BR112021015168A2

BR112021015168A2 - Anticorpo anti-pd-1, fragmento de ligação ao antígeno do mesmo e uso farmacêutico do mesmo

Info

Publication number: BR112021015168A2
Application number: BR112021015168-0A
Authority: BR
Inventors: Xiaoling GU; Xin Ye; Hu Ge; Weikang Tao
Original assignee: Jiangsu Hengrui Medicine Co., Ltd.; Shanghai Hengrui Pharmaceutical Co., Ltd.
Priority date: 2019-02-03
Filing date: 2020-01-31
Publication date: 2021-09-28
Also published as: AU2020213579A1; JP2022518588A; US20220098304A1; TWI843799B; KR20210124993A; EP3922647A1; MX2021009041A; CN112969716B; CN112969716A; TW202045538A; CA3128104A1; WO2020156509A1; EP3922647A4

Abstract

anticorpo anti-pd-1, fragmento de ligação ao antígeno do mesmo e uso farmacêutico do mesmo. são fornecidos um anticorpo anti-pd-1, um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, e um uso farmacêutico do mesmo. especificamente, são fornecidos um anticorpo anti-pd-1 humanizado contendo uma região cdr específica e um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, uma composição farmacêutica contendo o anticorpo anti-pd-1 e o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, e um seu uso como fármaco. em particular, é fornecido um uso do anticorpo anti-pd-1 humanizado na preparação do fármaco para o tratamento de doenças ou distúrbios associados ao pd-1.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para: “ANTICORPO ANTI-PD-1, FRAGMENTO DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO DO MESMO E USO FARMACÊUTICO DO MESMO” Campo da invenção

[001] A presente descrição pertence ao campo da biotecnologia. Mais especificamente, a presente descrição se refere a anticorpos anti-PD-1 e aplicações dos mesmos.

Técnica Anterior

[002] As declarações contidas nesse documento fornecem apenas informação de base relacionada com a presente invenção, e não constituem necessariamente um estado da técnica anterior.

[003] A imunoterapia tumoral é um método de tratamento que usa e mobiliza plenamente as células T exterminadoras em pacientes com tumor para eliminar o tumor. Ao mesmo tempo, a evasão de células tumorais é um enorme obstáculo à imunoterapia tumoral. As células tumorais usam seus próprios efeitos inibidores no sistema imunológico para promover o crescimento rápido dos tumores. Existe uma relação muito complicada entre o mecanismo de evasão imunológica dos tumores e a resposta imunológica do organismo aos tumores.

Na fase inicial da imunoterapia tumoral, as células T exterminadoras específicas do tumor têm sua atividade biológica, mas à medida que o tumor cresce, perdem sua função exterminadora na fase posterior.

[004] A ativação das células T no corpo humano adota dois sistemas de vias de sinalização. Para além do primeiro sinal fornecido às células T pela apresentação de peptídeos de antígeno MHC por células que apresentam antígeno, é também necessário um segundo sinal fornecido por uma série de moléculas coestimuladoras para permitir que as células T produzam respostas imunológicas normais. Este sistema de via de sinalização dupla desempenha um papel vital no equilíbrio do sistema imunológico do corpo. Regula rigorosamente diferentes respostas imunológicas do corpo a antígenos próprios e não próprios. Se o segundo sinal fornecido pela molécula coestimuladora estiver ausente, levará a uma não resposta ou a uma resposta imunológica específica sustentada das células T, levando assim à tolerância. Assim, a segunda via de sinalização desempenha um papel regulador muito crítico em todo o processo da resposta imunológica do organismo.

[005] O receptor de morte celular programada-1 (ou programmed death-1 - PD-1) é um receptor de proteínas expresso na superfície das células T descoberto em 1992 e está envolvido no processo de apoptose celular. O PD-1 pertence à família CD28. Tem 23% de homologia de aminoácidos com antígeno 4 de linfócito T citotóxico (ou cytotoxic T lymphocyte antigen 4 - CTLA-4), mas sua expressão é diferente da do CTLA, e é expressa principalmente nas células T,

células B e células mieloides ativadas. O PD-1 tem dois ligantes, PD-L1 e PD-L2, respectivamente. O PD-L1 é expresso principalmente nas células T, células B, macrófagos e células dendríticas (DC), pode se fazer a regulação ascendente de sua expressão nas células após ser ativada. A expressão do PD-L2 é relativamente limitada e é expressa principalmente em células apresentando antígeno, tais como os macrófagos e as células dendríticas ativadas.

[006] O PD-L1 inibe o sistema imunológico ligando-se a PD-1 e a B7-1. Muitas células tumorais e células imunológicas no microambiente do tecido tumoral expressam PD-L1. Novas investigações descobriram que foi detectada uma alta expressão da proteína PD-L1 no câncer da mama, câncer do pulmão (por exemplo, câncer do pulmão de células não pequenas), câncer gástrico, câncer do intestino, câncer do rim, melanoma, câncer do cólon, câncer da bexiga, câncer do ovário, câncer do pâncreas e câncer do fígado e outros tecidos tumorais humanos, e o nível de expressão de PD-L1 estava intimamente relacionado com a manifestação clínica e o prognóstico dos pacientes.

[007] O anticorpo monoclonal anti-PD-1 pode maximizar a resposta do próprio sistema imunológico do paciente a tumores, bloqueando a ligação de PD-L1/PD-1, alcançando assim o objetivo de eliminar células tumorais. Atualmente, o anticorpo anti-PD-1 Pembrolizumab (também conhecido como

Merck keytruda, keytruda, Merck-Pemb, Merck-keytruda, Merck- PD-1, pembrolizumab) e Novilumab (também conhecido como BMS Opdivo, Opdivo, BMS-Nivolumab, Novilumab) foi aprovado pela FDA para o tratamento de melanoma, pacientes com linfoma de Hodgkin, câncer do pulmão de células não pequenas e outros tumores. Além disso, documentos de patentes, tais como WO200139722, WO2006121168, WO2010036959, WO2010089411, WO2011110604, WO2013173223, WO2013181634, US2014335093, US6803192B1, US8617546B2, e WO2015085847, também descrevem uma variedade de anticorpos monoclonais anti-PD-1.

Sumário da Invenção

[008] A presente descrição fornece um novo anticorpo anti-PD-1, fragmento de ligação ao antígeno do mesmo e uso médico do mesmo.

[009] Em algumas modalidades alternativas, a presente descrição fornece um anticorpo anti-PD-1 ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, que é selecionado de qualquer um dos seguintes i) a iii): (i) um anticorpo anti-PD-1 ou fragmento de anticorpo de ligação ao antígeno do mesmo, cuja região variável de cadeia pesada compreende HCDR1, como mostrado na SEQ ID NO: 8 ou com no máximo 3, 2 ou 1 mutação de aminoácidos à mesma, HCDR2 como mostrado na SEQ ID NO: 9 ou com no máximo 3, 2 ou 1 mutação de aminoácidos à mesma, e HCDR3 como mostrado na SEQ ID NO: 10 ou que tenha no máximo 8, 3, 2, ou 1 mutação de aminoácidos à mesma; cuja região variável de cadeia leve compreende LCDR1 como mostrado na SEQ ID NO: 11 ou que tenha no máximo 4, 3, 2 ou 1 mutação de aminoácidos à mesma, LCDR2 como mostrada na SEQ ID NO: 12 ou que tenha no máximo 3, 2 ou 1 mutação de aminoácidos à mesma, e LCDR3 como mostrada na SEQ ID NO: 13 ou que tenha no máximo 3, 2 ou 1 mutação de aminoácidos à mesma;

(ii) um anticorpo anti-PD-1 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, cuja região variável de cadeia pesada compreende HCDR1, como mostrada na SEQ ID NO: 14 ou que tenha no máximo 3, 2 ou 1 mutação de aminoácidos à mesma, HCDR2 como mostrada na SEQ ID NO: 15 ou que tenha no máximo 3, 2 ou 1 mutação de aminoácidos à mesma, e HCDR3 como mostrada na SEQ ID NO: 16 ou que tenha no máximo 8, 3, 2 ou 1 mutação de aminoácidos à mesma; cuja região variável de cadeia leve compreende LCDR1, como mostrada na SEQ ID NO: 17 ou que tenha no máximo 4, 3, 2 ou 1 mutação de aminoácidos à mesma, LCDR2,

como mostrada na SEQ ID NO: 12 ou que tenha no máximo 3, 2 ou 1 mutação de aminoácidos à mesma, e LCDR3, como mostrada na SEQ ID NO: 18 ou que tenha no máximo 3, 2 ou 1 mutação de aminoácidos à mesma; e

(iii) um anticorpo anti-PD-1 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, cuja região variável de cadeia pesada compreende HCDR1, como mostrada na SEQ ID NO: 21 ou com no máximo 3, 2 ou 1 mutação de aminoácidos à mesma, HCDR2 como mostrada na SEQ ID NO: 22 ou com no máximo 3, 2 ou 1 mutação de aminoácidos à mesma, e HCDR3 como mostrada na SEQ ID NO: 23 ou que tenha no máximo 3, 2, ou 1 mutação de aminoácidos à mesma; cuja região variável de cadeia leve compreende LCDR1 como mostrada na SEQ ID NO: 24 ou que tenha no máximo 3, 2, ou 1 mutação de aminoácidos à mesma, LCDR2 como mostrada na SEQ ID NO: 25 ou que tenha no máximo 3, 2 ou 1 mutação de aminoácidos à mesma, e LCDR3 como mostrada na SEQ ID NO: 26 ou que tenha no máximo 3, 2 ou 1 mutação de aminoácidos à mesma.

[0010] Em algumas modalidades, o anticorpo anti-PD-1 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo da presente descrição supracitado se liga ao PD-1 humano com uma constante de equilíbrio de dissociação de 10-7 M ou inferior.

Em algumas modalidades, se liga ao PD-1 humano com uma constante de equilíbrio de dissociação igual ou inferior a 10-8 M, 10-9 M, 10-10 M ou 10-11 M.

[0011] Em algumas modalidades alternativas, a presente descrição fornece um anticorpo anti-PD-1 ou um fragmento do mesmo, cuja região variável de cadeia pesada compreende: HCDR1 como mostrada na SEQ ID NO: 65, HCDR2 como mostrada na SEQ ID NO: 66, e HCDR3 como mostrada na SEQ ID NO: 67; cuja região variável de cadeia leve compreende: LCDR1 como mostrado na SEQ ID NO: 68, LCDR2 como mostrado na SEQ ID NO: 12, e LCDR3 como mostrado na SEQ ID NO: 69; as sequências são mostradas na Tabela 1 abaixo: Tabela 1 Cadeia pesada Cadeia leve HCDR1 DYE X1H, X1 é selecionado LCDR1 RSSQSX13VHSX14X15X16TYLE de I ou M; , em que X13 é (SEQ ID NO: 65) selecionado de I ou L, X14 é selecionado de N, Q, L, T ou D, X15 é selecionado de G, A ou V, e X16 é selecionado de N ou K; (SEQ ID NO: 68) HCDR2 LX2DPETGGX3VYNQKFKX4, X2 é LCDR2 KVSNRFS; selecionado de F ou I, X3 (SEQ ID NO: 12) é selecionado de I/T e X4 é selecionado de G ou D; (SEQ ID NO: 66) HCDR3 EX5X6X7X8YX9X10X11X12DWYFDV, LCDR3 FQGSHVPYX17, X17 é X5 é selecionado de G ou selecionado de A ou R, X6 é selecionado de F T; ou ausente, X7 é S ou (SEQ ID NO: 69) ausente, X8 é Y ou ausente, X9 é G ou ausente, X10 é S ou ausente, X11 é selecionado de N ou T e X12 é selecionado de R ou S; (SEQ ID NO: 67)

[0012] Em algumas modalidades alternativas, no supracitado anticorpo anti-PD-1 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, a região variável de cadeia pesada compreende HCDR1, como mostrada na SEQ ID NO: 8, HCDR2, como mostrada na SEQ ID NO: 9, e HCDR3, como mostrada na SEQ ID NO: 10; a região variável de cadeia leve compreende LCDR2, como mostrada na SEQ ID NO: 12, LCDR3 como mostrado na SEQ ID NO: 13, e LCDR1 como mostrado na fórmula geral RSSQSX13VHSX14X15X16TYLE (SEQ ID NO: 68), em que X13 é selecionado de L, X14 é selecionado de N, Q, L, T ou D, X15 é selecionado de G, A ou V, e X16 é selecionado de N.

[0013] Em algumas modalidades alternativas, o anticorpo anti-PD-1 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo é selecionado de qualquer um dos seguintes (a) a (e):

(a) um anticorpo anti-PD-1 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, compreendendo HCDR1, HCDR2 e HCDR3,

como mostrado na SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 e SEQ ID NO: 10,

respectivamente, e LCDR2 e LCDR3 como mostrado na SEQ ID NO:

12 e SEQ ID NO: 13, respectivamente, e LCDR1 como mostrado na SEQ ID NO: 11, 47, 48, 49, 49, 50, 51 ou 52;

(b) um anticorpo anti-PD-1 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, compreendendo HCDR1, HCDR2 e HCDR3,

como mostrado na SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15 e SEQ ID NO:

16, respectivamente, e LCDR1, LCDR2 e LCDR3, como mostrado na SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 12 e SEQ ID NO: 18,

respectivamente;

(c) um anticorpo anti-PD-1 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, compreendendo HCDR1, HCDR2 e HCDR3,

como mostrado na SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22 e SEQ ID NO:

23, respectivamente, e LCDR1, LCDR2 e LCDR3 como mostrado na

SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25 e SEQ ID NO: 26, respectivamente;

(d) um anticorpo anti-PD-1 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, compreendendo HCDR1, HCDR2 e HCDR3,

como mostrado na SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15 e SEQ ID NO:

16, respectivamente, e LCDR2 e LCDR3, como mostrado na SEQ

ID NO: 12 e SEQ ID NO: 13, respectivamente, e LCDR1, como mostrado na SEQ ID NO: 11, 47, 48, 49, 50, 51 ou 52; e (e) a região variável de cadeia pesada compreende HCDR1, HCDR2 e HCDR3, como mostrado na SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 e SEQ ID NO: 10, respectivamente, e a região variável de cadeia leve compreende LCDR1, LCDR2 e LCDR3, como mostrado na SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 12 e SEQ ID NO: 18, respectivamente.

[0014] Em algumas modalidades, o anticorpo anti-PD-1 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreende uma região variável de cadeia pesada e uma região variável de cadeia leve, em que a região variável de cadeia pesada compreende HCDR1, HCDR2 e HCDR3, como mostrado na SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 e SEQ ID NO: 10, respectivamente, e a região variável de cadeia leve compreende LCDR1, LCDR2 e LCDR3, como mostrado na SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 12 e SEQ ID NO: 13, respectivamente.

[0015] Em algumas modalidades, o anticorpo anti-PD-1 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreende uma região variável de cadeia pesada e uma região variável de cadeia leve, em que a região variável de cadeia pesada compreende HCDR1, HCDR2 e HCDR3, como mostrado na SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22 e SEQ ID NO: 23, respectivamente, e a região variável de cadeia leve compreende LCDR1, LCDR2 e LCDR3, como mostrado na SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25 e SEQ ID NO: 26, respectivamente.

[0016] Em algumas modalidades alternativas, a presente descrição fornece um anticorpo anti-PD-1 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, que é selecionado de qualquer um dos seguintes iv) a vi):

iv) um anticorpo anti-PD-1 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, cuja região variável de cadeia pesada compreende HCDR1, HCDR2 e HCDR3 com as mesmas sequências que as da região variável de cadeia pesada mostrada na sequência

SEQ ID NO: 4, e a região variável de cadeia leve compreende

LCDR1, LCDR2 e LCDR3 com as mesmas sequências que as da região variável de cadeia leve mostrada na sequência SEQ ID

NO: 5;

v) um anticorpo anti-PD-1 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, cuja região variável de cadeia pesada compreende HCDR1, HCDR2 e HCDR3 com as mesmas sequências que as da região variável de cadeia pesada mostrada na sequência

SEQ ID NO: 6, e a região variável de cadeia leve compreende

NO: 7; e vi) um anticorpo anti-PD-1 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, cuja região variável de cadeia pesada compreende HCDR1, HCDR2 e HCDR3 com as mesmas sequências que as da região variável de cadeia pesada mostrada na sequência

SEQ ID NO: 19, e a região variável de cadeia leve compreende

LCDR1, LCDR2 e LCDR3 com as mesmas sequências que as da região variável de cadeia leve mostrada na sequência SEQ ID NO: 20.

[0017] Em algumas modalidades do referido anticorpo anti-PD-1 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, o anticorpo anti-PD-1 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo é um anticorpo murino ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, um anticorpo quimérico ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, um anticorpo totalmente humano ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, ou um anticorpo humanizado ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo.

[0018] Em algumas modalidades do referido anticorpo anti-PD-1 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, o anticorpo anti-PD-1 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo é um anticorpo humanizado ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo.

[0019] Em algumas modalidades, o anticorpo humanizado compreende uma região de estrutura (ou framework region) derivada de um anticorpo humano ou uma sua variante da região de estrutura.

[0020] Em algumas modalidades, a variante da região de estrutura tem no máximo 11 mutações reversas de aminoácidos em cada uma das região de cadeia leve e/ou região de cadeia pesada de um anticorpo humano.

[0021] Em algumas modalidades, a variante da região de estrutura compreende uma mutação(ões) selecionada(s) de qualquer uma das seguintes (f) a (h): (f) mutação reversa de aminoácido 2G compreendida na região variável de cadeia leve e/ou uma ou mais mutações reversas de aminoácidos selecionadas de 27Y, 48I, 67T, 69L, 82F e 93T compreendidas na região variável de cadeia pesada; (g) mutação reversa de aminoácido 2V compreendida na região variável de cadeia leve e/ou uma ou mais mutações reversas de aminoácidos selecionadas de 26D, 27F, 30T, 38K, 43H, 48I, 66K, 67A, 69L, 82F e 93T compreendidas na região variável de cadeia pesada; e (h) uma ou mais mutações reversas de aminoácidos selecionados de 42G, 44V e 71Y compreendidos na região variável de cadeia leve, e/ou mutações reversas de aminoácidos 1K e/ou 94S compreendidas na região variável de cadeia pesada.

[0022] Em algumas modalidades do referido anticorpo anti-PD-1 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, o anticorpo anti-PD-1 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreende regiões variáveis de anticorpo selecionados do grupo consistindo em: (a2) uma região variável de cadeia pesada compreendendo HCDR1, HCDR2 e HCDR3, como mostrado na SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 e SEQ ID NO: 10, respectivamente, e uma ou mais mutações reversas de aminoácidos de 27Y, 48I, 67T, 69L, 82F e 93T compreendidas na região de estrutura de cadeia pesada, e uma região variável de cadeia leve compreendendo LCDR2 e

LCDR3, como mostrado na SEQ ID NO: 12 e SEQ ID NO: 13,

respectivamente, e LCDR1 como mostrado na SEQ ID NO: 11, 47,

48, 49, 50, 51 ou 52, e a mutação reversa de aminoácido 2G compreendida na região de estrutura de cadeia leve;

(b2) uma região variável de cadeia pesada compreendendo

HCDR1, HCDR2 e HCDR3, como mostrado na SEQ ID NO: 14, SEQ ID

NO: 15 e SEQ ID NO: 16, respectivamente, e uma ou mais mutações reversas de aminoácidos selecionados de 26D, 27F,

30T, 38K, 43H, 48I, 66K, 67A, 69L, 82F e 93T compreendidas na região variável de cadeia pesada; e uma região variável de cadeia leve compreendendo LCDR1, LCDR2 e LCDR3, como mostrado na SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 12 e SEQ

ID NO: 18, respectivamente, e a mutação reversa de aminoácido

2V compreendida na região de estrutura de cadeia leve;

(c2) uma região variável de cadeia pesada compreendendo

HCDR1, HCDR2 e HCDR3, como mostrado na SEQ ID NO: 21, SEQ ID

NO: 22 e SEQ ID NO: 23, respectivamente, e mutações reversas de aminoácidos 1K e/ou 94S compreendidas na região de estrutura de cadeia pesada, e uma região variável de cadeia leve compreendendo LCDR1, LCDR2 e LCDR3, como mostrado na SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25 e SEQ

ID NO: 26, respectivamente, e uma ou mais mutações reversas de aminoácidos selecionados de 42G, 44V e 71Y compreendidas na região de estrutura de cadeia leve.

[0023] Em algumas modalidades do referido anticorpo anti-PD-1 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, o anticorpo anti-PD-1 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreende regiões variáveis de anticorpos selecionados de qualquer uma das seguintes (i) a (o): (i) uma região variável de cadeia pesada, cuja sequência é a indicada na SEQ ID NO: 4 ou tem pelo menos 90% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 4, e/ou uma região variável de cadeia leve, cuja sequência é a indicada na SEQ ID NO: 5 ou tem pelo menos 90% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 5; (j) uma região variável de cadeia pesada, cuja sequência é a indicada na SEQ ID NO: 6 ou tem pelo menos 90% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 6, e/ou uma região variável de cadeia leve, cuja sequência é a indicada na SEQ ID NO: 7 ou tem pelo menos 90% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 7; (k) uma região variável de cadeia pesada, cuja sequência é a indicada na SEQ ID NO: 19 ou tem pelo menos 90% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 19, e/ou uma região variável de cadeia leve, cuja sequência é a indicada na SEQ ID NO: 20 ou tem pelo menos 90% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 20; (l) uma região variável de cadeia pesada, cuja sequência é a indicada no ID SEQ NO: 27, 30, 31 ou 32, ou tem pelo menos 90% de identidade de sequência com a SEQ ID

NO: 27, 30, 31 ou 32, respectivamente; e/ou uma região variável de cadeia leve, cuja sequência é a indicada na SEQ ID NO: 28, 29, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59,

60, 61, 62, 63 ou 64, ou tem pelo menos 90% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 28, 29, 34, 35, 53, 54, 55, 56,

57, 58, 59, 60, 61, 62, 63 ou 64, respectivamente;

(m) uma região variável de cadeia pesada, cuja sequência é a indicada na SEQ ID NO: 33, 36, 37, 38, 39 ou

40, ou tem pelo menos 90% de identidade de sequência com a

SEQ ID NO: 33, 36, 37, 38, 39 ou 40, respectivamente, e/ou uma região variável de cadeia leve, cuja sequência é a indicada na SEQ ID NO: 34, 35, 28, 29, 53, 54, 55, 56, 57,

58, 59, 60, 61, 62, 63 ou 64, ou tem pelo menos 90% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 34, 35, 28, 29, 53,

54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63 ou 64, respectivamente;

(n) uma região variável de cadeia pesada, cuja sequência é a indicada na SEQ ID NO: 41, 45 ou 46, ou tem pelo menos 90% de identidade de sequência com a SEQ ID NO:

41, 45 ou 46, respectivamente, e/ou uma região variável de cadeia leve, cuja sequência é a indicada na SEQ ID NO: 42, 43 ou 44, ou tem pelo menos 90%

de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 42, 43 ou 44,

respectivamente;

(o) uma região variável de cadeia pesada, cuja sequência é a indicada na SEQ ID NO: 70 ou tem pelo menos

90% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 70, e/ou uma região variável de cadeia leve, cuja sequência é a indicada na SEQ ID NO: 71 ou tem pelo menos 90% de sequência de identidade com a SEQ ID NO: 71; e

(p) uma região variável de cadeia pesada, cuja sequência é a indicada na SEQ ID NO: 27, 30, 31 ou 32, ou tem pelo menos 90% de sequência com a SEQ ID NO: 27, 30, 31 ou 32, respectivamente, e/ou uma região variável de cadeia leve, cuja sequência é a indicada na SEQ ID NO: 34 ou 35, ou tem pelo menos 90% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 34 ou 35,

respectivamente;

em que as sequências SEQ ID NO: 70 e SEQ ID NO: 71 são representadas por sequências de fórmula geral, tal como mostradas na Tabela 2:

Tabela 2

EVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASX18X19TFX20DYEX1HWVX21Q DX29VMTQTPLSLPVTPGEPAS APGX22GLEWX23GLX2DPETGGX3VYNQKFKX4X24X25TX26TADKS ISCRSSQSX13VHSX14X15X16T TSTAYMEX27SSLRSEDTAVYYCX28REX5X6X7X8YX9X10X11X12DW YLEWYLQKPGQSPQLLIYKVS YFDVWGQGTTVTVSS, em que, X1 é selecionado de NRFSGVPDRFSGSGSGTDFTL I ou M, X2 é selecionado de F ou I, X3 é KISRVEAEDVGVYYCFQGSHV selecionado de I/T, X4 é selecionado de G ou PYX17FGGGTKVEIK, em D, X5 é selecionado de G ou R, X6 é F ou que, X13 é selecionado ausente, X7 é S ou ausente, X8 é Y ou ausente, de I ou L, X14 é X9 é G ou ausente, X10 é S ou ausente, X11 é selecionado de N, Q, selecionado de N ou T, X12 é selecionado de R L, T ou D, X15 é ou S, X18 é selecionado de G ou D, X19 é selecionado de G, A selecionado de G, F ou Y, X20 é selecionado de ou V, X16 é S ou T, X21 é selecionado de R ou K, X22 é selecionado de N ou selecionado de Q ou H, X23 é selecionado de M K, X17 é selecionado ou I, X24 é selecionado de R ou K, X25 é de A ou T e X29 é selecionado de V, A ou T, X26 é selecionado de selecionado de I, V ou G (SEQ ID NO: 71)

R ou K, X27 é selecionado de L ou F e X28 é selecionado de A ou T (SEQ ID NO: 70)

[0024] Em algumas modalidades, a região variável de cadeia pesada do anticorpo anti-PD-1 é como mostrada na SEQ ID NO: 27 ou tem pelo menos 90% de identidade com a SEQ ID NO: 27, e a sequência da região variável de cadeia leve do anticorpo anti-PD-1 é como mostrada na SEQ ID NO: 55 ou tem pelo menos 90% de identidade de sequência com a SEQ ID NO:

55.

[0025] Em algumas modalidades, a região variável de cadeia pesada do anticorpo anti-PD-1 é como mostrada na SEQ ID NO: 46 ou tem pelo menos 90% de identidade com a SEQ ID NO: 46, e a sequência da região variável de cadeia leve do anticorpo anti-PD-1 é como mostrada na SEQ ID NO: 43 ou tem pelo menos 90% de identidade de sequência com a SEQ ID NO:

43.

[0026] A referida “pelo menos 90% de identidade” inclui ter pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade.

[0027] Em algumas outras modalidades do referido anticorpo anti-PD-1 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, o anticorpo compreende ainda regiões constantes de anticorpo; em algumas outras modalidades, a região constante de cadeia pesada da região constante de anticorpo é selecionada de regiões constantes de IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4 humanas e suas variantes convencionais, a região constante de cadeia leve da região constante de anticorpo é selecionada de regiões constantes de cadeias κ e λ de anticorpos humanos e suas variantes convencionais; em algumas outras modalidades, as regiões constantes de anticorpo compreendem uma região constante de cadeia pesada IgG4 na qual são introduzidas uma ou mais mutações de S228P, F234A e L235A, por exemplo compreendem uma região constante de cadeia pesada tendo as três mutações de aminoácidos de S228P, F234A e L235A; em algumas outras modalidades, o anticorpo compreende uma região constante de cadeia pesada, como mostrada na SEQ ID NO: 72 ou SEQ ID NO: 79, e uma região constante de cadeia leve, como mostrada na SEQ ID NO: 73.

[0028] Em algumas modalidades do referido anticorpo anti-PD-1 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, o anticorpo anti-PD-1 compreende uma cadeia leve, como mostrada na SEQ ID NO: 78 e uma cadeia pesada, como mostrada na SEQ ID NO: 77 ou 82; ou uma cadeia leve como mostrada na SEQ ID NO: 75 e uma cadeia pesada como mostrada na SEQ ID NO: 74, 76, 80 ou 81.

[0029] Em algumas modalidades, o anticorpo anti-PD-1 compreende: uma cadeia pesada, como mostrada na SEQ ID NO: 74 e uma cadeia leve, como mostrada na SEQ ID NO: 75; ou uma cadeia pesada como mostrada na SEQ ID NO: 77 e uma cadeia leve como mostrada na SEQ ID NO: 78.

[0030] Em algumas modalidades, é fornecido um anticorpo anti-PD-1 ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, sendo que o anticorpo se liga competitivamente ao PD-1 humano ou se liga ao mesmo epítopo PD-1 humano com qualquer um dos anticorpos anti-PD-1 ou fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos referidos.

[0031] Em algumas modalidades do referido anticorpo anti-PD-1 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, o anticorpo é um anticorpo biespecífico ou um anticorpo multiespecífico.

[0032] Em algumas modalidades do anticorpo anti-PD-1 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, o fragmento de ligação ao antígeno é selecionado do grupo consistindo em Fab, Fab’, F(ab’)2, anticorpo de cadeia única (scFv), região V dimerizada (diacorpo) e região V estabilizada por ligação dissulfeto (dsFv).

[0033] Em algumas modalidades, é descrito um anticorpo monoclonal isolado ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, o referido anticorpo ligando-se competitivamente ao PD-1 humano com o anticorpo anti-PD-1 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com qualquer um dos parágrafos anteriores.

[0034] Em algumas modalidades, a presente descrição fornece também uma composição farmacêutica, compreendendo uma quantidade terapeuticamente eficaz do anticorpo anti-PD- 1 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com qualquer um dos parágrafos anteriores, ou uma quantidade terapeuticamente eficaz do referido anticorpo monoclonal isolado ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, e um ou mais veículos, diluentes, tampões ou excipientes farmaceuticamente aceitáveis. Em algumas modalidades, a quantidade terapeuticamente eficaz se refere a uma dose unitária da composição contendo 0,1 a 3000 mg do referido anticorpo anti-PD-1 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo.

[0035] Em algumas modalidades, a presente descrição fornece também uma molécula de ácido nucleico que codifica o anticorpo anti-PD-1 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo de acordo com qualquer um dos parágrafos anteriores, ou codifica o referido anticorpo monoclonal isolado ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo.

[0036] Em algumas modalidades, a presente descrição fornece também uma célula hospedeira compreendendo a referida molécula de ácido nucleico.

[0037] Em algumas modalidades, a presente descrição fornece também um método de imunodetecção ou determinação de PD-1, compreendendo uma etapa de usar o anticorpo anti-PD-1 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo de acordo com qualquer um dos parágrafos anteriores, ou uma etapa de usar o referido anticorpo monoclonal isolado ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo.

[0038] Em algumas modalidades, a presente descrição fornece também um kit compreendendo o referido anticorpo anti-PD-1 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo ou o referido anticorpo monoclonal isolado ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo.

[0039] Em algumas modalidades, é fornecido o uso do referido anticorpo anti-PD-1 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo na preparação de agentes de diagnóstico para doenças relacionadas com a PD-1.

[0040] Em algumas modalidades, a presente descrição fornece também um método de tratamento de doenças, compreendendo a administração a um sujeito de uma quantidade terapeuticamente eficaz do anticorpo anti-PD-1 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com qualquer um dos parágrafos anteriores, ou do referido anticorpo monoclonal isolado ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, ou da referida composição farmacêutica, ou da referida molécula de ácido nucleico.

[0041] Em algumas modalidades, a doença é um tumor.

[0042] Em algumas outras modalidades, a doença é selecionada de: carcinoma de células escamosas de cabeça e pescoço, câncer da cabeça e pescoço, câncer do cérebro, glioma, glioblastoma multiforme, neuroblastoma, câncer do sistema nervoso central, tumor neuroendócrino, câncer da faringe, câncer da nasofaringe, câncer do esófago, câncer da tireoide, mesotelioma pleural maligno, câncer do pulmão,

câncer da mama, câncer do fígado, hepatoma, carcinoma hepatocelular, câncer hepatobiliar, câncer pancreático,

câncer gástrico, câncer gastrointestinal, câncer do intestino, câncer do cólon, câncer colorretal, câncer renal,

carcinoma das células renais claras, câncer dos ovários,

câncer endometrial, câncer do colo do útero, câncer da bexiga, câncer da próstata, câncer dos testículos, câncer da pele, melanoma, leucemia, linfoma, câncer ósseo,

condrossarcoma, mieloma, mieloma múltiplo, síndrome mielodisplásica, neoplasia mieloproliferativa, carcinoma de células escamosas, sarcoma de Ewing, amiloidose sistémica de cadeia leve e carcinoma de células de Merkel; em algumas destas modalidades, o linfoma é selecionado de: linfoma de

Hodgkin, linfoma não Hodgkin, linfoma difuso de grandes células B, linfoma folicular, linfoma primário de grandes células B de mediastino, linfoma de células do manto, linfoma linfocítico pequeno, linfoma de grandes células B rico em células T/histiócitos e linfoma linfoplasmocítico, o câncer do pulmão é selecionado de: câncer do pulmão de células não pequenas e câncer do pulmão de células pequenas, a leucemia é selecionada de: leucemia mielóide crónica, leucemia mielóide aguda, leucemia linfocítica, leucemia linfoblástica, leucemia linfoblástica aguda, leucemia linfocítica crônica e leucemia mielóide; em algumas outras modalidades, a doença é selecionada de: melanoma PD-L1 positivo, câncer do pulmão, câncer do pulmão de células não pequenas, câncer da mama, câncer gástrico, câncer do rim, câncer da bexiga, câncer do intestino e câncer do cólon.

[0043] Em algumas modalidades, a presente descrição fornece também o uso do anticorpo anti-PD-1 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com qualquer um dos parágrafos anteriores, ou do referido anticorpo monoclonal isolado ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, ou da referida composição farmacêutica, ou da referida molécula de ácido nucleico, na preparação de fármacos para o tratamento ou prevenção de doenças.

[0044] Em algumas modalidades, a doença é um tumor.

[0045] Em algumas outras modalidades, a doença é selecionada de: carcinoma de células escamosas de cabeça e pescoço, câncer da cabeça e pescoço, câncer do cérebro, glioma, glioblastoma multiforme, neuroblastoma, câncer do sistema nervoso central, tumor neuroendócrino, câncer da faringe, câncer da nasofaringe, câncer do esófago, câncer da tireoide, mesotelioma pleural maligno, câncer do pulmão, câncer da mama, câncer do fígado, hepatoma, carcinoma hepatocelular, câncer hepatobiliar, câncer pancreático, câncer gástrico, câncer gastrointestinal, câncer do intestino, câncer do cólon, câncer colorretal, câncer renal,

carcinoma das células renais claras, câncer dos ovários,

Hodgkin, linfoma não Hodgkin, linfoma difuso de grandes células B, linfoma folicular, linfoma primário de grandes células B de mediastino, linfoma de células do manto, linfoma linfocítico pequeno, linfoma de grandes células B rico em células T/histiócitos e linfoma linfoplasmocítico, o câncer do pulmão é selecionado de: câncer do pulmão de células não pequenas e câncer do pulmão de células pequenas, a leucemia é selecionada de: leucemia mielóide crónica, leucemia mielóide aguda, leucemia linfocítica, leucemia linfoblástica, leucemia linfoblástica aguda, leucemia linfocítica crônica e leucemia mielóide; em algumas outras modalidades, a doença é selecionada de: melanoma PD-L1 positivo, câncer do pulmão, câncer do pulmão de células não pequenas, câncer da mama, câncer gástrico, câncer do rim,

câncer da bexiga, câncer do intestino e câncer do cólon.

[0046] Em algumas modalidades, a presente descrição fornece também o anticorpo anti-PD-1 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com qualquer um dos parágrafos anteriores, ou o referido anticorpo monoclonal isolado ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, ou a referida molécula de ácido nucleico, ou a referida composição farmacêutica, para uso como fármacos.

[0047] Em algumas modalidades, o fármaco é usado para o tratamento ou prevenção de doenças relacionadas com a PD-

1.

[0048] Em algumas modalidades, a doença é um tumor.

[0049] Em algumas outras modalidades, a doença é selecionada de: carcinoma de células escamosas de cabeça e pescoço, câncer da cabeça e pescoço, câncer do cérebro, glioma, glioblastoma multiforme, neuroblastoma, câncer do sistema nervoso central, tumor neuroendócrino, câncer da farínge, câncer da nasofaringe, câncer do esófago, câncer da tireoide, mesotelioma pleural maligno, câncer do pulmão, câncer da mama, câncer do fígado, hepatoma, carcinoma hepatocelular, câncer hepatobiliar, câncer pancreático, câncer gástrico, câncer gastrointestinal, câncer do intestino, câncer do cólon, câncer colorretal, câncer renal, carcinoma das células renais claras, câncer dos ovários, câncer endometrial, câncer do colo do útero, câncer da bexiga, câncer da próstata, câncer dos testículos, câncer da pele, melanoma, leucemia, linfoma, câncer ósseo, condrossarcoma, mieloma, mieloma múltiplo, síndrome mielodisplásica, neoplasia mieloproliferativa, carcinoma de células escamosas, sarcoma de Ewing, amiloidose sistémica de cadeia leve e carcinoma de células de Merkel; em algumas destas modalidades, o linfoma é selecionado de: linfoma de Hodgkin, linfoma não Hodgkin, linfoma difuso de grandes células B, linfoma folicular, linfoma primário de grandes células B de mediastino, linfoma de células do manto, linfoma linfocítico pequeno, linfoma de grandes células B rico em células T/histiócitos e linfoma linfoplasmocítico, o câncer do pulmão é selecionado de: câncer do pulmão de células não pequenas e câncer do pulmão de células pequenas, a leucemia é selecionada de: leucemia mielóide crónica, leucemia mielóide aguda, leucemia linfocítica, leucemia linfoblástica, leucemia linfoblástica aguda, leucemia linfocítica crônica e leucemia mielóide; em algumas outras modalidades, a doença é selecionada de: melanoma PD-L1 positivo, câncer do pulmão, câncer do pulmão de células não pequenas, câncer da mama, câncer gástrico, câncer do rim, câncer da bexiga, câncer do intestino e câncer do cólon.

Descrição dos Desenhos

[0050] A Figura 1: os resultados dos testes de anticorpos anti-PD-1 bloqueando a ligação do PD-1 ao seu ligante;

A Figura 2: o efeito dos anticorpos anti-PD-1 na secreção de IFNγ a partir de células PBMC; A Figura 3: a eficácia dos anticorpos anti-PD-1 em tumor de xenoenxerto de câncer do cólon MC38 em ratos; A Figura 4: o efeito dos anticorpos anti-PD-1 sobre o volume tumoral do câncer do cólon MC38 em ratos.

Descrição Detalhada da Invenção Visão geral

[0051] Para que a presente descrição seja mais fácil de compreender, alguns termos técnicos e científicos são definidos especificamente abaixo. A menos que exista definição clara em contrário, todos os outros termos técnicos e científicos usados nesse documento têm os significados comumente entendidos por aqueles versados na técnica à qual pertence a presente descrição.

[0052] Os termos “morte programada 1”, “morte celular programada 1”, “proteína PD-1”, “PD-1”, “PDCD1” e “hPD-1” são usados indistintamente e incluem variantes, isótipos, homólogos de espécies, e análogos de PD-1 humano que têm pelo menos um epítopo em comum com o PD-1. A sequência PD-1 completa pode ser encontrada com o número de acesso GenBank U64863.

[0053] O termo “ligante-1 de morte programada (PD-L1)” é um dos dois ligantes de glicoproteína de superfície celular do PD-1 (o outro é PD-L2), que faz a regulação descendente da ativação das células T e da secreção de citocinas quando se liga ao PD-1. O termo “PD-L1” como usado nesse documento inclui o PD-L1 humano (hPD-L1), variantes de hPD-L1, isótipos e homólogos interespécies, e 5 análogos que têm pelo menos um epítopo em comum com o hPD-1. A sequência completa do hPD-L1 pode ser encontrada com o número de acesso GenBank Q9NZQ7.

[0054] O termo “citocina” é um termo geral para proteínas liberadas por uma população de células e que atuam sobre outras células como mediadores intercelulares.

Exemplos de tais citocinas incluem linfocinas, monocinas, quimiocinas e hormonas de polipeptídeo tradicionais.

Citocinas exemplificativas incluem: IL-2 humana, IFN-γ, IL- 6, TNFα, IL-17 e IL-5.

[0055] Os códigos de três letras e os códigos de uma letra dos aminoácidos usados na presente descrição são como descritos em J. Biol. Chem., 243, p. 3558 (1968).

[0056] O “anticorpo” descrito na presente descrição se refere a uma imunoglobulina em geral. Um anticorpo natural intacto é uma estrutura de cadeia de tetrapeptídeos composta por duas cadeias pesadas idênticas e duas cadeias leves idênticas ligadas por ligações dissulfeto intercadeias. As composições e sequências de aminoácidos das regiões constantes de cadeia pesada da imunoglobulina são diferentes, pelo que a sua antigenicidade também é diferente.

Assim, as imunoglobulinas podem ser divididas em cinco classes, ou nomeadas como isótipos de imunoglobulinas, nomeadamente IgM, IgD, IgG, IgA e IgE, e suas cadeias pesadas correspondentes são cadeia µ, cadeia δ, cadeia γ, cadeia α e cadeia ε, respectivamente. A mesma classe de Ig pode ser dividida em subclasses diferentes de acordo com a diferença na composição de aminoácidos da região da dobradiça e com o número e posição das ligações dissulfeto de cadeia pesada.

Por exemplo, a IgG pode ser dividida em IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4. A cadeia leve é dividida em cadeia κ ou cadeia λ pela diferença da região constante. Cada uma das cinco classes de Ig pode ter uma cadeia κ ou uma cadeia λ. Os anticorpos referidos na presente descrição incluem anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos, incluindo anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos que foram modificados com base na imunoglobulina, mantendo a capacidade de ligar antígenos; incluindo anticorpos monoespecíficos, biespecíficos ou multiespecíficos; incluindo também anticorpos monovalentes, bivalentes ou multivalentes. Os fragmentos de ligação ao antígeno de anticorpos, por exemplo, podem ser aqueles compreendendo pelo menos uma estrutura VH-CH1 e pelo menos uma estrutura VL-CL, em que as estruturas VH e VL se podem aproximar entre si com base na interação intercadeias e manter a capacidade de ligação ao antígeno. Em algumas modalidades, o fragmento de ligação ao antígeno do anticorpo é um fragmento Fab monovalente (fragmento Fab1), fragmento Fab bivalente (F(ab)2), fragmento Fab trivalente (F(ab)3), fragmento Fab multivalente (dois ou mais), e também podem ser outros fragmentos de ligação ao antígeno monoespecíficos, biespecíficos ou multiespecíficos compreendendo pelo menos um fragmento Fab.

[0057] “Anticorpo biespecífico” se refere a um anticorpo (incluindo anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, tal como anticorpo de cadeia única) que se pode ligar especificamente a dois antígenos diferentes ou dois epítopos diferentes do mesmo antígeno. A técnica anterior divulgou anticorpos biespecíficos com várias estruturas. De acordo com a integridade da molécula IgG, estes podem ser divididos em anticorpos biespecíficos similares a IgG e anticorpos biespecíficos do tipo fragmento de anticorpo. De acordo com o número e a configuração das regiões de ligação dos antígenos, podem ser divididos em anticorpos biespecíficos bivalentes, trivalentes, tetravalentes ou mais-valentes. De acordo com a simetria da estrutura, podem ser divididos em anticorpos biespecíficos de estrutura simétrica e anticorpos biespecíficos de estrutura assimétrica. Entre eles, os anticorpos biespecíficos baseados em fragmentos de anticorpos, por exemplo fragmentos Fab sem fragmento Fc, formam anticorpos biespecíficos ligando dois ou mais fragmentos Fab em uma molécula. Estes anticorpos têm menor imunogenicidade e menor peso molecular e maior permeabilidade do tecido tumoral. As estruturas típicas de anticorpos deste tipo são anticorpos biespecíficos tais como F(ab)2, scFv-Fab, (scFv)2-Fab, etc.; para os anticorpos biespecíficos similares a IgG (por exemplo com fragmento Fc), este tipo de anticorpo tem maior peso molecular. O fragmento Fc ajuda à purificação do anticorpo em fases posteriores e melhora sua solubilidade e estabilidade. A fração Fc pode também se ligar ao receptor FcRn e aumentar a meia-vida do anticorpo no soro. Os modelos típicos de estrutura de anticorpos biespecíficos são tais como KiH, CrossMAb, Triomab quadroma, FcΔAdp, ART-Ig, BiMAb, Biclonics, BEAT, DuoBody, Azymetric, XmAb, 2:1 TCBs, 1Fab- IgG TDB, FynomAb, two-in-one/DAF, scFv-Fab-IgG, DART-Fc, LP- DART, CODV-Fab-TL, HLE-BiTE, F(ab)2-CrossMAb, IgG-(scFv)2, Bs4Ab, DVD-Ig, Tetravalent-DART-Fc, (scFv)4-Fc, CODV-Ig, mAb2, F(ab)4-CrossMAb e outros anticorpos biespecíficos (ver Aran F. Labrijn et al., Nature Reviews Drug Discovery volume 18, páginas 585-608 (2019); Chen S1 et al., J Immunol Res.

1 de Fevereiro 2019; 2019:4516041).

[0058] O termo “monovalente”, “bivalente”, “trivalente” ou “multivalente” se refere à presença de um número especificado de locais de ligação ao antígeno em um complexo de anticorpos ou de polipeptídeos. Por exemplo “anticorpo monovalente” significa que existe um local de ligação ao antígeno no anticorpo, “complexo de polipeptídeo monovalente” significa que existe um local de ligação ao antígeno no complexo de polipeptídeos; “anticorpo bivalente” significa que existem dois locais de ligação ao antígeno no anticorpo, “complexo de polipeptídeos bivalente” significa que existem dois locais de ligação ao antígeno no complexo de polipeptídeos; “anticorpo trivalente” significa que existem três locais de ligação ao antígeno no anticorpo, “complexo de polipeptídeos trivalente” significa que existem três locais de ligação ao antígeno no complexo de polipeptídeos; “anticorpo multivalente” significa que existem múltiplos (três ou mais) locais de ligação ao antígeno no anticorpo, e “complexo de polipeptídeos multivalente” significa que existem múltiplos (dois ou mais) locais de ligação ao antígeno no complexo de polipeptídeos.

[0059] O termo “proteína de fusão de anticorpos” se refere a uma proteína de fusão biologicamente ativa formada pela ligação de uma proteína de interesse (polipeptídeo) com uma imunoglobulina. A proteína de fusão tem a atividade biológica tanto da proteína ligada como da imunoglobulina.

[0060] A sequência de cerca de 110 aminoácidos perto do N-terminal da cadeia de anticorpos pesada e leve varia muito e é a região variável (região Fv); a sequência de aminoácidos remanescente perto do C-terminal é relativamente estável e é a região constante. A região variável inclui 3 regiões hipervariáveis (ou hypervariable regions - HVRs) e 4 regiões de estrutura (ou framework regions - FRs) com sequências relativamente conservadoras. As 3 regiões hipervariáveis que determinam a especificidade do anticorpo são também conhecidas como regiões determinantes da complementaridade (ou complementarity determining regions - CDRs). Cada uma das região variável de cadeia leve (ou variable light - VL) e região variável de cadeia pesada (ou variable heavy - VH) consiste em 3 regiões CDR e 4 regiões FR. A ordem desde o amino terminal até ao carboxi terminal é: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. As 3 regiões CDR da cadeia leve referem-se a LCDR1, LCDR2 e LCDR3; e as 3 regiões CDR da cadeia pesada referem-se a HCDR1, HCDR2 e HCDR3.

[0061] Os anticorpos da presente descrição incluem anticorpos murinos, anticorpos quiméricos, anticorpos humanizados e anticorpos totalmente humanos, de um modo preferido anticorpos humanizados.

[0062] O termo “anticorpo murino” na presente descrição é um anticorpo monoclonal contra PD-1 humano preparado de acordo com os conhecimentos e capacidades na técnica. Durante a preparação, o indivíduo do teste é injetado com antígeno PD-1, e depois são isolados os hibridomas expressando anticorpos com a sequência ou propriedades funcionais desejadas. Em uma modalidade preferida da presente descrição, o anticorpo murino anti-PD-1 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo pode ainda compreender a região constante de cadeia leve de cadeia κ, λ de murino ou sua variante, ou pode ainda compreender a região constante de cadeia pesada de IgG1, IgG2, IgG3 murino ou suas variantes.

[0063] O termo “anticorpo quimérico” é um anticorpo formado pela fusão da região variável de um anticorpo murino com a região constante de um anticorpo humano, que pode aliviar a resposta imunológica induzida pelo anticorpo murino. O estabelecimento de um anticorpo quimérico requer primeiro o estabelecimento de um hibridoma secretando anticorpos monoclonais específicos de murino, depois a clonagem do gene da região variável das células do hibridoma murino, e depois a clonagem do gene da região constante do anticorpo humano conforme necessário, ligando o gene de região variável de murino com o gene de região constante humano para formar um gene quimérico, inserindo o gene quimérico em um vetor de expressão, e finalmente expressando a molécula do anticorpo quimérico em um sistema eucariótico ou em um sistema procariótico. Em uma modalidade preferida da presente descrição, a cadeia leve de anticorpos do anticorpo quimérico PD-L1 compreende ainda uma região constante de cadeia leve de uma cadeia κ, λ humana ou sua variante. A cadeia pesada de anticorpos do anticorpo quimérico PD-1 compreende ainda a região constante de cadeia pesada de IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 humana ou sua variante, compreende de um modo preferido a região constante de cadeia pesada de IgG1, IgG2 ou IgG4 humana, ou compreende variantes de IgG1, IgG2, ou IgG4 com mutações de aminoácidos (por exemplo, mutações L234A e/ou L235A, e/ou mutações S228P).

[0064] O termo “anticorpo humanizado”, também conhecido como anticorpo enxertado por CDR, se refere a um anticorpo produzido pelo enxerto de sequências CDR murinas na estrutura de regiões variáveis de anticorpos humanos, isto é, se refere a um anticorpo produzido em diferentes tipos de sequências de estrutura de anticorpos da linha germinativa humana. Pode superar a reação heterogénea induzida pelo anticorpo quimérico, uma vez que transporta uma grande quantidade de componentes de proteína murina. Tais sequências de estrutura podem ser obtidas de bancos de dados públicos de DNA ou de referências publicadas que incluem sequências de genes de anticorpos da linha germinativa. Por exemplo, as sequências de DNA da linha germinativa dos genes da região variável de cadeia pesada e de cadeia leve humanas podem ser encontradas no banco de dados de sequências de linhas germinativas humanas “VBase” (disponível na Internet em www.mrccpe.com.ac.uk/vbase), bem como em Kabat, E. A., et al., 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5ª edição. A fim de evitar a diminuição da atividade ao mesmo tempo causada pela diminuição da imunogenicidade, a sequência de estrutura de regiões variáveis de anticorpos humanos pode ser sujeita a mutações inversas mínimas ou mutações reversas para manter a atividade. Os anticorpos humanizados da presente descrição também incluem anticorpos humanizados que foram ainda submetidos à maturação de afinidade das CDRs por exibição de leveduras.

[0065] Devido aos resíduos em contato com o antígeno, o enxerto de CDR pode resultar em uma afinidade reduzida do anticorpo produzido ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, ao antígeno, devido aos resíduos da estrutura em contato com o antígeno. Tais interações podem ser o resultado de hipermutação de células somáticas. Por conseguinte, pode ainda ser necessário enxertar esses aminoácidos de estrutura do doador na estrutura do anticorpo humanizado. Os resíduos de aminoácidos envolvidos na ligação ao antígenos e a partir de anticorpos não humanos ou fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos podem ser identificados pela observação da sequência e estrutura da região variável do anticorpo monoclonal animal. Os resíduos na estrutura de doador de CDR que diferem da linha germinativa podem ser considerados relacionados. Se a linha germinativa mais próxima não puder ser determinada, a sequência pode ser comparada com a sequência de consenso de uma subclasse ou de uma sequência de anticorpo animal com uma elevada percentagem de similaridade. Pensa-se que os resíduos de estrutura raros são o resultado da hipermutação de células somáticas e, portanto, desempenham um papel importante na ligação.

[0066] Em uma modalidade da presente descrição, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo pode ainda compreender uma região constante de cadeia leve de cadeia κ, λ humana ou murina ou sua variante, ou ainda compreender uma região constante de cadeia pesada de IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 humano ou murino ou sua variante; compreender de um modo preferido uma região constante de cadeia pesada de IgG1, IgG2 ou IgG4 humana, ou sua variante de IgG1, IgG2 ou IgG4 com mutações de aminoácidos (por exemplo, mutação L234A e/ou L235A, e/ou mutação S228P).

[0067] A “variante convencional” da região constante de cadeia pesada de anticorpos humanos e a região constante de cadeia leve de anticorpos humanos descrita na presente descrição se refere à variante de região constante de cadeia pesada ou região constante de cadeia leve que foi divulgada na técnica anterior e não altera a estrutura e função da região variável de anticorpo. As variantes exemplificativas incluem variantes de região constante de cadeia pesada de IgG1, IgG2, IgG3 ou IgG4 com modificações dirigidas ao local e substituições de aminoácidos da região constante de cadeia pesada. Substituições específicas são tais como mutações YTE, mutações L234A e/ou L235A, mutações S228P, e/ou mutações para obter uma estrutura “knob-into-hole” (fazendo com que a cadeia pesada de anticorpo tenha uma combinação de “knob- Fc” e “hole-Fc”) conhecida na técnica. Foi confirmado que estas mutações fazem com que o anticorpo tenha novas propriedades, mas não alteram a função da região variável do anticorpo.

[0068] “HuMAb”, “anticorpo humano”, “anticorpo totalmente humano” e “anticorpo humano completo” podem ser usados indistintamente, e podem referir-se a anticorpos derivados de humanos ou anticorpos obtidos de um organismo geneticamente modificado que é “manipulado” para produzir anticorpos humanos específicos em resposta à estimulação de antígenos e pode ser produzido por qualquer método conhecido na técnica. Em algumas tecnologias, os elementos dos locais de cadeias pesadas e leves humanas são introduzidos nas linhas celulares de organismos derivados de linhas de células tronco embrionárias, em que os locais de cadeia pesada e cadeia leve endógenos foram perturbados por alvo por aquilo que alveja os locais de cadeia pesada e de cadeia leve endógenos contidos nessas linhas celulares. Os organismos transgénicos podem sintetizar anticorpos humanos específicos a antígenos humanos, e os organismos podem ser usados para produzir hibridomas humanos secretores de anticorpos. Um anticorpo humano pode também ser um anticorpo em que as cadeias pesada e leve são codificadas por sequências de nucleotídeos derivadas de uma ou mais fontes de DNA humano.

Os anticorpos totalmente humanos também podem ser construídos por métodos de transfecção genética ou cromossómica e por tecnologia de phage display, ou construídos a partir de células B ativadas in vitro, todos eles conhecidos na técnica.

[0069] Os termos “anticorpo de comprimento total”, “anticorpo intacto”, “anticorpo completo” e “anticorpo inteiro” são usados nesse documento indistintamente e se referem a um anticorpo em uma forma substancialmente intacta, distinguido dos fragmentos de ligação ao antígeno definidos abaixo. Estes termos se referem especificamente a um anticorpo em que a cadeia pesada compreende a região Fc.

[0070] O termo “fragmento de ligação ao antígeno” ou “fragmento funcional” de um anticorpo se refere a um ou mais fragmentos do anticorpo que retêm a capacidade de se ligar especificamente a um antígeno (por exemplo, PD-1). Foi demonstrado que fragmentos de anticorpos de comprimento total podem ser usados para desempenhar a função de ligação ao antígeno dos anticorpos. Exemplos do fragmento de ligação incluído no termo “fragmento de ligação ao antígeno” do anticorpo incluem (i) fragmentos Fab, fragmentos monovalentes consistem em domínios VL, VH, CL e CH1; (ii) fragmentos F(ab’)2, incluindo fragmentos bivalentes de dois fragmentos Fab ligados por uma ponte dissulfeto na região da dobradiça, (iii) fragmentos Fd consistem em domínios VH e

CH1; (iv) fragmentos Fv compostos por domínios VH e VL de um braço de um anticorpo; (v) domínios simples ou fragmentos dAb (Ward et al., (1989) Nature 341:544-546), que consistem em um domínio VH; e (vi) regiões determinantes de complementaridade isoladas (CDR) ou (vii) combinações de duas ou mais CDRs isoladas, opcionalmente ligadas por ligantes sintéticos.

Adicionalmente, embora os dois domínios

VL e VH do fragmento Fv sejam codificados por genes separados, podem ser usados métodos de recombinação para os ligar por ligantes sintéticos de modo a que possa ser produzido como uma única cadeia de proteína na qual as regiões VL e VH se emparelham para formar uma molécula monovalente (referida como Fv de cadeia única (scFv); ver,

por exemplo, Bird et al., (1988) Science 242:423-426; e

Huston et al., (1988) Proc.

Natl.

Acad.

Sci USA 85:5879-

5883). Esses anticorpos de cadeia única também se destinam a ser incluídos no termo “fragmento de ligação ao antígeno”

de anticorpo.

Tais fragmentos de anticorpo são obtidos usando técnicas convencionais conhecidas por aqueles versados na técnica, e as funções dos fragmentos são rastreados da mesma forma que para aquelas de anticorpos intactos.

A fracção de ligação ao antígeno pode ser produzida por tecnologia de DNA recombinante ou por clivagem enzimática ou química da imunoglobulina intacta.

Os anticorpos podem ser anticorpos de diferentes isótipos, por exemplo, anticorpos IgG (por exemplo, subtipos IgG1, IgG2, IgG3 ou IgG4), IgA1, IgA2, IgD, IgE ou IgM.

[0071] Os fragmentos de ligação ao antígeno da presente descrição incluem Fab, F(ab’)2, Fab’, anticorpo de cadeia única (scFv), região V dimerizada (diacorpo), região V estabilizada por ligação dissulfeto (dsFv), peptídeo contendo CDR e similares.

[0072] Fab é um fragmento de anticorpo que tem um peso molecular de cerca de 50.000 e tem atividade de ligação ao antígeno, e é obtido pelo tratamento das moléculas de anticorpo IgG com a protease papaína (clivagem do resíduo do aminoácido na posição 224 da cadeia pesada), em que cerca de metade do lado N-terminal da cadeia pesada e toda a cadeia leve são unidas por ligação(ões) dissulfeto.

[0073] O Fab da presente descrição pode ser produzido usando a papaína para tratar o anticorpo monoclonal da presente descrição que reconhece especificamente o PD-1 humano e se liga à sequência de aminoácidos da região extracelular ou à sua estrutura tridimensional.

Adicionalmente, o Fab pode ser produzido inserindo o DNA que codifica o Fab do anticorpo em um vetor de expressão procariótica ou em um vetor de expressão eucariótica e introduzindo o vetor em um organismo procariótico ou organismo eucariótico para expressar o Fab.

[0074] F(ab’)2 é um fragmento de anticorpo que tem um peso molecular de cerca de 100.000 e tem atividade de ligação ao antígeno e compreende duas regiões Fab ligadas na posição de dobradiça, e é obtido pela digestão da parte inferior das duas ligações dissulfeto na região de dobradiça da IgG com a enzima pepsina.

[0075] O F(ab’)2 da presente descrição pode ser produzido usando a pepsina para tratar o anticorpo monoclonal da presente descrição que reconhece especificamente o PD-1 humano e se liga à sequência de aminoácidos da região extracelular ou à sua estrutura tridimensional.

Adicionalmente, o F(ab’)2 pode ser produzido ligando o Fab’ descrito abaixo com ligação tioéter ou ligação dissulfeto.

[0076] Fab’ é um fragmento de anticorpo que tem um peso molecular de cerca de 50.000 e tem atividade de ligação ao antígeno obtida através da clivagem da ligação dissulfeto na região da dobradiça do F(ab’)2. O Fab’ da presente descrição pode ser produzido usando agentes redutores, por exemplo o ditiotreitol para tratar o F(ab’)2 da presente descrição que reconhece especificamente o PD-1 e se liga à sequência de aminoácidos da região extracelular ou à sua estrutura tridimensional.

[0077] Além disso, o Fab’ pode ser produzido pela inserção do DNA que codifica o fragmento Fab’ do anticorpo em um vetor de expressão procariótica ou em um vetor de expressão eucariótica e, em seguida, introduzindo o vetor em um organismo procariótico ou organismo eucariótico para expressar o Fab’.

[0078] O termo “anticorpo de cadeia única”, “Fv de cadeia única” ou “scFv” se refere a moléculas compreendendo um domínio (ou região; VH) variável de cadeia pesada de anticorpo e um domínio (ou região; VL) variável de cadeia leve de anticorpo ligados por um ligante. Tais moléculas scFv podem ter a estrutura geral: NH2-VL-ligante-VH-COOH ou NH2-VH-ligante-VL-COOH. Os ligantes adequados na técnica anterior consistem em sequências repetidas de aminoácidos GGGGS ou suas variantes, por exemplo, uma variante com 1 a 4 sequências repetidas (Holliger et al. (1993), Proc. Natl.

Acad. Sci. USA 90:6444-6448). Outros ligantes que podem ser usados na presente descrição são descritos em Alfthan et al., (1995), Protein Eng. 8:725-731, Choi et al., (2001), Eur. J. Immunol. 31:94-106, Hu et al. (1996), Cancer Res.

56:3055-3061, Kipriyanov et al., (1999), J. Mol. Biol.

293:41-56 e Roovers et al., (2001), Cancer Immunol.

[0079] O scFv da presente descrição pode ser produzido pelas seguintes etapas: obter o cDNA codificando VH e VL do anticorpo monoclonal da presente descrição que reconhece especificamente o PD-1 humano e se liga à sequência de aminoácidos da região extracelular ou à sua estrutura tridimensional, construir o DNA codificando o scFv, inserir o DNA em um vetor de expressão procariótica ou em um vetor de expressão eucariótica, e depois introduzir o vetor de expressão em um organismo procariótico ou organismo eucariótico para expressar o scFv.

[0080] O diacorpo é um fragmento de anticorpo no qual o scFv é dimerizado, e é um fragmento de anticorpo com atividade de ligação ao antígeno bivalente. Na atividade de ligação ao antígeno bivalente, os dois antígenos podem ser iguais ou diferentes.

[0081] O diacorpo da presente descrição pode ser produzido pelas seguintes etapas: obter o cDNA codificando VH e VL do anticorpo monoclonal da presente descrição que reconhece especificamente o PD-1 humano e se liga à sequência de aminoácidos da região extracelular ou à sua estrutura tridimensional, construir o DNA codificando o scFv de modo a que o ligante de peptídeo tenha um comprimento de 8 ou menos resíduos de sequência de aminoácidos, inserir o DNA em um vetor de expressão procariótica ou em um vetor de expressão eucariótica, e depois introduzir o vetor de expressão em um organismo procariótico ou organismo eucariótico para expressar o diacorpo.

[0082] O dsFv é obtido pela ligação de polipeptídeos em que um resíduo de aminoácido em cada uma das VH e VL é substituído por um resíduo de cisteína através de uma ligação dissulfeto entre os resíduos de cisteína. Os resíduos de aminoácidos substituídos por resíduos de cisteína podem ser selecionados de acordo com um método conhecido (Protein Engineering, 7, 697 (1994)) com base na previsão da estrutura tridimensional do anticorpo.

[0083] O dsFv da presente descrição pode ser produzido pelas seguintes etapas: obter o cDNA codificando VH e VL do anticorpo monoclonal da presente descrição que reconhece especificamente o PD-1 humano e se liga à sequência de aminoácidos da região extracelular ou à sua estrutura tridimensional, construir o DNA codificando o dsFv, inserir o DNA em um vetor de expressão procariótica ou em um vetor de expressão eucariótica, e depois introduzir o vetor de expressão em um organismo procariótico ou organismo eucariótico para expressar o dsFv.

[0084] O peptídeo contendo CDR é construído por uma ou mais regiões, incluindo a(s) CDR(s) de VH ou VL. Peptídeos contendo múltiplas CDRs podem ser ligados diretamente ou através de um ligante de peptídeo adequado.

[0085] O peptídeo contendo CDR da presente descrição pode ser produzido pelas seguintes etapas: construir o(s) DNA(s) codificando o(s) CDR(s) da VH e VL do anticorpo monoclonal da presente descrição que reconhece especificamente o PD-1 humano e se liga à sequência de aminoácidos da região extracelular ou à sua estrutura tridimensional, inserir o(s) DNA(s) em um vetor de expressão procariótica ou em um vetor de expressão eucariótica, e depois introduzir o vetor de expressão em um organismo procariótico ou organismo eucariótico para expressar o peptídeo. O peptídeo contendo CDR também pode ser produzido por métodos de síntese química, por exemplo o método Fmoc ou o método tBoc.

[0086] O termo “diferença de aminoácidos” ou “mutação de aminoácidos” se refere à presença de alteração(ões) ou mutação(ões) de aminoácidos na variante de proteína ou de polipeptídeo em comparação com a proteína ou polipeptídeo original, incluindo ter 1, 2, 3 ou mais aminoácidos inseridos, deletados ou substituídos com base na proteína ou polipeptídeo original.

[0087] O termo “estrutura de anticorpos” ou “região FR” se refere a uma fração do domínio variável VL ou VH, que serve de estrutura de suporte (ou scaffold) para o laço de ligação ao antígeno (CDR) do domínio variável.

Essencialmente, é um domínio variável sem CDR.

[0088] O termo “região determinante da complementaridade”, “CDR” ou “região hipervariável” se refere a uma das seis regiões hipervariáveis no domínio variável de um anticorpo que contribuem principalmente para a ligação ao antígeno. Geralmente, existem três CDRs (HCDR1, HCDR2 e HCDR3) em cada região variável de cadeia pesada, e três CDRs (LCDR1, LCDR2 e LCDR3) em cada região variável de cadeia leve. Qualquer um dos esquemas conhecidos pode ser usado para determinar os limites da sequência de aminoácidos dos CDRs, incluindo os critérios de numeração “Kabat” (ver Kabat et al., (1991), “Sequences of Proteins of Immunological Interest”, 5ª edição, Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD), critérios de numeração “Chothia” (ver Al-Lazikani et al., (1997) JMB 273:927-948) e critérios de numeração ImmunoGenTics (IMGT) (Lefranc M.

P., Immunologist, 7, 132-136 (1999); Lefranc, M. P., et al., Dev. Comp. Immunol., 27, 55-77 (2003)), etc. Por exemplo, para o formato clássico, seguindo os critérios Kabat, a numeração dos resíduos de aminoácidos CDR no domínio variável de cadeia pesada (VH) é 31-35 (HCDR1), 50-65 (HCDR2) e 95- 102 (HCDR3); a numeração dos resíduos de aminoácidos CDR no domínio variável de cadeia leve (VL) é 24-34 (LCDR1), 50-56 (LCDR2) e 89-97 (LCDR3). Seguindo os critérios de Chothia, a numeração dos resíduos de aminoácidos CDR na VH é 26-32 (HCDR1), 52-56 (HCDR2) e 95-102 (HCDR3); e a numeração dos resíduos de aminoácidos na VL é 26-32 (LCDR1), 50-52 (LCDR2) e 91-96 (LCDR3). De acordo com a combinação das definições de CDR de Kabat e Chothia, as CDRs consistem em resíduos de aminoácidos 26-35 (HCDR1), 50-65 (HCDR2) e 95-102 (HCDR3) em VH humana e resíduos de aminoácidos 24-34 (LCDR1), 50-56 (LCDR2) e 89-97 (LCDR3) em VL humana. Seguindo os critérios IMGT, a numeração dos resíduos de aminoácidos CDR na VH é aproximadamente 26-35 (CDR1), 51-57 (CDR2) e 93-102 (CDR3),

e a numeração dos resíduos de aminoácidos CDR na VL é aproximadamente 27-32 (CDR1), 50-52 (CDR2) e 89-97 (CDR3).

Seguindo os critérios IMGT, as regiões CDR de um anticorpo podem ser determinadas usando o programa IMGT/DomainGap Align.

[0089] O termo “epítopo” ou “determinante antigénico” se refere a um local em um antígeno ao qual se liga especificamente uma imunoglobulina ou anticorpo (por exemplo, um local específico em moléculas PD-L1). Os epítopos incluem geralmente pelo menos 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 ou 15 aminoácidos consecutivos ou não consecutivos, em uma conformação espacial única. Ver, por exemplo, Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol. 66, G.E.Morris, Ed. (1996).

[0090] Os termos “liga especificamente”, “liga seletivamente”, “liga de forma seletiva” e “liga de forma específica” se referem à ligação de um anticorpo a um epítopo em um antígeno pré-determinado. Geralmente, os anticorpos se ligam com uma afinidade (KD) de aproximadamente menos de 10- 8 M, por exemplo aproximadamente menos de 10-9 M, 10-10 M, 10- 11 M ou menos.

[0091] O termo “KD” ou “Kd” se refere à constante de equilíbrio de dissociação de uma interação anticorpo- antígeno específica. Geralmente, os anticorpos da presente descrição se ligam ao PD-1 com uma constante de equilíbrio de dissociação (KD) inferior a cerca de 10-7 M, por exemplo, inferior a cerca de 10-8 M ou 10-9 M, por exemplo, medida em um instrumento BIACORE usando tecnologia de ressonância de plasmon de superfície (SPR).

[0092] Quando o termo “competição” é usado no contexto de proteínas de ligação ao antígenos que competem pelo mesmo epítopo (por exemplo, proteínas de ligação ao antígenos neutralizantes ou anticorpos neutralizantes), se refere à competição entre as proteínas de ligação ao antígenos, e pode ser determinado pelo seguinte ensaio: no ensaio, a proteína de ligação ao antígeno sendo testada (por exemplo, um anticorpo ou fragmento imunologicamente funcional do mesmo) impede ou inibe (por exemplo, reduz) a ligação específica de uma proteína de ligação ao antígeno de referência (por exemplo, um ligante ou um anticorpo de referência) a um antígeno comum (por exemplo, PD-1 ou fragmento do mesmo). Podem ser usados inúmeros tipos de ensaios de ligação competitiva para determinar se uma proteína de ligação ao antígeno compete com outra, estes ensaios são, por exemplo: radioimunoensaio direto ou indireto de fase sólida (RIA), imunoensaio enzimático direto ou indireto de fase sólida (EIA), ensaio de competição sandwich (ver por exemplo Stahli et al., 1983, Methods in Enzymology 9:242-253); EIA de biotina-avidina direto de fase sólida (ver por exemplo Kirkland et al, 1986, J. Immunol.

137:3614-3619); ensaio de marcação direta de fase sólida,

ensaio sandwich de marcação direta de fase sólida (ver por exemplo, Harlow e Lane, 1988, Antibodies, A Laboratory

Manual, Cold Spring Harbor Press); RIA de marcação direta de fase sólida com marcadores I-125 (ver por exemplo Morel et al., 1988, Molec.

Immunol. 25: 7-15); EIA de biotina-avidina direto de fase sólida (ver, por exemplo, Cheung et al., 1990,

Virology 176: 546-552); e RIA de marcação direta (Moldenhauer et al., 1990, Scand.

J.

Immunol. 32:77-82). Geralmente, o ensaio envolve o uso de antígeno purificado ligado a uma superfície sólida ou célula transportando uma proteína de ligação ao antígeno não marcada sendo testada ou uma proteína de ligação ao antígeno de referência marcada.

A inibição competitiva é medida medindo a quantidade de marcador ligado à superfície sólida ou célula na presença da proteína de ligação ao antígeno que está sendo testada.

Normalmente, a proteína de ligação ao antígeno sendo testada está presente em excesso.

As proteínas de ligação ao antígenos identificadas pelos ensaios de competição (proteínas de ligação ao antígenos competitivas) incluem: proteínas de ligação ao antígenos que se ligam ao mesmo epítopo que a proteína de ligação ao antígeno de referência; e proteínas de ligação ao antígenos que se ligam a epítopos adjacentes que estão suficientemente próximos do epítopo de ligação da proteína de ligação ao antígeno de referência, os dois epítopos se impedem estericamente entre si de se ligarem.

Detalhes adicionais sobre os métodos usados para determinar a ligação competitiva são fornecidos nos exemplos apresentados nesse documento. Normalmente, quando a proteína de ligação ao antígeno competitiva está presente em excesso, inibirá (por exemplo, reduzirá) a ligação específica da proteína de ligação ao antígeno de referência ao antígeno comum em pelo menos 40-45%, 45-50%, 50-55%, 55-60%, 60-65%, 65-70%, 70%-75% ou 75% ou mais. Em alguns casos, a ligação é inibida por pelo menos 80-85%, 85-90%, 90-95%, 95-97%, ou 97% ou mais.

[0093] O termo “molécula de ácido nucleico” usado nesse documento se refere a moléculas de DNA e moléculas de RNA.

A molécula de ácido nucleico pode ser de fita simples ou de fita dupla, e é de um modo preferido de DNA de fita dupla ou mRNA de fita simples ou mRNA modificado. Quando um ácido nucleico é colocado em uma relação funcional com outra sequência de ácido nucleico, o ácido nucleico é “operativamente ligado”. Por exemplo, se um promotor ou melhorador afetar a transcrição de uma sequência de codificação, então o promotor ou melhorador está operativamente ligado à sequência de codificação.

[0094] O termo “vetor” se refere a uma molécula de ácido nucleico capaz de transportar outro ácido nucleico ao qual tenha sido ligado. Em uma modalidade, o vetor é um

“plasmídeo”, que se refere a um laço circular de DNA de fita dupla, no qual segmentos adicionais de DNA podem ser ligados.

Em uma outra modalidade, o vetor é um vetor viral no qual segmentos adicionais de DNA podem ser ligados ao genoma viral. Os vetores descritos nesse documento podem replicar- se autonomamente na célula hospedeira na qual foram introduzidos (por exemplo, vetor bacteriano com origem bacteriana de replicação e vetor mamífero epissomal) ou podem ser integrados no genoma da célula hospedeira após serem introduzidos na célula hospedeira, de modo a replicarem-se juntamente com o genoma hospedeiro (por exemplo, vetor mamífero não epissomal).

[0095] Os métodos de produção e purificação de anticorpos e fragmentos de ligação ao antígenos são bem conhecidos na técnica anterior, tais como Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, Capítulos 5-8 e 15.

Por exemplo, os ratos podem ser imunizados com PD-1 humano ou fragmentos do mesmo, e os anticorpos obtidos podem ser renaturados, purificados, e o sequenciamento de aminoácidos pode ser realizado por métodos convencionais. Os fragmentos de ligação ao antígenos também podem ser preparados por métodos convencionais. Uma ou mais regiões FR humanas são adicionadas às regiões CDR não humanas dos anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno da invenção, pelo uso de métodos de manipulação genética. As sequências germinativas de FR humanas podem ser obtidas a partir do endereço de internet da ImmunoGeneTics (IMGT) http://imgt.cines.fr, comparando o banco de dados de genes germinativos de regiões variáveis de anticorpos humanos da IMGT e o software MOE, ou podem ser obtidas do The Immunoglobulin FactsBook, 2001ISBN012441351.

[0096] O termo “célula hospedeira” se refere a uma célula na qual foi introduzido um vetor de expressão. As células hospedeiras podem incluir bactérias, microrganismos, células vegetais ou animais. As bactérias que podem ser facilmente transformadas incluem membros das enterobacteriaceae, por exemplo as cepas Escherichia coli ou Salmonella; Bacillaceae por exemplo Bacillus subtilis; Pneumococcus; Streptococcus e Haemophilus influenzae.

Microrganismos adequados incluem Saccharomyces cerevisiae e Pichia pastoris. As linhas adequadas de células hospedeiras animais incluem CHO (Chinese Hamster Ovary Cell Line) e células NS0.

[0097] Os anticorpos manipulados ou fragmentos de ligação ao antígeno da presente descrição podem ser preparados e purificados por métodos convencionais. Por exemplo, as sequências de cDNA codificando as cadeias pesadas e leves podem ser clonadas e recombinadas em um vetor de expressão GS. O vetor de expressão da imunoglobulina recombinante pode ser estavelmente transfetado em células

CHO. Como uma técnica anterior mais recomendada, os sistemas de expressão de mamíferos podem levar à glicosilação de anticorpos, especialmente nos locais N-terminais altamente conservados da região Fc. Os clones estáveis são obtidos pela expressão de anticorpos que se ligam especificamente ao PD-1 humano. Os clones positivos são expandidos no meio sem soro do biorreator para produzir anticorpos. O meio de cultura no qual os anticorpos são segregados pode ser purificado por técnicas convencionais. Por exemplo, usando a coluna A ou G Sepharose FF com tampão ajustado para purificação. Os componentes de ligação não específicos são retirados por lavagem. Em seguida, os anticorpos de ligação são eluídos pelo método do gradiente de pH, e os fragmentos de anticorpos são detectados por SDS-PAGE e recolhidos. Os anticorpos podem ser filtrados e concentrados por métodos convencionais. As misturas solúveis e polímeros também podem ser removidos por métodos convencionais, por exemplo, peneiras moleculares e troca iônica. O produto resultante precisa ser congelado imediatamente, tal como a -70°C, ou liofilizado.

[0098] “Administrar”, “dar” e “tratar”, quando aplicados a animais, seres humanos, indivíduos experimentais, células, tecidos, órgãos ou fluidos biológicos, se referem ao contato do fármaco, agente terapêutico, agente de diagnóstico ou composição exógenos com os animais, seres humanos, indivíduos, células, tecidos, órgãos ou fluidos biológicos. “Administrar”, “dar” e “tratar” podem referir-se, por exemplo, ao tratamento, farmacocinética, diagnóstico, investigação e métodos experimentais. O tratamento de células inclui o contato de reagentes com células, e o contato de reagentes com fluidos, em que os fluidos estão em contato com as células.

“Administrar”, “dar” e “tratar” também se referem ao tratamento, por exemplo, de células através de reagentes, diagnóstico, composições de ligação ou por outra célula in vitro e ex vivo. “Tratar” quando aplicado a indivíduos humanos, veterinários ou de investigação, se refere a tratamento terapêutico, medidas de prevenção ou preventivas, investigação e aplicações de diagnóstico.

[0099] “Tratamento” se refere à administração de um agente terapêutico interno ou externo, por exemplo uma composição compreendendo qualquer um dos compostos de ligação da presente descrição, a um paciente que tem um ou mais sintomas de uma doença sobre a qual se sabe que o agente terapêutico tem efeito terapêutico. Geralmente, o agente terapêutico é administrado em uma quantidade eficaz para aliviar um ou mais sintomas da doença no paciente ou população tratada, para induzir a regressão de tais sintomas ou inibir o desenvolvimento de tais sintomas em qualquer medida clinicamente medida. A quantidade de agente terapêutico eficaz para aliviar qualquer sintoma específico da doença (também referida como “quantidade terapeuticamente eficaz”) pode variar de acordo com uma variedade de fatores, por exemplo, o estado da doença do paciente, a idade e o peso corporal, e a capacidade do fármaco para produzir o efeito terapêutico desejado no paciente. A existência de alívio dos sintomas da doença pode ser avaliada através de quaisquer métodos de ensaio clínico habitualmente usados por médicos ou outros profissionais de saúde para avaliar a gravidade ou a progressão dos sintomas. Embora as modalidades da presente descrição (por exemplo, métodos ou produtos de tratamento) possam ser ineficazes no alívio de cada sintoma da doença alvo, mas tal como determinado de acordo com quaisquer métodos de teste estatísticos conhecidos na técnica, tais como o teste t de Student, teste chi-square, teste U de Mann e Whitney, teste de Kruskal-Wallis (teste H), teste de Jonckheere-Terpstra e teste de Wilcoxon, devem reduzir o sintoma da doença alvo em um número estatisticamente significativo de pacientes.

[00100] “Modificação conservadora” ou “substituto ou substituição conservadora” se refere à substituição dos aminoácidos de uma proteína por outros aminoácidos com características similares (por exemplo, carga, tamanho da cadeia lateral, hidrofobicidade/hidrofilicidade, conformação e rigidez da cadeia principal, etc.) para que as alterações possam ser feitas frequentemente sem alterar a atividade biológica da proteína. As pessoas versadas na técnica sabem que, em geral, uma única substituição de aminoácidos em uma região não essencial de um polipeptídeo não altera substancialmente a atividade biológica (ver por exemplo Watson et al., (1987) Molecular Biology of the Gene, The Benjamin/Cummings Pub. Co., Página 224, (4ª edição)).

Adicionalmente, a substituição de aminoácidos com estrutura ou função similar é pouco suscetível de perturbar a atividade biológica. Substituições conservadoras exemplificativas estão indicadas na tabela abaixo “Substituições conservadoras de aminoácidos exemplificativas”.

Tabela 3. Substituições conservadoras de aminoácidos exemplificativas Resíduo original Substituição Conservadora Ala(A) Gly; Ser Arg(R) Lys; His Asn(N) Gln; His; Asp Asp(D) Glu; Asn Cys(C) Ser; Ala; Val Gln(Q) Asn; Glu Glu(E) Asp; Gln Gly(G) Ala His(H) Asn; Gln Ile(I) Leu; Val Leu(L) Ile; Val Lys(K) Arg; His Met(M) Leu; Ile; Tyr Phe(F) Tyr; Met; Leu Pro(P) Ala Ser(S) Thr Thr(T) Ser Trp(W) Tyr; Phe Tyr(Y) Trp; Phe Val(V) Ile; Leu

[00101] “Quantidade eficaz” ou “dose eficaz” se refere à quantidade de um fármaco, composto ou composição farmacêutica necessária para obter qualquer um ou mais resultados terapêuticos benéficos ou desejados. Para uso preventivo, os resultados benéficos ou desejados incluem a eliminação ou redução do risco, redução da gravidade ou atraso do início da doença, incluindo a bioquímica, histologia e sintomas comportamentais da doença, suas complicações e fenótipos patológicos intermédios que ocorrem durante o processo de desenvolvimento da doença. Para aplicações terapêuticas, os resultados benéficos ou desejados incluem resultados clínicos, por exemplo a redução da incidência de vários distúrbios relacionados com antígenos-alvo da presente descrição ou a melhoria de um ou mais sintomas do distúrbio, a redução da dose de outros agentes necessários para tratar o distúrbio, o melhoramento do efeito terapêutico de outro agente, e/ou o atraso da progressão do distúrbio relacionado com antígenos-alvo da presente descrição do paciente.

[00102] “Exógeno” se refere a substâncias produzidas no exterior dos organismos, células ou corpos humanos, de acordo com as circunstâncias. “Endógeno” se refere a substâncias produzidas no interior de células, organismos ou corpos humanos, de acordo com as circunstâncias.

[00103] “Homologia” se refere à similaridade de sequência entre duas sequências de polinucleotídeos ou entre dois polipeptídeos. Quando as posições nas duas sequências comparadas são ocupadas pela mesma subunidade de monómero de base ou de aminoácido, por exemplo, se cada posição de duas moléculas de DNA for ocupada por adenina, então as moléculas são homólogas nessa posição. A percentagem de homologia entre duas sequências é uma função do número de posições correspondentes ou homólogas partilhadas pelas duas sequências, dividido pelo número de posições comparadas x

100. Por exemplo, no alinhamento de sequência ideal, se existirem 6 correspondências ou homologia nas 10 posições das duas sequências, então as duas sequências são 60% homólogas; se existirem 95 correspondências ou homologia nas 100 posições das duas sequências, então as duas sequências são 95% homólogas. Geralmente, quando duas sequências estão alinhadas, a comparação é feita para dar a percentagem máxima de homologia. Por exemplo, a comparação pode ser realizada pelo algoritmo BLAST, no qual os parâmetros do algoritmo são selecionados para dar a correspondência máxima entre cada sequência ao longo de todo o comprimento de cada sequência de referência. As referências seguintes se referem ao algoritmo BLAST que é frequentemente usado para análise de sequências: BLAST ALGORITHMS: Altschul, S. F. et al., (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410; Gish, W. et al., (1993) Nature Genet. 3:266-272; Madden, T. L. et al., (1996) Meth. Enzymol.

266:131-141; Altschul, S. F. et al., (1997) Nucleic Acids

Res. 25:3389-3402; Zhang, J. et al., (1997) Genome Res.

7:649-656. Outros algoritmos BLAST convencionais, tais como fornecidos pelo NCBI BLAST, são também bem conhecidos pelas pessoas versadas na técnica.

[00104] As expressões “célula”, “linha celular” e “cultura de células”, como usadas nesse documento, podem ser usadas indistintamente, e todos esses nomes incluem descendência. Portanto, as palavras “transformante” e “célula transformada” incluem células de teste primárias e culturas derivadas das mesmas, independentemente dos números de passagem. Também deve ser entendido que devido a mutações deliberadas ou não intencionais, todos os descendentes não podem ser exatamente iguais em termos de conteúdo de DNA. A descendência mutante com a mesma função ou atividade biológica conforme verificada nas células transformadas originais está incluída. Será claramente compreendido pelo contexto quando for referido um nome diferente.

[00105] “Reação em cadeia da polimerase” ou “PCR”, como usado nesse documento, se refere a um procedimento ou técnica em que um vestígio de uma porção específica de ácido nucleico, RNA e/ou DNA é amplificada, como descrito, por exemplo, na Patente dos EUA nº 4,683,195. No geral, é necessário obter informações de sequência a partir do fim ou fora da região alvo para que os iniciadores de oligonucleotídeos possam ser concebidos; estes iniciadores são iguais ou similares em termos de sequência às fitas correspondentes do modelo sendo amplificado. Os nucleotídeos do terminal 5’ dos dois iniciadores podem ser idênticos às extremidades do material sendo amplificado. A PCR pode ser usada para amplificar sequências específicas de RNA, sequências específicas de DNA do DNA genómico total, e sequências de cDNA, fago ou plasmídeo transcritas do RNA celular total, etc. Ver geralmente Mullis et al. (1987) Cold Spring Harbor, Symp. Ouant. Biol. 51:263; Erlich ed., (1989) PCR TECHNOLOGY (Stockton Press, N.Y.). A PCR usada nesse documento é considerada como um exemplo, mas não o único exemplo, de um método de reação de polimerase do ácido nucleico para amplificar uma amostra de teste de ácido nucleico, e o método inclui o uso de ácidos nucleicos conhecidos como iniciadores e polimerases de ácido nucleico para amplificar ou produzir uma porção específica do ácido nucleico.

[00106] “Isolado” se refere a um estado purificado, e nesse caso significa que a molécula designada está substancialmente livre de outras biomoléculas, por exemplo ácidos nucleicos, proteínas, lipídeos, carboidratos ou outros materiais, por exemplo detritos celulares e meio de crescimento. Geralmente, o termo “isolado” não pretende significar a ausência completa desses materiais ou a ausência de água, tampões ou sais, a menos que estejam presentes em uma quantidade que interfira significativamente com o uso experimental ou terapêutico do composto, como descrito nesse documento.

[00107] “Opcional” ou “opcionalmente” significa que o evento ou ambiente descrito mais adiante pode, mas não necessariamente, ocorrer, e a descrição inclui ocasiões em que o evento ou ambiente ocorre ou não ocorre. Por exemplo, “opcionalmente compreendendo 1 a 3 regiões variáveis de cadeia pesada de anticorpos” significa que as regiões variáveis de cadeia pesada de anticorpos de sequências específicas podem mas não têm de estar presentes.

[00108] “Composição farmacêutica” significa uma mistura compreendendo um ou mais dos compostos descritos no nesse documento, ou um sal fisiologicamente/farmaceuticamente aceitável ou um pró- fármaco, e outros componentes químicos, por exemplo veículos e excipientes fisiologicamente/farmaceuticamente aceitáveis. O propósito da composição farmacêutica é promover a administração ao organismo, o que facilita a absorção do princípio ativo e, por conseguinte, exerce atividade biológica.

[00109] O termo “veículo farmaceuticamente aceitável” se refere a qualquer substância inativa adequada para uso em uma formulação para o fornecimento de anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígenos. O veículo pode ser um agente antiadesivo, ligante, revestimento, desintegrante, material de enchimento ou diluente, conservante (tal como agente antioxidante, antibacteriano ou antifúngico), adoçante, agente retardador de absorção, agente umectante, emulsionante, tampão, etc. Exemplos de veículos farmaceuticamente aceitáveis adequados incluem água, etanol, polióis (por exemplo glicerol, propanodiol, polietilenoglicol, etc.) dextrose, óleos vegetais (por exemplo, azeite), solução salina, tampão, solução salina tamponada, e agentes isotônicos, por exemplo açúcares, polióis, sorbitol e cloreto de sódio.

[00110] Além disso, a presente descrição inclui agentes de tratamento de doenças relacionadas com células positivas para o antígeno alvo (por exemplo PD-1), os agentes compreendendo o anticorpo anti-PD-1 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo da presente descrição como ingrediente ativo.

[00111] A doença relacionada com PD-1 na presente descrição não é limitada, desde que se trate de uma doença relacionada com PD-1. Por exemplo, a resposta terapêutica induzida pela molécula da presente descrição pode ser alcançada pela ligação ao PD-1 humano, e depois pela inibição da ligação de PD-1 e de seus ligantes PD-L1 e PD-L2, ou pela eliminação das células tumorais com superexpressão de PD-1.

Portanto, quando em preparações e formulações adequadas para aplicações terapêuticas, as moléculas da presente descrição são muito úteis para pessoas que têm tumor ou câncer, de um modo preferido melanoma, câncer do cólon, câncer da mama, câncer do pulmão, câncer gástrico, câncer do intestino, câncer do rim, câncer do pulmão de células não pequenas, câncer da bexiga, etc.

[00112] Além disso, a presente descrição se refere a métodos para imunodetecção ou determinação de antígenos alvo (por exemplo PD-1), reagentes para imunodetecção ou determinação de antígenos alvo (por exemplo PD-1), métodos para imunodetecção ou determinação de células expressando antígenos alvo (por exemplo PD-1) e agentes de diagnóstico para diagnóstico de doenças relacionadas com células positivas para antígenos alvo (por exemplo PD-1), que inclui o anticorpo ou fragmento de anticorpo da presente descrição, que reconhece especificamente o antígeno alvo (por exemplo PD-1 humano) e se liga com a sequência de aminoácidos da região extracelular ou sua estrutura tridimensional, sendo usado como um ingrediente ativo.

[00113] Na presente descrição, o método usado para detectar ou medir a quantidade do antígeno alvo (por exemplo PD-1) pode ser qualquer método conhecido. Por exemplo, inclui métodos de imunodetecção ou medição.

[00114] Os métodos de imunodetecção ou medição são métodos de detecção ou medição da quantidade de anticorpos ou antígenos usando antígenos ou anticorpos marcados.

Exemplos de métodos de imunodetecção ou medição incluem o radioimunoensaio (RIA), imunoensaio enzimático (EIA ou ELISA), imunoensaio de fluorescência (FIA), imunoensaio de luminescência, western blotting, métodos físico-químicos, etc.

[00115] As doenças supracitadas relacionadas com células positivas para PD-1 podem ser diagnosticadas através da detecção ou medição de células que expressam PD-1 usando os anticorpos ou fragmentos de anticorpos da presente descrição.

[00116] A fim de detectar células que expressam o polipeptídeo, podem ser usados métodos conhecidos de imunodetecção, de um modo preferido usando imunoprecipitação, coloração de células fluorescente, coloração imunohistoquímica, etc. Além disso, pode ser usado o método de coloração de anticorpos fluorescente usando o sistema FMAT8100HTS (Applied Biosystem).

[00117] Na presente descrição, não existe nenhuma limitação particular na amostra in vivo usada para a detecção ou medição do antígeno alvo (por exemplo PD-1), desde que tenha a possibilidade de conter células que expressem o antígeno alvo (por exemplo PD-1), por exemplo histiócitos, sangue, plasma, soro, fluido pancreático, urina, fezes, líquido de tecidos ou líquido de cultura.

[00118] De acordo com o método de diagnóstico requerido, o agente de diagnóstico compreendendo o anticorpo monoclonal ou fragmento de anticorpo do mesmo da presente descrição pode também compreender reagentes para realizar a reação antígeno-anticorpo ou reagentes para detectar a reação. Os reagentes usados para a realização da reação antígeno-anticorpo incluem tampões, sais, etc. Os reagentes usados para a detecção incluem reagentes normalmente usados em métodos de imunodetecção ou medição, por exemplo, segundos anticorpos marcados que reconhecem o anticorpo monoclonal, fragmento de anticorpo do mesmo ou conjugado do mesmo, e um substrato correspondente ao marcador, etc.

Preparação de antígenos

1. Construção de antígenos:

[00119] Uma proteína de fusão PD-1-IgG1Fc humana é concebida e sintetizada, com 150 aminoácidos da região extracelular do PD-1 humano no N-terminal e o fragmento Fc da IgG1 humana (hIgG1Fc) no C-terminal. Uma proteína PD-1- Fc recombinante com elevada pureza pode ser obtida após purificação com a coluna de afinidade de Proteína A e é usada para detectar a ligação do anticorpo anti-PD-1 ao antígeno.

[00120] PD-1-IgG1Fc humano (SEQ ID NO: 1):

MEFGLSWLFLVAILKGVQCPGWFLDSPDRPWNPPTFSPALLVVTEGDNATFTCSFSNTS ESFVLNWYRMSPSNQTDKLAAFPEDRSQPGQDCRFRVTQLPNGRDFHMSVVRARRNDSG TYLCGAISLAPKAQIKESLRAELRVTERRAEVPTAHPSPSPRPAGQFQTLVEPKSSDKT HTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGV EVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKG QPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDS DGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK.

Nota: A parte sublinhada é o peptídeo de sinal, a parte normal é a região extracelular do PD-1 humano, e a parte itálica é hIgG1Fc (peptídeo de sinal + região extracelular + hIgG1Fc).

[00121] PD-1-his humano (SEQ ID NO: 2):

[00122] MEFGLSWLFLVAILKGVQCPGWFLDSPDRPWNPPTFSPALLVVT

EGDNATFTCSFSNTSESFVLNWYRMSPSNQTDKLAAFPEDRSQPGQDCRFRVTQLPNGR DFHMSVVRARRNDSGTYLCGAISLAPKAQIKESLRAELRVTERRAEVPTAHPSPSPRPA GQFQTLVGSSDYKDDDDKHHHHHH.

[00123] Antígeno PD-1 codificado por ácidos nucleicos transfetados em células (SEQ ID NO: 3):

MQIPQAPWPVVWAVLQLGWRPGWFLDSPDRPWNPPTFSPALLVVTEGDNATFTCSFSNT SESFVLNWYRMSPSNQTDKLAAFPEDRSQPGQDCRFRVTQLPNGRDFHMSVVRARRNDS GTYLCGAISLAPKAQIKESLRAELRVTERRAEVPTAHPSPSPRPAGQFQTLVVGVVGGL LGSLVLLVWVLAVICSRAARGTIGARRTGQPLKEDPSAVPVFSVDYGELDFQWREKTPE PPVPCVPEQTEYATIVFPSGMGTSSPARRGSADGPRSAQPLRPEDGHCSWPL.

Preparação de anticorpos

[00124] Os anticorpos PD-1 anti-humanos podem ser produzidos pela imunização de ratos, e também podem ser obtidos a partir da biblioteca de imunização de ratos de fago PD-1 anti-humano.

[00125] O método de preparação de anticorpos anti- humanos PD-1 pela imunização de ratos é o seguinte:

1. Imunização: ratos brancos SJL de laboratório, fêmea, com 6-8 semanas de idade e ratos brancos Balb/c, fêmea, com 6-8 semanas de idade. Ambiente de alojamento: Nível SPF.

Após a compra dos ratos, estes foram alojados em um ambiente de laboratório por 1 semana sob um ciclo de ajuste de 12/12 horas de luz/obscuridade, em temperatura de 20-25°C; humidade 40-60%. Os ratos adaptados ao ambiente foram imunizados de acordo com diferentes protocolos, com 6-10 ratos em cada grupo. O antígeno imunológico poderia ser a proteína recombinante purificada PD-1-IgG1Fc (ver SEQ ID NO: 1), PD-1-his (ver SEQ ID NO: 2), ou células Jurkat/CHO-PD-1 transfetadas com PD-1 como antígeno (ver SEQ ID NO: 3). Um único antígeno combinado com diferentes adjuvantes imunológicos ou diferentes tipos de imunógenos poderia ser usado para a imunização cruzada. O local de imunização poderia ser a cavidade abdominal ou debaixo da pele nas costas, ou alternativamente ser imunizado nos dois locais.

O adjuvante imunológico TiterMax® Gold Adjuvant (doravante referido como Titermax, adquirido à Sigma, com nº de catálogo T2684) e Imject Alum Adjuvant (doravante referido como Alum, adquirido à Pierce, com nº de catálogo 77161) foram usados para a imunização cruzada. A proporção de antígeno para adjuvante (Titermax) foi de 1:1, a proporção de antígeno para adjuvante (Alum) foi de 3:1, 25-50 μg/animal (primeira imunização), 50 μg/animal (imunização de reforço), ou 1 x 107 células Jurkat/CHO-PD-1/animal. No dia 0, foram injetados intraperitonealmente 25-50 μg/animal de antígeno emulsionado, uma vez por semana ou uma vez a cada duas semanas após a primeira imunização, Titermax e Alum foram usados alternadamente, 5-8 vezes no total.

2. Fusão celular: ratos com elevados títulos de anticorpos no soro foram selecionados para a fusão de células do baço. Os olhos dos ratos foram sangrados 72 h após a imunização do tipo sprint. Os ratos foram sacrificados por deslocação cervical e colocados em 75% de etanol para desinfecção. Linfócitos esplénicos foram fundidos às células do mieloma células Sp2/0 (Chinese Academy of Science) para obter células de hibridoma pela aplicação do procedimento de fusão optimizado mediada por PEG. As células de hibridoma fundidas foram ressuspensas em meio completo HAT (meio RPMI- 1640 contendo 20% FBS, 1 x HAT e 1 x OPI), e colocadas em alíquotas em placas de cultura de células de 96 poços (1 x 105/150 μl/poço), incubadas a 37°C, 5% CO2, e semeadas em cerca de 10-30 placas no total. No quinto dia após a fusão, foi adicionado meio completo HAT a 50 μl/poço, e incubado a 37°C, 5% CO2. Do dia 7 ao dia 8 após a fusão, de acordo com a densidade de crescimento celular, o meio foi totalmente trocado a 200 μl/poço, e incubado a 37°C, 5% CO2.

3. Rastreio de células de hibridoma: 7-9 dias após a fusão, de acordo com a densidade de crescimento celular, o método ELISA foi realizado para detectar a ligação de anticorpos a PD-1, e as células em poços positivos foram ainda detectadas com ELISA para detecção do bloqueio da ligação PD-1/PDL1. O meio nos poços positivos foi trocado e as células foram expandidas para placas de 24 poços em tempo de acordo com a densidade celular. As linhas celulares transferidas para placas de 24 poços foram novamente testadas e depois preservadas e subclonadas pela primeira vez. Aquelas positivas no primeiro rastreio de subclonagem foram preservadas, e a segunda ou terceira subclonagem foi realizada até à obtenção de clones de célula única. As células de hibridoma com o efeito de bloquear a ligação de PD-1 e PDL1 foram obtidas por fusões múltiplas.

[00126] O método de obtenção de anticorpos PD-1 anti- humanos pela biblioteca de imunização de ratos de fago PD-1 anti-humano é o seguinte:

1. Construção de uma biblioteca de imunização de ratos de fago PD-1 anti-humano: foram selecionados os baços de ratos com elevado título de anticorpos no soro, e o RNA total do tecido foi extraído usando Trizol (Invitrogen nº de catálogo 15596-018). O cDNA foi obtido usando PrimeScriptTM II 1st Strand cDNA Synthesis Kit (Takara nº de catálogo 6210A) para a transcrição reversa. Os iniciadores para a construção da biblioteca foram concebidos e sintetizados de acordo com o banco de dados do IMGT. Os fragmentos de anticorpos de cadeia única foram obtidos por três ciclos de reações de PCR. Os fragmentos de anticorpos de cadeia única e o vetor de construção da biblioteca modificado pCantab5E (Amersham Biosciences/GE nº de catálogo 27-9400-01) foram digeridos com Sfi1 (NEB nº de catálogo #R0123L), e purificados e recuperados com o E.Z.N.A.® Gel Extraction Kit (Omega nº de catálogo D2500-02) após a eletroforese. Em seguida foi usada a T4 DNA ligase (NEB nº de catálogo #M0202L) para a ligação a 16°C por 16-18 h, e o kit acima referido foi usado para purificação e recuperação, e por fim foi realizada a eluição com água deionizada. 1 μg do produto de ligação foi recolhido e misturado com 1 frasco de TG1 competente (Lucigen nº de catálogo 60502-2) para a eletro-transformação, e a eletro- transformação foi realizada com o eletroporador (Bio Rad Micropulser), com parâmetros definidos para 2,5 kV, 200 Ω e 25 uF. A transformação foi repetida por 10 vezes. O produto foi espalhado nas placas e cultivado de cima para baixo a 37°C por 16-18 h. Todas as colónias foram depois separadas e misturadas, adicionadas com glicerina em uma concentração final de 15%, e armazenadas a -80°C paro uso.

2. Rastreio da biblioteca de imunização de ratos de fago PD-1 anti-humano: a biblioteca imunológica de fagos PD- 1 (1x1012 – 1x1013) e 100 μl de microesferas de estreptomicina

(Milenvi Biotec, Auburn, CA) foram adicionadas a 1 ml de solução salina de tampão fosfato contendo 2% de leite desnatado (MPBS) e incubadas em temperatura ambiente por 1 h, colocadas em um suporte magnético, e o sobrenadante foi recolhido. 10 μg/ml de proteína humana biotinilada PD-1-ECD-

his (comprada à Sino Biological) foi adicionada ao sobrenadante e incubada em temperatura ambiente por 1 h.

Em seguida 100 μl de esferas magnéticas revestidas com estreptavidina (pré-incubadas com 1 ml de MPBS) foram adicionadas e incubadas por 1 h em temperatura ambiente.

E foi carregado no sistema de suporte magnético para triagem,

e o sobrenadante foi aspirado. 1 ml de PBST (tampão fosfato contendo 0,1% de Tween-20) foi adicionado e virado várias vezes.

Foi adicionada uma solução de lavagem nova após aspiração completa, repetida 11 vezes para remover fragmentos de anticorpos não ligados, e foram adicionados

0,5 ml de solução de eluição (50 μl 10 mg/ml de solução de calda de tripsina adicionada em 450 μl PBS). Foi agitado por

15 min em temperatura ambiente, colocado em um suporte magnético, e o sobrenadante foi aspirado para um novo tubo

EP.

TG1 foi semeado em meio 2YT e expandido até a densidade de bactérias cultivadas de OD600=0,4. 1,75 ml de TG1

(OD600=0,4) foram adicionados a cada tubo, e 250 μl de fago eluído (fago) foram adicionados, foi incubado em um banho de água a 37°C por 30 min, e espalhado em placas com diluição de gradiente para testar o título. A solução TG1 restante foi centrifugada, espalhada em placas e incubada durante a noite a 37°C.

[00127] A biblioteca imune dos ratos de fago foi rastreada por 2-3 ciclos usando o antígeno humano biotinilado PD-1-ECD-his, com rastreio MACS (esferas magnéticas de estreptomicina, Invitrogen), e foram finalmente obtidos e verificados por sequenciamento os anticorpos monoclonais capazes de se ligarem a PD-1 e capazes de bloquear a ligação do PD-1 a PD-L1. Foram obtidas as sequências de região variável dos anticorpos.

Purificação de proteínas de antígeno recombinante/anticorpos

[00128] 1. Separação e purificação de sobrenadante de hibridoma/cromatografia de afinidade de proteína G: Para a purificação do sobrenadante do hibridoma do rato, a cromatografia de afinidade de Proteína G foi a primeira escolha. O hibridoma cultivado foi centrifugado para recolher o sobrenadante, e foi adicionado 10-15% de volume de 1 M Tris-HCl (pH 8,0-8,5) de acordo com o volume do sobrenadante para ajustar o pH do sobrenadante. Para a coluna Proteína G, foi usado cloridrato de guanidina a 6 M para lavar 3-5 vezes o volume da coluna, e depois foi usada água pura para lavar 3-5 vezes o volume da coluna; um sistema tampão como 1xPBS (pH 7,4) como tampão de equilíbrio foi usado para equilibrar a coluna por 3-5 vezes o volume da coluna; o sobrenadante da célula foi carregado e ligado usando uma taxa de fluxo baixa, que foi controlada para que o tempo de retenção fosse cerca de 1 min ou mais; 1xPBS (pH

7. 4) foi usado para lavar a coluna cromatográfica 3-5 vezes o volume da coluna até a absorção UV cair para a linha de base: 0,1M de tampão de ácido acético/acetato de sódio (pH 3,0) foi usado para eluição de amostras, os picos de eluição foram recolhidos de acordo com a detecção UV, e 1 M de Tris- HCl (pH 8,0) foi usado para ajustar rapidamente o pH do produto eluído para 5-6 para armazenamento temporário. Para o produto eluído, a substituição da solução poderia ser realizada por métodos bem conhecidos pelas pessoas versadas na técnica, tais como o uso de tubos de ultrafiltração para ultrafiltração e concentração e a substituição da solução pelo sistema tampão necessário, ou o uso de exclusão molecular tal como G-25 para dessalinizar e substituir pelo sistema tampão necessário, ou o uso de colunas de exclusão molecular de alta resolução como o Superdex 200 para remover os componentes agregados no produto eluído para melhorar a pureza da amostra.

[00129] 2. Purificação de proteínas ou anticorpos com cromatografia por afinidade de Proteína A: Primeiro, o sobrenadante da cultura de células expressando a proteína de antígeno ou anticorpo foi centrifugado a alta velocidade para recolher o sobrenadante. Para a coluna de afinidade de Proteína A, foi usado cloridrato de guanidina a 6 M para lavar 3-5 vezes o volume da coluna, e depois foi usada água pura para lavar 3-5 vezes o volume da coluna. Um sistema tampão tal como 1xPBS (pH 7,4) foi usado como tampão de equilíbrio para equilibrar a coluna de cromatografia por 3-5 vezes o volume da coluna. O sobrenadante de células foi carregado e ligado usando uma taxa de fluxo baixa, que foi controlada de modo a que o tempo de retenção fosse cerca de 1 minuto ou mais. Após a ligação estar completa, foi usado 1xPBS (pH 7,4) para lavar a coluna cromatográfica 3-5 vezes o volume da coluna até a absorção UV cair para a linha de base. Acido acético/acetato de sódio a 0,1M (pH 3,0-3,5) tampão foi usado para eluição de amostras, os picos de eluição foram recolhidos de acordo com a detecção UV, e Tris- HCl a 1 M (pH 8,0) foi usado para ajustar rapidamente o pH do produto eluído para 5-6 para armazenamento temporário.

Para o produto eluído, a substituição da solução poderia ser realizada por métodos bem conhecidos por aqueles versados na técnica, tais como o uso de tubos de ultrafiltração para ultrafiltração e concentração e a substituição da solução pelo sistema tampão necessário, ou o uso de exclusão molecular tal como G-25 para dessalinizar e substituir pelo sistema tampão necessário, ou o uso de colunas de exclusão molecular de alta resolução como o Superdex 200 para remover os componentes agregados no produto eluído para melhorar a pureza da amostra.

EXEMPLOS

[00130] A presente descrição é descrita mais adiante em combinação com os exemplos, mas estes exemplos não limitam o âmbito da presente descrição. Os métodos experimentais para os quais as condições não estão especificamente indicadas nos exemplos da presente descrição seguem geralmente condições convencionais, tais como Antibodies: A Laboratory Manual e Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor; ou de acordo com as condições recomendadas pelo fabricante da matéria-prima ou do produto.

Os reagentes para os quais as fontes não são especificamente indicadas são os reagentes convencionais disponíveis no mercado.

Exemplo 1. Obtenção de anticorpos murinos PD-1 anti-humanos

[00131] Os anticorpos murinos PD-1 anti-humanos obtidos pelo método supracitado foram submetidos a experimentos de ligação ao antígenos e rastreados para obter múltiplas cepas de anticorpos com boa atividade: em que foram incluídos M23, M32 e M33. Os clones de célula única foram expandidos e cultivados, o RNA foi extraído, e foram usados iniciadores degenerados de Ig de rato para realizar a amplificação de transcrição reversa (RT-PCR) para obter a sequência de região variável do anticorpo. A sequência de região variável de anticorpos murinos foi ligada à sequência de região constante de anticorpos humanos. O anticorpo quimérico do anticorpo monoclonal murino foi clonado e expresso de forma recombinante, e foram realizados experimentos de atividade in vitro para confirmar que a sequência de região variável de anticorpo monoclonal obtida estava correta.

[00132] As sequências de região variável dos anticorpos murinos M23, M32 e M33 são determinadas como se segue:

[00133] A região variável de cadeia pesada de anticorpo murino M23 (SEQ ID NO: 4):

QVQLQQSGAELVRPGASVTLSCKASGYTFTDYEMHWVKQTPIHGLEWIGLIDPETGGTV YNQKFKDKTILTADKSSSTAYMEFRSLTSEDSAVYHCTRERFSYYGSTSDWYFDVWGTG TTVTVSS.

[00134] A região variável de cadeia leve do anticorpo murino M23 (SEQ ID NO: 5):

DGLMTQTPLSLPVSLGDHASISCRSSQSLVHSNGNTYLEWYLQKPGQSPKLLIYKVSNR FSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGIYYCFQGSHVPYTFGGGTKLEIK.

[00135] A região variável de cadeia pesada do anticorpo murino M32 (SEQ ID NO: 6):

QVQLQQSGAELVRPGASVTLSCKASDFTFTDYEIHWVKQTPVHGLEWIGLFDPETGGIV YNQKFKGKAILTADKSSNTAYMEFRSLTSEDSAVYYCTREGYNRDWYFDVWGTGTTVTV SS.

[00136] A região variável de cadeia leve do anticorpo murino M32 (SEQ ID NO: 7):

DVLMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSIVHSNGNTYLEWYLQKPGQSPKLLIYKVSNR FSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGIYYCFQGSHVPYAFGGGTKLEIK.

[00137] A região variável de cadeia pesada de anticorpo murino M33 (SEQ ID NO: 19):

KVMLVESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFTFSSYAMSWVRQTPEKRLEWVATISGGGVDTY YQDNVQGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLRSEDTALYYCASPYGHGYFDVWGTGTTVTVSS

[00138] A região variável de cadeia leve do anticorpo murino M33 (SEQ ID NO: 20):

DIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDINNFLNWYQQKPDGTVKLLIYYTSSLHSGVP SRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPWTFGGGTKLEIK.

[00139] Nota: na região variável de cadeia pesada e nas sequências de região variável de cadeia leve dos anticorpos acima referidos, estão sublinhadas as sequências CDR determinadas pelo sistema de numeração Kabat, pela ordem seguinte: FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4.

Tabela 4. Sequências de região CDR de cadeia pesada e cadeia leve de anticorpos murinos M23, M32 e M33 Nome do Cadeia pesada Cadeia leve anticorpo HCDR1 DYEMH LCDR1 RSSQSLVHSNGNTYLE (SEQ ID NO: 8) (SEQ ID NO: 11) HCDR2 LIDPETGGTVYNQKFKD LCDR2 KVSNRFS (SEQ ID NO: 9) (SEQ ID NO: 12) M23 HCDR3 ERFSYYGSTSDWYFDV LCDR3 FQGSHVPYT (SEQ ID NO: 10) (SEQ ID NO: 13)

HCDR1 DYEIH LCDR1 RSSQSIVHSNGNTYLE (SEQ ID NO: 14) (SEQ ID NO: 17) HCDR2 LFDPETGGIVYNQKFKG LCDR2 KVSNRFS (SEQ ID NO: 15) (SEQ ID NO: 12) M32 HCDR3 EGYNRDWYFDV LCDR3 FQGSHVPYA (SEQ ID NO: 16) (SEQ ID NO: 18) HCDR1 SYAMS LCDR1 RASQDINNFLN (SEQ ID NO: 21) (SEQ ID NO: 24) HCDR2 TISGGGVDTYYQDNVQG LCDR2 YTSSLHS (SEQ ID NO: 22) (SEQ ID NO: 25) M33 HCDR3 PYGHGYFDV LCDR3 QQGNTLPWT (SEQ ID NO: 23) (SEQ ID NO: 26) Nota: as sequências CDR de anticorpos na tabela são determinadas de acordo com o sistema de numeração Kabat.

Exemplo 2. Humanização de anticorpos monoclonais PD-1 anti- humanos

[00140] Pelo alinhamento com o banco de dados de genes germinativos de região variável de cadeia leve e pesada de anticorpos humanos do IMGT e análise de software MOE, foram selecionados como modelos os genes germinativos de região variável de cadeia leve e pesada germinativos humanos com elevada identidade com M23, M32 e M33. As CDR destes 3 anticorpos murinos foram enxertados nos modelos de anticorpos humanos correspondentes para construir seus anticorpos humanizados correspondentes, respectivamente.

1. Humanização do anticorpo murino M23

1.1 Seleção da estrutura de humanização do anticorpo murino M23

[00141] Os modelos de cadeia leve de humanização do anticorpo murino M23 são IGKV2-40*01 e IGKJ4*01, e os modelos de cadeia pesada de humanização são IGHV1-69*02 e IGHJ6*01.

As sequências das regiões variáveis após a humanização são as seguintes (estão sublinhadas as sequências CDR):

[00142] Enxertado com Hu23VH-CDR: (SEQ ID NO: 27)

EVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSDYEMHWVRQAPGQGLEWMGLIDPETGGTV YNQKFKDRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARERFSYYGSTSDWYFDVWGQG TTVTVSS.

[00143] Enxertado com Hu23VL-CDR: (SEQ ID NO: 28)

DIVMTQTPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLVHSNGNTYLEWYLQKPGQSPQLLIYKVSNR FSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGSHVPYTFGGGTKVEIK.

1.2 Seleção de modelos de humanização e desenho de mutação reversa de anticorpo murino M23 Tabela 5. Mutações reversas de anticorpos murinos M23 humanizados

VL VH Hu23VL1 Enxertado Hu23VH1 Enxertado Hu23VL2 I2G Hu23VH2 G27Y I69L Hu23VH3 G27Y M48I V67T I69L L82F G27Y M48I V67T I69L L82F Hu23VH4 A93T Nota: enxertado significa que as CDRs de anticorpos murinos são implantados nas sequências de região FR germinativa humana. Os resíduos de aminoácidos são determinados e anotados pelo sistema de numeração Kabat, por exemplo I2G significa que o I na posição 2 da numeração Kabat é mutado de volta para G de acordo com o sistema de numeração Kabat.

[00144] As sequências de regiões variáveis das cadeias leve/pesada dos anticorpos humanizados de M23 são as seguintes:

[00145] > Hu23VL1 (igual a enxerto com Hu23VL-CDR): (SEQ ID NO: 28)

[00146] > Hu23VL2 (SEQ ID NO: 29)

DGVMTQTPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLVHSNGNTYLEWYLQKPGQSPQLLIYKVSNR FSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGSHVPYTFGGGTKVEIK.

[00147] > Hu23VH1 (igual a enxerto com Hu23VH-CDR): (SEQ ID NO: 27)

[00148] > Hu23VH2 (SEQ ID NO: 30)

EVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFSDYEMHWVRQAPGQGLEWMGLIDPETGGTV YNQKFKDRVTLTADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARERFSYYGSTSDWYFDVWGQG TTVTVSS.

[00149] > Hu23VH3 (SEQ ID NO: 31)

EVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFSDYEMHWVRQAPGQGLEWIGLIDPETGGTV YNQKFKDRTTLTADKSTSTAYMEFSSLRSEDTAVYYCARERFSYYGSTSDWYFDVWGQG TTVTVSS.

[00150] > Hu23VH4 (SEQ ID NO: 32)

EVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFSDYEMHWVRQAPGQGLEWIGLIDPETGGTV YNQKFKDRTTLTADKSTSTAYMEFSSLRSEDTAVYYCTRERFSYYGSTSDWYFDVWGQG TTVTVSS.

1.3 Combinação de sequência humanizada de anticorpos murinos M23

[00151] Os anticorpos e suas combinações de regiões variáveis obtidos por humanização do anticorpo murino M23 são mostrados na tabela abaixo.

Tabela 6. Combinações de regiões variáveis de anticorpos Hu23 humanizados

VL Hu23VL1 Hu23VL2

VH Hu23VH1 Hu23-1 Hu23-5 Hu23VH2 Hu23-2 Hu23-6 Hu23VH3 Hu23-3 Hu23-7 Hu23VH4 Hu23-4 Hu23-8 Nota: “Hu23-1” se refere a um anticorpo em que a região variável de cadeia leve é Hu23VL1 e a região variável de cadeia pesada é Hu23VH1, e assim por diante.

[00152] As combinações de regiões variáveis de cadeia leve/cadeia pesada de anticorpos (por exemplo Hu23-1) referidas na tabela acima podem ser ligadas com as regiões constantes de cadeia leve/cadeia pesada de anticorpos para formar anticorpos de comprimento total, respectivamente; a menos que exista especificação em contrário na presente descrição, quando se forma um anticorpo de comprimento total,

a região variável de cadeia leve está ligada à região constante de cadeia Kappa mostrada na SEQ ID NO: 73 para formar a cadeia leve de anticorpo, e a região variável de cadeia pesada está ligada à região constante de cadeia pesada

IgG4-AA mostrada na SEQ ID NO: 72 ou à região constante de cadeia pesada IgG4-P mostrada na SEQ ID NO: 79 para formar a cadeia pesada do anticorpo, e o nome na tabela referente à combinação das regiões variáveis de cadeia leve/pesada de anticorpo (por exemplo Hu23-1) mais o sufixo “.IgG4AA”

significa o anticorpo de comprimento total formado por ligadura com a região constante de cadeia pesada IgG4-AA,

mais o sufixo “.IgG4P” significa o anticorpo de comprimento total formado por ligação com a região constante de cadeia pesada IgG4-P, por exemplo, “Hu23-1.IgG4AA” significa o anticorpo de comprimento total formado pela ligação da cadeia pesada, formada pela ligação da região variável de cadeia pesada Hu23VH1 e da região constante da cadeia pesada IgG4-

AA, como mostrado na SEQ ID NO: 72, e da cadeia leve, formada pela ligação da região variável da cadeia leve Hu23VL1 e da região constante de cadeia Kappa, como mostrado na SEQ ID

NO: 73. “Hu23-1.IgG4P” significa o anticorpo de comprimento total formado pela ligação da cadeia pesada, formada pela ligação da região variável de cadeia pesada Hu23VH1 e da região constante de cadeia pesada IgG4-P, como mostrado na SEQ ID NO: 79, e da cadeia leve, formada pela ligação da região variável de cadeia leve Hu23VL1 e da região constante de cadeia Kappa, como mostrado na SEQ ID NO: 73.

2. Humanização do anticorpo murino M32

2.1 Seleção do quadro de humanização do anticorpo murino M32

[00153] Os modelos de cadeia leve de humanização do anticorpo murino M32 são IGKV2-40*01 e IGKJ4*01, e os modelos de cadeia pesada de humanização são IGHV1-69*02 e IGHJ6*01.

As sequências das regiões variáveis humanizadas são as seguintes (estão sublinhadas as sequências CDR):

[00154] Enxertado em Hu32VH-CDR: (SEQ ID NO: 33) IGHV1-69*02 e IGHJ6*01

EVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSDYEIHWVRQAPGQGLEWMGLFDPETGGIV YNQKFKGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAREGYNRDWYFDVWGQGTTVTV SS.

[00155] Enxertado em Hu32VL-CDR: (SEQ ID NO: 34)

DIVMTQTPLSLPVTPGEPASISCRSSQSIVHSNGNTYLEWYLQKPGQSPQLLIYKVSNR FSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGSHVPYAFGGGTKVEIK.

2.2 Seleção de modelo de humanização e desenho de mutação reversa do anticorpo murino M32

[00156] Tabela 7. Mutações reversas de anticorpos humanizados de anticorpos murinos M32

VL VH

Hu32VL1 Enxertado Hu32VH1 Enxertado Hu32VH2 G27F, I69L, A93T Hu32VH3 G26D, G27F, I69L, A93T G27F, M48I, V67A, I69L, L82F, Hu32VH4 A93T Hu32VL2 I2V G26D, G27F, S30T, M48I, V67A, Hu32VH5 I69L, L82F, A93T G26D, G27F, S30T, R38K, Q43H, Hu32VH6 M48I, R66K, V67A, I69L, L82F, A93T Nota: enxertado significa que as CDRs de anticorpos murinos são implantadas nas sequências da região FR germinativa humana. Os resíduos de aminoácidos são determinados e anotados pelo sistema de numeração Kabat, por exemplo I2V significa que o I na posição 2 da numeração Kabat é mutado de volta para V de acordo com o sistema de numeração Kabat.

[00157] As sequências das regiões variáveis de cadeia leve e pesada dos anticorpos humanizados do anticorpo murino M32 são as seguintes:

[00158] > Hu32VL1 (igual a enxertado em Hu32VL-CDR): (SEQ ID NO: 34)

[00159] > Hu32VL2 (SEQ ID NO: 35)

DVVMTQTPLSLPVTPGEPASISCRSSQSIVHSNGNTYLEWYLQKPGQSPQLLIYKVSNR FSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGSHVPYAFGGGTKVEIK.

[00160] > Hu32VH1 (igual a enxertado em Hu23VH-CDR): (SEQ ID NO: 33)

[00161] > Hu32VH2 (SEQ ID NO: 36)

EVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGFTFSDYEIHWVRQAPGQGLEWMGLFDPETGGIV YNQKFKGRVTLTADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCTREGYNRDWYFDVWGQGTTVTV SS.

[00162] > Hu32VH3 (SEQ ID NO: 37)

EVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASDFTFSDYEIHWVRQAPGQGLEWMGLFDPETGGIV YNQKFKGRVTLTADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCTREGYNRDWYFDVWGQGTTVTV SS.

[00163] > Hu32VH4 (SEQ ID NO: 38)

EVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGFTFSDYEIHWVRQAPGQGLEWIGLFDPETGGIV YNQKFKGRATLTADKSTSTAYMEFSSLRSEDTAVYYCTREGYNRDWYFDVWGQGTTVTV SS.

[00164] > Hu32VH5 (SEQ ID NO: 39)

EVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASDFTFTDYEIHWVRQAPGQGLEWIGLFDPETGGIV YNQKFKGRATLTADKSTSTAYMEFSSLRSEDTAVYYCTREGYNRDWYFDVWGQGTTVTV SS.

[00165] > Hu32VH6 (SEQ ID NO: 40)

EVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASDFTFTDYEIHWVKQAPGHGLEWIGLFDPETGGIV YNQKFKGKATLTADKSTSTAYMEFSSLRSEDTAVYYCTREGYNRDWYFDVWGQGTTVTV SS.

2.3 Combinação de sequência humanizada de anticorpo murino M32

[00166] Os anticorpos e suas combinações de regiões variáveis obtidos pela humanização do anticorpo murino M32.

Tabela 8. Combinações de regiões variáveis de cadeia leve/pesada do anticorpo humanizado Hu32

VL Hu32VL1 Hu32VL2

VH Hu32VH1 Hu32-1 Hu32-7 Hu32VH2 Hu32-2 Hu32-8 Hu32VH3 Hu32-3 Hu32-9 Hu32VH4 Hu32-4 Hu32-10 Hu32VH5 Hu32-5 Hu32-11 Hu32VH6 Hu32-6 Hu32-12 Nota: na tabela por exemplo, “Hu32-1” se refere a um anticorpo com a combinação da região variável de cadeia leve de Hu32VL1 do anticorpo e da região variável de cadeia pesada de Hu32VH1, e assim por diante.

[00167] As combinações de regiões variáveis de cadeia leve/pesada de anticorpos (por exemplo Hu32-1) referidas na tabela acima podem ser ligadas com as regiões constantes de cadeia leve/pesada de anticorpos para formar anticorpos de comprimento total, respectivamente; a menos que exista especificação em contrário na presente descrição, ao formar um anticorpo de comprimento total, a região variável de cadeia leve está ligada à região constante de cadeia Kappa mostrada na SEQ ID NO: 73 para formar a cadeia leve de anticorpo, e a região variável de cadeia pesada está ligada à região constante de cadeia pesada de IgG4-AA mostrada na SEQ ID NO: 72 ou à região constante de cadeia pesada IgG4-P mostrada em ID NO: 79 para formar a cadeia pesada do anticorpo, e o nome na tabela referente à combinação das regiões variáveis de cadeia leve/pesada de anticorpos (por exemplo Hu32-1) mais o sufixo “.IgG4AA” significa o anticorpo de comprimento total formado pela ligação com a região constante de cadeia pesada de IgG4-AA, mais o sufixo “.IgG4P” significa o anticorpo de comprimento total formado pela ligação com a região constante de cadeia pesada de IgG4-P, por exemplo, “Hu32-1.IgG4AA” significa o anticorpo de comprimento total formado pela ligação da cadeia pesada, formada pela ligação da região variável de cadeia pesada Hu32VH1 e da região constante de cadeia pesada IgG4-AA, como mostrado na SEQ ID NO: 72, e da cadeia leve, formada pela ligação da região variável de cadeia leve Hu32VL1 e da região constante de cadeia Kappa, como mostrado na SEQ ID NO: 73.

“Hu32-1.IgG4P” significa o anticorpo de comprimento total formado pela ligação da cadeia pesada, formada pela ligação da região variável de cadeia pesada Hu32VH1 e da região constante da cadeia pesada IgG4-P, como mostrado na SEQ ID NO: 79, e da cadeia leve, formada pela ligação da região variável de cadeia leve Hu32VL1 e da região constante de cadeia Kappa, como mostrado na SEQ ID NO: 73.

3. Humanização do anticorpo murino M33 Seleção da estrutura de humanização do anticorpo murino M33

[00168] Os modelos de cadeia leve de humanização do anticorpo murino M33 são IGKV1-39*01 e IGKJ4*01, e os modelos de cadeia pesada de humanização são IGHV3-7 e IGHJ6*01. As sequências das regiões variáveis humanizadas são as seguintes (estão sublinhadas as sequências do CDR):

[00169] Enxertado em Hu33VH-CDR (SEQ ID NO: 41):

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVATISGGGVDTY YQDNVQGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARPYGHGYFDVWGQGTTVTVSS

[00170] Enxertado em Hu33VL-CDR (SEQ ID NO: 42):

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDINNFLNWYQQKPGKAPKLLIYYTSSLHSGVP SRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQGNTLPWTFGGGTKVEIK.

3.2 Seleção de modelos de humanização e desenho de mutação de costas de anticorpos murinos M33 Tabela 9. Mutações reversas de anticorpos humanizados de anticorpo murinos M33

VL VH Hu33VL1 Enxertado Hu33VH1 Enxertado Hu33VL2 F71Y Hu33VH2 R94S Hu33VL3 K42G P44V F71Y Hu33VH3 E1K R94S Nota: enxertado significa que as CDRs de anticorpos murinos são implantadas nas sequências da região FR germinativa humana. Os resíduos de aminoácidos são determinados e anotados pelo sistema de numeração Kabat, por exemplo F71Y significa que F na posição 71 da numeração Kabat é mutado de volta para Y de acordo com o sistema de numeração Kabat.

[00171] As sequências da região variável de cadeia leve e da região variável de cadeia pesada dos anticorpos humanizados de anticorpos murinos M33 são as seguintes:

[00172] > Hu33VL1 (igual a enxertado em Hu33VL-CDR): (SEQ ID NO: 42)

[00173] > Hu33VL2 (SEQ ID NO: 43)

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDINNFLNWYQQKPGKAPKLLIYYTSSLHSGVP SRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFATYYCQQGNTLPWTFGGGTKVEIK.

[00174] > Hu33VL3 (SEQ ID NO: 44)

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDINNFLNWYQQKPGGAVKLLIYYTSSLHSGVP SRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFATYYCQQGNTLPWTFGGGTKVEIK.

[00175] > Hu33VH1 (igual a enxertado em Hu33VH-CDR): (SEQ ID NO: 41)

[00176] > Hu33VH2 (SEQ ID NO: 45)

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVATISGGGVDTY YQDNVQGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCASPYGHGYFDVWGQGTTVTVSS

[00177] > Hu33VH3 (SEQ ID NO: 46)

KVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVATISGGGVDTY YQDNVQGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCASPYGHGYFDVWGQGTTVTVSS

3.3 Combinação de sequências humanizadas de anticorpo murino M33

Tabela 10. Combinações das regiões variáveis de cadeia leve e pesada do anticorpo humanizado

VL Hu33VL1 Hu33VL2 Hu33VL3

VH Hu33VH1 Hu33-1 Hu33-4 Hu33-7 Hu33VH2 Hu33-2 Hu33-5 Hu33-8 Hu33VH3 Hu33-3 Hu33-6 Hu33-9 Nota: na tabela por exemplo, “Hu33-6” se refere a um anticorpo com a combinação da região variável de cadeia leve de anticorpo Hu33VL2 e a região variável de cadeia pesada de Hu33VH3, e assim por diante.

[00178] As combinações de regiões variáveis de cadeia leve/pesada de anticorpos (por exemplo Hu33-6) referidas na tabela acima podem ser ligadas com as regiões constantes de cadeia leve/pesada de anticorpos para formar anticorpos de comprimento total, respectivamente; a menos que exista especificação em contrário na presente descrição, ao formar um anticorpo de comprimento total, a região variável de cadeia leve está ligada à região constante de cadeia Kappa mostrada na SEQ ID NO: 73 para formar a cadeia leve de anticorpo, e a região variável de cadeia pesada está ligada à região constante de cadeia pesada IgG4-AA mostrada na SEQ ID NO: 72 ou à região constante de cadeia pesada IgG4-P mostrada na ID NO: 79 para formar a cadeia pesada de anticorpo, e o nome na tabela referente à combinação da região variável de cadeia leve/pesada do anticorpo (por exemplo Hu33-6) mais o sufixo “.IgG4AA” significa o anticorpo de comprimento total formado pela ligação com a região constante de cadeia pesada IgG4-AA, mais o sufixo “.IgG4P” significa o anticorpo de comprimento total formado pela ligação com a região constante de cadeia pesada IgG4-P, por exemplo, “Hu32-6.IgG4AA” significa o anticorpo de comprimento total formado pela ligação da cadeia pesada, formado pela ligação da região variável de cadeia pesada Hu33VH3 e da região constante de cadeia pesada IgG4-AA, como mostrado na SEQ ID NO: 72, e da cadeia leve, formada pela ligação da região variável de cadeia leve Hu33VL2 e da região constante de cadeia Kappa, como mostrado na SEQ ID NO: 73.

“Hu33-6.IgG4P” significa o anticorpo de comprimento total formado pela ligação da cadeia pesada, formada pela ligação da região variável de cadeia pesada Hu33VH3 e da região constante de cadeia pesada IgG4-P, como mostrado na SEQ ID NO: 79, e da cadeia leve, formada pela ligação da região variável de cadeia leve Hu33VL2 e da região constante de cadeia Kappa, como mostrado na SEQ ID NO: 73.

4. Mutantes de anticorpos humanizados

4.1 Anticorpos mutantes de anticorpo humanizado Hu23

[00179] Através de simulação por computador, os aminoácidos em locais específicos da cadeia leve LCDR1 (SEQ ID NO: 11) do anticorpo humanizado Hu23 foram submetidos a mutações direcionadas ao local, e as mutações específicas são mostradas na Tabela 11: Tabela 11. Sequências mutantes da cadeia leve LCDR1 de Hu23:

Nome Sequência (SEQ ID NO) Hu23LCDR1(N28Q) RSSQSLVHSQGNTYLE (SEQ ID NO: 47) Hu23LCDR1(N28L) RSSQSLVHSLGNTYLE (SEQ ID NO: 48) Hu23LCDR1(N28T) RSSQSLVHSTGNTYLE (SEQ ID NO: 49) Hu23LCDR1(N28D) RSSQSLVHSDGNTYLE (SEQ ID NO: 50) Hu23LCDR1(G29A) RSSQSLVHSNANTYLE (SEQ ID NO: 51) Hu23LCDR1(G29V) RSSQSLVHSNVNTYLE (SEQ ID NO: 52) Nota: Hu23LCDR1 (N28Q) significa a sequência de mutação do LCDR1 na qual N na posição 28 de acordo com os critérios de numeração Kabat da região variável de cadeia leve Hu23VL1 ou Hu23VL2 do anticorpo humanizado Hu23 é mutado para Q, Hu23LCDR1 (G29A) significa a sequência de mutação de LCDR1 na qual G na posição 29 de acordo com os critérios de numeração Kabat da região variável de cadeia leve Hu23VL1 ou Hu23VL2 do anticorpo humanizado Hu23 é mutado para A (as CDRs são determinadas pelo sistema de numeração Kabat).

[00180] As sequências da região variável de cadeia leve do anticorpo humanizado Hu23 após a mutação de LCDR1 são as seguintes:

[00181] > A sequência de Hu23VL1(N28Q) é:

DIVMTQTPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLVHSQGNTYLEWYLQKPGQSPQLLIYKVSNR

FSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGSHVPYTFGGGTKVEIK (SEQ ID NO: 53)

[00182] > A sequência de Hu23VL1(N28L) é:

DIVMTQTPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLVHSLGNTYLEWYLQKPGQSPQLLIYKVSNR

FSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGSHVPYTFGGGTKVEIK (SEQ ID NO: 54)

[00183] > A sequência de Hu23VL1(N28T) é:

DIVMTQTPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLVHSTGNTYLEWYLQKPGQSPQLLIYKVSNR

FSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGSHVPYTFGGGTKVEIK (SEQ ID NO: 55)

[00184] > A sequência de Hu23VL1(N28D) é:

DIVMTQTPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLVHSDGNTYLEWYLQKPGQSPQLLIYKVSNR

FSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGSHVPYTFGGGTKVEIK (SEQ ID NO: 56)

[00185] > A sequência de Hu23VL1(G29A) é:

DIVMTQTPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLVHSNANTYLEWYLQKPGQSPQLLIYKVSNR

FSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGSHVPYTFGGGTKVEIK (SEQ ID NO: 57)

[00186] > A sequência de Hu23VL1(G29V) é:

DIVMTQTPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLVHSNVNTYLEWYLQKPGQSPQLLIYKVSNR

FSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGSHVPYTFGGGTKVEIK (SEQ ID NO: 58)

[00187] > A sequência de Hu23VL2(N28Q) é:

DGVMTQTPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLVHSQGNTYLEWYLQKPGQSPQLLIYKVSNR

FSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGSHVPYTFGGGTKVEIK (SEQ ID NO: 59)

[00188] > A sequência de Hu23VL2(N28L) é:

DGVMTQTPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLVHSLGNTYLEWYLQKPGQSPQLLIYKVSNR

FSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGSHVPYTFGGGTKVEIK (SEQ ID NO: 60)

[00189] > A sequência de Hu23VL2(N28T) é:

DGVMTQTPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLVHSTGNTYLEWYLQKPGQSPQLLIYKVSNR

FSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGSHVPYTFGGGTKVEIK (SEQ ID NO: 61)

[00190] > A sequência de Hu23VL2(N28D) é:

DGVMTQTPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLVHSDGNTYLEWYLQKPGQSPQLLIYKVSNR

FSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGSHVPYTFGGGTKVEIK (SEQ ID NO: 62)

[00191] > A sequência de Hu23VL2(G29A) é:

DGVMTQTPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLVHSNANTYLEWYLQKPGQSPQLLIYKVSNR

FSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGSHVPYTFGGGTKVEIK (SEQ ID NO: 63)

[00192] > A sequência de Hu23VL2(G29V) é:

DGVMTQTPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLVHSNVNTYLEWYLQKPGQSPQLLIYKVSNR

FSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGSHVPYTFGGGTKVEIK (SEQ ID NO: 64) Tabela 12. Combinações das regiões variáveis de cadeia leve e pesada do anticorpo humanizado Hu23

VH Hu23VH1 Hu23VH2 Hu23VH3 Hu23VH4

VL Hu23VL1(N28Q) Hu23-9 Hu23-21 Hu23-33 Hu23-45 Hu23VL1(N28L) Hu23-10 Hu23-22 Hu23-34 Hu23-46 Hu23VL1(N28T) Hu23-11 Hu23-23 Hu23-35 Hu23-47 Hu23VL1(N28D) Hu23-12 Hu23-24 Hu23-36 Hu23-48 Hu23VL1(G29A) Hu23-13 Hu23-25 Hu23-37 Hu23-49 Hu23VL1(G29V) Hu23-14 Hu23-26 Hu23-38 Hu23-50 Hu23VL2(N28Q) Hu23-15 Hu23-27 Hu23-39 Hu23-51 Hu23VL2(N28L) Hu23-16 Hu23-28 Hu23-40 Hu23-52 Hu23VL2(N28T) Hu23-17 Hu23-29 Hu23-41 Hu23-53 Hu23VL2(N28D) Hu23-18 Hu23-30 Hu23-42 Hu23-54 Hu23VL2(G29A) Hu23-19 Hu23-31 Hu23-43 Hu23-55 Hu23VL2(G29V) Hu23-20 Hu23-32 Hu23-44 Hu23-56

Nota: na tabela por exemplo, “Hu23-11” se refere a um anticorpo com a combinação da região variável de cadeia leve de anticorpo Hu23VL1(N28T) e a região variável de cadeia pesada Hu23VH1, e assim por diante.

[00193] As combinações de regiões variáveis de cadeia leve/pesada de anticorpos (por exemplo Hu23-11) referidas na tabela acima podem ser ligadas com as regiões constantes de cadeia leve/pesada de anticorpos para formar anticorpos de comprimento total, respectivamente; a menos que exista especificação em contrário na presente descrição, ao formar um anticorpo de comprimento total, a região variável de cadeia leve está ligada à região constante de cadeia Kappa mostrada na SEQ ID NO: 73 para formar a cadeia leve de anticorpo, e a região variável de cadeia pesada está ligada à região constante de cadeia pesada IgG4-AA mostrada na SEQ ID NO: 72 ou à região constante de cadeia pesada IgG4-P mostrada na SEQ ID NO: 79 para formar a cadeia pesada do anticorpo, e o nome na tabela referente à combinação da região variável de cadeia leve/pesada do anticorpo (por exemplo Hu23-11) mais o sufixo “.IgG4AA” significa o anticorpo de comprimento total formado pela ligação com a região constante de cadeia pesada IgG4-AA, mais o sufixo “.IgG4P” significa o anticorpo de comprimento total formado pela ligação com a região constante de cadeia pesada IgG4- P, por exemplo, “Hu23-11.IgG4AA” significa o anticorpo de comprimento total formado pela ligação da cadeia pesada, formada pela ligação da região variável de cadeia pesada Hu23VH1 e da região constante de cadeia pesada IgG4-AA, como mostrado na SEQ ID NO: 72, e da cadeia leve, formada pela ligação da região variável de cadeia leve Hu23VL1(N28T) e da região constante de cadeia Kappa, como mostrado na SEQ ID NO: 73. “Hu23-11.IgG4P” significa o anticorpo de comprimento total formado pela ligação da cadeia pesada, formada pela ligação da região variável de cadeia pesada Hu23VH1 e da região constante de cadeia pesada IgG4-P, como mostrado na SEQ ID NO: 79, e da cadeia leve, formada pela ligação da região variável de cadeia leve Hu23VL1(N28T) e da região constante de cadeia Kappa, como mostrado na SEQ ID NO: 73.

[00194] Os resultados experimentais mostraram que após mutações do local, os anticorpos humanizados Hu23LCDR1 (N28Q), Hu23LCDR1 (N28L), Hu23LCDR1 (N28T), Hu23LCDR1 (N28D), Hu23LCDR1 (G29A) e Hu23LCDR1 (G29V) mantiveram todos a capacidade de ligação ao PD-1 (Tabela 16).

4.2 Anticorpos mutantes do anticorpo humanizado Hu32

[00195] A série de anticorpos humanizados Hu23 derivados de M23 e a série de anticorpos humanizados Hu32 derivados de M32 tinham elevada identidade de sequência por análise de sequência. A região variável de cadeia leve de Hu23 e a região variável de cadeia pesada de Hu32 foram combinadas em novas combinações de regiões variáveis de cadeia leve e pesada. Os resultados experimentais mostraram que os anticorpos humanizados compreendendo as novas combinações de regiões variáveis de cadeia leve e pesada mantêm a capacidade de ligação ao antígeno PD-1 (Tabela 16).

Tabela 13. Fórmulas gerais das sequências de consenso de regiões variáveis de anticorpos Hu32 e Hu23 Cadeia pesada Cadeia leve HCDR1 DYEX1H, em que X1 é LCDR1 RSSQSX13VHSX14X15X16TYLE selecionado de I ou M; , em que, X13 é (SEQ ID NO: 65) selecionado de I ou L, X14 é selecionado de N, Q, L, T ou D, X15 é selecionado de G, A ou V, e X16 é selecionado de N ou K; (SEQ ID NO: 68) HCDR2 LX2DPETGGX3VYNQKFKX4, em que LCDR2 KVSNRFS; X2 é selecionado de F ou I, (SEQ ID NO: 12) X3 é selecionado de I/T e em que X4 é selecionado de G ou D; (SEQ ID NO: 66) HCDR3 EX5X6X7X8YX9X10X11X12DWYFDV, em LCDR3 FQGSHVPYX17, em que X17 que X5 é selecionado de G ou é selecionado de A ou R, X6 é F ou ausente, X7 é S T; ou ausente, X8 é Y ou (SEQ ID NO: 69) ausente, X9 é G ou ausente, X10 é S ou ausente, X11 é selecionado de N ou T e X12 é selecionado de R ou S; (SEQ ID NO: 67) VH EVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASX18X VL DX29VMTQTPLSLPVTPGEPAS 19TFX20DYEX1HWVX21QAPGX22GLEWX23 ISCRSSQSX13VHSX14X15X16T GLX2DPETGGX3VYNQKFKX4X24X25TX26T YLEWYLQKPGQSPQLLIYKVS ADKSTSTAYMEX27SSLRSEDTAVYYCX28 NRFSGVPDRFSGSGSGTDFTL REX5X6X7X8YX9X10X11X12DWYFDVWGQG KISRVEAEDVGVYYCFQGSHV TTVTVSS, em que, X1 é PYX17FGGGTKVEIK, em selecionado de I ou M, X2 é que, X13 é selecionado selecionado de F ou I, X3 é de I ou L, X14 é selecionado de I/T, X4 é selecionado de N, Q, selecionado de G ou D, X5 é L, T ou D, X15 é selecionado de G ou R, X6 é F selecionado de G, A ou ausente, X7 é S ou ou V, X16 é ausente, X8 é Y ou ausente, selecionado de N ou X9 é G ou ausente, X10 é S ou K, X17 é selecionado ausente, X11 é selecionado de de A ou T e X29 é N ou T, X12 é selecionado de selecionado de I, V R ou S, X18 é selecionado de ou G. G ou D, X19 é selecionado de (SEQ ID NO: 71) G, F ou Y, X20 é selecionado de S ou T, X21 é selecionado de R ou K, X22 é selecionado de Q ou H, X23 é selecionado de M ou I, X24 é selecionado de R ou K, X25 é selecionado de V, A ou T, X26 é selecionado de R ou K, X27 é selecionado de L ou F e X28 é selecionado de A ou T (SEQ ID NO: 70) Tabela 14. Combinações de regiões variáveis de cadeia pesada de Hu32 e regiões variáveis de cadeia leve de Hu23

VH Hu32VH1 Hu32VH2 Hu32VH3 Hu32VH4 Hu32VH5 Hu32VH6

VL Hu32a- Hu32a- Hu32a- Hu32a- Hu32a- Hu32a- Hu23VL1(N28Q) 13 27 41 55 69 83 Hu32a- Hu32a- Hu32a- Hu32a- Hu32a- Hu32a- Hu23VL1(N28L) 14 28 42 56 70 84 Hu32a- Hu32a- Hu32a- Hu32a- Hu32a- Hu32a- Hu23VL1(N28T) 15 29 43 57 71 85 Hu32a- Hu32a- Hu32a- Hu32a- Hu32a- Hu32a- Hu23VL1(N28D) 16 30 44 58 72 86 Hu32a- Hu32a- Hu32a- Hu32a- Hu32a- Hu32a- Hu23VL1(G29A) 17 31 45 59 73 87 Hu32a- Hu32a- Hu32a- Hu32a- Hu32a- Hu32a- Hu23VL1(G29V) 18 32 46 60 74 88 Hu32a- Hu32a- Hu32a- Hu32a- Hu32a- Hu32a- Hu23VL2(N28Q) 19 33 47 61 75 89 Hu32a- Hu32a- Hu32a- Hu32a- Hu32a- Hu32a- Hu23VL2(N28L) 20 34 48 62 76 90 Hu32a- Hu32a- Hu32a- Hu32a- Hu32a- Hu32a- Hu23VL2(N28T) 21 35 49 63 77 91 Hu32a- Hu32a- Hu32a- Hu32a- Hu32a- Hu32a- Hu23VL2(N28D) 22 36 50 64 78 92 Hu32a- Hu32a- Hu32a- Hu32a- Hu32a- Hu32a- Hu23VL2(G29A) 23 37 51 65 79 93 Hu32a- Hu32a- Hu32a- Hu32a- Hu32a- Hu32a- Hu23VL2(G29V) 24 38 52 66 80 94 Hu32a- Hu32a- Hu32a- Hu32a- Hu32a- Hu32a- Hu23VL1 25 39 53 67 81 95 Hu32a- Hu32a- Hu32a- Hu32a- Hu32a- Hu32a- Hu23VL2 26 40 54 68 82 96 Nota: na tabela por exemplo, “Hu32a-85” se refere a um anticorpo com região variável de cadeia leve de anticorpo de Hu23VL1(N28T) e região variável de cadeia pesada de Hu32VH6, e assim por diante.

[00196] As combinações de regiões variáveis de cadeia leve/pesada do anticorpo (por exemplo Hu32a-85) referidas na tabela acima podem ser ligadas com as regiões constantes de cadeia leve/pesada do anticorpo para formar anticorpos de comprimento total, respectivamente; a menos que exista especificação em contrário na presente descrição, ao formar um anticorpo de comprimento total, a região variável de cadeia leve está ligada à região constante de cadeia Kappa mostrada na SEQ ID NO: 73 para formar a cadeia leve do anticorpo, e a região variável de cadeia pesada está ligada à região constante de cadeia pesada IgG4-AA mostrada na SEQ

ID NO: 72 ou à região constante de cadeia pesada IgG4-P mostrada na SEQ ID NO: 79 para formar a cadeia pesada do anticorpo, e o nome na tabela referente à combinação das regiões variáveis de cadeia leve/pesada do anticorpo (por exemplo Hu32a-85) mais o sufixo “.IgG4AA” significa o anticorpo de comprimento total formado pela ligação com a região constante de cadeia pesada IgG4-AA, mais o sufixo

“.IgG4P” significa o anticorpo de comprimento total formado pela ligação com a região constante de cadeia pesada IgG4-

P, por exemplo, “Hu32a-85.IgG4AA” significa o anticorpo de comprimento total formado pela ligação da cadeia pesada,

formada pela ligação da região variável de cadeia pesada

Hu32VH6 e da região constante de cadeia pesada IgG4-AA, como mostrado na SEQ ID NO: 72, e da cadeia leve, formada pela ligação da região variável de cadeia leve Hu23VL1(N28T) e da região constante de cadeia Kappa, como mostrado na SEQ ID

NO: 73. “Hu32a-85.IgG4P” significa o anticorpo de comprimento total formado pela ligação da cadeia pesada, formada pela ligação da região variável de cadeia pesada Hu32VH6 e da região constante de cadeia pesada IgG4-P, como mostrado na SEQ ID NO: 79, e da cadeia leve, formada pela ligação da região variável de cadeia leve Hu23VL1(N28T) e da região constante de cadeia Kappa, como mostrado na SEQ ID NO: 73.

Tabela 15. Combinações de regiões variáveis de cadeia pesada Hu23 e de regiões variáveis de cadeia leve Hu32

VH Hu23VH1 Hu23VH2 Hu23VH3

VL Hu32VL1 Hu23a-57 Hu23a-59 Hu23a-61 Hu32VL2 Hu23a-58 Hu23a-60 Hu23a-62 Nota: na tabela por exemplo, “Hu23a-57” se refere a um anticorpo com a combinação da região variável de cadeia leve do anticorpo Hu32VL1 e a região variável de cadeia pesada de Hu23VH1, e assim por diante.

[00197] As combinações de regiões variáveis de cadeia leve/pesada do anticorpo (por exemplo Hu23a-57) referidas na tabela acima podem ser ligadas com as regiões constantes de cadeia leve/pesada do anticorpo para formar anticorpos de comprimento total, respectivamente; a menos que exista especificação em contrário na presente descrição, ao formar um anticorpo de comprimento total, a região variável de cadeia leve está ligada à região constante de cadeia Kappa mostrada na SEQ ID NO: 73 para formar a cadeia leve do anticorpo, e a região variável de cadeia pesada está ligada à região constante de cadeia pesada IgG4-AA mostrada na SEQ ID NO: 72 ou à região constante de cadeia pesada IgG4-P mostrada na SEQ ID NO: 79 para formar a cadeia pesada do anticorpo, e o nome na tabela referente à combinação das regiões variáveis de cadeia leve/pesada do anticorpo (por exemplo Hu32a-85) mais o sufixo “.IgG4AA” significa o anticorpo de comprimento total formado pela ligação com a região constante de cadeia pesada IgG4-AA, mais o sufixo “.IgG4P” significa o anticorpo de comprimento total formado pela ligação com a região constante de cadeia pesada IgG4- P, por exemplo, “Hu23a-57.IgG4AA” significa o anticorpo de comprimento total formado pela ligação da cadeia pesada, formada pela ligação da região variável de cadeia pesada Hu23VH1 e da região constante de cadeia pesada IgG4-AA, como mostrado na SEQ ID NO: 72, e da cadeia leve, formada pela ligação da região variável de cadeia leve Hu32VL1 e da região constante de cadeia Kappa, como mostrado na SEQ ID NO: 73.

“Hu23a-57.IgG4P” significa o anticorpo de comprimento total formado pela ligação da cadeia pesada, formada pela ligação da região variável de cadeia pesada Hu23VH1 e da região constante de cadeia pesada IgG4-P, como mostrado na SEQ ID NO: 79, e a cadeia leve, formada pela ligação da região variável de cadeia leve Hu32VL1 e da região constante de cadeia Kappa, como mostrado na SEQ ID NO: 73.

5. Rastreio de anticorpos humanizados

[00198] A detecção de afinidade de diferentes anticorpos humanizados foi realizada por Biacore (ver Exemplo de Teste 3 para o método) e os resultados são mostrados na Tabela 16. Os resultados mostraram que diferentes anticorpos humanizados mantêm a capacidade de ligação ao PD-1, e alguns anticorpos humanizados têm afinidade mesmo substancialmente próxima àquela dos seus anticorpos murinos.

Tabela 16. Afinidade de anticorpo humanizado Hu23 com PD-1 humano Anticorpo ka (1/Ms) kd (1/s) KD (M) M23 4.57E+04 1.32E-04 2.89E-09 Hu23-1.IgG4AA 3.43E+04 1.10E-04 3.20E-09 Hu23-5.IgG4AA 2.99E+04 1.14E-04 3.82E-09 Hu23-2.IgG4AA 2.74E+04 1.61E-04 5.86E-09 Hu23-6.IgG4AA 2.79E+04 1.55E-04 5.57E-09 Hu23-3.IgG4AA 2.93E+04 1.60E-04 5.46E-09 Hu23-7.IgG4AA 2.77E+04 1.66E-04 5.97E-09 Hu23-4.IgG4AA 4.24E+04 1.44E-04 3.39E-09 Hu23-8.IgG4AA 4.11E+04 1.47E-04 3.56E-09 Hu23-9.IgG4AA 6.16E+04 1.32E-04 2.15E-09 Hu23-10.IgG4AA 5.51E+04 1.53E-04 2.77E-09 Hu23-11.IgG4AA 4.22E+04 1.14E-04 2.71E-09 Hu23-12.IgG4AA 5.45E+04 1.10E-04 2.02E-09 Hu23-13.IgG4AA 4.24E+04 1.22E-04 2.88E-09 Hu23-14.IgG4AA 7.23E+04 1.61E-04 2.22E-09 M32 7.83E+04 4.15E-04 5.3E-09 Hu32a-15.IgG4AA 4.89E+04 2.52E-03 5.14E-08 Hu32a-29.IgG4AA 7.89E+04 6.20E-04 7.86E-09 Hu32a-43.IgG4AA 8.39E+04 6.85E-04 8.16E-09 Hu32a-57.IgG4AA 7.94E+04 6.24E-04 7.85E-09 Hu32a-71.IgG4AA 8.60E+04 3.96E-04 4.61E-09 Hu32a-85.IgG4AA 9.90E+04 3.15E-04 3.18E-09 M33 3.08E+05 2.27E-04 7.37E-10 Hu33-1.IgG4AA 6.61E+04 1.28E-03 1.93E-08 Hu33-4.IgG4AA 8.11E+04 2.55E-03 3.14E-08 Hu33-7.IgG4AA 7.69E+04 2.60E-03 3.38E-08

Hu33-2.IgG4AA 1.35E+05 1.43E-04 1.06E-09 Hu33-5.IgG4AA 1.46E+05 1.35E-04 9.26E-10 Hu33-8.IgG4AA 1.53E+05 1.62E-04 1.06E-09 Hu33-3.IgG4AA 1.25E+05 1.36E-04 1.09E-09 Hu33-6.IgG4AA 1.30E+05 1.40E-04 1.08E-09 Hu33-9.IgG4AA 1.40E+05 1.53E-04 1.09E-09 Exemplo 3. Construção e expressão de anticorpos humanizados PD-1

[00199] Cada fragmento de gene VH/VK de anticorpo humanizado foi construído com os iniciadores concebidos por PCR, e depois foi usado para construir anticorpos de comprimento total expressando o vetor VH-CH1-Fc-pHr/VK-CL- pHr por recombinação homóloga com o vetor de expressão pHr (com peptídeo de sinal e fragmento de gene (CH1-Fc/CL) de região constante). IgG4-P representa a mutação S228P (correspondente à posição 108 da SEQ ID NO: 72 ou SEQ ID NO: 79), e IgG4-AA representa a mutação F234A (correspondente à posição 114 da sequência SEQ ID NO: 72 ou SEQ ID NO: 79), L235A (correspondente à posição 115 da SEQ ID NO: 72 ou SEQ ID NO: 79) e S228P (correspondente à posição 108 da SEQ ID NO: 72 ou SEQ ID NO: 79). Os formatos de anticorpo IgG4-AA e IgG4-P podem ser obtidos por mutações de ponto simples no formato de anticorpo IgG4.

[00200] A sequência da região constante de cadeia pesada de IgG4-AA é a seguinte (SEQ ID NO: 72):

ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQS SGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEAAGGP SVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFN STYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQE EMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKS RWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK.

[00201] A sequência da região constante de cadeia leve (cadeia Kappa) do anticorpo é a seguinte (SEQ ID NO: 73):

RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQ DSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC.

[00202] As sequências de anticorpo de comprimento total da forma IgG4AA construídas são exemplificadas como se segue

[00203] Cadeia pesada do anticorpo Hu23-11.IgG4AA (SEQ ID NO: 74):

EVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSDYEMHWVRQAPGQGLEWMGLIDPETGGTV YNQKFKDRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARERFSYYGSTSDWYFDVWGQG TTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHT FPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPA PEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTK PREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVY TLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYS RLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK.

[00204] Cadeia leve Hu23-11.IgG4AA (SEQ ID NO: 75):

DIVMTQTPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLVHSTGNTYLEWYLQKPGQSPQLLIYKVSNR FSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGSHVPYTFGGGTKVEIKRTVAAP SVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDST YSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC.

[00205] Cadeia pesada Hu32a-85.IgG4AA (SEQ ID NO: 76):

EVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASDFTFTDYEIHWVKQAPGHGLEWIGLFDPETGGIV YNQKFKGKATLTADKSTSTAYMEFSSLRSEDTAVYYCTREGYNRDWYFDVWGQGTTVTV SSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVL QSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEAAG GPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQ FNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPS QEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVD KSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK.

[00206] Cadeia leve Hu32a-85.IgG4AA (igual à cadeia leve de Hu23-11.IgG4AA, SEQ ID NO: 75):

[00207] Cadeia pesada Hu33-6.IgG4AA (SEQ ID NO: 77):

KVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVATISGGGVDTY YQDNVQGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCASPYGHGYFDVWGQGTTVTVSS ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQS SGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEAAGGP SVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFN STYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQE EMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKS RWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK.

[00208] Cadeia leve Hu33-6.IgG4AA (SEQ ID NO: 78):

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDINNFLNWYQQKPGKAPKLLIYYTSSLHSGVP SRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFATYYCQQGNTLPWTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIF PPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSS TLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC.

[00209] A sequência da região constante de cadeia pesada de IgG4-P é a seguinte (SEQ ID NO: 79):

ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQS SGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGP SVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFN STYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQE EMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKS RWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK.

[00210] As sequências de anticorpo de comprimento total da forma IgG4-P construídas são exemplificadas como se segue:

[00211] Cadeia pesada do anticorpo Hu23-11.IgG4P (SEQ ID NO: 80):

EVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSDYEMHWVRQAPGQGLEWMGLIDPETGGTV YNQKFKDRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARERFSYYGSTSDWYFDVWGQG TTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHT FPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPA PEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTK PREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVY TLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYS RLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK.

[00212] Cadeia leve Hu23-11.IgG4P (igual à cadeia leve de Hu23-11.IgG4AA, SEQ ID NO: 75):

[00213] Cadeia pesada Hu32a-85.IgG4P (SEQ ID NO: 81):

EVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASDFTFTDYEIHWVKQAPGHGLEWIGLFDPETGGIV YNQKFKGKATLTADKSTSTAYMEFSSLRSEDTAVYYCTREGYNRDWYFDVWGQGTTVTV SSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVL QSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLG GPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQ FNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPS QEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVD KSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK.

[00214] Cadeia leve Hu32a-85.IgG4P (igual à cadeia leve de Hu23-11.IgG4AA, SEQ ID NO: 75):

[00215] Cadeia pesada Hu33-6.IgG4P (SEQ ID NO: 82):

KVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVATISGGGVDTY YQDNVQGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCASPYGHGYFDVWGQGTTVTVSS ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQS SGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGP SVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFN STYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQE EMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKS RWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK.

[00216] Cadeia leve Hu33-6.IgG4P (igual à cadeia leve de Hu33-6.IgG4AA, SEQ ID NO: 78):

Exemplos de Teste Exemplo de Teste 1. Experimento ELISA de anticorpos anti- PD-1 se ligando ao ligante PD-1 e bloqueio de ligação in vitro

[00217] O PD-L1 na superfície das células tumorais se liga ao PD-1 na superfície das células T, inibindo assim a proliferação de células T. Os anticorpos PD-1 podem bloquear a via de sinalização PD-L1/PD-1 se ligando ao PD-1, estimulando assim a proliferação de células T. O experimento de bloqueio de ligação PD-1/PD-L1 foi usado para detectar a atividade de bloqueio dos anticorpos anti-PD-1 na via de sinalização.

[00218] Nesse experimento, após o revestimento da proteína PD-1-His (nº de catálogo 10377H08H, Sino Biological) em placas de 96 poços, os anticorpos anti-PD-1 sendo testados (incluindo os anticorpos: Hu23-11.IgG4AA, Hu32a-85.IgG4AA e Hu33-6.IgG4AA, anticorpo de controle positivo: H005-1 (ver anticorpo H005-1 na WO2015085847)) foram adicionados separadamente e a reação foi incubada; mais tarde, foi adicionado e incubado o anticorpo IgG (H+L) anti-humano de cabra marcado com HRP (nº de catálogo 109- 035-003, Jackson ImmunoResearch). Após a lavagem das placas, foram detectadas as quantidades de ligação de IgG (H+L) anti- humano de cabra marcado com HRP, e foram calculados os valores de EC50 da ligação de anticorpos anti-PD-1 ao ligante PD-1.

[00219] Nesse experimento, após o revestimento da proteína PD-1 fundida com Fc na região extracelular (PD-1- Fc, ver SEQ ID NO: 1 para a sequência) em placas de 96 poços, os anticorpos anti-PD-1 sendo testados (incluindo os anticorpos: Hu23-11.IgG4AA, Hu32a-85.IgG4AA e Hu33-6.IgG4AA, anticorpo de controle positivo: H005-1 (ver anticorpo H005- 1 na WO2015085847)) foram adicionados separadamente e incubados; mais tarde, foi adicionado e incubado PD-L1/PD- L2 marcado com biotina. Após a lavagem das placas, foram detectadas as quantidades de ligação do PD-L1/PD-L2 marcado com biotina, e foram calculados os valores IC50 de anticorpos anti-PD-1 para bloquear a ligação do ligante ao PD-L1/PD-

L2.O tampão CB pH 9,6 (1,59 g Na2CO3 e 2,93 g NaHCO3 dissolvidos em 1 L de água destilada) foi usado para diluir

PD-1-Fc até 1 µg/ml, que foi adicionado às placas de 96 poços a um volume de 100 µl/poço e deixado a 4°C por 16 h-20 h.

O tampão PBS foi aspirado das placas de 96 poços, e as placas foram lavadas uma vez com tampão PBST (PBS a pH 7,4 contendo

0,05% tween20). Foi adicionado 120 µl/poço PBST/1% de leite e foi incubado em temperatura ambiente por 1 h para o bloqueio.

A solução de bloqueio foi removida e as placas foram lavadas com tampão PBST uma vez.

Foi adicionado 90 µl de anticorpo anti-PD-1 sendo testado diluído à concentração apropriada com o diluente da amostra (PBS a pH 7,4 contendo

5% BSA, 0,05% Tween20) e foi pré-incubado a 4°C por 1 h.

Foi adicionado 10x a concentração de PD-L1/PD-L2 (Beijing Sino

Biological Co., Ltd.) (10 μg/ml) a um volume de 10 μl/poço,

agitado e misturado bem em um agitador, e depois incubado a

37°C por 1 h.

O sistema de reação foi removido e as placas foram lavadas com PBST 6 vezes.

Foi adicionado 100 μl/poço de polímero de estreptavidina-peroxidase 1:400 diluído com tampão PBST e foi incubado com agitação em temperatura ambiente por 50 min.

As placas foram lavadas com PBST 6 vezes.

Foi adicionado 100 μl/poço de TMB e foi incubado em temperatura ambiente por 5-10 min. Foi adicionado 100 µl/poço de H2SO4 a 1 M para parar a reação. Os valores de absorvência a 450 nm foram lidos usando um leitor de microplacas e os valores IC50 dos anticorpos anti-PD-1 para bloquear a ligação do ligante ao PD-L1/PD-L2 foram calculados. Os dados são mostrados na Tabela 17 abaixo em detalhe.

Tabela 17. ELISA dos anticorpos anti-PD-1 da presente descrição para ligar ao PD-1 e bloquear a ligação do ligante ao PD-L1/PD-L2 Bloqueio de ligação de Ligação ao antígeno PD-1 e PD-L1/PD-L2 Hu PD-1- hu PD-1- Anticorpo Hu PD-1-Fc/ Fc/ his OD hu PD-1-his PD-L1 IC50 PD-L2 valor EC50 (ng/ml) (ng/ml) IC50(ng/ml

MAX ) Hu23-11.IgG4AA 1.46 237.3 92.35 245.1 Hu32a-85.IgG4AA 1.265 135.9 78.63 205.9 Hu33-6.IgG4AA 1.706 205.6 103.5 207.2 H005-1 1.21 113.1 109.6 225.3

[00220] Os anticorpos exemplificativos anti-PD-1 Hu23-11.IgG4AA, Hu32a-85.IgG4AA e Hu33-6.IgG4AA da presente descrição podem todos bloquear eficazmente a ligação de PD- 1 a PD-L1/PD-L2, e sua atividade de bloqueio é similar à do anticorpo de controle positivo.

Exemplo de Teste 2. Teste de bloqueio de ligante de anticorpos exemplificativos

[00221] Foi estudado o efeito de bloqueio dos anticorpos na ligação do PD-1 e PD-L1. O processo experimental é descrito resumidamente como se segue:

[00222] Células CHOK1/PD-L1 (Promega) foram digeridas, adicionadas a placas de 96 poços a 100 μL/poço e colocadas em uma incubadora a 37°C, 5% CO2 para incubação por 24 h. O controle e as amostras foram diluídas a concentrações desejadas usando PBS. Células Jurkat/PD-1 (células Jurkat transfectadas estavelmente com PD-1) foram contadas e semeadas em uma certa proporção (90 μL/poço) em placas de cultura de células com células CHOK1/PD-L1, e 10 μL/poço de anticorpo diluídos (anticorpo: Hu23-11.IgG4AA, Hu32a-85.IgG4AA e Hu33-6.IgG4AA, anticorpo de controle positivo: H005-1, controle negativo: proteína IgG4, concentração de diluição do gradiente de anticorpo: 0,3 mg/ml, 3 mg/ml, 30 mg/ml) foram adicionados e colocados em uma incubadora a 37°C, 5% de CO2 para incubação por 5 h. As placas de cultura de células foram retiradas e colocadas em temperatura ambiente por 5 min. Depois foi adicionado 50 μl Reagente Bio-GloTM a cada poço e foi incubado em temperatura ambiente por 5 min antes da leitura da placa. Os resultados experimentais são mostrados na Figura 1.

[00223] Os resultados mostraram que os anticorpos exemplificativos anti-PD-1 Hu23-11.IgG4AA, Hu32a-85.IgG4AA e Hu33-6.IgG4AA na presente descrição podem bloquear eficazmente a ligação de PD-1 e PD-L1.

Exemplo de Teste 3. Experimento de afinidade de anticorpo BIAcore de anticorpos de anticorpos exemplificativos

[00224] O IgG foi capturado por afinidade usando um chip biossensor de Proteína A (nº de catálogo 29127556, GE).

O antígeno PD-1 humano (nº de catálogo 10377H08H, Sino Biological) e o antígeno Cyno PD-1 (comprado à Sino Biological) fluíram através da superfície do chip, e as curvas de ligação e dissociação foram obtidas através da detecção em tempo real de sinais de reação de anticorpos PD- 1 e do antígeno PD-1 por um instrumento Biacore T200. Após a conclusão da dissociação de cada ciclo experimental, o chip biossensor foi lavado e regenerado com tampão Glicina- HCl a 10 mM, pH 1,5. O sistema tampão experimental foi a solução de tampão 1xHBS-EP (nº de catálogo BR-1001-88, GE).

Após o experimento, o software GE Biacore T200 Evaluation versão 3.0 foi usado para ajustar os dados com um modelo Langmuir (1:1), e o valor de afinidade foi obtido. Os resultados são mostrados na Tabela 18.

Tabela 18. Afinidade dos anticorpos anti-PD-1 ao PD1 humano e ao PD-1 símio Anticorpo Antígeno ka (1/Ms) kd (1/s) KD (M) hPD-1-His 6.06E+04 1.13E-04 1.86E-09 Hu23-11.IgG4AA Cyno PD-1 4.79E+04 1.26E-04 2.62E-09 hPD-1-His 8.56E+04 2.78E-04 3.25E-09 Hu32a-85.IgG4AA Cyno PD-1 1.16E+05 4.75E-04 4.11E-09 hPD-1-His 1.24E+05 1.14E-04 9.18E-10 Hu33-6.IgG4AA Cyno PD-1 2.51E+05 2.41E-04 9.60E-10

[00225] Os resultados mostraram que os anticorpos anti-PD-1 exemplificativos, Hu23-11.IgG4AA, Hu32a-85.IgG4AA e Hu33-6.IgG4AA da presente descrição podem todos se ligar ao PD-1 humano e ao PD-1 símio.

Exemplo de Teste 4. O efeito de anticorpos na secreção de IFNγ pelas células no experimento de ativação de linfócitos

T PBMC

[00226] A fim de estudar o efeito dos anticorpos anti- PD-1 na função dos linfócitos T primários humanos, foram recolhidas e purificadas células mononucleares do sangue periférico humano (PBMC), estimuladas com tuberculina (TB) por 5 dias, e foi detectado o nível de secreção de citocinas IFNγ. O processo experimental é descrito resumidamente como se segue:

[00227] As PBMCs foram obtidas a partir de sangue novo usando Ficoll-Hypaque (17-5442-02, GE) para centrifugação de gradiente de densidade (Stem Cell Technologies), cultivadas em meio RPMI 1640 (SH30809.01, GE) suplementado com 10% (v/v) FBS (10099-141, Gibco) a 37°C e 5% CO2.

[00228] As PBMC recentemente isoladas e purificadas foram ajustadas a uma densidade de 2x106 células/ml com o meio RPMI 1640. 40 μl de tuberculina (97-8800, Synbiotics) foi adicionada a 20 mL de suspensão celular e cultivada em uma incubadora a 37°C, 5% de CO2 por 5 dias. No quinto dia, as células cultivadas supracitadas foram recolhidas por centrifugação, ressuspensas em meio RPMI 1640 novo,

ajustadas a uma densidade de 1,1x106 células/ml, e semeadas em placas de cultura de células de 96 poços a 90 µl por poço.

Ao mesmo tempo foram adicionadas amostras de anticorpos (incluindo os anticorpos da presente descrição: Hu23-

11.IgG4AA, Hu32a-85.IgG4AA e Hu33-6.IgG4AA, anticorpo de controle positivo H005-1, e proteína IgG4 de controle negativo, concentração de diluição de gradiente do anticorpo 0,3 mg/ml, 3 mg/ml e 30 mg/ml), diluído com PBS (B320, Shanghai BasalMedia Technologies Co., Ltd.), 10μl/poço. As placas de cultura de células foram colocadas em uma incubadora a 37°C, 5% de CO2 para incubação por 3 dias. As placas de cultura de células foram retiradas e o sobrenadante de cultura de células foi recolhido por centrifugação (4000 rpm, 10 min). Os níveis de IFN-γ foram detectados pelo método ELISA (kit de detecção de IFN-γ humano (EHC102g.96, Neobioscience)). Foi feita referência às instruções dos reagentes para operações específicas.

[00229] Os resultados dos testes são mostrados na Figura 2. Os resultados mostraram que os anticorpos anti-PD- 1 Hu23-11.IgG4AA, Hu32a-85.IgG4AA e Hu33-6.IgG4AA da presente descrição podem todos ativar eficazmente a secreção de IFN-γ.

Exemplo de Teste 5. O efeito de anticorpos anti-PD-1 no modelo de câncer do cólon MC38 em ratos PD-1 transgénicos

[00230] As células MC38 foram inoculadas a 5x105 células/rato/100 μl em 90 ratos TG hPD-1 (Biocytogen) por via subcutânea nas costelas direitas. Após 10 dias, animais com tumores demasiado grandes ou demasiado pequenos foram excluídos. Com base no volume médio do tumor de cerca de 120 mm3, os ratos foram divididos aleatoriamente em: veículo de controle em branco (PBS), o controle positivo H005-1 3 mpk, Hu32a-85.IgG4AA 1 mpk, Hu32a-85.IgG4AA 3 mpk, Hu23-11.IgG4AA 1 mpk, Hu23-11.IgG4AA 3 mpk e Hu33-6.IgG4AA 3 mpk, um total de 7 grupos, cada um com 8 animais. O anticorpo de cada grupo foi injetado intraperitonealmente três vezes por semana, a partir do dia 0. Após a primeira semana de administração, foi verificado que os tumores estavam significativamente inibidos. Nas segunda e terceira semanas, a frequência de administração foi ajustada para uma vez por semana para um total de 5 administrações. O volume do tumor e o peso dos animais foram monitorizados duas vezes por semana e os dados foram registrados. Quando o volume do tumor excedeu 2000 mm3 ou a maioria dos tumores apareceu ulcerada ou o peso corporal foi reduzido em 20%, os animais portadores do tumor foram submetidos a eutanásia como o ponto final do experimento.

Volume do tumor (TV) = 1/2 x Llongo x Lcurto2 Taxa de crescimento do tumor (T/C%) = (T-T0)/(C-C0) x 100% Taxa de inibição do crescimento do tumor (TGI%) = 1- T/C%

[00231] Em que T e T0 representam os volumes dos tumores no final do teste e no início do teste no grupo de administração de anticorpos, respectivamente, e C e C0 representam os volumes dos tumores no final do teste e o início do teste no grupo de controle em branco, respectivamente.

[00232] Os resultados do teste são mostrados na Tabela 19 e na Figura 3. Os resultados do teste mostraram que, em comparação com o controle em branco, os anticorpos da presente descrição podem todos inibir significativamente o crescimento de tumores de xenoenxerto MC38 de câncer do cólon no rato. Entre eles, o grupo Hu32a-85.IgG4AA-3 mpk teve a maior taxa de inibição de tumor, e a taxa de inibição de tumor foi de 77,64% na última medição. Quando a frequência de doseamento foi três vezes por semana para 3 administrações, na medição no sétimo dia, os resultados mostraram que as taxas de inibição de tumor dos anticorpos da presente descrição foram todas significativamente melhores do que a do anticorpo de controle positivo H005-1; depois disso, a frequência de doseamento foi reduzida para uma vez por semana, após duas administrações (dia 21), a diferença na eficácia dos anticorpos da presente descrição aumentou gradualmente, e mostrou uma forma dependente da dose, entre os quais Hu32a-85.IgG4AA foi significativamente melhor que a mesma dose de H005-1 (p < 0,05). Além disso, os ratos portadores de tumor podem tolerar bem todos os anticorpos anti-PD-1, com o peso corporal a aumentar constantemente durante todo o processo de administração, e não ocorreu nenhuma perda de peso corporal óbvia induzida pelo fármaco nem outros sintomas.

Tabela 19. O efeito dos anticorpos anti-PD-1 na taxa de inibição do crescimento de tumor do câncer do cólon do rato MC38 (mm3) H005- Hu33- Dias após a Hu32a-85.IgG4AA Hu23-11.IgG4AA 1 6.IgG4AA primeira administração 3mpk 1mpk 3mpk 1mpk 3mpk 3mpk

46.82 21 % 67.12% 77.64% 45.12% 75.32% 59.31% Exemplo de teste 6. O efeito dos anticorpos anti-PD-1 no modelo de câncer do cólon MC38 em ratos transgénicos PD-1

[00233] Os ratos transgénicos PD-1 foram comprados à ISIS INNOVATION LIMITED, University Offices, Wellington Square, Oxford OX1 2JD, Inglaterra, e criados na Cephrim Biosciences, Inc. para obter a quinta geração de ratos. As células MC38 foram inoculadas a 5x105 células/100 μl/animal em ratos transgénicos hPD-1 (metade fêmeas e metade machos) por via subcutânea nas costelas posteriores direitas. Quando o volume médio do tumor dos ratos atingiu entre 80-100 mm3, foram excluídos os animais com peso corporal ou tumores demasiado grandes ou demasiado pequenos. De acordo com o volume do tumor, os ratos portadores do tumor foram divididos aleatoriamente em 5 grupos (cada um com 8 animais): o controle negativo hIgG 30 mpk, H005-1 10 mpk, H005-1 30 mpk, Hu33-6.IgG4AA 10 mpk e Hu33-6.IgG4AA 30 mpk. A data de agrupamento e administração foi fixada para o Dia 0. Após o agrupamento, cada fármaco foi administrado intraperitonealmente por um período de 22 dias, uma vez a cada dois dias, por um total de 11 vezes. O volume do tumor foi medido 2 vezes por semana, o peso corporal foi medido, e os dados foram registrados. O peso corporal do animal e o volume do tumor de cada grupo foram todos apresentados como média ± desvio padrão (Média ± SEM), e foram usados os softwares Graphpad Prism 5 e Excel para gráficos, e o teste t de Student foi usado para análise estatística.

Volume do tumor (TV) = 0,5236 x Llongo x Lcurto2 Taxa de crescimento do tumor T/C% = (T-T0)/(C-C0) x 100% Taxa de inibição do crescimento do tumor %TGI = 1- T/C %

[00234] Em que T e T0 representam os volumes dos tumores no final do teste e no início do teste no grupo de administração de anticorpo, respectivamente, e C e C0 representam os volumes dos tumores no final do teste e no início do teste no grupo de controle em branco, respectivamente.

[00235] Os resultados do teste são mostrados na Tabela 20 e na Figura 4. Os resultados dos testes mostraram que, em comparação com o grupo de controle, os anticorpos da presente descrição podem inibir significativamente o crescimento de tumores de xenoenxerto do câncer do cólon de rato MC38. Entre eles, o grupo Hu33-6.IgG4AA-30 mpk tem a maior taxa de inibição de tumor, e a taxa de inibição de tumor é de 80,4% no Dia 20. No grupo de dose baixa (10 mpk), a eficácia de Hu33-6.IgG4AA-10 mpk é melhor que a do controle positivo H005-1-10 mpk.

Tabela 20. O efeito dos anticorpos anti-PD-1 no volume de tumor do câncer do cólon do rato MC38 Dias após a Grupo de Grupo Grupo Grupo Hu33- Grupo Hu33- primeira controle H005-1 H005-1 6.IgG4AA 10 6.IgG4AA 30 administração hIgG 10 mpk 30 mpk mpk mpk 0 96.2 96.1 95.3 94.7 94.5 20 1797.2 794.0 434.9 550.1 352.8 23 1034.2 534.1 632.4 387.6 Nota: a unidade do volume médio do tumor de cada grupo na tabela é: mm3.

Exemplo de teste 7. Teste farmacocinético de anticorpos anti- PD-1 em macacos cinomolgo

[00236] Os macacos cinomolgo usados no experimento eram 6 machos, 2-5 anos, 2-5 kg, adquiridos à Guangdong Frontier Biotechnology Co., Ltd., número de licença: SCXK (Guangdong) 2015-0037, número do certificado animal:

44613900000219.

[00237] Ambiente de alojamento: a temperatura ambiente foi controlada a 18°C-26°C, a umidade relativa foi de 40%-70%, e a iluminação foi alternadamente de luz e escuridão de 12 h. Os ratos tiveram livre acesso a comida e água, exceto no caso de ser necessário jejum.

[00238] Os animais foram pesados antes da administração, e o peso corporal estava entre 2,81 e 3,52 kg. A administração foi realizada usando uma bomba de injeção para infusão intravenosa subcutânea nos membros anteriores ou posteriores. A dose de cada grupo foi em todos 1 mg/kg (1 mpk), administrada por uma única injeção intravenosa a uma taxa de 0,1 mL/kg/min por um período de administração de cerca de 30 min. Antes da administração e 5 min, 0,25 h, 0,5 h (imediatamente após a administração estar completa), 1 h, 2 h, 4 h, 8 h, 1 d, 2 d, 3 d, 4 d, 5 d, 7 d, 10 d, 13 d, 14 d, 21 d e 28 d após o início da infusão intravenosa, o sangue total do animal foi recolhido nas veias dos membros posteriores e o soro foi separado. Entre eles, cerca de 2 mL de sangue total foi recolhido antes da administração e 14 d, 21 d e 28 d após o início da infusão intravenosa, e cerca de 1 mL de sangue total foi recolhido nos restantes momentos de amostragem de sangue. A concentração do fármaco no sangue no soro foi detectada por ELISA e foi realizada análise PK. Os resultados são apresentados na Tabela 21.

Tabela 21. Farmacocinética de anticorpos anti-PD1 humanizados em macacos cinomolgo Hu23- Hu33-

11.IgG4AA 6.IgG4AA t1/2 (dia) 5.5±0.7 4.6±1.3 Cmax (μg/mL) 23.75±2.29 21.47±2.13 AUC (h*μg/ml) 2775±241 2319±518 CL (ml/dia/kg) 8.7±0.7 10.7±2.3 Vz (mL/kg) 69±3.6 67.9±3.4

[00239] Os resultados mostraram que Hu23-11.IgG4AA e Hu33-6.IgG4AA têm boa atividade farmacocinética.

[00240] Embora para ajudar a uma compreensão clara, a invenção acima referida tenha sido descrita em pormenor com a ajuda de números e exemplos, as descrições e exemplos não devem ser interpretados como limitando o âmbito da presente descrição. As descrições de todas as patentes e documentos científicos citados nesse artigo são plena e claramente incorporadas por referência.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Anticorpo anti-PD-1 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, caracterizado pelo fato de que compreende uma região variável de cadeia pesada e uma região variável de cadeia leve, em que: a região variável de cadeia pesada compreende: HCDR1 como mostrado na SEQ ID NO: 65, HCDR2 como mostrado na SEQ ID NO: 66, e HCDR3 como mostrado na SEQ ID NO: 67; e a região variável de cadeia leve compreende: LCDR1 como mostrado na SEQ ID NO: 68, LCDR2 como mostrado na SEQ ID NO: 12, e LCDR3 como mostrado na SEQ ID NO: 69; de um modo preferido, a região variável de cadeia pesada compreende HCDR1 como mostrado na SEQ ID NO: 8, HCDR2 como mostrado na SEQ ID NO: 9, e HCDR3 como mostrado na SEQ ID NO: 10; e a região variável de cadeia leve compreende LCDR2 como mostrado na SEQ ID NO: 12, LCDR3 como mostrado na SEQ ID NO: 13, e LCDR1 como mostrado na fórmula geral RSSQSX13VHSX14X15X16TYLE (SEQ ID NO: 68), em que X13 é L, X14 é selecionado do grupo consistindo em N, Q, L, T e D, X15 é selecionado do grupo consistindo em G, A e V, e X16 é N.

2. Anticorpo anti-PD-1 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, caracterizado pelo fato de que compreende uma região variável de cadeia pesada e uma região variável de cadeia leve, em que a combinação da região variável de cadeia pesada e da região variável de cadeia leve é selecionada de qualquer uma das seguintes (a) a (e):

a) a região variável de cadeia pesada compreendendo

HCDR1, HCDR2 e HCDR3, como mostrado na SEQ ID NO: 8, SEQ ID

NO: 9 e SEQ ID NO: 10, respectivamente, e a região variável de cadeia leve compreendendo LCDR2 e

LCDR3, como mostrado na SEQ ID NO: 12 e SEQ ID NO: 13,

respectivamente, e LCDR1 como mostrado na SEQ ID NO: 11, 47,

48, 49, 50, 51 ou 52;

b) a região variável de cadeia pesada compreendendo

HCDR1, HCDR2 e HCDR3, como mostrado na SEQ ID NO: 14, SEQ ID

NO: 15 e SEQ ID NO: 16, respectivamente, e a região variável de cadeia leve compreendendo LCDR1,

LCDR2 e LCDR3, como mostrado na SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 12 e SEQ ID NO: 18, respectivamente;

c) a região variável de cadeia pesada compreendendo

HCDR1, HCDR2 e HCDR3, como mostrado na SEQ ID NO: 21, SEQ ID

NO: 22 e SEQ ID NO: 23, respectivamente, e a região variável de cadeia leve compreendendo LCDR1,

LCDR2 e LCDR3, como mostrado na SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25 e SEQ ID NO: 26;

d) a região variável de cadeia pesada compreendendo

HCDR1, HCDR2 e HCDR3, como mostrado na SEQ ID NO: 14, SEQ ID

NO: 15 e SEQ ID NO: 16, respectivamente, e a região variável de cadeia leve compreendendo LCDR2 e

LCDR3, como mostrado na SEQ ID NO: 12 e SEQ ID NO: 13, respectivamente, e LCDR1 como mostrado na SEQ ID NO: 11, 47, 48, 49, 50, 51 ou 52; e e) a região variável de cadeia pesada compreendendo HCDR1, HCDR2 e HCDR3, como mostrado na SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 e SEQ ID NO: 10, respectivamente, e a região variável de cadeia leve compreendendo LCDR1, LCDR2 e LCDR3, como mostrado na SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 12 e SEQ ID NO: 18, respectivamente; de um modo preferido, o anticorpo anti-PD-1 compreende uma combinação da região variável de cadeia pesada e da região variável de cadeia leve, como mostrado abaixo: (a1) a região variável de cadeia pesada compreendendo HCDR1, HCDR2 e HCDR3, como mostrado na SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 e SEQ ID NO: 10, respectivamente, e a região variável de cadeia leve compreendendo LCDR1, LCDR2 e LCDR3, como mostrado na SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 12 e SEQ ID NO: 13, respectivamente; ou (a2) a região variável de cadeia pesada compreendendo HCDR1, HCDR2 e HCDR3, tal como mostrado na SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22 e SEQ ID NO: 23, respectivamente, e a região variável de cadeia leve compreendendo LCDR1, LCDR2 e LCDR3, como mostrado na SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25 e SEQ ID NO: 26, respectivamente.

3. Anticorpo anti-PD-1 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, caracterizado pelo fato de que compreende uma combinação da região variável de cadeia pesada e da região variável de cadeia leve selecionada de qualquer uma das seguintes iv) a vi):

iv) a região variável de cadeia pesada compreendendo

HCDR1, HCDR2 e HCDR3 com as mesmas sequências que as da região variável de cadeia pesada mostrada na sequência SEQ

ID NO: 4, e a região variável de cadeia leve compreendendo

NO: 5;

v) a região variável de cadeia pesada compreendendo

HCDR1, HCDR2 e HCDR3 com as mesmas sequências que as da região variável de cadeia pesada mostradas na sequência SEQ

ID NO: 6, e a região variável de cadeia leve compreendendo

LCDR1, LCDR2 e LCDR3 com as mesmas sequências que as da região variável de cadeia leve mostradas na sequência SEQ ID

NO: 7; e vi) a região variável de cadeia pesada compreendendo

ID NO: 19, e a região variável de cadeia leve compreendendo

NO: 20.

4. Anticorpo anti-PD-1 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que o anticorpo anti-PD-1 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo é um anticorpo murino ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, um anticorpo quimérico ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, um anticorpo totalmente humano ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, ou um anticorpo humanizado ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo.

5. Anticorpo anti-PD-1 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que o anticorpo anti-PD-1 é um anticorpo humanizado, o referido anticorpo humanizado compreende uma região de estrutura derivada de um anticorpo humano ou uma sua variante de região de estrutura, em que: a variante de região de estrutura tem no máximo 11 mutações reversas de aminoácidos em cada uma da região de estrutura de cadeia leve e/ou a região de estrutura de cadeia pesada do anticorpo humano; de um modo preferido, a variante da região de estrutura compreende mutação(ões) selecionada(s) de qualquer uma das seguintes (f) a (h): (f) mutação reversa de aminoácido 2G compreendida na região variável de cadeia leve, e/ou uma ou mais mutações reversas de aminoácidos selecionados do grupo consistindo em 27Y, 48I, 67T, 69L, 82F e 93T, compreendidos na região variável de cadeia pesada; (g) mutação reversa de aminoácido 2V compreendida na região variável de cadeia leve, e/ou uma ou mais mutações reversas de aminoácidos selecionadas do grupo consistindo em 26D, 27F, 30T, 38K, 43H, 48I, 66K, 67A, 69L, 82F e 93T, compreendidos na região variável de cadeia pesada; e (h) uma ou mais mutações reversas de aminoácidos selecionadas do grupo consistindo em 42G, 44V e 71Y compreendidos na região variável de cadeia leve, e/ou mutações reversas de aminoácidos 1K e/ou 94S compreendidos na região variável de cadeia pesada; em que as posições dos aminoácidos são numeradas e determinadas de acordo com os Critérios Kabat.

6. Anticorpo anti-PD-1 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que a combinação da região variável de cadeia pesada e a região variável de cadeia leve do anticorpo é selecionada de qualquer uma das seguintes (i) a (o): (i) uma região variável de cadeia pesada, cuja sequência é a mostrada na SEQ ID NO: 4 ou tem pelo menos 90% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 4, e/ou uma região variável de cadeia leve, cuja sequência é a mostrada na SEQ ID NO: 5 ou tem pelo menos 90% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 5;

(j) uma região variável de cadeia pesada, cuja sequência é a mostrada na SEQ ID NO: 6 ou tem pelo menos 90%

de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 6, e/ou uma região variável de cadeia leve, cuja sequência é a mostrada na SEQ ID NO: 7 ou tem pelo menos 90% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 7;

(k) uma região variável de cadeia pesada, cuja sequência é a mostrada na SEQ ID NO: 19 ou tem pelo menos

90% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 19, e/ou uma região variável de cadeia leve, cuja sequência é a mostrada na SEQ ID NO: 20 ou tem pelo menos 90% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 20;

(l) uma região variável de cadeia pesada, cuja sequência é a mostrada na SEQ ID NO: 27, 30, 31 ou 32, ou tem pelo menos 90% de identidade de sequência com a SEQ ID

NO: 27, 30, 31 ou 32, e/ou uma região variável de cadeia leve, cuja sequência é a mostrada na SEQ ID NO: 28, 29, 34, 35, 53, 54, 55, 56, 57,

58, 59, 60, 61, 62, 63 ou 64, ou tem pelo menos 90% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 28, 29, 34, 35, 53,

54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63 ou 64;

(m) uma região variável de cadeia pesada, cuja sequência é a mostrada na SEQ ID NO: 33, 36, 37, 38, 39 ou

40, ou tem pelo menos 90% de identidade de sequência com a

SEQ ID NO: 33, 36, 37, 38, 39 ou 40, e/ou uma região variável de cadeia leve, cuja sequência é a mostrada na SEQ ID NO: 34, 35, 28, 29, 53, 54, 55, 56, 57,

54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63 ou 64;

(n) uma região variável de cadeia pesada, cuja sequência é a mostrada na SEQ ID NO: 41, 45 ou 46, ou tem pelo menos 90% de identidade de sequência com a SEQ ID NO:

41, 45 ou 46, e/ou uma região variável de cadeia leve, cuja sequência é a mostrada na SEQ ID NO: 42, 43 ou 44, ou tem pelo menos 90%

de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 42, 43 ou 44, e

(o) uma região variável de cadeia pesada, cuja sequência é a mostrada na SEQ ID NO: 70 ou tem pelo menos

90% de sequência com a SEQ ID NO: 70, e/ou uma região variável de cadeia leve, cuja sequência é a mostrada na SEQ ID NO: 71 ou tem pelo menos 90% de sequência de identidade com a SEQ ID NO: 71;

de um modo preferido, a combinação da região variável de cadeia pesada e da região variável de cadeia leve é selecionada de:

(p) uma região variável de cadeia pesada, cuja sequência é a mostrada na SEQ ID NO: 27 ou tem pelo menos

90% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 27, e/ou uma região variável de cadeia leve, cuja sequência é a mostrada na SEQ ID NO: 55 ou tem pelo menos 90% de sequência com a SEQ ID NO: 55; ou (q) uma região variável de cadeia pesada, cuja sequência é a mostrada na SEQ ID NO: 46 ou tem pelo menos 90% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 46, e/ou uma região variável de cadeia leve, cuja sequência é a mostrada na SEQ ID NO: 43 ou tem pelo menos 90% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 43.

7. Anticorpo anti-PD-1 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que o anticorpo compreende ainda uma região constante de anticorpo; de um modo preferido, a região constante de cadeia pesada da região constante de anticorpo é selecionada do grupo consistindo em as regiões constantes de IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4 humanas e suas variantes convencionais; a região constante de cadeia leve da região constante de anticorpo é selecionada do grupo consistindo em as regiões constantes de das cadeias κ e λ de anticorpo humano e suas variantes convencionais; de um modo mais preferido, o anticorpo compreende a região constante de cadeia pesada, como mostrada na SEQ ID NO: 72 ou 79, e a região constante de cadeia leve, como mostrada na SEQ ID NO: 73.

8. Anticorpo anti-PD-1 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que o anticorpo anti-PD-1 compreende: uma cadeia leve, como mostrada na SEQ ID NO: 78, e uma cadeia pesada, como mostrada na SEQ ID NO: 77 ou 82; ou o anticorpo anti-PD-1 compreende uma cadeia leve, como mostrada na SEQ ID NO: 75, e uma cadeia pesada, como mostrada na SEQ ID NO: 74, 76, 80 ou 81; de um modo preferido, o anticorpo anti-PD-1 compreende: uma cadeia pesada como mostrada na SEQ ID NO: 74 e uma cadeia leve, como mostrada na SEQ ID NO: 75; ou uma cadeia pesada como mostrada na SEQ ID NO: 77 e uma cadeia leve como mostrada na SEQ ID NO: 78.

9. Anticorpo anti-PD-1 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que o fragmento de ligação ao antígeno é selecionado do grupo consistindo em Fab, Fab’, F(ab’)2, anticorpo de cadeia única (scFv), região V dimerizada (diacorpo) e região V estabilizada por ligação dissulfeto (dsFv).

10. Anticorpo anti-PD-1 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é um anticorpo biespecífico, um anticorpo multiespecífico ou uma proteína de fusão de anticorpo.

11. Anticorpo monoclonal isolado ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, caracterizado pelo fato de que o referido anticorpo se liga competitivamente ao PD-1 humano com o anticorpo anti-PD-1 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 10.

12. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreendendo: uma quantidade terapeuticamente eficaz do anticorpo anti-PD-1 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10 ou uma quantidade terapeuticamente eficaz do anticorpo monoclonal isolado ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo conforme definido na reivindicação 11, e um ou mais veículos, diluentes, tampões ou excipientes farmaceuticamente aceitáveis.

13. Molécula de ácido nucleico caracterizada pelo fato de que codifica o anticorpo anti-PD-1 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 10, ou codifica o anticorpo monoclonal isolado ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, conforme definido na reivindicação 11.

14. Célula hospedeira, caracterizada pelo fato de que compreendendo a molécula de ácido nucleico conforme definida na reivindicação 13.

15. Método para a imunodetecção ou determinação de PD-1, caracterizado pelo fato de que compreende uma etapa de uso do anticorpo anti-PD-1 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 10, ou uma etapa de uso do anticorpo monoclonal isolado ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo conforme definido na reivindicação 11.

16. Kit, caracterizado pelo fato de que compreende o anticorpo anti-PD-1 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 10 ou o anticorpo monoclonal isolado ou fragmento de anticorpo de ligação ao antígeno do mesmo conforme definido na reivindicação 11.

17. Método de tratamento de doenças associadas ao PD-1, caracterizado pelo fato de que compreende a administração a um indivíduo de uma quantidade terapeuticamente eficaz do anticorpo anti-PD-1 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 10, ou do anticorpo monoclonal isolado ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo conforme definido na reivindicação 11, ou da composição farmacêutica conforme definida na reivindicação 12, ou da molécula de ácido nucleico conforme definida na reivindicação 13; em que a doença é de um modo preferido um tumor; de um modo mais preferido, a doença é selecionada do grupo consistindo em:

carcinoma de células escamosas de cabeça e pescoço, câncer da cabeça e pescoço, câncer do cérebro, glioma, glioblastoma multiforme, neuroblastoma, câncer do sistema nervoso central, tumor neuroendócrino, câncer da faringe, câncer da nasofaringe, câncer do esófago, câncer da tireoide,

mesotelioma pleural maligno, câncer do pulmão, câncer da mama, câncer do fígado, hepatoma, carcinoma hepatocelular,

câncer hepatobiliar, câncer pancreático, câncer gástrico,

câncer gastrointestinal, câncer do intestino, câncer do cólon, câncer colorretal, câncer renal, carcinoma das células renais claras, câncer dos ovários, câncer endometrial, câncer do colo do útero, câncer da bexiga,

câncer da próstata, câncer dos testículos, câncer da pele,

melanoma, leucemia, linfoma, câncer ósseo, condrossarcoma,

mieloma, mieloma múltiplo, síndrome mielodisplásica,

neoplasia mieloproliferativa, carcinoma de células escamosas, sarcoma de Ewing, amiloidose sistémica de cadeia leve e carcinoma de células de Merkel; de um modo mais preferido, o linfoma é selecionado do grupo consistindo em:

linfoma de Hodgkin, linfoma não Hodgkin, linfoma difuso de grandes células B, linfoma folicular, linfoma primário de grandes células B de mediastino, linfoma de células do manto,

linfoma linfocítico pequeno, linfoma de grandes células B rico em células T/histiócitos e linfoma linfoplasmocítico,

o câncer do pulmão é selecionado do grupo consistindo em:

câncer do pulmão de células não pequenas e câncer do pulmão de células pequenas, a leucemia é selecionada do grupo consistindo em: leucemia mielóide crónica, leucemia mielóide aguda, leucemia linfocítica, leucemia linfoblástica,

leucemia linfoblástica aguda, leucemia linfocítica crônica e leucemia mielóide; de um modo mais preferido, a doença é selecionada do grupo consistindo em: melanoma PD-L1 positivo, câncer do pulmão, câncer do pulmão de células não pequenas, câncer da mama, câncer gástrico, câncer do rim,

câncer da bexiga, câncer do intestino e câncer do cólon.