TW202327649A

TW202327649A - Ｐｖｒｉｇ／ｔｉｇｉｔ結合蛋白聯合免疫檢查點抑制劑用於治療癌症

Info

Publication number: TW202327649A
Application number: TW111134966A
Authority: TW
Inventors: 林侃; 林�源; 袁吉民; 孫星; 廖成
Original assignee: 大陸商江蘇恆瑞醫藥股份有限公司; 大陸商上海盛迪醫藥有限公司
Priority date: 2021-09-15
Filing date: 2022-09-15
Publication date: 2023-07-16
Also published as: WO2023040940A1

Abstract

本揭露關於PVRIG/TIGIT結合蛋白聯合免疫檢查點抑制劑用於治療癌症。具體地，本揭露關於PVRIG/TIGIT結合蛋白與免疫檢查點抑制劑聯合在製備治療癌症的藥物中的用途。

Description

PVRIG/TIGIT結合蛋白聯合免疫檢查點抑制劑用於治療癌症

本揭露要求2021年09月15日提交的中國專利申請(申請號CN202111078575.1)的優先權。

本揭露屬於醫藥領域，具體地，本揭露關於PVRIG/TIGIT結合蛋白聯合免疫檢查點抑制劑用於治療癌症的用途。

PVRIG(Poliovirus receptor-related Ig domain containing protein)又名CD112R，與TIGIT(T cell immunoglobulin and ITIM domain)、CD96和CD226等同屬B7/CD28超家族，在免疫系統中起重要作用。當PVRIG的配體PVRL2(又名CD112)結合PVRIG時，會活化PVRIG胞內區的ITIM結構域，使PVRIG起到免疫抑制的作用。PVRIG主要表達在CD4⁺T細胞，CD8⁺T細胞和NK細胞的表面。PVRIG和其配體PVRL2在多種實體瘤中高表達，包括肺癌、乳腺癌、卵巢癌、腎癌、胃癌、子宮內膜癌、頭頸癌等。PVRIG在這些癌症中的表達與TIGIT和PD-1有高度相關性。與PD-1和TIGIT相似，PVRIG陽性的T細胞也會呈現 Eomes陽性和Tbet陰性，表明PVRIG與T細胞的耗竭有關。因此，PVRIG可能代表了除了PD-1和TIGIT之外的有一個新的免疫檢查點，並起到冗餘(redundancy)的作用。體外細胞實驗和小鼠模型中顯示，對小鼠PVRIG的剔除或抑制，可以有效抑制癌症的生長，並與PD-1和TIGIT抑制劑發生協調作用。TIGIT在淋巴細胞上高度表達，包括浸潤不同類型癌症的癌症浸潤淋巴細胞(TIL)和Treg。已經證明TIGIT與其同源配體PVR(又名CD155)的接合藉由其細胞質ITIM結構域直接抑制NK細胞的細胞毒性。PVR也在癌症中廣泛表達，表明TIGIT-PVR信號軸可能是癌症的主要免疫逃逸機制。抑制性受體TIGIT、PVRIG與激活型受體DNAM-1結合同樣的配體CD155與CD112，但抑制性受體的親和力更高(Y.Zhu等人2016，J Exp Med.213：167-176)。腫瘤病人體內分離的NK細胞的DNAM-1表達下調，導致NK細胞更易受到TIGIT或PVRIG的抑制，阻斷TIGIT與PVRIG的結合，能夠激活NK細胞的細胞殺傷功能(L.Martinet等人2015，Cell Reports.11：85-97)。

雖然PD-1/PD-L1是目前臨床最成功的免疫檢查點抑制劑單抗，但T細胞表面其他免疫檢查點的表達上調會限制其療效。TIGIT和PVRIG除了調控T細胞的功能，還調控NK細胞活性，提示與PD-1/PD-L1在NK細胞中的功能可能產生協同。文獻報導TIGIT與PVRIG的配體CD155與CD112在肺癌、卵巢癌、結直腸癌、黑色素瘤中的高表達與PD-1/PD-L1治療不良預後顯著相關。如CD155表達高的患者對PD-1抗體響應差，而CD155表達低的患者對PD-1響應好(S.Whelan等人2019，Cancer Immunol Res.7：257-268；A.Lepletier等人2020，Clin Cancer Res.26：3671-3681)。

聯用抗PVRIG/TIGIT雙抗與PD-1/PD-L1潛在能夠從增強T細胞、NK細胞激活，克服PD-1/PD-L1耐藥與拓展應答患者人群等方面提高抗腫瘤治療的效果。本揭露旨在提供具有抑制體內腫瘤生長的高親和力、高選擇性、高生物活性的抗PVRIG/TIGIT雙特異性抗體與免疫檢查點抑制劑(如PD-1或PD-L1抗體)聯合用於治療癌症的用途，並顯示了良好的抑瘤效果，有潛力在臨床提供比現有PD-1、TIGIT、PVRIG藥物或其聯用更佳的療效。

本揭露提供PVRIG結合蛋白或PVRIG/TIGIT結合蛋白與免疫檢查點抑制劑聯合在製備治療疾病(例如，癌症)的藥物中的用途、或用於治療疾病(例如，癌症)的方法。

本揭露提供一種PVRIG結合蛋白和TIGIT結合蛋白聯合在製備治療疾病(例如，癌症)的藥物中的用途、或用於治療疾病(例如，癌症)的方法。一些實施方案中，在聯合使用時，還進一步包括免疫檢查點抑制劑。

本揭露提供一種PVRIG結合蛋白、TIGIT結合蛋白和免疫檢查點抑制劑聯合在製備治療疾病(例如，癌症)的藥物中的用途、或用於治療疾病(例如，癌症)的方法。

一些實施方案中，提供PVRIG結合蛋白(例如，抗PVRIG抗體或其抗原結合片段)與免疫檢查點抑制劑聯合在製備治療癌症的藥物中的用途，該PVRIG結合蛋白包含免疫球蛋白單一可變結構域，該免疫球蛋白單一可變結構域包含：

如SEQ ID NO：2、15-19任一所示胺基酸序列中的CDR1、CDR2和CDR3，或

如SEQ ID NO：3、21-25任一所示胺基酸序列中的CDR1、CDR2和CDR3，

該CDR1、CDR2和CDR3是根據Kabat、IMGT、Chothia、AbM或Contact編號系統定義的；

一些具體實施方案中，根據Kabat編號系統，該免疫球蛋白單一可變結構域的CDR1、CDR2和CDR3的胺基酸序列分別

如SEQ ID NO：4、5、20所示，

如SEQ ID NO：4、5、6所示，或

如SEQ ID NO：7、8、9所示。

一些實施方案中，前述PVRIG中的免疫球蛋白單一可變結構域為至少一個，例如，2、3、4、5、6、7、8個。

一些實施方案中，前述PVRIG結合蛋白的免疫球蛋白單一可變結構域是人源化、親和力成熟、去除T細胞表位、降低抗體脫醯胺和/或降低抗體異構化改造的；一些具體實施方案中，人源化改造過程使用的人種系模板的重鏈框架區為IGHV3-7 *01。

一些實施方案中，前述PVRIG結合蛋白的免疫球蛋白單一可變結構域的胺基酸序列分別如

SEQ ID NO：2、15-19任一所示；或SEQ ID NO：3、21-25任一所示；或與前述序列任一具有至少80%、至少90%序列同一性。

一些實施方案中，前述PVRIG結合蛋白還包含人免疫球蛋白Fc區；

較佳地，該Fc區是人IgG1或IgG4的Fc區；

更佳地，該人IgG4的Fc區具有S228P、F234A、L235A和/或K447A突變。

一些實施方案中，提供前述PVRIG結合蛋白和TIGIT結合蛋白(例如，抗TIGIT抗體或其抗原結合片段)與免疫檢查點抑制劑聯合在製備治療癌症的藥物中的用途。

一些實施方案中，該TIGIT結合蛋白包含重鏈可變區(VH)和輕鏈可變區(VL)，其中，

該重鏈可變區包含分別如SEQ ID NO：32、33和34所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3，該輕鏈可變區包含分別如SEQ ID NO：35、36和37所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3。該CDR1、CDR2和CDR3是根據Kabat編號系統定義的。

一些實施方案中，前述特異性結合TIGIT結合蛋白包含重鏈可變區(VH)和輕鏈可變區(VL)，其中，

該重鏈可變區包含如SEQ ID NO：38-40中任一所示或與之具有至少80%、至少90%序列同一性的胺基酸序列，

該輕鏈可變區包含如SEQ ID NO：41或42所示或與之具有至少80%、至少90%序列同一性的胺基酸序列；

例如，該重鏈可變區包含如SEQ ID NO：3所示或與之具有至少80%、至少90%序列同一性的胺基酸序列，

該輕鏈可變區包含如SEQ ID NO：42所示或與之具有至少80%、至少90%序列同一性的胺基酸序列。

一些實施方案中，前述TIGIT結合蛋白還包含人免疫球蛋白Fc區；

較佳地，該Fc區是人IgG1或IgG4的Fc區；

更佳地，該人IgG4的Fc區具有S228P、F234A、L235A和/或K447A突變。

一些具體實施方案中，前述特異性結合TIGIT結合蛋白包含如SEQ ID NO：26所示的重鏈全長序列或與之具有至少80%、至少90%序列同一性，和如SEQ ID NO：27所示的輕鏈全長序列或與之具有至少80%、至少90%序列同一性。

一些實施方案中，提供PVRIG/TIGIT結合蛋白(例如，抗PVRIG/TIGIT雙特異性抗體或其抗原結合片段)與免疫檢查點抑制劑聯合在製備治療癌症的藥物中的用途，該PVRIG/TIGIT結合蛋白包含特異性結合PVRIG的第一抗原結合結構域和特異性結合TIGIT的第二抗原結合結構域，該特異性結合PVRIG的第一抗原結合結構域包含免疫球蛋白單一可變結構域，該免疫球蛋白單一可變結構域包含：

如SEQ ID NO：2和15-19中任一所示胺基酸序列中的CDR1、CDR2和CDR3，或

如SEQ ID NO：3和21-25中任一所示胺基酸序列中的CDR1、CDR2和CDR3，

如SEQ ID NO：4、5和20所示，

如SEQ ID NO：4、5和6所示，或

如SEQ ID NO：7、8和9所示。

一些實施方案中，前述特異性結合PVRIG的第一抗原結合結構域是人源化、親和力成熟、去除T細胞表位、降低抗體脫醯胺和/或降低抗體異構化改造的；一些具體實施方案中，人源化改造過程使用的人種系模板的重鏈框架區為IGHV3-7 *01。

一些實施方案中，前述特異性結合PVRIG的第一抗原結合結構域中免疫球蛋白單一可變結構域的胺基酸序列分別如SEQ ID NO：2和15-19中任一所示；或如SEQ ID NO：3和21-25中任一所示；或與前述序列任一具有至少80%序列同一性，例如，至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%的序列同一性。

一些實施方案中，前述特異性結合TIGIT的第二抗原結合結構域包含重鏈可變區(VH)和輕鏈可變區(VL)，其中，

該重鏈可變區包含分別如SEQ ID NO：32、33和34所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3，該輕鏈可變區包含分別如SEQ ID NO：35、36和37所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3。

該重鏈可變區包含如SEQ ID NO：38-40中任一所示或與之具有至少80%，例如，至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列同一性的胺基酸序列，

該輕鏈可變區包含如SEQ ID NO：41或42所示或與之具有至少80%，例如，至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列同一性的胺基酸序列；

例如，該重鏈可變區包含如SEQ ID NO：38所示或與之具有至少80%，例如，至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列同一性的胺基酸序列，

該輕鏈可變區包含如SEQ ID NO：42所示或與之具有至少80%，例如，至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列同一性的胺基酸序列。

一些實施方案中，前述PVRIG/TIGIT結合蛋白還包含人免疫球蛋白Fc區；

較佳地，該Fc區是人IgG1或IgG4的Fc區；

更佳地，該人IgG4的Fc區具有S228P、F234A、L235A和/或K447A突變。

一些實施方案中，前述特異性結合PVRIG的第一抗原結合結構域和特異性結合TIGIT的第二抗原結合結構域直接或藉由連接子相連接；

例如，該連接子為具有如(G₄S)_x所示的胺基酸序列，其中，x獨立地選自1-20的整數；

又例如，該連接子為(G₄S)₂、(G₄S)₃、(G₄S)₄所示的胺基酸序列。

一些實施方案中，前述PVRIG/TIGIT結合蛋白中：

該特異性結合PVRIG的第一抗原結合結構域的免疫球蛋白單一可變結構域位於特異性結合TIGIT的第二抗原結合結構域的重鏈可變區的N端；

該特異性結合PVRIG的第一抗原結合結構域的免疫球蛋白單一可變結構域位於特異性結合TIGIT的第二抗原結合結構域的重鏈可變區的C端；

該特異性結合PVRIG的第一抗原結合結構域的免疫球蛋白單一可變結構域位於特異性結合TIGIT的第二抗原結合結構域的輕鏈可變區的N端；和/或

該特異性結合PVRIG的第一抗原結合結構域的免疫球蛋白單一可變結構域位於特異性結合TIGIT的第二抗原結合結構域的輕鏈可變區的C端。

一些實施方案中，提供PVRIG/TIGIT結合蛋白，其包含第一多肽鏈和第二多肽鏈，其中，

該第一多肽鏈包含如SEQ ID NO：28-29和43-45中任一所示、或與其具有至少80%，例如，至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列同一性的胺基酸序列，該第二多肽鏈包含如SEQ ID NO：27所示、或與其具有至少80%，例如，至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列同一性的胺基酸序列；或者

該第一多肽鏈包含如SEQ ID NO：26所示、或與其具有至少80%，例如，至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列同一性的胺基酸序列，該第二多肽鏈包含如SEQ ID NO：30或31所示、或與其具有至少80%，例如，至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列同一性的胺基酸序列。

一些具體實施方案中，前述PVRIG/TIGIT結合蛋白包含兩條相同的第一多肽鏈和兩條相同的第二多肽鏈。一些實施方案中，如前該免疫檢查點抑制劑包括但不限於靶向PD-1/PD-L1、PD-L2、B7-1/CTLA-4、B7-2/CTLA-4、B7-1/CD28、B7-2/CD28、B7-H2/ICOS、B7-H3、B7-H4、B7-H7、VISTA(PD-1H)、BTNL2、TIM3、LAG3、TNFSF/TNFRSF(如CD40-CD40L、CD27-CD70或OX40-OX40L)、白細胞免疫球蛋白樣受體(LIR/LILR)或免疫球蛋白樣轉錄子(ILT)、黏連蛋白或類黏連蛋白受體蛋白(如DNAM-1、CD226、PTA1、TLISA1、CD96、TIGIT、Vstm3和VSIG9)、NKG2A、KIRs、NKG2A、Siglecs family(Siglec-7/9)、CD47、CD94、CD200信號通路的抑制劑。

一些實施方案中，如前所述的免疫檢查點抑制劑包括但不限於蛋白或多肽、小分子、核酸類藥物。一些具體實施方案中，該免疫檢查點抑制劑為PD-1結合蛋白和/或PD-L1結合蛋白。在一些實施方案中，該免疫檢查點抑制劑為抗PD-1抗體、抗PD-L1抗體、該抗體的抗原結合片段、或包含該抗體或其抗原結合片段的融合蛋白。一些實施方案中，前述PD-1結合蛋白(例如，包含或為抗PD-1抗體或其抗原結合片段)包含：

分別如SEQ ID NO：59、60和61所示胺基酸序列的HCDR1、HCDR2和HCDR3，和分別如SEQ ID NO：62、63和64所示胺基酸序列的LCDR1、LCDR2和LCDR3；或

分別如SEQ ID NO：67、68和69所示胺基酸序列的HCDR1、HCDR2和HCDR3，和分別如SEQ ID NO：70、71和72所示胺基酸序列的LCDR1、LCDR2和LCDR3。

一些具體實施方案中，前述PD-1結合蛋白(例如，包含或為抗PD-1抗體或其抗原結合片段)包含重鏈可變區(VH)和輕鏈可變區(VL)，其中，

該重鏈可變區包含如SEQ ID NO：57所示或與之具有至少80%，例如，至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列同一性的胺基酸序列，該輕鏈可變區包含如SEQ ID NO：58所示或與之具有至少80%，例如，至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列同一性的胺基酸序列；或

該重鏈可變區包含如SEQ ID NO：73所示或與之具有至少80%，例如，至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列同一性的胺基酸序列，該輕鏈可變區包含如SEQ ID NO：74所示或與之具有至少80%，例如，至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列同一性的胺基酸序列。

一些實施方案中，前述PD-1結合蛋白還包含人免疫球蛋白Fc區；

較佳地，該Fc區是人IgG1或IgG4的Fc區；

更佳地，該人IgG4的Fc區具有S228P、F234A、L235A和/或K447A突變。

一些實施方案中，前述PD-1結合蛋白包含重鏈(HC)和輕鏈(LC)，其中，

該的胺基酸序列。

在一個實施方案中，該PD-1結合蛋白為抗PD-1抗體：卡瑞利珠單抗(Camrelizumab)；

該卡瑞利珠單抗抗體具有如下所示的CDR：

HCDR1為SYMMS(SEQ ID NO：67)

HCDR2為TISGGGANTYYPDSVKG(SEQ ID NO：68)

HCDR3為QLYYFDY(SEQ ID NO：69)

LCDR1為LASQTIGTWLT(SEQ ID NO：70)

LCDR2為TATSLAD(SEQ ID NO：71)

LCDR3為QQVYSIPWT(SEQ ID NO：72)

>該抗PD-1抗體卡瑞利珠單抗抗體的VH為

(SEQ ID NO：73)

>該抗PD-1抗體卡瑞利珠單抗抗體的VL為

(SEQ ID NO：74)

上述抗PD-1抗體重輕鏈可變區序列中，下劃線部分為CDR區，各序列依次順序為FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4。

>該抗PD-1抗體卡瑞利珠單抗的HC(Fc區具有S228P突變)為

(SEQ ID NO：75)

>該抗PD-1抗體卡瑞利珠單抗的LC為

(SEQ ID NO：76)。

一些實施方案中，前述PD-1結合蛋白包含或為抗PD-1抗體或其抗原結合片段，包括但不限於辛提利單抗(sintilimab)、西米普利單抗(cemiplimab)、JS-001、納武單抗(nivolumab)、替雷利珠單抗(tislelizumab)、匹博利珠單抗(pembrolizumab)、AK-103、多塔利單抗(dostarlimab)、PD1-PIK、GLS-010、杰諾單抗(genolimzumab)、BI- 754091、司巴塔利珠單抗(spartalizumab)、MGA-012、PF-06801591、XmAb-20717、CS-1003、Sym-021、AGEN-2034、MEDI-5752、MGD-013、AK-105、AK-104、BCD-100、PF-06753512、HLX-10、AMP-224、LZM-009。此處全文引入WO2020156509、WO2017054646中的抗PD-1抗體或其抗原結合片段。一些實施方案中，前述PD-L1結合蛋白(例如，包含或為抗PD-L1抗體或其抗原結合片段)包含

分別如SEQ ID NO：48、49和50所示胺基酸序列的HCDR1、HCDR2和HCDR3，和分別如SEQ ID NO：51、52和53所示胺基酸序列的LCDR1、LCDR2和LCDR3。

一些具體實施方案中，前述PD-L1結合蛋白包含重鏈可變區(VH)和輕鏈可變區(VL)，其中，

該重鏈可變區包含如SEQ ID NO：46所示或與之具有至少80%，例如，至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列同一性的胺基酸序列，該輕鏈可變區包含如SEQ ID NO：47所示或與之具有至少80%，例如，至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列同一性的胺基酸序列。

一些實施方案中，前述PD-L1結合蛋白還包含人免疫球蛋白Fc區；

例如，該Fc區是人IgG1或IgG4的Fc區；

又例如，該人IgG4的Fc區具有S228P、F234A、L235A和/或K447A突變。

一些實施方案中，前述PD-L1結合蛋白包含重鏈(HC)和輕鏈(LC)，其中，

該重鏈包含如SEQ ID NO：54所示或與之具有至少80%，例如，至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列同一性的胺基酸序列，該輕鏈包含如SEQ ID NO：55所示或與之具有至少80%，例如，至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列同一性的胺基酸序列。

一些實施方案中，前述PD-L1結合蛋白為抗PD-L1抗體或其抗原結合片段，包括但不限於阿維魯單抗(avelumab)、阿特利珠單抗(atezolizumab)、度伐魯單抗(durvalumab)、CS-1001、M-7824、KL-A167、CX-072、BGB-A333、GNS-1480、CA-170、BMS-936559。此處全文引入WO2017084495、WO2020094122中的抗PD-L1抗體。一些實施方案中，前述PD-L1結合蛋白為融合蛋白，該融合蛋白包含抗PD-1抗體或其抗原結合片段和TGF-β trap或TGF-βRII ECD；一些具體實施方案中，該TGF-βRII ECD的胺基酸序列如SEQ ID NO：56所示。

一些實施方案中，前述融合蛋白中，該TGF-βRII ECD藉由連接子與重鏈全長的C端連接，該連接子包含或為如(G₄S)_x所示的胺基酸序列，其中，x獨立地選自1-20的整數；一些具體實施方案中，該連接子為(G₄S)₄G、(G₄S)₃G、(G₄S)₂G、(G₄S)G。

一些實施方案中，前述融合蛋白包含第一多肽鏈和第二多肽鏈，其中，

該第一多肽鏈包含如SEQ ID NO：77或78所示或與之具有至少80%，例如，至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列同一性的胺基酸序列，該第二多肽鏈包含如SEQ ID NO：55所示或與之具有至少80%，例如，至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列同一性的胺基酸序列。

一些具體實施方案中，前述PD-L1結合蛋白包含兩條相同的第一多肽鏈和兩條相同的第二多肽鏈。

一些實施方案中，前述PD-L1結合蛋白包含或為抗PD-L1抗體或其抗原結合片段與TGF-β trap的融合蛋白，包括但不限於M7824、GS-19、TS-1905、TST-005、HBM-7015、PM-8001、抗PDL1-TGF βRIIecd。此處全文引入WO2011109789、WO2015118175、WO2018218215、WO2020248926、WO2019222252、WO2021007428、WO2021063352、WO2021063350中的抗PD-L1抗體或其抗原結合片段與TGF βRIIecd或TGF-β trap的融合蛋白。本揭露提供了一種PVRIG結合蛋白和TIGIT結合蛋白聯合在製備治療癌症的藥物中的用途，具體實施方案中，該PVRIG 結合蛋白包含如SEQ ID NO：16所示的免疫球蛋白單一可變結構域，以及該TIGIT結合蛋白包含如SEQ ID NO：26所示的HC和如SEQ ID NO：27所示的LC。本揭露提供了一種PVRIG結合蛋白、TIGIT結合蛋白和免疫檢查點抑制劑聯合在製備治療癌症的藥物中的用途，具體實施方案中，該PVRIG結合蛋白包含如SEQ ID NO：16所示的免疫球蛋白單一可變結構域；該TIGIT結合蛋白包含如SEQ ID NO：26所示的HC和如SEQ ID NO：27所示的LC；以及該免疫檢查點抑制劑選自：

PD-1結合蛋白，其包含胺基酸序列如SEQ ID NO：65所示HC和胺基酸序列如SEQ ID NO：66所示的LC；

PD-1結合蛋白，其包含胺基酸序列如SEQ ID NO：75所示HC和胺基酸序列如SEQ ID NO：76所示的LC；

PD-L1結合蛋白，其包含胺基酸序列如SEQ ID NO：54所示HC和胺基酸序列如SEQ ID NO：55所示的LC；或

PD-L1結合蛋白，其包含胺基酸序列如SEQ ID NO：77所示HC和胺基酸序列如SEQ ID NO：55所示的LC。本揭露還提供了一種PVRIG/TIGIT結合蛋白和免疫檢查點抑制劑聯合在製備治療癌症的藥物中的用途，具體實施方案中，該PVRIG/TIGIT結合蛋白包含如SEQ ID NO：43所示的HC(即第一多肽鏈)和如SEQ ID NO：27所示的LC(即第二多肽鏈)，以及該免疫檢查點抑制劑選自：

PD-1結合蛋白，其包含如SEQ ID NO：65所示HC和如SEQ ID NO：66所示的LC；

PD-1結合蛋白，其包含如SEQ ID NO：75所示HC和如SEQ ID NO：76所示的LC；

PD-L1結合蛋白，其包含如SEQ ID NO：54所示HC和如SEQ ID NO：55所示的LC；或

PD-L1結合蛋白，其包含如SEQ ID NO：77所示HC和如SEQ ID NO：55所示的LC。一些實施方案中，該癌症或腫瘤選自以下或其組合：前列腺癌、肝癌(HCC)、結直腸癌、卵巢癌、子宮內膜癌、乳腺癌、三陰性乳腺癌、胰腺癌、胃(stomach/gastric)癌、宮頸癌、頭頸癌、甲狀腺癌、睾丸癌、尿路上皮癌、肺癌(小細胞肺癌、非小細胞肺癌)、黑色素瘤、非黑色素瘤皮膚癌(鱗狀和基底細胞癌)、神經膠質瘤、腎癌(RCC)、淋巴瘤(NHL或HL)、急性骨髓性白血病(AML)、T細胞急性淋巴母細胞性白血病(T-ALL)、彌漫性大B細胞淋巴瘤、睾丸生殖細胞腫瘤、間皮瘤、食道癌、默克細胞癌(Merkel Cells cancer)、高MSI癌、KRAS突變腫瘤、成人T細胞白血病/淋巴瘤和骨髓增生異常綜合症(MDS)。上述病症可以是與PVRIG和/或TIGIT異常表達相關的。一些具體實施方案中，該癌症或腫瘤選自由以下癌症或其組合：黑色素瘤、三陰性乳腺癌、胃癌、肺癌(小細胞肺癌、非小細胞肺癌)、默克細胞癌、高MSI癌、KRAS突變腫瘤、成人T細胞白血病/淋巴瘤和骨髓增生異常綜合症(MDS)。一些具體實施方案中，該癌症或腫瘤選自由以下癌症或其組合：黑色素瘤、三陰性乳腺癌、胃癌、肺癌(小細胞肺癌、非小細胞肺癌)、默克細胞癌和高MSI癌。一些具體實施方案中，該癌症或腫瘤選自黑色素瘤。

一些實施方案中，該PVRIG結合蛋白(或其編碼多核苷酸)和TIGIT結合蛋白(或其編碼多核苷酸)，或PVRIG結合蛋白(或其編碼多核苷酸)、TIGIT結合蛋白(或其編碼多核苷酸)和免疫檢查點抑制劑(例如，PD-1/PD-L1抑制劑)，或PVRIG/TIGIT結合蛋白(或其編碼多核苷酸)和免疫檢查點抑制劑(例如，PD-1/PD-L1抑制劑)聯合用於癌症或腫瘤，給藥次序可以同時給藥、或者前後分開給藥。

一些實施方案中，該聯合的給藥途徑選自經口給藥、胃腸外給藥、經皮給藥，該胃腸外給藥包括但不限於靜脈注射、皮下注射、肌肉注射。

本揭露還提供了一種藥物套組，或者一種藥物包裝盒，其中含有前述的PVRIG結合蛋白和TIGIT結合蛋白，或PVRIG結合蛋白、TIGIT結合蛋白和免疫檢查點抑制劑，或PVRIG/TIGIT結合蛋白或其編碼多核苷酸和免疫檢查點抑制劑(例如，PD-1/PD-L1抑制劑)。

本揭露還提供了一種醫藥組成物，包含前述的有效量的PVRIG結合蛋白和TIGIT結合蛋白，或PVRIG結合蛋白、TIGIT結合蛋白和免疫檢查點抑制劑，或PVRIG/TIGIT結合蛋白或其編碼多核苷酸和免疫檢查點抑制劑，以及一種或多種可藥用的賦形劑、稀釋劑或載體。較佳地，該免疫檢查點抑制劑包括但不限於靶向PD-1/PD-L1、PD-L2、B7-1/CTLA-4、B7-2/CTLA-4、B7-1/CD28、B7-2/CD28、B7-H2/ICOS、B7-H3、B7-H4、B7-H7、VISTA(PD-1H)、BTNL2、TIM3、LAG3、TNFSF/TNFRSF(如CD40-CD40L、CD27-CD70或OX40-OX40L)、白細胞免疫球蛋白樣受體(LIR/LILR)或免疫球蛋白樣轉錄子(ILT)、黏連蛋白或類黏連蛋白受體蛋白(如DNAM-1、CD226、PTA1、TLISA1、CD96、TIGIT、Vstm3和VSIG9)、NKG2A、KIRs、NKG2A、Siglecs family(Siglec-7/9)、CD47、CD94、CD200信號通路的抑制劑；更佳地，該免疫檢查點抑制劑是PD-1/PD-L1信號通路抑制劑；最佳地，該PD-1/PD-L1信號通路抑制劑選自前述的PD-1結合蛋白或其編碼多核苷酸，和/或前述的PD-L1結合蛋白或其編碼多核苷酸。

本揭露提供一種產品，包含前述的有效量的PVRIG結合蛋白和TIGIT結合蛋白，或PVRIG結合蛋白、TIGIT結合蛋白和免疫檢查點抑制劑，或PVRIG/TIGIT結合蛋白和免疫檢查點抑制劑，或PVRIG結合蛋白和免疫檢查點抑制劑。

另一方面，本揭露還提供一種治療或緩解癌症的方法；包括向有需要的受試者施用治療或緩解有效量的PVRIG結合蛋白和TIGIT結合蛋白，或PVRIG結合蛋白、TIGIT結合蛋白和免疫檢查點抑制劑，或PVRIG/TIGIT結合蛋白或其編碼多核苷酸和免疫檢查點抑制劑。

以及，本揭露提供一種向有需要的受試者聯合施用治療或緩解有效量的PVRIG結合蛋白和TIGIT結合蛋白，或PVRIG結合蛋白、TIGIT結合蛋白和免疫檢查點抑制劑，或PVRIG/TIGIT結合蛋白和免疫檢查點抑制劑，或PVRIG結合蛋白和免疫檢查點抑制劑用於治療或緩解癌症的用途。

以及，本揭露提供一種前述PVRIG/TIGIT結合蛋白，或前述PVRIG結合蛋白和TIGIT結合蛋白治療或緩解癌症的方法，或前述PVRIG結合蛋白，包括施用免疫檢查點抑制劑。

以及，本揭露提供一種免疫檢查點抑制劑治療或緩解癌症的方法，包括施用前述PVRIG/TIGIT結合蛋白，或施用前述PVRIG結合蛋白和TIGIT結合蛋白，或前述PVRIG結合蛋白。

本揭露還提供一種活化NK細胞、γδT細胞和/或Th1細胞的方法，包含向有需要的受試者施用有效量的前述醫藥組成物或前述產品。

本揭露還提供一種增加受試者體內的IFN-γ產生和/或促炎性細胞因子分泌的方法，包含向有需要的受試者施用有效量的前述醫藥組成物或前述產品。

本揭露還提供一種抑制PD-1活性或促進T細胞增殖或使受試者從免疫反應上調獲益的方法，包括向受試者施用有效量的前述醫藥組成物或前述產品；例如，該受試者的PD-L1和/或PD-L2的表達是上調的；又例如，該受試者患有癌症。

一些實施方案中，前述PVRIG/TIGIT結合蛋白和前述免疫檢查點抑制劑具有抑制癌細胞生長的協同作用，相較於單藥療法，能夠顯著改善免疫檢查點抑制劑的抑癌效果。

本揭露全文引入PCT/CN2021/080470中的雙特異性抗體結構及其製備方法，特別是1708-30H2相關的。此外，本揭露提供多核苷酸和載體：

本揭露提供編碼本揭露的PVRIG結合蛋白、PVRIG/TIGIT結合蛋白、免疫檢查點抑制劑(例如，PD-1結合蛋白、PD-L1結合蛋白)的多核苷酸。本揭露的多核苷酸可為RNA、DNA或cDNA。根據本揭露的一些實施方案，本揭露的多核苷酸是基本上分離的多核苷酸。

本揭露的多核苷酸也可呈載體形式，可存在於載體中和/或可為載體的一部分，該載體例如質粒、黏端質粒、YAC或病毒載體。載體可尤其為表達載體，即可提供PD-1結合蛋白體外和/或體內(即在適合宿主細胞、宿主有機體和/或表達系統中)表達的載體。該表達載體通常包含至少一種本揭露的多核苷酸，其可操作地連接至一個或多個適合的表達調控元件(例如啟動子、增強子、終止子等)。針對在特定宿主中的表達對該元件及其序列進行選擇為所屬技術領域具有通常知識者的常識。對本揭露的PVRIG結合蛋白、PVRIG/TIGIT結合蛋白、免疫檢查點抑制劑(例如，PD-1結合蛋白、PD-L1結合蛋白)的表達有用或必需的調控元件及其他元件例如為啟動子、增強子、終止子、整合因子、選擇標記物、前導序列、報告基因。

本揭露的多核苷酸可基於本揭露的多肽的胺基酸序列的信息藉由已知的方式(例如藉由自動DNA合成和/或重組DNA技術)製備或獲得，和/或可從適合的天然來源加以分離。此外，本揭露提供宿主細胞：

本揭露提供表達或能夠表達一種或多種本揭露的PVRIG結合蛋白、PVRIG/TIGIT結合蛋白、免疫檢查點抑制劑(例如，PD-1結合蛋白、PD-L1結合蛋白)和/或含有本揭露的核酸或載體的重組宿主細胞。一些實施方案中，宿主細胞為細菌細胞、真菌細胞或哺乳動物細胞。

細菌細胞例如包括革蘭氏陰性細菌菌株(例如大腸桿菌(Escherichia coli)菌株、變形桿菌屬(Proteus)菌株及假單胞菌屬(Pseudomonas)菌株)及革蘭氏陽性細菌菌株(例如芽孢桿菌屬(Bacillus)菌株、鏈黴菌屬(Streptomyces)菌株、葡萄球菌屬(Staphylococcus)菌株及乳球菌屬(Lactococcus)菌株)的細胞。

真菌細胞例如包括木黴屬(Trichoderma)、脈孢菌屬(Neurospora)及麴菌屬(Aspergillus)的物種的細胞；或者包括酵母屬(Saccharomyces)(例如釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae))、裂殖酵母屬(Schizosaccharomyces)(例如粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe))、畢赤酵母屬(Pichia)(例如巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)及嗜甲醇畢赤酵母(Pichia methanolica))及漢森酵母屬(Hansenula)的物種的細胞。

哺乳動物細胞例如包括例如HEK293細胞、CHO細胞、BHK細胞、HeLa細胞、COS細胞等。

然而，本揭露也可使用兩棲類細胞、昆蟲細胞、植物細胞及本領域中用於表達異源蛋白的任何其他細胞。

本揭露的細胞不能發育成完成的植株或動物個體。此外，本揭露提供生產、製備方法：

本揭露提供製備本揭露的PVRIG結合蛋白、PVRIG/TIGIT結合蛋白、免疫檢查點抑制劑(例如，PD-1結合蛋白、PD-L1結合蛋白)的目的蛋白方法，該方法通常包含以下步驟：

-在允許表達本揭露的目的蛋白的條件下培養本揭露的宿主細胞；及

-從培養物回收由該宿主細胞表達的目的蛋白；及

-視需要的，包括進一步純化和/或修飾本揭露的目的蛋白。

本揭露的PVRIG結合蛋白、PVRIG/TIGIT結合蛋白、免疫檢查點抑制劑(例如，PD-1結合蛋白、PD-L1結合蛋白)可在如上所述細胞中以細胞內方式(例如在細胞質中、在周質中或在包涵體中)產生，接著從宿主細胞分離且視需要進一步純化；或其可以細胞外方式(例如在培養宿主細胞的培養基中)產生，接著自培養基分離且視需要進一步純化。

用於重組產生多肽的方法及試劑，例如特定適合表達載體、轉化或轉染方法、選擇標記物、誘導蛋白表達的方法、培養條件等在本領域中是已知的。類似地，適用於製造本揭露的結合分子或抗體等目的蛋白的分離及純化技術為所屬技術領域具有通常知識者所公知。生產和純化抗體的方法在現有技術中熟知和能找到，如冷泉港的抗體實驗技術指南(5-8章和15章)。本揭露工程化的抗體也可用常規方法製備和純化。比如，編碼重鏈和輕鏈的cDNA序列，可以選殖並重組至表達載體。重組的免疫球蛋白表達載體可以穩定地轉染細胞。哺乳動物類表達系統會導致抗體的糖基化，特別是在Fc區的高度保守N端。藉由表達與人源抗原特異性結合的抗體得到穩定的純株。陽性的純株在生物反應器的無血清培養基中擴大培養以生產抗體。分泌了抗體的培養液可以用常規技術純化、收集。抗體可用常規方法進行過濾濃縮。可溶的混合物和多聚體，也可以用常規方法去除，比如分子篩，離子交換。得到的產物需立即冷凍，如-70℃，或者凍乾。

然而，本揭露PVRIG結合蛋白、PVRIG/TIGIT結合蛋白、免疫檢查點抑制劑(例如，PD-1結合蛋白、PD-L1結合蛋白)也可以藉由本領域已知的其它產生蛋白質的方法獲得，例如化學合成，包括固相或液相合成。此外，本揭露提供組成物或組合：

本揭露提供組成物或組合，包含：

前述PVRIG/TIGIT結合蛋白和免疫檢查點抑制劑(例如，PD-1結合蛋白或PD-L1結合蛋白)；或，

前述PVRIG結合蛋白和免疫檢查點抑制劑(例如，PD-1結合蛋白或PD-L1結合蛋白)。

例如，提供醫藥組成物，其含有對癌症治療、緩解或預防有效量的如上所述的組成物或組合，和至少一種可藥用的賦形劑、稀釋或載體。

在一些具體實施方式中，該醫藥組成物單位計量中可含有0.01至99重量%的前述PVRIG/TIGIT結合蛋白和免疫檢查點抑制劑(例如，PD-1結合蛋白或PD-L1結合蛋白)，或醫藥組成物單位劑量中含前述PVRIG/TIGIT結合蛋白和免疫檢查點抑制劑(例如，PD-1結合蛋白或PD-L1結合蛋白)的量為0.1-2000mg，在一些具體實施方式中為1-1000mg。

一些實施方案中，提供製品或產品，包含組成物或組合。可選地，製品包含容器和標簽。容器例如瓶、注射器和試管。容器容納有效於治療病症的組成物或組合。容器上或與容器相連的標簽表明該組成物用於治療所選病症。示例性的，提供組成物或組合，其含有：

PVRIG/TIGIT結合蛋白和PD-1結合蛋白；或

PVRIG/TIGIT結合蛋白和PD-L1結合蛋白。

上述PVRIG/TIGIT結合蛋白包含特異性結合PVRIG的第一抗原結合結構域和特異性結合TIGIT的第二抗原結合結構域，其中，

該特異性結合PVRIG的第一抗原結合結構域包含免疫球蛋白單一可變結構域，該免疫球蛋白單一可變結構域包含：如SEQ ID NO：4、5、20所示的CDR1、CDR2和CDR3；

如SEQ ID NO：4、5、6所示的CDR1、CDR2和CDR3；

如SEQ ID NO：7、8、9所示的CDR1、CDR2和CDR3；

如SEQ ID NO：2、15-19任一所示或與之具有至少90%序列同一性的胺基酸序列；

如SEQ ID NO：3、21-25任一所示或與之具有至少90%序列同一性的胺基酸序列；

該特異性結合TIGIT的第二抗原結合結構域包含重鏈可變區(VH)和輕鏈可變區(VL)，該重鏈可變區包含如SEQ ID NO：38所示或與之具有至少90%序列同一性的胺基酸序列，該輕鏈可變區包含如SEQ ID NO：42所示或與之具有至少90%序列同一性的胺基酸序列。

上述PVRIG/TIGIT結合蛋白包含第一多肽鏈和第二多肽鏈，其中，

該第一多肽鏈包含如SEQ ID NO：28-29、43-45中任一所示的胺基酸序列，該第二多肽鏈包含如SEQ ID NO：27所示的胺基酸序列；或者

該第一多肽鏈包含如SEQ ID NO：26所示的胺基酸序列，該第二多肽鏈包含如SEQ ID NO：30、31所示的胺基酸序列。

上述PD-1結合蛋白包含重鏈可變區(VH)和輕鏈可變區(VL)，其中，

該重鏈可變區包含如SEQ ID NO：59、60、61所示胺基酸序列的HCDR1、HCDR2和HCDR3，該輕鏈可變區包含如SEQ ID NO：62、63、64所示胺基酸序列的LCDR1、LCDR2和LCDR3；

該重鏈可變區包含如SEQ ID NO：67、68、69所示胺基酸序列的HCDR1、HCDR2和HCDR3，該輕鏈可變區包含如SEQ ID NO：70、71、72所示胺基酸序列的LCDR1、LCDR2和LCDR3；

該重鏈可變區包含如SEQ ID NO：57所示或與之具有至少90%同一性的胺基酸序列，輕鏈可變區包含如SEQ ID NO：58所示或與之具有至少90%同一性的胺基酸序列；或

該重鏈可變區包含如SEQ ID NO：73所示或與之具有至少90%同一性的胺基酸序列，輕鏈可變區包含如SEQ ID NO：74所示或與之具有至少90%同一性的胺基酸序列。

上述PD-1結合蛋白包含重鏈全長(HC)和輕鏈全長(LC)，其中，

該重鏈全長包含如SEQ ID NO：65所示或與之具有至少90%同一性的胺基酸序列，輕鏈全長包含如SEQ ID NO：66所示或與之具有至少90%同一性的胺基酸序列；或

該重鏈全長包含如SEQ ID NO：75所示或與之具有至少90%同一性的胺基酸序列，輕鏈全長包含如SEQ ID NO：76所示或與之具有至少90%同一性的胺基酸序列。

上述PD-L1結合蛋白包含包含重鏈可變區(VH)和輕鏈可變區(VL)，其中，

該重鏈可變區包含如SEQ ID NO：48、49、50所示胺基酸序列的HCDR1、HCDR2和HCDR3，該輕鏈可變區包含如SEQ ID NO：51、52、53所示胺基酸序列的LCDR1、LCDR2和LCDR3；

該重鏈可變區包含如SEQ ID NO：46所示或與之具有至少90%同一性的胺基酸序列，輕鏈可變區包含如SEQ ID NO：47所示或與之具有至少90%同一性的胺基酸序列。

上述PD-L1結合蛋白包含重鏈全長(HC)和輕鏈全長(LC)，其中，

該重鏈全長包含如SEQ ID NO：54所示或與之具有至少80%同一性的胺基酸序列，輕鏈全長包含如SEQ ID NO：55所示或與之具有至少80%同一性的胺基酸序列。

上述PD-L1結合蛋白中還包含TGF-β RII ECD結構域，例如，該TGF-βRII ECD結構域的胺基酸序列如SEQ ID NO：56所示。

上述PD-L1結合蛋白包含第一多肽鏈和第二多肽鏈，該第一多肽鏈包含如SEQ ID NO：77或78所示或與之具有至少90%同一性的胺基酸序列，該第二多肽鏈包含如SEQ ID NO：55所示或與之具有至少90%同一性的胺基酸序列。

本揭露同時提供上述組成物或組合治療、緩解前述腫瘤的方法或製藥用途，活化NK細胞、γδT細胞和/或Th1細胞的方法或製藥用途，增加受試者體內的IFN-γ產生和/或促炎性細胞因子分泌的方法或用途，抑制PD-1活性或促進T細胞增殖或使受試者從免疫反應上調獲益的方法或用途，該受試者的PD-L1和/或PD-L2的表達可以是上調的。本揭露中，“至少90%(序列)同一性”涵蓋至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%(序列)同一性；“至少80%(序列)同一性”涵蓋至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%(序列)同一性。

圖1為抗PVRIG奈米抗體30、151的混合淋巴細胞反應(MLR)實驗結果，使用Tab5作為陽性對照，hIgG4作為陰性對照。

圖2為抗PVRIG/TIGIT雙抗1708-151H8的MLR實驗結果，同時檢測151H8、1708，hIgG4、Tab5、匹博利珠單抗作為對照。

圖3A為抗PVRIG/TIGIT雙抗1708-151、1708和151的聯用在人黑色素瘤A375混合人PBMC的小鼠皮下移植瘤模型中的小鼠體重圖，圖3B為對應的小鼠腫瘤體積圖。

圖4A為抗PVRIG/TIGIT雙抗1708-151H7和1708-30H2在人黑色素瘤A375混合人PBMC的小鼠皮下移植瘤模型中的小鼠體重圖，圖4B為對應的小鼠腫瘤體積圖。

圖5A為藥物A和B單獨或聯用時對人黑色素瘤A375混合PBMC皮下移植瘤模型的腫瘤體積的作用結果圖，圖5B為對應的腫瘤重量圖，圖5C為對應的小鼠體重圖，圖5D為對應的小鼠體重相對變化圖。

圖6A為藥物A和C單獨或聯用時對人黑色素瘤A375混合PBMC皮下移植瘤模型的腫瘤體積的作用結果圖，圖6B為對應的腫瘤重量圖，圖6C為對應的小鼠體重圖，圖6D為對應的小鼠體重相對變化圖。

圖7A為藥物A和D單獨或聯用時對人黑色素瘤A375混合PBMC皮下移植瘤模型的腫瘤體積的作用結果圖，圖7B為對應的腫瘤重量圖，圖7C為對應的小鼠體重圖。

術語定義

為了更容易理解本揭露，以下具體定義了某些技術和科學術語。除非在本揭露中另有明確定義，本揭露使用的所有其它技術和科學術語都具有本揭露所屬技術領域具有通常知識者通常理解的含義。

本揭露所用胺基酸三字母代碼和單字母代碼如J.biol.chem，243，p3558(1968)中所述。

“程序性死亡1”、“細胞程序性死亡1”、“蛋白PD-1”、“PD-1”、“PDCD1”和“hPD-1”可互換使用，且包括人PD-1的變體、同種型、物種同源物、以及與PD-1具有至少一個共同表位的類似物。完整的PD-1序列可以從GenBank登錄號U64863找到。“程序性死亡配體-1(PD-L1)”是PD-1的兩種細胞表面糖蛋白配體之一(另一種為PD-L2)，它在與PD-1結合時下調T細胞活化和細胞因子分泌。如本文中使用的“PD-L1”包括人PD- L1(hPD-L1)，hPD-L1的變體、同種型、和種間同源物，以及與hPD-L1具有至少一個共同表位的類似物。完整的hPD-L1序列可以用GenBank登錄號Q9NZQ7查到。

“PVRIG”或“PVRIG蛋白質”或“PVRIG多肽”可以視需要地包括任何這類蛋白質或其變異體、結合物或片段，包括(但不限於)如本文所述的已知或野生型PVRIG，以及任何天然產生的剪接變異體、胺基酸變異體或同工型，並且尤其是PVRIG的可溶性胞外域(ECD)片段。此處ECD的定義如專利WO2016134333中的。完整的人類PVRIG序列可以GenBank登錄號AAH73861.1找到。

“TIGIT”或“TIGIT蛋白質”或“TIGIT多肽”可以視需要地包括任何這類蛋白質或其變異體、結合物或片段，包括(但不限於)如本文所述的已知或野生型TIGIT，以及任何天然產生的剪接變異體、胺基酸變異體或同工型。完整的TIGIT序列可以GenBank登錄號AAI01289.1找到。

“與PVRIG結合”，指能與PVRIG或其表位相互作用，該PVRIG或其表位可以是人源的。“與TIGIT結合”，指能與TIGIT或其表位相互作用，該TIGIT或其表位可以是人源的。“抗原結合位點”指抗原上不連續的，由本揭露抗體或抗原結合片段識別的三維空間位點。

“免疫檢查點(immune checkpoint)分子”包括刺激性免疫檢查點分子和抑制性免疫檢查點分子，示例性分子包括CD27、CD28、CD40、CD40L、CD122、OX40、OX40L、GITR、ICOS、A2AR、B7-H3、B7-H4、B7-H7、BTLA、CTLA-4、IDO、KIR(Killer-cell Immunoglobulin-like Receptor)、LAG3、PD-1、PD-L1、PD-L2、TIM-3、VISTA、TIGIT、NKG2A等。

“抗體”以最廣義使用，涵蓋各種抗體結構，包括但不限於單株抗體，多株抗體；單特異性抗體，多特異性抗體(例如雙特異性抗體)，全長抗體和抗體片段(或抗原結合片段，或抗原結合部分)，只要它們展現出期望的抗原結合活性。抗體可以指免疫球蛋白，是由兩條相同的重鏈和兩條相同的輕鏈藉由鏈間二硫鍵連接而成的四肽鏈結構。免疫球蛋白重鏈恆定區的胺基酸組成和排列順序不同，故其抗原性也不同。據此，可將免疫球蛋白分為五類，或稱為免疫球蛋白的同種型，即IgM、IgD、IgG、IgA和IgE，其相應的重鏈分別為μ鏈、δ鏈、γ鏈、α鏈和ε鏈。同一類Ig根據其鉸鏈區胺基酸組成和重鏈二硫鍵的數目和位置的差別，又可分為不同的亞類，如IgG可分為IgG1、IgG2、IgG3、IgG4。輕鏈藉由恆定區的不同分為κ鏈或λ鏈。五類Ig中第每類Ig都可以有κ鏈或λ鏈。抗體重鏈和輕鏈靠近N端的約110個胺基酸的序列變化很大，為可變區(V區)；靠近C端的其餘胺基酸序列相對穩定，為恆定區(C區)。可變區包括3個高變區(CDR)和4個序列相對保守的骨架區(FR)。3個高變區決定抗體的特異性，又稱為互補性決定區(CDR)。每條輕鏈可變區(VL)和重鏈可變區(VH)由3個CDR區4個FR區組成，從胺基端到羧基端依次排列的順序為：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。輕鏈的3個CDR區指LCDR1、LCDR2、和LCDR3；重鏈的3個CDR區指HCDR1、HCDR2和HCDR3。

“抗原結合片段”涵蓋單鏈抗體(即全長重鏈和輕鏈)；Fab、修飾的Fab、Fab’、修飾的Fab’、F(ab’)2、Fv、Fab-Fv、Fab-dsFv、單結構域抗體(例如VH或VL或VHH)、scFv、二價或三價或四價抗體、Bis-scFv、雙抗體(diabody)、三抗體(tribody、triabody)、四抗體(tetrabody)和上述任意一種的表位結合片段(參見例如Holliger and Hudson,2005,Nature Biotech.23(9)：1126-1136；Adair and Lawson,2005,Drug Design Reviews-Online 2(3),209-217)。產生和製備這些抗原結合片段的方法在本領域是公知的(參見例如Verma等人，1998,Journal ofImmunological Methods,216,165-181)。Fab-Fv形式首先公開於WO2009/040562，其二硫鍵穩定化形式Fab-dsFv首先公開於WO2010/035012。本揭露的抗原結合片段還包括描述於WO2005/003169、WO2005/003170和WO2005/003171中的Fab和Fab’片段。多價抗體可包含多特異性例如雙特異性或可以是單特異性的(參見例如WO92/22583和WO05/113605)，後者的一個示例是描述於WO92/22583中的Tri-Fab(或TFM)。

“雙特異性抗體”涵蓋對兩個不同抗原或同一抗原的至少兩個不同抗原表位特異性結合的抗體(包括抗體或其抗原結合片段，如單鏈抗體)。現有技術已公開了各種結構的雙特異性抗體，根據IgG分子的完整性可分為IgG樣雙特異性抗體和抗體片段型雙特異性抗體，根據抗原結合區域的數量可分為二價、三價、四價或更多價的雙特異性抗體，根據結構左右是否對稱可分為對稱結構雙特異性抗體和不對稱結構雙特異性抗體。其中，基於抗體片段的雙特異性抗體，例如缺乏Fc片段的Fab片段，其藉由將2個或多個Fab片段結合在一個分子中形成雙特異性抗體，其具有較低的免疫原性，且分子量小，具有較高的腫瘤組織滲透性，該類型的典型的抗體結構如F(ab)2、scFv-Fab、(scFv)2-Fab等雙特異性抗體；IgG樣雙特異性抗體(例如具有Fc片段)，這類抗體相對分子量較大，Fc片段有助於抗體後期的純化，並提高其溶解性、穩定性，Fc部分還可能會與受體FcRn結合，增加抗體血清半衰期，典型的雙特異性抗體結構模型如KiH、CrossMAb、Triomab quadroma、Fc△Adp、ART-Ig、BiMAb、Biclonics、BEAT、DuoBody、Azymetric、XmAb、2：1 TCBs、1Fab-IgG TDB、FynomAb、two-in-one/DAF、scFv-Fab-IgG、DART-Fc、LP-DART、CODV-Fab-TL、HLE-BiTE、F(ab)2-CrossMAb、IgG-(scFv)2、Bs4Ab、DVD-Ig、Tetravalent-DART-Fc、(scFv)4-Fc、CODV-Ig、mAb2、F(ab)4-CrossMAb等雙特異性抗體(參見Aran F.Labrijn等，Nature Reviews Drug Discovery volume 18，pages585-608(2019)；Chen S1等，J Immunol Res.2019 Feb 11；2019：4516041)。

在未特殊指明的情況下，本揭露的抗體通常使用Kabat編號系統。Kabat中的EU編號一般也用於恆定結構域和/或Fc結構域。

對於CDR的確定或定義，能夠藉由分辨抗體的結構和/或分辨抗體-配體複合物的結構來完成CDR的確定性描繪和包含抗體的結合位點的殘基的鑑定。這可藉由所屬技術領域具有通常知識者已知的各種技術中的任一種，例如X射線晶體學來實現。多種分析方法可用於鑑定CDR，包括但不限於Kabat編號系統、Chothia編號系統、AbM編號系統、IMGT編號系統、接觸定義、構象定義。

Kabat編號系統是用於編號抗體中殘基的標準並且通常用於鑑定CDR區域(參見例如Johnson&Wu，2000，Nucleic Acids Res.，28：214-8)。Chothia編號系統與Kabat編號系統類似，但Chothia編號系統考慮了某些結構環區域的位置。(參見例如Chothia等，1986，J.Mol.Biol.，196：901-17；Chothia等人，1989，Nature，342：877-83)。AbM編號系統使用建模抗體結構的由Oxford Molecular Group生產的計算機程序集成套件(參見例如Martin等，1989，ProcNatl Acad Sci(USA)，86：9268-9272；“AbMTM，A Computer Program for ModelingVariable Regions of Antibodies，”Oxford，UK；Oxford Molecular，Ltd)。AbM編號系統使用知識數據庫和從頭開始方法的組合，從基本序列建模抗體的三級結構(參見Samudrala等，1999，在PROTEINS，Structure，Function and Genetics Suppl.，3：194-198中的“Ab Initio Protein Structure Prediction Using a Combined HierarchicalApproach”描述的那些)。接觸定義基於可用複雜晶體結構的分析(參見例如MacCallum等，1996，J.Mol.Biol.，5：732-45)。構象定義中，CDR的位置可鑑定為對抗原結合做出焓貢獻的殘基(參見例如Makabe等，2008，Journal ofBiological Chemistry，283：1156-1166)。另外其它的CDR邊界定義可能不嚴格遵循上述方法之一，但仍然與Kabat CDR的至少一部分重疊，儘管根據特定殘基或殘基組不顯著影響抗原結合的預測或實驗結果，它們可縮短或延長。如本揭露使用的，CDR可指藉由本領域已知的任何方法(包括方法的組合)定義的CDR。各種編號系統之間的對應關係是所屬技術領域具有通常知識者熟知的，示例性的，如下表中所示。

本揭露的抗體的VL區和VH區的CDR胺基酸殘基在數量和位置符合已知的Kabat編號系統。

本揭露的抗體可以是多株的、單株的、異種的、同種異體的、同基因的或其經過修飾的形式，其中單株抗體尤其適用於多個實施例中。一般來說，本揭露的抗體是重組抗體。如本文所用的“重組”泛指例如細胞或核酸、蛋白質或載體等產品，表示該細胞、核酸、蛋白質或載體已經藉由引入異源核酸或蛋白質或改變天然核酸或蛋白質而加以修飾，或該細胞來源於如此修飾的細胞。例如，重組細胞表達天然(非重組)細胞形式內不存在的基因或表達原本異常表達、低表達或完全不表達的天然基因。

多肽或蛋白的“結構域”是指折疊蛋白結構，其能夠獨立於蛋白的其餘部分維持其三級結構。一般而言，結構域負責蛋白的單個功能性質，且在許多情況下可添加、移除或轉移至其它蛋白而不損失蛋白的其餘部分和/或結構域的功能。

“免疫球蛋白結構域”是指抗體鏈(例如常規四肽鏈結構抗體的鏈或重鏈抗體的鏈)的球形區域，或是指基本上由這類球形區域組成的多肽。免疫球蛋白結構域的特徵在於其維持抗體分子的免疫球蛋白折疊特徵，其由排列在兩個β折疊中視需要由保守二硫鍵穩定的約7個反平行β折疊股的2層夾層組成。

“免疫球蛋白可變結構域”是指基本上由本領域及下文中分別稱為“框架區1”或“FR1”、“框架區2”或“FR2”、“框架區3”或“FR3”、及“框架區4”或“FR4”的四個“框架區”組成的免疫球蛋白結構域，其中該框架區由本領域及下文中分別稱為“互補決定區1”或“CDR1”、“互補決定區2”或“CDR2”、及“互補決定區3”或“CDR3”的三個“互補決定區”或“CDR”間隔開。因此，免疫球蛋白可變結構域的一般結構或序列可如下表示為：FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4。免疫球蛋白可變結構域因具有抗原結合位點而賦予其對抗原的特異性。

“抗體框架(FR)”，是指可變結構域的一部分，其用作該可變結構域的抗原結合環(CDR)的支架。

“免疫球蛋白單一可變結構域”通常用於指可以在不與其他可變結構域相互作用的情況下(例如在沒有如常規四鏈單株抗體的VH和VL結構域之間所需要的VH/VL相互作用的情況下)，形成功能性抗原結合位點的免疫球蛋白可變結構域(其可以是重鏈或輕鏈結構域，包括VH、VHH或VL結構域)。“免疫球蛋白單一可變結構域”的實例包括奈米抗體(包括VHH、人源化VHH和/或駱駝化VH，例如駱駝化人VH)、IgNAR、結構域、作為VH結構域或衍生自VH結構域的(單結構域)抗體(諸如dAbsTM)和作為VL結構域或衍生自VL結構域的(單結構域)抗體(諸如dAbsTM)。基於和/或衍生自重鏈可變結構域(諸如VH或VHH結構域)的免疫球蛋白單一可變結構域通常是較佳地。免疫球蛋白單一可變結構域的一個具體實例為如下文定義的“VHH結構域”(或簡稱為“VHH”)。

“VHH結構域”，亦稱為重鏈單域抗體、VHH、VHH結構域、VHH抗體片段、VHH抗體、奈米抗體，是稱為“重鏈抗體”(即“缺乏輕鏈的抗體”)的抗原結合免疫球蛋白的可變結構域(Hamers-Casterman C，Atarhouch T，Muyldermans S，Robinson G，Hamers C，Songa EB，Bendahman N，Hamers R.：“Naturally occurring antibodies devoid of light chains”；Nature363，446-448(1993))。使用術語“VHH結構域”以將該可變結構域與存在於常規四肽鏈結構抗體中的重鏈可變結構域(其在本揭露中稱為“VH結構域”)以及輕鏈可變結構域(其在本揭露中稱為“VL結構域”)進行區分。VHH結構域特異性結合表位而無需其他抗原結合結構域(此與常規四肽鏈結構抗體中的VH或VL結構域相反，在該情況下表位由VL結構域與VH結構域一起識別)。VHH結構域為由單一免疫球蛋白結構域形成的小型穩定及高效的抗原識別單元。術語“重鏈單域抗體”、“VHH結構域”、“VHH”、“VHH結構域”、“VHH抗體片段”、“VHH抗體”、“Nanobody®”以及““Nanobody®結構域””(“Nanobody”為Ablynx N.V.公司，Ghent，Belgium的商標)可互換使用。“VHH結構域”包括但不限於經駱駝科動物產生的天然抗體，也可以是駱駝科動物產生的抗體後再經人源化的，也可以是經噬菌體體展示技術篩選獲得的。VHH結構域中的胺基酸殘基的總數將通常在110至120範圍內，常常介於112與115之間。然而應注意較小及較長序列也可適於本揭露所述的目的。獲得結合特定抗原或表位的VHH的方法，先前已公開於以下文獻中：R.van der Linden et al.，Journal of Immunological Methods，240(2000)185-195；Li et al.，J Biol Chem.，287(2012)13713-13721；Deffar et al.，African Journal of Biotechnology Vol.8(12)，pp.2645-2652，17June，2009和WO94/04678。

如本領域中對於VH結構域及VHH結構域所公知的，各CDR中的胺基酸殘基的總數可能不同，且可能不對應於由Kabat編號指示的胺基酸殘基的總數(即根據Kabat編號的一個或多個位置可能在實際序列中未被佔據，或實際序列可能含有多於Kabat編號所允許數目的胺基酸殘基)。這意味著一般而言，根據Kabat的編號可能對應或可能不對應於實際序列中胺基酸殘基的實際編號。其它的編號系統或編碼規則包括Chothia、IMGT、AbM。

“人源化抗體(humanized antibody)”，也稱為CDR移植抗體(CDR-grafted antibody)，是指將非人CDR序列移植到人的抗體可變區框架中產生的抗體。可以克服嵌合抗體由於攜帶大量非人蛋白成分，從而誘導的強烈的免疫應答反應。為避免在免疫原性下降的同時引起活性的下降，可對該全人抗體可變區可進行最少反向突變，以保持活性。“人源化”的例子包括可將源自駱駝科的VHH結構域藉由以人常規四肽鏈結構抗體VH結構域中相應位置處存在的一個或多個胺基酸殘基置換原始VHH序列的胺基酸序列中的一個或多個胺基酸殘基而“人源化”(本揭露中亦稱為“序列優化”，除人源化外，“序列優化”也可涵蓋藉由提供VHH改良性質的一個或多個突變對序列進行的其它修飾，例如移除潛在的翻譯後修飾位點)。人源化VHH結構域可含有一個或多個完全人框架區序列，且在一些具體實施方案中，可含IGHV3的人框架區序列。“人源化”的又一例子包括將小鼠的CDR序列移植到人的抗體可變區框架，即不同類型的人種系抗體構架序列中產生的抗體。可以克服嵌合抗體由於攜帶大量小鼠蛋白成分，從而誘導的強烈的抗體可變抗體反應。人源化方法例如蛋白表面胺基酸人源化(resurfacing)及抗體人源化通用框架移植法(CDR grafting to a universal framework)，即將CDR“移植”於其它“支架”(包括但不限於人支架或非免疫球蛋白支架)上。適於該CDR移植的支架及技術在本領域中是已知的。如人重鏈和輕鏈可變區基因的種系DNA序列可以在“VBase”人種系序列數據庫，以及在Kabat，E.A.等人，1991 Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版中找到。本揭露的人源化抗體也包括進一步由噬菌體展示對CDR進行親和力成熟後的人源化抗體。此外，為避免免疫原性下降的同時，引起的活性下降，可對該人抗體可變區框架序列進行最少反向突變或回復突變，以保持活性。

“親和力成熟的”抗體指與不擁有此類改變的親本抗體相比，在一個或多個高變區(HVR)中具有一處或多處改變的抗體，此類改變導致該抗體對抗原的親和力改善。例如，“親和力成熟”的PD-1結合蛋白或PD-1抗體，在一個或多個CDR中具有一個或多個變化，該變化導致對抗原的親和力相比於其親本抗體有所增加。親和力成熟的抗體可藉由例如由以下所述的本領域中已知的方法來製備：Marks等人，1992，Biotechnology 10：779-783或Barbas等人，1994，Proc.Nat.Acad.Sci，USA 91：3809-3813.；Shier等人，1995，Gene 169：147-155；Yelton等人，1995，Immunol.155：1994-2004；Jackson等人，1995，J.Immunol.154(7)：3310-9；及Hawkins等人，1992，J.MoI.Biol.226(3)：889896；KS Johnson及RE Hawkins，“Affinity maturation of antibodies using phage display”，Oxford University Press 1996。

“全人抗體”包括具有人種系免疫球蛋白序列的可變和恆定區的抗體。本揭露的全人抗體可包括不由人種系免疫球蛋白序列編碼的胺基酸殘基(如藉由體外隨機或位點特異性誘變或藉由體內體細胞突變所引入的突變)。“全人抗體”不包括“人源化抗體”。

當“競爭”用於競爭相同表位的抗原結合蛋白(例如中和抗原結合蛋白或中和抗體)的情況中時，意指在抗原結合蛋白之間競爭，其藉由以下測定法來測定：待檢測的抗原結合蛋白(例如抗體或其免疫學功能片段)防止或抑制(例如降低)參考抗原結合蛋白(例如配體或參考抗體)與共同抗原(例如PVRIG抗原或其片段)的特異性結合。眾多類型的競爭性結合測定可用於確定一種抗原結合蛋白是否與另一種競爭，這些測定例如：固相直接或間接放射免疫測定(RIA)、固相直接或間接酶免疫測定(EIA)、夾心競爭測定(參見例如Stahli等，1983，Methodsin Enzymology 9：242-253)；固相直接生物素-親和素EIA(參見例如Kirkland等，1986，J.Immunol.137：3614-3619)、固相直接標記測定、固相直接標記夾心測定(參見例如Harlow和Lane，1988，Antibodies，A Laboratory Manual(抗體，實驗室手冊)，Cold Spring Harbor Press)；用I-125標記物的固相直接標記RIA(參見例如Morel等，1988，Molec.Immunol.25：7-15)；固相直接生物素-親和素EIA(參見例如Cheung，等，1990，Virology176：546-552)；和直接標記的RIA(Moldenhauer等，1990，Scand.J.Immunol.32：77-82)。通常該測定法涉及使用能與帶有未標記的檢測抗原結合蛋白及標記的參考抗原結合蛋白結合的純化抗原(該抗原在固態表面或細胞表面上)。在待測抗原結合蛋白存在下，測量結合於固態表面或細胞的標記的量，來測量競爭性抑制。通常，待測抗原結合蛋白是過量存在的。由競爭性測定(競爭抗原結合蛋白)鑑定的抗原結合蛋白包括：與參考抗原結合蛋白相同的表位發生結合的抗原結合蛋白；以及，與充分接近參考抗原結合蛋白結合的表位所鄰近的表位發生結合的抗原結合蛋白，該兩個表位在空間上互相妨礙結合的發生。在本揭露實施例中提供關於用於測定競爭性結合的方法的其它詳細資料。通常當競爭的抗原結合蛋白過量存在時，其將抑制(例如降低)至少40-45%、45-50%、50-55%、55-60%、60-65%、65-70%、70-75%或75%或更多參考抗原結合蛋白與共同抗原的特異性結合。在某些情況下，結合被抑制至少80-85%、85-90%、90-95%、95-97%或97%或更多。可使用所屬技術領域具有通常知識者已知的常規技術，就與相同表位的結合競爭性篩選抗體。例如，可進行競爭和交叉競爭研究，以獲得彼此競爭或交叉競爭與抗原結合的抗體。基於它們的交叉競爭來獲得結合相同表位的抗體的高通量方法描述於國際專利公開WO03/48731中。因此，可使用所屬技術領域具有通常知識者已知的常規技術，獲得例如與本揭露的抗體分子競爭結合PD-1上的相同表位的抗體。

“特異性結合”、“選擇性結合”是指抗體與預定的抗原上的表位結合。例如，當使用人PD-1或其表位作為分析物並使用抗體作為配體，在儀器中藉由表面電漿共振(SPR)技術測定時，抗體以大約低於10-7M或甚至更小的平衡解離常數(KD)與預定的抗原或其表位結合，並且其與預定抗原或其表位結合的親和力是其與預定抗原(或其表位)或緊密相關的抗原之外的非特異性抗原(如BSA等)結合的親和力的至少兩倍。“識別抗原的抗體”在本揭露中可以與“特異性結合的抗體”互換使用。

“結合親和力”或“親和力”在本揭露中用作兩個分子(例如抗體或其部分與抗原)之間的非共價相互作用的強度量度。兩個分子之間的結合親和力可藉由確定解離常數(KD)來量化。可藉由使用例如表面電漿共振(SPR)方法(Biacore)測量複合物形成和解離的動力學來確定KD。對應於單價複合物的結合和解離的速率常數分別被稱為結合速率常數ka(或kon)和解離速率常數kd(或koff)。KD藉由方程KD=kd/ka與ka和kd有關。解離常數的值可藉由眾所周知的方法直接確定，並且甚至可藉由例如Caceci等人(1984，Byte 9：340-362)中該那些方法對於複雜混合物進行計算。例如，可使用雙重過濾硝化纖維素濾器結合測定如Wong&Lohman(1993，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：5428-5432)中公開的那種來確定KD。評估抗體針對靶抗原的結合能力的其它標準測定是本領域已知的，包括例如ELISA、蛋白質印跡、RIA和流式細胞術分析、以及本揭露其它地方例舉的其它測定。抗體的結合動力學和結合親和力也可藉由本領域已知的標準測定，例如表面電漿共振(SPR)，例如藉由使用BiacoreTM系統或KinExA來評價。可藉由比較各個抗體/抗原複合物的KD值來比較與不同分子相互作用相關的結合親和力，例如，不同抗體對於給定抗原的結合親和力的比較。類似地，相互作用的特異性可藉由確定和比較目的相互作用(例如抗體和抗原之間的特異性相互作用)的KD值與非目的相互作用(例如已知不結合PD-1的對照抗體)的KD值進行評價。

“保守性置換”指置換為具有與原始胺基酸殘基相似的特性的另一個胺基酸殘基。例如，賴胺酸、精胺酸和組胺酸具有相似的特性，在於它們具有鹼性側鏈，並且天冬胺酸和谷胺酸具有相似的特性，在於它們具有酸性側鏈。此外，甘胺酸、天冬醯胺、穀胺醯胺、絲胺酸、蘇胺酸、酪胺酸、半胱胺酸和色胺酸具有相似的特性，在於它們具有不帶電荷極性側鏈，並且丙胺酸、纈胺酸、亮胺酸、蘇胺酸、異亮胺酸、脯胺酸、苯丙胺酸和甲硫胺酸具有相似的特性，在於它們具有非極性側鏈。另外，酪胺酸、苯丙胺酸、色胺酸和組胺酸具有相似的特性，在於它們具有芳族側鏈。因此，所屬技術領域具有通常知識者將顯而易見，甚至當置換如上文所述的顯示相似特性的組中的胺基酸殘基時，它將不顯示特性的特定變化。

“同源性”、“同一性”或“序列同一性”是指兩個多核苷酸序列之間或兩個多肽之間的序列相似性。當兩個比較序列中的位置均被相同核苷酸或胺基酸單體佔據時，例如如果兩個DNA分子的每一個位置都被相同核苷酸佔據時，那麼該分子在該位置是同源的。兩個序列之間的同源性百分率是兩個序列共有的匹配或同源位置數除以比較的位置數×100%的函數。例如，在序列最佳比對時，如果兩個序列中的10個位置有6個匹配或同源，那麼兩個序列為60%同源。一般而言，當比對兩個序列而得到最大的同源性百分率時進行比較。

“核酸”或“多核苷酸”在本文可互換使用，指的是單鏈或雙鏈的任何DNA分子或RNA分子以及在單鏈的情況下，它的互補序列的分子，較佳是雙鏈DNA。當將核酸與另一個核酸序列置於功能關係中時，核酸是“有效連接的”。例如，如果啟動子或增強子影響編碼序列的轉錄，那麼啟動子或增強子有效地連接至該編碼序列。

“宿主細胞”包括各個細胞或細胞培養物，其可為或已是用於摻入多核苷酸插入片段的載體的受體。宿主細胞包括單個宿主細胞的子代，並且由於天然、偶然或有意的突變，子代可不一定與原始親本細胞完全相同(在形態學或基因組DNA互補體中)。宿主細胞包括用本揭露的多核苷酸在體內轉染和/或轉化的細胞。“細胞”、“細胞系”和“細胞培養物”可互換使用，並且所有這類名稱都包括其後代。還應當理解的是，由於故意或非有意的突變，所有後代在DNA含量方面不可能精確相同。包括具有與最初轉化細胞中篩選的相同的功能或生物學活性的突變後代。

“抑制”或“阻斷”可互換使用，並涵蓋部分和完全抑制/阻斷這兩者。“抑制生長”(例如涉及細胞)旨在包括細胞生長任何可測量的降低。

“阻止…的生長”或“生長抑制”是指抑制細胞的生長或增殖。

“增殖性疾病”指與一定程度的異常細胞增殖有關的病症。在一個實施方案中，增殖性病症指癌症。“腫瘤”指所有贅生性(neoplastic)細胞生長和增殖，無論是惡性的還是良性的，及所有癌前(pre-cancerous)和癌性細胞和組織。“癌症”、“癌性”、“增殖性病症”和“腫瘤”在本揭露中提到時並不互相排斥。

“預防癌症”是指在受試者中延遲、抑制或防止癌症發作，該受試者中癌症發生或腫瘤發生的起始尚未得到證實，但是藉由例如遺傳篩查或其它方法確定，已鑑定了癌症易感性。該還包括治療具有癌變前病症的受試者以終止該癌變前病症向惡性腫瘤的進展或導致其消退。

“給予”、“施用”和“處理”當應用於動物、人、實驗受試者、細胞、組織、器官或生物流體時，是指外源性藥物、治療劑、診斷劑或組成物與動物、人、受試者、細胞、組織、器官或生物流體的接觸，例如治療、藥物代謝動力學、診斷、研究和實驗方法。細胞的處理包括試劑與細胞的接觸，以及試劑與流體的接觸，其中該流體與細胞接觸。“給予”、“施用”和“處理”還意指藉由試劑、診斷、結合組成物或藉由另一種細胞體外和離體處理例如細胞。當應用於人、獸醫學或研究受試者時，是指治療處理、預防或預防性措施，研究和診斷應用。

“治療”意指給予受試者內用或外用治療劑，例如包含本揭露的任一種結合蛋白或其醫藥組成物作為治療劑，該受試者已經患有、疑似患有、傾向於患有一種或多種增殖性疾病或其症狀，而已知該治療劑對這些症狀具有治療作用。通常，在受治療受試者或群體中以有效緩解一種或多種疾病症狀的量給予治療劑，無論是藉由誘導這類症狀退化還是抑制這類症狀發展到任何臨床能測量的程度。有效緩解任何具體疾病症狀的治療劑的量(也稱作“治療有效量”)可根據多種因素變化，例如受試者的疾病狀態、年齡和體重，以及藥物在受試者產生需要療效的能力。藉由醫生或其它專業衛生保健人士通常用於評價該症狀的嚴重性或進展狀況的任何臨床檢測方法，可評價疾病症狀是否已被減輕。儘管本揭露的實施方案(例如治療方法或製品)在緩解某個受試者中目標疾病症狀方面可能無效，但是根據本領域已知的任何統計學檢驗方法如Student t檢驗、卡方檢驗、依據Mann和Whitney的U檢驗、Kruskal-Wallis檢驗(H檢驗)、Jonckheere-Terpstra檢驗和Wilcoxon檢驗確定，其在統計學顯著數目的受試者中應當減輕目標疾病症狀。

“有效量”包含足以改善或預防醫學病症的症狀或病症的量。有效量還意指足以允許或促進診斷的量。用於受試者的有效量可依據以下因素而變化：如待治療的病症、受試者的總體健康情況、給藥的方法途徑和劑量以及副作用嚴重性。有效量可以是避免顯著副作用或毒性作用的最大劑量或給藥方案。本揭露的受試者可以是動物或人類受試者。

“視需要”或“視需要地”意味著隨後所描述地事件或環境可以但不必發生，該說明包括該事件或環境發生或不發生的場合。“和/或”應視為特定揭示兩種指定特徵或組分中的每一者具有或不具有另一者。因此，諸如本揭露中“A和/或B”的詞組中所用的術語“和/或”包括“A及B”、“A或B”、“A”(單獨)及“B”(單獨)。除非上下文另外清楚要求，否則在整個說明書和申請專利範圍中，應將詞語“包含”、“具有”、“包括”等理解為具有包含意義，而不是排他性或窮舉性意義；也即，“包括但不僅限於”的意義。

本揭露的“受試者”、“患者”意指哺乳動物，尤其靈長類動物，尤其是人。

發明的詳細說明

以下結合實施例用於進一步描述，但這些實施例並非限制的範圍。

實施例或測試例中未註明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件，或按照原料或商品製造廠商所建議的條件。參見Sambrook等，分子選殖，實驗室手冊，冷泉港實驗室；當代分子生物學方法，Ausubel等著，Greene出版協會，Wiley Interscience，NY。未註明具體來源的試劑，為市場購買的常規試劑。

實施例1. PVRIG/TIGIT雙特異性抗體

本實施例中，帶his標簽的人PVRIG(h-PVRIG-his)重組蛋白、帶小鼠IgG2a的Fc標簽的人PVRIG(h-PVRIG-mIgG2a Fc)重組蛋白、帶人IgG1的Fc標簽的小鼠PVRIG(m-PVRIG-hIgG1 Fc)購自Acrobiosystems公司。帶his標簽的PVRL2購自AcroBiosystem(PV2-H52E2)。

實施例1-1. 抗PVRIG奈米抗體的篩選和製備

1、免疫抗原、篩選抗原的序列和製備

帶his標簽的食蟹猴PVRIG(cyno-PVRIG-his)重組蛋白序列如下：

(SEQ ID NO：1)

2、羊駝免疫、奈米抗體噬菌體展示文庫構建和抗體篩選

使用實施例1-1的方法，使用帶his標簽的人PVRIG重組蛋白(h-PVRIG-his)免疫羊駝。從第56天的駱駝外周血中分離PBMC，提取RNA，反轉錄成cDNA，構建抗人PVRIG奈米抗體的噬菌體文庫。經過3輪篩選，對400個純株測序，其中2株的可變區序列如表2所示，CDR如表3所示。

將上述抗體可變區與人IgG4重鏈Fc區域連接，重鏈Fc區域包括鉸鏈(hinge)區，並帶有S228P，F234A，L235A，K447A突變(Eu命名系統)，構建全長抗體。

>hIgG4 Fc(S228P/F234A/L235A/K447A)

(SEQ ID NO：10)

>30全長

(SEQ ID NO：11)

>151全長

(SEQ ID NO：12)

WO2016134333中所示的抗PVRIG抗體CPA.7.021篩選自抗體噬菌體庫，其亞型為IgG1，能與人PVRIG較好結合，對食蟹猴PVRIG則無結合。將CPA.7.021的重鏈和輕鏈可變區，分別與人IgG4重鏈恆定區(帶有S228P，F234A、L235A、K447A突變)和人Kappa輕鏈恆定區連接，構建陽性抗體Tab5。

>Tab5重鏈全長

(SEQ ID NO：13)

>Tab5輕鏈全長

(SEQ ID NO：14)

將表達上述胺基酸序列的核酸序列選殖到pcDNA3.1表達載體，按常規方法進行抗體表達和純化，經檢測，獲得目的抗體。

實施例1-2. 抗PVRIG奈米抗體與抗原PVRIG的親和力鑑定

1、ELISA

用直接包被帶his標簽的PVRIG重組蛋白，加入抗體後，藉由加入二抗(HRP偶聯的抗一抗Fc的抗體)和HRP受質TMB檢測抗體與抗原結合的活性。

人、食蟹猴或小鼠PVRIG蛋白包被96孔板，按1μg/mL濃度每孔100μL，4℃孵育過夜。洗液洗三遍。加入300μL/孔封閉液(PBS+0.05% Tween20+1% BSA)室溫孵育1小時。洗液洗三遍。每孔加100μL 用稀釋液稀釋好的抗PVRIG待測抗體。37℃孵育1小時。洗液洗三遍。每孔加入100μL HRP標記的抗人IgG二抗(Sigma，A8667)。37℃孵育1小時。洗液洗三遍。每孔加入100μL TMB，避光反應15分鐘。加入50mL/孔的0.16M硫酸。Thermo MμLtiSkanFc酶標儀讀取OD450，計算抗PVRIG抗體對PVRIG的結合EC₅₀值。所有抗體均對人或食蟹猴的PVRIG重組蛋白有較強的結合能力，但不結合小鼠PVRIG重組蛋白。

2、FACS檢測

製備獲得表達人或食蟹猴PVRIG基因的HEK293穩轉細胞株。在96孔板中每孔接種2x10⁵個細胞。300g離心5分鐘，去上清，加入100μL待測抗體，4℃孵育1小時。離心去除上清，用200μL洗液(PBS+2% FBS)洗滌3次，加入100μL 1：500稀釋的用Alexa Fluor 488標記的抗人IgG二抗(Invitrogen，A-11013)，4℃孵育1小時。離心去除上清，用200μL洗液(PBS+2% FBS)洗滌3次。用100μL PBS重新懸浮細胞，用流式細胞儀(BD FACS Calibur或BD FACS Canto_II)檢測。所有抗體均對細胞表面表達的人或食蟹猴的PVRIG有較強的結合能力，明顯強於陽性抗體Tab5，而Tab5甚至完全不結合食蟹猴PVRIG。

3、Fortebio檢測

將Protein A生物傳感器(Fortebio，#18-5010)浸泡在200μL的KB緩衝液(PBS，pH 7.4，0.02% tween-20，0.1% BSA)中60秒，進行濕潤處理。然後，用KB緩衝液將抗PVRIG抗體稀釋到10μg/mL，將傳感器置於200μL該溶液中，待讀數為1.2nm時停止。將傳感器浸泡於KB緩衝液中100秒，以沖提多餘的抗體。將帶有his標簽的人PVRIG用KB緩衝液以2倍梯度稀釋至64nM-4nM之間。將傳感器置於該溶液中結合300秒，再置於KB緩衝液中解離600秒。採用動態1：1結合方式擬合，則抗PVRIG抗體與人PVRIG的親和力如表6所示。

結果顯示，所有檢測抗體均具有與人PVRIG的高親和力。

實施例1-3. 抗PVRIG奈米抗體的功能和活性驗證

1、抗PVRIG奈米抗體阻斷PVRIG和PVRL2結合實驗

人PVRIG重組蛋白(h-PVRIG-mIgG2a Fc)包被96孔板，按1μg/mL濃度每孔100μL，4℃孵育過夜。洗液洗三遍。加入300μL/孔封閉液室溫孵育1小時。洗液洗三遍。每孔加50μL稀釋好的抗PVRIG待測抗體和50μL帶his標簽的配體PVRL2，37℃孵育1小時。洗液洗三遍。每孔加入100μL按1：2000倍稀釋的用HRP標記的抗his標簽的二抗(Genscrpit)。37℃孵育1小時。洗液洗三遍。每孔加入100μL TMB，避光反應15分鐘。加入50μL每孔的0.16M硫酸。Thermo MμLtiSkanFc酶標儀讀取450nm OD值，計算抗PVRIG抗體對PVRIG與PVRL2結合阻斷的IC₅₀值。

表7結果顯示，所檢測抗體均可以強烈抑制人PVRIG與人PVRL2的結合。

2、抗PVRIG奈米抗體報告基因細胞活性實驗

首先，構建plvx-OS8(G418抗性)質粒，轉染293F細胞，G418篩選，用流式細胞儀檢測純株細胞OS8的表達同時檢測OS8對Jurkat 細胞的激活，選擇激活程度中等的純株，得到293F-OS8細胞株；構建plvx-PVRL2質粒，用它感染293F-OS8細胞，用流式細胞儀篩選出PVRL2表達量最高的純株，從而得到293F-OS8-PVRL2細胞株。

其次，構建plvx-NFAT-Luc(Hygromycin抗性)，包裝成慢病毒，感染Jurkat E6.1細胞，加Hygromycin篩選出有抗性的純株，用OKT3去刺激純株，篩選出Luciferase信號中等的純株，得到Jurkat-NFAT-Luc細胞系；構建plvx-PVRIG(Puromycin抗性)載體，包裝成慢病毒，感染Jurkat-NFAT-Luc細胞，經流式細胞儀篩選出PVRIG表達量最高的純株，從而得到Jurkat-NFAT-Luc-PVRIG細胞株。

將1E4個Jurkat-NFAT-Luc-PVRIG細胞與待測抗體在37℃孵育20分鐘。加入1E5個293F-OS8-PVRL2細胞，37℃孵育5小時。離心去除上清，加入Luciferase緩衝液(Promega，E6130)裂解細胞，檢測螢光值。計算EC₅₀值評價抗PVRIG抗體的體外細胞活性。實驗結果如表8所示。

結果顯示，所檢測抗體有較強的激活Jurkat細胞中Luciferase的能力，活性是陽性抗體的至少10倍以上，證明這些抗體可以結合PVRIG並阻斷PVRL2與PVRIG的結合。

3、抗PVRIG奈米抗體的NK細胞殺傷實驗

PVRIG在NK細胞上表達，而PVRL2在很多腫瘤細胞(包括K562細胞)中表達。抗PVRIG抗體可以藉由阻斷PVRL2與PVRIG的結合，解除腫瘤細胞對NK細胞活性的抑制作用。

在96孔板中每孔加入50μL(總計1×10⁵個)人惡性非霍奇金淋巴瘤NK92細胞。加入50μL 20nM或100nM待測抗體，37℃孵育30分鐘。用洗液洗滌兩次，重新懸浮至2×10⁵個/mL的密度。加入50μL(總計1×10⁴個)的人慢性髓系白血病K562細胞，使得NK92細胞與K562細胞個數的比例為10：1。37℃孵育4小時。使用CytoTox-Glo細胞毒性系統(Promega，G9292)對殺傷活性進行測量。首先加入50μL AAF-Glo試劑，室溫孵育15分鐘，測量被NK92細胞殺死的K562細胞的螢光。再加入50μL裂解液，室溫孵育15分鐘，裂解細胞，測量所有細胞的螢光。準備三種對照組，分別是只包括培養液的樣品(對照組一)，只包括NK92細胞的樣品(對照組二)，只包括K562細胞的樣品(對照組三)，進行同樣的操作。

根據如下公式，計算殺傷活性：

殺傷活性(%)={[(R-BG)-(T-BG)-(E-BG)]/[(TL-BGL)-(T-BG)]}×100

其中，R為加入AAF-Glo後的螢光值，BG為對照組一在加入AAF-Glo的螢光值，E為對照組二在加入AAF-Glo的螢光值，T為對照組三在加入AAF-Glo的螢光值；TL為對照組三在加入裂解液後的螢光值，BGL為對照組一再加入裂解液後的螢光值。

實驗結果如表9所示，表明所有檢測的抗PVRIG抗體均可以明顯的激活NK92細胞、殺傷K562細胞。

4、抗PVRIG奈米抗體的混合淋巴細胞反應(MLR)實驗

PVRIG在T細胞上表達，而PVRL2在DC細胞上表達。抗PVRIG抗體可以藉由阻斷PVRL2與PVRIG的結合，解除DC細胞對T細胞的抑制，活化T細胞。

從第一個體來源的外周血中分離PBMC，將細胞培養於含10% FBS的RPMI 1640培養基中，以50ng/mL GM-CSF(Peprotech，300-03-100UG)和50ng/mL IL-4(Peprotech，200-04-100UG)的終濃度添加，每2-3天添加含細胞因子的新鮮培養基；培養6天後，加入1μg/mL LPS(Sigma，L2880-25MG)孵育24小時，收集分化成熟得到的DC細胞。從第二個體來源的外周血中分離PBMC，使用EasySep人CD3⁺T細胞分離試劑盒(Stemcell，17952)從中分離CD3⁺ T細胞。調整CD3⁺ T細胞和DC細胞的密度，使得每孔加入1×10⁵個CD3⁺T細胞和2×10⁴個DC細胞。加入待測抗體，37℃孵育120小時，取上清，用ELISA試劑盒(R&D，DY202)檢測上清中的IFNγ含量。

如表10和圖1所示，相比對照抗體IgG4，所有檢測抗PVRIG抗體均可以明顯的激活T細胞分泌IFNγ。並且，在低劑量(如4nM、20nM)時，本揭露的抗體30和151較之陽性對照Tab5的效果更優。

實施例1-4. 抗PVRIG奈米抗體的序列改造

藉由對選定的抗PVRIG抗體分子進行三維結構同源建模，將抗PVRIG抗體序列與抗體GermLine數據庫比較，獲得同源性高的人種系模板IGHV3-7 *01。將CDR移植到相應的人源模板中。對移植後的單域抗體再次進行三維結構模擬並分析，對包埋殘基、與CDR區有直接相互作用的殘基，以及對可變區的構象有重要影響的殘基進行回復突變，並對CDR區化學不穩定胺基酸殘基優化，產生一系列人源化單域抗體。各個單域抗體的人種系模板以及人源化抗體重鏈可變區序列如下所示。

>30H1可變區

(SEQ ID NO：15)

>30H2可變區

(SEQ ID NO：16)

>30H3可變區

(SEQ ID NO：17)

>30H4可變區

(SEQ ID NO：18)

>30H5可變區

(SEQ ID NO：19)

可見，抗體30H1-30H5包含如GDCMG(SEQ ID NO：4)所示的CDR1，如TIDNAGRIKYADSVKG(SEQ ID NO：5)所示的CDR2，如GWTFGGQCSPAD(SEQ ID NO：20)所示的CDR3。

>151H2可變區

(SEQ ID NO：21)

>151H4可變區

(SEQ ID NO：22)

>151H7可變區

(SEQ ID NO：23)

>151H8可變區

(SEQ ID NO：24)

>151H9可變區

(SEQ ID NO：25)

將上述人源化抗體重鏈可變區與人IgG4重鏈Fc區域連接，構造形成全長抗PVRIG抗體。其中重鏈Fc區域包括鉸鏈(hinge)區，並帶有S228P/F234A/L235A/K447A，或S228P/K447A突變。按常規方法進行抗體的表達和純化，經檢測，得到目的抗體。

實施例1-5. 人源化抗PVRIG抗體的活性和功能驗證

1、人源化抗PVRIG抗體與表達PVRIG的細胞結合實驗

依照實施例1-2的方法，FACS檢測抗PVRIG抗體與人或食蟹猴PVRIG的結合。實驗結果如表11所示。

2、人源化抗PVRIG抗體與PVRIG的親和力測定

依照實施例1-2的Fortebio檢測方法，檢測人源化抗PVRIG抗體與人PVRIG的親和力。如表12所示，所有抗體均具有與人PVRIG的高親和力。

3、人源化抗PVRIG抗體報告基因細胞活性實驗

依照實施例1-3的方法，檢測人源化抗PVRIG抗體在報告基因細胞中的活性。實驗結果如表13所示。表中列出的抗體均具有激活Jurkat細胞的能力。

4、人源化抗PVRIG抗體的活化NK細胞殺傷能力實驗

依照實施例1-3的方法，檢測人源化抗PVRIG抗體對NK細胞的活化能力。實驗結果如表14-1和表14-2所示。結果顯示，所測抗體都有明顯的活化NK細胞的能力，促進NK細胞對於靶細胞K562的殺傷。

實施例1-6. 抗PVRIG/TIGIT雙抗的製備

為探索不同構造的抗PVRIG/TIGIT雙抗對抗體功能的影響，將抗PVRIG單域抗體151藉由GGGGSGGGGS(SEQ ID NO：152)連接子與抗TIGIT抗體1708的重鏈或輕鏈的N端或C端相連。形成4個抗PVRIG/TIGIT雙抗，命名為1708-151-1、1708-151-2、1708-151-3、1708-151-4，分別對應151被連接在1708的重鏈N端、重鏈C端、輕鏈N端和輕鏈C端。抗TIGIT抗體1708採用人IgG4亞型，並帶有S228P(Eu命名系統)的突變。抗TIGIT抗體1708和其與151形成的雙特異性抗體序列如下表15所示。抗TIGIT抗體序列信息如表16和表17所示。此處全文引入WO2019062832A中的TIGIT抗體。

將不同的人源化抗PVRIG抗體可變區(30H2、151H7、151H8)連接到抗TIGIT抗體1708的重鏈N端，即採用1708-151-1類似的雙特異性抗體構造，構建雙抗。

>1708-30H2第一多肽鏈

(SEQ ID NO：43)

>1708-151H7第一多肽鏈

(SEQ ID NO：44)

>1708-151H8第一多肽鏈

(SEQ ID NO：45)

1708-30H2、1708-151H7、1708-151H8的第二多肽鏈均與1708的輕鏈相同(SEQ ID NO：27)。

按常規方法進行抗體的瞬時轉染、表達和純化，經鑑定，得到本揭露的全長抗PVRIG/TIGIT雙抗。均顯示了良好的表達量和純度。

實施例1-7. 抗PVRIG/TIGIT雙抗的活性和功能驗證

1、雙特異性抗體與人PVRIG的結合及對配體PVRL2的阻斷

依照實施例1-2的方法，進行實驗。結果表明，不同構型的雙特異性抗體1708-151-1、1708-151-2、1708-151-3、1708-151-4，與人PVRIG重組蛋白和過表達人PVRIG細胞的結合，以及對PVRL2結合PVRIG的阻斷，基本一致、無差異。

2、雙特異性抗體與人TIGIT的結合及對配體PVR的阻斷

依照實施例1-2的方法(相應的受體和配體換為人TIGIT和人PVR)，進行實驗，結果如表18所示。結果表明，不同構型的雙特異性抗體1708-151-1、1708-151-2、1708-151-3、1708-151-4和抗TIGIT抗體，與人TIGIT重組蛋白和過表達人TIGIT細胞的結合，以及對TIGIT結合其配體PVR的阻斷，基本一致、無差異。

可見，抗PVRIG抗體無論是連接到抗TIGIT抗體的重、輕鏈的N端或C端，都保持了對PVRIG/TIGIT的結合和配體的阻斷，並且都顯示了良好的表達量、純度。

3、人源化抗PVRIG/TIGIT雙抗與PVRIG/TIGIT的結合以及對相應配體的阻斷

依照實施例1-2的方法，檢測人源化抗PVRIG/TIGIT雙抗對人和食蟹猴PVRIG的結合，對人PVRIG的配體阻斷。結果如表18所示。結果表明，各雙抗均可以結合人PVRIG，阻斷PVRIG結合PVRL2。

與實施例1-2類似地，檢測人源化抗PVRIG/TIGIT雙抗對人和食蟹猴TIGIT的結合，對人TIGIT與配體結合的阻斷，其中將PVRIG蛋白替換為TIGIT，並將PVRL2替換為PVR。結果如表19所示。結果表明，各雙抗均可以結合人和食蟹猴TIGIT，阻斷TIGIT結合PVR。

利用Biacore檢測雙抗與人PVRIG、與人TIGIT的親和力。將人源化雙特異性抗體捕獲於Biacore儀器(Biacore X100，GE)的Protein A生物傳感芯片(GE lifesciences，29127557)上，然後於芯片表面流經一系列濃度梯度下的人PVRIG抗原(AcroBiosystem，PVG-H52H4)或人TIGIT抗原(AcroBiosystem，TIT-H52H3)，獲得結合和解離曲線。結果見表20。

4、抗PVRIG/TIGIT雙抗的混合淋巴細胞反應(MLR)實驗

依照實施例1-3第4部分的方法，檢測人源化抗PVRIG/TIGIT雙抗對T細胞的活化能力。實驗結果如圖2和表21所示。結果顯示，人源化抗PVRIG/TIGIT雙抗1708-151H8具有明顯的活化T細胞的能力，促進T細胞分泌IFNγ。重要的是，雙特異性抗體的活性強於單用抗PVRIG抗體151H8，單用抗TIGIT抗體1708。

實施例1-8. 抗PVRIG/TIGIT雙抗體在人黑色素瘤A375混合人PBMC的小鼠皮下移植瘤模型中的抗腫瘤作用評估

為進一步探究雙特異性抗體亞型在動物藥效中的作用，進行動物藥效試驗。其中，1708-IgG1的重鏈全長與1708相同，只是重鏈恆定區亞型換為IgG1；1708-IgG1的輕鏈全長和1708-151-IgG1的第二多肽鏈均與與1708的輕鏈相同。

NCG小鼠，雌性，4-8週，體重約18-22g，購自江蘇集萃藥康生物科技有限公司。所有的NCG小鼠按照SPF級動物房IVC恆溫恆壓系統條件培養。

A375細胞培養在含10%胎牛血清(FBS)的DMEM培養液中。收集指數生長期的A375細胞，HBSS重新懸浮至適合濃度用於NCG小鼠皮下腫瘤接種。共培養所用的A375細胞需經過絲裂黴素C處理2h後，PBS洗三次。取正常人外周血，用密度梯度離心法分離人PBMC，計數。然後用RPMI1640培養基(含IL2和10% FBS)將PBMC重新懸浮至3×10⁶ 個/mL的濃度，與絲裂黴素C處理後的A375細胞共培養。共培養6天後，收取PBMC，同時收取新鮮消化下來的A375細胞。每隻小鼠接種：PBMC 5×10⁵個，A375細胞4×10⁶個；接種體積：0.2mL/隻(含50% Matrigel)；接種於雌性NCG小鼠右側皮下。根據小鼠體重隨機進行分組給藥，詳細的給藥方法、給藥劑量和給藥途徑見表22，分組給藥當天為第0天。由於抗PVRIG抗體和抗TIGIT抗體的分子量不同，該給藥劑量保證了抗PVRIG抗體與抗TIGIT抗體擁有同樣的起始莫耳濃度。

給藥開始後，小鼠每週2次測量體重及腫瘤體積。實驗結果分別見表23和圖3A、3B。

實驗結束時(給藥後第26天)，與對照組相比，抗PVRIG抗體151-IgG4單藥組沒有明顯差異。抗TIGIT抗體1708-IgG1單藥組，抗PVRIG抗體151-IgG4與抗TIGIT抗體1708-IgG1聯用組，腫瘤體積下降。而1708-151-IgG4雙抗組甚至可以完全抑制腫瘤的生長，與其它組間具有顯著性差異(見圖3B)。

根據小鼠體重隨機進行分組給藥，詳細的給藥方法、給藥劑量和給藥途徑見表24，分組給藥當天為第0天。

給藥開始後，小鼠每週2次測量體重及腫瘤體積。實驗結果分別見表25和圖4A-4B。

實驗結束時(給藥後第28天)，與對照組相比，1708-30H2與1708-151H7雙抗組均可以在低劑量下有效抑制腫瘤生長，與對照組間具有顯著性差異(見圖4B)。

實施例2. 評價抗PVRIG/TIGIT雙特異性抗體聯合抗PD-L1抗體對人黑色素瘤A375混合PBMC皮下移植瘤模型的抗腫瘤作用

1、受試藥物及材料

藥物A：1708-30H2(抗PVRIG/TIGIT雙特異性抗體)，參考前述實施例1方法製備，使用PBS配製3.58mg/mL溶液；

藥物B：抗PD-L1抗體(Adebrelimab)，參考WO2017084495製備，使用NS(生理鹽水)配製1.0mg/mL溶液；

陰性對照：同種型IgG4，上海恆瑞醫藥有限公司提供，用PBS稀釋。

細胞：人黑色素瘤A375細胞，來源於中國科學院上海生命科學研究院。

實驗動物：NCG小鼠，雌性，體重約18-22g。購自江蘇集萃藥康生物科技股份有限公司。

藥物B(抗PD-L1抗體)抗體序列如下：

>抗PD-L1抗體重鏈可變區：

(SEQ ID NO：46)

>抗PD-L1抗體輕鏈可變區：

(SEQ ID NO：47)

上述抗體重輕鏈可變區序列中，下劃線部分為CDR區，各序列依次順序為FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4。其中各抗體輕重鏈中CDR序列如表26所示。

>抗PD-L1抗體重鏈全長：(Fc區帶有S228P，F234A，L235A突變)

(SEQ ID NO：54)

>抗PD-L1抗體輕鏈全長：

(SEQ ID NO：55)

2、實驗方法

A375細胞培養在含10%胎牛血清(FBS)的DMEM培養液中。收集對數生長期的A375細胞，HBSS重新懸浮至適合濃度用於NCG小鼠皮下腫瘤接種。共培養實驗中用的A375細胞用絲裂黴素C處理2h，然後PBS洗三次。取復蘇的PBMC加入經絲裂黴素C處理的A375細胞中，PBMC與A375共培養5天，培養液為含IL-2和10% FBS的RPMI 1640培養液。PBMC與A375共培養5天後，收取PBMC與新鮮消化下來的A375細胞，PBMC 4×10⁵個，A375細胞4×10⁶個，接種體積0.2mL/隻(含50%基質膠)，接種於NCG小鼠右側皮下。接種後，根據小鼠體重隨機進行分組給藥，詳細的給藥方法、給藥劑量和給藥途徑見表27，分組給藥當天為第0天。

給藥第14天，藥物B改為每週一次；給藥第21天，只給藥物B每週一次和藥物A每週兩次；給藥第28天，只給藥物A每週兩次。

3、評估指標

腫瘤體積測量：使用游標卡尺每週兩次測量，腫瘤體積計算公式為V=0.5×a×b²，其中，a、b分別代表腫瘤的長徑和寬徑。

腫瘤生長抑制率TGI(%)=(1-T/C)×100%。T/C %為腫瘤相對增殖率，T/C %=(Ti-T0)/(Vi-V0)×100%，即在某一時間點，Ti為給藥組開始給藥後的平均腫瘤體積，T0為給藥組首次給藥時的平均腫瘤體積，V0為溶媒對照組首次給藥時的平均腫瘤體積，Vi為溶媒對照組開始給藥後的平均腫瘤體積。

荷瘤鼠體重測量：所有荷瘤鼠體重每週測量兩次。體重變化用公式RCBW %=(BWi-BW0)/BW0×100%，BWi是小鼠當前體重，BW0是分組當日的小鼠體重。

數據均用Graphpad進行分析，採用平均值±SEM表示。用Graphpad中student’s t test比較受試藥物組與對照組的組間差異，P<0.05認為具有顯著性差異。

4、實驗結果

如表28所示，給藥第23天後，陰性對照組平均腫瘤體積為1033.50±83.02mm³；藥物A(35.8mg/kg)給藥組、藥物B(10mg/kg)給藥組、藥物B(10mg/kg)+藥物A(35.8mg/kg)給藥組的腫瘤平均體積分別為872.37±78.44mm³、360.48±63.85mm³、193.20±39.49mm³，其腫瘤生長抑制率(TGI)分別為15.59%、65.12%、81.31%。

如表29所示，給藥第24天時，結束陰性對照組、藥物A(35.8mg/kg)給藥組、藥物B(10mg/kg)給藥組和藥物B(10mg/kg)+藥物 A(35.8mg/kg)給藥組實驗，其腫瘤平均重量分別為1.111±0.103g，0.986±0.078g、0.473±0.071g和0.257±0.043g。

參見圖5A和圖5B、表28和表29，與陰性對照組相比，藥物B(10mg/kg)給藥組和藥物B(10mg/kg)+藥物A(35.8mg/kg)給藥組的腫瘤體積與腫瘤重量均存在統計學上的顯著性差異(p<0.05)，表明上述藥物具有明顯抑制腫瘤生長的作用。與藥物B(10mg/kg)給藥組相比，藥物B(10mg/kg)+藥物A(35.8mg/kg)聯合給藥組的腫瘤體積與腫瘤重量存在統計學上的顯著性差異(p<0.05)，表明藥物B(10mg/kg)+藥物A(35.8mg/kg)聯合給藥具有更好抑制腫瘤生長的作用。

此外，本次實驗中，所有給藥組的小鼠均無行為異常表現，表明荷瘤小鼠對該受試劑量下的藥物具有良好的耐受性，參見圖5C、圖5D和表30。

實施例3. 評價抗PVRIG/TIGIT雙特異性抗體聯合含抗PD-L1抗體的融合蛋白對人黑色素瘤A375混合PBMC皮下移植瘤模型的抗腫瘤作用

1、受試藥物及材料

藥物A：1708-30H2(抗PVRIG/TIGIT雙特異性抗體)，參考PCT/CN2021/080470製備，使用PBS配製成3.58mg/mL或0.72mg/mL溶液；

藥物C：含抗PD-L1抗體的融合蛋白(融合蛋白9)，參考WO20200941225中製備，使用PBS配製成0.1mg/mL溶液；

藥物C是抗PD-L1抗體藉由(G₄S)₄G連接子與TGF-βRII ECD連接的融合蛋白，該抗PD-L1抗體即是實施例2中的藥物B抗體，其中TGF-βRII ECD序列是在N端有19個胺基酸的截短或缺失，如下所示：

>TGF-βRII ECD

(SEQ ID NO：56)

>抗PD-L1抗體重鏈全長(Fc區帶有S228P,F234A,L235A,K447A突變)

(SEQ ID NO：78)

>抗PD-L1抗體輕鏈全長(SEQ ID NO：55)

>融合蛋白9(PD-L1抗體與TGF-βRII ECD融合蛋白)的第一多肽鏈

(SEQ ID NO：77)

下劃線為連接子序列，融合蛋白9(PD-L1抗體與TGF-βRII ECD融合蛋白)的第二多肽鏈如SEQ ID NO：55所示。

融合蛋白9由兩條相同的第一多肽鏈和兩條相同的第二多肽鏈構成。

2、實驗方法

A375細胞培養在含10%胎牛血清(FBS)的DMEM培養液中。收集對數生長期的A375細胞，HBSS重新懸浮至適合濃度用於NCG小鼠皮下腫瘤接種。共培養實驗中用的A375細胞用絲裂黴素C處理2h，然後PBS洗三次。取正常人外周血，用密度梯度離心法分離人PBMC，計數。然後用RPMI1640培養基(含IL-2和10% FBS)將PBMC重新懸浮，與絲裂黴素C處理後的A375細胞共培養。PBMC與A375共培養6天後，收取PBMC與新鮮消化下來的A375細胞，PBMC5×10⁵個，A375細胞4×10⁶個，接種體積0.2mL/隻(含50% Matrigel)，接種於NCG小鼠右側皮下。接種後，根據小鼠體重隨機進行分組給藥，詳細的給藥方法、給藥劑量和給藥途徑見表31，分組給藥當天為第0天。

評估指標參考實施例2。數據均用Graphpad進行分析，採用平均值±SEM表示。用Graphpad中One way ANOVA LSD(L)test比較受試藥物組與對照組的組間差異，P<0.05即認為具有顯著性差異。

3、實驗結果

如表32所示，給藥第22天後，給藥組的腫瘤生長抑制率(TGI)分別為44.87%、50.54%、68.14%和78.93%。瘤重結果參見表33。

結果顯示，與陰性對照組相比，藥物A(7.2mg/kg)給藥組、藥物A(35.8mg/kg)給藥組、藥物C(1mg/kg)給藥組和藥物A(35.8mg/kg)+藥物C(1mg/kg)給藥組的腫瘤體積與腫瘤重量均存在統計學上的顯著性差異(p<0.05)，表明上述藥物具有明顯抑制腫瘤生長的作用(見圖6A、圖6B、表32和表33)。

本次實驗過程中，各組小鼠的體重以及臨床前的行為學均未出現明顯異常變化(見圖6C和圖6D)，表明荷瘤小鼠對測試劑量下的各受試藥物具有良好的耐受性。

實施例4. 評價抗PVRIG/TIGIT雙特異性抗體聯合抗PD-1抗體對人黑色素瘤A375混合PBMC皮下移植瘤模型的抗腫瘤作用

1、受試藥物及材料

藥物D：抗PD-1抗體(Hu23-11.IgG4AA)，參考WO2020156509製備，使用PBS配製成0.1mg/mL溶液；

藥物D(抗PD-1抗體)抗體序列如下：

>抗PD-1抗體重鏈可變區

(SEQ ID NO：57)

>抗PD-1抗體輕鏈可變區：

(SEQ ID NO：58)

上述抗體重輕鏈可變區序列中，下劃線部分為CDR區，各序列依次順序為FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4。其中各抗體輕重鏈中CDR序列如表34所示。

>抗PD-1抗體重鏈全長

(SEQ ID NO：65)

>抗PD-1抗體輕鏈全長

(SEQ ID NO：66)

2、實驗方法

A375細胞培養、PBMC的分離以及二者的共培養和混合接種步驟參考實施例2。根據小鼠體重隨機進行分組給藥，具體給藥方法、給藥劑量和給藥途徑見表35，分組給藥當天為第0天

評估指標參考實施例2。數據均用Graphpad進行分析，採用平均值±SEM表示。用Graphpad中student’s t test比較受試藥物組與對照組的組間差異，P<0.05即認為具有顯著性差異。

3、實驗結果

如表36所示，給藥第35天後，與陰性對照組相比，藥物A組，藥物D組，藥物A+藥物D聯用組的腫瘤體積均減小，給藥組腫瘤生長抑制率(TGI)分別為33.75%、82.58%和94.80%，其中藥物D組(p<0.001)和聯用組(p<0.001)表現出顯著的腫瘤生長的抑制作用。與藥物A組相比，聯用組能顯著抑制腫瘤的生長(33.75% vs 94.80%,p<0.05)；與藥物D組相比，聯合組雖未顯示出顯著性差異(p=0.057)，但腫瘤體積減小，聯用組的腫瘤生長抑制率更優(82.58% vs 94.80%)，表明藥物A與藥物D聯合組具有更好的抑瘤效果(見圖7A和表36)。

與藥物D單藥組相比，藥物A+藥物D聯用組的腫瘤重量顯著性減小(p<0.05)，表明藥物A與藥物D聯合組具有的強的抑制腫瘤生長作用，聯合給藥表現出更好抑瘤效果(見圖7B和表37)。

本次實驗過程中，藥物A單藥組和藥物A+藥物D聯用組在D35和D32各出現一隻動物死亡，可能小鼠對PBMC引起的排斥反應導致的。其他小鼠的體重以及臨床前的行為學均未出現明顯異常變化，表明荷瘤小鼠對測試劑量下的各受試藥物具有良好的耐受性(見圖7C)。

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Claims

一種PVRIG/TIGIT結合蛋白與免疫檢查點抑制劑聯合在製備治療癌症的藥物中的用途，其中，該PVRIG/TIGIT結合蛋白包含特異性結合PVRIG的第一抗原結合結構域和特異性結合TIGIT的第二抗原結合結構域，該特異性結合PVRIG的第一抗原結合結構域包含免疫球蛋白單一可變結構域，該免疫球蛋白單一可變結構域包含：

如SEQ ID NO：2和15-19中任一所示胺基酸序列中的CDR1、CDR2和CDR3，或

如SEQ ID NO：3和21-25中任一所示胺基酸序列中的CDR1、CDR2和CDR3，

該CDR1、CDR2和CDR3是根據Kabat、IMGT、Chothia、AbM或Contact編號系統定義的；

較佳地，根據Kabat編號系統，該免疫球蛋白單一可變結構域的CDR1、CDR2和CDR3的胺基酸序列分別

如SEQ ID NO：4、5和20所示，

如SEQ ID NO：4、5和6所示，或

如SEQ ID NO：7、8和9所示；

更佳地，該PVRIG/TIGIT結合蛋白為抗PVRIG/TIGIT雙特異性抗體或其抗原結合片段。
如請求項1所述的用途，其中，該特異性結合PVRIG的第一抗原結合結構域為人源化、親和力成熟、去除T細胞表位、降低抗體脫醯胺和/或降低抗體異構化的，

較佳地，人源化改造過程使用的人種系模板的重鏈框架區為IGHV3-7 *01。
如請求項1或2所述的用途，其中，該特異性結合PVRIG的第一抗原結合結構域中的免疫球蛋白單一可變結構域的胺基酸序列分別如

SEQ ID NO：2和15-19中任一所示或與之具有至少90%序列同一性；或

SEQ ID NO：3和21-25中任一所示或與之具有至少90%序列同一性。
如請求項1至3中任一項所述的用途，其中該特異性結合TIGIT的第二抗原結合結構域包含重鏈可變區(VH)和輕鏈可變區(VL)，其中，

該重鏈可變區包含分別如SEQ ID NO：32、33和34所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3，和該輕鏈可變區包含分別如SEQ ID NO：35、36和37所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3。
如請求項1至4中任一項所述的用途，其中該特異性結合TIGIT的第二抗原結合結構域包含重鏈可變區(VH)和輕鏈可變區(VL)，其中，

該重鏈可變區包含如SEQ ID NO：38-40中任一所示或與之具有至少90%序列同一性的胺基酸序列，和

該輕鏈可變區包含如SEQ ID NO：41或42所示或與之具有至少90%序列同一性的胺基酸序列；

較佳地，該重鏈可變區包含如SEQ ID NO：38所示或與之具有至少90%序列同一性的胺基酸序列，和

該輕鏈可變區包含如SEQ ID NO：42所示或與之具有至少90%序列同一性的胺基酸序列。
如請求項1至5中任一項所述的用途，其中該PVRIG/TIGIT結合蛋白還包含人免疫球蛋白Fc區；

較佳地，該Fc區是人IgG1或IgG4的Fc區；

更佳地，該人IgG4的Fc區具有S228P、F234A、L235A和/或K447A突變。
如請求項1至6中任一項所述的用途，其中該特異性結合PVRIG的第一抗原結合結構域和特異性結合TIGIT的第二抗原結合結構域直接或藉由連接子相連接；

較佳地，該連接子為具有如(G₄S)_x所示的胺基酸序列，其中，x獨立地選自1-20的整數；

更佳地，該連接子為(G₄S)₂、(G₄S)₃、(G₄S)₄所示的胺基酸序列。
如請求項1至7中任一項所述的用途，其中該特異性結合TIGIT的第二抗原結合結構域包含重鏈可變區(VH)和輕鏈可變區(VL)，其中，

該特異性結合PVRIG的第一抗原結合結構域的免疫球蛋白單一可變結構域位於特異性結合TIGIT的第二抗原結合結構域的重鏈可變區的N端；

該特異性結合PVRIG的第一抗原結合結構域的免疫球蛋白單一可變結構域位於特異性結合TIGIT的第二抗原結合結構域的重鏈可變區的C端；

該特異性結合PVRIG的第一抗原結合結構域的免疫球蛋白單一可變結構域位於特異性結合TIGIT的第二抗原結合結構域的輕鏈可變區的N端；或

該特異性結合PVRIG的第一抗原結合結構域的免疫球蛋白單一可變結構域位於特異性結合TIGIT的第二抗原結合結構域的輕鏈可變區的C端。
如請求項1至8中任一項所述的用途，其中該PVRIG/TIGIT結合蛋白包含第一多肽鏈和第二多肽鏈，其中，

該第一多肽鏈包含如SEQ ID NO：28-29和43-45中任一所示或與其具有至少90%序列同一性的胺基酸序列，該第二多肽鏈包含如SEQ ID NO：27所示或與其具有至少90%序列同一性的胺基酸序列；或者

該第一多肽鏈包含如SEQ ID NO：26所示或與其具有至少90%序列同一性的胺基酸序列，該第二多肽鏈包含如SEQ ID NO：30或31所示或與其具有至少90%序列同一性的胺基酸序列。
如請求項9所述的用途，其中該PVRIG/TIGIT結合蛋白包含兩條相同的第一多肽鏈和兩條相同的第二多肽鏈。
如請求項1至10中任一項所述的用途，其中該免疫檢查點抑制劑為PD-1/PD-L1信號通路抑制劑；

較佳地，該PD-1/PD-L1信號通路抑制劑選自抗PD-1抗體、抗PD-L1抗體、該抗體的抗原結合片段、或包含該抗體或其抗原結合片段的融合蛋白；

更佳地，該抗PD-1抗體選自卡瑞利珠單抗(Camrelizumab)、辛提利單抗(Sintilimab)、西米普利單抗(Cemiplimab)、JS-001、納武單抗(Nivolumab)、替雷利珠單抗(Tislelizumab)、匹博利珠單抗(Pembrolizumab)、AK-103、多塔利單抗(Dostarlimab)、PD1-PIK、GLS-010、杰諾單抗(Genolimzumab)、BI-754091、司巴塔利珠單抗(Spartalizumab)、MGA-012、PF-06801591、XmAb-20717、CS-1003、Sym- 021、AGEN-2034、MEDI-5752、MGD-013、AK-105、AK-104、BCD-100、PF-06753512、HLX-10、AMP-224和LZM-009；該抗PD-L1抗體選自阿得貝利單抗(Adebrelimab)、阿維魯單抗(Avelumab)、阿特利珠單抗(Atezolizumab)、度伐魯單抗(Durvalumab)、CS-1001、M-7824、KL-A167、CX-072、BGB-A333、GNS-1480、CA-170和BMS-936559；該包含PD-L1抗體的融合蛋白選自M7824、GS-19、TS-1905、TST-005、HBM-7015、PM-8001和抗PDL1-TGF βRIIecd。
如請求項11所述的用途，其中該抗PD-1抗體或其抗原結合片段包含重鏈可變區(VH)和輕鏈可變區(VL)，其中，

該重鏈可變區包含分別如SEQ ID NO：59、60和61所示胺基酸序列的HCDR1、HCDR2和HCDR3，該輕鏈可變區包含分別如SEQ ID NO：62、63和64所示胺基酸序列的LCDR1、LCDR2和LCDR3；或

該重鏈可變區包含分別如SEQ ID NO：67、68和69所示胺基酸序列的HCDR1、HCDR2和HCDR3，該輕鏈可變區包含分別如SEQ ID NO：70、71和72所示胺基酸序列的LCDR1、LCDR2和LCDR3；

較佳地，該重鏈可變區包含如SEQ ID NO：57所示或與之具有至少90%同一性的胺基酸序列，該輕鏈可變區包含如SEQ ID NO：58所示或與之具有至少90%同一性的胺基酸序列；或

該重鏈可變區包含如SEQ ID NO：73所示或與之具有至少90%同一性的胺基酸序列，輕鏈可變區包含如SEQ ID NO：74所示或與之具有至少90%同一性的胺基酸序列。
如請求項12所述的用途，其中該抗PD-1抗體或其抗原結合片段還包含人免疫球蛋白Fc區；

較佳地，該Fc區是人IgG1或IgG4的Fc區；

更佳地，該人IgG4的Fc區具有S228P、F234A、L235A和/或K447A突變。
如請求項12或13所述的用途，其中該抗PD-1抗體包含重鏈(HC)和輕鏈(LC)，其中，

該重鏈包含如SEQ ID NO：65所示或與之具有至少80%同一性的胺基酸序列，該輕鏈包含如SEQ ID NO：66所示或與之具有至少80%同一性的胺基酸序列；或

該重鏈包含如SEQ ID NO：75所示或與之具有至少80%同一性的胺基酸序列，該輕鏈包含如SEQ ID NO：76所示或與之具有至少80%同一性的胺基酸序列。
如請求項11所述的用途，該抗PD-L1抗體或其抗原結合片段包含重鏈可變區(VH)和輕鏈可變區(VL)，其中，

該重鏈可變區包含分別如SEQ ID NO：48、49和50所示胺基酸序列的HCDR1、HCDR2和HCDR3，該輕鏈可變區包含分別如SEQ ID NO：51、52和53所示胺基酸序列的LCDR1、LCDR2和LCDR3；

較佳地，該重鏈可變區包含如SEQ ID NO：46所示或與之具有至少90%同一性的胺基酸序列，該輕鏈可變區包含如SEQ ID NO：47所示或與之具有至少90%同一性的胺基酸序列。
如請求項15所述的用途，其中該抗PD-L1抗體或其抗原結合片段還包含人免疫球蛋白Fc區；

較佳地，該Fc區是人IgG1或IgG4的Fc區；

更佳地，該人IgG4的Fc區具有S228P、F234A、L235A和/或K447A突變。
如請求項15或16所述的用途，其中該抗PD-L1抗體包含重鏈(HC)和輕鏈(LC)，其中，

該重鏈包含如SEQ ID NO：54所示或與之具有至少80%同一性的胺基酸序列，該輕鏈包含如SEQ ID NO：55所示或與之具有至少80%同一性的胺基酸序列。
如請求項11、15至17中任一項所述的用途，其中該包含抗PD-L1抗體或其抗原結合片段的融合蛋白中還包含TGF-βRII ECD結構域，

較佳地，該TGF-βRII ECD結構域的胺基酸序列如SEQ ID NO：56所示。
如請求項18所述的用途，其中該包含抗PD-L1抗體或其抗原結合片段的融合蛋白中，TGF-βRII ECD結構域藉由連接子與重鏈全長的C端連接，該連接子較佳為(G₄S)₄G。
如請求項19所述的用途，其中該包含抗PD-L1抗體或其抗原結合片段的融合蛋白包含第一多肽鏈和第二多肽鏈，其中，

該第一多肽鏈包含如SEQ ID NO：77或78所示或與之具有至少90%同一性的胺基酸序列，該第二多肽鏈包含如SEQ ID NO：55所示或與之具有至少90%同一性的胺基酸序列。
如請求項1至20中任一項所述的用途，該癌症選自肺癌、前列腺癌、乳腺癌、頭頸部癌、食管癌、胃癌、結腸癌、結直腸癌、膀胱癌、宮頸癌、子宮癌、卵巢癌、肝癌、黑色素瘤、腎癌、鱗狀細胞癌、血液系統癌症，或其任意組合；

較佳地，該癌症為晚期或轉移性的。
一種醫藥組成物，其含有PVRIG/TIGIT結合蛋白和免疫檢查點抑制劑，其中該PVRIG/TIGIT結合蛋白如請求項1至10中任一項所定義，該免疫檢查點抑制劑如請求項11至20中任一項所定義；較佳地，該醫藥組成物進一步包含至少一種可藥用的賦形劑、稀釋劑或載體。
一種治療或緩解癌症的方法，該方法包括向有需要的受試者同時、相繼、或分開地施用治療或緩解有效量的PVRIG/TIGIT結合蛋白和免疫檢查點抑制劑；其中，該PVRIG/TIGIT結合蛋白如請求項1至10中任一項所定義，該免疫檢查點抑制劑如請求項11至20中任一項所定義；

較佳地，該癌症選自肺癌、前列腺癌、乳腺癌、頭頸部癌、食管癌、胃癌、結腸癌、結直腸癌、膀胱癌、宮頸癌、子宮癌、卵巢癌、肝癌、黑色素瘤、腎癌、鱗狀細胞癌、血液系統癌症，或其任意組合。
一種用於治療或緩解癌症的藥物組合，其包含PVRIG/TIGIT結合蛋白和免疫檢查點抑制劑；其中，該PVRIG/TIGIT結合蛋白如請求項1至10中任一項所定義，該免疫檢查點抑制劑如請求項11至20中任一項所定義；

較佳地，該癌症選自肺癌、前列腺癌、乳腺癌、頭頸部癌、食管癌、胃癌、結腸癌、結直腸癌、膀胱癌、宮頸癌、子宮癌、卵巢癌、肝癌、黑色素瘤、腎癌、鱗狀細胞癌、血液系統癌症，或其任意組合。
如請求項24該用於治療或緩解癌症的藥物組合，其中該PVRIG/TIGIT結合蛋白和免疫檢查點抑制劑具有抑制癌細胞生長的協同作用，相較於單藥療法，能夠顯著改善免疫檢查點抑制劑的抑癌效果。
一種活化NK細胞、γδT細胞和/或Th1細胞的方法，該方法包含向有需要的受試者同時、相繼、或分開地施用有效量的PVRIG/TIGIT結合蛋白和免疫檢查點抑制劑；其中，該PVRIG/TIGIT結合蛋白如請求項1至10中任一項所定義，該免疫檢查點抑制劑如請求項11至20中任一項所定義。
一種增加受試者體內的IFN-γ產生和/或促炎性細胞因子分泌的方法，該方法包含向有需要的受試者同時、相繼、或分開地施用有效量的PVRIG/TIGIT結合蛋白和免疫檢查點抑制劑；其中，該PVRIG/TIGIT結合蛋白如請求項1至10中任一項所定義，該免疫檢查點抑制劑如請求項11至20中任一項所定義。
一種抑制PD-1活性或促進T細胞增殖或使受試者從免疫反應上調獲益的方法，該方法包括向受試者同時、相繼、或分開地施用有效量的PVRIG/TIGIT結合蛋白和免疫檢查點抑制劑；其中，該PVRIG/TIGIT結合蛋白如請求項1至10中任一項所定義，該免疫檢查點抑制劑如請求項11至20中任一項所定義。