C57Bl6hCD19tg+/-、C57Bl6hCD19tg+/+、Balb/c hCD20tg+/-和Balb/c野生型小鼠中分离循环淋巴细胞。动物饲养在无病原体的设施中。所用各基因型的动物的年龄和数量见图10。利用PerCP Cy5.5偶联的抗-小鼠CD19(克隆1D3，BD生物科学公司(BD Biosciences))、PE偶联的抗-CD3(如克隆17A2，BD生物科学公司)、Alexa488偶联的抗-人CD19(克隆HIB19，BD生物科学公司)和Alexa647偶联的抗-人CD20抗体(如克隆2H7，AbD血清技术公司(AbD serotec))对分离细胞进行染色。用流式细胞仪分析免疫染色的细胞。B细胞群确定为抗-小鼠CD19+、抗-CD3-细胞。在hCD19和hCD20通道中检测到的抗-小鼠CD19+、抗-CD3-细胞的平均荧光强度见图10A。不出所料，只在hCD19转基因细胞上检测到人CD19的表达。hCD19表达是剂量依赖性的；tg+/+中的染色水平约为tg+/-B细胞的两倍。在所有检测的年龄组中，hCD19表达水平是稳定的。

计算所有样品的循环淋巴细胞中B细胞所占比例。出于计算目的，B细胞确定为抗-小鼠CD19+、抗-CD3-细胞。结果见图10B。具有hCD19转基因的动物的循环淋巴细胞中，B细胞数量减少。在hCD19tg+/+动物中，B细胞数的减少更显著。这些结果与以前公开的观察结果相一致(Zhou等，Mol.Cell.Biol.，14:3884-3894(1994))。

7.5.抗CD19抗体介导的B细胞体内消耗

可评估结合人CD19的本发明抗CD19抗体在体内消耗hCD19tg血液、脾脏和淋巴结B细胞的能力。例如，将各抗体给予小鼠，剂量为250或50μg/小鼠，此单次剂量比人用抗-CD20治疗中主要给予4次375mg/m²的剂量低约10-50倍(Maloney等，J.Clin.Oncol.，15:3266-74(1997)和McLaughlin等，利妥昔单抗在B细胞淋巴瘤中的临床状态和优化应用，肿瘤学(Clinical status and optimal use of rituximab for B cell lymphomas，Oncology)(威利斯顿公园(Williston Park))，12:1763-9(1998))。可通过流式细胞术分析免疫荧光染色来确定hCD19tg小鼠的血液、脾脏和淋巴结中的B细胞消耗。可将使用经鉴定能够消耗B细胞的抗CD19抗体的结果与人用相关联，具有所鉴定抗体的特性的抗体可用于本发明的组合物和方法，以治疗人B细胞失调和疾病，所述失调和疾病包括但不限于：B细胞恶性肿瘤和自身免疫疾病或失调。

在B细胞消耗实验中检测3649人源化抗CD19抗体，检测方法基本如上所述。给予C57Bl6hCD19tg+/-和C57Bl6hCD19tg+/+小鼠单次i.v.剂量50或250μg 3649抗体。使用两个对照组。第一组成员接受50或250μg具有无关特异性的R347抗体；第二组成员接受50或250μg ADCC活性降低的3649-TM Fc变体(见图6)。各组中的动物数量参见图11和12。动物饲养在无病原体设施内。治疗后7天，分离循环血液和脾脏中的单核细胞。用PerCP Cy5.5偶联的抗-小鼠CD19(克隆1D3，BD生物科学公司)和Apc-Cy5.5偶联的抗-小鼠B220(克隆RA3-6B2，英杰公司(Invitrogen))抗体对分离细胞进行染色。用流式细胞仪分析免疫染色的样品。出于实验目的，B细胞确定为抗-小鼠CD19+、抗-小鼠B220+细胞。循环淋巴细胞中B细胞所占百分数见图11。脾细胞中B细胞的百分数和绝对数量见图12。单一剂量的50mg 3649抗CD19抗体足以明显消耗循环B细胞和脾B细胞。消耗水平受到抗体剂量和hCD19表面密度的影响。在接受250μg抗体的hCD19tg+/+动物中，消耗最完全。在所有测试动物中，与脾脏相比，循环淋巴细胞中的消耗更广泛。

也进行单独的研究，以测定各种3649抗CD19抗体制剂消耗hCD19tg+/-动物的循环、脾脏、腹膜和骨髓B细胞亚群的能力。如下所述进行实验：通过侧尾静脉给3-4月龄性别匹配的C57Bl6hCD19tg+/-小鼠注射用PBS稀释的无菌、无内毒素的抗CD19抗体制剂，剂量为10、50或250μg/小鼠。检测以下抗CD19抗体：岩藻糖化抗CD19抗体#2(3649)、非岩藻糖化抗CD19抗体#2(3649-aFuc)、ADCC增强的Fc变异抗CD19抗体#2(3649-3M)和ADCC降低的Fc变异抗CD19抗体#2(3649-TM)。用具有无关特异性的同种型匹配的对照抗体(R347)注射一组对照动物。注射后7天，处死小鼠，采集血液、脾脏、骨髓和腹腔中的细胞。按照标准方法裂解红细胞，用活细胞自动细胞计数机测定总活细胞计数。对分离的单细胞悬液进行免疫染色，按照标准方法用流式细胞仪进行分析。用于免疫染色的抗体见表5。消耗结果见表6-21。利用非岩藻糖化抗CD19抗体#2(3649-aFuc)获得的消耗结果见图28。用非岩藻糖化或岩藻糖化抗CD19抗体#2(分别是3649-aFuc或3649)治疗的动物的NK细胞活化表型见图29。在分析过程中所用的B细胞亚组的定义如下：

血液：B细胞：B220+、小鼠CD19+

脾脏：B细胞：B220+、小鼠CD19+

移行B细胞：B细胞门选后，CD93+

移行1B细胞(T1)：IgM+CD23-

移行1B细胞(T2)：IgM+CD23+

移行1B细胞(T3)：IgM低CD23+

成熟B细胞：B细胞门选后，CD93-

滤泡B细胞：移行IgM+CD23+

边缘区B细胞：IgM高CD23-

骨髓：B细胞：B220+、小鼠CD19+

祖B细胞：B细胞门选后，CD43+IgM-

前B细胞：B细胞门选后，CD43-IgM-

未成熟和成熟B细胞：B细胞门选后，CD43-IgM+

未成熟B细胞：CD43-IgM+CD93+

成熟B细胞：CD43-IgM+CD93+低/-

腹腔：B细胞：IgM+

表5：用于在体内消耗实验中鉴定B细胞的抗体。通过7-AAD染色检测死细胞。

表6：循环B细胞消耗结果的小结。按照上述方案将3649、3649-3M、3649-TM或对照R347抗体给予hCD19tg+/-小鼠。％B细胞定义为血液淋巴细胞的B220+，小鼠CD19+组分；基于正面和侧面散射特征检测淋巴细胞群(详见图17A)。％消耗的计算方法为100x(％B细胞(对照抗体)-％B细胞(实验抗体))/％B细胞(对照抗体)。治疗动物的细胞群规模大于对照动物的相应值时，使用消耗负数。

表7：脾B细胞消耗结果的小结。按照上述方案将3649、3649-3M、3649-TM或对照R347抗体给予hCD19tg+/-小鼠。％B细胞定义为淋巴细胞的B220+、小鼠CD19+组分(详见图17B)。％消耗的计算方法为100x(细胞数(对照抗体)-细胞数(实验抗体))/细胞数(对照抗体)。治疗动物的细胞群规模大于对照动物的相应值时，使用消耗负数。

表8：脾移行B细胞消耗结果的小结。按照上述方案将3649、3649-3M、3649-TM或对照R347抗体给予hCD19tg+/-小鼠。％移行B细胞定义为B细胞的CD93+组分(详见图17B)。％消耗的计算方法为100x(细胞数(对照抗体)-细胞数(实验抗体))/细胞数(对照抗体)。

表9：脾T1B细胞消耗结果的小结。按照上述方案将3649、3649-3M、3649-TM或对照R347抗体给予hCD19tg+/-小鼠。％T1B细胞定义为移行B细胞的IgM+、CD23-组分(详见图17B)。％消耗的计算方法为100x(细胞数(对照抗体)-细胞数(实验抗体))/细胞数(对照抗体)。

表10：脾T2B细胞消耗结果的小结。按照上述方案将3649、3649-3M、3649-TM或对照R347抗体给予hCD19tg+/-小鼠。％T2B细胞定义为移行B细胞的IgM+、CD23+组分(详见图17B)。％消耗的计算方法为100x(细胞数(对照抗体)-细胞数(实验抗体))/细胞数(对照抗体)。

表11：脾T3B细胞消耗结果的小结。按照上述方案将3649、3649-3M、3649-TM或对照R347抗体给予hCD19tg+/-小鼠。％T3B细胞定义为移行B细胞的CD93+、IgM低、CD23+组分(详见图17B)。％消耗的计算方法为100x(细胞数(对照抗体)-细胞数(实验抗体))/细胞数(对照抗体)。治疗动物的细胞群规模大于对照动物的相应值时，使用消耗负数。

表12：脾成熟B细胞消耗结果的小结。按照上述方案将3649、3649-3M、3649-TM或对照R347抗体给予hCD19tg+/-小鼠。成熟B细胞定义为B细胞的CD93-组分(详见图17B)。％消耗的计算方法为100x(细胞数(对照抗体)-细胞数(实验抗体))/细胞数(对照抗体)。治疗动物的细胞群规模大于对照动物的相应值时，使用消耗负数。

表13：脾滤泡B细胞消耗结果的小结。按照上述方案将3649、3649-3M、3649-TM或对照R347抗体给予hCD19tg+/-小鼠。滤泡B细胞定义为成熟B细胞的IgM+、CD23+组分(详见图17B)。％消耗的计算方法为100x(细胞数(对照抗体)-细胞数(实验抗体))/细胞数(对照抗体)。治疗动物的细胞群规模大于对照动物的相应值时，使用消耗负数。

表14：脾边缘区B细胞消耗结果的小结。按照上述方案将3649、3649-3M、3649-TM或对照R347抗体给予hCD19tg+/-小鼠。边缘区B细胞定义为成熟B细胞的IgM高、CD23-组分(详见图17B)。％消耗的计算方法为100x(细胞数(对照抗体)-细胞数(实验抗体))/细胞数(对照抗体)。治疗动物的细胞群规模大于对照动物的相应值时，使用消耗负数。

表15：骨髓B细胞消耗结果的小结。按照上述方案将3649、3649-3M、3649-TM或对照R347抗体给予hCD19tg+/-小鼠。B细胞定义为淋巴细胞的B220+、小鼠CD19+组分(详见图17C)。％消耗的计算方法为100x(细胞数(对照抗体)-细胞数(实验抗体))/细胞数(对照抗体)。

表16：骨髓祖B细胞消耗结果的小结。按照上述方案将3649、3649-3M、3649-TM或对照R347抗体给予hCD19tg+/-小鼠。祖B细胞定义为B细胞的CD43+、IgM-组分(详见图17C)。％消耗的计算方法为100x(细胞数(对照抗体)-细胞数(实验抗体))/细胞数(对照抗体)。治疗动物的细胞群规模大于对照动物的相应值时，使用消耗负数。

表17：骨髓前B细胞消耗结果的小结。按照上述方案将3649、3649-3M、3649-TM或对照R347抗体给予hCD19tg+/-小鼠。前B细胞定义为B细胞的CD43-、IgM-分数(详见图17C)。％消耗的计算方法为100x(细胞数(对照抗体)-细胞数(实验抗体))/细胞数(对照抗体)。

表18：骨髓未成熟/成熟B细胞消耗结果的小结。按照上述方案将3649、3649-3M、3649-TM或对照R347抗体给予hCD19tg+/-小鼠。未成熟/成熟B细胞定义为B细胞的CD43-、IgM+组分(详见图17C)。％消耗的计算方法为100x(细胞数(对照抗体)-细胞数(实验抗体))/细胞数(对照抗体)。治疗动物的细胞群规模大于对照动物的相应值时，使用消耗负数。

表19：骨髓未成熟B细胞消耗结果的小结。按照上述方案将3649、3649-3M、3649-TM或对照R347抗体给予hCD19tg+/-小鼠。未成熟B细胞定义为未成熟/成熟B细胞的CD93+组分(详见图17C)。％消耗的计算方法为100x(细胞数(对照抗体)-细胞数(实验抗体))/细胞数(对照抗体)。治疗动物的细胞群规模大于对照动物的相应值时，使用消耗负数。

表30：骨髓成熟B细胞消耗结果的小结。按照上述方案将3649、3649-3M、3649-TM或对照R347抗体给予hCD19tg+/-小鼠。成熟B细胞定义为未成熟/成熟B细胞的CD93低/-组分(详见图17C)。％消耗的计算方法为100x(细胞数(对照抗体)-细胞数(实验抗体))/细胞数(对照抗体)。治疗动物的细胞群规模大于对照动物的相应值时，使用消耗负数。

表31：腹腔B细胞消耗结果的小结。按照上述方案将3649、3649-3M、3649-TM、H12B或对照R347抗体给予hCD19tg+/-小鼠。腹腔B细胞定义为腹膜淋巴细胞的IgM+组分(详见图17D)。％消耗的计算方法为100x(％B细胞(对照抗体)-％B细胞(实验抗体))/％B细胞(对照抗体)。治疗动物的细胞群规模大于对照动物的相应值时，使用消耗负数。

7.5.1.CD19密度影响CD19抗体诱导的B细胞消耗的有效性

为了测定抗CD19抗体消耗B细胞的能力是否依赖CD19密度，可将本发明抗CD19抗体给予具有不同hCD19表达水平的小鼠。获得的结果将证明B细胞上的人CD19密度和抗体同种型是否会影响抗CD19抗体存在下对B细胞的消耗。可利用相同实验来确定其它抗CD19抗体可否能有效消耗B细胞。将结果与具有不同CD19表达水平的人患者的治疗相关联。因此，如本文所述的检测CD19存在和密度的方法可用于人对象，以鉴定某些抗CD19抗体可消耗B细胞的患者或患者群体和/或确定合适的剂量。

为了测定CD19密度是否影响抗CD19抗体诱导的B细胞消耗的有效性，可在用本发明抗CD19抗体治疗(7天，250μg/小鼠)后，测定hCD19tg小鼠中代表性的血液和脾脏的B细胞消耗。预计结果会说明CD19密度会影响抗CD19抗体在体内引起B细胞消耗的有效性。例如，预计hCD19tg小鼠中的低水平CD19表达会明显影响所给抗体的循环或组织B细胞消耗作用。可以在抗CD19或对照mAb治疗单个小鼠后24小时，评估B细胞清除。

7.5.2.测定组织B细胞消耗是否是FCγR依赖性

如果给予本发明抗-CD19mAb可导致组织B细胞消耗，则可利用以下实验证明对FcγR表达的依赖性。通过使hCD19tg小鼠与不表达某些FcγR的小鼠杂交的过程，可产生表达hCD19而不表达某些FcγR的小鼠。可利用这类小鼠进行实验，以评估抗CD19抗体通过涉及FcγR表达的途径(如ADCC)消耗B细胞的能力。因此，可通过上述技术，使用这些实验中鉴定的抗CD19抗体工程改造嵌合、人或人源化的抗CD19抗体。进而，这类抗体可用于本发明的组合物和方法，以治疗人B细胞失调和疾病，所述失调和疾病包括但不限于：自身免疫疾病和失调。

在抗-CD20抗体治疗后，先天免疫系统通过FcγR依赖性过程介导B细胞消耗。小鼠效应细胞表达IgG的四种不同FcγR类型，高亲和FcγRI(CD64)和低亲和FcγRII(CD32)、FcγRIII(CD16)和FcγRIV分子。FcγRI、FcγRIII和FcγRIV是异源寡聚复合物，其中各配体结合的α链与普通γ链相结合(FcRγ)。FcγR组装和FcγR引发效应功能(包括巨噬细胞的吞噬作用)需要FcRγ链表达。由于FcRγ^-/-小鼠缺少高亲和FcγRI(CD64)和低亲和FcγRIII(CD16)和FcγRIV分子，所以可利用表达hCD19的FcRγ^-/-小鼠评估抗CD19抗体治疗后，FcγR在组织B细胞消耗中的作用。

7.5.3.抗CD19抗体诱导的B细胞消耗的持续时间

为了评估B细胞消耗的功效和持续时间，可给予hCD19tg小鼠一个低剂量(如250μg)注射的抗CD19抗体，随时间追踪B细胞消耗的持续时间和剂量反应。预计结果将证明，循环B细胞的消耗将持续相当长的一段时间(如一周至六个月)，然后血液中的B细胞逐渐恢复。

7.6.给予抗CD19抗体后，B细胞表面上CD19的持久性

给予本发明抗CD19抗体后，比较细胞表面CD19表达，以评估CD19内化是否影响体内B细胞消耗。例如，可研究用本发明抗CD19抗体或同种型匹配对照抗体(250μg)治疗的hCD19tg小鼠体内细胞表面CD19表达和B细胞清除随时间的变化。因此，可在时间零点(给予抗-CD19之前)和给予抗体后1、4和24小时收集脾B细胞，并测定CD19。可以在体外用饱和浓度的各种抗CD19抗体加上同种型特异性第二抗体处理分离的B细胞，用流式细胞术分析以观察细胞表面CD19的总体表达情况。B细胞表面上CD19维持(表达)时，表明对ADCC、CDC和凋亡继续易感。如果抗CD19抗体结合后CD19持续出现在细胞表面上，那么B细胞将保持对ADCC、CDC或凋亡活性的可及性。这些结果部分证明，本发明抗CD19抗体和治疗方案为何能有效治疗人B细胞失调和疾病，所述失调和疾病包括但不限于：移植物排斥以及自身免疫疾病和失调。

7.7.抗CD19抗体治疗可消除体液免疫和自身免疫

在CD19治疗能降低B细胞表现(representation)的事件中，可利用本实施例所述的实验证明本发明抗CD19抗体能够消除或降低免疫应答。也可利用这些实验鉴定其它抗CD19抗体，可利用上述技术和所述其它抗CD19抗体工程改造嵌合、人或人源化抗CD19抗体。进而，这类抗体可用于本发明的组合物和方法，以治疗人的自身免疫疾病和失调，以及进行移植治疗。

通过给hCD19tg小鼠单次注射抗CD19抗体，然后评估小鼠中免疫球蛋白水平的降低，从而评价抗CD19抗体诱导的B细胞消耗对血清抗体水平的影响。例如，可以在第0天单次注射本发明抗CD19抗体或对照抗体(如250μg)，以治疗两月龄同胞仔。然后，可通过ELISA测定抗体水平。预计结果将证明，1-2周后，血清IgM、IgG2b、IgG3和IgA抗体水平显著降低，并保持这种降低状态至少10周。

在抗CD19抗体或对照抗体治疗后7天，用TNP-LPS或DNP-Ficoll免疫hCD19tg小鼠(在第0天)，以评估B细胞消耗对T细胞依赖性1型(TI-1)和2型(TI-2)抗体应答的影响。预计在抗CD19抗体治疗的任意上述抗原免疫的小鼠中不会观察到明显的半抗原-特异性IgM、IgG和IgA抗体应答。也可利用免疫前7天通过抗CD19抗体治疗的小鼠来评估对T细胞依赖性(TD)Ag、DNP-KLH的抗体应答，其中预计抗CD19抗体治疗的DNP-KLH免疫小鼠将显示出体液免疫降低。

7.8.抗CD19抗体治疗与抗-CD22抗体治疗联用

可利用本文所述实验测定联合治疗，如抗CD19抗体与化疗、毒素治疗或放疗的联合治疗是否具有有益效果，如对B细胞的累加消耗作用或超过累加的消耗作用。可通过本领域熟知方式将动物模型中检测的联合治疗的结果与人相关联。

抗-CD20抗体能在体内有效消耗人和小鼠的B细胞。因此，可评估利用本发明抗CD19抗体和抗-CD20(如MB20-11；参见Yazawa等，Proc Natl Acad Sci USA.102(42):15178-83(2005))抗体同时治疗的益处，以确定这是否能提高B细胞的消耗。可用各抗体的次优剂量(如2μg、5μg、10μg、20μg或50μg)治疗小鼠，可单独使用各抗体或两种抗体联合使用。预计结果将证明，抗-CD19和抗-CD20抗体同时治疗是有益的。可以类似方式确定本发明抗CD19抗体与抗-CD22抗体联合治疗，或本发明抗CD19抗体、抗-CD20抗体和抗-CD22抗体的联合治疗的功效。

7.9.皮下(S.C.)给予本发明抗CD19抗体的疗效

可利用本文所述实验测定皮下给药途径给予本发明抗CD19抗体可否有效消耗B细胞。可通过本领域熟知方式将动物模型中检测的不同递送途径的疗效结果与人相关联。

例如，可利用250μg本发明抗CD19抗体通过皮下(s.c.)、腹膜内(i.p.)或静脉内(i.v.)给药途径治疗hCD19tg小鼠。在第7天利用流式细胞术测定血液(每毫升)、骨髓、脾脏、淋巴结和腹腔B220⁺B细胞数量的平均值(±SEM)。预计结果证明，皮下(s.c.)、腹膜内(i.p.)和静脉内(i.v.)给予本发明抗CD19抗体将有效消耗体内循环和组织的B细胞。

本发明的范围不受本文所述具体实施方式的限制。实际上，除上述形式以外，本领域技术人员通过阅读上述说明和附图会明白本发明的各种变形。这些变形应落入所附权利要求书的范围内。

7.10.抗CD19抗体降低体内淋巴瘤模型的肿瘤生长。

可评估结合人CD19的本发明抗CD19抗体降低体内动物模型的肿瘤生长的能力。例如，可以用人淋巴瘤细胞系注射SCID小鼠，以建立异种移植瘤(如，皮下注射拉吉(Raji)细胞)。接着，可给予小鼠数个剂量的本发明抗CD19抗体(如100μg抗体/小鼠5次)。可以用标准方法跟踪肿瘤生长(如肿瘤体积、动物体重、瘫痪)。可通过比较接受抗CD19或对照抗体治疗的动物，确定抗CD19治疗对肿瘤生长的作用。可将使用经鉴定能够减缓肿瘤生长的抗CD19抗体所获结果与人用相关联，能够减缓肿瘤生长的抗体可用于本发明的组合物和方法，以治疗人B细胞失调和疾病，所述失调和疾病包括但不限于：B细胞恶性肿瘤。

为了确定抗CD19抗体减缓肿瘤生长的能力是否依赖CD19密度，可利用上述体内肿瘤生长实验检测具有不同CD19表达概况的肿瘤细胞系。例如，道迪细胞(Daudi)、拉吉细胞(Raji)、纳玛瓦细胞(Namalwa)和拉莫斯细胞(Ramos)的细胞表面上均存在显著水平的CD19；另一方面，RPMI 8226多发性骨髓瘤细胞系不表达CD19。所获结果可证明肿瘤细胞表面上的人CD19密度可否影响抗CD19抗体减缓肿瘤生长的活性。可将结果与具有不同CD19表达水平的人患者的治疗相关联。因此，如本文所述的检测CD19存在和密度的方法可用于人对象，以鉴定某些抗CD19抗体可减缓恶性B细胞生长的患者或患者群体和/或确定合适的剂量。

为了确定抗CD19抗体减缓肿瘤生长的能力是否依赖于FcγR，可利用Fcγ受体活性削弱的SCID小鼠(如FcRγ^-/-)进行上述体内肿瘤生长实验。通过使SCID小鼠与不表达某些FcγR的小鼠杂交的过程，可产生也不表达某些FcγR的SCID小鼠(如SCID，FcRγ^-/-小鼠)。可利用这类小鼠进行实验，以评估抗CD19抗体通过涉及FcγR表达的途径(如ADCC)减缓肿瘤生长的能力。根据这些结果，可利用上述技术工程改造ADCC增强的抗CD19抗体。进而，这类抗体可用于本发明的组合物和方法，以治疗人B细胞失调和疾病，所述失调和疾病包括但不限于：B细胞恶性肿瘤。

以下是在体内动物模型中证明3649人源化抗CD19抗体减缓肿瘤生长的能力的实验细节。在实验第1天，给4-6周龄雌性CB-17SCID小鼠的后胁处皮下注射5x10⁶拉吉人淋巴瘤细胞。拉吉细胞表面上表达显著水平的CD19，对3649介导的ADCC敏感(参见图7和8)。用人源化抗CD19抗体、对照抗-CD20抗体、具有无关特异性的同种型对照抗体治疗10个拉吉细胞注射动物的小组。可并行检测多个不同剂量的抗体。治疗方案的非限制性例子是从第4天开始，每两周腹膜内给予剂量10mg/kg的抗体，共5次。还包括只接受PBS的动物对照组。用标准方法测定肿瘤体积。肿瘤体积大于2000mm³或出现明显病态迹象的动物被人道处死。将肿瘤生长对时间作图。

在图13小结的实验中，10只注射拉吉细胞的动物各自用以下方案进行治疗：从第4天开始每两周腹膜内给予10mg/kg(i)抗-CD20抗体、(ii)ADCC降低的3649-TM Fc变体、(iii)3649抗体或(iv)R347对照抗体，给药5次。另外10只动物的对照组只接受PBS。3649抗CD19抗体和阳性对照抗-CD20抗体治疗能明显降低肿瘤生长。接受3649或抗-CD20抗体的小组肿瘤大小的标准差随时间增大，因为两个治疗组中均存在完全无肿瘤的个体。3649-TMFc变体对肿瘤生长无显著疗效，这表明3649人源化抗CD19抗体的肿瘤生长降低作用是通过ADCC介导的。

在图14小结的实验中，10只注射拉吉细胞的动物各自用以下方案进行治疗：从第4天开始每两周腹膜内给予(i)10mg/kg抗-CD20抗体(抗CD20)、(ii)10mg/kg ADCC降低的3649-TM Fc变体(3649TM)、(iii)10mg/kg 3649抗体(3649)、(iv)2.5mg/kg 3649抗体(3649*)或(v)10mg/kg R347对照抗体，给药5次。用3649抗CD19抗体、3649-3M人ADCC增强的抗CD19抗体和阳性对照抗-CD20抗体治疗能显著降低肿瘤生长。3649-TM Fc变体抗CD19抗体对肿瘤生长无显著疗效，这表明3649的肿瘤生长降低作用是通过ADCC介导的。

在图30小结的实验中，10只注射拉吉细胞的动物各自用以下方案进行治疗：从第4天开始每两周腹膜内给予(i)10mg/kg抗-CD20抗体(抗CD20)、(ii)10mg/kg 3649抗体(3649)、(iii)2.5或10mg/kg非岩藻糖化3649抗体(3649-aFuc)或(iv)10mg/kg R347对照抗体，给药5次。用3649抗CD19抗体、3649-aFuc抗CD19抗体和阳性对照抗-CD20抗体治疗能显著降低肿瘤生长。

7.11.亲和成熟的3649抗CD19抗体

以下章节描述与亲本3649抗CD19抗体相比，对细胞表面表达的人CD19抗原结合亲和力提高的3649抗CD19抗体的亲和成熟CDR变体的鉴定。该章节也描述了亲和成熟的抗CD19抗体的体外表征。

7.11.1.亲和力提高的3649变异抗体的鉴定

通过筛选包含变异CDR序列的Fab片段文库鉴定3649变异抗CD19抗体(参见美国专利申请公开号US2006/0121042；Wu，H.，Methods Mol Biol.，207:197-212(2003)；Wu和An，Methods Mol Biol.，207:213-33(2003)；Wu等，J.Mol.Biol.，350:126-144(2005)；Wu等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95:6037-6042(1998))。

试剂：所有化学品均为分析级。限制性酶、DNA修饰酶、T4连接酶和T7DNA聚合酶购自马萨诸塞州贝弗利的新英格兰生物实验室公司(New England Biolabs，Inc.，Beverly，MA)。定制寡核苷酸由欧普龙公司(阿拉巴马州亨茨维尔(Huntsville，AL))合成。链霉亲和素磁珠购自纽约州成功湖的代纳公司(Dynal，Lake Success，NY)。

3649Fab噬菌体表达载体的构建：将编码3649抗CD19抗体的VH和VK结构域的多核苷酸克隆到基于M13的噬菌体表达载体中，该表达载体有利于在lacZ启动子控制下表达Fab片段(Dall’Acqua等，Methods 36:43-60(2005))。该载体包含人γ1重链的第一恒定区、人κ轻链的恒定区和两个用于克隆VH和VK基因的退火位点。通过杂交诱变进行克隆(Kunkel等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82:4778-82(1985))，如Wu和An，Methods Mol Biol.，207:213-33(2003)所述。简要说，利用约0.5pmol以下各种基因特异性寡核苷酸引物扩增编码3649的VH和VK区的多核苷酸：3649VH Fab正向(SEQ ID NO：128)、3649VH Fab反向(SEQ ID NO：129)、3649VK Fab正向(SEQ ID NO：130)和3649VK Fab反向(SEQ ID NO：131)(见表32)。各引物的5’核苷酸序列包含M13载体特异性序列，以便在PCR产物和单链载体之间退火。3649VH Fab正向(SEQ ID NO：128)和3649VK Fab正向(SEQ ID NO：130)引物的核苷酸序列分别包含28/25核苷酸序列，对应于M13基因3前导序列。3649VH Fab反向(SEQ ID NO：129)和3649VK Fab反向(SEQ ID NO：131)引物的5’核苷酸序列包含28/30核苷酸序列，分别对应于人γ1重链的第一恒定区和人κ轻链的恒定区。将正向引物3649VH Fab正向(SEQ ID NO：128)和3649VK Fab正向(SEQ ID NO：130)生物素化，以帮助分离PCR片段的负链。分别使用3649VH Fab正向(SEQ ID NO：128)/3649VH Fab反向(SEQ ID NO：129)和3649VK Fab正向(SEQ ID NO：130)/3649VK Fab反向(SEQ ID NO：131)引物组合，从相应的上述3649IgG表达构建物PCR扩增编码3649VH和VK基因的多核苷酸。通过琼脂糖凝胶电泳/电洗脱纯化PCR产物，随后用T4多核苷酸激酶(罗氏公司(Roche))磷酸化。用氢氧化钠解离双链PCR产物以分离PCR片段的负链，用链霉亲和素包被的磁珠消耗生物素化正链，通过乙醇沉淀回收负链。使相同摩尔量的分离的VH和VK PCR片段的负链退火到尿苷化的单链M13MD101-5A模板上，按照生产商说明书用T4DNA聚合酶(罗氏公司)、T4DNA连接酶(罗氏公司)进行处理。掺入分离的VH和VK负链多核苷酸的M13特异性核苷酸序列使它们特异性退火到M13载体DNA上的两个单独区域，这两个区域各自包含含有Xba I限制性核酸内切酶识别位点的回文环。因为即使在退火的VH或VK序列的存在下，回文环也会发生自身退火，所以用XbaI消化退火的T4DNA聚合酶/T4DNA连接酶处理的DNA复合物能够以消化的亲本模板正链为代价，选择新合成的包含分别与人κ恒定区和第一人γ1恒定区框内融合的VH和VK结构域的载体负链。用XbaI消化反应产物，热灭活，电穿孔到DH10B细胞中。在包含大肠杆菌(Escherichia coli)XL-1蓝色菌苔的细菌平板上测定转化的DH10B细胞的浓度。分离自几个独立噬斑的噬菌体DNA进行测序，以帮助鉴定编码3649Fab片段的克隆。

表32：用于产生杂交诱变所用的3649VH和VK编码多核苷酸的PCR引物。用下划线表示3649专有残基。

产生聚焦单一CDR(single CDR focused)的Fab文库：为3649抗体的六个CDR区各自制备两个不同的单氨基酸取代文库。“NSS”文库包括给定CDR的所有可能的单氨基酸取代变体，其中取代的氨基酸是NSS简并密码子编码的八种氨基酸中的任何一种。“NWS”文库包括给定CDR的所有可能的单氨基酸取代变体，其中取代的氨基酸是NWS简并密码子编码的十二种氨基酸中的任何一种。通过上述编码3649Fab的噬菌体载体的杂交诱变制备单个文库(Kunkel等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82:4778-82(1985)；Wu和An，Methods Mol Biol.，207:213-33(2003))。简要说，为六个CDR各自制备两组简并负链寡核苷酸。“NSS”和“NWS”组分别包含所有可能的NSS和NWS简并密码子对CDR区的单密码子取代。用于制备聚焦重链CDR1文库的寡核苷酸组的例子列于表33。在以10:1摩尔比退火至尿苷化单链3649Fab噬菌体模板DNA之前，将各简并负链寡核苷酸磷酸化。在1小时内将退火反应的温度从95℃降低至55℃。将T4连接酶和T7DNA聚合酶加入退火材料中，37℃培育1.5小时。汇集利用不同寡核苷酸由单个CDR特定组获得的最终负链合成产物；但NSS和NWS库是单独维持和独立筛选的。通常，将1μl汇集的负链合成反应物电穿孔到XL1-Blue中，以便在XL1-蓝色菌苔上形成噬斑。用200μl 10mM Tris(pH 7.4)、100mM NaCl缓冲液洗提单个噬菌体克隆，并储存于4℃。文库的表征包括对24个随机选择的噬菌体克隆进行测序，以确定突变在CDR内的分布并计算诱变率。表33：用于产生聚焦3649重链CDR1文库的寡核苷酸。利用包含NSS和NWS密码子的寡核苷酸产生单独的“NSS”和“NWS”文库。用下划线表示编码CDR残基的核苷酸。

聚焦单一CDR的Fab文库的初步筛选：该初步筛选由单点ELISA(SPE)组成，所述ELISA利用含分泌Fab的1ml噬菌体培养物的上清液和作为捕获剂的表达重组人CD19的300B4细胞进行。考虑到诱变率，通常可通过检测等于文库三倍大小的多个单个克隆对文库进行彻底筛选。例如，可通过筛选5x8x2＝80个随机选择的单个克隆，对50％诱变率的VHCDR1(5氨基酸残基)“NSS”取代文库(简并NSS密码子编码的8个可能的氨基酸)进行彻底筛选。然而，在本文所述实验中，不管CDR长度或合成效率如何，每个文库筛选约400个克隆。如Wu和An，Methods Mol Biol.，207:213-33(2003)所述分离小规模噬菌体培养物的上清液。简要说，在0.5mM IPTG存在下用75μl洗脱的噬菌体母液接种0.75mL指数级生长的TG1细胞，在96孔板中37℃培养1小时。将平板培养物转移到室温下，在振荡培养箱中培养过夜。通过低蛋白结合的尼龙膜(例如，购自纳尔基公司(Nalgene)的沉默筛选平板)过滤以收集0.36ml过夜培养物中的细菌，在滤器上用含有2mg/ml溶菌酶的200μl TES缓冲液(30mMTris pH 8.0，2mM EDTA，20％蔗糖)室温下处理10分钟，以便由周质空间释放分泌的Fab。过滤收集含有Fab片段的提取物。利用标准实验测定提取物中的Fab片段浓度。如上所述，进行基于300B4细胞的ELISA。基于细胞的ELISA实验中包括表达亲本3649Fab的噬菌体克隆作为阳性对照。通过将ELISA信号对Fab浓度作图，比较变异Fab片段的相对结合亲和力。例如，图18显示利用3649变体Fab获得的结果，所述3649变体Fab的VH CDR3内包含随机单氨基酸取代。与亲本3649Fab相比，Fab 4B7和4G6与表达人CD19的300B4细胞的结合亲和力明显提高。

聚焦单一CDR的Fab文库的次级筛选：初步筛选ELISA信号比3649亲本Fab高至少10％的CDR变体Fab克隆以15ml规模重新培养，在两复孔中通过基于300B4细胞的相同ELISA重新测定，以验证阳性结果。按照Wu，H.，Methods Mol Biol.，207:197-212(2003)所述的方法制备15ml规模的Fab提取物。利用标准试验测定Fab浓度。如上所述，进行基于300B4细胞的ELISA。该试验中包括3649亲本Fab用作阳性对照。对次级筛选信号比3649对照Fab高至少10％的克隆进行测序，以确定导致人CD19抗原结合水平提高的单氨基酸取代的种类。通过对分离的亲和力提高的抗-CD19Fab克隆进行测序鉴定的氨基酸取代见表34。

表34：由聚焦单一CDR的Fab文库分离的有益单氨基酸取代的列表。氨基酸位置按照Kabat进行编号。

组合Fab文库的产生：通过杂交诱变产生两个组合文库，它们包含由聚焦CDR的文库鉴定的有益单氨基酸取代的所有可能组合。利用编码亲本3649残基和已鉴定的有益单氨基酸取代的一组简并寡核苷酸产生第一组合文库(表35)。利用仅编码最有益的单氨基酸取代残基，但不编码3649亲本残基的另一组简并寡核苷酸产生第二组合文库(表36)。单独产生和筛选这两个文库。文库的产生方法如Wu，H.，Methods Mol Biol.，207:197-212(2003)；Wu和An，Methods Mol Biol.，207:213-33(2003)所述。简要说，合成并磷酸化简并引物组。在单个退火和合成反应中利用所有引物进行杂交诱变。文库的产生、检测和筛选方法如上所述。与表达人重组CD19的300B4细胞结合亲和力最高的六个组合Fab克隆的ELISA概况见图19。从利用简并寡核苷酸产生的第一组合文库中回收克隆7E12，所述简并寡核苷酸编码亲本和有益的CDR取代残基。由利用简并寡核苷酸产生的第二组合文库回收克隆14H5、15D7、15D1、16C9和16C4，所述简并寡核苷酸只编码最有益的CDR取代残基。对图19所列所有噬菌体克隆进行测序，以确定人CD19结合亲和力提高的变异CDR区的氨基酸序列。

表35：用于产生组合噬菌体文库的简并寡核苷酸。本文所列的寡核苷酸组编码亲本残基和由聚焦CDR的单取代文库鉴定的有益取代残基。

表36：用于产生组合噬菌体文库的简并寡核苷酸。本文所列的寡核苷酸组只编码由聚焦CDR的单取代文库鉴定的最佳取代残基。

7.11.2.抗CD19抗体的亲和力提高变体的表征

利用pfu DNA聚合酶由相应编码V区的M13噬菌体载体PCR扩增编码抗-CD19结合活性提高的7E12、14H5、15D7、15D1、16C9和16C4Fab变体可变区的多核苷酸(参见Dall’Acqua等，Methods 36:43-60(2005))。然后，将这些多核苷酸单独克隆到编码人巨细胞病毒主要立即早期(hCMVie)增强子、启动子和5'-非翻译区的哺乳动物表达载体中(M.Boshart等，Cell 41:521-530(1985))。在此系统中，人γ1链与人κ链一起分泌(S.Johnson，等，Infect.Dis.176:1215-1224(1997))。在HEK-293细胞中瞬时表达不同构建物，在转染后72和144小时收获。利用1ml HiTrap蛋白A柱，按照生产商说明书(新泽西州皮斯卡塔韦的AP生物科技公司(APBiotech，Inc.，Piscataway，NJ))，直接从条件培养基中纯化分泌的可溶性人IgG1。纯化的人IgG1(通过SDS-PAGE测定均一性一般>95％)用磷酸盐缓冲盐水(PBS)透析，快速冷冻，并储存于–70℃。

7.11.2.1.基于细胞的ELISA试验

在基于细胞的CD19结合试验中评估7E12、14H5、15D7、15D1、16C9和16C4IgG抗体结合人CD19的能力。采用以下三种不同的细胞系作为捕获试剂：(i)表达人重组CD19的300B4细胞(图20)，(ii)拉吉细胞(图21)和(iii)道迪细胞(图22)。按照标准方法培养所有三种细胞系。可利用标准的ELISA方法进行基于细胞的CD19结合试验。例如，将1x10⁵个300B4细胞接种到96孔U形底平板的每个孔中，培育过夜。用ELISA缓冲液洗涤细胞一次，然后在冰上与不同量的抗CD19抗体一起培育。在所检测的各抗体浓度下，一式三份地进行结合反应。该试验包括采用3649抗CD19抗体的阳性对照孔。用抗体培育后，用200微升ELISA缓冲液洗涤300B4细胞三次。按照标准方法，利用与辣根过氧化物酶偶联的山羊抗-人κ抗体检测细胞表面结合的抗CD19抗体。

利用300B4细胞、拉吉细胞或道迪细胞作为捕获试剂，3649、7E12、14H5、15D7、15D1、16C9和16C4抗-CD19IgG抗体的ELISA结合曲线见图20-22。除16C9和15D1外，所有检测抗体与细胞表面表达的人CD19的结合亲和力均显著高于对照3649抗体。300B4细胞用作捕获试剂时，16C9和15D1的结合亲和力与3649抗体相当。拉吉细胞或道迪细胞用作捕获试剂时，16C9和15D1抗体与人CD19的结合亲和力高于对照3649抗体。

7.11.2.2.具有修饰的脱酰胺位点的14H5抗CD19抗体变体。

3649、7E12、14H5、15D7和16C9抗体的一级氨基酸序列包含NG(VH CDR2的残基60-61)脱酰胺基序。在Kabat位置60处将天冬酰胺(N)残基改变为酪氨酸(Y)、天冬氨酸(D)或亮氨酸(L)，从而产生三个14H5的脱酰胺负变体。包含14H5变异VH区的Y60、D60和L60分别称为14H5-YG(SEQ ID NO：107)、14H5-DG(SEQIDNO：108)和14H5-LG(SEQ ID NO：109)。利用标准分子克隆技术产生包含编码脱酰胺负14H5变体的多核苷酸的抗体表达载体。如上所述纯化瞬时表达的14H5-YG、14H5-DG和14H5-LG抗-CD19IgG。通过基于细胞的ELISA试验，利用表达人重组CD10的300B4细胞作为捕获试剂，确认14H5-YG、14H5-DG和14H5-LG抗体的结合亲和力。14H5和16C4抗-CD10抗体用作阳性对照。所得结果见图23。14H5-YG、14H5-DG和14H5-LG抗体与表达重组人CD19的300B4细胞的结合亲和力低于14H5或16C4抗体。

7.11.2.3.亲和成熟的抗CD19抗体的动力学解离速率。

随时间跟踪细胞表面结合的抗CD19抗体的消除，以确定7E12、14H5、15D7、15D1、16C9和16C4抗-CD19IgG抗体的动力学解离速率。简要说，按照标准染色方法，将拉莫斯细胞与7E12、14H5、15D7、15D1、16C9或16C4亲和成熟的抗CD19抗体一起培育。培育后洗涤细胞，以去除任何未结合的第一抗体，再于37℃培育0、30或60分钟。在培育结束时，按照标准方法用RPE偶联的小鼠抗-人IgG Fc片段第二试剂对细胞染色，用流式细胞仪分析。对照组的细胞与3649抗CD19抗体或参比对照抗-CD20抗体一起培育，然后37℃培育。利用不同抗体在不同时间点上测定的平均荧光强度见图24A。100％平均荧光强度对应于用给定抗体在时间0点上观察到的染色强度。

利用亲和成熟的7E12、14H5、15D7、15D1、16C9和16C4抗CD19抗体观察到的平均荧光强度的下降程度低于利用抗-CD20参比对照抗体观察到的下降程度。相反，与参比对照抗-CD20抗体染色细胞相比，3649抗CD19抗体染色的拉莫斯细胞的平均荧光强度下降较快(图24A)。

在另一个实验中，按照标准方法，用Alexa 647偶联的16C4、3649或HB12B抗CD19抗体对拉莫斯细胞进行染色。染色后，洗涤细胞以去除未结合的抗体，再于37℃培育0、30或60分钟。随后用流式细胞仪分析细胞。该实验中包括荧光偶联的抗CD20抗体，用作参比对照。在不同时间点上观察到的平均荧光强度(MFI)见图24B。MFI表示为时间0点观察到的MFI值的分数。用16C4亲和成熟的抗CD19抗体检测的MFI下降比利用3649或HB12B抗CD19抗体观察到的MFI下降慢得多。抗-CD20参比对照抗体与3649和HB12B抗CD19抗体的解离速率相同。

7.11.2.4.亲和成熟的抗CD19抗体的细胞表面染色

按照标准方法，利用7E12、14H5、15D7、15D1、16C9和16C4抗CD19抗体和RPE偶联的山羊抗-人IgG(Fab’)2片段第二试剂对道迪细胞进行免疫染色。用流式细胞仪分析免疫染色的细胞。图25中绘制了不同第一抗体浓度下染色细胞的平均荧光强度(MFI)。包括用3649抗CD19抗体染色的细胞，作为参比对照。在所有测试浓度下，利用7E12、14H5、15D7、16C9和16C4抗CD19抗体检测的染色强度高于3649抗体染色细胞。低抗体浓度(0.5mg/ml或更低)下，利用15D1检测到的染色强度与利用3649抗体检测到的染色强度类似。然而，抗体浓度升高时(1mg/ml或更高)，15D1染色细胞的MFI高于3649抗体染色细胞。

7.11.2.5.亲和成熟的抗CD19抗体的体外ADCC活性

利用本文所述实验测定亲和成熟的抗CD19抗体的体外ADCC活性。例如，利用16C4、14H5和14H5-DG抗体以及道迪靶细胞获得的结果见图26。3549抗CD19抗体用作参比对照。在抗体浓度为0.1mg/ml或更低时，所有三种亲和成熟抗体的ADCC活性相对于3649参比对照抗体要高。在1mg/ml或更高的抗体浓度下，16C4、14H5和14H5-DG抗体的ADCC活性与3649抗体活性相当。

也利用本文所述实验测定亲和成熟的非岩藻糖化抗CD19抗体的体外ADCC活性。例如，利用道迪靶细胞测定非岩藻糖化16C4抗体(16C4-aFuc)介导的ADCC(图26)。该实验也包括16C4、3649-aFuc和用作参比对照的抗-CD20抗体。16C4-aFuc的ADCC明显高于3649-aFuc、抗-CD20或岩藻糖化16C4参比抗体。16C4-aFuc介导的ADCC与抗体相当。

还在标准化的体外ADCC实验中，利用各种靶细胞鉴定16C4、16C4-aFuc和3649-aFuc抗CD19抗体的体外ADCC活性。实验中包括用作对照的抗-CD20抗体。所用的靶细胞代表各种B细胞恶性肿瘤以及不同的CD19细胞表面密度(表37)。按照标准方法，通过流式细胞术测定靶细胞的CD19和CD20的相对表面表达。表37列出了用荧光标记的抗-CD20或16C4抗CD19抗体染色的靶细胞的平均荧光强度(MFI)。按照上述方案，进行ADCC反应。利用50,000个效应细胞和20,000个靶细胞一式三份地进行反应，以实现E:T比为2.5:1。表达CD16和相关信号转导多肽FCεRI-γ的转基因NK细胞用作效应细胞。允许ADCC反应在37℃进行4小时。在不同抗体浓度下测定ADCC活性。对％细胞毒性数据与抗体浓度作图。利用标准方法为靶细胞/抗体组合建立最大细胞杀伤和EC50数值(在所用条件下实现半数最大细胞毒性所需的抗体浓度)。表37表示最终结果。分别代表DLCL、NHL、ALL和伯基特淋巴瘤的Oci-LY19、KArpas-422、Nalm-6和纳玛瓦细胞对16C4-aFuc抗体介导的细胞毒性敏感，但对抗-CD20介导的ADCC基本不敏感。道迪细胞、托雷多细胞(Toledo)、RL细胞和拉吉细胞对16C4-aFuc抗体介导的细胞毒性的敏感性明显高于抗-CD20介导的ADCC。

7.11.2.6.亲和成熟的抗CD19抗体在体内消耗B细胞。

在B细胞消耗实验中检测亲和成熟的抗CD19抗体，检测方法基本如上所述。用10、50或250μg 16C4亲和成熟的抗-CD19抗体(16C4)或14H5DG亲和成熟的抗-CD19抗体(14H5DG)的单次i.v.剂量治疗C57Bl6hCD19tg+/-动物。用(i)3649抗-CD19抗体(3649)、(ii)3649抗CD19抗体的ADCC增强Fc变体(3649 3M)和(iii)非岩藻糖化3649抗-CD19抗体(3649-aFuc)治疗参比对照动物。利用(i)3649抗CD19抗体的ADCC削弱的Fc变体(3649TM)或(ii)具有无关特异性的抗体(R347)治疗阴性对照动物。在抗体治疗7天后，分离循环淋巴细胞和脾淋巴细胞。如表5所述，对分离细胞进行免疫染色，以鉴定不同B细胞群。按照标准方法，用流式细胞仪分析样品。

16C4亲和成熟的抗CD19抗体对B细胞的消耗略高于3649抗-CD19母体抗体。3649-aFuc和3649 3M抗体的消耗能力优于16C4亲和成熟抗体。14H5DG亲和成熟的抗CD19抗体对B细胞的消耗效率略低于3649抗-CD19母体抗体。

7.11.2.7.给予一个消耗剂量的亲和成熟的抗CD19抗体后，B淋巴细胞的长期恢复。

给予一个消耗剂量的16C4-aFuc抗-CD19单克隆抗体后，研究B细胞组分的长期恢复。25只C57Bl6hCD19tg+/-小鼠(13只雄性，12只雌性，2.5-3月龄)分成五组。给予试验抗体的前一周(第-1周)，检测动物的总体健康状况，称重，各小鼠取一小份血液进行分析。在实验的第0天，静脉内分别给予第1、2、3、4和5组动物250μg 16C4-aFuc mAb、50μg 16C4-aFucmAb、10μg 16C4-aFuc mAb、250mg具有无关特异性的R347对照抗体或PBS。在第7天(第1周)，随后以一周为间隔，检测各组小鼠并采集血液。对血液样品进行流式细胞术分析，以测定B细胞、T细胞、NKT细胞、嗜中性粒细胞、单核细胞和树突细胞的数量。对血液样品进行进一步分析，以确定IgM、IgG1、IgG2b、IgG2c、IgG3、IgA、抗-dsDNA IgM、抗-dsDNA IgG、抗-ssDNAIgM、抗-ssDNA IgG的血清浓度以及IL-7、CXCL12、CXCL13和BAFF的血清水平。按照标准方法进行测定。实验概况和所得结果见图38。

给予药物后没有观察到明显的副作用。所有实验组的动物都维持了正常的活动程度和体重(图38B)。接受16C4-aFuc抗CD19抗体的动物的B细胞水平明显低于对照动物(图38C和D)。在接受10mg 16C4-aFuc的动物中，B细胞甚至被完全消耗。B细胞消耗的持续时间是剂量依赖性的；消耗持续时间随16C4-aFuc抗体剂量升高而延长。在第3周接受10μg16C4-aFuc的动物的B细胞开始恢复，在第5周达到正常水平。接受50μg 16C4-aFuc的动物的恢复需要9周。在实验第11周时，接受250mg 16C4-aFuc的动物仍然基本没有B细胞。T细胞、NK-T细胞、NK细胞、树突细胞、嗜中性粒细胞和单核细胞的血液浓度不受16C4-aFuc抗体的影响(数据未显示)。16C4-aFuc抗体治疗也能降低IgM、IgG1和IgG2b的血清水平(图38E-G)。免疫球蛋白水平的降低为剂量敏感型；只在用50或250μg 16C4-aFuc抗体治疗的动物中观察到水平明显降低。免疫球蛋白水平的恢复与B细胞组分的恢复基本同步。

7.11.2.8.抗CD19抗体的IEF-PAGE分析。

按照标准方法对16C4、16C9、7E12、14H5、15D7、15D1、14H5-DG和3649抗CD19抗体进行天然等电聚焦聚丙烯酰胺凝胶电泳(IEF-PAGE)分析。用8μg纯化蛋白加载预制安福灵凝胶(安玛西亚生物科学公司(Amersham Biosciences)，pI范围3.5-9.5)。在10mM组氨酸pH6.0缓冲液中透析蛋白质样品，然后上样到凝胶上。利用宽范围pI标记标准品(安玛西亚，pI范围3-10，8μL)测定相对pI值。在1500V，50mA下电泳105分钟。固定凝胶45分钟，用简单蓝染料(Simply Blue stain)(英杰公司)在室温下染色过夜。用25％乙醇、8％乙酸溶液脱色。用装有Quantity One成像软件的伯乐(Bio-Rad)GS-800密度计测定等电点。考马斯蓝染色凝胶见图27。16C4、16C9、7E12、14H5、15D7、15D1、14H5-DG和3649抗体的等电点分别为7.83、8.04、7.69、7.76、7.61、7.72、7.48和7.75。

7.11.3.Fc变体亲和成熟的抗CD19抗体

利用Lazar等在US 2004/0132101和US 2005/0054832中所述的方法，产生编码包含L234F/L235F/P331S或L234F/L235Y/P331S氨基酸取代的16C4Fc变异抗体的抗体表达载体(下文中称为“16C4-235F”或“16C4-235Y”)。简要说，利用定位诱变试剂盒(如，快速改变试剂盒(QuickChange)(普洛麦格公司(Promega)))将必需的核苷酸残基取代引入编码重链恒定区的多核苷酸序列以修饰编码16C4的抗体表达载体，从而产生16C4-235F或16C4-235Y抗体表达载体。用合适的抗体表达载体转染HEK239F细胞，从而产生纯化的16C4Fc变异抗体。在第3天和第6天给转染细胞补料(feed)，在第9天收获含抗体的条件培养基。利用预制蛋白A柱(GE医疗保健公司(GE Healthcare))，从条件培养基中纯化抗体。用低pH缓冲液洗脱柱上的抗体，中和，并用PBS透析。由溶液在280nm的光密度计算纯化抗体的浓度。

平衡结合常数(K_D)的测定：利用BIAcore 3000设备(瑞典乌普萨拉(Uppsala，Sweden))测定所有Fcγ受体(人FcγRI、FcγRIIA、FcγRIIB、FcγRIIIA-V158以及鼠FcγRIIB、FcγRIII和FcγRIV)与16C4及其Fc变体的平衡结合常数。简要说，如生产商所推荐，利用标准的氨基偶联化学方法将所有IgG固定在两个CM5传感器芯片的单独流动室上。固定的IgG水平为8194-8725RU。制备浓度为4000或16000nM的重组表达的所有FcγR胞外结构域的母液，然后用设备缓冲液(含0.01M HEPES，pH 7.4，0.15M NaCl，3mM EDTA和0.005％P-20的50mM HBS缓冲液)连续稀释至所需浓度。然后，以5μL/分钟的流速在所有IgG表面上注入两次各种浓度的FcγR。采集约50分钟的结合数据，然后在注射间期给予30秒5mM HCl脉冲，以再生IgG表面。在整个注射过程中，也可间插若干次缓冲液注射。这些缓冲液注射中的一种可与参比细胞数据一起使用，以校正原始数据组。采集到所有结合数据后，对各γ浓度的单个数据组求平均值，然后拟合至1:1结合等温线，由结合等温线得到平衡结合常数K_D。利用BIA评估软件4.1版进行上述实验。K_D值(nM)见表38。

表38：各种人IgG1与人和小鼠FcγR的结合亲和力(K_D，nM)

	16C4	16C4-235F	16C4-235Y
				人FcγRI	19	1530	8650
人FcγRIIA	1280	6360	6980
				人FcγRIIB	14500	6810	17100
人FcγRIIIA(V158)	574	4610	5140
				小鼠FcγRIIB	1470	2820	2670
小鼠FcγRIV	329	11100	N/A
				小鼠FcγRIII	6360	10900	9240

7.12.分离16C4抗CD19抗体的亲和成熟变体

利用本文所述的方法鉴定16C4抗体的亲和成熟变体。该筛选由两个阶段构成。第一阶段关注含有单氨基酸取代的16C4变异Fab的鉴定，所述取代导致与细胞表面表达的人CD19抗体的结合活性提高。通过筛选聚焦单一CDR的噬菌体展示文库，鉴定包含有益单氨基酸取代的16C4变异Fab。筛选的第二阶段包括Fab克隆组合文库的筛选，所述组合文库代表(i)16C4亲和成熟过程的第一阶段或(ii)3649抗CD19抗体的亲和成熟过程中鉴定到的有益单氨基酸取代的所有可能组合。

如上所述，产生CDR特异噬菌体展示文库。在单点细胞基结合实验中检测大量噬菌体克隆(每个文库约400个克隆)，以筛选文库(Lu等，J.Immunol.Methods 314:74-79(2006))。试剂和一次性用品购自美索规模发现公司(Meso Scale Discovery)；按照生产商说明书进行实验。简要说，接种5,000个拉吉细胞或300B4细胞/孔，在25μl 1X PBS中室温培育1小时；用25μl 30％FBS室温封闭孔20分钟；弃去上清液；将25μl抗-CD19Ab加入各孔中，室温下培育1小时；用1X PBS洗涤孔三次；向各孔中加入25μl 0.25μg/ml山羊-抗-人Fab’₂-MSD Tag，室温下培育1小时；用1X PBS洗涤各孔三次；用150μl 1X T阅读缓冲液读出信号。VH CDR2中包含有益氨基酸取代的代表性克隆的结合曲线见图32。由16C4CDR特异文库鉴定的有益单氨基酸取代见表39。

表39:由基于16C4抗体的CDR特异噬菌体展示文库鉴定的有益单氨基酸取代。

如上所述，制备组合噬菌体展示文库。用于产生文库的16C4Fab特异性寡核苷酸见表40。检测来自组合文库的单个Fab克隆与300B4和拉吉细胞的结合(Lu等，J.Immunol.Methods 314:74-79(2006))。代表性Fab克隆的结合曲线见图33A-B。利用标准方法对与300B4细胞、拉吉细胞或二者的结合活性提高的Fab克隆进行测序。独特Fab克隆的CDR序列中发现的氨基酸改变的小结见图33C。

表40：用于产生组合噬菌体文库的简并寡核苷酸。

利用本文所述方法，将与细胞表面表达的人CD19抗原的结合活性提高的六个亲和成熟的16C4变异Fab克隆转化为完整的IgG1抗体。在不同细胞实验中鉴定3C3、6F7、2B11、6C11、9G7和5C4亲和成熟的抗CD19抗体的结合活性。图34代表在细胞ECL实验中利用300.B4细胞获得的结果(Lu等，J.Immunol.Methods 314:74-79(2006))。亲和成熟的16C4变异抗体的CD19结合活性高于对照16C4或3649抗体。

亲和成熟的抗CD19抗体的细胞表面染色。按照标准方法，利用3C3、6C11和9G7抗CD19抗体和RPE偶联的山羊抗-人IgG(Fab’)2片段第二试剂对道迪细胞和拉吉细胞进行免疫染色。用流式细胞仪分析免疫染色的细胞。图35中绘制了不同第一抗体浓度下染色细胞的平均荧光强度(MFI)。包括用16C4抗CD19抗体染色的细胞，作为参比对照。0.0625-0.25μg/ml抗体浓度下，用3C3和6C11亲和成熟抗体对拉吉细胞的染色强度高于16C4对照。在0.5-10μg/ml抗体浓度下，亲和成熟和对照抗体的拉吉细胞染色强度相同。在较低(0.0625-0.25μg/ml)抗体浓度下，9G7抗体与对照抗体的拉吉细胞染色相似，在较高(0.5-10μg/ml)抗体浓度下9G7抗体的染色比对照弱。9G7和6C11染色的道迪细胞的中值FI高于16C4染色细胞。在0.0625和0.125μg/ml抗体浓度下，3C3染色道迪细胞的中值FI高于对照细胞；在0.25-10μg/ml抗体浓度下与对照细胞基本相同。

亲和成熟的抗CD19抗体16C4变体的体外ADCC活性。利用本文所述实验测定亲和成熟的抗CD19抗体的体外ADCC活性。例如，利用3C3、6C11和9G7抗体以及拉吉和道迪靶细胞获得的结果分别见图36和37。16C4抗CD19抗体用作参比对照。在所检测的浓度范围90.0001-10μg/ml下，所有三种亲和成熟抗体的ADCC活性均与对照基本相同。

本领域技术人员应理解，还可按照本文所述方案进一步修饰16C4抗CD19抗体的亲和成熟变体。具体说，可修饰3C3、6C11和9G7抗体，以包含本文所述的任一种变异Fc区。也可制备非岩藻糖化的抗体。也可利用本文所述实验表征亲和成熟的抗体。具体说，可按照本文所述方案测定3C3、6C11和9G7抗体介导ADCC、体内消耗B细胞、缩小异种移植瘤、抑制抗-IgM/CpG刺激的B细胞增殖的能力。

7.13.抗CD19抗体介导的B细胞增殖抑制

7.13.1抗CD19抗体治疗诱导的CD19磷酸化

在5μg/ml 3649、3649-3M、3649-aFuc、3649-TM或16C4抗CD19抗体存在下，培育一千万个细胞15分钟。实验中包括用具有无关特异性的R347抗体治疗的对照细胞以及用作阴性对照的不用抗体治疗的对照细胞。培育后，按照标准方法制备细胞裂解物并进行免疫沉淀。在Laemmli SDS-PAGE上分离免疫沉淀的物质和输入的细胞裂解物，转移到固体支持物上(硝酸纤维素，英杰公司，目录号LC2001)，进行Western印迹。按照标准方案，用2μg HB12B抗CD19抗体进行免疫沉淀。分别利用(1:1000)抗-CD19(细胞信号转导技术公司(CellSignaling Technology)#3574)或(1:250)抗-磷酸化酪氨酸(PY20)抗体(圣克鲁斯生物技术公司(Santa Cruz Biotechnology)#sc-508HRP)进行Western印迹，以检测免疫沉淀物质中的CD19总蛋白水平和磷酸化的CD19水平。分别利用(1:2000)抗-磷酸化Erk1/2(细胞信号转导技术公司#9106S)和(1:1000)抗-Erk1/2抗体(细胞信号转导技术公司#9102)进行Western印迹，以测定输入细胞裂解物中的磷酸化Erk1/2蛋白和Erk1/2总蛋白水平。

图39A显示HB12B免疫沉淀后进行Western印迹的结果。除了来自各种实验的免疫沉淀样品(“3649”、“3649-3M”、“3649-aFuc”、“3649-TM”或“16C4”)和对照细胞裂解物(“nil”和“R347”)以外，膜也包括只含有HB12B抗体的对照泳道(“单独的抗体”)。在所有免疫沉淀样品中，CD19总蛋白水平基本相同。与对照样品相比，由抗-CD19处理细胞制备的细胞裂解物免疫沉淀的样品中，磷酸化CD19水平明显较高。图39B显示全细胞裂解物的Western印迹结果。在所有细胞裂解物中，Erk1/2总蛋白水平基本相同。与对照样品相比，由抗-CD19处理细胞制备的细胞裂解物中，磷酸化Erk1/2水平明显较高。

7.13.2.抗-CD19处理不会抑制抗-IgM介导的Erk1/2活化

在10μg/ml 3648-3M抗CD19抗体或10μg/ml R347对照抗体存在下，用5μg/ml抗-IgM抗体或PMA(50ng/ml)/伊屋诺霉素(1μM)刺激一百万个细胞5或10分钟。包括仅用3649或R347处理的细胞，用作对照。在培育结束时收获细胞并进行裂解。在Laemmli SDS-PAGE上分离全细胞裂解物，转移到硝酸纤维素支持膜上，按照标准方法进行Western印迹。利用抗-磷酸化Erk1/2抗体和抗-Erk1/2抗体进行Western印迹，分别检测细胞裂解物中磷酸化Erk1/2和总Erk1/2的水平。结果见图39C-D。

在所有细胞裂解物中，Erk1/2总蛋白水平基本相同。仅用3649抗体处理的细胞中，磷酸化Erk1/2的基线水平高于仅用R347处理的细胞。在3649或R347处理的细胞中，抗-IgM或PMA/伊屋诺霉素刺激能将磷酸化Erk1/2的水平提高到基线以上。与抗-IgM抗体刺激后相比，PMA/伊屋诺霉素刺激后Erk1/2磷酸化水平明显较高。

7.13.3.抗CD19抗体治疗抑制抗IgM/CD40诱导的B细胞增殖

利用B细胞分离试剂盒(密耳特伊生物技术公司(Miltenyi Biotec)#130-091-151)，由200ml血液纯化外周B细胞。将100,000个细胞接种于96孔U形底平板(100μl，1x10⁶个细胞/毫升)。接下来，将50μl体积的合适浓度的抗体加入该细胞中。将该平板放回培养箱，静置15分钟。然后，向细胞中加入50μl体积的刺激物。细胞/抗体/刺激物混合物的最终体积为200μl。培育细胞3天。在第3天利用发光细胞活力实验(普洛麦格公司)读出细胞数量。在永生化细胞系上进行的实验中接种10,000个细胞/孔。

抗CD19抗体处理对抗-IgM/CD40诱导的B细胞增殖的影响见图40。在10μg/ml3649、3649-TM和3649-3M抗CD19抗体存在下接种B细胞。15分钟后，用单独的抗-IgM(5μg/ml)、抗-IgM(5μg/ml)/CD40(1μg/ml)或单独的CpG(1μg/ml)刺激B细胞。进行3天的B细胞刺激。在实验结束时，利用发光细胞活力实验(普洛麦格公司)测定活细胞数。包括用具有无关特异性的R347抗体处理的细胞，用作对照。抗-IgM/CD40或CpG刺激能增加活细胞数，但单独的IgM刺激没有这种作用。抗-IgM/CD40诱导的细胞增殖被抗CD19抗体处理明显抑制。所有检测的抗CD19抗体的抑制水平相同(40％)。CpG诱导的细胞增殖不受抗CD19抗体处理的影响。

7.13.4.抗CD19抗体处理抑制抗-IgM/CpG诱导的B细胞增殖

利用CFSE实验评估响应各种刺激的细胞增殖。简要说，将纯化B细胞重悬于磷酸盐缓冲盐水(PBS)，浓度约为每毫升1千万个细胞。向该悬液中加入等体积的1μM CFSE的PBS溶液。CFSE的终浓度为0.5μM，细胞密度为每毫升5百万个。将该悬液避光保存10分钟。将等体积的胎牛血清(FCS)加入该混合物，以终止胞外CFSE。用培养基洗涤和稀释细胞。将100,000个CFSE标记的细胞接种于96孔U形底平板(100μl，1x10⁶个细胞/毫升)。接下来，将50μl体积的合适浓度的抗体加入该细胞中。将该平板放回培养箱，静置15分钟。然后，向细胞中加入50μl体积的刺激物。细胞/抗体/刺激物混合物的最终体积为200μl。培育细胞4天。培育结束时，洗涤细胞，用7-氨基放线菌素D(7-AAD)(BD生物科学公司)染色，并用流式细胞仪分析。检测活细胞的CFSE信号。在细胞群的CFSE图中，CFSE信号降低表明细胞分裂。CFSE信号水平降低的程度与细胞增殖水平相关联。

用抗-IgM(1μg/ml)/CpG(2μg/ml)或单独CpG(2μg/ml)刺激纯化的外周B细胞4天。用CFSE实验评估细胞增殖。图41A显示刺激和未刺激的对照细胞的CFSE图。IgM(1μg/ml)/CpG(2μg/ml)刺激细胞的CFSE信号明显低于对照细胞，这表明IgM(1μg/ml)/CpG(2μg/ml)刺激导致广泛的细胞增殖。只用CpG刺激的细胞的CFSE图表明只存在有限的细胞增殖。

16C4抗CD19抗体抑制抗-IgM/CpG诱导的B细胞增殖。在5μg/ml R347对照抗体或5μg/ml 16C4抗CD19抗体存在下，用抗-IgM(1μg/ml)/CpG(2μg/ml)刺激纯化的外周B细胞4天。用CFSE实验评估细胞增殖。图41B显示在R347或16C4抗体存在下，用IgM(1μg/ml)/CpG(2μg/ml)刺激的B细胞的CFSE图。在R347抗体存在下，用抗-IgM(1μg/ml)/CpG(2μg/ml)刺激的B细胞的CFSE图表明广泛的细胞增殖。与对照细胞相比，在16C4抗CD19抗体存在下，用抗-IgM(1μg/ml)/CpG(2μg/ml)刺激的B细胞的CFSE图表明细胞增殖程度较低。

7.13.5.Fc变异抗CD19抗体的抑制特性改变

在5μg/ml R347对照抗体、3649-3M Fc变异抗CD19抗体或3649-TM Fc变异抗CD19抗体存在下，用抗-IgM(1μg/ml)/CpG(2μg/ml)刺激纯化的外周B细胞4天。用CFSE实验评估细胞增殖。图42A显示在R347对照抗体存在下，用抗IgM(1μg/ml)/CpG(2μg/ml)刺激的B细胞的CFSE图。该CFSE图显示23.5+26.5+23.2＝73.2％的B细胞发生至少一轮细胞分裂。图42B和C分别显示在3649-TM和3649-3M Fc变异抗CD19抗体存在下，用抗-IgM(1μg/ml)/CpG(2μg/ml)刺激的B细胞的CFSE图。该CFSE图分别显示，在4天培育过程中，分别在3649-TM和3649-3M Fc变异抗CD19抗体存在下刺激的B细胞中44.8％和30.3％发生至少一轮细胞分裂。对所有三张CFSE图进行更仔细研究发现，不仅是发生至少一次细胞分裂的细胞数量，还有发生一次以上细胞分裂的细胞数量都降低，在R347和3649-3M存在下分别观察到最高和最低的细胞增殖水平。3649-TM处理抑制细胞增殖的效率低于3649-3M处理。

在5μg/ml R347、R347-3M Fc变体、3649、3649-3M Fc变体或3649-TM Fc变异抗体的存在下，用抗-IgM(5μg/ml)/CpG(1μg/ml)刺激纯化的B细胞4天。用CFSE实验评估细胞增殖。所有实验组中均包括在R347存在下刺激的B细胞的CFSE图，用作参比标准。图A-D中显示在R347-3M Fc变体、3649、3649-3MFc变体和3649-TM Fc变异抗体存在下刺激的B细胞的CFSE图。R347-3M Fc变体存在下的细胞增殖与R347参比标准品存在下观察到的细胞增殖相同。所有三种抗CD19抗体均能抑制细胞增殖。野生型3649和3649-TM Fc变异抗体抑制细胞增殖的程度相同。与3649或3649-TM抗体相比，3649-3M能更有效地抑制B细胞增殖。

抗-CD19和抗-Fcγ受体IIB(FcγRIIb或CD32b)抗体的抑制协同作用：以下实验设计能进一步检测抗-CD32b和抗CD19抗体介导的B细胞增殖抑制之间是否有协同作用。在(i)抗-CD32b抗体(如AT10)、(ii)抗CD19抗体或(iii)抗-CD32b和CD19抗体存在下，用抗-IgM(2μg/ml)/CpG(2μg/ml)刺激纯化的B细胞4天。用CFSE实验评估细胞增殖。预计抗-CD32b和抗CD19抗体介导的B细胞增殖抑制的协同作用会导致在两种抗体存在下B细胞增殖水平低于单独一种抗体存在下观察到的细胞增殖水平。

7.13.6.抗CD19抗体能有效内化。

抗体内化实验：利用5μg/ml Alexa Flour 488-标记抗体在37℃培育细胞至多60分钟。以10分钟间隔取出细胞等份，洗涤，分成两份，放置在冰上。将所述一半等份留在冰上不处理。另一半在冰上用含0.03M蔗糖和10％FCS的低pH(2.0)PBS溶液处理45秒，以剥离所有细胞表面结合的抗体分子。洗涤所有酸处理和未处理的样品，用4％多聚甲醛固定，用流式细胞仪分析。％内化抗体的计算方法为：酸洗涤细胞的荧光信号(仅内部信号)和未处理细胞的荧光信号(细胞表面和内部组分的总信号)之比。

图44显示在60分钟时间内，HB12B、3649和16C4抗体被拉吉细胞内化。内化曲线显示，约20-30分钟时抗-CD19摄入达到最大值。HB12B和3649抗体的内化最大值约为50％，16C4抗体约为30％。

7.13.7.抗CD19抗体处理24小时后，细胞表面CD19的损失

在抗CD19抗体存在下培育细胞24小时。在具有无关特异性的R347抗体存在下培育对照细胞群。培育后，收集细胞，洗涤，在含5μg/ml抗CD19抗体的染色溶液中冰上培育10分钟。用PE偶联的山羊抗-人IgG第二抗体染色细胞10分钟，以检测表面结合的抗CD19抗体。用4％多聚甲醛固定免疫染色细胞，用流式细胞仪分析。通过比较抗CD19抗体处理细胞的平均荧光强度(MFI)与免疫染色的R347处理细胞的MFI(0％表面损失)和仅用第二抗体染色的R347处理细胞的MFI(100％表面损失)，计算CD19表面损失。

图45显示在5μg/ml 3649、3649-3M、3649-TM、3648-aFuc和16C4抗CD19抗体存在下培育24小时后，拉吉细胞和原代B细胞的CD19表面损失。抗CD19抗体处理后，分别检测到拉吉细胞和原代B细胞的CD19表面表达损失为55-70％和65-90％。

本领域技术人员应了解或能够确定，使用常规实验即可获得本文所述的本发明具体实施方式的许多等同形式。这类等同形式应包含在所附权利要求书的范围内。

通过引用，将本文引用的各种发表物的全部内容纳入本文用于所有目的。通过引用将2006年9月8日提交的美国临时申请60/842,935、2006年11月22日提交的60/866,917、2007年4月12日提交的60/911,397、2007年5月1日提交的60/915,309和2007年5月22日提交的60/939,429的全部内容纳入本文用于所有目的。

虽然出于方便理解的目的，通过阐述和举例的方式详细描述了上述发明，但可明显看出，某些改变和修改应属于所附权利要求书的范围。

<110>米迪缪尼有限公司(MedImmune，Inc.)

M.达姆斯克洛德(Damschroder，Melissa)

P.基纳(Kiener，Peter)

H.吴(Wu，Herren)

W.达拉夸(Dall’Acqua，William)

R.赫伯斯特(Herbst，Ronald)

A.科伊尔(Coyle，Anthony)

<120>人源化抗CD19抗体及其在治疗癌症、移植病和自身免疫病中的应用

<130>BC105PCT

<150>60/842,935

<151>2006-09-08

<150>60/866,917

<151>2006-11-22

<150>60/911,397

<151>2007-04-12

<150>60/915,309

<151>2007-05-01

<150>60/939,429

<151>2007-05-22

<160>238

<170>PatentIn 3.3版

<210>1

<211>367

<212>DNA

<213>小鼠(Mus musculus)

<400>1

gaggtgcagc tgcaggagtc tggacctgag ctggtaaagc ctggggcttc agtgaagatg 60

tcctgcaagg cttctggata cacattcact agctatgtta tgcactgggt gaagcagaag 120

cctgggcagg gccttgagtg gattggatat tttaatcctt acaatgatgg tactgattac 180

tatgagaagt tcaaaggcaa ggccacactg acttcagaca aatcctccag cacagcctac 240

atggcgctca gcagcctgac ctctgaggac tctgcggtct attactgtgc aagagggacc 300

tattactacg gtagtagcta cccctttgac tactggggcc aaggcaccac tctcacagtc 360

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<210>2

<211>122

<212>PRT

<213>小鼠(Mus musculus)

<400>2

Glu Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Val Met His Trp Val Lys Gln Lys Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Tyr Phe Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Thr Asp Tyr Tyr Glu Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ser Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Ala Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Thr Tyr Tyr Tyr Gly Ser Ser Tyr Pro Phe Asp Tyr Trp

100 105 110

Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser

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<210>3

<211>333

<212>DNA

<213>小鼠(Mus musculus)

<400>3

gatgttggga tgacccagac tccactcact ttgtcggtca ccattggaca accagcctct 60

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<213>小鼠(Mus musculus)

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1 5 10 15

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20 25 30

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Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Val Gln Gly Thr

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tattttaatc cttacaatga tggtactgat tactatgaga agttcaaagg c 51

<210>8

<211>17

<212>PRT

<213>小鼠(Mus musculus)

<400>8

Tyr Phe Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Thr Asp Tyr Tyr Glu Lys Phe Lys

1 5 10 15

Gly

<210>9

<211>39

<212>DNA

<213>小鼠(Mus musculus)

<400>9

gggacctatt actacggtag tagctacccc tttgactac 39

<210>10

<211>13

<212>PRT

<213>小鼠(Mus musculus)

<400>10

Gly Thr Tyr Tyr Tyr Gly Ser Ser Tyr Pro Phe Asp Tyr

1 5 10

<210>11

<211>48

<212>DNA

<213>小鼠(Mus musculus)

<400>11

aagtcaagtc agagcctctt atatagtaat ggaaaaacct atttgaat 48

<210>12

<211>16

<212>PRT

<213>小鼠(Mus musculus)

<400>12

Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser Asn Gly Lys Thr Tyr Leu Asn

1 5 10 15

<210>13

<211>21

<212>DNA

<213>小鼠(Mus musculus)

<400>13

ctggtgtcta aactggactc t 21

<210>14

<211>7

<212>PRT

<213>小鼠(Mus musculus)

<400>14

Leu Val Ser Lys Leu Asp Ser

1 5

<210>15

<211>27

<212>DNA

<213>小鼠(Mus musculus)

<400>15

gtgcaaggta cacattttcc gtacacg 27

<210>16

<211>9

<212>PRT

<213>小鼠(Mus musculus)

<400>16

Val Gln Gly Thr His Phe Pro Tyr Thr

1 5

<210>17

<211>363

<212>DNA

<213>小鼠(Mus musculus)

<400>17

caggtccagt tgcagcagtc tggacctgag ctggtgaagc ctggggcctc agtgaagatt 60

tcctgcaaag cttctggcta cgcattcagt agctcttgga tgaactgggt gatacagagg 120

cctggacagg gtcttgagtg gattggacgg atttatcctg gagatggaga tactaactac 180

aatgggaagt tcaagggcaa ggccacactg actgcagaca aatcctccag tacagcctac 240

atgcagctca gcagcctgac ctctgtggac tctgcggtct atttctgtgc aagatcagga 300

tttattacta cggttttaga ctttgactac tggggccacg gcaccactct cacagtctcc 360

tca 363

<210>18

<211>121

<212>PRT

<213>小鼠(Mus musculus)

<400>18

Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Ser Ser

20 25 30

Trp Met Asn Trp Val Ile Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Arg Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asn Tyr Asn Gly Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Val Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys

85 90 95

Ala Arg Ser Gly Phe Ile Thr Thr Val Leu Asp Phe Asp Tyr Trp Gly

100 105 110

His Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser

115 120

<210>19

<211>333

<212>DNA

<213>小鼠(Mus musculus)

<400>19

gacattgtgc tgacgcagtc tccaacctct ttggctgtgt ctctagggca gagggccacc 60

atctcctgca gagccagcga aagtgttgat acttttggca ttagttttat gaactggttc 120

caacagaaac caggacagcc acccaaactc ctcatccatg ctgcatccaa tcaaggatcc 180

ggggtccctg ccaggtttag tggtagtggg tctgggacgg acttcagcct caacatccat 240

cctatggagg aggatgatag tgcaatgtat ttctgtcagc aaagtaagga ggttccattc 300

acgttcggct cggggacaaa gttggaaata aaa 333

<210>20

<211>111

<212>PRT

<213>小鼠(Mus musculus)

<400>20

Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Thr Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Thr Phe

20 25 30

Gly Ile Ser Phe Met Asn Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro

35 40 45

Lys Leu Leu Ile His Ala Ala Ser Asn Gln Gly Ser Gly Val Pro Ala

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Ser Leu Asn Ile His

65 70 75 80

Pro Met Glu Glu Asp Asp Ser Ala Met Tyr Phe Cys Gln Gln Ser Lys

85 90 95

Glu Val Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

<210>21

<211>15

<212>DNA

<213>小鼠(Mus musculus)

<400>21

agctcttgga tgaac 15

<210>22

<211>5

<212>PRT

<213>小鼠(Mus musculus)

<400>22

Ser Ser Trp Met Asn

1 5

<210>23

<211>51

<212>DNA

<213>小鼠(Mus musculus)

<400>23

cggatttatc ctggagatgg agatactaac tacaatggga agttcaaggg c 51

<210>24

<211>17

<212>PRT

<213>小鼠(Mus musculus)

<400>24

Arg Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asn Tyr Asn Gly Lys Phe Lys

1 5 10 15

Gly

<210>25

<211>36

<212>DNA

<213>小鼠(Mus musculus)

<400>25

tcaggattta ttactacggt tttagacttt gactac 36

<210>26

<211>12

<212>PRT

<213>小鼠(Mus musculus)

<400>26

Ser Gly Phe Ile Thr Thr Val Leu Asp Phe Asp Tyr

1 5 10

<210>27

<211>45

<212>DNA

<213>小鼠(Mus musculus)

<400>27

agagccagcg aaagtgttga tacttttggc attagtttta tgaac 45

<210>28

<211>15

<212>PRT

<213>小鼠(Mus musculus)

<400>28

Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Thr Phe Gly Ile Ser Phe Met Asn

1 5 10 15

<210>29

<211>21

<212>DNA

<213>小鼠(Mus musculus)

<400>29

gctgcatcca atcaaggatc c 21

<210>30

<211>7

<212>PRT

<213>小鼠(Mus musculus)

<400>30

Ala Ala Ser Asn Gln Gly Ser

1 5

<210>31

<211>27

<212>DNA

<213>小鼠(Mus musculus)

<400>31

cagcaaagta aggaggttcc attcacg 27

<210>32

<211>9

<212>PRT

<213>小鼠(Mus musculus)

<400>32

Gln Gln Ser Lys Glu Val Pro Phe Thr

1 5

<210>33

<211>363

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>重组的多核苷酸/多肽

<400>33

gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtccagc ctggagggtc cctgagactc 60

tcctgtgcag cctctggatt caccttcagt agctcttgga tgaactgggt ccgccaggct 120

ccagggaagg ggctggagtg ggttggccgg atttatcctg gagatggaga tactaactac 180

aatgggaagt tcaagggcag attcaccatc tcaagagatg attcaaagaa ctcactgtat 240

ctgcaaatga acagcctgaa aaccgaggac acggccgtgt attactgtgc tagatcagga 300

tttattacta cggttttaga ctttgactac tggggccaag gaaccctggt caccgtctcc 360

tca 363

<210>34

<211>121

<212>PRT

<213>人工

<220>

<223>重组的多核苷酸/多肽

<400>34

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Ser

20 25 30

Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Gly Arg Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asn Tyr Asn Gly Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Ser Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Ser Gly Phe Ile Thr Thr Val Leu Asp Phe Asp Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210>35

<211>90

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>重组的多核苷酸/多肽

<400>35

gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtccagc ctggagggtc cctgagactc 60

tcctgtgcag cctctggatt caccttcagt 90

<210>36

<211>30

<212>PRT

<213>人工

<220>

<223>重组的多核苷酸/多肽

<400>36

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser

20 25 30

<210>37

<211>42

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>重组的多核苷酸/多肽

<400>37

tgggtccgcc aggctccagg gaaggggctg gagtgggttg gc 42

<210>38

<211>14

<212>PRT

<213>人工

<220>

<223>重组的多核苷酸/多肽

<400>38

Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Gly

1 5 10

<210>39

<211>96

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>重组的多核苷酸/多肽

<400>39

agattcacca tctcaagaga tgattcaaag aactcactgt atctgcaaat gaacagcctg 60

aaaaccgagg acacggccgt gtattactgt gctaga 96

<210>40

<211>32

<212>PRT

<213>人工

<220>

<223>重组的多核苷酸/多肽

<400>40

Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Ser Leu Tyr Leu Gln

1 5 10 15

Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg

20 25 30

<210>41

<211>33

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>重组的多核苷酸/多肽

<400>41

tggggccaag gaaccctggt caccgtctcc tca 33

<210>42

<211>11

<212>PRT

<213>人工

<220>

<223>重组的多核苷酸/多肽

<400>42

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

1 5 10

<210>43

<211>363

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>重组的多核苷酸/多肽

<400>43

gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtccagc ctggagggtc cctgagaatc 60

tcctgtgcag cctctggata cgccttcagt agctcttgga tgaactgggt catccaggct 120

ccagggaagg ggctggagtg gattggccgg atttatcctg gagatggaga tactaactac 180

aatgggaagt tcaagggcag agccaccatc tcagcagatg attcaaagaa ctcactgtat 240

atgcaaatga acagcctgaa aaccgaggac acggccgtgt atatctgtgc tagatcagga 300

tttattacta cggttttaga ctttgactac tggggccaag gaaccctggt caccgtctcc 360

tca 363

<210>44

<211>121

<212>PRT

<213>人工

<220>

<223>重组的多核苷酸/多肽

<400>44

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Ile Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Ser Ser

20 25 30

Trp Met Asn Trp Val Ile Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Arg Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asn Tyr Asn Gly Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Arg Ala Thr Ile Ser Ala Asp Asp Ser Lys Asn Ser Leu Tyr

65 70 75 80

Met Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr Ile Cys

85 90 95

Ala Arg Ser Gly Phe Ile Thr Thr Val Leu Asp Phe Asp Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210>45

<211>90

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>重组的多核苷酸/多肽

<400>45

gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtccagc ctggagggtc cctgagaatc 60

tcctgtgcag cctctggata cgccttcagt 90

<210>46

<211>30

<212>PRT

<213>人工

<220>

<223>重组的多核苷酸/多肽

<400>46

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Ile Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser

20 25 30

<210>47

<211>42

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>重组的多核苷酸/多肽

<400>47

tgggtcatcc aggctccagg gaaggggctg gagtggattg gc 42

<210>48

<211>14

<212>PRT

<213>人工

<220>

<223>重组的多核苷酸/多肽

<400>48

Trp Val Ile Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly

1 5 10

<210>49

<211>96

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>重组的多核苷酸/多肽

<400>49

agagccacca tctcagcaga tgattcaaag aactcactgt atatgcaaat gaacagcctg 60

aaaaccgagg acacggccgt gtatatctgt gctaga 96

<210>50

<211>32

<212>PRT

<213>人工

<220>

<223>重组的多核苷酸/多肽

<400>50

Arg Ala Thr Ile Ser Ala Asp Asp Ser Lys Asn Ser Leu Tyr Met Gln

1 5 10 15

Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr Ile Cys Ala Arg

20 25 30

<210>51

<211>333

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>重组的多核苷酸/多肽

<400>51

gaaattgtgc tgactcagtc tccagacttt cagtctgtga ctccaaagga gaaagtcacc 60

atcacctgca gagccagcga aagtgttgat acttttggca ttagttttat gaactggtac 120

cagcagaaac cagatcagtc tccaaagctc ctcatcaagg ctgcatccaa tcaaggatcc 180

ggggtcccct cgaggttcag tggcagtgga tctgggacag atttcaccct caccatcaat 240

agcctggaag ctgaagatgc tgcaacgtat tactgtcagc aaagtaagga ggttccattc 300

acgttcggcg gagggaccaa ggtggagatc aaa 333

<210>52

<211>111

<212>PRT

<213>人工

<220>

<223>重组的多核苷酸/多肽

<400>52

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Asp Phe Gln Ser Val Thr Pro Lys

1 5 10 15

Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Thr Phe

20 25 30

Gly Ile Ser Phe Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gln Ser Pro

35 40 45

Lys Leu Leu Ile Lys Ala Ala Ser Asn Gln Gly Ser Gly Val Pro Ser

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn

65 70 75 80

Ser Leu Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Lys

85 90 95

Glu Val Pro Phe Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105 110

<210>53

<211>69

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>重组的多核苷酸/多肽

<400>53

gaaattgtgc tgactcagtc tccagacttt cagtctgtga ctccaaagga gaaagtcacc 60

atcacctgc 69

<210>54

<211>23

<212>PRT

<213>人工

<220>

<223>重组的多核苷酸/多肽

<400>54

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Asp Phe Gln Ser Val Thr Pro Lys

1 5 10 15

Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys

20

<210>55

<211>45

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>重组的多核苷酸/多肽

<400>55

tggtaccagc agaaaccaga tcagtctcca aagctcctca tcaag 45

<210>56

<211>15

<212>PRT

<213>人工

<220>

<223>重组的多核苷酸/多肽

<400>56

Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Lys

1 5 10 15

<210>57

<211>96

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>重组的多核苷酸/多肽

<400>57

ggggtcccct cgaggttcag tggcagtgga tctgggacag atttcaccct caccatcaat 60

agcctggaag ctgaagatgc tgcaacgtat tactgt 96

<210>58

<211>32

<212>PRT

<213>人工

<220>

<223>重组的多核苷酸/多肽

<400>58

Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr

1 5 10 15

Leu Thr Ile Asn Ser Leu Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys

20 25 30

<210>59

<211>30

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>重组的多核苷酸/多肽

<400>59

ttcggcggag ggaccaaggt ggagatcaaa 30

<210>60

<211>10

<212>PRT

<213>人工

<220>

<223>重组的多核苷酸/多肽

<400>60

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

1 5 10

<210>61

<211>333

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>重组的多核苷酸/多肽

<400>61

gaaattgtgc tgactcagtc tccagacttt cagtctgtga ctccaaagga gaaagtcacc 60

atcacctgca gagccagcga aagtgttgat acttttggca ttagttttat gaactggttc 120

cagcagaaac cagatcagtc tccaaagctc ctcatccatg ctgcatccaa tcaaggatcc 180

ggggtcccct cgaggttcag tggcagtgga tctgggacag atttcaccct caccatcaat 240

agcctggaag ctgaagatgc tgcaacgtat ttctgtcagc aaagtaagga ggttccattc 300

acgttcggcg gagggaccaa ggtggagatc aaa 333

<210>62

<211>111

<212>PRT

<213>人工

<220>

<223>重组的多核苷酸/多肽

<400>62

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Asp Phe Gln Ser Val Thr Pro Lys

1 5 10 15

Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Thr Phe

20 25 30

Gly Ile Ser Phe Met Asn Trp Phe Gln Gln Lys Pro Asp Gln Ser Pro

35 40 45

Lys Leu Leu Ile His Ala Ala Ser Asn Gln Gly Ser Gly Val Pro Ser

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn

65 70 75 80

Ser Leu Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Ser Lys

85 90 95

Glu Val Pro Phe Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105 110

<210>63

<211>45

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>重组的多核苷酸/多肽

<400>63

tggttccagc agaaaccaga tcagtctcca aagctcctca tccat 45

<210>64

<211>15

<212>PRT

<213>人工

<220>

<223>重组的多核苷酸/多肽

<400>64

Trp Phe Gln Gln Lys Pro Asp Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile His

1 5 10 15

<210>65

<211>96

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>重组的多核苷酸/多肽

<400>65

ggggtcccct cgaggttcag tggcagtgga tctgggacag atttcaccct caccatcaat 60

agcctggaag ctgaagatgc tgcaacgtat ttctgt 96

<210>66

<211>32

<212>PRT

<213>人工

<220>

<223>重组的多核苷酸/多肽

<400>66

Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr

1 5 10 15

Leu Thr Ile Asn Ser Leu Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Phe Cys

20 25 30

<210>67

<211>333

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>重组的多核苷酸/多肽

<400>67

gaaattgtgc tgactcagtc tccagacttt cagtctgtga ctccaaagga gaaagtcacc 60

atcacctgca gagccagcga aagtgttgat acttttggca ttagttttat gaactggttc 120

cagcagaaac cagatcagtc tccaaagctc ctcatccatg ctgcatccaa tcaaggatcc 180

ggggtcccct cgaggttcag tggcagtgga tctgggacag atttcaccct caccatcaat 240

agcctggaag ctgaagatgc tgcaacgtat tactgtcagc aaagtaagga ggttccattc 300

acgttcggcg gagggaccaa ggtggagatc aaa 333

<210>68

<211>111

<212>PRT

<213>人工

<220>

<223>重组的多核苷酸/多肽

<400>68

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Asp Phe Gln Ser Val Thr Pro Lys

1 5 10 15

Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Thr Phe

20 25 30

Gly Ile Ser Phe Met Asn Trp Phe Gln Gln Lys Pro Asp Gln Ser Pro

35 40 45

Lys Leu Leu Ile His Ala Ala Ser Asn Gln Gly Ser Gly Val Pro Ser

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn

65 70 75 80

Ser Leu Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Lys

85 90 95

Glu Val Pro Phe Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105 110

<210>69

<211>333

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>重组的多核苷酸/多肽

<400>69

gaaattgtgc tgactcagtc tccagacttt cagtctgtga ctccaaagga gaaagtcacc 60

atcacctgca gagccagcga aagtgttgat acttttggca ttagttttat gaactggttc 120

cagcagaaac cagatcagtc tccaaagctc ctcatcaagg ctgcatccaa tcaaggatcc 180

ggggtcccct cgaggttcag tggcagtgga tctgggacag atttcaccct caccatcaat 240

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acgttcggcg gagggaccaa ggtggagatc aaa 333

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<212>PRT

<213>人工

<220>

<223>重组的多核苷酸/多肽

<400>70

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1 5 10 15

Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Thr Phe

20 25 30

Gly Ile Ser Phe Met Asn Trp Phe Gln Gln Lys Pro Asp Gln Ser Pro

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Lys Leu Leu Ile Lys Ala Ala Ser Asn Gln Gly Ser Gly Val Pro Ser

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn

65 70 75 80

Ser Leu Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Lys

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Glu Val Pro Phe Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105 110

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<211>45

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>重组的多核苷酸/多肽

<400>71

tggttccagc agaaaccaga tcagtctcca aagctcctca tcaag 45

<210>72

<211>15

<212>PRT

<213>人工

<220>

<223>重组的多核苷酸/多肽

<400>72

Trp Phe Gln Gln Lys Pro Asp Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Lys

1 5 10 15

<210>73

<211>333

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>重组的多核苷酸/多肽

<400>73

gaaattgtgc tgactcagtc tccagacttt cagtctgtga ctccaaagga gaaagtcacc 60

atcacctgca gagccagcga aagtgttgat acttttggca ttagttttat gaactggttc 120

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acgttcggcg gagggaccaa ggtggagatc aaa 333

<210>74

<211>111

<212>PRT

<213>人工

<220>

<223>重组的多核苷酸/多肽

<400>74

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Asp Phe Gln Ser Val Thr Pro Lys

1 5 10 15

Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Thr Phe

20 25 30

Gly Ile Ser Phe Met Asn Trp Phe Gln Gln Lys Pro Asp Gln Ser Pro

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Lys Leu Leu Ile Lys Ala Ala Ser Asn Gln Gly Ser Gly Val Pro Ser

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn

65 70 75 80

Ser Leu Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Ser Lys

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Glu Val Pro Phe Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105 110

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<211>333

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>重组的多核苷酸/多肽

<400>75

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atcacctgca gagccagcga aagtgttgat acttttggca ttagttttat gaactggtac 120

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agcctggaag ctgaagatgc tgcaacgtat ttctgtcagc aaagtaagga ggttccattc 300

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<211>111

<212>PRT

<213>人工

<220>

<223>重组的多核苷酸/多肽

<400>76

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Asp Phe Gln Ser Val Thr Pro Lys

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Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Thr Phe

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Gly Ile Ser Phe Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gln Ser Pro

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Lys Leu Leu Ile His Ala Ala Ser Asn Gln Gly Ser Gly Val Pro Ser

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65 70 75 80

Ser Leu Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Ser Lys

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Glu Val Pro Phe Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105 110

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<211>333

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>重组的多核苷酸/多肽

<400>77

gaaattgtgc tgactcagtc tccagacttt cagtctgtga ctccaaagga gaaagtcacc 60

atcacctgca gagccagcga aagtgttgat acttttggca ttagttttat gaactggtac 120

cagcagaaac cagatcagtc tccaaagctc ctcatcaagg ctgcatccaa tcaaggatcc 180

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agcctggaag ctgaagatgc tgcaacgtat ttctgtcagc aaagtaagga ggttccattc 300

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<211>111

<212>PRT

<213>人工

<220>

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<400>78

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Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Thr Phe

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Gly Ile Ser Phe Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gln Ser Pro

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Lys Leu Leu Ile Lys Ala Ala Ser Asn Gln Gly Ser Gly Val Pro Ser

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Ser Leu Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Ser Lys

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Glu Val Pro Phe Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105 110

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<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>重组的多核苷酸/多肽

<400>79

gaaattgtgc tgactcagtc tccagacttt cagtctgtga ctccaaagga gaaagtcacc 60

atcacctgca gagccagcga aagtgttgat acttttggca ttagttttat gaactggtac 120

cagcagaaac cagatcagtc tccaaagctc ctcatccatg ctgcatccaa tcaaggatcc 180

ggggtcccct cgaggttcag tggcagtgga tctgggacag atttcaccct caccatcaat 240

agcctggaag ctgaagatgc tgcaacgtat tactgtcagc aaagtaagga ggttccattc 300

acgttcggcg gagggaccaa ggtggagatc aaa 333

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<211>111

<212>PRT

<213>人工

<220>

<223>重组的多核苷酸/多肽

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Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Asp Phe Gln Ser Val Thr Pro Lys

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<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>重组的多核苷酸/多肽

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<213>人工

<220>

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<212>PRT

<213>人工

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<223>重组的多核苷酸/多肽

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Met Gly Asp Asn Asp Ile His Phe Ala Phe Leu Ser Thr Gly Val His

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Ser

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<213>人工

<220>

<223>重组的多核苷酸/多肽

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Met Asp Met Arg Val Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp

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20

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<213>人工

<220>

<223>重组的多核苷酸/多肽

<400>85

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<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>重组的多核苷酸/多肽

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<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>重组的多核苷酸/多肽

<400>87

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<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>重组的多核苷酸/多肽

<400>88

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<210>89

<211>65

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>重组的多核苷酸/多肽

<400>89

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<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>重组的多核苷酸/多肽

<400>90

ggaagttcaa gggcagattc accatctcaa gagatgattc aaagaactca ctgtatctgc 60

aaatgaacag 70

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<211>68

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>重组的多核苷酸/多肽

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<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>重组的多核苷酸/多肽

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<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>重组的多核苷酸/多肽

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<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>重组的多核苷酸/多肽

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gtg 63

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<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>重组的多核苷酸/多肽

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<211>68

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>重组的多核苷酸/多肽

<400>96

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<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>重组的多核苷酸/多肽

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tggtttc 67

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<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>重组的多核苷酸/多肽

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gatccggggt cccctcgagg ttcagtggca gtggatctgg gacagatttc accctcacca 60

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<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>重组的多核苷酸/多肽

<400>99

gaacctcctt actttgctga cagaaatacg ttgcagcatc ttcagcttcc aggctattga 60

tggtgagg 68

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<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>重组的多核苷酸/多肽

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gcaaagtaag gaggttccat tcacgttcgg cggagggacc aaggtggaga tcaaa 55

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<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>重组的多核苷酸/多肽

<400>101

tatatatacg tacgtttgat ctccaccttg gtccctccgc cga 43

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<212>PRT

<213>人工

<220>

<223>重组的多核苷酸/多肽

<400>102

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

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<211>121

<212>PRT

<213>人工

<220>

<223>重组的多核苷酸/多肽

<400>103

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Ser

20 25 30

Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Gly Arg Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asn Tyr Asn Gly Lys Phe

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65 70 75 80

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Ala Arg Ser Gly Phe Ile Thr Thr Val Arg Asp Phe Asp Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

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<211>121

<212>PRT

<213>人工

<220>

<223>重组的多核苷酸/多肽

<400>104

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Ser

20 25 30

Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

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Gly Arg Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asn Tyr Asn Ala Lys Phe

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115 120

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<212>PRT

<213>人工

<220>

<223>重组的多核苷酸/多肽

<400>105

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Ser

20 25 30

Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

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Gly Arg Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asn Tyr Asn Gly Lys Phe

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Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Ser Leu Tyr

65 70 75 80

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<211>121

<212>PRT

<213>人工

<220>

<223>重组的多核苷酸/多肽

<400>106

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Ser

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<211>121

<212>PRT

<213>人工

<220>

<223>重组的多核苷酸/多肽

<400>107

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Ser

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<211>121

<212>PRT

<213>人工

<220>

<223>重组的多核苷酸/多肽

<400>108

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Ser

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Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

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<211>121

<212>PRT

<213>人工

<220>

<223>重组的多核苷酸/多肽

<400>109

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Ser

20 25 30

Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

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<210>110

<211>111

<212>PRT

<213>人工

<220>

<223>重组的多核苷酸/多肽

<400>110

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Asp Phe Gln Ser Val Thr Pro Lys

1 5 10 15

Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Thr Phe

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100 105 110

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<211>111

<212>PRT

<213>人工

<220>

<223>重组的多核苷酸/多肽

<400>111

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Asp Phe Gln Ser Val Thr Pro Lys

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100 105 110

<210>112

<211>111

<212>PRT

<213>人工

<220>

<223>重组的多核苷酸/多肽

<400>112

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Asp Phe Gln Ser Val Thr Pro Lys

1 5 10 15

Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp His Phe

20 25 30

Gly Ile Ser Phe Met Asn Trp Phe Gln Gln Lys Pro Asp Gln Ser Pro

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50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn

65 70 75 80

Ser Leu Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Lys

85 90 95

Glu Val Pro Ile Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105 110

<210>113

<211>111

<212>PRT

<213>人工

<220>

<223>重组的多核苷酸/多肽

<400>113

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Asp Phe Gln Ser Val Thr Pro Lys

1 5 10 15

Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Thr Phe

20 25 30

Gly Ile Ser Phe Met Asn Trp Phe Gln Gln Lys Pro Asp Gln Ser Pro

35 40 45

Lys Leu Leu Ile His Ala Ala Ser Asn Gln Gly Ser Gly Val Pro Ser

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn

65 70 75 80

Ser Leu Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Lys

85 90 95

Glu Val Pro Ile Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105 110

<210>114

<211>5

<212>PRT

<213>人工

<220>

<223>重组的多核苷酸/多肽

<400>114

Ser Thr Trp Met Asn

1 5

<210>115

<211>17

<212>PRT

<213>人工

<220>

<223>重组的多核苷酸/多肽

<400>115

Arg Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asn Tyr Asn Ala Lys Phe Lys

1 5 10 15

Gly

<210>116

<211>17

<212>PRT

<213>人工

<220>

<223>重组的多核苷酸/多肽

<400>116

Arg Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asn Tyr Asn Val Lys Phe Lys

1 5 10 15

Gly

<210>117

<211>17

<212>PRT

<213>人工

<220>

<223>重组的多核苷酸/多肽

<400>117

Arg Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asn Tyr Tyr Gly Lys Phe Lys

1 5 10 15

Gly

<210>118

<211>17

<212>PRT

<213>人工

<220>

<223>重组的多核苷酸/多肽

<400>118

Arg Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asn Tyr Asp Gly Lys Phe Lys

1 5 10 15

Gly

<210>119

<211>17

<212>PRT

<213>人工

<220>

<223>重组的多核苷酸/多肽

<400>119

Arg Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asn Tyr Leu Gly Lys Phe Lys

1 5 10 15

Gly

<210>120

<211>12

<212>PRT

<213>人工

<220>

<223>重组的多核苷酸/多肽

<400>120

Ser Gly Phe Ile Thr Thr Val Tyr Asp Phe Asp Tyr

1 5 10

<210>121

<211>12

<212>PRT

<213>人工

<220>

<223>重组的多核苷酸/多肽

<400>121

Ser Gly Phe Ile Thr Thr Val Arg Asp Phe Asp Tyr

1 5 10

<210>122

<211>12

<212>PRT

<213>人工

<220>

<223>重组的多核苷酸/多肽

<400>122

Ser Gly Phe Ile Thr Thr Val His Asp Phe Asp Tyr

1 5 10

<210>123

<211>15

<212>PRT

<213>人工

<220>

<223>重组的多核苷酸/多肽

<400>123

Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Thr Phe Gly Ile Ser Phe Ile Asn

1 5 10 15

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<211>15

<212>PRT

<213>人工

<220>

<223>重组的多核苷酸/多肽

<400>124

Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp His Phe Gly Ile Ser Phe Met Asn

1 5 10 15

<210>125

<211>7

<212>PRT

<213>人工

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<223>重组的多核苷酸/多肽

<400>125

Glu Ala Ser Asn Gln Gly Ser

1 5

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<212>PRT

<213>人工

<220>

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Gln Gln Thr Lys Glu Val Pro Phe Thr

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<211>9

<212>PRT

<213>人工

<220>

<223>重组的多核苷酸/多肽

<400>127

Gln Gln Ser Lys Glu Val Pro Ile Thr

1 5

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<211>51

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>重组的多核苷酸/多肽

<400>128

gctggtggtg ccgttctata gccatagcga ggtgcagctg gtggagtctg g 51

<210>129

<211>55

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>重组的多核苷酸/多肽

<400>129

ggaagaccga tgggcccttg gtggaggctg aggagacggt gaccagggtt ccttg 55

<210>130

<211>58

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>重组的多核苷酸/多肽

<400>130

ggtcgttcca ttttactccc actccgaaat tgtgctgact cagtctccag actttcag 58

<210>131

<211>62

<212>DNA

<213>人工

<220>

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<400>131

gatgaagaca gatggtgcag ccacagtacg tttgatctcc accttggtcc ctccgccgaa 60

cg 62

<210>132

<211>46

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>重组的多核苷酸/多肽

<220>

<221>misc_feature

<222>(17)..(17)

<223>n是a、c、g或t

<400>132

gcctggcgga cccassncat ccaagagcta ctgaaggtga atccag 46

<210>133

<211>46

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>重组的多核苷酸/多肽

<220>

<221>misc_feature

<222>(20)..(20)

<223>n是a、c、g或t

<400>133

gcctggcgga cccagttssn ccaagagcta ctgaaggtga atccag 46

<210>134

<211>46

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>重组的多核苷酸/多肽

<220>

<221>misc_feature

<222>(23)..(23)

<223>n是a、c、g或t

<400>134

gcctggcgga cccagttcat ssnagagcta ctgaaggtga atccag 46

<210>135

<211>46

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>重组的多核苷酸/多肽

<220>

<221>misc_feature

<222>(26)..(26)

<223>n是a、c、g或t

<400>135

gcctggcgga cccagttcat ccassngcta ctgaaggtga atccag 46

<210>136

<211>46

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>重组的多核苷酸/多肽

<220>

<221>misc_feature

<222>(29)..(29)

<223>n是a、c、g或t

<400>136

gcctggcgga cccagttcat ccaagassna ctgaaggtga atccag 46

<210>137

<211>46

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>重组的多核苷酸/多肽

<220>

<221>misc_feature

<222>(17)..(17)

<223>n是a、c、g或t

<400>137

gcctggcgga cccawsncat ccaagagcta ctgaaggtga atccag 46

<210>138

<211>46

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>重组的多核苷酸/多肽

<220>

<221>misc_feature

<222>(20)..(20)

<223>n是a、c、g或t

<400>138

gcctggcgga cccagttwsn ccaagagcta ctgaaggtga atccag 46

<210>139

<211>46

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>重组的多核苷酸/多肽

<220>

<221>misc_feature

<222>(23)..(23)

<223>n是a、c、g或t

<400>139

gcctggcgga cccagttcat wsnagagcta ctgaaggtga atccag 46

<210>140

<211>46

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>重组的多核苷酸/多肽

<220>

<221>misc_feature

<222>(26)..(26)

<223>n是a、c、g或t

<400>140

gcctggcgga cccagttcat ccawsngcta ctgaaggtga atccag 46

<210>141

<211>46

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>重组的多核苷酸/多肽

<220>

<221>misc_feature

<222>(29)..(29)

<223>n是a、c、g或t

<400>141

gcctggcgga cccagttcat ccaagawsna ctgaaggtga atccag 46

<210>142

<211>42

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>重组的多核苷酸/多肽

<400>142

ctggcggacc cagthcatcm aagwgctact gaaggtgaat cc 42

<210>143

<211>42

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>重组的多核苷酸/多肽

<400>143

ctggcggacc cagthcatct cagwgctact gaaggtgaat cc 42

<210>144

<211>42

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>重组的多核苷酸/多肽

<400>144

ctggcggacc cagagcatcm aagwgctact gaaggtgaat cc 42

<210>145

<211>42

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>重组的多核苷酸/多肽

<400>145

ctggcggacc cagagcatct cagwgctact gaaggtgaat cc 42

<210>146

<211>43

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>重组的多核苷酸/多肽

<400>146

ctgcccttga acttcscatw gtagttagda tctccatctc cag 43

<210>147

<211>43

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>重组的多核苷酸/多肽

<400>147

ctgcccttga acttcscatw gtagttatta tctccatctc cag 43

<210>148

<211>43

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>重组的多核苷酸/多肽

<400>148

ctgcccttga acttcscaag gtagttagda tctccatctc cag 43

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<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>重组的多核苷酸/多肽

<400>149

ctgcccttga acttcscaag gtagttatta tctccatctc cag 43

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<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>重组的多核苷酸/多肽

<400>150

cccagtagtc aaagtcgtra accgtagkaa taaatcctga tctagc 46

<210>151

<211>46

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>重组的多核苷酸/多肽

<400>151

cccagtagtc aaagtcsaaa accgtagkaa taaatcctga tctagc 46

<210>152

<211>46

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>重组的多核苷酸/多肽

<400>152

cccagtagtc aaagtctcga accgtagkaa taaatcctga tctagc 46

<210>153

<211>54

<212>DNA

<213>人工

<220>

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<400>153

ctgctggaac cagttyvtaa aactaakgcc aaaatgaata acactttcgc tggc 54

<210>154

<211>54

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>重组的多核苷酸/多肽

<400>154

ctgctggaac cagttyvtaa aactaakgcc aaaatgatca acactttcgc tggc 54

<210>155

<211>54

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>重组的多核苷酸/多肽

<400>155

ctgctggaac cagttyvtaa aactaakgcc aaaagtaata acactttcgc tggc 54

<210>156

<211>54

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>重组的多核苷酸/多肽

<400>156

ctgctggaac cagttyvtaa aactaakgcc aaaagtatca acactttcgc tggc 54

<210>157

<211>48

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>重组的多核苷酸/多肽

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<210>158

<211>48

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>重组的多核苷酸/多肽

<400>158

ggggaccccg gagtattgat tggatgcata atggatgagg agctttgg 48

<210>159

<211>48

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>重组的多核苷酸/多肽

<400>159

ggggaccccg gatcctgkat tggatgcata atggatgagg agctttgg 48

<210>160

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<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>重组的多核苷酸/多肽

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ggggaccccg gatccttgat tggatgcckc atggatgagg agctttgg 48

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<212>DNA

<213>人工

<220>

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<400>161

ggggaccccg gagtattgat tggatgcckc atggatgagg agctttgg 48

<210>162

<211>48

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>重组的多核苷酸/多肽

<400>162

ggggaccccg gatcctgkat tggatgcckc atggatgagg agctttgg 48

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<211>48

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>重组的多核苷酸/多肽

<400>163

ctccgccgaa cgtgawtgga acctccttag wttgctgaca gtaatacg 48

<210>164

<211>48

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>重组的多核苷酸/多肽

<400>164

ctccgccgaa cgtgtttgga acctccttag wttgctgaca gtaatacg 48

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<211>38

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>重组的多核苷酸/多肽

<400>165

aactaatgcc aaaagtaata acactttcgc tggctctg 38

<210>166

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<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>重组的多核苷酸/多肽

<400>166

cataaaacta atgccaaaat gaataacact ttcgctggct ctgcagg 47

<210>167

<211>47

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>重组的多核苷酸/多肽

<400>167

ccagttcata aaactaatgc caaaatgatc aacactttcg ctggctc 47

<210>168

<211>39

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>重组的多核苷酸/多肽

<400>168

ggatccttga ttggatgcct catggatgag gagctttgg 39

<210>169

<211>39

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>重组的多核苷酸/多肽

<400>169

gtccctccgc cgaacgtgwt tggaacctcc ttactttgc 39

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<211>43

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>重组的多核苷酸/多肽

<400>170

cctggcggac ccagttcatc tcagagctac tgaaggtgaa tcc 43

<210>171

<211>43

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>重组的多核苷酸/多肽

<400>171

cctggcggac ccagtacatc tcagagctac tgaaggtgaa tcc 43

<210>172

<211>43

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>重组的多核苷酸/多肽

<400>172

cctggcggac ccagtacatc caagagctac tgaaggtgaa tcc 43

<210>173

<211>42

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>重组的多核苷酸/多肽

<400>173

gaatctgccc ttgaacttcg cattgtagtt agtatctcca tc 42

<210>174

<211>45

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>重组的多核苷酸/多肽

<400>174

cttggcccca gtagtcaaag tctcgaaccg tagtaataaa tcctg 45

<210>175

<211>45

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>重组的多核苷酸/多肽

<400>175

cttggcccca gtagtcaaag tcgygaaccg tagtaataaa tcctg 45

<210>176

<211>32

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>重组的多核苷酸/多肽

<400>176

ggaccccgga tcctstattg gatgcctcat gg 32

<210>177

<211>43

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>重组的多核苷酸/多肽

<400>177

cctcgagggg accccggagt atstattgga tgcctcatgg atg 43

<210>178

<211>32

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>重组的多核苷酸/多肽

<400>178

ggaccccgga tcctgsattg gatgcctcat gg 32

<210>179

<211>43

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>重组的多核苷酸/多肽

<400>179

cctcgagggg accccggagt atgsattgga tgcctcatgg atg 43

<210>180

<211>48

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>重组的多核苷酸/多肽

<400>180

ctccgccgaa cgtgwttgga acctccttag wttgctgaca gtaatacg 48

<210>181

<211>52

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>重组的多核苷酸/多肽

<400>181

cgccgaacgt gaatggaacc cgcttagwtt gcgcacagta atacgttgca gc 52

<210>182

<211>48

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>重组的多核苷酸/多肽

<400>182

cgccgaacgt gaatggaacc cgcttagwtt gctgacagta atacgttg 48

<210>183

<211>52

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>重组的多核苷酸/多肽

<400>183

ctccgccgaa cgtgwttgga acctccttag wttgcgcaca gtaatacgtt gc 52

<210>184

<211>43

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>重组的多核苷酸/多肽

<400>184

cctggcggac ccagttcatc caaacgctac tgaaggtgaa tcc 43

<210>185

<211>43

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>重组的多核苷酸/多肽

<400>185

gcctggcgga cccagtwcat cmaaacgcta ctgaaggtga atc 43

<210>186

<211>45

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>重组的多核苷酸/多肽

<400>186

gagcctggcg gacccagagc atcmaaacgc tactgaaggt gaatc 45

<210>187

<211>52

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>重组的多核苷酸/多肽

<400>187

cttgaacttc acatwgtagt taktatctcc atctccarga taaatccggc ca 52

<210>188

<211>52

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>重组的多核苷酸/多肽

<400>188

cttgaacttc acattgtagt taktatctcc atctccarga taaatccggc ca 52

<210>189

<211>52

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>重组的多核苷酸/多肽

<400>189

cttgaacttc acatwgtagt tagtatctcc atctccarga taaatccggc ca 52

<210>190

<211>39

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>重组的多核苷酸/多肽

<400>190

gtcaaagtcg cgaaccgtag kaataaatcc tgatctagc 39

<210>191

<211>121

<212>PRT

<213>人工

<220>

<223>重组的多核苷酸/多肽

<400>191

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Val

20 25 30

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<212>PRT

<213>人工

<220>

<223>重组的多核苷酸/多肽

<400>192

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35 40 45

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50 55 60

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Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

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<211>111

<212>PRT

<213>人工

<220>

<223>重组的多核苷酸/多肽

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1 5 10 15

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<212>PRT

<213>人工

<220>

<223>重组的多核苷酸/多肽

<400>194

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<220>

<223>重组的多核苷酸/多肽

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<220>

<223>重组的多核苷酸/多肽

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<220>

<223>重组的多核苷酸/多肽

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<220>

<223>重组的多核苷酸/多肽

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<220>

<223>重组的多核苷酸/多肽

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<220>

<223>重组的多核苷酸/多肽

<400>200

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<220>

<223>重组的多核苷酸/多肽

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<220>

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<220>

<223>重组的多核苷酸/多肽

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<223>重组的多核苷酸/多肽

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<220>

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<220>

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<220>

<223>重组的多核苷酸/多肽

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<223>重组的多核苷酸/多肽

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<220>

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<220>

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<220>

<223>重组的多核苷酸/多肽

<400>221

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<223>重组的多核苷酸/多肽

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<220>

<223>重组的多核苷酸/多肽

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<212>PRT

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<223>重组的多核苷酸/多肽

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<223>重组的多核苷酸/多肽

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<212>PRT

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<220>

<223>重组的多核苷酸/多肽

<400>228

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<212>PRT

<213>人工

<220>

<223>重组的多核苷酸/多肽

<400>229

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<210>230

<211>5

<212>PRT

<213>人工

<220>

<223>重组的多核苷酸/多肽

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(2)..(2)

<223>Xaa＝Ser、Thr、Val

<400>230

Ser Xaa Trp Met Asn

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<210>231

<211>17

<212>PRT

<213>人工

<220>

<223>重组的多核苷酸/多肽

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(4)..(4)

<223>Xaa＝Pro、Leu

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(12)..(12)

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<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(13)..(13)

<223>Xaa＝Gly、Ala、Val

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1 5 10 15

Gly

<210>232

<211>12

<212>PRT

<213>人工

<220>

<223>重组的多核苷酸/多肽

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(8)..(8)

<223>Xaa＝Leu、Arg、Tyr、His

<400>232

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<210>233

<211>15

<212>PRT

<213>人工

<220>

<223>重组的多核苷酸/多肽

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(7)..(7)

<223>Xaa＝Asp、Ile

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(8)..(8)

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<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(11)..(11)

<223>Xaa＝Ile、Leu

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(14)..(14)

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<210>234

<211>7

<212>PRT

<213>人工

<220>

<223>重组的多核苷酸/多肽

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(1)..(1)

<223>Xaa＝Ala、Glu

<220>

<221>MISC_FEATURE

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<220>

<221>MISC_FEATURE

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Xaa Ala Ser Asn Xaa Xaa Ser

1 5

<210>235

<211>9

<212>PRT

<213>人工

<220>

<223>重组的多核苷酸/多肽

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(1)..(1)

<223>Xaa＝Gln、Ala

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(3)..(3)

<223>Xaa＝Ser、Thr

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(5)..(5)

<223>Xaa＝Glu、Arg

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(8)..(8)

<223>Xaa＝Phe、Ile、Asn

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1 5

<210>236

<211>121

<212>PRT

<213>人工

<220>

<223>重组的多核苷酸/多肽

<400>236

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Thr

20 25 30

Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

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Gly Arg Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asn Tyr Asn Val Lys Phe

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Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

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Ala Arg Ser Gly Phe Ile Thr Thr Val Arg Asp Phe Asp Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210>237

<211>121

<212>PRT

<213>人工

<220>

<223>重组的多核苷酸/多肽

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(20)..(20)

<223>Xaa＝Leu、Ile

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(27)..(27)

<223>Xaa＝Phe、Tyr

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(28)..(28)

<223>Xaa＝Thr，Ala

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(32)..(32)

<223>Xaa＝Ser、Thr、Val

<220>

<221>misc_feature

<222>(38)..(38)

<223>Xaa可以是任何天然产生的氨基酸

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(39)..(39)

<223>Xaa＝Arg、Ile

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(48)..(48)

<223>Xaa＝Val、Ile

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(53)..(53)

<223>Xaa＝Leu、Pro

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(61)..(61)

<223>Xaa＝Asn、Tyr、Asp、Leu

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(62)..(62)

<223>Xaa＝Gly、Ala、Val

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(68)..(68)

<223>Xaa＝Phe、Ala

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(72)..(72)

<223>Xaa＝Arg、Alav

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(81)..(81)

<223>Xaa＝Leu、Met

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(95)..(95)

<223>Xaa＝Tyr、Ile

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(106)..(106)

<223>Xaa＝Leu、Arg、Tyr、His

<400>237

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Xaa Ser Cys Ala Ala Ser Gly Xaa Xaa Phe Ser Ser Xaa

20 25 30

Trp Met Asn Trp Val Xaa Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Xaa

35 40 45

Gly Arg Ile Tyr Xaa Gly Asp Gly Asp Thr Asn Tyr Xaa Xaa Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Arg Xaa Thr Ile Ser Xaa Asp Asp Ser Lys Asn Ser Leu Tyr

65 70 75 80

Xaa Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr Xaa Cys

85 90 95

Ala Arg Ser Gly Phe Ile Thr Thr Val Xaa Asp Phe Asp Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210>238

<211>111

<212>PRT

<213>人工

<220>

<223>重组的多核苷酸/多肽

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(30)..(30)

<223>Xaa＝Asp、Ile

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(31)..(31)

<223>Xaa＝Thr、His

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(34)..(34)

<223>Xaa＝Ile、Leu

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(37)..(37)

<223>Xaa＝Met、Ile、Arg

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(40)..(40)

<223>Xaa＝Phe、Tyr

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(53)..(53)

<223>Xaa＝Lys、His

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(54)..(54)

<223>Xaa＝Ala、Glu

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(58)..(58)

<223>Xaa＝Gln、Pro、Thr

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(59)..(59)

<223>Xaa＝Gly、Tyr

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(91)..(91)

<223>Xaa＝Tyr、Phe

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(93)..(93)

<223>Xaa＝Gln、Ala

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(95)..(95)

<223>Xaa＝Ser、Thr

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(97)..(97)

<223>Xaa＝Glu、Arg

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(100)..(100)

<223>Xaa＝Phe、Ile、Asn

<400>238

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Asp Phe Gln Ser Val Thr Pro Lys

1 5 10 15

Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Xaa Xaa Phe

20 25 30

Gly Xaa Ser Phe Xaa Asn Trp Xaa Gln Gln Lys Pro Asp Gln Ser Pro

35 40 45

Lys Leu Leu Ile Xaa Xaa Ala Ser Asn Xaa Xaa Ser Gly Val Pro Ser

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn

65 70 75 80

Ser Leu Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Xaa Cys Xaa Gln Xaa Lys

85 90 95

Xaa Val Pro Xaa Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105 110

Claims (41)

1.包含氨基酸序列如SEQ ID NO：106所示的VH和氨基酸序列如SEQ ID NO：111所示的VL的抗体。

2.如权利要求1所述的抗体，其特征在于，所述抗体具有选自下组的功能活性：提高的抗原依赖性细胞介导的细胞毒性、诱导B细胞凋亡、抑制B细胞增殖和在体内消耗B细胞。

3.如权利要求1所述的抗体，其特征在于，所述抗体的Fc区结合有N-糖苷连接的复合糖链，其中岩藻糖不结合于糖链还原端中的N-乙酰基葡糖胺。

4.如权利要求3所述的抗体，其特征在于，所述抗体可有效介导对Karpas-422、Karpas-1106P和DB细胞系的体外抗原依赖性细胞介导的细胞毒性，但不介导对Granta-519细胞系的体外抗原依赖性细胞介导的细胞毒性。

5.如权利要求3所述的抗体，其特征在于，所述抗体能够消耗动物模型的B细胞，其中所述B细胞选自：循环B细胞、血液B细胞、脾B细胞、边缘区B细胞、滤泡B细胞、腹膜B细胞和/或骨髓B细胞。

6.如权利要求5所述的抗体，其特征在于，给予2.5mg/kg剂量的所述抗体7天后，所述消耗使B细胞水平降低至少50％。

7.如权利要求1所述的抗体，其特征在于，所述抗体是Fc变体，且按照Kabat的EU索引编号，所述Fc变体含有选自235F和235Y的突变，其中所述Fc变体与选自下组的一种或多种Fc配体的亲和力改变：C1q、FcγRI、FcγRIIA、FcγRIIB、FcγRIIIA和FcγRIV。

8.如权利要求7所述的抗体，其特征在于，所述Fc变体与Fc受体FcγRIIIA的亲和力是比较分子的至多1/5，所述Fc变体与Fc受体FcγRIIB的亲和力是比较分子亲和力的2倍以下，其中所述比较分子是除含有野生型Fc区域外其它氨基酸序列均与所述Fc变体相同的蛋白质。

9.如权利要求1所述的抗体，其特征在于，所述抗体是人源化单克隆抗体。

10.如权利要求6所述的抗体，其特征在于，给予2.5mg/kg剂量的所述抗体7天后，所述消耗使B细胞水平降低至少60％。

11.如权利要求6所述的抗体，其特征在于，给予2.5mg/kg剂量的所述抗体7天后，所述消耗使B细胞水平降低至少70％。

12.如权利要求6所述的抗体，其特征在于，给予2.5mg/kg剂量的所述抗体7天后，所述消耗使B细胞水平降低至少80％。

13.如权利要求6所述的抗体，其特征在于，给予2.5mg/kg剂量的所述抗体7天后，所述消耗使B细胞水平降低至少90％。

14.如权利要求6所述的抗体，其特征在于，给予2.5mg/kg剂量的所述抗体7天后，所述消耗使B细胞水平降低至少95％。

15.一种编码多肽的分离核酸，所述多肽由选自下组的氨基酸序列组成：SEQ ID NO：106和111。

16.一种分离细胞，其表达权利要求1所述的抗体。

17.一种用于结合人CD19抗原的药物组合物，其包含权利要求1所述的抗体和药学上可接受的载体。

18.一种抗体在制备治疗人的B细胞疾病或失调的药物中的用途，其特征在于，

a)所述抗体是嵌合单克隆抗体，

b)所述抗体包含VH和VL，其中所述VH由选自下组的氨基酸序列组成：SEQ ID NO：106，

c)所述VL由选自下组的氨基酸序列组成：SEQ ID NO：111，

d)所述抗体结合人CD19抗原，和

e)所述疾病或失调选自：B细胞恶性肿瘤、自身免疫病、自身免疫失调、人类移植患者的体液排斥、人类移植物接受者的移植物抗宿主病(GVHD)和移植后淋巴增殖性疾病。

19.如权利要求18所述的用途，其特征在于，所述药物消耗选自下组的B细胞：循环B细胞、血液B细胞、脾B细胞、边缘区B细胞、滤泡B细胞、腹膜B细胞和/或骨髓B细胞。

20.如权利要求18所述的用途，其特征在于，所述药物消耗选自下组的B细胞：祖B细胞、大前B细胞、小前B细胞、未成熟B细胞、成熟B细胞、抗原刺激的B细胞和/或浆细胞。

21.如权利要求20所述的用途，其特征在于，所述祖B细胞选自下组：早期祖B细胞和/或晚期祖B细胞。

22.如权利要求18所述的用途，其特征在于，所述抗体的抗原依赖性细胞介导的细胞毒性增强。

23.如权利要求19或20所述的用途，其特征在于，所述消耗使B细胞水平降低至少20％。

24.如权利要求19或20所述的用途，其特征在于，所述消耗使B细胞水平降低至少30％。

25.如权利要求19或20所述的用途，其特征在于，所述消耗使B细胞水平降低至少40％。

26.如权利要求19或20所述的用途，其特征在于，所述消耗使B细胞水平降低至少50％。

27.如权利要求19或20所述的用途，其特征在于，所述消耗使B细胞水平降低至少60％。

28.如权利要求19或20所述的用途，其特征在于，所述消耗使B细胞水平降低至少70％。

29.如权利要求19或20所述的用途，其特征在于，所述消耗使B细胞水平降低至少80％。

30.如权利要求19或20所述的用途，其特征在于，所述消耗使B细胞水平降低至少90％。

31.如权利要求19或20所述的用途，其特征在于，所述消耗使B细胞水平降低至少95％。

32.如权利要求19或20所述的用途，其特征在于，所述消耗使B细胞水平降低100％。

33.如权利要求19或20所述的用途，其特征在于，所述消耗持续至少1周。

34.如权利要求18所述的用途，其特征在于，所述抗体是人源化单克隆抗体。

35.如权利要求19或20所述的用途，其特征在于，所述消耗持续至少2周。

36.如权利要求19或20所述的用途，其特征在于，所述消耗持续至少3周。

37.如权利要求19或20所述的用途，其特征在于，所述消耗持续至少4周。

38.如权利要求19或20所述的用途，其特征在于，所述消耗持续至少5周。

39.如权利要求19或20所述的用途，其特征在于，所述消耗持续至少6周。

40.如权利要求19或20所述的用途，其特征在于，所述消耗持续至少7周。

41.如权利要求19或20所述的用途，其特征在于，所述消耗持续至少8周。