RU2664862C2 - Рекомбинантный дрожжевой трансформант и способ получения с его использованием Fc-фрагмента иммуноглобулина - Google Patents

Рекомбинантный дрожжевой трансформант и способ получения с его использованием Fc-фрагмента иммуноглобулина Download PDF

Info

Publication number
RU2664862C2
RU2664862C2 RU2015133452A RU2015133452A RU2664862C2 RU 2664862 C2 RU2664862 C2 RU 2664862C2 RU 2015133452 A RU2015133452 A RU 2015133452A RU 2015133452 A RU2015133452 A RU 2015133452A RU 2664862 C2 RU2664862 C2 RU 2664862C2
Authority
RU
Russia
Prior art keywords
fragment
immunoglobulin
transformant
pichia
igg4
Prior art date
Application number
RU2015133452A
Other languages
English (en)
Other versions
RU2015133452A (ru
Inventor
Джин-Сун КИМ
Йонг Хо ХУХ
Еух Лим Ох
Мин Юнг Ким
Сунг Юб ДЖУНГ
Се Чан КВОН
Original Assignee
Ханми Фарм. Ко., Лтд.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Ханми Фарм. Ко., Лтд. filed Critical Ханми Фарм. Ко., Лтд.
Publication of RU2015133452A publication Critical patent/RU2015133452A/ru
Application granted granted Critical
Publication of RU2664862C2 publication Critical patent/RU2664862C2/ru

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/14—Fungi; Culture media therefor
    • C12N1/16—Yeasts; Culture media therefor
    • C12N1/18—Baker's yeast; Brewer's yeast
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
    • C12N15/81—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts
    • C12N15/815—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts for yeasts other than Saccharomyces
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
    • C12N15/81—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/10—Immunoglobulins specific features characterized by their source of isolation or production
    • C07K2317/14—Specific host cells or culture conditions, e.g. components, pH or temperature
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

Группа изобретений относится к биоинженерии и биотехнологии. Предложены трансформант дрожжей Pichia sp. и способ получения Fc-фрагмента IgG4 человека. Трансформант модифицирован путем введения экспрессионного вектора, содержащего полинуклеотид, кодирующий Fc-фрагмент IgG4 человека, в дрожжи Pichia sp., причем экспрессионный вектор представляет собой рРIС9К-IgG4Fc, представленный при помощи рестрикционной карты на фиг. 1, или рРIС9К-mPSCFc, представленный при помощи рестрикционной карты на фиг. 2. Для получения Fc-фрагмента IgG4 осуществляют культивирование указанного трансформанта и выделение Fc-фрагмента иммуноглобулина из культуры. Изобретения позволяют получать Fc-фрагмент IgG4 человека с использованием простого способа очистки, не требующего дополнительного процесса рефолдинга при выделении белка и дополнительных аминокислотных остатков на N-конце. 2 н. и 5 з.п. ф-лы, 3 ил., 3 пр.

Description

Область изобретения
Изобретение относится к рекомбинантному дрожжевому трансформанту и к способу получения Fc-фрагмента иммуноглобулина с его использованием. Более конкретно настоящее изобретение относится к трансформанту, полученному путем введения в дрожжи Pichia sp. экспрессионного вектора, содержащего полинуклеотид, кодирующий Fc-фрагмент иммуноглобулина человека, к способу получения Fc-фрагмента иммуноглобулина, включающему культивирование трансформанта и выделение Fc-фрагмента иммуноглобулина из культуры, и к Fc-фрагменту иммуноглобулина, полученному описанным выше способом, для применения в качестве носителя лекарственного средства.
Предшествующий уровень техники
Благодаря развитию биоинженерии и биотехнологии были разработаны многие биологически активные полипептиды (белки) и пептидные лекарственные средства в качестве возможных способ лечения различных заболеваний. Однако из-за их низкой стабильности такие полипептиды или пептидные лекарственные средства легко денатурируют и, следовательно, в высокой степени подвержены почечному или печеночному клиренсу. Соответственно белковые лекарственные средства, содержащие полипептиды в качестве активных лекарственных ингредиентов, страдают недостатком, связанным с необходимостью их частого введением пациентам для поддержания подходящих сывороточных уровней и титров. Таким образом, при разработке белковых лекарственных средств очень важно обеспечить возможность их поддержания в организме на нужном уровне без частого введения.
Для решения этих проблем огромные усилия были направлены на повышение сывороточной стабильности белковых лекарственных средств и поддержание высокого уровня концентрации лекарственного средства в крови в течение пролонгированного периода времени для максимизации фармацевтической эффективности лекарственных средств, и с этой целью были предприняты попытки улучшенной модификации белковых препаратов, слияния с другими белками или связывания с полимером. В последние годы один из наиболее предпочтительных способов был сфокусирован на слиянии иммуноглобулинов с белками.
Были предприняты многочисленные попытки повышения стабильности белковых лекарственных средств путем использования иммуноглобулинов и их фрагментов, как описано в патенте US 5045312, где гормон роста человека конъюгирован с бычьим сывороточным альбумином или иммуноглобулином мыши при помощи сшивающего агента. Эти конъюгаты обладают повышенной активностью по сравнению с немодифицированным гормоном роста. Другие различные слитые белки также получают путем их экспрессии в млекопитающих после связывания Fc-фрагмента иммуноглобулина с интерфероном (патентная публикация Кореи 10-2003-0009464), рецептором интерлейкина-4, рецептором интерлейкина-7 или эритропоэтином (патент Кореи 10-249572). В патентной публикации РСТ WO 01/03737 раскрыт слитый белок, в котором цитокин или фактор роста связан посредством олигопептидного линкера с Fc-фрагментом иммуноглобулина. Также в патенте US 5116964 раскрыт белок, слитый с амино- или карбокси-концом Fc-фрагмента иммуноглобулина с использованием метода генетической рекомбинации. В патенте US 5349053 раскрыт слитый белок, в котором интерлейкин-2 (IL-2) связан с Fc-фрагментом иммуноглобулина посредством пептидной связи.
Раскрыты многие другие белки, слитые с Fc, сконструированные с использованием методик генетической рекомбинации, примеры которых включают слитый белок из Fc-фрагмента иммуноглобулина с интерфероном-бета или его производным (патентная публикация РСТ WO 00/23472) и Fc-фрагмента иммуноглобулина с рецептором IL-5 (интерлейкин-5) (патент US 5712121). Кроме того, Fc-фрагмент иммуноглобулина используют в качестве носителя, а не слитого белка, как раскрыто в патенте US 7736653.
Продуцирование иммуноглобулинов или Fc-фрагментов иммуноглобулинов осуществляли преимущественно в Е. coli. Американской фирмой Amgen Inc. в патенте US номер 6,660,843 и в патентных публикациях US 2004-0044188 и 2004-0053845 раскрыто производное Fc lgG1 человека, имеющее аминокислотные делеции первых пяти аминокислотных остатков шарнирной области, слитое с амино- или карбокси-концом терапевтического белка или пептида, имитирующего терапевтический белок, и его продуцирование с использованием хозяина Е. coli. Однако этот слитый белок, не имеющий сигнальной последовательности, экспрессируется в виде телец включения и, следовательно, должен подвергаться дополнительному процессу рефолдинга. Этот процесс рефолдинга белка снижает выходы и особенно при нахождении белка в форме гомодимера или гетеродимера значительно снижается продуцирование димера. Кроме того, при экспрессии в Е. coli белка, не имеющего сигнальной последовательности, к N-концу продукта экспрессии присоединяется остаток метионина из-за особенности системы экспрессии белков в Е. coli. Упомянутые выше продукты экспрессии Amgen Inc. имеют N-концевой остаток метионина, что может индуцировать иммунные ответы при многократном или избыточном введении в организм. Кроме того, поскольку эти слитые молекулы экспрессируются в форме слитого белка в Е. coli в результате связывания гена, кодирующего терапевтический белок, с геном Fc, их трудно экспрессировать в Е. coli, и терапевтический белок трудно продуцировать в Е. coli, если его экспрессия в Е. coli в слитой форме приводит к значительному снижению или потере активности. Кроме того, поскольку слияние двух молекул создает в участке соединения между двумя белками аномальную аминокислотную последовательность, не встречающуюся в природе, слитый белок потенциально может распознаваться иммунной системой как чужеродное вещество и, следовательно, индуцировать иммунные ответы.
Как описано выше, преимуществом использования Е. coli является то, что терапевтически эффективные белки могут экспрессироваться в агликозилированных формах с высоким выходом благодаря высокой скорости роста Е. coli и объединенной технологии ферментации и биоинженерии, а недостатком является то, что рекомбинантные белки, в отличие от нативных белков, содержат метионин в качестве первого аминокислотного остатка, и для удаления пирогенов (эндотоксинов), происходящих из Е. coli, требуется сложный процесс очистки и рефолдинг белка.
С другой стороны, использование животных клеток предпочтительно обеспечивает возможность продуцирования слитых белков в виде гликозилированных белков, схожих с нативными формами иммуноглобулинов, но имеет недостаток, состоящий в высоких затратах на получение и высокой склонности к заражению вирусами или белками животного происхождения. Таким образом, существует возрастающая потребность в решениях вышеописанных проблем. Рекомендована стратегия использования дрожжей в качестве клеток-хозяев, обладающих преимуществами как Е. coli, так и клеток животных.
Представителем дрожжей, используемым для продуцирования белка, являются Saccharomyces cerevisiae. Кроме безопасности для человеческого организма, эукариот Saccharomyces cerevisiae прост для генетического манипулирования и для культивирования в крупном масштабе. Кроме того, для эукариот были разработаны различные экспрессионные системы. При продуцировании белков, происходящих из клеток высших организмов, таких как белки человека, с использованием рекомбинантного метода этот микроорганизм, кроме того, продуцирует белки, обладающие способностью секретироваться вне клеток и подвергаться посттрансляционной модификации, например посредством гликозилирования. Кроме того, рекомбинантный белок дрожжей подвергается фолдингу, а также образованию дисульфидной связи, гликозилированию в процессе внеклеточной секреции, направляемой сигналом секреции, и, таким образом, превращается в полностью биологически активную форму. Дрожжи также являются экономически выгодными, поскольку для них не требуется лизис клеток и рефолдинг белка, являющиеся низкоэффективными. Однако, как было показано, проблема секреции белка Saccharomyces cerevisiae состоит в значительных колебаниях скорости секреции в зависимости от вида белка человека. Часто очень ценные белки, предназначенные для применения в качестве лекарственных средств для человека, трудно экспрессировать и секретировать в Saccharomyces cerevisiae (патент Кореи 10-0798894).
Сущность изобретения
Техническая задача
В результате проведения приведшего к настоящему изобретению интенсивного и тщательного исследования использования дрожжей при продуцировании белков для лекарственных средств для человека, проведенного авторами настоящего изобретения, было обнаружено, что дрожжи Pichia sp., представляющие собой вид метилотрофных дрожжей, можно использовать для продуцирования секреторного Fc-фрагмента иммуноглобулина, полезного в качестве носителя лекарственного средства, с высоким уровнем экспрессии, без дополнительного процессе рефолдинга и без N-концевой модификации дополнительной аминокислотой и что секреторный Fc-фрагмент иммуноглобулина может быть очищен с использованием простого способа при минимальной нагрузкой эндотоксинов или чужеродных патогенов животного происхождения.
Техническое решение
Объектом настоящего изобретения является предложение трансформанта, полученного путем введения экспрессионного вектора, содержащего полинуклеотид, кодирующий Fc-фрагмент иммуноглобулина человека, в дрожжи Pichia sp.
Другим объектом настоящего изобретения является предложение способа продуцирования Fc-фрагмента иммуноглобулина, включающего культивирование трансформанта и выделение Fc-фрагмента иммуноглобулина из культуры.
Следующим объектом настоящего изобретения является предложение Fc-фрагмента иммуноглобулина, получаемого способом, применяемого в качестве носителя лекарственного средства.
Полезные эффекты изобретения
Рекомбинантный трансформант по настоящему изобретению позволяет преодолеть проблемы, связанные с применением Е. coli или клеток животных в качестве клеток-хозяев при продуцировании Fc-фрагмента иммуноглобулина, полезен в качестве носителя лекарственного средства и может найти применения при эффективном и экономичном получении лекарственных средств.
Краткое описание графических материалов
Фиг. 1 представляет собой схематическое изображение, иллюстрирующее способы конструирования рекомбинантного экспрессионного вектора pPIC9K-lgG4Fc.
Фиг.2 представляет собой схематическое изображение, иллюстрирующее способы конструирования рекомбинантного экспрессионного вектора pPIC9K-mPSCFc.
Фиг. 3 представляет собой ПЦР-изображение, показывающее включение представляющих интерес генов в геномную ДНК многокопийных клонов, отбираемых с 3 мг/мл и 4 мг/мл генетицина.
Лучший способ осуществления изобретения
В одном воплощении данного аспекта изобретение относится к трансформанту, модифицированному путем введения экспрессионного вектора, содержащего полинуклеотид, кодирующий Fc-фрагмент иммуноглобулина человека, в дрожжи Pichia sp.
При использовании в данном описании изобретения термин "иммуноглобулин", также известный как "антитело", относится к белку, который продуцируется иммунной системой в ответ на антигенный стимул, и специфично связывается с конкретным антигеном при надзоре за кровью и лимфой, активизируя реакцию антиген-антитело. Иммуноглобулины в основном состоят из двух идентичных полноразмерных легких цепей и двух идентичных полноразмерных тяжелых цепей, имеющих соединения дисульфидными связями между тяжелыми цепями и между тяжелыми цепями и легкими цепями. Существует пять отдельных типов тяжелых цепей различающихся аминокислотными последовательностями их константных областей: гамма (γ), мю (μ), альфа (α), дельта (δ) и эпсилон (ε), и тяжелые цепи включают следующие подклассы: гамма 1 (γ1), гамма 2 (γ2), гамма 3 (γ3), гамма 4 (γ4), альфа 1 (α1) и альфа 2 (α2). В соответствии с признакам константных областей тяжелых цепей иммуноглобулины классифицированы на пять изотипов: IgG, IgA, IgD, IgE и IgM. Репрезентативный изотип IgG дополнительно разделен на подклассы lgG1, lgG2, lgG3 и lgG4. Для цели настоящего изобретения термин "иммуноглобулин" включает функциональный фрагмент молекулы иммуноглобулина, а также полноразмерную молекулу иммуноглобулина. Данный функциональный фрагмент означает фрагмент, сохраняющий антигенсвязывающую функцию, и включает Fab, F(ab'), F(ab')2, Fv, scFv, Fd и Fc.
Среди фрагментов иммуноглобулина Fab содержит вариабельные области легкой цепи и тяжелой цепи, константную область легкой цепи и первую константную область (СН1) тяжелой цепи, и имеет один антигенсвязывающий сайт. Фрагменты Fab' отличаются от фрагментов Fab тем, что они включают шарнирную область, содержащую один или более остатков цистеина, на С-конце домена СH1 тяжелой цепи. Фрагменты F(ab')2 получают в виде пары фрагментов Fab' с дисульфидной связью, образованной между остатками цистеина в шарнирных областей фрагментов Fab. Fv представляет собой минимальный фрагмент антитела, содержащий только вариабельную область тяжелой цепи и вариабельную область легкой цепи. Фрагменты scFv (одноцепочечные Fv) содержат вариабельную область тяжелой цепи и вариабельную область легкой цепи, которые связаны друг с другом пептидным линкером и, таким образом, находятся в одной полипептидной цепи. Fd-фрагменты также содержат только вариабельную область и домен СH1 тяжелой цепи. Эти функциональные фрагменты молекул иммуноглобулина могут быть получены с использованием протеолитических ферментов (например, полноразмерное антитело расщепляется до Fab посредством ферментативного гидролиза папаином, и до F(ab')2 посредством ферментативного гидролиза пепсином) или посредством технологии генетической рекомбинации.
При использовании в данном описании изобретения термин "Fc-фрагмент иммуноглобулина" относится к фрагменту иммуноглобулина, состоящему из двух тяжелых цепей, которые несут два константных домена (СН2 и СН3) без вариабельных доменов легких и тяжелых цепей, константного домена 1 тяжелой цепи (СН1) и константного домена легкой цепи (CL1). Fc-фрагмент иммуноглобулина возможно может дополнительно содержать шарнирную область, присоединенную к константному домену тяжелой цепи. Поскольку он является биоразлагаемым полипептидом, который может метаболизироваться in vivo, Fc-фрагмент иммуноглобулина безопасен для применения в качестве носителя лекарственного средства. Кроме того, Fc-фрагмент иммуноглобулина предпочтителен по сравнению с полноразмерной молекулой иммуноглобулина с точки зрения получения, очистки и выхода конъюгата благодаря его более низкой молекулярной массе. Ожидают, что Fc-фрагмент иммуноглобулина, не содержащий Fab-фрагмента, который является гетерогенным в связи с различиями аминокислотной последовательности в разных антителах, будет значительно увеличивать гомогенность конъюгата, снижая при этом вероятность провоцирования антигенности конъюгата в крови.
Fc-фрагмент иммуноглобулина по настоящему изобретению может представлять собой удлиненный Fc-фрагмент, содержащий часть или целый константный домен 1 тяжелой цепи (СН1) и/или часть или полный константный домен 1 легкой цепи (CL1) без вариабельных областей тяжелых и легких цепей, если только он демонстрирует эффекты, по существу идентичные или превосходящие эффекты классического Fc-фрагмента. Кроме того, Fc-фрагмент иммуноглобулина по настоящему изобретению может содержать СН2 и/или СН3, в которых отсутствует значительная часть аминокислотной последовательности. Следовательно, Fc-фрагмент иммуноглобулина по настоящему изобретению может состоять из: 1) домена СН1, домена СН2, домена СН3 и домена СН4, 2) домена СН1 и домена СН2, 3) домена СН1 и домена СН3, 4) домена СН2 и домена СН3, 5) комбинации одного или более константных доменов и шарнирной области (или части шарнирной области) иммуноглобулина либо 6) димера каждого константного домена тяжелой цепи и константного домена легкой цепи.
Кроме того, подразумевается, что Fc-фрагмент иммуноглобулина по настоящему изобретению охватывает не только нативные аминокислотные последовательности, но также их мутанты. Мутант аминокислотной последовательности означает аминокислотную последовательность, отличающуюся от нативной последовательности делецией, инсерцией, неконсервативной или консервативной заменой одного или более аминокислотных остатков, или их комбинациями. Например, аминокислотные остатки в положениях 214-238, 297-299, 318-322 или 327-331 IgG Fc, которые, как известно, играют важную роль в связывании антитела, можно модифицировать таким образом, чтобы использовать в качестве подходящих сайтов связывания. Кроме того, возможны различные мутанты, в которых, например, отсутствует остаток, образующий дисульфидную связь, или несколько N-концевых аминокислот нативного Fc, или имеющие дополнительный остаток метионина на N-конце нативного Fc. Кроме того, эффекторные функции могут быть ликвидированы путем удаления комплементсвязывающего мотива, например C1q-связывающего мотива, или мотива ADCC (антителозависимая клеточная цитотоксичность). Ссылка может быть сделана на публикации РСТ 97/34631 и 96/32478, относящиеся к получению мутантов аминокислотной последовательности Fc-фрагмента иммуноглобулинов. Fc-фрагмент может представлять собой нативную форму, выделенную от людей и других животных, включая коров, коз, свиней, мышей, кроликов, хомяков, крыс и морских свинок, или может представлять собой ее рекомбинант или производное, полученные из трансформированных клеток животных или микроорганизмов. В первом случае полноразмерный иммуноглобулин выделяют от людей или животных с последующей ферментативной обработкой. При обработке папаином полноразмерный иммуноглобулин разделен на Fab и Fc. Пепсин расщепляет полноразмерный иммуноглобулин на pF'c и F(ab). Из этих фрагментов Fc или pF'c можно выделить, используя эксклюзионную хроматографию. Предпочтительным является рекомбинантный Fc-домен иммуноглобулина, полученный из Fc-домена иммуноглобулина в микроорганизмах.
Для целей настоящего изобретения Fc-фрагмент иммуноглобулина может представлять собой фрагмент, происходящий от IgG, например Fc-фрагмент lgG1, Fc-фрагмент lgG2, Fc-фрагмент lgG3, Fc-фрагмент lgG4 и тому подобное, предпочтительно Fc-фрагмент lgG2 или Fc-фрагмент lgG4, более предпочтительно Fc-фрагмент lgG4 и наиболее предпочтительно Fc-фрагмент lgG4, кодируемый нуклеотидной последовательностью, представленной SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 2, или Fc-фрагмент lgG4, включающий аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 10 или SEQ ID NO: 11.
Fc-фрагмент иммуноглобулина может иметь аминокислотную замену, не изменяющую активность нативных белков или пептидов в целом. Наиболее типичные замены встречаются среди Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Thy/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, LeuA/al, Ala/Glu и Asp/Gly. При необходимости аминокислоты могут быть модифицированы, например путем фосфорилирования, сульфатирования, акрилирования, гликозилирования, метилирования, фарнезилирования, ацетилирования, амидирования и т.д. Эти способы модификации известны в данной области техники (Н. Neurath, R.L. Hill, The Proteins, Academic Press, New York, 1979).
При использовании в данном описании изобретения термин "трансформация" или "модификация" относится к генетическому изменению клеток-хозяев (включая прокариоты, эукариоты, клетки животных и клетки растений) в результате введения экзогенного генетического материала, либо переносимого, либо не переносимого плазмидой, с использованием методик генетических манипуляций. Термин "трансформант" означает клетку, стабильно сохраняющую и экспрессирующую экзогенный генетический материал, введенный извне, либо переносимый, либо не переносимый плазмидой, даже несмотря на то, что клетка делится много раз. Любой способ, с помощью которого нуклеиновокислотное вещество может быть введено в организм, клетку, ткань, орган, или нуклеиновокислотное вещество можно использовать для осуществления трансформации по настоящему изобретению. Предпочтительно стандартные способы, известные в данной области техники, могут быть выбраны в соответствии с клетками-хозяевами. Трансформацию в дрожжевых клетках-хозяевах обычно можно проводить, используя способ, раскрытый в статье Van Solingen (J. Bact., 1977, 130:946) и Hsiao et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 1979, 76:3829). Способы трансформации дрожжей включают, без ограничения ими, электропорацию с использованием электрического устройства и трансформацию сферопластов с использованием сферопласта без клеточной стенки. Для целей настоящего изобретения трансформант может находиться в форме многокопийного клона, полученного в результате введения гена Fc иммуноглобулина G в геном дрожжевого хозяина. Для целей настоящего изобретения на трансформант не налагаются никакие конкретные ограничения, пока он несет экспрессионный вектор, содержащий полинуклеотид, кодирующий Fc-фрагмент иммуноглобулина человека. Например, можно использовать Pichia (Komagataella) pastoris НМС041 (номер доступа КССМ11348Р), содержащий экспрессионный вектор pPIC9K-lgG4Fc, включающий полинуклеотид, кодирующий Fc-фрагмент иммуноглобулина, или Pichia (Komagataella) pastoris НМС042 (номер доступа КССМ11350Р), содержащий экспрессионный вектор pPIC9K-mPSCFc, включающий полинуклеотид, кодирующий Fc-фрагмент иммуноглобулина.
При использовании в данном описании изобретения термин "клетка-хозяин" означает клетку-мишень, в которую вводят экзогенный генетический материал. Примеры клеток-хозяев, полезных в настоящем изобретении, включают, без ограничения ими, дрожжи (например, Pichia pastoris, Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces sp., Neurospora crassa). Предпочтительно в качестве клеток-хозяев используют дрожжи, поскольку они могут экспрессировать рекомбинантный иммуноглобулин, структурно подобный нативной форме, без N-концевой модификации дополнительной аминокислотой, и без необходимости в процессе рефолдинга, и могут быть безопасными в отношении загрязнения веществом животного происхождения. Более предпочтительными являются дрожжи Pichia sp., причем наиболее предпочтительны Pichia pastoris.
Термин "экспрессионный вектор", описывающий вектор, способный экспрессировать целевой белок в подходящей клетке-хозяине, при использовании в данном описании изобретения относится к генетической конструкции, содержащей существенные регуляторные элементы, с которыми функциональным образом связана генная вставка, таким образом, чтобы экспрессироваться в клетке-хозяине. Конкретных ограничений на экспрессионный вектор не налагается, если он несет полинуклеотид, кодирующий Fc-фрагмент иммуноглобулина по настоящему изобретению. Для целей настоящего изобретения экспрессионный вектор сконфигурирован для экспрессии Fc-фрагмента иммуноглобулина после трансформации в дрожжи Pichia sp. Например, он может представлять собой вектор pPIC9K-lgG4Fc, представленный рестрикционной картой на Фиг. 1, или pPIC9K-mPSCFc, представленный рестрикционной картой на Фиг. 2.
Термин "функционально связанный", при использовании в данном описании, относится к функциональной связи между регуляторной последовательностью экспрессии нуклеиново-кислотной и нуклеиново-кислотной последовательностью, кодирующей целевой белок, осуществленной таким образом, что выполняются общие функции. Функциональная связь с рекомбинантным вектором может быть получена с использованием методики генетической рекомбинации, хорошо известной в данной области техники, а сайт-специфическое расщепление и лигирование ДНК может быть выполнено с помощью ферментов, общеизвестных в данной области техники.
Согласно одному воплощению настоящего изобретения конструируют экспрессионные векторы pPIC9K-lgG4Fc и pPIC9K-mPSCFc, каждый из которых содержит полинуклеотид, кодирующий Fc-фрагмент иммуноглобулина. Экспрессионными векторами pPIC9K-lgG4Fc и pPIC9K-mPSCFc трансформировали Pichia pastoris с получением трансформантов, которые были обозначены "Pichia (Komagataella) pastoris НМС041" и "Pichia (Komagataella) pastoris HMC042" и депонированы в корейском центре культур микроорганизмов (расположенном по адресу: 361-221, Hongje-1 dong, Seodaemungu, Сеул) 7 января 2013 под учетными номерами КССМ11348Р и КССМ11350Р соответственно.
Термин "многокопийный клон", при использовании в данном описании изобретения, относится к трансформанту, в котором множественные копии экзогенного гена случайным образом встроены в геном клетки-хозяина посредством рекомбинации или перегруппировки при скрещивании экзогенного гена с определенным геномным геном или сайтом клетки-хозяина после введения этого экзогенного гена в клетку-хозяина посредством генетической манипуляции. В целом многокопийный клон может представлять собой трансформант, в котором одна или более копий гена, отобранного с помощью маркера генетицина, встроены в геном клетки-хозяина, и предпочтительно в котором пять или более копий гена, отобранного с помощью маркера генетицина в концентрации 3 мг/мл или выше, встроены в геном.
В соответствии с другим аспектом настоящее изобретение относится к способу получения Fc-фрагмента иммуноглобулина, включающему культивирование трансформанта и выделение Fc-фрагмента иммуноглобулина из культуры. Этот способ может быть охарактеризован как не требующий дополнительного процесса рефолдинга белка.
Рекомбинантные дрожжи Pichia pastoris можно культивировать в подходящей среде в подходящих условиях, известных в данной области техники. Способ культивирования может быть легко скорректирован специалистами в данной области техники в зависимости от используемого штамма.
Fc-фрагмент иммуноглобулина, выделенный из культуры, можно использовать без дополнительной очистки или очищать с использованием диализа, высаливания и хроматографии. Из них наиболее широко используется хроматография. Нет правил, которые можно было бы универсально применять, независимо от вида и порядка используемых колонок. В соответствии со свойствами белков-мишеней антитела и способом культивирования выбор можно осуществлять между ионообменной хроматографией, эксклюзионной хроматографией, аффинной хроматографией, гидрофобной хроматографией и хроматографией на аффинной колонке с белком А.
В соответствии со следующим аспектом настоящее изобретение относится к Fc-фрагменту иммуноглобулина, полученному данным способом, для применения в качестве носителя лекарственного средства. Выступая в качестве носителя, Fc-фрагмент иммуноглобулина образует конъюгат с лекарственным средством и может повысить биодоступность этого лекарственного средства.
При использовании в данном описании изобретения термин "лекарственное средство" означает вещество, оказывающее терапевтический эффект на людей или животных при введении им. В объем термина «лекарственное средство» в качестве неограничивающих примеров включены пептиды, полипептиды, соединения, экстракты и нуклеиновые кислоты, предпочтительными являются пептиды или полипептиды.
При использовании в данном описании изобретения термин "носитель" относится к веществу, связанному с лекарственным средством с целью минимизации снижения физиологической активности этого лекарственного средства и повышения стабильности этого лекарственного средства in vivo. Таким образом, в настоящем изобретении предложены многочисленные возможные Fc-фрагменты lgG1, lgG2, lgG3 и lgG4 для повышения устойчивости лекарственного средства in vivo и минимизации снижения активности лекарственного средства in vivo. Предпочтительно предложены фрагменты Fc lgG2 и Fc lgG4. Более предпочтительно в настоящем изобретении предложен Fc-фрагмент lgG4. Однако в объем настоящего изобретения может попадать любой Fc-фрагмент, если он содержит сайт связывания рецептора FcRn, необходимый для устойчивости in vivo.
Преимущество Fc-фрагмента иммуноглобулина, полученного с использованием способа по настоящему изобретению, состоит в отсутствии необходимости в дополнительных процессах рефолдинга и отсутствии дополнительных аминокислотных остатков на N-конце. Кроме того, он может экспрессироваться на повышенном уровне при минимальной нагрузке эндотоксина или патогенов животного происхождения и может быть очищен с использованием простого способа. Поскольку Fc-фрагмент иммуноглобулина, обладающий такими преимуществами, представляет собой биоразлагаемый полипептид, который может метаболизироваться in vivo, его можно применять в качестве носителя лекарственного средства. Кроме того, Fc-фрагмент иммуноглобулина обладает преимуществом перед полноразмерной молекулой иммуноглобулина с точки зрения получения, очистки и выхода конъюгата благодаря его более низкой молекулярной массой. Ожидается, что в отсутствие Fab-фрагмента, обладающего гетерогенностью из-за различий аминокислотной последовательности среди антител, Fc-фрагмент иммуноглобулина значительно повысит гомогенность конъюгата и при этом снизит вероятность провоцирования антигенности конъюгата в крови.
Из подклассов IgG, lgG4 обладает наименьшей склонностью к связыванию комплемента (C1q). Имея более низкую аффинность к комплементу, Fc-фрагмент менее склонен опосредовать эффекторные функции, такие как ADCC (антителозависимая клеточная цитотоксичность) и CDC (комплементзависимая цитотоксичность), и, следовательно, провоцировать нежелательные иммунные ответы in vivo. Сродство к C1q ниже у Fc-фрагментов lgG2 и lgG4, чем у Fc-фрагментов lgG1, и является самым низким у Fc-фрагментов lgG4. Для применения в качестве носителя лекарственного средства Fc-фрагмент, конъюгированный с лекарственным средством, предпочтительно должен проявлять слабые эффекторные функции, такие как ADCC и CDC. Следовательно, для целей настоящего изобретения полезны Fc-фрагменты lgG2 и Fc lgG4, с большим предпочтением Fc-фрагментов lgG4. Таким образом, Fc-фрагмент иммуноглобулина, полезный в качестве носителя лекарственного средства в соответствии с настоящим изобретением, может представлять собой Fc-фрагмент, происходящий от Fc-фрагмента lgG4 человека, или его производное, в котором отсутствует часть шарнирной области, как представлено в SEQ ID NO: 10 или SEQ ID NO: 11, который может иметь такую же аминокислотную последовательность, что и белок, продуцируемый трансформантом Е. coli НМ11201 (КССМ-10660Р), раскрытым в патенте Кореи 10-824505.
Способ осуществления изобретения
Лучшее понимание настоящего изобретения может быть достигнуто с помощью следующих ниже примеров, которые приведены для иллюстрации, но не должны рассматриваться как ограничивающие настоящее изобретения.
ПРИМЕР 1: Конструирование экспрессионного вектора для продуцирования Fc-фрагмента иммуноглобулина в Pichia pastoris
Конструировали рекомбинантный экспрессионный вектор для экспрессии Fc-фрагмента иммуноглобулина человека в дрожжах Pichia pastoris с включением нуклеотидной последовательности (SEQ ID NO: 1), кодирующей Fc-фрагмент иммуноглобулина человека, состоящий из шарнирной области lgG4 и константных доменов СН2 и СН3 lgG4, как описано ниже.
ДНК Fc-фрагмента иммуноглобулина человека получали с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР), где в качестве матрицы служила плазмида pBG4CH1-3, раскрытая в патенте Кореи номер 10-0725314. Сначала был сконструирован прямой праймер (SEQ ID NO: 3) так, чтобы он содержал сайт рестрикции SnaB I для слияния с сигнальной последовательностью секреции альфа-фактора, тогда как обратный праймер (SEQ ID NO: 4) был сконструирован так, чтобы он включал сайт рестрикции EcoR I. ДНК, кодирующую Fc-фрагмент иммуноглобулина G4, амплифицировали с помощью ПЦР, используя эти праймеры. Выполняли ПЦР с 30 циклами денатурации при 95°С в течение 40 с, отжига при 60°С в течение 30 с и элонгации при 68°С в течение 50 с.
Figure 00000001
ДНК Fc-фрагмента иммуноглобулина G4 (приблизительно 700 пар оснований (п.о.)), полученную таким путем, клонировали в вектор рРIC9К (Invitrogen). Чтобы он находился в одной рамке считывания с сигнальной последовательностью секреции альфа-фактора, продукт ПЦР Fc-фрагмента иммуноглобулина G4 расщепляли ферментами рестрикции SnalB I и EcoR I, а затем лигировали в присутствии лигазы Т4 с вектором рРIC9К, который был предварительно обработан теми же ферментами рестрикции. Полученный в результате рекомбинантный экспрессионный вектор содержал ген Fc иммуноглобулина G4 непосредственно справа от сигнальной последовательности секреции альфа-фактора, но сайт распознавания SnB I, представленный прямым праймером, также находился на векторе слева, так что Fc-фрагмент иммуноглобулина G4, при экспрессии с вектора, должен содержать два нежелательных аминокислотных остатка на N-конце. Для делеции сайта распознавания SnaB I, встроенного в соединение между сигнальной последовательностью секреции альфа-фактора и геном Fc иммуноглобулина G4, был проведен сайт-направленный мутагенез с использованием пары праймеров, представленных SEQ ID NO: 6 и 7, и полученный в результате экспрессионный вектор был обозначен как рР1С9К-lgG4Fc (Фиг. 1).
Figure 00000002
Фиг. 1 представляет собой схематическое изображение, иллюстрирующее способы конструирования рекомбинантного экспрессионного вектора pPIC9K-lgG4Fc. Как видно на Фиг. 1, экспрессионный вектор рРIC9К-lgG4Fc содержит ДНК SEQ ID NO: 1 под контролем 5'-промотора гена алкогольоксидазы 1 (АОХ1) и может быть интегрирован в геномную ДНК клетки-хозяина посредством 3'-гена алкогольоксидазы 1 (АОХ1), расположенного ниже гена Fc иммуноглобулина G4.
ПРИМЕР 2: Конструирование экспрессионного вектора для продуцирования Fc-фрагмента иммуноглобулина, в котором частично отсутствует шарнирная область, в Pichia pastoris
Конструировали экспрессионный вектор для экспрессии Fc-фрагмента иммуноглобулина, в котором частично отсутствует шарнирная область, в Pichia pastoris с включением нуклеотидной последовательности (SEQ ID NO: 2) Fc-фрагмента иммуноглобулина, состоящей из части шарнирной области lgG4 и константных доменов СН2 и СН3 lgG4, согласно той же стратегии, которая описана в Примере 1.
ДНК, кодирующая Fc-фрагмент иммуноглобулина человека, в котором частично отсутствует шарнирная область, получали с помощью ПЦР, в которой в качестве матрицы служила плазмида pBG4CH1-3, раскрытая в патенте Кореи номер 10-0725314.
Сначала был сконструирован прямой праймер (SEQ ID NO: 5) так, чтобы он содержал сайт рестрикции SnaB I для слияния с сигнальной последовательностью секреции альфа-фактора, тогда как обратный праймер (SEQ ID NO: 4) был сконструирован так, чтобы он включал сайт рестрикции EcoR I. ДНК, кодирующую Fc-фрагмент иммуноглобулина G4, амплифицировали с помощью ПЦР, используя эти праймеры. Проводили ПЦР с 30 циклами денатурации при 95°С в течение 40 с, отжига при 60°С в течение 30 с и элонгации при 68°С в течение 50 с.
Figure 00000003
ДНК Fc-фрагмента иммуноглобулина G4 (приблизительно 680 п. о.), полученную таким образом, клонировали в вектор pPIC9K (Invitrogen). Чтобы он находился в одной рамке считывания с сигнальной последовательностью секреции альфа-фактора, продукт ПЦР Fc-фрагмента иммуноглобулина G4 расщепляли ферментами рестрикции SnalB I и EcoR I и затем лигировали в присутствии лигазы Т4 с вектором рР1С9К, который был предварительно обработан теми же ферментами рестрикции. Полученный в результате рекомбинантный экспрессионный вектор содержал ген Fc иммуноглобулина G4 непосредственно ниже сигнальной последовательности секреции альфа-фактора, но сайт распознавания SnB I, представленный прямым праймером, также оставался слева на векторе, так что Fc-фрагмент иммуноглобулина G4, при экспрессии с вектора, должен был содержать два нежелательных аминокислотных остатка на N-конце. Для удаления сайта распознавания SnaB I, встроенного в соединение между сигнальной последовательностью секреции альфа-фактора и геном Fc иммуноглобулина G4, был проведен сайт-направленный мутагенез с использованием пары праймеров, представленных SEQ ID NO: 8 и 9, и полученный экспрессионный вектор был обозначен рР1С9К-mPSCFc (Фиг. 2).
Figure 00000004
Figure 00000005
Фиг. 2 представляет собой схематическое изображение, иллюстрирующее способы конструирования рекомбинантного экспрессионного вектора pPIC9K-mPSCFc. Как видно на Фиг. 2, экспрессионный вектор рР1С9К-mPSCFc содержит ДНК SEQ ID NO: 2 под контролем 5'-промотора гена алкогольоксидазы 1 (АОХ1) и может быть интегрирован в геномную ДНК клетки-хозяина посредством 3'-гена алкогольоксидазы 1 (АОХ1), расположенного справа от гена Fc иммуноглобулина G4. Клетка-хозяин, трансформированная экспрессионным вектором, может секретировать в культуральную среду Fc-фрагмент иммуноглобулина, в котором частично отсутствует шарнирная область, под управлением сигнальной последовательностью секреции альфа-фактора.
ПРИМЕР 3: Трансформация дрожжей Pichia oastoris и отбор многокопийного клона
Для использования в стабильной трансформации и интеграции в геномную ДНК рекомбинантные векторы pPIC9K-IgG4Fc и pPIC9K-mPSCFc, полученные в Примерах 1 и 2 соответственно, линеаризовали путем расщепления ферментом рестрикции Sall. Линеаризованный рекомбинантный вектор экспрессии Fc-фрагмента IgG был сконструирован для интеграции в геномную ДНК клетки-хозяина посредством рекомбинации с сайтом гена алкогольоксидазы хозяина. Штаммы КМ71 и GS115 использовали в качестве хозяев для трансформации рекомбинантными экспрессионными векторами, полученными в Примерах 1 и 2. Трансформацию проводили посредством электропорации, которая известна как наиболее популярная и эффективная для дрожжей. Для использования в трансформации сферопласты Pichia pastoris КМ71 и GS115 получали согласно протоколу, предложенному Invitrogen USA.
После тщательного смешивания 10 мкг каждого из линеаризованных рекомбинантных векторов с 80 мкл сферопластов КМ 71 или GS115 смесь инкубировали в течение 5 мин в кювете со щелью 0,2 см на льду. Затем к кювете применяли электроудар 2000 В, 200 Ом, 25 мкФ в устройстве для электропорации Gene Pulser (BIO-Rad) для индукции трансформации. К реакционной смеси добавляли 1 мл охлажденного 1 М сорбита и сеяли на чашку Петри с MD (минимальным декстрозным) агаром, которую затем инкубировали при 28°С в течение 3 суток для отбора положительных трансформантов His+. Чтобы отличить многокопийные клоны, каждый из положительных трансформантов His+, образовавшихся на чашке с MD агаром, гомогенно суспендировали в 1 мл стерильной дистиллированной воды, и суспензии сеяли в количестве, соответствующем 105 клеток, на чашки с агаром YPD (пептон-декстроза для дрожжей), содержащим различные концентрации генетицина (0,5; 1,0; 2,0; 3,0; 4,0 мг/мл), затем инкубировали при 28°С в течение 5 суток. Из отобранных таким путем многокопийных клонов, резистентных к генетицину, колонии, образовавшиеся на чашках с агаром YPD, содержащим 3,0 мг/мл и 4,0 мг/мл, подвергали ПЦР колоний, чтобы проверить, встроились ли гены фрагмента иммуноглобулина в геномную ДНК. Кратко, в ПЦР использовали пару праймеров SEQ ID NO: 3 и 4 для проверки встраивания гена Fc-фрагмента иммуноглобулина, и пару праймеров SEQ ID NO: 5 и 4 для проверки встраивания гена, кодирующего Fc-фрагмент иммуноглобулина, в котором частично отсутствует шарнирная область. Проводили ПЦР с 30 циклами денатурации при 95°С в течение 40 с, отжига при 60°С в течение 30 с и элонгации при 68°С в течение 50 с (Фиг. 3). Фиг. 3 представляет собой изображение ПЦР, показывающее встраивание интересующих генов в геномную ДНК многокопийных клонов, отобранных при 3 мг/мл и 4 мг/мл генетицина. Как видно на Фиг. 3, ПЦР продемонстрировала встраивание генов Fc-фрагмента иммуноглобулина в геномы клеток-хозяев.
Трансформанты, полученные путем трансформации штаммов Pichia pastoris экспрессионными векторами pPIC9K-lgG4Fc и pPIC9K-mPSCFc, несущими соответствующие гены Fc-фрагмента иммуноглобулина, были обозначены как "Pichia (Komagataella) pastoris НМС041" и "Pichia (Komagataella) pastoris HMC042" и депонированы в корейском центре культур микроорганизмов (расположенном по адресу: 361-221, Hongje-1 dong, Seodaemungu, Сеул) 7 января 2013 под регистрационными номерами КССМ11348Р и КССМ11350Р соответственно.
Хотя предпочтительные воплощения настоящего изобретения раскрыты в иллюстративных целях, специалистам в данной области техники понятно, что возможны различные модификации, дополнения и замены без отклонения от объема и сущности изобретения, как раскрыто в прилагаемой формуле изобретения.

Claims (9)

1. Трансформант дрожжей Pichia sp. для продуцирования Fc-фрагмента IgG4, где трансформант модифицирован путем введения экспрессионного вектора, содержащего полинуклеотид, кодирующий Fc-фрагмент IgG4 человека, в дрожжи Pichia sp., где экспрессионный вектор представляет собой pPIC9K-IgG4Fc, представленный при помощи рестрикционной карты на фиг. 1, или pPIC9K-mPSCFc, представленный при помощи рестрикционной карты на фиг. 2
2. Трансформант по п. 1, где дрожжи Pichia sp. представляют собой Pichia pastoris.
3. Трансформант по п. 1, где Fc-фрагмент IgG4 содержит аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 10 или SEQ ID NO: 11.
4. Трансформант по п. 1, где полинуклеотид содержит нуклеотидную последовательность, представленную SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 2.
5. Трансформант по п. 1, представляющий собой Pichia (Komagataella) pastoris с регистрационным номером KCCM11348P или Pichia (Komagataella) pastoris с регистрационным номером KCCM11350P.
6. Способ получения Fc-фрагмента IgG4, включающий:
(а) культивирование трансформанта по любому из пп. 1-5; и
(б) выделение Fc-фрагмента IgG4 из культуры.
7. Способ по п. 6, отличающийся тем, что не требует дополнительного процесса рефолдинга белка.
RU2015133452A 2013-01-31 2014-02-03 Рекомбинантный дрожжевой трансформант и способ получения с его использованием Fc-фрагмента иммуноглобулина RU2664862C2 (ru)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020130011471A KR102073748B1 (ko) 2013-01-31 2013-01-31 재조합 효모 형질전환체 및 이를 이용하여 면역글로불린 단편을 생산하는 방법
KR10-2013-0011471 2013-01-31
PCT/KR2014/000901 WO2014119956A1 (en) 2013-01-31 2014-02-03 Recombinant yeast transformant and process for preparing immunoglobulin fc fragment employing the same

Publications (2)

Publication Number Publication Date
RU2015133452A RU2015133452A (ru) 2017-03-07
RU2664862C2 true RU2664862C2 (ru) 2018-08-23

Family

ID=51262604

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RU2015133452A RU2664862C2 (ru) 2013-01-31 2014-02-03 Рекомбинантный дрожжевой трансформант и способ получения с его использованием Fc-фрагмента иммуноглобулина

Country Status (14)

Country Link
US (1) US9394546B2 (ru)
EP (1) EP2951284B1 (ru)
JP (1) JP6473696B2 (ru)
KR (1) KR102073748B1 (ru)
CN (1) CN105073977B (ru)
AR (1) AR095117A1 (ru)
AU (1) AU2014213134B2 (ru)
CA (1) CA2899838C (ru)
DK (1) DK2951284T3 (ru)
ES (1) ES2865443T3 (ru)
RU (1) RU2664862C2 (ru)
SG (1) SG11201505800RA (ru)
TW (1) TWI628279B (ru)
WO (1) WO2014119956A1 (ru)

Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR102073748B1 (ko) * 2013-01-31 2020-02-05 한미약품 주식회사 재조합 효모 형질전환체 및 이를 이용하여 면역글로불린 단편을 생산하는 방법
KR101895634B1 (ko) * 2013-05-31 2018-09-05 한미약품 주식회사 변이된 힌지 영역을 포함하는 IgG4 Fc 단편
KR20170037247A (ko) * 2015-09-25 2017-04-04 한미약품 주식회사 개시 메티오닌 잔기를 포함하는 면역글로불린 Fc 영역의 생산방법
US20220273808A1 (en) * 2019-07-18 2022-09-01 Hanmi Pharm. Co., Ltd Novel method of preparing protein conjugate
CN114945587A (zh) * 2019-07-18 2022-08-26 韩美药品株式会社 通过制备中间体而制备长效药物缀合物的新方法
IL298428A (en) * 2020-05-22 2023-01-01 Hanmi Pharm Ind Co Ltd Liquid formulation

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6797493B2 (en) * 2001-10-01 2004-09-28 Lee-Hwei K. Sun Fc fusion proteins of human granulocyte colony-stimulating factor with increased biological activities
WO2005047334A1 (en) * 2003-11-13 2005-05-26 Hanmi Pharmaceutical. Co., Ltd. Igg fc fragment for a drug carrier and method for the preparation thereof
CN1974601A (zh) * 2005-11-28 2007-06-06 上海新生源医药研究有限公司 一种新型Fc融合蛋白及其生产方法
RU2009140146A (ru) * 2007-03-30 2011-05-10 Эбботт Лэборетриз (Us) Элементы рекомбинантного вектора экспрессии (reves) для усиления экспрессии рекомбинантных белков в клетках-хозяевах
US7968316B2 (en) * 2005-08-16 2011-06-28 Hanmi Holdings Co., Ltd. Method for the mass production of immunoglobulin Fc region deleted initial methionine residues

Family Cites Families (19)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB8504099D0 (en) 1985-02-18 1985-03-20 Wellcome Found Physiologically active substances
US5349053A (en) 1990-06-01 1994-09-20 Protein Design Labs, Inc. Chimeric ligand/immunoglobulin molecules and their uses
EP0464533B1 (de) 1990-06-28 1998-07-29 Hoechst Aktiengesellschaft Fusionsproteine mit immunglobulinanteilen, ihre Herstellung und Verwendung
EP0533006A1 (en) 1991-09-18 1993-03-24 F.Hoffmann-La Roche & Co. Aktiengesellschaft Chimaeric interleukin 5-receptor/immunoglobulin polypeptides
US6096871A (en) 1995-04-14 2000-08-01 Genentech, Inc. Polypeptides altered to contain an epitope from the Fc region of an IgG molecule for increased half-life
WO1997034631A1 (en) 1996-03-18 1997-09-25 Board Of Regents, The University Of Texas System Immunoglobin-like domains with increased half lives
JPH11174A (ja) * 1997-06-13 1999-01-06 Asahi Breweries Ltd 酵母を用いた抗体Ｆａｂ断片の製造法
CN100480266C (zh) 1998-10-16 2009-04-22 拜奥根Idec马萨诸塞公司 干扰素-β融合蛋白及用途
US6660843B1 (en) 1998-10-23 2003-12-09 Amgen Inc. Modified peptides as therapeutic agents
JP4944324B2 (ja) 1999-07-13 2012-05-30 ボルダー バイオテクノロジー， インコーポレイテッド 免疫グロブリン融合タンパク質
DE10021731B4 (de) 2000-05-04 2005-12-08 Aventis Pharma Deutschland Gmbh Cyclipostine, Verfahren zu ihrer Herstellung und pharmazeutische Zubereitung derselben
KR20050098032A (ko) 2004-01-19 2005-10-11 타이완 오아시스 테크놀러지 컴퍼니 리미티드 백색광 ｌｅｄ 및 상기 백색광 ｌｅｄ로부터 발생된 광의색상을 조정하는 방법
KR100594607B1 (ko) * 2004-11-03 2006-06-30 재단법인서울대학교산학협력재단 신규한 경구투여용 재조합 인간 성장호르몬 분비미생물제제 및 그 제조방법
WO2007016285A2 (en) * 2005-07-28 2007-02-08 Novartis Ag M-csf specific monoclonal antibody and uses thereof
US20100255012A1 (en) * 2007-05-31 2010-10-07 Genmab A/S Recombinant fucose modified monovalent half-antibodies obtained by molecular engineering
KR100980411B1 (ko) * 2007-10-15 2010-09-07 서울대학교산학협력단 유전자 변형 미생물의 조건적 자살을 이용한 치료 단백질의소장 전달방법
CN101748145A (zh) * 2008-12-03 2010-06-23 中国人民解放军军事医学科学院生物工程研究所 表达抗体或抗体类似物的重组酵母菌及其构建方法与应用
EP2275442A1 (en) * 2009-07-06 2011-01-19 Ludwig-Maximilians-Universität München Detection and vizualization of the cell cycle in living cells
KR102073748B1 (ko) * 2013-01-31 2020-02-05 한미약품 주식회사 재조합 효모 형질전환체 및 이를 이용하여 면역글로불린 단편을 생산하는 방법

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6797493B2 (en) * 2001-10-01 2004-09-28 Lee-Hwei K. Sun Fc fusion proteins of human granulocyte colony-stimulating factor with increased biological activities
WO2005047334A1 (en) * 2003-11-13 2005-05-26 Hanmi Pharmaceutical. Co., Ltd. Igg fc fragment for a drug carrier and method for the preparation thereof
US7968316B2 (en) * 2005-08-16 2011-06-28 Hanmi Holdings Co., Ltd. Method for the mass production of immunoglobulin Fc region deleted initial methionine residues
CN1974601A (zh) * 2005-11-28 2007-06-06 上海新生源医药研究有限公司 一种新型Fc融合蛋白及其生产方法
RU2009140146A (ru) * 2007-03-30 2011-05-10 Эбботт Лэборетриз (Us) Элементы рекомбинантного вектора экспрессии (reves) для усиления экспрессии рекомбинантных белков в клетках-хозяевах

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
LI H. ET AL. "Optimization of humanized IgGs in glycoengineered Pichia pastoris", Nature biotechnology, 2006, v.24, no.2, pp.210-215. *
LIN S. et al. "Selection of Pichia pastoris strains expressing recombinant immunoglobulin G by cell surface labeling", Journal of immunological methods, 2010, v.358, p. 66 - 74. *
LIN S. et al. "Selection of Pichia pastoris strains expressing recombinant immunoglobulin G by cell surface labeling", Journal of immunological methods, 2010, v.358, p. 66 - 74. PENG C. et al. "Generation of a fusion protein of the extracellular domain of BR3 with the Fc fragment of human IgG 1 (sBR3-Fc) in Pichia pastoris as an antagonist for BLyS", Applied microbiology and biotechnology, 2008, v.78, no.2, pp.275-282. LI H. ET AL. "Optimization of humanized IgGs in glycoengineered Pichia pastoris", Nature biotechnology, 2006, v.24, no.2, pp.210-215. *
PENG C. et al. "Generation of a fusion protein of the extracellular domain of BR3 with the Fc fragment of human IgG 1 (sBR3-Fc) in Pichia pastoris as an antagonist for BLyS", Applied microbiology and biotechnology, 2008, v.78, no.2, pp.275-282. *

Also Published As

Publication number Publication date
RU2015133452A (ru) 2017-03-07
AR095117A1 (es) 2015-09-30
JP2016505277A (ja) 2016-02-25
BR112015018288A2 (pt) 2018-08-14
EP2951284A4 (en) 2016-08-17
DK2951284T3 (da) 2021-04-26
CA2899838C (en) 2023-03-07
WO2014119956A1 (en) 2014-08-07
AU2014213134B2 (en) 2020-01-23
ES2865443T3 (es) 2021-10-15
JP6473696B2 (ja) 2019-02-20
EP2951284A1 (en) 2015-12-09
CA2899838A1 (en) 2014-08-07
CN105073977A (zh) 2015-11-18
NZ710448A (en) 2021-01-29
US20150361437A1 (en) 2015-12-17
TWI628279B (zh) 2018-07-01
KR102073748B1 (ko) 2020-02-05
US9394546B2 (en) 2016-07-19
TW201443234A (zh) 2014-11-16
AU2014213134A1 (en) 2015-08-13
CN105073977B (zh) 2020-11-10
KR20140098607A (ko) 2014-08-08
SG11201505800RA (en) 2015-08-28
EP2951284B1 (en) 2021-03-31

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP6689329B2 (ja) 免疫グロブリンＦｃ変異体
RU2664862C2 (ru) Рекомбинантный дрожжевой трансформант и способ получения с его использованием Fc-фрагмента иммуноглобулина
EP1765872B1 (en) Glycosylated immunoglobulin and immunoadhesin comprising the same
RU2428430C2 (ru) СПОСОБ МАССОВОГО ПРОИЗВОДСТВА ОБЛАСТИ Fc ИММУНОГЛОБУЛИНА С УДАЛЕННЫМИ НАЧАЛЬНЫМИ МЕТИОНИНОВЫМИ ОСТАТКАМИ
JP4234438B2 (ja) ハイブリッド・イソタイプ抗体部分を含有する蛋白質の発現技術
KR20150127185A (ko) 비글리코실화 Fc-함유 폴리펩티드
KR870009020A (ko) 하이브리드 인터페론 및 그의 제조방법
CN108948207B (zh) 一种人白细胞介素10-Fc融合蛋白及其编码基因与应用
KR20200037434A (ko) 수정된 항체 영역 및 그의 용도
WO2020097946A1 (zh) 一种重组人白细胞介素10融合蛋白及其应用
MX2007000115A (es) Hoja de puerta de cristal pivotante alrededor de un quicio superior y uno inferior.
KR102498976B1 (ko) pH-감응성 Fc 변이체
WO2021063313A1 (zh) 改变效应功能的Fc变体及其融合蛋白
NZ710448B2 (en) Recombinant yeast transformant and process for preparing immunoglobulin fc fragment employing the same
BR112015018288B1 (pt) Levedura transformante recombinante e um processo para a preparação de fragmento fe da imunoglobulina utilizando a mesma