TW202413633A - 表現car及複數個蛋白質表現阻斷劑之工程化免疫細胞及其用途 - Google Patents
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Abstract
本發明提供一或多個表現載體，其編碼抗CD7嵌合抗原受體(CAR)、抗CD7蛋白質表現阻斷劑、殺傷基因或自殺基因以及抗CD3蛋白質表現阻斷劑中之一或多者。亦提供包含該一或多個表現載體之免疫細胞。亦提供產生此類一或多個表現載體或免疫細胞之方法。亦提供使用此類一或多個表現載體或免疫細胞來治療癌症同時減輕移植物抗宿主疾病(GvHD)之症狀的方法。
Description
嵌合抗原受體(CAR)可重引導免疫細胞以特異性識別及殺死腫瘤細胞。CAR為人工多域蛋白，其由經由跨膜域連接至信號傳導分子的抗體之單鏈可變區(scFv)構成。當scFv連接其同源抗原時，觸發信號轉導，導致表現CAR之細胞毒性T淋巴球殺死腫瘤細胞(Eshhar Z, Waks T等人 PNAS USA. 90(2):720-724, 1993；Geiger TL等人 J Immunol. 162(10):5931-5939, 1999；Brentjens RJ等人 Nat Med. 9(3):279-286, 2003；Cooper LJ等人 Blood 101(4):1637-1644, 2003；Imai C等人 Leukemia. 18:676-684, 2004)。表現CAR之自體T淋巴球之臨床試驗在患有B細胞難治性白血病及淋巴瘤之患者中顯示陽性反應(參見例如Till BG等人 Blood 119(17):3940-3950, 2012；Maude SL等人 N Engl J Med. 371(16):1507-1517, 2014)。
靶向T細胞惡性腫瘤之CAR技術的發展遠遠落後於針對其B細胞對應物取得的進展。需要針對T細胞惡性腫瘤之新療法，但迄今為止進展緩慢。特定言之，缺乏有效的免疫治療選擇，且T細胞急性淋巴球性白血病(T-ALL)之治療依賴於強化化學療法及造血幹細胞移植。積極的治療方案不僅與顯著發病率相關，且此等方法之結果遠不令人滿意。
最近已開發出CAR-T細胞，其中CAR-T之目標抗原自身在CAR-T細胞中表現(Png等人, Blood, 2017, 1(25):2348-2360；WO 2018/098306)。為了避免自殺(self-killing) (例如自相殘殺(fratricide))，CAR-T細胞亦表現PEBL，其用於減少CAR-T之細胞表面上目標抗原之表現。為了產生活的CAR-T細胞，可表現蛋白質表現阻斷劑(PEBL)蛋白以在隨後表現CAR之前結合及隔離目標蛋白。由於所產生的工程化T細胞之細胞表面上預先存在目標抗原，因此CAR及PEBL之同時表現可能導致自相殘殺。特定言之，預先存在之細胞表面目標抗原可能不易被新表現之PEBL蛋白隔離，且可由新表現之CAR蛋白識別及靶向。
同時表現之替代方案可為依序表現。然而，T細胞中PEBL且隨後CAR之依序表現為PEBL CAR-T細胞之臨床實施帶來一些挑戰。首先，T細胞之依序工程化需要單獨製造及投與不同病毒載體，一種用於PEBL且第二種用於CAR。此增加成本及時間，以及產生工程化CAR-T細胞之實驗操作的複雜度。另外，T細胞之依序工程化在最終臨床產物中產生複雜的工程化細胞混合物，給產物表徵、均一性及功效帶來了挑戰。由於在各工程化步驟處僅一部分T細胞整合所引入之基因，因此最終產物(工程化T細胞)將包含一些僅接受PEBL基因之細胞、一些僅接受CAR基因之細胞以及一些接受兩種基因之細胞。
總而言之，對用於T細胞惡性腫瘤患者之新治療選擇的需求尚未得到滿足。需要用於產生工程化CAR-T細胞且消除CAR介導之T細胞自殺或自相殘殺的方法。另外，內源性T細胞受體(TCR)之表現會帶來移植物抗宿主疾病(GvHD)之風險，且有效的同種異體CAR-T細胞療法需要用於降低發生GvHD之風險的方法。
本文認識到需要改良的CAR-T細胞療法及產生工程化CAR-T細胞之方法。本文所提供之組合物及方法可產生工程化CAR-T細胞且消除CAR介導之T細胞自殺或自相殘殺。本文所提供之組合物及方法亦可降低發生移植物抗宿主疾病(GvHD)之風險。
在一態樣中，本發明提供一種工程化免疫細胞，其包含：(a)第一核酸序列，其編碼連接至(ii)合成定位域的(i)結合至T細胞受體(TCR)複合物之次單元之域；(b)第二核酸序列，其編碼嵌合抗原受體(CAR)；(c)第三核酸序列，其編碼連接至合成表面多肽定位域之表面多肽結合域；且其中該工程化免疫細胞包含的該第一核酸序列多達該第二核酸序列或該第三核酸序列之至少兩倍。
在一些實施例中，該TCR複合物之該次單元為CD3ε。在一些實施例中，該合成定位域包含ER滯留信號。在一些實施例中，該ER滯留信號包含胺基酸序列KDEL。在一些實施例中，該合成定位域進一步包含Myc標籤。
在一些實施例中，該合成定位域進一步包含連接子序列。在一些實施例中，該第一核酸序列在5'至3'方向上包含：編碼結合至該TCR複合物之次單元之該域的序列；編碼Myc標籤之序列；編碼(GGGGS)
4序列之序列；及編碼包含胺基酸序列KDEL之該ER滯留信號之序列。在一些實施例中，該第一核酸序列在5'至3'方向上包含：編碼抗CD3ε抗體之序列；編碼Myc標籤之序列；編碼(GGGGS)
4序列之序列；及編碼包含胺基酸序列KDEL之該ER滯留信號之序列。
在一些實施例中，該第二核酸序列及該第三核酸序列位於同一核酸分子上。
在一些實施例中，該同一核酸分子為載體。
在一些實施例中，該第一核酸序列位於與該第二核酸序列或該第三核酸序列分開的核酸分子上，且其中具有該第一核酸序列之該核酸分子為第一表現載體。
在一些實施例中，本文所描述之工程化免疫細胞進一步包含編碼殺傷基因之第四核酸序列。在一些實施例中，該殺傷基因包含CD20或其衍生物。
在一些實施例中，該第一表現載體進一步包含該第四核酸序列。在一些實施例中，該第一表現載體進一步包含該第一核酸序列與該第四核酸序列之間的核糖體密碼子跳躍位點。
在一些實施例中，該第一表現載體自5'至3'包含啟動子、該第四核酸序列、該核糖體密碼子跳躍位點及該第一核酸序列。在一些實施例中，該核糖體密碼子跳躍位點包含2A自裂解肽。在一些實施例中，該第一表現載體為慢病毒載體。
在一些實施例中，該CAR包含結合至表面多肽之目標結合域。在一些實施例中，該表面多肽為CD7。
在一些實施例中，該表面多肽結合域為第一抗體或其抗原結合域，且該目標結合域為第二抗體或其抗原結合域，且其中該第一抗體之胺基酸序列與該第二抗體之胺基酸序列至少80%一致。
在一些實施例中，該第一抗體及該第二抗體之HC CDR及/或LC CDR之胺基酸序列至少90%一致。
在一些實施例中，該第一抗體包含SEQ ID NO: 47之HC CDR1、SEQ ID NO: 48之HC CDR2、SEQ ID NO: 49之HC CDR3以及SEQ ID NO: 44之輕鏈(LC) CDR1、SEQ ID NO: 45之LC CDR2、SEQ ID NO: 46之LC CDR3。在一些實施例中，該第二抗體包含SEQ ID NO: 47之HC CDR1、SEQ ID NO: 48之HC CDR2、SEQ ID NO: 49之HC CDR3以及SEQ ID NO: 44之輕鏈(LC) CDR1、SEQ ID NO: 45之LC CDR2、SEQ ID NO: 46之LC CDR3。
在一些實施例中，結合至該TCR複合物之該次單元的該域包含抗體或其抗原結合域。在一些實施例中，該抗體為抗CD3ε抗體。在一些實施例中，該抗體為單鏈Fv (scFv)或單域抗體(sdAb)。
在一些實施例中，該抗CD3ε抗體包含SEQ ID NO: 212或215之重鏈互補決定區(HC CDR) 1、SEQ ID NO: 213或216之HC CDR2、SEQ ID NO: 214或217之HC CDR3以及SEQ ID NO: 218或221之輕鏈(LC) CDR1、SEQ ID NO: 219或222之LC CDR2、SEQ ID NO: 220或223之LC CDR3。在一些實施例中，該抗CD3ε抗體包含具有與SEQ ID NO: 114具有至少90%序列一致性之胺基酸序列的重鏈可變域。在一些實施例中，該抗CD3ε抗體包含具有與SEQ ID NO: 115具有至少90%序列一致性之胺基酸序列的輕鏈可變域。在一些實施例中，該抗CD3ε抗體包含與SEQ ID NO: 104具有至少90%序列一致性之胺基酸序列。
在一些實施例中，該載體為第二表現載體，且其中該第二表現載體為雙順反子慢病毒表現載體。在一些實施例中，該第二核酸序列及該第三核酸序列藉由內部核糖體進入位點(IRES)或核糖體密碼子跳躍位點可操作地連接。在一些實施例中，該核糖體密碼子跳躍位點包含2A自裂解肽。
在一些實施例中，該合成定位域或該合成表面多肽定位域包含內質網(ER)滯留序列、高基氏體(Golgi)滯留序列、蛋白酶體定位序列或跨膜域。在一些實施例中，該ER滯留序列包含胺基酸序列KDEL或KKXX，其中X為任何胺基酸。在一些實施例中，該ER滯留序列包含胺基酸序列KDEL，且該第三核酸序列進一步包含編碼偶聯該表面多肽結合域與該合成表面多肽定位域之連接子的序列。在一些實施例中，該合成定位域及該合成表面多肽定位域包含相同的ER滯留序列。
在一些實施例中，該CAR進一步包含跨膜域、4-1BB細胞內信號傳導域及CD3ζ細胞內信號傳導域。在一些實施例中，該TCR複合物及該表面多肽之表面表現在該工程化免疫細胞中下調。
在一些實施例中，該工程化免疫細胞為T細胞。在一些實施例中，該工程化免疫細胞為自然殺手(NK)細胞。
在一態樣中，本發明提供一種工程化免疫細胞，其包含：(a)第一核酸序列，其編碼連接至合成定位域之CD3ε結合域，其中該CD3ε結合域包含SEQ ID NO: 212或215之重鏈互補決定區(HC CDR1)、SEQ ID NO: 213或216之HC CDR2、SEQ ID NO: 214或217之HC CDR3以及SEQ ID NO: 218或221之輕鏈(LC) CDR1、SEQ ID NO: 219或222之LC CDR2、SEQ ID NO: 220或223之LC CDR3；(b)第二核酸序列，其編碼嵌合抗原受體(CAR)；及(c)第三核酸序列，其編碼連接至合成表面多肽定位域之表面多肽結合域。
在一些實施例中，該CD3ε結合域包含具有與SEQ ID NO: 114具有至少90%序列一致性之胺基酸序列的重鏈可變域。在一些實施例中，該CD3ε結合域包含具有與SEQ ID NO: 115具有至少90%序列一致性之胺基酸序列的輕鏈可變域。在一些實施例中，該CD3ε結合域包含與SEQ ID NO: 104具有至少90%序列一致性之胺基酸序列。
在一些實施例中，該合成定位域包含ER滯留信號。在一些實施例中，該ER滯留信號包含胺基酸序列KDEL。在一些實施例中，該合成定位域進一步包含Myc標籤。在一些實施例中，該合成定位域進一步包含連接子序列。
在一些實施例中，該第一核酸序列在5'至3'方向上包含：編碼結合至TCR複合物之次單元之域的序列；編碼Myc標籤之序列；編碼(GGGGS)
4序列之序列；及編碼包含胺基酸序列KDEL之該ER滯留信號之序列。在一些實施例中，該第一核酸序列在5'至3'方向上包含：編碼抗CD3ε抗體之序列；編碼Myc標籤之序列；編碼(GGGGS)
4序列之序列；及編碼包含胺基酸序列KDEL之該ER滯留信號之序列。
在一些實施例中，該第二核酸序列及該第三核酸序列位於同一核酸分子上。在一些實施例中，該同一核酸分子為載體。在一些實施例中，該第一核酸序列位於與該第二核酸序列或該第三核酸序列分開的核酸分子上，且其中具有該第一核酸序列之該核酸分子為第一表現載體。
在一些實施例中，本文所描述之工程化免疫細胞進一步包含編碼殺傷基因之第四核酸序列。在一些實施例中，該殺傷基因包含CD20或其衍生物。在一些實施例中，該第一表現載體進一步包含該第四核酸序列。在一些實施例中，該第一表現載體進一步包含該第一核酸序列與該第四核酸序列之間的核糖體密碼子跳躍位點。在一些實施例中，該第一表現載體自5'至3'包含啟動子、該第四核酸序列、該核糖體密碼子跳躍位點及該第一核酸序列。在一些實施例中，該核糖體密碼子跳躍位點包含2A自裂解肽。在一些實施例中，該第一表現載體為慢病毒載體。
在一些實施例中，該CAR包含結合至表面多肽之目標結合域。在一些實施例中，該表面多肽為CD7。在一些實施例中，該表面多肽結合域為第一抗體或其抗原結合域，且該目標結合域為第二抗體或其抗原結合域，且其中該第一抗體之胺基酸序列與該第二抗體之胺基酸序列至少80%一致。
在一些實施例中，該第一抗體及該第二抗體之HC CDR及/或LC CDR之胺基酸序列至少90%一致。在一些實施例中，該第一抗體包含SEQ ID NO: 47之HC CDR1、SEQ ID NO: 48之HC CDR2、SEQ ID NO: 49之HC CDR3以及SEQ ID NO: 44之輕鏈(LC) CDR1、SEQ ID NO: 45之LC CDR2、SEQ ID NO: 46之LC CDR3。在一些實施例中，該第二抗體包含SEQ ID NO: 47之HC CDR1、SEQ ID NO: 48之HC CDR2、SEQ ID NO: 49之HC CDR3以及SEQ ID NO: 44之輕鏈(LC) CDR1、SEQ ID NO: 45之LC CDR2、SEQ ID NO: 46之LC CDR3。
在一些實施例中，該載體為第二表現載體，且其中該第二表現載體為雙順反子慢病毒表現載體。在一些實施例中，該第二核酸序列及該第三核酸序列藉由內部核糖體進入位點(IRES)或核糖體密碼子跳躍位點可操作地連接。在一些實施例中，該核糖體密碼子跳躍位點包含2A自裂解肽。
在一些實施例中，該合成定位域或該合成表面多肽定位域包含內質網(ER)滯留序列、高基氏體滯留序列、蛋白酶體定位序列或跨膜域。在一些實施例中，該ER滯留序列包含胺基酸序列KDEL或KKXX，其中X為任何胺基酸。在一些實施例中，該ER滯留序列包含胺基酸序列KDEL，且該第三核酸序列進一步包含編碼偶聯該表面多肽結合域與該合成表面多肽定位域之連接子的序列。在一些實施例中，該合成定位域及該合成表面多肽定位域包含相同的ER滯留序列。
在一些實施例中，該CAR進一步包含跨膜域、4-1BB細胞內信號傳導域及CD3ζ細胞內信號傳導域。在一些實施例中，該TCR複合物及該表面多肽之表面表現在該工程化免疫細胞中下調。
在一些實施例中，該工程化免疫細胞為T細胞。在一些實施例中，該工程化免疫細胞為自然殺手(NK)細胞。
在一態樣中，本發明提供一種細胞群體，其包含工程化免疫細胞，其中該等工程化免疫細胞包含：(a)第一核酸序列，其編碼連接至合成定位域的結合至T細胞受體(TCR)複合物之次單元之域；及(b)第二核酸序列，其編碼嵌合抗原受體(CAR)；且其中少於2%之該等細胞在其表面上表現該TCR複合物。
在一些實施例中，該等工程化免疫細胞進一步包含第三核酸序列，其編碼連接至合成表面多肽定位域之表面多肽結合域。
在一些實施例中，該等工程化免疫細胞中之各者包含的該第一核酸序列多達該第二核酸序列或該第三核酸序列之至少兩倍。
在一些實施例中，該第二核酸序列及該第三核酸序列位於同一核酸分子上。在一些實施例中，該同一核酸分子為載體。在一些實施例中，該第一核酸序列位於與該第二核酸序列或該第三核酸序列分開的核酸分子上，且其中具有該第一核酸序列之該核酸分子為第一表現載體。
在一些實施例中，本文所描述之細胞群體進一步包含編碼殺傷基因之第四核酸序列。在一些實施例中，該殺傷基因包含CD20或其衍生物。
在一些實施例中，該第一表現載體進一步包含該第四核酸序列。在一些實施例中，該第一表現載體進一步包含該第一核酸序列與該第四核酸序列之間的核糖體密碼子跳躍位點。在一些實施例中，該第一表現載體自5'至3'包含啟動子、該第四核酸序列、該核糖體密碼子跳躍位點及該第一核酸序列。在一些實施例中，該核糖體密碼子跳躍位點包含2A自裂解肽。
在一些實施例中，該第一表現載體為慢病毒載體。
在一些實施例中，該TCR複合物之該次單元為CD3ε。在一些實施例中，結合至該TCR複合物之該次單元的該域包含抗體或其抗原結合域。在一些實施例中，該抗體為抗CD3ε抗體。在一些實施例中，該抗體為單鏈Fv (scFv)或單域抗體(sdAb)。
在一些實施例中，該抗CD3ε抗體包含SEQ ID NO: 212或215之重鏈互補決定區(HC CDR) 1、SEQ ID NO: 213或216之HC CDR2、SEQ ID NO: 214或217之HC CDR3以及SEQ ID NO: 218或221之輕鏈(LC) CDR1、SEQ ID NO: 219或222之LC CDR2、SEQ ID NO: 220或223之LC CDR3。在一些實施例中，該抗CD3ε抗體包含具有與SEQ ID NO: 114具有至少90%序列一致性之胺基酸序列的重鏈可變域。在一些實施例中，該抗CD3ε抗體包含具有與SEQ ID NO: 115具有至少90%序列一致性之胺基酸序列的輕鏈可變域。在一些實施例中，該抗CD3ε抗體包含與SEQ ID NO: 104具有至少90%序列一致性之胺基酸序列。
在一些實施例中，該等工程化免疫細胞耗盡CD3+細胞。在一些實施例中，該等工程化免疫細胞經歷兩輪或更多輪CD3+細胞耗盡。
在一些實施例中，該合成定位域包含ER滯留信號。在一些實施例中，該ER滯留信號包含胺基酸序列KDEL。在一些實施例中，該合成定位域進一步包含Myc標籤。在一些實施例中，該合成定位域進一步包含連接子序列。
在一些實施例中，該第一核酸序列在5'至3'方向上包含：編碼結合至該TCR複合物之次單元之該域的序列；編碼Myc標籤之序列；編碼(GGGGS)
4序列之序列；及編碼包含胺基酸序列KDEL之該ER滯留信號之序列。在一些實施例中，該第一核酸序列在5'至3'方向上包含：編碼抗CD3ε抗體之序列；編碼Myc標籤之序列；編碼(GGGGS)
4序列之序列；及編碼包含胺基酸序列KDEL之該ER滯留信號之序列。
在一些實施例中，該CAR包含結合至表面多肽之目標結合域。在一些實施例中，該表面多肽為CD7。
在一些實施例中，該表面多肽結合域為第一抗體或其抗原結合域，且該目標結合域為第二抗體或其抗原結合域，且其中該第一抗體之胺基酸序列與該第二抗體之胺基酸序列至少80%一致。在一些實施例中，該第一抗體及該第二抗體之HC CDR及/或LC CDR之胺基酸序列至少90%一致。
在一些實施例中，該第一抗體包含SEQ ID NO: 47之HC CDR1、SEQ ID NO: 48之HC CDR2、SEQ ID NO: 49之HC CDR3以及SEQ ID NO: 44之輕鏈(LC) CDR1、SEQ ID NO: 45之LC CDR2、SEQ ID NO: 46之LC CDR3。在一些實施例中，該第二抗體包含SEQ ID NO: 47之HC CDR1、SEQ ID NO: 48之HC CDR2、SEQ ID NO: 49之HC CDR3以及SEQ ID NO: 44之輕鏈(LC) CDR1、SEQ ID NO: 45之LC CDR2、SEQ ID NO: 46之LC CDR3。
在一些實施例中，該載體為第二表現載體，且其中該第二表現載體為雙順反子慢病毒表現載體。在一些實施例中，該第二核酸序列及該第三核酸序列藉由內部核糖體進入位點(IRES)或核糖體密碼子跳躍位點可操作地連接。在一些實施例中，該核糖體密碼子跳躍位點包含2A自裂解肽。
在一些實施例中，該合成定位域或該合成表面多肽定位域包含內質網(ER)滯留序列、高基氏體滯留序列、蛋白酶體定位序列或跨膜域。在一些實施例中，該ER滯留序列包含胺基酸序列KDEL或KKXX，其中X為任何胺基酸。在一些實施例中，該ER滯留序列包含胺基酸序列KDEL，且該第三核酸序列進一步包含編碼偶聯該表面多肽結合域與該合成表面多肽定位域之連接子的序列。在一些實施例中，該合成定位域及該合成表面多肽定位域包含相同的ER滯留序列。
在一些實施例中，該CAR進一步包含跨膜域、4-1BB細胞內信號傳導域及CD3ζ細胞內信號傳導域。在一些實施例中，該TCR複合物及該表面多肽之表面表現在該工程化免疫細胞中下調。
在一些實施例中，該等工程化免疫細胞為T細胞。在一些實施例中，該等工程化免疫細胞為自然殺手(NK)細胞。
在一態樣中，本發明提供一種雙順反子載體，其包含：(a)第一核苷酸序列，其編碼殺傷基因；及(b)第二核苷酸序列，其編碼連接至定位域之表面多肽結合域。
在一些實施例中，該雙順反子載體在5'至3'方向上包含：轉錄起始位點；編碼該殺傷基因之該第一核苷酸序列；核糖體密碼子跳躍位點；及編碼連接至該定位域之該表面多肽結合域之該第二核苷酸序列。在一些實施例中，該殺傷基因編碼細胞表面抗原。在一些實施例中，該細胞表面抗原為CD20或其衍生物。在一些實施例中，該表面多肽結合域結合至TCR複合物之次單元。在一些實施例中，該次單元為CD3ε。
在一些實施例中，該定位域包含ER滯留信號。在一些實施例中，該ER滯留信號包含胺基酸序列KDEL。在一些實施例中，該定位域進一步包含Myc標籤。在一些實施例中，該定位域進一步包含連接子序列。
在一些實施例中，該第二核苷酸序列在5'至3'方向上包含：編碼該表面多肽結合域之序列；編碼Myc標籤之序列；編碼(GGGGS)
4序列之序列；及編碼包含胺基酸序列KDEL之該ER滯留信號之序列。
在一些實施例中，結合至該TCR複合物之該次單元的該表面多肽結合域包含抗體或其抗原結合域。在一些實施例中，該抗體為抗CD3ε抗體。在一些實施例中，該抗體為單鏈Fv (scFv)或單域抗體(sdAb)。在一些實施例中，該核糖體密碼子跳躍位點包含2A自裂解肽。
在一些實施例中，該雙順反子載體為慢病毒載體。
在一些實施例中，該第一核苷酸序列及該第二核苷酸序列藉由內部核糖體進入位點(IRES)可操作地連接。在一些實施例中，該定位域包含內質網(ER)滯留序列、高基氏體滯留序列、蛋白酶體定位序列或跨膜域。
在一些實施例中，該表面多肽結合域為抗CD3ε抗體或其抗原結合域。在一些實施例中，該抗CD3ε抗體包含SEQ ID NO: 212或215之重鏈互補決定區(HC CDR) 1、SEQ ID NO: 213或216之HC CDR2、SEQ ID NO: 214或217之HC CDR3以及SEQ ID NO: 218或221之輕鏈(LC) CDR1、SEQ ID NO: 219或222之LC CDR2、SEQ ID NO: 220或223之LC CDR3。在一些實施例中，該抗CD3ε抗體包含具有與SEQ ID NO: 114具有至少90%序列一致性之胺基酸序列的重鏈可變域。在一些實施例中，該抗CD3ε抗體包含具有與SEQ ID NO: 115具有至少90%序列一致性之胺基酸序列的輕鏈可變域。在一些實施例中，該抗CD3ε抗體包含與SEQ ID NO: 104具有至少90%序列一致性之胺基酸序列。
在一態樣中，本發明提供一種重組核酸分子，其編碼連接至合成定位域之CD3ε結合域，其中該CD3ε結合域包含SEQ ID NO: 212或215之重鏈互補決定區(HC CDR1)、SEQ ID NO: 213或216之HC CDR2、SEQ ID NO: 214或217之HC CDR3以及SEQ ID NO: 218或221之輕鏈(LC) CDR1、SEQ ID NO: 219或222之LC CDR2、SEQ ID NO: 220或223之LC CDR3，且其中該合成定位域包含長度為至少5個胺基酸之連接子序列及胺基酸序列KDEL。
在一些實施例中，該連接子序列包含(GGGGS)n，其中n為1至10之任何整數。在一些實施例中，該連接子序列包含(GGGGS)4。在一些實施例中，該合成定位域進一步包含Myc標籤。在一些實施例中，該重組核酸分子包含SEQ ID NO: 99之序列。在一些實施例中，本文提供一種工程化免疫細胞，其包含本文所描述之重組核酸分子。
在一態樣中，本發明提供一種產生工程化免疫細胞群體之方法，該方法包含：(a)將以下引入免疫細胞中：(i)第一核酸序列，其編碼連接至(ii)合成定位域的(i)結合至T細胞受體(TCR)複合物之次單元之域；(ii)第二核酸序列，其編碼嵌合抗原受體(CAR)；及(iii)第三核酸序列，其編碼連接至合成表面多肽定位域之表面多肽結合域，藉此產生該工程化免疫細胞群體；及(b)培養該工程化免疫細胞群體；藉此在該工程化免疫細胞群體中表現該CAR且下調該TCR複合物及表面多肽之表面表現；其中該第一核酸序列之量多達該第二核酸序列或該第三核酸序列之量的至少兩倍。
在一些實施例中，該CAR包含結合至表面多肽之目標結合域。在一些實施例中，該表面多肽之該下調防止該工程化免疫細胞群體由於該CAR而自相殘殺。在一些實施例中，該表面多肽包含CD7。
在一些實施例中，該第二核酸序列及該第三核酸序列位於同一核酸分子上。在一些實施例中，該同一核酸分子為雙順反子載體。在一些實施例中，該第一核酸序列位於與該第二核酸序列或該第三核酸序列分開的核酸分子上，且其中該核酸分子為第一載體。
在一些實施例中，引入免疫細胞中包含共轉導包含該第二核酸序列及該第三核酸序列之該雙順反子載體及包含該第一核酸序列之該第一載體。在一些實施例中，引入免疫細胞中包含在轉導包含該第二核酸序列及該第三核酸序列之該雙順反子載體之前0至2天轉導包含該第一核酸序列之該第一載體。
在一些實施例中，該雙順反子載體之感染倍率(MOI)為約10。在一些實施例中，該第一載體之MOI為至少約20。在一些實施例中，該第一載體之MOI為20至40。在一些實施例中，該雙順反子載體之MOI與該第一載體之MOI的比率為至多約1:8。
在一些實施例中，本文所描述之方法進一步包含將編碼殺傷基因之第四核酸序列引入該等免疫細胞中。在一些實施例中，該殺傷基因編碼表面抗原。在一些實施例中，該表面抗原為CD20或其衍生物。
在一些實施例中，本文所描述之方法進一步包含自該工程化免疫細胞群體中耗盡表現該TCR複合物之細胞。
在一些實施例中，本文所描述之方法進一步包含富集表現該表面抗原之細胞，藉此耗盡表現該TCR複合物之細胞。
在一些實施例中，本文所描述之方法進一步包含在耗盡之前富集表現該表面抗原之細胞，藉此產生CD20+TCR-工程化免疫細胞群體。
在一些實施例中，培養該工程化免疫細胞群體包含在該引入與該耗盡之間擴增該工程化免疫細胞群體至少5天。
在一些實施例中，至少95%之該CD20+TCR-工程化免疫細胞群體不表現CD3。在一些實施例中，該TCR複合物之該次單元為CD3ε。在一些實施例中，結合至該TCR複合物之該次單元的該域包含抗體或其抗原結合域。在一些實施例中，該抗體為抗CD3ε抗體。在一些實施例中，該抗體為單鏈Fv (scFv)或單域抗體(sdAb)。
在一些實施例中，該抗CD3ε抗體包含SEQ ID NO: 212或215之重鏈互補決定區(HC CDR) 1、SEQ ID NO: 213或216之HC CDR2、SEQ ID NO: 214或217之HC CDR3以及SEQ ID NO: 218或221之輕鏈(LC) CDR1、SEQ ID NO: 219或222之LC CDR2、SEQ ID NO: 220或223之LC CDR3。在一些實施例中，該抗CD3ε抗體包含具有與SEQ ID NO: 104具有至少90%序列一致性之胺基酸序列的重鏈可變域。在一些實施例中，該抗CD3ε抗體包含具有與SEQ ID NO: 105具有至少90%序列一致性之胺基酸序列的輕鏈可變域。在一些實施例中，該抗CD3ε抗體包含與SEQ ID NO: 104具有至少90%序列一致性之胺基酸序列。
在一些實施例中，該合成定位域包含ER滯留信號。在一些實施例中，該ER滯留信號包含胺基酸序列KDEL。在一些實施例中，該合成定位域進一步包含Myc標籤。在一些實施例中，該合成定位域進一步包含連接子序列。
在一些實施例中，該第一載體進一步包含該第四核酸序列。在一些實施例中，該第一載體自5'至3'包含啟動子、該第四核酸序列、核糖體密碼子跳躍位點及該第一核酸序列。在一些實施例中，該核糖體密碼子跳躍位點包含2A自裂解肽。
在一些實施例中，該第一載體為慢病毒載體。
在一些實施例中，該表面多肽結合域為第一抗體或其抗原結合域，且該目標結合域為第二抗體或其抗原結合域，且其中該第一抗體之胺基酸序列與該第二抗體之胺基酸序列至少80%一致。在一些實施例中，該第一抗體及該第二抗體之HC CDR及/或LC CDR之胺基酸序列至少90%一致。
在一些實施例中，該第一抗體包含SEQ ID NO: 47之HC CDR1、SEQ ID NO: 48之HC CDR2、SEQ ID NO: 49之HC CDR3以及SEQ ID NO: 44之輕鏈(LC) CDR1、SEQ ID NO: 45之LC CDR2、SEQ ID NO: 46之LC CDR3。在一些實施例中，該第二抗體包含SEQ ID NO: 47之HC CDR1、SEQ ID NO: 48之HC CDR2、SEQ ID NO: 49之HC CDR3以及SEQ ID NO: 44之輕鏈(LC) CDR1、SEQ ID NO: 45之LC CDR2、SEQ ID NO: 46之LC CDR3。
在一些實施例中，該第二核酸序列及該第三核酸序列藉由內部核糖體進入位點(IRES)或核糖體密碼子跳躍位點可操作地連接。在一些實施例中，該核糖體密碼子跳躍位點包含2A自裂解肽。在一些實施例中，該合成定位域或該合成表面多肽定位域包含內質網(ER)滯留序列、高基氏體滯留序列、蛋白酶體定位序列或跨膜域。在一些實施例中，該ER滯留序列包含胺基酸序列KDEL或KKXX，其中X為任何胺基酸。在一些實施例中，該ER滯留序列包含胺基酸序列KDEL，且該第三核酸序列進一步包含編碼偶聯該表面多肽結合域與該合成表面多肽定位域之連接子的序列。在一些實施例中，該合成定位域及該合成表面多肽定位域包含相同的ER滯留序列。
在一些實施例中，該CAR進一步包含跨膜域、4-1BB細胞內信號傳導域及CD3ζ細胞內信號傳導域。在一些實施例中，該TCR複合物及該表面多肽之表面表現在該工程化免疫細胞中下調。
在一些實施例中，該等工程化免疫細胞為T細胞。在一些實施例中，該等工程化免疫細胞為自然殺手(NK)細胞。
在一態樣中，本發明提供一種治療有需要之個體之疾病的方法，該方法包含：投與治療有效量的工程化免疫細胞，其中該等工程化免疫細胞包含：(a)第一核酸序列，其編碼連接至(ii)合成定位域的(i)結合至T細胞受體(TCR)複合物之次單元之域；(b)第二核酸序列，其編碼嵌合抗原受體(CAR)；及(c)第三核酸序列，其編碼連接至合成表面多肽定位域之表面多肽結合域；其中連接至該合成定位域的結合至TCR複合物之該次單元之該域下調該TCR複合物之表面表現，藉此治療該有需要之個體之該疾病。
在一些實施例中，相比於與投與包含該第二核酸序列或該第三核酸序列但不包含該第一核酸序列之其他方面相同之免疫細胞相關的風險，投與該等工程化免疫細胞後該個體中發生移植物抗宿主疾病(GvHD)反應之風險降低。在一些實施例中，該個體患有癌症。
在一些實施例中，該CAR包含結合至CD7之目標結合域。
在一些實施例中，該TCR複合物之該次單元為CD3ε。
在一些實施例中，該等工程化免疫細胞為T細胞或自然殺手(NK)細胞。
在一些實施例中，該癌症包含CD7陽性癌症。
在一些實施例中，該癌症包含急性淋巴母細胞性白血病(T-ALL)、早期T細胞前驅細胞急性淋巴母細胞性白血病(ETP-ALL)、急性骨髓性白血病或T細胞淋巴母細胞性淋巴瘤。
在一些實施例中，該等工程化免疫細胞抑制該個體中之腫瘤細胞生長。
在一些實施例中，結合至該TCR複合物之該次單元的該域包含抗體或其抗原結合域。在一些實施例中，該抗體為抗CD3ε抗體。在一些實施例中，該抗體為單鏈Fv (scFv)或單域抗體(sdAb)。
在一些實施例中，該抗CD3ε抗體包含SEQ ID NO: 212或215之重鏈互補決定區(HC CDR) 1、SEQ ID NO: 213或216之HC CDR2、SEQ ID NO: 214或217之HC CDR3以及SEQ ID NO: 218或221之輕鏈(LC) CDR1、SEQ ID NO: 219或222之LC CDR2、SEQ ID NO: 220或223之LC CDR3。在一些實施例中，該抗CD3ε抗體包含具有與SEQ ID NO: 114具有至少90%序列一致性之胺基酸序列的重鏈可變域。在一些實施例中，該抗CD3ε抗體包含具有與SEQ ID NO: 115具有至少90%序列一致性之胺基酸序列的輕鏈可變域。在一些實施例中，該抗CD3ε抗體包含與SEQ ID NO: 104具有至少90%序列一致性之胺基酸序列。
在一些實施例中，該合成定位域包含ER滯留信號。在一些實施例中，該ER滯留信號包含胺基酸序列KDEL。在一些實施例中，該合成定位域進一步包含Myc標籤。在一些實施例中，該合成定位域進一步包含連接子序列。
在一些實施例中，該第一核酸序列在5'至3'方向上包含：編碼結合至該TCR複合物之次單元之該域的序列；編碼Myc標籤之序列；編碼(GGGGS)
4序列之序列；及編碼包含胺基酸序列KDEL之該ER滯留信號之序列。在一些實施例中，該第一核酸序列在5'至3'方向上包含：編碼抗CD3ε抗體之序列；編碼Myc標籤之序列；編碼(GGGGS)
4序列之序列；及編碼包含胺基酸序列KDEL之該ER滯留信號之序列。
在一些實施例中，該第二核酸序列及該第三核酸序列位於同一核酸分子上。在一些實施例中，該同一核酸分子為載體。在一些實施例中，該第一核酸序列位於與該第二核酸序列或該第三核酸序列分開的核酸分子上，且其中具有該第一核酸序列之該核酸分子為第一表現載體。
在一些實施例中，本文所描述之方法進一步包含編碼殺傷基因之第四核酸序列。在一些實施例中，該殺傷基因包含CD20或其衍生物。在一些實施例中，該第一表現載體進一步包含該第四核酸序列。
在一些實施例中，該第一表現載體進一步包含該第一核酸序列與該第四核酸序列之間的核糖體密碼子跳躍位點。在一些實施例中，該第一表現載體自5'至3'包含啟動子、該第四核酸序列、該核糖體密碼子跳躍位點及該第一核酸序列。在一些實施例中，該核糖體密碼子跳躍位點包含2A自裂解肽。
在一些實施例中，該第一表現載體為慢病毒載體。
在一些實施例中，該表面多肽為CD7。
在一些實施例中，該表面多肽結合域為第一抗體或其抗原結合域，且該目標結合域為第二抗體或其抗原結合域，且其中該第一抗體之胺基酸序列與該第二抗體之胺基酸序列至少80%一致。在一些實施例中，該第一抗體及該第二抗體之HC CDR及/或LC CDR之胺基酸序列至少90%一致。
在一些實施例中，該第一抗體包含SEQ ID NO: 47之HC CDR1、SEQ ID NO: 48之HC CDR2、SEQ ID NO: 49之HC CDR3以及SEQ ID NO: 44之輕鏈(LC) CDR1、SEQ ID NO: 45之LC CDR2、SEQ ID NO: 46之LC CDR3。在一些實施例中，該第二抗體包含SEQ ID NO: 47之HC CDR1、SEQ ID NO: 48之HC CDR2、SEQ ID NO: 49之HC CDR3以及SEQ ID NO: 44之輕鏈(LC) CDR1、SEQ ID NO: 45之LC CDR2、SEQ ID NO: 46之LC CDR3。
在一些實施例中，該載體為第二表現載體，且其中該第二表現載體為雙順反子慢病毒表現載體。
在一些實施例中，該第二核酸序列及該第三核酸序列藉由內部核糖體進入位點(IRES)或核糖體密碼子跳躍位點可操作地連接。在一些實施例中，該核糖體密碼子跳躍位點包含2A自裂解肽。在一些實施例中，該合成定位域或該合成表面多肽定位域包含內質網(ER)滯留序列、高基氏體滯留序列、蛋白酶體定位序列或跨膜域。在一些實施例中，該ER滯留序列包含胺基酸序列KDEL或KKXX，其中X為任何胺基酸。在一些實施例中，該ER滯留序列包含胺基酸序列KDEL，且該第三核酸序列進一步包含編碼偶聯該表面多肽結合域與該合成表面多肽定位域之連接子的序列。在一些實施例中，其中該合成定位域及該合成表面多肽定位域包含相同的ER滯留序列。
在一些實施例中，該CAR進一步包含跨膜域、4-1BB細胞內信號傳導域及CD3ζ細胞內信號傳導域。在一些實施例中，該等工程化免疫細胞為T細胞。在一些實施例中，該等工程化免疫細胞為自然殺手(NK)細胞。
在一態樣中，本發明提供一種在有需要之個體中投與之後耗盡工程化免疫細胞的方法，該方法包含向該個體投與表現以下之工程化免疫細胞群體：(a)對T細胞表面抗原具有特異性之嵌合抗原受體(CAR)；(b)第一蛋白質表現阻斷劑(PEBL)，其下調該T細胞表面抗原之細胞表面表現；(c)第二PEBL，其下調T細胞受體(TCR)複合物之次單元之細胞表面表現；及(d)殺傷蛋白質。
在一些實施例中，該殺傷蛋白質為細胞表面抗原。在一些實施例中，該細胞表面抗原為CD20或其衍生物。在一些實施例中，該殺傷蛋白質為經截短CD20 (CD20t)。在一些實施例中，該CD20t包含SEQ ID NO: 106之胺基酸序列。
在一些實施例中，本文所描述之方法進一步包含向該個體投與利妥昔單抗(rituximab)或奧法木單抗(ofatumumab)以誘導該工程化免疫細胞群體之消除，藉此耗盡該工程化免疫細胞群體。
在一些實施例中，該個體已診斷出患有免疫病狀。在一些實施例中，該個體已診斷出患有T細胞惡性腫瘤。
在一些實施例中，該T細胞表面抗原為CD7。在一些實施例中，該TCR複合物之該次單元為CD3ε。
在一些實施例中，該工程化免疫細胞群體包含T細胞。在一些實施例中，該工程化免疫細胞群體包含自然殺手(NK)細胞。
在一態樣中，本發明提供一種套組，其包含：(a)第一表現載體，其包含編碼連接至(ii)合成定位域的(i)結合至T細胞受體(TCR)複合物之次單元之域的核苷酸序列及編碼殺傷基因之核苷酸序列；及(b)第二表現載體，其包含編碼嵌合抗原受體(CAR)之核苷酸序列及編碼連接至合成表面多肽定位域之表面多肽結合域之核苷酸序列。
在一些實施例中，該第一表現載體或該第二表現載體為反轉錄病毒載體。在一些實施例中，該第一表現載體或該第二表現載體為慢病毒載體。
在一些實施例中，該CAR包含結合至CD7之目標結合域。在一些實施例中，該表面多肽為CD7。在一些實施例中，該TCR複合物之該次單元為CD3ε。
在一些實施例中，編碼連接至(ii)合成定位域的(i)結合至TCR複合物之次單元之該域的該核苷酸序列及編碼該殺傷基因之該核苷酸序列藉由內部核糖體進入位點(IRES)或核糖體密碼子跳躍位點可操作地連接。在一些實施例中，編碼該CAR之該核苷酸序列及編碼連接至該合成表面多肽定位域之該表面多肽結合域之該核苷酸序列藉由內部核糖體進入位點(IRES)或核糖體密碼子跳躍位點可操作地連接。在一些實施例中，該核糖體密碼子跳躍位點包含2A自裂解肽。
在一些實施例中，該第一表現載體及該第二表現載體以至少2:1之比率混合。
相關申請案之交互參考
本申請案主張2022年8月11日申請之美國臨時申請案第63/397,067號、2022年9月20日申請之美國臨時申請案第63/408,228號及2022年11月14日申請之美國臨時申請案第63/425,174號的權益，其中各者之全部內容以全文引用之方式併入本文中。
引言
CAR-T細胞已被開發用於靶向T細胞惡性腫瘤。患有T細胞惡性腫瘤(諸如T細胞急性淋巴母細胞性白血病(T-ALL)及難治性/復發性T-ALL)之患者之T細胞含量偏低或功能異常，其無法產生用於有效工程化之CAR-T細胞的自體T細胞。工程化同種異體CAR-T細胞提供替代的細胞來源，允許在此類患者中進行CAR-T細胞輸注，其目的為在幹細胞移植或自體CAR-T細胞輸注之前誘導此等患者之緩解，且此等患者可提高存活率。同種異體CAR-T細胞存在若干優點，例如，用於工程化之T細胞可選自提供健康T細胞之健康供體；製造過程可經標準化以提供高品質的工程化CAR-T細胞產物；以及所產生的工程化CAR-T細胞產物可在世界各地容易地獲得及分佈給有需要之患者。關於同種異體移植的一個擔憂為被稱為移植物抗宿主疾病(或GvHD)之病狀。在GvHD中，供給細胞將接受者之身體視為外來的，由此攻擊接受者之身體，且此可危及生命。GvHD係由T細胞表面上之T細胞受體(TCR)/CD3介導。
本發明提供工程化免疫細胞，其包含：抗CD7 CAR，其識別且殺死CD7+目標細胞；抗CD7蛋白質表現阻斷劑(CD7 PEBL)，其消除工程化免疫細胞之表面CD7表現以防止自相殘殺或自殺；及抗CD3蛋白質表現阻斷劑(CD3 PEBL)，以避免移植物抗宿主疾病(GvHD)或其症狀。另外，此等工程化免疫細胞可藉由表現殺傷基因而併有另一安全機制，從而在不良事件情況期間自患者消除該等工程化免疫細胞。
本發明提供工程化免疫細胞組合物及方法，其用於在T細胞中共表現誘導自相殘殺之嵌合抗原受體(例如CAR)及下調第一免疫細胞表面蛋白質之第一防自相殘殺蛋白質(例如蛋白質表現阻斷劑(PEBL))以及下調第二免疫細胞表面蛋白質之第二PEBL，從而產生活的靶向T細胞抗原的表現CAR之細胞毒性T淋巴球(CAR-T)。在一些態樣中，CAR及第一PEBL靶向相同的分子，而第二PEBL靶向與CAR及第一PEBL不同的分子。在一些態樣中，單一表現載體包含編碼CAR之核酸及編碼第一PEBL之核酸。在一些情況下，編碼CAR之核酸及編碼第一PEBL之核酸位於雙順反子載體(例如雙順反子反轉錄病毒載體、雙順反子慢病毒載體)中，使得CAR及第一PEBL同時表現。在一些態樣中，編碼CAR之核酸及編碼第一PEBL之核酸藉由內部核糖體進入位點(IRES)或核糖體密碼子跳躍位點可操作地連接。在一些實施例中，該核糖體密碼子跳躍位點包含2A自裂解肽。在一些情況下，編碼CAR之核酸及編碼第一PEBL之核酸處於同一啟動子控制下。在一些情況下，編碼CAR之核酸及編碼第一PEBL之核酸處於不同啟動子控制下。在一些情況下，編碼第二PEBL之核酸位於與包含編碼CAR及第一PEBL之核酸的載體分開的載體中。在一些情況下，編碼第二PEBL之核酸位於包含編碼CAR及第一PEBL之核酸的同一載體中。在一些情況下，編碼CAR、第一PEBL及第二PEBL之核酸位於不同載體中。在一些情況下，編碼第二PEBL之核酸位於第二反轉錄病毒載體或慢病毒載體中。在一些實施例中，第二反轉錄病毒載體或慢病毒載體進一步包含殺傷基因。在一些實施例中，編碼第二PEBL及殺傷基因之核酸位於包含編碼CAR及第一PEBL之核酸的同一載體中。
在一些態樣中，編碼第二PEBL之核酸及編碼殺傷基因之核酸藉由內部核糖體進入位點(IRES)或核糖體密碼子跳躍位點可操作地連接。在一些實施例中，該核糖體密碼子跳躍位點包含2A自裂解肽。在一些情況下，編碼第二PEBL之核酸及編碼殺傷基因之核酸處於同一啟動子控制下。在一些情況下，編碼第二PEBL之核酸及編碼殺傷基因之核酸處於不同啟動子控制下。
在一些情況下，其中編碼第二PEBL之核酸位於與包含編碼CAR及第一PEBL之核酸的載體分開的載體中，該兩個載體可同時引入。在一些情況下，其中編碼第二PEBL之核酸位於與包含編碼CAR及第一PEBL之核酸的載體分開的載體中，該兩個載體可依序引入。在一些情況下，其中編碼第二PEBL之核酸位於與包含編碼CAR及第一PEBL之核酸的載體分開的載體中，編碼CAR及第一PEBL之載體在編碼第二PEBL之載體之前引入。在一些情況下，其中編碼第二PEBL之核酸位於與包含編碼CAR及第一PEBL之核酸的載體分開的載體中，編碼CAR及第一PEBL之載體在編碼第二PEBL之載體之後引入。
在一些情況下，其中編碼第二PEBL及殺傷基因之核酸位於與包含編碼CAR及第一PEBL之核酸的載體分開的載體中，該兩個載體可同時引入。在一些情況下，其中編碼第二PEBL及殺傷基因之核酸位於與包含編碼CAR及第一PEBL之核酸的載體分開的載體中，該兩個載體可依序引入。在一些情況下，其中編碼第二PEBL及殺傷基因之核酸位於與包含編碼CAR及第一PEBL之核酸的載體分開的載體中，編碼CAR及第一PEBL之載體在編碼第二PEBL及殺傷基因之載體之前引入。在一些情況下，其中編碼第二PEBL及殺傷基因之核酸位於與包含編碼CAR及第一PEBL之核酸的載體分開的載體中，編碼CAR及第一PEBL之載體在編碼第二PEBL及殺傷基因之載體之後引入。
在一些情況下，其中編碼CAR、第一PEBL及第二PEBL之核酸位於不同載體中，該等不同載體可同時引入。在一些情況下，其中編碼CAR、第一PEBL及第二PEBL之核酸位於不同載體中，該等不同載體可依序引入。
在一些情況下，其中編碼CAR、第一PEBL、殺傷基因及第二PEBL之核酸位於不同載體中，該等不同載體可同時引入。在一些情況下，其中編碼CAR、第一PEBL、殺傷基因及第二PEBL之核酸位於不同載體中，該等不同載體可依序引入。
在一些情況下，工程化免疫細胞包含CAR及靶向免疫細胞標記多肽(例如，CD7等)之第一PEBL以及靶向免疫細胞受體多肽(例如，T細胞受體複合物CD3等)之第二PEBL。因此，本文所描述之內容包括針對CD7的表現CAR之抗自相殘殺CAR-T細胞，且此類CAR-T細胞具有減少的或沒有CD7以及T細胞受體複合物蛋白質(例如CD3)之表面表現。在一些情況下，本發明部分地基於使用雙順反子構築體(諸如雙順反子病毒載體)共表現針對CD7之嵌合抗原受體(CAR)及針對CD7之蛋白質表現阻斷劑(PEBL)且在單獨載體中表現針對免疫細胞(例如T細胞)中之CD3之另一蛋白質表現阻斷劑(PEBL)。在一些情況下，針對CD7之嵌合抗原受體(CAR)、針對CD7之蛋白質表現阻斷劑(PEBL)及針對免疫細胞(例如T細胞)中之免疫細胞受體(例如CD3)之蛋白質表現阻斷劑(PEBL)的共表現可藉由使用具有三重轉殖基因(CAR、第一PEBL及第二PEBL)之載體來達成。在一些情況下，三個轉殖基因之表現由偶聯至該等轉殖基因之單獨啟動子驅動。在一些情況下，CAR及第一PEBL之表現由第一啟動子驅動，且第二PEBL之表現由第二啟動子驅動。
在一些情況下，工程化免疫細胞包含CAR、靶向免疫細胞標記多肽(例如，CD7等)之第一PEBL、靶向免疫細胞受體多肽(例如，T細胞受體複合物CD3等)之第二PEBL及殺傷基因(例如，CD20或經截短CD20)。因此，本文所描述之內容包括針對CD7的表現CAR及CD20或經截短CD20之抗自相殘殺CAR-T細胞，且此類CAR-T細胞具有減少的或沒有CD7以及T細胞受體複合物蛋白質(例如CD3)之表面表現。在一些情況下，本發明部分地基於使用雙順反子構築體(諸如雙順反子病毒載體)共表現針對CD7之嵌合抗原受體(CAR)及針對CD7之蛋白質表現阻斷劑(PEBL)且在另一單獨雙順反子載體中共表現針對免疫細胞(例如T細胞)中之CD3之另一蛋白質表現阻斷劑(PEBL)以及殺傷基因(例如，CD20或經截短CD20 (CD20t))。在一些情況下，針對CD7之嵌合抗原受體(CAR)、針對CD7之蛋白質表現阻斷劑(PEBL)、針對免疫細胞(例如T細胞)中之免疫細胞受體(例如，CD3)之蛋白質表現阻斷劑(PEBL)及殺傷基因(例如，CD20或經截短CD20 (CD20t))的共表現可藉由使用具有四重轉殖基因(CAR、第一PEBL、殺傷基因及第二PEBL)之載體來達成。在一些情況下，四個轉殖基因之表現由偶聯至該等轉殖基因之單獨啟動子驅動。在一些情況下，CAR及第一PEBL之表現由第一啟動子驅動，且殺傷基因及第二PEBL之表現由第二啟動子驅動。
在一個態樣中，本發明係關於一種工程化免疫細胞(例如工程化T細胞(PCART7-CD3PEBL(allo-PCART7))，其包含：i)雙順反子構築體，其包含編碼抗CD7 CAR之聚核苷酸序列及編碼抗CD7 PEBL之聚核苷酸序列；及ii)另一構築體，其包含編碼抗CD3 PEBL之聚核苷酸序列。在一些實施例中，第二構築體為包含編碼殺傷基因或自殺基因之聚核苷酸序列及編碼CD3 PEBL之聚核苷酸序列的另一雙順反子構築體，且此等工程化免疫細胞可為工程化T細胞(allo-PCART7
KG)。在一些實施例中，CAR包含細胞內信號傳導域4-1BB及CD3ζ以及特異性結合CD7之抗體(例如，單鏈可變片段或scFv)。本發明之CD7 CAR在本文中有時被稱作「抗CD7-41BB-CD3ζ」。在一些實施例中，CAR亦包括CD8α鉸鏈及跨膜域。在一些實施例中，抗CD7 PEBL包含特異性結合CD7之抗體(例如scFv)及細胞內定位序列。在某些實施例中，抗CD7 PEBL包含特異性結合CD7之抗體(例如scFv)、CD8α鉸鏈及跨膜域以及細胞內定位序列。
CD7為一種40 kDa I型跨膜醣蛋白，其為T細胞惡性腫瘤之主要標記物，且其在所有T細胞ALL病例中高度表現，包括早期T細胞前驅細胞急性淋巴母細胞性白血病(ETP-ALL)。抗CD7 CAR可誘導T細胞針對T細胞惡性腫瘤發揮特異性細胞毒性。此外，當抗CD7 CAR與效應T細胞上CD7表現之下調組合使用時，T細胞之細胞毒性顯示顯著增加。T細胞中之CD7經由表現抗CD7 PEBL達成之下調(例如消除、減少及/或重定位)防止相應抗CD7 CAR發揮之自相殘殺效應。此引起與滯留目標抗原(例如CD7)之細胞相比更高的CAR表現後T細胞回收，以及針對T白血病/淋巴瘤細胞之更有效細胞毒性。在一些情況下，抗CD3 PEBL包含特異性結合CD3之抗體(例如scFv)及細胞內定位序列。在某些實施例中，抗CD3 PEBL包含特異性結合CD3之抗體(例如scFv)。在一些情況下，CD3結合域包含來源於純系OKT3或純系UCHT1之抗CD3抗體之一部分或片段。在一些情況下，CD3結合域包含源自來源於純系OKT3或純系UCHT1之抗CD3抗體之結合序列。
T細胞受體(TCR)為存在於T細胞表面上之蛋白質複合物。人類T細胞具有四個TCR基因：TCRα、TCRβ、TCRγ及TCRδ，其形成兩種不同異二聚體：TCRα/TCRβ或TCRγ/TCRδ。大部分成熟T細胞表現TCRα及TCRβ同功異型物，且此等類型之T細胞通常被稱為αβ T細胞。相對而言，小部分(0.5-5%) T細胞表現TCRγ及TCRδ同功異型物，且其被稱為γδ T細胞。TCRα/TCRβ或TCRγ/TCRδ異二聚體均與CD3 δ、γ、ε及ζ鏈形成多蛋白質複合物(TCR-CD3複合物)。此等CD3蛋白質經由非共價疏水相互作用與TCR締合，且可能係細胞表面上之完整TCR定位所必需的。T細胞之此TCR-CD3複合物在將抗原識別與若干細胞內信號轉導路徑耦合方面發揮重要作用，且其為T細胞發育及活化針對外來抗原之免疫反應的主要決定因素，其可觸發GvHD。(參見例如Shah K等人 Signal Transduction and Targeted Therapy. 6:412, 2021；Kamiya T等人 Blood Adv. 2(5):517-528, 2018)。
由於內源性TCR-CD3複合物之表現存在GvHD之風險，因此藉由使用針對CD3之蛋白質表現阻斷劑(PEBL)消除表面TCRαβ可阻斷表面CD3及TCRαβ表現，從而降低GvHD之風險。具有抗CD7 PEBL及抗CD3 PEBL之雙重表現的抗CD7 CAR T細胞(在本文中有時被稱為「PCART7-CD3PEBL」或「allo-PCART7」)不僅具有較小的自相殘殺效應，且亦降低介導GvHD之風險。
殺傷基因或自殺基因係在活化後藉由經由細胞過程(諸如細胞凋亡或壞死)或藉由其他機制(諸如活化免疫反應中之效應細胞)殺死自身來誘導細胞死亡的基因。自殺基因之活化可使用最終導致細胞死亡之特定藥劑(例如抗體或醫藥化合物)進行。在一些情況下，殺傷基因包含CD20、p53蛋白、誘導型凋亡蛋白酶9 (iCasp9)、單純疱疹病毒酪胺酸激酶(HSV-TK)、人類胸苷酸激酶(TMPK)、表皮生長因子受體(EGFR)或其衍生物。在一些實施例中，自殺基因包含CD20、其衍生物或其一部分(例如，其功能片段)。在一些實施例中，自殺基因包含經修飾之CD20。在一些實施例中，自殺基因包含經截短CD20。在一些實施例中，CD20為人類CD20。在一些情況下，人類CD20呈經截短CD20形式。在一些情況下，工程化免疫細胞(例如allo-PCART7細胞)在細胞表面上進一步表現殺傷基因，例如經截短CD20。
定義
除非另外定義，否則本文所使用之所有技術及科學術語均具有與一般熟習本發明所屬技術者通常所理解相同的含義。儘管與本文所描述之方法及材料類似或等效的任何方法及材料可用於實踐本發明之測試，但本文描述較佳材料及方法。在描述及主張本發明時，將使用以下術語。
亦應理解，本文所使用之術語僅出於描述特定實施例之目的，且不意欲為限制性的。
冠詞「一(a)」及「一(an)」在本文中用以指代冠詞之一個或多於一個(亦即，至少一個)文法對象。舉例而言，「一要素」意謂一個要素或多於一個要素。
如本文所使用，有關參考數值及其文法等效物之術語「約」及其文法等效詞可包括該值加或減10%的一系列值。舉例而言，量「約10」包括9至11之量。有關參考數值之術語「約」亦可包括該值加或減10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%或1%的一系列值。
如本文所使用，術語「核酸」係指包含多個核苷酸單體(例如核糖核苷酸單體或去氧核糖核苷酸單體)之聚合物。「核酸」包括例如基因體DNA、cDNA、RNA及DNA-RNA雜交分子。核酸分子可為天然存在、重組或合成的。另外，核酸分子可為單股、雙股或三股的。在某些實施例中，核酸分子可經修飾。在雙股聚合物的情況下，「核酸」可指分子之任一或兩個股。如本文所使用，核酸及聚核苷酸可互換。
關於核酸之術語「核苷酸序列」係指藉由共價鍵連接的一系列連續核苷酸，該等共價鍵諸如磷鍵(例如磷酸二酯、烷基膦酸酯及芳基膦酸酯、硫代磷酸酯、磷酸三酯鍵)及/或非磷鍵(例如肽及/或胺基磺酸酯鍵)。在某些實施例中，編碼例如連接至定位域之目標結合分子之核苷酸序列為異源序列(例如，具有不同物種或細胞類型來源之基因)。
術語「核苷酸」及「核苷酸單體」係指天然存在之核糖核苷酸或去氧核糖核苷酸單體，以及其非天然存在之衍生物及類似物。因此，核苷酸可包括例如包含天然存在之鹼基(例如腺苷、胸苷、鳥苷、胞苷、尿苷、肌苷、去氧腺苷、去氧胸苷、去氧鳥苷或去氧胞苷)的核苷酸及包含此項技術中已知之經修飾鹼基的核苷酸。
術語「可操作地連接」係指調控序列與異源核酸序列之間的功能連接，其引起異源核酸序列之表現。舉例而言，當第一核酸序列與第二核酸序列以功能關係置放時，該第一核酸序列與該第二核酸序列可操作地連接。舉例而言，若啟動子影響編碼序列之轉錄或表現，則該啟動子可操作地連接至該編碼序列。一般而言，可操作地連接之DNA序列為連續的，且在需要連接兩個蛋白質編碼區時，位於同一閱讀框架中。
術語「序列一致性」意謂兩個核苷酸序列或兩個胺基酸序列在諸如藉由程式GAP或BESTFIT使用預設空位權重進行最佳比對時具有例如至少70%序列一致性、或至少80%序列一致性、或至少85%序列一致性、或至少90%序列一致性、或至少95%序列一致性、或更高序列一致性。對於序列比較，通常一個序列充當與測試序列進行比較之參考序列(例如親本序列)。當使用序列比較演算法時，將測試序列及參考序列輸入電腦，必要時指定子序列座標，且指定序列演算法程式參數。接著，序列比較演算法基於所指定之程式參數來計算測試序列相對於參考序列之序列一致性百分比。
可例如藉由以下方法來進行序列之最佳比對以進行比較：Smith及Waterman,
Adv. Appl. Math.2:482 (1981)之局部同源演算法；Needleman及Wunsch,
J. Mol. Biol.48:443 (1970)之同源比對演算法；Pearson及Lipman,
Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA85:2444 (1988)之相似性搜尋方法；此等演算法之電腦化實施方案(Wisconsin Genetics套裝軟體中之GAP、BESTFIT、FASTA及TFASTA, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, Wis.)；或目視檢查(通常參見Ausubel等人,
Current Protocols in Molecular Biology)。適用於測定序列一致性及序列相似性百分比之演算法的一個實例為BLAST演算法，其描述於Altschul等人,
J. Mol. Biol.215:403 (1990)中。用於進行BLAST分析之軟體可經由國家生物技術資訊中心(National Center for Biotechnology Information)公開獲取(經由國家衛生研究院NCBI網際網路伺服器公開訪問)。通常，可使用預設程式參數來進行序列比較，但亦可使用自訂參數。對於胺基酸序列，BLASTP程式使用如下預設值：字長(W)為3，期望值(E)為10，及BLOSUM62計分矩陣(參見Henikoff及Henikoff,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA89:10915 (1989))。
如熟習此項技術者將理解，在一些態樣中，核酸進一步包含質體序列。質體序列可包括例如啟動子序列、選擇標記物序列或基因座靶向序列之一或多個序列。
如本文所使用，術語「啟動子」或「啟動子元件」定義為由細胞之合成機制或引入之合成機制識別的DNA序列，其可有助於起始聚核苷酸序列之特異性轉錄。
術語「反轉錄病毒載體」可指γ反轉錄病毒載體。反轉錄病毒載體可包括例如啟動子、包裝信號、引子結合位點(PBS)、一或多個(例如兩個)長末端重複序列(LTR)及所關注聚核苷酸，例如編碼CAR之聚核苷酸及編碼PEBL之聚核苷酸。反轉錄病毒載體可能缺乏病毒結構基因，諸如gag、pol及env。例示性反轉錄病毒(例如γ反轉錄病毒)載體包括鼠類胚胎幹細胞病毒(MESV)、鼠類幹細胞病毒(MSCV)、鼠類白血病病毒(MLV)、脾病灶形成病毒(SFFV)及骨髓增生性肉瘤病毒(MPSV)，以及自其衍生之載體。其他γ反轉錄病毒載體描述於例如Maetzig等人,
Viruses, 2011; 3(6): 677-713中。
術語「雙順反子表現」通常藉由將本文所描述之聚核苷酸可操作地連接至啟動子且將雙順反子構築體併入表現載體中來達成。該等載體可適用於複製及整合真核生物。典型選殖載體含有轉錄及轉譯終止子、起始序列及適用於調控所需核酸序列之表現的啟動子。核酸可選殖至許多類型之載體中。舉例而言，核酸可選殖至包括(但不限於)質體、噬菌粒、噬菌體衍生物、動物病毒及黏質體之載體中。尤其受關注之載體包括表現載體、複製載體、探針產生載體及定序載體。
「表現載體」係指包含重組聚核苷酸之載體，該重組聚核苷酸包含可操作地連接至待表現之核苷酸序列的表現控制序列。表現載體包含足夠順式作用元件用於表現；用於表現之其他元件可由宿主細胞供應或在活體外表現系統中。表現載體包括此項技術中已知之所有表現載體，諸如併有重組聚核苷酸之黏質體、質體(例如裸露或含於脂質體中)及病毒(例如慢病毒、反轉錄病毒、腺病毒及腺相關病毒)。
此外，表現載體可以病毒載體形式提供至細胞。病毒載體技術為此項技術中眾所周知的且描述於例如Sambrook等人, 2012, MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 第1至4卷, Cold Spring Harbor Press, NY)及其他病毒學與分子生物學手冊中。適用作載體之病毒包括但不限於反轉錄病毒、腺病毒、腺相關病毒、疱疹病毒及慢病毒。一般而言，適合載體含有在至少一種生物體中起作用的複製起點、啟動子序列、適宜的限制性核酸內切酶位點及一或多種可選標記物(例如WO 01/96584；WO 01/29058；及美國專利第6,326,193號)。
其他啟動子元件(例如，強化子)調控轉錄起始頻率。通常，此等元件位於起始位點上游30至110 bp區域中，但許多啟動子已顯示亦含有起始位點下游之功能元件。啟動子元件之間的間距通常為靈活的，因此當元件相對彼此倒置或移動時保有啟動子功能。在胸苷激酶(tk)啟動子中，啟動子元件之間的間距可在活性開始下降之前增加至相隔50 bp。視啟動子而定，個別元件似乎可協作地或獨立地起作用以活化轉錄。例示性啟動子包括即刻早期巨細胞病毒(CMV)、EF-1α、泛素C或磷酸甘油酸激酶(PGK)啟動子。可使用能夠驅動與其可操作地連接之任何聚核苷酸序列之高表現量的強組成型啟動子序列。可使用其他組成型啟動子序列，包括(但不限於)猿猴病毒40 (SV40)早期啟動子、小鼠乳房腫瘤病毒(MMTV)、人類免疫缺乏病毒(HIV)長末端重複序列(LTR)啟動子、MoMuLV啟動子、禽類白血病病毒啟動子、埃-巴二氏病毒(Epstein-Barr virus)即刻早期啟動子、勞氏肉瘤病毒(Rous sarcoma virus)啟動子以及人類基因啟動子，諸如(但不限於)肌動蛋白啟動子、肌球蛋白啟動子、延伸因子-1及其類似者。在一些實施例中，啟動子為誘導型啟動子，提供分子開關，其能夠在需要此類表現時開啟與其可操作地連接之聚核苷酸序列之表現，或在不需要表現時關閉表現。誘導型啟動子之實例包括(但不限於)金屬硫蛋白啟動子、糖皮質激素啟動子、孕酮啟動子及四環素啟動子。
如本文所使用，「抗體」意謂完整抗體或抗體之抗原結合片段，包括經修飾或工程化或者為人類抗體之完整抗體或抗原結合片段。經修飾或工程化之抗體之實例為嵌合抗體、人源化抗體、多互補位抗體(例如雙互補位抗體)及多特異性抗體(例如雙特異性抗體)。抗原結合片段之實例包括Fab、Fab'、F(ab')
2、Fv、單鏈抗體(例如scFv)、微型抗體及雙功能抗體。
當提及蛋白質或肽時，術語「特異性(或選擇性)結合」或「對……具有特異性(或選擇性)免疫反應性」係指通常在異源蛋白質群體及其他生物製劑中決定蛋白質之存在的結合反應。因此，在指定免疫分析條件下，指定抗體結合至特定蛋白質，此為背景之至少兩倍且更通常為背景之超過10至100倍。在此類條件下與抗體之特異性結合需要根據針對特定蛋白質之特異性選擇的抗體。舉例而言，多株抗體可經選擇以僅獲得對所選抗原且不對其他蛋白質具有特異性免疫反應性的多株抗體。此選擇可藉由減去與其他分子交叉反應之抗體來達成。各種免疫分析型式可用於選擇對特定蛋白質具有特異性免疫反應性之抗體。舉例而言，常規地使用固相ELISA免疫分析來選擇對蛋白質具有特異性免疫反應性的抗體(關於可用於確定特異性免疫反應性之免疫分析型式及條件的描述，參見例如Harlow及Lane, Using Antibodies, A Laboratory Manual (1998))。
在某些實施例中，結合CD7之抗體為單鏈可變片段抗體(「scFv抗體」)。scFv係指包含抗體之VH及VL域之抗體片段，其中此等域存在於單一多肽鏈中。一般而言，Fv多肽進一步包含VH與VL域之間的多肽連接子，其使得scFv能夠形成用於抗原結合之所需結構。關於scFv之綜述，參見Pluckthun (1994)
The Pharmacology Of Monoclonal Antibodies, 第113卷, Rosenburg及Moore編 Springer-Verlag, New York, 第269至315頁。亦參見PCT公開案第WO 88/01649號以及美國專利第4,946,778號及第5,260,203號。如熟習此項技術者將理解，可設計及測試各種適合的連接子以獲得最佳功能，如此項技術中所提供及如本文所揭示。
如本文所使用，「工程化」免疫細胞包括與天然存在之免疫細胞相比經過遺傳修飾之免疫細胞。舉例而言，根據本發明方法產生之工程化T細胞攜帶包含並非天然存在於其來源之T細胞中之核苷酸序列的核酸，諸如本文所例示之核酸。
如本文所使用，「實質上經純化之」細胞為基本上不含其他細胞類型之細胞。實質上經純化之細胞亦指已與在其天然存在之狀態下通常與其相關之其他細胞類型分離的細胞。在一些情況下，實質上經純化之細胞群體係指均質細胞群體。在其他情況下，此術語僅指已與在其天然狀態下與其天然相關之細胞分離的細胞。在一些實施例中，細胞在活體外培養。在其他實施例中，細胞不在活體外培養。
如本文所使用，「CD7 CAR+/CD7陰性」T細胞係指表現針對人類CD7之嵌合抗原受體且具有低水準或沒有內源CD7表面表現的T細胞。在一些情況下，「CD7 CAR+/CD7陰性」T細胞係指「PCART7」細胞。在一些實施例中，低水準或沒有內源CD7表面表現係歸因於針對人類CD7之PEBL之表現，其防止或阻礙內源CD7蛋白質易位至T細胞之表面。在一些情況下，CD7之表面表現可使用此項技術者已知之標準方法測定，諸如(但不限於)免疫細胞化學法、流式細胞分析技術或FACS。
如本文所使用，「PCART7-CD3PEBL」T細胞係指表現針對人類CD7之嵌合抗原受體且具有低水準或沒有內源CD7及CD3表面表現的T細胞。在一些情況下，「PCART7-CD3PEBL」T細胞係指「同種異體PCART7」或「allo-PCART7」細胞。在一些實施例中，低水準或沒有內源CD7及CD3表面表現係歸因於針對人類CD7之PEBL及針對人類CD3之另一PEBL之表現，其分別防止或阻礙內源CD7蛋白質及內源CD3蛋白質易位至T細胞之表面。在一些情況下，CD7及CD3之表面表現可使用此項技術者已知之標準方法測定，諸如(但不限於)免疫細胞化學法、流式細胞分析技術或FACS。
如本文所使用，「allo-PCART7
KG」T細胞係指表現針對人類CD7之嵌合抗原受體、具有低水準或沒有內源CD7及CD3表面表現且表現殺傷基因或自殺基因的T細胞。在一些實施例中，低水準或沒有內源CD7及CD3表面表現係歸因於針對人類CD7之PEBL及針對人類CD3之另一PEBL之表現，其分別防止或阻礙內源CD7蛋白質及內源CD3蛋白質易位至T細胞之表面。在一些實施例中，殺傷基因為CD20。在一些情況下，CD7、CD3及CD20之表面表現可使用此項技術者已知之標準方法測定，諸如(但不限於)免疫細胞化學法、流式細胞分析技術或FACS。
如本文所使用，術語「自體」及其文法等效詞可指來源於同一存在。舉例而言，樣品(例如細胞)可經取出、處理且在稍後時間返回給同一個體(例如患者)。自體方法與同種異體方法不同，在同種異體方法中供體及接受者為不同個體。
「同種異體」係指來源於同一物種之不同動物的移植物。
如本文所使用，術語「治療(treat)」、「治療(treating)」或「治療(treatment)」係指抵抗醫學病狀(例如，與T細胞惡性腫瘤相關之病狀)，達到該醫學病狀根據臨床上可接受之標準得到改善的程度。
如本文所使用，「個體」係指哺乳動物(例如人類、非人類靈長類動物、牛、綿羊、山羊、馬、狗、貓、兔、天竺鼠、大鼠、小鼠)。在某些實施例中，個體為人類。「有需要之個體」係指患有或有風險出現疾病或病狀之個體(例如患者)，該疾病或病狀可藉由誘導T細胞發揮針對惡性T細胞之特異性細胞毒性來治療(例如改良、改善、預防)。
如本文所定義，「治療量」係指當向個體投與時足以在投與條件下在個體中達成所需治療效果(治療與T細胞惡性腫瘤相關之病狀)的量。待投與藥劑之有效量可由一般技術之臨床醫師使用本文所提供之指導及此項技術中已知之其他方法來確定，且取決於若干因素，包括例如所選擇的特定藥劑、個體年齡、敏感性、藥物耐受性及整體健康狀況。
如本文所使用，「殺傷基因」或「自殺基因」係指在活化後，將藉由自身(例如自我誘導之細胞凋亡)或藉由其他機制(例如效應細胞介導之免疫反應、補體依賴性細胞毒性、抗體依賴性細胞毒性等)誘導細胞死亡的基因。殺傷基因之活化可使用例如抗體或藥物之試劑進行，且此引起細胞死亡。
如本文所使用，「感染倍率(MOI)」係指感染培養基中試劑(例如病毒粒子)之數目與感染目標(例如宿主細胞)之數目的比率。MOI可影響轉導或感染。對於構築體，較高MOI可達成較高轉導率。
如本文所使用，「載體拷貝數(VCN)」係指宿主細胞內試劑(例如病毒粒子)之數目。舉例而言，VCN為1可指單個病毒粒子轉導且整合至單個宿主細胞之基因體中。
實施例之詳細描述
如下文詳細描述，抗CD7 CAR (亦稱為「CD7 CAR」)可包含基於TH69抗體的靶向CD7之抗原結合域。在一些實施例中，CD7 CAR之抗原結合域係基於3A1F抗體。在一些實施例中，CD7 CAR之抗原結合域係基於T3-3A1抗體。在一些實施例中，本發明之CD7 CAR包含選自由SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30及SEQ ID NO:31組成之群的胺基酸序列。在一些實施例中，CD7 CAR包含與選自由SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30及SEQ ID NO:31組成之群的胺基酸序列具有至少90%序列一致性的胺基酸序列。在一些情況下，本發明之工程化免疫細胞包含SEQ ID NO:28之CD7 CAR。在一些情況下，工程化免疫細胞包含與SEQ ID NO:28具有至少90%序列一致性之CD7 CAR。在一些情況下，工程化免疫細胞包含SEQ ID NO:29之CD7 CAR。在一些情況下，工程化免疫細胞包含與SEQ ID NO:29具有至少90%序列一致性之CD7 CAR。在一些情況下，工程化免疫細胞包含SEQ ID NO:30之CD7 CAR。在一些情況下，工程化免疫細胞包含與SEQ ID NO:30具有至少90%序列一致性之CD7 CAR。在一些情況下，工程化免疫細胞包含SEQ ID NO:31之CD7 CAR。在一些情況下，工程化免疫細胞包含與SEQ ID NO:31具有至少90%序列一致性之CD7 CAR。
在一些實施例中，本發明之CD7 PEBL包含選自由SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26及SEQ ID NO:27組成之群的胺基酸序列。在一些實施例中，本發明之CD7 PEBL包含與選自由SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26及SEQ ID NO:27組成之群的胺基酸序列具有至少90%序列一致性的胺基酸序列。在一些情況下，本發明之工程化免疫細胞包含SEQ ID NO: 24之CD7 PEBL。在一些情況下，本發明之工程化免疫細胞包含與SEQ ID NO:24具有至少90%序列一致性之CD7 PEBL。在一些情況下，工程化免疫細胞包含SEQ ID NO: 25之CD7 PEBL。在一些情況下，工程化免疫細胞包含與SEQ ID NO: 25具有至少90%序列一致性之CD7 PEBL。在一些情況下，工程化免疫細胞包含SEQ ID NO: 26之CD7 PEBL。在一些情況下，工程化免疫細胞包含與SEQ ID NO: 26具有至少90%序列一致性之CD7 PEBL。在一些情況下，工程化免疫細胞包含SEQ ID NO: 27之CD7 PEBL。在一些情況下，工程化免疫細胞包含與SEQ ID NO: 27具有至少90%序列一致性之CD7 PEBL。
在一些實施例中，本發明之工程化免疫細胞或工程化免疫細胞群體包含SEQ ID NO: 24之CD7 PEBL及SEQ ID NO:28之CD7 CAR。在一些實施例中，工程化免疫細胞或工程化免疫細胞群體包含與SEQ ID NO: 24具有至少90%序列一致性之CD7 PEBL及與SEQ ID NO:28具有至少90%序列一致性之CD7 CAR。在一些實施例中，工程化免疫細胞或工程化免疫細胞群體包含SEQ ID NO: 24之CD7 PEBL及SEQ ID NO:30之CD7 CAR。在一些實施例中，工程化免疫細胞或工程化免疫細胞群體包含與SEQ ID NO: 24具有至少90%序列一致性之CD7 PEBL及與SEQ ID NO:30具有至少90%序列一致性之CD7 CAR。在一些實施例中，工程化免疫細胞或工程化免疫細胞群體包含SEQ ID NO: 26之CD7 PEBL及SEQ ID NO:28之CD7 CAR。在一些實施例中，工程化免疫細胞或工程化免疫細胞群體包含與SEQ ID NO: 26具有至少90%序列一致性之CD7 PEBL及與SEQ ID NO:28具有至少90%序列一致性之CD7 CAR。在一些實施例中，工程化免疫細胞或工程化免疫細胞群體包含SEQ ID NO: 26之CD7 PEBL及SEQ ID NO:30之CD7 CAR。在一些實施例中，工程化免疫細胞或工程化免疫細胞群體包含與SEQ ID NO: 26具有至少90%序列一致性之CD7 PEBL及與SEQ ID NO:30具有至少90%序列一致性之CD7 CAR。在一些實施例中，工程化免疫細胞或工程化免疫細胞群體包含SEQ ID NO: 25之CD7 PEBL及SEQ ID NO:29之CD7 CAR。在一些實施例中，工程化免疫細胞或工程化免疫細胞群體包含與SEQ ID NO: 25具有至少90%序列一致性之CD7 PEBL及與SEQ ID NO:29具有至少90%序列一致性之CD7 CAR。在一些實施例中，工程化免疫細胞或工程化免疫細胞群體包含SEQ ID NO: 25之CD7 PEBL及SEQ ID NO:31之CD7 CAR。在一些實施例中，工程化免疫細胞或工程化免疫細胞群體包含與SEQ ID NO: 25具有至少90%序列一致性之CD7 PEBL及與SEQ ID NO:31具有至少90%序列一致性之CD7 CAR。在一些實施例中，工程化免疫細胞或工程化免疫細胞群體包含SEQ ID NO: 27之CD7 PEBL及SEQ ID NO:29之CD7 CAR。在一些實施例中，工程化免疫細胞或工程化免疫細胞群體包含與SEQ ID NO: 27具有至少90%序列一致性之CD7 PEBL及與SEQ ID NO:29具有至少90%序列一致性之CD7 CAR。在一些實施例中，工程化免疫細胞或工程化免疫細胞群體包含SEQ ID NO: 27之CD7 PEBL及SEQ ID NO:31之CD7 CAR。在一些實施例中，工程化免疫細胞或工程化免疫細胞群體包含與SEQ ID NO: 27具有至少90%序列一致性之CD7 PEBL及與SEQ ID NO:31具有至少90%序列一致性之CD7 CAR。
在一些情況下，工程化免疫細胞為工程化T細胞。在一些實施例中，工程化免疫細胞為工程化CD4+ T細胞。在一些實施例中，工程化免疫細胞為工程化CD8+ T細胞。在一些實施例中，含有雙順反子構築體或雙啟動子構築體之工程化免疫細胞由PBMC產生。在一些實施例中，含有雙順反子構築體或雙啟動子構築體之工程化免疫細胞由經純化之CD4+ T細胞產生。在一些實施例中，含有雙順反子構築體或雙啟動子構築體之工程化免疫細胞由經純化之CD8+ T細胞產生。在一些實施例中，含有雙順反子構築體或雙啟動子構築體之工程化免疫細胞由包含經純化之CD4+ T細胞及經純化之CD8+ T細胞的細胞群體產生。在一些實施例中，含有雙順反子構築體或雙啟動子構築體之工程化免疫細胞由包含經純化之CD3+ T細胞的細胞群體產生。
在一些實施例中，本發明之CD3 PEBL包含CD3結合域及細胞內定位序列。在一些情況下，CD3結合域包含結合CD3/TCRaβ複合物蛋白質之抗體。在一些情況下，該抗體為結合CD3/TCRaβ複合物蛋白質之單鏈可變片段(scFv)，該複合物蛋白質選自由TCRα、TCRβ、CD3δ、CD3ε、CD3γ及CD3ζ組成之群。定位域亦可包括跨膜域，該跨膜域選自來源於CD8α、CD8β、4-1BB、CD28、CD34、CD4、FcεRIγ、CD16、OX40、CD3ζ、CD3δ、CD3ε、CD3γ、TCRα、CD32、CD64、VEGFR2、FAS或FGFR2B之跨膜域。在一些實施例中，ER滯留序列包含選自KDEL、KDEL樣模體、KKMP、KKTN、KKXX、XXXKTN、KXKXX或[HKR][DE][ED][LF]之胺基酸序列，其中X為任何胺基酸。在一些實施例中，ER滯留序列描述於例如以下文獻中：Pelham, 1988, EMBO J；Raykhel, 2007, JCB；Robbi, 1991, JBC；Raykhel, 2007, JCB；Alanen, 2011, JMB；Schindler, 1993, Eur J Cell Biol；Jackson, 1990, EMBO J；Nilsson, 1989, Cell；Itin, 1995, EMBO J；Neve, 2003, Exp Cell Research；Nufer, 2003, JBC；Zerangue, 2000, PNAS；及Gao, 2014, Trends Plant Sci.，其中之各者以全文引用之方式併入。
在一些情況下，CD3結合域包含抗體，該抗體包含如下表中所描述之序列。在一些情況下，抗CD3 PEBL包含特異性結合CD3之抗體(例如scFv)及細胞內定位序列。在某些實施例中，抗CD3 PEBL包含特異性結合CD3之抗體(例如scFv)。在一些情況下，CD3結合域包含來源於純系OKT3或純系UCHT1之抗CD3抗體之一部分或片段。在一些情況下，CD3結合域包含源自來源於純系OKT3或純系UCHT1之抗CD3抗體之結合序列。
在一些實施例中，針對CD3之PEBL包含SEQ ID NO: 101之胺基酸序列。在一些實施例中，CD3結合域包含如SEQ ID NO: 102中之源自來源於純系OKT3之抗CD3抗體之結合序列。在一些實施例中，針對CD3之PEBL包含SEQ ID NO: 103之胺基酸序列。在一些實施例中，CD3結合域包含如SEQ ID NO: 104中之源自來源於純系UCHT1之抗CD3抗體之結合序列。
表 1. CD3 結合域之例示性抗體序列
| SEQ ID NO. | 名稱 | 序列 |
| 101 | OKT3 PEBL5序列 | MALPVTALLLPLALLLHAARPQIVLTQSPAIMSASPGEKVTMTCSASSSVSYMNWYQQKSGTSPKRWIYDTSKLASGVPAHFRGSGSGTSYSLTISGMEAEDAATYYCQQWSSNPFTFGSGTKLEINRGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLQQSGAELARPGASVKMSCKASGYTFTRYTMHWVKQRPGQGLEWIGYINPSRGYTNYNQKFKDKATLTTDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARYYDDHYCLDYWGQGTTLTVSSAGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSAEKDEL |
| 102 | OKT3 scFv | QIVLTQSPAIMSASPGEKVTMTCSASSSVSYMNWYQQKSGTSPKRWIYDTSKLASGVPAHFRGSGSGTSYSLTISGMEAEDAATYYCQQWSSNPFTFGSGTKLEINRGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLQQSGAELARPGASVKMSCKASGYTFTRYTMHWVKQRPGQGLEWIGYINPSRGYTNYNQKFKDKATLTTDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARYYDDHYCLDYWGQGTTLTVSSA |
| 110 | OKT3 VH胺基酸序列 | EVQLQQSGAELARPGASVKMSCKASGYTFTRYTMHWVKQRPGQGLEWIGYINPSRGYTNYNQKFKDKATLTTDKSSSTAYMQLSS LTSEDSAVYYCARYYDDHYCLDYWGQGTTLTVSSA |
| 111 | OKT3 VL胺基酸序列 | QIVLTQSPAIMSASPGEKVTMTCSASSSVSYMNWYQQKSGTSPKRWIYDTSKLASGVPAHFRGSGSGTSYSLTISGMEAEDAATYYCQQWSSNPFTFGSGTKLEINR |
| 112 | OKT3 VH核苷酸序列 | GAGGTCCAGCTGCAGCAGTCTGGGGCTGAACTGGCAAGACCTGGGGCCTCAGTGAAGATGTCCTGCAAGGCTTCTGGCTACACCTTTACTAGGTACACGATGCACTGGGTAAAACAGAGGCCTGGACAGGGTCTGGAATGGATTGGATACATTAATCCTAGCCGTGGTTATACTAATTACAATCAGAAGTTCAAGGACAAGGCCACATTGACTACAGACAAATCCTCCAGCACAGCCTACATGCAACTGAGCAGCCTGACATCTGAGGACTCTGCAGTCTATTACTGTGCAAGATATTATGATGATCATTACTGCCTTGACTACTGGGGCCAAGGCACCACTCTCACAGTCTCCTCAGCC |
| 113 | OKT3 VL核苷酸序列 | CAAATTGTTCTCACCCAGTCTCCAGCAATCATGTCTGCATCTCCAGGGGAGAAGGTCACCATGACCTGCAGTGCCAGCTCAAGTGTAAGTTACATGAACTGGTACCAGCAGAAGTCAGGCACCTCCCCCAAAAGATGGATTTATGACACATCCAAACTGGCTTCTGGAGTCCCTGCTCACTTCAGGGGCAGTGGGTCTGGGACCTCTTACTCTCTCACAATCAGCGGCATGGAGGCTGAAGATGCTGCCACTTATTACTGCCAGCAGTGGAGTAGTAACCCATTCACGTTCGGCTCGGGGACAAAGTTGGAAATAAACCGG |
| 200 | OCKT3 HC CDR1 (Kabat) | RYTMH |
| 201 | OCKT3 HC CDR2 (Kabat) | YINPSRGYTNYNQKFKD |
| 202 | OCKT3 HC CDR3 (Kabat) | YYDDHYCLDY |
| 203 | OCKT3 HC CDR1 (Chothia) | GYTFTRY |
| 204 | OCKT3 HC CDR2 (Chothia) | NPSRGY |
| 205 | OCKT3 HC CDR3 (Chothia) | YYDDHYCLDY |
| 206 | OCKT3 LC CDR1 (Kabat) | SASSSVSYMN |
| 207 | OCKT3 LC CDR2 (Kabat) | DTSKLAS |
| 208 | OCKT3 LC CDR3 (Kabat) | QQWSSNPFT |
| 209 | OCKT3 LC CDR1 (Chothia) | SASSSVSYMN |
| 210 | OCKT3 LC CDR2 (Chothia) | DTSKLAS |
| 211 | OCKT3 LC CDR3 (Chothia) | QQWSSNPFT |
| 103 | UCHT1 PEBL22序列 | MALPVTALLLPLALLLHAARPDIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDIRNYLNWYQQKPDGTVKLLIYYTSRLHSGVPSKFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPWTFAGGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLQQSGPELVKPGASMKISCKASGYSFTGYTMNWVKQSHGKNLEWMGLINPYKGVSTYNQKFKDKATLTVDKSSSTAYMELLSLTSEDSAVYYCARSGYYGDSDWYFDVWGQGTTLTVFSEQKLISEEDLGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSAEKDEL |
| 104 | UCHT1 scFv | DIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDIRNYLNWYQQKPDGTVKLLIYYTSRLHSGVPSKFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPWTFAGGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLQQSGPELVKPGASMKISCKASGYSFTGYTMNWVKQSHGKNLEWMGLINPYKGVSTYNQKFKDKATLTVDKSSSTAYMELLSLTSEDSAVYYCARSGYYGDSDWYFDVWGQGTTLTVFS |
| 114 | UCHT1 VH胺基酸序列 | EVQLQQSGPELVKPGASMKISCKASGYSFTGYTMNWVKQSHGKNLEWMGLINPYKGVSTYNQKFKDKATLTVDKSSSTAYMELLSLTSEDSAVYYCARSGYYGDSDWYFDVWGQGTTLTVFS |
| 115 | UCHT1 VL胺基酸序列 | DIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDIRNYLNWYQQKPDGTVKLLIYYTSRLHSGVPSKFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPWTFAGGTKLEIK |
| 116 | UCHT1 VH核苷酸序列 | GAGGTGCAGCTGCAGCAGAGCGGCCCCGAGCTGGTGAAGCCCGGCGCCAGCATGAAGATC AGCTGCAAGGCCAGCGGCTACAGCTTCACCGGCTACACCATGAACTGGGTGAAGCAGAGC CACGGCAAGAACCTGGAGTGGATGGGCCTGATCAACCCCTACAAGGGCGTGAGCACCTAC AACCAGAAGTTCAAGGACAAGGCCACCCTGACCGTGGACAAGAGCAGCAGCACCGCCTAC ATGGAGCTGCTGAGCCTGACCAGCGAGGACAGCGCCGTGTACTACTGCGCCAGGAGCGGC TACTACGGCGACAGCGACTGGTACTTCGACGTGTGGGGCCAGGGCACCACCCTGACCGTG TTCAGC |
| 117 | UCHT1 VL核苷酸序列 | GACATCCAGATGACCCAGACCACCAGCAGCCTGAGCGCCAGCCTGGGCGACAGGGTGACC ATCAGCTGCAGGGCCAGCCAGGACATCAGGAACTACCTGAACTGGTACCAGCAGAAGCCC GACGGCACCGTGAAGCTGCTGATCTACTACACCAGCAGGCTGCACAGCGGCGTGCCCAGC AAGTTCAGCGGCAGCGGCAGCGGCACCGACTACAGCCTGACCATCAGCAACCTGGAGCAG GAGGACATCGCCACCTACTTCTGCCAGCAGGGCAACACCCTGCCCTGGACCTTCGCCGGC GGCACCAAGCTGGAGATCAAG |
| 212 | UCHT1 HC CDR1 (Kabat) | GYTMN |
| 213 | UCHT1 HC CDR2 (Kabat) | LINPYKGVSTYNQKFKD |
| 214 | UCHT1 HC CDR3 (Kabat) | SGYYGDSDWYFDV |
| 215 | UCHT1 HC CDR1 (Chothia) | GYSFTGY |
| 216 | UCHT1 HC CDR2 (Chothia) | NPYKGV |
| 217 | UCHT1 HC CDR3 (Chothia) | SGYYGDSDWYFDV |
| 218 | UCHT1 LC CDR1 (Kabat) | RASQDIRNYLN |
| 219 | UCHT1 LC CDR2 (Kabat) | YTSRLHS |
| 220 | UCHT1 LC CDR3 (Kabat) | QQGNTLPWT |
| 221 | UCHT1 LC CDR1 (Chothia) | RASQDIRNYLN |
| 222 | UCHT1 LC CDR2 (Chothia) | YTSRLHS |
| 223 | UCHT1 LC CDR3 (Chothia) | QQGNTLPWT |
在一些情況下，諸如CD7 CAR+/CD7陰性T細胞或PCART7-CD3PEBL T細胞之工程化免疫細胞可進一步包含有包含自殺基因或殺傷基因之第四核酸。在一些實施例中，自殺基因或殺傷基因包含CD20或其衍生物。在一些實施例中，自殺基因或殺傷基因包含CD20、其衍生物或其一部分。在一些實施例中，自殺基因或殺傷基因包含經修飾之CD20。在一些實施例中，自殺基因包含經截短CD20。在一些實施例中，自殺基因或殺傷基因包含CD20、p53蛋白、誘導型凋亡蛋白酶9 (iCasp9)、單純疱疹病毒酪胺酸激酶(HSV-TK)、人類胸苷酸激酶(TMPK)、表皮生長因子受體(EGFR)或其衍生物。在一些實施例中，第四核酸位於第二表現載體中，其中第二表現載體編碼第二PEBL。在一些實施例中，第四核酸位於第一表現載體中，其中第一表現載體編碼CAR及第一PEBL。在一些實施例中，第四核酸位於單獨表現載體，例如第三表現載體中。
在一些情況下，編碼第二PEBL之核酸及編碼包含自殺基因之第四核酸的核酸位於雙順反子載體(例如雙順反子反轉錄病毒載體、雙順反子慢病毒載體)中，使得第二PEBL及編碼自殺基因之第四核酸同時表現。在一些態樣中，編碼第二PEBL之核酸及編碼自殺基因之核酸藉由內部核糖體進入位點(IRES)或核糖體密碼子跳躍位點可操作地連接。在一些實施例中，該核糖體密碼子跳躍位點包含2A自裂解肽。在一些情況下，編碼第二PEBL之核酸及編碼自殺基因之核酸位於第二反轉錄病毒載體或慢病毒載體中。
在一些情況下，其中編碼第二PEBL之核酸位於與包含編碼CAR及第一PEBL之核酸的載體分開的載體中，該兩個載體可同時引入。在一些情況下，其中編碼第二PEBL之核酸位於與包含編碼CAR及第一PEBL之核酸的載體分開的載體中，該兩個載體可依序引入。在一些情況下，其中編碼第二PEBL之核酸位於與包含編碼CAR及第一PEBL之核酸的載體分開的載體中，編碼CAR及第一PEBL之載體在編碼第二PEBL之載體之前引入。在一些情況下，其中編碼第二PEBL之核酸位於與包含編碼CAR及第一PEBL之核酸的載體分開的載體中，編碼CAR及第一PEBL之載體在編碼第二PEBL之載體之後引入。
在一些情況下，其中編碼自殺基因或殺傷基因及第二PEBL之核酸位於與包含編碼CAR及第一PEBL之核酸的載體分開的載體中，該兩個載體可同時引入。在一些情況下，其中編碼自殺基因或殺傷基因及第二PEBL之核酸位於與包含編碼CAR及第一PEBL之核酸的載體分開的載體中，該兩個載體可依序引入。在一些情況下，其中編碼自殺基因或殺傷基因及第二PEBL之核酸位於與包含編碼CAR及第一PEBL之核酸的載體分開的載體中，編碼CAR及第一PEBL之載體在編碼自殺基因或殺傷基因及第二PEBL之載體之前引入。在一些情況下，其中編碼自殺基因或殺傷基因及第二PEBL之核酸位於與包含編碼CAR及第一PEBL之核酸的載體分開的載體中，編碼CAR及第一PEBL之載體在編碼自殺基因或殺傷基因及第二PEBL之載體之後引入。
在一些情況下，編碼CAR、第一PEBL及第二PEBL之核酸位於不同載體中。在一些情況下，編碼CAR、第一PEBL及第二PEBL之核酸位於同一載體中。在一些情況下，其中編碼CAR、第一PEBL及第二PEBL之核酸位於不同載體中，該等不同載體可同時引入。在一些情況下，其中編碼CAR、第一PEBL及第二PEBL之核酸位於不同載體中，該等不同載體可依序引入。
在一些情況下，編碼CAR、第一PEBL、自殺基因及第二PEBL之核酸位於不同載體中。在一些情況下，編碼CAR、第一PEBL、自殺基因及第二PEBL之核酸位於同一載體中。在一些情況下，其中編碼CAR、第一PEBL、自殺基因或殺傷基因及第二PEBL之核酸位於不同載體中，該等不同載體可同時引入。在一些情況下，其中編碼CAR、第一PEBL、自殺基因或殺傷基因及第二PEBL之核酸位於不同載體中，該等不同載體可依序引入。
在一些情況下，其中編碼第二PEBL及自殺基因之核酸位於與包含編碼CAR及第一PEBL之核酸的載體分開的載體中，該兩個載體可同時引入。在一些情況下，其中編碼第二PEBL及自殺基因之核酸位於與包含編碼CAR及第一PEBL之核酸的載體分開的載體中，該兩個載體可依序引入。在一些情況下，其中編碼第二PEBL及自殺基因之核酸位於與包含編碼CAR及第一PEBL之核酸的載體分開的載體中，編碼CAR及第一PEBL之載體在編碼第二PEBL及自殺基因之載體之前引入。在一些情況下，其中編碼第二PEBL及自殺基因之核酸位於與包含編碼CAR及第一PEBL之核酸的載體分開的載體中，編碼CAR及第一PEBL之載體在編碼第二PEBL及自殺基因之載體之後引入。
在一些情況下，其中編碼CAR、第一PEBL、第二PEBL及自殺基因之核酸位於不同載體中，該等不同載體可同時引入。在一些情況下，其中編碼CAR、第一PEBL、第二PEBL及自殺基因之核酸位於不同載體中，該等不同載體可依序引入。
在一些情況下，工程化免疫細胞為NK細胞。在一些情況下，工程化免疫細胞為CD56、CD161、CD16、CD94或CD57陽性NK細胞。
在一些態樣中，本文提供一種工程化免疫細胞，其包含：(a)第一核酸序列，其編碼連接至(ii)合成定位域的(i)結合至T細胞受體(TCR)複合物之次單元之域。工程化免疫細胞可進一步包含(b)第二核酸序列，其編碼嵌合抗原受體(CAR)。工程化免疫細胞可進一步包含(c)第三核酸序列，其編碼連接至合成表面多肽定位域之表面多肽結合域。工程化免疫細胞包含的第一核酸序列可多達第二核酸序列或第三核酸序列之至少兩倍。
工程化免疫細胞可包含：第一核酸序列，其編碼連接至合成定位域之CD3ε結合域，其中該CD3ε結合域包含SEQ ID NO: 212或215之重鏈互補決定區(HC CDR1)、SEQ ID NO: 213或216之HC CDR2、SEQ ID NO: 214或217之HC CDR3以及SEQ ID NO: 218或221之輕鏈(LC) CDR1、SEQ ID NO: 219或222之LC CDR2、SEQ ID NO: 220或223之LC CDR3；第二核酸序列，其編碼嵌合抗原受體(CAR)；及第三核酸序列，其編碼連接至合成表面多肽定位域之表面多肽結合域。
在一些實施例中，工程化免疫細胞中編碼連接至(ii)合成定位域的(i)結合至T細胞受體(TCR)複合物之次單元之域的第一核酸序列的量比編碼CAR之第二核酸序列或編碼連接至合成表面多肽定位域之表面多肽結合域之第三核酸序列的量多至少約1.5倍、至少約2.0倍、至少約2.5倍、至少約3.0倍、至少約4.0倍、至少約4.5倍、至少約5.0倍、至少約5.5倍、至少約6.0倍、至少約6.5倍、至少約7.0倍、至少約7.5倍、至少約8.0倍、至少約8.5倍、至少約9.0倍、至少約9.5倍、至少約10.0倍、至少約10.5倍、至少約11.0倍、至少約11.5倍、至少約12.0倍、至少約12.5倍、至少約13.0倍、至少約14.0倍、至少約15.0倍、至少約20.0倍、至少約25.0倍、至少約30.0倍、至少約35.0倍、至少約40.0倍、至少約45.0倍、或至少約50.0倍。
在一些實施例中，工程化免疫細胞中編碼連接至(ii)合成定位域的(i)結合至T細胞受體(TCR)複合物之次單元之域的第一核酸序列的量比編碼CAR之第二核酸序列或編碼連接至合成表面多肽定位域之表面多肽結合域之第三核酸序列的量多約1.5倍至約50倍。在一些實施例中，工程化免疫細胞中編碼連接至(ii)合成定位域的(i)結合至T細胞受體(TCR)複合物之次單元之域的第一核酸序列的量比編碼CAR之第二核酸序列或編碼連接至合成表面多肽定位域之表面多肽結合域之第三核酸序列的量多約1.5倍至約2倍、約1.5倍至約5倍、約1.5倍至約7.5倍、約1.5倍至約10倍、約1.5倍至約15倍、約1.5倍至約20倍、約1.5倍至約25倍、約1.5倍至約30倍、約1.5倍至約35倍、約1.5倍至約40倍、約1.5倍至約50倍、約2倍至約5倍、約2倍至約7.5倍、約2倍至約10倍、約2倍至約15倍、約2倍至約20倍、約2倍至約25倍、約2倍至約30倍、約2倍至約35倍、約2倍至約40倍、約2倍至約50倍、約5倍至約7.5倍、約5倍至約10倍、約5倍至約15倍、約5倍至約20倍、約5倍至約25倍、約5倍至約30倍、約5倍至約35倍、約5倍至約40倍、約5倍至約50倍、約7.5倍至約10倍、約7.5倍至約15倍、約7.5倍至約20倍、約7.5倍至約25倍、約7.5倍至約30倍、約7.5倍至約35倍、約7.5倍至約40倍、約7.5倍至約50倍、約10倍至約15倍、約10倍至約20倍、約10倍至約25倍、約10倍至約30倍、約10倍至約35倍、約10倍至約40倍、約10倍至約50倍、約15倍至約20倍、約15倍至約25倍、約15倍至約30倍、約15倍至約35倍、約15倍至約40倍、約15倍至約50倍、約20倍至約25倍、約20倍至約30倍、約20倍至約35倍、約20倍至約40倍、約20倍至約50倍、約25倍至約30倍、約25倍至約35倍、約25倍至約40倍、約25倍至約50倍、約30倍至約35倍、約30倍至約40倍、約30倍至約50倍、約35倍至約40倍、約35倍至約50倍、或約40倍至約50倍。
在一些實施例中，工程化免疫細胞中編碼連接至(ii)合成定位域的(i)結合至T細胞受體(TCR)複合物之次單元之域的第一核酸序列的量比編碼CAR之第二核酸序列或編碼連接至合成表面多肽定位域之表面多肽結合域之第三核酸序列的量多至少約2倍、至少約3倍、至少約4倍、至少約5倍、至少約6倍、至少約7倍、至少約8倍、至少約9倍、至少約10倍、至少約11倍、至少約12倍、至少約13倍、至少約14倍、至少約15倍、至少約20倍、至少約25倍、至少約30倍、至少約35倍、或至少約40倍。在一些實施例中，工程化免疫細胞中編碼連接至(ii)合成定位域的(i)結合至T細胞受體(TCR)複合物之次單元之域的第一核酸序列的量比編碼CAR之第二核酸序列或編碼連接至合成表面多肽定位域之表面多肽結合域之第三核酸序列的量多至多約40倍、至多約35倍、至多約30倍、至多約25倍、至多約20倍、至多約15倍、至多約10倍、至多約9倍、至多約8倍、至多約7倍、至多約6倍、至多約5倍、至多約4倍、至多約3倍、或至多約2倍。
在一些實施例中，工程化免疫細胞中編碼連接至(ii)合成定位域的(i)結合至T細胞受體(TCR)複合物之次單元之域的第一核酸序列的量比編碼CAR之第二核酸序列或編碼連接至合成表面多肽定位域之表面多肽結合域之第三核酸序列的量多約2倍至約20倍。在一些實施例中，工程化免疫細胞中編碼連接至(ii)合成定位域的(i)結合至T細胞受體(TCR)複合物之次單元之域的第一核酸序列的量比編碼CAR之第二核酸序列或編碼連接至合成表面多肽定位域之表面多肽結合域之第三核酸序列的量多約2倍至約3倍、約2倍至約4倍、約2倍至約5倍、約2倍至約6倍、約2倍至約7倍、約2倍至約8倍、約2倍至約9倍、約2倍至約10倍、約2倍至約15倍、約2倍至約7倍、約2倍至約20倍、約3倍至約4倍、約3倍至約5倍、約3倍至約6倍、約3倍至約7倍、約3倍至約8倍、約3倍至約9倍、約3倍至約10倍、約3倍至約15倍、約3倍至約7倍、約3倍至約20倍、約4倍至約5倍、約4倍至約6倍、約4倍至約7倍、約4倍至約8倍、約4倍至約9倍、約4倍至約10倍、約4倍至約15倍、約4倍至約7倍、約4倍至約20倍、約5倍至約6倍、約5倍至約7倍、約5倍至約8倍、約5倍至約9倍、約5倍至約10倍、約5倍至約15倍、約5倍至約7倍、約5倍至約20倍、約6倍至約7倍、約6倍至約8倍、約6倍至約9倍、約6倍至約10倍、約6倍至約15倍、約6倍至約7倍、約6倍至約20倍、約7倍至約8倍、約7倍至約9倍、約7倍至約10倍、約7倍至約15倍、約7倍至約7倍、約7倍至約20倍、約8倍至約9倍、約8倍至約10倍、約8倍至約15倍、約8倍至約7倍、約8倍至約20倍、約9倍至約10倍、約9倍至約15倍、約9倍至約7倍、約9倍至約20倍、約10倍至約15倍、約10倍至約7倍、約10倍至約20倍、約15倍至約7倍、約15倍至約20倍、或約7倍至約20倍。
連接至合成定位域之域可結合至TCR複合物之次單元。在一些實施例中，該TCR複合物之該次單元為CD3ε、CD3γ或CD3δ。在一些實施例中，該TCR複合物之該次單元為CD3ε。在一些實施例中，結合至TCR複合物之次單元(例如CD3ε)的域可為抗體或抗原結合域。在一些實施例中，該抗體結合至CD3ε (例如抗CD3ε抗體)。在一些實施例中，該抗體為單鏈Fv (scFv)或單域抗體(sdAb)。
該抗CD3ε抗體可為本文所描述或此項技術中已知之任何抗CD3ε抗體。在一些實施例中，該抗CD3ε抗體包含SEQ ID NO: 212或215之重鏈互補決定區(HC CDR) 1、SEQ ID NO: 213或216之HC CDR2、SEQ ID NO: 214或217之HC CDR3以及SEQ ID NO: 218或221之輕鏈(LC) CDR1、SEQ ID NO: 219或222之LC CDR2、SEQ ID NO: 220或223之LC CDR3。在一些實施例中，該抗CD3ε抗體包含具有與SEQ ID NO: 114具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%序列一致性之胺基酸序列的重鏈可變域。在一些實施例中，該抗CD3ε抗體包含具有與SEQ ID NO: 115具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%序列一致性之胺基酸序列的輕鏈可變域。在一些實施例中，該抗CD3ε抗體包含與SEQ ID NO: 104具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%序列一致性之胺基酸序列。
在一些實施例中，本文所描述之工程化免疫細胞包含合成定位域。在一些實施例中，該合成定位域包含ER滯留信號(例如ER滯留序列)、高基氏體滯留序列及/或蛋白酶體定位序列。在一些實施例中，該ER滯留信號包含胺基酸序列KDEL或KKXX，其中X可為任何胺基酸。在一些實施例中，該合成定位域可包含Myc標籤及/或連接子序列。在一些實施例中，該Myc標籤包含胺基酸序列EQKLISEEDL。在一些實施例中，該連接子序列可為(GGGGS)n，其中n為1至12之任何整數。
在一些實施例中，本文所描述之工程化免疫細胞之第一核酸序列在5'至3'方向上包含：編碼結合至TCR複合物之次單元之域的序列；編碼Myc標籤之序列；編碼(GGGGS)
4序列之序列；及編碼包含胺基酸序列KDEL之ER滯留信號之序列。在一些實施例中，本文所描述之工程化免疫細胞之第一核酸序列在5'至3'方向上包含：編碼抗CD3ε抗體之序列；編碼Myc標籤之序列；編碼(GGGGS)
4序列之序列；及編碼包含胺基酸序列KDEL之ER滯留信號之序列。
在一些實施例中，第二核酸序列及第三核酸序列位於同一核酸分子上。在一些實施例中，第二核酸序列及第三核酸序列位於不同核酸分子上。在一些實施例中，同一核酸分子可為載體。
在一些實施例中，第一核酸序列可位於與第二核酸序列或第三核酸序列分開的核酸分子上。具有第一核酸序列之核酸分子可為表現載體。
在一些實施例中，本文所描述之工程化免疫細胞可包含編碼殺傷基因(例如自殺基因)之核酸序列。在一些實施例中，具有第一核酸序列之表現載體亦可包含編碼殺傷基因之核酸序列。該殺傷基因可為CD20或其片段。在一些實施例中，表現載體可包含第一核酸序列與另一核酸之間的核糖體密碼子跳躍位點。在一些實施例中，表現載體可包含第一核酸序列與編碼殺傷基因之第四核酸序列之間的核糖體密碼子跳躍位點。核糖體密碼子跳躍位點可係指其中特定病毒肽阻止核糖體共價連接新插入之胺基酸的轉譯機制。核糖體跳躍事件可由「2A樣」或CHYSEL (順式作用水解酶元件)序列誘導。在一些實施例中，核糖體密碼子跳躍位點可包含2A自裂解肽。
在一些實施例中，表現載體可為慢病毒載體、反轉錄病毒載體、腺病毒載體或腺相關病毒載體。在一些實施例中，表現載體可為慢病毒載體。
在一些實施例中，本文所描述之CAR包含結合至表面多肽之目標結合域。在一些實施例中，表面多肽可為CD7。在一些實施例中，表面多肽結合域及目標結合域可分別包含第一抗體或抗原結合域及第二抗體或抗原結合域。在一些實施例中，表面多肽結合域(例如CAR之結合域)之胺基酸序列與目標結合域(例如PEBL之結合域)之胺基酸序列可至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%一致。在一些實施例中，表面多肽結合域(例如CAR之結合域)之胺基酸序列與目標結合域(例如PEBL之結合域)之胺基酸序列可至少80%一致。在一些實施例中，表面多肽結合域(例如CAR之結合域)之胺基酸序列與目標結合域(例如PEBL之結合域)之胺基酸序列可至少90%一致。在一些實施例中，表面多肽結合域(例如CAR之結合域)之胺基酸序列與目標結合域(例如PEBL之結合域)之胺基酸序列可一致。
在一些實施例中，本文所描述之工程化免疫細胞之抗體包含SEQ ID NO: 47之HC CDR1、SEQ ID NO: 48之HC CDR2、SEQ ID NO: 49之HC CDR3以及SEQ ID NO: 44之輕鏈(LC) CDR1、SEQ ID NO: 45之LC CDR2、SEQ ID NO: 46之LC CDR3。
在一些實施例中，本文所描述之表現載體可為雙順反子慢病毒表現載體。在一些實施例中，編碼CAR之核酸序列及編碼PEBL之核酸序列可在雙順反子慢病毒表現載體中可操作地連接。在一些實施例中，編碼CAR之核酸序列及編碼PEBL之核酸序列可藉由內部核糖體進入位點(IRES)或核糖體密碼子跳躍位點可操作地連接。
在一些實施例中，本文所描述之合成定位域或合成表面多肽定位域可包含內質網(ER)滯留序列、高基氏體滯留序列、蛋白酶體定位序列或跨膜域。在一些實施例中，ER滯留序列包含胺基酸序列KDEL，且另一核酸序列進一步包含編碼偶聯表面多肽結合域與合成表面多肽定位域之連接子的序列。在一些實施例中，合成定位域及合成表面多肽定位域包含相同的ER滯留序列。在一些實施例中，合成定位域及合成表面多肽定位域包含不同的ER滯留序列。
在一些實施例中，合成表面多肽定位域可係指將表面多肽引導至細胞內區室之定位域。在一些實施例中，合成表面多肽定位域可經由結合域間接地將表面多肽引導至細胞內區室。舉例而言，合成表面多肽定位域可連接至靶向表面多肽之結合域。表面多肽可為CD7。在一些實施例中，結合域可為抗體或其片段。
在一些實施例中，CAR包含跨膜域及細胞內信號傳導域。在一些實施例中，細胞內信號傳導域可為4-1BB細胞內信號傳導域、CD3ζ細胞內信號傳導域或CD28細胞內信號傳導域。在一些實施例中，CAR可包含共刺激域。在一些實施例中，本文所描述之CAR之共刺激域可包含誘導型T細胞共刺激劑(ICOS)、CD27、MYD88、CD40、CD30、CD84、CRTAM、DR3、GITR、HVEM、ICOS、SLAMF1、TIM1或OX40 (CD134)。
在一些實施例中，在本文所描述之工程化免疫細胞中，TCR複合物及表面多肽之表現可下調。在一些實施例中，工程化免疫細胞可為T細胞或自然殺手(NK)細胞。
本文亦提供一種包含此類工程化免疫細胞之細胞群體。在一些態樣中，本發明提供一種本文所描述之工程化免疫細胞之細胞群體，其包含：(i)編碼連接至合成定位域的結合至T細胞受體(TCR)複合物之次單元之域的核酸序列；及(ii)編碼嵌合抗原受體(CAR)之核酸序列。
在一些實施例中，細胞群體中少於0.5%、少於1%、少於1.5%、少於1.6%、少於1.7%、少於1.8%、少於1.9%、少於2%、少於2.1%、少於2.2%、少於2.3%、少於2.4%、少於2.5%、少於2.6%、少於2.7%、少於2.8%、少於2.9%、少於3%、少於3.5%、或少於4%之細胞在其表面上表現TCR複合物。在一些實施例中，細胞群體中不超過4%、不超過3.5%、不超過3%、不超過2.9%、不超過2.8%、不超過2.7%、不超過2.6%、不超過2.5%、不超過2.4%、不超過2.3%、不超過2.2%、不超過2.1%、不超過2%、不超過1.9%、不超過1.8%、不超過1.7%、不超過1.6%、不超過1.5%、不超過1%、或不超過0.5%之細胞在其表面上表現TCR複合物。在一些實施例中，TCR複合物包含次單元，其中該次單元可為CD3。
在一些實施例中，可在CD3耗盡步驟之後測定細胞群體中表現CD3之細胞的百分比。在一些實施例中，CD3耗盡之後細胞群體中表現CD3之細胞的百分比少於0.5%、少於1%、少於1.5%、少於1.6%、少於1.7%、少於1.8%、少於1.9%、少於2%、少於2.1%、少於2.2%、少於2.3%、少於2.4%、少於2.5%、少於2.6%、少於2.7%、少於2.8%、少於2.9%、少於3%、少於3.5%、或少於4%。在一些實施例中，CD3耗盡之後細胞群體中表現CD3之細胞的百分比不超過4%、不超過3.5%、不超過3%、不超過2.9%、不超過2.8%、不超過2.7%、不超過2.6%、不超過2.5%、不超過2.4%、不超過2.3%、不超過2.2%、不超過2.1%、不超過2%、不超過1.9%、不超過1.8%、不超過1.7%、不超過1.6%、不超過1.5%、不超過1%、或不超過0.5%。
在一些實施例中，細胞群體中之工程化免疫細胞可經歷至少1輪、至少2輪、至少3輪、至少4輪、至少5輪、至少6輪、至少7輪、至少8輪、至少9輪、或至少10輪CD3耗盡。在一些實施例中，細胞群體中之工程化免疫細胞可經歷至多10輪、至多9輪、至多8輪、至多7輪、至多6輪、至多5輪、至多4輪、至多3輪、至多2輪、或至多1輪CD3耗盡。在一些實施例中，細胞群體中之工程化免疫細胞可經歷約1輪至約5輪CD3耗盡。在一些實施例中，細胞群體中之工程化免疫細胞可經歷約1輪至約2輪、約1輪至約3輪、約1輪至約4輪、約1輪至約5輪、約2輪至約3輪、約2輪至約4輪、約2輪至約5輪、約3輪至約4輪、約3輪至約5輪、或約4輪至約5輪CD3耗盡。
CAR 及第一 PEBL 之雙順反子表現構築體
本文提供重組雙順反子病毒構築體或載體，其含有如本文所描述之編碼CAR (例如，包含對CD7具有特異性之結合域的CAR)之聚核苷酸及編碼PEBL (例如，包含對CD7具有特異性之結合域的PEBL)之聚核苷酸。在一些實施例中，重組雙順反子病毒構築體包括CAR之核酸序列與PEBL之核酸序列之間的內部核糖體進入位點(IRES)序列。在一些實施例中，重組雙順反子病毒構築體包括CAR之核酸序列與PEBL之核酸序列之間的核糖體密碼子跳躍位點序列(亦稱為編碼2A自裂解肽之序列)。在雙順反子構築體之一些實施例中，編碼CAR之聚核苷酸位於IRES序列上游(5'端)，且編碼PEBL之聚核苷酸位於IRES下游(3'端)。在一些情況下，編碼CAR之核酸序列可操作地連接至IRES序列，且IRES序列可操作地連接至編碼PEBL之核酸序列。在一些情況下，編碼PEBL之核酸序列可操作地連接至IRES序列，且IRES序列可操作地連接至編碼CAR之核酸序列。
在雙順反子構築體之一些實施例中，編碼CAR之聚核苷酸位於編碼2A自裂解肽之聚核苷酸上游(5'端)，且編碼PEBL之聚核苷酸位於編碼2A自裂解肽之聚核苷酸下游(3'端)。在一些情況下，編碼CAR之核酸序列可操作地連接至編碼2A自裂解肽之核酸序列，該編碼2A自裂解肽之核酸序列可操作地連接至編碼PEBL之核酸序列。在一些情況下，編碼PEBL之核酸序列可操作地連接至編碼2A自裂解肽之核酸序列，該編碼2A自裂解肽之核酸序列可操作地連接至編碼CAR之核酸序列。
經由2A肽序列進行核糖體密碼子跳躍之機制適用於由一個轉錄本產生兩個蛋白質；正常肽鍵在2A序列處減弱，導致一個轉譯事件產生兩個不連續的蛋白質片段。自裂解2A肽(例如2A裂解位點)描述於Kim等人, PLoS One, 2011, 6(4):e18556中。
在一些實施例中，IRES係來自腦心肌炎病毒(
Encephalomyocarditisvirus)。在一些實施例中，IRES係來自腸病毒(
Enterovirus)。在一些實施例中，IRES序列之核酸序列示於SEQ ID NO:62 (參見例如表2)中。
在一些實施例中，核糖體密碼子跳躍位點係基於2A自裂解肽(參見例如表3)。在一些實施例中，2A自裂解肽係選自由P2A、E2A、F2A及T2A組成之群。在一些情況下，P2A肽之胺基酸序列包含SEQ ID NO:67之胺基酸序列或與其具有至少90%序列一致性之胺基酸序列。在一些情況下，E2A肽之胺基酸序列包含SEQ ID NO:68之胺基酸序列或與其具有至少90%序列一致性之胺基酸序列。在一些情況下，F2A肽之胺基酸序列包含SEQ ID NO:69之胺基酸序列或與其具有至少90%序列一致性之胺基酸序列。在一些情況下，T2A肽之胺基酸序列包含SEQ ID NO:70之胺基酸序列或與其具有至少90%序列一致性之胺基酸序列。
在一些實施例中，病毒構築體(例如反轉錄病毒構築體)包含編碼選自由P2A、E2A、F2A及T2A組成之群的2A自裂解肽(例如2A肽裂解位點)的核酸序列，其中編碼2A自裂解肽之聚核苷酸連接編碼CAR之核酸序列與編碼PEBL之核酸序列。換言之，編碼2A自裂解肽之聚核苷酸位於編碼CAR之核酸序列與編碼PEBL之核酸序列之間。如上文所描述，在一些實施例中，構築體自5'端至3'端包含以下或由以下組成：編碼CAR之核酸序列；編碼P2A自裂解肽之核酸序列；及編碼PEBL之核酸序列。在一些實施例中，構築體自5'端至3'端包含以下或由以下組成：編碼本文所描述之任何CD7 CAR之核酸序列；編碼P2A自裂解肽之核酸序列；及編碼本文所描述之任何CD7 PEBL之核酸序列。在一些實施例中，構築體自5'端至3'端包含以下或由以下組成：編碼本文所描述之任何CD7 CAR之核酸序列；編碼E2A自裂解肽之核酸序列；及編碼本文所描述之任何CD7 PEBL之核酸序列。在一些實施例中，構築體自5'端至3'端包含以下或由以下組成：編碼本文所描述之任何CD7 CAR之核酸序列；編碼F2A自裂解肽之核酸序列；及編碼本文所描述之任何CD7 PEBL之核酸序列。在一些實施例中，構築體自5'端至3'端包含以下或由以下組成：編碼本文所描述之任何CD7 CAR之核酸序列；編碼T2A自裂解肽之核酸序列；及編碼本文所描述之任何CD7 PEBL之核酸序列。
在一些實施例中，構築體自5'端至3'端包含以下或由以下組成：編碼PEBL之核酸序列；編碼P2A自裂解肽之核酸序列；及編碼CAR之核酸序列。在一些實施例中，構築體自5'端至3'端包含以下或由以下組成：編碼PEBL之核酸序列；編碼E2A自裂解肽之核酸序列；及編碼CAR之核酸序列。在一些實施例中，構築體自5'端至3'端包含以下或由以下組成：編碼PEBL之核酸序列；編碼F2A自裂解肽之核酸序列；及編碼CAR之核酸序列。在一些實施例中，構築體自5'端至3'端包含以下或由以下組成：編碼PEBL之核酸序列；編碼T2A自裂解肽之核酸序列；及編碼CAR之核酸序列。
在一些實施例中，編碼P2A之核酸序列包含與SEQ ID NO:63具有至少90%序列一致性之核酸或由其組成。在一些實施例中，編碼P2A之核酸序列包含SEQ ID NO:63之核酸或由其組成。在一些實施例中，編碼E2A之核酸序列包含與SEQ ID NO:64具有至少90%序列一致性之核酸或由其組成。在一些實施例中，編碼E2A之核酸序列包含SEQ ID NO:64之核酸或由其組成。在一些實施例中，編碼F2A之核酸序列包含與SEQ ID NO:65具有至少90%序列一致性之核酸或由其組成。在一些實施例中，編碼F2A之核酸序列包含SEQ ID NO:65之核酸或由其組成。在一些實施例中，編碼T2A之核酸序列包含與SEQ ID NO:66具有至少90%序列一致性之核酸序列或由其組成。在一些實施例中，編碼T2A之核酸序列包含SEQ ID NO:66之核酸或由其組成。
在一些實施例中，編碼PEBL之核酸序列安置於(例如位於)編碼CAR之核酸序列之5'。在一些實施例中，編碼CAR之核酸序列安置於編碼PEBL之核酸序列之5'。在一些實施例中，雙順反子構築體自5'至3'端包含以下或由以下組成：(a1) SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:63及SEQ ID NO:2；(a2) SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:63及SEQ ID NO:3；(a3) SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:63及SEQ ID NO:2；(a4) SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:63及SEQ ID NO:3；(b1) SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:64及SEQ ID NO:2；(b2) SEQ ID NO:4、SEQ ID NO: 64及SEQ ID NO:3；(b3) SEQ ID NO:5、SEQ ID NO: 64及SEQ ID NO:2；(b4) SEQ ID NO:5、SEQ ID NO: 64及SEQ ID NO:3；(c1) SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:65及SEQ ID NO:2；(c2) SEQ ID NO:4、SEQ ID NO: 65及SEQ ID NO:3；(c3) SEQ ID NO:5、SEQ ID NO: 65及SEQ ID NO:2；(c4) SEQ ID NO:5、SEQ ID NO: 65及SEQ ID NO:3；(d1) SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:66及SEQ ID NO:2；(d2) SEQ ID NO:4、SEQ ID NO: 66及SEQ ID NO:3；(d3) SEQ ID NO:5、SEQ ID NO: 66及SEQ ID NO:2；(d4) SEQ ID NO:5、SEQ ID NO: 66及SEQ ID NO:3；(e1) SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:63及SEQ ID NO:4；(e2) SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:63及SEQ ID NO:4；(e3) SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:63及SEQ ID NO:5；(e4) SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:63及SEQ ID NO:5；(f1) SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:64及SEQ ID NO:4；(f2) SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:64及SEQ ID NO:4；(f3) SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:63及SEQ ID NO:5；(f4) SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:64及SEQ ID NO:5；(g1) SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:65及SEQ ID NO:4；(g2) SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:65及SEQ ID NO:4；(g3) SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:65及SEQ ID NO:5；(g4) SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:65及SEQ ID NO:5；(h1) SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:66及SEQ ID NO:4；(h2) SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:66及SEQ ID NO:4；(h3) SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:66及SEQ ID NO:5；或(h4) SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:66及SEQ ID NO:5。
在一些實施例中，雙順反子構築體自5'至3'端包含以下或由以下組成：編碼SEQ ID NO:28之CD7 (TH69) CAR之聚核苷酸；編碼SEQ ID NO:67之P2A肽之聚核苷酸；及編碼SEQ ID NO:24之CD7 (TH69) PEBL之聚核苷酸。在一些實施例中，雙順反子構築體自5'至3'端包含以下或由以下組成：編碼CD7 (TH69) CAR之聚核苷酸；編碼SEQ ID NO:67之P2A肽之聚核苷酸；及編碼CD7 (TH69) PEBL之聚核苷酸。在一些實施例中，雙順反子構築體自5'至3'端包含以下或由以下組成：編碼SEQ ID NO:28之CD7 (TH69) CAR之聚核苷酸；編碼SEQ ID NO:67之P2A肽之聚核苷酸；及編碼SEQ ID NO:26之CD7 (3A1F) PEBL之聚核苷酸。在一些實施例中，雙順反子構築體自5'至3'端包含以下或由以下組成：編碼CD7 (TH69) CAR之聚核苷酸；編碼SEQ ID NO:67之P2A肽之聚核苷酸；及編碼CD7 (3A1F) PEBL之聚核苷酸。在一些實施例中，雙順反子構築體自5'至3'端包含以下或由以下組成：編碼SEQ ID NO:30之CD7 (3A1F) CAR之聚核苷酸；編碼SEQ ID NO:67之P2A肽之聚核苷酸；及編碼SEQ ID NO:24之CD7 (TH69) PEBL之聚核苷酸。在一些實施例中，雙順反子構築體自5'至3'端包含以下或由以下組成：編碼CD7 (3A1F) CAR之聚核苷酸；編碼SEQ ID NO:67之P2A肽之聚核苷酸；及編碼CD7 (TH69) PEBL之聚核苷酸。在一些實施例中，雙順反子構築體自5'至3'端包含以下或由以下組成：編碼SEQ ID NO:30之CD7 (3A1F) CAR之聚核苷酸；編碼SEQ ID NO:67之P2A肽之聚核苷酸；及編碼SEQ ID NO:26之CD7 (3A1F) PEBL之聚核苷酸。在一些實施例中，雙順反子構築體自5'至3'端包含以下或由以下組成：編碼CD7 (3A1F) CAR之聚核苷酸；編碼SEQ ID NO:67之P2A肽之聚核苷酸；及編碼CD7 (3A1F) PEBL之聚核苷酸。在一些實施例中，雙順反子構築體自5'至3'端包含以下或由以下組成：編碼SEQ ID NO:28之CD7 (TH69) CAR之聚核苷酸；編碼SEQ ID NO:68之P2A肽之聚核苷酸；及編碼SEQ ID NO:24之CD7 (TH69) PEBL之聚核苷酸。在一些實施例中，雙順反子構築體自5'至3'端包含以下或由以下組成：編碼CD7 (TH69) CAR之聚核苷酸；編碼SEQ ID NO:68之P2A肽之聚核苷酸；及編碼CD7 (TH69) PEBL之聚核苷酸。在一些實施例中，雙順反子構築體自5'至3'端包含以下或由以下組成：編碼SEQ ID NO:28之CD7 (TH69) CAR之聚核苷酸；編碼SEQ ID NO:68之P2A肽之聚核苷酸；及編碼SEQ ID NO:26之CD7 (3A1F) PEBL之聚核苷酸。在一些實施例中，雙順反子構築體自5'至3'端包含以下或由以下組成：編碼CD7 (TH69) CAR之聚核苷酸；編碼SEQ ID NO:68之P2A肽之聚核苷酸；及編碼CD7 (3A1F) PEBL之聚核苷酸。在一些實施例中，雙順反子構築體自5'至3'端包含以下或由以下組成：編碼SEQ ID NO:30之CD7 (3A1F) CAR之聚核苷酸；編碼SEQ ID NO:68之P2A肽之聚核苷酸；及編碼SEQ ID NO:24之CD7 (TH69) PEBL之聚核苷酸。在一些實施例中，雙順反子構築體自5'至3'端包含以下或由以下組成：編碼CD7 (3A1F) CAR之聚核苷酸；編碼SEQ ID NO:68之P2A肽之聚核苷酸；及編碼CD7 (TH69) PEBL之聚核苷酸。在一些實施例中，雙順反子構築體自5'至3'端包含以下或由以下組成：編碼SEQ ID NO:30之CD7 (3A1F) CAR之聚核苷酸；編碼SEQ ID NO:68之P2A肽之聚核苷酸；及編碼SEQ ID NO:26之CD7 (3A1F) PEBL之聚核苷酸。在一些實施例中，雙順反子構築體自5'至3'端包含以下或由以下組成：編碼CD7 (3A1F) CAR之聚核苷酸；編碼SEQ ID NO:68之P2A肽之聚核苷酸；及編碼CD7 (3A1F) PEBL之聚核苷酸。在一些實施例中，雙順反子構築體自5'至3'端包含以下或由以下組成：編碼SEQ ID NO:28之CD7 (TH69) CAR之聚核苷酸；編碼SEQ ID NO:69之P2A肽之聚核苷酸；及編碼SEQ ID NO:24之CD7 (TH69) PEBL之聚核苷酸。在一些實施例中，雙順反子構築體自5'至3'端包含以下或由以下組成：編碼CD7 (TH69) CAR之聚核苷酸；編碼SEQ ID NO:69之P2A肽之聚核苷酸；及編碼SEQ ID NO: 24或SEQ ID NO: 25之CD7 (TH69) PEBL之聚核苷酸。在一些實施例中，雙順反子構築體自5'至3'端包含以下或由以下組成：編碼SEQ ID NO:28之CD7 (TH69) CAR之聚核苷酸；編碼SEQ ID NO:69之P2A肽之聚核苷酸；及編碼SEQ ID NO:26之CD7 (3A1F) PEBL之聚核苷酸。在一些實施例中，雙順反子構築體自5'至3'端包含以下或由以下組成：編碼CD7 (TH69) CAR之聚核苷酸；編碼SEQ ID NO:69之P2A肽之聚核苷酸；及編碼CD7 (3A1F) PEBL之聚核苷酸。在一些實施例中，雙順反子構築體自5'至3'端包含以下或由以下組成：編碼SEQ ID NO:30之CD7 (3A1F) CAR之聚核苷酸；編碼SEQ ID NO:69之P2A肽之聚核苷酸；及編碼SEQ ID NO:24之CD7 (TH69) PEBL之聚核苷酸。在一些實施例中，雙順反子構築體自5'至3'端包含以下或由以下組成：編碼CD7 (3A1F) CAR之聚核苷酸；編碼SEQ ID NO:69之P2A肽之聚核苷酸；及編碼CD7 (TH69) PEBL之聚核苷酸。在一些實施例中，雙順反子構築體自5'至3'端包含以下或由以下組成：編碼SEQ ID NO:30之CD7 (3A1F) CAR之聚核苷酸；編碼SEQ ID NO:69之P2A肽之聚核苷酸；及編碼SEQ ID NO:26之CD7 (3A1F) PEBL之聚核苷酸。在一些實施例中，雙順反子構築體自5'至3'端包含以下或由以下組成：編碼CD7 (3A1F) CAR之聚核苷酸；編碼SEQ ID NO:69之P2A肽之聚核苷酸；及編碼CD7 (3A1F) PEBL之聚核苷酸。在一些實施例中，雙順反子構築體自5'至3'端包含以下或由以下組成：編碼SEQ ID NO:28之CD7 (TH69) CAR之聚核苷酸；編碼SEQ ID NO:70之P2A肽之聚核苷酸；及編碼SEQ ID NO:24之CD7 (TH69) PEBL之聚核苷酸。在一些實施例中，雙順反子構築體自5'至3'端包含以下或由以下組成：編碼CD7 (TH69) CAR之聚核苷酸；編碼SEQ ID NO:70之P2A肽之聚核苷酸；及編碼CD7 (TH69) PEBL之聚核苷酸。在一些實施例中，雙順反子構築體自5'至3'端包含以下或由以下組成：編碼SEQ ID NO:28之CD7 (TH69) CAR之聚核苷酸；編碼SEQ ID NO:70之P2A肽之聚核苷酸；及編碼SEQ ID NO:26之CD7 (3A1F) PEBL之聚核苷酸。在一些實施例中，雙順反子構築體自5'至3'端包含以下或由以下組成：編碼CD7 (TH69) CAR之聚核苷酸；編碼SEQ ID NO:70之P2A肽之聚核苷酸；及編碼CD7 (3A1F) PEBL之聚核苷酸。在一些實施例中，雙順反子構築體自5'至3'端包含以下或由以下組成：編碼SEQ ID NO:30之CD7 (3A1F) CAR之聚核苷酸；編碼SEQ ID NO:70之P2A肽之聚核苷酸；及編碼SEQ ID NO:24之CD7 (TH69) PEBL之聚核苷酸。在一些實施例中，雙順反子構築體自5'至3'端包含以下或由以下組成：編碼CD7 (3A1F) CAR之聚核苷酸；編碼SEQ ID NO:70之P2A肽之聚核苷酸；及編碼CD7 (TH69) PEBL之聚核苷酸。在一些實施例中，雙順反子構築體自5'至3'端包含以下或由以下組成：編碼SEQ ID NO:30之CD7 (3A1F) CAR之聚核苷酸；編碼SEQ ID NO:70之P2A肽之聚核苷酸；及編碼SEQ ID NO:26之CD7 (3A1F) PEBL之聚核苷酸。在一些實施例中，雙順反子構築體自5'至3'端包含以下或由以下組成：編碼CD7 (3A1F) CAR之聚核苷酸；編碼SEQ ID NO:70之P2A肽之聚核苷酸；及編碼CD7 (3A1F) PEBL之聚核苷酸。
在一些實施例中，編碼PEBL之聚核苷酸序列安置於IRES位點之5' (上游)，且IRES位點安置於編碼CAR之聚核苷酸序列之5'。在一些實施例中，編碼CAR之聚核苷酸序列安置於IRES位點之5'，且IRES位點安置於編碼PEBL之聚核苷酸序列之5'。
在一些實施例中，編碼PEBL之聚核苷酸序列安置於核糖體密碼子跳躍位點之5' (上游)，且核糖體密碼子跳躍位點安置於編碼CAR之聚核苷酸序列之5'。在一些實施例中，編碼CAR之聚核苷酸序列安置於核糖體密碼子跳躍位點之5'，且核糖體密碼子跳躍位點安置於編碼PEBL之聚核苷酸序列之5'。在一些實施例中，編碼PEBL之聚核苷酸序列不安置於編碼CAR之聚核苷酸序列之5' (上游)。舉例而言，編碼PEBL之聚核苷酸序列可不安置於核糖體密碼子跳躍位點之5' (上游)，而該核糖體密碼子跳躍位點又安置於編碼CAR之聚核苷酸序列之5'。
在一些態樣中，本文提供一種重組雙順反子構築體，其與選自由SEQ ID NO:63、SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:65及SEQ ID NO:66組成之群的一或多者之核酸序列具有至少90%序列一致性。在一些實施例中，重組雙順反子構築體與SEQ ID NO:63之核酸序列具有至少90%序列一致性。在一些實施例中，重組雙順反子構築體與SEQ ID NO:64之核酸序列具有至少90%序列一致性。在一些實施例中，重組雙順反子構築體與SEQ ID NO:65之核酸序列具有至少90%序列一致性。在一些實施例中，重組雙順反子構築體與SEQ ID NO:66之核酸序列具有至少90%序列一致性。在一些實施例中，重組雙順反子構築體包含選自由SEQ ID NO:63、SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:65及SEQ ID NO:66組成之群之一者的核酸序列。
表 2 . 核糖體密碼子跳躍肽及 IRES 之核酸序列
表 3 . 核糖體密碼子跳躍位點之胺基酸序列
| 名稱 | SEQ ID NO | 核酸序列 |
| IRES | SEQ ID NO:62 | CGGGATCAATTCCGCCCCCCCCCTAACGTTACTGGCCGAAGCCGCTTGGAATAAGGCCGGTGTGCGTTTGTCTATATGTTATTTTCCACCATATTGCCGTCTTTTGGCAATGTGAGGGCCCGGAAACCTGGCCCTGTCTTCTTGACGAGCATTCCTAGGGGTCTTTCCCCTCTCGCCAAAGGAATGCAAGGTCTGTTGAATGTCGTGAAGGAAGCAGTTCCTCTGGAAGCTTCTTGAAGACAAACAACGTCTGTAGCGACCCTTTGCAGGCAGCGGAACCCCCCACCTGGCGACAGGTGCCTCTGCGGCCAAAAGCCACGTGTATAAGATACACCTGCAAAGGCGGCACAACCCCAGTGCCACGTTGTGAGTTGGATAGTTGTGGAAAGAGTCAAATGGCTCTCCTCAAGCGTATTCAACAAGGGGCTGAAGGATGCCCAGAAGGTACCCCATTGTATGGGATCTGATCTGGGGCCTCGGTGCACATGCTTTACATGTGTTTAGTCGAGGTTAAAAAAACGTCTAGGCCCCCCGAACCACGGGGACGTGGTTTTCCTTTGAAAAACACGATAATACC |
| P2A | SEQ ID NO:63 | GCCACAAACTTCTCTCTGCTAAAGCAAGCAGGTGATGTTGAAGAAAACCCCGGGCCT |
| E2A | SEQ ID NO:64 | CAGTGTACTAATTATGCTCTCTTGAAATTGGCTGGAGATGTTGAGAGCAACGGAGGTCCC |
| F2A | SEQ ID NO:65 | GTGAAACAGACTTTGAATTTTGACCTTCTCAAGTTGGCGGGAGACGTGGAGTCCAACCCTGGACCT |
| T2A | SEQ ID NO:66 | GAGGGCAGGGGAAGTCTTCTAACATGCGGGGACGTGGAGGAAAATCCCGGCCCA |
| 名稱 | SEQ ID NO | 胺基酸序列 |
| P2A | SEQ ID NO:67 | ATNFSLLKQAGDVEENPGP |
| E2A | SEQ ID NO:68 | QCTNYALLKLAGDVESNPGP |
| F2A | SEQ ID NO:69 | VKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP |
| T2A | SEQ ID NO:70 | EGRGSLLTCGDVEENPGP |
本發明提供其中插入有本文所描述之任一聚核苷酸的載體，諸如表現載體。在一些實施例中，載體來源於反轉錄病毒，諸如慢病毒。此類載體為達成長期基因轉移之合適工具，因為其允許外源聚核苷酸(例如轉殖基因)之長期穩定整合及該外源聚核苷酸在子細胞中之增殖。與來源於致癌反轉錄病毒(諸如鼠類白血病病毒)之載體不同，慢病毒載體可轉導非增殖性細胞。慢病毒載體亦具有低免疫原性。在其他實施例中，載體為腺病毒載體。在某些實施例中，載體為質體。
在一些實施例中，啟動子與CMV啟動子具有至少90%，例如90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.9%或更高序列一致性。在一些實施例中，啟動子包含CMV啟動子。在一些實施例中，CMV啟動子包含SEQ ID NO:6之序列。在一些實施例中，本文所描述之任一構築體包含SEQ ID NO:6之CMV啟動子或由其組成。
在一些實施例中，啟動子與EF1α啟動子具有至少90%，例如90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.9%或更高序列一致性。在一些實施例中，啟動子包含EF1α啟動子。在一些實施例中，EF1α啟動子包含SEQ ID NO:7之序列。在一些實施例中，EF1α啟動子包含SEQ ID NO:7之序列。在一些實施例中，本文所描述之任一構築體包含SEQ ID NO:7之EF1α啟動子或由其組成。
在一些實施例中，啟動子與EFS啟動子具有至少90%，例如90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.9%或更高序列一致性。在一些實施例中，啟動子包含EFS啟動子。在一些實施例中，EFS啟動子包含SEQ ID NO:8之序列。在一些實施例中，EFS啟動子包含SEQ ID NO:8之序列。在一些實施例中，本文所描述之任一構築體包含SEQ ID NO:8之EFS啟動子或由其組成。
在一些實施例中，啟動子與鼠類幹細胞病毒(MSCV)啟動子具有至少90%，例如90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.9%或更高序列一致性。在一些實施例中，啟動子包含MSCV啟動子。在一些實施例中，MSCV啟動子包含SEQ ID NO:9之序列。在一些實施例中，本文所描述之任一構築體包含SEQ ID NO:9之MSCV啟動子或由其組成。
在一些實施例中，啟動子與磷酸甘油酯激酶(PGK)啟動子具有至少90%，例如90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.9%或更高序列一致性。在一些實施例中，啟動子包含PGK啟動子。在一些實施例中，PGK啟動子包含SEQ ID NO:10之序列。在一些實施例中，本文所描述之任一構築體包含SEQ ID NO:10之PGK啟動子或由其組成。
在一些實施例中，雙順反子載體包含SEQ ID NO:11之核酸序列或由其組成。在一些實施例中，雙順反子載體與SEQ ID NO:11之序列具有至少90%，例如90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.9%或更高序列一致性。雙順反子載體包含如下核酸序列，該核酸序列自5'端至3'端包含：編碼CD7 PEBL之核酸序列、IRES序列及編碼CD7 CAR之核酸序列，且視情況在5'端包含選自由以下組成之群的啟動子：CMV啟動子(例如SEQ ID NO:6)、EF1α啟動子(例如SEQ ID NO:7)、EFS啟動子(例如SEQ ID NO:8)、MSCV啟動子(例如SEQ ID NO:9)及PGK啟動子(例如SEQ ID NO:10)。
在一些實施例中，雙順反子載體包含SEQ ID NO:12之核酸序列。在一些實施例中，雙順反子載體與SEQ ID NO:12之序列具有至少90%，例如90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.9%或更高序列一致性。雙順反子載體包含如下核酸序列，該核酸序列自5'端至3'端包含：編碼CD7 CAR之核酸序列、IRES序列及編碼CD7 PEBL之核酸序列，視情況在5'端包含選自由以下組成之群的啟動子：CMV啟動子、EF1α啟動子、EFS啟動子、MSCV啟動子及PGK啟動子。
在一些實施例中，雙順反子載體包含SEQ ID NO:13之核酸序列。雙順反子載體與SEQ ID NO:13之序列具有至少90%，例如90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.9%或更高序列一致性。雙順反子載體包含如下核酸序列，該核酸序列自5'端至3'端包含：編碼CD7 CAR之核酸序列、編碼P2A肽之核酸序列及編碼CD7 PEBL之核酸序列，視情況在5'端包含選自由以下組成之群的啟動子：CMV啟動子、EF1α啟動子、EFS啟動子、MSCV啟動子及PGK啟動子。
在一些實施例中，雙順反子載體包含SEQ ID NO:14之核酸序列。在一些實施例中，雙順反子載體與SEQ ID NO:14之序列具有至少90%，例如90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.9%或更高序列一致性。雙順反子載體包含如下核酸序列，該核酸序列自5'端至3'端包含：啟動子、編碼CD7 CAR之核酸序列、P2A序列及編碼CD7 PEBL之核酸序列。在一些情況下，雙順反子載體包含如下核酸序列，該核酸序列自5'端至3'端包含：MSCV啟動子、編碼CD7 CAR之核酸序列、編碼P2A肽之核酸序列及編碼CD7 PEBL之核酸序列。
在一些實施例中，雙順反子載體包含SEQ ID NO:15之核酸序列。在一些實施例中，雙順反子載體與SEQ ID NO:15之序列具有至少90%，例如90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.9%或更高序列一致性。在一些情況下，雙順反子載體包含如下核酸序列，該核酸序列自5'端至3'端包含：EF1α啟動子、編碼CD7 CAR之核酸序列、編碼P2A肽之核酸序列及編碼CD7 PEBL之核酸序列。
在一些實施例中，雙順反子載體包含SEQ ID NO:16之核酸序列。在一些實施例中，雙順反子載體與SEQ ID NO:16之序列具有至少90%，例如90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.9%或更高序列一致性。在一些情況下，雙順反子載體包含如下核酸序列，該核酸序列自5'端至3'端包含：EFS啟動子、編碼CD7 CAR之核酸序列、編碼P2A肽之核酸序列及編碼CD7 PEBL之核酸序列。
CAR 及第一 PEBL 之雙啟動子反轉錄病毒構築體
本文提供用於在細胞(諸如T細胞)中同時表現CAR及PEBL的重組反轉錄病毒構築體(或載體)。在一些實施例中，反轉錄病毒構築體包括可操作地連接至編碼本文所描述之任一CAR之聚核苷酸的啟動子及可操作地連接至編碼本文所描述之任一PEBL之聚核苷酸的啟動子。在一些實施例中，CAR之啟動子及PEBL之啟動子具有低於90%序列一致性，例如低於90%一致性、低於80%一致性、低於75%序列一致性、低於70%序列一致性、低於65%序列一致性、低於60%序列一致性、低於55%序列一致性及其類似者。在一些實施例中，CAR之啟動子及PEBL之啟動子具有80%序列一致性或更低序列一致性，例如80%一致性、75%序列一致性、70%序列一致性、65%序列一致性、60%序列一致性、55%序列一致性及其類似者。在一些實施例中，CAR之啟動子及PEBL之啟動子具有至少50%序列一致性，例如50%序列一致性、55%序列一致性、60%序列一致性、65%序列一致性、70%序列一致性、75%序列一致性、80%序列一致性、85%序列一致性、90%序列一致性、95%序列一致性或更高序列一致性。
在一些實施例中，CAR之啟動子(稱為第一啟動子)不同於PEBL之啟動子(稱為第二啟動子)。第一啟動子及第二啟動子可具有相同序列。在其他情況下，第一啟動子及第二啟動子具有不同序列。
在一些實施例中，第一啟動子及/或第二啟動子與CMV啟動子具有至少90%，例如90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.9%或更高序列一致性。在一些實施例中，第一啟動子及/或第二啟動子包含CMV啟動子。在一些實施例中，CMV啟動子包含SEQ ID NO:6之序列。
在一些實施例中，第一啟動子及/或第二啟動子與EF1α啟動子具有至少90%，例如90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.9%或更高序列一致性。在一些實施例中，第一啟動子及/或第二啟動子包含EF1α啟動子。在一些實施例中，EF1α啟動子包含SEQ ID NO:7之序列。
在一些實施例中，第一啟動子及/或第二啟動子與EFS啟動子具有至少90%，例如90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.9%或更高序列一致性。在一些實施例中，第一啟動子及/或第二啟動子包含EFS啟動子。在一些實施例中，EFS啟動子包含SEQ ID NO:8之序列。
在一些實施例中，第一啟動子及/或第二啟動子與鼠類幹細胞病毒(MSCV)啟動子具有至少90%，例如90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.9%或更高序列一致性。在一些實施例中，第一啟動子及/或第二啟動子包含MSCV啟動子。在一些實施例中，MSCV啟動子包含SEQ ID NO:9之序列。
在一些實施例中，第一啟動子及/或第二啟動子與磷酸甘油酯激酶(PGK)啟動子具有至少90%，例如90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.9%或更高序列一致性。在一些實施例中，第一啟動子及/或第二啟動子包含PGK啟動子。在一些實施例中，PGK啟動子包含SEQ ID NO:10之序列。
在一些實施例中，反轉錄病毒構築體自5'至3'包括可操作地連接至編碼CAR之聚核苷酸的第一啟動子及可操作地連接至編碼PEBL之聚核苷酸的第二啟動子。在各種實施例中，反轉錄病毒構築體自5'至3'包括可操作地連接至編碼PEBL之聚核苷酸的第二啟動子及可操作地連接至編碼CAR之聚核苷酸的第一啟動子。
在一些實施例中，第一啟動子位於第二啟動子上游。在一些實施例中，第一啟動子為CMV啟動子且第二啟動子為EFS啟動子。在一些實施例中，第一啟動子為CMV啟動子且第二啟動子為EF1α啟動子。在一些實施例中，第一啟動子為CMV啟動子且第二啟動子為PGK啟動子。在一些實施例中，第一啟動子為CMV啟動子且第二啟動子為MSCV啟動子。在一些實施例中，第一啟動子為CMV啟動子且第二啟動子為CMV啟動子。在一些實施例中，第一啟動子為MSCV啟動子且第二啟動子為EFS啟動子。在一些實施例中，第一啟動子為MSCV啟動子且第二啟動子為EF1α啟動子。在一些實施例中，第一啟動子為MSCV啟動子且第二啟動子為PGK啟動子。在一些實施例中，第一啟動子為MSCV啟動子且第二啟動子為CMV啟動子。在一些實施例中，第一啟動子為MSCV啟動子且第二啟動子為MSCV啟動子。在一些實施例中，第一啟動子為PGK啟動子且第二啟動子為EFS啟動子。在一些實施例中，第一啟動子為PGK啟動子且第二啟動子為EF1α啟動子。在一些實施例中，第一啟動子為PGK啟動子且第二啟動子為MSCV啟動子。在一些實施例中，第一啟動子為PGK啟動子且第二啟動子為CMV啟動子。在一些實施例中，第一啟動子為PGK啟動子且第二啟動子為PGK啟動子。在一些實施例中，第一啟動子為EF1α啟動子且第二啟動子為MSCV啟動子。在一些實施例中，第一啟動子為EF1α啟動子且第二啟動子為PGK啟動子。在一些實施例中，第一啟動子為EF1α啟動子且第二啟動子為EFS啟動子。在一些實施例中，第一啟動子為EF1α啟動子且第二啟動子為CMV啟動子。在一些實施例中，第一啟動子為EF1α啟動子且第二啟動子為EF1α啟動子。在一些實施例中，第一啟動子為EFS啟動子且第二啟動子為MSCV啟動子。在一些實施例中，第一啟動子為EFS啟動子且第二啟動子為EF1α啟動子。在一些實施例中，第一啟動子為EFS啟動子且第二啟動子為PGK啟動子。在一些實施例中，第一啟動子為EFS啟動子且第二啟動子為CMV啟動子。在一些實施例中，第一啟動子為EFS啟動子且第二啟動子為EFS啟動子。
在一些實施例中，本發明之反轉錄病毒構築體包含與SEQ ID NO:17具有至少90%，例如90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.9%或更高序列一致性之核酸序列。在一些實施例中，本發明之反轉錄病毒構築體包含SEQ ID NO:17之核酸序列。在一些實施例中，本發明之反轉錄病毒構築體包含與SEQ ID NO:18具有至少90%，例如90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.9%或更高序列一致性之核酸序列。在一些實施例中，本發明之反轉錄病毒構築體包含SEQ ID NO:18之核酸序列。在一些實施例中，本發明之反轉錄病毒構築體包含與SEQ ID NO:19具有至少90%，例如90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.9%或更高序列一致性之核酸序列。在一些實施例中，本發明之反轉錄病毒構築體包含SEQ ID NO:19之核酸序列。在一些實施例中，本發明之反轉錄病毒構築體包含與SEQ ID NO:20具有至少90%，例如90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.9%或更高序列一致性之核酸序列。在一些實施例中，本發明之反轉錄病毒構築體包含SEQ ID NO:20之核酸序列。在一些實施例中，本發明之反轉錄病毒構築體包含與SEQ ID NO:21具有至少90%，例如90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.9%或更高序列一致性之核酸序列。在一些實施例中，本發明之反轉錄病毒構築體包含SEQ ID NO:21之核酸序列。在一些實施例中，本發明之反轉錄病毒構築體包含與SEQ ID NO:22具有至少90%，例如90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.9%或更高序列一致性之核酸序列。在一些實施例中，本發明之反轉錄病毒構築體包含SEQ ID NO:22之核酸序列。在一些實施例中，本發明之反轉錄病毒構築體包含與SEQ ID NO:23具有至少90%，例如90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.9%或更高序列一致性之核酸序列。在一些實施例中，本發明之反轉錄病毒構築體包含SEQ ID NO:23之核酸序列。
結合 CD7 之 抗體
在某些實施例中，基於TH69抗體之抗CD7 scFv包含可變重鏈(重鏈可變區或VH)及可變輕鏈(輕鏈可變區或VL)，其含有之胺基酸序列各自與SEQ ID NO:32及33中分別所示之VH及VL序列具有至少90%序列一致性、至少91%序列一致性、至少92%序列一致性、至少93%序列一致性、至少94%序列一致性、至少95%序列一致性、至少96%序列一致性、至少97%序列一致性、至少98%序列一致性、至少99%序列一致性、或100%序列一致性。重鏈可變區可與SEQ ID NO:32之VH序列具有至少90%序列一致性、至少91%序列一致性、至少92%序列一致性、至少93%序列一致性、至少94%序列一致性、至少95%序列一致性、至少96%序列一致性、至少97%序列一致性、至少98%序列一致性、至少99%序列一致性、或100%序列一致性。輕鏈可變區可與SEQ ID NO:33之VL序列具有至少90%序列一致性、至少91%序列一致性、至少92%序列一致性、至少93%序列一致性、至少94%序列一致性、至少95%序列一致性、至少96%序列一致性、至少97%序列一致性、至少98%序列一致性、至少99%序列一致性、或100%序列一致性。在一些情況下，重鏈可變區包含SEQ ID NO:32中所示之序列中之至少一個(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多個)胺基酸取代。在某些情況下，重鏈可變區包含SEQ ID NO:32中所示之序列中之10個或更少個(例如0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個)胺基酸取代。在一些情況下，輕鏈可變區包含SEQ ID NO:33中所示之序列中之至少一個(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多個)胺基酸取代。在某些情況下，輕鏈可變區包含SEQ ID NO:33中所示之序列中之10個或更少個(例如0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個)胺基酸取代。本文所描述之任一胺基酸取代可為保守或非保守取代。
在一些實施例中，抗CD7 scFv包含SEQ ID NO:44之VL CDR1 (SASQGISNYLN)、SEQ ID NO:45之VL CDR2 (YTSSLHS)及SEQ ID NO:46之VL CDR3 (QQYSKLPYT)。在一些實施例中，抗CD7 scFv包含SEQ ID NO:47之VH CDR1 (SYAMS)SEQ ID NO:48之VH CDR2 (SISSGGFTYYPDSVKG)及SEQ ID NO:49之VH CDR3 (DEVRGYLDV)。在一些實施例中，抗CD7 scFv包含SEQ ID NO:44之VL CDR1、SEQ ID NO:45之VL CDR2、SEQ ID NO:46之VL CDR3、SEQ ID NO:47之VH CDR1、SEQ ID NO:48之VH CDR2及SEQ ID NO:49之VH CDR3。
在一些實施例中，編碼VH之核酸序列與SEQ ID NO:38中所示之核酸序列具有至少90%序列一致性、至少91%序列一致性、至少92%序列一致性、至少93%序列一致性、至少94%序列一致性、至少95%序列一致性、至少96%序列一致性、至少97%序列一致性、至少98%序列一致性、至少99%序列一致性、或100%序列一致性。在其他實施例中，編碼VL之核酸序列與SEQ ID NO:39中所示之核酸序列具有至少90%序列一致性、至少91%序列一致性、至少92%序列一致性、至少93%序列一致性、至少94%序列一致性、至少95%序列一致性、至少96%序列一致性、至少97%序列一致性、至少98%序列一致性、至少99%序列一致性、或100%序列一致性。
在某些實施例中，基於3A1F抗體之抗CD7 scFv包含可變重鏈(重鏈可變區或VH)及可變輕鏈(輕鏈可變區或VL)，其含有之序列各自與SEQ ID NO:34及35中分別所示之VH及VL序列具有至少90%序列一致性、至少91%序列一致性、至少92%序列一致性、至少93%序列一致性、至少94%序列一致性、至少95%序列一致性、至少96%序列一致性、至少97%序列一致性、至少98%序列一致性、至少99%序列一致性、或100%序列一致性。重鏈可變區可與SEQ ID NO:34之VH序列具有至少90%序列一致性、至少91%序列一致性、至少92%序列一致性、至少93%序列一致性、至少94%序列一致性、至少95%序列一致性、至少96%序列一致性、至少97%序列一致性、至少98%序列一致性、至少99%序列一致性、或100%序列一致性。輕鏈可變區可與SEQ ID NO:35之VL序列具有至少90%序列一致性、至少91%序列一致性、至少92%序列一致性、至少93%序列一致性、至少94%序列一致性、至少95%序列一致性、至少96%序列一致性、至少97%序列一致性、至少98%序列一致性、至少99%序列一致性、或100%序列一致性。在一些情況下，重鏈可變區包含SEQ ID NO:34中所示之序列中之至少一個(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多個)胺基酸取代。在某些情況下，重鏈可變區包含SEQ ID NO:34中所示之序列中之10個或更少個(例如0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個)胺基酸取代。在一些情況下，輕鏈可變區包含SEQ ID NO:35中所示之序列中之至少一個(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或更多個)胺基酸取代。在某些情況下，重鏈可變區包含SEQ ID NO:35中所示之序列中之10個或更少個(例如0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個)胺基酸取代。本文所描述之任一胺基酸取代可為保守或非保守取代。
在一些實施例中，抗CD7 scFv包含SEQ ID NO:50之VL CDR1 (RASQSISNNLH)、SEQ ID NO:51之VL CDR2 (SASQSIS)及SEQ ID NO:52之VL CDR3 (QQSNSWPYT)。在一些實施例中，抗CD7 scFv包含SEQ ID NO:53之VH CDR1 (SYWMH)、SEQ ID NO:54之VH CDR2 (KINPSNGRTNYNEKFKS)及SEQ ID NO:55之VH CDR3 (GGVYYDLYYYALDY)。在各種實施例中，抗CD7 scFv包含SEQ ID NO:50之VL CDR1、SEQ ID NO:51之VL CDR2、SEQ ID NO:52之VL CDR3、SEQ ID NO:53之VH CDR1、SEQ ID NO:54之VH CDR2及SEQ ID NO:55之VH CDR3。
在一些實施例中，編碼VH之核酸序列與SEQ ID NO:40中所示之核酸序列具有至少90%序列一致性、至少91%序列一致性、至少92%序列一致性、至少93%序列一致性、至少94%序列一致性、至少95%序列一致性、至少96%序列一致性、至少97%序列一致性、至少98%序列一致性、至少99%序列一致性、或100%序列一致性。在其他實施例中，編碼VL之核酸序列與SEQ ID NO:41中所示之核酸序列具有至少90%序列一致性、至少91%序列一致性、至少92%序列一致性、至少93%序列一致性、至少94%序列一致性、至少95%序列一致性、至少96%序列一致性、至少97%序列一致性、至少98%序列一致性、至少99%序列一致性、或100%序列一致性。
在某些實施例中，基於T3-3A1抗體之抗CD7 scFv包含可變重鏈(重鏈可變區或VH)及可變輕鏈(輕鏈可變區或VL)，其含有之序列各自與SEQ ID NO:36及37中分別所示之VH及VL序列具有至少90%序列一致性、至少91%序列一致性、至少92%序列一致性、至少93%序列一致性、至少94%序列一致性、至少95%序列一致性、至少96%序列一致性、至少97%序列一致性、至少98%序列一致性、至少99%序列一致性、或100%序列一致性。重鏈可變區可與SEQ ID NO:36之VH序列具有至少90%序列一致性、至少91%序列一致性、至少92%序列一致性、至少93%序列一致性、至少94%序列一致性、至少95%序列一致性、至少96%序列一致性、至少97%序列一致性、至少98%序列一致性、至少99%序列一致性、或100%序列一致性。輕鏈可變區可與SEQ ID NO:37之VL序列具有至少90%序列一致性、至少91%序列一致性、至少92%序列一致性、至少93%序列一致性、至少94%序列一致性、至少95%序列一致性、至少96%序列一致性、至少97%序列一致性、至少98%序列一致性、至少99%序列一致性、或100%序列一致性。在一些情況下，重鏈可變區包含SEQ ID NO:36中所示之序列中之至少一個(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多個)胺基酸取代。在某些情況下，重鏈可變區包含SEQ ID NO:36中所示之序列中之13個或更少個(例如0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或13個)胺基酸取代。在一些情況下，輕鏈可變區包含SEQ ID NO:37中所示之序列中之至少一個(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多個)胺基酸取代。在某些情況下，重鏈可變區包含SEQ ID NO:37中所示之序列中之11個或更少個(例如0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11個)胺基酸取代。本文所描述之任一胺基酸取代可為保守或非保守取代。
在一些實施例中，抗CD7 scFv包含SEQ ID NO:56之VL CDR1 (RASKSVSASGYSYMH)、SEQ ID NO:57之VL CDR2 (LASNLES)及SEQ ID NO:58之VL CDR3 (QHSRELPYT)。在一些實施例中，抗CD7 scFv包含SEQ ID NO:59之VH CDR1 (SFGMH)、SEQ ID NO:60之VH CDR2 (YISSGSSTLHYADTVKG)及SEQ ID NO:61之VH CDR3 (WGNYPHYAMDY)。在各種實施例中，抗CD7 scFv包含SEQ ID NO:56之VL CDR1、SEQ ID NO:57之VL CDR2、SEQ ID NO:58之VL CDR3、SEQ ID NO:59之VH CDR1、SEQ ID NO:60之VH CDR2及SEQ ID NO:61之VH CDR3。
在一些實施例中，編碼VH之核酸序列與SEQ ID NO:42中所示之核酸序列具有至少90%序列一致性、至少91%序列一致性、至少92%序列一致性、至少93%序列一致性、至少94%序列一致性、至少95%序列一致性、至少96%序列一致性、至少97%序列一致性、至少98%序列一致性、至少99%序列一致性、或100%序列一致性。在其他實施例中，編碼VL之核酸序列與SEQ ID NO:43中所示之核酸序列具有至少90%序列一致性、至少91%序列一致性、至少92%序列一致性、至少93%序列一致性、至少94%序列一致性、至少95%序列一致性、至少96%序列一致性、至少97%序列一致性、至少98%序列一致性、至少99%序列一致性、或100%序列一致性。
在一些實施例中，本發明之scFv包含與抗CD7抗體之可變重鏈序列具有至少90%序列一致性、至少91%序列一致性、至少92%序列一致性、至少93%序列一致性、至少94%序列一致性、至少95%序列一致性、至少96%序列一致性、至少97%序列一致性、至少98%序列一致性、至少99%序列一致性、或100%序列一致性的可變重鏈序列。在一些實施例中，本發明之scFv包含與抗CD7抗體之可變輕鏈序列具有至少90%序列一致性、至少91%序列一致性、至少92%序列一致性、至少93%序列一致性、至少94%序列一致性、至少95%序列一致性、至少96%序列一致性、至少97%序列一致性、至少98%序列一致性、至少99%序列一致性、或100%序列一致性的可變輕鏈序列。舉例而言，抗CD7抗體可為熟習此項技術者公認之任何此類抗體。
表 4. 抗 CD7 scFv 之 VH 區及 VL 區之胺基酸序列
表 5. 抗 CD7 scFv 之 VH 區及 VL 區之核酸序列
表 15. 抗 CD7 scFv 之 VH 、 VL 及 CDR 區 之例示性胺基酸序列
細胞內 CD7 經由 CD7 PEBL 之下調
| 抗體 | 組分 | 胺基酸序列 |
| TH69 | VH | EVQLVESGGGLVKPGGSLKLSCAASGLTFSSYAMSWVRQTPEKRLEWVASISSGGFTYYPDSVKGRFTISRDNARNILYLQMSSLRSEDTAMYYCARDEVRGYLDVWGAGTTVTVSS (SEQ ID NO:32) |
| VL | AAYKDIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCSASQGISNYLNWYQQKPDGTVKLLIYYTSSLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEPEDIATYYCQQYSKLPYTFGGGTKLEIKR (SEQ ID NO:33) | |
| 3A1F | VH | QVQLQESGAELVKPGASVKLSCKASGYTFTSYWMHWVKQRPGQGLEWIGKINPSNGRTNYNEKFKSKATLTVDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARGGVYYDLYYYALDYWGQGTTVTVSS (SEQ ID NO:34) |
| VL | DIELTQSPATLSVTPGDSVSLSCRASQSISNNLHWYQQKSHESPRLLIKSASQSISGIPSRFSGSGSGTDFTLSINSVETEDFGMYFCQQSNSWPYTFGGGTKLEIKR (SEQ ID NO:35) | |
| T3-3A1 | VH | DVQLVESGGGLVQPGGSRKLSCAASGFTFSSFGMHWVRQAPEKGLEWVAYISSGSSTLHYADTVKGRFTISRDNPKNTLFLQMTSLRSEDTAMYYCARWGNYPHYAMDYWGQGTSVTVSS (SEQ ID NO:36) |
| VL | DIVMTQSPASLAVSLGQRATISCRASKSVSASGYSYMHWYQQKPGQPPKLLIYLASNLESGVPARFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDAVTYYCQHSRELPYTFGGGTKLEIK (SEQ ID NO:37) |
| 抗體 | 組分 | 核酸序列 |
| TH69 | VH | GAGGTGCAGCTGGTCGAATCTGGAGGAGGACTGGTGAAGCCAGGAGGATCTCTGAAACTGAGTTGTGCCGCTTCAGGCCTGACCTTCTCAAGCTACGCCATGAGCTGGGTGCGACAGACACCTGAGAAGCGGCTGGAATGGGTCGCTAGCATCTCCTCTGGCGGGTTCACATACTATCCAGACTCCGTGAAAGGCAGATTTACTATCTCTCGGGATAACGCAAGAAATATTCTGTACCTGCAGATGAGTTCACTGAGGAGCGAGGACACCGCAATGTACTATTGTGCCAGGGACGAAGTGCGCGGCTATCTGGATGTCTGGGGAGCTGGCACTACCGTCACCGTCTCCAGC (SEQ ID NO:38) |
| VL | GCCGCATACAAGGATATTCAGATGACTCAGACCACAAGCTCCCTGAGCGCCTCCCTGGGAGACCGAGTGACAATCTCTTGCAGTGCATCACAGGGAATTAGCAACTACCTGAATTGGTATCAGCAGAAGCCAGATGGCACTGTGAAACTGCTGATCTACTATACCTCTAGTCTGCACAGTGGGGTCCCCTCACGATTCAGCGGATCCGGCTCTGGGACAGACTACAGCCTGACTATCTCCAACCTGGAGCCCGAAGATATTGCCACCTACTATTGCCAGCAGTACTCCAAGCTGCCTTATACCTTTGGCGGGGGAACAAAGCTGGAGATTAAAAGG (SEQ ID NO:39) | |
| 3A1F | VH | CAGGTCCAGCTGCAGGAGTCAGGAGCTGAGCTGGTGAAGCCAGGGGCAAGCGTCAAACTGTCCTGCAAGGCCTCTGGATATACATTCACTAGCTACTGGATGCACTGGGTGAAACAGAGACCCGGACAGGGCCTGGAGTGGATCGGAAAGATTAACCCTAGCAATGGCAGGACCAACTACAACGAAAAGTTTAAATCCAAGGCAACCCTGACAGTGGACAAGAGCTCCTCTACAGCCTACATGCAGCTGAGTTCACTGACTTCAGAGGATAGCGCAGTGTACTATTGCGCCAGAGGCGGGGTCTACTATGACCTGTACTATTACGCCCTGGATTATTGGGGGCAGGGAACCACAGTGACTGTCAGCTCC (SEQ ID NO:40) |
| VL | GACATCGAGCTGACCCAGAGTCCTGCTACACTGAGCGTGACTCCAGGCGATTCTGTCAGTCTGTCATGTCGGGCAAGCCAGTCCATCTCTAACAATCTGCACTGGTACCAGCAGAAATCCCATGAATCTCCACGACTGCTGATTAAGAGTGCCTCACAGAGCATCTCCGGCATTCCCTCCCGGTTCTCTGGCAGTGGGTCAGGAACTGACTTTACCCTGAGTATTAACTCAGTGGAGACAGAAGATTTCGGCATGTATTTTTGCCAGCAGAGCAATTCCTGGCCCTACACTTTCGGAGGCGGGACCAAACTGGAGATCAAGCGG (SEQ ID NO:41) | |
| T3-3A1 | VH | GATGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTAGTGCAGCCTGGAGGGTCCCGGAAACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACTTTCAGTAGCTTTGGAATGCACTGGGTTCGTCAGGCTCCAGAGAAGGGGCTGGAGTGGGTCGCATACATTAGTAGTGGCAGTAGTACCCTCCACTATGCAGACACAGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATCCCAAGAACACCCTGTTCCTGCAAATGACCAGTCTAAGGTCTGAGGACACGGCCATGTATTACTGTGCAAGATGGGGTAACTACCCTCACTATGCTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCA SEQ ID NO:42) |
| VL | GACATTGTGATGACCCAGTCTCCTGCTTCCTTAGCTGTATCTCTGGGGCAGAGGGCCACCATCTCATGCAGGGCCAGCAAAAGTGTCAGTGCATCTGGCTATAGTTATATGCACTGGTACCAACAGAAACCAGGACAGCCACCCAAACTCCTCATCTATCTTGCATCCAACCTAGAATCTGGGGTCCCTGCCAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACCCTCAACATCCATCCTGTGGAGGAGGAGGATGCTGTAACCTATTACTGTCAGCACAGTAGGGAGCTTCCGTACACGTTCGGAGGGGGGACCAAGCTGGAAATAAAA (SEQ ID NO:43) |
| 名稱 | VL | VH | LC CDR1 | LC CDR2 | LC CDR3 | HC CDR1 | HC CDR2 | HC CDR3 |
| TH69 | AAYKDIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCSASQGISNYLNWYQQKPDGTVKLLIYYTSSLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEPEDIATYYCQQYSKLPYTFGGGTKLEIKR (SEQ ID NO: 33) | EVQLVESGGGLVKPGGSLKLSCAASGLTFSSYAMSWVRQTPEKRLEWVASISSGGFTYYPDSVKGRFTISRDNARNILYLQMSSLRSEDTAMYYCARDEVRGYLDVWGAGTTVTVSS (SEQ ID NO:32) | SASQGISNYLN (SEQ ID NO: 44) | YTSSLHS (SEQ ID NO: 45) | QQYSKLPYT (SEQ ID NO: 46) | SYAMS (SEQ ID NO: 47) | SISSGGFTYYPDSVKG (SEQ ID NO: 48) | DEVRGYLDV (SEQ ID NO: 49) |
| 3A1F | DIELTQSPATLSVTPGDSVSLSCRASQSISNNLHWYQQKSHESPRLLIKSASQSISGIPSRFSGSGSGTDFTLSINSVETEDFGMYFCQQSNSWPYTFGGGTKLEIKR (SEQ ID NO:35) | QVQLQESGAELVKPGASVKLSCKASGYTFTSYWMHWVKQRPGQGLEWIGKINPSNGRTNYNEKFKSKATLTVDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARGGVYYDLYYYALDYWGQGTTVTVSS (SEQ ID NO: 34) | RASQSISNNLH(SEQ ID NO: 50) | SASQSIS (SEQ ID NO: 51) | QQSNSWPYT (SEQ ID NO: 52) | SYWMH (SEQ ID NO: 53) | KINPSNGRTNYNEKFKS (SEQ ID NO: 54) | GGVYYDLYYYALDY (SEQ ID NO: 55) |
| T3-3A1 | DIVMTQSPASLAVSLGQRATISCRASKSVSASGYSYMHWYQQKPGQPPKLLIYLASNLESGVPARFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDAVTYYCQHSRELPYTFGGGTKLEIK (SEQ ID NO:37) | DVQLVESGGGLVQPGGSRKLSCAASGFTFSSFGMHWVRQAPEKGLEWVAYISSGSSTLHYADTVKGRFTISRDNPKNTLFLQMTSLRSEDTAMYYCARWGNYPHYAMDYWGQGTSVTVSS (SEQ ID NO:36) | RASKSVSASGYSYMH(SEQ ID NO: 55) | LASNLES (SEQ ID NO: 56) | QHSRELPYT (SEQ ID NO: 57) | SFGMH (SEQ ID NO: 58) | YISSGSSTLHYADTVKG (SEQ ID NO: 59) | WGNYPHYAMDY (SEQ ID NO: 60) |
如本文所描述，當抗CD7 CAR與效應T細胞上CD7表現之下調組合使用時，T細胞之細胞毒性顯示顯著增加。如本文所證明，CD7之下調(例如消除、減少及/或重定位)防止相應抗CD7 CAR發揮之自相殘殺效應，實現與滯留目標抗原(例如CD7)之細胞相比更高的CAR表現後T細胞回收，以及針對T白血病/淋巴瘤細胞之更有效細胞毒性。如熟習此項技術者將理解，效應T細胞上CD7表現之下調可根據多種已知方法達成，包括例如針對CD7之蛋白質表現阻斷劑(PEBL) (如WO2016/126213中所描述)、針對CD7之RNAi或基因編輯方法，諸如大範圍核酸酶、TALEN、CRISPR/Cas9及鋅指核酸酶。經由鹼基編輯技術亦有可能達成基因破壞。鹼基編輯器能夠在限定的遺傳基因座處產生單一鹼基對改變以改變基因表現。腺嘌呤鹼基編輯器(ABE)及胞嘧啶鹼基編輯器(CBE)將去胺酶與Cas切口酶組合以介導DNA中不會出現雙股斷裂的基因編輯。不希望受理論所束縛，本文所提供之方法可提供有效的靶向多重編輯系統。在一些實施例中，鹼基編輯器系統包含：核苷酸結合域；用於使目標核苷酸序列中之核鹼基脫去胺基之去胺酶域；及一或多個使Cas靶向特定基因座之引導RNA分子(gRNA)。腺嘌呤鹼基編輯器在目標位點處產生A至G (或T至C)點突變，且胞嘧啶鹼基編輯器在目標位點處產生C至T (或G至A)點突變。在一些情況下，胞嘧啶鹼基編輯器可與尿嘧啶DNA醣苷酶抑制劑(UGI)融合以防止鹼基切除修復。在一些實施例中，去胺酶為腺苷去胺酶。在一些實施例中，腺苷去胺酶催化去氧核糖核酸(DNA)中腺嘌呤或腺苷之水解去胺作用。在一些實施例中，去胺酶可為AID、CDA1或APOBEC3G。在一些實施例中，ADE或CBE可在基因體目標位點處產生1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多個同時編輯。在一些實施例中，鹼基編輯器可藉由在剪接模體或起始密碼子中產生點突變來破壞基因表現。在一些實施例中，鹼基編輯器可藉由產生點突變形成終止密碼子來破壞基因表現。在一些實施例中，本文所描述之鹼基編輯系統可用於產生CD3 CAR T細胞。在一些實施例中，鹼基編輯器系統可包含雙鹼基編輯器(例如，腺嘌呤及胞嘧啶鹼基編輯組件之融合物)。雙鹼基編輯器(例如，組合式鹼基編輯器或多功能鹼基編輯器)可包含腺苷去胺酶域及胞苷去胺酶域。雙鹼基編輯器可進一步包含一或多種UGI。
本發明描述結合目標抗原且將目標抗原隔離至細胞之細胞質中的PEBL。本發明描述結合目標抗原且將目標抗原隔離至細胞之細胞內區室中的PEBL。目標抗原可在細胞內合成且結合至PEBL。
在某些實施例中，本文提供一種聚核苷酸，其包含編碼PEBL之核酸序列，該PEBL包含連接至定位域之目標結合分子(例如CD7抗原結合域)。在一些情況下，PEBL自N端至C端包含：CD7抗原結合域、視情況存在之域連接子以及細胞定位域。在一些實施例中，PEBL進一步包含融合至CD7抗原結合域N端之信號肽。在一些實施例中，CD7抗原結合域包含VL域、域連接子及VH域。
如本文所使用，在蛋白質表現阻斷劑的上下文中，「連接」係指編碼目標結合分子之基因與編碼一或多個定位域之一或多個基因直接框內相鄰(例如無連接子)。或者，編碼目標結合分子之基因可經由例如如WO2016/126213中所描述之連接子序列連接至編碼一或多個定位域之一或多個基因。如熟習此項技術者將理解，此類連接子序列以及此類連接子序列之變體為此項技術中已知的。設計併入連接子序列之構築體的方法以及評估功能性之方法為熟習此項技術者容易獲得的。
在一些實施例中，PEBL之定位域包含內質網(ER)或高基氏體滯留序列；或蛋白酶體定位序列。在某些實施例中，定位域包含表6之內質網(ER)滯留肽。在某些實施例中，定位域包含表6中所示之蛋白酶體定位序列。定位域可將PEBL引導至特定細胞區室，諸如高基氏體或內質網、蛋白酶體或細胞膜，視應用而定。
在一些實施例中，蛋白酶體定位藉由將scFv序列連接至三聯模體21 (tripartite motif containing 21，TRIM21)靶向域序列且共表現編碼人類TRIM21 E3泛素連接酶蛋白之序列來達成。TRIM21以高親和力結合至抗體之Fc域，且可募集泛素-蛋白酶體複合物以降解與抗體結合之分子(例如蛋白質及肽)。TRIM21靶向域序列編碼選自人類免疫球蛋白G (IgG)恆定區(Fc)基因(諸如IgG1、IgG2或IgG4)之群的胺基酸序列，且用於形成包含scFv及Fc域之融合蛋白。在此實施例中，外源表現之TRIM21蛋白結合與目標蛋白(例如CD7)結合之scFv-Fc融合蛋白，且將複合物引導至蛋白酶體進行降解。
人類TRIM21 E3連接酶蛋白之胺基酸序列之詳情可見於例如NCBI蛋白質資料庫中之NCBI Ref. Seq. No. NP_003132.2。編碼人類TRIM21 E3連接酶蛋白之核酸序列之詳情可見於例如NCBI蛋白質資料庫中之NCBI Ref. Seq. No. NM_003141.3。
在一些實施例中，PEBL亦包括來源於CD8α、CD8β、4-1BB、CD28、CD34、CD4、FcεRIγ、CD16、OX40、CD3ζ、CD3ε、CD3γ、CD3δ、TCRα、CD32、CD64、VEGFR2、FAS或FGFR2B之鉸鏈域及跨膜域序列。在一些實施例中，PEBL包含選自由以下組成之群的鉸鏈及跨膜域：CD8α之鉸鏈及跨膜域、CD8β之鉸鏈及跨膜域、4-1BB之鉸鏈及跨膜域、CD28之鉸鏈及跨膜域、CD34之鉸鏈及跨膜域、CD4之鉸鏈及跨膜域、FcεRIγ之鉸鏈及跨膜域、CD16之鉸鏈域及跨膜域、OX40之鉸鏈及跨膜域、CD3ζ之鉸鏈及跨膜域、CD3ε之鉸鏈及跨膜域、CD3γ之鉸鏈及跨膜域、CD3δ之鉸鏈及跨膜域、TCRα之鉸鏈及跨膜域、CD32之鉸鏈及跨膜域、CD64之鉸鏈及跨膜域、VEGFR2之鉸鏈及跨膜域、FAS之鉸鏈及跨膜域，以及FGFR2B之鉸鏈及跨膜域。
在某些實施例中，PEBL包含表6中所示之一或多個組分。
表 6. CD7 PEBL 之所選組分之胺基酸序列資訊
| 組分 | SEQ ID NO | 胺基酸序列 |
| ER定位域 經由myc系連至scFv之KDEL (「myc KDEL」) | SEQ ID NO:71 | EQKLISEEDLKDEL |
| 定位域「連接(20)AEKDEL」 | SEQ ID NO:72 | GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSAEKDEL |
| KDEL域 | SEQ ID NO:73 | KDEL |
| KKXX域 | SEQ ID NO:74 | KKXX，其中X為任何胺基酸 |
| KXD/E域 | KXD或KXE，其中X為任何胺基酸 | |
| YQRL域 | SEQ ID NO:75 | YQRL |
| PEST模體 | SEQ ID NO:76 | PEST |
| 定位域 「mb DEKKMP」域 | SEQ ID NO:77 | TTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYKYKSRRSFIDEKKMP |
| CD8α鉸鏈及跨膜域 | SEQ ID NO:78 | TTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLY |
| VH-VL連接子 | SEQ ID NO:79 | GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS |
| CD8α信號肽 | SEQ ID NO:80 | MALPVTALLLPLALLLHAARP |
| PEBL22滯留序列 | SEQ ID NO: 99 | EQKLISEEDLGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSAEKDEL |
在一些實施例中，CD7 PEBL含有CD7抗原結合域，其包含SEQ ID NO:32之胺基酸序列、SEQ ID NO:33之胺基酸序列及VH-VL連接子。VH-VL連接子可為(G
4S)
n連接子，其中n可在1至6之範圍內，例如1、2、3、4、5或6。在一個實施例中，CD7 PEBL包含SEQ ID NO:32之胺基酸序列、SEQ ID NO:33之胺基酸序列及SEQ ID NO:79之胺基酸序列。在一些實施例中，CD7 PEBL包含與SEQ ID NO:32具有至少90%序列一致性或至少95%序列一致性之胺基酸序列、SEQ ID NO:33之胺基酸序列及SEQ ID NO:79之胺基酸序列。在某些實施例中，CD7 PEBL包含SEQ ID NO:32之胺基酸序列、與SEQ ID NO:33具有至少90%序列一致性或至少95%序列一致性之胺基酸序列及SEQ ID NO:79之胺基酸序列。在其他實施例中，抗CD7蛋白質表現阻斷劑包含與SEQ ID NO:32具有至少90%序列一致性或至少95%序列一致性之胺基酸序列、與SEQ ID NO:33具有至少90%序列一致性或至少95%序列一致性之胺基酸序列及SEQ ID NO:79之胺基酸序列。
在一些實施例中，CD7 PEBL含有CD7抗原結合域，其包含SEQ ID NO:34之胺基酸序列、SEQ ID NO:35之胺基酸序列及VH-VL連接子。VH-VL連接子可為(G
4S)
n連接子，其中n可在1至6之範圍內，例如1、2、3、4、5或6。在一個實施例中，CD7 PEBL包含SEQ ID NO:34之胺基酸序列、SEQ ID NO:35之胺基酸序列及SEQ ID NO:79之胺基酸序列。在一些實施例中，CD7 PEBL包含與SEQ ID NO:34具有至少95%序列一致性之胺基酸序列、SEQ ID NO:35之胺基酸序列及SEQ ID NO:79之胺基酸序列。在某些實施例中，CD7 PEBL包含SEQ ID NO:34之胺基酸序列、與SEQ ID NO:35具有至少95%序列一致性之胺基酸序列及SEQ ID NO:79之胺基酸序列。在其他實施例中，CD7 PEBL包含與SEQ ID NO:34具有至少90%序列一致性或至少95%序列一致性之胺基酸序列、與SEQ ID NO:35具有至少90%序列一致性或至少95%序列一致性之胺基酸序列及SEQ ID NO:79之胺基酸序列。
在一些實施例中，CD7 PEBL含有CD7抗原結合域，其包含SEQ ID NO:36之胺基酸序列、SEQ ID NO:37之胺基酸序列及VH-VL連接子。VH-VL連接子可為(G
4S)
n連接子，其中n可在1至6之範圍內，例如1、2、3、4、5或6。在一個實施例中，CD7 PEBL包含SEQ ID NO:36之胺基酸序列、SEQ ID NO:37之胺基酸序列及SEQ ID NO:79之胺基酸序列。在一些實施例中，CD7 PEBL包含與SEQ ID NO:36具有至少90%序列一致性或至少95%序列一致性之胺基酸序列、SEQ ID NO:37之胺基酸序列及SEQ ID NO:79之胺基酸序列。在某些實施例中，CD7 PEBL包含SEQ ID NO:36之胺基酸序列、與SEQ ID NO:37具有至少90%序列一致性或至少95%序列一致性之胺基酸序列及SEQ ID NO:79之胺基酸序列。在其他實施例中，CD7 PEBL包含與SEQ ID NO:36具有至少90%序列一致性或至少95%序列一致性之胺基酸序列、與SEQ ID NO:37具有至少90%序列一致性或至少95%序列一致性之胺基酸序列及SEQ ID NO:79之胺基酸序列。
在一些情況下，CD7 PEBL亦包含選自SEQ ID NO: 72-77中所示之任一序列的定位域。在一些情況下，CD7 PEBL亦包含CD8α信號肽，諸如但不限於SEQ ID NO:80中所示之CD8α信號肽。在其他情況下，抗CD7蛋白質表現阻斷劑亦包含CD8α鉸鏈及跨膜域，諸如但不限於SEQ ID NO:78中所示之CD8α鉸鏈及跨膜域。
在一個實施例中，由本文所描述之雙順反子載體編碼的CD7 PEBL包含SEQ ID NO:24之序列及N端處之脯胺酸。在一些實施例中，CD7 PEBL包含SEQ ID NO:25之序列。N端脯胺酸殘基由2A裂解產生。在一些實施例中，由本文所描述之雙順反子載體編碼的CD7 PEBL包含SEQ ID NO:26之序列及N端處之脯胺酸。在一些實施例中，CD7 PEBL包含SEQ ID NO:27之序列。
在一些實施例中，本發明之工程化免疫細胞包含由雙順反子載體編碼之CD7 PEBL，使得該CD7 PEBL包含SEQ ID NO:24之序列及N端處之脯胺酸或者SEQ ID NO:25之序列。在一些實施例中，工程化免疫細胞為CD4+ T細胞，其包含由雙順反子載體編碼之CD7 PEBL，使得該CD7 PEBL包含SEQ ID NO:24之序列及N端處之脯胺酸或者SEQ ID NO:25之序列。在一些實施例中，工程化免疫細胞為CD8+ T細胞，其包含由雙順反子載體編碼之CD7 PEBL，其中該CD7 PEBL包含SEQ ID NO:24之序列及N端處之脯胺酸或者SEQ ID NO:25之序列。在一些實施例中，工程化免疫細胞為CD3+ T細胞，其包含由雙順反子載體編碼之CD7 PEBL，其中該CD7 PEBL包含SEQ ID NO:24之序列及N端處之脯胺酸或者SEQ ID NO:25之序列。
在一些實施例中，本發明之工程化免疫細胞包含由雙順反子載體編碼之CD7 PEBL，使得該CD7 PEBL包含SEQ ID NO:26之序列及N端處之脯胺酸或者SEQ ID NO:27之序列。在一些實施例中，工程化免疫細胞為CD4+ T細胞，其包含由雙順反子載體編碼之CD7 PEBL，其中該CD7 PEBL包含SEQ ID NO:26之序列及N端處之脯胺酸或者SEQ ID NO:27之序列。在一些實施例中，工程化免疫細胞為CD8+ T細胞，其包含由雙順反子載體編碼之CD7 PEBL，其中該CD7 PEBL包含SEQ ID NO:26之序列及N端處之脯胺酸或者SEQ ID NO:27之序列。在一些實施例中，工程化免疫細胞為CD3+ T細胞，其包含由雙順反子載體編碼之CD7 PEBL，其中該CD7 PEBL包含SEQ ID NO:26之序列及N端處之脯胺酸或者SEQ ID NO:27之序列。
在一些實施例中，由本文所描述之雙啟動子載體編碼的CD7 PEBL包含SEQ ID NO:24之序列。在一些實施例中，由本文所描述之雙啟動子載體編碼的CD7 PEBL結合至CD7且與SEQ ID NO:24具有至少90%序列一致性。在一些實施例中，由本文所描述之雙啟動子載體編碼的CD7 PEBL包含SEQ ID NO:26之序列。在一些實施例中，由本文所描述之雙啟動子載體編碼的CD7 PEBL結合至CD7且與SEQ ID NO:26具有至少90%序列一致性。
在一些實施例中，編碼CD7 PEBL之聚核苷酸包含表6中所示之一或多個核酸序列。
在一些實施例中，PEBL之抗CD7 scFv之VH域包含SEQ ID NO:38之核苷酸序列，且PEBL之抗CD7 scFv之VL域包含SEQ ID NO:39之核苷酸序列。在某些實施例中，PEBL之抗CD7 scFv之VH域包含與SEQ ID NO:38具有至少90%序列一致性(例如90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高序列一致性)之核苷酸序列，且PEBL之抗CD7 scFv之VL域包含與SEQ ID NO:39具有至少90%序列一致性(例如90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高序列一致性)之核苷酸序列。在一些實施例中，PEBL之抗CD7 scFv之VH域包含與SEQ ID NO:38具有至少90%序列一致性(例如90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高序列一致性)之核苷酸序列，且PEBL之抗CD7 scFv之VL域包含與SEQ ID NO:39具有至少90%序列一致性(例如90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高序列一致性)之核苷酸序列，或其密碼子最佳化變體。
在一些實施例中，PEBL之抗CD7 scFv之VH域包含SEQ ID NO:40之核苷酸序列，且PEBL之抗CD7 scFv之VL域包含SEQ ID NO:41之核苷酸序列。在某些實施例中，PEBL之抗CD7 scFv之VH域包含與SEQ ID NO:40具有至少90%序列一致性(例如90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高序列一致性)之核苷酸序列，且PEBL之抗CD7 scFv之VL域包含與SEQ ID NO:41具有至少90%序列一致性(例如90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高序列一致性)之核苷酸序列。在一些實施例中，PEBL之抗CD7 scFv之VH域包含與SEQ ID NO:40具有至少90%序列一致性(例如90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高序列一致性)之核苷酸序列，且PEBL之抗CD7 scFv之VL域包含與SEQ ID NO:41具有至少90%序列一致性(例如90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高序列一致性)之核苷酸序列，或其密碼子最佳化變體。
在一些實施例中，PEBL之抗CD7 scFv之VH域包含SEQ ID NO:42之核苷酸序列，且PEBL之抗CD7 scFv之VL域包含SEQ ID NO:43之核苷酸序列。在某些實施例中，PEBL之抗CD7 scFv之VH域包含與SEQ ID NO:42具有至少90%序列一致性(例如90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高序列一致性)之核苷酸序列，且PEBL之抗CD7 scFv之VL域包含與SEQ ID NO:43具有至少90%序列一致性(例如90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高序列一致性)之核苷酸序列。在一些實施例中，PEBL之抗CD7 scFv之VH域包含與SEQ ID NO:42具有至少90%序列一致性(例如90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高序列一致性)之核苷酸序列，且PEBL之抗CD7 scFv之VL域包含與SEQ ID NO:43具有至少90%序列一致性(例如90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高序列一致性)之核苷酸序列，或其密碼子最佳化變體。
表 7. CD7 PEBL 之所選組分之核酸序列資訊
| 組分 | SEQ ID NO | 序列 |
| CD8α信號肽 | SEQ ID NO:81 | ATGGCTCTGCCTGTGACCGCACTGCTGCTGCCCCTGGCTCTGCTGCTGCACGCCGCAAGACCT |
| VH-VL連接子 | SEQ ID NO:82 | GGAGGAGGAGGAAGCGGAGGAGGAGGATCCGGAGGCGGGGGATCTGGAGGAGGAGGAAGT |
| ER定位域 經由myc系連至scFv之KDEL (「myc KDEL」) | SEQ ID NO:83 | GAGCAGAAACTGATTAGCGAAGAGGACCTGAAAGATGAACTG |
在本發明之某些態樣中，PEBL可結合至表現於細胞表面上之分子，包括但不限於醣蛋白CD1家族之成員、CD2、CD3、CD4、CD5、CD7、CD8、CD25、CD28、CD38、CD45、CD45RA、CD45RO、CD52、CD56、CD57、CD99、CD127及CD137。
在一些實施例中，CD7 PEBL包含與SEQ ID NO:2具有至少85% (例如85%、86%、87%、88%、89%、90%或更高)序列一致性之核酸序列且結合至CD7。在一些實施例中，CD7 PEBL包含與SEQ ID NO:2具有至少90% (例如90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高)序列一致性之核酸序列且結合至CD7。在一些實施例中，CD7 PEBL包含與SEQ ID NO:2具有至少90% (例如90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高)序列一致性之核酸序列。
在一些實施例中，CD7 PEBL包含與SEQ ID NO:3具有至少85% (例如85%、86%、87%、88%、89%、90%或更高)序列一致性之核酸序列且結合至CD7。在一些實施例中，CD7 PEBL包含與SEQ ID NO:3具有至少90% (例如90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高)序列一致性之核酸序列且結合至CD7。在一些實施例中，CD7 PEBL包含與SEQ ID NO:3具有至少90% (例如90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高)序列一致性之核酸序列。
在一些實施例中，本發明之工程化免疫細胞包含由雙順反子構築體編碼之CD7 PEBL，該雙順反子構築體包含與SEQ ID NO:2具有至少90% (例如90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高)序列一致性的CD7 PEBL之核酸序列。在一些實施例中，工程化免疫細胞為CD4+ T細胞，其包含由雙順反子載體構築體編碼之CD7 PEBL，該雙順反子載體構築體包含與SEQ ID NO:2具有至少90%序列一致性的CD7 PEBL之核酸序列。在一些實施例中，工程化免疫細胞為CD8+ T細胞，其包含由雙順反子構築體編碼之CD7 PEBL，該雙順反子構築體包含與SEQ ID NO:2具有至少90%序列一致性的CD7 PEBL之核酸序列。在一些實施例中，工程化免疫細胞為CD3+ T細胞，其包含由雙順反子構築體編碼之CD7 PEBL，該雙順反子構築體包含與SEQ ID NO:2具有至少90%序列一致性的CD7 PEBL之核酸序列。又，本文提供一種包含此類細胞之群體。
在一些實施例中，本發明之工程化免疫細胞包含由雙順反子構築體編碼之CD7 PEBL，該雙順反子構築體包含與SEQ ID NO:3具有至少90% (例如90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高)序列一致性的CD7 PEBL之核酸序列。在一些實施例中，工程化免疫細胞為CD4+ T細胞，其包含由雙順反子載體構築體編碼之CD7 PEBL，該雙順反子載體構築體包含與SEQ ID NO:3具有至少90%序列一致性的CD7 PEBL之核酸序列。在一些實施例中，工程化免疫細胞為CD8+ T細胞，其包含由雙順反子構築體編碼之CD7 PEBL，該雙順反子構築體包含與SEQ ID NO:3具有至少90%序列一致性的CD7 PEBL之核酸序列。在一些實施例中，工程化免疫細胞為CD3+ T細胞，其包含由雙順反子構築體編碼之CD7 PEBL，該雙順反子構築體包含與SEQ ID NO:3具有至少90%序列一致性的CD7 PEBL之核酸序列。又，本文提供一種包含此類細胞之群體。
結合 CD7 之 嵌合抗原受體
在一些實施例中，本發明之CAR包含細胞內信號傳導域4-1BB及CD3ζ以及特異性結合CD7之抗原結合域(例如單鏈可變片段或scFv)。本發明之CD7 CAR在本文中有時被稱作「抗CD7-41BB-CD3ζ」。在一些實施例中，CAR亦包括CD8α鉸鏈域及跨膜域，諸如但不限於SEQ ID NO:84之胺基酸序列。
如熟習此項技術者將理解，在某些實施例中，本文所揭示之各種組分(例如scFv、細胞內信號傳導域、連接子及其組合)之胺基酸序列中之任一者可與本文所揭示之特定相應序列具有至少90%序列一致性、至少91%序列一致性、至少92%序列一致性、至少93%序列一致性、至少94%序列一致性、至少95%序列一致性、至少96%序列一致性、至少97%序列一致性、至少98%序列一致性、至少99%序列一致性、或100%序列一致性。舉例而言，在某些實施例中，細胞內信號傳導域4-1BB可與SEQ ID NO:85具有至少90%序列一致性、至少91%序列一致性、至少92%序列一致性、至少93%序列一致性、至少94%序列一致性、至少95%序列一致性、至少96%序列一致性、至少97%序列一致性、至少98%序列一致性、至少99%序列一致性、或100%序列一致性，只要其具有所需功能。在某些實施例中，細胞內信號傳導域4-1BB包含SEQ ID NO:85中所示之胺基酸序列。
作為另一實例，在某些實施例中，細胞內信號傳導域4-1BB可經來自共刺激分子之另一細胞內信號傳導域置換，該共刺激分子諸如CD28、OX40、ICOS、CD27、GITR、HVEM、TIM1、LFA1、CD30、CD84、CRTAM、DR3、SLAMF1或CD2。在一些實施例中，CAR之細胞內信號傳導域可與CD28、OX40、ICOS、CD27、GITR、HVEM、TIM1、LFA1或CD2之細胞內信號傳導域具有至少90%序列一致性、至少91%序列一致性、至少92%序列一致性、至少93%序列一致性、至少94%序列一致性、至少95%序列一致性、至少96%序列一致性、至少97%序列一致性、至少98%序列一致性、至少99%序列一致性、或100%序列一致性。
作為另一實例，在某些情況下，細胞內信號傳導域4-1BB亦可包括來自共刺激分子之另一細胞內信號傳導域(或其一部分)，該共刺激分子諸如CD28、OX40、ICOS、CD27、GITR、HVEM、TIM1、LFA1、CD30、CD84、CRTAM、DR3、SLAMF1或CD2。在一些實施例中，該另一細胞內信號傳導域可與CD28、OX40、ICOS、CD27、GITR、HVEM、TIM1、LFA1或CD2之細胞內信號傳導域具有至少90%序列一致性、至少91%序列一致性、至少92%序列一致性、至少93%序列一致性、至少94%序列一致性、至少95%序列一致性、至少96%序列一致性、至少97%序列一致性、至少98%序列一致性、至少99%序列一致性、或100%序列一致性。在其他實施例中，該另一細胞內信號傳導域與CD28、OX40、ICOS、CD27、GITR、HVEM、TIM1、LFA1或CD2之一或多個細胞內信號傳導域片段具有至少90%序列一致性、至少91%序列一致性、至少92%序列一致性、至少93%序列一致性、至少94%序列一致性、至少95%序列一致性、至少96%序列一致性、至少97%序列一致性、至少98%序列一致性、至少99%序列一致性、或100%序列一致性。
作為另一實例，在某些實施例中，細胞內信號傳導域CD3ζ可與SEQ ID NO:86具有至少90%序列一致性、至少91%序列一致性、至少92%序列一致性、至少93%序列一致性、至少94%序列一致性、至少95%序列一致性、至少96%序列一致性、至少97%序列一致性、至少98%序列一致性、至少99%序列一致性、或100%序列一致性，只要其具有所需功能。在某些實施例中，細胞內信號傳導域CD3ζ包含SEQ ID NO:86中所示之胺基酸序列。
在一些情況下，細胞內信號傳導域包含基於免疫受體酪胺酸之活化模體(ITAM)或其一部分，只要其具有所需功能。CAR之細胞內信號傳導域可包括與ITAM具有至少90%序列一致性、至少91%序列一致性、至少92%序列一致性、至少93%序列一致性、至少94%序列一致性、至少95%序列一致性、至少96%序列一致性、至少97%序列一致性、至少98%序列一致性、至少99%序列一致性、或100%序列一致性的序列。在一些情況下，細胞內信號傳導域可與FcεRIγ、CD4、CD7、CD8、CD28、OX40、CD79a、CD79b、DAP12或H2-Kb具有至少95%序列一致性、至少96%序列一致性、至少97%序列一致性、至少98%序列一致性、至少99%序列一致性、或100%序列一致性，只要其具有所需功能。
在某些實施例中，抗CD7 CAR進一步包含鉸鏈域及/或跨膜域。適合用於本發明之鉸鏈及跨膜域為此項技術中已知的，且提供於例如以全文引用之方式併入的公開案WO2016/126213中。在一些實施例中，抗CD7 CAR之鉸鏈及跨膜域包括來自CD8β、4-1BB、CD28、CD34、CD4、FcεRIγ、CD16、OX40、CD3ζ、CD3ε、CD3γ、CD3δ、TCRα、CD32、CD64、VEGFR2、FAS、FGFR2B或另一跨膜蛋白之信號傳導域(例如，鉸鏈及跨膜域)。
在某些實施例中，抗CD7 CAR進一步包含CD8α信號肽。包含本文所描述之實施例的抗CD7 CAR之示意圖展示於US 2018/0179280之圖17中。
在一些實施例中，嵌合抗原受體(CAR)可結合至表現於細胞表面上之分子，包括但不限於醣蛋白CD1家族之成員、CD2、CD3、CD4、CD5、CD7、CD8、CD25、CD28、CD38、CD45、CD45RA、CD45RO、CD52、CD56、CD57、CD99、CD127及CD137。
在某些實施例中，本發明之經分離多肽包含根據表8的編碼CAR之胺基酸序列。在一些實施例中，多肽包含根據表8的編碼CAR之組分之胺基酸序列。
表 8. CD7 CAR 之所選組分之胺基酸序列資訊
| 組分 | SEQ ID NO | 胺基酸序列 |
| CD8α鉸鏈及跨膜域 | SEQ ID NO:84 | TTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLY |
| 細胞內信號傳導域4-1BB | SEQ ID NO:85 | KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL |
| 細胞內信號傳導域CD3ζ | SEQ ID NO:86 | RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR |
在一些實施例中，CD7 CAR包含CD7抗原結合域、4-1BB細胞內信號傳導域、CD3ζ細胞內信號傳導域以及CD8鉸鏈及跨膜域。在一些實施例中，CD7抗原結合域包含VH域及VL域以及VH-VL連接子，諸如但不限於(G
4S)
n連接子，其中n可在1至6之範圍內，例如1、2、3、4、5或6。在一些實施例中，CD7 CAR自N端至C端包含：CD8信號肽、CD7抗原結合域、CD8鉸鏈及跨膜域、4-1BB細胞內信號傳導域及CD3ζ細胞內信號傳導域。
在一些實施例中，由本文所描述之雙順反子載體編碼的CD7 CAR包含SEQ ID NO:28之胺基酸序列。在一些實施例中，由本文所描述之雙順反子載體編碼的CD7 CAR包含SEQ ID NO:29之胺基酸序列。在一些實施例中，由本文所描述之雙順反子載體編碼的CD7 CAR包含SEQ ID NO:30之胺基酸序列。在一些實施例中，由本文所描述之雙順反子載體編碼的CD7 CAR包含SEQ ID NO:31之胺基酸序列。
在一些實施例中，本發明之工程化免疫細胞包含由雙順反子載體編碼之CD7 CAR，使得CD7 CAR包含SEQ ID NO:28之序列及C端處藉由2A自裂解肽之裂解產生的另外胺基酸殘基，或CD7 CAR包含SEQ ID NO:29之序列。在一些實施例中，工程化免疫細胞為CD4+ T細胞，其包含由雙順反子載體編碼之CD7 CAR，使得CD7 CAR包含SEQ ID NO:28之序列及C端處藉由2A自裂解肽之裂解產生的另外胺基酸殘基，或CD7 CAR包含SEQ ID NO:29之序列。在一些實施例中，工程化免疫細胞為CD8+ T細胞，其包含由雙順反子載體編碼之CD7 CAR，使得CD7 CAR包含SEQ ID NO:28之序列及C端處藉由2A自裂解肽之裂解產生的另外胺基酸殘基，或CD7 CAR包含SEQ ID NO:29之序列。在一些實施例中，工程化免疫細胞為CD3+ T細胞，其包含由雙順反子載體編碼之CD7 CAR，使得CD7 CAR包含SEQ ID NO:28之序列及C端處藉由2A自裂解肽之裂解產生的另外胺基酸殘基，或CD7 CAR包含SEQ ID NO:29之序列。又，本文提供包含此類細胞之群體。
在一些實施例中，本發明之工程化免疫細胞包含由雙順反子載體編碼之CD7 CAR，使得CD7 CAR包含SEQ ID NO:30之序列及C端處藉由2A自裂解肽之裂解產生的另外胺基酸殘基，或CD7 CAR包含SEQ ID NO:31之序列。在一些實施例中，工程化免疫細胞為CD4+ T細胞，其包含由雙順反子載體編碼之CD7 CAR，使得CD7 CAR包含SEQ ID NO:30之序列及C端處藉由2A自裂解肽之裂解產生的另外胺基酸殘基，或CD7 CAR包含SEQ ID NO:31之序列。在一些實施例中，工程化免疫細胞為CD8+ T細胞，其包含由雙順反子載體編碼之CD7 CAR，使得CD7 CAR包含SEQ ID NO:30之序列及C端處藉由2A自裂解肽之裂解產生的另外胺基酸殘基，或CD7 CAR包含SEQ ID NO:31之序列。在一些實施例中，工程化免疫細胞為CD3+ T細胞，其包含由雙順反子載體編碼之CD7 CAR，使得CD7 CAR包含SEQ ID NO:30之序列及C端處藉由2A自裂解肽之裂解產生的另外胺基酸殘基，或CD7 CAR包含SEQ ID NO:31之序列。又，本文提供此類細胞之群體。
在一些實施例中，由本文所描述之雙啟動子載體編碼的CD7 CAR包含SEQ ID NO:28之胺基酸序列。在一些實施例中，本發明之工程化免疫細胞包含由雙啟動子載體編碼之CD7 CAR，使得CD7 CAR包含SEQ ID NO:28之序列。在一些實施例中，工程化免疫細胞為CD4+ T細胞，其包含由雙啟動子載體編碼之CD7 CAR，使得CD7 CAR包含SEQ ID NO:28之序列。在一些實施例中，工程化免疫細胞為CD8+ T細胞，其包含由雙啟動子載體編碼之CD7 CAR，使得CD7 CAR包含SEQ ID NO:28之序列。在一些實施例中，工程化免疫細胞為CD3+ T細胞，其包含由雙啟動子載體編碼之CD7 CAR，使得CD7 CAR包含SEQ ID NO:28之序列。在一些實施例中，由本文所描述之雙順反子載體編碼的CD7 CAR包含SEQ ID NO:30之胺基酸序列。在一些實施例中，本發明之工程化免疫細胞包含由雙啟動子載體編碼之CD7 CAR，使得CD7 CAR包含SEQ ID NO:30之序列。在一些實施例中，工程化免疫細胞為CD4+ T細胞，其包含由雙啟動子載體編碼之CD7 CAR，使得CD7 CAR包含SEQ ID NO:30之序列。在一些實施例中，工程化免疫細胞為CD8+ T細胞，其包含由雙啟動子載體編碼之CD7 CAR，使得CD7 CAR包含SEQ ID NO:30之序列。在一些實施例中，工程化免疫細胞為CD3+ T細胞，其包含由雙啟動子載體編碼之CD7 CAR，使得CD7 CAR包含SEQ ID NO:30之序列。又，本文提供此類細胞之群體。
在某些實施例中，本發明之CD7 CAR之經分離聚核苷酸包含表9之一或多個核酸序列。在一些實施例中，核酸序列包含如表9中所示的編碼CAR之一或多個組分之序列。
表 9. CD7 CAR 之所選組分之核酸序列資訊
| 組分 | SEQ ID NO | 核酸序列 |
| CD8α鉸鏈及跨膜域 | SEQ ID NO:96 | ACCACTACACCTGCACCAAGGCCTCCCACACCCGCTCCCACTATCGCTTCCCAGCCACTGTCCCTGAGGCCCGAGGCCTGCAGGCCAGCAGCTGGCGGAGCCGTGCATACTAGGGGGCTGGACTTCGCTTGCGACATCTACATCTGGGCCCCACTGGCAGGGACATGCGGAGTCCTGCTGCTGTCCCTGGTCATCACACTGTACTGC |
| 細胞內信號傳導域4-1BB | SEQ ID NO:97 | AAGCGGGGGCGCAAAAAACTGCTGTATATCTTTAAGCAGCCTTTCATGAGACCAGTGCAGACAACCCAGGAGGAAGATGGGTGCTCATGCCGGTTTCCCGAGGAGGAGGAAGGCGGCTGCGAGCTG |
| 細胞內信號傳導域CD3ζ | SEQ ID NO:98 | GGGTGAAGTTTTCCCGCTCAGCAGATGCTCCTGCCTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTGTATAATGAGCTGAACCTGGGCAGACGCGAAGAGTATGATGTGCTGGACAAAAGGCGGGGAAGAGACCCCGAAATGGGAGGGAAGCCAAGGCGGAAAAACCCCCAGGAGGGCCTGTACAATGAGCTGCAGAAGGACAAAATGGCAGAGGCTTACAGTGAGATTGGGATGAAGGGAGAGAGACGGAGGGGAAAAGGGCACGATGGCCTGTACCAGGGGCTGAGCACAGCAACCAAAGATACTTATGACGCACTGCACATGCAGGCACTGCCACCCAGA |
在一些實施例中，編碼CD7 CAR之聚核苷酸包含結合CD7之抗原結合域之核酸序列、CD8α鉸鏈及跨膜域之核酸序列、細胞內信號傳導域4-1BB之核酸序列及細胞內信號傳導域CD3ζ之核酸序列。在某些實施例中，聚核苷酸亦包括CD8信號肽之核酸序列。
在某些實施例中，抗原結合域為抗CD7 scFv。在一些實施例中，scFv之VH序列包含與SEQ ID NO:38之序列具有至少90%序列一致性(例如90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高序列一致性)的核酸序列，且VL序列包含與SEQ ID NO:39之序列具有至少90%序列一致性(例如90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高序列一致性)的核酸序列。
在一些實施例中，scFv之VH序列包含與SEQ ID NO:40之序列具有至少90%序列一致性(例如90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高序列一致性)的核酸序列，且VL序列包含與SEQ ID NO:41之序列具有至少90%序列一致性(例如90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高序列一致性)的核酸序列。在一些實施例中，scFv之VH序列包含與SEQ ID NO:42之序列具有至少90%序列一致性(例如90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高序列一致性)的核酸序列，且VL序列包含與SEQ ID NO:43之序列具有至少90%序列一致性(例如90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高序列一致性)的核酸序列。
在一些實施例中，編碼CD7 CAR之聚核苷酸自5'端至3'端包含：結合CD7之抗原結合域之核酸序列、SEQ ID NO:96、SEQ ID NO:97及SEQ ID NO:98。在一些實施例中，編碼CD7 CAR之聚核苷酸自5'端至3'端包含：SEQ ID NO:81、結合CD7之抗原結合域之核酸序列、SEQ ID NO:96、SEQ ID NO:97及SEQ ID NO:98。
在一些實施例中，CD7 CAR包含與SEQ ID NO:4具有至少85% (例如85%、86%、87%、88%、89%、90%或更高)序列一致性之核酸序列且結合至CD7。在一些實施例中，CD7 CAR包含與SEQ ID NO:4具有至少90% (例如90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高)序列一致性之核酸序列且結合至CD7。在一些實施例中，CD7 PEBL包含與SEQ ID NO:4具有至少90% (例如90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高)序列一致性之核酸序列。
在一些實施例中，CD7 CAR包含與SEQ ID NO:5具有至少85% (例如85%、86%、87%、88%、89%、90%或更高)序列一致性之核酸序列且結合至CD7。在一些實施例中，CD7 CAR包含與SEQ ID NO:5具有至少90% (例如90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高)序列一致性之核酸序列且結合至CD7。在一些實施例中，CD7 PEBL包含與SEQ ID NO:5具有至少90% (例如90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高)序列一致性之核酸序列。
在一些實施例中，本發明之工程化免疫細胞包含由雙順反子構築體或雙啟動子構築體編碼之CD7 CAR，該雙順反子構築體或雙啟動子構築體包含與SEQ ID NO:4具有至少90% (例如90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高)序列一致性的CD7 CAR之核酸序列。在一些實施例中，工程化免疫細胞為CD4+ T細胞，其包含由雙順反子載體構築體或雙啟動子構築體編碼之CD7 CAR，該雙順反子載體構築體或雙啟動子構築體包含與SEQ ID NO:4具有至少90%序列一致性的CD7 PEBL之核酸序列。在一些實施例中，工程化免疫細胞為CD8+ T細胞，其包含由雙順反子構築體編碼之CD7 PEBL，該雙順反子構築體包含與SEQ ID NO:4具有至少90%序列一致性的CD7 PEBL之核酸序列。在一些實施例中，工程化免疫細胞為CD3+ T細胞，其包含由雙順反子構築體編碼之CD7 PEBL，該雙順反子構築體包含與SEQ ID NO:4具有至少90%序列一致性的CD7 PEBL之核酸序列。又，本文提供一種包含此類細胞之群體。
在一些實施例中，本發明之工程化免疫細胞包含由雙順反子構築體或雙啟動子構築體編碼之CD7 CAR，該雙順反子構築體或雙啟動子構築體包含與SEQ ID NO:5具有至少90% (例如90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高)序列一致性的CD7 CAR之核酸序列。在一些實施例中，工程化免疫細胞為CD4+ T細胞，其包含由雙順反子載體構築體編碼之CD7 CAR，該雙順反子載體構築體包含與SEQ ID NO:5具有至少90%序列一致性的CD7 PEBL之核酸序列。在一些實施例中，工程化免疫細胞為CD8+ T細胞，其包含由雙順反子構築體編碼之CD7 PEBL，該雙順反子構築體包含與SEQ ID NO:5具有至少90%序列一致性的CD7 PEBL之核酸序列。在一些實施例中，工程化免疫細胞為CD3+ T細胞，其包含由雙順反子構築體編碼之CD7 PEBL，該雙順反子構築體包含與SEQ ID NO:5具有至少90%序列一致性的CD7 PEBL之核酸序列。又，本文提供一種包含此類細胞之群體。
細胞內 CD3 經由 CD3 PEBL 之下調
在一些情況下，如本文所描述，當抗CD7 CAR與效應T細胞上CD7及CD3表現之下調組合使用時，T細胞之細胞毒性顯示顯著增加。如本文所證明，CD7及CD3之下調(例如消除、減少及/或重定位)不僅防止相應抗CD7 CAR發揮之自相殘殺效應，實現與滯留目標抗原(例如CD7)之細胞相比更高的CAR表現後T細胞回收，以及針對T白血病/淋巴瘤細胞之更有效細胞毒性，且亦防止發生GvHD。如熟習此項技術者將理解，效應T細胞上CD7及CD3表現之下調可根據多種已知方法達成，包括例如針對CD7 (如WO2016/126213中所描述)及針對CD3之蛋白質表現阻斷劑(PEBL)、針對CD7及針對CD3之RNAi或基因編輯方法，諸如大範圍核酸酶、TALEN、CRISPR/Cas9及鋅指核酸酶。經由鹼基編輯技術亦有可能達成基因破壞。鹼基編輯器能夠在限定的遺傳基因座處產生單一鹼基對改變以改變基因表現。腺嘌呤鹼基編輯器(ABE)及胞嘧啶鹼基編輯器(CBE)將去胺酶與Cas切口酶組合以介導DNA中不會出現雙股斷裂的基因編輯。不希望受理論所束縛，本文所提供之方法可提供有效的靶向多重編輯系統。在一些實施例中，鹼基編輯器系統包含：核苷酸結合域；用於使目標核苷酸序列中之核鹼基脫去胺基之去胺酶域；及一或多個使Cas靶向特定基因座之引導RNA分子(gRNA)。腺嘌呤鹼基編輯器在目標位點處產生A至G (或T至C)點突變，且胞嘧啶鹼基編輯器在目標位點處產生C至T (或G至A)點突變。在一些情況下，胞嘧啶鹼基編輯器可與尿嘧啶DNA醣苷酶抑制劑(UGI)融合以防止鹼基切除修復。在一些實施例中，去胺酶為腺苷去胺酶。在一些實施例中，腺苷去胺酶催化去氧核糖核酸(DNA)中腺嘌呤或腺苷之水解去胺作用。在一些實施例中，去胺酶可為AID、CDA1或APOBEC3G。在一些實施例中，ADE或CBE可在基因體目標位點處產生1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多個同時編輯。在一些實施例中，鹼基編輯器可藉由在剪接模體或起始密碼子中產生點突變來破壞基因表現。在一些實施例中，鹼基編輯器可藉由產生點突變形成終止密碼子來破壞基因表現。在一些實施例中，本文所描述之鹼基編輯系統可用於產生CD3 CAR T細胞。在一些實施例中，鹼基編輯器系統可包含雙鹼基編輯器(例如，腺嘌呤及胞嘧啶鹼基編輯組件之融合物)。雙鹼基編輯器(例如，組合式鹼基編輯器或多功能鹼基編輯器)可包含腺苷去胺酶域及胞苷去胺酶域。雙鹼基編輯器可進一步包含一或多種UGI。
本發明描述結合目標抗原且將目標抗原隔離至細胞之特定細胞區室中的PEBL。目標抗原在細胞內合成且結合至PEBL。
如熟習此項技術者將理解，在某些實施例中，本文所揭示之各種組分(例如scFv、細胞內信號傳導域、連接子及其組合)之胺基酸序列中之任一者可與本文所揭示之特定相應序列具有至少90%序列一致性、至少91%序列一致性、至少92%序列一致性、至少93%序列一致性、至少94%序列一致性、至少95%序列一致性、至少96%序列一致性、至少97%序列一致性、至少98%序列一致性、至少99%序列一致性、或100%序列一致性。
在某些實施例中，本文提供一種聚核苷酸，其包含編碼PEBL之核酸序列，該PEBL包含連接至定位域之目標結合分子(例如CD3抗原結合域)。在一些情況下，PEBL自N端至C端包含：CD3抗原結合域、視情況存在之域連接子以及細胞定位域。在一些實施例中，PEBL進一步包含融合至CD3抗原結合域N端之信號肽。在一些實施例中，CD3抗原結合域包含VL域、域連接子及VH域。
如本文所使用，在蛋白質表現阻斷劑的上下文中，「連接」係指編碼目標結合分子之基因與編碼一或多個定位域之一或多個基因直接框內相鄰(例如無連接子)。或者，編碼目標結合分子之基因可經由例如如WO2016/126213中所描述之連接子序列連接至編碼一或多個定位域之一或多個基因。如熟習此項技術者將理解，此類連接子序列以及此類連接子序列之變體為此項技術中已知的。設計併入連接子序列之構築體的方法以及評估功能性之方法為熟習此項技術者容易獲得的。
在一些實施例中，PEBL之定位域包含內質網(ER)或高基氏體滯留序列；或蛋白酶體定位序列。在某些實施例中，定位域包含表10或表11之內質網(ER)滯留肽。在某些實施例中，定位域包含表10或表11中所示之蛋白酶體定位序列。定位域可將PEBL引導至特定細胞區室，諸如高基氏體或內質網、蛋白酶體或細胞膜，視應用而定。
在一些實施例中，蛋白酶體定位藉由將scFv序列連接至三聯模體21 (TRIM21)靶向域序列且共表現編碼人類TRIM21 E3泛素連接酶蛋白之序列來達成。TRIM21以高親和力結合至抗體之Fc域，且可募集泛素-蛋白酶體複合物以降解與抗體結合之分子(例如蛋白質及肽)。TRIM21靶向域序列編碼選自人類免疫球蛋白G (IgG)恆定區(Fc)基因(諸如IgG1、IgG2或IgG4)之群的胺基酸序列，且用於形成包含scFv及Fc域之融合蛋白。在此實施例中，外源表現之TRIM21蛋白結合與目標蛋白(例如CD7)結合之scFv-Fc融合蛋白，且將複合物引導至蛋白酶體進行降解。
人類TRIM21 E3連接酶蛋白之胺基酸序列之詳情可見於例如NCBI蛋白質資料庫中之NCBI Ref. Seq. No. NP_003132.2。編碼人類TRIM21 E3連接酶蛋白之核酸序列之詳情可見於例如NCBI蛋白質資料庫中之NCBI Ref. Seq. No. NM_003141.3。
在一些實施例中，PEBL亦包括來源於CD8α、CD8β、4-1BB、CD28、CD34、CD4、FcεRIγ、CD16、OX40、CD3ζ、CD3ε、CD3γ、CD3δ、TCRα、CD32、CD64、VEGFR2、FAS或FGFR2B之鉸鏈域及跨膜域序列。在一些實施例中，PEBL包含選自由以下組成之群的鉸鏈及跨膜域：CD8α之鉸鏈及跨膜域、CD8β之鉸鏈及跨膜域、4-1BB之鉸鏈及跨膜域、CD28之鉸鏈及跨膜域、CD34之鉸鏈及跨膜域、CD4之鉸鏈及跨膜域、FcεRIγ之鉸鏈及跨膜域、CD16之鉸鏈域及跨膜域、OX40之鉸鏈及跨膜域、CD3ζ之鉸鏈及跨膜域、CD3ε之鉸鏈及跨膜域、CD3γ之鉸鏈及跨膜域、CD3δ之鉸鏈及跨膜域、TCRα之鉸鏈及跨膜域、CD32之鉸鏈及跨膜域、CD64之鉸鏈及跨膜域、VEGFR2之鉸鏈及跨膜域、FAS之鉸鏈及跨膜域，以及FGFR2B之鉸鏈及跨膜域。
在一些實施例中，針對CD3之PEBL包含表10中所示之一或多個組分。在一些實施例中，針對CD3之PEBL包含SEQ ID NO: 101之胺基酸序列。在一些實施例中，CD3結合域包含如SEQ ID NO: 102中之源自來源於純系OKT3之抗CD3抗體之結合序列。
OKT3 PEBL5
序列
(SEQ ID NO: 101)
：
MALPVTALLLPLALLLHAARPQIVLTQSPAIMSASPGEKVTMTCSASSSVSYMNWYQQKSGTSPKRWIYDTSKLASGVPAHFRGSGSGTSYSLTISGMEAEDAATYYCQQWSSNPFTFGSGTKLEINRGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLQQSGAELARPGASVKMSCKASGYTFTRYTMHWVKQRPGQGLEWIGYINPSRGYTNYNQKFKDKATLTTDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARYYDDHYCLDYWGQGTTLTVSSAGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSAEKDEL
表 10 ： CD3 PEBL 之所選組分之胺基酸序列資訊
| CD8信號肽 | MALPVTALLLPLALLLHAARP |
| OKT3 scFv (SEQ ID NO: 102) | QIVLTQSPAIMSASPGEKVTMTCSASSSVSYMNWYQQKSGTSPKRWIYDTSKLASGVPAHFRGSGSGTSYSLTISGMEAEDAATYYCQQWSSNPFTFGSGTKLEINRGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLQQSGAELARPGASVKMSCKASGYTFTRYTMHWVKQRPGQGLEWIGYINPSRGYTNYNQKFKDKATLTTDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARYYDDHYCLDYWGQGTTLTVSSA |
| GS連接子 + 另外2個aa | GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSAE |
| ER滯留 | KDEL |
在一些實施例中，針對CD3之PEBL包含表11中所示之一或多個組分。在一些實施例中，針對CD3之PEBL包含SEQ ID NO: 103之胺基酸序列。在一些實施例中，CD3結合域包含如SEQ ID NO: 104中之源自來源於純系UCHT1之抗CD3抗體之結合序列。
UCHT1 PEBL22
序列
(SEQ ID NO: 103)
：
MALPVTALLLPLALLLHAARPDIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDIRNYLNWYQQKPDGTVKLLIYYTSRLHSGVPSKFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPWTFAGGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLQQSGPELVKPGASMKISCKASGYSFTGYTMNWVKQSHGKNLEWMGLINPYKGVSTYNQKFKDKATLTVDKSSSTAYMELLSLTSEDSAVYYCARSGYYGDSDWYFDVWGQGTTLTVFSEQKLISEEDLGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSAEKDEL
表 11 ： CD3 PEBL 之所選組分之胺基酸序列資訊
| CD8信號肽 | MALPVTALLLPLALLLHAARP |
| UCHT1 scFv (SEQ ID NO: 104) | DIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDIRNYLNWYQQKPDGTVKLLIYYTSRLHSGVPSKFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPWTFAGGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLQQSGPELVKPGASMKISCKASGYSFTGYTMNWVKQSHGKNLEWMGLINPYKGVSTYNQKFKDKATLTVDKSSSTAYMELLSLTSEDSAVYYCARSGYYGDSDWYFDVWGQGTTLTVFS |
| Myc標籤 | EQKLISEEDL |
| GS連接子 + 另外2個aa | GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSAE |
| ER滯留 | KDEL |
在一些實施例中，CD3 PEBL包含與SEQ ID NO:101具有至少85% (例如85%、86%、87%、88%、89%、90%或更高)序列一致性之胺基酸序列且結合至CD3。在一些實施例中，CD3 PEBL包含與SEQ ID NO:101具有至少90% (例如90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高)序列一致性之胺基酸序列且結合至CD3。在一些實施例中，CD3 PEBL包含與SEQ ID NO:101具有至少90% (例如90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高)序列一致性之胺基酸序列。
在一些實施例中，本發明之工程化免疫細胞包含由構築體編碼之CD3 PEBL，該構築體包含編碼與SEQ ID NO:101具有至少90% (例如90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高)序列一致性的CD3 PEBL之胺基酸序列的核酸序列。在一些實施例中，工程化免疫細胞為CD4+ T細胞，其包含由構築體編碼之CD7 PEBL，該構築體包含編碼與SEQ ID NO:101具有至少90%序列一致性的CD3 PEBL之胺基酸序列的核酸序列。在一些實施例中，工程化免疫細胞為CD8+ T細胞，其包含由構築體編碼之CD3 PEBL，該構築體包含編碼與SEQ ID NO:101具有至少90%序列一致性的CD3 PEBL之胺基酸序列的核酸序列。又，本文提供一種包含此類細胞之群體。
在一些態樣中，CD3 PEBL靶向CD3ε。在一些態樣中，CD3 PEBL包含結合至CD3ε之結合域。在一些態樣中，CD3 PEBL包含結合至CD3ε之抗體或其抗原結合域。在一些實施例中，CD3 PEBL包含與SEQ ID NO:103具有至少85% (例如85%、86%、87%、88%、89%、90%或更高)序列一致性之胺基酸序列且結合至CD3。在一些實施例中，CD3 PEBL包含與SEQ ID NO:103具有至少90% (例如90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高)序列一致性之胺基酸序列且結合至CD3。在一些實施例中，CD3 PEBL包含與SEQ ID NO:103具有至少90% (例如90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高)序列一致性之胺基酸序列。
在一些實施例中，本發明之工程化免疫細胞包含由構築體編碼之CD3 PEBL，該構築體包含編碼與SEQ ID NO:103具有至少90% (例如90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高)序列一致性的CD3 PEBL之胺基酸序列的核酸序列。在一些實施例中，工程化免疫細胞為CD4+ T細胞，其包含由構築體編碼之CD7 PEBL，該構築體包含編碼與SEQ ID NO:103具有至少90%序列一致性的CD3 PEBL之胺基酸序列的核酸序列。在一些實施例中，工程化免疫細胞為CD8+ T細胞，其包含由構築體編碼之CD3 PEBL，該構築體包含編碼與SEQ ID NO:103具有至少90%序列一致性的CD3 PEBL之胺基酸序列的核酸序列。又，本文提供一種包含此類細胞之群體。
在一些態樣中，本文提供重組核酸分子，其編碼連接至合成定位域之CD3ε結合域。在一些實施例中，CD3ε結合域包含SEQ ID NO: 212或215之重鏈互補決定區(HC CDR1)、SEQ ID NO: 213或216之HC CDR2、SEQ ID NO: 214或217之HC CDR3以及SEQ ID NO: 218或221之輕鏈(LC) CDR1、SEQ ID NO: 219或222之LC CDR2、SEQ ID NO: 220或223之LC CDR3。
在一些實施例中，合成定位域包含長度為至少2個、至少3個、至少4個、至少5個、至少6個、至少7個、至少8個、至少9個、或至少10個胺基酸之連接子序列，且包含胺基酸序列KDEL。在一些實施例中，連接子序列包含(GGGGS)n，其中n為1至10之任何整數。在一些實施例中，連接子序列包含(GGGGS)
4。合成定位域亦可包含Myc標籤。在一些實施例中，重組核酸分子包含與SEQ ID NO: 99具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、至少99.5%、或至少99.9%序列一致性之序列。在一些實施例中，重組核酸分子包含SEQ ID NO: 99之序列。
在一些實施例中，工程化免疫細胞可包含本文所描述之重組核酸分子。
殺傷基因或自殺基因
在一些實施例中，本文所描述之工程化免疫細胞可包含在活化後誘導工程化免疫細胞之細胞死亡的殺傷基因或自殺基因。在一些實施例中，本發明之編碼CAR之構築體可包含在活化後誘導工程化免疫細胞之細胞死亡的殺傷基因或自殺基因。在一些情況下，編碼CD3 PEBL之構築體可包含殺傷基因。
在一些情況下，諸如CD7 CAR+/CD7陰性T細胞或PCART7-CD3PEBL T細胞之工程化免疫細胞可進一步包含有包含自殺基因之第四核酸。在一些實施例中，自殺基因包含CD20或其衍生物。在一些實施例中，自殺基因包含CD20、其衍生物或其一部分。其衍生物可包含CD20之功能片段，例如SEQ ID NO: 106。在一些實施例中，自殺基因包含經修飾之CD20。在一些實施例中，自殺基因包含經截短CD20。在一些實施例中，自殺基因包含CD20、p53蛋白、誘導型凋亡蛋白酶9 (iCasp9)、單純疱疹病毒酪胺酸激酶(HSV-TK)、人類胸苷酸激酶(TMPK)、表皮生長因子受體(EGFR)或其衍生物。
在一些實施例中，第四核酸位於第二表現載體中，其中第二表現載體編碼第二PEBL，例如第二雙順反子表現載體。在一些實施例中，第四核酸位於第一表現載體中，其中第一表現載體編碼CAR及第一PEBL，例如三順反子表現載體。在一些實施例中，第四核酸位於單獨表現載體，例如第三表現載體中。在一些實施例中，編碼CAR之第一核酸、編碼第一PEBL之第二核酸、編碼第二PEBL之第三核酸及編碼自殺基因之第四核酸位於單獨表現載體中。在一些實施例中，編碼CAR之第一核酸、編碼第一PEBL之第二核酸、編碼第二PEBL之第三核酸及編碼自殺基因之第四核酸位於同一表現載體中。
自殺基因及第二 PEBL 之雙順反子表現構築體
本文提供重組雙順反子病毒構築體或載體，其含有如本文所描述之編碼自殺基因之聚核苷酸及編碼第二PEBL之聚核苷酸。在一些實施例中，重組雙順反子病毒構築體包括自殺基因之核酸序列與第二PEBL之核酸序列之間的內部核糖體進入位點(IRES)序列。在一些實施例中，重組雙順反子病毒構築體包括自殺基因之核酸序列與第二PEBL之核酸序列之間的核糖體密碼子跳躍位點序列(亦稱為編碼2A自裂解肽之序列)。在雙順反子構築體之一些實施例中，編碼自殺基因之聚核苷酸位於IRES序列上游(5'端)，且編碼第二PEBL之聚核苷酸位於IRES下游(3'端)。在一些情況下，編碼自殺基因之核酸序列可操作地連接至IRES序列，且IRES序列可操作地連接至編碼第二PEBL之核酸序列。在一些情況下，編碼第二PEBL之核酸序列可操作地連接至IRES序列，且IRES序列可操作地連接至編碼自殺基因之核酸序列。
在雙順反子構築體之一些實施例中，編碼自殺基因之聚核苷酸位於編碼2A自裂解肽之聚核苷酸上游(5'端)，且編碼第二PEBL之聚核苷酸位於編碼2A自裂解肽之聚核苷酸下游(3'端)。在一些情況下，編碼自殺基因之核酸序列可操作地連接至編碼2A自裂解肽之核酸序列，該編碼2A自裂解肽之核酸序列可操作地連接至編碼第二PEBL之核酸序列。在一些情況下，編碼第二PEBL之核酸序列可操作地連接至編碼2A自裂解肽之核酸序列，該編碼2A自裂解肽之核酸序列可操作地連接至編碼自殺基因之核酸序列。
本文所提供之雙順反子載體可包含：第一核苷酸序列，其編碼殺傷基因；及第二核苷酸序列，其編碼連接至定位域之表面多肽結合域(例如PEBL)。
在雙順反子構築體之一些實施例中，編碼殺傷基因之聚核苷酸位於編碼核糖體密碼子跳躍位點(例如2A自裂解肽)之聚核苷酸上游(5'端)，且編碼PEBL之聚核苷酸位於編碼核糖體密碼子跳躍位點之聚核苷酸下游(3'端)。在一些實施例中，殺傷基因可編碼細胞表面抗原。細胞表面抗原可為CD20。表面多肽結合域可結合至TCR複合物之次單元。在一些實施例中，表面多肽結合域可結合至CD3ε。在一些實施例中，表面多肽結合域可結合至CD3ε、CD3γ或CD3δ。在一些實施例中，表面多肽結合域可為抗CD3ε抗體或其抗原結合域。
在一些實施例中，雙順反子構築體包含抗CD3ε抗體，其包含SEQ ID NO: 212或215之重鏈互補決定區(HC CDR) 1、SEQ ID NO: 213或216之HC CDR2、SEQ ID NO: 214或217之HC CDR3以及SEQ ID NO: 218或221之輕鏈(LC) CDR1、SEQ ID NO: 219或222之LC CDR2、SEQ ID NO: 220或223之LC CDR3。在一些實施例中，雙順反子構築體包含抗CD3ε抗體，其包含具有與SEQ ID NO: 114具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或至少100%序列一致性之胺基酸序列的重鏈可變域。在一些實施例中，雙順反子構築體包含抗CD3ε抗體，其包含具有與SEQ ID NO: 115具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或至少100%序列一致性之胺基酸序列的輕鏈可變域。在一些實施例中，雙順反子構築體包含抗CD3ε抗體，其包含與SEQ ID NO: 104具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或至少100%序列一致性之胺基酸序列。
經由2A肽序列進行核糖體密碼子跳躍之機制適用於由一個轉錄本產生兩個蛋白質；正常肽鍵在2A序列處減弱，導致一個轉譯事件產生兩個不連續的蛋白質片段。自裂解2A肽(例如2A裂解位點)描述於Kim等人, PLoS One, 2011, 6(4):e18556中。
在一些實施例中，IRES係來自腦心肌炎病毒。在一些實施例中，IRES係來自腸病毒。在一些實施例中，IRES序列之核酸序列示於SEQ ID NO: 62 (參見例如表2)中。
在一些實施例中，核糖體密碼子跳躍位點係基於2A自裂解肽(參見例如表3)。在一些實施例中，2A自裂解肽係選自由P2A、E2A、F2A及T2A組成之群。在一些情況下，P2A肽之胺基酸序列包含SEQ ID NO:67之胺基酸序列或與其具有至少90%序列一致性之胺基酸序列。在一些情況下，E2A肽之胺基酸序列包含SEQ ID NO: 68之胺基酸序列或與其具有至少90%序列一致性之胺基酸序列。在一些情況下，F2A肽之胺基酸序列包含SEQ ID NO: 69之胺基酸序列或與其具有至少90%序列一致性之胺基酸序列。在一些情況下，T2A肽之胺基酸序列包含SEQ ID NO: 70之胺基酸序列或與其具有至少90%序列一致性之胺基酸序列。
在一些實施例中，病毒構築體(例如反轉錄病毒構築體)包含編碼選自由P2A、E2A、F2A及T2A組成之群的2A自裂解肽(例如2A肽裂解位點)的核酸序列，其中編碼2A自裂解肽之聚核苷酸連接編碼自殺基因之核酸序列與編碼第二PEBL之核酸序列。換言之，編碼2A自裂解肽之聚核苷酸位於編碼自殺基因之核酸序列與編碼第二PEBL之核酸序列之間。如上文所描述，在一些實施例中，構築體自5'端至3'端包含以下或由以下組成：編碼自殺基因之核酸序列；編碼P2A自裂解肽之核酸序列；及編碼第二PEBL之核酸序列。在一些實施例中，構築體自5'端至3'端包含以下或由以下組成：編碼本文所描述之任何自殺基因之核酸序列；編碼P2A自裂解肽之核酸序列；及編碼本文所描述之任何CD3 PEBL之核酸序列。在一些實施例中，構築體自5'端至3'端包含以下或由以下組成：編碼本文所描述之任何自殺基因之核酸序列；編碼E2A自裂解肽之核酸序列；及編碼本文所描述之任何CD3 PEBL之核酸序列。在一些實施例中，構築體自5'端至3'端包含以下或由以下組成：編碼本文所描述之任何自殺基因之核酸序列；編碼F2A自裂解肽之核酸序列；及編碼本文所描述之任何CD3 PEBL之核酸序列。在一些實施例中，構築體自5'端至3'端包含以下或由以下組成：編碼本文所描述之任何自殺基因之核酸序列；編碼T2A自裂解肽之核酸序列；及編碼本文所描述之任何CD3 PEBL之核酸序列。
在一些實施例中，構築體自5'端至3'端包含以下或由以下組成：編碼第二PEBL之核酸序列；編碼P2A自裂解肽之核酸序列；及編碼自殺基因之核酸序列。在一些實施例中，構築體自5'端至3'端包含以下或由以下組成：編碼第二PEBL之核酸序列；編碼E2A自裂解肽之核酸序列；及編碼自殺基因之核酸序列。在一些實施例中，構築體自5'端至3'端包含以下或由以下組成：編碼第二PEBL之核酸序列；編碼F2A自裂解肽之核酸序列；及編碼自殺基因之核酸序列。在一些實施例中，構築體自5'端至3'端包含以下或由以下組成：編碼第二PEBL之核酸序列；編碼T2A自裂解肽之核酸序列；及編碼自殺基因之核酸序列。
在一些實施例中，編碼P2A之核酸序列包含與SEQ ID NO: 63具有至少90%序列一致性之核酸或由其組成。在一些實施例中，編碼P2A之核酸序列包含SEQ ID NO: 63之核酸或由其組成。在一些實施例中，編碼E2A之核酸序列包含與SEQ ID NO:64具有至少90%序列一致性之核酸或由其組成。在一些實施例中，編碼E2A之核酸序列包含SEQ ID NO: 64之核酸或由其組成。在一些實施例中，編碼F2A之核酸序列包含與SEQ ID NO: 65具有至少90%序列一致性之核酸或由其組成。在一些實施例中，編碼F2A之核酸序列包含SEQ ID NO: 65之核酸或由其組成。在一些實施例中，編碼T2A之核酸序列包含與SEQ ID NO: 66具有至少90%序列一致性之核酸序列或由其組成。在一些實施例中，編碼T2A之核酸序列包含SEQ ID NO: 66之核酸或由其組成。
本發明提供其中插入有本文所描述之任一聚核苷酸的載體，諸如表現載體。在一些實施例中，載體來源於反轉錄病毒，諸如慢病毒。此類載體為達成長期基因轉移之合適工具，因為其允許外源聚核苷酸(例如轉殖基因)之長期穩定整合及該外源聚核苷酸在子細胞中之增殖。與來源於致癌反轉錄病毒(諸如鼠類白血病病毒)之載體不同，慢病毒載體可轉導非增殖性細胞。慢病毒載體亦具有低免疫原性。在其他實施例中，載體為腺病毒載體。在某些實施例中，載體為質體。
在一些實施例中，啟動子與CMV啟動子具有至少90%，例如90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.9%或更高序列一致性。在一些實施例中，啟動子包含CMV啟動子。在一些實施例中，CMV啟動子包含SEQ ID NO: 6之序列。在一些實施例中，本文所描述之任一構築體包含SEQ ID NO: 6之CMV啟動子或由其組成。
在一些實施例中，啟動子與EF1α啟動子具有至少90%，例如90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.9%或更高序列一致性。在一些實施例中，啟動子包含EF1α啟動子。在一些實施例中，EF1α啟動子包含SEQ ID NO: 7之序列。在一些實施例中，EF1α啟動子包含SEQ ID NO:7之序列。在一些實施例中，本文所描述之任一構築體包含SEQ ID NO: 7之EF1α啟動子或由其組成。
在一些實施例中，啟動子與EFS啟動子具有至少90%，例如90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.9%或更高序列一致性。在一些實施例中，啟動子包含EFS啟動子。在一些實施例中，EFS啟動子包含SEQ ID NO: 8之序列。在一些實施例中，EFS啟動子包含SEQ ID NO: 8之序列。在一些實施例中，本文所描述之任一構築體包含SEQ ID NO: 8之EFS啟動子或由其組成。
在一些實施例中，啟動子與鼠類幹細胞病毒(MSCV)啟動子具有至少90%，例如90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.9%或更高序列一致性。在一些實施例中，啟動子包含MSCV啟動子。在一些實施例中，MSCV啟動子包含SEQ ID NO: 9之序列。在一些實施例中，本文所描述之任一構築體包含SEQ ID NO:9之MSCV啟動子或由其組成。
在一些實施例中，啟動子與磷酸甘油酯激酶(PGK)啟動子具有至少90%，例如90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.9%或更高序列一致性。在一些實施例中，啟動子包含PGK啟動子。在一些實施例中，PGK啟動子包含SEQ ID NO:10之序列。在一些實施例中，本文所描述之任一構築體包含SEQ ID NO:10之PGK啟動子或由其組成。
在一些實施例中，編碼自殺基因之核酸序列安置於編碼第二PEBL之核酸序列之5'。在一些實施例中，雙順反子構築體自5'至3'端包含以下或由以下組成：自殺基因或殺傷基因、操作連接子(例如IRES或核糖體密碼子跳躍位點，其亦稱為編碼2A自裂解肽之序列)、CD8信號肽、CD3 PEBL、Myc標籤、後接2個胺基酸之GS重複序列連接子(例如GGGGS)以及ER滯留序列。在一些實施例中，自殺基因為CD20或其衍生物。
在一些實施例中，自殺基因為經截短CD20 (CD20t)。在一些實施例中，核糖體密碼子跳躍位點係基於2A自裂解肽(參見例如表3)。在一些實施例中，2A自裂解肽係選自由P2A、E2A、F2A及T2A組成之群。在一些實施例中，核糖體密碼子跳躍位點為P2A。在一些實施例中，GS重複序列連接子包含後接2個胺基酸之至少1個重複序列、至少2個重複序列、至少3個重複序列、至少4個重複序列、至少5個重複序列、至少6個重複序列、至少7個重複序列、至少8個重複序列、至少9個重複序列及至少10個重複序列。在一些實施例中，GS重複序列連接子包含後接2個胺基酸之至多1個重複序列、至多2個重複序列、至多3個重複序列、至多4個重複序列、至多5個重複序列、至多6個重複序列、至多7個重複序列、至多8個重複序列、至多9個重複序列及至多10個重複序列。在一些實施例中，位於GS連接子下游之2個胺基酸包含AE。
在一些實施例中，第二雙順反子構築體包含自殺基因、第二PEBL及表12中所示之一或多個組分。在一些實施例中，自殺基因及第二PEBL包含表12中所示之一或多個組分。在一些實施例中，自殺基因及第二PEBL包含SEQ ID NO: 105中所示之一或多個組分。在一些實施例中，自殺基因包含如SEQ ID NO: 106中所描述之來源於CD20或其衍生物之胺基酸序列。
CD20t-P2A-UCHT1 PEBL22序列(SEQ ID NO: 105)：
MTTPRNSVNGTFPAEPMKGPIAMQSGPKPLFRRMSSLVGPTQSFFMRESKTLGAVQIMNGLFHIALGGLLMIPAGIYAPICVTVWYPLWGGIMYIISGSLLAATEKNSRKCLVKGKMIMNSLSLFAAISGMILSIMDILNIKISHFLKMESLNFIRAHTPYINIYNCEPANPSEKNSPSTQYCYSIQSLFLGILSVMLIFAFFQELVIAGIVENEWKRTCSRPKSNIVLLSAEEKKEQTIEIKEEVVGLTETSSQPKNEEDIEGSGATNFSLLKQAGDVEENPGPMALPVTALLLPLALLLHAARPDIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDIRNYLNWYQQKPDGTVKLLIYYTSRLHSGVPSKFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPWTFAGGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLQQSGPELVKPGASMKISCKASGYSFTGYTMNWVKQSHGKNLEWMGLINPYKGVSTYNQKFKDKATLTVDKSSSTAYMELLSLTSEDSAVYYCARSGYYGDSDWYFDVWGQGTTLTVFSEQKLISEEDLGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSAEKDEL
表 12 ：自殺基因 ( 或殺傷基因 ) 及 CD3 PEBL 之所選組分之胺基酸序列資訊
| CD20t (SEQ ID NO: 106) | MTTPRNSVNGTFPAEPMKGPIAMQSGPKPLFRRMSSLVGPTQSFFMRESKTLGAVQIMNGLFHIALGGLLMIPAGIYAPICVTVWYPLWGGIMYIISGSLLAATEKNSRKCLVKGKMIMNSLSLFAAISGMILSIMDILNIKISHFLKMESLNFIRAHTPYINIYNCEPANPSEKNSPSTQYCYSIQSLFLGILSVMLIFAFFQELVIAGIVENEWKRTCSRPKSNIVLLSAEEKKEQTIEIKEEVVGLTETSSQPKNEEDIE |
| P2A | GSGATNFSLLKQAGDVEENPGP |
| CD8信號肽 | MALPVTALLLPLALLLHAARP |
| UCHT1 scFv (SEQ ID NO: 104) | DIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDIRNYLNWYQQKPDGTVKLLIYYTSRLHSGVPSKFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPWTFAGGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLQQSGPELVKPGASMKISCKASGYSFTGYTMNWVKQSHGKNLEWMGLINPYKGVSTYNQKFKDKATLTVDKSSSTAYMELLSLTSEDSAVYYCARSGYYGDSDWYFDVWGQGTTLTVFS |
| Myc標籤 | EQKLISEEDL |
| GS連接子 + 另外2個aa | GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSAE |
| ER滯留 | KDEL |
在一些實施例中，自殺基因包含與SEQ ID NO:106具有至少85% (例如85%、86%、87%、88%、89%、90%或更高)序列一致性之胺基酸序列。在一些實施例中，自殺基因或殺傷基因包含與SEQ ID NO:106具有至少90% (例如90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高)序列一致性之胺基酸序列。在一些實施例中，自殺基因或殺傷基因包含與SEQ ID NO:106具有至少90% (例如90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高)序列一致性之胺基酸序列。
在一些實施例中，本發明之工程化免疫細胞進一步包含由雙順反子構築體編碼之自殺基因或殺傷基因及第二PEBL，該雙順反子構築體包含編碼與SEQ ID NO:106具有至少90% (例如90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高)序列一致性的自殺基因或殺傷基因之胺基酸序列的核酸序列。在一些實施例中，工程化免疫細胞為CD4+ T細胞，其包含由雙順反子構築體編碼之自殺基因或殺傷基因及第二PEBL，該雙順反子構築體包含編碼與SEQ ID NO:106具有至少90%序列一致性的自殺基因之胺基酸序列的核酸序列。在一些實施例中，工程化免疫細胞為CD8+ T細胞，其包含由構築體編碼之自殺基因及第二PEBL，該構築體包含編碼與SEQ ID NO:106具有至少90%序列一致性的自殺基因或殺傷基因之胺基酸序列的核酸序列。又，本文提供一種包含此類細胞之群體。
在一些實施例中，第二反轉錄病毒載體或慢病毒載體進一步包含殺傷基因。在一些實施例中，編碼第二PEBL及殺傷基因之核酸位於包含編碼CAR及第一PEBL之核酸的同一載體中。
在一些實施例中，編碼CAR及第一PEBL之第一載體及編碼殺傷基因及第二PEBL之第二載體為相同類型之載體。在一些實施例中，編碼CAR及第一PEBL之第一載體及編碼殺傷基因及第二PEBL之第二載體均為慢病毒載體。在一些實施例中，編碼CAR及第一PEBL之第一載體及編碼殺傷基因及第二PEBL之第二載體均為反轉錄病毒載體。
在一些實施例中，編碼CAR及第一PEBL之第一載體及編碼殺傷基因及第二PEBL之第二載體為不同類型之載體。在一些實施例中，編碼CAR及第一PEBL之第一載體為慢病毒載體，且編碼殺傷基因及第二PEBL之第二載體為反轉錄病毒載體。在一些實施例中，編碼CAR及第一PEBL之第一載體為反轉錄病毒載體，且編碼殺傷基因及第二PEBL之第二載體為慢病毒載體。
在一些態樣中，編碼第二PEBL之核酸及編碼殺傷基因之核酸藉由內部核糖體進入位點(IRES)或核糖體密碼子跳躍位點可操作地連接。在一些實施例中，核糖體密碼子跳躍位點包含2A自裂解肽。在一些情況下，編碼第二PEBL之核酸及編碼殺傷基因之核酸處於同一啟動子控制下。在一些情況下，編碼第二PEBL之核酸及編碼殺傷基因之核酸處於不同啟動子控制下。
在一些情況下，其中編碼第二PEBL及殺傷基因之核酸位於與包含編碼CAR及第一PEBL之核酸的載體分開的載體中，該兩個載體可同時引入。在一些情況下，其中編碼第二PEBL及殺傷基因之核酸位於與包含編碼CAR及第一PEBL之核酸的載體分開的載體中，該兩個載體可依序引入。在一些情況下，其中編碼第二PEBL及殺傷基因之核酸位於與包含編碼CAR及第一PEBL之核酸的載體分開的載體中，編碼CAR及第一PEBL之載體在編碼第二PEBL及殺傷基因之載體之前引入。在一些情況下，其中編碼第二PEBL及殺傷基因之核酸位於與包含編碼CAR及第一PEBL之核酸的載體分開的載體中，編碼CAR及第一PEBL之載體在編碼第二PEBL及殺傷基因之載體之後引入。
在一些情況下，其中編碼CAR、第一PEBL、殺傷基因及第二PEBL之核酸位於不同載體中，該等不同載體可同時引入。在一些情況下，其中編碼CAR、第一PEBL、殺傷基因及第二PEBL之核酸位於不同載體中，該等不同載體可依序引入。
自殺基因 ( 殺傷基因 ) 及第二 PEBL 之 雙啟動子反轉錄病毒構築體
本文提供用於在細胞(諸如T細胞)中同時表現自殺基因及第二PEBL的重組反轉錄病毒構築體(或載體)。在一些實施例中，反轉錄病毒構築體包括可操作地連接至編碼本文所描述之任一自殺基因之聚核苷酸的啟動子及可操作地連接至編碼本文所描述之任一第二PEBL之聚核苷酸的啟動子。在一些實施例中，自殺基因之啟動子及第二PEBL之啟動子具有低於90%序列一致性，例如低於90%一致性、低於80%一致性、低於75%序列一致性、低於70%序列一致性、低於65%序列一致性、低於60%序列一致性、低於55%序列一致性及其類似者。在一些實施例中，自殺基因之啟動子及第二PEBL之啟動子具有80%序列一致性或更低序列一致性，例如80%一致性、75%序列一致性、70%序列一致性、65%序列一致性、60%序列一致性、55%序列一致性及其類似者。在一些實施例中，自殺基因之啟動子及第二PEBL之啟動子具有至少50%序列一致性，例如50%序列一致性、55%序列一致性、60%序列一致性、65%序列一致性、70%序列一致性、75%序列一致性、80%序列一致性、85%序列一致性、90%序列一致性、95%序列一致性、或更高序列一致性。
在一些實施例中，自殺基因之啟動子(稱為第一啟動子)不同於第二PEBL之啟動子(稱為第二啟動子)。第一啟動子及第二啟動子可具有相同序列。在其他情況下，第一啟動子及第二啟動子具有不同序列。
在一些實施例中，第一啟動子及/或第二啟動子與CMV啟動子具有至少90%，例如90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高序列一致性。在一些實施例中，第一啟動子及/或第二啟動子包含CMV啟動子。在一些實施例中，CMV啟動子包含SEQ ID NO:6之序列。
在一些實施例中，第一啟動子及/或第二啟動子與EF1α啟動子具有至少90%，例如90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高序列一致性。在一些實施例中，第一啟動子及/或第二啟動子包含EF1α啟動子。在一些實施例中，EF1α啟動子包含SEQ ID NO:7之序列。
在一些實施例中，第一啟動子及/或第二啟動子與EFS啟動子具有至少90%，例如90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高序列一致性。在一些實施例中，第一啟動子及/或第二啟動子包含EFS啟動子。在一些實施例中，EFS啟動子包含SEQ ID NO:8之序列。
在一些實施例中，第一啟動子及/或第二啟動子與鼠類幹細胞病毒(MSCV)啟動子具有至少90%，例如90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高序列一致性。在一些實施例中，第一啟動子及/或第二啟動子包含MSCV啟動子。在一些實施例中，MSCV啟動子包含SEQ ID NO:9之序列。
在一些實施例中，第一啟動子及/或第二啟動子與磷酸甘油酯激酶(PGK)啟動子具有至少90%，例如90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高序列一致性。在一些實施例中，第一啟動子及/或第二啟動子包含PGK啟動子。在一些實施例中，PGK啟動子包含SEQ ID NO:10之序列。
在一些實施例中，反轉錄病毒構築體自5'至3'包括可操作地連接至編碼自殺基因之聚核苷酸的第一啟動子及可操作地連接至編碼第二PEBL之聚核苷酸的第二啟動子。在各種實施例中，反轉錄病毒構築體自5'至3'包括可操作地連接至編碼第二PEBL之聚核苷酸的第二啟動子及可操作地連接至編碼自殺基因之聚核苷酸的第一啟動子。
在一些實施例中，第一啟動子位於第二啟動子上游。在一些實施例中，第一啟動子為CMV啟動子且第二啟動子為EFS啟動子。在一些實施例中，第一啟動子為CMV啟動子且第二啟動子為EF1α啟動子。在一些實施例中，第一啟動子為CMV啟動子且第二啟動子為PGK啟動子。在一些實施例中，第一啟動子為CMV啟動子且第二啟動子為MSCV啟動子。在一些實施例中，第一啟動子為CMV啟動子且第二啟動子為CMV啟動子。在一些實施例中，第一啟動子為MSCV啟動子且第二啟動子為EFS啟動子。在一些實施例中，第一啟動子為MSCV啟動子且第二啟動子為EF1α啟動子。在一些實施例中，第一啟動子為MSCV啟動子且第二啟動子為PGK啟動子。在一些實施例中，第一啟動子為MSCV啟動子且第二啟動子為CMV啟動子。在一些實施例中，第一啟動子為MSCV啟動子且第二啟動子為MSCV啟動子。在一些實施例中，第一啟動子為PGK啟動子且第二啟動子為EFS啟動子。在一些實施例中，第一啟動子為PGK啟動子且第二啟動子為EF1α啟動子。在一些實施例中，第一啟動子為PGK啟動子且第二啟動子為MSCV啟動子。在一些實施例中，第一啟動子為PGK啟動子且第二啟動子為CMV啟動子。在一些實施例中，第一啟動子為PGK啟動子且第二啟動子為PGK啟動子。在一些實施例中，第一啟動子為EF1α啟動子且第二啟動子為MSCV啟動子。在一些實施例中，第一啟動子為EF1α啟動子且第二啟動子為PGK啟動子。在一些實施例中，第一啟動子為EF1α啟動子且第二啟動子為EFS啟動子。在一些實施例中，第一啟動子為EF1α啟動子且第二啟動子為CMV啟動子。在一些實施例中，第一啟動子為EF1α啟動子且第二啟動子為EF1α啟動子。在一些實施例中，第一啟動子為EFS啟動子且第二啟動子為MSCV啟動子。在一些實施例中，第一啟動子為EFS啟動子且第二啟動子為EF1α啟動子。在一些實施例中，第一啟動子為EFS啟動子且第二啟動子為PGK啟動子。在一些實施例中，第一啟動子為EFS啟動子且第二啟動子為CMV啟動子。在一些實施例中，第一啟動子為EFS啟動子且第二啟動子為EFS啟動子。
表現雙順反子載體之工程化免疫細胞
在某些實施例中，提供一種工程化免疫細胞，其包含雙順反子構築體，該雙順反子構築體包含：(i)編碼嵌合抗原受體(CAR)之聚核苷酸，其中該CAR包含細胞內信號傳導域4-1BB及CD3ζ以及特異性結合CD7之抗原結合域；(ii)編碼連接至定位域之目標結合分子之聚核苷酸，其中該目標結合分子為結合CD7之抗原結合域，且該定位域包含內質網滯留序列；及(iii)編碼2A自裂解肽或IRES序列之核酸序列，如本文所例示。
在某些實施例中，在CAR的上下文中以及在針對CD7之抗原結合域的上下文中，結合CD7之抗原結合域包含：SEQ ID NO:32中所示之VH序列及SEQ ID NO:33中所示之VL序列；SEQ ID NO:34中所示之VH序列及SEQ ID NO:35中所示之VL序列；或SEQ ID NO:36中所示之VH序列及SEQ ID NO:37中所示之VL序列。如本文所描述，在某些實施例中，抗原結合域包含VH及VL，其含有之序列各自與SEQ ID NO:32及33中分別所示；SEQ ID NO:34及35中分別所示；或SEQ ID NO:36及37中分別所示之VH及VL序列具有至少90%序列一致性、至少91%序列一致性、至少92%序列一致性、至少93%序列一致性、至少94%序列一致性、至少95%序列一致性、至少96%序列一致性、至少97%序列一致性、至少98%序列一致性、至少99%序列一致性、或100%序列一致性。在某些實施例中，CAR上下文中的結合CD7之抗原結合域可不同於目標結合分子(蛋白質表現阻斷劑或PEBL)上下文中的結合CD7之抗體，如本文所描述。
在一些實施例中，工程化免疫細胞包含雙順反子構築體，其包含核酸構築體，該核酸構築體自5'端至3'端包含：編碼連接至定位域之目標結合分子之聚核苷酸，其中該目標結合分子結合CD7 (例如CD7 PEBL)；IRES序列；及編碼針對CD7之嵌合抗原受體(例如CD7 CAR)之聚核苷酸。在一些情況下，工程化免疫細胞包含含有SEQ ID NO:11之核酸構築體。在一些實施例中，本文提供一種工程化CD4+ T細胞或其群體，其包含含有SEQ ID NO:11之核酸構築體。在其他實施例中，本文提供一種工程化CD8+ T細胞或其群體，其包含含有SEQ ID NO:11之核酸構築體。在一些實施例中，本文提供一種工程化CD3+ T細胞或其群體，其包含含有SEQ ID NO:11之核酸構築體。
在一些實施例中，工程化免疫細胞包含雙順反子構築體，其包含核酸構築體，該核酸構築體自5'端至3'端包含：編碼針對CD7之嵌合抗原受體之聚核苷酸；IRES序列；及編碼連接至定位域之目標結合分子之聚核苷酸，其中該目標結合分子結合CD7 (例如針對CD7之PEBL)。在一些情況下，工程化免疫細胞包含含有SEQ ID NO:12之核酸構築體。在一個實施例中，本文提供一種工程化CD4+ T細胞或其群體，其包含含有SEQ ID NO:12之核酸構築體。在一些實施例中，本文提供一種工程化CD8+ T細胞或其群體，其包含含有SEQ ID NO:12之核酸構築體。在一些實施例中，本文提供一種工程化CD3+ T細胞或其群體，其包含含有SEQ ID NO:12之核酸構築體。
在一些實施例中，工程化免疫細胞包含雙順反子構築體，其包含核酸構築體，該核酸構築體自5'端至3'端包含：編碼針對CD7之嵌合抗原受體(例如CD7 CAR)之聚核苷酸；編碼2A自裂解肽之核酸序列；及編碼連接至定位域之目標結合分子之聚核苷酸，其中該目標結合分子結合CD7 (例如CD7 PEBL)。在一些情況下，工程化免疫細胞包含含有SEQ ID NO:13之核酸構築體。在一個實施例中，本文提供一種工程化CD4+ T細胞或其群體，其包含含有SEQ ID NO:13之核酸構築體。在一些實施例中，本文提供一種工程化CD8+ T細胞或其群體，其包含含有SEQ ID NO:13之核酸構築體。在一些實施例中，本文提供一種工程化CD3+ T細胞或其群體，其包含含有SEQ ID NO:13之核酸構築體。
在一些實施例中，工程化免疫細胞包含雙順反子構築體，其包含核酸構築體，該核酸構築體自5'端至3'端包含：編碼連接至定位域之目標結合分子之聚核苷酸，其中該目標結合分子結合CD7；編碼2A自裂解肽之核酸序列；及編碼針對CD7之嵌合抗原受體之聚核苷酸。
在一些實施例中，工程化免疫細胞包含雙順反子構築體，其包含核酸構築體，該核酸構築體自5'端至3'端包含：啟動子；編碼針對CD7之嵌合抗原受體(例如CD7 CAR)之聚核苷酸；編碼2A自裂解肽之核酸序列；及編碼連接至定位域之目標結合分子之聚核苷酸，其中該目標結合分子結合CD7 (例如CD7 PEBL)。在一些情況下，工程化免疫細胞包含與SEQ ID NO:14-16之核酸序列中之任一者具有至少85%序列一致性的核酸構築體。在一些情況下，工程化免疫細胞包含含有SEQ ID NO:14-16之核酸序列中之任一者的核酸構築體。在一些實施例中，工程化免疫細胞包含與SEQ ID NO:14具有至少85% (例如85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高)序列一致性之核酸構築體。在一些實施例中，工程化免疫細胞包含與SEQ ID NO:15具有至少85% (例如85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高)序列一致性之核酸構築體。在一些實施例中，工程化免疫細胞包含與SEQ ID NO:16具有至少85% (例如85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高)序列一致性之核酸構築體。
在一些實施例中，工程化免疫細胞包含雙順反子構築體，其包含核酸構築體，該核酸構築體自5'端至3'端包含：啟動子；編碼針對CD7之嵌合抗原受體之聚核苷酸；編碼2A自裂解肽之核酸序列；及編碼連接至定位域之目標結合分子之聚核苷酸，其中該目標結合分子結合CD7。在一些情況下，啟動子係選自MSCV啟動子、PGK啟動子、EF1α啟動子及EFS啟動子。在一些情況下，工程化免疫細胞包含含有SEQ ID NO:14之聚核苷酸。在一個實施例中，本文提供一種工程化CD4+ T細胞或其群體，其包含含有SEQ ID NO:14之核酸構築體。在一些實施例中，本文提供一種工程化CD8+ T細胞或其群體，其包含含有SEQ ID NO:14之核酸構築體。在一些實施例中，本文提供一種工程化CD3+ T細胞或其群體，其包含含有SEQ ID NO:14之核酸構築體。
在一些情況下，工程化免疫細胞包含含有SEQ ID NO:15之聚核苷酸。在一個實施例中，本文提供一種工程化CD4+ T細胞或其群體，其包含含有SEQ ID NO:15之核酸構築體。在一些實施例中，本文提供一種工程化CD8+ T細胞或其群體，其包含含有SEQ ID NO:15之核酸構築體。在一個實施例中，本文提供一種工程化CD4+ T細胞或其群體，其包含含有SEQ ID NO:15之核酸構築體。在一些實施例中，本文提供一種工程化CD3+ T細胞或其群體，其包含含有SEQ ID NO:15之核酸構築體。
在一些情況下，工程化免疫細胞包含含有SEQ ID NO:16之聚核苷酸。在一個實施例中，本文提供一種工程化CD4+ T細胞或其群體，其包含含有SEQ ID NO:16之核酸構築體。在一些實施例中，本文提供一種工程化CD8+ T細胞或其群體，其包含含有SEQ ID NO:16之核酸構築體。在一些實施例中，本文提供一種工程化CD3+ T細胞或其群體，其包含含有SEQ ID NO:16之核酸構築體。
在一些實施例中，本文所描述之工程化免疫細胞或其群體包含至少10% CD7 CAR+/CD7陰性T細胞、至少15% CD7 CAR+/CD7陰性T細胞、至少20% CD7 CAR+/CD7陰性T細胞、至少25% CD7 CAR+/CD7陰性T細胞、至少30% CD7 CAR+/CD7陰性T細胞、至少35% CD7 CAR+/CD7陰性T細胞、至少40% CD7 CAR+/CD7陰性T細胞、至少45% CD7 CAR+/CD7陰性T細胞、至少50% CD7 CAR+/CD7陰性T細胞、至少55% CD7 CAR+/CD7陰性T細胞、至少60% CD7 CAR+/CD7陰性T細胞、至少65% CD7 CAR+/CD7陰性T細胞、至少70% CD7 CAR+/CD7陰性T細胞、至少75% CD7 CAR+/CD7陰性T細胞、至少80% CD7 CAR+/CD7陰性T細胞、至少85% CD7 CAR+/CD7陰性T細胞、至少90% CD7 CAR+/CD7陰性T細胞、至少95% CD7 CAR+/CD7陰性T細胞、至少96% CD7 CAR+/CD7陰性T細胞、至少97% CD7 CAR+/CD7陰性T細胞、至少98% CD7 CAR+/CD7陰性T細胞、至少99% CD7 CAR+/CD7陰性T細胞、或100% CD7 CAR+/CD7陰性T細胞。在一些實施例中，本文所概述之工程化免疫細胞包括實質上經純化之CD7 CAR+/CD7陰性T細胞之群體，其中此類細胞表現所描述之任一雙順反子構築體。
在某些實施例中，提供一種工程化免疫細胞，其包含兩個雙順反子構築體，該兩個雙順反子構築體包含：第一雙順反子構築體，其包含：(i)編碼嵌合抗原受體(CAR)之聚核苷酸，其中該CAR包含細胞內信號傳導域4-1BB及CD3ζ以及特異性結合CD7之抗原結合域；(ii)編碼連接至定位域之目標結合分子之聚核苷酸，其中該目標結合分子為結合CD7之抗原結合域，且該定位域包含內質網滯留序列；及(iii)編碼2A自裂解肽或IRES序列之核酸序列，如本文所例示；及第二雙順反子構築體，其包含：(i)編碼自殺基因之聚核苷酸；(ii)編碼連接至定位域之目標結合分子之聚核苷酸，其中該目標結合分子為結合CD3之抗原結合域，且該定位域包含內質網滯留序列；及(iii)編碼2A自裂解肽或IRES序列之核酸序列，如本文所例示。
在一些情況下，諸如CD7 CAR+/CD7陰性T細胞或PCART7-CD3PEBL T細胞(allo-PCART7細胞)之工程化免疫細胞進一步包含有包含自殺基因之第四核酸。在一些實施例中，自殺基因包含CD20或其衍生物。在一些實施例中，自殺基因包含CD20、其衍生物或其一部分。在一些實施例中，自殺基因包含經修飾之CD20。在一些實施例中，自殺基因包含經截短CD20。在一些實施例中，第四核酸位於第二表現載體中，其中第二表現載體編碼第二PEBL。在一些實施例中，第四核酸位於第一表現載體中，其中第一表現載體編碼CAR及第一PEBL。在一些實施例中，第四核酸位於單獨表現載體，例如第三表現載體中。
在一些情況下，編碼第二PEBL之核酸及編碼包含自殺基因之第四核酸的核酸位於雙順反子載體(例如雙順反子反轉錄病毒載體、雙順反子慢病毒載體)中，使得第二PEBL及編碼自殺基因之第四核酸同時表現。在一些態樣中，編碼第二PEBL之核酸及編碼自殺基因之核酸藉由內部核糖體進入位點(IRES)或核糖體密碼子跳躍位點可操作地連接。在一些實施例中，核糖體密碼子跳躍位點包含2A自裂解肽。在一些情況下，編碼第二PEBL之核酸及編碼自殺基因之核酸位於第二反轉錄病毒載體或慢病毒載體中。
在一些情況下，其中編碼第二PEBL之核酸位於與包含編碼CAR及第一PEBL之核酸的載體分開的載體中，該兩個載體可同時引入。在一些情況下，其中編碼第二PEBL之核酸位於與包含編碼CAR及第一PEBL之核酸的載體分開的載體中，該兩個載體可依序引入。在一些情況下，其中編碼第二PEBL之核酸位於與包含編碼CAR及第一PEBL之核酸的載體分開的載體中，編碼CAR及第一PEBL之載體在編碼第二PEBL之載體之前引入。在一些情況下，其中編碼第二PEBL之核酸位於與包含編碼CAR及第一PEBL之核酸的載體分開的載體中，編碼CAR及第一PEBL之載體在編碼第二PEBL之載體之後引入。
在一些情況下，編碼CAR、第一PEBL及第二PEBL之核酸位於不同載體中。在一些情況下，編碼CAR、第一PEBL及第二PEBL之核酸位於同一載體中。在一些情況下，其中編碼CAR、第一PEBL及第二PEBL之核酸位於不同載體中，該等不同載體可同時引入。在一些情況下，其中編碼CAR、第一PEBL及第二PEBL之核酸位於不同載體中，該等不同載體可依序引入。
在一些情況下，其中編碼自殺基因及第二PEBL之核酸位於與包含編碼CAR及第一PEBL之核酸的載體分開的載體中，該兩個載體可同時引入。在一些情況下，其中編碼自殺基因及第二PEBL之核酸位於與包含編碼CAR及第一PEBL之核酸的載體分開的載體中，該兩個載體可依序引入。在一些情況下，其中編碼自殺基因及第二PEBL之核酸位於與包含編碼CAR及第一PEBL之核酸的載體分開的載體中，編碼CAR及第一PEBL之載體在編碼自殺基因及第二PEBL之載體之前引入。在一些情況下，其中編碼自殺基因及第二PEBL之核酸位於與包含編碼CAR及第一PEBL之核酸的載體分開的載體中，編碼CAR及第一PEBL之載體在編碼自殺基因及第二PEBL之載體之後引入。
在一些情況下，編碼CAR、第一PEBL、自殺基因及第二PEBL之核酸位於不同載體中。在一些情況下，編碼CAR、第一PEBL、自殺基因及第二PEBL之核酸位於同一載體中。在一些情況下，其中編碼CAR、第一PEBL、自殺基因及第二PEBL之核酸位於不同載體中，該等不同載體可同時引入。在一些情況下，其中編碼CAR、第一PEBL、自殺基因及第二PEBL之核酸位於不同載體中，該等不同載體可依序引入。
在一些情況下，其中編碼第二PEBL及自殺基因之核酸位於與包含編碼CAR及第一PEBL之核酸的載體分開的載體中，該兩個載體可同時引入。在一些情況下，其中編碼第二PEBL及自殺基因之核酸位於與包含編碼CAR及第一PEBL之核酸的載體分開的載體中，該兩個載體可依序引入。在一些情況下，其中編碼第二PEBL及自殺基因之核酸位於與包含編碼CAR及第一PEBL之核酸的載體分開的載體中，編碼CAR及第一PEBL之載體在編碼第二PEBL及自殺基因之載體之前引入。在一些情況下，其中編碼第二PEBL及自殺基因之核酸位於與包含編碼CAR及第一PEBL之核酸的載體分開的載體中，編碼CAR及第一PEBL之載體在編碼第二PEBL及自殺基因之載體之後引入。
在一些情況下，其中編碼CAR、第一PEBL、第二PEBL及自殺基因之核酸位於不同載體中，該等不同載體可同時引入。在一些情況下，其中編碼CAR、第一PEBL、第二PEBL及自殺基因之核酸位於不同載體中，該等不同載體可依序引入。
表現雙啟動子載體之工程化免疫細胞
在一些實施例中，提供一種工程化免疫細胞，其包含重組反轉錄病毒載體，該重組反轉錄病毒載體包含：(a)第一啟動子，其可操作地連接至編碼本文所描述之任一CAR之第一聚核苷酸；及(b)第二啟動子，其可操作地連接至編碼本文所描述之任一PEBL之第二聚核苷酸。在一些實施例中，工程化免疫細胞包含本文所描述之任一重組反轉錄病毒載體，其含有驅動CAR表現之啟動子及驅動PEBL表現之另一啟動子。
在一些實施例中，提供一種工程化免疫細胞，其包含兩個重組反轉錄病毒載體，該兩個重組反轉錄病毒載體包含：第一重組反轉錄病毒載體，其包含：(a)第一啟動子，其可操作地連接至編碼本文所描述之任一CAR之第一聚核苷酸；及(b)第二啟動子，其可操作地連接至編碼本文所描述之第一PEBL之第二聚核苷酸；及第二重組反轉錄病毒載體，其包含：(a)第一啟動子，其可操作地連接至編碼本文所描述之自殺基因之第一聚核苷酸；及(b)第二啟動子，其可操作地連接至編碼本文所描述之第二PEBL之第二聚核苷酸。在一些實施例中，工程化免疫細胞包含本文所描述之任一重組反轉錄病毒載體，其含有驅動CAR表現之啟動子及驅動PEBL表現之另一啟動子。在一些實施例中，工程化免疫細胞包含本文所描述之任一重組反轉錄病毒載體，其含有驅動自殺基因表現之啟動子及驅動另一PEBL表現之另一啟動子。
在一些實施例中，工程化免疫細胞包含重組反轉錄病毒載體，其包含與SEQ ID NO:17具有至少85% (例如85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高)序列一致性之核酸序列。在一些實施例中，工程化免疫細胞包含重組反轉錄病毒載體，其包含與SEQ ID NO: 18具有至少85% (例如85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高)序列一致性之核酸序列。在一些實施例中，工程化免疫細胞包含重組反轉錄病毒載體，其包含與SEQ ID NO: 19具有至少85% (例如85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高)序列一致性之核酸序列。在一些實施例中，工程化免疫細胞包含重組反轉錄病毒載體，其包含與SEQ ID NO: 20具有至少85% (例如85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高)序列一致性之核酸序列。在一些實施例中，工程化免疫細胞包含重組反轉錄病毒載體，其包含與SEQ ID NO:21具有至少85% (例如85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高)序列一致性之核酸序列。在一些實施例中，工程化免疫細胞包含重組反轉錄病毒載體，其包含與SEQ ID NO: 22具有至少85% (例如85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高)序列一致性之核酸序列。在一些實施例中，工程化免疫細胞包含重組反轉錄病毒載體，其包含與SEQ ID NO: 23具有至少85% (例如85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高)序列一致性之核酸序列。在一些情況下，工程化免疫細胞為工程化CD4+ T細胞或其群體或包含此類工程化CD4+ T細胞之群體。在一些情況下，工程化免疫細胞為工程化CD8+ T細胞或其群體或包含此類工程化CD8+ T細胞之群體。在一些情況下，工程化免疫細胞為工程化CD3+ T細胞或其群體或包含此類工程化CD3+ T細胞之群體。
在一些情況下，工程化免疫細胞包含含有SEQ ID NO:17之聚核苷酸。在一個實施例中，本文提供一種工程化CD4+ T細胞或其群體，其包含含有SEQ ID NO:17之核酸構築體。在一些實施例中，本文提供一種工程化CD8+ T細胞或其群體，其包含含有SEQ ID NO:17之核酸構築體。在一些實施例中，本文提供一種工程化CD3+ T細胞或其群體，其包含含有SEQ ID NO:17之核酸構築體。
在一些情況下，工程化免疫細胞包含含有SEQ ID NO:18之聚核苷酸。在一個實施例中，本文提供一種工程化CD4+ T細胞或其群體，其包含含有SEQ ID NO:18之核酸構築體。在一些實施例中，本文提供一種工程化CD8+ T細胞或其群體，其包含含有SEQ ID NO:18之核酸構築體。在一些實施例中，本文提供一種工程化CD3+ T細胞或其群體，其包含含有SEQ ID NO:18之核酸構築體。
在一些情況下，工程化免疫細胞包含含有SEQ ID NO:19之聚核苷酸。在一個實施例中，本文提供一種工程化CD4+ T細胞或其群體，其包含含有SEQ ID NO:19之核酸構築體。在一些實施例中，本文提供一種工程化CD8+ T細胞或其群體，其包含含有SEQ ID NO:19之核酸構築體。在一些實施例中，本文提供一種工程化CD3+ T細胞或其群體，其包含含有SEQ ID NO:19之核酸構築體。
在一些情況下，工程化免疫細胞包含含有SEQ ID NO:20之聚核苷酸。在一個實施例中，本文提供一種工程化CD4+ T細胞或其群體，其包含含有SEQ ID NO:20之核酸構築體。在一些實施例中，本文提供一種工程化CD8+ T細胞或其群體，其包含含有SEQ ID NO:20之核酸構築體。在一些實施例中，本文提供一種工程化CD3+ T細胞或其群體，其包含含有SEQ ID NO:20之核酸構築體。
在一些情況下，工程化免疫細胞包含含有SEQ ID NO:21之聚核苷酸。在一個實施例中，本文提供一種工程化CD4+ T細胞或其群體，其包含含有SEQ ID NO:21之核酸構築體。在一些實施例中，本文提供一種工程化CD8+ T細胞或其群體，其包含含有SEQ ID NO:21之核酸構築體。在一些實施例中，本文提供一種工程化CD3+ T細胞或其群體，其包含含有SEQ ID NO:21之核酸構築體。
在一些情況下，工程化免疫細胞包含含有SEQ ID NO:22之聚核苷酸。在一個實施例中，本文提供一種工程化CD4+ T細胞或其群體，其包含含有SEQ ID NO:22之核酸構築體。在一些實施例中，本文提供一種工程化CD8+ T細胞或其群體，其包含含有SEQ ID NO:22之核酸構築體。在一些實施例中，本文提供一種工程化CD3+ T細胞或其群體，其包含含有SEQ ID NO:22之核酸構築體。
在一些情況下，工程化免疫細胞包含含有SEQ ID NO:23之聚核苷酸。在一個實施例中，本文提供一種工程化CD4+ T細胞或其群體，其包含含有SEQ ID NO:23之核酸構築體。在一些實施例中，本文提供一種工程化CD8+ T細胞或其群體，其包含含有SEQ ID NO:23之核酸構築體。在一些實施例中，本文提供一種工程化CD3+ T細胞或其群體，其包含含有SEQ ID NO:23之核酸構築體。
在一些實施例中，本文所描述之工程化免疫細胞或其群體包含至少10% CD7 CAR+/CD7陰性T細胞、至少15% CD7 CAR+/CD7陰性T細胞、至少20% CD7 CAR+/CD7陰性T細胞、至少25% CD7 CAR+/CD7陰性T細胞、至少30% CD7 CAR+/CD7陰性T細胞、至少35% CD7 CAR+/CD7陰性T細胞、至少40% CD7 CAR+/CD7陰性T細胞、至少45% CD7 CAR+/CD7陰性T細胞、至少50% CD7 CAR+/CD7陰性T細胞、至少55% CD7 CAR+/CD7陰性T細胞、至少60% CD7 CAR+/CD7陰性T細胞、至少65% CD7 CAR+/CD7陰性T細胞、至少70% CD7 CAR+/CD7陰性T細胞、至少75% CD7 CAR+/CD7陰性T細胞、至少80% CD7 CAR+/CD7陰性T細胞、至少85% CD7 CAR+/CD7陰性T細胞、至少90% CD7 CAR+/CD7陰性T細胞、至少95% CD7 CAR+/CD7陰性T細胞、至少96% CD7 CAR+/CD7陰性T細胞、至少97% CD7 CAR+/CD7陰性T細胞、至少98% CD7 CAR+/CD7陰性T細胞、至少99% CD7 CAR+/CD7陰性T細胞、或100% CD7 CAR+/CD7陰性T細胞。在一些實施例中，本文所概述之工程化免疫細胞包括實質上經純化之CD7 CAR+/CD7陰性T細胞之群體，其中此類細胞表現所描述之任一雙啟動子構築體。
內源 CD7 表現減少的 CD7 CAR+ 工程化免疫細胞
在一些實施例中，本文所描述之工程化免疫細胞表現CD7 CAR，且與非工程化免疫細胞相比具有減少的內源CD7表現或沒有內源CD7表現。此類工程化免疫細胞表現CD7 PEBL，其最大限度地減少或消除免疫細胞表面上之內源CD7表現。在一些實施例中，減少之CD7表現係指細胞對表面CD7之下調或部分下調。在一些情況下，減少之表現包括與類似野生型或非工程化細胞之表現量相比表現量之至少5% (例如至少5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、20%、24%、25%、28%、40%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、86%、88%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)減少。在一些實施例中，本文所概述之工程化免疫細胞包括實質上經純化之CD7 CAR+/CD7陰性T細胞之群體。
在一些實施例中，本文所描述之工程化免疫細胞表現與SEQ ID NO:24具有至少90%序列一致性之CD7 PEBL。在一些實施例中，工程化免疫細胞表現與SEQ ID NO:25具有至少90%序列一致性之CD7 PEBL。在一些實施例中，工程化免疫細胞表現與SEQ ID NO:26具有至少90%序列一致性之CD7 PEBL。在一些實施例中，工程化免疫細胞表現與SEQ ID NO:27具有至少90%序列一致性之CD7 PEBL。
在一些實施例中，本文所描述之工程化免疫細胞表現與SEQ ID NO:28具有至少90%序列一致性之CD7 CAR。在一些實施例中，工程化免疫細胞表現與SEQ ID NO:29具有至少90%序列一致性之CD7 CAR。在一些實施例中，工程化免疫細胞表現與SEQ ID NO:30具有至少90%序列一致性之CD7 CAR。在一些實施例中，工程化免疫細胞表現與SEQ ID NO:31具有至少90%序列一致性之CD7 CAR。
在一些實施例中，本文所描述之工程化免疫細胞表現與SEQ ID NO:24具有至少90%序列一致性之CD7 PEBL及與SEQ ID NO:28具有至少90%序列一致性之CD7 CAR。在一些實施例中，本文所描述之工程化免疫細胞表現與SEQ ID NO:24具有至少90%序列一致性之CD7 PEBL及與SEQ ID NO:30具有至少90%序列一致性之CD7 CAR。
在一些實施例中，工程化免疫細胞表現與SEQ ID NO:25具有至少90%序列一致性之CD7 PEBL且表現與SEQ ID NO:29具有至少90%序列一致性之CD7 CAR。在一些實施例中，工程化免疫細胞表現與SEQ ID NO:25具有至少90%序列一致性之CD7 PEBL且表現與SEQ ID NO:31具有至少90%序列一致性之CD7 CAR。
在一些實施例中，工程化免疫細胞表現與SEQ ID NO:26具有至少90%序列一致性之CD7 PEBL及與SEQ ID NO:28具有至少90%序列一致性之CD7 CAR。在一些實施例中，工程化免疫細胞表現與SEQ ID NO:26具有至少90%序列一致性之CD7 PEBL及與SEQ ID NO:30具有至少90%序列一致性之CD7 CAR。
在一些實施例中，工程化免疫細胞表現與SEQ ID NO:27具有至少90%序列一致性之CD7 PEBL且表現與SEQ ID NO:29具有至少90%序列一致性之CD7 CAR。在一些實施例中，工程化免疫細胞表現與SEQ ID NO:27具有至少90%序列一致性之CD7 PEBL且表現與SEQ ID NO:31具有至少90%序列一致性之CD7 CAR。
在某些實施例中，工程化免疫細胞為工程化T細胞、工程化自然殺手(NK)細胞、工程化NK/T細胞、工程化單核球、工程化巨噬細胞或工程化樹突狀細胞。在一些實施例中，工程化免疫細胞為工程化CD4+ T細胞。在一些實施例中，工程化免疫細胞為工程化CD8+ T細胞。在一些實施例中，工程化免疫細胞為工程化CD3+ T細胞。亦提供本文所描述之任一工程化細胞之群體。
在一些實施例中，本文提供一種工程化免疫細胞(例如CD3+ T細胞、CD4+ T細胞或CD8+ T細胞)群體，其包含至少約50% (例如約50%、55%、58%、60%、62%、64%、66%、68%、70%、71%、73%、75%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多) CD7 CAR陽性的內源CD7陰性細胞。在一些實施例中，本文提供一種工程化免疫細胞群體，其包含至少約50% (例如約50%、55%、58%、60%、62%、64%、66%、68%、70%、71%、73%、75%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多) CD7 CAR陽性的內源CD7陰性CD4+ T細胞。在一些實施例中，本文提供一種工程化免疫細胞群體，其包含至少約50% (例如約50%、55%、58%、60%、62%、64%、66%、68%、70%、71%、73%、75%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多) CD7 CAR陽性的內源CD7陰性CD8+ T細胞。此類細胞群體可由周邊血液單核細胞(PBMC)、經純化之CD4+ T細胞、經純化之CD8+ T細胞或包含經純化之CD4+ T細胞及經純化之CD8+ T細胞的群體產生。
在一些實施例中，培養本文所描述之工程化免疫細胞以產生內源CD7表現減少的高純度CD7 CAR-T細胞群體。純度水準可為至少約75% (例如約75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多) CD7 CAR-T細胞不具有表面CD7表現。CD7之表現量可根據此項技術者已知之標準方法測定，包括(但不限於)免疫細胞化學法、流式細胞分析技術及FACS分析。
在一些實施例中，本發明之工程化免疫細胞包括CD45RO+細胞。在一些實施例中，工程化免疫細胞包括CCR7陰性細胞。在一些實施例中，工程化免疫細胞包括中樞記憶T細胞。在一些實施例中，工程化免疫細胞包括效應記憶T細胞。在一些實施例中，工程化免疫細胞包括效應T細胞。在一些實施例中，工程化免疫細胞包括初始T細胞。
在一些情況下，工程化免疫細胞群體包含效應記憶T細胞、中樞記憶T細胞、效應T細胞及初始T細胞。在一些實施例中，工程化免疫細胞群體包含比效應T細胞及初始T細胞更高百分比之效應記憶T細胞及中樞記憶T細胞。
在一些情況下，工程化免疫細胞群體包含PD1陰性細胞。在一些情況下，工程化免疫細胞群體包含TIM-1陰性細胞。
在一些實施例中，工程化免疫細胞產生免疫反應且分泌干擾素γ。工程化免疫細胞回應於癌細胞(諸如表現CD7之癌細胞)而誘導T細胞介導之細胞毒性。
在一些實施例中，包含雙順反子表現載體的本文所描述之細胞可用於產生CD7 CAR+/CD7陰性T細胞群體。CD7 CAR+/CD7陰性T細胞可隨時間推移而擴增及富集。CD7 CAR+/CD7陰性T細胞可由包括但不限於以下之細胞產生：整體PBMC、包含CD4+及CD8+ T細胞之經純化T細胞以及經純化之CD3+ T細胞。CD7 CAR+/CD7陰性T細胞可用於產生包括效應記憶T細胞、中樞記憶T細胞、效應T細胞及初始T細胞之不同T細胞子集。
在另一態樣中，亦提供一種用於產生具有本文所描述之任一實施例的工程化免疫細胞(例如工程化CD3+ T細胞、工程化CD4+ T細胞及工程化CD8+ T細胞)之方法，該方法包含將免疫細胞引入本發明之任一雙順反子構築體或雙啟動子構築體中。在一些實施例中，工程化免疫細胞來源於獲自個體之免疫細胞，該個體將接受工程化免疫細胞作為療法。在一些實施例中，工程化免疫細胞來源於獲自供體之免疫細胞，且所得工程化免疫細胞作為療法投與個體。
在各種態樣中，亦提供一種用於產生本文所描述之工程化免疫細胞的套組。本發明套組可用於產生例如具有抗CD7 CAR介導之細胞毒活性的同種異體或自體T細胞。在一些實施例中，套組適用於產生具有抗CD7 CAR介導之細胞毒活性的同種異體效應T細胞。在某些實施例中，套組適用於產生具有抗CD7 CAR介導之細胞毒活性的自體效應T細胞。
因此，本文提供一種套組，其包含本文所描述之任一雙順反子構築體或雙啟動子構築體。
在某些實施例中，雙順反子構築體進一步包含允許例如選殖及/或表現之序列(例如質體或載體序列)。舉例而言，核苷酸序列可作為質體之一部分提供，以便選殖至其他質體及/或載體(表現載體或病毒表現載體)中以例如轉染、轉導或電穿孔至細胞(例如免疫細胞)中。
通常，套組經分隔以便於使用，且可包括一或多個裝有試劑之容器。在某些實施例中，所有套組組分包裝在一起。或者，套組之一或多種個別組分可提供於與其他套組組分分開的包裝中。套組亦可包括使用套組組分之說明書。
在一些態樣中，本文提供經組態以用於產生本文所描述之工程化免疫細胞的套組。在一些態樣中，套組包含：(a)第一表現載體，其包含編碼連接至(ii)合成定位域的(i)結合至T細胞受體(TCR)複合物之次單元之域的核苷酸序列及編碼殺傷基因之核苷酸序列；及(b)第二表現載體，其包含編碼嵌合抗原受體(CAR)之核苷酸序列及編碼連接至合成表面多肽定位域之表面多肽結合域之核苷酸序列。
在一些實施例中，第一表現載體或第二表現載體可為反轉錄病毒載體、慢病毒載體、腺病毒載體或腺相關病毒載體。在一些實施例中，第一表現載體或第二表現載體可為慢病毒載體。在一些實施例中，第一表現載體或第二表現載體可為反轉錄病毒載體。在一些實施例中，套組之CAR可包含目標結合域。在一些實施例中，CAR之目標結合域可結合至CD7。在一些實施例中，(ii)之表面多肽可為CD7。在一些實施例中，TCR複合物之次單元可為CD3ε。在一些實施例中，TCR複合物之次單元可為CD3ε、CD3γ、CD3δ、TCRα或TCRβ。
在一些實施例中，編碼連接至(ii)合成定位域的(i)結合至TCR複合物之次單元之域的核苷酸序列及編碼殺傷基因之核苷酸序列可藉由內部核糖體進入位點(IRES)或核糖體密碼子跳躍位點可操作地連接。在一些實施例中，編碼CAR之核苷酸序列及編碼連接至合成表面多肽定位域之表面多肽結合域之核苷酸序列藉由內部核糖體進入位點(IRES)或核糖體密碼子跳躍位點可操作地連接。在一些實施例中，核糖體密碼子跳躍位點可為2A自裂解肽。
在一些實施例中，本文所描述之套組之第一表現載體及第二表現載體以至少1:1、至少2:1、至少3:1、至少4:1、至少5:1、至少6:1、至少7:1、至少8:1、至少9:1、至少10:1、至少11:1、至少12:1、至少13:1、至少14:1、至少15:1、至少1:2、至少1:3、至少1:4、至少1:5、至少1:6、至少1:7、或至少1:8之比率混合。在一些實施例中，本文所描述之套組之第一表現載體及第二表現載體以至少2:1之比率混合。
內源 CD7 及 CD3 表現減少的 CD7 CAR+ 工程化免疫細胞
在一些態樣中，本文所描述之工程化免疫細胞表現CD7 CAR，且與非工程化免疫細胞相比具有減少的內源CD7表現及CD3表現。此類工程化免疫細胞表現CD7 PEBL及CD3 PEBL，其分別最大限度地減少或消除免疫細胞表面上之內源CD7及CD3表現。在一些實施例中，減少之CD7及CD3表現係指細胞表面上之CD7及CD3表面表現之下調或部分下調。在一些情況下，減少之表現包括與類似野生型或非工程化細胞之表現量相比表現量之至少5% (例如至少5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、20%、24%、25%、28%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、86%、88%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)減少。在一些實施例中，本文所概述之工程化免疫細胞包括實質上經純化之CD7 CAR+/CD7陰性/CD3陰性T細胞之群體。
在某些實施例中，工程化免疫細胞為工程化T細胞、工程化自然殺手(NK)細胞、工程化NK/T細胞、工程化單核球、工程化巨噬細胞或工程化樹突狀細胞。在一些實施例中，工程化免疫細胞為工程化CD4+ T細胞。在一些實施例中，工程化免疫細胞為工程化CD8+ T細胞。在一些實施例中，工程化免疫細胞為工程化CD3+ T細胞。亦提供本文所描述之任一工程化細胞之群體。
在一些實施例中，本文提供一種工程化免疫細胞(例如CD3+ T細胞、CD4+ T細胞或CD8+ T細胞)群體，其包含至少約50% (例如約50%、55%、58%、60%、62%、64%、66%、68%、70%、71%、73%、75%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多) CD7 CAR陽性的內源CD7陰性及內源CD3陰性細胞。在一些實施例中，本文提供一種工程化免疫細胞群體，其包含至少約50% (例如約50%、55%、58%、60%、62%、64%、66%、68%、70%、71%、73%、75%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多) CD7 CAR陽性的內源CD7陰性及內源CD3陰性CD4+ T細胞。在一些實施例中，本文提供一種工程化免疫細胞群體，其包含至少約50% (例如約50%、55%、58%、60%、62%、64%、66%、68%、70%、71%、73%、75%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多) CD7 CAR陽性的內源CD7陰性及內源CD3陰性CD8+ T細胞。此類細胞群體可由周邊血液單核細胞(PBMC)、經純化之CD4+ T細胞、經純化之CD8+ T細胞或包含經純化之CD4+ T細胞及經純化之CD8+ T細胞的群體產生。
在一些實施例中，培養本文所描述之工程化免疫細胞以產生內源CD7及內源CD3表現減少的高純度CD7 CAR-T細胞群體。純度水準可為至少約75% (例如約75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多) CD7 CAR-T細胞不具有表面CD7及CD3表現。CD7及CD3之表現量可根據此項技術者已知之標準方法測定，包括(但不限於)免疫細胞化學法、流式細胞分析技術及FACS分析。
在一些實施例中，本發明之工程化免疫細胞包括CD45RO+細胞。在一些實施例中，工程化免疫細胞包括CCR7陰性細胞。在一些實施例中，工程化免疫細胞包括中樞記憶T細胞。在一些實施例中，工程化免疫細胞包括效應記憶T細胞。在一些實施例中，工程化免疫細胞包括效應T細胞。在一些實施例中，工程化免疫細胞包括初始T細胞。
在一些情況下，工程化免疫細胞群體包含效應記憶T細胞、中樞記憶T細胞、效應T細胞及初始T細胞。在一些實施例中，工程化免疫細胞群體包含比效應T細胞及初始T細胞更高百分比之效應記憶T細胞及中樞記憶T細胞。在一些實施例中，工程化免疫細胞群體包含約40%或更多效應記憶T細胞。
在一些情況下，工程化免疫細胞群體包含PD1陰性細胞。在一些情況下，工程化免疫細胞群體包含TIM-1陰性細胞。在一些實施例中，群體包含約60%或更多PD1陰性、TIM-1陰性細胞。在一些實施例中，群體包含約4%至約20% PD1陽性、TIM-1陽性細胞。
在一些實施例中，工程化免疫細胞產生免疫反應且分泌干擾素γ。工程化免疫細胞回應於癌細胞(諸如表現CD7之癌細胞)而誘導T細胞介導之細胞毒性。
在一些實施例中，本文所描述之細胞包含可用於產生CD7 CAR+/CD7-neg/CD3-neg T細胞群體之雙順反子表現載體及另一表現載體。CD7 CAR+/CD7-neg/CD3-neg T細胞可隨時間推移而擴增及富集。CD7 CAR+/CD7-neg/CD3-neg T細胞可由包括但不限於以下之細胞產生：整體PBMC、包含CD4+及CD8+ T細胞之經純化T細胞。CD7 CAR+/CD7-neg/CD3-neg T細胞可用於產生包括效應記憶T細胞、中樞記憶T細胞、效應T細胞及初始T細胞之不同T細胞子集。
在另一態樣中，亦提供一種用於產生工程化免疫細胞之方法，該工程化免疫細胞表現靶向細胞表面蛋白質之嵌合抗原受體(CAR)，該方法包含將以下引入免疫細胞中：a)第一核酸，其包含編碼連接至第一定位域之第一目標結合域之核苷酸序列；b)第二核酸，其包含編碼嵌合抗原受體(CAR)之核苷酸序列，其中該CAR包含第二目標結合域；c)第三核酸，其包含編碼連接至第二定位域之第三目標結合域之核苷酸序列，其中該第一目標結合域及該第二目標結合域結合至第一免疫細胞表面受體分子且該第三目標結合域結合至第二免疫細胞表面受體分子；及ii)培養該工程化免疫細胞，藉此產生該工程化免疫細胞。在一些實施例中，工程化免疫細胞來源於獲自個體之免疫細胞，該個體將接受工程化免疫細胞作為療法。在一些實施例中，工程化免疫細胞來源於獲自供體之免疫細胞，且所得工程化免疫細胞作為療法投與個體。
在各種態樣中，亦提供一種用於產生本文所描述之工程化免疫細胞的套組。本發明套組可用於產生例如介導GvHD之風險較低的CD7 CAR+/CD7-neg/CD3-neg T細胞。
因此，本文提供一種套組，其包含：第一表現載體，其包含：a)第一核酸，其包含編碼連接至定位域之第一目標結合域之核苷酸序列；b)第二核酸，其包含編碼嵌合抗原受體(CAR)之核苷酸序列，其中該CAR包含第二目標結合域；第二表現載體，其包含第三核酸，該第三核酸包含編碼連接至定位域之第三目標結合域之核苷酸序列；且其中該第一目標結合域及該第二目標結合域結合至第一免疫細胞表面受體分子且該第三目標結合域結合至第二免疫細胞表面受體分子。
在某些實施例中，雙順反子構築體進一步包含允許例如選殖及/或表現之序列(例如質體或載體序列)。舉例而言，核苷酸序列可作為質體之一部分提供，以便選殖至其他質體及/或載體(表現載體或病毒表現載體)中以例如轉染、轉導或電穿孔至細胞(例如免疫細胞)中。
通常，套組經分隔以便於使用，且可包括一或多個裝有試劑之容器。在某些實施例中，所有套組組分包裝在一起。或者，套組之一或多種個別組分可提供於與其他套組組分分開的包裝中。套組亦可包括使用套組組分之說明書。
內源 CD7 及 CD3 表現減少且誘導自殺基因 ( 殺傷基因 ) 表現的 CD7 CAR+ 工程化免疫細胞
在一些態樣中，本文所描述之工程化免疫細胞表現CD7 CAR及自殺基因，且與非工程化免疫細胞相比具有減少的內源CD7表現及CD3表現。在一些實施例中，自殺基因為CD20或其衍生物。在一些實施例中，自殺基因為經截短CD20。此類工程化免疫細胞表現CD7 PEBL及CD3 PEBL，其分別最大限度地減少或消除免疫細胞表面上之內源CD7及CD3表現。在一些實施例中，減少之CD7及CD3表現係指細胞表面上之CD7及CD3表面表現之下調或部分下調。在一些情況下，減少之表現包括與類似野生型或非工程化細胞之表現量相比表現量之至少5% (例如至少5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、20%、21%、22%、23%、24%、25%、26%、27%、28%、29%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、86%、88%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)減少。在一些實施例中，本文所概述之工程化免疫細胞包括實質上經純化之CD7 CAR陽性/CD20陽性/CD7陰性/CD3陰性T細胞之群體。
在某些實施例中，工程化免疫細胞為工程化T細胞、工程化自然殺手(NK)細胞、工程化NK/T細胞、工程化單核球、工程化巨噬細胞或工程化樹突狀細胞。在一些實施例中，工程化免疫細胞為工程化CD4+ T細胞。在一些實施例中，工程化免疫細胞為工程化CD8+ T細胞。在一些實施例中，工程化免疫細胞為工程化CD3+ T細胞。亦提供本文所描述之任一工程化細胞之群體。
在一些實施例中，本文提供一種工程化免疫細胞(例如CD3+ T細胞、CD4+ T細胞或CD8+ T細胞)群體，其包含至少約50% (例如約50%、55%、58%、60%、62%、64%、66%、68%、70%、71%、73%、75%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多) CD7 CAR陽性、CD20陽性、內源CD7陰性及內源CD3陰性細胞。在一些實施例中，本文提供一種工程化免疫細胞群體，其包含至少約50% (例如約50%、55%、58%、60%、62%、64%、66%、68%、70%、71%、73%、75%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多) CD7 CAR陽性、CD20陽性、內源CD7陰性及內源CD3陰性CD4+ T細胞。在一些實施例中，本文提供一種工程化免疫細胞群體，其包含至少約50% (例如約50%、55%、58%、60%、62%、64%、66%、68%、70%、71%、73%、75%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多) CD7 CAR陽性、CD20陽性、內源CD7陰性及內源CD3陰性CD8+ T細胞。此類細胞群體可由周邊血液單核細胞(PBMC)、經純化之CD4+ T細胞、經純化之CD8+ T細胞或包含經純化之CD4+ T細胞及經純化之CD8+ T細胞的群體產生。
在一些實施例中，培養本文所描述之工程化免疫細胞以產生內源CD7及內源CD3表現減少的高純度CD7 CAR陽性及CD20陽性T細胞群體。純度水準可為至少約75% (例如約75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多) CD7 CAR陽性及CD20陽性T細胞不具有表面CD7及CD3表現。CD7及CD3之表現量可根據此項技術者已知之標準方法測定，包括(但不限於)免疫細胞化學法、流式細胞分析技術及FACS分析。
在一些實施例中，本發明之工程化免疫細胞包括CD45RO+細胞。在一些實施例中，工程化免疫細胞包括CCR7陰性細胞。在一些實施例中，工程化免疫細胞包括中樞記憶T細胞。在一些實施例中，工程化免疫細胞包括效應記憶T細胞。在一些實施例中，工程化免疫細胞包括效應T細胞。在一些實施例中，工程化免疫細胞包括初始T細胞。
在一些情況下，工程化免疫細胞群體包含效應記憶T細胞、中樞記憶T細胞、效應T細胞及初始T細胞。在一些實施例中，工程化免疫細胞群體包含比效應T細胞及初始T細胞更高百分比之效應記憶T細胞及中樞記憶T細胞。在一些實施例中，工程化免疫細胞群體包含約40%或更多效應記憶T細胞。
在一些情況下，工程化免疫細胞群體包含PD1陰性細胞。在一些情況下，工程化免疫細胞群體包含TIM-1陰性細胞。在一些實施例中，群體包含約60%或更多PD1陰性、TIM-1陰性細胞。在一些實施例中，群體包含約4%至約20% PD1陽性、TIM-1陽性細胞。
在一些實施例中，工程化免疫細胞產生免疫反應且分泌干擾素γ。工程化免疫細胞回應於癌細胞(諸如表現CD7之癌細胞)而誘導T細胞介導之細胞毒性。
在一些實施例中，本文所描述之細胞包含可用於產生CD7 CAR陽性/CD20陽性/CD7陰性/CD3陰性T細胞群體之兩個雙順反子表現載體。CD7 CAR陽性/CD20陽性/CD7陰性/CD3陰性T細胞可隨時間推移而擴增及富集。CD7 CAR陽性/CD20陽性/CD7陰性/CD3陰性T細胞可由包括但不限於以下之細胞產生：整體PBMC、包含CD4+及CD8+ T細胞之經純化T細胞。CD7 CAR陽性/CD20陽性/CD7陰性/CD3陰性T細胞可用於產生包括效應記憶T細胞、中樞記憶T細胞、效應T細胞及初始T細胞之不同T細胞子集。
在另一態樣中，亦提供一種用於產生工程化免疫細胞之方法，該工程化免疫細胞表現靶向細胞表面蛋白質之嵌合抗原受體(CAR)，該方法包含：i)將以下引入免疫細胞中：a)第一核酸，其包含編碼連接至第一定位域之第一目標結合域之核苷酸序列；b)第二核酸，其包含編碼嵌合抗原受體(CAR)之核苷酸序列，其中該CAR包含第二目標結合域；c)第三核酸，其包含編碼連接至第二定位域之第三目標結合域之核苷酸序列，其中該第一目標結合域及該第二目標結合域結合至第一免疫細胞表面受體分子且該第三目標結合域結合至第二免疫細胞表面受體分子；d)第四核酸，其包含編碼自殺基因之核苷酸序列；及ii)培養該工程化免疫細胞，藉此產生該工程化免疫細胞。在一些實施例中，工程化免疫細胞來源於獲自個體之免疫細胞，該個體將接受工程化免疫細胞作為療法。在一些實施例中，工程化免疫細胞來源於獲自供體之免疫細胞，且所得工程化免疫細胞作為療法投與個體。在一些實施例中，工程化免疫細胞為自體工程化免疫細胞。在一些實施例中，工程化免疫細胞為同種異體工程化免疫細胞。
在各種態樣中，亦提供一種用於產生本文所描述之工程化免疫細胞的套組。本發明套組可用於產生例如介導GvHD之風險較低的CD7 CAR陽性/CD20陽性/CD7陰性/CD3陰性T細胞。
因此，本文提供一種套組，其包含：第一表現載體，其包含：a)第一核酸，其包含編碼連接至定位域之第一目標結合域之核苷酸序列；b)第二核酸，其包含編碼嵌合抗原受體(CAR)之核苷酸序列，其中該CAR包含第二目標結合域；第二表現載體，其包含：a)第三核酸，其包含編碼連接至定位域之第三目標結合域之核苷酸序列；b)第四核酸，其包含編碼自殺基因之核苷酸序列；且其中該第一目標結合域及該第二目標結合域結合至第一免疫細胞表面受體分子且該第三目標結合域結合至第二免疫細胞表面受體分子。
用於產生工程化免疫細胞之方法
在一些態樣中，本文提供產生工程化免疫細胞群體之方法。該方法可包含a)將以下引入免疫細胞中：第一核酸序列，其編碼連接至(ii)合成定位域的(i)結合至T細胞受體(TCR)複合物之次單元之域；第二核酸序列，其編碼嵌合抗原受體(CAR)；及第三核酸序列，其編碼連接至合成表面多肽定位域之表面多肽結合域(例如PEBL)，藉此產生工程化免疫細胞群體。
該方法可進一步包含b)培養工程化免疫細胞群體；藉此在工程化免疫細胞群體中表現CAR且下調TCR複合物及表面多肽之表面表現；其中編碼連接至(ii)合成定位域的(i)結合至T細胞受體(TCR)複合物之次單元之域的第一核酸序列的量多達編碼CAR之第二核酸序列或編碼連接至合成表面多肽定位域之表面多肽結合域之第三核酸序列的量的至少兩倍。
在一些實施例中，工程化免疫細胞中編碼連接至(ii)合成定位域的(i)結合至T細胞受體(TCR)複合物之次單元之域的第一核酸序列的量多達編碼CAR之第二核酸序列或編碼連接至合成表面多肽定位域之表面多肽結合域之第三核酸序列的量的至少約2倍、至少約3倍、至少約4倍、至少約5倍、至少約6倍、至少約7倍、至少約8倍、至少約9倍、至少約10倍、至少約11倍、至少約12倍、至少約13倍、至少約14倍、至少約15倍、至少約20倍、至少約25倍、至少約30倍、至少約35倍、或至少約40倍。在一些實施例中，工程化免疫細胞中編碼連接至(ii)合成定位域的(i)結合至T細胞受體(TCR)複合物之次單元之域的第一核酸序列的量多達編碼CAR之第二核酸序列或編碼連接至合成表面多肽定位域之表面多肽結合域之第三核酸序列的量的至多約40倍、至多約35倍、至多約30倍、至多約25倍、至多約20倍、至多約15倍、至多約10倍、至多約9倍、至多約8倍、至多約7倍、至多約6倍、至多約5倍、至多約4倍、至多約3倍、或至多約2倍。
在一些實施例中，工程化免疫細胞中編碼連接至(ii)合成定位域的(i)結合至T細胞受體(TCR)複合物之次單元之域的第一核酸序列的量多達編碼CAR之第二核酸序列或編碼連接至合成表面多肽定位域之表面多肽結合域之第三核酸序列的量的約2倍至約20倍。在一些實施例中，工程化免疫細胞中編碼連接至(ii)合成定位域的(i)結合至T細胞受體(TCR)複合物之次單元之域的第一核酸序列的量多達編碼CAR之第二核酸序列或編碼連接至合成表面多肽定位域之表面多肽結合域之第三核酸序列的量的約2倍至約3倍、約2倍至約4倍、約2倍至約5倍、約2倍至約6倍、約2倍至約7倍、約2倍至約8倍、約2倍至約9倍、約2倍至約10倍、約2倍至約15倍、約2倍至約7倍、約2倍至約20倍、約3倍至約4倍、約3倍至約5倍、約3倍至約6倍、約3倍至約7倍、約3倍至約8倍、約3倍至約9倍、約3倍至約10倍、約3倍至約15倍、約3倍至約7倍、約3倍至約20倍、約4倍至約5倍、約4倍至約6倍、約4倍至約7倍、約4倍至約8倍、約4倍至約9倍、約4倍至約10倍、約4倍至約15倍、約4倍至約7倍、約4倍至約20倍、約5倍至約6倍、約5倍至約7倍、約5倍至約8倍、約5倍至約9倍、約5倍至約10倍、約5倍至約15倍、約5倍至約7倍、約5倍至約20倍、約6倍至約7倍、約6倍至約8倍、約6倍至約9倍、約6倍至約10倍、約6倍至約15倍、約6倍至約7倍、約6倍至約20倍、約7倍至約8倍、約7倍至約9倍、約7倍至約10倍、約7倍至約15倍、約7倍至約7倍、約7倍至約20倍、約8倍至約9倍、約8倍至約10倍、約8倍至約15倍、約8倍至約7倍、約8倍至約20倍、約9倍至約10倍、約9倍至約15倍、約9倍至約7倍、約9倍至約20倍、約10倍至約15倍、約10倍至約7倍、約10倍至約20倍、約15倍至約7倍、約15倍至約20倍、或約7倍至約20倍。
CAR可包含結合至表面多肽之目標結合域，且表面多肽可為CD7。表面多肽之下調可防止工程化免疫細胞群體由於CAR而自相殘殺。編碼CAR之核酸序列及編碼PEBL之核酸序列可位於同一核酸分子上，該同一核酸分子可為雙順反子載體。編碼結合至TCR複合物之次單元之域的核酸序列可位於與編碼CAR之核酸序列及編碼PEBL之核酸序列分開的核酸分子上。該單獨核酸分子可為另一載體。雙順反子載體及包含編碼結合至TCR複合物之次單元之域的核酸序列的載體可同時或依序引入免疫細胞中。
在一些實施例中，在本文所提供之方法中，步驟a)可包含共轉導包含第二核酸序列及第三核酸序列之雙順反子載體及包含第一核酸序列之第一載體。在一些實施例中，在本文所提供之方法中，步驟a)可包含依序轉導包含第二核酸序列及第三核酸序列之雙順反子載體及包含第一核酸序列之第一載體。當轉導依序發生時，包含第一核酸序列之載體可在轉導包含第二核酸序列及第三核酸序列之雙順反子載體之前至少1小時、至少2小時、至少5小時、至少10小時、至少12小時、至少18小時、至少24小時、至少36小時、至少48小時、至少3天、至少4天、或至少5天引入免疫細胞中。
在一些實施例中，雙順反子載體之感染倍率(MOI)可為至少約5、至少約10、至少約15、至少約20、至少約25、至少約30、至少約40、或至少約50。在一些實施例中，雙順反子載體之感染倍率(MOI)可為至多約50、至多約40、至多約30、至多約25、至多約20、至多約15、至多約10、或至多約5。在一些實施例中，雙順反子載體之感染倍率(MOI)可為約3至約60。在一些實施例中，雙順反子載體之感染倍率(MOI)可為約3至約5、約3至約7、約3至約10、約3至約12、約3至約15、約3至約20、約3至約25、約3至約30、約3至約40、約3至約50、約3至約60、約5至約7、約5至約10、約5至約12、約5至約15、約5至約20、約5至約25、約5至約30、約5至約40、約5至約50、約5至約60、約7至約10、約7至約12、約7至約15、約7至約20、約7至約25、約7至約30、約7至約40、約7至約50、約7至約60、約10至約12、約10至約15、約10至約20、約10至約25、約10至約30、約10至約40、約10至約50、約10至約60、約12至約15、約12至約20、約12至約25、約12至約30、約12至約40、約12至約50、約12至約60、約15至約20、約15至約25、約15至約30、約15至約40、約15至約50、約15至約60、約20至約25、約20至約30、約20至約40、約20至約50、約20至約60、約25至約30、約25至約40、約25至約50、約25至約60、約30至約40、約30至約50、約30至約60、約40至約50、約40至約60、或約50至約60。
在一些實施例中，包含結合至TCR複合物之次單元之域的載體(例如第一載體)之感染倍率(MOI)可為至少約10、至少約15、至少約20、至少約25、至少約30、至少約40、至少約50、至少約60、或至少約75。在一些實施例中，包含結合至TCR複合物之次單元之域的載體之感染倍率(MOI)可為至多約60、至多約50、至多約40、至多約30、至多約25、至多約20、至多約15、或至多約10。在一些實施例中，包含結合至TCR複合物載體之次單元之域的載體之感染倍率(MOI)可為約10至約75。在一些實施例中，包含結合至TCR複合物之次單元之域的載體之感染倍率(MOI)可為約10至約15、約10至約20、約10至約25、約10至約30、約10至約35、約10至約40、約10至約45、約10至約50、約10至約55、約10至約60、約10至約75、約15至約20、約15至約25、約15至約30、約15至約35、約15至約40、約15至約45、約15至約50、約15至約55、約15至約60、約15至約75、約20至約25、約20至約30、約20至約35、約20至約40、約20至約45、約20至約50、約20至約55、約20至約60、約20至約75、約25至約30、約25至約35、約25至約40、約25至約45、約25至約50、約25至約55、約25至約60、約25至約75、約30至約35、約30至約40、約30至約45、約30至約50、約30至約55、約30至約60、約30至約75、約35至約40、約35至約45、約35至約50、約35至約55、約35至約60、約35至約75、約40至約45、約40至約50、約40至約55、約40至約60、約40至約75、約45至約50、約45至約55、約45至約60、約45至約75、約50至約55、約50至約60、約50至約75、約55至約60、約55至約75、或約60至約75。
在一些實施例中，雙順反子載體之MOI與包含結合至TCR複合物之次單元之域的載體(例如第一載體)之MOI之比率可為至少約1:2、至少約1:3、至少約1:4、至少約1:5、至少約1:6、至少約1:7、至少約1:8、至少約1:10、至少約1:12、或至少約1:16。在一些實施例中，雙順反子載體之MOI與包含結合至TCR複合物之次單元之域的載體(例如第一載體)之MOI之比率可為至多約1:16、至多約1:12、至多約1:10、至多約1:8、至多約1:7、至多約1:6、至多約1:5、至多約1:4、至多約1:3、或至多約1:2。
在一些實施例中，CD3 PEBL與CD7 CAR之載體拷貝數(VCN)比率可為至少約1:1、至少約1.5:1、至少約1.6:1、至少約1.7:1、至少約1.8:1、至少約1.9:1、至少約2:1、至少約2.1:1、至少約2.2:1、至少約2.3:1、至少約2.4:1、至少約2.5:1、至少約2.6:1、至少約2.7:1、至少約2.8:1、至少約2.9:1、至少約3:1、至少約3.5:1、至少約4:1、至少約4.5:1、至少約5:1、至少約6:1、至少約7:1、至少約8:1、至少約9:1、或至少約10:1。在一些實施例中，CD3 PEBL與CD7 CAR之載體拷貝數(VCN)比率可為至多約10:1、至多約9:1、至多約8:1、至多約7:1、至多約6:1、至多約5:1、至多約4.5:1、至多約4:1、至多約3.5:1、至多約3:1、至多約2.9:1、至多約2.8:1、至多約2.7:1、至多約2.6:1、至多約2.5:1、至多約2.4:1、至多約2.3:1、至多約2.2:1、至多約2.1:1、至多約2:1、至多約1.5:1、或至多約1:1。在一些實施例中，CD3 PEBL與CD7 PEBL之載體拷貝數(VCN)比率可為至少約1:1、至少約1.5:1、至少約1.6:1、至少約1.7:1、至少約1.8:1、至少約1.9:1、至少約2:1、至少約2.1:1、至少約2.2:1、至少約2.3:1、至少約2.4:1、至少約2.5:1、至少約2.6:1、至少約2.7:1、至少約2.8:1、至少約2.9:1、至少約3:1、至少約3.5:1、至少約4:1、至少約4.5:1、至少約5:1、至少約6:1、至少約7:1、至少約8:1、至少約9:1、或至少約10:1。在一些實施例中，CD3 PEBL與CD7 PEBL之載體拷貝數(VCN)比率可為至多約10:1、至多約9:1、至多約8:1、至多約7:1、至多約6:1、至多約5:1、至多約4.5:1、至多約4:1、至多約3.5:1、至多約3:1、至多約2.9:1、至多約2.8:1、至多約2.7:1、至多約2.6:1、至多約2.5:1、至多約2.4:1、至多約2.3:1、至多約2.2:1、至多約2.1:1、至多約2:1、至多約1.5:1、或至多約1:1。
在一些實施例中，產生工程化免疫細胞之方法包含將編碼殺傷基因之核酸序列引入免疫細胞中。在一些實施例中，殺傷基因編碼表面抗原，且該表面抗原可包含CD20或其片段及/或衍生物。在一些實施例中，殺傷基因包含本文所描述之殺傷基因。
在一些實施例中，產生工程化免疫細胞之方法包含自工程化免疫細胞群體中耗盡表現TCR複合物之細胞。在一些實施例中，產生工程化免疫細胞之方法包含富集表現表面抗原之細胞，藉此耗盡表現TCR複合物之細胞。在一些實施例中，產生工程化免疫細胞之方法包含在耗盡之前富集表現表面抗原之細胞，藉此產生CD20+TCR-工程化免疫細胞群體。
在一些實施例中，產生工程化免疫細胞之方法包含培養工程化免疫細胞群體，其包含在引入與耗盡之間擴增工程化免疫細胞群體至少1天、至少2天、至少3天、至少4天、至少5天、至少6天、至少7天、至少8天、至少9天、或至少10天。在一些實施例中，在耗盡過程之後，至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、或至少99%之CD20+TCR-工程化免疫細胞群體不表現CD3。
在一些實施例中，在製造之後，所產生之工程化免疫細胞群體可包含本文所描述之工程化免疫細胞。
投與工程化免疫細胞
在其他態樣中，亦提供一種治療有需要之個體之癌症的方法，其包含向該個體投與治療量的具有本文所描述之任一實施例之工程化免疫細胞，藉此治療有需要之個體之癌症。
在某些實施例中，該方法包含投與治療量之工程化免疫細胞，其包含雙順反子病毒構築體，該雙順反子病毒構築體包含：包含編碼CAR之核酸序列的聚核苷酸及包含編碼PEBL之核酸序列的聚核苷酸。在各種實施例中，該方法包含投與治療量之本文所描述之任一工程化免疫細胞，其包含重組反轉錄病毒載體，該重組反轉錄病毒載體包含：(a)第一啟動子，其可操作地連接至編碼如本文所概述之CD7嵌合抗原受體(CD7 CAR)之第一聚核苷酸；及(b)第二啟動子，其可操作地連接至編碼如本文所概述之CD7蛋白質表現阻斷劑(CD7 PEBL)之第二聚核苷酸。
在一些實施例中，該方法包含投與治療量之工程化免疫細胞，其包含兩個雙順反子病毒構築體，該兩個雙順反子病毒構築體包含：第一雙順反子病毒構築體，其包含：包含編碼CAR之核酸序列之聚核苷酸；及包含編碼第一PEBL之核酸序列之聚核苷酸；及第二雙順反子病毒構築體，其包含：包含編碼自殺基因之核酸序列之聚核苷酸；及包含編碼第二PEBL之核酸序列之聚核苷酸。在各種實施例中，該方法包含投與治療量之本文所描述之任一工程化免疫細胞，其包含重組反轉錄病毒載體，該重組反轉錄病毒載體包含：(a)第一啟動子，其可操作地連接至編碼如本文所概述之CD7嵌合抗原受體(CD7 CAR)之第一聚核苷酸；(b)第二啟動子，其可操作地連接至編碼CD7蛋白質表現阻斷劑(CD7 PEBL)之第二聚核苷酸；(c)第三啟動子，其可操作地連接至編碼自殺基因(例如CD20)之第三聚核苷酸；及(d)第四啟動子，其可操作地連接至編碼如本文所概述之CD3蛋白質表現阻斷劑(CD3 PEBL)之第四聚核苷酸。
在一些實施例中，向患有癌症之個體投與治療量之包含含有SEQ ID NO:11之核酸構築體的工程化免疫細胞(例如工程化CD3+ T細胞、工程化CD4+ T細胞或工程化CD8+ T細胞)或其群體。在一些實施例中，向患有癌症之個體投與治療量之包含含有SEQ ID NO:12之核酸構築體的工程化免疫細胞(例如工程化CD3+ T細胞、工程化CD4+ T細胞或工程化CD8+ T細胞)或其群體。在一些實施例中，向患有癌症之個體投與治療量之包含含有SEQ ID NO:13之核酸構築體的工程化免疫細胞(例如工程化CD3+ T細胞、工程化CD4+ T細胞或工程化CD8+ T細胞)或其群體。在一些實施例中，向患有癌症之個體投與治療量之包含含有SEQ ID NO:14之核酸構築體的工程化免疫細胞(例如工程化CD3+ T細胞、工程化CD4+ T細胞或工程化CD8+ T細胞)或其群體。在一些實施例中，向患有癌症之個體投與治療量之包含含有SEQ ID NO:15之核酸構築體的工程化免疫細胞(例如工程化CD3+ T細胞、工程化CD4+ T細胞或工程化CD8+ T細胞)或其群體。在一些實施例中，向患有癌症之個體投與治療量之包含含有SEQ ID NO:16之核酸構築體的工程化免疫細胞(例如工程化CD3+ T細胞、工程化CD4+ T細胞或工程化CD8+ T細胞)或其群體。在一些實施例中，向患有癌症之個體投與治療量之包含含有SEQ ID NO:17之核酸構築體的工程化免疫細胞(例如工程化CD3+ T細胞、工程化CD4+ T細胞或工程化CD8+ T細胞)或其群體。在一些實施例中，向患有癌症之個體投與治療量之包含含有SEQ ID NO:18之核酸構築體的工程化免疫細胞(例如工程化CD3+ T細胞、工程化CD4+ T細胞或工程化CD8+ T細胞)或其群體。在一些實施例中，向患有癌症之個體投與治療量之包含含有SEQ ID NO:19之核酸構築體的工程化免疫細胞(例如工程化CD3+ T細胞、工程化CD4+ T細胞或工程化CD8+ T細胞)或其群體。在一些實施例中，向患有癌症之個體投與治療量之包含含有SEQ ID NO:20之核酸構築體的工程化免疫細胞(例如工程化CD3+ T細胞、工程化CD4+ T細胞或工程化CD8+ T細胞)或其群體。在一些實施例中，向患有癌症之個體投與治療量之包含含有SEQ ID NO:21之核酸構築體的工程化免疫細胞(例如工程化CD3+ T細胞、工程化CD4+ T細胞或工程化CD8+ T細胞)或其群體。在一些實施例中，向患有癌症之個體投與治療量之包含含有SEQ ID NO:22之核酸構築體的工程化免疫細胞(例如工程化CD3+ T細胞、工程化CD4+ T細胞或工程化CD8+ T細胞)或其群體。在一些實施例中，向患有癌症之個體投與治療量之包含含有SEQ ID NO:23之核酸構築體的工程化免疫細胞(例如工程化CD3+ T細胞、工程化CD4+ T細胞或工程化CD8+ T細胞)或其群體。
在一些實施例中，向患有癌症之個體投與治療量之包含SEQ ID NO:25之CD7 PEBL的工程化免疫細胞(例如工程化CD3+ T細胞、工程化CD4+ T細胞或工程化CD8+ T細胞)群體。在一些實施例中，向患有癌症之個體投與治療量之包含SEQ ID NO:27之CD7 PEBL的工程化免疫細胞(例如工程化CD3+ T細胞、工程化CD4+ T細胞或工程化CD8+ T細胞)群體。
在一些實施例中，向患有癌症之個體投與治療量之包含SEQ ID NO:29之CD7 CAR的工程化免疫細胞(例如工程化CD3+ T細胞、工程化CD4+ T細胞或工程化CD8+ T細胞)群體。在一些實施例中，向患有癌症之個體投與治療量之包含SEQ ID NO:31之CD7 CAR的工程化免疫細胞(例如工程化CD3+ T細胞、工程化CD4+ T細胞或工程化CD8+ T細胞)群體。
在一些實施例中，向患有癌症之個體投與治療量之包含SEQ ID NO:25之CD7 PEBL及SEQ ID NO:29之CD7 CAR的工程化免疫細胞(例如工程化CD3+ T細胞、工程化CD4+ T細胞或工程化CD8+ T細胞)群體。在一些實施例中，向患有癌症之個體投與治療量之包含SEQ ID NO:27之CD7 PEBL及SEQ ID NO:29之CD7 CAR的工程化免疫細胞(例如工程化CD3+ T細胞、工程化CD4+ T細胞或工程化CD8+ T細胞)群體。
在一些實施例中，向患有癌症之個體投與治療量之包含SEQ ID NO:25之CD7 PEBL及SEQ ID NO:31之CD7 CAR的工程化免疫細胞(例如工程化CD3+ T細胞、工程化CD4+ T細胞或工程化CD8+ T細胞)群體。在一些實施例中，向患有癌症之個體投與治療量之包含SEQ ID NO:27之CD7 PEBL及SEQ ID NO:31之CD7 CAR的工程化免疫細胞(例如工程化CD3+ T細胞、工程化CD4+ T細胞或工程化CD8+ T細胞)群體。
在一些實施例中，向患有癌症之個體投與治療量之工程化免疫細胞(例如工程化CD3+ T細胞、工程化CD4+ T細胞或工程化CD8+ T細胞)群體，其中該等工程化免疫細胞包含SEQ ID NO:95。
在某些實施例中，癌症為T細胞惡性腫瘤，例如T細胞白血病或T細胞淋巴瘤，諸如T細胞急性淋巴母細胞性白血病、T細胞前淋巴細胞性白血病、T細胞大顆粒淋巴細胞性白血病、腸病相關T細胞淋巴瘤、肝脾T細胞淋巴瘤、皮下脂層炎樣T細胞淋巴瘤、蕈樣肉芽腫、塞紮里症候群(Sézary syndrome)、原發性皮膚γ-δ T細胞淋巴瘤、非特指型周邊T細胞淋巴瘤、血管免疫母細胞性T細胞淋巴瘤、退行性大細胞淋巴瘤。在某些實施例中，T細胞惡性腫瘤為早期T細胞前驅細胞急性淋巴母細胞性白血病(ETP-ALL)。
在一些實施例中，工程化免疫細胞對需要治療(例如癌症治療)之個體而言為自體的。在其他實施例中，工程化免疫細胞對需要治療之個體而言為同種異體的。
在某些實施例中，工程化免疫細胞藉由靜脈內輸注、動脈內輸注、直接注射至腫瘤中及/或手術後腫瘤床灌注、植入人工支架中之腫瘤部位、鞘內投與及眼內投與而投與至個體中。
在某些實施例中，工程化免疫細胞藉由輸注投與至個體中。輸注免疫細胞(例如同種異體或自體免疫細胞)之方法為此項技術中已知的。向接受者投與足夠數目個細胞以改善疾病之症狀。通常，在單次設定中輸注10
7至10
10個細胞之劑量，例如10
9個細胞之劑量。輸注以單次10
9個細胞劑量或分成若干個10
9個細胞劑量投與。必要或指示時，輸注頻率可為每天、每2至30天或甚至更長時間間隔。輸注數量一般為每個個體至少1次輸注且較佳至少3次輸注，視耐受情況而定，或直至疾病症狀得到改善。細胞可以50-250 ml/hr之速率靜脈內輸注。其他適合的投與模式包括動脈內輸注、腹膜內輸注、直接注射至腫瘤中及/或手術後腫瘤床灌注、植入人工支架中之腫瘤部位、鞘內投與。使本發明適應此類遞送模式的方法為熟習此項技術者容易獲得的。
在某些實施例中，根據本發明之治療癌症之方法與至少一種其他已知癌症療法組合，例如放射線療法、化學療法或其他免疫療法。
在其他態樣中，亦提供一種具有本文所描述之任一實施例之工程化免疫細胞的用途，其用於治療癌症，其包含向有需要之個體投與治療量之工程化免疫細胞。在某些實施例中，癌症為T細胞惡性腫瘤。在某些實施例中，T細胞惡性腫瘤為早期T細胞前驅細胞急性淋巴母細胞性白血病(ETP-ALL)。
在某些實施例中，工程化免疫細胞藉由靜脈內輸注、動脈內輸注、腹膜內輸注、直接注射至腫瘤中及/或手術後腫瘤床灌注、植入人工支架中之腫瘤部位及鞘內投與而投與至個體中。
在一些態樣中，本文提供用於調節有需要之個體之免疫系統的方法，該方法包含：投與治療有效量之工程化免疫細胞。該等工程化免疫細胞可包含：(a)第一核酸序列，其編碼連接至(ii)合成定位域的(i)結合至T細胞受體(TCR)複合物之次單元之域；(b)第二核酸序列，其編碼嵌合抗原受體(CAR)；及(c)第三核酸序列，其編碼連接至合成表面多肽定位域之表面多肽結合域。連接至合成定位域的結合至TCR複合物之次單元之域可下調TCR複合物之表面表現，藉此調節有需要之個體之免疫系統。
在一些實施例中，如本文所使用之調節免疫系統可指使用治療劑來改變個體之免疫反應。在一些實施例中，調節免疫系統可包含投與治療有效量之藥劑以改變個體之免疫反應。在一些實施例中，調節免疫系統可包含投與本文所描述之工程化免疫細胞以降低個體對藥劑產生免疫反應的風險。
在一些態樣中，本文提供用於治療有需要之個體之疾病的方法，該方法包含：投與治療有效量之工程化免疫細胞。該等工程化免疫細胞可包含：(a)第一核酸序列，其編碼連接至(ii)合成定位域的(i)結合至T細胞受體(TCR)複合物之次單元之域；(b)第二核酸序列，其編碼嵌合抗原受體(CAR)；及(c)第三核酸序列，其編碼連接至合成表面多肽定位域之表面多肽結合域。連接至合成定位域的結合至TCR複合物之次單元之域可下調TCR複合物之表面表現，藉此治療有需要之個體之疾病。
在一些實施例中，個體可患有移植物抗宿主疾病(GvHD)之症狀。在一些實施例中，個體可患有病狀及/或與同種異體移植相關。在一些實施例中，調節免疫系統可包含預防、緩解或降低GvHD及/或GvHD症狀之風險。在一些實施例中，調節患有GvHD之個體之免疫系統可包含藉由CD7 CAR在活體外或離體殺死CD7+ T細胞。不希望受理論所束縛，本文所描述之PEBL可下調細胞表面上之TCR/CD3複合物，藉此降低個體回應於所投與之藥劑而出現移植物抗宿主疾病(GvHD)的風險。工程化免疫細胞可降低個體中出現GvHD之風險。在一些實施例中，相比於與投與僅包含CAR或僅包含CD7 PEBL之其他方面相同之免疫細胞相關的風險，投與本文所描述之工程化免疫細胞後個體出現移植物抗宿主疾病(GvHD)反應之風險降低。
在一些實施例中，個體可患有癌症。在一些實施例中，癌症可為T細胞惡性腫瘤，例如T細胞白血病或T細胞淋巴瘤，諸如T細胞急性淋巴母細胞性白血病、T細胞前淋巴細胞性白血病、T細胞大顆粒淋巴細胞性白血病、腸病相關T細胞淋巴瘤、肝脾T細胞淋巴瘤、皮下脂層炎樣T細胞淋巴瘤、蕈樣肉芽腫、塞紮里症候群、原發性皮膚γ-δ T細胞淋巴瘤、非特指型周邊T細胞淋巴瘤、血管免疫母細胞性T細胞淋巴瘤、退行性大細胞淋巴瘤。
在一些實施例中，癌症包含T細胞急性淋巴母細胞性白血病(T-ALL)、早期T細胞前驅細胞急性淋巴母細胞性白血病(ETP-ALL)、急性骨髓性白血病或T細胞淋巴母細胞性淋巴瘤。在一些實施例中，癌症可為CD7陽性癌症。在一些實施例中，調節免疫系統可包含治療癌症及/或治療癌症之症狀。
在一些實施例中，CAR包含結合至表面多肽之目標結合域。在一些實施例中，表面多肽可為CD7。在一些實施例中，TCR複合物之次單元為CD3ε、CD3γ或CD3δ。在一些實施例中，TCR複合物之次單元為CD3ε。在一些實施例中，結合至TCR複合物之次單元(例如CD3ε)的域可為抗體或抗原結合域。在一些實施例中，該抗體結合至CD3ε (例如抗CD3ε抗體)。在一些實施例中，該抗體可為單鏈Fv (scFv)或單域抗體(sdAb)。
在一些實施例中，該抗CD3ε抗體包含SEQ ID NO: 212或215之重鏈互補決定區(HC CDR) 1、SEQ ID NO: 213或216之HC CDR2、SEQ ID NO: 214或217之HC CDR3以及SEQ ID NO: 218或221之輕鏈(LC) CDR1、SEQ ID NO: 219或222之LC CDR2、SEQ ID NO: 220或223之LC CDR3。在一些實施例中，該抗CD3ε抗體包含具有與SEQ ID NO: 114具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%序列一致性之胺基酸序列的重鏈可變域。在一些實施例中，該抗CD3ε抗體包含具有與SEQ ID NO: 115具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%序列一致性之胺基酸序列的輕鏈可變域。在一些實施例中，該抗CD3ε抗體包含與SEQ ID NO: 104具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%序列一致性之胺基酸序列。
在一些實施例中，工程化免疫細胞可為T細胞或自然殺手(NK)細胞。在一些實施例中，工程化免疫細胞可為T細胞、自然殺手(NK)細胞、NK/T細胞、單核球、巨噬細胞或樹突狀細胞。在一些實施例中，工程化免疫細胞可為CD4+ T細胞或CD8+ T細胞。在一些實施例中，工程化免疫細胞抑制個體中之腫瘤生長。在一些實施例中，工程化免疫細胞抑制、減少或預防個體中之腫瘤生長。在一些實施例中，相比於腫瘤與工程化免疫細胞接觸前之尺寸，工程化免疫細胞使腫瘤縮小至至少約兩倍、至少約三倍、至少約四倍、至少約五倍、至少約六倍、至少約七倍、至少約八倍、至少約九倍、或至少約十倍。在一些實施例中，相比於與工程化免疫細胞接觸前之腫瘤負荷，工程化免疫細胞可將腫瘤負荷減少至少約兩倍、至少約三倍、至少約四倍、至少約五倍、至少約六倍、至少約七倍、至少約八倍、至少約九倍、或至少約十倍。
在一些實施例中，本文所描述之任何工程化免疫細胞可用於調節有需要之個體之免疫系統。例示性工程化免疫細胞可包含含有CD7 CAR及CD7 PEBL之雙順反子載體。例示性工程化免疫細胞可包含含有CD3 PEBL及殺傷基因之雙順反子載體。
在一些態樣中，本文提供在有需要之個體中投與之後耗盡工程化免疫細胞的方法。在一些態樣中，該方法包含向個體投與表現以下之工程化免疫細胞群體：(a)對T細胞表面抗原具有特異性之嵌合抗原受體(CAR)；(b)第一蛋白質表現阻斷劑(PEBL)，其下調T細胞表面抗原之細胞表面表現；(c)第二PEBL，其下調T細胞受體(TCR)複合物之次單元之細胞表面表現；及(d)殺傷蛋白質。
在一些實施例中，該殺傷蛋白質包含CD20或其衍生物。在一些實施例中，該殺傷蛋白質包含CD20、其衍生物或其一部分。在一些實施例中，該殺傷蛋白質包含經修飾之CD20。在一些實施例中，該殺傷蛋白質包含經截短CD20 (CD20t)。在一些實施例中，該CD20t包含SEQ ID NO: 106之胺基酸序列。在一些實施例中，該CD20t包含與SEQ ID NO: 106具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%序列一致性之胺基酸序列。
在一些實施例中，在有需要之個體中投與之後耗盡工程化免疫細胞之方法可包含向該個體投與利妥昔單抗以誘導工程化免疫細胞群體之消除，藉此耗盡該工程化免疫細胞群體。在一些實施例中，在有需要之個體中投與之後耗盡工程化免疫細胞之方法可包含向該個體投與奧法木單抗以誘導工程化免疫細胞群體之消除，藉此耗盡該工程化免疫細胞群體。在一些實施例中，該個體可已診斷出患有免疫病狀。在一些實施例中，該個體可已診斷出患有T細胞惡性腫瘤。在一些實施例中，CAR可對CD7具有特異性。在一些實施例中，藉由第二PEBL下調的TCR複合物之次單元為CD3ε、CD3γ或CD3δ。在一些實施例中，藉由第二PEBL下調的TCR複合物之次單元為CD3ε。
在一些實施例中，該工程化免疫細胞群體包含T細胞或自然殺手(NK)細胞。在一些實施例中，該工程化免疫細胞群體可為T細胞、自然殺手(NK)細胞、NK/T細胞、單核球、巨噬細胞或樹突狀細胞。在一些實施例中，該工程化免疫細胞群體可為CD4+ T細胞或CD8+ T細胞。
實施例段落
實施例1. 一種工程化免疫細胞，其包含：(a)第一核酸，其包含編碼連接至第一定位域之第一目標結合域之核苷酸序列；(b)第二核酸，其包含編碼嵌合抗原受體(CAR)之核苷酸序列，其中該CAR包含第二目標結合域；(c)第三核酸，其包含編碼連接至第二定位域之第三目標結合域之核苷酸序列；且其中該第一目標結合域及該第二目標結合域結合至第一免疫細胞表面受體分子且該第三目標結合域結合至第二免疫細胞表面受體分子。
實施例2. 如實施例1之工程化免疫細胞，其中該第一免疫細胞表面受體分子為CD7。
實施例3. 如實施例1或2之工程化免疫細胞，其中該第二免疫細胞表面受體分子為CD3。
實施例4. 如實施例1至3中任一者之工程化免疫細胞，其中該第一目標結合域及該第二目標結合域分別為第一抗體及第二抗體，且其中該第一抗體之胺基酸序列與該第二抗體之胺基酸序列至少80%一致。
實施例5. 如實施例4之工程化免疫細胞，其中該第一抗體之CDR之胺基酸序列與該第二抗體之CDR1至CDR3之胺基酸序列至少90%一致。
實施例6. 如實施例4至5中任一者之工程化免疫細胞，其中該第一抗體包含TH69之CDR序列。
實施例7. 如實施例4至6中任一者之工程化免疫細胞，其中該第二抗體包含TH69之CDR序列。
實施例8. 如實施例3至7中任一者之工程化免疫細胞，其中該第三目標結合域包含抗CD3抗體。
實施例9. 如實施例1至8中任一者之工程化免疫細胞，其中該第一核酸及該第二核酸位於第一表現載體中。
實施例10. 如實施例9之工程化免疫細胞，其中該第一表現載體為雙順反子慢病毒表現載體。
實施例11. 如實施例9或10之工程化免疫細胞，其中該第一核酸及該第二核酸藉由內部核糖體進入位點(IRES)或核糖體密碼子跳躍位點可操作地連接。
實施例12. 如實施例11之工程化免疫細胞，其中該核糖體密碼子跳躍位點包含2A自裂解肽。
實施例13. 如實施例9之工程化免疫細胞，其中該第三核酸位於第二表現載體中。
實施例14. 如實施例1至13中任一者之工程化免疫細胞，其進一步包含第四核酸，其中該第四核酸包含自殺基因或殺傷基因。
實施例15. 如實施例14之工程化免疫細胞，其中該自殺基因或殺傷基因包含CD20或其衍生物。
實施例16. 如實施例14或15之工程化免疫細胞，其中該第四核酸位於該第二表現載體中。
實施例17. 如實施例1至16中任一者之工程化免疫細胞，其中該第二表現載體為慢病毒載體。
實施例18. 如實施例1至17中任一者之工程化免疫細胞，其中該第一定位域及該第二定位域包含內質網(ER)滯留序列、高基氏體滯留序列、蛋白酶體定位序列或跨膜域。
實施例19. 如實施例18之工程化免疫細胞，其中該ER滯留序列包含KDEL或KKXX。
實施例20. 如實施例18或19之工程化免疫細胞，其中該第一定位域及該第二定位域為相同的胺基酸序列。
實施例21. 如實施例18或19之工程化免疫細胞，其中該第一定位域及該第二定位域包含不同的胺基酸序列。
實施例22. 如實施例1至21中任一者之工程化免疫細胞，其中該第一核酸進一步包含編碼偶聯該第一目標結合域與該第一定位域之連接子的核酸序列。
實施例23. 如實施例1至22中任一者之工程化免疫細胞，其中該CAR包含跨膜域、4-1BB細胞內信號傳導域及CD3ζ細胞內信號傳導域。
實施例24. 如實施例1至23中任一者之工程化免疫細胞，其中該第一細胞表面受體分子及該第二細胞表面受體分子之表面表現在該工程化免疫細胞中下調。
實施例25. 如實施例1至24中任一者之工程化免疫細胞，其中該工程化免疫細胞為T細胞或NK細胞。
實施例26. 一種產生工程化免疫細胞之方法，該工程化免疫細胞表現靶向細胞表面蛋白質之嵌合抗原受體(CAR)，該方法包含：(i)將以下引入免疫細胞中：(a)第一核酸，其包含編碼連接至第一定位域之第一目標結合域之核苷酸序列；(b)第二核酸，其包含編碼嵌合抗原受體(CAR)之核苷酸序列，其中該CAR包含第二目標結合域；(c)第三核酸，其包含編碼連接至第二定位域之第三目標結合域之核苷酸序列，其中該第一目標結合域及該第二目標結合域結合至第一免疫細胞表面受體分子且該第三目標結合域結合至第二免疫細胞表面受體分子；及(ii)培養該工程化免疫細胞，藉此產生該工程化免疫細胞。
實施例27. 如實施例26之方法，其中該第一目標結合域或該第三目標結合域之表現防止在步驟(ii)期間該工程化免疫細胞之自相殘殺。
實施例28. 如實施例26或27之方法，其中該第一免疫細胞表面受體分子為CD7。
實施例29. 如實施例26至28中任一者之方法，其中該第二免疫細胞表面受體分子為CD3。
實施例30. 如實施例26至29中任一者之方法，其中該免疫細胞為T細胞或NK細胞。
實施例31. 如實施例26至30中任一者之方法，其中該第一核酸、該第二核酸及該第三核酸之該引入不影響該工程化免疫細胞之擴增或功能。
實施例32. 如實施例26至31中任一者之方法，其中與用該第一核酸及該第二核酸轉導但不用該第三核酸轉導之工程化免疫細胞相比，該第三核酸之該引入不影響該工程化免疫細胞之細胞毒性。
實施例33. 一種治療有需要之個體之癌症的方法，其包含：投與治療有效量之工程化免疫細胞，其中該工程化免疫細胞包含：(a)第一核酸，其包含編碼連接至第一定位域之第一目標結合域之核苷酸序列；(b)第二核酸，其包含編碼嵌合抗原受體(CAR)之核苷酸序列，其中該CAR包含第二目標結合域；(c)第三核酸，其包含編碼連接至第二定位域之第三目標結合域之核苷酸序列，其中該第一目標結合域及該第二目標結合域結合至第一免疫細胞表面受體分子且該第三目標結合域結合至第二免疫細胞表面受體分子；以及藉此治療該癌症。
實施例34. 如實施例33之方法，其中該第一免疫細胞表面受體分子為CD7。
實施例35. 如實施例33或34之方法，其中該第二免疫細胞表面受體分子為CD3。
實施例36. 如實施例33至35中任一者之方法，其中該工程化免疫細胞為T細胞。
實施例37. 如實施例33至36中任一者之方法，其中該癌症包含CD7陽性癌症。
實施例38. 如實施例33至37中任一者之方法，其中該癌症包含急性淋巴母細胞性白血病(T-ALL)、早期T細胞前驅細胞急性淋巴母細胞性白血病(ETP-ALL)、急性骨髓性白血病或T細胞淋巴母細胞性淋巴瘤。
實施例39. 如實施例33至38中任一者之方法，其中該工程化免疫細胞之該投與抑制該個體中之腫瘤細胞生長。
實施例40. 一種用於預防、緩解或減輕有需要之個體之移植物抗宿主疾病(GvHD)之症狀的方法，其包含：投與治療有效量之工程化免疫細胞，其中該工程化免疫細胞包含：(a)第一核酸，其包含編碼連接至定位域之第一目標結合域之核苷酸序列；(b)第二核酸，其包含編碼嵌合抗原受體(CAR)之核苷酸序列，其中該CAR包含第二目標結合域；(c)第三核酸，其包含編碼連接至定位域之第三目標結合域之核苷酸序列，其中該第一目標結合域及該第二目標結合域結合至第一免疫細胞表面受體分子且該第三目標結合域結合至第二免疫細胞表面受體分子；其中該第三目標結合域之表現下調該工程化免疫細胞之免疫細胞受體之表面表現，從而防止免疫細胞受體介導之抗原識別，藉此預防、緩解或減輕GvHD之症狀。
實施例41. 如實施例40之方法，其中該第一免疫細胞表面受體分子為CD7。
實施例42. 如實施例40或41之方法，其中該第二免疫細胞表面受體分子為CD3。
實施例43. 如實施例40至42中任一者之方法，其中該工程化免疫細胞為T細胞或NK細胞。
實施例44. 一種套組，其包含：第一表現載體，其包含：(a)第一核酸，其包含編碼連接至定位域之第一目標結合域之核苷酸序列；(b)第二核酸，其包含編碼嵌合抗原受體(CAR)之核苷酸序列，其中該CAR包含第二目標結合域；第二表現載體，其包含第三核酸，該第三核酸包含編碼連接至定位域之第三目標結合域之核苷酸序列；且其中該第一目標結合域及該第二目標結合域結合至第一免疫細胞表面受體分子且該第三目標結合域結合至第二免疫細胞表面受體分子。
實施例45. 如實施例44之套組，其中該第一表現載體為雙順反子反轉錄病毒表現載體。
實施例46. 如實施例44或45之套組，其中該第二表現載體為反轉錄病毒載體。
實施例47. 如實施例45或46之套組，其中該第一表現載體為雙順反子慢病毒載體。
實施例48. 如實施例45至47中任一者之套組，其中該第二表現載體為慢病毒載體。
實施例49. 如實施例44至48中任一者之套組，其中該第一免疫細胞表面受體分子為CD7。
實施例50. 如實施例44至49中任一者之套組，其中該第二免疫細胞表面受體分子為CD3。
實施例51. 如實施例44至50中任一者之套組，其中該第一核酸及該第二核酸藉由內部核糖體進入位點(IRES)或核糖體密碼子跳躍位點可操作地連接。
實施例52. 如實施例51之套組，其中該核糖體密碼子跳躍位點包含2A自裂解肽。
實例 實例 1 ： 在無基因編輯的情況下產生用於 T 細胞急性淋巴母細胞性白血病 (T-ALL) 之同種異體 CAR-T 細胞療法的 缺乏 T 細胞受體之 抗 CD7 CAR-T 細胞
CAR-T細胞療法徹底改變了B譜系ALL及其他B細胞惡性腫瘤之治療，但T細胞惡性腫瘤之細胞療法的發展卻滯後。在T-ALL中，CD7為極佳的CAR目標，因為其在白血病細胞中持續且高度表現，並且在化學療法期間及復發時保持著。然而，CD7亦在正常T細胞中表現，且抗CD7 CAR之表現觸發T細胞自相殘殺，導致活的及/或有效的CAR-T細胞顯著減少。吾人開發出一種自體抗CD7 CAR-T細胞產物(PCART7)，其利用CD7蛋白質表現阻斷劑(PEBL)來下調CD7表面表現且防止自相殘殺。PEBL由與細胞內滯留域融合之目標結合域組成，該細胞內滯留域使得表面蛋白質能夠在細胞內重定位(Png等人 Blood Adv 2017；Kamiya等人 Blood Adv 2018；Kamiya等人, JCI 2019)。缺乏CD7且表現抗CD7 CAR之自體T細胞可在cGMP條件下有效產生，且該技術正在臨床試驗中進行測試。
用於治療復發性/難治性T-ALL之自體CAR-T細胞之產生可能會因周邊血液中存在高百分比之白血病細胞及/或T細胞數目低而受到阻礙。「現成」可獲得的同種異體抗CD7 CAR-T細胞產物將代表一種減少白血病負荷之工具，作為移植或自體CAR-T細胞療法之橋樑。由於同種異體T細胞可在其T細胞受體(TCR)/CD3複合物與宿主組織接觸時經活化，因此其輸注具有引起移植物抗宿主疾病(GvHD)之風險。在此實例中，開發出了可有效下調表面TCR/CD3之CD3 PEBL。另外，亦開發出了一種基於慢病毒之方法，其允許同時表現此PEBL以及抗CD7 PEBL及抗CD7 CAR。表面CD7及TCR/CD3藉由PEBL滯留在細胞內，藉此最大限度地減少自相殘殺且消除TCR介導之抗原識別。
方法
同種異體PCART7 (allo-PCART7)細胞係由健康供體T細胞，藉由使用遞送抗CD7 PEBL及抗CD7 CAR之雙順反子慢病毒載體及遞送抗CD3 PEBL之第二慢病毒載體之雙重轉導製成。
圖 1展示同種異體PCART7-CD3PEBL或allo-PCART7細胞之組成。
將PBMC細胞解凍且回收。用TransAct及120 IU/ml IL-2活化T細胞。用慢病毒轉導經活化T細胞。第3天，移除LVV培養基(慢病毒培養基)且對細胞進行傳代。藉由使用來自Neon Transfection System之緩衝液T (Buffer T)進行T細胞之電穿孔。第15天，進行CD3耗盡以耗盡全細胞產物中之CD3+群體。細胞用CD3磁珠進行標記，隨後使用LD管柱藉由磁力分離進行分離。
TCR
反應性分析
進行此實驗以測試其中CD3藉由CD3 PEBL (例如OKT3 PEBL5)下調的PCART7細胞中TCR對TransAct之反應性。
對於TransAct刺激，對細胞進行計數且在24孔盤中用新鮮培養基以1×10
6個細胞/毫升進行接種。接著，將10 μl TransAct (10 μl/10
6個細胞)及120 IU/ml IL-2添加至各別孔中。將含有IL-2之培養基添加至未經處理之對照孔中。將細胞培育48小時且收集，並且染色以用於FACS分析。
慢性刺激分析
進行此分析以測定PCART7-CD3 PEBL細胞在用TransAct或經照射之CD3-KO Jurkat細胞重複刺激後之細胞表面CD3表現，以評估CD3 PEBL在滯留CD3方面之有效性。
第0天，對細胞進行計數，隨後接種於6孔盤中，每種條件2×10
6個細胞(5×10
5個細胞/毫升)。針對以下組，每3至4天刺激細胞且計數：
● 未經刺激。
● TransAct (10 μl/ml)。
● 1:1 E:T比率之經照射CD3-KO Jurkat細胞。
第21天，用CAR、CD3及CD25標記物對細胞進行染色以用於FACS分析。
細胞毒性分析
- Incucyte
進行此實驗以評估allo-PCART7細胞之細胞毒性功能。效應細胞及目標細胞在96孔平底盤中共培養。塗佈接種以下條件：僅目標細胞(Jurkat-GFP或Nalm-6 GFP)、效應細胞 + Jurkat GFP及效應細胞 + Nalm6-GFP。未經轉導之T細胞用作對照。
結果
如
圖 2中所展示，超過90%之allo-PCART7細胞具有所需CAR+CD7-CD3-表型。在耗盡殘餘CD3/TCRαβ+細胞之後，同種異體PCART7細胞純度＞99%。此等結果在多個供體中再現。此外，CD3 PEBL對表面TCR/CD3之有效下調與藉由TRAC之CRISPR基因剔除(PCART7-TRAC KO)達成的效果類似。
此外，
圖 3A 至圖 3C中之結果展示allo-PCART7之表型特徵。
圖 3A展示在製造開始後15天，藉由流式細胞分析技術所分析，經各別抗體染色之工程化T細胞具有所需表面表型。進行CD3耗盡，且此過程能夠藉由將CD3+細胞之百分比降低至小於0.1%來提高allo-PCART7之品質。
圖 3B上圖展示在收穫時，PCART7及allo-PCART7之CAR+細胞百分比在兩組之間類似。然而，如
圖 3B下圖中所描繪，藉由流式細胞分析技術所分析，與PCART7相比，allo-PCART7細胞為TCRαβ陰性及CD3陰性的。
圖 3C展示PCART7及allo-PCART7在整個15天製造過程中具有類似的擴增及細胞活力。
為了研究allo-PCART7是否可經由T細胞受體(TCR)/CD3複合物活化，用TransAct刺激細胞，TransAct為一種用於活化T細胞的與抗CD3及抗CD28抗體共價連接之聚合奈米基質。使用或不使用TransAct處理細胞72小時，隨後藉由流式細胞分析技術偵測CD25活化標記物。CD25為在諸如GvHD中之主動免疫反應期間活化之淋巴球的細胞表面標記物。
圖 4描繪同種異體PCART7對TransAct刺激沒有反應且不會上調CD25。此結果顯示同種異體PCART7細胞不能經由TCR刺激。
此外，
圖 5A 至圖 5C中之結果顯示allo-PCART7細胞具有有效的CD3下調。
圖 5A展示實驗時間表。簡言之，在21天之時間內每3至4天用目標細胞或TransAct (T細胞之CD3及CD28活化)刺激allo-PCART7細胞，以評估CD3 PEBL將CD3滯留在細胞內之長期有效性。
圖 5B展示在用CD3-KO Jurkat細胞刺激之前及之後allo-PCART7細胞均不表現CD3且區別於CD3陽性PCART7細胞(由實線指示)。在用CD3-KO Jurkat細胞刺激之後，allo-PCART7細胞及PCART7細胞之數目增加，但CD3含量保持不變，指示在allo-PCART7細胞中，CD3藉由CD3 PEBL有效地滯留在細胞內。實線指示CD3-KO Jurkat細胞與allo-PCART7細胞或PCART7細胞之共培養。虛線指示僅allo-PCART7細胞或僅PCART7細胞。
圖 5C展示在用TransAct刺激後第21天，CD25之表現量%在allo-PCART7細胞中保持不變，CD25為在諸如GvHD中之主動免疫反應期間活化之淋巴球的細胞表面標記物。另一方面，PCART7細胞在刺激之後顯示CD25表現%之大幅增加。
進行活體外細胞毒性實驗。簡言之，將未經轉導之T細胞、PCART7-CD3PEBL (allo-PCART7)或PCART7細胞與表現GFP之CD7+ Jurkat細胞(左側)或CD7陰性Nalm6細胞(右側)以1:1效應子:目標(E:T)比率共培養。使用IncuCyte®活細胞成像系統監測來自目標細胞之GFP強度。
圖 6描繪allo-PCART7細胞可在活體外有效且特異性地殺死T細胞急性淋巴母細胞性白血病(T-ALL)細胞。在此實驗中，藉由將allo-PCART7細胞與T-ALL細胞以1:1效應子:目標(E:T)比率共培養，在活體外評估allo-PCART7細胞之抗腫瘤潛力。CD7+及CD7陰性ALL細胞經工程化以表現綠色螢光蛋白，且使用IncuCyte®系統進行共培養實驗以即時觀測對目標細胞之影響。y軸上之值與孔中目標細胞之數目相關，且x軸為共培養時間。如左圖所展示，當單獨培養時，CD7+ T-ALL細胞(Jurkat-GFP)隨時間推移而擴增。然而，一旦此等細胞與PCART7細胞或allo-PCART7細胞共培養，CD7+目標細胞就會減少，達到不可偵測之水準。如右圖所展示，CD7陰性B細胞前驅細胞白血病細胞株(Nalm6-GFP)用作對照目標細胞。與工程化T細胞(PCART7細胞或allo-PCART7細胞)之共培養不影響CD7陰性細胞，指示此等工程化T細胞之非特異性殺傷作用極小。
總之，此研究證明瞭同時使用兩個PEBL進行細胞內蛋白質滯留而不擾亂關鍵CAR-T細胞功能的可行性。使用PEBL技術產生同種異體PCART7細胞無縫地符合cGMP製造方案，且避免因使用基因編輯技術而產生的遺傳毒性之風險。由於所產生之同種異體PCART7細胞具有高效力且沒有TCR反應性，因此其代表一種用於T-ALL及其他CD7+惡性腫瘤之現成CAR-T細胞療法的有吸引力的新工具。
實例 2 ： 缺乏細胞表面 CD7 及 T 細胞受體之 同種異體抗 CD7 CAR-T 細胞 (allo-PCART7) 發揮 有效的抗腫瘤功效但不具有異種反應性
在此實例中，在活體內進行allo-PCART7產物之驗證。
方法
NSG
小鼠中之
抗腫瘤功效驗證
進行此實驗以驗證allo-PCART7細胞在NSG小鼠中之抗腫瘤功效。
在第0天，向各NSG小鼠靜脈內注射1×10
6個表現螢火蟲螢光素酶及綠色螢光蛋白之CCRF-CEM白血病細胞。在第3天，各小鼠經腹膜內注射150 mg/kg D-螢光素以進行IVIS成像，隨後靜脈內輸注1×10
7個allo-PCART7細胞且腹膜內輸注20,000 IU IL-2。在第7天、第14天及第21天進行另外的IVIS成像。在第10天、第17天及第24天收集血液樣品。自第3天開始，一週三次輸注20,000 IU IL-2。
活體內異種反應性評估
(GvHD
活體內實驗
)
進行此實驗以評估allo-PCART7產物在NSG小鼠中之異種反應性。
在第-1天，對NSG小鼠進行2.5 Gy之γ照射。在第0天，靜脈內輸注allo-PCART7細胞且亦經腹膜內進行IL-2輸注。在第7天及實驗結束時，收集血液樣品。在第0天之後，一週三次進行體重量測及20,000 IU IL-2之腹膜內輸注直至實驗結束。
結果
為了測試allo-PCART7細胞之活體內功效，使用NSG腫瘤異種移植小鼠模型。使用實例1中所描述之方案產生同種異體PCART7-CD3PEBL細胞(缺乏CD7及TCR/CD3之抗CD7 CAR-T細胞)。簡言之，向NSG小鼠靜脈內注射1×10
6個表現螢火蟲螢光素酶及綠色螢光蛋白之CCRF-CEM白血病細胞。三天後，用PBS (媒劑)、未經轉導之T細胞、PCART7細胞或PCART7-CD3PEBL (allo-PCART7)細胞治療荷瘤小鼠。來自腫瘤細胞之生物冷光使用IVIS成像進行偵測。
如
圖 7中所展示，在使用CCRF-CEM T-ALL細胞株之異種移植模型中，同種異體PCART7細胞有效抑制腫瘤生長且提高存活率。
為了進一步確認此結果，進行類似實驗。簡言之，如
圖 8A中所展示，在第0天，經由靜脈內注射(i.v.)向NSG小鼠輸注1×10
6個CCRF-CEM Luc-GFP細胞(一種T-ALL細胞株)。在第5天，此等小鼠隨後經由靜脈內注射接受PBS (媒劑)、未經轉導之T細胞或allo-PCART7細胞。隨後藉由IVIS成像監測腫瘤生長。如
圖 8B中所展示，媒劑組及未經轉導之T細胞組中之小鼠在第21天具有高腫瘤負荷。然而，用allo-PCART7細胞治療之小鼠顯示出對腫瘤細胞之劑量依賴性抑制。總通量[p/s]隨時間變化之圖展示於各組下方，且顯示最高劑量治療產生最低腫瘤負荷。此等結果指示，allo-PCART7細胞有效殺死小鼠中之白血病細胞。
亦在NSG小鼠之GvHD小鼠模型中評估allo-PCART7細胞之異種反應性。在此實驗中，NSG小鼠用2.5 Gy照射且在照射之後一天靜脈內注射1 × 10
7個未經轉導之T細胞或allo-PCART7細胞(n=5只小鼠/組)。在注射之後，量測接受治療之小鼠的體重至少7週以監測GvHD。當連續兩次量測中平均體重減輕超過20%時，對小鼠實施安樂死。如
圖 9中所展示，在2個供體中，在移植同種異體PCART7-CD3PEBL細胞之小鼠組中未觀測到體重減輕超過20%，而在移植T細胞之小鼠組中觀測到超過20%之體重減輕。此類結果指示，與未經轉導之T細胞相比，同種異體TCR/CD3陰性PCART7-CD3PEBL細胞不引起GvHD。總體而言，此等結果表明，allo-PCART7細胞在殺死小鼠中之白血病細胞方面高度有效且不具有異種反應性。
實例 3 ： 產生具有殺傷基因之 Allo-PCART7 細胞 (Allo-PCART7
KG 細胞 )
為了在工程化免疫細胞(例如allo-PCART7細胞)提供另一安全機制，將殺傷基因或自殺基因併入工程化allo-PCART7細胞中。CD20為一種非免疫原性蛋白質，其具有作為選擇標記物及作為自殺基因之雙重功能。截短形式之CD20 (CD20t形式)可用作殺傷基因。在不良事件的情況下，可在注射或輸注至患者體內之後藉由投與靶向CD20之治療性單株抗體(例如利妥昔單抗)而使用此CD20t來消除allo-PCART7。在此實例中，具有殺傷基因之工程化allo-PCART7細胞被稱為「allo-PCART7
KG」細胞。抗CD20抗體(例如利妥昔單抗)與allo-PCART7
KG之結合觸發各種抗體依賴性效應機制，諸如補體依賴性細胞毒性，藉此特異性地消除allo-PCART7
KG細胞。
方法
allo-PCART7
KG細胞係由健康供體T細胞，藉由使用遞送抗CD7 PEBL及抗CD7 CAR之雙順反子慢病毒載體及遞送抗CD3 PEBL及殺傷基因之第二雙順反子慢病毒載體之雙重轉導製成。經截短CD20 (CD20t)用作此實驗中之殺傷基因。
圖 10展示使用健康供體T細胞之allo-PCART7
KG細胞之製造過程的流程。
圖 11描繪allo-PCART7
KG製造過程之詳細工作流程。簡言之，在第0天解凍自健康供體收集之冷凍PBMC或富集CD4+/CD8+之T細胞。在第1天，使用TransAct活化T細胞。在第2天，使用慢病毒載體對T細胞進行轉導以共轉導2個PEBL (CD3 PEBL及CD7 PEBL)、CD7 CAR及視情況存在之自殺基因。轉導後，在第3天至第13天活體外擴增細胞。在第13天與第15天之間，使用CD3微珠進行一次工程化T細胞之CD3耗盡。隨後將此等細胞冷凍保存作為最終細胞產物。在此實例中，對allo-PCART7進行轉導以表現用作自殺基因之CD20t。
結果
如
圖 12A中所展示，在製造開始後15天，用各別抗體對allo-PCART7
KG細胞進行染色，且藉由流式細胞分析技術所分析，該等細胞具有所需表面表型(CAR+/CD7-/CD3-/CD20+)。
圖 12B比較PCART7細胞與allo-PCART7細胞(PCART7
TCRneg)及allo-PCART7
KG細胞(PCART7
TCRnegKG)之細胞毒活性。此結果表明，PCART7細胞、allo-PCART7細胞(PCART7
TCRneg)及allo-PCART7
KG細胞(PCART7
TCRnegKG)在對CD7+細胞(Jurkat細胞)之殺死能力及靶向方面沒有差異，表明自殺基因(例如CD20t)不會影響allo-PCART7
KG細胞(PCART7
TCRnegKG)之功能。此等結果顯示allo-PCART7
KG細胞(PCART7
TCRnegKG)之所需表型及功能特徵。
此外，為了驗證殺傷基因之功能，進行補體依賴性細胞毒性(CDC)分析及抗體依賴性細胞毒性(ADCC)分析。如
圖 13A 至圖 13B中所展示，來自CDC分析及ADCC分析之結果顯示，表現CD20t之allo-PCART7
KG細胞由抗CD20單株抗體利妥昔單抗識別，分別引起補體級聯之啟動及效應細胞之識別，藉此特異性地消除allo-PCART7
KG細胞。利妥昔單抗之添加並未在不表現CD20t之allo-PCART7細胞中誘發細胞毒性。靶向HER2之單株抗體曲妥珠單抗用作陰性對照。總體而言，此等資料表明殺傷基因CD20t具有功能性且能夠特異性耗盡allo-PCART7
KG細胞。
實例 4 ：依序轉導 PCART7 及 CD3 PEBL 之作用
為了確定依序轉導產生allo-PCART7產物之可行性，在第1天用PCART7或CD3 PEBL轉導細胞，隨後在第6天用另一構築體轉導(
圖 14A)。藉由流式細胞分析技術評估CAR、CD3及CD7表現。
圖 14B展示，對於CD3 PEBL隨後PCART7之轉導，在收穫期間不存在活細胞，此可能係由於PCART7之低表現(例如，由於CD7 PEBL不足而沒有防止自相殘殺)。對於PCART7隨後CD3 PEBL之轉導，由於第二慢病毒載體轉導之轉導效率較低，觀測到CD3下調不佳。總體而言，此等資料表明CD3 PEBL及PCART7之依序轉導不產生具有所需表型(CAR+CD7-CD3-)之allo-PCART7細胞。
實例 5 ： OKT3 PEBL 及 UCHT1 PEBL 在 CD3 下調方面之比較
在此實驗中，用PCART7 (MOI 10)及OKT3 PEBL或UCHT1 PEBL (MOI 20)轉導T細胞。15天後藉由流式細胞分析技術檢查CAR、CD7及CD3表現。如
圖 15中所展示，UCHT1 PEBL顯示allo-PCART7細胞中之表面CD3之更大程度下調。
實例 6 ：製造 Allo-PCART7 細胞時 CD3 PEBL 之 MOI 最佳化
在T細胞活化之後，用PCART7及CD3 PEBL共轉導細胞，其中CD3 PEBL具有不同感染倍率(MOI)。MOI係指每個細胞之病毒粒子數目。MOI 5指示孔中每個細胞存在五個轉導單位。在慢病毒載體轉導之後，擴增細胞且在TCRαβ/CD3耗盡之前收穫(
圖 16A)。藉由流式細胞分析技術檢查CAR、CD7及CD3表現。CD3 PEBL對CD3存在MOI依賴性下調，因此增加MOI引起CD3之更大程度下調(
圖 16B)。PCART7與MOI大於5之CD3 PEBL之共轉導產生超過95%之CAR+CD7-CD3-細胞群體(
圖 16C)。另外，PCART7與MOI為5之CD3 PEBL之共轉導(10+5)顯示出穩健的細胞擴增。此等資料證明，MOI為5或更大的CD3 PEBL引起CD3之充分下調。
實例 7 ： 鑑別用於 CD3 滯留之 CD3 PEBL:PCART7 之最小載體拷貝數比率
在此實驗中，CD3 PEBL MOI在各種條件下變化，以確定穩定CD3滯留之最小VCN比率。用PCART7 (MOI 10)及MOI為5、10、20、30、40或50之CD3 PEBL (UCHT1)轉導T細胞(參見
圖 17A中之表)。在轉導之後，細胞在製造第15天經歷CD3耗盡。將CD3耗盡之樣品培養14天，在此期間藉由流式細胞分析技術來量測CD3表現(
圖 17A)。亦檢查CD3耗盡之樣品的載體拷貝數定量。
來自流式細胞分析技術之結果在
圖 17B中定量，其中CD3陰性細胞之百分比相對於CD3 PEBL/PCART7 VCN比率繪製。確定大約2之CD3 PEBL/PCART7 VCN比率足以引起穩定的CD3滯留(亦即，在第14天維持超過95%之CD3陰性細胞)。
實例 8 ：殺傷基因及 CD3 PEBL 載體構築體之最佳化
此實驗比較三種構築體之CD3及CD20表現(
圖 18A)：不具有殺傷基因(KG)序列之CD3 PEBL、具有KG(P2A)之CD3 PEBL (CD20t-P2A-UCHT1 PEBL)及具有KG(IRES)之CD3 PEBL (UCHT1 PEBL-IRES-CD20t)。用PCART7及僅CD3 PEBL構築體或KG-CD3 PEBL構築體共轉導T細胞。在製造第15天藉由流式細胞分析技術評估CD3及CD20表現(
圖 18B)。
當與PCART7共轉導時，KG(P2A)構築體(Allo-PCART7
KG(P2A))表現出優於KG(IRES) (Allo-PCART7
KG(IRES))之效能。KG(P2A)表現出更高的CD20表現及更大程度的CD3下調。CD20t在UCHT1 PEBL之前的第一個位置允許使用P2A而非IRES。KG(P2A)構築體提供更佳轉導及更高的CD20t表現。
實例 9 ：製造 Allo-PCART7
KG 細胞時殺傷基因 - CD3 PEBL 之 MOI 最佳化
用PCART7慢病毒載體(MOI 10)及CD3 PEBL (UCHT1)共轉導T細胞。CD3 PEBL以40、50、60或80之不同MOI轉導。在製造15天之後，藉由流式細胞分析技術分析CD7及CD3表現(
圖 19A)。在另一個實驗中，用PCART7慢病毒載體(MOI 10)及具有殺傷基因之CD3 PEBL (UCHT1) (KG-CD3 PEBL)共轉導T細胞。KG-CD3 PEBL以20、40及80之不同MOI轉導。藉由流式細胞分析技術分析CAR及CD3表現(
圖 19B)。MOI 10之PCART7及MOI 40之KG-CD3 PEBL顯示為用於共轉導之最佳比率。該比率對CAR表現及CD3下調有效。
實例 10 ： CD20 富集對 allo-PCART7
KG 表型之影響
Allo-PCART7
KG(P2A)細胞在存在或不存在先前CD20富集步驟的情況下經歷CD3耗盡。在細胞製造之後，藉由流式細胞分析技術分析CD3及CD20表現且定量CD20中值螢光強度(MFI)。在耗盡後第0天，經歷CD20富集之細胞顯示更高CD20表現(
圖 20A)。在細胞製造過程中添加CD20富集步驟藉由回收CD20高表現細胞而改良細胞表型及同質性。與僅經歷CD3耗盡之細胞相比，在CD3耗盡之前經歷CD20富集步驟之Allo-PCART7
KG(P2A)細胞具有更高的CD20 MFI及更窄的CD20表現分佈(
圖 20B)。
實例 11 ： CD20 富集之 allo-PCART7
KG 細胞之功能評估
用PCART7及CD3 PEBL KG(P2A)構築體共轉導T細胞。在細胞擴增之後，富集CD20，耗盡TCR/CD3，且對細胞進行功能評估。
使用補體依賴性細胞毒性(CDC)分析來評估細胞毒性。用曲妥珠單抗或利妥昔單抗處理未經轉導之對照T細胞及CD20富集之allo-PCART7
KG(P2A)細胞(
圖 21A 至圖 21B)。CD20富集之細胞被利妥昔單抗有效消除，但未被曲妥珠單抗消除，而未經轉導之T細胞則未被兩者殺死。亦在存在及不存在CD20富集之allo-PCART7
KG(P2A)細胞中監測耗盡後14天之CD3滯留。藉由流式細胞分析技術檢查CD20及CD3表現(
圖 21C)。在不存在CD20富集之allo-PCART7
KG(P2A)細胞中，耗盡後14天出現CD3陽性群體(
圖 21C，參見左側細胞分析圖)。CD20富集增強CD3滯留，且藉由選擇CD20高(因此CD3 PEBL高)表現細胞而克服CD3之出現。CD20富集之allo-PCART7
KG(P2A)細胞在耗盡後14天表現出良好的CD3滯留(亦即，超過95% CD3陰性)。此與不具有殺傷基因之allo-PCART7細胞相當。
使用IncuCyte®活細胞分析系統來評估allo-PCART7及CD20富集之allo-PCART7
KG(P2A)細胞對表現GFP之CD7+及CD7-白血病細胞的細胞毒活性。CD20富集之allo-PCART7
KG(P2A)細胞表現出與未經歷CD20富集之allo-PCART7
KG(P2A)細胞相當的殺傷功效(
圖 21D 至圖 20F)。僅針對CD7+細胞發現細胞毒活性(參見
圖 21D 至圖 21E)。在allo-PCART7
KG(P2A)細胞之產生中併入CD20富集的實驗程序可見於
圖 21G中。
本文所引用之所有專利、公開申請案及參考文獻之教示均以全文引用之方式併入。
雖然本發明已參考其實例實施例特定展示及描述，但熟習此項技術者應理解，可在不脫離隨附申請專利範圍所涵蓋之本發明之範疇的情況下在其中進行形式及細節之各種改變。
附錄 A 表 13 ：例示性核苷酸序列
表 14 ： 抗 CD7 PEBL 及抗 CD7 CAR 之 例示性胺基酸序列
| SEQ ID NO. | 名稱 | 序列 |
| 1 | CPPT-CMV-MCS-PGK-GFP-WPRE | ATCGATTTTAAAAGAAAAGGGGGGATTGGGGGGTACAGTGCAGGGGAAAGAATAGTAGACATAATAGCAACAGACATACAAACTAAAGAATTACAAAAACAAATTACAAAAATTCAAAATTTTCGGGTTTATTAATTAACAGGGACATGCAGAGATCCAGTTTAAGCTTGGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTCGTTTAGTGAACCGTCAGATCGCCTGGAGACGCCATCCACGCTGTTTTGACCTCCATAGAAGACACCGACTCTACTAGAGGATCGCTAGCGCTACCGGACTCAGATCGAATTCCTCAAGCTTCCTCGAGTGCAGTCGACGCGGGCCCGGGATCCCGCGACTCTAGATAATTCTACCGGGTAGGGGAGGCGCTTTTCCCAAGGCAGTCTGGAGCATGCGCTTTAGCAGCCCCGCTGGGCACTTGGCGCTACACAAGTGGCCTCTGGCCTCGCACACATTCCACATCCACCGGTAGGCGCCAACCGGCTCCGTTCTTTGGTGGCCCCTTCGCGCCACCTTCTACTCCTCCCCTAGTCAGGAAGTTCCCCCCCGCCCCGCAGCTCGCGTCGTGCAGGACGTGACAAATGGAAGTAGCACGTCTCACTAGTCTCGTGCAGATGGACAGCACCGCTGAGCAATGGAAGCGGGTAGGCCTTTGGGGCAGCGGCCAATAGCAGCTTTGCTCCTTCGCTTTCTGGGCTCAGAGGCTGGGAAGGGGTGGGTCCGGGGGCGGGCTCAGGGGCGGGCTCAGGGGCGGGGCGGGCGCCCGAAGGTCCTCCGGAGGCCCGGCATTCTGCACGCTTCAAAAGCGCACGTCTGCCGCGCTGTTCTCCTCTTCCTCATCTCCGGGCCTTTCGACTGGCCACCGGCTTCCACCATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGACGTAAACGGCCACAAGTTCAGCGTGTCCGGCGAGGGCGAGGGCGATGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACCCTCGTGACCACCCTGACCTACGGCGTGCAGTGCTTCAGCCGCTACCCCGACCACATGAAGCAGCACGACTTCTTCAAGTCCGCCATGCCCGAAGGCTACGTCCAGGAGCGCACCATCTTCTTCAAGGACGACGGCAACTACAAGACCCGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTGGTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGCATCGACTTCAAGGAGGACGGCAACATCCTGGGGCACAAGCTGGAGTACAACTACAACAGCCACAACGTCTATATCATGGCCGACAAGCAGAAGAACGGCATCAAGGTGAACTTCAAGATCCGCCACAACATCGAGGACGGCAGCGTGCAGCTCGCCGACCACTACCAGCAGAACACCCCCATCGGCGACGGCCCCGTGCTGCTGCCCGACAACCACTACCTGAGCACCCAGTCCGCCCTGAGCAAAGACCCCAACGAGAAGCGCGATCACATGGTCCTGCTGGAGTTCGTGACCGCCGCCGGGATCACTCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAGTAACGCGTCTGGAACAATCAACCTCTGGATTACAAAATTTGTGAAAGATTGACTGGTATTCTTAACTATGTTGCTCCTTTTACGCTATGTGGATACGCTGCTTTAATGCCTTTGTATCATGCTATTGCTTCCCGTATGGCTTTCATTTTCTCCTCCTTGTATAAATCCTGGTTGCTGTCTCTTTATGAGGAGTTGTGGCCCGTTGTCAGGCAACGTGGCGTGGTGTGCACTGTGTTTGCTGACGCAACCCCCACTGGTTGGGGCATTGCCACCACCTGTCAGCTCCTTTCCGGGACTTTCGCTTTCCCCCTCCCTATTGCCACGGCGGAACTCATCGCCGCCTGCCTTGCCCGCTGCTGGACAGGGGCTCGGCTGTTGGGCACTGACAATTCCGTGGTGTTGTCGGGGAAGCTGACGTCCTTTCCATGGCTGCTCGCCTGTGTTGCCACCTGGATTCTGCGCGGGACGTCCTTCTGCTACGTCCCTTCGGCCCTCAATCCAGCGGACCTTCCTTCCCGCGGCCTGCTGCCGGCTCTGCGGCCTCTTCCGCGTCTTCGCCTTCGCCCTCAGACGAGTCGGATCTCCCTTTGGGCCGCCTCCCCGCCTGG |
| 2 | 抗人類CD7 (TH69) PEBL | ATGGCTCTGCCTGTGACCGCACTGCTGCTGCCCCTGGCTCTGCTGCTGCACGCCGCAAGACCTGCCGCATACAAGGATATTCAGATGACTCAGACCACAAGCTCCCTGAGCGCCTCCCTGGGAGACCGAGTGACAATCTCTTGCAGTGCATCACAGGGAATTAGCAACTACCTGAATTGGTATCAGCAGAAGCCAGATGGCACTGTGAAACTGCTGATCTACTATACCTCTAGTCTGCACAGTGGGGTCCCCTCACGATTCAGCGGATCCGGCTCTGGGACAGACTACAGCCTGACTATCTCCAACCTGGAGCCCGAAGATATTGCCACCTACTATTGCCAGCAGTACTCCAAGCTGCCTTATACCTTTGGCGGGGGAACAAAGCTGGAGATTAAAAGGGGAGGAGGAGGAAGCGGAGGAGGAGGATCCGGAGGCGGGGGATCTGGAGGAGGAGGAAGTGAGGTGCAGCTGGTCGAATCTGGAGGAGGACTGGTGAAGCCAGGAGGATCTCTGAAACTGAGTTGTGCCGCTTCAGGCCTGACCTTCTCAAGCTACGCCATGAGCTGGGTGCGACAGACACCTGAGAAGCGGCTGGAATGGGTCGCTAGCATCTCCTCTGGCGGGTTCACATACTATCCAGACTCCGTGAAAGGCAGATTTACTATCTCTCGGGATAACGCAAGAAATATTCTGTACCTGCAGATGAGTTCACTGAGGAGCGAGGACACCGCAATGTACTATTGTGCCAGGGACGAAGTGCGCGGCTATCTGGATGTCTGGGGAGCTGGCACTACCGTCACCGTCTCCAGCGAGCAGAAACTGATTAGCGAAGAGGACCTGAAAGATGAACTGTAA |
| 3 | 抗人類CD7 (3A1F) PEBL | ATGGCTCTGCCCGTCACCGCTCTGCTGCTGCCTCTGGCTCTGCTGCTGCACGCCGCAAGACCCCAGGTCCAGCTGCAGGAGTCAGGGGCAGAGCTGGTGAAACCCGGAGCCAGTGTCAAACTGTCCTGTAAGGCCAGCGGCTATACTTTCACCAGCTACTGGATGCACTGGGTGAAACAGAGGCCAGGACAGGGCCTGGAGTGGATCGGCAAGATTAACCCCAGCAATGGGCGCACCAACTACAACGAAAAGTTTAAATCCAAGGCTACACTGACTGTGGACAAGAGCTCCTCTACCGCATACATGCAGCTGAGTTCACTGACATCTGAAGATAGTGCCGTGTACTATTGCGCCAGAGGCGGGGTCTACTATGACCTGTACTATTACGCACTGGATTATTGGGGGCAGGGAACCACAGTGACTGTCAGCTCCGGAGGAGGAGGATCCGGCGGAGGAGGCTCTGGGGGAGGCGGGAGTGACATCGAGCTGACACAGTCTCCAGCCACTCTGAGCGTGACCCCTGGCGATTCTGTCAGTCTGTCATGTAGAGCTAGCCAGTCCATCTCTAACAATCTGCACTGGTACCAGCAGAAATCACATGAAAGCCCTCGGCTGCTGATTAAGAGTGCTTCACAGAGCATCTCCGGGATTCCAAGCAGATTCTCTGGCAGTGGGTCAGGAACCGACTTTACACTGTCCATTAACTCTGTGGAGACCGAAGATTTCGGCATGTATTTTTGCCAGCAGAGCAATTCCTGGCCTTACACATTCGGAGGCGGGACTAAACTGGAGATTAAGAGGGAGCAGAAACTGATTAGCGAAGAGGACCTGAAGGACGAACTGTGA |
| 4 | 抗人類CD7 (TH69) CAR | ATGGCTCTGCCTGTGACTGCCCTGCTGCTGCCCCTGGCCCTGCTGCTGCACGCTGCTAGACCCGCCGCATACAAGGACATTCAGATGACTCAGACTACATCCAGCCTGTCAGCTTCCCTGGGCGATCGAGTGACTATCAGCTGTTCAGCAAGCCAGGGGATCAGCAATTACCTGAACTGGTACCAGCAGAAGCCCGACGGAACTGTCAAGCTGCTGATCTACTATACTTCCAGTCTGCATAGCGGGGTCCCTAGCCGATTCTCTGGGAGTGGAAGCGGCACCGACTATAGCCTGACCATTTCCAACCTGGAACCAGAGGACATTGCCACCTATTACTGTCAGCAGTATTCAAAGCTGCCCTATACCTTTGGCGGAGGGACTAAGCTGGAGATCAAGCGAGGAGGGGGAGGATCAGGGGGAGGGGGGAGCGGAGGCGGGGGGAGTGGCGGCGGAGGGTCAGAAGTCCAGCTGGTCGAGAGTGGGGGCGGACTGGTGAAACCTGGGGGCTCTCTGAAACTGAGCTGTGCAGCCAGTGGCCTGACATTCTCCTCATATGCTATGTCTTGGGTGCGGCAGACCCCAGAAAAGAGACTGGAGTGGGTGGCTTCAATCTCTTCCGGGGGCTTCACTTACTATCCTGACAGCGTGAAAGGCAGATTCACTATCTCCAGGGATAACGCACGGAATATCCTGTATCTGCAGATGAGCTCACTGAGATCCGAGGACACCGCAATGTACTACTGCGCAAGAGACGAAGTGCGGGGGTATCTGGACGTGTGGGGAGCAGGCACTACCGTCACCGTGTCTAGCACCACTACACCTGCACCAAGGCCTCCCACACCCGCTCCCACTATCGCTTCCCAGCCACTGTCCCTGAGGCCCGAGGCCTGCAGGCCAGCAGCTGGCGGAGCCGTGCATACTAGGGGGCTGGACTTCGCTTGCGACATCTACATCTGGGCCCCACTGGCAGGGACATGCGGAGTCCTGCTGCTGTCCCTGGTCATCACACTGTACTGCAAGCGGGGGCGCAAAAAACTGCTGTATATCTTTAAGCAGCCTTTCATGAGACCAGTGCAGACAACCCAGGAGGAAGATGGGTGCTCATGCCGGTTTCCCGAGGAGGAGGAAGGCGGCTGCGAGCTGAGGGTGAAGTTTTCCCGCTCAGCAGATGCTCCTGCCTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTGTATAATGAGCTGAACCTGGGCAGACGCGAAGAGTATGATGTGCTGGACAAAAGGCGGGGAAGAGACCCCGAAATGGGAGGGAAGCCAAGGCGGAAAAACCCCCAGGAGGGCCTGTACAATGAGCTGCAGAAGGACAAAATGGCAGAGGCTTACAGTGAGATTGGGATGAAGGGAGAGAGACGGAGGGGAAAAGGGCACGATGGCCTGTACCAGGGGCTGAGCACAGCAACCAAAGATACTTATGACGCACTGCACATGCAGGCACTGCCACCCAGATGA |
| 5 | 抗人類CD7 (3A1F) CAR | ATGGCTCTGCCCGTCACCGCTCTGCTGCTGCCTCTGGCTCTGCTGCTGCACGCTGCTCGACCACAGGTCCAGCTGCAGGAGTCAGGAGCTGAGCTGGTGAAGCCAGGGGCAAGCGTCAAACTGTCCTGCAAGGCCTCTGGATATACATTCACTAGCTACTGGATGCACTGGGTGAAACAGAGACCCGGACAGGGCCTGGAGTGGATCGGAAAGATTAACCCTAGCAATGGCAGGACCAACTACAACGAAAAGTTTAAATCCAAGGCAACCCTGACAGTGGACAAGAGCTCCTCTACAGCCTACATGCAGCTGAGTTCACTGACTTCAGAGGATAGCGCAGTGTACTATTGCGCCAGAGGCGGGGTCTACTATGACCTGTACTATTACGCCCTGGATTATTGGGGGCAGGGAACCACAGTGACTGTCAGCTCCGGAGGAGGAGGAAGCGGAGGAGGAGGATCCGGAGGAGGAGGATCTGACATCGAGCTGACCCAGAGTCCTGCTACACTGAGCGTGACTCCAGGCGATTCTGTCAGTCTGTCATGTCGGGCAAGCCAGTCCATCTCTAACAATCTGCACTGGTACCAGCAGAAATCCCATGAATCTCCACGACTGCTGATTAAGAGTGCCTCACAGAGCATCTCCGGCATTCCCTCCCGGTTCTCTGGCAGTGGGTCAGGAACTGACTTTACCCTGAGTATTAACTCAGTGGAGACAGAAGATTTCGGCATGTATTTTTGCCAGCAGAGCAATTCCTGGCCCTACACTTTCGGAGGCGGGACCAAACTGGAGATCAAGCGGACTACCACACCAGCTCCAAGACCACCTACCCCTGCACCAACAATTGCTAGTCAGCCACTGTCACTGAGACCAGAAGCATGTAGGCCTGCAGCTGGAGGAGCTGTGCACACCAGAGGCCTGGACTTTGCCTGCGATATCTACATTTGGGCTCCTCTGGCAGGAACCTGTGGCGTGCTGCTGCTGTCTCTGGTCATCACACTGTATTGCAAACGAGGGCGGAAGAAACTGCTGTACATTTTCAAGCAGCCCTTTATGAGGCCTGTGCAGACTACCCAGGAGGAAGACGGCTGCAGCTGTCGCTTCCCTGAGGAAGAGGAAGGGGGATGTGAGCTGCGCGTCAAATTTTCTCGAAGTGCAGATGCCCCAGCTTATCAGCAGGGCCAGAACCAGCTGTACAACGAGCTGAATCTGGGGCGGAGAGAGGAATATGACGTGCTGGATAAGAGGCGAGGAAGGGACCCAGAAATGGGAGGGAAACCACGACGGAAGAACCCCCAGGAGGGCCTGTATAATGAACTGCAGAAAGACAAGATGGCAGAGGCCTACTCTGAAATCGGGATGAAAGGAGAGAGAAGGCGCGGCAAGGGGCATGATGGCCTGTACCAGGGGCTGAGCACAGCAACCAAAGACACCTATGACGCACTGCACATGCAGGCACTGCCACCACGGTAATGA |
| 6 | CMV啟動子 | AAGCTTGGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGT |
| 7 | EF1α 啟動子 | GGCTCCGGTGCCCGTCAGTGGGCAGAGCGCACATCGCCCACAGTCCCCGAGAAGTTGGGGGGAGGGGTCGGCAATTGAACCGGTGCCTAGAGAAGGTGGCGCGGGGTAAACTGGGAAAGTGATGTCGTGTACTGGCTCCGCCTTTTTCCCGAGGGTGGGGGAGAACCGTATATAAGTGCAGTAGTCGCCGTGAACGTTCTTTTTCGCAACGGGTTTGCCGCCAGAACACAGGTAAGTGCCGTGTGTGGTTCCCGCGGGCCTGGCCTCTTTACGGGTTATGGCCCTTGCGTGCCTTGAATTACTTCCACCTGGCTGCAGTACGTGATTCTTGATCCCGAGCTTCGGGTTGGAAGTGGGTGGGAGAGTTCGAGGCCTTGCGCTTAAGGAGCCCCTTCGCCTCGTGCTTGAGTTGAGGCCTGGCCTGGGCGCTGGGGCCGCCGCGTGCGAATCTGGTGGCACCTTCGCGCCTGTCTCGCTGCTTTCGATAAGTCTCTAGCCATTTAAAATTTTTGATGACCTGCTGCGACGCTTTTTTTCTGGCAAGATAGTCTTGTAAATGCGGGCCAAGATCTGCACACTGGTATTTCGGTTTTTGGGGCCGCGGGCGGCGACGGGGCCCGTGCGTCCCAGCGCACATGTTCGGCGAGGCGGGGCCTGCGAGCGCGGCCACCGAGAATCGGACGGGGGTAGTCTCAAGCTGGCCGGCCTGCTCTGGTGCCTGGCCTCGCGCCGCCGTGTATCGCCCCGCCCTGGGCGGCAAGGCTGGCCCGGTCGGCACCAGTTGCGTGAGCGGAAAGATGGCCGCTTCCCGGCCCTGCTGCAGGGAGCTCAAAATGGAGGACGCGGCGCTCGGGAGAGCGGGCGGGTGAGTCACCCACACAAAGGAAAAGGGCCTTTCCGTCCTCAGCCGTCGCTTCATGTGACTCCACGGAGTACCGGGCGCCGTCCAGGCACCTCGATTAGTTCTCGAGCTTTTGGAGTACGTCGTCTTTAGGTTGGGGGGAGGGGTTTTATGCGATGGAGTTTCCCCACACTGAGTGGGTGGAGACTGAAGTTAGGCCAGCTTGGCACTTGATGTAATTCTCCTTGGAATTTGCCCTTTTTGAGTTTGGATCTTGGTTCATTCTCAAGCCTCAGACAGTGGTTCAAAGTTTTTTTCTTCCATTTCAGGTGTCGTGA |
| 8 | EFS啟動子 | ATTCTACCGGGTAGGGGAGGCGCTTTTCCCAAGGCAGTCTGGAGCATGCGCTTTAGCAGCCCCGCTGGGCACTTGGCGCTACACAAGTGGCCTCTGGCCTCGCACACATTCCACATCCACCGGTAGGCGCCAACCGGCTCCGTTCTTTGGTGGCCCCTTCGCGCCACCTTCTACTCCTCCCCTAGTCAGGAAGTTCCCCCCCGCCCCGCAGCTCGCGTCGTGCAGGACGTGACAAATGGAAGTAGCACGTCTCACTAGTCTCGTGCAGATGGACAGCACCGCTGAGCAATGGAAGCGGGTAGGCCTTTGGGGCAGCGGCCAATAGCAGCTTTGCTCCTTCGCTTTCTGGGCTCAGAGGCTGGGAAGGGGTGGGTCCGGGGGCGGGCTCAGGGGCGGGCTCAGGGGCGGGGCGGGCGCCCGAAGGTCCTCCGGAGGCCCGGCATTCTGCACGCTTCAAAAGCGCACGTCTGCCGCGCTGTTCTCCTCTTCCTCATCTCCGGGCCTTTCGA |
| 9 | MSCV啟動子 | GGAATGAAAGACCCCACCTGTAGGTTTGGCAAGCTAGCTTAAGTAACGCCATTTTGCAAGGCATGGAAAATACATAACTGAGAATAGAGAAGTTCAGATCAAGGTTAGGAACAGAGAGACAGCAGAATATGGGCCAAACAGGATATCTGTGGTAAGCAGTTCCTGCCCCGGCTCAGGGCCAAGAACAGATGGTCCCCAGATGCGGTCCCGCCCTCAGCAGTTTCTAGAGAACCATCAGATGTTTCCAGGGTGCCCCAAGGACCTGAAATGACCCTGTGCCTTATTTGAACTAACCAATCAGTTCGCTTCTCGCTTCTGTTCGCGCGCTTCTGCTCCCCGAGCTCAATAAAAGAGCCCACAACCCCTCACTCGGCGCGCCAGTCC |
| 10 | PGK啟動子 | ATTCTACCGGGTAGGGGAGGCGCTTTTCCCAAGGCAGTCTGGAGCATGCGCTTTAGCAGCCCCGCTGGGCACTTGGCGCTACACAAGTGGCCTCTGGCCTCGCACACATTCCACATCCACCGGTAGGCGCCAACCGGCTCCGTTCTTTGGTGGCCCCTTCGCGCCACCTTCTACTCCTCCCCTAGTCAGGAAGTTCCCCCCCGCCCCGCAGCTCGCGTCGTGCAGGACGTGACAAATGGAAGTAGCACGTCTCACTAGTCTCGTGCAGATGGACAGCACCGCTGAGCAATGGAAGCGGGTAGGCCTTTGGGGCAGCGGCCAATAGCAGCTTTGCTCCTTCGCTTTCTGGGCTCAGAGGCTGGGAAGGGGTGGGTCCGGGGGCGGGCTCAGGGGCGGGCTCAGGGGCGGGGCGGGCGCCCGAAGGTCCTCCGGAGGCCCGGCATTCTGCACGCTTCAAAAGCGCACGTCTGCCGCGCTGTTCTCCTCTTCCTCATCTCCGGGCCTTTCGA |
| 11 | 抗人類CD7 (TH69) PEBL-IRES-抗人類CD7 (TH69) CAR | ATGGCTCTGCCTGTGACCGCACTGCTGCTGCCCCTGGCTCTGCTGCTGCACGCCGCAAGACCTGCCGCATACAAGGATATTCAGATGACTCAGACCACAAGCTCCCTGAGCGCCTCCCTGGGAGACCGAGTGACAATCTCTTGCAGTGCATCACAGGGAATTAGCAACTACCTGAATTGGTATCAGCAGAAGCCAGATGGCACTGTGAAACTGCTGATCTACTATACCTCTAGTCTGCACAGTGGGGTCCCCTCACGATTCAGCGGATCCGGCTCTGGGACAGACTACAGCCTGACTATCTCCAACCTGGAGCCCGAAGATATTGCCACCTACTATTGCCAGCAGTACTCCAAGCTGCCTTATACCTTTGGCGGGGGAACAAAGCTGGAGATTAAAAGGGGAGGAGGAGGAAGCGGAGGAGGAGGATCCGGAGGCGGGGGATCTGGAGGAGGAGGAAGTGAGGTGCAGCTGGTCGAATCTGGAGGAGGACTGGTGAAGCCAGGAGGATCTCTGAAACTGAGTTGTGCCGCTTCAGGCCTGACCTTCTCAAGCTACGCCATGAGCTGGGTGCGACAGACACCTGAGAAGCGGCTGGAATGGGTCGCTAGCATCTCCTCTGGCGGGTTCACATACTATCCAGACTCCGTGAAAGGCAGATTTACTATCTCTCGGGATAACGCAAGAAATATTCTGTACCTGCAGATGAGTTCACTGAGGAGCGAGGACACCGCAATGTACTATTGTGCCAGGGACGAAGTGCGCGGCTATCTGGATGTCTGGGGAGCTGGCACTACCGTCACCGTCTCCAGCGAGCAGAAACTGATTAGCGAAGAGGACCTGAAAGATGAACTGTAACGGGATCAATTCCGCCCCCCCCCTAACGTTACTGGCCGAAGCCGCTTGGAATAAGGCCGGTGTGCGTTTGTCTATATGTTATTTTCCACCATATTGCCGTCTTTTGGCAATGTGAGGGCCCGGAAACCTGGCCCTGTCTTCTTGACGAGCATTCCTAGGGGTCTTTCCCCTCTCGCCAAAGGAATGCAAGGTCTGTTGAATGTCGTGAAGGAAGCAGTTCCTCTGGAAGCTTCTTGAAGACAAACAACGTCTGTAGCGACCCTTTGCAGGCAGCGGAACCCCCCACCTGGCGACAGGTGCCTCTGCGGCCAAAAGCCACGTGTATAAGATACACCTGCAAAGGCGGCACAACCCCAGTGCCACGTTGTGAGTTGGATAGTTGTGGAAAGAGTCAAATGGCTCTCCTCAAGCGTATTCAACAAGGGGCTGAAGGATGCCCAGAAGGTACCCCATTGTATGGGATCTGATCTGGGGCCTCGGTGCACATGCTTTACATGTGTTTAGTCGAGGTTAAAAAAACGTCTAGGCCCCCCGAACCACGGGGACGTGGTTTTCCTTTGAAAAACACGATAATACCATGGCTCTGCCTGTGACTGCCCTGCTGCTGCCCCTGGCCCTGCTGCTGCACGCTGCTAGACCCGCCGCATACAAGGACATTCAGATGACTCAGACTACATCCAGCCTGTCAGCTTCCCTGGGCGATCGAGTGACTATCAGCTGTTCAGCAAGCCAGGGGATCAGCAATTACCTGAACTGGTACCAGCAGAAGCCCGACGGAACTGTCAAGCTGCTGATCTACTATACTTCCAGTCTGCATAGCGGGGTCCCTAGCCGATTCTCTGGGAGTGGAAGCGGCACCGACTATAGCCTGACCATTTCCAACCTGGAACCAGAGGACATTGCCACCTATTACTGTCAGCAGTATTCAAAGCTGCCCTATACCTTTGGCGGAGGGACTAAGCTGGAGATCAAGCGAGGAGGGGGAGGATCAGGGGGAGGGGGGAGCGGAGGCGGGGGGAGTGGCGGCGGAGGGTCAGAAGTCCAGCTGGTCGAGAGTGGGGGCGGACTGGTGAAACCTGGGGGCTCTCTGAAACTGAGCTGTGCAGCCAGTGGCCTGACATTCTCCTCATATGCTATGTCTTGGGTGCGGCAGACCCCAGAAAAGAGACTGGAGTGGGTGGCTTCAATCTCTTCCGGGGGCTTCACTTACTATCCTGACAGCGTGAAAGGCAGATTCACTATCTCCAGGGATAACGCACGGAATATCCTGTATCTGCAGATGAGCTCACTGAGATCCGAGGACACCGCAATGTACTACTGCGCAAGAGACGAAGTGCGGGGGTATCTGGACGTGTGGGGAGCAGGCACTACCGTCACCGTGTCTAGCACCACTACACCTGCACCAAGGCCTCCCACACCCGCTCCCACTATCGCTTCCCAGCCACTGTCCCTGAGGCCCGAGGCCTGCAGGCCAGCAGCTGGCGGAGCCGTGCATACTAGGGGGCTGGACTTCGCTTGCGACATCTACATCTGGGCCCCACTGGCAGGGACATGCGGAGTCCTGCTGCTGTCCCTGGTCATCACACTGTACTGCAAGCGGGGGCGCAAAAAACTGCTGTATATCTTTAAGCAGCCTTTCATGAGACCAGTGCAGACAACCCAGGAGGAAGATGGGTGCTCATGCCGGTTTCCCGAGGAGGAGGAAGGCGGCTGCGAGCTGAGGGTGAAGTTTTCCCGCTCAGCAGATGCTCCTGCCTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTGTATAATGAGCTGAACCTGGGCAGACGCGAAGAGTATGATGTGCTGGACAAAAGGCGGGGAAGAGACCCCGAAATGGGAGGGAAGCCAAGGCGGAAAAACCCCCAGGAGGGCCTGTACAATGAGCTGCAGAAGGACAAAATGGCAGAGGCTTACAGTGAGATTGGGATGAAGGGAGAGAGACGGAGGGGAAAAGGGCACGATGGCCTGTACCAGGGGCTGAGCACAGCAACCAAAGATACTTATGACGCACTGCACATGCAGGCACTGCCACCCAGATGACAGCCAGGGGATTTCACCACTCAAAGGCCAGACCTGCAGACGCCCAGATTATGAGACACA |
| 12 | 抗人類CD7 (TH69) CAR-IRES-抗人類CD7 (TH69) PEBL | ATGGCTCTGCCTGTGACTGCCCTGCTGCTGCCCCTGGCCCTGCTGCTGCACGCTGCTAGACCCGCCGCATACAAGGACATTCAGATGACTCAGACTACATCCAGCCTGTCAGCTTCCCTGGGCGATCGAGTGACTATCAGCTGTTCAGCAAGCCAGGGGATCAGCAATTACCTGAACTGGTACCAGCAGAAGCCCGACGGAACTGTCAAGCTGCTGATCTACTATACTTCCAGTCTGCATAGCGGGGTCCCTAGCCGATTCTCTGGGAGTGGAAGCGGCACCGACTATAGCCTGACCATTTCCAACCTGGAACCAGAGGACATTGCCACCTATTACTGTCAGCAGTATTCAAAGCTGCCCTATACCTTTGGCGGAGGGACTAAGCTGGAGATCAAGCGAGGAGGGGGAGGATCAGGGGGAGGGGGGAGCGGAGGCGGGGGGAGTGGCGGCGGAGGGTCAGAAGTCCAGCTGGTCGAGAGTGGGGGCGGACTGGTGAAACCTGGGGGCTCTCTGAAACTGAGCTGTGCAGCCAGTGGCCTGACATTCTCCTCATATGCTATGTCTTGGGTGCGGCAGACCCCAGAAAAGAGACTGGAGTGGGTGGCTTCAATCTCTTCCGGGGGCTTCACTTACTATCCTGACAGCGTGAAAGGCAGATTCACTATCTCCAGGGATAACGCACGGAATATCCTGTATCTGCAGATGAGCTCACTGAGATCCGAGGACACCGCAATGTACTACTGCGCAAGAGACGAAGTGCGGGGGTATCTGGACGTGTGGGGAGCAGGCACTACCGTCACCGTGTCTAGCACCACTACACCTGCACCAAGGCCTCCCACACCCGCTCCCACTATCGCTTCCCAGCCACTGTCCCTGAGGCCCGAGGCCTGCAGGCCAGCAGCTGGCGGAGCCGTGCATACTAGGGGGCTGGACTTCGCTTGCGACATCTACATCTGGGCCCCACTGGCAGGGACATGCGGAGTCCTGCTGCTGTCCCTGGTCATCACACTGTACTGCAAGCGGGGGCGCAAAAAACTGCTGTATATCTTTAAGCAGCCTTTCATGAGACCAGTGCAGACAACCCAGGAGGAAGATGGGTGCTCATGCCGGTTTCCCGAGGAGGAGGAAGGCGGCTGCGAGCTGAGGGTGAAGTTTTCCCGCTCAGCAGATGCTCCTGCCTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTGTATAATGAGCTGAACCTGGGCAGACGCGAAGAGTATGATGTGCTGGACAAAAGGCGGGGAAGAGACCCCGAAATGGGAGGGAAGCCAAGGCGGAAAAACCCCCAGGAGGGCCTGTACAATGAGCTGCAGAAGGACAAAATGGCAGAGGCTTACAGTGAGATTGGGATGAAGGGAGAGAGACGGAGGGGAAAAGGGCACGATGGCCTGTACCAGGGGCTGAGCACAGCAACCAAAGATACTTATGACGCACTGCACATGCAGGCACTGCCACCCAGATGACAGCCAGGGGATTTCACCACTCAAAGGCCAGACCTGCAGACGCCCAGATTATGAGACACACGGGATCAATTCCGCCCCCCCCCTAACGTTACTGGCCGAAGCCGCTTGGAATAAGGCCGGTGTGCGTTTGTCTATATGTTATTTTCCACCATATTGCCGTCTTTTGGCAATGTGAGGGCCCGGAAACCTGGCCCTGTCTTCTTGACGAGCATTCCTAGGGGTCTTTCCCCTCTCGCCAAAGGAATGCAAGGTCTGTTGAATGTCGTGAAGGAAGCAGTTCCTCTGGAAGCTTCTTGAAGACAAACAACGTCTGTAGCGACCCTTTGCAGGCAGCGGAACCCCCCACCTGGCGACAGGTGCCTCTGCGGCCAAAAGCCACGTGTATAAGATACACCTGCAAAGGCGGCACAACCCCAGTGCCACGTTGTGAGTTGGATAGTTGTGGAAAGAGTCAAATGGCTCTCCTCAAGCGTATTCAACAAGGGGCTGAAGGATGCCCAGAAGGTACCCCATTGTATGGGATCTGATCTGGGGCCTCGGTGCACATGCTTTACATGTGTTTAGTCGAGGTTAAAAAAACGTCTAGGCCCCCCGAACCACGGGGACGTGGTTTTCCTTTGAAAAACACGATAATACCATGGCTCTGCCTGTGACCGCACTGCTGCTGCCCCTGGCTCTGCTGCTGCACGCCGCAAGACCTGCCGCATACAAGGATATTCAGATGACTCAGACCACAAGCTCCCTGAGCGCCTCCCTGGGAGACCGAGTGACAATCTCTTGCAGTGCATCACAGGGAATTAGCAACTACCTGAATTGGTATCAGCAGAAGCCAGATGGCACTGTGAAACTGCTGATCTACTATACCTCTAGTCTGCACAGTGGGGTCCCCTCACGATTCAGCGGATCCGGCTCTGGGACAGACTACAGCCTGACTATCTCCAACCTGGAGCCCGAAGATATTGCCACCTACTATTGCCAGCAGTACTCCAAGCTGCCTTATACCTTTGGCGGGGGAACAAAGCTGGAGATTAAAAGGGGAGGAGGAGGAAGCGGAGGAGGAGGATCCGGAGGCGGGGGATCTGGAGGAGGAGGAAGTGAGGTGCAGCTGGTCGAATCTGGAGGAGGACTGGTGAAGCCAGGAGGATCTCTGAAACTGAGTTGTGCCGCTTCAGGCCTGACCTTCTCAAGCTACGCCATGAGCTGGGTGCGACAGACACCTGAGAAGCGGCTGGAATGGGTCGCTAGCATCTCCTCTGGCGGGTTCACATACTATCCAGACTCCGTGAAAGGCAGATTTACTATCTCTCGGGATAACGCAAGAAATATTCTGTACCTGCAGATGAGTTCACTGAGGAGCGAGGACACCGCAATGTACTATTGTGCCAGGGACGAAGTGCGCGGCTATCTGGATGTCTGGGGAGCTGGCACTACCGTCACCGTCTCCAGCGAGCAGAAACTGATTAGCGAAGAGGACCTGAAAGATGAACTGTAA |
| 13 | 抗人類CD7 (TH69) CAR-P2A-抗人類CD7 (TH69) PEBL | ATGGCTCTGCCTGTGACTGCCCTGCTGCTGCCCCTGGCCCTGCTGCTGCACGCTGCTAGACCCGCCGCATACAAGGACATTCAGATGACTCAGACTACATCCAGCCTGTCAGCTTCCCTGGGCGATCGAGTGACTATCAGCTGTTCAGCAAGCCAGGGGATCAGCAATTACCTGAACTGGTACCAGCAGAAGCCCGACGGAACTGTCAAGCTGCTGATCTACTATACTTCCAGTCTGCATAGCGGGGTCCCTAGCCGATTCTCTGGGAGTGGAAGCGGCACCGACTATAGCCTGACCATTTCCAACCTGGAACCAGAGGACATTGCCACCTATTACTGTCAGCAGTATTCAAAGCTGCCCTATACCTTTGGCGGAGGGACTAAGCTGGAGATCAAGCGAGGAGGGGGAGGATCAGGGGGAGGGGGGAGCGGAGGCGGGGGGAGTGGCGGCGGAGGGTCAGAAGTCCAGCTGGTCGAGAGTGGGGGCGGACTGGTGAAACCTGGGGGCTCTCTGAAACTGAGCTGTGCAGCCAGTGGCCTGACATTCTCCTCATATGCTATGTCTTGGGTGCGGCAGACCCCAGAAAAGAGACTGGAGTGGGTGGCTTCAATCTCTTCCGGGGGCTTCACTTACTATCCTGACAGCGTGAAAGGCAGATTCACTATCTCCAGGGATAACGCACGGAATATCCTGTATCTGCAGATGAGCTCACTGAGATCCGAGGACACCGCAATGTACTACTGCGCAAGAGACGAAGTGCGGGGGTATCTGGACGTGTGGGGAGCAGGCACTACCGTCACCGTGTCTAGCACCACTACACCTGCACCAAGGCCTCCCACACCCGCTCCCACTATCGCTTCCCAGCCACTGTCCCTGAGGCCCGAGGCCTGCAGGCCAGCAGCTGGCGGAGCCGTGCATACTAGGGGGCTGGACTTCGCTTGCGACATCTACATCTGGGCCCCACTGGCAGGGACATGCGGAGTCCTGCTGCTGTCCCTGGTCATCACACTGTACTGCAAGCGGGGGCGCAAAAAACTGCTGTATATCTTTAAGCAGCCTTTCATGAGACCAGTGCAGACAACCCAGGAGGAAGATGGGTGCTCATGCCGGTTTCCCGAGGAGGAGGAAGGCGGCTGCGAGCTGAGGGTGAAGTTTTCCCGCTCAGCAGATGCTCCTGCCTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTGTATAATGAGCTGAACCTGGGCAGACGCGAAGAGTATGATGTGCTGGACAAAAGGCGGGGAAGAGACCCCGAAATGGGAGGGAAGCCAAGGCGGAAAAACCCCCAGGAGGGCCTGTACAATGAGCTGCAGAAGGACAAAATGGCAGAGGCTTACAGTGAGATTGGGATGAAGGGAGAGAGACGGAGGGGAAAAGGGCACGATGGCCTGTACCAGGGGCTGAGCACAGCAACCAAAGATACTTATGACGCACTGCACATGCAGGCACTGCCACCCAGAGGCAGCGGCGCCACAAACTTCTCTCTGCTAAAGCAAGCAGGTGATGTTGAAGAAAACCCCGGGCCTATGGCTCTGCCTGTGACCGCACTGCTGCTGCCCCTGGCTCTGCTGCTGCACGCCGCAAGACCTGCCGCATACAAGGATATTCAGATGACTCAGACCACAAGCTCCCTGAGCGCCTCCCTGGGAGACCGAGTGACAATCTCTTGCAGTGCATCACAGGGAATTAGCAACTACCTGAATTGGTATCAGCAGAAGCCAGATGGCACTGTGAAACTGCTGATCTACTATACCTCTAGTCTGCACAGTGGGGTCCCCTCACGATTCAGCGGATCCGGCTCTGGGACAGACTACAGCCTGACTATCTCCAACCTGGAGCCCGAAGATATTGCCACCTACTATTGCCAGCAGTACTCCAAGCTGCCTTATACCTTTGGCGGGGGAACAAAGCTGGAGATTAAAAGGGGAGGAGGAGGAAGCGGAGGAGGAGGATCCGGAGGCGGGGGATCTGGAGGAGGAGGAAGTGAGGTGCAGCTGGTCGAATCTGGAGGAGGACTGGTGAAGCCAGGAGGATCTCTGAAACTGAGTTGTGCCGCTTCAGGCCTGACCTTCTCAAGCTACGCCATGAGCTGGGTGCGACAGACACCTGAGAAGCGGCTGGAATGGGTCGCTAGCATCTCCTCTGGCGGGTTCACATACTATCCAGACTCCGTGAAAGGCAGATTTACTATCTCTCGGGATAACGCAAGAAATATTCTGTACCTGCAGATGAGTTCACTGAGGAGCGAGGACACCGCAATGTACTATTGTGCCAGGGACGAAGTGCGCGGCTATCTGGATGTCTGGGGAGCTGGCACTACCGTCACCGTCTCCAGCGAGCAGAAAC T GAT TAGCGAAGAGGACCT GAAAGATGAACTGTAA |
| 14 | MSCV啟動子-抗人類CD7 (TH69) CAR-p2A-抗人類CD7 (TH69) PEBL | GGAATGAAAGACCCCACCTGTAGGTTTGGCAAGCTAGCTTAAGTAACGCCATTTTGCAAGGCATGGAAAATACATAACTGAGAATAGAGAAGTTCAGATCAAGGTTAGGAACAGAGAGACAGCAGAATATGGGCCAAACAGGATATCTGTGGTAAGCAGTTCCTGCCCCGGCTCAGGGCCAAGAACAGATGGTCCCCAGATGCGGTCCCGCCCTCAGCAGTTTCTAGAGAACCATCAGATGTTTCCAGGGTGCCCCAAGGACCTGAAATGACCCTGTGCCTTATTTGAACTAACCAATCAGTTCGCTTCTCGCTTCTGTTCGCGCGCTTCTGCTCCCCGAGCTCAATAAAAGAGCCCACAACCCCTCACTCGGCGCGCCAGTCCGAATTCGGCTTCCACCATGGCTCTGCCTGTGACTGCCCTGCTGCTGCCCCTGGCCCTGCTGCTGCACGCTGCTAGACCCGCCGCATACAAGGACATTCAGATGACTCAGACTACATCCAGCCTGTCAGCTTCCCTGGGCGATCGAGTGACTATCAGCTGTTCAGCAAGCCAGGGGATCAGCAATTACCTGAACTGGTACCAGCAGAAGCCCGACGGAACTGTCAAGCTGCTGATCTACTATACTTCCAGTCTGCATAGCGGGGTCCCTAGCCGATTCTCTGGGAGTGGAAGCGGCACCGACTATAGCCTGACCATTTCCAACCTGGAACCAGAGGACATTGCCACCTATTACTGTCAGCAGTATTCAAAGCTGCCCTATACCTTTGGCGGAGGGACTAAGCTGGAGATCAAGCGAGGAGGGGGAGGATCAGGGGGAGGGGGGAGCGGAGGCGGGGGGAGTGGCGGCGGAGGGTCAGAAGTCCAGCTGGTCGAGAGTGGGGGCGGACTGGTGAAACCTGGGGGCTCTCTGAAACTGAGCTGTGCAGCCAGTGGCCTGACATTCTCCTCATATGCTATGTCTTGGGTGCGGCAGACCCCAGAAAAGAGACTGGAGTGGGTGGCTTCAATCTCTTCCGGGGGCTTCACTTACTATCCTGACAGCGTGAAAGGCAGATTCACTATCTCCAGGGATAACGCACGGAATATCCTGTATCTGCAGATGAGCTCACTGAGATCCGAGGACACCGCAATGTACTACTGCGCAAGAGACGAAGTGCGGGGGTATCTGGACGTGTGGGGAGCAGGCACTACCGTCACCGTGTCTAGCACCACTACACCTGCACCAAGGCCTCCCACACCCGCTCCCACTATCGCTTCCCAGCCACTGTCCCTGAGGCCCGAGGCCTGCAGGCCAGCAGCTGGCGGAGCCGTGCATACTAGGGGGCTGGACTTCGCTTGCGACATCTACATCTGGGCCCCACTGGCAGGGACATGCGGAGTCCTGCTGCTGTCCCTGGTCATCACACTGTACTGCAAGCGGGGGCGCAAAAAACTGCTGTATATCTTTAAGCAGCCTTTCATGAGACCAGTGCAGACAACCCAGGAGGAAGATGGGTGCTCATGCCGGTTTCCCGAGGAGGAGGAAGGCGGCTGCGAGCTGAGGGTGAAGTTTTCCCGCTCAGCAGATGCTCCTGCCTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTGTATAATGAGCTGAACCTGGGCAGACGCGAAGAGTATGATGTGCTGGACAAAAGGCGGGGAAGAGACCCCGAAATGGGAGGGAAGCCAAGGCGGAAAAACCCCCAGGAGGGCCTGTACAATGAGCTGCAGAAGGACAAAATGGCAGAGGCTTACAGTGAGATTGGGATGAAGGGAGAGAGACGGAGGGGAAAAGGGCACGATGGCCTGTACCAGGGGCTGAGCACAGCAACCAAAGATACTTATGACGCACTGCACATGCAGGCACTGCCACCCAGATGAGGCAGCGGCGCCACAAACTTCTCTCTGCTAAAGCAAGCAGGTGATGTTGAAGAAAACCCCGGGCCTATGGCTCTGCCTGTGACCGCACTGCTGCTGCCCCTGGCTCTGCTGCTGCACGCCGCAAGACCTGCCGCATACAGCAGTATTCAGATGACTCAGACCACAAGCTCCCTGAGCGCCTCCCTGGGAGACCGAGTGACAATCTCTTGCAGTGCATCACAGGGAATTAGCAACTACCTGAATTGGTATCAGCAGAAGCCAGATGGCACTGTGAAACTGCTGATCTACTATACCTCTAGTCTGCACAGTGGGGTCCCCTCACGATTCAGCGGATCCGGCTCTGGGACAGACTACAGCCTGACTATCTCCAACCTGGAGCCCGAAGATATTGCCACCTACTATTGCCAGCAGTACTCCAAGCTGCCTTATACCTTTGGCGGGGGAACAAAGCTGGAGATTAAAAGGGGAGGAGGAGGAAGCGGAGGAGGAGGATCCGGAGGCGGGGGATCTGGAGGAGGAGGAAGTGAGGTGCAGCTGGTCGAATCTGGAGGAGGACTGGTGAAGCCAGGAGGATCTCTGAAACTGAGTTGTGCCGCTTCAGGCCTGACCTTCTCAAGCTACGCCATGAGCTGGGTGCGACAGACACCTGAGAAGCGGCTGGAATGGGTCGCTAGCATCTCCTCTGGCGGGTTCACATACTATCCAGACTCCGTGAAAGGCAGATTTACTATCTCTCGGGATAACGCAAGAAATATTCTGTACCTGCAGATGAGTTCACTGAGGAGCGAGGACACCGCAATGTACTATTGTGCCAGGGACGAAGTGCGCGGCTATCTGGATGTCTGGGGAGCTGGCACTACCGTCACCGTCTCCAGCGAGCAGAAACTGATTAGCGAAGAGGACCTGAAAGATGAACTGTAA |
| 15 | EF1α 啟動子-抗人類CD7 (TH69) CAR-P2A-抗人類CD7 (TH69) PEBL | GGCTCCGGTGCCCGTCAGTGGGCAGAGCGCACATCGCCCACAGTCCCCGAGAAGTTGGGGGGAGGGGTCGGCAATTGAACCGGTGCCTAGAGAAGGTGGCGCGGGGTAAACTGGGAAAGTGATGTCGTGTACTGGCTCCGCCTTTTTCCCGAGGGTGGGGGAGAACCGTATATAAGTGCAGTAGTCGCCGTGAACGTTCTTTTTCGCAACGGGTTTGCCGCCAGAACACAGGTAAGTGCCGTGTGTGGTTCCCGCGGGCCTGGCCTCTTTACGGGTTATGGCCCTTGCGTGCCTTGAATTACTTCCACCTGGCTGCAGTACGTGATTCTTGATCCCGAGCTTCGGGTTGGAAGTGGGTGGGAGAGTTCGAGGCCTTGCGCTTAAGGAGCCCCTTCGCCTCGTGCTTGAGTTGAGGCCTGGCCTGGGCGCTGGGGCCGCCGCGTGCGAATCTGGTGGCACCTTCGCGCCTGTCTCGCTGCTTTCGATAAGTCTCTAGCCATTTAAAATTTTTGATGACCTGCTGCGACGCTTTTTTTCTGGCAAGATAGTCTTGTAAATGCGGGCCAAGATCTGCACACTGGTATTTCGGTTTTTGGGGCCGCGGGCGGCGACGGGGCCCGTGCGTCCCAGCGCACATGTTCGGCGAGGCGGGGCCTGCGAGCGCGGCCACCGAGAATCGGACGGGGGTAGTCTCAAGCTGGCCGGCCTGCTCTGGTGCCTGGCCTCGCGCCGCCGTGTATCGCCCCGCCCTGGGCGGCAAGGCTGGCCCGGTCGGCACCAGTTGCGTGAGCGGAAAGATGGCCGCTTCCCGGCCCTGCTGCAGGGAGCTCAAAATGGAGGACGCGGCGCTCGGGAGAGCGGGCGGGTGAGTCACCCACACAAAGGAAAAGGGCCTTTCCGTCCTCAGCCGTCGCTTCATGTGACTCCACGGAGTACCGGGCGCCGTCCAGGCACCTCGATTAGTTCTCGAGCTTTTGGAGTACGTCGTCTTTAGGTTGGGGGGAGGGGTTTTATGCGATGGAGTTTCCCCACACTGAGTGGGTGGAGACTGAAGTTAGGCCAGCTTGGCACTTGATGTAATTCTCCTTGGAATTTGCCCTTTTTGAGTTTGGATCTTGGTTCATTCTCAAGCCTCAGACAGTGGTTCAAAGTTTTTTTCTTCCATTTCAGGTGTCGTGAGAATTCGGCTTCCACCATGGCTCTGCCTGTGACTGCCCTGCTGCTGCCCCTGGCCCTGCTGCTGCACGCTGCTAGACCCGCCGCATACAAGGACATTCAGATGACTCAGACTACATCCAGCCTGTCAGCTTCCCTGGGCGATCGAGTGACTATCAGCTGTTCAGCAAGCCAGGGGATCAGCAATTACCTGAACTGGTACCAGCAGAAGCCCGACGGAACTGTCAAGCTGCTGATCTACTATACTTCCAGTCTGCATAGCGGGGTCCCTAGCCGATTCTCTGGGAGTGGAAGCGGCACCGACTATAGCCTGACCATTTCCAACCTGGAACCAGAGGACATTGCCACCTATTACTGTCAGCAGTATTCAAAGCTGCCCTATACCTTTGGCGGAGGGACTAAGCTGGAGATCAAGCGAGGAGGGGGAGGATCAGGGGGAGGGGGGAGCGGAGGCGGGGGGAGTGGCGGCGGAGGGTCAGAAGTCCAGCTGGTCGAGAGTGGGGGCGGACTGGTGAAACCTGGGGGCTCTCTGAAACTGAGCTGTGCAGCCAGTGGCCTGACATTCTCCTCATATGCTATGTCTTGGGTGCGGCAGACCCCAGAAAAGAGACTGGAGTGGGTGGCTTCAATCTCTTCCGGGGGCTTCACTTACTATCCTGACAGCGTGAAAGGCAGATTCACTATCTCCAGGGATAACGCACGGAATATCCTGTATCTGCAGATGAGCTCACTGAGATCCGAGGACACCGCAATGTACTACTGCGCAAGAGACGAAGTGCGGGGGTATCTGGACGTGTGGGGAGCAGGCACTACCGTCACCGTGTCTAGCACCACTACACCTGCACCAAGGCCTCCCACACCCGCTCCCACTATCGCTTCCCAGCCACTGTCCCTGAGGCCCGAGGCCTGCAGGCCAGCAGCTGGCGGAGCCGTGCATACTAGGGGGCTGGACTTCGCTTGCGACATCTACATCTGGGCCCCACTGGCAGGGACATGCGGAGTCCTGCTGCTGTCCCTGGTCATCACACTGTACTGCAAGCGGGGGCGCAAAAAACTGCTGTATATCTTTAAGCAGCCTTTCATGAGACCAGTGCAGACAACCCAGGAGGAAGATGGGTGCTCATGCCGGTTTCCCGAGGAGGAGGAAGGCGGCTGCGAGCTGAGGGTGAAGTTTTCCCGCTCAGCAGATGCTCCTGCCTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTGTATAATGAGCTGAACCTGGGCAGACGCGAAGAGTATGATGTGCTGGACAAAAGGCGGGGAAGAGACCCCGAAATGGGAGGGAAGCCAAGGCGGAAAAACCCCCAGGAGGGCCTGTACAATGAGCTGCAGAAGGACAAAATGGCAGAGGCTTACAGTGAGATTGGGATGAAGGGAGAGAGACGGAGGGGAAAAGGGCACGATGGCCTGTACCAGGGGCTGAGCACAGCAACCAAAGATACTTATGACGCACTGCACATGCAGGCACTGCCACCCAGATGAGGCAGCGGCGCCACAAACTTCTCTCTGCTAAAGCAAGCAGGTGATGTTGAAGAAAACCCCGGGCCTATGGCTCTGCCTGTGACCGCACTGCTGCTGCCCCTGGCTCTGCTGCTGCACGCCGCAAGACCTGCCGCATACAAGGATATTCAGATGACTCAGACCACAAGCTCCCTGAGCGCCTCCCTGGGAGACCGAGTGACAATCTCTTGCAGTGCATCACAGGGAATTAGCAACTACCTGAATTGGTATCAGCAGAAGCCAGATGGCACTGTGAAACTGCTGATCTACTATACCTCTAGTCTGCACAGTGGGGTCCCCTCACGATTCAGCGGATCCGGCTCTGGGACAGACTACAGCCTGACTATCTCCAACCTGGAGCCCGAAGATATTGCCACCTACTATTGCCAGCAGTACTCCAAGCTGCCTTATACCTTTGGCGGGGGAACAAAGCTGGAGATTAAAAGGGGAGGAGGAGAAGCCAGAGGAGGAGGATCCGGAGGCGGGGGATCTGGAGGAGGAGGAAGTGAGGTGCAGCTGGTCGAATCTGGAGGAGGACTGGTGAAGCCAGGAGGATCTCTGAAACTGAGTTGTGCCGCTTCAGGCCTGACCTTCTCAAGCTACGCCATGAGCTGGGTGCGACAGACACCTGAGAAGCGGCTGGAATGGGTCGCTAGCATCTCCTCTGGCGGGTTCACATACTATCCAGACTCCGTGAAAGGCAGATTTACTATCTCTCGGGATAACGCAAGAAATATTCTGTACCTGCAGATGAGTTCACTGAGGAGCGAGGACACCGCAATGTACTATTGTGCCAGGGACGAAGTGCGCGGCTATCTGGATGTCTGGGGAGCTGGCACTACCGTCACCGTCTCCAGCGAGCAGAAACTGATTAGCGAAGAGGACCTGAAAGATGAACTGTAA |
| 16 | EFS啟動子-抗人類CD7 (TH69) CAR-P2A-抗人類CD7 (TH69) PEBL | GGGCAGAGCGCACATCGCCCACAGTCCCCGAGAAGTTGGGGGGAGGGGTCGGCAATTGAACCGGTGCCTAGAGAAGGTGGCGCGGGGTAAACTGGGAAAGTGATGTCGTGTACTGGCTCCGCCTTTTTCCCGAGGGTGGGGGAGAACCGTATATAAGTGCAGTAGTCGCCGTGAACGTTCTTTTTCGCAACGGGTTTGCCGCCAGAACACAGGTGTCGTGACCGCGGGTCTAGAGGATCCGGTACTCGAGGAACTGAAAAACCAGAAAGTTAACTGGTAAGTTTAGTCTTTTTGTCTTTTATTTCAGGTCCCGGATCCGGTGGTGGTGCAAATCAAAGAACTGCTCCTCAGTGGATGTTGCCTTTACTTCTAGGAATTCGGCTTCCACCATGGCTCTGCCTGTGACTGCCCTGCTGCTGCCCCTGGCCCTGCTGCTGCACGCTGCTAGACCCGCCGCATACAAGGACATTCAGATGACTCAGACTACATCCAGCCTGTCAGCTTCCCTGGGCGATCGAGTGACTATCAGCTGTTCAGCAAGCCAGGGGATCAGCAATTACCTGAACTGGTACCAGCAGAAGCCCGACGGAACTGTCAAGCTGCTGATCTACTATACTTCCAGTCTGCATAGCGGGGTCCCTAGCCGATTCTCTGGGAGTGGAAGCGGCACCGACTATAGCCTGACCATTTCCAACCTGGAACCAGAGGACATTGCCACCTATTACTGTCAGCAGTATTCAAAGCTGCCCTATACCTTTGGCGGAGGGACTAAGCTGGAGATCAAGCGAGGAGGGGGAGGATCAGGGGGAGGGGGGAGCGGAGGCGGGGGGAGTGGCGGCGGAGGGTCAGAAGTCCAGCTGGTCGAGAGTGGGGGCGGACTGGTGAAACCTGGGGGCTCTCTGAAACTGAGCTGTGCAGCCAGTGGCCTGACATTCTCCTCATATGCTATGTCTTGGGTGCGGCAGACCCCAGAAAAGAGACTGGAGTGGGTGGCTTCAATCTCTTCCGGGGGCTTCACTTACTATCCTGACAGCGTGAAAGGCAGATTCACTATCTCCAGGGATAACGCACGGAATATCCTGTATCTGCAGATGAGCTCACTGAGATCCGAGGACACCGCAATGTACTACTGCGCAAGAGACGAAGTGCGGGGGTATCTGGACGTGTGGGGAGCAGGCACTACCGTCACCGTGTCTAGCACCACTACACCTGCACCAAGGCCTCCCACACCCGCTCCCACTATCGCTTCCCAGCCACTGTCCCTGAGGCCCGAGGCCTGCAGGCCAGCAGCTGGCGGAGCCGTGCATACTAGGGGGCTGGACTTCGCTTGCGACATCTACATCTGGGCCCCACTGGCAGGGACATGCGGAGTCCTGCTGCTGTCCCTGGTCATCACACTGTACTGCAAGCGGGGGCGCAAAAAACTGCTGTATATCTTTAAGCAGCCTTTCATGAGACCAGTGCAGACAACCCAGGAGGAAGATGGGTGCTCATGCCGGTTTCCCGAGGAGGAGGAAGGCGGCTGCGAGCTGAGGGTGAAGTTTTCCCGCTCAGCAGATGCTCCTGCCTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTGTATAATGAGCTGAACCTGGGCAGACGCGAAGAGTATGATGTGCTGGACAAAAGGCGGGGAAGAGACCCCGAAATGGGAGGGAAGCCAAGGCGGAAAAACCCCCAGGAGGGCCTGTACAATGAGCTGCAGAAGGACAAAATGGCAGAGGCTTACAGTGAGATTGGGATGAAGGGAGAGAGACGGAGGGGAAAAGGGCACGATGGCCTGTACCAGGGGCTGAGCACAGCAACCAAAGATACTTATGACGCACTGCACATGCAGGCACTGCCACCCAGATGAGGCAGCGGCGCCACAAACTTCTCTCTGCTAAAGCAAGCAGGTGATGTTGAAGAAAACCCCGGGCCTATGGCTCTGCCTGTGACCGCACTGCTGCTGCCCCTGGCTCTGCTGCTGCACGCCGCAAGACCTGCCGCATACAAGGATATTCAGATGACTCAGACCACAAGCTCCCTGAGCGCCTCCCTGGGAGACCGAGTGACAATCTCTTGCAGTGCATCACAGGGAATTAGCAACTACCTGAATTGGTATCAGCAGAAGCCAGATGACTCTGTGAAACTGCTGATCTACTATACCTCTAGTCTGCACAGTGGGGTCCCCTCACGATTCAGCGGATCCGGCTCTGGGACAGACTACAGCCTGACTATCTCCAACCTGGAGCCCGAAGATATTGCCACCTACTATTGCCAGCAGTACTCCAAGCTGCCTTATACCTTTGGCGGGGGAACAAAGCTGGAGATTAAAAGGGGAGGAGGAGGAAGCGGAGGAGGAGGATCCGGAGGCGGGGGATCTGGAGGAGGAGGAAGTGAGGTGCAGCTGGTCGAATCTGGAGGAGGACTGGTGAAGCCAGGAGGATCTCTGAAACTGAGTTGTGCCGCTTCAGGCCTGACCTTCTCAAGCTACGCCATGAGCTGGGTGCGACAGACACCTGAGAAGCGGCTGGAATGGGTCGCTAGCATCTCCTCTGGCGGGTTCACATACTATCCAGACTCCGTGAAAGGCAGATTTACTATCTCTCGGGATAACGCAAGAAATATTCTGTACCTGCAGATGAGTTCACTGAGGAGCGAGGACACCGCAATGTACTATTGTGCCAGGGACGAAGTGCGCGGCTATCTGGATGTCTGGGGAGCTGGCACTACCGTCACCGTCTCCAGCGAGCAGAAACT GATTAGCGAAGAGGACCTGAAAGATGAACTGTAA |
| 17 | MSCV啟動子-抗人類CD7 (TH69) CAR-PGK啟動子-抗人類CD7 (TH69) PEBL | TTAATTAATTTATTTAGTCTCCAGAAAAAGGGGGGAATGAAAGACCCCACCTGTAGGTTTGGCAAGCTAGCTTAAGTAACGCCATTTTGCAAGGCATGGAAAATACATAACTGAGAATAGAGAAGTTCAGATCAAGGTTAGGAACAGAGAGACAGCAGAATATGGGCCAAACAGGATATCTGTGGTAAGCAGTTCCTGCCCCGGCTCAGGGCCAAGAACAGATGGTCCCCAGATGCGGTCCCGCCCTCAGCAGTTTCTAGAGAACCATCAGATGTTTCCAGGGTGCCCCAAGGACCTGAAATGACCCTGTGCCTTATTTGAACTAACCAATCAGTTCGCTTCTCGCTTCTGTTCGCGCGCTTCTGCTCCCCGAGCTCAATAAAAGAGCCCACAACCCCTCACTCGGCGCGCCAGTCCGAATTCGGCTTCCACCATGGCTCTGCCTGTGACTGCCCTGCTGCTGCCCCTGGCCCTGCTGCTGCACGCTGCTAGACCCGCCGCATACAAGGACATTCAGATGACTCAGACTACATCCAGCCTGTCAGCTTCCCTGGGCGATCGAGTGACTATCAGCTGTTCAGCAAGCCAGGGGATCAGCAATTACCTGAACTGGTACCAGCAGAAGCCCGACGGAACTGTCAAGCTGCTGATCTACTATACTTCCAGTCTGCATAGCGGGGTCCCTAGCCGATTCTCTGGGAGTGGAAGCGGCACCGACTATAGCCTGACCATTTCCAACCTGGAACCAGAGGACATTGCCACCTATTACTGTCAGCAGTATTCAAAGCTGCCCTATACCTTTGGCGGAGGGACTAAGCTGGAGATCAAGCGAGGAGGGGGAGGATCAGGGGGAGGGGGGAGCGGAGGCGGGGGGAGTGGCGGCGGAGGGTCAGAAGTCCAGCTGGTCGAGAGTGGGGGCGGACTGGTGAAACCTGGGGGCTCTCTGAAACTGAGCTGTGCAGCCAGTGGCCTGACATTCTCCTCATATGCTATGTCTTGGGTGCGGCAGACCCCAGAAAAGAGACTGGAGTGGGTGGCTTCAATCTCTTCCGGGGGCTTCACTTACTATCCTGACAGCGTGAAAGGCAGATTCACTATCTCCAGGGATAACGCACGGAATATCCTGTATCTGCAGATGAGCTCACTGAGATCCGAGGACACCGCAATGTACTACTGCGCAAGAGACGAAGTGCGGGGGTATCTGGACGTGTGGGGAGCAGGCACTACCGTCACCGTGTCTAGCACCACTACACCTGCACCAAGGCCTCCCACACCCGCTCCCACTATCGCTTCCCAGCCACTGTCCCTGAGGCCCGAGGCCTGCAGGCCAGCAGCTGGCGGAGCCGTGCATACTAGGGGGCTGGACTTCGCTTGCGACATCTACATCTGGGCCCCACTGGCAGGGACATGCGGAGTCCTGCTGCTGTCCCTGGTCATCACACTGTACTGCAAGCGGGGGCGCAAAAAACTGCTGTATATCTTTAAGCAGCCTTTCATGAGACCAGTGCAGACAACCCAGGAGGAAGATGGGTGCTCATGCCGGTTTCCCGAGGAGGAGGAAGGCGGCTGCGAGCTGAGGGTGAAGTTTTCCCGCTCAGCAGATGCTCCTGCCTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTGTATAATGAGCTGAACCTGGGCAGACGCGAAGAGTATGATGTGCTGGACAAAAGGCGGGGAAGAGACCCCGAAATGGGAGGGAAGCCAAGGCGGAAAAACCCCCAGGAGGGCCTGTACAATGAGCTGCAGAAGGACAAAATGGCAGAGGCTTACAGTGAGATTGGGATGAAGGGAGAGAGACGGAGGGGAAAAGGGCACGATGGCCTGTACCAGGGGCTGAGCACAGCAACCAAAGATACTTATGACGCACTGCACATGCAGGCACTGCCACCCAGATGACTCGAGTGCAGTCGACGCGGGCCCGGGATCCCGCGACTCTAGATAATTCTACCGGGTAGGGGAGGCGCTTTTCCCAAGGCAGTCTGGAGCATGCGCTTTAGCAGCCCCGCTGGGCACTTGGCGCTACACAAGTGGCCTCTGGCCTCGCACACATTCCACATCCACCGGTAGGCGCCAACCGGCTCCGTTCTTTGGTGGCCCCTTCGCGCCACCTTCTACTCCTCCCCTAGTCAGGAAGTTCCCCCCCGCCCCGCAGCTCGCGTCGTGCAGGACGTGACAAATGGAAGTAGCACGTCTCACTAGTCTCGTGCAGATGGACAGCACCGCTGAGCAATGGAAGCGGGTAGGCCTTTGGGGCAGCGGCCAATAGCAGCTTTGCTCCTTCGCTTTCTGGGCTCAGAGGCTGGGAAGGGGTGGGTCCGGGGGCGGGCTCAGGGGCGGGCTCAGGGGCGGGGCGGGCGCCCGAAGGTCCTCCGGAGGCCCGGCATTCTGCACGCTTCAAAAGCGCACGTCTGCCGCGCTGTTCTCCTCTTCCTCATCTCCGGGCCTTTCGACTGGCCAGGCTTCCACCATGGCTCTGCCTGTGACCGCACTGCTGCTGCCCCTGGCTCTGCTGCTGCACGCCGCAAGACCTGCCGCATACAAGGATATTCAGATGACTCAGACCACAAGCTCCCTGAGCGCCTCCCTGGGAGACCGAGTGACAATCTCTTGCAGTGCATCACAGGGAATTAGCAACTACCTGAATTGGTATCAGCAGAAGCCAGATGGCACTGTGAAACTGCTGATCTACTATACCTCTAGTCTGCACAGTGGGGTCCCCTCACGATTCAGCGGATCCGGCTCTGGGACAGACTACAGCCTGACTATCTCCAACCTGGAGCCCGAAGATATTGCCACCTACTATTGCCAGCAGTACTCCAAGCTGCCTTATACCTTTGGCGGGGGAACAAAGCTGGAGATTAAAAGGGGAGGAGGAGGAAGCGGAGGAGGAGGATCCGGAGGCGGGGGATCTGGAGGAGGAGGAAGTGAGGTGCAGCTGGTCGAATCTGGAGGAGGACTGGTGAAGCCAGGAGGATCTCTGAAACTGAGTTGTGCCGCTTCAGGCCTGACCTTCTCAAGCTACGCCATGAGCTGGGTGCGACAGACACCTGAGAAGCGGCTGGAATGGGTCGCTAGCATCTCCTCTGGCGGGTTCACATACTATCCAGACTCCGTGAAAGGCAGATTTACTATCTCTCGGGATAACGCAAGAAATATTCTGTACCTGCAGATGAGTTCACTGAGGAGCGAGGACACCGCAATGTACTATTGTGCCAGGGACGAAGTGCGCGGCTATCTGGATGTCTGGGGAGCTGGCACTACCGTCACCGTCTCCAGCGAGCAGAAACTGATTAGCGAAGAGGACCTGAAAGATGAACTGTAACGCGT |
| 18 | MSCV啟動子-抗人類CD7 (TH69) CAR-EF1a啟動子-抗人類CD7 (TH69) PEBL | GGAATGAAAGACCCCACCTGTAGGTTTGGCAAGCTAGCTTAAGTAACGCCATTTTGCAAGGCATGGAAAATACATAACTGAGAATAGAGAAGTTCAGATCAAGGTTAGGAACAGAGAGACAGCAGAATATGGGCCAAACAGGATATCTGTGGTAAGCAGTTCCTGCCCCGGCTCAGGGCCAAGAACAGATGGTCCCCAGATGCGGTCCCGCCCTCAGCAGTTTCTAGAGAACCATCAGATGTTTCCAGGGTGCCCCAAGGACCTGAAATGACCCTGTGCCTTATTTGAACTAACCAATCAGTTCGCTTCTCGCTTCTGTTCGCGCGCTTCTGCTCCCCGAGCTCAATAAAAGAGCCCACAACCCCTCACTCGGCGCGCCAGTCCGAATTCGGCTTCCACCATGGCTCTGCCTGTGACTGCCCTGCTGCTGCCCCTGGCCCTGCTGCTGCACGCTGCTAGACCCGCCGCATACAAGGACATTCAGATGACTCAGACTACATCCAGCCTGTCAGCTTCCCTGGGCGATCGAGTGACTATCAGCTGTTCAGCAAGCCAGGGGATCAGCAATTACCTGAACTGGTACCAGCAGAAGCCCGACGGAACTGTCAAGCTGCTGATCTACTATACTTCCAGTCTGCATAGCGGGGTCCCTAGCCGATTCTCTGGGAGTGGAAGCGGCACCGACTATAGCCTGACCATTTCCAACCTGGAACCAGAGGACATTGCCACCTATTACTGTCAGCAGTATTCAAAGCTGCCCTATACCTTTGGCGGAGGGACTAAGCTGGAGATCAAGCGAGGAGGGGGAGGATCAGGGGGAGGGGGGAGCGGAGGCGGGGGGAGTGGCGGCGGAGGGTCAGAAGTCCAGCTGGTCGAGAGTGGGGGCGGACTGGTGAAACCTGGGGGCTCTCTGAAACTGAGCTGTGCAGCCAGTGGCCTGACATTCTCCTCATATGCTATGTCTTGGGTGCGGCAGACCCCAGAAAAGAGACTGGAGTGGGTGGCTTCAATCTCTTCCGGGGGCTTCACTTACTATCCTGACAGCGTGAAAGGCAGATTCACTATCTCCAGGGATAACGCACGGAATATCCTGTATCTGCAGATGAGCTCACTGAGATCCGAGGACACCGCAATGTACTACTGCGCAAGAGACGAAGTGCGGGGGTATCTGGACGTGTGGGGAGCAGGCACTACCGTCACCGTGTCTAGCACCACTACACCTGCACCAAGGCCTCCCACACCCGCTCCCACTATCGCTTCCCAGCCACTGTCCCTGAGGCCCGAGGCCTGCAGGCCAGCAGCTGGCGGAGCCGTGCATACTAGGGGGCTGGACTTCGCTTGCGACATCTACATCTGGGCCCCACTGGCAGGGACATGCGGAGTCCTGCTGCTGTCCCTGGTCATCACACTGTACTGCAAGCGGGGGCGCAAAAAACTGCTGTATATCTTTAAGCAGCCTTTCATGAGACCAGTGCAGACAACCCAGGAGGAAGATGGGTGCTCATGCCGGTTTCCCGAGGAGGAGGAAGGCGGCTGCGAGCTGAGGGTGAAGTTTTCCCGCTCAGCAGATGCTCCTGCCTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTGTATAATGAGCTGAACCTGGGCAGACGCGAAGAGTATGATGTGCTGGACAAAAGGCGGGGAAGAGACCCCGAAATGGGAGGGAAGCCAAGGCGGAAAAACCCCCAGGAGGGCCTGTACAATGAGCTGCAGAAGGACAAAATGGCAGAGGCTTACAGTGAGATTGGGATGAAGGGAGAGAGACGGAGGGGAAAAGGGCACGATGGCCTGTACCAGGGGCTGAGCACAGCAACCAAAGATACTTATGACGCACTGCACATGCAGGCACTGCCACCCAGATGAGTCGACGGCTCCGGTGCCCGTCAGTGGGCAGAGCGCACATCGCCCACAGTCCCCGAGAAGTTGGGGGGAGGGGTCGGCAATTGAACCGGTGCCTAGAGAAGGTGGCGCGGGGTAAACTGGGAAAGTGATGTCGTGTACTGGCTCCGCCTTTTTCCCGAGGGTGGGGGAGAACCGTATATAAGTGCAGTAGTCGCCGTGAACGTTCTTTTTCGCAACGGGTTTGCCGCCAGAACACAGGTAAGTGCCGTGTGTGGTTCCCGCGGGCCTGGCCTCTTTACGGGTTATGGCCCTTGCGTGCCTTGAATTACTTCCACCTGGCTGCAGTACGTGATTCTTGATCCCGAGCTTCGGGTTGGAAGTGGGTGGGAGAGTTCGAGGCCTTGCGCTTAAGGAGCCCCTTCGCCTCGTGCTTGAGTTGAGGCCTGGCCTGGGCGCTGGGGCCGCCGCGTGCGAATCTGGTGGCACCTTCGCGCCTGTCTCGCTGCTTTCGATAAGTCTCTAGCCATTTAAAATTTTTGATGACCTGCTGCGACGCTTTTTTTCTGGCAAGATAGTCTTGTAAATGCGGGCCAAGATCTGCACACTGGTATTTCGGTTTTTGGGGCCGCGGGCGGCGACGGGGCCCGTGCGTCCCAGCGCACATGTTCGGCGAGGCGGGGCCTGCGAGCGCGGCCACCGAGAATCGGACGGGGGTAGTCTCAAGCTGGCCGGCCTGCTCTGGTGCCTGGCCTCGCGCCGCCGTGTATCGCCCCGCCCTGGGCGGCAAGGCTGGCCCGGTCGGCACCAGTTGCGTGAGCGGAAAGATGGCCGCTTCCCGGCCCTGCTGCAGGGAGCTCAAAATGGAGGACGCGGCGCTCGGGAGAGCGGGCGGGTGAGTCACCCACACAAAGGAAAAGGGCCTTTCCGTCCTCAGCCGTCGCTTCATGTGACTCCACGGAGTACCGGGCGCCGTCCAGGCACCTCGATTAGTTCTCGAGCTTTTGGAGTACGTCGTCTTTAGGTTGGGGGGAGGGGTTTTATGCGATGGAGTTTCCCCACACTGAGTGGGTGGAGACTGAAGTTAGGCCAGCTTGGCACTTGATGTAATTCTCCTTGGAATTTGCCCTTTTTGAGTTTGGATCTTGGTTCATTCTCAAGCCTCAGACAGTGGTTCAAAGTTTTTTTCTTCCATTTCAGGTGTCGTGACCCGGGGGCTTCCACCATGGCTCTGCCTGTGACCGCACTGCTGCTGCCCCTGGCTCTGCTGCTGCACGCCGCAAGACCTGCCGCATACAAGGATATTCAGATGACTCAGACCACAAGCTCCCTGAGCGCCTCCCTGGGAGACCGAGTGACAATCTCTTGCAGTGCATCACAGGGAATTAGCAACTACCTGAATTGGTATCAGCAGAAGCCAGATGGCACTGTGAAACTGCTGATCTACTATACCTCTAGTCTGCACAGTGGGGTCCCCTCACGATTCAGCGGATCCGGCTCTGGGACAGACTACAGCCTGACTATCTCCAACCTGGAGCCCGAAGATATTGCCACCTACTATTGCCAGCAGTACTCCAAGCTGCCTTATACCTTTGGCGGGGGAACAAAGCTGGAGATTAAAAGGGGAGGAGGAGGAAGCGGAGGAGGAGGATCCGGAGGCGGGGGATCTGGAGGAGGAGGAAGTGAGGTGCAGCTGGTCGAATCTGGAGGAGGACTGGTGAAGCCAGGAGGATCTCTGAAACTGAGTTGTGCCGCTTCAGGCCTGACCTTCTCAAGCTACGCCATGAGCTGGGTGCGACAGACACCTGAGAAGCGGCTGGAATGGGTCGCTAGCATCTCCTCTGGCGGGTTCACATACTATCCAGACTCCGTGAAAGGCAGATTTACTATCTCTCGGGATAACGCAAGAAATATTCTGTACCTGCAGATGAGTTCACTGAGGAGCGAGGACACCGCAATGTACTATTGTGCCAGGGACGAAGTGCGCGGCTATCTGGATGTCTGGGGAGCTGGCACTACCGTCACCGTCTCCAGCGAGCAGAAACTGATTAGCGAAGAGGACCTGAAAGATGAACTGTAA |
| 19 | MSCV啟動子-抗人類CD7 (TH69) CAR-EFS啟動子-抗人類CD7 (TH69) PEBL | GGAATGAAAGACCCCACCTGTAGGTTTGGCAAGCTAGCTTAAGTAACGCCATTTTGCAAGGCATGGAAAATACATAACTGAGAATAGAGAAGTTCAGATCAAGGTTAGGAACAGAGAGACAGCAGAATATGGGCCAAACAGGATATCTGTGGTAAGCAGTTCCTGCCCCGGCTCAGGGCCAAGAACAGATGGTCCCCAGATGCGGTCCCGCCCTCAGCAGTTTCTAGAGAACCATCAGATGTTTCCAGGGTGCCCCAAGGACCTGAAATGACCCTGTGCCTTATTTGAACTAACCAATCAGTTCGCTTCTCGCTTCTGTTCGCGCGCTTCTGCTCCCCGAGCTCAATAAAAGAGCCCACAACCCCTCACTCGGCGCGCCAGTCC/GAATTCGGCTTCCACC/ATGGCTCTGCCTGTGACTGCCCTGCTGCTGCCCCTGGCCCTGCTGCTGCACGCTGCTAGACCCGCCGCATACAAGGACATTCAGATGACTCAGACTACATCCAGCCTGTCAGCTTCCCTGGGCGATCGAGTGACTATCAGCTGTTCAGCAAGCCAGGGGATCAGCAATTACCTGAACTGGTACCAGCAGAAGCCCGACGGAACTGTCAAGCTGCTGATCTACTATACTTCCAGTCTGCATAGCGGGGTCCCTAGCCGATTCTCTGGGAGTGGAAGCGGCACCGACTATAGCCTGACCATTTCCAACCTGGAACCAGAGGACATTGCCACCTATTACTGTCAGCAGTATTCAAAGCTGCCCTATACCTTTGGCGGAGGGACTAAGCTGGAGATCAAGCGAGGAGGGGGAGGATCAGGGGGAGGGGGGAGCGGAGGCGGGGGGAGTGGCGGCGGAGGGTCAGAAGTCCAGCTGGTCGAGAGTGGGGGCGGACTGGTGAAACCTGGGGGCTCTCTGAAACTGAGCTGTGCAGCCAGTGGCCTGACATTCTCCTCATATGCTATGTCTTGGGTGCGGCAGACCCCAGAAAAGAGACTGGAGTGGGTGGCTTCAATCTCTTCCGGGGGCTTCACTTACTATCCTGACAGCGTGAAAGGCAGATTCACTATCTCCAGGGATAACGCACGGAATATCCTGTATCTGCAGATGAGCTCACTGAGATCCGAGGACACCGCAATGTACTACTGCGCAAGAGACGAAGTGCGGGGGTATCTGGACGTGTGGGGAGCAGGCACTACCGTCACCGTGTCTAGCACCACTACACCTGCACCAAGGCCTCCCACACCCGCTCCCACTATCGCTTCCCAGCCACTGTCCCTGAGGCCCGAGGCCTGCAGGCCAGCAGCTGGCGGAGCCGTGCATACTAGGGGGCTGGACTTCGCTTGCGACATCTACATCTGGGCCCCACTGGCAGGGACATGCGGAGTCCTGCTGCTGTCCCTGGTCATCACACTGTACTGCAAGCGGGGGCGCAAAAAACTGCTGTATATCTTTAAGCAGCCTTTCATGAGACCAGTGCAGACAACCCAGGAGGAAGATGGGTGCTCATGCCGGTTTCCCGAGGAGGAGGAAGGCGGCTGCGAGCTGAGGGTGAAGTTTTCCCGCTCAGCAGATGCTCCTGCCTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTGTATAATGAGCTGAACCTGGGCAGACGCGAAGAGTATGATGTGCTGGACAAAAGGCGGGGAAGAGACCCCGAAATGGGAGGGAAGCCAAGGCGGAAAAACCCCCAGGAGGGCCTGTACAATGAGCTGCAGAAGGACAAAATGGCAGAGGCTTACAGTGAGATTGGGATGAAGGGAGAGAGACGGAGGGGAAAAGGGCACGATGGCCTGTACCAGGGGCTGAGCACAGCAACCAAAGATACTTATGACGCACTGCACATGCAGGCACTGCCACCCAGAT GAGTCGACGGGCAGAGCGCACATCGCCCACAGTCCCCGAGAAGTTGGGGGGAGGGGTCGGCAATTGAACCGGTGCCTAGAGAAGGTGGCGCGGGGTAAACTGGGAAAGTGATGTCGTGTACTGGCTCCGCCTTTTTCCCGAGGGTGGGGGAGAACCGTATATAAGTGCAGTAGTCGCCGTGAACGTTCTTTTTCGCAACGGGTTTGCCGCCAGAACACAGGTGTCGTGACCGCGGGTCTAGAGGATCCGGTACTCGAGGAACTGAAAAACCAGAAAGTTAACTGGTAAGTTTAGTCTTTTTGTCTTTTATTTCAGGTCCCGGATCCGGTGGTGGTGCAAATCAAAGAACTGCTCCTCAGTGGATGTTGCCTTTACTTCTA GCCCGGGGGCTTCCACCATGGCTCTGCCTGTGACCGCACTGCTGCTGCCCCTGGCTCTGCTGCTGCACGCCGCAAGACCTGCCGCATACAAGGATATTCAGATGACTCAGACCACAAGCTCCCTGAGCGCCTCCCTGGGAGACCGAGTGACAATCTCTTGCAGTGCATCACAGGGAATTAGCAACTACCTGAATTGGTATCAGCAGAAGCCAGATGGCACTGTGAAACTGCTGATCTACTATACCTCTAGTCTGCACAGTGGGGTCCCCTCACGATTCAGCGGATCCGGCTCTGGGACAGACTACAGCCTGACTATCTCCAACCTGGAGCCCGAAGATATTGCCACCTACTATTGCCAGCAGTACTCCAAGCTGCCTTATACCTTTGGCGGGGGAACAAAGCTGGAGATTAAAAGGGGAGGAGGAGGAAGCGGAGGAGGAGGATCCGGAGGCGGGGGATCTGGAGGAGGAGGAAGTGAGGTGCAGCTGGTCGAATCTGGAGGAGGACTGGTGAAGCCAGGAGGATCTCTGAAACTGAGTTGTGCCGCTTCAGGCCTGACCTTCTCAAGCTACGCCATGAGCTGGGTGCGACAGACACCTGAGAAGCGGCTGGAATGGGTCGCTAGCATCTCCTCTGGCGGGTTCACATACTATCCAGACTCCGTGAAAGGCAGATTTACTATCTCTCGGGATAACGCAAGAAATATTCTGTACCTGCAGATGAGTTCACTGAGGAGCGAGGACACCGCAATGTACTATTGTGCCAGGGACGAAGTGCGCGGCTATCTGGATGTCTGGGGAGCTGGCACTACCGTCACCGTCTCCAGCGAGCAGAAACTGATTAGCGAAGAGGACCTGAAAGATGAACTGTAA |
| 20 | PGK啟動子-抗人類CD7 (3A1F) CAR-EF1a啟動子-抗人類CD7 (TH69) PEBL | ATTCTACCGGGTAGGGGAGGCGCTTTTCCCAAGGCAGTCTGGAGCATGCGCTTTAGCAGCCCCGCTGGGCACTTGGCGCTACACAAGTGGCCTCTGGCCTCGCACACATTCCACATCCACCGGTAGGCGCCAACCGGCTCCGTTCTTTGGTGGCCCCTTCGCGCCACCTTCTACTCCTCCCCTAGTCAGGAAGTTCCCCCCCGCCCCGCAGCTCGCGTCGTGCAGGACGTGACAAATGGAAGTAGCACGTCTCACTAGTCTCGTGCAGATGGACAGCACCGCTGAGCAATGGAAGCGGGTAGGCCTTTGGGGCAGCGGCCAATAGCAGCTTTGCTCCTTCGCTTTCTGGGCTCAGAGGCTGGGAAGGGGTGGGTCCGGGGGCGGGCTCAGGGGCGGGCTCAGGGGCGGGGCGGGCGCCCGAAGGTCCTCCGGAGGCCCGGCATTCTGCACGCTTCAAAAGCGCACGTCTGCCGCGCTGTTCTCCTCTTCCTCATCTCCGGGCCTTTCGAGAATTCGGCTTCCACCATGGCTCTGCCCGTCACCGCTCTGCTGCTGCCTCTGGCTCTGCTGCTGCACGCTGCTCGACCACAGGTCCAGCTGCAGGAGTCAGGAGCTGAGCTGGTGAAGCCAGGGGCAAGCGTCAAACTGTCCTGCAAGGCCTCTGGATATACATTCACTAGCTACTGGATGCACTGGGTGAAACAGAGACCCGGACAGGGCCTGGAGTGGATCGGAAAGATTAACCCTAGCAATGGCAGGACCAACTACAACGAAAAGTTTAAATCCAAGGCAACCCTGACAGTGGACAAGAGCTCCTCTACAGCCTACATGCAGCTGAGTTCACTGACTTCAGAGGATAGCGCAGTGTACTATTGCGCCAGAGGCGGGGTCTACTATGACCTGTACTATTACGCCCTGGATTATTGGGGGCAGGGAACCACAGTGACTGTCAGCTCCGGAGGAGGAGGAAGCGGAGGAGGAGGATCCGGAGGAGGAGGATCTGACATCGAGCTGACCCAGAGTCCTGCTACACTGAGCGTGACTCCAGGCGATTCTGTCAGTCTGTCATGTCGGGCAAGCCAGTCCATCTCTAACAATCTGCACTGGTACCAGCAGAAATCCCATGAATCTCCACGACTGCTGATTAAGAGTGCCTCACAGAGCATCTCCGGCATTCCCTCCCGGTTCTCTGGCAGTGGGTCAGGAACTGACTTTACCCTGAGTATTAACTCAGTGGAGACAGAAGATTTCGGCATGTATTTTTGCCAGCAGAGCAATTCCTGGCCCTACACTTTCGGAGGCGGGACCAAACTGGAGATCAAGCGGACTACCACACCAGCTCCAAGACCACCTACCCCTGCACCAACAATTGCTAGTCAGCCACTGTCACTGAGACCAGAAGCATGTAGGCCTGCAGCTGGAGGAGCTGTGCACACCAGAGGCCTGGACTTTGCCTGCGATATCTACATTTGGGCTCCTCTGGCAGGAACCTGTGGCGTGCTGCTGCTGTCTCTGGTCATCACACTGTATTGCAAACGAGGGCGGAAGAAACTGCTGTACATTTTCAAGCAGCCCTTTATGAGGCCTGTGCAGACTACCCAGGAGGAAGACGGCTGCAGCTGTCGCTTCCCTGAGGAAGAGGAAGGGGGATGTGAGCTGCGCGTCAAATTTTCTCGAAGTGCAGATGCCCCAGCTTATCAGCAGGGCCAGAACCAGCTGTACAACGAGCTGAATCTGGGGCGGAGAGAGGAATATGACGTGCTGGATAAGAGGCGAGGAAGGGACCCAGAAATGGGAGGGAAACCACGACGGAAGAACCCCCAGGAGGGCCTGTATAATGAACTGCAGAAAGACAAGATGGCAGAGGCCTACTCTGAAATCGGGATGAAAGGAGAGAGAAGGCGCGGCAAGGGGCATGATGGCCTGTACCAGGGGCTGAGCACAGCAACCAAAGACACCTATGACGCACTGCACATGCAGGCACTGCCACCACGGTAATG AGTCGACGGCTCCGGTGCCCGTCAGTGGGCAGAGCGCACATCGCCCACAGTCCCCGAGAAGTTGGGGGGAGGGGTCGGCAATTGAACCGGTGCCTAGAGAAGGTGGCGCGGGGTAAACTGGGAAAGTGATGTCGTGTACTGGCTCCGCCTTTTTCCCGAGGGTGGGGGAGAACCGTATATAAGTGCAGTAGTCGCCGTGAACGTTCTTTTTCGCAACGGGTTTGCCGCCAGAACACAGGTAAGTGCCGTGTGTGGTTCCCGCGGGCCTGGCCTCTTTACGGGTTATGGCCCTTGCGTGCCTTGAATTACTTCCACCTGGCTGCAGTACGTGATTCTTGATCCCGAGCTTCGGGTTGGAAGTGGGTGGGAGAGTTCGAGGCCTTGCGCTTAAGGAGCCCCTTCGCCTCGTGCTTGAGTTGAGGCCTGGCCTGGGCGCTGGGGCCGCCGCGTGCGAATCTGGTGGCACCTTCGCGCCTGTCTCGCTGCTTTCGATAAGTCTCTAGCCATTTAAAATTTTTGATGACCTGCTGCGACGCTTTTTTTCTGGCAAGATAGTCTTGTAAATGCGGGCCAAGATCTGCACACTGGTATTTCGGTTTTTGGGGCCGCGGGCGGCGACGGGGCCCGTGCGTCCCAGCGCACATGTTCGGCGAGGCGGGGCCTGCGAGCGCGGCCACCGAGAATCGGACGGGGGTAGTCTCAAGCTGGCCGGCCTGCTCTGGTGCCTGGCCTCGCGCCGCCGTGTATCGCCCCGCCCTGGGCGGCAAGGCTGGCCCGGTCGGCACCAGTTGCGTGAGCGGAAAGATGGCCGCTTCCCGGCCCTGCTGCAGGGAGCTCAAAATGGAGGACGCGGCGCTCGGGAGAGCGGGCGGGTGAGTCACCCACACAAAGGAAAAGGGCCTTTCCGTCCTCAGCCGTCGCTTCATGTGACTCCACGGAGTACCGGGCGCCGTCCAGGCACCTCGATTAGTTCTCGAGCTTTTGGAGTACGTCGTCTTTAGGTTGGGGGGAGGGGTTTTATGCGATGGAGTTTCCCCACACTGAGTGGGTGGAGACTGAAGTTAGGCCAGCTTGGCACTTGATGTAATTCTCCTTGGAATTTGCCCTTTTTGAGTTTGGATCTTGGTTCATTCTCAAGCCTCAGACAGTGGTTCAAAGTTTTTTTCTTCCATTTCAGGTGTCGTGACCCGGGGGCTTCCACCATGGCTCTGCCTGTGACCGCACTGCTGCTGCCCCTGGCTCTGCTGCTGCACGCCGCAAGACCTGCCGCATACAAGGATATTCAGATGACTCAGACCACAAGCTCCCTGAGCGCCTCCCTGGGAGACCGAGTGACAATCTCTTGCAGTGCATCACAGGGAATTAGCAACTACCTGAATTGGTATCAGCAGAAGCCAGATGGCACTGTGAAACTGCTGATCTACTATACCTCTAGTCTGCACAGTGGGGTCCCCTCACGATTCAGCGGATCCGGCTCTGGGACAGACTACAGCCTGACTATCTCCAACCTGGAGCCCGAAGATATTGCCACCTACTATTGCCAGCAGTACTCCAAGCTGCCTTATACCTTTGGCGGGGGAACAAAGCTGGAGATTAAAAGGGGAGGAGGAGGAAGCGGAGGAGGAGGATCCGGAGGCGGGGGATCTGGAGGAGGAGGAAGTGAGGTGCAGCTGGTCGAATCTGGAGGAGGACTGGTGAAGCCAGGAGGATCTCTGAAACTGAGTTGTGCCGCTTCAGGCCTGACCTTCTCAAGCTACGCCATGAGCTGGGTGCGACAGACACCTGAGAAGCGGCTGGAATGGGTCGCTAGCATCTCCTCTGGCGGGTTCACATACTATCCAGACTCCGTGAAAGGCAGATTTACTATCTCTCGGGATAACGCAAGAAATATTCTGTACCTGCAGATGAGTTCACTGAGGAGCGAGGACACCGCAATGTACTATTGTGCCAGGGACGAAGTGCGCGGCTATCTGGATGTCTGGGGAGCTGGCACTACCGTCACCGTCTCCAGCGAGCAGAAACTGATTAGCGAAGAGGACCTGAAAGATGAACTGTAA |
| 21 | PGK啟動子-抗人類CD7 (TH69) CAR-EF1a啟動子-抗人類CD7 (3A1F) PEBL | ATTCTACCGGGTAGGGGAGGCGCTTTTCCCAAGGCAGTCTGGAGCATGCGCTTTAGCAGCCCCGCTGGGCACTTGGCGCTACACAAGTGGCCTCTGGCCTCGCACACATTCCACATCCACCGGTAGGCGCCAACCGGCTCCGTTCTTTGGTGGCCCCTTCGCGCCACCTTCTACTCCTCCCCTAGTCAGGAAGTTCCCCCCCGCCCCGCAGCTCGCGTCGTGCAGGACGTGACAAATGGAAGTAGCACGTCTCACTAGTCTCGTGCAGATGGACAGCACCGCTGAGCAATGGAAGCGGGTAGGCCTTTGGGGCAGCGGCCAATAGCAGCTTTGCTCCTTCGCTTTCTGGGCTCAGAGGCTGGGAAGGGGTGGGTCCGGGGGCGGGCTCAGGGGCGGGCTCAGGGGCGGGGCGGGCGCCCGAAGGTCCTCCGGAGGCCCGGCATTCTGCACGCTTCAAAAGCGCACGTCTGCCGCGCTGTTCTCCTCTTCCTCATCTCCGGGCCTTTCGAGAATTCGGCTTCCACCATGGCTCTGCCTGTGACTGCCCTGCTGCTGCCCCTGGCCCTGCTGCTGCACGCTGCTAGACCCGCCGCATACAAGGACATTCAGATGACTCAGACTACATCCAGCCTGTCAGCTTCCCTGGGCGATCGAGTGACTATCAGCTGTTCAGCAAGCCAGGGGATCAGCAATTACCTGAACTGGTACCAGCAGAAGCCCGACGGAACTGTCAAGCTGCTGATCTACTATACTTCCAGTCTGCATAGCGGGGTCCCTAGCCGATTCTCTGGGAGTGGAAGCGGCACCGACTATAGCCTGACCATTTCCAACCTGGAACCAGAGGACATTGCCACCTATTACTGTCAGCAGTATTCAAAGCTGCCCTATACCTTTGGCGGAGGGACTAAGCTGGAGATCAAGCGAGGAGGGGGAGGATCAGGGGGAGGGGGGAGCGGAGGCGGGGGGAGTGGCGGCGGAGGGTCAGAAGTCCAGCTGGTCGAGAGTGGGGGCGGACTGGTGAAACCTGGGGGCTCTCTGAAACTGAGCTGTGCAGCCAGTGGCCTGACATTCTCCTCATATGCTATGTCTTGGGTGCGGCAGACCCCAGAAAAGAGACTGGAGTGGGTGGCTTCAATCTCTTCCGGGGGCTTCACTTACTATCCTGACAGCGTGAAAGGCAGATTCACTATCTCCAGGGATAACGCACGGAATATCCTGTATCTGCAGATGAGCTCACTGAGATCCGAGGACACCGCAATGTACTACTGCGCAAGAGACGAAGTGCGGGGGTATCTGGACGTGTGGGGAGCAGGCACTACCGTCACCGTGTCTAGCACCACTACACCTGCACCAAGGCCTCCCACACCCGCTCCCACTATCGCTTCCCAGCCACTGTCCCTGAGGCCCGAGGCCTGCAGGCCAGCAGCTGGCGGAGCCGTGCATACTAGGGGGCTGGACTTCGCTTGCGACATCTACATCTGGGCCCCACTGGCAGGGACATGCGGAGTCCTGCTGCTGTCCCTGGTCATCACACTGTACTGCAAGCGGGGGCGCAAAAAACTGCTGTATATCTTTAAGCAGCCTTTCATGAGACCAGTGCAGACAACCCAGGAGGAAGATGGGTGCTCATGCCGGTTTCCCGAGGAGGAGGAAGGCGGCTGCGAGCTGAGGGTGAAGTTTTCCCGCTCAGCAGATGCTCCTGCCTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTGTATAATGAGCTGAACCTGGGCAGACGCGAAGAGTATGATGTGCTGGACAAAAGGCGGGGAAGAGACCCCGAAATGGGAGGGAAGCCAAGGCGGAAAAACCCCCAGGAGGGCCTGTACAATGAGCTGCAGAAGGACAAAATGGCAGAGGCTTACAGTGAGATTGGGATGAAGGGAGAGAGACGGAGGGGAAAAGGGCACGATGGCCTGTACCAGGGGCTGAGCACAGCAACCAAAGATACTTATGACGCACTGCACATGCAGGCACTGCCACCCAGATGAGTCGACGGCTCCGGTGCCCGTCAGTGGGCAGAGCGCACATCGCCCACAGTCCCCGAGAAGTTGGGGGGAGGGGTCGGCAATTGAACCGGTGCCTAGAGAAGGTGGCGCGGGGTAAACTGGGAAAGTGATGTCGTGTACTGGCTCCGCCTTTTTCCCGAGGGTGGGGGAGAACCGTATATAAGTGCAGTAGTCGCCGTGAACGTTCTTTTTCGCAACGGGTTTGCCGCCAGAACACAGGTAAGTGCCGTGTGTGGTTCCCGCGGGCCTGGCCTCTTTACGGGTTATGGCCCTTGCGTGCCTTGAATTACTTCCACCTGGCTGCAGTACGTGATTCTTGATCCCGAGCTTCGGGTTGGAAGTGGGTGGGAGAGTTCGAGGCCTTGCGCTTAAGGAGCCCCTTCGCCTCGTGCTTGAGTTGAGGCCTGGCCTGGGCGCTGGGGCCGCCGCGTGCGAATCTGGTGGCACCTTCGCGCCTGTCTCGCTGCTTTCGATAAGTCTCTAGCCATTTAAAATTTTTGATGACCTGCTGCGACGCTTTTTTTCTGGCAAGATAGTCTTGTAAATGCGGGCCAAGATCTGCACACTGGTATTTCGGTTTTTGGGGCCGCGGGCGGCGACGGGGCCCGTGCGTCCCAGCGCACATGTTCGGCGAGGCGGGGCCTGCGAGCGCGGCCACCGAGAATCGGACGGGGGTAGTCTCAAGCTGGCCGGCCTGCTCTGGTGCCTGGCCTCGCGCCGCCGTGTATCGCCCCGCCCTGGGCGGCAAGGCTGGCCCGGTCGGCACCAGTTGCGTGAGCGGAAAGATGGCCGCTTCCCGGCCCTGCTGCAGGGAGCTCAAAATGGAGGACGCGGCGCTCGGGAGAGCGGGCGGGTGAGTCACCCACACAAAGGAAAAGGGCCTTTCCGTCCTCAGCCGTCGCTTCATGTGACTCCACGGAGTACCGGGCGCCGTCCAGGCACCTCGATTAGTTCTCGAGCTTTTGGAGTACGTCGTCTTTAGGTTGGGGGGAGGGGTTTTATGCGATGGAGTTTCCCCACACTGAGTGGGTGGAGACTGAAGTTAGGCCAGCTTGGCACTTGATGTAATTCTCCTTGGAATTTGCCCTTTTTGAGTTTGGATCTTGGTTCATTCTCAAGCCTCAGACAGTGGTTCAAAGTTTTTTTCTTCCATTTCAGGTGTCGT GACCCGGGGGCTTCCACCATGGCTCTGCCCGTCACCGCTCTGCTGCTGCCTCTGGCTCTGCTGCTGCACGCCGCAAGACCCCAGGTCCAGCTGCAGGAGTCAGGGGCAGAGCTGGTGAAACCCGGAGCCAGTGTCAAACTGTCCTGTAAGGCCAGCGGCTATACTTTCACCAGCTACTGGATGCACTGGGTGAAACAGAGGCCAGGACAGGGCCTGGAGTGGATCGGCAAGATTAACCCCAGCAATGGGCGCACCAACTACAACGAAAAGTTTAAATCCAAGGCTACACTGACTGTGGACAAGAGCTCCTCTACCGCATACATGCAGCTGAGTTCACTGACATCTGAAGATAGTGCCGTGTACTATTGCGCCAGAGGCGGGGTCTACTATGACCTGTACTATTACGCACTGGATTATTGGGGGCAGGGAACCACAGTGACTGTCAGCTCCGGAGGAGGAGGATCCGGCGGAGGAGGCTCTGGGGGAGGCGGGAGTGACATCGAGCTGACACAGTCTCCAGCCACTCTGAGCGTGACCCCTGGCGATTCTGTCAGTCTGTCATGTAGAGCTAGCCAGTCCATCTCTAACAATCTGCACTGGTACCAGCAGAAATCACATGAAAGCCCTCGGCTGCTGATTAAGAGTGCTTCACAGAGCATCTCCGGGATTCCAAGCAGATTCTCTGGCAGTGGGTCAGGAACCGACTTTACACTGTCCATTAACTCTGTGGAGACCGAAGATTTCGGCATGTATTTTTGCCAGCAGAGCAATTCCTGGCCTTACACATTCGGAGGCGGGACTAAACTGGAGATTAAGAGGGAGCAGAAACTGATTAGCGAAGAGGACCTGAAGGACGAACTGTGA |
| 22 | PGK啟動子-抗人類CD7 (TH69) CAR-EF1a啟動子-抗人類CD7 (TH69) PEBL | ATTCTACCGGGTAGGGGAGGCGCTTTTCCCAAGGCAGTCTGGAGCATGCGCTTTAGCAGCCCCGCTGGGCACTTGGCGCTACACAAGTGGCCTCTGGCCTCGCACACATTCCACATCCACCGGTAGGCGCCAACCGGCTCCGTTCTTTGGTGGCCCCTTCGCGCCACCTTCTACTCCTCCCCTAGTCAGGAAGTTCCCCCCCGCCCCGCAGCTCGCGTCGTGCAGGACGTGACAAATGGAAGTAGCACGTCTCACTAGTCTCGTGCAGATGGACAGCACCGCTGAGCAATGGAAGCGGGTAGGCCTTTGGGGCAGCGGCCAATAGCAGCTTTGCTCCTTCGCTTTCTGGGCTCAGAGGCTGGGAAGGGGTGGGTCCGGGGGCGGGCTCAGGGGCGGGCTCAGGGGCGGGGCGGGCGCCCGAAGGTCCTCCGGAGGCCCGGCATTCTGCACGCTTCAAAAGCGCACGTCTGCCGCGCTGTTCTCCTCTTCCTCATCTCCGGGCCTTTCGAGAATTCGGCTTCCACCATGGCTCTGCCTGTGACTGCCCTGCTGCTGCCCCTGGCCCTGCTGCTGCACGCTGCTAGACCCGCCGCATACAAGGACATTCAGATGACTCAGACTACATCCAGCCTGTCAGCTTCCCTGGGCGATCGAGTGACTATCAGCTGTTCAGCAAGCCAGGGGATCAGCAATTACCTGAACTGGTACCAGCAGAAGCCCGACGGAACTGTCAAGCTGCTGATCTACTATACTTCCAGTCTGCATAGCGGGGTCCCTAGCCGATTCTCTGGGAGTGGAAGCGGCACCGACTATAGCCTGACCATTTCCAACCTGGAACCAGAGGACATTGCCACCTATTACTGTCAGCAGTATTCAAAGCTGCCCTATACCTTTGGCGGAGGGACTAAGCTGGAGATCAAGCGAGGAGGGGGAGGATCAGGGGGAGGGGGGAGCGGAGGCGGGGGGAGTGGCGGCGGAGGGTCAGAAGTCCAGCTGGTCGAGAGTGGGGGCGGACTGGTGAAACCTGGGGGCTCTCTGAAACTGAGCTGTGCAGCCAGTGGCCTGACATTCTCCTCATATGCTATGTCTTGGGTGCGGCAGACCCCAGAAAAGAGACTGGAGTGGGTGGCTTCAATCTCTTCCGGGGGCTTCACTTACTATCCTGACAGCGTGAAAGGCAGATTCACTATCTCCAGGGATAACGCACGGAATATCCTGTATCTGCAGATGAGCTCACTGAGATCCGAGGACACCGCAATGTACTACTGCGCAAGAGACGAAGTGCGGGGGTATCTGGACGTGTGGGGAGCAGGCACTACCGTCACCGTGTCTAGCACCACTACACCTGCACCAAGGCCTCCCACACCCGCTCCCACTATCGCTTCCCAGCCACTGTCCCTGAGGCCCGAGGCCTGCAGGCCAGCAGCTGGCGGAGCCGTGCATACTAGGGGGCTGGACTTCGCTTGCGACATCTACATCTGGGCCCCACTGGCAGGGACATGCGGAGTCCTGCTGCTGTCCCTGGTCATCACACTGTACTGCAAGCGGGGGCGCAAAAAACTGCTGTATATCTTTAAGCAGCCTTTCATGAGACCAGTGCAGACAACCCAGGAGGAAGATGGGTGCTCATGCCGGTTTCCCGAGGAGGAGGAAGGCGGCTGCGAGCTGAGGGTGAAGTTTTCCCGCTCAGCAGATGCTCCTGCCTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTGTATAATGAGCTGAACCTGGGCAGACGCGAAGAGTATGATGTGCTGGACAAAAGGCGGGGAAGAGACCCCGAAATGGGAGGGAAGCCAAGGCGGAAAAACCCCCAGGAGGGCCTGTACAATGAGCTGCAGAAGGACAAAATGGCAGAGGCTTACAGTGAGATTGGGATGAAGGGAGAGAGACGGAGGGGAAAAGGGCACGATGGCCTGTACCAGGGGCTGAGCACAGCAACCAAAGATACTTATGACGCACTGCACATGCAGGCACTGCCACCCAGATGAGTCGACGGCTCCGGTGCCCGTCAGTGGGCAGAGCGCACATCGCCCACAGTCCCCGAGAAGTTGGGGGGAGGGGTCGGCAATTGAACCGGTGCCTAGAGAAGGTGGCGCGGGGTAAACTGGGAAAGTGATGTCGTGTACTGGCTCCGCCTTTTTCCCGAGGGTGGGGGAGAACCGTATATAAGTGCAGTAGTCGCCGTGAACGTTCTTTTTCGCAACGGGTTTGCCGCCAGAACACAGGTAAGTGCCGTGTGTGGTTCCCGCGGGCCTGGCCTCTTTACGGGTTATGGCCCTTGCGTGCCTTGAATTACTTCCACCTGGCTGCAGTACGTGATTCTTGATCCCGAGCTTCGGGTTGGAAGTGGGTGGGAGAGTTCGAGGCCTTGCGCTTAAGGAGCCCCTTCGCCTCGTGCTTGAGTTGAGGCCTGGCCTGGGCGCTGGGGCCGCCGCGTGCGAATCTGGTGGCACCTTCGCGCCTGTCTCGCTGCTTTCGATAAGTCTCTAGCCATTTAAAATTTTTGATGACCTGCTGCGACGCTTTTTTTCTGGCAAGATAGTCTTGTAAATGCGGGCCAAGATCTGCACACTGGTATTTCGGTTTTTGGGGCCGCGGGCGGCGACGGGGCCCGTGCGTCCCAGCGCACATGTTCGGCGAGGCGGGGCCTGCGAGCGCGGCCACCGAGAATCGGACGGGGGTAGTCTCAAGCTGGCCGGCCTGCTCTGGTGCCTGGCCTCGCGCCGCCGTGTATCGCCCCGCCCTGGGCGGCAAGGCTGGCCCGGTCGGCACCAGTTGCGTGAGCGGAAAGATGGCCGCTTCCCGGCCCTGCTGCAGGGAGCTCAAAATGGAGGACGCGGCGCTCGGGAGAGCGGGCGGGTGAGTCACCCACACAAAGGAAAAGGGCCTTTCCGTCCTCAGCCGTCGCTTCATGTGACTCCACGGAGTACCGGGCGCCGTCCAGGCACCTCGATTAGTTCTCGAGCTTTTGGAGTACGTCGTCTTTAGGTTGGGGGGAGGGGTTTTATGCGATGGAGTTTCCCCACACTGAGTGGGTGGAGACTGAAGTTAGGCCAGCTTGGCACTTGATGTAATTCTCCTTGGAATTTGCCCTTTTTGAGTTTGGATCTTGGTTCATTCTCAAGCCTCAGACAGTGGTTCAAAGTTTTTTTCTTCCATTTCAGGTGTCGTGA CCCGGGGGCTTCCACCATGGCTCTGCCTGTGACCGCACTGCTGCTGCCCCTGGCTCTGCTGCTGCACGCCGCAAGACCTGCCGCATACAAGGATATTCAGATGACTCAGACCACAAGCTCCCTGAGCGCCTCCCTGGGAGACCGAGTGACAATCTCTTGCAGTGCATCACAGGGAATTAGCAACTACCTGAATTGGTATCAGCAGAAGCCAGATGGCACTGTGAAACTGCTGATCTACTATACCTCTAGTCTGCACAGTGGGGTCCCCTCACGATTCAGCGGATCCGGCTCTGGGACAGACTACAGCCTGACTATCTCCAACCTGGAGCCCGAAGATATTGCCACCTACTATTGCCAGCAGTACTCCAAGCTGCCTTATACCTTTGGCGGGGGAACAAAGCTGGAGATTAAAAGGGGAGGAGGAGGAAGCGGAGGAGGAGGATCCGGAGGCGGGGGATCTGGAGGAGGAGGAAGTGAGGTGCAGCTGGTCGAATCTGGAGGAGGACTGGTGAAGCCAGGAGGATCTCTGAAACTGAGTTGTGCCGCTTCAGGCCTGACCTTCTCAAGCTACGCCATGAGCTGGGTGCGACAGACACCTGAGAAGCGGCTGGAATGGGTCGCTAGCATCTCCTCTGGCGGGTTCACATACTATCCAGACTCCGTGAAAGGCAGATTTACTATCTCTCGGGATAACGCAAGAAATATTCTGTACCTGCAGATGAGTTCACTGAGGAGCGAGGACACCGCAATGTACTATTGTGCCAGGGACGAAGTGCGCGGCTATCTGGATGTCTGGGGAGCTGGCACTACCGTCACCGTCTCCAGCGAGCAGAAACTGATTAGCGAAGAGGACCTGAAAGATGAACTGTAA |
| 23 | PGK啟動子-抗人類CD7 (TH69) CAR-EFS啟動子-抗人類CD7 (TH69) PEBL | ATTCTACCGGGTAGGGGAGGCGCTTTTCCCAAGGCAGTCTGGAGCATGCGCTTTAGCAGCCCCGCTGGGCACTTGGCGCTACACAAGTGGCCTCTGGCCTCGCACACATTCCACATCCACCGGTAGGCGCCAACCGGCTCCGTTCTTTGGTGGCCCCTTCGCGCCACCTTCTACTCCTCCCCTAGTCAGGAAGTTCCCCCCCGCCCCGCAGCTCGCGTCGTGCAGGACGTGACAAATGGAAGTAGCACGTCTCACTAGTCTCGTGCAGATGGACAGCACCGCTGAGCAATGGAAGCGGGTAGGCCTTTGGGGCAGCGGCCAATAGCAGCTTTGCTCCTTCGCTTTCTGGGCTCAGAGGCTGGGAAGGGGTGGGTCCGGGGGCGGGCTCAGGGGCGGGCTCAGGGGCGGGGCGGGCGCCCGAAGGTCCTCCGGAGGCCCGGCATTCTGCACGCTTCAAAAGCGCACGTCTGCCGCGCTGTTCTCCTCTTCCTCATCTCCGGGCCTTTCGAGAATTCGGCTTCCACCATGGCTCTGCCTGTGACTGCCCTGCTGCTGCCCCTGGCCCTGCTGCTGCACGCTGCTAGACCCGCCGCATACAAGGACATTCAGATGACTCAGACTACATCCAGCCTGTCAGCTTCCCTGGGCGATCGAGTGACTATCAGCTGTTCAGCAAGCCAGGGGATCAGCAATTACCTGAACTGGTACCAGCAGAAGCCCGACGGAACTGTCAAGCTGCTGATCTACTATACTTCCAGTCTGCATAGCGGGGTCCCTAGCCGATTCTCTGGGAGTGGAAGCGGCACCGACTATAGCCTGACCATTTCCAACCTGGAACCAGAGGACATTGCCACCTATTACTGTCAGCAGTATTCAAAGCTGCCCTATACCTTTGGCGGAGGGACTAAGCTGGAGATCAAGCGAGGAGGGGGAGGATCAGGGGGAGGGGGGAGCGGAGGCGGGGGGAGTGGCGGCGGAGGGTCAGAAGTCCAGCTGGTCGAGAGTGGGGGCGGACTGGTGAAACCTGGGGGCTCTCTGAAACTGAGCTGTGCAGCCAGTGGCCTGACATTCTCCTCATATGCTATGTCTTGGGTGCGGCAGACCCCAGAAAAGAGACTGGAGTGGGTGGCTTCAATCTCTTCCGGGGGCTTCACTTACTATCCTGACAGCGTGAAAGGCAGATTCACTATCTCCAGGGATAACGCACGGAATATCCTGTATCTGCAGATGAGCTCACTGAGATCCGAGGACACCGCAATGTACTACTGCGCAAGAGACGAAGTGCGGGGGTATCTGGACGTGTGGGGAGCAGGCACTACCGTCACCGTGTCTAGCACCACTACACCTGCACCAAGGCCTCCCACACCCGCTCCCACTATCGCTTCCCAGCCACTGTCCCTGAGGCCCGAGGCCTGCAGGCCAGCAGCTGGCGGAGCCGTGCATACTAGGGGGCTGGACTTCGCTTGCGACATCTACATCTGGGCCCCACTGGCAGGGACATGCGGAGTCCTGCTGCTGTCCCTGGTCATCACACTGTACTGCAAGCGGGGGCGCAAAAAACTGCTGTATATCTTTAAGCAGCCTTTCATGAGACCAGTGCAGACAACCCAGGAGGAAGATGGGTGCTCATGCCGGTTTCCCGAGGAGGAGGAAGGCGGCTGCGAGCTGAGGGTGAAGTTTTCCCGCTCAGCAGATGCTCCTGCCTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTGTATAATGAGCTGAACCTGGGCAGACGCGAAGAGTATGATGTGCTGGACAAAAGGCGGGGAAGAGACCCCGAAATGGGAGGGAAGCCAAGGCGGAAAAACCCCCAGGAGGGCCTGTACAATGAGCTGCAGAAGGACAAAATGGCAGAGGCTTACAGTGAGATTGGGATGAAGGGAGAGAGACGGAGGGGAAAAGGGCACGATGGCCTGTACCAGGGGCTGAGCACAGCAACCAAAGATACTTATGACGCACTGCACATGCAGGCACTGCCACCCAGATGAGTCGACGGGCAGAGCGCACATCGCCCACAGTCCCCGAGAAGTTGGGGGGAGGGGTCGGCAATTGAACCGGTGCCTAGAGAAGGTGGCGCGGGGTAAACTGGGAAAGTGATGTCGTGTACTGGCTCCGCCTTTTTCCCGAGGGTGGGGGAGAACCGTATATAAGTGCAGTAGTCGCCGTGAACGTTCTTTTTCGCAACGGGTTTGCCGCCAGAACACAGGTGTCGTGACCGCGGGTCTAGAGGATCCGGTACTCGAGGAACTGAAAAACCAGAAAGTTAACTGGTAAGTTTAGTCTTTTTGTCTTTTATTTCAGGTCCCGGATCCGGTGGTGGTGCAAATCAAAGAACTGCTCCTCAGTGGATGTTGCCTTTACTTCTAGCCCGGGGGCTTCCACCATGGCTCTGCCTGTGACCGCACTGCTGCTGCCCCTGGCTCTGCTGCTGCACGCCGCAAGACCTGCCGCATACAAGGATATTCAGATGACTCAGACCACAAGCTCCCTGAGCGCCTCCCTGGGAGACCGAGTGACAATCTCTTGCAGTGCATCACAGGGAATTAGCAACTACCTGAATTGGTATCAGCAGAAGCCAGATGGCACTGTGAAACTGCTGATCTACTATACCTCTAGTCTGCACAGTGGGGTCCCCTCACGATTCAGCGGATCCGGCTCTGGGACAGACTACAGCCTGACTATCTCCAACCTGGAGCCCGAAGATATTGCCACCTACTATTGCCAGCAGTACTCCAAGCTGCCTTATACCTTTGGCGGGGGAACAAAGCTGGAGATTAAAAGGGGAGGAGGAGGAAGCGGAGGAGGAGGATCCGGAGGCGGGGGATCTGGAGGAGGAGGAAGTGAGGTGCAGCTGGTCGAATCTGGAGGAGGACTGGTGAAGCCAGGAGGATCTCTGAAACTGAGTTGTGCCGCTTCAGGCCTGACCTTCTCAAGCTACGCCATGAGCTGGGTGCGACAGACACCTGAGAAGCGGCTGGAATGGGTCGCTAGCATCTCCTCTGGCGGGTTCACATACTATCCAGACTCCGTGAAAGGCAGATTTACTATCTCTCGGGATAACGCAAGAAATATTCTGTACCTGCAGATGAGTTCACTGAGGAGCGAGGACACCGCAATGTACTATTGTGCCAGGGACGAAGTGCGCGGCTATCTGGATGTCTGGGGAGCTGGCACTACCGTCACCGTCTCCAGCGAGCAGAAACTGATTAGCGAAGAGGACCTGAAAGATGAACTGTAA |
| SEQ ID NO. | 名稱 | 序列 |
| 24 | 抗CD7 (TH69) PEBL | MALPVTALLLPLALLLHAARPAAYKDIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCSASQGISNYLNWYQQKPDGTVKLLIYYTSSLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEPEDIATYYCQQYSKLPYTFGGGTKLEIKR//GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVKPGGSLKLSCAASGLTFSSYAMSWVRQTPEKRLEWVASISSGGFTYYPDSVKGRFTISRDNARNILYLQMSSLRSEDTAMYYCARDEVRGYLDVWGAGTTVTVSSEQKLISEEDLKDEL |
| 25 | 抗CD7 (TH69) PEBL變體 | PMALPVTALLLPLALLLHAARPAAYKDIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCSASQGISNYLNWYQQKPDGTVKLLIYYTSSLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEPEDIATYYCQQYSKLPYTFGGGTKLEIKRGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVKPGGSLKLSCAASGLTFSSYAMSWVRQTPEKRLEWVASISSGGFTYYPDSVKGRFTISRDNARNILYLQMSSLRSEDTAMYYCARDEVRGYLDVWGAGTTVTVSSEQKLISEEDLKDEL |
| 26 | 抗CD7 (3A1F) PEBL | MALPVTALLLPLALLLHAARPQVQLQESGAELVKPGASVKLSCKASGYTFTSYWMHWVKQRPGQGLEWIGKINPSNGRTNYNEKFKSKATLTVDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARGGVYYDLYYYALDYWGQGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIELTQSPATLSVTPGDSVSLSCRASQSISNNLHWYQQKSHESPRLLIKSASQSISGIPSRFSGSGSGTDFTLSINSVETEDFGMYFCQQSNSWPYTFGGGTKLEIKREQKLISEEDLKDEL |
| 27 | 抗CD7 (3A1F) PEBL變體 | PMALPVTALLLPLALLLHAARPQVQLQESGAELVKPGASVKLSCKASGYTFTSYWMHWVKQRPGQGLEWIGKINPSNGRTNYNEKFKSKATLTVDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARGGVYYDLYYYALDYWGQGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIELTQSPATLSVTPGDSVSLSCRASQSISNNLHWYQQKSHESPRLLIKSASQSISGIPSRFSGSGSGTDFTLSINSVETEDFGMYFCQQSNSWPYTFGGGTKLEIKREQKLISEEDLKDEL |
| 28 | 抗CD7 (TH69) CAR | MALPVTALLLPLALLLHAARPAAYKDIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCSASQGISNYLNWYQQKPDGTVKLLIYYTSSLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEPEDTATYYCQQYSKLPYTFGGGTKLEIKRGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVKPGGSLKLSCAASGLTFSSYAMSWVRQTPEKRLEWVASISSGGFTYYPDSVKGRFTISRDNARNILYLQMSSLRSEDTAMYYCARDEVRGYLDVWGAGTTVTVSSTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNOLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR |
| 29 | 抗CD7 (TH69) CAR變體 | MALPVTALLLPLALLLHAARPAAYKDIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCSASQGISNYLNWYQQKPDGTVKLLIYYTSSLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEPEDIATYYCQQYSKLPYTFGGGTKLEIKRGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVKPGGSLKLSCAASGLTFSSYAMSWVRQTPEKRLEWVASISSGGFTYYPDSVKGRFTISRDNARNILYLQMSSLRSEDTAMYYCARDEVRGYLDVWGAGTTVTVSSTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNOLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPRGSGATNFSLLKQAGDVEENPG |
| 30 | 抗CD7 (3A1F) CAR | MALPVTALLLPLALLLHAARPQVQLQESGAELVKPGASVKLSCKASGYTFTSYWMHWVKQRPGQGLEWIGKINPSNGRTNYNEKFKSKATLTVDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARGGVYYDLYYYALDYWGQGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIELTQSPATLSVTPGDSVSLSCRASQSISNNLHWYQQKSHESPRLLIKSASQSISGIPSRFSGSGSGTDFTLSINSVETEDFGMYFCQQSNSWPYTFGGGTKLEIKRTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMA.EAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR |
| 31 | 抗CD7 (3A1F) CAR變體 | MALPVTALLLPLALLLHAARPQVQLQESGAELVKPGASVKLSCKASGYTFTSYWMHWVKQRPGQGLEWIGKINPSNGRTNYNEKFKSKATLTVDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARGGVYYDLYYYALDYWGQGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIELTQSPATLSVTPGDSVSLSCRASQSISNNLHWYQQKSHESPRLLIKSASQSISGIPSRFSGSGSGTDFTLSINSVETEDFGMYFCQQSNSWPYTFGGGTKLEIKRTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPRGSGATNFSLLKQAGDVEENPG |
| 100 | 抗人類CD7 (TH69) CAR-p2A-抗人類CD7 (TH69) PEBL | MALPVTALLLPLALLLHAARPAAYKDIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCSASQGISNYLNWYQQKPDGTVKLLIYYTSSLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEPEDIATYYCQQYSKLPYTFGGGTKLEIKRGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVKPGGSLKLSCAASGLTFSSYAMSWVRQTPEKRLEWVASISSGGFTYYPDSVKGRFTISRDNARNILYLQMSSLRSEDTAMYYCARDEVRGYLDVWGAGTTVTVSSTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPRGSGATNFSLLKOAGDVEENPGPMALPVTALLLPLALLLHAARPAAYKDIOMTQTTSSLSASLGDRVTISCSASQGISNYLNWYQQKPDGTVKLLIYYTSSLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEPEDIATYYCQQYSKLPYTFGGGTKLEIKRGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVKPGGSLKLSCAASGLTFSSYAMSWVRQTPEKRLEWVASISSGGFTYYPDSVKGRFTISRDNARNILYLQMSSLRSEDTAM YYCARDEVRGYLDVWGAGTTVTVSSEQKLISEEDLKDEL |
圖 1描繪使用健康供體T細胞之同種異體PCART7-CD3PEBL細胞(allo-PCART7)之流程。
圖 2描繪同種異體PCART7-CD3PEBL細胞(allo-PCART7)之表型驗證。將T細胞解凍且用TransAct活化，隨後單獨使用PCART7 LVV或使用PCART7 LVV與CD3 PEBL LVV之組合進行轉導。三天後，用TRAC RNP對經PCART7轉導之細胞進行電穿孔以產生PCART7-TRAC KO細胞。在CD3耗盡之前將細胞再擴增10天。用各別抗體對細胞進行染色且使用流式細胞分析技術進行分析。
圖 3A 至圖 3C描繪allo-PCART7之表型特徵。
圖 3A展示存在及不存在CD3耗盡之製造過程開始後15天對CAR、CD7及CD3表現之流式細胞分析評估。CD3耗盡能夠提高allo-PCART7之品質。
圖 3B上圖展示PCART7及allo-PCART7在收穫時的CAR+細胞百分比在兩組之間類似。然而，如
圖 3B下圖中所描繪，藉由流式細胞分析技術所分析，allo-PCART7顯示TCRαβ及CD3標記物耗盡。
圖 3C展示工程化T細胞、PCART7及allo-PCART7在整個製造持續時間期間具有類似的擴增及活力。
圖 4描繪同種異體PCART7-CD3PEBL細胞對TransAct介導之TCR刺激沒有反應。使用或不使用TransAct處理細胞72小時，隨後藉由流式細胞分析技術偵測CD25活化標記物。
圖 5A 至圖 5C描繪allo-PCART7細胞表現出有效的持續CD3下調。
圖 5A展示實驗時間表。每3至4天用目標細胞或TransAct (T細胞之CD3及CD28活化)刺激allo-PCART7細胞，以驗證CD3 PEBL將CD3滯留在細胞內之有效性。
圖 5B展示在用CD3-KO Jurkat細胞刺激之前及之後allo-PCART7細胞均不表現CD3且不同於CD3+ PCART7細胞(實線)。在用CD3-KO Jurkat細胞刺激之後，allo-PCART7及PCART7細胞之數目增加，但CD3含量保持不變，表明在allo-PCART7細胞中，CD3藉由CD3 PEBL有效地滯留在細胞內。實線指示CD3-KO Jurkat細胞與allo-PCART7細胞或PCART7細胞之共培養。虛線指示僅allo-PCART7細胞或僅PCART7細胞。
圖 5C展示在用TransAct刺激後第10天，CD25之表現量%在allo-PCART7細胞中保持不變，CD25為在諸如GvHD中之主動免疫反應期間活化之淋巴球的細胞表面標記物。然而，PCART7細胞顯示在刺激之後CD25表現%大幅增加。
圖 6描繪allo-PCART7細胞可在活體外有效且特異性地殺死T細胞急性淋巴母細胞性白血病(T-ALL)細胞。在此實驗中，使用allo-PCART7細胞與T-ALL細胞以1:1效應子:目標(E:T)比率之共培養，在活體外評估allo-PCART7細胞之抗腫瘤潛力。CD7+及CD7- T-ALL細胞經工程化以表現綠色螢光蛋白(GFP)，且使用IncuCyte®系統進行共培養實驗以監測實驗孔中T-ALL目標細胞隨時間推移之量。y軸為來自孔中之目標細胞之GFP信號，且x軸為共培養之持續時間。如左圖所展示，單獨擴增Jurkat-GFP細胞(CD7+ T-ALL細胞株)。然而，一旦此等細胞與PCART7細胞或allo-PCART7細胞共培養，CD7+目標細胞就會減少，達到不可偵測之水準。如右圖所展示，Nalm6-GFP (B細胞前驅細胞白血病細胞株)用作CD7-目標細胞。工程化T細胞(PCART7細胞或allo-PCART7細胞)之共培養不影響CD7-細胞，表明此等工程化T細胞沒有非特異性靶向CD7。
圖 7描繪同種異體PCART7-CD3PEBL (allo-PCART7)之活體內功效。NSG小鼠經靜脈內注射1×10
6個表現FLuc-GFP之CCRF-CEM白血病細胞。三天後，用PBS (媒劑)、未經轉導之T細胞、PCART7或PCART7-CD3PEBL治療荷瘤小鼠。來自腫瘤細胞之生物冷光使用IVIS成像進行偵測。
圖 8A 至圖 8B描繪allo-PCART7細胞有效殺死NSG小鼠模型中之T-ALL細胞。
圖 8A展示實驗流程及時間表。簡言之，在第0天，經由靜脈內注射(i.v.)以每只小鼠1×10
6個細胞向NSG小鼠輸注來源於CCRF-CEM T-ALL細胞株之CCRF-CEM FLuc-GFP細胞。在第5天，此等小鼠經由靜脈內注射接受PBS (媒劑)、未經轉導之T細胞或allo-PCART7細胞。隨後藉由IVIS成像監測腫瘤生長。如
圖 8B中所展示，用PBS治療之小鼠(媒劑組)及用未經轉導之T細胞治療之小鼠(T細胞組)在第21天顯示高腫瘤負荷。然而，用allo-PCART7細胞治療之小鼠顯示出對腫瘤細胞之劑量依賴性抑制。總通量[p/s]展示在各組下方，且最高劑量治療顯示最低腫瘤水準。此等結果表明，allo-PCART7細胞有效殺死小鼠中之白血病細胞。
圖 9描繪allo-PCART7細胞不會在小鼠模型中觸發GvHD。在此實驗中，將細胞注射至經照射之NSG小鼠中且追蹤此等小鼠之體重。結果顯示，注射未經轉導之T細胞的小鼠之體重實質上下降且不得不被安樂死。然而，注射allo-PCART7細胞的小鼠之體重保持與經照射之對照小鼠相似，表明allo-PCART7細胞不具有異種反應性。
圖 10描繪具有經截短CD20之同種異體PCART7-CD3PEBL或allo-PCART7
KG的製造流程。此等allo-PCART7
KG細胞包含識別且殺死CD7+目標細胞之抗CD7 CAR。抗CD7 PEBL存在於此等細胞中以消除表面CD7，從而防止自殺或自相殘殺。存在抗CD3 PEBL以最大程度降低移植物抗宿主疾病(GVHD)之風險。此外，藉由表現諸如經截短CD20之殺傷基因或自殺基因而在此等細胞中工程化另一安全機制，以便能夠在不良事件期間自具有抗CD20抗體之患者中消除allo-PCART7
KG細胞。
圖 11描繪allo-PCART7
KG製造過程之詳細工作流程。簡言之，在第0天，自健康供體收集包含免疫細胞(例如T細胞)之細胞。隨後在第1天，分離T細胞且使用TransAct進行活化，TransAct為用於人類T細胞之活體外活化及擴增的即用型試劑。在第2天，使用慢病毒載體對T細胞進行共轉導以引入2個PEBL (CD3 PEBL及CD7 PEBL)、CD7 CAR及視情況存在之自殺基因或殺傷基因。轉導後，在第3天至第13天活體外擴增細胞。在第13天至第15天之間，使用CD3微珠進行工程化T細胞之CD3耗盡。隨後將此等細胞冷凍保存作為最終細胞產物。
圖 12A 至圖 12B描繪具有自殺基因(或殺傷基因或KG)之allo-PCART7之表型特徵，且此等細胞被稱為allo-PCART7
KG(PCART7
TCRnegKG)。在此實例中，對allo-PCART7進行轉導以表現用作自殺或殺傷基因之經截短CD20。
圖 12A展示在製造開始之後15天，當藉由流式細胞分析技術進行分析時，allo-PCART7
KG細胞(PCART7
TCRnegKG)具有所需特徵(CD7 CAR+/CD7-/CD3-/CD20+)。
圖 12B展示allo-PCART7
KG細胞(PCART7
TCRnegKG)相比於allo-PCART7細胞(PCART7
TCRneg)及PCART7細胞之細胞毒活性。此結果表明，PCART7細胞、allo-PCART7細胞(PCART7
TCRneg)及allo-PCART7
KG細胞(PCART7
TCRnegKG)對CD7+細胞(Jurkat細胞)之殺死能力及靶向沒有差異，表明自殺基因或殺傷基因(例如CD20、CD20t)之表現不會顯著影響allo-PCART7
KG細胞之功能。
圖 13A 至圖 13B描繪allo-PCART7
KG細胞中之殺傷基因之功能。為了驗證殺傷基因之功能，進行補體依賴性細胞毒性(CDC)分析及抗體依賴性細胞毒性(ADCC)分析。如
圖 13A 至圖 13B中所展示，CDC分析及ADCC分析之結果表明，表現CD20t之allo-PCART7
KG細胞由利妥昔單抗(一種抗CD20單株抗體)識別，引起CDC或ADCC之觸發，藉此特異性地消除allo-PCART7
KG細胞。相反，利妥昔單抗之添加並未在不表現CD20之allo-PCART7細胞中誘發細胞毒性。靶向HER2之單株抗體曲妥珠單抗(trastuzumab)用作陰性對照。
圖 14A 至圖 14B描繪依序轉導PCART7及CD3 PEBL之結果。
圖 14A展示實驗時間表。在活化PBMC之後，在第1天發生第一次慢病毒載體轉導，且在第6天發生第二次慢病毒載體轉導。隨後對經轉導之細胞進行FACS分析。
圖 14B展示細胞在轉導CD3 PEBL隨後轉導PCART7的情況下不能存活。對於PCART7隨後CD3 PEBL之依序轉導，CD3下調為次佳的。
圖 15描繪OKT3與UCHT1 PEBL之對比。UCHT1 PEBL在下調allo-PCART7細胞中之表面CD3表現方面表現出優異效能。
圖 16A 至圖 16C描繪其中CD3 PEBL具有不同感染倍率(MOI)的allo-PCART7之表型特徵。
圖 16A展示實驗時間表。在T細胞活化之後，用PCART7及CD3 PEBL對細胞進行共轉導。
圖 16B展示細胞在製造之後15天經各別抗體染色以藉由流式細胞分析技術確認CD3、CD7及/或CAR之表現。存在CD3 PEBL對CD3之MOI依賴性下調。PCART7與MOI大於5之CD3 PEBL之共轉導產生＞95%之CAR+CD7-CD3-群體。
圖 16C展示PCART7與MOI為5之CD3 PEBL之共轉導(10+5)顯示出穩健的表型及細胞擴增。
圖 17A 至圖 17B描繪鑑別用於CD3滯留之CD3PEBL/PCART7之最小拷貝數比率的結果。
圖 17A展示T細胞經指定MOI之PCART7及CD3 PEBL共轉導，接著在製造第15天進行CD3耗盡。藉由流式細胞分析技術檢查CD3表現。
圖 17B展示針對CD3PEBL/PCART7 VCN比率繪製的CD3陰性細胞之百分比，以判定在第14天維持＞95% CD3陰性細胞之最低VCN比率。
圖 18A 至圖 18B描繪用於CD3 PEBL載體最佳化之不同殺傷基因構築體之比較。
圖 18A展示測試構築體之示意性圖示。CD3 PEBL藉由P2A序列(例如KG(P2A))或IRES序列(例如KG(IRES))與殺傷基因(CD20t)分開。
圖 18B展示流式細胞分析圖，其證明與PCART7共轉導之KG(P2A)引起比KG(IRES)更高的CD20表現及更佳的CD3下調。
圖 19A 至圖 19B描繪PCART7:CD3 PEBL共轉導之MOI比率最佳化。
圖 19A展示用PCART7慢病毒載體及不具有殺傷基因之CD3 PEBL慢病毒載體共轉導後的結果。製造後15天，藉由流式細胞分析技術評估細胞之CAR及CD3表現。
圖 19B展示與圖19A類似的共轉導，不同之處為具有殺傷基因。MOI 10之PCART7及MOI 40之CD3 PEBL顯示用於共轉導之最佳比率。
圖 20A 至 圖 20B描繪在細胞製造過程中添加CD20富集步驟。
圖 20A展示檢查CD20及CD3表現之流式細胞分析圖。在CD3耗盡之前富集CD20引起CD20高表現細胞之回收(第0天)。
圖 20B展示在細胞製造中添加CD20富集步驟產生更高的CD20 MFI。
圖 21A 至圖 21G描繪CD20富集之allo-PCART7
KG(P2A)細胞之功能評估。
圖 21A展示藉由曲妥珠單抗誘導的未經轉導之對照T細胞及CD20富集之allo-PCART7
KG(P2A)細胞的細胞毒性。
圖 21B展示藉由利妥昔單抗誘導的未經轉導之對照T細胞及CD20富集之allo-PCART7
KG(P2A)細胞的細胞毒性。
圖 21C展示藉由流式細胞分析技術分析的CD3耗盡後14天allo-PCART7
KG(P2A)細胞及CD20富集之allo-PCART7
KG(P2A)細胞中之CD3及CD20表現。
圖 21D 至圖 21F展現使用IncuCyte®活細胞分析評估的allo-PCART7及allo-PCART7
KG(P2A)細胞針對CD7+及CD7-目標細胞之細胞毒活性。
圖 21G展示產生allo-PCART7
KG(P2A)細胞之實驗方案。
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Claims (274)
- 一種工程化免疫細胞，其包含： (a)第一核酸序列，其編碼連接至(ii)合成定位域的(i)結合至T細胞受體(TCR)複合物之次單元之域； (b)第二核酸序列，其編碼嵌合抗原受體(CAR)； (c)第三核酸序列，其編碼連接至合成表面多肽定位域之表面多肽結合域；且 其中該工程化免疫細胞包含的該第一核酸序列多達該第二核酸序列或該第三核酸序列之至少兩倍。
- 如請求項1之工程化免疫細胞，其中該TCR複合物之該次單元為CD3ε。
- 如請求項1或2之工程化免疫細胞，其中該合成定位域包含ER滯留信號。
- 如請求項3之工程化免疫細胞，其中該ER滯留信號包含胺基酸序列KDEL。
- 如請求項3之工程化免疫細胞，其中該合成定位域進一步包含Myc標籤。
- 如請求項3之工程化免疫細胞，其中該合成定位域進一步包含連接子序列。
- 如請求項3之工程化免疫細胞，其中該第一核酸序列在5'至3'方向上包含：編碼結合至該TCR複合物之次單元的該域之序列；編碼Myc標籤之序列；編碼(GGGGS) 4序列之序列；及編碼包含胺基酸序列KDEL之該ER滯留信號之序列。
- 如請求項3之工程化免疫細胞，其中該第一核酸序列在5'至3'方向上包含：編碼抗CD3ε抗體之序列；編碼Myc標籤之序列；編碼(GGGGS) 4序列之序列；及編碼包含胺基酸序列KDEL之該ER滯留信號之序列。
- 如請求項1或2之工程化免疫細胞，其中該第二核酸序列及該第三核酸序列位於同一核酸分子上。
- 如請求項9之工程化免疫細胞，其中該同一核酸分子為載體。
- 如請求項10之工程化免疫細胞，其中該第一核酸序列位於與該第二核酸序列或該第三核酸序列分開的核酸分子上，且其中具有該第一核酸序列之該核酸分子為第一表現載體。
- 如請求項1或2之工程化免疫細胞，其進一步包含編碼殺傷基因之第四核酸序列。
- 如請求項12之工程化免疫細胞，其中該殺傷基因包含CD20或其衍生物。
- 如請求項12之工程化免疫細胞，其中該第一表現載體進一步包含該第四核酸序列。
- 如請求項14之工程化免疫細胞，其中該第一表現載體進一步包含該第一核酸序列與該第四核酸序列之間的核糖體密碼子跳躍位點。
- 如請求項15之工程化免疫細胞，其中該第一表現載體自5'至3'包含啟動子、該第四核酸序列、該核糖體密碼子跳躍位點及該第一核酸序列。
- 如請求項15之工程化免疫細胞，其中該核糖體密碼子跳躍位點包含2A自裂解肽。
- 如請求項11之工程化免疫細胞，其中該第一表現載體為慢病毒載體。
- 如請求項1或2之工程化免疫細胞，其中該CAR包含結合至表面多肽之目標結合域。
- 如請求項1或2之工程化免疫細胞，其中該表面多肽為CD7。
- 如請求項19之工程化免疫細胞，其中該表面多肽結合域為第一抗體或其抗原結合域，且該目標結合域為第二抗體或其抗原結合域，且其中該第一抗體之胺基酸序列與該第二抗體之胺基酸序列至少80%一致。
- 如請求項21之工程化免疫細胞，其中該第一抗體及該第二抗體之HC CDR及/或LC CDR之胺基酸序列至少90%一致。
- 如請求項21之工程化免疫細胞，其中該第一抗體包含SEQ ID NO: 47之HC CDR1、SEQ ID NO: 48之HC CDR2、SEQ ID NO: 49之HC CDR3以及SEQ ID NO: 44之輕鏈(LC) CDR1、SEQ ID NO: 45之LC CDR2、SEQ ID NO: 46之LC CDR3。
- 如請求項21之工程化免疫細胞，其中該第二抗體包含SEQ ID NO: 47之HC CDR1、SEQ ID NO: 48之HC CDR2、SEQ ID NO: 49之HC CDR3以及SEQ ID NO: 44之輕鏈(LC) CDR1、SEQ ID NO: 45之LC CDR2、SEQ ID NO: 46之LC CDR3。
- 如請求項1或2之工程化免疫細胞，其中結合至該TCR複合物之該次單元的該域包含抗體或其抗原結合域。
- 如請求項25之工程化免疫細胞，其中該抗體為抗CD3ε抗體。
- 如請求項25之工程化免疫細胞，其中該抗體為單鏈Fv (scFv)或單域抗體(sdAb)。
- 如請求項26之工程化免疫細胞，其中該抗CD3ε抗體包含SEQ ID NO: 212或215之重鏈互補決定區(HC CDR) 1、SEQ ID NO: 213或216之HC CDR2、SEQ ID NO: 214或217之HC CDR3以及SEQ ID NO: 218或221之輕鏈(LC) CDR1、SEQ ID NO: 219或222之LC CDR2、SEQ ID NO: 220或223之LC CDR3。
- 如請求項28之工程化免疫細胞，其中該抗CD3ε抗體包含具有與SEQ ID NO: 114具有至少90%序列一致性之胺基酸序列的重鏈可變域。
- 如請求項28之工程化免疫細胞，其中該抗CD3ε抗體包含具有與SEQ ID NO: 115具有至少90%序列一致性之胺基酸序列的輕鏈可變域。
- 如請求項28之工程化免疫細胞，其中該抗CD3ε抗體包含與SEQ ID NO: 104具有至少90%序列一致性之胺基酸序列。
- 如請求項10之工程化免疫細胞，其中該載體為第二表現載體，且其中該第二表現載體為雙順反子慢病毒表現載體。
- 如請求項1或2之工程化免疫細胞，其中該第二核酸序列及該第三核酸序列藉由內部核糖體進入位點(IRES)或核糖體密碼子跳躍位點可操作地連接。
- 如請求項33之工程化免疫細胞，其中該核糖體密碼子跳躍位點包含2A自裂解肽。
- 如請求項1或2之工程化免疫細胞，其中該合成定位域或該合成表面多肽定位域包含內質網(ER)滯留序列、高基氏體(Golgi)滯留序列、蛋白酶體定位序列或跨膜域。
- 如請求項35之工程化免疫細胞，其中該ER滯留序列包含胺基酸序列KDEL或KKXX，其中X為任何胺基酸。
- 如請求項35之工程化免疫細胞，其中該ER滯留序列包含胺基酸序列KDEL，且該第三核酸序列進一步包含編碼偶聯該表面多肽結合域與該合成表面多肽定位域之連接子的序列。
- 如請求項35之工程化免疫細胞，其中該合成定位域及該合成表面多肽定位域包含相同的ER滯留序列。
- 如請求項19之工程化免疫細胞，其中該CAR進一步包含跨膜域、4-1BB細胞內信號傳導域及CD3ζ細胞內信號傳導域。
- 如請求項1或2之工程化免疫細胞，其中該TCR複合物及該表面多肽之表面表現在該工程化免疫細胞中下調。
- 如請求項1或2之工程化免疫細胞，其中該工程化免疫細胞為T細胞。
- 如請求項1或2之工程化免疫細胞，其中該工程化免疫細胞為自然殺手(NK)細胞。
- 一種工程化免疫細胞，其包含： 第一核酸序列，其編碼連接至合成定位域之CD3ε結合域，其中該CD3ε結合域包含SEQ ID NO: 212或215之重鏈互補決定區(HC CDR1)、SEQ ID NO: 213或216之HC CDR2、SEQ ID NO: 214或217之HC CDR3以及SEQ ID NO: 218或221之輕鏈(LC) CDR1、SEQ ID NO: 219或222之LC CDR2、SEQ ID NO: 220或223之LC CDR3； 第二核酸序列，其編碼嵌合抗原受體(CAR)；及 第三核酸序列，其編碼連接至合成表面多肽定位域之表面多肽結合域。
- 如請求項43之工程化免疫細胞，其中該CD3ε結合域包含具有與SEQ ID NO: 114具有至少90%序列一致性之胺基酸序列的重鏈可變域。
- 如請求項43或44之工程化免疫細胞，其中該CD3ε結合域包含具有與SEQ ID NO: 115具有至少90%序列一致性之胺基酸序列的輕鏈可變域。
- 如請求項43或44之工程化免疫細胞，其中該CD3ε結合域包含與SEQ ID NO: 104具有至少90%序列一致性之胺基酸序列。
- 如請求項43或44之工程化免疫細胞，其中該合成定位域包含ER滯留信號。
- 如請求項47之工程化免疫細胞，其中該ER滯留信號包含胺基酸序列KDEL。
- 如請求項47之工程化免疫細胞，其中該合成定位域進一步包含Myc標籤。
- 如請求項47之工程化免疫細胞，其中該合成定位域進一步包含連接子序列。
- 如請求項47之工程化免疫細胞，其中該第一核酸序列在5'至3'方向上包含：編碼結合至TCR複合物之次單元之域的序列；編碼Myc標籤之序列；編碼(GGGGS)4序列之序列；及編碼包含胺基酸序列KDEL之該ER滯留信號之序列。
- 如請求項47之工程化免疫細胞，其中該第一核酸序列在5'至3'方向上包含：編碼抗CD3ε抗體之序列；編碼Myc標籤之序列；編碼(GGGGS)4序列之序列；及編碼包含胺基酸序列KDEL之該ER滯留信號之序列。
- 如請求項43或44之工程化免疫細胞，其中該第二核酸序列及該第三核酸序列位於同一核酸分子上。
- 如請求項53之工程化免疫細胞，其中該同一核酸分子為載體。
- 如請求項54之工程化免疫細胞，其中該第一核酸序列位於與該第二核酸序列或該第三核酸序列分開的核酸分子上，且其中具有該第一核酸序列之該核酸分子為第一表現載體。
- 如請求項43或44之工程化免疫細胞，其進一步包含編碼殺傷基因之第四核酸序列。
- 如請求項56之工程化免疫細胞，其中該殺傷基因包含CD20或其衍生物。
- 如請求項56之工程化免疫細胞，其中該第一表現載體進一步包含該第四核酸序列。
- 如請求項58之工程化免疫細胞，其中該第一表現載體進一步包含該第一核酸序列與該第四核酸序列之間的核糖體密碼子跳躍位點。
- 如請求項59之工程化免疫細胞，其中該第一表現載體自5'至3'包含啟動子、該第四核酸序列、該核糖體密碼子跳躍位點及該第一核酸序列。
- 如請求項59之工程化免疫細胞，其中該核糖體密碼子跳躍位點包含2A自裂解肽。
- 如請求項55之工程化免疫細胞，其中該第一表現載體為慢病毒載體。
- 如請求項43或44之工程化免疫細胞，其中該CAR包含結合至表面多肽之目標結合域。
- 如請求項43或44之工程化免疫細胞，其中該表面多肽為CD7。
- 如請求項63之工程化免疫細胞，其中該表面多肽結合域為第一抗體或其抗原結合域，且該目標結合域為第二抗體或其抗原結合域，且其中該第一抗體之胺基酸序列與該第二抗體之胺基酸序列至少80%一致。
- 如請求項65之工程化免疫細胞，其中該第一抗體及該第二抗體之HC CDR及/或LC CDR之胺基酸序列至少90%一致。
- 如請求項65之工程化免疫細胞，其中該第一抗體包含SEQ ID NO: 47之HC CDR1、SEQ ID NO: 48之HC CDR2、SEQ ID NO: 49之HC CDR3以及SEQ ID NO: 44之輕鏈(LC) CDR1、SEQ ID NO: 45之LC CDR2、SEQ ID NO: 46之LC CDR3。
- 如請求項65之工程化免疫細胞，其中該第二抗體包含SEQ ID NO: 47之HC CDR1、SEQ ID NO: 48之HC CDR2、SEQ ID NO: 49之HC CDR3以及SEQ ID NO: 44之輕鏈(LC) CDR1、SEQ ID NO: 45之LC CDR2、SEQ ID NO: 46之LC CDR3。
- 如請求項54之工程化免疫細胞，其中該載體為第二表現載體，且其中該第二表現載體為雙順反子慢病毒表現載體。
- 如請求項43或44之工程化免疫細胞，其中該第二核酸序列及該第三核酸序列藉由內部核糖體進入位點(IRES)或核糖體密碼子跳躍位點可操作地連接。
- 如請求項70之工程化免疫細胞，其中該核糖體密碼子跳躍位點包含2A自裂解肽。
- 如請求項43或44之工程化免疫細胞，其中該合成定位域或該合成表面多肽定位域包含內質網(ER)滯留序列、高基氏體滯留序列、蛋白酶體定位序列或跨膜域。
- 如請求項72之工程化免疫細胞，其中該ER滯留序列包含胺基酸序列KDEL或KKXX，其中X為任何胺基酸。
- 如請求項72之工程化免疫細胞，其中該ER滯留序列包含胺基酸序列KDEL，且該第三核酸序列進一步包含編碼偶聯該表面多肽結合域與該合成表面多肽定位域之連接子的序列。
- 如請求項72之工程化免疫細胞，其中該合成定位域及該合成表面多肽定位域包含相同的ER滯留序列。
- 如請求項63之工程化免疫細胞，其中該CAR進一步包含跨膜域、4-1BB細胞內信號傳導域及CD3ζ細胞內信號傳導域。
- 如請求項43或44之工程化免疫細胞，其中該TCR複合物及該表面多肽之表面表現在該工程化免疫細胞中下調。
- 如請求項43或44之工程化免疫細胞，其中該工程化免疫細胞為T細胞。
- 如請求項43或44之工程化免疫細胞，其中該工程化免疫細胞為自然殺手(NK)細胞。
- 一種細胞群體，其包含工程化免疫細胞，其中該等工程化免疫細胞包含： (a)第一核酸序列，其編碼連接至合成定位域的結合至T細胞受體(TCR)複合物之次單元之域；及 (b)第二核酸序列，其編碼嵌合抗原受體(CAR)；且 其中少於2%之該等細胞在其表面上表現該TCR複合物。
- 如請求項80之細胞群體，其中該等工程化免疫細胞進一步包含第三核酸序列，其編碼連接至合成表面多肽定位域之表面多肽結合域。
- 如請求項80或81之細胞群體，其中該等工程化免疫細胞中之各者包含的該第一核酸序列多達該第二核酸序列或該第三核酸序列之至少兩倍。
- 如請求項80或81之細胞群體，其中該第二核酸序列及該第三核酸序列位於同一核酸分子上。
- 如請求項83之細胞群體，其中該同一核酸分子為載體。
- 如請求項80或81之細胞群體，其中該第一核酸序列位於與該第二核酸序列或該第三核酸序列分開的核酸分子上，且其中具有該第一核酸序列之該核酸分子為第一表現載體。
- 如請求項80或81之細胞群體，其進一步包含編碼殺傷基因之第四核酸序列。
- 如請求項86之細胞群體，其中該殺傷基因包含CD20或其衍生物。
- 如請求項86之細胞群體，其中該第一表現載體進一步包含該第四核酸序列。
- 如請求項88之細胞群體，其中該第一表現載體進一步包含該第一核酸序列與該第四核酸序列之間的核糖體密碼子跳躍位點。
- 如請求項89之細胞群體，其中該第一表現載體自5'至3'包含啟動子、該第四核酸序列、該核糖體密碼子跳躍位點及該第一核酸序列。
- 如請求項89之細胞群體，其中該核糖體密碼子跳躍位點包含2A自裂解肽。
- 如請求項85之細胞群體，其中該第一表現載體為慢病毒載體。
- 如請求項80或81之細胞群體，其中該TCR複合物之該次單元為CD3ε。
- 如請求項80或81之細胞群體，其中結合至該TCR複合物之該次單元的該域包含抗體或其抗原結合域。
- 如請求項94之細胞群體，其中該抗體為抗CD3ε抗體。
- 如請求項94之細胞群體，其中該抗體為單鏈Fv (scFv)或單域抗體(sdAb)。
- 如請求項95之細胞群體，其中該抗CD3ε抗體包含SEQ ID NO: 212或215之重鏈互補決定區(HC CDR) 1、SEQ ID NO: 213或216之HC CDR2、SEQ ID NO: 214或217之HC CDR3以及SEQ ID NO: 218或221之輕鏈(LC) CDR1、SEQ ID NO: 219或222之LC CDR2、SEQ ID NO: 220或223之LC CDR3。
- 如請求項97之細胞群體，其中該抗CD3ε抗體包含具有與SEQ ID NO: 114具有至少90%序列一致性之胺基酸序列的重鏈可變域。
- 如請求項97之細胞群體，其中該抗CD3ε抗體包含具有與SEQ ID NO: 115具有至少90%序列一致性之胺基酸序列的輕鏈可變域。
- 如請求項97之細胞群體，其中該抗CD3ε抗體包含與SEQ ID NO: 104具有至少90%序列一致性之胺基酸序列。
- 如請求項93之細胞群體，其中該等工程化免疫細胞耗盡CD3+細胞。
- 如請求項93之細胞群體，其中該等工程化免疫細胞經歷兩輪或更多輪CD3+細胞耗盡。
- 如請求項80或81之細胞群體，其中該合成定位域包含ER滯留信號。
- 如請求項103之細胞群體，其中該ER滯留信號包含胺基酸序列KDEL。
- 如請求項103之細胞群體，其中該合成定位域進一步包含Myc標籤。
- 如請求項103之細胞群體，其中該合成定位域進一步包含連接子序列。
- 如請求項103之細胞群體，其中該第一核酸序列在5'至3'方向上包含：編碼結合至該TCR複合物之次單元之該域的序列；編碼Myc標籤之序列；編碼(GGGGS)4序列之序列；及編碼包含胺基酸序列KDEL之該ER滯留信號之序列。
- 如請求項103之細胞群體，其中該第一核酸序列在5'至3'方向上包含：編碼抗CD3ε抗體之序列；編碼Myc標籤之序列；編碼(GGGGS)4序列之序列；及編碼包含胺基酸序列KDEL之該ER滯留信號之序列。
- 如請求項80或81之細胞群體，其中該CAR包含結合至表面多肽之目標結合域。
- 如請求項81之細胞群體，其中該表面多肽為CD7。
- 如請求項81之細胞群體，其中該表面多肽結合域為第一抗體或其抗原結合域，且該目標結合域為第二抗體或其抗原結合域，且其中該第一抗體之胺基酸序列與該第二抗體之胺基酸序列至少80%一致。
- 如請求項111之細胞群體，其中該第一抗體及該第二抗體之HC CDR及/或LC CDR之胺基酸序列至少90%一致。
- 如請求項111之細胞群體，其中該第一抗體包含SEQ ID NO: 47之HC CDR1、SEQ ID NO: 48之HC CDR2、SEQ ID NO: 49之HC CDR3以及SEQ ID NO: 44之輕鏈(LC) CDR1、SEQ ID NO: 45之LC CDR2、SEQ ID NO: 46之LC CDR3。
- 如請求項111之細胞群體，其中該第二抗體包含SEQ ID NO: 47之HC CDR1、SEQ ID NO: 48之HC CDR2、SEQ ID NO: 49之HC CDR3以及SEQ ID NO: 44之輕鏈(LC) CDR1、SEQ ID NO: 45之LC CDR2、SEQ ID NO: 46之LC CDR3。
- 如請求項84之細胞群體，其中該載體為第二表現載體，且其中該第二表現載體為雙順反子慢病毒表現載體。
- 如請求項81之細胞群體，其中該第二核酸序列及該第三核酸序列藉由內部核糖體進入位點(IRES)或核糖體密碼子跳躍位點可操作地連接。
- 如請求項116之細胞群體，其中該核糖體密碼子跳躍位點包含2A自裂解肽。
- 如請求項81之細胞群體，其中該合成定位域或該合成表面多肽定位域包含內質網(ER)滯留序列、高基氏體滯留序列、蛋白酶體定位序列或跨膜域。
- 如請求項118之細胞群體，其中該ER滯留序列包含胺基酸序列KDEL或KKXX，其中X為任何胺基酸。
- 如請求項118之細胞群體，其中該ER滯留序列包含胺基酸序列KDEL，且該第三核酸序列進一步包含編碼偶聯該表面多肽結合域與該合成表面多肽定位域之連接子的序列。
- 如請求項118之細胞群體，其中該合成定位域及該合成表面多肽定位域包含相同的ER滯留序列。
- 如請求項109之細胞群體，其中該CAR進一步包含跨膜域、4-1BB細胞內信號傳導域及CD3ζ細胞內信號傳導域。
- 如請求項81之細胞群體，其中該TCR複合物及該表面多肽之表面表現在該工程化免疫細胞中下調。
- 如請求項80或81之細胞群體，其中該等工程化免疫細胞為T細胞。
- 如請求項80或81之細胞群體，其中該等工程化免疫細胞為自然殺手(NK)細胞。
- 一種雙順反子載體，其包含： (a)第一核苷酸序列，其編碼殺傷基因；及 (b)第二核苷酸序列，其編碼連接至定位域之表面多肽結合域。
- 如請求項126之雙順反子載體，其中該雙順反子載體在5'至3'方向上包含：轉錄起始位點；編碼該殺傷基因之該第一核苷酸序列；核糖體密碼子跳躍位點；及編碼連接至該定位域之該表面多肽結合域之該第二核苷酸序列。
- 如請求項126或127之雙順反子載體，其中該殺傷基因編碼細胞表面抗原。
- 如請求項126或127之雙順反子載體，其中該細胞表面抗原為CD20或其衍生物。
- 如請求項126或127之雙順反子載體，其中該表面多肽結合域結合至TCR複合物之次單元。
- 如請求項130之雙順反子載體，其中該次單元為CD3ε。
- 如請求項126或127之雙順反子載體，其中該定位域包含ER滯留信號。
- 如請求項132之雙順反子載體，其中該ER滯留信號包含胺基酸序列KDEL。
- 如請求項132之雙順反子載體，其中該定位域進一步包含Myc標籤。
- 如請求項132之雙順反子載體，其中該定位域進一步包含連接子序列。
- 如請求項132之雙順反子載體，其中該第二核苷酸序列在5'至3'方向上包含：編碼該表面多肽結合域之序列；編碼Myc標籤之序列；編碼(GGGGS) 4序列之序列；及編碼包含胺基酸序列KDEL之該ER滯留信號之序列。
- 如請求項130之雙順反子載體，其中結合至該TCR複合物之該次單元的該表面多肽結合域包含抗體或其抗原結合域。
- 如請求項137之雙順反子載體，其中該抗體為抗CD3ε抗體。
- 如請求項137之雙順反子載體，其中該抗體為單鏈Fv (scFv)或單域抗體(sdAb)。
- 如請求項127之雙順反子載體，其中該核糖體密碼子跳躍位點包含2A自裂解肽。
- 如請求項126或127之雙順反子載體，其中該雙順反子載體為慢病毒載體。
- 如請求項126或127之雙順反子載體，其中該第一核苷酸序列及該第二核苷酸序列藉由內部核糖體進入位點(IRES)可操作地連接。
- 如請求項126或127之雙順反子載體，其中該定位域包含內質網(ER)滯留序列、高基氏體滯留序列、蛋白酶體定位序列或跨膜域。
- 如請求項126或127之雙順反子載體，其中該表面多肽結合域為抗CD3ε抗體或其抗原結合域。
- 如請求項144之雙順反子載體，其中該抗CD3ε抗體包含SEQ ID NO: 212或215之重鏈互補決定區(HC CDR) 1、SEQ ID NO: 213或216之HC CDR2、SEQ ID NO: 214或217之HC CDR3以及SEQ ID NO: 218或221之輕鏈(LC) CDR1、SEQ ID NO: 219或222之LC CDR2、SEQ ID NO: 220或223之LC CDR3。
- 如請求項145之雙順反子載體，其中該抗CD3ε抗體包含具有與SEQ ID NO: 114具有至少90%序列一致性之胺基酸序列的重鏈可變域。
- 如請求項145之雙順反子載體，其中該抗CD3ε抗體包含具有與SEQ ID NO: 115具有至少90%序列一致性之胺基酸序列的輕鏈可變域。
- 如請求項145之雙順反子載體，其中該抗CD3ε抗體包含與SEQ ID NO: 104具有至少90%序列一致性之胺基酸序列。
- 一種重組核酸分子，其編碼連接至合成定位域之CD3ε結合域，其中該CD3ε結合域包含SEQ ID NO: 212或215之重鏈互補決定區(HC CDR1)、SEQ ID NO: 213或216之HC CDR2、SEQ ID NO: 214或217之HC CDR3以及SEQ ID NO: 218或221之輕鏈(LC) CDR1、SEQ ID NO: 219或222之LC CDR2、SEQ ID NO: 220或223之LC CDR3，且其中該合成定位域包含長度為至少5個胺基酸之連接子序列及胺基酸序列KDEL。
- 如請求項149之重組核酸分子，其中該連接子序列包含(GGGGS)n，其中n為1至10之任何整數。
- 如請求項149或150之重組核酸分子，其中該連接子序列包含(GGGGS)4。
- 如請求項149或150之重組核酸分子，其中該合成定位域進一步包含Myc標籤。
- 如請求項149或150之重組核酸分子，其中該重組核酸分子包含SEQ ID NO: 99之序列。
- 一種工程化免疫細胞，其包含如請求項149至153中任一項之重組核酸分子。
- 一種產生工程化免疫細胞群體之方法，該方法包含： (a)將以下引入免疫細胞中： (a)第一核酸序列，其編碼連接至(ii)合成定位域的(i)結合至T細胞受體(TCR)複合物之次單元之域； (b)第二核酸序列，其編碼嵌合抗原受體(CAR)；及 (c)第三核酸序列，其編碼連接至合成表面多肽定位域之表面多肽結合域，藉此產生該工程化免疫細胞群體；及 (b)培養該工程化免疫細胞群體； 藉此在該工程化免疫細胞群體中表現該CAR且下調該TCR複合物及表面多肽之表面表現； 其中該第一核酸序列之量多達該第二核酸序列或該第三核酸序列之量的至少兩倍。
- 如請求項155之方法，其中該CAR包含結合至該表面多肽之目標結合域。
- 如請求項155或156之方法，其中該表面多肽之該下調防止該工程化免疫細胞群體由於該CAR而自相殘殺。
- 如請求項155或156之方法，其中該表面多肽包含CD7。
- 如請求項155或156之方法，其中該第二核酸序列及該第三核酸序列位於同一核酸分子上。
- 如請求項159之方法，其中該同一核酸分子為雙順反子載體。
- 如請求項155或156之方法，其中該第一核酸序列位於與該第二核酸序列或該第三核酸序列分開的核酸分子上，且其中該核酸分子為第一載體。
- 如請求項161之方法，其中引入免疫細胞中包含共轉導包含該第二核酸序列及該第三核酸序列之該雙順反子載體及包含該第一核酸序列之該第一載體。
- 如請求項161之方法，其中引入免疫細胞中包含在轉導包含該第二核酸序列及該第三核酸序列之該雙順反子載體之前0至2天轉導包含該第一核酸序列之該第一載體。
- 如請求項160之方法，其中該雙順反子載體之感染倍率(MOI)為約10。
- 如請求項160之方法，其中該第一載體之MOI為至少約20。
- 如請求項160之方法，其中該第一載體之MOI為20至40。
- 如請求項160之方法，其中該雙順反子載體之MOI與該第一載體之MOI的比率為至多約1:8。
- 如請求項160之方法，其進一步包含將編碼殺傷基因之第四核酸序列引入該等免疫細胞中。
- 如請求項168之方法，其中該殺傷基因編碼表面抗原。
- 如請求項169之方法，其中該表面抗原為CD20或其衍生物。
- 如請求項155或156之方法，其進一步包含自該工程化免疫細胞群體中耗盡表現該TCR複合物之細胞。
- 如請求項169之方法，其進一步包含富集表現該表面抗原之細胞，藉此耗盡表現該TCR複合物之細胞。
- 如請求項171之方法，其進一步包含在耗盡之前富集表現該表面抗原之細胞，藉此產生CD20+TCR-工程化免疫細胞群體。
- 如請求項171之方法，其中培養該工程化免疫細胞群體包含在該引入與該耗盡之間擴增該工程化免疫細胞群體至少5天。
- 如請求項173之方法，其中至少95%之該CD20+TCR-工程化免疫細胞群體不表現CD3。
- 如請求項155或156之方法，其中該TCR複合物之該次單元為CD3ε。
- 如請求項155或156之方法，其中結合至該TCR複合物之該次單元的該域包含抗體或其抗原結合域。
- 如請求項177之方法，其中該抗體為抗CD3ε抗體。
- 如請求項177之方法，其中該抗體為單鏈Fv (scFv)或單域抗體(sdAb)。
- 如請求項178之方法，其中該抗CD3ε抗體包含SEQ ID NO: 212或215之重鏈互補決定區(HC CDR) 1、SEQ ID NO: 213或216之HC CDR2、SEQ ID NO: 214或217之HC CDR3以及SEQ ID NO: 218或221之輕鏈(LC) CDR1、SEQ ID NO: 219或222之LC CDR2、SEQ ID NO: 220或223之LC CDR3。
- 如請求項180之方法，其中該抗CD3ε抗體包含具有與SEQ ID NO: 104具有至少90%序列一致性之胺基酸序列的重鏈可變域。
- 如請求項180之方法，其中該抗CD3ε抗體包含具有與SEQ ID NO: 105具有至少90%序列一致性之胺基酸序列的輕鏈可變域。
- 如請求項180之方法，其中該抗CD3ε抗體包含與SEQ ID NO: 104具有至少90%序列一致性之胺基酸序列。
- 如請求項155或156之方法，其中該合成定位域包含ER滯留信號。
- 如請求項184之方法，其中該ER滯留信號包含胺基酸序列KDEL。
- 如請求項184之方法，其中該合成定位域進一步包含Myc標籤。
- 如請求項184之方法，其中該合成定位域進一步包含連接子序列。
- 如請求項168之方法，其中該第一載體進一步包含該第四核酸序列。
- 如請求項188之方法，其中該第一載體自5'至3'包含啟動子、該第四核酸序列、核糖體密碼子跳躍位點及該第一核酸序列。
- 如請求項188之方法，其中該核糖體密碼子跳躍位點包含2A自裂解肽。
- 如請求項161之方法，其中該第一載體為慢病毒載體。
- 如請求項156之方法，其中該表面多肽結合域為第一抗體或其抗原結合域，且該目標結合域為第二抗體或其抗原結合域，且其中該第一抗體之胺基酸序列與該第二抗體之胺基酸序列至少80%一致。
- 如請求項192之方法，其中該第一抗體及該第二抗體之HC CDR及/或LC CDR之胺基酸序列至少90%一致。
- 如請求項192之方法，其中該第一抗體包含SEQ ID NO: 47之HC CDR1、SEQ ID NO: 48之HC CDR2、SEQ ID NO: 49之HC CDR3以及SEQ ID NO: 44之輕鏈(LC) CDR1、SEQ ID NO: 45之LC CDR2、SEQ ID NO: 46之LC CDR3。
- 如請求項192之方法，其中該第二抗體包含SEQ ID NO: 47之HC CDR1、SEQ ID NO: 48之HC CDR2、SEQ ID NO: 49之HC CDR3以及SEQ ID NO: 44之輕鏈(LC) CDR1、SEQ ID NO: 45之LC CDR2、SEQ ID NO: 46之LC CDR3。
- 如請求項160之方法，其中該第二核酸序列及該第三核酸序列藉由內部核糖體進入位點(IRES)或核糖體密碼子跳躍位點可操作地連接。
- 如請求項196之方法，其中該核糖體密碼子跳躍位點包含2A自裂解肽。
- 如請求項155或156之方法，其中該合成定位域或該合成表面多肽定位域包含內質網(ER)滯留序列、高基氏體滯留序列、蛋白酶體定位序列或跨膜域。
- 如請求項198之方法，其中該ER滯留序列包含胺基酸序列KDEL或KKXX，其中X為任何胺基酸。
- 如請求項198之方法，其中該ER滯留序列包含胺基酸序列KDEL，且該第三核酸序列進一步包含編碼偶聯該表面多肽結合域與該合成表面多肽定位域之連接子的序列。
- 如請求項198之方法，其中該合成定位域及該合成表面多肽定位域包含相同的ER滯留序列。
- 如請求項156之方法，其中該CAR進一步包含跨膜域、4-1BB細胞內信號傳導域及CD3ζ細胞內信號傳導域。
- 如請求項155或156之方法，其中該TCR複合物及該表面多肽之表面表現在該工程化免疫細胞中下調。
- 如請求項155或156之方法，其中該等工程化免疫細胞為T細胞。
- 如請求項155或156之方法，其中該等工程化免疫細胞為自然殺手(NK)細胞。
- 一種工程化免疫細胞之用途，其用於製造供治療有需要之個體之疾病所用的藥劑，該治療包含： 投與治療有效量之工程化免疫細胞，其中該等工程化免疫細胞包含： (a)第一核酸序列，其編碼連接至(ii)合成定位域的(i)結合至T細胞受體(TCR)複合物之次單元之域； (b)第二核酸序列，其編碼嵌合抗原受體(CAR)；及 (c)第三核酸序列，其編碼連接至合成表面多肽定位域之表面多肽結合域； 其中連接至該合成定位域的結合至TCR複合物之該次單元之該域下調該TCR複合物之表面表現，藉此治療該有需要之個體之該疾病。
- 如請求項206之用途，其中相比於與投與包含該第二核酸序列或該第三核酸序列但不包含該第一核酸序列之其他方面相同之免疫細胞相關的風險，投與該等工程化免疫細胞後該個體中發生移植物抗宿主疾病(GvHD)反應之風險降低。
- 如請求項206或207之用途，其中該個體患有癌症。
- 如請求項206或207之用途，其中該CAR包含結合至CD7之目標結合域。
- 如請求項206或207之用途，其中該TCR複合物之該次單元為CD3ε。
- 如請求項206或207之用途，其中該等工程化免疫細胞為T細胞或自然殺手(NK)細胞。
- 如請求項208之用途，其中該癌症包含CD7陽性癌症。
- 如請求項208之用途，其中該癌症包含急性淋巴母細胞性白血病(T-ALL)、早期T細胞前驅細胞急性淋巴母細胞性白血病(ETP-ALL)、急性骨髓性白血病或T細胞淋巴母細胞性淋巴瘤。
- 如請求項206或207之用途，其中該等工程化免疫細胞抑制該個體中之腫瘤細胞生長。
- 如請求項206或207之用途，其中結合至該TCR複合物之該次單元的該域包含抗體或其抗原結合域。
- 如請求項215之用途，其中該抗體為抗CD3ε抗體。
- 如請求項215之用途，其中該抗體為單鏈Fv (scFv)或單域抗體(sdAb)。
- 如請求項216之用途，其中該抗CD3ε抗體包含SEQ ID NO: 212或215之重鏈互補決定區(HC CDR) 1、SEQ ID NO: 213或216之HC CDR2、SEQ ID NO: 214或217之HC CDR3以及SEQ ID NO: 218或221之輕鏈(LC) CDR1、SEQ ID NO: 219或222之LC CDR2、SEQ ID NO: 220或223之LC CDR3。
- 如請求項218之用途，其中該抗CD3ε抗體包含具有與SEQ ID NO: 114具有至少90%序列一致性之胺基酸序列的重鏈可變域。
- 如請求項218之用途，其中該抗CD3ε抗體包含具有與SEQ ID NO: 115具有至少90%序列一致性之胺基酸序列的輕鏈可變域。
- 如請求項218之用途，其中該抗CD3ε抗體包含與SEQ ID NO: 104具有至少90%序列一致性之胺基酸序列。
- 如請求項206或207之用途，其中該合成定位域包含ER滯留信號。
- 如請求項222之用途，其中該ER滯留信號包含胺基酸序列KDEL。
- 如請求項222之用途，其中該合成定位域進一步包含Myc標籤。
- 如請求項222之用途，其中該合成定位域進一步包含連接子序列。
- 如請求項222之用途，其中該第一核酸序列在5'至3'方向上包含：編碼結合至該TCR複合物之次單元之該域的序列；編碼Myc標籤之序列；編碼(GGGGS) 4序列之序列；及編碼包含胺基酸序列KDEL之該ER滯留信號之序列。
- 如請求項222之用途，其中該第一核酸序列在5'至3'方向上包含：編碼抗CD3ε抗體之序列；編碼Myc標籤之序列；編碼(GGGGS) 4序列之序列；及編碼包含胺基酸序列KDEL之該ER滯留信號之序列。
- 如請求項206或207之用途，其中該第二核酸序列及該第三核酸序列位於同一核酸分子上。
- 如請求項228之用途，其中該同一核酸分子為載體。
- 如請求項206或207之用途，其中該第一核酸序列位於與該第二核酸序列或該第三核酸序列分開的核酸分子上，且其中具有該第一核酸序列之該核酸分子為第一表現載體。
- 如請求項206或207之用途，其進一步包含編碼殺傷基因之第四核酸序列。
- 如請求項231之用途，其中該殺傷基因包含CD20或其衍生物。
- 如請求項231之用途，其中該第一表現載體進一步包含該第四核酸序列。
- 如請求項233之用途，其中該第一表現載體進一步包含該第一核酸序列與該第四核酸序列之間的核糖體密碼子跳躍位點。
- 如請求項234之用途，其中該第一表現載體自5'至3'包含啟動子、該第四核酸序列、該核糖體密碼子跳躍位點及該第一核酸序列。
- 如請求項234之用途，其中該核糖體密碼子跳躍位點包含2A自裂解肽。
- 如請求項230之用途，其中該第一表現載體為慢病毒載體。
- 如請求項206或207之用途，其中該表面多肽為CD7。
- 如請求項209之用途，其中該表面多肽結合域為第一抗體或其抗原結合域，且該目標結合域為第二抗體或其抗原結合域，且其中該第一抗體之胺基酸序列與該第二抗體之胺基酸序列至少80%一致。
- 如請求項239之用途，其中該第一抗體及該第二抗體之HC CDR及/或LC CDR之胺基酸序列至少90%一致。
- 如請求項239之用途，其中該第一抗體包含SEQ ID NO: 47之HC CDR1、SEQ ID NO: 48之HC CDR2、SEQ ID NO: 49之HC CDR3以及SEQ ID NO: 44之輕鏈(LC) CDR1、SEQ ID NO: 45之LC CDR2、SEQ ID NO: 46之LC CDR3。
- 如請求項239之用途，其中該第二抗體包含SEQ ID NO: 47之HC CDR1、SEQ ID NO: 48之HC CDR2、SEQ ID NO: 49之HC CDR3以及SEQ ID NO: 44之輕鏈(LC) CDR1、SEQ ID NO: 45之LC CDR2、SEQ ID NO: 46之LC CDR3。
- 如請求項229之用途，其中該載體為第二表現載體，且其中該第二表現載體為雙順反子慢病毒表現載體。
- 如請求項228之用途，其中該第二核酸序列及該第三核酸序列藉由內部核糖體進入位點(IRES)或核糖體密碼子跳躍位點可操作地連接。
- 如請求項244之用途，其中該核糖體密碼子跳躍位點包含2A自裂解肽。
- 如請求項206或207之用途，其中該合成定位域或該合成表面多肽定位域包含內質網(ER)滯留序列、高基氏體滯留序列、蛋白酶體定位序列或跨膜域。
- 如請求項246之用途，其中該ER滯留序列包含胺基酸序列KDEL或KKXX，其中X為任何胺基酸。
- 如請求項246之用途，其中該ER滯留序列包含胺基酸序列KDEL，且該第三核酸序列進一步包含編碼偶聯該表面多肽結合域與該合成表面多肽定位域之連接子的序列。
- 如請求項246之用途，其中該合成定位域及該合成表面多肽定位域包含相同的ER滯留序列。
- 如請求項209之用途，其中該CAR進一步包含跨膜域、4-1BB細胞內信號傳導域及CD3ζ細胞內信號傳導域。
- 如請求項206或207之用途，其中該等工程化免疫細胞為T細胞。
- 如請求項206或207之用途，其中該等工程化免疫細胞為自然殺手(NK)細胞。
- 一種工程化免疫細胞群體之用途，其用於製造在有需要之個體中投與之後耗盡工程化免疫細胞的藥劑，該耗盡包含向該個體投與表現以下之該工程化免疫細胞群體： (a)對T細胞表面抗原具有特異性之嵌合抗原受體(CAR)； (b)第一蛋白質表現阻斷劑(PEBL)，其下調該T細胞表面抗原之細胞表面表現； (c)第二PEBL，其下調T細胞受體(TCR)複合物之次單元之細胞表面表現；及 (d)殺傷蛋白質。
- 如請求項253之用途，其中該殺傷蛋白質為細胞表面抗原。
- 如請求項253或254之用途，其中該細胞表面抗原為CD20或其衍生物。
- 如請求項253之用途，其中該殺傷蛋白質為經截短CD20 (CD20t)。
- 如請求項256之用途，其中該CD20t包含SEQ ID NO: 106之胺基酸序列。
- 如請求項253、254、256及257中任一項之用途，該耗盡進一步包含向該個體投與利妥昔單抗(rituximab)或奧法木單抗(ofatumumab)以誘導該工程化免疫細胞群體之消除，藉此耗盡該工程化免疫細胞群體。
- 如請求項253、254、256及257中任一項之用途，其中該個體已診斷出患有免疫病狀。
- 如請求項259之用途，其中該個體已診斷出患有T細胞惡性腫瘤。
- 如請求項253、254、256及257中任一項之用途，其中該T細胞表面抗原為CD7。
- 如請求項253、254、256及257中任一項之用途，其中該TCR複合物之該次單元為CD3ε。
- 如請求項253、254、256及257中任一項之用途，其中該工程化免疫細胞群體包含T細胞。
- 如請求項253、254、256及257中任一項之用途，其中該工程化免疫細胞群體包含自然殺手(NK)細胞。
- 一種套組，其包含： (a)第一表現載體，其包含編碼連接至(ii)合成定位域的(i)結合至T細胞受體(TCR)複合物之次單元之域的核苷酸序列及編碼殺傷基因之核苷酸序列；及 (b)第二表現載體，其包含編碼嵌合抗原受體(CAR)之核苷酸序列及編碼連接至合成表面多肽定位域之表面多肽結合域之核苷酸序列。
- 如請求項265之套組，其中該第一表現載體或該第二表現載體為反轉錄病毒載體。
- 如請求項265或266之套組，其中該第一表現載體或該第二表現載體為慢病毒載體。
- 如請求項265或266之套組，其中該CAR包含結合至CD7之目標結合域。
- 如請求項265或266之套組，其中該表面多肽為CD7。
- 如請求項265或266之套組，其中該TCR複合物之該次單元為CD3ε。
- 如請求項265或266之套組，其中編碼連接至(ii)合成定位域的(i)結合至TCR複合物之次單元之該域的該核苷酸序列及編碼該殺傷基因之該核苷酸序列藉由內部核糖體進入位點(IRES)或核糖體密碼子跳躍位點可操作地連接。
- 如請求項265或266之套組，其中編碼該CAR之該核苷酸序列及編碼連接至該合成表面多肽定位域之該表面多肽結合域之該核苷酸序列藉由內部核糖體進入位點(IRES)或核糖體密碼子跳躍位點可操作地連接。
- 如請求項271之套組，其中該核糖體密碼子跳躍位點包含2A自裂解肽。
- 如請求項265或266之套組，其中該第一表現載體及該第二表現載體以至少2:1之比率混合。
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