EA044114B1 - Агонистические антитела против pd-1 и их применение - Google Patents
Агонистические антитела против pd-1 и их применение Download PDFInfo
- Publication number
- EA044114B1 EA044114B1 EA202091809 EA044114B1 EA 044114 B1 EA044114 B1 EA 044114B1 EA 202091809 EA202091809 EA 202091809 EA 044114 B1 EA044114 B1 EA 044114B1
- Authority
- EA
- Eurasian Patent Office
- Prior art keywords
- antibody
- seq
- disease
- amino acid
- acid sequence
- Prior art date
Links
- 230000001270 agonistic effect Effects 0.000 title description 13
- 102100040678 Programmed cell death protein 1 Human genes 0.000 claims description 111
- 101710089372 Programmed cell death protein 1 Proteins 0.000 claims description 105
- 101000611936 Homo sapiens Programmed cell death protein 1 Proteins 0.000 claims description 65
- 102000048362 human PDCD1 Human genes 0.000 claims description 57
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 55
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 claims description 53
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 claims description 52
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims description 28
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims description 25
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 21
- 208000009329 Graft vs Host Disease Diseases 0.000 claims description 20
- 208000024908 graft versus host disease Diseases 0.000 claims description 20
- 206010052779 Transplant rejections Diseases 0.000 claims description 17
- 201000000596 systemic lupus erythematosus Diseases 0.000 claims description 17
- 201000004681 Psoriasis Diseases 0.000 claims description 16
- 206010039073 rheumatoid arthritis Diseases 0.000 claims description 16
- 206010002556 Ankylosing Spondylitis Diseases 0.000 claims description 15
- 206010009900 Colitis ulcerative Diseases 0.000 claims description 15
- 208000007465 Giant cell arteritis Diseases 0.000 claims description 15
- 208000022559 Inflammatory bowel disease Diseases 0.000 claims description 15
- 201000001263 Psoriatic Arthritis Diseases 0.000 claims description 15
- 208000036824 Psoriatic arthropathy Diseases 0.000 claims description 15
- 208000021386 Sjogren Syndrome Diseases 0.000 claims description 15
- 206010067584 Type 1 diabetes mellitus Diseases 0.000 claims description 15
- 201000006704 Ulcerative Colitis Diseases 0.000 claims description 15
- 201000006417 multiple sclerosis Diseases 0.000 claims description 15
- 206010043207 temporal arteritis Diseases 0.000 claims description 15
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 claims description 14
- 206010003827 Autoimmune hepatitis Diseases 0.000 claims description 12
- 206010039710 Scleroderma Diseases 0.000 claims description 12
- 206010047115 Vasculitis Diseases 0.000 claims description 12
- 239000007787 solid Substances 0.000 claims description 12
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 claims description 10
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims description 10
- 208000007048 Polymyalgia Rheumatica Diseases 0.000 claims description 9
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 claims description 9
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 claims description 9
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 8
- 208000026872 Addison Disease Diseases 0.000 claims description 7
- 201000001320 Atherosclerosis Diseases 0.000 claims description 7
- 208000004300 Atrophic Gastritis Diseases 0.000 claims description 7
- 206010069002 Autoimmune pancreatitis Diseases 0.000 claims description 7
- 208000023328 Basedow disease Diseases 0.000 claims description 7
- 208000015943 Coeliac disease Diseases 0.000 claims description 7
- 208000011231 Crohn disease Diseases 0.000 claims description 7
- 208000036495 Gastritis atrophic Diseases 0.000 claims description 7
- 206010072579 Granulomatosis with polyangiitis Diseases 0.000 claims description 7
- 208000015023 Graves' disease Diseases 0.000 claims description 7
- 208000001204 Hashimoto Disease Diseases 0.000 claims description 7
- 208000030836 Hashimoto thyroiditis Diseases 0.000 claims description 7
- 206010058359 Hypogonadism Diseases 0.000 claims description 7
- 208000000038 Hypoparathyroidism Diseases 0.000 claims description 7
- 208000009525 Myocarditis Diseases 0.000 claims description 7
- 201000002481 Myositis Diseases 0.000 claims description 7
- 206010034277 Pemphigoid Diseases 0.000 claims description 7
- 208000031845 Pernicious anaemia Diseases 0.000 claims description 7
- 208000000594 bullous pemphigoid Diseases 0.000 claims description 7
- 208000016644 chronic atrophic gastritis Diseases 0.000 claims description 7
- 208000025302 chronic primary adrenal insufficiency Diseases 0.000 claims description 7
- 208000000509 infertility Diseases 0.000 claims description 7
- 231100000535 infertility Toxicity 0.000 claims description 7
- 230000036512 infertility Effects 0.000 claims description 7
- 206010028417 myasthenia gravis Diseases 0.000 claims description 7
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 claims description 7
- 208000027496 Behcet disease Diseases 0.000 claims description 6
- 208000007475 hemolytic anemia Diseases 0.000 claims description 6
- 208000005777 Lupus Nephritis Diseases 0.000 claims description 5
- 229940122544 PD-1 agonist Drugs 0.000 claims description 4
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims description 3
- 238000010172 mouse model Methods 0.000 claims description 3
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims 14
- 230000008520 organization Effects 0.000 claims 1
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 148
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 56
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 30
- 238000002198 surface plasmon resonance spectroscopy Methods 0.000 description 30
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 21
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 20
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 16
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 16
- 210000003819 peripheral blood mononuclear cell Anatomy 0.000 description 16
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 16
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 14
- 238000001943 fluorescence-activated cell sorting Methods 0.000 description 13
- 241000282567 Macaca fascicularis Species 0.000 description 12
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 12
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 12
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 12
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 12
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 12
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 12
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 12
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 11
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 11
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 11
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 11
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 11
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 9
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 9
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 9
- 239000000556 agonist Substances 0.000 description 8
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 8
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 8
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 8
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 8
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 8
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 8
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 8
- 230000004044 response Effects 0.000 description 8
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 8
- 108010047041 Complementarity Determining Regions Proteins 0.000 description 7
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 7
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 7
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 7
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 7
- 108010074708 B7-H1 Antigen Proteins 0.000 description 6
- 102000008096 B7-H1 Antigen Human genes 0.000 description 6
- 206010061818 Disease progression Diseases 0.000 description 6
- 101100407308 Mus musculus Pdcd1lg2 gene Proteins 0.000 description 6
- 108700030875 Programmed Cell Death 1 Ligand 2 Proteins 0.000 description 6
- 102100024213 Programmed cell death 1 ligand 2 Human genes 0.000 description 6
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 6
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 6
- 230000005750 disease progression Effects 0.000 description 6
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 6
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 6
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 description 5
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 5
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 5
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 5
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 5
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 5
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 5
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 5
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 5
- NFGXHKASABOEEW-UHFFFAOYSA-N 1-methylethyl 11-methoxy-3,7,11-trimethyl-2,4-dodecadienoate Chemical compound COC(C)(C)CCCC(C)CC=CC(C)=CC(=O)OC(C)C NFGXHKASABOEEW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 206010000234 Abortion spontaneous Diseases 0.000 description 4
- 208000035285 Allergic Seasonal Rhinitis Diseases 0.000 description 4
- 208000007984 Female Infertility Diseases 0.000 description 4
- 206010021928 Infertility female Diseases 0.000 description 4
- 102100037850 Interferon gamma Human genes 0.000 description 4
- 108010074328 Interferon-gamma Proteins 0.000 description 4
- 208000018583 New-onset refractory status epilepticus Diseases 0.000 description 4
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 4
- 206010039085 Rhinitis allergic Diseases 0.000 description 4
- 102100040247 Tumor necrosis factor Human genes 0.000 description 4
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 4
- 206010047642 Vitiligo Diseases 0.000 description 4
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 4
- 208000026935 allergic disease Diseases 0.000 description 4
- 201000010105 allergic rhinitis Diseases 0.000 description 4
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 4
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 4
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 4
- 208000006673 asthma Diseases 0.000 description 4
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 4
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 4
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 4
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 4
- 230000036541 health Effects 0.000 description 4
- 210000002865 immune cell Anatomy 0.000 description 4
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 4
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 4
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 4
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 4
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 4
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 4
- 208000000995 spontaneous abortion Diseases 0.000 description 4
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 4
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 4
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 4
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 4
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 4
- MZOFCQQQCNRIBI-VMXHOPILSA-N (3s)-4-[[(2s)-1-[[(2s)-1-[[(1s)-1-carboxy-2-hydroxyethyl]amino]-4-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-5-(diaminomethylideneamino)-1-oxopentan-2-yl]amino]-3-[[2-[[(2s)-2,6-diaminohexanoyl]amino]acetyl]amino]-4-oxobutanoic acid Chemical compound OC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CCCCN MZOFCQQQCNRIBI-VMXHOPILSA-N 0.000 description 3
- 229920001917 Ficoll Polymers 0.000 description 3
- 101000914514 Homo sapiens T-cell-specific surface glycoprotein CD28 Proteins 0.000 description 3
- 102000037982 Immune checkpoint proteins Human genes 0.000 description 3
- 108091008036 Immune checkpoint proteins Proteins 0.000 description 3
- 102000003814 Interleukin-10 Human genes 0.000 description 3
- 108090000174 Interleukin-10 Proteins 0.000 description 3
- 102000000588 Interleukin-2 Human genes 0.000 description 3
- 239000005089 Luciferase Substances 0.000 description 3
- 208000007466 Male Infertility Diseases 0.000 description 3
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 3
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 3
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 3
- 230000006044 T cell activation Effects 0.000 description 3
- 108091008874 T cell receptors Proteins 0.000 description 3
- 102000016266 T-Cell Antigen Receptors Human genes 0.000 description 3
- 102100027213 T-cell-specific surface glycoprotein CD28 Human genes 0.000 description 3
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 230000001363 autoimmune Effects 0.000 description 3
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 3
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 3
- 230000004540 complement-dependent cytotoxicity Effects 0.000 description 3
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 3
- 238000011161 development Methods 0.000 description 3
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 3
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 3
- 230000006058 immune tolerance Effects 0.000 description 3
- 230000002757 inflammatory effect Effects 0.000 description 3
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 3
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 3
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 3
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 3
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 3
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 3
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 3
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 3
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 3
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 3
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 3
- IVLXQGJVBGMLRR-UHFFFAOYSA-N 2-aminoacetic acid;hydron;chloride Chemical compound Cl.NCC(O)=O IVLXQGJVBGMLRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000017420 CD3 protein, epsilon/gamma/delta subunit Human genes 0.000 description 2
- 108050005493 CD3 protein, epsilon/gamma/delta subunit Proteins 0.000 description 2
- 108010021064 CTLA-4 Antigen Proteins 0.000 description 2
- 102000008203 CTLA-4 Antigen Human genes 0.000 description 2
- 229940045513 CTLA4 antagonist Drugs 0.000 description 2
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 2
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 2
- 108700010070 Codon Usage Proteins 0.000 description 2
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101001117317 Homo sapiens Programmed cell death 1 ligand 1 Proteins 0.000 description 2
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 2
- 108090001005 Interleukin-6 Proteins 0.000 description 2
- 102000004889 Interleukin-6 Human genes 0.000 description 2
- FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N Magnesium Chemical compound [Mg] FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 2
- 230000006052 T cell proliferation Effects 0.000 description 2
- 238000010162 Tukey test Methods 0.000 description 2
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 2
- 230000003042 antagnostic effect Effects 0.000 description 2
- 230000010056 antibody-dependent cellular cytotoxicity Effects 0.000 description 2
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 2
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 2
- 229960000074 biopharmaceutical Drugs 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 2
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 2
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000012754 cardiac puncture Methods 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 2
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 2
- 230000009266 disease activity Effects 0.000 description 2
- 230000009429 distress Effects 0.000 description 2
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 2
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 2
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 2
- 229960001269 glycine hydrochloride Drugs 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- 102000048776 human CD274 Human genes 0.000 description 2
- 230000005931 immune cell recruitment Effects 0.000 description 2
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 2
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 2
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 2
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 2
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 2
- 230000003259 immunoinhibitory effect Effects 0.000 description 2
- 238000000099 in vitro assay Methods 0.000 description 2
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 2
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 2
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 2
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 2
- 238000007477 logistic regression Methods 0.000 description 2
- 239000011777 magnesium Substances 0.000 description 2
- 229910052749 magnesium Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 2
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 2
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 2
- 238000012552 review Methods 0.000 description 2
- 238000013207 serial dilution Methods 0.000 description 2
- 210000004988 splenocyte Anatomy 0.000 description 2
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000016261 weight loss Diseases 0.000 description 2
- 230000004580 weight loss Effects 0.000 description 2
- RMQHBNLAFHDMEN-UHFFFAOYSA-N (4,4,4-trifluoro-2-oxobutyl) dihydrogen phosphate Chemical compound OP(O)(=O)OCC(=O)CC(F)(F)F RMQHBNLAFHDMEN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010002091 Anaesthesia Diseases 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101150011571 BSL2 gene Proteins 0.000 description 1
- 208000009137 Behcet syndrome Diseases 0.000 description 1
- 102100021935 C-C motif chemokine 26 Human genes 0.000 description 1
- 238000011740 C57BL/6 mouse Methods 0.000 description 1
- 206010006895 Cachexia Diseases 0.000 description 1
- 102000000844 Cell Surface Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010001857 Cell Surface Receptors Proteins 0.000 description 1
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 1
- 241000699802 Cricetulus griseus Species 0.000 description 1
- CMSMOCZEIVJLDB-UHFFFAOYSA-N Cyclophosphamide Chemical compound ClCCN(CCCl)P1(=O)NCCCO1 CMSMOCZEIVJLDB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010013975 Dyspnoeas Diseases 0.000 description 1
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 1
- 206010015548 Euthanasia Diseases 0.000 description 1
- 238000012413 Fluorescence activated cell sorting analysis Methods 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 101000897493 Homo sapiens C-C motif chemokine 26 Proteins 0.000 description 1
- 101000841411 Homo sapiens Protein ecdysoneless homolog Proteins 0.000 description 1
- 101000946860 Homo sapiens T-cell surface glycoprotein CD3 epsilon chain Proteins 0.000 description 1
- 102000009490 IgG Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010073807 IgG Receptors Proteins 0.000 description 1
- 108010054477 Immunoglobulin Fab Fragments Proteins 0.000 description 1
- 102000001706 Immunoglobulin Fab Fragments Human genes 0.000 description 1
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 1
- PIWKPBJCKXDKJR-UHFFFAOYSA-N Isoflurane Chemical compound FC(F)OC(Cl)C(F)(F)F PIWKPBJCKXDKJR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 101000686985 Mouse mammary tumor virus (strain C3H) Protein PR73 Proteins 0.000 description 1
- 230000004988 N-glycosylation Effects 0.000 description 1
- 229930193140 Neomycin Natural products 0.000 description 1
- 229940124060 PD-1 antagonist Drugs 0.000 description 1
- 208000002193 Pain Diseases 0.000 description 1
- 208000037273 Pathologic Processes Diseases 0.000 description 1
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 1
- 239000012979 RPMI medium Substances 0.000 description 1
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 description 1
- 206010051379 Systemic Inflammatory Response Syndrome Diseases 0.000 description 1
- 230000024932 T cell mediated immunity Effects 0.000 description 1
- 102100035794 T-cell surface glycoprotein CD3 epsilon chain Human genes 0.000 description 1
- 108700012920 TNF Proteins 0.000 description 1
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 1
- 108010022394 Threonine synthase Proteins 0.000 description 1
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 description 1
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 230000003044 adaptive effect Effects 0.000 description 1
- 230000004721 adaptive immunity Effects 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 230000008484 agonism Effects 0.000 description 1
- 230000037005 anaesthesia Effects 0.000 description 1
- 238000000540 analysis of variance Methods 0.000 description 1
- 238000004873 anchoring Methods 0.000 description 1
- 208000007502 anemia Diseases 0.000 description 1
- 230000001093 anti-cancer Effects 0.000 description 1
- 230000003466 anti-cipated effect Effects 0.000 description 1
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 1
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 1
- 230000006472 autoimmune response Effects 0.000 description 1
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 239000000090 biomarker Substances 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 244000309466 calf Species 0.000 description 1
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 230000022131 cell cycle Effects 0.000 description 1
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 230000008614 cellular interaction Effects 0.000 description 1
- PBAYDYUZOSNJGU-UHFFFAOYSA-N chelidonic acid Natural products OC(=O)C1=CC(=O)C=C(C(O)=O)O1 PBAYDYUZOSNJGU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 239000013611 chromosomal DNA Substances 0.000 description 1
- 238000002648 combination therapy Methods 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 239000003246 corticosteroid Substances 0.000 description 1
- 229960001334 corticosteroids Drugs 0.000 description 1
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 1
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 1
- 229960004397 cyclophosphamide Drugs 0.000 description 1
- 206010052015 cytokine release syndrome Diseases 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 210000004443 dendritic cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000000432 density-gradient centrifugation Methods 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 230000008021 deposition Effects 0.000 description 1
- 230000037213 diet Effects 0.000 description 1
- 235000005911 diet Nutrition 0.000 description 1
- 102000004419 dihydrofolate reductase Human genes 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 208000026500 emaciation Diseases 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 231100000655 enterotoxin Toxicity 0.000 description 1
- 239000012997 ficoll-paque Substances 0.000 description 1
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 229960002449 glycine Drugs 0.000 description 1
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 1
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000009931 harmful effect Effects 0.000 description 1
- 230000002949 hemolytic effect Effects 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000047791 human ECD Human genes 0.000 description 1
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000011577 humanized mouse model Methods 0.000 description 1
- 230000028996 humoral immune response Effects 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 229910052588 hydroxylapatite Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 1
- 230000036737 immune function Effects 0.000 description 1
- 230000008105 immune reaction Effects 0.000 description 1
- 208000026278 immune system disease Diseases 0.000 description 1
- 229940124622 immune-modulator drug Drugs 0.000 description 1
- 230000000415 inactivating effect Effects 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 1
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 1
- 230000015788 innate immune response Effects 0.000 description 1
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 description 1
- 229960002725 isoflurane Drugs 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 230000005923 long-lasting effect Effects 0.000 description 1
- 238000011866 long-term treatment Methods 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 238000004020 luminiscence type Methods 0.000 description 1
- 206010025135 lupus erythematosus Diseases 0.000 description 1
- 239000012516 mab select resin Substances 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- KJLLKLRVCJAFRY-UHFFFAOYSA-N mebutizide Chemical compound ClC1=C(S(N)(=O)=O)C=C2S(=O)(=O)NC(C(C)C(C)CC)NC2=C1 KJLLKLRVCJAFRY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002483 medication Methods 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 238000010197 meta-analysis Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 210000001616 monocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000007837 multiplex assay Methods 0.000 description 1
- 210000004897 n-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 210000000581 natural killer T-cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 229960004927 neomycin Drugs 0.000 description 1
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 1
- 229960003301 nivolumab Drugs 0.000 description 1
- 230000009871 nonspecific binding Effects 0.000 description 1
- 238000001543 one-way ANOVA Methods 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 1
- -1 pH 3.0 Substances 0.000 description 1
- 230000036407 pain Effects 0.000 description 1
- 230000009054 pathological process Effects 0.000 description 1
- XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D pentacalcium;hydroxide;triphosphate Chemical compound [OH-].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D 0.000 description 1
- 230000002688 persistence Effects 0.000 description 1
- 230000004962 physiological condition Effects 0.000 description 1
- 229920000136 polysorbate Polymers 0.000 description 1
- 210000004986 primary T-cell Anatomy 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 230000000750 progressive effect Effects 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 239000012146 running buffer Substances 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 230000007781 signaling event Effects 0.000 description 1
- 238000009097 single-agent therapy Methods 0.000 description 1
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 230000002483 superagonistic effect Effects 0.000 description 1
- 231100000617 superantigen Toxicity 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 230000009897 systematic effect Effects 0.000 description 1
- 238000007910 systemic administration Methods 0.000 description 1
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 1
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 1
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 1
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 1
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 1
- 210000001541 thymus gland Anatomy 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 1
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 1
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 1
- 238000011269 treatment regimen Methods 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940046728 tumor necrosis factor alpha inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 239000002451 tumor necrosis factor inhibitor Substances 0.000 description 1
- 230000003442 weekly effect Effects 0.000 description 1
Description
Данное изобретение относится к области медицины. Более конкретно, данное изобретение относится к агонистическим антителам, направленным на белок 1 запрограммированной гибели клетки человека (PD-1; также известный как CD279), к композициям, содержащим такие агонистические антитела против
PD-1 человека, и к способам применения таких агонистических антител против PD-1 человека для лечения аутоиммунных нарушений или отторжения трансплантата.
Пути иммунных контрольных точек модулируют как аутоиммунный ответ, так и противораковый иммунный ответ (Isakov, N., J. Autoimmune Disorders 2016; 2(2):17). В терапии аутоиммунных заболеваний является желательным стимулирование, то есть агонизация, эффект иммуноингибирующего пути, так что иммунный ответ подавляется. И наоборот, при лечении рака желательно ингибировать, то есть антагонизировать, активность иммуноингибирующего пути, так что иммунный ответ подавляется или стимулируется.
PD-1 представляет собой белок клеточной мембраны типа I. PD-1 принадлежит к расширенному семейству CD28/CTLA-4, содержащему внеклеточный домен IgV, за которым следует трансмембранный и внутриклеточный домен. Активация пути PD-1 приводит к ингибированию активации иммунных клеток, такому как снижение пролиферации клеток, снижение выживаемости клеток и ингибирование воспалительных цитокинов (например, IFNy, TNFa и IL-2). PD-1 экспрессируется на недавно активированных иммунных клетках, таких как Т-клетки, В-клетки, NKT-клетки, моноциты и дендритные клетки; и его экспрессия жестко регулируется. Важность опосредованной PD-1 передачи сигналов в модулировании иммунного ответа человека была продемонстрирована успехом лечения онкологических пациентов антагонистическими антителами против PD-1. У пациентов с раком, которые получают антагонистическое антитело против PD-1, побочные эффекты лечения имеют различные аутоиммунные проявления (Cappelli, L.C., et al., 2017; Hoffman, L., et al., 2016). Кроме того, существуют другие известные корреляции между активностью аутоиммунного заболевания и путём PD-1. Например, у пациентов с СКВ, страдающих от обострений, обычно наблюдается низкая экспрессия PD-L1 (Mozaffarian, N., et al., 2008) и аутоантител к PD-1 (Shi, H., et al., 2017).
Следовательно, увеличение PD-1 опосредованной передачи сигналов представляет собой потенциальный подход к лечению аутоиммунных нарушений, что может привести к глубокой модификации заболевания и длительности ответа, а также к основным преимуществам безопасности по сравнению с современными иммуномодулирующими препаратами. Эти современные методы лечения, в общем случае, в целом деактивируют иммунную систему организма (например, кортикостероиды и циклофосфамид). Однако PD-1 экспрессируется в основном на активированных иммунных клетках. Следовательно, антитела анти-PD-1 обладают способностью избирательно нацеливаться на клетки, которые активируются во время лечения, оставляя остальную часть репертуара иммунных клеток интактной.
В данной области техники прилагали усилия, чтобы доставлять агонистические антитела против PD-1 (Sharpe, A. and Pauken, E., Nature Reviews Immunology (2017)). Считается, что трудность доставки, по меньшей мере частично, является результатом сложных клеточных взаимодействий, необходимых для достижения агонизма PD-1 в физиологических условиях in vitro или in vivo. Следовательно, контекст анализа или модели, применяемых для идентификации терапевтических антител, явно важен при оценке активности агонистического антитела против PD-1.
Публикация заявки на патент США US20170088618 описывает антитела против PD-1 человека, которые в некоторых вариантах осуществления и в некоторых анализах in vitro ведут себя как агонисты со скоростями ассоциации и диссоциации по отношению к внеклеточному домену PD-1, что приводит к значениям KD между 19-22 нМ (что определяется с помощью анализа поверхностного плазмонного резонанса (SPR) с применением BIAcore® T200).
Таким образом, существует потребность в альтернативных антителах против PD-1 человека, которые: 1) связывают PD-1 человека с желаемыми скоростями ассоциации и диссоциации для оптимальной активности агониста, 2) агонизируют PD-1 человека в иммунологически релевантном контексте для достижения эффективности in vivo, 3) демонстрируют достаточную эффективность в качестве монотерапии для лечения и/или профилактики аутоиммунных нарушений или предотвращения отторжения трансплантата, 4) демонстрируют желаемую активность как часть комбинированной терапии с другими терапевтическими средствами для лечения и/или профилактики аутоиммунных нарушений или предотвращения отторжения трансплантата, и/или 5) предлагают эффективную альтернативу для смены лекарственного средства, когда во время лечения аутоиммунного нарушения другим агонистическим антителом против PD-1 человека терапия приостановлена из-за по меньшей мере одного нежелательного явления и/или неэффективности (в частности, снижения эффективности, опосредованного антителами против лекарственного средства (ADA)).
Соответственно, данное изобретение относится к новым гуманизированным агонистическим антителам IgG1 против PD-1 человека. Антитела по данному изобретению особенно выгодны по сравнению с антителами анти-PD-1 предшествующего уровня техники по различным причинам, включая, но не ограничиваясь этим, следующее: 1) они связывают PD-1 человека (а также PD-1 обезьяны яванского макака) с желаемыми скоростями ассоциации и диссоциации, 2) они могут быть терапевтически эффективными
- 1 044114 при более низких дозах или менее частых введениях дозы, 3) они ингибируют первичную пролиферацию Т-клеток человека in vitro, 4) они регулируют экспрессию PD-1 человека на поверхности клетки, 5) они ингибируют сигнальную активность Т-клеточных рецепторов в анализе in vitro NFAT-репортерных клеток, 6) они обладают низким потенциалом иммуногенности терапевтического белка (то есть антител против лекарственного средства (ADA)), 7) они снижают активность заболевания в гуманизированной модели GvHD и/или 8) в модели волчаночного нефрита in vivo они ингибируют активацию иммунных клеток:
a) без значительной и/или определяемой комплемент-зависимой цитотоксичности,
b) без конкуренции с PD-L1/2 человека за связывание с PD-1 человека,
c) без индуцирования значительного и/или определяемого высвобождения цитокинов в анализах in vitro.
Кроме того, типовые агонистические антитела IgG1 против PD-1 человека по данному изобретению также проявляют стабильность in vivo, физическую и химическую стабильность, включая, но не ограничиваясь этим, термическую стабильность, растворимость, низкую самоассоциацию и фармакокинетические характеристики, которые являются приемлемыми для разработки и/или применения в лечении аутоиммунных нарушений и/или отторжения трансплантата (то есть болезни трансплантат против хозяина). Кроме того, описанные в данном документе полинуклеотидные последовательности, которые кодируют типовые агонистические антитела IgGl против PD-1 человека по данному изобретению, были разработаны для применения предпочтительного кодона для значительного улучшения экспрессии антител в предпочтительных системах экспрессии клеточных линий млекопитающих, таких как CHO.
В данном изобретении предлагается прогресс по сравнению с предшествующим уровнем техники, предоставляя композиции и способы, применимые для профилактики, подавления или ослабления аутоиммунных и/или иммунологических нарушений, связанных со стимуляцией иммунной контрольной точки, с помощью специально сконструированного агонистического антитела IgG1 против PD-1 человека. Агонистические антитела IgG1 против PD-1 человека по данному изобретению способны деактивировать или ослаблять иммунную патологию, предпочтительно, путем ингибирования адаптивного звена иммунного ответа, отмены антигенспецифического иммунного процесса и, таким образом, непосредственно воздействия на патологию, лежащую в основе заболевания. Клиническое применение таких антител может привести к длительной выносливости общего состояния или ремиссии заболевания (заболеваний), подлежащего лечению.
В данном изобретении предлагается антитело против PD-1 человека, содержащее: 1) вариабельную область тяжелой цепи (HCVR), содержащую HCDR1, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5, HCDR2, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO 6, HCDR3, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 7; и 2) вариабельную область легкой цепи (LCVR), содержащую LCDR1, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8, LCDR2, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 9, и LCDR3, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 10, при этом указанное антитело представляет собой подкласс 1 изотипа IgG (IgG1).
В некоторых вариантах осуществления данного изобретения предлагается антитело против PD-1 человека, содержащее: 1) HCVR, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3; и 2) LCVR, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4, при этом указанное антитело представляет собой IgG1.
В некоторых вариантах осуществления данного изобретения предлагается антитело против PD-1 человека, содержащее: 1) тяжелую цепь, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1; и 2) легкую цепь, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2.
В некоторых вариантах осуществления данного изобретения предлагается антитело против PD-1 человека, состоящее из двух тяжелых цепей, имеющих аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, и двух легких цепей, имеющих аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2.
В данном изобретении также предлагается клетка млекопитающего, способная экспрессировать антитело против PD-1 человека, содержащее: 1) HCVR, содержащую HCDR1, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5, HCDR2, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6, HCDR3, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 7; и 2) LCVR, содержащую LCDR1, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8, LCDR2, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 9, и LCDR3, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 10, при этом указанное антитело представляет собой IgG1.
В некоторых вариантах осуществления данного изобретения предлагается клетка млекопитающего, способная экспрессировать антитело против PD-1 человека, содержащее: 1) HCVR, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3; и 2) LCVR, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4, при этом указанное антитело представляет собой IgG1.
В некоторых вариантах осуществления данного изобретения предлагается клетка млекопитающего, способная экспрессировать антитело против PD-1 человека, содержащее: 1) тяжелую цепь, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1; и 2) легкую цепь, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2. В некоторых вариантах осуществления данного изобретения предлага- 2 044114 ется антитело против PD-1 человека, состоящее из двух тяжелых цепей, имеющих аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, и двух легких цепей, имеющих аминокислотную последовательность
SEQ ID NO: 2.
В данном изобретении также предлагается способ продуцирования антитела против PD-1 человека, включающий: а) культивирование клетки млекопитающего, способной экспрессировать указанное антитело, при этом указанное антитело содержит: 1) HCVR, включающую HCDR1, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5, HCDR2, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6, HCDR3, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 7; и 2) LCVR, содержащую LCDR1, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8, LCDR2, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 9, и LCDR3, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 10, при этом указанное антитело представляет собой IgG1; и b) восстановление антитела.
В некоторых вариантах осуществления данного изобретения предлагается способ продуцирования антитела против PD-1 человека, включающий: а) культивирование клетки млекопитающего, способной экспрессировать указанное антитело, при этом указанное антитело содержит: 1) HCVR, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3; и 2) LCVR, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4, при этом указанное антитело представляет собой IgG1; и b) восстановление антитела.
В некоторых вариантах осуществления данного изобретения предлагается способ продуцирования антитела против PD-1 человека, включающий: а) культивирование клетки млекопитающего, способной экспрессировать указанное антитело, при этом указанное антитело содержит: 1) тяжелую цепь, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1; и 2) легкую цепь, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2; и b) восстановление антитела.
В некоторых вариантах осуществления данного изобретения предлагается способ продуцирования агонистического антитела против PD-1 человека, включающий: а) культивирование клетки млекопитающего, способной экспрессировать указанное антитело, при этом указанное антитело состоит из двух тяжелых цепей, имеющих аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, и двух легких цепей, имеющих аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2; и b) восстановление антитела.
В данном изобретении также предлагается антитело против PD-1 человека, полученное с помощью вышеупомянутых способов.
В данном изобретении также предлагается фармацевтическая композиция, содержащая антитело против PD-1 человека, полученное с помощью вышеупомянутых способов, а также приемлемый носитель, разбавитель или вспомогательное вещество.
В данном изобретении также предлагается молекула ДНК, содержащая полинуклеотид, имеющий последовательность SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12 или SEQ ID NO: 11 и 12. В данном изобретении также предлагается клетка млекопитающего, содержащая молекулу ДНК, содержащую полинуклеотид, имеющий последовательность SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12 или SEQ ID NO: 11 и 12.
В данном изобретении предлагается фармацевтическая композиция, содержащая: 1) антитело против PD-1 человека, содержащее: a) HCVR, содержащую HCDR1, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5, HCDR2, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6, HCDR3, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 7; и b) LCVR, содержащую LCDR1, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8, LCDR2, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 9, и LCDR3, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 10, при этом указанное антитело представляет собой IgG1; а также 2) приемлемый носитель, разбавитель или вспомогательное вещество.
В некоторых вариантах осуществления данного изобретения предлагается фармацевтическая композиция, содержащая: 1) антитело против PD-1 человека, содержащее: a) HCVR, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3; и
b) LCVR, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4, при этом указанное антитело представляет собой IgG1; а также 2) приемлемый носитель, разбавитель или вспомогательное вещество.
В данном изобретении предлагается фармацевтическая композиция, содержащая: 1) антитело против PD-1 человека, содержащее: а) тяжелую цепь, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1; и b) легкую цепь, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2; а также 2) приемлемый носитель, разбавитель или вспомогательное вещество. В некоторых вариантах осуществления данного изобретения антитело против PD-1 человека из вышеупомянутых фармацевтических композиций состоит из двух тяжелых цепей, имеющих аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, и двух легких цепей, имеющих аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2.
В данном контексте термин PD-1 относится к белку 1 запрограммированной гибели клеток, также известному как белок 1 запрограммированной гибели (PD-1; CD279), который является белком клеточной мембраны типа I, который принадлежит к расширенному семейству CD28/CTLA-4, содержащему внеклеточный IgV, домен, за которым следует трансмембранный и внутриклеточный домен.
В данном контексте термин hPD-1 или PD-1 человека относится к PD-1 дикого типа человека, предпочтительно, PD-1 дикого типа человека, который имеет аминокислотную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 13 (то есть эталонная последовательность NCBI NP_005009.2).
- 3 044114
Термины супо, яванский макак или обезьяна яванский макак применяются в данном документе взаимозаменяемо. При применении в отношении полипептида PD-1 подразумевается, что указанные термины относятся к PD-1 дикого типа обезьяны яванский макак и, предпочтительно, к PD-1 дикого типа обезьяны яванский макак, которая имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ
ID NO: 15.
Внеклеточный домен полипептида PD-1 или ECD относится к форме полипептида PD-1, которая по существу не содержит трансмембранного и цитоплазматического доменов. Предпочтительно, ECD PD-1 имеет менее чем 1% трансмембранного и цитоплазматического домена, более предпочтительно, ECD PD-1 имеет менее чем 0,5% таких доменов. Еще более предпочтительно полипептид ECD PD-1 человека является таким, как продемонстрировано в SEQ ID NO: 14, а полипептид ECD PD-1 обезьяны яванский макак является таким, как продемонстрировано в SEQ ID NO: 16. ECD полипептида PD-1 может быть получен с помощью способов, известных в данной области техники. В альтернативном варианте, ECD полипептида PD-1 человека может быть приобретен коммерчески у различных поставщиков, таких как Sino Biological (Пекин, Китай; эталонный № 10377-Н08) и R&D Systems (Миннеаполис, штат Миннесота, США; кат. № 8986-PD). ECD полипептида PD-1 яванского макака может быть приобретен коммерчески у компании R&D Systems (Миннеаполис, штат Миннесота, США; кат. № 8509-PD).
В данном контексте термин агонистическое антитело против PD-1 человека относится к антителу, которое связывается с PD-1 человека и при введении in vivo приводит по меньшей мере к одному значительному уменьшению аутоиммунной активности, такому как снижение титров анти-двухцепочечной ДНК (ds-ДНК), снижение показателей бальной оценки заболевания или снижение уровня воспалительных цитокинов.
В данном контексте термин антитело 1 относится к антителу, связывающему PD-1 человека, содержащему: 1) HCVR, имеющую аминокислотную последовательность HCDR1 SEQ ID NO: 5, аминокислотную последовательность HCDR2 SEQ ID NO: 6, аминокислотную последовательность HCDR3 SEQ ID NO: 7; и 2) LCVR, имеющую аминокислотную последовательность LCDR1 SEQ ID NO: 8, аминокислотную последовательность LCDR2 SEQ ID NO: 9, аминокислотную последовательность LCDR3 SEQ ID NO: 10, аминокислотную последовательность HCVR SEQ ID NO: 3, аминокислотную последовательность LCVR SEQ ID NO: 4, аминокислотную последовательность НС SEQ ID NO: 1 и аминокислотную последовательность LC SEQ ID NO: 2.
В данном контексте термин антитело относится к сконструированному не встречающемуся в природе полипептидному комплексу, имеющему две тяжелые цепи (НС) и две легкие цепи (LC), так что тяжелые цепи и легкие цепи связаны дисульфидными связями, при этом указанное антитело является изотипическим антителом IgG. Применяемый в отношении антител по данному изобретению термин антитело относится к антителу, которое является подклассом 1 изотипического IgG (то есть IgG1) и имеет тяжелые цепи и легкие цепи, которые сшиты с помощью внутри- и межцепочечных дисульфидных связей. Каждая легкая цепь образует дисульфидные связи с тяжелой цепью, а две тяжелые цепи образуют две дисульфидные связи между собой. Каждая тяжелая цепь состоит из N-концевой HCVR и константной области тяжелой цепи (HCCR). Каждая легкая цепь состоит из N-концевой LCVR и константной области легкой цепи (LCCR). При экспрессии в определенных биологических системах антитела, имеющие Fc-последовательности, являются гликозилированными в Fc-области. Как правило, гликозилирование происходит в Fc-области антитела в высококонсервативном сайте N-гликозилирования. Nгликаны, как правило, присоединяются к аспарагину. Антитела могут быть гликозилированы и в других положениях.
Предпочтительно антитела по данному изобретению содержат Fc-часть, которая является подтипом IgG1 человека. Хорошо известно, что IgG1 человека связывается с семейством рецепторов Fc-гамма (FcyR), а также с C1q. Взаимодействие с этими рецепторами может индуцировать антителозависимую клеточную цитотоксичность (ADCC) и комплементзависимую цитотоксичность (CDC).
Константная область тяжелых цепей содержит домены CH1, CH2 и СН3. CH1 идет после HCVR; при этом СН1 и HCVR образуют часть тяжелой цепи Fab. CH2 идет после шарнирной области и перед СН3. СН3 идет после СН2 и находится в карбокси-конце тяжелой цепи. Константная область легких цепей содержит один домен, CL. CL идет после LCVR; при этом CL и LCVR образуют часть легкой цепи Fab. Предпочтительно CL-области агонистических антител против PD-1 человека по данному изобретению относятся к подтипу каппа человека (например, SEQ ID NO: 18).
Молекула ДНК согласно данному изобретению представляет собой не встречающуюся в природе молекулу ДНК, которая содержит полинуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид, имеющий аминокислотную последовательность одного из полипептидов в антителе согласно данному изобретению (например, тяжелая цепь, легкая цепь, вариабельная тяжелая цепь и вариабельная легкая цепь).
Области HCVR и LCVR антитела по данному изобретению могут быть дополнительно подразделены на области гипервариабельности, называемые областями, определяющими комплементарность (CDR), перемежающимися с областями, которые являются более консервативными, называемыми каркасными областями (FR). Каждая LCVR и HCVR состоит из 3 CDR и 4 FR, расположенных от амино- 4 044114 конца до карбоксиконца в следующем порядке: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. В данном документе три CDR тяжелой цепи обозначены как HCDR1, HCDR2 и HCDR3, а три CDR легкой цепи обозначены как LCDR1, LCDR2 и LCDR3. CDR содержат большинство остатков, которые образуют специфические взаимодействия с антигеном. Определение CDR по Кабату (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)) основано на вариабельности последовательности антител. Определение CDR по Чотиа (Chothia et al., Canonical structures for the hypervariable regions of immunoglobulins, Journal of Molecular Biology, 196, 901-917 (1987); AlLazikani et al., Standard conformations for the canonical structures of immunoglobulins, Journal of Molecular Biology, 273, 927-948 (1997)) основано на трехмерных структурах антител и топологиях CDR-петель. Определения CDR по Чотиа идентичны определениям CDR по Кабату, за исключением HCDR1 и HCDR2. Определение CDR по Норсу (North et al., A New Clustering of Antibody CDR Loop Conformations, Journal of Molecular Biology, 406, 228-256 (2011)) основано на кластеризации распространения аффинности с большим количеством кристаллических структур. Для целей данного изобретения, назначение аминокислот доменам CDR в областях LCVR и HCVR антител по данному изобретению основано на хорошо известной конвенции по нумерации по Кабату (Kabat, et al., Ann. NY Acad. Sci. 190:382-93 (1971); Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242 (1991)), и конвенции по нумерации по Норсу (North et al., A New Clustering of Antibody CDR Loop Conformations, Journal of Molecular Biology, 406:228-256 (2011)). В случае CDR легкой цепи антител по данному изобретению применяются определения CDR по Норсу. В тяжелой цепи как HCDR1, так и HCDR3 также применяются определения по Норсу. В HCDR2 применяется гибрид определений по Норсу и Кабату. Определение по Норсу применяют для идентификации начального N-терминального участка, а определение по Кабату - для определения последнего положения.
Выделенную ДНК, кодирующую область HCVR, можно преобразовать в полноразмерный ген тяжелой цепи путем функционального связывания HCVR-кодирующей ДНК с другой молекулой ДНК, кодирующей константные области тяжелой цепи. Последовательности генов константной области тяжелой цепи человека, а также других млекопитающих известны в данной области техники. Фрагменты ДНК, охватывающие эти области, можно получить, например, с помощью стандартной ПНР-амплификации.
Выделенную ДНК, кодирующую область LCVR, можно преобразовать в полноразмерный ген легкой цепи путем функционального связывания LCVR-кодирующей ДНК с другой молекулой ДНК, кодирующей константную область легкой цепи. Последовательности генов константной области легкой цепи человека, а также других млекопитающих известны в данной области техники. Фрагменты ДНК, охватывающие эти области, можно получать с помощью стандартной ПНР-амплификации. Константная область легкой цепи может представлять собой константную область каппа или лямбда. Предпочтительно для антител по данному изобретению константная область легкой цепи представляет собой константную область каппа.
Полинуклеотиды по данному изобретению могут быть экспрессированы в клетке-хозяине после функционального соединения указанных последовательностей с последовательностью контроля экспрессии. Экспрессионные векторы, как правило, пригодны для репликации в организмах-хозяевах либо в виде эписом, либо в виде неотъемлемой части хромосомной ДНК хозяина. Обычно экспрессионные векторы содержат селективные маркеры, например, тетрациклин, неомицин и дигидрофолатредуктаза, чтобы обеспечить возможность обнаружения тех клеток, которые трансформированы необходимыми последовательностями ДНК.
Антитела по данному изобретению легко можно получить в клетках млекопитающих, таких как клетки СНО, NS0, HEK293 или COS. Клетки-хозяева культивируют, применяя методики, хорошо известные в данной области техники.
Векторы, содержащие представляющие интерес полинуклеотидные последовательности (например, полинуклеотиды, кодирующие полипептиды антитела, и последовательности контроля экспрессии), могут быть перенесены в клетку-хозяина с помощью хорошо известных способов, которые изменяются в зависимости от типа клетки-хозяина.
Различные способы очистки белка могут применяться для очистки белков, включая антитела, но не ограничиваясь ими, при этом такие способы известны в данной области техники.
В другом варианте осуществления данного изобретения антитело или кодирующие его нуклеиновые кислоты предлагаются в выделенной форме. В данном контексте термин выделенный относится к белку, пептиду или нуклеиновой кислоте, которые не содержат или по существу не содержат любые другие макромолекулярные компоненты, обнаруживаемые в клеточной среде. В данном контексте термин по существу не содержит означает, что представляющие интерес белок, пептид или нуклеиновая кислота содержат более 80% (в мольном отношении) макромолекулярных компонентов, предпочтительно более 90% и более предпочтительно более 95%.
Антитело по данному изобретению или фармацевтическую композицию, содержащую его, можно вводить парентеральными путями, неограничивающими примерами которых являются подкожное введение и внутривенное введение. Антитело по данному изобретению можно вводить пациенту отдельно с
- 5 044114 фармацевтически приемлемыми носителями, разбавителями или вспомагательными веществами в однократной или многократных дозах. Фармацевтические композиции по данному изобретению можно приготовить с помощью способов, хорошо известных в данной области техники (например, Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 22nd ed. (2012), A. Loyd et al., Pharmaceutical Press), и при этом они будут содержать антитело, описанное в данном документе, и один или большее количество фармацевтически приемлемых носителей, разбавителей или вспомагательных веществ.
В данном контексте термин аутоиммунное заболевание или аутоиммунное нарушение применяется в данном документе взаимозаменяемо и относится к нежелательным патологическим состояниям, которые возникают в результате нефизиологических или нежелательных иммунных реакций против собственных леток и/или тканей или трансплантированных клеток и/или тканей. Термин аутоиммунное заболевание или аутоиммунное нарушение предназначен для включения таких патологических состояний, независимо от того, опосредованы ли они гуморальным или клеточным иммунным ответом. Типовые аутоиммунные заболевания или нарушения включают, но не ограничиваются ими, реакция трансплантат против хозяина (GVHD), отторжение трансплантата твердого органа, васкулит, системную красную волчанку (SLE), сахарный диабет 1 типа (T1DM), рассеянный склероз (MS), гигантоклеточный артериит (GCA), псориаз (PsO), псориатический артрит (PsA), ревматоидный артрит (RA), воспалительное заболевание кишечника (IBD), язвенный колит (UC), анкилозирующий спондилит (AS), синдром Шегрена (SjS), аутоиммунный гепатит, склеродермию, целиакию, болезнь Аддисона, болезнь Хасимото, болезнь Грейвса, атрофический гастрит/пернициозную анемию, приобретенный гипогонадизм/бесплодие, гипопаратиреоз, положительно-гемолитическую анемию Кумбса, хронические аллергические заболевания (такие как астма, сенная лихорадка или аллергический ринит), болезнь Крона, мужское или женское бесплодие, болезнь Бехчета, гранулематоз Вегенера, миокардит, миозит, ревматическую полимиалгию (PMR), самопроизвольный аборт, витилиго, атеросклероз, аутоиммунный панкреатит, буллёзный пемфигоид, хронические вирусные инфекции и миастениь гравис. Для целей данного изобретения предпочтительными аутоиммунными заболеваниями являются реакция трансплантат против хозяина (GVHD), отторжение трансплантата твердого органа, васкулит, системная красная волчанка (SLE), сахарный диабет 1 типа (T1DM), рассеянный склероз (MS), гигантоклеточный артериит (GCA), псориаз (PsO), псориатический артрит (PsA), ревматоидный артрит (RA), воспалительное заболевание кишечника (IBD), язвенный колит (UC), анкилозирующий спондилит (AS), синдром Шегрена (SjS), аутоиммунный гепатит и склеродермия.
В данном контексте термин около подразумевает плюс или минус десять процентов от заявленного значения или диапазона значений. Например: около 12, включает значения в диапазоне от 10,8 (включительно) до 13,2 (включительно); около 10 мас.% охватывает структуру, которая включает от 9 (включительно) до 11 (включительно) мас.%; и тому подобное.
В данном контексте термин связывает в отношении аффинности агонистического антитела IgG1 против PD-1 человека к PD-1 человека (SEQ ID NO: 13) или ECD PD-1 человека, предпочтительно ECD PD-1 человека, как продемонстрировано в SEQ ID NO: 14, предназначен для обозначения, если не указано иное, значения KD, равного около 1x10’7 М, около 1x10’8 М, около 1x10’9 М, около 5x10’9 М, около 1x10’1° М, что определено с помощью способов, известных в данной области техники, и/или с помощью способов, в основном таких, как описано в данном документе, включая, но не ограничиваясь этим, применение биосенсора поверхностного плазмонного резонанса (SPR) при 25°С или 37°С. Более предпочтительно, агонистическое антитело IgG1 против PD1 человека по данному изобретению связывается с PD-1 человека (то есть SEQ ID NO: 13) или с ECD PD-1 человека (например, SEQ ID NO: 14) со значением KD, составляющим от около 1x10’8 М до около 5x10’10 М, что определено с помощью способов, известных в данной области техники, и/или с помощью способов, в основном таких, как описано в данном документе, включая применение биосенсора SPR при 25°С или 37°С. Еще более предпочтительно, чтобы такое антитело обладало аффинностью к PD-1 человека (то есть SEQ ID NO: 13) или с ECD PD-1 человека (например, SEQ ID NO: 14) в пределах около 5x10’8 М и около 5x10’10 М, что определено с помощью способов, известных в данной области техники, и/или с помощью способов, в основном таких, как описано в данном документе, включая применение биосенсора SPR при 25°С или 37°С. Еще более предпочтительно, чтобы такое антитело имело значения Koon и Koff для ECD PD-1 человека (например, SEQ ID NO: 14) от около 1,0x10-4 до около 1,0x10’3 и от около 1,3x 105 до около 2,0x105 соответственно (что определено с помощью SPR с применением BIAcore®8K, по существу, как описано в данном документе).
В контексте моноклональных антител термины человек, гуманизированный и полностью человеческий хорошо известны специалистам в данной области техники (Weiner LJ, J. Immunother. 2006; 29: 1-9; Mallbris L, et al., J. Clin. Aesthet. Dermatol. 2016; 9: 13-15).
В данном контексте термин адаптивный иммунитет включает тип иммунного ответа, который, в отличие от врожденного иммунного ответа, является антигенспецифичным и демонстрирует усиленные вторичные антигенспецифические иммунные ответы при повторной стимуляции тем же антигеном.
Термин лечение (или лечить, или процесс лечения) относится к замедлению, прерыванию, приостановке, облегчению, прекращению, уменьшению или обращению вспять прогрессирования или тяжести существующего симптома, нарушения, патологического состояния или заболевания.
- 6 044114
Эффективное количество означает такое количество агонистического антитела IgG1 против PD-1 человека по данному изобретению или фармацевтической композиции, содержащей такое антитело, которое вызывает биологический или клинический ответ или необходимый терапевтический эффект в ткани, системе, организме животного, млекопитающего или человека, который предполагается исследователем, врачом или другим медицинским работником. Эффективное количество антитела может изменяться в зависимости от таких факторов, как патологическое состояние, возраст, пол и масса индивидуума, и способности антитела вызывать желаемый ответ у индивидуума. Эффективное количество также является таким, при котором любой токсический или вредный эффект антитела перевешивается терапевтически благоприятными эффектами. Такое преимущество включает в себя любой из следующих факторов: повышенную иммунную толерантность трансплантированных органов; стабилизированное аутоиммунное заболевание или нарушение; или ослабление признаков или симптомов аутоиммунного нарушения и т.д. Специалист в данной области техники может легко определить эффективное количество, применяя для этого известные методики и наблюдая результаты, полученные при аналогичных обстоятельствах. При определении эффективного количества для пациентов лечащий врач-диагност учитывает множество факторов, включая, но не ограничиваясь ими: конституцию пациента; его массу, возраст и общее состояние здоровья; конкретное рассматриваемое заболевание или нарушение; степень или вовлечение в патологический процесс, или тяжесть заболевания или нарушения; ответ конкретного пациента; конкретное вводимое соединение; способ введения; характеристики биодоступности вводимого препарата; выбранную схему лечения; применение сопутствующих лекарственных препаратов; и другие значимые обстоятельства.
В данном контексте термин эффективный ответ пациента или ответ пациента на лечение относится к клинической или терапевтической пользе, которую пациент получает при введении антитела по данному изобретению. Такая польза включает в себя любое одно или большее количество из следующих явлений: повышенную иммунную толерантность трансплантированных органов; стабилизированное аутоиммунное заболевание или нарушение; или ослабление признаков или симптомов аутоиммунного нарушения и т.д.
Потенциальным преимуществом способов, описанных в данном документе, является возможность достижения выраженного и/или длительного облегчения состояния у пациента, страдающего аутоиммунным нарушением, с приемлемым профилем безопасности, включающим приемлемую переносимость, уровень токсичности и/или нежелательные явления, так что пациент получает пользу от способа лечения в целом. Эффективность лечения по данному изобретению может быть измерена с помощью различных критериев, которые обычно применяются при оценке лечения различных аутоиммунных нарушений, включая, но не ограничиваясь этим, индекс Американского колледжа ревматологии (ACR) 20, ACR50, ACR70, индекс площади и тяжести псориаза (PASI) 50, PASI75, PASI90, PASI100, индекс активности системной красной волчанки (SLEDAI). Необязательно могут применяться различные другие подходы к определению эффективности любой конкретной терапии по данному изобретению, включая, например, маркеры активации иммунных клеток, показатели воспаления, визуализацию измерения зависимых от клеточного цикла биомаркеров и/или измерение ответа посредством оценки боли.
Образование противолекарственных антител к биологическим препаратам может снизить эффективность лечения из-за образования нейтрализующих антител или более быстрой фармакокинетики. В некоторых редких случаях ADA также могут быть ассоциированы с проблемами безопасности. Аутоиммунные заболевания являются хроническими, требующими длительного лечения. Следовательно, часто существует потребность в альтернативных способах лечения, когда терапевтическое биологическое лекарственное средство (например, терапевтическое антитело) перестает быть эффективным. Чтобы преодолеть проблемы с иммуногенностью с течением времени, последовательное применение биопрепаратов, даже тех, которые нацелены на одну и ту же мишень, например, ингибиторы TNF, является широко распространенной и широко применяемой практикой лечения при аутоиммуннох нарушениях (см., например, Lloyd, S., et al. (2010) The effectiveness of anti-TNFa therapies when used sequentially in rheumatoid arthritis patients: a systematic review and meta-analysis. Rheumatology, 49:2313-21).
В данном изобретении предлагается антитело против PD-1 человека, содержащее:
1) HCVR, содержащую HCDR1, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5, HCDR2, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6, HCDR3, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 7; и
2) LCVR, содержащую LCDR1, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8, LCDR2, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 9, и LCDR3, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 10, при этом указанное антитело представляет собой IgG1. Предпочтительно, чтобы такое антитело связывалось с PD-1 человека (то есть SEQ ID NO: 13) или ECD PD-1 человека (например, SEQ ID NO: 14), со значением KD, составляющим около 1х10’7 М, около 1х10’8 М, около 1x10’9 М, около 5x10’9 М или около 1х10’10 М, что определено с помощью способов, известных в данной области техники, и/или с помощью способов, по существу, как описано в данном документе, включая, но не ограничиваясь этим, применение биосенсора поверхностного плазмонного резонанса
- 7 044114 (SPR) при 25°С или 37°С. Предпочтительно, чтобы такое антитело связывалось с PD-1 человека (то есть SEQ ID NO: 13) или ECD PD-1 человека (например, SEQ ID NO: 14), со значением KD, составляющим от около 1х10-8 М до около 5х10-10 М, что определено с помощью способов, известных в данной области техники, и/или с помощью способов, по существу, как описано в данном документе, включая, но не ограничиваясь этим, применение биосенсора поверхностного плазмонного резонанса (SPR) при 25°С или 37°С. Более предпочтительно, чтобы такое антитело связывалось с PD-1 человека (то есть SEQ ID NO: 13) или ECD PD-1 человека (например, SEQ ID NO: 14), со значением KD, составляющим от около 5х10’8 М до около 5х10-10 М, что определено с помощью способов, известных в данной области техники, и/или с помощью способов, по существу, как описано в данном документе, включая, но не ограничиваясь этим, применение биосенсора поверхностного плазмонного резонанса (SPR) при 25°С или 37°С.
В некоторых вариантах осуществления данного изобретения предлагается антитело против PD-1 человека, содержащее:
1) HCVR, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3; и
2) LCVR, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4, при этом указанное антитело представляет собой IgG1. Предпочтительно, чтобы такое антитело связывалось с PD-1 человека (то есть SEQ ID NO: 13) или ECD PD-1 человека (например, SEQ ID NO: 14), со значением KD, составляющим около 1х10-7 М, около 1х10-8 М, около 1х10-9 М, около 5х10-9 М или около 1х10-10 М, что определено с помощью способов, известных в данной области техники, и/или с помощью способов, по существу, как описано в данном документе, включая, но не ограничиваясь этим, применение биосенсора поверхностного плазмонного резонанса (SPR) при 25°С или 37 °С. Более предпочтительно, чтобы такое антитело связывалось с PD-1 человека (то есть SEQ ID NO: 13) или ECD PD-1 человека (например, SEQ ID NO: 14), со значением KD, составляющим от около 1х10-8 М до около 5х10-10 М, что определено с помощью способов, известных в данной области техники, и/или с помощью способов, по существу, как описано в данном документе, включая, но не ограничиваясь этим, применение биосенсора поверхностного плазмонного резонанса (SPR) при 25°С или 37°С. Еще более предпочтительно, чтобы такое антитело связывалось с PD-1 человека (то есть SEQ ID NO: 13) или ECD PD-1 человека (например, SEQ ID NO: 14), со значением KD, составляющим от около 5х10-8 М до около 5х10-10 М, что определено с помощью способов, известных в данной области техники, и/или с помощью способов, по существу, как описано в данном документе, включая, но не ограничиваясь этим, применение биосенсора поверхностного плазмонного резонанса (SPR) при 25°С или 37°С.
В некоторых вариантах осуществления данного изобретения предлагается антитело против PD-1 человека, содержащее:
1) тяжелую цепь, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1; и
2) легкую цепь, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2. В некоторых вариантах осуществления данного изобретения предлагается антитело против PD-1 человека, состоящее из двух тяжелых цепей, имеющих аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, и двух легких цепей, имеющих аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2. Предпочтительно, чтобы такое антитело связывалось с PD-1 человека (то есть SEQ ID NO: 13) или ECD PD-1 человека (например, SEQ ID NO: 14), со значением KD, составляющим около 1х10-7 М, около 1х10-8 М, около 1х10-9 М, около 5х10-9 М или около 1х10-10 М, что определено с помощью способов, известных в данной области техники, и/или с помощью способов, по существу, как описано в данном документе, включая, но не ограничиваясь этим, применение биосенсора поверхностного плазмонного резонанса (SPR) при 25°С или 37°С. Более предпочтительно, чтобы такое антитело связывалось с PD-1 человека (то есть SEQ ID NO: 13) или ECD PD-1 человека (например, SEQ ID NO: 14), со значением KD, составляющим от около 1х10-8 М до около 5х10-10 М, что определено с помощью способов, известных в данной области техники, и/или с помощью способов, по существу, как описано в данном документе, включая, но не ограничиваясь этим, применение биосенсора поверхностного плазмонного резонанса (SPR) при 25°С или 37°С. Еще более предпочтительно, чтобы такое антитело связывалось с PD-1 человека (то есть SEQ ID NO: 13) или ECD PD-1 человека (например, SEQ ID NO: 14), со значением KD, составляющим от около 5х10-8 М до около 5х10-10 М, что определено с помощью способов, известных в данной области техники, и/или с помощью способов, по существу, как описано в данном документе, включая, но не ограничиваясь этим, применение биосенсора поверхностного плазмонного резонанса (SPR) при 25°С или 37°С.
В данном изобретении также предлагается клетка млекопитающего, способная экспрессировать антитело против PD-1 человека, содержащее: HCDR1, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5, HCDR2, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6, HCDR3, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 7, LCDR1, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8, LCDR2, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 9, и LCDR3, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 10, при этом указанное антитело представляет собой IgG1.
В некоторых вариантах осуществления данного изобретения предлагается клетка млекопитающего, способная экспрессировать антитело против PD-1 человека, содержащее HCVR, имеющую аминокислот- 8 044114 ную последовательность SEQ ID NO: 3, и LCVR, имеющую аминокислотную последовательность SEQ
ID NO: 4, при этом указанное антитело представляет собой IgG1.
В некоторых вариантах осуществления данного изобретения предлагается клетка млекопитающего, способная экспрессировать антитело против PD-1 человека, содержащее тяжелую цепь, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, и легкую цепь, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2. В некоторых вариантах осуществления данного изобретения предлагается клетка млекопитающего, способная экспрессировать антитело против PD-1 человека, состоящее из двух тяжелых цепей, имеющих аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, и двух легких цепей, имеющих аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2.
В данном изобретении также предлагается способ продуцирования антитела против PD-1 человека, включающий: 1) культивирование клетки млекопитающего, способной экспрессировать антитело против PD-1 человека, содержащее HCDR1, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5, HCDR2, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6, HCDR3, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 7, LCDR1, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8, LCDR2, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 9, и LCDR3, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 10, при этом указанное антитело представляет собой IgG1; и 2) восстановление антитела.
В некоторых вариантах осуществления данного изобретения предлагается способ продуцирования антитела против PD-1 человека, включающий: 1) культивирование клетки млекопитающего, способной экспрессировать антитело против PD-1 человека, содержащее HCVR, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3, и LCVR, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4, при этом указанное антитело представляет собой IgG1; и 2) восстановление антитела.
В некоторых вариантах осуществления данного изобретения предлагается способ продуцирования антитела против PD-1 человека, включающий: 1) культивирование клетки млекопитающего, способной экспрессировать антитело против PD-1 человека, содержащее тяжелую цепь, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, и легкую цепь, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2; и 2) восстановление антитела. В некоторых вариантах осуществления данного изобретения предлагается способ продуцирования антитела против PD-1 человека, включающий: 1) культивирование клетки млекопитающего, способной экспрессировать антитело против PD-1 человека, состоящее из двух тяжелых цепей, имеющих аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, и двух легких цепей, имеющих аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2; и 2) восстановление антитела. В данном изобретении также предлагается антитело против PD-1 человека, полученное с помощью указанного способа, а также приемлемый носитель, разбавитель или вспомогательное вещество.
В данном изобретении предлагается молекула ДНК, содержащая полинуклеотид, имеющий последовательность SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12 или SEQ ID NO: 11 и 12. В данном изобретении также предлагается клетка млекопитающего, содержащая молекулу ДНК, содержащую полинуклеотид, имеющий последовательность SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12 или SEQ ID NO: 11 и 12.
В данном изобретении предлагается фармацевтическая композиция, содержащая 1) антитело против PD-1 человека, содержащую HCDR1, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5, HCDR2, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6, HCDR3, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 7; LCDR1, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8, LCDR2, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 9, и LCDR3, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 10, при этом указанное антитело представляет собой IgG1; а также 2) приемлемый носитель, разбавитель или вспомогательное вещество. В некоторых вариантах осуществления данного изобретения указанное антитело против PD-1 человека содержит HCVR, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3; и LCVR, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4, при этом указанное антитело представляет собой IgG1. В некоторых вариантах осуществления данного изобретения указанное антитело против PD-1 человека содержит тяжелую цепь, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, и легкую цепь, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2. В некоторых вариантах осуществления данного изобретения указанное антитело против PD-1 человека состоит из двух тяжелых цепей, имеющих аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, и двух легких цепей, имеющих аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2.
Роль пути PD-1 как контрольной точки для иммунитета была тщательно изучена. Известно, что когда стимулируется путь PD-1, активность иммунной системы обычно снижается, что может быть использовано для лечения аутоиммунных нарушений, индукции иммунной толерантности и/или ослабления проявлений реакции трансплантат против хозяина.
В данном изобретении предлагается способ лечения аутоиммунного нарушения, включающий введение нуждающемуся в этом пациенту эффективного количества антитела против PD-1 человека, содержащего: 1) HCVR, содержащую HCDR1, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5, HCDR2, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6, HCDR3, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 7; и 2) LCVR, содержащую LCDR1, имеющую аминокислотную
- 9 044114 последовательность SEQ ID NO: 8, LCDR2, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 9, и LCDR3, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 10, при этом указанное антитело представляет собой IgG1. В некоторых вариантах осуществления данного изобретения предлагается способ лечения аутоиммунного нарушения, включающий введение нуждающемуся в этом пациенту эффективного количества антитела против PD-1 человека, содержащего: 1) HCVR, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3; и 2) LCVR, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4, при этом указанное антитело представляет собой IgG1. В некоторых вариантах осуществления данного изобретения предлагается способ лечения аутоиммунного нарушения, включающий введение нуждающемуся в этом пациенту эффективного количества антитела против PD-1 человека, содержащего: 1) тяжелую цепь, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, и 2) легкую цепь, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2. В некоторых вариантах осуществления данного изобретения также предлагается указанное, состоящее из двух тяжелых цепей, имеющих аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, и двух легких цепей, имеющих аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2. В таких вариантах осуществления данного изобретения также предполагается, что аутоиммунное нарушение представляет собой GVHD, отторжение трансплантированного твердого органа, васкулит, SLE, T1DM, MS, GCA, PsO, PsA, RA, IBD, UC, AS, SjS, аутоиммунный гепатит, склеродерму, целиакию, болезнь Аддисона, болезнь Хашимото, болезнь Грейвса, атрофический гастрит/пернициозную анемию, приобретенный гипогонадизм/бесплодие, гипопаратиреоз, позитивногемолитическую анемию Кумбса, хронические аллергические заболевания (такие как астма, сенная лихорадка или аллергический ринит), болезнь Крона, мужское или женское бесплодие, болезнь Бехчета, гранулематоз Вегенера, миокардит, миозит, PMR, самопроизвольный аборт, витилиго, атеросклероз, аутоиммунный панкреатит, буллезный пемфигоид, хронические вирусные инфекции или миастению гравис.
В некоторых вариантах осуществления данного изобретения также предполагается, что указанное антитело вводят в комбинации с другими терапевтическими агентами, применяемыми для лечения аутоиммунных нарушений.
В данном документе описано антитело против PD-1 человека по данному изобретению для применения в терапии. В некоторых вариантах осуществления данного изобретения предлагается антитело против PD-1 человека, содержащее: 1) HCVR, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3; и 2) LCVR, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4, при этом указанное антитело представляет собой IgG1 для применения в терапии. В некоторых вариантах осуществления данного изобретения предлагается антитело против PD-1 человека, содержащее: 1) тяжелую цепь, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1; и легкую цепь, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2, для применения в терапии. В некоторых вариантах осуществления данного изобретения также предлагается указанное, состоящее из двух тяжелых цепей, имеющих аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, и двух легких цепей, имеющих аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2. В некоторых вариантах осуществления данного изобретения предполагается, что указанная терапия предназначена для лечения аутоиммунного нарушения. В некоторых вариантах осуществления данного изобретения предполагается, что указанное аутоиммунное нарушение представляет собой GVHD, отторжение трансплантированного твердого органа, васкулит, SLE, T1DM, MS, GCA, PsO, PsA, RA, IBD, UC, AS, SjS, аутоиммунный гепатит, склеродерму, целиакию, болезнь Аддисона, болезнь Хашимото, болезнь Грейвса, атрофический гастрит/пернициозную анемию, приобретенный гипогонадизм/бесплодие, гипопаратиреоз, позитивно-гемолитическую анемию Кумбса, хронические аллергические заболевания (такие как астма, сенная лихорадка или аллергический ринит), болезнь Крона, мужское или женское бесплодие, болезнь Бехчета, гранулематоз Вегенера, миокардит, миозит, PMR, самопроизвольный аборт, витилиго, атеросклероз, аутоиммунный панкреатит, буллезный пемфигоид, хронические вирусные инфекции или миастению гравис. В некоторых вариантах осуществления данного изобретения предполагается, что указанное антитело вводят в комбинации с другим терапевтическим агентом для лечения аутоиммунного нарушения. В некоторых вариантах осуществления данного изобретения также предполагается, что указанное антитело вводят (или должны вводить) в одновременной, раздельной или последовательной комбинации с другим терапевтическим агентом для лечения аутоиммунного нарушения.
В данном документе описано антитело против PD-1 человека по данному изобретению для изготовления лекарственного средства для лечения аутоиммунного нарушения. В некоторых вариантах осуществления данного изобретения предлагается антитело против PD-1 человека, содержащее: 1) HCVR, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3; и 2) LCVR, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4, при этом указанное антитело представляет собой IgG1, для изготовления лекарственного средства для лечения аутоиммунного нарушения. В некоторых вариантах осуществления данного изобретения предлагается антитело против PD-1 человека, содержащее: 1) тяжелую цепь, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1; и 2) легкую цепь, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2 для изготовления лекарственного средства для лечения аутоиммунного расстройства. В некоторых вариантах осуществления данного изобретения также пред
- 10 044114 лагается указанное, состоящее из двух тяжелых цепей, имеющих аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, и двух легких цепей, имеющих аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2. В одном варианте осуществления данного изобретения предполагается, что указанное лекарственное средство предназначено для лечения аутоиммунного нарушения. В некоторых вариантах осуществления данного изобретения предполагается, что указанное лекарственное средство предназначено для лечения GVHD, отторжения трансплантированного твердого органа, васкулита, SLE, T1DM, MS, GCA, PsO, PsA, RA, IBD, UC, AS, SjS, аутоиммунного гепатита, склеродермы целиакии, болезни Аддисона, болезни Хашимото, болезни Грейвса, атрофического гастрита/пернициозной анемию, приобретенного гипогонадизма/бесплодие, гипопаратиреоза, позитивно-гемолитической анемии Кумбса, хронических аллергических заболеваний (таких как астма, сенная лихорадка или аллергический ринит), болезни Крона, мужского или женского бесплодия, болезни Бехчета, гранулематози Вегенера, миокардита, миозита, PMR, самопроизвольного аборта, витилиго, атеросклероза, аутоиммунногой панкреатита, буллезного пемфигоида, хронических вирусных инфекций или миастении гравис.
Схемы введения могут быть скорректированы для обеспечения оптимального желаемого ответа (например, терапевтического эффекта). Дозы лекарственного средства могут титроваться для оптимизации безопасности и эффективности. Схемы введения доз для внутривенного (внутривенного) или не внутривенного введения, подкожного (п/к) локализованного или системного введения или их комбинаций, как правило, будут варьироваться от однократной болюсной дозы или непрерывной инфузии до множества подкожных введений в месяц, предпочтительно, не чаще, чем один раз в день, более предпочтительно, не чаще, чем один раз в неделю, еще более предпочтительно, не чаще, чем один раз в каждые две недели, еще более предпочтительно, не чаще, чем один раз в месяц или как назначено лечащим врачом и обусловлено состоянием пациента. Количество и частота введения доз могут быть определены врачем (врачами), который лечит пациента.
Пример 1. Экспрессия и очистка антител.
Аминокислотные последовательности CDR вариабельной области тяжелой цепи и легкой цепи, полные аминокислотные последовательности тяжелой цепи и легкой цепи антитела 1 и нуклеотидные последовательности, кодирующие их, перечислены ниже в разделе, озаглавленном Аминокислотные и нуклеотидные последовательности. Кроме того, SEQ ID NO аминокислотных последовательностей легкой цепи, тяжелой цепи, LCVR и HCVR антитела 1 приведены в табл. 1(а) ниже. Кроме того, в табл. 1(а) приведены SEQ ID NO для аминокислотных последовательностей CDR вариабельной области НС и вариабельной области LC антитела 1.
Антитела по данному изобретению, включая, но не ограничиваясь ими, антитело 1, можно изготовить и очистить по существу следующим образом. Соответствующая клетка-хозяин, такая как, но не ограничиваясь этим, HEK 293 или СНО, может быть либо временно, либо стабильно трансфицирована системой экспрессии для секреции антител с помощью, например, одного вектора, кодирующего экспрессию тяжелой цепи и легкой цепи, или с помощью двух векторов, из которых один кодирует тяжелую цепь, а другой кодирует легкую цепь (применяя оптимальное заранее определенное соотношение векторов HC:LC (например, 1:3 или 1:2).
Поскольку эффективная экспрессия терапевтических антител в клетках млекопитающих часто является критическим фактором для коммерческого успеха терапевтического антитела, кДНК, кодирующая антитело 1, была оптимизирована путем тестирования множества вариантов кодонов, включая некоторые, полученные из коммерчески доступных служб оптимизации кодонов для сигнальной последовательности и вариабельных областей. Полинуклеотиды, продемонстрированные в SEQ ID NO: 11 и 12, кодирующие тяжелую и легкую цепь антитела 1, соответственно, применяли для генерации линии клеток, которая эффективно продуцирует повышенные титры (например, предпочтительно, примерно до 6 раз, более предпочтительно, примерно до 7 раз, еще более предпочтительно, примерно до 8 раз, еще более предпочтительно, примерно до 9 раз, еще более предпочтительно, до 10 раз, еще более предпочтительно, до 11 раз выше по сравнению с аналогичной линией клеток СНО, экспрессирующей полинуклеотид, как продемонстрировано в SEQ ID NO: 12, и полинуклеотид, кодирующий тяжелую цепь антитела 1, который не был оптимизирован в отношении применения кодонов в стабильной линии клеток СНО.
Среда, в которую секретировалось антитело 1, может быть очищена с помощью любой из многих обычно применяемых методик. Например, в случае фрагмента Fab среда может быть нанесена на колонку MabSelect (GE Healthcare) или колонку KappaSelect (GE Healthcare), уравновешенную совместимым буфером, таким как фосфатно-солевой буфер (рН 7,4). Колонка может быть промыта для удаления неспецифических связывающих компонентов. Связанное антитело может быть элюировано, например, с помощью градиента рН (например, 20 мМ Трис-буфера рН 7 к 10 мМ цитратного натриевого буфера, рН 3,0, или фосфатно-солевым буфером рН 7,4 к 100 мМ глицинового буфера, рН 3,0). Обнаружение фракций антител можно проводить, например, с помощью УФ-абсорбции или ДСН-ПААГ электрофореза, а затем проводить их объединение. Растворимые агрегаты и мультимеры могут быть эффективно удалены с помощью обычных способов, включая эксклюзионную, с гидрофобным взаимодействием, ионообменную, мультимодальную или гидроксиапатитную хроматографию. Антитело может быть сконцентрировано, заменено буфером и/или стерильно отфильтровано с помощью обычных методик. Полученный
- 11 044114 продукт может храниться при 4-5°С или может быть незамедлительно заморожен при -80°С или может быть лиофилизирован.
Таблица 1(а)
SEQ ID NO для агонистического антитела против PD-1 человека
| Антитело 1 | |
| Аминокислотная последовательность для | SEQ ID NO: |
| Тяжелая цепь | 1 |
| Легкая цепь | 2 |
| HCVR | 3 |
| LCVR | 4 |
| HCDR1 | 5 |
| HCDR2 | 6 |
| HCDR3 | 7 |
| LCDR1 | 8 |
| LCDR2 | 9 |
| LCDR3 | 10 |
| ДНК-кодирующая последовательность для: | SEQ ID NO: |
| НС | 11 |
| LC | 12 |
Таблица 1(b)
SEQ ID NO для последовательностей PD-1
| Аминокислотная последовательность для: | SEQ ID NO: |
| PD-1 человека | 13 |
| ECD PD-1 человека | 14 |
| PD-1 обезьяны яванский макак | 15 |
| ECD PD-1 обезьяны яванский макак | 16 |
Пример 2. Антитело 1 связывается с PD-1 человека и обезьяны яванский макак на клеточной поверхности.
Способность агонистических антител против PD-1 человека, описанных в данном документе, связываться с клеточной поверхностью PD-1 человека или обезьяны яванский макак может быть измерена с помощью анализа проточной цитометрии. PD-1 человека и обезьяны яванский макак (то есть как продемонстрировано в SEQ ID NO: 13 и 15 соответственно), экспрессирующие стабильные клетки, генерируют путем трансфекции плазмидной ДНК PD-1 человека или обезьяны яванский макак в клетки яичника китайского хомяка (CHO-k1; Lonza) с помощью системы электропорации (Gene Pulser Xcell; BioRad) в соответствии с известными протоколами. Стабильные клетки отбирают из отдельных выделенных клеток, применяя для этого 500 мкг/мл G418 (Thermo Scientific) в культуральной среде. Для проведения проточной цитометрии, клетки переносят на 96-луночный планшет с V-образным дном лунок с плотностью 1 х 105 клеток/лунку. Клетки промывают 1х буфером FACS (Becton Dickinson # 554656). Добавляют антитело 1 или контрольный IgG1 человека (разведенный в буфере FACS при трехкратном 12-точечном титровании антител, начиная с 100 мкг/мл) (в 100 мкл), и инкубируют клетки при 4°С в течение 30 мин.
После двухкратной промывки в буфере FACS, добавляют FITC-конъюгированный F(ab')2 фрагмент козьего антитела против IgG человека, специфичное для FcY-фрагмента вторичное антитело (Jackson ImmunoResearch Laboratories 109-096-170) в разведении 1:200 и клетки инкубируют при 4°С в течение 30 мин. После двухкратной промывки в буфере FACS, проводят окрашивание живых/мертвых клеток с
- 12 044114 применением SytoxBlue (Invitrogen, # S34857) в соответствии с протоколом производителя. Клетки обрабатывают на приборе для проточной цитометрии Fortessa, Fortessa Fx или LSRII. Данные проточной цитометрии анализируют с помощью программного обеспечения FlowJo. Средние геометрические значения интенсивности флуоресценции (GMFI) применяются для расчета относительного EC50 на основе логистической регрессии с 4 параметрами.
В экспериментах, выполненных по существу так же, как описано выше, антитело 1 было способно связываться с экспрессируемым на клеточной мембране PD-1 человека или обезьяны яванский макак, со средним значением EC50, равным 1,30 +/- 0,16 мкг/мл и 1,09 +/- 0,30 мкг/мл соответственно. Эти данные демонстрируют, что антитело 1 способно связывать мембраносвязанный PD-1 как человека и обезьяны яванский макак, с одинаковой аффинностью.
Пример 3. Кинетика связывания антитела 1/аффиность к ECD PD-1 человека и обезьяны яванский макак.
Кинетика связывания агонистического антитела против PD-1 человека по данному изобретению с ECD PD-1 человека и обезьяны яванский макак может быть определена с помощью биосенсора в анализе поверхностного плазмонного резонанса, таком как BIAcore®2000, BIAcore®3000, BIAcore® 8K, или BIAcore® T100 (GE Healthcare, Пискатауэй, штат Нью-Джерси). Вкратце, прибор BIAcore® 8K применяется для измерения кинетики связывания антитела 1 с PD1-внеклеточным доменом (ECD)-His человека и обезьяны яванский макак посредством поверхностного плазмонного резонанса (SPR) при 25°С. Образцы растворяют в 1X HBS-EP + рабочий буфер (Teknova кат. № Н8022) и белок А, связанный с сенсорным чипом СМ5 серии S (GE Healthcare кат. № 29139131-АА), применяют для захвата mAb. Белки PD1-ECD человека и обезьяны яванский макак, которые содержат С-концевую 8х гистидиновую метку, экспрессируют в клетках СНО и очищают никель-заряженным IMAC с последующим исключением по размеру.
Связывание оценивают с выполнением нескольких аналитических циклов. Каждый цикл выполняется при 25°С при скорости потока 10 мкл/мин для захвата mAb и 30 мкл/мин - для ассоциации и диссоциации лиганда. Каждый цикл состоит из следующих этапов: введение mAb в количестве 2 мкг/мл в течение 60 с времени контакта с целью достичь уровня захвата приблизительно 220RUs в проточной ячейке 2, введение в течение 150 секунд PD1-ECD-his человека или обезьяны яванский макак (диапазон концентрации от 400 нМ до 1,6 нМ при четырехкратном серийном разведении) с последующей 600секундной фазой диссоциации и регенерацией с применением 10 мМ гидрохлорида глицина, рН 1,5, в течение 30-секундного времени контакта. Скорости ассоциации (то есть Kon) и диссоциации (то есть Koff) для каждого цикла оценивают с применением стандартной двойной привязки и соответствия модели связывания 1: 1 (Ленгмюра) при оценке Biacore 8K в пакетном режиме параллельной кинетики. Аффинность (KD) рассчитывают из кинетики связывания согласно соотношению KD = Koff/Kon.
В последующих экспериментах Biacore применяли для измерения кинетики связывания антитела 1 с PD1-внеклеточным доменом (ECD)-His человека и обезьяны яванский макак с помощью поверхностного плазмонного резонанса (SPR) при 37°С посредством BIAcore® T200. Для анализов при 37°С, связывание оценивают с применением множества аналитических циклов. Каждый цикл выполняется при 37°С при скорости потока 10 мкл/мин для захвата mAb и 100 мкл/мин для ассоциации и диссоциации лиганда. Каждый цикл состоит из следующих этапов: введение mAb в количестве 2,5 мкг/мл с целью достичь уровня захвата приблизительно 220RUs в проточной ячейке 2, введение в течение 180 с PD1-ECD-his человека или обезьяны яванский макак (диапазон концентрации от 1000 нМ до 1,6 нМ при двуххкратном серийном разведении) с последующей 600-секундной фазой диссоциации и регенерацией с применением 10 мМ гидрохлорида глицина, рН 1,5, в течение 30-секундного времени контакта. Kon, Koff и KD рассчитываются по существу так, как описано выше. Данные по аффинности представлены в виде среднего значения и стандартных отклонений, определенных из трех измерений в трех независимых экспериментах (среднее ±SD, n = 9). В экспериментах, проведенных по существу так же, как описано выше, антитело 1 связывается с PD1-ECD-his человека и обезьяны яванский макак, что определено посредством Biacore при 25°С (n = 1) и при 37°С (n = 9) и как продемонстрировано в табл. 2.
Таблица 2
Кинетика и аффинность связывания антитела 1 с ECD PD-1
| Виды ECD PD-1 | Коп (1/Мс) | KOff(l/c) | KD (нМ) | |
| 25 °C | Человек | 1,7Е + 05 | 1,7Е-04 | 1,0 |
| Яванский макак | 2,4Е±05 | Ι,ΙΕ-03 | 4,7 | |
| 37 °C | Человек | 3,07 ± 0,16 х 105 | 7,01 ± 0,92 х 10'4 | 2,29 ±0,36 |
| Яванский макак | 5,19 ± 0,52 х 105 | 4,89 ± 0,10 х 10'3 | 9,51 ±0,85 |
Как показано в табл. 2, антитело 1 связывает ECD PD-1 как человека, так и обезьяны яванский макак с наномолярной аффинностью и демонстрирует сходную кинетику связывания для ECD PD-1 человека и обезьяны яванский макак.
- 13 044114
Пример 4. Антитело 1 не блокирует связывание PD-1 с PD-L1 или PD-L2.
Способность антитела по данному изобретению блокировать связывание PD-1 с PD-L1 и PD-L2 можно определить следующим образом. Вкратце, стабильные клетки, экспрессирующие PD-1 человека, генерируют путем трансфекции плазмидной ДНК PD-1 человека в клетки CHO-k1 (Lonza) с помощью системы электропорации (Gene Pulser Xcell; BioRad) в соответствии с известными протоколами. Стабильные клетки отбирают из отдельных выделенных клеток, применяя для этого 500 мкг/мл G418 (Thermo Scientific) в культуральной среде. Тестируемые антитела к PD-1 в количестве 200 мкг/мл или начиная с 100 мкг/мл с последующим 12-кратным 7-точечным титрованием антител в буфере FACS инкубируют при 4°С в течение 30 мин. Клетки дважды промывают буфером FACS. Клетки ресуспендируют в 50 мкл буфера FACS с 20 мкг/мл биотинилированного PD-L1 человека (Acros, # PD-1-H82F3) или PD-L2 (Abcam, ab 198764) и инкубируют при 4 °С в течение 30 мин. Клетки дважды промывают буфером FACS и ресуспендируют в 100 мкл буфера FACS со стрептавидином-АРС (BD Bioscienses, # 554067) в разведении 1:200 в буфере FACS и инкубируют при 4°С в течение 30 мин. После двухкратной промывки в буфере FACS, проводят окрашивание живых/мертвых клеток с применением SytoxBlue (Invitrogen, # S34857) в соответствии с протоколом производителя. Клетки обрабатывают на приборе для проточной цитометрии Fortessa, Fortessa Fx или LSRII. Данные проточной цитометрии анализируют с помощью программного обеспечения FlowJo. Значения средней интенсивности флуоресценции (MFI) применяются для расчета относительного IC50 на основе логистической регрессии с 4 параметрами.
В экспериментах, проведенных по существу так же, как описано выше, антитело 1 и антитело изотипического контроля не блокировали связывание PD-L1 и PD-L2, при этом показатель IC50 для антитела положительного контроля, специфического антагонистического антитела к PD-1 (гомолог ниволумаба), составлял 0,22 +/- 0,02 μ мкг/мл для PD-L1 и 0,42 +/- 0,12 μ мкг/мл для PD-L2. Эти данные демонстрируют, что антитело 1 не блокирует связывание PD-1 с PD-L1 или PD-L2.
Пример 5. Антитело 1 ингибирует сигналинг NFAT, индуцированный активацией Т-клеток.
NFAT (ядерный фактор активированных Т-клеток) является транскрипционным фактором, который играет важную роль в обеспечении активации рецептора Т-клеток к иммунному ответу путем модулирования экспрессии генов, кодирующих воспалительные цитокины, например, TNF, IL-2, а также нескольких рецепторов клеточной поверхности. Способность антител, описанных в данном документе, ингибировать сигналинг NFAT, индуцированный активацией Т-клеток, можно измерить следующим образом.
Описывая вкратце, Т-клетки Jurkat, трансфицированные как NFAT-люциферазным репортером, так и PD-1 человека (Promega), активируют антителом против CD3 человека и клетками ТНР-1 (АТСС®). Клетки TFLP-1 (40000 клеток/лунку) высевают в 100 мкл на белый 96-луночный планшет (Corning, # 3917). Два мкг/мл антитела против CD3 человека (OKT3) (eBioscience, # 16-0037) и терапевтических антител (антитело 1 или антитело изотипического контроля) в конечной концентрации 20 мкг/мл или пятикратном 7-точечном титровании антитела, начиная с количества 10 мкг/мл, добавляют к клеткам ТНР-1. Смеси клеток и антител инкубируют при 37°С, 5% СО2 в течение 30 мин. Клетки Jurkat с NFATлюциферазным репортером, экспрессирующие PD-1 (50000 клеток/лунку), добавляют к клеткам ТНР-1, антителам к CD3 и терепавтическим антителам на 96-луночные планшеты и инкубируют при 37°С, 5% CO2 в течение 5 ч. В конце инкубации планшеты доводят до комнатной температуры в течение 10 мин. 80 мкл реагента BioGlo (Promega, # G7940) добавляют в лунки и инкубируют в течение 10 мин при комнатной температуре. Люминесценция готова с помощью LMaxII384 (Molecular Devices) или Envision 2105 (Perkin Elmer).
В экспериментах, проведенных по существу так же, как описано выше, антитело 1 и антитело изотипического контроля ингибировали активность клетки человека с PD-1 и NFAT-люциферазным репортером со средним показателем IC50 из четырех независимых экспериментов, равным 75,2 +/- 37,6 нг/мл, тогда как антитело изотипического контроля незначительно ингибировало сигналинг NFAT. Эти данные демонстрируют, что антитело 1 способно ингибировать сигналинг NFAT, индуцированный активацией Т-клеток.
Пример 6. Антитело 1 ингибирует пролиферацию первичных Т-клеток человека.
Способность антител, описанных в данном документе, ингибировать пролиферацию Т-клеток, индуцированную активацией рецепторов Т-клеток, можно измерить следующим образом. Вкратце, мононуклеарные клетки периферической крови человека (МКПК) выделяют из LRS Trima здорового человека (Банк крови СанДиего; Сан-Диего, штат Калифорния) с помощью метода центрифугирования в градиенте плотности Ficoll путем наложения 35 мл разбавленной крови (десятикратное разведение в PBS без кальция или магния в 15 мл среды Ficoll при 37°С (Ficoll-Paque Plus, GE Healthcare; # 17144002) в конических пробирках объемом 50 мл. Пробирки центрифугируют при комнатной температуре в течение 30 мин при 900xG. Поверхность раздела клеток переносят в новую коническую пробирку объемом 50 мл. Конечный объем доводят до 50 мл с помощью PBS комнатной температуры (без кальция или магния). После двухкратной промывки в PBS клетки ресуспендируют в полной среде CTS (Gibco, # А1048501;#А10484-02).
Выделенные МКПК человека помечают с помощью CFSE (Biolegend, кат. № 79898). МКПК трижды промывают в бессывороточной среде RPMI. Мечение с помощью CFSE проводят в бессывороточной
- 14 044114 среде в присутствии 1 мкМ CFSE при 37°С с 5% СО2 в течение 20 мин. CFSE гасят полной средой CTS с последующим этапом промывки.
МКПК, меченные с помощью CFSE (150000 клеток/лунку), добавляют в каждую лунку с круглым дном 96-луночного планшета, содержащую антитело 1 или антитело изотипического контроля. Клетки стимулируют с применением 4 нг/мл суперантигена (стафилококковый энтеротоксин, SEB) (Toxin Technologies BT2021MG) в течение 72 ч при 37°С с 5% СО2.
Планшеты после инкубации промывают буфером FACS (Miltenyi Biotec; # 130-091-221), инкубируют с реагентом, блокирующим Fc человека (Miltenyi Biotec, # 130-059-901) в течение 10 мин с последующим окрашиванием мечеными антителами против CD4 (Biolegend, # 317426) и PD-1 (eBioscience, # 17-2799-42) в течение 30 мин на льду. После промывки в буфере FACS, проводят окрашивание живых/мертвых клеток с применением SytoxBlue (Invitrogen, # S34857) в соответствии с протоколом производителя. Клетки обрабатывают на приборе для проточной цитометрии Fortessa X20 в присутствии гранул CountBright (Invitrogen, # C36950) для количественного определения числа клеток. Данные проточной цитометрии анализируют с помощью программного обеспечения FlowJo. Абсолютное количество делящихся CD4-позитивных клеток рассчитывают с посредством окрашивания CFSE и гранул CountBright.
В экспериментах, проведенных по существу так же, как описано выше, антитело 1 было способно ингибировать пролиферацию первичных Т-клеток человека со средним показателем IC50, составляющим 175 +/- 128 нг/мл для восьми различных доноров, тогда как антитело изотипического контроля не ингибировало пролиферацию первичных Т-клеток. Эти данные демонстрируют, что антитело 1 способно ингибировать пролиферацию Т-клеток in vitro.
Пример 7. Исследования высвобождения цитокинов in vitro.
Целью данного исследования является проверка того, индуцирует ли антитело 1 высвобождение цитокинов из нестимулированных МКПК человека.
Описывая вкратце, свежевыделенные МКПК от здоровых субъектов инкубируют со связанным с планшетом Антителом 1 или контрольными антителами в течение 24 ч в диапазоне титрования от 0,5 мкг до 1,5 мкг. Положительными контролями являются коммерчески доступное антитело против CD3ε человека, OKT3, и гомолог CD28-специфического суперагонистического терапевтического антитела, TGN1412. Известно, что оба антитела вызывают синдром высвобождения цитокинов, форму синдрома системного воспалительного ответа, которая может быть опасной для жизни. Отрицательный контроль представляет собой антитело изотипического контроля IgG1 дикого типа (WT) человека. С помощью коммерчески доступного мультиплексного анализа на основе платформы Mesoscale в супернатантах клеточных культур измеряют пять цитокинов, включая IFN-γ, IL-2, IL-6, IL-10 и TNF-α.
В экспериментах, проводимых в основном так, как описано выше, инкубация МКПК человека с Антителом 1 не приводила к значительным уровням высвобождения цитокинов для IFN-γ, IL-2, IL-6, IL-10 и TNF-α в концентрациях 0,5, 1 или 1,5 мкг/лунку. Напротив, инкубация МКПК с антителом анти-CD3ε и антителом положительного контроля TGN1412 в количестве 1 мкг на лунку приводила к устойчивой продукции IL-2, IFN-γ, IL-10 и TNF-α у большинства доноров.
Пример 8. Модель реакции трансплантат против хозяина мыши (GVHD) in vivo.
Гуманизированные мышиные модели ксеногенной GvHD, основанные на иммунодефицитных штаммах, инъецированных МКПК человека (мыши Hu-РВМС), являются важными инструментами для изучения иммунной функции человека in vivo. Способность антител, описанных в данном документе, защищать мышей от GvHD, оценивали на модели мышей Hu-РВМС.
Вкратце, самок мышей NSG (NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtmlWjl/SzJ, JAX Labs, Stock # 05557) содержали по 3 на клетку при 72°С при 12-часовом цикле освещение:темнота и разрешали прием еды и воды ad libitum (n = 78). МКПК человека выделяли из пробирок LRS, полученных от двух доноров (банк крови Сан-Диего), с использованием пробирок для приготовления SepMate 50 Ficoll в соответствии с инструкциями производителя (STEMCELL Technologies, Ванкувер, Британская Колумбия). Свежие выделенные МКПК суспендировали в PBS при 1,2х108 клеток/мл, и мышам вводили 100 μ мкл суспензии МКПК внутривенно в день 0 (1,2х107/мышь); 36 мышей получали МКПК от донора 1, 36 от донора 2, и 6 мышей составили контрольную группу, которым не вводили суспензию. Идентичные протоколы впоследствии соблюдали для каждого донора. В день 1 мышей разделяли на четыре группы, соответствующие весу/донору, и подкожно вводили изотипический контроль или антитело 1 в количестве 0,1, 1,0 или 10,0 мг/кг (200 мкг/мышь). Введение дозы продолжали два раза в неделю до конца эксперимента. Проверку состояния здоровья и измерение веса тела мышей проводили регулярно. Мышей, которые теряли 20% своего начального веса или испытывали сильный дистресс, подвергают эвтаназии. Когда большинство мышей, получающих изотипический контроль, нуждались в эвтаназии из-за прогрессирования заболевания, всех мышей умерщвляли. У всех эвтанизированных мышей кровь собирали путем пункции сердца под анестезией изофлураном в пробирки с ЭДТК для анализа FACS и очищали центрифугированием для анализа плазмы. Вес тела и клинические наблюдения. Мышей взвешивали в камере BSL2 и оценивали по клиническим признакам дистресса 2-3 раза в неделю. Клиническими признаками, общими для этой мо- 15 044114 дели, являются неухоженная шерсть, сгорбленное тело, истощение, а также затрудненное дыхание или движения. Изменение веса тела рассчитывали в процентах от их исходного показателя: (день (х) вес/день вес)· 100.
Анализ плазмы.
Кровь в результате пункции сердца собирали в пробирки, содержащие ЭДТК, очищаелия центрифугированием, а полученную плазму хранили при -80°С для дальнейшей обработки. Плазменные цитокины измеряли с помощью системы Mesoscale Discovery Human Th1/Th2 10-Vplex (Роквилл, штат Мэриленд) в соответствии с инструкциями производителя.
Статистика.
Собирали данные и рассчитывали статистику с помощью программного обеспечения Prism (GraphPad, Сан-Диего, штат Калифорния). Различия в весе между группами определяли с применением двухфакторного анализа RM-ANOVA с апостериорным критерием Тьюки. Различия в терминальных уровнях цитокинов в плазме определяли с помощью однофакторного анализа ANOVA с апостериорным критерием Тьюки. Различия между исследуемыми группами считались достоверными, если р < 0,05.
В экспериментах, проведенных по существу так же, как описано выше, трансплантация МКПК человека от донора 1 или донора 2 вызывала GvHD, о чем свидетельствовало заметное истощение у мышей NSG. Прогрессирование заболевания было более быстрым у мышей, которым трансплантировали МКПК донора 2, по сравнению с донором 1, с прекращением исследования из-за значительной потери веса на 26 и 40 дни, соответственно. Лечение антителом 1 значительно замедляло прогрессирование заболевания, что измерялось по снижению потери веса у мышей, которым трансплантировали материал любого из доноров. Кроме того, антитело 1 ингибировало выраженное увеличение в плазме цитокинов Th1 (IFN-γ) и Th2 (IL-13) человека, ассоциированных с прогрессированием заболевания. Следовательно, антитело 1 значительно снижает прогрессирование заболевания в гуманизированной модели GvHD.
Пример 9. Мышиная модель волчаночного нефрита hPD-1 KI - Bm12 хроническая GvHD.
Хроническую GvHD (cGvHD), характеризующуюся развитием аутоантител и патологией, сходной с волчаночным нефритом человека, можно индуцировать у мышей Bm12 путем инъекции спленоцитов от мышей-доноров, экспрессирующих PD-1 человека, на фоне C57BL/6. В исследовании, описанном в этом примере 9, спленоциты от мышей hPD-1 KI (C57BL/6-Pdcd1<tm1606.1) инъецировали мышам B6(C)-H2Ab1bm12/KhEgJ (Bm12) Впоследствии у мышей-хозяев развивалось медленно прогрессирующее SLEподобное заболевание, характеризующееся развитием аутоантител против ds-ДНК и отложением иммунного комплекса в почках. Таким образом, активность агонистического антитела к PD-1 может быть оценена на этой модели волчаночного нефрита следующим образом.
Описывая вкратце, самцы мышей с нокином PD-1 (Taconic Laboratories) достигали возраста 9 недель после прибытия, а самцы мышей Bm12 (Jackson Laboratories) - 11 недель после прибытия. Всех мышей содержали по 4 на клетку и давали им акклиматизироваться в течение 1 недели до начала исследования. Мышей кормили кормом Teklad Global Rodent Diet 2014 (Harlan) и разрешали воду ad libitum. Мышей содержали при 12-часовом цикле свет/темнота при температуре окружающей среды, установленной на 68-79°F. За четыре дня до начала исследования мышей случайным образом сортировали по весуе тела, и отбирали 75 мкл цельной крови через насечку в хвосте. Сыворотку отделяли от цельной крови путем центрифугирования при 10000 об/мин в течение 5 мин и применяли для количественного определения титров анти-ds-ДНК. Затем мышей распределяли по следующим группам лечения: (1) 10,0 мг/кг изотипического контроля hIgG1, (2) 1,0 мг/кг антитела 1, (3) 10,0 мг/кг антитела 1. Мышам вводили подкожно изотипический контроль IgG1 человека или антитело 1 дважды в неделю, начиная со дня 0. Образцы сыворотки отбирали у мышей через насечку в хвосте каждые 2 недели до окончания исследования, через 42 дня после начала лечения.
Уровни анти-ds-ДНК в сыворотке измеряли с помощью специального ИФА. Планшеты (96 лунок) покрывали в течение ночи при 4°С 10 мкг/мл ДНК тимуса теленка (R&D Systems). После промывки с помощью PBS-Tween (0,05%) добавляли 2 мкл образца (разведение 1:100) и серийно разводили 1:3. После 2-часовой инкубации при комнатной температуре планшеты промывали и добавляли козий антимышиный IgG (Jackson ImmunoResearch) в разведении 1:2000 в течение 90 мин. Планшеты промывали и добавляли Ultra-TMB (ThermoSci Pierce) в течение 15 мин и останавливали реакцию с помощью 1N H2S04. OD считывали при длине волны 450 нм и рассчитывали значения ЕС50.
В экспериментах, проведенных по существу так же, как описано выше в примере 9, аутоантитела против титров двухцепочной ДНК (анти-ds-ДНК) снижались при обработке Антителом 1 дозозависимым образом в ходе исследования. При применении доз 1 мг/кг и 10 мг/кг антитела 1, снижение уровней антиds-ДНК было статистически значимым по сравнению с контрольной группой изотипического контроля IgG1 человека в дни 28 и 42. Показатели AUC анти-ds-ДНК также снижались зависимо от дозы антитела 1. Антитело 1 в дозе 10 мг/кг было способно значительно снизить AUC анти-ds-ДНК по сравнению с изотипическим контролем IgG1 человека. Следовательно, антитело 1 может значительно снизить прогрессирование заболевания в cGvHD-модели волчанки.
- 16 044114
Аминокислотные и нуклеотидные последовательности
Тяжелая цепь Антитела 1 (SEQ ID NO: 1)
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKVSGYSLSKYDMSWVRQAPGKGLEWMGIIYTSGYT DYAQKFQGRVTMTEDTSTDTAYMELSSLRSEDTAVYYCATGNPYYTNGFNSWGQGTL VTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPA VLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAP ELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKP REEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVY TLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSK LTVDKSRWQQGNVF SC S VMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
Легкая цепь Антитела 1 (SEQ ID NO: 2)
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQSPNNLLAWYQQKPGKAPKLLIYGASDLPSGVPS RFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQNNYYVGPVSYAFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIF PPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSS TLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
Вариабельная область тяжелой цепи Антитела 1 (SEQ ID NO: 3)
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKVSGYSLSKYDMSWVRQAPGKGLEWMGIIYTSGYT DYAQKFQGRVTMTEDTSTDTAYMELSSLRSEDTAVYYCATGNPYYTNGFNSWGQGTL VTVSS
Вариабельная область легкой цепи Антитела 1 (SEQ ID NO: 4)
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQSPNNLLAWYQQKPGKAPKLLIYGASDLPSGVPS RFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQNNYYVGPVSYAFGGGTKVEIK
HCDR1 Антитела 1 (SEQ ID NO: 5)
KVSGYSLSKYDMS
HCDR2 Антитела 1 (SEQ ID NO: 6)
IIYTSGYTDYAQKFQG
HCDR3 Антитела 1 (SEQ ID NO: 7)
- 17 044114
ATGNPYYTNGFNS
LCDR1 Антитела 1 (SEQ ID NO: 8)
QASQSPNNLLA
LCDR2 Антитела 1 (SEQ ID NO: 9)
YGASDLPS
LCDR3 Антитела 1 (SEQ ID NO: 10)
QNNYYVGPVSYA
ДНК, кодирующая тяжелую цепь Антитела 1 (SEQ ID NO: 11) caagtgcagttggtgcagtcgggggcagaagtgaaaaagcccggcgcttcggtgaaagtgtcctgcaaagtgtccggctattctttgtcca aatacgacatgtcatgggtcagacaggctcccggaaagggtctggagtggatggggattatctatacatccggctacaccgattacgccca aaagttccaggggagagtcaccatgactgaggatacgtccaccgacaccgcctacatggaactgtccagcctgcggtccgaggacactg cggtgtactactgcgcgaccggaaacccatactacaccaatggattcaatagctggggacagggtactcttgtgacggtgtccagcgcctc caccaagggcccatcggtcttcccgctagcaccctcctccaagagcacctctgggggcacagcggccctgggctgcctggtcaaggact acttccccgaaccggtgacggtgtcgtggaactcaggcgccctgaccagcggcgtgcacaccttcccggctgtcctacagtcctcaggact ctactccctcagcagcgtggtgaccgtgccctccagcagcttgggcacccagacctacatctgcaacgtgaatcacaagcccagcaacac caaggtggacaagaaagttgagcccaaatcttgtgacaaaactcacacatgcccaccgtgcccagcacctgaactcctggggggaccgtc agtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaa gaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagca cgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcc cagcccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggacgagct gaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccgg agaacaactacaagaccacgccccccgtgctggactccgacggctccttcttcctctatagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggc agcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaaa
ДНК, кодирующая легкую цепь Антитела 1 (SEQ ID NO: 12) gacatccagatgacccagtctccatcctccctgtctgcatctgtgggagacagagtcaccatcacttgccaggccagtcagagccctaataa cctcctggcctggtatcagcagaaaccagggaaagcccctaagctcctgatctatggtgcatccgatctgccatctggggtcccatcaaggt tcagtggcagtggatctgggacagatttcactctcaccatcagcagtctgcaacctgaagattttgcaacttactactgtcagaacaattattat gtgggaccagtgagctatgctttcggcggagggaccaaggtggagatcaagcggaccgtggctgcaccatctgtcttcatcttcccgccat ctgatgagcagttgaaatctggaactgcctctgttgtgtgcctgctgaataacttctatcccagagaggccaaagtacagtggaaggtggata
- 18 044114 acgccctccaatcgggtaactcccaggagagtgtcacagagcaggacagcaaggacagcacctacagcctcagcagcaccctgacgct gagcaaagcagactacgagaaacacaaagtctacgcctgcgaagtcacccatcagggcctgagctcgcccgtcacaaagagcttcaaca ggggagagtgc
Аминокислотная последовательность PD-1 человека (SEQ ID NO: 13)
MQIPQAPWPVVWAVLQLGWRPGWFLDSPDRPWNPPTFSPALLVVTEGDNATFTCSFSN TSESFVLNWYRMSPSNQTDKLAAFPEDRSQPGQDCRFRVTQLPNGRDFHMSVVRARRN DSGTYLCGAISLAPKAQIKESLRAELRVTERRAEVPTAHPSPSPRPAGQFQTLVVGVVGG LLGSLVLLVWVLAVICSRAARGTIGARRTGQPLKEDPSAVPVFSVDYGELDFQWREKTP EPPVPCVPEQTEYATIVFPSGMGTSSPARRGSADGPRSAQPLRPEDGHCSWPL
Аминокислотная последовательность ECD PD-1 человека (SEQ ID NO: 14)
LDSPDRPWNPPTFSPALLVVTEGDNATFTCSFSNTSESFVLNWYRMSPSNQTDKLAAFPE DRSQPGQDCRFRVTQLPNGRDFHMSVVRARRNDSGTYLCGAISLAPKAQIKESLRAELR VTERRAEVPTAHPSPSPRPAGQFQ
Аминокислотная последовательность PD-1 обезьяны яванский макак (SEQ ID NO: 15)
MQIPQAPWPVVWAVLQLGWRPGWFLESPDRPWNAPTFSPALLLVTEGDNATFTCSFSN ASESFVLNWYRMSPSNQTDKLAAFPEDRSQPGQDCRFRVTRLPNGRDFHMSVVRARRN DSGTYLCGAISLAPKAQIKESLRAELRVTERRAEVPTAHPSPSPRPAGQFQALVVGVVGG LLGSLVLLVWVLAVICSRAAQGTIEARRTGQPLKEDPSAVPVFSVDYGELDFQWREKTP EPPAPCVPEQTEYATIVFPSGLGTSSPARRGSADGPRSPRPLRPEDGHCSWPL
Аминокислотная последовательность ECD PD-1 обезьяны яванский макак (SEQ ID NO: 16)
LESPDRPWNAPTF SPALLLVTEGDNATFTC SF SNASESF VLNWYRMSPSNQTDKLAAFPE DRSQPGQDCRFRVTRLPNGRDFHMSVVRARRNDSGTYLCGAISLAPKAQIKESLRAELR VTERRAEVPTAHPSPSPRPAGQFQ
Аминокислотная последовательность IgGi человека (SEQ ID NO: 17):
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGV HTFP AVLQS SGLYSLS S VVTVPS S SLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEP KSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVS HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGK
-
Claims (20)
- EYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKАминокислотные последовательности каппа дикого типа человека (SEQ ID NO: 18)TVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTARVGCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLRSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECАминокислотная последовательность лямбда дикого типа человека (SEQ ID NO: 19)QPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAAESELSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVVAPTECSФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ1. Антитело, которое связывает белок 1 запрограммированной гибели клетки (PD-1) человека, содержащее: 1) вариабельную область тяжелой цепи (HCVR) и 2) вариабельную область легкой цепи (LCVR), при этом HCVR содержит HCDR1, HCDR2 и HCDR3, a LCVR содержит LCDR1, LCDR2 и LCDR3, при этом аминокислотная последовательность HCDR1 представляет собой SEQ ID NO: 5, аминокислотная последовательность HCDR2 представляет собой SEQ ID NO: 6, а аминокислотная последовательность HCDR3 представляет собой SEQ ID NO: 7, аминокислотная последовательность LCDR1 представляет собой SEQ ID NO: 8, аминокислотная последовательность LCDR2 представляет собой SEQ ID NO: 9, а аминокислотная последовательность LCDR3 представляет собой SEQ ID NO: 10, и при этом указанное антитело представляет собой IgG1.
- 2. Антитело по п.1, отличающееся тем, что аминокислотная последовательность HCVR представляет собой SEQ ID NO: 3, а аминокислотная последовательность LCVR представляет собой SEQ ID NO: 4.
- 3. Антитело по п.2, содержащее: 1) НС и 2) LC, при этом аминокислотная последовательность НС представляет собой SEQ ID NO: 1, а аминокислотная последовательность LC представляет собой SEQ ID NO: 2.
- 4. Антитело по п.3, содержащее две НС и две LC, при этом аминокислотная последовательность каждой из НС представляет собой SEQ ID NO: 1, а аминокислотная последовательность каждой из LC представляет собой SEQ ID NO: 2.
- 5. Антитело по любому из пп.1-4, отличающееся тем, что указанное антитело является агонистом PD-1 человека, как определено в модели аутоиммунного нарушения или отторжения трансплантата in vivo.
- 6. Антитело по п.5, отличающееся тем, что указанная модель in vivo представляет собой модель для реакции трансплантат против хозяина (GVHD), отторжения трансплантированного твердого органа, васкулита, системной красной волчанки (SLE), сахарного диабета 1 типа (T1DM), рассеянного склероза (MS), гигантоклеточного артериита (GCA), псориаза (PsO), псориатического артрита (PsA), ревматоидного артрита (RA), воспалительного заболевания кишечника (IBD), язвенного колита (UC), анкилозирующего спондилита (AS), синдрома Шегрена (SjS), аутоиммунного гепатита или склеродермии.
- 7. Антитело по п.5, отличающееся тем, что указанная модель in vivo представляет собой мышиную модель для GVHD и/или волчаночного нефрита.
- 8. Фармацевтическая композиция, содержащая антитело по любому из пп.1-7 и один или большее количество фармацевтически приемлемых носителей, разбавителей или вспомогательных веществ.
- 9. Способ лечения аутоиммунного заболевания, включающий введение нуждающемуся в этом пациенту эффективного количества антитела по любому из пп.1-7.
- 10. Способ по п.9, отличающийся тем, что указанное аутоиммунное заболевание представляет собой GVHD, отторжение трансплантированного твердого органа, васкулит, SLE, T1DM, MS, GCA, PsO, PsA, RA, IBD, UC, AS, SjS, аутоиммунный гепатит, склеродерму, целиакию, болезнь Аддисона, болезнь Хашимото, болезнь Грейвса, атрофический гастрит/пернициозную анемию, приобретенный гипогонадизм/бесплодие, гипопаратиреоз, позитивно-гемолитическую анемию Кумбса, болезнь Крона, болезнь Бехчета, гранулематоз Вегенера, миокардит, миозит, ревматическую полимиалгию (PMR), атеросклероз, аутоиммунный панкреатит, буллезный пемфигоид или миастению гравис.
- 11. Способ по п.10, отличающийся тем, что указанное аутоиммунное заболевание представляет собой GVHD, отторжение трансплантированного твердого органа, васкулит, SLE, T1DM, MS, GCA, PsO, PsA, RA, IBD, UC, AS, SjS, аутоиммунный гепатит или склеродермию.- 20 044114
- 12. Способ по любому из пп.9-11, отличающийся тем, что указанное антитело вводят в комбинации с другим терапевтическим агентом, эффективным для лечения аутоиммунного заболевания.
- 13. Применение антитела по любому из пп.1-7 для лечения аутоиммунного заболевания.
- 14. Применение по п.13, отличающееся тем, что указанное аутоиммунное заболевание представляет собой GVHD, отторжение трансплантированного твердого органа, васкулит, SLE, T1DM, MS, GCA, PsO, PsA, RA, IBD, UC, AS, SjS, аутоиммунный гепатит, склеродерму, целиакию, болезнь Аддисона, болезнь Хашимото, болезнь Грейвса, атрофический гастрит/пернициозную анемию, приобретенный гипогонадизм/бесплодие, гипопаратиреоз, позитивно-гемолитическую анемию Кумбса, болезнь Крона, болезнь Бехчета, гранулематоз Вегенера, миокардит, миозит, PMR, атеросклероз, аутоиммунный панкреатит, буллезный пемфигоид или миастению гравис.
- 15. Применение по п.14, отличающееся тем, что указанное аутоиммунное заболевание представляет собой GVHD, отторжение трансплантированного твердого органа, васкулит, SLE, T1DM, MS, GCA, PsO, PsA, RA, IBD, UC, AS, SjS, аутоиммунный гепатит или склеродермию.
- 16. Применение по любому из пп. 13-15, отличающееся тем, что указанное антитело применяют одновременно или последовательно с другим терапевтическим агентом, эффективным для лечения аутоиммунного заболевания.
- 17. Применение антитела по любому из пп.1-7 для изготовления лекарственного средства для лечения аутоиммунного заболевания.
- 18. Применение по п.17, отличающееся тем, что указанное аутоиммунное заболевание представляет собой GVHD, отторжение трансплантированного твердого органа, васкулит, SLE, T1DM, MS, GCA, PsO, PsA, RA, IBD, UC, AS, SjS, аутоиммунный гепатит, склеродерму, целиакию, болезнь Аддисона, болезнь Хашимото, болезнь Грейвса, атрофический гастрит/пернициозную анемию, приобретенный гипогонадизм/бесплодие, гипопаратиреоз, позитивно-гемолитическую анемию Кумбса, болезнь Крона, болезнь Бехчета, гранулематоз Вегенера, миокардит, миозит, PMR, атеросклероз, аутоиммунный панкреатит, буллезный пемфигоид или миастению гравис.
- 19. Применение по п.18, отличающееся тем, что указанное аутоиммунное заболевание представляет собой GVHD, отторжение трансплантированного твердого органа, васкулит, SLE, T1DM, MS, GCA, PsO, PsA, RA, IBD, UC, AS, SjS, аутоиммунный гепатит или склеродермию.
- 20. Применение по любому из пп.17 и 18, отличающееся тем, что указанное антитело применяют одновременно или последовательно с другим терапевтическим агентом, эффективным для лечения аутоиммунного заболевания.Евразийская патентная организация, ЕАПВРоссия, 109012, Москва, Малый Черкасский пер., 2
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US62/637,643 | 2018-03-02 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| EA044114B1 true EA044114B1 (ru) | 2023-07-24 |
Family
ID=
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US10493148B2 (en) | PD-1 agonist antibodies and uses thereof | |
| AU2014368449C1 (en) | Canine antibodies with modified CH2-CH3 sequences | |
| US11220550B2 (en) | Antagonistic anti-CD40 antibodies and methods of antagonizing CD40 activity | |
| TWI790548B (zh) | 抗人類cd19抗體 | |
| AU2022285741A1 (en) | Anti-ccr8 antibodies and uses thereof | |
| US20230272067A1 (en) | Human monoclonal antibodies against tigit for immune related diseases | |
| JP7122354B2 (ja) | 抗ｔｉｇｉｔ抗体および使用方法 | |
| US20230002500A1 (en) | Methods of cancer treatment using anti-ox40 antibodies in combination with anti-tigit antibodies | |
| EP3994172A1 (en) | Antibodies and methods of use | |
| US20230022859A1 (en) | Treatment of cancer with anti-ox40 antibodies and multi-kinase inhibitors | |
| EA044114B1 (ru) | Агонистические антитела против pd-1 и их применение | |
| US20230365714A1 (en) | Antibodies capable of binding to ror2 and bispecific antibodies binding to ror2 and cd3 | |
| WO2021098774A1 (en) | Methods of cancer treatment using anti-ox40 antibodies in combination with anti-pd1 or anti-pdl1 antibodies | |
| WO2021098748A1 (en) | Methods of cancer treatment with anti-ox40 antibody in combination with chemotherapeutic agents | |
| US20230002501A1 (en) | Methods of cancer treatment using anti-ox40 antibodies in combination with anti-tim3 antibodies | |
| WO2024108088A1 (en) | Lag-3 and pd-1/lag-3-antibodies |