TW202330600A - Fap/cd40 結合分子及其醫藥用途 - Google Patents

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Abstract

本揭露關於FAP/CD40結合分子及其醫藥用途；具體地，本揭露提供FAP結合分子、CD40結合分子及FAP/CD40結合分子，以及其治療、預防疾病(例如腫瘤或癌症)的方法和醫藥用途。

Description

FAP/CD40結合分子及其醫藥用途
本揭露要求2021年08月24日提交的中國專利申請(申請號CN202110973560.5)的優先權。
本揭露關於生物醫藥領域，特別是治療或干預與CD40/CD40L信號通路相關疾病的領域。具體而言，本揭露關於FAP/CD40結合分子、其醫藥組成物，及用於治療疾病，特別是腫瘤或癌症的方法和相關製藥用途。
CD40(TNFRSF5)是一種跨膜磷酸化糖蛋白，屬腫瘤壞死因子受體超家族(TNFRS)成員。CD40在多種細胞類型中表達，包括B細胞、濾泡樹突細胞(DC)、上皮細胞、單核細胞、巨噬細胞、平滑肌細胞和腫瘤細胞。其配體CD40L主要表達在激活的T細胞、激活的B細胞、血小板和平滑肌細胞等。CD40L結合使CD40多聚化，產生下游激活、生長和分化信號。CD40信號轉導激活多種下游信號通路，如NF-κB、MAPK和STAT3(Pype S,et al.J Biol Chem.2000 Jun.16；275(24)：1858693)，這些途徑藉由調節激活蛋白c-Jun、ATF2和Rel轉錄因子來調節基因表達。CD40與CD40L結合誘導靜息B細胞增殖，免疫球蛋 白轉換，抗體分泌，並在組織生髮中心發育和B細胞存活發揮重要作用，所有這些對於體液免疫反應是必不可少的(Kehry M R.J Immunol 1996；156：2345-2348)。CD40L與DC上的CD40結合，誘導DC成熟，表現為共刺激因子B7家族(CD80，CD86)的表達上調和促炎細胞因子如白細胞介素12(IL-12)的分泌增加。CD40和CD40L相互作用為T細胞激活提供共刺激信號，並促進DC細胞遞呈抗原給T細胞。
隨著以CD40、CTLA-4和PD-L1為靶點的免疫檢查點抑制(ICI)療法在腫瘤治療中取得的臨床勝利，免疫治療已成為第三代腫瘤治療中最令人期待的研究領域。其中藉由激活CD40從而增加DC細胞對T細胞的抗原遞呈及激活為機制的抗腫瘤免疫療法已展示出臨床有效性。但是，CD40存在系統性激活，這會導致一些靶點特異的毒性，如細胞因子風暴、肝毒性、血液毒性以及外周CD40激活導致的靜脈血栓。這些毒性限制了CD40激動型抗體的治療窗口。Pfizer公司的CD40激動劑CP-870、893和Medimmune公司的CD40L-Fc融合蛋白MEDI5083(AstraZeneca公司的可激活CD40信號通路的新型融合蛋白，由3個串聯的CD40L與IgG4-Fc的融合蛋白)先後終止了臨床研究。因此。在第二代CD40激動劑抗體的研發中，研究者期望藉由腫瘤抗原(Tumor-associated antigen，TAA)介導CD40激活，使得CD40在腫瘤內部特異性激活，同時降低外周CD40的激活，從而提高CD40激動型抗體的治療窗。
成纖維細胞活化蛋白FAP(fibroblast activation protein)α是腫瘤相關抗原，FAP在健康成年人的正常組織中表達量較低，選擇性地表達在93%的腫瘤組織中，其中30%為高表達，例如結腸癌、胰腺癌、乳腺癌、胃癌、前列腺癌、膀胱癌和口腔鱗癌。本揭露提供了抗FAP抗體、抗CD40抗體及兩者的雙 特異性抗體，所述雙特異性抗體能藉由FAP介導針對腫瘤特異性的CD40激活，對APC(例如樹突細胞DC)具有促成熟、激活作用，能去除肝毒性、外周血液毒性及其它外周毒性，具有優良的給藥窗口和成藥性，為臨床應用提供了解決方案。
本揭露提供了具有新結構的CD40結合分子、FAP結合分子、FAP/CD40結合分子(例如，抗FAP/CD40雙特異性抗體)，其編碼核酸、載體、宿主細胞、醫藥組成物，及其用於治療、緩解或預防細胞增殖性疾病(例如腫瘤或癌症)的方法和相關製藥用途。
CD40結合分子
本揭露提供了一種CD40結合分子，其包含至少一個免疫球蛋白單一可變結構域，該免疫球蛋白單一可變結構域包含三個互補決定區CDR1、CDR2、CDR3，其中，
1)該免疫球蛋白單一可變結構域中的CDR1包含或為SEQ ID NO：39所示的胺基酸序列，和/或CDR2包含或為SEQ ID NO：40所示的胺基酸序列，和/或CDR3包含或為SEQ ID NO：41所示的胺基酸序列；
2)該免疫球蛋白單一可變結構域中的CDR1、CDR2、CDR3的胺基酸序列分別如SEQ ID NO：39、40、41所示；
3)該免疫球蛋白單一可變結構域中的CDR1、CDR2、CDR3的胺基酸序列分別如SEQ ID NO：24、25、26所示，或如SEQ ID NO：27、28、29所示；
4)該免疫球蛋白單一可變結構域中的胺基酸序列包含或如SEQ ID NO：22、23、32至38任一所示，或與SEQ ID NO：22、23、32至38任一具有至少90%、至少95%、至少98%、至少99%的序列同一性；和/或
5)該免疫球蛋白單一可變結構域中的CDR1、CDR2和CDR3如SEQ ID NO：22中的CDR1、CDR2和CDR3所示，或如SEQ ID NO：23中的CDR1、CDR2和CDR3所示，或如SEQ ID NO：32中的CDR1、CDR2和CDR3所示，或如SEQ ID NO：33中的CDR1、CDR2和CDR3所示，或如SEQ ID NO：34中的CDR1、CDR2和CDR3所示，或如SEQ ID NO：35中的CDR1、CDR2和CDR3所示，或如SEQ ID NO：36中的CDR1、CDR2和CDR3所示，或如SEQ ID NO：37中的CDR1、CDR2和CDR3所示，或如SEQ ID NO：38中的CDR1、CDR2和CDR3所示；該CDR是根據Kabat、IMGT、Chothia、AbM或Contact編號系統定義的；一些具體實施方案中，該CDR是根據Kabat編號系統定義的。
一些實施方案中，提供CD40結合分子，其包含前述任意一個或多個(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個)免疫球蛋白單一可變結構域，該免疫球蛋白單一可變結構域可以是相同的或不同的。
一些實施方案中，前述免疫球蛋白單一可變結構域為奈米抗體或VHH。
一些實施方案中，前述CD40結合分子中還包含人免疫球蛋白Fc區。一些具體實施方案中，該Fc區是人IgG1、IgG2、IgG4的Fc區。一些具體實施方案中，該人IgG1的Fc區具有能夠增加與FcγRIIb親和力、減弱ADCC效應的突變，例如S267E/L328F。減弱ADCC效應的示例性突變是IgG1上的L234A/L235A，IgG2上的V234A/G237A/P238S/H268A/V309L/A330S/P331S， IgG4上的F234A/L235A，IgG4上的S228P/F234A/L235A，IgG1、IgG2、IgG3或IgG4上的N297A，IgG2上的V234A/G237A，IgG1上的K214T/E233P/L234V/L235A/G236缺失/A327G/P331A/D365E/L358M，IgG2上的H268Q/V309L/A330S/P331S，IgG1上的S267E/L328F，IgG1上的L234F/L235E/D265A，IgG1上的L234A/L235A/G237A/P238S/H268A/A330S/P331S，IgG4上的S228P/F234A/L235A/G237A/P238S，以及IgG4上的S228P/F234A/L235A/G236缺失/G237A/P238S。還可使用雜合IgG2/4Fc域，例如具有來自IgG2的殘基117-260和來自IgG4的殘基261-447的Fc。增加與FcγRIIb親和力的示例性突變還包括IgG1上的E233D/G237D/P238D/H268D/P271G/A330R。
一些實施方案中，前述Fc區可以使該抗CD40抗體或其抗原結合片段形成二聚體或多聚體分子。
一些實施方案中，前述CD40結合分子中的免疫球蛋白單一可變結構域與Fc區直接或藉由接頭相連接。該接頭可以是長度為1-20個或更多個胺基酸、無二級以上結構的非功能性胺基酸序列。例如，該接頭是柔性接頭，例如G4S、GS、GAP、(G4S)2、(G4S)3、(G4S)4、(G4S)5、ASGS等。
一些實施方案中，提供CD40結合分子，其包含如SEQ ID NO：57至63中任一所示或與之具有至少80%同一性的胺基酸序列。
一些實施方案中，前述CD40結合分子與至少一個結合其它抗原的抗體直接或間接相連接，例如，形成異二聚體。
一些實施方案中，前述CD40結合分子，具有選自以下至少一項的活性：
(a)以
Figure 111131935-A0202-12-0005-112
10-7M KD值與人CD40或其表位結合；
(b)增加或促進APC(例如樹突細胞DC)的活化和/或增殖；和
(c)抑制腫瘤生長和/或轉移。
一些實施方案中，前述CD40結合分子抑制CD40與CD40L的結合，或與CD40L競爭性結合CD40。
一些實施方案中，前述CD40結合分子能夠抑制腫瘤生長和/或轉移至少約10%，例如至少約20%、約30%、約40%、約50%、約60%、約70%、約80%。
一些實施方案中，前述CD40結合分子使CD40L與CD40的結合降低至少45%、至少50%、至少60%、至少75%、至少80%、至少90%或至少95%。
一些實施方案中，前述CD40結合分子以10-7M、10-8M、10-9M、10-10M、10-11M或更低的KD結合人CD40。
一些實施方案中，前述CD40結合分子為抗CD40抗體或其抗原結合片段。
一些實施方案中，前述CD40結合分子為激動劑型抗CD40抗體或其抗原結合片段。
一些實施方案中，前述抗CD40抗體為駱駝抗體、嵌合抗體、人源化抗體、全人抗體。一些實施方案中，前述抗CD40抗體為奈米抗體或VHH。
一些實施方案中，前述抗CD40抗體或其抗原結合片段包括但不限於：線性抗體、單鏈抗體、奈米抗體、肽抗體(peptibody)、結構域抗體和多特異性抗體(雙特異性抗體、雙鏈抗體(diabody)、三鏈抗體(triabody)和四鏈抗體(tetrabody)、串聯二-scFv、串聯三-scFv)。
一些實施方案中，前述抗CD40抗體或其抗原結合片段涵蓋變體，例如與SEQ ID NO：22、23、32至38中任一相比，包含一或多個胺基酸取代，例如，保守胺基酸取代；例如，該變體包含1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個保守胺基酸取代。
一些實施方案中，本揭露提供抗CD40抗體或其抗原結合片段，其是SEQ ID NO：22、23經過親合力成熟獲得的，該經親合力成熟的抗CD40抗體可以在一個或多個CDR中具有一個或多個變化，該變化導致對CD40的親合力相比於親本抗CD40抗體有所增加。
一些實施方案中，提供抗CD40抗體或其抗原結合片段，其與前述抗CD40抗體或其抗原結合片段結合或競爭結合相同的表位。
一些實施方案中，提供抗CD40抗體或其抗原結合片段，其阻斷前述抗CD40抗體或其抗原結合片段與CD40(例如人CD40)的結合。
一些實施方案中，提供抗CD40抗體或其抗原結合片段，其與CD40(例如人CD40)的結合被前述抗CD40抗體或其抗原結合片段阻斷。
一些實施方案中，提供綴合物，包含前述本揭露的抗CD40抗體或其抗原結合片段。
本揭露中，“至少90%(序列)同一性”涵蓋至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%(序列)同一性；“至少80%(序列)同一性”涵蓋至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%(序列)同一性。
FAP結合分子
本揭露提供了一種FAP結合分子，其包含重鏈可變區和輕鏈可變區，該重鏈可變區包含HCDR1、HCDR2、HCDR3，該輕鏈可變區包含LCDR1、LCDR2、LCDR3，其中，
1)該HCDR1的胺基酸序列如SEQ ID NO：9所示，和/或該HCDR2的胺基酸序列如SEQ ID NO：10所示，和/或該HCDR3的胺基酸序列如SEQ ID NO：18所示；和/或該LCDR1的胺基酸序列如SEQ ID NO：12所示，和/或該LCDR2的胺基酸序列如SEQ ID NO：13所示，和/或該LCDR3的胺基酸序列如SEQ ID NO：19所示；
2)該HCDR1、HCDR2、HCDR3的胺基酸序列分別如SEQ ID NO：9、10、18所示；和/或該LCDR1、LCDR2、LCDR3的胺基酸序列分別如SEQ ID NO：12、13、19所示；
3)該HCDR1、HCDR2、HCDR3的胺基酸序列分別如SEQ ID NO：9、10、11所示，該LCDR1、LCDR2、LCDR3的胺基酸序列分別如SEQ ID NO：12、13、14所示；
該HCDR1、HCDR2、HCDR3的胺基酸序列分別如SEQ ID NO：9、10、15所示，該LCDR1、LCDR2、LCDR3的胺基酸序列分別如SEQ ID NO：12、13、14所示；
該HCDR1、HCDR2、HCDR3的胺基酸序列分別如SEQ ID NO：9、10、15所示；該LCDR1、LCDR2、LCDR3的胺基酸序列分別如SEQ ID NO：12、13、16所示；或
該HCDR1、HCDR2、HCDR3的胺基酸序列分別如SEQ ID NO：9、10、11所示；該LCDR1、LCDR2、LCDR3的胺基酸序列分別如SEQ ID NO：12、13、17所示；
4)重鏈可變區包含如SEQ ID NO：1所示或與之具有至少90%同一性的胺基酸序列，輕鏈可變區包含如SEQ ID NO：2所示或與之具有至少90%同一性的胺基酸序列；
重鏈可變區包含如SEQ ID NO：3所示或與之具有至少90%同一性的胺基酸序列，輕鏈可變區包含如SEQ ID NO：4所示或與之具有至少90%同一性的胺基酸序列；
重鏈可變區包含如SEQ ID NO：5所示或與之具有至少90%同一性的胺基酸序列，輕鏈可變區包含如SEQ ID NO：6所示或與之具有至少90%同一性的胺基酸序列；或
重鏈可變區包含如SEQ ID NO：7所示或與之具有至少90%同一性的胺基酸序列，輕鏈可變區包含如SEQ ID NO：8所示或與之具有至少90%同一性的胺基酸序列；
5)重鏈可變區中包含SEQ ID NO：1中的HCDR1、HCDR2、HCDR3，輕鏈可變區中包含SEQ ID NO：2中的LCDR1、LCDR2、LCDR3；
重鏈可變區中包含SEQ ID NO：3中的HCDR1、HCDR2、HCDR3，輕鏈可變區中包含SEQ ID NO：4中的LCDR1、LCDR2、LCDR3；
重鏈可變區中包含SEQ ID NO：5中的HCDR1、HCDR2、HCDR3，輕鏈可變區中包含SEQ ID NO：6中的LCDR1、LCDR2、LCDR3；或
重鏈可變區中包含SEQ ID NO：7中的HCDR1、HCDR2、HCDR3，輕鏈可變區中包含SEQ ID NO：8中的LCDR1、LCDR2、LCDR3，其中，該CDR是根據Kabat、IMGT、Chothia、AbM或Contact編號系統定義的，例如為Kabat編號系統定義的。
一些實施方案中，提供FAP結合分子(例如，抗FAP抗體或其抗原結合片段)，包含前述HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、LCDR3中的任一個或幾個的組合。
一些實施方案中，前述FAP結合分子還包含人免疫球蛋白Fc區。一些具體實施方案中，該Fc區是人IgG1、IgG2、IgG4的Fc區。一些實施方案中，該人IgG1的Fc具有去除或降低Fc效應器功能的突變，例如IgG1上具有N297A或D265A/N297A。其它去除或降低Fc效應器功能的示例性突變包括IgG1上的L234A/L235A、L234A/L235A/P329G、L234E、L234F、L234E/L235F、L234E/L235F/P329G，IgG2上的V234A/G237A/P238S/H268A/V309L/A330S/P331S，IgG4上的F234A/L235A，IgG4上的S228P/F234A/L235A，IgG2或IgG4上的N297A，IgG2上的V234A/G237A，IgG1上的K214T/E233P/L234V/L235A/G236缺失/A327G/P331A/D365E/L358M，IgG2上的H268Q/V309L/A330S/P331S，IgG1上的S267E/L328F，IgG1上的L234F/L235E/D265A，IgG1上的L234A/L235A/G237A/P238S/H268A/A330S/P331S，IgG4上的S228P/F234A/L235A/G237A/P238S。
一些實施方案中，提供FAP結合分子(例如，抗FAP抗體或其抗原結合片段)，其包含重鏈(HC)和輕鏈(LC)，其中，
重鏈為SEQ ID NO：49所示或與之具有至少80%同一性的胺基酸序列，輕鏈為SEQ ID NO：50所示或與之具有至少80%同一性的胺基酸序列；
重鏈為SEQ ID NO：51所示或與之具有至少80%同一性的胺基酸序列，輕鏈為SEQ ID NO：52所示或與之具有至少80%同一性的胺基酸序列；
重鏈為SEQ ID NO：53所示或與之具有至少80%同一性的胺基酸序列，輕鏈為SEQ ID NO：54所示或與之具有至少80%同一性的胺基酸序列；或
重鏈為SEQ ID NO：55所示或與之具有至少80%同一性的胺基酸序列，輕鏈為SEQ ID NO：56所示或與之具有至少80%同一性的胺基酸序列。
一些實施方案中，前述FAP結合分子的重鏈可變區有0至10個(1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個)胺基酸變化；輕鏈可變區有0至10個(1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個)胺基酸變化。在一些具體實施方案中，該胺基酸變化為保守的替換、取代或修飾，和/或不影響功能的缺失、添加。
一些實施方案中，前述FAP結合分子，具有選自以下至少一項的活性：
(a)以
Figure 111131935-A0202-12-0011-113
10-7的KD值與人FAP或其表位結合；
(b)增加或促進APC(例如樹突細胞DC)的活化和/或增殖；
(c)抑制腫瘤生長和/或轉移。
一些實施方案中，前述FAP結合分子以10-7M、10-8M、10-9M、10-10M、10-11M或更低的KD結合FAP(例如人FAP)或其片段。
一些實施方案中，前述FAP結合分子為抗FAP抗體或其抗原結合片段；一些具體實施方案中，為嵌合抗體、人源化抗體、全人抗體或其抗原結合片段。
一些實施方案中，前述抗FAP抗體的抗原結合片段包括但不限於：Fab、Fv、sFv、Fab’、F(ab’)2、線性抗體、單鏈抗體、scFv、sdAb、sdFv、奈米抗體、肽抗體peptibody、結構域抗體和多特異性抗體(雙特異性抗體、雙鏈抗體(diabody)、三鏈抗體(triabody)和四鏈抗體(tetrabody)、串聯二-scFv、串聯三-scFv)，例如為scFv、Fv、Fab或Fab’片段。
一些實施方案中，提供抗FAP抗體或其抗原結合片段，其與前述抗FAP抗體或其抗原結合片段結合或競爭結合相同的FAP(例如人FAP)表位。
一些實施方案中，提供抗FAP抗體或其抗原結合片段，其阻斷前述抗FAP抗體或其抗原結合片段與FAP(例如人FAP)的結合。
一些實施方案中，提供抗FAP抗體或其抗原結合片段，其與FAP(例如人FAP)的結合被前述抗FAP抗體或其抗原結合片段阻斷。
一些實施方案中，提供綴合物，其包含前述抗FAP抗體或其抗原結合片段。
FAP/CD40結合分子
本揭露提供一種FAP/CD40結合分子，其包含特異性結合FAP的第一抗原結合結構域和特異性結合CD40的第二抗原結合結構域，該特異性結合CD40的第二抗原結合結構域包含(至少一個)免疫球蛋白單一可變結構域。
一些實施方案中，該FAP/CD40結合分子包含一個特異性結合CD40的免疫球蛋白單一可變結構域。在另一些實施方案中，該FAP/CD40結合分子包含2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多個特異性結合CD40的免疫球蛋白單一可變結構域，該免疫球蛋白單一可變結構域可以是相同的或不同的。
一些實施方案中，該FAP/CD40結合分子包含至少一個(例如2、3、4個)特異性結合FAP的抗原結合結構域。
一些實施方案中，前述FAP/CD40結合分子中，特異性結合CD40的免疫球蛋白單一可變結構域包含三個互補決定區CDR1、CDR2和CDR3，該CDR1、CDR2、CDR3的胺基酸序列分別如SEQ ID NO：39、40、41所示。一些具體實施方案中，該CDR1、CDR2、CDR3的胺基酸序列分別如SEQ ID NO：24、25、26所示；或該CDR1、CDR2、CDR3的胺基酸序列分別如SEQ ID NO：27、28、29所示。
一些實施方案中，提供一種FAP/CD40結合分子，其包含特異性結合FAP的第一抗原結合結構域和特異性結合CD40的第二抗原結合結構域，該特異性結合FAP的第一抗原結合結構域包含重鏈可變區和輕鏈可變區，該重鏈可變區包含HCDR1、HCDR2、HCDR3，該輕鏈可變區包含LCDR1、LCDR2、LCDR3，其中，
HCDR1、HCDR2、HCDR3的胺基酸序列分別如SEQ ID NO：9、10、18所示；LCDR1、LCDR2、LCDR3的胺基酸序列分別如SEQ ID NO：12、13、19所示。
一些具體實施方案中，前述特異性結合FAP的第一抗原結合結構域中：
HCDR1、HCDR2、HCDR3的胺基酸序列分別如SEQ ID NO：9、10、11所示；LCDR1、LCDR2、LCDR3的胺基酸序列分別如SEQ ID NO：12、13、14所示；
HCDR1、HCDR2、HCDR3的胺基酸序列分別如SEQ ID NO：9、10、15所示；LCDR1、LCDR2、LCDR3的胺基酸序列分別如SEQ ID NO：12、13、14所示；
HCDR1、HCDR2、HCDR3的胺基酸序列分別如SEQ ID NO：9、10、15所示；LCDR1、LCDR2、LCDR3的胺基酸序列分別如SEQ ID NO：12、13、16所示；或
HCDR1、HCDR2、HCDR3的胺基酸序列分別如SEQ ID NO：9、10、11所示；LCDR1、LCDR2、LCDR3的胺基酸序列分別如SEQ ID NO：12、13、17所示。
一些實施方案中，前述FAP/CD40結合分子中，該特異性結合FAP的第一抗原結合結構域的重鏈可變區包含如SEQ ID NO：1所示或與之具有至少80%同一性的胺基酸序列，輕鏈可變區包含如SEQ ID NO：2所示或與之具有至少80%同一性的胺基酸序列；
重鏈可變區包含如SEQ ID NO：3所示或與之具有至少80%同一性的胺基酸序列，輕鏈可變區包含如SEQ ID NO：4所示或與之具有至少80%同一性的胺基酸序列；
重鏈可變區包含如SEQ ID NO：5所示或與之具有至少80%同一性的胺基酸序列，輕鏈可變區包含如SEQ ID NO：6所示或與之具有至少80%同一性的胺基酸序列；或
重鏈可變區包含如SEQ ID NO：7所示或與之具有至少80%同一性的胺基酸序列，輕鏈可變區包含如SEQ ID NO：8所示或與之具有至少80%同一性的胺基酸序列。
一些實施方案中，前述FAP/CD40結合分子中，該特異性結合FAP的第一抗原結合結構域包含重鏈(HC)和輕鏈(LC)；
例如，重鏈為IgG1或IgG4同種型，輕鏈為Kappa同種型；
一些具體實施方案中，重鏈為SEQ ID NO：49所示或與之具有至少80%同一性的胺基酸序列，輕鏈為SEQ ID NO：50所示或與之具有至少80%同一性的胺基酸序列；
重鏈為SEQ ID NO：51所示或與之具有至少80%同一性的胺基酸序列，輕鏈為SEQ ID NO：52所示或與之具有至少80%同一性的胺基酸序列；
重鏈為SEQ ID NO：53所示或與之具有至少80%同一性的胺基酸序列，輕鏈為SEQ ID NO：54所示或與之具有至少80%同一性的胺基酸序列；或
重鏈為SEQ ID NO：55所示或與之具有至少80%同一性的胺基酸序列，輕鏈為SEQ ID NO：56所示或與之具有至少80%同一性的胺基酸序列。
一些實施方案中，前述FAP/CD40結合分子中，該特異性結合FAP的第一抗原結合結構域包含重鏈可變區和輕鏈可變區，其中，
該特異性結合CD40的第二抗原結合結構域的免疫球蛋白單一可變結構域位於特異性結合FAP的第一抗原結合結構域的重鏈可變區的N端；
該特異性結合CD40的第二抗原結合結構域的免疫球蛋白單一可變結構域位於特異性結合FAP的第一抗原結合結構域的重鏈可變區的C端；
該特異性結合CD40的第二抗原結合結構域的免疫球蛋白單一可變結構域位於特異性結合FAP的第一抗原結合結構域的輕鏈可變區的N端；和/或
該特異性結合CD40的第二抗原結合結構域的免疫球蛋白單一可變結構域位於特異性結合FAP的第一抗原結合結構域的輕鏈可變區的C端。
一些實施方案中，前述特異性結合CD40的第二抗原結合結構域的免疫球蛋白單一可變結構域與特異性結合FAP的第一抗原結合結構域直接或藉由連接子相連接；例如，該連接子為具有如(G4S)x所示的胺基酸序列，其中，x獨立地選自1-20的整數(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10)；例如，該連接子為(G4S)2、(G4S)3、(G4S)4所示的胺基酸序列。
一些實施方案中，前述FAP/CD40結合分子中，特異性結合CD40的第二抗原結合結構域為多價(例如，一個前述FAP/CD40結合分子中含有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個特異性結合CD40的第二抗原結合結構域)。一些具體實施方案中，特異性結合CD40的第二抗原結合結構域為二價、四價或六價。一些具體實施方案中，特異性結合CD40的第二抗原結合結構域包含2、3、4、5或6個該免疫球蛋白單一可變結構域。
一些實施方案中，提供FAP/CD40結合分子，其包含第一多肽鏈和第二多肽鏈，其中，第一多肽鏈包含如SEQ ID NO：42、44-48中任一所示或與之具有至少80%同一性的胺基酸序列，第二多肽鏈包含如SEQ ID NO：43所示或與之具有至少80%同一性的胺基酸序列。一些具體實施方案中，一個FAP/CD40結合分子中包含兩條第一多肽鏈和兩條第二多肽鏈；一些具體實施方案中，該兩條第一多肽鏈是相同的，該兩條第二多肽鏈是相同的。
一些實施方案中，前述FAP/CD40結合分子能夠抑制腫瘤生長(例如體積增大、瘤重增加)和/或轉移(例如多器官或多組織轉移、遠端轉移)至少約10%，例如至少約20%、約30%、約40%、約50%、約60%、約70%、約80%、約90%。
一些實施方案中，前述FAP/CD40結合分子為抗FAP/CD40雙特異性抗體或其抗原結合片段，該抗原結合片段包括但不限於：Fab、Fv、sFv、Fab’、F(ab’)2、線性抗體、單鏈抗體、scFv、sdAb、sdFv、奈米抗體、肽抗體(peptibody)、結構域抗體和多特異性抗體(雙特異性抗體、雙鏈抗體(diabody)、三鏈抗體(triabody)和四鏈抗體(tetrabody)、串聯二-scFv、串聯三-scFv)，例如為scFv、Fv、Fab或Fab’片段。
一些實施方案中，抗FAP/CD40雙特異性抗體含有前述本揭露提供的特異性結合CD40的第二抗原結合結構域中的免疫球蛋白單一可變結構域，和前述本揭露提供的特異性結合FAP的第一抗原結合結構域中的重鏈可變區(VH)和輕鏈可變區(VL)。
一些實施方案中，抗FAP/CD40雙特異性抗體中：
特異性結合FAP的第一抗原結合結構域為第一抗體，其包括重鏈(HC)和輕鏈(LC)；和
特異性結合CD40的第二抗原結合結構域為第二抗體，其是VHH，具有前述本揭露提供的CD40結合分子中的CDR1、CDR2、CDR3。
一些具體實施方案中，該VHH作為第二抗體位於第一抗體的重鏈或輕鏈的N端和/或C端。
一些具體實施方案中，抗FAP/CD40雙特異性抗體包含1個第一抗體和1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個(例如2個、4個、6個)VHH的第二抗體；該第一抗體包括兩條HC和兩條LC，第一抗體的一條HC的VH與一條LC的VL形成抗原結合部位，另一條HC的VH與另一條LC的VL形成抗原結合部位。
一些具體實施方案中，抗FAP/CD40雙特異性抗體或其抗原結合片段的第一抗體可以連接有1、2、3、4、5、6、7、8個VHH的第二抗體，該VHH的第二抗體可以是相同的或不同的，可以均連接在第一抗體的重鏈N端，或均連接在第一抗體的重鏈C端，或均連接在第一抗體的輕鏈N端，或均連接在第一抗體的輕鏈C端，或重鏈N端、重鏈C端、輕鏈N端、輕鏈C端的任意組合。一些具體實施方案中，抗FAP/CD40雙特異性抗體包含第一多肽鏈和第二多肽鏈：
(i)第一多肽鏈從N端至C端為：[第一抗體的重鏈]-接頭1-[第二抗體]；第二多肽鏈為第一抗體的輕鏈；
(ii)第一多肽鏈從N端至C端為：[第一抗體的重鏈]-接頭1-[第二抗體]1-接頭2-[第二抗體]2；第二多肽鏈為第一抗體的輕鏈；
(iii)第一多肽鏈從N端至C端為：[第一抗體的重鏈]-接頭1-[第二抗體]1-接頭2-[第二抗體]2-接頭3-[第二抗體]3；第二多肽鏈為第一抗體的輕鏈；
(iv)第一多肽鏈從N端至C端為：[第二抗體]-接頭1-[第一抗體的重鏈]；第二多肽鏈為第一抗體的輕鏈；
(v)第一多肽鏈從N端至C端為：[第二抗體]2-接頭2-[第二抗體]1-接頭1-[第一抗體的重鏈]；第二多肽鏈為第一抗體的輕鏈；
(vi)第一多肽鏈從N端至C端為：[第二抗體]3-接頭3-[第二抗體]2-接頭2-[第二抗體]1-接頭1-[第一抗體的重鏈]；第二多肽鏈為第一抗體的輕鏈；
(vii)第一多肽鏈從N端至C端為：[第二抗體]1-接頭1-[第一抗體的重鏈]-接頭2-[第二抗體]2；第二多肽鏈為第一抗體的輕鏈；
(viii)第一多肽鏈從N端至C端為：[第二抗體]1-接頭1-[第二抗體]2-接頭2-[第一抗體的重鏈]-接頭3-[第二抗體]3；第二多肽鏈為第一抗體的輕鏈；
(ix)第一多肽鏈從N端至C端為：[第二抗體]1-接頭1-[第一抗體的重鏈]-接頭2-[第二抗體]2-接頭3-[第二抗體]3；第二多肽鏈為第一抗體的輕鏈；
其中，[第二抗體]1、[第二抗體]2、[第二抗體]3可以相同或不同。
一些實施方案中，前述抗FAP/CD40雙特異性抗體中的VHH的第二抗體直接或藉由連接子與第一抗體連接。該連接子(接頭)選自：如(GmSn)x或(GGNGT)x或(YGNGT)x所示的胺基酸序列，其中m、n各自獨立地選自1-8的整數(例如，1、2、3、4、5、6、7或8)，x獨立地選自1-20的整數(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20)。例如，連接子為G4S、(G4S)2、(G4S)3、(G4S)4、(G4S)5、(G4S)6所示的胺基酸序列。一些實施方案中，接頭1、接頭2、接頭3可以相同或不同。
一些實施方案中，抗FAP/CD40雙特異性抗體的第一抗體的重鏈包含重鏈可變區(VH)和重鏈恆定區(CH)，輕鏈包含輕鏈可變區(VL)和輕鏈恆定區(CL)。第一抗體可以為全長抗體。
一些實施方案中，抗FAP/CD40雙特異性抗體第一抗體的重鏈為IgG同種型，例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4，例如為IgG1同種型；和/或，該第一抗體的輕鏈為Kappa同種型。
一些實施方案中，抗FAP/CD40雙特異性抗體的兩條HC包含相同的CDR和/或兩條LC包含相同的CDR。一些具體實施方案中，第一抗體的兩條HC包含相同的VH和/或兩條LC包含相同的VL。一些具體實施方案中，第一抗體的兩條HC具有相同的胺基酸序列和/或兩條LC具有相同的胺基酸序列。
一些實施方案中，抗FAP/CD40雙特異性抗體兩個VHH的第二抗體具有相同或不相同的胺基酸序列。例如，兩個該VHH的第二抗體具有相同的胺基酸序列。
一些實施方案中，抗FAP/CD40雙特異性抗體包含兩條第一多肽鏈和兩條第二多肽鏈，其中對於每條多肽鏈：a)第一多肽鏈各自獨立地包含VHH的第二抗體和第一抗體的重鏈(HC)；和b)第二多肽鏈各自獨立地包含第一抗體的輕鏈(LC)；其中，VHH藉由接頭與第二抗體的HC的N端和/或C端相連；
或者，i)第一多肽鏈各自獨立地包含第一抗體的重鏈(HC)；和ii)第二多肽鏈各自獨立地包含VHH的第二抗體和第一抗體的輕鏈(LC)；其中，VHH直接或藉由連接子與第一抗體的LC的N端和/或C端相連。
一些具體實施方案中，抗FAP/CD40雙特異性抗體包含兩條相同的第一多肽鏈和兩條相同的第二多肽鏈。一些實施方案中，提供與本揭露的抗FAP/CD40雙特異性抗體競爭性結合相同表位的抗體。
一些實施方案中，在本揭露的FAP/CD40結合分子或抗FAP/CD40雙特異性抗體的Fc區引入突變。該突變例如是使得IgG的Fc效應器功能去除或降低的突變，包括但不限於：IgG1的N297A或D265A/N297A，或IgG1上的L234A/L235A、L234A/L235A/P329G、L234E、L234F、L234E/L235F、L234E/L235F/P329G，IgG2上的V234A/G237A/P238S/H268A/V309L/A330S/P331S，IgG4上的F234A/L235A，IgG4上的S228P/F234A/L235A，IgG2或IgG4上的N297A，IgG2上的V234A/G237A，IgG1上的K214T/E233P/L234V/L235A/G236缺失/A327G/P331A/D365E/L358M，IgG2上的H268Q/V309L/A330S/P331S，IgG1上的S267E/L328F，IgG1上的L234F/L235E/D265A，IgG1上的 L234A/L235A/G237A/P238S/H268A/A330S/P331S，IgG4上的S228P/F234A/L235A/G237A/P238S。
在本文中Fc區所包含的突變的上下文中，“/”表示“和”，例如，“D265A/N297A”表示“D265A和N297A”，即，Fc中包含D265A和N297A突變；突變的胺基酸位置是根據EU編號系統編號的。
一些實施方案中，前述本揭露提供的FAP/CD40結合分子或抗FAP/CD40雙特異性抗體具有如下的一項或多項特徵：
(a)以
Figure 111131935-A0202-12-0021-114
10-7的KD值與人FAP或其表位結合；
(b)以
Figure 111131935-A0202-12-0021-115
10-7的KD值與人CD40或其表位結合；
(c)誘導CD40表達性抗原呈遞細胞(APC)的免疫刺激；
(d)增加APC(例如樹突細胞)的活化，和/或促進APC(例如樹突細胞)的增殖；
(e)刺激腫瘤特異性T細胞應答；
(f)引起或促進腫瘤細胞的凋亡；和/或
(g)抑制腫瘤生長和/或轉移。
此外，本揭露的抗CD40抗體、抗FAP抗體、FAP/CD40結合分子對熱處理均具有抗性或具有較高的穩定性。例如，在40℃下處理30天未見明顯聚集或降解，至少在60℃下穩定。
多核苷酸
本揭露提供編碼本揭露的CD40結合分子、FAP結合分子、FAP/CD40結合分子、抗FAP/CD40雙特異性抗體或其抗原結合片段的多核苷酸。本揭露的核酸可為RNA、DNA或cDNA。一些實施方案中，本揭露的核酸是基本上分離的核酸。
本揭露的核酸也可呈載體形式，可存在於載體中和/或可為載體的一部分，該載體例如質粒、黏端質粒、YAC或病毒載體。載體可尤其為表達載體，即可提供CD40結合分子體外和/或體內(即在適合宿主細胞、宿主有機體和/或表達系統中)表達的載體。該表達載體通常包含至少一種本揭露的核酸，其可操作地連接至一個或多個適合的表達調控元件(例如啟動子、增強子、終止子等)。針對在特定宿主中的表達對該元件及其序列進行選擇為所屬技術領域具有通常知識者的常識。對本揭露的CD40結合分子、FAP結合分子、FAP/CD40結合分子、抗FAP/CD40雙特異性抗體或其抗原結合片段的表達有用或必需的調控元件及其它元件例如為啟動子、增強子、終止子、整合因子、選擇標記物、前導序列、報告基因。
本揭露的核酸可基於本揭露的多肽的胺基酸序列的信息藉由已知的方式(例如藉由自動DNA合成和/或重組DNA技術)製備或獲得，和/或可從適合的天然來源加以分離。
宿主細胞
本揭露提供表達或能夠表達一種或多種本揭露的CD40結合分子、FAP結合分子、FAP/CD40結合分子、抗FAP/CD40雙特異性抗體或其抗原結合片段，和/或含有本揭露的核酸或載體的重組宿主細胞。
一些實施方案中，宿主細胞為細菌細胞、真菌細胞或哺乳動物細胞。
細菌細胞例如包括革蘭氏陰性細菌菌株(例如大腸桿菌(Escherichia coli)菌株、變形桿菌屬(Proteus)菌株及假單胞菌屬(Pseudomonas)菌株)及革蘭氏陽性細菌菌株(例如芽孢桿菌屬(Bacillus)菌株、鏈黴菌屬 (Streptomyces)菌株、葡萄球菌屬(Staphylococcus)菌株及乳球菌屬(Lactococcus)菌株)的細胞。
真菌細胞例如包括木黴屬(Trichoderma)、脈孢菌屬(Neurospora)及麴菌屬(Aspergillus)的物種的細胞；或者包括酵母屬(Saccharomyces)(例如釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae))、裂殖酵母屬(Schizosaccharomyces)(例如粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe))、畢赤酵母屬(Pichia)(例如巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)及嗜甲醇畢赤酵母(Pichia methanolica))及漢森酵母屬(Hansenula)的物種的細胞。
哺乳動物細胞例如包括例如HEK293細胞、CHO細胞、BHK細胞、HeLa細胞、COS細胞等。
然而，本揭露也可使用兩極類細胞、昆蟲細胞、植物細胞及本領域中用於表達異源蛋白的任何其它細胞。
本揭露的細胞不能發育成完成的植株或動物個體。
生產或製備方法
本揭露提供製備本揭露的CD40結合分子、FAP結合分子、FAP/CD40結合分子、抗FAP/CD40雙特異性抗體或其抗原結合片段的方法，該方法通常包含以下步驟：
- 在允許表達本揭露的CD40結合分子、FAP結合分子、FAP/CD40結合分子、抗FAP/CD40雙特異性抗體或其抗原結合片段的條件下培養本揭露的宿主細胞；及
- 從培養物回收由該宿主細胞表達的目的蛋白；及
- 視需要的，包括進一步純化和/或修飾本揭露的目的蛋白。
本揭露的CD40結合分子、FAP結合分子、FAP/CD40結合分子、抗FAP/CD40雙特異性抗體或其抗原結合片段可在如上所述細胞中以細胞內方式(例如在細胞質中、在周質中或在包涵體中)產生，接著從宿主細胞分離且視需要進一步純化；或其可以細胞外方式(例如在培養宿主細胞的培養基中)產生，接著自培養基分離且視需要進一步純化。
用於重組產生多肽的方法及試劑，例如特定適合表達載體、轉化或轉染方法、選擇標記物、誘導蛋白表達的方法、培養條件等在本領域中是已知的。類似地，適用於製造本揭露的結合分子或抗體等得目的蛋白分離及純化技術為所屬技術領域具有通常知識者所公知。生產和純化抗體的方法在現有技術中熟知和能找到，如冷泉港的抗體實驗技術指南(5-8章和15章)。本揭露工程化的抗體也可用常規方法製備和純化。比如，編碼重鏈和輕鏈的cDNA序列，可以選殖並重組至表達載體。重組的免疫球蛋白表達載體可以穩定地轉染細胞。哺乳動物類表達系統會導致抗體的糖基化，特別是在Fc區的高度保守N端。藉由表達與人源抗原特異性結合的抗體得到穩定的純株。陽性的純株在生物反應器的無血清培養基中擴大培養以生產抗體。分泌了抗體的培養液可以用常規技術純化、收集。抗體可用常規方法進行過濾濃縮。可溶的混合物和多聚體，也可以用常規方法去除，比如分子篩，離子交換。得到的產物需立即冷凍，如-70℃，或者凍乾。
然而，本揭露的CD40結合分子、FAP結合分子、FAP/CD40結合分子、抗FAP/CD40雙特異性抗體或其抗原結合片段也可以藉由本領域已知的其它產生蛋白質的方法獲得，例如化學合成，包括固相或液相合成。
組成物
本揭露提供組成物(例如醫藥組成物)，其含有預防或治療有效量的如上所述的本揭露的CD40結合分子、FAP結合分子、FAP/CD40結合分子、抗FAP/CD40雙特異性抗體或其抗原結合片段、或編碼多核苷酸，以及一種或多種藥學上可接受的載體、稀釋劑、緩衝劑或賦形劑。
一些具體實施方案中，該醫藥組成物單位劑量中可含有0.01至99重量%的CD40結合分子、FAP/CD40結合分子或抗FAP/CD40雙特異性抗體或其抗原結合片段。另一些具體實施方案中，醫藥組成物單位劑量中含CD40結合分子、FAP/CD40結合分子或抗FAP/CD40雙特異性抗體的量為0.1-2000mg；一些具體實施方案中為1-1000mg。
試劑盒
本揭露提供試劑盒，包含本揭露的CD40結合分子、FAP結合分子、FAP/CD40結合分子、抗FAP/CD40雙特異性抗體或其抗原結合片段、和/或編碼多核苷酸。一些實施方案中，還提供包含上述多核苷酸的診斷試劑，以及提供相關診斷用途。
治療疾病的方法和製藥用途
本揭露提供了本揭露的CD40結合分子、FAP結合分子、FAP/CD40結合分子、抗FAP/CD40雙特異性抗體或其抗原結合片段、編碼多核苷酸或醫藥組成物在預防和/或治療疾病中用途和方法，該疾病可以是與CD40信號通路相關或不相關的。一些實施方案中，本揭露提供一種預防和/或治療與CD40相關的疾病的方法，該方法包括向受試者施用預防和/或治療有效量的本揭露的CD40結合分子，或包含本揭露CD40結合分子的醫藥組成物。以及，還提供在製備本揭露 的CD40結合分子在預防和/或治療與CD40或CD40L相關疾病、CD40或CD40L相关障得的藥物中的用途。
本揭露的CD40結合分子、FAP結合分子、FAP/CD40結合分子、抗FAP/CD40雙特異性抗體或其抗原結合片段、編碼多核苷酸或醫藥組成物可以單獨使用，或者與其它抗癌症或腫瘤治療手段聯合使用(例如與其它免疫原性劑、標準癌症療法或其它抗體分子聯合使用)，以抑制癌症或腫瘤的生長。
一些實施方案中，本揭露提供一種預防和/或治療癌症或腫瘤的方法，包括給患者或受試者施用預防和/或治療有效量的本揭露的CD40結合分子、FAP結合分子、FAP/CD40結合分子、抗FAP/CD40雙特異性抗體或其抗原結合片段、編碼多核苷酸、醫藥組成物，抑制患者或受試者中的腫瘤細胞生長。一些具體實施方案中，該癌症較佳但不限於對免疫治療有應答的癌症。
以上方法或用途中，癌症或腫瘤的非限制性的例子包括肺癌、卵巢癌、結腸癌、直腸癌、黑色素瘤(例如轉移的惡性黑色素瘤)、腎癌、膀胱癌、乳腺癌、肝癌、淋巴瘤、惡性血液病、頭頸癌、膠質瘤、胃癌、鼻咽癌、喉癌、宮頸癌、子宮體瘤和骨肉瘤。可以用本揭露的方法治療的其它癌症的例子包括：骨癌、胰腺癌、皮膚癌、前列腺癌、皮膚或眼內惡性黑色素瘤、子宮癌、肛區癌、睾丸癌、輸卵管癌、子宮內膜癌、陰道癌、陰戶癌、何傑金病、非何傑金氏淋巴瘤、食道癌、小腸癌、內分泌系統癌、甲狀腺癌、甲狀旁腺癌、腎上腺癌、軟組織肉瘤、尿道癌、陰莖癌、慢性或急性白血病，包括急性髓細胞樣白血病、慢性髓細胞樣白血病、急性成淋巴細胞性白血病、慢性淋巴細胞性白血病、兒童實體瘤、淋巴細胞性淋巴瘤、膀胱癌、腎或輸尿管癌、腎盂癌、中樞神經系統(CNS)腫瘤、原發性CNS淋巴瘤、腫瘤血管發生、脊柱腫瘤、腦幹神經膠質瘤、垂體 腺瘤、卡波西肉瘤、表皮狀癌、鱗狀細胞癌、T細胞淋巴瘤、環境誘發的癌症，包括石棉誘發的癌症，以及該癌症的組合。一些實施方案中，上述腫瘤或癌症是轉移性的和/或晚期的。
此外，本揭露還提供一種預防和/或治療受試者或患者中的感染性疾病的方法，包括給該受試者或患者施用本揭露的CD40結合分子、FAP結合分子、FAP/CD40結合分子、抗FAP/CD40雙特異性抗體或其抗原結合片段、編碼多核苷酸或醫藥組成物，使得該對象的感染性疾病得到預防和/或治療。類似於對於如上所述的癌症或腫瘤的應用，CD40結合分子可以單獨使用，或者與疫苗組合使用來刺激對病原體、毒素和自身抗原的免疫應答。特別可以應用該治療方法的病原體的示例包括當前沒有有效疫苗的病原體，或常規疫苗不完全有效的病原體。其中包括但不限於HIV、肝炎病毒(A、B、C)、流感病毒、皰疹病毒、賈第蟲、瘧疾、利什曼原蟲、金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌。
檢測
本揭露提供檢測CD40或FAP的組成物，該組成物包含根據本揭露的CD40結合分子或FAP結合分子。本揭露還提供用於體內或體外檢測CD40或FAP的方法、系統或裝置，其包括用本揭露的CD40結合分子或FAP結合分子處理樣品。
一些實施方案中，體外檢測方法、系統或裝置可能例如包括：
(1)使樣品與結合CD40或FAP的抗體接觸；
(2)檢測在結合CD40或FAP的抗體和樣品之間形成的複合物；和/或
(3)使參比樣品(例如，對照樣品)與抗體接觸；和
(4)藉由與參比樣品比較，確定複合物形成的程度。如與對照樣品或受試者中相比，樣品或受試者中複合物形成的變化(例如，統計學上的顯著變化)表示樣品中存在CD40或FAP。
另一些實施方案中，體內檢測方法、系統或裝置可以包括：
(1)向受試者施用結合CD40結合分子或FAP結合分子；和
(2)檢測CD40結合分子或FAP結合分子和受試者之間複合物的形成。
檢測可以包括確定形成複合物的位置或時間。用可檢測物質對CD40結合分子或FAP結合分子標記，藉由對該標記檢測以實現檢測。合適的可檢測物質包括多種酶、輔基、螢光物質、發光物質和放射性物質。可以藉由測量與CD40或FAP結合或不結合的抗體或使其可視化，檢測CD40結合分子和和CD40，或FAP結合分子和FAP之間的複合物形成。可以使用常規檢測測定法，例如，酶聯免疫吸附測定(ELISA)、放射免疫測定(RIA)或組織免疫組織化學。出於檢測目的，本揭露的CD40結合分子或FAP結合分子可以用螢光團發色團標記。
一些實施方案中，還提供試劑盒，該試劑盒包含CD40結合分子或FAP結合分子，還可以包含診斷使用說明。試劑盒還可以含有至少一種額外的試劑，如標記物或額外的診斷劑。對於體內使用，CD40結合分子或FAP結合分子可以配製為醫藥組成物。
定義
為了更容易理解本揭露，以下具體定義了某些技術和科學。除非在本文中另有明確定義，本文使用的所有其它技術和科學都具有本揭露所屬技術領域具有通常知識者通常理解的含義。
除非上下文另外清楚要求，否則在整個說明書和申請專利範圍中，應將詞語“包含”、“具有”、“包括”等理解為具有包含意義，而不是排他性或窮舉性意義；也即，“包括但不僅限於”的意義。“視需要”或“視需要地”意味著隨後所描述地事件或環境可以但不必發生，該說明包括該事件或環境發生或不發生的場合。
本揭露所用胺基酸三字母代碼和單字母代碼如J.biol.chem，243，p3558(1968)中所述。
“CD40”和“CD40抗原”是指在正常和贅生性B細胞表面上表達的約48kD糖蛋白，其充當參與細胞增殖和分化的信號的受體(Ledbetter等人，1987,J.Immunol.138：788-785)。內源性表達CD40的細胞是特徵在於CD40的表面表達的任何細胞，包括但不限於正常和贅生性B細胞、交錯突細胞、基底上皮細胞、癌細胞、巨噬細胞、內皮細胞、濾泡樹突細胞、扁桃體細胞和骨髓來源的漿細胞。本揭露“CD40”指來自任何脊椎動物來源，包括哺乳動物例如靈長類(例如人)和齧齒類(例如小鼠和大鼠)的任何天然CD40，除非另有說明。已從由伯基特氏淋巴瘤細胞系Raji製備的文庫中分離出編碼CD40的cDNA分子(Stamenkovic等人，1989,EMBO J.8：1403)。序列信息可參見本揭露表8。本揭露“CD40”涵蓋全長未加工的CD40以及源自細胞中的加工的任何形式的CD40，還涵蓋CD40的天然發生變體，例如剪接變體或等位變體。在一個實施方案中，本揭露的CD40結合分子能夠特異性結合人，小鼠和/或食蟹猴CD40。
“成纖維細胞激活蛋白(FAP)”和“FAP抗原”，也稱作脯胺醯內肽酶FAP或分離酶(Seprase)(EC 3.4.21)，指來自任何脊椎動物來源的任何天然FAP，包括哺乳動物，例如靈長類(例如人)，非人靈長類(例如食蟹猴)和齧齒類(例如小 鼠和大鼠)，除非另外指明。本揭露“FAP”涵蓋全長未加工的FAP以及源自細胞中的加工的任何形式的FAP，還涵蓋FAP的天然發生變體，例如剪接變體或等位變體。在一個實施方案中，本揭露的FAP結合分子能夠特異性結合人，小鼠和/或食蟹猴FAP。人FAP的胺基酸序列在UniProt(www.uniprot.org)登錄號Q12884(版本149，SEQ ID NO：2)，或NCBI(www.ncbi.nlm.nih.gov/)RefSeq NP_004451.2、GeneBank Accession NO.AAC51668中顯示。人FAP的細胞外結構域(ECD)自胺基酸位置26延伸至760。帶His標簽的人FAP ECD等胺基酸序列在本揭露表2中顯示。小鼠FAP的胺基酸序列在UniProt登錄號P97321(版本126，SEQ ID NO：143)，或NCBI RefSeq NP_032012.1中顯示。小鼠FAP的細胞外結構域(ECD)自胺基酸位置26延伸至761。一些實施方案中，本揭露的FAP結合分子結合FAP的細胞外結構域。
“抗體”以最廣義使用，涵蓋各種抗體結構，包括但不限於單株抗體，多株抗體；單特異性抗體，多特異性抗體(例如雙特異性抗體)，全長抗體和抗體片段(或抗原結合片段，或抗原結合部分)，只要它們展現出期望的抗原結合活性。抗體可以指免疫球蛋白，是由兩條相同的重鏈和兩條相同的輕鏈藉由鏈間二硫鍵連接而成的四肽鏈結構。免疫球蛋白重鏈恆定區的胺基酸組成和排列順序不同，故其抗原性也不同。據此，可將免疫球蛋白分為五類，或稱為免疫球蛋白的同種型，即IgM、IgD、IgG、IgA和IgE，其相應的重鏈分別為μ鏈、δ鏈、γ鏈、α鏈和ε鏈。同一類Ig根據其鉸鏈區胺基酸組成和重鏈二硫鍵的數目和位置的差別，又可分為不同的亞類，如IgG可分為IgG1、IgG2、IgG3、IgG4。輕鏈藉由恆定區的不同分為κ鏈或λ鏈。五類Ig中第每類Ig都可以有κ鏈或λ鏈。抗體重鏈和輕鏈靠近N端的約110個胺基酸的序列變化很大，為可變區(V區)； 靠近C端的其餘胺基酸序列相對穩定，為恆定區(C區)。可變區包括3個高變區(CDR)和4個序列相對保守的骨架區(FR)。3個高變區決定抗體的特異性，又稱為互補性決定區(CDR)。每條輕鏈可變區(VL)和重鏈可變區(VH)由3個CDR區4個FR區組成，從胺基端到羧基端依次排列的順序為：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。輕鏈的3個CDR區指LCDR1、LCDR2、和LCDR3；重鏈的3個CDR區指HCDR1、HCDR2和HCDR3。
“雙特異性抗體”涵蓋對兩個不同抗原或同一抗原的至少兩個不同抗原表位特異性結合的抗體(包括抗體或其抗原結合片段，如單鏈抗體)。典型的雙特異性抗體結構模型如KiH、CrossMAb、Triomab quadroma、FcΔAdp、ART-Ig、BiMAb、Biclonics、BEAT、DuoBody、Azymetric、XmAb、2：1 TCBs、1Fab-IgG TDB、FynomAb、two-in-one/DAF、scFv-Fab-IgG、DART-Fc、LP-DART、CODV-Fab-TL、HLE-BiTE、F(ab)2-CrossMAb、IgG-(scFv)2、Bs4Ab、DVD-Ig、Tetravalent-DART-Fc、(scFv)4-Fc、CODV-Ig、mAb2、F(ab)4-CrossMAb等雙特異性抗體(參見Aran F.Labrijn等，Nature Reviews Drug Discovery volume 18，pages585-608(2019)；Chen S1等，J Immunol Res.2019 Feb 11；2019：4516041)。
對於CDR的確定或定義，能夠藉由分辨抗體的結構和/或分辨抗體-配體複合物的結構來完成CDR的確定性描繪和包含抗體的結合位點的殘基的鑑定。這可藉由所屬技術領域具有通常知識者已知的各種技術中的任一種，例如X射線晶體學來實現。多種分析方法可用於鑑定CDR，包括但不限於Kabat編號系統、Chothia編號系統、AbM編號系統、IMGT編號系統、接觸定義、構象定義。
Kabat編號系統是用於編號抗體中殘基的標準並且通常用於鑑定CDR區域(參見例如Johnson&Wu，2000，Nucleic Acids Res.，28：214-8)。Chothia編號系統與Kabat編號系統類似，但Chothia編號系統考慮了某些結構環區域的位置。(參見例如Chothia等，1986，J.Mol.Biol.，196：901-17；Chothia等人，1989，Nature，342：877-83)。AbM編號系統使用建模抗體結構的由Oxford Molecular Group生產的計算機程序集成套件(參見例如Martin等，1989，ProcNatl Acad Sci(USA)，86：9268-9272；“AbMTM，A Computer Program for ModelingVariable Regions of Antibodies，”Oxford，UK；Oxford Molecular，Ltd)。AbM編號系統使用知識數據庫和從頭開始方法的組合，從基本序列建模抗體的三級結構(參見Samudrala等，1999，在PROTEINS，Structure，Functionand Genetics Suppl.，3：194-198中的“Ab Initio Protein Structure Prediction Using a Combined HierarchicalApproach”描述的那些)。接觸定義基於可用複雜晶體結構的分析(參見例如MacCallum等，1996，J.Mol.Biol.，5：732-45)。構象定義中，CDR的位置可鑑定為對抗原結合做出焓貢獻的殘基(參見例如Makabe等，2008，Journal ofBiological Chemistry，283：1156-1166)。另外其它的CDR邊界定義可能不嚴格遵循上述方法之一，但仍然與Kabat CDR的至少一部分重疊，儘管根據特定殘基或殘基組不顯著影響抗原結合的預測或實驗結果，它們可縮短或延長。如本揭露使用的，CDR可指藉由本領域已知的任何方法(包括方法的組合)定義的CDR。各種編號系統之間的對應關係是所屬技術領域具有通常知識者熟知的，示例性的，如下表1中所示。
表1. CDR編號系統之間的關係
Figure 111131935-A0202-12-0033-29
本揭露的抗體的VL區和VH區的CDR胺基酸殘基在數量和位置符合已知的Kabat編號系統。
多肽或蛋白的“結構域”是指折疊蛋白結構，其能夠獨立於蛋白的其餘部分維持其三級結構。一般而言，結構域負責蛋白的單個功能性質，且在許多情況下可添加、移除或轉移至其它蛋白而不損失蛋白的其餘部分和/或結構域的功能。
“免疫球蛋白結構域”是指抗體鏈(例如常規四肽鏈結構抗體的鏈或重鏈抗體的鏈)的球形區域，或是指基本上由這類球形區域組成的多肽。免疫球蛋白結構域的特徵在於其維持抗體分子的免疫球蛋白折疊特徵，其由排列在兩個β折疊中視需要由保守二硫鍵穩定的約7個反平行β折疊股的2層夾層組成。
“免疫球蛋白可變結構域”是指基本上由本領域及下文中分別稱為“框架區1”或“FR1”、“框架區2”或“FR2”、“框架區3”或“FR3”、及“框架區4”或“FR4”的四個“框架區”組成的免疫球蛋白結構域，其中該框架區由本領域及下文 中分別稱為“互補決定區1”或“CDR1”、“互補決定區2”或“CDR2”、及“互補決定區3”或“CDR3”的三個“互補決定區”或“CDR”間隔開。因此，免疫球蛋白可變結構域的一般結構或序列可如下表示為：FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4。免疫球蛋白可變結構域因具有抗原結合位點而賦予其對抗原的特異性。
“免疫球蛋白可變結構域”是指基本上由本領域及下文中分別稱為“框架區1”或“FR1”、“框架區2”或“FR2”、“框架區3”或“FR3”、及“框架區4”或“FR4”的四個“框架區”組成的免疫球蛋白結構域，其中該框架區由本領域及下文中分別稱為“互補決定區1”或“CDR1”、“互補決定區2”或“CDR2”、及“互補決定區3”或“CDR3”的三個“互補決定區”或“CDR”間隔開。因此，免疫球蛋白可變結構域的一般結構或序列可如下表示為：FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4。免疫球蛋白可變結構域因具有抗原結合位點而賦予其對抗原的特異性。
“抗體框架(FR)”，是指可變結構域的一部分，其用作該可變結構域的抗原結合環(CDR)的支架。
“免疫球蛋白單一可變結構域”通常用於指可以在不與其他可變結構域相互作用的情況下(例如在沒有如常規四鏈單克隆抗體的VH和VL結構域之間所需要的VH/VL相互作用的情況下)，形成功能性抗原結合位點的免疫球蛋白可變結構域(其可以是重鏈或輕鏈結構域，包括VH、VHH或VL結構域)。“免疫球蛋白單一可變結構域”的實例包括奈米抗體(包括VHH、人源化VHH和/或駱駝化VH，例如駱駝化人VH)、IgNAR、結構域、作為VH結構域或衍生自VH結構域的(單結構域)抗體(諸如dAbsTM)和作為VL結構域或衍生自VL結構域的(單結構域)抗體(諸如dAbsTM)。基於和/或衍生自重鏈可變結構域(諸如VH或 VHH結構域)的免疫球蛋白單一可變結構域通常是較佳的。免疫球蛋白單一可變結構域的一個具體實例為如下文定義的“VHH結構域”(或簡稱為“VHH”)。
“VHH結構域”，亦稱為重鏈單域抗體、VHH、VHH結構域、VHH抗體片段、VHH抗體、奈米抗體，是稱為“重鏈抗體”(即“缺乏輕鏈的抗體”)的抗原結合免疫球蛋白的可變結構域(Hamers-Casterman C，Atarhouch T，Muyldermans S，Robinson G，Hamers C，Songa EB，Bendahman N，Hamers R.：“Naturally occurring antibodies devoid of light chains”；Nature363，446-448(1993))。使用術語“VHH結構域”以將該可變結構域與存在於常規四肽鏈結構抗體中的重鏈可變結構域(其在本揭露中稱為“VH結構域”)以及輕鏈可變結構域(其在本揭露中稱為“VL結構域”)進行區分。VHH結構域特異性結合表位而無需其他抗原結合結構域(此與常規四肽鏈結構抗體中的VH或VL結構域相反，在該情況下表位由VL結構域與VH結構域一起識別)。VHH結構域為由單一免疫球蛋白結構域形成的小型穩定及高效的抗原識別單元。術語“重鏈單域抗體”、“VHH結構域”、“VHH”、“VHH結構域”、“VHH抗體片段”、“VHH抗體”、“Nanobody®”以及““Nanobody®結構域””(“Nanobody”為Ablynx N.V.公司，Ghent，Belgium的商標)可互換使用。“VHH結構域”包括但不限於經駱駝科動物產生的天然抗體，也可以是駱駝科動物產生的抗體後再經人源化的，也可以是經噬菌體體展示技術篩選獲得的。VHH結構域中的胺基酸殘基的總數將通常在110至120範圍內，常常介於112與115之間。然而應注意較小及較長序列也可適於本揭露所述的目的。獲得結合特定抗原或表位的VHH的方法，先前已公開於以下文獻中：R.van der Linden et al.，Journal of Immunological Methods，240(2000)185- 195；Li et al.，J Biol Chem.，287(2012)13713-13721；Deffar et al.，African Journal of Biotechnology Vol.8(12)，pp.2645-2652，17June，2009和WO94/04678。
如本領域中對於VH結構域及VHH結構域所公知的，各CDR中的胺基酸殘基的總數可能不同，且可能不對應於由Kabat編號指示的胺基酸殘基的總數(即根據Kabat編號的一個或多個位置可能在實際序列中未被佔據，或實際序列可能含有多於Kabat編號所允許數目的胺基酸殘基)。這意味著一般而言，根據Kabat的編號可能對應或可能不對應於實際序列中胺基酸殘基的實際編號。其它的編號系統或編碼規則包括Chothia、IMGT、AbM。
“人源化抗體(humanized antibody)”，也稱為CDR移植抗體(CDR-grafted antibody)，是指將非人CDR序列移植到人的抗體可變區框架中產生的抗體。可以克服嵌合抗體由於攜帶大量非人蛋白成分，從而誘導的強烈的免疫應答反應。為避免在免疫原性下降的同時引起活性的下降，可對該全人抗體可變區可進行最少反向突變，以保持活性。“人源化”的例子包括可將源自駱駝科的VHH結構域藉由以人常規四肽鏈結構抗體VH結構域中相應位置處存在的一個或多個胺基酸殘基置換原始VHH序列的胺基酸序列中的一個或多個胺基酸殘基而“人源化”(本揭露中亦稱為“序列優化”，除人源化外，“序列優化”也可涵蓋藉由提供VHH改良性質的一個或多個突變對序列進行的其它修飾，例如移除潛在的翻譯後修飾位點)。人源化VHH結構域可含有一個或多個完全人框架區序列。此外，為避免免疫原性下降的同時，引起的活性下降，可對該人抗體可變區框架序列進行最少反向突變或回复突變，以保持活性。
“全人抗體”包括具有人種系免疫球蛋白序列的可變和恆定區的抗體。本揭露的全人抗體可包括不由人種系免疫球蛋白序列編碼的胺基酸殘基(如 藉由體外隨機或位點特異性誘變或藉由體內體細胞突變所引入的突變)。“全人抗體”不包括“人源化抗體”。
通常，本揭露的CD40結合分子、FAP結合分子將以如於Biacore或KinExA或Fortibio測定中測量的較佳10-7至10-10莫耳/升(M)、更佳10-8至10-10莫耳/升、甚至更佳10-9至10-10或更低的解離常數(KD)，和/或以至少10-7M、較佳至少10-8M、更佳至少10-9M，更佳至少10-10M的締合常數(KA)結合所要結合的抗原(即CD40或FAP)。任何大於10-4M的KD值一般都視為指示非特異性結合。抗原結合蛋白對抗原或表位的特異性結合可以以已知的任何適合方式來測定，包括例如本揭露所述的表面電漿共振術(SPR)測定、Scatchard測定和/或競爭性結合測定(例如放射免疫測定(RIA)、酶免疫測定(EIA)及夾心式競爭性測定)。
當“競爭”用於競爭相同表位的抗原結合蛋白(例如中和抗原結合蛋白或中和抗體)的情況中時，意指在抗原結合蛋白之間競爭，其藉由以下測定法來測定：待檢測的抗原結合蛋白(例如抗體或其免疫學功能片段)防止或抑制(例如降低)參考抗原結合蛋白(例如配體或參考抗體)與共同抗原(例如CD40或其片段)的特異性結合。眾多類型的競爭性結合測定可用於確定一種抗原結合蛋白是否與另一種競爭，這些測定例如：固相直接或間接放射免疫測定(RIA)、固相直接或間接酶免疫測定(EIA)、夾心競爭測定(參見例如Stahli等，1983，Methodsin Enzymology 9：242-253)；固相直接生物素-親和素EIA(參見例如Kirkland等，1986，J.Immunol.137：3614-3619)、固相直接標記測定、固相直接標記夾心測定(參見例如Harlow和Lane，1988，Antibodies，A Laboratory Manual(抗體，實驗室手冊)，Cold Spring Harbor Press)；用I-125標記物的固相直接標記RIA(參見例如Morel等，1988，Molec.Immunol.25：7-15)；固相直接生物素-親和素EIA(參 見例如Cheung，等，1990，Virologyl 76：546-552)；和直接標記的RIA(Moldenhauer等，1990，Scand.J.Immunol.32：77-82)。通常該測定法涉及使用能與帶有未標記的檢測抗原結合蛋白及標記的參考抗原結合蛋白結合的純化抗原(該抗原在固態表面或細胞表面上)。在待測抗原結合蛋白存在下，測量結合於固態表面或細胞的標記的量，來測量競爭性抑制。通常，待測抗原結合蛋白是過量存在的。由競爭性測定(競爭抗原結合蛋白)鑑定的抗原結合蛋白包括：與參考抗原結合蛋白相同的表位發生結合的抗原結合蛋白；以及，與充分接近參考抗原結合蛋白結合的表位所鄰近的表位發生結合的抗原結合蛋白，該兩個表位在空間上互相妨礙結合的發生。通常當競爭的抗原結合蛋白過量存在時，其將抑制(例如降低)至少40-45%、45-50%、50-55%、55-60%、60-65%、65-70%、70-75%或75%或更多參考抗原結合蛋白與共同抗原的特異性結合。在某些情況下，結合被抑制至少80-85%、85-90%、90-95%、95-97%或97%或更多。
可使用所屬技術領域具有通常知識者已知的常規技術，就與相同表位的結合競爭性篩選抗體。例如，可進行競爭和交叉競爭研究，以獲得彼此競爭或交叉競爭與抗原結合的抗體。基於它們的交叉競爭來獲得結合相同表位的抗體的高通量方法描述於國際專利公開WO03/48731中。因此，可使用所屬技術領域具有通常知識者已知的常規技術，獲得與本揭露的抗體分子競爭結合CD40或FAP上的相同表位的抗體。
“CD40結合分子”意指任何能夠特異性結合CD40的蛋白或包含該蛋白的任何分子。CD40結合分子可以包括針對CD40的如本揭露定義的抗體或其綴合物。CD40結合分子還涵蓋免疫球蛋白超家族抗體(IgSF)或CDR移植分子。本揭露的“CD40結合分子”可以包含至少一個結合CD40的免疫球蛋白單一 可變結構域(如VHH)。在一些實施方案中，“CD40結合分子”可以包含2、3、4或更多個結合CD40的免疫球蛋白單一可變結構域(如VHH)。本揭露的CD40結合分子除結合包含CD40的免疫球蛋白單一可變結構域外，也可包含接頭和/或具有效應器功能的部分，例如半衰期延長部分(如結合血清白蛋白的免疫球蛋白單一可變結構域)、和/或融合配偶體(如血清白蛋白)和/或綴合的聚合物(如PEG)和/或Fc區。在一些實施方案中，本揭露的“CD40結合分子”還涵蓋雙/多特異性抗體，其含有結合不同抗原的免疫球蛋白(如結合第一抗原(如CD40)的第一抗體和結合第二抗原(如FAP)的第二抗體，可選的，包括結合第三抗原的第三抗體，進一步可選的，包括結合第四抗原的第四抗體。
“FAP結合分子”意指任何能夠特異性結合FAP的蛋白或包含該蛋白的任何分子。FAP結合分子可以包括針對FAP的如本揭露定義的抗體或其綴合物。
“FAP/CD40結合分子”意指任何能夠特異性結合CD40和FAP的蛋白或包含該蛋白的任何分子。FAP/CD40結合分子可以包括針對CD40和FAP的如本揭露定義的抗體或其綴合物。
“與CD40結合”或“結合CD40”，指能與CD40或其表位相互作用，該CD40或其表位可以是人源的。“與FAP結合”或“結合FAP”，指能與FAP或其表位相互作用，該FAP或其表位可以是人源的。本揭露的“抗原結合位點”指抗原上不連續的，由本揭露抗體識別的三維空間位點。
“抗原”指用於免疫接種免疫活性的脊椎動物的分子，以產生識別抗原的抗體，或篩選表達文庫(例如尤其是噬菌體、酵母或核糖體展示文庫)。在本揭露中，抗原被更廣義地定義，包括由抗體特異性識別的靶分子，以及包括用 於產生抗體的免疫接種過程或用於選擇抗體的文庫篩選中使用的分子的一部分或模擬物。例如，對於本揭露的與人CD40結合的抗體，人CD40的單體和多聚體(例如二聚體、三聚體等)，以及人CD40的截短變體和其它變體均被稱為抗原。
“表位”是指抗原上與免疫球蛋白或抗體結合的位點。表位可以由相鄰的胺基酸、或藉由蛋白質的三級折疊而並列的不相鄰的胺基酸形成。由相鄰的胺基酸形成的表位通常在暴露於變性溶劑後保持，而藉由三級折疊形成的表位通常在變性溶劑處理後喪失。表位通常以獨特的空間構象包括至少3-15個胺基酸。確定什麼表位由給定的抗體結合的方法在本領域中是熟知的，包括免疫印跡和免疫沉澱檢測分析等。確定表位的空間構象的方法包括本領域中的技術和本揭露該技術，例如X射線晶體分析法和二維核磁共振等。
“特異性結合”、“選擇性結合”是指抗體與預定的抗原上的表位結合。例如，當使用人CD40或其表位作為分析物並使用抗體作為配體，在儀器中藉由表面電漿共振(SPR)技術測定時，抗體以大約低於10-7M或甚至更小的平衡解離常數(KD)與預定的抗原或其表位結合，並且其與預定抗原或其表位結合的親和力是其與預定抗原(或其表位)或緊密相關的抗原之外的非特異性抗原(如BSA等)結合的親和力的至少兩倍。“識別抗原的抗體”在本揭露中可以與“特異性結合的抗體”互換使用。
“結合親和力”或“親和力”在本揭露中用作兩個分子(例如抗體或其部分與抗原)之間的非共價相互作用的強度量度。兩個分子之間的結合親和力可藉由確定解離常數(KD)來量化。可藉由使用例如表面電漿共振(SPR)方法(Biacore)測量複合物形成和解離的動力學來確定KD。對應於單價複合物的結合和解離的速率常數分別被稱為結合速率常數ka(或kon)和解離速率常數kd(或 koff)。KD藉由方程KD=kd/ka與ka和kd有關。解離常數的值可藉由眾所周知的方法直接確定，並且可藉由方法例如Caceci等人(1984，Byte 9：340-362)中該那些甚至對於複雜混合物進行計算。例如，可使用雙重過濾硝化纖維素濾器結合測定如Wong&Lohman(1993，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：5428-5432)中公開的那種來確定KD。評估抗體針對靶抗原的結合能力的其它標準測定是本領域已知的，包括例如ELISA、蛋白質印跡、RIA和流式細胞術分析、以及本揭露其它地方例舉的其它測定。抗體的結合動力學和結合親和力也可藉由本領域已知的標準測定，例如表面電漿共振(SPR)，例如藉由使用BiacoreTM系統或KinExA來評價。可藉由比較各個抗體/抗原複合物的KD值來比較與不同分子相互作用相關的結合親和力，例如，不同抗體對於給定抗原的結合親和力的比較。類似地，相互作用的特異性可藉由確定和比較目的相互作用(例如抗體和抗原之間的特異性相互作用)的KD值與非目的相互作用(例如已知不結合CD40的對照抗體)的KD值進行評價。
“保守性置換”指置換為具有與原始胺基酸殘基相似的特性的另一個胺基酸殘基。例如，賴胺酸、精胺酸和組胺酸具有相似的特性，在於它們具有鹼性側鏈，並且天冬胺酸和谷胺酸具有相似的特性，在於它們具有酸性側鏈。此外，甘胺酸、天冬醯胺、穀胺醯胺、絲胺酸、蘇胺酸、酪胺酸、半胱胺酸和色胺酸具有相似的特性，在於它們具有不帶電荷極性側鏈，並且丙胺酸、纈胺酸、亮胺酸、蘇胺酸、異亮胺酸、脯胺酸、苯丙胺酸和甲硫胺酸具有相似的特性，在於它們具有非極性側鏈。另外，酪胺酸、苯丙胺酸、色胺酸和組胺酸具有相似的特性，在於它們具有芳族側鏈。因此，所屬技術領域具有通常知識者將顯而易見， 甚至當置換如上文該顯示相似特性的組中的胺基酸殘基時，它將不顯示特性的特定變化。
“同源性”、“同一性”或“序列同一性”是指兩個多核苷酸序列之間或兩個多肽之間的序列相似性。當兩個比較序列中的位置均被相同核苷酸或胺基酸單體佔據時，例如如果兩個DNA分子的每一個位置都被相同核苷酸佔據時，那麼該分子在該位置是同源的。兩個序列之間的同源性百分率是兩個序列共有的匹配或同源位置數除以比較的位置數×100%的函數。例如，在序列最佳比對時，如果兩個序列中的10個位置有6個匹配或同源，那麼兩個序列為60%同源。一般而言，當比對兩個序列而得到最大的同源性百分率時進行比較。
“宿主細胞”包括各個細胞或細胞培養物，其可為或已是用於摻入多核苷酸插入片段的載體的受體。宿主細胞包括單個宿主細胞的子代，並且由於天然、偶然或有意的突變，子代可不一定與原始親本細胞完全相同(在形態學或基因組DNA互補體中)。宿主細胞包括用本揭露的多核苷酸在體內轉染和/或轉化的細胞。“細胞”、“細胞系”和“細胞培養物”可互換使用，並且所有這類名稱都包括其後代。還應當理解的是，由於故意或非有意的突變，所有後代在DNA含量方面不可能精確相同。包括具有與最初轉化細胞中篩選的相同的功能或生物學活性的突變後代。
“抑制”或“阻斷”可互換使用，並涵蓋部分和完全抑制/阻斷這兩者。“抑制生長”(例如涉及細胞)旨在包括細胞生長任何可測量的降低。
“激動活性”、“激動劑活性”或“激動性”指作為激動劑的物質功能。激動劑與細胞受體的結合引起了與該受體的天然配體所引起的相類似或相同的反應或活性。例如，CD40激動劑或CD40激動型抗體可誘導任何或全部的下列 應答：細胞增殖和/或分化；藉由例如ICAM-1、E-選凝素、VCAM等分子上調細胞之間的黏附；分泌促炎性細胞因子，例如IL-1、IL-6、IL-8、IL-12、TNF等；經CD40受體藉由以下途徑轉導信號，例如TRAF(例如，TRAF2和/或TRAF3)、MAP激酶，如NIK(NF-κB誘導激酶)、1-κB激酶(IKKα/β)、轉錄因子NF-κB、Ras和MEK/ERK途徑、PI3K/Akt途徑、P38 MAPK途徑等；藉由XIAP、Mcl-1、BCLx等分子轉導抗-凋亡信號；B和/或T細胞記憶的產生；B細胞抗體產生；B細胞同種型轉換；上調II類MHC和CD80/86的細胞表面表達等。
“CD40相關疾病”或“CD40相關病症”指示表達CD40的細胞的被修飾或消除的病症。這些細胞包括表現出異常增殖的表達CD40的細胞或與癌性或惡性生長相關聯的表達CD40的細胞。表現出CD40抗原的異常表達的癌症的更具體例子包括B淋巴母細胞、伯基特氏淋巴瘤、多發性骨髓瘤、T細胞淋巴瘤、卡波西氏肉瘤、骨肉瘤、表皮和內皮腫瘤、胰腺癌、肺癌、乳腺癌、卵巢癌、結腸癌、前列腺癌、頭頸癌、皮膚癌(黑色素瘤)、膀胱癌和腎癌。此類障礙包括但不限於白血病、淋巴瘤(包括B細胞淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤)、多發性骨髓瘤、瓦爾登斯特羅姆巨球蛋白血症；實體瘤，包括肉瘤，例如骨肉瘤、尤因氏肉瘤、惡性黑色素瘤、腺癌(包括卵巢腺癌)、卡波西氏肉瘤/卡波西氏腫瘤和鱗狀細胞癌。
“增殖性疾病”指與一定程度的異常細胞增殖有關的病症。在一個實施方案中，增殖性病症指癌症。
“癌症”、“癌性”、“增殖性病症”和“腫瘤”在本揭露中提到時並不互相排斥。
“預防癌症”是指在受試者中延遲、抑制或防止癌症發作，該受試者中癌症發生或腫瘤發生的起始尚未得到證實，但是藉由例如遺傳篩查或其它方法確定，已鑑定了癌症易感性。該還包括治療具有癌變前病症的受試者以終止該癌變前病症向惡性腫瘤的進展或導致其消退。
“給予”、“施用”和“處理”當應用於動物、人、實驗受試者、細胞、組織、器官或生物流體時，是指外源性藥物、治療劑、診斷劑或組成物與動物、人、受試者、細胞、組織、器官或生物流體的接觸，例如治療、藥物代謝動力學、診斷、研究和實驗方法。細胞的處理包括試劑與細胞的接觸，以及試劑與流體的接觸，其中該流體與細胞接觸。“給予”、“施用”和“處理”還意指藉由試劑、診斷、結合組成物或藉由另一種細胞體外和離體處理例如細胞。當應用於人、獸醫學或研究受試者時，是指治療處理、預防或預防性措施，研究和診斷應用。
“治療”意指給予受試者內用或外用治療劑，例如包含本揭露的任一種抗體或其醫藥組成物作為治療劑，該受試者已經患有、疑似患有、傾向於患有一種或多種增殖性疾病或其症狀，而已知該治療劑對這些症狀具有治療作用。通常，在受治療受試者或群體中以有效緩解一種或多種疾病症狀的量給予治療劑，無論是藉由誘導這類症狀退化還是抑制這類症狀發展到任何臨床能測量的程度。有效緩解任何具體疾病症狀的治療劑的量(也稱作“治療有效量”)可根據多種因素變化，例如受試者的疾病狀態、年齡和體重，以及藥物在受試者產生需要療效的能力。藉由醫生或其它專業衛生保健人士通常用於評價該症狀的嚴重性或進展狀況的任何臨床檢測方法，可評價疾病症狀是否已被減輕。儘管本揭露的實施方案(例如治療方法或製品)在緩解某個受試者中目標疾病症狀方面可能無效，但是根據本領域已知的任何統計學檢驗方法如Student t檢驗、卡方檢驗、依 據Mann和Whitney的U檢驗、Kruskal-Wallis檢驗(H檢驗)、Jonckheere-Terpstra檢驗和Wilcoxon檢驗確定，其在統計學顯著數目的受試者中應當減輕目標疾病症狀。
“有效量”包含足以改善或預防醫學病症的症狀或病症的量。有效量還意指足以允許或促進診斷的量。用於受試者的有效量可依據以下因素而變化：如待治療的病症、受試者的總體健康情況、給藥的方法途徑和劑量以及副作用嚴重性。有效量可以是避免顯著副作用或毒性作用的最大劑量或給藥方案。本揭露的受試者可以是動物或人類受試者。
本揭露的“受試者”、“患者”意指哺乳動物，尤其靈長類動物，尤其是人。
圖1為抗FAP抗體Ab9、Ab10、Ab14、Ab15與細胞表面人FAP的結合，使用28H1作為陽性對照，IgG1同種型作為陰性對照。
圖2為抗FAP抗體Ab9、Ab10、Ab14、Ab15與細胞表面小鼠FAP的結合，使用28H1作為陽性對照，IgG1同種型作為陰性對照。
圖3為抗CD40抗體A12、A297與Raji細胞表面人CD40的結合，使用9E5-SELFNS作為陽性對照，IgG1作為陰性對照。
圖4為抗CD40抗體A12、A297與HEK293細胞表面人CD40的結合，使用9E5-SELFNS作為陽性對照，IgG1作為陰性對照，縱坐標為相對於200nM 9E5-SELFNS的激動活性百分比。
圖5A為人源化抗CD40抗體A12_V1、A12_V2、A12_V3與過表達人CD40的HEK293細胞的親和力流式檢測結果，圖5B為人源化抗CD40抗體A297_V1、A297_V2、A297_V3、A297_V4與過表達人CD40的HEK293細胞的親和力流式檢測結果，均使用9E5-SELFNS作為陽性對照，hIgG作為陰性對照。
圖6A為人源化抗CD40抗體A12_V1、A12_V2、A12_V3藉由FcγRIIb介導的HEK-BlueTMCD40L細胞的活化作用，圖6B為人源化抗CD40抗體A297_V1、A297_V2、A297_V3、A297_V4藉由FcγRIIb介導的HEK-BlueTMCD40L細胞的活化作用，均使用9E5-SELFNS作為陽性對照，hIgG作為陰性對照。
圖7為抗FAP/CD40雙特異性抗體結構示意圖。
圖8A為抗FAP/CD40雙特異性抗體Ab10-A12V2-2、Ab10-A12V2-4、Ab10-A297V3-2、Ab10-A297V3-4與高表達人FAP抗原的CHOK1/FAP穩轉株的親和力流式檢測結果；圖8B、圖8C分別為前述抗FAP/CD40雙特異性抗體與高表達鼠FAP抗原、食蟹猴FAP抗原的CHOK1/FAP穩轉株的親和力流式檢測結果。
圖9A為抗FAP/CD40雙特異性抗體Ab10-A12V2-2、Ab10-A12V2-4、Ab10-A297V3-2、Ab10-A297V3-4與高表達人CD40抗原的HEK-BlueTMCD40L穩轉株的親和力流式檢測結果；圖9B為前述抗FAP/CD40雙特異性抗體與高表達食蟹猴CD40抗原的HEK293細胞的親和力流式檢測結果。
圖10為抗FAP/CD40雙特異性抗體Ab10-A297V3-2、Ab10-A297V3-4與人未成熟DC上CD40親和力流式檢測結果。
圖11為濃度梯度的抗FAP/CD40雙特異性抗體Ab10-A12V2-2、Ab10-A12V2-4、Ab10-A297V3-2、Ab10-A297V3-4在沒有CHOK1/FAP穩轉細胞交聯情況下促DC成熟作用，使用LPC、hIgG1、載劑作為對照。
圖12為濃度梯度的抗FAP/CD40雙特異性抗體Ab10-A12V2-2、Ab10-A12V2-4、Ab10-A297V3-2、Ab10-A297V3-4在CHOK1/FAP穩轉細胞交聯情況下促DC成熟作用，使用LPC、hIgG1、載劑作為對照。
圖13A為向mFAP-MC38荷瘤hCD40人源化小鼠注射單劑量抗體Ab10-A297V3-2或Ab10-A297V3-4後小鼠腫瘤生長曲線；圖13B為小鼠相應外周血B細胞的激活；圖13C為小鼠相應體重變化曲線；圖13D為小鼠相應血小板計數的變化；圖13E為小鼠相應肝功能的影響。
圖14A為向mFAP-MC38荷瘤hCD40人源化小鼠注射多劑量抗體Ab10-A297V3-2或Ab10-A297V3-4後小鼠腫瘤生長曲線；圖14B為小鼠相應外周血B細胞的激活；圖14C為小鼠相應體重變化曲線；圖14D為小鼠相應血小板計數的變化；圖14E為小鼠相應肝功能的影響。
圖15A為向mFAP-MC38荷瘤hCD40人源化小鼠注射多劑量抗體Ab10-A12V2-2後小鼠腫瘤生長曲線；圖15B為小鼠相應體重變化曲線；圖15C為小鼠相應肝功能的影響；圖15D為小鼠相應血小板計數變化。
圖16A為向mFAP-MC38荷瘤hCD40人源化小鼠注射單劑量Ab10-A12V2-4後小鼠腫瘤生長曲線；圖16B為小鼠相應體重變化曲線；圖16C為小鼠相應肝功能的影響；圖16D為小鼠相應血小板計數的影響。
圖17為雙特異性抗體Ab10-A12V2-2和Ab10-A297V3-2的藥物代謝動力學比較結果。
其中，圖13A至圖17中，除圖中另有標識外，P值均是相對於對照hIgG1計算。使用統計學方法Student’ t-test，其中，ns是指不具有顯著性差異，*為p<0.05，**為p<0.01，***為p<0.001，****為p<0.0001。
以下結合實施例用於進一步描述本揭露，但這些實施例並非限制本揭露的範圍。
本揭露實施例或測試例中未註明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件，或按照原料或商品製造廠商所建議的條件。參見Sambrook等，分子選殖，實驗室手冊，冷泉港實驗室；當代分子生物學方法，Ausubel等著，Greene出版協會，Wiley Interscience，NY。未註明具體來源的試劑，為市場購買的常規試劑。
實施例1. 抗FAP單株抗體的篩選和製備
1.1 篩選抗原、檢測抗原的序列和製備
人成纖維細胞激活蛋白(FAP；GeneBank登錄號AAC51668)是一種分子量約為170kDa的絲胺酸寡肽酶，是同源二聚體。本揭露使用的重組FAP蛋白序列、來源和用途如表2。
表2. 重組蛋白胺基酸序列來源
Figure 111131935-A0202-12-0048-28
1.2 從人天然Fab噬菌體展示庫中篩選h-FAP特異性結合抗體片段
以h-FAP-biotin抗原為靶分子，採用表面帶有親和素的磁珠捕獲抗原特異性噬菌體，並用磁力架進行噬菌體的富集。用pH2.2的甘胺酸溶液沖提抗原特異性噬菌體。
經二輪篩選，隨機挑選284個純株，採用噬菌體ELISA篩選陽性純株，包括如下具體步驟：計數鋪皿生長菌落，共計284個，接種96孔板，每孔含有400μL培養液(2YT+Amp+0.2%葡萄糖)，37℃下250rpm振搖培養6h。用抗原h-FAP-His包板，100ng/100μL/孔，4℃過夜。第二天，洗滌封閉96孔板後，每孔加100μL過夜培養的菌液，37℃下孵育1h，洗滌，加二抗(HRP標記的抗人IgG-Fab的抗體)，37℃下孵育40min，洗滌，加顯色液，避光保存30min，酶標儀讀取OD600數值。測序經兩次篩選得到的共計122個陽性純株，得到74個獨特的VH(構成了VH富集庫)、48個獨特的κ輕鏈(構成了KLC富集庫)和10個獨特的λ輕鏈(構成了LLC富集庫)。
1.3 構建CHO細胞表面全長抗體展示庫
1)構建全長抗體CHO細胞展示基因庫，包括：用三套引子分別PCR擴增VH富集庫、KLC富集庫和LLC富集庫。將三個富集庫經酶切後插入相應的組件載體，構建相應的組件庫。酶切KLC、LLC、VH組件庫，電泳分析純化酶切後的KLC片段庫、LLC片段庫和VH片段庫。酶切全長抗體細胞展示載體，純化載體片段。將酶切純化的載體片段、KLC片段庫、LLC片段庫、VH片段庫混合並連接。純化連接產物，電轉進入大腸桿菌，鋪皿，37℃培養過夜，計數菌落。經檢測，庫容達到3.6×10E6，是理論多樣性(74×58=4292)的800倍以上。收集全部菌落，提取載體DNA，得到全長抗體細胞展示基因庫。
2)構建h-FAP抗原特異性全長抗體細胞展示庫，包括：用全長抗體細胞展示基因庫載體DNA轉化，構建全長抗體CHO細胞展示庫。用潮黴素加壓篩選細胞庫。得到穩定轉化細胞庫，用PE標記的鼠抗人κ(或者λ)輕鏈抗體和FITC標記的h-FAP抗原雙染細胞庫，FACS分選PE和FITC雙陽性細胞，每孔一個細胞，κ輕鏈庫分選2塊96孔板，λ輕鏈庫分選1塊96孔板，潮黴素加壓培養。
3)FACS分析鑑定展示h-FAP抗原特異性抗體單細胞純株，包括：潮黴素加壓培養14天，得到穩定轉化κ鏈單細胞純株153個，λ鏈單細胞純株50個。用0.5mM EDTA-PBS緩衝液消化細胞，用PE標記的鼠抗人κ(或者λ)輕鏈抗體和FITC標記的h-FAP抗原雙染單細胞純株，經FACS分析，得到PE和FITC螢光雙陽性單細胞純株138個。
4)純株抗體基因，包括：藉由FACS檢測分析陽性純株的親和力，決定對45個純株進行抗體基因PCR擴增。離心收集陽性純株，棄上清，提取細胞基因組DNA，PCR擴增VH和LC，電泳分離擴增片段，測序分析，確定6個獨特VH和6個獨特κ，組合可得到12個有獨特序列的純株，其中的4個純株的VH和VL的序列參見表3。
表3. h-FAP抗體VH及VL(KLC的κ)胺基酸序列
Figure 111131935-A0202-12-0051-3
本揭露還提供Ab9、Ab10、Ab14、Ab15的重鏈全長和輕鏈全長序列。
>Ab9重鏈全長
Figure 111131935-A0202-12-0051-4
Figure 111131935-A0202-12-0052-7
Figure 111131935-A0202-12-0052-8
(SEQ ID NO：49)
>Ab9輕鏈全長
Figure 111131935-A0202-12-0052-9
Figure 111131935-A0202-12-0052-10
(SEQ ID NO：50)
>Ab10重鏈全長
Figure 111131935-A0202-12-0052-11
Figure 111131935-A0202-12-0052-13
(SEQ ID NO：51)
>Ab10輕鏈全長
Figure 111131935-A0202-12-0052-14
Figure 111131935-A0202-12-0053-15
Figure 111131935-A0202-12-0053-16
(SEQ ID NO：52)
>Ab14重鏈全長
Figure 111131935-A0202-12-0053-17
Figure 111131935-A0202-12-0053-18
(SEQ ID NO：53)
>Ab14輕鏈全長
Figure 111131935-A0202-12-0053-19
(SEQ ID NO：54)
>Ab15重鏈全長
Figure 111131935-A0202-12-0053-20
Figure 111131935-A0202-12-0054-21
Figure 111131935-A0202-12-0054-23
(SEQ ID NO：55)
>Ab15輕鏈全長
Figure 111131935-A0202-12-0054-24
(SEQ ID NO：56)
表4. 抗FAP抗體的CDR
Figure 111131935-A0202-12-0054-27
也即，上述抗FAP抗體有如下通式結構：
HCDR1均為SEQ ID NO：9；
HCDR2均為SEQ ID NO：10；
HCDR3均為DX1SLTARPYYFYGFDV(SEQ ID NO：18)，其中，X1為E或A；
LCDR1均為SEQ ID NO：12；
LCDR2均為SEQ ID NO：13；
LCDR3均為QQANSFPX2X3(SEQ ID NO：19)，其中，X2為P或L，X3為A或T。
1.4 構建CHO細胞表面全長抗體展示庫
1)構建可溶性抗體表達載體，包括：分別酶切純化具有獨特序列陽性VH片段和LC片段。將VH片段插入可溶性重鏈表達載體(IgG1)，將LC片段插入可溶性輕鏈表達載體，送菌落測序確定並提取DNA。
2)表達純化可溶性抗體，包括：懸浮培養擴增Expi293細胞。按上述確定的輕重鏈配對，輕鏈表達載體18μg，重鏈表達載體12μg的比例混合。將載體DNA與PEI以重量比1：2.5的比例混合，轉化Expi293細胞，第六天收集培養液上清，Protein-A法純化抗體。SDS-PAGE變性凝膠電泳分析，抗體純度均達到90%以上，-80℃保存。
1.5 ELISA結合測試
直接包被帶His標簽的FAP重組蛋白，加入抗體後，藉由加入二抗(HRP偶聯的抗人IgG的抗體)和HRP受質TMB檢測抗體與抗原結合的活性。包括：用人FAP-His蛋白包被96孔酶標板，按0.5μg/mL濃度每孔100μL，4℃孵育過 夜。充分洗滌，加入200μL/孔封閉液室溫孵育2h。充分洗滌，每孔加入100μL用稀釋液稀釋好的抗FAP待測抗體。室溫孵育1h，充分洗滌，每孔加入100μL用稀釋液按1：20000倍稀釋的HRP標記的羊抗人IgG二抗。室溫孵育1h，充分洗滌，每孔加入100μL TMB，避光反應15min。加入50μL/孔的0.16M硫酸。Thermo MultiSkanFc酶標儀讀取450nm OD值，計算抗FAP抗體的結合EC50值，結果見表5。
表5. 抗FAP抗體與人FAP抗原結合的親和力EC50值
Figure 111131935-A0202-12-0056-26
1.6 表面電漿共振技術(surface plasmon resonance,SPR)結合測試
選用CM5傳感器芯片，流動相採用HBS-EP+緩衝溶液(10mM HEPES,150mM NaCl,3mM EDTA,0.05% surfactant P20)。抗人IgG(Fc)抗體用10mM醋酸鈉緩衝液(pH 5.0)配製成30μg/mL溶液，進行胺基偶聯固定。用HBS-EP+緩衝溶液配製各待測抗體，藉由芯片通道上的抗人IgG(Fc)抗體進行捕獲。用HBS-EP+緩衝溶液配製h-FAP-His作為分析物，2倍梯度稀釋。將稀釋好的抗體在30μL/min的流速下流過實驗通道和參比通道，結合1min，解離15min。用10mM Glycine pH1.5作為再生緩衝液，10μL/min的流速下運行30秒。分析數據，表6結果顯示，與對照抗FAP抗體28H1(專利US9266938B2的序列219和序列233)相比較，Ab9、Ab10、Ab14、Ab15與抗原FAP的親和力要高3-6倍，最高的Ab15親和力KD達到2.15x10-10。而本揭露同步篩選獲得的其它抗FAP抗體，例如Ab2、Ab4、Ab5(序列未出示)與抗原結合親和力則低於28H1。
表6. 抗FAP抗體的SPR親和力Ka、Kd及KD值
Figure 111131935-A0202-12-0057-111
其中，對照抗體28H1的重鏈輕鏈可變區序列如下：
>28H1的VH
Figure 111131935-A0202-12-0057-31
Figure 111131935-A0202-12-0057-32
(SEQ ID NO：20)
>28H1的VL
EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSRSYLAWYQQKPGQAPRLLIIGASTRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQGQVIPPTFGQGTKVEIK(SEQ ID NO：21)
1.7 FACS結合測試
用FACS實驗檢測抗FAP抗體在細胞上的結合特性。包括：構建過表達人FAP的CHO細胞系，鋪板(1E5/孔)。加入待測抗體，100μL/孔，最高濃度為100nM，5倍稀釋，共8個濃度，4℃孵育1h。加入抗hIgG Alexa Fluor-647作為二抗，按1：500比例4℃孵育30min，利用FACS進行檢測。能結合FAP的抗體可以標記細胞。被標記的過表達人FAP的細胞的數量占所有細胞的百分比與抗體濃度之間的關係如圖1所示，人FAP與抗體的結合EC50值參見表7；被標記的 過表達小鼠FAP的細胞的數量占所有細胞百分比與抗體濃度之間的關係如圖2所示。
表7. 抗FAP抗體與人FAP抗原結合的親和力EC50值
Figure 111131935-A0202-12-0058-33
實施例2. 抗CD40奈米抗體(VHH)的篩選和製備
2.1 免疫抗原，篩選抗原的序列和製備
選擇帶His標簽的人CD40重組蛋白(h-CD40-His)，C端生物素標簽的人CD40重組蛋白(h-CD40-biotin)，C端帶His標簽的猴CD40重組蛋白(cyno-CD40-His)。序列和來源見表8。該蛋白試劑可用於下述各實施例實驗中。
表8. 重組蛋白胺基酸序列及來源
Figure 111131935-A0202-12-0058-34
2.2 羊駝免疫流程及效價檢測
用h-CD40-his免疫羊駝，每兩周免疫一次，共免疫四次。首次免疫時，將0.5mg抗原與弗氏完全佐劑(CFA)1mL混勻皮下注射，後三次免疫將0.25mg抗原與弗氏不完全佐劑(IFA)1mL混勻皮下注射。免疫前採集空白血清，第3次免疫後一週和第4次免疫後一週分別採50mL外周血分離淋巴細胞，檢測血清效價。
2.3 效價檢測及噬菌體文庫構建
羊駝經四次免疫後檢測血清效價。效價合格後，分離PBMC，提取總RNA，檢測純度，反轉錄為DNA，兩輪巢式PCR後將純化載體與VHH目的片段酶切連接。電轉，挑選純株，獲得噬菌體文庫A庫和B庫。
2.4 噬菌體文庫親和淘選及ELISA鑑定
以h-CD40抗原為靶分子，採用Gly-HCL酸沖提方法進行篩選，沖提特異噬菌體。經二輪篩選，從第一、二輪滴度測定平板隨機挑選384個純株，採用噬菌體ELISA篩選陽性純株，檢測450nm下光密度。根據測序結果，對序列進行序列比對和進化樹分析，篩選出16條序列，其中兩個功能較好的抗CD40抗體的胺基酸序列見表9和表10。
表9. 抗CD40單域抗體序列
Figure 111131935-A0202-12-0059-35
表10. 抗CD40抗體的CDR
Figure 111131935-A0202-12-0059-36
2.5 抗CD40單域抗體-Fc融合蛋白的表達純化
將以上2條VHH分別與含有N297A突變的人IgG1-Fc進行連接，連接後的VHH-Fc融合蛋白序列見表11。下劃線為人IgG1-Fc，加粗為N297A突變。
採用9E5-SELFNS作為CD40激動劑陽性對照(參見WO2020108611A1的序列58和序列59)。
表11. 抗CD40單域抗體與人IgG1-Fc的融合蛋白序列
Figure 111131935-A0202-12-0060-37
構建質粒，瞬時轉染細胞，表達抗體，並純化。經檢測，獲得目的抗體。
2.6 FACS結合測試
用FACS實驗檢測抗CD40抗體在細胞上的結合特性。包括：獲得Raji單細胞，鋪板。加入待測抗體，100μL/孔，最高濃度點為100nM，5倍稀釋，獲得共8個梯度點，4℃孵育1h。加入抗hIgG Alexa Fluor-647作為二抗，按1：500比 例4℃孵育30min。FACS檢測。使用CD40激動劑為陽性對照，各抗體EC50見圖3及表12。
表12. 抗CD40抗體與人CD40抗原結合的親和力EC50值
Figure 111131935-A0202-12-0061-38
對於用做FAP/CD40雙特異性抗體中的CD40激動性抗體而言，其對CD40的親和力EC50不宜太高，否則會導致雙特異性抗體優先結合CD40，更期望的是，雙特異性抗體優先結合FAP，進而發揮作用。因此，A12和A297具有更符合以上特性的優勢，這在表13中也有所體現。
2.7 抗CD40奈米抗體的活性檢測
檢測抗CD40抗體對CD40報告基因細胞的活化作用，根據EC50評價CD40抗體的激動劑活性。包括：製備HEK-BlueTMCD40L細胞(購自Invivogen Cat#hkb-cd40，該細胞穩定轉染了人CD40基因和NF-κB介導的SEAP基因組，可以藉由SEAP受質QUANTI-Blue檢測上清中分泌的SEAP含量來表徵CD40信號通路的活化水平)，培養基為含10% FBS、100μg/mL Normocin、100μg/mL Zeocin和30pg/mL Blasticidin的DMEM。將細胞以5E4/孔鋪入96孔板，培養基為含10%FBS和100μg/mL Normocin的DMEM，培養過夜，細胞貼壁後，每孔加入100μL梯度稀釋的待測抗體，37℃過夜培養。將細胞離心，轉移細胞上清到一個新96孔板中，加入180μL QUANTI-Blue受質溶液，避光孵育15分鐘，用Envision酶標儀測定在620nm處的吸光度，計算EC50值。使用CD40激動劑(9E5-SELFNS)為陽性對照，相對激動活性百分比(與200nM 9E5-SELFNS相比)與抗體濃度之間的關係EC50見圖4和表13。
表13. 抗CD40抗體的激動活性EC50值及其與陽性對照的相對激活活性百分比%
Figure 111131935-A0202-12-0062-39
2.8 抗CD40奈米抗體的人源化
根據以上結果，將A12、A297進行人源化。在所獲得的奈米抗體A12和A297的VHH典型結構的基礎上，將VHH可變區序列與抗體種系數據庫比較，獲得同源性高的人種系模板。本揭露抗體A12和A297較佳人種系模板均為IGHV3-48*03。再把CDR移植到人FR中，對影響抗體結構和功能的關鍵胺基酸進行回復突變，以恢復結合力和活性。各人源化序列如表14所示。
表14. 抗CD40人源化抗體序列
Figure 111131935-A0202-12-0063-40
也即，本揭露的抗CD40奈米抗體有如下通式結構：
CDR1為X4YGMK(SEQ ID NO：39)，其中，X4為N或R；
CDR2為TIX5SX6GX7X8TYYADSVKG(SEQ ID NO：40)，其中，X5為N或L，X6為Q或H，X7為G或D，X8為S或T；
CDR3為X9D X10SDYSX11(SEQ ID NO：41)，其中，X9為V或I，X10為W或Y，X11為P或S。
將以上7條VHH分別連入含有S267E/L328F突變(根據EU編號)的人IgG1-Fc。連接後的VHH-Fc融合蛋白序列見表15。下劃線為人IgG1-Fc，加粗為S267E/L328F突變。
表15. 人源化抗CD40單域抗體與人IgG1-Fc(S267E/L328F)的融合蛋白序列
Figure 111131935-A0202-12-0064-41
Figure 111131935-A0202-12-0065-42
將以上7條VHH-Fc瞬時轉染細胞並表達，純化抗體。經檢測，獲得目標抗體蛋白。
2.9 人源化CD40抗體對CD40高表達細胞株的親和力
採用FACS檢測人源化抗體與高表達人抗原蛋白CD40的細胞的結合能力。用CD40質粒(CD40 cDNA ORF Clone,Human,C-DYKDDDDK(Flag®)Tag；Sino Biological；HG10774-CF)瞬時轉染HEK293細胞，獲得高表達CD40的HEK293 細胞，用流式染色液(PBS+2% FBS)重新懸浮，加入梯度稀釋後的不同濃度的待檢測抗體。冰上孵育1h後，PBS洗滌，400g離心5min。加入帶有螢光基團Alexa Fluor 647標記的羊抗人Fc抗體作為二抗，冰浴染色1h，PBS清洗兩遍後用FACS檢測細胞表面的螢光信號。結果如圖5A和5B所示，EC50值見表16。本揭露人源化抗體對CD40高表達細胞株均有較高的親和力。
表16. 各人源化抗CD40抗體與人CD40高表達細胞株的親和力EC50值
Figure 111131935-A0202-12-0066-43
2.10 人源化CD40抗體對HEK-BlueTM CD40L細胞的活化作用
藉由檢測CD40抗體在被FcγRIIb交聯的情況下對HEK-BlueTMCD40L細胞的活化作用來評價CD40抗體的體外激動活性。人源化CD40抗體的Fc中帶有的S267E/L328F突變，增強了IgG1 Fc與FcγRIIb的親合力，因此也增強了FcγRIIb對抗體的交聯。藉由FcγRIIb介導的CD40抗體對HEK-BlueTM CD40L細胞的活化作用模擬了CD40抗體在被完全交聯的情況下的激動劑活性。用FcγRIIb質粒(CD32B/Fcgr2b cDNA ORF Clone,Human,N-His tag；Sino Biological；HG10259- NH)瞬時轉染HEK293細胞，獲得高表達FcγRIIb的HEK293細胞。將HEK-BlueTMCD40L細胞以5E4/孔鋪入96孔細胞培養板(培養基為DMEM，10% FBS，100μg/mL Normocin)，加入5E4/孔表達FcγRIIb的HEK293細胞，每孔加入100μL梯度稀釋的待測抗體，37℃過夜培養。將細胞離心，轉移20μL細胞上清到一個新96孔板中，加入180μL QUANTI-Blue受質溶液，避光孵育30min，用Envision酶標儀測定在620nm處的吸光度，計算EC50值以及Emax值(相對無抗體組螢光強度)，以EC50值來評價CD40抗體的體外細胞激動劑活性。
CD40抗體藉由FcγRIIb介導的HEK-BlueTMCD40L細胞的活化作用如圖6A、6B所示，EC50值及Emax值(相對螢光強度)見表17。
結果顯示，在上述報告基因細胞體系下，人源化CD40抗體在被FcγRIIb交聯的情況下，人源化CD40抗體的激動劑活性均較強。
表17. 各人源化抗CD40抗體對HEK-BlueTMCD40L細胞的活化作用
Figure 111131935-A0202-12-0067-44
實施例3. 抗FAP/CD40雙特異性抗體的設計和製備
3.1 抗FAP/CD40雙特異性抗體的設計及表達純化
根據人源化後的抗CD40抗體篩選結果，選擇A12V2和A297V3；根據抗FAP抗體的篩選結果，選擇Ab10，進行抗FAP/CD40雙特異性抗體的構建。雙特異性抗體採用Ab10為IgG骨架，在Ab10的兩條重鏈的C端各串聯1個或2個或3個抗CD40奈米抗體。CD40奈米抗體之間以及與Ab10重鏈C端的連接子採用“GGGGSGGGGS”。每個雙特異性抗體分別含有2價、4價和6價的CD40奈米抗體，如圖7所示。對於抗體名稱，例如，對於Ab10-A12V2-2，Ab10代表採用的抗FAP抗體，A12V2代表採用的人源化抗CD40抗體，最後的2代表CD40的價數為2價。其它抗體均採用該命名規則。瞬時轉染與表達、純化抗體採用實施例2的2.5中方法。經檢測，獲得目的雙特異性抗體分子。各雙特異性抗體分子胺基酸序列如下。
>Ab10-A12V2-2的重鏈
Figure 111131935-A0202-12-0068-45
Figure 111131935-A0202-12-0068-46
(SEQ ID NO：42)
>Ab10-A12V2-2的輕鏈
Figure 111131935-A0202-12-0069-47
Figure 111131935-A0202-12-0069-116
(SEQ ID NO：43)
>Ab10-A12V2-4的重鏈
Figure 111131935-A0202-12-0069-48
Figure 111131935-A0202-12-0069-50
(SEQ ID NO：44)
>Ab10-A12V2-6的重鏈
Figure 111131935-A0202-12-0070-51
Figure 111131935-A0202-12-0070-52
(SEQ ID NO：45)
>Ab10-A297V3-2的重鏈
Figure 111131935-A0202-12-0070-53
Figure 111131935-A0202-12-0071-54
Figure 111131935-A0202-12-0071-55
(SEQ ID NO：46)
>Ab10-A297V3-4的重鏈
Figure 111131935-A0202-12-0071-56
Figure 111131935-A0202-12-0071-57
(SEQ ID NO：47)
>Ab10-A297V3-6的重鏈
Figure 111131935-A0202-12-0072-58
Figure 111131935-A0202-12-0072-59
(SEQ ID NO：48)
Ab10-A12V2-4、Ab10-A12V2-6、Ab10-A297V3-2、Ab10-A297V3-4、Ab10-A297V3-6的輕鏈均為SEQ ID NO：43所示。
註：重鏈的下劃線為CH1和Fc區，輕鏈的下劃線為CL區，斜體為連接子，加粗為LALA(L234A和L235A突變)。
3.2 抗FAP/CD40雙特異性抗體的抗原結合親和力檢測
採用SPR(GE Healthcare；Biacore 8K)檢測抗FAP/CD40雙特異性抗體與其抗原人FAP蛋白(Acro公司，FAP-H5244)、人CD40蛋白(Acro公司，CD0-H5228)之間的親和力。選用CM5傳感器芯片，流動相採用HBS-EP+緩衝溶液(10mM HEPES,150mM NaCl,3mM EDTA,0.05% surfactant P20)。將抗人IgG(Fc)抗體藉由胺基偶聯固定。用HBS-EP+緩衝溶液分別配製各待測抗體作為配體，藉由芯片通道上的抗人IgG(Fc)抗體進行捕獲。不同種屬的抗原蛋白作為分析物。結果見表18、表19，顯示製備成雙特異性抗體後，不影響抗體與FAP的結合，且雙特異性抗體對CD40的親和力更低，將優先結合FAP，進而發揮作用。
表18. 抗FAP/CD40雙特異性抗體與人FAP的親和力
Figure 111131935-A0202-12-0073-60
表19. 抗FAP/CD40雙特異性抗體與人CD40的親和力
Figure 111131935-A0202-12-0073-62
3.3 抗FAP/CD40雙特異性抗體對高表達FAP細胞株的親和力檢測
本實驗藉由FACS檢測抗FAP/CD40雙特異性抗體對高表達人FAP、食蟹猴FAP和小鼠FAP的CHOK1細胞穩轉株的結合情況。顯示雙特異性抗體能結合 人、小鼠、食蟹猴的細胞表面FAP抗原，且結合能力與單抗相類似，參見圖8A-8C，EC50值見表20。
表20. 抗FAP/CD40雙特異性抗體與人、鼠細胞表面FAP抗原結合的EC50值
Figure 111131935-A0202-12-0074-63
3.4 抗FAP/CD40雙特異性抗體對高表達CD40細胞株的親和力檢測
利用FACS檢測雙特異性抗體對於細胞表面CD40的結合情況，包括高表達人CD40的HEK-BlueTMCD40細胞(Invivogen,Cat#hkb-cd40)，瞬轉食蟹猴CD40質粒(Sino Biological,cat# CG90970-UT)使其高表達食蟹猴CD40的HEK293細胞。結果顯示，雙特異性抗體能夠結合人和食蟹猴的細胞膜表面CD40。詳見圖9A、9B，圖11和表21。
表21. 雙特異性抗體與人細胞表面CD40抗原結合的EC50值
Figure 111131935-A0202-12-0074-64
3.5 人源化抗FAP/CD40雙特異性抗體FAP依賴性促DC成熟活性檢測
為了驗證抗FAP/CD40雙特異性抗體對樹突狀細胞成熟的影響，利用CD14陽性磁珠從新鮮PBMC中分離單核細胞，用含50ng/mL的GM-CSF和50ng/mL 的hIL-4的1640培養基培養5天。每2-3天半數換液，第5天將誘導成的樹突狀細胞以1E5/孔的密度加入96孔板中，再分別加入處於對期生長的CHOK1和過表達人FAP的CHOK1細胞。同時加入梯度稀釋好的待測抗體，1μg/mL LPS作為陽性對照，100nM hIgG1和無抗體組作為陰性對照。培養48h後，用FACS檢測樹突狀細胞表面分子CD83的表達。
如圖11(無CHOK1/FAP)和圖12(有CHOK1/FAP)，結果顯示，2價分子Ab10-A12V2-2和Ab10-A297V3-2在沒有CHOK1/FAP情況下不能活化DC，其CD40激動劑活性完全依賴於FAP介導的交聯(crosslink)。而4價分子Ab10-A12V2-4和Ab10-A297V3-4在沒有CHOK1/FAP細胞存在情況下能進夠誘導DC細胞的成熟，在有CHOK1/FAP存在的情況下，DC細胞的激活能進一步增強。因此，無論對於2價分子和4價分子而言，樹突細胞表面表達的FAP均能提供雙特異性抗體的激活窗口。
實施例4. 抗FAP/CD40雙特異性抗體Ab10-A297V3-2/4的小鼠體內藥效
B-hCD40人源化小鼠來自百奧賽圖江蘇基因生物技術有限公司(種屬Mus musc μLus，品系C57BL/6，雌性)。在小鼠腸癌MC38細胞中轉染小鼠全長FAP質粒，構建穩轉株，接種細胞5×105/0.1mL/隻於小鼠右腋皮下，當平均腫瘤體積長至80-100mm3時，挑選個體腫瘤體積合適的小鼠，隨機分組，每組6隻。小鼠腹腔注射給藥，每週兩次，首次給藥48h後抽取外周血檢測B細胞數目及細胞表面CD86表達，分組後第8天檢測血液中的穀丙轉胺酶ALT(Alanine Aminotransferase)和穀草轉胺酶AST(Aspartate aminotransferase)濃度， 給藥4次後停止給藥，直至hIgG1對照組有小鼠腫瘤體積超過2000mm3給藥最後一次，最後一次給藥24h後檢測血常規。
4.1 Ab10-A297V3-2或Ab10-A297V3-4單劑量小鼠體內藥效及毒性
在單一劑量的情況下比較了Ab10-A297V3-2或Ab10-A297V3-4與CD40激動劑單抗9E5-mIgG1的抗腫瘤活性。9E5-mIgG1與9E5-SELFNS具有相同的可變區，只是重、輕鏈恆定區採用小鼠mIgG1重鏈的恆定區以及小鼠kappa鏈的恆定區。由於CD40激動劑單抗的活性依賴於FcγRIIb對其Fc的交聯，因此採用了小鼠IgG1重鏈恆定區的9E5-mIgG1可以更好地在小鼠體內展示CD40的激動劑活性。在小鼠體內藥效實驗中，9E5-mIgG1是比9E5-SELFNS更好的對照抗體。
Ab10-A297V3-4抗腫瘤活性無論是從TGI(Tumor growth inhibition，腫瘤生長抑制)還是CR(Complete Response，完全響應)的角度上，均強於同莫耳劑量的CD40單抗9E5-mIgG1，序列如下：
>9E5-mIgG1重鏈
Figure 111131935-A0202-12-0076-65
Figure 111131935-A0202-12-0077-66
Figure 111131935-A0202-12-0077-67
(SEQ ID NO：64)
>9E5-mIgG1輕鏈
Figure 111131935-A0202-12-0077-68
(SEQ ID NO：65)
兩倍莫耳濃度下的Ab10-A297V3-2的抗腫瘤活性依然弱於Ab10-A297V3-4，與9E5-mIgG1相當。
藉由檢測小鼠外周血B淋巴細胞的激活來檢測雙特異性抗體分子對於外周CD40的激活，結果與體外實驗一致。Ab10-A297V3-4由於具有部分不依賴於FAP的CD40激活活性，所以能部分激活外周B淋巴細胞，而Ab10-A297V3-2由於對CD40的激活完全依賴於FAP，所以未檢測到顯著的外周B細胞的激活(One-WayANOVA)。所測抗體信息如表22，體內藥效結果如圖13A(各組抗體相對hIgG1對照組均P<0.0001)和圖13B。
表22. 所測試抗體信息
Figure 111131935-A0202-12-0077-69
從小鼠毒性上來看，Ab10-A297V3-2和Ab10-A297V3-4都未產生小鼠體重上的變化，參見圖13C。
從血常規的檢測來看，與同莫耳劑量hIgG1對照組相比，9E5-mIgG1能引發一定程度的血小板下降，與肝毒性相類似；Ab10-A297V3-2沒有引發血小板下降；Ab10-A297V3-4能引發與9E5-mIgG1同等程度的血小板下降，參見圖13D。Ab10-A297V3-2/4的小鼠體內給藥劑量和腫瘤生長抑制率統計詳見表23。
其中，TGI的計算公式為：
TGI=(空白組當天腫瘤體積-給藥當天組腫瘤體積)/(空白組當天腫瘤體積)*100%
表23. Ab10-A297V3-2或4的小鼠體內給藥劑量和腫瘤生長抑制率
Figure 111131935-A0202-12-0078-70
從ALT和AST的檢測中可以看出，9E5-mIgG1藉由CD32B(即FcγRIIB)介導的交聯，在給藥後第8天顯示出一定的肝毒性。Ab10-A297V3-4由於具有一定的本底激活，所以也具有一定的肝毒性，但是由於其激活不依賴於CD32B，所以肝毒性低於9E5-mIgG1；Ab10-A297V3-2由於依賴FAP才能激活CD40，因此完全沒有肝毒性，參見圖13E。
4.2 Ab10-A297V3-2或Ab10-A297V3-4多劑量小鼠體內藥效和毒性
為了摸索Ab10-A297V3-2或4的治療窗，進一步提高了Ab10-A297V3-2的劑量，並降低了Ab10-A297V3-4分子的劑量，詳見表24。當繼續升高2價Ab10-A297V3-2分子的給藥劑量時，其抗腫瘤活性並能沒有得到進一步的提高，也沒 有觀測到外周B淋巴細胞的激活。降低Ab10-A297V3-4的給藥劑量至1.3mg/kg(即9E5-mIgG1的1/3莫耳劑量)時，其仍有92.6%的TGI，遠遠好於9E5-mIgG1。
為了在體內實驗中評估4價CD40雙特異性抗體中FAP抗體的作用，比較了Ab10-A297V3-4和另一個沒有FAP結合功能的4價CD40雙特異性抗體(同種型-A297V3-4)的抗腫瘤活性。同種型-A297V3-4與Ab10-A297V3-4的構造完全一致，除了將抗FAP部分的Ab10替換為另一個不結合任何鼠源蛋白的同種型抗體。
圖14A-14E的結果顯示，4價CD40雙特異性抗體即使不結合FAP就有較好的抗腫瘤活性，而結合FAP則抗腫瘤活性更強。從毒性上來看，Ab10-A297V3-2提高劑量後仍未見體重、ALT/AST以及血小板數目的異常，而對於Ab10-A297V3-4，在降低劑量後，之前在高劑量下觀測到的ALT/AST以及血小板數目上的異常消失了，而仍保留了很強的抗腫瘤效果(P<0.0001)，說明對比CD40單抗9E5-mIgG1，無論是Ab10-A297V3-2和Ab10-A297V3-4都具有更寬的治療窗。抗體信息見表24，Ab10-A297V3-2或Ab10-A297V3-4多劑量體內藥效統計數據見表25。
表24. 所測試抗體信息
Figure 111131935-A0202-12-0079-71
表25. Ab10-A297V3-2/4多劑量體內藥效統計
Figure 111131935-A0202-12-0080-72
4.3 Ab10-A12V2-2多劑量小鼠體內藥效和毒性
參見圖15A-15D和表26，Ab10-A12V2-2與Ab10-A297V3-2具有相似的小鼠體內藥理學特徵(兩個劑量與hIgG1對照組相比，均為P<0.0001)，從抗腫瘤活性上優於9E5-mIgG1。升高劑量不能進一步提高其抗腫瘤活性，但是沒有ALT/AST的升高及血小板的下降，顯示其更寬的治療窗和更低的副作用。
表26. 所測試抗體信息及TGI
Figure 111131935-A0202-12-0080-73
4.4 Ab10-A12V2-4單劑量小鼠體內藥效和毒性
與前類似地，本實施例探索Ab10-A12V2-4單劑量小鼠藥效及毒性。Ab10-A12V2-4與hIgG1對照組相比，Ab10-A12V2-4組P<0.0001，從抗腫瘤活性上優 於9E5-mIgG1，且沒有ALT/AST的升高及血小板的下降，參見表27和圖16A-16D。
表27. 所測試抗體信息及TGI
Figure 111131935-A0202-12-0081-74
4.5 抗FAP/CD40雙特異性抗體藥物代謝動力學檢測
本揭露在mFAP-MC38荷瘤hCD40人源化小鼠中，從三個不同方向比較了抗FAP/CD40雙特異性抗體的藥物代謝動力學特徵。分別藉由靜脈注射的方式給予不同濃度的抗體，然後在不同時間點取血，藉由檢測小鼠血液中人Fc的含量來分析每個抗體分子的血藥濃度/時間曲線。
用PBS稀釋抗人IgG-Fc抗體至1.5μg/mL，用此抗體包板，每孔100μL，4℃過夜。去除溶液，每孔加入200μL PBST洗三次，棄去PBST後每孔加100μL 1%BSA，37℃封閉2h。去除溶液，每孔加入200μL PBST洗三次後每孔加入50μL稀釋後的抗體或者血清樣品(均用1%BSA PBS稀釋，血清分別10倍、100倍、1000倍、10000倍稀釋)，37℃孵育1h。去除溶液，每孔加入200μL PBST洗三次後每孔加入50μL HRP標記的羊抗人IgG-Fc二抗(1%BSA PBS稀釋，1：20000)，37℃孵育20min。去除溶液，每孔加入200μL PBST洗五次後每孔加入50μL TMB顯色，觀察到抗體有梯度顏色反應後，每孔加入50μL ELISA終止液。Envision上機讀值OD450，取血清OD450讀值在抗體標準曲線線性範圍內的數值換算濃度後作圖分析PK曲線。
結果見圖17，比較了Ab10-A297V3-2和Ab10-A12V2-2分子在13.92mg/kg給藥劑量下的藥物代謝動力學特徵。結果發現兩個分子的藥物代謝動力學特徵類似，因此，本揭露雙特異性抗體的藥物代謝動力學特徵不因CD40抗體的序列不同而變化。
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Claims (29)

  1. 一種FAP/CD40結合分子，其包含特異性結合FAP的第一抗原結合結構域和特異性結合CD40的第二抗原結合結構域，該特異性結合FAP的第一抗原結合結構域包含重鏈可變區和輕鏈可變區，該重鏈可變區包含HCDR1、HCDR2、HCDR3，該輕鏈可變區包含LCDR1、LCDR2、LCDR3，其中，
    該HCDR1、HCDR2、HCDR3分別包含如SEQ ID NO：9、10、18所示的胺基酸序列；該LCDR1、LCDR2、LCDR3分別包含如SEQ ID NO：12、13、19所示的胺基酸序列；
    較佳地，
    該HCDR1、HCDR2、HCDR3分別包含如SEQ ID NO：9、10、15所示的胺基酸序列；該LCDR1、LCDR2、LCDR3分別包含如SEQ ID NO：12、13、14所示的胺基酸序列；
    該HCDR1、HCDR2、HCDR3分別包含如SEQ ID NO：9、10、11所示的胺基酸序列；該LCDR1、LCDR2、LCDR3分別包含如SEQ ID NO：12、13、14所示的胺基酸序列；
    該HCDR1、HCDR2、HCDR3分別包含如SEQ ID NO：9、10、15所示的胺基酸序列；該LCDR1、LCDR2、LCDR3分別包含如SEQ ID NO：12、13、16所示的胺基酸序列；或
    該HCDR1、HCDR2、HCDR3分別包含如SEQ ID NO：9、10、11所示的胺基酸序列；該LCDR1、LCDR2、LCDR3分別包含如SEQ ID NO：12、13、17所示的胺基酸序列。
  2. 如請求項1所述的FAP/CD40結合分子，其中該特異性結合CD40的第二抗原結合結構域包含至少一個免疫球蛋白單一可變結構域，該免疫球蛋白單一可變結構域包含三個互補決定區CDR1、CDR2和CDR3，該CDR1、CDR2、CDR3分別包含如SEQ ID NO：39、40、41所示的胺基酸序列；
    較佳地，該CDR1、CDR2、CDR3分別包含如SEQ ID NO：24、25、26所示的胺基酸序列；或該CDR1、CDR2、CDR3分別包含如SEQ ID NO：27、28、29所示的胺基酸序列。
  3. 如請求項1或2所述的FAP/CD40結合分子，其中該特異性結合FAP的第一抗原結合結構域中：
    該重鏈可變區包含如SEQ ID NO：3所示或與之具有至少90%同一性的胺基酸序列，該輕鏈可變區包含如SEQ ID NO：4所示或與之具有至少90%同一性的胺基酸序列；
    該重鏈可變區包含如SEQ ID NO：1所示或與之具有至少90%同一性的胺基酸序列，該輕鏈可變區包含如SEQ ID NO：2所示或與之具有至少90%同一性的胺基酸序列；
    該重鏈可變區包含如SEQ ID NO：5所示或與之具有至少90%同一性的胺基酸序列，該輕鏈可變區包含如SEQ ID NO：6所示或與之具有至少90%同一性的胺基酸序列；或
    該重鏈可變區包含如SEQ ID NO：7所示或與之具有至少90%同一性的胺基酸序列，該輕鏈可變區包含如SEQ ID NO：8所示或與之具有至少90%同一性的胺基酸序列。
  4. 如請求項2或3所述的FAP/CD40結合分子，其中該特異性結合CD40的第二抗原結合結構域中的免疫球蛋白單一可變結構域包含如SEQ ID NO：22、23、32至38任一所示或與SEQ ID NO：22、23、32至38任一具有至少90%序列同一性的胺基酸序列。
  5. 如請求項2至4中任一項所述的FAP/CD40結合分子，其中，特異性結合CD40的第二抗原結合結構域包含2、3、4、5或6個該免疫球蛋白單一可變結構域。
  6. 如請求項2至5中任一項所述的FAP/CD40結合分子，其中該特異性結合FAP的第一抗原結合結構域包含重鏈可變區和輕鏈可變區，其中，
    該特異性結合CD40的第二抗原結合結構域的免疫球蛋白單一可變結構域位於特異性結合FAP的第一抗原結合結構域的重鏈可變區的N端；
    該特異性結合CD40的第二抗原結合結構域的免疫球蛋白單一可變結構域位於特異性結合FAP的第一抗原結合結構域的重鏈可變區的C端；
    該特異性結合CD40的第二抗原結合結構域的免疫球蛋白單一可變結構域位於特異性結合FAP的第一抗原結合結構域的輕鏈可變區的N端；和/或
    該特異性結合CD40的第二抗原結合結構域的免疫球蛋白單一可變結構域位於特異性結合FAP的第一抗原結合結構域的輕鏈可變區的C端。
  7. 如請求項2至6中任一項所述的FAP/CD40結合分子，其中，特異性結合CD40的第二抗原結合結構域的免疫球蛋白單一可變結構域與特異性結合FAP的第一抗原結合結構域直接或藉由連接子相連接；
    較佳地，該連接子為具有如(G4S)x所示的胺基酸序列，其中，x獨立地選自1-20的整數；
    更佳地，該連接子為(G4S)2、(G4S)3或(G4S)4所示的胺基酸序列。
  8. 如請求項1至7中任一項所述的FAP/CD40結合分子，其還包含人免疫球蛋白Fc區；
    較佳地，該Fc區是人IgG1或IgG4的Fc區；
    更佳地，該人IgG1具有去除或降低Fc效應器功能的突變；
    最佳地，該人IgG1具有選自N297A、D265A/N297A、L234A/L235A、L234A/L235A/P329G、L234E、L234F、L234E/L235F和L234E/L235F/P329G的突變。
  9. 如請求項1至8中任一項所述的FAP/CD40結合分子，該特異性結合FAP的第一抗原結合結構域包含重鏈和輕鏈：
    較佳地，該重鏈為IgG1或IgG4同種型，該輕鏈為Kappa同種型；
    更佳地，該重鏈為SEQ ID NO：51所示或與之具有至少90%同一性的胺基酸序列，該輕鏈為SEQ ID NO：52所示或與之具有至少90%同一性的胺基酸序列；
    該重鏈為SEQ ID NO：49所示或與之具有至少90%同一性的胺基酸序列，該輕鏈為SEQ ID NO：50所示或與之具有至少90%同一性的胺基酸序列；
    該重鏈為SEQ ID NO：53所示或與之具有至少90%同一性的胺基酸序列，該輕鏈為SEQ ID NO：54所示或與之具有至少90%同一性的胺基酸序列；或
    該重鏈為SEQ ID NO：55所示或與之具有至少90%同一性的胺基酸序列，該輕鏈為SEQ ID NO：56所示或與之具有至少90%同一性的胺基酸序列。
  10. 如請求項1至9中任一項所述的FAP/CD40結合分子，其包含第一多肽鏈和第二多肽鏈，其中，
    該第一多肽鏈包含如SEQ ID NO：42、44-48中任一所示或與之具有至少90%同一性的胺基酸序列，第二多肽鏈包含如SEQ ID NO：43所示或與之具有至少90%同一性的胺基酸序列；
    較佳地，該FAP/CD40結合分子中含有兩條相同的第一多肽鏈和兩條相同的第二多肽鏈。
  11. 一種FAP結合分子，包含重鏈可變區和輕鏈可變區，該重鏈可變區包含HCDR1、HCDR2、HCDR3，輕鏈可變區包含LCDR1、LCDR2、LCDR3，其中，
    該HCDR1、HCDR2、HCDR3分別包含如SEQ ID NO：9、10、18所示的胺基酸序列；該LCDR1、LCDR2、LCDR3分別包含如SEQ ID NO：12、13、19所示的胺基酸序列；
    較佳地，
    該HCDR1、HCDR2、HCDR3分別包含如SEQ ID NO：9、10、15所示的胺基酸序列；該LCDR1、LCDR2、LCDR3分別包含如SEQ ID NO：12、13、14所示的胺基酸序列；
    該HCDR1、HCDR2、HCDR3分別包含如SEQ ID NO：9、10、11所示的胺基酸序列；該LCDR1、LCDR2、LCDR3分別包含如SEQ ID NO：12、13、14所示的胺基酸序列；
    該HCDR1、HCDR2、HCDR3分別包含如SEQ ID NO：9、10、15所示的胺基酸序列；該LCDR1、LCDR2、LCDR3分別包含如SEQ ID NO：12、13、16所示的胺基酸序列；或
    該HCDR1、HCDR2、HCDR3分別包含如SEQ ID NO：9、10、11所示的胺基酸序列；LCDR1、LCDR2、LCDR3分別包含如SEQ ID NO：12、13、17所示的胺基酸序列。
  12. 如請求項11所述的FAP結合分子，其中，
    該重鏈可變區包含如SEQ ID NO：3所示或與之具有至少90%同一性的胺基酸序列，該輕鏈可變區包含如SEQ ID NO：4所示或與之具有至少90%同一性的胺基酸序列；
    該重鏈可變區包含如SEQ ID NO：1所示或與之具有至少90%同一性的胺基酸序列，該輕鏈可變區包含如SEQ ID NO：2所示或與之具有至少90%同一性的胺基酸序列；
    該重鏈可變區包含如SEQ ID NO：5所示或與之具有至少90%同一性的胺基酸序列，該輕鏈可變區包含如SEQ ID NO：6所示或與之具有至少90%同一性的胺基酸序列；或
    該重鏈可變區包含如SEQ ID NO：7所示或與之具有至少90%同一性的胺基酸序列，該輕鏈可變區包含如SEQ ID NO：8所示或與之具有至少90%同一性的胺基酸序列。
  13. 如請求項11或12所述的FAP結合分子，其還包含人免疫球蛋白Fc區；
    較佳地，該Fc區是人IgG1或IgG4的Fc區；
    更佳地，該人IgG1具有去除或降低Fc效應器功能的突變；
    最佳地，該人IgG1具有選自N297A、D265A/N297A、L234A/L235A、L234A/L235A/P329G、L234E、L234F、L234E/L235F和L234E/L235F/P329G的突變。
  14. 如請求項11至13中任一項所述的FAP結合分子，其包含重鏈和輕鏈，其中，
    該重鏈為SEQ ID NO：51所示或與之具有至少90%同一性的胺基酸序列，該輕鏈為SEQ ID NO：52所示或與之具有至少90%同一性的胺基酸序列；
    該重鏈為SEQ ID NO：49所示或與之具有至少90%同一性的胺基酸序列，該輕鏈為SEQ ID NO：50所示或與之具有至少90%同一性的胺基酸序列；
    該重鏈為SEQ ID NO：53所示或與之具有至少90%同一性的胺基酸序列，該輕鏈為SEQ ID NO：54所示或與之具有至少90%同一性的胺基酸序列；或
    該重鏈為SEQ ID NO：55所示或與之具有至少90%同一性的胺基酸序列，該輕鏈為SEQ ID NO：56所示或與之具有至少90%同一性的胺基酸序列。
  15. 如請求項11至14中任一項所述的FAP結合分子，其為抗FAP抗體或其抗原結合片段；
    較佳地，該抗FAP抗體或其抗原結合片段選自：雙或多特異性抗體、scFv、scFv二聚體、dsFv、(dsFv)2、dsFv-dsFv'、Fv片段、Fab、Fab'或F(ab')2；
    較佳地，該抗FAP抗體或其抗原結合片段為嵌合抗體、人源化抗體、全人抗體或其抗原結合片段。
  16. 一種CD40結合分子，其包含結合CD40的免疫球蛋白單一可變結構域，該免疫球蛋白單一可變結構域包含三個互補決定區CDR1、CDR2、 CDR3，該CDR1、CDR2、CDR3分別包含如SEQ ID NO：39、40、41所示的胺基酸序列；
    較佳地，該CDR1、CDR2、CDR3分別包含如SEQ ID NO：24、25、26所示的胺基酸序列；或，該CDR1、CDR2、CDR3分別包含如SEQ ID NO：27、28、29所示的胺基酸序列。
  17. 如請求項16所述的CD40結合分子，其包含SEQ ID NO：22、23、32至38中任一所示或與之具有至少90%同一性的胺基酸序列。
  18. 如請求項16或17所述的CD40結合分子，其還包含人免疫球蛋白Fc區；
    較佳地，該Fc區是人IgG1或IgG4的Fc區；
    更佳地，該人IgG1的Fc區具有能夠增加與FcγRIIb親和力和/或減弱ADCC效應的突變；
    最佳地，該人IgG1的Fc區具有選自S267E/L328F、L234A/L235A、N297A、L234F、L235E、L234F/L235E/D265A、L234A/L235A/G237A/P238S/H268A/A330S/P331S、和E233D/G237D/P238D/H268D/P271G/A330R中的突變。
  19. 如請求項16至18中任一項所述的CD40結合分子，其包含如SEQ ID NO：57至63中任一所示或與之具有至少90%同一性的胺基酸序列。
  20. 如請求項16至19任一項所述的CD40結合分子，其為抗CD40抗體或其抗原結合片段；
    較佳地，該抗CD40抗體或其抗原結合片段選自線性抗體、單鏈抗體、奈米抗體、肽抗體、結構域抗體和多特異性抗體；
    較佳地，該抗CD40抗體或其抗原結合片段為駱駝抗體、嵌合抗體、人源化抗體、全人抗體或其抗原結合片段。
  21. 一種FAP/CD40結合分子，其包含特異性結合FAP的第一抗原結合結構域和特異性結合CD40的第二抗原結合結構域，該特異性結合CD40的第二抗原結合結構域包含至少一個免疫球蛋白單一可變結構域，該免疫球蛋白單一可變結構域包含三個互補決定區CDR1、CDR2和CDR3，該CDR1、CDR2、CDR3分別包含如SEQ ID NO：39、40、41所示的胺基酸序列；
    較佳地，該CDR1、CDR2、CDR3分別包含如SEQ ID NO：24、25、26所示的胺基酸序列；或該CDR1、CDR2、CDR3分別包含如SEQ ID NO：27、28、29所示的胺基酸序列。
  22. 如請求項21所述的FAP/CD40結合分子，其中該特異性結合CD40的第二抗原結合結構域中的免疫球蛋白單一可變結構域包含如SEQ ID NO：22、23、32至38任一所示或與SEQ ID NO：22、23、32至38任一具有至少90%序列同一性的胺基酸序列。
  23. 如請求項1至10和21至22中任一項所述的FAP/CD40結合分子，其為抗FAP/CD40雙特異性抗體。
  24. 一種多核苷酸，其編碼如請求項1至10和21至23中任一項所述的FAP/CD40結合分子、如請求項11至15中任一項所述的FAP結合分子、或如請求項16至20中任一項所述的CD40結合分子。
  25. 一種載體，其含有如請求項24所述的多核苷酸。
  26. 一種宿主細胞，其含有或表達如請求項24所述的多核苷酸或如請求項25所述的載體。
  27. 一種醫藥組成物，其含有如請求項1至10和21至23中任一項所述的FAP/CD40結合分子、如請求項11至15中任一項所述的FAP結合分子、或如請求項16至20中任一項所述的CD40結合分子，以及至少一種可藥用的賦形劑、稀釋劑或載體。
  28. 一種如請求項1至10和21至23中任一項所述的FAP/CD40結合分子、如請求項11至15中任一項所述的FAP結合分子、如請求項16至20中任一項所述的CD40結合分子、如請求項24所述的多核苷酸、或如請求項27所述的醫藥組成物在製備治療或緩解疾病或病症的藥物中的用途；
    該疾病或病症較佳為腫瘤或癌症；
    更佳為肺癌、前列腺癌、乳腺癌、頭頸部癌、食管癌、胃癌、結直腸癌、膀胱癌、宮頸癌、子宮癌、卵巢癌、肝癌、黑色素瘤、腎癌、鳞狀細胞癌、血液系統癌症。
  29. 一種治療或緩解腫瘤或癌症的方法，該方法包括：
    向有需要的受試者施用治療有效量的如請求項1至10和21至23中任一項所述的FAP/CD40結合分子、如請求項11至15中任一項所述的FAP結合分子、如請求項16至20中任一項所述的CD40結合分子、如請求項24所述的多核苷酸、或如請求項27所述的醫藥組成物；
    該腫瘤或癌症較佳為肺癌、前列腺癌、乳腺癌、頭頸部癌、食管癌、胃癌、結直腸癌、膀胱癌、宮頸癌、子宮癌、卵巢癌、肝癌、黑色素瘤、腎癌、鳞狀細胞癌、血液系統癌症。
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US7771951B2 (en) 2001-12-03 2010-08-10 Amgen Fremont Inc. Antibody categorization based on binding characteristics
AU2015213405B2 (en) * 2010-08-13 2017-08-03 Roche Glycart Ag Anti-FAP antibodies and methods of use
MY190604A (en) 2011-02-10 2022-04-27 Roche Glycart Ag Mutant interleukin-2 polypeptides
CN108368510B (zh) * 2015-09-30 2023-09-01 詹森生物科技公司 特异性结合人cd40的激动性抗体和使用方法
JP7122311B2 (ja) * 2017-01-03 2022-08-19 エフ・ホフマン－ラ・ロシュ・アクチェンゲゼルシャフト 抗４－１ｂｂクローン２０ｈ４．９を含む二重特異性抗原結合分子
SG11201908787WA (en) * 2017-04-04 2019-10-30 Hoffmann La Roche Novel bispecific antigen binding molecules capable of specific binding to cd40 and to fap
PE20211863A1 (es) * 2018-10-01 2021-09-21 Hoffmann La Roche Moleculas de union a antigeno biespecificas que comprenden el clon 212 anti-fap
US20220025060A1 (en) 2018-11-30 2022-01-27 Jiangsu Hengrui Medicine Co., Ltd. Anti-cd40 antibody, antigen binding fragmentand pharmaceutical use thereof
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