KR101666041B1 - 조성물 및 치료용 항종양 백신 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 숙주에서, 항원을 발현하는 세포, 특히 종양 세포에 대항하는 세포독성 세포 반응을 유도하고, 상기 항원을 함유하는 적혈구를 포함하는 조성물에 관한 것이다. 상기 적혈구들은 적혈구 표면의 에피토프를 인식하는 면역글로불린, 특히 IgG와의 면역복합체의 형태로 존재할 수 있고/있거나, 수지상세포에 의한 상기 적혈구의 포식을 촉진하기 위해 열처리 되거나 또는 화학적 방법으로 처리된다. 변이체로써, 상기 적혈구는 이종의 적혈구일 수 있다. 또한 본 발명은 그러한 조성물을 함유하는 치료용 특히 항종양 백신에 관한 것이다.
Description
관련된 출원들의 상호참조
본 출원은 양자 모두 참조에 의하여 본 명세서에 포함되어지는, 2007년 8월 9일자로 출원된 미국 가특허 출원 60/954,917, 및 2007년 8월 8일자로 출원된 프랑스 특허 출원 FR 07 05767에 대해 우선권을 주장한다.
본 발명은 숙주에서, 항종양 목적의 세포독성 반응을 유도하는 조성물, 및 이 조성물을 함유하는 치료용 항종양 백신에 관한 것이다.
종양 항원에 대한 자연적 면역 반응은 상대적으로 비효율적이며, 종양들이 항종양 면역반응을 회피할 수 있게 해주는 다양한 메커니즘들이 확인되어 왔다. 종래의 백신 접근법은 불충분한 것으로 밝혀진 체액성 반응을 유발한다.
항원제시세포(antigen-presenting cells, APCs), 특히 수지상세포에 기초한 세포독성 반응을 유발시킬 목적의 전략들이 연구되어 왔다. 그 원리는 환자 자신의 면역 방어(체계)를 자극함으로써 환자의 암세포를 특이적으로 파괴하는 데 있다.
수지상세포들은 종양세포에 특이적인 세포독성 작동체(effectors)를 생산하는데 매우 효과적인 항원제시세포들이다. 그들은 종양세포에서 유래한 사멸세포(apoptotic cell) 또는 사멸체(apoptotic body)를 포식할 수 있으며, 그에 따라 MHC 클라스 Ⅰ 및 클라스 Ⅱ 분자와 연합하여, 종양 항원을 T림프구에 제시할 수 있다. 따라서 수지상세포는 세포증식 및 특이적 세포용해성 T 림프구의 클론 생산을 개시할 수 있다. 이 반응의 마지막에는, 그렇게 분화된 킬러 림프구(killer lymphocyte)가 림프구획(lymphoid compartment)을 떠나서 유기체 내를 순환하고, 종양과 결합한다. 종양에 의해 발현된 항원의 인식은 용해 신호(lytic signal)를 유도하고 종양 세포의 파괴를 야기한다.
수지상세포를 타겟으로 한 몇몇 항암 백신 전략들이 연구되어 왔다(Eymard JC, Bernard J, Bull Cancer. 2003, 90(8-9):734-43). 일부는 수지상세포를 인 비트로(in vitro)에서 조작하는 것을 기반으로 하며, 다른 것들은 체내(in vivo)에서 수지상세포를 자극하는 것을 기반으로 한다. 첫 번째 경우에서는, 수지상세포들은 환자로부터 채취된 혈액 세포로부터 분화된다: 이들은 체외에서 종양 펩티드, 종양 용해물(lysates), 사멸 종양세포 또는 자가 종양에서 추출된 열충격 단백질과 함께 배양 및 성숙되고, "펄스되고(pulsed)", 즉 자극되며, 최종적으로는 환자에 다시 주입된다. 두 번째 경우에서 수지상세포의 자극은, 펩티드, 단백질, 방사선 조사 종양세포 또는 수지상세포를 타겟으로 하는 항원성 펩티드를 함유하는 다른 바이러스들을 환자 내로 주입한 이후에 이루어진다. 그러나, 얻어지는 세포독성반응은 거의 임상 효능을 동반하지 않는다. 상기 수지상세포의 활성화는 세포용해성 T 림프구를 효과적으로 활성화하는 그의 능력에 "영향을 미친다(conditions)". 수지상세포 활성화의 정도는 이 백신 전략에 있어 까다로운 요소인 것으로 보인다.
항종양 백신을 얻기 위한 체외에서의 수지상세포의 이용은 다음에 대해 얼마간의 문제를 야기한다: 이차적 면역기관으로 이동하고 효과적인 세포독성 T반응을 유도할 수 있는 수지상세포를 생산하기 위한 수지상세포의 성숙 상태, 주입되어야 하는 세포 수, 경로, 장소 및 주입 빈도(Banchereau J, Schuler-Thurner B, Palucka AK, Schuler G. [Dendritic cells as vectors for therapy] Cell. 2001 , 10, 106(3): 271 -4.).
체내에서의 수지상세포의 활성화는, 그로서는, 종양 항원의 미약한 면역원성 능력 및 수지상세포를 충분한 수준까지 활성화하는데 있어서의 어려움으로 인해 제한된다.
항원이 적혈구 내에 피막되거나 표면에 결합되어 APCs로 전달되는, 항원 수송을 위한 운반체로서의 적혈구의 이용은 몇몇 문헌에서 시사된 바 있다. 상기 촉발된 면역 반응은 인 비트로 및 체내에서 연구되어왔다.
Hamidi 등은 최근 BSA(bovine serum albumin)의 피막화를 인간 적혈구 내 항원의 한 모델로서 개시한 바 있다(Hamidi M 등, Drug Deliv., 2007; 14(5):295-300 및 Int J Pharm., 2007, 29, 338(1 -2): 70-8). 저자들은 세망내피계(RES)의 APCs에 대한 항원의 제시를 위한 벡터로서 적혈구의 이용을 제안하였다. Hamidi 등에 의해 공개된 또다른 리뷰에서(J. Control. Release, 2007, 118(2): 145-60), 이들은 RES로의 타게팅을 촉진하기 위한 일정 수의 전략들이 연구되어 왔음을 시사하였으며, 상기 타게팅은 적혈구를 노화시켜 용혈을 위한 이들의 흡수(uptake)를 유도함으로써 촉진된다. 그외 다른 경로들이 언급되었는데, 적혈구를 안정화제, 특히 가교제에 노출시키거나, 비장을 표적화하기 위해 IgG형 또는 간을 표적화하기 위해 IgM형의 항-RH 항체로 적혈구를 코팅하거나, 열충격을 가하거나 또는 산화제, 효소 또는 항생제에 노출시키는 것이 그 예이다.
항원-적재된 적혈구로 면역화한 후에는 체액성 면역반응이 체내에서(in vivo) 얻어질 수 있다. Murray 등에 의해 수행된 연구에 의하면, 마우스 내에서, 다음 네 가지 항원들 중 하나가 적재된 생쥐 적혈구를 정맥 내 투여한 후 IgG 면역글로불린을 발견할 수 있었다: KLH (Keyhole Limpet Haemocyanin), BSA (Bovine Serum Albumin), CTB (Cholera Toxin b Subunit) 및 ADA (Bovine Adenosine Deaminase). Th2 반응 중에 가장 우세한 아이소타입인 IgGI, lgG3, 및 Th1 반응의 마커인 아이소타입 IgG2의 발견은, 체액성 및 세포성 면역 두 가지 유형의 면역반응이 모두 관여함을 보여준다(Murray AM 등, Vaccine., 2006 28, 24(35-36): 6129-39).
적혈구와 함께 사용되는 또다른 항원의 제형이 Dominici 등에 의해 시험된 바 있다. HIV-1 바이러스의 Tat 단백질은 아비딘/비오틴 커플링에 의해 마우스 적혈구 표면에 고정되어 있었다. 이 항원 제형의 복강 내 주사에 의해 마우스를 면역화한 결과, 항원이 수지상세포에 의해 세포 내 함입(internalized)되었으며, 체내에서 체액-매개성 면역반응이 촉발되었다. 발견된 면역글로불린의 아이소타입 규명결과는 Th1 및 Th2 반응이 유도되었음을 시사한다. 상기 항원과 결합된 적혈구로 처리된 마우스에 대하여 항-Tat 세포독성 활성이 종래의 크로뮴-방출 기술에 의해, 인 비트로에서 확인되었다(Dominici S 등, Vaccine., 2003 16, 21 (17-18): 2073-81 ).
Corinti 등에 의해 동일한 제형을 이용하여 인 비트로에서의 세포성 반응이 입증되었다. 인간 단핵구로부터 유래한 수지상세포에 의한, Tat 단백질과 접합된 적혈구의 포식 작용, 및 CD4+ 및 CD8+ 반응의 유도가 확인되었다. 게다가, 인터페론 감마의 존재 하에서의 수지상세포의 성숙은 클라스 Ⅰ 면역반응을 촉진시켰다(Corinti S. 등, Leukoc. Biol. 2002, 71 (4): 652- 8).
Boberg 등은 아비딘/비오틴 시스템에 의해 마우스 적혈구의 표면에 고정된 HIV-1 프로테아제로부터 유래된 펩티드로 이루어진 백신을 마우스에 복강 내 주사하였다. 그들은 APCs에 의한 인식을 촉진할 목적으로 상기 적혈구를 화학적으로 변형시켰으나, 미약한 면역반응만이 얻어졌다. 그들은 적혈구에 의한 항원성 펩티드의 제한된 적재량 및 주입된 혈액 부피로 인해, 소량의 항원만이 운반되었으며, 이는 APCs의 항원 인식을 촉진하기 위한 운반체의 화학적 변형에 의해서도 보상되지 못한 것으로 결론을 내렸다(Boberg A. 등, Infect. Agents Cancer. , 2007, 182: 9).
본 발명은 면역 요법적 접근에 따라, 암의 치료에 사용될 수 있는 조성물과 백신을 제공함을 목적으로 한다.
따라서 발명의 목적은 숙주 내에서, 종양 세포에 대한 세포독성 세포 반응을 유도하고, 종양 항원을 함유하는 적혈구를 포함하는 조성물이다.
"숙주(host)"란 용어는 바람직하게는 인간이나, 또한 동물, 특히 애완동물( 특히 개나 고양이) 및 스포츠 목적의 동물(특히 말)을 가리킨다. 본 발명에 따르면, 상기 적혈구는 항원을 함유, 즉 피막화(encapsulate)하며, 이는 항원이 적혈구 내부에 있거나 본질적으로 적혈구 내부에 있는 것을 의미한다.
상기의 적혈구들은 바람직하게는, APCs 및 특히 수지상세포에 의한 적혈구의 포식 작용을 촉진할 목적으로 디자인되거나 선택되거나 또는 변형된다. 특히, 상기 적혈구들은 비장 및 간에서의 적혈구의 포식 작용을 촉진할 목적으로 디자인되거나, 선택되거나 또는 변형되며, 가장 본질적인 목적은 비장의 APCs를 표적화 하는 것이다.
바람직한 구체예에서, 본 발명에 따른 조성물은 항원을 보유하며 비장을 표적으로 하는 적혈구를 포함한다. 상기 조성물은 APCs, 특히 비장에 있는 수지상세포에 의한 상기 적혈구의 포식 작용을 촉진한다.
제 1 구체예에서, 상기 적혈구들은 종양 항원을 보유하며 상기 적혈구 표면에 존재하는 에피토프를 인식하는 면역글로불린과의 면역 복합체의 형태이며, 이는 특히 수지상세포에 의한 상기 적혈구의 포식 작용을 촉진하기 위함이다. 상기 조성물은 또한 대식세포에 의한 포식 작용의 촉진을 가능하게 한다. 바람직하게는, 면역글로불린은 면역글로불린 G이다.
상기 면역 복합체의 형성은 적혈구 및 하나 이상의 항체, 바람직하게는 IgG 서브타입을 포함한다. 수지상세포는, 그들의 표면에, 면역글로불린 G(IgGs)의 불변 Fc 영역에 대한 수용체를 갖는다. 이 수용체는 그와 같이 형성된 항원-IgGs 면역 복합체의 포식 작용 또는 세포 내 함입을 촉발할 수 있고, MHC 클라스 Ⅰ 및 클라스 Ⅱ 분자의 항원 제시를 촉진할 수 있으며, 이는 CD4+ 보조 림프구(helper lymphocytes) 및 특히 CD8+ 세포독성 림프구(cytotoxic lymphocytes)의 생산을 야기한다.(A. Regnault 등, J. Exp. Med., Janvier 1999, 189(2): 371 -80).
적당한 항체로서, 항-레서스 항체, 항-글리코포린 A 항체, 및 항-CR1 항체(complement receptor type 1: CR1)가 언급될 수 있다. 항-글리코포린 A 항체가(A.Bigbee 등, MoI. Immunol., December 1983, 20(12): 1353-62) 바람직한 양상이다.
바람직하게는, 면역 복합체를 형성하는데 사용되는 인간 유래 상기 적혈구는 공여체로부터 유래한 외래 적혈구이다.
제 2 구체예에서, 상기 적혈구는 종양 항원을 보유하고 열 또는 화학적 방법으로 변형되어 특히 수지상세포에 의한 적혈구의 포식 작용을 촉진하도록 되어 있다. 상기 조성물은 대식세포에 의한 포식 작용을 또한 촉진할 수 있다.
상기 열처리는 특히 다음의 조건 하에서 이루어진다: 적혈구를 약 15분에서 90분, 바람직하게는 약 25분에서 약 50분 동안, 약 42℃와 약 55℃ 사이의 온도, 바람직하게는 약 47℃와 약 51℃ 사이의 온도에서 가열한다. 일반적으로, 적혈구는 약 48℃와 약 50℃ 사이, 예를 들면 약 48℃에서 약 30분 동안 가열된다.
상기 화학적 처리는 적혈구의 표면을 변형시키는 물질, 및 특히 비스(술포숙시니미딜) 수버레이트(BS3 또는 BS³), 글루타르알데히드 또는 뉴라미니다아제와 같은 연결제(bridging agent) 또는 가교제(crosslinking agent)를 사용하여 수행된다.
특정한 구체예에서, 2 이상의 표적화 방법이 조합되며, 예로서, 상기 조성물은 항원을 보유하는 적혈구를 포함하고, 이 적혈구는 면역 복합체의 형태로 존재하며 열 또는 화학적 방법으로 처리되어 비장 및/또는 간에서의 흡수, 바람직하게는 비장에서의 흡수를 촉진하고, APCs, 특히 수지상세포에 의한 포식 작용을 촉진하도록 되어있다.
제 3 구체예에서, 상기 항원을 보유하는 적혈구는 이종의 것이다. 사람에 대한 이종 적혈구 주입은 환자의 자연항체와 주입된 적혈구가 결합하는 결과를 초래한다. 그렇게 형성된 면역 복합체는 APCs, 특히 수지상세포에 의한 포식 작용을 촉진한다. 바람직하게는, 상기의 적혈구들은 돼지에서 유래한 것이다.
특정한 구체예에서, 상기 이종 적혈구는 이에 대한 포식 작용을 촉진하기 위해 열 또는 화학적 방법으로 변형된다.
본 발명에 따른 상기 조성물은 하나 이상의 종양 항원을 포함할 수 있다. 다수의 종양 항원이 존재할 경우, 상기 종양 항원은 한 종류의 종양 또는 종양 세포에 대항하는 면역반응을 유도하기 위해 바람직하게 선택된다.
조성물은 바람직하게는 치료되어야 할 종양을 나타내는 2 이상의 종양 항원을 포함한다. 그 목적은 세포독성 T 림프구의 다수의 클론을 생산하는 것으로, 이들은 각각 특이적인 항원성 펩티드를 인식하여 보다 효과적인 면역 반응을 발달시킨다.
특정한 구체예에서, 싱기 조성물은 2군(population) 이상의 적혈구를 포함하며, 이들 각각은 서로 다른 항원을 보유한다.
여기서 사용 가능한 가장 잘 알려진 항원들이 아래 표에 기재되어 있으며, 이들은 카테고리별로 분류되어 있다.
고유 항원:
몇몇 종양에 공통되는 항원:
a) 종양-특이적 항원
b) 분화 항원
c)과발현 항원
Van der Bruggen 등은 T 림프구에 의해 인식되고 본 발명에 따른 암 면역요법적 접근에 이용 가능한 인간 종양 항원을 참조하는 데이터베이스를 구축하였다:
http://www.cancerimmunity.org/peptidedatabase/Tcellepitopes.htm.
다음과 같은 다른 항원들이 본 발명에서 이용될 수 있다: 가스트린 17, 인간 융모성 생식선 자극호르몬, EGFRvIII, HER2, HER2/neu, P501, 구아닐릴 시클라아제 C, PAP.
항원이란 단어는 항원이 적절한 면역 반응을 개시할 수 있는 한, 자연적 또는 합성적 또는 인공적 기원을 갖는 항원, 치료받는 환자로부터 유래된 항원, 항원의 단편, 유도체 또는 변이체를 모두 포함한다. 상기 항원은 예를 들어 추출되거나, 화학적으로 합성되거나, 또는 유전공학기술에 의해 제조될 수 있다.
효과적인 면역 반응을 발생시키기 위해서는, 수지상세포가 활성화 및 성숙해야 하며, 사이토카인 및 케모카인을 생산해야 하고 T 림프구의 모집(recruitment) 및 활성화에 필요한 동시자극(costimulation) 분자들을 발현해야 한다.
다양한 종류의 항원보강제들이 APCs, 특히 수지상세포를 자극하는데 사용될 수 있다. 박테리아 또는 바이러스 RNA 또는 DNA, 열충격단백질(HSPs), 당, 면역 복합체 및 사이토카인들은 APC의 성숙, 특히 특이적인 수용체(Toll-유사 수용체 TLR, 만노오스 수용체)의 자극에 의해 매개되는 수지상세포의 성숙을 유도하는 다양한 인자들이다. 대식세포와 수지상세포가 표면에 모두 동일한 수용체를 나타내는 것은 아니다. 따라서 항원보강제의 선택은, 인체에서 세포독성 면역반응을 발생시킬 능력이 있으며, 본 발명의 적혈구들을 포식하는 세포들의 표면, 따라서 특히 수지상세포의 표면에서 수용체가 발견되는 분자들과 관련이 있다.
일 구체예에 따르면, 상기 항원보강제는 적혈구의 내부에 피막화되어 있거나 적혈구의 표면에 부착된 분자이다. 이들은 바람직하게는 항원을 함유하는 적혈구들이다.
대안적으로, 상기 항원보강제는 별도로 처리된 다른 적혈구들의 내부에 피막화되거나 표면에 부착된다. 이 적혈구들은 APCs, 특히 수지상세포들에 의한 포식 작용의 촉진을 위해 변형 또는 선택될 수 있다. 따라서 이들은, 전술된 바와 같이, 면역 복합체의 형태로 존재하거나, 열처리 또는 화학적 처리에 의해 변형되거나 또는 이종에서 유래한 것일 수 있다.
또다른 구체예에 따르면, 상기 항원보강제는 별개의 항원보강제 조성물이며, 이는 상기 항원을 함유하는 적혈구들과 동시에 또는 별개로 투여될 수 있다.
상기 항원보강제가 별개의 조성물일 수 있는 한(적혈구 조성물 또는 항원보강제 조성물), 상기 항원보강제는 상기 항원을 함유하는 적혈구와 각각 또는 혼합물의 형태로서 동시 투여되거나, 또는 별개로, 예를 들어 상기 항원을 함유하는 적혈구의 투여 후 몇 시간 또는 몇 일 뒤에 투여될 수도 있음은 당연한 것이다.
사용가능한 상기 항원보강제 중에서, 이하의 바람직한 항원보강제들에 대해 우선적으로 언급한다.
-TLRs(Toll-유사 수용체) 리간드, 특히 이미다조퀴놀론, 바람직하게는 다음과 같다: 이미다조퀴놀린 CL097, 이미퀴모드, 레지퀴모드와 같은 이미다조퀴놀린계; CpG 올리고데옥시뉴클레오티드; LPSs(lipopolysaccharides); 폴리(이노신산)-(폴리시티딘산 폴리(1:C));
-사이토카인, 특히: 인터페론 알파, IL-2(인터루킨 2), IFNγ(인터페론 감마), GM-CSF(과립구 단핵구 집락 자극인자), IL-12(인터루킨 12), TNFα(종양괴사인자 알파).
다른 사용가능한 상기 항원보강제 중에서는 특히 다음의 것들이 언급될 수 있다:
-박테리아 구성성분, 특히 BCG(Bacillus Calmette Guerin), MDP(무라밀 디펩티드), TDM(트리할로오스 디마이콜레이트), LPS(lipopolysaccharide), MPL(모노포스포릴 리피드 A);
-광물성 항원보강제, 특히: 알루미늄 히드록사이드, 알루미늄 포스페이트, 포타슘 포스페이트 및 칼슘 포스페이트;
-박테리아성 독소, 특히: CT(Vibrio cholera에서 분리한 콜레라 독소), CTB(
Vibrio cholera에서 분리한 콜레라 독소), PT(Bordetella pertusis에서 분리한 백일해 독소), LT(Escherichia coli에서 분리한 열불안정성 림포톡신);
-KLH, Keyhole limpet haemocyanin.
활성 성분들을 적혈구 내에 피막화하는 기술이 알려져 있으며, 여기서 바람직한 용해-재봉합(lysis-resealing)에 의한 기초적 기술이 특허 EP-A-101 341 및 EP-A-679 101에 개시되어 있으며 당업자는 이를 참조할 수 있다. 상기 기술에 의하면, 투석 성분의 일차 구획이(예를 들어, 투석 튜빙 또는 투석 카트리지) 적혈구의 현탁액으로 지속적으로 공급되며, 반면 이차 구획은 적혈구를 용해시킬 목적으로 적혈구 현탁액에 대해 저장성인 수용액을 함유한다. 다음으로, 재봉합 유닛에서는, 삼투압(osmotic 및/또는 oncotic pressure)을 증가시킴으로써 상기 종양 항원의 존재하에 적혈구의 재봉합이 유도되며, 그 후 상기 종양 항원을 보유하는 적혈구의 현탁액이 수집된다.
지금까지 개시된 다양한 방법들 중에 바람직한 것은 프랑스 특허출원 No. 0408667에 개시된 것으로, 이에 의하면 효율적이고 재생가능하며 안전하고 안정적으로 상기 종양 항원을 피막화할 수 있다. 이 방법은 하기의 단계들을 포함한다:
1- 헤마토크리트 수치가 65% 이상인 등장액 내의 적혈구 펠렛 현탁액을 +1 및 +8°C 사이에서 냉각시키는 단계,
2- 상기 적혈구 펠렛에서 채취한 적혈구의 샘플을 이용한 삼투압 취약성(osmotic fragility) 측정
1단계와 2단계는 어느 순서로도 수행될 수 있다(병행하는 것을 포함).
3- + 1 및 + 8°C 사이의 온도가 일정하게 유지되는 동일한 챔버(chamber) 내에서 이루어지는 용혈단계 및 종양 항원의 함입 단계로서, 해마토크리트 수치가 65% 이상인 적혈구의 현탁액 및 + 1 및+ 8°C사이로 냉각된 저장의 용혈용액을 투석 카트리지를 통해 통과시키는 단계를 포함하며; 및 이전에 측정한 상기 삼투압 취약성에 따라 용혈 파라미터를 조정하는 단계; 및
4- 제 2 챔버 내에서, 내부 온도는 + 30 및 + 40℃ 사이이며, 고장액의 존재 하에서 수행되는 재봉합 단계.
"함입(internalization)"은 상기 종양 항원의 상기 적혈구 내부로의 침투를 의미하기 위한 목적으로 사용된다.
특히, 투석에 있어서, 상기 적혈구 펠렛은 높은 헤마토크리트 수치, 즉 65%이상인 등장액, 바람직하게는 70% 이상인 등장액에서 현탁화되며, 이 현탁액은 + 1 및 + 8°C 사이, 바람직하게는 +2 및 +6°C 사이, 일반적으로는 약 +4°C의 영역 에서 냉각된다. 특정한 구체예에 따르면, 상기 헤마토크리트 수치는 65% 및 80% 사이이고, 바람직하게는 70% 및 80% 사이이다.
상기 삼투압 취약성은 유익하게도 상기 용혈 단계 직전 상기 적혈구에 대해 측정된다. 적혈구 또는 이들을 함유하는 현탁액은 유익하게도 용해를 위해 선택된 온도와 동일하거나 그에 가까운 온도에서 존재한다. 본 발명의 또다른 유익한 특성으로, 상기 삼투압 취약성의 측정이 신속하게 이루어지는데, 즉 상기 용해 과정이 샘플이 채취된 이후 단시간내에 이루어진다. 바람직하게, 샘플 채취와 용해 시작 사이의 시간 간격은 30분 이하이고, 더욱 바람직하게는 25분보다 훨씬 이하, 심지어 20분 이하이다.
상기 삼투압 취약성을 측정 및 고려하면서 용해-재봉합 과정이 수행되는 방식과 관련하여, 보다 세부적 사항을 위해서 당업자들은 프랑스 특허출원 제 0408667호를 참고할 수 있다.
본 발명의 한 특징에 따르면, 본 발명에 따른 상기 조성물은 결국에는 헤마토크리트 수치가 약 40% 및 약 70% 사이, 바람직하게는 약 45% 및 약 55% 사이, 더욱 바람직하게는 약 50%인 적혈구 현탁액을 포함한다. 이는 바람직하게는 약 10 에서 약 250ml 부피로 포장된다. 포장은 바람직하게는 수혈에 적당한 종류의 혈액 가방에서 이루어진다. 처방전에 부합하는 피막된 종양 항원의 양은 바람직하게는 전량 혈액 가방에 포함되어 있다.
또한 본 발명의 목적은 본 발명에 따른 하나 이상의 조성물의 유효량을 포함하는 치료용 항종양 백신이다. 따라서 상기 백신은 피막되거나 그렇지 않은 항원보강제의 존재 또는 부재하에서, 그 자체로 하나 이상의 종양항원을 보유하는(encapsulating) 하나의 적혈구 집단을 포함하는 본 발명에 따른 조성물 자체, 또는 피막되거나 그렇지 않은 항원보강제의 존재 하에서 하나 이상의 종양 항원을보유하는 적혈구의 서로 다른 집단들을 갖는 2 이상의 본 발명에 따른 조성물을 포함할 수 있다.
또한 본 발명의 목적은 환자 내에서, 종양 세포 또는 종양에 대항하는 세포독성 세포 반응을 유도하는 방법이다. 이 방법은 환자에게 본 발명에 따른 조성물의 유효량을 특히 정맥내로, 주사(injection) 또는 주입(infusion), 바람직하게는 주입에 의해 투여하는 과정을 포함한다. 이 방법은 특히 환자의 수지상세포 및 CD8+ 세포독성 세포 반응의 활성화를 목적으로 한다. 전술된 바와 같이, 특이적 CD4+ 헬퍼 및 세포독성 반응이 얻어진다.
또한 본 발명의 목적은 전술된 바와 같이, 환자 내에서 종양 세포 또는 종양에 대항하는 세포독성 세포 반응을 유도하기 위한 항암 치료방법이다. 이 방법은 환자에게 본 발명에 따른 항종양 백신의 유효량을 특히 정맥내로, 주사 또는 주입, 바람직하게는 주입에 의해 투여하는 단계를 포함한다.
본 발명의 한 특징에 따르면, 헤마토크리트 수치가 약 40% 및 약 70% 사이, 바람직하게는 약 45% 및 약 55% 사이, 더욱 바람직하게는 약 50%인 적혈구 현탁액 약 10 내지 약 250ml가 투여된다.
또한 본 발명의 목적은 치료용 항종양 백신의 제조를 위한, 본 발명에 따른 조성물의 용도이다.
또한 본 발명의 목적은 숙주 내에서 수지상세포에 의해 매개되고 종양 세포 또는 종양에 대항하여 야기되는 세포독성 세포 반응의 유도를 위한, 발명에 따른 조성물의 용도이다.
본 발명의 또다른 목적은 치료용 항종양 백신으로서 사용하기 위한 본 발명에 따른 조성물이다.
도 1 : 인 비트로(in vitro)에서 비장 수지상세포에 의한, 항-TER 119 항체로 처리된 "항원-적재된(antigen-loaded)" 적혈구에 대한 포식 작용의 측정.
도 2 : 체내(in vivo)에서 비장 대식세포 및 수지상세포에 의한, 항-TER 119 항체로 처리된 또는 열처리된 "항원-적재된" 적혈구에 대한 포식 작용의 측정.
도 3 : 마우스에 대한 주사 3일 후 오브알부민-특이적 CD4 T세포의 증식 및 활성화를 보여주는 그래프.
(A) 세포분열이 CFSE 형광 강도의 저하를 야기한다. OVA- 특이적 CD4 T세포들은 각 분열때마다 형광 물질의 반을 잃는다. 4번 뱃치(batch)에서 관찰되는 피크는 CFSE를 다량 함유한 미분열된 세포들을 나타낸다. 다른 모든 피크들은 1,2,3,4,5,6, 또는 7회의 세포분열을 거친 세포들을 나타낸다. 세포가 8회 이상 분열한 경우, 세포의 CFSE 함량은 사실상 0이 된다.
(B) CD4 세포 활성 마커의 발현이 분열 횟수에 대한 함수로서 나타나있다.
도 2 : 체내(in vivo)에서 비장 대식세포 및 수지상세포에 의한, 항-TER 119 항체로 처리된 또는 열처리된 "항원-적재된" 적혈구에 대한 포식 작용의 측정.
도 3 : 마우스에 대한 주사 3일 후 오브알부민-특이적 CD4 T세포의 증식 및 활성화를 보여주는 그래프.
(A) 세포분열이 CFSE 형광 강도의 저하를 야기한다. OVA- 특이적 CD4 T세포들은 각 분열때마다 형광 물질의 반을 잃는다. 4번 뱃치(batch)에서 관찰되는 피크는 CFSE를 다량 함유한 미분열된 세포들을 나타낸다. 다른 모든 피크들은 1,2,3,4,5,6, 또는 7회의 세포분열을 거친 세포들을 나타낸다. 세포가 8회 이상 분열한 경우, 세포의 CFSE 함량은 사실상 0이 된다.
(B) CD4 세포 활성 마커의 발현이 분열 횟수에 대한 함수로서 나타나있다.
이하 본 발명은 비제한적인 실시예에 의한 구체예들에 의해, 첨부된 도면을 참조하여 보다 상세히 기술될 것이다.
실시예 1. 마우스 및 사람의 적혈구 및 돼지의 적혈구 내에 오브알부민을 피막화하는 방법.
변형(
variant
) 1:
오브알부민(45 kDa의 단백질, 암탉의 난 오브알부민)을 투석 튜빙 내에서 저장 투석(hypotonic dialysis)의 방법에 의해 마우스의 적혈구(OF1 마우스 또는 C57BI/6 마우스)에 피막화한다. 투석을 위해 상기 적혈구 현탁액을 수차례 세척하여 헤마토크리트가 70%가 되게 한다. 상기 투석은 투석 튜빙 내 낮은 오스몰농도의 용해 완충액에서, 투석이 열처리 후에 이루어지는 경우 약 1시간 또는 30분 동안 수행된다. 그 후 상기 적혈구를 30분 동안 높은 오스몰농도의 용액을 이용하여 재봉합한다. 몇번의 세척 후에 최종 산물을 완충액 SAG-만니톨(mannitol)에 넣고 헤마토크리트가 50%가 되게 하였다.
변형(
variant
) 2:
여기서는 오브알부민을 투석 컬럼 내에서 저장 투석의 방법에 의해 마우스의 적혈구 내에 피막화한다. 투석을 위해 상기 적혈구 현탁액을 수차례 세척하여 헤마토크리트가 70%가 되게 한다. 투석은 투석 컬럼 내 낮은 오스몰농도의 용혈 완충액에서, 약 10분 동안 수행된다. 컬럼을 빠져나가는 즉시, 상기 적혈구들은 37℃에서 30분 동안 높은 오스몰농도의 용액을 이용하여 재봉합된다. 몇번의 세척 후에, 최종 산물을 클루코오스 SAG 만니톨을 함유하는 NaCl 글루코오스 완충액, 또는 보체가 제거된(decomplemented) 혈장에 넣고, 헤마토크리트가 다시 50%가 되게 하였다.
실시예 2. 상기 적혈구에 대한 열처리
피막화가 실시예 1의 변형 1에 따라 이루어질 경우, 열처리는 투석 과정 이전에 이루어진다. 피막화가 실시예 1의 변형 2에 따라 이루어질 경우, 열처리는 투석 및 재봉합 공정 이후, 세척 단계 및 NaCl 글루코오스 완충액의 첨가 이전에 이루어진다.
적혈구를 수차례 세척하여 헤마토크리트가 10%가 되게 한다. 그리고 나서 이를 48℃에서 30분 동안 가열한다.
실시예 3. 오브알부민을 함유하는 적혈구에 대한 항체 처리
오브알부민을 함유하는 적혈구의 현탁액을 수차례 세척한 후 체내(in vivo) 실험의 경우 109 cells/ml, 인 비트로(in vitro) 실험의 경우 108cells/ml이 되게 하였다. 이를 4℃에서 30분 동안 항-TER 119 항체와 함께 배양한다(인 비트로 실험의 경우 10 μg/ml, 체내 실험의 경우 23 μg/ml 또는 5 μg/ml). 몇번의 세척 후에 최종 산물을 주사가능한 품질의 완충액에 넣고, 헤마토크리트는 50%가 되게 한다.
실시예 4. 오브알부민을 함유하는 적혈구에 대한 비스(술포숙시니미딜) 수버레이트(BS3)를 이용한 화학적 처리
오브알부민을 함유하는 적혈구의 현탁액을 수차례 PBS로 세척한 후 1.7 x 106 cell/μl이 되게 하고, 2 mM BS3의 완충액 (BS3 용액은 글루코오스와 인산 완충액을 함유한다, pH7.4) 1 부피와 혼합하여 최종 1mM의 BS3 농도를 얻었다. 세포들을 30분 동안 상온에서 배양한다. 반응은 1부피의 20 mM Tris-HCl을 첨가함으로써 종료된다. 상온에서 5분 동안 배양한 후에, 상기 혼합물을 4℃에서 800g로 5분 동안 원심분리한다. 상기 세포들을 글루코오스를 함유하는 PBS로 2회(800g에서 원심분리), SAG-만니톨로 1회(1000g에서 원심분리) 10분 동안 세척하여 최종 산물을 얻었다.
실시예 5. 인 비트로(in vitro)에서 수지상세포에 의한 오브알부민을 함유하는 적혈구에 대한 포식 작용의 측정
실시예 1의 변형 1로부터 얻어지는 다양한 처리(열 및 항체)들이 적혈구에 대한 수지상세포의 포식 작용의 효율에 미치는 영향을 인 비트로에서 측정한다. 상기 적혈구들을 4℃에서 20분 동안, 형광성 라벨인 CFSE(카르복시플루오레신 숙시니미딜 에스테르)로 표지한다. CFSE는 세포막을 통해 확산되는 비형광성 염료이다. 일단 세포 내에 들어가면, 분자는 세포내 에스테라아제에 의해 절단된 후 형광을 띠게 된다.
수지상세포는 자성을 띠는 비드를 사용하여 C57BI/6 마우스의 비장에서 분리된다. 이러한 비드들은 CD11c 마커를 인식하는 항체들을 가지고 있으며, 이에 따라 CD11c+ 수지상세포 분획을 분리할 수 있다.
CFSE로 표지되거나 그렇지 않은 적혈구들을 그 후 4시간 동안, 37°C, 5% CO2 에서 둥근 바닥 96-well 배양 접시에서 200 μl/well의 최종 부피로 수지상세포와 함께(10 x 106 cell/ml) 20:1의 비율로 배양한다. 4시간 동안 배양한 후, 수지상세포에 의해 포식되지 않은 상기 적혈구들은 NH4Cl에 의해 용해되며, 수차례의 세척을 수행한다. 그 후 수지상세포에 의한 CFSE 플루오로크롬의 포획을 유세포분석법(flow cytometry)에 의해 측정한다(R. Segura 등, J. Immunol, January 2006, 176(1 ): 441 -50).
세 군의 적혈구들에 대하여 시험하였다:
(A) 오브알부민이 적재되고 CFSE 플루오로크롬으로 표지되지 않은 적혈구,
(B) 오브알부민이 적재되고 CFSE로 표지된 적혈구,
(C) 오브알부민이 적재되고 항-TER 119 항체로 처리되었으며 CFSE로 표지된 적혈구.
결과
<표 1> 형광 적혈구를 포식한 수지상세포의 백분율:
인 비트로에서(in vitro), 4시간 동안 함께 배양한 결과, 오브알부민이 적재되고 항-TER 119 항체로 처리된 마우스의 적혈구는 그러한 처리를 하지 않은 적혈구에 비해 비장에서 분리된 수지상세포에 의해 보다 효율적으로 포식되었다(도 1, 각각 C 및 B). 상기 수지상세포의 36%가 상기 항체를 수송하는 상기 적혈구들을 포식한 데 비해, 항체가 없는 상태에서는 27%에 불과하였다. CD11c 수지상세포 마커를 발현하지 않는 집단에 의해서도 항체 처리된 적혈구들의 포식작용이 관찰되었다(10.95%; 도 1, C).
실시예 6. 마우스에 대한 체내 실험(in vivo)에 있어, 비장 및 간의 대식세포 및 수지상세포에 의한, 오브알부민을 함유하는 적혈구 포식의 측정
본 연구는 오브알부민을 함유하는 OF1 마우스의 적혈구를 혈족이 아닌 C57BI/6 마우스에 투여하였으므로 동종 연구(allogenic study)에 해당한다.
OF1 마우스로부터 유래하고 오브알부민이 적재된(실시예 1의 변형 1) 적혈구 74 x 107로 이루어진 세 종류의 뱃치로서, 열로 처리된 것, 항-TER 119 항체로 처리된 것(각각 실시예 2 및 3에 상술되었다), 또는 아무런 처리가 되지 않은 것이 준비되었다. 이 뱃치들은 다음과 같은 방법으로 나뉘어진다.
뱃치 1: 열 또는 항체 처리를 하지 않은 것(도 2, A 및 D)
뱃치 2: 열로 처리된 것(도 2, B 및 E)
뱃치 3: 항-TER 119 항체로 처리된 것(도 2, C 및 F).
각각의 뱃치는 CFSE로 표지했고 C57BI/6 마우스에게 정맥 투여했다. 주사 후 3시간 뒤, 마우스의 혈액, 비장 및 간을 추출하였다. 마우스의 혈액 중을 순환하는 형광 적혈구의 백분율을 유세포분석법(flow cytometry)에 의해 측정하였다. F4/80 마커를 발현하는 비장 대식세포(도 2, A, B, C), F4/80 마커를 발현하는 간 대식세포 및 CD11c 마커를 발현하는 비장의 수지상세포(도 2, D, E, F)로 유입된 형광을 유세포분석법에 의해 측정하였다.
결과
<표 2> 마우스에 대한 주사 3시간 경과 후 형광 적혈구를 포식한 비장 대식세포 또는 수지상세포의 백분율:
주사 3시간 후, 오브알부민이 적재되고 열처리 또는 항-TER 119항체 처리된 마우스의 적혈구들은 대부분 더이상 마우스의 혈액에 남아있지 않았으며(1.6% 및 1%), 반면 아무런 처리를 하지 않은, 오브알부민이 적재된 적혈구들은 마우스의 혈관에 여전히 존재하였다(4.6%).
열처리 또는 항-TER 119 항체 처리된 적혈구들은 비장의 F4/80 대식세포 및 CD11c 수지상세포에 의해 포식된다(도 2).
항-TER 119 항체 처리된 적혈구들이 열처리된 적혈구 또는 아무런 처리도 되지 않은 적혈구에 비해 보다 효율적으로 비장 내 F4/80 대식세포에 의해 포식되었다(도 2. A,B,C). 열처리된 적혈구의 경우 68%, 아무런 처리되지 않은 적혈구의 경우 불과 28%의 대식세포만이 이들을 포식한 데 비해, 비장 대식세포의 81%가 항체 처리된 적혈구를 포식하였다(표 2).
열처리 또는 항체 처리된 적혈구들은 비장의 CD11c 수지상세포에 의해서도 아무런 처리를 하지 않은 적혈구보다 더욱 효율적으로 포식되었다(도 2). 각각 수지상세포의 22% 및 19%가 항체 처리된 적혈구 및 열처리된 적혈구를 포식한 반면, 아무런 처리를 하지 않은 적혈구의 경우 5%만이 수지상세포에 의하여 포식되었다(표 2).
CD11c 수지상세포 마커 또는 F4/80 대식세포 마커를 발현하지 않는 비장 유래 군집에 의한 항체-처리된 적혈구의 포식작용 역시 관찰되었다(11.9% 및 12.8%, 도 2).
<표 3> 마우스에 대한 주사 3시간 경과 후 형광 적혈구들을 포식한 간 대식세포의 백분율.
상기 열처리된 적혈구 또는 항-TER 119 항체 처리된 적혈구들은 간의 F4/80 대식세포에 의해 포식된다.
항-TER 119 항체 처리된 적혈구들은 열처리 되었거나 아무런 처리를 하지 않은 적혈구에 비해 간의 F4/80 대식세포에 의해 보다 효율적으로 포식되었다. 간 대식세포의 50%가 항체 처리된 적혈구들을 포식한 데 비해, 열처리된 적혈구의 경우 대식세포의 40%, 아무런 처리를 하지 않은 뱃치의 경우 24%의 대식세포만이 이들을 포식하였다(표 3).
결론적으로, 적혈구에 대한 항체의 결합 및 열처리는 비장 및 간에서 적혈구의 효율적인 표적화를 가능하게 하며, 이 적혈구들을 포식할 수 있는 수지상세포 및 대식세포의 백분율을 현저히 증가시킨다.
실시예 7. 체내(in vivo)에서, 골수 대식세포 및 수지상세포에 의한 형광 오브알부민을 함유하는 마우스 적혈구의 포식작용의 측정.
본 연구는 OF1 마우스의 적혈구를 OF1 마우스에 투여하였으므로, 자가 연구(autologous study)에 해당한다.
실시예 1의 변형 2를 사용하여 준비된, 형광 오브알부민이 적재된 OF1 마우스의 적혈구 132 x 107 로 이루어진 4개의 뱃치를(Serlabo Technologies, ref WO-LS003054), 항 TER 119 항체로 처리하거나 열 또는 BS3로 처리하거나(각각 실시예 3,2 및 4에 상술된 바와 같음) 또는 아무런 처리도 하지 않은 상태로 준비한다. 각각의 적혈구 뱃치를 두 마리의 마우스에 정맥내 주사한다. 주사 후 한 시간 반 경과 후, 마우스들을 희생시키고 대퇴골을 제거한다. F4/80 마커 또는 CD11b 마커를 발현하는 대식세포, Gr1 마커를 발현하는 과립구, CD11c 및 CD11b 마커를 발현하는 골수 수지상세포 및 CD11c 및 CD8 마커를 발현하는 형질세포양세포성(plasmatoid) 수지상세포 내로 유입된 형광을 유세포분석법에 의해 측정한다.
뱃치 1: 오브알부민-적재된 적혈구로서, BS3 처리된 것
뱃치 2: 오브알부민-적재된 적혈구로서, 열처리된 것
뱃치 3: 오브알부민-적재된 적혈구로서, 항-TER 119항체 처리된 것
뱃치 4: 오브알부민-적재된 적혈구
뱃치 5: NaCl 글루코오스
결과
<표 4> 주사 1시간 30분 경과 후 형광 오브알부민을 포식한 골수 대식세포, 과립구 또는 수지상세포의 백분율
주사 후 1시간 30분이 경과한 뒤, 항-TER 119항체 처리된, 오브알부민-적재된 적혈구들은 골수의 F4/80 대식세포, 과립구 및 수지상세포에 의해 효율적으로 포식되었다. 상기 골수의 골수성(myeloid) 수지상세포는 항-TER 119항체 처리된 오브알부민-적재된 적혈구의 포식에 가장 많이 관여하는 세포이다.
결론적으로, 항-TER 119항체 처리된 적혈구의 사용은 상기 골수에서 면역 세포에 의한 가장 뛰어난 적혈구 표적화 및 포식을 가능하게 한다.
실시예 8. 오브알부민이 적재된 적혈구 및 폴리(I:C) 항원보강제의 단일 주사 후의 오브알부민-특이적 CD4 T 세포 반응의 측정
OVA(오브알부민)-특이적 CD4 T 세포 반응의 평가는 OVA-특이적 CD4 T 세포의 백분율, 이들의 증식, 이들의 활성화 정도 및 IFNg(g=감마)의 생성량의 측정에 있다.
CD4 T 세포 반응의 평가는 Russo V. 등 The Journal of Clinical Investigation, 2007, 117 : 3087-3096 ; Stoitzner P. 등, The Journal of Immunology 2008, 180 : 1991 -1998 에서 상술된 방법들을 각색하여 이루어진다. OVA-특이적 CD4 T 세포반응을 측정하기 위해 OT-II 유전자이식 마우스의 CD4 T 세포들이 사용된다(Charles River, ref C57BL/6-Tg(TcraTcrb425Cbn/Crl)). 상기 OT-II 마우스는 주된 조직적합 복합체 클라스 II 분자들과 결합된 오브알부민 펩티드 323-339를 인식하는 CD4 T세포 만을 발현하는 마우스이다.
상기 OT-II 유전자이식 마우스는 OT-II 마우스의 비장으로부터 분리되며, Ly5.1 마우스에 정맥 주사되기 전 CFSE로 표지된다. OT-II 마우스와 Ly5.1 마우스는 동일한 유전적 배경을 가지나, 양자의 세포들은 CD45 마커에 의해서 확인될 수 있다. 이는 OT-II 마우스의 세포는 CD45.2 마커를 발현하는 반면, Ly5.1 마우스는 CD45.1 마커를 발현하기 때문이다.
유전자이식 마우스의 CD4 T 세포를 주사하고 20시간 경과 후, 다음 뱃치들을 Ly5.1 마우스에 정맥 투여한다. 세 마리에는 적혈구를 함유하는 뱃치를, 두 마리에는 유리된 OVA를 함유하는 뱃치 또는 대조군을 주사한다.
실시예 1의 변형 2를 이용하여 만들어지고, 항-TER 119 항체로 처리되거나 그렇지 않은( 실시예 3에 상술된 바와 같음 ), 오브알부민이 적재된 C57BI/6 마우스의 적혈구 183 x107 뱃치 두 개를 준비한다. 항원보강제인 폴리(I:C)(Invivogen, ref tlrl-pic)를 상기 뱃치들 및 유리된 오브알부민을 함유하는 뱃치에도 첨가한다. 마우스당 투여되는 폴리(I:C)의 양은 25 μg이다. 마우스에 투여되는 OVA의 양은 표 5에 나타나 있다.
이는 오브알부민이 적재된 C57BI/6 마우스의 적혈구를 Ly5.1 마우스에 투여하므로 자가 연구(이다. C57BI/6, Ly5.1 및 OT-II 마우스는 동일한 유전적 배경을 갖는다.
뱃치 1 : 폴리 (I:C), 및 항-TER 119 항체 처리된 오브알부민-적재된 적혈구
뱃치 2 : 폴리 (I:C), 및 오브알부민-적재된 적혈구
뱃치 3 : 폴리 (I:C), 및 유리 오브알부민
뱃치 4 : 혈장
뱃치를 주사하고 3일 후, 마우스를 죽이고 비장을 적출한다. 비장 내 OVA-특이적 CD4 T 세포의 백분율을 CD4, CD44 및 CD45.2 마커를 이용한 유세포분석법에 의해 측정한다(표 5). OVA-특이적 CD4 T 세포의 수는 OVA-특이적 CD4 T 세포의 백분율 및 트리판 블루에 의하여 계수된 총 림프구의 수로부터 계산하였다.
마우스의 비장 내 OVA-특이적 CD4 T 세포의 증식 및 활성화를 CD4, CD44 및 CD45.2 마커 및 CFSE를 이용하는 유세포분석법에 의해 측정한다( 표 6 및 7). 각 세포분열마다, OVA-특이적 CD4 T 세포에 함유된 CFSE의 양이 2로 나뉘어지며, 이는 유세포분석법에 의해 세포 분열 횟수를 결정할 수 있게 해준다(도 3).
마우스의 비장세포에 의한 IFNg의 생성량은 10 μg/ml의 오브알부민 펩티드 323-339의 존재하에서 인 비트로(in vitro) 자극을 가하고 3일 후 배양 상청액으로부터 (Neomps, ref) ELISA 검정법에 의해 측정한다.
결과
<표 5> 뱃치 투여 3일 후 OVA-특이적 CD4 T 세포의 백분율 및 수(평균±표준편차):
뱃치 투여 3일 후, 폴리(I:C) 및 항-TER 119 항체 처리되었거나 그렇지 않은 오브알부민-적재된 적혈구를 주사한 마우스는 유리 OVA 및 폴리(I:C)를 투여한 마우스보다 현저히 높은 OVA-특이적 CD4 T 세포의 백분율 및 수를 나타낸다(스튜던트 시험 *p= 0.01 , ** p=0.02).
더 나아가, 항-TER 119 항체 처리된 오브알부민-보유 적혈구를 함유하는 뱃치는, 아무런 처리를 하지 않은 오브알부민-보유 적혈구를 함유하는 뱃치보다 OVA-특이적 CD4 T 세포 수의 증가를 유도하는데 더욱 효과적이다(스튜던트 시험 p=0.04).
<표 6> 뱃치 주사 3일 후 0,1,2,3,4,5,6 또는 7번 분열한 OVA-특이적 CD4 T 세포의 백분율:
이러한 관찰결과는 체내 세포증식실험 결과에 의해서도 확인된다(표 6 및 도 3). 세포분열은 CFSE 형광 강도의 감소를 야기한다: 각 분열마다 형광 물질의 반이 소실된다(도 3A). 폴리(I:C) 및 항-TER 119 항체 처리된 상기 오브알부민-적재된 적혈구를 주사한 마우스의 경우(6에서 7회 분열), 유리 OVA 및 폴리(I:C)를 투여한 마우스와 비교할 때(3에서 4회 분열) OVA-특이적 CD4 T 세포가 더욱 빠르게 분열한다(표 6 및 도 3A). 더 나아가, 항-TER 119 항체 처리된 오브알부민-적재된 적혈구를 함유하는 뱃치는 아무런 처리를 하지 않은 오브알부민-적재된 적혈구를 함유하는 뱃치에 비해 세포 증식을 유도하는데 보다 효과적인 것으로 나타났다.
<표 7> 뱃치 투여 3일 후 OVA-특이적 CD4 T 세포의 활성화:
세포 활성화 정도(CD44 마커의 발현 정도에 의해 특징 지워진다)에 대한 결과는 분열하는 모든 OVA-특이적 CD4 T 세포는 높은 세포활성화 정도를 갖고 있음을 나타낸다(표 7 및 도 3). 또한, OVA-특이적 CD4 T 세포의 활성화 정도는 이들 세포의 분열 횟수와도 밀접한 연관성이 있을 수 있다: 세포들이 더 많이 분열하고 그들의 CFSE 마커 함량을 상실할수록, 더 높은 정도의 활성화 마커를 발현한다(도 3B).
<표 8> 3일 동안 10μg/ml의 오브알부민 펩티드 323-339로 인 비트로(in vitro)자극시킨 비장세포에 의한 IFNg 생성량
비장세포에 의한 IFNg 생성 결과는 폴리(I:C) 및 항-TER 119 항체 처리되었거나 그렇지 않은 오브알부민-적재된 적혈구를 주사한 마우스의 비장세포에 의한 IFNg의 대량 생산(strong production)을 보여준다. 결론적으로, 상기 결과들은 IFNg를 생산할 수 있는 OVA-특이적 CD4 T 세포들의 활성화 및 증식에 있어서, 항-TER 119 항체 처리되었거나 그렇지 않은 오브알부민-적재된 적혈구의 우월성을 입증한다.
실시예 9. 오브알부민-적재된 적혈구 및 폴리(I:C) 항원보강제의 1회 투여 후 오브알부민-특이적 CD8 T 세포 반응의 측정
상기 OVA-특이적 CD8 T 세포 반응의 평가는 OVA-특이적 CD8 T 세포의 백분율, IFNg의 생성 및 체내에서의(in vivo), 주조직적합복합체 클라스 I 분자와 결합된 오브알부민 펩티드 257-264를 제시하는 세포들의 세포용해를 측정하는 데 있다. 본 연구는 OF1 마우스에서 분리된 오브알부민-적재된 적혈구를 혈족이 아닌 C57BI/6 마우스에 투여하므로 동종 연구에 해당한다.
실시예 1의 변형 2를 이용하여 만들어지고, 항-TER 119 항체로 처리되거나 그렇지 않은( 실시예 3에 상술된 바와 같음 ), 오브알부민-적재된 OF1 마우스의 적혈구 167 x 107 뱃치 두 개를 준비한다. 상기 항원보강제인 폴리(I:C)를 상기 뱃치들 및 유리된 오브알부민을 함유하는 뱃치에도 첨가한다. 마우스당 투여되는 폴리(I:C)의 양은 25 μg이다. 마우스에 투여되는 OVA의 양은 표 9에 나타나 있다.
뱃치들을 C57BI/6 마우스에 정맥내 주사한다. 주어진 뱃치 하나를 최소 4마리의 마우스에 투여한다. 체내에서의(in vivo) 세포 용해는 Hervas-Stubbs S. 등, Blood 2007, 109 : 5318-5326 에서 상술된 방법을 각색하여 측정한다. 주조직적합복합체 클라스 I 분자와 결합된 오브알부민 펩티드 257-264를 제시하는 세포들을 면역된 마우스에 투여한다. 간단히, 투여 6일 후, 마우스에 오브알부민 펩티드 257-264를 제시하고 적당한 농도의 CFSE로 표지된 비장세포들 0.5 x 106(Neomps, ref SC1302) 및 펩티드를 제시하지 않고 고농도의 CFSE로 표지된 비장세포들 0.5 x 106를(세포용해 대조군) 주사한다(I:C).
오브알부민 펩티드 257-264 (BOVAp) 결합된 라텍스 비드(Latex bead) 및 폴리(I:C)가 오브알부민에 대항하여 CD8 T 면역반응을 유도하는 양성 대조군으로 사용된다. 체내에서(in vivo) BOVAp 및 폴리(I:C)의 투여는 오브알부민-특이적 CD8 T 세포의 백분율의 증가 및 OVA 257-264 펩티드를 제시하는 세포의 파괴를 유도한다는 사실을 보여준다(Herva-Stubbs).
뱃치 1 : 폴리(I:C), 및 항-TER 119 항체로 처리된 오브알부민-적재된 적혈구
뱃치 2 : 폴리(I:C), 및 오브알부민-적재된 적혈구
뱃치 3 : 오브알부민 펩티드 257-264에 결합된 라텍스 비드
뱃치 4 : 폴리(I:C), 및 오브알부민 펩티드 257-264에 결합된 라텍스 비드
뱃치 5 : 폴리(I:C) 및 유리 오브알부민
뱃치 6 : NaCl 글루코오스 + 혈장
비장세포의 투여 16시간 후, 마우스를 희생시킨 후 비장을 적출한다. 마우스의 비장 내 OVA-특이적 CD8 T 세포 백분율을 4량체(tetramer) 및 CD8 마커를 이용한 유세포분석법에 의해 측정한다(표 9). CD8 T 세포에 의한 IFNg 생성량 및 탈과립(CD107) 관련 마커의 발현량을 0.1 μg/ml의 오브알부민 펩티드 257-264의 존재하에서 4시간 동안 인 비트로(in vitro) 자극을 가한 후 유세포분석법에 의해 측정한다(표 10). 체내(in vivo)에서의 세포 용해는 CFSE를 사용한 유세포분석법에 의해 측정한다(표 11).
결과
<표 9> 뱃치 주사 7일 후 OVA-특이적 CD8 T 세포의 백분율(평균 ± 표준편차):
폴리(I:C) 및 항-TER 119 항체로 처리되었거나 그렇지 않은 오브알부민-적재된 적혈구를 주사한 마우스는 유리 OVA 및 폴리(I:C)를 투여한 마우스 또는 폴리(I:C) 및 BOVAp를 투여한 마우스보다 현저히 높은 OVA-특이적 CD8 T 세포의 백분율을 나타낸다(스튜던트 시험: *p = 0.001 및 **p = 0.01 ).
<표 10> 인 비트로(in vitro)에서 4시간 동안 0.1 μg/ml의 오브알부민 펩티드 257-264로 자극된 CD8 T세포에 의한 IFNg의 생성량
생산된 CD8 T 세포들은 오브알부민 펩티드의 자극에 반응하여 IFNg를 생산하고 CD107 마커를 발현하기 때문에 효과적이며 세포독성을 갖는다(표 10). IFNg를 생산하고 CD107 마커를 발현하는 CD8 T세포의 백분율은 유리 OVA 및 폴리(I:C) 또는 폴리(I:C) 및 BOVAp를 투여한 마우스에 비해, 폴리(I:C) 및 항-TER 119 항체로 처리되었거나 그렇지 않은 오브알부민-적재된 적혈구를 주사한 마우스에서 현저히 높다(스튜던트 시험, p < 0.008).
<표 11> 체내(in vivo) 항-OVA-특이적 세포용해의 백분율 (평균 ± 표준편차):
세포용해 결과는 탈과립(degranulation)과 관련된 마커의 발현과 밀접한 연관이 있다(표 10 및 11). 폴리(I:C) 및 항-TER 119 항체로 처리되었거나 그렇지 않은 오브알부민-적재된 적혈구의 투여는 폴리(I:C) 및 유리 오브알부민의 투여보다 효과적인 방식으로 오브알부민 펩티드 257-264를 전시하는 세포들의 용해를 유도한다(표 10).
결론적으로, 이러한 결과는 IFNg를 생산하고, 탈과립화하며, 오브알부민 펩티드 257-264를 전시하는 세포들을 용해시킬 수 있는 세포독성 CD8 T 세포들의 활성화 및 증식에 있어서, 폴리(I:C) 및 항-TER 119 항체로 처리되었거나 그렇지 않은 오브알부민-적재된 적혈구들의 우월성을 입증한다.
실시예 10. 오브알부민-적재된 적혈구 및 항원보강제 폴리(I:C)의 1회 투여 후 오브알부민-특이적 CD8 T 세포반응의 지속도 측정
OVA-특이적 CD8 T 세포반응의 지속도 평가는 OVA-특이적 CD8 T 세포의 백분율 및 1회 주사 34일 후 체내에서의(in vivo) 세포 용해의 측정으로 이루어진다.
본 연구는 OF1 마우스 오브알부민이 적재된 적혈구를 혈족이 아닌 C57BI/6 마우스에 투여하므로 동종 연구에 해당한다.
실시예 1의 변형 2에 따라 얻어지며, 항-TER 119 항체로 처리되거나 그렇지 않은( 실시예 3에 상술된 바와 같음 ), 오브알부민-적재된 OF1 마우스의 적혈구 15O x 107 뱃치 두 개를 준비한다. 항원보강제인 폴리(I:C)를 상기 뱃치들 및 유리된 오브알부민 또는 BOVAps를 함유하는 뱃치에도 첨가한다. 마우스당 투여되는 폴리(I:C)의 양은 25 μg이다. 마우스에 투여되는 OVA의 양은 표 12에 나타나 있다.
뱃치들을 C57BI/6 마우스에 정맥내 주사한다. 주어진 뱃치는 3마리의 마우스에 투여된다. 체내에서의(in vivo) 세포 용해를 측정하기 위해, 주조직적합복합체 클라스 I 분자와 결합된 오브알부민 펩티드 257-264를 제시하는 세포들을 면역된 마우스에 투여한다. 투여 33일 후, 마우스에 오브알부민 펩티드 257-264를 제시하고 적당한 농도의 CFSE로 표지된 비장세포들 0.5 x 106(NeoMPS, reference SC1302) 및 상기 펩티드를 제시하지 않고 고농도의 CFSE로 표지된 비장세포들 0.5 x 106를 주사한다(세포용해 분석법).
뱃치 1: 폴리(I:C) 및 항-TER119 항체 처리된 오브알부민-적재된 적혈구
뱃치 2: 폴리(I:C) 및 오브알부민-적재된 적혈구
뱃치 3: 오브알부민 펩티드 257-264와 결합된 라텍스 비드
뱃치4: 폴리(I:C) 및 BOVAp
뱃치5: 폴리(I:C) 및 유리 오브알부민
뱃치6: NaCl 글루코오스 + 혈장
비장세포 투여 16시간 후, 마우스를 희생시킨 후 비장을 적출한다. 마우스의 비장 내 OVA-특이적 CD8 T 세포 백분율은 4량체(tetramer) 및 CD8 마커를 이용한 유세포분석법에 의해 측정한다(표 12). 체내(in vivo)에서의 세포 용해는 CFSE를 사용한 유세포분석법에 의해 측정한다(표 13).
<표 12> 뱃치 주사 34일 후 OVA-특이적 CD8 T 세포의 백분율(평균 ± 표준편차)
주사 34일 후, OVA-특이적 CD8 T 세포의 백분율은 각 그룹이 동등하였다(표 12). 이러한 결과는 CD8 T 세포 증식의 정점이 약 7일째이고, 이후 수축기가 뒤따른다는 점을 고려할 때 놀라운 일이 아니다(Hervas-Stubbs S 등, Blood, 2007, 109: 5318-5326).
<표 13> 체내(in vivo)에서의 항-OVA-특이적 세포용해의 백분율 ( 평균 ± 표준편차 ):
주사 34일 후, OVA-특이적 CD8 T 세포들은 여전히 오브알부민 펩티드 257-264를 전시하는 세포들을 용해시킬 능력을 갖는다(표 13). 폴리(I:C) 및 항-TER 119 항체로 처리된 오브알부민-적재된 적혈구의 투여는 폴리(I:C) 및 BOVAp의 투여보다 효과적인 방식으로 세포용해를 유도한다(*스튜던트 시험, p < 0.04).
결론적으로, 이러한 결과들은 오브알부민-적재된 적혈구들이 세포독성 CD8 T 세포의 활성화 및 증식 측면에서 뿐 아니라, 오브알부민 펩티드 257-264를 전시하는 세포를 용해할 능력이 있는 T세포들의 지속/생존의 측면에서도 우월함을 입증한다.
실시예 11. 화학적으로 처리된 오브알부민-적재된 적혈구 및 폴리(I:C) 항원보강제의 1회 투여 후 오브알부민-특이적 CD8 세포반응의 측정
본 연구는 OF1 마우스에서 분리된 오브알부민-적재된 적혈구가 혈족이 아닌 C57BI/6 마우스에 투여되므로 동종 연구에 해당한다.
실시예 1의 변형 2를 이용하여 만들어지며, 1mM BS3로 화학적 처리된( 실시예 4에 상술된 바와 같음 ), 오브알부민-적재된 OF1 마우스의 적혈구 132 x 107 뱃치가 준비된다. 항원보강제인 폴리(I:C)가 상기 뱃치 및 유리된 오브알부민을 함유하는 뱃치에 첨가된다. 마우스당 투여되는 폴리(I:C)의 양은 25 μg이다. 마우스에 투여되는 OVA의 양은 표 14에 나타나 있다.
뱃치 1: 폴리(I:C) 및 1mM BS3로 화학적 처리된 오브알부민-적재된 적혈구
뱃치 2: 폴리(I:C) 및 유리 오브알부민
뱃치 3: 폴리(I:C)
뱃치4: 글루코오스를 함유하는 NaCl
뱃치들을 C57BI/6 마우스에 정맥내 주사한다. 주어진 뱃치 하나를 최소 3마리의 마우스에 투여한다. 투여하고 7일 후, 마우스를 희생시킨 후 비장을 적출한다. 마우스의 비장 내 OVA-특이적 CD8 T 세포 백분율을 4량체(tetramer) 및 CD8 마커를 이용한 유세포분석법에 의해 측정한다(표 14).
결과
<표 14> 뱃치 주사 7일 후 OVA-특이적 CD8 T 세포의 백분율 및 수(평균 ± 표준편차):
폴리(I:C) 및 BS3로 처리된 오브알부민-적재된 적혈구가 투여된 마우스는 유리 OVA 및 폴리(I:C)가 투여된 마우스 또는 폴리(I:C)가 투여된 마우스보다 높은 백분율의 OVA-특이적 CD8 T 세포를 갖는다. 이러한 결과는 통계학적으로는 다르지 않으나, 유리 OVA 투여량은 OVA-적재된 적혈구를 포함하는 뱃치로 투여된 OVA의 양보다 3배 이상 많다는 사실에 주목해야 한다.
결론적으로, 이러한 결과는 BS3로 처리된 오브알부민-적재된 적혈구 역시 OVA-특이적 CD8 T 세포를 생산할 능력이 있음을 보여준다.
실시예 12. 오브알부민-적재된 적혈구 및 CL-097 항원보강제의 1회 투여 후 오브알부민-특이적 CD8 T 세포반응의 측정
본 연구는 OF1 마우스에서 분리한 오브알부민-적재된 적혈구를 혈족이 아닌 C57BI/6 마우스에 투여하므로 동종 연구에 해당한다.
실시예 1의 변형 1을 이용하여 만들어지며, 항-TER 119 항체로 처리되거나 그렇지 않은( 실시예 3에 상술된 바와 같음 ), 오브알부민-적재된 OF1 마우스의 적혈구 119 x 107 뱃치들을 준비한다. 항원보강제인 CL097(Invivogen, ref tlrl-c97)을 상기 뱃치들에 첨가하거나 첨가하지 않는다. 마우스당 투여되는 CL097의 양은 0.15 μg이다. 마우스에 투여되는 OVA의 양은 표 15에 나타나 있다.
뱃치 1: CL097 및 항-TER 119 항체로 처리된 오브알부민-적재된 적혈구
뱃치 2: 항-TER 119 항체로 처리된 오브알부민-적재된 적혈구
뱃치 3: CL097 및 오브알부민-적재된 적혈구
뱃치 4: 오브알부민-적재된 적혈구
뱃치 5: 글루코오스를 함유하는 NaCl
상기 뱃치들을 C57BI/6 마우스에 정맥내 주사하였다. 투여한 지 4일 뒤, 마우스를 희생시키고 비장을 적출하였다. 다양한 뱃치를 투여한 쥐의 비장세포에 의한 IFNg 생성량은, 0.1 μg/ml의 오브알부민 펩티드 257- 264의 존재하에서 3일 동안 인 비트로 자극을 가한 후, 배양 상청액에서 ELISA 분석법에 의해 측정한다.
결과
<표 15> 인 비트로에서 3일 동안 0.1 μg/ml의 오브알부민 펩티드 257- 264로 자극된 비장세포에 의한 IFNg 생성량:
상기 비장세포에 의한 IFNg 생성 결과는 마우스가 CL097 항원보강제 및 항-TER 119 항체를 처리하거나 그렇지 않은 오브알부민-적재된 적혈구 모두를 투여받은 경우 더욱 증대된 IFNg 생성량을 보여준다.
결론적으로 CL097 항원보강제는 또한 오브알부민-적재된 적혈구의 투여로 유도된 IFNg 반응의 강도를 증대시킨다.
실시예 13. 마우스에서, 항원보강제인 폴리(I:C) 및 처리되거나 그렇지 않은 오브알부민-적재된 적혈구(erythrocyte)의 1회 투여 후 종양 성장의 측정
본 연구의 목적은 폴리(I:C) 및 처리되거나 그렇지 않은 오브알부민-적재된 적혈구의 1회 복용량 투여 후의 C57BI/6 마우스의 EG.7 세포주의 종양 성장을 측정하는 것이다. EG.7 종양 세포는 ATCC (ATCC-CRL-2113)로부터 얻을 수 있다. EG.7 세포는 EL.4 세포주에서 유래하며, 이들은 OVA를 항시적으로 합성 및 분비한다.
본 연구는 OF1 마우스에서 분리된 오브알부민-적재된 적혈구를 혈족이 아닌 C57BI/6 마우스에 투여하므로 동종 연구에 해당한다. 본 실험에서의 모델은 예방을 위한 모델이다.
항체로 처리되거나 그렇지 않은, OF1 마우스로부터 얻은 오브알부민-적재된 적혈구 165 x 107 뱃치 두 개를 실시예 1의 변형 2에 따라 준비하였다. 항원보강제인 폴리(I:C)를 상기 뱃치들에 첨가했다. 마우스당 25 μg의 폴리(I:C)를 투여하였다. 음성 대조군은 OVA가 적재되지 않은 적혈구의 현탁액이다. 마우스에 투여되는 OVA의 양은 표 16에 나타나 있다.
뱃치 1: 폴리(I:C) 및 항체 처리한 오브알부민-적재된 적혈구
뱃치 2: 폴리(I:C) 및 오브알부민-적재된 적혈구
뱃치 3: 오브알부민이 적재되지 않은 적혈구
상기 뱃치들을 C57BI/6 마우스에 정맥내 주사하였다(그룹당 마우스 10마리). 뱃치 투여하고 7일 후, 마우스당 2.2x106 EG.7 세포를 피하 주사하였다. 마우스의 종양 성장 여부를 지켜보았다. 종양 성장은 종양의 직경을 센티미터 단위로 측정함으로써(수직인 두 개의 직경 측정치의 평균으로 기록됨) 평가된다. 종양 크기는 14일동안 2일 간격으로 주 3회 측정한다. 직경 2.0cm 이상의 종양을 갖는 마우스는 희생시킨다.
<표 16> 마우스당 투여된 OVA의 양
<표 17> 종양 성장
EG.7 투여 7일 후에, 전에 OVA가 적재되지 않은 적혈구를 투여한 마우스의 옆구리에서는 종양의 크기가 측정 가능하였으며, 종양은 연구의 종료시까지 계속하여 성장하였다. 반면, 폴리(I:C) 및 항 TER 119 항체로 처리하거나 그렇지 않은 오브알부민-적재된 적혈구를 투여한 마우스의 옆구리에서는 종양이 발견되지 않았다. 상기 마우스 관찰은 여전히 진행중이다.
결론적으로, 이러한 결과들은 항-TER 119 항체로 처리하거나 그렇지 않은 오브알부민-적재된 적혈구가 OVA를 발현하는 암세포의 성장을 예방하는 데 효과적임을 입증한다.
실시예 14. 체내(in vivo)에서의 대식세포 및 수지상세포에 의한 돼지 적혈구 포식의 측정
본 연구는 돼지 적혈구들을 C57BI/6 마우스에 투여하므로 이종 연구(xenogenic study)에 해당한다.
돼지 적혈구를 글루코오스를 함유하는 NaCl에 3회 세척한 후, 전술된 바와 같이 CFSE로 표지하였다. 적혈구를 다시 글루코오스를 함유하는 NaCl에 3회 세척하고, 해마토크리트 50%까지 도달하도록 하였다. 돼지 적혈구 142 x 107 뱃치 하나를 3마리의 C57BI/6 마우스에 정맥내 주사하였다. 투여하고 1시간 후, 마우스를 희생시키고 마우스의 비장, 간장 및 대퇴골을 제거하였다. F4/80 마커 또는 CD11b 마커를 발현하는 대식세포, CD11c 및 CD11b 마커를 발현하는 골수 수지상세포, CD11c 및 CD8 마커를 발현하는 형질세포양세포성 수지상세포 내에 유입된 형광을 유세포분석법에 의해 측정하였다.
뱃치 1: 돼지 적혈구
뱃치 2: 글루코오스를 함유하는 NaCl
결과
<표 18> 투여 1시간 후 형광 적혈구를 포식한 비장 대식세포 또는 수지상세포의 백분율:
<표 19> 투여 1시간 후 형광 적혈구를 포식한 골수 대식세포 또는 수지상세포의 백분율:
<표 20> 투여 1시간 후 형광 적혈구를 포식한 간 대식세포 또는 수지상세포의 백분율:
투여 1시간 후, 돼지 적혈구는 비장의 F4/80 대식세포 및 수지상세포에 의해 효과적으로 포식되었다(표 18). 비장의 형질세포양세포성 수지상세포는 돼지 적혈구의 포식에 가장 많이 관여하는 세포이다. 골수 및 간에서는, 대식세포와 수지상세포는 형광 적혈구를 포식하지 않았다(표 19 및 20).
결론적으로, 돼지 적혈구의 사용은 면역 반응의 발생에 관여하는 비장 세포에 의한 적혈구의 표적화 및 포식을 가능하게 한다(Lou Y., 2007, J of Immunol, 178: 1534-1541 ).
실시예 15. 오브알부민을 포함하는 돼지 적혈구의 특성
오브알부민이 적재된 돼지 적혈구(실시예 1의 변형 2에 따라 얻어짐) 또는 적재되지 않은 돼지 적혈구 뱃치 2개를 준비하였다.
뱃치 1: OVA가 적재된 돼지 적혈구
뱃치 2: OVA가 적재되지 않은 돼지 적혈구.
상기 출발 물질에서 시작한 뱃치는 생성 완료시 및 생성 18시간 후 그 특성을 관찰하였다. 평균 입자 체적(globular volume), 평균적혈구혈색소량(corpuscular haemoglobin) 및 적혈구 농도는 ABX 세포 계수기를 사용하여 측정하였다. 삼투압 취약성은, 적혈구 50%의 용혈을 유도하는 NaCl의 농도에 대응되며, 이는 Osmocells instrument(SD Medical)을 사용하여 측정한다. 세포외 헤모글로빈은 분광광도법에 의해 측정한다. 오브알부민의 적혈구 내 농도, 세포외 오브알부민 농도 및 오브알부민의 평균 입자량은 ELISA 분석법을 이용하여 결정한다.
<표 21> 오브알부민을 포함하는 돼지 적혈구의 특성
예상대로, 투석 과정이 입자 체적 및 혈구혈색소량의 감소를 야기하였다. 또한. 상기 뱃치들의 삼투압 취약성은 최초 혈액의 적혈구의 그것보다 낮았다(표 21). 오브알부민을 포함하는 뱃치(뱃치 1)와 포함하지 않는 뱃치(뱃치 2) 간에 중대한 차이는 관찰되지 않았다.
뱃치 1에 있어 세포외 오브알부민의 양은 피막화된 오브알부민의 양과 비교할 때 상대적으로 낮았고, 생성 18시간 후에도 증가하지 않았으며 이는 오브알부민을 피막화하고 있는 적혈구의 안정성을 입증하는 것이다.
따라서, 오브알부민을 돼지 적혈구에 피막화하는 것이 가능하다.
Claims (19)
- 적혈구 내부에 종양 항원을 함유하는 적혈구의 현탁액, 주사가능한 완충액, 및 수지상세포의 성숙을 활성화하기 위한 항원보강제를 포함하는, 암 치료용 약제학적 조성물로서, 상기 조성물은 숙주에서 종양세포에 대한 세포독성 세포반응을 유도할 수 있는 것인 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 주사가능한 완충액은 NaCl 글루코오스 완충액인 것인 조성물.
- 제1항에 있어서, 헤마토크리트 수치가 40% 내지 70%인 적혈구를 포함하는 것인 조성물.
- 제1항에 있어서, 헤마토크리트 수치가 45% 내지 55%인 적혈구를 포함하는 것인 조성물.
- 제1항에 있어서, 헤마토크리트 수치가 50%인 적혈구를 포함하는 것인 조성물.
- 제1항에 있어서, 10 내지 250 ml 부피로 포장되는 것인 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 적혈구는 이종의 적혈구인 것인 조성물.
- 삭제
- 제1항에 있어서, 상기 항원보강제는 상기 적혈구의 내부, 상기 적혈구의 표면, 상기 적혈구의 외부, 또는 그의 조합에 존재하는 것인 조성물.
- 제9항에 있어서, 상기 항원보강제는 TLR(톨유사수용체, Toll-like receptor) 리간드 또는 사이토카인인 것인 조성물.
- 제10항에 있어서, 상기 TLR 리간드는 이미다조퀴놀린(imidazoquinoline), 이미퀴모드(imiquimod), 레지퀴모드(resiquimod), CpG 올리고데옥시뉴클레오티드, LPS (리포폴리사카라이드), 또는 폴리(이노신산)-폴리(사이티딘산)(poly(inosinic acid)-poly(cytidylic acid))으로부터 선택된 것인 조성물.
- 제10항에 있어서, 상기 사이토카인은 인터페론 알파, IL-2(인터루킨 2), IFN[γ](인터페론 감마), GM-CSF(Granulocyte Monocyte-Colony Stimulating Factor, 과립구 단핵구-집락자극인자), IL-12(인터루킨 12) 또는 TNF[α](Tumor Necrosis Factor alpha, 종양괴사인자 알파)로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 조성물.
- 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 치료되어야 할 종양을 나타내는 두 개 이상의 종양 항원을 포함하는 것인 조성물.
- 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 종양 항원은 하기의 항원들로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 조성물: 알파-액티닌-4; ARTC1; BCR-ABL 융합 단백질(b3a2); B-RAF; CASP-5; CASP-8; 베타-카테닌; Cdc27; CDK4; CDKN2A; COA-1; dek-can 융합 단백질; EFTUD2; 연장인자 2(Elongation factor 2); ETV6-AML1 융합 단백질; FN1 ; GPNMB; LDLR-퓨코실트랜스퍼라아제AS 융합 단백질; HLA-A2d; HLA-A11d; hsp70-2; KIAAO205; MART2; ME1 ; MUM-If; MUM-2; MUM-3; neo-PAP; 미오신 클라스 I; NFYC; OGT; OS-9; pml-RAR알파 융합 단백질; PRDX5; PTPRK; K-ras; N-ras; RBAF600; SIRT2; SNRPD1 ; SYT-SSX1 또는 SSX2 융합 단백질; 트리오즈포스페이트 이소머라아제(Triosephosphate Isomerase); BAGE-1; GAGE-1,2,8; GAGE-3,4,5,6,7; GnTVf; HERV-K-MEL; KK-LC-1; KM-HN-1; LAGE-1; MAGE-A1; MAGE-A2; MAGE-A3; MAGE-A4; MAGE-A6; MAGE-A9; MAGE-A10; MAGE-A12; MAGE-C2; mucin k; NA-88; NY-ESO-1 / LAGE-2; SAGE; Sp17; SSX-2; SSX-4; TRAG-3; TRP2-INT2g; CEA; gp100 / Pmel17; 칼리크레인 4(Kallikrein 4); 마마글로빈-A(mammaglobin-A); 멜란-A(Melan-A) / MART-1; NY-BR-1; OA1; PSA; RAB38 / NY-MEL-1; TRP-1 / gp75; TRP-2; 티로시나아제; 아디포필린(adipophilin); AIM-2; BING-4; CPSF; 싸이클린 D1; Ep-CAM; EphA3; FGF5; G250 / MN / CAIX; HER-2 / neu; IL13R알파2; 장관 카르복실 에스터라아제(Intestinal carboxyl esterase); 알파-포에토프로틴(alpha-foetoprotein); M-CSF; mdm-2; MMP-2; MUC1; p53; PBF; PRAME; PSMA; RAGE-1; RNF43; RU2AS; 세세르닌 1(secernin 1); SOX10; STEAP1; 서바이빈(survivin); 텔로머라아제(Telomerase); WT1; FLT3-ITD; BCLX(L); DKK1; ENAH(hMena); MCSP; RGS5; 가스트린-17; 인간 융모성생식선자극호르몬(Human Chorionic Gonadotropin), EGFRvIII, HER2, HER2/neu, P501 , 구아닐릴 시클라아제 C(Guanylyl Cyclase C), PAP.
- 유효량의 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 조성물을 포함하는 치료용 항종양 백신.
- 삭제
- 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 치료용 항종양 백신으로서 사용하기 위한 것인 조성물.
- 삭제
- 삭제
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