CN118108853A - Cd47/4-1bb结合蛋白及其医药用途 - Google Patents
Cd47/4-1bb结合蛋白及其医药用途 Download PDFInfo
- Publication number
- CN118108853A CN118108853A CN202311611230.7A CN202311611230A CN118108853A CN 118108853 A CN118108853 A CN 118108853A CN 202311611230 A CN202311611230 A CN 202311611230A CN 118108853 A CN118108853 A CN 118108853A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- binding
- binding protein
- protein
- antibody
- linker
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 101000868279 Homo sapiens Leukocyte surface antigen CD47 Proteins 0.000 title claims abstract description 209
- 102100032913 Leukocyte surface antigen CD47 Human genes 0.000 title claims abstract description 206
- 108091008324 binding proteins Proteins 0.000 title claims abstract description 153
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 title abstract description 128
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims abstract description 65
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 38
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 claims abstract description 21
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims abstract description 12
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims description 150
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 107
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 claims description 75
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 claims description 75
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 68
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims description 63
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 63
- 230000035772 mutation Effects 0.000 claims description 61
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 claims description 58
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 claims description 58
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 55
- 101000863873 Homo sapiens Tyrosine-protein phosphatase non-receptor type substrate 1 Proteins 0.000 claims description 34
- 102100029948 Tyrosine-protein phosphatase non-receptor type substrate 1 Human genes 0.000 claims description 34
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 claims description 27
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 claims description 27
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 claims description 27
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 claims description 26
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 claims description 24
- NFGXHKASABOEEW-UHFFFAOYSA-N 1-methylethyl 11-methoxy-3,7,11-trimethyl-2,4-dodecadienoate Chemical compound COC(C)(C)CCCC(C)CC=CC(C)=CC(=O)OC(C)C NFGXHKASABOEEW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 17
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 15
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 14
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 claims description 10
- 210000004602 germ cell Anatomy 0.000 claims description 8
- 206010009944 Colon cancer Diseases 0.000 claims description 6
- 101001037140 Homo sapiens Immunoglobulin heavy variable 3-23 Proteins 0.000 claims description 6
- 101000839661 Homo sapiens Immunoglobulin heavy variable 3-64 Proteins 0.000 claims description 6
- 101000839687 Homo sapiens Immunoglobulin heavy variable 3-74 Proteins 0.000 claims description 6
- 102100040220 Immunoglobulin heavy variable 3-23 Human genes 0.000 claims description 6
- 102100028321 Immunoglobulin heavy variable 3-64 Human genes 0.000 claims description 6
- 102100028305 Immunoglobulin heavy variable 3-74 Human genes 0.000 claims description 6
- 102220533819 Protein BEX2_K19E_mutation Human genes 0.000 claims description 6
- 102220489345 Melanoma-associated antigen 1_K53G_mutation Human genes 0.000 claims description 5
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 5
- 208000029742 colonic neoplasm Diseases 0.000 claims description 4
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 4
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 claims description 3
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 claims description 3
- 230000006240 deamidation Effects 0.000 claims description 3
- 201000010536 head and neck cancer Diseases 0.000 claims description 3
- 208000014829 head and neck neoplasm Diseases 0.000 claims description 3
- 230000002489 hematologic effect Effects 0.000 claims description 3
- 238000006317 isomerization reaction Methods 0.000 claims description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 3
- 206010005003 Bladder cancer Diseases 0.000 claims description 2
- 206010008342 Cervix carcinoma Diseases 0.000 claims description 2
- 208000000461 Esophageal Neoplasms Diseases 0.000 claims description 2
- 208000008839 Kidney Neoplasms Diseases 0.000 claims description 2
- 206010058467 Lung neoplasm malignant Diseases 0.000 claims description 2
- 206010030155 Oesophageal carcinoma Diseases 0.000 claims description 2
- 206010033128 Ovarian cancer Diseases 0.000 claims description 2
- 206010061535 Ovarian neoplasm Diseases 0.000 claims description 2
- 206010060862 Prostate cancer Diseases 0.000 claims description 2
- 208000000236 Prostatic Neoplasms Diseases 0.000 claims description 2
- 206010038389 Renal cancer Diseases 0.000 claims description 2
- 208000005718 Stomach Neoplasms Diseases 0.000 claims description 2
- 208000007097 Urinary Bladder Neoplasms Diseases 0.000 claims description 2
- 208000006105 Uterine Cervical Neoplasms Diseases 0.000 claims description 2
- 208000002495 Uterine Neoplasms Diseases 0.000 claims description 2
- 201000010881 cervical cancer Diseases 0.000 claims description 2
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 claims description 2
- 201000004101 esophageal cancer Diseases 0.000 claims description 2
- 206010017758 gastric cancer Diseases 0.000 claims description 2
- 201000010982 kidney cancer Diseases 0.000 claims description 2
- 201000007270 liver cancer Diseases 0.000 claims description 2
- 208000014018 liver neoplasm Diseases 0.000 claims description 2
- 201000005202 lung cancer Diseases 0.000 claims description 2
- 208000020816 lung neoplasm Diseases 0.000 claims description 2
- 201000001441 melanoma Diseases 0.000 claims description 2
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 claims description 2
- 206010041823 squamous cell carcinoma Diseases 0.000 claims description 2
- 201000011549 stomach cancer Diseases 0.000 claims description 2
- 201000005112 urinary bladder cancer Diseases 0.000 claims description 2
- 206010046766 uterine cancer Diseases 0.000 claims description 2
- 102000023732 binding proteins Human genes 0.000 claims 25
- 102220489019 Dual specificity protein phosphatase 13 isoform A_N51I_mutation Human genes 0.000 claims 1
- 208000015634 Rectal Neoplasms Diseases 0.000 claims 1
- 206010038038 rectal cancer Diseases 0.000 claims 1
- 201000001275 rectum cancer Diseases 0.000 claims 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 59
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 59
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 59
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 46
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 45
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 43
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 41
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 40
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 38
- 102100035360 Cerebellar degeneration-related antigen 1 Human genes 0.000 description 32
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 26
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 26
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 25
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 24
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 20
- 108010047041 Complementarity Determining Regions Proteins 0.000 description 19
- 102000025171 antigen binding proteins Human genes 0.000 description 19
- 108091000831 antigen binding proteins Proteins 0.000 description 19
- 101710117290 Aldo-keto reductase family 1 member C4 Proteins 0.000 description 17
- 101100112922 Candida albicans CDR3 gene Proteins 0.000 description 17
- 108010003723 Single-Domain Antibodies Proteins 0.000 description 17
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 17
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 16
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 16
- 102100035361 Cerebellar degeneration-related protein 2 Human genes 0.000 description 15
- 101000737793 Homo sapiens Cerebellar degeneration-related antigen 1 Proteins 0.000 description 15
- 101000737796 Homo sapiens Cerebellar degeneration-related protein 2 Proteins 0.000 description 15
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 15
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 15
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 15
- 101150036449 SIRPA gene Proteins 0.000 description 14
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 14
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 14
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 14
- 108700001691 ALX148 Proteins 0.000 description 13
- 229940125979 ALX148 Drugs 0.000 description 13
- 229960004641 rituximab Drugs 0.000 description 13
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 13
- 241000282567 Macaca fascicularis Species 0.000 description 12
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 11
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 11
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 11
- 238000001943 fluorescence-activated cell sorting Methods 0.000 description 11
- 230000006870 function Effects 0.000 description 11
- 229950005972 urelumab Drugs 0.000 description 11
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 10
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 10
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 9
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 9
- 108700008625 Reporter Genes Proteins 0.000 description 9
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 description 9
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 9
- 238000003127 radioimmunoassay Methods 0.000 description 9
- 238000002198 surface plasmon resonance spectroscopy Methods 0.000 description 9
- 206010057249 Phagocytosis Diseases 0.000 description 8
- 108060008683 Tumor Necrosis Factor Receptor Proteins 0.000 description 8
- 239000000556 agonist Substances 0.000 description 8
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 8
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 8
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 8
- 230000008782 phagocytosis Effects 0.000 description 8
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 8
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 8
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 8
- 102000003298 tumor necrosis factor receptor Human genes 0.000 description 8
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 8
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 7
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 7
- 102100029205 Low affinity immunoglobulin gamma Fc region receptor II-b Human genes 0.000 description 7
- 108060001084 Luciferase Proteins 0.000 description 7
- 239000005089 Luciferase Substances 0.000 description 7
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 7
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 7
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 7
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 7
- 102000044459 human CD47 Human genes 0.000 description 7
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 7
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 7
- 210000000440 neutrophil Anatomy 0.000 description 7
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 7
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 6
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 6
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 6
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 6
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 6
- 238000009169 immunotherapy Methods 0.000 description 6
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 6
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 6
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 6
- 108010021472 Fc gamma receptor IIB Proteins 0.000 description 5
- 101710098610 Leukocyte surface antigen CD47 Proteins 0.000 description 5
- 210000001772 blood platelet Anatomy 0.000 description 5
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 5
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 5
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 5
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 5
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 5
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 5
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 5
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 5
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 5
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 5
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 5
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 5
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 5
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 5
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 5
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 5
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 5
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 4
- 108091005461 Nucleic proteins Proteins 0.000 description 4
- 230000006052 T cell proliferation Effects 0.000 description 4
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 4
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 4
- 208000007502 anemia Diseases 0.000 description 4
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 4
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 4
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 4
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 4
- 230000008859 change Effects 0.000 description 4
- 230000009918 complex formation Effects 0.000 description 4
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 4
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 4
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 4
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 4
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 4
- 230000035931 haemagglutination Effects 0.000 description 4
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 4
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 4
- 208000004235 neutropenia Diseases 0.000 description 4
- 210000003819 peripheral blood mononuclear cell Anatomy 0.000 description 4
- 238000002823 phage display Methods 0.000 description 4
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 4
- 210000003289 regulatory T cell Anatomy 0.000 description 4
- DAEPDZWVDSPTHF-UHFFFAOYSA-M sodium pyruvate Chemical compound [Na+].CC(=O)C([O-])=O DAEPDZWVDSPTHF-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 4
- 230000004614 tumor growth Effects 0.000 description 4
- 208000031261 Acute myeloid leukaemia Diseases 0.000 description 3
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 3
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 3
- 101000946889 Homo sapiens Monocyte differentiation antigen CD14 Proteins 0.000 description 3
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 description 3
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 description 3
- 102000000588 Interleukin-2 Human genes 0.000 description 3
- 208000033776 Myeloid Acute Leukemia Diseases 0.000 description 3
- 208000015914 Non-Hodgkin lymphomas Diseases 0.000 description 3
- 241000235648 Pichia Species 0.000 description 3
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 3
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 3
- 230000004075 alteration Effects 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 3
- 238000012875 competitive assay Methods 0.000 description 3
- 238000011161 development Methods 0.000 description 3
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 3
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 3
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 3
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 3
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 3
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 3
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 3
- 231100000304 hepatotoxicity Toxicity 0.000 description 3
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 3
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 3
- 102000006495 integrins Human genes 0.000 description 3
- 108010044426 integrins Proteins 0.000 description 3
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 3
- 210000000822 natural killer cell Anatomy 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- 206010043554 thrombocytopenia Diseases 0.000 description 3
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 3
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 2
- 102000002627 4-1BB Ligand Human genes 0.000 description 2
- 108010082808 4-1BB Ligand Proteins 0.000 description 2
- 102220586180 ATP-dependent Clp protease proteolytic subunit, mitochondrial_E54R_mutation Human genes 0.000 description 2
- 102100036475 Alanine aminotransferase 1 Human genes 0.000 description 2
- 108010082126 Alanine transaminase Proteins 0.000 description 2
- 241000228212 Aspergillus Species 0.000 description 2
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 description 2
- 208000005623 Carcinogenesis Diseases 0.000 description 2
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 2
- 208000001333 Colorectal Neoplasms Diseases 0.000 description 2
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 2
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 2
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 2
- -1 FR3 Proteins 0.000 description 2
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 2
- 206010019851 Hepatotoxicity Diseases 0.000 description 2
- 101000976075 Homo sapiens Insulin Proteins 0.000 description 2
- 101000917826 Homo sapiens Low affinity immunoglobulin gamma Fc region receptor II-a Proteins 0.000 description 2
- 101000917824 Homo sapiens Low affinity immunoglobulin gamma Fc region receptor II-b Proteins 0.000 description 2
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 2
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 2
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 description 2
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 2
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 2
- 241000186660 Lactobacillus Species 0.000 description 2
- 102000043136 MAP kinase family Human genes 0.000 description 2
- 108091054455 MAP kinase family Proteins 0.000 description 2
- 102100035877 Monocyte differentiation antigen CD14 Human genes 0.000 description 2
- 241000221960 Neurospora Species 0.000 description 2
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 2
- 241001452677 Ogataea methanolica Species 0.000 description 2
- 208000006994 Precancerous Conditions Diseases 0.000 description 2
- 102000001708 Protein Isoforms Human genes 0.000 description 2
- 108010029485 Protein Isoforms Proteins 0.000 description 2
- 241000588769 Proteus <enterobacteria> Species 0.000 description 2
- 241000589516 Pseudomonas Species 0.000 description 2
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 2
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 2
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 2
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 description 2
- 241000235347 Schizosaccharomyces pombe Species 0.000 description 2
- 108010071390 Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- 102000007562 Serum Albumin Human genes 0.000 description 2
- 102100025795 Signal-regulatory protein gamma Human genes 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 241000191940 Staphylococcus Species 0.000 description 2
- 241000187747 Streptomyces Species 0.000 description 2
- 230000006044 T cell activation Effects 0.000 description 2
- 108091008874 T cell receptors Proteins 0.000 description 2
- 102000016266 T-Cell Antigen Receptors Human genes 0.000 description 2
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 2
- 102000007614 Thrombospondin 1 Human genes 0.000 description 2
- 108010046722 Thrombospondin 1 Proteins 0.000 description 2
- 241000223259 Trichoderma Species 0.000 description 2
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241001416177 Vicugna pacos Species 0.000 description 2
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 2
- 238000001261 affinity purification Methods 0.000 description 2
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 239000013060 biological fluid Substances 0.000 description 2
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 2
- 230000036952 cancer formation Effects 0.000 description 2
- 231100000504 carcinogenesis Toxicity 0.000 description 2
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 2
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 2
- HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N cholesterol Chemical compound C1C=C2C[C@@H](O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H]([C@H](C)CCCC(C)C)[C@@]1(C)CC2 HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N 0.000 description 2
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 2
- 238000004590 computer program Methods 0.000 description 2
- 239000013068 control sample Substances 0.000 description 2
- 230000000139 costimulatory effect Effects 0.000 description 2
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 2
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 2
- 239000000032 diagnostic agent Substances 0.000 description 2
- 229940039227 diagnostic agent Drugs 0.000 description 2
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 2
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 2
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 description 2
- 208000007475 hemolytic anemia Diseases 0.000 description 2
- 230000007686 hepatotoxicity Effects 0.000 description 2
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000002865 immune cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 2
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 2
- 230000001976 improved effect Effects 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- PBGKTOXHQIOBKM-FHFVDXKLSA-N insulin (human) Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H]1CSSC[C@H]2C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@H](C(N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=3NC=NC=3)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)CNC1=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O)=O)CSSC[C@@H](C(N2)=O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CN)[C@@H](C)CC)[C@@H](C)CC)[C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)C1=CN=CN1 PBGKTOXHQIOBKM-FHFVDXKLSA-N 0.000 description 2
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 2
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 description 2
- 229940039696 lactobacillus Drugs 0.000 description 2
- 229940125052 lemzoparlimab Drugs 0.000 description 2
- 229940121581 magrolimab Drugs 0.000 description 2
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 239000002808 molecular sieve Substances 0.000 description 2
- 210000001616 monocyte Anatomy 0.000 description 2
- 210000000581 natural killer T-cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000001613 neoplastic effect Effects 0.000 description 2
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 2
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 2
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 2
- 229960002450 ofatumumab Drugs 0.000 description 2
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 2
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 2
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 2
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 2
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 2
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 2
- 238000000159 protein binding assay Methods 0.000 description 2
- 235000004252 protein component Nutrition 0.000 description 2
- 239000013074 reference sample Substances 0.000 description 2
- 239000012898 sample dilution Substances 0.000 description 2
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 2
- URGAHOPLAPQHLN-UHFFFAOYSA-N sodium aluminosilicate Chemical compound [Na+].[Al+3].[O-][Si]([O-])=O.[O-][Si]([O-])=O URGAHOPLAPQHLN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229940054269 sodium pyruvate Drugs 0.000 description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 2
- 241000894007 species Species 0.000 description 2
- 238000012289 standard assay Methods 0.000 description 2
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 description 2
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 2
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 2
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 2
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 2
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 2
- 231100000041 toxicology testing Toxicity 0.000 description 2
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 2
- 239000012096 transfection reagent Substances 0.000 description 2
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 2
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229950003520 utomilumab Drugs 0.000 description 2
- 238000002424 x-ray crystallography Methods 0.000 description 2
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RTQWWZBSTRGEAV-PKHIMPSTSA-N 2-[[(2s)-2-[bis(carboxymethyl)amino]-3-[4-(methylcarbamoylamino)phenyl]propyl]-[2-[bis(carboxymethyl)amino]propyl]amino]acetic acid Chemical compound CNC(=O)NC1=CC=C(C[C@@H](CN(CC(C)N(CC(O)=O)CC(O)=O)CC(O)=O)N(CC(O)=O)CC(O)=O)C=C1 RTQWWZBSTRGEAV-PKHIMPSTSA-N 0.000 description 1
- NMUSYJAQQFHJEW-KVTDHHQDSA-N 5-azacytidine Chemical compound O=C1N=C(N)N=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 NMUSYJAQQFHJEW-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 1
- 206010067484 Adverse reaction Diseases 0.000 description 1
- HJCMDXDYPOUFDY-WHFBIAKZSA-N Ala-Gln Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(N)=O HJCMDXDYPOUFDY-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- 239000012103 Alexa Fluor 488 Substances 0.000 description 1
- 239000012099 Alexa Fluor family Substances 0.000 description 1
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010003415 Aspartate Aminotransferases Proteins 0.000 description 1
- 102000004625 Aspartate Aminotransferases Human genes 0.000 description 1
- 208000028564 B-cell non-Hodgkin lymphoma Diseases 0.000 description 1
- 241000124815 Barbus barbus Species 0.000 description 1
- 208000011691 Burkitt lymphomas Diseases 0.000 description 1
- 102000006355 CD47 Antigen Human genes 0.000 description 1
- 108010058590 CD47 Antigen Proteins 0.000 description 1
- 241000282832 Camelidae Species 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- 101150015280 Cel gene Proteins 0.000 description 1
- 230000006820 DNA synthesis Effects 0.000 description 1
- 101100012887 Drosophila melanogaster btl gene Proteins 0.000 description 1
- 101100012878 Drosophila melanogaster htl gene Proteins 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000012286 ELISA Assay Methods 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- 206010015287 Erythropenia Diseases 0.000 description 1
- 101000867232 Escherichia coli Heat-stable enterotoxin II Proteins 0.000 description 1
- 108091006027 G proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000030782 GTP binding Human genes 0.000 description 1
- 108091000058 GTP-Binding Proteins 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 1
- 206010066896 HER-2 positive gastric cancer Diseases 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 101000690301 Homo sapiens Aldo-keto reductase family 1 member C4 Proteins 0.000 description 1
- 101000935587 Homo sapiens Flavin reductase (NADPH) Proteins 0.000 description 1
- 101001002657 Homo sapiens Interleukin-2 Proteins 0.000 description 1
- 101000958041 Homo sapiens Musculin Proteins 0.000 description 1
- 101001116548 Homo sapiens Protein CBFA2T1 Proteins 0.000 description 1
- 101000835928 Homo sapiens Signal-regulatory protein gamma Proteins 0.000 description 1
- 102000003839 Human Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108090000144 Human Proteins Proteins 0.000 description 1
- GRRNUXAQVGOGFE-UHFFFAOYSA-N Hygromycin-B Natural products OC1C(NC)CC(N)C(O)C1OC1C2OC3(C(C(O)C(O)C(C(N)CO)O3)O)OC2C(O)C(CO)O1 GRRNUXAQVGOGFE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091008036 Immune checkpoint proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000037982 Immune checkpoint proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 description 1
- 102000006496 Immunoglobulin Heavy Chains Human genes 0.000 description 1
- 108010019476 Immunoglobulin Heavy Chains Proteins 0.000 description 1
- 238000001265 Jonckheere trend test Methods 0.000 description 1
- 241000235058 Komagataella pastoris Species 0.000 description 1
- 238000012313 Kruskal-Wallis test Methods 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P L-argininium(2+) Chemical compound NC(=[NH2+])NCCC[C@H]([NH3+])C(O)=O ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 1
- 241000282560 Macaca mulatta Species 0.000 description 1
- 102000007651 Macrophage Colony-Stimulating Factor Human genes 0.000 description 1
- 108010046938 Macrophage Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 1
- 240000002769 Morchella esculenta Species 0.000 description 1
- 235000002779 Morchella esculenta Nutrition 0.000 description 1
- 108090000143 Mouse Proteins Proteins 0.000 description 1
- 238000005481 NMR spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 1
- 108010019160 Pancreatin Proteins 0.000 description 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 1
- 241000288906 Primates Species 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 241000235070 Saccharomyces Species 0.000 description 1
- 241000235346 Schizosaccharomyces Species 0.000 description 1
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 1
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710092332 Signal-regulatory protein gamma Proteins 0.000 description 1
- 241000191967 Staphylococcus aureus Species 0.000 description 1
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 1
- 238000000692 Student's t-test Methods 0.000 description 1
- BPEGJWRSRHCHSN-UHFFFAOYSA-N Temozolomide Chemical compound O=C1N(C)N=NC2=C(C(N)=O)N=CN21 BPEGJWRSRHCHSN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108090000340 Transaminases Proteins 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000001793 Wilcoxon signed-rank test Methods 0.000 description 1
- 241000212749 Zesius chrysomallus Species 0.000 description 1
- 238000000367 ab initio method Methods 0.000 description 1
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 101150027964 ada gene Proteins 0.000 description 1
- 230000004721 adaptive immunity Effects 0.000 description 1
- 230000001464 adherent effect Effects 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 230000006838 adverse reaction Effects 0.000 description 1
- 230000009824 affinity maturation Effects 0.000 description 1
- 230000004520 agglutination Effects 0.000 description 1
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 1
- 230000000735 allogeneic effect Effects 0.000 description 1
- 230000005875 antibody response Effects 0.000 description 1
- 210000000612 antigen-presenting cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000005975 antitumor immune response Effects 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 description 1
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 1
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 1
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 1
- 238000003149 assay kit Methods 0.000 description 1
- 229960002756 azacitidine Drugs 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 1
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 1
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 1
- 230000036765 blood level Effects 0.000 description 1
- 238000010241 blood sampling Methods 0.000 description 1
- 238000011094 buffer selection Methods 0.000 description 1
- 102220408217 c.296T>A Human genes 0.000 description 1
- 230000022534 cell killing Effects 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 238000000546 chi-square test Methods 0.000 description 1
- 235000012000 cholesterol Nutrition 0.000 description 1
- 230000009137 competitive binding Effects 0.000 description 1
- 230000006957 competitive inhibition Effects 0.000 description 1
- 229920000547 conjugated polymer Polymers 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 1
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 1
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 1
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 1
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 1
- 230000016396 cytokine production Effects 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 238000011033 desalting Methods 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 230000018732 detection of tumor cell Effects 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 231100000371 dose-limiting toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 238000009510 drug design Methods 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 238000003114 enzyme-linked immunosorbent spot assay Methods 0.000 description 1
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 1
- 230000005714 functional activity Effects 0.000 description 1
- 238000002825 functional assay Methods 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 238000010448 genetic screening Methods 0.000 description 1
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 1
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000009036 growth inhibition Effects 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 201000005787 hematologic cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000019691 hematopoietic and lymphoid cell neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 208000024200 hematopoietic and lymphoid system neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 230000000004 hemodynamic effect Effects 0.000 description 1
- 208000006454 hepatitis Diseases 0.000 description 1
- 102000046699 human CD14 Human genes 0.000 description 1
- 102000046949 human MSC Human genes 0.000 description 1
- 102000054751 human RUNX1T1 Human genes 0.000 description 1
- 238000011577 humanized mouse model Methods 0.000 description 1
- GRRNUXAQVGOGFE-NZSRVPFOSA-N hygromycin B Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](NC)C[C@@H](N)[C@H](O)[C@H]1O[C@H]1[C@H]2O[C@@]3([C@@H]([C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](C(N)CO)O3)O)O[C@H]2[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 GRRNUXAQVGOGFE-NZSRVPFOSA-N 0.000 description 1
- 229940097277 hygromycin b Drugs 0.000 description 1
- 229960001001 ibritumomab tiuxetan Drugs 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 238000003119 immunoblot Methods 0.000 description 1
- 239000000677 immunologic agent Substances 0.000 description 1
- 229940124541 immunological agent Drugs 0.000 description 1
- 238000001114 immunoprecipitation Methods 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000015788 innate immune response Effects 0.000 description 1
- 230000002452 interceptive effect Effects 0.000 description 1
- 238000010253 intravenous injection Methods 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 1
- 238000005304 joining Methods 0.000 description 1
- 238000012004 kinetic exclusion assay Methods 0.000 description 1
- 238000011813 knockout mouse model Methods 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 208000018191 liver inflammation Diseases 0.000 description 1
- 230000007056 liver toxicity Effects 0.000 description 1
- 238000003670 luciferase enzyme activity assay Methods 0.000 description 1
- 238000003468 luciferase reporter gene assay Methods 0.000 description 1
- 230000003211 malignant effect Effects 0.000 description 1
- 108010082117 matrigel Proteins 0.000 description 1
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 1
- 230000001394 metastastic effect Effects 0.000 description 1
- 206010061289 metastatic neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 1
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 1
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 230000004001 molecular interaction Effects 0.000 description 1
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 1
- 238000007857 nested PCR Methods 0.000 description 1
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 1
- 230000009871 nonspecific binding Effects 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 229940055695 pancreatin Drugs 0.000 description 1
- 238000004091 panning Methods 0.000 description 1
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 1
- 230000002093 peripheral effect Effects 0.000 description 1
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 1
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 1
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 1
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- 230000034190 positive regulation of NF-kappaB transcription factor activity Effects 0.000 description 1
- 230000004481 post-translational protein modification Effects 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 description 1
- 238000000455 protein structure prediction Methods 0.000 description 1
- 239000000941 radioactive substance Substances 0.000 description 1
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 1
- 230000000306 recurrent effect Effects 0.000 description 1
- 239000012557 regeneration buffer Substances 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 238000004062 sedimentation Methods 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 239000012679 serum free medium Substances 0.000 description 1
- 231100000748 severe hepatic injury Toxicity 0.000 description 1
- 239000007974 sodium acetate buffer Substances 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 239000008354 sodium chloride injection Substances 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000000528 statistical test Methods 0.000 description 1
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 1
- 239000012089 stop solution Substances 0.000 description 1
- VLYWMPOKSSWJAL-UHFFFAOYSA-N sulfamethoxypyridazine Chemical compound N1=NC(OC)=CC=C1NS(=O)(=O)C1=CC=C(N)C=C1 VLYWMPOKSSWJAL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 229960004964 temozolomide Drugs 0.000 description 1
- 238000010998 test method Methods 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 102000014898 transaminase activity proteins Human genes 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 238000003146 transient transfection Methods 0.000 description 1
- 102000035160 transmembrane proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091005703 transmembrane proteins Proteins 0.000 description 1
- 239000013638 trimer Substances 0.000 description 1
- 238000010798 ubiquitination Methods 0.000 description 1
- 230000034512 ubiquitination Effects 0.000 description 1
- 229950004593 ublituximab Drugs 0.000 description 1
- 238000010200 validation analysis Methods 0.000 description 1
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 1
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 1
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 1
Landscapes
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
本公开涉及CD47/4‑1BB结合蛋白及其医药用途。具体涉及4‑1BB结合蛋白、CD47/4‑1BB结合蛋白、药物组合物及其用于治疗癌症的方法和相关制药用途。
Description
技术领域
本公开涉及生物医药领域，具体涉及4-1BB结合蛋白、CD47/4-1BB结合蛋白及其用于治疗癌症的方法和相关制药用途。
背景技术
4-1BB(CD137，TNFRSF9)是一种跨膜蛋白，属于肿瘤坏死因子受体超家族。4-1BB表达在CD8+和CD4+T细胞、调节性T细胞(Tregs)、NK细胞和NKT细胞、B细胞和中性粒细胞等细胞表面的共刺激分子。在T细胞上，4-1BB并非组成型表达，而是在T细胞受体(TCR)激活后才发生诱导性表达的。4-1BB在细胞表面以单体或二聚体形式表达，与其天然配体4-1BBL结合后形成三聚体，经由TNFR相关因子(TRAF)-2和TRAF-1进行信号传导。4-1BB的早期信号传导涉及K-63的多泛素化，激活核因子(NF-κB)和丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)途径信号通路，导致T细胞的增殖、成熟和存活延长，以及细胞因子的产生等结果。
研究显示，针对4-1BB的抗体激动剂在小鼠中可以促进T细胞的抗肿瘤功能(Murillo等，Clin Cancer Res.2008；14(21)：6895-906)。激活4-1BB的抗体在许多模型中可以增加共剌激分子的表达，诱导T细胞的存活和增殖，从而增强抗肿瘤免疫应答，引起免疫细胞对肿瘤的杀伤。已有的4-1BB激活抗体例如Bristol Myers Squibb(BMS)公司的Urelumab，其是一种人IgG4抗体(WO2005035584)；Pfizer公司Utomilumab，其是一种人IgG2抗体(Fisher等，Cancer Immunol.2012；61：1721-1733)；以及Adagene公司ADG106，其是一种人IgG4抗体(WO2019037711A1)。但是，靶向4-1BB的抗肿瘤抗体研发进展并不顺利，其主要的原因是，4-1BB除了激活肿瘤内部的T细胞，也能激活外周(如，肝脏)中的T细胞，引发肝部炎症进而导致严重的肝损伤(Todd Bartkowiak等人Clin Cancer Res；24(5)March 1，2018)。这使得4-1BB的治疗窗窄。
细胞表面蛋白CD47，又被称为整合素相关蛋白(integrin-associated protein，IAP)，是重要的巨噬细胞免疫检查点蛋白，在多种肿瘤中表达或过度表达，包括急性骨髓性白血病(AML)、B细胞非霍奇金淋巴瘤等多种血液瘤(NHL)，以及乳腺癌等许多人类实体瘤。表达在肿瘤细胞上的CD47与巨噬细胞上的信号调节蛋白α(SIRPα)结合，使肿瘤细胞表面产生“别吃我”信号，介导肿瘤逃逸。因此，CD47除了作为肿瘤的特异性蛋白以外，阻断CD47/SIRPα通路成为了肿瘤免疫治疗领域一个重要策略。目前CD47的阻断型抗体或SIRPα融合蛋白已在血液瘤和实体瘤中均显示出临床活性。例如，Forty Seven公司针对CD47的IgG4单克隆抗体Magrolimab(Hu5F9)，在临床试验中开展与阿扎胞苷联用作为AML的免疫疗法；I-mab公司的靶向CD47的IgG4单抗Lemzoparlimab(TJC4)，在临床试验中与抗CD20抗体利妥昔单抗联用作为NHL的免疫疗法；ALX Oncology公司的SIRPα融合蛋白ALX148，在临床实验中作为几种适应症的免疫疗法，包括NHL、Her2阳性的胃癌、头颈癌、结肠直肠癌等。
CD47除了和SIRPα相互作用介导“别吃我”信号外，也同时结合于T细胞上的SIRPγ蛋白。SIRPγ在T细胞和活化的NK细胞上表达，是CD47的天然配体之一。与SIRPα相比，SIRPγ以低10倍的亲和力结合CD47。CD47/SIRPγ相互作用在抗原呈递细胞与T细胞接触、刺激T细胞活化及促进T细胞增殖、促进T细胞的跨内皮迁移中发挥重要作用。所以，CD47抗体在阻断和SIRPα相互作用外同时也阻断了和SIRPγ的相互作用，这导致T细胞激活活性的下降。目前已有同时针对CD47和4-1BB肿瘤特异性免疫制剂，如KAHR公司的DSP107，但DSP107是利用重组蛋白技术将SIRPαECD domain和4-1BB配体偶联，因为没有Fc，半衰期相对较短，并且由于采用野生型SIRPαECD，亲和力较低，因而需要较高的血药浓度才能封闭CD47的靶点封闭活性。
基于现有技术中存在的问题，本公开提供了新结构的4-1BB单域抗体及其与SIRPγ的融合蛋白(即，CD47/4-1BB结合蛋白)。我们发现，首先，CD47/4-1BB结合蛋白具有CD47依赖的4-1BB激活活性，使得4-1BB只在CD47阳性的肿瘤部位激活，提高4-1BB的肿瘤靶向性，降低如肝毒性的外周毒性。其次，4-1BB可以在激活T细胞的同时，阻断CD47/SIRPα介导的“别吃我”信号，激活巨噬细胞对肿瘤细胞的吞噬作用，实现先天性免疫和适应性免疫的桥接，共同促进抗肿瘤作用的发挥。再次，本公开的CD47/4-1BB双功能结合蛋白具有良好的药理活性、成药性、表达量。因此，本公开的CD47/4-1BB结合蛋白有较大潜力成为临床治疗肿瘤的候选药物。
发明内容
本公开提供了4-1BB结合蛋白、CD47/4-1BB结合蛋白，其编码核酸、载体、宿主细胞、药物组合物、其用于治疗或预防癌症的方法和相关制药用途。
4-1BB结合蛋白
本公开提供4-1BB结合蛋白，其包含免疫球蛋白单一可变结构域，所述免疫球蛋白单一可变结构域包含SEQ ID NO：12、20-23任一所示氨基酸序列中的CDR1、CDR2和CDR3，所述CDR1、CDR2和CDR3是根据Kabat、IMGT、Chothia、AbM或Contact编号系统定义的。所述免疫球蛋白单一可变结构是特异性结合4-1BB抗原或其片段的。
一些实施方案中，提供4-1BB结合蛋白，包含上述CDR1、CDR2和CDR3中的任意一个或其任意组合。
一些实施方案中，提供4-1BB结合蛋白，所述免疫球蛋白单一可变结构域的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：13、14、15所示，或如SEQ ID NO：13、14、24所示。其是根据Kabat编号系统定义的CDR。
一些实施方案中，前述4-1BB结合蛋白中的免疫球蛋白单一可变结构域为人源化的、亲和力成熟、去除/减少T细胞表位(TCE)、降低抗体脱酰胺和/或降低抗体异构化改造的。
一些实施方案中，所述免疫球蛋白单一可变结构域经过去除/减少TCE获得的，其在一个或多个CDR中具有一个或多个变化，所述变化导致4-1BB结合蛋白的免疫原性降低。
一些实施方案中，所述免疫球蛋白单一可变结构域是经过人源化改造的。所述人源化所使用的人种系模板的重链框架区(FR)源自IGHV3-64*04、IGHV3-23*03和/或IGHV3-74*01。一些实施方案中，FR1源自IGHV3-64*04，FR2源自IGHV3-23*03，FR3源自IGHV3-74*01
一些实施方案中，前述4-1BB结合蛋白中所述免疫球蛋白单一可变结构域的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：12、20-23任一所示，或与SEQ ID NO：12、20-23任一具有至少80％、至少90％序列同一性。
本公开中，“至少80％(序列)同一性”涵盖至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％(序列)同一性；“至少90％(序列)同一性”涵盖至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％(序列)同一性。
一些实施方案中，前述4-1BB结合蛋白中包含或为特异性结合4-1BB或其片段的抗体。一些具体实施方案中，所述抗体例如为骆驼抗体、嵌合抗体、人源化抗体、全人抗体。一些具体实施方案中，所述抗体例如为重组抗体或其片段。一些具体实施方案中，所述抗体为线性抗体、单链抗体、纳米抗体、肽抗体peptibody、结构域抗体和多特异性抗体(双特异性抗体、diabody、triabody和tetrabody、串联二-scFv、串联三-scFv)。
一些实施方案中，前述4-1BB结合蛋白中的免疫球蛋白单一可变结构域是VHH。
一些实施方案中，本公开提供4-1BB结合蛋白，其包含一个或多个(例如2、3、4、5、6、7、8个)前述免疫球蛋白单一可变结构域，所述免疫球蛋白单一可变结构域可以是相同或不同的，可以形成二聚体或多聚体分子。
一些实施方案中，前述4-1BB结合蛋白还包含人免疫球蛋白Fc区；例如，所述Fc区是人IgG1、IgG2或IgG4的Fc区。所述Fc区可以具有突变，示例性突变是IgG1上的L234A/L235A，IgG2上的V234A/G237A/P238S/H268A/V309L/A330S/P331S，IgG4上的F234A/L235A，IgG4上的S228P/F234A/L235A，IgG1、IgG2、IgG3或IgG4上的N297A，IgG2上的V234A/G237A，IgG1上的K214T/E233P/L234V/L235A/G236缺失/A327G/P331A/D365E/L358M，IgG2上的H268Q/V309L/A330S/P331S，IgG1上的S267E/L328F，IgG1上的L234F/L235E/D265A，IgG1上的L234A/L235A/G237A/P238S/H268A/A330S/P331S，IgG4上的S228P/F234A/L235A/G237A/P238S，以及IgG4上的S228P/F234A/L235A/G236缺失/G237A/P238S。还可使用杂合IgG2/4Fc域，例如具有来自IgG2的残基117-260和来自IgG4的残基261-447的Fc。一些具体的实施方案中，前述4-1BB结合蛋白包含人IgG1的Fc区，所述Fc具有C220A/S267E/L328F、C220A/L234A/L235A/N297A、S267E/L328F或L234A/L235A/N297A突变。一些具体的实施方案中，前述4-1BB结合蛋白包含人IgG4的Fc区，所述人IgG4的Fc区具有S228P突变。
一些实施方案中，前述4-1BB结合蛋白还包含人免疫球蛋白Fc区，所述Fc区如SEQID NO:16-18任一所示，或与SEQ ID NO:16-18任一具有至少80％、至少90％序列同一性。
一些实施方案中，提供4-1BB结合蛋白，其具有如SEQ ID NO:19所示的氨基酸序列或与之具有至少80％、至少90％序列同一性。
在本公开中Fc区所包含的突变的上下文中，“/”表示“和”，例如，“L234A/L235A”表示“L234A和L235A，即，Fc中包含L234A和L235A突变；突变的氨基酸位置是根据EU编号系统编号的。
一些实施方案中，前述4-1BB结合蛋白中包含的Fc区可以使所述结合蛋白形成二聚体分子，同时延长所述结合蛋白的体内半衰期。
一些实施方案中，前述4-1BB结合蛋白中免疫球蛋白单一可变结构域与Fc区直接或通过连接子连接。所述连接子可以是长1-20个或更多个氨基酸、无二级以上结构的非功能性氨基酸序列。例如，所述连接子是柔性连接子，例如G4S(SEQ ID NO:53)、GS、GAP、(G4S)2(SEQ ID NO:54)、(G4S)3(SEQ ID NO:55)、(G4S)4(SEQ ID NO:56)、(G4S)5(SEQ ID NO:57)、ASGS(SEQ ID NO:58)等，更例如是(G4S)2。
一些实施方案中，本公开的4-1BB结合蛋白为抗4-1BB抗体，或包含所述抗体的缀合物、融合蛋白。
一些实施方案中，前述4-1BB结合蛋白，具有选自以下至少一项的活性：
(a)以≤10-7的KD值与人4-1BB或其表位结合；
(b)未经FcγRIIb(即，CD32b)交联时，对4-1BB信号通路弱激活或不激活，例如，在100n抗体浓度下，未经FcγRIIb交联的激活程度不超过在经FcγRIIb交联时饱和抗体浓度条件下活性的10％；
(c)经FcγRIIb交联时，对4-1BB信号通路较强激活或强激活，例如，EC50小于1nM；
(d)激活T细胞和/或促T细胞增殖；
(e)抑制肿瘤生长；
其中，(b)、(c)中对4-1BB信号通路的激活检测例如参见实施例2的4-1BB/NF-κB荧光素酶报告基因检测方法。
一些实施方案中，本公开的前述4-1BB结合蛋白结合4-1BB的KD值可以≤1×10-7M，例如≤1×10-8M，或≤1×10-9M，或≤1×10-10M。
一些实施方案中，本公开的前述4-1BB结合蛋白能够抑制肿瘤生长至少约10％，例如至少约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％。
一些实施方案中，本公开的前述4-1BB结合蛋白涵盖变体，所述变体与SEQ ID NO:12、20-23任一相比有一个或多个(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个)氨基酸突变；所述氨基酸突变可以是保守的替换、取代或修饰，和/或不影响功能的缺失、添加；所述氨基酸突变可以发生在CDR区和/或FR区。
一些实施方案中，提供抗4-1BB抗体，其与前述本公开的4-1BB结合蛋白中的免疫球蛋白单一可变结构域结合或竞争结合相同的表位。
一些实施方案中，提供抗4-1BB抗体，其阻断前述本公开的4-1BB结合蛋白中的免疫球蛋白单一可变结构域与4-1BB(例如人4-1BB)的结合。一些具体实施方案中，所述抗4-1BB抗体也能激活T细胞和/或促T细胞增殖。
一些实施方案中，提供抗4-1BB抗体，其与4-1BB(例如人4-1BB)的结合被前述本公开的4-1BB结合蛋白中的免疫球蛋白单一可变结构域阻断。
一些实施方案中，提供蛋白或分子，其包含前述本公开任意一个或多个(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个)4-1BB结合蛋白中的免疫球蛋白单一可变结构域，所述免疫球蛋白单一可变结构域是相同的或不同的。例如，所述蛋白或分子为缀合物，所述缀合物例如可包含任意可检测标记。
CD47/4-1BB结合蛋白
本公开提供CD47/4-1BB结合蛋白，其包含特异性结合4-1BB的第一结合结构域、特异性结合CD47的第二结合结构域，能同时或分别特异性结合4-1BB和CD47。
关于特异性结合4-1BB的第一结合结构域：
一些实施方案中，所述CD47/4-1BB结合蛋白中特异性结合4-1BB的第一结合结构域包含免疫球蛋白单一可变结构域，所述免疫球蛋白单一可变结构域包含SEQ ID NO：12、20-23任一所示氨基酸序列中的CDR1、CDR2和CDR3，所述CDR1、CDR2和CDR3是根据Kabat、IMGT、Chothia、AbM或Contact编号系统定义的。所述免疫球蛋白单一可变结构是特异性结合4-1BB抗原或其片段的。
一些实施方案中，所述免疫球蛋白单一可变结构域包含上述CDR1、CDR2和CDR3中的任意一个或其任意组合。
一些实施方案中，所述免疫球蛋白单一可变结构域的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：13、14、15所示，或如SEQ ID NO：13、14、24所示。
一些实施方案中，所述免疫球蛋白单一可变结构域为人源化的、亲和力成熟、去除/减少T细胞表位、降低抗体脱酰胺和/或降低抗体异构化改造的。
一些实施方案中，所述免疫球蛋白单一可变结构域经过去除/减少T细胞表位获得的，其在一个或多个CDR中具有一个或多个变化，所述变化导致4-1BB结合蛋白的免疫原性降低。
一些实施方案中，所述免疫球蛋白单一可变结构域是经过人源化改造的。所述人源化所使用的人种系模板的重链框架区(FR)源自IGHV3-64*04、IGHV3-23*03和/或IGHV3-74*01。一些实施方案中，FR1源自IGHV3-64*04，FR2源自IGHV3-23*03，FR3源自IGHV3-74*01
一些实施方案中，所述免疫球蛋白单一可变结构域的氨基酸序列分别如SEQ IDNO：12、20-23任一所示，或与SEQ ID NO：12、20-23任一具有至少80％序列同一性。
一些实施方案中，所述CD47/4-1BB结合蛋白中特异性结合4-1BB的第一结合结构域包含Urelumab、Utomilumab、ADG106和WO2005035584A、WO2019037711A、US20190055314A1、WO2019014328A3、US20210206867A中的抗4-1BB抗体。本公开全文引入上述专利。
关于特异性结合CD47的第二结合结构域：
一些实施方案中，所述CD47/4-1BB结合蛋白中特异性结合CD47的第二结合结构域选自SIRPγ多肽、SIRPα多肽、抗CD47抗体。
本公开全文引入WO2020177733A、WO2022048616A中的SIRPγ多肽，其可作为本公开的SIRPγ多肽。
一些实施方案中，所述SIRPγ多肽是野生型SIRPγ多肽，例如SEQ ID NO：31所示的氨基酸序列。
一些实施方案中，所述SIRPγ多肽是在相当于如SEQ ID NO：31所示的野生型SIRPγ多肽的第51位具有氨基酸突变的SIRPγ多肽，例如氨基酸替代突变。一些具体实施方案中，是51M、51V、51F、51I、51L或51R突变；一些具体实施方案中，是N51突变；一些具体实施方案中，是N51M、N51V、N51F、N51I、N51L或N51R突变。一些具体实施方案中，前述第51位具有氨基酸替代突变的SIRPγ多肽基本不结合红细胞表面的CD47。
一些实施方案中，所述第51位突变的SIRPγ多肽相对于如SEQ ID NO：31所示的野生型SIRPγ多肽进一步地在第19位、第53位、第101位、第31位、第52位、第54位、第56位、第70位、第72位、第112位具有一个或多个位点的氨基酸突变，例如氨基酸替代突变。一些具体实施方案中，是K19、K53、N101、L31、Q52、E54、H56、N70、M72和M112中的一个或更多个位点的氨基酸替代突变。
一些实施方案中，所述第51位突变的SIRPγ多肽相对于如SEQ ID NO：31所示的野生型SIRPγ多肽进一步地在第19位、第53位、第101位具有一个或多个位点的氨基酸突变，例如氨基酸替代突变。一些具体实施方案中，是19E、53G、101D中的一个或更多个位点的氨基酸替代突变。一些具体实施方案中，是K19E、K53G、N101D中的一个或更多个位点的氨基酸替代突变，例如K19E/K53G/N101D。
一些实施方案中，所述SIRPγ多肽相对于如SEQ ID NO：31所示的野生型SIRPγ多肽在第19位、第51位、第52位、第53位、第54位、第72位、第101位具有一个或多个位点的氨基酸突变，例如氨基酸替代突变。一些具体实施方案中，是19E、51M或51V、52S、53G、54R、72K和101D中的一个或更多个位点的氨基酸替代突变。一些具体实施方案中，是K19E、N51M或N51V、Q52S、K53G、E54R、M72K和N101D中的一个或更多个位点的氨基酸替代突变，例如K19E/N51M/Q52S/K53G/E54R/M72K/N101D，或K19E/N51V/Q52S/K53G/E54R/M72K/N101D。
一些实施方案中，前述SIRPγ多肽相对于如SEQ ID NO：31所示的野生型SIRPγ多肽进一步地在第6位、第27位、第30位、第33位、第36位、第37位、第42位、第47位、第66位、第67位、第92位或第98位的一个或更多个位点具有氨基酸替代突变。一些具体实施方案中，是进一步地在M6、V27、L30、V33、V36、L37、V42、E47、L66、T67、V92或S98的一个或更多个位点具有氨基酸替代。
一些实施方案中，如前所述的具有突变的SIRPγ多肽具有结合肿瘤细胞表面CD47的活性，例如，所述SIRPγ多肽具有较野生型SIRPγ多肽增强地结合肿瘤细胞表面CD47的活性。
一些实施方案中，所述SIRPγ多肽具通式I(SEQ ID NO：32)所示的氨基酸序列：
EEELQMIQPE KLLLVTVGET ATLHCTVTSL X1PVGPVLWFR GVGPGRELIY X2X3GX4GX5FPRVTTVSDLTKRX6 NX7DFSIRISS ITPADVGTYY CVKFRKGSPE DVEFKSGPGT EX8ALGAKPS(SEQ ID NO：32)
其中，X1选自L或W，X2选自M、V、F、I或L，X3选自Q、S或T，X4选自E、T或R，X5选自H或R，X6选自D、N或E，X7选自I、V、M、R或K，和X8选自M或V。
一些实施方案中，所述SIRPγ多肽具通式II(SEQ ID NO：33)所示的氨基酸序列：
EEELQMIQPE KLLLVTVGET ATLHCTVTSL X1PVGPVLWFR GVGPGRELIY RX3GX4GX5FPRVTTVSDLTKRX6 NX7DFSIRISS ITPADVGTYY CVKFRKGSPE DVEFKSGPGT EX8ALGAKPS(SEQ ID NO：33)
其中，X1选自L或W，X3选自Q、S或T，X4选自E、T或R，X5选自H或R，X6选自D、N或E，X7选自I、V、M、R或K，和X8选自M或V。
一些实施方案中，所述SIRPγ多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO：25、31、34-52所示，优选如SEQ ID NO：25所示。
>野生型SIRPγ多肽(SEQ ID NO：31)
EEELQMIQPEKLLLVTVGKTATLHCTVTSLLPVGPVLWFRGVGPGRELIYNQKEGHFPRVTTVSDLTKRNNMDFSIRISSITPADVGTYYCVKFRKGSPENVEFKSGPGTEMALGAKPS
>S58(SEQ ID NO:34)
EEELQMIQPEKLLLVTVGETATLHCTVTSLLPVGPVLWFRGVGPGRELIYMSGRGHFPRVTTVSDLTKRNNMDFSIRISSITPADVGTYYCVKFRKGSPEDVEFKSGPGTEMALGAKPS
>S79(SEQ ID NO:35)
EEELQMIQPEKLLLVTVGETATLHCTVTSLWPVGPVLWFRGVGPGRELIYRTGTGRFPRVTTVSDLTKRNNMDFSIRISSITPADVGTYYCVKFRKGSPEDVEFKSGPGTEVALGAKPS
>S15(SEQ ID NO:36)
EEELQMIQPEKLLLVTVGETATLHCTVTSLLPVGPVLWFRGVGPGRELIYVSGRGHFPRVTTVSDLTKRENRDFSIRISSITPADVGTYYCVKFRKGSPEDVEFKSGPGTEMALGAKPS
>S12(SEQ ID NO:37)
EEELQMIQPEKLLLVTVGETATLHCTVTSLLPVGPVLWFRGVGPGRELIYVSGRGHFPRVTTVSDLTKRENKDFSIRISSITPADVGTYYCVKFRKGSPEDVEFKSGPGTEMALGAKPS
>S19(SEQ ID NO:38)
EEELQMIQPEKLLLVTVGETATLHCTVTSLLPVGPVLWFRGVGPGRELIYVSGRGHFPRVTTVSDLTKRNNRDFSIRISSITPADVGTYYCVKFRKGSPEDVEFKSGPGTEMALGAKPS
>S85(SEQ ID NO:39)
EEELQMIQPEKLLLVTVGETATLHCTVTSLLPVGPVLWFRGVGPGRELIYVSGRGHFPRVTTVSDLTKRNNKDFSIRISSITPADVGTYYCVKFRKGSPEDVEFKSGPGTEMALGAKPS
>S37(SEQ ID NO:25)
EEELQMIQPEKLLLVTVGETATLHCTVTSLLPVGPVLWFRGVGPGRELIYMSGRGHFPRVTTVSDLTKRNNKDFSIRISSITPADVGTYYCVKFRKGSPEDVEFKSGPGTEMALGAKPS
>S38(SEQ ID NO:40)
EEELQMIQPEKLLLVTVGETATLHCTVTSLLPVGPVLWFRGVGPGRELIYFSGRGHFPRVTTVSDLTKRNNMDFSIRISSITPADVGTYYCVKFRKGSPEDVEFKSGPGT
EMALGAKPS
>S22(SEQ ID NO:41)
EEELQMIQPEKLLLVTVGETATLHCTVTSLLPVGPVLWFRGVGPGRELIYISG
RGHFPRVTTVSDLTKRNNMDFSIRISSITPADVGTYYCVKFRKGSPEDVEFKSGP
GTEMALGAKPS
>S29(SEQ ID NO:42)
EEELQMIQPEKLLLVTVGETATLHCTVTSLLPVGPVLWFRGVGPGRELIYLSGRGHFPRVTTVSDLTKRNNMDFSIRISSITPADVGTYYCVKFRKGSPEDVEFKSGPGT
EMALGAKPS
>S34(SEQ ID NO:43)
EEELQMIQPEKLLLVTVGETATLHCTVTSLLPVGPVLWFRGVGPGRELIYRSGRG
HFPRVTTVSDLTKRNNMDFSIRISSITPADVGTYYCVKFRKGSPEDVEFKSGPGT
EMALGAKPS
>S41(SEQ ID NO:44)
EEELQMIQPEKLLLVTVGETATLHCTVTSLLPVGPVLWFRGVGPGRELIYVSGRGHFPRVTTVSDLTKRNNMDFSIRISSITPADVGTYYCVKFRKGSPEDVEFKSGPGTEMALGAKPS
>S42(SEQ ID NO:45)
EEELQMIQPEKLLLVTVGETATLHCTVTSLLPVGPVLWFRGVGPGRELIYMSGRGHFPRVTTVSDLTKRNNIDFSIRISSITPADVGTYYCVKFRKGSPEDVEFKSGPGT
EMALGAKPS
>S43(SEQ ID NO:46)
EEELQMIQPEKLLLVTVGETATLHCTVTSLLPVGPVLWFRGVGPGRELIYMSGR
GHFPRVTTVSDLTKRNNRDFSIRISSITPADVGTYYCVKFRKGSPEDVEFKSGPGT
EMALGAKPS
>S44(SEQ ID NO:47)
EEELQMIQPEKLLLVTVGETATLHCTVTSLLPVGPVLWFRGVGPGRELIYMSGR
GHFPRVTTVSDLTKRNNVDFSIRISSITPADVGTYYCVKFRKGSPEDVEFKSGPGT
EMALGAKPS
>S45(SEQ ID NO:48)
EEELQMIQPEKLLLVTVGETATLHCTVTSLLPVGPVLWFRGVGPGRELIYMSGR
GHFPRVTTVSDLTKRDNMDFSIRISSITPADVGTYYCVKFRKGSPEDVEFKSGPG
TEMALGAKPS
>S46(SEQ ID NO:49)
EEELQMIQPEKLLLVTVGETATLHCTVTSLLPVGPVLWFRGVGPGRELIYMSGR
GHFPRVTTVSDLTKRENKDFSIRISSITPADVGTYYCVKFRKGSPEDVEFKSGPGT
EMALGAKPS
>S47(SEQ ID NO:50)
EEELQMIQPEKLLLVTVGETATLHCTVTSLLPVGPVLWFRGVGPGRELIYMSGR
GHFPRVTTVSDLTKRENKDFSIRISSITPADVGTYYCVKFRKGSPEDVEFKSGPGT
EVALGAKPS
>S48(SEQ ID NO:51)
EEELQMIQPEKLLLVTVGETATLHCTVTSLLPVGPVLWFRGVGPGRELIYRSGRG
HFPRVTTVSDLTKRNNKDFSIRISSITPADVGTYYCVKFRKGSPEDVEFKSGPGTE
MALGAKPS
>S49(SEQ ID NO:52)
EEELQMIQPEKLLLVTVGETATLHCTVTSLLPVGPVLWFRGVGPGRELIYRSGRG
HFPRVTTVSDLTKRENKDFSIRISSITPADVGTYYCVKFRKGSPEDVEFKSGPGTE
MALGAKPS
表1显示了不同SIRPγ多肽相对于野生型SIRPγ肽的氨基酸替代突变位点及示例性替代氨基酸残基。本公开全文引入WO2020177733A，包括其中的SIRPγ多肽(SIRPγ肽变体)及其功能、效果验证。
表1
一些实施方案中，本公开所述CD47/4-1BB结合蛋白中特异性结合CD47的第二结合结构域选自SIRPα多肽、抗CD47抗体，包括抗CD47抗体Magrolimab(Hu5F9)、Lemzoparlimab(TJC4)，以及WO2020098232A1、WO2018075960A1、WO2019042285A1、CN110461872A、US2021024598A1、WO2020012486A1、US2021206829A1和US2018371435A1中的抗CD47抗体、SIRPα多肽。本公开全文引入上述专利。
一些实施方案中，提供CD47/4-1BB结合蛋白，其包含特异性结合4-1BB的第一结合结构域、特异性结合CD47的第二结合结构域。
一些具体实施方案中，所述CD47/4-1BB结合蛋白中，特异性结合4-1BB的第一结合结构域包含免疫球蛋白单一可变结构域，所述免疫球蛋白单一可变结构域包含SEQ ID NO：12、20-23任一所示氨基酸序列中的CDR1、CDR2和CDR3，所述CDR1、CDR2和CDR3是根据Kabat、IMGT、Chothia、AbM或Contact编号系统定义的。一些具体实施方案中，根据Kabat编号系统，所述免疫球蛋白单一可变结构域的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：13、14、15所示，或如SEQ ID NO：13、14、24所示。一些具体实施方案中，所述免疫球蛋白单一可变结构域的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：12、20-23任一所示，或与SEQ ID NO：12、20-23任一具有至少80％、至少90％序列同一性。一些具体实施方案中，所述免疫球蛋白单一可变结构域为单域抗体或VHH。
一些具体实施方案中，所述CD47/4-1BB结合蛋白中，特异性结合CD47的第二结合结构域包含SIRPγ多肽，所述SIRPγ多肽包含或具有通式I(SEQ ID NO：32)或通式II(SEQID NO：33)所示的氨基酸序列。一些具体实施方案中，所述SIRPγ多肽包含或为SEQ ID NO：25、31、34-52任一所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO：25、31、34-52任一所示的氨基酸序列具有至少80％、至少90％的序列同一性。一些具体实施方案中，所述SIRPγ多肽为SEQ IDNO：25所示的氨基酸序列或与之具有至少80％、至少90％的序列同一性。
一些具体实施方案中，所述CD47/4-1BB结合蛋白中有一个或多个(例如2、3、4、5、6个)特异性结合4-1BB的第一结合结构域，和/或，有一个或多个(例如2、3、4、5、6个)特异性结合CD47的第二结合结构域。一些具体实施方案中，所述CD47/4-1BB结合蛋白中有2个特异性结合4-1BB的第一结合结构域，并且有2个特异性结合CD47的第二结合结构域。
一些具体实施方案中，所述CD47/4-1BB结合蛋白中，特异性结合4-1BB的第一结合结构域位于特异性结合CD47的第二结合结构域的N端；另一些实施方案中，特异性结合CD47的第二结合结构域位于特异性结合4-1BB的第一结合结构域的N端；另一些实施方案中，特异性结合4-1BB的第一结合结构域位于特异性结合CD47的第二结合结构域的N端和C端；另一些实施方案中，特异性结合CD47的第二结合结构域位于特异性结合4-1BB的第一结合结构域的N端和C端。
一些具体实施方案中，所述CD47/4-1BB结合蛋白还包含人免疫球蛋白Fc区。一些实施方案中，所述Fc区可以使所述结合蛋白形成二聚体分子，同时延长所述结合蛋白的体内半衰期。例如，所述Fc区是人IgG1、IgG2或IgG4的Fc区。所述Fc区可以具有突变，示例性突变是IgG1上的L234A/L235A，IgG2上的V234A/G237A/P238S/H268A/V309L/A330S/P331S，IgG4上的F234A/L235A，IgG4上的S228P/F234A/L235A，IgG1、IgG2、IgG3或IgG4上的N297A，IgG2上的V234A/G237A，IgG1上的K214T/E233P/L234V/L235A/G236缺失/A327G/P331A/D365E/L358M，IgG2上的H268Q/V309L/A330S/P331S，IgG1上的S267E/L328F，IgG1上的L234F/L235E/D265A，IgG1上的L234A/L235A/G237A/P238S/H268A/A330S/P331S，IgG4上的S228P/F234A/L235A/G237A/P238S，以及IgG4上的S228P/F234A/L235A/G236缺失/G237A/P238S。还可使用杂合IgG2/4Fc域，例如具有来自IgG2的残基117-260和来自IgG4的残基261-447的Fc。一些具体的实施方案中，所述CD47/4-1BB结合蛋白包含人IgG1的Fc区，所述Fc具有C220A/S267E/L328F、C220A/L234A/L235A/N297A、S267E/L328F或L234A/L235A/N297A突变。一些具体的实施方案中，所述CD47/4-1BB结合蛋白包含人IgG4的Fc区，所述人IgG4的Fc区具有S228P突变。
一些具体实施方案中，所述CD47/4-1BB结合蛋白中，所述特异性结合4-1BB的第一结合结构域与特异性结合CD47的第二结合结构域直接或通过连接子连接。一些具体实施方案中，所述特异性结合4-1BB的第一结合结构域与Fc区直接或通过连接子连接。一些具体实施方案中，所述特异性结合CD47的第二结合结构域与Fc区直接或通过连接子连接。
一些具体实施方案中，所述包括但不限于如(GmSn)h或(GGNGT)h或(YGNGT)h或(EPKSS)h所示的氨基酸序列，其中m，n各自独立地选自1-8的整数(例如，1、2、3、4、5、6、7或8)，h独立地选自1-20的整数(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20)。一些具体实施方案中，所述连接子可以是长1-20个或更多个氨基酸、无二级以上结构的非功能性氨基酸序列。一些具体实施方案中，所述连接子是柔性连接子。一些具体实施方案中，所述连接子选自G4S、GS、GAP、(G4S)2、(G4S)3、(G4S)4、(G4S)5、ASGS，例如为(G4S)2。
一些具体实施方案中，所述CD47/4-1BB结合蛋白包含多肽链，所述多肽链从N端到C端如下：
(1)[特异性结合4-1BB的第一结合结构域]-Fc区-[连接子1]a-[特异性结合CD47的第二结合结构域]
(2)[特异性结合CD47的第二结合结构域]-Fc区-[连接子1]a-[特异性结合4-1BB的第一结合结构域]
(3)[特异性结合4-1BB的第一结合结构域]-[连接子1]a-[特异性结合CD47的第二结合结构域]-Fc区
(4)[特异性结合CD47的第二结合结构域]-[连接子1]a-[特异性结合4-1BB的第一结合结构域]-Fc区
(5)Fc区-[连接子1]b-[特异性结合4-1BB的第一结合结构域]-[连接子1]a-[特异性结合CD47的第二结合结构域]
(6)Fc区-[连接子1]b-[特异性结合CD47的第二结合结构域]-[连接子1]a-[特异性结合4-1BB的第一结合结构域]
其中，-表示肽键，连接子为能够实现连接功能的多肽，连接子1、连接子2，可以相同，也可以不同。所述连接子例如选自G4S、GS、GAP、(G4S)2、(G4S)3、(G4S)4、(G4S)5、ASGS，例如为(G4S)2。
一些具体实施方案中，提供CD47/4-1BB结合蛋白，其包含多肽链，所述多肽链的氨基酸序列如SEQ ID NO:26-30任一所示，或与SEQ ID NO:26-30任一具有至少80％、至少90％序列同一性。一些具体实施方案中，所述多肽链的氨基酸序列如SEQ ID NO:26所示或与之具有至少80％、至少90％序列同一性。
一些实施方案中，本公开的CD47/4-1BB结合蛋白，具有选自以下至少一项的活性：
(a)以≤10-7的KD值与人4-1BB或其表位结合；
(b)未经FcγRIIb(即，CD32b)交联时，对4-1BB信号通路弱激活或不激活，例如，在100n抗体浓度下，未经FcγRIIb交联的激活程度不超过在经FcγRIIb交联时饱和抗体浓度条件下活性的10％；
(c)经FcγRIIb交联时，对4-1BB信号通路较强激活或强激活，例如，EC50小于1nM；
(d)激活T细胞和/或促T细胞增殖；
(e)抑制肿瘤生长；
(f)具有相对野生型SIRPγ多肽(例如SEQ ID NO:31)增强的结合肿瘤细胞表面CD47的活性；
(g)具有相对野生型SIRPγ多肽(例如SEQ ID NO:31)降低的结合红细胞表面的CD47水平，或不结合、基本不结合红细胞表面的CD47，或不引起实质性的红细胞减少、贫血或红细胞凝集；
(h)具有低免疫原性，或具有低的与预存抗药抗体(pre-ADA)结合水平；
(i)促进巨噬细胞介导的对表达CD47细胞的吞噬作用(ADCP)；
(j)阻断CD47与SIRPα的结合；
其中，(b)、(c)中对4-1BB信号通路的激活检测例如参见实施例2的4-1BB/NF-κB荧光素酶报告基因检测方法。
一些实施方案中，本公开的CD47/4-1BB结合蛋白能够抑制肿瘤生长至少约10％，例如至少约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％。
一些实施方案中，本公开的CD47/4-1BB结合蛋白涵盖变体，所述变体与SEQ IDNO:26-30任一相比有一个或多个(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个)氨基酸突变；所述氨基酸突变可以是保守的替换、取代或修饰，和/或不影响功能的缺失、添加。
一些实施方案中，提供CD47/4-1BB结合蛋白，其与前述本公开的CD47/4-1BB结合蛋白结合或竞争结合CD47和/或4-1BB，或，结合或竞争结合CD47和/或4-1BB的相同表位。
一些实施方案中，提供CD47/4-1BB结合蛋白，其阻断前述本公开的CD47/4-1BB结合蛋白结合CD47和/或4-1BB。
一些实施方案中，提供蛋白或分子，其包含前述本公开任意的CD47/4-1BB结合蛋白。例如，所述蛋白或分子为缀合物，所述缀合物例如可包含任意可检测标记。
多核苷酸和载体
本公开提供编码本公开的4-1BB结合蛋白、CD47/4-1BB结合蛋白的多核苷酸。本公开的核酸可为RNA、DNA或cDNA。根据本公开的一些实施方案，本公开的核酸是基本上分离的核酸。
本公开的核酸也可呈载体形式，可存在于载体中和/或可为载体的一部分，该载体例如质粒、粘端质粒、YAC或病毒载体。载体可尤其为表达载体，即可提供4-1BB结合蛋白、CD47/4-1BB结合蛋白体外和/或体内(即在适合宿主细胞、宿主有机体和/或表达系统中)表达的载体。该表达载体通常包含至少一种本公开的核酸，其可操作地连接至一个或多个适合的表达调控元件(例如启动子、增强子、终止子等)。针对在特定宿主中的表达对所述元件及其序列进行选择为本领域技术人员的常识。对本公开的4-1BB结合蛋白、CD47/4-1BB结合蛋白表达有用或必需的调控元件及其他元件例如为启动子、增强子、终止子、整合因子、选择标记物、前导序列、报告基因。
本公开的核酸可基于本公开的多肽的氨基酸序列的信息通过已知的方式(例如通过自动DNA合成和/或重组DNA技术)制备或获得，和/或可从适合的天然来源加以分离。
宿主细胞
本公开提供表达或能够表达一种或多种本公开的4-1BB结合蛋白、CD47/4-1BB结合蛋白和/或含有本公开的多核苷酸或载体的重组宿主细胞。一些实施方案中，宿主细胞为细菌细胞、真菌细胞或哺乳动物细胞。
细菌细胞例如包括革兰氏阴性细菌菌株(例如大肠杆菌(Escherichia coli)菌株、变形杆菌属(Proteus)菌株及假单胞菌属(Pseudomonas)菌株)及革兰氏阳性细菌菌株(例如芽孢杆菌属(Bacillus)菌株、链霉菌属(Streptomyces)菌株、葡萄球菌属(Staphylococcus)菌株及乳球菌属(Lactococcus)菌株)的细胞。
真菌细胞例如包括木霉属(Trichoderma)、脉孢菌属(Neurospora)及曲菌属(Aspergillus)的物种的细胞；或者包括酵母属(Saccharomyces)(例如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae))、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)(例如粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe))、毕赤酵母属(Pichia)(例如巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris)及嗜甲醇毕赤酵母(Pichia methanolica))及汉森酵母属(Hansenula)的物种的细胞。
哺乳动物细胞例如包括例如HEK293细胞、CHO细胞、BHK细胞、HeLa细胞、COS细胞等。
然而，本公开也可使用两栖类细胞、昆虫细胞、植物细胞及本领域中用于表达异源蛋白的任何其他细胞。
制备方法
本公开提供一种用于制备4-1BB结合蛋白、CD47/4-1BB结合蛋白的方法，包括：在如前所述的宿主细胞中表达所述目的蛋白，并自该宿主细胞中分离目的蛋白。可选地，还可以包含纯化步骤，例如，用含调整过的缓冲液的A或G Sepharose FF柱进行纯化，洗去非特异性结合的组分，再用PH梯度法洗脱结合的抗体，用SDS-PAGE检测，收集。可选地，用常规方法进行过滤浓缩。可溶的混合物和多聚体，也可以用常规方法去除，比如分子筛、离子交换。得到的产物需立即冷冻，如-70℃，或者冻干。
生产和纯化抗体的方法在现有技术中熟知和能找到，如冷泉港的抗体实验技术指南(5-8章和15章)。
本公开工程化的抗体或抗原结合片段可用常规方法制备和纯化。比如，编码重链和轻链的cDNA序列，可以克隆并重组至表达载体。重组的免疫球蛋白表达载体可以稳定地转染CHO细胞。哺乳动物类表达系统会导致抗体的糖基化，特别是在Fc区的高度保守N端。通过表达与人源抗原特异性结合的抗体得到稳定的克隆。阳性的克隆在生物反应器的无血清培养基中扩大培养以生产抗体。分泌了抗体的培养液可以用常规技术纯化、收集。抗体可用常规方法进行过滤浓缩。可溶的混合物和多聚体，也可以用常规方法去除，比如分子筛，离子交换。
组合物
本公开提供组合物，包含前述本公开的4-1BB结合蛋白、CD47/4-1BB结合蛋白。例如，提供药物组合物，其含有对癌症治疗、缓解或预防有效量的前述4-1BB结合蛋白和/或CD47/4-1BB结合蛋白，和至少一种可药用的赋形剂、稀释或载体。
在一些具体实施方案中，所述药物组合物单位计量中可含有0.01至99重量％的4-1BB结合蛋白、CD47/4-1BB结合蛋白，或药物组合物单位剂量中含4-1BB结合蛋白、CD47/4-1BB结合蛋白的量为0.1-2000mg，在一些具体实施方案中为1-1000mg。
在一些实施方案中，组合物中进一步包含抗CD20抗体。例如，利妥昔单抗(rituximab)、奥法妥木单抗(ofatumumab)、ublituximab、和/或替伊莫单抗(ibritumomabtiuxetan)。
一些实施方案中，提供制品或产品(如试剂盒)，其包含至少一个容器，所述容器独立地包含前述4-1BB结合蛋白或CD47/4-1BB结合蛋白。可选地，制品包含容器和标签。容器例如瓶、注射器和试管。容器容纳有效于治疗病症的组合物。容器上或与容器相连的标签表明所述组合物用于治疗所选病症。
治疗方法和制药用途
本公开提供前述4-1BB结合蛋白、CD47/4-1BB结合蛋白、多核苷酸、组合物(包括药物组合物)用于治疗、缓解、预防、诊断疾病或病症的方法。
一些实施方案中，提供改善、缓解、治疗或预防疾病的方法，包括向受试者施用改善、缓解、治疗或预防有效量的前述4-1BB结合蛋白、CD47/4-1BB结合蛋白、多核苷酸、组合物(包括药物组合物)。
一些实施方案中，提供本公开的4-1BB结合蛋白、CD47/4-1BB结合蛋白、多核苷酸、组合物(包括药物组合物)用于制备改善、缓解、治疗或预防疾病的药物的用途。
一些实施方案中，前述疾病为增殖性病症或者任何特征在于不受控细胞生长的其它疾病或病症，例如癌症。本公开中，癌症和肿瘤可互相替代使用。
一些实施方案中，前述癌症为实体瘤或血液肿瘤。
一些实施方案中，前述癌症为晚期或转移性的。
一些实施方案中，前述癌症为4-1BB和/或CD47相关。
一些实施方案中，前述癌症选自以下或其组合：肺癌、前列腺癌、乳腺癌、头颈部癌、食管癌、胃癌、结肠癌、结直肠癌、膀胱癌、宫颈癌、子宫癌、卵巢癌、肝癌、黑色素瘤、肾癌、鳞状细胞癌、血液系统癌症或者任何特征在于不受控细胞生长的其它疾病或病症。
检测
本公开提供4-1BB结合蛋白、CD47/4-1BB结合蛋白、多核苷酸、组合物的检测用途。本公开还提供用于体内或体外检测4-1BB、CD47的方法、系统或装置，其包括用本公开的前述结合蛋白、多核苷酸、组合物处理样品。
一些实施方案中，体外检测方法、系统或装置可能例如包括：
(1)使样品与本公开的4-1BB结合蛋白、CD47/4-1BB结合蛋白、多核苷酸、组合物接触；
(2)检测在前述结合蛋白、多核苷酸和样品之间形成的复合物；和/或
(3)使参比样品(例如，对照样品)与结合蛋白、核酸接触；和
(4)通过与参比样品比较，确定复合物形成的程度。如与对照样品或受试者中相比，样品或受试者中复合物形成的变化(例如，统计学上的显著变化)表示样品中存在4-1BB结合蛋白、CD47/4-1BB结合蛋白。
另一些实施方案中，体内检测方法、系统或装置可以包括：
(1)向受试者施用本公开的4-1BB结合蛋白、CD47/4-1BB结合蛋白、多核苷酸；和
(2)检测在结合前述结合蛋白、多核苷酸和受试者之间复合物的形成。
检测可以包括确定形成复合物的位置或时间。用可检测物质对前述结合蛋白、多核苷酸标记，通过对所述标记检测以实现对能结合的蛋白、多核苷酸的物质(例如4-1BB结合蛋白、CD47/4-1BB结合蛋白)的检测。合适的可检测物质包括多种酶、辅基、荧光物质、发光物质和放射性物质。可以通过测量与4-1BB、CD47结合或不结合的物质或使其可视化，检测结合蛋白、多核苷酸与4-1BB、CD47的复合物形成。可以使用常规检测测定法，例如，酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射免疫测定(RIA)或组织免疫组织化学。出于检测目的，本公开的结合蛋白、多核苷酸可以用荧光团发色团标记。
一些实施方案中，还提供试剂盒，所述试剂盒包含前述4-1BB结合蛋白、CD47/4-1BB结合蛋白、多核苷酸，还可以包含诊断使用说明。试剂盒还可以含有至少一种额外的试剂，如标记物或额外的诊断剂。对于体内使用，4-1BB结合蛋白、CD47/4-1BB结合蛋白可以配制为药物组合物。
术语定义
为了更容易理解本公开，以下具体定义了某些技术和科学术语。除非在本公开中另有明确定义，本公开使用的所有其它技术和科学术语都具有本公开所属领域的一般技术人员通常理解的含义。
本公开所用氨基酸三字母代码和单字母代码如J.biol.chem，243，p3558(1968)中所述。
“CD47蛋白”或“CD47”又称整联蛋白相关蛋白(integrin associated protein，IAP)，其属于免疫球蛋白超家族。CD47蛋白可与膜整合素(membrane integrins)、凝血栓蛋白-1(thrombospondin-1，TSP-1)或信号调节蛋白α(signal-regulatory protein alpha，SIRPα)结合，也可与信号调节蛋白γ(signal-regulatory protein alpha，SIRPγ)结合。CD47蛋白可以表达于细胞膜表面，在多种肿瘤中表达或过度表达。所述CD47蛋白可以为由特定的整联蛋白、G蛋白及胆固醇组成的超分子复合物。本公开中，CD47蛋白可为人CD47蛋白，其在GenBank数据库的登录号为CEJ95640.1。
“SIRPγ多肽”或“SIRPγ”又称为SIRPg、SIRPgamma、CD172g或SIRP beta 2，表达在人T细胞表面。本公开中，“SIRPγ多肽”或“SIRPγ”是指能够结合CD47的任何SIRPγ多肽或其片段、变体，野生型SIRPγ肽的氨基酸序列例如SEQ ID NO：31所示。
“4-1BB蛋白”或“4-1BB”又称CD137、肿瘤坏死因子受体超家族9，是TNF受体超家族(TNFRSF)的成员，是表达在CD8+和CD4+T细胞、调节性T细胞(Tregs)、NK细胞和NKT细胞、B细胞和中性粒细胞等细胞表面的共刺激分子。4-1BB属于共刺激分子，在免疫细胞被激活后表达。人4-1BB蛋白在NCBI登录号为NP_001552.2。本公开中，“4-1BB”可以任选地包括任何这类蛋白质或其片段、变体，包括(但不限于)如本公开所述的已知或野生型4-1BB，以及任何天然产生的剪接变体、氨基酸变体或同工型，例如SEQ ID NO:11所示的人4-1BB。
“4-1BB结合蛋白”涵盖任何能够特异性结合4-1BB的蛋白或其表位的任何分子，包括但不限于针对4-1BB的如本公开定义的抗体、其抗原结合片段或其缀合物。本公开的“4-1BB结合蛋白”可以包含至少一个(例如1、2、3、4、5、6或更多个)结合4-1BB的免疫球蛋白单一可变结构域(如VHH)。本公开的“4-1BB结合蛋白”除包含4-1BB的免疫球蛋白单一可变结构域外，也可包含连接子和/或具有效应器功能的部分，例如半衰期延长部分(如结合血清白蛋白的免疫球蛋白单一可变结构域)和/或融合配偶体(如血清白蛋白)和/或缀合的聚合物(如PEG)和/或Fc区。在一些实施方案中，本公开的“4-1BB结合蛋白”还涵盖双/多特异性抗体，其含有结合不同抗原的免疫球蛋白(如结合第一抗原(如4-1BB结合蛋白)的第一抗体和结合第二抗原的第二抗体，可选的，包括结合第三抗原的第三抗体，进一步可选的，包括结合第四抗原的第四抗体。
“CD47/4-1BB结合蛋白”涵盖任何能够特异性结合CD47蛋白或其表位和4-1BB蛋白或其表位的任何分子，包括但不限于抗体、多肽、抗体和多肽的融合蛋白(例如抗4-1BB抗体和SIRPγ多肽的融合蛋白)或其缀合物。一些实施方案中，“CD47/4-1BB结合蛋白”涵盖本公开实施例中的CD47/4-1BB双特异性融合蛋白。
“抗体”涵盖各种抗体结构，包括但不限于单克隆抗体，多克隆抗体；单特异性抗体，多特异性抗体(例如双特异性抗体)，全长抗体和抗体片段(或抗原结合片段，或抗原结合部分)，只要它们展现出期望的抗原结合活性。
抗体可以指免疫球蛋白，是由两条重链和两条轻链通过链间二硫键连接而成的四肽链结构。免疫球蛋白重链恒定区的氨基酸组成和排列顺序不同，故其抗原性也不同。据此，可将免疫球蛋白分为五类，或称为免疫球蛋白的同种型，即IgM、IgD、IgG、IgA和IgE，其相应的重链分别为μ链、δ链、γ链、α链和ε链。同一类Ig根据其铰链区氨基酸组成和重链二硫键的数目和位置的差别，又可分为不同的亚类，如IgG可分为IgG1、IgG2、IgG3、IgG4。轻链通过恒定区的不同分为κ链或λ链。五类Ig中第每类Ig都可以有κ链或λ链。抗体重链和轻链靠近N端的约110个氨基酸的序列变化很大，为可变区(V区)；靠近C端的其余氨基酸序列相对稳定，为恒定区(C区)。可变区包括3个高变区(HVR)和4个序列相对保守的框架区(FR)。3个高变区决定抗体的特异性，又称为互补性决定区(CDR)。每条轻链可变区(VL)和重链可变区(VH)由3个CDR区4个FR区组成，从氨基端到羧基端依次排列的顺序为：FR1，CDR1，FR2，CDR2，FR3，CDR3，FR4。轻链的3个CDR区指LCDR1，LCDR2，和LCDR3；重链的3个CDR区指HCDR1，HCDR2和HCDR3。
本公开的抗体可以是多克隆的、单克隆的、异种的、同种异体的、同基因的或其经过修饰的形式，其中单克隆抗体尤其适用于多个实施例中。一般来说，本公开的抗体是重组抗体。如本文所用的“重组”泛指例如细胞或核酸、蛋白质或载体等产品，表示所述细胞、核酸、蛋白质或载体已经通过引入异源核酸或蛋白质或改变天然核酸或蛋白质而加以修饰，或所述细胞来源于如此修饰的细胞。例如，重组细胞表达天然(非重组)细胞形式内不存在的基因或表达原本异常表达、低表达或完全不表达的天然基因。
“抗原结合片段”涵盖单链抗体(即全长重链和轻链)；Fab、修饰的Fab、Fab’、修饰的Fab’、F(ab’)2、Fv、Fab-Fv、Fab-dsFv、单结构域抗体(例如VH或VL或VHH)、scFv、二价或三价或四价抗体、Bis-scFv、diabody、tribody、triabody、tetrabody和上述任意一种的表位结合片段(参见例如Holliger and Hudson,2005,Nature Biotech.23(9)：1126-1136；Adair and Lawson,2005,Drug Design Reviews-Online2(3),209-217)。产生和制备这些抗原结合片段的方法在本领域是公知的(参见例如Verma等人,1998,JournalofImmunological Methods,216,165-181)。
对于CDR的确定或定义，能够通过分辨抗体的结构和/或分辨抗体-配体复合物的结构来完成CDR的确定性描绘和对抗体的结合位点的残基的鉴定。这可通过本领域技术人员已知的各种技术中的任一种，例如X射线晶体学来实现。多种分析方法可用于鉴定CDR，包括但不限于Kabat编号系统、Chothia编号系统、AbM编号系统、IMGT编号系统、接触定义、构象定义。Kabat编号系统是用于编号抗体中残基的标准并且通常用于鉴定CDR区域(参见例如Johnson&Wu，2000，Nucleic Acids Res.，28：214-8)。Chothia编号系统与Kabat编号系统类似，但Chothia编号系统考虑了某些结构环区域的位置。(参见例如Chothia等，1986，J.Mol.Biol.，196：901-17；Chothia等人，1989，Nature，342：877-83)。AbM编号系统使用建模抗体结构的由Oxford Molecular Group生产的计算机程序集成套件(参见例如Martin等，1989，ProcNatl Acad Sci(USA)，86：9268-9272；“AbMTM，A Computer Program forModelingVariable Regions of Antibodies，”Oxford，UK；Oxford Molecular，Ltd)。AbM编号系统使用知识数据库和从头开始方法的组合，从基本序列建模抗体的三级结构(参见Samudrala等，1999，在PROTEINS，Structure，Function and Genetics Suppl.，3：194-198中的“Ab Initio Protein Structure Prediction Using a CombinedHierarchicalApproach”描述的那些)。接触定义基于可用复杂晶体结构的分析(参见例如MacCallum等，1996，J.Mol.Biol.，5：732-45)。构象定义中，CDR的位置可鉴定为对抗原结合做出焓贡献的残基(参见例如Makabe等，2008，Journal ofBiological Chemistry，283：1156-1166)。另外其它的CDR边界定义可能不严格遵循上述方法之一，但仍然与Kabat CDR的至少一部分重叠，尽管根据特定残基或残基组不显著影响抗原结合的预测或实验结果，它们可缩短或延长。如本公开使用的，CDR可指通过本领域已知的任何方法(包括方法的组合)定义的CDR。各种编号系统之间的对应关系是本领域技术人员熟知的。
多肽或蛋白的“结构域”是指折叠蛋白结构，其能够独立于蛋白的其余部分维持其三级结构。一般而言，结构域负责蛋白的特定功能性质，且在许多情况下可添加、移除或转移至其它蛋白而不损失蛋白的其余部分和/或结构域的功能。
“免疫球蛋白结构域”是指抗体链(例如常规四肽链结构抗体的链或重链抗体的链)的球形区域，或是指基本上由这类球形区域组成的多肽。免疫球蛋白结构域的特征在于其维持抗体分子的免疫球蛋白折叠特征。
“免疫球蛋白可变结构域”是指基本上由本领域及下文中分别称为“框架区1”或“FR1”、“框架区2”或“FR2”、“框架区3”或“FR3”、及“框架区4”或“FR4”的四个“框架区”组成的免疫球蛋白结构域，其中所述框架区由本领域及下文中分别称为“互补决定区1”或“CDR1”、“互补决定区2”或“CDR2”、及“互补决定区3”或“CDR3”的三个“互补决定区”或“CDR”间隔开。因此，免疫球蛋白可变结构域的一般结构或序列可如下表示为：FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4。免疫球蛋白可变结构域因具有抗原结合位点而赋予其对抗原的特异性。
“抗体框架(FR)”，是指可变结构域的一部分，其用作该可变结构域的互补决定区(CDR)的支架。
“免疫球蛋白单一可变结构域”通常用于指在不与其他可变结构域相互作用的情况下(例如在没有如常规四链单克隆抗体的VH和VL结构域之间所需要的VH/VL相互作用的情况下)，能够形成功能性抗原结合位点的免疫球蛋白可变结构域(其可以是重链或轻链结构域，包括VH、VHH或VL结构域)。“免疫球蛋白单一可变结构域”的实例包括纳米抗体(包括VHH、人源化VHH和/或骆驼化VH，例如骆驼化人VH)、IgNAR、结构域、作为VH结构域或衍生自VH结构域的(单结构域)抗体(诸如dAbsTM)和作为VL结构域或衍生自VL结构域的(单结构域)抗体(诸如dAbsTM)。基于和/或衍生自重链可变结构域(诸如VH或VHH结构域)的免疫球蛋白单一可变结构域通常是优选的。免疫球蛋白单一可变结构域的一个具体实例为如下文定义的“VHH结构域”(或简称为“VHH”)。
“VHH结构域”，亦称为重链单域抗体、VHH、VHH结构域、VHH抗体片段、VHH抗体、纳米抗体，是称为“重链抗体”(即“缺乏轻链的抗体”)的抗原结合免疫球蛋白的可变结构域(Hamers-Casterman C，Atarhouch T，Muyldermans S，Robinson G，Hamers C，Songa EB，Bendahman N，Hamers R.:“Naturally occurring antibodies devoid of lightchains”；Nature363，446-448(1993))。使用术语“VHH结构域”以将所述可变结构域与存在于常规四肽链结构抗体中的重链可变结构域(其在本公开中称为“VH结构域”)以及轻链可变结构域(其在本公开中称为“VL结构域”)进行区分。VHH结构域特异性结合表位而无需其他抗原结合结构域(此与常规四肽链结构抗体中的VH或VL结构域相反，在该情况下表位由VL结构域与VH结构域一起识别)。VHH结构域为由单一免疫球蛋白结构域形成的小型稳定及高效的抗原识别单元。术语“重链单域抗体”、“VHH结构域”、“VHH”、“VHH结构域”、“VHH抗体片段”、“VHH抗体”、以及““/>结构域””(“Nanobody”为Ablynx N.V.公司，Ghent，Belgium的商标)可互换使用。“VHH结构域”包括但不限于经骆驼科动物产生的天然抗体，也可以是骆驼科动物产生的抗体后再经人源化的，也可以是经噬菌体体展示技术筛选获得的。VHH结构域中的氨基酸残基的总数将通常在110至120范围内，常常介于112与115之间。然而应注意较小及较长序列也可适于本公开所述的目的。获得结合特定抗原或表位的VHH的方法，先前已公开于以下文献中：R.van der Linden et al.，Journal ofImmunological Methods，240(2000)185-195；Li et al.，J Biol Chem.，287(2012)13713-13721；Deffar et al.，African Journal of Biotechnology Vol.8(12)，pp.2645-2652，17June，2009和WO94/04678。
如本领域中对于VH结构域及VHH结构域所公知的，各CDR中的氨基酸残基的总数可能不同，且可能不对应于由Kabat编号指示的氨基酸残基的总数(即根据Kabat编号的一个或多个位置可能在实际序列中未被占据，或实际序列可能含有多于Kabat编号所允许数目的氨基酸残基)。这意味着一般而言，根据Kabat的编号可能对应或可能不对应于实际序列中氨基酸残基的实际编号。其它的编号系统或编码规则包括Chothia、IMGT、AbM。
“人源化抗体(humanized antibody)”，也称为CDR移植抗体(CDR-graftedantibody)，是指将非人CDR序列移植到人的抗体可变区框架中产生的抗体。可以克服嵌合抗体由于携带大量非人蛋白成分，从而诱导的强烈的免疫应答反应。为避免在免疫原性下降的同时引起活性的下降，可对所述的全人抗体可变区可进行最少反向突变，以保持活性。“人源化”的例子包括可将源自骆驼科的VHH结构域通过以人常规四肽链结构抗体VH结构域中相应位置处存在的一个或多个氨基酸残基置换原始VHH序列的氨基酸序列中的一个或多个氨基酸残基而“人源化”(本公开中亦称为“序列优化”，除人源化外，“序列优化”也可涵盖通过提供VHH改良性质的一个或多个突变对序列进行的其它修饰，例如移除潜在的翻译后修饰位点)。人源化VHH结构域可含有一个或多个完全人框架区序列，且在一些具体实施方案中，可含IGHV3的人框架区序列。“人源化”的又一例子包括将小鼠的CDR序列移植到人的抗体可变区框架，即不同类型的人种系抗体构架序列中产生的抗体。可以克服嵌合抗体由于携带大量小鼠蛋白成分，从而诱导的强烈的抗体可变抗体反应。人源化方法例如蛋白表面氨基酸人源化(resurfacing)及抗体人源化通用框架移植法(CDR grafting to auniversal framework)，即将CDR“移植”于其它“支架”(包括但不限于人支架或非免疫球蛋白支架)上。适于所述CDR移植的支架及技术在本领域中是已知的。如人重链和轻链可变区基因的种系DNA序列可以在“VBase”人种系序列数据库，以及在Kabat，E.A.等人，1991Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版中找到。本公开的人源化抗体也包括进一步由噬菌体展示对CDR进行亲和力成熟后的人源化抗体。此外，为避免免疫原性下降的同时，引起的活性下降，可对所述的人抗体可变区框架序列进行最少反向突变或回复突变，以保持活性。
“亲和力成熟的”抗体指与不拥有此类改变的亲本抗体相比，在一个或多个高变区(HVR)中具有一处或多处改变的抗体,此类改变导致该抗体对抗原的亲和力改善。例如，“亲和力成熟”的4-1BB结合蛋白或抗4-1BB抗体，在一个或多个CDR中具有一个或多个变化，所述变化导致对抗原的亲和力相比于其亲本抗体有所增加。亲和力成熟的抗体可通过例如由以下所述的本领域中已知的方法来制备：Marks等人，1992，Biotechnology 10：779-783或Barbas等人，1994，Proc.Nat.Acad.Sci，USA91：3809-3813.；Shier等人，1995，Gene 169：147-155；Yelton等人，1995，Immunol.155：1994-2004；Jackson等人，1995，J.Immunol.154(7)：3310-9；及Hawkins等人，1992，J.MoI.Biol.226(3)：889896；KS Johnson及REHawkins，“Affinity maturation of antibodies using phage display”，OxfordUniversity Press 1996。
通常，本公开的4-1BB结合蛋白、CD47/4-1BB结合蛋白将以如于Biacore或KinExA或Fortibio测定中测量的优选10-7至10-10摩尔/升(M)、更优选10-8至10-10摩尔/升、甚至更优选10-9至10-10或更低的解离常数(KD)，和/或以至少10-7M、优选至少10-8M、更优选至少10- 9M，更优选至少10-10M的缔合常数(KA)结合所要结合的抗原或靶蛋白(即4-1BB、CD47)。任何大于10-4M的KD值一般都视为指示非特异性结合。抗原结合蛋白对抗原或表位的特异性结合可以以已知的任何适合方式来测定，包括例如本公开所述的表面等离子体共振术(SPR)测定、Scatchard测定和/或竞争性结合测定(例如放射免疫测定(RIA)、酶免疫测定(EIA)及夹心式竞争性测定)。
当“竞争”用于竞争相同表位的抗原结合蛋白(例如中和抗原结合蛋白或中和抗体)的情况中时，意指在抗原结合蛋白之间竞争，其通过以下测定法来测定：待检测的抗原结合蛋白(例如抗体或其免疫学功能片段)防止或抑制(例如降低)参考抗原结合蛋白(例如配体或参考抗体)与共同抗原(例如4-1BB抗原或其片段)的特异性结合。众多类型的竞争性结合测定可用于确定一种抗原结合蛋白是否与另一种竞争，这些测定例如：固相直接或间接放射免疫测定(RIA)、固相直接或间接酶免疫测定(EIA)、夹心竞争测定(参见例如Stahli等，1983，Methodsin Enzymology 9：242-253)；固相直接生物素-亲和素EIA(参见例如Kirkland等，1986，J.Immunol.137：3614-3619)、固相直接标记测定、固相直接标记夹心测定(参见例如Harlow和Lane，1988，Antibodies，A Laboratory Manual(抗体，实验室手册)，Cold Spring Harbor Press)；用I-125标记物的固相直接标记RIA(参见例如Morel等，1988，Molec.Immunol.25：7-15)；固相直接生物素-亲和素EIA(参见例如Cheung，等，1990，Virology176：546-552)；和直接标记的RIA(Moldenhauer等，1990，Scand.J.Immunol.32：77-82)。通常所述测定法涉及使用能与带有未标记的检测抗原结合蛋白及标记的参考抗原结合蛋白结合的纯化抗原(所述抗原在固态表面或细胞表面上)。在待测抗原结合蛋白存在下，测量结合于固态表面或细胞的标记的量，来测量竞争性抑制。通常，待测抗原结合蛋白是过量存在的。由竞争性测定(竞争抗原结合蛋白)鉴定的抗原结合蛋白包括：与参考抗原结合蛋白相同的表位发生结合的抗原结合蛋白；以及，与充分接近参考抗原结合蛋白结合的表位所邻近的表位发生结合的抗原结合蛋白，所述两个表位在空间上互相妨碍结合的发生。在本公开实施例中提供关于用于测定竞争性结合的方法的其它详细资料。通常当竞争的抗原结合蛋白过量存在时，其将抑制(例如降低)至少40-45％、45-50％、50-55％、55-60％、60-65％、65-70％、70-75％或75％或更多参考抗原结合蛋白与共同抗原的特异性结合。在某些情况下，结合被抑制至少80-85％、85-90％、90-95％、95-97％或97％或更多。可使用本领域技术人员已知的常规技术，就与相同表位的结合竞争性筛选抗体。例如，可进行竞争和交叉竞争研究，以获得彼此竞争或交叉竞争与抗原结合的抗体。基于它们的交叉竞争来获得结合相同表位的抗体的高通量方法描述于国际专利公开WO03/48731中。因此，可使用本领域技术人员已知的常规技术，获得例如与本公开的抗体分子竞争结合4-1BB上的相同表位的抗体。
“表位”是指抗原上与免疫球蛋白或抗体结合的位点。表位可以由相邻的氨基酸、或通过蛋白质的三级折叠而并列的不相邻的氨基酸形成。由相邻的氨基酸形成的表位通常在暴露于变性溶剂后保持，而通过三级折叠形成的表位通常在变性溶剂处理后丧失。表位通常以独特的空间构象包括至少3-15个氨基酸。确定表位与给定的抗体结合的方法在本领域中是熟知的，包括免疫印迹和免疫沉淀检测分析等。确定表位的空间构象的方法包括本领域中的技术和本公开所述的技术，例如X射线晶体分析法和二维核磁共振等。
“结合亲和力”或“亲和力”在本公开中用作两个分子(例如抗体或其部分与抗原)之间的非共价相互作用的强度量度。两个分子之间的结合亲和力可通过确定解离常数(KD)来量化。可通过使用例如表面等离子共振(SPR)方法(Biacore)测量复合物形成和解离的动力学来确定KD。对应于单价复合物的结合和解离的速率常数分别被称为结合速率常数ka(或kon)和解离速率常数kd(或koff)。KD通过方程KD＝kd/ka与ka和kd有关。解离常数的值可通过众所周知的方法直接确定，并且甚至可通过例如Caceci等人(1984，Byte 9：340-362)中所述的那些方法对于复杂混合物进行计算。例如，可使用双重过滤硝化纤维素滤器结合测定如Wong&Lohman(1993，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：5428-5432)中公开的那种来确定KD。评估抗体针对靶抗原的结合能力的其它标准测定是本领域已知的，包括例如ELISA、蛋白质印迹、RIA和流式细胞术分析、以及本公开其它地方例举的其它测定。抗体的结合动力学和结合亲和力也可通过本领域已知的标准测定，例如表面等离子共振(SPR)，例如通过使用BiacoreTM系统或KinExA来评价。可通过比较各个抗体/抗原复合物的KD值来比较与不同分子相互作用相关的结合亲和力，例如，不同抗体对于给定抗原的结合亲和力的比较。类似地，相互作用的特异性可通过确定和比较目的相互作用(例如抗体和抗原之间的特异性相互作用)的KD值与非目的相互作用(例如已知不结合4-1BB的对照抗体)的KD值进行评价。
“保守性置换”指置换为具有与原始氨基酸残基相似的特性的另一个氨基酸残基。例如，赖氨酸、精氨酸和组氨酸具有相似的特性，在于它们具有碱性侧链，并且天冬氨酸和谷氨酸具有相似的特性，在于它们具有酸性侧链。此外，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸和色氨酸具有相似的特性，在于它们具有不带电荷极性侧链，并且丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、苏氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸和甲硫氨酸具有相似的特性，在于它们具有非极性侧链。另外，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和组氨酸具有相似的特性，在于它们具有芳族侧链。因此，本领域技术人员将显而易见，甚至当置换如上文所述的显示相似特性的组中的氨基酸残基时，它将不显示特性的特定变化。
“同源性”、“同一性”或“序列同一性”是指两个多核苷酸序列之间或两个多肽之间的序列相似性。当两个比较序列中的位置均被相同核苷酸或氨基酸单体占据时，例如如果两个DNA分子的每一个位置都被相同核苷酸占据时，那么所述分子在该位置是同源的。两个序列之间的同源性百分率是两个序列共有的匹配或同源位置数除以比较的位置数×100％的函数。例如，在序列最佳比对时，如果两个序列中的10个位置有6个匹配或同源，那么两个序列为60％同源。一般而言，当比对两个序列而得到最大的同源性百分率时进行比较。
“核酸”或“多核苷酸”在本文可互换使用，指的是单链或双链的任何DNA分子或RNA分子以及在单链的情况下，它的互补序列的分子，优选是双链DNA。当将核酸与另一个核酸序列置于功能关系中时，核酸是“有效连接的”。例如，如果启动子或增强子影响编码序列的转录，那么启动子或增强子有效地连接至所述编码序列。
“宿主细胞”包括各个细胞或细胞培养物，其可为或已是用于掺入多核苷酸插入片段的载体的受体。宿主细胞包括单个宿主细胞的子代，并且由于天然、偶然或有意的突变，子代可不一定与原始亲本细胞完全相同(在形态学或基因组DNA互补体中)。宿主细胞包括用本公开的多核苷酸在体内转染和/或转化的细胞。“细胞”、“细胞系”和“细胞培养物”可互换使用，并且所有这类名称都包括其后代。还应当理解的是，由于故意或非有意的突变，所有后代在DNA含量方面不可能精确相同。包括具有与最初转化细胞中筛选的相同的功能或生物学活性的突变后代。
“抑制”或“阻断”可互换使用，并涵盖部分和完全抑制/阻断这两者。“抑制生长”(例如涉及细胞)旨在包括细胞生长任何可测量的降低。
“阻止...的生长”或“生长抑制”是指抑制细胞的生长或增殖。
“增殖性疾病”指与一定程度的异常细胞增殖有关的病症。在一个实施方案中，增殖性病症指癌症。“肿瘤”指所有赘生性(neoplastic)细胞生长和增殖，无论是恶性的还是良性的，及所有癌前(pre-cancerous)和癌性细胞和组织。“癌症”、“癌性”、“增殖性病症”和“肿瘤”在本公开中提到时并不互相排斥。
“预防癌症”是指在受试者中延迟、抑制或防止癌症发作，所述受试者中癌症发生或肿瘤发生的起始尚未得到证实，但是通过例如遗传筛查或其它方法确定，已鉴定了癌症易感性。该还包括治疗具有癌变前病症的受试者以终止所述癌变前病症向恶性肿瘤的进展或导致其消退。
“给予”、“施用”和“处理”当应用于动物、人、实验受试者、细胞、组织、器官或生物流体时，是指外源性药物、治疗剂、诊断剂或组合物与动物、人、受试者、细胞、组织、器官或生物流体的接触，例如治疗、药物代谢动力学、诊断、研究和实验方法。细胞的处理包括试剂与细胞的接触，以及试剂与流体的接触，其中所述流体与细胞接触。“给予”、“施用”和“处理”还意指通过试剂、诊断、结合组合物或通过另一种细胞体外和离体处理例如细胞。当应用于人、兽医学或研究受试者时，是指治疗处理、预防或预防性措施，研究和诊断应用。
“治疗”意指给予受试者内用或外用治疗剂，例如包含本公开的任一种结合蛋白或其药物组合物作为治疗剂，所述受试者已经患有、疑似患有、倾向于患有一种或多种增殖性疾病或其症状，而已知所述治疗剂对这些症状具有治疗作用。通常，在受治疗受试者或群体中以有效缓解一种或多种疾病症状的量给予治疗剂，无论是通过诱导这类症状退化还是抑制这类症状发展到任何临床能测量的程度。有效缓解任何具体疾病症状的治疗剂的量(也称作“治疗有效量”)可根据多种因素变化，例如受试者的疾病状态、年龄和体重，以及药物在受试者产生需要疗效的能力。通过医生或其它专业卫生保健人士通常用于评价该症状的严重性或进展状况的任何临床检测方法，可评价疾病症状是否已被减轻。尽管本公开的实施方案(例如治疗方法或制品)在缓解某个受试者中目标疾病症状方面可能无效，但是根据本领域已知的任何统计学检验方法如Student t检验、卡方检验、依据Mann和Whitney的U检验、Kruskal-Wallis检验(H检验)、Jonckheere-Terpstra检验和Wilcoxon检验确定，其在统计学显著数目的受试者中应当减轻目标疾病症状。
“有效量”包含足以改善或预防医学病症的症状或病症的量。有效量还意指足以允许或促进诊断的量。用于受试者的有效量可依据以下因素而变化：如待治疗的病症、受试者的总体健康情况、给药的方法途径和剂量以及副作用严重性。有效量可以是避免显著副作用或毒性作用的最大剂量或给药方案。本公开的受试者可以是动物或人类受试者。
“任选”或“任选地”意味着随后所描述地事件或环境可以但不必发生，该说明包括该事件或环境发生或不发生的场合。“和/或”应视为特定揭示两种指定特征或组分中的每一者具有或不具有另一者。因此，诸如本公开中“A和/或B”的词组中所用的术语“和/或”包括“A及B”、“A或B”、“A”(单独)及“B”(单独)。除非上下文另外清楚要求，否则在整个说明书和权利要求书中，应将词语“包含”、“具有”、“包括”等理解为具有包含意义，而不是排他性或穷举性意义；也即，“包括但不仅限于”的意义。
本公开的“受试者”、“患者”意指哺乳动物，尤其灵长类动物，尤其是人。
附图说明
图1为待测抗体与人4-1BB抗原的FACS结合测试结果。
图2为待测抗体在FcγRIIb交联前和交联后的4-1BB/NF-κB荧光素酶报告基因检测结果。
图3为抗4-1BB抗体C5、其人源化后的抗体C5_V1、C5_V2、C5_V3与HEK293细胞表面人4-1BB结合的FACS检测结果，使用Urelumab、同种型IgG1抗体作为对照。
图4为抗4-1BB抗体C5与其人源化后的抗体C5_V1、C5_V2、C5_V3对NF-κB信号通路的激活作用检测结果，使用Urelumab、同种型IgG1抗体作为对照。
图5为C5_V2和去TCE改造后的C5_V2-YTI与HEK293细胞表面人4-1BB的结合的FACS检测结果，使用Urelumab、同种型IgG1抗体作为对照。
图6为CD47/4-1BB双特异性融合蛋白的结构示意图。
图7为CD47/4-1BB双特异性融合蛋白对细胞表面的4-1BB/CD47抗原结合活性检测结果。图7A为CHO-K1过表达4-1BB的CHO-K1-Hu4-1BB细胞结合的FACS检测结果，所检测的CD47/4-1BB双特异性融合蛋白为47-C5_V2-G1、47-C5_V2-G4、47-C5_V2-YTI-G1、47-C5_V2-YTI-G4，所使用的对照为C5-V2和同种型IgG1、IgG4；图7B为MCF7细胞结合的FACS检测结果所检测的CD47/4-1BB双特异性融合蛋白为47-C5_V2-G1、47-C5_V2-G4、47-C5_V2-YTI-G1、47-C5_V2-YTI-G4，所使用的对照为Hu5F9、ALX148、TJC4、SIRRγ-Fc和同种型IgG1、IgG4。
图8为CD47/4-1BB双特异性融合蛋白对CD47/SIRPα结合阻断的ELISA检测结果，所检测的CD47/4-1BB双特异性融合蛋白为47-C5_V2-G1、47-C5_V2-G4，所使用的对照为DSP107、SIRRγ-Fc、Hu5F9、ALX148、TJC4和同种型IgG1、IgG4。
图9为CD47/4-1BB双特异性融合蛋白对两个供体的T淋巴细胞激活的评价结果，是对IL-2进行检测，所检测的CD47/4-1BB双特异性融合蛋白为47-C5_V2-G1、47-C5_V2-G4，所使用的对照为DSP107和同种型IgG1、IgG4。
图10为CD47/4-1BB双特异性融合蛋白诱导巨噬细胞对肿瘤细胞吞噬(ADCP)的FACS检测结果，所检测的CD47/4-1BB双特异性融合蛋白为47-C5_V2-G1、47-C5_V2-G4，所使用的对照为Hu5F9、ALX148、TJC4、DSP107和同种型IgG1、IgG4。
图11.CD47/4-1BB双特异性融合蛋白增强抗CD20抗体利妥昔单抗的ADCP活性的FACS检测结果，所检测的CD47/4-1BB双特异性融合蛋白为47-C5_V2-G1，所使用的对照为ALX148、DSP107。
图12为CD47/4-1BB双特异性融合蛋白的红细胞凝集实验，所检测的CD47/4-1BB双特异性融合蛋白为47-C5_V2-G1、47-C5_V2-G4，所使用的对照为Hu5F9。
图13为CD47/4-1BB双特异性融合蛋白47-C5_V2-YTI-G1对比ALX148对Raji移植瘤的抑瘤效果。
图14为CD47/4-1BB双特异性融合蛋白47-C5_V2-YTI-G4对比TJC4对Raji移植瘤的抑瘤效果。
图15为CD47/4-1BB双特异性融合蛋白47-C5_V2-YTI-G1、47-C5_V2-YTI-G4对MC38-hCD47移植瘤的抑瘤效果。
图16为CD47/4-1BB双特异性融合蛋白47-C5_V2-YTI-G1、47-C5_V2-YTI-G4对小鼠体重的影响结果。
图17为CD47/4-1BB双特异性融合蛋白47-C5_V2-YTI-G1、47-C5_V2-YTI-G4对小鼠ALT/AST的影响。
图18为CD47/4-1BB双特异性融合蛋白47-C5_V2-YTI-G1在食蟹猴中的毒性评价结果。
具体实施方式
以下结合实施例用于进一步描述本公开，但这些实施例并非限制着本公开的范围。本公开实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，如冷泉港的抗体技术实验手册，分子克隆手册；或按照原料或商品制造厂商所建议的条件。未注明具体来源的试剂，为市场购买的常规试剂。
本公开使用的蛋白：人4-1BB蛋白(Human1BB/TNFSF9Protein，His Tag，购自Acrobiosystems，货号41B-H5227)，人4-1BB蛋白(生物素/His标签)(Biotinylated Human4-1BB/TNFRSF9 Protein，AvitagTM，His Tag，购自Acrobiosystems，货号41B-H82E3)，猴4-1BB蛋白(Cynomolgus/Rhesus macaque 4-1BB/TNFRSF9 Protein，His Tag，购自Acrobiosystems，货号41B-C52H4)，氨基酸序列的起止均为Leu24-Gln186。人CD47蛋白(Human CD47 Protein，hCD47)，购自Sino Biological，货号2283-H08H)，猴CD47蛋白(Cynomolgus CD47 Protein，CynoCD47)。
以上蛋白试剂可用于本公开各实施例实验中，包括用作免疫抗原、筛选抗原、活性与功能鉴定。本公开所使用的对照分子的氨基酸序列如表2。
表2
/>
实施例1.抗4-1BB单域抗体的筛选和准备
1.羊驼免疫、效价检测和噬菌体文库亲和淘选
使用His标签的人4-1BB重组蛋白(Acrobiosystems，41B-H5227)免疫羊驼，每两周免疫一次，共免疫四次。首次免疫时，将0.5mg抗原与1mL的弗氏完全佐剂(CFA)混匀皮下注射，后三次免疫将0.25mg抗原与1mL的弗氏不完全佐剂(IFA)混匀皮下注射。免疫前采集空白血清，第3次免疫后一周和第4次免疫后一周分别采集50mL外周血，分离PBMC，提取总RNA，检测纯度，反转录为DNA，两轮巢式PCR后将纳米抗体目的片段与噬菌体展示载体连接。电转染，获得噬菌体文库。
>人4-1BB蛋白序列
LQDPCSNCPAGTFCDNNRNQICSPCPPNSFSSAGGQRTCDICRQCKGVFRTRKECSSTSNAECDCTPGFHCLGAGCSMCEQDCKQGQELTKKGCKDCCFGTFNDQKRGICRPWTNCSLDGKSVLVNGTKERDVVCGPSPADLSPGASSVTPPAPAREPGHSPQ(SEQ ID NO:11)
为获得同时识别人和猴的抗4-1BB纳米抗体，采用两轮人、猴抗原的交叉筛选的策略。第一轮和第二轮筛选抗原分别采用人4-1BB和猴4-1BB，或猴4-1BB和人4-1BB。每轮筛选均采用Gly-HCl酸洗脱方法，洗脱特异性结合4-1BB的噬菌体。从第一轮和第二轮滴度测定平板上分别随机挑选96个克隆(共192个克隆)，采用噬菌体ELISA筛选阳性克隆，检测450nm下的光密度。将阳性克隆进行测序。根据测序结果，进行序列比对和进化树分析，筛选出14条独特序列，包括H27、H170、C3、C5、C145等，其中C5序列如下所示。
>C5
QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCSASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSDINSGGESTFYEDSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLKPEDTAVYYCAKHPLTFTIATMNDYDYWGQGTQVTVSS(SEQ ID NO:12)(注：下划线为CDR区)
表3.抗4-1BB单域抗体C5的CDR(Kabat编号规则)
2.VHH-Fc融合蛋白的表达纯化
将C5的序列与带有C220A，S267E和L328F突变(根据Eu系统编号)的人IgG1-Fc(SEQID NO：16，下划线为突变)进行连接。连接后的VHH-Fc融合蛋白序列如下所示。以及，在人IgG1的Fc上引入L234A，L235A和N297A(根据Eu系统编号)等突变，以完全去除抗体FcγR介导的效应功能(例如SEQ ID NO：15所示)；在人IgG4的Fc上引入S228P(根据Eu系统编号)，以稳定抗体分子阻止半分子形成(例如SEQ ID NO：18所示)，这均是可选择的IgG Fc。SEQ IDNO：16-18中，下划线为Fc突变。
>人IgG1-Fc(含有C220A，S267E，L328F突变)
EPKSADKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVEHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKAFPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO：16)
>人IgG1-Fc(含有C220A，L234A，L235A，N297A突变)
EPKSADKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKC
KVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO：17)
>人IgG4-Fc(含有S228P突变)
ESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVS
NKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK(SEQ ID NO：18)
示例性列出C5与SEQ ID NO:16连接的抗体序列，如SEQ ID NO:19所示。
>C5-Fc
(注：斜体为Fc)
构建质粒，瞬时转染细胞，表达抗体，并纯化。经检测，获得目的抗体。
实施例2.抗4-1BB抗体的抗原结合活性及其激动剂活性的检测
1、与4-1BB抗原的结合能力检测
用流式细胞仪检测抗4-1BB单域抗体与人4-1BB蛋白的结合活性。
HEK293-Hu4-1BB细胞由HEK293细胞(ATCC CRL-1573)瞬转表达人4-1BB蛋白(CD137 cDNA ORF Clone，Human，C-OFPSpark tag；购自Sino Biological，Cat#HG10041-ACR)获得，细胞培养基为DMEM(Gibco，Cat#11995065)，含有10％胎牛血清。实验培养基为无菌PBS(磷酸盐缓冲液，pH7.40)含有2％胎牛血清。用实验培养基洗HEK293-Hu4-1BB细胞两次，每孔1×105个HEK293-Hu4-1BB细胞种于96孔U底板，加入不同浓度的待测抗4-1BB抗体VHH-Fc样品，细胞4℃孵育1小时后，用实验培养基洗两次；随后加入羊抗人IgG(H+L)AlexaFluor 488抗体(Thermo，Cat#A11013)，洗两次后，流式细胞仪读取荧光信号值。使用Urelumab单抗为阳性对照，各抗体MFI值见图1。
结果显示，涉及的抗4-1BB抗体对HEK293-Hu4-1BB细胞表面的4-1BB具有不同程度的结合能力，其中，C5具有良好的细胞膜表面抗原结合活性。
2、对4-1BB信号通路的激动剂活性检测
使用4-1BB/NF-κB报告基因评估抗4-1BB抗体的激动剂活性。
HEK293细胞(ATCC CRL-1573)瞬转表达人4-1BB基因(CD137 cDNA ORF Clone，Human，C-OFPSpark tag；购自Sino Biological，Cat#HG10041-ACR)和NF-κB报告基因(pGL4.32[luc2P/NF-κB-RE/Hygro]Vector，购自Promega，Cat#E849A)，获得HEK293-Hu4-1BB/NF-κB双转染细胞，可以通过NF-κB信号通路的活化水平表征4-1BB的激活。用FcγRIIb质粒(CD32B/Fcgr2b cDNA ORF Clone，Human，N-His tag；购自Sino Biological，Cat#HG10259-NH)瞬时转染HEK293细胞，获得高表达FcγRIIb的HEK293细胞。细胞培养基为DMEM(Gibco，Cat#11995065)，含有10％胎牛血清。将HEK293-Hu4-1BB/NF-κB细胞(2×106/mL)以50μL铺入96孔细胞培养板，加入40μL培养基或者表达FcγRIIb的HEK293细胞(2.5×106/mL)，每孔加入10×10μL梯度稀释的待测抗4-1BB抗体，37℃培养6小时。取出细胞，每孔加入等体积Bio-Glo Luciferase Assay System试剂(Promega，Cat#G7940)，避光孵育5分钟，用Envision酶标仪(PerkinElmer，2150)测定荧光信号，计算EC50值以及Emax值(相对无抗体组荧光强度)，以EC50值来评价抗4-1BB抗体的体外细胞激动剂活性。结果如图2和表4所示。
结果显示，未加入FcγRIIb(即，CD32b)阳性交联时，涉及的抗4-1BB抗体显示对4-1BB/NF-κB荧光素酶报告基因信号通路的激活均远弱于Urelumab对照，说明本公开的抗4-1BB抗体的安全性更好；加入FcγRIIb交联后，涉及的抗4-1BB抗体显示对4-1BB/NF-κB荧光素酶报告基因信号通路的显著激活，C5的激活能力最强且与Urelumab对照相当。综合活性结果，筛选出在FcγRIIb交联前具有低本底激活，且在FcγRIIb交联后具有更强激活活性的序列C5，并进行人源化。
表4.抗4-1BB抗体对4-1BB/NF-κB荧光素酶报告基因的激动活性EC50值
(注：“-”为检测数值超出了检测限)
实施例3.抗4-1BB抗体的改造
1、人源化改造
根据Kabat编号系统标识C5序列的CDR以及FR区(人框架区域，framework)的氨基酸编号，将FR1+CDR1序列，FR2+CDR2序列，FR3+CDR3序列分别于抗体种系数据库进行配比，分别获得同源性较高的FR人种系模板。FR1来自IGHV3-64*04，FR2来自IGHV3-23*03，FR3来自IGHV3-74*01。将以上各人种系FR区域分别替换插入原序列，以降低在人体中产生的免疫原性。对影响抗体结构和功能的关键氨基酸进行回复突变，以恢复结合力和活性。各人源化序列如下所示。
>C5_V1
QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCSASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSDINSGGESTFYEDSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARHPLTFTIATMNDYDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO：20)
>C5_V2
QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCSASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSDINSGGESTFYEDSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKHPLTFTIATMNDYDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO：21)
>C5_V3
QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCSASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSDINSGGESTFYEDSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLKPEDTAVYYCAKHPLTFTIATMNDYDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO：22)(注：下划线为CDR区)
将上述3条人源化序列分别与人IgG1-Fc(SEQ ID NO：14)进行连接。构建质粒，瞬时转染，表达并纯化。具体过程为：将培养液稀释60μL转染试剂后与15μg质粒混匀，37℃孵育15分钟后，将混合转染液逐滴加入30mL细胞液中，放置摇床培养表达一周，收集上清。随后对其进行ProteinA亲和纯化，用柠檬酸缓冲液(pH 3.4)进行洗脱，最后使用1xPBS缓冲液进行透析，冻存。
2、TCE位点的去除
随后，我们对C5_V2序列进行了T细胞表位预测(T-cell Epitope，TCE)，根据预测结果对C5_V2的CDR3序列进行了改造，以减少TCE数目。将CDR3区域的F突变为Y(F99Y，根据Kabat编号系统)获得了TCE优化版本的C5_V2序列，命名为C5_V2-YTI，其序列如下：
>C5_V2-YTI
QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCSASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSDINS
GGESTFYEDSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKHPLTYTIATMNDYDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO：23)
即，按照Kabat编号系统，C5_V2-YTI中的CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:13所示，CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:14所示，CDR3的氨基酸序列如HPLTYTIATMNDYDY(SEQ IDNO:24)所示。
将上述C5_V2-YTI序列与人IgG1-Fc(SEQ ID NO：16)进行连接。构建质粒，瞬时转染，表达并纯化，获得目的抗体。
3.对抗4-1BB单域抗体的VH框架(FR)的氨基酸改造，全文引入WO2023093899，获得C5_V2-YTI-AA(对应WO2023093899中第30条序列所示的C5_V2-YTI-53)。
实施例4.经改造的抗4-1BB抗体的抗原结合活性、激动剂活性检测
1、与4-1BB抗原的结合能力检测
人源化抗体使用如实施例2所述的FACS检测方法对抗原结合活性进行检测。结果见图3，表5。
结果显示，涉及的人源化抗4-1BB抗体对HEK293-Hu4-1BB细胞表面的4-1BB具有不同程度的结合能力，C5_V1、C5_V2、C5_V3均保持良好的结合活性。
表5.人源化前/后抗4-1BB抗体与人4-1BB高表达细胞株的亲和力EC50值
| 抗体编号 | EC50(nM) | 最大荧光值 |
| C5 | 3.196 | 1101 |
| C5_V1 | 3.789 | 1036 |
| C5_V2 | 1.624 | 1031 |
| C5_V3 | 1.651 | 1096 |
| Urelumab | 1.184 | 1005 |
2、对4-1BB信号通路的激动剂活性检测
人源化抗体使用如实施例2所述的NF-κB荧光素酶报告基因实验中检测依赖于的4-1BB/NF-κB信号激活，结果见图4，表6。
结果显示，加入FcγRIIb交联后，涉及的人源化抗4-1BB抗体显示对4-1BB/NF-κB荧光素酶报告基因信号通路的激活，C5、C5_V1、C5_V2、C5_V3的激活能力与Urelumab对照相当。
表6.人源化前/后抗4-1BB抗体对NF-κB信号通路的激活作用
/>
(注：Emax变化倍数<1.5，定义活性为“-”；1.5至2，定义为“+”；2至2.5，定义为“++”；2.5至3，定义为“+++”；>3，定义为“++++”。)
3、去除TCE后的人源化4-1BB抗体与抗原的结合能力检测
对人源化抗体C5_V2进行去除TCE的优化，所获得的抗体为C5_V2-YTI(详见实施例3)，使用如实施例2所述的FACS检测方法，比较了C5_V2与C5_V2-YTI对抗原结合的活性，结果见图5，表7。结果显示，涉及的C5_V2-YTI对HEK293-Hu4-1BB细胞表面的4-1BB保持良好的结合活性，与C5_V2相当。
表7.C5_V2，C5_V2-YTI与人4-1BB高表达细胞株的亲和力EC50值
| 抗体编号 | EC50(nM) | 最大荧光值 |
| C5_V2 | 0.98 | 53,669 |
| C5_V2-YTI | 0.62 | 53,825 |
| Urelumab | 1.64 | 39,666 |
| IgG1 | - | 67 |
实施例5.CD47/4-1BB双特异性融合蛋白的设计和制备
将人源化抗4-1BB纳米抗体C5_V2或C5_V2-YTI与增强了与CD47亲和力的SIRPγ突变体(WO2020177733A1)进行融合，构建CD47/4-1BB双特异性融合蛋白。
>SIRPγ突变体序列
EEELQMIQPEKLLLVTVGETATLHCTVTSLLPVGPVLWFRGVGPGRELIYMSGRGHFPRVTTVSDLTKRNNKDFSIRISSITPADVGTYYCVKFRKGSPEDVEFKSGPGTEMALGAKPS(SEQ ID NO：25)
在人IgG1的Fc上引入L234A，L235A和N297A等突变，以完全去除抗体FcγR介导的效应功能；在人IgG1的Fc铰链区N端直接融合SIRPγ突变体，在Fc的C端通过(G4S)2的连接子分别融合C5_V2或C5_V2-YTI，从而获得47-C5_V2-G1和47-C5_V2-YTI-G1。
在人IgG4的Fc上引入S228P，以稳定抗体分子阻止半分子形成；在IgG4的Fc铰链区N端直接融合SIRPγ突变体，在Fc的C端通过(G4S)2的连接子分别融合C5_V2或C5_V2-YTI，从而获得47-C5_V2-G4和47-C5_V2-YTI-G4。
以上4个双特异性融合蛋白分子结构如图6所示，分子的氨基酸序列如下。
>47-C5_V2-G1
(注：下划线虚线为SIRPγ突变体序列，斜体为Fc，下划线为linker)
>47-C5_V2-G4
>47-C5_V2-YTI-G1
>47-C5_V2-YTI-G4
我们对以上47-C5_V2-YTI-G1双抗分子进一步优化，用C5_V2-YTI-AA替换C端的C5_V2-YTI，即去除pre-ADA。优化后的双抗分子命名为47-C5_V2-YTI-AA-G1。
>47-C5_V2-YTI-AA-G1
构建质粒，瞬时转染，表达并纯化。具体过程为：将培养液稀释60μL转染试剂后与15μg质粒混匀，37℃孵育15分钟后，将混合转染液逐滴加入30mL细胞液中，放置摇床培养表达一周，收集上清。随后对其进行ProteinA亲和纯化，用柠檬酸缓冲液(pH 3.4)进行洗脱，最后使用1xPBS缓冲液进行透析，冻存。经检测，获得目的双抗融合蛋白。
实施例6.CD47/4-1BB双特异性融合蛋白的抗原结合活性检测
1.流式细胞仪检测(FACS)
CHO-K1-Hu4-1BB细胞由CHO-K1细胞(CCL-61TM)过表达人4-1BB蛋白获得，复苏后传代调整细胞状态。细胞培养基为Ham’sF12+GlutaMAXTM-I(Gibco，Cat#31765035)，含有10％胎牛血清和800μg/mL潮霉素B。MCF7细胞由ATCC购得(/>HTB-22TM)，复苏后传代调整细胞状态。细胞培养基为MEM(Gibco，Cat#11095-080)，含有1mM丙酮酸钠，0.01mg/mL人胰岛素，非必需氨基酸和10％胎牛血清。实验培养基为无菌PBS(磷酸盐缓冲液，pH7.40)含有2％胎牛血清。用实验培养基洗CHO-K1-Hu4-1BB或MCF7细胞两次，每孔1×105个细胞种于96孔U底板，加入不同浓度的待测样品，细胞4℃孵育1小时后，用实验培养基洗两次；随后加入Alexa Fluor 647-鼠抗人(IgG，Fcγfragment specific)抗体(Jackson，Cat#209-605-098)，洗两次后，流式细胞仪读取荧光信号值。结果见图7，表8和表9。
FACS检测结果显示，涉及的CD47/4-1BB双特异性融合蛋白对CHO-K1-Hu4-1BB细胞表面的4-1BB具有很强的结合能力，和连接前4-1BB抗体C5_V2的结合能力相当。涉及的CD47/4-1BB双特异性融合蛋白对MCF7细胞表面的CD47具有很强的结合能力，和对照抗体Hu5F9、ALX148的结合能力相当。
表8.CD47/4-1BB双特异性融合蛋白结合CHO-K1-Hu4-1BB细胞的结果
表9.CD47/4-1BB双特异性融合蛋白结合MCF7细胞
| 抗体名称 | EC50(nM) | 最大荧光值 |
| 47-C5_V2-G1 | 0.61 | 15191 |
| 47-C5_V2-G4 | 0.51 | 11887 |
| 47-C5_V2-YTI-G1 | 0.57 | 9668 |
| 47-C5_V2-YTI-G4 | 0.53 | 9857 |
| Hu5F9 | 0.58 | 8940 |
| TJC4 | 1.71 | 13153 |
| ALX148 | 0.37 | 13117 |
| SIRPγ-Fc | 0.39 | 10765 |
| IgG1 | / | 293 |
| IgG4 | / | 306 |
其中，SIRPγ-Fc所使用的Fc为SEQ ID NO：17。
2.采用表面等离子共振技术(surface plasmon resonance，SPR)
选用CM5传感器芯片，流动相采用HBS-EP+缓冲溶液(10mM HEPES，150mM NaCl，3mMEDTA，0.05％surfactant P20)。Anti-human IgG(Fc)antibody用10mM醋酸钠缓冲液(pH5.0)，配制成25μg/mL溶液，选择Immobilization程序自动进行Anti-human IgG(Fc)antibody通道氨基偶联固定。用HBS-EP+缓冲溶液分别配制各待测抗体作为配体与芯片通道上的Anti-human IgG(Fc)antibody进行捕获。不同抗原(人CD47蛋白，食蟹猴CD47蛋白，人4-1BB蛋白，食蟹猴4-1BB蛋白)作为分析物用HBS-EP+缓冲溶液进行配制，分析物进行2倍梯度稀释将稀释好的抗体在30μL/min的流速下流过实验通道和参比通道。人CD47和食蟹猴CD47的检测时间为结合45秒，解离160秒；人4-1BB和食蟹猴4-1BB的检测时间为结合60秒，解离200秒。再生缓冲液选择10mM Glycine pH1.5(GE Healthcare，BR-1003-54)在10μL/min的流速下运行30秒。所使用的ZebaTM脱盐离心柱购自Thermo(货号Cat#89882)。
数据用Biacore 8K evaluation software软件进行分析。结果见表10，说明涉及的CD47/4-1BB双特异性融合蛋白对人、食蟹猴CD47的抗原结合亲和力和对照抗体Hu5F9的结合能力相当，略弱于对照抗体ALX148；对人、食蟹猴4-1BB的抗原结合亲和力与母本4-1BBVHH抗体C5_V2相当。
表10.CD47/4-1BB双特异性融合蛋白对不同抗原的Biacore亲和力
/>
实施例7.CD47/4-1BB双特异性融合蛋白对CD47/SIRPα结合的阻断
为了研究CD47/4-1BB双特异性融合蛋白对CD47与SIRPα结合的阻断活性，采用ELISA检测方法，用PBS将CD47-His蛋白(购自北京义翘神州生物技术有限公司，Cat#12283-H08H)稀释至1μg/mL，以50μL/孔的体积加于96孔板中，于4℃放置16-20小时。将96孔板中PBS缓冲液吸掉，用PBS-T(pH7.40 PBS含有0.05％Tween-20)缓冲液洗板3次后，加入50μL/孔封闭液(pH7.40 PBS含有3％ BSA)，室温孵育1小时进行封闭。弃封闭液，用PBS-T缓冲液洗板3次后，加入45μL用样品稀释液(pH7.40 PBS含有1％BSA)稀释至合适浓度的待测CD47/4-1BB双特异性融合蛋白，室温孵育1小时。以5μL/孔的体积加入10×生物素标记SIRPα(购自百英生物生物技术有限公司，300μg/mL)，室温孵育1小时。移去反应体系，用PBS-T洗板3次后，加入50μL/孔用样品稀释液1:5000稀释的Streptavidin HRP(BD，Cat#554066)，室温孵育1小时。弃反应液，用PBS-T洗板5次后，加入50μL/孔TMB(Thermo Fisher，Cat#34029)，于室温孵育5-10分钟。加入50μL/孔ELISA终止液(Solarbio，Cat#C1058)终止反应。在EnVision(PerkinElmer，2150)酶标仪上测量OD450并计算IC50值，结果见图8和表11。
结果显示，涉及的CD47/4-1BB双特异性融合蛋白均能有效的对CD47/SIRPα通路产生阻断，其活性强于对照DSP107。
表11.CD47/4-1BB双特异性融合蛋白对CD47/SIRPα结合的阻断ELISA
实施例8.T淋巴细胞激活实验
为了研究CD47/4-1BB双特异性融合蛋白对人原代T淋巴细胞的影响，新鲜分离纯化的PBMC重悬于RPMI1640(Gibco，Cat#10491A-01)，含有100ng/mL金黄色葡萄球菌肠毒素B(北京康博贝宁科技有限公司，Cat#2090681)和10％胎牛血清，密度调整为5×105个/mL。MCF7细胞由ATCC购得(HTB-22TM)，复苏后传代调整细胞状态。细胞培养基为MEM(Gibco，Cat#11095-080)，含有1mM丙酮酸钠，0.01mg/mL人胰岛素，非必需氨基酸和10％胎牛血清，密度调整为1.875×106个/mL。每孔100μL PBMC细胞(5×104个/孔)与80μL培养基或MCF7细胞(1.5×105个/孔)接种于96孔板，以20μL/孔的体积加入10×不同浓度的待测样品，37℃，5％ CO2培养箱孵育3天。取出细胞培养板，离心(400g，5分钟)收集细胞培养上清，采用人IL-2检测试剂盒(Cisbio，Cat#62HIL02PEG)检测IL-2的水平。具体操作参考试剂说明书。结果见图9。
结果显示，两个donor中，在CD47交联后，涉及的CD47/4-1BB双特异性融合蛋白都可以激活IL-2的分泌，强于对照DSP107。在没有CD47的情况下仅有微弱的T细胞激活活性。
实施例9.CD47/4-1BB双特异性融合蛋白在体外诱导抗体介导的细胞吞噬作用(ADCP)的实验
为了研究CD47/4-1BB双特异性融合蛋白对人原代巨噬细胞吞噬作用的影响，将PBMC分离自新鲜人血，然后用Human CD14 MicroBeads(Miltenyi Biotec，130-050-201)分选CD14+单核细胞。这些CD14+单核细胞培养在巨噬细胞分化培养基RPMI1640(Gibco，Cat#10491A-01)中，含有50ng/mL重组人巨噬细胞集落刺激因子(rhM-CSF，PeproTech，Cat#300-25)和10％胎牛血清。分化6天后，巨噬细胞变得具有粘附力，长有触角。将巨噬细胞用胰酶消化5分钟，刮刀轻轻刮下，分别用cellTrace Far Red(Invitrogen，C34564)和celltraceViolet(Invitrogen，C34557)在37℃标记巨噬细胞及Raji细胞15分钟，用PBS清洗两次后，将其以每个巨噬细胞给予5个Raji的比例添加至巨噬细胞(4×104个/孔)中，并加入梯度稀释后的CD47/4-1BB双特异性融合蛋白对靶细胞进行3小时的吞噬作用。吞噬结束后，用PBS洗三次，然后按照一定的比例加入PI(爱必信，abs9358)染色10分钟。用PBS洗涤两次后采用流式细胞术进行分析。通过在PI阴性活细胞门选后，评估Far Red+/Violet+双阳性细胞百分比的方式测量吞噬作用。结果见图10-11。
结果显示，具有IgG4形式Fc的CD47/4-1BB双特异性融合蛋白可以促进巨噬细胞对肿瘤细胞的吞噬，强于对照抗体TJC4，略弱于Hu5F9。具有沉默形式Fc的CD47/4-1BB双特异性融合蛋白可以增强抗CD20抗体利妥昔单抗诱导的巨噬细胞对肿瘤细胞的ADCP活性，强于对照抗体DSP107，略弱于ALX148。
实施例10.CD47/4-1BB双特异性融合蛋白的红细胞凝集实验
由于红细胞表达CD47，通过抗体或融合蛋白的偶联可能引起红细胞凝集，并继发引起红细胞的裂解，并最终导致贫血。为了研究CD47/4-1BB双特异性融合蛋白对人红细胞凝集的影响，采用新鲜健康人血用PBS(Gibco，Cat#10010-023)稀释100倍。稀释后的全血(1×108/mL)接种于96孔板(Corning，Cat#3799)，30μL/孔。等体积加入2×不同浓度的待测样品，混匀后于37℃静置4-6小时。用ELISPOT分析仪(CLT，S6)观察红细胞沉降情况。清晰红点显示未发生红细胞凝集，弥散样显示红细胞凝集。
每个样品从第一列(3μM)起始，稀释到第11列，1:3稀释。最后一列为不加抗体的PBS空白孔，结果见图12。
结果显示，同样条件下，涉及的CD47/4-1BB双特异性融合蛋白在测试的不同浓度下均不引起红细胞凝集，提示其在安全性方面的优势。
实施例11.CD47/4-1BB双特异性融合蛋白对Raji移植瘤抑瘤效果
将人Burkitt's淋巴瘤Raji细胞以5×106个/100μL/只(含50％基质胶)接种于NCG小鼠右侧皮下，待肿瘤生长到大约75mm3时按肿瘤体积挑选60只随机分组，每组6只，共10组，参见表12。
隔天给药1次，给药和观察期间每周测量2次小鼠体重和肿瘤体积，并记录测量值。计算肿瘤体积(tumor volume，TV)，计算公式为TV＝1/2×a×b2，其中a，b分别代表测量肿瘤的长径和短径。
相对肿瘤增值率T/C％＝(T-T0)/(C-C0)×100％；抑瘤率TGI％＝1-T/C％。
显著性差异定义：p>0.05，ns；p<0.05，*；p<0.01，**；p<0.001，***。
结果见图13、图14和表12。结果显示，具有沉默形式Fc的CD47/4-1BB双特异性融合蛋白及对照抗体ALX148单药无效，与抗CD20抗体利妥昔单抗联用显著增强其抗肿瘤活性，两个分子活性相当；具有IgG4形式Fc的CD47/4-1BB双特异性融合蛋白及TJC4单药显示一定的抗肿瘤活性，与抗CD20抗体利妥昔单抗联用后显著增强其抗肿瘤活性，IgG4形式Fc的CD47/4-1BB双特异性融合蛋白抗肿瘤活性优于对照抗体TJC4。本公开的CD47/4-1BB双特异性融合蛋白对小鼠的体重几乎无影响(结果未出示)。
表12.不同CD47-4-1BB双特异性融合蛋白对小鼠移植瘤的抑瘤作用(TGI％)
| 组别 | 给药方案(剂量) | TGI(％) | p value vs G1 |
| G1 | 溶媒 | - | - |
| G2 | 利妥昔单抗(10mg/kg) | 11.51 | 0.4343 |
| G3 | 47-C5_V2-YTI-G1(10.5mg/kg) | 19.77 | 0.0503 |
| G4 | 47-C5_V2-YTI-G1联用利妥昔单抗(10.5mg/kg+10mg/kg) | 52.52 | <0.0001 |
| G5 | 47-C5_V2-YTI-G4(10.5mg/kg) | 56.17 | <0.0001 |
| G6 | 47-C5_V2-YTI-G4联用利妥昔单抗(10.5mg/kg+10mg/kg) | 69.92 | <0.0001 |
| G7 | ALX148(7.5mg/kg) | 19.62 | 0.0376 |
| G8 | ALX148联用利妥昔单抗(7.5mg/kg+10mg/kg) | 54.39 | <0.0001 |
| G9 | TJC4(15mg/kg) | 40.28 | <0.0001 |
| G10 | TJC4联用利妥昔单抗(15mg/kg+10mg/kg) | 47.04 | <0.0001 |
实施例12.CD47/4-1BB双特异性融合蛋白在小鼠结肠癌模型MC38-hCD47中的体内药效
将MC38-hCD47细胞(向MC38转入人CD47，敲除鼠CD47)以5×105个/100μL/只接种于B-h4-1BB人源化小鼠(百奥赛图公司提供)皮下，待肿瘤生长到大约120mm3时按肿瘤体积挑选30只随机分组，每组6只，共5组，分别为：溶媒、47-C5_V2-YTI-G1(2mg/kg)、47-C5_V2-YTI-G1(7mg/kg)、47-C5_V2-YTI-G4(7mg/kg)和ADG106(10mg/kg)。每周给药2次，给药和观察期间每周测量2次肿瘤体积并测量体重，并记录测量值。
肿瘤体积(tumor volume，TV)计算公式为：
TV＝1/2×a×b2，其中a，b分别代表测量肿瘤的长径和短径。
相对肿瘤增值率T/C％＝(T-T0)/(C-C0)×100％；抑瘤率TGI％＝1-T/C％。
CR％(肿瘤完全消退比例)＝肿瘤完全消退(<120mm3)的小鼠数量/入组小鼠数量。
结果见图15，表13。结果显示，涉及的CD47/4-1BB双特异性融合蛋白具有良好的抗肿瘤活性，对小鼠的体重几乎无影响(结果未出示)。
表13.不同CD47-4-1BB双特异性融合蛋白对小鼠移植瘤的抑瘤作用
| 组别 | 给药方案(剂量) | TGI(％) | p value | CR％(<120mm3) |
| G1 | 溶媒 | - | - | - |
| G2 | 47-C5_V2-YTI-G1(7mg/kg) | 105.1 | <0.0001 | 83.3 |
| G3 | 47-C5_V2-YTI-G4(7mg/kg) | 106.9 | <0.0001 | 100.0 |
| G4 | 47-C5_V2-YTI-G1(2mg/kg) | 109.1 | <0.0001 | 100.0 |
| G5 | ADG106(10mg/kg) | 103.9 | <0.0001 | 83.3 |
实施例13.CD47/4-1BB双特异性融合蛋白的安全性评价
CD47是一种广泛表达的膜蛋白，包括红细胞、血小板、中性粒细胞等正常细胞。当CD47抗体或SIRPα/γ融合蛋白在红细胞、血小板、中性粒细胞等正常细胞表面发生偶联时，即可能破坏这些正常细胞的功能，引发贫血、血小板减少、中性粒细胞减少等不良反应。多项临床试验结果显示，贫血、血小板减少等是限制靶向CD47药物开发的重要安全性问题。例如，Celgene公司针对CD47的IgG4单克隆抗体CC-90002，在临床试验中与抗CD20抗体利妥昔单抗联用作为NHL的免疫疗法，尽管没有显示溶血性贫血，但3/4级中性粒细胞减少和血小板减少不良反应分别达38％和21％(NCT02367196)。另一种CD47的IgG4单克隆抗体SurfaceOncology公司的SRF231，在临床试验中单独使用作为复发性实体瘤的免疫疗法，临床结果显示，3级中性粒细胞减少、溶血性贫血及4级中性粒细胞减少均是其重要的剂量限制性毒性(NCT03512340)。以上两种CD47抗体均由于严重的血液毒性终止开发。
因此，本实施例评估了本公开CD47/4-1BB双特异性融合蛋白的安全性。
1、小鼠中的毒性研究
在实施例14所述小鼠结肠癌模型MC38的实验过程中，于第17天取血检测谷丙转氨酶(glutamic pyruvic transaminase，ALT)和谷草转氨酶(glutamic oxaloacetictransaminase，AST)的水平结果见图16和图17，显示给药过程中小鼠体重平稳，提示涉及的CD47/4-1BB双特异性融合蛋白各给药剂量没有明显的毒副作用。第17天ALT/AST检测结果显示，涉及的CD47/4-1BB双特异性融合蛋白在有效的抗肿瘤剂量下，未显示明显肝毒。
2、食蟹猴中的毒性研究
采用>3岁食蟹猴2只(一雌一雄，普通级，动物来源：广西河池德恒生物科技有限公司)，静脉推注射CD47/4-1BB双特异性融合蛋白47-C5_V2-YTI-G1。单次给药，剂量设置为5mg/kg，给药时间60分钟(以0.9％氯化钠注射液稀释)。在给药前和7天时采集血液，测量并统计血浆中AST、ALT的含量及外周血中红细胞(RBC)、血小板(PLT)、中性粒细胞(NEUT)的数目。结果见图18，CD47/4-1BB双特异性融合蛋白47-C5_V2-YTI-G1在食蟹猴中未显示出明显肝毒性及红细胞、血小板、中性粒细胞毒性。结果表明，CD47/4-1BB双特异性融合蛋白47-C5_V2-YTI-G1在食蟹猴中显示良好的安全性。
虽然以上描述了本公开的具体实施方案，但是本领域的技术人员应当理解，这些仅是举例说明，在不背离本公开的原理和实质的前提下，可以对这些实施方案做出多种变更或修改。因此，本公开的保护范围由所附权利要求书限定。
Claims (16)
1.4-1BB结合蛋白，其包含特异性结合4-1BB的第一结合结构域，和第二结合结构域；其中，特异性结合4-1BB的第一结合结构域包含免疫球蛋白单一可变结构域，所述免疫球蛋白单一可变结构域包含：
SEQ ID NO：12、20-23任一所示氨基酸序列中的CDR1、CDR2和CDR3，所述CDR1、CDR2和CDR3是根据Kabat、IMGT、Chothia、AbM或Contact编号系统定义的；
优选地，所述免疫球蛋白单一可变结构域的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别SEQID NO：13、14、15所示，或如SEQ ID NO：13、14、24所示。
2.如权利要求1所述的4-1BB结合蛋白，所述免疫球蛋白单一可变结构域为人源化、亲和力成熟、去除T细胞表位、降低抗体脱酰胺和/或降低抗体异构化改造的；
优选地，人源化改造过程使用的人种系模板的重链框架区为IGHV3-64*04、IGHV3-23*03和/或IGHV3-74*01。
3.如权利要求1或2所述的4-1BB结合蛋白，所述免疫球蛋白单一可变结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO:20-23任一所示，或与SEQ ID NO:20-23任一具有至少80％、至少90％序列同一性。
4.如权利要求1至3任一项所述的4-1BB结合蛋白，其中，所述第二结合结构域特性结合CD47，所述4-1BB结合蛋白为CD47/4-1BB结合蛋白；
优选地，所述第二结合结构域为SIRPγ多肽、SIRPα多肽、或抗CD47抗体；
优选地，所述CD47/4-1BB结合蛋白是抗4-1BB纳米抗体和SIRPγ多肽的融合蛋白。
5.如权利要求4所述的4-1BB结合蛋白，其中，所述SIRPγ多肽具有SEQ ID NO:32或33所示的序列；或者，
所述SIRPγ多肽在相对于野生型SIRPγ多肽的第51位具有氨基酸替代突变，所述野生型SIRPγ多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:31所示；或者，
所述SIRPγ多肽在相对于野生型SIRPγ多肽在第19位、第51位、第53位、第101位具有替代突变；
优选地，所述第51位替代突变为51M、51V、51F、51I、51L或51R替代突变；更优选地，所述第51位替代突变为N51M、N51V、N51F、N51I、N51L或N51R替代突变；
优选地，所述第19位、第53位、第101位的突变分别为19E、53G、101D突变，更优选为K19E、K53G、N101D突变。
6.如权利要求4或5所述的4-1BB结合蛋白，其中，所述SIRPγ多肽的氨基酸序列如SEQID NO：25、31、34-52任一所示。
7.如权利要求1至6任一项所述的4-1BB结合蛋白，其还包含人免疫球蛋白Fc区；
优选地，所述Fc区是人IgG1或人IgG4的Fc区；
更优选地，所述人IgG1的Fc区具有S267E和/或L328F突变，或具有L234A、L235A和/或N297A，或具有C220A突变，或具有C220A/S267E/L328F突变，或具有C220A/L234A/L235A/N297A突变；
更优选地，所述人IgG4的Fc区具有S228P、F234A、L235A和/或K447A突变。
8.如权利要求1至7任一项所述的4-1BB结合蛋白，所述结合蛋白中还具有连接子；
优选地，所述连接子的氨基酸序列如(GmSn)h或(GGNGT)h或(YGNGT)h或(EPKSS)h所示，其中，m、n各自独立地选自1-8的整数，h独立地选自1-20的整数；更优选地，所述连接子为(G4S)2、(G4S)3所示的连接子。
9.CD47/4-1BB结合蛋白，其包含多肽链，所述多肽链从N端到C端如下所示：
(1)[特异性结合4-1BB的第一结合结构域]-Fc区-[连接子1]a-[特异性结合CD47的第二结合结构域]
(2)[特异性结合CD47的第二结合结构域]-Fc区-[连接子1]a-[特异性结合4-1BB的第一结合结构域]
(3)[特异性结合4-1BB的第一结合结构域]-[连接子1]a-[特异性结合CD47的第二结合结构域]-Fc区
(4)[特异性结合CD47的第二结合结构域]-[连接子1]a-[特异性结合4-1BB的第一结合结构域]-Fc区
(5)Fc区-[连接子1]b-[特异性结合4-1BB的第一结合结构域]-[连接子1]a-[特异性结合CD47的第二结合结构域]
(6)Fc区-[连接子1]b-[特异性结合CD47的第二结合结构域]-[连接子1]a-[特异性结合4-1BB的第一结合结构域]；
其中，特异性结合4-1BB的第一结合结构域如权利要求1-3任一项所限定；特异性结合CD47的第二结合结构域如权利要求4-6任一项所限定；-表示肽键，连接子为能够实现连接功能的多肽，连接子1、连接子2，可以相同，也可以不同；
优选地，所述连接子为(GxS)y连接子，其中，x选自1-5的整数，y选自1-6的整数；更优选地，所述连接子为(G4S)2、(G4S)3所示的连接子。
10.如权利要求9所述的CD47/4-1BB结合蛋白，其包含如SEQ ID NO:26-30任一所示，或与SEQ ID NO:26-30任一具有至少80％、至少90％序列同一性的多肽链。
11.多核苷酸，其编码权利要求1至8任一项所述的4-1BB结合蛋白、权利要求9至10任一项所述的CD47/4-1BB结合蛋白；
优选地，所述多核苷酸为DNA或RNA。
12.载体，其包含权利要求11所述的多核苷酸。
13.宿主细胞，其含有或表达权利要求11所述的多核苷酸或权利要求12所述的载体。
14.制备CD47/4-1BB结合蛋白、4-1BB结合蛋白的方法，包括：
在权利要求13所述的宿主细胞中表达权利要求11所述的多核苷酸或权利要求12所述的载体，以及从所述宿主细胞中分离表达的CD47/4-1BB结合蛋白、4-1BB结合蛋白；
可选地，进一步包含纯化所述CD47/4-1BB结合蛋白、4-1BB结合蛋白的步骤。
15.药物组合物，其包含权利要求1至8任一项所述的4-1BB结合蛋白、权利要求9至10任一项所述的CD47/4-1BB结合蛋白，以及，至少一种可药用的赋形剂、稀释剂或载体；
优选地，所述药物组合物进一步包含抗CD20抗体。
16.权利要求1至8任一项所述的4-1BB结合蛋白、权利要求9至10任一项所述的CD47/4-1BB结合蛋白、权利要求11所述的多核苷酸、权利要求12所述的载体用于制备治疗癌症的药物的用途；
优选地，所述癌症选自肺癌、前列腺癌、乳腺癌、头颈部癌、食管癌、胃癌、结肠癌、直肠癌、膀胱癌、宫颈癌、子宫癌、卵巢癌、肝癌、黑色素瘤、肾癌、鳞状细胞癌或血液系统癌症。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202211515120 | 2022-11-29 | ||
| CN2022115151206 | 2022-11-29 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN118108853A true CN118108853A (zh) | 2024-05-31 |
Family
ID=91211339
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202311611230.7A Pending CN118108853A (zh) | 2022-11-29 | 2023-11-29 | Cd47/4-1bb结合蛋白及其医药用途 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN118108853A (zh) |
-
2023
- 2023-11-29 CN CN202311611230.7A patent/CN118108853A/zh active Pending
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US10882916B2 (en) | Anti-C5a receptor antibodies | |
| TWI754800B (zh) | 新型抗ox40/pd-l1雙特異性抗體分子、新型抗vegf/gitr雙特異性抗體分子及其用途 | |
| CN109843927B (zh) | 抗b7-h3抗体、其抗原结合片段及其医药用途 | |
| EP4119162A1 (en) | Pvrig binding protein and its medical uses | |
| CN112166124A (zh) | 拮抗性cd73抗体 | |
| CA3089260A1 (en) | Anti-4-1bb antibody, antigen-binding fragment thereof and medical use thereof | |
| JP2022516140A (ja) | 白血球免疫グロブリン様受容体２中和抗体 | |
| CN110461874B (zh) | 抗gitr抗体、其抗原结合片段及其医药用途 | |
| CN115298216A (zh) | 抗体或其抗原结合片段、其制备方法及医药用途 | |
| WO2022078490A1 (zh) | 抗erbb3抗体或其抗原结合片段及其医药用途 | |
| CN114437227A (zh) | 双特异抗体及其应用 | |
| CN115397860A (zh) | 抗cd25抗体、其抗原结合片段及其医药用途 | |
| CN118108853A (zh) | Cd47/4-1bb结合蛋白及其医药用途 | |
| CN108473586B (zh) | 抗cd27抗体、其抗原结合片段及其医药用途 | |
| WO2024114676A1 (zh) | Cldn18.2/4-1bb结合蛋白及其医药用途 | |
| WO2023040945A1 (zh) | 特异性结合pd-1的蛋白及其医药用途 | |
| WO2023025194A1 (zh) | Fap/cd40结合分子及其医药用途 | |
| WO2023093899A1 (zh) | 经修饰的蛋白或多肽 | |
| WO2023040940A1 (zh) | Pvrig/tigit结合蛋白联合免疫检查点抑制剂用于治疗癌症 | |
| WO2024017326A1 (zh) | 抗gprc5d纳米抗体及其应用 | |
| TW202421667A (zh) | Ｃｌｄｎ１８．２／４－１ｂｂ結合蛋白及其醫藥用途 | |
| CN118339179A (zh) | 经修饰的蛋白或多肽 | |
| CN116813786A (zh) | 抗cd73抗体及其应用 | |
| CN115109157A (zh) | 抗体或其抗原结合片段，其制备方法及医药用途 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication |