CN101873862A - 组合物和治疗性抗肿瘤疫苗 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种组合物，其在宿主中诱导针对表达抗原之细胞特别是肿瘤细胞的细胞毒性细胞应答，并且包含含有所述抗原的红细胞。这些红细胞可以与免疫球蛋白特别是IgG形成免疫复合物，所述免疫球蛋白识别红细胞表面上的表位，和/或这些红细胞可以经过热处理或化学处理以促进所述红细胞被树突细胞吞噬。作为一种变化形式，所述红细胞可以是异种红细胞。本发明还涉及含有该组合物的治疗剂，特别是抗肿瘤疫苗。

Description

组合物和治疗性抗肿瘤疫苗
相关申请的交叉引用
本申请要求2007年8月9日提交的美国临时专利申请60/954,917以及2007年8月8日提交的法国专利申请FR 0705767的优先权，这两件专利申请在此通过引用并入本文。
本发明涉及在宿主中诱导抗肿瘤目的的细胞毒性应答的组合物，还涉及含有该组合物的治疗性抗肿瘤疫苗。
针对肿瘤抗原的天然免疫应答相对无效，已经确定了多种使得肿瘤逃避抗肿瘤免疫应答的机制。常规疫苗方法产生的体液应答已被证明是不够的。
已经研究了产生基于抗原呈递细胞(APC)特别是基于树突细胞的细胞毒性应答的策略。其原理具体地为通过激活患者自身免疫防御来破坏癌细胞。
树突细胞是抗原呈递细胞(APC)，其在产生肿瘤细胞特异性细胞毒性效应器方面非常有效。它们能够吞噬凋亡细胞或来源于肿瘤细胞的凋亡小体，然后能够与MHC I类和II类分子联合将肿瘤抗原呈递至T淋巴细胞。因此，树突细胞能够启动特异性溶细胞性T淋巴细胞克隆的增殖和产生。在该反应结束时，如此分化的杀伤淋巴细胞离开淋巴区室，从而在生物体内循环并结合到肿瘤上。对肿瘤所表达抗原进行识别，随后诱导溶解信号，导致肿瘤细胞的破坏。
已经研究了一些靶向树突细胞的抗癌疫苗的策略(Eymard JC，Bernard J，Bull Cancer.2003，90(8-9)：734-43)。其中一些是基于对树突细胞进行体外操纵，另一些是基于体内激活树突细胞。在前一种情况中，将树突细胞从取自患者的血细胞中分离出来；对它们进行培养并使其成熟，“脉冲刺激”，即用肿瘤肽、肿瘤裂解物、凋亡肿瘤细胞或者提取自自体肿瘤的热休克蛋白进行离体激活，最后再注射进该患者体内。在第二种情况中，在将肽、蛋白、经辐照的肿瘤细胞或者包含靶向树突细胞的抗原性肽的病毒注射到患者体内之后进行树突细胞的激活。然而，所获得的细胞毒性应答很少伴随临床效果。树突细胞的活化成为其有效活化溶细胞性T淋巴细胞能力的条件。树突细胞的活化水平似乎是本疫苗策略中的关键点。
离体使用树突细胞以获得抗肿瘤疫苗带来了有关下列项的一些问题：树突细胞的成熟状态，待注射细胞的数目，产生能够迁移到二级淋巴器官并诱导有效细胞毒性T应答之树突细胞的注射的途径、部位和频率(Banchereau J，Schuler-Thurner B，Palucka AK，Schuler G.[Dendriticcells as vectors for therapy]Cell.2001，10，106(3)：271-4.)。
树突细胞在体内的活化部分地受到以下限制：肿瘤抗原的弱免疫原性能力以及以充足的水平活化树突细胞的难度。
在数个出版物中已有设想使用红细胞作为载体来运输抗原并递送给APC的用途，其中抗原被包封到红细胞中或者结合到其表面上。已经在体内和体外研究了引发的免疫应答。
Hamidi等人最近描述了将BSA(牛血清白蛋白)作为抗原模型包封到人红细胞中(Hamidi M等人.，Drug Deliv.，2007；14(5)：295-300以及lntJ Pharm.，2007，29，338(1-2)：70-8)。作者建议将红细胞用作载体来将抗原呈递到网状内皮系统(RES)的APC中。在Hamidi等人发表的另一篇综述(J.Control.Release，2007，118(2)：145-60)中，作者指出已经研究了数种策略以促进靶向RES，所述靶向是由红细胞的衰老促进的，导致它们被摄取从而被裂解。还提到了其它途径，例如使红细胞暴露于稳定剂(特别是交联剂)，用抗RH抗体包裹红细胞，用IgG类型的抗体靶向脾脏或者用IgM类型的抗体靶向肝脏，热休克或者暴露于氧化剂、酶或抗生素。
在用装载抗原的红细胞免疫后可在体内获得体液免疫应答。由Murray等人进行的研究使得可在小鼠中静脉内注射装载了下列四种抗原之一的小鼠红细胞之后检测IgG免疫球蛋白：KLH(钥孔帽贝血蓝蛋白)、BSA(牛血清白蛋白)、CTB(霍乱毒素b亚基)以及ADA(牛腺苷脱氨酶)。检测到在Th2应答期间主要的免疫球蛋白同种型IgG1和IgG3以及Th1应答标志物IgG2免疫球蛋白同种型，表明涉及两种类型的免疫应答，即体液应答和细胞应答(Murray AM et al.，Vaccine.，200628，24(35-36)：6129-39)。
与红细胞一起使用的另一种抗原制剂已由Dominici等人进行了测试。HIV-1病毒的Tat蛋白通过亲和素/生物素偶联锚定到小鼠红细胞的表面上。通过腹膜内注射该抗原制剂对小鼠进行免疫，所述制剂被树突细胞内化，引发体液介导的体内免疫应答。所测得的免疫球蛋白的同种型表征显示出诱导Th1和Th2应答。针对用偶联了所述抗原的红细胞处理的小鼠，通过常规的铬释放方法体外显示了抗Tat细胞毒活性。(Dominici S et al.，Vaccine.，200316，21(17-18)：2073-81)。
Corinti等人已经使用相同的制剂在体外证明了细胞应答。如CD4+和CD8+应答的诱导，来源于人单核细胞的树突细胞显示出对缀合Tat蛋白的红细胞的细胞吞噬作用。此外，在干扰素γ存在下树突细胞的成熟促进了I型免疫应答(Corinti S.et al.，Leukoc.Biol.2002，71(4)：652-8)。
Boberg等人给小鼠腹膜内注射来源于HIV-1蛋白酶的肽组成且通过亲和素/生物素体系锚定于小鼠红细胞表面的疫苗。它们从化学上修饰了红细胞，以促进它们被APC所识别，但是获得了弱的免疫反应。他们得出如下结论：由于红细胞有限装载抗原肽，所以递送的抗原量少，所注射的血容量并没有被原本认为促进APC抗原识别的载体的化学修饰所补偿(Boberg A.et al.，Infect.Agents Cancer.，2007，182：9)。
本发明的目的是提供可用于根据免疫治疗方法治疗癌症的组合物和疫苗。
因此，本发明的目的之一是在宿主中诱导针对肿瘤细胞的细胞毒性细胞应答的组合物，并且所述组合物包含含有肿瘤抗原的红细胞。
术语“宿主”优选指人，但也指动物，特别是宠物(特别是狗或猫)以及运动用动物(animals for sport)(特别是马)。
根据本发明，所述红细胞含有所述抗原，即包封有所述抗原，其意指该抗原在红细胞内部或基本上在红细胞内部。
优选地，对所述红细胞进行设计、选择或修饰，以促进其被APC吞噬，最特别是被树突细胞吞噬。特别地，对所述红细胞进行设计、选择或修饰以促进其在脾脏和肝脏中被吞噬，主要目标是靶向脾脏的APC。
在一个优选的实施方案中，根据本发明的组合物包含有所述抗原并靶向脾脏的红细胞。所述组合物促进这些红细胞在脾脏中被APC特别是树突细胞吞噬。
根据一个实施方案，所述红细胞含有肿瘤抗原，并且是与识别所述红细胞表面上表位的免疫球蛋白形成的免疫复合物，以促进所述红细胞被吞噬，特别是被树突细胞吞噬。所述组合物还可促进被巨噬细胞的吞噬。优选地，所述免疫球蛋白是免疫球蛋白G。
所述免疫复合物的形成包括红细胞和至少一种抗体，优选IgG亚型。树突细胞在其表面上具有免疫球蛋白G(IgG)的恒定Fc区的受体。这些受体能引发所述抗原-IgG免疫复合物被吞噬或内化，由此形成并促进MHC I类和II类分子的抗原呈递，导致产生CD4+辅助淋巴细胞，特别是CD8+细胞毒性淋巴细胞(A.Regnault et al.，J.Exp.Med.，Janvier 1999，189(2)：371-80)。
作为合适的抗体，可提及抗恒河猴(anti-rhesus)抗体、抗血型糖蛋白A抗体和抗CR1抗体(CR1＝补体受体1型)。抗血型蛋白A抗体(A.Bigbee et al.，Mol.Immunol.，December 1983，20(12)：1353-62)是优选的形式。
优选地，用于形成免疫复合物的来源于人的红细胞是来自于供体的异体红细胞。
根据另一个实施方案，所述红细胞含有肿瘤抗原并且被热或化学修饰，以促进所述红细胞被吞噬，特别是被树突细胞吞噬。所述组合物还可促进被巨噬细胞的吞噬。
特别地，在下列条件下进行热处理：在约42至约55℃下、优选约47至约51℃下，加热红细胞约15分钟至约90分钟、优选约25至约50分钟。通常，在约48至约50℃例如约48℃下，加热红细胞约30分钟。
使用修饰红细胞表面的物质进行化学处理，特别是桥连剂或交联剂，例如辛二酸双(硫代琥珀酰亚胺基)酯(BS3或BS3)、戊二醛或神经氨酸酶。
在一个具体的实施方案中，将至少两种靶向方法相结合，例如所述组合物包含含有抗原的红细胞，其为免疫复合物形式，并且被热或化学处理，以促进它们在脾脏和/或肝脏(优选脾脏)中的摄取，以及促进它们被APC特别是树突细胞吞噬。
在另一个实施方案中，所述含抗原红细胞是异种的。将异种红细胞注射进人体导致患者的天然抗体与所注射红细胞相结合。由此形成的免疫复合物促进其被APC吞噬，特别是被树突细胞吞噬。优选地，所述红细胞是猪来源的。
在一个具体的实施方案中，所述异种红细胞经热或化学修饰以促进其被吞噬。
根据本发明的组合物可包含一种或多种肿瘤抗原。在存在数种肿瘤抗原时，优选选择所述肿瘤抗原以诱导针对一种类型的肿瘤或肿瘤细胞的免疫应答。
所述组合物优选包含至少两种代表所治疗肿瘤的肿瘤抗原。目的是产生多个细胞毒性T淋巴细胞克隆，其各自识别特异性抗原性肽，以产生更有效的免疫应答。
在一个具体的实施方案中，所述组合物包含至少两个红细胞群，其各自包封不同的抗原。
可用于本文的最众所周知的抗原示于下表中，在表中按种类对其进行分类。
独特抗原：
  基因/蛋白质   肿瘤
  α-辅肌动蛋白-4   肺癌
  基因/蛋白质   肿瘤
  ARTC1   黑素瘤
  BCR-ABL融合蛋白(b3a2)   慢性髓性白血病
  B-RAF   黑素瘤
  CASP-5   结肠直肠癌、胃癌和子宫内膜癌
  CASP-8   头颈部鳞状细胞癌
  β-联蛋白(catenin)   黑素瘤
  Cdc27   黑素瘤
  CDK4   黑素瘤
  CDKN2A   黑素瘤
  COA-1   结肠直肠癌
  dek-can融合蛋白   髓性白血病
  EFTUD2   黑素瘤
  延伸因子2   肺鳞状细胞癌
  ETV6-AML1融合蛋白   急性淋巴细胞性白血病
  FN1   黑素瘤
  GPNMB   黑素瘤
  LDLR-岩藻糖基转移酶AS融合蛋白   黑素瘤
  HLA-A2d   肾细胞癌
  HLA-A11d   黑素瘤
  基因/蛋白质   肿瘤
  hsp70-2   肾细胞癌
  KIAAO205   膀胱肿瘤
  MART2   黑素瘤
  ME1   “非小细胞”肺癌
  MUM-1f   黑素瘤
  MUM-2   黑素瘤
  MUM-3   黑素瘤
  neo-PAP   黑素瘤
  肌球蛋白I类   黑素瘤
  NFYC   肺鳞状细胞癌
  OGT   结肠直肠癌
  OS-9   黑素瘤
  pml-RARα-融合蛋白   原髓细胞白血病
  PRDX5   黑素瘤
  PTPRK   黑素瘤
  K-ras   胰腺腺癌
  N-ras   黑素瘤
  RBAF600   黑素瘤
  SIRT2   黑素瘤
  SNRPD1   黑素瘤
  基因/蛋白质   肿瘤
  SYT-SSX1或SYT-SSX2融合蛋白   肉瘤
  磷酸丙糖异构酶   黑素瘤
  FLT3-ITD   急性髓样白血病
  p53   头颈部鳞状癌
数种肿瘤的常见抗原：
a)肿瘤特异性抗原
  基因
  BAGE-1
  GAGE-1，2，8
  GAGE-3，4，5，6，7
  GnTVf
  HERV-K-MEL
  KK-LC-1
  KM-HN-1
  LAGE-1
  MAGE-A1
  MAGE-A2
  MAGE-A3
  MAGE-A4
  MAGE-A6
  基因
  MAGE-A9
  MAGE-A10
  MAGE-A12
  MAGE-C2
  粘蛋白k
  NA-88
  NY-ESO-1/LAGE-2
  SAGE
  Sp17
  SSX-2
  SSX-4
  TRAG-3
  TRP2-INT2g
b)分化抗原
  基因/蛋白质   肿瘤
  CEA   肠癌
  gp 100/Pmel17   黑素瘤
  激肽释放酶4   前列腺
  乳腺珠蛋白-A(mammaglobin-A)   乳癌
  黑色素-A/MART-1   黑素瘤
  基因/蛋白质   肿瘤
  NY-BR-1   乳癌
  OA1   黑素瘤
  PSA   前列腺癌
  RAB38/NY-MEL-1   黑素瘤
  TRP-1/gp 75   黑素瘤
  TRP-2   黑素瘤
  酪氨酸酶   黑素瘤
c)过表达抗原
  基因   组织表达
  亲脂素(adipophilin)   脂肪细胞、巨噬细胞
  AIM-2   普遍存在(低水平)
  BING-4   普遍存在(低水平)
  CPSF   普遍存在(低水平)
  细胞周期素D1   普遍存在(低水平)
  Ep-CAM   上皮细胞
  EphA3   许多
  FGF5   脑、肾
  G250/MN/CAIX   胃、肝脏、胰腺
  HER-2/neu   普遍存在(低水平)
  IL 13Rα2
  基因   组织表达
  肠羧基酯酶   肝脏、肠、肾
  甲胎蛋白   肝脏
  M-CSF   肝脏、肾
  mdm-2   普遍存在(脑、肌肉、肺)
  MMP-2   普遍存在
  MUC1   腺上皮
  p53   普遍存在(低水平)
  PBF   卵巢、胰腺、脾脏、肝脏
  PRAME   睾丸、卵巢、子宫内膜、肾上腺
  PSMA   前列腺、CNS、肝脏
  RAGE-1   视网膜
  RNF43
  RU2AS   睾丸、肾、膀胱
  分离蛋白1(secernin 1)   普遍存在
  SOX10   普遍存在(低水平)
  STEAP1   前列腺
  存活蛋白(survivin)   普遍存在
  端粒酶   睾丸、胸腺、骨髓、淋巴结
  WT1   睾丸、卵巢、骨髓、脾脏
  BCLX(L)   普遍存在(低水平)
  基因   组织表达
  DKK1   睾丸、前列腺、间质干细胞
  ENAH(hMena)   乳房、前列腺、结肠直肠基质和上皮、胰腺、上皮
  MCSP   上皮细胞、软骨细胞、非横纹肌细胞
  RGS5   心脏、骨骼肌、周边细胞
Van der Bruggen等人已开发了一个引用了T淋巴细胞识别的并且可用于本发明癌症免疫疗法的所有人肿瘤抗原的数据库：http://www.cancerimmunity.org/peptidedatabase/Tcellepitopes.htm.
其它可用于本发明的抗原有例如：胃泌素17、人绒毛膜促性腺激素、EGFRvIII、HER2、HER2/neu、P501、鸟苷酸环化酶C、PAP。
词语“抗原”涵盖天然或合成或人工来源的抗原，来源于待治疗患者的抗原，抗原片段、衍生物或变体，只要该抗原能够引发合适的免疫应答即可。所述抗原可以是例如提取的、化学合成的或者通过遗传工程产生的。
为了产生有效的免疫应答，树突细胞必须是有活性且成熟的，它们必须产生细胞因子和趋化因子，并且表达募集和活化T淋巴细胞所需的共刺激分子。
可使用多种类型的佐剂来激活APC，特别是树突细胞。细菌或病毒RNA或DNA、热休克蛋白(HSP)、糖、免疫复合物和细胞因子是诱导特异性受体(Toll样受体TLR、甘露糖受体)激活介导的APC成熟特别是树突细胞成熟的多种因子。巨噬细胞和树突细胞在其表面上并非都表达相同的受体。因此，佐剂的选择涉及能够在人体中产生细胞毒性免疫应答并且其受体存在于摄取本发明红细胞的细胞表面上(因此特别是在树突细胞表面上)的分子。
根据一个实施方案，所述佐剂被包封到红细胞内部或者附着于红细胞表面上的分子。它们优选为含有所述抗原的红细胞。
或者，所述佐剂被装到独立治疗的其它红细胞内部或者附着于其上。这些红细胞也可经过修饰或选择，以促进其被APC吞噬，特别是被树突细胞吞噬。因此，如上所述，它们可以是免疫复合物形式，或者是被热或化学修饰的，或者是异种的。
根据另一个实施方案，所述佐剂是分开的佐剂组合物，其可以与包含所述抗原的红细胞同时或分别施用。
不言而喻，只要所述佐剂可以处于分开的组合物(红细胞组合物或佐剂组合物)中，该佐剂就可以分开施用的方式与含有所述抗原的红细胞伴随施用、或者以混合物的形式一起施用，或者分别施用，例如在施用包含所述抗原的红细胞之后，特别是间隔数小时或数天施用。
在可以使用的佐剂中，首先可提及下文的优选佐剂：
-TLR(Toll样受体)配体，特别是咪唑并喹啉类，例如优选：咪唑并喹啉，例如咪唑并喹啉CL097、咪喹莫特、雷西莫特；CpG寡聚脱氧核苷酸；LPS(脂多糖)；聚(肌苷酸)-(聚胞苷酸)聚(I:C)；
-细胞因子，特别是：干扰素α、IL-2(白细胞介素2)、IFNγ(干扰素γ)、GM-CSF(粒细胞单核细胞-集落刺激因子)、IL-12(白细胞介素12)、TNFα(肿瘤坏死因子α)。
在其它可使用的佐剂中，可特别提及：
-细菌成分，特别是BCG(卡介苗)、MDP(胞壁酰二肽)、TDM(海藻糖二霉菌酸酯)、LPS(脂多糖)、MPL(单磷酰基脂A)；
-矿物佐剂，特别是：氢氧化铝、磷酸铝、磷酸钾和磷酸钙；
-细菌毒素，特别是：CT(来自霍乱弧菌(Vibrio cholera)的霍乱毒素)、CTB(来自霍乱弧菌的霍乱毒素)、PT(来自百日咳杆菌(Bordetellapertussis)的百日咳毒素)、LT(来自大肠杆菌(Escherichia coli)的热不稳定淋巴细胞毒素)；
-KLH，钥孔帽贝血蓝蛋白。
将活性成分包封在红细胞中的方法是已知的，本文中优选的裂解-再封的基本技术描述于专利EP-A-101 341和EP-A-679 101中，本领域技术人员可参考。根据此方法，将红细胞悬液连续充入透析元件(例如透析管或透析筒)的主要区室中，同时次要区室含有相对于所述红细胞悬液低渗的水溶液，以裂解所述红细胞；然后，在再封单元中，通过增加渗透压和/或胶体渗透压在肿瘤抗原存在下诱导红细胞的再封，然后收集含有所述肿瘤抗原的红细胞悬液。
在迄今为止描述的变化形式中，优选法国专利申请No.0408667中所述的方法，其可有效、可重现并且安全稳固地包封肿瘤抗原。此方法包括以下步骤：
1-在血细胞比容水平大于或等于65％的等渗溶液中悬浮红细胞沉淀，于+1至+8℃下冷却，
2-使用来自所述红细胞沉淀的红细胞样品测定渗透脆性，步骤1和2可以任何顺序进行(包括平行进行)，
3-肿瘤抗原的裂解和内化过程，其在相同腔室内在恒定维持在+1至+8℃的温度下进行，包括使血细胞比容水平大于或等于65％的红细胞悬液和冷却到+1至+8℃的低渗裂解溶液通过透析筒；以及根据之前测量的渗透脆性调节裂解参数；和
4-在第二腔室中进行的再封过程，在其中温度为+30至+40℃，并且存在高渗溶液。
“内化”意为肿瘤抗原渗透进入红细胞内部。
特别地，对于透析而言，将红细胞沉淀悬浮于大于或等于65％、优选大于或等于70％的高血细胞比容水平的等渗溶液中，此悬液被冷却到+1至+8℃，优选+2至6℃，通常约+4℃。根据一个具体实施方案，所述血细胞比容水平为65％至80％，优选70％至80％。
有利地，在即将进行裂解步骤之前测定所述红细胞的渗透脆性。红细胞或包含它们的悬液有利地处在接近或等于裂解所选的温度下。根据本发明的另一个有利特点，快速地进行渗透脆性的测量，即在取得样品之后很快进行裂解过程。优选地，取样和开始裂解之间的时间间隔小于或等于30分钟，更优选地小于或等于25分钟，甚至小于或等于20分钟。
关于进行所述裂解-再封过程的方式，以及测量和考虑的渗透脆性，本领域技术人员可参阅法国专利申请No.0408667以获得更多细节。
根据本发明的一个特点，根据本发明的组合物最终包含约40％至约70％、优选约45％至约55％、更优选约50％的血细胞比容水平的红细胞悬液。其优选地包装在约10至约250毫升的体积中。该包装优选是适于输血的血液袋类型。对应于医生处方的被包封肿瘤抗原的量优选全部包含于所述血液袋中。
本发明的目的之一还在于治疗性抗肿瘤疫苗，其包含有效量的一种或多种根据本发明的组合物。因此，该疫苗可包含根据本发明的组合物，在存在或不存在包封的或未包封之佐剂的情形下，其本身含有装有一种或多种肿瘤抗原的红细胞群体，或者可包含至少两种根据本发明的组合物，在存在包封或未包封之佐剂的情形下，其具有不同的装有一种或多种肿瘤抗原的红细胞群体。
本发明的目的之一还在于在患者体内诱导针对肿瘤细胞或肿瘤的细胞毒性细胞应答的方法。此方法包括向该患者施用有效量的本发明组合物，特别是通过静脉内、注射或输注，优选通过输注施用。该方法的目的尤其在于诱导患者树突细胞的活化和CD8+细胞毒性细胞应答。如上所述，获得特异性CD4+辅助和CD8+细胞毒性应答。
本发明的目的之一还在于在患者体内诱导如上所述针对肿瘤细胞或肿瘤的细胞毒性细胞应答的抗癌治疗方法。此方法包括向该患者施用有效量的本发明抗肿瘤疫苗，特别是通过静脉内、注射或输注，优选通过输注施用。
根据本发明的一个特点，施用血细胞比容水平为约40％至约70％、优选约45％至约55％、更优选50％的约10至约250毫升红细胞悬液。
本发明的目的之一还在于本发明的组合物在制备治疗性抗肿瘤疫苗中的用途。
本发明的目的之一还在于本发明的组合物用于在宿主中诱导树突细胞介导的并针对肿瘤细胞或肿瘤的细胞毒性细胞应答的用途。
本发明的的另一个目的是用作治疗性抗肿瘤疫苗的本发明组合物。
接下来，通过非限制性实施例方式的实施方案并且参考附图来进一步详细描述本发明。
图1：用抗TER 119抗体处理的“装载抗原的”红细胞在体外被脾脏树突细胞吞噬的测定。
图2：用抗TER 119抗体处理的或热处理的“装载抗原的”红细胞在体内被脾脏巨噬细胞和树突细胞吞噬的测定。
图3：该图说明在注射到小鼠体内后3天卵清蛋白特异性CD4T细胞的增殖和活化。
(A)细胞分裂导致CFSE荧光强度的降低。每次分裂时OVA-特异性CD4T细胞均失去其一半的荧光物质。所观察到的批次4的峰代表具有高CFSE含量的未分裂细胞。所有其它的峰代表已经历了1、2、3、4、5、6或7次细胞分裂的细胞。当细胞分裂多于8次时，细胞的CFSE含量几乎为0。
(B)CD44细胞活化标志物表达表示为所发生的分裂次数。
实施例1.在小鼠和人红细胞以及在猪红细胞中装入卵清蛋白的方法
变型1：
通过在透析管中进行低渗透析的方法将卵清蛋白(45kDa蛋白质，母鸡卵清蛋白)包封到小鼠红细胞(OF1小鼠或C57BI/6小鼠)中。在达到透析的70％血细胞比容之前将红细胞悬液洗涤几遍。在热处理之后发生透析时，在低摩尔渗透压浓度的裂解缓冲液中于透析管内透析约1小时或30分钟。然后，通过高摩尔渗透压浓度溶液将红细胞再封30分钟。数次洗涤之后，在缓冲液Sag-甘露醇中接受最终产物，血细胞比容达到50％。
实施例1的变型2：
本文中，通过低渗透析的方法在透析柱中将卵清蛋白包封到小鼠红细胞中。在达到透析的70％血细胞比容之前将红细胞悬液洗涤几遍。在低摩尔渗透压浓度的裂解缓冲液中于透析柱内透析约10分钟。一旦它们离开柱时，就通过高摩尔渗透压浓度溶液在37℃下将红细胞再封30分钟。数次洗涤之后，在包含葡萄糖SAG甘露醇的NaCl葡萄糖缓冲液中或去除补体的血浆中接受最终产物，血细胞比容达到50％。
实施例2.对红细胞的热处理
当根据实施例1的变型1实现包装时，在透析过程之前进行热处理。当根据实施例1的变型2实现包装时，在透析和再封过程之后、洗涤步骤和添加NaCl葡萄糖缓冲液之前进行热处理。
在达到10％血细胞比容之前将红细胞洗涤几遍。然后，将它们在48℃下加热30分钟。
实施例3.对含有卵清蛋白的红细胞进行抗体处理
在达到109个细胞/ml(对于体内试验)和108个细胞/ml(对于体外试验)之前，将包封了卵清蛋白的红细胞悬液洗涤几遍。与抗TER 119抗体(针对体外试验为10μg/ml，针对体内试验为23μg/ml或5μg/ml)一起在4℃下孵育30分钟。数次洗涤之后，在具有可注射品质的缓冲液中接受最终产物，血细胞比容达到50％。
实施例4.用辛二酸双(硫代琥珀酰亚胺基)酯(BS3)对含有卵清蛋白的红细胞进行化学处理
在达到1.7×106个细胞/微升之前用PBS将包封卵清蛋白的红细胞悬液清洗数遍，将其与一倍体积的2mM BS3缓冲溶液(该BS3溶液含有葡萄糖和磷酸盐缓冲液，pH 7.4)混合，获得1mM的BS3终浓度。在室温下将细胞孵育30分钟。加入一倍体积的20mM Tris-HCl淬灭反应。在室温下孵育5分钟之后，在4℃下以800g将混合物离心5分钟。然后，用含有葡萄糖的PBS将细胞洗两遍(以800g离心)，用SAG-甘露醇洗一遍(以1000g离心)10分钟，然后得到终产物。
实施例5.树突细胞吞噬含卵清蛋白之红细胞的体外测量
在体外测定多种处理(加热和抗体)对树突细胞吞噬根据实施例1的变型1获得的红细胞的效率的作用。用荧光标签CFSE(羧基荧光素琥珀酰亚胺酯)在4℃下标记所述红细胞20分钟。CFSE是一种透过细胞膜扩散的非荧光染料。一旦进入细胞内，该分子在被细胞内的酯酶切割之后就变成具有荧光的。
使用磁珠从C57BI/6小鼠的脾中分离树突细胞。这些珠带有识别CD11c标志物的抗体，由此可分离CD11c+树突细胞级分。
然后在37℃和5％CO2下将CFSE标记的或未标记的红细胞与树突细胞(10×106个细胞/毫升)以20∶1的比例在终体积为200微升/孔的圆底96孔培养板中一起孵育4小时，孵育4小时后，用NH4Cl裂解未被树突细胞摄取的红细胞，洗数遍。然后通过流式细胞仪测定树突细胞对CFSE荧光团(flurochrome)的捕获(R.Segura et al.，J.Immunol，January 2006，176(1)：441-50)。
对三个红细胞群体进行测试：
(A)装载有卵清蛋白但未用CFSE荧光物标记的红细胞，
(B)装载有卵清蛋白并且用CFSE荧光物标记的红细胞，
(C)装载有卵清蛋白，用抗TER 119抗体处理并且用CFSE标记的红细胞。
结果
表1：吞噬荧光红细胞的树突细胞的百分率
  红细胞群体   树突细胞％
  (A)   4％
  (B)   27％
  (C)   36％
在体外共培养4小时后，相比于未处理的红细胞，装载卵清蛋白并且用抗TER 119抗体处理的小鼠红细胞更有效地被分离自脾脏的树突细胞所吞噬(图1，分别为C和B)。36％的树突细胞吞噬带有抗体的红细胞，而仅27％的树突细胞吞噬不带抗体的红细胞。还观察到不表达CD11c树突细胞标志物的群体吞噬抗体处理的红细胞(10.9％；图1，C)。
实施例6.小鼠体内脾脏和肝脏的巨噬细胞和树突细胞对含有卵清蛋白的红细胞之吞噬作用的测定
该研究是异源性研究，因为是将含有卵清蛋白的OF1小鼠红细胞注射到非同源的C57BI/6小鼠中。
制备三批74×107个来自OF1小鼠的装载卵清蛋白(实施例1变型1)的红细胞，进行热处理、用抗TER 119抗体处理(分别如实施例2和3所述)或者不处理。按下述方式划分这些批次：
批次1：无热处理或抗体处理(图2，A和D)
批次2：热处理(图2，B和E)
批次3：用抗TER 119抗体处理(图2，C和F)。
每一批都用CFSE标记，并静脉内注射到C57BI/6小鼠体内。注射后三小时，取小鼠的血液、脾脏和肝脏。通过流式细胞仪测定小鼠血液中循环的带荧光红细胞的百分比。通过流式细胞仪测定纳入表达F4/80标志物的脾脏巨噬细胞(图2，A、B、C)中、纳入表达F4/80标志物的肝脏巨噬细胞中以及纳入表达CD11c标志物的脾脏树突细胞(图2，D、E、F)中的荧光。
结果
表2：在注射给小鼠后三个小时吞噬了荧光红细胞的来自脾脏的巨噬细胞或树突细胞的百分比
  批次   巨噬细胞   树突细胞
  1   28％   5％
  2   68％   19％
  3   81％   22％
注射后三个小时，装载卵清蛋白并且被过热处理或者抗TER 119抗体处理的小鼠红细胞几乎不再存在于小鼠血液中(1.6％和1％)，而小鼠血液中仍有未处理的装载卵清蛋白的红细胞(4.6％)。
被热处理或抗TER 119抗体处理的红细胞被脾脏的F4/80巨噬细胞和CD11c树突细胞吞噬(图2)。
相比于热处理的红细胞或者未处理的红细胞，用抗TER 119抗体处理的红细胞更有效地被脾脏的F4/80巨噬细胞所吞噬(图2，A、B、C)。81％的脾脏巨噬细胞吞噬抗体处理的红细胞，而68％的巨噬细胞吞噬热处理的红细胞，而在未处理批次中仅有28％(表2)。
相比于未处理的红细胞，经过热处理或抗体处理的红细胞也更有效地被来自脾脏的CD11c树突细胞所吞噬(图2)。分别有22％和19％的树突细胞吞噬抗体处理的红细胞和热处理的红细胞，而对于未处理的的红细胞而言仅有5％(表2)。
还观察到不表达CD11c树突细胞标志物或F4/80巨噬细胞标志物的来自脾脏的群体对抗体处理的红细胞的吞噬(11.9％和12.8％；图2)。
表3：在注射给小鼠后三个小时，肝脏巨噬细胞吞噬荧光红细胞的百分比
  批次   巨噬细胞
  1   24％
  2   40％
  3   50％
被热处理的红细胞或用抗TER 119抗体处理的红细胞被肝脏的F4/80巨噬细胞所吞噬。
相比于被热处理或未处理的红细胞，被抗TER119抗体处理的红细胞更有效地被肝脏的F4/80巨噬细胞所吞噬。50％的肝脏巨噬细胞吞噬抗体处理的红细胞，而40％的巨噬细胞吞噬热处理的红细胞，而在未处理批次中仅有24％(表3)。
结论是，抗体与红细胞的结合以及热处理使得有效靶向脾脏和肝脏中的红细胞，显著增加能够吞噬这些红细胞的树突细胞和巨噬细胞的百分比。
实施例7.体内骨髓巨噬细胞和树突细胞对含有荧光卵清蛋白的小鼠红细胞的吞噬作用的测定
本研究是同源性研究，因为将OF1小鼠红细胞注射给OF1小鼠。
制备四批132×107个使用实施例1变型2制得的装载荧光卵清蛋白(Serlabo Technologies，ref WO-LS003054)的OF1小鼠红细胞，用抗TER119抗体处理、热处理或者用BS3处理(分别如实施例3、2和4所述)或者未处理。将每个批次的红细胞静脉内注射到两只小鼠体内。注射后一个半小时，处死小鼠，取小鼠的股骨。通过流式细胞仪测定纳入表达F4/80标志物或者CD11b标志物的巨噬细胞、表达Gr1标志物的粒细胞、表达CD11c和CD11b标志物的髓样树突细胞以及纳入表达CD11c和CD8标志物的浆细胞样树突细胞的荧光。
批次1：用BS3处理的装载卵清蛋白的红细胞
批次2：热处理的装载卵清蛋白的红细胞
批次3：用抗TER119抗体处理的装载卵清蛋白的红细胞
批次4：装载卵清蛋白的红细胞
批次5：NaCl葡萄糖
结果
表4：在注射后1小时30分，吞噬了荧光卵清蛋白的骨髓巨噬细胞、粒细胞或树突细胞的百分比
批次 F4/80巨噬细胞 CD11b巨噬细胞 粒细胞 髓样树突细胞   浆细胞样树突细胞
  1   2.5   0.05   12.5   2.7   2.4
  2   3.3   0   15.5   2.2   3.4
  3   17.7   1.75   21   15.3   6
  4   2.4   0   13   1.6   2.4
  5   0.5   0.1   1.3   0.8   1.5
注射后一个半小时，用抗TER 119抗体处理的装载卵清蛋白的红细胞有效地被骨髓F4/80巨噬细胞、粒细胞和树突细胞所吞噬。骨髓的髓样树突细胞是最多地涉及吞噬用抗TER 119抗体处理过的装载卵清蛋白的红细胞的细胞。
结论是，使用被抗TER 119抗体处理的红细胞能得到最佳靶向以及红细胞被骨髓中免疫细胞最佳的吞噬作用。
实施例8.单次注射装载卵清蛋白的红细胞和聚(I:C)佐剂之后卵清蛋白特异性CD4T细胞应答的测定
对OVA(卵清蛋白)特异性CD4T细胞应答的评价由以下所组成：测定OVA特异性CD4T细胞的百分比，测定这些细胞的增殖、测定这些细胞的活化水平以及测定IFNg(g＝γ)的产生。
使用Russo V.等人的The Journal of Clinical Investigation，2007，117：3087-3096；Stoitzner P.等人的The Journal of Immunology 2008，180：1991-1998中所述方法的改进评价CD4T细胞应答。使用OT-II转基因小鼠(Charles River，ref C57BL/6-Tg(TcraTcrb425Cbn/Crl))的CD4 T细胞测定OVA-特异性CD4T细胞应答。OT-II小鼠是仅仅表达识别与主要组织相容性复合物II类分子相关联的卵清蛋白肽323-339的CD4T细胞的小鼠。
从OT-II小鼠的脾脏分离OT-II转基因CD4T细胞，用CFSE标记，然后静脉内注射到Ly5.1小鼠体内。OT-II小鼠和Ly5.1小鼠具有相同的遗传背景，但是两种类型小鼠的细胞都可通过CD45标志物来鉴定。这是因为OT-H小鼠细胞表达CD45.2标志物，而Ly5.1小鼠表达CD45.1标志物。
注射转基因小鼠CD4T细胞后20小时，Ly5.1小鼠接受下列批次的静脉内注射。用含有红细胞的批次注射三只小鼠，用含有游离OVA或对照的批次注射两只小鼠。制备两批183×107个使用实施例1的变型2制得的装载卵清蛋白(Serlabo Technologies，参考号WO-LS003054)的C57BI/6小鼠红细胞，用抗TER 119抗体处理或者未处理(如实施例3所述)。向这些批次以及含有游离卵清蛋白的批次添加佐剂即聚(I:C)(Invivogen，参考号lrl-pic)。每只小鼠注射的聚(I:C)量为25微克。注射到小鼠体内的OVA量显示于表5中。
该研究是同源性研究，因为是将装载卵清蛋白的C57BI/6小鼠红细胞注射到ly5.1小鼠中。C57BI/6、Ly5.1和OT-II小鼠具有相同的遗传背景。
批次1：聚(I:C)和用抗TER 119抗体处理的装载卵清蛋白的红细胞
批次2：聚(I:C)和装载卵清蛋白的红细胞
批次3：聚(I:C)和游离卵清蛋白
批次4：血浆
注射所述批次后三天，处死小鼠，取出小鼠的脾脏。通过流式细胞仪使用CD4和CD45.2标志物测量小鼠脾脏中OVA特异性CD4T细胞的百分比(表5)。从OVA特异性CD4T细胞的百分比和使用台盼蓝(trypanblue)(Invitrogen，参考号15250061)计算的总淋巴细胞数来计算OVA特异性CD4T细胞的数量(表5)。
通过流式细胞仪使用CD4、CD44和CD45.2标志物以及使用CFSE测定小鼠脾脏中OVA特异性CD4T细胞的增殖和活化(表6和7)。每次细胞分裂时，将OVA特异性CD4T细胞中所含的CFSE量除以因子2，其可通过流式细胞仪测定细胞分裂的次数(图3)。
在10μg/ml卵清蛋白肽323-339(Neomps，ref)存在下体外刺激3天后通过ELISA检测在培养物上清中来测定小鼠脾细胞产生的IFNg。
结果
表5：注射所述批次后三天，OVA特异性CD4 T细胞百分比和数量(平均值±标准偏差)
  批次  注射给小鼠的OVA的量(μg)   OVA特异性cD4T细胞％   0VA特异性cD4T细胞数(百万个细胞)
  1   160   6.6±1.4＊   8±2＊
  2   129   3.6±0.9＊＊   4.1±2＊
  3   150   0.8±0.3   1.3±0.7
  批次  注射给小鼠的OVA的量(μg)   OVA特异性cD4T细胞％   0VA特异性cD4T细胞数(百万个细胞)
  4   0   0.1±0.1   0.2±0.1
注射所述批次后三天，相比于注射游离OVA和聚(I:C)的小鼠，注射聚(I:C)和用抗TER 119抗体处理或未处理的装载卵清蛋白的红细胞的小鼠具有显著更高的OVA特异性CD4T细胞的百分比和数量(Student检验，＊p＝0.01，＊＊p＝0.02)。
此外，相比于含有未处理的装载卵清蛋白的红细胞的批次，含有用抗TER 119抗体处理的装载卵清蛋白的红细胞的批次在诱导OVA特异性CD4T细胞数量增加方面更为有效(Student检验，p＝0.04)。
表6：注射所述批次后三天，分裂0、1、2、3、4、5、6或7次的OVA特异性CD4 T细胞的百分比
体内细胞增殖结果证实了这些结果(表6和图3)。细胞分裂诱导CFSE荧光强度的降低：每次分裂时荧光物质的一半消失(图3A)。相比于注射游离oVA和聚(I:C)的小鼠(3至4次分裂)，注射聚(I:C)和用抗TER119抗体处理的装载卵清蛋白的红细胞的小鼠的OVA特异性CD4 T细胞分裂得更快(6至7次分裂)(表6和图3A)。此外，相比于含有未处理的装载卵清蛋白的红细胞的批次，含有用抗TER119抗体处理的装载卵清蛋白的红细胞的批次在诱导细胞增殖方面似乎更为有效。
表7：注射所述批次后三天，OVA特异性CD4 T细胞的活化水平
批次     OVA特异性CD4 T细胞活化荧光的平均值(平均值±标准偏差)
    1     32.6±2.3
    2     37.6±3.5
    3     34.6±3.9
    4     11.4±0.5
细胞活化水平的结果(以CD44标志物的表达水平为特征)显示所有分裂的OVA特异性CD4 T细胞都具有高的细胞活化水平(表7和图3)。另外，OVA特异性CD4 T细胞的活化水平可与这些细胞的分裂数相关：细胞分裂和失去其CFSE标志物含量越多，它们表达的高水平活化标志物就越多(图3B)。
表8：用10μg/ml卵清蛋白肽323-339体外刺激三天，脾细胞所产生的IFNg
批次   脾细胞产生的IFNg(ng/ml)(平均值±标准偏差)
  1   56.3
  2   60±26.8
  3   9.4±1.6
  4   6.7±1
脾细胞产生IFNg的结果显示注射聚(I:C)和用抗TER 119抗体处理或未处理的装载卵清蛋白的红细胞的小鼠的脾细胞产生大量IFNg。
结论为，这些结果证明了用抗TER 119抗体处理或未处理的装载卵清蛋白的红细胞对能够产生IFNg的OVA特异性CD4T细胞得活化和增殖具有优越性。
实施例9.单次注射装载卵清蛋白的红细胞和聚(I:C)佐剂之后卵清蛋白特异性CD8T细胞应答的测定
对OVA特异性CD8T细胞应答的评价由下述步骤组成：测定OVA特异性CD8T细胞的百分比、测定IFNg的产生以及呈递与主要组织相容性复合物I类分子相关联的卵清蛋白肽257-264的细胞的体内细胞裂解。该研究是异源性研究，因为是将来自OF1小鼠的装载卵清蛋白的红细胞注射到非同源的C57BI/6小鼠中。
制备两批167×107个使用实施例1的变型2制得的装载卵清蛋白的OF1小鼠红细胞，用抗TER119抗体处理或者未处理(如实施例3所述)。向这些批次以及含有游离卵清蛋白的批次添加佐剂即聚(I:C)。每只小鼠注射的聚(I:C)量为25微克。注射到小鼠体内的OVA量显示于表9中。
将这些批次静脉内注射到C57BI/6小鼠体内。用给定批次注射最少4只小鼠。使用Hervas-Stubbs S.等人的Blood 2007，109：5318-5326中所述方法的改进测定体内细胞裂解。将呈递与主要组织相容性复合物I类分子相关联的卵清蛋白肽257-264的细胞注射到被免疫小鼠体内。简而言之，注射后六天，给小鼠注射0.5×106个呈递卵清蛋白257-264肽(Neomps，参考号SC1302)并用中等浓度CFSE标记的脾细胞，以及0.5×106个不呈递所述肽并用高浓度CFSE标记的脾细胞(细胞裂解对照)。
将与卵清蛋白肽257-264(BOVAp)偶联的乳胶珠以及聚(I:C)用作阳性对照，以诱导针对乳清蛋白的CD8T免疫应答。其显示，注射BOVAp和聚(I:C)在体内诱导了卵清蛋白特异性CD8T细胞百分比的增加以及对呈递OVA257-264肽的细胞的破坏(Herva-Stubbs)。
批次1：聚(I:C)和用抗TER 119抗体处理的装载卵清蛋白的红细胞
批次2：聚(I:C)和装载卵清蛋白的红细胞
批次3：与卵清蛋白肽257-264偶联的乳胶珠
批次4：聚(I:C)和与卵清蛋白肽257-264偶联的乳胶珠
批次5：聚(I:C)和游离卵清蛋白
批次6：NaCl葡萄糖+血浆
注射脾细胞后16小时，通过安乐死处死小鼠，取出小鼠的脾脏。通过流式细胞仪使用四聚物和CD8标志物测量小鼠脾脏中OVA特异性CD8T细胞的百分比(表9)。在0.1μg/ml卵清蛋白肽257-264存在下体外刺激4小时后，通过流式细胞仪来测定CD8T细胞产生的IFNg以及与去颗粒作用相关的标志物(CD107)的表达(表10)。通过流式细胞仪使用CFSE测定体内细胞裂解(表11)。
结果
表9：注射所述批次后七天，OVA特异性CD8T细胞百分比(平均值±标准偏差)
批次  注射给小鼠的OVA的量(μg)   OVA特异性CD8T细胞％(平均值±标准偏差)   非OVA特异性T细胞％(平均值±标准偏差)
  1   95   14±3.2＊   2.4±0.2
  2   91   12.5±5.2＊＊   1.2±0.5
  3   0   1.2±0.1   1.2±0.1
  4   0   2.5±0.4＊   0.9±0.1
  5   130   2.4±1.4   1±0.2
  6   0   0.7±0.4   1±0.1
相比于注射游离OVA和聚(I:C)的小鼠或者注射聚(I:C)和BOVAp的小鼠，注射聚(I:C)和用抗TER119抗体处理或未经处理的装载卵清蛋白的红细胞的小鼠具有显著更高的OVA特异性CD8T细胞百分比(Student’s检验，＊p＝0.001，＊＊p＝0.01)。
表10：用0.1μg/ml卵清蛋白肽257-264体外刺激4小时，CD8 T细胞产生的IFNg
批次 产生IFNg的CD8 T细胞％  产生IFNg并表达CD107标志物的CD8 T细胞％
  1   8.7±1.8＊   71±4＊
批次 产生IFNg的CD8 T细胞％  产生IFNg并表达CD107标志物的CD8 T细胞％
  2   6.6±1.7＊   71±4＊
  3   1.4±0.1   33±4.5
  4   2.8±0.5   57±5.5
  5   1.8±0.5   46±7
  6   0.7±0.1   18±2
所产生的CD8T细胞有效且具有细胞毒性，因为它们响应于卵清蛋白肽的刺激而产生IFNg并且表达CD107标志物(表10)。相比于注射游离OVA和聚(I:C)的小鼠或者注射聚(I:C)和BOVAp的小鼠，注射聚(I:C)和用抗TER119抗体处理或未经处理的装载卵清蛋白的红细胞的小鼠具有显著更高的产生IFNg且表达CD107的CD8 T细胞百分比(Student’s检验，p＜0.008)。
表11：体内抗OVA特异性细胞裂解的百分比(平均值±标准偏差)
  批次   体内细胞裂解％(平均值±标准偏差)
  1   82±7
  2   83±4
  5   53±8
  6   0
细胞裂解的结果与去颗粒作用相关标志物的表达相关联(表10和11)。注射聚(I:C)和用抗TER 119抗体处理或未经处理的装载卵清蛋白的红细胞以比注射聚(I:C)和游离卵清蛋白更有效的方式诱导显示卵清蛋白肽257-264的细胞的裂解(表10)。
结论是，这些结果证明了用抗TER119抗体处理或未经处理的装载卵清蛋白的红细胞在能够产生IFNg、脱颗粒和裂解显示卵清蛋白肽257-264之细胞的细胞毒性CD8T细胞的活化和增殖方面具有优越性。
实施例10.在单次注射装载卵清蛋白的红细胞和佐剂聚(I:C)之后30天，卵清蛋白特异性CD8T细胞应答之维持的测定
对OVA特异性CD8T细胞应答维持的评价由下列组成：在单次注射后34天，体内测定OVA特异性CD8T细胞的百分比以及细胞裂解。
该研究是异源性研究，因为是将装载OF1小鼠卵清蛋白的红细胞注射到非同源的C57BI/6小鼠中。
制备两批150×107个装载卵清蛋白的OF1小鼠红细胞，其根据实施例1的变型2获得，用抗TER119抗体处理或未经处理(如实施例3所述)。向这些批次以及含有游离卵清蛋白或BOVAp的批次添加佐剂聚(I:C)。每只小鼠注射的聚(I:C)量为25微克。注射到小鼠体内的OVA量显示于表12中。
将这些批次静脉内注射到C57BI/6小鼠体内。用给定批次注射三只小鼠。为了测定体内细胞裂解，将显示与主要组织相容性复合物I类分子相关联的卵清蛋白肽257-264的细胞注射到被免疫小鼠体内。注射后33天，给小鼠注射0.5×106个显示卵清蛋白257-264肽(NeoMPS，参考号SC1302)并用中等浓度CFSE标记的脾细胞，以及0.5×106个未显示所述肽并用高浓度CFSE标记的脾细胞(细胞裂解试验)。
批次1：聚(I:C)和用抗TER119抗体处理的装载卵清蛋白的红细胞
批次2：聚(I:C)和装载卵清蛋白的红细胞
批次3：与卵清蛋白肽257-264偶联的乳胶珠：BOVAp
批次4：聚(I:C)和BOVAp
批次5：聚(I:C)和游离卵清蛋白
批次6：NaCl葡萄糖+血浆
注射所述脾细胞后16小时，对小鼠实施安乐死，取出其脾脏。通过流式细胞仪使用四聚物和CD8标志物测量小鼠脾脏中OVA特异性CD8T细胞的百分比(表12)。通过流式细胞仪使用CFSE测定体内细胞裂解(表13)。
表12：注射所述批次后34天，OVA特异性CD8 T细胞的百分比(平均值±标准偏差)
批次   注射给小鼠的OVA的量(μg)   OVA特异性CD8T细胞％(平均值±标准偏差)
  1   170   1.5±0.2
  2   138   1.7±0.3
  3   0   1.6±0.1
  4   0   1.4±0.1
  5   150   2.2±0.2
  6   0   1.8±0.06
注射后34天，每个组中OVA特异性CD8 T细胞的百分比相当(表12)。考虑到峰值CD8T细胞增殖在约第7天且随后是减小阶段，所以该结果并非出人意料的(Hervas-Stubbs S et al，Blood，2007，109：5318-5326)。
表13：体内抗0VA特异性细胞裂解的百分比(平均值±标准偏差)
批次   体内细胞裂解％(平均值±标准偏差)
  1   49±9＊
  2   54±28
  3   12±5.4
  4   21.6±12
  5   20.4±19
  6   0.9±0.9
注射后34天，OVA特异性CD8T细胞仍然能够裂解显示卵清蛋白肽257-264的细胞(表13)。注射聚(I:C)和用抗TER119抗体处理的装载卵清蛋白的红细胞以比注射聚(I:C)和BOVAp更有效的方式诱导细胞裂解(＊Student’s检验，p＜0.04)。
结论为，这些结果证明装载卵清蛋白的红细胞不仅在细胞毒性CD8T细胞的活化和增殖方面具有优越性，而且在这些能够裂解显示卵清蛋白肽257-264的细胞的T细胞的维持/存活方面也有优越性。
实施例11.单次注射化学处理的装载卵清蛋白的红细胞和聚(I:C)佐剂之后卵清蛋白特异性CD8T细胞应答的测定
该研究是外源性研究，因为是将来自OF1小鼠的装载卵清蛋白的红细胞注射到非同源的C57BI/6小鼠中。
制备一批132×107个用1mM BS3化学处理的(如实施例4所述)使用实施例1的变型2制备的装载卵清蛋白的OF1小鼠红细胞。向该批次以及含有游离卵清蛋白的批次中添加佐剂聚(I:C)。每只小鼠注射的聚(I:C)量为25微克。注射到小鼠体内的OVA量显示于表14中。
批次1：聚(I:C)和用1mM BS3处理的装载卵清蛋白的红细胞
批次2：聚(I:C)和游离卵清蛋白
批次3：聚(I:C)
批次4：含葡萄糖的NaCl
将这些批次静脉内注射到C57BI/6小鼠体内。用给定批次注射最少3只小鼠。注射后七天，处死小鼠，取小鼠脾脏。通过流式细胞仪使用四聚物和CD8标志物测量小鼠脾脏中OVA特异性CD8T细胞的百分比(表14)。
结果
表14：注射所述批次后七天的OVA特异性CD8 T细胞的百分比和数量(平均值±标准偏差)
批次   注射给小鼠的OVA的量   OVA特异性CD8T细胞％(平均值±标准偏差)
  1   38   1.8±0.6
  2   150   1.2±0.3
  3   0   1±
4 0 0.8±0.1
与注射游离OVA和聚(I:C)的小鼠或者注射聚(I:C)的小鼠相比，注射聚(I:C)和用BS3处理的装载卵清蛋白的红细胞的小鼠具有更高百分比的OVA特异性CD8T细胞。这些结果不具有统计学上的差异，但是应当指出的是，注射的游离OVA的量比在含装载OVA的红细胞批次中注射的OVA量大三倍多。
结论为，这些结果显示用BS3处理的装载卵清蛋白的红细胞也能够产生OVA特异性CD8T细胞。
实施例12.单次注射装载卵清蛋白的红细胞和CL-097佐剂之后卵清蛋白特异性CD8T细胞应答的测定
该研究是异源性研究，因为是将来自OF1小鼠的装载卵清蛋白的红细胞注射到非同源的C57BI/6小鼠中。
制备以下批次：119×107个用抗TER 119抗体处理的或者未处理的(如实施例3所述)使用实施例1变型1制备的装载卵清蛋白的OF1小鼠红细胞。向这些批次中添加或不添加佐剂CL097(Invivogen，参考号tlrl-c97)。每只小鼠注射的CL097量为0.15微克。注射到小鼠体内的OVA量显示于表15中。
批次1：CL097和用抗TER 119抗体处理的装载卵清蛋白的红细胞
批次2：用抗TER 119抗体处理的装载卵清蛋白的红细胞
批次3：CL097和装载卵清蛋白的红细胞
批次4：装载卵清蛋白的红细胞
批次5：含葡萄糖的NaCl
将这些批次静脉内注射到C57BI/6小鼠体内。注射后四天，处死小鼠，取小鼠脾脏。在0.1μg/ml卵清蛋白肽257-264存在下体外刺激三天后，通过ELISA检测在培养物上清中测定注射多个批次的小鼠脾细胞产生的IFNg。
结果
表15：用0.1μg/ml卵清蛋白肽257-264体外刺激3天，脾细胞产生的IFNg
批次   注射给小鼠的OVA的量(μg)   脾细胞产生的IFNg(ng/ml)
  1   83   15.
  2   83   5.7
  3   103   11.
  4   103   7.4
  5   0   0.4
脾细胞产生IFNg的结果显示，当给小鼠注射CL097佐剂和用抗TER 119抗体处理或未处理的装载卵清蛋白的红细胞时产生更多的IFNg。
结论为，CL097佐剂也增强了注射装载卵清蛋白的红细胞所诱导的IFNg应答。
实施例13.在小鼠中单次注射佐剂聚(I:C)和处理或未处理的装载卵清蛋白的红细胞之后肿瘤生长的测定
该研究的目的是测定注射单剂量聚(I:C)和处理或未处理的装载卵清蛋白红细胞之后C57BI/6小鼠中EG.7细胞系的肿瘤生长。EG.7肿瘤细胞获得自ATCC(ATCC-CRL-2113)。EG.7细胞来源于EL.4细胞系，其组成型地合成并分泌OVA。
该研究是异源性研究，因为是将来自OF1小鼠的装载卵清蛋白的红细胞注射到C57BI/6小鼠中。该实验中的模型是预防性模型。
根据实施例1的变型2制备两批次来自OF1小鼠的165×107个抗体处理的或未处理的装载卵清蛋白的红细胞。将佐剂聚(I:C)添加到这些批次中。每只小鼠注射25微克的聚(I:C)。阴性对照是未装载的红细胞悬液。注射到小鼠体内的OVA量显示于表16中。
批次1：聚(I:C))和用抗体处理的装载卵清蛋白的红细胞
批次2：聚(I:C)和装载卵清蛋白的红细胞
批次3：非装载的红细胞
将所述批次静脉内注射到C57BI/6小鼠体内(每组10只小鼠)。注射批次后七天，皮下注射2.2×106个EG.7细胞/小鼠。对小鼠肿瘤生长进行随访。通过以厘米计测量肿瘤直径来评估肿瘤生长(记录为两垂直直径测量的平均值)。在14天中以两天的间隔每周测量3次肿瘤大小。处死肿瘤直径超过2.0厘米的小鼠。
表16：每只小鼠注射的OVA量
  批次   注射给小鼠的OVA的量(μg)
  1   134
  2   134
  批次   注射给小鼠的OVA的量(μg)
  3   0
表17：肿瘤生长
注射EG.7后7天，可在之前注射未装载的红细胞之小鼠的侧腹测量肿瘤大小，肿瘤继续生长直至研究结束。而在注射聚(I:C)和用抗TER119抗体处理或不处理的装载卵清蛋白的红细胞的小鼠侧腹观察不到肿瘤。对小鼠的观察仍在进行中。
结论为，这些结果证明用抗TER119抗体处理或未处理的装载卵清蛋白的红细胞有效地阻止了表达OVA的肿瘤细胞的生长。
实施例14.体内巨噬细胞和树突细胞对猪红细胞的吞噬作用的测定
本研究是异种性研究，因为是将猪红细胞注射到C57BI/6小鼠体内。
在含有葡萄糖的NaCl中将猪红细胞清洗三次，然后如上所述用CFSE标记。在含有葡萄糖的NaCl中将红细胞再清洗三次，然后使其恢复到50％血细胞比容。将142×107个猪红细胞的批次静脉内注射到三只C57BI/6小鼠中。注射后一个小时，处死小鼠，取小鼠的脾脏、肝脏和股骨。通过流式细胞仪测定纳入表达F4/80标志物或者CD11b标志物的巨噬细胞、纳入表达CD11c和CD11b标志物的髓样树突细胞、以及纳入表达CD11c和CD8标志物的浆细胞样树突细胞的荧光。
批次1：猪红细胞
批次2：含葡萄糖的NaCl
结果
表18：注射后1小时具有被吞噬的荧光红细胞的脾脏巨噬细胞或树突细胞的百分比
批次 F4/80巨噬细胞 CD11b巨噬细胞 髓样树突细胞   浆细胞样树突细胞
  1   27±6   4±2   21±5.5   45±6
  2   0   1   4   3
表19：注射后1小时具有被吞噬的荧光红细胞的骨髓巨噬细胞或树突细胞的百分比
批次 F4/80巨噬细胞 CD11b巨噬细胞 髓样树突细胞   浆细胞样树突细胞
  1   5.3±7.5   0.8±1   5±3   5±7
  2   6.3   0   6   12.9
表20：注射后1小时具有被吞噬的荧光红细胞的肝脏巨噬细胞或树突细胞的百分比
批次 CD11b巨噬细胞 髓样树突细胞   浆细胞样树突细胞
  1   1.1±1.1   3±   1.2±
  2   1.7   3.4   0.7
注射后一个小时，猪红细胞被脾脏的F4/80巨噬细胞和树突细胞有效吞噬(表18)。脾脏的浆细胞样树突细胞是最多地涉及猪红细胞噬菌作用的细胞。在骨髓和肝脏中，巨噬细胞和树突细胞不吞噬荧光红细胞(表19和20)。
结论是，使用猪红细胞使得红细胞能够被涉及产生免疫应答的脾脏细胞靶向和吞噬(Lou Y.，2007，J of Immunol，178：1534-1541)。
实施例15.包含卵清蛋白的猪红细胞的特征。
制备两批猪红细胞，其装载有卵清蛋白(根据实施例1的变型2获得)或者未装载。
批次1：装载OVA的猪红细胞
批次2：未装载OVA的猪红细胞。
在制备结束时以及制备后18小时表征来自起始材料的批次。使用ABX细胞计数器测定平均球状体积、平均血球血红蛋白和红细胞浓度。使用Osmocells设备(SD Medical)测定对应于引起50％红细胞溶血的NaCl浓度的渗透脆性。通过分光光度法测定细胞外血红蛋白。使用ELISA试验测定卵清蛋白的血球浓度、卵清蛋白的细胞外浓度以及卵清蛋白平均球状的量。
表21：包含卵清蛋白的猪红细胞的表征
Figure GPA00001081479900331
正如所料，透析过程造成球状体积和血球血红蛋白减少。此外，所述批次的渗透脆性比初始血液中红细胞的低(表21)。在包含卵清蛋白的批次(批次1)和不包含卵清蛋白的批次(批次2)之间未观察到显著性差异。
对于批次1，细胞外卵清蛋白的量比装载的卵清蛋白的量相对低，在制备后18小时未增加，从而证明了装载卵清蛋白的红细胞的稳定性。
因此，可以将卵清蛋白包封到猪红细胞内。

Claims (19)

1.一种组合物，其在宿主中诱导针对肿瘤细胞的细胞毒性细胞应答，并且包含含有肿瘤抗原的红细胞。
2.根据权利要求1的组合物，其中所述红细胞(1)含有抗原以及(2)与免疫球蛋白形成免疫复合物，所述免疫球蛋白识别红细胞表面上的表位，由此促进所述红细胞被树突细胞吞噬。
3.根据权利要求2的组合物，其中所述红细胞与抗Rh或抗血型糖蛋白A或抗CR1抗体形成免疫复合物。
4.根据权利要求2或3的组合物，其中所述免疫球蛋白是IgG。
5.根据权利要求1的组合物，其中红细胞(1)含有抗原以及(2)被热处理或化学处理，由此促进所述红细胞被树突细胞吞噬。
6.根据权利要求2的组合物，其中所述免疫复合物形式的红细胞被热处理或化学处理。
7.根据权利要求1、2、5或6中任一项的组合物，其中所述红细胞是异种红细胞。
8.根据权利要求1至7中任一项的组合物，其还包含激活树突细胞成熟的佐剂。
9.根据权利要求8的组合物，其中所述佐剂存在于所述红细胞内、所述红细胞表面和/或所述红细胞外。
10.根据权利要求9的组合物，其中所述佐剂是TLR(Toll样受体)配体或细胞因子。
11.根据权利要求10的组合物，其中所述TLR配体选自属于下组中的咪唑并喹啉类：咪唑喹啉、咪喹莫特、雷西莫特、CpG寡聚脱氧核苷酸、LPS(脂多糖)或者聚(肌苷酸)-聚(胞苷酸)。
12.根据权利要求10的组合物，其中所述细胞因子选自：干扰素α、IL-2(白细胞介素2)、IFNγ(干扰素γ)、GM-CSF(粒细胞单核细胞-集落刺激因子)、IL-12(白细胞介素12)或TNFα(肿瘤坏死因子α)。
13.根据权利要求1至12中任一项的组合物，其包含待治疗肿瘤的至少两种代表性肿瘤抗原。
14.根据权利要求1至13中任一项的组合物，其中所述肿瘤抗原选自以下抗原：α-辅肌动蛋白-4；ARTC1；BCR-ABL融合蛋白(b3a2)；B-RAF；CASP-5；CASP-8；β-联蛋白；Cdc27；CDK4；CDKN2A；COA-1；dek-can融合蛋白；EFTUD2；延伸因子2；ETV6-AML1融合蛋白；FN1；GPNMB；LDLR-岩藻糖基转移酶AS融合蛋白；HLA-A2d；HLA-A11d；hsp70-2；KIAAO205；MART2；ME1；MUM-1f；MUM-2；MUM-3；neo-PAP；肌球蛋白I类；NFYC；OGT；OS-9；pml-RARα融合蛋白；PRDX5；PTPRK；K-ras；N-ras；RBAF600；SIRT2；SNRPD1；SYT-SSX1或SYT--SSX2融合蛋白；磷酸丙糖异构酶；BAGE-1；GAGE-1，2，8；GAGE-3，4，5，6，7；GnTVf；HERV-K-MEL；KK-LC-1；KM-HN-1；LAGE-1；MAGE-A1；MAGE-A2；MAGE-A3；MAGE-A4；MAGE-A6；MAGE-A9；MAGE-A10；MAGE-A12；MAGE-C2；粘蛋白k；NA-88；NY-ESO-1/LAGE-2；SAGE；Sp17；SSX-2；SSX-4；TRAG-3；TRP2-INT2g；CEA；gp100/Pmel17；激肽释放酶4；乳腺珠蛋白-A；Melan-A/MART-1；NY-BR-1；OA1；PSA；RAB38/NY-MEL-1；TRP-1/gp75；TRP-2；酪氨酸酶；亲脂素；AIM-2；BING-4；CPSF；细胞周期素D1；Ep-CAM；EphA3；FGF5；G250/MN/CAIX；HER-2/neu；IL13Rα2；肠羧基酯酶；甲胎蛋白；M-CSF；mdm-2；MMP-2；MUC1；p53；PBF；PRAME；PSMA；RAGE-1；RNF43；RU2AS；分离蛋白1；SOX10；STEAP1；存活蛋白；端粒酶；WT1；FLT3-ITD；BCLX(L)；DKK1；ENAH(hMena)；MCSP；RGS5；胃泌素-17；人绒毛膜促性腺激素，EGFRvIII，HER2，HER2/neu，P501，鸟苷酸环化酶C以及PAP。
15.治疗性抗肿瘤疫苗，其包含有效量的根据权利要求1至14中任一项的组合物。
16.根据权利要求1至14中任一项的组合物在制备治疗性抗肿瘤疫苗中的用途。
17.用作治疗性抗肿瘤疫苗的根据权利要求1至14中任一项的组合物。
18.在患者中诱导针对肿瘤细胞或肿瘤的细胞毒性细胞应答的方法，其包括向该患者施用有效量的根据权利要求1至14中任一项的组合物。
19.在患者中诱导针对肿瘤细胞或肿瘤的细胞毒性细胞免疫应答的抗癌症治疗方法，其包括向该患者施用有效量的根据权利要求15的抗肿瘤疫苗。
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