JP2009510102A - 免疫調節組成物およびその使用 - Google Patents

免疫調節組成物およびその使用 Download PDF

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Abstract

A41Lおよび130Lと呼ばれるポックスウイルスタンパク質は、免疫細胞の細胞表面に存在する3つの受容体様タンパク質チロシンホスファターゼ(RPTP)、すなわち、白血球共通抗原関連タンパク質(LAR)、RPTP-δおよびRPTP-σと結合する。宿主がポックスウイルスに感染すると、A41Lが宿主細胞の細胞表面タンパク質と結合し、免疫応答の抑制が起こる。本発明は、免疫細胞により発現されるLAR、RPTP-δおよびRPTP-σの1以上と相互作用するか、またはRPTPをコードしているポリヌクレオチドと相互作用する、抗体およびその抗原結合フラグメント、小分子、アプタマー、短い干渉RNAおよびペプチド-IgFc融合ポリペプチドなどの薬剤を提供する。このような薬剤は、本明細書に記載の方法に従って被験体の免疫障害を治療するのに有用である。
【選択図】図３

Description

CD-ROMで提出した配列表に関する陳述
本願に関する配列表は紙コピーの代わりにCD-ROMで提出し、参照により本明細書に組み入れられる。配列表の同一コピーの入った3枚のCD-ROMを提出し、CD-ROM No. 1はCOPY 1と表示し、2006年9月29日に作成した0.76MBのファイルseq_930118_401.app.txtが入っており、CD-ROM No. 2はCOPY 2と表示し、2006年9月29日に作成した0.76MBのファイルseq_930118_401.app.txtが入っており、CD-ROM No. 3はCRF (Computer Readable Form)と表示し、2006年9月29日に作成した0.76MBのファイルseq_930118_401.app.txtが入っている。
関連出願の相互参照
本願は、2005年9月29日出願の米国仮出願第60/721,876号、2006年3月22日出願の米国仮出願第60/784,710号、および2006年5月19日出願の米国仮出願第60/801,992号の利益を主張するものであり、これらは全て、参照によりそのまま本明細書に組み入れられる。
発明の分野
本発明は、免疫細胞の細胞表面に存在する3つの受容体様タンパク質チロシンホスファター(RPTP)、すなわち、白血球共通抗原関連タンパク質(LAR)、RPTP-δおよびRPTP-σの1以上の機能に、A41Lおよび130Lなどのポックスウイルスタンパク質と同一または類似の様式で作用する薬剤を提供する。このような薬剤は免疫細胞の免疫応答性を変化させるのに、または被験体において免疫障害を治療するのに有用である。
関連技術の記載
ポックスウイルスは、細胞の細胞質で複製し、非常に多くの異なる宿主で複製するように適応させた二本鎖DNAウイルス群を形成する。多くのウイルスの1つの適応機構は、ウイルスに宿主の免疫系を回避させ、および／またはウイルス複製を容易にする宿主遺伝子の獲得を含む(BugertおよびDarai, Virus Genes 21:111 (2000); Alcamiら, Semin. Virol. 8:419 (1998); McFaddenおよびBarry, Semin. Virol. 8:429 (1998))。この過程は、ポックスウイルスゲノムの比較的大きなサイズと複雑性によって容易になる。天然痘ワクチンとして広く用いられている原型ポックスウイルスであるワクシニアウイルスはおよそ190キロベースのゲノムを有し、潜在的に200を超えるタンパク質をコードしている(Goebelら, Virology 179:247 (1990))。たとえワクシニアウイルスの全ゲノムが配列決定されているとしても、潜在的な多くのオープンリーディングフレーム(ORF)の機能、およびそれによりコードされているポリペプチドの存在はまだ知られていない。
ある特定のポックスウイルスポリペプチドがそのウイルスの毒性の原因となっている。A41Lと呼ばれるORFが、Cowpoxウイルス(CPV)、ワクシニアウイルス（コペンハーゲン株、アンカラ株、ティアンタン株およびWR株）および痘瘡ウイルス（Harvey株、India-1967株およびGarcia-1966株を含む）をはじめとする数種の異なるポックスウイルスに存在する。A41L遺伝子は、ポックスウイルスに感染した細胞により分泌されるウイルス毒性因子である糖タンパク質（ここではA41Lポリペプチドと呼ぶ）をコードしている（例えば、米国特許第6,852,486号；国際特許出願公開WO98/37217; Ngら, J. Gen. Virol. 82:2095-105 (2001)参照）。A41Lは、ポックスウイルスに感染した宿主において、少なくとも部分的に、そのウイルスに特異的な免疫応答を抑制する働きをする。
さらなるウイルス毒性因子の同定や免疫細胞により発現され、A41Lと相互作用する細胞ポリペプチドの同定は、例えば多発性硬化症、関節リウマチおよび全身性紅斑性狼瘡(SLE)をはじめとする炎症性疾患および自己免疫疾患などの免疫障害の治療に有用かつ有益である。このような免疫疾患および障害の治療および予防に使用可能な組成物を特定および開発する必要がある。
発明の簡単な概要
本明細書に記載のいくつかの実施形態は、免疫疾患および障害を予防および治療する組成物および方法に関する。一実施形態では、(i)白血球共通抗原関連タンパク質(LAR)；(ii)RPTP-σ；および(iii)RPTP-δから選択される少なくとも2つの受容体様タンパク質チロシンホスファターゼ(RPTP)ポリペプチドと特異的に結合し、かつ、(b)ポックスウイルスポリペプチドと該少なくとも2つのRPTPポリペプチドとの結合を競合的に阻害する、単離された抗体またはその抗原結合フラグメントが提供される。別の実施形態では、この単離された抗体またはその抗原結合フラグメントは、免疫細胞の細胞表面に存在する少なくとも1つの受容体様タンパク質チロシンホスファターゼ(RPTP)と特異的に結合し、該少なくとも1つのRPTPはRPTP-σまたはRPTP-δであり、該抗体またはその抗原結合フラグメントと免疫細胞の細胞表面上に存在する該RPTPとの結合が免疫細胞の免疫応答性を抑制する。特定の実施形態では、該抗体はポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体である。他の特定の実施形態では、該抗原結合フラグメントはF(ab´)2、Fab´、Fab、Fd、Fvおよび単鎖Fv(scFv)から選択される。別の実施形態では、該ポックスウイルスポリペプチドはA41Lまたはヤバ様病ウイルス130Lのいずれかである。さらに本明細書では、抗体またはその抗原結合フラグメントのいずれかと製薬上好適な賦形剤とを含む組成物である。また、別の実施形態では、被験体において免疫応答を抑制する方法であって、被験体に該組成物を投与することを含む方法が提供される。さらに別の実施形態では、被験体において免疫疾患または免疫障害を治療する方法であって、被験体に該組成物を投与することを含む方法が提供される。別の実施形態では、該組成物を作製するための製造方法が提供される。
また、本明細書では、(a)受容体様タンパク質チロシンホスファターゼ(RPTP)と特異的に結合し得る第一の抗原結合部分〔該RPTPは、(i)白血球共通抗原関連タンパク質(LAR)；(ii)RPTP-σ；および(iii)RPTP-δから選択される〕と、(b)RPTPと特異的に結合し得る第二の抗原結合部分〔該RPTPは、(i)白血球共通抗原関連タンパク質(LAR)；(ii)RPTP-σ；および(iii)RPTP-δから選択される〕とを含み、該第一の抗原結合部分と第二の抗原結合部分が異なり、免疫細胞の免疫応答性を抑制する二重特異性抗体が提供される。また、二重特異性抗体と製薬上好適な賦形剤とを含む組成物も提供される。また、別の実施形態では、被験体において免疫応答を抑制する方法であって、被験体に該組成物を投与することを含む方法が提供される。さらに別の実施形態では、被験体において免疫疾患または免疫障害を治療する方法であって、被験体に該組成物を投与することを含む方法が提供される。また、さらに別の実施形態では、二重特異性抗体を製造する方法が提供される。
別の実施形態では、(a)第一の受容体様タンパク質チロシンホスファターゼ(RPTP)の免疫グロブリン様ドメイン2ポリペプチド；(b)第二のRPTPの免疫グロブリン様ドメイン3ポリペプチド；および(c)免疫グロブリンFcポリペプチドまたはそのムテインを含み、該第一のRPTPおよび第二のRPTPがそれぞれ、(i)白血球共通抗原関連タンパク質(LAR)；(ii)RPTP-σ；および(iii)RPTP-δから選択され、該第一と第二のRPTPが同一または異なる、融合ポリペプチドが提供される。1つの特定の実施形態では、第一のRPTPと第二のRPTPは同一である。別の特定の実施形態では、第一のRPTPはRPTP-σであり、第二のRPTPはRPTP-σであって、融合ポリペプチドはRPTP-σの免疫グロブリン様ドメイン1ポリペプチドをさらに含む。さらに別の実施形態では、第一のRPTPはRPTP-δであり、第二のRPTPはRPTP-δであって、融合ポリペプチドはRPTP-δの免疫グロブリン様ドメイン1ポリペプチドをさらに含む。また、融合ポリペプチドと製薬上好適な賦形剤とを含む組成物も提供される。また、別の実施形態では、被験体において免疫応答を抑制する方法であって、被験体に該組成物を投与することを含む方法が提供される。さらに別の実施形態では、被験体において免疫疾患または免疫障害を治療する方法であって、被験体に該組成物を投与することを含む方法が提供される。別の実施形態では、該融合ポリペプチドを作製するための製造方法が提供される。
また、(a)第一の受容体様タンパク質チロシンホスファターゼ(RPTP)の少なくとも1つの免疫グロブリン様ドメイン2ポリペプチドと(b)第二のRPTPの少なくとも1つの免疫グロブリン様ドメイン3ポリペプチドとを含み、該第一と第二のRPTPが同一または異なり、(i)白血球共通抗原関連タンパク質(LAR)；(ii)RPTP-σ；および(iii)RPTP-δから選択される組成物が提供される。特定の実施形態では、該第一のRPTPと第二のRPTPは同一であり、別の特定の実施形態では、該第一のRPTPと第二のRPTPは異なる。1つの特定の実施形態では、第一のRPTPはRPTP-σであり、第二のRPTPはRPTP-σであり、組成物はRPTP-σの免疫グロブリン様ドメイン1ポリペプチドをさらに含む。さらに別の特定の実施形態では、第一のRPTPはRPTP-δであり、第二のRPTPはRPTP-δであって、組成物はRPTP-δの免疫グロブリン様ドメイン1ポリペプチドをさらに含む。
また、ポリペプチド二量体を含む組成物であって、該ポリペプチド二量体が、(a)第一の受容体様タンパク質チロシンホスファターゼ(RPTP)の免疫グロブリン様ドメイン2ポリペプチドと免疫グロブリン様ドメイン3ポリペプチドを含む第一の単量体と、(b)第二のRPTPの免疫グロブリン様ドメイン2ポリペプチドと免疫グロブリン様ドメイン3ポリペプチドを含む第二の単量体を含み、ここで該第一と第二のRPTPは同一または異なり、かつ、(i)白血球共通抗原関連タンパク質(LAR)；(ii)RPTP-σ；および(iii)RPTP-δから選択される、組成物も提供される。1つの特定の実施形態では、第一のRPTPと第二のRPTPは異なる。別の特定の実施形態では、第一のRPTPと第二のRPTPは同一である。特定の実施形態では、第一の単量体は第一のRPTの免疫グロブリン様ドメイン1をさらに含み、第二の単量体は第二のRPTPの免疫グロブリン様ドメイン1をさらに含む。別の特定の実施形態では、第一の単量体は免疫グロブリンFcポリペプチドと融合され、第二の単量体は免疫グロブリンFcポリペプチドと融合されている。
他の特定の実施形態では、本明細書に記載の組成物はそれぞれ製薬上好適な賦形剤をさらに含む。また、別の実施形態では、被験体において免疫応答を抑制する方法であって、被験体に該組成物を投与することを含む方法も提供される。さらに別の実施形態では、被験体において免疫疾患または免疫障害を治療する方法であって、被験体に該組成物を投与することを含む方法が提供される。別の実施形態では、該組成物を作製する製造方法が提供される。
別の実施形態では、ムテインFcポリペプチドと融合されたポックスウイルスポリペプチドを含み、該ムテインFcポリペプチドが、少なくとも1つの突然変異を含むヒトIgG1免疫グロブリンのFc部分のアミノ酸配列を含み、該少なくとも1つの突然変異がヒンジ領域におけるシステイン残基の置換または欠失であり、この置換または欠失したシステイン残基が、野生型ヒトIgG1免疫グロブリンFc部分のヒンジ領域のアミノ末端に最も近いシステイン残基であり、該ポックスウイルスポリペプチドが、(i)白血球共通抗原関連タンパク質(LAR)；(ii)RPTP-σ；および(iii)RPTP-δから選択される受容体様タンパク質チロシンホスファターゼ(RPTP)と結合し得る、融合ポリペプチドが提供される。1つの特定の実施形態では、該ムテインFcポリペプチドは少なくとも1つの第二の突然変異を含み、該少なくとも1つの第二の突然変異は、融合ポリペプチドのIgG Fc受容体結合能が低下するようなCH2ドメインにおける少なくとも1つのアミノ酸の置換である。
また、本明細書では、融合ポリペプチドのいずれか1つを含み、製薬上好適な賦形剤をさらに含む組成物も提供される。また、(a)上記の抗体またはその抗原結合フラグメントと、(b)製薬上好適な賦形剤とを含む組成物も提供される。また、別の実施形態では、被験体において免疫応答を抑制する方法であって、被験体に該組成物を投与することを含む方法も提供される。さらに別の実施形態では、被験体において免疫疾患または免疫障害を治療する方法であって、被験体に該組成物を投与することを含む方法が提供される。別の実施形態では、該融合ポリペプチドを作製する製造方法が提供される。
一実施形態では、(a)(i)白血球共通抗原関連タンパク質(LAR)；(ii)RPTP-σ；および(iii)RPTP-δから選択される少なくとも2つの受容体様タンパク質チロシンホスファターゼ(RPTP)ポリペプチドと特異的に結合し、かつ、(b)A41Lと該少なくとも2つのRPTPポリペプチドとの結合を競合的に阻害する、単離された抗体またはその抗原結合フラグメントが提供される。特定の実施形態では、該抗体はLARとRPTP-σに特異的に結合するか、または該抗体はLARとRPTP-δに特異的に結合するか、または該抗体はRPTP-σとRPTP-δに特異的に結合する。別の特定の実施形態では、該抗体はLAR、RPTP-σおよびRPTP-δに特異的に結合する。
別の実施形態では、受容体様タンパク質チロシンホスファターゼ-シグマ(RPTP-σ)または受容体様タンパク質チロシンホスファターゼ-デルタ(RPTP-δ)のいずれか、またはその双方と特異的に結合し、該抗体またはその抗原結合フラグメントの結合がA41LとRPTP-σ、RPTP-δまたはその双方との結合を阻害する、単離された抗体またはその抗原結合フラグメントが提供される。
さらに別の実施形態では、(a)白血球共通抗原関連タンパク質(LAR)；(ii)RPTP-σ；および(iii)RPTP-δから選択される少なくとも2つの受容体様タンパク質チロシンホスファターゼ(RPTP)ポリペプチドと特異的に結合し、かつ、(b)該RPTPポリペプチドの少なくとも1つを発現する免疫細胞の免疫応答性を抑制する、単離された抗体またはその抗原結合フラグメントが提供される。特定の実施形態では、該抗体はLARとRPTP-σに特異的に結合するか、または該抗体はLARとRPTP-δに特異的に結合するか、または該抗体はRPTP-σとRPTP-δに特異的に結合する。別の特定の実施形態では、該抗体はLARｍ RPTP-σおよびRPTP-δに特異的に結合する。
なおさらに別の実施形態では、単離された抗体またはその抗原結合フラグメントは、(a)(i)白血球共通抗原関連タンパク質(LAR)；(ii)RPTP-σ；および(iii)RPTP-δから選択される少なくとも2つの受容体様タンパク質チロシンホスファターゼ(RPTP)ポリペプチドと特異的に結合し、かつ、(b)A41Lと、LAR；(ii)RPTP-σ；および(iii)RPTP-δの少なくとも1つを発現する免疫細胞との結合を阻害する。特定の実施形態では、該抗体はLARとRPTP-σに特異的に結合するか、または該抗体はLARとRPTP-δに特異的に結合するか、または該抗体はRPTP-σとRPTP-δに特異的に結合する。別の特定の実施形態では、該抗体はLAR、RPTP-σおよびRPTP-δに特異的に結合する。
一実施形態では、受容体様タンパク質チロシンホスファターゼ-シグマ(RPTP-σ)と特異的に結合し、該抗体またはその抗原結合フラグメントと免疫細胞の細胞表面に存在するRPTP-σとの結合が免疫細胞の免疫応答性を抑制する、単離された抗体またはその抗原結合フラグメントが提供される。別の実施形態では、受容体様タンパク質チロシンホスファターゼ-デルタ(RPTP-δ)と特異的に結合し、該抗体またはその抗原結合フラグメントと免疫細胞の細胞表面に存在するRPTP-δとの結合がRPTP-δを発現する免疫細胞の免疫応答性を抑制する、単離された抗体またはその抗原結合フラグメントが提供される。さらに別の実施形態では、受容体様タンパク質チロシンホスファターゼ-シグマ(RPTP-σ)または受容体様タンパク質チロシンホスファターゼ-デルタ(RPTP-δ)のいずれかまたはRPTP-σとRPTP-δの双方と特異的に結合し、該抗体またはその抗原結合フラグメントと免疫細胞の細胞表面に存在するRPTP-σまたはPTP-δのいずれかまたはRPTP-σとRPTP-δの双方との結合が免疫細胞の免疫応答性を抑制する、単離された抗体またはその抗原結合フラグメントが提供される。
ある特定の実施形態では、上記抗体のいずれか1つに関して、該抗体はポリクローナル抗体である。他の特定の実施形態では、該抗体はモノクローナル抗体である。別の特定の実施形態では、該モノクローナル抗体はマウスモノクローナル抗体、ヒトモノクローナル抗体、ラットモノクローナル抗体およびハムスターモノクローナル抗体から選択される。本明細書ではまた、モノクローナル抗体を発現する宿主細胞が提供され、ある特定の実施形態では、該宿主細胞はハイブリドーマ細胞である。別の特定の実施形態では、該抗体はヒト化抗体またはキメラ抗体である。別の実施形態では、ヒト化抗体またはキメラ抗体を発現する宿主細胞が提供される。
別の特定の実施形態では、上記抗体（またはその抗原結合フラグメント）のいずれか1つと製薬上好適な担体とを含む組成物が提供される。また、別の実施形態では、上記抗体またはその抗原結合フラグメントのいずれかを作製するための製造方法が提供される。
他の特定の実施形態では、上記抗体のいずれか1つの抗原結合フラグメントのいずれか1つに関して、該抗原結合フラグメントはF(ab´)2、Fab´、Fab、FdおよびFvから選択される。別の特定の実施形態では、該抗原結合フラグメントはヒト起源、マウス起源、ニワトリ起源またはウサギ起源のものである。さらに別の特定の実施形態では、該抗原結合フラグメントは単鎖Fv(scFv)である。別の特定の実施形態では、上記抗体のいずれか1つの抗原結合フラグメントのいずれか1つと製薬上好適な担体とを含む組成物が提供される。
また、別の実施形態では、上記抗体のいずれか1つまたはその抗原結合フラグメントと特異的に結合する抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合フラグメントを含む単離された抗体が提供される。ある特定の実施形態では、該抗イディオタイプ抗体はポリクローナル抗体である。他の特定の実施形態では、該抗イディオタイプ抗体はモノクローナル抗体である。本明細書ではまた、抗イディオタイプ抗体を発現する宿主細胞が提供される。ある特定の実施形態では、該宿主細胞はハイブリドーマ細胞である。別の特定の実施形態では、抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合フラグメントと製薬上好適な担体とを含む組成物が提供される。
一実施形態では、また、(a)RPTPと特異的に結合し得る第一の抗原結合部分〔該RPTPは、(i)白血球共通抗原関連タンパク質(LAR)；(ii)RPTP-σ；および(iii)RPTP-δから選択される〕と、(b)RPTPと特異的に結合し得る第二の抗原結合部分〔該RPTPは、(i)白血球共通抗原関連タンパク質(LAR)；(ii)RPTP-σ；および(iii)RPTP-δから選択される〕とを含み、免疫細胞の免疫応答性を抑制する二重特異性抗体も提供される。特定の実施形態では、該第一の抗原結合部分はLARと特異的に結合し得るものであり、該第二の抗原結合部分はRPTP-σと特異的に結合し得るものである。別の特定の実施形態では、該第一の抗原結合部分はLARと特異的に結合し得るものであり、該第二の抗原結合部分はRPTP-δと特異的に結合し得るものである。さらに別の特定の実施形態では、該第一の抗原結合部分はRPTP-σと特異的に結合し得るものであり、該第二の抗原結合部分はRPTP-δと特異的に結合し得るものである。別の特定の実施形態では、二重特異性抗体と製薬上好適な担体とを含む組成物が提供される。
別の実施形態では、少なくとも1つの免疫グロブリン定常領域ドメインと融合された、(i)白血球共通抗原関連タンパク質(LAR)；(ii)RPTP-σ；および(iii)RPTP-δから選択されるRPTPの少なくとも1つの免疫グロブリン様ドメインを含む融合ポリペプチドが提供される。特定の実施形態では、該RPTPの少なくとも1つの免疫グロブリン様ドメインは免疫グロブリンFcポリペプチドと融合されている。特定の実施形態では、該FcポリペプチドはヒトIgG1免疫グロブリンに由来する。別の特定の実施形態では、該RPTPはLARであり、該融合ポリペプチドは免疫細胞の免疫応答性を抑制する。特定の実施形態では、該Fcポリペプチドは、ヒンジ領域におけるシステイン残基の置換または欠失を含むムテインFcポリペプチドであり、この置換または欠失したシステイン残基は野生型IgG1免疫グロブリンのFc部分のヒンジ領域のアミノ末端に最も近いシステイン残基である。さらに別の特定の実施形態では、該Fcポリペプチドは、融合ポリペプチドのIgG Fc受容体結合能が低下するようなムテインFcポリペプチドのCH2ドメインにおける少なくとも1つのアミノ酸残基の置換を含むムテインFcポリペプチドである。なおさらに別の特定の実施形態では、該ムテインFcポリペプチドはヒンジ領域におけるシステイン残基の置換または欠失をさらに含み、この置換または欠失したシステイン残基は野生型IgG1免疫グロブリンのFc部分のヒンジ領域のアミノ末端に最も近いシステイン残基である。さらに別の特定の実施形態では、該RPTPはRPTP-σであり、該融合ポリペプチドは免疫細胞の免疫応答性を抑制する。別の特定の実施形態では、該RPTPはRPTP-δであり、該融合ポリペプチドは免疫細胞の免疫応答性を抑制する。別の特定の実施形態では、該融合ポリペプチドと製薬上好適な担体とを含む組成物が提供される。
一実施形態では、白血球共通抗原関連タンパク質(LAR)；(ii)RPTP-σ；および(iii)RPTP-δから選択される少なくとも2つの受容体様タンパク質チロシンホスファターゼ(RPTP)ポリペプチドと特異的に結合し、かつ、(b)A41LとLAR、RPTP-σおよびRPTP-δのいずれか1つとの結合を妨げる薬剤が提供される。ある特定の実施形態では、該薬剤は、A41Lと免疫細胞の細胞表面に存在するLAR、RPTP-σおよびRPTP-δのいずれか1つとの結合を妨げる。他の特定の実施形態では、該薬剤は抗体またはその抗原結合フラグメント；小分子；アプタマー；およびペプチド-IgFc融合ポリペプチドから選択される。別の特定の実施形態では、該薬剤と製薬上好適な担体とを含む組成物が提供される。
また、一実施形態では、白血球共通抗原関連タンパク質(LAR)；(ii)RPTP-σ；および(iii)RPTP-δから選択される少なくとも2つの受容体様タンパク質チロシンホスファターゼ(RPTP)ポリペプチドの発現を特異的に妨げる薬剤が提供される。特定の実施形態では、該薬剤はアンチセンスポリヌクレオチドを含み、別の特定の実施形態では、該薬剤はshort interfering RNA (siRNA)を含む。別の特定の実施形態では、該薬剤と製薬上好適な担体とを含む組成物が提供される。
別の実施形態では、免疫細胞の免疫応答性を抑制する薬剤を同定する方法であって、(a)(1)候補薬剤と；(2)(i)白血球共通抗原関連タンパク質(LAR)；(ii)RPTP-σ；および(iii)RPTP-δから選択される少なくとも1つの受容体様タンパク質チロシンホスファターゼ(RPTP)ポリペプチドを発現する免疫細胞と；(3)A41Lとを、少なくとも1つのRPTPポリペプチドとA41Lの間の相互作用を可能とするのに十分な条件および時間で接触させること；および(b)その候補薬剤の存在下でA41Lと免疫細胞の結合のレベルを測定し、候補薬剤の不在下でのA41Lと免疫細胞の結合のレベルと比較することを含み、候補薬剤の存在下でA41Lと免疫細胞の結合のレベルが低下していれば、その候補薬剤が免疫細胞の免疫応答性を抑制することを示す方法が提供される。特定の実施形態では、該免疫細胞は(i)LAR；(ii)RPTP-σ；および(iii)RPTP-δから選択される少なくとも2つのRPTPポリペプチドを発現する。
本明細書ではまた、A41Lと少なくとも2つの受容体様タンパク質チロシンホスファターゼ(RPTP)ポリペプチドとの結合を阻害する薬剤を同定する方法であって、(a)(1)候補薬剤と；(2)(i)白血球共通抗原関連タンパク質(LAR)；(ii)RPTP-σ；および(iii)RPTP-δから選択される少なくとも2つのRPTPポリペプチドを含む生物学的サンプルと；(3)A41Lとを、少なくとも2つのRPTPポリペプチドとA41Lの間の相互作用を可能とするのに十分な条件および時間で接触させること；および(b)その候補薬剤の存在下でA41Lと少なくとも2つのRPTPポリペプチドの結合のレベルを測定し、候補薬剤の不在下でのA41Lと少なくとも2つのRPTPポリペプチドの結合のレベルと比較することを含み、候補薬剤の存在下でA41Lと少なくとも2つのRPTPポリペプチドの結合のレベルが低下していれば、その候補薬剤がA41Lと少なくとも2つのRPTPポリペプチドの結合を阻害することを示す方法が提供される。
別の実施形態では、製薬上好適な担体と、受容体様タンパク質チロシンホスファターゼ(RPTP)-σと特異的に結合する抗体またはその抗原結合フラグメントとを含む組成物を投与することを含む、被験体において免疫応答を抑制する方法が提供される。一実施形態では、製薬上好適な担体と、受容体様タンパク質チロシンホスファターゼ(RPTP)-δと特異的に結合する抗体またはその抗原結合フラグメントを含む組成物を投与することを含む、被験体において免疫応答を抑制する方法が提供される。別の実施形態では、製薬上好適な担体と、(i)白血球共通抗原関連タンパク質(LAR)；(ii)RPTP-σ；および(iii)RPTP-δから選択される少なくとも2つの受容体様タンパク質チロシンホスファターゼ(RPTP)ポリペプチドと特異的に結合する抗体またはその抗原結合フラグメントとを含む組成物を投与することを含む、被験体において免疫応答を抑制する方法が提供される。
一実施形態では、被験体において免疫疾患または免疫障害を治療する方法であって、被験体に、製薬上好適な担体と、(a)少なくとも1つの受容体様タンパク質チロシンホスファターゼ(RPTP)ポリペプチドの生物活性を変化させるか（該RPTPはRPTP-σまたはRPTP-δのいずれかである）；または(b)白血球共通抗原関連タンパク質(LAR)；(ii)RPTP-σ；および(iii)RPTP-δから選択される少なくとも2つのRPTPポリペプチドの生物活性を変化させる薬剤とを含む組成物を投与することを含む方法が提供される。特定の実施形態では、該免疫疾患または免疫障害は自己免疫疾患または炎症性疾患である。ある特定の実施形態では、該自己免疫疾患または炎症性疾患は多発性硬化症、関節リウマチ、全身性紅斑性狼瘡、移植片対宿主病、敗血症、糖尿病、乾癬、アテローム性動脈硬化症、シェーグレン症候群、進行性全身性硬化症、硬皮症、急性冠動脈症候群、虚血性再潅流、クローン病、子宮内膜症、糸球体腎炎、重症筋無力症、特発性肺繊維症、喘息、急性呼吸窮迫症候群(ARDS)、脈管炎、または炎症性自己免疫性筋炎である。別の特定の実施形態では、該薬剤は抗体またはその抗原結合フラグメント；小分子；アプタマー；アンチセンスポリヌクレオチド；短い干渉RNA(siRNA)；およびペプチド-IgFc融合ポリペプチドから選択される。
一実施形態では、被験体において細胞移動、細胞増殖および細胞分化の少なくとも1つの変化に関連する疾病または障害を治療する方法であって、被験体に、製薬上好適な担体と、(a)受容体様タンパク質チロシンホスファターゼ(RPTP)-σまたはRPTP-δの少なくとも1つの生物活性を変化させるか、または(b)(i)白血球共通抗原関連タンパク質(LAR)；(ii)RPTP-σ；および(iii)RPTP-δから選択される少なくとも2つのRPTPポリペプチドの生物活性を変化させる薬剤とを投与することを含む方法が提供される。ある特定の実施形態では、該疾病または障害は免疫疾患または免疫障害、心血管疾病または心血管障害、代謝性疾病または代謝性障害、あるいは増殖性疾患または増殖性障害である。特定の実施形態では、該免疫疾患または免疫障害は自己免疫疾患または炎症性疾患である。別の特定の実施形態では、該免疫疾患または免疫障害は多発性硬化症、関節リウマチ、全身性紅斑性狼瘡、移植片対宿主病、敗血症、糖尿病、乾癬、アテローム性動脈硬化症、シェーグレン症候群、進行性全身性硬化症、硬皮症、急性冠動脈症候群、虚血性再潅流、クローン病、子宮内膜症、糸球体腎炎、重症筋無力症、特発性肺繊維症、喘息、急性呼吸窮迫症候群(ARDS)、脈管炎、または炎症性自己免疫性筋炎である。別の特定の実施形態では、該心血管疾病または心血管障害はアテローム性動脈硬化症、心内膜炎、高血圧症、または末梢虚血性疾患である。別の特定の実施形態では、該薬剤は抗体またはその抗原結合フラグメント；小分子；アプタマー；アンチセンスポリヌクレオチド；短い干渉RNA(siRNA)；およびペプチド-IgFc融合ポリペプチドから選択される。
別の実施形態では、免疫細胞の免疫応答性を抑制する薬剤を生産するための製造方法であって、(a)免疫細胞の免疫応答性を抑制する薬剤を同定すること〔該同定工程は、(1)(i)候補薬剤と；(ii)白血球共通抗原関連タンパク質(LAR)；RPTP-σ；およびRPTP-δから選択される少なくとも1つの受容体様タンパク質チロシンホスファターゼ(RPTP)ポリペプチドを発現する免疫細胞と；(iii)A41Lとを、少なくとも1つのRPTPポリペプチドとA41Lの相互作用を可能とするのに十分な条件および時間で接触させること；および(2)候補薬剤の存在下でA41Lと免疫細胞の結合のレベルを測定し、候補薬剤の不在下でのA41Lと免疫細胞の結合のレベルと比較することを含み、候補薬剤の存在下でA41Lと免疫細胞の結合のレベルが低下していれば、その候補薬剤が免疫細胞の免疫応答性を抑制することを示す〕、ならびに(b)工程(a)で同定された薬剤を生産することを含む方法が提供される。ある特定の実施形態では、該薬剤は抗体またはその抗原結合フラグメント；小分子；アプタマー；アンチセンスポリヌクレオチド；短い干渉RNA(siRNA)；およびペプチド-IgFc融合ポリペプチドから選択される。別の特定の実施形態では、該薬剤は抗体またはその抗原結合フラグメントである。
一実施形態では、融合ポリペプチドは、ムテインFcポリペプチドとフレーム内(in frame)で融合されたA41Lポリペプチドを含み、該ムテインFcポリペプチドはヒトIgG1免疫グロブリンのFc部分のアミノ酸配列を含み、該ムテインFcポリペプチドは、少なくとも2つの突然変異を含むことで野生型ヒトIgG1免疫グロブリンのFc部分と異なり、該ムテインFcポリペプチドの第一の突然変異は、融合ポリペプチドのIgG Fc受容体結合能が低下するような、CH2ドメインにおける少なくとも1つのアミノ酸の置換を含み、該ムテインFcポリペプチドの第二の突然変異はヒンジ領域におけるシステイン残基の置換または欠失であり、該システイン残基は野生型ヒトIgG1免疫グロブリンのヒンジ領域のアミノ末端に最も近いシステイン残基である。特定の実施形態では、該ムテインFcポリペプチドは、CH2ドメインにおける少なくとも2つのアミノ酸の置換を含む。別の特定の実施形態では、該ムテインFcポリペプチドは、CH2ドメインにおける少なくとも3つのアミノ酸の置換を含む。さらに別の特定の実施形態では、CH2ドメインにおいて置換されているアミノ酸は、ヒトIgG免疫グロブリンのCH2ドメインにおけるEU位置番号235番に相当する位置にある。さらに別の特定の実施形態では、置換されている第一のアミノ酸はヒトIgG免疫グロブリンのCH2ドメインにおけるEU234番に相当する位置にあり、置換されている第二のアミノ酸はヒトIgG免疫グロブリンのCH2ドメインにおけるEU235番に相当する位置にある。さらに別の特定の実施形態では、置換されている第一のアミノ酸はヒトIgG免疫グロブリンのCH2ドメインにおけるEU234番に相当する位置にあり、置換されている第二のアミノ酸はヒトIgG免疫グロブリンのCH2ドメインにおけるEU235番に相当する位置にあり、置換されている第三のアミノ酸はヒトIgG免疫グロブリンのCH2ドメインにおけるEU237番に相当する位置にある。ある特定の実施形態では、ヒトIgG免疫グロブリンのCH2ドメインにおけるEU235番に相当する位置にあるロイシン残基がグルタミン酸残基またはアラニン残基で置換されている。別の特定の実施形態では、ヒトIgG免疫グロブリンのCH2ドメインにおけるEU234番に相当する位置にあるロイシン残基がアラニン残基で置換されている。さらに別の特定の実施形態では、ヒトIgG免疫グロブリンのCH2ドメインにおけるEU237番に相当する位置にあるグリシン残基がアラニン残基で置換されている。別の特定の実施形態では、該ムテインFcポリペプチドは、ヒンジ領域における少なくとも1つの非システイン残基の置換または欠失をさらに含む。別の特定の実施形態では、該ムテインFcポリペプチドはヒンジ領域における少なくとも2つのアミノ酸残基の欠失を含み、該少なくとも2つのアミノ酸残基はシステイン残基とその隣接するC末端残基を含み、該システイン残基は野生型ヒトIgG1免疫グロブリンのヒンジ領域のアミノ末端に最も近いシステイン残基である。特定の実施形態では、該融合ポリペプチドは配列番号73で示されるアミノ酸配列を含む。
本明細書ではまた、被験体において免疫応答を抑制する方法であって、製薬上好適な担体と、上記のムテインFcポリペプチドとフレーム内で融合されたA41Lポリペプチドを含む融合ポリペプチドとを含む組成物を投与することを含む方法が提供される。特定の実施形態では、該融合ポリペプチドは、(a)受容体様タンパク質チロシンホスファターゼ(RPTP)-σおよびRPTP-δの少なくとも1つの生物活性を変化させるか、または(b)(i)白血球共通抗原関連タンパク質(LAR)；(ii)RPTP-σ；および(iii)RPTP-δから選択される少なくとも2つのRPTPポリペプチドの生物活性を変化させる。
別の実施形態では、被験体において免疫疾患または免疫障害を治療する方法であって、被験体に、製薬上好適な担体と、上記のムテインFcポリペプチドとフレーム内で融合されたA41Lポリペプチドを含む融合ポリペプチドとを投与することを含む方法が提供される。特定の実施形態では、該融合ポリペプチドは、(a)受容体様タンパク質チロシンホスファターゼ(RPTP)-σおよびRPTP-δの少なくとも1つの生物活性を変化させるか、または(b)(i)白血球共通抗原関連タンパク質(LAR)；(ii)RPTP-σ；および(iii)RPTP-δから選択される少なくとも2つのRPTPポリペプチドの生物活性を変化させる。別の特定の実施形態では、該免疫疾患または免疫障害は自己免疫疾患または炎症性疾患であり、ある特定の実施形態では、該自己免疫疾患または炎症性疾患は多発性硬化症、関節リウマチ、全身性紅斑性狼瘡、移植片対宿主病、敗血症、糖尿病、乾癬、アテローム性動脈硬化症、シェーグレン症候群、進行性全身性硬化症、硬皮症、急性冠動脈症候群、虚血性再潅流、クローン病、子宮内膜症、糸球体腎炎、重症筋無力症、特発性肺繊維症、喘息、急性呼吸窮迫症候群(ARDS)、脈管炎、または炎症性自己免疫性筋炎である。
一実施形態では、被験体において細胞移動、細胞増殖および細胞分化の少なくとも1つの変化に関連する疾病または障害を治療する方法であって、被験体に、製薬上好適な担体と、上記のムテインFcポリペプチドとフレーム内で融合されたA41Lポリペプチドを含む融合ポリペプチドとを投与することを含む方法が提供される。特定の実施形態では、該融合ポリペプチドは、(a)受容体様タンパク質チロシンホスファターゼ(RPTP)-σまたはRPTP-δの少なくとも１つの生物活性を変化させるか、または(b)(i)白血球共通抗原関連タンパク質(LAR)；(ii)RPTP-σ；および(iii)RPTP-δから選択される少なくとも2つのRPTPポリペプチドの生物活性を変化させる。別の実施形態では、該疾病または障害は免疫疾患または免疫障害、心血管疾病または心血管障害、代謝性疾病または代謝性障害、あるいは増殖性疾患または増殖性障害である。特定の実施形態では、該免疫疾患または免疫障害は自己免疫疾患または炎症性疾患である。別の特定の実施形態では、該免疫疾患または免疫障害は多発性硬化症、関節リウマチ、全身性紅斑性狼瘡、移植片対宿主病、敗血症、糖尿病、乾癬、アテローム性動脈硬化症、シェーグレン症候群、進行性全身性硬化症、硬皮症、急性冠動脈症候群、虚血性再潅流、クローン病、子宮内膜症、糸球体腎炎、重症筋無力症、特発性肺繊維症、喘息、急性呼吸窮迫症候群(ARDS)、脈管炎、または炎症性自己免疫性筋炎である。さらに別の特定の実施形態では、該心血管疾病または心血管障害はアテローム性動脈硬化症、心内膜炎、高血圧症、または末梢の虚血性疾患である。別の実施形態では、上記のムテインFcポリペプチドとフレーム内で融合されたA41Lポリペプチドを含む融合ポリペプチドを生産するための製造方法が提供される。
別の実施形態では、(a)(i)白血球共通抗原関連タンパク質(LAR)；(ii)RPTP-σ；および(iii)RPTP-δから選択される少なくとも1つの受容体様タンパク質チロシンホスファターゼ(RPTP)ポリペプチドと特異的に結合し、かつ、(b)130Lポリペプチドと該少なくとも1つのRPTPポリペプチドとの結合を競合的に阻害する単離された抗体またはその抗原結合フラグメントが提供され、該130Lポリペプチドのアミノ酸配列は配列番号85または配列番号150で示されるアミノ酸配列と少なくとも80%同一である。特定の実施形態では、該130Lポリペプチドは、(i)LAR;(ii)RPTP-σ；および(iii)RPTP-δから選択される少なくとも2つのRPTPポリペプチドと特異的に結合し、別の特定の実施形態では、該130Lポリペプチドは、(i)LAR;(ii)RPTP-σ；および(iii)RPTP-δと特異的に結合する。ある特定の実施形態では、該抗体またはその抗原結合フラグメントはLARとRPTP-σに特異的に結合する。別の特定の実施形態では、該抗体またはその抗原結合フラグメントはLARとPTP-δに特異的に結合する。さらに別の特定の実施形態では、該抗体またはその抗原結合フラグメントはRPTP-σとRPTP-δに特異的に結合する。別の実施形態では、該抗体または抗原結合フラグメントは、該RPTPポリペプチドの少なくとも1つを発現する免疫細胞の免疫応答性を変化させる。特定の実施形態では、免疫細胞の免疫応答性を変化させることは、免疫細胞の免疫応答性を抑制することである。
別の実施形態では、(a)(i)白血球共通抗原関連タンパク質(LAR)；(ii)RPTP-σ；および(iii)RPTP-δから選択される少なくとも1つの受容体様タンパク質チロシンホスファターゼ(RPTP)ポリペプチドと特異的に結合し、かつ、(b)130Lポリペプチドと(i)LAR;(ii)RPTP-σ；および(iii)RPTP-δの少なくとも1つを発現する免疫細胞との結合を阻害する、単離された抗体またはその抗原結合フラグメントが提供され、該130Lポリペプチドのアミノ酸配列は配列番号85または配列番号150で示されるアミノ酸配列と少なくとも80%同一である。特定の実施形態では、該130Lポリペプチドのアミノ酸配列は、(a)配列番号85または配列番号150で示されるアミノ酸配列を含むか；(b)配列番号85または配列番号150と少なくとも95%同一であるか；(c)配列番号85または配列番号150と少なくとも90%同一であるか；あるいは(d)配列番号85または配列番号150と少なくとも85%同一である。ある特定の実施形態では、該抗体またはその抗原結合フラグメントはLARとRPTP-σに特異的に結合する。別の特定の実施形態では、該抗体またはその抗原結合フラグメントはLARとRPTP-δに特異的に結合する。さらに別の特定の実施形態では、該抗体またはその抗原結合フラグメントはRPTP-σとRPTP-δに特異的に結合する。別の特定の実施形態では、該抗体またはその抗原結合フラグメントはLAR、RPTP-σおよびRPTP-δに特異的に結合する。
本明細書ではまた、受容体様タンパク質チロシンホスファターゼ-シグマ(RPTP-σ)または受容体様タンパク質チロシンホスファターゼ-デルタ(RPTP-δ)のいずれかまたは双方と特異的に結合し、該抗体またはその抗原結合フラグメントの結合が、(i)白血球共通抗原関連タンパク質(LAR)；(ii)RPTP-σ；および(iii)RPTP-δから選択されるRPTPを発現する免疫細胞の免疫応答性を変化させる、単離された抗体またはその抗原結合フラグメントが提供される。ある特定の実施形態では、免疫細胞の免疫応答性を変化させることが免疫細胞の免疫応答性を抑制することである。
ある特定の実施形態では、上記の、また本明細書に記載の抗体のいずれか1つがポリクローナル抗体である。別の特定の実施形態では、該抗体はモノクローナル抗体である。ある特定の実施形態では、該モノクローナル抗体は、マウスモノクローナル抗体、ヒトモノクローナル抗体、ラットモノクローナル抗体およびハムスターモノクローナル抗体から選択される。本明細書ではまた、抗体などを発現する宿主細胞が提供され、特定の実施形態では、該宿主細胞はハイブリドーマ細胞である。他の実施形態では、上記の、また本明細書に記載の抗体のいずれか1つがヒト化抗体またはキメラ抗体である。本明細書ではまた、該ヒト化抗体またはキメラ抗体を発現する宿主細胞が提供される。他の特定の実施形態では、該抗原結合フラグメントはF(ab´)2、Fab´、Fab、FdおよびFvから選択される。特定の実施形態では、該抗原結合フラグメントはヒト起源、マウス起源、ニワトリ起源またはウサギ起源のものである。別の特定の実施形態では、該抗原結合フラグメントは単鎖Fv(scFv)である。単離された抗体は、上記の、また本明細書に記載の抗体のいずれか1つと特異的に結合する抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合フラグメントを含む。特定の実施形態では、該抗イディオタイプ抗体はポリクローナル抗体である。別の特定の実施形態では、該抗イディオタイプ抗体はモノクローナル抗体である。別の実施形態では、抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合フラグメントと製薬上好適な担体とを含む組成物である。
本明細書ではまた、別の実施形態において、いずれか1つの抗体またはその抗原結合フラグメントと製薬上好適な担体とを含む組成物が提供される。本明細書ではまた、上記の、また本明細書に記載のいずれか1つの抗体またはその抗原結合フラグメントを生産するための製造方法が提供される。
本明細書ではまた、(a)(i)白血球共通抗原関連タンパク質(LAR)；(ii)RPTP-σ；および(iii)RPTP-δから選択される少なくとも1つの受容体様タンパク質チロシンホスファターゼ(RPTP)ポリペプチドと特異的に結合し、かつ、(b)130LポリペプチドとLAR、RPTP-σおよびRPTP-δのいずれか1つとの結合を妨げる薬剤が提供され、該130Lポリペプチドのアミノ酸配列は配列番号85または配列番号150のいずれかで示されるアミノ酸配列と少なくとも80%同一である。ある特定の実施形態では、該130Lポリペプチドのアミノ酸配列は、(a)配列番号85または配列番号150で示されるアミノ酸配列を含むか；(b)配列番号85または配列番号150と少なくとも95%同一であるか；(c)配列番号85または配列番号150と少なくとも90%同一であるか；あるいは(d)配列番号85または配列番号150を少なくとも85%同一である。特定の実施形態では、該薬剤は、(i)LAR;(ii)RPTP-σ；および(iii)RPTP-δから選択される少なくとも2つのRPTPポリペプチドと特異的に結合する。別の特定の実施形態では、該薬剤は130Lポリペプチドと、LAR、RPTP-σおよびRPTP-δのいずれか1つを発現する免疫細胞との結合を妨げる。特定の実施形態では、該薬剤は、抗体またはその抗原結合フラグメント；小分子；アプタマー；およびペプチド-IgFc融合ポリペプチドから選択される。
本明細書ではまた、上記の、また本明細書に記載の薬剤のいずれか1つと製薬上好適な担体とを含む組成物が提供される。
別の実施形態では、免疫細胞の免疫応答性を抑制する薬剤を同定する方法であって、(a)(1)候補薬剤と；(2)(i)白血球共通抗原関連タンパク質(LAR)；(ii)RPTP-σ；および(iii)RPTP-δから選択される少なくとも1つの受容体様タンパク質チロシンホスファターゼ(RPTP)ポリペプチドを発現する免疫細胞と；(3)130Lポリペプチドとを、該少なくとも1つのRPTPポリペプチドと130Lポリペプチドの間の相互作用を可能とするのに十分な条件および時間で接触させること（ここで、該130Lポリペプチドのアミノ酸配列は配列番号85または配列番号150で示されるアミノ酸配列と少なくとも80%同一である）、および(b)その候補薬剤の存在下で130Lポリペプチドと免疫細胞の結合のレベルを測定し、候補薬剤の不在下での130Lポリペプチドと免疫細胞の結合のレベルと比較することを含み、候補薬剤の存在下で130Lポリペプチドと免疫細胞の結合のレベルが低下していれば、その候補薬剤が免疫細胞の免疫応答性を抑制することを示す方法が提供される。ある特定の実施形態では、該130Lポリペプチドのアミノ酸配列は、(a)配列番号85または配列番号150で示されるアミノ酸配列を含むか；(b)配列番号85または配列番号150と少なくとも95%同一であるか；(c)配列番号85または配列番号150と少なくとも90%同一であるか；あるいは(d)配列番号85または配列番号150と少なくとも85%同一である。特定の実施形態では、該免疫細胞は(i)LAR;(ii)RPTP-σ；および(iii)RPTP-δから選択される少なくとも2つのRPTPポリペプチドを発現する。
本明細書ではまた、別の実施形態において、130Lポリペプチドと少なくとも1つの受容体様タンパク質チロシンホスファターゼ(RPTP)ポリペプチドとの結合を阻害する薬剤を同定する方法であって、(a)(1)候補薬剤と；(2)(i)白血球共通抗原関連タンパク質(LAR)；(ii)RPTP-σ；および(iii)RPTP-δから選択されるRPTPポリペプチドを含む生物学的サンプルと；(3)130Lポリペプチドとを、該RPTPポリペプチドと130Lポリペプチドの間の相互作用を可能とするのに十分な条件および時間で接触させること（ここで、該130Lポリペプチドのアミノ酸配列は配列番号85または配列番号150で示されるアミノ酸配列と少なくとも80%同一である）；および(b)その候補薬剤の存在下で130LポリペプチドとRPTPポリペプチドの結合のレベルを測定し、候補薬剤の不在下での130LポリペプチドとRPTPポリペプチドの結合のレベルと比較することを含み、候補薬剤の存在下で130LポリペプチドとRPTPポリペプチドの結合のレベルが低下していれば、その候補薬剤が130LポリペプチドとRPTPポリペプチドの結合阻害することを示す方法が提供される。ある特定の実施形態では、該130Lポリペプチドのアミノ酸配列は、(a)配列番号85または配列番号150で示されるアミノ酸配列を含むか；(b)配列番号85または配列番号150と少なくとも95%同一であるか；(c)配列番号85または配列番号150と少なくとも90%同一であるか；あるいは(d)配列番号85または配列番号150と少なくとも85%同一である。
本明細書ではまた、免疫細胞の免疫応答性を抑制する薬剤を生産するための製造方法であって、(a)免疫細胞の免疫応答性を抑制する薬剤を同定すること｛｛該同定工程は、(1)(i)候補薬剤と；(ii)白血球共通抗原関連タンパク質(LAR)；RPTP-σ；およびRPTP-δから選択される少なくとも1つの受容体様タンパク質チロシンホスファターゼ(RPTP)ポリペプチドを発現する免疫細胞と；(iii)130Lポリペプチド（該130Lポリペプチドのアミノ酸配列は配列番号85または配列番号150で示されるアミノ酸配列と少なくとも80%同一である）とを、該少なくとも1つのRPTPポリペプチドと130Lポリペプチドの相互作用を可能とするのに十分な条件および時間で接触させること；および(2)その候補薬剤の存在下で130Lポリペプチドと免疫細胞の結合のレベルを測定し、候補薬剤の不在下での130Lポリペプチドと免疫細胞の結合のレベルと比較することを含み、候補薬剤の存在下で130Lポリペプチドと免疫細胞の結合のレベルが低下していれば、その候補薬剤が免疫細胞の免疫応答性を抑制することを示す｝、ならびに(b)工程(a)で同定された薬剤を生産することを含む方法が提供される。ある特定の実施形態では、該130Lポリペプチドのアミノ酸配列は、(a)配列番号85または配列番号150で示されるアミノ酸配列を含むか；(b)配列番号85または配列番号150と少なくとも95%同一であるか；(c)配列番号85または配列番号150と少なくとも90%同一であるか；あるいは(d)配列番号85または配列番号150と少なくとも85%同一である。特定の実施形態では、該薬剤は抗体またはその抗原結合フラグメント；小分子；アプタマー；アンチセンスポリヌクレオチド；短い干渉RNA(siRNA)；およびペプチド-IgFc融合ポリペプチドから選択される。さらに別の特定の実施形態では、該薬剤は抗体またはその抗原結合フラグメントである。
別の実施形態では、Fcポリペプチドと融合された130Lポリペプチドを含む融合ポリペプチドが提供される。特定の実施形態では、該FcポリペプチドはヒトIgG1Fcポリペプチドである。特定の実施形態では、該ヒトIgG1FcポリペプチドはムテインFcポリペプチドであり、該ムテインFcポリペプチドはヒトIgG1免疫グロブリンのFc部分のアミノ酸配列を含み、該ムテインFcポリペプチドは、少なくとも2つの突然変異を含むことで野生型ヒトIgG1免疫グロブリンのFc部分と異なり、該ムテインFcポリペプチドの第一の突然変異は、融合ポリペプチドのIgG Fc受容体結合能を低下するような、CH2ドメインにおける少なくとも1つのアミノ酸の置換を含み、該ムテインFcポリペプチドの第二の突然変異はヒンジ領域におけるシステイン残基の置換または欠失であり、該システイン残基は野生型ヒトIgG1免疫グロブリンのヒンジ領域のアミノ末端に最も近いシステイン残基である。別の特定の実施形態では、該ムテインFcポリペプチドはCH2ドメインにおける少なくとも2つのアミノ酸の置換を含む。さらに別の特定の実施形態では、該ムテインFcポリペプチドはCH2ドメインにおける少なくとも3つのアミノ酸の置換を含む。ある特定の実施形態では、置換されているアミノ酸はヒトIgG免疫グロブリンのCH2ドメインにおけるEU235番に相当する位置にある。他の特定の実施形態では、置換されている第一のアミノ酸はヒトIgG免疫グロブリンのCH2ドメインにおけるEU234番に相当する位置にあり、置換されている第二のアミノ酸はヒトIgG免疫グロブリンのCH2ドメインにおけるEU235番に相当する位置にある。別の特定の実施形態では、置換されている第一のアミノ酸はヒトIgG免疫グロブリンのCH2ドメインにおけるEU234番に相当する位置にあり、置換されている第二のアミノ酸はヒトIgG免疫グロブリンのCH2ドメインにおけるEU235番に相当する位置にあり、置換されている第三のアミノ酸はヒトIgG免疫グロブリンCH2ドメインにおけるEU237番に相当する位置にある。特定の実施形態では、ヒトIgG免疫グロブリンのCH2ドメインにおけるEU235番に相当する位置にあるロイシン残基はグルタミン酸残基またはアラニン残基で置換されている。別の特定の実施形態では、ヒトIgG免疫グロブリンのCH2ドメインにおけるEU234番に相当する位置にあるロイシン残基はアラニン残基で置換されている。さらに別の特定の実施形態では、ヒトIgG免疫グロブリンのCH2ドメインにおけるEU237番に相当する位置にあるグリシン残基はアラニン残基で置換されている。さらに別の特定の実施形態では、該ムテインFcポリペプチドはヒンジ領域における少なくとも1つの非システイン残基の置換または欠失をさらに含む。1つの特定の実施形態では、該ムテインFcポリペプチドはヒンジ領域における少なくとも2つのアミノ酸残基の欠失を含み、該少なくとも2つのアミノ酸残基はシステイン残基とその隣接するC末端残基を含み、該システイン残基は野生型ヒトIgG1免疫グロブリンのヒンジ領域のアミノ末端に最も近いシステイン残基である。特定の実施形態では、該融合ポリペプチドは配列番号149で示されるアミノ酸配列を含む。
別の実施形態では、被験体において免疫応答を抑制する方法が提供され、その方法は、製薬上好適な担体と、上記の、また本明細書に記載のFcポリペプチドと融合された130Lポリペプチドを含む融合ポリペプチドとを含む組成物を投与することを含む。特定の実施形態では、該融合ポリペプチドは、(a)(i)白血球共通抗原関連タンパク質(LAR)；(ii)RPTP-σ；および(iii)RPTP-δから選択される少なくとも1つの受容体様タンパク質チロシンホスファターゼ(RPTP)の生物活性を変化させるか；あるいは(b)(i)LAR;(ii)RPTP-σ；および(iii)RPTP-δから選択される少なくとも2つのRPTPポリペプチドの生物活性を変化させる。別の実施形態では、被験体において免疫疾患または免疫障害を治療する方法であって、被験体に、製薬上好適な担体と、上記の、また本明細書に記載のFcポリペプチドと融合された130Lポリペプチドを含む融合ポリペプチドとを投与することを含む方法が提供される。特定の実施形態では、該融合ポリペプチドは、(a)受容体様タンパク質チロシンホスファターゼ(RPTP)-σおよびRPTP-δの少なくとも1つの生物活性を変化させるか；あるいは(b)(i)白血球共通抗原関連タンパク質(LAR)；(ii)RPTP-σ；および(iii)RPTP-δから選択される少なくとも2つのRPTPポリペプチドの生物活性を変化させる。ある特定の実施形態では、該免疫疾患または免疫障害は自己免疫疾患または炎症性疾患である。特定の実施形態では、該自己免疫疾患または炎症性疾患は多発性硬化症、関節リウマチ、全身性紅斑性狼瘡、移植片対宿主病、敗血症、糖尿病、乾癬、アテローム性動脈硬化症、シェーグレン症候群、進行性全身性硬化症、硬皮症、急性冠動脈症候群、虚血性再潅流、クローン病、子宮内膜症、糸球体腎炎、重症筋無力症、特発性肺繊維症、喘息、急性呼吸窮迫症候群(ARDS)、脈管炎または炎症性自己免疫性筋炎である。
別の実施形態では、被験体において、細胞移動、細胞増殖および細胞分化の少なくとも1つの変化に関連する疾病または障害を治療する方法であって、被験体に、製薬上好適な担体と、上記の、また本明細書に記載のFcポリペプチドと融合された130Lポリペプチドを含む融合ポリペプチドとを投与することを含む方法が提供される。特定の実施形態では、該融合ポリペプチドは、(a)受容体様タンパク質チロシンホスファターゼ(RPTP)-σまたはRPTP-δの少なくとも１つの生物活性を変化させるか、あるいは(b)(i)白血球共通抗原関連タンパク質(LAR)；(ii)RPTP-σ；および(iii)RPTP-δから選択される少なくとも2つのRPTPポリペプチドの生物活性を変化させる。別の特定の実施形態では、該疾病または障害は免疫疾患または免疫障害、心血管疾病または心血管障害、代謝性疾病または代謝性障害、あるいは増殖性疾患または増殖性障害である。さらに別の特定の実施形態では、該免疫疾患または免疫障害は自己免疫疾患または炎症性疾患である。ある特定の実施形態では、該免疫疾患または免疫障害は多発性硬化症、関節リウマチ、全身性紅斑性狼瘡、移植片対宿主病、敗血症、糖尿病、乾癬、アテローム性動脈硬化症、シェーグレン症候群、進行性全身性硬化症、硬皮症、急性冠動脈症候群、虚血性再潅流、クローン病、子宮内膜症、糸球体腎炎、重症筋無力症、特発性肺繊維症、喘息、急性呼吸窮迫症候群(ARDS)、脈管炎または炎症性自己免疫性筋炎である。他の特定の実施形態では、該心血管疾病または心血管障害はアテローム性動脈硬化症、心内膜炎、高血圧症または末梢虚血性疾患である。本発明ではまた、上記の、また本明細書に記載のFcポリペプチドと融合された130Lポリペプチドを含む融合ポリペプチドを生産するための製造方法が提供される。
本明細書に引用される、および／または出願データシートに挙げられている米国特許、米国特許出願公開、米国特許出願、外国特許、外国特許出願および非特許刊行物は全て、参照によりそのまま本明細書に組み入れられる。
発明の詳細な説明
本発明は、3つの受容体様タンパク質チロシンホスファターゼ(RPTP)、すなわち、白血球共通抗原関連タンパク質(LAR)、受容体タンパク質チロシンホスファターゼ-デルタ(RPTP-δ)、および受容体タンパク質チロシンホスファターゼ-シグマ(RPTP-σ)が免疫調節機能を示すという発見に関する。免疫細胞によるLAR、RPTP-δおよびRPTP-σの発現は、ポックスウイルスポリペプチドであるA41Lおよびヤバ様病ウイルス(Yaba-like Disease Virus;YLDV)由来の130Lと相互作用した免疫細胞により発現されるポリペプチドを同定することにより発見された。
免疫細胞（例えば、マクロファージ、THP-1細胞系統）の細胞表面にLARが存在することは、ポックスウイルスポリペプチドA41Lと相互作用したポリペプチドを発現した細胞を同定することにより示された（例えば、米国特許第6,852,486号参照)。予期しないことに、本明細書に記載されるように、RPTP-δとRPTP-σも免疫細胞により発現され、A41Lならびに別のポックスウイルスポリペプチド130Lにも結合する。これまでの研究では、RPTP-δおよびRPTP-σは主として脳および神経系組織で発現されることが示されている（例えば、Pulidoら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:11686-90 (1995)参照）。もっと最近の研究ではLAR、RPTP-δおよびRPTP-σはショウジョウバエ(Drosophila)で軸索誘導を調節する役割（例えば、Johnsonら, Physiol. Rev. 83:1-21 (2003)）、また、興奮性シナプスの発達および維持する役割（例えば、Dunahら, Nat. Neurosci. 8:458-67 (2005)）を持っていることが示唆されている。
LAR、RPTP-δおよびRPTP-σと特異的に結合し、かつ／またはそれらと相互作用するウイルスポリペプチド130LはA41Lと相同ではない（図６参照）。ヤバ様病ウイルス(YLDV)は、クロドポックスウイルス科(Chrodopoxvirinae)のヤタポックスウイルス(Yatapoxvirus)に属す。この属には、タナポックスウイルス(tanapox virus)、ヤバサル腫瘍ウイルス(yaba monkey tumor virus)およびYLDVの3つのメンバーがある。霊長類では、YLDVは急性の発熱病態を引き起こし、特徴的には局所的な皮膚病巣を伴う（例えば、Knightら, Virology 172:116-24 (1989)）。130Lと呼ばれるYLDV遺伝子は、推定分子量およそ21Kdの分泌型タンパク質をコードしている（例えば、Leeら, Virology 281:170-92 (2001)参照）。
A41Lおよび130Lなどのポックスウイルスポリペプチドは、ポックスウイルスに感染した宿主において、少なくともいくらかそのウイルスに特異的な免疫応答を抑制する働きをする。ウイルス感染宿主において免疫応答が抑制されると、ウイルスが複製および感染を継続できる環境が得られる。本発明に記載されるように、宿主細胞、ならびにA41Lおよび130Lなどのポックスウイルスポリペプチドと相互作用するポリペプチドをはじめとする宿主細胞の成分を同定できれば、免疫応答を変化させる治療分子の開発につながる。これらのポックスウイルスポリペプチドは、インターフェロン、補体、サイトカインおよび／またはケモカインなどの宿主因子の機能を阻害または遮断することにより、あるいは炎症や発熱の作用を阻害、遮断または変化させることにより働き得る（例えば、米国特許第6,852,486号も参照）。例えば、LAR由来ポリペプチド（すなわち、ヒトIgG Fcポリペプチドと融合されたLARの免疫グロブリン様ドメイン1、2および3）の存在下では、末梢血単球は刺激されてインターフェロン-ガンマ(IFN-γ)を産生する。特定の理論に縛られるわけではないが、IFN-γは免疫応答のいくつかの側面を刺激および誘導することで病原体の排除に関与することから、A41Lは、LARのIFN-γ産生刺激能を阻害することにより、侵入したポックスウイルスに対する免疫応答の発現に寄与するLARの能力を阻害し得る。また、IFN-γ産生の増加は、全身性紅斑性狼瘡(SLE)など、免疫疾患および自己免疫疾患に関連している。よって、A41L、130L、または例えば、A41Lもしくは130LとLARの間の相互作用を模倣する薬剤、高分子、または化合物は有効な免疫抑制薬となり得る。A41Lや130Lなどのポックスウイルスポリペプチド、またはこのポックスウイルスポリペプチドと同様に免疫細胞の免疫応答性を抑制する働きをする薬剤、ポリペプチド、分子もしくは化合物は、免疫疾患または免疫障害を治療または予防するために使用可能である。
本明細書では、免疫細胞とLAR、RPTP-δおよびRPTP-σの1以上と相互作用する分子、化合物または組成物とを接触させて、免疫細胞の免疫応答性を阻害（低下、排除、抑制、回避）することにより、炎症性疾患および自己免疫疾患をはじめとする疾病および障害を治療するための組成物および方法が提供される。また、このような化合物または組成物は、本明細書に記載のように心血管疾患または代謝性疾患を治療するのにも有用であり得る。あるいは、LAR、RPTP-δおよびRPTP-σの1以上と相互作用し、かつ、炎症性疾患、自己免疫疾患、心血管疾患、または代謝性疾患の治療に有用な分子、化合物または組成物は、免疫系の免疫応答性を増強し得る。
本明細書では、免疫疾患または免疫障害、心血管疾患または心血管障害、代謝性疾病または代謝性障害、あるいは増殖性疾患または増殖性障害を治療する、または予防する、阻害する、その進行を遅延させる、またはそれに伴う症状を軽減するための組成物および方法が提供される。免疫疾患としては、炎症性疾患または炎症性障害、および自己免疫疾患または自己免疫障害が挙げられる。炎症または炎症性応答は損傷に対する宿主の正常な防御的応答であるが、炎症は望ましくない傷害も招く。例えば、アテローム性動脈硬化症は少なくともある程度は動脈損傷と一連の炎症カスケードに対する病理学的応答である。本明細書に記載のLAR、RPTP-δおよびRPTP-σの1以上と結合または相互作用する抗体またはその抗原結合フラグメント（または他の作用因子）で治療可能な免疫障害の例としては、限定されるものではないが、多発性硬化症、関節リウマチ、全身性紅斑性狼瘡(SLE)、移植片対宿主病(GVHD)、敗血症、糖尿病、乾癬、アテローム性動脈硬化症、シェーグレン症候群、進行性全身性硬化症、硬皮症、急性冠動脈症候群、虚血性再潅流、クローン病、子宮内膜症、糸球体腎炎、重症筋無力症、特発性肺繊維症、喘息、急性呼吸窮迫症候群(ARDS)、脈管炎、または炎症性自己免疫性筋炎および他の炎症性筋肉変性疾患（例えば、皮膚筋炎、多発性筋炎、若年性皮膚筋炎、封入体筋炎）が挙げられる。治療可能な心血管疾患または心血管障害は、免疫疾患／障害とも考えられる疾患および障害を含み、例えば、アテローム性動脈硬化症、心内膜炎、高血圧症または末梢虚血性疾患が挙げられる。治療可能な代謝性疾病または代謝性障害は、免疫疾患／障害とも考えられる疾患および障害も含み、例えば、糖尿病、肥満およびミトコンドリア機能の異常または変化を伴う疾患が挙げられる。
本明細書において「単離された」とは、材料がその元の環境（例えば、天然に存在するものである場合には、その天然環境）から取り出されていることを意味する。例えば、生きている動物中に存在する天然の核酸またはポリペプチドは単離されていないが、同じ核酸がまたはポリペプチドがその天然系に同時に存在する材料のいくつかまたは全てから分離されている場合には、単離されている。このような核酸はベクターの一部であってもよいし、かつ／またはこのような核酸またはポリペプチドは組成物の一部であってもよく、このベクターまたは組成物がその核酸またはポリペプチドにとっての天然環境の一部ではないという点ではやり単離されている。「遺伝子」とは、あるポリペプチド鎖の生産に関与するDNAセグメントを意味し、それはコード領域の前後の領域「リーダーおよびトレーラー」ならびに個々のコードセグメント（エキソン）間の介在配列（イントロン）を含む。
本明細書および添付の特許請求の範囲において、単数形「a」、「and」および「the」は、特に断りのない限り、複数の対象を含む。よって、例えば、「薬剤(a agent)」という場合には複数のこのような薬剤を含み、「その細胞(the cell)」という場合には1以上の細胞および当業者に公知のその等価物も含むなどである。「含む(comprising)」（および「含む(compriseまたはcomprisesまたはhavingまたはincluding)」などの関連語は、他の特定の実施形態において、例えば、本明細書に記載のあらゆる、物質の組成、組成物、方法またはプロセスなどの実施形態が、記載の特徴「からなる」または「から本質的になる」ことを排除するものではない。
A41Lポリペプチド
A41Lは、例えば、痘瘡ウイルス、粘液腫ウイルス、ショーブ繊維腫ウイルス、ラクダ痘ウイルス、サル痘ウイルス、エクロメリア(ecromelia)ウイルス、牛痘ウイルスおよびワクシニアウイルスをはじめとするポックスウイルス科のメンバーであるウイルスの遺伝子座を指す。A41L遺伝子は、ポックスウイルスに感染した細胞により分泌されるウイルス毒性因子である糖タンパク質（本明細書ではA41Lポリペプチドと呼ぶ）をコードしている（例えば、国際特許出願公開WO98/37217; Ngら, J. Gen. Virol. 82:2095-105 (2001)参照）。ポックスウイルスのゲノムは二本鎖DNAであり、ウイルスに宿主の免疫系を回避させ、かつ／またはウイルス複製を容易にする宿主遺伝子を獲得させることにより種々の宿主種で複製できるようにしてある（例えば、Bugertら, Virus Genes 21:111-33 (2000); Alcamiら, Immunol. Today 21:447-55 (2000); McFaddenら, J. Leukoc. Biol. 57:731-38 (1995)参照）。種々のポックスウイルスのゲノムによりコードされているポリペプチドは、インターフェロン、補体、サイトカインおよび／またはケモカインなどの宿主因子の機能を阻害または遮断することにより、あるいは炎症および発熱の作用を阻害、遮断または変化させることにより免疫応答に影響を及ぼし得る。例えば、組換え発現A41LポリペプチドはMigおよびIP-10などのIFN-γ由来ケモカインと結合し（例えば、国際特許出願公開WO98/37217参照）、A41LはLARと結合する（例えば、米国特許第6,852,486号参照）。
本明細書においてA41Lポリペプチドとは、限定されるものではないが、痘瘡ウイルス、粘液腫ウイルス、ショーペ繊維腫(Shope fibroma)ウイルス（ウサギ繊維腫ウイルス）、ラクダ痘ウイルス、サル痘ウイルス、エクロメリアウイルス、牛痘ウイルスおよびワクシニアウイルス｛GenBank受託番号NC_001559; NC_001611; Y16780; X69198; NC_003310; NC_005337; AY603355; NC_003391; AF438165; U94848; AY243312; AF380138; L22579; M35027; NC_003663; X94355; AF482758; NC_001132; AF170726; NC_001266; AF170722; F36852（ポリペプチドのみ）のゲノム配列（A41Lポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む）の例を参照｝をはじめとする多数のポックスウイルスのいずれか1つのゲノムによりコードされている多数のA41Lポリペプチド（当技術分野ではA41L以外の名称で呼ばれる場合もある）いずれか1つを指す。A41Lポリペプチドは本明細書で開示されているか、あるいは当技術分野で既知のアミノ酸配列のいずれか1つまたはこのようなアミノ酸配列の変異体（オーソログを含む）を含む。A41Lポリペプチドのアミノ酸配列例は配列番号1〜8およびGenBank受託番号NP_063835(配列番号10); NP_042191(配列番号11); CAA49088(配列番号12); NP_536578(配列番号13); P33854(配列番号14); P24766(配列番号15); P21064(配列番号16); AA50551(配列番号17); NP_570550(配列番号18); NP-570548(配列番号19); AAL73867(配列番号20); AAL73865(配列番号21)で示される。
A41Lポリペプチドはまた、本明細書に記載の、または当技術分野で公知のA41Lポリペプチドとは少なくとも1つのアミノ酸で異なるアミノ酸配列を含むA41Lポリペプチド変異体を含み得る。このA41Lポリペプチド変異体は少なくとも1つのアミノ酸の挿入、欠失、付加および／または置換により野生型のアミノ酸配列とは異なっており、少なくとも2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、7つ、8つ、9つまたは10個のアミノ酸の挿入、欠失、付加および／または置換により異なっている場合もあるし、あるいは10〜45個のいずれかの個数のアミノ酸で異なっている場合もある。A41Lポリペプチド変異体としては、例えば、天然多型（すなわち、違うポックスウイルス株のゲノムによりコードされているオーソログA41Lポリペプチド）または組換え操作もしくは組換え処理されたA41Lポリペプチド変異体が挙げられる。
ある特定の実施形態では、A41Lポリペプチドの変異体は野生型A41Lポリペプチドの少なくとも1つの機能的活性または生物活性を保持しており、他の特定の実施形態では、A41Lポリペプチド変異体は野生型A41Lポリペプチドの少なくとも1つ、ある特定の実施形態では、全ての機能的活性または生物活性を保持している。A41Lポリペプチドまたはその変異体の機能的活性または生物活性は本明細書に記載の、また、当技術分野で公知の方法に従って測定することができ、その機能または活性としては、(1)受容体PTPであるLAR、RPTP-δおよびRPTP-σの少なくとも1つ、または少なくとも2つ、または3つ全てと結合または相互作用する能力；(2)野生型A41Lポリペプチドと特異的に結合する抗体と結合する能力；および(3)LAR、RPTP-δおよびRPTP-σの少なくとも1つを発現する細胞の免疫応答を抑制する能力が挙げられる。野生型A41Lポリペプチドの機能的活性または生物活性を保持するA41Lポリペプチド変異体は、野生型A41Lポリペプチドが示す機能的活性または生物活性レベルに匹敵する（すなわち、統計学的に有意に異ならない）レベルの機能または活性を示す。
A41Lポリペプチド変異体およびこれらの変異体をコードするポリヌクレオチドは配列比較により同定することができる。本明細書において、2つのアミノ酸配列は、最大の一致が得られるようにアラインした場合にその2つのアミノ酸配列のアミノ酸残基が同一であれば、100%のアミノ酸配列同一性を有する。同様に、2つのポリヌクレオチドは、最大の一致が得られるようにアラインした場合にその2つの配列のヌクレオチド残基が同一であれば、100%のヌクレオチド配列同一性を有する。配列比較は、当業者に周知のコンピューターアルゴリズムの使用を含むいずれかの方法を用いて行うことができるこのようなアルゴリズムとしては、NCBIウェブサイト（[オンライン]インターネット:<URL: http://www/ncbi.nlm.nih.gov/cgi-bin/BLAST参照）で入手できるAlignまたはBLASTアルゴリズムがある（例えば、Altschul, J. Mol. Biol. 219:555-565, 1991; HenikoffおよびHenikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915-10919, 1992参照）。デフォルトパラメーターが使用可能である。さらに、LASERGENE bioinformatics computing suite (DNASTAR, Inc., Madison, WI)；CLUSTALWプログラム(Thompsonら, Nucleic Acids Res. 22:4673-80 (1991))；および「GeneDoc」(Nicholasら, EMBNEW News 4:14 (1991))に含まれているものなどの標準的なソフトウエアプログラムも利用可能である。最適アライメントを決定することで2つのヌクレオチド配列またはアミノ酸配列を比較するための他の方法も当業者により実施されている（例えば、PeruskiおよびPeruski, The Internet and the New Biology: Tools for Genomic and Molecular Research (ASM Press, Inc. 1997); Wuら(編), “Information Superhighway and Computer Databases of Nucleic Acids and Proteins,” in Methods in Gene BioTEchnology, 123-151頁(CRC Press, Inc. 1997);およびBishop(編), Guide to Human Genome Computing, 第2版(Academic Press, Inc. 1998)参照）。
ある特定の実施形態では、A41Lポリペプチド変異体のアミノ酸配列は、対応するA41L野生型ポリペプチドまたは本明細書に記載の、かつ／または当技術分野で公知のA41Lポリペプチドと少なくとも60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%または98%同一である（例えば、配列番号1〜21参照）。あるいは、A41Lポリペプチド変異体は、その変異体をコードしているポリヌクレオチドのヌクレオチド配列とA41Lポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドとを比較することで同定することができる。特定の実施形態では、A41Lポリペプチド変異体をコードするポリヌクレオチドのヌクレオチド配列は、本明細書に記載のA41Lポリペプチドをコードしているポリヌクレオチド配列の1以上と少なくとも70%、75%、80%、85%、90%または95%同一である。ポリヌクレオチド変異体はまた、遺伝コードの縮重のためにヌクレオチド配列そのものが異なるが、本明細書に開示されている、または当技術分野で公知のアミノ酸配列を有するA41Lポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドも含む。
本明細書に記載されるように、細胞表面に存在するA41Lポリペプチドは、本明細書に記載のA41Lポリペプチド変異体およびフラグメントおよび融合ポリペプチド（LAR、RPTP-δおよびRPTP-σの少なくとも1つ、2つ、または3つと相互作用または結合するか、あるいはLAR、RPTP-δおよびRPTP-σの少なくとも1つの少なくとも1つ、2つ、または3つと相互作用または結合する）は、免疫細胞の免疫応答性を変化させる（例えば、抑制または増強する）ために使用可能である。
一実施形態では、本明細書に記載のA41Lまたはその変異体またはA41L融合ポリペプチドは急性免疫応答を示す患者の治療に使用可能である。例えば、A41Lポリペプチド、その変異体またはフラグメントは急性呼吸窮迫症候群(ARDS)などの疾病または症状に関連する免疫応答を抑制し得る。成人にも小児にも発症し得るARDSは、肺胞-毛細血管装置を傷害する直接的肺発作または全身発作（例えば、敗血症、肺炎、誤嚥)の結果として起こる場合が多い。例えば、腫瘍壊死因子-アルファ(TNF-α)、インターロイキン-ベータ(IL-β)、IL-10および可溶性細胞間接着分子1(sICAM-1)をはじめとする数種のサイトカインがこの症候群の発症に関連している。生物学的サンプルにおけるこれらの因子およびサイトカインのレベルの増減は本明細書に記載の方法およびアッセイにより容易に判定することができ、急性状態を監視するためや治療の効果を監視するために当技術分野で関連的に行われている。
A41Lに特異的な免疫応答の可能性または程度を低減または最小化するために、A41L変異体、その誘導体またはフラグメントを限定回数投与することができ、A41Lのグリコシル化を変化させる様式で産生させる、または誘導することができ、A41Lの抗原性を低減または最小化する条件下で投与することができる。例えば、A41Lは、免疫応答、特にA41Lに特異的な応答を抑制する第二の組成物を宿主に投与する前、投与すると同時、または投与した後に投与することができる。さらに、当業者ならば、ポリペプチドをPEG化するなどにより、ポリペプチドの半減期を延長し、かつ／または薬物動態特性を改良する方法を知っている。
特定の他の実施形態では、A41Lポリペプチドフラグメントは免疫細胞の免疫応答性を変化させることができる。このようなA41Lフラグメントは、受容体PTPであるLAR、RPTP-δおよびRPTP-σの少なくとも1つ、少なくとも2つ、または3つ全てと相互作用または結合する。このフラグメントは少なくとも6つ、7つ、8つ、9つ、10個、11個、12個、13個、14個または15個の連続するアミノ酸を含み得る。ある特定の実施形態では、A41LフラグメントはA41Lポリペプチドの少なくとも20〜50個の間のいずれかの数の連続するアミノ酸を含み、他の実施形態では、A41LフラグメントはA41Lポリペプチドの少なくとも50〜100個の間のいずれかの数の連続するアミノ酸を含む。A41Lフラグメントはまた、末端切断型のA41Lポリペプチドも含む。末端切断型A41Lポリペプチドは、全長A41Lポリペプチドのアミノ末端もしくはカルボキシ末端のいずれか、またはアミノ末端とカルボキシ末端の双方から少なくとも1つ、2〜10個、11〜20個、21〜30個、31〜40個、または50個のアミノ酸を欠いている。ある特定の実施形態では、A41Lフラグメントは、全長A41Lポリペプチドのアミノ末端半分またはカルボキシ末端半分全体を欠いている。他の実施形態では、A41Lポリペプチドフラグメント（末端切断型フラグメントを含む）は、A41Lポリペプチドまたはフラグメントではない部分とコンジュゲート、融合またはそうでなければ連結していてもよい。例えば、A41Lポリペプチドフラグメントは免疫細胞（この免疫細胞はA41Lポリペプチドまたはフラグメントにより影響を受けた細胞と同じ細胞であってもよいし、同種の細胞であってもよいし、異なる細胞であってもよい）の免疫応答性を変化させ得る（例えば、免疫細胞の免疫応答性を抑制し得る）別の分子と連結することができる。
A41L融合ポリペプチドの例としては、免疫グロブリン(Ig)Fcポリペプチドとフレーム内で融合された本明細書に記載のA41Lポリペプチド、その変異体またはフラグメントが挙げられる。免疫グロブリンのFcポリペプチドは、重鎖CH2ドメインおよびCH3ドメイン、およびCH1とCH2の間に位置するヒンジ領域の一部または全部を含む。歴史的にみれば、Fcフラグメントは免疫グロブリンのパパイン消化により誘導され、免疫グロブリンのヒンジ領域を含んでいる。Fc領域は、共有結合（例えば、特にジスルフィド結合）および非共有結合により連結して二量体型または多量体型とすることができる単量体ポリペプチドである。Fcポリペプチドの単量体サブユニット間の分子間ジスルフィド結合の数は免疫グロブリンクラス（例えば、IgG、IgA、IgE)またはサブクラス（例えば、ヒトIgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2)によって異なる。
また、C末端で末端切断された（すなわち、少なくとも1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、10個、15個、20個またはそれを超えるアミノ酸が除去または欠失されている）FcポリペプチドなどのFcポリペプチドフラグメントも使用可能である。ある特定の実施形態では、本明細書に記載のFcポリペプチドは、2つの独立したA41L/Fc融合タンパク質のFcポリペプチド部分間で鎖間ジスルフィド結合を形成させてA41L/Fc融合ポリペプチド二量体を形成するように、ヒンジ領域の少なくともいくつかまたは全てのシステイン残基といった複数のシステイン残基を含む。他の実施形態では、抗体依存性細胞性細胞傷害作用(ADCC)および補体結合（および関連の補体関連細胞傷害作用(associated complement associated cytotoxicity (CDC)）の保持が望まれる場合には、このFcポリペプチドは、Fcポリペプチド融合タンパク質が単量体となり、二量体が形成できないように、ヒンジ領域のシステイン残基の置換または欠失を含む（例えば、米国特許出願公開第2005/0175614号参照）。
免疫グロブリンのFc部分は、免疫グロブリンのある種のエフェクター機能を媒介する。Fc領域に関連しているエフェクター機能の3つの一般的カテゴリーとして、(1)従来の補体カスケードの活性化、(2)エフェクター細胞との相互作用、および(3)免疫グロブリンの区画化がある。現在のところ、Fcポリペプチド、およびいずれか1以上の定常領域ドメイン、および少なくとも1つの免疫グロブリン定常領域ドメインを含む融合タンパク質は当業者に公知の組換え分子生物学の技術に従って容易に作製することができる。
A41Lポリペプチドまたは変異体、またはそのフラグメントは、その使用に関してA41L-IgFc融合ポリペプチドが意図される動物種に由来するヌクレオチドおよびそのコードされているアミノ酸配列を用いて作製される免疫グロブリンFcポリペプチド(A41L-Fc融合ポリペプチド)とフレーム内で融合させることができる。分子生物学の熟練者であれば、本明細書に記載の、また、当技術分野で慣例的に行われている方法に従い、このような融合ポリペプチドを容易に作製することができる。一実施形態では、Fcポリペプチドはヒト起源のものであり、ヒトIgG1、IgG2、IgG3、IgG4またはIgAなどの免疫グロブリン種のいずれかに由来するものであり得る。ある特定の実施形態では、FcポリペプチドはヒトIgG1免疫グロブリン由来のものである（Kabatら、前掲参照）。別の実施形態では、A41L-Fc融合ポリペプチドは、例えば限定されるものではないが、マウス、ラット、ウサギまたはハムスターなどの非ヒト動物由来のFcポリペプチドを含む。A41L-Fc融合ポリペプチドが投与され得る宿主種の免疫グロブリン由来Fcポリペプチドのアミノ酸配列は、非同系宿主由来のFcポリペプチドよりも免疫原性が低いか、または非免疫原である可能性がある。本明細書に記載されているように、当技術分野では、例えば、Kabatら(in Sequences of Proteins of Immunological Interest, 第4版, (U.S. Dept. of Health and Human Services, U.S. Government Printing Office, 1991))など、種々の種の免疫グロブリン配列が入手可能である。
本明細書に記載されているように、Fcポリペプチドとフレーム内で融合されているA41Lポリペプチド（またはその変異体もしくはフラグメント）は本明細書に開示されている、または当技術分野で公知のA41Lポリペプチドのいずれか1つを含み得る。例えば、牛痘Brighton Red株のゲノムにコードされているA41Lポリペプチドのアミノ酸配列を有するA41Lポリペプチドを、免疫グロブリンFc領域にフレーム内で融合することができる。また、本明細書に記載されているように、この融合ポリペプチドのFc部分はヒトまたは非ヒト免疫グロブリンに由来するものであり得る。例えば、A41L-Fc融合ポリペプチドのFc部分は、ヒト免疫グロブリン、例えばIgG1のヒンジ領域の全部または一部のアミノ酸配列、CH2ドメインおよびCH3ドメインを含み得る。このような例示的融合ポリペプチドは図５に示されている。A41L-Fc融合ポリペプチドは、融合ポリペプチドが発現される宿主細胞においてポリペプチドの翻訳後輸送を助けるシグナルペプチド配列をさらに含み得る。このシグナルペプチド配列は、そのA41L配列が得られたポックスウイルスゲノムにコードされているA41Lシグナルペプチド配列に由来するものであり得る。あるいは、このシグナルペプチド配列は、ヒト成長ホルモンなどの関連のないポリペプチドに由来するアミノ酸配列を含み得る。
本明細書に記載のFcポリペプチドは、Fcポリペプチド変異体も含む。このようなFcポリペプチド変異体の1つは、Fcポリペプチドを形成する2つの重鎖定常領域ポリペプチドの間で形成し得る鎖間ジスルフィド結合の数を減らすために、セリンなどの別のアミノ酸で置換された鎖間ジスルフィド結合を形成する1以上のシステイン残基（ヒンジ領域の1以上のシステイン残基など）を有する。その上、またはその代わりに、完全な免疫グロブリン分子において軽鎖定常領域とジスルフィド結合を形成するヒンジ領域の最もアミノ末端のシステイン残基を例えばセリン残基などで置換することができる。あるいは、Fcポリペプチドの野生型ヒンジから1以上のシステイン残基を欠失させることもできる。Fcポリペプチド変異体の別の例として、Fcポリペプチドが低レベルのエフェクター機能しか持たないように置換または欠失したエフェクター機能に関与する1以上のアミノ酸を有する変異体がある。例えば、補体カスケードの成分の結合を低減または排除するため（例えば、Duncanら, Nature 332:563-64 (1988); Morganら, Immunology 86:319-24 (1995)参照）、または免疫細胞により発現されるIgG Fc受容体と結合するFcポリペプチドの能力を低減または排除するため(Winesら, J. Immunol. 164:5313-18 (2000); Chappelら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:9036 (1991); Canfieldら, J. Exp. Med. 173:1483 (1991); Duncanら,前掲)、または抗体依存性の細胞の細胞傷害性を変化させるために、Fc領域のアミノ酸を置換してもよい。野生型Fcポリペプチドとは異なるこのようなFcポリペプチド変異体は本発明ではまたムテインFcポリペプチドとも呼ぶ。
一実施形態では、A41Lポリペプチド（またはそのフラグメントまたは変異体）は、野生型Fc領域ポリペプチドにおいて、Fcポリペプチドまたは免疫グロブリンとある種の免疫細胞で発現される1以上のIgG Fc受容体との結合に寄与する残基の少なくとも1つの置換を含むFcポリペプチドとフレーム内で融合される。このようなムテインFcポリペプチドは、免疫細胞の表面に存在するIgG Fc受容体などのIgG Fc受容体と結合する融合ポリペプチドの能力が低下するように、ムテインFcポリペプチドのCH2ドメインにおいて少なくとも1つのアミノ酸残基の置換を含む。
バックグラウンドとして、ヒト白血球では、構造および機能的特性、ならびに抗原構造により区別される3つの異なる種のFc IgG-受容体が発現され、これらの違いはCD特異的モノクローナル抗体により検出される。これらのIgG Fc受容体はFcγRI(CD64)、FcγRII(CD32)およびFcγRIII(CD16)と表され、重複する白血球のサブセットで違った発現を示す。
単球、マクロファージ、好中球、骨髄前駆体および樹状細胞で発現される高親和性受容体FcγRI(CD64)はイソ型laとlbを含む。FcγRII(CD32)はイソ型IIa、llb1、llb2、llb3およびllcからなり、最も広く分布しているヒトFcγR型である低親和性受容体であり、ほとんどの白血球種ならびにランゲルハンス細胞、樹状細胞および血小板で発現される。FcγRlll(CD16)には2つのイソ型があり、双方ともヒトIgG1およびIgG3と結合し得る。FcyRIllaイソ型はIgGに対して中間的な親和性を有し、マクロファージ、単球、ナチュラルキラー(NK)細胞およびＴ細胞のサブセットで発現される。FcγRlllbはIgGに対して親和性の低い受容体であり、好中球で選択的に発現される。
IgG Fc受容体の結合に寄与するCH2ドメインのアミノ末端部分の残基には、Leu234〜Ser239部分の残基(Leu-Leu-Gly-Gly-Pro-Ser（配列番号80）(EUナンバリングシステム、Kabatら,前掲)が含まれる（例えば、Morganら, Immunology 86:319-24 (1995)およびそこに引用されている参照文献を参照）。これらの部分はヒトIgG1 Fcポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号79）の15〜20番の位置に相当する。このCH2ドメインにおけるこれら6つの部分の1以上（すなわち、1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、または6全て）のアミノ酸が置換されると、1以上のIgG Fc受容体（またはそのイソ型）と結合するFcポリペプチドの能力が低下する（例えば、Burtonら, Adv. Immunol. 51:1 (1992); Hulettら, Adv. Immunol. 57:1 (1994); Jefferisら, Immunol. Rev. 163:59 (1998); Lundら, J. Immunol. 147:2657 (1991); Sarmayら, Mol. Immunol. 29:633 (1992); Lundら, l. Immunol. 29:53 (1992); Morganら, 前掲参照）。EU234〜239番の1以上のアミノ酸の置換に加え、この領域（239番のカルボキシ末端側でも234番のアミノ末端側でもよい）に隣接する1つ、2つ、3つ、またはそれを超えるアミノ酸も置換することができる。
例として、235番（配列番号79の16番に相当する）のロイシン残基をグルタミン酸残基またはアラニン残基で置換すると、それぞれFcγRIに対する免疫グロブリン（ヒトIgG3など）の親和性が消失または低減する(Lundら, 1991, 前掲; Canfieldら, 前掲; Morganら, 前掲)。別の例としては、234番と235番（配列番号79の15番と16番に相当する）のロイシン残基を例えばアラニン残基で置換すると、免疫グロブリンとFcγRIIaとの結合が排除される（例えば、Winesら, 前掲参照）。あるいは、234番（配列番号79の15番に相当する）のロイシン、235番（配列番号79の16番に相当する）のロイシンおよび237番（配列番号79の18番に相当する）のグリシンはそれぞれ異なるアミノ酸で置換してもよく、例えば、234番のロイシンをアラニン残基で置換し(L234A)、235番のロイシンをアラニン残基(L235A)またはグルタミン酸残基(L235E)で置換し、237番のグリシン残基を例えばアラニン残基(G237A)などの別のアミノ酸で置換してもよい。
一実施形態では、ウイルスポリペプチド（またはその変異体もしくはフラグメント）とフレーム内で融合されているムテインFcポリペプチドは、本明細書に記載されているように、ヒトIgG1 CH2ドメインの234〜239番（EUナンバリングシステム）に相当するの配列番号79の15〜20番に1つ、2つ、3つ、4つ、5つまたは6つの突然変異を含む。ムテインFcポリペプチドの例としては、配列番号77の13番、14番および16番に(L234A)、(L235E)および(G237A)に相当する置換が見られてもよい、配列番号77で示されるアミノ酸配列を有する。
別の実施形態では、ムテインFcポリペプチドは、Fcポリペプチドのヒンジ領域にシステイン残基の突然変異を含む。一実施形態では、Fcポリペプチドのヒンジ領域のアミノ末端に最も近いシステイン残基（例えば、野生型IgG1免疫グロブリンのFc部分のヒンジ領域のアミノ末端に最も近いシステイン残基）が欠失されているか、または別のアミノ酸で置換されている。すなわち、例としては、配列番号79の1番のシステイン残基が欠失されているか、1番のシステイン残基が、ジスルフィド結合を形成することができない別のアミノ酸、例えばセリン残基で置換されている。別の実施形態では、ムテインFcポリペプチドは、Fcポリペプチドのヒンジ領域のアミノ末端に最も近いシステイン残基の欠失または置換を含み、さらに隣接するC末端アミノ酸の欠失または置換も含む。ある特定の実施形態では、このシステイン残基および隣接するC末端残基は双方ともムテインFcポリペプチドのヒンジ領域から欠失されている。特定の実施形態では、配列番号79の1番のシステイン残基と配列番号79の2番のアスパラギン酸が欠失されている。ヒンジ領域にこれらのシステイン残基およびアスパラギン酸残基の欠失を含むFcポリペプチドは宿主細胞で効率的に発現可能であり、ある例では、野生型のシステイン残基およびアスパラギン酸残基を保持しているFcポリペプチドよりも細胞で効率的に発現させることができる。
特定の実施形態では、ムテインFcポリペプチドは、配列番号79の1番のシステイン残基が欠失され、かつ、配列番号79の2番のアスパラギン酸が欠失され、かつ、配列番号79の15番のロイシン残基がアラニン残基で置換され、16番のロイシン残基がグルタミン酸残基で置換され、かつ、18番のグリシンがアラニン残基で置換され、野生型Fcポリペプチド（配列番号79）とは異なる、配列番号77で示されるアミノ酸配列を含む（図５も参照）。よって、ムテインFcポリペプチドの例は、そのアミノ末端部分にKTHTCPPCPAPEAEGAPS（配列番号81）のアミノ酸配列を含む（Fcムテイン配列例、配列番号77を参照）。
他のFc変異体は、限定されるものではないが例を挙げれば、共有結合的化学修飾、挿入、欠失および／または置換（さらに保存的置換を含んでもよい）などの軽微な変化だけを含む、既知のFcポリペプチド配列の類似アミノ酸配列を包含する。互いに類似するアミノ酸配列は、配列が相同な実質的領域を共有し得る。同様に、Fc変異体をコードしているヌクレオチド配列は実質的に類似のヌクレオチド配列を含み、限定されるものではないが例を挙げれば、共有結合的化学修飾、挿入、欠失および／または置換（さらに遺伝コードの縮重のためサイレント突然変異を含んでもよい）などの軽微な変化だけを含む。互いに類似するヌクレオチド配列は、配列が相同な実質的領域を共有し得る。
Fcポリペプチドまたは少なくとも1つの免疫グロブリン(immunogloblulin)定常領域、またはその一部は、着目するペプチドまたはポリペプチドと融合された場合、二量体または他の多量体を形成することにより、少なくとも部分的に、分解を防ぎ、かつ／または半減期を延長し、毒性を軽減し、免疫原性を軽減し、かつ／またはペプチドの生物活性を高めるビヒクルまたは担体部分として働く（例えば、米国特許第6,018,026号、同第6,291,646号、同第6,323,323号、同第6,300,099号、同第5,843,725号参照）。（また、例えば、米国特許第5,428,130号、同第6,660,843号、米国特許出願公開第2003/064480号、同第2001/053539号、同第2004/087778号、同第2004/077022号、同第2004/071712号、同第2004/057953号、同第2004/053845号、同第2004/044188号、同第2004/001853号、同第2004/082039号も参照。）
FcポリペプチドまたはFcポリペプチド変異体（例えば、ムテインFcポリペプチド）とフレーム内で融合されたA41Lポリペプチド（またはその変異体もしくはフラグメント）は、そのA41LポリペプチドとFcポリペプチドの間にペプチドリンカーを含んでもよい。このリンカーは1つのアミノ酸（例えば、グリシン残基など）であってもよいし、あるいは2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、7つ、8つ、9つ、または10個のアミノ酸であってもよいし、あるいは10〜20個の間のいずれの数のアミノ酸であってもよい。限定されるものではないが例を挙げれば、リンカーは、制限酵素認識部位であるヌクレオチド配列によってコードされている少なくとも2つのアミノ酸を含み得る。このような制限酵素認識部位の例としては、例えば、BamHI、ClaI、EcoRI、HindIII、KpnI、NcoI、NheI、PmlI、PstI、SalIおよびXhoIが挙げられる。
ムテインFcポリペプチドとフレーム内で融合されたA41Lポリペプチド、そのフラグメントまたはその変異体は、本明細書に記載の、また、医療従事者に知られている方法に従って製薬上または生理学上好適な担体または賦形剤とともに投与した場合、被験体において免疫応答を抑制するために使用可能である。このような融合ポリペプチドは、本明細書に記載の少なくとも1つのRPTPポリペプチド（すなわち、LAR、RPTP-σ、RPTP-δ）、少なくとも2つのRPTPポリペプチド、または3つ全てのRPTPポリペプチドの生物活性を変化させ得る。ある特定の実施形態では、ムテインFcポリペプチドとフレーム内で融合されたA41Lポリペプチド、そのフラグメントまたはその変異体は、本明細書に詳細に記載されている免疫疾患または免疫障害（自己免疫疾患または炎症性疾患を含む）を治療するために使用される。本明細書に記載されているように、A41l/ムテインFcポリペプチドはまた、限定されるものではないが、免疫疾患または免疫障害、心血管疾患または心血管障害、代謝性疾病または代謝性障害、あるいは増殖性疾患または増殖性障害を含む、細胞移動、細胞増殖または細胞分化の変化に関連する疾病または障害を治療するために使用可能である。
A41Lポリペプチドフラグメントとしては、A41Lポリペプチド変異体フラグメントを含む。A41Lポリペプチドフラグメントはまた、そのフラグメントが由来する全長A41Lとは異なるアミノ酸配列を有するA41Lフラグメントを含み、すなわち、そのA41Lポリペプチドフラグメント変異体は全長A41Lポリペプチドの一部と少なくとも99%、98%、97%、95%、90%、87%、85%、または80%のアミノ酸配列同一性を有する。免疫細胞の免疫応答性を変化させる（抑制する、または増強する）能力を有するA41Lポリペプチドフラグメントの変異体は、匹敵する免疫細胞の免疫応答性を変化させる能力を保持している。
免疫細胞の免疫応答性を変化させる能力を保持しているA41Lポリペプチド変異体およびA41Lポリペプチドフラグメント変異体としては、保存的アミノ酸置換を含む変異体を含む。当業者に公知の様々な判定基準が、ペプチドまたはポリペプチドの特定の位置のアミノ酸が保存的（または類似）であるかどうかを示す。例えば、類似アミノ酸置換または保存的アミノ酸置換は、アミノ酸残基が、塩基性側鎖（例えば、リシン、アルギニン、ヒスチジン）；酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）；非荷電極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン、ヒスチジン）；非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）；β分枝側鎖（例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン）および芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン）を持つアミノ酸など、類似側鎖を有するアミノ酸残基で置換されているものである。分類がより難しいと考えられるが、プロリンは、脂肪族側鎖を有するアミノ酸（例えば、ロイシン、バリン、イソロイシンおよびアラニン）と特性を共有している。ある特定の状況では、グルタミン酸のグルタミンへの置換またはアスパラギン酸のアスパラギンへの置換は、グルタミンおよびアスパラギンがそれぞれグルタミン酸およびアスパラギン酸のアミド誘導体であるということから類似置換であると考えられる。当技術分野で理解されているように、2つのポリペプチド間の「類似性」は、ポリペプチドのアミノ酸配列およびそれに対する保存されたアミノ酸置換をもう1つのポリペプチドの配列と比較することにより判定される（例えば、本明細書に記載のGENEWORKS、Align、またはBLASTアルゴリズムを使用）。例を挙げれば、本明細書に記載のA41L変異体は、配列番号82の50番にアルギニン残基からリシン残基への保存的置換を有し(GenBank Acc. No. AAM13618, May 20, 2003)、配列番号83となっている（例えば、Huら, Virology 181:716-20 (1991); Huら, Virology 204:343-56 (1994)も参照）。このA41L変異体は野生型A41Lポリペプチドの機能および特性を保持している。
A41Lポリペプチド変異体としてはまた、LAR、RPTP-δおよびRPTP-σの3つ全てとは相互作用または結合せず、1つまたは2つだけ（すなわち、LARとRPTP-δ、LARとRPTP-σ、またはRPTP-δとRPTP-σ）と相互作用または結合する変異体も含む。このような変異体は、野生型A41Lポリペプチドに比べて、少なくとも1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、7つ、8つ、9つ、10個、11〜15個、16〜25個、26〜35個、または36〜45個のアミノ酸置換、欠失または挿入を含む。A41Lと各RPTPの結合は本明細書に記載の、また、当技術分野で実践されている方法に従って判定することができる。結合研究のためのポリペプチドの供給源としては、例えば、単離されたA41LおよびRPTPもしくはそのフラグメント、またはA41L、LAR、RPTP-δおよびRPTP-σの組換え発現が可能な個々の細胞系統が挙げられる。
A41L全長ポリペプチドまたはA41Lフラグメントの変異体は、遺伝子工学および組換え分子生物学の方法および技術によって容易に作製することができる。A41Lポリペプチドの一次アミノ酸配列および二次アミノ酸配列の解析ならびにポリペプチドの三次構造を解析するためのコンピューターモデリングは、A41Lポリペプチドの構造および結果としてのおそらくは機能を変化させずに置換可能な特定のアミノ酸残基を特定する助けとなる。A41LポリペプチドまたはフラグメントをコードしているDNAの修飾は、そのDNAの部位特異的または部位指定突然変異誘発をはじめとする種々の方法によって行うことができ、これらの方法はオーバーラップエクステンションによるPCRスプライシング(SOE)など、DNA鋳型における変化を導入および増幅するためプライマーを用いてDNA増幅を行うことを含む。突然変異は、天然配列のフラグメントに連結可能とする制限部位によってフランキングされた、突然変異配列を含むオリゴヌクレオチドを合成することにより、特定の位置に導入することができる。連結後、得られた再構築配列は、所望のアミノ酸挿入、置換または欠失を有する変異体（または誘導体）をコードしている。
部位指定突然変異誘発は一般に、M13ファージベクターなど、一本鎖型および二本鎖型を有する、周知かつ市販のファージベクターを用いて行われる。一本鎖ファージ複製起点を含む他の好適なベクターも使用可能である（例えば、Veiraら, Meth. Enzymol. 15:3 (1987)参照）。一般に、部位指定突然変異誘発は、着目するタンパク質をコードしている一本鎖ベクターを作製することにより行われる。一本鎖ベクターの、そのDNAと相同な領域内に所望の突然変異を含むオリゴヌクレオチドプライマーをベクターにアニーリングした後、その二本鎖領域をプライマーとして用い、一方の鎖が変異配列をコードし、もう一方の鎖が元の配列をコードしているヘテロ二本鎖を作出する大腸菌DNAポリメラーゼI（クレノウフラグメント）などのDNAポリメラーゼを添加する。部位指定突然変異誘発に関するさらなる開示は、例えばKunkelら(Meth. Enzymol. 154:367 (1987))および米国特許第4,518,584号および同第4,737,462号に見出せる。このヘテロ二本鎖を適当な細菌細胞に導入し、所望の突然変異を含むクローンを選択する。結果として得られた変異したDNA分子を適当な宿主細胞で組換え発現させ、変異体、改変タンパク質を生産することができる。
オリゴヌクレオチド指定部位特異的（またはセグメント特異的）突然変異誘発法は、所望の置換、欠失または挿入に従って変異された特定のコドンを有する変異型ポリヌクレオチドを得るために使用することができる。また、タンパク質の欠失または末端切断誘導体は、所望の欠失に隣接する便宜な制限エンドヌクレアーゼ部位を用いることでも構築することができる。制限処理の後、オーバーハングを埋め、DNAを再連結すればよい。上記に示される変異を作出する方法の例は、Sambrookら(Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 第3版, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY 2001)。あるいは、アラニンスキャニング突然変異誘発、誤りがちな(error prone)ポリメラーゼ連鎖反応突然変異誘発およびオリゴヌクレオチド指定突然変異誘発などのランダム突然変異誘発技術を用いてA41Lポリペプチド変異体およびフラグメント変異体を得ることもできる（例えば、Sambrookら, 前掲参照）。
変異体が非変異体ポリペプチドまたはフラグメントに匹敵するコンフォメーションへフォールディングされているかどうかを評価するアッセイとしては、例えば、天然型または非フォールディングエピトープに特異的なモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体と反応するそのタンパク質の能力、リガンド結合機能の保持、およびプロテアーゼ消化に対してその突然変異タンパク質が感受性か抵抗性かを含む（Sambrookら, 前掲参照）。本明細書に記載のA41L変異体は、本明細書に記載のこれらの方法または当業者が通常行っている当技術分野で公知の他の方法に従って同定、特性決定および／または作製することができる。
A41Lポリペプチドをコードしている核酸分子において作出または同定された突然変異はそのコード配列のリーディングフレームを保持していることが好ましい。さらに、これらの突然変異は、転写された際にハイブリダイズして、そのmRNAの翻訳に悪影響のないループまたはヘアピンなどのmRNAの二次構造を作り出すことができる相補領域を作らないことが好ましい。突然変異部位は予め決定できるが、その突然変異の性質自体は予め決定される必要はない。例えば、ある部位の突然変異の最適な特徴を選択するためには、目的コドンにランダム突然変異誘発を行い、発現された突然変異体を生物活性の獲得または欠損または保持に関してスクリーニングすればよい。
A41Lポリヌクレオチドは、A41LポリペプチドまたはA41Lポリペプチドの少なくとも一部（またはフラグメント）またはその変異体をコードしているか、またはこのようなポリヌクレオチドに相補的であるポリヌクレオチドである。A41Lをコードするポリヌクレオチドまたはそのオーソログのヌクレオチド配列は例えば、本明細書に受託番号がGenBank登録に示されるポックスウイルスのゲノム配列に見出すことができ（GenBank受託番号NC_001559; NC_001611; Y16780; X69198; NC_003310; NC_005337; AY603355; NC_003391; AF438165; U94848; AY243312; AF380138; L22579; M35027; NC_003663; X94355; AF482758; NC_001132; AF170726; NC_001266; AF170722）また、本明細書に開示されているアミノ酸配列（例えば、配列番号1〜21）から推定することができる。ポリヌクレオチドは、A41Lポリペプチドをコードしている配列、またはこのような配列に相補的なヌクレオチド配列を含む、少なくとも15の連続するヌクレオチドまたは少なくとも30、35、40、50、55または60の連続するヌクレオチド、ある特定の実施形態では、少なくとも70、75、80、90、100、110、120、125または130の連続するヌクレオチド、他の実施形態では、少なくとも135、140、145、150、155、160または170の連続するヌクレオチド、他の実施形態では、少なくとも180、190、200、225、250、275、300、325、350、375、400、405、410、420、425、445、450、475、500、525、530、545、550、575、600、625、650または660の連続するヌクレオチドを含む。A41Lポリペプチド、その変異体またはフラグメントをコードしている特定のポリヌクレオチドはまた、本明細書に記載されているように、プローブ、プライマー、short interfering RNA(siRNA)、またはアンチセンスオリゴヌクレオチドとしても使用可能である。ポリヌクレオチドは一本鎖DNAまたはRNA（コードまたはアンチセンス）または二本鎖RNA（例えば、ゲノムRNAまたは合成RNA）またはDNA（例えば、cDNAまたは合成DNA）であってよい。
ポリヌクレオチド変異体は、ハイブリダイゼーション法によって同定することもできる。好適な中程度のストリンジェント条件としては、例えば、5X SSC、0.5%SDS、1.0mM EDTA(pH8.0)の溶液中での予備洗浄；50℃〜70℃、5X SSCで1〜16時間のハイブリダイズ；その後、0.05〜0.1%SDSを含有する2X、0.5Xおよび0.2X SSC各1以上での22〜65℃で20〜40分1回または2回の洗浄を含む。さらなるストリンジェンシーでは、条件は0.1X SSCおよび0.1%SDS中50〜60℃で15分間の洗浄を含み得る。当業者に理解されているように、ハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシーのバリエーションは、プレハイブリダイゼーション、ハイブリダイゼーションおよび洗浄工程の時間、温度、および／または使用溶液の濃度を変更することで達成することができる。また、好適な条件は、いくらかは、用いるプローブの特定のヌクレオチド配列（すなわち例えば、グアニンおよびシトシン(G/C)含量とアデニンおよびチミジン(A/T)含量）にも依存する。よって、当業者ならば、プローブの所望の選択性が特定されれば、適当なストリンジェント条件は過度な試験を行わずとも容易に選択できることが分かるであろう。
130Lポリペプチド
本明細書に記載されているように、130L遺伝子はYLDVに感染した細胞により分泌され、おそらくウイルス毒性因子である糖タンパク質（本明細書では130Lポリペプチドと呼ぶ）をコードしている。他のポックスウイルス同様、YLDVのゲノムは二本鎖DNAであり、そのウイルスは、ウイルスに宿主の免疫系を回避させ、かつ／またはウイルス複製を容易にする宿主遺伝子を獲得させることにより種々の宿主種で複製するようになっている（例えば、Najarroら, J. Gen. Virol. 84:3325-36 (2003)参照）。種々のポックスウイルスのゲノムによってコードされているポリペプチドは、インターフェロン、補体、サイトカインおよび／またはケモカインなどの宿主因子の機能を阻害または遮断することにより、あるいは炎症および発熱の作用を阻害、遮断または変化させることにより免疫応答に影響を及ぼし得る。
本明細書において130Lポリペプチドは、ヤタポックスウイルスであるヤバ様病ウイルスのゲノムにコードされているいくつかの130Lポリペプチドのうちのいずれか1つを指す（GenBank受託番号AJ293568.1およびNC_002642.1のヤバ様病ウイルスのゲノム配列例（130Lポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む）を参照）。130Lポリペプチドは本明細書で開示されている、または当技術分野で公知のアミノ酸配列のいずれか1つ、またはこのようなアミノ酸配列の変異体（オーソログを含む）を含み得る。130Lポリペプチドのアミノ酸配列例は配列番号85（GenBank受託番号CAC21368.1参照）およびGenBank受託番号NP_073515.1（配列番号144）で示される。
また、130Lポリペプチドは、本明細書に記載の、または当技術分野で公知の130Lポリペプチド配列と少なくとも1つのアミノ酸で異なるアミノ酸配列を含む130Lポリペプチド変異体も含み得る。この130Lポリペプチド変異体は、少なくとも1つのアミノ酸の挿入、欠失、付加および／または置換により野生型のアミノ酸配列とは異なっており、少なくとも2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、7つ、8つ、9つまたは10個のアミノ酸の挿入、欠失、付加および／または置換により異なっている場合もあるし、あるいは10〜45個のいずれかの個数のアミノ酸で異なっている場合もある。130Lポリペプチド変異体としては、例えば、天然多型（すなわち、違うヤタポックスウイルス株のゲノムによりコードされている130Lポリペプチドのオーソログ）または組換え操作もしくは組換え処理された130Lポリペプチド変異体が挙げられる。
ある特定の実施形態では、130Lポリペプチドの変異体は野生型130Lポリペプチドの少なくとも1つの機能的活性または生物活性を保持しており、他の特定の実施形態では、130Lポリペプチド変異体は野生型130Lポリペプチドの少なくとも1つ、ある特定の実施形態では、全ての機能的活性または生物活性を保持している。130Lポリペプチドまたはその変異体の機能的活性または生物活性は本明細書に記載の、また、当技術分野で公知の方法に従って測定することができ、その機能または活性としては、(1)受容体PTPであるLAR、RPTP-δおよびRPTP-σの少なくとも1つ、または少なくとも2つ、または3つ全てと結合または相互作用する能力；(2)野生型130Lポリペプチドと特異的に結合する抗体と結合する能力；および(3)LAR、RPTP-δおよびRPTP-σの少なくとも1つを発現する細胞の免疫応答を抑制する能力が挙げられる。野生型130Lポリペプチドの機能的活性または生物活性を保持する130Lポリペプチド変異体は、野生型130Lポリペプチドが示す機能的活性または生物活性レベルに匹敵する（すなわち、統計学的に有意に、または生物学的に有意に異ならない）レベルの機能または活性を示す。
130Lポリペプチド変異体およびこれらの変異体をコードするポリヌクレオチドは配列比較により同定することができる。本明細書において、2つのアミノ酸配列は、最大の一致が得られるようにアラインした場合にその2つのアミノ酸配列のアミノ酸残基が同一であれば、100%のアミノ酸配列同一性を有する。同様に、2つのポリヌクレオチドは、最大の一致が得られるようにアラインした場合にその2つの配列のヌクレオチド残基が同一であれば、100%のヌクレオチド配列同一性を有する。配列比較は、当業者に周知のコンピューターアルゴリズムの使用を含むいずれかの方法を用いて行うことができるこのようなアルゴリズムとしては、NCBIウェブサイト（[オンライン]インターネット:<URL: http://www/ncbi.nlm.nih.gov/cgi-bin/BLAST参照）で入手できるAlignまたはBLASTアルゴリズムがある（例えば、Altschul, J. Mol. Biol. 219:555-565, 1991; HenikoffおよびHenikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915-10919, 1992参照）。デフォルトパラメーターが使用可能である。さらに、LASERGENE bioinformatics computing suite (DNASTAR, Inc., Madison, WI)；CLUSTALWプログラム(Thompsonら, Nucleic Acids Res. 22:4673-80 (1991))；および「GeneDoc」(Nicholasら, EMBNEW News 4:14 (1991))に含まれているものなどの標準的なソフトウエアプログラムも利用可能である。最適アライメントを決定することで2つのヌクレオチド配列またはアミノ酸配列を比較するための他の方法も当業者により実施されている（例えば、PeruskiおよびPeruski, The Internet and the New Biology: Tools for Genomic and Molecular Research (ASM Press, Inc. 1997); Wuら(編), “Information Superhighway and Computer Databases of Nucleic Acids and Proteins,” in Methods in Gene BioTEchnology, 123-151頁(CRC Press, Inc. 1997);およびBishop(編), Guide to Human Genome Computing, 第2版(Academic Press, Inc. 1998)参照）。
ある特定の実施形態では、130Lポリペプチド変異体のアミノ酸配列は、対応する130L野生型ポリペプチド、または本明細書に記載の、かつ／または当技術分野で公知の130Lポリペプチドと少なくとも60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%または98%同一である（例えば、配列番号85（シグナルペプチド配列（配列番号151）を有する）または配列番号150（成熟130Lポリペプチド）参照）。あるいは、130Lポリペプチド変異体は、その変異体をコードしているポリヌクレオチドのヌクレオチド配列と130Lポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドとを比較することで同定することができる。特定の実施形態では、130Lポリペプチド変異体をコードするポリヌクレオチドのヌクレオチド配列は、本明細書に記載の130Lポリペプチドをコードしているポリヌクレオチド配列の1以上と少なくとも70%、75%、80%、85%、90%または95%同一である。ポリヌクレオチド変異体はまた、遺伝コードの縮重のためにヌクレオチド配列そのものが異なるが、本明細書に開示されている、または当技術分野で公知のアミノ酸配列を有する130Lポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドも含む。
本明細書に記載されているように、細胞表面に存在する130Lポリペプチドは、本明細書に記載の130Lポリペプチド変異体およびフラグメントおよび融合ポリペプチド（LAR、RPTP-δおよびRPTP-σの少なくとも1つ、2つ、または3つと相互作用または結合する）は、免疫細胞の免疫応答性を変化させる（例えば、抑制または増強する）ために使用可能である。一実施形態では、本明細書に記載の130Lポリペプチドまたはその変異体または130L融合ポリペプチドは急性免疫応答を示す患者の治療に使用可能である。例えば、130Lポリペプチド、その変異体またはフラグメントは急性呼吸窮迫症候群(ARDS)などの疾病または症状に関連する免疫応答を抑制し得る。成人にも小児にも発症し得るARDSは、肺胞-毛細血管装置を傷害する直接的肺発作または全身発作（例えば、敗血症、肺炎、誤嚥)の結果として起こる場合が多い。例えば、腫瘍壊死因子-アルファ(TNF-α)、インターロイキン-ベータ(IL-β)、IL-10および可溶性細胞間接着分子1(sICAM-1)をはじめとする数種のサイトカインがこの症候群の発症に関連している。生物学的サンプルにおけるこれらの因子およびサイトカインのレベルの増減は本明細書に記載の方法およびアッセイにより容易に判定することができ、急性状態を監視するためや治療の効果を監視するために当技術分野で関連的に行われている。
130Lに特異的な免疫応答の可能性または程度を低減または最小化するために、130Lポリペプチド、130L変異体、その誘導体またはフラグメント、またはそれらを含む融合タンパク質を限定回数投与することができ、130Lのグリコシル化を変化させる様式で産生させる、または誘導することができ、かつ／または130Lの抗原性を低減または最小化する条件下で投与することができる。例えば、130Lは、免疫応答、特に130Lに特異的な応答を抑制する第二の組成物を宿主に投与する前、投与すると同時、または投与した後に投与することができる。
特定の他の実施形態では、130Lポリペプチドフラグメントは免疫細胞の免疫応答性を変化させることができる。このような130Lフラグメントは、受容体PTPであるLAR、RPTP-δおよびRPTP-σの少なくとも1つ、少なくとも2つ、または3つ全てと相互作用または結合する。このフラグメントは少なくとも6つ、7つ、8つ、9つ、10個、11個、12個、13個、14個または15個の連続するアミノ酸を含み得る。ある特定の実施形態では、130Lフラグメントは130Lポリペプチドの少なくとも20〜50個の間のいずれかの数の連続するアミノ酸を含み、他の実施形態では、130Lフラグメントは130Lポリペプチドの少なくとも50〜100個の間のいずれかの数の連続するアミノ酸を含む。130Lフラグメントはまた、末端切断型の130Lポリペプチドも含む。末端切断型130Lポリペプチドは、全長130Lポリペプチドのアミノ末端もしくはカルボキシ末端のいずれか、またはアミノ末端とカルボキシ末端の双方から少なくとも1つ、2〜10個、11〜20個、21〜30個、31〜40個、または50個のアミノ酸を欠いている。ある特定の実施形態では、130Lフラグメントは、全長130Lポリペプチドのアミノ末端半分またはカルボキシ末端半分全体を欠いている。他の実施形態では、130Lポリペプチドフラグメント（末端切断型フラグメントを含む）は、130Lポリペプチドまたはフラグメントではない部分とコンジュゲート、融合またはそうでなければ連結していてもよい。例えば、130Lポリペプチドフラグメントは免疫細胞（この免疫細胞は130Lポリペプチドまたはフラグメントにより影響を受けた細胞と同じ細胞であってもよいし、同種の細胞であってもよいし、異なる細胞であってもよい）の免疫応答性を変化させ得る（例えば、免疫細胞の免疫応答性を抑制し得る）別の分子と連結することができる。さらに、当業者ならば、ポリペプチドをPEG化するなどにより、ポリペプチドの半減期を延長し、かつ／または薬物動態特性を改良する方法を知っている。
130L融合ポリペプチドの例としては、免疫グロブリン(Ig)Fcポリペプチドとフレーム内で融合された本明細書に記載の130Lポリペプチド、その変異体またはフラグメントが挙げられる。免疫グロブリンのFcポリペプチドは、重鎖CH2ドメインとCH3ドメイン、およびCH1とCH2の間に位置するヒンジ領域の一部または全部を含む。歴史的にみれば、Fcフラグメントは免疫グロブリンのパパイン消化により誘導され、免疫グロブリンのヒンジ領域を含んでいる。Fc領域は、共有結合（例えば、特にジスルフィド結合）および非共有結合により連結して二量体型または多量体型とすることができる単量体ポリペプチドである。Fcポリペプチドの単量体サブユニット間の分子間ジスルフィド結合の数は免疫グロブリンクラス（例えば、IgG、IgA、IgE)またはサブクラス（例えば、ヒトIgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgGA2)によって異なる。
また、C末端で末端切断された（すなわち、少なくとも1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、10個、15個、20個またはそれを超えるアミノ酸が除去または欠失されている）FcポリペプチドなどのFcポリペプチドフラグメントも使用可能である。ある特定の実施形態では、本明細書に記載のFcポリペプチドは、2つの独立した130L/Fc融合タンパク質のFcポリペプチド部分間で鎖間ジスルフィド結合を形成させて130L/Fc融合ポリペプチド二量体を形成するように、ヒンジ領域の少なくともいくつかまたは全てのシステイン残基といった複数のシステイン残基を含む。他の実施形態では、抗体依存性細胞性細胞傷害作用(ADCC)および補体結合（および関連の補体関連細胞傷害作用(associated complement associated cytotoxicity (CDC)）の保持が望まれる場合には、このFcポリペプチドは、Fcポリペプチド融合タンパク質が単量体となり、二量体が形成できないように、ヒンジ領域のシステイン残基の置換または欠失を含む（例えば、米国特許出願公開第2005/0175614号参照）。
免疫グロブリンのFc部分は、免疫グロブリンのある種のエフェクター機能を媒介する。Fc領域に関連しているエフェクター機能の3つの一般的カテゴリーとして、(1)従来の補体カスケードの活性化、(2)エフェクター細胞との相互作用、および(3)免疫グロブリンの区画化がある。現在のところ、Fcポリペプチド、およびいずれか1以上の定常領域ドメイン、および少なくとも1つの免疫グロブリン定常領域ドメインを含む融合タンパク質は当業者に公知の組換え分子生物学の技術に従って容易に作製することができる。
130Lポリペプチドまたは変異体、またはそのフラグメントは、その使用に関して130L-IgFc融合ポリペプチドが意図される動物種に由来するヌクレオチドおよびそのコードされているアミノ酸配列を用いて作製される免疫グロブリンFcポリペプチド(130L-Fc融合ポリペプチド)とフレーム内で融合させることができる。分子生物学の熟練者であれば、本明細書に記載の、また、当技術分野で慣例的に行われている方法に従い、このような融合ポリペプチドを容易に作製することができる。一実施形態では、Fcポリペプチドはヒト起源のものであり、ヒトIgG1、IgG2、IgG3、IgG4またはIgAなどの免疫グロブリンクラスおよびサブクラスのいずれかに由来するものであり得る。ある特定の実施形態では、FcポリペプチドはヒトIgG1免疫グロブリン由来のものである（Kabatら、前掲参照）。別の実施形態では、130L-Fc融合ポリペプチドは、例えば限定されるものではないが、マウス、ラット、ウサギまたはハムスターなどの非ヒト動物由来のFcポリペプチドを含む。130L-Fc融合ポリペプチドが投与され得る宿主種の免疫グロブリン由来Fcポリペプチドのアミノ酸配列は、非同系宿主由来のFcポリペプチドよりも免疫原性が低いか、または非免疫原である可能性がある。本明細書に記載されているように、当技術分野では、例えば、Kabatら (in Sequences of Proteins of Immunological Interest, 第4版, (U.S. Dept. of Health and Human Services, U.S. Government Printing Office, 1991))など、種々の種の免疫グロブリン配列が入手可能である。
本明細書に記載されているように、Fcポリペプチドと融合されている130Lポリペプチド（またはその変異体もしくはフラグメント）は本明細書に開示されている、または当技術分野で公知の130Lポリペプチドのいずれか1つを含み得る。例えば、ヤバ様病ウイルス（例えば、GenBank受託番号AJ293568.1およびNC_002642参照）のゲノムにコードされている130Lポリペプチドのアミノ酸配列を有する130Lポリペプチドを、免疫グロブリンFc領域と融合することができる（例えば、配列番号154参照）。また、本明細書に記載されているように、この融合ポリペプチドのFc部分はヒトまたは非ヒト免疫グロブリンに由来するものであり得る。例えば、130L-Fc融合ポリペプチドのFc部分は、ヒト免疫グロブリン、例えばIgG1のヒンジ領域の全部または一部のアミノ酸配列、CH2ドメインおよびCH3ドメインを含み得る。130L-Fc融合ポリペプチドは、融合ポリペプチドが発現される宿主細胞においてポリペプチドの翻訳後輸送を助けるシグナルペプチド配列をさらに含み得る。このシグナルペプチド配列は、その130L配列が得られたポックスウイルスゲノムにコードされている130Lシグナルペプチド配列に由来するものであり得る。あるいは、このシグナルペプチド配列は、ヒト成長ホルモンなどの関連のないポリペプチドに由来するアミノ酸配列を含み得る。
本明細書に記載のFcポリペプチドは、Fcポリペプチド変異体も含む。このようなFcポリペプチド変異体の1つは、Fcポリペプチドを形成する2つの重鎖定常領域ポリペプチドの間で形成し得る鎖間ジスルフィド結合の数を減らすために、セリンなどの別のアミノ酸で置換された鎖間ジスルフィド結合を形成する1以上のシステイン残基（ヒンジ領域の1以上のシステイン残基など）を有する。その上、またはその代わりに、完全な免疫グロブリン分子において軽鎖定常領域とジスルフィド結合を形成するヒンジ領域の最もアミノ末端のシステイン残基を例えばセリン残基などで置換することができる。あるいは、Fcポリペプチドの野生型ヒンジから1以上のシステイン残基を欠失させることもできる。Fcポリペプチド変異体の別の例として、Fcポリペプチドが低レベルのエフェクター機能しか持たないように置換または欠失したエフェクター機能に関与する1以上のアミノ酸を有する変異体がある。例えば、補体カスケードの成分の結合を低減または妨げるため（例えば、Duncanら, Nature 332:563-64 (1988); Morganら, Immunology 86:319-24 (1995)参照）、または免疫細胞により発現されるIgG Fc受容体と結合するFcポリペプチドの能力を低減または妨げるため(Winesら, J. Immunol. 164:5313-18 (2000); Chappelら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:9036 (1991); Canfieldら, J. Exp. Med. 173:1483 (1991); Duncanら,前掲)、または抗体依存性の細胞の細胞傷害性を変化させるために、Fc領域のアミノ酸を置換してもよい。野生型Fcポリペプチドとは異なるこのようなFcポリペプチド変異体は本発明ではまたムテインFcポリペプチドとも呼ぶ。
一実施形態では、130Lポリペプチド（またはそのフラグメントまたは変異体）は、野生型Fc領域ポリペプチドにおいて、Fcポリペプチドまたは免疫グロブリンとある種の免疫細胞で発現される1以上のIgG Fc受容体との結合に寄与する残基の少なくとも1つの置換を含むFcポリペプチドと融合される。このようなムテインFcポリペプチドは、免疫細胞の表面に存在するIgG Fc受容体などのIgG Fc受容体と結合する融合ポリペプチドの能力が低下するように、ムテインFcポリペプチドのCH2ドメインにおいて少なくとも1つのアミノ酸残基の置換を含む。
本明細書で論じるように、IgG Fc受容体結合に寄与するCH2ドメインのアミノ末端部分の残基には、Leu234〜Ser239番の残基(Leu-Leu-Gly-Gly-Pro-Ser（配列番号152）(EUナンバリングシステム、Kabatら, 前掲）)が含まれる（例えば、Morganら, Immunology 86:319-24 (1995)およびそこに引用されている参照文献を参照）。このCH2ドメインにおけるこれら6つの位置の1以上（すなわち、1つ、2つ、3つ、4つ、5つまたは6つ全て）のアミノ酸が置換されると、Fcポリペプチドの、1以上のIgG Fc受容体（またはそのイソ型）と結合する能力が低下する（例えば、Burtonら, Adv. Immunol. 51:1 (1992); Hulettら, Adv. Immunol. 57:1 (1994); Jefferisら, Immunol. Rev. 163:59 (1998); Lundら, J. Immunol. 147:2657 (1991); Sarmayら, Mol. Immunol. 29:633 (1992); Lundら, Mol. Immunol. 29:53 (1992); Morganら, 前掲参照）。EU234〜239番の1以上のアミノ酸に置換に加え、この領域（239番のカルボキシ末端側でも234番のアミノ末端側でもよい）に隣接する1つ、2つ、または3つ、またはそれを超えるアミノ酸も置換することができる。
例として、235番のロイシン残基をグルタミン酸残基またはアラニン残基で置換すると、それぞれFcγRIに対する免疫グロブリン（ヒトIgG3など）の親和性が消失または低減する(Lundら, 1991, 前掲; Canfieldら, 前掲; Morganら, 前掲)。別の例としては、234番と235番のロイシン残基を例えばアラニン残基で置換すると、免疫グロブリンとFcγRIIaとの結合が妨げられる（例えば、Winesら, 前掲参照）。あるいは、234番のロイシン、235番のロイシンおよび237番のグリシンはそれぞれ異なるアミノ酸で置換してもよく、例えば、234番のロイシンをアラニン残基で置換し(L234A)、235番のロイシンをアラニン残基(L235A)またはグルタミン酸残基(L235E)で置換し、237番のグリシン残基を例えばアラニン残基(G237A)などの別のアミノ酸で置換してもよい。
一実施形態では、130Lポリペプチド（またはその変異体もしくはフラグメント）とフレーム内で融合されているムテインFcポリペプチドは、本明細書に記載されているように、ヒトIgG1 CH2ドメインの234〜239番（EUナンバリングシステム）に相当するの配列番号145の15〜20番の間か、配列番号146の13〜18番の間に位置する1つ、2つ、3つ、4つ、5つまたは6つの突然変異（EU234、235および237に相当する位置における置換）を含む。
別の実施形態では、ムテインFcポリペプチドは、Fcポリペプチドのヒンジ領域にシステイン残基の突然変異を含む。一実施形態では、Fcポリペプチドのヒンジ領域のアミノ末端に最も近いシステイン残基（例えば、野生型IgG1免疫グロブリンのFc部分のヒンジ領域のアミノ末端に最も近いシステイン残基）が欠失されているか、または別のアミノ酸で置換されている。すなわち、例としては、配列番号145の1番のシステイン残基が欠失されているか、1番のシステイン残基が、ジスルフィド結合を形成することができない別のアミノ酸、例えばセリン残基で置換されている。別の実施形態では、ムテインFcポリペプチドは、Fcポリペプチドのヒンジ領域のアミノ末端に最も近いシステイン残基の欠失または置換を含み、さらに隣接するC末端アミノ酸の欠失または置換も含む。ある特定の実施形態では、このシステイン残基および隣接するC末端残基は双方ともムテインFcポリペプチドのヒンジ領域から欠失されている。特定の実施形態では、配列番号145の1番のシステイン残基と配列番号145の2番のアスパラギン酸が欠失されている。ヒンジ領域にアミノ末端に最も近いシステイン残基の欠失を含むFcポリペプチドは、このようなFcポリペプチドをコードしている組換え発現構築物を含む宿主細胞でより効率的に発現する。
特定の実施形態では、ムテインFcポリペプチドは、Fcポリペプチドのヒンジ領域のアミノ末端に最も近いシステイン残基が欠失され、かつ、Ｃ末端に隣接したアスパラギン酸が欠失され、かつ、EU234に相当するロイシン残基がアラニン残基で置換され、EU235に相当するロイシン残基がグルタミン酸残基で置換され、かつ、EU237に相当するグリシンがアラニン残基で置換された、野生型Fcポリペプチド（配列番号145）とは異なる、配列番号146で示されるアミノ酸配列を含む（配列番号146参照）。よって、ムテインFcポリペプチドの例は、そのアミノ末端部分にKTHTCPPCPAPEAEGAPS（配列番号148）（配列番号146の1〜18番）のアミノ酸配列を含む。
他のFc変異体は、限定されるものではないが例を挙げれば、共有結合的化学修飾、挿入、欠失および／または置換（さらに保存的置換を含んでもよい）などの軽微な変化だけを含む、既知のFcポリペプチド配列の類似アミノ酸配列を包含する。互いに類似するアミノ酸配列は、配列が相同な実質的領域を共有し得る。同様に、Fc変異体をコードしているヌクレオチド配列は実質的に類似のヌクレオチド配列を含み、限定されるものではないが例を挙げれば、共有結合的化学修飾、挿入、欠失および／または置換（さらに遺伝コードの縮重のためサイレント突然変異を含んでもよい）などの軽微な変化だけを含む。互いに類似するヌクレオチド配列は、配列が相同な実質的領域を共有し得る。
Fcポリペプチドまたは少なくとも1つの免疫グロブリン(immunogloblulin)定常領域、またはその一部は、着目するペプチドまたはポリペプチドと融合された場合、二量体または他の多量体を形成することにより、少なくとも部分的に、分解を防ぎ、かつ／または半減期を延長し、毒性を軽減し、免疫原性を軽減し、かつ／またはペプチドの生物活性を高めるビヒクルまたは担体部分として働く（例えば、米国特許第6,018,026号、同第6,291,646号、同第6,323,323号、同第6,300,099号、同第5,843,725号参照）。（また、例えば、米国特許第5,428,130号、同第6,660,843号、米国特許出願公開第2003/064480号、同第2001/053539号、同第2004/087778号、同第2004/077022号、同第2004/071712号、同第2004/057953号、同第2004/053845号、同第2004/044188号、同第2004/001853号、同第2004/082039号も参照。）
FcポリペプチドまたはFcポリペプチド変異体（例えば、ムテインFcポリペプチド）とフレーム内で融合された130Lポリペプチド（またはその変異体もしくはフラグメント）は、その130LポリペプチドとFcポリペプチドの間にペプチドリンカーを含んでもよい。このリンカーは1つのアミノ酸（例えば、グリシン残基など）であってもよいし、あるいは2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、7つ、8つ、9つ、または10個のアミノ酸であってもよいし、あるいは10〜20個の間のいずれの数のアミノ酸であってもよい。限定されるものではないが例を挙げれば、リンカーは、制限酵素認識部位であるヌクレオチド配列にコードされている少なくとも2つのアミノ酸を含み得る。このような制限酵素認識部位の例としては、例えば、BamHI、ClaI、EcoRI、HindIII、KpnI、NcoI、NheI、PmlI、PstI、SalIおよびXhoIが挙げられる。
ムテインFcポリペプチドとフレーム内で融合された130Lポリペプチド、そのフラグメントまたはその変異体は、本明細書に記載の、また、医療従事者に知られている方法に従って製薬上または生理学上好適な担体または賦形剤とともに投与した場合、被験体において免疫応答を抑制するために使用可能である。このような融合ポリペプチドは、本明細書に記載の少なくとも1つのRPTPポリペプチド（すなわち、LAR、RPTP-σ、RPTP-δ）、少なくとも2つのRPTPポリペプチド、または3つ全てのRPTPポリペプチドの生物活性を変化させ得る。ある特定の実施形態では、ムテインFcポリペプチドとフレーム内で融合された130Lポリペプチド、そのフラグメントまたはその変異体は、本明細書に詳細に記載されている免疫疾患または免疫障害（自己免疫疾患または炎症性疾患を含む）を治療するために使用される。本明細書に記載されているように、130L/ムテインFcポリペプチドはまた、限定されるものではないが、免疫疾患または免疫障害、心血管疾患または心血管障害、代謝性疾病または代謝性障害、あるいは増殖性疾患または増殖性障害を含む、細胞移動、細胞増殖または細胞分化の変化に関連する疾病または障害を治療するために使用可能である。
130Lポリペプチドフラグメントとしては、130Lポリペプチド変異体フラグメントを含む。130Lポリペプチドフラグメントはまた、そのフラグメントが由来する全長130Lとは異なるアミノ酸配列を有する130Lフラグメントを含み、すなわち、その130Lポリペプチドフラグメント変異体は全長130Lポリペプチドの一部と少なくとも99%、98%、97%、95%、90%、87%、85%、または80%のアミノ酸配列同一性を有する。免疫細胞の免疫応答性を変化させる（抑制する、または増強する）能力を有する130Lポリペプチドフラグメントの変異体は、匹敵する免疫細胞の免疫応答性を変化させる能力を保持している。
免疫細胞の免疫応答性を変化させる能力を保持している130Lポリペプチド変異体および130Lポリペプチドフラグメント変異体としては、保存的アミノ酸置換を含む変異体を含む。当業者に公知の様々な判定基準が、ペプチドまたはポリペプチドの特定の位置のアミノ酸が保存的（または類似）であるかどうかを示す。例えば、類似アミノ酸置換または保存的アミノ酸置換は、アミノ酸残基が、塩基性側鎖（例えば、リシン、アルギニン、ヒスチジン）；酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）；非荷電極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン、ヒスチジン）；非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）；β分枝側鎖（例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン）および芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン）を持つアミノ酸など、類似側鎖を有するアミノ酸残基で置換されているものである。分類がより難しいと考えられるが、プロリンは、脂肪族側鎖を有するアミノ酸（例えば、ロイシン、バリン、イソロイシンおよびアラニン）と特性を共有している。ある特定の状況では、グルタミン酸のグルタミンへの置換またはアスパラギン酸のアスパラギンへの置換は、グルタミンおよびアスパラギンがそれぞれグルタミン酸およびアスパラギン酸のアミド誘導体であるということから類似置換であると考えられる。当技術分野で理解されているように、2つのポリペプチド間の「類似性」は、ポリペプチドのアミノ酸配列およびそれに対する保存されたアミノ酸置換をもう1つのポリペプチドの配列と比較することにより判定される（例えば、本明細書に記載のGENEWORKS、Align、またはBLASTアルゴリズムを使用）。
130Lポリペプチド変異体としてはまた、LAR、RPTP-δおよびRPTP-σの3つ全てとは相互作用または結合せず、1つまたは2つだけ（すなわち、LARとRPTP-δ、LARとRPTP-σ、またはRPTP-δとRPTP-σ）と相互作用または結合する変異体も含む。このような変異体は、野生型130Lポリペプチドに比べて、少なくとも1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、7つ、8つ、9つ、10個、11〜15個、16〜25個、26〜35個、または36〜45個のアミノ酸置換、欠失または挿入を含む。130Lと各RPTPの結合は本明細書に記載の、また、当技術分野で実践されている方法に従って判定することができる。結合研究のためのポリペプチドの供給源としては、例えば、単離された130LおよびRPTPもしくはそのフラグメント、または130L、LAR、RPTP-δおよびRPTP-σの組換え発現が可能な個々の細胞系統が挙げられる。
130L全長ポリペプチドまたは130Lフラグメントの変異体は、遺伝子工学および組換え分子生物学の方法および技術によって容易に作製することができる。130Lポリペプチドの一次アミノ酸配列および二次アミノ酸配列の解析ならびにポリペプチドの三次構造を解析するためのコンピューターモデリングは、130Lポリペプチドの構造および結果としてのおそらくは機能を変化させずに置換可能な特定のアミノ酸残基を特定する助けとなる。130LポリペプチドまたはフラグメントをコードしているDNAの改変は、そのDNAの部位特異的または部位指定突然変異誘発をはじめとする種々の方法によって行うことができ、これらの方法はオーバーラップエクステンションによるPCRスプライシング(SOE)など、DNA鋳型における変化を導入および増幅するためプライマーを用いてDNA増幅を行うことを含む。突然変異は、天然配列のフラグメントに連結可能とする制限部位によってフランキングされた、突然変異配列を含むオリゴヌクレオチドを合成することにより、特定の位置に導入することができる。連結後、得られた再構築配列は、所望のアミノ酸挿入、置換または欠失を有する変異体（または誘導体）をコードしている。
部位指定突然変異誘発は一般に、M13ファージベクターなど、一本鎖型および二本鎖型を有する、周知かつ市販のファージベクターを用いて行われる。一本鎖ファージ複製起点を含む他の好適なベクターも使用可能である（例えば、Veiraら, Meth. Enzymol. 15:3 (1987)参照）。一般に、部位指定突然変異誘発は、着目するタンパク質をコードしている一本鎖ベクターを作製することにより行われる。一本鎖ベクターの、そのDNAと相同な領域内に所望の突然変異を含むオリゴヌクレオチドプライマーをベクターにアニーリングした後、その二本鎖領域をプライマーとして用い、一方の鎖が変異配列をコードし、もう一方の鎖が元の配列をコードしているヘテロ二本鎖を作出する大腸菌DNAポリメラーゼI（クレノウフラグメント）などのDNAポリメラーゼを添加する。部位指定突然変異誘発に関するさらなる開示は、例えばKunkelら(Meth. Enzymol. 154:367 (1987))および米国特許第4,518,584号および同第4,737,462号に見出せる。このヘテロ二本鎖を適当な細菌細胞に導入し、所望の突然変異を含むクローンを選択する。結果として得られた変異したDNA分子を適当な宿主細胞で組換え発現させ、変異体、改変タンパク質を生産することができる。
オリゴヌクレオチド指定部位特異的（またはセグメント特異的）突然変異誘発法は、所望の置換、欠失または挿入に従って変異された特定のコドンを有する変異型ポリヌクレオチドを得るために使用することができる。また、タンパク質の欠失または末端切断誘導体は、所望の欠失に隣接する便宜な制限エンドヌクレアーゼ部位を用いることでも構築することができる。制限処理の後、オーバーハングを埋め、DNAを再連結すればよい。上記に示される変異を作出する方法の例は、Sambrookら (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 第3版, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY 2001)。あるいは、アラニンスキャニング突然変異誘発、誤りがちな(error prone)ポリメラーゼ連鎖反応突然変異誘発およびオリゴヌクレオチド指定突然変異誘発などのランダム突然変異誘発技術を用いて130Lポリペプチド変異体およびフラグメント変異体を得ることもできる（例えば、Sambrookら, 前掲参照）。
変異体が非変異体ポリペプチドまたはフラグメントに匹敵するコンフォメーションへフォールディングされているかどうかを評価するアッセイとしては、例えば、天然型または非フォールディングエピトープに特異的なモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体と反応するそのタンパク質の能力、リガンド結合機能の保持、およびプロテアーゼ消化に対してその突然変異タンパク質が感受性か抵抗性かを含む（Sambrookら, 前掲参照）。本明細書に記載の130L変異体は、本明細書に記載のこれらの方法または当業者が通常行っている当技術分野で公知の他の方法に従って同定、特性決定および／または作製することができる。
130Lポリペプチドをコードしている核酸において作出または同定された突然変異はそのコード配列のリーディングフレームを保持していることが好ましい。さらに、これらの突然変異は、転写された際にハイブリダイズして、そのmRNAの翻訳に悪影響のないループまたはヘアピンなどのmRNAの二次構造を作り出すことができる相補領域を作らないことが好ましい。突然変異部位は予め決定できるが、その突然変異の性質自体は予め決定される必要はない。例えば、ある部位の突然変異の最適な特徴を選択するためには、目的コドンにランダム突然変異誘発を行い、発現された突然変異体を生物活性の獲得または欠損または保持に関してスクリーニングすればよい。
130Lポリヌクレオチドは、130Lポリペプチドまたは130Lリペプチドの少なくとも一部（またはフラグメント）またはその変異体をコードしているか、またはこのようなポリヌクレオチドに相補的であるポリヌクレオチドである。130Lをコードするポリヌクレオチドまたはそのオーソログのヌクレオチド配列は例えば、本明細書に受託番号がGenBank登録に示されるヤタポックスウイルスのゲノム配列に見出すことができ（GenBank受託番号AJ293568およびNC_002642）また、本明細書に開示されているアミノ酸配列（例えば、配列番号85および配列番号150）から推定することができる。ポリヌクレオチドは、130Lポリペプチドをコードしている配列、またはこのような配列に相補的なヌクレオチド配列を含む、少なくとも15の連続するヌクレオチドまたは少なくとも30、35、40、50、55または60の連続するヌクレオチド、ある特定の実施形態では、少なくとも70、75、80、90、100、110、120、125または130の連続するヌクレオチド、他の実施形態では、少なくとも135、140、145、150、155、160または170の連続するヌクレオチド、他の実施形態では、少なくとも180、190、200、225、250、275、300、325、350、375、400、405、410、420、425、445、450、475、500、525、530、545、550、575、600、625、650または660の連続するヌクレオチドを含む。130Lポリペプチド、その変異体またはフラグメントをコードしている特定のポリヌクレオチドはまた、本明細書に記載されているように、プローブ、プライマー、short interfering RNA(siRNA)、またはアンチセンスオリゴヌクレオチドとしても使用可能である。ポリヌクレオチドは一本鎖DNAまたはRNA（コードまたはアンチセンス）または二本鎖RNA（例えば、ゲノムRNAまたは合成RNA）またはDNA（例えば、cDNAまたは合成DNA）であってよい。
ポリヌクレオチド変異体は、ハイブリダイゼーション法によって同定することもできる。好適な中程度のストリンジェント条件としては、例えば、5X SSC、0.5%SDS、1.0mM EDTA(pH8.0)の溶液中での予備洗浄；50℃〜70℃、5X SSCで1〜16時間のハイブリダイズ；その後、0.05〜0.1%SDSを含有する2X、0.5Xおよび0.2X SSC各1以上での22〜65℃で20〜40分1回または2回の洗浄を含む。さらなるストリンジェンシーでは、条件は0.1X SSCおよび0.1%SDS中50〜60℃で15分間の洗浄を含み得る。当業者に理解されているように、ハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシーのバリエーションは、プレハイブリダイゼーション、ハイブリダイゼーションおよび洗浄工程の時間、温度、および／または使用溶液の濃度を変更することで達成することができる。また、好適な条件は、いくらかは、用いるプローブの特定のヌクレオチド配列（すなわち例えば、グアニンおよびシトシン(G/C)含量とアデニンおよびチミジン(A/T)含量）にも依存する。よって、当業者ならば、プローブの所望の選択性が特定されれば、適当なストリンジェント条件は過度な試験を行わずとも容易に選択できることが分かるであろう。
受容体タンパク質チロシンホスファターゼ(RPTP)：LAR、RPTP-δおよびRPTP-σ
白血球共通抗原関連タンパク質(LAR)、受容体様タンパク質チロシンホスファターゼ-δ(RPTP-δ)およびRPTP-σは受容体様II型タンパク質チロシンホスファターゼ(PTP)のメンバーである。これらのRPTP（本明細書ではタンパク質チロシンホスファターゼ(PTP)または受容体タンパク質チロシンホスファターゼとも呼ぶ）は、3つの免疫グロブリン様(Ig様)ドメイン、細胞外ドメインに一連のフィブロネクチンIII型様モチーフ、可能性のあるタンパク質分解プロセシング部位、トランスメンブランエレメントおよび2つのタンデム細胞質ホスファターゼドメインD1とD2を含む（例えば、Alonsoら, Cell 117:699-711 (2004)、その中の図2参照；Streuliら, J. Exp. Med. 168:1523 (1988); Charbonneauら, Annu. Rev. Cell Biol. 8:463-93 (1992); Panら, J. Biol. Chem. 268:19284-91 (1993); Waltonら, Neuron 11:387-400 (1993); Yanら, J. Biol. Chem. 268:24880-86 (1993); Zhangら, Biochem. J. 302:39-47 (1994); Pulidoら, J. Biol. Chem. 270:6722-28 (1995)参照）。
LARのいくつかの選択的スプライシング変異体が同定されており、発達段階により調節されていると考えられている(O'Gradyら, J. Biol. Chem. 269:25193 (1994); Zhang and Longo, J. Cell. Biol. 128:415 (1995); Honkaniemiら, Mol. Brain. Res. 61:1 (1998))。LARだけでなく、RPTP-δおよびRPTP-σの複数のイソ型も組織特異的な選択的スプライシングにより生じる（例えば、Pulidoら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:11686-90 (1995)参照）。ヒトでは、このLAR遺伝子は、神経板外胚葉起源の腫瘍において欠損していることの多い領域である染色体1p32にマッピングされている(Jirikら, Cytogenet. Cell Genet. 61:266 (1992))。
LAR、RPTP-δおよびRPTP-σなどのタンパク質チロシンホスファターゼは、細胞シグナル伝達経路の成分であるチロシルリンタンパク質を脱リン酸する。基質のチロシン残基のリン酸化と脱リン酸化の調節は、細胞成長、細胞増殖、代謝、分化および運動などの細胞プロセスの主要な制御機構である。よって、可逆的なチロシンリン酸化を調節するタンパク質チロシンホスファターゼおよびタンパク質チロシンキナーゼの活性は細胞に組み込まれ、調節されなければならない。調節が異常であれば、いくつかの疾病および障害が現れる（例えば、TonksおよびNeel, Curr. Opin. Cell Biol. 13:182-95 (2001)参照）。特定の理論に縛られるわけではないが、受容体PTP(RPTP)の生体特異性はそれらの同族リガンドに由来する可能性がある。LAR、RPTP-δおよびRPTP-σのある種の態様な生物機能が、遺伝子ノックアウト動物の研究結果により示唆されている。LAR遺伝子の発現が妨げられると、妊娠中の腺房の最終分化が損なわれるために乳腺発達に欠陥が生じ(Schaapveidら, Dev. Biol. 188:134-46 (1996))、前脳の大きさおよび海馬の組織化に幾分欠陥が生じ(Yeoら, J. Neurosci. Res. 47:348-60 (1997))、おそらくはグルコース代謝にも欠陥が生じる(Renら, Diabetes 47:493-97 (1998))。これに対し、RPTP-δが欠失すると、海馬の長期増強および学習に影響があり(Renら, EMBO J. 19:2775-85 (2000))、PTP-σ欠陥マウスは、視床下部、嗅球および脳下垂体の縮小をはじめ、脳の発達に欠陥を示す(Elcheblyら, Nat. Genet. 21:330-33 (1999); Wallaceら、Nat. Genet. 21:334-38 (1999))。
様々な研究の結果が、細胞の増殖能の変化（例えば、Yangら, Carcinogenesis 21:125; Tisiら, J. Neurobiol. 42:477 (2000)参照）；腫瘍細胞増殖の抑制(Zhaiら, Mol. Carcinogen. 14:103 (1995))；インスリン受容体の脱リン酸化およびグルコースホメオスタシスへの影響(AhmadおよびGoldstein, J. Biol. Chem. 272:448 (1997)；Renら, Diabetes 47:493 (1998))；細胞-マトリックス相互作用の調節(Pulidoら, 前掲)；シナプスの形態形成および機能の調節（例えば、Dunahら, Nat. Neurosci. 8:458-67 (2005)参照）；および免疫細胞機能への影響（米国特許第6,852,486号）など、LARのいくつかの生物学的役割を示唆した。RPTP-δおよびRPTP-σも細胞間接着(Pulidoら, 前掲)およびシナプスの形態形成および機能（例えば、Dunahら, 前掲参照）に影響を及ぼし得ることを示した研究があるが、これら2つのホスファターゼが免疫細胞機能にも影響を及ぼし得ることを示唆するものはない。よって、本明細書に記載の実施形態は、免疫細胞によりLAR、RPTP-δおよびRPTP-σの3つのホスファターゼ全てが発現されるという予期しない発見に関する。
LAR、RPTP-δおよびRPTP-σは、ウイルスタンパク質A41Lおよび130Lの細胞標的である。これらのウイルスタンパク質とこれらホスファターゼのいずれか1つとの結合は免疫細胞機能に影響を及ぼし得る。特に、A41Lまたは130Lは免疫応答を抑制し、宿主の免疫系のサプレッサーとして働く。A41Lおよび130Lが結合し、その機能を変化させることができるLARのイソ型の例としては、GenBank受託番号NP_002832（配列番号22）（NM_002840（配列番号23）で示されるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドによってコードされている）；配列番号24(AAH48768)（BCO48768（配列番号65）で示されるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドにコードされている）；CAI14894（配列番号25）；GenBank NP_569707（配列番号26）（NM_130440（配列番号27）で示されるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドにコードされている）；およびCAI14895（配列番号28）で示されるアミノ酸配列を含むLARが挙げられる。A41Lまたは130Lが結合し、その機能を変化させることができるRPTP-σのイソ型の例としては、GenBank NP_002841（配列番号29）(NM_002850（配列番号30）で示されるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドにコードされている）；NP_570924（配列番号31）（NM_130854（配列番号32）で示されるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドにコードされている）；GenBank NP_570923（配列番号33）(NM_130853（配列番号34）で示されるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドにコードされている）；およびNP_570925（配列番号35）（NM_130855（配列番号36）で示されるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドにコードされている）；およびQ13332（配列番号64）で示されるアミノ酸配列を含むRPTP-σが挙げられる。ウイルスタンパク質が結合し、その機能を変化させることができるRPTP-δのイソ型の例としては、GenBank NP_002830（配列番号37）（NM_002839（配列番号38）で示されるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドにコードされている）；NP_569075（配列番号39）(NM_120391（配列番号40）で示されるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドにコードされている）；NP_569076（配列番号41）(NM_130392（配列番号42）で示されるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドにコードされている）；およびNP_569077（配列番号43）(NM_130393（配列番号44）で示されるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドにコードされている）で示されるアミノ酸配列を含むRPTP-δが挙げられる。
本明細書に記載のLAR、RPTP-δおよびRPTP-σポリペプチドとしてはまた、変異体または個々の各RPTP、および本明細書で開示されるアミノ酸配列と類似のアミノ酸配列を有するものが含まれる。変異体としては、例えば、天然多型（例えば、対立遺伝子変異体など）または組換え操作もしくは組換え処理されたRPTPポリペプチド変異体が含まれる。RPTP変異体は野生型RPTPと少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、95%または98%の同一性また類似性を有する。当業者に公知の様々な判定基準が、ペプチドまたはポリペプチドの特定の位置のアミノ酸が保存されているかどうか、または類似であるかどうかを示す。例えば、類似アミノ酸弛緩または保存的アミノ酸置換としては、例えば、類似アミノ酸置換または保存的アミノ酸置換は、アミノ酸残基が、塩基性側鎖（例えば、リシン、アルギニン、ヒスチジン）；酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）；非荷電極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン、ヒスチジン）；非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）；β分枝側鎖（例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン）および芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン）を持つアミノ酸など、類似側鎖を有するアミノ酸残基で置換されているものである。分類がより難しいと考えられるが、プロリンは、脂肪族側鎖を有するアミノ酸（例えば、ロイシン、バリン、イソロイシンおよびアラニン）と特性を共有している。ある特定の状況では、グルタミン酸のグルタミンへの置換またはアスパラギン酸のアスパラギンへの置換は、グルタミンおよびアスパラギンがそれぞれグルタミン酸およびアスパラギン酸のアミド誘導体であるということから類似置換であると考えられる。アミノ酸配列を有する2つのRPTP間の同一性%または類似性%は、本明細書に記載され、また、当業者に公知のアライメント法により容易に判定することができる（例えば、GENEWORKS、Align、またはBLASTアルゴリズムを使用）。
また、RPTP変異体は、本明細書においてA41Lポリペプチド変異体に関して記載されているように、遺伝子工学および組換え分子生物学の方法および技術によって容易に作製することができる。要するに、RPTPの一次アミノ酸配列および二次アミノ酸配列の解析ならびにポリペプチドの三次構造を解析するためのコンピューターモデリングは、置換可能な特定のアミノ酸残基を特定する助けとなる。RPTPポリペプチドまたはフラグメントをコードしているDNAの修飾は、そのDNAの部位特異的または部位指定突然変異誘発をはじめとする種々の方法によって行うことができ、これらの方法はオーバーラップエクステンションによるPCRスプライシング(SOE)など、DNA鋳型における変化を導入および増幅するためプライマーを用いてDNA増幅を行うことを含む。突然変異は、天然配列のフラグメントに連結可能とする制限部位によってフランキングされた、突然変異配列を含むオリゴヌクレオチドを合成することにより、特定の位置に導入することができる。連結後、得られた再構築配列は、所望のアミノ酸挿入、置換または欠失を有する変異体（または誘導体）をコードしている。
本明細書に記載されているように、部位特異的突然変異誘発は一般に、M13ファージベクターなど、一本鎖型および二本鎖型を有する、周知かつ市販のファージベクターを用いて行われる（例えば、Veiraら, Meth. Enzymol. 15:3 (1987); Kunkelら, Meth. Enzymol. 154:367 (1987)ならびに米国特許第4,518,584号および同第4,737,462号参照）。オリゴヌクレオチド指定部位特異的（またはセグメント特異的）突然変異誘発法は、所望の置換、欠失または挿入に従って変異された特定のコドンを有する変異型ポリヌクレオチドを得るために使用することができる。また、タンパク質の欠失または末端切断誘導体は、所望の欠失に隣接する便宜な制限エンドヌクレアーゼ部位を用いることでも構築することができる。上記に示される変異を作出する方法の例は、Sambrookら(Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 第3版, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY 2001)。あるいは、アラニンスキャニング突然変異誘発、誤りがちな(error prone)ポリメラーゼ連鎖反応突然変異誘発およびオリゴヌクレオチド指定突然変異誘発などのランダム突然変異誘発技術を用いてRPTPポリペプチド変異体およびフラグメント変異体を得ることもできる（例えば、Sambrookら, 前掲参照）。変異体が非変異体ポリペプチドまたはフラグメントに匹敵するコンフォメーションへフォールディングされているかどうかを評価するアッセイとしては、例えば、天然型または非フォールディングエピトープに特異的なモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体と反応するそのタンパク質の能力、リガンド結合機能の保持、およびプロテアーゼ消化に対してその突然変異タンパク質が感受性か抵抗性かを含む（Sambrookら, 前掲参照）。本明細書に記載のRPTP変異体は、本明細書に記載のこれらの方法または当業者が通常行っている当技術分野で公知の他の方法に従って同定、特性決定および／または作製することができる。
RPTPポリペプチドをコードしている核酸において作出または同定された突然変異はそのコード配列のリーディングフレームを保持していることが好ましい。さらに、これらの突然変異は、転写された際にハイブリダイズして、そのmRNAの翻訳に悪影響のないループまたはヘアピンなどのmRNAの二次構造を作り出すことができる相補領域を作らないことが好ましい。突然変異部位は予め決定できるが、その突然変異の性質自体は予め決定される必要はない。例えば、ある部位の突然変異の最適な特徴を選択するためには、目的コドンにランダム突然変異誘発を行い、発現された突然変異体を生物活性の獲得または欠損または保持に関してスクリーニングすればよい。
RPTP変異体は野生型RPTPの少なくとも1つの生物活性または機能（例えば、ホスファターゼ活性、野生型RPTPに関連したシグナル伝達を媒介または誘導し、本明細書でさらに詳細に記載されるように少なくとも1つの同族リガンドと結合する）を保持する。好ましくは、RPTPは同族リガンドと相互作用し、チロシンリン酸化基質を脱リン酸化する能力を保持している。
ポリヌクレオチド変異体は、ハイブリダイゼーション法によって同定することもできる。好適な中程度のストリンジェント条件としては、例えば、5X SSC、0.5%SDS、1.0mM EDTA(pH8.0)の溶液中での予備洗浄；50℃〜70℃、5X SSCで1〜16時間のハイブリダイズ；その後、0.05〜0.1%SDSを含有する2X、0.5Xおよび0.2X SSC各1以上での22〜65℃で20〜40分1回または2回の洗浄を含む。さらなるストリンジェンシーでは、条件は0.1X SSCおよび0.1%SDS中50〜60℃で15分間の洗浄を含み得る。当業者に理解されているように、ハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシーのバリエーションは、プレハイブリダイゼーション、ハイブリダイゼーションおよび洗浄工程の時間、温度、および／または使用溶液の濃度を変更することで達成することができる。また、好適な条件は、いくらかは、用いるプローブの特定のヌクレオチド配列（すなわち例えば、グアニンおよびシトシン(G/C)含量とアデニンおよびチミジン(A/T)含量）にも依存する。よって、当業者ならば、プローブの所望の選択性が特定されれば、適当なストリンジェント条件は過度な試験を行わずとも容易に選択できることが分かるであろう。
RPTPはそれぞれアミノ末端におよそ20〜30アミノ酸のシグナルペプチド配列を有する（例えば、Pulidoら, 前掲参照）（また、例えば、GenBankデータベースレポートも参照）。シグナルペプチドはタンパク質の翻訳の際に切断されるか、またはシグナルペプチドは細胞外膜に固定されたままである（このようなペプチドをシグナルアンカーとも呼ぶ）ので、分泌タンパク質またはトランスメンブランタンパク質の細胞表面には露出していない（例えば、Nielsenら, Protein Engineering 10:1-6 (1997); Nielsenら, in J. Glasgowら編, Proc. Sixth Int. Conf. on Intelligent Systems for Molecular Biology, 122-30 (AAAI Press 1998)参照）。よって、RPTPのシグナルペプチド配列は、RPTPの細胞外部分と特異的に結合する、A41Lまたは抗体またはその抗原結合フラグメントなど、リガンドが結合するRPTPの細胞外部分上の結合部位の一部でない可能性がある。
本明細書に記載されているように、細胞（免疫細胞など）の外表面に露出しており、シグナルペプチド（本明細書では成熟RPTPとも呼ばれる）を含まないRPTPの細胞外部分は、3つの免疫グロブリン様ドメインを含む。これらの免疫グロブリンドメイン（または免疫グロブリン様ドメイン）本明細書では第一、第二および第三の免疫グロブリンドメインと呼び（あるいは、Ig-1、Ig-2、Ig-3または免疫グロブリン様ドメイン1、免疫グロブリン様ドメイン2および免疫グロブリン様ドメイン3と呼ばれる）、第一の免疫グロブリンドメインはRPTPのN末端に最も近いドメインである（図1参照）。第一の免疫グロブリンドメインはシグナルペプチドのカルボキシ末端に直接隣接している（図1参照）。よって、本明細書において、RPTPの第一の免疫グロブリン様ドメインはRPTPのアミノ末端に最も近い免疫グロブリン様ドメインであり、RPTPの第二の免疫グロブリン様ドメインはRPTPの第一の免疫グロブリン様ドメインと第三の免疫グロブリン様ドメインの間にある免疫グロブリン様ドメインであり。RPTPの第三の免疫グロブリン様ドメインはRPTPのカルボキシ末端最も近い免疫グロブリン様ドメインである。
当業者ならば、これらのドメインの末端または境界が、例えば図1に示されるような一次配列の厳密なアミノ酸位置に相当する必要は必ずしもないことが分かるであろう。よって、例えば、免疫グロブリンドメイン、フィブロネクチンIIIリピートおよび触媒ドメインは、各ドメインのアミノ末端および／またはカルボキシ末端に隣接する位置に1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、7つ、8つ、またはそれを超えるアミノ酸を含み得る。当業者ならば、本明細書に示される配列および図面ならびに当技術分野で既知の配列（アミノ酸配列およびコードしているヌクレオチド配列の双方）を用い、RPTPのどの位置がRPTPの各Ig様ドメインに相当するかを容易に判定することができる。例えば、限定されるものではないが、LARのIg-1ドメインは配列番号25のアミノ酸31〜125番のに相当し、LARのIg-2ドメインはアミノ酸111〜227番に相当し、LARのIg-3ドメインはアミノ酸228〜316番に相当する。RPTP-σでは、Ig-1ドメインはアミノ酸31〜125番に相当し、Ig-2ドメインはアミノ酸127〜240番に相当し、Ig-3ドメインはアミノ酸241〜329番に相当する。RPTP-δでは、Ig-1ドメインはアミノ酸22〜116番に相当し、Ig-2ドメインはアミノ酸118〜231番に相当し、Ig-3ドメインはアミノ酸232〜320番に相当する。本明細書で論じるように、これらのドメインの各末端のアミノ酸は特定のRPTPまたはその変異体（対立遺伝子変異体、細胞種変異体など）によって異なり、Igドメイン変異体は、本明細書に記載の各RPTPの各免疫グロブリン様ドメインの配列と99%、98%、97%、96%、95%または90%、85%、または80%同一であるLAR、RPTP-δまたはRPTP-σのIgドメインを含む。
一実施形態では、LAR、RPTP-δまたはRPTP-σの細胞外部分を用いて、免疫細胞の免疫応答性を変化させる（統計学的または生物学的に有意に増強または抑制する）することができる。別の実施形態では、LAR、RPTP-δまたはRPTP-σの免疫グロブリン様ドメインの少なくとも1つ、2つまたは3つ全てを含み、RPTPのフィブロネクチンドメインのいずれか1以上を含まないRPTPの細胞外部分（本明細書では可溶性LAR、RPTP-δまたはRPTP-σとも呼ぶ）を用いて、免疫細胞の免疫応答性を変化させることができる。引用を容易にするため、後者のポリペプチド、（すなわち、本明細書に記載されているように、これら免疫グロブリン様ドメインの少なくとも1つ、2つまたは3つ全てを単量体またはオリゴマーとして含むRPTP(LAR、RPTP-δまたはRPTP-σ））は、本明細書ではRPTP Ig様ドメインポリペプチドと呼ぶ。
ある特定の実施形態では、免疫細胞の免疫応答性が増強される。免疫グロブリン様ドメインの少なくとも1つ、2つまたは3つ全てなど、RPTPの細胞外部分またはフラグメントを宿主または被験体に投与することができ、その結果、免疫細胞で発現されたRPTPと結合する少なくとも1つのリガンドが外から加えたRPTPフラグメントと結合する。このリガンドは可溶性であてもよいし、あるいはこのリガンドはRPTPを発現する免疫細胞と同じ細胞の細胞表面で発現し得るか、あるいはこのリガンドは別の細胞により発現される細胞表面タンパク質であってもよい。このように、可溶性LAR、RPTP-δまたはRPTP-σはこのリガンドと相互作用し、免疫細胞上で発現されたRPTPとの結合に利用可能なリガンドの量を低減することができ、すなわち、このリガンドは、細胞上で発現されたRPTPとの結合から遮断され、そして機能、活性（例えば、ホスファターゼ活性）またはそのリガンドとRPTPの結合に伴うシグナル伝達事象が阻害、防止、縮小、低減または妨害される。
別の実施形態では、LAR、RPTP-δまたはRPTP-σのいずれか1つの細胞外部分（例えば、免疫グロブリン様ドメインの少なくとも1つ、2つまたは3つ全て）は免疫応答を抑制し得る。可溶性リガンドであるか、または細胞表面タンパク質であるリガンドであり得るリガンドは、免疫細胞の細胞表面でRPTと相互作用することができ、この相互作用は炎症性応答を誘導し得るか、あるいは炎症応答または自己免疫応答を誘導または悪化させるサイトカイン（例えば、限定されるものではないが、IFN-γをはじめとする本明細書に記載のサイトカイン）の発現または産生を誘導し得る。免疫細胞上で発現されたLAR、RPTP-δおよびRPTP-σの1以上とこのようなリガンド（可溶性タンパク質または細胞表面タンパク質）との相互作用は、そのリガンドとまず相互作用し、結合する可溶性RPTPにより阻害、回避または遮断され得る。
ある特定の実施形態では、免疫グロブリン様ドメインの少なくとも1つ、2つまたは3つ全てが非RPTP部分の連結（すなわち、付着または融合）されている。この部分は、その部分の性質（その部分が炭水化物であるか、ポリペプチドであるか、小分子であるかなど）によって異なり、当技術分野に知られている、例えば、コンジュゲーション法を用い、その部分とフラグメントとの共有結合または非共有結合により、RPTPフラグメントに連結することができる。あるいは、非RPTP部分がペプチドまたはポリペプチドである場合、この部分を組換えにより連結し、RPTPフラグメント融合ポリペプチドを形成することができる。例えば、免疫グロブリンFcポリペプチドの少なくとも1つの免疫グロブリン(Ig)定常領域ドメインまたは少なくとも2つのIg定常領域ドメインと融合されたRPTPの少なくとも1つ、少なくとも2つ、または3つ全ての免疫グロブリン様ドメイン（またはその一部）を含む融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む組換え発現構築物を作製することができる。
一実施形態では、LARの、またはRPTP-δの、またはRPTP-σの第二および第三の免疫グロブリン様ドメインが免疫グロブリンFcポリペプチドと融合され、さらに別の実施形態では、LARの、またはRPTP-δの、またはRPTP-σの第一、第二および第三の免疫グロブリン様ドメインが免疫グロブリンFcポリペプチドと融合される。ある特定の実施形態では、LARの、またはRPTP-δの、またはRPTP-σの第一の免疫グロブリン様ドメインが免疫グロブリンFcポリペプチドと融合される。別の実施形態では、LARの、またはRPTP-δの、またはRPTP-σの第二の免疫グロブリン様ドメインが免疫グロブリンFcポリペプチドと融合され、さらに別の実施形態では、LARの、またはRPTP-δの、またはRPTP-σの第三の免疫グロブリン様ドメインが免疫グロブリンFcポリペプチドと融合される。他の実施形態では、LARの、またはRPTP-δの、またはRPTP-σの第一および第二の免疫グロブリン様ドメインが免疫グロブリンFcポリペプチドと融合され、さらに他の実施形態では、LARの、またはRPTP-δの、またはRPTP-σの第一および第三の免疫グロブリン様ドメインが免疫グロブリンFcポリペプチドと融合される。ある特定の場合では、Fcポリペプチドと融合された、第一の免疫グロブリン様ドメイン単独（すなわち、第二および／または第三の免疫グロブリン様ドメインが存在しない場合）または第一の免疫グロブリン様ドメインと第二の免疫グロブリン様ドメインを含むポリペプチド（すなわち、第三のIg様ドメインが存在しない場合）を用いると、A41Lの場合と同様に、免疫細胞または宿主における免疫応答の抑制に効果が小さい場合がある。特定の理論に縛られるわけではないが、本明細書に記載されているように、A41Lは、第二および第三のIg様ドメインの不在下では第一の免疫グロブリン様ドメイン単独と結合しないので、第一のドメインだけを組み込んだRPTPIg様ドメインはリガンドまたは細胞表面ポリペプチドと相互作用して、A41Lと同じ様式で免疫応答の抑制を果たすのにあまり有効でない可能性がある。
さらに他の実施形態では、可溶性RPTP（すなわち、RPTP Ig様ドメインポリペプチド）は、非RPTP部分と付着または融合していない1つ、2つまたは3つの免疫グロブリン様ドメインを上記の種々の組合せで含み得る。例えば、RPTP Ig様ドメインポリペプチドはRPTP(LAR、RPTP-δまたはRPTP-σ)の第一、第二および第三のIg様ドメイン；RPTPの第二および第三のIg様ドメインを含む。ある特定の別の実施形態では、RPTP Ig様ドメインポリペプチドはRPTPの第一と第二または第一と第三のIg様ドメイン；あるいは各Ig様ドメイン単独を含む場合がある。
可溶性RPTP Ig様ドメインポリペプチドはまた、二量体および三量体などの多量体として存在してもよい。これらの多量体は非共有結合的相互作用を好む条件（生理学的条件を含む）ではそのような相互作用により形成されてもよいし、あるいは共有結合的および非共有結合的相互作用の組合せにより形成されてもよい。あるいは、多量体は少なくとも2つの単量体RPTP Ig様ドメインポリペプチドを化学的または組換え的に結合させることにより形成することもできる。これらの多量体は例えば、ホモ二量体またはヘテロ二量体を含み得る。例えば、ホモ二量体は、(1)RPTPの少なくとも1つ、2つまたは3つの免疫グロブリン様ドメインの第一の単量体および(2)同じRPTPの同じ少なくとも1つ、2つまたは3つの免疫グロブリン様ドメインの第二の単量体を含み得る。ある特定の実施形態では、例えば、ホモ二量体は、それぞれLARの第二および第三（または第一、第二および第三）の免疫グロブリン様ドメインを含む、第一および第二の単量体を含み得る。別の実施形態では、ホモ二量体の各単量体（例えば、第二および第三の免疫グロブリン様ドメインまた第一、第二および第三の免疫グロブリン様ドメイン）はRPTP-δに由来し、別の実施形態では、各単量体はRPTP-σに由来する。
あるいは、二量体などのオリゴマーはヘテロ二量体であってもよく、各単量体は異なるRPTP（すなわち、LAR、RPTP-δまたはRPTP-σ）に由来する。ある特定の実施形態では、ヘテロ二量体は、LARの第二および第三（または第一、第二および第三）の免疫グロブリン様ドメインを含む第一の単量体と、RPTP-δかRPTP-σのいずれかの第二および第三（または第一、第二および第三）の免疫グロブリン様ドメインを含む第二の単量体とを含み得る。別の実施形態では、ヘテロ二量体の第一の単量体は、RPTP-δの第二および第三（または第一、第二および第三）の免疫グロブリン様ドメインを含み、ヘテロ二量体の第二の単量体はRPTP-σの対応する免疫グロブリン様ドメインを含む。
特定の他の実施形態では、ホモ二量体またはヘテロ二量体は第一および第二の単量体を含み、各単量体はRPTP由来の免疫グロブリン様ドメインを1つだけ含む。さらに他の実施形態では、ホモ二量体またはヘテロ二量体の各単量体はRPTPの第一および第三の免疫グロブリン様ドメインを含み、ある特定の他の実施形態では、各単量体はRPTPの第一および第二の免疫グロブリン様ドメインを含む。よって、ホモ二量体は、それぞれLARの第一および第二の免疫グロブリン様ドメインからなる2つの単量体を含んでもよいし、あるいは各単量体はLARの第一および第三の免疫グロブリン様ドメインからなってもよい。ホモ二量体はRPTP-δとRPTP-σのそれぞれで同様に構築することができる。ヘテロ二量体は、RPTP-δまたはRPTP-σのそれぞれで、例えば、第一の単量体がLARの第一および第二の免疫グロブリン様ドメイン、または第一および第三の免疫グロブリン様ドメインを含み、第二の単量体が第一および第二の免疫グロブリン様ドメイン、または第一および第三の免疫グロブリン様ドメインを含んでもよいというように、異なる第一単量体と第二の単量体から作製することができる。他の実施形態では、ヘテロ二量体は、RPTP-δの第一および第二の免疫グロブリン様ドメイン、または第一および第三の免疫グロブリン様ドメインを含む第一の単量体を含んでよく、第二の単量体はそれぞれRPTP-σの第一および第二の免疫グロブリン様ドメイン、または第一および第三の免疫グロブリン様ドメインを含んでよい。
他の実施形態では、1つのRPTPに由来する免疫グロブリン様ドメインを異なるRPTPに由来する免疫グロブリンドメインと融合させてもよい。例えば、RPTP-δまたはRPTP-σの第一の免疫グロブリン様ドメインをLARの第二および第三の免疫グロブリン様ドメインと融合させてもよい。全部で2つまたは3つの免疫グロブリン様ドメインを含む可溶性RPTP分子を得るためには、本明細書に記載の3つの各RPTPに由来する免疫グロブリン様ドメインのいくつかの組合せが考えられる。上記のように、可溶性RPTP Igドメインポリペプチドは、分子生物学的技術を用いて組換え生産してもよいし、あるいは1以上の架橋アミノ酸またはスペーサーアミノ酸を用いて、または用いずに共有結合的に結合させるかまたは共有結合的に融合させてもよい。
上記で詳説したように、RPTP Ig様ドメインポリペプチドと融合され得る免疫グロブリンのFcポリペプチドは、重鎖CH2ドメインおよびCH3ドメインと、CH1とCH2の間に位置するヒンジ領域の一部または全部を含む。歴史的にみれば、Fcフラグメントは免疫グロブリンのパパイン消化により誘導され、免疫グロブリンのヒンジ領域を含んでいる。Fc領域は、共有結合（例えば、特にジスルフィド結合）および非共有結合により連結して二量体型または多量体型とすることができる単量体ポリペプチドである。Fcポリペプチドの単量体サブユニット間の分子間ジスルフィド結合の数は免疫グロブリンクラス（例えば、IgG、IgA、IgE)またはサブクラス（例えば、ヒトIgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2)によって変化する。
また、C末端で末端切断された（すなわち、少なくとも1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、10個、15個、20個またはそれを超えるアミノ酸が除去または欠失されている）FcポリペプチドなどのFcポリペプチドフラグメントも使用可能である。ある特定の実施形態では、本明細書に記載のFcポリペプチドは、2つの分離したRPTPドメイン/Fc融合タンパク質のFcポリペプチド部分間で鎖間ジスルフィド結合を形成させてRPTPドメイン/Fc融合ポリペプチド二量体を形成するように、ヒンジ領域の少なくともいくつかまたは全てのシステイン残基といった複数のシステイン残基を含む。他の実施形態では、抗体依存性細胞性細胞傷害作用(ADCC)および補体結合（および関連の補体関連細胞傷害作用(associated complement associated cytotoxicity (CDC)）の保持が望まれる場合には、このFcポリペプチドは、Fcポリペプチド融合タンパク質が単量体となり、二量体が形成できないように、ヒンジ領域のシステイン残基の置換または欠失を含む（例えば、米国特許出願公開第2005/0175614号参照）。
免疫グロブリンのFc部分は、免疫グロブリンのある種のエフェクター機能を媒介する。Fc領域に関連しているエフェクター機能の3つの一般的カテゴリーとして、(1)従来の補体カスケードの活性化、(2)エフェクター細胞との相互作用、および(3)免疫グロブリンの区画化(compartmentalization)がある。現在のところ、Fcポリペプチド、およびいずれか1以上の定常領域ドメイン、および少なくとも1つの免疫グロブリン定常領域ドメインを含む融合タンパク質は当業者に公知の組換え分子生物学の技術に従って容易に作製することができる。
Fcポリペプチドは好ましくは、その使用に関して当該ペプチド-IgFc融合ポリペプチドが意図される動物種に由来するヌクレオチド配列およびそのコードされているアミノ酸配列を用いて作製される。一実施形態では、このFcポリペプチドはヒト起源のものであり、ヒトIgG1およびIgG2などの免疫グロブリン種のいずれに由来するものであってもよい。
本明細書に記載のFcポリペプチドは、Fcポリペプチド変異体も含む。このようなFcポリペプチド変異体の1つは、2つのFcポリペプチドの間で形成されるジスルフィド結合の数を減らすために、セリンなどの別のアミノ酸で置換された別のFcポリペプチドとジスルフィド結合を形成する1以上のシステイン残基（ヒンジ領域の1以上のシステイン残基など）を有する。あるいは、Fcポリペプチドの野生型ヒンジから1以上のシステイン残基を欠失させることもできる。
Fcポリペプチド変異体の別の例として、Fcポリペプチドが低レベルのエフェクター機能しか持たないように置換または欠失したエフェクター機能に関与する1以上のアミノ酸を有する変異体がある。例えば、補体カスケードの成分の結合を低減するまたは妨げるため（例えば、Duncanら, Nature 332:563-64 (1988); Morganら, Immunology 86:319-24 (1995)参照）、または免疫細胞により発現されるIgG Fc受容体と結合するFcポリペプチドの能力を低減するまたは妨げるため(Winesら, J. Immunol. 164:5313-18 (2000); Chappelら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:9036 (1991); Canfieldら, J. Exp. Med. 173:1483 (1991); Duncanら,前掲)、または抗体依存性の細胞の細胞傷害性を変化させるために、Fc領域のアミノ酸を置換してもよい。野生型Fcポリペプチドとは異なるこのようなFcポリペプチド変異体は本発明ではまたムテインFcポリペプチドとも呼ぶ。
一実施形態では、RPTP（LAR、RPTP-δ、RPTP-σまたはその変異体）の少なくとも1つの免疫グロブリン様ドメインは、野生型Fc領域ポリペプチドにおいて、Fcポリペプチドまたは免疫グロブリンとある種の免疫細胞で発現される1以上のIgG Fc受容体との結合に寄与する残基の少なくとも1つの置換を含むFcポリペプチドとフレーム内で融合される。このようなムテインFcポリペプチドは、免疫細胞の表面に存在するIgG Fc受容体などのIgG Fc受容体と結合する融合ポリペプチドの能力が低下するように、ムテインFcポリペプチドのCH2ドメインにおいて少なくとも1つのアミノ酸残基の置換を含む。ヒト白血球で発現されるこれらのタイプのFc IgG受容体が上記に詳しく記載されている。
本明細書に詳細に記載されているように、IgG Fc受容体の結合に寄与するCH2ドメインのアミノ末端部分の残基には、Leu234〜Ser239部分の残基(Leu-Leu-Gly-Gly-Pro-Ser（配列番号80）(EUナンバリングシステム、Kabatら,前掲)が含まれる（例えば、Morganら, Immunology 86:319-24 (1995)およびそこに引用されている参照文献を参照）。これらの部分はヒトIgG1 Fcポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号79）の15〜20番に相当する。このCH2ドメインにおけるこれら6つの部分の1以上（すなわち、1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、または6全て）のアミノ酸が置換されると、1以上のIgG Fc受容体（またはそのイソ型）と結合するFcポリペプチドの能力が低下する（例えば、Burtonら, Adv. Immunol. 51:1 (1992); Hulettら, Adv. Immunol. 57:1 (1994); Jefferisら, Immunol. Rev. 163:59 (1998); Lundら, J. Immunol. 147:2657 (1991); Sarmayら, Mol. Immunol. 29:633 (1992); Lundら, l. Immunol. 29:53 (1992); Morganら, 前掲参照）。EU234〜239番の1以上のアミノ酸の置換に加え、この領域（239番のカルボキシ末端側でも234番のアミノ末端側でもよい）に隣接する1つ、2つ、3つ、またはそれを超えるアミノ酸も置換することができる。
例として、235番（配列番号79の16番に相当する）のロイシン残基をグルタミン酸残基またはアラニン残基で置換すると、それぞれFcγRIに対する免疫グロブリン（ヒトIgG3など）の親和性が消失または低減する(Lundら, 1991, 前掲; Canfieldら, 前掲; Morganら, 前掲)。別の例としては、234番と235番（配列番号79の15番と16番に相当する）のロイシン残基を例えばアラニン残基で置換すると、免疫グロブリンとFcγRIIaとの結合が妨げられる（例えば、Winesら, 前掲参照）。あるいは、234番（配列番号79の15番に相当する）のロイシン、235番（配列番号79の16番に相当する）のロイシンおよび237番（配列番号79の18番に相当する）のグリシンはそれぞれ異なるアミノ酸で置換してもよく、例えば、234番のロイシンをアラニン残基で置換し(L234A)、235番のロイシンをアラニン残基(L235A)またはグルタミン酸残基(L235E)で置換し、237番のグリシン残基を例えばアラニン残基(G237A)などの別のアミノ酸で置換してもよい。
一実施形態では、ウイルスポリペプチド（またはその変異体もしくはフラグメント）とフレーム内で融合されているムテインFcポリペプチドは、本明細書に記載されているように、ヒトIgG1 CH2ドメインの234〜239番（EUナンバリングシステム）に相当するの配列番号79の15〜20番に1つ、2つ、3つ、4つ、5つまたは6つの突然変異を含む。ムテインFcポリペプチドの例としては、配列番号77の13番、14番および16番に(L234A)、(L235E)および(G237A)に相当する置換が見られてもよい、配列番号77で示されるアミノ酸配列を有する。
別の実施形態では、ムテインFcポリペプチドは、Fcポリペプチドのヒンジ領域にシステイン残基の突然変異を含む。一実施形態では、Fcポリペプチドのヒンジ領域のアミノ末端に最も近いシステイン残基（例えば、野生型IgG1免疫グロブリンのFc部分のヒンジ領域のアミノ末端に最も近いシステイン残基）が欠失されているか、または別のアミノ酸で置換されている。すなわち、例としては、配列番号79の1番のシステイン残基が欠失されているか、1番のシステイン残基が、ジスルフィド結合を形成することができない別のアミノ酸、例えばセリン残基で置換されている。別の実施形態では、ムテインFcポリペプチドは、Fcポリペプチドのヒンジ領域のアミノ末端に最も近いシステイン残基の欠失または置換を含み、さらに隣接するC末端アミノ酸の欠失または置換も含む。ある特定の実施形態では、このシステイン残基および隣接するC末端残基は双方ともムテインFcポリペプチドのヒンジ領域から欠失されている。特定の実施形態では、配列番号79の1番のシステイン残基と配列番号79の2番のアスパラギン酸が欠失されている。ヒンジ領域にこれらのシステイン残基およびアスパラギン酸残基の欠失を含むFcポリペプチドは宿主細胞で効率的に発現可能であり、ある例では、野生型のシステイン残基およびアスパラギン酸残基を保持しているFcポリペプチドよりも細胞で効率的に発現させることができる。
特定の実施形態では、ムテインFcポリペプチドは、配列番号79の1番のシステイン残基が欠失され、かつ、配列番号79の2番のアスパラギン酸が欠失され、かつ、配列番号79の、EU234番に相当する15番のロイシン残基がアラニン残基で置換され、16番（EU235に相当する）のロイシン残基がグルタミン酸残基で置換され、かつ、EU237に相当する18番のグリシンがアラニン残基で置換され、野生型Fcポリペプチド（配列番号79）とは異なる、配列番号77で示されるアミノ酸配列)を含む（図５も参照）。よって、ムテインFcポリペプチドの例は、そのアミノ末端部分にKTHTCPPCPAPEAEGAPS（配列番号81）のアミノ酸配列を含む（Fcムテイン配列例、配列番号77を参照）。
他のFc変異体は、限定されるものではないが例を挙げれば、共有結合的化学修飾、挿入、欠失および／または置換（さらに保存的置換を含んでもよい）などの軽微な変化だけを含む、既知のFcポリペプチド配列の類似アミノ酸配列を包含する。互いに類似するアミノ酸配列は、配列が相同な実質的領域を共有し得る。同様に、Fc変異体をコードしているヌクレオチド配列は実質的に類似のヌクレオチド配列を含み、限定されるものではないが例を挙げれば、共有結合的化学修飾、挿入、欠失および／または置換（さらに遺伝コードの縮重のためサイレント突然変異を含んでもよい）などの軽微な変化だけを含む。互いに類似するヌクレオチド配列は、配列が相同な実質的領域を共有し得る。
Fcポリペプチドまたは少なくとも1つの免疫グロブリン(immunogloblulin)定常領域、またはその一部は、着目するペプチドまたはポリペプチドと融合された場合、二量体または他の多量体を形成することにより、少なくとも部分的に、分解を防ぎ、かつ／または半減期を延長し、毒性を軽減し、免疫原性を軽減し、かつ／またはペプチドの生物活性を高めるビヒクルまたは担体部分として働く（例えば、米国特許第6,018,026号、同第6,291,646号、同第6,323,323号、同第6,300,099号、同第5,843,725号参照）。（また、例えば、米国特許第5,428,130号、同第6,660,843号、米国特許出願公開第2003/064480号、同第2001/053539号、同第2004/087778号、同第2004/077022号、同第2004/071712号、同第2004/057953号、同第2004/053845号、同第2004/044188号、同第2004/001853号、同第2004/082039号も参照。）免疫細胞の免疫応答性を変化させるペプチドに連結または融合可能なFcポリペプチドなどの免疫グロブリン定常領域に対する別の部分としては、例えば、直鎖ポリマー（例えば、ポリエチレングリコール、ポリリジン、デキストランなど；例えば、米国特許第4,289,872号、国際特許出願公開WO93/21259参照）；脂質；コレステロール基（ステロイドなど）；炭水化物またはオリゴ糖が挙げられる。
種々の種に由来する種々のクラスおいびイソ型の免疫グロブリンのFcポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は既知である、GenBankデータベースおよびKabat（Kabatら, in Sequences of Proteins of Immunological Interest, 第4版(U.S. Dept. of Health and Human Services, U.S. Government Printing Office, 1991)、オンラインKabatデータベースのアップデートも参照）で入手でき、これらの配列はいずれも、当業者が通常行っている分子生物学の方法に従って組換え構築物を作製するために使用可能である。RPTPフラグメント融合ポリペプチドが投与される宿主または被験体においてFcポリペプチドの免疫原性を最小にするには、一般にFcポリペプチドの配列を同じ種の免疫グロブリンから選択し、すなわち、例えば、ヒトFcポリペプチド配列をヒト被験体または宿主に投与するRPTPフラグメントと融合させる。
A41Lまたは130Lなどのポックスウイルスポリペプチドと相互作用する、かつ／または結合するRPTPSなどの細胞表面分子を同定するための本明細書に記載の方法はまた、本明細書に記載のRPTP（すなわち、LAR、RPTP-δおよび／またはRPTP-σ）と相互作用する、またはそれらのリガンドである、またはそれらと複合体を形成する、またはそうでなければそれらと会合する細胞内分子を同定するためにも使用可能である。特定の理論に縛られるわけではないが、ポックスウイルスポリペプチドとRPTPの間の相互作用のためにLAR、RPTP-δおよびRPTP-σの1以上と相互作用する細胞内分子を同定することにより、疾病または障害の発現に関与する、あるいが阻害または活性化された際に疾病または障害の発現をもたらす特定の経路（およびその成分）を特定することができる。1以上のRPTPと会合し、1以上のシグナル伝達経路に関与するこのような細胞内分子（例えば、A41Lを用いたTAP-TAG法により同定される少なくともLARと相互作用するプラコグロブリンおよびリプリン-1-β）は、本明細書に記載の免疫疾患または免疫障害、心血管疾患または心血管障害、あるいは代謝性疾病または代謝性障害の治療に有用である薬剤および組成物の標的となり得る。あるいは、LAR、RPTP-δおよびRPTP-σの1以上と相互作用し、疾病または障害の治療および／または免疫細胞の免疫応答性の変更に有用な本明細書に記載の薬剤は、RPTPと細胞内分子の間の相互作用に影響を及ぼし、従って、その細胞の1以上の生物活性を変化させ得る。
薬剤
A41Lまたは130LなどのポックスウイルスポリペプチドとLAR、RPTP-δおよび／またはRPTP-σとの結合はこれらのホスファターゼの少なくとも1つの生物機能を変化させ、本明細書に記載されているように、A41Lまたは130Lと免疫細胞の細胞表面で発現されるLAR、RPTP-δおよび／またはRPTP-σとの相互作用はその細胞の免疫応答性を変化させる（例えば、抑制または増強する）ことができる。免疫細胞の免疫応答性の変更はまた、ポックスウイルスポリペプチドと同様に、生物活性薬剤（化合物または分子）によって達成することもできる。生物活性薬剤としては例えば、小分子、核酸（アプタマー、siRNA、アンチセンス核酸など）、抗体およびそのフラグメントならびに融合タンパク質（ペプチド-Fc融合タンパク質およびRPTP Ig領域-Fc融合タンパク質など）が挙げられる。薬剤は、A41Lもしくは130Lが結合する場所と同じまたはA41Lもしくは130Lが結合する場所と同じ場所に近接するRPTP上の場所でLAR、RPTP-δおよびRPTP-σの少なくとも1つと相互作用し、結合し得る。あるいは、ポックスウイルスポリペプチドが結合する場所から離れた場所で薬剤とRPTPが結合または相互作用しても、薬剤によりA41L（または130L）の作用の場合と同様に免疫応答性を変化させることができる。薬剤が結合して免疫細胞の免疫応答性に影響を及ぼす能力およびレベルを測定および比較するには、本明細書に記載の、また当技術分野で実践されている方法に従って、競合結合アッセイおよび機能アッセイをはじめ、細胞の免疫応答性のレベルを示す結合試験を行えばよい。
本明細書では、免疫細胞の免疫応答性を変化させる（統計学的または生物学的に有意に抑制または増強する）薬剤を同定する、また、ひと度同定されたこのような薬剤の抑制または増強のレベルを特定および測定する方法が提供される。本明細書で詳細に述べ、また、当業者に知られているこのような方法としては、限定されるものではないが、イムノアッセイ（例えば、ELISA、ラジオイムノアッセイ、免疫ブロットなど）、競合結合アッセイおよび表面プラズモン共鳴結合アッセイが挙げられる。これらの方法は、(1)候補薬剤と、(2)LAR、RPTP-σおよびRPTP-δの少なくとも1つを発現する免疫細胞と、(3)A41Lまたは130Lなどのポックスウイルスポリペプチドとを、少なくとも1つのRPTPポリペプチドとポックスウイルスポリペプチドの間の相互作用を可能とするのに十分な条件および時間で接触させる（混合する、合わせる、またはいくつかの方法では相互作用させる）ことを含む。特定アッセイの条件としては、温度、バッファー（塩、陽イオン、媒体を含む）、ならびにこれらの細胞、これらの薬剤およびこれらのポックスウイルスポリペプチドの完全性を維持する、当業者に知られ、かつ／または容易に測定できる他の成分が挙げられる。候補薬剤の存在下でのA41L（または130L）と免疫細胞の相互作用または結合レベルはは容易に測定し、薬剤の不在下におけるA41L（または130L）と該細胞の結合レベルと比較することができる。候補薬剤の存在下でA41L（または130L）と免疫細胞の結合のレベルが低下していれば、その候補薬剤が免疫細胞の免疫応答性を抑制することを示す。
別の実施形態では、免疫細胞の免疫応答性を変化させる（抑制または増強する)薬剤を同定する方法は、薬剤の存在下でLAR、RPTP-σおよびRPTP-δの少なくとも1つを発現する免疫細胞の免疫応答性のレベルを測定することを含む。ある特定の実施形態では、免疫細胞の免疫応答性を抑制する薬剤が同定される。免疫応答性はサイトカイン、増殖および刺激のレベルを測定するなど、当技術分野で実践されている方法に従って測定することができる。免疫細胞の免疫応答性は、細胞間接着および細胞移動の変化を評価すること、また、限定されるものではないが、細胞骨格タンパク質および細胞の接着と移動に影響を及ぼす他のタンパク質をはじめとする細胞タンパク質のチロシンリン酸化パターンを調べることによっても測定することができる。
生体分子と同族リガンドの間の相互作用または結合を測定するための多くのアッセイおよび技術が当業者により実践されている。よって、A41Lまたは130LなどのポックスウイルスポリペプチドとLAR、RPTP-σおよびRPTP-δのいずれか1以上の間の相互作用は、薬剤の存在下でのこの相互作用および／または結合に対する生物活性剤の作用をはじめ、本明細書で詳説されているようなアッセイおよび技術によって容易に測定することができる。
小分子
生物活性薬剤としてはまた、天然および合成分子、例えば、ポックスウイルスポリペプチド（例えば、A41Lまたは130L)と結合する、またはLAR、RPTP-σおよびRPTP-δの1以上と結合する、および／またはポックスウイルスポリペプチド（例えば、A41Lまたは130L)とLAR、RPTP-σおよびRPTP-δのいずれか1つの間の複合体と結合する小分子が含まれる。免疫細胞の免疫応答性を変化させ（抑制または増強し）、かつ／またはポックスウイルスポリペプチド（例えば、A41Lまたは130L）とLAR、RPTP-σおよびRPTP-δの少なくとも1つ、少なくとも2つ、または3つ全てとの結合を阻害する薬剤をスクリーニング方法で用いるための候補薬剤は、化合物、組成物または分子の「ライブラリー」またはコレクションとして提供することができる。
このような分子としては一般に、当技術分野で「小分子」として知られ、105ダルトン未満、104ダルトン未満、または103ダルトン未満の分子量を有する化合物が挙げられる。例えば、試験化合物ライブラリーのメンバーを、それぞれ本明細書に示される少なくとも1つのチロシンホスファターゼポリペプチドを含有する複数のサンプルに投与した後、LAR、RPTP-σおよび／またはRPTP-δにより媒介される基質の脱リン酸化または基質との結合を増強または阻害する能力、ホスファターゼとポックスウイルスポリペプチド（例えば、A41Lまたは130L）との結合を阻害または増強する能力、および／または免疫細胞の免疫応答性を調節する試験化合物の能力に関してそのサンプルをアッセイする。このようにしてポックスウイルスポリペプチドLAR、RPTP-σおよび／またはRPTP-δの少なくとも1つの機能に影響を及ぼし得ると特定された化合物は、LAR、RPTP-σおよび／またはRPTP-δ活性と関連する疾病の治療および／または検出を可能とすることから、治療目的および／または診断目的に有用であり得る。このような化合物はまた、LAR、RPTP-σおよび／またはRPTP-δのいずれか1以上を含むシグナル伝達分子機構を対象とした研究にも有用である。
候補薬剤はさらにコンビナトリアルライブラリーのメンバーとしても提供することができ、この場合には複数の反応容器で行われる複数の所定の化学反応に従って作製される合成薬剤を含むのが好ましい。例えば、ある構築物の、反応条件の複数の順列および／または組合せを追跡可能な実施を可能とする固相合成、記録されているランダムミックス法および記録されている反応分離技術の1以上に従って種々の出発化合物を作製すればよい。得られた産物は、ペプチドの合成コンビナトリアルライブラリー（例えば、国際特許出願第PCT/US91/08694号および同第PCT/US91/04666号）または本明細書に示されているような小分子を含む他の組成物（例えば、参照にそのまま本明細書に組み入れられる国際特許出願第PCT/US94/08542号、EP特許第0774464号、米国特許第5,798,035号、米国特許第5,789,172号、米国特許第5,751,629号参照）など、スクリーニングの後に反復的選択・合成法を行うことができるライブラリーを含む。当業者ならば、このようなライブラリーの多様な組を確立された方法で作製し、本明細書の開示に従って試験可能であることが分かるであろう。
分子ライブラリーの合成方法の例は、例えば、DeWittら, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90:6909 (1993); Erbら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:11422 (1994); Zuckermannら, J. Med. Chem. 37:2678 (1994); Choら, Science 261:1303 (1993); Carrellら, Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33:2059 (1994); Carellら, Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33:2061 (1994)およびGallopら, J. Med. Chem. 37:1233 (1994)など、当技術分野で見出すことができる。化合物のライブラリーは溶液中（例えば、Houghten, Biotechniques 13:412-21(1992))；またはビーズ上(Lam, Nature 354:82-84 (1991))；チップ上(Fodor, Nature 364:555-56 (1993))；細菌上(Ladner, 米国特許第5,223,409号)；胞子上(Ladner, 前掲)；プラスミド上(Cullら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:1865-69(1992))；またはファージ上(ScottおよびSmith, Science 249:386-390 (1990)；Devlin, Science 249:404-406 (1990); Cwirlaら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:6378-82 (1990); Felici, J. Mol. Biol. 222:301-10 (1991); Ladner, 前掲)で提供することができる。
ペプチド-免疫グロブリン定常領域融合ポリペプチド
一実施形態では、免疫細胞の免疫応答性を変化させるために使用可能であり、かつ、免疫疾患または免疫障害の治療に使用可能である生物活性薬剤は、ペプチド-IgFc融合ポリペプチドを含む、ペプチド-免疫グロブリン(Ig)定常領域融合ポリペプチドである。このペプチドは天然分子であっても組換え生産された分子であってもよい。ペプチド-IgFc融合ポリペプチドなどのペプチド-Ig定常領域融合ポリペプチド（当技術分野ではペプチボディーとも呼ぶ（例えば、米国特許第6,660,843号参照））は、免疫グロブリンの一部、少なくとも1つの定常領域ドメイン（例えば、CH1、CH2、CH3および／またはCH4）、またはFcポリペプチド(CH2-CH3)と融合された、免疫細胞により発現されるRPTP(LAR、RPTP-σおよび／またはRPTP-δ)などの、目的のタンパク質の活性を変化させ得る生物的に活性なペプチドまたはポリペプチドを含む。FcポリペプチドはFc部分またはFc領域とも呼ばれる。
一実施形態では、融合ポリペプチドのペプチド部分はLAR、RPTP-σおよびRPTP-δの少なくとも1つ、少なくとも2つ、または3つ全てと相互作用または結合し、これらのRPTPの少なくとも1つと結合した際にポックスウイルスポリペプチド（例えば、A41Lまたは130L）と同じ生物活性を果たし、ひいてはRPTPを発現する免疫細胞の免疫応答性を抑制（阻害、回避、低下または妨害）することができる。本明細書では、免疫細胞の免疫応答性を変化させる（例えば、抑制する）ことができるペプチド（A41Lまたは130L模倣体として働くペプチドである）を同定する方法が提供される。例えば、このようなペプチドは、A41L（または130L）とこれらのRPTPの少なくとも1つとの結合を阻害または遮断する能力を測定することにより同定することができる。あるいは、候補ペプチドを、これらのRPTPの少なくとも1つを発現する免疫細胞と接触または相互作用させ、その候補ペプチドの、免疫細胞の免疫応答性を抑制または増強する能力を本明細書に記載され、また当技術分野で実践されている方法に従って測定することができる。候補ペプチドはコンビナトリアルライブラリーのメンバーとしても提供することができ、この場合には複数の反応容器で行われる複数の所定の化学反応に従って作製される合成ペプチドを含むのが好ましい。例えば、当業者に周知の標準的なペプチド合成技術に従って種々の出発ペプチドを作製すればよい。
免疫細胞の免疫応答性を変化させるペプチドをコンビナトリアルライブラリーから（例えば、国際特許出願第PCT/US91/08694号および同第PCT/US91/04666号参照）、またファージディスプレーペプチドライブラリーから（例えば、Scottら, Science 249:386 (1990); Devlinら, Science 249:404 (1990); Cwirlaら, Science 276: 1696-99 (1997);米国特許第5,223,409号;同第5,733,731号;同第5,498,530号;同第5,432,018号;同第5,338,665号; 1994;同第5,922,545号;国際出願公開第WO96/40987号およい同第WO98/15833号参照）同定および単離することができる。ファージディスプレーペプチドライブラリーでは、ランダムなペプチド配列をファージコートタンパク質と、それらのペプチドが繊維状ファージ粒子の外表面に提示されるように融合させる。一般に、これらの提示ペプチドを、着目するリガンドまたは結合分子と接触させ、そのペプチドとリガンドまたは結合分子の間で相互作用させ、結合しなかったファージを除去し、結合したファージを溶出させた後、アフィニティー精製と再増殖を繰り返すことで富化する。着目するリガンドまたは結合分子または標的分子（例えば、本明細書に記載のRPTP）に対して最大の親和性を有するペプチドを配列決定して重要な残基を同定し、これにより1以上の構造的に関連のあるペプチドファミリー内にあるペプチドを同定することができる。ペプチドの配列を比較することで、また、このようなペプチド中のどの残基が突然変異誘発により安全に置換または欠失され得るかを示すことができる。次に、これらのペプチドを、スクリーニング可能なさらなるペプチドライブラリーに組み込み、最適な親和性を有するペプチドを同定することができる。
免疫細胞の免疫応答性を変化させ得る、従って、免疫疾患または免疫障害の治療および／または予防に有用なペプチドを同定するためのさらなる方法としては、限定されるものではないが、(1)RPTP標的の結晶構造を解析するなど（例えば、Jia, Biochem. Cell Biol. 75:17-26 (1997)参照）、ペプチドの設計に有用な、RPTPの重要な残基を特定し、その配向を決定するためのタンパク質-タンパク質相互作用の構造解析（例えば、Takasakiら, Nature Biotech. 15: 1266-70 (1997)参照）；(2)ペプチドグリカン会合リポタンパク質と融合され、大腸菌(E. coli)などの細菌の外表面に提示されたペプチドを含むペプチドライブラリー；(3)RNA会合ペプチドを作製するためにポリペプチドの翻訳を妨げることによるペプチドライブラリーの作製；および(4)ポリペプチドを1以上のプロテアーゼで消化することによるペプチドの作製が挙げられる（例えば、米国特許第6,660,843号;同第5,773,569号;同第5,869,451号;同第5,932,946号;同第5,608,035号;同第5,786,331号;同第5,880,096号も参照）。ペプチドは3〜75個、3〜60個、3〜50個、3〜40個、3〜30個、3〜20個、または3〜10個の間のいずれかの数のアミノ酸を含み得る。免疫細胞の免疫応答性を変化させる（例えば、ある特定の実施形態では、免疫細胞の免疫応答性を抑制する、また、ある特定の他の実施形態では、免疫細胞の免疫応答性を増強する）能力を有するペプチドは、ペプチド-Ig定常領域融合タンパク質（架橋配列またはスペーサー配列であるアミノ酸など）の構築に有用なアミノ酸を付加または挿入するためにさらに誘導体化することもできる。
ペプチド-Ig定常領域融合ポリペプチド（ペプチド-IgFc融合ポリペプチドを含む）を構築するために使用可能なペプチドは、A41Lポリペプチドまたは130Lポリペプチドなどのポックスウイルスポリペプチドに由来するものであってよい。A41Lまたは130Lペプチドは種々のプロテアーゼのいずれか1以上を用いてタンパク質分解消化により無作為に作製し、単離し、その後、免疫細胞の免疫応答性を変化させる能力に関して分析すればよい。このようなペプチドはまた、本明細書に記載され、また、当技術分野で実践されている組換え法を用いて作製することもできる。また、無作為に生成したペプチドを用いて、本明細書および当技術分野で記載されているようなペプチドコンビナトリアルライブラリーまたはファージライブラリーを作製することもできる。あるいは、LAR、RPTP-σおよび／またはRPTP-δと相互作用するA41Lまたは130Lの部分のアミノ酸配列を、ホスファターゼ、またはホスファターゼの一部、例えば、細胞外部分またはIgドメインのコンピューターモデリング、および／またはＸ線結晶学（ホスファターゼ単独またはホスファターゼ-ウイルスポリペプチド複合体の結晶の作製および解析を含み得る)により決定することもできる。
上記で詳説したように、免疫グロブリンのFcポリペプチドは、重鎖CH2ドメインおよびCH3ドメインと、CH1とCH2の間に位置するヒンジ領域の一部または全部を含む。Fc領域は、共有結合（例えば、特にジスルフィド結合）および非共有結合により連結して二量体型または多量体型とすることができる単量体ポリペプチドである。Fcポリペプチドの単量体サブユニット間の分子間ジスルフィド結合の数は免疫グロブリンクラス（例えば、IgG、IgA、IgE)またはサブクラス（例えば、ヒトIgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2)によって異なる。現在のところ、Fcポリペプチド、およびいずれか1以上の定常領域ドメイン、および少なくとも1つの免疫グロブリン(Ig)定常領域ドメインを含む融合タンパク質は当業者に公知の組換え分子生物学の技術に従って容易に作製することができる。
Fcポリペプチドは好ましくは、その使用に関して当該ペプチド-IgFc融合ポリペプチドが意図される動物種に由来するヌクレオチドおよびそのコードされているアミノ酸配列を用いて作製される。一実施形態では、このFcポリペプチドはヒト起源のものであり、ヒトIgG1およびIgG2などの免疫グロブリンクラスのいずれに由来するものであってもよい。
本明細書に記載のFcポリペプチドは、Fcポリペプチド変異体も含む。このようなFcポリペプチド変異体の1つは、2つのFcポリペプチドの間で形成されるジスルフィド結合の数を減らすために、セリンなどの別のアミノ酸で置換された別のFcポリペプチドとジスルフィド結合を形成する1以上のシステイン残基（ヒンジ領域の1以上のシステイン残基など）を有する。あるいは、Fcポリペプチドの野生型ヒンジから1以上のシステイン残基を欠失させることもできる。
Fcポリペプチド変異体の別の例として、Fcポリペプチドが低レベルのエフェクター機能しか持たないように置換または欠失したエフェクター機能に関与する1以上のアミノ酸を有する変異体がある。例えば、補体カスケードの成分の結合を低減するかまたは妨げるため（例えば、Duncanら, Nature 332:563-64 (1988); Morganら, Immunology 86:319-24 (1995)参照）、または免疫細胞により発現されるIgG Fc受容体と結合するFcポリペプチドの能力を低減するかまたは妨げるため(Winesら, J. Immunol. 164:5313-18 (2000); Chappelら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:9036 (1991); Canfieldら, J. Exp. Med. 173:1483 (1991); Duncanら,前掲)、または抗体依存性の細胞の細胞傷害性を変化させるために、Fc領域のアミノ酸を置換してもよい。野生型Fcポリペプチドとは異なるこのようなFcポリペプチド変異体は本発明ではまたムテインFcポリペプチドとも呼ぶ。
一実施形態では、本明細書に記載のペプチドは、野生型Fc領域ポリペプチドにおいて、Fcポリペプチドまたは免疫グロブリンとある種の免疫細胞で発現される1以上のIgG Fc受容体との結合に寄与する残基の少なくとも1つの置換を含むFcポリペプチドとフレーム内で融合される。このようなムテインFcポリペプチドは、免疫細胞の表面に存在するIgG Fc受容体などのIgG Fc受容体と結合する融合ポリペプチドの能力が低下するように、ムテインFcポリペプチドのCH2ドメインにおいて少なくとも1つのアミノ酸残基の置換を含む。ヒト白血球で発現されるこれらのタイプのFc IgG受容体が上記に詳しく記載されている。
IgG Fc受容体の結合に寄与するCH2ドメインのアミノ末端部分の残基には、Leu234〜Ser239部分の残基(Leu-Leu-Gly-Gly-Pro-Ser（配列番号80）(EUナンバリングシステム、Kabatら,前掲)が含まれる（例えば、Morganら, Immunology 86:319-24 (1995)およびそこに引用されている参照文献を参照）。これらの部分はヒトIgG1 Fcポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号79）の15〜20番に相当する。このCH2ドメインにおけるこれら6つの部分の1以上（すなわち、1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、または6全て）のアミノ酸が置換されると、1以上のIgG Fc受容体（またはそのイソ型）と結合するFcポリペプチドの能力が低下する（例えば、Burtonら, Adv. Immunol. 51:1 (1992); Hulettら, Adv. Immunol. 57:1 (1994); Jefferisら, Immunol. Rev. 163:59 (1998); Lundら, J. Immunol. 147:2657 (1991); Sarmayら, Mol. Immunol. 29:633 (1992); Lundら, l. Immunol. 29:53 (1992); Morganら, 前掲参照）。EU234〜239番の1以上のアミノ酸の置換に加え、この領域（239番のカルボキシ末端側でも234番のアミノ末端側でもよい）に隣接する1つ、2つ、3つ、またはそれを超えるアミノ酸も置換することができる。
例として、235番（配列番号79の16番に相当する）のロイシン残基をグルタミン酸残基またはアラニン残基で置換すると、それぞれFcγRIに対する免疫グロブリン（ヒトIgG3など）の親和性が消失または低減する(Lundら, 1991, 前掲; Canfieldら, 前掲; Morganら, 前掲)。別の例としては、234番と235番（配列番号79の15番と16番に相当する）のロイシン残基を例えばアラニン残基で置換すると、免疫グロブリンとFcγRIIaとの結合が妨げられる（例えば、Winesら, 前掲参照）。あるいは、234番（配列番号79の15番に相当する）のロイシン、235番（配列番号79の16番に相当する）のロイシンおよび237番（配列番号79の18番に相当する）のグリシンはそれぞれ異なるアミノ酸で置換してもよく、例えば、234番のロイシンをアラニン残基で置換し(L234A)、235番のロイシンをアラニン残基(L235A)またはグルタミン酸残基(L235E)で置換し、237番のグリシン残基を例えばアラニン残基(G237A)などの別のアミノ酸で置換してもよい。
一実施形態では、ウイルスポリペプチド（またはその変異体もしくはフラグメント）とフレーム内で融合されているムテインFcポリペプチドは、本明細書に記載されているように、ヒトIgG1 CH2ドメインの234〜239番（EUナンバリングシステム）に相当するの配列番号79の15〜20番に1つ、2つ、3つ、4つ、5つまたは6つの突然変異を含む。ムテインFcポリペプチドの例としては、配列番号77の13番、14番および16番に(L234A)、(L235E)および(G237A)に相当する置換が見られてもよい、配列番号77で示されるアミノ酸配列を有する。
別の実施形態では、ムテインFcポリペプチドは、Fcポリペプチドのヒンジ領域にシステイン残基の突然変異を含む。一実施形態では、Fcポリペプチドのヒンジ領域のアミノ末端に最も近いシステイン残基（例えば、野生型IgG1免疫グロブリンのFc部分のヒンジ領域のアミノ末端に最も近いシステイン残基）が欠失されているか、または別のアミノ酸で置換されている。すなわち、例としては、配列番号79の1番のシステイン残基が欠失されているか、1番のシステイン残基が、ジスルフィド結合を形成することができない別のアミノ酸、例えばセリン残基で置換されている。別の実施形態では、ムテインFcポリペプチドは、Fcポリペプチドのヒンジ領域のアミノ末端に最も近いシステイン残基の欠失または置換を含み、さらに隣接するC末端アミノ酸の欠失または置換も含む。ある特定の実施形態では、このシステイン残基および隣接するC末端残基は双方ともムテインFcポリペプチドのヒンジ領域から欠失されている。特定の実施形態では、配列番号79の1番のシステイン残基と配列番号79の2番のアスパラギン酸が欠失されている。ヒンジ領域にこれらのシステイン残基およびアスパラギン酸残基の欠失を含むFcポリペプチドは宿主細胞で効率的に発現可能であり、ある例では、野生型のシステイン残基およびアスパラギン酸残基を保持しているFcポリペプチドよりも細胞で効率的に発現させることができる。
特定の実施形態では、ムテインFcポリペプチドは、配列番号79の1番のシステイン残基が欠失され、かつ、配列番号79の2番のアスパラギン酸が欠失され、かつ、配列番号79の15番のロイシン残基がアラニン残基で置換され、16番のロイシン残基がグルタミン酸残基で置換され、かつ、18番のグリシンがアラニン残基で置換され、野生型Fcポリペプチド（配列番号79）とは異なる、配列番号77で示されるアミノ酸配列)を含む（図５も参照）。よって、ムテインFcポリペプチドの例は、そのアミノ末端部分にKTHTCPPCPAPEAEGAPS（配列番号81）のアミノ酸配列を含む（Fcムテイン配列例、配列番号77を参照）。
他のFc変異体は、限定されるものではないが例を挙げれば、共有結合的化学修飾、挿入、欠失および／または置換（さらに保存的置換を含んでもよい）などの軽微な変化だけを含む、既知のFcポリペプチド配列の類似アミノ酸配列を包含する。互いに類似するアミノ酸配列は、配列が相同な実質的領域を共有し得る。同様に、Fc変異体をコードしているヌクレオチド配列は実質的に類似のヌクレオチド配列を含み、限定されるものではないが例を挙げれば、共有結合的化学修飾、挿入、欠失および／または置換（さらに遺伝コードの縮重のためサイレント突然変異を含んでもよい）などの軽微な変化だけを含む。互いに類似するヌクレオチド配列は、配列が相同な実質的領域を共有し得る。
Fcポリペプチドまたは少なくとも1つの免疫グロブリン(immunogloblulin)定常領域、またはその一部は、着目するペプチドまたはポリペプチドと融合された場合、二量体または他の多量体を形成することにより、少なくとも部分的に、分解を防ぎ、かつ／または半減期を延長し、毒性を軽減し、免疫原性を軽減し、かつ／またはペプチドの生物活性を高めるビヒクルまたは担体部分として働く（例えば、米国特許第6,018,026号、同第6,291,646号、同第6,323,323号、同第6,300,099号、同第5,843,725号参照）。（また、例えば、米国特許第5,428,130号、同第6,660,843号、米国特許出願公開第2003/064480号、同第2001/053539号、同第2004/087778号、同第2004/077022号、同第2004/071712号、同第2004/057953号、同第2004/053845号、同第2004/044188号、同第2004/001853号、同第2004/082039号も参照。）免疫細胞の免疫応答性を変化させるペプチドに連結または融合可能なFcポリペプチドなどの免疫グロブリン定常領域に対する別の部分としては、例えば、直鎖ポリマー（例えば、ポリエチレングリコール、ポリリジン、デキストランなど；例えば、米国特許第4,289,872号、国際特許出願公開WO93/21259参照）；脂質；コレステロール基（ステロイドなど）；炭水化物またはオリゴ糖が挙げられる。
核酸分子
ある特定の実施形態では、RPTP(LAR、RPTP-σまたはRPTP-δ)をコードする配列の少なくとも一部（例えば、short interfering核酸、アンチセンスポリヌクレオチド、リボザイム、またはペプチド核酸）と相補的であり、かつ、遺伝子および／またはタンパク質の発現を変化させるのに使用可能なポリヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチドが提供される。本明細書に記載されているように、RPTP(LAR、RPTP-σまたはRPTP-δ)をコードする核酸分子と特異的に結合またはハイブリダイズするこれらのポリヌクレオチドは、本明細書に示され、また、当業者に利用可能なヌクレオチド配列（例えば、LARをコードする配列番号23および27；RPTP-σをコードする配列番号30、32、34、36；およびRPTP-δをコードする配列番号38、40、42、44）を用いて作製することができる。別の実施形態では、配列特異的でないアプタマーなどの核酸分子を用いて、遺伝子および／またはタンパク質の発現を変化させることもできる。
RNA干渉(RNAi)
バックグラウンドとして、RNA干渉は、short interfering RNA(siRNA)により媒介される動物における配列特異的転写後遺伝子サイレンシングのプロセスを指す(Zamoreら, Cell, 101:25-33 (2000); Fireら, Nature 391:806 (1998); Hamiltonら, Science 286:950-51 (1999); Linら, Nature 402:128-29 (1999); Sharp, Genes & Dev. 13:139-41 (1999);およびStrauss, Science 286:886 (1999); Sandyら, Biotechniques 39:215-24 (2005));米国特許第6,506,559号;同第6,573,099号;国際特許出願公開WO01/75164)。阻害は、標的遺伝子の一部のヌクレオチド配列（例えば、本明細書に記載のRPTPを発現する遺伝子）を阻害RNAが生じるように選択されるという点で配列特異的である。転写後遺伝子サイレンシングのプロセスは、外来遺伝子の発現を妨げるために用いる細胞防御機構であると考えられる(Fireら, Trends Genet. 15:358 (1999))。このプロセスは、細胞に、部分的または完全に二本鎖の特性を有する核酸分子、一般にはRNAを導入することを含む。細胞におけるdsRNAの存在は、まだ完全に特性決定されていない機構によってRNAi応答を誘発する。この機構は、プロテインキナーゼPKRおよび2',5'-オリゴアデニレートシンセターゼのdsRNAによる活性化から生じ、リボヌクレアーゼLによるmRNAの非特異的切断をもたらすインターフェロン応答など、二本鎖RNA特異的リボヌクレアーゼを含む他の機構とは異なっているようである（例えば、米国特許第6,107,094号;同第5,898,031号; Clemensら, J. Interferon Cytokine Res. 17:503-24 (1997); Adahら, Curr. Med. Chem. 8:1189 (2001))。
細胞における長いdsRNAの存在は、ダイサーと呼ばれるリボヌクレアーゼIII酵素の活性を刺激する(Bass, Cell 101:235 (2000); Zamoreら, Cell, 101:25-33 (2000); Hammondら, Nature 404:293 (2000))。ダイサーはsiRNAとして知られるdsRNAの小片へとdsRNAを処理することに関与している(Zamoreら, Cell 101:25-33 (2000); Bass, Cell 101:235 (2000); Bersteinら, Nature 409:363 (2001))。ダイサー活性に由来するshort interfering RNAは一般に約21〜約23ヌクレオチド長であり、約19塩基対の二本鎖（例えば、19塩基対の二本鎖コアと各3'末端に2つの対合していないヌクレオチドを含む21〜22ヌクレオチド長のdsRNA分子）を含む(Zamoreら, 2000, 前掲; Elbashirら, 2001, 前掲; Dykxhoornら, Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 4:457-67 (2003))。ダイサーは、翻訳制御に関連づけられている保存された構造の前駆体RNAからの21および22ヌクレオチドのsmall temporal RNA (stRNA)の切り出しをにも関連づけられている(Hutvagnerら, Sience 293:834 (2001))。RNAi応答はまた、一般にRNA誘導型サイレンシング複合体(RISC)と呼ばれる、siRNA二本鎖のアンチセンス鎖に相補的な配列を有する一本鎖RNAの切断を媒介するエンドヌクレアーゼ複合体を特徴とする。この標的RNAの切断は、siRNA二本鎖のアンチセンス鎖に相補的な領域の中央で起こる(Elbashirら, 2001, 前掲)。
short interfering RNAは、LAR、RPTP-σおよび／またはRPTP-δ遺伝子の発現を調節（低減または阻害）するために使用することができる。本明細書の開示は、RPTP、すなわちLAR、RPTP-σおよびRPTP-δをコードしている遺伝子の発現および活性を、小核酸分子を用いたRNA干渉により調節するために有用な化合物、組成物および方法に関する。特に、short interfering RNA(siRNA)分子、マイクロRNA(miRNA)分子およびショートヘアピンRNA(shRNA)分子などの小核酸分子は、LAR、RPTP-σおよび／またはRPTP-δ、またはその変異体の発現を調節する本明細書に記載の方法に従って使用することができる。siRNAポリヌクレオチドは二本鎖RNA(dsRNA)を含むのが好ましいが、一本鎖RNAを含んでもよい（例えば、Martinezら, Cell 110:563-74 (2002))。siRNAポリヌクレオチドは、ヌクレオチド（リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドまたはその双方の組合せ）および／または本明細書で示され、また、当業者に公知であり用いられているヌクレオチド類似体の他の天然ポリマー、組換えポリマー、または合成一本鎖もしくは二本鎖ポリマーを含んでもよい。
二本鎖siRNAポリヌクレオチドの少なくとも1つの鎖は、siRNAポリヌクレオチドの各鎖または好ましくは両鎖の3'末端に「突出した(overhang)」（すなわち、反対の鎖の相補塩基と塩基対を形成していない）少なくとも1つ、好ましくは2つのヌクレオチドを有する。一般に、siRNAポリヌクレオチド二本鎖の各鎖は3’末端にヌクレオチド2つのオーバーハングを有する。このヌクレオチド2つのオーバーハングはチミジンジヌクレオチド(TT)であってもよいし、あるいは例えばTCジヌクレオチドまたはTGジヌクレオチドまたは他のいずれかのジヌクレオチドなどの他の塩基を含んでもよい（例えば、国際特許出願公開WO01/75164参照）。あるいは、このsiRNAポリヌクレオチドは平滑末端、すなわち、二本鎖の一方の鎖の各ヌクレオチドが好ましくは反対の鎖のヌクレオチドに相補的である（例えば、ワトソン-クリックの塩基対合による））を有してもよい。
siRNAは鋳型として、例えばU6プロモーターまたはH1 RNAポリメラーゼIIIプロモーターなどのRNAポリメラーゼプロモーターを含むDNA（ゲノムDNA、cDNAまたは合成DNA）を用いて転写することもできるし、あるいはsiRNAは合成的に誘導されたRNA分子であってもよい。siRNAの二本鎖構造は、1本の自己相補的RNA鎖により、または2本の相補的RNA鎖から形成させてもよい。RNA二本鎖の形成は細胞内で始まっても細胞外で始まってもよい。RNAは1細胞当たり少なくとも1コピー、または1細胞当たり少なくとも5、10、50、100、250、500または1000コピーを送達する量で導入すればよい。siRNAポリヌクレオチドであるポリヌクレオチドは、一般にはスペーサー配列により隔てられた、一本鎖オリゴヌクレオチドフラグメント（例えば、約15〜30ヌクレオチド、約19〜25ヌクレオチド、または約19〜22ヌクレオチド、なお、15と30を含め、15〜30の間の任意の全整数を含むと理解すべきである）とその逆相補体を含む一本鎖ポリヌクレオチドから誘導することができる。ある特定のこのような実施形態によれば、このスペーサーが切断されると、一本鎖オリゴヌクレオチドフラグメントとその逆相補体が生じ、その結果、それらがアニーリングして二本鎖siRNAポリヌクレオチドが形成され得る。場合により、さらなる処理工程により、一方の鎖または両鎖の3'末端および／または5'末端に、あるいは3'末端および／または5'末端から、1つ、2つ、3つまたはそれを超えるヌクレオチドが付加または除去され得る。ある特定の実施形態では、このスペーサーは、スペーサーの切断（および場合により、一方の鎖または両鎖の3'末端および／または5'末端に、あるいは3'末端および／または5'末端からの、1つ、2つ、3つ、4つまたはそれを超えるヌクレオチドの付加または除去をもたらし得るその後の処理工程）の前にそのフラグメントとその逆相補体がアニーリングして二本鎖（例えば、ヘアピンポリヌクレオチド様の）構造を形成可能な長さである。従って、スペーサー配列は、二本鎖核酸へとアニーリングされた際にsiRNAポリヌクレオチドを含む2つの相補的ポリヌクレオチド配列の間の領域に位置するいずれのポリヌクレオチド配列であってもよい。スペーサー配列は少なくとも4つのヌクレオチドを含み得るが、ある特定の実施形態では、このスペーサーは5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16,17、18、19、20、21〜25、26〜30、31〜40、41〜50、51〜70、71〜90、91〜110、111〜150、151〜200またはそれを超えるヌクレオチドを含み得る。スペーサーにより隔てられた2つの相補的ヌクレオチド配列を含む1本のヌクレオチド鎖に由来するsiRNAポリヌクレオチドの例が記載されている（例えば、Brummelkampら, 2002 Science 296:550; Paddisonら, 2002 Genes Develop. 16:948; Paulら, Nat. Biotechnol. 20:505-508 (2002); Grabarekら, Biotechniques 34:734-44 (2003))。
siRNAポリヌクレオチドの発現に好適なベクターは、例えばヒトU6 snRNAプロモーター（例えば、Miyagishiら, Nat. Biotechnol. 20:497-500 (2002); Leeら, Nat. Biotechnol. 20:500-505 (2002); Paulら, Nat. Biotechnol. 20:505-508 (2002); Grabarekら, BioTechniques 34:73544 (2003)参照、また、Suiら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99:5515-20 (2002)も参照）などのRNA分子の転写のための1以上のプロモーターを含む組換え核酸構築物を含み得る。siRNAポリヌクレオチドの各鎖はそれぞれ別個のプロモーターの指令のもと別に転写してもよく、その後、細胞内でハイブリダイズさせてsiRNAポリヌクレオチド二重らせんを形成させてもよい。各鎖はまた、別個のベクターから転写させてもよい（Leeら, 前掲参照）。あるいは、RPTP(LAR、RPTP-σおよび／またはRPTP-δ)に特異的なセンス配列およびアンチセンス配列を1つのプロモーターの制御下で転写させてもよく、その結果、このsiRNAポリヌクレオチドはヘアピン分子を形成する（Paulら, 前掲）。この場合、siRNA特異的配列の相補鎖は、少なくとも4つのヌクレオチドを含むが、本明細書に記載されているように少なくとも5つ、6つ、7つ、8つ、9つ、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、または18個のヌクレオチドまたはそれを超えるヌクレオチドを含んでもよいスペーサーにより隔てられる。さらに、U6プロモーターの制御下で転写され、ヘアピンを形成するsiRNAは、3'末端に転写終結シグナルとして働く約4つのウリジンのストレッチを含んでもよい(Miyagishiら, 前掲; Paulら, 前掲)。例を示せば、標的配列が19ヌクレオチドである場合、siRNAヘアピンポリヌクレオチド（5'末端で始まる）は19ヌクレオチドのセンス配列とその後にスペーサー（19ヌクレオチドのセンス配列の3'末端に隣接する2つのウリジンヌクレオチドを有する）およびスペーサーを有し、このスペーサーは19ヌクレオチドのアンチセンス配列に連結され、その後に4ウリジンの末端配列が続き、オーバーハングが形成されている。このようなオーバーハングを有するshort interfering RNAポリヌクレオチドは標的ポリペプチドの発現を効率的に妨げる（例えば、Miyagishiら, 前掲; Paulら, 前掲）。組換え構築物はまた、siRNAポリヌクレオチドに作動可能なように連結することができる別のRNAポリメラーゼIIIプロモーターであるH1 RNAプロモーターを用いて作出することもでき、これを、siRNA特異的配列を含むヘアピン構造の転写またはsiRNA二本鎖ポリヌクレオチドの各鎖の個別転写に用いることができる（例えば、Brummelkampら, Science 296:550-53 (2002); Paddisonら, 前掲参照）。siRNAポリヌクレオチドの転写のための配列の挿入に有用なDNAベクターとしては、pSUPERベクター（例えば、Brummelkampら, 前掲参照）；pCWRSVN由来のpAVベクター（例えば、Paulら, 前掲参照）；およびpIND（例えば、Leeら, 前掲参照）などが挙げられる。
RPTPポリペプチドは適当なプロモーターの制御下で哺乳類細胞、酵母、細菌または他の細胞で発現させることができ、このような系は本明細書に示されるポリペプチド発現と干渉し得るsiRNAポリヌクレオチドの同定および特性決定に提供され、利用可能である。原核生物宿主および真核生物宿主とともに用いる適当なクローニングベクターおよび発現ベクターは、例えばSambrookら, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 第3版, Cold Spring Harbor, New York、(2001)により記載されている。
これらのsiRNAは、LAR、RPTP-σおよびRPTP-δの1以上またはその変異体の発現を阻害、低減または妨害するため、よって、免疫細胞の免疫応答性を変化させるために使用可能であり、1以上のRPTPの発現または過剰発現に関連する炎症性疾患または自己免疫疾患、あるいは心血管疾患または代謝性疾患を有する被験体または宿主を治療するために使用可能である。海馬ニューロンにおけるラットLAR、RPTP-σおよびRPTP-δの発現の干渉は、siRNA分子を用いれば効果的であった(Dunahら, Nat. Neurosci. 8:458-67 (2005))。
一実施形態では、siRNA分子はLAR RNAの発現に影響を及ぼすRNAi活性を有し、このsiRNA分子は、限定されるものではないが、本明細書に記載されている配列をはじめ、LARポリペプチドまたはその変異体をコードしているRNA分子に相補的な配列を含む。別の実施形態では、siRNA分子はRPTP-σまたはRPTP-δRNAの発現に影響を及ぼすRNAi活性を有し、このsiRNA分子は、本明細書に記載されている配列をはじめ、それぞれRPTP-σをコードしているか、またはRPTP-δポリペプチドまたはその変異体をコードしているRNAに相補的な配列を含む。特定の他の実施形態では、siRNA分子は、LAR RNA、RPTP-σRNAおよびRPTP-δRNAの少なくとも2つの発現に影響を及ぼすRNAi活性を有する。少なくとも2つのコードされているRPTPの発現を阻害、低減または妨害するこのようなsiRNAは、これら少なくとも2つのRPTPヌクレオチド配列に共通で同一のコード配列の一部を認識するか、またはそれと結合もしくはハイブリダイズする。別の実施形態では、siRNAはLAR RNA、RPTP-σRNAおよびRPTP-δRNAの発現を阻害、低減または妨害し、3つ全てのRPTPヌクレオチド配列に共通で同一のコード配列の一部を認識するか、またはそれと結合もしくはハイブリダイズする。
本明細書に記載のように、LAR、RPTP-σおよびRPTP-δのそれぞれをコードしているヌクレオチド配列は、そのポリヌクレオチドの特定の場所において配列同一性を有する。このような相同または同一配列は、例えば配列アライメントを用い、当業者に公知の、また、本明細書で記載される方法に従って同定することができる。siRNA分子は、例えば完全に相補的な配列を用いるか、または例えばミスマッチおよび／またはゆらぎの塩基対など、さらなる標的配列を提供し得る不規則な塩基対を組み込むことにより、このような相同配列を標的とするように設計することができる（例えば、米国特許出願第2005/0137155号参照）。
siRNA分子は、LAR、RPTP-σおよび／またはRPTP-δポリペプチドをコードするヌクレオチド配列またはその一部に相補的なヌクレオチド配列を有するアンチセンス鎖を含み、センス鎖をさらに含んでもよく、このセンス鎖はLAR、RPTP-σおよび／またはRPTP-δ遺伝子またはmRNAのヌクレオチド配列またはその一部を含む。一実施形態では、siRNA分子は約15、16、17、18、19、20または21のヌクレオチドを有するアンチセンス鎖を含み、別の実施形態では、約19〜約30（例えば、約19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29または30）のヌクレオチドを含み、このアンチセンス鎖はLAR、RPTP-σおよびRPTP-δの1以上をコードしているRNA配列に相補的である。特定の他の実施形態では、このsiRNAは約16、17、18、19、20または21のヌクレオチドを有するセンス鎖をさらに含み、別の実施形態では、約19〜約30（例えば、約19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29または30）のヌクレオチドを含む。このセンス鎖およびアンチセンス鎖は少なくとも約19の相補的ヌクレオチドを有する異なるヌクレオチド配列である。siRNAポリヌクレオチドのヌクレオチド配列は、本明細書に記載のRPTPをコードしているポリヌクレオチド配列の一部と同一であってもよいし、あるいはヌクレオチド配列は1つ、2つ、3つまたは4つのヌクレオチドで異なっていてもよい。標的配列に対する1つの点突然変異は阻害に効果的であることが分かっている。
siRNA分子の配列を決定するのには、種々のアルゴリズムが利用できる。一般に、siRNAを設計する際に無効にされる標的ポリヌクレオチド配列の領域としては、(1)開始コドンまたは終結コドンの50〜100塩基対の範囲内の領域；(2)イントロン領域；(3)4以上の同一塩基のストレッチ；(4)GC含量が30%未満または60%を超える領域；および(5)リピートおよび複雑性の低い配列を含む。LAR、RPTP-σおよび／またはRPTP-δ遺伝子またはmRNAの発現を阻害するsiRNAを設計するために使用可能な1つのアルゴリズムは、Tuschlルールと呼ばれている(Elbashirら, Nature 411:494-98 (2001); Elbashirら, EMBO J. 20:6877-88 (2001); Elbashirら, Methods 26:199-213 (2002))。標的領域は開始コドンの下流の50〜100ヌクレオチドが選択され、この配列は好ましい順で(1)23ヌクレオチドの配列モチーフAA(N19)；(2)23ヌクレオチドの配列モチーフ(NA(N21)；センスsiRNAの3'末端の、TTへの変換；(3)NAR(N17)YNN（ここで、R=AまたはG(プリン)；Y-TまたはC(ピリミジン)およびN=任意のヌクレオチド）を含む。この標的配列のGC含量はおよそ50%でなければならない。.合理的siRNAデザイン(Dharmacon, Inc.)と呼ばれる別の方法では、特定の配列特徴にポイントを割り当てる（例えば、Reynoldsら, Nat. Biotechnol. 22:326-30 (2004)参照）。さらに、いくつかの販売業者が専売アルゴリズムを用いて、標的配列に基づくsiRNA分子を設計および製造している（例えば、Ambion, Inc., Austin, TX, Cenix Bioscience; Qiagen, Inc., Valencia, CAにより開発されたアルゴリズム参照）。
siRNAは修飾されていなくとも化学修飾されていてもよく、化学合成、ベクターからの発現または酵素的合成が可能である。化学修飾siRNAの使用は、例えば、in vivoにおいてヌクレアーゼ分解耐性を高めることにより、かつ／または細胞取り込みの改良により、天然siRNA分子の種々の特性を改良する（例えば、米国特許出願第2005/0137155号参照）。
遺伝子発現の阻害とは、LAR、RPTP-σまたはRPTP-δをコードしている標的遺伝子からのタンパク質および／またはmRNA生成物のレベルの消失（または観察可能な低下）を指す。特異性とは、細胞の他の遺伝子に対する作用を発現することなく、標的遺伝子を阻害することができることを指す。阻害の結果はその細胞または生物の特性の検討、あるいはRNA液相ハイブリダイゼーション、ヌクレアーゼ保護、ノーザンハイブリダイゼーション、逆転写、マイクロアレイを用いた遺伝子発現モニタリング、抗体結合、酵素結合免疫吸着検定法(ELISA)、ウエスタンブロット法、ラジオイムノアッセイ(RIA)、他のイムノアッセイおよび蛍光活性化細胞分析(FACS)などの生化学技術により確認することができる。細胞系統または完全な生物体におけるRNAを媒介とする阻害では、遺伝子発現は便宜には、そのタンパク質産物が容易にアッセイされるリポーターまたは薬剤耐性遺伝子の使用によりアッセイされる。リポーター遺伝子の例としては、アセトヒドロキシ酸シンターゼ(AHAS)、アルカリ性ホスファターゼ(AP)、βガラクトシダーゼ(LacZ)、βグルクロニダーゼ(GUS)、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ(CAT)、緑色蛍光タンパク質(GFP)、セイヨウワサビペルオキシダーゼ(HRP)、ルシフェラーゼ(Luc)、ノパリンシンターゼ(NOS)、オクトピンシンターゼ(OCS)およびその誘導体が挙げられる。ブレオマイシン、クロラムフェニコール、ゲンタマイシン、ハイグロマイシン、カナマイシン、リンコマイシン、メトトレキサート、ホスフィノトリシン、ピューロマイシンおよびテトラサイクリン耐性を付与する多くの選択マーカーが利用可能である。
アンチセンスポリヌクレオチドおよびリボザイム
アンチセンスポリヌクレオチドは配列特異的にmRNAまたはDNAなどの核酸と結合する。アンチセンス因子として用いるためのオリゴヌクレオチドおよびリボザイムの同定ならびに標的送達のための遺伝子をコードしているDNAの同定としては、当業者に周知の方法を含む。例えば、このようなオリゴヌクレオチドの望ましい特性、長さ、および他の特徴は周知である。アンチセンス技術はポリメラーゼ、転写因子、または他の調節分子技術の結合の干渉により、遺伝子発現を制御するために使用可能であるs（Geeら, In Huber and Carr, Molecular and Immunologic Approaches, Futura Publishing Co. (Mt. Kisco、NY; 1994)参照）。アンチセンスポリヌクレオチドはまた、翻訳されないコード遺伝子またはmRNAの一部と特異的にハイブリダイズすることにより、LAR、RPTP-σおよび／またはRPTP-δのいずれか1つの遺伝子発現を変化させることもできるし、あるいは調節配列である配列でもあり得る。このようなアンチセンス分子はRPTP遺伝子の制御領域（例えば、プロモーター、エンハンサーまたは転写開始部位）とハイブリダイズし、遺伝子の転写を遮断するか、または転写物とリボソームの結合を阻害することにより転写を遮断するように設計することもできる。
相補的配列を有するmRNAと結合した際、アンチセンスはそのmRNAの翻訳を妨げる（例えば、米国特許第5,168,053号;米国特許第5,190,931号;米国特許第5,135,917号;米国特許第5,087,617号;ダンベル型アンチセンスオリゴヌクレオチドを記載しているCluselら, Nucleic Acids Res. 21:3405-3411 (1993)参照）。三重鎖分子とは、二重鎖DNAと結合して共直線性の三重鎖分子を形成する、それにより転写を妨げるDNA一本鎖を指す（例えば、二重鎖DNA上の標的部位と結合する合成オリゴヌクレオチドを作製する方法を記載している米国特許第5,176,996号参照。また、例えば、Helene, Anticancer Drug Des. 6:569-84 (1991); Heleneら, Ann. N.Y. Acad. Sci. 660:27-36 (1992); Maher, Bioassays 14:807-15 (1992)も参照）。
アンチセンスポリヌクレオチドは、タンパク質をコードしているセンスポリヌクレオチドに相補的な、例えば、二本鎖cDNA分子のコード鎖に相補的な、またはmRNA配列に相補的なヌクレオチド配列を含む。従って、アンチセンスポリヌクレオチドはセンスポリヌクレオチドと水素結合することができる。アンチセンスポリヌクレオチドは完全RPTPコード鎖に、またはその一部だけに相補的であってもよい。一実施形態では、アンチセンスポリヌクレオチド分子は、LAR、RPTP-σまたはRPTP-δをコードしているポリヌクレオチドのコード領域に対してアンチセンスである。このアンチセンスポリヌクレオチドは、LAR、RPTP-σまたはRPTP-δに独特なヌクレオチド配列の一部に対してアンチセンスである配列を含んでもよいし、あるいはLAR、RPTP-σまたはRPTP-δをコードしている各ポリヌクレオチドにおいて類似または同一のコード配列の一部に対してアンチセンスである配列を含んでもよい。コード領域とは、アミノ酸残基に翻訳されるコドンを含むヌクレオチド配列の領域を指す。別の実施形態では、このアンチセンス核酸分子は、LAR、RPTP-σまたはRPTP-δのいずれか1つをコードしているヌクレオチド配列のコード鎖の「非コード領域」に対してアンチセンスである。「非コード領域」とは、アミノ酸に翻訳されないコード領域にフランキングする5'配列および3'配列を指す（すなわち、5'非翻訳領域および3'非翻訳領域とも呼ばれる）。
本明細書に開示されているRPTPをコードしている、かつ当業界で利用可能である、コード鎖配列が与えられると、アンチセンスポリヌクレオチドはワトソンとクリックの塩基対形成の法則に従って設計することができる。このアンチセンスポリヌクレオチドは例えばRPTP mRNAの全コード領域に相補的であってもよく、あるいはRPTP mRNAのコード領域または非コード領域の一部のみに対してアンチセンスであるオリゴヌクレオチドであってもよい。例えば、このアンチセンスオリゴヌクレオチドは、RPTP mRNAの翻訳開始部位周辺の領域に相補的であり得る。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、例えば、約5、10、15、20、25、30、35、40、45または50のヌクレオチドまたはそれを超える長さである。アンチセンス核酸は当業者に公知の方法を用い、化学合成および酵素的連結反応を用いて構築することができる。例えば、アンチセンス核酸（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド）は、天然ヌクレオチド、あるいは分子の生物学的安定性を高めるよう、またはアンチセンス核酸とセンス核酸の間で形成される二本鎖の物理的安定性を高めるように設計された様々に修飾されたヌクレオチド（例えば、ホスホロチオエート誘導体およびアクリジン置換ヌクレオチドが使用できる）を用い、化学合成することができる。
アンチセンスオリゴヌクレオチドは一般に、ホスホロチオエート、メチルホスホネート、スルホン、スルフェート、ケチル、ホスホロジチオエート、ホスホルアミデート、リン酸エステルなどの結合および他のこのような結合を用いることで、内因性のヌクレオチド分解酵素による分解に耐性となるように設計される（例えば、Agrwalら, Tetrahedron Lett. 28:3539-42 (1987); Millerら, J. Am. Chem. Soc. 93:6657-65 (1971); Stecら, Tetrahedron Lett. 26:2191-2194 (1985); Moodyら, Nucleic Acids Res. 12:4769-82 (1989); Uznanskiら, 核Nucleic Acids Res. 17:4863-71 (1989); Letsingerら, Tetrahedron 40:137-43 (1984); Eckstein, Annu. Rev. Biochem. 54:367-402 (1985); Eckstein, Trends Biol. Sci. 14:97-100 (1989); Stein, In: Oligodeoxynucleotides. Antisense Inhibitors of Gene Expression, Cohen編, Macmillan Press, London, 97-117頁(1989); Jagerら, Biochemistry 27:7237-46 (1988)参照）。アンチセンス核酸を作製するために使用可能な修飾ヌクレオチドの例としては、5-フルオロウラシル、5-ブロモウラシル、5-クロロウラシル、5-ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、4-アセチルシトシン、5-(カルボキシヒドロキシルメチル)ウラシル、5-カルボキシメチルアミノメチル-2-チオウリジン、5-カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、β-D-ガラクトシルキューオシン、イノシン、N6-イソペンテニルアデニン、1-メチルグアニン、1-メチルイノシン、2,2-ジメチルグアニン、2-メチルアデニン、2-メチルグアニン、3-メチルシトシン、5-メチルシトシン、N6-アデニン、7-メチルグアニン、5-メチルアミノメチルウラシル、5-メトキシアミノメチル-2-チオウラシル、β-D-マンノシルキューオシン、5'-メトキシカルボキシメチルウラシル、5-メトキシウラシル、2-メチルチオ-N6-イソペンテニルアデニン、ウラシル-5-オキシ酢酸(v)、ワイブトキソシン、シュードウラシル、キューオシン、2-チオシトシン、5-メチル-2-チオウラシル、2-チオウラシル、4-チオウラシル、5-メチルウラシル、ウラシル-5-オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル-5-オキシ酢酸(v)、5-メチル-2-チオウラシル、3-(3-アミノ-3-N-2-カルボキシプロピル)ウラシル、(acp3)wおよび2,6-ジアミノプリンが挙げられる。あるいは、このアンチセンスポリヌクレオチド（またはオリゴヌクレオチド）は、核酸がアンチセンス配向でサブクローニングされている（すなわち、挿入された核酸から転写されるRNAが目的の標的ポリヌクレオチドに対してアンチセンス配向となる）発現ベクターを用いて生物学的に産生させることができる。
LAR、RPTP-σまたはRPTP-δをコードしている1以上のポリヌクレオチドに特異的なアンチセンスポリヌクレオチドは一般に被験体に投与されるか、またはin situで生成され、その結果、このアンチセンスポリヌクレオチドはRPTPをコードしている細胞mRNAおよび／またはゲノムDNAとハイブリダイズまたは結合し、それにより例えば転写および／または翻訳を阻害することにより、タンパク質の発現を阻害する。ハイブリダイゼーションは従来のヌクレオチド相補性により安定な二本鎖の形成をもたらすことができ、あるいは例えばアンチセンスポリヌクレオチドがDNA二本鎖に結合する場合、そのアンチセンスポリヌクレオチドは二重らせんの主溝における特異的相互作用により結合する。
アンチセンスポリヌクレオチドは組織部位に直接注射することにより宿主または被験体に投与することができる。あるいは、アンチセンスポリヌクレオチドは、選択された細胞を標的とするように修飾または操作した後、全身投与することもできる。例えば、全身投与では、アンチセンス分子は、例えば、アンチセンス核酸分子と、細胞表面受容体または抗原と結合するペプチドまたは抗体とを連結することにより、選択された細胞表面で発現される受容体または抗原と特異的に結合するように修飾することができる。また、アンチセンスポリヌクレオチドは、本明細書に記載され、当技術分野で使用されているベクターを用いて細胞へ送達することもできる。アンチセンス分子の十分な細胞内濃度を達成するため、アンチセンスポリヌクレオチドが強力なpol IIまたはpol IIIプロモーターの制御下に置かれているようなベクターを構築することができる。
さらに別の実施形態では、このアンチセンスポリヌクレオチドはα-アノマー核酸分子である。α-アノマー核酸分子は、通常のβ-ユニットとは対照的にその鎖が互いに平行に走っている相補的RNAと特異的な二本鎖ハイブリッドを形成する(Gaultierら (1987) Nucleic Acids. Res. 15:6625-6641)。このアンチセンス核酸分子はまた、2'-o-メチルリボヌクレオチド(Inoueら, Nucleic Acids Res. 15:6131-6148 (1987))またはキメラRNA-DNA類似体(Inoueら, FEBS Lett. 215:327-330 (1987))を含み得る。
別の実施形態では、免疫細胞の免疫応答性を、LAR、RPTP-σまたはRPTP-δの1以上を発現する細胞とリボザイムを接触させることにより変化させることができる。リボザイムは、そのリボザイムがそれに対する相補領域を有するmRNAなどの一本鎖核酸を特異的に切断して、細胞の遺伝子発現の特異的阻害または干渉をもたらし得る、リボヌクレアーゼ活性を有する触媒RNA分子である。少なくとも5種類の既知のリボザイムがRNA鎖の切断および／または連結に関与している（例えば、Haselhoff and Gerlach (Nature 334:585-591 (1988)に記載されているハンマーヘッド型リボザイム）。リボザイムはいずれのRNA転写物でも標的とすることができ、このような転写物を触媒的に切断することができる（例えば、米国特許第5,272,262号;米国特許第5,144,019号;および米国特許第5,168,053号、同第5,180,818号、同第5,116,742号および同第5,093,246号参照）。このように、RPTPコード核酸に特異的なリボザイムは本明細書に記載され、また、当技術分野で利用可能なRPTPのヌクレオチド配列に基づいて設計することができる。例えば、活性部位のヌクレオチド配列がRPTPコードmRNAでは切断されるヌクレオチド配列に相補的であるテトラヒメナ(Tetrahymena)L-19 IVS RNAの誘導体を構築（例えば、Cechら., 米国特許第4,987,071号;およびCechら, 米国特許第5,116,742号参照）。あるいは、RPTPをコードしているmRNA分子を用い、RNA分子のプールから特異的リボヌクレアーゼ活性を有する触媒RNAを選択することもできる（例えば、Bartelら, Science 261:1411-18 (1993)参照）。
ペプチド核酸
別の実施形態では、本明細書に記載のRPTPのいずれか1つをコードしているポリヌクレオチド（またはその一部）のデオキシリボースリン酸主鎖を修飾することにより、ペプチド核酸(PNA)を作製することができる（例えば、Hyrup Bら, Bioorganic & Medicinal Chemistry 4:5-23) (1996)参照）。「ペプチド核酸」または「PNA」とは、デオキシリボースリン酸主鎖がシュードペプチド主鎖に置き換わり、4つの天然核酸塩基だけが保持されている核酸模倣体、例えばDNA模倣体を指す。PNAの天然主鎖は低イオン強度条件下でDNAおよびRNAと特異的ハイブリダイゼーションが見込めることが示されている。PNAオリゴマーの合成は標準的な固相ペプチド合成プロトコールを用いて行うことができる（例えば、Hyrup B, 前掲; Perry-O'Keefeら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:14670-75 (1996)参照）。LAR、RPTP-σおよびRPTP-δの1以上に特異的なPNA分子は、例えば、転写停止または翻訳停止を誘導することにより、または複製を阻害することにより、遺伝子発現の配列特異的モジュレーションのためのアンチセンスまたはアンチ遺伝子剤として使用可能である。
アプタマー
アプタマーは、核酸、タンパク質、脂質などをはじめ、他の分子と結合する能力に基づきランダムプールから選択された、一般には一本鎖のDNAまたはRNA分子である。着目するポリペプチドをコードしている配列を含むポリヌクレオチドと結合し、転写または翻訳を変化させる、アンチセンスポリヌクレオチド、short interfering RNA(siRNA)、またはリボザイムとは違い、アプタマーはポリペプチドを標的として、ポリペプチドと結合することができる。アプタマーは、特異的標的、この場合にはLAR、RPTP-δおよび／またはRPTP-σと結合する能力により、ランダムまたは非修飾オリゴヌクレオチドライブラリーから選択することができる（例えば、米国特許第6,867,289号;米国特許第5,567,588号参照）。アプタマーは種々の二次元および三次元構造を形成する能力を持ち、それらのモノマーの範囲内で、モノマーであれポリマーであれ、事実上いずれの化学化合物とも、利用可能なリガンドとして働く（すなわち、特異的結合対を形成する）に十分な化学的多彩性を持つ。いずれの大きさおよび組成の分子も標的として働き得る。in vitro選択の反復的プロセスを用い、その標的に対して高い親和性を有する種に関してライブラリーを富化することができる。このプロセスは、このライブラリーを所望の標的とともにインキュベートし、その標的と結合したものから遊離のオリゴヌクレオチドを分離し、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)の使用などにより結合したオリゴヌクレオチドサブセットを増幅するという反復サイクルを含む。その標的に対して高い親和性を有する配列の選択亜集団から、亜集団をサブクローニングし、特定のアプタマーをさらに詳しく調べ、標的の生物機能を変化させるアプタマーを同定することができる（例えば、米国特許第6,699,843号参照）。
アプタマーは、いずれのデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチド、あるいはデキシチオホスホスフェート（またはホスホロチオエート）など、リンと結合した非架橋型リガンドの1つとして酸素の代わりに硫黄を有するこれらの塩基の修飾物を含んでもよい。モノチオホスフェートαSは1つの硫黄原子を有し、よって、リン酸中心のまわりはキラルである。ジチオホスフェートは両酸素とも置換されているのでキラルではない。ホスホロチオエートヌクレオチドは市販されているか、または当技術分野で公知のいくつかの異なる方法で合成することもできる。
抗体および抗原結合フラグメント
本明細書では、LAR、RPTP-δまたはRPTP-σと特異的に結合する抗体；LARおよびRPTP-δと特異的に結合する抗体；LARおよびRPTP-σと特異的に結合する抗体；RPTP-δおよびRPTP-σと特異的に結合する抗体；およびLAR、RPTP-δおよびRPTP-σと特異的に結合する抗体；ならびにこれらの抗体を作製および使用する方法が提供される。これらの特異的抗体は動物を免疫化した後に抗体を単離することにより作製されるポリクローナルであってもモノクローナルであってもよく、あるいは抗体は組換え抗体であってもよい。本明細書に記載の抗体は、LAR、RPTP-δおよびRPTP-σの少なくとも1つを発現する免疫細胞の免疫応答性に影響を与えるのに有用である。ある特定の実施形態では、これらの抗体はLAR、RPTP-δおよびRPTP-σの少なくとも1つを発現する免疫細胞の免疫応答性を抑制する。このような抗体としては、免疫細胞に対してポックスウイルスタンパク質A41Lまたは130Lと同様の作用を示すものが含まれる。これらの抗体は、A41L（あるいは、130L)と免疫細胞との結合を競合的に阻害することができ、かつ／またはその結合を損なう（すなわち、回避、遮断、低減する）ことができる。一実施形態では、抗体またはその抗原結合フラグメントは少なくとも2つのRPTP（LAR、RPTP-δおよびRPTP-σのいずれか2つであり得る）と特異的に結合し、A41L（または130L）と少なくとも2つのRPTPポリペプチドとの結合を競合的に阻害する。別の実施形態では、このような抗体はA41L（または130L）と、LAR、RPTP-δおよびRPTP-σのいずれか1つを発現する免疫細胞との結合を阻害する。よって、この抗体またはその抗原結合フラグメントは、LAR、RPTP-δおよびRPTP-σのいずれか1つを発現する免疫細胞の免疫応答性を抑制する。特定の実施形態では、抗体またはその抗原結合フラグメントはRPTP-δおよびRPTP-σの双方と特異的に結合し、A41Lまたは130LとRPTP-δまたはRPTP-σの結合、あるいはRPTP-δおよびRPTP-σの双方との結合を阻害する。別の実施形態では、抗体またはその抗原結合フラグメントはLAR、RPTP-δおよびRPTP-σの3つ全てと特異的に結合する。
本明細書に記載の抗体は、免疫疾患または免疫障害、心血管疾患または心血管障害、代謝性疾病または代謝性障害、あるいは増殖性疾患または増殖性障害に関連する症状を治療または予防する、阻害する、その進行を遅延させる、または軽減するのに有用であり得る。免疫疾患としては、炎症性疾患または炎症性障害および自己免疫疾患または自己免疫障害が挙げられる。炎症または炎症性応答は損傷に対する宿主の正常な防御的応答であるが、炎症は望ましくない傷害も招く。例えば、アテローム性動脈硬化症は少なくともある程度は動脈損傷と一連の炎症カスケードに対する病理学的応答である。本明細書に記載の抗体またはその抗原結合フラグメントで治療可能な免疫障害の例としては、限定されるものではないが、多発性硬化症、関節リウマチ、全身性紅斑性狼瘡(SLE)、移植片対宿主病(GVHD)、敗血症、糖尿病、乾癬、アテローム性動脈硬化症、シェーグレン症候群、進行性全身性硬化症、硬皮症、急性冠動脈症候群、虚血性再潅流、クローン病、子宮内膜症、糸球体腎炎、重症筋無力症、特発性肺繊維症、喘息、急性呼吸窮迫症候群(ARDS)、脈管炎、または炎症性自己免疫性筋炎および他の炎症性筋肉変性疾患（例えば、皮膚筋炎、多発性筋炎、若年性皮膚筋炎、封入体筋炎）が挙げられる。治療可能な心血管疾患または心血管障害は、免疫疾患／障害とも考えられる疾患および障害を含み、例えば、アテローム性動脈硬化症、心内膜炎、高血圧症または末梢虚血性疾患が挙げられる。代謝性疾病または代謝性障害としては、糖尿病、肥満およびミトコンドリア機能の異常または変化を伴う疾患が挙げられる。
本明細書に記載のRPTPのいずれか1以上はまた、抗体含有サンプル、例えば、精製抗体、抗血清または細胞培養上清のサンプル、または1以上のRPTPに特異的な1以上の抗体を含み得る他のいずれかの生物学的サンプルをスクリーニングする方法でも使用可能である。1以上のRPTPはまた、生物学的サンプルから、1以上のRPTPと特異的に結合する抗体を産生している1以上のB細胞を同定および選択する方法（例えば、プラーク形成アッセイなど）でも使用可能である。これらのB細胞は次いで、当技術分野で知られ、本明細書に記載されている組換え分子生物学的技術によりクローニングし、かつ／または修飾することができる特異的抗体コードポリヌクレオチドの供給源として使用することができる。
本明細書において抗体は、検出可能なレベルで、好ましくは親和性定数Kaが約104M-1以上、または約105M-1以上、約106M-1以上、約107M-1以上、または108M-1以上で、1以上のRPTPと反応する場合に、「免疫特異的」またはLAR、RPTP-δおよびRPTP-σの1以上と「特異的」または「特異的に結合する」と言われる。抗体のその同族抗原に対する親和性は一般に解離定数KDとして表すこともでき、抗RPTP抗体は、KDが10-4M以下、約10-5M以下、約10-6M以下、10-7M未満、または10-8M未満で結合する場合に、1以上のRPTPと特異的に結合する。
結合相手または抗体の親和性は、例えばScatchardら(Ann. N.Y. Acad. Sci. USA 51:660 (1949))に記載のものおよび表面プラズモン共鳴(SPR; BIAcore(商標), Biosensor, Piscataway, NJ)などの従来の技術を用いて容易に測定することができる。表面プラズモン共鳴では、標的分子は固相に固定化されており、フローセルを流れる移動相中のリガンドに曝される。固定化された標的にリガンドの結合が起これば、その場所の屈折率が変化してSPR角の変化が起こり、これを、反射光の強度変化を検出することにより、リアルタイムでモニタリングすることができる。表面プラズモン共鳴シグナルの変化率を分析し、その結合反応の会合相および解離相の見掛けの速度定数を得ることができる。これらの値の比率から見掛けの平衡定数（親和性）が得られる（例えば、Wolffら, Cancer Res. 53:2560-2565 (1993)参照）。
抗体と本明細書に記載のRPTPとの結合特性は一般に、例えば、酵素結合免疫吸着検定法(ELISA)、免疫沈降、免疫ブロット法、向流免疫電気泳動、ラジオイムノアッセイ、ドットブロット法、阻害または競合アッセイをはじめ、当業者が容易に実施できる免疫検出法を用い、測定および評価することができる（例えば、米国特許第4,376,110号および同第4,486,530号; Harlowら, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1988)参照）。イムノアッセイ法としては、対照と、抗体がLAR、RPTP-δおよび／またはRPTP-σと特異的に結合するかどうか、また、他のタンパク質チロシンホスファターゼ、特に受容体様タンパク質チロシンホスファターゼを認識しないか、またはそれらと交差反応しないかどうかを判定する方法を含み得る。さらに、特定の担体ポリペプチドとコンジュゲートしたRPTPによる宿主の免疫化に応答して産生される抗RPTP（すなわち、抗LAR、抗RPTP-δおよび／または抗RPTP-σ）抗体の検出のために行われるイムノアッセイに、免疫担体ポリペプチドと特異的に結合する抗体の検出を低減または排除するために、免疫化に用いるものとは異なる担体ポリペプチドとコンジュゲートされているRPTPの使用を組み込んでもよい。あるいは、担体分子とコンジュゲートされていない本明細書に記載のRPTPを、免疫特異的抗体を検出するためのイムノアッセイで使用することもできる。
ある特定の実施形態では、本明細書に記載の抗体はLAR、RPTP-δおよびRPTP-σの1つだけに特異的である。すなわち、例えば、LARと特異的に結合する抗体は、RPTP-δまたはRPTP-σのいずれとも特異的に結合せず；RPTP-δと特異的に結合する抗体は、LARまたはRPTP-σとは特異的に結合せず；また、RPTP-σと特異的に結合する抗体は、LARまたはRPTP-δとは特異的に結合しない。本明細書に記載のRPTPの1つだけと特異的に結合するこのような抗体は、別のRPTPに存在するアミノ酸配列と同一または類似でないRPTPのアミノ酸配列を含むエピトープ（抗原決定基）と結合し、あるいはこのような抗体は、その抗体が特異的に結合するRPTPにだけ存在するコンフォメーショナルエピトープと特異的に結合する。特定のRPTPに対する抗体の特異性は、当技術分野で利用可能で、本明細書に記載されている種々のイムノアッセイのいずれかを用いて容易に決定することができる。
他の実施形態では、抗体またはその抗原結合フラグメントLAR、RPTP-δおよびRPTP-σの少なくとも2つ（すなわち、LARとRPTP-δ、LARとRPTP-σ、またはRPTP-δとRPTP-σ）と特異的に結合し、他の実施形態では、抗体またはその抗原結合フラグメントは、本明細書に記載の3つ全てのRPTPと特異的に結合する。LAR、RPTP-δおよびRPTP-σと特異的に結合する抗体は、各RPTPに共通に存在しているエピトープ（抗原決定基）を認識する。LAR、RPTP-δおよびRPTP-σの少なくとも2つに共通の抗原決定基またはエピトープは、少なくとも2つの各RPTPに同一または類似のアミノ酸配列を含んでもよく、あるいはRPTPの少なくとも2つに共通のコンフォメーショナルエピトープを含んでもよく、あるいは類似の化学構造、例えば、エピトープに含まれるアミノ酸の表面電荷の分布から生じる化学構造を含んでもよい。例として、配列番号54で示されるアミノ酸配列(YSAPANLYV)はLAR、RPTP-δおよびRPTP-σのそれぞれに共通である。従って、各RPTPの第二の免疫グロブリン様ドメインに存在するこのアミノ酸配列を含んでなるエピトープと結合する抗体は、LAR、RPTP-δおよびRPTP-σのそれぞれと特異的に結合する。
抗体は一般に当業者に公知の様々な技術のいずれによって作製してもよい。例えば、Harlowら, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1988); Peterson, ILAR J. 46:314-19 (2005)参照。本明細書に記載のRPTPのいずれか1つ、またはそのペプチドもしくはフラグメント、またはこれらRPTPの1以上を発現する細胞は、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体のいずれかを産生するための動物の免疫化のための免疫原として使用可能である。免疫原として使用可能な各RPTPのフラグメントは、細胞外領域（3つの免疫グロブリン(Ig)ドメインとフィブロネクチンドメインを含む）と細胞内領域（2つのホスファターゼ触媒ドメインD1およびD2を含む）、またはそのより小さいフラグメントなど、より大きなフラグメントを含み得る。
免疫原は、少なくとも1つのIgドメインもしくはその一部、または少なくとも1つのフィブロネクチンドメインもしくはその一部など、細胞外領域の一部を含み得る。RPTPペプチドおよびポリペプチド免疫原は、免疫細胞の免疫応答性を変化させる（統計学的に有意にまたは生物学的に有意に増強または低減する、好ましくは低減する）ことができる抗体またはその抗原結合フラグメントを作製および／または同定するために使用可能である。ペプチド免疫原の例としては、本明細書に提供されているLAR、またはRPTP-δまたはRPTP-σの（またはその変異体の）6、7、8、9、10、11、12、20〜25、21〜50、26〜30、31〜40、41〜50、51〜60、61〜70、または71〜75の連続するアミノ酸を含み得る。例えば、RPTP-δの配列番号53(SGALQIEQSEESDQGK)；配列番号54(YSAPANLYV)；配列番号55(WMLGAEDLTPEDDMPIGR)；および配列番号56(NVLELNDVR)などのIgドメインに由来するペプチドを免疫原として用いてもよい。RPTP-δのフィブロネクチンIIIリピートに由来するペプチドの例としては、配列番号57(GPPSEPVLTQTSEQAPSSAPR)；配列番号58(SPQGLGASTAEISAR)；配列番号59(YTAVDGEDDKPHEILGIPSDTTK)；配列番号60(VGFGEEMVK)；および配列番号61(GPGPYSPSVQFR)が挙げられる。RPTP-σのフィブロネクチンIIIリピートに由来するペプチドの例としては、配列番号45(SIGQGPPSESVVTR)；配列番号46(HNVDDSLLTTVGSLLEDETYVR)；配列番号47(VLAFTSVGDGPLSDPIQVK)；配列番号48(TEVGPGPESSPVVVR)；配列番号49(WEPPAGTAEDQVLGYR)；および配列番号50(TSVLLSWEFPDNYNSPTPYK)が挙げられる。A41Lまたは130Lなどのポックスウイルスポリペプチドはおそらくは、LAR、RPTP-δおよび／またはRPTP-σなどの細胞表面抗原の細胞外部分と結合することにより免疫細胞の免疫応答を変化させるので、RPTPの細胞内部分に存在する抗原決定基（エピトープ）と特異的に結合する抗体は、これらのウイルスポリペプチドとRPTPとの結合を競合的に阻害する（または結合を損なう）とは考えられない。RPTPの細胞内部分と特異的に結合する抗体は、免疫細胞の免疫応答性を変化させ、A41Lまたは130Lと少なくとも1つのRPTPの結合を競合的に阻害する抗体（または他の薬剤）と組み合わせて使用することができる。よって、細胞内ドメイン、特に触媒ドメイン、D1またはD2のいずれかに由来するアミノ酸配列を含むペプチドおよびフラグメントも免疫原として使用可能である（例えば、RPTP-σの配列番号51(TEVGPGPESSPVVVR)）。
免疫原として有用なRPTPペプチドおよびフラグメントは、A41Lまたは130Lが結合するRPTPの部分を含む。A41Lまたは130Lと相互作用するRPTPドメインは、それにより1以上の細胞外ドメインが欠失されるRPTP細胞外ドメインポリペプチドを構築することで同定することができる。例として、例えば融合ポリペプチドは、あるRPTPのフィブロネクチンドメインを排除してもよく、従って、1つ、2つまたは3つのRPTP Ig様ドメインだけを含んでもよいこのようなRPTP Ig様ドメインポリペプチドは免疫グロブリンFcポリペプチドとまたはそのそのムテインと融合させてもよく、Fcポリペプチドと融合された、RPTPの第一の免疫グロブリン様ドメイン、第一および第二の免疫グロブリン様ドメイン、第一および第三の免疫グロブリン様ドメイン、第二または第三の免疫グロブリン様ドメイン、あるいは3つ全ての免疫グロブリン様ドメインを含む。このようなRPTP Ig様ドメインポリペプチドはまた、ポックスウイルスポリペプチドがRPTP免疫グロブリン様ドメインに結合する、または細胞リガンドに結合する程度を特定および決定するのにも有用であり得る。
LAR、RPTP-δおよびRPTP-σのいずれか1つのポックスウイルスポリペプチドまたはその結合部位の一部のアミノ酸配列を決定するための1つの方法として、ペプチドマッピング技術が挙げられる。例えば、LAR、RPTP-δまたはRPTP-σペプチドは種々のプロテアーゼのいずれか1以上を用いたタンパク質分解消化により無作為に作製し、それらのペプチドを分離／または単離し（例えば、ゲル電気泳動、カラムクロマトグラフィーによる）、その後、A41Lまたは130Lなどのポックスウイルスポリペプチドのどのペプチドが結合するかを決定した後、それらのペプチドの配列解析を行えばよい。これらのRPTPペプチドはまた、本明細書に記載され、また、当技術分野で実践されている組換え法を用いて作製することができる。組換え法により無作為に作製されたペプチドはまた、本明細書、また当技術分野に記載されているペプチドコンビナトリアルライブラリーまたはファージライブラリーを作製するために使用可能である。あるいは、ポックスウイルスポリペプチドと相互作用するLAR、RPTP-σおよび／またはRPTP-δの一部のアミノ酸配列を、ホスファターゼ、またはホスファターゼの一部、例えば細胞外部分またはIgドメインのコンピューターモデリングおよび／またはＸ線結晶学（ホスファターゼ単独またはホスファターゼ-ウイルスポリペプチド複合体の結晶の作製および解析を含み得る）により決定することもできる。
LAR、またはRPTP-δまたはRPTP-σの免疫原ペプチドはまた、親水性プロットを求めるためのRPTPのアミノ酸配列のコンピューター解析により決定することもできる。抗体にアクセス可能なRPTPの部分は、水性環境に接触しているタンパク質のおそらくほとんどの部分であり、親水性である。親水性領域は当業者に利用可能で、タンパク質中の各アミノ酸に「親水性指数」を割り付けるコンピュータープログラムを用いて決定し、その後プロフィールをプロットすることができる。
動物に注射するための免疫原、特にポリペプチドフラグメントまたはペプチドの作製は、RPTPフラグメントまたはペプチド（またはその変異体）と、例えばキーホールリンペットヘモシアニン(KLH)またはウシ血清アルブミン(BSA)などの担体タンパク質といった別の免疫原タンパク質との共有結合を含み得る。ポリペプチドまたはペプチド免疫原は、N末端またはC末端のいずれかにコンジュゲーション手順を容易にする1以上の付加的アミノ酸を含み得る（例えば、ペプチドとKLHのコンジュゲーションを容易にするためのシステインの付加）。ポリペプチドまたはペプチド内の他のアミノ酸残基は特定のアミノ酸位置において担体ポリペプチドとのコンジュゲーションを妨げるために置換してもよいし（例えば、ポリペプチド／ペプチドの内部位置におけるシステイン残基のセリン残基への置換、あるいは可溶性を助けるため、または免疫原性を高めるために置換してもよい。
本明細書で意図され、記載される抗体は、例えば、IgG、IgE、IgM、IgDまたはIgAなどの免疫グロブリンクラスのいずれに属してもよい。抗体は、例えば、家禽類（例えば、ニワトリ）および限定されるものではないが、マウス、ラット、ハムスター、ウサギまたは他の齧歯類、ウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ラクダ、ヒトまたは他の霊長類といった動物などの動物から得られるか、動物から誘導され得る。抗体はインターナライジング型抗体であってもよい。このような技術の1つでは、本明細書に記載のRPTPまたはそのフラグメントを抗原として用いて動物を免疫化し、ポリクローナル抗血清を作製する。好適な動物としては、例えば、ウサギ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、ウシが挙げられ、マウス、ラットおよびハムスターなどのより小さな哺乳類種、または他の種も含み得る。
LAR、RPTP-δおよび／またはRPTP-σと特異的に結合するポリクローナル抗体は、本明細書に記載され、当業者に実践されている方法を用いて作製することができる（例えば、Greenら, “Production of Polyclonal Antisera,” in Immunochemical Protocols (Manson編), 1-5頁 (Humana Press 1992); Harlowら, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1988); Williamsら, “Expression of foreign Proteins in E. coli using plasmid vectors and purification of specific polyclonal antibodies,” in DNA Cloning 2: Expression Systems, 第2版, Gloverら(編) 15頁 (Oxford University Press 1995)参照）。ポリクローナル抗体は一般に、ラット、マウス、ウサギ、ヤギ、ウシまたはヒツジなどの動物で作製されるが、抗RPTP抗体はヒト以外の霊長類からも得られる。ヒヒにおいて診断上および治療上有用な抗体を作製するための一般技術は例えば国際特許出願公開WO91/11465(1991)およびLosmanら, Int. J. Cancer 46:310, 1990に見出せる。
さらに、免疫原として用いるLAR、RPTP-δおよび／もしくはRPTP-σポリペプチド、そのフラグメントもしくはペプチド、またはこれらRPTPの1以上を発現する細胞をアジュバント中に乳化させてもよい。例えば、Harlowら, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1988)参照。非ヒト動物の免疫化に一般に用いられるアジュバントとしては、限定されるものではないが、フロイントの完全アジュバント、フロイントの不完全アジュバント、モンタニドISA、Ribiアジュバント系(RAS)(Corixa Corporation, Seattle, WA)およびニトロセルロース吸着抗原が挙げられる。免疫原は、腹腔内、静脈内、筋肉内、皮内、眼内、または皮下をはじめとするいずれかの数の種々の経路を介して動物に注射することができる。一般に、1回目の注射の後、動物には、とりわけ抗原、アジュバント（存在すれば）および／または特定の動物種によって異なり得る好ましい計画に従って1回以上の追加免疫を行う。免疫応答は、定期的に動物から採血し、採取した血液から血清を分離し、この血清をELISAまたはオクタロニー拡散アッセイなどの特異的な抗体力価を測定するためのイムノアッセイで分析することによりモニタリングすることができる。十分な抗体力価が確立されたところで、動物から定期的に採血しポリクローナル抗血清を蓄積する。次に、このような血清から、例えば好適な固相支持体に固定化したプロテインAまたはプロテインGを用いたアフィニティークロマトグラフィーにより、LAR、RPTP-δおよび／またはRPTP-σと特異的に結合するポリクローナル抗体を精製することができる（例えば、Coligan., 前掲, 2.7.1-2.7.12頁; 2.9.1-2.9.3頁; Bainesら, Purification of Immunoglobulin G (IgG), in Methods in Molecular Biology, 10:9-104 (The Humana Press, Inc. (1992)参照）。あるいは、RPTPまたは特定の免疫動物種のIg定常領域に特異的な抗体が好適な固相支持体に固定化されているアフィニティークロマトグラフィーを行ってもよい。
LAR、RPTP-δおよび／またはRPTP-σと特異的に結合するモノクローナル抗体、および所望の結合特異性を有するモノクローナル抗体を産生する不死化真核細胞系統例であるハイブリドーマもまた、例えば、KohlerおよびMilsteinの技術(Nature, 256:495-97 (1976), Eur. J. Immunol. 6:511-19 (1975))およびその対する改良法（例えば、Coliganら(編), Current Protocols in Immunology, 1:2.5.1-2.6.7 (John Wiley & Sons 1991);米国特許第4,902,614号、同第4,543,439号および同第4,411,993号; Monoclonal Antibodies, Hybridomas: A New Dimension in Biological Analyses, Plenum Press, Kennettら(編)(1980);およびAntibodies: A Laboratory Manual, Harlow and Lane(編), Cold Spring Harbor Laboratory Press (1988)参照;また、例えば、Brandら, Planta Med. 70:986-92 (2004); Pasqualiniら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101:257-59 (2004)も参照）を用いて作製することができる。動物、例えばラット、ハムスター、またはより一般にはマウスは、上記のように作製したRPTP免疫原で免疫化する。特異的抗体産生の存在は最初の注射後（注射はポリクローナル抗体の作製に関して上記したいくつかの経路のいずれか1つにより投与すればよい）および／または追加免疫注射後に、血清サンプルを採取し、当技術分野で公知であり、本明細書に記載されているいくつかの免疫検出法のいずれか1つを用いて、LAR、RPTP-δおよび／またはRPTP-σと結合する抗体の存在を検出することによりモニタリングすることができる。
LAR、RPTP-δおよび／またはRPTP-σと結合する抗体を産生する動物から、脾臓またはリンパ節由来の最も一般的な細胞であるリンパ細胞を取り出し、抗体形成細胞であるリンパ細胞であるBリンパ球を得る。リンパ細胞、一般には脾臓細胞は、薬剤感作骨髄腫（例えば、形質細胞腫）融合相手、好ましくは免疫化した動物と同系であり、場合により他の望ましい特性（例えば、内因性のIg遺伝子産物、例えば、P3X63-Ag8.653 (ATCC No.CRL1580); NS0, SP20)を発現することができない）も有するものとの融合により不死化することができる。リンパ細胞および骨髄腫細胞は、ポリエチレングリコールまたは非イオン性界面活性剤などの膜融合誘導剤と数分間合わせた後、ハイブリドーマ細胞の増殖は抑制するが、非融合骨髄腫細胞の増殖は抑制しない選択培地上に低密度でプレーティングすればよい。好ましい選択培地はHAT（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン）である。十分な時間、通常は1〜2週間の後、細胞のコロニーが観察される。これらの細胞のより産生される抗体はLAR、RPTP-δおよび／またはRPTP-σに対する結合活性に関して試験することができる。これらのハイブリドーマをクローニングし（例えば、制限希釈クローニングまたは軟寒天プラーク単離による）、その抗原に特異的な抗体を産生する陽性クローンを選択し、培養する。LAR、RPTP-δおよび／またはRPTP-σに対する高親和性と特異性を有するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマが好ましい。
モノクローナル抗体はハイブリドーマ培養物の上清から単離することができる。ネズミモノクローナル抗体の産生のための別法は、ハイブリドーマ細胞を同系マウス、例えば、処置された（例えば、プリスタンでプライミングされた）マウスの腹腔内に注射し、モノクローナル抗体を含む腹水の形成を促進する。その後採取された腹水（通常1〜3週間内）から夾雑物を、クロマトグラフィー（例えば、サイズ排除、イオン交換）、ゲル濾過、沈殿、抽出などの常法により除去することができる（例えば、Coligan, 前掲, 2.7.1-2.7.12頁; 2.9.1-2.9.3頁; Bainesら, Purification of Immunogloburin G (IgG), in Methods in Molecular Biology, 10:9-104 (The Humana Press, Inc. (1992)参照）。例えば、抗体は、モノクローナル抗体の特定の特性（例えば、重鎖または軽鎖イソ型、結合特異性など）に基づいて選択された適当なリガンドを用いたアフィニティークロマトグラフィーにより精製することができる。固相支持体に固定化される好適なリガンドの例としては、プロテインA、プロテインG、抗定常領域（軽鎖または重鎖）抗体、抗イディオタイプ抗体、LAR、RPTP-δおよび／またはRPTP-σまたはそのフラグメントが挙げられる。
LAR、RPTP-δおよび／またはRPTP-σと特異的に結合する抗体はヒトモノクローナル抗体であり得る。ヒトモノクローナル抗体は、当業者に周知のいくつかの技術のいずれにより作製してもよい。このような方法としては、限定されるものではないが、ヒト末梢血細胞（例えば、Bリンパ球を含む）のエプスタイン・バーウイルス(EBV)形質転換、ヒトB細胞のin vitro免疫化、ヒト免疫グロブリン遺伝子が挿入された免疫化トランスジェニックマウスの脾臓細胞の融合、ヒト免疫グロブリンV領域ファージライブラリーからの単離、または当技術分野で公知であり、本明細書の開示に基づく他の手順が挙げられる。
例えば、ヒトモノクローナル抗体は抗原刺激に応答して特異的ヒト抗体を産生するよう操作されたトランスジェニックマウスから得ることができる。トランスジェニックマウスからヒト抗体を得る方法は、例えば、Greenら, Nature Genet. 7:13 (1994); Lonbergら, Nature 368:856 (1994); Taylorら, Int. Immun. 6:579 (1994); 米国特許第5,877,397号; Bruggemannら, Curr. Opin. Biotechnol. 8:455-58 (1997); Jakobovitsら, Ann. N. Y. Acad. Sci. 764:525-35 (1995)に記載されている。この技術では、ヒト重鎖および軽鎖遺伝子座のエレメントは、内因性ネズミ重鎖および軽鎖遺伝子座の標的破壊を含むマウス由来胚幹細胞系統株に遺伝子操作することにより人工的に導入される（また、Bruggemannら, Curr. Opin. Biotechnol. 8:455-58 (1997)も参照）。例えば、ヒト免疫グロブリン導入遺伝子はミニ遺伝子構築物であっても、またはマウスリンパ組織においてB細胞特異的DNA再構成と過剰突然変異を受ける、酵母人工染色体上のトランス遺伝子座であってもよい。ヒトモノクローナル抗体は、後にその抗原に特異的なヒト抗体を産生し得るトランスジェニックマウスを免疫化することにより得ることができる。免疫化トランスジェニックマウスのリンパ細胞を用い、本明細書に記載の方法に従い、ヒト抗体分泌ハイブリドーマを産生することができる。ヒト抗体を含むポリクローナル血清はまた、免疫動物の血液から得ることもできる。
ヒト抗原特異的モノクローナル抗体を生成する別法としては、EBVの形質転換によるヒト末梢血細胞の不死化を含む。例えば、米国特許第4,464,456号参照。LAR、RPTP-δおよび／またはRPTP-σと特異的に結合するモノクローナル抗体を産生するこのようなB細胞系統（リンパ芽細胞細胞系統）は、本明細書で提供される免疫検出法、例えば、ELISAにより同定され、その後、標準的なクローニング技術により単離することができる。抗LAR、RPTP-δおよび／またはRPTP-σ抗体を産生するリンパ芽細胞系統の安定性は、当技術分野で公知の方法に従い、形質転換細胞系統とネズミ骨髄腫を融合してマウス-ヒトハイブリッド細胞系統を作製することにより改良することができる（例えば、Glaskyら, Hybridoma 8:377-89 (1989)参照）。ヒトモノクローナル抗体を作製するさらなる別法としては、ヒト脾臓B細胞を抗原で刺激した後、刺激されたB細胞をヘテロハイブリッド融合相手と融合させることを含むin vitro免疫化がある。例えば、Boernerら, J. Immunol. 147:86-95 (1991)参照。
ある特定の実施形態では、抗RPTP抗体を産生するB細胞が選択され、そのB細胞から、当技術分野で公知の（WO92/02551;米国特許第5,627,052号; Babcookら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:7843-48 (1996))、また本明細書に記載されている分子生物学的技術に従い、軽鎖および重鎖可変領域がクローニングされる。免疫動物由来のB細胞を、LAR、RPTP-δおよび／またはRPTP-σと特異的に結合する抗体を産生する細胞を選択することにより、脾臓、リンパ節、または末梢血サンプルから単離する。B細胞はまたヒトから、例えば末梢血サンプルから単離してもよい。所望の特異性を有する抗体を産生する1種類のB細胞を検出する方法は当技術分野で周知であり、例えば、プラーク形成、蛍光活性化細胞選別、その後の特異的抗体の検出による。特異的抗体を産生するB細胞の選択方法は、例えば、LAR、RPTP-δおよび／またはRPTP-σまたはそのフラグメントを含む軟寒天においてB細胞の単一の細胞懸濁液を作製することを含む。B細胞により産生された特異的抗が抗原と結合すると、免疫沈降物として目に見える複合体が形成する。特異的抗体を産生するB細胞を選択した後、当技術分野で公知であり、また、本明細書に記載されている方法に従い、DNAまたはmRNAを単離および増幅することによりその特異的抗体遺伝子をクローンニングする。
ヒト化抗体をはじめ、LAR、RPTP-δおよび／またはRPTP-σに特異的なキメラ抗体も作成可能である。キメラ抗体は第一の哺乳類種に由来する少なくとも1つの定常領域ドメインと第二の異なる哺乳類種に由来する少なくとも1つの可変領域ドメインを有する。例えば、Morrisonら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-55 (1984)参照。一実施形態では、キメラ抗体は、ネズミ、ラットまたはハムスターモノクローナル抗体に由来する可変領域などの、非ヒトモノクローナル抗体に由来する少なくとも1つの可変領域ドメインをコードしているポリヌクレオチド配列を、少なくとも1つのヒト定常領域をコードしている核酸配列を含むベクターにクローニングすることにより構築することができる（例えば、Shinら, Methods Enzymol. 178:459-76 (1989); Wallsら, Nucleic Acids Res. 21:2921-29 (1993)参照）。例としては、ネズミモノクローナル抗体の軽鎖可変領域をコードしているポリヌクレオチド配列を、ヒトκ軽鎖定常領域配列をコードしている核酸配列を含むベクターへ挿入することができる。独立したベクターにおいて、モノクローナル抗体の重鎖可変領域をコードしているポリヌクレオチド配列を、ヒトIgG1定常領域をコードしている配列と同じフレーム内にクローンニングすることができる。選択される特定のヒト定常領域は、特定の抗体に対して望まれるエフェクター機能（例えば、補体結合、特定のFc受容体への結合など）に依存し得る。キメラ抗体を作製するための当技術分野で公知の別法は相同組換えである（例えば、米国特許第5,482,856号）。好ましくは、これらのベクターをキメラ抗体の安定発現のために真核細胞にトランスフェクトする。
非ヒト／ヒトキメラ抗体はさらに「ヒト化」抗体を作出するために遺伝子操作することができる。このようなヒト化抗体は非ヒト哺乳類種の免疫グロブリンに由来する複数のCDR、少なくとも1つのヒト可変フレームワーク領域および少なくとも1つのヒト免疫グロブリン定常領域を含み得る。ある特定の実施形態では、ヒト化により、例えば、LAR、RPTP-δおよび／またはRPTP-σ結合可変領域が得られた非ヒトモノクローナル抗体か、上記のようにこのようなV領域と少なくとも1つのヒトC領域を有するキメラ抗体のいずれかと比較した場合に、LAR、RPTP-δおよび／またはRPTP-σに対する結合親和性が低い抗体が得られる。従って、ヒト化抗体を設計するための有用な方法論としては、例えば、限定されるものではないが例を示せば、キメラ抗体の非ヒトフレームワーク領域にほとんど相同なヒト可変フレームワーク領域の同定が挙げられる。特定の理論に縛られるわけではないが、このような方法論は、ヒト化抗体がLAR、RPTP-δおよび／またはRPTP-σに対して特異的な結合親和性を保持する可能性を高め、いくつかの好ましい実施形態では、LAR、RPTP-δおよび／またはRPTP-σに対して実質的に同じであってよく、他の特定の実施形態では、LAR、RPTP-δおよび／またはRPTP-σに対して高い親和性であってよい（例えば、Jonesら, Nature 321:522-25 (1986); Riechmannら, Nature 332:323-27 (1988)参照）。
従って、ヒト化抗体の設計には、例えば、コンピューターモデリングとその後のCDRループおよび決定基と既知のヒトCDRループ構造および決定基との比較により、非ヒト可変領域のCDRループコンフォメーションおよび構造決定基を決定することを含み得る（例えば、Padlanら, FASEB 9:133-39 (1995); Chothiaら, Nature, 342:377-83 (1989)参照）。また、コンピューターモデリングを用いて、配列相同性により選択されたヒト構造鋳型を非ヒト可変領域と比較することもできる（例えば、Bajorathら, Ther. Immunol. 2:95-103 (1995); EP-0578515-A3参照）。非ヒトCDRのヒト化が結合親和性の低下をもたらすならば、コンピューターモデリングは、部位指定突然変異誘発、または親和性を部分的に、もしくは完全に、もしくは最適には至らずに(supra-optimally)回復させる（すなわち、非ヒト化抗体の場合よりも高いレベルに増加させる）ための他の突然変異誘発技術によって変更することができる特定のアミノ酸残基を同定する助けとなり得る。当業者ならばこれらの技術に通じ、このような設計方法論に対する多くのバリエーションおよび改良法が容易に分かるであろう。
ヒト化抗体を作製するためのこのような方法の1つは、ベニア化(veneering)と呼ばれている。ベニア化フレームワーク(FR)残基とは、天然FRポリペプチドフォールディング構造の実質的全てを保持する抗原結合部位を含む異種分子を得るための、例えば齧歯類重鎖または軽鎖V領域由来のFR残基とヒトFR残基との選択的置換を指す。ベニア化技術は、抗原結合部位のリガンド結合特性が、主として、抗原結合表面内の重鎖および軽鎖CDRセットの構造および相対的傾向により決定されるという理解に基づいている（例えば、Daviesら, Ann. Rev. Biochem. 59:439-73, (1990)参照）。よって、CDRの構造、それらの互いの相互作用およびそれらの残りのV領域ドメインとの相互作用が慎重に維持されれば、ヒト化抗体において抗原結合特異性を保存することができる。ベニア化技術を用いれば、免疫系の遭遇が容易な外部（例えば、溶媒アクセス可能な）FR残基をヒト残基で選択的に置換し、免疫原性の弱い、または実質的に非免疫原性であるベニア化表面を含むハイブリッド分子が得られる。
このベニア化のプロセスで、Sequenses of Proteins of Immunological Interest, 第4版(U.S. Dept. of Health and Human Services, U.S. Government Printing Office, 1991)においてKabatらが編集したヒト抗体可変ドメインの利用可能なデータが使用でき、Kabatデータベースおよび他のアクセス可能な米国や外国のデータベース（核酸およびタンパク質の双方）に更新されている。
V領域アミノ酸の溶媒アクセス可能性は、ヒトおよびネズミ抗体フラグメントの既知の三次元構造から推定することができる。まず、着目する抗体分子の可変ドメインのFRアミノ酸配列を、上記に示されるデータベースおよび刊行物から得られるヒト可変ドメインの対応するFR配列と比較する。次に、最も相同性の高いヒトV領域を対応するネズミアミノ酸と残基ごとに比較する。ヒト対応物と異なるネズミFRの残基を、当技術分野で周知の組換え技術を用い、ヒト部分に存在する残基で置換する。残基の切り替えは、少なくとも部分的に露出している（溶媒アクセス可能な）部分でのみ行われ、プロリン、グリシンおよび荷電アミノ酸など、V領域ドメインの三次元構造に対して有意な作用を持ち得るアミノ酸残基の置換に注意を払う。
このように、得られた「ベニア化」抗原結合部位は、齧歯類CDR残基、それらのCDRに実質的に隣接する残基、埋没またはほとんど埋没していると確認されている残基（溶媒アクセス不能）、重鎖ドメインと軽鎖ドメインの間の非共有結合的（例えば、静電気的および疎水的）接触に関与すると考えられる残基、およびCDRループの「正準」三次元構造に影響を及ぼすと考えられるFRの保存されている構造領域に由来する残基を保持するように設計される（例えば、Chothiaら, Nature, 342:377-383 (1989)参照）。次に、これらの設計基準を用い、齧歯類抗体分子の抗原特異性を示す組換えヒト抗体の発現を目的に哺乳類細胞のトランスフェクトに使用可能なヒト様のFRへと抗原結合部位の重鎖および軽鎖双方のCDRを併せ持つ組換えヌクレオチド配列を作製する。
特定の使用では、抗体の抗原結合フラグメントが望ましい。抗体フラグメントF(ab')2、Fab、Fab'、FvおよびFdは、例えば、従来の方法に従った、抗体全体のタンパク質加水分解、例えばペプシンまたはパパイン消化により得ることができる。例としては、抗体フラグメントは、抗体をペプシンで酵素的に切断してF(ab')2と呼ばれるフラグメントを得ることにより作製することができる。このフラグメントを、チオール還元剤を用いてさらに切断し、Fab'一価フラグメントを作製することもできる。所望により、この切断反応は、ジスルフィド結合の切断から生じるスルフヒドリル基に対する遮断基を用いて行うこともできる。別法として、パパインを用いた抗体の酵素的切断により、2つの一価FabフラグメントとFcフラグメントが得られる（例えば、米国特許第4,331,647号; Nisonoffら, Arch. Biochem. Biophys. 89:230 (1960); Porter, Biochem. J. 73:119 (1959); Edelmanら, in Methods in Enzymology 1:422 (Academic Press 1967); Weir, Handbook of Experimental Immunology, ackwell Scientific, Boston (1986)参照）。これらの抗原結合フラグメントはFcフラグメントから、例えば、固定化プロテインA、プロテインG、Fc特異的抗体、または固定化RPTPポリペプチドまたはそのフラグメントを用いたアフィニティークロマトグラフィーにより分離することができる。一価軽鎖-重鎖フラグメント(Fd)を形成するための重鎖の分離、フラグメントのさらなる切断、または他の酵素的、化学的もしくは遺伝的技術といった抗体切断のための他の方法も、それらのフラグメントが完全抗体により認識されるRPTPと結合する限り、使用可能である。
抗体フラグメントはまた、特異的抗原に結合して複合体を形成するという点で抗体のように働く合成または遺伝子操作タンパク質であってもよい。例えば、抗体フラグメントとしては、軽鎖可変領域からなる単離されたフラグメント、重鎖および軽鎖可変領域からなるFvフラグメント、軽鎖および重鎖可変領域がペプチドリンカーにより接続されている組換え単鎖ポリペプチド分子(scFvタンパク質)、ならびに超可変領域を模倣するアミノ酸残基からなる最小認識単位が挙げられる。この抗体は少なくとも1つの可変領域ドメインを含む。可変領域ドメインはいずれの大きさであってもよいし、いずれのアミノ酸組成でもよく、一般に抗原の結合を担う少なくとも1つの超可変アミノ酸配列を含み、1以上のフレームワーク配列に隣接しているか、または1以上のフレームワーク配列を同じフレームにある。一般に、可変(V)領域ドメインは免疫グロブリン重鎖(VH)および／または軽鎖(VL)可変ドメインのいずれの好適な並びでもよい。よって、例えば、V領域ドメインは、許容される親和性で独立して抗原と結合し得る単量体のVHまたはVLドメインであってもよい。あるいは、V領域ドメインは二量体で、VH-VH、VH-VL、またはVL-VL二量体を含んでもよい。好ましくは、V領域二量体は非共有結合的に会合された少なくとも1つのVH鎖と少なくとも1つのVL鎖を含む（以下、Fvと呼ぶ）。所望により、これらの鎖は直接、または例えば2つの可変ドメイン間のジスルフィド結合を介して、または例えばペプチドリンカーなどのリンカーを介して共有結合し、単鎖Fv(scFv)を形成してもよい。
最小認識単位は1つの相補性決定領域(CDR)を含む抗体フラグメントである。このようなCDRペプチドは着目する抗体のCDRをコードしているポリヌクレオチドを構築することにより得られる。このポリヌクレオチドは例えば、当業者に実践されている方法に従い、抗体産生細胞から単離された、または抗体産生細胞内に含まれるmRNAを鋳型として用いて可変領域を合成するためにポリメラーゼ連鎖反応を使用することで作製される（例えば、Larrickら, Methods: A Companion to Methods in Enzymology 2:106, (1991); Courtenay-Luck, “Genetic Manipulation of Monoclonal Antibodies,” in Monoclonal Antibodies: Production, Engineering and Clinical Application, Ritterら(編), 166頁(Cambridge University Press 1995);およびWardら, “Genetic Manipulation and Expression ofAntibodies,” in Monoclonal Antibodies: Principles and Applications, Birchら,(編), 137頁 (Wiley-Liss, Inc. 1995)参照）。あるいは、このようなCDRペプチドおよび他の抗体フラグメントは自動ペプチド合成装置を用いて合成することもできる。
ある特定の実施形態によれば、本明細書に記載のIg分子のいずれかの非ヒト、ヒトまたはヒト化重鎖および軽鎖可変領域はscFvポリペプチドフラグメント（単鎖抗体）として構築することもできる。例えば、Birdら, Science 242:423-426 (1988); Hustonら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-83 (1988)参照。多官能性scFv融合タンパク質は、scFvポリペプチドをコードしているポリヌクレオチド配列と様々な既知のエフェクタータンパク質のいずれかをコードしている少なくとも1つのポリヌクレオチド配列をフレーム内で連結することにより作製することができる。これらの方法は当業者に公知であり、例えば、EP-B1-0318554、米国特許第5,132,405号、米国特許第5,091,513号および米国特許第5,476,786号に開示されている。例として、エフェクタータンパク質は免疫グロブリン定常領域配列を含み得る。例えば、Hollenbaughら, J. Immunol. Methods 188:1-7 (1995)参照。他のエフェクタータンパク質例として酵素がある。限定されない例としては、このような 酵素は治療目的の生物活性をもたらす場合があり（例えば、Siemersら, Bioconjug. Chem. 8:510-19 (1997)参照）、あるいが診断用途で、セイヨウワサビペルオキシダーゼを触媒としていくつかの周知の基質のいずれかを検出可能な産物に変換させるなど、検出可能な活性をもたらす場合もある。
scFvは、ある特定の実施形態では、融合タンパク質と抗原（例えば、本明細書に記載のRPTPの1以上）の間の特異的結合の検出を可能とするペプチドまたはポリペプチドドメインと融合させることができる。例えば、この融合ポリペプチドドメインはアフィニティータグポリペプチドであってもよい。従って、scFv融合タンパク質と結合相手（例えば、本明細書に記載のRPTPの1以上またはそのフラグメント）の結合は、当業者が周知の様々な技術のいずれかにより、アビジン、ストレプトアビジンまたはHis（例えば、ポリヒスチジン）タグなどのアフィニティーポリペプチドまたはペプチドタグを用いて検出することができる。検出技術としてはまた、例えば、アビジンまたはストレプトアビジン融合タンパク質とビオチンまたはビオチン模倣配列の結合（例えば、Luoら, J. Biotechnol. 65:225 (1998)およびそこに引用されている参照文献参照）、融合タンパク質と検出可能な部分（例えば、標識部分）との直接的共有結合的修飾、融合タンパク質と特異的に標識されたリポーター分子との非共有結合、酵素活性を有する部分を含む融合タンパク質による検出可能な基質の酵素的修飾、または固相支持体への融合タンパク質の固定化（共有結合的または非共有結合的）が挙げられる。RPTP特異的免疫グロブリン由来ポリペプチドを含むscFv融合タンパク質を、望ましい親和特性を有するエフェクターペプチドなどの別のポリペプチドと融合させてもよい（例えば、米国特許第5,100,788号; WO89/03422;米国特許第5,489,528号;米国特許第5,672,691号; WO93/24631;米国特許第5,168,049号;米国特許第5,272,254号; EP511,747参照）。本明細書に示されるように、scFvポリペプチド配列は、全長融合ポリペプチドを含んでもよく、あるいはその変異体またはフラグメントを含んでもよい、エフェクタータンパク質配列をはじめとする融合ポリペプチド配列と融合させてもよい。
また、抗体は、ヒト免疫グロブリンファージライブラリー、ウサギ免疫グロブリンファージライブラリー、マウス免疫グロブリンファージライブラリーおよび／またはニワトリ免疫グロブリンファージライブラリーから同定および単離してもよい（例えば、Winterら, Annu. Rev. Immunol. 12:433-55 (1994); Burtonら, Adv. Immunol. 57:191-280 (1994);米国特許第5,223,409号; Huseら, Science 246:1275-81 (1989); Schlebuschら, Hybridoma 16:47-52 (1997)およびそこに引用されている参照文献; Raderら, J. Biol. Chem. 275:13668-76 (2000); Popkovら, J. Mol. Biol. 325:325-35 (2003); Andris-Widhopfら, J. Immunol. Methods 242:159-31 (2000)参照）。非ヒト種または非ヒト免疫グロブリンライブラリーから単離された抗体は、本明細書に記載され、また、抗体またはそのフラグメントを「ヒト化」するために当技術分野で公知の方法に従い、遺伝子操作することができる。免疫グロブリン可変領域遺伝子コンビナトリアルライブラリーは、本明細書に記載のRPTPと特異的に結合するIgフラグメント(Fab、Fv、scFv、またはその多量体)を選択すべくスクリーニング可能なファージベクターで作製することができる（例えば、米国特許第5,223,409号; Huse, Science 246:1275-81 (1989); Sastry, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:5728-32 (1989); Alting-Mees, Strategies in Molecular Biology 3:1-9 (1990); Kang, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:4363-66 (1991); Hoogenboom, J. Molec. Biol. 227:381-388 (1992); Schlebusch, Hybridoma 16:47-52 (1997)およびそこに引用されている参照文献;米国特許第6,703,015号参照）。
例えば、Ig可変領域フラグメントをコードしている複数のポリヌクレオチド配列を含むライブラリーを、M13またはその変異体などの繊維状バクテリオファージのゲノムの、遺伝子IIIまたは遺伝子VIIIなどのファージコートタンパク質をコードしている配列と同じフレーム内に挿入してもよい。融合タンパク質は、このコートタンパク質と軽鎖可変領域ドメインとの、かつ／または重鎖可変領域ドメインとの融合であってよい。ある特定の実施形態によれば、免疫グロブリンFabフラグメントはまたファージ粒子上に提示されてもよい（例えば、米国特許第5,698,426号参照）。
重鎖および軽鎖免疫グロブリンcDNA発現ライブラリーはまた、例えば、λImmunoZap（商標）(H)およびλImmunoZap（商標）(L)ベクター(Stratagene, La Jolla, California)を用い、λファージで作製してもよい。要するに、B細胞集団からmRNAを単離し、これを用いて、λImmunoZap(H)およびλImmunoZap(L)ベクター内の重鎖および軽鎖免疫グロブリンcDNA発現ライブラリーを作出する。これらのベクターを個々にスクリーニングしてもよいし、あるいは同時発現させてFabフラグメントまたは抗体を形成させてもよい（Huse, 前掲参照;また、Sastry, 前掲も参照）。次に、陽性プラークを、大腸菌からのモノクローナル抗体フラグメントの高レベル発現を可能とする非溶菌プラスミドに変換することができる。
LAR、RPTP-δおよび／またはRPTP-σと結合するIgフラグメントを提示するファージ（例えば、Ig V領域またはFab）は、そのファージライブラリーとLAR、RPTP-δおよび／またはRPTP-σまたはそのフラグメントと混合することにより、またはそのファージライブラリーを固相マトリックスに固定されたこのようなポリペプチドまたはペプチド分子と、結合させるに十分な条件および時間で接触させることにより選択することができる。結合していないファージを洗浄により除去し、その後、特異的に結合したファージ（すなわち、RPTP特異的Igフラグメントを含むファージ）を溶出させる（例えば、Messmer, Biotechniques 30:798-802 (2001)参照）。溶出したファージを適当な細菌宿主で増殖させ、一般にはRPTP結合と溶出を連続的に行うことで、RPTP特異的免疫グロブリンを発現するファージの収量を繰り返し高めることができる。
また、ファージディスプレー技術を用い、LAR、RPTP-δおよび／またはRPTP-σと結合するIgフラグメントまたは単鎖抗体を選択することもできる。このような抗体フラグメントまたは関連ペプチドをコードしている候補核酸分子（例えばDNA）が挿入可能な多重クローニング部位を有する好適なベクターの例としては、例えば、McLafferty, Gene 128:29-36 (1993); Scott, Science 249:386-90 (1990); Smith, Meth. Enzymol. 217:228-57 (1993); Fisch, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:7761-66 (1996)を参照。挿入されたDNA分子は無作為に生成された配列を含む可能性があり、またはLAR、RPTP-δおよび／またはRPTP-σと特異的に結合する既知のペプチドまたはポリペプチドドメイン（A41Lなど）の変異体をコードしている可能性もある。一般に、この核酸インサートはアミノ酸60個までのペプチドをコードし得るか、またはアミノ酸3〜35個のペプチドをコードし得るか、またはアミノ酸6〜20個のペプチドをコードし得る。この挿入配列によりコードされているペプチドがバクテリオファージの表面に提示される。RPTPに対する結合ドメインを発現するファージは、固定化RPTPまたはそのフラグメントとの特異的結合に基づいて選択することができる。このフラグメントを含む融合タンパク質を構築するには、周知の組換え遺伝子技術が使用可能である。例えば、得られた産物のLAR、RPTP-δおよび／またはRPTP-σに対する結合親和性を最大にするには、2以上のアフィニティー選択された類似または非類似RPTP結合ペプチドドメインのタンデムアレイを含むポリペプチドを作製すればよい。
また、ファージライブラリーを用いるコンビナトリアル突然変異誘発方法論も、非ヒト可変領域をヒト化するために使用可能である（例えば、Rosok, J. Biol. Chem. 271:22611-18 (1996); Rader, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:8910-15 (1998)参照）。最小に低下されている、または非ヒト可変領域に匹敵する結合親和性を有するヒト化可変領域が選択可能であり、それらのヒト化可変領域をコードしているヌクレオチド配列は標準的な技術により決定することができる（Sambrook, Molecular Cloning: A Labotratory Manual, Cold Spring Harbor Press (2001)参照）。次に、アフィニティー選択されたIgをコードしている配列を、そのIgフラグメントの発現用の別の好適なベクターにクローニングしてもよいし、あるいは所望により、免疫グロブリン鎖全体を発現させるため、Ig定常領域を含むベクターにクローニングしてもよい。
同様に、RPTP特異的抗体の部分、またはFabおよびFvフラグメントなどのフラグメントは、通常の酵素消化または、LAR、RPTP-δおよび／またはRPTP-σに特異的な抗体をコードしている遺伝子の可変領域を組み込むための組換えDNA技術を用いて構築することもできる。一実施形態では、ハイブリドーマにおいて、着目するモノクローナル抗体を発現する遺伝子の可変領域を、ヌクレオチドプライマーを用いて増幅させる。これらのプライマーは当業者ならば合成可能であり、あるいは市販供給源から購入することもできる（例えば、マウスおよびヒト可変領域を増幅するためのプライマーを販売しているStratagene (La Jolla、California)参照）。これらのプライマーは重鎖または軽鎖可変領域の増幅に使用可能であり、その後、それぞれImmunoZAP（商標）HまたはImmunoZAP（商標）L (Stratagene)などのベクターに挿入することができる。次に、これらのベクターを発現用の大腸菌系、酵母系または哺乳類に基づく系に導入することができる。この方法を用いて、VHドメインとVLドメインの融合物を含む、多量の単鎖タンパク質を産生させることができる（Bird, Science 242:423-426 (1988)参照）。さらに、このような技術を用い、抗体の結合特異性を変化させずに非ヒト抗体V領域をヒト化することもできる。
特定の他の実施形態では、RPTP-特異的抗体は多量体抗体フラグメントである。一般に、in Hayden, Curr Opin. Immunol. 9:201-12 (1997)およびColoma, Nat. Biotechnol. 15:159-63 (1997)に有用な方法論が記載されている。例えば、多量体抗体フラグメントは、ミニ抗体(米国特許第5,910 573号)またはダイアボディー(Holliger, Cancer Immunol. Immunother. 45:128-30 (1997))を形成するためのファージ技術によって作出することができる。RPTP特異的Fvの多量体である多量体フラグメントも作製可能である。
多量体抗体としては、抗原に特異的な第一のFvが、異なる抗原特異性を有する第二のFvと会合したものを含む二重特異性・二機能性抗体を含む（例えば、Drakeman, Expert Opin. Investig. Drugs 6:1169-78 (1997); Koelemij, J. Immunother. 22:514-24 (1999); Marvin, Acta Pharmacol. Sin. 26:649-58 (2005); Das, Methods Mol. Med. 109:329-46 (2005)参照）。例えば、一実施形態では、二重特異性抗体は、LARと特異的に結合するFvまたは本明細書に記載の他の抗原結合フラグメントを含み、かつ、RPTP-σと特異的に結合するFvまたは他の抗原結合フラグメントを含む。同様に、別の実施形態では、二重特異性抗体は、LARと特異的に結合するFvまたは本明細書に記載の他の抗原結合フラグメントを含み、かつ、RPTP-δと特異的に結合するFvまたは他の抗原結合フラグメントを含む。さらに別の実施形態では、二重特異性抗体は、RPTP-σと特異的に結合するFvまたは本明細書に記載の他の抗原結合フラグメントを含み、かつ、RPTP-δと特異的に結合するFvまたは他の抗原結合フラグメントを含む。他の特定の実施形態では、多価抗体または二重特異性抗体は、LAR、RPTP-δおよびRPTP-σの少なくとも1つと特異的に結合するFvまたは他の抗原結合フラグメントを含み、かつ、例えば、特異的抗体が結合した際に免疫細胞の免疫応答性の変更（抑制または増強）に寄与する、変更（抑制または増強）を助ける、または変更（抑制または増強）することができる細胞表面抗原など、非PTPポリペプチドに特異的なFvまたは他の抗原結合フラグメントをさらに含む。
RPTP結合免疫グロブリン分子へのアミノ酸突然変異の導入は、RPTPに対する特異性または親和性の増強、またはエフェクター機能の変更に有用であり得る。LAR、RPTP-δおよび／またはRPTP-σに対してより高い親和性を有する免疫グロブリンは、特定の残基の部位特異的突然変異誘発により作出することができる。コンピューター支援三次元分子モデリングを用いれば、RPTPに対する親和性を向上させるために変化させるアミノ酸残基を特定することができる（例えば、Mountain, Biotechnol. Genet. Eng. Rev. 10:1-142 (1992)参照）。あるいは、M13ファージでCDRのコンビナトリアルライブラリーを作製し、親和性の向上した免疫グロブリンフラグメントをスクリーニングすることもできる（例えば、Glaser, J. Immunol. 149:3903-13 (1992); Barbas, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:3809-13 (1994); 米国特許第5,792,456号参照）。
ある特定の実施形態では、変化したエフェクター機能を有するように抗体を遺伝子操作することができる。例えば、この抗体は、変更された（生物学的または統計学的に有意に増強または低減された）補体依存的細胞傷害性(CDC)または抗体依存的細胞傷害性(ADCC)媒介能、あるいは変更された、エフェクター細胞に存在するFc受容体を介したエフェクター細胞に対する結合能を持ち得る。エフェクター機能は部位特異的突然変異誘発により変更することができる（例えば、Duncan, Nature 332:563-64 (1988); Morgan, Immunology 86:319-24 (1995); Eghtedarzedeh-Kondri, Biotechniques 23:830-34 (1997)参照）。例えば、免疫グロブリンのFc部分上のグリコシル化部位の突然変異により、免疫グロブリンの補体固定能が変更され得る（例えば、Wright, Trends Biotechnol. 15:26-32 (1997)参照）。定常領域ドメインにおける他の突然変異によっても、免疫グロブリンの補体固定能またはADCC作用能が変更され得る（例えば、Duncan, Nature 332:563-64(1988); Morgan, Immunology 86:319-24 (1995); Sensel, Mol. Immunol. 34:1019-29 (1997)参照）。(また、例えば、米国特許公開第2003/0118592号;同第2003/0133939号も参照。）
本明細書に記載されているように、RPTPと特異的に結合する抗体またはそのフラグメントをコードしている核酸分子は、核酸の切り出し、連結、形質転換およびトランスフェクションのための様々な周知の手順のいずれかに従い、増幅および発現させることができる。よって、ある特定の実施形態では、抗体フラグメントの発現は、大腸菌(Escherichia coli)などの原核生物宿主細胞において行うのが好ましい（例えば、Pluckthun, Methods Enzymol. 178:497-515 (1989)参照）。特定の他の実施形態では、抗体またはその抗原結合フラグメントの発現は、酵母（例えば、サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)、シゾサッカロミセス・ポムベ(Schizosaccharomyces pombe)およびピキア・パストリス(Pichia pastoris)）、動物細胞（哺乳類細胞を含む）；または植物細胞をはじめとする真核生物宿主細胞で行うのが好ましい。好適な動物細胞の例としては、限定されるものではないが、骨髄腫、COS、CHOまたはハイブリドーマ細胞が挙げられる。植物細胞の例としては、タバコ、トウモロコシ、ダイズおよびイネ細胞が挙げられる。当業者に公知であり、本明細書の開示に基づく方法により、特定の宿主系で外来配列を発現させるよう核酸ベクターを設計した後、RPTP結合抗体（またはそのフラグメント）をコードしているポリヌクレオチド配列を挿入すればよい。調節エレメントは特定の宿主によって異なる。
可変および／または定常領域をコードしているポリヌクレオチドを含む1以上の複製可能な発現ベクターを作製し、これを用いて、例えば、マウスNSO系統などの非産生骨髄腫細胞系統または抗体の産生が起こる大腸菌などの細菌といった適当な細胞系統を形質転換することができる。効率的な転写および翻訳を得るため、各ベクターのポリヌクレオチド配列は、可変ドメイン配列に作動可能なように連結された適当な調節配列、特にプロモーターおよびリーダー配列を含まなければならない。このようにして抗体を生産する特定の方法は一般に周知であり、慣例的に用いられている。例えば、分子生物学的手法はSambrookら (Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 第2版, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1989;また、Sambrook, 第3版, Cold Spring Harbor Laboratory, New York、(2001)も参照）。DNAシーケンシングはSangerら(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74:5463 (1977))およびAmersham International plcシーケンシングハンドブック（それに対する改変も含む）に記載されているように行うことができる。
免疫グロブリン可変(V領域)、フレームワーク領域および／または定常領域の部位特異的突然変異誘発は、本明細書に記載され、当技術分野で実践されている多くの方法のいずれかに従って行うことができる(Kramer, Nucleic Acids Res. 12:9441 (1984); Kunkel Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:488-92 (1985); Kunkel, Methods Enzymol. 154:367-82 (1987))。RPTP(LAR、RPTP-δおよび／またはRPTP-σ)に対する結合に重要であるか、または変更されてもその抗原と抗体の結合には影響を及ぼさない残基を特定するためのランダム突然変異誘発法は、当業者が慣例的に行っている手順（例えば、アラニンスキャニング突然変異誘発、誤りがちな(error prone)ポリメラーゼ連鎖反応突然変異誘発およびオリゴヌクレオチド指定突然変異誘発（例えば、Sambrookら, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 第3版, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY (2001)）参照)に従って行うことができる。さらに、多くの刊行物に、DNA操作による抗体の作製、発現ベクターの作出、および適当な細胞の形質転換に好適な技術が記載されている(Mountain, in Biotechnology and Genetic Engineering Reviews (Tombs編, M P, 10, Chapter 1, Intercept, Andover, UK (1992));国際特許公開第WO91/09967号）。
LAR、RPTP-δおよび／またはRPTP-σと特異的に結合する抗体およびその抗原結合フラグメントはまた、生物学的サンプル中の1以上のRPTPの存在を検出するための免疫化学分析用の試薬としても有用であり得る。ある特定の実施形態では、LAR、RPTP-δおよびRPTP-σの少なくとも1つと特異的に結合する抗体を用いて、少なくとも1つのRPTPの発現を検出することができる。ある特定の実施形態では、1つの抗体または抗体パネルを、RPTPを発現する細胞に曝し、そのRPTPの発現を、最初にそれらの細胞と相互作用させた抗体とは異なるエピトープと結合する別のRPTP特異的抗体を用いて検出することにより判定することができる。
このような目的のため、本明細書に記載のRPTP結合免疫グロブリン（またはそのフラグメント）は、酵素、細胞傷害性薬剤、または他のリポーター分子（色素、放射性核種、発光基、蛍光基またはビオチンなどを含む）などの検出可能な部分または標識を含み得る。RPTP特異的免疫グロブリンまたはそのフラグメントは、診断適用または治療適用のために放射性標識してもよい。抗体の放射性標識技術は当技術分野で公知である（例えば、Adams, In Vivo 12:11-21 (1998); Hiltunen, Acta Oncol. 32:831-9 (1993)参照）。エフェクターまたはリポーター分子は、その付着または付着プロセスが結合特性に悪影響を及ぼして分子の有用性が損なわれない限り、抗体内にある利用可能ないずれかのアミノ酸側鎖、末端アミノ酸、または炭水化物官能基を介して抗体に付着させることができる。特定の官能基としては、例えば、遊離アミノ、イミノ、チオール、ヒドロキシル、カルボキシルまたはアルデヒド基が挙げられる。抗体またはその抗原結合フラグメントとエフェクターおよび／またはリポーター分子の付着は、このような基とエフェクターまたはリポーター分子内の適当な官能基を介して達成される。この結合は直接的なものでも、スペーシング基または架橋基を介して間接的なものであってもよい（例えば、国際特許出願公開WO93/06231、WO92/22583、WO90/091195およびWO89/01476参照;また、例えば、Pierce Biotechnology, Rockford, ILなどの商業的販売者も参照）。
本明細書で示されるように、また、当技術分野で周知の方法論によれば、LAR、RPTP-δおよび／またはRPTP-σおよびそのフラグメントのアフィニティー単離にはポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体が使用可能である（例えば、Hermanson, Immobilized Affinity Ligand Techniques, Academic Press, Inc. New York、(1992)参照）。要するに、抗体（またはその抗原結合フラグメント）を固相支持体に固定化し、その後これを、RPTPを含むサンプルと接触させればよい。このサンプルは、RPTPと固定化抗体の結合を可能とするに十分な条件および時間で固定化抗体と相互作用させ、サンプルの非結合成分（すなわち、RPTP と無関連の成分）を除去した後、適当な溶出液を用いてこの固定化抗体からRPTPを遊離させる。
ある特定の実施形態では、LAR、RPTP-δおよび／またはRPTP-σと特異的に結合する抗体（またはその抗原結合フラグメント）を認識し、それと特異的に結合する抗イディオタイプ抗体が提供され、これらの抗イディオタイプ抗体を使用する方法も提供される。抗イディオタイプ抗体は、本明細書に記載の方法により、免疫原として抗LAR、抗RPTP-δまたは抗RPTP-σ抗体（またはその抗原結合フラグメント）を用い、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体として作製することができる。また、抗イディオタイプ抗体またはそのフラグメントは、上記の組換え遺伝子操作法のいずれか、またはファージディスプレー選択により作製することもできる。さらに、抗イディオタイプ抗体は、本明細書に詳細に示されている記載に従い、キメラまたはヒト化抗イディオタイプ抗体を得るために操作することができる。抗イディオタイプ抗体は、抗体とRPTPとの結合が競合的に阻害されるように、抗RPTP抗体の抗原結合部位と特異的に結合し得る。あるいは、本明細書で示される抗イディオタイプ抗体は、抗RPTP抗体とRPTPの結合を競合的に阻害しなくてもよい。
一実施形態では、抗イディオタイプ抗体を用いて、免疫細胞の免疫応答性を変化させることができる。ある特定の実施形態では、抗イディオタイプ抗体を用いて、免疫細胞の免疫応答性を抑制する、また、免疫疾患または免疫障害を治療することができる。抗イディオタイプ抗体は、LAR、RPTP-δおよび／またはRPTP-σと特異的に結合する抗体と特異的に結合し、この抗イディオタイプ抗体の抗原結合部位はRPTPのエピトープを模倣し、すなわち、この抗イディオタイプ抗体は同族リガンドならびにRPTPと特異的に結合する抗体と結合する。よって、抗イディオタイプ抗体は、このようなリガンドがRPTPと結合する場合に免疫細胞の免疫応答性を刺激、誘導または増強する同族リガンドの結合を回避、遮断または低減するのに有用であり得る。
抗イディオタイプ抗体はまた、生物学的サンプルにおいて抗RPTP抗体の存在を判定するためのイムノアッセイに有用である。例えば、ELISAおよび当業者により実践されている本明細書に記載の他のアッセイなどのイムノアッセイは、宿主に本明細書に記載のRPTPポリペプチドまたはそのフラグメントを投与する（すなわち、宿主を本明細書に記載のRPTPポリペプチドまたはそのフラグメントで免疫化する）ことにより誘発される免疫応答の存在を判定するのに使用可能である。
ある特定の実施形態では、LAR、RPTP-δおよび／またはRPTP-σに特異的な抗体は、細胞内タンパク質として発現される抗体またはその抗原結合フラグメントであり得る。このような細胞内抗体はまたイントラボディーとも呼ばれ、Fabフラグメント、Fvフラグメント、scFv分子、scFv-Fc融合抗体、または二重特異性抗体を含んでよく、これらは全て本明細書に記載されているように、また、当技術分野で実践されている方法に従って作製可能である（例えば、Lobato, Curr. Mol. Med. 4:519-28 (2004); Strube, Methods 34:179-83 (2004); Lecerf, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98:4764-49 (2001); (Weisbart, Int. J. Oncol. 25:1113-18 (2004)参照）。イントラボディーの形態で有用な抗体としては、RPTPの細胞内部分と特異的に結合する抗体がある。例えば、触媒ドメインD1およびD2と配列番号51で示される配列を有するペプチドを含む領域とを含む、LAR、RPTP-δおよび／またはRPTP-σの細胞内部分の領域内でエピトープと結合する抗体。
細胞内の還元環境におけるイントラボディーの発現レベル、安定性および／または溶解度を改良するために、CDR領域にフランキングするフレームワーク領域を改変することができる（例えば、Auf der Maur, Methods 34:215-24 (2004); Strube, 前掲; Worn, J. Biol. Chem. 275:2795-803 (2000)参照）。イントラボディーは、例えば、細胞内の特定の標的抗原をコードしているポリヌクレオチド配列と作動可能なように融合され得るイントラボディーの可変領域をコードしているポリヌクレオチド配列を含むベクターを構築することで、特定の細胞部位またはオルガネラに対するものとすることができる（例えば、Graus-Porta, Mol. Cell Biol. 15:1182-91 (1995); Lener, Eur. J. Biochem. 267:1196-205 (2000); Popkov, Cancer Res. 65:972-81 (2005)参照）。種々のタイプのイントラボディーが癌治療のため（例えば、Weisbart, 前掲; Popkov, 前掲; Krauss, Breast Dis. 11:113-24 (1999)参照）)、また、パーキンソン病(Zhou, Mol. Ther. 10:1023-31 (2004))およびハンチントン病(Murphy, Brain Res. Mol. Brain Res. 121:141-45 (2004); Colby, J. Mol. Biol. 342:901-12 (2004); Colby, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101:17616-21 (2004), Erratum in Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102:955 (2005) 参照）などの神経変性疾患の治療のための治療薬として考案されている。イントラボディーは、遺伝子療法ベクター、脂質混合物（例えば、Imgenex Corporation, San Diego, CAにより製造されているProvectin（商標））、光線化学インターナリゼーション法または当技術分野で公知の他の方法はじめ、当業者に利用可能な種々の技術により細胞内に導入することができる。
A41L、130L、RPTPおよびポリペプチド因子の発現
A41L、130L、RPTP(LAR、RPTP-δおよびRPTP-σ)ならびに融合ポリペプチド（例えば、ペプチド-IgFc融合ポリペプチド、RPTP Igドメイン-Fc融合ポリペプチド）をはじめとする本明細書に記載のポリペプチドは、ベクターと、このようなポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを含む構築物、特に組換え発現構築物を用いて発現させることができる。宿主細胞を組換え技術により、これらのポリペプチドおよび融合タンパク質、またはフラグメントもしくは変異体を生産するためのベクターおよび／または構築物を用いて遺伝子的に操作する。本明細書に記載のポリペプチドおよび融合ポリペプチドは各々、適当なプロモーターの制御下、哺乳類細胞、酵母、細菌または他の細胞内で発現させることができる。DNA構築物に由来するRNAを用い、無細胞翻訳系を用いてもこのようなタンパク質を生産することもできる。原核生物宿主および真核生物宿主とともに用いるのに適当なクローニングおよび発現ベクターは、例えば、Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 第3版, Cold Spring Harbor, New York, (2001)に記載されている。
一般に、組換え発現ベクターは、複製起点、宿主細胞の形質転換を可能とする選択マーカー（例えば、大腸菌のアンピシリン耐性遺伝子およびS.セレビシエTRP1遺伝子）、ならびに下流の構造配列の転写を指令するための、発現の高い遺伝子に由来するプロモーターを含む。プロモーターは、とりわけ、3-ホスホグリセリン酸キナーゼ(PGK)、α因子、酸性ホスファターゼまたは熱ショックタンパク質などの解糖系酵素をコードしているオペロンに由来するものであり得る。この異種構造配列を翻訳開始および終結配列と適当な位相で組み立てる。
場合により、異種配列は、所望の特性を付与する、例えば、産生されたポリペプチを安定化するまたは発現された組換え産物の精製を簡単にするアミノ末端またはカルボキシ末端識別ペプチドまたはポリペプチドを含む融合タンパク質をコードすることができる。このような識別ペプチドとしては、ポリヒスチジンタグ（hisタグ）またはFLAG（登録商標）エピトープタグ(DYKDDDDK、配列番号62)、β-ガラクトシダーゼ、アルカリ性ホスファターゼ、GST、またはXPRESS（商標）エピトープタグ(DLYDDDDK、配列番号63; Invitrogen Life Technologies, Carlsbad、CA)などが挙げられる（例えば、米国特許第5,011,912号; Hopp, (Bio/Technology 6:1204 (1988)参照）。親和性配列は、例えば、pBAD/His (Invitrogen)で提供されるヘキサヒスチジンタグなどのベクターにより提供され得る。あるいは、親和性配列は、核酸コード配列を組換え生成するために用いるプライマーに合成的または組換え的に付加してもよい（例えば、ポリメラーゼ連鎖反応を用いる）。
記載の組換え発現構築物を含む宿主細胞は、ベクターおよび／または発現構築物（例えば、クローニングベクター、シャトルベクター、または発現構築物を用いて遺伝子操作（形質導入、形質転換またはトランスフェクト）することができる。このベクターまたは構築物はプラスミド、ウイルス粒子、ファージなどの形態であってよい。操作された宿主細胞はプロモーターの活性化、形質転換体の選択または特定の遺伝子またはコードヌクレオチド配列の増幅に関して適宜改変した通常の栄養培地で培養することができる。温度、pHなど、特定の宿主細胞のための培養条件の選択および維持は、当業者には容易に明らかになる。好ましくは、技術確立されている方法論に従い、宿主細胞を持続的な培養増殖に適応させて、細胞系統を得ることができる。ある特定の実施形態では、細胞系統は不死細胞系統であり、これは長期培養の後に繰り返し（活性を保持しながら少なくとも10回）継代培養可能な細胞系統を指す。他の実施形態では、細胞系統の作出に用いられる宿主細胞は、癌細胞、転換細胞、または悪性細胞など、調節を受けない増殖が可能な細胞である。
有用な細菌発現構築物は、好適な好適な翻訳開始シグナルと終結シグナルとともに所望のタンパク質をコードしている構造DNA配列を発現ベクターに、機能的プロモーターと作動可能な読み取り位相で挿入することにより構築される。この構築物は1以上の表現型選択マーカーとそのベクター構築物の維持を保証するため、また所望により宿主内での増幅を得るための複製起点を含み得る。形質転換に好適な原核生物宿主としては、大腸菌、枯草菌(Bacillus subtilis)、ネズミチフス菌(Salmonella typhimurium)およびシュードモナス属(Pseudomonas)、放線菌属(streptomyces)およびブドウ球菌属(Staphylococcus)内の種々の種が挙げられるが、他のものも選択肢として使用可能である。他のプラスミドまたはベクターも、宿主内で複製能および生存能がある限り使用可能である。よって、例えば、本明細書に示されている核酸は、ポリペプチド発現用の組換え発現構築物として種々の発現ベクター構築物のいずれか1つに含まれてよい。このようなベクターおよび構築物としては、染色体DNA配列、非染色体DNA配列および合成DNA配列、例えば、細菌プラスミド；ファージDNA；バキュロウイルス；酵母プラスミド；プラスミドとファージDNAの組合せに由来するベクター；ワクシニア、アデノウイルス、鶏痘ウイルスおよびシュード狂犬病などのウイルスDNAが挙げられる。しかしながら、他のベクターも、宿主内で複製能および生存能がある限り、組換え発現構築物の作製のために使用可能である。
適当なDNA配列を、種々の手法によりベクターに挿入することができる。一般に、DNA配列は、当業者に公知の手法により、適当な制限エンドヌクレアーゼ部位に挿入する。クローニング、DNA単離、増幅および精製のための標準的技術、DNAリガーゼ、DNAポリメラーゼ、制限エンドヌクレアーゼなどを含む酵素反応のための標準的技術、ならびに種々の分離技術は公知であり、当業者に汎用されている。多くの標準的技術が例えば、Ausubelら (Current Protocols in Molecular Biology (Greene Publ. Assoc. Inc. & John Wiley & Sons, Inc., 1993)); Sambrookら (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 第3版, (Cold Spring Harbor Laboratory 2001)); Maniatisら (Molecular Cloning, (Cold Spring Harbor Laboratory 1982))および他所に記載されている。
発現ベクター中のポリペプチドをコードしているDNA配列は、mRNA合成を命令するために少なくとも1つの適当な発現制御配列（例えば、プロモーターまたは調節プロモーター）に作動可能なように連結される。このような発現制御配列の代表例としては、LTRまたはSV40プロモーター、大腸菌lacまたはtrp、ファージλPLプロモーター、および原核生物または真核細胞またはそれらのウイルスにおいて遺伝子の発現を制御することが知られている他のプロモーターが挙げられる。プロモーター領域は、CAT（クロラムフェニコールトランスフェラーゼ）ベクターまたは選択マーカーを有する他のベクターを用い、所望の遺伝子から選択することができる。特定の細菌プロモーターとしては、lacI、lacZ、T3、T5、T7、gpt、λPR、PLおよびtrpが挙げられる。真核生物のプロモーターとしては、CMV前初期、HSVチミジンキナーゼ、前記および後期SV40、レトロウイルス由来のLTRおよびマウスメタロチオネイン-Iが挙げられる。適当なベクターおよびプロモーターの選択、ならびに本明細書に記載の核酸と作動可能なように連結された少なくとも1つのプロモーターまたは調節プロモーターを含む特定の組換え発現構築物の作製は十分当業者の水準の範囲内にある。
誘導プロモーター、調節プロモーターおよび／または厳密に調節されるプロモーターの設計および選択は当技術分野で公知であり、特定の宿主細胞および発現系によって異なる。pBAD発現系(Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA)は、大腸菌アラビノースオペロン(PBADまたはPARA)を用いる厳密に調節される発現系の一例であり（Guzman, J. Bacteriology 177:4121-30 (1995); Smith, J. Biol. Chem. 253:6931-33 (1978); Hirsh, Cell 11:545-50 (1977))、これはアラビノース代謝経路を制御する。この系を用いる種々のベクターが市販されている。厳密に調節されるプロモーター駆動発現系の他の例としては、Stratagene (La Jolla, CA)から入手可能なPET発現系（米国特許第4.952,496号参照）またはtet調節発現系(Gossen, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:5547-51 (1992); Gossen, Science 268:1766-69 (1995))がある。pLP-TRE2アクセプターベクター(BD Biosciences Clontech, Palo Alto, CA)は、部位特異的Cre-lox組換え系（例えば、Sauer, Methods 14:381-92 (1998); Furth, J. Mamm. Gland Biol. Neoplas. 2:373 (1997) 参照）を用いて着目する遺伝子の厳密に制御された誘導発現のためのテトラサイクリン調節発現構築物を迅速に作出するよう、CLONTECHのCreator（商標）クローニングキットとともに用いるために設計されており、これは宿主細胞の不死化にも使用可能である（例えば、Cascio, Artif. Organs 25:529 (2001)参照）。
ベクターはレトロウイルスベクターなどのウイルスベクターであってもよい。例えば、レトロウイルスプラスミドベクターが由来し得るレトロウイルスは、限定されるものではないが、モロニーネズミ白血病ウイルス、脾臓壊死ウイルス、ラウス肉腫ウイルス、ハーベイ肉腫ウイルス、鳥類白血病ウイルス、テナガザル(gibbon ape)白血病ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、アデノウイルス、骨髄増殖性肉腫ウイルスおよび乳癌ウイルスが挙げられる。また、ウイルスベクターは1以上のプロモーターを含む。使用可能な好適なプロモーターとしては、限定されるものではないが、Miller, Biotechniques 7:980-990 (1989)に記載されているレトロウイルスLTR；SV40プロモーター；およびヒトサイトメガロウイルス(CMV)プロモーター、または他のプロモーター（例えば、ヒストン、pol IIIおよびβ-アクチンプロモーターをはじめとする真核細胞プロモーター）が挙げられる。使用可能な他のウイルスプロモーターとしては、限定されるものではないが、アデノウイルスプロモーター、チミジンキナーゼ(TK)プロモーターおよびB19パルボウイルスプロモーターが挙げられる。
レトロウイルスプラスミドベクターは、パッケージング細胞系統（例えば、PE501、PA317、Ψ-2、Ψ-AM、PA12、T19-14X、VT-19-17-H2、ΨCRE、ΨCRIP、GP+E-86、GP+envAm12 DAN；また、例えば、Miller, Human Gene Therapy, 1:5-14 (1990)も参照）に形質導入して生産細胞系統を作出するのに使用可能である。このベクターは例えば、エレクトロポレーション、リポソームに使用およびリン酸カルシウム沈殿法など、当技術分野で公知の手段によってパッケージング細胞に形質導入可能である。生産細胞系統は、本明細書に記載のポリペプチドまたは融合タンパク質をコードしている核酸配列を含む、感染力のあるレトロウイルスベクター粒子を生成する。次に、このようなレトロウイルスベクター粒子を用い、in vitroまたはin vivoで真核細胞に形質導入することができる。形質導入可能な真核細胞としては、例えば、胚性幹細胞、胚性癌腫細胞、造血幹細胞、肝細胞、繊維芽細胞、筋芽細胞、ケラチノサイト、内皮細胞、気管支上皮細胞および他の培養適応細胞系統が挙げられる。
別の例として、ポリペプチドまたは融合タンパク質の発現を命令する組換えウイルス構築物により形質導入された宿主細胞は、ウイルスの出芽中にウイルス粒子により組み込まれる宿主細胞膜の一部に由来する発現ポリペプチドまたは融合タンパク質を含むウイルス粒子を生産し得る。ポリペプチドをコードしている核酸配列をバキュロウイルスシャトルベクターにクローニングすることができ、次に、これを、例えば、Sf9宿主細胞に感染させるのに用いる組換えバキュロウイルス発現構築物を生成するためにバキュロウイルスと組換えを行う（例えば、Baculovirus Expression Protocols, Methods in Molecular Biology Vol. 39, Richardson編, (Human Press 1995); Piwnica-Worms, “Expression of Proteins in Insect Cells Using Baculoviral Vectors,” Section II, Chapter 16 in Short Protocols in Molecular Biology, 第2編, Ausubel編, (John Wiley & Sons 1992), 16-32〜16-48頁参照）。
免疫細胞の免疫応答性を変化させる薬剤の同定および特性決定方法
本明細書では、免疫細胞の免疫応答性を変化させる（統計学的に有意にまたは生物学的に有意に抑制または増強、好ましくは抑制する）薬剤の同定または選択のため、または免疫細胞の免疫応答性を変化させる本明細書に記載の薬剤の能力を測定するための方法が提供される。一実施形態では、免疫細胞の免疫応答性を抑制する薬剤を同定する方法が提供され、その方法は、(1)候補薬剤と；(2)RPTP、すなわち、LAR、RPTP-δおよびRPTP-σの少なくとも1つを発現する免疫細胞と；(3)A41Lまたは130Lなどのポックスウイルスポリペプチドとを、少なくとも1つのRPTPとポックスウイルスポリペプチドの間の相互作用を可能とするのに十分な条件および時間で接触させる（混合する、合わせる、または場合によっては相互作用させる）こと、およびその後候補薬剤の存在下および不在下でポックスウイルスポリペプチド（すなわち、A41Lまたは130L）と免疫細胞の結合のレベルを測定することを含む。候補薬剤の存在下でポックスウイルスポリペプチドと免疫細胞の結合が低下していれば、その候補薬剤が免疫細胞の免疫応答性を抑制することを示す。ある特定の実施形態では、免疫細胞はLAR、RPTP-δおよびRPTP-σの少なくとも2つ（LARとRPTP-δ、LARとRPTP-σ、およびRPTP-δとRPTP-σなど）を発現し、他の特定の実施形態では、免疫細胞は3つ全てのRPTPを発現する。この免疫細胞は本明細書に記載のサンプル中に存在していてもよいし、あるいは単離されていてもよい。例えば、この免疫細胞は一次細胞培養物または長期細胞培養物から得てもよいし、あるいは被験体（ヒトまたは非ヒト動物）から得られる生物学的サンプル中に存在していてもよいし、あるいは単離されていてもよい。
別の実施形態では、A41Lまたは130LなどのポックスウイルスポリペプチドとRPTPの少なくとも2つ（すなわち、LAR、RPTP-δおよびRPTP-σの少なくとも2つ）との結合を阻害する薬剤を同定する方法が提供される。この方法は、(1)候補薬剤と；(2)(i)LAR、(ii)RPTP-σおよび(iii)RPTP-δから選択される少なくとも2つのRPTPポリペプチドを含む生物学的サンプルと；(3)ポックスウイルスポリペプチドとを、少なくとも2つのRPTPポリペプチドとポックスウイルスポリペプチドの間の相互作用を可能とするのに十分な条件および時間で接触させる（混合する、合わせる、または場合によっては相互作用させる）ことを含む。次に、ポックスウイルスポリペプチドと少なくとも2つのRPTPポリペプチドの結合のレベルを候補薬剤の存在下で測定し、候補薬剤の不在下でのポックスウイルスポリペプチドと少なくとも2つのRPTPポリペプチドの各々との結合レベルを比較する。候補薬剤の存在下でポックスウイルスポリペプチドと少なくとも2つのRPTPポリペプチドの結合レベルが低下していれば、その候補薬剤がポックスウイルスポリペプチドと少なくとも2つのRPTPポリペプチドの結合を阻害することを示す。別の実施形態では、候補薬剤は、LAR、RPTP-σおよびRPTP-δを含む生物学的サンプルと接触させ、薬剤の存在下での各ホスファターゼに対する結合レベルを測定する。
この方法および本明細書に記載の他の方法の反応成分を相互作用させるのに適当な条件としては、例えば、適当な濃度の試薬および成分（ポックスウイルスポリペプチドおよび候補薬剤およびRPTPを含む）、温度およびバッファーが挙げられ、これらについては当業者に公知である。反応成分を相互作用させるのに十分な反応成分の濃度、バッファー、温度および時間は、本明細書に記載の方法に従って決定および／または調節することができ、これについては当業者に公知である。本明細書に記載の実施するため、当業者ならばまた、これらの方法を実施する際にどの制御が適宜含まれるかが容易に認識、理解できるであろう。
生体分子と同族リガンドの間の相互作用または結合を測定するため、多くのアッセイおよび技術が当業者により実践されている。よって、薬剤の存在下でのこの相互作用および／または結合に対する生物活性薬剤の作用を含め、ポックスウイルスポリペプチドA41Lおよび／または130LとLAR、RPTP-σおよびRPTP-δの1以上の間の相互作用は、競合アッセイ形式を含み得るこのようなアッセイおよび技術により容易に測定することができる。方法例としては、限定されるものではないが、蛍光共鳴エネルギー移動、蛍光偏光、時間分解蛍光共鳴エネルギー移動、シンチレーション近接アッセイ、リポーター遺伝子アッセイ、蛍光消光酵素基質、発色酵素基質および電気化学発光、イムノアッセイ（酵素結合免疫吸着検定法(ELISA)、ラジオイムノアッセイ、免疫ブロット法、免疫組織化学など）、表面プラズモン共鳴、リポーター遺伝子を用いるものなどの細胞に基づくアッセイ、および機能アッセイ（例えば、LAR、RPTP-σおよびRPTP-δの1以上によるチロシンリン酸化基質の脱リン酸化を評価するアッセイおよび免疫機能と免疫応答性を評価するアッセイ）が挙げられる。本明細書に記載され、当業者に公知の方法の多くは、ポックスウイルスポリペプチドおよび／またはLAR、RPTP-σおよびRPTP-δの結合、相互作用または生物機能に対する薬剤の作用、ならびに免疫細胞の免疫応答性に対する薬剤の作用を決定するために、化合物のライブラリーからなどの多数の生物活性薬剤を分析するためのハイスループットスクリーニングに適合させることができる（例えば、High Throughput Screening: The Discovery of Bioactive Substances, Devlin編, (Marcel Dekker New York, 1997)参照）。
これらの技術およびアッセイ形式にはまた、ポックスウイルスポリペプチド（例えば、A41Lまたは130L）とRPTPの間などの複合体の形成を示すシグナルを検出および／または増幅するのに有用な第二の試薬（特異的抗体など）を含み得る。1以上のアッセイ成分または第二の試薬を、酵素、細胞傷害性剤、または他のリポーター分子（色素、放射性核種、発光基、蛍光基、またはビオチンなど）などの検出可能な部分（または標識もしくはリポーター分子）に付着させることができる。抗体および他のポリペプチドの放射性標識のための技術は当技術分野で公知である（例えば、Adams, In Vivo 12:11-21 (1998); Hiltunen, Acta Oncol. 32:831-9 (1993)参照）。検出可能な部分は、その付着または付着プロセスが結合特性に悪影響を及ぼして分子の有用性が損なわれない限り、ポリペプチド内に存在する利用可能なアミノ酸側鎖、末端アミノ酸、または炭水化物官能基などを介して、ポリペプチド（例えば、抗体）に付着させることができる。特定の官能基としては、例えば、遊離アミノ、イミノ、チオール、ヒドロキシル、カルボキシルまたはアルデヒド基が挙げられる。ポリペプチドと検出可能な部分の付着は、このような基と検出可能な部分内の適当な官能基を介して達成される。この結合は直接的なものでも、スペーシング基または架橋基を介して間接的なものであってもよい（例えば、国際特許出願公開WO93/06231、WO92/22583、WO90/091195およびWO89/01476参照;また、例えば、Pierce Biotechnology, Rockford, ILなどの商業的販売者も参照）。
本明細書において「生物学的サンプル」とは、ある特定の実施形態では、LAR、RPTP-σおよびRPTP-δの少なくとも1つまたはポックスウイルスポリペプチドもしくはその変異体を含むサンプルを指す。生物学的サンプルは血液サンプル（それから血清または血漿が調製できる）、生検、体液（例えば、肺洗浄液、腹水、粘膜洗浄液、滑液）、骨髄、リンパ節、組織外植片、器官培養物、または被験体もしくは生物源由来の他のいずれかの組織または細胞調製物であり得る。サンプルはさらに、例えば解剖、解離、可溶化、分画、均質化、生化学もしくは化学的抽出、粉砕、凍結乾燥、音波処理、または被験体もしくは生物源由来のサンプルを処理するための他のいずれかの手段により、形態学的完全性または生理状態が妨げられている組織または細胞調製物も指す。被験体もしくは生物源はヒトまたは非ヒト動物、一次細胞培養物（例えば、免疫細胞、ウイルス感染細胞）、または培養適応細胞系統（限定されるものではないが、一般に、染色体に組み込まれた、またはエピソーム性の組換え核酸配列を含み得る遺伝子操作細胞系統、不死化されたまたは不死化可能な細胞系統、体細胞雑種細胞系統、分化したまたは分化可能な細胞系統、形質転換細胞系統などであり得る。
候補薬剤としては、限定されるものではないが、本明細書に記載され、二重特異性または二機能性抗体、キメラ抗体、ヒトもしくはヒト化抗体、scFv、またはダイアボディーなども含み得る抗体またはその抗原結合フラグメントが挙げられる。免疫細胞の免疫応答性を変化させる（ある特定の実施形態では、免疫細胞の免疫応答性を抑制する）ため、また、免疫疾患または免疫障害を治療するために有用な本明細書に記載のさらなる薬剤としては、限定されるものではないが、小分子、ペプチド-免疫グロブリン定常領域融合ポリペプチド（ペプチド-IgFc融合ポリペプチドなど）、アプタマー、siRNAポリヌクレオチド、アンチセンス核酸、リボザイムおよびペプチド核酸が挙げられる。
免疫細胞および免疫応答
免疫細胞は、リンパ球およびアクセサリー細胞などの非リンパ細胞をはじめとする免疫系のいずれかの細胞である。リンパ球は外来抗原を特異的に認識して応答する細胞であり、アクセサリー細胞はある特定の抗原には特異的でなく、免疫応答の認識期および活性化期に関与する細胞である。例えば、単核食細胞（マクロファージ）、他の白血球（例えば、好中球、好酸球、好塩基球をはじめとする顆粒球）および樹状細胞は免疫応答の誘導においてアクセサリー細胞として働く。外来抗原によるリンパ球の活性化は、その抗原を排除する働きをする多くのエフェクター機構の誘導または惹起をもたらす。エフェクター機構とともに作用するまたはエフェクター機構に関与する単核食細胞などのアクセサリー細胞はまたエフェクター細胞とも呼ばれる。
リンパ球の主要なクラスとしては、Bリンパ球（B細胞）、Tリンパ球（T細胞）およびナチュラルキラー(NK)細胞が挙げられ、これらは大型の顆粒リンパ球である。B細胞は抗体を産生することができる。Tリンパ球はさらにヘルパーT細胞(CD4+)と細胞溶解性または細胞傷害性T細胞(CD8+)に再分割される。ヘルパー細胞はT細胞ならびにB細胞およびマクロファージをはじめとする他の細胞の増殖および分化を促進するサイトカインを分泌し、炎症性白血球を補充および活性化する。制御性T細胞またはサプレッサーT細胞と呼ばれるT細胞の別のサブグループは、免疫系の活性を積極的に抑制し、病的な自己反応性（すなわち、自己免疫疾患）を予防する。免疫抑制サイトカインTGF-βおよびインターロイキン-10(IL-10)が、制御性T細胞機能に関連づけられている。
一般に、免疫応答としては、抗原に特異的な抗体が、血漿細胞として知られている分化したBリンパ球により産生される体液性応答を含み得る。免疫応答としてはまた、体液性応答に加え、または体液性応答の代わりに、種々のタイプのTリンパ球がいくつかの機構により抗原を排除するように働く細胞媒介応答を含み得る。例えば、特異的抗原を認識し得るヘルパーT細胞は、サイトカインなどの可溶性メディエーターを放出することで応答し、免疫応答に関わるべく、さらなる免疫系の細胞を補充する。また、特異的抗原認識も可能な細胞傷害性T細胞は、抗原担持細胞または粒子に結合し、それらを破壊または傷害することで応答し得る。
宿主または被験体における免疫応答は、本明細書に記載されている周知のいくつかの免疫法により測定することができ、それについては当業者ならば容易に分かる。このようなアッセイとしては、限定されるものではないが、可溶性抗体、サイトカイン（例えば、IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-10、IL-12およびTGF-β）、リンホカイン、ケモカイン、ホルモン、増殖因子などの可溶性メディエーター、ならびに他の可溶性小ペプチド、炭水化物、ヌクレオチドおよび／または脂質性メディエーターのin vivoまたはin vitro測定；免疫系の細胞の機能的および構造的特性の変化、例えば、細胞増殖、運動性の変化、特異的遺伝子発現または細胞溶解挙動などの特殊な活性の誘導により決定される細胞の活性化状態の変化；表面抗原発現プロフィールの変化またはアポトーシス（プログラムされた細胞死）の開始を含む免疫系の細胞による細胞分化が挙げられる。これらの、また類似のアッセイを行うための手順は、例えば、Lefkovits (Immunology Methods Manual: The Comprehensive Sourcebook of Techniques, 1998)に見出せる。また、Current Protocols in Immunology; Weir, Handbook of Experimental Immunology, Blackwell Scientific, Boston, MA (1986); Mishell and Shigii (編) Selected Methods in Cellular Immunology, Freeman Publishing, San Francisco, CA (1979); GreenおよびReed, Science 281:1309 (1998)およびそこに引用されている参照文献も参照。
A41Lまたは130Lなどのポックスウイルスポリペプチドまたはそのフラグメントもしくは変異体の、また、本明細書に記載の薬剤（例えば、LAR、RPTP-σおよび／またはRPTP-δと特異的に結合する抗体またはその抗原結合フラグメント；核酸分子（アプタマー、siRNA、アンチセンスポリヌクレオチドなど）；ペプチド-IgFc融合ポリペプチド）の、免疫細胞の免疫応答性を抑制し、従って自己免疫疾患または炎症性疾患または炎症性障害などの免疫疾患または免疫障害、心血管疾患または心血管障害、代謝性疾病または代謝性障害、あるいは増殖性疾患または増殖性障害を治療するのに有用な能力は、本明細書に記載され、また、当業者に用いられているいくつかの動物モデルのいずれか1つで測定および評価することができる（例えば、Taneja による総説, Nat. Immunol. 2:781-84 (2001); Lam-Tse et al., Springer Semin. Immunopathol. 24:297-321 (2002)参照）。例えば、受容体チロシンキナーゼをコードしているTyro3、MerおよびAxlの3つの遺伝子がノックアウトされたマウスは、関節リウマチおよびSLEをはじめとする自己免疫疾患のいくつかの症状を示す(Lu et al., Science 293:228-29 (2001))。自発的狼瘡様疾患のネズミモデルがNZB/WF1ハイブリッドマウスを用いて記載されている（例えば、Drake et al., Immunol. Rev. 144:51-74 (1995)参照）。疾病の発症、調節および／または疾病からの動物の保護に影響を及ぼす薬剤および分子の試験を可能とするI型糖尿病の動物モデルはMHCトランスジェニック(Tg)マウスを用いる。HLA-DQ8導入遺伝子（HLA-DQ8は、ヒトI型糖尿病の主要な疾病素因遺伝子である）およびHLA-DQ6導入遺伝子（糖尿病保護的である）を発現するマウスをRIP（ラットインスリンプロモーター）.B7-1-Tgマウスと交配させ、自発的糖尿病を発症するHLA-DQ8 RIP.B7-1トランスジェニックマウスを得る（Wakeland et al., Curr. Opin. Immunol. 11:701-707 (1999); Wen, J. Exp. Med. 191:97-104 (2000)参照）。(また、Brondum et al., Horm. Metab. Res. 37 Suppl 1:56-60 (2005)も参照。）
関節リウマチの治療に有用な薬剤の特性決定に使用可能な動物モデルとしては、コラーゲン誘発関節炎モデル（例えば、Kakimoto, Chin. Med. Sci. J. 6:78-83 (1991); Myers, Life Sci. 61:1861-78 (1997)参照）および抗コラーゲン抗体誘発関節炎モデル（例えば、Kakimoto, 前掲参照)が挙げられる。免疫疾患に適用可能な他の動物モデルとしては、実験的自己免疫性脳脊髄炎モデル（実験的アレルギー性脳脊髄炎モデルとも呼ばれる）、多発性硬化症の動物モデル；I型およびII型インターフェロン受容体に欠陥があり、かつ、組換え活性化遺伝子2に欠陥がAGR129マウスを使用する乾癬モデル(Zenz et al., Nature 437:369-75 (2005); Boyman et al., J. Exp. Med. 199:731-36 (2004)；2004年2月23日にオンライン発表）；および炎症性腸疾患のTNBS（2,4,6-トリニトロベンゼンスルホン酸）マウスモデルが挙げられる。心血管疾患では多くの動物モデルが利用可能であり、van Vlijmen et al., J Clin. Invest. 93:1403-10 (1994); Kiriazis et al., Annu. Rev. Physiol. 62:321-51 (2000); Babu et al., Methods Mol. Med. 112:365-77 (2005)に記載されているモデルを含む。
免疫障害および免疫疾患の治療
別の実施形態では、本明細書に記載の免疫疾患および免疫障害、特に炎症性疾患または炎症性障害、自己免疫疾患または自己免疫障害、心血管疾患または心血管障害、代謝性疾病または代謝性障害、あるいは増殖性疾患または増殖性障害を治療および／または予防する方法が提供される。このような治療を必要とする被験体としては、免疫疾患の症状を発症している、または免疫疾患を発症するリスクのあるヒトであっても、あるいは非ヒト霊長類または他の動物（すなわち、獣医学的使用）であってもよい。非ヒト霊長類および他の動物の例としては、限定されるものではないが、農場動物、ペットおよび動物園動物（例えば、ウマ、ウシ、スイギュウ、ラマ、ヤギ、ウサギ、ネコ、イヌ、チンパンジー、オランウータン、ゴリラ、サル、ゾウ、クマ、大型ネコ科など）が挙げられる。ある特定の実施形態では、本明細書に記載の抗体もしくはその抗原結合フラグメント、二重特異性抗体、融合ポリペプチド、RPTP Igドメインポリペプチド（単量体または多量体）、高分子、核酸、または他の薬剤と製薬上許容される賦形剤とを含む組成物が提供される。
本明細書に記載されているように、製薬上許容される担体と、LAR、RPTP-σおよびRPTP-δの少なくとも1つと特異的に結合する抗体またはその抗原結合フラグメントとを含む組成物を投与することにより、免疫疾患または免疫障害を有するか、または免疫疾患または免疫障害を発症するリスクがある被験体（宿主または患者）において免疫応答を変化させる（例えば、抑制または増強する）方法が提供される。特定の実施形態では、抗体またはその抗原結合フラグメントはA41Lまたは130LとRPTPの結合を阻害、回避またはそれと競合することができる。ある特定の実施形態では、この組成物はRPTP-σと特異的に結合する抗体またはその抗原結合フラグメントを含み、別の特定の実施形態では、組成物はRPTP-δと特異的に結合する抗体またはその抗原結合フラグメントを含む。また、製薬上許容される担体と、LAR、RPTP-σおよびRPTP-δの少なくとも2つ（例えば、LARとRPTP-σ、LARとRPTP-δ、RPTP-σとRPTP-δ）と特異的に結合する抗体（すなわち、少なくとも)またはその抗原結合フラグメントとを含む組成物を投与することにより、免疫疾患または免疫障害を有するか、または免疫疾患または免疫障害を発症するリスクがある被験体（宿主または患者）において免疫応答を変化させる（例えば、抑制または増強する）方法が提供される。特定の実施形態では、このような方法は被験体の免疫応答を抑制する。あるいは、この組成物はRPTPの3つ全てと特異的に結合する抗体またはその抗原結合フラグメントを含む。ある特定の実施形態では、この組成物は製薬上許容される担体と、LAR、RPTP-σおよびRPTP-δの3つ全てと結合する少なくとも1つの抗体を含む。他の実施形態では、この組成物は本明細書に記載のいずれか2つ以上の抗体またはその抗原結合フラグメントを含む。よって、免疫応答を変化させる（抑制または増強する）組成物は、LARと結合する少なくとも1つの抗体と、RPTP-σと結合する少なくとも1つの抗体と、RPTP-δと結合する少なくとも1つの抗体を含む。別の実施形態では、この組成物は、LARと結合する少なくとも1つの抗体と、RPTP-σおよびRPTP-δの双方と結合する少なくとも1つの抗体を含む。また、LAR、RPTP-σおよびRPTP-δのいずれか2つと結合する少なくとも1つの第一の抗体と、少なくとも1つの第一の抗体によっては特異的に認識されないRPTPと結合する少なくとも1つの第二の抗体を含む組成物も意図され、本明細書に記載される。
別の実施形態では、免疫疾患または免疫障害を治療する方法が提供され、この方法は、それを必要とする被験体に、製薬上好適な担体と、LAR、RPTP-σまたはRPTP-δの少なくとも1つの生物活性を変化させる、あるいはLAR、RPTP-σおよびRPTP-δの少なくとも2つまたは3つ全ての生物活性を変化させる薬剤を投与することを含む。本明細書に記載の薬剤（抗体またはその抗原結合フラグメント；小分子；アプタマー；アンチセンスポリヌクレオチド；small interfering RNA(siRNA)；ペプチド-IgFc融合ポリペプチドまたはペプチドIg定常領域ドメイン融合ポリペプチド；RPTP Ig様ドメインポリペプチド（単量体または多量体）およびRPTP Ig様ドメイン-Ig定常領域ドメイン融合ポリペプチドを含み、これらは全て本明細書に詳細に記載されている）は免疫疾患または免疫障害の治療に有用であり、少なくとも1つのRPTPの少なくとも1つの生物活性（機能）を変化させる（統計学的に有意に、または生物学的に有意に増強または低減する）ことができる。他の実施形態では、この薬剤は、LAR、RPTP-σおよびRPTP-δの少なくとも1つ、2つ、または3つ全ての少なくとも1つの生体を変化させる。本明細書に記載されているように、これらのタンパク質チロシンホスファターゼはチロシルリンタンパク質を脱リン酸化するとともに、タンパク質チロシンキナーゼは、細胞に組み込まれている動的な関係において可逆的なチロシンリン酸化を調節する。シグナル伝達経路の基質のチロシン残基のリン酸化および脱リン酸化の調節は、細胞成長、細胞増殖、代謝、分化および運動などの細胞プロセスの主要な制御機構である。従って、免疫疾患または免疫障害の治療に用いる薬剤は、(1)チロシルリン酸化基質を脱リン酸化する能力（すなわち、触媒活性に影響を及ぼす）；(2)細胞増殖に影響を及ぼす能力；(3)細胞代謝に影響を及ぼす能力；(4)細胞分化に影響を及ぼす能力；(5)細胞運動にに影響を及ぼす能力；および(6)同じシグナル伝達経路の別の成分の機能に影響を及ぼす能力を含む、LAR、RPTP-σおよびRPTP-δの少なくとも1つ、2つ、またはまたは3つ全てのいずれか1以上の生物活性または機能に影響を及ぼすか、または変化させることができる。
本明細書に記載の薬剤、組成物、抗体またはそのフラグメント、融合ポリペプチド、RPTP Igドメインポリペプチド、分子および方法は、免疫疾患または免疫障害の治療（すなわち、治癒、予防、症状の改善、または進行の遅延、阻害もしくは停止）に使用可能である。特定の疾病または障害は、医学分野の熟練者ならば容易に決定することができる有効力の特定の薬剤を投与することにより治療することができる。自己免疫疾患または炎症性障害のような疾病および障害としては、限定されるものではないが、多発性硬化症、関節リウマチ、全身性紅斑性狼瘡(SLE)、移植片対宿主病(GVHD)、敗血症、糖尿病、乾癬、アテローム性動脈硬化症、シェーグレン症候群、進行性全身性硬化症、硬皮症、急性冠動脈症候群、虚血性再潅流、クローン病、子宮内膜症、糸球体腎炎、重症筋無力症、特発性肺繊維症、喘息、急性呼吸窮迫症候群(ARDS)、脈管炎または炎症性自己免疫性筋炎が挙げられる。また、免疫障害または免疫疾患には、心血管疾患または心血管障害、代謝性疾病または代謝性障害、あるいは増殖性疾患または増殖性障害が含まれる。本明細書に記載の方法に従い、本明細書に記載の薬剤を用いて治療可能な心血管疾患または心血管障害としては、例えば、アテローム性動脈硬化症、心内膜炎、高血圧症または末梢虚血性疾患が挙げられる。免疫障害または免疫疾患でもある代謝性疾患としては、糖尿病、クローン病および炎症性腸疾患が挙げられる。増殖性疾患の例は癌である。
本明細書において患者（または被験体）は、免疫疾患または免疫障害を有する可能性のある、または罹患している可能性のある、あるいは検出可能な疾病が存在しない可能性のあるヒトをはじめとするいずれの動物であってもよい。よって、この治療は既存の疾病を有する被験体に投与してもよいし、あるいは疾病または症状を発症するリスクのある被験体に予防的に投与してもよい。
医薬組成物は無菌水溶液または非水溶液、懸濁液またはエマルションであってよく、さらに生理学上許容される賦形剤（製薬上許容されるまたは好適な賦形剤または担体）（すなわち、有効成分の活性を妨げない無毒な物質）を含む。このような組成物は固体、液体または気体（エーロゾル）の形態であってよい。あるいは、本明細書に記載の組成物は凍結乾燥品として処方してもよく、または当技術分野で公知の技術を用い、組成物をリポソームに封入してもよい。医薬組成物はまた、生物学的に活性であっても不活性であってもよい他の薬剤も含み得る。このような成分としては、限定されるものではないが、バッファー（例えば、中性緩衝生理食塩水またはリン酸緩衝生理食塩水）、炭水化物（例えば、グルコース、マンノース、スクロースまたはデキストラン）、マンニトール、タンパク質、ポリペプチドまたはグリシンなどのアミノ酸、抗酸化剤、EDTAまたはグルタチオンなどのキレート剤、安定剤、色素、香味剤および沈殿防止剤および／または保存剤が挙げられる。
本明細書に記載の組成物には、医薬組成物において当業者に公知の好適な賦形剤または担体を使用することができる。治療用の賦形剤は周知であり、例えば、Remingtons Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co. (A.R. Gennaro編 1985)に記載されている。一般に、賦形剤の種類は投与様式に基づいて選択される。医薬組成物は、例えば、局所投与、経口投与、鼻腔投与、くも膜下腔内投与、直腸投与、膣投与、眼内投与、結膜下投与、舌下投与または非経口投与（皮下、静脈内、筋肉内、胸骨内、空洞内、道内または尿道内注射または注入を含む）を含むいずれの適当な投与様式用にも処方することができる。非経口投与では、担体は好ましくは、水、生理食塩水、アルコール、油脂、ワックスまたはバッファーを含む。経口投与では、上記の賦形剤のいずれか、またはマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、タルク、セルロース、カオリン、グリセリン、デンプンデキストリン、アルギン酸ナトリウム、カルボキシメチルセルロース、エチルセルロース、グルコース、スクロースおよび／または炭酸マグネシウムなどの固形の賦形剤または担体が使用可能である。
医薬組成物（例えば、経口投与用または注射送達用）は、液体の形態であってもよい。液体医薬組成物は、例えば、次のうち1以上のもの：注射水、食塩水、好ましくは、生理食塩水、リンゲル液、等張性塩化ナトリウム、溶媒または懸濁媒として働き得る硬化油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコールまたは他の溶媒などの無菌希釈剤；抗菌剤；抗酸化剤；キレート剤；バッファー；および塩化ナトリウムまたはデキストロースなど、張力調整のための薬剤を含む得る。非経口製剤は、ガラスまたはプラスチック製のアンプル、使い捨てシリンジまたは多回用量バイアルに封入することができる。生理食塩水を用いるのが好ましく、注射用医薬組成物は無菌であることが好ましい。
LAR、PTP-σおよびRPTP-δの少なくとも1つと特異的に結合する抗体およびその抗原結合フラグメントおよび二重特異性抗体、小分子、核酸分子、RPTP Ig様ドメインポリペプチドならびにペプチドおよびポリペプチド融合タンパク質を含む本明細書に記載の薬剤は、徐放性または遅延放出用に処方することができる。このような組成物は一般に、周知の技術を用いて作製することができ、例えば経口投与、直腸投与または皮下移植により、あるいは所望の標的部位への埋植により投与することができる。徐放性製剤は担体マトリックス中に分散された、かつ／または速度制御膜に取り囲まれたリザーバー内に収容された薬剤を含み得る。このような製剤中に用いる賦形剤は生体適合性であり、生分解性でもあり、好ましくはこの製剤は比較的一定レベルの有効成分放出を提供する。徐放性製剤に含まれる有効成分の量は、放出の速度および予測時間、および治療または予防する症状の性質によって異なる。
免疫疾患または免疫障害を治療するための組成物の用量は、医学分野の熟練者に理解されているパラメーターに従って決定することができる。よって、適当な用量は患者（例えばヒト）の症状、すなわち、病期、全身の健康状態、ならびに年齢、性別、および体重、さらに医学分野の熟練者に公知の他の因子によって異なる。
医薬組成物は、医学分野の熟練者ににより決定された治療（または予防）する疾病に適当な様式で投与することができる。適当な用量、ならびに投与の好適な期間および頻度は、患者の症状、患者の疾病のタイプおよび重篤度、有効成分の特定の形態、ならびに投与方法などの因子によって決定される。一般に、適当な用量および治療計画は、治療的利益および／または予防的利益（例えば、完全緩解または部分緩解の頻度の増加、または無病状態および／または全体的生存率の長期化、または症状の重篤度の軽減）をもたらすに十分な量の組成物を提供する。予防的使用では、用量は免疫疾患または免疫障害を伴う疾病の予防、発症の遅延、または重篤度の軽減に十分なものでなければならない。
最適用量は一般に実験モデルおよび／または臨床試験を用いて決定することができる。最適用量は患者の体積、体重、または血液量によって異なる。一般に、1用量中に存在する、または1用量中に存在するDNAによりin situで生産される、本明細書に記載の抗体もしくはその抗原結合フラグメント、または融合ポリペプチド、またはRPTP Igドメインポリペプチドなどのポリペプチドの量は、宿主1kg当たり約0.01μg〜約1000μgの範囲である。有効な治療を提供するのに十分な最少容量を用いるのが通常好ましい。一般に、患者は、治療または予防する症状に好適なアッセイを用い、治療有効性または予防有効性に関してモノタリングすることができ、これらのアッセイは当業者に公知である。好適な用量は患者の大きさによって異なるが、一般には10〜60kgの被験体で約1ml〜約500mlの範囲である。
アプタマー、siRNA、アンチセンス、リボザイム、またはペプチド核酸を含む核酸分子である薬剤を含む医薬組成物では、核酸分子は、核酸を含む当業者に公知の様々な送達系、ならびに細菌発現系、ウイルス発現系および例えば本明細書で提供される組換え発現構築物などの哺乳類発現系のいずれに存在してもよい。DNAをこのような発現系に組み込む技術は当業者に周知である。また、このDNAは、例えばUlmer, Science 259:1745-49, 1993に記載され、Cohen, Science 259:1691-1692, 1993に概説されているように「裸」であってもよい。裸のDNAの取り込みは、細胞に効率的に送られる生分解性ビーズにDNAをコーティングすることにより高めることができる。
核酸分子は当技術分野に記載されているいくつかの方法のいずれか1つに従って細胞へ送達することができる（例えば、Akhtar et al., Trends Cell Bio. 2:139 (1992); Delivery Strategies for Antisence Oligonucleotide Therapeutics, Akhtar編, 1995, Maurer et al., Mol. Membr. Biol. 16:129-40 (1999); HoflandおよびHuang, Handb. Exp. Pharmacol. 137:165-92 (1999); Lee et al., ACS Symp. Ser. 752:184-92 (2000); 米国特許第6,395,713号;国際特許出願公開WO94/02595); Selbo et al., Int. J. Cancer 87:853-59 (2000); Selbo et al., Tumour Biol. 23:103-12 (2002); 米国特許出願公開第2001/0007666号および同第2003/077829号参照）。当業者に公知のこのような送達方法としては、限定されるものではないが、リポソームへの封入、イオン泳動によるもの、または生分解性ポリマー；ヒドロゲル；シクロデキストリン（例えば、Gonzalez et al., Bioconjug. Chem. 10:1068-74 (1999); Wang et al., 国際出願公開WO03/47518およびWO03/46185参照）；ポリ(乳酸-コ-グリコール酸)酸(PLGA)およびPLCAミクロスフェア（ペプチドおよびポリペプチドおよび他の物質の送達にも有用である）（例えば、米国特許第6,447,796号;米国特許出願公開第2002/130430号参照);生分解性ナノカプセル;および生体接着性ミクロスフェアなどの他のビヒクルへの組み込みによるもの、またはタンパク質性ベクター(国際出願公開WO00/53722)によるものが挙げられる。別の実施形態では、免疫細胞の免疫応答の変更（抑制または増強）に用いるため、また、免疫疾患または免疫障害を治療するための核酸分子はまた、ポリエチレンイミンおよび例えばポリエチレンイミン-ポリエチレングリコール-N-アセチルガラクトサミン(PEI-PEG-GAL)またはポリエチレンイミン-ポリエチレングリコール-トリ-N-アセチルガラクトサミン(PEI-PEG-triGAL)誘導体などのその誘導体ととともに処方することもできるし、それらと複合体を形成させることもできる（また、例えば、米国特許出願公開第2003/0077829号参照）。
本発明ではまた、免疫細胞の免疫応答性を変化させ（抑制または増強し）、免疫疾患または免疫障害を有するか、またはそれを発症するリスクのある被験体を治療するのに有用なを作製するための製造方法が提供される。一実施形態では、このような製造方法は、本明細書に記載され、当技術分野で実践されている方法に従い、(a)免疫細胞の免疫応答性を抑制する薬剤を同定することを含む。例えば、薬剤の同定は、(i)候補薬剤と；(ii)白血球共通抗原関連タンパク質(LAR)、RPTP-σおよびRPTP-δから選択される少なくとも1つの受容体様タンパク質チロシンホスファターゼ(RPTP)ポリペプチドを発現する免疫細胞と；(iii)A41Lとを、少なくとも1つのRPTPポリペプチドとA41Lおよび130Lなどのポックスウイルスポリペプチドの間の相互作用を可能とするのに十分な条件および時間で接触させることを含む。候補薬剤の存在下でポックスウイルスポリペプチドと免疫細胞の結合を測定し、候補薬剤の不在下でのポックスウイルスポリペプチドと免疫細胞の結合と比較し、候補薬剤の存在下でポックスウイルスポリペプチドと免疫細胞の結合が低下していれば、その候補薬剤が免疫細胞の免疫応答性を抑制することを示す。次に、薬剤の製造に関して当技術分野で公知の方法に従い、薬剤を製造する。
この薬剤は、例えば抗体またはその抗原結合フラグメント；二重特異性抗体；小分子；アプタマー；アンチセンスポリヌクレオチド；短い干渉RNA(small interfering RNA;siRNA)；RPTP Ig様ドメインポリペプチド（単量体または多量体）およびペプチド-IgFc融合ポリペプチドなどの本明細書に記載のいずれの薬剤であってもよい。特定の実施形態では、この薬剤は本明細書に記載の方法に従って製造され、大規模製造に応用され得る抗体またはその抗原結合フラグメントである。例えば、製造方法としては、適当な培養条件を維持するためにモニタリングおよび制御されるバッチ細胞培養が挙げられる。抗体またはその抗原結合フラグメントの精製は、本明細書に記載され、当業者に公知であり、かつ、国内外の規制当局の指針に沿った方法に従って行えばよい。
以下の実施例は本発明を説明するために示され、本発明の範囲を限定するものではない。
実施例１
A41Lと結合する免疫細胞で発現されたRPTPの同定
この実施例は、A41Lと結合する細胞表面ポリペプチドを同定する方法について記載する。
タンデムアフィニティー精製(TAP)法（TAPタグ法とも呼ばれる）のため、牛痘A41L融合ポリペプチドがコードされているポリヌクレオチドを含む組換え発現ベクターを構築した（また、例えば、Rigautら, Nat. Biotech. 17:1030-32 (1999); Puig, Methods 24:218-29 (2001); Knueselら, Mol. Cell. Proteomics 2:1225-33 (2003)も参照）。A41LCRFC と呼ばれる構築物を作製し、標準的な分子生物学およびアフィニティー精製技術・方法に従い、融合ポリペプチドを発現させ、単離した。構築物の模式図を図2に示す。このA41LCRFC構築物は、ヒト成長ホルモンリーダーペプチドのC末端と融合された牛痘ウイルス由来の成熟A41Lコード配列がコードされているヌクレオチド配列を含んでいた。このCRFCタンデムアフィニティータグをA41LのC末端に融合させた。このCRFCタグは、アミノ酸YPYDVDYA（配列番号67）のヒトインフルエンザウイルス血球凝集素ペプチドHAエピトープを含んでおり、これに対する抗体は市販されており、蛍光活性化セルソーター(FACS)または免疫ブロット法などの免疫化学法により発現融合ポリペプチドの検出が可能である。このHAエピトープのカルボキシル末端に、ヒトCタンパク質の重鎖に由来するアミノ酸EDQVDPRLIDGK（配列番号68）のCタンパク質タグを融合させた。このCタンパク質タグのカルボキシル末端にアミノ酸LEVLFQGP（配列番号69）のヒトライノウイルスHRV3Cプロテアーゼ部位を融合させ、このHRV3Cプロテアーゼ部位のカルボキシル末端にヒトIgGのFc部分のムテイン誘導体を融合させた。
TAPタグ法を示した模式図が図3にある。プロテインAと結合させた10μgのA41LCRFC融合ポリペプチドを、5x106単球から調製した細胞溶解液とともにインキュベートした。B細胞およびT細胞（活性化されたもの、および活性化されていないもの）、マクロファージ、上皮細胞、繊維芽細胞、ならびにRaji（B細胞リンパ腫)、THP-1（急性単球性白血病）およびJurkat（T細胞白血病）などの細胞系統をはじめ、種々の正常細胞種および腫瘍細胞種を用い、A41Lと結合または相互作用する細胞ポリペプチドを同定することができる。
A41LCRFC/細胞溶解物複合体を洗浄した後、HRV3Cプロテアーゼによる切断を行い、A41Lおよび会合しているタンパク質を遊離させた。遊離させたこのA41L/細胞溶解物複合体に塩化カルシウム(1M)を加え、その後、抗Cタンパク質タグアフィニティー樹脂に適用した。塩化カルシウムは抗CタグとCタグエピトープの相互作用に必要である。抗Cタンパク質タグアフィニティー樹脂に結合した複合体を塩化カルシウムを含むで洗浄した後、EGTAを用いたカルシウムキレート化により溶出させた。次に、この溶出液をトリプシンで消化し、消化されたA41l複合体に対して直接タンデム質量分析を行い、A41Lおよびその会合タンパク質を同定した。
トリプシンにより生じたペプチドの配列を質量分析により確認した。それぞれ図4A、4Bおよび4Cに示されるように、これらのペプチドは受容体様タンパク質チロシンホスファターゼであるLAR、RPTP-σおよびRPTP-δの一部であることが確認された。
実施例2
A41L-Fc融合ポリペプチドの作製
この実施例は、A41L-Fc融合ポリペプチドおよびA41L-ムテインFc融合ポリペプチドの発現のための組換え発現ベクターの作製について記載する。
分子生物学分野の熟練者が通常実践している方法に従い、組換え発現ベクターを作製した。A41L-FcをコードしているポリヌクレオチドおよびA41L-ムテインFcをコードしているポリヌクレオチドをベクターpDC409の多重クローニング部位にクローニングした（例えば、米国特許第6,512,095号および米国特許第6,680,840号、ならびにそこに引用されている参照文献参照）。A41L-Fcポリペプチドのアミノ酸配列は配列番号74で示され、A41L-ムテインFcポリペプチドのアミノ酸配列を配列番号73で示される（図5参照）。ムテインFc(ヒトIgG1)ポリペプチド(配列番号77)をコードしているヌクレオチド配列は配列番号78で示される。各発現プラスミド10〜20μgを、直径10cm系の標準的な組織培養プレートでおよそ80%の集密度まで増殖させたHEK293T細胞またはCOS-7細胞(American Type Tissue Collection (ATCC), Manassas, VA)にトランスフェクトした。トランスフェクションはLipofectamine（商標）Plus（商標）(Invitrogen Corp., Carlsbad, CA)を用いて行った。トランスフェクトされた細胞を48時間培養した後、細胞培養物の上清を採取した。A41L融合タンパク質は、標準的な手順に従い、プロテインAセファロースアフィニティークロマトグラフィーにより精製した。
実施例3
ヤバ様(Yaba-like)病ウイルス130Lと結合する免疫細胞で発現されたRPTPの同定
この実施例は、130Lと結合する細胞表面ポリペプチドを同定する方法について記載する。
実施例1に記載したようにタンデムアフィニティー精製(TAP)法（TAPタグ法とも呼ばれる）のために、130L融合ポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを含む組換え発現ベクターがコードされているポリヌクレオチドを含む組換え発現ベクターを構築した。この構築物を作製し、標準的な分子生物学およびアフィニティー精製技術・方法に従い、融合ポリペプチドを発現させ、単離した。
この130Lタンデムアフィニティータグ構築物は、ヒト成長ホルモンシグナルペプチドアミノ酸配列のC末端(MATGSRTSLLLAFGLLCLPWLQEGSA)（配列番号153）をコードしているヌクレオチド配列に融合されたYLDV由来の成熟130Lアミノ酸配列をコードしているヌクレオチド配列を含んでいた（すなわち、130Lをコードしているヌクレオチド配列の5'末端がシグナルペプチドをコードしているヌクレオチド配列の3'末端に融合されている）。
このタンデムアフィニティータグを130LのC末端に融合させた。このタグはアミノ酸YPYDVDYA（配列番号141）のヒトインフルエンザウイルス血球凝集素ペプチドHAエピトープを含んでおり、これに対する抗体は市販されており、蛍光活性化セルソーター(FACS)または免疫ブロット法などの免疫化学法により発現融合ポリペプチドの検出が可能である。このHAエピトープのカルボキシル末端に、ヒトCタンパク質の重鎖に由来するアミノ酸EDQVDPRLIDGK（配列番号142）のCタンパク質タグを融合させた。このCタンパク質タグのカルボキシル末端にアミノ酸LEVLFQGP（配列番号143）のヒトライノウイルスHRV3Cプロテアーゼ部位を融合させ、このHRV3Cプロテアーゼ部位のカルボキシル末端にヒトIgGのFc部分のムテイン誘導体を融合させた（例えば、配列番号146）。
組換え発現した130L融合ポリペプチド10μgをプロテインAアフィニティーマトリックスに結合させた。プロテインAと結合した130L融合ポリペプチドを5x106単球から調製した細胞溶解液とともにインキュベートした。B細胞およびT細胞（活性化されたもの、および活性化されていないもの）、マクロファージ、上皮細胞、繊維芽細胞、ならびにRaji（B細胞リンパ腫)、THP-1（急性単球性白血病）およびJurkat（T細胞白血病）などの細胞系統をはじめ、種々の正常細胞種および腫瘍細胞種を用い、130Lと結合または相互作用する細胞ポリペプチドを同定することができる。
130L融合ポリペプチド/細胞溶解物複合体を洗浄した後、HRV3Cプロテアーゼによる切断を行い、130Lおよび会合しているタンパク質を遊離させた。遊離させたこの130L/細胞溶解物複合体に塩化カルシウム(1M)を加え、その後、抗Cタンパク質タグアフィニティー樹脂に適用した。塩化カルシウムは抗CタグとCタグエピトープの相互作用に必要である。抗Cタンパク質タグアフィニティー樹脂に結合した複合体を塩化カルシウムを含むで洗浄した後、EGTAを用いたカルシウムキレート化により溶出させた。次に、この溶出液をトリプシンで消化し、消化された130L複合体に対して直接タンデム質量分析を行い、130Lおよびその会合タンパク質を同定した。
トリプシンにより生じたペプチドの配列を質量分析により確認した。それぞれ図7A、7Bおよび7Cに示されるように、これらのペプチドは受容体様タンパク質チロシンホスファターゼ、LAR、RPTP-σ及びRPTP-δの一部であることが確認された。
実施例4
LAR(Igドメイン)-Fc融合タンパク質による非接着性PBMCにおけるIFN-γの誘導
この実施例は、異種ドナー細胞の存在下および不在下での末梢血単核細胞(PBMC)におけるIFN-γの生産について記載する。
LAR-Fc融合タンパク質発現用の組換え発現ベクターを、分子生物学分野の熟練者が通常実践している方法に従って作製した。LARの第一の免疫グロブリン様ドメイン(Ig-1)、第二の免疫グロブリン様ドメイン(Ig-2)および第三の免疫グロブリン様ドメイン(Ig-3)をコードしているヌクレオチド配列を、Fcムテインポリペプチドをコードしているヌクレオチド配列にフレーム内で融合させた。このFcムテインポリペプチドはヒトIgG1免疫グロブリンに由来するものであった。この発現構築物を細胞にトランスフェクトし、発現された融合ポリペプチドを細胞上清からプロテインAアフィニティークロマトグラフィーにより単離した。
新しく採取した全血から、当技術分野の標準法に従って、ヒトPBMCを単離した。このPBMCを、組織培養フラスコの2%ヒト血清を含むRPMI中に2時間置いた後、非接着性細胞を含む細胞培養上清をゆっくり取り出すことで、PBMCの非接着性PBMCを富化した。次に、非接着性細胞(2x105)を単独で、2種類の異種ドナー(Do476およびDo495)の各々から104の単球由来樹状細胞を含む、0.8、4、20および100μg/mlのLAR-FcまたはヒトIgGでの混合リンパ球反応液中で培養した。18時間後、非接着性PBMCによるIFN-γの産生を測定により求めた。細胞上清中のIFN-γの濃度をELISA (DuoSet ELISA Human IFN-γ, カタログ番号D6285, R & D Systems, Minneapolis, MN)により測定した。図8に示すように、LAR-Fc融合タンパク質は、混合リンパ球反応液で非接着性PBMCによるIFN-γの分泌を促進した(図8Bおよび8C)。さらに、LAR-Fcで処理した非接着性PBMCは、抗原刺激がなくてもIFN-γを産生した(図8A)。
実施例5
LAR(Igドメイン)-Fc融合タンパク質のゲル濾過クロマトグラフィー
この実施例は、LAR Ig1-Ig2-Ig3-Fc (LAR-Fc)融合ポリペプチドのサイズ排除クロマトグラフィー分離について記載する。
LAR-Fc融合ポリペプチドは実施例4に記載の通りに作製した。次に、この融合ポリペプチドを、ゲル濾過カラムを用いてHPLCにより分析し、この融合ポリペプチドの推定分子量を得た。溶出プロフィールを図9に示す。このポリペプチドの見掛けの分子量は、その溶出時間（分）を標準分子量マーカーポリペプチドの溶出時間と比較することにより求めた。ゲル濾過法による推定分子量はおよそ260,000ダルトンであった。このLAR-Fc融合ポリペプチドは2つのFcポリペプチド間の相互作用のために二量体を形成すると考えられ、計算分子量は140,000ダルトンである。これらのデータは、融合ポリペプチドのStokeの半径が、融合ポリペプチド二量体が球形構造を有していた場合に予測されるものよりも大きいことを示唆する。特定の理論に縛られるわけではないが、この2つのLAR Fc融合ポリペプチドの各々のIgドメインは、2つの融合ポリペプチドのFc部分間の相互作用とは独立かつ異なって、互いに相互作用して二量体構造を形成する可能性がある。
実施例6
A41LとLAR Igドメインの間の相互作用
この実施例は、A41LとLARの免疫グロブリン様ドメインの間の相互作用について記載する。
LAR-Fc融合ポリペプチドの発現用の組換え発現ベクターを、標準的な分子生物学的技術を用い、実施例2に記載の通りに作製した。この融合ポリペプチドはTAP-Fc融合ポリペプチド、すなわち、第一、第二および第三の免疫グロブリン様ドメインをTAP配列とともに含む融合ポリペプチドを含んでおり、ヒトIgGFcポリペプチド配列(LAR Ig1-2-3-tapFC)；TAP-Fcと融合されたLARの第一の免疫グロブリン様ドメインからなる融合ポリペプチド(LAR Ig1-tapFC)；およびTAP-Fcに融合された第一および第二の免疫グロブリン様ドメインからなる融合ポリペプチド(LAR Ig1-Ig2-tapFC)を含んでいた。このTAP構築物を293-T17細胞で発現させた。LAR Ig1-Ig2-tapFCをコードしているこの発現ベクターでトランスフェクトされた細胞は融合ポリペプチドを発現しなかった。また、純粋なLAR Ig1-Ig2-Ig3-Fc融合ポリペプチドとP35-FCポリペプチド（非RPTP、非A41Lポリペプチド対照）を含んでいた。
免疫沈降反応を行った。上記の各TAP-Fc融合ポリペプチドをコードしている組換え発現構築物で細胞をトランスフェクトし、培養し、細胞上清を採取した。これらの上清を精製したA41Lポリペプチド（単量体）と合わせ、プロテインA結合ビーズを加えた。対照として含まれるP35-FCおよびLAR Ig1-Ig2-Ig3-Fc融合ポリペプチドは純粋なポリペプチドであり、精製A41Lとともにインキュベートした。次に、これらの融合ポリペプチドを免疫沈降物から単離し、SDS-PAGEを行った。LAR融合ポリペプチドと結合したA41Lの存在を免疫ブロット法により分析した。結果を図10に示す。LAR融合ポリペプチドと結合したA41Lは3つ全ての免疫グロブリン様ドメインを含んでいたが、LAR Ig1-tapFC融合ポリペプチドとは結合しなかった。
以上のことから、例示を目的に本発明の特定の実施形態を記載したが、本発明の精神および範囲から逸脱することなく様々な改変が行えると考えられる。当業者ならば、本明細書に記載の発明の特定の実施形態に対する多くの均等物を認識し、または通常の実験だけを用いて確認することができるであろう。このようか均等物は特許請求の範囲に含まれるものとする。
RPTP-σ（配列番号29）、RPTP-δ（配列番号37）およびLAR（配列番号25）のアミノ酸配列のアライメントを示す。このアライメントでは、各RPTPのリーダーペプチド配列、免疫グロブリン様ドメイン（第一のIgドメイン、第二のIgドメイン、第三のIgドメイン）；フィブロネクチンIIIリピート領域(FNIII)；トランスメンブラン領域（TM領域）；およびホスファターゼドメイン(D1およびD2)がマークされている。各領域の最初のアミノ酸が太字で示されている。各ホスファターゼのプロテアーゼ切断部位が下線で示されている。同一領域のアミノ酸は「*」で示され、類似領域のアミノ酸はドットで示されている。このアライメントはCLUSTALWプログラム(Thompsonら, Nucleic Acids Res. 22:4673-80 (1991))および「GeneDoc」(Nicholasら, EMBNEW News 4:14 (1991))を用いて作成されたものである。 RPTP-σ（配列番号29）、RPTP-δ（配列番号37）およびLAR（配列番号25）のアミノ酸配列のアライメントを示す（図1Aの続き）。 RPTP-σ（配列番号29）、RPTP-δ（配列番号37）およびLAR（配列番号25）のアミノ酸配列のアライメントを示す（図1Bの続き）。 RPTP-σ（配列番号29）、RPTP-δ（配列番号37）およびLAR（配列番号25）のアミノ酸配列のアライメントを示す（図1Cの続き）。 RPTP-σ（配列番号29）、RPTP-δ（配列番号37）およびLAR（配列番号25）のアミノ酸配列のアライメントを示す（図1Dの続き）。 RPTP-σ（配列番号29）、RPTP-δ（配列番号37）およびLAR（配列番号25）のアミノ酸配列のアライメントを示す（図1Eの続き）。 タンデムアフィニティー精製(TAP)に用いられる融合ポリペプチドの発現のための組換え発現構築物(A41LCRFC)によりコードされるA41L融合ポリペプチドの概略図を示す。コードされている融合ポリペプチドは、そのアミノ末端でヒト成長ホルモンリーダーペプチド(GHリーダー)のカルボキシ末端に融合された牛痘ウイルス由来の成熟A41Lを含む。タンデムアフィニティータグ(CRFC)はA41Lのカルボキシ末端に融合され、ヒトタンパク質Cの重鎖に由来するタンパク質C-TAG（EDQVDPRLIDGK（配列番号68））と同位相で(in frame)ヒトインフルエンザウイルス血球凝集素(HA)エピトープ（YPYDVDYA、配列番号67）；ヒトライノウイルスHRV3Cプロテアーゼ部位（HRV3C切断部位）（LEVLFQGP（配列番号69））；およびヒトIgG免疫グロブリンのFc部分のムテイン誘導体（ムテインFC）を含んでいた。 A41Lと結合する細胞ポリペプチドを同定するためのTAP手順の概略図を示す。 A41Lを用いたタンデムアフィニティー精製(TAP)により同定されたLAR、RPTP-δおよびRPTP-σのペプチドを示す。図４Ａは、TAP後にLC/MS/MSにより同定されたLAR内のペプチド配列（配列番号70）を示す（太字）。 A41Lを用いたタンデムアフィニティー精製(TAP)により同定されたLAR、RPTP-δおよびRPTP-σのペプチドを示す。図４Ｂは、TAP後にLC/MS/MSにより同定されたRPTP-σ内のペプチド配列（配列番号71）を示す（太字）。 A41Lを用いたタンデムアフィニティー精製(TAP)により同定されたLAR、RPTP-δおよびRPTP-σのペプチドを示す。図４Ｃは、TAP後にLC/MS/MSにより同定されたRPTP-δ内のペプチド配列（配列番号72）を示す（太字）。 (i)A41Lシグナルペプチド配列、A41LポリペプチドおよびヒトIgG1Fcポリペプチド(A41L/Fc)を含むA41L/Fc融合ポリペプチド（配列番号74）と、(ii)ヒト成長ホルモンシグナルペプチド配列、A41Lポリペプチド変異体およびムテインFcポリペプチド(A41L/ムテインFc)を含むA41L/ムテインFc融合ポリペプチド（配列番号73）の間のアミノ酸配列アライメントを示す。コンセンサス配列（配列番号75）も示されている。垂直の点線はA41Lポリペプチドのアミノ末端とカルボキシ末端を示す。 ヤバ様病ウイルス(YLDV)由来の130Lポリペプチド(GenBank受託番号CAC21368.1)（配列番号85）と牛痘ウイルス由来のA41L（配列番号87）(GenBank受託番号AAM13618)のアミノ酸配列のアライメントを示す。 ヤバ様病ウイルス130Lを用いたタンデムアフィニティー精製(TAP)により同定されたLAR、RPTP-δおよびRPTP-σのペプチドを示す。図７Ａは、TAP後にLC/MS/MSにより同定されたLAR内のペプチド配列（配列番号155）を示す（太字および下線）。 ヤバ様病ウイルス130Lを用いたタンデムアフィニティー精製(TAP)により同定されたLAR、RPTP-δおよびRPTP-σのペプチドを示す。図７Ｂは、TAP後にLC/MS/MSにより同定されたRPTP-σ内のペプチド配列（配列番号156）を示す（太字および下線）。 ヤバ様病ウイルス130Lを用いたタンデムアフィニティー精製(TAP)により同定されたLAR、RPTP-δおよびRPTP-σのペプチドを示す。図７Ｃは、TAP後にLC/MS/MSにより同定されたRPTP-δ内のペプチド配列（配列番号157）を示す（太字および下線）。 白血球共通抗原関連タンパク質-ヒトFcコンジュゲート(Lar-hFc)の存在下での非接着性末梢血単核細胞(PBMC)におけるインターフェロン-ガンマ(IFN-γ)の産生を示す。図８Ｂおよび８Ｃは、Lar-hFcの存在下での混合リンパ球反応(MLR)におけるIFN-γ産生のレベルを示す。ドナーDo476（図８Ｂ）由来および第二のドナーDo495（図８Ｃ）由来の単球由来樹状細胞(104)を、非接着性PBMCと合わせ、これにLar-hFcを種々の濃度で加えた。IFN-γの産生をELISAで測定した。対照としてヒトIgGを示されている濃度で加えた。 ゲル濾過HPLCカラムに載置したLAR Ig-1-Ig-2-Ig-3-Fc融合ポリペプチドの溶出プロフィールを示す。 ヒトIgG Fcと融合されたLAR-Igドメイン構築物の免疫ブロットをA41lLと合わせたものを示す。複合体をプロテインAを用いた免疫沈降により単離した。LAR-Ig-Fc構築物のFc部分は抗Fc抗体を用いて検出し（図１０Ａ）、A41Lの存在は抗A41L抗体を用いた免疫ブロット法により測定した（図１０Ｂ）。

Claims (35)

  1. (a)(i)白血球共通抗原関連タンパク質(LAR)；(ii)RPTP-σ；および(iii)RPTP-δから選択される少なくとも2つの受容体様タンパク質チロシンホスファターゼ(RPTP)ポリペプチドと特異的に結合し、かつ、(b)ポックスウイルスポリペプチドと該少なくとも2つのRPTPポリペプチドとの結合を競合的に阻害する、単離された抗体またはその抗原結合フラグメント。
  2. 免疫細胞の細胞表面に存在する少なくとも1つの受容体様タンパク質チロシンホスファターゼ(RPTP)と特異的に結合し、該少なくとも1つのRPTPはRPTP-σまたはRPTP-δであり、該抗体またはその抗原結合フラグメントと免疫細胞の細胞表面上に存在する該RPTPとの結合が免疫細胞の免疫応答性を抑制する、単離された抗体またはその抗原結合フラグメント。
  3. 前記抗体がポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体である、請求項１または２のいずれか一項に記載の抗体。
  4. 前記抗原結合フラグメントがF(ab´)2、Fab´、Fab、Fd、Fvおよび単鎖Fv(scFv)から選択される、請求項１または２のいずれか一項に記載の抗原結合フラグメント。
  5. ポックスウイルスポリペプチドがA41Lまたはヤバ様病ウイルス130Lのいずれかである、請求項１または請求項２のいずれか一項に記載の抗体。
  6. (a)受容体様タンパク質チロシンホスファターゼ(RPTP)と特異的に結合し得る第一の抗原結合部分であって、ここで該RPTPは、(i)白血球共通抗原関連タンパク質(LAR)；(ii)RPTP-σ；および(iii)RPTP-δから選択される、該第一の抗原結合部分と、(b)RPTPと特異的に結合し得る第二の抗原結合部分であって、ここで該RPTPは、(i)白血球共通抗原関連タンパク質(LAR)；(ii)RPTP-σ；および(iii)RPTP-δから選択される、該第二の抗原結合部分とを含み、該第一の抗原結合部分と第二の抗原結合部分が異なり、免疫細胞の免疫応答性を抑制する、二重特異性抗体。
  7. (a)第一の受容体様タンパク質チロシンホスファターゼ(RPTP)の免疫グロブリン様ドメイン2ポリペプチド；(b)第二のRPTPの免疫グロブリン様ドメイン3ポリペプチド；および(c)免疫グロブリンFcポリペプチドまたはそのムテインを含み、該第一のRPTPおよび第二のRPTPのそれぞれが、(i)白血球共通抗原関連タンパク質(LAR)；(ii)RPTP-σ；および(iii)RPTP-δから選択され、該第一と第二のRPTPが同一または異なるものである、融合ポリペプチド。
  8. 前記第一のRPTPと前記第二のRPTPが同一である、請求項７に記載の融合ポリペプチド。
  9. 前記第一のRPTPがRPTP-δであり、前記第二のRPTPがRPTP-σであって、前記融合ポリペプチドがRPTP-σの免疫グロブリン様ドメイン1ポリペプチドをさらに含むか；あるいは前記第一のRPTPがRPTP-δであり、前記第二のRPTPがRPTP-δであって、前記融合ポリペプチドがRPTP-δの免疫グロブリン様ドメイン1ポリペプチドをさらに含む、請求項７に記載の融合ポリペプチド。
  10. (a)第一の受容体様タンパク質チロシンホスファターゼ(RPTP)の少なくとも1つの免疫グロブリン様ドメイン2ポリペプチドと(b)第二のRPTPの少なくとも1つの免疫グロブリン様ドメイン3ポリペプチドとを含み、該第一と第二のRPTPが同一または異なり、(i)白血球共通抗原関連タンパク質(LAR)；(ii)RPTP-σ；および(iii)RPTP-δから選択される、組成物。
  11. 前記第一のRPTPと前記第二のRPTPが同一である、請求項１０に記載の組成物。
  12. 前記第一のRPTPがRPTP-δであり、前記第二のRPTPがRPTP-σであって、前記組成物がRPTP-σの免疫グロブリン様ドメイン1ポリペプチドをさらに含むか；あるいは前記第一のRPTPがRPTP-δであり、前記第二のRPTPがRPTP-δであって、前記組成物がRPTP-δの免疫グロブリン様ドメイン1ポリペプチドδをさらに含む、請求項１０に記載の組成物。
  13. ポリペプチド二量体を含む組成物であって、該ポリペプチド二量体が、(a)第一の受容体様タンパク質チロシンホスファターゼ(RPTP)の免疫グロブリン様ドメイン2ポリペプチドと免疫グロブリン様ドメイン3ポリペプチドを含む第一の単量体と、(b)第二のRPTPの免疫グロブリン様ドメイン2ポリペプチドと免疫グロブリン様ドメイン3ポリペプチドを含む第二の単量体を含み、ここで該第一と第二のRPTPは同一または異なり、かつ、(i)白血球共通抗原関連タンパク質(LAR)；(ii)RPTP-σ；および(iii)RPTP-δから選択される、前記組成物。
  14. 前記第一のRPTPと前記第二のRPTPが異なるものである、請求項１３に記載の組成物。
  15. 前記第一のRPTPと前記第二のRPTPが同一である、請求項１３に記載の組成物。
  16. 前記第一の単量体が前記第一のRPTPの免疫グロブリン様ドメイン1を含み、前記第二の単量体が前記第二のRPTPの免疫グロブリン様ドメイン1を含む、請求項１３に記載の組成物。
  17. 前記第一の単量体が免疫グロブリンFcポリペプチドと融合され、前記第二の単量体が免疫グロブリンFcポリペプチドと融合されている、請求項１３に記載の組成物。
  18. 製薬上好適な賦形剤をさらに含む、請求項１０または請求項１３のいずれか一項に記載の組成物。
  19. ムテインFcポリペプチドと融合されたポックスウイルスポリペプチドを含む融合ポリペプチドであって、該ムテインFcポリペプチドが、少なくとも1つの突然変異を含むヒトIgG1免疫グロブリンのFc部分のアミノ酸配列を含み、該少なくとも1つの突然変異がヒンジ領域におけるシステイン残基の置換または欠失であり、この置換または欠失したシステイン残基が、野生型ヒトIgG1免疫グロブリンFc部分のヒンジ領域のアミノ末端に最も近いシステイン残基であり、該ポックスウイルスポリペプチドが、(i)白血球共通抗原関連タンパク質(LAR)；(ii)RPTP-σ；および(iii)RPTP-δから選択される受容体様タンパク質チロシンホスファターゼ(RPTP)と結合し得る、前記融合ポリペプチド。
  20. 前記ムテインFcポリペプチドは少なくとも1つの第二の突然変異を含み、前記少なくとも1つの第二の突然変異は、融合ポリペプチドのIgG Fc受容体結合能が低下するようなCH2ドメインにおける少なくとも1つのアミノ酸の置換である、請求項１９に記載の融合ポリペプチド。
  21. 請求項７または１９のいずれか一項に記載の融合ポリペプチドと製薬上好適な賦形剤とを含む、組成物。
  22. (a)請求項1または2のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合フラグメントと、(b)製薬上好適な賦形剤とを含む、組成物。
  23. 請求項６に記載の二重特異性抗体と製薬上好適な賦形剤とを含む、組成物。
  24. 被験体において免疫応答を抑制する方法であって、被験体に請求項１８に記載の組成物を投与することを含む、前記方法。
  25. 被験体において免疫応答を抑制する方法であって、被験体に請求項２１に記載の組成物を投与することを含む、前記方法。
  26. 被験体において免疫応答を抑制する方法であって、被験体に請求項２２に記載の組成物を投与することを含む、前記方法。
  27. 被験体において免疫応答を抑制する方法であって、被験体に請求項２３に記載の組成物を投与することを含む、前記方法。
  28. 被験体において免疫疾患または免疫障害を治療する方法であって、被験体に請求項１８に記載の組成物を投与することを含む、前記方法。
  29. 被験体において免疫疾患または免疫障害を治療する方法であって、被験体に請求項２１に記載の組成物を投与することを含む、前記方法。
  30. 被験体において免疫疾患または免疫障害を治療する方法であって、被験体に請求項２２に記載の組成物を投与することを含む、前記方法。
  31. 被験体において免疫疾患または免疫障害を治療する方法であって、被験体に請求項２３に記載の組成物を投与することを含む、前記方法。
  32. 請求項１または２のいずれか一項に記載の抗体を作製するための製造方法。
  33. 請求項６に記載の二重特異性抗体を作製するための製造方法。
  34. 請求項７または１９のいずれか一項に記載の融合ポリペプチドを作製するための製造方法。
  35. 請求項１０または１３のいずれか一項に記載の組成物を作製するための製造方法。
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