CN108368510A - 特异性结合人cd40的激动性抗体和使用方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及特异性结合人CD40的激动性抗体、编码该抗体或抗原结合片段的多核苷酸、以及制备和使用前述物质的方法。

Description

特异性结合人CD40的激动性抗体和使用方法
技术领域
本发明涉及特异性结合人CD40的激动性抗体、编码该抗体或抗原结合片段的多核苷酸、以及制备和使用前述物质的方法。
背景技术
细胞表面CD40分子是肿瘤坏死因子受体超家族(TNFR)的成员以及先天性和适应性免疫应答两者中的关键调节因子。CD40在人抗原递呈细胞，特别是B细胞、树突细胞和巨噬细胞，以及成纤维细胞、平滑肌细胞、内皮细胞和上皮细胞上表达。CD40也在广泛范围的肿瘤细胞，包括所有的B淋巴瘤，30-70％的实体瘤、黑素瘤和癌上表达。
CD40的天然配体(命名为CD154或CD40L)主要在活化T淋巴细胞和血小板上表达。CD40与CD40L在T细胞上的相互作用包括体液和细胞介导的免疫应答。CD40调节该配体-受体对来活化B细胞以及包括树突细胞(DC)在内的其它抗原递呈细胞(APC)，从而驱动T细胞活化。例如，B细胞上CD40的活化诱导B细胞增殖，体细胞超变，分化为抗体分泌细胞并且在次级淋巴器官中的生发中心同种型转换。体外研究已经显示CD40活化对细胞因子产生(例如IL-6、IL-10、IL-12、TNF-α)，粘附分子和协同刺激受体(例如ICAM、CD23、CD80和CD86)的表达，以及B淋巴细胞对I类MHC、II类MHC和TAP转运蛋白提高的表达的直接影响。
CD40抗体可经由各种机制(包括抗原递呈细胞的活化)诱发其抗肿瘤作用，从而导致肿瘤特异性细胞毒性T淋巴细胞和自然杀伤细胞(NK细胞)的活性增大，或直接抗体介导的肿瘤细胞凋亡或CD40阳性肿瘤的细胞毒性。然而，抗CD40抗体的全身给药也与不良副作用诸如细胞因子释放综合征相关。
因此，需要一种改善的抗CD40抗体用于癌症治疗和免疫应答的增强。
发明内容
本发明提供一种特异性结合SEQ ID NO:75的人CD40的分离的激动性抗体。
本发明还提供一种特异性结合人CD40的分离的激动性抗体，其中抗体就其激动活性而言需要交联。
本发明还提供一种特异性结合人CD40的分离的激动性抗体，其包含如本文所述的特定VH、VL、HCDR、LCDR、重链或轻链序列。
本发明还提供一种药物组合物，其包含本发明的抗体以及药学上可接受的载体。
本发明还提供一种编码本发明的抗体VH、抗体VL、抗体VH与抗体VL、抗体重链、抗体轻链、或抗体重链与抗体轻链的多核苷酸。
本发明还提供一种包含本发明的多核苷酸的载体。
本发明还提供一种包含本发明的载体的宿主细胞。
本发明还提供一种制备本发明抗体的方法，该方法包括在表达抗体的条件下培养本发明的宿主细胞，并且回收宿主细胞产生的抗体。
本发明还提供一种治疗受试者的癌症的方法，该方法包括以足以治疗癌症的时间向对其有需要的受试者施用治疗有效量的本发明的分离的抗体或本发明的药物组合物。
本发明还提供一种增强受试者的免疫应答的方法，该方法包括以足以增强免疫应答的时间向对其有需要的受试者施用治疗有效量的本发明的分离的抗体或本发明的药物组合物。
本发明还提供一种特异性结合本发明抗体的抗独特型抗体。
本发明还提供一种包含本发明抗体的试剂盒。
附图说明
图1A示出特异性结合人CD40的抗体以交联依赖性方式活化B细胞。B细胞活化被测为在不存在交联剂时增加的CD23表面表达。M9是指抗体C40M9等。对照：CP-870,893。
图1B示出特异性结合人CD40的抗体以交联依赖性方式活化B细胞。B细胞活化被测为在存在交联剂时增加的CD23表面表达。M9是指抗体C40M9等。对照：CP-870,893。
图1C示出特异性结合人CD40的抗体以交联依赖性方式活化B细胞。B细胞活化被测为在不存在交联剂时增加的HLA-DR表面表达。M9是指抗体C40M9等。对照：CP-870,893。
图1D示出特异性结合人CD40的抗体以交联依赖性方式活化B细胞。B细胞活化被测为在存在交联剂时增加的HLA-DR表面表达。M9是指抗体C40M9等。对照：CP-870,893。
图2A示出特异性结合人CD40的抗体以交联依赖性方式活化树突细胞(DC)。DC活化被测为在不存在交联剂时增加的CD83表面表达。M9是指抗体C40M9等。对照：CP-870,893。
图2B示出特异性结合人CD40的抗体以交联依赖性方式活化树突细胞(DC)。DC活化被测为在存在交联剂时增加的CD83表面表达。M9是指抗体C40M9等。对照：CP-870,893。
图2C示出特异性结合人CD40的抗体以交联依赖性方式活化树突细胞(DC)。DC活化被测为在不存在交联剂时增加的HLA-DR表面表达。M9是指抗体C40M9等。对照：CP-870,893。
图2D示出特异性结合人CD40的抗体以交联依赖性方式活化树突细胞(DC)。DC活化被测为在存在交联剂时增加的HLA-DR表面表达。M9是指抗体C40M9等。对照：CP-870,893。
图3示出C40M9(C40H43；SEQ ID NO:60)和人种系IGHV4-39*01(SEQ ID NO:73；如图中示为IGHV4-39)的VH的残基1-98的氨基酸比对。HCDR1和HCDR2氨基酸标有下划线。C40M9和IGHV4-39*01框架的差异在于3个氨基酸。
图4示出C40M18(C40L64；SEQ ID NO:66)和人种系IGLV3-1(SEQ ID NO:86)的残基1-94VL的氨基酸比对。LCDR1和LCDR2氨基酸序列标有下划线。C40M18框架与IGLV3-1的差异在于2个氨基酸。
图5示出了与CD40复合的C40M126的晶体结构。
图6示出C40B126表位和互补位残基的草图。CD40残基根据SEQ ID NO:75进行编号。C40M126VH和VL残基分别根据SEQ ID NO:62和69进行编号。
图7示出C40M126在与对照抗体CP-870,893比较时更有效的活化树突细胞，并且C40M9具有最小的交联非依赖性激动作用。DC活化被测为在不存在交联剂时增加的HLA-DR表面表达。M9是指抗体C40M9，并且M126是指抗体C40M126。对照：CP-870,893。
图8示出了给予10mg/ml对照抗体CP-870,893的动物中的血小板计数瞬时降低，而给予C40M9或C40M126并未导致血小板计数降低。示出了每组两只独立动物的结果。
图9示出相比于给予C40M9或C40M126的动物，用10mg/ml对照抗体CP-870,893处理的动物中IL-6的产量(pg/ml)增大。示出了每组两只独立动物的结果。
具体实施方式
本说明书中所引用的所有出版物，包括但不限于专利和专利申请均以引用方式并入本文，如同在本文中完整给出。
应当了解，本文所用的术语只是为了描述具体实施方案的目的，并非旨在进行限制。除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语的含义与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的含义相同。
如本文所用的，单数形式“一个”、“一种”和“所述”包括复数指代，除非上下文中另有明确说明。
虽然与本文所述的那些方法和材料相似或等效的任意方法和材料都可以用于检验本发明的实践中，然而本文中描述示例性材料和方法。
“特异性结合”或“特异性地结合”或“结合”是指抗体以比针对非相关抗原更高的亲和力结合到人CD40。通常，抗体以1×10-8M或更小，例如1×10-9M或更小、1×10-10M或更小、1×10-11M或更小、或1×10-12M或更小的解离常数(KD)结合于人CD40，通常KD为其结合至非相关抗原(例如BSA、酪蛋白)的KD的至少一百倍。可使用标准程序来测量解离常数。然而，特异性地结合人CD40的抗体可能对其它相关的抗原具有交叉反应性，例如，对来自其它物种(同源)(诸如人或猴，例如食蟹猴(Macaca fascicularis)(cynomolgus,cyno)、黑猩猩(Pan troglodytes)(chimpanzee,chimp)或狨猴(Callithrix jacchus)(commonmarmoset,marmoset))的相同抗原具有交叉反应性。虽然单特异性抗体特异性地结合一个抗原或一个表位，而双特异性抗体特异性地结合两个不同的抗原或两个不同的表位。
“抗体”广义上是指并包括免疫球蛋白分子，具体包括单克隆抗体(包括鼠科动物单克隆抗体、人单克隆抗体、人源化单克隆抗体和嵌合单克隆抗体)，抗原结合片段，双特异性或多特异性抗体，二聚、四聚或多聚抗体，单链抗体、域抗体，以及包含具有所需特异性的抗原结合位点的免疫球蛋白分子的任何其它经修饰构型。“全长抗体”包含由二硫键互连的两条重链(H)与两条轻链(L)以及它们的多聚体(例如IgM)。每条重链包含重链可变区(VH)和重链恒定区(包含域CH1、铰链CH2和CH3)。每条轻链包含轻链可变区(VL)和轻链恒定区(CL)。VH和VL区可进一步细分为称作互补决定区(CDR)的超变区，间插有框架区(FR)。各个VH和VL由三个CDR和四个FR片段构成，并按以下顺序从氨基端至羧基端排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。
“互补决定区(CDR)”为抗体中的“抗原结合位点”。可使用不同的术语来定义CDR：(i)三个在VH(HCDR1、HCDR2、HCDR3)中并且三个在VL中(LCDR1、LCDR2、LCDR3)的互补决定区(CDR)是基于序列变异性(Wu和Kabat，J Exp Med 132:211-50,1970；Kabat等人，Sequencesof Proteins of Immunological Interest，第5版，Public Health Service,NationalInstitutes of Health,Bethesda,Md.,1991)。(ii)三个在VH(H1、H2、H3)中并且三个在VL(L1、L2、L3)中的“超变区”、“HVR”或“HV”是指抗体可变域中的在结构上超变的区域，如Chothia和Lesk所定义(Chothia和Lesk，Mol Biol 196:901-17,1987)。国际免疫遗传学(IMGT)数据库(http://www_imgt_org)提供了抗原结合位点的标准化编号和定义。CDR、HV和IMGT描述之间的对应关系在Lefranc等人，Dev Comparat Immunol 27:55-77,2003中描述。除非在说明书中另有明确说明，如本文所用，术语“CDR”、“HCDR1”、“HCDR2”、“HCDR3”、“LCDR1”、“LCDR2”和“LCDR3”包括上文所述的任何方法(Kabat、Chothia或IMGT)所定义的CDR。
免疫球蛋白可根据重链恒定域氨基酸序列被指定为五种主要种类IgA、IgD、IgE、IgG和IgM。IgA和IgG进一步亚分类为同种型IgA1、IgA2、IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。基于其恒定域的氨基酸序列，可将任何脊椎物种的抗体轻链指定为两种完全不同的类型即kappa(κ)和lambda(λ)中的一种。
“抗原结合片段”是指免疫球蛋白分子的保留亲本全长抗体的抗原结合特性的部分。示例性的抗原结合片段为重链互补决定区(HCDR)1、2和/或3、轻链互补决定区(LCDR)1、2和/或3、重链可变区(VH)、或轻链可变区(VL)、Fab、F(ab')2、Fd和Fv片段以及由一个VH域或一个VL域组成的域抗体(dAb)。VH和VL域可经由合成接头连接在一起以形成各种类型的单链抗体设计，其中在VH域和VL域由单独链表达的情况下，VH/VL域在分子内或分子间配对，以形成单价抗原结合位点，诸如单链Fv(scFv)或双价抗体；例如在国际专利公布WO1998/44001，国际专利公布WO1988/01649；国际专利公布WO1994/13804；国际专利公布WO1992/01047中所描述的。
“单克隆抗体”是指在每条重链和每条轻链中具有单一氨基酸组成的抗体群，除了可能的熟知改变，诸如从抗体重链中除去C末端赖氨酸之外。除了多特异性单克隆抗体结合两个或更多个不同的抗原或表位之外，单克隆抗体通常结合一个抗原表位。双特异性单克隆抗体结合两个不同的抗原表位。单克隆抗体可在抗体群内具有异质糖基化。单克隆抗体可以是单特异性的或多特异性的，或者是单价的、二价的或多价的。多特异性抗体，诸如双特异性抗体或三特异性抗体包括在术语单克隆抗体之中。
“分离的抗体”是指基本上不含具有不同抗原特异性的其它抗体的抗体或其抗原结合片段(例如，特异性结合人CD40的分离的抗体基本上不含特异性结合人CD40之外的抗原的抗体)。就双特异性抗体而言，双特异性抗体特异性结合两种感兴趣的抗原，并且基本上不含特异性结合除两种感兴趣抗原以外的抗原的抗体。“分离的抗体”涵盖分离至更高纯度的抗体，诸如80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％纯度的抗体。
“人源化抗体”是指其中至少一个CDR来源于非人物种并且可变区框架来源于人免疫球蛋白序列的抗体。人源化抗体在框架区中可包括特意引入的突变，使得该框架可能不是表达的人免疫球蛋白序列或种系基因序列的精确拷贝。
“人抗体”是指具有重链可变区和轻链可变区的抗体，其中框架和全部6个CDR均来源于人起源的序列。如果抗体包含恒定区或恒定区的一部分，则该恒定区也来源于人起源的序列。
如果抗体的可变区由使用人种系免疫球蛋白或重排免疫球蛋白基因的系统获得，则人抗体包含来源于人起源序列的重链可变区或轻链可变区。此类示例性系统为在噬菌体上展示的人免疫球蛋白基因文库，以及转基因非人动物，诸如携带如本文所述的人免疫球蛋白基因座的小鼠或大鼠。在与人种系免疫球蛋白序列或重排免疫球蛋白序列进行比较时，人抗体通常包含由于例如天然存在的体细胞突变、在框架或抗原结合位点中特意引入置换所引起的氨基酸差异以及在非人动物中克隆和VDJ重组期间引入的氨基酸变化。通常，人抗体的氨基酸序列与由人种系或重排免疫球蛋白基因编码的氨基酸序列具有至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性。在一些情况下，人抗体可包含由人框架序列分析得到的共有框架序列(例如Knappik等人，J Mol Biol 296:57-86,2000中所述)；或结合到展示在噬菌体上的人免疫球蛋白基因文库中的合成HCDR3(例如Shi等人，J Mol Biol397:385-96,2010和国际专利公布WO2009/085462中所述)。
“重组体”包括以重组手段制备、表达、创建或分离的抗体及其它蛋白质。
“表位”是指抗原的与抗体特异性结合的部分。表位通常由部分诸如氨基酸或多糖侧链的化学活性(诸如，极性、非极性或疏水性)表面基团组成，并且可具有特定三维结构特征以及特定电荷特征。表位可由形成构象空间单元的连续和/或不连续氨基酸构成。对于不连续表位，来自抗原的线性序列的不同部分的氨基酸因蛋白质分子的折叠而在三维空间上靠近。
“多特异性”是指特异性结合至少两个不同抗原或抗原内两个不同表位，例如三个、四个或五个不同的抗原或表位的抗体。
“双特异性”是指特异性结合两个不同抗原或同一抗原内的两个不同表位的抗体。双特异性抗体可对其它相关抗原具有交叉反应性，或者可结合两个或更多个不同抗原之间所共享的表位。
“变体”是指因一处或多处修饰(例如，置换、插入或缺失)而不同于参考多肽或参考多核苷酸的多肽或多核苷酸。
“载体”是指能够在生物系统内复制或可在这类系统之间移动的多核苷酸。载体多核苷酸通常含有诸如复制起点、聚腺苷酸化信号或选择标记的元件，其功能是促进这些多核苷酸在生物系统中的复制或保持。此类生物系统的示例可包括细胞、病毒、动物、植物和用能够复制载体的生物组分再造的生物系统。包含载体的多核苷酸可为DNA或RNA分子或这些分子的杂合分子。
“表达载体”是指可用于在生物系统或再造生物系统中以指导由存在于表达载体中的多核苷酸序列所编码的多肽进行翻译的载体。
“多核苷酸”是指包含磷酸糖类主链共价连接的核苷酸链或其它等同共价化学物的合成分子。cDNA是多核苷酸的典型示例。
“多肽”或“蛋白质”是指包含由肽键连接以形成多肽的至少两个氨基酸残基的分子。少于50个氨基酸的小多肽可以称作“肽”。
“CD40”或“huCD40”是指人CD40蛋白质。CD40也被称为肿瘤坏死因子受体超家族成员5(TNFRSF5)、CD4OL受体或CD154受体。全长人CD40的氨基酸序列示于SEQ ID NO:75中。人全长CD40蛋白质是具有277个氨基酸的I型膜蛋白。信号序列跨越SEQ ID NO:75的残基1-20，胞外域跨越残基21-193，跨膜域跨越残基194-215，并且胞质域跨越残基216-277。在整个说明书，CD40的胞外域“CD40ECD的”是指SEQ ID NO:75的残基21-193的CD40片段。
“激动剂”或“激动性”是指特异性结合人CD40的抗体，在结合CD40时诱导B细胞和/或树突细胞(DC)活化。B细胞和DC活化可通过如下方式测定：测定增加的B细胞增殖，或者测定B细胞上任何表面标记物CD23、CD80、CD83、CD86，或DC上CD80、CD83、CD86和HLA-DR的上调。在与不含抗体的对照样本进行比较时，激动剂能够以统计意义上显著的方式诱导B细胞和/或DC活化。
“交联”是指在由特异性结合人CD40的抗体结合顺式或反式FcγRIIb所诱导的细胞上CD40的更高级多聚化，导致诱导CD40的激动活性。可在体外将如本文所述的抗人F(ab’)2用作交联剂对交联进行评估。
“就激动活性而言需要交联”意指当使用实施例1中所述的方法采用流式细胞术测定表面表达时，抗体在存在20μg/ml交联剂抗人F(ab’)2时以剂量依赖性方式诱导B细胞上CD23表达和树突细胞上CD83表面表达，并且该抗体在不存在交联剂时对B细胞上的CD23表面表达和树突细胞上的CD83表达表面没有影响。没有影响意指在流式细胞术中获得的信号指示在1×10-12M至1×10-6M范围的抗体浓度下整个抗体滴定曲线上，CD23和CD83的表面表达在±1SD之内。
术语“约”意指如由本领域的普通技术人员所确定，在特定值的可接受误差范围内，其部分地取决于如何测量或确定该值，即测量体系的限制。在特定测定、结果或实施方案的上下文中，除非实施例或说明书其它地方内另有明确说明，否则“约”意指在根据本领域惯例的一个标准偏差之内、或多至5％的范围(无论哪个更大)。
“与……组合”意指将两种或更多种治疗剂以混合物一起、作为单一药剂同时或作为单一药剂以任何顺序依次施用给受试者。
本文使用如表1中所示的常规单字母和三字母氨基酸代码。
表1：
特异性结合人CD40的激动性抗体
本发明提供了有效地活化抗原递呈细胞(APC)和B细胞的特异性结合人CD40的激动性抗体。在癌症适应症的临床开发中，在与其它抗CD40抗体进行比较时，该抗体可在不存在交联时展示出最小活性或无激动活性，因此该抗体可具有改善的安全特性，同时维持功效。
CD40激动剂CP-870,893(被开发为野生型IgG2)先前已在临床试验中对患有胰腺癌或黑素瘤的受试者进行了测试。CP-870,893能够活化APC而无需交联，并且在活化B细胞时功效比树突细胞高约20倍。该超激动活性可因二价可溶性单克隆抗体与优先活化的B细胞偶联而导致由B细胞分泌的IL-6所诱导的细胞因子释放综合征(CRS)。在患者临床试验中，该抗体的最常见副作用是中度CRS，特征为在抗体静脉输注当天发冷、发烧、寒颤和其它症状。CP-870,893对B细胞的效应可因此以足以活化APC的治疗剂量产生剂量限制性毒性。
就其激动活性而言需要交联的本发明的特异性结合人CD40的激动性抗体可具有降低的CRS诱导的潜在毒性。不受任何具体理论的束缚，预期外周中的循环APC不太可能被本发明的特异性结合CD40的激动性抗体活化，原因是抗体需要到达组织来经由FcγR交联发生显著更高级的多聚化，并导致后续APC活化。APC(例如树突细胞)的活化可比B细胞活化的临床相关性更大。CD40激动剂的癌症治疗与T细胞活化紧密关联(French等人，1999,Nature Medicine,548-553；van Kooten等人，2000,J Leucoc Biol,67:2-17；Sotomayor等人，1999,Nature Medicine,5:780-787)，并且该T细胞活化依赖于专门的抗原递呈细胞，特别是树突细胞的活化(Melief等人，2000,75:235-282)。
本发明提供一种特异性结合SEQ ID NO:75的人CD40的分离的激动性抗体。
本发明还提供一种特异性结合SEQ ID NO:75的人CD40的分离的激动性抗体，其中抗体就其激动活性而言需要交联。
CD40是一种细胞表面表达的糖蛋白，属于肿瘤坏死因子受体(TNFR)超家族，并且在免疫系统中起到核心作用。其表达于多种免疫细胞，诸如B细胞、树突细胞、单核细胞和巨噬细胞上，这些细胞在经由CD40发生信号转导时被活化(综述见Tasci等人，2001,Cell.Mol.Life.Sci.,(58),4-43)。
由CD40信号转导所介导的树突细胞和B细胞活化触发若干生物事件，包括免疫细胞活化、增殖、以及细胞因子和趋化因子的产生。用于测定与CD40相关的树突细胞和B细胞活化的方法在本领域中是已知的(Schonbeck等人，2001,Cell Mol Life Sci.,58:40-43；van Kooten等人，2000,J.Leuk.,Biol.,67:2-17)并且在本文有所描述。一种示例性方法是使用诸如血细胞计数的标准方法评估表面标记物CD23、CD80、CD83、CD86和HLA-DR、或它们的组合的上调。
激动活性对交联的依赖性可使用已知的方法在体外进行评估。例如，可在不存在和存在交联剂(诸如抗免疫球蛋白抗体)情况下对B细胞或DC活化进行评估。在体内，交联通常通过抗体Fc与FcγR的相互作用发生。
示例性的特异性结合人CD40的激动性抗体为本文所述的抗体C40M67、C40M66、C40M63、C40M62、C40M59、C40M58、C40M56、C40M55、C40M51、C40M18、C40M17、C40M12、C40M102、C40M103、C40M104、C40M105和C40M121。
以交联非依赖性方式激动CD40的示例性特异性结合人CD40的激动性抗体为抗体C40M126。C40M126在Fc区中具有S267E突变，使抗体转化为交联非依赖性激动剂。除了S267E突变之外，C40M126和交联依赖性激动性mAb C40M121具有相同的重链和轻链氨基酸序列。
本发明还提供了一种诱导CD80、CD83、CD86和HLA-DR表达的特异性结合人CD40的分离的激动性抗体，该表达用流式细胞术在人树突细胞上测定。
在一些实施方案中，特异性结合人CD40的分离的激动性抗体诱导CD23、CD80、CD83、CD86和HLA-DR的表达，该表达用流式细胞术在人B细胞上测定。
在一些实施方案中，特异性结合人CD40的分离的激动性抗体诱导CD83的表达，该表达用流式细胞术在人树突细胞上测定。
在一些实施方案中，特异性结合人CD40的分离的激动性抗体诱导CD23的表达，该表达用流式细胞术在人B细胞上测定。
本发明还提供了一种特异性结合SEQ ID NO:75的人CD40的分离的激动性抗体或其抗原结合片段，其包含SEQ ID NO:5的重链可变区(HCDR)1、SEQ ID NO:10的HCDR2、SEQID NO:18的HCDR3、SEQ ID NO:32的轻链可变区(LCDR)1、SEQ ID NO:34的LCDR2和SEQ IDNO:47的LCDR3。
在一些实施方案中，抗体在SEQ ID NO:75的残基46-64和75-76内结合人CD40。“在...之内”意指该抗体结合的80％或更多的表位残基位于氨基酸段46-64或75-76之内，并且该抗体结合的多至20％的表位残基位于氨基酸段46-64或75-76之外。
抗体结合的CD40表位可例如使用氢/氘化交换(H/D交换)或通过分析与CD40复合的抗体的晶体结构来解析。表位残基是经过H/D交换氘化水平差异为至少5％的受抗体保护的那些，或者在抗体与CD40的复合物的晶体结构中被测定结合抗体的那些表面暴露的氨基酸残基。在抗体与CD40的复合物的晶体结构中，表位残基是位于距任何抗体CDR残基距离之内或更小的那些CD40残基。
在H/D交换测定中，将CD40蛋白在存在或不存在抗体情况下于氘化水中温育预定时间，从而导致氘在不受抗体保护的可交换氢原子处引入，之后使蛋白酶消化蛋白质并使用LC-MS分析肽片段。在一个示例性测定中，将5μL的测试抗体(10μg)或5μL的CD40与测试抗体的复合物(分别10与7.35μg)用120μL氧化氘标记缓冲液(50mM磷酸盐、100mM氯化钠，pH7.4)温育0秒、60秒、300秒、1800秒、7200秒和14400秒。通过添加63μL的5M盐酸胍对氘交换进行淬火，并且最终pH为2.5。使淬灭的样本经受柱上胃蛋白酶/蛋白酶XIII型消化和LC-MS分析。对于胃蛋白酶/蛋白酶XIII型消化，通过加入63μL的5M盐酸胍(最终pH为2.5)使含5μg样本的125μL对照缓冲液(50mM磷酸盐、100mM氯化钠，pH 7.4)变性并温育混合物3分钟。然后，使混合物经受柱上胃蛋白酶/蛋白酶XIII型消化并且用UPLC-MS系统分析所得的肽，该系统由连接于Q ExactiveTM混合四极-轨道陷阱质谱议(Thermo)的Waters Acquity UPLC组成。用HDX WorkBench软件处理原始MS数据，以分析H/D交换MS数据。使用氘化肽与其天然形式(t0)之间的平均质量差来计算氘水平。通过采用Mascot，针对CD40搜索MS/MS数据进行肽鉴定。前体和产物离子的质量容差分别为20ppm和0.05Da。
对于X射线结晶学，使用标准规程对CD40和测试抗体进行表达和纯化。将CD40/测试抗体复合物在4℃下温育过夜，浓缩，并采用尺寸排阻色谱法从未复合的物类中分离。通过蒸气扩散法从各种已知的测试溶液，例如包含PEG3350、柠檬酸铵和2-(N-吗啉代)乙磺酸(MES)的溶液中结晶该复合物。
在SEQ ID NO:75的人CD40残基46-64和75-76内结合的抗体可如下产生：利用噬菌体展示文库分离出结合CD40的抗体，选择与参考抗体C40M126(SEQ ID NO:62的VH和SEQ IDNO:69的VL)100％竞争结合CD40的那些抗体，并通过解析抗体/CD40复合物的晶体结构来确认所产生抗体的表位。另选地，可使用包含SEQ ID NO:75的残基46-64和75-76的肽对小鼠、大鼠或兔子进行免疫，并且可对所产生抗体在所述区域内的结合进行评价。
在一些实施方案中，抗体具有下列特性中的至少一个：
与SEQ ID NO:75的人CD40以约5×10-9M或更小的解离常数(KD)结合，此时所述KD在包含0.01％聚山梨酸酯20(PS-20)和
100μg/ml牛血清白蛋白的杜贝克氏磷酸盐缓冲盐水中于25℃使用
ProteOn XPR36系统测定；或者
就其对B细胞和树突细胞(DC)的激动活性而言需要交联，其中
在20μg/ml的交联剂抗人F(ab’)2存在下，通过B细胞CD23表面表达
测定对B细胞的激动活性，并且通过DC CD83表面表达测定对DC的
激动活性，此时使用流式细胞术测定CD23和CD83表面表达。
抗体对人CD40的亲和力可使用任何合适的方法通过实验测定。示例性方法利用本领域技术人员已知的ProteOn XPR36、Biacore 3000或KinExA仪器、ELISA或竞争结合测定。如果在不同的条件(例如，同渗容摩、pH)下测量，所测特定抗体对CD40的亲和力可变化。因此，亲和力和其它结合参数(例如，KD、Kon和Koff)的测量通常用标准化条件和标准化缓冲液(诸如本文所述的缓冲液)进行。本领域技术人员将会知道，使用例如Biacore 3000或ProteOn进行亲和力测量的内部误差(测量为标准偏差，SD)通常可在典型检出限内的测量值的5-33％内。因此，当提及KD值时术语“约”反映测定中的典型标准偏差。例如，1×10-9M的KD的典型SD为至多±0.33×10-9M。
对于B细胞活化测定，可使用阴性B细胞分离试剂盒根据制造商规程(MACSMiltenyi)将人B细胞从新鲜或冷冻的PBMC中分离。
对于DC活化测定，可使用阴性CD14分离试剂盒根据制造商规程(MACS Miltenyi)将人单核细胞从冷冻/新鲜PBMC中分离，在100ng/ml人GM-CSF和人IL-4(Peprotech)存在下在完全培养基RPMI(Invitrogen)中培养5天并且每2天补充培养基。可将测试CD40抗体滴定铺板到96孔U形底板上，并且可添加B细胞或DC并且可将混合物在室温下温育15分钟。可将培养基或交联剂抗人F(ab’)2以固定浓度20μg/ml加入，并且对于DC活化测定，可将复合物在37℃下温育24小时，并且对于B细胞活化测定，温育48小时。可在时间点结束时收获得到细胞，用流动缓冲液洗涤两次，并用人Fc阻断液(Miltenyi)在室温下温育15分钟，然后洗涤一次。然后，可针对活化标记物CD23或CD83将细胞在冰上染色30分钟，接着洗涤两次。使用BD Fortessa分析细胞。另选地，也可对活化标记物CD80、CD86、HLA-DR的表面表达进行评估。
在一些实施方案中，抗体重链框架来源于人IGHV4-39*01(SEQ ID NO:73)并且抗体轻链框架来源于人IGLV2-8*01(SEQ ID NO:87)。
在一些实施方案中，抗体包含SEQ ID NO:62或61的重链可变区(VH)和SEQ ID NO:69的轻链可变区(VL)。
在一些实施方案中，抗体包含SEQ ID NO:62的VH和SEQ ID NO:69的VL。
在一些实施方案中，VH由包含SEQ ID NO:103的多核苷酸序列的多核苷酸编码，并且VL由包含SEQ ID NO:110的多核苷酸序列的多核苷酸编码。
在一些实施方案中，抗体包含SEQ ID NO:61的VH和SEQ ID NO:69的VL。
在一些实施方案中，VH由包含SEQ ID NO:102的多核苷酸序列的多核苷酸编码，并且VL由包含SEQ ID NO:110的多核苷酸序列的多核苷酸编码。
在一些实施方案中，抗体是IgG1同种型。
在一些实施方案中，抗体是IgG2同种型。
在一些实施方案中，抗体是IgG3同种型。
在一些实施方案中，抗体是IgG4同种型。
在一些实施方案中，抗体包含SEQ ID NO:62的VH和SEQ ID NO:69的VL并且为IgG1/λ同种型，在相比于野生型IgG1时任选地包含S267E突变。
在一些实施方案中，抗体包含SEQ ID NO:62的VH和SEQ ID NO:69的VL并且为IgG1/λ同种型，在相比于野生型IgG1时任选地包含S267E/I332E突变。
在一些实施方案中，抗体包含SEQ ID NO:62的VH和SEQ ID NO:69的VL并且为IgG1/λ同种型，在相比于野生型IgG1时任选地包含S267E/L328F突变。
在一些实施方案中，抗体包含SEQ ID NO:62的VH和SEQ ID NO:69的VL并且为IgG1/λ同种型，在相比于野生型IgG1时任选地包含E233D/G237D/H268D/P271G/A330R/P238D突变。
在一些实施方案中，抗体包含SEQ ID NO:61的VH和SEQ ID NO:69的VL并且为IgG1/λ同种型，在相比于野生型IgG1时任选地包含S267E突变。
在一些实施方案中，抗体包含SEQ ID NO:61的VH和SEQ ID NO:69的VL并且为IgG1/λ同种型，在相比于野生型IgG1时任选地包含S267E/I332E突变。
在一些实施方案中，抗体包含SEQ ID NO:61的VH和SEQ ID NO:69的VL并且为IgG1/λ同种型，在相比于野生型IgG1时任选地包含S267E/L328F突变。
在一些实施方案中，抗体包含SEQ ID NO:61的VH和SEQ ID NO:69的VL并且为IgG1/λ同种型，在相比于野生型IgG1时任选地包含E233D/G237D/H268D/P271G/A330R/P238D突变。
在一些实施方案中，抗体包含SEQ ID NO:129的重链(HC)和SEQ ID NO:136的轻链(LC)。
在一些实施方案中，HC由包含SEQ ID NO:155的多核苷酸序列的多核苷酸编码，并且LC由包含SEQ ID NO:162的多核苷酸序列的多核苷酸编码。
在一些实施方案中，抗体包含SEQ ID NO:128的重链(HC)和SEQ ID NO:136的轻链(LC)。
在一些实施方案中，HC由包含SEQ ID NO:154的多核苷酸序列的多核苷酸编码，并且LC由包含SEQ ID NO:162的多核苷酸序列的多核苷酸编码。
在一些实施方案中，抗体包含SEQ ID NO:127的重链(HC)和SEQ ID NO:136的轻链(LC)。
在一些实施方案中，HC由包含SEQ ID NO:153的多核苷酸序列的多核苷酸编码，并且LC由包含SEQ ID NO:162的多核苷酸序列的多核苷酸编码。
在一些实施方案中，抗体是多特异性抗体。
在一些实施方案中，抗体是双特异性抗体。
该抗体适用于治疗，例如治疗癌症。
该抗体适用于治疗，例如治疗实体瘤。
该抗体适用于治疗，例如治疗黑素瘤。
该抗体适用于治疗，例如治疗肺癌。
该抗体适用于治疗，例如治疗鳞状非小细胞肺癌(NSCLC)。
该抗体适用于治疗，例如治疗非鳞状NSCLC。
该抗体适用于治疗，例如治疗肺腺癌。
该抗体适用于治疗，例如治疗肾细胞癌(RCC)(例如，肾透明细胞癌或肾乳头状细胞癌)或其转移性病变。
该抗体适用于治疗，例如治疗间皮瘤。
该抗体适用于治疗，例如治疗鼻咽癌(NPC)。
该抗体适用于治疗，例如治疗结肠直肠癌。
该抗体适用于治疗，例如治疗前列腺癌或阉割抗性前列腺癌。
该抗体适用于治疗，例如治疗胃癌。
该抗体适用于治疗，例如治疗卵巢癌。
该抗体适用于治疗，例如治疗胃癌。
该抗体适用于治疗，例如治疗肝癌。
该抗体适用于治疗，例如治疗胰腺癌。
该抗体适用于治疗，例如治疗甲状腺癌。
该抗体适用于治疗，例如治疗头颈部鳞状上皮细胞癌。
该抗体适用于治疗，例如治疗食道癌或胃肠道癌。
该抗体适用于治疗，例如治疗乳腺癌。
该抗体适用于治疗，例如治疗输卵管癌。
该抗体适用于治疗，例如治疗脑癌。
该抗体适用于治疗，例如治疗尿道癌。
该抗体适用于治疗，例如治疗子宫内膜异位症。
该抗体适用于治疗，例如治疗宫颈癌。
该抗体适用于治疗，例如治疗癌症转移性病变。
该抗体适用于治疗，例如治疗多发性骨髓瘤。
该抗体适用于治疗，例如治疗淋巴瘤。
该抗体适用于治疗，例如治疗白血病。
本发明还提供一种特异性结合SEQ ID NO:75的人CD40的分离的激动性抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体具有下列特性中的至少一个：
与SEQ ID NO:75的人CD40以约5×10-9M或更小的解离常数(KD)结合，此时所述KD在包含0.01％聚山梨酸酯20(PS-20)和
100μg/ml牛血清白蛋白的杜贝克氏磷酸盐缓冲盐水中于25℃使用
ProteOn XPR36系统测定；或者
就其对B细胞和树突细胞(DC)的激动活性而言需要交联，其中
在20μg/ml的交联剂抗人F(ab’)2存在下，通过B细胞CD23表面表达
测定对B细胞的激动活性，并且通过DC CD83表面表达测定对DC的
激动活性，此时使用流式细胞术测定CD23和CD83表面表达。
在一些实施方案中，抗体包含：分别为SEQ ID NO:1、8、22、28、38和42的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3，分别为SEQ ID NO:48和63的VH和VL，和/或分别为SEQID NO:114和130的重链(HC)和轻链(LC)。
在一些实施方案中，VH和VL分别由包含SEQ ID NO:89和104的多核苷酸序列的多核苷酸编码。
在一些实施方案中，HC和LC分别由包含SEQ ID NO:140和156的多核苷酸序列的多核苷酸编码。
在一些实施方案中，抗体包含：分别为SEQ ID NO:2、7、25、26、39和44的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3，分别为SEQ ID NO:49和64的VH和VL，和/或分别为SEQID NO:115和131的重链(HC)和轻链(LC)。
在一些实施方案中，VH和VL分别由包含SEQ ID NO:90和105的多核苷酸序列的多核苷酸编码。
在一些实施方案中，HC和LC分别由包含SEQ ID NO:141和157的多核苷酸序列的多核苷酸编码。
在一些实施方案中，抗体包含：分别为SEQ ID NO:2、7、24、26、39和44的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3，分别为SEQ ID NO:50和64的VH和VL，和/或分别为SEQID NO:116和131的重链(HC)和轻链(LC)。
在一些实施方案中，VH和VL分别由包含SEQ ID NO:91和105的多核苷酸序列的多核苷酸编码。
在一些实施方案中，HC和LC分别由包含SEQ ID NO:142和157的多核苷酸序列的多核苷酸编码。
在一些实施方案中，抗体包含：分别为SEQ ID NO:2、7、23、26、39和44的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3，分别为SEQ ID NO:51和64的VH和VL；和/或分别为SEQID NO:117和131的重链(HC)和轻链(LC)。
在一些实施方案中，VH和VL分别由包含SEQ ID NO:92和105的多核苷酸序列的多核苷酸编码。
在一些实施方案中，HC和LC分别由包含SEQ ID NO:143和157的多核苷酸序列的多核苷酸编码。
在一些实施方案中，抗体包含分别为SEQ ID NO:3、13、17、27、33和43的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3；分别为SEQ ID NO:52和65的VH和VL；和/或分别为SEQID NO:118和132的重链(HC)和轻链(LC)。
在一些实施方案中，VH和VL分别由包含SEQ ID NO:93和106的多核苷酸序列的多核苷酸编码。
在一些实施方案中，HC和LC分别由包含SEQ ID NO:144和158的多核苷酸序列的多核苷酸编码。
在一些实施方案中，抗体包含分别为SEQ ID NO:4、6、19、27、33和43的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3；分别为SEQ ID NO:53和65的VH和VL；和/或分别为SEQID NO:119和132的重链(HC)和轻链(LC)。
在一些实施方案中，VH和VL分别由包含SEQ ID NO:94和106的多核苷酸序列的多核苷酸编码。
在一些实施方案中，HC和LC分别由包含SEQ ID NO:145和158的多核苷酸序列的多核苷酸编码。
在一些实施方案中，抗体包含分别为SEQ ID NO:4、6、20、27、33和43的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3；分别为SEQ ID NO:54和65的VH和VL；和/或分别为SEQID NO:120和132的重链(HC)和轻链(LC)。
在一些实施方案中，VH和VL分别由包含SEQ ID NO:95和106的多核苷酸序列的多核苷酸编码。
在一些实施方案中，HC和LC分别由包含SEQ ID NO:146和158的多核苷酸序列的多核苷酸编码。
在一些实施方案中，抗体包含分别为SEQ ID NO:2、7、14、27、33和43的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3；分别为SEQ ID NO:55和65的VH和VL；和/或分别为SEQID NO:121和132的重链(HC)和轻链(LC)。
在一些实施方案中，VH和VL分别由包含SEQ ID NO:96和106的多核苷酸序列的多核苷酸编码。
在一些实施方案中，HC和LC分别由包含SEQ ID NO:147和158的多核苷酸序列的多核苷酸编码。
在一些实施方案中，抗体包含分别为SEQ ID NO:4、6、21、27、33和43的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3；分别为SEQ ID NO:56和65的VH和VL；和/或分别为SEQID NO:122和132的重链(HC)和轻链(LC)。
在一些实施方案中，VH和VL分别由包含SEQ ID NO:97和106的多核苷酸序列的多核苷酸编码。
在一些实施方案中，HC和LC分别由包含SEQ ID NO:148和158的多核苷酸序列的多核苷酸编码。
在一些实施方案中，抗CD38抗体包含分别为SEQ ID NO:4、9、15、30、36和41的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3，分别为SEQ ID NO:57和66的VH和VL；和/或分别为SEQ ID NO:123和133的重链(HC)和轻链(LC)。
在一些实施方案中，VH和VL分别由包含SEQ ID NO:98和107的多核苷酸序列的多核苷酸编码。
在一些实施方案中，HC和LC分别由包含SEQ ID NO:149和159的多核苷酸序列的多核苷酸编码。
在一些实施方案中，抗CD38抗体包含分别为SEQ ID NO:4、11、16、29、37和40的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3，分别为SEQ ID NO:58和67的VH和VL；和/或分别为SEQ ID NO:124和134的重链(HC)和轻链(LC)。
在一些实施方案中，VH和VL分别由包含SEQ ID NO:99和108的多核苷酸序列的多核苷酸编码。
在一些实施方案中，HC和LC分别由包含SEQ ID NO:150和160的多核苷酸序列的多核苷酸编码。
在一些实施方案中，抗体包含：分别为SEQ ID NO:4、12、15、30、35和46的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3，分别为SEQ ID NO:59和68的VH和VL，和/或分别为SEQID NO:125和135的重链(HC)和轻链(LC)。
在一些实施方案中，VH和VL分别由包含SEQ ID NO:100和109的多核苷酸序列的多核苷酸编码。
在一些实施方案中，HC和LC分别由包含SEQ ID NO:151和161的多核苷酸序列的多核苷酸编码。
在一些实施方案中，抗体包含：分别为SEQ ID NO:4、9、15、30、36和41的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3，分别为SEQ ID NO:57和70的VH和VL，和/或分别为SEQID NO:123和137的重链(HC)和轻链(LC)。
在一些实施方案中，VH和VL分别由包含SEQ ID NO:98和111的多核苷酸序列的多核苷酸编码。
在一些实施方案中，HC和LC分别由包含SEQ ID NO:149和163的多核苷酸序列的多核苷酸编码。
在一些实施方案中，抗体包含：分别为SEQ ID NO:4、9、15、31、36和41的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3，分别为SEQ ID NO:57和71的VH和VL，和/或分别为SEQID NO:123和138的重链(HC)和轻链(LC)。
在一些实施方案中，VH和VL分别由包含SEQ ID NO:98和112的多核苷酸序列的多核苷酸编码。
在一些实施方案中，HC和LC分别由包含SEQ ID NO:149和164的多核苷酸序列的多核苷酸编码。
在一些实施方案中，抗体包含：分别为SEQ ID NO:4、9、15、31、36和41的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3，分别为SEQ ID NO:57和72的VH和VL，和/或分别为SEQID NO:123和139的重链(HC)和轻链(LC)。
在一些实施方案中，VH和VL分别由包含SEQ ID NO:98和113的多核苷酸序列的多核苷酸编码。
在一些实施方案中，HC和LC分别由包含SEQ ID NO:149和165的多核苷酸序列的多核苷酸编码。
在一些实施方案中，本发明的抗体包含SEQ ID NO:48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、61或62的重链可变区(VH)的重链互补决定区(HCDR)1(HCDR1)、2(HCDR2)和3(HCDR3)氨基酸序列，其中HCDR由Kabat、Chothia或IMGT定义。
在一些实施方案中，本发明的抗体包含SEQ ID NO:63、64、65、66、67、68、70、71或72的轻链可变区(VL)的轻链互补决定区(LCDR)1(LCDR1)、2(LCDR2)和3(LCDR3)氨基酸序列，其中LCDR由Kabat、Chothia或IMGT定义。
在一些实施方案中，本发明的抗体包含SEQ ID NO:48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、61或62的VH。
在一些实施方案中，本发明的抗体包含SEQ ID NO:63、64、65、66、67、68、70、71或72的VL。
表2示出了本发明的示例性抗CD40抗体的HCDR和LCDR序列。表3示出了本发明的示例性抗CD40抗体的VH、VL、HC和LC蛋白质和氨基酸序列。
表2：
表3：
本发明的特异性结合CD40的激动性抗体的变体在本发明的范围之内。例如，变体可在VH和/或VL中包含一、二、三、四、五、六、七、八、九、十、十一、十二、十三、十四或十五个氨基酸置换，该置换并未不利地影响抗体特性。在一些实施方案中，对本发明的VH或VL氨基酸序列的序列同一性可为约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％。
两个序列之间的百分比同一性是序列所共有的相同位置数目的函数(即，同一性％＝相同位置的数目/位置总数×100)，考虑到空位的数目和每个空位的长度，需要引入这些参数用于两个序列的最佳比对。
两个氨基酸序列之间的百分比同一性可以采用E.Meyers和W.Miller(Comput.Appl.BBiosci.,4:11-17(1988))的算法(该算法已经并入ALIGN程序(版本2.0)中)，使用PAM120加权残基表、空位长度罚分12和空位罚分4来确定。此外，两个氨基酸序列之间的百分比同一性可以使用Needleman和Wunsch(J.Mol.Biol.48:444-453(1970))的算法(该算法已并入GCG软件包中(可在http://_www_gcg_com获得))，使用Blossum 62矩阵或PAM250矩阵、以及16、14、12、10、8、6、或4的缺口权重和1、2、3、4、5、或6的长度权重来确定。
在一些实施方案中，特异性结合人CD40的激动性抗体包含与SEQ ID NO:48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、61或62的VH有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的VH。
在一些实施方案中，特异性结合人CD40的激动性抗体包含与SEQ ID NO:63、64、65、66、67、68、70、71或72的VL有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的VL。
在一些实施方案中，本发明的特异性结合人CD40的激动性抗体包含与SEQ ID NO:48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、61或62的VH有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的VH，以及与SEQ ID NO:63、64、65、66、67、68、70、71或72的VL有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的VL。
在一些实施方案中，本发明的特异性结合人CD40的激动性抗体包含SEQ ID NO:48的VH和SEQ ID NO:63的VL，其中VH、VL、或VH与VL两者任选地包含一、二、三、四、五、六、七、八、九、十、十一、十二、十三、十四或十五个氨基酸置换。
在一些实施方案中，本发明的特异性结合人CD40的激动性抗体包含SEQ ID NO:49的VH和SEQ ID NO:64的VL，其中VH、VL、或VH与VL两者任选地包含一、二、三、四、五、六、七、八、九、十、十一、十二、十三、十四或十五个氨基酸置换。
在一些实施方案中，特异性结合人CD40的激动性抗体包含SEQ ID NO:50的VH和SEQ ID NO:64的VL，其中VH、VL、或VH与VL两者任选地包含一、二、三、四、五、六、七、八、九、十、十一、十二、十三、十四或十五个氨基酸置换。
在一些实施方案中，特异性结合人CD40的激动性抗体包含SEQ ID NO:51的VH和SEQ ID NO:64的VL，其中VH、VL、或VH与VL两者任选地包含一、二、三、四、五、六、七、八、九、十、十一、十二、十三、十四或十五个氨基酸置换。
在一些实施方案中，特异性结合人CD40的激动性抗体包含SEQ ID NO:52的VH和SEQ ID NO:65的VL，其中VH、VL、或VH与VL两者任选地包含一、二、三、四、五、六、七、八、九、十、十一、十二、十三、十四或十五个氨基酸置换。
在一些实施方案中，特异性结合人CD40的激动性抗体包含SEQ ID NO:53的VH和SEQ ID NO:65的VL，其中VH、VL、或VH与VL两者任选地包含一、二、三、四、五、六、七、八、九、十、十一、十二、十三、十四或十五个氨基酸置换。
在一些实施方案中，特异性结合人CD40的激动性抗体包含SEQ ID NO:54的VH和SEQ ID NO:65的VL，其中VH、VL、或VH与VL两者任选地包含一、二、三、四、五、六、七、八、九、十、十一、十二、十三、十四或十五个氨基酸置换。
在一些实施方案中，特异性结合人CD40的激动性抗体包含SEQ ID NO:55的VH和SEQ ID NO:65的VL，其中VH、VL、或VH与VL两者任选地包含一、二、三、四、五、六、七、八、九、十、十一、十二、十三、十四或十五个氨基酸置换。
在一些实施方案中，特异性结合人CD40的激动性抗体包含SEQ ID NO:56的VH和SEQ ID NO:65的VL，其中VH、VL、或VH与VL两者任选地包含一、二、三、四、五、六、七、八、九、十、十一、十二、十三、十四或十五个氨基酸置换。
在一些实施方案中，特异性结合人CD40的激动性抗体包含SEQ ID NO:57的VH和SEQ ID NO:66的VL，其中VH、VL、或VH与VL两者任选地包含一、二、三、四、五、六、七、八、九、十、十一、十二、十三、十四或十五个氨基酸置换。
在一些实施方案中，特异性结合人CD40的激动性抗体包含SEQ ID NO:58的VH和SEQ ID NO:67的VL，其中VH、VL、或VH与VL两者任选地包含一、二、三、四、五、六、七、八、九、十、十一、十二、十三、十四或十五个氨基酸置换。
在一些实施方案中，特异性结合人CD40的激动性抗体包含SEQ ID NO:59的VH和SEQ ID NO:68的VL，其中VH、VL、或VH与VL两者任选地包含一、二、三、四、五、六、七、八、九、十、十一、十二、十三、十四或十五个氨基酸置换。
在一些实施方案中，特异性结合人CD40的激动性抗体包含SEQ ID NO:57的VH和SEQ ID NO:70的VL，其中VH、VL、或VH与VL两者任选地包含一、二、三、四、五、六、七、八、九、十、十一、十二、十三、十四或十五个氨基酸置换。
在一些实施方案中，特异性结合人CD40的激动性抗体包含SEQ ID NO:57的VH和SEQ ID NO:71的VL，其中VH、VL、或VH与VL两者任选地包含一、二、三、四、五、六、七、八、九、十、十一、十二、十三、十四或十五个氨基酸置换。
在一些实施方案中，特异性结合人CD40的激动性抗体包含SEQ ID NO:57的VH和SEQ ID NO:72的VL，其中VH、VL、或VH与VL两者任选地包含一、二、三、四、五、六、七、八、九、十、十一、十二、十三、十四或十五个氨基酸置换。
在一些实施方案中，特异性结合人CD40的激动性抗体包含SEQ ID NO:61的VH和SEQ ID NO:69的VL，其中VH、VL、或VH与VL两者任选地包含一、二、三、四、五、六、七、八、九、十、十一、十二、十三、十四或十五个氨基酸置换。
在一些实施方案中，特异性结合人CD40的激动性抗体包含SEQ ID NO:62的VH和SEQ ID NO:69的VL，其中VH、VL、或VH与VL两者任选地包含一、二、三、四、五、六、七、八、九、十、十一、十二、十三、十四或十五个氨基酸置换。
在一些实施方案中，特异性结合人CD40的激动性抗体包括包含HCDR1、HCDR2和HCDR3序列的重链可变区以及包含LCDR1、LCDR2和LCDR3序列的轻链可变区，其中一个或多个CDR序列包含基于本文所述抗体(例如，表2所示的抗体)的特定氨基酸序列或其保守修饰，并且其中抗体保留了本发明的特异性结合CD40的激动性抗体的期望功能特性。
包含某些HCDRl、HCDR2、HCDR3、LCDRl、LCDR2和LCDR3序列以及它们的保守修饰的特异性结合人CD40的激动性抗体具有下列特性中的至少一个：
与SEQ ID NO:75的人CD40以约5×10-9M或更小的解离常数(KD)结合，此时所述KD在包含0.01％聚山梨酸酯20(PS-20)和
100μg/ml牛血清白蛋白的杜贝克氏磷酸盐缓冲盐水中于25℃使用
ProteOn XPR36系统测定；或者
就其对B细胞和树突细胞(DC)的激动活性而言需要交联，其中
在20μg/ml的交联剂抗人F(ab’)2存在下，通过B细胞CD23表面表达
测定对B细胞的激动活性，并且通过DC CD83表面表达测定对DC的
激动活性，此时使用流式细胞术测定CD23和CD83表面表达。
“保守修饰”是指不会显著影响或改变含有氨基酸序列的抗体的结合特征的氨基酸修饰。保守修饰包括氨基酸置换、添加和缺失。保守置换是其中氨基酸被具有相似侧链的氨基酸残基替换的置换。具有相似侧链的氨基酸残基家族是明确定义的，包括具有如下侧链的氨基酸：酸性侧链(例如，天冬氨酸、谷氨酸)、碱性侧链(例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、非极性侧链(例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)、不带电极性侧链(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、色氨酸)、芳香族侧链(例如，苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸、酪氨酸)、脂肪族侧链(例如，甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、丝氨酸、苏氨酸)、酰胺(例如，天冬酰胺、谷氨酰胺)、β-分支侧链(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)以及含硫侧链(半胱氨酸、甲硫氨酸)。此外，多肽中的任何天然残基还可以用丙氨酸来置换，如此前对于丙氨酸扫描诱变所述(MacLennan等人，Acta Physiol.Scand.Suppl.643:55-67，1998；Sasaki等人，Adv.Biophys.35:1-24，1998)。对本发明的抗体的氨基酸置换可通过公知的方法进行，例如通过PCR诱变(美国专利4,683,195)进行。另选地，可使用已知的方法，例如使用随机(NNK)或非随机密码子(例如DVK密码子，其编码11个氨基酸(Ala、Cys、Asp、Glu、Gly、Lys、Asn、Arg、Ser、Tyr、Trp))产生变体文库。可使用本文所述的测定法来测试所得抗体变体的特征。
尽管实施例中所示的实施方案包括成对的可变区，一个来自重链并且一个来自轻链，但本领域技术人员将认识到另选实施方案可包括单一重链可变区或单一轻链可变区。单一可变区可用于筛选能够形成能够例如特异性结合CD40的二域特异性抗原结合片段的可变域。筛选可通过噬菌体展示筛选方法来完成，其中使用例如在国际专利公布WO1992/01047中所公开的分级双组合方法。在此方法中，包含H链克隆或L链克隆的单个菌落被用来感染编码另一链(L或H)的克隆的完全文库，并且所得的双链特异性抗原结合域根据本文所述的噬菌体展示技术来选择并且测试其对CD40的结合和激动活性。
本发明的抗体可使用各种技术产生。例如，可使用Kohler和Milstein,Nature256:495,1975所述的杂交瘤方法来产生单克隆抗体。在杂交瘤方法中，用CD40的人或cynoCD40片段(诸如CD40的胞外域)来免疫小鼠或其它宿主动物(诸如仓鼠、大鼠或猴)，之后使用标准方法将来自免疫动物的脾细胞与骨髓瘤细胞融合以形成杂交瘤细胞(Goding,Monoclonal Antibodies:Principles and Practice，第59-103页(Academic Press,1986))。筛选出由单个永生化杂交瘤细胞产生的菌落，用以制备具有所需特性(诸如结合特异性、交叉反应性或缺乏结合特异性、缺乏交叉反应性，以及抗原的亲和力)的抗体。
可使用各种宿主动物来产生本发明的CD40抗体。例如，可使用Balb/c小鼠来产生小鼠抗人CD40抗体。可使用各种技术来人源化由Balb/c小鼠和其它非人动物制备的抗体，从而产生更类似人的序列。包括选择人受体框架的示例性人源化技术是已知的，包括CDR接枝(美国专利5,225,539)、SDR接枝(美国专利6,818,749)、表面重塑(Padlan,Mol Immunol28:489-499,1991)、特异性决定残基表面重塑(美国专利公布20100261620)、人改型(或人框架改型)(美国专利公布US2009/0118127)、超人源化(Superhumanization)(美国专利7,709,226)和定向选择(Osbourn等人(2005)Methods 36:61-68,2005；美国专利5,565,332)。在这些方法中，亲本抗体的CDR被转移到人框架上，该人框架可基于其与亲本框架的总体同源性，基于框架CDR长度、同源性或规范结构信息、或它们的组合进行选择。
可通过如下过程进一步优化人源化抗体以改善其对所需抗原的选择性或亲和力：通过采用诸如国际专利公布WO90/007861和国际专利公布WO92/22653中所公开的技术，引入修改的框架支持残基来保持结合亲和力(回复突变)，或者通过引入任何CDR的变体来改善例如抗体的亲和力。
基因组中携带人免疫球蛋白(Ig)基因座的转基因小鼠可用于生成抗目标蛋白质的人抗体，这在例如国际专利公布WO90/04036、美国专利6150584、国际专利公布WO99/45962、国际专利公布WO02/066630、国际专利公布WO02/43478、Lonberg等人(1994)Nature368:856-9；Green等人(1994)Nature Genet.7:13-21；Green&Jakobovits(1998)Exp.Med.188:483-95；Lonberg和Huszar(1995)Int.Rev.Immunol.13:65-93；Bruggemann等人(1991)Eur.J.Immunol.21:1323-1326；Fishwild等人(1996)Nat.Biotechnol.14:845-851；Mendez等人(1997)Nat.Genet.15:146-156；Green(1999)J.Immunol.Methods 231:11-23；Yang等人(1999)Cancer Res.59:1236-1243；Brüggemann和Taussig(1997)Curr.Opin.Biotechnol.8:455-458；国际专利公布WO02/043478中有所描述。可破坏此类鼠中的内源性免疫球蛋白基因座或使该基因座缺失，并且可使用转染色体或微小基因，通过同源或非同源重组将至少一种完整或部分的人免疫球蛋白基因座插入小鼠基因组中。可邀请诸如Regeneron(http://_www_regeneron_com)、Harbour Antibodies(http://_www_harbourantibodies_com)、Open Monoclonal Technology,Inc.(OMT)(http://_www_omtinc_net)、KyMab(http://_www_kymab_com)、Trianni(http://_www.trianni_com)和Ablexis(http://_www_ablexis_com)等公司使用上述技术以提供抗所选抗原的人抗体。
人抗体可选自噬菌体展示文库，其中噬菌体被工程化以表达人免疫球蛋白或其部分，诸如Fab、单链抗体(scFv)或者未配对或配对抗体可变区(Knappik等人，J.Mol Biol296:57-86,2000；Krebs等人，J Immunol Meth254:67-84,2001；Vaughan等人，NatureBiotechnology 14:309-314,1996；Sheets等人，PITAS(USA)95:6157-6162,1998；Hoogenboom和Winter,J Mol Biol 227:381,1991；Marks等人，J Mol Biol 222:581,1991)。可例如用噬菌体pIX外壳蛋白从将抗体重链和轻链可变区表达为融合蛋白的噬菌体展示文库中分离出本发明的抗体，如Shi等人，J Mol Biol 397:385-96,2010和国际专利公布WO09/085462中所述。可从文库中筛选与人和/或cyno CD40结合的噬菌体，并可进一步表征所获得的阳性克隆，从克隆裂解物中分离Fab，并将其表达为全长IgG。用于分离人抗体的此类噬菌体展示方法描述于例如：授予Ladner等人的美国专利5,223,409；5,403,484；和5,571,698；授予Dower等人的美国专利5,427,908和5,580,717；授予McCafferty等人的美国专利5,969,108和6,172,197；以及授予Griffiths等人的美国专利5,885,793；6,521,404；6,544,731；6,555,313；6,582,915和6,593,081。
免疫源性抗原的制备以及单克隆抗体的产生可用任何合适的技术诸如重组蛋白产生来进行。免疫原性抗原可以纯化蛋白质或蛋白质混合物(包括全细胞或细胞提取物或组织提取物)的形式施用于动物，或抗原可在动物体内由编码所述抗原或其部分的核酸从头形成。
本发明抗体可为人抗体或人源化抗体。
在一些实施方案中，本发明的特异性结合人CD40的激动性抗体包含来源于IGHV3-23*03(SEQ ID NO:79)、IGHV1-69*01(SEQ ID NO:80)、IGHV3-23*01(SEQ ID NO:81)、IGHV3-23*04(SEQ ID NO:82)或IGHV4-39*01(SEQ ID NO:73)的VH框架。
在一些实施方案中，本发明的特异性结合人CD40的激动性抗体包含来源于IGKV3-20*1(SEQ ID NO:74)、IGKV4-1*01(SEQ ID NO:84)、IGKV1-39*01(SEQ ID NO:85)、IGLV3-1*01(SEQ ID NO:86)或IGLV2-8*01(SEQ ID NO:87)的VL框架。
在一些实施方案中，本发明的特异性结合人CD40的激动性抗体包含来源于人IGHV3-23*03(SEQ ID NO:79)的重链框架和来源于人IGKV3-20*01(SEQ ID NO:74)的轻链框架。
在一些实施方案中，本发明的特异性结合人CD40的激动性抗体包含来源于人IGHV1-69*01(SEQ ID NO:80)的重链框架和来源于人IGKV4-1*01(SEQ ID NO:84)的轻链框架。
在一些实施方案中，本发明的特异性结合人CD40的激动性抗体包含来源于人IGHV1-69*01(SEQ ID NO:80)的重链框架和来源于人IGKV1-39*01(SEQ ID NO:85)的轻链框架。
在一些实施方案中，本发明的特异性结合人CD40的激动性抗体包含来源于人IGHV3-23*01(SEQ ID NO:81)的重链框架和来源于人IGKV1-39*01(SEQ ID NO:85)的轻链框架。
在一些实施方案中，本发明的特异性结合人CD40的激动性抗体包含来源于人IGHV3-23*04(SEQ ID NO:82)的重链框架和来源于人IGLV3-1*01(SEQ ID NO:86)的轻链框架。
在一些实施方案中，本发明的特异性结合人CD40的激动性抗体包含来源于人IGHV4-39*01(SEQ ID NO:73)的重链框架和来源于人IGLV2-8*01(SEQ ID NO:87)的轻链框架。
包含“来源于”特定框架或种系序列的重链或轻链可变区的抗体是指从使用人种系免疫球蛋白基因的系统获得的抗体，诸如从转基因小鼠或如下文讨论的噬菌体展示文库获得的抗体。“来源于”特定框架或种系序列的抗体相比于其所来源的序列，可能由于例如天然存在的体细胞突变或特意置换而包含一些氨基酸差异。
本发明的抗体可为IgA、IgD、IgE、IgG或IgM同种型。本发明的抗体可为IgG1、IgG2、IgG3、IgG4型。
本发明的抗体可被进一步工程化以产生修饰抗体，在相比于亲本抗体时具有类似或改变的特性。可在本发明的抗体中工程化VH、VL、VH和VL、恒定区、VH框架、VL框架、或任意或全部六个CDR。
本发明的抗体可通过CDR接枝进行工程化。可将本发明的抗体中的一个或多个CDR序列接枝到不同的框架序列上。CDR接枝可使用本文所述的方法进行。在本文所述的一些实施方案中，并且在各个和每个下文所列编号实施方案的一些实施方案中，本发明抗体包括：VH，包含SEQ ID NO:1、2、3、4或5的HDCR1，SEQ ID NO:6、7、8、9、10、11、12或13的HCDR2，SEQID NO:14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25的HCDR3；以及VL，包含SEQ ID NO:26、27、28、29、30、31或32的LCDR1，SEQ ID NO:33、34、35、36、37、38或39的LCDR2和/或SEQ ID NO:40、41、42、43、44、45、46或47的LCDR3，其中VH框架不来源于IGHV3-23*03(SEQ ID NO:79)、IGHV1-69*01(SEQ ID NO:80)、IGHV3-23*01(SEQ ID NO:81)、IGHV3-23*04(SEQ ID NO:82)或IGHV4-39*01(SEQ ID NO:73)，并且VL框架不来源于IGLV4-1*01(SEQ ID NO:84)、IGKV1-39*01(SEQ ID NO:85)、IGLV3-1*01(SEQ ID NO:86)或IGLV2-8*01(SEQ ID NO:87)。
待使用的框架序列可获自公共DNA数据库或包括种系抗体基因序列的已出版参考文献。例如，人重链和轻链可变区基因的种系DNA和编码蛋白质序列可见于theinternational ImMunoGeneTics information http://_www-imgt_org。能够被用来置换本发明抗体中现有框架序列的框架序列是显示与亲本框架的百分比同一性最高的那些。
亲本和工程化抗体的框架序列还可例如通过回复突变来修饰，以恢复和/或改善所得抗体与抗原的结合，如例如在美国专利6,180,370中所描述。亲本和工程化抗体的框架序列还可通过使框架区内，或甚至一个或多个CDR区内的一个或多个残基突变来修饰，以移除T-细胞表位，从而降低抗体的潜在免疫原性。该方法也被称为“去免疫化”并且在美国专利公布20030153043中进一步详述。
可使本发明抗体的CDR残基突变，以改善感兴趣的抗体的一个或多个结合特性。可进行定点诱变或PCR介导的诱变以引入突变，并可在如本文所述和实施例所提供的体外或体内测定中评估对抗体结合、或其它感兴趣的功能特性的影响。可引入的示例性置换是如上文讨论的保守修饰。此外，通常在CDR区内不超过一个、二个、三个、四或五个残基被改变。
可对本发明的抗体进行Fc区的突变，以调节抗体效应子功能和药代动力学特性。
在一些实施方案中，本发明的特异性结合人CD40的激动性抗体在抗体Fc区中包含至少一个置换。
可对本发明的抗体进行Fc突变以调节抗体半衰期。例如，可引入M252Y/S254T/T256E突变以提高所得抗体的半衰期(Dall’Acqua等人，J Biol Chem 281:23514–240,2006)。
在一些实施方案中，本发明的特异性结合人CD40的激动性抗体在Fc区中包含至少一个突变，使抗体与FcyRIIb的结合增强。
“与FcyRIIb的结合增强”是指当与不具有突变的相同抗体比较时，在Fc区中包含至少一个突变的本发明抗体与FcyRIIb的结合在统计意义上显著增大(例如EC50值减小)。
可使用流式细胞术，在被工程化成表达FcyRIIb的细胞上评估抗体与FcyRIIb的结合。在一个示例性结合测定中，在96-孔板中每孔接种2×105个细胞，并在BSA染色缓冲液(BD Biosciences,San Jose,USA)中于4℃封闭30分钟。在4℃下，将细胞与测试抗体在冰上一起温育1.5小时。在用BSA染色缓冲液洗涤两次之后，将细胞与R-PE标记的抗人IgG二抗(Jackson Immunoresearch Laboratories)在4℃下一起温育45分钟。将细胞在染色缓冲液中洗涤两次，然后重悬于150μL的含有1:200稀释的DRAQ7Live/Dead染色剂(CellSignaling Technology,Danvers,USA)的染色缓冲液中。分别使用B2和B4通道，通过Miltenyi MACSQuant流式细胞计(Miltenyi Biotec,Auburn,USA)检测染色细胞的PE和DRAQ7信号。活细胞用DRAQ7排除实施门控，并且测定所采集的至少10,000个活事件的几何平均荧光信号。使用FlowJo软件(Tree Star)进行分析。数据被绘制成抗体浓度的对数对于平均荧光信号的图。非线性回归分析是通过GraphPad Prism 6(GraphPad Software,Inc.)进行的，并且计算EC50值。
本发明的特异性结合人CD40的激动性抗体与FcγRIIb增强的结合可增强CD40分子的交联，从而导致本发明的激动性抗体对CD40更强的活化。产生具有增加的FcγRIIb的抗体的示例性Fc突变为S267E突变、S267D突变、S267E/I332E突变、S267E/L328F突变、G236D/S267E突变和E233D/G237D/H268D/P271G/A330R/P238D突变，残基根据EU索引进行编号。
在一些实施方案中，本发明的特异性结合人CD40的激动性抗体在Fc区中包含S267E突变，其中残基根据EU索引进行编号。
在一些实施方案中，本发明的特异性结合人CD40的激动性抗体在Fc区中包含S267E/I332E突变，其中残基根据EU索引进行编号。
在一些实施方案中，本发明的特异性结合人CD40的激动性抗体在F区中包含S267E/L328F突变，其中残基根据EU索引进行编号。
在一些实施方案中，本发明的特异性结合人CD40的激动性抗体在Fc区中包含E233D/G237D/H268D/P271G/A330R/P238D突变，其中残基根据EU索引进行编号。
在一些实施方案中，本发明的特异性结合人CD40的激动性抗体在Fc区中包含至少一个突变，所述突变增强抗体与Fcγ受体(FcγR)的结合并且/或者增强Fc效应子功能，诸如Clq结合、补体依赖性细胞毒性(GDC)、抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)或吞噬作用(ADCP)。
可被突变成增加抗体与活化Fey的结合和/或增强抗体效应子功能的Fc区位置是例如描述于美国专利6,737,056；美国专利公布2015/0259434；Shields等人，(2001)J BiolChem 276:6591-6604；Lazar等人，(2006)Proc Natal Acad Sci,103:4005-4010；Stavenhagen等人，(2007)Cancer Res67:8882-8890；Richards等人，(2008)Mol CancerTher 7:2517-2527；Diebolder等人，Science；2014年3月13日在线发表；doi:10.1126/science.1248943中的那些，并且包括位置236、239、243、256,290,292、298、300、305、312、326、330、332、333、334、345、360、339、378、396或430(残基根据EU索引进行编号)。可单独或组合进行的示例性突变为G236A突变、S239D突变、F243L突变、T256A突变、K290A突变、R292P突变、S298A突变、Y300L突变、V305L突变、K326A突变、A330K突变、I332E突变、E333A突变、K334A突变、A339T突变和P396L突变。产生ADCC或ADCP增大的抗体的示例性组合置换为IgGl上的239D/I332E突变、S298A/E333A/K334A突变、F243L/R292P/Y300L突变、F243L/R292P/Y300L/P396L突变、F243L/R292P/Y300L/V305I/P396L突变和G236A/S239D/I332E突变。
可被突变成增强抗体CDC的Fc区位置是描述于例如国际专利申请W02014/108198、Idusogie等人，(2001)J Immunol 166:2571-2575以及Moore等人，(2010)Mabs,2:181-189中的那些，并且包括位置267、268、324、326、333、345和430。可单独或组合进行的示例性突变为S267E突变、F1268F突变、S324T突变、K326A突变、K326W突变、E333A突变、E345K突变、E345Q突变、E345R突变、E345Y突变、E430S突变、E430F突变和E430T突变。产生ADCC或ADCP增大的抗体的示例性组合突变为IgGl上的K326A/E333A突变、K326W/E333A突变、H268F/S324T突变、S267E/H268F突变、S267E/S324T突变和S267E/H268F/S324T突变。
单克隆抗体诱导ADCC的能力也可通过工程化其低聚糖组分来增强。人IgG1或IgG3在Asn297处被熟知的双分枝G0、G0F、G1、G1F、G2或G2F形式的大多数聚糖N-糖基化。未工程化的CHO细胞所产生的抗体通常具有约至少85％的聚糖岩藻糖含量。从连接到Fc区的双分枝复合物型低聚糖去除核心岩藻糖，可经由改善的FcγRIIIa结合来增强抗体的ADCC，而不会改变抗原结合或CDC活性。此类mAb可使用据报道能引起具有双分枝复合物型Fc低聚糖的相对较高去岩藻糖基化抗体的成功表达的不同方法实现，诸如控制培养物渗透压(Konno等人，Cytotechnology，64:249-65，2012)，应用变体CHO细胞系Lec13作为宿主细胞系(Shields等人，J Biol Chem 277:26733-26740,2002)，应用变体CHO细胞系EB66作为宿主细胞系(Olivier等人，MAbs；2(4)，2010；Epub ahead of print；PMID:20562582)、应用大鼠杂交瘤细胞系YB2/0作为宿主细胞系(Shinkawa等人，J Biol Chem 278:3466-3473,2003)、引入特异性针对α1,6-岩藻糖基转移酶(FUT8)基因的小干扰RNA(Mori等人，BiotechnolBioeng88:901-908,2004)、或共表达β-1,4-N-乙酰葡糖胺基转移酶III和高尔基体α-甘露糖苷酶II或有效的α-糖苷酶I抑制剂、几夫碱(Ferrara等人，J Biol Chem281:5032-5036,2006,Ferrara等人，Biotechnol Bioeng93:851-861,2006；Xhou等人，Biotechnol Bioeng99:652-65,2008)。
在一些实施方案中，本发明的特异性结合人CD40的激动性抗体具有岩藻糖含量为约0％至约15％(例如15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％或0％)的双分枝聚糖结构。
在一些实施方案中，本发明的特异性结合人CD40的激动性抗体具有岩藻糖含量为约50％、40％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％或0％的双分枝聚糖结构。
“岩藻糖含量”意指Asn297处糖链内的岩藻糖单糖的量。岩藻糖的相对量为含岩藻糖的结构相对于所有糖结构的百分比。这些可通过多种方法进行表征和定量，例如：1)使用经N-糖苷酶F处理的样本(例如，复合结构、混合结构及低聚甘露糖结构和高甘露糖结构)的MALDI-TOF，如国际专利公布WO2008/077546中所描述；2)通过酶促释放Asn297聚糖，随后衍生化并通过具有荧光检测的HPLC(UPLC)和/或HPLC-MS(UPLC-MS)进行检测/定量；3)在用或不用Endo S或其它酶处理Asn297聚糖的情况下，对天然或还原后的mAb进行完整蛋白分析，所述其它酶在第一GlcNAc单糖和第二GlcNAc单糖之间进行裂解，留下连接至第一GlcNAc的岩藻糖；4)通过酶消化(例如，胰蛋白酶或肽链内切酶Lys-C)将mAb消化为成分肽，随后通过HPLC-MS(UPLC-MS)进行分离、检测和定量；或5)用PNGase F在Asn 297处进行特异性酶促去糖基化，从而将mAb低聚糖与mAb蛋白分离。可通过各种互补技术对释放的低聚糖进行荧光团标记、分离并鉴定，这些技术允许：采用基质辅助激光解吸电离(MALDI)质谱法，通过比较实验质量与理论质量来对聚糖结构进行精细表征；通过离子交换HPLC(GlycoSep C)确定唾液酸化程度；通过正相HPLC(GlycoSep N)，根据亲水性标准分离和定量低聚糖形式；以及通过高效毛细管电泳激光诱导荧光(HPCE-LIF)分离和定量低聚糖。
如本申请中所用，“低岩藻糖”或“低岩藻糖含量”是指抗体的岩藻糖含量为约0％-15％。
如本文所用，“正常岩藻糖”或“正常岩藻糖含量”是指抗体的岩藻糖含量大约高于50％，通常大约高于60％、70％、80％或高于85％。
具有增强的ADCC、ADCP和/或CDC的本发明的特异性结合CD40的激动性抗体可用于治疗表达CD40的血液恶性肿瘤。
“抗体依赖性细胞的细胞毒性”、“抗体依赖性细胞介导的细胞毒性”或“ADCC”是诱导细胞死亡的机制，该机制依赖于抗体包被靶细胞与具有裂解活性的效应细胞(诸如自然杀伤细胞、单核细胞、巨噬细胞和中性粒细胞)经由效应细胞上表达的Fcγ受体(FcγR)发生的相互作用。例如，NK细胞表达FcγRIIIa，而单核细胞表达FcγRI、FcγRII和FcγRIIIa。为评估本发明抗体的ADCC活性，可将抗体与免疫效应细胞联合加入到靶细胞中，该免疫效应细胞可被抗原抗体复合物激活，从而使靶细胞发生细胞裂解。通常根据从裂解细胞中释放的标记(例如放射性底物、荧光染料或天然胞内蛋白)来检测细胞溶解。用于此类测定法的示例性效应细胞包括外周血单核细胞(PBMC)和NK细胞。示例性靶细胞包括表达CD40的细胞。
“抗体依赖性细胞吞噬作用”(“ADCP”)是指通过吞噬细胞(诸如巨噬细胞或树突细胞)的内化作用消除抗体包被的靶细胞的机制。可使用单核细胞衍生的巨噬细胞作为效应细胞以及被工程化为表达GPP或其它标记分子的表达CD40的细胞作为靶细胞对进行ADCP评价。效应细胞:靶细胞比例可为例如4:1。可在含或不含测试CD40抗体的情况下，将效应细胞与靶细胞一起温育4小时。在温育后，可使用细胞消化液(accutase)分离细胞。可使用偶联至荧光标记的抗-CD11抗体和抗-CD14抗体鉴定巨噬细胞，并且可使用标准方法基于CD11+CD14+巨噬细胞中的GFP荧光％确定吞噬百分比。
“补体依赖性细胞毒性”或“CDC”是指诱导细胞死亡的机制，其中靶结合抗体的Fc效应域结合并激活补体成分Clq，Clq继而激活补体级联，从而导致靶细胞死亡。补体的激活也可导致补体成分沉积在靶细胞表面上，这些补体成分通过结合白细胞上的补体受体(例如，CR3)来促进ADCC。可例如通过将表达CD40的细胞铺在适当的培养基中，将抗CD4抗体添加到混合物中，然后添加混合的人血清来测量表达CD40的细胞的CDC。在温育期之后，可使用标准方法在FACS测定中将裂解细胞百分比(％)检测为碘化丙锭染色的细胞％。
“增强的ADCC”、“增强的CDC”和“增强的ADCP”是指当与不具有突变的相同抗体进行比较时，由在Fc区中包含至少一个突变的本发明抗体介导的ADCC、CDC和/或ADCP在统计意义上显著增大。ADCC、CDC和/或ADCP在诸如本文所述的测定和美国专利8,871,204所述的测定中进行。
另外，本发明的特异性结合人CD40的激动性抗体可通过诸如糖基化、异构化、去糖基化或非天然存在的共价修饰(例如添加聚乙二醇部分(聚乙二醇化)和脂质化)等过程进行翻译后修饰。此类修饰可在体内或体外进行。例如，本发明的抗体可与聚乙二醇缀合(聚乙二醇化)以改善其药代动力学性质。缀合可通过本领域技术人员已知的技术来实施。治疗抗体与PEG的缀合已示出增强药效学，同时不干扰功能(Knigh等人，Platelets 15:409-18,2004；Leong等人，Cytokine 16:106-19,2001；Yang等人，Protein Eng.16:761-70,2003)。
经修饰以改善稳定性、选择性、交叉反应性、亲和力、免疫原性或其它所需生物学或生物物理学特性的本发明抗体或其抗原结合片段处于本发明的范围内。抗体的稳定性受许多因素影响，包括(1)影响其内在稳定性的单独域的核心堆叠，(2)对HC和LC配对具有影响的蛋白质/蛋白质界面相互作用，(3)极性和带电残基的包埋，(4)极性和带电残基的H键网络；以及(5)其它分子内力和分子间力中的表面电荷和极性残基分布(Worn等人，J MolBiol 305:989-1010,2001)。潜在的结构不稳定残基可根据该抗体的晶体结构或在某些情况下通过分子建模来鉴定，并且所述残基对于抗体稳定性的影响可通过生成并评估在所鉴定残基中携带突变的变体来测试。一种增加抗体稳定性的方法是升高由差示扫描量热法(DSC)测量的热转变中间点(Tm)。一般来讲，蛋白质的Tm与其稳定性相关联并且与其对溶液中的解折叠和变性以及依赖于该蛋白质解折叠倾向的降解过程的易感性成反向相关(Remmele等人，Biopharm 13:36-46,2000)。大量的研究已经发现了通过DSC以热稳定性而测量的制剂物理稳定性的级别与通过其它方法测量的物理稳定性之间的相关性(Gupta等人，AAPS PharmSci 5E8,2003；Zhang等人，J Pharm Sci 93:3076-89,2004；Maa等人，Int JPharm 140:155-68,1996；Bedu-Addo等人，Pharm Res 21:1353-61,2004；Remmele等人，Pharm Res 15:200-8,1997)。制剂研究提示，Fab Tm对相应mAb的长期物理稳定性有影响。
在一些实施方案中，本发明的抗体是多特异性抗体。
在一些实施方案中，本发明的抗体是双特异性抗体。
本发明的特异性结合人CD40的激动性抗体可工程改造成双特异性抗体，该双特异性抗体也涵盖于本发明的范围内。
全长双特异性抗体可以例如使用两个单特异性二价抗体之间的Fab臂交换(或半分子交换，在重链-轻链对上交换)通过下列方式产生：在每个半分子中的重链CH3交界处引入突变以促成两个在体外无细胞环境中或使用共表达而具有不同特异性的抗体半分子的异源二聚体形成。Fab臂交换反应是二硫键异构化反应和CH3域解离-缔合的结果。亲本单特异性抗体的铰链区中的重链二硫键减少。亲本单特异性抗体之一的所得游离半胱氨酸与第二亲本单特异性抗体分子的半胱氨酸残基形成重链间二硫键，同时亲本抗体的CH3域通过解离-缔合而释放和重新形成。可以将Fab臂的CH3域改造成促成异源二聚化而非同源二聚化。所得产物是具有两个Fab臂或半分子的双特异性抗体，这两个Fab臂或半分子各自结合不同的表位。可使用一个重链中的突变F405L和另一个重链中的K409R。为了产生双特异性抗体，将第一单特异性二价抗体和第二单特异性二价抗体被工程化为在Fc区中具有F405L或K409R突变，使抗体在足以允许半胱氨酸在铰链区发生二硫键异构化的还原条件下一起温育；从而通过Fab臂交换产生双特异性抗体。温育条件最理想地可恢复到非还原条件。可使用的示例性还原剂为2-巯基乙胺(2-MEA)、二硫苏糖醇(DTT)、二硫赤藓糖醇(DTE)、谷胱甘肽、三(2-羧乙基)膦(TCEP)、L-半胱氨酸和β-巯基乙醇。例如，可使用如下条件：在至少25mM 2-MEA的存在下或至少0.5mM二硫苏糖醇的存在下，在5-8的pH例如pH7.0或pH7.4，至少20℃的温度下，温育至少90分钟。
双特异性抗体也可使用诸如钮扣(Genentech)、CrossMAbs(Roche)和静电匹配(Chugai,Amgen,NovoNordisk,Oncomed)、LUZ-Y(Genentech)、Strand ExchangeEngineered Domain body(SEEDbody)(EMD Serono)、以及Biclonic(Merus)的设计产生。
“钮扣”策略(参见，例如国际公布WO 2006/028936)可用于产生本发明的全长双特异性抗体。简而言之，在人IgG中形成CH3域的交界的选定氨基酸可在影响CH3域相互作用的位置处突变，从而促进异源二聚体形成。将具有小侧链(扣)的氨基酸引入特异性地结合第一抗原的抗体的重链中，并将具有大侧链(钮)的氨基酸引入特异性地结合第二抗原的抗体的重链中。在两种抗体共表达后，由于具有“扣”的重链与具有“钮”的重链的优先相互作用而形成异源二聚体。形成钮和扣的示例性CH3置换对(表示为第一重链的第一CH3域中的修饰位置/第二重链的第二CH3域中的修饰位置)是：T366Y/F405A、T366W/F405W、F405W/Y407A、T394W/Y407T、T394S/Y407A、T366W/T394S、F405W/T394S和T366W/T366S_L368A_Y407V。
CrossMAb技术可用于产生本发明的全长双特异性抗体。除利用“钮扣”策略促进Fab壁交换之外，CrossMAb在半臂之一中具有交换的CH1和CL域，以确保所得的双特异性抗体正确的轻链配对(参见例如美国专利8,242,247)。
可使用其它交换策略如下产生本发明的全长双特异性抗体：在双特异性抗体的一个或两个臂中，在重链与轻链之间或重链之内交换可变域或恒定域、或这两种域。这些交换包括例如VH-CH1与VL-CL、VH与VL、CH3与CL以及CH3与CH1，如在国际专利公布WO2009/080254、WO2009/080251、WO2009/018386和WO2009/080252中所描述。
还可使用其它技术，诸如通过在一个CH3表面置换带正电荷的残基并在另一CH3表面置换带负电荷的残基使用静电相互作用促进重链异源二聚化，如美国专利公布US2010/0015133；美国专利公布US2009/0182127；美国专利公布US2010/028637或美国专利公布US2011/0123532中所描述。在其它技术中，可通过下面的置换(表示为第一重链的第一CH3域中的修饰位置/第二重链的第二CH3域中的修饰位置)促进异源二聚化：L351Y_F405A_Y407V/T394W、T366I_K392M_T394W/F405A_Y407V、T366L_K392M_T394W/F405A_Y407V、L351Y_Y407A/T366A_K409F、L351Y_Y407A/T366V_K409F、Y407A/T366A_K409F、或T350V_L351Y_F405A_Y407V/T350V_T366L_K392L_T394W，如美国专利公布US2012/0149876或美国专利公布US2013/0195849中所描述。
LUZ-Y技术可用于产生本发明的双特异性抗体。在该技术中，将亮氨酸拉链加入CH3域的C末端，以驱动由亲本单克隆抗体装配异源二聚体，该亲本单克隆抗体经后纯化移除，如Wranik等人，(2012)J Biol Chem287(52):42221-9中所描述。
SEEDbody技术可用于产生本发明的双特异性抗体。SEEDbodies在其恒定域中具有所选择的经IgA残基取代的IgG残基，以促进异源二聚化，如在美国专利US20070287170中所描述。
通常使用标准方法以DNA水平到分子水平(诸如抗体的恒定域)上进行突变。
本发明的抗体可被工程为各种公知的抗体形式。
在一些实施方案中，双特异性抗体包括重组IgG样双重靶向分子，其中分子的两侧各自包含至少两种不同抗体的Fab片段或Fab片段的一部分；IgG融合分子，其中全长IgG抗体与额外的Fab片段或Fab片段的一部分融合；Fc融合分子，其中单链Fv分子或稳定的双体融合于重链恒定域、Fc区或它们的一部分；Fab融合分子，其中不同的Fab片段融合在一起；ScFv-和双体基以及重链抗体(例如，域抗体，纳米抗体)，其中不同的单链Fv分子或不同的双体或不同的重链抗体(例如域抗体，纳米抗体)彼此融合或融合于另一个蛋白质或载体分子。
本发明还提供了具有特定VH和VL序列的特异性结合人CD40的激动性抗体，其中VH由第一多核苷酸编码并且VL由第二多核苷酸编码。多核苷酸可为互补脱氧核酸(cDNA)，并且可经密码子优化以在合适的宿主中表达。密码子优化是公知的技术。
多核苷酸、载体、宿主细胞
本发明还提供编码本发明抗体的VH、本发明抗体的VL、本发明抗体的重链或本发明抗体的轻链的分离的多核苷酸。
本发明还提供编码SEQ ID NO:48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、61或62的VH的分离的多核苷酸。
本发明还提供编码SEQ ID NO:63、64、65、66、67、68、69、70、71或72的VL的分离的多核苷酸。
本发明还提供编码SEQ ID NO:48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、61或62的VH以及SEQ ID NO:63、64、65、66、67、68、69、70、71或72的VL的分离的多核苷酸。
本发明还提供包含SEQ ID NO:89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112或113的多核苷酸序列的分离的多核苷酸。
本发明还提供编码SEQ ID NO:114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、127、128或129的重链的分离的多核苷酸。
本发明还提供编码SEQ ID NO:130、131、132、133、134、135、136、137、138或139的轻链的分离的多核苷酸。
本发明还提供编码SEQ ID NO:114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125,127、128或129的重链以及SEQ ID NO:130、131、132、133、134、135、136、137、138或139的轻链的分离的多核苷酸。
本发明还提供包含SEQ ID NO:140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164或165的多核苷酸序列的分离的多核苷酸。
编码本发明抗体的VH或VL或其抗原结合片段、或本发明抗体的重链和轻链的多核苷酸序列能够有效连接至一个或多个调控元件，诸如启动子或增强子，该调控元件允许核苷酸序列在预期宿主细胞中的表达。多核苷酸可为cDNA。
本发明还提供了包含本发明的多核苷酸的载体。此类载体可以是质粒载体、病毒载体、用于杆状病毒表达的载体、基于转座子的载体或任何其它适于通过任何手段将本发明的合成多核苷酸引入给定生物体或遗传背景的载体。例如，将可任选地与恒定区连接的编码本发明抗体的轻链可变区和/或重链可变区的多核苷酸插入表达载体中。轻链和/或重链可被克隆在相同或不同的表达载体中。可将编码免疫球蛋白链的DNA片段可操作地连接到确保免疫球蛋白多肽表达的一个或多个表达载体中的对照序列。对此类对照序列包括信号序列、启动子(例如，天然相关联的或异源的启动子)、增强子元件和转录终止子序列进行选择，以使其与选择用于表达抗体的宿主细胞相容。载体被结合到适当的宿主后，将宿主保持在适于蛋白质的高水平表达的条件下，所述蛋白质由结合的多核苷酸编码。
在一些实施方案中，载体包含SEQ ID NO:89的多核苷酸和SEQ ID NO:104的多核苷酸。
在一些实施方案中，载体包含SEQ ID NO:90的多核苷酸和SEQ ID NO:105的多核苷酸。
在一些实施方案中，载体包含SEQ ID NO:91的多核苷酸和SEQ ID NO:105的多核苷酸。
在一些实施方案中，载体包含SEQ ID NO:92的多核苷酸和SEQ ID NO:105的多核苷酸。
在一些实施方案中，载体包含SEQ ID NO:93的多核苷酸和SEQ ID NO:106的多核苷酸。
在一些实施方案中，载体包含SEQ ID NO:94的多核苷酸和SEQ ID NO:106的多核苷酸。
在一些实施方案中，载体包含SEQ ID NO:95的多核苷酸和SEQ ID NO:106的多核苷酸。
在一些实施方案中，载体包含SEQ ID NO:96的多核苷酸和SEQ ID NO:106的多核苷酸。
在一些实施方案中，载体包含SEQ ID NO:97的多核苷酸和SEQ ID NO:106的多核苷酸。
在一些实施方案中，载体包含SEQ ID NO:98的多核苷酸和SEQ ID NO:107的多核苷酸。
在一些实施方案中，载体包含SEQ ID NO:99的多核苷酸和SEQ ID NO:108的多核苷酸。
在一些实施方案中，载体包含SEQ ID NO:100的多核苷酸和SEQ ID NO:109的多核苷酸。
在一些实施方案中，载体包含SEQ ID NO:98的多核苷酸和SEQ ID NO:111的多核苷酸。
在一些实施方案中，载体包含SEQ ID NO:98的多核苷酸和SEQ ID NO:112的多核苷酸。
在一些实施方案中，载体包含SEQ ID NO:98的多核苷酸和SEQ ID NO:113的多核苷酸。
在一些实施方案中，载体包含SEQ ID NO:102的多核苷酸和SEQ ID NO:110的多核苷酸。
在一些实施方案中，载体包含SEQ ID NO:103的多核苷酸和SEQ ID NO:110的多核苷酸。
合适的表达载体通常可以在宿主生物体中作为游离基因或宿主染色体DNA的一部分进行复制。通常，表达载体包含选择标记，诸如氨苄青霉素抗性、潮霉素抗性、四环素抗性、卡那霉素抗性或新霉素抗性，以便对那些转化了所需DNA序列的细胞进行检测。
合适的启动子和增强子元件是本领域已知的。为了在真核细胞中表达，示例性启动子包括轻链和/或重链免疫球蛋白基因启动子和增强子元件；巨细胞病毒立即早期启动子；单纯疱疹病毒胸苷激酶启动子；早期和晚期SV40启动子；逆转录病毒长末端重复序列中存在的启动子；小鼠金属硫蛋白-I启动子；以及各种已知的组织特异性启动子。选择适当的载体和启动子在本领域普通技术人员的水平范围内。
可使用的示例性载体为细菌：pBs、phagescript、PsiX174、pBluescript SK、pBsKS、pNH8a、pNH16a、pNH18a、pNH46a(Stratagene,La Jolla,Calif.,USA)；pTrc99A、pKK223-3、pKK233-3、pDR540和pRIT5(Pharmacia,Uppsala,Sweden)。真核：pWLneo、pSV2cat、pOG44、PXR1、pSG(Stratagene)、pSVK3、pBPV、pMSG和pSVL(Pharmacia)、pEE6.4(Lonza)和pEE12.4(Lonza)。
本发明还提供一种宿主细胞，其包含本发明的一个或多个载体。“宿主细胞”是指已引入载体的细胞。应该理解，术语宿主细胞不仅旨在指特定的主体细胞，还指此类细胞的子代，并且也指特定主体细胞所产生的稳定细胞系。因为由于突变或者由于环境影响，在后代中可发生某些修饰，因此这种子代可与母体细胞不同，但仍包括在本文所用的术语“宿主细胞”的范围内。此类宿主细胞可以是真核细胞、原核细胞、植物细胞或古菌细胞。
原核宿主细胞的示例是大肠杆菌(Escherichia coli)、杆菌属(bacilli)诸如枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)和其它肠杆菌科(enterobacteriaceae)诸如沙门氏菌(Salmonella)、沙雷氏菌(Serratia)以及各种假单胞菌属(Pseudomonas)物种。其他微生物诸如酵母也可用于表达。酵母属(Saccharomyces)(例如，酿酒酵母(S.Cerevisiae))和毕赤酵母是合适的酵母宿主细胞的示例。示例性真核细胞可以是哺乳动物、昆虫、禽类或其它动物来源。哺乳动物真核细胞包括无限增殖化细胞系，诸如杂交瘤或骨髓瘤细胞系，诸如SP2/0(美国典型培养物保藏中心(ATCC),Manassas,VA,CRL-1581)、NS0(欧洲细胞培养物保藏中心(ECACC),Salisbury,Wiltshire,UK,ECACC No.85110503)、FO(ATCC CRL-1646)和Ag653(ATCC CRL-1580)鼠细胞系。一种示例性人骨髓瘤细胞系是U266(ATTC CRL-TIB-196)。其它可用的细胞系包括衍生自中国仓鼠卵巢(CHO)细胞的那些细胞系，诸如CHOK1SV(LonzaBiologics,Walkersville,MD)、CHOK2SV(Lonza)、CHO-K1(ATCC CRL-61)或DG44。
本发明还提供一种制备本发明抗体的方法，该方法包括在使抗体表达的条件下培养本发明的宿主细胞，并且回收由宿主细胞产生的抗体。制备抗体并将其纯化的方法是本领域所熟知的。一旦被合成(以化学方式或重组方式)后，全部抗体、其二聚体、单个轻链和/或重链、或者其它抗体片段诸如VH和/或VI，可以根据标准程序进行纯化，包括硫酸铵沉淀、亲和柱、柱层析法、高效液相色谱(HPLC)纯化、凝胶电泳等等(参见generally Scopes,Protein Purification(Springer-Verlag,N.Y.,(1982))。受试者抗体可以基本上是纯净的，例如，至少约80％至85％纯净、至少约85％至90％纯净、至少约90％至95％纯净、或者至少约98％至99％纯净，或者更加纯净，例如，不含污染物，诸如细胞碎片、除受试者抗体之外的大分子等。
本发明的另一个实施方案是制备特异性结合人CD40的激动性抗体的方法，包括：
将编码抗体的VH的第一多核苷酸和编码抗体的VL的第二多核苷酸引入表达载体中；
用表达载体转化宿主细胞；
在使VL和VH表达并形成抗体的条件下，将宿主细胞在培养基中进行培养；以及
从宿主细胞或培养基中回收抗体。
可使用标准分子生物方法将本发明的多核苷酸序列结合到载体中。使用熟知的方法完成宿主细胞转化、培养、抗体表达和纯化。
治疗方法
本发明的特异性结合人CD40的激动性抗体具有在体外和体内进行诊断，以及治疗和预防的用途。例如，本发明的抗体可被施用于体外或离体培养的细胞，或者待治疗的受试者，预防和/或诊断各种疾病，诸如癌症和感染性疾病。
本发明的特异性结合人CD40的激动性抗体，例如抗体C40M67、C40M66、C40M63、C40M62、C40M59、C40M58、C40M56、C40M55、C40M51、C40M18、C40M17、C40M12、C40M102、C40M103、C40M104、C40M105、C40M121和C40M126可用于治疗和/或预防任何病症或疾病，其中增强CD40信号转导可在治疗学上有效并且可减轻疾病的症状。
本发明的方法可用于治疗属于任何动物分类的受试者。可被治疗的受试者的示例包括哺乳动物，诸如人、啮齿动物、犬类、猫类和农畜。
本发明的抗体可用于制备用于此类治疗的药物，其中制备所述药物以按照本文定义的剂量施用。
本发明提供一种治疗癌症的方法，该方法包括以足以治疗癌症的时间向对其有需要的受试者施用治疗有效量的本发明的特异性结合人CD40的分离的激动性抗体。
可用本发明的特异性结合人CD40的激动性抗体治疗的受试者是已被诊断患有脑癌、肺癌、骨癌、胰腺癌、皮肤癌、头颈癌、皮肤或眼内黑素瘤、子宫癌、卵巢癌、直肠癌、肛区癌、胃癌、胃窦癌、结肠直肠癌、结肠癌、妇科肿瘤(例如，子宫肉瘤、输卵管癌、子宫内膜癌、宫颈癌、阴道癌或外阴癌)、食道癌、小肠癌、内分泌系统的癌症(例如，甲状腺癌、甲状旁腺癌或肾上腺)、软组织肉瘤、白血病、骨髓瘤、多发性骨髓瘤、尿道癌、阴茎癌、前列腺癌、慢性或急性白血病、儿童期实体瘤、淋巴细胞性淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、膀胱癌、肝癌、肾癌、肾脏癌或输尿管癌(例如，肾细胞癌，肾盂癌)、或中枢神经系统的肿瘤(例如，原发性CNS淋巴瘤、脊轴瘤、脑干胶质瘤或垂体腺瘤)、神经胶质瘤或纤维肉瘤的受试者。
本发明还提供一种治疗实体瘤的方法，该方法包括以足以治疗实体瘤的时间向对其有需要的受试者施用治疗有效量的本发明的特异性结合人CD40的分离的激动性抗体。
本发明还提供一种治疗血液恶性肿瘤的方法，该方法包括以足以治疗血液恶性肿瘤的时间向对其有需要的受试者施用治疗有效量的本发明的特异性结合人CD40的分离的激动性抗体。
在一些实施方案中，实体瘤为前列腺癌、乳腺癌、结肠直肠癌、胰腺癌、卵巢癌、肺癌、宫颈癌、横纹肌肉瘤、成神经细胞瘤、黑素瘤、膀胱癌、或头颈癌。
在一些实施方案中，实体瘤为黑色素瘤。
在一些实施方案中，实体瘤为肺癌。
在一些实施方案中，实体瘤为鳞状非小细胞肺癌(NSCLC)。
在一些实施方案中，实体瘤为非鳞状NSCLC。
在一些实施方案中，实体瘤为肺腺癌。
在一些实施方案中，实体瘤为肾细胞癌(RCC)(例如，肾透明细胞癌或肾乳头状细胞癌)或其转移性病变。
在一些实施方案中，实体瘤为间皮瘤。
在一些实施方案中，实体瘤是鼻咽癌(NPC)。
在一些实施方案中，实体瘤为结直肠癌。
在一些实施方案中，实体瘤为前列腺癌或去势抵抗性前列腺癌。
在一些实施方案中，实体瘤为胃部癌症。
在一些实施方案中，实体瘤为卵巢癌。
在一些实施方案中，实体瘤为胃癌。
在一些实施方案中，实体瘤为肝癌。
在一些实施方案中，实体瘤为胰腺癌。
在一些实施方案中，实体瘤为甲状腺癌。
在一些实施方案中，实体瘤为头颈部的鳞状细胞癌。
在一些实施方案中，实体瘤为食道或胃肠道癌。
在一些实施方案中，实体瘤为乳腺癌。
在一些实施方案中，实体瘤为输卵管癌。
在一些实施方案中，实体瘤为脑癌。
在一些实施方案中，实体瘤为尿道癌。
本发明还提供一种增强免疫应答的方法，该方法包括以足以增强免疫应答的时间向对其有需要的受试者施用治疗有效量的本发明的特异性结合人CD40的分离的激动性抗体。
“治疗”或“诊疗”是指治疗剂治疗，其中治疗对象将减慢(减轻)非期望的生理改变或疾病诸如肿瘤或肿瘤细胞的发展或扩散，或者用于在治疗期间提供有益或期望的临床结果。有益或期望的临床结果包括症状减轻、疾病程度减弱、疾病状态稳定(即未恶化)、疾病进展延迟或减慢、未转移、疾病状态改善或缓和，以及缓解(不论是部分缓解还是完全缓解)，不论是可检测的还是不可检测的。“治疗”也可意指与受试者未接受治疗时的预期生存期相比延长生存期。需要治疗的那些受试者包括已经患有非期望的生理改变或疾病的那些受试者、以及倾向于患有生理改变或疾病的那些受试者。
“抑制生长”(例如，涉及肿瘤细胞)是指与在不存在治疗剂的情况下相同肿瘤细胞或肿瘤组织的生长相比，在与治疗剂或治疗剂的组合接触时体外或体内肿瘤细胞生长或肿瘤组织的可测量的下降。体外或体内肿瘤细胞或肿瘤组织生长的抑制可为至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、99％或100％。
“治疗有效量”是指在所需剂量和时间段有效实现期望的治疗结果的量。治疗有效量可根据以下因素变化：诸如个体的疾病状态、年龄、性别和重量，以及治疗剂或治疗剂组合在个体中引发期望的应答的能力。有效治疗剂或治疗剂组合的示例性指标包括，例如：患者健康状况的改善、肿瘤负荷的减少、肿瘤生长的遏止或减慢和/或癌细胞没有向身体其它部位转移的情况。
本发明还提供一种增强受试者中免疫应答的方法，该方法包括以足以增强免疫应答的时间向对其有需要的受试者施用治疗有效量的特异性结合人CD40的激动性抗体。
在一些实施方案中，受试者是免疫失能的。
在一些实施方案中，受试者处于免疫失能的风险。免疫失能的受试者可能正在经历，或已经经历化学治疗或放射治疗。
在一些实施方案中，受试者因感染而免疫失能或处于免疫失能的风险中。
在一些实施方案中，受试者具有病毒感染。
本发明还提供一种治疗病毒感染的方法，该方法包括以足以治疗病毒感染的时间向对其有需要的受试者施用治疗有效量的本发明的特异性结合人CD40的分离的激动性抗体。
施用/药物组合物
本发明的特异性结合人CD40的激动性抗体能够以合适的药物组合物提供，该药物组合物包含抗体以及药学上可接受的载体。载体可为特异性结合CD40的激动性抗体与之一起施用的稀释剂、佐剂、赋形剂或媒介物。此类媒介物可以是液体，诸如水和油，包括来源于石油、动物、植物的油或合成的那些油，诸如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等。例如，可使用0.4％盐水和0.3％甘氨酸。这些溶液是无菌的，并且通常不含颗粒物。它们可通过熟知的常规灭菌技术(例如过滤)进行灭菌。该组合物可根据需要含有药学上可接受的辅助物质，以接近生理条件，所述辅助物质诸如pH调节剂和缓冲剂、稳定剂、增稠剂、润滑剂和着色剂等。此类药物制剂中的本发明的分子或抗体的浓度可在很大范围内变化，即，从按重量计小于约0.5％，通常到至少约1％至多达15或20％、25％、30％、35％、40％、45％或50％，并且将根据所选择的具体施用方式，主要基于所需的剂量、流体体积、粘度等进行选择。包含其它人蛋白(例如，人血清白蛋白)在内的合适的媒介物和制剂在例如Remington:The Scienceand Practice of Pharmacy，第21版，Troy,D.B.编辑，Lipincott Williams and Wilkins,Philadelphia,PA 2006，第5部分，Pharmaceutical Manufacturing，第691-1092页(特别参见第958-989页)中有所描述。
本发明的特异性结合人CD40的激动性抗体的施用模式可为任何合适的途径，诸如胃肠外施用，例如真皮内、肌肉内、腹膜内、静脉内或皮下、粘膜(口腔、鼻内、阴道内、直肠)或如本领域所熟知的技术人员了解的其它方式。特异性结合CD40的激动性抗体可使用已知的方法瘤内施用到淋巴结引流部位以局部递送到肿瘤中。
本发明的特异性结合人CD40的激动性抗体可通过任何合适的途径，例如经肠胃外通过静脉(i.v.)输注或弹丸式注射、肌内或皮下或腹膜内注射施用于患者。静脉输注可例如给予15、30、60、90、120、180、或240分钟，或1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12小时。
向患者给予的剂量足以缓解或至少部分地遏止正在治疗的疾病(“治疗有效量”)，并且有时可为0.005mg至约100mg/kg，例如约0.05mg至约30mg/kg，或约5mg至约25mg/kg，或约4mg/kg，约8mg/kg，约16mg/kg或约24mg/kg，或例如约1、2、3、4、5、6、7、8、9或10mg/kg，但可甚至更高，例如约15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、40、50、60、70、80、90或100mg/kg。
也可以给予固定的单位剂量，例如50、100、200、500或1000mg，或者剂量可基于患者的表面积，例如500、400、300、250、200或100mg/m2。通常可施用介于1和8次之间(例如，1、2、3、4、5、6、7或8次)的剂量来治疗AL，但可给予9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多次的剂量。
可在一天、两天、三天、四天、五天、六天、一周、两周、三周、一个月、五周、六周、七周、两个月、三个月、四个月、五个月、六个月或更长时间之后重复施用本发明的特异性结合人CD40的激动性抗体。也可以重复治疗过程，按照慢性施用一样。重复施用可为相同剂量或不同剂量。例如，本发明的特异性结合人CD40的激动性抗体可通过静脉内输注以8mg/kg或以16mg/kg按一周的时间间隔施用8周，接着以8mg/kg或以16mg/kg按每两周一次的方式再施用16周，然后以8mg/kg或以16mg/kg按每四周一次的方式施用。
特异性结合人CD40的激动性抗体可通过维持疗法施用，例如按每周一次的方式持续6个月或更长时间。
例如，本发明的特异性结合人CD40的激动性抗体可在治疗开始后第1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40天中的至少一天，或者另选地，在第1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20周中的至少一周，或其任何组合，使用单次剂量或者每24、12、8、6、4或2小时一次的分次剂量或其任何组合，以约0.1-100mg/kg的量作为日剂量提供，诸如0.5、0.9、1.0、1.1、1.5、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、40、45、50、60、70、80、90或100mg/kg/天。
本发明的特异性结合人CD40的激动性抗体也可预防性地施用，以降低罹患癌症的风险、延迟癌症进展中事件的发作和/或在癌症缓解后降低复发的风险。这对于肿瘤难以定位而由于其它生物因素已知患有肿瘤的患者可能尤其有用。
本发明的特异性结合人CD40的激动性抗体可冻干以便于储存，使用之前可在合适的载体中复原。此项技术已被证实对常规的蛋白制剂有效，并且可采用熟知的冻干和复原技术。
联合治疗
本发明提供一种治疗患有癌症的受试者的方法，该方法包括将治疗有效量的本发明的特异性结合人CD40的激动性抗体以及第二治疗剂联合施用。
第二治疗剂可为免疫检查点调节剂，此类抑制剂例如为特异性结合PD-1、PD-Ll、CTLA-4、LAG-3或TIM-3的拮抗性抗体。
第二治疗剂也可为T细胞活化分子的激动剂，例如特异性结合4-IBB、CD27、ICOS、或0X40的激动性抗体。
第二治疗剂还可为酶吲哚胺2,3-双加氧酶的抑制剂。
可使用的示例性抗-PD-1抗体为(纳武单抗(nivolumab))和(派姆单抗(pembrolizumab))。(派姆单抗)在例如美国专利8,354,509中有所描述，并且包含SEQ ID NO:166的VH和SEQ ID NO:167的VL。(纳武单抗)描述于例如美国专利8,008,449(抗体5C4)中并且包含SEQ ID NO:168的VH和SEQ ID NO:169的VL。纳武单抗和派姆单抗的氨基酸序列也可通过CAS注册获得。可使用的另外PD-1抗体描述于美国专利7,332,582、美国专利公布2014/0044738、国际专利公布WO2014/17966和美国专利公布2014/0356363。
SEQ ID NO:166
QVQLVQSGVEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYYMYWVRQAPGQGLEWMGGINPSNGGTNFNEKFKNRVTLTTDSSTTTAYMELKSLQFDDTAVYYCARRDYRFDMGFDYWGQGTTVTVSS
SEQ ID NO:167
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASKGVSTSGYSYLHWYQQKPGQAPRLLIYLASYLESGVPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQHSRDLPLTFGGGTKVEIK
SEQ ID NO:168
QVQLVESGGGVWQPGRSLRLDCKASGITFSNSGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWYDGSKRYYADSVKGRFTISRDNSKNTLFLQMNSLRAEDTAVYYCATNDDYWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO:169
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQSSNWPRTFGQGTKVEIK
可使用的示例性抗-PD-Ll抗体为度伐鲁单抗(durvalumab)、阿特珠单抗(atezolizumab)和阿维单抗(avelumab)，以及描述于例如美国专利公布2009/0055944、美国专利8,552,154、美国专利8,217,149和美国专利8,779,108中的那些。度伐鲁单抗包含SEQ ID NO:170的VH和SEQ ID NO:171的VL。阿特珠单抗包含SEQ ID NO:172的VH和SEQ IDNO:173的VL。阿维单抗包含SEQ ID NO:174的VH和SEQ ID NO:175的VL。
SEQ ID NO:170
EVQLVESGGG
LVQPGGSLRLSCAASGFTFSRYWMSWVRQAPGKGLEWVAN
IKQDGSEKYYVDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAREGGWFGELAFDYWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO:171
EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQRVSSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYGSLPWTFGQGTKVEIK
SEQ ID NO:172
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDSWIHWVRQAPGKGLEWVAWISPYGGSTYYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARRHWPGGFDYWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO:173
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVSTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYLYHPATFGQGTKVEIK
SEQ ID NO:174
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYIMMWVRQAPGKGLEWVSSIYPSGGITFYADTVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARIKLGTVTTVDYWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO:175
QSALTQPASVSGSPGQSITISCTGTSSDVGGYNYVSWYQQHPGKAPKLMIYDVSNRPSGVSNRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCSSYTSSSTRVFGTGTKVTVL
第二治疗剂可为本领域技术人员已知的任意一种或多种化学治疗药物或其它抗癌治疗剂。化学治疗剂包括烷基化剂、抗代谢药、抗微管抑制剂、拓扑异构酶抑制剂、受体酪氨酸激酶抑制剂、血管生成抑制剂等。化学治疗剂的示例包括：烷基化剂，诸如噻替哌和环磷酰胺烷基磺酸盐，诸如白消安、硫丹和嗪消安；氮丙啶，诸如苯并多巴(benzodopa)、卡波醌(carboquone)、麦曲多巴(meturedopa)和尤利多巴(uredopa)；乙撑亚胺和甲基蜜胺，包括六甲蜜胺、三乙撑蜜胺、三乙撑磷酰胺(triethylenephosphoramide)、三乙撑硫代磷酰胺(triethylenethiophosphoramide)和三羟甲蜜胺(trimethylomelamine)；氮芥(nitrogen mustards)，诸如苯丁酸氮芥、萘氮芥(chlornaphazine)、胆磷酰胺(cholophosphamide)、雌莫司汀(estramustine)、异环磷酰胺、双氯乙基甲胺、盐酸氧氮芥(mechlorethamine oxide hydrochloride)、美法仑、新氮芥(novembichin)、苯芥胆甾醇(phenesterine)、泼尼莫司汀(prednimustine)、曲磷胺(trofosfamide)、尿嘧啶氮芥(uracil mustard)；亚硝脲(nitrosoureas)，诸如卡莫司汀、氯脲霉素、福莫司汀(fotemustine)、洛莫司汀(lomustine)、尼莫司汀(nimustine)、雷莫司汀(ranimnustine)；抗生素，诸如阿克拉霉素(aclacinomysins)、放线菌素、氨茴霉素(anthramycin)、偶氮丝氨酸(azaserine)、博来霉素、放线菌素(cactinomycin)、加利车霉素(calicheamicin)、carabicin、洋红霉素(carminomycin)、嗜癌霉素(carzinophilin)、色霉素、更生霉素、柔红霉素、地托比星(detorubicin)、6-二氮-5-氧-L-正亮氨酸、多柔比星、表柔比星、依索比星、伊达比星、麻西罗霉素(marcellomycin)、丝裂霉素类(mitomycins)、霉酚酸(mycophenolic acid)、诺拉霉素(nogalamycin)、橄榄霉素(olivomycin)、培洛霉素(peplomycin)、potfiromycin、嘌呤霉素(puromycin)、三铁阿霉素(quelamycin)、罗多比星(rodorubicin)、链黑菌素(streptonigrin)、链脲霉素、杀结核菌素(tubercidin)、乌苯美司(ubenimex)、净司他丁(zinostatin)、佐柔比星(zorubicin)；抗代谢药，诸如甲氨蝶呤和5-FU；叶酸类似物，诸如二甲叶酸(denopterin)、甲氨蝶呤、蝶罗呤(pteropterin)、三甲曲沙(trimetrexate)；嘌呤类似物，诸如氟达拉滨(fludarabine)、6-巯嘌呤、硫咪嘌呤(thiamiprine)、硫鸟嘌呤；嘧啶类似物，诸如安西他滨(ancitabine)、阿扎胞苷(azacitidine)、6-氮尿苷(azauridine)、卡莫氟(carmofur)、阿糖胞苷、双脱氧尿苷(dideoxyuridine)、去氧氟尿苷(doxifluridine)、依诺他滨(enocitabine)、氟尿苷；雄激素类，诸如卡鲁睾酮(calusterone)、丙酸屈他雄酮(dromostanolone propionate)、环硫雄醇(epitiostanol)、美雄烷(mepitiostane)、睾内酯(testolactone)；抗肾上腺类，诸如氨鲁米特、米托坦、曲洛司坦(trilostane)；叶酸补充剂，诸如亚叶酸(frolinic acid)；醋葡醛内酯(aceglatone)；醛磷酰胺糖苷(aldophosphamide glycoside)；氨基乙酰丙酸(aminolevulinic acid)；安吖啶；bestrabucil；比生群(bisantrene)；依达曲沙；地磷酰胺(defofamide)；地美可辛(demecolcine)；地吖醌；elfornithine；依利醋铵(elliptiniumacetate)；依托格鲁(etoglucid)；硝酸镓；羟基脲；香菇多糖(lentinan)；氯尼达明(lonidamine)；米托胍腙(mitoguazone)；米托蒽醌；莫哌达醇(mopidanmol)；二胺硝吖啶(nitrarine)；喷司他丁(pentostatin)；蛋氨氮芥(phenamet)；吡柔比星(pirarubicin)；鬼臼酸(podophyllinic acid)；2-乙基酰肼(2-ethylhydrazide)；丙卡巴肼；雷佐生(razoxane)；西佐喃(sizofiran)；螺旋锗(spirogermanium)；细交链孢菌酮酸(tenuazonicacid)；三亚胺醌(triaziquone)；2,2',2"-三氯三乙胺；乌拉坦(urethan)；长春地辛；达卡巴嗪；甘露莫司汀(mannomustine)；二溴甘露醇(mitobronitol)；二溴卫矛醇(mitolactol)；哌泊溴烷(pipobroman)；gacytosine；阿糖胞苷(arabinoside)(“Ara-C”)；环磷酰胺；噻替哌；新型紫杉类或紫杉烷家族的成员，诸如紫杉醇(多西他赛)及其类似物；苯丁酸氮芥；吉西他滨；6-硫鸟嘌呤；巯嘌呤；甲氨蝶呤；铂类似物，诸如顺铂和卡铂；长春碱；铂；依托泊苷(VP-16)；异环磷酰胺；丝裂霉素C；米托蒽醌；长春新碱；长春瑞滨；去甲长春碱；诺安托(novantrone)；替尼泊苷；道诺霉素；氨基蝶呤(aminopterin)；希罗达；伊本膦酸盐(ibandronate)；CPT-11；拓扑异构酶抑制剂RFS 2000；二氟甲基鸟氨酸(DMFO)；视黄酸；埃斯波霉素(esperamicins)；卡培他滨；受体酪氨酸激酶抑制剂和/或血管生成抑制剂，包括索拉非尼舒尼替尼帕唑帕尼(VOTRIENTTM)、toceranib(PALLADIATM)、凡德他尼(ZACTIMATM)、西地尼布瑞格拉非尼(BAY73-4506)、阿西替尼(AG013736)、来他替尼(CEP-701)、埃罗替尼吉非替尼(IRESSATM)、BIBW 2992(TOVOKTM)、拉帕替尼来那替尼(HKI-272)等、以及上述任何物质的药学上可接受的盐、酸或衍生物。该定义还包括用于调节或抑制激素对肿瘤的作用的抗激素药物诸如抗雌激素药物，包括例如他莫昔芬、雷洛昔芬、芳香化酶抑制4(5)-咪唑、4-羟基他莫昔芬、曲沃昔芬、keoxifene、LY117018、奥那司酮和托瑞米芬和抗雄激素，诸如氟他胺、尼鲁米特、比卡鲁胺、醋酸亮丙瑞林和戈舍瑞林；以及上述任一者的药学上可接受的盐、酸或衍生物。其它常规的细胞毒性化学化合物如在Wiemann等人，1985年，Medical Oncology(Calabresi等人编辑)，第10章，McMillan Publishing中所公开的那些，也适用于本发明的方法。
可与本发明的特异性结合人CD40的激动性抗体联合使用的示例性制剂包括酪氨酸激酶抑制剂和靶向抗癌疗法，诸如(吉非替尼)和Tarceva(厄洛替尼)以及HER2、HER3、HER4或VEGF的其它拮抗剂。示例性HER2拮抗剂包括CP-724-714、HERCEPTINTM(曲妥珠单抗)、OMNITARGTM(帕妥珠单抗)、TAK-165、拉帕替尼(EGFR和HER2抑制剂)和GW-282974。示例性HER3拮抗剂包括抗-Her3抗体(参见例如美国专利公布US2004/0197332)。示例性HER4拮抗剂包括抗-HER4siRNA(参见例如Maatta等人，Mol Biol Cell 17:67-79,2006)。示例性VEGF拮抗剂为贝伐单抗(AvastinTM)。
可与本发明的特异性结合CD40的激动性抗体联合使用的示例性治疗剂包括用于实体瘤的标准护理药物。
本发明的特异性结合人CD40的激动性抗体与第二治疗剂可在任何方便的时间范围内联合施用。例如，特异性结合人CD40的激动性抗体和第二治疗剂可在同一天、甚至在同一静脉内输注中施用给受试者。然而，本发明的特异性结合人CD40的激动性抗体和第二治疗剂也可以隔天或隔周或隔月等施用。本发明的特异性结合人CD40的激动性抗体和第二治疗剂可在足够接近的时间内施用，使得它们同时以可检测水平存在于正在治疗的患者体内(例如，血清中)。在一定时间段内由多个剂量组成的本发明的特异性结合人CD40的激动性抗体的整个治疗过程之后或之前是由多个剂量组成的第二治疗剂的治疗过程。可在施用本发明的特异性结合人CD40的激动性抗体和第二治疗剂之间使用1天、2天或若干天或若干周的恢复期。
本发明的特异性结合人CD40的激动性抗体或者本发明的特异性结合人CD40的激动性抗体和第二治疗剂的组合可连同任何形式的放射疗法(包括外照射、调强放射治疗(IMRT)、聚焦放射)和任何形式的放射外科手术(包括伽玛刀、射波刀(Cyberlaiife)、直线加速器和组织间放射(例如，植入放射性粒子、GliaSite球囊))和/或连同外科手术一起施用。
可使用的聚焦放射方法包括立体定向放射外科手术、分次立体定向放射外科手术、和调强放射疗法(IMRT)。明显的是立体定向放射外科手术涉及将放射精确递送至肿瘤组织如脑瘤，同时避开周围的非肿瘤正常组织。使用立体定向放射外科手术施用的放射剂量可变化，通常从1Gy至约30Gy，并且可包括中间范围，包括例如1至5、10、15、20、25、至多30Gy的剂量。因为有无创固定装置，立体定向放射不需要在单次治疗中递送。治疗计划可每天可靠地重复，从而允许递送多个分次放射剂量。当用于随时间治疗肿瘤时，放射外科手术称为“分次立体定向放射外科手术”或FSR。相比之下，立体定向放射外科手术是指一次性治疗。分次立体定向放射外科手术可导致高治疗比，即，高比率的肿瘤细胞杀灭和对正常组织的低影响。肿瘤和正常组织对单次高放射剂量和多次较小放射剂量的响应不同。与若干次较小放射剂量相比，单次大放射剂量可杀伤更多正常组织。因此，多次较小放射剂量能够杀伤更多肿瘤细胞，同时避开正常组织。使用分次立体定向放射施用的放射剂量可在1Gy至约50Gy的范围内变化，并且可包括中间范围，包括例如1至5、10、15、20、25、30、40、至多50Gy的少分次剂量。也可使用调强放射疗法(IMRT)。IMRT是高精度三维保形放射疗法(3DCRT)的高级模式，其使用计算机控制的线性加速器将精确的放射剂量递送至恶性肿瘤或肿瘤内的特定区域，利用多叶准直器(MLC)将各个放射束的轮廓成形以从射野方向观视(BEV)匹配靶标的轮廓，从而产生多个光束。IMRT允许通过调节在多个区中的放射束的强度，使放射剂量较精确地适配于肿瘤的三维(3-D)形状。因此，IMRT允许较高的放射剂量集中在肿瘤内的区域，同时最小化周围的正常关键结构的剂量。IMRT改善适配治疗区与凹肿瘤形状的能力，例如当肿瘤围绕易受伤害的结构时，诸如脊髓或主要器官或血管。
抗独特型抗体
本发明提供与本发明抗体结合的抗独特型抗体。
本发明还提供特异性结合包含SEQ ID NO:48的VH和SEQ ID NO:63的VL的抗体的抗独特型抗体。
本发明还提供特异性结合包含SEQ ID NO:49的VH和SEQ ID NO:64的VL的抗体的抗独特型抗体。
本发明还提供特异性结合包含SEQ ID NO:50的VH和SEQ ID NO:64的VL的抗体的抗独特型抗体。
本发明还提供特异性结合包含SEQ ID NO:51的VH和SEQ ID NO:64的VL的抗体的抗独特型抗体。
本发明还提供特异性结合包含SEQ ID NO:52的VH和SEQ ID NO:65的VL的抗体的抗独特型抗体。
本发明还提供特异性结合包含SEQ ID NO:53的VH和SEQ ID NO:65的VL的抗体的抗独特型抗体。
本发明还提供特异性结合包含SEQ ID NO:54的VH和SEQ ID NO:65的VL的抗体的抗独特型抗体。
本发明还提供特异性结合包含SEQ ID NO:55的VH和SEQ ID NO:65的VL的抗体的抗独特型抗体。
本发明还提供特异性结合包含SEQ ID NO:55的VH和SEQ ID NO:65的VL的抗体的抗独特型抗体。
本发明还提供特异性结合包含SEQ ID NO:57的VH和SEQ ID NO:66的VL的抗体的抗独特型抗体。
本发明还提供特异性结合包含SEQ ED NO:58的VH和SEQ ID NO:67的VL的抗体的抗独特型抗体。
本发明还提供特异性结合包含SEQ ID NO:59的VH和SEQ ID NO:68的VL的抗体的抗独特型抗体。
本发明还提供特异性结合包含SEQ ID NO:57的VH和SEQ ID NO:70的VL的抗体的抗独特型抗体。
本发明还提供特异性结合包含SEQ ED NO:57的VH和SEQ ID NO:71的VL的抗体的抗独特型抗体。
本发明还提供特异性结合包含SEQ ED NO:57的VH和SEQ ID NO:72的VL的抗体的抗独特型抗体。
本发明还提供特异性结合包含SEQ ID NO:61的VH和SEQ ID NO:69的VL的抗体的抗独特型抗体。
本发明还提供特异性结合包含SEQ ID NO:62的VH和SEQ ED NO:69的VL的抗体的抗独特型抗体。
抗独特型(Id)抗体是识别抗体的抗原决定簇(例如互补位或CDR)的抗体。Id抗体可为抗原封闭性或非封闭性的。抗原封闭性Id可用于检测样本中的游离抗体(例如本文所述的本发明CD40抗体)。非封闭性Id可用于检测样本中的总抗体(游离，部分结合于抗原，或完全结合于抗原的抗体)。Id抗体可通过用抗体对正在制备抗Id的动物免疫来制备。
抗Id抗体还可以用作免疫原以在另一动物中诱导免疫应答，从而产生所谓的抗-抗Id抗体。抗-抗-Id抗体可与诱导抗-Id的初始单克隆抗体在表位上相同。因此，通过使用针对单克隆抗体的独特型决定簇的抗体，可以识别出表达相同特异性抗体的其它克隆。抗Id抗体可以改变(从而产生抗Id抗体变体)并且/或者通过任何合适的技术衍生化。
免疫缀合物
“免疫缀合物”是指缀合至一个或多个异源分子的本发明的抗体。
在一些实施方案中，本发明的抗体缀合至一种或多种细胞毒剂或显像剂。
示例性细胞毒剂包括化学治疗剂或化学治疗药、生长抑制剂、毒素(例如蛋白毒素，细菌、真菌、植物、或动物来源的酶活性毒素或其片段)、以及和放射性核素。
细胞毒剂可为一种或多种药物，诸如mayatansinoid(参见例如美国专利5,208,020、5,416,06)，奥瑞斯他汀诸如一甲基澳瑞他汀药物部分DE和DF(MMAE和MMAF)(参见例如美国专利5,635,483和5,780,588、以及7,498,298)、多拉司它汀、卡里奇霉素或它们的衍生物(参见例如美国专利5,712,374、5,714,586、5,739,116、5,767,285、5,770,701、5,770,710、5,773,001和5,877,296；Hinman等人，(1993)Cancer Res 53:3336-3342；和Lode等人，(1998)Cancer Res 58:2925-2928)；蒽环类抗生素诸如道诺霉素或多柔比星(参见例如Kratz等人，(2006)Current Med.Chem 13:477-523；Jeffrey等人，(2006)Bioorganic&MedChem Letters 16:358-362；Torgov等人，(2005)Bioconj Chem 16:717-721；Nagy等人，(2000)Proc Natl Acad Sci USA 97:829-834；Dubowchik等人，Bioorg.&Med.Chem.Letters 12:1529-1532(2002)；King等人，(2002)J Med Chem 45:4336-4343；和美国专利6,630,579)、甲氨蝶呤、长春地辛、紫杉烷诸如多西他赛、紫杉醇、拉洛他赛、tesetaxel和奥他赛。
细胞毒剂也可为酶促活性毒素或其片段，诸如白喉A链、白喉毒素的非结合活性片段、外毒素A链(来自铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa))、蓖麻毒素A链、蒴莲根毒素A链、α-八叠球菌素、油桐(Aleurites fordii)蛋白质、香石竹毒蛋白、美洲商陆(Phytolacca americana)蛋白质(PAPI、PAPII和PAP-S)、苦瓜(momordica charantia)抑制剂、麻疯树毒素、巴豆毒素、肥阜草(sapaonaria officinalis)抑制剂、白树毒素、迈托毒素、局限曲霉素、酚霉素、伊诺霉素和单端孢霉烯族化合物。
细胞毒剂或显像剂也可为放射性核素。示例性放射性核素包括Ac-225、At-211、1-131、I-125、Y-90、Re-186、Re-188、Sm-153、Bi-212、P-32、Pb-212和Lu的放射性同位素。当使用放射性缀合物进行检测时，其可包含用于闪烁成像研究的放射性原子，例如Tc-99m或I-123，或用于核磁共振(NMR)成像(也称为磁共振成像，mri)的自旋标记物，诸如I-123、I-131、In-111、F-19、C-13、N-15或O-17。
本发明的抗体和异源分子的缀合可使用多种双功能蛋白偶联剂进行，所述双功能蛋白偶联剂为诸如N-琥珀酰亚胺-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)、琥珀酰亚胺基-4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-l-羧酸酯(SMCC)、亚氨基噻吩(IT)、亚氨酸酯的双功能衍生物(诸如，二甲基己二酰亚胺盐HQ)、活性酯(诸如，双琥珀酰亚胺辛二酸酯)、醛(诸如，戊二醛)、双-叠氮化合物(诸如，双(对叠氮苯甲酰基)己二胺)、双重氮衍生物(诸如，双(对重氮苯甲酰基)乙二胺)、二异氰酸酯(诸如，甲苯2,6-二异氰酸酯)和双活性氟化合物(诸如，l,5-二氟-2,4-二硝基苯)。例如，蓖麻毒蛋白免疫毒素可如Vitetta等人，(1987)Science238:1098中所述制备。C14标记的1-异硫氰酸苯甲基-3-甲基二乙烯三氨五乙酸(MX-DTPA)是使放射性核苷酸与抗体缀合的示例性螯合剂。参见，例如，W094/11026。接头可为“可裂解接头”，从而促进细胞毒性药物在细胞中释放。例如，可使用酸不稳定性接头、肽酶敏感性接头、光不稳定性接头、二甲基接头或含二硫化物接头(Chari等人，(1992)Cancer Res 52:127-131；美国专利5,208,020)。
本发明的抗体与异源分子的缀合物可使用可商购获得(例如得自PierceBiotechnology,Inc.,Rockford,IL.,U.S.A)的交联剂诸如BMPS、EMCS、GMBS、HBVS、LC-SMCC、MBS、MPBH、SBAP、SIA、SIAB、SMCC、SMPB、SMPH、硫代-EMCS、硫代-GMBS、硫代-KMUS、硫代-MBS、硫代-SIAB、硫代-SMCC、和硫代-SMPB、以及SVSB(琥珀酰亚胺-(4-乙烯基砜)苯甲酸酯)进行制备。
本发明还提供一种免疫缀合物，该免疫缀合物包含连接至细胞毒剂或显像剂的本发明的特异性结合SEQ ID NO:75的CD40的抗体。
诊断用途和试剂盒
本发明还提供包含本发明的特异性结合人CD40的激动性抗体的试剂盒。
试剂盒可用于治疗用途并用作诊断试剂盒。
试剂盒可用于检测生物样本中CD40的存在。
在一些实施方案中，试剂盒包含本发明的特异性结合人CD40的拮抗性抗体和用于检测抗体的试剂。试剂盒可包含一个或多个其它元件，包括：使用说明；其它试剂，例如标记、治疗剂、或者可用于使抗体与标记或治疗剂螯合或以其它方式偶联的试剂、或放射防护组合物；用于准备施用抗体的装置或其它材料；药学上可接受的载体；以及向受试者施用的装置或其它材料。
在一些实施方案中，试剂盒包含在容器中的本发明抗体和试剂盒的使用说明。
在一些实施方案中，试剂盒中的抗体被标记。
在一些实施方案中，试剂盒包含抗体C40M67、C40M66、
40M63、C40M62、C40M59、C40M58、C40M56、C40M55、C40M51、C40M18、C40M17、C40MI2、C40MI02、C40MI03、C40M104、C40MI05、C40M121或C40M126。
检测CD40的方法
本发明还提供了一种检测样本中CD40的方法，包括：获得样本，使样本与本发明的抗体接触，并且检测与样本中的CD40结合的抗体。
在一些实施方案中，样本可来源于尿液、血液、血清、血浆、唾液、腹水、循环细胞、循环肿瘤细胞、非组织缔合的细胞(即游离细胞)、组织(例如手术切除的肿瘤组织、活体组织切片，包括细针抽吸组织)、组织学制备物等。
可使用已知的方法检测本发明的抗体。示例性方法包括使用荧光或化学发光标记、或放射标记物直接标记抗体，或者使易于检测的部分(诸如生物素、酶或表位标签)连接到本发明的抗体上。示例性的标记和部分为钌、111In-DOTA、111In-二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)、辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶和β-半乳糖苷酶、聚组氨酸(HIS标签)、吖啶染料、花青染料、荧光酮染料、噁嗪染料、菲啶染料、罗丹明染料和染料。
本发明的抗体可用于多种测定以检测样本中的CD40。示例性的测定为蛋白质印迹分析、放射性免疫测定、表面等离振子共振、免疫沉淀、平衡透析、免疫扩散、电化学发光(ECL)免疫测定、以及免疫组织化学、荧光激活细胞分选(FACS)或ELISA测定。
本发明现结合以下具体的、非限制性实施例进行描述。
实施例1：材料和方法
用于研究的抗原的产生
使用标准方法进行抗原的克隆、表达和纯化。所用蛋白质的氨基酸序列如下所示；
全长人CD40(huCD40)；SEQ ID NO:75
MVRLPLQCVLWGCLLTAVHPEPPTACREKQYLINSQCCSLCQPGQKLVSDCTEFTETECLPCGESEFLDTWNRETHCHQHKYCDPNLGLRVQQKGTSETDTICTCEEGWHCTSEACESCVLHRSCSPGFGVKQIATGVSDTICEPCPVGFFSNVSSAFEKCHPWTSCETKDLVVQQAGTNKTDVVCGPQDRLRALVVIPIIFGILFAILLVLVFIKKVAKKPTNKAPHPKQEPQEINFPDDLPGSNTAAPVQETLHGCQPVTQEDGKESRISVQERQ
人CD40胞外域(huCD40-ECD)；SEQ ID NO:76
EPPTACREKQYLINSQCCSLCQPGQKLVSDCTEFTETECLPCGESEFLDTWNRETHCHQHKYCDPNLGLRVQQKGTSETDTICTCEEGWHCTSEACESCVLHRSCSPGFGVKQIATGVSDTICEPCPVGFFSNVSSAFEKCHPWTSCETKDLVVQQAGTNKTDVVCGPQDRLR
食蟹猴(cynomolgous，本文称为cyno)CD40(cCD40)；SEQ ID NO:77
MVRLPLQCVLWGCLLTAVYPEPPTACREKQYLINSQCCSLCQPGQKLVSDCTEFTETECLPCSESEFLDTWNRETRCHQHKYCDPNLGLRVQQKGTSETDTICTCEEGLHCMSESCESCVPHRSCLPGFGVKQIATGVSDTICEPCPVGFFSNVSSAFEKCRPWTSCETKDLVVQQAGTNKTDVVCGPQDRQRALVVIPICLGILFVILLLVLVFIKKVAKKPNDKAPHPKQEPQEINFLDDLPGSNPAAPVQETLHGCQPVTQEDGKESRISVQERQ
Cyno CD40胞外域(cCD40-ECD)；SEQ ID NO:78
EPPTACREKQYLINSQCCSLCQPGQKLVSDCTEFTETECLPCSESEFLDTWNRETRCHQHKYCDPNLGLRVQQKGTSETDTICTCEEGLHCMSESCESCVPHRSCLPGFGVKQIATGVSDTICEPCPVGFFSNVSSAFEKCRPWTSCETKDLVVQQAGTNKTDVVCGPQDRQR
全长人CD154；SEQ ID NO:83
MIETYNQTSPRSAATGLPISMKIFMYLLTVFLITQMIGSALFAVYLHRRLDKIEDERNLHEDFVFMKTIQRCNTGERSLSLLNCEEIKSQFEGFVKDIMLNKEETKKENSFEMQKGDQNPQIAAHVISEASSKTTSVLQWAEKGYYTMSNNLVTLENGKQLTVKRQGLYYIYAQVTFCSNREASSQAPFIASLCLKSPGRFERILLRAANTHSSAKPCGQQSIHLGGVFELQPGASVFVNVTDPSQVSHGTGFTSFGLL
可溶性人CD154；SEQ ID NO:88
MQKGDQNPQIAAHVISEASSKTTSVLQWAEKGYYTMSNNLVTLENGKQLTVKRQGLYYIYAQVTFCSNREASSQAPFIASLCLKSPGRFERILLRAANTHSSAKPCGQQSIHLGGVFELQPGASVFVNVTDPSQVSHGTGFTSFGLLKL
可溶性cyno CD154(SEQ ID NO:45)
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原代人和cyno树突细胞(DC)中的结合测定
人单核细胞使用阴性CD14分离试剂盒根据制造商规程(MACS Miltenyi)从冷冻/新鲜的PBMC中分离。Cyno单核细胞使用阳性CD14分离试剂盒根据制造商规程(MACSMiltenyi)从新鲜的PBMC中分离。为了产生DC，可在100ng/ml人GM-CSF和人IL-4(Peprotech)存在下将单核细胞在完全培养基RPMI(Invitrogen)中培养5天并且每2天补充培养基。在第5天，用100ng/ml LPS(Sigma)对DC刺激24小时。然后，在100μl体积的流式细胞仪缓冲液(PBS+1％FBS；BD Bioscience)中，将细胞在冰上用不同的浓度的各测试CD40抗体染色30分钟，然后用流动缓冲液洗涤两次。接着，将细胞在冰上用APC-缀合的抗人IgG(Jackson ImmunoResearch)以推荐的稀释度1:100染色另外30分钟，并用流动缓冲液洗涤两次。用Fortessa(BD Bioscience)对细胞的阳性百分比和平均荧光强度(MFI)进行分析，以测定抗体的结合。
Raji(B细胞淋巴瘤细胞系)和HEKCD40细胞系中的结合测定
Raji细胞获自ATCC和HEKCD40细胞系，并且获自Invivogen。根据公司的推荐将细胞在完全RMPI培养基中进行培养。对于原代人和cyno DC中的结合测定，如上所述进行染色。
人DC和B细胞活化试验
如上所述产生人DC。人B细胞使用阴性B细胞分离试剂盒根据制造商规程(MACSMiltenyi)从新鲜或冷冻的PBMC中分离。将各个CD40抗体滴定铺板到96孔U形底板上，并且加入细胞并将混合物在室温下温育15分钟。将培养基或交联剂抗人F(ab’)2以固定浓度20μg/ml加入，并且将复合物在37℃培养箱中温育24小时(对于DC测定)以及48小时(对于B细胞测定)。可在时间点结束时收获得到细胞，用流动缓冲液洗涤两次，并用人Fc阻断液(Miltenyi)在室温下温育15分钟，然后洗涤一次。然后，针对活化标记物CD80、CD83、CD86、HLA-DR和CD23(BD Bioscience and BioLegend)，将细胞在冰上染色30分钟，接着洗涤两次。使用BD Fortessa分析细胞。
Cyno B细胞活化试验
Cyno B细胞使用阳性B细胞分离试剂盒根据制造商规程(MACS Milteny)从新鲜的PBMC中分离。如上文所述针对人DC和B细胞建立活化试验。
HEK-BlueTMCD40L NF-κB活化试验
使用过表达CD40的HEK-BlueTMCD40L细胞(Invivogen)来评估抗体阻断CD40-CD154相互作用或活化CD40的能力。HEK-BlueTMCD40L细胞系稳定表达人CD40和NF-κB-诱导分泌型胚碱性磷酸酶(SEAP)。HEK-BlueTMCD40L细胞上CD40的活化诱导了下游信号转导事件，导致NF-κB活化并分泌SEAP，这可根据制造商的说明书用QUANTI-BlueTM加以测定。评估抗-CD40抗体阻断或刺激CD40活化的能力。
HEK-Blue CD40L细胞系中CD40依赖性NF-kB活化的抑制
使根据供应商的方案处理和维持的HEK-BlueTMCD40L细胞系(Invivogen)以100μl体积中2.5×104个细胞/孔的细胞密度接种到96孔组织培养板中。将测定板盖好，并且过夜后回收细胞(37℃，5％CO2)。第二天，制备4X rhCD154-ECD-His溶液(40ng/ml最终浓度)以及适当浓度(1-25μg/ml最终浓度)的4X抗-CD40单克隆抗体、或Fab，并且将所得2X溶液以100μl/孔添加含有HEK-Blue CD40LTM细胞的96孔测定板(200μl/孔最终体积)中。在16-24h温育(37℃，5％CO2)时间后，通过将40μl/孔的上清液添加到160μl/孔的预热QUANTI-BlueTM(Invivogen，根据供应商的方案制备)中，分析96孔测定板中上清液的磷酸酶活性。在获得650nm处的吸光度之前，将板密封并温育30-60分钟。
HEK-Blue CD40L NFkB-SEAP细胞系中CD40依赖性NF-kB活化将HEK-BlueTMCD40L细胞如上所述的那样进行接种并过夜后回收。第二天，将CD40mAb以2X溶液添加到含有HEK-BlueTMCD40L细胞(200μl最终体积/孔)的96孔板中，并且将该板温育过夜(37℃，5％CO2)。为了测量单独的抗-CD40mAb的激动活性，使用宽范围的1-25μg/ml的最终测定浓度。为了测定交联对抗-CD40mAb的激动活性的影响，在加入细胞之前，将针对抗-hIgG Fc片段的4X抗体溶液和4X F(ab’)2--片段溶液(相对于mAb而言5-10倍过量)在室温下预温育1小时；滴定以1μg/ml抗-CD40mAb起始，用于获得剂量曲线。在16-24h温育(37℃，5％CO2)后，通过将40μl/孔的上清液添加到160μl/孔的预热QUANTI-BlueTM(Invivogen，根据供应商的方案制备)中，分析96孔测定板中上清液的磷酸酶活性。在获得650nm处的吸光度之前，将板密封并温育30-60分钟。
实施例2：噬菌体展示文库中抗-CD40抗体的分离
噬菌体展示文库中抗-CD40抗体的分离
CD40-结合Fab选自从头合成pIX噬菌体展示文库，如Shi等人，J Mol Biol 397:385-96,2010，国际专利公布WO2009/085462和美国专利公布US2010/0021477中所述。简而言之，通过多样化人支架生成文库，其中种系VH基因IGHV1-69*01、IGHV3-23*01和IGHV5-51*01与人IGHJ-4微小基因经由H3环重组，并且人种系VL kappa基因O12(IGKV1-39*01)、L6(IGKV3-11*01)、A27(IGKV3-20*01)和B3(IGKV4-1*01)与IGKJ-1微小基因重组以组装完整VH域和VL域。选择在围绕H1、H2、L1、L2和L3环的重链和轻链可变区中的位置用于多样化，所述位置与被鉴别为经常与蛋白和肽抗原接触的位置相对应。在选定位置处的序列多样性限于在各个IGHV或IGLV基因的IGHV或IGLV种系基因家族中的每个位置处出现的残基。通过使用长度为7-14个氨基酸的短至中等大小的合成环来产生在H3环处的多样性。设计在H3处的氨基酸分布，以模仿在人抗体中观察到的氨基酸变异。文库设计详述于Shi等人，J MolBiol 397:385-96,2010。根据它们的人VH和VL种系基因起源，命名用于生成文库的支架。将三个重链文库与四个种系轻链相组合或与多样化轻链文库相组合，以产生12个独特的VH:VL组合。将这些文库稍后基于文库版本进一步组合产生附加文库，以针对CD40进行淘选实验。
针对融合于Fc的生物素酰化huCD40-ECD或cCD40-ECD，对这些文库进行淘选。生物素酰化抗原被捕集在链霉抗生物素蛋白磁珠(Dynal)上并以100nM或10nM的最终浓度暴露于从头合成pIX Fab文库。在PBS-Tween中洗掉非特异性噬菌体，并且通过TG1大肠杆菌细胞感染来回收结合的噬菌体。从这些细胞扩增噬菌体过夜，并且重复淘选共四轮。在四轮生物淘选之后，在ELISA板上筛选出与融合于Fc或His标签的huCD40-ECD和cCD40-ECD结合的单克隆Fab，其中Fab被绵羊抗-人FD捕集于ELISA板上，将生物素酰化CD40添加至捕集的Fab，随后用链霉抗生物素蛋白HRP检测抗原。在重链和轻链可变区中对已证实结合CD40的人和cyno型式的克隆进行测序。
所选择的克隆是进一步亲和力成熟的。因为从头合成淘选输出是通过重链汇集的，轻链的单克隆配对不是已知的。因此，亲和力成熟被进行成使得来自每个从头合成选择输出的重链克隆到所有四个可能的k轻链v5文库中。
对每个从头合成输出的VH区进行PCR扩增并且经由XhoI和NcoI限制性酶位点克隆到轻链文库中。这些文库在M13噬菌体上制备并且用于如所述的那样进行淘选和筛选，不同的是通过三轮淘选抗原的浓度降低(10nM，1nM，0.3nM)。另外，在大肠杆菌细胞感染之前，在第三轮中进行长时间的一小时洗涤。筛选以与从头合成选择相同的方式结合人和cynoCD40两者的获自亲和力成熟活动的单克隆Fab，并且对示出交叉反应性的那些进行测序。
使用表达人免疫球蛋白基因座的大鼠分离抗-CD40抗体
使用表达人免疫球蛋白基因座的转基因大鼠(OMT,Inc)产生抗-CD40抗体。将内源性免疫球蛋白基因座用人Igκ和Igλ基因座以及嵌合人/大鼠IgH基因座替代，该嵌合人/大鼠IgH基因座具有连接于大鼠CH基因座的人源V、D和J片段。IgH基因座包含连接于大鼠CH基因座的天然构型的22个人VHs，所有人D和JH片段。的产生和表征描述于Osbor等人J Immunol 190:1481-1490,2013；和国际专利公布WO 14/093908中。
将五只OmniRat的单独群体用重组人和cyno CD40ECD-His或者人和cynoCD40ECD-Fc蛋白质进行免疫。在31-34天免疫方案之后，从两只大鼠收获得到淋巴结并用于产生杂交瘤。对所产生的结合人和cyno CD40-ECD两者的杂交瘤进行筛选。根据单因素ANOVA采用Dunnett's平均比较事后测试，对表现出统计意义上显著结合人和cyno CD40-ECD两者的杂交瘤进行克隆，并使用标准过程对其V区进行测序。
由从头合成噬菌体淘选和对OMT大鼠免疫、以及随后对杂交瘤上清液进行筛选所鉴定的序列被表达为mAb和Fab两者，并且在HEK-BlueTMCD40L NF-κB活化试验中针对潜在拮抗活性进行筛选。在表达为mAb的18个从头合成噬菌体衍生的序列中，基于如下判据4个mAb被鉴定表现出拮抗活性：拮抗剂所具有的信号低于经单独的rhCD154-ECD-his处理的HEK-BlueTMCD40L细胞的平均信号的3x标准偏差。基于相同的判据，在对应的18个Fab中，15个Fab被鉴定为拮抗剂。在13个杂交瘤衍生的序列中，6个mAb和8个对应的Fab被鉴定为拮抗剂。因此，从总共31个mAb和对应的Fab中，10个mAb和23个Fab被鉴定为具有拮抗活性。
在无任何CD40配体的情况下，在HEK-BlueTMCD40L NF-κB活化试验中对上述的31个mAb进行筛选，以鉴定出潜在的激动剂。在18个从头合成噬菌体衍生的序列中，基于如下判据16个mAb被鉴定为激动剂：拮抗剂所示出的信号高于单独的HEK-BlueTMCD40L细胞的平均信号的3x标准偏差。在来自杂交瘤文库的13个序列中，8个mAb被鉴定为激动剂。因此，在共31个mAb中，所筛选的24个mAb被鉴定为激动剂。
实施例3：结合细胞上CD40的抗CD40抗体
对所选择的阻断CD154与CD40结合的抗体针对其与表达CD40的各种细胞的结合进行进一步表征。
使用上述测定法进行实验。基于20种抗体与人DC、cyno DC、Raji细胞和HEK-BlueTMCD40L细胞的结合，对这些抗体进行进一步表征。表4示出所选择抗体就其与这些细胞的结合而言的EC50值以及抗体源(噬菌体或OMT大鼠)
表4：
实施例4：激动性抗-CD40抗体的表征
在存在或不存在交联剂抗人(F(ab’)2时，使用上述测定来测试所选抗体以交联依赖性方式活化原代人树突细胞和B细胞的能力。图1示出当通过诱导的CD23表面表达(图1A和图1B)或诱导的HLA-DR表面表达(图1C和图1D)评估B细胞活化时，所选抗体仅在交联剂存在下能够活化B细胞。图2示出当通过诱导的CD83表面表达(图2A和图2B)或诱导的HLA-DR表面表达(图2C和图2D)评估DC活化时，所选抗体仅在交联剂存在下能够活化DC细胞。该测定中所用的对照抗体以交联非依赖性方式诱导B和DC细胞活化(CP-870,893)。
对诱导DC活化标记物CD80、CD83、CD86和HLA-DR以及B细胞活化标记物CD23、CD80、CD83、CD86和HLA-DR的表面表达的各个测试抗体的EC50值进行测定。诱导所有测试DC和B细胞标记物的表面表达的抗体(当交联时)被归类为激动剂。表5示出所选抗体就其诱导B细胞活化标记物的表面表达而言的EC50值。表6示出所选抗体就其诱导DC活化标记物的表面表达而言的EC50值。
表5：
表6：
采用四种DC表面标记物，对所产生的抗体与参考抗体CP-870,893诱导DC活化的能力进行比较。几种抗体诱导至少一种DC活化标记物(CD80、CD83、CD86、HLA-DR)的表面表达，EC50值与参考抗体相当或比其更低。在该测定中，在交联剂存在下评估所产生的CD40抗体，而在不存在交联剂下评估参考抗体。
在相比于参考抗体时，抗体C40M9和C40M48更有效地诱导所评估的所有DC活化标记物的表面表达。
在相比于参考抗体时，抗体C40M18、C40M55和C40M63更有效地诱导所评估的三种DC活化标记物的表面表达。
在相比于参考抗体时，抗体C40M17、C40M51和C40M56更有效地诱导所评估的两种DC活化标记物的表面表达。
在相比于参考抗体时，抗体C40M12、C40M62和C40M66更有效地诱导所评估的一种DC活化标记物的表面表达。
实验数据表明，所产生的几种CD40激动性抗体相比于参考抗体在活化树突细胞的能力方面更有效。重要的是，因为在不交联的情况下产生的抗体不能活化DC或B细胞，预期它们在相比于参考抗体时具有有利的安全特征。
实施例5：CD40抗体的结构表征
使用标准方法进行抗体分离和多肽链的测序。所选的抗-CD40抗体的HCDR1氨基酸序列示于表7中。
所选的抗-CD40抗体的HCDR2氨基酸序列示于表8中。
所选的抗-CD40抗体的HCDR3氨基酸序列示于表9中。
所选的抗-CD40抗体的LCDR1氨基酸序列示于表10中。
所选的抗-CD40抗体的LCDR2氨基酸序列示于表11中。
所选的抗-CD40抗体的LCDR3氨基酸序列示于表12中。
所选的抗-CD40抗体的VH氨基酸序列示于表13中。所选的抗-CD40抗体的VL氨基酸序列示于表14中。所选的抗-CD40抗体的VH DNA序列示于表15中。所选的抗-CD40抗体的VLDNA序列示于表16中。所选的抗-CD40抗体的重链氨基酸序列示于表17中。所选的抗-CD40抗体的重链DNA序列示于表18中。所选的抗-CD40抗体的轻链氨基酸序列示于表19中。所选的抗-CD40抗体的轻链DNA序列示于表20中。
表7：
表8：
表9：
表10：
表11：
表12：
表13：
表14：
表15：
表16：
表17：
表18：
表19：
表20：
将抗体框架与最近的种系基因序列进行比较以鉴定潜在的免疫原性风险。在与最近的种系序列进行比较时，C40M18、C40M17、C40M12和C40M9mAb VH和/或VL具有突变。表20示出了抗体框架和突变数。
表21：
mAb 最近的重链框架 VH中的突变数 最近的轻链框架 VL中的突变数
C40M67 IGHV3-23*03 0 IGKV3-20*01 NA
C40M66 IGHV1-69*01 0 IGKV4-1*01 0
C40M63 IGHV1-69*01 0 IGKV4-1*01 0
C40M62 IGHV1-69*01 0 IGKV4-1*01 0
C40M59 IGHV1-69*01 0 IGKV1-39*01 0
C40M58 IGHV3-23*01 0 IGKV1-39*01 0
C40M56 IGHV3-23*01 0 IGKV1-39*01 0
C40M55 IGHV1-69*01 0 IGKV1-39*01 0
C40M51 IGHV3-23*01 0 IGKV1-39*01 0
C40M18 IGHV3-23*04 0 IGLV3-1*01 3
C40M17 IGHV3-23*04 2 IGLV3-1*01 0
C40M12 IGHV3-23*04 1 IGLV3-1*01 2
C40M9 IGHV4-39*01 3 IGLV2-8*01 0
C40M102 IGHV3-23*04 0 IGLV3-1*01 1
C40M103 IGHV3-23*04 0 IGLV3-1*01 0
C40M104 IGHV3-23*04 0 IGLV3-1*01 2
C40M105 IGHV4-39*01 0 IGLV2-8*01 0
C40M121 IGHV4-39*01 1 IGLV2-8*01 0
框架序列：
IGHV3-23*03(SEQ ID NO:79)
>IGHV3-23*03
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSVIYSGGSSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAK
IGHV1-69*01(SEQ ID NO:80)
>IGHV1-69*01
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYAISWVRQAPGQGLEWMGGIIPIFGTANYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARIGHV3-23*01(SEQ ID NO:81)
>IGHV3-23*01
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAK
IGHV3-23*04(SEQ ID NO:82)
>IGHV3-23*04
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAK
IGHV4-39*01(SEQ ID NO:73)
>IGHV4-39*01
QLQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSISSSSYYWGWIRQPPGKGLEWIGSIYYSGSTYYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCAR
IGKV3-20*01(SEQ ID NO:74)
EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYGSSP
IGKV4-1*01(SEQ ID NO:84)
>IGKV4-1*01
DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSVLYSSNNKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQYYSTP
IGKV1-39*01(SEQ ID NO:85)
>IGKV1-39*01
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTP
IGLV3-1*01(SEQ ID NO:86)
IGLV3-1*01
SYELTQPPSVSVSPGQTASITCSGDKLGDKYACWYQQKPGQSPVLVIYQDSKRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISGTQAMDEADYYCQAWDSST
IGLV2-8*01(SEQ ID NO:87)
>IGLV2-8*01
QSALTQPPSASGSPGQSVTISCTGTSSDVGGYNYVSWYQQHPGKAPKLMIYEVSKRPSGVPDRFSGSKSGNTASLTVSGLQAEDEADYYCSSYAGSNNF
实施例6：激动性CD40抗体的优化
C40M9(C40H43；SEQ ID NO:60)的VH在框架区具有在序列上不同于IGHV4-39(SEQID NO:73)的最近人种系序列的三个氨基酸。C40H43残基1-98相比于IGHV4-39的比对示于图3。
IGHV4-39 SEQ ID NO:73:
QLQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSISSSSYYWGWIRQPPGKGLEWIGSIYYSGSTYYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCAR
C40H43的变体被制成使不同于种系序列的位置单独地或组合地突变。将所得的VH链与亲本VL链BCML12结合，并且在结合和功能测定中对所得的抗体进行测试。
C40M18(C40L64；SEQ ID NO:66)的VL在框架区在序列上具有不同于IGLV3-1(SEQID NO:86)的最近人种系序列的两个氨基酸。C40M18VL相比于IGVL3-1的比对示于图4。
IGLV3-1(SEQ ID NO:86)
SYELTQPPSVSVSPGQTASITCSGDKLGDKYACWYQQKPGQSPVLVIYQDSKRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISGTQAMDEADYYCQAWDSST
C40L64的变体被制成使不同于种系序列的位置单独或组合地突变。此外，使位于C40L64的CDR1中的半胱氨酸突变。将所得的变体VL链与亲本VH链C40H48结合，并且在结合和功能测定中对所得抗体进行测试。
表22示出产生的变体抗体。抗体C40M103和C40M104(C40L64链在LCDR1处具有突变的半胱氨酸)具有SGDKLGDKYVS(SEQ ID NO:31)的LCDR1序列以及如亲本VH和VL中的其它CDR。所有产生的抗体变体均被克隆为IgG1。
表22：
就所得抗体与CD40的结合而言，对抗体进行测试，并且在功能测定中评估进行的置换的效应(如果有的话)。表23示出就B细胞、DC细胞或HEK-BlueTMCD40L细胞上mAb与CD40的结合而言的EC50值。mAb C40M102、C40M103和C40M104保持着与亲本C40M18类似的结合。C40M105在相比于亲本C40M9时结合下降。
表23：
测试抗体对HEK-BlueTMCD40L细胞和原代B细胞的激动活性。表24示出测定中抗体的EC50值。C40M102、C40M103和C40M104在相比于亲本C40M18mAb时具有类似的活化B细胞的效能。C40M105在相比于亲本C40M9时活性降低。
表24：
实施例7：以高亲和力结合人CD40的激动性抗CD40抗体
使用ProteOn XPR36system(BioRad)，利用表面等离子体共振(SPR)进行亲和力测量。按照用于胺偶联化学的制造商说明书，通过将抗人IgG Fc(Jackson，目录号109-005-098)偶联到GLC芯片(BioRad，目录号176-5011)的改性藻酸盐聚合物层表面来制备生物传感器表面。将大约5000RU(应答单位)mAb固定。在25℃下在运行缓冲液(DPBS+0.01％P20+100μg/ml BSA)中进行动力学实验。为了进行动力学实验，捕集200RU的mAb，之后以5种浓度(以4倍连续稀释)注射分析物(人或cyno CD40)。将结合相在50μL/min下监测3分钟，然后进行15分钟的缓冲液流动(解离相)。在100μL/min下，用100mM H3PO4(Sigma，Cat#7961)的两个18秒的脉冲，使芯片表面再生。
使用ProteOn Manager软件处理采集的数据。首先，利用区间(inter-spots)对数据进行背景校正。然后，对于分析物注射，使用缓冲液注射来实施数据的双基准减法。使用朗缪尔1:1结合模型进行数据的动力学分析。每个mAb的结果以Ka(结合率)、Kd(解离率)和KD(平衡解离常数)的格式记录。
所选择的结合人CD40的CD40mAb的动力学亲和力的汇总示于表25。对于所有样本，该表中记录的参数获自1:1朗缪尔结合模型。亲和力，KD＝kd/ka。
表25：
抗体 ka(1/Ms) kd(1/s) KD(M)
C40M9(n＝5) 7.27(1.83)E+05 2.85(0.97)E-03 4.09(1.51)E-09
C40M12 1.30E+06 1.76E-04 1.36E-10
C40M17 2.74E+06 8.06E-05 2.94E-11
C40M18 1.07E+06 1.62E-04 1.51E-10
C40M51 7.40E+05 8.78E-04 1.19E-09
C40M55(n＝2) 9.44(8.68-10.2)E+05 2.03(1.88-2.17)E-03 2.15(2.12-2.17)E-09
C40M56 7.77E+05 1.01E-03 1.30E-09
C40M58 4.17E+05 7.14E-04 1.71E-09
C40M59 1.18E+05 1.06E-03 9.00E-09
C40M62 1.89E+05 2.47E-03 1.31E-08
C40M63 5.28E+05 6.41E-04 1.21E-09
C40M66 3.78E+05 1.16E-03 3.05E-09
C40M67 1.63E+05 3.10E-04 1.91E-09
C40M9n＝5次平行测定，列为平均值和(标准偏差)的值
C40M55n＝2次平行测定，列为平均值和(范围)的值
2个样本(C40M9，C40M55)并未良好拟合于1:1结合模型。
所选择的结合Cyno CD40的CD40mAb的动力学亲和力的汇总示于表26。对于所有样本，该表中记录的参数获自1:1朗缪尔结合模型。亲和力，KD＝kd/ka。
表26：
C40M9n＝3次平行测定，列为平均值和(标准偏差)的值
4个样本(C40M55，C40M56，C40M62，C40M63)并未良好拟合于1:1结合模型。
实施例8：激动性抗-CD40抗体的Fc工程化
将S267E突变引入C40M121以产生mAb C40M126。C40M126展示出不依赖于交联的激动作用增强，如树突细胞上诱导的HLA-DR表面表达所评估的那样(图6)。
实施例9：与人CD40复合的C40M126的晶体结构
方法
使人CD40的His-标记胞外域(ECD)表达于杆状病毒感染的Hi5昆虫细胞中，并且通过亲和色谱和尺寸排阻色谱法(Genscript，Piscataway,NJ)进行纯化。在HEK293Expi细胞中表达His-标记的mAb C40M126的Fab片段，并通过亲和色谱和尺寸排阻色谱法进行纯化。通过将组分与过量的Fab以1:1.2的摩尔比混合来制备抗体-抗原复合物，并且在4℃下温育过夜。将蛋白质在20mM HEPES pH 7.5、100mM NaCl中浓缩至12mg/mL，并通过蒸气扩散法从包含1.6M硫酸铵、5％PEG 400、0.1M HEPES(pH7.5)的溶液中结晶。将一个晶体转移到补充有24％甘油的母液中，在液氮中冷冻，并且用于X射线衍射数据采集。在分辨率下测定结构。
结果
C40M126在细胞表面远侧的位点处结合CD40(图5)。表位是构象表位，并且包括：一段连续的氨基酸残基46-64，形成β发夹；以及来自于相邻环的两个更多残基75-76(残基根据SEQ ID NO:75编号)。参与结合CD40的抗体残基包括来自轻链的9个残基和来自重链的11个残基(图6)。所有六个CDR均参与结合。抗体-抗原界面伸展并在每个分子上覆盖
在与C40M9进行比较时，C40M126是在重链的框架区具有两个突变I17T和N85S的C40M9变体。这两个残基背离mAb结合位点并且不影响抗体的结合特性。因此，预期C40M9结合与C40M126相同的表位残基。
因此，与表位和作用机理相关的所有结论对C40B8同样成立。
Cyno CD40与人CD40的ECD有95％相同，与人CD40区别在于表位中的仅一个位置。狨猴CD40具有与人CD40更多的氨基酸差异，其中4个就在表位之内。所有的差异都位于表位的周边，并且可能被抗体耐受，即预期C40M9针对cyno和狨猴CD40均有交叉反应性。
受体-配体复合物上的抗体-抗原结构(可得自蛋白质数据库(Protein DataBank，登录3QD6)的重合示出C40M126和CD40L的表位不重叠。然而，C40M126和CD40L将因空间效应而竞争同一分子CD40，例如C40M126将阻断CD40L-CD40交互作用。
实施例10：食蟹猴中抗-CD40抗体的药代动力学研究
材料和方法
使整夜禁食(或至少8小时)的原始食蟹猴以0.1mg/kg、10mg/kg或10mg/kg接受单次推注静脉注射的抗-CD40抗体C40M9、C40M126或对照抗体CP-870,893。该研究的动物福利符合美国农业部(USDA)动物福利法(联邦法规全书(CFR)第9卷，第1、2和3部分)。
对于生物分析研究，在给药前和给药后0.5、1、2、4、8、12、24、48、72、96小时以及7、14、21和28天从股动脉采集约1mL/样本。在各间隔下完成样本采集后，使样本在环境温度下凝块至少15分钟，然后将样本在30分钟内于环境条件下离心。将所得的血清分成三份大约相等的等分试样(当可用时)，并置入96孔板中。将样本在-60℃至-90℃下冷冻保存。
结果
雄性食蟹猴被施用0.1、1.0、或10mg/kg剂量的单次静脉推注的C40M9、C40M126或对照抗体CP-870,893。一般来讲，效应趋于在施用CP-870,893时产生或最显著。观察到以下发现：
·在10mg/kg C40M9以及1.0和10mg/kg CP-870,893下，红细胞群中度减少，有适当的再生响应的迹象，如根据血涂片的显微镜观察的增大的网织红细胞计数、红血细胞分布宽度(RDW)、多染性和/或有核红细胞所指示的那样；红细胞群减少趋于在第21天和/或28天消退，而再生响应一般持续存在。
·在0.1、1.0和10mg/kgCP-870,893下，血小板计数瞬时轻度至中度下降。
·在10mg/kg CP-870,893下，白蛋白瞬时中度下降，球蛋白中度增加，并且/或者中性粒细胞质变化，暗示着轻度炎性刺激。
·在14至28天，在10mg/kg CP-870,893下，纤维蛋白原轻度降低。
·在10mg/kg CP-870,893下，瞬时改变的凝血的证据由APTT和凝血酶原时间的最小延长加以指示，这因较小的变化幅度而不太可能有生物学意义。
血液学
在雄性中以10mg/kg C40M9以及1.0和10mg/kg CP-870,893给药后72小时、第7天和/或14天采集时，存在红细胞群的中度减少(多至-29％；百分比变化表示为相对于验前平均值的组平均值)，比其它治疗组中的红细胞群下降的幅度(多至-20％)更大。其它治疗组中红细胞群的减少通常在组之间中具有类似的幅度；它们被认为是最大可能操作相关的并且归因为重复的药代动力学血液采集，但因缺乏用于比较的对照而不可进行明确比较。在10mg/kg C40M9以及1.0和10mg/kg Cp-870,893下，红细胞群的较大下降最可能与试验样品相关，具有并行操作相关的贡献。红细胞群下降趋于在21天和/或28天消退。
在所有组中第7天至28天采集时，网织红细胞计数相对于验前有轻度到显著的增大(高至+883％)，指示对红细胞群下降适当的再生响应。在1.0mg/kg和10mg/kg CP-870,893下，根据血涂片显微镜观察，红血细胞分布宽度也同时增加(RDW；多至+44％，指示红细胞尺寸变化增大)，并且多染性和/或有核红细胞升高，这同样指示再生响应。再生响应在10mg/kg CP-870,893下最为显著，这与所观察的红细胞群的最大降低一致。
在≥0.1mg/kg CP-870,893给药后72小时采集，以及10mg/kg CP-870,893下第7天和14天采集，血小板计数相对于验前存在轻度至中度瞬时减少(高达-81％)，这被认为是CP-870,893相关的。在这些下降之后，在后续采集时血小板计数瞬时增加，指示了适当的再生响应，并且通常在第28天采集时消退。图8示出在给予10mg/kg的C40M9、C40M126或对照抗体CP-870,893的动物中随时间推移的血小板计数。血小板计数的瞬时减少并未在给予C40M9或C40M126的动物中观察到。
在10mg/kg CP-870,893下，在一只雄性中第14天采集时，根据血涂片显微镜观察，观察到存在中性粒细胞质变化。该变化最能指示炎性刺激，如与白蛋白减少和球蛋白增加相关。
在≥0.1mg/kg CP-870,893和10mg/kg C40M126下，在雄性中给药后72小时和/或第7天采集时，淋巴细胞计数相对于验前存在轻度至中度瞬时减少(多至-46％)，这通常在后续采集中消退。这些变化与试验样品不确定的相关，这是由于这些变化在治疗组之间的幅度大致类似，并且平均值和个体值与生物和操作相关的变化的期望值相关。
因为它们的较小幅度，偶现性质、给药接近度、和/或与生物和操作相关的变化的期望值相关，血液学端点中的所有其它波动都被认为没有意义。
凝血
在10mg/kg CP-870,893下，在雄性中在第7天和14天采集时，相对于验前，APTT(多至+32％)和凝血酶原时间(多至+22％)存在最小限度的延长。这些变化是CP-870,893相关的并且指示改变的凝血，但因较小的变化幅度而不太可能具有生物意义。它们在后续采集中消退。
在10mg/kg CP-870,893下，在雄性中第14天、21天和28天采集时，纤维蛋白原相对于验前存在轻度降低(高达-66％)。这些变化是CP-870,893相关的，并且可能涉及改变的凝血。凝血时间(即APTT和凝血酶原时间)和纤维蛋白原的其它波动由于其较小幅度、变化方向和/或涉及预期值而被认为没有意义。
临床化学
在10mg/kg CP-870,893下，在雄性中第7天、14天和21天采集时，相对于验前，白蛋白中度降低(多至-30％)且球蛋白增加(多至+33％)。这些变化被认为是试验样品相关的，并且暗示了轻微的炎性刺激，如与在两只动物之一所见的中性粒细胞质变化相关(参见血液学部分)。这些变化趋向于在28天采集消退。在所有采集中其它治疗组之间也通常观察到白蛋白轻微至轻度下降(多至-16％)，但这些下降通常趋于在第21天和/或28天采集时返回到验前值。这些下降被认为最可能与操作相关，因为涉及到红细胞群下降(参见血液学部分)。白蛋白的减少通常伴随着钙的减少，因为白蛋白是钙的主要血液载体，并且伴随着总蛋白和/或白蛋白与球蛋白比率的降低。在其它研究端点中，这些变化缺乏相关发现。
除1.0mg/kg C40M126以外，在所有治疗组中雄性给药后72小时和/或第7天采集时，天冬氨酸转氨酶(AST；多至+529％)和/或丙氨酸转氨酶(ALT；多至+374％)相对于验前存在中轻度至中度增加，这通常在后续采集中消退，并且最能暗示轻微肌损失。这些变化因为缺乏剂量响应模式、瞬时性质、并且在其它研究端点中缺乏相关发现，被视为最可能是操作相关的，可能与重复的静脉穿刺相关。
因为它们的较小幅度，偶现性质、给药接近度、和/或涉及期望值，临床化学端点中的所有其它波动都被认为没有意义。
在该cyno耐药性研究中生成的毒性数据表明，在与对照抗体进行比较时，C40M9和C40M126诱导较小的血小板损耗和较低水平的细胞因子风暴，这大概是来自于CD40抗体的激动剂活性所驱动的APC活化。C40M9和C40M126可一起诱导与CD40活性相关的较小毒性，同时保持强APC活化，如体外DC活化中所示。

Claims (65)

1.一种特异性结合SEQ ID NO:75的人CD40的分离的激动性抗体或其抗原结合片段，包含SEQ ID NO:5的重链可变区(HCDR)1、SEQ ID NO:10的HCDR2、SEQ ID NO:18的HCDR3、SEQID NO:32的轻链可变区(LCDR)1、SEQ ID NO:34的LCDR2和SEQ ID NO:47的LCDR3。
2.根据权利要求1所述的抗体，其中所述抗体在SEQ ID NO:75的人CD40残基46-64和75-76内结合SEQ ID NO:75的人CD40。
3.根据权利要求1或2所述的抗体，其中所述抗体具有下列特性中的至少一个：
a)与SEQ ID NO:75的人CD40以约5×10-9M或更小的解离常数(KD)结合，此时所述KD在包含0.01％聚山梨酸酯20(PS-20)和100μg/ml牛血清白蛋白的杜贝克氏磷酸盐缓冲盐水中于25℃使用ProteOn XPR36系统测定；或者
b)就其对B细胞和树突细胞(DC)的激动活性而言需要交联，其中当使用流式细胞术测定CD23和CD83表面表达时，在20μg/ml的交联剂抗人F(ab’)2存在下，通过B细胞CD23表面表达测定对B细胞的激动活性，并且通过DC CD83表面表达测定对DC的激动活性。
4.根据权利要求3所述的抗体，包含SEQ ID NO:62或61的重链可变区(VH)和SEQ IDNO:69的轻链可变区(VL)。
5.根据权利要求3所述的抗体，包含分别为SEQ ID NO:62和69的VH和VL。
6.根据权利要求3所述的抗体，包含分别为SEQ ID NO:61和69的VH和VL。
7.根据权利要求3所述的抗体，其中所述抗体包含来源于人IGHV4-39*01(SEQ ID NO:73)的重链框架和来源于人IGLV2-8*01(SEQ ID NO:87)的轻链框架。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的抗体，其中所述抗体是IgG1、IgG2、IgG3或IgG4同种型。
9.根据权利要求5所述的抗体，包含分别为SEQ ID NO:129和136的重链和轻链。
10.根据权利要求5所述的抗体，包含分别为SEQ ID NO:128和136的重链和轻链。
11.根据权利要求6所述的抗体，包含分别为SEQ ID NO:127和136的重链和轻链。
12.根据权利要求1-11中任一项所述的抗体，还包含Fc区中的至少一个突变。
13.根据权利要求12所述的抗体，其中所述Fc区中的至少一个突变使所述抗体与FcγRIIb的结合增强。
14.根据权利要求13所述的抗体，其中所述Fc区中的至少一个突变是S267E突变、S267E/I332E突变、S267E/L328F突变、G236D/S267E突变或E233D/G237D/H268D/P271G/A330R/P238D突变，残基根据EU索引进行编号。
15.根据权利要求13所述的抗体，其中所述Fc区中的至少一个突变是S267E突变。
16.根据权利要求1-15中任一项所述的抗体，其中所述抗体为多特异性抗体。
17.根据权利要求16所述的抗体，其中所述抗体为双特异性抗体。
18.一种免疫缀合物，包含连接至细胞毒剂或显像剂的根据权利要求1-17中任一项所述的抗体。
19.一种药物组合物，包含根据权利要求1-17中任一项所述的抗体以及药学上可接受的载体。
20.一种药物组合物，包含根据权利要求18所述的免疫缀合物以及药学上可接受的载体。
21.一种多核苷酸，其编码SEQ ID NO:62或61的抗体VH、SEQ ID NO:69的抗体VL、或者SEQ ID NO:62或61的抗体VH与SEQ ID NO:69的抗体VL。
22.一种多核苷酸，其编码SEQ ID NO:129、128或127的抗体重链、SEQ ID NO:136的抗体轻链、或者SEQ ID NO:129、128或127的抗体重链与SEQ ID NO:136的抗体轻链。
23.一种多核苷酸，包含SEQ ID NO:102、103、110、153、154、155或162的多核苷酸序列。
24.一种载体，包含根据权利要求21所述的多核苷酸。
25.一种载体，包含根据权利要求22所述的多核苷酸。
26.一种载体，包含根据权利要求23所述的多核苷酸。
27.一种宿主细胞，包含根据权利要求24所述的载体。
28.一种宿主细胞，包含根据权利要求25所述的载体。
29.一种宿主细胞，包含根据权利要求26所述的载体。
30.一种制备特异性结合人CD40的激动性抗体的方法，包括在表达所述抗体的条件下培养根据权利要求27、28或29所述的宿主细胞，并且回收所述宿主细胞产生的抗体。
31.一种治疗受试者的癌症的方法，包括以足以治疗所述癌症的时间向对其有需要的受试者施用治疗有效量的根据权利要求1-17中任一项所述的分离的抗体。
32.根据权利要求31所述的方法，其中所述癌症是实体瘤或血液恶性肿瘤。
33.根据权利要求32所述的方法，其中所述实体瘤是膀胱癌、肾癌、肺癌、非小细胞肺癌、胰腺癌、卵巢癌、乳腺癌或头颈癌。
34.根据权利要求31-33中任一项所述的方法，其中将所述抗体与第二治疗剂联合施用。
35.根据权利要求34所述的方法，其中所述第二治疗剂是化学治疗剂、用于治疗实体瘤或血液恶性肿瘤的标准护理药物、或免疫检查点调节剂。
36.根据权利要求34或35所述的方法，其中所述第二治疗剂是同时、依次或分开施用的。
37.一种与根据权利要求4、5或6所述的抗体结合的抗独特型抗体。
38.一种试剂盒，包含根据权利要求4、5或6所述的抗体。
39.根据权利要求38所述的试剂盒，还包含用于检测所述抗体的试剂以及使用说明。
40.根据权利要求1-17中任一项所述的抗体或者根据权利要求19或20所述的药物组合物，其在治疗中使用。
41.一种特异性结合SEQ ID NO:75的人CD40的分离的激动性抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体具有下列特性中的至少一个：
a)与SEQ ID NO:75的人CD40以约5×10-9M或更小的解离常数(KD)结合，此时所述KD在包含0.01％聚山梨酸酯20(PS-20)和100μg/ml牛血清白蛋白的杜贝克氏磷酸盐缓冲盐水中于25℃使用ProteOn XPR36系统测定；或者
b)就其对B细胞和树突细胞(DC)的激动活性而言需要交联，其中在20μg/ml的交联剂抗人F(ab’)2存在下，通过B细胞CD23表面表达测定对B细胞的激动活性，并且通过DC CD83表面表达测定对DC的激动活性，此时使用流式细胞术测定CD23和CD83表面表达。
42.根据权利要求41所述的抗体，包含：
a)分别为SEQ ID NO:1、8、22、28、38和42的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3，分别为SEQ ID NO:48和63的VH和VL，和/或分别为SEQ ID NO:114和130的重链(HC)和轻链(LC)；
b)分别为SEQ ID NO:2、7、25、26、39和44的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3，分别为SEQ ID NO:49和64的VH和VL，和/或分别为SEQ ID NO:115和131的重链(HC)和轻链(LC)；
c)分别为SEQ ID NO:2、7、24、26、39和44的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3，分别为SEQ ID NO:50和64的VH和VL，和/或分别为SEQ ID NO:116和131的重链(HC)和轻链(LC)；
d)分别为SEQ ID NO:2、7、23、26、39和44的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3，分别为SEQ ID NO:51和64的VH和VL；或分别为SEQ ID NO:117和131的重链(HC)和轻链(LC)；
e)分别为SEQ ID NO:3、13、17、27、33和43的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3；分别为SEQ ID NO:52和65的VH和VL；或分别为SEQ ID NO:118和132的重链(HC)和轻链(LC)；
f)分别为SEQ ID NO:4、6、19、27、33和43的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3；分别为SEQ ID NO:53和65的VH和VL；或分别为SEQ ID NO:119和132的重链(HC)和轻链(LC)；
g)分别为SEQ ID NO:4、6、20、27、33和43的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3；分别为SEQ ID NO:54和65的VH和VL；或分别为SEQ ID NO:120和132的重链(HC)和轻链(LC)；
h)分别为SEQ ID NO:2、7、14、27、33和43的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3；分别为SEQ ID NO:55和65的VH和VL；或分别为SEQ ID NO:121和132的重链(HC)和轻链(LC)；
i)分别为SEQ ID NO:4、6、21、27、33和43的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3；分别为SEQ ID NO:56和65的VH和VL；或分别为SEQ ID NO:122和132的重链(HC)和轻链(LC)；
j)分别为SEQ ID NO:4、9、15、30、36和41的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3，分别为SEQ ID NO:57和66的VH和VL；或分别为SEQ ID NO:123和133的重链(HC)和轻链(LC)；
k)分别为SEQ ID NO:4、11、16、29、37和40的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3，分别为SEQ ID NO:58和67的VH和VL；或分别为SEQ ID NO:124和134的重链(HC)和轻链(LC)；
l)分别为SEQ ID NO:4、12、15、30、35和46的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3，分别为SEQ ID NO:59和68的VH和VL，和/或分别为SEQ ID NO:125和135的重链(HC)和轻链(LC)；
m)分别为SEQ ID NO:4、9、15、30、36和41的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3，分别为SEQ ID NO:57和70的VH和VL，和/或分别为SEQ ID NO:123和137的重链(HC)和轻链(LC)；
n)分别为SEQ ID NO:4、9、15、31、36和41的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3，分别为SEQ ID NO:57和71的VH和VL，和/或分别为SEQ ID NO:123和138的重链(HC)和轻链(LC)；
o)分别为SEQ ID NO:4、9、15、31、36和41的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3，分别为SEQ ID NO:57和72的VH和VL，和/或分别为SEQ ID NO:123和139的重链(HC)和轻链(LC)。
43.根据权利要求41-42中任一项所述的抗体，其中所述抗体是IgG1、IgG2、IgG3或IgG4同种型。
44.根据权利要求43所述的抗体，还包含Fc区中的至少一个突变。
45.根据权利要求44所述的抗体，其中所述Fc区中的至少一个突变使所述抗体与FcγRIIb的结合增强。
46.根据权利要求45所述的抗体，其中所述Fc区中的至少一个突变是S267E突变、S267E/I332E突变、S267E/L328F突变、G236D/S267E突变或E233D/G237D/H268D/P271G/A330R/P238D突变，残基根据EU索引进行编号。
47.根据权利要求41-46中任一项所述的抗体，其中所述抗体为多特异性抗体。
48.根据权利要求47所述的抗体，其中所述抗体为双特异性抗体。
49.一种免疫缀合物，包含连接至细胞毒剂或显像剂的根据权利要求41-48中任一项所述的抗体。
50.一种药物组合物，包含根据权利要求41-48中任一项所述的抗体以及药学上可接受的载体。
51.一种药物组合物，包含根据权利要求49所述的免疫缀合物以及药学上可接受的载体。
52.一种多核苷酸，其编码SEQ ID NO:48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58或59的抗体VH、SEQ ID NO:63、64、65、66、67、68、70、71或72的抗体VL、或者SEQ ID NO:48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58或59的抗体VH与SEQ ID NO:63、64、65、66、67、68、70、71或72的抗体VL。
53.一种载体，包含根据权利要求52所述的多核苷酸。
54.一种宿主细胞，包含根据权利要求53所述的载体。
55.一种制备特异性结合人CD40的激动性抗体的方法，包括在表达所述抗体的条件下培养根据权利要求54所述的宿主细胞，并且回收所述宿主细胞产生的抗体。
56.一种治疗受试者的癌症的方法，包括以足以治疗所述癌症的时间向对其有需要的受试者施用治疗有效量的根据权利要求41-48中任一项所述的分离的抗体。
57.根据权利要求56所述的方法，其中所述癌症是实体瘤或血液恶性肿瘤。
58.根据权利要求57所述的方法，其中所述实体瘤是膀胱癌、肾癌、肺癌、非小细胞肺癌、胰腺癌、卵巢癌、乳腺癌或头颈癌。
59.根据权利要求56-58中任一项所述的方法，其中将所述抗体与第二治疗剂联合施用。
60.根据权利要求59所述的方法，其中所述第二治疗剂是化学治疗剂、用于治疗实体瘤或血液恶性肿瘤的标准护理药物、或免疫检查点调节剂。
61.根据权利要求59或60所述的方法，其中所述第二治疗剂是同时、依次或分开施用的。
62.一种与根据权利要求42所述的抗体结合的抗独特型抗体。
63.一种试剂盒，包含根据权利要求42所述的抗体。
64.根据权利要求63所述的试剂盒，还包含用于检测所述抗体的试剂以及使用说明。
65.根据权利要求41-48中任一项所述的抗体或者根据权利要求49或50所述的药物组合物，其在治疗中使用。
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