KR102223187B1 - 항 cd47 단일클론항체 및 그 용도 - Google Patents

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Abstract

항 CD47 단일클론항체 및 그 용도. 본 발명에서 제공하는 항 CD47 단일클론항체는 종양의 성장을 효과적으로 억제할 수 있으며, 인간 SIRP와 인간 CD47 신호를 차단하여 종양세포에 대한 대식세포의 식세포 작용을 촉진할 수 있으며, 종양세포가 종양 면역의 방어 시스템을 회피하는 것을 저지하여 항종양 작용을 발휘할 수 있다. 종양세포 표면의 CD47과 대식세포 표면의 SIRP의 결합을 차단하여 종양세포의"공격 무력화(do not eat me)" 신호를 차단할 수 있으며, 종양세포에 대한 대식세포의 인식 및 섭취를 촉진하여 종양세포가 탐식되는 것을 촉진할 수 있다. 종양세포 표면의 CD47과 대식세포 표면의 SIRP의 결합은 보편적인"공격 무력화(do not eat me)" 신호이며, 항 CD47 항체는 종양 면역 시스템에서 매우 유망한 표적으로서 인간의 종양 치료 방면에서 강력하고 효과적인 작용을 발휘할 수 있다.

Description

항 CD47 단일클론항체 및 그 용도
본 발명은 항체 약물 기술분야에 관한 것으로서, 특히 항 CD47 단일클론항체 및 그 용도에 관한 것이다.본 출원은 2016년 06월 17일자로 중국 특허청에 제출된 출원번호가 201610436519.3이고 발명의 명칭이 "항 CD47 단일클론항체 및 그 용도"인 중국 특허 출원의 우선권을 주장하며, 그 모든 내용은 인용에 의해 본 출원에 결합된다.
CD47
CD47은 인테그린 결합 단백질(IAP)이라고도 불리우며, 최초에는 인간 태반과 인테그린 aVβ3의 공동정제(co-purification) 및 혈소판과 β3 인테그린의 공동면역침전(co-immunoprecipitation)에 의하여 알려졌으며, 세포 표면에서 광범위하게 발현되는 막관통 당단백질로서, 면역글로불린 상과(immunoglobulin superfamily)에 속한다.
CD47은 세포 표면의 매우 중요한 마커로서, 분자량은 47~55kD 사이이며, 구조는 하나의 아미노 말단 세포외 가변영역, 하나의 3~5개 고소수성 막관통 단편으로 구성된 막관통 영역과 하나의 친수성 카르복시 말단 세포질 꼬리(cytoplasmic tail)를 포함한다. 이는 인테그린, SIRPα(신호조절 단백질α), SIRPγ와 트롬보스폰딘(thrombospondin)과 같은 다양한 리간드와 상호 작용을 한다.
SIRPα
신호조절 단백질α(SIRPα)도 주로 대식세포, 수지상 세포와 신경세포 표면에서 발현되는 일종의 막관통 단백질이다. 이의 세포외 영역은 3개의 면역글로불린 상과-유사 영역을 함유하며, 그중 N말단의 영역은 CD47과의 결합을 매개하고, 이의 세포 내 구조 영역은 전형적인 면역 수용체 타이로신 기반 억제화 모티프(ITIM)를 가지고 있다. CD47과 결합한 후, SIRPα의 ITIM은 인산화되고, 단계적 연쇄반응이 발생하여 대식세포의 식세포 작용을 억제한다.
CD47/SIRPα의 종양 면역의 회피 메커니즘에 대한 관여
선천적인 면역 시스템에서, CD47은 자체 마커로서, 대식세포, 호중구와 수지상 세포와 같은 골수성 세포에서 발현되는 SIRPα와의 결합을 통하여 억제성 "공격 무력화(do not eat me)"신호를 전달하여 기능을 발휘한다. 따라서, 생리적 조건에서 CD47의 광범위한 발현의 작용은 건강한 세포가 선천적인 면역 시스템에 의해 제거되는 것을 방지하는 것이다. 그러나 종양세포는 CD47의 과발현에 의해 면역 감시를 효과적으로 회피할 수 있다.
최근 몇 년 동안, CD47과 CD47-SIRPα 신호 시스템은 광범위한 주목을 받고 있다. 그중, 종양 치료에서의 잠재적인 약물 표적으로서 가장 주목을 받고 있다. 기존 연구에 의하여, CD47의 발현은 대부분의 인간 암(예컨대, NHL, AML, 유방암, 결장암, 교모세포종(glioblastoma), 신경교종, 난소암, 방광암 및 전립선암)에서 상향조절되고, 상승된 CD47의 발현 수준은 침습성 질환과 낮은 생존율과 관련된다고 증명되었다. 스탠포드대학의 Weissman은 다양한 고형종양 중 CD47의 발현 수준을 체계적으로 연구하였으며, 그 결과, 모든 인간 고형종양세포에서 CD47은 과발현을 나타내며, 평균 발현 수준은 대응되는 정상 세포의 3.3배 정도임을 발견하였다. 또한, 고형종양 환자의 CD47 mRNA의 수준은 예후 지수와 부적 상관관계를 나타내는 것을 발견하였다.
정위치(in situ) 면역결핍성 마우스 이종이식 동물모델에 대한 추가적인 실험에 의하여, 항 CD47 단일클론항체의 투여는 대형 종양의 성장과 전이를 억제할 수 있으며, 소형 종양은 완치될 수 있음을 발견하였다. 또한, Willingham 등은 정위치 마우스 유방암 모델 실험에서 항 CD47 단일클론항체의 유효성과 안전성을 증명하였다. 해당 연구는 CD47의 과발현은 종양세포가 면역 감시를 회피하는 보편적인 메커니즘임을 증명하였을 뿐만 아니라, CD47-SIRPα 신호 경로를 차단하여 종양을 치료하는데 대하여 중요한 참고를 제공하였다.
치료성 항 CD47 항체
CD47은 다양한 종류의 종양에서 과발현되고, "공격 무력화(do not eat me)" 신호로서 식세포 작용을 억제하며, 이는 CD47-SIRPα 경로를 표적화 하는 것은 다양한 종류의 종양 치료를 위한 방법으로 사용할 수 있음을 의미한다.
RAUH 등은 체내외 실험으로 차단성 항 CD47 단일클론항체는 종양세포에 대한 대식세포의 탐식을 촉진할 수 있고, 마우스 체내에서 급성골수성백혈병(AML)의 형성을 억제할 수 있으며, 이미 체내에 이식 성공한 AML을 제거할 수 있으며, 백혈병 줄기세포(LSC)를 표적화하여 제거할 수 있음을 증명하였다. CHAO 등은 급성림프성백혈병에 대한 연구를 통하여, 항 CD47 단일클론항체와 리툭시맵(rituximab)을 결합하면 최초 이식 부위의 종양을 제거할 수 있을 뿐만 아니라 혈액순환 및 간장, 비장, 림프절 등 부위로 확산된 종양을 제거할 수도 있어, 장기간 생존 및 종양 재발 억제 효과를 달성할 수 있으나, 항 CD47 단일클론항체 또는 항 CD20 단일클론항체를 단독으로 사용하면, NHL의 성장속도만 억제할 수 있을 뿐, NHL을 완전히 제거할 수는 없음을 발견하였다.
종양에 대한 항 CD47 단일클론항체의 작용을 추가로 증명하기 위하여, WILLINGHAM 등은 면역 활성을 가지는 마우스로 이식종양 모델을 구축하여, 항-쥐 및 항-인간 CD47 단일클론항체는 모두 종양의 성장을 유의적으로 억제할 수 있으며, 항 CD47 항체는 다양한 종류의 고형종양을 제거할 수 있고, 종양의 전이 및 재발을 억제할 수 있음을 증명하였으며, 또한, 항 CD47 단일클론항체는 종양 줄기세포(CSC) 및 이의 분화된 아형(subtype)에도 항종양 작용이 있으며, 종양 형성 TAM을 항종양성 효과인자로 전환시켜 이의 식세포 작용을 증강시킬 수 있음을 증명하였다. 마우스 CD47 발현의 억제는 종양세포의 방사선 치료에 대한 민감도를 증가시킬 수 있고, 정상 조직에 대해 보호 작용이 있으며, 이러한 작용은 숙주 면역세포의 보호성 자가포식작용 발생의 유도와 관련이 있을 수 있다.
항 CD47 단일클론항체의 종양에 대한 치료는 다양한 메커니즘과 관련이 있다. 먼저, 항 CD47 단일클론항체는 종양세포 상의 CD47과 대식세포 상의 SIRPα의 결합을 차단하여 종양세포가 탐식되게 한다. 다음, 항체 의존성 세포 매개 세포독성과 보체 의존성 세포독성과 관련이 있으며, 연구에 의하여 항 CD47 항체는 NK 세포가 관여한 항-두경부 종양세포의 세포독성을 유도할 수 있음을 발견하였다. 또한, 사멸을 직접적으로 유도하여 종양세포를 제거할 수 있다. 마지막으로, 면역 활성을 가지는 마우스에 대한 연구에 의하여, 항 CD47 단일클론항체는 CD8+T세포를 활성화시키고, 획득성 T세포의 면역반응을 일으켜 종양세포를 추가로 살상할 수 있음을 발견하였다.
종양 분자의 발생 메커니즘에 대한 연구가 지속적으로 심화됨에 따라, 분자 면역 치료는 점차적으로 수술 및 화학약물 치료 외의 또 다른 효과적인 치료수단으로 되고 있다. 현재 종양 치료에서의 생물치료의 작용은 해마다 향상되고 있으며, 생물치료는 종양 재발 방지, 암 말기 및 이의 합병증의 치료 등 수많은 방면에서 많은 우세가 있다. 따라서, CD47을 표적화 할 수 있는 항체와 치료가 요구되고 있다.
이를 근거로, 본 발명이 해결하고자 하는 기술적 과제는 항 CD47 단일클론항체 및 그 용도를 제공하는 것이며, 본 발명에서 제공하는 항 CD47 단일클론항체는 인간 CD47 및 원숭이 CD47과 결합할 수 있고, 용량 의존적으로 인간 SIRP와 인간 CD47의 결합을 차단할 수 있으며; 종양세포에 대한 대식세포의 식세포 작용을 촉진할 수 있다. SIRP와 인간 CD47의 결합 신호를 차단함으로써, 종양세포가 종양 면역의 방어 시스템을 회피하는 것을 저지하여 항종양 작용을 발휘한다.
본 발명에서 제공하는 항 CD47 단일클론항체는 중쇄 가변영역과 경쇄 가변영역을 가지며:
(I) 상기 중쇄 가변영역의 아미노산 서열은 서열번호 1 또는 서열번호 2 또는 서열번호 3 또는 서열번호 4 또는 서열번호 5 또는 서열번호 6 또는 서열번호 7로 표시되며;
(II) 상기 경쇄 가변영역의 아미노산 서열은 서열번호 8 또는 서열번호 9 또는 서열번호 10 또는 서열번호 11 또는 서열번호 12 또는 서열번호 13 또는 서열번호 14로 표시되며;
(III) 상기 (I) 또는 (II)의 아미노산 서열이 하나 또는 복수개의 아미노산의 치환, 결실 또는 첨가에 의하여 얻은, (I) 또는 (II)의 아미노산 서열과 기능이 동일하거나 유사한 아미노산 서열이며; 또는
(IV) 상기 (I) 또는 (II)의 서열과 적어도 80%의 상동성을 갖는 아미노산 서열이다.
본 발명에 따른 일 구현예에서, 상기 항CD47 단일클론항체의 아미노산 서열이 하나 또는 복수개의 아미노산의 치환, 결실 또는 첨가에 의하여 얻은 아미노산 서열에 있어서, 상기 복수개는 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 21개, 22개, 23개, 24개, 25개, 26개, 27개, 28개, 29개, 30개, 31개 또는 32개이다.
상기 치환은 초가변영역에서 발생하며;
상기 중쇄 가변영역의 초가변영역은 HVR-H1, HVR-H2, HVR-H3이며;
서열번호 2의 초가변영역 HVR-H1 서열은 서열번호 45로 표시되며; HVR-H2 서열은 서열번호 46으로 표시되며; HVR-H3 서열은 서열번호 47로 표시되며;
서열번호 5의 초가변영역 HVR-H1 서열은 서열번호 48로 표시되며; HVR-H2 서열은 서열번호 49로 표시되며; HVR-H3 서열은 서열번호 50으로 표시되며;
서열번호 6의 초가변영역 HVR-H1 서열은 서열번호 51로 표시되며; HVR-H2 서열은 서열번호 52로 표시되며; HVR-H3 서열은 서열번호 53으로 표시되며;
상기 경쇄 가변영역의 초가변영역은 HVR-L1, HVR-L2, HVR-L3이며;
서열번호 9의 초가변영역 HVR-L1 서열은 서열번호 54로 표시되며; HVR-L2 서열은 서열번호 55로 표시되며; HVR-L3 서열은 서열번호 56으로 표시되며;
서열번호 12의 초가변영역 HVR-L1 서열은 서열번호 57로 표시되며; HVR-L2 서열은 서열번호 58로 표시되며; HVR-L3 서열은 서열번호 59로 표시되며;
서열번호 13의 초가변영역 HVR-L1 서열은 서열번호 60으로 표시되며; HVR-L2 서열은 서열번호 61로 표시되며; HVR-L3 서열은 서열번호 62로 표시된다.
이의 중쇄 가변영역의 아미노산 서열은 서열번호 1~7 중 어느 하나로 표시되며;
이의 경쇄 가변영역의 아미노산 서열은 서열번호 8~14 중 어느 하나로 표시된다.
본 발명에 따른 일 구현예에서, 상기 항 CD47 단일클론항체는:
(i) 아미노산 서열이 서열번호 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7인 중쇄 가변영역과 아미노산 서열이 서열번호 8인 경쇄 가변영역;
(ii) 아미노산 서열이 서열번호 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7인 중쇄 가변영역과 아미노산 서열이 서열번호 9인 경쇄 가변영역;
(iii) 아미노산 서열이 서열번호 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7인 중쇄 가변영역과 아미노산 서열이 서열번호 10인 경쇄 가변영역;
(iv) 아미노산 서열이 서열번호 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7인 중쇄 가변영역과 아미노산 서열이 서열번호 11인 경쇄 가변영역;
(V) 아미노산 서열이 서열번호 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7인 중쇄 가변영역과 아미노산 서열이 서열번호 12인 경쇄 가변영역;
(VI) 아미노산 서열이 서열번호 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7인 중쇄 가변영역과 아미노산 서열이 서열번호 13인 경쇄 가변영역;
(VII) 아미노산 서열이 서열번호 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7인 중쇄 가변영역과 아미노산 서열이 서열번호 14인 경쇄 가변영역;을 가진다.
본 발명에서 제공하는 항 CD47 단일클론항체의 중쇄 유형은 IgG1, IgG3 또는 IgM이며; 경쇄 유형은 κ이다.
본 발명은 상기 항 CD47 단일클론항체를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 추가로 제공한다.
본 발명에 따른 일 구현예에서, 상기 뉴클레오티드는
(I) 서열번호 15~21로 표시되는 중쇄 가변영역의 뉴클레오티드 서열; 서열번호 22~28로 표시되는 경쇄 가변영역의 뉴클레오티드 서열; 또는
(II) 서열번호 15~21로 표시되는 중쇄 가변영역의 뉴클레오티드 서열의 상보적 서열; 서열번호 22~28로 표시되는 경쇄 가변영역의 뉴클레오티드 서열의 상보적 서열; 또는
(III) 상기 (I) 또는 (II)의 뉴클레오티드 서열과 동일한 단백질을 코딩하나, 유전 암호의 퇴보로 인해 (I) 또는 (II)의 뉴클레오티드 서열과 상이한 서열; 또는
(IV) 상기 (I) 또는 (II) 또는 (III)의 서열과 적어도 80%의 상동성을 갖는 서열;을 가진다.
본 발명에 따른 일 구현예에서, 상기 뉴클레오티드는 (I) 또는 (II) 또는 (III) 또는 (IV)의 뉴클레오티드 서열이 하나 또는 복수개의 뉴클레오티드의 치환, 결실 또는 첨가에 의하여 얻은, (I) 또는 (II) 또는 (III) 또는 (IV)의 뉴클레오티드 서열과 기능이 동일하거나 유사한 뉴클레오티드 서열을 가진다.
본 발명에 따른 일 구현예에서, 상기 뉴클레오티드는 (I) 또는 (II) 또는 (III) 또는 (IV)의 뉴클레오티드 서열이 하나 또는 복수개의 뉴클레오티드의 치환, 결실 또는 첨가에 의하여 얻은 뉴클레오티드 서열을 가지며, 상기 복수개는 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 21개, 22개, 23개, 24개, 25개, 26개, 27개, 28개, 29개, 30개, 31개 또는 32개이다.
본 발명은 본 발명에서 제공하는 항 CD47 단일클론항체를 코딩하는 뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터를 추가로 제공한다.
본 발명은 본 발명에 따른 발현 벡터로 형질전환된 숙주세포를 추가로 제공한다.
본 발명은 서열번호 29~32 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열을 가지는 항원을 추가로 제공한다.
본 발명은 본 발명에 따른 항 CD47 단일클론항체를 생성하는 하이브리도마 세포주를 추가로 제공한다.
본 발명에서 제공하는 항 CD47 단일클론항체의 제조방법은:
단계1: 본 발명에서 제공하는 항원으로 마우스를 면역시킨 후, 마우스의 비장세포를 얻는 단계;
단계2: 상기 비장세포와 골수종세포를 융합시키고, CD47과 결합할 수 있는 하이브리도마 세포주를 선별하며, 체외 배양하여 항 CD47 단일클론항체를 제조하는 단계;를 포함한다.
본 발명은 본 발명에 따른 항 CD47 단일클론항체를 화학적 마커와 바이오마커를 거쳐 제조한 결합체(combination)를 추가로 제공한다.
상기 화학적 마커는 동위원소, 면역독소 및/또는 화학약물이며;
상기 바이오마커는 비오틴, 아비딘 또는 효소표지이다.
본 발명은 상기 항 CD47 단일클론항체 또는 결합체와 고체 매질 또는 반고체 매질의 커플링에 의하여 제조한 접합체(conjugate)를 추가로 제공한다.
본 발명은 CD47 발현 측정을 위한 제품의 제조에 있어서, 본 발명에 따른 항 CD47 단일클론항체, 결합체 및/또는 접합체의 용도를 제공한다.
본 발명은 상기 항 CD47 단일클론항체, 결합체 및/또는 접합체를 포함하는 키트를 추가로 제공한다.
본 발명은 본 발명에서 제공하는 키트로 CD47 발현을 측정하여 CD47의 발현량에 따라 질환에 걸렸는지 여부를 판단하며;
상기 질환은 백혈병, 림프종, 유방암, 폐암, 위암, 장암, 식도암, 난소암, 자궁경부암, 신장암, 방광암, 췌장암, 신경교종 및/또는 흑색종인, 질환의 진단방법을 제공한다.
본 발명은 CD47과 SIRPα의 결합 차단을 위한 제제의 제조에 있어서, 본 발명에 따른 항 CD47 단일클론항체, 결합체 및/또는 접합체의 용도를 제공한다.
본 발명은 종양세포에 대한 대식세포의 탐식지수 향상을 위한 제제의 제조에 있어서, 본 발명에 따른 항 CD47 단일클론항체, 결합체 및/또는 접합체의 용도를 제공한다.
본 발명의 실시예에서, 종양세포는 인간 말초혈액 백혈병 T세포이다.
본 발명은 종양세포 사멸 촉진을 위한 제제의 제조에 있어서, 본 발명에 따른 항 CD47 단일클론항체, 결합체 및/또는 접합체의 용도를 제공한다.
본 발명의 실시예에서, 종양세포는 인간 말초혈액 백혈병 T세포이다.
본 발명은 질환의 예방 및 치료를 위한 약물의 제조에 있어서,
상기 질환은 백혈병, 림프종, 유방암, 폐암, 위암, 장암, 식도암, 난소암, 자궁경부암, 신장암, 방광암, 췌장암, 신경교종 및/또는 흑색종인,
상기 항 CD47 단일클론항체, 결합체 및/또는 접합체의 용도를 제공한다.
본 발명은 본 발명에 따른 항 CD47 단일클론항체, 이의 결합체 및/또는 접합체를 포함하는 약물을 추가로 제공한다.
본 발명은 본 발명에 따른 약물을 투여하며; 상기 질환은 백혈병, 림프종, 유방암, 폐암, 위암, 장암, 식도암, 난소암, 자궁경부암, 신장암, 방광암, 췌장암, 신경교종 및/또는 흑색종인, 질환의 예방 및 치료방법을 제공한다.
본 발명에서 제공하는 항 CD47 단일클론항체는 종양의 성장을 효과적으로 억제할 수 있으며; 인간 SIRP와 인간 CD47 신호를 차단하여 종양세포에 대한 대식세포의 식세포 작용을 촉진할 수 있으며, 종양세포가 종양 면역의 방어 시스템을 회피하는 것을 저지하여 항종양 작용을 발휘할 수 있다. 종양세포 표면의 CD47과 대식세포 표면의 SIRP의 결합을 차단하여 종양세포의 "공격 무력화(do not eat me)" 신호를 차단할 수 있으며, 종양세포에 대한 대식세포의 인식 및 섭취를 촉진하여 종양세포가 탐식되는 것을 촉진할 수 있다. 종양세포 표면의 CD47과 대식세포 표면의 SIRP의 결합은 보편적인 "공격 무력화(do not eat me)" 신호이며, 항 CD47 항체는 종양 면역 시스템에서 매우 유망한 표적으로서 인간의 종양 치료 방면에서 강력하고 효과적인 작용을 발휘할 수 있다.
도1은 SDS-PAGE 전기영동법으로 정제된 인간과 원숭이의 CD47을 측정한 것을 나타낸 것이며; 레인 M: 단백질 분자량 마커; 도1-A: 레인 1: 인간 CD47-링커 펩티드-hIgG1Fc; 레인 2: 인간 CD47-링커 펩티드-His; 도1-B: 레인 1: 쥐 CD47-링커 펩티드-hIgG1Fc; 레인 2: 쥐 CD47-링커 펩티드-His이다.
도2는 SDS-PAGE 전기영동법으로 양성 항체(PAB)를 측정한 것을 나타낸 것이며; 레인 M: 단백질 분자량 마커; 레인 1: 비환원 PAB; 레인 2: 환원 PAB이다.
도3은 비환원 SDS-PAGE 전기영동법으로 정제된 후보 항체를 측정한 것을 나타낸 것이며; 레인 M: 단백질 분자량 마커; 레인 1: 059-1.11.1 정제 항체; 레인 2: 059-1.20.1 정제 항체; 레인 3: 059-1.30.1 정제 항체; 레인 4: 059-1.43.1 정제 항체; 레인 5: 059-1.51.2정제 항체; 레인 6: 059-1.82.1 정제 항체; 레인 7: 059-1.100.5 정제 항체이다.
도4는 전기영동으로 총 RNA을 측정한 것을 나타낸 것이며; M: DL2000 분자량 마커, 레인 1~7: 각각 059-1.11.1, 059-1.20.1, 059-1.30.1, 059-1.43.1, 059-1.51.2, 059-1.82.1, 059-1.100.5, 총 RNA 전기영동 밴드이다.
도5는 PCR로 증폭한 후보 항체의 중쇄 가변영역과 경쇄 가변영역의 아가로스 전기영동 측정 결과를 나타낸 것이다.
도6은 항체 059-1.20.1, 059-1.30.1, 059-1.43.1, 059-1.82.1이 인간 CD47과 SIRPα를 차단한 결과를 나타낸 도면이다.
도7은 항체 059-1.20.1, 059-1.30.1, 059-1.43.1, 059-1.82.1과 jurkat 세포 표면의 CD47이 결합한 FACS 측정 실험을 나타낸 것이다.
도8은 항체 059-1.20.1, 059-1.30.1, 059-1.43.1, 059-1.82.1이 Jurkat 세포에 대한 마우스 복강 초대배양 대식세포의 탐식을 촉진하는 것을 나타낸 것이다.
본 발명은 항 CD47 단일클론항체 및 그 용도를 제공하며, 당업자는 본 발명의 내용을 참고하여 공정계수에 대한 적당한 개진에 의하여 실현할 수 있다. 특히, 모든 유사한 대체와 수정은 당업자에게 있어서 자명한 것이며, 이들 모두 본 발명에 포함되는 것으로 간주됨을 주의하여야 한다. 본 발명에 따른 방법 및 용도는 이미 바람직한 실시예를 통해 설명하였으며, 당업자는 본 발명의 내용, 주지와 범위를 벗어나지 않는 범위 내에서 본 발명에 따른 방법과 용도에 대해 수정 또는 적당한 변경과 조합을 진행하여 본 발명의 기술을 실현하고 응용할 수 있음은 명확한 것이다.
"항체"는 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 하나 또는 복수의 폴리펩티드로 구성된 단백질을 의미한다. 항체의 한가지 형식은 항체의 기본 구조 단위를 구성한다. 이와 같은 형식은 사합체(tetramer)로서, 완전히 동일한 2쌍의 항체 사슬로 구성되며, 매 쌍마다 1개의 경쇄와 1개의 중쇄가 있다. 매 쌍의 항체 사슬에서 경쇄와 중쇄의 가변영역은 연합되어 공동으로 항원과의 결합을 담당하며, 불변영역은 항체의 효과기 기능을 담당한다.
항체의 중쇄 또는 경쇄의 "가변영역"은 해당 사슬의 N말단 성숙 영역이다. 현재까지 알려진 항체 유형은 κ과 λ경쇄, 및 α, γ(IgG1, IgG2, IgG3, IgG4), δ, ε와 μ 중쇄 또는 이들의 기타 유형의 등가물을 포함한다. 전장(full-length) 면역글로불린의 "경쇄"(약 25kDa 또는 약 214개 아미노산)는 하나의 NH2-말단의 약 110개 아미노산으로 형성된 가변영역, 및 하나의 COOH-말단의
Figure 112018128839341-pct00001
또는
Figure 112018128839341-pct00002
불변영역을 포함한다. 전장(full-length) 면역글로불린의 "중쇄"(약 50kDa 또는 약 446개 아미노산)는 동일하게 하나의 가변영역(약 116개 아미노산), 및 중쇄 불변영역 중 하나, 예컨대, λ(약 330개 아미노산)를 포함한다.
"항체"는 임의의 동형체의 항체 또는 면역글로불린, 또는 항원과의 특이적 결합을 유지하는 항체 단편을 포함하며, Fab, Fv, scFv와 Fd 단편, 키메라 항체, 인간화 항체, 단쇄 항체 및 항체를 포함하는 항원 결합부와 비항체 단백질의 융합 단백질을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 항체는 표지 및 측정될 수 있으며, 예컨대, 방사성 동위원소, 측정 가능한 물질을 생성하는 효소, 형광 단백질, 비오틴 등으로 표지 및 측정될 수 있다. 또한, 항체는 고체 벡터와 결합할 수 있으며, 폴리스티렌 시트 또는 비드를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명은 중쇄 가변영역과 경쇄 가변영역을 가지며:
(I) 상기 중쇄 가변영역의 아미노산 서열은 서열번호 1 또는 서열번호 2 또는 서열번호 3 또는 서열번호 4 또는 서열번호 5 또는 서열번호 6 또는 서열번호 7로 표시되며;
(II) 상기 경쇄 가변영역의 아미노산 서열은 서열번호 8 또는 서열번호 9 또는 서열번호 10 또는 서열번호 11 또는 서열번호 12 또는 서열번호 13 또는 서열번호 14로 표시되며;
(III) 상기 (I) 또는 (II)의 아미노산 서열이 하나 또는 복수개의 아미노산의 치환, 결실 또는 첨가에 의하여 얻은, (I) 또는 (II)의 아미노산 서열과 기능이 동일하거나 유사한 아미노산 서열이며; 또는
(IV) 상기 (I) 또는 (II)의 서열과 적어도 80%의 상동성을 갖는 아미노산 서열인, 항 CD47 단일클론항체를 제공한다.
본 발명에 따른 일 구현예에서, 상기 항 CD47 단일클론항체의 아미노산 서열이 하나 또는 복수개의 아미노산의 치환, 결실 또는 첨가에 의하여 얻은 아미노산 서열에 있어서, 상기 복수개는 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 21개, 22개, 23개, 24개, 25개, 26개, 27개, 28개, 29개, 30개, 31개 또는 32개이다.
상기 치환은 초가변영역에서 발생하며;
상기 중쇄 가변영역의 초가변영역은 HVR-H1, HVR-H2, HVR-H3이며;
서열번호 2의 초가변영역 HVR-H1 서열은 서열번호 45로 표시되며; HVR-H2 서열은 서열번호 46으로 표시되며; HVR-H3 서열은 서열번호 47로 표시되며;
서열번호 5의 초가변영역 HVR-H1 서열은 서열번호 48로 표시되며; HVR-H2 서열은 서열번호 49로 표시되며; HVR-H3 서열은 서열번호 50으로 표시되며;
서열번호 6의 초가변영역 HVR-H1 서열은 서열번호 51로 표시되며; HVR-H2 서열은 서열번호 52로 표시되며; HVR-H3 서열은 서열번호 53으로 표시되며;
상기 경쇄 가변영역의 초가변영역은 HVR-L1, HVR-L2, HVR-L3이며;
서열번호 9의 초가변영역 HVR-L1서열은 서열번호 54로 표시되며; HVR-L2 서열은 서열번호 55로 표시되며; HVR-L3 서열은 서열번호 56으로 표시되며;
서열번호 12의 초가변영역 HVR-L1 서열은 서열번호 57로 표시되며; HVR-L2 서열은 서열번호 58로 표시되며; HVR-L3 서열은 서열번호 59로 표시되며;
서열번호 13의 초가변영역 HVR-L1 서열은 서열번호 60으로 표시되며; HVR-L2 서열은 서열번호 61로 표시되며; HVR-L3 서열은 서열번호 62로 표시된다.
본 발명에 따른 일 구현예에서, 상기 항 CD47 단일클론항체는:
(i) 아미노산 서열이 서열번호 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7인 중쇄 가변영역과 아미노산 서열이 서열번호 8인 경쇄 가변영역;
(ii) 아미노산 서열이 서열번호 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7인 중쇄 가변영역과 아미노산 서열이 서열번호 9인 경쇄 가변영역;
(iii) 아미노산 서열이 서열번호 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7인 중쇄 가변영역과 아미노산 서열이 서열번호 10인 경쇄 가변영역;
(iv) 아미노산 서열이 서열번호 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7인 중쇄 가변영역과 아미노산 서열이 서열번호 11인 경쇄 가변영역;
(V) 아미노산 서열이 서열번호 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7인 중쇄 가변영역과 아미노산 서열이 서열번호 12인 경쇄 가변영역;
(VI) 아미노산 서열이 서열번호 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7인 중쇄 가변영역과 아미노산 서열이 서열번호 13인 경쇄 가변영역;
(VII) 아미노산 서열이 서열번호 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7인 중쇄 가변영역과 아미노산 서열이 서열번호 14인 경쇄 가변영역;을 가진다.
본 발명에서 제공하는 항 CD47 단일클론항체의 중쇄 유형은 IgG1, IgG3 또는 IgM이며; 경쇄 유형은 κ이다.
구체적으로, 항 CD47 단일클론항체의 중쇄 가변영역의 아미노산 서열은 서열번호 1로 표시되며, 경쇄 가변영역의 아미노산 서열은 서열번호 8로 표시된다.
또는, 항 CD47 단일클론항체의 중쇄 가변영역의 아미노산 서열은 서열번호 2로 표시되며, 경쇄 가변영역의 아미노산 서열은 서열번호 8로 표시된다.
또는, 항 CD47 단일클론항체의 중쇄 가변영역의 아미노산 서열은 서열번호 3으로 표시되며, 경쇄 가변영역의 아미노산 서열은 서열번호 8로 표시된다.
또는, 항 CD47 단일클론항체의 중쇄 가변영역의 아미노산 서열은 서열번호 4로 표시되며, 경쇄 가변영역의 아미노산 서열은 서열번호 8로 표시된다.
또는, 항 CD47 단일클론항체의 중쇄 가변영역의 아미노산 서열은 서열번호 5로 표시되며, 경쇄 가변영역의 아미노산 서열은 서열번호 8로 표시된다.
또는, 항 CD47 단일클론항체의 중쇄 가변영역의 아미노산 서열은 서열번호 6으로 표시되며, 경쇄 가변영역의 아미노산 서열은 서열번호 8로 표시된다.
또는, 항 CD47 단일클론항체의 중쇄 가변영역의 아미노산 서열은 서열번호 7로 표시되며, 경쇄 가변영역의 아미노산 서열은 서열번호 8로 표시된다.
또는, 항 CD47 단일클론항체의 중쇄 가변영역의 아미노산 서열은 서열번호 1로 표시되며, 경쇄 가변영역의 아미노산 서열은 서열번호 9로 표시된다.
또는, 항 CD47 단일클론항체의 중쇄 가변영역의 아미노산 서열은 서열번호 2로 표시되며, 경쇄 가변영역의 아미노산 서열은 서열번호 9로 표시된다.
또는, 항 CD47 단일클론항체의 중쇄 가변영역의 아미노산 서열은 서열번호 3으로 표시되며, 경쇄 가변영역의 아미노산 서열은 서열번호 9로 표시된다.
또는, 항 CD47 단일클론항체의 중쇄 가변영역의 아미노산 서열은 서열번호 4로 표시되며, 경쇄 가변영역의 아미노산 서열은 서열번호 9로 표시된다.
또는, 항 CD47 단일클론항체의 중쇄 가변영역의 아미노산 서열은 서열번호 5로 표시되며, 경쇄 가변영역의 아미노산 서열은 서열번호 9로 표시된다.
또는, 항 CD47 단일클론항체의 중쇄 가변영역의 아미노산 서열은 서열번호 6으로 표시되며, 경쇄 가변영역의 아미노산 서열은 서열번호 9로 표시된다.
또는, 항 CD47 단일클론항체의 중쇄 가변영역의 아미노산 서열은 서열번호 7로 표시되며, 경쇄 가변영역의 아미노산 서열은 서열번호 9로 표시된다.
또는, 항 CD47 단일클론항체의 중쇄 가변영역의 아미노산 서열은 서열번호 1로 표시되며, 경쇄 가변영역의 아미노산 서열은 서열번호 10으로 표시된다.
또는, 항 CD47 단일클론항체의 중쇄 가변영역의 아미노산 서열은 서열번호 2로 표시되며, 경쇄 가변영역의 아미노산 서열은 서열번호 10으로 표시된다.
또는, 항 CD47 단일클론항체의 중쇄 가변영역의 아미노산 서열은 서열번호 3으로 표시되며, 경쇄 가변영역의 아미노산 서열은 서열번호 10으로 표시된다.
또는, 항 CD47 단일클론항체의 중쇄 가변영역의 아미노산 서열은 서열번호 4로 표시되며, 경쇄 가변영역의 아미노산 서열은 서열번호 10으로 표시된다.
또는, 항 CD47 단일클론항체의 중쇄 가변영역의 아미노산 서열은 서열번호 5로 표시되며, 경쇄 가변영역의 아미노산 서열은 서열번호 10으로 표시된다.
또는, 항 CD47 단일클론항체의 중쇄 가변영역의 아미노산 서열은 서열번호 6으로 표시되며, 경쇄 가변영역의 아미노산 서열은 서열번호 10으로 표시된다.
또는, 항 CD47 단일클론항체의 중쇄 가변영역의 아미노산 서열은 서열번호 7로 표시되며, 경쇄 가변영역의 아미노산 서열은 서열번호 10으로 표시된다.
또는, 항 CD47 단일클론항체의 중쇄 가변영역의 아미노산 서열은 서열번호 1로 표시되며, 경쇄 가변영역의 아미노산 서열은 서열번호 11로 표시된다.
또는, 항 CD47 단일클론항체의 중쇄 가변영역의 아미노산 서열은 서열번호 2로 표시되며, 경쇄 가변영역의 아미노산 서열은 서열번호 11로 표시된다.
또는, 항 CD47 단일클론항체의 중쇄 가변영역의 아미노산 서열은 서열번호 3으로 표시되며, 경쇄 가변영역의 아미노산 서열은 서열번호 11로 표시된다.
또는, 항 CD47 단일클론항체의 중쇄 가변영역의 아미노산 서열은 서열번호 4로 표시되며, 경쇄 가변영역의 아미노산 서열은 서열번호 11로 표시된다.
또는, 항 CD47 단일클론항체의 중쇄 가변영역의 아미노산 서열은 서열번호 5로 표시되며, 경쇄 가변영역의 아미노산 서열은 서열번호 11로 표시된다.
또는, 항 CD47 단일클론항체의 중쇄 가변영역의 아미노산 서열은 서열번호 6으로 표시되며, 경쇄 가변영역의 아미노산 서열은 서열번호 11로 표시된다.
또는, 항 CD47 단일클론항체의 중쇄 가변영역의 아미노산 서열은 서열번호 7로 표시되며, 경쇄 가변영역의 아미노산 서열은 서열번호 11로 표시된다.
또는, 항 CD47 단일클론항체의 중쇄 가변영역의 아미노산 서열은 서열번호 1로 표시되며, 경쇄 가변영역의 아미노산 서열은 서열번호 12로 표시된다.
또는, 항 CD47 단일클론항체의 중쇄 가변영역의 아미노산 서열은 서열번호 2로 표시되며, 경쇄 가변영역의 아미노산 서열은 서열번호 12로 표시된다.
또는, 항 CD47 단일클론항체의 중쇄 가변영역의 아미노산 서열은 서열번호 3으로 표시되며, 경쇄 가변영역의 아미노산 서열은 서열번호 12로 표시된다.
또는, 항 CD47 단일클론항체의 중쇄 가변영역의 아미노산 서열은 서열번호 4로 표시되며, 경쇄 가변영역의 아미노산 서열은 서열번호 12로 표시된다.
또는, 항 CD47 단일클론항체의 중쇄 가변영역의 아미노산 서열은 서열번호 5로 표시되며, 경쇄 가변영역의 아미노산 서열은 서열번호 12로 표시된다.
또는, 항 CD47 단일클론항체의 중쇄 가변영역의 아미노산 서열은 서열번호 6으로 표시되며, 경쇄 가변영역의 아미노산 서열은 서열번호 12로 표시된다.
또는, 항 CD47 단일클론항체의 중쇄 가변영역의 아미노산 서열은 서열번호 7로 표시되며, 경쇄 가변영역의 아미노산 서열은 서열번호 12로 표시된다.
또는, 항 CD47 단일클론항체의 중쇄 가변영역의 아미노산 서열은 서열번호 1로 표시되며, 경쇄 가변영역의 아미노산 서열은 서열번호 13으로 표시된다.
또는, 항 CD47 단일클론항체의 중쇄 가변영역의 아미노산 서열은 서열번호 2로 표시되며, 경쇄 가변영역의 아미노산 서열은 서열번호 13으로 표시된다.
또는, 항 CD47 단일클론항체의 중쇄 가변영역의 아미노산 서열은 서열번호 3으로 표시되며, 경쇄 가변영역의 아미노산 서열은 서열번호 13으로 표시된다.
또는, 항 CD47 단일클론항체의 중쇄 가변영역의 아미노산 서열은 서열번호 4로 표시되며, 경쇄 가변영역의 아미노산 서열은 서열번호 13으로 표시된다.
또는, 항 CD47 단일클론항체의 중쇄 가변영역의 아미노산 서열은 서열번호 5로 표시되며, 경쇄 가변영역의 아미노산 서열은 서열번호 13으로 표시된다.
또는, 항 CD47 단일클론항체의 중쇄 가변영역의 아미노산 서열은 서열번호 6으로 표시되며, 경쇄 가변영역의 아미노산 서열은 서열번호 13으로 표시된다.
또는, 항 CD47 단일클론항체의 중쇄 가변영역의 아미노산 서열은 서열번호 7로 표시되며, 경쇄 가변영역의 아미노산 서열은 서열번호 13으로 표시된다.
또는, 항 CD47 단일클론항체의 중쇄 가변영역의 아미노산 서열은 서열번호 1로 표시되며, 경쇄 가변영역의 아미노산 서열은 서열번호 14로 표시된다.
또는, 항 CD47 단일클론항체의 중쇄 가변영역의 아미노산 서열은 서열번호 2로 표시되며, 경쇄 가변영역의 아미노산 서열은 서열번호 14로 표시된다.
또는, 항 CD47 단일클론항체의 중쇄 가변영역의 아미노산 서열은 서열번호 3으로 표시되며, 경쇄 가변영역의 아미노산 서열은 서열번호 14로 표시된다.
또는, 항 CD47 단일클론항체의 중쇄 가변영역의 아미노산 서열은 서열번호 4로 표시되며, 경쇄 가변영역의 아미노산 서열은 서열번호 14로 표시된다.
또는, 항 CD47 단일클론항체의 중쇄 가변영역의 아미노산 서열은 서열번호 5로 표시되며, 경쇄 가변영역의 아미노산 서열은 서열번호 14로 표시된다.
또는, 항 CD47 단일클론항체의 중쇄 가변영역의 아미노산 서열은 서열번호 6으로 표시되며, 경쇄 가변영역의 아미노산 서열은 서열번호 14로 표시된다.
또는, 항 CD47 단일클론항체의 중쇄 가변영역의 아미노산 서열은 서열번호 7로 표시되며, 경쇄 가변영역의 아미노산 서열은 서열번호 14로 표시된다.
본 발명의 실시예에서, 항 CD47 단일클론항체의 중쇄 가변영역의 아미노산 서열은 서열번호 1로 표시되며, 경쇄 가변영역의 아미노산 서열은 서열번호 8로 표시된다.
또는, 항 CD47 단일클론항체의 중쇄 가변영역의 아미노산 서열은 서열번호 2로 표시되며, 경쇄 가변영역의 아미노산 서열은 서열번호 9로 표시된다.
또는, 항 CD47 단일클론항체의 중쇄 가변영역의 아미노산 서열은 서열번호 3으로 표시되며, 경쇄 가변영역의 아미노산 서열은 서열번호 10으로 표시된다.
또는, 항 CD47 단일클론항체의 중쇄 가변영역의 아미노산 서열은 서열번호 4로 표시되며, 경쇄 가변영역의 아미노산 서열은 서열번호 11로 표시된다.
또는, 항 CD47 단일클론항체의 중쇄 가변영역의 아미노산 서열은 서열번호 5로 표시되며, 경쇄 가변영역의 아미노산 서열은 서열번호 12로 표시된다.
또는, 항 CD47 단일클론항체의 중쇄 가변영역의 아미노산 서열은 서열번호 6으로 표시되며, 경쇄 가변영역의 아미노산 서열은 서열번호 13으로 표시된다.
또는, 항 CD47 단일클론항체의 중쇄 가변영역의 아미노산 서열은 서열번호 7로 표시되며, 경쇄 가변영역의 아미노산 서열은 서열번호 14로 표시된다.
본 발명에 따른 항체 059-1.82.1의 중쇄 불변영역은 쥐 IgG3이고, 경쇄 불변영역은 쥐 κ사슬의 불변영역이며, 059-1.30.1, 059-1.43.1과 059-1.20.1은 모두 쥐 IgG1이고, 경쇄 불변영역은 쥐 κ사슬의 불변영역이며, 059-1.11.1, 059-1.51.2, 059-1.100.5의 중쇄 불변영역은 쥐 IgM이고, 중쇄 가변영역의 아미노산 서열은 서열번호 1~7 중 하나이며, 경쇄 가변영역의 아미노산 서열은 서열번호 8~14 중 하나이다.
본 발명에서 제공하는 항 CD47 단일클론항체는 인간 CD47 및 원숭이 CD47과 결합할 수 있으며; 일부 실시형태에서 항체와 이의 표적 간의 친화력은 Ka, Kd(해리 상수), KD(평형 해리 상수)로 표현하며, 본 발명에서 제공하는 항체의 KD값은 30nM이하이다.
본 발명에서 제공하는 항 CD47 단일클론항체는 용량 의존적으로 인간 SIRP와 인간 CD47의 결합을 차단할 수 있으며; 이의 차단 효과는 EC50값으로 표시하며, 본 발명에서 제공하는 항체의 EC50값은 850nM이상이다.
본 발명에서 제공하는 항 CD47 단일클론항체는 세포 표면의 CD47과 결합할 수 있으며; 해당 효과에 대한 측정은 FACS법으로 진행하고, 그 결과는 MFI(형광 강도)로 표시하며, 본 발명에서 제공하는 항체와 세표 표면의 CD47이 결합한 MFI값은 9547이상이고, 최대 18533에 달할 수 있다.
본 발명에서 제공하는 항 CD47 단일클론항체는 종양세포에 대한 대식세포의 식세포 작용을 촉진할 수 있으며, 해당 효과는 형광 영상법으로 측정하고, 결과는 탐식지수로 표시한다. 본 발명에서 제공하는 항체의 Jurkat 세포에 대한 탐식지수는 79에 달할 수 있다.
또한, 본 발명에서 제공하는 항 CD47 단일클론항체는 종양세포의 사멸을 유도할 수 있으며, 해당 효과는 유세포분석기로 세포 사멸율을 측정하여 표시하고, 결과에 따르면 본 발명에서 제공하는 항체는 jurkat 세포의 사멸을 유도할 수 있으며, 사멸율은 48%에 달할 수 있다.
Jurkat 세포는 급성 T세포 백혈병 세포주에 속하는 것으로서, 다양한 악성 종양세포 중 하나이며, 기타 악성 종양세포와 동일하게 jurkat 세포 표면의 CD47은 과발현을 나타낸다. 본 발명은 jurkat에 대한 실험을 통하여, 본 발명에서 제공하는 CD47 단일클론항체는 SIRP와 인간 CD47의 결합 신호를 차단하여 종양세포가 종양 면역의 방어 시스템을 회피하는 것을 저지하여 항종양 작용을 발휘할 수 있음을 증명하였다.
본 발명에서 제공하는 단일클론항체에 있어서, 중쇄 가변영역의 아미노산 서열은 서열번호 2로 표시되고, 경쇄 가변영역의 아미노산 서열은 서열번호 9로 표시되며; 중쇄 가변영역의 아미노산 서열은 서열번호 3으로 표시되고, 경쇄 가변영역의 아미노산 서열은 서열번호 10으로 표시되며; 중쇄 가변영역의 아미노산 서열은 서열번호 4로 표시되고, 경쇄 가변영역의 아미노산 서열은 서열번호 11로 표시되며; 중쇄 가변영역의 아미노산 서열은 서열번호 6으로 표시되고, 경쇄 가변영역의 아미노산 서열은 서열번호 13으로 표시되는 단일클론항체는 인간 CD47, 원숭이 CD47과 모두 우수한 친화력을 가지고 있으며, CD47과 SIRPα의 결합을 차단할 수 있고, 세포 표면의 CD47과 결합하여 대식세포가 종양세포를 탐식하는 것을 촉진하고, 종양세포의 사멸을 유도할 수 있다.
그중, 중쇄 가변영역의 아미노산 서열은 서열번호 4로 표시되고, 경쇄 가변영역의 아미노산 서열은 서열번호 11로 표시되는 단일클론항체의 CD47과 SIRPα의 결합을 차단하는 효과가 가장 우수하고, 종양세포 표면의 CD47과 결합하는 효과도 가장 우수하며, 대식세포가 종양세포를 탐식하는 것을 유도하는 효과도 가장 우수하다. 그러나 종양세포의 사멸을 유도하는 방면에서, 중쇄 가변영역의 아미노산 서열은 서열번호 3으로 표시되고, 경쇄 가변영역의 아미노산 서열은 서열번호 10으로 표시되는 단일클론항체가 더 우수한 효과를 구비한다.
또한, 본 발명은 상기 항 CD47 단일클론항체를 코딩하는 뉴클레오티드를 제공한다.
본 발명에 따른 일 구현예에서, 상기 뉴클레오티드는
(I) 서열번호 15~21로 표시되는 중쇄 가변영역의 뉴클레오티드 서열; 서열번호 22~28로 표시되는 경쇄 가변영역의 뉴클레오티드 서열; 또는
(II) 서열번호 15~21로 표시되는 중쇄 가변영역의 뉴클레오티드 서열의 상보적 서열; 서열번호 22~28로 표시되는 경쇄 가변영역의 뉴클레오티드 서열의 상보적 서열; 또는
(III) 상기 (I) 또는 (II)의 뉴클레오티드 서열과 동일한 단백질을 코딩하나, 유전 암호의 퇴보로 인해 (I) 또는 (II)의 뉴클레오티드 서열과 상이한 서열; 또는
(IV) 상기 (I) 또는 (II) 또는 (III)의 서열과 적어도 80%의 상동성을 갖는 서열;을 가진다.
본 발명에 따른 일 구현예에서, 상기 뉴클레오티드는 (I) 또는 (II) 또는 (III) 또는 (IV)의 뉴클레오티드 서열이 하나 또는 복수개의 뉴클레오티드의 치환, 결실 또는 첨가에 의하여 얻은, (I) 또는 (II) 또는 (III) 또는 (IV)의 뉴클레오티드 서열과 기능이 동일하거나 유사한 뉴클레오티드 서열을 가진다.
본 발명에 따른 일 구현예에서, 상기 뉴클레오티드는 (I) 또는 (II) 또는 (III) 또는 (IV)의 뉴클레오티드 서열이 하나 또는 복수개의 뉴클레오티드의 치환, 결실 또는 첨가에 의하여 얻은 뉴클레오티드 서열을 가지며, 상기 복수개는 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 21개, 22개, 23개, 24개, 25개, 26개, 27개, 28개, 29개, 30개, 31개 또는 32개이다.
또한, 본 발명은 본 발명에서 제공하는 항 CD47 단일클론항체의 중쇄 가변영역 및/또는 경쇄 가변영역의 뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터를 제공한다.
본 발명은 본 발명에 따른 발현 벡터로 형질전환된 숙주세포를 추가로 제공한다.
본 발명은 서열번호 29~32 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열을 가지는 항원을 추가로 제공한다.
본 발명은 본 발명에 따른 항 CD47 단일클론항체를 생성하는 하이브리도마 세포주를 추가로 제공한다.
본 발명에서 제공하는 항 CD47 단일클론항체의 제조방법은:
단계1: 본 발명에서 제공하는 항원으로 마우스를 면역시킨 후, 마우스의 비장세포를 얻는 단계;
단계2: 상기 비장세포와 골수종세포를 융합시키고, CD47과 결합할 수 있는 하이브리도마 세포주를 선별하며, 체외 배양하여 항 CD47 단일클론항체를 제조하는 단계;를 포함한다.
본 발명에서 상기 단계1의 항원의 아미노산 서열은 서열번호 29 또는 31로 표시된다.
본 발명에서 항원과 보조제를 혼합한 후 마우스에 대해 면역을 진행한다.
항원과 보조제의 부피비는 1:1이다.
상기 면역은 구체적으로 최초 면역 2주 후 2차 면역을 진행하고, 3일 후 혈청 역가가 1:200000을 초과하는 마우스를 취하여 면역 강화를 진행한다.
최초 면역, 2차 면역과 면역 강화의 용량은 항원 질량을 기준으로 모두 10μg이다.
면역은 2지점 주사(two-point injection)로 진행한다.
최초 면역의 보조제는 완전 프로인트 보강제이며, 2차 면역과 면역 강화의 보조제는 불완전 프로인트 보강제이다.
면역에서 사용된 마우스는 BALB/C 마우스이다.
골수종세포는 P3X63Ag8.653이다.
비장세포와 골수종세포는 개수비 5:1로 융합한다.
상기 선별은 HAT 배지를 사용하여 선별한다.
상기 CD47과의 결합은 구체적으로 CD47 단백질과 결합할 수 있고 표면의 CD47 단백질을 발현하는 세포와 결합할 수 있는 것을 의미한다.
동정(identification)을 통하여, 본 발명에서 제공하는 방법으로 제조된 CD47 단일클론항체는, 중쇄의 유형은 IgG3, IgM 또는 IgG1이며, 경쇄의 유형은 κ이다.
본 발명은 본 발명에 따른 항 CD47 단일클론항체를 화학적 마커와 바이오마커를 거쳐 제조한 결합체를 제공한다.
상기 화학적 마커는 동위원소, 면역독소 및/또는 화학약물이며;
상기 바이오마커는 비오틴, 아비딘 또는 효소표지이다.
상기 효소표지는 바람직하게 겨자무과산화효소 또는 알칼리 포스파타아제이다.
상기 면역독소는 바람직하게 아플라톡신(aflatoxin), 디프테리아독소(diphtheria toxin), 녹농균 외독소(Pseudomonas aeruginosa exotoxin), 리신(ricin), 아브린(abrin), 겨우살이 렉틴(Mistletoe Lectin), 모데신독소(modeccin), PAP, 사포린(saporin), 젤로닌(gelonin) 또는 루핀(luffin)이다.
본 발명은 상기 항 CD47 단일클론항체 또는 이의 결합체와 고체 매질 또는 반고체 매질의 커플링에 의하여 제조한 접합체를 추가로 제공한다.
상기 고체 매질 또는 반고체 매질은 콜로이드 골드, 폴리스티렌 시트 또는 비드로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 발명은 CD47 발현 측정을 위한 제품의 제조에 있어서, 본 발명에 따른 항 CD47 단일클론항체, 결합체 및/또는 접합체의 용도를 제공한다.
실험에 의하여, 본 발명에서 제공하는 CD47 단일클론항체는 CD47 단백질과 결합할 수 있고, 표면의 CD47을 발현하는 세포와 결합할 수 있음을 증명하였다. 따라서, 본 발명에서 제공하는 CD47 단일클론항체는 CD47 단백질 또는 표면의 CD47을 발현하는 세포 측정에 사용할 수 있다. 또한, 종양세포 표면의 표지물인 CD47의 과발현으로 인하여, 본 발명에서 제공하는 항체는 종양 표면의 표지물인 CD47 측정을 위한 키트를 제조할 수 있다. 그중, CD47 단백질에 대한 측정은 ELISA법을 사용하며, 표면의 CD47을 발현하는 세포에 대한 측정은 FACS법을 사용한다.
본 발명은 상기 항 CD47 단일클론항체, 결합체 및/또는 접합체를 포함하는 키트를 추가로 제공한다.
CD47 단백질을 측정하는 키트는 코팅 완충액, 세척액, 차단액 및/또는 발색액을 더 포함한다.
상기 코팅 완충액은 탄산염 완충액이다.
상기 세척액은 PBS, Tween, 염화나트륨, 염화칼륨, 인산수소이나트륨, 인산수소이칼륨을 포함한다.
상기 차단액은 PBS와 BSA를 포함한다.
상기 발색액은 TMB 용액, 기질 완충액과 정지액을 포함한다.
상기 기질 완충액은 구연산과 인산수소이나트륨을 포함한다.
상기 정지액은 과산화수소 수용액이다.
표면의 CD47을 발현하는 세포 측정을 위한 키트는 PBS, Goat Anti-Mouse IgG Fc와 TITC 이차 항체를 더 포함한다.
본 발명은 CD47과 SIRPα의 결합 차단을 위한 제제의 제조에 있어서, 본 발명에 따른 항 CD47 단일클론항체, 결합체 및/또는 접합체의 용도를 제공한다.
상기 표면의 CD47을 발현하는 세포는 종양세포이다.
상기 종양세포는 백혈병 세포, 림프종 세포, 유방암 세포, 폐암 세포, 위암 세포, 장암 세포, 식도암 세포, 난소암 세포, 자궁경부암 세포, 신장암 세포, 방광암 세포, 췌장암 세포, 신경교종 세포 및/또는 흑색종 세포로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 발명은 본 발명에서 제공하는 키트로 CD47 발현을 측정하여 CD47의 발현량에 따라 질환에 걸렸는지 여부를 판단하며;
상기 질환은 백혈병, 림프종, 유방암, 폐암, 위암, 장암, 식도암, 난소암, 자궁경부암, 신장암, 방광암, 췌장암, 신경교종 및/또는 흑색종인, 질환의 진단방법을 제공한다.
본 발명은 CD47과 SIRPα의 결합 차단을 위한 제제의 제조에 있어서, 본 발명에 따른 항 CD47 단일클론항체, 결합체 및/또는 접합체의 용도를 제공한다.
본 발명에 따른 항 CD47 단일클론항체가 CD47과 SIRPα의 결합을 차단하는 EC50값은 850nM~2340nM이다.
본 발명은 종양세포에 대한 대식세포의 탐식지수 향상을 위한 제제의 제조에 있어서, 본 발명에 따른 항 CD47 단일클론항체, 결합체 및/또는 접합체의 용도를 제공한다.
본 발명에 따른 항 CD47 단일클론항체의 종양세포에 대한 대식세포의 탐식지수를 향상시키는 용량은 항체 농도를 기준으로 10μg/mL이다.
본 발명의 실시예에서, 종양세포는 인간 말초혈액 백혈병 T세포이다.
본 발명은 종양세포 사멸 촉진을 위한 제제의 제조에 있어서, 본 발명에 따른 항 CD47 단일클론항체, 결합체 및/또는 접합체의 용도를 제공한다.
본 발명의 실시예에서, 종양세포는 인간 말초혈액 백혈병 T세포이다.
본 발명에 따른 항 CD47 단일클론항체의 종양세포 사멸을 촉진하는 용량은 10μg/mL이다.
본 발명은 종양의 예방 및 치료를 위한 약물의 제조에 있어서,
상기 질환은 백혈병, 림프종, 유방암, 폐암, 위암, 장암, 식도암, 난소암, 자궁경부암, 신장암, 방광암, 췌장암, 신경교종 및/또는 흑색종인, 상기 항 CD47 단일클론항체, 이의 결합체 및/또는 접합체의 용도를 제공한다.
본 발명은 본 발명에 따른 항 CD47 단일클론항체, 결합체 및/또는 접합체를 포함하는 약물을 추가로 제공한다.
본 발명은 본 발명에 따른 약물을 투여하며; 상기 질환은 백혈병, 림프종, 유방암, 폐암, 위암, 장암, 식도암, 난소암, 자궁경부암, 신장암, 방광암, 췌장암, 신경교종 및/또는 흑색종인, 질환의 예방 및 치료방법을 제공한다.
본 발명에서 제공하는 약물은 종양세포의 "공격 무력화(do not eat me)" 신호를 차단하여, 종양세포에 대한 대식세포의 인식 및 섭취를 촉진함으로써 종양세포가 탐식되는 것을 촉진할 수 있다.
본 발명에서 제공하는 약물의 제형은 주사액제 또는 주사분말제이다.
상기 주사액에서 항체의 농도는 10μg/mL이다.
본 발명에서 제공하는 항 CD47 단일클론항체는 종양의 성장을 효과적으로 억제할 수 있으며; 인간 SIRP와 인간 CD47 신호를 차단하여 종양세포에 대한 대식세포의 식세포 작용을 촉진할 수 있으며, 종양세포가 종양 면역의 방어 시스템을 회피하는 것을 저지하여 항종양 작용을 발휘할 수 있다. 종양세포 표면의 CD47과 대식세포 표면의 SIRP의 결합을 차단하여 종양세포의 "공격 무력화(do not eat me)" 신호를 차단할 수 있으며, 종양세포에 대한 대식세포의 인식 및 섭취를 촉진하여 종양세포가 탐식되는 것을 촉진할 수 있다. 종양세포 표면의 CD47과 대식세포 표면의 SIRP의 결합은 보편적인 "공격 무력화(do not eat me)" 신호이며, 항 CD47 항체는 종양 면역 시스템에서 매우 유망한 표적으로서 인간의 종양 치료 방면에서 강력하고 효과적인 작용을 발휘할 수 있다.
본 발명에서 사용하는 기기는 모두 통상적으로 시판되는 제품이며, 모두 시중에서 구매할 수 있는 것이다.
이하, 실시예를 결합하여 구제적으로 본 발명을 설명한다.
실시예1 항원 단백질 및 양성대조 항체의 제조
1.1 항원 유전자의 합성 및 발현 벡터의 구축
인간 유래 및 원숭이 유래 CD47 단백질의 세포외 영역의 아미노산 서열과 링커 펩티드-hIgG1Fc 또는 링커 펩티드-7his 아미노산 서열을 융합시켰으며, 아미노산 서열의 설계는 서열번호 29, 30, 31, 32로 표시된다:
상술한 바와 같이 설계한 인간과 원숭이 CD47 단백질의 세포외 영역의 융합 단백질(CD47ECD-링커 펩티드-hIgG1Fc 또는 CD47ECD-링커 펩티드-7his)에 대응되는 아미노산 서열에 대하여 인공적으로 코돈 최적화를 진행하며, 서열번호 33, 34, 35, 36의 5'말단에 Hind III 제한효소 절단 사이트와 Kozak 서열 GCCGCCACC를 첨가하고, 3'말단에 종결코돈 TAG와 EcoR I 제한효소 절단 사이트를 첨가하며, GenScript Biotech사에 의뢰하여 DNA를 합성 및 최적화한 후, 상기 DNA를 pUC57simple(GenScript Biotech사에서 제공) 벡터에 클론하여 인간과 원숭이 pUC57simple-CD47-링커 펩티드-hIgG1Fc 및/또는 CD47ECD-링커 펩티드-7his 플라스미드를 얻었다.
인간과 원숭이의 플라스미드 pUC57simple-CD47-링커 펩티드-hIgG1Fc, pUC57simple-CD47ECD-링커 펩티드-7his와 벡터 pcDNA3.1을 효소로 절단(Hind III와 EcoR I)하고, 얻은 융합 유전자 단편 CD47-링커 펩티드-hIgG1Fc와 CD47ECD-링커 펩티드-7his를 전기영동에 의하여 회수하며, 벡터 pcDNA3.1과 연결반응하여 재조합 및 구축에 의하여 발현 플라스미드를 얻었다:
pcDNA3.1-인간 CD47-링커 펩티드-hIgG1Fc;
pcDNA3.1-인간 CD47ECD-링커 펩티드-7his;
pcDNA3.1-원숭이 CD47-링커 펩티드-hIgG1Fc;
pcDNA3.1-원숭이 CD47ECD-링커 펩티드-7his;
양성 항체 유전자 합성 및 발현 벡터의 구축
pAb 항체 서열은 하기와 같다:
PABH, 서열번호 37, 38로 표시되며:
PABL, 서열번호 39, 40으로 표시된다:
상술한 항체 서열에 대응되는 아미노산 서열에 대하여 인공적으로 코돈 최적화를 진행하며, 5'말단에 Hind III 제한효소 절단 사이트와 Kozak 서열 GCCGCCACC를 첨가하고, 3'말단에 종결코돈 TAG와 EcoR I 제한효소 절단 사이트를 첨가하며, GenScript Biotech사에 의뢰하여 DNA 를 합성 및 최적화한 후, 상기 DNA를 pUC57simple(GenScript Biotech사에서 제공) 벡터에 클론하여 pUC57simple-PCABH, pUC57simple-PCABL 플라스미드를 얻었으며, 플라스미드 pUC57simple-PCABH, pUC57simple-PCABL을 효소로 절단(Hind III와 EcoR I)한 후, 얻은 유전자 단편 PCABH, PCABL을 전기영동에 의하여 회수하며, 벡터 pcDNA3.1과 연결반응하여 재조합 및 구축에 의하여 pcDNA3.1-PCABH, pcDNA3.1-PCABL을 얻었다.
1.2 일시적 형질주입(transient transfection) 발현
pcDNA3.1- PCABH,
pcDNA3.1- PCABL.
pcDNA3.1-인간 CD47-링커 펩티드-hIgG1Fc;
pcDNA3.1-인간 CD47ECD-링커 펩티드-7his;
pcDNA3.1-원숭이 CD47-링커 펩티드-hIgG1Fc;
pcDNA3.1-원숭이 CD47ECD-링커 펩티드-7his;에 대하여 일시적 발현을 진행하였다.
FreeStyleTM 293F세포를 사용하여 FreeStyle 배지에서 일시적 형질주입 발현을 진행하였다. 형질주입을 진행하기 24시간 전에, 293F세포를 0.6Х106세포/ml로 125ml 삼각 플라스크에 접종하고, 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 130rpm 진탕 배양하였다. 형질주입을 진행할 때, 먼저 293fectin 60마이크로리터를 취하여 OPtiMEM 1ml에 첨가하여 충분히 균일하게 혼합한 후, 실온에서 5분 동안 배양시키며; 이와 동시에3:2:1의 비율로 재조합 벡터 경쇄와 중쇄 및 형질주입 시약을 혼합하며, 총 DNA 량은 30μg이고, OPtiMEM 1ml에 용해시켰다. 그 다음, DNA와 293fectin을 충분히 혼합하고, 총 부피는 2ml이며, 실온에서 15분 동안 배양시킨 후, 혼합물을 전부 세포 배양웰에 첨가하여 균일하게 혼합하고, 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 7일 동안 130rpm 진탕 배양하였다. 배양액을 고속 원심분리하고, 정밀 여과막으로 진공 여과하였다.
1.3 단백질 정제
제조업체에서 제공한 조작방법으로 Protein A 컬럼(단백질 정제 액체 크로마토그래피 시스템/AKTA Purifier 10, GE)을 사용하여 정제하여, 정제된 인간 PDL-1-mIgG2aFc 융합 단백질을 얻었다. AKTA를 초순수로 깨끗하게 세척한 다음, 1ml의 rProtianA Fast Flow Prepacked Column을 AKTA에 연결하며; 세척: 1M HAC 5개 컬럼 부피로 세척하였다. 평형: 20mM PB 0.15M NaCl (pH 7.0） 5개 컬럼 부피로 평형시켰다.
시료의 적재: 세포 발현 상등액 시료를 1000rpmХ5min으로 원심분리하고, 상등액을 취하여 8000rpmХ30min으로 원심분리하며, 원심분리 후의 상등액 20ml를 취하여 적재하였으며, 유속은 0.2ml/min이다. 평형: 20mM PB 0.15M NaCl (pH 7.0) 5개 컬럼 부피로 평형시키고, 0.2ml/min. 세척: 20mM PB 1M NaCl (pH 7.0) 5개 컬럼 부피로 세척하였다. 평형: 20mM PB 0.15M NaCl (pH 7.0) 5개 컬럼 부피로 평형시켰다.
용출: 20mM 구연산나트륨 완충액(pH 3.0)으로 용출하며, 유속은 0.2ml/min이다. UV280이 100mAu에 달하였을 때 수집하기 시작하여, 100mAu으로 낮아졌을 때 수집을 정지하였다. 1M Tirs로 시료의 pH를 pH 6~8로 조절하였으며, 정제된 시료는 도1~2와 같다.
실시예2 단일클론 하이브리도마의 제조
1. 마우스의 면역
항원과 보조제를 부피비 1:1의 비율로 사용하여 면역원인 인간 CD47-hFc(실시예 1에서 제조)를 유화하였으며, 1차 면역은 완전 프로인트 보강제를 사용하여 항원을 유화하였고, 2주 후 2차 면역을 시작하여, 불완전 프로인트 보강제를 사용하여 항원을 유화하였고, 피하 2지점에서 주사하였으며, 마우스당 주사한 항원의 량은 10μg이고, 각 주사지점에서 주사한 부피는 25μL이다.
2차 면역 후 3일째에 마우스의 안와(orbital)에서 채혈하고, 소량의 혈액 시료를 취하여 혈청 역가 검출을 진행하였으며, 간접적인 ELISA방법으로 측정한 혈청 역가가 1:200000 또는 그 이상에 달한 후, 마우스에 대해 면역 강화를 진행하였다.
그룹당 5마리의 마우스로, 총 3개 그룹에 대해 면역을 진행하였다.
2. 배양보조세포와 골수종세포의 준비
배양보조세포(feeder cell)의 준비에 있어서, 정상 BALB/C 마우스(경추 탈구법으로 희생시킴)의 복부 피부를 절개하여 복막을 노출시키고, 주사기로 DMEM 배지를 취한 후, 마우스 복강에 주입하고, 흡수된 복강 대식세포를 세척하고, 원심관에 수집하여 1500rmp/min로 3min 동안 원심분리하며, 하층 갈색 침전물을 재현탁한 다음 대기시켰다. 상술한 단계를 반복하여 3마리 정상 마우스의 복강 대식세포를 얻었다.
골수종세포의 준비에 있어서, 일주일 전에 P3X63Ag8.653를 소생(thawed)시키고, 1X 8-아자구아닌을 함유한 완전 배지로 배양하였고, 융합 이틀 전에 15% 우태아 혈청의 DMEM로 교체하여 배양하였으며, 융합 당일까지 P3X63Ag8.653의 밀도를 70%~80%으로 유지하였다.
3. 세포 융합 및 HAT 선별
비장세포의 수득과 제조: 면역 강화 후의 마우스 2마리(L1, L2로 표시)를 취하여, L1, L2의 면역 혈청을 채취한 다음 희생시켜 75% 알코올에 침지하였다. 면역 마우스의 복부 측면의 피부와 복막을 절개하여 비장을 노출시키며, 가위 끝부분으로 주변 조직을 제거하여 비장을 수득하고, 그라인딩 로드로 연마한 다음, 세포 스트레이너로 여과한 후 단세포 현탁액으로 제조하였다.
세포 융합 전처리: 배양병 내의 P3X63Ag8.653을 수집하여, 1000rpm/5min으로 원심분리한 후 상등액을 제거하고, 재현탁한 후 생존한 세포의 개수를 계산하였다. 2000rpm/5min으로 비장세포 현탁액을 원심분리하고, 상등액을 제거한 후 재현탁하며, 생존한 세포의 개수를 계산하였다. P3X63Ag8.653의 생존한 세포의 개수, 비장세포의 생존한 세포수를 기록하였다.
세포의 융합: 비장세포:P3X63Ag8.653=5:1의 비율로 세포를 혼합하고, 2000rpm/5min으로 원심분리한 후 상등액을 완전히 제거하였으며, 세포 침전물을 진탕하여 분산시키고, 37℃ 수욕에서 예열된 50% PEG1500 용액 1mL를 천천히 적가하면서, 튜브의 밑부분이 37℃ 물에서 원을 그리며 흔들도록 하였으며, 상술한 조작 시간은 1min 정도로 제어하고, 30s 동안 정치하여 반응시키며, 튜브에 느린 속도로부터 빠른 속도로 37℃로 예열된 DMEM배지를 첨가하여 반응을 종료시켰다. 반응이 종료된 후의 세포 현탁액을 800rpm로 3min 동안 원심분리한 후 상등액을 제거하고, 세포 침전물을 가볍게 진탕하여 분산시켰다.
HAT 배지 선별: 1ХHAT, 1Х페니실린-스트렙토마이신, 15% 우태아 혈청과 85% DMEM배지를 함유하는 HAT 선별 배지를 배합하였다. 상기 HAT 선별 배지로 쥐 하이브리도마 세포와 배양보조세포를 재현탁하고, 양자를 혼합하였다. 세포 현탁액을 300μl/웰로 20개의 96웰 세포배양 플레이트에 첨가하고, 37℃의 세포 인큐베이터에서 배양하였다. 일주일 배양한 후, HT 배지로 1차 교체를 진행하고, 37℃의 세포 인큐베이터에서 배양하며; 3일 동안 배양한 후, HT 배지로 2차 교체를 진행하였다.
4. 양성 세포주의 선별
융합 2주 후, 세포 상등액을 취하여 ELISA실험을 진행하여, 세포 상등액과 인간 CD47-his 단백질의 결합 상황을 측정하였으며, ELISA 결과가 양성인 세포를 선별한 다음, 2차 ELISA 실험으로 재측정을 진행하였으며; 재측정 결과가 양성인 세포 상등액을 취하여 FACS 실험을 진행하여, 세포 상등액과 jurkat 세포 표면의 CD47 단백질의 결합 상황을 측정하였다.
5. 증폭 배양
ELISA와 FACS 측정에서 모두 양성을 나타낸 세포주를 96웰에서 24웰로 옮겨서 배양하였으며, 가득차게 성장한 후, 25cm2 배양병으로 옮겨서 배양하였다.
6. 한계희석법 서브클론
양성 세포주는 피펫팅(pipetting)을 통하여 균일하게 혼합하고, 소량을 취하여 생존한 세포의 개수를 계산하였다. 약 100개의 세포를 취하여 40mL 완전 배지에 첨가하여 균일하게 혼합하고, 2개의 플레이트에 첨가하였으며; 별도로 약 100개 세포를 취하여 20mL 완전 배지에 첨가하여 균일하게 혼합하고, 1개의 플레이트에 첨가하였으며; 별도로 약 1000개 세포를 취하여 20mL 완전 배지에 첨가하여 균일하게 혼합하고, 1개의 플레이트에 첨가하였으며; 총 3개의 상이한 세포 밀도로 4개의 플레이트에 첨가하였으며, 각각 0.5세포/웰, 1세포/웰, 10세포/웰이다. 96웰 플레이트를 37℃?, 5% CO2 인큐베이터에서 배양하였다.
7. 클론 측정과 증폭 배양
단일클론 세포웰의 상등액을 취하여 ELISA와 FACS실험을 진행하여, 세포 클론 항체와 인간, 원숭이 CD47-his 태그의 결합 및 jurkat 세포 표면의 CD47 단백질과의 결합 상황을 각각 측정하였다. ELISA와 FACS 측정에서 모두 양성을 나타낸 세포주(총 7개, 각각 059-1.11.1, 059-1.20.1, 059-1.30.1, 059-1.43.1, 059-1.51.2, 059-1.82.1, 059-1.100.5로 표기)를 96웰에서 24웰로 옮겨서 배양하였으며, 가득차게 성장한 후, 25cm2 배양병으로 옮겨서 배양하였다.
8. 서브클래스의 동정
Goat Anti-Mouse IgG(Fc) 코팅, 2μg/ml, 웰당 50μL, 4℃에서 밤샘, BSA로 차단, 측정할 세포의 상등액을 첨가, 실온, 2시간, 효소 표지 서브클래스 2차 항체 IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG2c, IgG3, κ, λ(abcam)를 첨가, 발색, 450nm에서 수치를 읽었으며, 측정한 세포주의 서브클래스는 IgG3 또는 IgM 또는 IgG1,κ인 것으로 판단되었다.
그중, 항체 059-1.82.1의 중쇄 불변영역은 쥐 IgG3이고, 경쇄 불변영역은 쥐
Figure 112018128839341-pct00003
사슬의 불변영역이며, 059-1.30.1, 059-1.43.1과 059-1.20.1의 중쇄 불변영역은 모두 쥐 IgG1이고, 경쇄 불변영역은 쥐 κ사슬의 불변영역이며, 059-1.11.1、059-1.51.2、059-1.100.5의 중쇄 불변영역은 쥐 IgM이고, 중쇄 가변영역의 아미노산 서열은 서열번호 1~7 중 하나이며, 경쇄 가변영역의 아미노산 서열은 서열번호 8~14 중 하나이다.
용액을 첨가하기 전, 각 단계는 PBST로 3회 세척하였다.
9. 세포 냉동보관
냉동 보관 용액의 배합: 90% 우태아 혈청, 10% DMSO.
배양병 내 세포를 재현탁하고, 세포 개수를 계산한 후, 1500rpm/min으로 3min 동안 원심분리한 다음 상등액을 제거하고, 10% DMSO를 함유한 우태아 혈청으로 피펫팅(pipetting)하여 현탁시키며, 튜브당 5Х106 세포수로 냉동보관 박스 내에 냉동보관하여, -80℃에서 밤샘시킨 후, 다음날 액체질소로 옮겼다.
10. 단일클론 하이브리도마 유전자의 보관
양성 단일클론 세포주 RNA 추출액을 취하여 RNA를 추출하고, cDNA로 역전사하여 -80℃에서 영구적으로 보관하였다.
실시예3 단일클론항체의 제조 및 동정
1. 체외배양법을 사용한 항체의 제조
실시예2에서 제조한 하이브리도마 세포주를 10% 우태아 혈청, 1% 페니실린-스트렙토마이신을 함유하는 DMEM배지로 소생시키는 방법으로 소생시켜 소형 플라스크로 배양하였으며, 세포 밀집도가 약 90%에 달한 후, 계대 증폭 배양을 진행하여 세포 배양 상등액이 총 200mL로 될 때까지 증폭 배양하였다.
2. 항체의 정제
7일 정도 배양한 세포의 상등액을 수집하여, 부피를 측정하였으며(약 200mL), 상등액 중 NaCl이 2.5M가 되도록 NaCl을 첨가하였으며, 0.22μm의 혼합 셀룰로오스 정밀 여과막으로 진공 여과한 후, 4℃에서 보관하였으며, Protein A 친화성 크로마토그래피로 항체를 정제하였다. 시료의 적재: 2.5M NaCl를 함유하는 세포배양 상등액을 0.22μm의 여과막으로 여과한 후, 30ml로 농축한 다음 시료를 직접 적재하였다. 세척: UV280의 베이스라인이 0으로 될 때까지 pH 7.4, 2.5M PBS로 세척하였다. 용출: pH 3.5, 0.1M 구연산 용액으로 진행하고, 분획당 2ml 용출액을 수집하고, 튜브당 1M Tris 용액 100μl 첨가하였다. 수집액을 농축하고, PBS로 초기 성분 비율이 0.1% 미만으로 될 때까지 용출하였다. SDS-PAGE 겔로 정제된 항체의 순도를 확인하였다(도3).
실시예4 단일클론항체의 유전자 시퀀싱과 재조합 항체의 제조
1. 단일클론항체의 유전자 시퀀싱
면역, 융합 및 단일클론화를 거친 후, 친화력 실험 결과에 따라 059-1.11.1, 059-1.20.1, 059-1.30.1, 059-1.43.1, 059-1.51.2, 059-1.82.1, 059-1.100.5, 단일클론항체 세포주를 선택하여 총 RNA을 추출하고, cDNA로 역전사한 후, cDNA를 주형으로 하여 PCR로 항체의 중쇄 가변영역과 경쇄 가변영역을 증폭하였다.
항체 유전자의 중쇄와 경쇄의 서열 분석을 진행하였다. 7개 단일클론항체의 총 RNA는 Invitrogen사의 Trizol® reagent키트(15596-026)로 설명서에 따라 추출하였고, 추출 결과는 도4에 나타낸 바와 같다.
다음으로, Takara사의 5'RACE FULL 키트(D315)를 사용하여, 총 RNA를 주형으로 하여 키트 중의 랜덤 프라이머에 의해 제1사슬 cDNA로 역전사한 다음, 중쇄는 불변영역 설계 프라이머(mIgG R)와 키트 중의 링커 프라이머로 PCR 증폭을 진행하였으며, 경쇄는 불변영역 설게 프라이머(mIgK R)와 키트 중의 링커 프라이머로 PCR 증폭을 진행하였다. mIgG R과 mIgK R의 서열은 하기와 같다:
mIgG R: CTCAGGGAARTARCCYTTGAC, (서열번호 41로 표시);
mIgK R: TCACTGCCATCAATCTTCCAC, (서열번호 42로 표시).
7개 단일클론항체 세포주의 중쇄 가변영역과 경쇄 가변영역의 PCR 증폭 후의 전기영동 측정은 도5에 나타낸 바와 같으며,
아가로스 겔 회수 키트로 회수한 PCR 단편은 TA 클론을 진행한 다음 단일클론에 대한 PCR 동정을 진행하였으며, 동정 프라이머는 M13-F와 M13-R이고, 정확하게 동정된 세포주에서 일부 샘플을 선택하여 Invitrogen에 전달하여 시퀀싱을 진행하였다. 최종적으로 중쇄 가변영역의 단백질 서열은 서열번호 1~7이고; 경쇄 가변영역의 단백질 서열은 서열번호 8~14이며; 중쇄 뉴클레오티드 서열은 서열번호 15~21이고; 경쇄 뉴클레오티드 서열은 서열번호 22~28임을 확정하였다:
동정 프라이머 M13-F는 하기와 같다:
5'TGTAAAACGACGGCCAGT3', (서열번호 43으로 표시);
동정 프라이머 M13-R는 하기와 같다:
5'CAGGAAACAGCTATGACC3', (서열번호 44로 표시).
아미노산 서열 뉴클레오티드 서열
중쇄 가변영역 경쇄 가변영역 중쇄 가변영역 경쇄 가변영역
059-1.100.5 서열번호 1 서열번호 8 서열번호 15 서열번호 22
059-1.82.1 서열번호 2 서열번호 9 서열번호 16 서열번호 23
059-1.51.2 서열번호 3 서열번호 10 서열번호 17 서열번호 24
059-1.43.1 서열번호 4 서열번호 11 서열번호 18 서열번호 25
059-1.30.1 서열번호 5 서열번호 12 서열번호 19 서열번호 26
059-1.20.1 서열번호 6 서열번호 13 서열번호 20 서열번호 27
059-1.11.1 서열번호 7 서열번호 14 서열번호 21 서열번호 28
실시예5 친화력 측정 및 경쟁적 ELISA 측정
1. 인간 CD47과의 결합에 대한 측정(ELISA)
코팅: PBS로 hCD47-his를 1μg/ml로 희석하고, ELISA 플레이트 96웰에 웰당 100μL씩 첨가하여, 4℃에서 밤샘 배양하였다. 차단: 플레이트를 3회 세척한 후, 1% BSA+PBS로 웰당 300μL으로 차단하였으며, 실온 조건하에서 2시간 동안 배양하였다. 후보 항체의 첨가: 플레이트를 3회 세척한 후, 후보 항체의 세포 배양 상등액 또는 양성대조 또는 음성대조를 웰당 100μl 씩 첨가하였고, l실온 조건하에서 2시간동안 배양시켰다. 2차 항체의 첨가: 플레이트를 3회 세척한 후, Goat Anti-Mouse IgG Fc, HRP(1:10000)를 웰당 100μL씩 첨가하고, 실온 조건하에서 1시간 동안 반응시켰다. 발색: 플레이트를 4회 세척한 후, TMB 발색액을 웰당 100μL씩 첨가하고, 실온에서 빛을 차단하여 10분 동안 발색시켰다. 정지: 정지액을 직접 웰당 100μL씩 첨가하여 반응을 정지시켰다. 측정: 반응 정지 직후 ELISA 플레이트를 ELISA Reader에 넣어 450nm에서 이의 OD값을 측정하였으며, 원 데이터를 보존하여 후보 클론과 인간 CD47의 ELISA로 측정한 OD450값dmf 하기 표2와 같이 정리하였다.
항체 명칭 OD450
059-1.11.1 3.6718
059-1.20.1 4.0
059-1.30.1 4.0
059-1.43.1 4.0
059-1.51.2 0.7709
059-1.82.1 4.0
059-1.100.5 0.81
음성대조 0.086
2. 원숭이 CD47과의 결합에 대한 측정(ELISA)
코팅: PBS로 원숭이 CD47-his를 1μg/ml로 희석하고, ELISA 플레이트 96웰에 웰당 100μL씩 첨가하여, 4℃에서 밤샘 배양하였다. 차단: 플레이트를 3회 세척한 후, 1% BSA+PBS로 웰당 300μL으로 차단하였으며, 실온 조건하에서 2시간 동안 배양하였다. 후보 항체의 첨가: 플레이트를 3회 세척한 후, 후보 항체의 세포 배양 상등액 또는 음성대조를 웰당 100μl,씩 첨가하여 실온 조건하에서 2시간동안 배양하였다. 2차 항체의 첨가: 플레이트를 3회 세척한 후, Goat Anti-Mouse IgG Fc, HRP(1:10000)를 웰당 100μL씩 첨가하고, 실온 조건하에서 1시간 동안 반응시켰다. 발색: 플레이트를 4회 세척한 후, TMB 발색액을 웰당 100μL씩 첨가하고, 실온에서 빛을 차단한 후 10분 동안 발색시켰다. 정지: 정지액을 직접 웰당 100μL씩 첨가하여 반응을 정지시켰다. 측정: 반응 정지 직후 ELISA 플레이트를 ELISA Reader에 넣어 450nm에서 이의 OD값을 측정하였으며, 원 데이터를 보존하여 후보 클론과 원숭이 CD47의 ELISA로 측정한 OD값을 하기 표3과 같이 정리하였다.
항체 명칭 OD450
059-1.11.1 4
059-1.20.1 4
059-1.30.1 4
059-1.43.1 4
059-1.51.2 0.6336
059-1.82.1 3.896
059-1.100.5 0.6166
음성대조 0.0883
3. 인간 CD47 단백질과의 친화력에 대한 측정Biacore T200 기기로 인간 CD47 항체의 친화력 상수를 측정하였으며, 아미노기 공유결합으로 항-마우스 Fc항체(GE Healthcare사, BR-1008-38)를 CM5 바이오센서칩(GE Healthcare사)에 커플링하였고, 칩 상의 항-마우스 Fc 항체가 후보 단일클론항체 또는 양성대조 B6H12(상업화된 CD47 항체, Abcam으로부터 구입, 제품 번호: ab3283)를 포획하면, 상이한 농도의 인간 CD47은 30μL/min의 유속으로 칩 상의 후보 항체를 통과하여, 인간 CD47과 후보 항체는 결합하며, 결합 시간은 120s이고, 해리 시간은 300s이다. BIAevalution 소프트웨어(GE Healthcare사)로 동력학 피팅(dynamic fitting)을 진행하였으며, 친화력이 제일 높은 것은 059-1.82.1이고, 얻은 친화력 상수의 결과(후보 클론과 인간 CD47 단백질과의 친화력 측정 결과)는 하기 표4와 같다:
항체 명칭 Ka (1/Ms) Kd (1/s) KD (nM)
059-1.11.1 2.60E5 0.004015 15.5
059-1.20.1 2.17E5 0.00548 25.3
059-1.30.1 4.24E5 0.01276 30.1
059-1.43.1 2.36E5 0.006657 28.3
059-1.51.2 3.70E5 0.01009 27.3
059-1.82.1 2.56E5 0.003643 14.2
059-1.100.5 1.57E5 0.0069 44.0
음성대조 1.32E5 0.003636 27.5
실시예6 용량 의존적으로 인간 CD47과 인간 SIRP의 결합 차단(ELISA 법)
코팅: PBS로 인간CD47-hFc를 2μg/ml로 희석하고, ELISA 플레이트 96웰에 웰당 100μL씩 첨가하여, 4℃에서 밤샘 배양하였다. 차단: 플레이트를 3회 세척한 후, 1% BSA+PBS를 웰당 300μL으로 차단하였으며, 실온 조건하에서 1시간 동안 배양하였다. 후보 항체와 SIRP-his의 혼합: 정제된 후보 항체를 각각 PBST로 20μg/ml로 희석하고, PBST용액으로 3배 구배 희석을 진행하여, 총 7개 구배를 희석하였으며; PBST로 인간 SIRP-his 단백질을 500ng/mL로 희석하고, 상이한 희석 구배의 후보 항체와 인간 SIRP-his 단백질을 1:1로 혼합하여 실온에서 30min 동안 배양하였다. 후보 항체와 인간 SIRP-his 단백질 혼합물의 첨가: 웰당 100μL씩 첨가하여, 실온에서 1h 동안 반응시키며, 대조 웰에는 IgG 동일 유형 대조와 인간 SIRP-his 단백질의 혼합물을 첨가하였다. 2차 항체의 첨가: 플레이트를 3회 세척한 후, 항-His 태그 항체, HRP(1:3000)를 웰당 100μL씩 첨가하고, 실온 조건하에서 1시간 동안 반응시켰다. 발색: 플레이트를 4회 세척한 후, TMB 발색액을 웰당 100μL씩 첨가하여, 실온에서 빛을 차단한 후 10분 동안 발색시켰다. 정지: 정지액을 직접 웰당 100μL씩 첨가하여 반응을 정지시켰다. 측정: 반응 정지 직후 ELISA 플레이트를 ELISA Reader에 넣어, 450nm에서 이의 OD값을 측정하였으며, 원 데이터를 보존하였다. 데이터 처리: 원 데이터를 소프트웨어 SoftMax Pro 6.2.1에 입력하여 데이터 처리를 진행하였다. 결과는 표5, 도6에 나타낸 바와 같다(도면에 나타낸 데이터는 최종 산출된 데이터임).
항체 명칭 EC50(nM)
059-1.11.1 2340
059-1.20.1 1190
059-1.30.1 1030
059-1.43.1 850
059-1.51.2 --
059-1.82.1 1030
059-1.100.5 --
양성대조 1190
음성대조 --
결과에 의하면, 후보 항체 059-1.11.1, 059-1.20.1, 059-1.30.1, 059-1.43.1과 059-1.82.1은 모두 비교적 강력한 차단 효능이 있으며, 059-1.51.2와 059-1.100.5는 인간 CD47과 인간 SIRP의 결합을 차단하는 효능이 없음을 나타낸다.
실시예7 세포 표면의 CD47과의 결합에 대한 측정(FACS법)
Jurkat 세포를 배양한 후 수집하여, 2000rpm으로 5min 동안 원심분리하고, PBS로 1회 세척한 후 생존한 세포의 개수를 계산하였으며; 튜브당 2.0Х105의 세포를 첨가하여 2000rpm으로 5min 동안 원심분리하고, 상등액을 제거하였으며, 튜브당 후보 항체의 세포 상등액 100μL를 첨가하고, 양성대조 튜브에는 1ng/mL의 B6H12 항체(상업화된 CD47항체, Abcam으로부터 구입, 제품 번호: ab3283) 100μL를 첨가하며, 음성대조 튜브에는 DMEM배지 100μL를 첨가하여, 실온에서 1시간 동안 반응시켰으며; 2000rpm으로 5min 동안 원심분리하고, PBS로 3회 세척하였으며, 튜브당 4ng/mL Goat Anti-Mouse IgG Fc, FITC 2차 항체 100μL를 첨가하여, 실온 조건하에서 1시간 동안 반응시켰으며; 2000rpm으로 5min 동안 원심분리하고, PBS로 3회 세척하였으며; 튜브당 PBS 300μL를 첨가하여, 유세포분석기 시료 주입 튜브로 옮겨서 기기로 측정하였다. 결과는 표6, 도7에 나타낸 바와 같다.
항체 명칭 MFI
059-1.11.1 6633
059-1.20.1 15315
059-1.30.1 9951
059-1.43.1 18533
059-1.51.2 144
059-1.82.1 9547
059-1.100.5 216
양성대조(B6H12) 13000
음성대조 57
결과에 의하면, 후보 항체와 세포 표면의 CD47은 명확한 결합 활성이 있음을 나타낸다.
실시예8 Jurkat 세포에 대한 CD47 항체 매개 마우스 복강 초대배양 대식세포의 탐식 실험
1. C57 쥐 복강 초대배양 대식세포의 제조
동물을 경추 탈구로 희생시키고, 손으로 쥐 꼬리 부분을 잡고 쥐 전체를 70% 알코올에 3~5초 동안 침지하였다. 동물을 해부대에 놓고, 핀으로 사지를 고정하였으며, 양손으로 핀셋을 들고 피부를 찢어 양측으로 당겨서 복막을 노출시키고, 70% 알코올로 복막벽을 닦은 후, 주사기로 Eagle 용액 10ml를 복강에 주입하는 동시에 양측으로부터 손가락으로 복막벽을 문질러 액체가 복강 내에서 충분히 유동되도록 하였다. 주사바늘로 복막벽을 가볍게 치켜들고, 동물의 몸체가 한쪽으로 약간 치우치게 하여, 복강 내 액체가 주사바늘 아래로 집중되게 한 후, 주사관 내로 흡입되게 하였다. 주사바늘을 조심스럽게 뽑은 후, 액체를 원심분리 튜브에 주입하여 250g, 4℃에서 10분 동안 원심분리하고, 상등액을 제거하였으며, Eagle 배지 10 ml를 첨가하고, 세포 개수를 계산하였다. 3Х105 접착세포/cm2를 얻기 위하여, 접종후의 농도가 2.5Х106/ml가 되도록 접종하여야 한다. 배양 세포를 정제하기 위하여, 기타 백혈구를 제거하고, 접종 수시간 후, 배양액을 제거하였으며, Eagle 용액으로 1~2회 세척한 다음, 다시 새로운 Eagle 배양액을 첨가하여 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 배양하였다.
2. 대식세포의 탐식 실험
형광 영상법으로 실시예5에서 제조한 CD47 항체의 Jurkat 세포에 대한 C57BL 마우스 복강 초대배양 대식세포의 탐식 작용에 대한 영향을 연구하였다. 하루 전 PKH26 염료로 마우스 대식세포를 염색하고(4마이크로몰, 5min), 96웰 플레이트에 2만 세포/웰로 접종하였으며; 다음날, CFSE 염료로 Jurkat 세포를 염색하고(2마이크로몰, 10min), 세척한 후 Jurkat 세포를 무혈청 배지에 재현탁하고, 8만 세포/웰로 대식세포에 접종하였다. Jurkat 세포를 접종하기 2시간 전에 대식세포 중 혈청 함유 배지를 무혈청 배지로 교체하였으며, 각종 항체는 10마이크로그램/ml의 농도로 두가지 혼합 현탁 세포에 첨가하였다. 2시간 배양한 후, 탐식되지 않은 Jurkat 세포를 씻어내고, 형광현미경으로 세포 영상을 형성한 후, 100개 대식세포당 탐식한 Jurkat 세포, 즉, 탐식지수를 계산하여, CD47 항체가 탐식작용을 촉진하는 우열을 정량적으로 분석하였다. 결과는 도8(탐식효과 도면)과 표7(탐식지수)에 나타낸 바와 같다. B6H12(상업화된 CD47 항체, Abcam으로부터 구입, 제품 번호: ab3283)는 문헌에서 보고된 바와 같이 탐식을 촉진하는 작용이 비교적 약하였다. 실시예5에서 선별한 4개의 항체 분자, 특히 059-1.30.1, 059-1.43.1과 059-1.82.1은 모두 양호한 탐식 촉진 작용을 구비한다.
항체 명침 탐식지수
059-1.20.1 43
059-1.30.1 70
059-1.43.1 79
059-1.82.1 74
양성대조(B6H12) 20
음성대조 0
실시예9 CD47 항체의 체외 Jurkat 세포 사멸 유도 실험
대수적으로 성장한 Jurkat 세포를 수집하고, 무혈청 배지로 세척한 다음, 5% FBS-1640으로 단세포 현탁액을 제조하였으며, 세포를 10Х105/ml로 재현탁하고, 5Х105/웰, 즉, 500μl/웰로 24웰 플레이트에 첨가하여 배양하였다. 실험은 CD47 항체를 첨가한 것은(최종 농도 10μl/ml) 50μl/웰로 하고, anti-Fas 양성대조 웰을 설치하며, 항체를 첨가할 필요가 없는 웰은 동일한 부피의 배지로 보충 첨가하는 것으로 설계하였다. 5h 후 세포 현탁액을 1.5ml의 EP 튜브에 수집하여, 500gХ5min으로 원심분리하였다. 상등액을 제거하고, 각 튜브에 PBS 100μl를 첨가하여 세포를 재현탁하여 균일하게 혼합하고, 아넥신-V(Roche Diagnostics)로 4℃에서 빛을 차단하여 30분 동안 염색하였다. PBS로 3회 세척한 후, 각 튜브에 PBS 500μl를 첨가하여 세포를 재현탁하여 균일하게 혼합하고, 유세포분석기에 로딩하기 10~15min 전에 PI(최종 농도 1μg/ml)를 첨가하여 유세포분석기로 아넥신-V 양성과 아넥신-V, PI 이중 양성 세포가 총 세포에서 차지하는 비율, 즉, Jurkat 세포의 사멸율을 측정하였다. 결과는 표8에 나타낸 바와 같다:
항체 명칭 사멸율(%)
059-1.20.1 33
059-1.30.1 48
059-1.43.1 37
059-1.82.1 24
대조 항체(B6H12) 8
음성대조 5
B6H12는 Jurkat 세포의 사멸을 유도하지 않으나, 측정한 4개의 059 항체는 모두 상이한 정도로 Jurkat 세포의 사멸을 유도하였으며, 059-1.30.1의 작용이 가장 강력하였다. 059-1.30.1은 대식세포의 탐식 촉진과 Jurkat 세포 사멸 유도에서 모두 가장 우수한 효과를 나타냈다.이상은 본 발명의 바람직한 실시형태일 뿐이며, 당업계의 통상의 기술자에게 있어서, 본 발명의 원리를 벗어나지 않은 전제하에서 일부 개선과 수정을 진행할 수 있으며, 이러한 개선과 수정도 본 발명의 보호범위에 속하는 것으로 간주되어야 한다.
[염기서열]
SEQUENCE LISTING
<110> CHANGCHUN GENESCIENCE PHARMACEUTICALS CORP.
<120> ANTI-CD47 MONOCLONAL ANTIBODY AND APPLICATION THEREOF
<130> OP170553
<160> 63
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 136
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 1
Met Glu Trp Ser Trp Val Phe Leu Phe Leu Leu Ser Val Ile Ala Gly
1 5 10 15
Val Gln Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg
20 25 30
Pro Gly Ala Ser Val Thr Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe
35 40 45
Thr Asp Tyr Glu Met His Trp Val Lys Gln Thr Pro Val His Gly Leu
50 55 60
Glu Trp Ile Gly Ala Ile Asp Pro Glu Thr Gly Gly Thr Ala Tyr Asn
65 70 75 80
Gln Asn Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser
85 90 95
Thr Ala Tyr Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val
100 105 110
Tyr Tyr Cys Thr Arg Gly Thr Pro Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
115 120 125
Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
130 135
<210> 2
<211> 136
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 2
Met Glu Trp Ser Trp Ile Phe Leu Phe Leu Leu Ser Gly Thr Ala Gly
1 5 10 15
Val His Ser Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys
20 25 30
Pro Gly Ala Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe
35 40 45
Thr Asn Tyr Val Met His Trp Val Lys Gln Lys Pro Gly Gln Gly Leu
50 55 60
Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Thr Asn Tyr Asn
65 70 75 80
Glu Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ser Asp Lys Ser Ser Ser
85 90 95
Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val
100 105 110
Tyr Tyr Cys Ala Lys Gly Gly Trp Phe Ser Met Asp Tyr Trp Gly Gln
115 120 125
Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
130 135
<210> 3
<211> 136
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 3
Met Glu Trp Ser Trp Ile Phe Leu Phe Leu Leu Ser Gly Thr Ala Gly
1 5 10 15
Val His Ser Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys
20 25 30
Pro Gly Ala Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe
35 40 45
Thr Asn Tyr Val Met His Trp Met Lys Gln Lys Pro Gly Gln Gly Leu
50 55 60
Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Asp Thr Lys Tyr Asn
65 70 75 80
Glu Lys Phe Lys Asp Arg Ala Thr Leu Thr Ser Asp Lys Ser Ser Ser
85 90 95
Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val
100 105 110
Tyr Tyr Cys Ala Lys Gly Gly Tyr Tyr Ser Met Asp Tyr Trp Gly Gln
115 120 125
Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
130 135
<210> 4
<211> 136
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 4
Met Glu Trp Ser Trp Val Phe Leu Phe Leu Leu Ser Val Ile Ala Gly
1 5 10 15
Val Gln Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg
20 25 30
Pro Gly Ala Ser Val Thr Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe
35 40 45
Thr Asp Tyr Glu Met His Trp Val Lys Gln Thr Pro Val His Gly Leu
50 55 60
Glu Trp Ile Gly Ala Ile Asp Pro Glu Thr Gly Gly Thr Ala Tyr Asn
65 70 75 80
Gln Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser
85 90 95
Thr Ala Tyr Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val
100 105 110
Tyr Tyr Cys Thr Arg Gly Thr Pro Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
115 120 125
Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
130 135
<210> 5
<211> 136
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 5
Met Glu Trp Ser Trp Ile Phe Leu Phe Leu Leu Ser Gly Thr Ala Gly
1 5 10 15
Val His Ser Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys
20 25 30
Pro Gly Ala Ser Val Arg Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe
35 40 45
Thr Asn Tyr Val Met His Trp Val Lys Gln Lys Pro Gly Gln Gly Leu
50 55 60
Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Thr Lys Tyr Ser
65 70 75 80
Glu Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ser Asp Lys Ser Ser Ile
85 90 95
Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val
100 105 110
Tyr Tyr Cys Ala Lys Gly Gly Leu Phe Thr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln
115 120 125
Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser
130 135
<210> 6
<211> 136
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 6
Met Glu Trp Ser Trp Ile Phe Leu Phe Leu Leu Ser Gly Thr Ala Gly
1 5 10 15
Val His Ser Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys
20 25 30
Pro Gly Ala Ser Val Asn Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe
35 40 45
Thr Asn Tyr Phe Leu His Trp Val Lys Gln Lys Pro Gly Gln Gly Leu
50 55 60
Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Thr Asn Tyr Asn
65 70 75 80
Glu Asn Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ser Asp Lys Ser Ser Ser
85 90 95
Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val
100 105 110
Tyr Tyr Cys Ala Lys Gly Gly Trp Phe Ser Met Asp Tyr Trp Gly Gln
115 120 125
Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
130 135
<210> 7
<211> 136
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 7
Met Glu Trp Ser Trp Val Phe Leu Phe Leu Leu Ser Val Ile Ala Gly
1 5 10 15
Val Gln Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg
20 25 30
Pro Gly Ala Ser Val Thr Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe
35 40 45
Thr Asp Tyr Glu Met His Trp Val Lys Gln Thr Pro Val His Gly Leu
50 55 60
Glu Trp Ile Gly Ala Ile Asp Pro Glu Thr Gly Gly Thr Ala Tyr Asn
65 70 75 80
Gln Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser
85 90 95
Thr Ala Tyr Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val
100 105 110
Tyr Tyr Cys Thr Arg Gly Thr Pro Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
115 120 125
Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
130 135
<210> 8
<211> 131
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 8
Met Lys Leu Pro Val Arg Leu Leu Val Leu Met Phe Trp Ile Pro Ala
1 5 10 15
Ser Ser Ser Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val
20 25 30
Ser Leu Gly Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu
35 40 45
Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro
50 55 60
Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser
65 70 75 80
Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr
85 90 95
Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys
100 105 110
Ser Gln Ser Thr His Val Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu
115 120 125
Glu Ile Lys
130
<210> 9
<211> 130
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 9
Met Lys Leu Pro Val Arg Leu Leu Val Leu Met Phe Trp Ile Pro Ala
1 5 10 15
Ser Ser Ser Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val
20 25 30
Ser Leu Gly Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu
35 40 45
Val His Ser Asn Gly Lys Thr Tyr Leu Gln Trp Tyr Leu Gln Lys Pro
50 55 60
Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser
65 70 75 80
Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr
85 90 95
Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys
100 105 110
Ser Gln Ser Thr His Val Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu
115 120 125
Ile Lys
130
<210> 10
<211> 131
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 10
Met Lys Leu Pro Val Arg Leu Leu Val Leu Met Phe Trp Ile Pro Ala
1 5 10 15
Ser Ser Ser Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val
20 25 30
Ser Leu Gly Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu
35 40 45
Val His Ser Lys Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro
50 55 60
Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser
65 70 75 80
Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr
85 90 95
Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys
100 105 110
Ser Gln Ser Thr His Val Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu
115 120 125
Glu Ile Lys
130
<210> 11
<211> 131
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 11
Met Lys Leu Pro Val Arg Leu Leu Val Leu Met Phe Trp Ile Pro Ala
1 5 10 15
Ser Ser Ser Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val
20 25 30
Ser Leu Gly Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu
35 40 45
Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro
50 55 60
Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser
65 70 75 80
Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr
85 90 95
Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys
100 105 110
Ser Gln Ser Thr His Val Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu
115 120 125
Glu Ile Lys
130
<210> 12
<211> 131
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 12
Met Lys Leu Pro Val Arg Leu Leu Val Leu Met Phe Trp Ile Pro Ala
1 5 10 15
Ser Ser Ser Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val
20 25 30
Ser Leu Gly Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu
35 40 45
Val His Ser Lys Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro
50 55 60
Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Arg Val Ser Asn Arg Phe Ser
65 70 75 80
Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr
85 90 95
Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys
100 105 110
Ser Gln Ser Thr His Val Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu
115 120 125
Glu Ile Lys
130
<210> 13
<211> 130
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 13
Met Lys Leu Pro Val Arg Leu Leu Val Leu Met Phe Trp Ile Pro Ala
1 5 10 15
Ser Ser Ser Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val
20 25 30
Ser Leu Gly Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu
35 40 45
Val His Ser Asn Gly Lys Thr Tyr Leu Gln Trp Tyr Leu Gln Lys Pro
50 55 60
Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser
65 70 75 80
Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr
85 90 95
Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys
100 105 110
Ser Gln Ser Thr His Val Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu
115 120 125
Ile Lys
130
<210> 14
<211> 131
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 14
Met Lys Leu Pro Val Arg Leu Leu Val Leu Met Phe Trp Ile Pro Ala
1 5 10 15
Ser Ser Ser Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val
20 25 30
Ser Leu Gly Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu
35 40 45
Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro
50 55 60
Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser
65 70 75 80
Gly Val Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr
85 90 95
Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys
100 105 110
Ser Gln Ser Thr His Val Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu
115 120 125
Glu Ile Lys
130
<210> 15
<211> 408
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 15
atggaatgga gctgggtctt tctcttcctc ctgtcagtaa ttgcaggtgt ccaatcccag 60
gttcaactgc agcagtctgg ggctgagctg gtgaggcctg gggcttcagt gacgctgtcc 120
tgcaaggctt cgggctacac atttactgac tatgaaatgc actgggtgaa gcagacacct 180
gtgcatggcc tggaatggat tggagctatt gatcctgaaa ctggtggtac tgcctacaat 240
cagaacttca agggcaaggc cacactgact gcagacaaat cctccagcac agcctacatg 300
gagctccgca gcctgacatc tgaggactct gccgtctatt actgtacaag aggtaccccc 360
tatgctatgg actactgggg tcaaggaacc tcagtcaccg tctcctca 408
<210> 16
<211> 408
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 16
atggaatgga gttggatatt tctctttctc ctgtcaggaa ctgcaggtgt ccactctgag 60
gtccagctgc agcagtctgg acctgagctg gtaaagcctg gggcttcagt gaagatgtcc 120
tgcaaggctt ctggatacac attcactaac tatgttatgc actgggtgaa gcagaagcct 180
ggacagggcc ttgagtggat tggatatatt aatccttaca atgatggtac taactacaat 240
gagaagttca aaggcaaggc cacactgact tcagacaaat cctccagcac agcctacatg 300
gagctcagca gcctgacctc tgaggactct gcggtctatt actgtgcaaa aggggggtgg 360
ttctccatgg actactgggg tcaaggaacc tcagtcaccg tctcctca 408
<210> 17
<211> 408
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 17
atggaatgga gttggatatt tctctttctc ctgtcaggaa ctgcaggtgt ccactctgag 60
gtccagctgc agcagtctgg acctgagctg gtaaagcctg gggcttcagt gaagatgtcc 120
tgcaaggctt ctggatacac attcactaac tatgttatgc actggatgaa gcagaagcct 180
gggcagggcc ttgagtggat tggatatatt aatccttaca atgatgatac taaatacaat 240
gagaaattca aagacagggc cacactgact tcagacaaat cctccagcac agcctacatg 300
gagctcagca gcctgacctc tgaggactct gcggtctatt actgtgcaaa ggggggttac 360
tattctatgg actactgggg tcaaggaacc tcagtcaccg tctcctca 408
<210> 18
<211> 408
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 18
atggaatgga gctgggtctt tctcttcctc ctgtcagtaa ttgcaggtgt ccaatcccag 60
gttcaactgc agcagtctgg ggctgagctg gtgaggcctg gggcttcagt gacgctgtcc 120
tgcaaggctt cgggctacac atttactgac tatgaaatgc actgggtgaa gcagacacct 180
gtgcatggcc tggaatggat tggagctatt gatcctgaaa ctggtggtac tgcctacaat 240
cagaagttca agggcaaggc cacactgact gcagacaaat cctccagcac agcctacatg 300
gaactccgca gcctgacatc tgaggactct gccgtctatt actgtacaag aggtaccccc 360
tatgctatgg actactgggg tcaaggaacc tcagtcaccg tctcctca 408
<210> 19
<211> 408
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 19
atggaatgga gttggatatt tctctttctc ctgtcaggaa ctgcaggtgt ccactctgag 60
gtccagctgc agcagtctgg acctgagctg gtaaagcctg gggcttcagt gaggatgtcc 120
tgcaaggctt ctggatacac attcactaac tatgttatgc actgggtgaa gcagaagcct 180
gggcagggac ttgagtggat tggatatatt aatccttaca atgatggtac taagtacagt 240
gagaagttca aaggcaaggc cacactgact tcagacaaat cctccatcac agcctatatg 300
gagctcagca gcctgacctc tgaggactct gcggtctatt actgtgcaaa aggggggctt 360
tttacctttg actactgggg ccaaggcacc actctcacag tctcctca 408
<210> 20
<211> 408
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 20
atggaatgga gttggatatt tctctttctc ctgtcaggaa ctgcaggtgt ccactctgag 60
gtccagctgc agcagtctgg acctgagctg gtaaagcctg gggcttcagt taatatgtcc 120
tgcaaggctt ctggatacac attcactaac tattttttgc actgggtgaa gcagaagcct 180
gggcagggcc ttgagtggat tggatatatt aatccttaca atgatggtac taactacaat 240
gagaacttca aaggcaaggc cactctgact tcagacaaat cctccagcac agcctacatg 300
gagctcagca gcctgacctc tgaggactct gcggtctatt actgtgcaaa aggggggtgg 360
ttctccatgg actactgggg tcaaggaacc tcagtcaccg tctcctca 408
<210> 21
<211> 408
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 21
atggaatgga gctgggtctt tctcttcctc ctgtcagtaa ttgcaggtgt ccaatcccag 60
gttcaactgc agcagtctgg ggctgagctg gtgaggcctg gggcttcagt gacgctgtcc 120
tgcaaggctt cgggctacac atttactgac tatgaaatgc actgggtgaa gcagacacct 180
gtgcatggcc tggaatggat tggagctatt gatcctgaaa ctggtggtac tgcctacaat 240
cagaagttca agggcaaggc cacactgact gcagacaaat cctccagcac agcctacatg 300
gagctccgca gcctgacatc tgaggactct gccgtctatt actgtacaag aggtaccccc 360
tatgctatgg actactgggg tcaaggaacc tcagtcaccg tctcctca 408
<210> 22
<211> 393
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 22
atgaagttgc ctgttaggct gttggtgctg atgttctgga ttcctgcttc cagcagtgat 60
gttgtgatga cccaaactcc actctccctg cctgtcagtc ttggagatca agcctccatc 120
tcttgcagat ctagtcagag ccttgtacac agtaatggaa acacctattt acattggtac 180
ctgcagaagc caggccagtc tccaaagctc ctgatctaca aagtttccaa ccgattttct 240
ggggtcccag acaggttcag tggcagtgga tcagggacag atttcacact caagatcagc 300
agagtggagg ctgaggatct gggagtttat ttctgctctc aaagtacaca tgttccgtgg 360
acgttcggtg gaggcaccaa gctggaaatc aaa 393
<210> 23
<211> 390
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 23
atgaagttgc ctgttaggct gttggtgctg atgttctgga ttcctgcttc cagcagtgat 60
gttgtgatga cccaaactcc actctccctg cctgtcagtc ttggagatca agcctccatc 120
tcttgcagat ctagtcagag ccttgtacac agtaatggaa aaacctattt acagtggtac 180
ctgcagaagc caggccagtc tccaaagctc ctgatctaca aagtttccaa ccgattttct 240
ggggtcccag acaggttcag tggcagtgga tcagggacag atttcacact caagatcagc 300
agagtggagg ctgaggatct gggagtttat ttctgctctc aaagtacaca tgtttacacg 360
ttcggagggg ggaccaagct ggaaataaaa 390
<210> 24
<211> 393
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 24
atgaagttgc ctgttaggct gttggtgctg atgttctgga ttcctgcttc cagcagtgat 60
gttgtgatga cccaaactcc actttctctg cctgtcagtc ttggagatca agcctccatc 120
tcttgcagat ctagtcagag ccttgtacac agtaaaggaa acacctattt acattggtac 180
ctgcagaagc caggccagtc tccaaagctc ctgatctaca aagtttccaa ccgattttct 240
ggggtcccag acaggttcag tggcagtgga tcagggacag atttcacact caagatcagc 300
agagtggagg ctgaggatct gggagtttat ttctgctctc aaagtacaca tgttccattc 360
acgttcggct cggggacaaa gttggaaata aaa 393
<210> 25
<211> 393
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 25
atgaagttgc ctgttaggct gttggtgctg atgttctgga ttcctgcttc cagcagtgat 60
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acgttcggtg gaggcaccaa gctggaaatc aaa 393
<210> 26
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 26
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 27
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<211> 393
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 28
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<210> 29
<211> 379
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 29
Met Trp Pro Leu Val Ala Ala Leu Leu Leu Gly Ser Ala Cys Cys Gly
1 5 10 15
Ser Ala Gln Leu Leu Phe Asn Lys Thr Lys Ser Val Glu Phe Thr Phe
20 25 30
Cys Asn Asp Thr Val Val Ile Pro Cys Phe Val Thr Asn Met Glu Ala
35 40 45
Gln Asn Thr Thr Glu Val Tyr Val Lys Trp Lys Phe Lys Gly Arg Asp
50 55 60
Ile Tyr Thr Phe Asp Gly Ala Leu Asn Lys Ser Thr Val Pro Thr Asp
65 70 75 80
Phe Ser Ser Ala Lys Ile Glu Val Ser Gln Leu Leu Lys Gly Asp Ala
85 90 95
Ser Leu Lys Met Asp Lys Ser Asp Ala Val Ser His Thr Gly Asn Tyr
100 105 110
Thr Cys Glu Val Thr Glu Leu Thr Arg Glu Gly Glu Thr Ile Ile Glu
115 120 125
Leu Lys Tyr Arg Val Val Ser Trp Phe Ser Pro Ser Gly Gly Gly Gly
130 135 140
Ser Ala Ser Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro
145 150 155 160
Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro
165 170 175
Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr
180 185 190
Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn
195 200 205
Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg
210 215 220
Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val
225 230 235 240
Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser
245 250 255
Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys
260 265 270
Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp
275 280 285
Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe
290 295 300
Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu
305 310 315 320
Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe
325 330 335
Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly
340 345 350
Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr
355 360 365
Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
370 375
<210> 30
<211> 152
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 30
Met Trp Pro Leu Val Ala Ala Leu Leu Leu Gly Ser Ala Cys Cys Gly
1 5 10 15
Ser Ala Gln Leu Leu Phe Asn Lys Thr Lys Ser Val Glu Phe Thr Phe
20 25 30
Cys Asn Asp Thr Val Val Ile Pro Cys Phe Val Thr Asn Met Glu Ala
35 40 45
Gln Asn Thr Thr Glu Val Tyr Val Lys Trp Lys Phe Lys Gly Arg Asp
50 55 60
Ile Tyr Thr Phe Asp Gly Ala Leu Asn Lys Ser Thr Val Pro Thr Asp
65 70 75 80
Phe Ser Ser Ala Lys Ile Glu Val Ser Gln Leu Leu Lys Gly Asp Ala
85 90 95
Ser Leu Lys Met Asp Lys Ser Asp Ala Val Ser His Thr Gly Asn Tyr
100 105 110
Thr Cys Glu Val Thr Glu Leu Thr Arg Glu Gly Glu Thr Ile Ile Glu
115 120 125
Leu Lys Tyr Arg Val Val Ser Trp Phe Ser Pro Ser Gly Gly Gly Gly
130 135 140
Ser His His His His His His His
145 150
<210> 31
<211> 379
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 31
Met Trp Pro Leu Val Ala Ala Leu Leu Leu Gly Ser Ala Cys Cys Gly
1 5 10 15
Ser Ala Gln Leu Leu Phe Asn Lys Thr Lys Ser Val Glu Phe Thr Phe
20 25 30
Cys Asn Asp Thr Val Val Ile Pro Cys Phe Val Thr Asn Met Glu Ala
35 40 45
Gln Asn Thr Thr Glu Val Tyr Val Lys Trp Lys Phe Lys Gly Arg Asp
50 55 60
Ile Tyr Thr Phe Asp Gly Ala Leu Asn Lys Ser Thr Ala Pro Ala Asn
65 70 75 80
Phe Ser Ser Ala Lys Ile Glu Val Ser Gln Leu Leu Lys Gly Asp Ala
85 90 95
Ser Leu Lys Met Asp Lys Ser Asp Ala Val Ser His Thr Gly Asn Tyr
100 105 110
Thr Cys Glu Val Thr Glu Leu Thr Arg Glu Gly Glu Thr Ile Ile Glu
115 120 125
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Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro
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195 200 205
Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg
210 215 220
Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val
225 230 235 240
Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser
245 250 255
Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys
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Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp
275 280 285
Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe
290 295 300
Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu
305 310 315 320
Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe
325 330 335
Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly
340 345 350
Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr
355 360 365
Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
370 375
<210> 32
<211> 152
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 32
Met Trp Pro Leu Val Ala Ala Leu Leu Leu Gly Ser Ala Cys Cys Gly
1 5 10 15
Ser Ala Gln Leu Leu Phe Asn Lys Thr Lys Ser Val Glu Phe Thr Phe
20 25 30
Cys Asn Asp Thr Val Val Ile Pro Cys Phe Val Thr Asn Met Glu Ala
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Gln Asn Thr Thr Glu Val Tyr Val Lys Trp Lys Phe Lys Gly Arg Asp
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Ile Tyr Thr Phe Asp Gly Ala Leu Asn Lys Ser Thr Ala Pro Ala Asn
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Phe Ser Ser Ala Lys Ile Glu Val Ser Gln Leu Leu Lys Gly Asp Ala
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Ser Leu Lys Met Asp Lys Ser Asp Ala Val Ser His Thr Gly Asn Tyr
100 105 110
Thr Cys Glu Val Thr Glu Leu Thr Arg Glu Gly Glu Thr Ile Ile Glu
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Leu Lys Tyr Arg Val Val Ser Trp Phe Ser Pro Ser Gly Gly Gly Gly
130 135 140
Ser His His His His His His His
145 150
<210> 33
<211> 1137
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 33
atgtggcccc tggtagcggc gctgttgctg ggctcggcgt gctgcggatc agctcagcta 60
ctatttaata aaacaaaatc tgtagaattc acgttttgta atgacactgt cgtcattcca 120
tgctttgtta ctaatatgga ggcacaaaac actactgaag tatacgtaaa gtggaaattt 180
aaaggaagag atatttacac ctttgatgga gctctaaaca agtccactgt ccccactgac 240
tttagtagtg caaaaattga agtctcacaa ttactaaaag gagatgcctc tttgaagatg 300
gataagagtg atgctgtctc acacacagga aactacactt gtgaagtaac agaattaacc 360
agagaaggtg aaacgatcat cgagctaaaa tatcgtgttg tttcatggtt ttctccatcc 420
ggaggtggag gttccgctag cgagcccaaa tcttgtgaca aaactcacac atgcccaccg 480
tgcccagcac ctgaactcct ggggggaccg tcagtcttcc tcttcccccc aaaacccaag 540
gacaccctca tgatctcccg gacccctgag gtcacatgcg tggtggtgga cgtgagccac 600
gaagaccctg aggtcaagtt caactggtac gtggacggcg tggaggtgca taatgccaag 660
acaaagccgc gggaggagca gtacaacagc acgtaccgtg tggtcagcgt cctcaccgtc 720
ctgcaccagg actggctgaa tggcaaggag tacaagtgca aggtctccaa caaagccctc 780
ccagccccca tcgagaaaac catctccaaa gccaaagggc agccccgaga accacaggtg 840
tacaccctgc ctccatctcg ggatgagctg accaagaacc aggtcagcct gacctgcctg 900
gtcaaaggct tctatcccag cgacatcgcc gtggagtggg agagcaatgg gcagccggag 960
aacaactaca agaccacgcc tcccgtgctg gactccgacg gctccttctt cctctatagc 1020
aagctcaccg tggacaagag caggtggcag caggggaacg tcttctcatg ctccgtgatg 1080
catgaggctc tgcacaacca ctacacgcag aagagcctct ccctgtctcc gggtaaa 1137
<210> 34
<211> 457
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 34
atgtggcccc tggtagcggc gctgttgctg ggctcggcgt gctgcggatc agctcagcta 60
ctatttaata aaacaaaatc tgtagaattc acgttttgta atgacactgt cgtcattcca 120
tgctttgtta ctaatatgga ggcacaaaac actactgaag tatacgtaaa gtggaaattt 180
aaaggaagag atatttacac ctttgatgga gctctaaaca agtccactgt ccccactgac 240
tttagtagtg caaaaattga agtctcacaa ttactaaaag gagatgcctc tttgaagatg 300
gataagagtg atgctgtctc acacacagga aactacactt gtgaagtaac agaattaacc 360
agagaaggtg aaacgatcat cgagctaaaa tatcgtgttg tttcatggtt ttctccatcc 420
ggaggtggtg gatcccatca ccatcaccac catcatt 457
<210> 35
<211> 1137
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 35
atgtggcccc tggtagcggc gctgttgctg ggctcggcgt gctgcggatc agctcaacta 60
ctatttaata aaacaaaatc tgtagaattc acgttctgta atgacactgt cgtcattcca 120
tgctttgtta ctaatatgga ggcacaaaac actaccgaag tatatgtaaa gtggaaattt 180
aaaggaagag atatttacac gtttgatgga gctctaaaca agtccactgc ccccgctaac 240
tttagtagtg caaaaattga agtctcacaa ttactaaaag gagatgcctc tttgaagatg 300
gataagagtg atgctgtctc acacacagga aactacactt gtgaagtaac agaattaacc 360
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ggaggtggag gttccgctag cgagcccaaa tcttgtgaca aaactcacac atgcccaccg 480
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<210> 36
<211> 457
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 36
atgtggcccc tggtagcggc gctgttgctg ggctcggcgt gctgcggatc agctcaacta 60
ctatttaata aaacaaaatc tgtagaattc acgttctgta atgacactgt cgtcattcca 120
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agagaaggtg aaacgatcat tgagctaaaa tatcgtgttg tttcgtggtt ttctccatcc 420
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<210> 37
<211> 444
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 37
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Gln Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn His
20 25 30
Val Ile His Trp Leu Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Tyr Ile Tyr Pro Tyr Asn Asp Gly Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Asp Arg Val Thr Met Thr Ser Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Gly Tyr Tyr Thr Tyr Asp Asp Trp Gly Gln Ala Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu
115 120 125
Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys
130 135 140
Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser
145 150 155 160
Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser
165 170 175
Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser
180 185 190
Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn
195 200 205
Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro
210 215 220
Ser Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe
225 230 235 240
Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val
245 250 255
Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe
260 265 270
Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro
275 280 285
Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr
290 295 300
Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val
305 310 315 320
Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala
325 330 335
Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln
340 345 350
Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly
355 360 365
Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro
370 375 380
Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser
385 390 395 400
Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu
405 410 415
Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His
420 425 430
Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
435 440
<210> 38
<211> 1332
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 38
caggtgcagc tggtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctggggcctc agtgcaggtt 60
tcctgtaagg catctggata caccttcacc aaccatgtta ttcactggct gcgacaggcc 120
cctggacaag ggcttgagtg gatgggatat atttatcctt acaatgatgg tactaagtat 180
aatgagaagt tcaaggacag agtcacgatg acctcagaca cgtccatcag cacagcctac 240
atggagttga gcagtctcag atctgacgac acggccgtct attattgtgc tagagggggt 300
tactatactt acgacgactg gggccaagca accctggtca ccgtctcgag cgctagcacc 360
aagggcccat ccgtcttccc cctggcgccc tgctccagga gcacctccga gagcacagcc 420
gccctgggct gcctggtcaa ggactacttc cccgaaccgg tgacggtgtc gtggaactca 480
ggcgccctga ccagcggcgt gcacaccttc ccggctgtcc tacagtcctc aggactctac 540
tccctcagca gcgtggtgac cgtgccctcc agcagcttgg gcacgaagac ctacacctgc 600
aacgtagatc acaagcccag caacaccaag gtggacaaga gagttgagtc caaatatggt 660
cccccatgcc caccatgccc agcacctgag ttcctggggg gaccatcagt cttcctgttc 720
cccccaaaac ccaaggacac tctcatgatc tcccggaccc ctgaggtcac gtgcgtggtg 780
gtggacgtga gccaggaaga ccccgaggtc cagttcaact ggtacgtgga tggcgtggag 840
gtgcataatg ccaagacaaa gccgcgggag gagcagttca acagcacgta ccgtgtggtc 900
agcgtcctca ccgtcctgca ccaggactgg ctgaacggca aggagtacaa gtgcaaggtc 960
tccaacaaag gcctcccgtc ctccatcgag aaaaccatct ccaaagccaa agggcagccc 1020
cgagagccac aggtgtacac cctgccccca tcccaggagg agatgaccaa gaaccaggtc 1080
agcctgacct gcctggtcaa aggcttctac cccagcgaca tcgccgtgga gtgggagagc 1140
aatgggcagc cggagaacaa ctacaagacc acgcctcccg tgctggactc cgacggctcc 1200
ttcttcctct acagcaggct aaccgtggac aagagcaggt ggcaggaggg gaatgtcttc 1260
tcatgctccg tgatgcatga ggctctgcac aaccactaca cacagaagag cctctccctg 1320
tctctgggta aa 1332
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<211> 219
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 39
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser
20 25 30
Asn Gly Lys Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Asp Asp Val Gly Ile Tyr Tyr Cys Ser Gln Ser
85 90 95
Thr His Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
115 120 125
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
130 135 140
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
145 150 155 160
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
165 170 175
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
180 185 190
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
195 200 205
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 40
Gly Ala Thr Ala Thr Thr Gly Thr Gly Ala Thr Gly Ala Cys Thr Cys
1 5 10 15
Ala Gly Thr Cys Thr Cys Cys Ala Cys Thr Cys Thr Cys Cys Cys Thr
20 25 30
Gly Cys Cys Cys Gly Thr Cys Ala Cys Cys Cys Cys Thr Gly Gly Ala
35 40 45
Gly Ala Gly Cys Cys Gly Gly Cys Cys Thr Cys Cys Ala Thr Cys Thr
50 55 60
Cys Cys Thr Gly Cys Ala Gly Ala Thr Cys Ala Ala Gly Thr Cys Ala
65 70 75 80
Gly Ala Gly Cys Cys Thr Thr Gly Thr Gly Cys Ala Cys Ala Gly Thr
85 90 95
Ala Ala Thr Gly Gly Ala Ala Ala Gly Ala Cys Cys Thr Ala Thr Thr
100 105 110
Thr Ala Cys Ala Thr Thr Gly Gly Thr Ala Thr Cys Thr Gly Cys Ala
115 120 125
Gly Ala Ala Gly Cys Cys Ala Gly Gly Cys Cys Ala Gly Thr Cys Thr
130 135 140
Cys Cys Ala Ala Gly Ala Cys Thr Cys Cys Thr Gly Ala Thr Cys Thr
145 150 155 160
Ala Cys Ala Ala Ala Gly Thr Thr Thr Cys Cys Ala Ala Cys Cys Gly
165 170 175
Ala Thr Thr Thr Thr Cys Thr Gly Gly Thr Gly Thr Cys Cys Cys Ala
180 185 190
Gly Ala Cys Ala Gly Ala Thr Thr Cys Ala Gly Cys Gly Gly Cys Ala
195 200 205
Gly Thr Gly Gly Gly Thr Cys Ala Gly Gly Cys Ala Cys Thr Gly Ala
210 215 220
Thr Thr Thr Cys Ala Cys Ala Cys Thr Gly Ala Ala Ala Ala Thr Cys
225 230 235 240
Ala Gly Cys Ala Gly Gly Gly Thr Gly Gly Ala Gly Gly Cys Thr Gly
245 250 255
Ala Thr Gly Ala Thr Gly Thr Thr Gly Gly Ala Ala Thr Thr Thr Ala
260 265 270
Thr Thr Ala Cys Thr Gly Cys Thr Cys Thr Cys Ala Ala Ala Gly Thr
275 280 285
Ala Cys Ala Cys Ala Thr Gly Thr Thr Cys Cys Gly Thr Ala Cys Ala
290 295 300
Cys Gly Thr Thr Thr Gly Gly Cys Cys Ala Gly Gly Gly Gly Ala Cys
305 310 315 320
Cys Ala Ala Gly Cys Thr Gly Gly Ala Gly Ala Thr Cys Ala Ala Ala
325 330 335
Cys Gly Gly Ala Cys Cys Gly Thr Gly Gly Cys Gly Gly Cys Gly Cys
340 345 350
Cys Ala Thr Cys Thr Gly Thr Cys Thr Thr Cys Ala Thr Cys Thr Thr
355 360 365
Cys Cys Cys Gly Cys Cys Ala Thr Cys Thr Gly Ala Thr Gly Ala Gly
370 375 380
Cys Ala Gly Thr Thr Gly Ala Ala Ala Thr Cys Thr Gly Gly Thr Ala
385 390 395 400
Cys Cys Gly Cys Thr Ala Gly Cys Gly Thr Thr Gly Thr Gly Thr Gly
405 410 415
Cys Cys Thr Gly Cys Thr Gly Ala Ala Thr Ala Ala Cys Thr Thr Cys
420 425 430
Thr Ala Thr Cys Cys Cys Ala Gly Ala Gly Ala Gly Gly Cys Cys Ala
435 440 445
Ala Ala Gly Thr Ala Cys Ala Gly Thr Gly Gly Ala Ala Gly Gly Thr
450 455 460
Gly Gly Ala Thr Ala Ala Cys Gly Cys Cys Cys Thr Cys Cys Ala Ala
465 470 475 480
Thr Cys Gly Gly Gly Thr Ala Ala Cys Thr Cys Cys Cys Ala Gly Gly
485 490 495
Ala Gly Ala Gly Thr Gly Thr Cys Ala Cys Ala Gly Ala Gly Cys Ala
500 505 510
Gly Gly Ala Cys Ala Gly Cys Ala Ala Gly Gly Ala Cys Ala Gly Cys
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Ala Cys Cys Thr Ala Cys Ala Gly Cys Cys Thr Cys Ala Gly Cys Ala
530 535 540
Gly Cys Ala Cys Cys Cys Thr Gly Ala Cys Gly Cys Thr Gly Ala Gly
545 550 555 560
Cys Ala Ala Ala Gly Cys Ala Gly Ala Cys Thr Ala Cys Gly Ala Gly
565 570 575
Ala Ala Ala Cys Ala Cys Ala Ala Ala Gly Thr Cys Thr Ala Cys Gly
580 585 590
Cys Cys Thr Gly Cys Gly Ala Ala Gly Thr Cys Ala Cys Cys Cys Ala
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Thr Cys Ala Gly Gly Gly Cys Cys Thr Gly Ala Gly Cys Thr Cys Gly
610 615 620
Cys Cys Cys Gly Thr Cys Ala Cys Ala Ala Ala Gly Ala Gly Cys Thr
625 630 635 640
Thr Cys Ala Ala Cys Ala Gly Gly Gly Gly Ala Gly Ala Gly Thr Gly
645 650 655
Thr
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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ctcagggaar tarccyttga c 21
<210> 42
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 42
tcactgccat caatcttcca c 21
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 43
tgtaaaacga cggccagt 18
<210> 44
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 44
caggaaacag ctatgacc 18
<210> 45
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> MOD_RES
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(17)
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<400> 46
Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Thr Xaa Tyr Xaa Glu Lys Phe Lys
1 5 10 15
Gly
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<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(8)
<223> Xaa（3）=Trp、Lys、Thr、Leu；Xaa（4）=Ser、Thr、Lys；Xaa（5）=Met
、Phe、Gly
<400> 47
Gly Gly Xaa Phe Xaa Xaa Asp Tyr
1 5
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<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(5)
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<400> 48
Asp Tyr Xaa Met His
1 5
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(17)
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1 5 10 15
Gly
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<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(8)
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Gly Thr Pro Xaa Ala Met Asp Tyr
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(5)
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<400> 51
Asn Tyr Xaa Xaa His
1 5
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<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(17)
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<400> 52
Tyr Ile Asn Xaa Tyr Asn Asp Gly Thr Asn Tyr Asn Glu Xaa Phe Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 53
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(10)
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<400> 53
Ala Xaa Gly Gly Trp Phe Xaa Met Asp Tyr
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(16)
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His、Cys、Lys
<400> 54
Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser Xaa Gly Xaa Thr Tyr Leu Xaa
1 5 10 15
<210> 55
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(7)
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<400> 55
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<210> 56
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(8)
<223> Xaa（7）=Tyr、Pro、Phe、Asp
<400> 56
Ser Gln Ser Thr His Val Xaa Thr
1 5
<210> 57
<211> 16
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(16)
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<400> 57
Arg Ser Ser Xaa Ser Leu Val His Ser Asn Xaa Asn Thr Tyr Leu His
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<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(7)
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Lys Val Ser Asn Xaa Phe Ser
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<213> Artificial Sequence
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(9)
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Ser Gln Ser Xaa His Val Pro Trp Thr
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(16)
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<213> Artificial Sequence
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(7)
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<213> Artificial Sequence
<220>
<221> MOD_RES
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Ser Xaa Gln Ser Thr His Val Xaa Tyr Thr
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<110> CHANGCHUN GENESCIENCE PHARMACEUTICALS CORP. <120> ANTI-CD47 MONOCLONAL ANTIBODY AND APPLICATION THEREOF <130> PI18-E503 <160> 62 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 136 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 1 Met Glu Trp Ser Trp Val Phe Leu Phe Leu Leu Ser Val Ile Ala Gly 1 5 10 15 Val Gln Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg 20 25 30 Pro Gly Ala Ser Val Thr Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe 35 40 45 Thr Asp Tyr Glu Met His Trp Val Lys Gln Thr Pro Val His Gly Leu 50 55 60 Glu Trp Ile Gly Ala Ile Asp Pro Glu Thr Gly Gly Thr Ala Tyr Asn 65 70 75 80 Gln Asn Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser 85 90 95 Thr Ala Tyr Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val 100 105 110 Tyr Tyr Cys Thr Arg Gly Thr Pro Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln 115 120 125 Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser 130 135 <210> 2 <211> 136 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 2 Met Glu Trp Ser Trp 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gtgaagtaac agaattaacc 360 agagaaggtg aaacgatcat cgagctaaaa tatcgtgttg tttcatggtt ttctccatcc 420 ggaggtggag gttccgctag cgagcccaaa tcttgtgaca aaactcacac atgcccaccg 480 tgcccagcac ctgaactcct ggggggaccg tcagtcttcc tcttcccccc aaaacccaag 540 gacaccctca tgatctcccg gacccctgag gtcacatgcg tggtggtgga cgtgagccac 600 gaagaccctg aggtcaagtt caactggtac gtggacggcg tggaggtgca taatgccaag 660 acaaagccgc gggaggagca gtacaacagc acgtaccgtg tggtcagcgt cctcaccgtc 720 ctgcaccagg actggctgaa tggcaaggag tacaagtgca aggtctccaa caaagccctc 780 ccagccccca tcgagaaaac catctccaaa gccaaagggc agccccgaga accacaggtg 840 tacaccctgc ctccatctcg ggatgagctg accaagaacc aggtcagcct gacctgcctg 900 gtcaaaggct tctatcccag cgacatcgcc gtggagtggg agagcaatgg gcagccggag 960 aacaactaca agaccacgcc tcccgtgctg gactccgacg gctccttctt cctctatagc 1020 aagctcaccg tggacaagag caggtggcag caggggaacg tcttctcatg ctccgtgatg 1080 catgaggctc tgcacaacca ctacacgcag aagagcctct ccctgtctcc gggtaaa 1137 <210> 34 <211> 457 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> 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tttgaagatg 300 gataagagtg atgctgtctc acacacagga aactacactt gtgaagtaac agaattaacc 360 agagaaggtg aaacgatcat tgagctaaaa tatcgtgttg tttcgtggtt ttctccatcc 420 ggaggtggag gttccgctag cgagcccaaa tcttgtgaca aaactcacac atgcccaccg 480 tgcccagcac ctgaactcct ggggggaccg tcagtcttcc tcttcccccc aaaacccaag 540 gacaccctca tgatctcccg gacccctgag gtcacatgcg tggtggtgga cgtgagccac 600 gaagaccctg aggtcaagtt caactggtac gtggacggcg tggaggtgca taatgccaag 660 acaaagccgc gggaggagca gtacaacagc acgtaccgtg tggtcagcgt cctcaccgtc 720 ctgcaccagg actggctgaa tggcaaggag tacaagtgca aggtctccaa caaagccctc 780 ccagccccca tcgagaaaac catctccaaa gccaaagggc agccccgaga accacaggtg 840 tacaccctgc ctccatctcg ggatgagctg accaagaacc aggtcagcct gacctgcctg 900 gtcaaaggct tctatcccag cgacatcgcc gtggagtggg agagcaatgg gcagccggag 960 aacaactaca agaccacgcc tcccgtgctg gactccgacg gctccttctt cctctatagc 1020 aagctcaccg tggacaagag caggtggcag caggggaacg tcttctcatg ctccgtgatg 1080 catgaggctc tgcacaacca ctacacgcag aagagcctct ccctgtctcc gggtaaa 1137 <210> 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third Xaa is Trp or Lys or Thr or Leu and the fourth Xaa is Ser or Thr or Lys and the fivth Xaa is Met or Phe or Gly <400> 47 Gly Gly Xaa Phe Xaa Xaa Asp Tyr 1 5 <210> 48 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(5) <223> the third Xaa is Glu or Gly or Thr <400> 48 Asp Tyr Xaa Met His 1 5 <210> 49 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(16) <223> the fivth Xaa is Glu or Tyr or Lys and the eighth is Gly or Asn or Pro and the thirteenth Xaa is Glu or Asn or Gly or Ser <400> 49 Ala Ile Asp Pro Xaa Thr Gly Xaa Thr Ala Tyr Asn Xaa Lys Phe Lys 1 5 10 15 Gly <210> 50 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(8) <223> the fourth Xaa is Tyr or Lys or Leu <400> 50 Gly Thr Pro Xaa Ala Met Asp Tyr 1 5 <210> 51 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(5) <223> the third Xaa is Phe or Asn or Tys and the fourth Xaa is Leu or Asn or Gly <400> 51 Asn Tyr Xaa Xaa His 1 5 <210> 52 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(17) <223> the fourth Xaa is Pro or Gly or Ser or Cys or Lys and the fourteenth Xaa is Asn or Lys <400> 52 Tyr Ile Asn Xaa Tyr Asn Asp Gly Thr Asn Tyr Asn Glu Xaa Phe Lys 1 5 10 15 Gly <210> 53 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(10) <223> the second Xaa is Lys or Trp or Phe and the seventh Xaa is Ser or Asp or Tyr <400> 53 Ala Xaa Gly Gly Trp Phe Xaa Met Asp Tyr 1 5 10 <210> 54 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(16) <223> the tenth Xaa is Asn or Lys or Gly and the twelveth Xaa is Lys or Gly or Asn and the sixteenth Xaa is Glu or His or Cys or Lys <400> 54 Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser Xaa Gly Xaa Thr Tyr Leu Xaa 1 5 10 15 <210> 55 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(7) <223> the Xaa is Lys or Arg <400> 55 Xaa Val Ser Asn Arg Phe Ser 1 5 <210> 56 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(8) <223> the seventh Xaa is Tyr or Pro or Phe or Asp <400> 56 Ser Gln Ser Thr His Val Xaa Thr 1 5 <210> 57 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(16) <223> the fourth Xaa is Tyr or Pro or Phe or Asp and the eleventh Xaa is Gly or Lys or Asn or Ser <400> 57 Arg Ser Ser Xaa Ser Leu Val His Ser Asn Xaa Asn Thr Tyr Leu His 1 5 10 15 <210> 58 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(7) <223> the fivth Xaa is Arg or Gly or Ser or Lys <400> 58 Lys Val Ser Asn Xaa Phe Ser 1 5 <210> 59 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(9) <223> the fourth Xaa is Thr or Lys <400> 59 Ser Gln Ser Xaa His Val Pro Trp Thr 1 5 <210> 60 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(16) <223> the sixth Xaa is Leu or Arg and the fourteenth Xaa is Tyr or Lys or Leu or Gly <400> 60 Arg Ser Ser Gln Ser Xaa Val His Ser Asn Gly Lys Thr Xaa Leu Gln 1 5 10 15 <210> 61 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(7) <223> the second Xaa is Val or Asn or Lys or Ser <400> 61 Lys Xaa Ser Asn Arg Phe Ser 1 5 <210> 62 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(10) <223> the second Xaa is Gln or Cys and the seventh Xaa is Tys or Pro or Trp or Asp <400> 62 Ser Xaa Gln Ser Thr His Val Xaa Tyr Thr 1 5 10

Claims (28)

  1. 이하의 중쇄 가변영역과 경쇄 가변영역을 갖는 것을 특징으로 하는 항 CD47 단일클론항체:
    (I) 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변영역 및 서열번호 9로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변영역;
    (II) 서열번호 4로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변영역 및 서열번호 11로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변영역;
    (III) 서열번호 5로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변영역 및 서열번호 12로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변영역; 또는
    (IV) 서열번호 6으로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변영역 및 서열번호 13으로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변영역.
  2. 삭제
  3. 제1항에 있어서,
    상기 중쇄 가변영역의 초가변영역은 HVR-H1, HVR-H2, HVR-H3이며;
    상기 서열번호 2의 초가변영역 HVR-H1 서열은 서열번호 45로 표시되며; HVR-H2 서열은 서열번호 46으로 표시되며; HVR-H3 서열은 서열번호 47로 표시되며;
    상기 서열번호 5의 초가변영역 HVR-H1 서열은 서열번호 48로 표시되며; HVR-H2 서열은 서열번호 49로 표시되며; HVR-H3 서열은 서열번호 50으로 표시되며;
    상기 서열번호 6의 초가변영역 HVR-H1 서열은 서열번호 51로 표시되며; HVR-H2 서열은 서열번호 52로 표시되며; HVR-H3 서열은 서열번호 53으로 표시되며;
    상기 경쇄 가변영역의 초가변영역은 HVR-L1, HVR-L2, HVR-L3이며;
    상기 서열번호 9의 초가변영역 HVR-L1 서열은 서열번호 54로 표시되며; HVR-L2 서열은 서열번호 55로 표시되며; HVR-L3 서열은 서열번호 56으로 표시되며;
    상기 서열번호 12의 초가변영역 HVR-L1 서열은 서열번호 57로 표시되며; HVR-L2 서열은 서열번호 58로 표시되며; HVR-L3 서열은 서열번호 59로 표시되며;
    상기 서열번호 13의 초가변영역 HVR-L1 서열은 서열번호 60으로 표시되며; HVR-L2 서열은 서열번호 61로 표시되며; HVR-L3 서열은 서열번호 62로 표시되는 것을 특징으로 하는 항 CD47 단일클론항체.
  4. 삭제
  5. 제1항 또는 제3항에 있어서,
    상기 중쇄의 유형은 IgG1, IgG3 또는 IgM이며; 상기 경쇄의 유형은 κ인 것을 특징으로 하는 항 CD47 단일클론항체.
  6. 제1항 또는 제3항의 항 CD47 단일클론항체를 코딩하는 뉴클레오티드.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 뉴클레오티드는
    (I) 서열번호 16, 18, 19 및 20으로 표시되는 중쇄 가변영역의 뉴클레오티드 서열; 서열번호 23, 25, 26 및 27로 표시되는 경쇄 가변영역의 뉴클레오티드 서열; 또는
    (II) 서열번호 16, 18, 19 및 20으로 표시되는 중쇄 가변영역의 뉴클레오티드 서열의 상보적 서열; 서열번호 23, 25, 26 및 27로 표시되는 경쇄 가변영역의 뉴클레오티드 서열의 상보적 서열; 또는
    (III) 상기 (I) 또는 (II)의 뉴클레오티드 서열과 동일한 단백질을 코딩하나, 유전 암호의 퇴보로 인해 (I) 또는 (II)의 뉴클레오티드 서열과 상이한 서열; 또는
    (IV) 상기 (I) 또는 (II) 또는 (III)의 서열과 적어도 80%의 상동성을 갖는 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 뉴클레오티드.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 (I) 또는 (II) 또는 (III) 또는 (IV)의 뉴클레오티드 서열은 하나 또는 복수개의 뉴클레오티드의 치환, 결실 또는 첨가에 의하여 얻어진 것을 특징으로 하는 뉴클레오티드.
  9. 제8항에 있어서,
    상기 복수개는 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 21개, 22개, 23개, 24개, 25개, 26개, 27개, 28개, 29개, 30개, 31개 또는 32개인 것을 특징으로 하는 뉴클레오티드.
  10. 제6항의 뉴클레오티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 발현 벡터.
  11. 제10항의 발현 벡터로 형질전환된 것을 특징으로 하는 숙주세포.
  12. 삭제
  13. 제1항 또는 제3항의 항 CD47 단일클론항체를 생성하는 하이브리도마 세포주.
  14. 단계1: 서열번호 29~32 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열을 가지는 항원으로 마우스를 면역시킨 후, 마우스의 비장세포를 얻는 단계;
    단계2: 상기 비장세포와 골수종세포를 융합시키고, CD47과 결합할 수 있는 하이브리도마 세포주를 선별하여 체외 배양하여 항 CD47 단일클론항체를 제조하는 단계; 를 포함하는 것을 특징으로 하는 제1항 또는 제3항의 항 CD47 단일클론항체의 제조방법.
  15. 제1항의 항 CD47 단일클론항체를 화학적 마커와 바이오마커를 거쳐 제조한 결합체.
  16. 제15항에 있어서,
    상기 화학적 마커는 동위원소, 면역독소 또는 화학약물이며, 상기 바이오마커는 비오틴, 아비딘 또는 효소표지인 것을 특징으로 하는 결합체.
  17. 제1항 또는 제3항의 항 CD47 단일클론항체 또는 제15항 내지 제16항 중 어느 한 항의 결합체와 고체 매질 또는 반고체 매질의 커플링에 의하여 제조한 접합체.
  18. 삭제
  19. 제1항 또는 제3항의 항 CD47 단일클론항체 또는 제15항 내지 제16항 중 어느 한 항의 결합체를 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.
  20. 삭제
  21. 삭제
  22. 삭제
  23. 삭제
  24. 삭제
  25. 삭제
  26. 제1항 또는 제3항의 항 CD47 단일클론항체 또는 제15항 내지 제16항 중 어느 한 항의 결합체를 포함하는 것을 특징으로 하는 백혈병, 림프종, 유방암, 폐암, 위암, 장암, 식도암, 난소암, 자궁경부암, 신장암, 방광암, 췌장암, 신경교종 또는 흑색종의 예방 및 치료를 위한 약물.
  27. 삭제
  28. 삭제
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